BR112021009913A2 - vetor viral adeno-associado recombinante para inserção gênica - Google Patents

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BR112021009913A2
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Timothy J. Miller
Linas Padegimas
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Abeona Therapeutics, Inc.
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Abstract

VETOR VIRAL ADENO-ASSOCIADO RECOMBINANTE PARA INSERÇÃO GÊNICA. São fornecidos, neste documento, vetores AAV recombinantes, vetores virais AAV e proteínas do capsídeo para terapia gênica aprimorada, e métodos para fabricação e uso dos mesmos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VETOR VIRAL ADENO-ASSOCIADO RECOMBINANTE PARA INSER- ÇÃO GÊNICA".
REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório U.S. nº. 62/775.871, depositado em 5 de dezembro de 2018; 62/ 801.195, depositado em 5 de fevereiro de 2019; 62/863.126 depositado em 18 de junho de 2019 e 62/914.856 depositado em 14 de outubro de 2019, cada um dos quais está incorporado por referência neste documento em sua totalidade para todos os propósitos.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[0002] O conteúdo do arquivo de texto enviado eletronicamente neste documento está incorporado neste documento por referência em sua to- talidade: Uma cópia em formato legível por computador da Listagem de Sequência (nome do arquivo: ABEO 002 04WO SeqList ST25, data de criação: 3 de dezembro de 2019, tamanho do arquivo: 556 kb).
ANTECEDENTES
[0003] Os vetores virais adenoassociados são vetores de distribui- ção promissores para terapia gênica. No entanto, sua eficácia terapêu- tica é minada pela eficiência de distribuição dos vetores ou tropismos teciduais limitados. Portanto, há uma necessidade urgente por novos vetores AAV com um melhor potencial terapêutico.
SUMÁRIO
[0004] A presente invenção refere-se no geral ao campo de terapia gênica e, em particular, às partículas do vetor viral adenoassociado recombinante (AAV) (também conhecidas como vetores virais AAV) com novas proteínas de capsídeo, sua fabricação e seu uso para dis- tribuir transgenes para tratar ou prevenir uma doença ou distúrbio.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0005] FIGURA 1 Estratégia para a construção da biblioteca de capsídeos AIM.
[0006] FIGURA 2A Comparação da eficiência de transdução em cultura de tecido. Células HEK 293 foram plaqueadas em uma placa de 96 poços a 50.000 células por poço. As células foram transduzidas com capsídeos contendo vírus AAV9-GFP ou AAV214-GFP em um MOI de 5E+5. As imagens foram tiradas 45 horas após a transdução.
[0007] FIGURA 2B Comparação da eficiência de transdução em diferentes tecidos de camundongo dosado com genomas virais 2E+11 (vg) de vírus AAV9 ou AAV214.
[0008] FIGURA 2C Comparação da eficiência de transdução e ní- veis de expressão no cérebro de camundongos dosados com 2E+11 vg de vírus AAV9 ou AAV214.
[0009] FIGURA 3A Digitalização por oftalmoscopia a laser de reti- nas de camundongo após administração de AAV. Camundongos C57BL/6J do tipo selvagem receberam administração do sorotipo de AAV marcado pela injeção sub-retiniana (olho direito) e intravítrea (olho esquerdo). 1 uL de vetor AAV a 5E+12 vg/mL (5E+9 vg/olho) foi injetado por ambos os métodos de administração e os animais foram fotografados após 10 dias com um Oftalmoscópio a Laser de Varredu- ra Spectralis HRA2 (Heidelberg Engineering, Carisbad, CA). Imagens em que a catarata impediu observação suficiente foram omitidas da figura.
[0010] FIGURA 3B Análise IHC do olho de camundongo dosado com AAV204-GFP por via intravítrea.
[0011] A FIG. 4 compara a expressão de GFP mediada por transdução de AAV204 ou AAV9 em primatas por RT-GPCR. A |i- nha pontilhada corresponde à base calculada como média de -RT mais 2 ou 4 desvios padrão.
[0012] As FIGS. 5A-5SF mostram expressão ocular mediada por AAV204. A FIG. 5A mostra a disseminação da transdução me-
diada por injeção intravítrea de AAV204, principalmente periférica e algumas foveais. A FIG. 5B mostra (por expressão de GFP) trans- dução de uma variedade de células da retina, incluindo fotorrecep- tores e células RPE em primatas após injeção intravítrea do vírus AAV204. A FIG. 5C mostra transdução de RPE e fotorrecepetor maciça na mácula onde a maioria dos cones (fotorreceptores res- ponsáveis pela visão colorida) foram concentrados. As FIGS. 5D- 5F mostram a expressão de GFP de AAV204 conduzido pelo VMDZ?2 (promotores de degeneração macular viteliforme-2), que é um promotor específico de célula para o RPE. O exame de imagem por SLO foi realizado no Dia 14 (FIG. 5D) e Dia 28 (FIG. 5E) após injeção intravítrea do vetor de genomas virais 2,5 x 10º? (vg). A FIG. 5F mostra a expressão de GFP e núcleos (DAPI) na periferia no Dia 28.
[0013] A FIG. 6 mostra a análise de IHC da transdução de explante do olho de NPH realizada ex vivo.
[0014] FIG. 7 Estratégia de quantificação de anticorpos neutra- lizantes. A ausência de luminescência indicou que o AAV alvo es- tava ligado por anticorpos neutralizantes.
[0015] A FIG. 8 demonstra imunogenicidade diferente de AAV204 e AAVO. A titulação de anticorpo neutralizante foi obtida usando um processo desenvolvido internamente. O AAV9-Luc ou pA-AAV204-Luc foi incubado com várias diluições de soro a um MO! de 25.000. Após a incubação, a mistura de vírus/soro foi trans- ferida para poços contendo 20.000 células Lec2 e incubada com as células por 24 horas, após o qual a luminescência foi medida e comparada a um valor de controle de células transduzidas apenas com vírus no mesmo MOI.
[0016] A FIG. 9 mostra a comparação da transdução pulmonar usando AAV204 ou AAVG6 (marca de referência da transdução pul-
monar de AAV) através de distribuição intratraqueal.
[0017] As FIGS. 10A-10C mostram a funcionalidade de CFETRAR e cassete de expressão de comprimento total por ensaio FLIPR (FIG. 10A) e resposta à dose (FIG. 10B) para tratamento com cassete de expressão de CFTRAR empacotado com AAV204. A FIG. 10C mostra uma comparação de expressão de CFTRAR versus expres- são de CFTR otimizada para códon de comprimento total em rela- ção ao potencial de membrana analisado por FLIPR. 293 células foram transduzidas com AAV204 expressando as proteínas e foram monitoradas quanto a alterações na fluorescência. A avaliação ini- cial foi lida por 1 minuto e, em seguida, forscolina 50uM foi adicio- nada às células.
[0018] As FIGS. 11A-11C mostram a capacidade do AAV204 de transduzir células de pacientes com CF cultivadas (FIGURA 11A), expressão de CFTRAR e localização adequada na membra- na celular (FIGURA 11B) e a expressão de CFTRAR restaura a corrente de CFTR em células de pacientes com CF humana (FI- GURA 11C).
[0019] A FIG. 12A mostra o efeito in vivo da administração de partículas de AAV204 compreendendo modelos de fibrose cística de transgene nasal para camundongo de CFTR. A FIG. 12B mostra o efeito do tratamento com AAV204/CFTRAR (pelo aumento do po- tencial da membrana nasal) em diferentes células de pacientes com CF.
[0020] A FIG. 13 mostra a biodistribuição dos vetores AAV9- CLN3 e AAV214-CLN3 em modelo de camundongos CLN3Aex7/8 dias após a administração intravenosa de partículas virais.
[0021] A FIG. 14 mostra a expressão de vetores AAV9-CLN3 e AAV214-CLN3 em tecidos cerebrais de camundongos CLN3Aex7/8 conforme medido por RT-gPCR.
[0022] A FIG. 15 mostra o imunoblot da expressão de GLA em células HEK293 transduzidas.
[0023] A FIG. 16 mostra as atividades enzimáticas (suprafisio- lógicas) de GLA no plasma, cérebro, fígado, medula espinhal, co- ração, rim e olho em camundongos C57BL/6 após administração de AAV.
[0024] As FIGS. 17 mostram as atividades enzimáticas de GAA no cérebro, bíceps, diafragma e fígado em camundongos C57BL/6 após administração de AAV por injeção intravenosa.
[0025] As FIGS. 18A-18B mostram análise por imunoblot (FIG. 18A) e enzimática (FIG. 18B) de hGAA recombinante expresso em células HEK293 por transfecção.
[0026] As FIGS. 19A-19E mostram as atividades enzimáticas de GAA no plasma (FIG. 19A), cérebro (FIG. 19B), bíceps (FIG. 19C), diafragma (FIG. 19D) ou fígado (FIG. 19E) em camundongos C57BL/6 após administração de AAV. A FIG. 19F mostra níveis de glicogênio em camundongos GAA -/- tratados IV com capsídeo de AAV. Os dados são apresentados como % de glicogênio encontra- do nos camundongos GAA -/-. A diminuição do glicogênio mostra a restauração da funcionalidade de GAA pela expressão mediada por AAV9 e AAV214 da enzima GAA otimizada para códon.
[0027] A FIG. 20 mostra um alinhamento das sequências de aminoácidos VP1 de AAV204 (SEQ ID NO: 2) e AAV6 (SEQ ID NO: 63).
[0028] A FIG. 21 mostra um alinhamento das sequências de aminoácidos da proteína VP1 de AAV214 (SEQ I|D NO: 3); AAV214A (SEQ ID NO: 30), AAV214AB (SEQ ID NO: 84), AAV214e (SEQ ID NO: 31), AAV214e8 (SEQ ID NO: 32), AAV214e9 (SEQ ID NO: 33), AAV214e10 (SEQ ID NO: 34), ITB204 45 (SEQ ID NO: 49), AAV9 (SEQ ID NO: 71) e AAV8 (SEQ
ID NO: 67).
[0029] A FIG. 22 mostra um alinhamento das sequências de aminoácidos da proteína VP2 de AAV214 (SEQ ID NO: 35); AAV214A (SEQ ID NO: 36), AAV214AB (SEQ ID NO: 85), AAV214e (SEQ ID NO: 37), AAV214e8 (SEQ ID NO: 38), AAV214e9 (SEQ ID NO: 39), AAV214e10 (SEQ ID NO: 40), ITB204 45 (SEQ ID NO: 50), AAV9 (SEQ ID NO: 72) e AAV8 (SEQ ID NO: 68).
[0030] A FIG. 23 mostra um alinhamento das sequências de aminoácidos da proteína VP3 de AAV214 (SEQ ID NO: 41); AAV214A (SEQ ID NO: 42), AAV214AB (SEQ ID NO: 86), AAV214e (SEQ ID NO: 43), AAV214e8 (SEQ ID NO: 4), AAV214e9 (SEQ ID NO: 45), AAV214e10 (SEQ ID NO: 46), ITB204 45 (SEQ ID NO: 51), AAV9 (SEQ ID NO: 73) e AAV8 (SEQ ID NO: 69).
[0031] A FIG. 24A mostra a expressão de um transgene de GFP distribuído por uma partícula do vetor AAV110 e uma partícula do vetor AAV9 no músculo após administração intramuscular. O painel superior mostra as pernas esquerda e direita em luz branca mostrando a estrutura geral do tecido. O painel inferior mostra fluo- rescência de GFP.
[0032] A FIG. 24B fornece uma análise quantitativa da fluores- cência obtida na Fig. 24A para a partícula de AAV110 (ITCord1.10) em comparação com AAV9.
[0033] As FIGS. 25A-25C ilustram a expressão, em relação ao AAV9, de um transgene distribuído pela partícula de AAV110 (ITCord1.10) após administração intramuscular. Os dados mostram que a expressão de AAV110 no músculo é particularmente eleva- da.
[0034] A FIG. 26A mostra imuno-histoquímica do tecido muscu-
lar para detectar a expressão de GFP após administração intra- muscular de partículas de AAV110 e AAV9 que expressam GFP. À Figura mostra GFP expresso a partir de partículas do vetor AAV9 (painel inferior esquerdo), GFP expresso a partir de partículas AAV110 (painel inferior direito) e músculo de controle (painel supe- rior). O tecido foi corado com anticorpo anti-GFP.
[0035] FIG.26B.O AAV214 administrado por IM transduz uma área muscular maior do que o AAV9. O músculo de rato inteiro (bíceps fe- moral) foi analisado para expressão de GFP ou mCherry por imuno- histoquímica 10 dias após injeção IM. As seções fixas e congeladas foram sondadas com GFP e mCherry pAb. O AAV214 exibiu uma área de transdução significativamente maior em comparação com o AAV9, que foi amplamente confinado à porção superior do músculo consis- tente com o local da injeção.
[0036] A FIG. 27 mostra uma imagem de bioluminescência mostrando luciferase, expressa como um transgene e exposta à luciferina. Os dados foram obtidos 28 dias após a administração de AAV21A4.
[0037] A FIG. 28 compara a expressão muscular da proteína SMN-1 distribuída por via intravenosa em AAV214 e AAVO9.
[0038] A FIG. 29 mostra a expressão de GFP no coração e no bíceps como um transgene mediado por variantes do AAV214 ver- sus AAV9. O eixo y mostra o valor log10 do número de cópias do vírus por micrograma de DNA genômico.
[0039] A FIG. 30 mostra um diagrama das proteínas do capsí- deo VP1, VP2 e VP3. As porções específicas de VP1 e VP2 são indicadas juntamente com a porção VP3, que é idêntica à proteína VP3 produzida. A sequência de aminoácidos de AAV214 VP3 (SEQ ID NO:41) é mostrada e as regiões variáveis |-IX são indica- das. A sequência completa de aminoácidos da proteína VP1 para
AAV214 é fornecida como SEQ ID NO:3.
[0040] As FIGS. 31A-31C ilustram que animais tratados com AAV214 demonstram geração reduzida de anticorpos neutralizan- tes contra AAV9. A FIG. 31A mostra que os animais dosados por IM com AAV9 ou AAV214 foram testados para anticorpos neutrali- zantes contra AAVO9. A análise foi realizada pela medição da capa- cidade do soro animal em inibir a transdução de um vetor AAVO9.luciferase no tipo de célula permissiva, Lec2. Três dias após a transdução, as células foram analisadas quanto à atividade de luciferase. Cada grupo consistiu em 2 ou 3 ratos para o controle, seja de AAV9 ou AAV214. As FIGS. 31B e 31C mostram reativida- de cruzada com AAV9 e AAV20A4. A FIG. 31B mostra o desenvol- vimento de vários anticorpos neutralizantes de AAV após desafio com AAV9. A FIG. 31C mostra o desenvolvimento de vários anti- corpos neutralizantes de AAV após o desafio com AAV204.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0041] Algumas modalidades de acordo com a presente invenção serão descritas mais detalhadamente a seguir. Os aspectos da inven- ção podem, no entanto, ser incorporados em diferentes formas e não devem ser interpretados como limitados às modalidades estabelecidas neste documento. Em vez disso, essas modalidades são fornecidas de modo que esta invenção seja completa e completa e transmitirá com- pletamente o escopo da invenção aos versados na técnica. A termino- logia usada na descrição neste documento tem o objetivo de descrever apenas modalidades específicas e não se destina a ser limitante.
[0042] Salvo definição em contrário, todos os termos (incluindo termos técnicos e científicos) usados neste documento têm o mesmo significado comumente entendido por aquele versado na técnica ao qual esta invenção pertence. Será entendido ainda que termos, tais como aqueles definidos em dicionários comumente usados, devem ser interpretados como tendo um significado que seja consistente com seu significado no contexto do presente pedido e na técnica relevante e não devem ser interpretados em um sentido idealizado ou excessiva- mente formal, a menos que expressamente definido neste documento.
[0043] A menos que o contexto indique o contrário, pretende-se especificamente que as várias características da invenção descritas neste documento possam ser usadas em qualquer combinação. Além disso, a invenção também contempla que, nas modalidades, qualquer recurso ou combinação de recursos estabelecidos neste documento pode ser excluída ou omitida. Para ilustrar, se o relatório descritivo afirmar que um complexo compreende os componentes A, B e C, pre- tende-se especificamente que qualquer um dentre A, B ou C, ou uma combinação dos mesmos, possa ser omitido e dispensado singular- mente ou em qualquer combinação.
[0044] Salvo indicação em contrário, todas as modalidades, recur- sos e termos especificados pretendem incluir tanto a modalidade, re- curso ou termo citados quanto seus equivalentes biológicos. Incorporação por referência
[0045] Todas as referências, artigos, publicações, patentes, publi- cações de patentes e pedidos de patentes citados neste documento são incorporados por referência em sua totalidade para todos os fins. No entanto, a menção de qualquer referência, artigo, publicação, pa- tente, publicação de patente e pedido de patente citados neste docu- mento não é, e não deve, ser tomada como um reconhecimento ou qualquer forma de sugestão de que eles constituem estado da técnica válido ou fazem parte do conhecimento geral comum em qualquer país do mundo. Definições
[0046] A prática da presente tecnologia usará, a menos que indi- cado em contrário, técnicas convencionais de química orgânica, far-
macologia, imunologia, biologia molecular, microbiologia, biologia celu- lar e DNA recombinante, que estão dentro dos conhecimentos da téc- nica. Ver, por exemplo, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989); Current Protocols In Molecular Biology (F. M. Ausubel, et a/. eds., (1987)); a série Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow e Lane, eds. (1988) Antibodies, a Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (RI. Freshney, ed. (1987)).
[0047] Conforme usado na descrição da invenção e nas reivindi- cações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" destinam-se a incluir também as formas plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário.
[0048] Conforme usado neste documento, o termo "compreenden- do" destina-se a significar que as composições e métodos incluem os elementos citados, mas não excluem outros. Conforme usado neste documento, a frase de transição "consistindo essencialmente em" (e variantes gramaticais) deve ser interpretada como abrangendo os ma- teriais ou etapas citadas e aqueles que não afetam materialmente as características básicas e novas da modalidade citada. Assim, o termo "consistindo essencialmente em", conforme usado neste documento, não deve ser interpretado como equivalente a "compreendendo". "Consiste em" significa excluir mais do que elementos-traço de outros ingredientes e etapas substanciais do método para administrar as composições descritas neste documento. Os aspectos definidos por cada um desses termos de transição estão dentro do escopo da pre- sente invenção.
[0049] Todas as designações numéricas, por exemplo, pH, tempe- ratura, tempo, concentração e peso molecular, incluindo intervalos, são aproximações que são variadas (+) ou (-) por incrementos de 1,0 ou 0,1, conforme apropriado, ou, alternativamente, por uma variação de +/- 15%, 10%, 5%, 2%. Deve ser entendido, embora nem sempre explicitamente declarado, que todas as designações numéricas são precedidas pelo termo "cerca de". Deve ser entendido também, embo- ra nem sempre explicitamente declarado, que os reagentes descritos neste documento são meramente exemplificativos e que equivalentes destes são conhecidos na técnica. O termo "cerca de", conforme usa- do neste documento, ao se referir a um valor mensurável, tal como uma quantidade ou concentração e similares, destina-se a abranger variações de 20%, 10%, 5%, 1%, 0,5% ou mesmo 0,1% da quantidade especificada.
[0050] Os termos "aceitável", "eficaz" ou "suficiente" quando usa- dos para descrever a seleção de quaisquer componentes, intervalos, formas de dose, etc. descritos neste documento pretendem que o refe- rido componente, intervalo, forma de dose, etc. seja adequado para o objetivo descrito.
