JP2016505256A - 配列操作のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ成分系、方法および組成物 - Google Patents

配列操作のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ成分系、方法および組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、配列および／または標的配列の活性の操作のための系、方法、および組成物を提供する。一部がＣＲＩＳＰＲ複合体の１つ以上の成分をコードするベクターおよびベクター系、ならびにそのようなベクターを設計および使用する方法が提供される。真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ複合体形成を指向する方法およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を利用して正確な突然変異を導入することにより規定の細胞を選択する方法も提供される。

Description

関連出願および参照による組み込み
本出願は、それぞれＢｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１１／００８／ＷＳＧＲ整理番号４４０６３−７０１．１０１、ＢＩ−２０１１／００８／ＷＳＧＲ整理番号４４０６３−７０１．１０２、Ｂｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１１／００８／ＶＰ整理番号４４７９０．０１．２００３、ＢＩ−２０１１／００８／ＶＰ整理番号４４７９０．０２．２００３およびＢＩ−２０１１／００８／ＶＰ整理番号４４７９０．０３．２００３を有する米国仮特許出願第６１／７３６，５２７号明細書、同第６１／７４８，４２７号明細書、同第６１／７６８，９５９号明細書、同第６１／７９１，４０９号明細書および同第６１／８３５，９３１号明細書の優先権を主張し、これらは全て標題ＳＹＳＴＥＭＳ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮであり、それぞれ２０１２年１２月１２日、２０１３年１月２日、２０１３年２月２５日、２０１３年３月１５日および２０１３年６月１７日に出願されたものである。
米国仮特許出願第６１／７５８，４６８号明細書；同第６１／７６９，０４６号明細書；同第６１／８０２，１７４号明細書；同第６１／８０６，３７５号明細書；同第６１／８１４，２６３号明細書；同第６１／８１９，８０３号明細書および同第６１／８２８，１３０号明細書が参照され、それぞれ、標題ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＯＰＴＩＭＩＺＡＴＩＯＮ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮであり、それぞれ、２０１３年１月３０日；２０１３年２月２５日；２０１３年３月１５日；２０１３年３月２８日；２０１３年４月２０日；２０１３年５月６日および２０１３年５月２８日に出願されたものである。それぞれ２０１３年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／８３５，９３６号明細書、同第６１／８３６，１２７号明細書、同第６１／８３６，１０１号明細書、同第６１／８３６，０８０号明細書、同第６１／８３６，１２３号明細書および同第６１／８３５，９７３号明細書も参照される。それぞれＢｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１１／００８Ａを有する米国仮特許出願第６１／８４２，３２２号明細書および米国特許出願第１４／０５４，４１４号明細書も参照され、標題ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＡＬＴＥＲＩＮＧ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＯＦ ＧＥＮＥ ＰＲＯＤＵＣＴＳを有し、それぞれ２０１３年７月２日および２０１３年１０月１５日に出願されたものである。
上記の出願、ならびにそれらの出願においてまたはそれらの審査中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）およびその出願引用文献において引用または参照される全ての文献、ならびに本明細書において引用または参照される全ての文献（「本明細書引用文献」）、および本明細書引用文献において引用または参照される全ての文献は、本明細書においてまたは本明細書に参照により組み込まれる任意の文献において挙げられる任意の製品に関する任意の製造業者の指示書、説明書、製品仕様書、および製品シートと一緒に、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施において用いることができる。より具体的には、全ての参照文献は、それぞれの個々の文献が個別具体的に参照により組み込まれることが示されるような程度で参照により組み込まれる。
本発明は、一般に、クラスター化等間隔短鎖回分リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）およびその成分に関するベクター系を使用し得る配列ターゲティング、例えば、ゲノム摂動または遺伝子編集を含む遺伝子発現の制御に使用される系、方法および組成物に関する。
連邦政府により資金提供された研究に関する記述
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）により助成されたＮＩＨパイオニアアワードＤＰ１ＭＨ１００７０６のもと政府支援によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
ゲノムシーケンシング技術および分析法の近年の進歩により、多様な範囲の生物学的機能および疾患に関連する遺伝因子を分類およびマッピングする技能が顕著に加速されている。正確なゲノムターゲティング技術は、個々の遺伝子エレメントの選択的摂動を可能とすることにより因果的遺伝子変異の体系的なリバースエンジニアリングを可能とするため、ならびに合成生物学、バイオテクノロジーおよび医薬用途を進歩させるために必要とされる。ゲノム編集技術、例えば、デザイナー亜鉛フィンガー、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）、またはホーミングメガヌクレアーゼがターゲティングされるゲノム摂動の産生に利用可能であるが、安価で、設定が容易で、スケーラブルで、真核ゲノム内の複数位置をターゲティングしやすい新たなゲノムエンジニアリング技術が依然として必要とされている。
米国特許第４，８７３，３１６号明細書
多彩な用途の配列ターゲティングのための代替的で堅牢な系および技術が差し迫って必要とされている。本発明は、この必要性に対処し、関連する利点を提供する。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系（両方の用語は、本出願全体にわたり互換的に使用される）は特異的配列をターゲティングするためにカスタム化タンパク質の生成を要求しないが、単一Ｃａｓ酵素を短鎖ＲＮＡ分子によりプログラミングして特異的ＤＮＡ標的を認識させることができ、換言すると、Ｃａｓ酵素は、前記短鎖ＲＮＡ分子を使用して特異的ＤＮＡ標的にリクルートすることができる。ゲノムシーケンシング技術および分析法のレパートリーへのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の付加により方法論が顕著に簡易化され、多様な範囲の生物学的機能および疾患に関連する遺伝因子を分類およびマッピングする技能が加速される。有害効果を有さずにゲノム編集にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を有効に利用するため、特許請求される本発明の態様であるそれらのゲノムエンジニアリングツールのエンジニアリングおよび最適化の態様を理解することが重要である。
一態様において、本発明は、１つ以上のベクターを含むベクター系を提供する。一部の実施形態において、系は、（ａ）ｔｒａｃｒメイト配列および１つ以上のガイド配列をｔｒａｃｒメイト配列の上流に挿入するための１つ以上の挿入部位に作動可能に結合している第１の調節エレメント（ガイド配列は、発現された場合、真核細胞中の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む）；ならびに（ｂ）核局在化配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメントを含み；成分（ａ）および（ｂ）は、系の同一または異なるベクター上にある。一部の実施形態において、成分（ａ）は、第１の調節エレメントの制御下でｔｒａｃｒメイト配列の下流のｔｒａｃｒ配列をさらに含む。一部の実施形態において、成分（ａ）は、第１の調節エレメントに作動可能に結合している２つ以上のガイド配列をさらに含み、２つ以上のガイド配列のそれぞれは、発現された場合、真核細胞中の異なる標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する。一部の実施形態において、系は、第３の調節エレメント、例えば、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターの制御下でｔｒａｃｒ配列を含む。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、最適にアラインされた場合にｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列相補性を示す。最適アラインメントの決定は、当業者の技能の範囲内である。例えば、公開および市販のアラインメントアルゴリズムおよびプログラム、例えば、限定されるものではないが、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ｍａｔｌａｂにおけるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ｂｏｗｔｉｅ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、ＢｉｏｐｙｔｈｏｎおよびＳｅｑＭａｎが存在する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、真核細胞の核中の検出可能な量の前記ＣＲＩＳＰＲ複合体の蓄積をドライブするために十分な強度の１つ以上の核局在化配列を含む。理論により拘束されるものではないが、核局在化配列は、真核生物中のＣＲＩＳＰＲ複合体活性に必要でないが、そのような配列を含めることにより、特に核中の核酸分子のターゲティングに関して系の活性が向上すると考えられる。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９酵素である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９酵素は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９であり、それらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９を含み得る。酵素は、Ｃａｓ９ホモログまたはオルソログであり得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の局在における１つまたは２つの鎖の開裂を指向する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ鎖開裂活性を欠く。一部の実施形態において、第１の調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、第２の調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、ガイド配列は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５ヌクレオチド、または１０〜３０、もしくは１５〜２５、もしくは１５〜２０ヌクレオチド長である。一般に、および本明細書全体で、用語「ベクター」は、それが結合した別の核酸を輸送し得る核酸分子を指す。ベクターとしては、限定されるものではないが、一本鎖、二本鎖、または部分二本鎖の核酸分子；１つ以上の自由末端を含み、自由末端を含まない（例えば、環状）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含む核酸分子；および当技術分野において公知の他の種々のポリヌクレオチドが挙げられる。あるタイプのベクターは、「プラスミド」であり、それは、付加ＤＮＡセグメントを例えば標準分子クローニング技術により挿入することができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、それにおいてウイルス由来ＤＮＡまたはＲＮＡ配列がウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）中へのパッケージングのためにベクター中に存在する。ウイルスベクターとしては、宿主細胞中への形質移入のためにウイルスにより担持されるポリヌクレオチドも挙げられる。あるベクターは、それが導入された宿主細胞中で自己複製し得る（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーマル哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーマル哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入時に宿主細胞のゲノム中にインテグレートされ、それにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、あるベクターは、それが作動的に結合している遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。組換えＤＮＡ技術において有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。
組換え発現ベクターは、宿主細胞中の核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸を含み得、そのことは、組換え発現ベクターが、発現に使用すべき宿主細胞に基づき選択することができ、発現させるべき核酸配列に作動的に結合している１つ以上の調節エレメントを含むことを意味する。組換え発現ベクターのうち、「作動可能に結合している」は、目的ヌクレオチド配列が調節エレメントに、そのヌクレオチド配列の発現（例えば、インビトロ転写／翻訳系またはベクターが宿主細胞中に導入された場合、宿主細胞中で）を可能とするように結合していることを意味するものとする。
用語「調節エレメント」は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および他の発現制御エレメント（例えば、転写終結シグナル、例えば、ポリアデニル化シグナルおよびポリＵ配列）を含むものとする。このような調節エレメントは、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節エレメントとしては、多くのタイプの宿主細胞中のヌクレオチド配列の構成的発現を指向するものおよびある宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指向するもの（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。組織特異的プロモーターは、主として所望の目的組織、例えば、筋肉、神経細胞、骨、皮膚、血液、特異的臓器（例えば、肝臓、膵臓）、または特定の細胞タイプ（例えば、リンパ球）中で発現を指向し得る。調節エレメントは、時間依存的様式、例えば、細胞周期依存的または発生段階依存的様式の発現も指向し得、それは、組織または細胞タイプ特異的であってもなくてもよい。一部の実施形態において、ベクターは、１つ以上のｐｏｌＩＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５つ、またはそれよりも多いｐｏｌＩＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５つ、またはそれよりも多いｐｏｌＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５つ、またはそれよりも多いｐｏｌＩプロモーター）、またはそれらの組合せを含む。ｐｏｌＩＩＩプロモーターの例としては、限定されるものではないが、Ｕ６およびＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌＩＩプロモーターの例としては、限定されるものではないが、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合により、ＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合により、ＣＭＶエンハンサーを有する）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーターが挙げられる。用語「調節エレメント」により、エンハンサーエレメント、例えば、ＷＰＲＥ；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲ中のＲ−Ｕ５’セグメント（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８（１），ｐ．４６６−４７２，１９８８）；ＳＶ４０エンハンサー；およびウサギβ−グロビンのエキソン２と３との間のイントロン配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．７８（３），ｐ．１５２７−３１，１９８１）も包含される。発現ベクターの設計は、形質転換すべき宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどのような因子に依存し得ることが当業者により認識される。ベクターを宿主細胞中に導入し、それにより本明細書に記載の核酸によりコードされる転写物、融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質、またはペプチド（例えば、クラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、それらの突然変異体、それらの融合タンパク質など）を産生することができる。
有利なベクターとしては、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが挙げられ、そのようなベクターのタイプは、特定のタイプの細胞のターゲティングのために選択することもできる。
一態様において、本発明は、１つ以上の核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している調節エレメントを含むベクターを提供する。一部の実施形態において、前記調節エレメントは真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ酵素の転写を、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が真核細胞の核中で検出可能な量で蓄積するようにドライブする。一部の実施形態において、調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９酵素である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９酵素は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９であり、それらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９を含み得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の局在における１つまたは２つの鎖の開裂を指向する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ鎖開裂活性を欠く。
一態様において、本発明は、真核細胞の核中の検出可能な量の前記ＣＲＩＳＰＲ酵素の蓄積をドライブするために十分な強度の１つ以上の核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素を提供する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９酵素である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９酵素は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９であり、それらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９を含み得る。酵素は、Ｃａｓ９ホモログまたはオルソログであり得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、それが結合する標的配列の１つ以上の鎖を開裂する能力を欠く。
一態様において、本発明は、（ａ）ｔｒａｃｒメイト配列および１つ以上のガイド配列をｔｒａｃｒメイト配列の上流に挿入するための１つ以上の挿入部位に作動可能に結合している第１の調節エレメント（ガイド配列は、発現された場合、真核細胞中の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む）；ならびに／または（ｂ）核局在化配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメントを含む真核宿主細胞を提供する。一部の実施形態において、宿主細胞は、成分（ａ）および（ｂ）を含む。一部の実施形態において、成分（ａ）、成分（ｂ）、または成分（ａ）および（ｂ）は、宿主真核細胞のゲノム中に安定的にインテグレートされている。一部の実施形態において、成分（ａ）は、第１の調節エレメントの制御下でｔｒａｃｒメイト配列の下流のｔｒａｃｒ配列をさらに含む。一部の実施形態において、成分（ａ）は、第１の調節エレメントに作動可能に結合している２つ以上のガイド配列をさらに含み、２つ以上のガイド配列のそれぞれは、発現された場合、真核細胞中の異なる標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する。一部の実施形態において、真核宿主細胞は、前記ｔｒａｃｒ配列に作動可能に結合している第３の調節エレメント、例えば、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターをさらに含む。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、最適にアラインされた場合にｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列相補性を示す。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞の核中の検出可能な量の前記ＣＲＩＳＰＲ酵素の蓄積をドライブするために十分な強度の１つ以上の核局在化配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９酵素である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９酵素は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９であり、それらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９を含み得る。酵素は、Ｃａｓ９ホモログまたはオルソログであり得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の局在における１つまたは２つの鎖の開裂を指向する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ鎖開裂活性を欠く。一部の実施形態において、第１の調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、第２の調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、ガイド配列は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５ヌクレオチド、または１０〜３０、もしくは１５〜２５、もしくは１５〜２０ヌクレオチド長である。一態様において、本発明は、記載の実施形態のいずれかによる真核宿主細胞を含む非ヒト真核生物；好ましくは、多細胞真核生物を提供する。他の態様において、本発明は、記載の実施形態のいずれかによる真核宿主細胞を含む真核生物；好ましくは、多細胞真核生物を提供する。これらの態様の一部の実施形態における生物は、動物；例えば、哺乳動物であり得る。また、生物は、節足動物、例えば、昆虫であり得る。生物は、植物でもあり得る。さらに、生物は、真菌であり得る。
一態様において、本発明は、本明細書に記載の成分の１つ以上を含むキットを提供する。一部の実施形態において、キットは、ベクター系およびキットの使用指示書を含む。一部の実施形態において、ベクター系は、（ａ）ｔｒａｃｒメイト配列および１つ以上のガイド配列をｔｒａｃｒメイト配列の上流に挿入するための１つ以上の挿入部位に作動可能に結合している第１の調節エレメント（ガイド配列は、発現された場合、真核細胞中の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む）；ならびに／または（ｂ）核局在化配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメントを含む。一部の実施形態において、キットは、系の同一または異なるベクター上にある成分（ａ）および（ｂ）を含む。一部の実施形態において、成分（ａ）は、第１の調節エレメントの制御下でｔｒａｃｒメイト配列の下流のｔｒａｃｒ配列をさらに含む。一部の実施形態において、成分（ａ）は、第１の調節エレメントに作動可能に結合している２つ以上のガイド配列をさらに含み、２つ以上のガイド配列のそれぞれは、発現された場合、真核細胞中の異なる標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する。一部の実施形態において、系は、前記ｔｒａｃｒ配列に作動可能に結合している第３の調節エレメント、例えば、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターをさらに含む。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、最適にアラインされた場合にｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列相補性を示す。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞の核中の検出可能な量の前記ＣＲＩＳＰＲ酵素の蓄積をドライブするために十分な強度の１つ以上の核局在化配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９酵素である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９酵素は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９であり、それらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９を含み得る。酵素は、Ｃａｓ９ホモログまたはオルソログであり得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の局在における１つまたは２つの鎖の開裂を指向する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ鎖開裂活性を欠く。一部の実施形態において、第１の調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、第２の調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、ガイド配列は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５ヌクレオチド、または１０〜３０、もしくは１５〜２５、もしくは１５〜２０ヌクレオチド長である。
一態様において、本発明は、真核細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記標的ポリヌクレオチドの開裂を生じさせ、それにより標的ポリヌクレオチドを改変することを含み、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、次いでｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合している。一部の実施形態において、前記開裂は、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素により標的配列の局在における１つまたは２つの鎖を開裂することを含む。一部の実施形態において、前記開裂は、標的遺伝子の転写の減少をもたらす。一部の実施形態において、方法は、外因性テンプレートポリヌクレオチドとの相同組換えにより前記開裂標的ポリヌクレオチドを修復することをさらに含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む突然変異をもたらす。一部の実施形態において、前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子から発現されるタンパク質中の１つ以上のアミノ酸変化をもたらす。一部の実施形態において、方法は、１つ以上のベクターを前記真核細胞に送達することをさらに含み、１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に結合しているガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現をドライブする。一部の実施形態において、前記ベクターを対象中の真核細胞中に送達する。一部の実施形態において、前記改変を、細胞培養物中の前記真核細胞中で行う。一部の実施形態において、方法は、前記改変前に前記真核細胞を対象から単離することをさらに含む。一部の実施形態において、方法は、前記真核細胞および／またはそれに由来する細胞を前記対象に戻すことをさらに含む。
一態様において、本発明は、真核細胞中のポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体をポリヌクレオチドに結合させ、その結果、前記結合が前記ポリヌクレオチドの発現の増加または減少をもたらすことを含み；ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、次いでｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合している。一部の実施形態において、方法は、１つ以上のベクターを前記真核細胞に送達することをさらに含み、１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に結合しているガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現をドライブする。
一態様において、本発明は、突然変異疾患遺伝子を含むモデル真核細胞を生成する方法を提供する。一部の実施形態において、疾患遺伝子は、疾患を有し、または発症するリスクの増加に関連する任意の遺伝子である。一部の実施形態において、方法は、（ａ）１つ以上のベクターを真核細胞に導入すること（１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に結合しているガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現をドライブする）および（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記疾患遺伝子内の標的ポリヌクレオチドの開裂を生じさせ（ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む）、それにより、突然変異疾患遺伝子を含むモデル真核細胞を生成することを含む。一部の実施形態において、前記開裂は、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素により標的配列の局在における１つまたは２つの鎖を開裂することを含む。一部の実施形態において、前記開裂は、標的遺伝子の転写の減少をもたらす。一部の実施形態において、方法は、外因性テンプレートポリヌクレオチドとの相同組換えにより前記開裂標的ポリヌクレオチドを修復することをさらに含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む突然変異をもたらす。一部の実施形態において、前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子から発現されるタンパク質中の１つ以上のアミノ酸変化をもたらす。
一態様において、本発明は、疾患遺伝子に関連する細胞シグナリングイベントをモジュレートする生物活性剤を開発する方法を提供する。一部の実施形態において、疾患遺伝子は、疾患を有し、または発症するリスクの増加に関連する任意の遺伝子である。一部の実施形態において、方法は、（ａ）試験化合物を、記載の実施形態のいずれか１つのモデル細胞と接触させること；および（ｂ）前記疾患遺伝子中の前記突然変異に関連する細胞シグナリングイベントの低減または増大を示すリードアウトの変化を検出し、それにより、前記疾患遺伝子に関連する前記細胞シグナリングイベントをモジュレートする前記生物活性剤を開発することを含む。
一態様において、本発明は、ｔｒａｃｒメイト配列の上流のガイド配列を含む組換えポリヌクレオチドであって、ガイド配列は、発現された場合、真核細胞中に存在する対応する標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する組換えポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態において、標的配列は、真核細胞中に存在するウイルス配列である。一部の実施形態において、標的配列は、原癌遺伝子または癌遺伝子である。
一態様において、本発明は、１つ以上の原核細胞中の遺伝子中の１つ以上の突然変異を導入することにより１つ以上の原核細胞を選択する方法であって、１つ以上のベクターを原核細胞中に導入すること（１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に結合しているガイド配列、ｔｒａｃｒ配列、および編集テンプレートの１つ以上の発現をドライブし；編集テンプレートは、ＣＲＩＳＰＲ酵素開裂を停止させる１つ以上の突然変異を含む）；編集テンプレートと、選択すべき細胞中の標的ポリヌクレオチドとを相同組換えさせること；ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記遺伝子内の標的ポリヌクレオチドの開裂を生じさせ（ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、標的ポリヌクレオチドへのＣＲＩＳＰＲ複合体の結合は、細胞死を誘導する）、それにより、１つ以上の突然変異が導入された１つ以上の原核細胞の選択を可能とすることを含む方法を提供する。好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９である。本発明の別の態様において、選択すべき細胞は、真核細胞であり得る。本発明の態様により、選択マーカーもカウンターセレクション系を含み得る２ステッププロセスも要求しない規定の細胞の選択が可能となる。
したがって、本発明の目的は、任意の既に公知の生成物、その生成物の作製方法、またはその生成物の使用方法を本発明に包含することではなく、したがって、本出願人らは、その権利を保有し、任意の既に公知の生成物、作製方法、または使用方法の放棄を本明細書に開示する。本発明は、ＵＳＰＴＯ（米国特許法第１１２条、第１段落）またはＥＰＯ（欧州特許条約第８３条）の記載要件および実施可能要件を満たさない任意の生成物、方法、または生成物の作製または生成物の使用方法を、本発明の範囲に包含しないものとし、したがって、本出願人らは、その権利を保有し、任意の既に記載の生成物、その生成物の作製方法、またはその生成物の使用方法の放棄を本明細書に開示することがさらに留意される。
本開示および特に特許請求の範囲および／または段落において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのような用語は、米国特許法に帰属する意味を有し得；例えば、それらは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得；「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」のような用語は、米国特許法に帰属する意味を有し、例えば、それらは、明示的に記述されない構成要素を許容するが、先行技術に見出され、または本発明の基本もしくは新規特徴に影響する構成要素を排除することが留意される。これらのおよび他の実施形態は、以下の詳細な説明により開示され、またはそれから明らかであり、それにより包含される。
本発明の新規特徴を、特に添付の特許請求の範囲を用いて記載する。本発明の特徴および利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用される説明的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、および付属の図面を参照することにより得られる。
ＣＲＩＳＰＲ系の模式的モデルを示す。化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９ヌクレアーゼ（黄色）を、２０ｎｔガイド配列（青色）および足場（赤色）からなる合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によりゲノムＤＮＡにターゲティングする。必要な５’−ＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ；マゼンタ）のすぐ上流のＤＮＡ標的（青色）とのガイド配列塩基対、およびＣａｓ９は、ＰＡＭの約３ｂｐ上流の二本鎖切断（ＤＳＢ）（赤色三角）を媒介する。 例示的ＣＲＩＳＰＲ系、考えられる作用機序、真核細胞中の発現の例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。 例示的ＣＲＩＳＰＲ系、考えられる作用機序、真核細胞中の発現の例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。 例示的ＣＲＩＳＰＲ系、考えられる作用機序、真核細胞中の発現の例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。 例示的ＣＲＩＳＰＲ系、考えられる作用機序、真核細胞中の発現の例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。 例示的ＣＲＩＳＰＲ系、考えられる作用機序、真核細胞中の発現の例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。 例示的ＣＲＩＳＰＲ系、考えられる作用機序、真核細胞中の発現の例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。 真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ系エレメントの発現のための例示的発現カセット、例示的ガイド配列の予測構造、ならびに真核および原核細胞中で計測されたＣＲＩＳＰＲ系活性を示す。 例示的標的についてのＳｐＣａｓ９特異性の評価の結果を示す。 例示的標的についてのＳｐＣａｓ９特異性の評価の結果を示す。 例示的標的についてのＳｐＣａｓ９特異性の評価の結果を示す。 例示的標的についてのＳｐＣａｓ９特異性の評価の結果を示す。 例示的ベクター系および真核細胞中の相同組換えの指向におけるその使用についての結果を示す。 例示的ベクター系および真核細胞中の相同組換えの指向におけるその使用についての結果を示す。 例示的ベクター系および真核細胞中の相同組換えの指向におけるその使用についての結果を示す。 例示的ベクター系および真核細胞中の相同組換えの指向におけるその使用についての結果を示す。 例示的ベクター系および真核細胞中の相同組換えの指向におけるその使用についての結果を示す。 例示的ベクター系および真核細胞中の相同組換えの指向におけるその使用についての結果を示す。 例示的ベクター系および真核細胞中の相同組換えの指向におけるその使用についての結果を示す。 プロトスペーサー配列の表を提供し、ヒトおよびマウスゲノム中の遺伝子座に対して例示的化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ系に基づき設計されたプロトスペーサー標的と対応するＰＡＭについての改変効率結果をまとめる。細胞をＣａｓ９およびプレｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡまたはキメラＲＮＡのいずれかにより形質移入し、形質移入から７２時間後に分析した。インデルパーセントは、示された細胞系からのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ結果に基づき算出した（全てのプロトスペーサー標的についてＮ＝３、誤差は、標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）であり、Ｎ．Ｄ．は、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを使用して検出可能でないことを示し、Ｎ．Ｔ．は、本試験において試験しなかったことを示す）。 Ｃａｓ９媒介遺伝子ターゲティングについての異なるｔｒａｃｒＲＮＡ転写物の比較を示す。 Ｃａｓ９媒介遺伝子ターゲティングについての異なるｔｒａｃｒＲＮＡ転写物の比較を示す。 Ｃａｓ９媒介遺伝子ターゲティングについての異なるｔｒａｃｒＲＮＡ転写物の比較を示す。 二本鎖切断により誘導された微小挿入および欠失の検出のためのｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイの模式図を示す。 真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ系エレメントの発現のための例示的バイシストロニック発現ベクターを示す。 細菌プラスミド形質転換干渉アッセイ、それに使用された発現カセットおよびプラスミド、ならびにそれに使用された細胞の形質転換効率を示す。 ヒトゲノム中の隣接する化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０遺伝子座１ＰＡＭ（ＮＧＧ）（図１０Ａ）と、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ９遺伝子座２ＰＡＭ（ＮＮＡＧＡＡＷ）（図１０Ｂ）との間の距離のヒストグラム；ならびに染色体（Ｃｈｒ）単位のそれぞれのＰＡＭについての距離（図１０Ｃ）を示す。 例示的ＣＲＩＳＰＲ系、真核細胞中の発現のための例示的適応、およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。 哺乳動物細胞中のゲノム遺伝子座のターゲティングのためのＣＲＩＳＰＲ系の例示的操作を示す。 哺乳動物細胞中のｃｒＲＮＡプロセシングのノザンブロット分析の結果を示す。 ヒトＰＶＡＬＢおよびマウスＴｈ遺伝子座中のプロトスペーサーの例示的選択を示す。 ヒトＥＭＸ１遺伝子座中のＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ系の例示的プロトスペーサーおよび対応するＰＡＭ配列標的を示す。 Ｓｕｒｖｅｙｏｒ、ＲＦＬＰ、ゲノムシーケンシング、およびノザンブロットアッセイに使用されたプライマーおよびプローブについての配列の表を提供する。 キメラＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ系の例示的操作および真核細胞中の系活性についてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を示す。 キメラＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ系の例示的操作および真核細胞中の系活性についてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を示す。 キメラＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ系の例示的操作および真核細胞中の系活性についてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を示す。 真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ系活性についてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果のグラフ表示を示す。 ＵＣＳＣゲノムブラウザを使用するヒトゲノム中のいくつかの化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９標的部位の例示的可視化を示す。 ガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列、およびｔｒａｃｒ配列を含む例示的キメラＲＮＡについての予測二次構造を示す。 真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ系エレメントの発現のための例示的バイシストロニック発現ベクターを示す。 内因性標的に対するＣａｓ９ヌクレアーゼ活性を、ゲノム編集に活用することができることを示す。（ａ）ＣＲＩＳＰＲ系を使用するゲノム編集の概念。ＣＲＩＳＰＲターゲティング構築物は、染色体遺伝子座の開裂を指向し、標的と組み換わる編集テンプレートと同時形質転換して開裂を妨害した。ＣＲＩＳＰＲアタックから生存したカナマイシン耐性形質転換体は、編集テンプレートにより誘導された改変、ｔｒａｃｒ、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ；ａｐｈＡ−３、カナマイシン耐性遺伝子を含有した。（ｂ）編集テンプレートなし、Ｒ６野生型ｓｒｔＡまたはＲ６３７０．１編集テンプレートを用いるＲ６８２３２．５細胞中のｃｒＲ６Ｍ ＤＮＡの形質転換。Ｒ６ｓｒｔＡまたはＲ６３７０．１のいずれかの組換えは、Ｃａｓ９による開裂を妨害した。形質転換効率は、ｃｒＲ６Ｍ ＤＮＡ１μｇ当たりのコロニー形成単位（ｃｆｕ）として算出し；少なくとも３つの独立実験からの標準偏差とともに平均値を示す。ＰＣＲ分析は、それぞれの形質転換において８つのクローンに対して実施した。「Ｕｎ．」は、株Ｒ６８２３２．５の非編集ｓｒｔＡ遺伝子座を示し；「Ｅｄ．」は、編集テンプレートを示す。Ｒ６８２３２．５およびＲ６３７０．１標的は、ＥａｅＩによる制限により区別する。 Ｃａｓ９開裂を排除するＰＡＭおよびシード配列の分析を示す。（ａ）ランダム化されたＰＡＭ配列またはランダム化されたシード配列を有するＰＣＲ産物を、ｃｒＲ６細胞中に形質転換した。これらの細胞は、Ｒ６ゲノムに不存在のＲ６８２３２．５細胞の染色体領域（桃色で強調）をターゲティングするｃｒＲＮＡがロードされているＣａｓ９を発現した。不活性ＰＡＭまたはシード配列を担持する２×１０５個を超えるクロラムフェニコール耐性形質転換体を、標的領域の増幅およびディープシーケンシングのために合わせた。（ｂ）ｃｒＲ６細胞中のランダムＰＡＭ構築物の形質転換後のリード数の相対比率（Ｒ６形質転換体におけるリード数と比較）。それぞれの３−ヌクレオチドＰＡＭ配列についての相対存在量を示す。極度に過少の配列（ＮＧＧ）を赤色で示し；部分的に過少のものを橙色で示す（ＮＡＧ）。（ｃ）ｃｒＲ６細胞中のランダムシード配列構築物の形質転換後のリード数の相対比率（Ｒ６形質転換体におけるリード数と比較）。プロトスペーサー配列の最初の２０ヌクレオチドのそれぞれの位置についてのそれぞれのヌクレオチドの相対存在量を示す。高い存在量は、Ｃａｓ９による開裂の欠如、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ不活性突然変異を示す。灰色線は、ＷＴ配列のレベルを示す。点線は、突然変異が開裂を有意に破壊するレベルを表す（実施例５のセクション「ディープシーケンシングデータの分析」参照）。 肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）におけるＣＲＩＳＰＲ系を使用する単一および複数突然変異の導入を示す。（ａ）野生型および編集された（緑色ヌクレオチド；下線付きアミノ酸残基）ｂｇａＡのヌクレオチドおよびアミノ酸配列。プロトスペーサー、ＰＡＭおよび制限部位を示す。（ｂ）編集テンプレートまたは対照の存在下でターゲティング構築物により形質転換された細胞の形質転換効率。（ｃ）それぞれの編集実験と、それに続くＢｔｇＺＩ（Ｒ→Ａ）およびＴｓｅＩ（ＮＥ→ＡＡ）による消化の８つの形質転換体についてのＰＣＲ分析。ｂｇａＡの欠失は、より小さいＰＣＲ産物として明らかになった。（ｄ）ＷＴおよび編集された株のβ−ガラクトシダーゼ活性を計測するためのＭｉｌｌｅｒアッセイ。（ｅ）単一ステップの二重欠失のため、ターゲティング構築物は２つのスペーサー（この場合、マッチングｓｒｔＡおよびｂｇａＡ）を含有し、２つの異なる編集テンプレートにより同時形質転換した。（ｆ）ｓｒｔＡおよびｂｇａＡ遺伝子座の欠失を検出するための８つの形質転換体についてのＰＣＲ分析。８つ中６つの形質転換体が両方の遺伝子を欠失した。 ＣＲＩＳＰＲ系を使用する編集を基礎とする機序を提供する。（ａ）終止コドンをエリスロマイシン耐性遺伝子ｅｒｍＡＭ中に導入して株ＪＥＮ５３を生成した。ＣＲＩＳＰＲ：：ｅｒｍＡＭ（終止）構築物により終止コドンをターゲティングし、ｅｒｍＡＭ野生型配列を編集テンプレートとして使用することにより野生型配列を復帰させることができる。（ｂ）突然変異体および野生型ｅｒｍＡＭ配列。（ｃ）総またはカナマイシン耐性（ｋａｎＲ）ｃｆｕから算出されたエリスロマイシン耐性（ｅｒｍＲ）ｃｆｕの率。