[0051] Além disso, conforme usado neste documento, "e/ou" refe- re-se a e engloba toda e qualquer combinação possível de um ou mais dos itens listados associados, bem como a falta de combinações quando interpretadas na alternativa ("ou").
[0052] A menos que especificamente citado, o termo "célula hos- pedeira" inclui uma célula hospedeira eucariótica, incluindo, por exem- plo, células fúngicas, células de levedura, células de plantas mais ele- vadas, células de inseto e células de mamíferos. Exemplos não limi- tantes de células hospedeiras eucarióticas incluem células símias, bo- vinas, suínas, murinas, de rato, aviárias, reptiianas e humanas, por exemplo, células HEK293 e células 293T.
[0053] O termo "isolado", conforme usado neste documento, refe- re-se a moléculas ou materiais biológicos ou celulares substancialmen- te livres de outros materiais.
[0054] Conforme usado neste documento, os termos "sequência de ácido nucleico" e "polinucleotídeo" são usados de forma intercam- biável para se referir a uma forma polimérica de nucleotídeos de qual- quer comprimento, ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. As- sim, este termo inclui, mas não está limitado a DNA ou RNA de fita simples, dupla ou múltipla, DNA genômico, cDNA, híbridos de DNA- RNA ou um polímero compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em bases de purina e pirimidina ou outras bases de nu- cleotídeos naturais, quimicamente ou bioquimicamente modificadas, não naturais ou derivatizadas.
[0055] Um "gene" refere-se a um polinucleotídeo contendo pelo menos uma estrutura de leitura aberta (ORF) que é capaz de codificar um polipeptídeo ou proteína específica. Um "produto de gene" ou, al- ternativamente, um "produto de expressão de gene" refere-se à se- quência de aminoácidos (por exemplo, peptídeo ou polipeptídeo) ge- rada quando um gene é transcrito e traduzido.
[0056] Conforme usado neste documento, "expressão" refere-se ao processo de duas etapas pelo qual os polinucleotídeos são transcri- tos em mRNA e/ou o processo pelo qual o mRNA transcrito é subse- quentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Se o polinucleotídeo for derivado do DNA genômico, a expressão pode in- cluir splicing do MRNA em uma célula eucariótica.
[0057] "Sob controle transcricional" é um termo bem compreendido na técnica e indica que a transcrição de uma sequência polinucleotídi- ca, geralmente uma sequência de DNA, depende de estar operacio- nalmente ligada a um elemento que contribui para o início ou promove a transcrição. "Operativamente ligado" pretende dizer que os polinu- cleotídeos sejam dispostos de uma maneira que permita que eles fun- cionem em uma célula. Em um aspecto, esta invenção fornece promo- tores operacionalmente ligados às sequências a jusante.
[0058] O termo "codificar" conforme é aplicado aos polinucleotí- deos refere-se a um polinucleotídeo que, diz-se, "codifica" um polipep- tídeo se, em seu estado nativo ou quando manipulado por métodos bem conhecidos pelos versados na técnica, ele pode ser transcrito pa- ra produzir o mMRNA para o polipeptídeo e/ou um fragmento do mesmo. A fita antisense é o complemento de tal ácido nucleico e a sequência codificadora pode ser deduzida a partir da mesma.
[0059] O termo "promotor", conforme usado neste documento, sig- nifica uma sequência de controle que é uma região de uma sequência polinucleotídica na qual a iniciação e a taxa de transcrição de uma se- quência codificante, tal como um gene ou um transgene, são controla- das. Os promotores podem ser constitutivos, induzíveis, reprimíveis ou específicos do tecido, por exemplo. Promotores podem conter elemen- tos genéticos aos quais proteínas e moléculas reguladoras, tais como polimerase de RNA e fatores de transcrição, podem se ligar. Promoto- res exemplares não limitantes incluem promotor de LTR do vírus sar- coma Rous (VSR) (opcionalmente com o potenciador do VSR), um promotor de citomegalovírus (CMV), um promotor SV40, um promotor de di-hidrofolato redutase, um promotor de B-actina, um promotor de fosfoglicerol quinase (PGK), um promotor de U6, um promotor de H1, um promotor híbrido de B-actina de galinha (CBh), um pequeno promo- tor de RNA nuclear (U1a ou U1b), um promotor de MeCP2, um promo- tor de MeP418, um promotor de MeP426, um promotor de MeCP2 mí- nimo, um promotor de VMD2, um promotor de mRho ou um promotor de EFI.
[0060] Promotores exemplares não limitantes adicionais fornecidos neste documento incluem, mas não estão limitados a EFla, Ubc, B- actina humana, CAG, TRE, Ac5, Poliedrina, CaMKlla, Gal1, TEF1, GDS, ADH1, Ubi e a-1-antitripsina (DAAT). É conhecido na técnica que as sequências nucleotídicas de tais promotores podem ser modifica-
das a fim de aumentar ou diminuir a eficiência da transcrição de MRNA. Ver, por exemplo, Gao et al. (2018) Mol. Ther.: Nucleic Acids 12:135-145 (modificando a caixa TATA de promotores 7SK, U6 e H1 para abolir a transcrição da RNA polimerase ll e estimular a transcri- ção do MRNA dependente da RNA polimerase Il). Promotores deriva- dos sinteticamente podem ser usados para expressão ubíqua ou es- pecífica do tecido. Além disso, promotores derivados de vírus, alguns dos quais são observados acima, podem ser úteis nos métodos descri- tos neste documento, por exemplo, promotores de CMV, HIV, adenoví- rus e AAV. Em modalidades, o promotor é usado juntamente com um potenciador para aumentar a eficiência da transcrição. Exemplos não limitantes de potenciadores incluem um potenciador de proteína de ligação a retinoides intersticial (IRBP), um potenciador de RSV ou um potenciador de CMV.
[0061] Um potenciador é um elemento regulador que aumenta a expressão de uma sequência alvo. Um "promotor/potencializador" é um polinucleotídeo que contém sequências capazes de fornecer fun- ções promotoras e potenciadoras. Por exemplo, as longas repetições terminais de retrovírus contêm funções promotoras e potenciadoras. O potenciador/promotor pode ser "endógeno" ou "exógeno" ou "heterólo- go". Um potenciador/promotor "endógeno" é aquele que está natural- mente ligado a um determinado gene no genoma. Um potencia- dor/promotor "exógeno" ou "heterólogo" é aquele que é colocado em justaposição a um gene por meio de manipulação genética (isto é, téc- nicas biológicas moleculares) de modo que a transcrição desse gene seja direcionada pelo potenciador/promotor ligado. Exemplos não limi- tantes de potenciador/promotor ligado para uso nos métodos, compo- sições e construtos fornecidos neste documento incluem um promotor de PDE mais potenciador de IRBP ou um potenciador de CMV mais promotor de U1a. Entende-se na técnica que os potenciadores podem operar a uma distância e independentemente de sua orientação em relação à localização de um promotor endógeno ou heterólogo. Enten- de-se, portanto, que um potenciador que opera a uma distância de um promotor está, portanto, "operacionalmente ligado" a esse promotor, independentemente de sua localização no vetor ou de sua orientação em relação à localização do promotor.
[0062] O termo "proteína", "peptídeo" e "polipeptídeo" são usados de forma intercambiável e em seu sentido mais amplo para se referir a um composto de duas ou mais subunidades de aminoácidos, análogos de aminoácidos ou peptidomiméticos. As subunidades podem ser liga- das por ligações peptídicas. Em outro aspecto, a subunidade pode ser ligada por outras ligações, por exemplo, éster, éter, etc. Uma proteína ou peptídeo deve conter pelo menos dois aminoácidos e nenhuma |li- mitação é colocada no número máximo de aminoácidos que podem compreender, consistir essencialmente em, ou consistir em uma se- quência de proteína ou peptídeo. Conforme usado neste documento, o termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo glicina e ambos os isômeros ópticos D e L, análogos de aminoácidos e peptidomiméticos.
[0063] Conforme usado neste documento, o termo "peptídeo de sinal" ou "polipeptídeo de sinal" pretende indicar uma sequência de aminoácidos geralmente presente na extremidade de terminal N de polipeptídeos ou proteínas secretoras ou de membrana recém- sintetizadas. Ela atua para direcionar o polipeptídeo para uma locali- zação celular específica, por exemplo, através de uma membrana ce- lular, em uma membrana celular ou no núcleo. Em modalidades, o peptídeo sinal é removido após a localização. Exemplos de peptídeos sinal são bem conhecidos na técnica. Exemplos não limitantes são aqueles descritos nas Patentes US n.º 8.853.381, 5.958.736, e
8.795.965. Em modalidades, o peptídeo sinal pode ser um peptídeo sinal de IDUA.
[0064] Os termos "equivalente" ou "equivalente biológico" são usados de forma intercambiável ao se referir a uma molécula, ma- terial biológico ou material celular em particular e pretendem que aqueles tenham homologia mínima enquanto ainda mantêm a es- trutura ou funcionalidade desejada. Exemplos não limitantes de po- lipeptídeos equivalentes incluem um polipeptídeo com pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% de identidade ou pelo menos cerca de 99% de identidade a um polipeptídeo de referência (por exemplo, um polipeptídeo do tipo selvagem); ou um polipeptídeo que é codificado por um polinu- cleotídeo com pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% de identidade, pe- lo menos cerca de 97% de identidade de sequência ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência ao polinucleotídeo de referência (por exemplo, um polinucleotídeo do tipo selvagem).
[0065] "Homologia" ou "identidade" ou "similaridade" refere-se à similaridade de sequência entre dois peptídeos ou entre duas mo- léculas de ácido nucleico. A identidade percentual pode ser deter- minada pela comparação de uma posição em cada sequência que pode ser alinhada para fins de comparação. Quando uma posição na sequência comparada é ocupada pela mesma base ou aminoá- cido, então as moléculas são idênticas nessa posição. Um grau de identidade entre sequências é uma função do número de posições correspondentes compartilhadas pelas sequências. Sequências "não relacionadas" ou "não catalogadas" compartilham menos de 40% de identidade, menos de 25% de identidade, com uma das sequências da presente invenção. O alinhamento e a porcentagem de identidade de sequência podem ser determinados para as se- quências de ácido nucleico ou aminoácido fornecidas neste docu- mento pela importação das referidas sequências de ácido nucleico ou aminoácido para dentro e usando ClustalW (disponível em https://genome .jp/tools-bin/clustalw/). Por exemplo, os parâmetros ClustalW usados para realizar os alinhamentos de sequência de proteína encontrados neste documento (por exemplo, FIGURAS 20-23) foram gerados usando a matriz de peso Gonnet (para prote- ína). Em modalidades, os parâmetros ClustalW usados para reali- zar alinhamentos de sequência de ácido nucleico usando as se- quências de ácido nucleico encontradas neste documento são ge- rados usando a matriz de peso ClustalW (para DNA).
[0066] Conforme usado neste documento, modificações de amino- ácidos podem ser substituições de aminoácidos, deleções de aminoá- cidos ou inserções de aminoácidos. As substituições de aminoácidos podem ser substituições de aminoácidos conservativas ou substitui- ções de aminoácidos não conservativas. Uma substituição conservati- va (também chamada de mutação conservativa, ou uma variação con- servativa) é uma substituição de aminoácido em uma proteína que al- tera um determinado aminoácido para um aminoácido diferente com propriedades bioquímicas similares (por exemplo, carga, hidrofobici- dade ou tamanho). Conforme usado neste documento, "variações con- servativas" referem-se à substituição de um resíduo de aminoácido por outro resíduo biologicamente similar. Exemplos de variações conser- vativas incluem a substituição de um resíduo hidrofóbico, como isoleu- cina, valina, leucina ou metionina por outro; ou a substituição de um resíduo carregado ou polar por outro, como a substituição de arginina por lisina, ácido glutâmico por ácido aspártico, glutamina por asparagi- na e similares. Outros exemplos ilustrativos de substituições conserva-
tivas incluem as alterações de: alanina para serina; asparagina para glutamina ou histidina; aspartato para glutamato; cisteína para serina; glicina para prolina; histidina para asparagina ou glutamina; lisina para arginina, glutamina ou glutamato; fenilalanina para tirosina, serina para treonina; treonina para serina; triptofano para tirosina; tirosina para triptofano ou fenilalanina; e similares.
[0067] Conforme usado neste documento, o termo "vetor" refere- se a um ácido nucleico que compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em um replicon intacto de modo que o vetor possa ser re- plicado quando colocado dentro de uma célula, por exemplo, por um processo de transfecção, infecção ou transformação. Entende-se na técnica que, uma vez dentro de uma célula, um vetor pode se replicar como um elemento extracromossômico (epissomal) ou pode ser inte- grado em um cromossomo de célula hospedeira. Os vetores podem incluir ácidos nucleicos derivados de retrovírus, adenovírus, herpesvií- rus, baculovírus, baculovírus modificados, papovavírus ou vírus de ocorrência natural de outra forma modificados. Vetores não virais exemplares para a distribuição de ácido nucleico incluem DNA nu; DNA complexado com lipídios catiônicos, sozinho ou em combinação com polímeros catiônicos; lipossomas aniônicos e catiônicos; Comple- xos e partículas de proteína de DNA compreendendo, consistindo es- sencialmente em, ou consistindo em DNA condensado com polímeros catiônicos, tais como polilisina heterogênea, oligopeptídeos de com- primento definido, e polietilenoimina, em alguns casos contidos em |i- possomas; e o uso de complexos ternários compreendendo, consistin- do essencialmente em, ou consistindo em um vírus e polilisina-DNA.
[0068] Em relação às técnicas recombinantes gerais, vetores que contêm um promotor e um sítio de clonagem no qual um polinucleotí- deo pode ser operacionalmente ligado são bem conhecidos na técnica. Tais vetores são capazes de transcrever RNA in vitro ou in vivo e es-
tão comercialmente disponíveis a partir de fontes como a Agilent Technologies (Santa Clara, Califórnia) e Promega Biotech (Madison, Wis.). A fim de otimizar a expressão e/ou transcrição in vitro, pode ser necessário remover, adicionar ou alterar porções não traduzidas 5' e/ou 3' de transgenes clonados para eliminar códons de iniciação de tradução alternativos inapropriados extras e potenciais ou outras se- quências que podem interferir ou reduzir a expressão, tanto no nível de transcrição quanto tradução. Alternativamente, sítios de ligação do ribossoma consenso podem ser inseridos imediatamente a 5' do códon de iniciação para aumentar a expressão.
[0069] Um "vetor viral" é definido como um vírus ou partícula viral produzido de forma recombinante que contém um polinucleotídeo a ser distribuído em uma célula hospedeira, in vivo, ex vivo ou in vitro. Exemplos de vetores virais incluem vetores retrovirais, vetores AAV, vetores lentivirais, vetores adenovírus, vetores alfavírus e similares. Os vetores alfavírus, tais como vetores baseados no vírus da floresta de Semliki e vetores baseados no vírus de Sindbis, também foram desen- volvidos para uso na terapia genética e imunoterapia. Ver, por exem- plo, Schlesinger and Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434- 439 e Ying, et al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827.
[0070] Conforme usado neste documento, o termo "sistema de ex- pressão recombinante" ou "vetor recombinante" refere-se a um cons- truto genético ou construtos para a expressão de determinado material genético formado por recombinação.
[0071] Um "veículo de distribuição de gene" é definido como qualquer molécula que pode transportar polinucleotídeos inseridos em uma célula hospedeira. Exemplos de veículos de distribuição de gene são lipossomas, polímeros biocompatíveis de micelas, in- cluindo polímeros naturais e polímeros sintéticos; lipoproteínas; po- lipeptídeos; polissacarídeos; lipopolissacarídeos; envelopes virais artificiais; partículas metálicas; bactérias; vírus, como baculovírus, adenovírus e retrovírus; bacteriófago, cosmídeo, plasmídeo, e veto- res fúngicos; e outros veículos de recombinação normalmente usa- dos na técnica que foram descritos para expressão em uma varie- dade de hospedeiros eucarióticos e procarióticos e podem ser usa- dos para terapia gênica, bem como para expressão de proteína simples. Os lipossomas que também compreendem, consistem es- sencialmente em, ou consistem em um anticorpo de direcionamen- to ou fragmento do mesmo podem ser usados nos métodos descri- tos neste documento. Além da distribuição de polinucleotídeos a uma célula ou população de células, a introdução direta das proteí- nas descritas neste documento à célula ou população de células pode ser feita pela técnica não limitante de transfecção de proteína, alternativamente, as condições de cultivo que podem potencializar a expressão e/ou promover a atividade das proteínas descritas neste documento são outras técnicas não limitantes.
[0072] Um polinucleotídeo descrito neste documento pode ser distribuído a uma célula ou tecido usando um veículo de distribui- ção de gene. "Distribuição de gene", "transferência de gene", "transdução" e similares, conforme usado neste documento, são termos que se referem à introdução de um polinucleotídeo exógeno (às vezes referido como um "transgene") em uma célula hospedei- ra, independentemente do método usado para a introdução. Tais métodos incluem uma variedade de técnicas bem conhecidas, tais como transferência de gene mediada por vetor (por exemplo, infec- ção/transfecção viral ou vários outros complexos de distribuição de gene baseados em proteína ou lipídios), bem como técnicas que facilitam a distribuição de polinucleotídeos "nus" (tais como eletro- poração, distribuição "pistola de gene" e várias outras técnicas usadas para a introdução de polinucleotídeos). O polinucleotídeo introduzido pode ser mantido de forma estável ou transitória na cé- lula hospedeira. A manutenção estável normalmente requer que o polinucleotídeo introduzido contenha uma origem de replicação compatível com a célula hospedeira ou se integre em um replicon da célula hospedeira, tal como um replicon extracromossômico (por exemplo, um plasmídeo) ou um cromossomo nuclear ou mitocon- drial. Uma série de vetores são conhecidos por serem capazes de mediar a transferência de genes para células de mamíferos, como é conhecido na técnica e descrito neste documento.
[0073] Um "plasmídeo" é uma molécula de DNA que é tipicamente separada e capaz de se replicar independentemente do DNA cromos- sômico. Em muitos casos, é circular e de fita dupla. Os plasmídeos fornecem um mecanismo para transferência gênica horizontal dentro de uma população de micróbios e tipicamente fornecem uma vanta- gem seletiva sob um determinado estado ambiental. Os plasmídeos podem transportar genes que fornecem resistência a antibióticos de ocorrência natural em um nicho ambiental competitivo, ou, alternati- vamente, as proteínas produzidas podem agir como toxinas em cir- cunstâncias similares. É conhecido na técnica que, embora os vetores de plasmídeo frequentemente existam como moléculas de DNA circu- lar extracromossômicas, os vetores de plasmídeo também podem ser projetados para serem estavelmente integrados em um cromossomo hospedeiro de forma aleatória ou direcionada, e tal integração pode ser realizada usando um plasmídeo circular ou um plasmídeo que foi linearizado antes da introdução na célula hospedeira.
[0074] "Plasmídeos" usados na engenharia genética são chama- dos de "vetores plasmídeos". Muitos plasmídeos estão comercialmente disponíveis para tais usos. O gene a ser replicado é inserido em có- pias de um plasmídeo contendo genes que tornam as células resisten- tes a antibióticos específicos e um sítio de clonagem múltiplo (MCS, ou poliligante), que é uma região curta contendo vários sítios de restrição comumente usados permitindo a inserção fácil de fragmentos de DNA neste local. Outro uso importante dos plasmídeos é produzir grandes quantidades de proteínas. Neste caso, os pesquisadores cultivam bac- térias ou células eucarióticas contendo um plasmídeo que abriga o ge- ne de interesse, que pode ser induzido a produzir grandes quantidades de proteínas a partir do gene inserido.