（ｄ）ＣＲＩＳＰＲ構築物および編集テンプレートの両方を獲得する総細胞数の率。ＣＲＩＳＰＲターゲティング構築物の同時形質転換は、より多くの形質転換体を産生した（ｔ検定、ｐ＝０．０１１）。全ての場合において、値は３つの独立実験についての平均±標準偏差を示す。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のＣＲＩＳＰＲ系によるゲノム編集を説明する。（ａ）遺伝子をターゲティングして編集するＣＲＩＳＰＲアレイを担持するカナマイシン耐性プラスミド（ｐＣＲＩＳＰＲ）は、ｃａｓ９およびｔｒａｃｒを保有するクロラムフェニコール耐性プラスミド（ｐＣａｓ９）を含有するＨＭＥ６３リコンビニアリング株中に、突然変異を規定するオリゴヌクレオチドと一緒に形質転換することができる。（ｂ）ストレプトマイシン耐性を付与するＫ４２Ｔ突然変異をｒｐｓＬ遺伝子中に導入した。（ｃ）総またはカナマイシン耐性（ｋａｎＲ）ｃｆｕから算出されたストレプトマイシン耐性（ｓｔｒｅｐＲ）ｃｆｕの率。（ｄ）ｐＣＲＩＳＰＲプラスミドおよび編集オリゴヌクレオチドの両方を獲得する総細胞数の率。ｐＣＲＩＳＰＲターゲティングプラスミドの同時形質転換は、より多くの形質転換体を産生した（ｔ検定、ｐ＝０．００４）。全ての場合において、値は３つの独立実験についての平均±標準偏差を示した。 ｃｒＲ６ゲノムＤＮＡの形質転換がターゲティングされる遺伝子座の編集をもたらすことを説明する。（ａ）肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒ６のＩＳ１１６７エレメントを、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０のＣＲＩＳＰＲ０１遺伝子座により置き換えてｃｒＲ６株を生成した。この遺伝子座はＣａｓ９ヌクレアーゼ、６つのスペーサーを有するＣＲＩＳＰＲアレイ、ｃｒＲＮＡバイオジェネシスに要求されるｔｒａｃｒＲＮＡ、ならびにターゲティングに必要でないタンパク質Ｃａｓ１、Ｃａｓ２およびＣｓｎ２をコードする。株ｃｒＲ６Ｍは、ｃａｓ１、ｃａｓ２およびｃｓｎ２を有さない最小機能的ＣＲＩＳＰＲ系を含有する。ａｐｈＡ−３遺伝子は、カナマイシン耐性をコードする。連鎖球菌バクテリオファージφ８２３２．５およびφ３７０．１からのプロトスペーサーをクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）に融合し、株Ｒ６のｓｒｔＡ遺伝子中にインテグレートして株Ｒ６８２３２．５およびＲ６３７０．１を生成した。（ｂ）左側パネル：Ｒ６８２３２．５およびＲ６３７０．１中のｃｒＲ６およびｃｒＲ６ＭゲノムＤＮＡの形質転換。細胞コンピテンスの対照として、ストレプトマイシン耐性遺伝子も形質転換した。右側パネル：ｃｒＲ６ゲノムＤＮＡを有する８つのＲ６８２３２．５形質転換体のＰＣＲ分析。ｓｒｔＡ遺伝子座を増幅するプライマーをＰＣＲに使用した。８つ中７つのゲノタイピングされたコロニーが、Ｒ６８２３２．５ｓｒｔＡ遺伝子座をｃｒＲ６ゲノムＤＮＡからのＷＴ遺伝子座により置き換えた。 本試験において得られた編集された細胞のＤＮＡ配列のクロマトグラムを提供する。全ての場合において、野生型および突然変異体プロトスペーサーおよびＰＡＭ配列（またはそれらの逆相補鎖）を示す。関連する場合、プロトスペーサーによりコードされるアミノ酸配列を提供する。それぞれの編集実験について、ＰＣＲおよび制限分析が所望の改変の導入を裏付けた全ての株をシーケンシングした。代表的なクロマトグラムを示す。（ａ）Ｒ６８２３２．５標的中へのＰＡＭ突然変異の導入についてのクロマトグラム（図２３ｄ）。（ｂ）β−ガラクトシダーゼ（ｂｇａＡ）中へのＲ＞ＡおよびＮＥ＞ＡＡ突然変異の導入についてのクロマトグラム（図２５ｃ）。（ｃ）ｂｇａＡ ＯＲＦ内の６６６４ｂｐ欠失の導入についてのクロマトグラム（図２５ｃおよび２５ｆ）。点線は、欠失の限界を示す。（ｄ）ｓｒｔＡ ＯＲＦ内の７２９ｂｐ欠失の導入についてのクロマトグラム（図２５ｆ）。点線は、欠失の限界を示す。（ｅ）ｅｒｍＡＭ内の早期終止コドンの生成についてのクロマトグラム（図３３）。（ｆ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｒｐｓＬ編集（図２７）。 異なるＰＡＭを含有するランダム肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）標的に対するＣＲＩＳＰＲ免疫性を説明する。（ａ）肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒ６ゲノム上の１０個のランダム標的の位置。選択された標的は異なるＰＡＭを有し、両方の鎖上に存在する。（ｂ）標的に対応するスペーサーを、プラスミドｐＬＺ１２上の最小ＣＲＩＳＰＲアレイ中でクローニングし、プロセシングおよびターゲティング機構をトランスで供給する株ｃｒＲ６Ｒｃ中に形質転換した。（ｃ）株Ｒ６およびｃｒＲ６Ｒｃ中の異なるプラスミドの形質転換効率。ｃｒＲ６Ｒｃ中のｐＤＢ９９〜１０８（Ｔ１〜Ｔ１０）の形質転換についてコロニーは回収されなかった。点線は、アッセイの検出限界を表す。 ターゲティングされるゲノム編集の一般スキームを提供する。ターゲティングされるゲノム編集を促進するため、ｃｒＲ６ＭをｔｒａｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９およびＣＲＩＳＰＲアレイの１つのみのリピートと、それに続くカナマイシン耐性マーカー（ａｐｈＡ−３）を含有するようにさらにエンジニアリングし、株ｃｒＲ６Ｒｋを生成した。この株からのＤＮＡを、新たなスペーサー（Ｎにより示される緑色の枠）を導入するように設計されたプライマーとともにＰＣＲのためのテンプレートとして使用する。左側および右側ＰＣＲは、ギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）法を使用してアセンブリしてターゲティング構築物を創成する。次いで、ターゲティングおよび編集構築物の両方を、ｃｒＲ６Ｒｋと同等の株であるが、カナマイシン耐性マーカーがクロラムフェニコール耐性マーカー（ｃａｔ）により置き換えられた株ｃｒＲ６Ｒｃ中に形質転換する。カナマイシン耐性形質転換体の約９０％が所望の突然変異を含有する。 ＰＡＭ間の距離の分布を説明する。有効なＰＡＭであるとみなされるＮＧＧおよびＣＣＮ。肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒ６ゲノムならびに同一長および同一ＧＣ含有率（３９．７％）を有するランダム配列についてのデータを示す。点線は、Ｒ６ゲノム中のＰＡＭ間の平均距離（１２）を表す。 ゲノムＤＮＡをターゲティング構築物として使用するｅｒｍＡＭ遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ媒介編集を説明する。ゲノムＤＮＡをターゲティング構築物として使用するため、ＣＲＩＳＰＲ自己免疫性を回避することが必要であり、したがって、染色体中に存在しない配列に対するスペーサーを使用しなければならない（この場合、ｅｒｍＡＭエリスロマイシン耐性遺伝子）。（ａ）野生型および突然変異（赤色文字）ｅｒｍＡＭ遺伝子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。プロトスペーサーおよびＰＡＭ配列を示す。（ｂ）ゲノムＤＮＡを使用するｅｒｍＡＭ遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ媒介編集の模式図。ｅｒｍＡＭターゲティングスペーサー（青色の欄）を担持する構築物をＰＣＲおよびギブソン・アセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ）により作製し、株ｃｒＲ６Ｒｃ中に形質転換し、株ＪＥＮ３７を生成した。次いで、ＪＥＮ３７のゲノムＤＮＡをターゲティング構築物として使用し、ｓｒｔＡ遺伝子がｅｒｍＡＭの野生型コピーにより置き換えられた株であるＪＥＮ３８中に編集テンプレートとともに同時形質転換した。カナマイシン耐性形質転換体は、編集されたゲノタイプを含有する（ＪＥＮ４３）。（ｃ）ターゲティングおよび編集または対照テンプレートの同時形質転換後に得られたカナマイシン耐性細胞の数。対照テンプレートの存在下で５．４×１０３ｃｆｕ／ｍｌが得られ、編集テンプレートを使用した場合は４．３×１０５ｃｆｕ／ｍｌが得られた。この差は、約９９％［（４．３×１０５−５．４×１０３）／４．３×１０５］の編集効率を示す。（ｄ）編集された細胞の存在を確認するため、７つのカナマイシン耐性クローンおよびＪＥＮ３８を、エリスロマイシンを有し（ｅｒｍ＋）、または有さない（ｅｒｍ−）寒天プレート上でストリークした。陽性対照のみ、エリスロマイシンに対する耐性を示した。これらの形質転換体の１つのｅｒｍＡＭｍｕｔゲノタイプは、ＤＮＡシーケンシングによっても確認した（図２９ｅ）。 ＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム編集による突然変異の逐次導入を説明する。（ａ）ＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム編集による突然変異の逐次導入についての模式図。第１に、Ｒ６は、ｃｒＲ６Ｒｋを生成するようにエンジニアリングする。ｃｒＲ６Ｒｋは、編集された細胞のクロラムフェニコール選択のためのｃａｔに融合しているｓｒｔＡターゲティング構築物により、ΔｓｒｔＡインフレーム欠失のための編集構築物とともに同時形質転換する。株ｃｒＲ６ΔｓｒｔＡは、クロラムフェニコールに基づく選択により生成する。続いて、ΔｓｒｔＡ株は、編集された細胞のカナマイシン選択のためのａｐｈＡ−３に融合しているｂｇａＡターゲティング構築物、およびΔｂｇａＡインフレーム欠失を含有する編集構築物により同時形質転換する。最後に、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、最初に野生型ＩＳ１１６７遺伝子座を含有するＲ６ＤＮＡおよびｂｇａＡプロトスペーサーを担持するプラスミド（ｐＤＢ９７）を同時形質転換し、スペクチノマイシンに基づき選択することにより染色体から消去することができる。（ｂ）ｓｒｔＡ遺伝子座の欠失を検出するための８つのクロラムフェニコール（Ｃａｍ）耐性形質転換体についてのＰＣＲ分析。（ｃ）Ｍｉｌｌｅｒアッセイにより計測されたβ−ガラクトシダーゼ活性。肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）において、この酵素はソルターゼＡにより細胞壁に固定される。ｓｒｔＡ遺伝子の欠失は、上清中へのβ−ガラクトシダーゼの放出をもたらす。ΔｂｇａＡ突然変異体は活性を示さない。（ｄ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の野生型ＩＳ１１６７による置き換えを検出するための８つのスペクチノマイシン（Ｓｐｅｃ）耐性形質転換体についてのＰＣＲ分析。 肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）におけるＣＲＩＳＰＲのバックグラウンド突然変異頻度を説明する。（ａ）ｅｒｍＡＭ編集テンプレートを用い、または用いないＪＥＮ５３中のＣＲＩＳＰＲ：：φまたはＣＲＩＳＰＲ：：ｅｒｍ（終止）ターゲティング構築物の形質転換。ＣＲＩＳＰＲ：：φとＣＲＩＳＰＲ：：ｅｒｍ（終止）との間のｋａｎＲＣＦＵの差は、Ｃａｓ９開裂が非編集細胞を殺傷することを示す。編集テンプレートの不存在下でＣＲＩＳＰＲ干渉をエスケープする突然変異体は、３×１０−３の頻度において観察される。（ｂ）エスケーパーのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のＰＣＲ分析は、８つ中７つがスペーサー欠失を有することを示す。（ｃ）エスケーパー＃２は、ｃａｓ９中の点突然変異を担持する。 化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座１の不可欠なエレメントが、ｐＣａｓ９を使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で再構成されることを説明する。プラスミドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９、およびｃｒＲＮＡアレイをドライブするリーダー配列を含有した。ｐＣＲＩＳＰＲプラスミドは、リーダーおよびアレイのみを含有した。スペーサーは、アニールされたオリゴヌクレオチドを使用してＢｓａＩ部位間のｃｒＲＮＡアレイ中に挿入することができる。オリゴヌクレオチド設計を下方に示す。ｐＣａｓ９は、クロラムフェニコール耐性（ＣｍＲ）を担持し、低コピーｐＡＣＹＣ１８４プラスミド骨格をベースとする。ｐＣＲＩＳＰＲは、高コピー数ｐＺＥ２１プラスミドをベースとする。２つのプラスミドが要求された。それというのも、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体をターゲティングするスペーサーを含有するｐＣＲＩＳＰＲプラスミドは、Ｃａｓ９も存在する場合にこの生物をクローニング宿主として使用して構築することができない（それが宿主を殺傷する）ためである。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５中のＣＲＩＳＰＲ指向編集を説明する。ストレプトマイシン耐性を付与し、ＣＲＩＳＰＲ免疫性を停止させる点突然変異を担持するオリゴヌクレオチド（Ｗ５４２）を、ｒｐｓＬをターゲティングするプラスミド（ｐＣＲＩＳＰＲ：：ｒｐｓＬ）または対照プラスミド（ｐＣＲＩＳＰＲ：：φ）と一緒に、ｐＣａｓ９を含有する野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＧ１６５５中に同時形質転換した。形質転換体は、ストレプトマイシンまたはカナマイシンのいずれかを含有する培地上で選択した。点線は形質転換アッセイの検出限界を示す。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＭＥ６３中のＣＲＩＳＰＲのバックグラウンド突然変異頻度を説明する。（ａ）ＨＭＥ６３コンピテント細胞中へのｐＣＲＩＳＰＲ：：φまたはｐＣＲＩＳＰＲ：：ｒｐｓＬプラスミドの形質転換。ＣＲＩＳＰＲ干渉をエスケープする突然変異体は、２．６×１０−４の頻度において観察された。（ｂ）エスケーパーのＣＲＩＳＰＲアレイの増幅は、８つ中８つがスペーサーを欠失したことを示した。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の円形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の円形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の円形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の円形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に局在している配列を示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に局在している配列を示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に局在している配列を示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に局在している配列を示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に局在している配列を示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に局在している配列を示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に局在している配列を示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に局在している配列を示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に局在している配列を示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に局在している配列を示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に局在している配列を示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に局在している配列を示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に局在している配列を示す。 触媒ドメイン中の２つの突然変異（Ｄ１０およびＨ８４０）を有するＣａｓ９に転写活性化ドメイン（ＶＰ６４）が融合している模式的構築物を示す。 相同組換えを介するゲノム編集を示す。（ａ）ＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン中のＤ１０Ａ突然変異を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼの模式図。（ｂ）センスまたはアンチセンス一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを修復テンプレートとして使用するヒトＥＭＸ１遺伝子座における相同組換え（ＨＲ）を表す模式図。上方の赤色矢印は、ｓｇＲＮＡ開裂部位を示し；ゲノタイピングのためのＰＣＲプライマー（表ＪおよびＫ）を右側パネルに矢印として示す。（ｃ）ＨＲにより改変された領域の配列。ｄ、ＥＭＸ標的１遺伝子座における野生型（ｗｔ）およびニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）ＳｐＣａｓ９媒介インデルについてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（ｎ＝３）。矢印は、予測断片サイズの位置を示す。 相同組換えを介するゲノム編集を示す。（ａ）ＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン中のＤ１０Ａ突然変異を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼの模式図。（ｂ）センスまたはアンチセンス一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを修復テンプレートとして使用するヒトＥＭＸ１遺伝子座における相同組換え（ＨＲ）を表す模式図。上方の赤色矢印は、ｓｇＲＮＡ開裂部位を示し；ゲノタイピングのためのＰＣＲプライマー（表ＪおよびＫ）を右側パネルに矢印として示す。（ｃ）ＨＲにより改変された領域の配列。ｄ、ＥＭＸ標的１遺伝子座における野生型（ｗｔ）およびニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）ＳｐＣａｓ９媒介インデルについてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（ｎ＝３）。矢印は、予測断片サイズの位置を示す。 相同組換えを介するゲノム編集を示す。（ａ）ＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン中のＤ１０Ａ突然変異を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼの模式図。（ｂ）センスまたはアンチセンス一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを修復テンプレートとして使用するヒトＥＭＸ１遺伝子座における相同組換え（ＨＲ）を表す模式図。上方の赤色矢印は、ｓｇＲＮＡ開裂部位を示し；ゲノタイピングのためのＰＣＲプライマー（表ＪおよびＫ）を右側パネルに矢印として示す。（ｃ）ＨＲにより改変された領域の配列。ｄ、ＥＭＸ標的１遺伝子座における野生型（ｗｔ）およびニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）ＳｐＣａｓ９媒介インデルについてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（ｎ＝３）。矢印は、予測断片サイズの位置を示す。 相同組換えを介するゲノム編集を示す。（ａ）ＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン中のＤ１０Ａ突然変異を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼの模式図。（ｂ）センスまたはアンチセンス一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを修復テンプレートとして使用するヒトＥＭＸ１遺伝子座における相同組換え（ＨＲ）を表す模式図。上方の赤色矢印は、ｓｇＲＮＡ開裂部位を示し；ゲノタイピングのためのＰＣＲプライマー（表ＪおよびＫ）を右側パネルに矢印として示す。（ｃ）ＨＲにより改変された領域の配列。ｄ、ＥＭＸ標的１遺伝子座における野生型（ｗｔ）およびニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）ＳｐＣａｓ９媒介インデルについてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（ｎ＝３）。矢印は、予測断片サイズの位置を示す。 ＳｐＣａｓ９のための単一ベクター設計を示す。 ＳｐＣａｓ９のための単一ベクター設計を示す。 ＮＬＳ−Ｃｓｎ１構築物ＮＬＳ−Ｃｓｎ１、Ｃｓｎ１、Ｃｓｎ１−ＮＬＳ、ＮＬＳ−Ｃｓｎ１−ＮＬＳ、ＮＬＳ−Ｃｓｎ１−ＧＦＰ−ＮＬＳおよびＵｎＴＦＮ開裂の定量を示す。 ＮＬＳ−Ｃａｓ９、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９−ＮＬＳおよびＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＮＬＳの指数頻度を示す。 ニッカーゼ突然変異を有するＳｐＣａｓ９が二本鎖切断を（個々に）誘導しないことを実証するゲルを示す。 本実験において相同組換え（ＨＲ）テンプレートとして使用されたオリゴＤＮＡの設計ならびにＣａｓ９タンパク質およびＨＲテンプレートの異なる組合せにより誘導されたＨＲ効率の比較を示す。 コンディショナルＣａｓ９、Ｒｏｓａ２６ターゲティングベクターマップを示す。 構成的Ｃａｓ９、Ｒｏｓａ２６ターゲティングベクターマップを示す。 図４９Ａ〜Ｂのベクターマップ中に存在するそれぞれのエレメントの配列を示す。 図４９Ａ〜Ｂのベクターマップ中に存在するそれぞれのエレメントの配列を示す。 図４９Ａ〜Ｂのベクターマップ中に存在するそれぞれのエレメントの配列を示す。 図４９Ａ〜Ｂのベクターマップ中に存在するそれぞれのエレメントの配列を示す。 図４９Ａ〜Ｂのベクターマップ中に存在するそれぞれのエレメントの配列を示す。 図４９Ａ〜Ｂのベクターマップ中に存在するそれぞれのエレメントの配列を示す。 図４９Ａ〜Ｂのベクターマップ中に存在するそれぞれのエレメントの配列を示す。 図４９Ａ〜Ｂのベクターマップ中に存在するそれぞれのエレメントの配列を示す。 構成的およびコンディショナルＣａｓ９構築物中の重要なエレメントの模式図を示す。 構成的およびコンディショナルＣａｓ９構築物の発現の機能的検証を示す。 ＳｕｒｖｅｙｏｒによるＣａｓ９ヌクレアーゼ活性の検証を示す。 Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性の定量を示す。 構築物設計および相同組換え（ＨＲ）方針を示す。 ２つの異なるゲル曝露時間（上列について３分間および下列について１分間）における構成的（右側）およびコンディショナル（左側）構築物についてのゲノムＰＣＲゲノタイピング結果を示す。 ｍＥＳＣ中のＣａｓ９活性化を示す。 ２つのガイドＲＮＡとともにＣａｓ９のニッカーゼバージョンを使用するＮＨＥＪを介する遺伝子ノックアウトを媒介するために使用された方針の模式図を示す。 ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復が遺伝子編集をいかに促進するかを示す。エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路において、ＤＳＢの末端は内因性ＤＮＡ修復機構によりプロセシングされ、一緒に再結合し、このことは接合部位におけるランダム挿入／欠失（インデル）突然変異をもたらし得る。遺伝子のコード領域内で生じるインデル突然変異は、フレームシフトおよび早期終止コドンをもたらし得、遺伝子ノックアウトをもたらす。あるいは、プラスミドまたは一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）の形態の修復テンプレートを供給して高いフィデリティおよび正確な編集を可能とする相同性組換え修復（ＨＤＲ）経路を活用することができる。 実験の時系列および概要を示す。試薬設計、構築、検証、および細胞系増殖のステップ。それぞれの標的についてのカスタムｓｇＲＮＡ（淡青色バー）、およびゲノタイピングプライマーを、本出願人らのオンライン設計ツール（ウェブサイトｇｅｎｏｍｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓにおいて入手可能）を介してインシリコで設計する。次いで、ｓｇＲＮＡ発現ベクターを、Ｃａｓ９を含有するプラスミド（ＰＸ３３０）中にクローニングし、ＤＮＡシーケンシングを介して検証する。次いで、完成プラスミド（ｐＣＲＩＳＰＲ）、および相同組換え修復を促進するための任意選択の修復テンプレートを細胞中に形質移入し、ターゲティングされる開裂を媒介する能力についてアッセイする。最後に、形質移入された細胞をクローン増殖させて規定の突然変異を有するアイソジェニック細胞系を得ることができる。 標的選択および試薬調製を示す。（ａ）化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９について、２０ｂｐ標的（青色で強調）に、ゲノムＤＮＡのいずれかの鎖上で生じ得る５’−ＮＧＧが続かなければならない。本出願人らは、標的選択の支援にあたり本プロトコルに記載のオンラインツールの使用を推奨する（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ）。（ｂ）Ｃａｓ９発現プラスミド（ＰＸ１６５）およびＰＣＲ増幅されたＵ６によりドライブされるｓｇＲＮＡ発現カセットの同時形質移入についての模式図。Ｕ６プロモーター含有ＰＣＲテンプレートおよび固定フォワードプライマー（Ｕ６Ｆｗｄ）を使用して、ｓｇＲＮＡコードＤＮＡをＵ６リバースプライマー（Ｕ６Ｒｅｖ）上に付加し、伸長ＤＮＡオリゴ（ＩＤＴからのＵｌｔｒａｍｅｒオリゴ）として合成することができる。Ｕ６Ｒｅｖ中のガイド配列（青色のＮ）は、５’−ＮＧＧフランキング標的配列の逆相補鎖であることに留意されたい。（ｃ）Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡ足場を含有するプラスミド（ＰＸ３３０）中へのガイド配列オリゴのスカーレスクローニングについての模式図。ガイドオリゴ（青色のＮ）は、ＰＳ３３０上のＢｂｓＩ部位のペア中へのライゲーションのためのオーバーハングを含有し、トップおよびボトム鎖配向はゲノム標的のものにマッチする（すなわち、トップオリゴは、ゲノムＤＮＡ中の５’−ＮＧＧに先行する２０ｂｐ配列である）。ＢｂｓＩによるＰＸ３３０の消化は、アニールされたオリゴの直接挿入によるＩＩｓ型制限部位（青色の枠）の置き換えを可能とする。追加のＧをガイド配列の最初の塩基前に配置したことに十分留意されたい。本出願人らは、ガイド配列前の追加のＧがターゲティング効率に悪影響を与えないことを見出した。最適な２０ｎｔガイド配列がグアニンから開始しない場合、追加のグアニンは、ｓｇＲＮＡが転写物の最初の塩基中のグアニンを優先するＵ６プロモーターにより効率的に転写されることを確保する。 多重ＮＨＥＪについての予測結果を示す。（ａ）インデルの割合を決定するために使用されたＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの模式図。第１に、Ｃａｓ９にターゲティングされた細胞の異種集団からのゲノムＤＮＡを、ＰＣＲにより増幅する。次いで、アンプリコンをゆっくりとリアニールさせてヘテロ二本鎖を生成する。リアニールされたヘテロ二本鎖をＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼにより開裂させる一方、ホモ二本鎖をインタクトのままとする。Ｃａｓ９媒介開裂効率（％インデル）を、ゲルバンドの統合強度により決定された開裂ＤＮＡの率に基づき算出する。（ｂ）２つのｓｇＲＮＡ（橙色および青色バー）を、ヒトＧＲＩＮ２ＢおよびＤＹＲＫ１Ａ遺伝子座をターゲティングするように設計する。ＳＵＲＶＥＹＯＲゲルは、形質移入された細胞中の両方の遺伝子座における改変を示す。着色矢印は、それぞれの遺伝子座についての予測断片サイズを示した。（ｃ）ｓｇＲＮＡのペア（淡青色および緑色バー）を、ヒトＥＭＸ１遺伝子座中のエキソン（暗青色）を切り出すように設計する。標的配列およびＰＡＭ（赤色）をそれぞれの色で示し、開裂部位を赤色三角により示す。予測接合部を下方に示す。ｓｇＲＮＡ３、４またはその両方により形質移入された細胞集団から単離された個々のクローンを、ＰＣＲ（ＯＵＴ Ｆｗｄ、ＯＵＴ Ｒｅｖ）によりアッセイし、約２７０ｂｐの欠失を反映する。改変なし（１２／２３）、単アレル（１０／２３）、および両アレル（１／２３）改変を有する代表的なクローンを示す。ＩＮ ＦｗｄおよびＩＮ Ｒｅｖプライマーを使用して逆位イベントをスクリーニングする（図６ｄ）。（ｄ）ＥＭＸ１エキソンを欠失するクローン系統の定量。ｓｇＲＮＡの２つのペア（３．１、３．２左側フランキングｓｇＲＮＡ；４．１、４．２、右側フランキングｓｇＲＮＡ）を使用して１つのＥＭＸ１エキソン周囲の可変サイズの欠失を媒介する。形質移入された細胞をクローン単離し、欠失および逆位イベントについてのゲノタイピング分析のために増殖させた。１０５個のクローンのうち、それぞれヘテロ接合およびホモ接合欠失を担持する５１個（４９％）および１１個（１０％）がスクリーニングされる。接合は可変であり得るため、推定欠失サイズを挙げる。 ＨＥＫ２９３ＦＴおよびＨＵＥＳ９細胞中のＣａｓ９の野生型およびニッカーゼ突然変異体の両方を用いるＨＲを媒介するためのｓｓＯＤＮおよびターゲティングベクターの適用を示し、効率は１．０〜２７％の範囲である。 哺乳動物細胞中の迅速で効率的なＣＲＩＳＰＲターゲティングのためのＰＣＲベースの方法の模式図を示す。ヒトＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターＵ６を含有するプラスミドを、Ｕ６特異的フォワードプライマーおよびＵ６プロモーターの一部の逆相補鎖を担持するリバースプライマー、ガイド配列を有するｓｇＲＮＡ（＋８５）足場、および転写終結のための７つのＴヌクレオチドを使用してＰＣＲ増幅する。得られたＰＣＲ産物を精製し、ＣＢｈプロモーターによりドライブされるＣａｓ９を担持するプラスミドとともに同時送達する。 それぞれのｇＲＮＡおよびそれぞれの対照についてのＴｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓからのＳＵＲＶＥＹＯＲ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ結果を示す。陽性ＳＵＲＶＥＹＯＲ結果は、ゲノムＰＣＲに対応する１つの大きいバンドおよび突然変異部位における二本鎖切断を作製するＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼの産物である２つのより小さいバンドである。それぞれのｇＲＮＡをマウス細胞系Ｎｅｕｒｏ−Ｎ２ａ中で、ｈＳｐＣａｓ９とのリポソーム一過的同時形質移入により検証した。形質移入から７２時間後、ＥｐｉｃｅｎｔｒｅからのＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡを使用してゲノムＤＮＡを精製した。ＰＣＲを実施して目的の遺伝子座を増幅した。 ３８匹の生存仔（レーン１〜３８）、１匹の死亡仔（レーン３９）および比較用の１匹の野生型仔（レーン４０）についてのＳｕｒｖｅｙｏｒ結果を示す。仔１〜１９にｇＲＮＡ Ｃｈｄ８．２をインジェクトし、仔２０〜３８にｇＲＮＡ Ｃｈｄ８．３をインジェクトした。３８匹の生存仔のうち、１３匹は突然変異について陽性であった。１匹の死亡仔も突然変異を有した。野生型試料において突然変異は検出されなかった。ゲノムＰＣＲシーケンシングは、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの知見と一致した。 異なるＣａｓ９ＮＬＳ構築物の設計を示す。全てのＣａｓ９は、ＳｐＣａｓ９のヒトコドン最適化バージョンであった。ＮＬＳ配列をｃａｓ９遺伝子にＮ末端またはＣ末端のいずれかにおいて結合させる。異なるＮＬＳ設計を有する全てのＣａｓ９バリアントを、それがＥＦ１ａプロモーターによりドライブされるように含有する骨格ベクター中にクローニングした。同一ベクター上に、Ｕ６プロモーターによりドライブされるヒトＥＭＸ１遺伝子座をターゲティングするキメラＲＮＡが存在し、２成分系を一緒に形成する。 異なるＮＬＳ設計を担持するＣａｓ９バリアントにより誘導されたゲノム開裂の効率を示す。割合は、それぞれの構築物により開裂されたヒトＥＭＸ１ゲノムＤＮＡの一部を示す。全ての実験は、３つの生物学的複製物からのものであり、ｎ＝３であり、誤差は標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を示す。 転写活性化活性を有するＣＲＩＳＰＲ−ＴＦ（転写因子）設計を示す。キメラＲＮＡをＵ６プロモーターにより発現させる一方、３つのＮＬＳおよびＶＰ６４機能ドメインに作動可能に結合しているＣａｓ９タンパク質のヒトコドン最適化二重突然変異体バージョン（ｈＳｐＣａｓ９ｍ）をＥＦ１ａプロモーターにより発現させる。二重突然変異Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａにより、ｃａｓ９タンパク質がいかなる開裂も導入し得なくなるが、キメラＲＮＡによりガイドされた場合に標的ＤＮＡに結合するその能力は維持された。 ＣＲＩＳＰＲ−ＴＦ系（キメラＲＮＡおよびＣａｓ９−ＮＬＳ−ＶＰ６４融合タンパク質）によるヒトＳＯＸ２遺伝子の転写活性化を示す。２９３ＦＴ細胞を、２つの成分を担持するプラスミドにより形質移入した：（１）ヒトＳＯＸ２ゲノム遺伝子座内またはその周囲の２０ｂｐ配列をターゲティングするＵ６によりドライブされる異なるキメラＲＮＡ、および（２）ＥＦ１ａによりドライブされるｈＳｐＣａｓ９ｍ（二重突然変異体）−ＮＬＳ−ＶＰ６４融合タンパク質。形質移入から９６時間後、２９３ＦＴ細胞を回収し、ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用してｍＲＮＡ発現の誘導により活性化のレベルを計測する。全ての発現レベルを、キメラＲＮＡを有さないＣＲＩＳＰＲ−ＴＦ骨格プラスミドにより形質移入された細胞からの結果を表す対照群（灰色バー）に対して正規化する。ＳＯＸ２ｍＲＮＡの検出に使用されたｑＲＴ−ＰＣＲプローブは、Ｔａｑｍａｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。全ての実験は、３つの生物学的複製物からのデータを表し、ｎ＝３であり、エラーバーは標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）を示す。 ＳｐＣａｓ９のためのＮＬＳアーキテクチャー最適化を示す。 ＮＧＧＮＮ配列についてのＱＱプロットを示す。 フィットされた正規分布（黒色線）および．９９分位点（点線）とともにデータ密度のヒストグラムを示す。 ｄｇＲＮＡ：：ｃａｓ９＊＊によるｂｇａＡ発現のＲＮＡによりガイドされた抑制を示す。ａ．Ｃａｓ９タンパク質は、ｔｒａｃｒＲＮＡおよび前駆体ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡに結合し、それがＲＮアーゼＩＩＩによりプロセシングされてｃｒＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡは、ｂｇａＡプロモーターへのＣａｓ９の結合を指向し、転写を抑制する。ｂ．Ｃａｓ９＊＊をｂｇａＡプロモーターに指向するために使用された標的を表す。推定−３５、−１０およびｂｇａＡスタートコドンを太字で示す。ｃ．ターゲティングの不存在下および４つの異なる標的についてＭｉｌｌｅｒアッセイにより計測されたベータガラクトシダーゼ活性。 Ｃａｓ９＊＊媒介抑制の特性決定を示す。ａ．ｇｆｐｍｕｔ２遺伝子およびそのプロモーターを、−３５および−１０シグナルも含め、本試験において使用された異なる標的部位の位置と一緒に表す。ｂ．コード鎖のターゲティング時の相対蛍光。ｃ．非コード鎖のターゲティング時の相対蛍光。ｄ．Ｔ５、Ｔ１０、Ｂ１０または標的を有さない対照株から抽出されたＲＮＡに対するプローブＢ４７７およびＢ４７８を用いるノザンブロット。ｅ．Ｂ１、Ｔ５およびＢ１０のｃｒＲＮＡの５’末端における増加数の突然変異の効果。
本明細書における図面は、説明目的のためのものにすぎず、必ずしも一定の縮尺で描画されるものではない。
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用される。これらは、任意の長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらのアナログのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、既知または未知の任意の機能を遂行し得る。以下のものは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖分析から定義される遺伝子座（遺伝子座）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意配列の単離ＤＮＡ、任意配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、１つ以上の改変ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得る。ヌクレオチド構造の改変は、存在する場合、ポリマーの集合前または後に与えることができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断することができる。ポリヌクレオチドは、重合後に例えば標識成分とのコンジュゲーションによりさらに改変することができる。
本発明の態様において、用語「キメラＲＮＡ」、「キメラガイドＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」および「合成ガイドＲＮＡ」は、互換的に使用され、ガイド配列、ｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｒメイト配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。用語「ガイド配列」は、標的部位を規定するガイドＲＮＡ内の約２０ｂｐ配列を指し、用語「ガイド」または「スペーサー」と互換的に使用することができる。用語「ｔｒａｃｒメイト配列」も、用語「ダイレクトリピート」と互換的に使用することができる。
本明細書において使用される用語「野生型」は、当業者により理解される当技術分野の用語であり、突然変異体またはバリアント形態から区別される天然状態で生じるままの生物、株、遺伝子または特徴の典型的な形態を意味する。
本明細書において使用される用語「バリアント」は、天然状態で生じるものから逸脱するパターンを有する品質の提示を意味すると解釈すべきである。
用語「天然に存在しない」または「エンジニアリングされた」は、互換的に使用され、人工の関与を示す。この用語は、核酸分子またはポリペプチドを指す場合、核酸分子またはポリペプチドが、それらが天然状態で天然に会合し、または天然状態で見出される少なくとも１つの他の成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。
「相補性」は、古典的ワトソン−クリック塩基対形成または他の非古典的タイプのいずれかによる別の核酸配列との水素結合を形成する核酸の能力を指す。相補性パーセントは、第２の核酸配列との水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対形成）を形成し得る核酸分子中の残基の割合を示す（例えば、１０のうち５、６、７、８、９、１０は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％の相補性である）。「完全に相補的」は、核酸配列の全ての連続残基が第２の核酸配列中の同一数の連続残基と水素結合することを意味する。本明細書において使用される「実質的に相補的」は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれよりも多いヌクレオチドの領域に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％である相補性の程度を指し、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。
本明細書において使用されるハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」は、標的配列に対する相補性を有する核酸が、標的配列と優位にハイブリダイズし、非標的配列と実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、一般に、配列依存的であり、多数の因子に応じて変動する。一般に、配列が長ければ、配列がその標的配列と特異的にハイブリダイズする温度が高い。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に詳述されている。
「ハイブリダイゼーション」は、１つ以上のポリヌクレオチドが反応してヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対形成、フーグスティーン結合により、または任意の他の配列特異的様式で生じ得る。複合体は、二本鎖構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３つ以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズする鎖、またはそれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より広範なプロセス、例えば、ＰＣＲの開始、または酵素によるポリヌクレオチドの開裂におけるステップを構成し得る。所与の配列とハイブリダイズし得る配列は、所与の配列の「相補鎖」と称される。
本明細書において使用される「発現」は、ポリヌクレオチドがＤＮＡテンプレートから（例えば、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物に）転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされるポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」と称することができる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞中のｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために互換的に使用される。ポリマーは、直鎖または分枝鎖であり得、それは、改変アミノ酸を含み得、それは、非アミノ酸により中断されていてよい。この用語は、改変、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作、例えば、標識成分とのコンジュゲーションを受けたアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書において使用される用語「アミノ酸」は、グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体の両方を含む天然および／または非天然または合成アミノ酸、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣体を含む。
用語「対象」、「個体」、および「患者」は、本明細書において脊椎動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトを指すために互換的に使用される。哺乳動物としては、限定されるものではないが、ネズミ、サル、ヒト、家畜、競技動物、および愛玩動物が挙げられる。インビボで得られ、またはインビトロで培養される生物学的実体の組織、細胞およびそれらの子孫も包含される。
用語「治療剤（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）」、「治療可能薬剤」または「治療剤（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｇｅｎｔ）」は、互換的に使用され、対象への投与時にいくつかの利益効果を付与する分子または化合物を指す。利益効果としては、診断測定の使用可能性；疾患、症状、障害、または病的状態の改善；疾患、症状、障害または病態の軽減またはその発症の予防；および一般には疾患、症状、障害または病的状態の中和が挙げられる。
本明細書において使用される「治療」もしくは「治療する」または「緩和する」または「改善する」は、互換的に使用される。これらの用語は、利益または所望の結果、例として、限定されるものではないが、治療利益および／または予防利益を得るためのアプローチを指す。治療利益は、治療中の１つ以上の疾患、病態、または症状の任意の治療関連改善またはそれらに対する効果を意味する。予防利益については、疾患も、病態も、症状もこれまで顕在化し得なかった場合であっても、組成物を特定の疾患、病態、もしくは症状の発症リスクのある対象に、または疾患の生理学的症状の１つ以上を報告する対象に投与することができる。
用語「有効量」または「治療有効量」は、利益または所望の結果を生じさせるために十分な薬剤の量を指す。治療有効量は、治療される対象および病状、対象の体重および年齢、病状の重症度、投与様式などの１つ以上に応じて変動し得、それらは当業者が容易に決定することができる。この用語は、本明細書に記載のイメージング法のいずれか１つによる検出のための画像を提供する用量にも当てはまる。規定の用量は、選択される特定の薬剤、遵守すべき投与レジメン、他の化合物との組合せで投与するか否か、投与のタイミング、イメージングすべき組織、およびそれが担持される物理的送達系の１つ以上に応じて変動し得る。
本発明の実施は、特に記載のない限り、当業者の技能の範囲内である免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えＤＮＡの慣用の技術を用いる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（１９８７））；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、およびＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））参照。
本発明のいくつかの態様は、１つ以上のベクターを含むベクター系、またはベクター自体に関する。ベクターは、原核または真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質、または酵素）の発現のために設計することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、または哺乳動物細胞中で発現させることができる。好適な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）にさらに考察されている。あるいは、組換え発現ベクターをインビトロで、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して転写および翻訳させることができる。
ベクターは、原核生物中に導入し、その中で増殖させることができる。一部の実施形態において、原核生物を使用して真核細胞中に導入すべきベクターのコピーを増幅し、または真核細胞中に導入すべきベクターの産生における中間ベクターとして使用される（例えば、ウイルスベクターパッケージング系の一部としてプラスミドを増幅）。一部の実施形態において、原核生物を使用してベクターのコピーを増幅し、１つ以上の核酸を発現させ、例えば、宿主細胞または宿主生物への送達のための１つ以上のタンパク質の資源を提供する。原核生物中のタンパク質の発現は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中で、融合または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的または誘導的プロモーターを含有するベクターを用いて実施されることが最も多い。融合ベクターは、多数のアミノ酸をそれにコードされるタンパク質に、例えば、組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。このような融合ベクターは、１つ以上の目的、例えば、（ｉ）組換えタンパク質の発現の増加；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度の増加；および（ｉｉｉ）親和性精製におけるリガンドとして作用することによる組換えタンパク質の精製の支援を果たし得る。融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解開裂部位を融合部分および組換えタンパク質の接合部に導入して融合タンパク質の精製後に融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能とすることが多い。このような酵素、およびそのコグネート認識配列としては、Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。例示的融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合する。
好適な誘導的非融合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。
一部の実施形態において、ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母の出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）中の発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｉｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