[0075] Em aspectos em que a transferência gênica é mediada por um vetor viral de DNA, tal como um adenovírus (Ad) ou vírus adeno- associado (AAV), um construto de vetor refere-se ao polinucleotídeo que compreende, consiste essencialmente em, ou consiste no genoma viral ou parte do mesmo, e um transgene.
[0076] O termo "vírus adenoassociado" ou "AAV", conforme usado neste documento, refere-se a um membro da classe de vírus associa- dos a este nome e pertencentes ao gênero Dependoparvovírus, família Parvoviridae. O vírus adenoassociado é um vírus de DNA de fita sim- ples que cresce apenas em células nas quais certas funções são for- necidas por um vírus auxiliar coinfeccioso. Informações gerais e revi- sões de AAV podem ser encontradas em, por exemplo, Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169- 228, e Berns, 1990, Viro- logy, pp. 1743-1764, Raven Press, (Nova York). Espera-se plenamen- te que os mesmos princípios descritos nestas resenhas sejam aplicá- veis a sorotipos de AAV adicionais caracterizados após as datas de publicação das revisões, porque é bem conhecido que os vários soro- tipos estão bastante intimamente relacionados, tanto estruturalmente quanto funcionalmente, mesmo no nível genético. (Ver, por exemplo, Blacklowe, 1988, pp. 165-174 de Prvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.; e Rose, Comprehensive Virology 3: 1-61 (1974)). Por exemplo, todos os sorotipos de AAV aparentemente exibem proprie- dades de replicação muito similares mediadas por genes rep homólo-
gos; e todos carregam três proteínas do capsídeo relacionadas, tais como aquelas expressas em AAV2. O grau de relação é ainda sugeri- do pela análise heteroduplex que descreve extensa hibridização cru- zada entre os sorotipos ao longo do comprimento do genoma; e a pre- sença de segmentos de autoanelamento análogos nos terminais que correspondem a "sequências de repetição terminal invertidas" (ITRs). Os padrões de infectividade similares também sugerem que as fun- ções de replicação em cada sorotipo estão sob controle regulador si- milar. É conhecido que múltiplos sorotipos deste vírus são adequados para a distribuição de genes; todos os sorotipos conhecidos podem infectar células de vários tipos de tecidos. Pelo menos 11 sorotipos AAV numerados sequencialmente são conhecidos na técnica. Os soro- tipos exemplares não limitantes úteis nos métodos descritos neste do- cumento incluem qualquer um dos 11 sorotipos, por exemplo, AAV?2, AAV8, AAV9, ou sorotipos variantes, por exemplo, AAV-DJ e AAV PHP.B. A partícula de AAV compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em três proteínas virais principais: VPI, VP2 e VP3. Em modalidades, o AAV refere-se ao sorotipo AAV1, AAV2, AAVA, AAVS5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV1O, AAV11, AAV12, AAV1I3, AAV- PHP.B, ou AAVrh74.
[0077] Um "vetor AAV", conforme usado neste documento, refere- se a um vetor que compreende, consiste essencialmente em, ou con- siste em uma ou mais sequências de ácido nucleico heterólogo (HNA) e uma ou mais sequências de repetição terminal (ITRs) invertidas por AAV. Tais vetores AAV podem ser replicados e empacotados em par- tículas virais infecciosas quando presentes em uma célula hospedeira que fornece a funcionalidade de produtos gênicos rep e cap; por exemplo, por transfecção da célula hospedeira. Em modalidades, veto- res AAV contêm um promotor, pelo menos um ácido nucleico que po- de codificar pelo menos uma proteína ou RNA e/ou um potenciador e/ou um terminador dentro das ITRs flanqueadoras que é empacotado na partícula de AAV infecciosa. A porção de ácido nucleico encapsula- do pode ser referida como o genoma do vetor AAV. Os plasmídeos contendo vetor AAV também podem conter elementos para fins de fa- bricação, por exemplo, genes de resistência a antibióticos, etc., mas estes não estão encapsulados e, portanto, não fazem parte da partícu- la de AAV.
[0078] Conforme usado neste documento, o termo "capsídeo viral" ou "capsídeo" refere-se ao envoltório ou revestimento proteináceo de uma partícula viral. Os capsídeos funcionam para encapsular, prote- ger, transportar e liberar na célula hospedeira um genoma viral. Os capsídeos são geralmente compostos por subunidades estruturais oli- goméricas de proteína ("proteínas do capsídeo"). Conforme usado neste documento, o termo "encapsulado" significa encerrado dentro de um capsídeo viral. O capsídeo viral do AAV é composto por uma mis- tura de três proteínas do capsídeo viral: VP1, VP2 e VP3. A mistura de VP1, VP2 e VP3 contém 60 monômeros que são dispostos em uma simetria icosaédrica T = 1 em uma razão de 1:1:10 (VP1:VP2:VP3) ou 1:1:20 (VP1:VP2:VP3), conforme descrito em Sonntag F et al., junho de 2010). "A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22): 102205, e Rabinowitz JE, Samulski RJ (December 2000). "Building a better vector: the manipula- tion of AAV virions". Virology. 278 (2): 3018, cada uma das quais é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.
[0079] Um "vírion AAV" ou "partícula viral AAV" ou "vetor viral AAV" ou "partícula do vetor AAV" ou "partícula AAV" refere-se a uma partícula viral composta por pelo menos uma proteína do capsídeo AAV e um vetor AAV de polinucleotídeo encapsulado. Assim, a produ- ção de partícula de vetor AAV necessariamente inclui a produção de vetor AAV, pois tal vetor está contido dentro de uma partícula de vetor AAV.
[0080] Conforme usado neste documento, o termo "ajuda" em re- ferência a um vírus ou plasmídeo refere-se a um vírus ou plasmídeo usado para fornecer os componentes adicionais necessários para re- plicação e empacotamento de qualquer um dos vetores AAV descritos neste documento. Os componentes codificados por um vírus auxiliar podem incluir quaisquer genes necessários para a montagem do ví- rion, encapsulação, replicação do genoma e/ou empacotamento. Por exemplo, o vírus ou plasmídeo auxiliar pode codificar as enzimas ne- cessárias para a replicação do genoma viral. Exemplos não limitantes de vírus e plasmídeos auxiliares adequados para uso com construtos de AAV incluem pHELP (plasmídeo), adenovírus (vírus) ou herpesví- rus (vírus). Em modalidades, o plasmídeo pHELP pode ser o plasmí- deo pHELPK, em que o cassete de expressão de ampiícilina é trocado por um cassete de expressão de canamicina; pHELPK tem a sequên- cia mostrada na SEQ ID NO: 92.
[0081] Conforme usado neste documento, uma célula empacota- dora (ou uma célula auxiliar) é uma célula usada para produzir vetores virais. A produção de vetores virais AAV recombinantes requer proteí- nas Rep e Cap fornecidas em trans, bem como sequências gênicas de Adenovírus que ajudam a replicar AAV. Em alguns aspectos, as célu- las de empacotamento/ajuda contêm um plasmídeo estavelmente in- corporado ao genoma da célula. Em outros aspectos, a célula de em- pacotamento pode ser transitoriamente transfectada. Normalmente, uma célula empacotadora é uma célula eucariótica, tal como uma célu- la de mamífero ou uma célula de inseto.
[0082] Conforme usado neste documento, uma proteína repórter é uma proteína detectável que está operacionalmente ligada a um pro- motor para analisar a expressão (por exemplo, especificidade e/ou for-
ça do tecido) do promotor. Em aspectos, uma proteína repórter pode estar operacionalmente ligada a um polipeptídeo. Em aspectos, as proteínas repórter podem ser usadas no monitoramento de métodos de distribuição de DNA, identificação funcional e caracterização de elementos promotores e potencializadores, regulação de tradução e transcrição, processamento de mRNA e interações de proteí- na:proteína. Exemplos não limitantes de uma proteína repórter são B- galactosidase; uma proteína fluorescente, tal como, Proteína Verde Fluorescente (GFP) ou Proteína Vermelha Fluorescente (RFP); lucife- rase; glutationa S-transferase; e proteína de ligação a maltose.
[0083] Uma "composição" destina-se a significar uma combinação de polipeptídeo ativo, polinucleotídeo ou anticorpo e outro composto ou composição, inerte (por exemplo, um marcador detectável) ou ativo (por exemplo, um veículo de distribuição de gene).
[0084] Uma "composição farmacêutica" destina-se a incluir a com- binação de um polipeptídeo, polinucleotídeo ou anticorpo ativo com um transportador, inerte ou ativo, tal como um suporte sólido, tornando a composição adequada para uso diagnóstico ou terapêutico in vitro, in vivo ou ex vivo.
[0085] Conforme usado neste documento, o termo "transportador farmaceuticamente aceitável" abrange qualquer um dos transportado- res farmacêuticos padrão, tais como uma solução salina tamponada com fosfato, água e emulsões, tais como um óleo/água ou emulsão de água/óleo e vários tipos de agentes umectantes. As composições tam- bém podem incluir estabilizadores e conservantes. Para obter exem- plos de transportadores, estabilizadores e adjuvantes, consulte Martin (1975) Remington's Pharm. Sci., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton).
[0086] Um "sujeito" de diagnóstico ou tratamento é uma célula ou um animal, tal como um mamífero, ou um ser humano. Um sujeito não está limitado a uma espécie específica e inclui animais não humanos sujeitos a diagnóstico ou tratamento e aqueles sujeitos a infecções ou modelos animais, incluindo, sem limitação, espécies de símios, muri- nos, ratos, caninos ou leporinos, bem como outros animais de gado, animais esportivos ou animais de estimação. Em modalidades, o sujei- to é um humano.
[0087] O termo "tecido" é usado neste documento para se referir ao tecido de um organismo vivo ou falecido ou qualquer tecido deriva- do ou projetado para imitar um organismo vivo ou falecido. O tecido pode ser saudável, doente e/ou ter mutações genéticas. O tecido bio- lógico pode incluir qualquer tecido único (por exemplo, uma coleção de células que podem ser interconectadas) ou um grupo de tecidos que compõem um órgão ou parte ou região do corpo de um organismo. O tecido pode compreender, consistir essencialmente em, ou consistir em um material celular homogêneo ou pode ser uma estrutura com- posta, tal como a encontrada nas regiões do corpo, incluindo o tórax que, por exemplo, pode incluir tecido pulmonar, tecido esquelético e/ou tecido muscular. Tecidos exemplares incluem, sem limitação, aqueles derivados de fígado, pulmão, tireoide, pele, pâncreas, vasos sanguí- neos, bexiga, rins, cérebro, árvore biliar, duodeno, aorta abdominal, veia ilíaca, coração e intestinos, incluindo qualquer combinação des- tes.
[0088] Conforme usado neste documento, "tratar" ou "tratamento" de uma doença em um sujeito refere-se a (1) prevenir que os sintomas ou a doença ocorram em um sujeito que está predisposto ou ainda não exibe sintomas da doença; (2) inibir a doença ou interromper seu de- senvolvimento; ou (3) melhorar ou causar regressão da doença ou dos sintomas da doença. Conforme entendido na técnica, "tratamento" é uma abordagem para obter resultados benéficos ou desejados, inclu- indo resultados clínicos. Para os fins da presente tecnologia, resulta- dos benéficos ou desejados podem incluir, sem limitação, um ou mais de melhora ou alívio de um ou mais sintomas, diminuição da extensão de uma condição (incluindo uma doença), estabilização (ou seja, não piorar) de uma condição (incluindo doença), atraso ou retardamento da condição (incluindo doença), progressão, melhora ou paliação da con- dição (incluindo doença), estados e remissão (parcial ou total), seja detectável ou indetectável.
[0089] Conforme usado neste documento, o termo "quantidade efetiva" pretende significar uma quantidade suficiente para alcançar um efeito desejado. No contexto de aplicações terapêuticas ou profilá- ticas, a quantidade eficaz dependerá do tipo e gravidade da condição em questão e das características do sujeito individual, tais como saúde geral, idade, sexo, peso corporal e tolerância a composições farma- cêuticas. No contexto da terapia gênica, nas modalidades, a quantida- de eficaz é a quantidade suficiente para resultar na recuperação de parte ou função completa de um gene que é deficiente em um sujeito. Em outras modalidades, a quantidade eficaz de uma partícula viral de AAV é a quantidade suficiente para resultar na expressão de um gene em um sujeito. Em modalidades, a quantidade eficaz é a quantidade necessária para aumentar o metabolismo de galactose em um sujeito em necessidade disto. Os versados na técnica serão capazes de de- terminar quantidades apropriadas dependendo destes e de outros fato- res.
[0090] Em modalidades, a quantidade eficaz dependerá do tama- nho e da natureza da aplicação em questão. Isso também dependerá da natureza e sensibilidade do sujeito alvo e dos métodos em uso. Os versados na técnica serão capazes de determinar a quantidade eficaz com base nestas e em outras considerações. A quantidade eficaz po- de compreender, consistir essencialmente em, ou consistir em uma ou mais administrações de uma composição dependendo da modalidade.
[0091] Conforme usado neste documento, o termo "administrar" ou
"administração" destina-se a significar a entrega de uma substância a um sujeito, tal como um animal ou humano. A administração pode ser efetuada em uma dose, contínua ou intermitentemente, durante todo o curso do tratamento. Métodos para determinar os meios mais eficazes e a dosagem de administração são conhecidos pelos versados na técnica e variam com a composição usada para terapia, o objetivo da terapia, bem como a idade, saúde ou sexo do sujeito sendo tratado. Administra- ções únicas ou múltiplas podem ser realizadas com o nível de dose e padrão sendo selecionados pelo médico responsável pelo tratamento ou no caso de animais de estimação e outros animais, tratando veteriná- rios.
Estrutura e função de AAV
[0092] O AAV é um parvovírus deficiente em replicação, cujo ge- noma de DNA de fita simples tem cerca de 4,7 kb de comprimento, incluindo duas repetições terminais invertidas (ITRs) de 145 nucleotí- deos. Existem vários sorotipos de VAA. As sequências nucleotídicas dos genomas dos sorotipos AAV são conhecidas. Por exemplo, o ge- noma completo de AAV-1 é fornecido em N.º de Acesso GenBank NC 002077; o genoma completo de AAV-2 é fornecido em N.º de Acesso GenBank NC 001401 e Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 (1983); o genoma completo de AAV-3 é fornecido no N.º de Acesso GenBank NC 1829; o genoma completo de AAV-4 é fornecido no N.º de Acesso GenBank NC 001829; o genoma do AAV-5 é fornecido no N.º de Acesso GenBank AFO85716; o genoma completo do AAV-6 é fornecido no N.º de Acesso GenBank NC 001862; pelo menos por- ções de genomas de AAV-7 e AAV-8 são fornecidas nos N.º de Aces- so GenBank AX753246 e AX753249, respectivamente; o genoma de AAV-9 é fornecido em Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004); o ge- noma de AAV-10 é fornecido em Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006) e o genoma de AAV-11 é fornecido em Virology, 330(2): 375-383 (2004). A sequência do genoma de AAV rh.74 é fornecida na Patente U.S.
9.434.928, incorporada neste documento por referência em sua totali- dade. A Patente U.S. n.º 9.434.928 também fornece as sequências das proteínas do capsídeo e um genoma autocomplementar. Em um aspecto, o genoma é um genoma autocomplementar. Sequências de ação cis que direcionam a replicação do DNA viral (rep), encapsula- ção/empacotamento e integração cromossômica de célula hospedeira estão contidas dentro das ITRs de AAV. Três promotores de AAV (chamados p5, p19 e p40 para seus locais de mapa relativos) condu- zem a expressão dos dois quadros de leitura abertos internos de AAV que codificam genes rep e cap. Os dois promotores rep (p5 e p19), acoplados ao splicing diferencial do íntron AAV único (nos nucleotí- deos 2107 e 2227), resultam na produção de quatro proteínas rep (rep 78, rep 68, rep 52 e rep 40) do gene rep. As proteínas rep possuem múltiplas propriedades enzimáticas que são, em última análise, res- ponsáveis por replicar o genoma viral.
[0093] O gene cap é expresso a partir do promotor p40 e codifica as três proteínas do capsídeo, VPI, VP2 e VP3. Sítios alternativos de splicing e início translacional não consensual são responsáveis pela produção das três proteínas do capsídeo relacionadas. Mais especifi- camente, após o mMRNA único a partir do qual cada uma das proteínas VP1, VP2 e VP3 é traduzida ser transcrita, ela pode ser emendada de duas maneiras diferentes: um íntron mais longo ou mais curto pode ser excisado, resultando na formação de dois pools de mMRNAs: um pool de mRNA de 2,3 kb e um pool de mRNA de 2,6 kb de comprimento. O íntron mais longo é frequentemente preferencial e, portanto, o MRNA de 2,3 kb de comprimento pode ser chamado de variante de splice principal. Essa forma carece do primeiro códon AUG, a partir do qual a síntese da proteína VP1 começa, resultando em um nível geral reduzi- do da síntese da proteína VP1. O primeiro códon AUG que permanece na variante de splice principal é o códon de iniciação para a proteína VP3. No entanto, a montante desse códon no mesmo quadro de leitura aberto encontra-se uma sequência ACG (que codifica treonina) que é cercada por um contexto Kozak (iniciação da tradução) ideal. Isso con- tribui para um baixo nível de síntese da proteína VP2, que é realmente a proteína VP3 com resíduos N terminais adicionais, como é VP1, con- forme descrito em Becerra SP et al., (dezembro de 1985). "Direct ma- pping of adeno-associated virus capsid proteins B and C: a possible ACG initiation codon". Proceedings of the National Academy of Scien- ces of the United States of America. 82 (23): 7919-23, Cassinotti P et al., (novembro de 1988). "Organization of the adeno-associated virus (AAV) capsid gene: mapping of a minor spliced MRNA coding for virus capsid protein 1". Virology. 167 (1): 176-84, Muralidhar S et a/., (janei- ro de 1994). "Site-directed mutagenesis of adeno-associated virus type 2 structural protein initiation codons: effects on regulation of synthesis and biological activity". Journal of Virology. 68 (1): 1706, e Trempe JP, Carter BJ (setembro de 1988). "Alternate mMRNA splicing is requi- red for synthesis of adeno-associated virus VP1 capsid protein". Jour- nal of Virology. 62 (9): 3356—63, cada um dos quais é incorporado nes- te documento por referência. Um único sítio consenso poli-A está loca- lizado na posição do mapa 95 do genoma do AAV. O ciclo de vida e a genética do AAV são analisados em Muzyczka, Current Topics in Mi- crobiology and Immunology, 158: 97-129 (1992).
[0094] Cada proteína VP1 contém uma porção VP1, uma porção VP2 e uma porção VP3. A porção VP1 é a porção de terminal N da proteína VP1 que é exclusiva para a proteína VP1. A porção VP2 é a sequência de aminoácidos presente dentro da proteína VP1 que tam- bém é encontrada na porção de terminal N da proteína VP2. A porção VP3 e a proteína VP3 têm a mesma sequência. A porção VP3 é a por- ção de terminal C da proteína VP1 que é compartilhada com as proteí-
nas VP1 e VP2. Consultar Fig. 30.