一部の実施形態において、ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞中のタンパク質発現をドライブする。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中のタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）が挙げられる。
一部の実施形態において、ベクターは、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞中の１つ以上の配列の発現をドライブし得る。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクター制御機能は、典型的には、１つ以上の調節エレメントにより提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２型、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス４０、ならびに本明細書に開示の他のものおよび当技術分野において公知のものに由来する。原核および真核細胞の両方のために他の好適な発現系については、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒｓ １６ ａｎｄ １７ ｏｆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９参照。
一部の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞タイプ中の核酸の発現を優先的に指向し得る（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現させる）。組織特異的調節エレメントは、当技術分野において公知である。好適な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ，１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特にＴ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９．ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｉｊｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８）、神経細胞特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号明細書および欧州特許出願公開第２６４，１６６号明細書）が挙げられる。発生制御プロモーター、例えば、ネズミｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトタンパク質プロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）も包含される。
一部の実施形態において、調節エレメントは、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現をドライブするようにＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントに作動可能に結合している。一般に、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化等間隔短鎖回分リピート）は、ＳＰＩＤＲ（スペーサー散在型ダイレクトリピート（ＳＰａｃｅｒ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｐｅａｔ））としても公知であり、通常、特定の細菌種に特異的であるＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で認識された区別されるクラスの散在型短鎖配列リピート（ＳＳＲ）（Ｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９：５４２９−５４３３［１９８７］；およびＮａｋａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１：３５５３−３５５６［１９８９］）および関連遺伝子を含む。類似の散在型ＳＳＲが、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、および結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）中で同定されている（Ｇｒｏｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０：１０５７−１０６５［１９９３］；Ｈｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，５：２５４−２６３［１９９９］；Ｍａｓｅｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３０７：２６−３０［１９９６］；およびＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７：８５−９３［１９９５］参照）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、典型的には他のＳＳＲとリピートの構造が異なり、それは短鎖等間隔リピート（ＳＲＳＲ）と称されている（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＯＭＩＣＳ Ｊ．Ｉｎｔｅｇ．Ｂｉｏｌ．，６：２３−３３［２００２］；およびＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３６：２４４−２４６［２０００］）。一般に、リピートは、実質的に一定の長さを有するユニーク介入配列により等間隔とされているクラスターで生じる短いエレメントである（Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２０００］、前掲）。リピート配列は株間で高度に保存されているが、散在型リピートの数およびスペーサー領域の配列は、典型的には、株ごとに異なる（ｖａｎ Ｅｍｂｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２：２３９３−２４０１［２０００］）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、４０を超える原核生物中で同定されており（例えば、Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３：１５６５−１５７５［２００２］；およびＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２００５］参照）、例として、限定されるものではないが、アエロパイラム属（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、パイロバキュラム属（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、スルフォロバス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アーケオグロバス属（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロカーキュラ属（Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサルシナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノパイラス属（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィラス属（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アキフェックス属（Ａｑｕｉｆｅｘ）、ポーフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、クロロビウム属（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サーモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アザーカス属（Ａｚａｒｃｕｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、デスルフォビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、ジオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、ミクソコッカス属（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ウォリネラ属（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、およびサーモトガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）である。
一般に、「ＣＲＩＳＰＲ系」は、集合的に、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現またはその活性の指向に関与する転写物および他のエレメント、例として、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関して「ダイレクトリピート」およびｔｒａｃｒＲＮＡによりプロセシングされる部分ダイレクトリピートを包含）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関して「スペーサー」とも称される）、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列および転写物を指す。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に由来する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントは、内因性ＣＲＩＳＰＲ系を含む特定の生物、例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関してプロトスペーサーとも称される）におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントを特徴とする。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関して、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。完全相補性は必ずしも要求されず、但し、ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するために十分な相補性が存在することを条件とする。標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、標的配列は、細胞の核または細胞質中に局在している。一部の実施形態において、標的配列は、真核細胞のオルガネラ、例えば、ミトコンドリアまたはクロロプラスト内に存在し得る。標的配列を含むターゲティングされる遺伝子座中への組換えに使用することができる配列またはテンプレートは、「編集テンプレート」または「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」と称される。本発明の態様において、外因性テンプレートポリヌクレオチドを編集テンプレートと称することができる。本発明の一態様において、組換えは、相同組換えである。
典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関して、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成（標的配列にハイブリダイズされ、１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体形成しているガイド配列を含む）は、標的配列中または付近（例えば、それから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれよりも多い塩基対内）の一方または両方の鎖の開裂をもたらす。理論により拘束されるものではないが、ｔｒａｃｒ配列は、野生型ｔｒａｃｒ配列の全部または一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約または約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５、またはそれよりも多い数を超えるヌクレオチド）を含み得、またはそれからなっていてよく、例えば、ガイド配列に作動可能に結合しているｔｒａｃｒメイト配列の全部または一部とのｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿うハイブリダイゼーションによりＣＲＩＳＰＲ複合体の一部も形成し得る。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、ハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関与するためにｔｒａｃｒメイト配列に対する十分な相補性を有する。標的配列と同様に、完全相補性は必要とされず、但し、機能的であるために十分な相補性が存在することを条件とすることが考えられる。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、最適にアラインされた場合、ｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の配列相補性を有する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現をドライブする１つ以上のベクターを宿主細胞中に導入し、その結果、ＣＲＩＳＰＲ系のエレメントの発現が１つ以上の標的部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を指向する。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に結合しているガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列は、それぞれ別個のベクター上の別個の調節エレメントに作動可能に結合させることができる。あるいは、同一または異なる調節エレメントから発現されるエレメントの２つ以上を単一ベクター中で合わせることができ、ＣＲＩＳＰＲ系の任意の成分を提供する１つ以上の追加のベクターは第１のベクター中に含まれない。単一ベクター中で合わせるＣＲＩＳＰＲ系エレメントは、任意の好適な配向で配置することができ、例えば、あるエレメントを第２のエレメントに対して５’側（の上流）にまたは３’側（の下流）に局在化することができる。あるエレメントのコード配列は、第２のエレメントのコード配列の同一または逆鎖上で局在化し、同一または逆向きで配向させることができる。一部の実施形態において、単一のプロモーターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする転写物、ならびに１つ以上のイントロン配列内に埋め込まれているガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列（場合により、ガイド配列に作動可能に結合している）、およびｔｒａｃｒ配列（例えば、それぞれが異なるイントロン中に、２つ以上が少なくとも１つのイントロン中に、または全部が単一のイントロン中に存在する）の１つ以上の発現をドライブする。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列、およびｔｒａｃｒ配列は、同一のプロモーターに作動可能に結合しており、それから発現される。
一部の実施形態において、ベクターは、１つ以上の挿入部位、例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（「クローニング部位」とも称される）を含む。一部の実施形態において、１つ以上の挿入部位（例えば、約または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多い数を超える挿入部位）は、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流および／または下流に局在している。一部の実施形態において、ベクターは、ｔｒａｃｒメイト配列の上流、および場合によりｔｒａｃｒメイト配列に作動可能に結合している調節エレメントの下流の挿入部位を含み、その結果、挿入部位中へのガイド配列の挿入後および発現時にガイド配列が真核細胞中の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する。一部の実施形態において、ベクターは、２つ以上の挿入部位を含み、それぞれの挿入部位は、それぞれの部位におけるガイド配列の挿入を可能とするために２つのｔｒａｃｒメイト配列間に局在している。このような配置において、２つ以上のガイド配列は、単一ガイド配列の２つ以上のコピー、２つ以上の異なるガイド配列、またはそれらの組合せを含み得る。複数の異なるガイド配列を使用する場合、単一発現構築物を使用して細胞内の複数の異なる対応する標的配列に対するＣＲＩＳＰＲ活性をターゲティングすることができる。例えば、単一ベクターは、約または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれよりも多い数を超えるガイド配列を含み得る。一部の実施形態において、約または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多い数を超えるそのようなガイド配列含有ベクターを提供し、場合により細胞に送達することができる。
一部の実施形態において、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している調節エレメントを含む。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、またはそれらの改変バージョンが挙げられる。これらの酵素は公知であり；例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース中にアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２のもと見出すことができる。一部の実施形態において、非改変ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ開裂活性を有し、例えば、Ｃａｓ９である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９であり、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）または肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からのＣａｓ９であり得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の局在における、例えば、標的配列内および／または標的配列の相補鎖内の一方または両方の鎖の開裂を指向する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドからの約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、またはそれよりも多い塩基対内の一方または両方の鎖の開裂を指向する。一部の実施形態において、ベクターは、対応する野生型酵素に対して突然変異しているＣＲＩＳＰＲ酵素をコードし、その結果、突然変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を開裂する能力を欠く。例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン中のアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を両方の鎖を開裂するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を開裂する）に変換する。Ｃａｓ９をニッカーゼに変える突然変異の他の例としては、限定されるものではないが、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、およびＮ８６３Ａが挙げられる。一部の実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ガイド配列、例えば、ＤＮＡ標的のセンスおよびアンチセンス鎖をそれぞれターゲティングする２つのガイド配列との組合せで使用することができる。この組合せにより、両方の鎖をニック形成し、それを使用してＮＨＥＪを誘導することが可能となる。本出願人らは、突然変異原性ＮＨＥＪの誘導における２つのニッカーゼ標的（すなわち、同一局在であるがＤＮＡの異なる鎖にターゲティングされるｓｇＲＮＡ）の効力を実証した（データ示さず）。単一ニッカーゼ（単一ｓｇＲＮＡを有するＣａｓ９−Ｄ１０Ａ）は、ＮＨＥＪを誘導し、インデルを創成し得ないが、本出願人らは、二重ニッカーゼ（同一局在における異なる鎖にターゲティングされるＣａｓ９−Ｄ１０Ａおよび２つのｓｇＲＮＡ）がヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）中でそれを行い得ることを示した。効率は、ｈＥＳＣ中でヌクレアーゼ（すなわち、Ｄ１０突然変異を有さない通常のＣａｓ９）の約５０％である。
さらなる例として、Ｃａｓ９の２つ以上の触媒ドメイン（ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ、およびＲｕｖＣ ＩＩＩ）を突然変異させて全てのＤＮＡ開裂活性を実質的に欠く突然変異Ｃａｓ９を産生することができる。一部の実施形態において、Ｄ１０Ａ突然変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８６３Ａ突然変異の１つ以上と組み合わせて全てのＤＮＡ開裂活性を実質的に欠くＣａｓ９酵素を産生する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、突然変異酵素のＤＮＡ開裂活性がその非突然変異形態に対して約２５％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％、またはそれよりも小さい数未満である場合、全てのＤＮＡ開裂活性を実質的に欠くとみなす。他の突然変異は有用であり得；Ｃａｓ９または他のＣＲＩＳＰＲ酵素は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）以外の種からのものである場合、対応するアミノ酸の突然変異は、類似効果を達成するように作製することができる。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、特定の細胞、例えば、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。真核細胞は、特定の生物、例えば、哺乳動物、例として、限定されるものではないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、または非ヒト霊長類のものまたはそれに由来し得る。一般に、コドン最適化は、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約または約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、またはそれよりも多い数を超えるコドン）を、その宿主細胞の遺伝子中で使用されるより高頻度または最も高頻度のコドンにより置き換える一方、天然アミノ酸配列を維持することにより目的宿主細胞中の発現の向上のために核酸配列を改変するプロセスを指す。種々の種は、特定のアミノ酸のあるコドンについて特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の差）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関することが多く、このことは、次いで、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存的であると考えられる。細胞中で選択されるｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成において最も高頻度で使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づき所与の生物中の最適な遺伝子発現のために調整することができる。コドン使用頻度表は、例えば、「コドン使用頻度データベース」において容易に入手可能であり、これらの表は、多数の手法で適応させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）参照。特定の宿主細胞中の発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも入手可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）も入手可能である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列中の１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、またはそれよりも多い、または全てのコドン）は、特定のアミノ酸について最も高頻度で使用されるコドンに対応する。
一部の実施形態において、ベクターは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）、例えば、約また約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多い数を超えるＮＬＳを含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、アミノ末端またはその付近における約または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多い数を超えるＮＬＳ、カルボキシ末端またはその付近における約または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多い数を超えるＮＬＳ、またはそれらの組合せ（例えば、アミノ末端における１つ以上のＮＬＳおよびカルボキシ末端における１つ以上のＮＬＳ）を含む。２つ以上のＮＬＳが存在する場合、それぞれは、単一のＮＬＳが２つ以上のコピーで存在し得るように他のものから独立して、および／または１つ以上のコピーで存在する１つ以上の他のＮＬＳとの組合せで選択することができる。本発明の好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、多くとも６つのＮＬＳを含む。一部の実施形態において、ＮＬＳは、ＮＬＳの最近傍アミノ酸が、ＮまたはＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、またはそれよりも多いアミノ酸内である場合、ＮまたはＣ末端付近に存在するとみなす。典型的には、ＮＬＳは、タンパク質表面上で露出される正荷電リジンまたはアルギニンの１つ以上の短い配列からなるが、他のタイプのＮＬＳが公知である。ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンからのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有するヌクレオプラスミン二分（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤまたはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ−ｍｙｃＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチンアルファからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰおよびＰＰＫＫＡＲＥＤ；ヒトｐ５３の配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ；マウスｃ−ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲおよびＰＫＱＫＫＲＫ；肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ；ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ；ならびにステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫに由来するＮＬＳ配列が挙げられる。
一般に、１つ以上のＮＬＳは、真核細胞の核中の検出可能な量のＣＲＩＳＰＲ酵素の蓄積をドライブするために十分な強度である。一般に、核局在化活性の強度は、ＣＲＩＳＰＲ酵素中のＮＬＳの数、使用される特定のＮＬＳ、またはそれらの因子の組合せに由来し得る。核中の蓄積の検出は、任意の好適な技術により実施することができる。例えば、検出可能なマーカーをＣＲＩＳＰＲ酵素に融合させることができ、その結果、細胞内の局在を、例えば、核の局在を検出する手段（例えば、核に特異的な染色、例えば、ＤＡＰＩ）との組合せで可視化することができる。検出可能なマーカーの例としては、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、またはＧＦＰ；ＲＦＰ；ＣＦＰ）、およびエピトープタグ（ＨＡタグ、ｆｌａｇタグ、ＳＮＡＰタグ）が挙げられる。細胞核を細胞から単離することもでき、次いでその含有物を、タンパク質を検出する任意の好適なプロセス、例えば、免疫組織学的分析、ウエスタンブロット、または酵素活性アッセイにより分析することができる。核中の蓄積は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体形成の効果についてのアッセイ（例えば、標的配列におけるＤＮＡ開裂もしくは突然変異についてのアッセイ、またはＣＲＩＳＰＲ複合体形成および／もしくはＣＲＩＳＰＲ酵素活性により影響される遺伝子発現活性の変化についてのアッセイ）により、ＣＲＩＳＰＲ酵素にも複合体にも曝露されず、または１つ以上のＮＬＳを欠くＣＲＩＳＰＲ酵素に曝露される対照と比較して間接的に測定することもできる。
一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向するために標的ポリヌクレオチド配列との十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインされた場合、約または約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれよりも大きい数を超える。最適なアラインメントは、配列をアラインするための任意の好適なアルゴリズムを使用して決定することができ、その非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍをベースとするアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて入手可能）、およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて入手可能）が挙げられる。一部の実施形態において、ガイド配列は、約または約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５、またはそれよりも大きい数を超えるヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２、またはそれよりも小さい数未満のヌクレオチド長である。標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向するガイド配列の能力は、任意の好適なアッセイにより評価することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するために十分なＣＲＩＳＰＲ系の成分、例として、試験すべきガイド配列は、対応する標的配列を有する宿主細胞に、例えば、ＣＲＩＳＰＲ配列の成分をコードするベクターによる形質移入により提供することができ、次いで標的配列内の優先的開裂を例えば本明細書に記載のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより評価する。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の開裂は、試験管中で標的配列、ＣＲＩＳＰＲ複合体の成分、例として、試験すべきガイド配列および試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を提供し、試験および対照ガイド配列反応間の標的配列における結合または開裂の比率を比較することにより評価することができる。他のアッセイが考えられ、当業者はそれを認識する。
ガイド配列は、任意の標的配列をターゲティングするように選択することができる。一部の実施形態において、標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。例示的な標的配列としては、標的ゲノム中でユニークなものが挙げられる。例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９について、ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧのＣａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり；Ｘは、いずれでもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧの化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり；Ｘは、いずれであってもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９について、ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷのＣａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり；Ｘは、いずれであってもよく；Ｗは、ＡまたはＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷのＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり；Ｘは、いずれであってもよく；Ｗは、ＡまたはＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９について、ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧのＣａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり；Ｘは、いずれであってもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧの化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり；Ｘは、いずれであってもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。これらの配列のそれぞれにおいて、「Ｍ」は、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり得、配列をユニークと同定するにあたり考慮する必要はない。
一部の実施形態において、ガイド配列は、ガイド配列内の二次構造の程度を低減させるように選択される。二次構造は、任意の好適なポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムにより決定することができる。一部のプログラムは、最小ギブス自由エネルギーの算出をベースとする。１つのこのようなアルゴリズムの例は、ｍＦｏｌｄであり、Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３−１４８）により記載されている。別の例示的フォールディングアルゴリズムは、セントロイド構造予測アルゴリズムを使用するＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎａにより開発されたオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである（例えばＡ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３−２４；およびＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１−６２参照）。さらなるアルゴリズムは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願番号ＴＢＡ（代理人整理番号４４７９０．１１．２０２２；Ｂｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１３／００４Ａ）に見出すことができる。
一般に、ｔｒａｃｒメイト配列は、（１）対応するｔｒａｃｒ配列を含有する細胞中でｔｒａｃｒメイト配列によりフランキングされているガイド配列の切り出し；および（２）標的配列におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成（ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列を含む）の１つ以上を促進するためにｔｒａｃｒ配列との十分な相補性を有する任意の配列を含む。一般に、相補性の程度は、２つの配列の短い方の長さに沿うｔｒａｃｒメイト配列およびｔｒａｃｒ配列の最適なアラインメントに準拠する。最適なアラインメントは、任意の好適なアラインメントアルゴリズムにより決定することができ、二次構造、例えばｔｒａｃｒ配列またはｔｒａｃｒメイト配列内の自己相補性をさらに説明し得る。一部の実施形態において、２つの短い方の長さに沿ったｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒメイト配列との間の相補性の程度は、最適にアラインされた場合、約または約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれよりも大きい数を超える。ｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒメイト配列との間の最適なアラインメントの例示的説明を図１２Ｂおよび１３Ｂに提供する。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、約または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、またはそれよりも大きい数を超えるヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｔメイト配列は、単一転写物内に含有され、その結果、２つの間のハイブリダイゼーションが二次構造、例えば、ヘアピンを有する転写物を産生する。ヘアピン構造において使用される好ましいループ形成配列は、４ヌクレオチド長であり、最も好ましくは、配列ＧＡＡＡを有する。しかしながら、代替配列であり得るようにより長いまたは短いループ配列を使用することができる。配列は、好ましくは、ヌクレオチドトリプレット（例えば、ＡＡＡ）、および追加のヌクレオチド（例えば、ＣまたはＧ）を含む。ループ形成配列の例としては、ＣＡＡＡおよびＡＡＡＧが挙げられる。本発明の一実施形態において、転写物または転写されるポリヌクレオチド配列は、少なくとも２つ以上のヘアピンを有する。好ましい実施形態において、転写物は、２、３、４または５つのヘアピンを有する。本発明の別のさらなる実施形態において、転写物は、多くとも５つのヘアピンを有する。一部の実施形態において、単一転写物は、転写終結配列をさらに含み；好ましくは、これはポリＴ配列、例えば、６つのＴヌクレオチドである。このようなヘアピン構造の例示的説明を、図１３Ｂの下方位置に提供し、最後の「Ｎ」およびループの上流の５’側の配列の部分は、ｔｒａｃｒメイト配列に対応し、ループの３’側の配列の部分は、ｔｒａｃｒ配列に対応する。ガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列、およびｔｒａｃｒ配列を含む単一ポリヌクレオチドのさらなる非限定的な例は、以下のとおりであり（５’から３’に列記）、「Ｎ」は、ガイド配列の塩基を表し、第１の小文字のブロックは、ｔｒａｃｒメイト配列を表し、第２の小文字のブロックは、ｔｒａｃｒ配列を表し、最後のポリＴ配列は、転写ターミネーターを表す：
Figure 2016505256
 一部の実施形態において、配列（１）から（３）は、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１からのＣａｓ９との組合せで使用される。一部の実施形態において、配列（４）から（６）は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９との組合せで使用される。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、ｔｒａｃｒメイト配列を含む転写物と別個の転写物である（例えば、図１３Ｂの上図に説明されるもの）。
一部の実施形態において、組換えテンプレートも提供される。組換えテンプレートは、本明細書に記載の別のベクターの成分であり、別個のベクター中で含有させ、または別個のポリヌクレオチドとして提供することができる。一部の実施形態において、組換えテンプレートは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部としてのＣＲＩＳＰＲ酵素によりニック形成または開裂される標的配列内またはその付近での相同組換えにおけるテンプレートとして機能するように設計される。テンプレートポリヌクレオチドは、任意の好適な長さ、例えば、約または約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００、１０００、またはそれよりも大きい数を超えるヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態において、テンプレートポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部に相補的である。最適にアラインされた場合、テンプレートポリヌクレオチドは、標的配列の１つ以上のヌクレオチド（例えば、約または約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれよりも多い数を超えるヌクレオチド）と重複し得る。一部の実施形態において、テンプレート配列および標的配列を含むポリヌクレオチドが最適にアラインされた場合、テンプレートポリヌクレオチドの最近傍ヌクレオチドは、標的配列から約１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、１００００、またはそれよりも多いヌクレオチド内に存在する。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素の他の約または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多い数を超えるドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列、および場合により任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合させることができるタンパク質ドメインの例としては、限定されるものではないが、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、ならびに以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ開裂活性および核酸結合活性の１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられる。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、限定されるものではないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および自己蛍光タンパク質、例として、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ分子に結合し、または他の細胞分子に結合するタンパク質またはタンパク質の断片、例として、限定されるものではないが、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン融合物、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物をコードする遺伝子配列に融合させることができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得る追加のドメインは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１００５９５０２号明細書に記載されている。一部の実施形態において、タグ化ＣＲＩＳＰＲ酵素を使用して標的配列の局在を同定する。
一部の態様において、本発明は、１つ以上のポリヌクレオチド、例えば、または本明細書に記載の１つ以上のベクター、１つ以上のその転写物、および／またはそれから転写された１つまたはタンパク質を宿主細胞に送達することを含む方法を提供する。一部の態様において、本発明は、そのような細胞により産生された細胞、およびそのような細胞を含み、またはそれから産生された生物（例えば、動物、植物、または真菌）をさらに提供する。一部の実施形態において、ガイド配列との組合せの（および場合によりそれと複合体形成している）ＣＲＩＳＰＲ酵素を細胞に送達する。慣用のウイルスおよび非ウイルスベース遺伝子移入法を使用して核酸を哺乳動物細胞または標的組織中に導入することができる。このような方法を使用してＣＲＩＳＰＲ系の成分をコードする核酸を培養物中の細胞に、または宿主生物中に投与することができる。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のベクターの転写物）、ネイキッド核酸、および送達ビヒクル、例えば、リポソームと複合体形成している核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、細胞への送達後にエピソーム性またはインテグレートされるゲノムを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられる。遺伝子療法手順の概要については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ＆Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１−２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ＆Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ＆Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１−４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｅｈｍ（ｅｄｓ）（１９９５）；およびＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６（１９９４）参照。
核酸の非ウイルス送達の方法としては、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤により向上されるＤＮＡの取り込みが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号明細書、同第４，９４６，７８７号明細書；および同第４，８９７，３５５号明細書）に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオンおよび中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレットのものが挙げられる。送達は、細胞（例えば、インビトロまたはエクスビボ投与）または標的組織（例えば、インビボ投与）に対するものであり得る。
脂質：核酸複合体、例として、ターゲティングされるリポソーム、例えば、免疫脂質複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号明細書、同第４，２１７，３４４号明細書、同第４，２３５，８７１号明細書、同第４，２６１，９７５号明細書、同第４，４８５，０５４号明細書、同第４，５０１，７２８号明細書、同第４，７７４，０８５号明細書、同第４，８３７，０２８号明細書、および同第４，９４６，７８７号明細書参照）。
核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベース系の使用は、ウイルスを体内の規定の細胞にターゲティングし、ウイルスペイロードを核に輸送する高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与することができ（インビボ）、またはそれらを使用してインビトロで細胞を治療することができ、場合により、改変された細胞を患者に投与することができる（エクスビボ）。慣用のウイルスベース系としては、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴および単純ヘルペスウイルスベクターを挙げることができる。宿主ゲノム中のインテグレーションは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルス遺伝子移入法について考えられ、挿入されたトランス遺伝子の長期発現をもたらすことが多い。さらに、高い形質導入効率が多くの異なる細胞タイプおよび標的組織において観察されている。