[0095] A proteína VP3 pode ser dividida ainda em regiões de su- perfície variáveis discretas |-IX (VR-I-IX). Cada uma das regiões de superfície variável (VRs) pode compreender ou conter sequências de aminoácidos específicas que, sozinhas ou em combinação com as se- quências de aminoácidos específicas de cada uma das outras VRs, podem conferir fenótipos de infecção exclusivos (por exemplo, dimi- nuição da antigenicidade, melhoria da transdução e/ou do tropismo específico do tecido em relação a outros sorotipos de AAV) para um sorotipo específico, conforme descrito em DiMatta et a/l., "Structural Insight into the Unique Properties of adenoassociated Virus Serotype 9" J. Virol., Vol. 86 (12): 6947-6958, junho de 2012, cujo conteúdo está incorporado neste documento por referência.
[0096] O AAV possui características únicas que o tornam atraente como um vetor para a entrega de DNA estranho às células, por exem- plo, na terapia gênica. A infecção por AAV de células em cultura é não citopática e a infecção natural de humanos e outros animais é silencio- sa e assintomática. Além disso, o AAV infecta muitas células de mamí- feros, permitindo a possibilidade de visar muitos tecidos diferentes in vivo. Além disso, o AAV transduz células que se dividem lentamente e que não se dividem, e pode persistir essencialmente durante a vida dessas células como um epissoma nuclear transcricionalmente ativo (elemento extracromossômico). O genoma proviral do AAV é inserido como DNA clonado em plasmídeos, o que torna a construção de ge- nomas recombinantes viável. Além disso, como os sinais que direcio- nam a replicação de AAV e a encapsulação do genoma estão contidos nas ITRs do genoma de AAV, alguns ou todos os aproximadamente 4,3 kb internos do genoma (codificando a replicação e proteínas do capsídeo estrutural, rep-cap) podem ser substituídos por DNA estra- nho para gerar vetores de AAV. As proteínas rep e cap podem ser for-
necidas em trans. Outra característica significativa do AAV é que ele é um vírus extremamente estável e saudável. Ele resiste facilmente às condições usadas para inativar adenovírus (56º a 65ºC por várias ho- ras), tornando a preservação do frio do AAV menos crítica. O AAV po- de até ser liofilizado. Finalmente, as células infectadas com AAV não são resistentes à superinfecção.
[0097] Vários estudos demonstraram expressão de proteína medi- ada por AAV recombinante de longo prazo (> 1,5 anos) no músculo. Ver, Clark et al., Hum Gene Ther, 8: 659-669 (1997); Kessler et al., Proc Nat. Acad Sc. USA, 93: 14082-14087 (1996); e Xiao et al., J Virol, 70: 8098-8108 (1996). Ver também, Chao et al., Mol Ther, 2:619-623 (2000) e Chao et al., Mol Ther, 4:217-222 (2001). Além disso, como o músculo é altamente vascularizado, a transdução de AAV recombinan- te resultou no aparecimento de produtos de transgene na circulação sistêmica após injeção intramuscular, conforme descrito em Herzog et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 5804-5809 (1997) e Murphy et al. Proc Natl Acad Sci USA, 94: 13921- 13926 (1997). Além disso, Lewis et al., J Virol, 76: 8769-8775 (2002) demonstraram que as miofibras esqueléticas possuem os fatores celulares necessários para a correta glicosilação, dobramento e secreção do anticorpo, indicando que o músculo é capaz de expressão estável de terapêuticas proteicas se- cretadas. Os genomas de AAV recombinantes (rAAV) da invenção compreendem, consistem essencialmente em, ou consistem em uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína terapêutica (por exemplo, CFTR) e um ou mais ITRs de AAV flanqueando a molécula de ácido nucleico. O DNA de AAV nos genomas de rAAV pode ser de qualquer sorotipo de AAV para o qual um vírus recombinante pode ser derivado, incluindo, mas não limitado a, sorotipos de AAV AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV- 12, AAV-13, AAV PHP.B e AAV rh74. Produção de rA-
AVis pseudotipados descrita em, por exemplo, WO2001083692. Ou- tros tipos de variantes de rAAV, por exemplo, rAAV com mutações do capsídeo, também são contemplados. Ver, por exemplo, Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014). As sequências nucleo- tídicas dos genomas de vários sorotipos de AAV são conhecidas na técnica. Partículas do vetor AAV, proteínas do capsídeo e vetores AAV
[0098] São fornecidas neste documento partículas de vetor AAV, vetores AAV e proteínas do capsídeo que têm especificidade de tecido desejável e encontram uso na distribuição de uma variedade de car- gas terapêuticas, incluindo ácidos nucleicos e proteínas úteis no tra- tamento da doença. Proteínas do capsídeo de AAV
[0099] A invenção fornece partículas de AAV que possuem pro- priedades de alta eficiência de transferência gênica e tropismo de teci- do aumentado. A distribuição do vetor AAV atualmente depende do uso da seleção de sorotipo para direcionamento de tecido com base no tropismo natural do vírus ou pela injeção direta nos tecidos alvo. Se a distribuição sistêmica for necessária para alcançar o benefício tera- pêutico máximo, então a seleção de sorotipo é a única opção disponí- vel para direcionamento de tecido combinado com promotores especií- ficos de tecido. Muitos vetores AAV atualmente disponíveis são, por- tanto, subótimos para terapia gênica.
[00100] A presente invenção fornece sequências de proteína do capsídeo de AAV que conferem alta eficiência de transferência gênica e maior especificidade tecidual nos capsídeos de AAV que as compre- endem. Em modalidades, as sequências do capsídeo de AAV forneci- das neste documento foram geradas usando a plataforma geradora do capsídeo de AAV mostrada na Figura 1.
[00101] Em modalidades, a proteína do capsídeo VP1 compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos listadas na Tabela 1, ou uma sequência com até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos mu- tados, excluídos ou adicionados em comparação com qualquer uma das sequências de aminoácidos listadas na Tabela 1. Em aspectos, até 20 aminoácidos, até 30 aminoácidos ou até 40 aminoácidos podem ser mutados, excluídos ou adicionados em comparação com essas sequências. Em modalidades, a proteína do capsídeo VP1 é codifica- da por qualquer uma das sequências de ácido nucleico listadas na Ta- bela 1, ou uma sequência com até 5, até 10, até 30 ou até 60 altera- ções de nucleotídeos em qualquer uma das sequências de ácido nu- cleico listadas na Tabela 1. Tabela 1: Proteínas do capsídeo VP1 SEQ ID NO: de Amino- | NA SEQ ID NO: Nome do capsídeo ma vs RR Pos ns
[00102] Em modalidades, a proteina VP1 de AAV compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em uma sequência de ami- noácidos das SEQ ID NOs: 1-3, 30-34, 49 ou 84, ou uma sequência com até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos diferentes das SEQ ID NOs: 1-3, 30-34, 49 ou 84. São fornecidos também polinucleotídeos que codificam essas proteínas VP1. Em modalidades, os polinucleotí-
deos que codificam as proteínas VP1 compreendem, consistem es- sencialmente em, ou consistem na sequência de SEQ ID NOs: 15, 18- 23, 47, 82 e 98 ou uma sequência com até 5, até 10, ou até 30 altera- ções nucleotídicas nas SEQ ID NOs: 15, 18-23, 47, 82 e 98.
[00103] Em modalidades, a sequência do capsídeo de AAV é uma proteína do capsídeo de AAV-110 (SEQ ID NO: 1), proteína do capsí- deo de AAV204 (SEQ ID NO: 2), proteína do capsídeo de AAV214 (SEQ ID NO: 3) ou proteína do capsídeo de AAV ITB102 45 (SEQ ID NO: 49). Em modalidades, a proteína do capsídeo de AAV é uma vari- ante da proteína do capsídeo de AAV214. Em modalidades, a proteína do capsídeo de AAV é AAV214A (SEQ ID NO: 30), AAV-214-AB (SEQ ID NO: 84), AAV214e (SEQ ID NO: 31), AAV214e8 (SEQ ID NO: 32), AAV214e9 (SEQ ID NO: 33) ou AAV214e10 (SEQ ID NO: 34).
[00104] Sequências para proteínas VP2 e VP3 exemplares são for- necidas na Tabela 2 e Tabela 3. Dadas as sequências VP2 e VP3, as porções VP1 podem ser determinadas pelo alinhamento com a se- quência de proteína VP1 completa.
Tabela 2: Proteínas do capsídeo VP2 [sa IDNo de Amincácido Name —
[00105] Um ácido nucleico exemplar para ITB102 45 é a SEQ ID NO:47. Ácidos nucleicos exemplares para as outras porções VP2 do capsídeo podem ser derivados das porções correspondentes dos áci-
dos nucleicos da proteína do capsídeo VP1. Tabela 3: Proteínas do capsídeo VP3 SEQ ID NO: de Amino- | NA SEQ ID NO: Nome do capsídeo ts a E e pe
[00106] As proteínas VP3 de AAV214, AAV214e, AAV214e8, AAV214e9, AAV214e10 têm as mesmas sequências de aminoácidos (SEQ ID NO:41) e ácido nucleico (SEQ ID NO: 24).
[00107] Em modalidades, as proteínas VP2 de AAV compreendem, consistem essencialmente em, ou consistem em uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 35-40, 50 ou 85, ou uma sequência com até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos dife- rentes das SEQ ID NOs: 35-40, 50 ou 85. São fornecidos também po- linucleotídeos que codificam essas proteínas VP2. Em modalidades, o polinucleotídeo que codifica a proteína VP2 compreende, consiste es- sencialmente em, ou consiste na sequência de SEQ ID NO: 47, ou uma sequência com até 5, até 10, ou até 30 alterações nucleotídicas em SEQ ID NOs: 47.
[00108] Em modalidades, as proteínas VP3 de AAV compreendem, consistem essencialmente em, ou consistem em uma sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 17, 41-46, 51 ou 86, ou uma sequência com até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos diferentes das SEQ
ID NOs: 17, 41-46, 51 ou 86. São fornecidos também polinucleotídeos que codificam essas proteínas VP3. Em modalidades, os polinucleotí- deos que codificam as proteínas que compreendem, consistem essen- cialmente em, ou consistem na sequência de SEQ ID NOs: 16, 24-29, 48 e 83, ou uma sequência com até 5, até 10, ou até 30 alterações nu- cleotídicas nas SEQ ID NOs: 16, 24-29, 48 e 83.
[00109] Em modalidades, a proteína do capsídeo de AAV é uma proteína quimérica. Em modalidades, uma porção VP1, VP2 ou VP3 da proteína do capsídeo de AAV descrita neste documento pode ser substituída por uma porção VP1, VP2 ou VP3 de uma proteína do capsídeo de AAV diferente descrita neste documento.
[00110] Em modalidades, é fornecida neste documento uma proteí- na do capsídeo de AAV compreendendo um resíduo de leucina no aminoácido 129, um resíduo de asparagina no aminoácido 586 e um resíduo de ácido glutâmico no aminoácido 723, em que as posições de aminoácido na proteína do capsídeo de AAV são numeradas em rela- ção às posições de aminoácido na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em alguns casos, a proteína compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em outros casos, esses aminoácidos podem ser introduzidos em outras proteínas do capsídeo.
[00111] Em modalidades, é fornecida neste documento uma proteí- na do capsídeo VP1 de AAV compreendendo uma porção VP1, uma porção VP2 e uma porção VP3, em que a porção VP1 compreende um resíduo de leucina (L) no aminoácido 129, em que a porção VP2 com- preende um resíduo de treonina (T) ou asparagina (N) no aminoácido 157 e um resíduo de lisina (K) ou serina (S) no aminoácido 162, e em que a porção VP3 compreende resíduo de asparagina (N) no aminoá- cido 223, um resíduo de alanina (A) no aminoácido 224, um resíduo de histidina (H) no aminoácido 272, um resíduo de treonina (T) no amino- ácido 410, um resíduo de histidina (H) no aminoácido 724 e um resí-
duo de prolina (P) no aminoácido 734, em que as posições de aminoá- cidos na proteína do capsídeo de AAV são numeradas em relação às posições de aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 (ou seja, numeração de subunidade do capsídeo VP1).
[00112] Em modalidades, a porção VP1 compreende ainda um re- síduo de ácido aspártico (D) ou alanina (A) no aminoácido 24, em que as posições de aminoácidos na proteína do capsídeo de AAV são nu- meradas em relação às posições de aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. Em modalidades, a porção VP2 com- preende ainda um ou mais dentre (i) um resíduo de prolina (P) no ami- noácido 148; (ii) um resíduo de arginina (R) inserido no aminoácido 152; (iii) um resíduo de arginina (R) no aminoácido 168; (iv) um resí- duo de isoleucina (1) no aminoácido 189; e (v) um resíduo de serina (S) no aminoácido 200, em que as posições de aminoácido na proteína de capsídeo de AAV são numeradas em relação às posições de aminoá- cido na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[00113] Em modalidades, uma ou mais regiões variáveis de | a IX (ver Fig. 30) nas proteínas do capsídeo da porção VP3 descritas po- dem ser removidas e substituídas por regiões alternativas. As alterna- tivas adequadas são identificadas na tabela abaixo. A localização de- las, bem como a identidade de alternativas adicionais, pode ser identi- ficada pelo alinhamento com a SEQ ID NO:41, conforme mostrado na Fig. 30. Em modalidades, uma ou mais VRs podem ter uma inserção de 1, 2 ou 3 aminoácidos. Em modalidades, uma ou mais VRs podem ter uma deleção de 1, 2 ou 3 aminoácidos.
SASTGAS (SEQ ID NO. 52); NSTSGGSS (SEQ ID NO. 53);
OERRSASERADNA [5 fonvovkissato Na sa [nm ressteatoNa-s5
[00114] A invenção fornece ácidos nucleicos que codificam qual- quer uma das proteínas do capsídeo de AAV descritas neste docu- mento. A invenção também fornece vetores que compreendem qual- quer um dos ácidos nucleicos descritos neste documento.
[00115] Em modalidades, AAV é um sorotipo de AAV9. Sorotipos alternativos ou vírus do capsídeo modificados podem ser usados para otimizar o tropismo neuronal. Os vetores alternativos incluem: um vetor de sorotipo AAV9 modificado para maior tropismo neuronal do que o AAVO9 padrão, por exemplo, PHP.B, que usa um sistema de recombi- nação Cre-lox para identificar vetores neuronalmente direcionados. Alternativamente, o AAV9 PHP.B tem um aminoácido modificado 498 de VP1 de asparagina para lisina para reduzir o tropismo hepático. Ou- tras variantes de AAVrh74 que sofreram mutação de vários aminoáci- dos podem ser usadas para tropismo tecidual muito amplo, incluindo o cérebro. Vetores AAV
[00116] Os vetores AAV fornecem o ácido nucleico que se envolve na partícula do vetor AAV, incluindo elemento(s) envolvido(s) no con- trole da expressão dos ácidos nucleicos no sujeito, bem como as ITRs para facilitar a encapsulação. Em modalidades, os vetores AAV descri- tos neste documento compreendem pelo menos uma sequência de ácido nucleico heterólogo (HNA), que, quando expressa em uma célu- la de um sujeito, é eficaz para tratar uma doença ou distúrbio. Em modalidades, a sequência de HNA compreende um transgene. Em modalidades, os vetores AAV compreendem pelo menos uma sequên-
cia de ITR e pelo menos um transgene. Em modalidades, o transgene codifica uma proteína terapêutica ou um RNA terapêutico.
[00117] Em modalidades, o controle da expressão do transgene na célula hospedeira pode ser regulado por elementos reguladores conti- dos dentro do vetor AAV, incluindo sequências promotoras e sítios po- li-A. Em modalidades, o vetor AAV também pode codificar um peptídeo sinal. Em formas de realização, os vetores AAV têm repetições termi- nais invertidas (ITRs) 5' e 3. A ITR 5' está localizada a montante de um promotor, que, por sua vez, está a montante do transgene. Em modalidades, as ITR 5' e 3' têm a mesma sequência. Em certas moda- lidades, elas têm uma sequência diferente. Em modalidades, um vetor AAV da invenção pode compreender, na orientação 5' a 3', uma pri- meira (5') ITR, um promotor, um transgene, um sítio poli-A e uma se- gunda (3') ITR.
[00118] Em modalidades, o vetor AAV tem a sequência nucleotídica mostrada na SEQ ID NO: 88 (pA CF1), SEQ ID NO: 89 (pA CF3), SEQ ID NO: 90 (pA CF5), ou SEQ ID NO: 91 (pA CF7). Esses veto- res contêm os seguintes componentes: Nome do | Promotor Peptídeo | CETRAR plasmídeo sinal pA-CF1 Uia nenhum | completo | nenhum CFTRAR otimizado para códon pA-CF3 Uia nenhum | completo | nenhum CFTRAR otimizado para códon pA-CF5 H1 mut. nenhum | completo | nenhum CFTRAR otimizado para códon pA-CF7 H1 mut. nenhum | completo | nenhum CFTR otimizado para códon (tamanho total)
[00119] Em modalidades, o HNA (por exemplo, um HNA compreen- dendo um transgene) está operacionalmente ligado a um promotor constitutivo. O promotor constitutivo pode ser qualquer promotor cons- titutivo conhecido na técnica e/ou fornecido neste documento. Em mo-
dalidades, o promotor constitutivo compreende, consiste essencial- mente em, ou consiste em um promotor de LTR do vírus sarcoma Rous (VSR) (opcionalmente com o potenciador do VSR), um promotor de citomegalovírus (CMV), um promotor SV40, um promotor de di- hidrofolato redutase, um promotor de beta-actina, um promotor de fos- foglicerol quinase (PGK), um promotor de U6, um promotor de H1, um promotor de beta actina de frango híbrido, um promotor MeCP2, um promotor de H1, um promotor de U1a, um promotor de mMeP418, um promotor mMeP426, um promotor de MeCP2 mínimo, um promotor de CAG, ou um promotor de EF1. É conhecido na técnica que as sequên- cias nucleotídicas de tais promotores podem ser modificadas a fim de aumentar ou diminuir a eficiência da transcrição de mRNA. Ver, por exemplo, Gao et al. (2018) Mol. Ther.: Nucleic Acids 12:135-145 (mo- dificando a caixa TATA de promotores 7SK, U6 e H1 para abolir a transcrição da RNA polimerase Ill e estimular a transcrição do MRNA dependente da RNA polimerase Il). Em modalidades, a sequência de HNA está operacionalmente ligada a um promotor de controle especií- fico de tecido, ou um promotor induzível. Em modalidades, o promotor de controle específico ao tecido é um promotor específico de célula do sistema nervoso central (SNC), um promotor específico ao pulmão, um promotor específico à pele, um promotor específico ao músculo, um promotor específico ao fígado, um promotor específico ao olho (por exemplo, um promotor de VMD2 ou mRho).
[00120] Em modalidades, o promotor pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir em um polinucleotídeo com a sequên- cia da SEQ ID NO: 96 (promotor de U1 de camundongo) ou uma SEQ ID NO: 97 (um promotor de H1). Em modalidades, o promotor é um promotor de U1a ou U1b, promotor de EF1 ou CBA (beta-actina de galinha). Em modalidades, o promotor pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir em qualquer uma das sequências de ácido nucleico listadas na Tabela 5, ou uma sequência com até 5, até 10, ou até 30 alterações nucleotídicas em qualquer uma das sequên- cias de ácido nucleico listadas na Tabela 5.
Tabela 5: Nome do promotor SEQ ID No. de im ento Promotor híbrido de B-actina de galinha CBh (o promotor de | 154 E a meiro éxon de CBA e íntron parcial)
[00121] Em modalidades, a sequência de HNA é operativamente ligada a um elemento regulador adicional. O elemento regulador adici- onal pode ser um elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite da marmota ("WPRE"). Em modalidades, vetores AAV podem compreender componentes reguladores adequados para crescimento e cultura do vetor em um hospedeiro bacteriano para fins de produção de vetor. Por exemplo, o vetor pode compreender genes para resis- tência a antibióticos e manutenção do plasmídeo em bactérias, bem como elementos reguladores associados para controlar a expressão de proteína em bactérias.
[00122] Em modalidades, a sequência de HNA está operacional- mente ligada a um sítio poli-A. O sítio de poliadenilação compreende,
consiste essencialmente em ou consiste em um sítio poli-A de MeCP?2, um sítio poli-A de retinol desidrogenase 1 (RDH1), um sítio poli-A de hormônio de crescimento bovino (BGH), um sítio poli-A de SV40, um sítio poli-A de SPA49, um sítio poli-A de SNRP-TK65, um sítio poli-A de sSNRP, ou um sítio poli-A de TK65. Uma sequência de poli-A de SPA49 exemplar é descrita em Ostedgaard et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA (22 de fevereiro de 2005) 102:2952-2957, incorporado neste documento por referência. Ácidos nucleicos heterólogos (HNA)
[00123] Os vetores AAV descritos neste documento infectam e distri- buem um ou mais ácidos nucleicos heterólogos (HNA) aos tecidos al- vo. Em modalidades, as sequências de HNA são transcritas e, opcio- nalmente, traduzidas nas células do tecido alvo.
[00124] Em alguns casos, o HNA codifica um RNA antisense, mi- CroRNA, siRNA ou RNA guia (gRNA). A tecnologia CRISPR tem sido usada para direcionar o genoma de células vivas para modificação. A proteína Cas9 é uma grande enzima que deve ser distribuída eficien- temente aos tecidos e células alvo para mediar o reparo do gene atra- vés do sistema CRISPR e os protocolos atuais de correção do gene CRISPR/Cas9 sofrem de uma série de desvantagens. A expressão de longo prazo de Cas9 pode provocar respostas imunes do hospedeiro. Um RNA guia adicional pode ser distribuído através de um vetor sepa- rado devido a restrições de empacotamento. Em modalidades, o HNA codifica uma proteína Cas9 ou um equivalente desta.
[00125] Em modalidades, o HNA compreende um transgene que co- difica uma proteína, que pode ser expressa em células de um sujeito para tratar uma doença ou um distúrbio, resultante da atividade redu- zida ou eliminada da proteína nativa. Assim, em modalidades, o trans- gene pode codificar uma proteína selecionada do regulador de condu- tância transmembrana de fibrose cística (CFTR), N-acetil-alfa-
glicosaminidase (NAGLU), N-sulfoglicosamina sulfo-hidrolase (SGSH), tioesterase 1 de proteína palmitoil (PPT1), sobrevida do neurônio mo- tor 1, telomérico (SMN1), fosfatase alcalina, biomineralização associa- da (ALPL, também conhecida como TNALP), fator neurotrófico deriva- do de células gliais (GDNF), glucosilceramidase beta (GBA1), iduroni- dase alfa-L- (IDUA), membro 2 da subfamília V da família 4 do cito- cromo P450 (CYP4V2), retinosquisina 1 (RS1), fosfodiesterase 6B (PDEG6B), proteína de ligação a metil-CpG 2 (MeCP2), rodopsina (Rho), ou lipofuscinose ceroide, neuronal, 1 (CLN1).
[00126] Em modalidades, o transgene codifica um CFTR. Em mo- dalidades, o CFTR compreende uma sequência mutante, uma sequên- cia otimizada para códon e/ou uma sequência truncada de CFTR. Se- quências de CFTR adequadas exemplares são descritas na Pub. de Pa- tente U.S. n.º 20110035819, que é incorporado neste documento por re- ferência em sua totalidade. Em modalidades, o CFTR compreende uma deleção de aminoácidos 708-759 ("CFTRAR"). Ver Ostedgaard et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA (22 de fevereiro de 2005) 102:2952-2957, in- corporado neste documento por referência em sua totalidade.
[00127] Em modalidades, um transgene compreende, consiste es- sencialmente em, ou consiste em um ácido nucleico tendo a sequência da SEQ ID NO: 4 (um CFTRAR otimizado para códon) ou SEQ ID NO: 93 (CFTR otimizado para códon de comprimento total), ou uma se- quência tendo até 5, até 10, ou até 30 alterações nucleotídicas na SEQ ID No 4 ou 93. Em modalidades, o transgene codifica uma prote- Ína que compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em um aminoácido com a sequência da SEQ ID NO: 95 (um CFTRAR) ou SEQ IS NO: 94 (CFTR de comprimento total), ou uma sequência com até 1, 2,3,4,5,6,7,8,9 ou 10 aminoácidos diferentes da SEQ ID NO: 94 ou 95.
[00128] Em modalidades, o transgene codifica uma proteína de transmembrana lisossômica/endossômica CLN3, proteína battenina (CLN3), alfa-galactosidase A (GLA), ou alfa-acido-palaglucosidase (GAA),.
[00129] Em modalidades, a proteína GAA é codificada por uma se- quência nucleotídica de SEQ ID NOs: 5, 6 ou 7, ou uma sequência com até 5, até 10 ou até 30 alterações nucleotídicas nas SEQ ID No 5, 6 ou 7. Em modalidades, a proteína GAA compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, ou uma sequência com até 1,2,3, 4,5,6,7,8,9 ou 10 aminoácidos diferentes da SEQ ID NO.8.
[00130] Em modalidades, a proteína GLA é codificada por uma se- quência nucleotídica SEQ ID NO: 9 ou 10, ou uma sequência com até 5, até 10, ou até 30 alterações nucleotídicas na SEQ ID No 9 ou 10. Em modalidades, a proteína GLA compreende uma sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 11, ou uma sequência com até 1,2,3,4,5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos diferentes da SEQ ID No 11.
[00131] Em modalidades, a proteína CLN3 é codificada por uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 12 ou 13, ou uma sequência com até 5, até 10 ou até 30 alterações nucleotídicas na SEQ ID No 12 ou 13. Em modalidades, a proteína CLN3 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14, ou uma sequência com até 1,2,3, 4,5,6,7,8,9 ou 10 aminoácidos diferentes da SEQ ID No 14.
[00132] Em modalidades, o transgene compreende qualquer uma das sequências de ácido nucleico listadas na Tabela 4, ou uma se- quência com até 5, até 10, ou até 30 alterações nucleotídicas em qualquer uma das sequências de DNA na Tabela 4. Em modalidades, o transgene codifica qualquer uma das sequências de aminoácidos listadas na Tabela 4, ou uma sequência com até 1, 2, 3,4, 5,6,7,8,9 ou 10 aminoácidos diferentes de qualquer uma das sequências de aminoácidos listadas na Tabela 4.
Tabela 4 Ácido nucleico | codificado por transgene [Sufogicosamina sufo-iarolase (ESA fmBRE TNREo A . tremidade C s CO1-TNALP 108 138 Otimizado para códon, contém ui laomememedo | CO2-TNALP 109 138 Otimizado para códon, contém
RS MA A PEC AA
Nome do transgene SEQ ID Nos. de | SEQID Nos. de aminoácido | Características Si ASAONIOUCo jeoafeadopartamsne 1
SE CR AA [Ácido Afa-Glicosidase (BRA) so Naa | ore q E jomizadoparacádom | [8086 E fe eme O [oa is e rr jotmizado paracódon o &
S AR (CFTRAR) deleção de domínio R Regulador transmembrana de fibrose cística (CFTR) | 133 151 Otimizado para códon, compri- iemmemen dote e AT ne E em
[00133] Em modalidades, o transgene compreende uma sequência de ácido nucleico estabelecida em qualquer uma das SEQ ID No 99- 133, ou uma sequência com até 5, até 10, ou até 30 alterações nucleo- tídicas em qualquer uma das SEQ ID No 99-133. Em modalidades, o transgene codifica uma sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID n. 134-151, ou uma sequência com até 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos diferentes de qualquer uma das sequências de aminoácidos SEQ ID n. 134-151.
[00134] Em modalidades, o ácido nucleico heterólogo codifica uma proteína repórter; por exemplo, uma proteína fluorescente. Métodos de Produção de Vetores Virais AAV
[00135] Uma variedade de abordagens pode ser usada para produzir vetores virais AAV. Em modalidades, o empacotamento é obtido usan- do um vírus auxiliar ou plasmídeo auxiliar e uma linhagem celular. O vírus auxiliar ou plasmídeo auxiliar contém elementos e sequências que facilitam a produção do vetor viral. Em outro aspecto, o plasmídeo auxiliar é estavelmente incorporado no genoma de uma linhagem celu- lar empacotadora, de modo que a linhagem celular empacotadora não requer transfecção adicional com um plasmídeo auxiliar.
[00136] Em modalidades, a célula é uma linhagem de células empa- cotadoras ou auxiliares. Em modalidades, em aspectos, a linhagem celular auxiliar é célula eucariótica; por exemplo, uma célula HEK 293 ou célula 293T. Em modalidades, a célula auxiliar é uma célula de le- vedura ou uma célula de inseto.
[00137] Em modalidades, a célula compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína ativadora de tetraciclina; e um promotor que regula a expressão da proteína ativadora de tetraciclina. Em modalida- des, o promotor que regula a expressão da proteína ativadora de tetraci- clina é um promotor constitutivo. Em modalidades, o promotor é um pro- motor de fosfoglicerato quinase (PGK) ou um promotor de CMV.
[00138] Um plasmídeo auxiliar pode compreender, por exemplo, pelo menos uma sequência de DNA auxiliar viral derivada de um genoma viral incompetente de replicação que codifica em trans todas as proteí- nas de vírion necessárias para empacotar um AAV incompetente de replicação e para produzir proteínas de vírion capazes de empacotar o AAV incompetente de replicação em título alto, sem a produção de AAV competente de replicação.
[00139] Os plasmídeos auxiliares para empacotamento de AAV são conhecidos na técnica, ver, por exemplo, Pub. de Patente U.S. n.º 2004/0235174 A1, incorporada neste documento por referência. Con- forme declarado neste documento, um plasmídeo auxiliar de AAV po- de conter como sequências de DNA do vírus auxiliar, a título de exem- plo não limitante, os genes de Ad5 E2A, E4 e VA, controlados por seus respectivos promotores originais ou por promotores heterólogos. Os plasmídeos auxiliares de AAV podem conter adicionalmente um casse- te de expressão para a expressão de uma proteína marcadora, tal co- mo uma proteína fluorescente, para permitir a simples detecção de transfecção de uma célula alvo desejada.
[00140] A invenção fornece métodos de produção de partículas de AAV compreendendo transfectar uma linhagem celular de empacota- mento com qualquer um dos plasmídeos auxiliares de AAV descritos neste documento; e qualquer um dos vetores de AAV descritos neste documento. Em modalidades, o plasmídeo auxiliar de AAV e vetor AAV são cotransfectados na linhagem celular de empacotamento. Em modalidades, a linhagem celular é uma linhagem celular de mamiífe- ros, por exemplo, linhagem celular 293 de rim embrionário humano (HEK). A invenção fornece células que compreendem qualquer um dos vetores AAV e/ou partículas de AAV descritos neste documento. Composições farmacêuticas
[00141] A invenção fornece composições farmacêuticas compreen-
dendo qualquer um dos vetores AAV, capsídeos de AAV e/ou partícu- las de AAV descritas neste documento. Normalmente, as partículas de AAV são administradas para terapia.
[00142] A composição farmacêutica, conforme descrita neste docu- mento, pode ser formulada por quaisquer métodos conhecidos ou de- senvolvidos na técnica de farmacologia, que incluem, mas sem limita- ção, contatar os ingredientes ativos (por exemplo, partículas virais ou vetores recombinantes) com um excipiente ou outro ingrediente aces- sório, dividindo ou empacotando o produto em uma unidade de dose. As partículas virais desta invenção podem ser formuladas com carac- terísticas desejáveis, por exemplo, estabilidade aumentada, transfec- ção celular aumentada, liberação sustentada ou retardada, biodistri- buições ou tropismos, tradução modulada ou potencializada da proteí- na codificada in vivo e o perfil de liberação da proteína codificada in vivo.
[00143] Como tal, a composição farmacêutica pode compreender ainda solução salina, lipoides, lipossomas, nanopartículas lipídicas, polímeros, lipoplexos, nanopartículas core-shell, peptídeos, proteínas, células transfectadas com vetores virais (por exemplo, para transplan- te em um sujeito), imitações de nanopartículas ou combinações dos mesmos. Em modalidades, a composição farmacêutica é formulada como uma nanopartícula. Em modalidades, a nanopartícula é uma na- nopartícula de ácido nucleico automontada.
[00144] “Uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser preparada, embalada e/ou vendida a granel, como uma dose unitária única e/ou como uma pluralidade de doses unitárias únicas. A quantidade do ingrediente ativo é geralmente igual à dosa- gem do ingrediente ativo que seria administrada a um sujeito e/ou uma fração conveniente de tal dosagem, tal como, por exemplo, um meio ou um terço de tal dosagem. As formulações da invenção podem inclu-
ir um ou mais excipientes, cada um em uma quantidade que aumenta a estabilidade do vetor viral, aumenta a transfecção ou transdução ce- lular pelo vetor viral, aumenta a expressão da proteína codificada pelo vetor viral e/ou altera o perfil de liberação de proteínas codificadas pe- lo vetor viral. Em modalidades, a composição farmacêutica compreen- de um excipiente. Exemplos não limitantes de excipientes incluem sol- ventes, meios de dispersão, diluentes ou outros veículos líquidos, auxi- liares de dispersão ou suspensão, agentes ativos de superfície, agen- tes isotônicos, agentes espessantes ou emulsificantes, conservantes ou combinação dos mesmos.
[00145] Em modalidades, a composição farmacêutica compreende um crioprotetor. O termo "crioprotetor" refere-se a um agente capaz de reduzir ou eliminar danos a uma substância durante o congelamento. Exemplos não limitantes de crioprotetores incluem sacarose, trealose, lactose, glicerol, dextrose, rafinose e/ou manitol. Métodos Terapêuticos
[00146] Esta invenção fornece métodos de prevenção ou tratamen- to de um distúrbio, compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em administrar a um sujeito uma quantidade terapeuti- camente eficaz de qualquer uma das composições farmacêuticas des- critas neste documento.
[00147] Em modalidades, o distúrbio é um distúrbio do SNC, um distúrbio da pele, um distúrbio pulmonar, um distúrbio muscular, um distúrbio hepático ou uma doença oftálmica (ou uma doença da retina). Em modalidades, o distúrbio é fibrose cística.
[00148] Em modalidades, o distúrbio é hipofosfatasia, esclerose late- ral amiotrófica (ALS), atrofia muscular espinhal (SMA), epidermólise bolhosa distrófica recessiva (RDEB), distúrbio de armazenamento |i- sossomal (incluindo distrofia muscular de Duchenne e distrofia muscu- lar de Becker), doença de Batten juvenil, doença de Batten infantil au-
tossômica,, distrofia muscular, distrofia cristalina de Bietti, retinosquise (por exemplo, degenerativa, hereditária, tracional, exsudativa), hemofi- lia A, hemofilia B, esclerose múltipla, diabetes mellitus, doença de Fa- bry, doença de Pompe, lipofuscinose ceroide neuronal 1 (CLN1), do- ença CLN3 ( ou Lipofuscinose Neuronal Ceroide Juvenil), doença de Gaucher, câncer, artrite, perda muscular, doença cardíaca, hiperplasia intimal, síndrome de Rett, epilepsia, doença de Huntington, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, uma doença autoimune, fibrose císti- ca, talassemia, Síndrome de Hurler (MPS IH), síndrome de Sly, sín- drome de Scheie, síndrome de Hurler-Scheie, síndrome de Hunter, síndrome de Sanfilippo A (mucopolissacaridose IIIA ou MPS IIIA), Sín- drome de Sanfilippo B (mucopolissacaridose IIIB ou MPS IIIB), Sín- drome de Sanfilippo C, Síndrome de Sanfilippo D, Síndrome de Mor- quio, Síndrome de Maroteaux-Lamy, doença de Krabbe, fenilcetonúria, ataxia cerebral espinhal, deficiência de receptor de LDL, hiperamone- mia, anemia, artrite ou deficiência de adenosina desaminase.
[00149] Além dos transgenes específicos descritos neste documento, sequências enzimáticas ativas conhecidas podem ser usadas como transgenes para fornecer atividade enzimática funcional.
[00150] Um dos desafios para o tratamento da fibrose cística é a restrição de tamanho no empacotamento de um gene CFTR em uma partícula viral e a dificuldade de distribuição de partículas virais para as células pulmonares. As partículas de AAV desta invenção resolvem esses problemas fornecendo construtos de transgene de CFTR que são eficientemente empacotados e têm melhor tropismo pulmonar. Portanto, nas modalidades, a invenção fornece composições e méto- dos para tratar a fibrose cística.
[00151] Em modalidades, o distúrbio é a doença de CLN3. A doen- ça de CLN3 ou lipofuscinose Ceroide Neuronal Juvenil é uma doença de armazenamento lisossômico causada por uma mutação autossômi-
ca herdada recessivamente no gene CLN3. A doença de CLN3 é um distúrbio neurodegenerativo progressivo no qual o sistema nervoso central (SNC) é muito afetado, resultando em problemas comporta- mentais, perda de visão e outras deficiências cognitivas.
[00152] Em modalidades, o distúrbio é a doença de Fabry. A doen- ça de Fabry é um distúrbio do armazenamento lisossômico ligado ao cromossomo X causado por uma deficiência na atividade da alfa- galactosidase A (GLA) que resulta no acúmulo dos produtos glicolipí- dicos, globotriaosilceramida (Gb3) e Iyso-Gb3 no lisossoma. A apre- sentação da doença é altamente heterogênea, mas geralmente inclui episódios frequentes de dor neurotrófica periférica, angioqueratomas, produção reduzida de suor, distrofia córnea e complicações gastroin- testinais. À medida que a doença progride, os pacientes sofrem de cardiomiopatia, insuficiência renal e doença cerebrovascular, todas as quais são as causas primárias da redução da vida em pacientes com doença de Fabry. Embora os homens sejam a população mais grave- mente afetada de pacientes com mutações no gene GLA, tornou-se cada vez mais claro que pacientes do sexo feminino também são sin- tomáticos, mas são frequentemente diagnosticados incorretamente. À terapia de reposição enzimática (ERT) é atualmente a única terapia aprovada pela FDA para tratar a doença de Fabry e requer injeções bissemanais de quantidades relativamente grandes de proteína re- combinante. Embora a TRE reduza o acúmulo de Gb3 no coração, rim e vasculatura, ela não consegue tratar completamente todos os sinto- mas de Fabry, principalmente devido à sua incapacidade de entrar efi- cientemente no SNC. As estratégias de terapia genética foram investi- gadas e, embora muitas mostrem grande promessa na correção do acúmulo de glicolipídios, a maioria não conseguiu entrar eficientemen- te no SNC e também sofreu de uma resposta imune frequentemente observada durante a substituição de GLA.
[00153] Em modalidades, os vetores virais AAV descritos neste do- cumento são usados para tratar a doença de Fabry em pacientes que não respondem à ERT, ou quando a ERT não consegue tratar todos os sintomas. Em modalidades, os vetores virais AAV descritos neste documento são usados para tratar a doença de Fabry em pacientes que já receberam ERT.