レトロウイルスの向性は、外来エンベロープタンパク質を取り込むことにより変え、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染し、典型的には、高ウイルス力価を産生し得るレトロウイルスベクターである。したがって、レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、６〜１０ｋｂまでの外来配列のためのパッケージング能を有するシス作用長鎖末端リピートを含む。最小シス作用ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、次いでそれを使用して治療遺伝子を標的細胞中にインテグレートして恒久的なトランス遺伝子発現を提供する。広く使用されるレトロウイルスベクターとしては、ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）をベースとするもの、またはそれらの組合せが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００号明細書参照）。一過的発現が好ましい用途においては、アデノウイルスベース系を使用することができる。アデノウイルスベースベクターは、多くの細胞タイプにおいて極めて高い形質導入効率を示し得、細胞分裂を要求しない。このようなベクターについて、高い力価および発現のレベルが得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生することができる。例えば、核酸およびペプチドのインビトロ産生において、ならびにインビボおよびエクスビボ遺伝子療法手順のためにアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを使用して細胞に標的核酸を形質導入することもできる（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８−４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号明細書；国際公開第９３／２４６４１号パンフレット；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）参照。組換えＡＡＶベクターの構築は、多数の刊行物、例として、米国特許第５，１７３，４１４号明細書；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６−６４７０（１９８４）；およびＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）に記載されている。
典型的には、パッケージング細胞を使用して宿主細胞に感染し得るウイルス粒子を形成する。このような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法において使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする細胞系を産生することにより生成する。ベクターは、典型的には、パッケージングおよび後続の宿主中へのインテグレーションに要求される最小ウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現させるべきポリヌクレオチドのための発現カセットにより置き換えられている。欠損ウイルス機能は、典型的には、パッケージング細胞系によりトランスで供給する。例えば、遺伝子療法において使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノム中へのパッケージングおよびインテグレーションに要求されるＡＡＶゲノムからのＩＴＲ配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞系中にパッケージングされる。細胞系は、ヘルパーとしてのアデノウイルスにより感染させることもできる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して顕著な量でパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性である熱処理により低減させることができる。核酸を細胞に送達する追加の方法は、当業者に公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３００８７８１７号明細書参照。
一部の実施形態において、宿主細胞を、本明細書に記載の１つ以上のベクターにより一過的にまたは非一過的に形質移入する。一部の実施形態において、細胞を、それが対象中で天然に生じるままで形質移入する。一部の実施形態において、形質移入される細胞を対象から採取する。一部の実施形態において、細胞は、対象から採取された細胞、例えば、細胞系に由来する。組織培養のための広範な細胞系は、当技術分野において公知である。細胞系の例としては、限定されるものではないが、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ−３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ−Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｃ１、ＰＣ−３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ−２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ−７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ−ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ−Ｋ２、ＷＥＨＩ−２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ−１、ＢＣ−３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ−５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨｅＬａ Ｂ、ＨｅＬａ Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−６、ＣＯＳ−Ｍ６Ａ、ＢＳ−Ｃ−１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３Ｓｗｉｓｓ、３Ｔ３−Ｌ１、１３２−ｄ５ヒト胎児線維芽細胞；１０．１マウス線維芽細胞、２９３−Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ−５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ−１細胞、ＢＥＡＳ−２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ−２１、ＢＲ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ−２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ−７、ＣＨＯ−ＩＲ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ２、ＣＨＯ−Ｔ、ＣＨＯ Ｄｈｆｒ−／−、ＣＯＲ−Ｌ２３、ＣＯＲ−Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ−Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ−Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ−７、ＣＯＶ−４３４、ＣＭＬ Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨＬ−６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ−２９、Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ−Ｍｅｌ１−４８、ＭＣ−３８、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ−ＭＡＣ６、ＭＴＤ−１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＮＡＬＭ−１、ＮＷ−１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞系、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ−１Ａ／ＰＮＴ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ−５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｓｆ−９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ−４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１細胞系、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ−４９、Ｘ６３、ＹＡＣ−１、ＹＡＲ、およびそれらのトランスジェニック変種が挙げられる。細胞系は、当業者に公知の種々の資源から入手可能である（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓｕｓ，Ｖａ．）参照）。一部の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のベクターにより形質移入された細胞を使用して１つ以上のベクター由来配列を含む新たな細胞系を樹立する。一部の実施形態において、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ系の成分により一過的に形質移入され（例えば、１つ以上のベクターの一過的形質移入、またはＲＮＡによる形質移入により）、ＣＲＩＳＰＲ複合体の活性を通して改変された細胞を使用して改変を含有するがあらゆる他の外因性配列を欠く細胞を含む新たな細胞系を樹立する。一部の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のベクターにより一過的にまたは非一過的に形質移入された細胞、またはそのような細胞に由来する細胞系を、１つ以上の試験化合物の評価において使用する。
一部の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のベクターを使用して非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物を産生する。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、またはウサギである。ある実施形態において、生物または対象は、植物である。ある実施形態において、生物または対象または植物は、藻類である。トランスジェニック植物および動物を産生する方法は、当技術分野において公知であり、一般に、例えば、本明細書に記載の細胞形質移入の方法から出発する。
一態様において、本発明は、真核細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記標的ポリヌクレオチドの開裂を生じさせ、それにより、標的ポリヌクレオチドを改変することを含み、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、次いでｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合している。
一態様において、本発明は、真核細胞中のポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体をポリヌクレオチドに結合させ、その結果、前記結合が前記ポリヌクレオチドの発現の増加または減少をもたらすことを含み；ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、次いでｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合している。
作物ゲノミクスの近年の進歩とともに、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用して効率的でコスト効率の良い遺伝子編集および操作を実施する技能により、産生の改善および形質の向上のためにそのようなゲノムを形質転換するための単一および多重化遺伝子操作の迅速な選択および比較が可能となる。これに関して、米国特許および刊行物：米国特許第６，６０３，０６１号明細書−Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ；米国特許第７，８６８，１４９号明細書−Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆおよび米国特許出願公開第２００９／０１００５３６号明細書−Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｇｒｏｎｏｍｉｃ Ｔｒａｉｔｓが参照され、これらのそれぞれの全ての内容および開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。本発明の実施において、Ｍｏｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ“Ｃｒｏｐ ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ｄｅｃ ２９；１３（２）：８５−９６の内容および開示も参照により全体として本明細書に組み込まれる。本発明の有利な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して微細藻類をエンジニアリングする（実施例１５）。したがって、本明細書における動物細胞への言及は、必要な変更を加え、特に明らかでない限り植物細胞にも当てはまり得る。
一態様において、本発明は、インビボ、エクスビボまたはインビトロであり得る真核細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ヒトまたは非ヒト動物または植物（微細藻類を含む）から細胞または細胞の集団をサンプリングし、１つまたは複数の細胞を改変することを含む。培養は、任意の段階においてエクスビボで行うことができる。１つまたは複数の細胞は、非ヒト動物または植物（微細藻類を含む）中に再導入することもできる。
植物において、病原体は宿主特異的であることが多い。例えば、トマト萎凋病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）は、トマト萎凋病を引き起こすが、トマトのみを攻撃し、カーネーション萎凋病菌（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｄｉａｎｔｈｉｉ）コムギ黒さび病菌（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ．ｔｒｉｔｉｃｉ）はコムギのみを攻撃する。植物は、ほとんどの病原体に抵抗するための既存および誘導的防御を有する。植物生成にわたる突然変異および組換えイベントは、特に病原体が植物よりも高頻度で繁殖する場合に感受性を生じさせる遺伝子変異をもたらす。植物において、非宿主耐性が存在し得、例えば、宿主および病原体は不適合性である。水平耐性、例えば、典型的には、多くの遺伝子により制御される病原体の全ての種に対する部分耐性および垂直耐性、例えば、典型的には、少数の遺伝子により制御される病原体の一部の種に対するが他の種に対するものでない完全耐性も存在し得る。遺伝子対遺伝子レベルにおいて、植物および病原体は、一緒に進化し、あるものの遺伝子変化は他の変化と均衡を保つ。したがって、自然変動を使用して、育種者は、収穫高、品質、均一性、耐寒性、耐性に最も有用な遺伝子を組み合わせる。耐性遺伝子の資源としては、天然または外来種、在来種、野生植物類縁種、および誘導突然変異、例えば、植物材料を突然変異誘発剤により処理することが挙げられる。本発明を使用して、植物育種者に、突然変異を誘導するための新たなツールを提供する。したがって、当業者は、耐性遺伝子の資源のゲノムを分析し、所望の特徴または形質を有する品種において本発明を用いて耐性遺伝子の出現を従来の突然変異誘発剤よりも正確に誘導し、したがって、植物育種プログラムを加速および改善することができる。
一態様において、本発明は、上記方法および組成物に開示のエレメントのいずれか１つ以上を含有するキットを提供する。一部の実施形態において、キットは、ベクター系およびキットの使用指示書を含む。一部の実施形態において、ベクター系は、（ａ）ｔｒａｃｒメイト配列およびガイド配列をｔｒａｃｒメイト配列の上流に挿入するための１つ以上の挿入部位に作動可能に結合している第１の調節エレメント（ガイド配列は、発現された場合、真核細胞中の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む）；ならびに／または（ｂ）核局在化配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメントを含む。エレメントは、個々にまたは組合せで提供することができ、任意の好適な容器、例えば、バイアル、ボトル、またはチューブ中で提供することができる。一部の実施形態において、キットは、１つ以上の言語の、例えば、２つ以上の言語の指示書を含む。
一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載のエレメントの１つ以上を利用するプロセスにおいて使用される１つ以上の試薬を含む。試薬は、任意の好適な容器中で提供することができる。例えば、キットは、１つ以上の反応または貯蔵緩衝液を提供し得る。試薬は、特定のアッセイにおいて使用可能な形態で、または使用前に１つ以上の他の成分の添加を要求する形態（例えば、濃縮物または凍結乾燥形態）で提供することができる。緩衝液は、任意の緩衝液、例として、限定されるものではないが、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、およびそれらの組合せであり得る。一部の実施形態において、緩衝液はアルカリ性である。一部の実施形態において、緩衝液は、約７から約１０のｐＨを有する。一部の実施形態において、キットは、ガイド配列および調節エレメントを作動可能に結合させるためのベクター中への挿入のためのガイド配列に対応する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、キットは、相同組換えテンプレートポリヌクレオチドを含む。
一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントを使用する方法を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチドを改変する有効な手段を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、広範な有用性、例として、非常に多数の細胞タイプ中の標的ポリヌクレオチドの改変（例えば、欠失、挿入、転座、不活性化、活性化）を有する。したがって、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、例えば、遺伝子療法、薬物スクリーニング、疾患診断、および予後における幅広い用途範囲を有する。例示的ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。ガイド配列は、次いでｔｒａｃｔ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合している。
ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞に対して内因性または外因性である任意のポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核中に残留するポリヌクレオチドであり得る。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列または非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチドまたはジャンクＤＮＡ）であり得る。理論により拘束されるものではないが、標的配列がＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）；すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体により認識される短い配列と会合するはずであることが考えられる。ＰＡＭについての正確な配列および長さの条件は、使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素に応じて異なるが、ＰＡＭは、典型的には、プロトスペーサー（すなわち、標的配列）に隣接する２〜５塩基対配列である。ＰＡＭ配列の例を以下の実施例セクションに挙げ、当業者は、所与のＣＲＩＳＰＲ酵素について使用されるさらなるＰＡＭ配列を同定することができる。
ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドとしては、それぞれＢｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１１／００８／ＷＳＧＲ整理番号４４０６３−７０１．１０１およびＢＩ−２０１１／００８／ＷＳＧＲ整理番号４４０６３−７０１．１０２を有する米国仮特許出願第６１／７３６，５２７号明細書および同第６１／７４８，４２７号明細書（両方とも、標題ＳＹＳＴＥＭＳ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ、それぞれ２０１２年１２月１２日および２０１３年１月２日に出願、これらの全ての内容は参照により全体として本明細書に組み込まれる）に列記の多数の疾患関連遺伝子およびポリヌクレオチドならびにシグナリング生化学経路関連遺伝子およびポリヌクレオチドを挙げることができる。
標的ポリヌクレオチドの例としては、シグナリング生化学経路に関連する配列、例えば、シグナリング生化学経路関連遺伝子またはポリヌクレオチドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドの例としては、疾患関連遺伝子またはポリヌクレオチドが挙げられる。「疾患関連」遺伝子またはポリヌクレオチドは、非疾患対照の組織または細胞と比較して患部組織に由来する細胞中で異常なレベルにおいてまたは異常な形態で転写または翻訳産物を生じさせている任意の遺伝子またはポリヌクレオチドを指す。これは、異常に高いレベルにおいて発現されるようになる遺伝子であり得；これは、異常に低いレベルにおいて発現されるようになる遺伝子であり得、発現の変化は、疾患の発生および／または進行と相関する。疾患関連遺伝子は、疾患の病因を直接担い、または疾患の病因を担う遺伝子と連鎖不平衡をなす突然変異または遺伝子変異を有する遺伝子も指す。転写または翻訳される産物は、既知または未知のものであり得、正常または異常レベルにおけるものであり得る。
疾患関連遺伝子およびポリヌクレオチドの例は、ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｎａｔｈａｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｍｄ．）およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）から入手可能であり、ワールドワイドウェブから入手可能である。
疾患関連遺伝子およびポリヌクレオチドの例を表ＡおよびＢに列記する。疾患特異的情報は、ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｎａｔｈａｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ （Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）から入手可能であり、ワールドワイドウェブから入手可能である。シグナリング生化学経路関連遺伝子およびポリヌクレオチドの例を表Ｃに列記する。
これらの遺伝子および経路中の突然変異は、不適切なタンパク質の産生または機能に影響する不適切な量のタンパク質をもたらし得る。遺伝子、疾患およびタンパク質のさらなる例は、２０１２年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／７３６，５２７号明細書および２０１３年２月２日に出願された同第６１／７４８，４２７号明細書から参照により本明細書に組み込まれる。このような遺伝子、タンパク質および経路は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドであり得る。
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本発明の実施形態は、遺伝子のノックアウト、遺伝子の増幅ならびにＤＮＡリピート不安定性および神経学的疾患に関連する特定の突然変異の修復に関連する方法および組成物にも関する（Ｒｏｂｅｒｔ Ｄ．Ｗｅｌｌｓ，Ｔｅｔｓｕｏ Ａｓｈｉｚａｗａ，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｃｔ １３，２０１１−Ｍｅｄｉｃａｌ）。規定の態様のタンデムリピート配列が２０を超えるヒト疾患を担うことが見出されている（Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｒｅｐｅａｔ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ：ｒｏｌｅ ｏｆ ＲＮＡ・ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｓ．ＭｃＩｖｏｒ ＥＩ，Ｐｏｌａｋ Ｕ，Ｎａｐｉｅｒａｌａ Ｍ．ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；７（５）：５５１−８）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を利用してゲノム不安定性のこれらの異常を補正することができる。
本発明のさらなる態様は、ラフォラ病に関連することが同定されているＥＭＰ２ＡおよびＥＭＰ２Ｂ遺伝子の異常の補正のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の利用に関する。ラフォラ病は、青年期において癲癇性発作として始まり得る進行性ミオクローヌス癲癇を特徴とする常染色体劣性病態である。この疾患の数例は、未だ同定されていない遺伝子の突然変異により引き起こされ得る。この疾患は、発作、筋痙攣、歩行困難、認知症、および最終的に死亡を引き起こす。現在、疾患進行に対して有効であることが証明されている治療は存在しない。癲癇に関連する他の遺伝子異常を、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系によりターゲティングすることもでき、基礎となる遺伝学は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｐｉｌｅｐｓｉｅｓ，Ｇｉｕｌｉａｎｏ Ａｖａｎｚｉｎｉ，Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｌ．Ｎｏｅｂｅｌｓにより編集，Ｍａｒｉａｎｉ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ：２０；２００９）にさらに記載されている。
本発明のさらに別の態様において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用し、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｙｅ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｌｉａｓ Ｉ．Ｔｒａｂｏｕｌｓｉにより編集，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１２にさらに記載されているいくつかの遺伝子突然変異から生じる眼の異常を補正することができる。
本発明のいくつかのさらなる態様は、米国国立衛生研究所のウェブサイト（ｈｅａｌｔｈ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｐｉｃ／ＧｅｎｅｔｉｃＤｉｓｏｒｄｅｒｓにおけるウェブサイト）上にトピックサブセクションＧｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓのもとでさらに記載されている広範な遺伝子疾患に関連する異常の補正に関する。遺伝子脳疾患としては、限定されるものではないが、副腎白質ジストロフィー、脳梁欠損症、アイカルディ症候群、アルパース病、アルツハイマー病、バース症候群、バッテン病、ＣＡＤＡＳＩＬ、小脳変性症、ファブリー病、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病、ハンチントン病および他のトリプレットリピート病、リー病、レッシュ−ナイハン症候群、メンケス病、ミトコンドリアミオパチーならびにＮＩＮＤＳコルポセファリーが挙げられる。これらの疾患は、米国国立衛生研究所のウェブサイト上にサブセクションＧｅｎｅｔｉｃ Ｂｒａｉｎ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓのもとでさらに記載されている。
一部の実施形態において、病態は、新形成である。病態が新形成であり得る一部の実施形態において、ターゲティングすべき遺伝子は、表Ａに列記のもののいずれかであり得る（この場合、ＰＴＥＮなど）。一部の実施形態において、病態は、加齢黄斑変性症であり得る。一部の実施形態において、病態は、統合失調症であり得る。一部の実施形態において、病態は、トリヌクレオチドリピート障害であり得る。一部の実施形態において、病態は、脆弱性Ｘ症候群であり得る。一部の実施形態において、病態は、セクレターゼ関連障害であり得る。一部の実施形態において、病態は、プリオン関連障害であり得る。一部の実施形態において、病態は、ＡＬＳであり得る。一部の実施形態において、病態は、薬物嗜好であり得る。一部の実施形態において、病態は、自閉症であり得る。一部の実施形態において、病態は、アルツハイマー病であり得る。一部の実施形態において、病態は、炎症であり得る。一部の実施形態において、病態は、パーキンソン病であり得る。
パーキンソン病に関連するタンパク質の例としては、限定されるものではないが、α−シヌクレイン、ＤＪ−１、ＬＲＲＫ２、ＰＩＮＫ１、パーキン、ＵＣＨＬ１、シンフィリン−１、およびＮＵＲＲ１が挙げられる。
嗜好関連タンパク質の例としては、例えば、ＡＢＡＴを挙げることができる。
炎症関連タンパク質の例としては、例えば、Ｃｃｒ２遺伝子によりコードされる単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ１）、Ｃｃｒ５遺伝子によりコードされるＣ−Ｃケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５）、Ｆｃｇｒ２ｂ遺伝子によりコードされるＩｇＧ受容体ＩＩＢ（ＦＣＧＲ２ｂ、ＣＤ３２とも称される）、またはＦｃｅｒ１ｇ遺伝子によりコードされるＦｃイプシロンＲ１ｇ（ＦＣＥＲ１ｇ）タンパク質を挙げることができる。
心血管疾患関連タンパク質の例としては、例えば、ＩＬ１Ｂ（インターロイキン１、ベータ）、ＸＤＨ（キサンチンデヒドロゲナーゼ）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＰＴＧＩＳ（プロスタグランジンＩ２（プロスタサイクリン）シンターゼ）、ＭＢ（ミオグロビン）、ＩＬ４（インターロイキン４）、ＡＮＧＰＴ１（アンジオポエチン１）、ＡＢＣＧ８（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）、メンバー８）、またはＣＴＳＫ（カテプシンＫ）を挙げることができる。
アルツハイマー病関連タンパク質の例としては、例えば、ＶＬＤＬＲ遺伝子によりコードされる超低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）、ＵＢＡ１遺伝子によりコードされるユビキチン様修飾因子活性化酵素１（ＵＢＡ１）、またはＵＢＡ３遺伝子によりコードされるＮＥＤＤ８活性化酵素Ｅ１触媒サブユニットタンパク質（ＵＢＥ１Ｃ）を挙げることができる。
自閉症スペクトラム障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＢＺＲＡＰ１遺伝子によりコードされるベンゾジアゼピン受容体（末梢性）関連タンパク質１（ＢＺＲＡＰ１）、ＡＦＦ２遺伝子（ＭＦＲ２とも称される）によりコードされるＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２タンパク質（ＡＦＦ２）、ＦＸＲ１遺伝子によりコードされる脆弱性Ｘ精神遅滞常染色体ホモログ１タンパク質（ＦＸＲ１）、またはＦＸＲ２遺伝子によりコードされる脆弱性Ｘ精神遅滞常染色体ホモログ２タンパク質（ＦＸＲ２）を挙げることができる。
黄斑変性症に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＡＢＣＲ遺伝子によりコードされるＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー４タンパク質（ＡＢＣＡ４）、ＡＰＯＥ遺伝子によりコードされるアポリポタンパク質Ｅタンパク質（ＡＰＯＥ）、またはＣＣＬ２遺伝子によりコードされるケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２タンパク質（ＣＣＬ２）を挙げることができる。
統合失調症に関連するタンパク質の例としては、ＮＲＧ１、ＥｒｂＢ４、ＣＰＬＸ１、ＴＰＨ１、ＴＰＨ２、ＮＲＸＮ１、ＧＳＫ３Ａ、ＢＤＮＦ、ＤＩＳＣ１、ＧＳＫ３Ｂ、およびそれらの組合せを挙げることができる。
腫瘍抑制に関与するタンパク質の例としては、例えば、ＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調症変異）、ＡＴＲ（毛細血管拡張性運動失調症およびＲａｄ３関連）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＥＲＢＢ２（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ２）、ＥＲＢＢ３（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ３）、ＥＲＢＢ４（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４）、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、またはＮｏｔｃｈ４を挙げることができる。
セクレターゼ障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＰＳＥＮＥＮ（プレセニリンエンハンサー２ホモログ（線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）））、ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＰＳＥＮ１（プレセニリン１）、ＡＰＰ（アミロイドベータ（Ａ４）前駆体タンパク質）、ＡＰＨ１Ｂ（咽頭前部欠損１ホモログＢ（線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）））、ＰＳＥＮ２（プレセニリン２（アルツハイマー病４））、またはＢＡＣＥ１（ベータ部位ＡＰＰ開裂酵素１）を挙げることができる。
筋萎縮性側索硬化症に関連するタンパク質の例としては、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）、ＡＬＳ２（筋萎縮性側索硬化症２）、ＦＵＳ（ｆｕｓｅｄ ｉｎ ｓａｒｃｏｍａ）、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質）、ＶＡＧＦＡ（血管内皮成長因子Ａ）、ＶＡＧＦＢ（血管内皮成長因子Ｂ）、およびＶＡＧＦＣ（血管内皮成長因子Ｃ）、およびそれらの任意の組合せを挙げることができる。
プリオン疾患に関連するタンパク質の例としては、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）、ＡＬＳ２（筋萎縮性側索硬化症２）、ＦＵＳ（ｆｕｓｅｄ ｉｎ ｓａｒｃｏｍａ）、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質）、ＶＡＧＦＡ（血管内皮成長因子Ａ）、ＶＡＧＦＢ（血管内皮成長因子Ｂ）、およびＶＡＧＦＣ（血管内皮成長因子Ｃ）、およびそれらの任意の組合せを挙げることができる。
プリオン障害における神経変性病態に関連するタンパク質の例としては、例えば、Ａ２Ｍ（アルファ−２−マクログロブリン）、ＡＡＴＦ（アポトーシス拮抗転写因子）、ＡＣＰＰ（前立腺酸性ホスファターゼ）、ＡＣＴＡ２（大動脈平滑筋アクチンアルファ２）、ＡＤＡＭ２２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン）、ＡＤＯＲＡ３（アデノシンＡ３受容体）、またはＡＤＲＡ１Ｄ（アルファ−１Ｄアドレナリン受容体についてのアルファ−１Ｄアドレナリン作動性受容体）を挙げることができる。
免疫不全症に関連するタンパク質の例としては、例えば、Ａ２Ｍ［アルファ−２−マクログロブリン］；ＡＡＮＡＴ［アリールアルキルアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ］；ＡＢＣＡ１［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー１］；ＡＢＣＡ２［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー２］；またはＡＢＣＡ３［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー３］を挙げることができる。
トリヌクレオチドリピート障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＡＲ（アンドロゲン受容体）、ＦＭＲ１（脆弱性Ｘ精神遅滞１）、ＨＴＴ（ハンチントン）、またはＤＭＰＫ（筋緊張性異栄養症タンパク質キナーゼ）、ＦＸＮ（フラタキシン）、ＡＴＸＮ２（アタキシン２）が挙げられる。
神経伝達障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＳＳＴ（ソマトスタチン）、ＮＯＳ１（一酸化窒素シンターゼ１（神経型））、ＡＤＲＡ２Ａ（アドレナリン作動性アルファ−２Ａ受容体）、ＡＤＲＡ２Ｃ（アドレナリン作動性アルファ−２Ｃ受容体）、ＴＡＣＲ１（タキキニン受容体１）、またはＨＴＲ２ｃ（５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体２Ｃ）が挙げられる。
神経発達関連配列の例としては、例えば、Ａ２ＢＰ１［アタキシン２結合タンパク質１］、ＡＡＤＡＴ［アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ］、ＡＡＮＡＴ［アリールアルキルアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ］、ＡＢＡＴ［４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ］、ＡＢＣＡ１［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１］、またはＡＢＣＡ１３［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１３］が挙げられる。
本発明の系により治療可能な好ましい病態のさらなる例は、以下のものから選択することができる：アルカルディ−グティエール症候群；アレキサンダー病；アラン−ハーンドン−ダッドリー症候群；ＰＯＬＧ関連障害；アルファ−マンノシドーシス（ＩＩおよびＩＩＩ型）；アルストレム症候群；アンジェルマン症候群；毛細血管拡張性運動失調症；神経セロイドリポフスチン症；ベータ−セラサミア；両側性視神経委縮症および（幼児型）視神経委縮症１型；網膜芽腫（両側性）；カナバン病；脳・眼・顔・骨格症候群１［ＣＯＦＳ１］；脳腱黄色腫症；コルネリア・デ・ラング症候群；ＭＡＰＴ関連障害；遺伝性プリオン病；ドラベ症候群；早期発症型家族性アルツハイマー病；フリードライヒ運動失調症［ＦＲＤＡ］；フリンス症候群；フコシドーシス；福山型先天性筋ジストロフィー；ガラクトシアリドーシス；ゴーシェ病；有機酸血症；血球貪食性リンパ組織球症；ハッチンソン−ギルフォード早老症候群；ムコリピドーシスＩＩ型；幼児遊離シアル酸蓄積症；ＰＬＡ２Ｇ６関連神経変性症；ジャーベル・ランゲ−ニールセン症候群；接合型表皮水疱症；ハンチントン病；クラッベ病（幼児型）；ミトコンドリアＤＮＡ関連リー症候群およびＮＡＲＰ；レッシュ−ナイハン症候群；ＬＩＳ１関連滑脳症；ロウ症候群；メープルシロップ尿症；ＭＥＣＰ２重複症候群；ＡＴＰ７Ａ関連銅輸送障害；ＬＡＭＡ２関連筋ジストロフィー；アリールスルファターゼＡ欠損症；ムコ多糖症Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ型；ペルオキシソーム形成異常症、ツェルウェーガー症候群スペクトラム；脳の鉄蓄積症を伴う神経変性症；酸性スフィンゴミエリナーゼ欠損症；ニーマン−ピック病Ｃ型；グリシン脳症；ＡＲＸ関連障害；尿素サイクル異常症；ＣＯＬ１Ａ１／２関連骨形成不全症；ミトコンドリアＤＮＡ欠失症候群；ＰＬＰ１関連障害；ペリー症候群；フェラン−マクダーモット症候群；グリコーゲン蓄積症ＩＩ型（ポンペ病）（幼児型）；ＭＡＰＴ関連障害；ＭＥＣＰ２関連障害；肢根型点状軟骨異形成症１型；ロバーツ症候群；サンドホフ病；シンドラー病１型；アデノシンデアミナーゼ欠損症；スミス−レムリ−オピッツ症候群；脊髄性筋萎縮症；幼児期発症型脊髄小脳失調症；ヘキソサミニダーゼＡ欠損症；致死性異形成１型；コラーゲンＶＩ型関連障害；アッシャー症候群Ｉ型；先天性筋ジストロフィー；ウォルフ−ヒルシュホーン症候群；リソソーム酸リパーゼ欠損症；ならびに色素性乾皮症。
明らかなとおり、本発明の系を使用して任意の目的ポリヌクレオチド配列をターゲティングすることができることが想定される。本発明の系を使用して有用に治療することができる病態または疾患の一部の例を上記表に含め、それらの病態に現在関連する遺伝子の例もその表に提供する。しかしながら、例示される遺伝子は排他的なものではない。
以下の実施例を、本発明の種々の実施形態を説明する目的のために挙げ、それらは本発明をいかなる様式にも限定することを意味しない。本実施例は、本明細書に記載の方法とともに、目下好ましい実施形態の代表例であり、例示であり、本発明の範囲に対する限定を意図するものではない。特許請求の範囲の範囲により定義される本発明の趣旨に包含されるその変更および他の使用は、当業者が行う。
実施例１：真核細胞の核中のＣＲＩＳＰＲ複合体活性
例示的なＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、４つの遺伝子Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、およびＣｓｎ１のクラスター、ならびに２つの非コードＲＮＡエレメント、ｔｒａｃｒＲＮＡおよび非反復配列の短いストレッチ（スペーサー、それぞれ約３０ｂｐ）により間隔が空いている反復配列の特徴的アレイ（ダイレクトリピート）を含有する化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０からのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座である。この系において、ターゲティングされるＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を４つの連続ステップにおいて生成する（図２Ａ）。第１に、２つの非コードＲＮＡ、プレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡがプレｃｒＲＮＡのダイレクトリピートにハイブリダイズし、次いでそれが個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされる。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体がＣａｓ９を、ｃｒＲＮＡのスペーサー領域とプロトスペーサーＤＮＡとの間のヘテロ二本鎖形成を介してプロトスペーサーおよび対応するＰＡＭからなるＤＮＡ標的に指向する。最後に、Ｃａｓ９は、ＰＡＭの上流の標的ＤＮＡの開裂を媒介してプロトスペーサー内でＤＳＢを創成する（図２Ａ）。この例は、このＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼ系を適応させて真核細胞の核中のＣＲＩＳＰＲ複合体活性を指向する例示プロセスを記載する。
細胞培養および形質移入
ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞系ＨＥＫ２９３ＦＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１０％のウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補給されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃において５％のＣＯ２インキュベーションで維持した。マウスｎｅｕｒｏ２Ａ（Ｎ２Ａ）細胞系（ＡＴＣＣ）を、５％のウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補給されたＤＭＥＭにより、３７℃、５％のＣＯ２で維持した。
ＨＥＫ２９３ＦＴまたはＮ２Ａ細胞を２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に、形質移入１日前に１ウェル当たり２００，０００個の細胞の密度において播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の推奨プロトコルに従って使用して細胞を形質移入した。２４ウェルプレートのそれぞれのウェルについて、合計８００ｎｇのプラスミドを使用した。
ゲノム改変についてのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイおよびシーケンシング分析
ＨＥＫ２９３ＦＴまたはＮ２Ａ細胞を、上記プラスミドＤＮＡにより形質移入した。形質移入後、細胞を３７℃において７２時間インキュベートしてからゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡは、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔＤＮＡ抽出キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を製造業者のプロトコルに従って使用して抽出した。手短に述べると、細胞をＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液中で再懸濁させ、６５℃において１５分間および９８℃において１０分間インキュベートした。抽出されたゲノムＤＮＡを直ちに処理または−２０℃において貯蔵した。
それぞれの遺伝子についてのＣＲＩＳＰＲ標的部位周囲のゲノム領域をＰＣＲ増幅し、ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者のプロトコルに従って使用して産物を精製した。合計４００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を２μｌの１０×ＴａｑポリメラーゼＰＣＲ緩衝液（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）と混合し、超純水で２０μｌの最終容量とし、リアニーリングプロセスに供してヘテロ二本鎖形成を可能とした：９５℃において１０分間、−２℃／秒における傾斜で９５℃から８５℃、−０．２５℃／秒における８５℃から２５℃、および２５℃において１分間維持。リアニーリング後、産物をＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼおよびＳｕｒｖｅｙｏｒエンハンサーＳ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）により製造業者の推奨プロトコルに従って処理し、４〜２０％のＮｏｖｅｘ ＴＢＥポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分析した。ゲルをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ ＤＮＡ染色（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により３０分間染色し、Ｇｅｌ Ｄｏｃゲルイメージングシステム（Ｂｉｏ−ｒａｄ）によりイメージングした。定量は、開裂したＤＮＡの率の尺度としての相対バンド強度に基づくものであった。図８は、このＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイの模式的説明を提供する。
相同組換えの検出のための制限断片長多型アッセイ
ＨＥＫ２９３ＦＴおよびＮ２Ａ細胞を、プラスミドＤＮＡにより形質移入し、３７℃において７２時間インキュベートしてから上記のとおりゲノムＤＮＡを抽出した。相同組換え（ＨＲ）テンプレートのホモロジーアーム外側のプライマーを使用して標的ゲノム領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を１％のアガロースゲル上で分離し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により抽出した。精製産物をＨｉｎｄＩＩＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）により消化し、６％のＮｏｖｅｘ ＴＢＥポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分析した。
ＲＮＡ二次構造予測および分析