[00154] Em modalidades, o distúrbio é doença de Pompe. A doença de Pompe é um distúrbio de armazenamento lisossômico causado por uma deficiência na atividade da a-glicosidade ácida (GAA) que resulta no acúmulo de glicogênio no lisossoma. A doença apresenta-se como uma forma de distrofia muscular que afeta primariamente a musculatu- ra lisa e estriada, bem como o sistema nervoso central (SNC), com mortalidade precoce. A terapia de reposição enzimática (ERT) é atu- almente a única terapia aprovada pela FDA para tratar Pompe e re- quer injeções bissemanais de quantidades relativamente grandes de proteína recombinante. Embora a TRE reduza significativamente a ta- xa de mortalidade de pacientes com Pompe infantil, que normalmente morrem aos dois anos de idade sem terapia, ela não melhora comple- tamente todos os sintomas de Pompe, principalmente devido à sua incapacidade de entrar eficientemente no SNC e às respostas imunes resultantes à proteína GAA. As estratégias de terapia genética foram investigadas e, embora muitas mostrem grande promessa na correção do acúmulo de glicogênio e outros sintomas de Pompe. A maioria so- freu com a resposta imune grave observada durante a substituição de GAA. Trabalhos anteriores demonstraram que a expressão hepática específica pode fazer com que os animais tolerem a proteína GAA e reduzam significativamente a resposta humoral.
[00155] Em modalidades, os vetores virais AAV descritos neste do- cumento são usados para tratar a doença de Pompe em pacientes que já receberam TRE; por exemplo, aqueles que não respondem à TRE,
ou quando a TRE não aborda todos os seus sintomas.
[00156] Em modalidades, o câncer é um câncer sólido; por exem- plo, de bexiga, mama, cervical, cólon, retal, endometrial, de rim, lábio, oral, de fígado, melanoma, mesotelioma, pulmão de células não pe- quenas, pele não melanoma, ovário, pancreático, de próstata, sarco- ma, tumor de pulmão de pequenas células ou tireoide.
[00157] Em modalidades, o distúrbio é uma doença oftálmica. O olho é um tecido imune privilegiado. Apenas um número muito peque- no de vírus é necessário para benefício terapêutico. Em modalidades, a doença oftálmica afeta as células fotorreceptoras e de RPE. Em al- gumas modalidades, a doença oftálmica compreende, consiste essen- cialmente em, ou consiste em retinite pigmentosa (por exemplo, autos- sômico recessivo (gene SPATA7; gene LRAT; gene TULP1), autos- sômico dominante (gene AIPL1), e ligada ao X (gene RPGR)), distúr- bios oculares relacionados a mutações no gene da bestrofina-1 (BEST-1) (por exemplo, distrofia macular viteliforme, degeneração ma- cular relacionada à idade, vitreorretinocoroidopatia autossômica domi- nante, glaucoma, catarata), amaurose congênita de Leber (ACL; gene do tipo proteína 1 de interação aril-hidrocarboneto (AIPL1), distrofia da haste cônica (CRD; gene ABCA4), Stargardt (gene ABCAA4), coroide- remia (gene CHM), Síndrome de Usher (gene MYO7A; gene CDH23; gene USH2A; gene CLRN1), retinosquise (gene RS1), Distrofia Crista- lina de Bietti (gene CYP4V2) ou Acromatópsia (gene CNGA3, gene CNGB3, gene GNAT2, gene PDEG6C, ou gene PDE6H).
[00158] Em modalidades, o sujeito é um mamífero; por exemplo, um humano. Em aspectos específicos, o humano é um humano infan- til; por exemplo, com menos de 3 anos de idade, 2 anos de idade ou menos de 1 ano de idade.
[00159] Os métodos de tratamento e prevenção descritos neste do- cumento podem ser combinados com técnicas de diagnóstico apropri-
adas para identificar e selecionar pacientes para a terapia ou preven- ção. Por exemplo, o método de tratamento ou prevenção de um dis- túrbio, por exemplo, fibrose cística, descrito neste documento, pode compreender ainda etapas de realização de um teste genético para identificar uma mutação genética ou deleção relacionada ao distúrbio no sujeito. Em modalidades, o método de tratamento ou prevenção de um distúrbio, por exemplo, fibrose cística, compreende administrar a um sujeito que foi previamente identificado como portador de uma mu- tação relacionada ao distúrbio, ou como estando em alto risco de de- senvolver o distúrbio (por exemplo, com base em fatores hereditários).
[00160] A invenção fornece métodos de aumento do nível de uma proteína em uma célula hospedeira, compreendendo o contato da cé- lula hospedeira com qualquer uma das partículas de AAV descritas neste documento, em que a partícula de AAV compreende qualquer um dos vetores de AAV descritos neste documento, compreendendo uma sequência de HNA que codifica a proteína. Em modalidades, a proteína é uma proteína terapêutica. Em modalidades, a célula hospe- deira é in vitro, in vivo ou ex vivo. Em modalidades, a célula hospedei- ra é derivada de um sujeito. Em modalidades, o sujeito sofre de um distúrbio, o que resulta em um nível e/ou funcionalidade reduzidos da proteína, em comparação com o nível e/ou funcionalidade da proteína em um sujeito normal.
[00161] Em modalidades, o nível da proteína é aumentado para um nível de cerca de 1 x10 ng, cerca de 3 x10” ng, cerca de 5 x10” ng, cerca de 7 x10”7 ng, cerca de 9 x107 ng, cerca de 1 x10 ng, cerca de 2 x10º ng, cerca de 3 x10º ng, cerca de 4 x10 ng, cerca de 6 x10º ng, cerca de 7 x10º ng, cerca de 8 x10 ng, cerca de 9 x10 ng, cerca de 10 x10 ng, cerca de 12 x10 ng, cerca de 14 x10* ng, cerca de 16 x10* ng, cerca de 18 x10º ng, cerca de 20 x10* ng, cerca de 25 x10º ng, cerca de 30 x10 ng, cerca de 35 x10* ng, cerca de 40 x10* ng,
cerca de 45 x10* ng, cerca de 50 x10 ng, cerca de 55 x10 ng, cerca de 60 x10* ng, cerca de 65 x10 ng, cerca de 70 x10* ng, cerca de 75 x10 ng, cerca de 80 x10* ng, cerca de 85 x10 ng, cerca de 90 x106 ng, cerca de 95 x10 ng, cerca de 10 x10* ng, cerca de 20 x10* ng, cerca de 30 x10* ng, cerca de 40 x10* ng, cerca de 50 x10º* ng, cerca de 60 x10* ng, cerca de 70 x10* ng, cerca de 80 x10º ng, ou cerca de 90 x10* ng na célula hospedeira.
[00162] A invenção fornece métodos de introdução de um gene de interesse a uma célula em um sujeito que compreende o contato da célula com uma quantidade eficaz de qualquer uma das partículas do vetor viral AAV descritas neste documento, em que a partícula contém qualquer um dos vetores AAV descritos neste documento, compreen- dendo o gene de interesse. Dosagem e administração
[00163] Métodos para determinar os meios mais eficazes e dosa- gem de administração são conhecidos por aqueles versados na técni- ca e irão variar com a composição usada para terapia, o objetivo da terapia e o sujeito sendo tratado. Administrações únicas ou múltiplas podem ser realizadas com o nível de dose e padrão selecionados pelo médico responsável pelo tratamento. É observado que a dosagem po- de ser afetada pela via de administração. Formulações de dosagem adequadas e métodos de administração dos agentes são conhecidos na técnica. Exemplos não limitantes de tais dosagens adequadas po- dem ser tão baixos quanto 10º genomas de vetor a até 10!” genomas de vetor por administração.
[00164] Nas modalidades dos métodos descritos neste documento, o número de partículas virais (por exemplo, AAV) administradas ao sujeito varia de cerca de 10º a cerca de 10”. Particularmente em al- gumas modalidades, cerca de 10"º a cerca de 10º, cerca de 10º a cerca de 10º?, cerca de 10" a cerca de 10*?, cerca de 10º a cerca de
104, cerca de 5 x 10º a cerca de 5 x 10º? ou cerca de 10? a cerca de 103 partículas virais são administradas ao sujeito. Para administração a um olho humano, uma dose total de cerca de 1 x 10*º vg/olho pode ser usada e uma dose total de 5 x 10º vg/olho pode ser usada para um olho de camundongo. Técnicas de imagem in vivo não invasivas po- dem ser usadas para monitorar a eficácia/segurança em animais, que incluem, entre outros, oftalmoscopia a laser por varredura (SLO), to- mografia de coerência óptica (OCT), microscopia multifotônica, angio- grafia com fluoresceína.
[00165] Nas modalidades, as partículas de AAV reparam a deficiên- cia genética em um sujeito. Nas modalidades, a razão entre polinucle- otídeo ou polipeptídeo alvo reparado e polinucleotídeo ou polipeptídeo alvo não reparado em uma célula, tecido, órgão ou sujeito tratado com sucesso é de pelo menos cerca de 1,5:1, cerca de 2:1, cerca de 3:1, cerca de 4:1, cerca de 5:1, cerca de 6:1, cerca de 7:1, cerca de 8:1, cerca de 9:1, cerca de 10:1, cerca de 20:1, cerca de 50:1, cerca de 100:1, cerca de cerca de 1000:1,cerca de 10,000:1, cerca de
100.000:1 ou cerca de 1.000,000:1. A quantidade ou razão de polinu- cleotídeo ou polipeptídeo alvo reparado pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado a Western blot, Northern blot, Southern blot, PCR, sequenciamento, es- pectrometria de massa, citometria de fluxo, imuno-histoquímica, imu- nofluorescência, hibridização fluorescente in situ, sequenciamento de próxima geração, imunoblot e ELISA.
[00166] Nas modalidades, a partícula viral é introduzida ao sujeito por via intravenosa, intratecal, intracerebral, intraventricular, intranasal, intratraqueal, intra-aural, intraocular ou periocular, oral, retal, transmu- cosa, por inalação, por via transdérmica, parenteral, subcutânea, intra- dérmica, intramuscular, intrapleural, tópica, intralinfática, intracisternal; tal introdução também pode ser intra-arterial, intracardíaca, subventri-
cular, epidural, intracerebral, intracerebroventricular, sub-retiniana, in- travítrea, intra-articular, intraperitoneal, intrauterina ou qualquer combi- nação destas. Nas modalidades, as partículas virais são distribuídas a um tecido alvo desejado, por exemplo, para o pulmão, olho ou SNC, como exemplos não limitantes. Nas modalidades, a distribuição de partículas virais é sistêmica. A via de administração intracisternal en- volve a administração de um medicamento diretamente no líquido ce- falorraquidiano dos ventrículos cerebrais. Ela pode ser realizada por injeção direta na cisterna magna ou através de um tubo posicionado permanentemente.
[00167] Para tratar uma doença oftálmica (ou um distúrbio ocular) por via intraocular, existem vários modos de administração conhecidos pelos versados na técnica, incluindo, mas não limitados a: administra- ção na glândula lacrimal (GL), colírio tópico, administração intraestro- mal à córnea, administração intracameral (câmara anterior), adminis- tração intravítrea, administração sub-retiniana, administração sistêmica ou uma combinação destes. 80% de distúrbios genéticos oculares ocorrem nos fotorreceptores. A administração intravítrea de terapias genéticas de pequeno volume pode ocorrer em uma clínica ambulato- rial.
[00168] A administração do vetor de AAV, partícula de AAV ou composições desta invenção pode ser efetuada em uma dose, contí- nua ou intermitentemente ao longo do curso do tratamento. Nas moda- lidades, o vetor de AAV, partícula de AAV ou composições desta in- venção são administrados por via parentérica por injeção, infusão ou implantação.
[00169] Nas modalidades, as partículas de AAV desta invenção mos- tram tropismo aumentado para cérebro e coluna cervical. Nas modali- dades, as partículas virais da invenção podem atravessar a barreira hematoencefálica (BHE). Nas modalidades, as partículas de AAV des-
ta invenção mostram alto tropismo retiniano por injeções sub- retinianas e intravítreas. Nas modalidades, as partículas de AAV desta invenção visam vários tipos de células oculares, como, por exemplo, cones, hastes e epitélio pigmentar da retina (RPE). Nas modalidades, as partículas de AAV desta invenção escapam de anticorpos neutrali- zantes contra sorotipos naturais e, assim, permitem a redosagem po- tencial. Em um aspecto adicional, as partículas e composições de AAV da invenção podem ser administradas em combinação com outros tra- tamentos conhecidos para o distúrbio sendo tratado. Kits
[00170] Os agentes, vetores ou composições descritas neste do- cumento podem, nas modalidades, ser montados em kits farma- cêuticos, de diagnóstico ou pesquisa para facilitar seu uso em apli- cações terapêuticas, de diagnóstico ou de pesquisa. Nas modali- dades, os kits da presente invenção incluem qualquer uma das pro- teínas do capsídeo de AAV modificadas, vetores de AAV, partícu- las de AAV, células hospedeiras, tecidos isolados, composições ou composições farmacêuticas, conforme descrito neste documento.
[00171] Nas modalidades, um kit compreende ainda instruções de uso. Especificamente, esses kits podem incluir um ou mais agentes descritos neste documento, juntamente com instruções que descrevem a aplicação pretendida e o uso adequado desses agentes. Como exemplo, nas modalidades, o kit pode incluir instruções para misturar um ou mais componentes do kit e/ou isolar e misturar uma amostra e aplicar a um sujeito. Nas modalidades, os agentes em um kit estão em uma formulação farmacêutica e dosagem adequadas para uma aplica- ção particular e para um método de administração dos agentes. Os kits para fins de pesquisa podem conter os componentes em concen- trações ou quantidades apropriadas para executar vários experimen- tos.
[00172] O kit pode ser concebido para facilitar o uso dos métodos descritos neste documento e pode assumir muitas formas. Cada uma das composições do kit, quando aplicável, pode ser fornecida na forma líquida (por exemplo, em solução) ou na forma sólida (por exemplo, um pó seco). Em certos casos, algumas das composições podem ser constituíveis ou processáveis (por exemplo, a uma forma ativa), por exemplo, pela adição de um solvente adequado ou outras espécies (por exemplo, água ou um meio de cultura de células), que podem ou não ser fornecidas com o kit. Em modalidades, as composições podem ser fornecidas em uma solução de preservação (por exemplo, solução de criopreservação). Exemplos não limitantes de soluções de preser- vação incluem DMSO, paraformaldeído e CryoStor& (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canadá). Nas modalidades, a solução de preservação contém uma quantidade de inibidores de metaloprotease.
[00173] Nas modalidades, o kit contém qualquer um ou mais dos componentes descritos neste documento em um ou mais recipientes. Assim, nas modalidades, o kit pode incluir agentes de compartimento de recipiente descritos neste documento. Os agentes podem estar na forma de um líquido, gel ou sólido (pó). Os agentes podem ser prepa- rados de forma estéril, embalados em uma seringa e enviados refrige- rados. Alternativamente, eles podem ser alojados em um frasco ou ou- tro recipiente para armazenamento. Um segundo recipiente pode ter outros agentes preparados de maneira estéril. Alternativamente, o kit pode incluir os agentes ativos pré-misturados e enviados em uma se- ringa, frasco, tubo ou outro recipiente. O kit pode ter um ou mais ou todos os componentes necessários para administrar os agentes a um sujeito, tal como uma seringa, dispositivos de aplicação tópica ou tubo e bolsa com agulha |V.
[00174] Deve ser compreendido que, embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com as modalidades acima, a descrição e os exemplos anteriores destinam-se a ilustrar e não limitar o escopo da invenção. Outros aspectos, vantagens e modificações dentro do esco- po da invenção serão evidentes para aqueles versados na técnica aos quais a invenção pertence.
[00175] Além disso, onde características ou aspectos da invenção são descritos em termos de grupos Markush, aqueles versados na técnica reconhecerão que a invenção também é descrita, desse modo, em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo Markush.
EXEMPLOS EXEMPLO 1 Plataforma geradora de capsídeos
[00176] Algumas sequências do capsídeo de AAV fornecidas neste documento (por exemplo, AAV204, AAV110) foram geradas usando a plataforma geradora do capsídeo de AAV mostrada na FIG. 1. Resu- midamente, a plataforma compreende uma etapa de fragmentação de DNase | e uma etapa de montagem e amplificação, que finalmente re- sulta na formação de uma biblioteca de capsídeo quimérico. Outras sequências do capsídeo de AAV fornecidas neste documento (por exemplo, AAV214) foram geradas por design racional.
[00177] As proteínas do capsídeo geradas usando essas metodolo- gias foram analisadas pelo alinhamento com as sequências de amino- ácidos das proteínas do capsídeo de AAV conhecidas. O alinhamento de sequência da sequência de proteína VP1 de AAV204 (SEQ |D NO: 2) e AAV6 (SEQ ID NO: 63) é mostrado na FIG. 20. O alinhamento de sequência de sequências de aminoácidos VP1 de AAV 214, AAV 214A, AAV 214e, AAV 214e8, AAV 214€9, AAV 214€10, AAV 214AB e AAV ITB102 45 é fornecido na FIG. 21. O alinhamento de sequência de sequências de aminoácidos VP2 de AAV 214, AAV 214A, AAV 214e, AAV 214e8, AAV 214e9, AAV 214e10, AAV 214AB e AAV
ITB102 45 é fornecido na FIG. 22. O alinhamento de sequência de sequências de aminoácidos VP1 de AAV 214, AAV 214A, AAV 214e, AAV 214e8, AAV 214e9, AAV 214€10, AAV 214AB e AAV ITB102 45 é fornecido na FIG. 23.
[00178] Os vetores virais podem ser feitos usando um método de transfecção tripla padrão conhecido na técnica. Resumidamente, três plasmídeos separados que expressam, respectivamente, a proteína do capsídeo viral, proteínas auxiliares (por exemplo, as proteínas essen- ciais Rep e Cap virais) e o transgene de interesse são transfectados em células 293 aderentes ou em suspensão e as partículas virais são posteriormente coletadas usando ultracentrifugação ou cromatografia seguida por diafiltração/ultrafiltração e filtragem terminal estéril. Ver, por exemplo, Guo et al., Mol. Ther. Methods Clin. Dev., vol. 13, págs. 40-46 em 44 (nov. 2018); Wang et al., Human Gene Ther. Methods, vol. 25, págs. 261-68 em 262; e Gao et al., Human Gene Ther. Me- thods, vol. 11, págs. 2079-91, cada um destes sendo incorporado nes- te documento por referência em sua totalidade para todos os fins. EXEMPLO 2 Caracterização dos vetores virais AAV214 e AAV204
[00179] A eficiência da transdução de vetores AAV214 ou AAV204 em diferentes tecidos alvo foi avaliada conforme descrito abaixo.
[00180] A eficiência de transdução de um vetor viral AAV214 com- preendendo um transgene EGFP (AAV214-GFP) e um vetor viral AAV9 compreendendo um transgene EGFP (AAV9-GFP) foi avaliada in vitro. Células HEK 293 foram semeadas em uma placa de 96 poços a 50.000 células por poço. As células foram transduzidas com AAV214-GFP ou AAV9-GFP a um MOI de 5E+5. As imagens tiradas 45 horas após a transdução descreveram que a eficiência da transdu- ção foi maior para AAV214-GFP em células HEK 293 (FIG. 2A). É ob- servado que "GFP", conforme usado neste documento, refere-se a
EGFP (ver, por exemplo, Zhang et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Comme'n. 227(3):707-11), salvo especificação em contrário.
[00181] Para testar a eficiência de transdução in vivo, camundon- gos C57BL/6 de 10 semanas de idade foram dosados por injeção in- travenosa (IV) de 2E+11 vg de AAV214-GFP ou AAV9-GFP em 200 ul de TMN200 (200 mM de Tris-HCl, 1 mM de MgCl2, 200 mM de NaCl e 0,001% de Pluronic F68). Treze dias depois, os camundongos foram sacrificados, amostras de tecido de órgãos internos (cérebro, medula espinhal (cervical e lombar), nervo ciático, olhos, coração, rim, fígado, pulmão, testículos, baço e músculo) foram coletadas e o DNA total foi isolado e analisado usando uma abordagem de qPCR absoluta para estimativa do número de cópias do gene de GFP. Os dados de biodis- tribuição de AAV obtidos foram representados graficamente usando o software Prism para análise estatística (GraphPad Software). Um teste t não pareado realizado em dados transformados em log não revelou uma diferença estatisticamente significativa entre as eficiências de transdução de AAV9-GFP e AAV214-GFP na maioria dos tecidos tes- tados (p < 0,05). No entanto, no caso do nervo ciático e músculo, o valor médio do número de cópias de DNA viral detectado por micro- grama do DNA total isolado de animais tratados com AAV214-GFP foi maior e estatisticamente significativamente diferente dos animais tra- tados com AAV9-GFP (nervo ciático: 4,1 vezes, p = 0,0228; músculo: 3 vezes, p = 0,0125) (FIG. 2B).
[00182] O mesmo experimento foi repetido com a amostra cerebral dividida em duas metades. Uma metade foi usada para isolamento to- tal de DNA e seguida por análise de biodistribuição usando qPCR ab- soluta. A outra metade foi usada para isolamento total de RNA, trata- mento com DNase, conversão em cDNA e análise de qPCR para quantificar os níveis de expressão do gene EGFP. Os dados de biodis- tribuição e expressão do transgene do AAV obtidos foram representa-
dos graficamente usando o software Prism para análise estatística. Um teste t não pareado realizado em dados transformados em log não re- velou uma diferença estatisticamente significativa entre as eficiências de transdução de AAV9-GFP e AAV214-GFP (p = 0,7668) ou níveis de expressão (p = 0,0709) no tecido cerebral (FIG. 2C).
[00183] “Camundongos C57BL/6J do tipo selvagem foram adminis- trados com um conjunto de vetores virais de AAV, incluindo AAV204- GFP, AAV110-GFP e AAV214-GFP por injeção sub-retiniana (olho di- reito) e intravítrea (olho esquerdo). 1 uL de vetor AAV a 5E+12 vg/mL (5E+9 vg/olho) foi injetado por ambos os métodos de administração e os animais foram fotografados após 10 dias com um oftalmoscópio a laser de varredura Spectralis HRA2 (Heidelberg Engineering, Caris- bad, CA). Imagens onde a catarata impediu observação suficiente fo- ram omitidas da análise. Os exames de imagem por oftalmoscopia descreveram que todos os vírus testados eram capazes de transfectar células da retina se administrados na cavidade sub-retiniana. No en- tanto, apenas AAV204 e AAV110 mostraram transdução aumentada de células retinianas mediadas por administração intravítrea (FIG.3A). A análise imuno-histoquímica dos olhos de camundongo com dose in- travítrea de AAV204-GFP demonstrou expressão de GFP em vários tipos de células retinianas, incluindo fotorreceptores, RPE, células glia de Múller, células ganglionares retinianas e células bipolares (FIG. 3B).
[00184] —AAV204-GFP e AAV9-GFP foram administrados por injeção intratecal (1E+13 vg) e/ou intravítrea (1,5E+12 vg) a macacos cynomo- Igus de 2,5 a 3 anos de idade (Macaca fascicularis), cada um pesando cerca de 2 kg. Após quatro semanas, os animais foram sacrificados e a expressão de GFP foi avaliada por RT-GPCR. A análise dos dados mostrou que a distribuição mediada por AAV204-GFP resultou em ex- pressão de GFP melhorada na maioria dos tecidos que foram analisa-
dos, incluindo áreas específicas do cérebro e medula espinhal. Con- sultar FIG. 4. Os olhos dos macacos cynomolgus com dose intravítrea (1,5E+12 vg de AAV204-GFP por olho) foram avaliados por oftalmos- copia a laser de varredura (SLO), seccionados e analisados para GFP, rodopsina e DNA genômico usando métodos de coloração imunoquíi- mica convencionais. Conforme mostrado nas FIGs. 5A e 5B, a admi- nistração de AAV204-GFP resultou em transdução significativa do ve- tor na retina periférica e na região fóvea do olho. Foi observada ex- pressão potencializada de GFP distribuída por AAV204 em células re- tinianas, incluindo fotorreceptores, RPE, células bipolares e células ganglionares (FIG. 5B). Um número significativo de hastes e cones foi transduzido na mácula (FIG. 5C).
[00185] O vetor AAV204 também pode ser combinado com promoto- res específicos de RPE para expressar proteínas especificamente. As FIGs. 5D-5F mostram a expressão de GFP de AAV204 conduzido pelo promotor VMD2 (degeneração macular viteliforme-2) (SEQ |D NO:159). O vetor de genomas virais 2,5 x 101? (vg) foi administrado por via intravítrea e a expressão foi monitorada em 14 dias e em 28 dias (sacrifício). O exame de imagem por oftalmoscopia a laser (SLO) foi realizado no Dia 14 (FIG. 5D) e Dia 28 (FIG. 5E). A FIG. 5F mostra a expressão de GFP e núcleos (DAPI) na periferia no Dia 28.
[00186] O AAV204-GFP também foi avaliado em culturas de ex- plante de primatas não humanos. As retinas de macaco cynomolgus foram isoladas dos olhos dentro de 1 hora após o animal ter sido hu- manamente sacrificado. As retinas foram dissecadas em seções de -5 x 5 mm e cultivadas em placas de cultura para insertos transwell. Um dia após o isolamento, os explantes foram transduzidos com AAV204- GFP em meio de cultura e incubados por uma semana após a trans- dução. Os explantes foram fixados, incorporados e seccionados para imuno-histoquímica padrão. As seções foram coradas para GFP (ver-
de) e rodopsina (vermelho) e fotografadas usando microscopia de fluo- rescência. As seções mostraram expressão significativa de GFP na camada de fotorreceptor após transdução de AAV204-GFP (FIG.6).
[00187] A imunogenicidade do vetor AAV204 foi avaliada usando o ensaio de anticorpo neutralizante (FIG. 7). O vírus AAV9-Luc compos- to por capsídeo de AAV9 e um cassete de expressão de luciferase de vagalume ou vírus AAV204-Luc composto por capsídeo de AAV204 e um cassete de expressão de luciferase de vagalume foram incubados com várias diluições de soro de um sujeito humano tratado com AAV9 (60 dias após o tratamento) no MOI de 25.000. Após a incubação, a mistura de vírus/soro foi transferida para poços contendo 20.000 célu- las Lec2. Células tratadas com soro foram incubadas por 24 horas e, em seguida, a luminescência emitida foi medida e comparada a um valor de controle de células transduzidas com vírus não tratado no mesmo MOI. Os resultados mostraram que as partículas do vetor de AAV204 tiveram imunogenicidade reduzida em comparação com as partículas do vetor de AAV9 (ver FIG. 8). EXEMPLO 3 Melhora de defeitos causados por mutações no gene regulador de condutância transmembrana de fibrose cística (CFTR) usando um transgene CFTR administrado pelo vetor viral AAV204.
[00188] Partículas do vetor de AAV204 contendo um ácido nucleico que codifica um transgene de CFTR otimizado por códon (ou seja, um gene de CFTRAR que compreende sequência de ácido nucleico esta- belecida na SEQ ID NO: 4, e que codifica uma proteína carece de aminoácidos 708-759 de CFTR de comprimento total) foram prepara- das usando um plasmídeo pA-CF3 (SEQ ID NO: 89) com de 5 a 3, um ITR de 5', um promotor U1a de camundongo (SEQ ID NO: 96), o transgene de CFTRAR, uma sequência sintética poli-A (49 bp) e um ITR de 3'. As partículas resultantes foram usadas para distribuir o transgene CFTRAR em células ou camundongos, conforme descrito abaixo.
[00189] Ensaios in vitro: Um vetor viral de AAV204 compreendendo o transgene de CFTRAR foi usado para transduzir células Lec2. O ensaio FLIPR foi usado para medir a funcionalidade do transgene de CFTRAR distribuído pelo vetor viral de AAV204-CFTRAR. Os resulta- dos mostraram que a função do canal iônico do CFTR humano (NCFTR) foi restaurada por estimulação com forscolina, um abridor co- nhecido do canal de cloreto de CFTR, quando as células foram trans- duzidas usando o vetor viral de AAV204-CFTRAR, em comparação com as células transfectadas com um vetor viral de AAV204 controle sem um transgene. Além disso, o sinal de corrente específico ao clore- to aumentou 3,5 vezes em comparação com a avaliação inicial em cé- lulas transduzidas usando o vetor viral de AAV204-CFTRAR em com- paração com o controle. Consultar FIG. 10A, painel esquerdo. A pré- incubação com um inibidor seletivo de CFTR, CFTRinh-172 (ácido 4- [[4-Ox0-2-tioxo-3-[3-trifluorometil)fenil]-5-tiazolidinilideno]metil]benzoico (Tocris Bioscience, disponível em http://tocris.com/products/cftrinhh- 172 3430) impediu as alterações potenciais da membrana induzida por forscolina na presença de CFTRAR. Consultar FIG. 10B. Esses resultados demonstram a funcionalidade do cassete de expressão de CFTRAR.
[00190] Foi realizado um ensaio de potencial de membrana para avaliar se a funcionalidade do cassete de expressão CFTRAR depen- dia da quantidade do vírus de AAV204-CFTRAR usado para transfec- ção. Consultar FIG. 10B. Os resultados mostraram que as alterações potenciais da membrana na presença de CFTRAR eram de fato de- pendentes da dose da partícula do vírus que distribui o transgene. Também expressamos a CFTR de comprimento total usando AAV204 e obtivemos fluorescência aumentada em resposta à forscolina. (FIG.
10C). Também confirmamos por western blot que a expressão de AAV204 resulta em CFTR e CFTRAR de comprimento total totalmente processadas (dados não mostrados). Estes dados confirmam que a distribuição de AAV204 de qualquer proteína restaura a função do ca- nal de cloreto in vitro.
[00191] — Ensaios in vivo usando modelo de camundongo: Um vetor viral de AAV204 compreendendo um transgene da luciferase foi admi- nistrado a camundongos por via intratraqueal. A geração de imagens de bioluminescência (BLI) foi usada para avaliar a capacidade de um vetor viral de AAV204 de transduzir células pulmonares, conforme re- fletido pela expressão de luciferase, em comparação com AAV6. À FIG. 9, painel superior, mostra que a expressão de luciferase mediada pelo vetor viral AAV204 foi cerca de 3,5 vezes maior em comparação com o vetor viral AAV6. A FIG. 9, painel inferior, ilustra a expressão mostrada por BLI ex vivo, nos pulmões esquerdo e direito com pouca ou nenhuma expressão no fígado ou rim. Esses resultados demons- tram que um vetor viral de AAV204 é capaz de promover a expressão potencializada de um transgene repórter em tecidos específicos em camundongos.
[00192] A eficácia das partículas do vetor de AAV204 compreen- dendo o transgene de CFTRAR foi testada em um modelo de fibrose cística de camundongo referido como "F508del". Esses camundongos portam um gene CFTR mutante compreendendo uma deleção de um único aminoácido, F508, que é a mutação de CFTR mais comum em humanos, afetando aproximadamente 90% dos pacientes com FC (ver, por exemplo, Park et al/., PLoS One (10 de fevereiro de 2016) 11(2): e0149131). As partículas do vetor de AAV204 compreendendo o transgene de CFTRAR ou o transgene luciferase foram administradas por via intranasal a camundongos do tipo selvagem e F508del. A dife- rença do potencial nasal (NPD) foi medida para determinar a funciona-
lidade do transgene CFTRAR. Conforme mostrado na Fig. 12A, ca- mundongos que foram administrados com as partículas do vetor de AAV204-CFTR mostraram corrente estimulada por forscolina corrigida, em comparação com camundongos que receberam o vetor de controle contendo um transgene luciferase (AAV204-Luc).
[00193] Ensaios usando células de pacientes humanos : Foi avalia- da a capacidade das partículas do vetor de AAV204 compreendendo o transgene de CFTRAR para mediar a distribuição de hCoFTR em célu- las de vias aéreas humanas isoladas de pacientes que sofrem de fi- brose cística e corrigir o transporte de cloreto nessas células. Quando as partículas do vetor AAV204 que compreendem transgene de GFP foram aplicadas aos compartimentos apical e basolateral, o AAV204 transduziu células epiteliais nasais e brônquicas humanas (HNE e HBE) isoladas de pacientes com fibrose cística e manteve em culturas de interface ar-líquido. Consultar FIG. 11A. A proteína CFTRAR foi lo- calizada em membrana nessas células; ver Fig. 11B, painel esquerdo. A FIG. 11B, painel direito mostra um western blot ilustrando a localiza- ção da membrana.
[00194] A funcionalidade das partículas do vetor de AAV204 com- preendendo o transgene de CFTRAR foi avaliada conforme descrito abaixo. Os resultados mostram que a corrente de CFTR foi restaurada em culturas de explante de células epiteliais nasais humanas deriva- das de pacientes com fibrose cística após a transdução do vetor de AAV204 compreendendo o transgene de CFTRAR. Consultar a Fig. 11C. Também foi testado se as partículas de AAV poderiam restaurar a função de CFTR em células nasais e brônquicas isoladas de pacien- tes com fibrose cística humana medindo alterações na condutância transmembrana usando uma câmara de Ussing, que é conhecida pe- los versados na técnica para medir o movimento de íons entre as su- perfícies do epitélio polarizado. Em resumo, em uma câmara Ussing,
as superfícies apical e basolateral do epitélio estão voltadas para duas câmaras separadas contendo soluções simétricas de sal. O transporte de íons através do epitélio produz uma diferença potencial entre as duas câmaras. As forças de difusão que, de outra forma, criariam uma diferença potencial são ativamente canceladas pela aplicação de uma corrente de curto-circuito (ls) ao longo do epitélio. Isso permite que o movimento de íons por transporte ativo após estimulação seja medido por alterações nesta corrente (Alsc) e o cálculo da condutância trans- membrana de fibrose cística, como é bem conhecido na técnica. Ver, por exemplo, Li et al., J. Cystic Fibrosis (julho de 2004) 3:123-126; Park et a/., PLoS One (10 de fevereiro de 2016) 11(2): 0149131. Con- forme mostrado na FIG. 12B, quando CFTRAR foi transduzida, estimu- lada por forscolina, a corrente inibida por CFTRinh-172 foi restaurada para 6-7 uA/cm? em comparação com o veículo.
[00195] Em suma, nossos resultados mostram que o AAV204 me- deia a distribuição eficiente de CFTR funcional e altamente expressa e, além disso, restaura a função de CFTR em células in vitro, em mo- delos de camundongo e em culturas explantes de células de pacientes humanos. Esses resultados demonstram o potencial terapêutico na fibrose cística de partículas de AAV204 compreendendo o transgene de CFTRAR. EXEMPLO 4: Melhora dos defeitos causados pela doença CLN3 usando trans- genes CLN3 otimizados administrados pelo vetor AAV214
[00196] Um capsídeo de AAV (AAV214) com tropismo potencializa- do para tecido do SNC após administração sistêmica e um cassete de transgene de CLN3 otimizado (compreendendo uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 122) para melhorar a biodistribuição e expressão em tecidos do SNC e somáticos foram desenvolvidos e tes- tados quanto à funcionalidade. O AAV9 foi usado como um parâmetro de comparação para avaliar o tropismo do AAV214 e a biodistribuição do cassete de transgene CLN3 otimizado em um modelo de camun- dongo com lipofuscinose ceroide neuronal juvenil, que carece de um segmento de 1,02 kb abrangendo os éxons 7 e 8 de CLN3 (CLN3Aex7/8) em um contexto C57BL/6. Essa deleção de CLN3 ocor- re em aproximadamente 85% dos alelos de CLN3 mutantes e recapitu- la muitos fenótipos da doença associados à doença humana, incluindo déficits motores, ativação glial e acúmulo progressivo de material de armazenamento lisossômico. Tabela 6. Desenho do estudo com modelo de camundongos CLN32x78 animais dose (vg/kg) se (ul/animal) e a EL 6 fêmeas fêmeas 5 fêmeas
[00197] Os vetores virais de AAV9 e AAV214, cada um compreen- dendo o transgene de CLN3 (AAV9-CLN3 e AAV214-CLN3, respecti- vamente) foram administrados por via intravenosa a camundongos do tipo selvagem em uma dosagem de 2.0 x 103 vg/kg (genomas do ve- tor viral/quilograma). Consultar Tabela 6. Após 30 dias, os animais fo- ram humanamente sacrificados e os tecidos foram coletados para aná- lise de biodistribuição, que avalia a distribuição das partículas do vetor a vários órgãos diferentes, incluindo as regiões primárias do SNC e da medula espinhal (cervical e lombar). Uma análise de teste t de dados transformados em log não revelou uma diferença estatisticamente sig- nificativa entre AAV214-CLN3 e AAV9-CLN3 nos valores de biodistri- buição para a maioria dos tecidos que foram testados (ver FIG. 13). No entanto, o nervo ciático demonstrou uma biodistribuição estatística maior (744%) e significante (p = 0,0001) usando AAV214-CLN3 em comparação a AAV9, enquanto o baço foi melhor transduzido com AAV9-CLN3 (p < 0,0001). Os estudos atuais que avaliam a expressão e a resposta à dose ao longo de uma duração mais longa indicam que AAV214-CLN3 pode ser usado para distribuir efetivamente o cassete de expressão de CLN3 aos tecidos do SNC através da administração sistêmica.
[00198] A expressão do transgene de CLN3 foi avaliada por RTqPCR usando RNA total isolado dos hemisférios esquerdos do cé- rebro. A análise ANOVA unidirecional dos dados transformados em log não revelou diferença estatisticamente significativa nos valores médios de expressão de CLN3 para animais tratados com AAV9-CLN3 versus AAV214-CLN3 (p = 0,4489). No entanto, ambos os vetores virais tes- tados produziram níveis de expressão de CLN3 mais altos do que o controle (p < 0,0001; FIG. 14).