ＲＮＡ二次構造予測は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎａにおいて開発されたオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄを使用し、セントロイド構造予測アルゴリズムを使用して実施した（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３−２４；およびＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１−６２参照）。
細菌プラスミド形質転換干渉アッセイ
ＣＲＩＳＰＲ活性に十分な化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座１のエレメントを、ｐＣＲＩＳＰＲプラスミドを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で再構成した（図１０Ａに模式的に説明する）。ｐＣＲＩＳＰＲは、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ＳｐＣａｓ９、およびｃｒＲＮＡアレイをドライブするリーダー配列を含有した。スペーサー（「ガイド配列」とも称される）を、説明のとおりアニールされたオリゴヌクレオチドを使用してｃｒＲＮＡアレイ中にＢｓａＩ部位間で挿入した。干渉アッセイにおいて使用されるチャレンジプラスミドは、プロトスペーサー（「標的配列」とも称される）配列を、隣接ＣＲＩＳＰＲモチーフ配列（ＰＡＭ）とともにｐＵＣ１９中に挿入することにより構築した（図１０Ｂ参照）。チャレンジプラスミドは、アンピシリン耐性を含有した。図１０Ｃは、干渉アッセイの模式的表示を提供する。既にｐＣＲＩＳＰＲおよび適切なスペーサーを担持する化学コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を、対応するプロトスペーサー−ＰＡＭ配列を含有するチャレンジプラスミドにより形質転換した。ｐＵＣ１９を使用してそれぞれのｐＣＲＩＳＰＲ担持コンピテント株の形質転換効率を評価した。ＣＲＩＳＰＲ活性は、プロトスペーサーを担持するｐＰＳＰプラスミドの開裂をもたらし、そうでなければプロトスペーサーを欠くｐＵＣ１９により付与されるアンピシリン耐性を除外した。図１０Ｄは、図４Ｃに説明されるアッセイにおいて使用されたそれぞれのｐＣＲＩＳＰＲ担持大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のコンピテンスを説明する。
ＲＮＡ精製
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を上記のとおり維持および形質移入した。細胞をトリプシン処理により回収し、次いでリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄した。トータル細胞ＲＮＡをＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ）により製造業者のプロトコルに従って抽出した。抽出されたトータルＲＮＡをＮａｏｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量し、同一濃度に正規化した。
哺乳動物細胞中のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ発現のノザンブロット分析
ＲＮＡを等容量の２×ローディング緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）と混合し、９５℃に５分間加熱し、氷上で１分間冷蔵し、次いで８％の変性ポリアクリルアミドゲル（ＳｅｑｕａＧｅｌ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）上に、少なくとも３０分間のゲルのプレラン後にロードした。試料を４０Ｗ限界において１．５時間電気泳動した。その後、ＲＮＡをＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋メンブレン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に３００ｍＡにおいてセミドライ転写装置（Ｂｉｏ−ｒａｄ）中で室温において１．５時間転写した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＵＶ ＣｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒのＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）上のオートクロスリンクボタンを使用してＲＮＡをメンブレンに架橋させた。メンブレンをＵＬＴＲＡｈｙｂ−オリゴハイブリダイゼーション緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）中で回転させながら４２℃において３０分間プレハイブリダイズさせ、次いでプローブを添加し、一晩ハイブリダイズさせた。プローブはＩＤＴに発注し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて［ガンマ−３２Ｐ］ＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により標識した。メンブレンを予備加温（４２℃）された２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより１分間１回洗浄し、次いで４２℃において３０分間２回洗浄した。メンブレンを蛍光スクリーンに室温において１時間または一晩曝露させ、次いでｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｔｙｐｈｏｏｎ）によりスキャンした。
細菌ＣＲＩＳＰＲ系構築および評価
ｔｒａｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９、およびリーダーを含むＣＲＩＳＰＲ遺伝子座エレメントを、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０ゲノムＤＮＡから、ギブソン・アセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ）のためのフランキングホモロジーアームを用いてＰＣＲ増幅した。２つのＢｓａＩ ＩＩＳ型部位を２つのダイレクトリピート間に導入してスペーサーの容易な挿入を促進した（図９）。Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を使用してＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶ消化ｐＡＣＹＣ１８４中にｔｅｔプロモーターの下流でクローニングした。Ｃｓｎ２の最後の５０ｂｐは除き、他の内因性ＣＲＩＳＰＲ系エレメントは除外した。相補的オーバーハングを有するスペーサーをコードするオリゴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をＢｓａＩ消化ベクターｐＤＣ０００（ＮＥＢ）中にクローニングし、次いでＴ７リガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）によりライゲートしてｐＣＲＩＳＰＲプラスミドを生成した。ＰＡＭ配列（本明細書において「ＣＲＩＳＰＲモチーフ配列」とも称される）を有するスペーサーを含有するチャレンジプラスミドを、同等のオーバーハングを担持するハイブリダイズされたオリゴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をＢａｍＨＩ消化ｐＵＣ１９中にライゲートすることにより創成した。全ての構築物のためのクローニングは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＪＭ１０９（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）中で実施した。
Ｚ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｔ３００１）を製造業者の指示書に従って使用して、ｐＣＲＩＳＰＲ担持細胞をコンピテントとした。形質転換アッセイにおいて、ｐＣＲＩＳＰＲを担持するコンピテント細胞の５０ｕＬのアリコートを氷上で解凍し、１ｎｇのスペーサープラスミドまたはｐＵＣ１９により氷上で３０分間形質転換し、次いで４２℃において４５秒間熱ショックし、氷上で２分間維持した。続いて、２５０ｕｌのＳＯＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、次いで振とうさせながら３７℃において１時間インキュベートし、１００ｕＬのＳＯＣ後前培養物を二重選択プレート（１２．５ｕｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリン）上にプレーティングした。ｃｆｕ／ＤＮＡ１ｎｇを得るため、総コロニー数に３を乗じた。
哺乳動物細胞中のＣＲＩＳＰＲ成分の発現を改善するため、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））ＳＦ３７０遺伝子座１からの２つの遺伝子Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）およびＲＮアーゼＩＩＩ（ＳｐＲＮアーゼＩＩＩ）をコドン最適化した。核局在化を促進するため、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をＳｐＣａｓ９およびＳｐＲＮアーゼＩＩＩの両方のアミノ（Ｎ）またはカルボキシル（Ｃ）末端に含めた（図２Ｂ）。タンパク質発現の可視化を促進するため、蛍光タンパク質マーカーも両方のタンパク質のＮまたはＣ末端に含めた（図２Ｂ）。ＮおよびＣ末端の両方に付着しているＮＬＳを有するＳｐＣａｓ９のバージョン（２×ＮＬＳ−ＳｐＣａｓ９）も生成した。ＮＬＳ融合ＳｐＣａｓ９およびＳｐＲＮアーゼＩＩＩを含有する構築物を２９３ＦＴヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞中に形質移入し、ＳｐＣａｓ９およびＳｐＲＮアーゼＩＩＩに対するＮＬＳの相対的位置決めが、それらの核局在化効率に影響することが見出された。Ｃ末端ＮＬＳは標的ＳｐＲＮアーゼＩＩＩを核にターゲティングするために十分であった一方、ＳｐＣａｓ９のＮまたはＣ末端のいずれかへのこれらの特定のＮＬＳの単一コピーの付着は、この系中の適切な核局在化を達成し得なかった。この例において、Ｃ末端ＮＬＳは、ヌクレオプラスミンのもの（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）であり、Ｃ末端ＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原のもの（ＰＫＫＫＲＫＶ）であった。試験されたＳｐＣａｓ９のバージョンのうち、２×ＮＬＳ−ＳｐＣａｓ９のみが核局在化を示した（図２Ｂ）。
化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からのｔｒａｃｒＲＮＡは、２つの転写開始部位を有し、８９ヌクレオチド（ｎｔ）および１７１ｎｔの２つの転写物を生じさせ、それは続いて同一の７５ｎｔ成熟ｔｒａｃｒＲＮＡにプロセシングされる。より短い８９ｎｔのｔｒａｃｒＲＮＡを哺乳動物細胞中の発現のために選択した（図７Ａに説明される発現構築物、図７Ｂに示されるＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイの結果により決定された機能性を有する）。転写開始部位を＋１として標識し、転写ターミネーターおよびノザンブロットによりプロ―ビングされる配列も示す。プロセシングされたｔｒａｃｒＲＮＡの発現もノザンブロットにより確認した。図７Ｃは、長鎖または短鎖ｔｒａｃｒＲＮＡ、ならびにＳｐＣａｓ９およびＤＲ−ＥＭＸ１（１）−ＤＲを担持するＵ６発現構築物により形質移入された２９３ＦＴ細胞から抽出されたトータルＲＮＡのノザンブロット分析の結果を示す。左および右側のパネルは、それぞれＳｐＲＮアーゼＩＩＩを用いず、または用いて形質移入された２９３ＦＴ細胞からのものである。Ｕ６は、ヒトＵ６ｓｎＲＮＡをターゲティングするプローブによりブロットされたローディング対照を示す。短鎖ｔｒａｃｒＲＮＡ発現構築物の形質移入は、十分なレベルのプロセシング形態のｔｒａｃｒＲＮＡ（約７５ｂｐ）をもたらした。極めて少量の長鎖ｔｒａｃｒＲＮＡがノザンブロット上で検出される。
正確な転写開始を促進するため、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩベースＵ６プロモーターを選択してｔｒａｃｒＲＮＡの発現をドライブした（図２Ｃ）。同様に、Ｕ６プロモーターベース構築物を開発して２つのダイレクトリピート（ＤＲ、用語「ｔｒａｃｒメイト配列」にも包含される；図２Ｃ）によりフランキングされている単一スペーサーからなるプレｃｒＲＮＡアレイを発現させた。最初のスペーサーは、大脳皮質の発達におけるキー遺伝子であるヒトＥＭＸ１遺伝子座中の３３塩基対（ｂｐ）標的部位（３０ｂｐのプロトスペーサーと、Ｃａｓ９のＮＧＧ認識モチーフを満たす３ｂｐのＣＲＩＳＰＲモチーフ（ＰＡＭ）配列）をターゲティングするように設計した（図２Ｃ）。
哺乳動物細胞中のＣＲＩＳＰＲ系（ＳｐＣａｓ９、ＳｐＲＮアーゼＩＩＩ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびプレｃｒＲＮＡ）の異種発現がターゲティングされる哺乳動物染色体の開裂を達成し得るか否かを試験するため、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をＣＲＩＳＰＲ成分の組合せにより形質移入した。哺乳動物核中のＤＳＢは部分的には、インデルの形成をもたらす非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路により修復されるため、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを使用して標的ＥＭＸ１遺伝子座における潜在的な開裂活性を検出した（図８）（例えば、Ｇｕｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６４９：２４７参照）。４つ全てのＣＲＩＳＰＲ成分の同時形質移入は、プロトスペーサーの最大５．０％の開裂を誘導し得た（図２Ｄ参照）。ＳｐＲＮアーゼＩＩＩを除く全てのＣＲＩＳＰＲ成分の同時形質移入も、プロトスペーサーの最大４．７％のインデルを誘導し、このことはｃｒＲＮＡ成熟を支援し得る内因性哺乳動物ＲＮアーゼ、例えば、関連ＤｉｃｅｒおよびＤｒｏｓｈａ酵素などが存在し得ることを示唆した。残り３つの成分のいずれかを除去すると、ＣＲＩＳＰＲ系のゲノム開裂活性は停止する（図２Ｄ）。標的遺伝子座を含有するアンプリコンのサンガーシーケンシングにより開裂活性を確認し；４３個のシーケンシングされたクローンのうち５つの突然変異アレル（１１．６％）が見出された。種々のガイド配列を使用する同様の実験は、２９％と高いインデル割合を生じさせた（図４〜７、１２、および１３参照）。これらの結果は、哺乳動物細胞中の効率的なＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム改変のための３成分系を定義する。開裂効率を最適化するため、本出願人らは、ｔｒａｃｒＲＮＡの異なるアイソフォームが開裂効率に影響するか否かも試験し、この例示的系において、短鎖（８９ｂｐ）転写物形態のみがヒトＥＭＸ１ゲノム遺伝子座の開裂を媒介し得ることを見出した（図７Ｂ）。
図１４は、哺乳動物細胞中のｃｒＲＮＡプロセシングの追加のノザンブロット分析を提供する。図１４Ａは、２つのダイレクトリピートによりフランキングされている単一スペーサー（ＤＲ−ＥＭＸ１（１）−ＤＲ）についての発現ベクターを示す模式図を説明する。ヒトＥＭＸ１遺伝子座プロトスペーサー１をターゲティングする３０ｂｐのスペーサー（図６参照）およびダイレクトリピート配列を、図１４Ａの下方の配列中に示す。線は、逆相補配列を使用してＥＭＸ１（１）ｃｒＲＮＡ検出のためのノザンブロットプローブを生成する領域を示す。図１４Ｂは、ＤＲ−ＥＭＸ１（１）−ＤＲを担持するＵ６発現構築物により形質移入された２９３ＦＴ細胞から抽出されたトータルＲＮＡのノザンブロット分析を示す。左および右側のパネルは、それぞれＳｐＲＮアーゼＩＩＩを用いず、または用いて形質移入された２９３ＦＴ細胞からのものである。ＤＲ−ＥＭＸ１（１）−ＤＲは、ＳｐＣａｓ９が存在する場合のみ成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされ、短鎖ｔｒａｃｒＲＮＡはＳｐＲＮアーゼＩＩＩの存在に依存的でなかった。形質移入２９３ＦＴトータルＲＮＡから検出された成熟ｃｒＲＮＡは、約３３ｂｐであり、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からの３９〜４２ｂｐの成熟ｃｒＲＮＡよりも短かった。これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ系を真核細胞中に移植し、リプログラミングして内因性哺乳動物標的ポリヌクレオチドの開裂を促進することができることを実証する。
図２は、本実施例に記載の細菌ＣＲＩＳＰＲ系を説明する。図２Ａは、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０からのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座１およびこの系によるＣＲＩＳＰＲ媒介ＤＮＡ開裂の提案される機序を示す模式図を説明する。ダイレクトリピート−スペーサーアレイからプロセシングされた成熟ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９を、相補的プロトスペーサーおよびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）からなるゲノム標的に指向する。標的−スペーサー塩基対形成時、Ｃａｓ９は標的ＤＮＡ中の二本鎖切断を媒介する。図２Ｂは、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）およびＲＮアーゼＩＩＩ（ＳｐＲＮアーゼＩＩＩ）の、哺乳動物核中への輸送を可能とするための核局在化シグナル（ＮＬＳ）によるエンジニアリングを説明する。図２Ｃは、構成的ＥＦ１ａプロモーターによりドライブされるＳｐＣａｓ９およびＳｐＲＮアーゼＩＩＩならびに正確な転写開始および終結を促進するためのＲＮＡＰｏｌ３プロモーターＵ６によりドライブされるｔｒａｃｒＲＮＡおよびプレｃｒＲＮＡアレイ（ＤＲ−スペーサー−ＤＲ）の哺乳動物発現を説明する。十分なＰＡＭ配列を有するヒトＥＭＸ１遺伝子座からのプロトスペーサーを、プレｃｒＲＮＡアレイ中のスペーサーとして使用する。図２Ｄは、ＳｐＣａｓ９媒介少数挿入および欠失についてのｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイを説明する。ＳｐＣａｓ９を、ＳｐＲＮアーゼＩＩＩ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびＥＭＸ１標的スペーサーを担持するプレｃｒＲＮＡアレイを用いてまたは用いずに発現させた。図２Ｅは、標的遺伝子座とＥＭＸ１ターゲティングｃｒＲＮＡとの間の塩基対形成の模式的表示、ならびにＳｐＣａｓ９開裂部位に隣接する微小欠失を示す例示的クロマトグラムを説明する。図２Ｆは、種々の微小挿入および欠失を示す４３個のクローンアンプリコンのシーケンシング分析から同定された突然変異アレルを説明する。点線は、欠失塩基を示し、アラインされず、またはミスマッチの塩基は挿入または突然変異を示す。スケールバー＝１０μｍ。
３成分系をさらに簡略化するため、ステム−ループを介して成熟ｃｒＲＮＡ（ガイド配列を含む）を部分ｔｒａｃｒＲＮＡに融合させて天然ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖を模倣するキメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド設計を適応させた（図３Ａ）。同時送達効率を増加させるため、形質移入細胞中のキメラＲＮＡおよびＳｐＣａｓ９の同時発現をドライブするバイシストロニック発現ベクターを創成した（図３Ａおよび８）。並行して、バイシストロニックベクターを使用してプレｃｒＲＮＡ（ＤＲ−ガイド配列−ＤＲ）をＳｐＣａｓ９とともに発現させてｃｒＲＮＡへのプロセシングを誘導し、ｔｒａｃｒＲＮＡを別個に発現させた（図１３Ｂの上図および下図を比較）。図９は、ｈＳｐＣａｓ９を有するプレｃｒＲＮＡアレイ（図９Ａ）またはキメラｃｒＲＮＡ（図９Ｂ中のガイド配列挿入部位の下流およびＥＦ１αプロモーターの上流の短い線により表わされる）のためのバイシストロニック発現ベクターの模式的説明を提供し、種々のエレメントの局在およびガイド配列挿入の場所を示す。図９Ｂ中のガイド配列挿入部位の局在周囲の拡大された配列は、部分ＤＲ配列（ＧＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡ）および部分ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（ＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＴＴＴ）も示す。ガイド配列は、アニールされたオリゴヌクレオチドを使用してＢｂｓＩ部位間に挿入することができる。オリゴヌクレオチドについての配列設計を図９の模式的説明の下方に示し、適切なライゲーションアダプターを示す。ＷＰＲＥは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントを表す。キメラＲＮＡ媒介開裂の効率を、上記の同一のＥＭＸ１遺伝子座をターゲティングすることにより試験した。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイおよびアンプリコンのサンガーシーケンシングの両方を使用して、本出願人らは、キメラＲＮＡ設計がヒトＥＭＸ１遺伝子座の開裂を約４．７％の改変比率で促進することを確認した（図４）。
真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ媒介開裂の一般化可能性を、ヒトＥＭＸ１およびＰＶＡＬＢ、ならびにマウスＴｈ遺伝子座中の複数部位をターゲティングするキメラＲＮＡを設計することによりヒトおよびマウス細胞の両方において追加のゲノム遺伝子座をターゲティングすることにより試験した。図１５は、いくつかの追加のターゲティングされるヒトＰＶＡＬＢ（図１５Ａ）およびマウスＴｈ（図１５Ｂ）遺伝子座中のプロトスペーサーの選択を説明する。遺伝子座およびそれぞれの最後のエキソン内の３つのプロトスペーサーの局在の模式図を提供する。下線付き配列は、３０ｂｐのプロトスペーサー配列およびＰＡＭ配列に対応する３’末端における３ｂｐを含む。センスおよびアンチセンス鎖上のプロトスペーサーを、それぞれＤＮＡ配列の上方および下方に示す。ヒトＰＶＡＬＢおよびマウスＴｈ遺伝子座についてそれぞれ６．３％および０．７５％の改変比率が達成され、このことは複数の生物にわたる異なる遺伝子座の改変におけるＣＲＩＳＰＲ系の幅広い適用可能性を実証した（図３Ｂおよび６）。開裂はキメラ構築物を使用してそれぞれの遺伝子座について３つのスペーサーのうち１つについてのみ検出された一方、同時発現されるプレｃｒＲＮＡ配置を使用した場合、全ての標的配列が２７％に達するインデル生成の効率で開裂された（図６）。
図１３は、ＳｐＣａｓ９をリプログラミングして哺乳動物細胞中の複数のゲノム遺伝子座をターゲティングすることができることのさらなる説明を提供する。図１３Ａは、下線付き配列により示される５つのプロトスペーサーの局在を示すヒトＥＭＸ１遺伝子座の模式図を提供する。図１３Ｂは、プレｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのダイレクトリピート領域間のハイブリダイゼーションを示すプレｃｒＲＮＡ／ｔｒｃｒＲＮＡ複合体の模式図（上図）および２０ｂｐのガイド配列、ならびにヘアピン構造にハイブリダイズしている部分ダイレクトリピートおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列からなるｔｒａｃｒメイトおよびｔｒａｃｒ配列を含むキメラＲＮＡ設計の模式図（下図）を提供する。ヒトＥＭＸ１遺伝子座中の５つのプロトスペーサーにおけるＣａｓ９媒介開裂の効力を比較するＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイの結果を、図１３Ｃに説明する。プロセシングされたプレｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体（ｃｒＲＮＡ）またはキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）のいずれかを使用してそれぞれのプロトスペーサーをターゲティングする。
ＲＮＡの二次構造は分子間相互作用に重要であり得るため、最小自由エネルギーおよびボルツマン加重構造アンサンブルに基づく構造予測アルゴリズムを使用して本出願人らのゲノムターゲティング実験に使用される全てのガイド配列の推定二次構造を比較した（図３Ｂ）（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３６：Ｗ７０参照）。分析により、ほとんどの場合、キメラｃｒＲＮＡコンテクスト中の有効なガイド配列は二次構造モチーフを実質的に含まない一方、無効なガイド配列は標的プロトスペーサーＤＮＡとの塩基対形成を妨害し得る内部二次構造を形成する可能性がより高いことが明らかになった。したがって、スペーサー二次構造の変動性は、キメラｃｒＲＮＡを使用する場合にＣＲＩＳＰＲ媒介干渉の効率に影響し得ることが考えられる。
図３は、例示的発現ベクターを説明する。図３Ａは、合成ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡキメラ（キメラＲＮＡ）およびＳｐＣａｓ９の発現をドライブするためのバイシストロニックベクターの模式図を提供する。キメラガイドＲＮＡは、ゲノム標的部位中のプロトスペーサーに対応する２０ｂｐのガイド配列を含有する。図３Ｂは、ヒトＥＭＸ１、ＰＶＡＬＢ、およびマウスＴｈ遺伝子座をターゲティングするガイド配列、ならびにそれらの予測二次構造を示す模式図を提供する。それぞれの標的部位における改変効率をＲＮＡ二次構造図の下方に示す（ＥＭＸ１、ｎ＝２１６アンプリコンシーケンシングリード；ＰＶＡＬＢ、ｎ＝２２４リード；Ｔｈ、ｎ＝２６５リード）。フォールディングアルゴリズムは、図３Ｂにグレースケールで再現されるレインボースケールにより示されるとおり、それぞれの塩基が予測二次構造を仮定するその確率に従って着色されたアウトプットを生じさせた。ＳｐＣａｓ９のためのさらなるベクター設計を図４４に示し、それはガイドオリゴのための挿入部位に結合しているＵ６プロモーター、およびＳｐＣａｓ９コード配列に結合しているＣｂｈプロモーターを取り込む単一発現ベクターを説明する。図４４ｂに示されるベクターは、Ｈ１プロモーターに結合しているｔｒａｃｒＲＮＡコード配列を含む。
ＣＲＩＳＰＲが天然に作動する原核細胞中で二次構造を含有するスペーサーが機能し得るか否かを試験するため、プロトスペーサー担持プラスミドの形質転換干渉を、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座１を異種発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株中で試験した（図１０）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を低コピー大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクター中にクローニングし、ｃｒＲＮＡアレイをＤＲのペアによりフランキングされている単一スペーサーにより置き換えた（ｐＣＲＩＳＰＲ）。異なるｐＣＲＩＳＰＲプラスミドを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を、対応するプロトスペーサーおよびＰＡＭ配列を含有するチャレンジプラスミドにより形質転換した（図１０Ｃ）。細菌アッセイにおいて、全てのスペーサーが効率的なＣＲＩＳＰＲ干渉を促進した（図４Ｃ）。これらの結果は、哺乳動物細胞中のＣＲＩＳＰＲ活性の効率に影響する追加の因子が存在し得ることを示唆する。
ＣＲＩＳＰＲ媒介開裂の特異性を調査するため、哺乳動物ゲノム中のプロトスペーサー開裂に対するガイド配列中の単一ヌクレオチド突然変異の効果を、単一点突然変異を有する一連のＥＭＸ１ターゲティングキメラｃｒＲＮＡを使用して分析した（図４Ａ）。図４Ｂは、異なる突然変異体キメラＲＮＡと対形成した場合のＣａｓ９の開裂効率を比較するＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイの結果を説明する。ＰＡＭの５’側の最大１２ｂｐの単一塩基ミスマッチは、ＳｐＣａｓ９によるゲノム開裂を実質的に停止させた一方、さらなる上流位置に突然変異を有するスペーサーは元のプロトスペーサー標的に対する活性を保持した（図４Ｂ）。ＰＡＭの他、ＳｐＣａｓ９は、スペーサーの最後の１２ｂｐ内の単一塩基特異性を有する。さらに、ＣＲＩＳＰＲは、同一ＥＭＸ１プロトスペーサーをターゲティングするＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のペアと同程度に効率的にゲノム開裂を媒介し得る。図４Ｃは、ＥＭＸ１をターゲティングするＴＡＬＥＮの設計を示す模式図を提供し、図４Ｄは、ＴＡＬＥＮおよびＣａｓ９の効率を比較するＳｕｒｖｅｙｏｒゲルを示す（ｎ＝３）。
エラープローンＮＨＥＪ機序を通した哺乳動物細胞中のＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集を達成するための成分のセットを樹立したため、相同組換え（ＨＲ）、ゲノム中の正確な編集を作製するための高フィデリティ遺伝子修復経路を刺激するＣＲＩＳＰＲの能力を試験した。野生型ＳｐＣａｓ９は、ＮＨＥＪおよびＨＲの両方を通して修復され得る部位特異的ＤＳＢを媒介し得る。さらに、ＳｐＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン中のアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）をエンジニアリングしてヌクレアーゼをニッカーゼに変換し（ＳｐＣａｓ９ｎ；図５Ａに説明）（例えば、Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９：９２７５；Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０９：Ｅ２５７９参照）、その結果、ニック形成されたゲノムＤＮＡが高フィデリティ相同性組換え修復（ＨＤＲ）を受ける。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより、ＳｐＣａｓ９ｎはＥＭＸ１プロトスペーサー標的におけるインデルを生成しないことを確認した。図５Ｂに説明されるとおり、ＥＭＸ１ターゲティングキメラｃｒＲＮＡとＳｐＣａｓ９との同時発現は標的部位中のインデルを生じさせた一方、ＳｐＣａｓ９ｎとの同時発現は生じさせなかった（ｎ＝３）。さらに、３２７個のアンプリコンのシーケンシングは、ＳｐＣａｓ９ｎにより誘導されるいかなるインデルも検出しなかった。同一の遺伝子座を選択し、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をＥＭＸ１をターゲティングするキメラＲＮＡ、ｈＳｐＣａｓ９またはｈＳｐＣａｓ９ｎ、およびプロトスペーサー付近に制限部位のペア（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩ）を導入するためのＨＲテンプレートにより同時形質移入することによりＣＲＩＳＰＲ媒介ＨＲを試験した。図５Ｃは、ＨＲ方針の模式的説明を、組換え場所の相対局在およびプライマーアニーリング配列（矢印）とともに提供する。ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９ｎは、実際、ＥＭＸ１遺伝子中へのＨＲテンプレートのインテグレーションを触媒した。標的領域のＰＣＲ増幅とそれに続くＨｉｎｄＩＩＩによる制限消化により、予測断片サイズ（図５Ｄに示される制限断片長多型ゲル分析中の矢印）に対応する開裂産物が明らかになり、ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９ｎは類似レベルのＨＲ効率を媒介した。本出願人らは、ゲノムアンプリコンのサンガーシーケンシングを使用してＨＲをさらに確認した（図５Ｅ）。これらの結果は、哺乳動物ゲノム中のターゲティングされる遺伝子挿入を促進するためのＣＲＩＳＰＲの有用性を実証する。野生型ＳｐＣａｓ９の１４ｂｐ（スペーサーからの１２ｂｐおよびＰＡＭからの２ｂｐ）の標的特異性を考慮すると、ニッカーゼの利用可能性は、一本鎖分解物がエラープローンＮＨＥＪ経路のための基質でないため、オフターゲット改変の可能性を顕著に低減させ得る。
アレイスペーサーを有するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の天然アーキテクチャーを模倣する発現構築物（図２Ａ）を構築して多重化配列ターゲティングの可能性を試験した。ＥＭＸ１およびＰＶＡＬＢターゲティングスペーサーのペアをコードする単一のＣＲＩＳＰＲアレイを使用して、両方の遺伝子座における効率的な開裂が検出された（図４Ｆ、ｃｒＲＮＡアレイの模式的設計および開裂の効率的な媒介を示すＳｕｒｖｅｙｏｒブロットの両方を示す）。１１９ｂｐにより間隔が空いているＥＭＸ１内の２つの標的に対するスペーサーを使用する同時ＤＳＢを通したより大きいゲノム領域のターゲティングされる欠失も試験し、１．６％の欠失効力（１８２個のアンプリコンのうち３つ；図４Ｇ）が検出された。このことは、ＣＲＩＳＰＲ系が単一ゲノム内の多重化編集を媒介し得ることを実証する。
実施例２：ＣＲＩＳＰＲ系改変および代替例
配列特異的ＤＮＡ開裂をプログラミングするためにＲＮＡを使用する技能は、種々の研究および産業用途のための新たなクラスのゲノムエンジニアリングツールを定義する。ＣＲＩＳＰＲ系のいくつかの態様は、ＣＲＩＳＰＲターゲティングの効率および多用途性を増加させるようにさらに改善することができる。最適なＣａｓ９活性は、哺乳動物核中に存在するものよりも高いレベルにおけるフリーＭｇ２＋の利用可能性に依存し得（例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：８１６参照）、プロトスペーサーのすぐ下流のＮＧＧモチーフについての優先性は、ヒトゲノム中で平均１２ｂｐごとでターゲティング能を制限する（図１１、ヒト染色体配列のプラスおよびマイナス鎖の両方を評価）。これらの拘束の一部は、微生物メタゲノムにわたるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の多様性を利用することにより克服することができる（例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，９：４６７参照）。他のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を、実施例１に記載のものと同様の方法により哺乳動物細胞環境中に移植することができる。例えば、図１２は、ＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム編集を達成するための哺乳動物細胞中の異種発現のためのストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９のＣＲＩＳＰＲ１からのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系の適応を説明する。図１２Ａは、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９のＣＲＩＳＰＲ１の模式的説明を提供する。図１２Ｂは、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ系のための発現系の設計を説明する。ヒトコドン最適化ｈＳｔＣａｓ９を、構成的ＥＦ１αプロモーターを使用して発現させる。ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの成熟バージョンを、Ｕ６プロモーターを使用して発現させて正確な転写開始を促進する。成熟ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡからの配列を説明する。ｃｒＲＮＡ配列中の小文字「ａ」により示される単一塩基を使用してＲＮＡｐｏｌＩＩＩ転写ターミネーターとして機能するポリＵ配列を除去する。図１２Ｃは、ヒトＥＭＸ１遺伝子座ターゲティングするガイド配列を示す模式図およびそれらの予測二次構造を提供する。それぞれの標的部位における改変効率を、ＲＮＡ二次構造の下方に示す。この構造を生成するアルゴリズムは、それぞれの塩基を予測二次構造を仮定するその確率に従って着色し、これを図１２Ｃにグレースケールで再現されるレインボースケールにより示す。図１２Ｄは、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを使用する標的遺伝子座中のｈＳｔＣａｓ９媒介開裂の結果を示す。ＲＮＡガイドスペーサー１および２は、それぞれ１４％および６．４％を誘導した。これらの２つのプロトスペーサー部位における生物学的複製物にわたる開裂活性の統計分析も図６に提供する。図１６は、ヒトＥＭＸ１遺伝子座中のＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ系の追加のプロトスペーサーおよび対応するＰＡＭ配列標的の模式図を提供する。２つのプロトスペーサー配列を強調し、ＮＮＡＧＡＡＷモチーフを満たすそれらの対応するＰＡＭ配列を対応する強調配列に対して３’側で下線を付けることにより示す。両方のプロトスペーサーは、アンチセンス鎖をターゲティングする。
実施例３：試料標的配列選択アルゴリズム
規定のＣＲＩＳＰＲ酵素についての所望のガイド配列長およびＣＲＩＳＰＲモチーフ配列（ＰＡＭ）に基づきインプットＤＮＡ配列の両方の鎖上の候補ＣＲＩＳＰＲ標的配列を同定するためのソフトウェアプログラムを設計する。例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９についての標的部位は、ＰＡＭ配列ＮＧＧを用いて、インプット配列およびインプットの逆相補鎖の両方の上の５’−Ｎｘ−ＮＧＧ−３’を探索することにより同定することができる。同様に、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１のＣａｓ９についての標的部位は、ＰＡＭ配列ＮＮＡＧＡＡＷを用いて、インプット配列およびインプットの逆相補鎖の両方の上の５’−Ｎｘ−ＮＮＡＧＡＡＷ−３’を探索することにより同定することができる。同様に、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ３のＣａｓ９についての標的部位は、ＰＡＭ配列ＮＧＧＮＧを用いて、インプット配列およびインプットの逆相補鎖の両方の上の５’−Ｎｘ−ＮＧＧＮＧ−３’を探索することにより同定することができる。Ｎｘ中の値「ｘ」は、プログラムにより固定し、または使用者により規定することができ、例えば、２０である。
ＤＮＡ標的部位のゲノム中の複数の発生は、非特異的ゲノム編集をもたらし得るため、全ての潜在的な部位を同定した後、プログラムは配列が関連参照ゲノム中で出現する回数に基づき配列をフィルタリング除去する。配列特異性が「シード」配列、例えば、ＰＡＭ配列自体を含め、ＰＡＭ配列から５’側の１１〜１２ｂｐにより決定されるそれらのＣＲＩＳＰＲ酵素について、フィルタリングステップはシード配列に基づき得る。したがって、追加のゲノム遺伝子座における編集を回避するため、結果を関連ゲノム中のシード：ＰＡＭ配列の発生数に基づきフィルタリングする。使用者に、シード配列の長さを選択させることができる。使用者に、フィルタ通過の目的のためにゲノム中のシード：ＰＡＭ配列の発生数を規定させることもできる。デフォルトは、ユニーク配列をスクリーニングすることである。フィルトレーションレベルは、シード配列の長さおよびゲノム中の配列の発生数の両方を変えることにより変更する。プログラムは、さらにまたは代替的に、同定された標的配列の逆相補鎖を提供することにより、報告された標的配列に相補的なガイド配列の配列を提供し得る。
配列選択を最適化する方法およびアルゴリズムのさらなる詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６１／８３６，０８０号明細書（代理人整理番号４４７９０．１１．２０２２）に見出すことができる。
実施例４：複数のキメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドの評価
本実施例は、異なる長さの野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を取り込むｔｒａｃｒ配列を有するキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ；ガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列、およびｔｒａｃｒ配列を単一転写物中で含む）について得られた結果を記載する。図１８ａは、キメラＲＮＡおよびＣａｓ９のためのバイシストロニック発現ベクターの模式図を説明する。Ｃａｓ９はＣＢｈプロモーターによりドライブされ、キメラＲＮＡはＵ６プロモーターによりドライブされる。キメラガイドＲＮＡは、からなる。示される種々の位置においてトランケートされたｔｒａｃｒ配列（下方の鎖の最初の「Ｕ」から転写物の末端に及ぶ）に結合している２０ｂｐのガイド配列（Ｎ）からなる。ガイドおよびｔｒａｃｒ配列は、ｔｒａｃｒメイト配列ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡと、それに続くループ配列ＧＡＡＡにより離隔している。ヒト遺伝子座ＥＭＸ１およびＰＶＡＬＢ遺伝子座におけるＣａｓ９媒介インデルについてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を、それぞれ図１８ｂおよび１８ｃに説明する。矢印は、予測ＳＵＲＶＥＹＯＲ断片を示す。ｃｈｉＲＮＡをそれらの「＋ｎ」表記により示し、ｃｒＲＮＡは、ガイドおよびｔｒａｃｒ配列が別個の転写物として発現されるハイブリッドＲＮＡを指す。トリプリケートで実施されたこれらの結果の定量を、図１９ａおよび１９ｂにヒストグラムにより示し、それぞれ図１８ｂおよび１８ｃに対応する（「Ｎ．Ｄ．」は、インデルが検出されなかったことを示す）。プロトスペーサーＩＤおよびそれらの対応するゲノム標的、プロトスペーサー配列、ＰＡＭ配列、および鎖局在を表Ｄに提供する。ガイド配列は、ハイブリッド系における別個の転写物の場合、プロトスペーサー配列全体に相補的であるように、またはキメラＲＮＡの場合、下線部にのみ相補的であるように設計した。
Figure 2016505256
細胞培養および形質移入
ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞系２９３ＦＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１０％のウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補給されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃において５％のＣＯ２インキュベーションで維持した。２９３ＦＴ細胞を２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に、形質移入２４時間前に１ウェル当たり１５０，０００個の細胞の密度において播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の推奨プロトコルに従って使用して細胞を形質移入した。２４ウェルプレートのそれぞれのウェルについて、合計５００ｎｇのプラスミドを使用した。
ゲノム改変についてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ
２９３ＦＴ細胞を上記プラスミドＤＮＡにより形質移入した。細胞を３７℃において形質移入後７２時間インキュベートしてからゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡは、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を製造業者のプロトコルに従って使用して抽出した。手短に述べると、ペレット化細胞をＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液中で再懸濁させ、６５℃において１５分間および９８℃において１０分間インキュベートした。それぞれの遺伝子についてのＣＲＩＳＰＲ標的部位をフランキングするゲノム領域を、ＰＣＲ増幅し（表Ｅに列記のプライマー）、ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者のプロトコルに従って使用して産物を精製した。合計４００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を２μｌの１０×Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＰＣＲ緩衝液（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）と混合し、超純水で２０μｌの最終容量とし、リアニーリングプロセスに供してヘテロ二本鎖形成を可能とした：９５℃において１０分間、−２℃／秒における傾斜で９５℃から８５℃、−０．２５℃／秒における８５℃から２５℃、および２５℃において１分間維持。リアニーリング後、産物をＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼおよびＳＵＲＶＥＹＯＲエンハンサーＳ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）により製造業者の推奨プロトコルに従って処理し、４〜２０％のＮｏｖｅｘ ＴＢＥポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分析した。ゲルをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ ＤＮＡ染色（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により３０分間染色し、Ｇｅｌ Ｄｏｃゲルイメージングシステム（Ｂｉｏ−ｒａｄ）によりイメージングした。定量は、相対バンド強度に基づくものであった。
Figure 2016505256
ユニークＣＲＩＳＰＲ標的部位のコンピュータによる同定
ヒト、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、ミバエ、および線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ゲノム中の化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）酵素についてのユニーク標的部位を同定するため、本出願人らは、ＤＮＡ配列の両方の鎖をスキャンし、考えられる全てのＳｐＣａｓ９標的部位を同定するためのソフトウェアパッケージを開発した。この実施例について、それぞれのＳｐＣａｓ９標的部位を２０ｂｐ配列と、それに続くＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列として操作上定義し、本出願人らは、全ての染色体上のこの５’−Ｎ２０−ＮＧＧ−３’定義を満たす全ての配列を同定した。非特異的ゲノム編集を防止するため、全ての潜在的な部位を同定した後、全ての標的部位をそれらが関連参照ゲノム中で出現する回数に基づきフィルタリングした。例えば、ＰＡＭ配列から５’側の約１１〜１２ｂｐ配列であり得る「シード」配列により付与されるＣａｓ９活性の配列特異性を利用するため、５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−ＮＧＧ−３’配列を関連ゲノム中でユニークであると選択した。全てのゲノム配列をＵＣＳＣゲノムブラウザからダウンロードした（ヒトゲノムｈｇ１９、マウスゲノムｍｍ９、ラットゲノムｒｎ５、ゼブラフィッシュゲノムｄａｎＲｅｒ７、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ゲノムｄｍ４および線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ゲノムｃｅ１０）。全探索結果は、ＵＣＳＣゲノムブラウザ情報を使用して閲覧利用可能である。ヒトゲノム中の一部の標的部位の例示的可視化を図２１に提供する。
最初に、ヒトＨＥＫ２９３ＦＴ細胞中のＥＭＸ１遺伝子座内の３つの部位をターゲティングした。それぞれのｃｈｉＲＮＡのゲノム改変効率は、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ損傷修復経路によるその後続の修復から生じる突然変異を検出するＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイを使用して評価した。ｃｈｉＲＮＡ（＋ｎ）と表記される構築物は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの最大＋ｎ個のヌクレオチドがキメラＲＮＡ構築物中に含まれることを示し、ｎについては４８、５４、６７、および８５の値が使用される。野生型ｔｒａｃｒＲＮＡのより長い断片を含有するキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ（＋６７）およびｃｈｉＲＮＡ（＋８５））は、３つ全てのＥＭＸ１標的部位におけるＤＮＡ開裂を媒介し、特にｃｈｉＲＮＡ（＋８５）は、ガイドおよびｔｒａｃｒ配列を別個の転写物中で発現する対応するｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドよりも顕著に高いレベルのＤＮＡ開裂を実証した（図１８ｂおよび１９ａ）。ハイブリッド系（別個の転写物として発現されるガイド配列およびｔｒａｃｒ配列）を検出可能な開裂を生じなかったＰＶＡＬＢ遺伝子座中の２つの部位も、ｃｈｉＲＮＡを使用してターゲティングした。ｃｈｉＲＮＡ（＋６７）およびｃｈｉＲＮＡ（＋８５）は、２つのＰＶＡＬＢプロトスペーサーにおける顕著な開裂を媒介し得た（図１８ｃおよび１９ｂ）。
ＥＭＸ１およびＰＶＡＬＢ遺伝子座中の５つ全ての標的について、ｔｒａｃｒ配列長さの増加に伴うゲノム改変効率の一貫した増加が観察された。いかなる理論によっても拘束されるものではないが、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端により形成される二次構造は、ＣＲＩＳＰＲ複合体形成の比率の向上における役割を担い得る。本実施例において使用されるキメラＲＮＡのそれぞれについての予測二次構造の説明を、図２１に提供する。二次構造は、最小自由エネルギーおよび分配関数アルゴリズムを使用するＲＮＡｆｏｌｄ（ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｔｂｉ．ｕｎｉｖｉｅ．ａｃ．ａｔ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＲＮＡｆｏｌｄ．ｃｇｉ）を使用して予測した。それぞれの塩基についての疑似カラー（グレースケールで再現）は、対形成の確率を示す。より長いｔｒａｃｒ配列を有するｃｈｉＲＮＡは、天然ＣＲＩＳＰＲｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドにより開裂されない標的を開裂し得たため、キメラＲＮＡをＣａｓ９上にその天然ハイブリッド相当物よりも効率的にロードすることができることが考えられる。真核細胞および生物中の部位特異的ゲノム編集のためのＣａｓ９の適用を促進するため、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９について予測される全てのユニーク標的部位をヒト、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、およびキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ゲノムにおいてコンピュータにより同定した。キメラＲＮＡは、他の微生物からのＣａｓ９酵素について設計してＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼの標的スペースを拡大することができる。
図２２は、最大＋８５ヌクレオチドの野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、および核局在化配列を有するＳｐＣａｓ９を含むキメラＲＮＡの発現のための例示的なバイシストロニック発現ベクターを説明する。ＳｐＣａｓ９は、ＣＢｈプロモーターから発現され、ｂＧＨポリＡシグナル（ｂＧＨｐＡ）により終結される。模式図の直下に説明される拡大配列は、ガイド配列挿入部位を包囲する領域に対応し、５’から３’でＵ６プロモーターの３’部分（最初の陰影領域）、ＢｂｓＩ開裂部位（矢印）、部分ダイレクトリピート（ｔｒａｃｒメイト配列ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡ、下線付き）、ループ配列ＧＡＡＡ、および＋８５ｔｒａｃｒ配列（ループ配列後の下線付き配列）を含む。例示的なガイド配列インサートを、ガイド配列挿入部位の下方に説明し、選択される標的についてのガイド配列のヌクレオチドを「Ｎ」により表す。
上記実施例に記載の配列は、以下のとおりである（ポリヌクレオチド配列は、５’から３’である）：
Ｕ６−短鎖ｔｒａｃｒＲＮＡ（化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０）：
Figure 2016505256
 Ｕ６−長鎖ｔｒａｃｒＲＮＡ（化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０）：
Figure 2016505256
 Ｕ６−ＤＲ−ＢｂｓＩ骨格−ＤＲ（化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０）：
Figure 2016505256
 Ｕ６−キメラＲＮＡ−ＢｂｓＩ骨格（化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０）
Figure 2016505256
 ＮＬＳ−ＳｐＣａｓ９−ＥＧＦＰ：
Figure 2016505256
 ＳｐＣａｓ９−ＥＧＦＰ−ＮＬＳ：
Figure 2016505256
 ＮＬＳ−ＳｐＣａｓ９−ＥＧＦＰ−ＮＬＳ：
Figure 2016505256
 ＮＬＳ−ＳｐＣａｓ９−ＮＬＳ：
Figure 2016505256
 ＮＬＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＳｐＲＮアーゼ３：
Figure 2016505256
 ＳｐＲＮアーゼ３−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＮＬＳ：
Figure 2016505256
 ＮＬＳ−ＳｐＣａｓ９ｎ−ＮＬＳ（Ｄ１０Ａニッカーゼ突然変異は小文字である）：
Figure 2016505256
 ｈＥＭＸ１−ＨＲテンプレート−ＨｉｎｄＩＩ−ＮｈｅＩ：
Figure 2016505256
Figure 2016505256
 ＮＬＳ−ＳｔＣｓｎ１−ＮＬＳ：
Figure 2016505256
 Ｕ６−Ｓｔ＿ｔｒａｃｒＲＮＡ（７−９７）：
Figure 2016505256
 Ｕ６−ＤＲ−スペーサー−ＤＲ（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０）
Figure 2016505256
 ＋４８ｔｒａｃｒＲＮＡを含有するキメラＲＮＡ（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０）
Figure 2016505256
 ＋５４ｔｒａｃｒＲＮＡを含有するキメラＲＮＡ（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０）
Figure 2016505256
 ＋６７ｔｒａｃｒＲＮＡを含有するキメラＲＮＡ（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０）
Figure 2016505256
 ＋８５ｔｒａｃｒＲＮＡを含有するキメラＲＮＡ（化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０）
Figure 2016505256
 ＣＢｈ−ＮＬＳ−ＳｐＣａｓ９−ＮＬＳ
Figure 2016505256
Figure 2016505256
Figure 2016505256
 Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９のための例示的キメラＲＮＡ（ＮＮＡＧＡＡＷのＰＡＭの場合）
Figure 2016505256
 Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９のための例示的キメラＲＮＡ（ＮＮＡＧＡＡＷのＰＡＭの場合）
Figure 2016505256
 Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９のための例示的キメラＲＮＡ（ＮＮＡＧＡＡＷのＰＡＭの場合）
Figure 2016505256
 Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９のための例示的キメラＲＮＡ（ＮＮＡＧＡＡＷのＰＡＭの場合）
Figure 2016505256
 Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９のための例示的キメラＲＮＡ（ＮＮＡＧＡＡＷのＰＡＭの場合）
Figure 2016505256
 Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９のための例示的キメラＲＮＡ（ＮＮＡＧＡＡＷのＰＡＭの場合）
Figure 2016505256
 Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９のための例示的キメラＲＮＡ（ＮＮＡＧＡＡＷのＰＡＭの場合）
Figure 2016505256
 Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９のための例示的キメラＲＮＡ（ＮＮＡＧＡＡＷのＰＡＭの場合）
Figure 2016505256
 Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９のための例示的キメラＲＮＡ（ＮＮＡＧＡＡＷのＰＡＭの場合）
Figure 2016505256
 Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９ＣＲＩＳＰＲ３Ｃａｓ９のための例示的キメラＲＮＡ（ＮＧＧＮＧのＰＡＭの場合）
Figure 2016505256
 Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９ＣＲＩＳＰＲ３遺伝子座からのＣａｓ９のコドン最適化バージョン（５’および３’末端の両方においてＮＬＳを有する）
Figure 2016505256
Figure 2016505256
Figure 2016505256
Figure 2016505256
実施例５：ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用する細菌ゲノムのＲＮＡによりガイドされる編集
本出願人らは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９を使用して肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のゲノム中に正確な突然変異を導入した。このアプローチは、非突然変異細胞を殺傷するためのターゲティングされる部位におけるＣａｓ９指向開裂に依存し、選択可能なマーカーまたはカウンターセレクション系の必要性を回避した。Ｃａｓ９特異性は、編集テンプレート上で担持される単一および多ヌクレオチド変化を作製するように短鎖ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列を変化させることによりリプログラミングした。２つのｃｒＲＮＡの同時使用により、複数の突然変異導入が可能になった。肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）において、Ｃａｓ９開裂から生存した細胞のほぼ１００％が、所望の突然変異を含有し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるリコンビニアリングとの組合せで使用された場合は６５％が所望の突然変異を含有した。本出願人らは、もっぱら、ターゲティング可能な配列の範囲を定義するためのＣａｓ９標的要件を徹底的に分析し、それらの要件に合致しない編集部位のための方針を示し、このことは、細菌ゲノムエンジニアリングのためのこの技術の多用途性を示唆した。
遺伝子機能の理解は、制御様式での細胞内のＤＮＡ配列の変化の可能性に依存する。真核生物中の部位特異的突然変異導入は、目的突然変異を含有するテンプレートＤＮＡの相同組換えを促進する配列特異的ヌクレアーゼの使用により達成される。亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびホーミングメガヌクレアーゼを、規定の局在のゲノムを開裂するようにプログラミングすることができるが、それらのアプローチは、それぞれの標的配列のための新たな酵素のエンジニアリングを要求する。原核生物において、突然変異導入法は、編集される遺伝子座中に選択マーカーを導入し、またはカウンターセレクション系を含む２ステッププロセスを要求する。近年、直鎖ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドの相同組換えを促進する技術であるファージ組換えタンパク質がリコンビニアリングに使用されている。しかしながら、突然変異の選択が存在しないため、リコンビニアリング効率は比較的低いことがあり（より大きい改変について１０−５〜１０−６に至る点突然変異について０．１〜１０％）、多くの場合、多数のコロニーのスクリーニングを要求する。したがって、安価で、使用が容易であり、効率的な新たな技術が真核および原核生物の両方の遺伝子エンジニアリングに依然として必要とされている。
原核生物のＣＲＩＳＰＲ（クラスター化等間隔短鎖回分リピート）適応免疫系に関する近年の研究は、配列特異性が小分子ＲＮＡによりプログラミングされるヌクレアーゼの同定をもたらしている。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、バクテリオファージおよび他の可動遺伝子エレメントのゲノムにマッチする「スペーサー」配列により離隔している一連のリピートから構成される。リピート−スペーサーアレイは、長い前駆体として転写され、リピート配列内でプロセシングされてＣＲＩＳＰＲ系により開裂される標的配列（プロトスペーサーとしても公知）を規定する小分子ｃｒＲＮＡを生成する。プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）としての公知の標的領域のすぐ下流の配列モチーフの存在は、開裂に不可欠である。ＣＲＩＳＰＲ関連（ｃａｓ）遺伝子は、通常、リピート−スペーサーアレイをフランキングし、ｃｒＲＮＡバイオジェネシスおよびターゲティングを担う酵素機構をコードする。Ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡガイドを使用して開裂の部位を規定するｄｓＤＮＡエンドヌクレアーゼである。Ｃａｓ９上へのｃｒＲＮＡガイドのローディングは、ｃｒＲＮＡ前駆体のプロセシングの間に生じ、前駆体に対する小分子ＲＮＡアンチセンス、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびＲＮアーゼＩＩＩを要求する。ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮによるゲノム編集とは対照的に、Ｃａｓ９標的特異性の変化は、タンパク質エンジニアリングを要求するのではなく、短鎖ｃｒＲＮＡガイドの設計のみを要求する。
本出願人らは、近年、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）において染色体遺伝子座をターゲティングするＣＲＩＳＰＲ系の導入が、形質転換細胞の殺傷をもたらすことを示した。偶発的生存物が標的領域中の突然変異を含有することが観察され、このことは、内因性標的に対するＣａｓ９ｄｓＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性をゲノム編集に使用することができることを示唆した。本出願人らは、ゲノム中で組換わり、Ｃａｓ９標的認識を排除するテンプレートＤＮＡ断片の形質転換を通してマーカーレス突然変異を導入することができることを示した。いくつかの異なるｃｒＲＮＡによるＣａｓ９の特異性の指向により、複数の突然変異の同時導入が可能となる。本出願人らは、Ｃａｓ９ターゲティングのための配列要件も詳細に特性決定し、このアプローチを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のゲノム編集のためのリコンビニアリングと組み合わせることができることを示す。
結果：染色体標的のＣａｓ９開裂によるゲノム編集
肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株ｃｒＲ６は、バクテリオファージφ８２３２．５中に存在する標的配列を開裂するＣａｓ９ベースＣＲＩＳＰＲ系を含有する。この標的を第２の株Ｒ６８２３２．５のｓｒｔＡ染色体遺伝子座中にインテグレートした。ＰＡＭ領域中の突然変異を含有する変化標的配列を第３の株Ｒ６３７０．１のｓｒｔＡ遺伝子座中にインテグレートし、この株をＣＲＩＳＰＲ開裂に対して「免疫性」とした（図２８ａ）。本出願人らは、Ｒ６８２３２．５およびＲ６３７０．１細胞をｃｒＲ６細胞からのゲノムＤＮＡにより形質転換し、Ｒ６８２３２．５細胞の良好な形質転換が標的遺伝子座の開裂および細胞死をもたらすはずであることを予測した。この予測とは逆に、本出願人らは、Ｒ６３７０．１形質転換体よりも約１０倍小さい効率にもかかわらず、Ｒ６８２３２．５形質転換体を単離した（図２８ｂ）。８つのＲ６８２３２．５形質転換体の遺伝子分析（図２８）により、大多数は、φ８２３２．５標的をＣａｓ９認識に要求されるプロトスペーサーを含有しないｃｒＲ６ゲノム野生型ｓｒｔＡ遺伝子座により置き換えることによりＣａｓ９ターゲティングの毒性を排除する二重組換えイベントの産物であることが明らかになった。これらの結果は、ゲノム遺伝子座をターゲティングするＣＲＩＳＰＲ系（ターゲティング構築物）の、ターゲティングされる遺伝子座中への組換えのためのテンプレート（編集テンプレート）と一緒の同時導入はターゲティングされるゲノム編集をもたらす証明であった（図２３ａ）。
簡略化されたゲノム編集のための系を創成するため、本出願人らは、ＣＲＩＳＰＲターゲティングに非必須であることが示されているｃａｓ１、ｃａｓ２およびｃｓｎ２遺伝子を欠失させることにより株ｃｒＲ６中のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を改変し、株ｃｒＲ６Ｍを生じさせた（図２８ａ）。この株は、ｃｒＲ６の同一の特性を保持した（図２８ｂ）。Ｃａｓ９ベース編集の効率を増加させ、最適なＤＮＡのテンプレートを使用して導入される突然変異を制御することができることを実証するため、本出願人らは、Ｒ６８２３２．５細胞を、いずれかがＣａｓ９による開裂に対して耐性であるはずの野生型ｓｒｔＡ遺伝子または突然変異体Ｒ６３７０．１標的のＰＣＲ産物により同時形質転換した。このことは、ゲノムｃｒＲ６ＤＮＡ単独と比較して形質転換頻度の５から１０倍増加をもたらした（図２３ｂ）。編集の効率も実質的に増加し、試験された８つのうち８つの形質転換体が野生型ｓｒｔＡコピーを含有し、８つのうち７つがＲ６３７０．１標的中に存在するＰＡＭ突然変異を含有した（図２３ｂおよび図２９ａ）。まとめると、これらの結果は、Ｃａｓ９により支援されるゲノム編集の潜在性を示した。
Ｃａｓ９標的要件の分析：ゲノム中の規定の変化を導入するため、Ｃａｓ９媒介開裂を停止させ、それにより細胞死を妨害する突然変異を担持する編集テンプレートを使用しなければならない。このことは、標的の欠失または別の配列によるその置換（遺伝子挿入）が求められる場合に達成することが容易である。目的が遺伝子融合物を産生することまたは単一ヌクレオチド突然変異を生成することである場合、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性の停止は、ＰＡＭまたはプロトスペーサー配列のいずれかを変える編集テンプレート中の突然変異を導入することによってのみ可能である。ＣＲＩＳＰＲ媒介編集の拘束を決定するため、本出願人らは、ＣＲＩＳＰＲターゲティングを停止させるＰＡＭおよびプロトスペーサー突然変異の徹底的分析を実施した。
従来の研究は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９がプロトスペーサーのすぐ下流のＮＧＧ ＰＡＭを要求することを提案した。しかしながら、極めて限定された数のＰＡＭ不活性化突然変異がこれまで記載されているにすぎないため、本出願人らは、体系的分析を実施してＣＲＩＳＰＲ開裂を排除するプロトスペーサー後の全ての５ヌクレオチド配列を見出した。本出願人らは、ランダム化オリゴヌクレオチドを使用してｃｒＲ６またはＲ６細胞中に形質転換される異種ＰＣＲ産物中の考えられる全ての１，０２４個のＰＡＭ配列を生成した。機能的ＰＡＭを担持する構築物は、Ｒ６細胞ではなくｃｒＲ６細胞中でＣａｓ９により認識および破壊されることが予測された（図２４ａ）。２×１０５個を超えるコロニーを一緒にプールして全ての標的の同時増幅のためのテンプレートとして使用されるＤＮＡを抽出した。ＰＣＲ産物をディープシーケンシングし、全１，０２４個の配列を含有することを見出し、カバレッジは５から４２，４７２リードの範囲であった（セクション「ディープシーケンシングデータの分析」参照）。それぞれのＰＡＭの機能性は、Ｒ６試料に対するｃｒＲ６試料中のそのリードの相対比率により推定した。ＰＡＭの最初の３塩基の分析により、２つの最後の塩基を平均化し、ＮＧＧパターンがｃｒＲ６形質転換体中で過少であることが明確に示された（図２４ｂ）。さらに、次の２つの塩基は、ＮＧＧ ＰＡＭに対する検出可能な効果を有さず（セクション「ディープシーケンシングデータの分析」参照）、このことは、ＮＧＧＮＮ配列がＣａｓ９活性を許容するために十分であることを実証した。部分ターゲティングは、ＮＡＧ ＰＡＭ配列について観察された（図２４ｂ）。また、ＮＮＧＧＮパターンは、ＣＲＩＳＰＲターゲティングを部分的に不活性化し（表Ｇ）、このことは、ＮＧＧモチーフが１ｂｐだけシフトされた場合に低減された効率でＣａｓ９により依然として認識され得ることを示した。これらのデータにより、Ｃａｓ９標的認識の分子機序が浮き彫りになり、ＮＧＧ（または相補鎖上のＣＣＮ）配列がＣａｓ９ターゲティングに十分であることおよび編集テンプレート中のＮＧＧからＮＡＧまたはＮＮＧＧＮへの突然変異を回避すべきことが明らかになった。これらのトリヌクレオチド配列の高頻度（８ｂｐごとに１回）に起因して、このことは、ゲノムのほぼいずれの位置でも編集することができることを意味する。実際、本出願人らは、ランダムに選択された、種々のＰＡＭを担持する１０個の標的を試験し、全てが機能的であることが見出された（図３０）。
Ｃａｓ９媒介開裂を破壊する別の手法は、編集テンプレートのプロトスペーサー領域中の突然変異を導入することである。「シード配列」（ＰＡＭに直接隣接する８から１０個のプロトスペーサーヌクレオチド）内の点突然変異が、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによる開裂を停止させ得ることが公知である。しかしながら、この領域の正確な長さは不明であり、シード中のどのヌクレオチドの突然変異がＣａｓ９標的認識を破壊し得るかが不明確である。本出願人らは、上記の同一のディープシーケンシングアプローチに従ってｃｒＲＮＡとの塩基対接触に関与するプロトスペーサー配列全体をランダム化し、ターゲティングを破壊する全ての配列を決定した。Ｒ６８２３２．５細胞中に存在するｓｐｃ１標的中の２０個のマッチングヌクレオチド（１４）（図２３ａ）のそれぞれの位置をランダム化し、ｃｒＲ６およびＲ６細胞中に形質転換した（図２４ａ）。シード配列の存在と一致して、ＰＡＭのすぐ上流の１２ヌクレオチドの突然変異のみが、Ｃａｓ９による開裂を停止させた（図２４ｃ）。しかしながら、異なる突然変異は、著しく異なる効果を示した。シードの（ＰＡＭから）遠位位置（１２から７位）は、ほとんどの突然変異を許容し、１つの特定の塩基置換のみターゲティングを停止させた。対照的に、近位位置（６から１位、３位を除く）における任意のヌクレオチドの突然変異は、それぞれの特定の置換について異なるレベルにおいてであるが、Ｃａｓ９活性を排除した。３位においては、２つの置換のみがＣＲＩＳＰＲ活性に影響し、強度が異なった。本出願人らは、シード配列突然変異がＣＲＩＳＰＲターゲティングを妨害し得るが、シードのそれぞれの位置において作製することができるヌクレオチド変化に関して制限が存在することを結論付けた。さらに、これらの制限は、異なるスペーサー配列によって変動する可能性が最も高いことがある。したがって、本出願人らは、ＰＡＭ配列中の突然変異が、可能であれば、好ましい編集方針であるはずであると考える。あるいは、シード配列中の複数の突然変異を導入してＣａｓ９ヌクレアーゼ活性を妨害することができる。
肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）中のＣａｓ９媒介ゲノム編集：ターゲティングされるゲノム編集の迅速で効率的な方法を開発するため、本出願人らは、スペーサーをＰＣＲにより容易に導入することができる株である株ｃｒＲ６Ｒｋをエンジニアリングした（図３３）。本出願人らは、活性を容易に計測することができる肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）のβ−ガラクトシダーゼ（ｂｇａＡ）遺伝子を編集することを決定した。本出願人らは、この酵素の活性部位中のアミノ酸のアラニン置換を導入した：Ｒ４８１Ａ（Ｒ→Ａ）およびＮ５６３Ａ、Ｅ５６４Ａ（ＮＥ→ＡＡ）突然変異。異なる編集方針を説明するため、本出願人らは、ＰＡＭ配列およびプロトスペーサーシードの両方の突然変異を設計した。両方の場合、ＴＧＧ ＰＡＭ配列（相補鎖中のＣＣＡ、図２６）に隣接するβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の領域に相補的なｃｒＲＮＡを有する同一のターゲティング構築物を使用した。Ｒ→Ａ編集テンプレートは、プロトスペーサーシード配列上の３ヌクレオチドミスマッチを創成した（ＣＧＴからＧＣＡ、ＢｔｇＺＩ制限部位も導入）。ＮＥ→ＡＡ編集テンプレートにおいて、本出願人らは、不活性ＰＡＭを創成する同義的突然変異（ＴＧＧからＴＴＧ）を、プロトスペーサー領域の２１８ｎｔ下流の突然変異（ＡＡＴ ＧＡＡからＧＣＴ ＧＣＡ、ＴｓｅＩ制限部位も生成）とともに同時に導入した。この最後の編集方針は、遠いＰＡＭを使用して適切な標的を選択することが困難であり得る場所に突然変異を作製する可能性を実証した。例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒ６ゲノムは、３９．７％のＧＣ含有率を有し、１２ｂｐごとに平均１つのＰＡＭモチーフを含有するが、一部のＰＡＭモチーフは、最大１９４ｂｐだけ離隔している（図３３）。さらに、本出願人らは、６，６６４ｂｐのΔｂｇａＡインフレーム欠失を設計した。３つ全ての場合、ターゲティングおよび編集テンプレートの同時形質転換は、野生型ｂｇａＡ配列を含有する対照編集テンプレートによる同時形質転換よりも１０倍カナマイシン耐性の細胞を産生した（図２５ｂ）。本出願人らは、２４個の形質転換体（それぞれの編集実験について８つ）をゲノタイピングし、１つを除き全てが所望の変化を取り込むことを見出した（図２５ｃ）。ＤＮＡシーケンシングによっても、導入された突然変異の存在だけでなく、標的領域中の二次突然変異の不存在を確認した（図２９ｂ、ｃ）。最後に、本出願人らは、β−ガラクトシダーゼ活性を計測して全ての編集細胞が予測表現型を示すことを確認した（図２５ｄ）。
Ｃａｓ９媒介編集を使用して生物学的経路の研究のために複数の突然変異を生成することもできる。本出願人らは、表面タンパク質をグラム陽性細菌のエンベロープに固定するソルターゼ依存性経路についてそれを説明することを決定した。本出願人らは、クロラムフェニコール耐性ターゲティング構築物およびΔｓｒｔＡ編集テンプレートの同時形質転換（図３３ａ、ｂ）と、それに続くΔｂｇａＡを置き換えるカナマイシン耐性ターゲティング構築物を使用するΔｂｇａＡ欠失によりソルターゼ欠失を導入した。肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）において、β−ガラクトシダーゼは、ソルターゼにより細胞壁に共有結合している。したがって、ｓｒｔＡの欠失は、上清中への表面タンパク質の放出をもたらす一方、二重欠失は、検出可能なβ−ガラクトシダーゼ活性を有さない（図３４ｃ）。このような逐次選択を必要な回数繰り返して複数の突然変異を生成することができる。
これらの２つの突然変異は、同時に導入することもできる。本出願人らは、２つのスペーサー、１つのマッチングｓｒｔＡおよび他のマッチングｂｇａＡを含有するターゲティング構築物を設計し、それを両方の編集テンプレートとともに同時に同時形質転換した（図２５ｅ）。形質転換体の遺伝子分析により、編集が８つのケースのうち６つに生じることが示された（図２５ｆ）。特に、残りの２つのクローンは、それぞれΔｓｒｔＡおよびΔｂｇａＡ欠失のいずれかを含有し、このことは、Ｃａｓ９を使用するコンビナトリアル突然変異導入を実施する可能性を示唆した。最後に、ＣＲＩＳＰＲ配列を排除するため、本出願人らは、ｂｇａＡ標的およびスペクチノマイシン耐性遺伝子を野生型株Ｒ６からのゲノムＤＮＡとともに含有するプラスミドを導入した。プラスミドを保持するスペクチノマイシン耐性形質転換体は、ＣＲＩＳＰＲ配列を排除した（図３４ａ、ｄ）。
編集の機序および効率：Ｃａｓ９によるゲノム編集の基礎をなす機序を理解するため、本出願人らは、編集効率をＣａｓ９開裂とは独立して計測する実験を設計した。本出願人らは、ｅｒｍＡＭエリスロマイシン耐性遺伝子をｓｒｔＡ遺伝子座中にインテグレートし、Ｃａｓ９媒介編集を使用して早期終止コドンを導入した（図３３）。得られた株（ＪＥＮ５３）は、ｅｒｍＡＭ（終止）アレルを含有し、エリスロマイシンに対して感受性である。この株を使用してＣａｓ９開裂を使用してまたは使用せずに抗生物質耐性を復帰させる細胞の率を計測することによりｅｒｍＡＭ遺伝子が修復される効率を評価することができる。ＪＥＮ５３を、野生型アレルを復帰させる編集テンプレートにより、ｅｒｍＡＭ（終止）アレルをターゲティングするカナマイシン耐性ＣＲＩＳＰＲ構築物（ＣＲＩＳＰＲ：：ｅｒｍＡＭ（終止））またはスペーサーを有さない対照構築物（ＣＲＩＳＰＲ：：φ）のいずれかと一緒に形質転換した（図２６ａ、ｂ）。カナマイシン選択の不存在下、編集されたコロニーの率は、１０-２（エリスロマイシン耐性ｃｆｕ／総ｃｆｕ）（図２６ｃ）のオーダーであり、これは、非編集細胞に対するＣａｓ９媒介選択を有さない組換えのベースライン頻度を表した。しかしながら、カナマイシン選択を適用し、対照ＣＲＩＳＰＲ構築物を同時形質転換した場合、編集されたコロニーの率は、約１０−１（カナマイシンおよびエリスロマイシン耐性ｃｆｕ／カナマイシン耐性ｃｆｕ）（図２６ｃ）に増加した。この結果は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の組換えの選択が、ゲノムのＣａｓ９開裂とは独立してｅｒｍＡＭ遺伝子座の組換えを同時選択したことを示し、このことは、細胞の部分集団が形質転換および／または組換えを受ける傾向があることを示唆する。ＣＲＩＳＰＲ：：ｅｒｍＡＭ（終止）構築物の形質転換とそれに続くカナマイシン選択は、エリスロマイシン耐性の編集細胞の率の９９％への増加をもたらした（図２６ｃ）。この増加が非編集細胞の殺傷により引き起こされるか否かを決定するため、本出願人らは、ＪＥＮ５３細胞のＣＲＩＳＰＲ：：ｅｒｍＡＭ（終止）またはＣＲＩＳＰＲ：：φ構築物による同時形質転換後に得られたカナマイシン耐性コロニー形成単位（ｃｆｕ）を比較した。
本出願人らは、ｅｒｍＡＭ（終止）構築物（２．５×１０４／４．７×１０３、図３５ａ）の形質転換後に５．３倍少ないカナマイシン耐性コロニーを計数し、Ｃａｓ９による染色体遺伝子座のターゲティングが実際に非編集細胞の殺傷をもたらすことを示唆する結果であった。最後に、細菌染色体中のｄｓＤＮＡ分解の導入は、損傷ＤＮＡの組換えの比率を増加させる修復機序をトリガーすることが公知であるため、本出願人らは、Ｃａｓ９による開裂が編集テンプレートの組換えを誘導するか否かを調査した。本出願人らは、ＣＲＩＳＰＲ：：ｅｒｍ（終止）構築物による同時形質転換後にＣＲＩＳＰＲ：：φ構築物よりも２．２倍多いコロニーを計数し（図２６ｄ）、このことは、適度な組換えの誘導が存在することを示した。まとめると、これらの結果は、形質転換可能な細胞の同時選択、Ｃａｓ９媒介開裂による組換えの誘導および非編集細胞に対する選択は、それぞれ、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）中の高い効率のゲノム編集に寄与することを示した。
Ｃａｓ９によるゲノムの開裂が非編集細胞を殺傷するため、編集テンプレートを受容しなかったものを除きカナマイシン耐性含有Ｃａｓ９カセットを受容したいかなる細胞も回収されないことが予測される。しかしながら、編集テンプレートの不存在下、本出願人らは、ＣＲＩＳＰＲ：：ｅｒｍＡＭ（終止）構築物の形質転換後に多くのカナマイシン耐性コロニーを回収した（図３５ａ）。ＣＲＩＳＰＲ誘導死から「エスケープ」するこれらの細胞は、本方法の限界を決定するバックグラウンドを産生した。このバックグラウンド頻度は、ＣＲＩＳＰＲ：：ｅｒｍＡＭ（終止）／ＣＲＩＳＰＲ：：φｃｆｕの比として算出することができ、この実験においては２．６×１０−３（７．１×１０１／２．７×１０４）であり、これは、編集テンプレートの組換え頻度がこの値未満である場合、ＣＲＩＳＰＲ選択がバックグラウンドを上回って所望の突然変異体を効率的に回収し得ないことを意味する。これらの細胞の起源を理解するため、本出願人らは、８つのバックグラウンドコロニーをゲノタイピングし、７つがターゲティングスペーサーを欠失し（図３５ｂ）、１つがＣａｓ９中の推定不活性化突然変異を保有することを見出した（図３５ｃ）。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のＣａｓ９によるゲノム編集：ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の染色体インテグレーションを通すＣａｓ９ターゲティングの活性化は、高度に組換え性の生物中でのみ可能である。他の微生物に適用可能なより一般的な方法を開発するため、本出願人らは、プラスミドベースＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のゲノム編集を実施することを決定した。２つのプラスミドを構築した：ｔｒａｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９およびクロラムフェニコール耐性カセットを担持するｐＣａｓ９プラスミド（図３６）、およびＣＲＩＳＰＲスペーサーのアレイを担持するｐＣＲＩＳＰＲカナマイシン耐性プラスミド。ＣＲＩＳＰＲ選択とは独立した編集の効率を計測するため、本出願人らは、ストレプトマイシン耐性を付与するｒｐｓＬ遺伝子中のＡからＣへのトランスバージョンを導入することを求めた。本出願人らは、野生型ｒｐｓＬアレルのＣａｓ９開裂をガイドするが、突然変異体ｒｐｓＬアレルのＣａｓ９開裂をガイドしないスペーサーを保有するｐＣＲＩＳＰＲ：：ｒｐｓＬプラスミドを構築した（図２７ｂ）。ｐＣａｓ９プラスミドを最初に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５中に導入し、得られた株をｐＣＲＩＳＰＲ：：ｒｐｓＬプラスミドおよびＡからＣへの突然変異を含有する編集オリゴヌクレオチドＷ５４２により同時形質転換した。ｐＣＲＩＳＰＲ：：ｒｐｓＬプラスミドの形質転換後にストレプトマイシン耐性コロニーのみが回収され、このことは、Ｃａｓ９開裂がオリゴヌクレオチドの組換えを誘導することを示唆した（図３７）。しかしながら、ストレプトマイシン耐性コロニーの数は、推定上Ｃａｓ９による開裂からエスケープする細胞であるカナマイシン耐性コロニーの数よりも２桁低かった。したがって、これらの条件において、Ｃａｓ９による開裂は、突然変異の導入を促進したが、効率は、「エスケーパー」のバックグラウンドを上回って突然変異体細胞を選択するために十分でなかった。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のゲノム編集の効率を改善するため、本出願人らは、Ｃａｓ９誘導細胞死を使用するリコンビニアリングにより本発明のＣＲＩＳＰＲ系を適用して所望の突然変異を選択した。ｐＣａｓ９プラスミドを、□−ｒｅｄファージのＧａｍ、ＥｘｏおよびＢｅｔａ機能を含有するリコンビニアリング株ＨＭＥ６３（３１）中に導入した。得られた株を、ｐＣＲＩＳＰＲ：：ｒｐｓＬプラスミド（またはｐＣＲＩＳＰＲ：：φ対照）およびＷ５４２オリゴヌクレオチドにより同時形質転換した（図２７ａ）。リコンビニアリング効率は、対照プラスミドを使用した場合にストレプトマイシン耐性になる総細胞数の率として算出して５．３×１０−５であった（図２７ｃ）。対照的に、ｐＣＲＩＳＰＲ：：ｒｐｓＬプラスミドによる形質転換は、突然変異体細胞の割合を６５±１４％に増加させた（図２７ｃおよび２９ｆ）。本出願人らは、ｃｆｕの数がｐＣＲＩＳＰＲ：：ｒｐｓＬプラスミドの形質転換後に対照プラスミドよりも約３桁だけ低減することを観察し（４．８×１０５／５．３×１０２、図３８ａ）、このことは、選択が非編集細胞のＣＲＩＳＰＲ誘導死から生じることを示唆した。本出願人らの方法の重要なパラメータであるＣａｓ９開裂が不活性化される比率を計測するため、本出願人らは、細胞をｐＣＲＩＳＰＲ：：ｒｐｓＬまたは対照プラスミドのいずれかによりＷ５４２編集オリゴヌクレオチドを用いずに形質転換した（図３８ａ）。ＣＲＩＳＰＲ「エスケーパー」のこのバックグラウンドは、ｐＣＲＩＳＰＲ：：ｒｐｓＬ／ｐＣＲＩＳＰＲ：：φｃｆｕの比として計測して、２．５×１０-４（１．２×１０２／４．８×１０５）であった。これらのエスケーパーの８つのゲノタイピングにより、全ての場合、ターゲティングスペーサーの欠失が存在することが明らかになった（図３８ｂ）。このバックグラウンドは、ｒｐｓＬ突然変異のリコンビニアリング効率５．３×１０−５よりも高く、このことは、６５％の編集細胞を得るためにＣａｓ９開裂はオリゴヌクレオチド組換えを誘導しなければならないことを示唆した。これを確認するため、本出願人らは、ｐＣＲＩＳＰＲ：：ｒｐｓＬまたはｐＣＲＩＳＰＲ：：φの形質転換後のカナマイシンおよびストレプトマイシン耐性ｃｆｕの数を比較した（図２７ｄ）。肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の場合と同様に、本出願人らは、約６．７倍（２．０×１０-４／３．０×１０-５）の適度な組換えの誘導を観察した。まとめると、これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ系がリコンビニアリングにより導入された突然変異を選択する方法を提供することを示した。
本出願人らは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を、野生型細胞を殺傷するターゲティング構築物およびＣＲＩＳＰＲ開裂を排除し、所望の突然変異を誘導する編集テンプレートの同時形質転換により細菌中のターゲティングされるゲノム編集に使用することができることを示した。異なるタイプの突然変異（挿入、欠失またはスカーレス単一ヌクレオチド置換）を生成することができる。複数の突然変異を同時に導入することができる。ＣＲＩＳＰＲ系を使用する編集の特異性および多用途性は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのいくつかのユニークな特性に依存した：（ｉ）その標的特異性は、酵素エンジニアリングを必要とせずに小分子ＲＮＡによりプログラミングすることができ、（ｉｉ）標的特異性は、２０ｂｐのＲＮＡ−ＤＮＡ相互作用により決定して極めて高く、非標的認識の可能性は低く、（ｉｉｉ）ほぼいずれの配列もターゲティングすることができ、要件は、隣接ＮＧＧ配列の存在のみであり、（ｉｖ）ＮＧＧ配列中のほぼいずれの突然変異も、およびプロトスペーサーのシード配列中の突然変異は、ターゲティングを排除する。
本出願人らは、ＣＲＩＳＰＲ系を使用するゲノムエンジニアリングが、高度に組換え性の細菌、例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）中だけでなく、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でも機能することを示した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の結果は、本方法がプラスミドを導入することができる他の微生物に適用可能であり得ることを示唆した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、このアプローチは、突然変異原性オリゴヌクレオチドのリコンビニアリングを補完する。リコンビニアリングが可能でない微生物中でこの方法論を使用するため、プラスミド上の編集テンプレートを提供することにより宿主相同組換え機構を使用することができる。さらに、蓄積した証拠は、染色体のＣＲＩＳＰＲ媒介開裂が、多くの細菌および古細菌の細胞死をもたらすことを示すため、編集目的のための内因性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の使用を想定することが可能である。
肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の両方において、本出願人らは、編集が形質転換可能な細胞の同時選択およびＣａｓ９開裂による標的部位における組換えの小さい誘導により促進されるが、編集に大部分寄与する機序が非編集細胞に対する選択であることを観察した。したがって、本方法の主な限定は、ＣＲＩＳＰＲ誘導細胞死からエスケープし、所望の突然変異を欠く細胞のバックグラウンドの存在であった。本出願人らは、これらの「エスケーパー」が、推定上、ターゲティングスペーサーをフランキングするリピート配列の組換え後に主としてターゲティングスペーサーの欠失を通して生じることを示した。さらなる改善は、機能的ｃｒＲＮＡのバイオジェネシスを依然として支持し得るが、組換えを排除するために互いに十分に異なるフランキング配列のエンジニアリングにフォーカスし得る。あるいは、キメラｃｒＲＮＡのダイレクト形質転換を調査することができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の特定の場合、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の構築は、この生物をクローニング宿主としても使用した場合に可能でなかった。本出願人らは、この問題をＣａｓ９およびｔｒａｃｒＲＮＡをＣＲＩＳＰＲアレイとは異なるプラスミド上に配置することにより解決した。誘導系のエンジニアリングもこの限定を回避し得る。
新たなＤＮＡ合成技術が高スループットで任意の配列をコスト効率良く創成する技能を提供するが、合成ＤＮＡを生細胞中にインテグレートして機能的ゲノムを創成する困難性が残る。近年、同時選択ＭＡＧＥ方針が、所与の遺伝子座またはその周囲における組換えを達成する可能性が増加した細胞の部分集団を選択することによりリコンビニアリングの突然変異効率を改善するために示された。この方法において、選択可能な突然変異の導入を使用して近くの選択不可能な突然変異を生成する機会を増加させる。この方針により提供される間接的選択とは対照的に、ＣＲＩＳＰＲ系の使用により、所望の突然変異を直接選択し、それを高い効率で回収することが可能となる。これらの技術は、遺伝子エンジニアのツールボックスを増大し、ＤＮＡ合成と一緒に、それらは遺伝子機能を解読し、バイオテクノロジー目的のために生物を操作する技能を実質的に進歩させ得る。２つの他の試験も、哺乳動物ゲノムのＣＲＩＳＰＲ支援エンジニアリングに関する。これらのｃｒＲＮＡ指向ゲノム編集技術は、基礎および医科学において幅広く有用であり得ることが予測される。
株および培養条件。肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株Ｒ６は、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｔｏｍａｓｚ博士により提供された。株ｃｒＲ６は上記試験において生成した。肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の液体培養物をＴＨＹＥ培地（３０ｇ／ｌのＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ寒天、５ｇ／ｌの酵母エキス）中で増殖させた。細胞を、５％の脱線維素ヒツジ血液が補給されたトリプシンダイズ寒天（ＴＳＡ）上でプレーティングした。適宜、抗生物質を以下のとおり添加した：カナマイシン（４００μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍｌ）、エリスロマイシン（１μｇ／ｍｌ）ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）またはスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）。β−ガラクトシダーゼ活性の計測は、上記のとおりＭｉｌｌｅｒアッセイを使用して行った。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＧ１６５５およびＨＭＥ６３（ＭＧ１６５５に由来、Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃ）Ｕ１６９λｃＩ８５７Δｃｒｏ−ｂｉｏＡ ｇａｌＫ ｔｙｒ１４５ＵＡＧ ｍｕｔＳ＜＞ａｍｐ）（３１）は、それぞれＪｅｆｆ ＲｏｂｅｒｔｓおよびＤｏｎａｌｄ Ｃｏｕｒｔにより提供された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の液体培養物をＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ）中で増殖させた。適宜、抗生物質を以下のとおり添加した：クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）。
肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）形質転換。コンピテント細胞を上記のとおり調製した（２３）。全てのゲノム編集形質転換のため、細胞を穏やかに氷上で解凍し、１００ｎｇ／ｍｌのコンピテンス刺激ペプチドＣＳＰ１（４０）が補給された１０容量のＭ２培地中で再懸濁させ、次いで編集構築物を添加した（編集構築物は、０．７ｎｇ／μｌから２．５μｇ／ｕｌの最終濃度において細胞に添加した）。細胞を３７℃において２０分間インキュベートしてから、２μｌのターゲティング構築物を添加し、次いで３７℃において４０分間インキュベートした。細胞の段階希釈物を適切な培地上でプレーティングしてコロニー形成単位（ｃｆｕ）計数値を測定した。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラムダ−ｒｅｄリコンビニアリング。株ＨＭＥ６３を全てのリコンビニアリング実験に使用した。リコンビニアリング細胞を調製し、既に公開されているプロトコルに従って取り扱った（６）。手短に述べると、プレートから得られた単一コロニーから接種された２ｍｌの一晩培養物（ＬＢ培地）を、３０℃において増殖させた。一晩培養物を１００倍希釈し、振とう（２００ｒｐｍ）させながら３０℃においてＯＤ６００が０．４〜０．５になるまで（約３時間）増殖させた。ラムダｒｅｄ誘導のため、培養物を４２℃の水浴に移して２００ｒｐｍにおいて１５分間振とうさせた。誘導直後、培養物を氷水スラリー中で回転させ、氷上で５〜１０分間冷蔵した。次いで、細胞をプロトコルに従って洗浄およびアリコート処理した。電気的形質転換のため、５０μｌの細胞を１ｍＭの塩不含オリゴ（ＩＤＴ）または１００〜１５０ｎｇのプラスミドＤＮＡ（ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎにより調製）と混合した。１ｍｍのＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒキュベット（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を１．８ｋＶにおいて使用して細胞をエレクトロポレートし、１ｍｌの室温ＬＢ培地中で直ちに再懸濁させた。細胞を３０℃において１〜２時間回収してから適切な抗生物質耐性を有するＬＢ寒天上でプレーティングし、３２℃において一晩インキュベートした。
肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ゲノムＤＮＡの調製。形質転換目的のため、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）により提供された指示書に従って使用して肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノタイピング目的のため、７００ｕｌの一晩肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）培養物をペレット化し、６０ｕｌのリゾチーム溶液（２ｍｇ／ｍｌ）中で再懸濁させ、３７℃において３０分間インキュベートした。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。
株構築。本試験において使用された全てのプライマーを表Ｇに提供する。肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｃｒＲ６Ｍを生成するため、中間株ＬＡＭ２２６を作製した。この株において、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｃｒＲ６株のＣＲＩＳＰＲアレイに隣接するａｐｈＡ−３遺伝子（カナマイシン耐性を提供）を、ｃａｔ遺伝子（クロラムフェニコール耐性を提供）により置き換えた。手短に述べると、プライマーＬ４４８／Ｌ４４４およびＬ４４７／Ｌ４８１をそれぞれ使用してｃｒＲ６ゲノムＤＮＡを増幅した。ｃａｔ遺伝子をプラスミドｐＣ１９４からプライマーＬ４４５／Ｌ４４６を使用して増幅した。それぞれのＰＣＲ産物をゲル精製し、３つ全てをプライマーＬ４４８／Ｌ４８１を用いてＳＯＥｉｎｇ ＰＣＲにより融合させた。得られたＰＣＲ産物をコンピテント肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｃｒＲ６細胞中に形質転換し、クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択した。肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｃｒＲ６Ｍを生成するため、プライマーＬ４０９／Ｌ４８８およびＬ４４８／Ｌ４８１をそれぞれ使用して肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｃｒＲ６ゲノムＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。それぞれのＰＣＲ産物をゲル精製し、それらをプライマーＬ４０９／Ｌ４８１を用いてＳＯＥｉｎｇ ＰＣＲにより融合させた。得られたＰＣＲ産物をコンピテント肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＬＡＭ２２６細胞に形質転換し、カナマイシン耐性形質転換体を選択した。
肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｃｒＲ６Ｒｃを生成するため、プライマーＬ４３０／Ｗ２８６を使用して肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｃｒＲ６ＭゲノムＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、プライマーＷ２８８／Ｌ４８１を使用して肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＬＡＭ２２６ゲノムＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。それぞれのＰＣＲ産物をゲル精製し、プライマーＬ４３０／Ｌ４８１を用いてそれらをＳＯＥｉｎｇ ＰＣＲにより融合させた。得られたＰＣＲ産物をコンピテント肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｃｒＲ６Ｍ細胞中に形質転換し、クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択した。
肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｃｒＲ６Ｒｋを生成するため、プライマーＬ４３０／Ｗ２８６およびＷ２８７／Ｌ４８１をそれぞれ使用して肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｃｒＲ６ＭゲノムＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。それぞれのＰＣＲ産物をゲル精製し、プライマーＬ４３０／Ｌ４８１を用いてそれらをＳＯＥｉｎｇ ＰＣＲにより融合させた。得られたＰＣＲ産物をコンピテント肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｃｒＲ６Ｒｃ細胞中に形質転換し、カナマイシン耐性形質転換体を選択した。
ＪＥＮ３７を生成するため、プライマーＬ４３０／Ｗ３５６およびＷ３５７／Ｌ４８１をそれぞれ使用して肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｃｒＲ６ＲｋゲノムＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。それぞれのＰＣＲ産物をゲル精製し、プライマーＬ４３０／Ｌ４８１を用いてそれらをＳＯＥｉｎｇ ＰＣＲにより融合させた。得られたＰＣＲ産物をコンピテント肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｃｒＲ６Ｒｃ細胞中に形質転換し、カナマイシン耐性形質転換体を選択した。
ＪＥＮ３８を生成するため、プライマーＬ４２２／Ｌ４６１およびＬ４５９／Ｌ４２６をそれぞれ使用してＲ６ゲノムＤＮＡを増幅した。プライマーＬ４５７／Ｌ４５８を使用してプラスミドｐＦＷ１５４３からｅｒｍＡＭ遺伝子（エリスロマイシン耐性を規定）を増幅した。それぞれのＰＣＲ産物をゲル精製し、プライマーＬ４２２／Ｌ４２６を用いて３つ全てをＳＯＥｉｎｇ ＰＣＲにより融合させた。得られたＰＣＲ産物をコンピテント肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｃｒＲ６Ｒｃ細胞中に形質転換し、エリスロマイシン耐性形質転換体を選択した。
肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＪＥＮ５３は２ステップで生成した。最初に、ＪＥＮ４３を図３３に説明されるとおり構築した。ＪＥＮ５３は、ＪＥＮ２５のゲノムＤＮＡをコンピテントＪＥＮ４３細胞中に形質転換し、クロラムフェニコールおよびエリスロマイシンの両方に基づき選択することにより生成した。
肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＪＥＮ６２を生成するため、プライマーＷ２５６／Ｗ３６５およびＷ３６６／Ｌ４０３をそれぞれ使用して肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｃｒＲ６ＲｋゲノムＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。それぞれのＰＣＲ産物を精製し、ギブソン・アセンブリによりライゲートした。アセンブリ産物をコンピテント肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｃｒＲ６Ｒｃ細胞中に形質転換し、カナマイシン耐性形質転換体を選択した。
プラスミド構築。ｐＤＢ９７は、オリゴヌクレオチドＢ２９６／Ｂ２９７のリン酸化およびアニーリングと、それに続くＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩにより消化されたｐＬＺ１２ｓｐｅｃ中へのライゲーションを通して構築した。本出願人らは、ｐＬＺ１２ｓｐｅｃを完全にシーケンシングし、その配列をｇｅｎｅｂａｎｋに寄託した（アクセッション番号：ＫＣ１１２３８４）。
ｐＤＢ９８は、ＣＲＩＳＰＲリーダー配列をリピート−スペーサー−リピート単位と一緒にｐＬＺ１２ｓｐｅｃ中にクローニングした後に得た。このことは、プライマーＢ２９８／Ｂ３２０およびＢ２９９／Ｂ３２１を用いるｃｒＲ６ＲｃＤＮＡの増幅と、それに続く両方の産物のＳＯＥｉｎｇ ＰＣＲおよび制限部位ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩを有するｐＬＺ１２ｓｐｅｃ中のクローニングを通して達成した。このように、ｐＤＢ９８中のスペーサー配列を、新たなスペーサーのスカーレスクローニングを可能とする反対方向の２つのＢｓａＩ制限部位を含有するようにエンジニアリングした。
ｐＤＢ９９からｐＤＢ１０８は、オリゴヌクレオチドＢ３００／Ｂ３０１（ｐＤＢ９９）、Ｂ３０２／Ｂ３０３（ｐＤＢ１００）、Ｂ３０４／Ｂ３０５（ｐＤＢ１０１）、Ｂ３０６／Ｂ３０７（ｐＤＢ１０２）、Ｂ３０８／Ｂ３０９（ｐＤＢ１０３）、Ｂ３１０／Ｂ３１１（ｐＤＢ１０４）、Ｂ３１２／Ｂ３１３（ｐＤＢ１０５）、Ｂ３１４／Ｂ３１５（ｐＤＢ１０６）、Ｂ３１５／Ｂ３１７（ｐＤＢ１０７）、Ｂ３１８／Ｂ３１９（ｐＤＢ１０８）のアリーリングと、それに続くＢｓａＩにより切断されたｐＤＢ９８中のライゲーションにより構築した。
ｐＣａｓ９プラスミドは、以下のとおり構築した。不可欠なＣＲＩＳＰＲエレメントを、ギブソン・アセンブリのためのフランキングホモロジーアームを用いて化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｏｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０ゲノムＤＮＡから増幅した。ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９は、オリゴＨＣ００８およびＨＣ０１０を用いて増幅した。リーダーおよびＣＲＩＳＰＲ配列は、スペーサーの容易な挿入を促進するために２つのＢｓａＩ ＩＩＳ型部位が２つのダイレクトリピート間に導入されるようにＨＣ０１１／ＨＣ０１４およびＨＣ０１５／ＨＣ００９を用いて増幅した。
ｐＣＲＩＳＰＲは、オリゴＢ２９８＋Ｂ２９９を用いる増幅ならびにＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用いる制限を通してｐＣａｓ９ＣＲＩＳＰＲアレイをｐＺＥ２１−ＭＣＳ１中でサブクローニングすることにより構築した。オリゴＢ３５２＋Ｂ３５３をアリーリングし、ＢｓａＩ切断ｐＣＲＩＳＰＲ中にクローニングすることによりｒｐｓＬターゲティングスペーサーをクローニングし、ｐＣＲＩＳＰＲ：：ｒｐｓＬを得た。
ターゲティングおよび編集構築物の生成。ゲノム編集に使用されるターゲティング構築物は、左側ＰＣＲおよび右側ＰＣＲのギブソン・アセンブリにより作製した（表Ｇ）。編集構築物は、適用可能な場合、ＰＣＲ産物Ａ（ＰＣＲ Ａ）、ＰＣＲ産物Ｂ（ＰＣＲ Ｂ）およびＰＣＲ産物Ｃ（ＰＣＲ Ｃ）を融合するＳＯＥｉｎｇ ＰＣＲにより作製した（表Ｇ）。ＣＲＩＳＰＲ：：φおよびＣＲＩＳＰＲ：：ｅｒｍＡＭ（終止）ターゲティング構築物は、ＪＥＮ６２およびｃｒＲ６ゲノムＤＮＡぞれぞれのオリゴＬ４０９およびＬ４８１を用いるＰＣＲ増幅により生成した。
ランダム化ＰＡＭまたはプロトスペーサー配列を用いる標的の生成。スペーサー１標的後の５ヌクレオチドを、プライマーＷ３７７／Ｌ４２６を用いるＲ６８２３２．５ゲノムＤＮＡの増幅を通してランダム化した。次いで、このＰＣＲ産物を、プライマーＬ４２２／Ｗ３７６を用いて同一テンプレートから増幅されたｃａｔ遺伝子およびｓｒｔＡ上流領域とアセンブルした。８０ｎｇのアセンブルされたＤＮＡを使用して株Ｒ６およびｃｒＲ６を形質転換した。ランダム化試料のための試料は、以下のプライマーを使用して調製した：標的の塩基１〜１０をランダム化するためのＢ２８０〜Ｂ２９０／Ｌ４２６および塩基１０〜２０をランダム化するためのＢ２６９〜Ｂ２７８／Ｌ４２６。プライマーＬ４２２／Ｂ２６８およびＬ４２２／Ｂ２７９を使用してそれぞれ最初および最後の１０個のＰＣＲ産物とアセンブルすべきｃａｔ遺伝子およびｓｒｔＡ上流領域を増幅した。アセンブルされた構築物を一緒にプールし、Ｒ６およびｃｒＲ６中で３０ｎｇを形質転換した。形質転換後、細胞をクロラムフェニコール選択に基づきプレーティングした。それぞれの試料について、２×１０５個を超える細胞を１ｍｌのＴＨＹＥ中で一緒にプールし、ゲノムＤＮＡをＰｒｏｍｅｇａ Ｗｉｚａｒｄキットにより抽出した。プライマーＢ２５０／Ｂ２５１を使用して標的領域を増幅した。ＰＣＲ産物をタグ化し、１つのＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑペアエンドレーン上で３００サイクルを使用して流した。
ディープシーケンシングデータの分析
ランダム化ＰＡＭ：ランダム化ＰＡＭ実験について、ｃｒＲ６について３，４２９，４０６リード、Ｒ６について３，２５３，９９８リードが得られた。これらの半数のみがＰＡＭ標的に対応する一方、他の半数がＰＣＲ産物の他の末端をシーケンシングすることが予測される。ｃｒＲ６リードの１，６２３，００８およびＲ６リードの１，５３７，１３１は、エラーのない標的配列を担持した。これらのリードの中のそれぞれの考えられるＰＡＭの発生率を補足ファイルに示す。ＰＡＭの機能性を推定するため、Ｒ６試料に対するｃｒＲ６試料中のその相対比率を計算し、ｒｉｊｋｌｍ（式中、Ｉ、ｊ、ｋ、ｌ、ｍは、４つの考えられる塩基の１つである）で示す。以下の統計モデルを構築した：
ｌｏｇ（ｒｉｊｋｌｍ）＝μ＋ｂ２ｉ＋ｂ３ｊ＋ｂ４ｋ＋ｂ２ｂ３ｉ，ｊ＋ｂ３ｂ４ｊ，ｋ＋εｉｊｋｌｍ
（式中、εは、残差であり、ｂ２は、ＰＡＭの第２の塩基の効果であり、ｂ３は、第３の塩基の効果であり、ｂ４は、第４の塩基の効果であり、ｂ２ｂ３は、第２の塩基と第３の塩基との間の相互作用であり、ｂ３ｂ４は、第３の塩基と第４の塩基との間の相互作用である）。分散分析を実施した。
Figure 2016505256
このモデルに付加する場合、ｂ１またはｂ５は、有意でないと考えられ、含められるものを除き他の相互作用を廃棄することもできる。モデル選択を、Ｒ．テューキーのＨＳＤ検定（Ｒ．Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｈｏｎｅｓｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｔｅｓｔ）におけるａｎｏｖａ法の使用を使用して事実上完全なモデルの継時比較を通して行って効果間のペアワイズ差が有意であるか否かを決定した。
ＮＧＧＮＮパターンは、全ての他のパターンと有意に異なり、最も強い効果を有する（以下の表参照）。
１、４または５位がＮＧＧＮＮパターンに影響しないことを示すため、本出願人らは、これらの配列のみを考察した。これらの効果は、正規分布されると考えられ（図７１中のＱＱプロット参照）、Ｒにおけるａｎｏｖａ法を使用するモデル比較は、ヌルモデルが最良のものであること、すなわち、ｂ１、ｂ４およびｂ５の有意な役割が存在しないことを示す。
Figure 2016505256
ＮＡＧＮＮおよびＮＮＧＧＮパターンの部分干渉
ＮＡＧＮＮパターンは、全ての他のパターンと有意に異なるが、ＮＧＧＮＮよりもかなり少ない効果を有する（以下のテューキーのＨＳＤ検定参照）。
最後に、ＮＴＧＧＮおよびＮＣＧＧＮパターンも同様であり、ボンフェローニ調整ペアワイズスチューデント検定により示されるとおり、ＮＴＧＨＮおよびＮＣＧＨＮパターン（Ｈは、Ａ、ＴまたはＣである）よりも大きいＣＲＩＳＰＲ干渉を有意に示す。
Figure 2016505256
まとめると、これらの結果により、ＮＮＧＧＮパターンが一般にＮＧＧＧＮの場合に完全干渉を、またはＮＡＧＧＮ、ＮＴＧＧＮもしくはＮＣＧＧＮの場合に部分干渉を生じさせることを結論付けることが可能となる。
Figure 2016505256
ランダム化標的
ランダム化標的実験について、ｃｒＲ６について５４０，７２６リードが、Ｒ６について７５３，５７０リードが得られた。上記のとおり、リードの半数のみがＰＣＲ産物の目的末端をシーケンシングすることが予測される。エラーフリーまたは単一の点突然変異を有する標的を担持するリードをフィルタリングした後、ｃｒＲ６およびＲ６についてそれぞれ２１７，６５６および３５３，１４１リードが残存した。Ｒ６試料に対するｃｒＲ６試料におけるそれぞれの突然変異体の相対比率を計算した（図２４ｃ）。シード配列の外側（ＰＡＭから１３〜２０塩基離れている）の全ての突然変異は、完全干渉を示す。これらの配列を参照として使用してシード配列の内側の他の突然変異が干渉を有意に破壊し得ると考えられるか否かを決定した。ＭＡＳＳ Ｒパッケージのｆｉｔｄｉｓｔｒ関数を使用して正規分布をこれらの配列にフィットさせた。フィットされた分布の０．９９分位点を図２４ｃに点線として示す。図７２は、フィットされた正規分布（黒線）および０．９９分位点（点線）を有するデータ密度のヒストグラムを示す。
Figure 2016505256
Figure 2016505256
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Figure 2016505256
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実施例６：化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９と称される）についてのガイドＲＮＡの最適化
本出願人らは、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびダイレクトリピート配列を突然変異させ、またはキメラガイドＲＮＡを突然変異させて細胞中のＲＮＡを向上させた。
最適化は、ｐｏｌ３プロモーターによる早期転写終結をもたらし得るｔｒａｃｒＲＮＡおよびガイドＲＮＡ中にチミンのストレッチ（Ｔ）が存在した観察に基づく。したがって、本出願人らは、以下の最適化配列を生成した。最適化ｔｒａｃｒＲＮＡおよび対応する最適化ダイレクトリピートをペアで表す。
最適化ｔｒａｃｒＲＮＡ１（下線は突然変異）：
Figure 2016505256
 最適化ダイレクトリピート１（下線は突然変異）：
Figure 2016505256
 最適化ｔｒａｃｒＲＮＡ２（下線は突然変異）：
Figure 2016505256
 最適化ダイレクトリピート２（下線は突然変異）：
Figure 2016505256
 本出願人らは、真核細胞中の最適な活性のためにキメラガイドＲＮＡも最適化した。
元のガイドＲＮＡ：
Figure 2016505256
 最適化キメラガイドＲＮＡ配列１：
Figure 2016505256
 最適化キメラガイドＲＮＡ配列２：
Figure 2016505256
 最適化キメラガイドＲＮＡ配列３：
Figure 2016505256
本出願人らは、最適化キメラガイドＲＮＡが図３に示されるとおり、より良好に機能することを示した。本実験は、２９３ＦＴ細胞をＣａｓ９およびＵ６ガイドＲＮＡ ＤＮＡカセットにより同時形質移入して上記４つのＲＮＡ形態の１つを発現させることにより実施した。ガイドＲＮＡの標的は、ヒトＥｍｘ１遺伝子座：「ＧＴＣＡＣＣＴＣＣＡＡＴＧＡＣＴＡＧＧＧ」中の同一標的部位である。
実施例７：ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）ＬＭＤ−９ ＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９と称される）の最適化
本出願人らは、図４に示されるガイドキメラＲＮＡを設計した。
Ｓｔ１Ｃａｓ９ガイドＲＮＡは、ポリチミンのストレッチ（Ｔ）を分解することによりＳｐＣａｓ９ガイドＲＮＡに関して同一タイプの最適化を受け得る。
実施例８：Ｃａｓ９多様性および突然変異
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、細菌から古細菌にわたる多様な種により用いられる侵入外因性ＤＮＡに対する適応免疫機序である。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座中への外来ＤＮＡの「獲得」を担うタンパク質をコードする遺伝子のセット、およびＤＮＡ開裂機序の「実行」をコードする遺伝子のセットからなり；これらは、ＤＮＡヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）、非コードトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、およびダイレクトリピートによりフランキングされている外来ＤＮＡ由来スペーサーのアレイ（ｃｒＲＮＡ）を含む。Ｃａｓ９による成熟時、ｔｒａｃＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ二本鎖は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをスペーサーガイド配列により規定される標的ＤＮＡ配列にガイドし、開裂に要求され、それぞれのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に特異的な標的ＤＮＡ中の短鎖配列モチーフ付近のＤＮＡの二本鎖切断を媒介する。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、細菌界全体にわたり見出されており、Ｃａｓ９タンパク質配列およびサイズ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡダイレクトリピート配列、それらのエレメントのゲノム構成、および標的開裂のためのモチーフ要件は高度に多様である。ある種は、複数の区別されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を有し得る。
本出願人らは、公知のＣａｓ９との配列相同性および公知のサブドメイン、例として、ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインおよびＲｕｖＣエンドヌクレアーゼドメイン［Ｅｕｇｅｎｅ ＫｏｏｎｉｎおよびＫｉｒａ Ｍａｋａｒｏｖａからの情報］とオルソロガスな構造に基づき同定された細菌種から２０７個の推定Ｃａｓ９を評価した。このセットのタンパク質配列保存に基づく系統発生分析により、大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つのファミリーが明らかになった（図３９および４０Ａ〜Ｆ）。
本実施例において、本出願人らは、以下の突然変異がＳｐＣａｓ９をニック形成酵素に変換し得ることを示す：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｄ９８６Ａ。
本出願人らは、突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内のどこに局在するかを示す配列を提供する（図４１）。本出願人らは、ニッカーゼが相同組換えを依然として媒介し得ることも示す（図２に示されるアッセイ）。さらに、本出願人らは、これらの突然変異を有するＳｐＣａｓ９が（個々に）二本鎖切断を誘導しないことを示す（図４７）。
実施例９：ＲＮＡによりガイドされるＣａｓ９ヌクレアーゼのＤＮＡ標的特異性に関する補足
細胞培養および形質移入
ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞系２９３ＦＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１０％のウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補給されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃において５％のＣＯ２インキュベーションで維持した。
２９３ＦＴ細胞を６ウェルプレート、２４ウェルプレート、または９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に、形質移入２４時間前に播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の推奨プロトコルに従って使用して細胞を８０〜９０％のコンフルエンスにおいて形質移入した。６ウェルプレートのそれぞれのウェルについて、合計１ｕｇのＣａｓ９＋ｓｇＲＮＡプラスミドを使用した。特に記載のない限り、２４ウェルプレートのそれぞれのウェルについて、合計５００ｎｇのＣａｓ９＋ｓｇＲＮＡプラスミドを使用した。９６ウェルプレートのそれぞれのウェルについて、６５ｎｇのＣａｓ９プラスミドをＵ６−ｓｇＲＮＡ ＰＣＲ産物との１：１のモル比において使用した。
ヒト胚性幹細胞系ＨＵＥＳ９（Ｈａｒｖａｒｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｃｏｒｅ）を、１００ｕｇ／ｍｌのＮｏｒｍｏｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）が補給されたｍＴｅｓＲ培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のＧｅｌＴｒｅｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上でフィーダーフリー条件において維持した。ＨＵＥＳ９細胞をＡｍａｘａ Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４−Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ）により製造業者のプロトコルに従って形質移入した。
ゲノム改変についてのＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイ
２９３ＦＴ細胞を上記のとおりプラスミドＤＮＡにより形質移入した。細胞を３７℃において形質移入後７２時間インキュベートしてからゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡは、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を製造業者のプロトコルに従って使用して抽出した。手短に述べると、ペレット化細胞をＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液中で懸濁させ、６５℃において１５分間および９８℃において１０分間インキュベートした。
それぞれの遺伝子についてのＣＲＩＳＰＲ標的部位をフランキングするゲノム領域をＰＣＲ増幅（表ＪおよびＫに列記のプライマー）し、ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者のプロトコルに従って使用して産物を精製した。合計４００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を、２μｌの１０×Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＰＣＲ緩衝液（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）と混合し、超純水で２０μｌの最終容量とし、リアニーリングプロセスに供してヘテロ二本鎖形成を可能とした：９５℃において１０分間、−２℃／秒における傾斜で９５℃から８５℃、−０．２５℃／秒における８５℃から２５℃、および２５℃において１分間維持。リアニーリング後、産物をＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼおよびＳＵＲＶＥＹＯＲエンハンサーＳ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）により製造業者の推奨プロトコルに従って処理し、４〜２０％のＮｏｖｅｘ ＴＢＥポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分析した。ゲルをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ ＤＮＡ染色（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により３０分間染色し、Ｇｅｌ Ｄｏｃゲルイメージングシステム（Ｂｉｏ−ｒａｄ）によりイメージングした。定量は、相対バンド強度に基づくものであった。
ヒト細胞中のｔｒａｃｒＲＮＡ発現のノザンブロット分析
ノザンブロットを、上記のとおり実施した。手短に述べると、ＲＮＡを９５℃に５分間加熱してから８％の変性ポリアクリルアミドゲル（ＳｅｑｕａＧｅｌ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）上にロードした。その後、ＲＮＡを事前にハイブリダイズさせたＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋メンブレン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に転写し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＵＶ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により架橋した。プローブをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて［ガンマ−３２Ｐ］ＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により標識した。洗浄後、メンブレンを蛍光スクリーンに１時間曝露し、ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｔｙｐｈｏｏｎ）によりスキャンした。
ＤＮＡメチル化状態を評価するためのバイサルファイトシーケンシング
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、上記のとおりＣａｓ９により形質移入した。ゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により単離し、バイサルファイトをＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により変換した。バイサルファイトＰＣＲは、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｅｋｅｒを使用して設計されたプライマー（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、表ＪおよびＫ）を用いてＫＡＰＡ２Ｇ Ｒｏｂｕｓｔ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。得られたＰＣＲアンプリコンをゲル精製し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、形質転換前にｐＵＣ１９骨格中にライゲートした。次いで、個々のクローンをサンガーシーケンシングしてＤＮＡメチル化状態を評価した。
インビトロ転写および開裂アッセイ
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を上記のとおりＣａｓ９により形質移入した。次いで、ホールセル溶解物を、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）が補給された溶解緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、５％のグリセロール、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を用いて調製した。カスタムオリゴ（実施例１０）およびＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を製造業者の推奨プロトコルに従って使用してＴ７によりドライブされるｓｇＲＮＡをインビトロで転写させた。メチル化標的部位を調製するため、ｐＵＣ１９プラスミドをＭ．ＳｓｓＩによりメチル化し、次いでＮｈｅＩにより線形化した。インビトロ開裂アッセイを以下のとおり実施した：２０ｕＬの開裂反応物について、１０ｕＬの細胞溶解物を２ｕＬの開裂緩衝液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、５００ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＤＴＴ、２５％のグリセロール）、インビトロ転写されたＲＮＡ、３００ｎｇのｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡとともにインキュベートした。
ターゲティング特異性を評価するためのディープシーケンシング
９６ウェルプレート中でプレーティングされたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、Ｃａｓ９プラスミドＤＮＡおよび単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ＰＣＲカセットにより７２時間形質移入してからゲノムＤＮＡを抽出した（図７２）。それぞれの遺伝子についてのＣＲＩＳＰＲ標的部位をフランキングするゲノム領域を、融合ＰＣＲ法により増幅してＩｌｌｕｍｉｎａ Ｐ５アダプターおよびユニークな試料特異的バーコードを標的アンプリコン（図７３に記載の模式図）に付着させた（図７４、図８０（実施例１０）。ＰＣＲ産物は、ＥｃｏｎｏＳｐｉｎ９６ウェルＦｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅｓ（Ｅｐｏｃｈ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造業者の推奨プロトコルに従って使用して精製した。
バーコード化および精製ＤＮＡ試料を、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ ＫｉｔまたはＱｕｂｉｔ ２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により定量し、等モル比でプールした。次いで、シーケンシングライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりディープシーケンシングした。
シーケンシングデータ分析およびインデル検出
ＭｉＳｅｑリードは、少なくとも２３の平均Ｐｈｒｅｄクオリティ（Ｑスコア）ならびにバーコードおよびアンプリコンフォワードプライマーとの完全配列マッチを要求することによりフィルタリングした。オンおよびオフターゲット遺伝子座からのリードは、標的部位の上流および下流の５０ヌクレオチド（合計１２０ｂｐ）を含むアンプリコン配列に対してＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアラインメントを最初に実施することにより分析した。その一方、アラインメントを標的部位の上流の５ヌクレオチドから下流の５ヌクレオチド（合計３０ｂｐ）のインデルについて分析した。これらのアラインメントの一部がＭｉＳｅｑリード自体の外側に収まる場合、またはマッチした塩基対がそれらの全長の８５％未満を含む場合に分析された標的領域を廃棄した。
それぞれの試料についての陰性対照は、推定切断イベントとしてのインデルの包含または排除のための測定基準を提供した。それぞれの試料について、インデルをその品質スコアがμ−σ（μは、その試料に対応する陰性対照の平均品質スコアを意味し、σはその標準偏差である）を超過する場合のみカウントした。このことは、陰性対照およびそれらの対応試料の両方についての全標的領域インデル比率を生じさせた。陰性対照の標的領域ごとのリードごとのエラー比率ｑ、試料の観察されたインデルカウントｎ、およびそのリードカウントＲを使用して、真のインデルを有する標的領域を有するリードの率についての最尤推定量ｐを以下のとおり２項エラーモデルを適用することにより得た。
少なくとも１つのインデルを有するとして不正確にカウントされた標的領域を有する試料中の（不明）数のリードをＥとして、
Figure 2016505256
 を記載することができ（真のインデル数についていかなる仮定もしない）、Ｒ（１−ｐ）は、真のインデルを有さない標的領域を有するリードの数である。その一方、インデルを有すると観察されたリードの数はｎであるため、ｎ＝Ｅ＋Ｒｐであり、すなわち、エラーを有するが真インデルを有さない標的領域を有するリードの数と、標的領域がインデルを正確に有するリードの数である。次いで、上式を書き換えることができる。
Figure 2016505256
真のインデルｐを有する標的領域の頻度の全ての値が推測的に同等に起こり得るとみなす場合、Ｐｒｏｂ（ｎ｜ｐ）∝Ｐｒｏｂ（ｐ｜ｎ）である。したがって、真のインデルを有する標的領域の頻度についての最尤推定量（ＭＬＥ）を、Ｐｒｏｂ（ｎ｜ｐ）を最大化するｐの値として設定した。これを数値評価した。
エラーバウンドをシーケンシングライブラリー自体の中の真のインデルリード頻度に配置するため、Ｗｉｌｓｏｎスコア間隔（２）をそれぞれの試料について算出し、真のインデル標的領域Ｒｐおよびリードの数ＲについてのＭＬＥ推定量を得た。明確には、下限ｌおよび上限μを下式
Figure 2016505256
 のとおり算出し、ｚは、分散１の正規分布において要求される信頼についての標準スコアであり、９５％の信頼を意味する１．９６に設定した。それぞれの生物学的複製物についての最大上限および最小下限を図８０〜８３に列記する。
相対Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡ発現のｑＲＴ−ＰＣＲ分析
２４ウェルプレート中でプレーティングされた２９３ＦＴ細胞を、上記のとおり形質移入した。形質移入７２時間後、トータルＲＮＡをｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により回収した。ｓｇＲＮＡについての逆鎖合成は、ｑＳｃｒｉｐｔ Ｆｌｅｘ ｃＤＮＡキット（ＶＷＲ）およびカスタム第１鎖合成プライマー（表ＪおよびＫ）を用いて実施した。ｑＰＣＲ分析は、ＧＡＰＤＨを内因性対照として使用してＦａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびカスタムプライマー（表ＪおよびＫ）を用いて実施した。相対定量をΔΔＣＴ法により算出した。
表Ｉ｜標的部位配列。化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系についての試験標的部位と必要なＰＡＭ。細胞をＣａｓ９およびそれぞれの標的についてのｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡまたはキメラｓｇＲＮＡのいずれかにより形質移入した。
Figure 2016505256
Figure 2016505256
Figure 2016505256
Figure 2016505256
表Ｋ｜ｓｇＲＮＡアーキテクチャーを試験するためのプライマーについての配列。プライマーは、特に記載のない限り、Ｕ６プロモーターの逆鎖にハイブリダイズする。Ｕ６プライミング部位をイタリックで、ガイド配列をＮのストレッチとして示し、ダイレクトリピート配列を太字で強調し、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に下線を付す。それぞれのｓｇＲＮＡアーキテクチャーの二次構造を図４３に示す。
Figure 2016505256
表Ｌ｜Ｃａｓ９のＰＡＭ特異性を試験するための標的部位と代替ＰＡＭ。ＰＡＭ特異性試験のための全ての標的部位が、ヒトＥＭＸ１遺伝子座内に見出される。
Figure 2016505256
実施例１０：補足配列
全ての配列は、５’から３’方向である。Ｕ６転写のため、下線付きのＴのストリングが転写ターミネーターとして機能する。
＞Ｕ６−短鎖ｔｒａｃｒＲＮＡ（化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０）
Figure 2016505256
 ＞Ｕ６−ＤＲ−ガイド配列−ＤＲ（化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０）
Figure 2016505256
 ＞＋４８ｔｒａｃｒＲＮＡを含有するｓｇＲＮＡ（化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０）
Figure 2016505256
 ＞＋５４ｔｒａｃｒＲＮＡを含有するｓｇＲＮＡ（化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０）
Figure 2016505256
 ＞＋６７ｔｒａｃｒＲＮＡを含有するｓｇＲＮＡ（化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０）
Figure 2016505256
 ＞＋８５ｔｒａｃｒＲＮＡを含有するｓｇＲＮＡ（化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０）
Figure 2016505256
 ＞ＣＢｈ−ＮＬＳ−ＳｐＣａｓ９−ＮＬＳ
Figure 2016505256
Figure 2016505256
Figure 2016505256
Figure 2016505256
 ＞ＥＭＸ１ガイド１．１、１．１４、１．１７のためのアンプリコンのシーケンシング
Figure 2016505256
 ＞ＥＭＸ１ガイド１．２、１．１６のためのアンプリコンのシーケンシング
Figure 2016505256
 ＞ＥＭＸ１ガイド１．３、１．１３、１．１５のためのアンプリコンのシーケンシング
Figure 2016505256
 ＞ＥＭＸ１ガイド１．６のためのアンプリコンのシーケンシング
Figure 2016505256
 ＞ＥＭＸ１ガイド１．１０のためのアンプリコンのシーケンシング
Figure 2016505256
 ＞ＥＭＸ１ガイド１．１１、１．１２のためのアンプリコンのシーケンシング
Figure 2016505256
 ＞ＥＭＸ１ガイド１．１８、１．１９のためのアンプリコンのシーケンシング
Figure 2016505256
 ＞ＥＭＸ１ガイド１．２０のためのアンプリコンのシーケンシング
Figure 2016505256
 ＞標的鎖とのアニーリングのためのＴ７プロモーターＦプライマー
Figure 2016505256
 ＞メチル化のためのｐＵＣ１９標的部位１を含有するオリゴ（Ｔ７リバース）
Figure 2016505256
 ＞メチル化のためのｐＵＣ１９標的部位２を含有するオリゴ（Ｔ７リバース）
Figure 2016505256
実施例１１：オリゴ媒介Ｃａｓ９誘導相同組換え
オリゴ相同組換え試験は、異なるＣａｓ９バリアントおよび異なるＨＲテンプレート（オリゴ対プラスミド）にわたる効率の比較である。
２９３ＦＴ細胞を使用した。ＳｐＣａｓ９＝野生型Ｃａｓ９であり、ＳｐＣａｓ９ｎ＝ニッカーゼＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）である。キメラＲＮＡ標的は、実施例５、９および１０と同一のＥＭＸ１プロトスペーサー標的１であり、オリゴはＰＡＧＥ精製を使用してＩＤＴにより合成されたものである。
図４４は、本実験における相同組換え（ＨＲ）テンプレートとして使用されるオリゴＤＮＡの設計を示す。長鎖オリゴは、ＥＭＸ１遺伝子座およびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位と１００ｂｐの相同性を含有する。２９３ＦＴ細胞を、第１に、ヒトＥＭＸ１遺伝子座をターゲティングするキメラＲＮＡおよび野生型ｃａｓ９タンパク質を含有するプラスミド、ならびに第２に、ＨＲテンプレートとしてのオリゴＤＮＡにより同時形質移入した。試料は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００による形質移入から９６時間後に回収された２９３ＦＴ細胞からのものである。全ての産物を、ＥＭＸ１ＨＲプライマーを用いて増幅し、ゲル精製し、次いでＨｉｎｄＩＩＩにより消化してヒトゲノム中へのＨＲテンプレートのインテグレーションの効率を検出した。
図４５および４６は、Ｃａｓ９タンパク質およびＨＲテンプレートの異なる組合せにより誘導されたＨＲ効率の比較を示す。使用されるＣａｓ９構築物は、野生型Ｃａｓ９またはＣａｓ９のニッカーゼバージョン（Ｃａｓ９ｎ）のいずれかであった。使用されるＨＲテンプレートは、アンチセンスオリゴＤＮＡ（上図のアンチセンスオリゴ）またはセンスオリゴＤＮＡ（上図のセンスオリゴ）、またはプラスミドＨＲテンプレート（上図のＨＲテンプレート）であった。センス／アンチセンス定義は、転写されるｍＲＮＡに対応する配列を有する活性的に転写される鎖が、ゲノムのセンス鎖として定義されることである。ＨＲ効率は、全てのゲノムＰＣＲ増幅産物に対するＨｉｎｄＩＩＩ消化バンドの割合として示す（下方の数字）。
実施例１２：自閉症マウス
近年の大規模シーケンシング構想は、疾患に関連する多数の遺伝子を生じさせた。遺伝子の発見は、その遺伝子が何であるか、およびいかにそれが疾患表現型をもたらすのかの理解の始まりにすぎない。候補遺伝子を研究するための現在の技術およびアプローチは、緩慢で煩雑である。代表的な基準である遺伝子ターゲティングおよび遺伝子ノックアウトは、金銭および研究人材の両方の観点から時間および資源のかなりの投資を要求する。本出願人らは、ｈＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼを利用して多くの標的遺伝子をターゲティングし、任意の他の技術と比較して高い効率および低いターンアラウンドでそれを行うように設定した。ｈＳｐＣａｓ９の高い効率のため、本出願人らは、ＲＮＡインジェクションをマウス接合子中に行い、ｍＥＳＣにおけるいかなる予備遺伝子ターゲティングを行うことも必要とせずにゲノム改変動物を直ちに得ることができる。
クロモドメインヘリカーゼＤＮＡ結合タンパク質８（ＣＨＤ８）は、早期脊椎動物発生および形態形成に関与する極めて重要な遺伝子である。ＣＨＤ８を欠くマウスは、胚発生の間に死亡する。ＣＨＤ８遺伝子の突然変異は、ヒトにおける自閉症スペクトラム障害に関連している。この関連は、Ｎａｔｕｒｅに同時に公開された３つの異なる論文においてなされた。同一の３つの研究は、自閉症スペクトラム障害に関連する大量の遺伝子を同定した。本出願人らの目的は、全ての論文に見出された４つの遺伝子Ｃｈｄ８、Ｋａｔｎａｌ２、Ｋｃｔｄ１３、およびＳｃｎ２ａについてのノックアウトマウスを創成することであった。さらに、本出願人らは、自閉症スペクトラム障害、統合失調症、およびＡＤＨＤに関連する２つの他の遺伝子ＧＩＴ１、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、およびＣＡＣＮＢ２を選択した。最後に、陽性対照として本出願人らは、ＭｅＣＰ２をターゲティングすることを決定した。
それぞれの遺伝子について、本出願人らは、遺伝子をノックアウトする可能性が高い３つのｇＲＮＡを設計した。ノックアウトは、ｈＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼが二本鎖切断、およびエラープローンＤＮＡ修復経路、非相同末端結合を作製し、切断を補正し、突然変異を創成した後に生じる。最も可能性が高い結果は、遺伝子をノックアウトするフレームシフト突然変異である。ターゲティング方針は、ＰＡＭ配列ＮＧＧを有し、ゲノム中でユニークな遺伝子のエキソン中のプロトスペーサーを見出すことを含んだ。遺伝子に最も有害である第１のエキソン中のプロトスペーサーを優先した。
それぞれのｇＲＮＡは、マウス細胞系Ｎｅｕｒｏ−Ｎ２ａ中でｈＳｐＣａｓ９とのリポソーム一過的同時形質移入により検証した。形質移入から７２時間後、ＥｐｉｃｅｎｔｒｅからのＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡを使用してゲノムＤＮＡを精製した。ＰＣＲを実施して目的遺伝子座を増幅した。続いて、ＴｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓからのＳＵＲＶＥＹＯＲ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いた。それぞれのｇＲＮＡについてのＳＵＲＶＥＹＯＲ結果およびそれぞれの対照を図Ａ１に示す。陽性ＳＵＲＶＥＹＯＲ結果は、ゲノムＰＣＲに対応する１つの大きいバンドであり、突然変異の部位における二本鎖切断を作製するＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼの産物である２つのより小さいバンドである。それぞれのｇＲＮＡの平均切断効率も、それぞれのｇＲＮＡについて測定した。インジェクションのために選択されたｇＲＮＡは、ゲノム内の最もユニークな最大効率のｇＲＮＡであった。
ＲＮＡ（ｈＳｐＣａｓ９＋ｇＲＮＡ ＲＮＡ）を接合子の前核中にインジェクトし、その後に代理母に移植した。代理母を妊娠満期にさせ、出産１０日後に仔をテールスニップ（ｔａｉｌ ｓｎｉｐ）によりサンプリングした。ＤＮＡを抽出し、ＰＣＲのためのテンプレートとして使用し、次いでそれをＳＵＲＶＥＹＯＲにより処理した。さらに、ＰＣＲ産物をシーケンシングのために送った。ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイまたはＰＣＲシーケンシングのいずれかにおいて陽性として検出された動物は、ｐＵＣ１９ベクター中にクローニングされ、シーケンシングされてそれぞれのアレルからの推定突然変異を決定されたそれらのゲノムＰＣＲ産物を有する。
これまで、Ｃｈｄ８ターゲティング実験からの仔マウスは、アレルシーケンシングの時点まで完全に処理されている。３８匹の生存仔（レーン１〜３８）、１匹の死亡仔（レーン３９）および比較用の１匹の野生型の仔（レーン４０）についてのＳｕｒｖｅｙｏｒ結果を図Ａ２に示す。仔１〜１９にｇＲＮＡ Ｃｈｄ８．２をインジェクトし、仔２０〜３８にｇＲＮＡ Ｃｈｄ８．３をインジェクトした。３８匹の生存仔のうち、１３匹は突然変異について陽性であった。１匹の死亡仔も突然変異を有した。野生型試料において突然変異は検出されなかった。ゲノムＰＣＲシーケンシングは、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの知見と一致した。
実施例１３：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介転写モジュレーション
図６７は、転写活性化活性を有するＣＲＩＳＰＲ−ＴＦ（転写因子）の設計を示す。キメラＲＮＡをＵ６プロモーターにより発現させる一方、３つのＮＬＳおよびＶＰ６４機能ドメインに作動可能に結合しているＣａｓ９タンパク質のヒトコドン最適化二重突然変異体バージョン（ｈＳｐＣａｓ９ｍ）をＥＦ１ａプロモーターにより発現させる。二重突然変異Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａにより、ｃａｓ９タンパク質がいかなる開裂も導入し得なくなるが、キメラＲＮＡによりガイドされた場合に標的ＤＮＡに結合するその能力は維持された。
図６８は、ＣＲＩＳＰＲ−ＴＦ系（キメラＲＮＡおよびＣａｓ９−ＮＬＳ−ＶＰ６４融合タンパク質）によるヒトＳＯＸ２遺伝子の転写活性化を示す。２９３ＦＴ細胞を２つの成分を担持するプラスミドにより形質移入した：（１）ヒトＳＯＸ２ゲノム遺伝子座内またはその周囲の２０ｂｐ配列をターゲティングするＵ６によりドライブされる異なるキメラＲＮＡ、および（２）ＥＦ１ａによりドライブされるｈＳｐＣａｓ９ｍ（二重突然変異体）−ＮＬＳ−ＶＰ６４融合タンパク質。形質移入から９６時間後、２９３ＦＴ細胞を回収し、ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用してｍＲＮＡ発現の導入により活性化のレベルを計測する。全ての発現レベルを、キメラＲＮＡを有さないＣＲＩＳＰＲ−ＴＦ骨格プラスミドにより形質移入された細胞からの結果を表す対照群（灰色バー）に対して正規化する。ＳＯＸ２ｍＲＮＡを検出するために使用されるｑＲＴ−ＰＣＲプローブは、Ｔａｑｍａｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。全ての実験は、３つの生物学的複製物からのデータを表し、ｎ＝３であり、エラーバーは標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）を示す。
実施例１４：ＮＬＳ：Ｃａｓ９ＮＬＳ
２９３ＦＴ細胞を、２つの成分を含有するプラスミドにより形質移入した：（１）異なるＮＬＳ設計を有するＣａｓ９（野生型ヒトコドン最適化ＳｐＣａｓ９）の発現をドライブするＥＦ１ａプロモーター（２）ヒトＥＭＸ１遺伝子座をターゲティングする同一キメラＲＮＡをドライブするＵ６プロモーター。
細胞を形質移入後７２時間の時点において回収し、次いで５０μｌのＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔゲノムＤＮＡ抽出溶液により製造業者のプロトコルに従って抽出した。標的ＥＭＸ１ゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅し、次いで１％のアガロースゲルによりゲル精製した。ゲノムＰＣＲ産物をリアニーリングし、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイに製造業者のプロトコルに従って供した。異なる構築物のゲノム開裂効率を４〜１２％のＴＢＥ−ＰＡＧＥゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上のＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して計測し、ＩｍａｇｅＬａｂ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）ソフトウェアにより分析および定量し、全て製造業者のプロトコルに従った。
図６９は、異なるＣａｓ９ＮＬＳ構築物の設計を示す。全てのＣａｓ９は、ＳｐＣａｓ９のヒトコドン最適化バージョンであった。ＮＬＳ配列をｃａｓ９遺伝子にＮ末端またはＣ末端のいずれかにおいて結合させた。異なるＮＬＳ設計を有する全てのＣａｓ９バリアントを、それがＥＦ１ａプロモーターによりドライブされるように含有する骨格ベクター中にクローニングした。同一ベクター上に、Ｕ６プロモーターによりドライブされるヒトＥＭＸ１遺伝子座をターゲティングするキメラＲＮＡが存在し、２成分系を一緒に形成する。
表Ｍ．Ｃａｓ９ ＮＬＳ設計試験結果。ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイによる異なるｃａｓ９−ｎｌｓ構築物のゲノム開裂の定量。
Figure 2016505256
図７０は、異なるＮＬＳ設計を担持するＣａｓ９バリアントにより誘導されたゲノム開裂の効率を示す。割合は、それぞれの構築物により開裂されたヒトＥＭＸ１ゲノムＤＮＡの一部を示す。全ての実験は、３つの生物学的複製物からのデータを表し、ｎ＝３であり、エラーバーは標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を示す。
実施例１５：Ｃａｓ９を使用する微細藻類のエンジニアリング
Ｃａｓ９を送達する方法
方法１：本出願人らは、構成的プロモーター、例えば、Ｈｓｐ７０Ａ−Ｒｂｃ Ｓ２またはベータ２−チューブリンの制御下でＣａｓ９を発現するベクターを使用してＣａｓ９およびガイドＲＮＡを送達する。
方法２：本出願人らは、構成的プロモーター、例えば、Ｈｓｐ７０Ａ−Ｒｂｃ Ｓ２またはベータ２−チューブリンの制御下でＣａｓ９およびＴ７ポリメラーゼを発現するベクターを使用してＣａｓ９およびＴ７ポリメラーゼを送達する。ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡをドライブするＴ７プロモーターを含有するベクターを使用して送達する。
方法３：本出願人らは、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびインビトロで転写されたガイドＲＮＡを藻類細胞に送達する。ＲＮＡは、インビトロで転写させることができる。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、Ｃａｓ９についてのコード領域およびＣａｓ９ｍＲＮＡの安定化を確保するためのＣｏｐ１からの３’ＵＴＲからなる。
相同組換えのため、本出願人らは、追加の相同組換え修復テンプレートを提供する。
ベータ−２チューブリンプロモーターの制御下でＣａｓ９の発現をドライブするカセットと、それに続くＣｏｐ１の３’ＵＴＲについての配列。
Figure 2016505256
Figure 2016505256
Figure 2016505256
Figure 2016505256
ベータ−２チューブリンプロモーターの制御下でＴ７ポリメラーゼの発現をドライブするカセットと、それに続くＣｏｐ１の３’ＵＴＲについての配列：
Figure 2016505256
Figure 2016505256
Ｔ７プロモーターによりドライブされるガイドＲＮＡの配列（Ｔ７プロモーター、Ｎは、ターゲティング配列を表す）：
Figure 2016505256
遺伝子送達：
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒからのコナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）株ＣＣ−１２４およびＣＣ−１２５を、エレクトロポレーションに使用する。エレクトロポレーションプロトコルは、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇキットからの標準的な推奨プロトコルに従う。
また、本出願人らは、Ｃａｓ９を構成的に発現するコナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）の系統を生成する。このことは、ｐＣｈｌａｍｙ１（ＰｖｕＩを使用して線形化）を使用し、ハイグロマイシン耐性コロニーを選択することにより行うことができる。Ｃａｓ９を含有するｐＣｈｌａｍｙ１についての配列を以下に示す。遺伝子ノックアウトを達成するためのこの手法において、ガイドＲＮＡのためのＲＮＡを送達することが必要なだけである。相同組換えのため、本出願人らは、ガイドＲＮＡおよび線形化相同組換えテンプレートを送達する。
ｐＣｈｌａｍｙ１−Ｃａｓ９：
Figure 2016505256
Figure 2016505256
Figure 2016505256
Figure 2016505256
Figure 2016505256
Figure 2016505256
全ての改変コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）細胞について、本出願人らは、ＰＣＲ、ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイ、およびＤＮＡシーケンシングを使用して良好な改変を確認した。
実施例１６：細菌中の転写リプレッサーとしてのＣａｓ９の使用
転写を人工的に制御する技能は、遺伝子機能の研究および所望の特性を有する合成遺伝子ネットワークの構築の両方に不可欠である。本出願人らは、本明細書において、プログラマブル転写リプレッサーとしてのＲＮＡによりガイドされるＣａｓ９タンパク質の使用を記載する。
本出願人らは、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０のＣａｓ９タンパク質をいかに使用して肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）中のゲノム編集を指向することができるかを既に実証している。この研究において、本出願人らは、ｃａｓ９、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびリピートからなる最小のＣＲＩＳＰＲ系を含有するｃｒＲ６Ｒｋ株をエンジニアリングした。Ｄ１０Ａ−Ｈ８４０突然変異をこの株中のｃａｓ９中に導入し、株ｃｒＲ６Ｒｋ＊＊を得た。ｂｇａＡβ−ガラクトシダーゼ遺伝子プロモーターの異なる位置をターゲティングする４つのスペーサーを、既に記載されたｐＤＢ９８プラスミドにより担持されるＣＲＩＳＰＲアレイ中でクローニングした。本出願人らは、ターゲティングされる位置に応じてβ−ガラクトシダーゼ活性のＸからＹ倍の低減を観察し、このことは、プログラマブルリプレッサーとしてのＣａｓ９の潜在性を実証した（図７３）。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中のＣａｓ９＊＊抑制を達成するため、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポータープラスミド（ｐＤＢ１２７）を構築して構成的プロモーターからｇｆｐｍｕｔ２遺伝子を発現させた。プロモーターは、両方の鎖上のいくつかのＮＰＰ ＰＡＭを担持するように設計して種々の位置におけるＣａｓ９＊＊結合の効果を計測した。本出願人らは、Ｄ１０Ａ−Ｈ８４０突然変異を、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃａｓ９および新たなスペーサーの容易なクローニングのために設計された最小のＣＲＩＳＰＲアレイを担持する記載のプラスミドのｐＣａｓ９中に導入した。２２個の異なるスペーサーを、ｇｆｐｍｕｔ２プロモーターおよびオープンリーディングフレームの異なる領域をターゲティングするよう設計した。−３５および−１０プロモーターエレメントならびにシャインダルガノ配列に重複または隣接する領域のターゲティング時に蛍光の約２０倍の低減が観察された。両方の鎖上の標的は、類似の抑制レベルを示した。これらの結果は、プロモーター領域の任意の位置へのＣａｓ９＊＊の結合が、推定上ＲＮＡＰ結合の立体阻害を通して転写開始を妨害することを示唆する。
Ｃａｓ９＊＊が転写伸長を妨害し得るか否かを決定するため、本出願人らは、それをｇｐｆｍｕｔ２のリーディングフレームに指向した。ターゲティングされたコードおよび非コード鎖の両方の場合に蛍光の低減が観察され、このことは、Ｃａｓ９結合が作動するＲＮＡＰに対する障害を表すほど実際に強力であることを示唆した。しかしながら、コード鎖をターゲティングした場合には発現の４０％の低減が観察された一方、非コード鎖の場合には２０倍の低減が観察された（図２１ｂ、Ｔ９、Ｔ１０およびＴ１１とＢ９、Ｂ１０およびＢ１１とを比較）。転写に対するＣａｓ９＊＊結合の効果を直接決定するため、本出願人らは、Ｔ５、Ｔ１０、Ｂ１０またはｐＤＢ１２７をターゲティングしない対照構築物のいずれかを担持する株からＲＮＡを抽出し、それを、Ｂ１０およびＴ１０標的部位の前（Ｂ４７７）または後（Ｂ５１０）に結合するプローブのいずれかを使用するノザンブロット分析に供した。本出願人らの蛍光法と一致して、Ｃａｓ９＊＊をプロモーター領域（Ｔ５標的）に指向した場合にｇｆｐｍｕｔ２転写は検出されず、Ｔ１０領域のターゲティング後に転写が観察された。興味深いことに、Ｂ４７７プローブについてより小さい転写物が観察された。このバンドは、Ｃａｓ９＊＊により中断される転写物の予測サイズに対応し、コード鎖へのｄｇＲＮＡ：：Ｃａｓ９＊＊結合により引き起こされる転写終結の直接的な指標である。驚くべきことに、本出願人らは、非コード鎖をターゲティングした場合（Ｂ１０）に転写物を検出しなかった。Ｂ１０領域へのＣａｓ９＊＊結合が転写開始を干渉する可能性が低いため、この結果は、ｍＲＮＡが分解されたことを示唆する。ＤｇＲＮＡ：：Ｃａｓ９は、インビトロでｓｓＲＮＡに結合することが示された。本出願人らは、結合が宿主ヌクレアーゼによるｍＲＮＡの分解をトリガーし得ることを推測する。実際、リボソーム停滞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の翻訳されるｍＲＮＡに対する開裂を誘導し得る。
一部の用途は、遺伝子発現の完全な抑制よりも遺伝子発現の正確な調整を要求する。本出願人らは、ｃｒＲＮＡ／標的相互作用を弱めるミスマッチの導入を通して中間的な抑制レベルを達成することを求めた。本出願人らは、ｃｒＲＮＡの５’末端中の突然変異の増加数を有するＢ１、Ｔ５およびＢ１０構築物に基づき一連のスペーサーを創成した。Ｂ１およびＴ５中の最大８つの突然変異が抑制レベルに影響せず、蛍光の漸増が追加の突然変異について観察された。
ｃｒＲＮＡとその標的との間の８ｎｔマッチについてのみ観察された抑制により、転写調節因子としてのＣａｓ９＊＊の使用のオフターゲティング効果の問題が生じる。良好なＰＡＭ（ＮＧＧ）もＣａｓ９結合に要求されるため、同一レベルの呼吸を得るためにマッチするヌクレオチドの数は１０である。１０ｎｔマッチは、約１Ｍｂｐごとに１回ランダムに生じ、したがってそのような部位は小さい細菌ゲノム中でも見出される可能性が高い。しかしながら、転写を有効に抑制するため、そのような部位は遺伝子のプロモーター領域中に存在することが必要であり、これによりオフターゲティングの可能性がかなり低くなる。本出願人らは、遺伝子の非コード鎖がターゲティングされる場合に遺伝子発現が影響され得ることも示した。これを起こすため、ランダム標的は右方向で存在しなければならないが、そのようなイベントは起こる可能性が比較的高い。実際のところ、本試験の過程の間、本出願人らは、ｐＣａｓ９＊＊上で設計されたスペーサーの１つを構築することができなかった。本出願人らは後に、このスペーサーが不可欠なｍｕｒＣ遺伝子中の良好なＰＡＭに隣接する１２ｂｐマッチを示すことを見出した。このようなオフターゲティングは、設計されるスペーサーの体系的なｂｌａｓｔにより容易に回避することができる。
本発明の態様を、以下の番号付与された段落にさらに記載する：
１．１つ以上のベクターを含むベクター系であって、
ａ．ｔｒａｅｒメイト配列およびガイド配列をｔｒａｅｒメイト配列の上流に挿入するための１つ以上の挿入部位に作動可能に結合している第１の調節エレメント（ガイド配列は、発現された場合、真核細胞中の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｅｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｅｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む）；ならびに
ｂ．核局在化配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメント
を含み；
成分（ａ）および（ｂ）は、系の同一または異なるベクター上にある
ベクター系。
２．成分（ａ）が、第１の調節エレメントの制御下でｔｒａｅｒメイト配列の下流のｔｒａｅｒ配列をさらに含む、段落１に記載のベクター系。
３．成分（ａ）が、第１の調節エレメントに作動可能に結合している２つ以上のガイド配列をさらに含み、２つ以上のガイド配列のそれぞれは、発現された場合、真核細胞中の異なる標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する、段落１に記載のベクター系。
４．第３の調節エレメントの制御下でｔｒａｅｒ配列を含む、段落１に記載のベクター系。
５．ｔｒａｅｒ配列が、最適にアラインされた場合にｔｒａｅｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％の配列相補性を示す、段落１に記載のベクター系。
６．ＣＲＩＳＰＲ酵素が、真核細胞の核中の検出可能な量の前記ＣＲＩＳＰＲ酵素の蓄積をドライブするために十分な強度の１つ以上の核局在化配列を含む、段落１に記載のベクター系。
７．ＣＲＩＳＰＲ酵素が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である、段落１に記載のベクター系。
８．ＣＲＩＳＰＲ酵素が、Ｃａｓ９酵素である、段落１に記載のベクター系。
９．ＣＲＩＳＰＲ酵素が、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている、段落１に記載のベクター系。
１０．ＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列の局在における１つまたは２つの鎖の開裂を指向する、段落１に記載のベクター系。
１１．ＣＲＩＳＰＲ酵素が、ＤＮＡ鎖開裂活性を欠く、段落１に記載のベクター系。
１２．第１の調節エレメントが、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである、段落１に記載のベクター系。
１３．第２の調節エレメントが、ポリメラーゼＩＩプロモーターである、段落１に記載のベクター系。
１４．第３の調節エレメントが、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである、段落４に記載のベクター系。
１５．ガイド配列が、少なくとも１５ヌクレオチド長である、段落１に記載のベクター系。
１６．ガイド配列のヌクレオチドの５０％未満が、最適にフォールディングされた場合に自己相補的塩基対形成に関与する、段落１に記載のベクター系。
１７．１つ以上の核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している調節エレメントを含むベクターであって、前記調節エレメントは、真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ酵素の転写を、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が真核細胞の核中で検出可能な量で蓄積するようにドライブするベクター。
１８．前記調節エレメントが、ポリメラーゼＩＩプロモーターである、段落１７に記載のベクター系。
１９．前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である、段落１７に記載のベクター系。
２０．前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、Ｃａｓ９酵素である、段落１７に記載のベクター系。
２１．前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、それが結合する標的配列の１つ以上の鎖を開裂する能力を欠く、段落１７に記載のベクター系。
２２．真核細胞の核中の検出可能な量のＣＲＩＳＰＲ酵素の蓄積をドライブするために十分な強度の１つ以上の核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素。
２３．ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である、段落２２に記載のＣＲＩＳＰＲ酵素。
２４．Ｃａｓ９酵素である、段落２２に記載のＣＲＩＳＰＲ酵素。
２５．結合する標的配列の１つ以上の鎖を開裂する能力を欠く、段落２２に記載のＣＲＩＳＰＲ酵素。
２６．ａ．ｔｒａｅｒメイト配列およびガイド配列をｔｒａｅｒメイト配列の上流に挿入するための１つ以上の挿入部位に作動可能に結合している第１の調節エレメント（ガイド配列は、発現された場合、真核細胞中の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｅｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｅｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む）；ならびに／または
ｂ．核局在化配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメント
を含む真核宿主細胞。
２７．成分（ａ）および（ｂ）を含む、段落２６に記載の真核宿主細胞。
２８．成分（ａ）、成分（ｂ）、または成分（ａ）および（ｂ）が、宿主真核細胞のゲノム中に安定的にインテグレートされている、段落２６に記載の真核宿主細胞。
２９．成分（ａ）が、第１の調節エレメントの制御下でｔｒａｅｒメイト配列の下流のｔｒａｅｒ配列をさらに含む、段落２６に記載の真核宿主細胞。
３０．成分（ａ）が、第１の調節エレメントに作動可能に結合している２つ以上のガイド配列をさらに含み、２つ以上のガイド配列のそれぞれは、発現された場合、真核細胞中の異なる標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する、段落２６に記載の真核宿主細胞。
３１．前記ｔｒａｅｒ配列に作動可能に結合している第３の調節エレメントをさらに含む、段落２６に記載の真核宿主細胞。
３２．ｔｒａｅｒ配列が、最適にアラインされた場合にｔｒａｅｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％の配列相補性を示す、段落２６に記載の真核宿主細胞。
３３．ＣＲＩＳＰＲ酵素が、真核細胞の核中の検出可能な量の前記ＣＲＩＳＰＲ酵素の蓄積をドライブするために十分な強度の１つ以上の核局在化配列を含む、段落２６に記載の真核宿主細胞。
３４．ＣＲＩＳＰＲ酵素が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である、段落２６に記載の真核宿主細胞。
３５．ＣＲＩＳＰＲ酵素が、Ｃａｓ９酵素である、段落２６に記載の真核宿主細胞。
３６．ＣＲＩＳＰＲ酵素が、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている、段落２６に記載の真核宿主細胞。
３７．ＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列の局在における１つまたは２つの鎖の開裂を指向する、段落２６に記載の真核宿主細胞。
３８．ＣＲＩＳＰＲ酵素が、ＤＮＡ鎖開裂活性を欠く、段落２６に記載の真核宿主細胞。
３９．第１の調節エレメントが、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである、段落２６に記載の真核宿主細胞。
４０．第２の調節エレメントが、ポリメラーゼＩＩプロモーターである、段落２６に記載の真核宿主細胞。
４１．第３の調節エレメントが、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである、段落３１に記載の真核宿主細胞。
４２．ガイド配列が、少なくとも１５ヌクレオチド長である、段落２６に記載の真核宿主細胞。
４３．ガイド配列のヌクレオチドの５０％未満が、最適にフォールディングされた場合に自己相補的塩基対形成に関与する、段落２６に記載の真核宿主細胞。
４４．段落２６〜４３のいずれか１つに記載の真核宿主細胞を含む非ヒト動物。
４５．ベクター系およびキットの使用指示書を含むキットであって、ベクター系は、
ａ．ｔｒａｅｒメイト配列およびガイド配列をｔｒａｅｒメイト配列の上流に挿入するための１つ以上の挿入部位に作動可能に結合している第１の調節エレメント（ガイド配列は、発現された場合、真核細胞中の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｅｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｅｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む）；ならびに／または
ｂ．核局在化配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメント
を含むキット。
４６．系の同一または異なるベクター上にある成分（ａ）および（ｂ）を含む、段落４５に記載のキット。
４７．成分（ａ）が、第１の調節エレメントの制御下でｔｒａｅｒメイト配列の下流のｔｒａｅｒ配列をさらに含む、段落４５に記載のキット。
４８．成分（ａ）が、第１の調節エレメントに作動可能に結合している２つ以上のガイド配列をさらに含み、２つ以上のガイド配列のそれぞれは、発現された場合、真核細胞中の異なる標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する、段落４５に記載のキット。
４９．系が、第３の調節エレメントの制御下でｔｒａｅｒ配列を含む、段落４５に記載のキット。
５０．ｔｒａｅｒ配列が、最適にアラインされた場合にｔｒａｅｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％の配列相補性を示す、段落４５に記載のキット。
５１．ＣＲＩＳＰＲ酵素が、真核細胞の核中の検出可能な量の前記ＣＲＩＳＰＲ酵素の蓄積をドライブするために十分な強度の１つ以上の核局在化配列を含む、段落４５に記載のキット。
５２．ＣＲＩＳＰＲ酵素が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である、段落４５に記載のキット。
５３．ＣＲＩＳＰＲ酵素が、Ｃａｓ９酵素である、段落４５に記載のキット。
５４．ＣＲＩＳＰＲ酵素が、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている、段落４５に記載のキット。
５５．ＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列の局在における１つまたは２つの鎖の開裂を指向する、段落４５に記載のキット。
５６．ＣＲＩＳＰＲ酵素が、ＤＮＡ鎖開裂活性を欠く、段落４５に記載のキット。
５７．第１の調節エレメントが、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである、段落４５に記載のキット。
５８．第２の調節エレメントが、ポリメラーゼＩＩプロモーターである、段落４５に記載のキット。
５９．第３の調節エレメントが、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである、段落４９に記載のキット。
６０．ガイド配列が、少なくとも１５ヌクレオチド長である、段落４５に記載のキット。
６１．ガイド配列のヌクレオチドの５０％未満が、最適にフォールディングされた場合に自己相補的塩基対形成に関与する、段落４５に記載のキット。
６２．ＣＲＩＳＰＲ複合体によるターゲティングのための真核細胞中の核酸配列内の候補標的配列を選択するコンピュータシステムであって、
ａ．前記核酸配列を受容および／または保存するように構成された記憶装置；および
ｂ．（ｉ）前記核酸配列内のＣＲＩＳＰＲモチーフ配列を局在化し、（ｉｉ）前記局在化されたＣＲＩＳＰＲモチーフ配列に隣接する配列を、ＣＲＩＳＰＲ複合体が結合する候補標的配列として選択するようにプログラミングされた単独または組合せにおける１つ以上のプロセッサ
を含むシステム。
６３．前記局在化ステップが、前記標的配列から約５００ヌクレオチド未満離れて局在しているＣＲＩＳＰＲモチーフ配列を同定することを含む、段落６２に記載のコンピュータシステム。
６４．候補標的配列が、少なくとも１０ヌクレオチド長である、段落６２に記載のコンピュータシステム。
６５．候補標的配列の３’末端におけるヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲモチーフ配列の上流の約１０ヌクレオチド以下に局在している、段落６２に記載のコンピュータシステム。
６６．真核細胞中の核酸配列が、真核ゲノムに対して内因性である、段落６２に記載のコンピュータシステム。
６７．真核細胞中の核酸配列が、真核ゲノムに対して外因性である、請求項６２に記載のコンピュータシステム。
６８．１つ以上のプロセッサによる実行時、ＣＲＩＳＰＲ複合体によるターゲティングのための真核細胞中の核酸配列内の候補標的配列を選択する方法を実装するコードを含むコンピュータ可読媒体であって、前記方法が、（ａ）前記核酸配列内のＣＲＩＳＰＲモチーフ配列を局在化し、（ｂ）前記局在化されたＣＲＩＳＰＲモチーフ配列に隣接する配列をＣＲＩＳＰＲ複合体が結合する候補標的配列として選択することを含むコンピュータ可読媒体。
６９．前記局在化ステップが、前記標的配列から約５００ヌクレオチド未満離れているＣＲＩＳＰＲモチーフ配列を局在化することを含む、段落６８に記載のコンピュータ可読媒体。
７０．前記候補標的配列が、少なくとも１０ヌクレオチド長である、段落６８に記載のコンピュータ可読媒体。
７１．候補標的配列の３’末端におけるヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲモチーフ配列の上流の約１０ヌクレオチド以下に局在している、段落６８に記載のコンピュータ可読媒体。
７２．真核細胞中の核酸配列が、真核ゲノムに対して内因性である、段落６８に記載のコンピュータ可読媒体。
７３．真核細胞中の核酸配列が、真核ゲノムに対して外因性である、段落６８に記載のコンピュータ可読媒体。
７４．真核生物中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法であって、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記標的ポリヌクレオチドの開裂を生じさせ、それにより標的ポリヌクレオチドを改変することを含み、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、次いでｔｒａｅｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｅｒメイト配列に結合している方法。
７５．前記開裂は、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素により標的配列の局在における１つまたは２つの鎖を開裂することを含む、段落７４に記載の方法。
７６．前記開裂が、標的遺伝子の転写の減少をもたらす、段落７４に記載の方法。
７７．外因性テンプレートポリヌクレオチドとの相同組換えにより前記開裂標的ポリヌクレオチドを修復することをさらに含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む突然変異をもたらす、段落７４に記載の方法。
７８．前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子から発現されるタンパク質中の１つ以上のアミノ酸変化をもたらす、段落７７に記載の方法。
７９．１つ以上のベクターを前記真核細胞に送達することをさらに含み、１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｅｒメイト配列に結合しているガイド配列、およびｔｒａｅｒ配列の１つ以上の発現をドライブする、段落７４に記載の方法。
８０．前記ベクターを対象中の真核細胞中に送達する、段落７９に記載の方法。
８１．前記改変を、細胞培養物中の前記真核細胞中で行う、段落７４に記載の方法。
８２．前記改変前に前記真核細胞を対象から単離することをさらに含む、段落７４に記載の方法。
８３．前記真核細胞および／またはそれに由来する細胞を前記対象に戻すことをさらに含む、段落８２に記載の方法。
８４．真核細胞中のポリヌクレオチドの発現を改変する方法であって、ＣＲＩＳＰＲ複合体をポリヌクレオチドに結合させ、その結果、前記結合が前記ポリヌクレオチドの発現の増加または減少をもたらすことを含み；ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、次いでｔｒａｅｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｅｒメイト配列に結合している方法。
８５．１つ以上のベクターを前記真核細胞に送達することをさらに含み、１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｅｒメイト配列に結合しているガイド配列、およびｔｒａｅｒ配列の１つ以上の発現をドライブする、段落７４に記載の方法。
８６．突然変異疾患遺伝子を含むモデル真核細胞を生成する方法であって、
ａ．１つ以上のベクターを真核細胞に導入すること（１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｅｒメイト配列に結合しているガイド配列、およびｔｒａｅｒ配列の１つ以上の発現をドライブする）；および
ｂ．ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記疾患遺伝子内の標的ポリヌクレオチドの開裂を生じさせ（ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｅｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｅｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む）、それにより、突然変異疾患遺伝子を含むモデル真核細胞を生成することを含む方法。
８７．前記開裂が、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素により標的配列の局在における１つまたは２つの鎖を開裂することを含む、段落８６に記載の方法。
８８．前記開裂が、標的遺伝子の転写の減少をもたらす、段落８６に記載の方法。
８９．外因性テンプレートポリヌクレオチドとの相同組換えにより前記開裂標的ポリヌクレオチドを修復することをさらに含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む突然変異をもたらす、段落８６に記載の方法。
９０．前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子から発現されるタンパク質中の１つ以上のアミノ酸変化をもたらす、段落８９に記載の方法。
９１．疾患遺伝子に関連する細胞シグナリングイベントをモジュレートする生物活性剤を開発する方法であって、
ａ．試験化合物を、段落８６〜９０のいずれか１つに記載のモデル細胞と接触させること；および
ｂ．前記疾患遺伝子中の前記突然変異に関連する細胞シグナリングイベントの低減または増大を示すリードアウトの変化を検出し、それにより、前記疾患遺伝子に関連する前記細胞シグナリングイベントをモジュレートする前記生物活性剤を開発することを含む方法。
９２．ｔｒａｅｒメイト配列の上流のガイド配列を含む組換えポリヌクレオチドであって、ガイド配列は、発現された場合、真核細胞中に存在する対応する標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する組換えポリヌクレオチド。
９３．標的配列が、真核細胞中に存在するウイルス配列である、段落８９に記載の組換えポリヌクレオチド。
９４．標的配列が、原癌遺伝子または癌遺伝子である、段落８９に記載の組換えポリヌクレオチド。
本発明の好ましい実施形態を本明細書において示し、記載したが、そのような実施形態が例として提供されるにすぎないことは当業者に明らかである。当業者は目下、多数のバリエーション、変更、および置換を本発明から逸脱せずに行う。本明細書に記載の本発明の実施形態の種々の代替例を本発明の実施において用いることができることを理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、それらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物は、特許請求の範囲により包含されるものとする。
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４２．Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ：ＳＯＥｉｎｇ Ｔｏｇｅｔｈｅｒ Ｔａｉｌｏｒ−Ｍａｄｅ Ｇｅｎｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５，２５１−２６１（１９９３）．
４３．Ｐｏｄｂｉｅｌｓｋｉ，Ａ．，Ｓｐｅｌｌｅｒｂｅｒｇ，Ｂ．，Ｗｏｉｓｃｈｎｉｋ，Ｍ．，Ｐｏｈｌ，Ｂ．＆Ｌｕｔｔｉｃｋｅｎ，Ｒ．Ｎｏｖｅｌ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｇｒｏｕｐ Ａ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（ＧＡＳ）．Ｇｅｎｅ １７７，１３７−１４７（１９９６）．
４４．Ｈｕｓｍａｎｎ，Ｌ．Ｋ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｒ．，Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｇ．＆Ｓｔｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｐ ｐｒｏｔｅｉｎ，ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ，ｉｓ ｎｏｔ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６３，３４５−３４８（１９９５）．
４５．Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｐ ｔｏ ｓｅｖｅｒａｌ ｈｕｎｄｒｅｄ ｋｉｌｏｂａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６，３４３−３４５（２００９）．

Claims (34)

  1. 天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物であって、
    Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列に作動可能に結合している第１の調節エレメントであって、前記ポリヌクレオチド配列は、
    （ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、
    （ｂ）ｔｒａｃｒメイト配列、および
    （ｃ）ｔｒａｃｒ配列
    を含む、第１の調節エレメント、および
    ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素の末端に近接する少なくとも１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメント
    を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含み、
    （ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、５’から３’配向で配置されており、
    成分ＩおよびＩＩは、前記系の同一または異なるベクター上にあり、
    前記ｔｒａｃｒメイト配列は、転写された場合、前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、前記ガイド配列は、前記標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、
    前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的配列にハイブリダイズされる前記ガイド配列、および（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされる前記ｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成している前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、
    前記キメラＲＮＡポリヌクレオチド配列は、２つ以上のヘアピンを含む
    天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物。
  2. 複数のｃｈｉＲＮＡポリヌクレオチド配列が使用されて多重化系が提供される、請求項１に記載の組成物。
  3. 多重化ＣＲＩＳＰＲ酵素系であって、
    Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列に作動可能に結合している第１の調節エレメントであって、前記ポリヌクレオチド配列は、
    （ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、
    （ｂ）ｔｒａｃｒメイト配列、および
    （ｃ）ｔｒａｃｒ配列
    を含む、第１の調節エレメント、および
    ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素の末端に近接する少なくとも１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメント
    を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含み、
    （ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、５’から３’配向で配置されており、
    成分ＩおよびＩＩは、前記系の同一または異なるベクター上にあり、
    前記ｔｒａｃｒメイト配列は、転写された場合、前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、前記ガイド配列は、前記標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、
    前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的配列にハイブリダイズされる前記ガイド配列、および（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされる前記ｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成している前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、
    前記ｃｈｉＲＮＡポリヌクレオチド配列は、２つ以上のヘアピンを含み、
    前記多重化系において複数のｃｈｉＲＮＡポリヌクレオチド配列が使用される
    多重化ＣＲＩＳＰＲ酵素系。
  4. 前記第１の調節エレメントが、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物または系。
  5. 前記第２の調節エレメントが、ポリメラーゼＩＩプロモーターである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物または系。
  6. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、真核細胞の核中の検出可能な量の前記ＣＲＩＳＰＲ酵素の蓄積をドライブするために十分な強度の１つ以上のＮＬＳを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物または系。
  7. 前記ｔｒａｃｒ配列が、最適にアラインされた場合に前記ｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％の配列相補性を示す、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物または系。
  8. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物または系。
  9. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、Ｃａｓ９酵素である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物または系。
  10. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物または系。
  11. 前記ガイド配列が、少なくとも１５ヌクレオチド長である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物または系。
  12. 前記キメラＲＮＡポリヌクレオチド配列が、２、３、４または５つのヘアピンを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物または系。
  13. 天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物であって、
    Ｉ．第１の調節エレメントであって、
    （ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、および
    （ｂ）ｔｒａｃｒメイト配列
    に作動可能に結合している第１の調節エレメント、
    ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素の末端に近接する少なくとも１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメント、ならびに
    ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列に作動可能に結合している第３の調節エレメント
    を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含み、
    成分Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩは、前記系の同一または異なるベクター上にあり、
    前記ｔｒａｃｒメイト配列は、転写された場合、前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、前記ガイド配列は、前記標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、
    前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的配列にハイブリダイズされる前記ガイド配列、および（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされる前記ｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成している前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む
    天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物。
  14. 複数のガイド配列および単一ｔｒａｃｒ配列が使用されて多重化系が提供される、請求項１３に記載の組成物。
  15. 多重化ＣＲＩＳＰＲ酵素系であって、
    Ｉ．第１の調節エレメントであって、
    （ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、および
    （ｂ）ｔｒａｃｒメイト配列
    に作動可能に結合している第１の調節エレメント、
    ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素の末端に近接する少なくとも１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメント、ならびに
    ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列に作動可能に結合している第３の調節エレメント
    を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含み、
    成分Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩは、前記系の同一または異なるベクター上にあり、
    前記ｔｒａｃｒメイト配列は、転写された場合、前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、前記ガイド配列は、前記標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、
    前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的配列にハイブリダイズされる前記ガイド配列、および（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされる前記ｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成している前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、
    前記多重化系において複数のガイド配列および単一ｔｒａｃｒ配列が使用される
    多重化ＣＲＩＳＰＲ酵素系。
  16. 前記第１の調節エレメントが、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の組成物または系。
  17. 前記第２の調節エレメントが、ポリメラーゼＩＩプロモーターである、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の組成物または系。
  18. 前記第３の調節エレメントが、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の組成物または系。
  19. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、真核細胞の核中の検出可能な量の前記ＣＲＩＳＰＲ酵素の蓄積をドライブするために十分な強度の１つ以上のＮＬＳを含む、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の組成物または系。
  20. 前記ｔｒａｃｒ配列が、最適にアラインされた場合に前記ｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％の配列相補性を示す、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の組成物または系。
  21. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の組成物または系。
  22. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、Ｃａｓ９酵素である、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の組成物または系。
  23. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている、請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の組成物または系。
  24. 前記ガイド配列が、少なくとも１５ヌクレオチド長である、請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の組成物または系。
  25. 請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組成物または系を含む真核宿主細胞。
  26. 請求項２５に記載の真核宿主細胞を含む生物。
  27. 請求項２５に記載の真核宿主細胞を含む非ヒト生物。
  28. 請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組成物およびキットの使用指示書を含むキット。
  29. 真核細胞中の目的ゲノム遺伝子座の発現を変化させる方法であって、
    前記ゲノム遺伝子座を請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組成物と接触させること、および
    前記ゲノム遺伝子座の発現が変化したか否かを決定すること
    含む方法。
  30. 前記ガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲモチーフ配列の存在に基づき前記標的配列への前記ＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記ＣＲＩＳＰＲモチーフ配列が、ＮＡＧである、請求項３０に記載の方法。
  32. １つ以上の原核細胞中の遺伝子中の１つ以上の突然変異を導入することにより１つ以上の原核細胞を選択する方法であって、
    １つ以上のベクターを前記原核細胞中に導入することであって、前記１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に結合しているガイド配列、ｔｒａｃｒ配列、および編集テンプレートの１つ以上の発現をドライブし；
    前記編集テンプレートは、ＣＲＩＳＰＲ酵素開裂を停止させる前記１つ以上の突然変異を含むこと；
    前記編集テンプレートと、選択すべき前記細胞中の標的ポリヌクレオチドとを相同組換えさせること；
    ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記遺伝子内の前記標的ポリヌクレオチドの開裂を生じさせることであって、前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的ポリヌクレオチド内の前記標的配列にハイブリダイズされる前記ガイド配列、および（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされる前記ｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成している前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、
    前記標的ポリヌクレオチドへの前記ＣＲＩＳＰＲ複合体の結合は、細胞死を誘導し、
    それにより、１つ以上の突然変異が導入された１つ以上の原核細胞の選択を可能とすること
    を含む方法。
  33. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、Ｃａｓ９である、請求項３３に記載の方法。
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