[00199] Em resumo, esses resultados mostraram que o novo vetor viral AAV214 compreendendo um cassete de expressão de CLN3 oti- mizado demonstra tropismo equivalente ao AAV9 na maioria dos teci- dos, incluindo SNC, se administrado por administração sistêmica em modelo de camundongo da doença CLN3. Esses resultados indicam que o vetor de AAV214 compreendendo o transgene de CLN3 otimi- zado descrito neste documento pode ser usado na prevenção e trata- mento da doença CLN3. EXEMPLO 5 Melhora dos defeitos causados pela doença de Fabry usando transgenes de GLA otimizados administrados pelo vetor de AAV214
[00200] Vetores virais de AAV9 e AAV214 compreendendo um promotor CBh, íntron híbrido de CBA-MVM, sequência de transgene de GLA natural e sítio TK65 poli-A foram administrados a camundon-
gos C57BL/6 do tipo selvagem por injeção IV (ver Tabela 7). O tama- nho esperado da proteína GLA transgenética em amostras de plasma foi confirmado por imunoblotting (FIG. 15). A atividade enzimática de GLA foi avaliada no plasma, cérebro, medula espinhal, coração, rim, fígado e olho. A análise estatística realizada nos valores transforma- dos em log da atividade enzimática de GLA mostrou que todas as amostras transduzidas com AAV214-GLA apresentaram atividade de GLA significativamente maior em termos estatísticos em comparação com o controle (p < 0,0001). A atividade enzimática de GLA também foi significativamente maior em termos estatísticos no plasma, cérebro e tecidos da medula espinhal transduzidos com AAV214-GLA em comparação a AAV9-GLA (FIG. 16). Em resumo, a análise da ativida- de enzimática de GLA mostra a transdução eficaz de construtos de AAV214 em múltiplos tecidos alvo, particularmente tecidos do SNC, demonstrando benefício terapêutico do vetor de AAV214 em partici- pantes com doença de Fabry. Tabela 7 Desenho do Estudo em Animais camundongo (microlitro) es vs [2 ess — aoraia [ntos o e [E eres — aaa [nos o je
[00201] Não foram observados efeitos tóxicos agudos da adminis- tração sistêmica do transgene de GLA através de um vetor viral de AAV9 ou AAV214 após o estudo de 10 dias em animais do tipo selva- gem. Nenhum animal tratado neste experimento apresentou quaisquer efeitos adversos devido ao tratamento. A distribuição eficaz de AAV9 e AAV214 aos tecidos alvo, especialmente no SNC, coração e rim, após administração sistêmica demonstra a capacidade de transduzir com segurança os principais tecidos alvo associados à doença de Fabry.
EXEMPLO 6 Melhora dos defeitos causados pela doença de Pompe usando transgenes de GAA otimizados distribuídos pelo vetor de AAV214
[00202] Vetores de AAV9-GAA e AAV214-GAA compreendendo um promotor CBh, íntron híbrido de CBA-MVM, sequência transgenética de GAA otimizada para códon e sítio poli-A de BGH foram dosados por via intravenosa em camundongos C57BL/6 do tipo selvagem (ver Ta- bela 8). Para determinar se os transgenes foram efetivamente distribu- ídos aos tecidos alvo, a proteína de atividade enzimática GAA foi tes- tada no cérebro, medula espinhal, diafragma, bíceps, fígado e plasma dos camundongos tratados. A análise ANOVA unidirecional dos valo- res transformados em log da atividade enzimática de GAA revelou que todos os tecidos testados dos animais dosados tiveram atividade de GAA significativamente maior (p < 0,002) em comparação aos animais controle. Nenhuma diferença estatisticamente significativa na atividade enzimática foi mostrada entre os tecidos dosados com AAV214 e AAV9, exceto no plasma, onde AAVO9 teve ligeira vantagem (p = 0,0018) (FIGS. 19A-E). A análise da atividade enzimática de GAA con- firmou a transdução eficaz de construtos de AAV214 em múltiplos te- cidos alvo, incluindo uma capacidade de atravessar a barreira hema- toencefálica e transdução para tecidos importantes para tratar a doen- ça de Pompe, tais como bíceps e diafragma (FIG. 19). Esses resulta- dos sugerem que uma injeção intravenosa única de um vetor viral de AAV214 compreendendo um cassete de expressão de GAA otimizado, conforme descrito neste documento, pode ser suficiente para alcançar a distribuição do transgene de GAA corrigido aos tecidos alvo. Não foram observados efeitos tóxicos agudos a partir da administração sis- têmica do transgene de GAA através do vetor de AAV9 ou AAV2I4 após o estudo de 10 dias em animais do tipo selvagem.
[00203] A FIG. 19F mostra reparo da patologia molecular subjacente por GAA distribuída por AAV. Análise de glicogênio de camundongos gaa-/- tratados por via intravenosa com capsídeos de AAV empacota- dos com GAA humana otimizada para códon. O teor de glicogênio foi medido indiretamente pela liberação de glicose após o tratamento com amiloglicosidade. A glicose livre foi medida com o reagente de glicose Infinity e analisada em um SpectraMax iôx. Os dados são apresenta- dos como o % dos animais gaa-/- tratados com controle de veículo. Os dados mostram a redução nos níveis de glicogênio obtidos por GAA distribuída por AAV. Foi observada depuração de glicogênio em todos os tecidos alvo com AAV214 desempenhando de forma tão eficaz quanto o AAV9.
[00204] Estes dados confirmam que a distribuição sistêmica de AAV9 e AAV214, notadamente com expressão muscular e do sistema nervo- so periférico (SNP), demonstra a capacidade de transduzir com segu- rança os principais tecidos alvo associados à doença de Pompe e de restaurar a funcionalidade de GAA. Tabela 8: Desenho do Estudo em Animais camundongo (microlitros) es o Ee ee nm a e EXEMPLO 7 Partículas do vetor de AAV110 mostram tropismo muscular alta- mente específico
[00205] As partículas de AAV110 foram preparadas usando o plas- mídeo pAAV110 (também referido como plasmídeo ITCord1.10) que codifica as proteínas do capsídeo de AAV110. Um vetor viral de AAV110-GFP compreendendo um promotor CBh, íntron híbrido CBA- MVM, sequência transgenética de EGFP e sítio poli-A de BGH foi ad- ministrado (1 x 10º vg total, equivalente a 5 x 10"? vg/kg) em cada pa-
ta (bíceps femoral) em uma única injeção em camundongos C57BI/6 do tipo selvagem. Outro grupo de animais recebeu uma quantidade equivalente de vetor viral de AAV9-GFP para comparação.
[00206] A expressão de GFP foi avaliada por imagem do músculo da perna para fluorescência. Fig. 24A. Os dados mostraram que as patas direita e esquerda administradas com o vetor viral de AAV110- GFP expressaram um alto nível de GFP, estabelecendo o tropismo muscular para o capsídeo de AAV110. Em contraste, as partículas do vetor de AAV9-GFP forneceram expressão muscular substancialmente menor (Fig. 24B).
[00207] Para avaliar a distribuição do transgene de GFP em outros tecidos induzidos pela dosagem intramuscular de AAV110-GFP ou AAV9-GFP, examinamos a biodistribuição (BD) do transgene em um painel de órgãos. Consultar Fig. 25. Os dados confirmam que a trans- dução do AAV110 ocorre principalmente no músculo, bem como no nervo ciático e baço. Em contraste com o AAV9, o AAV110 mostra pouca ou nenhuma biodistribuição no cérebro, rim, olho, pulmão, cora- ção, fígado e testículos. Em cada caso, a BD foi cerca de 3% ou me- nos do que o obtido com a distribuição intramuscular de AAV9 do transgene.
[00208] A análise imuno-histoquímica do tecido muscular confirmou altos níveis de expressão de GFP no músculo com AAV110 e menos com AAV9 (FIG. 26). Estes dados confirmam o tropismo muscular su- perior e a expressão por AAV110. EXEMPLO 8 Partículas do vetor de AAV214 fornecem expressão de alto nível no músculo após administração IM e IV
[00209] — Foi gerado um vetor viral de AAV compreendendo as prote- íÍnas do capsídeo de AAV214 e um cassete de expressão de luciferase conduzido pelo promotor Uia (AAV214-Luc). Foi administrado
AAV214-Luc na pata direita de ratos adultos do tipo selvagem na dose de 5 x 10? vg/kg em cada músculo em um volume total de 0,1 mL por músculo. A pata esquerda não foi tratada. Para medir a expressão, expusemos os músculos à luciferina e medimos a luz emitida. Os da- dos na tabela abaixo mostram que o músculo injetado, mas não o músculo não tratado, mostra alta expressão 28 dias após a adminis- tração. A FIG. 27 mostra atividade de luciferase no tecido, indicando atividade da enzima expressa.
Do se pesa pesa]
[00210] Resultados similares foram obtidos com um transgene dife- rente, SMN-1 otimizado por códon (sobrevida do neurônio motor 1, que é defeituoso na atrofia muscular espinhal - AME) conduzido por um promotor de CBh. Comparamos a capacidade das partículas do vetor viral de AAV214-SMN1 administradas por via intravenosa com partículas do vetor de AAV9-SMN1 de expressar SMN-1 quando ad- ministradas por via intravenosa. A FIG. 28 mostra a expressão de SMN1 no tecido do músculo tibial anterior após a infecção de camun- dongos do tipo selvagem juvenis. Os dados ilustram que as partículas do vetor de AAV214 fornecem expressão melhorada com um aumento de pelo menos 10 a 30% em relação ao veículo e são adequadas para transdução muscular quando distribuídas por via intravenosa.
[00211] A comparação dos vetores virais de AAV214 e AAV9 para transduzir o tecido muscular mostrou que a administração IM de AAV214 é capaz de transduzir uma área muscular maior do que o
AAV9. O músculo de rato inteiro (bíceps femoral) foi analisado para expressão de GFP ou mCherry por imuno-histoquímica 10 dias após injeção IM. As seções fixas e congeladas foram sondadas com GFP e mCherry pAb. O AAV214 exibiu uma área de transdução significativa- mente maior em comparação com o AAV9, que foi amplamente confi- nado à porção superior do músculo consistente com o local da injeção. (FIG. 26B). EXEMPLO 9 Partículas do vetor de AAV contendo proteínas do capsídeo deri- vadas de AAV214 exibem alta expressão no músculo após dosa- gem IV
[00212] As proteínas VP1 de AAV214 foram modificadas pela troca de seu terminal N com sequências de aminoácidos de sorotipos de AAV conhecidos (AAV8, AAV9, AAVrh10), produzindo assim as varian- tes mostradas na tabela abaixo. As partículas do vetor viral de AAV foram então preparadas com cada uma das proteínas recém-derivadas do capsídeo, essencialmente conforme descrito no Exemplo 1 e sua capacidade de transdução muscular após administração intravenosa foi avaliada. Descobrimos que cada vetor viral conferia uma boa trans- dução muscular na perna e no coração (Fig. 29). A análise ANOVA unidirecional dos dados de biodistribuição transformados em log não revelou uma diferença estatisticamente significativa (p > 0,05) nos va- lores médios de biodistribuição para os vetores virais testados. SEQ ID NO de ami- | SEQ ID NO de ácido | Nome do capsídeo de
EXEMPLO 10 PRODUÇÃO DE ANTICORPO NEUTRALIZANTE CRUZADO INDU-
ZIDO POR CAPSÍDEO
[00213] AAV204 e AAV214 têm reatividade cruzada limitada ou muito baixa com nAbs de AAV9 e baixa possibilidade de indução da reação cruzada da produção de nAbs com AAV9.
[00214] Nós testamos a capacidade dos animais dosados por IM com AAV9 ou AAV214 em produzir anticorpos neutralizantes contra AAV9. (FIG. 31A). A análise foi realizada pela medição da capacidade do so- ro animal em inibir a transdução de um vetor AAV9.luciferase no tipo de célula permissiva, Lec2. Três dias após as células de transdução foram analisadas quanto à atividade da luciferase. Cada grupo consis- tiu em 2 ou 3 ratos para o controle, seja de AAV9 ou AAV214. Vanta- josamente, os animais injetados com AAV214 por IM não mostram uma resposta imune de reatividade cruzada ao AAV9, o que poderia permitir uma maior população de pacientes devido à inclusão de paci- entes com imunidade preexistente ao AAV9, de ocorrência natural ou devido à administração de dose anterior.
[00215] Dados similares foram obtidos em primatas não humanos (NHPs). Tanto o AAV9 por via intratecal (IT) quanto os NHPs adminis- trados por via intravenosa (IV) desenvolveram nAbs contra AAV9 (FIG. 31B). O soro animal dosado por via IT mostrou reatividade cruzada muito maior a outros vírus testados (AAV204, AAV214 e AAV6). No entanto, acreditamos que a via de dosagem não tem impacto significa- tivo nas diferenças de desenvolvimento de nAbs, pois dois animais que receberam AAV204 por via intratecal mais intravítrea (IT + |V) também descreveram diferenças similares na reatividade cruzada (FIG. 31C; consultar NHP-2 e NHP-3). Além disso, somente animais com dose de AAV204 administrado por via intravítrea (IVT) (FIG, 31C; consultar NHP-4) mostraram reatividade cruzada similar à de animais tratados com IT + IVT (NHP-3). As diferenças na reatividade cruzada desenvolvida podem ser explicadas pela identidade do epítopo da pro- teína do capsídeo de AAV contra o qual nAbs foram produzidos. Am- bas as amostras de soro de animais tratados com AAV9 mostraram baixa reatividade ao AAV204 (FIG. 31B) e dois dos três animais trata- dos com AAV204 demonstraram reatividade muito baixa a AAV9 e AAV214 sugerindo alta probabilidade de compatibilidade (FIG. 31C). Em contraste, o AAV6 revelou alta reatividade cruzada em todos os animais tratados com AAV204 (FIGs. 31B e C).
MODALIDADES ALTERNATIVAS
1. Um polinucleotídeo que codifica uma proteína do capsí- deo viral adeno-associado (AAV) que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 3, 30-34, 49 ou 84 ou o uso de um polinucleotídeo que codifica uma proteína do capsídeo viral adeno-associado (AAV) que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 1.
2. O polinucleotídeo, de acordo com a modalidade 1, em que a sequência de aminoácidos tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 3, 30-34, 49 ou 84.
3. O polinucleotídeo, de acordo com a modalidade 1, em que a sequência de aminoácidos tem pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 3, 30-34, 49 ou 84.
4. O polinucleotídeo, de acordo com a modalidade 1, em que a sequência de aminoácidos tem pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 3, 30-34, 49 ou 84.
5. O polinucleotídeo, de acordo com a modalidade 1, em que a sequência de aminoácidos tem pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 3, 30-34, 49 ou 84.
6. O polinucleotídeo, de acordo com a modalidade 1, em que a sequência de aminoácidos compreende SEQ ID NO: 3, 30-34, 49 ou 84.
7. O polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das mo- dalidades 1-6, em que a sequência de aminoácidos compreende uma porção VP1, VP2 e VP3 da proteína do capsídeo de AAV e em que a porção VP3 tem a sequência de SEQ ID NO:41.
8. O polinucleotídeo, de acordo com a modalidade 7, em que a proteína do capsídeo de AAV é pelo menos 70%, 80%, 90% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 3, 30-34, 49 ou 84.
9. O polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das mo- dalidades 1-8, em que o polinucleotídeo está contido dentro de um plasmídeo, um cromossomo artificial bacteriano, um cromossomo arti- ficial de levedura um fago, ou um vetor viral.
10. Uma célula hospedeira compreendendo o polinucleotí- deo de acordo com qualquer uma das modalidades 1-8.
11. Uma proteína do capsídeo de AAV compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, 80%, 90% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 3, 30-34, 49 ou 84.
12. Uma proteína do capsídeo de AAV compreendendo uma sequência de aminoácidos com a sequência da SEQ ID NO:2, 3, 30-34, 49 ou 84.
13. Um vetor viral AAV compreendendo (i) uma proteína do capsídeo de AAV de acordo com a mo- dalidade 11 ou 12, e (ii) um vetor AAV.
14. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 13, em que o vetor AAV compreende um ácido nucleico heterólogo.
15. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 14, em que o ácido nucleico heterólogo é um transgene.
16. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 13 a 15,
em que o transgene codifica um regulador da condutância transmem- brana da fibrose cística (CFTR), uma proteína CLN3, uma alfa- galactosidase A (GLA) ou uma alfa-galactosidase ácida (GAA).
17. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 15, em que o transgene compreende uma sequência com pelo menos 70%, 80%, 90% ou 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 5,6,7,9,10,12 e 13.
18. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 15, em que o transgene codifica uma proteína compreendendo uma sequên- cia de aminoácidos com pelo menos 70%, 80%, 90% ou 99% de iden- tidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 5,8, 11 e 14.
19. O vetor viral AAV, de acordo com as modalidades 13 a 18, em que o ácido nucleico heterólogo está operacionalmente ligado a um promotor.
20. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 19, em que o promotor é um promotor de controle específico do tecido, ou um promotor constitutivo.
21. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 20, em que o promotor é um promotor LTR do vírus do sarcoma de Rous (RSV) (opcionalmente com o potenciador de RSV), um promotor de citomegalovírus (CMV), um promotor de SV40, um promotor de di- hidrofolato redutase, um promotor de beta-actina, um promotor de fos- foglicerol quinase (PGK), um promotor U6, um promotor H1, um pro- motor CAG, um promotor híbrido de beta-actina de frango, um promo- tor de MeCP2, um promotor de EF1, um promotor híbrido de B-actina de galinha (CBh), um promotor U1a, um promotor U1b, um promotor de MeCP2, um promotor de MeP418, um promotor de MeP426, um promotor mínimo de MeCP2, um promotor de VMD2, um promotor de mRho, promotor de EFla, promotor de Ubc, promotor de B-actina hu- mana, promotor de TRE, promotor de Ac5, promotor de poliedrina,
promotor de CaMKlla, promotor de Gal1, promotor de TEF1, promotor de GDS, promotor de ADH1, promotor de Ubi, ou promotor de a-1- antitripsina (DAAT).
22. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 10, em que o promotor é um promotor de controle específico de tecido, que é um promotor específico de célula do sistema nervoso central (SNC), um promotor específico de pulmão, um promotor específico de pele, um promotor específico de músculo, um promotor específico de fígado ou um promotor específico de olho.
23. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 14, em que o ácido nucleico heterólogo codifica um mRNA, siRNA, gRNA ou microRNA.
24. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 14, em que o ácido nucleico heterólogo codifica um polipeptídeo.
25. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 14, em que o ácido nucleico heterólogo codifica um regulador da condutância transmembrana da fibrose cística (CFTR), uma proteína CLN3, uma alfa-galactosidase A (GLA) ou uma alfa-glicosidase ácida (GAA).
26. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 25, em que o ácido nucleico heterólogo codifica um CFTR.
27. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 26, em que o CFTR compreende ou consiste em uma sequência de aminoáci- dos codificada pela SEQ ID NO: 4.
28. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 15, em que o ácido nucleico heterólogo codifica uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, 80%, 90% ou 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 8, 11 e 14.
29. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 15, em que o ácido nucleico heterólogo compreende uma sequência com pelo menos 70%, 80%, 90% ou 99% de identidade com qualquer uma das
SEQ ID NOS: 4, 5,6,7,9,10,12e13.
30. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 18, em que o ácido nucleico heterólogo codifica uma proteína repórter.
31. O método de introdução de um gene de interesse a uma célula em um sujeito, compreendendo o contato da célula com uma quantidade eficaz de vetores virais AAV de acordo com qualquer uma das modalidades 13-30.
32. O método, de acordo com a modalidade 31, em que o vetor viral AAV é introduzido, ao sujeito, por via oral, retal, transmuco- sa, inalatória, transdérmica, parenteral, intravenosa, subcutânea, intra- dérmica, intramuscular, intrapleural, intracerebral, intratecal, intracere- bral, intraventricular, intranasal, intra-auricular, intraocular, periocular, tópica, intralinfática, intracisternal, intratecal ou intravítrea.
33. O método, de acordo com a modalidade 31 ou 32, em que o sujeito é um mamífero.
34. O método, de acordo com as modalidades 31 a 33, em que o sujeito é humano.
35. O método, de acordo com as modalidades 31 a 34, em que a célula é uma célula somática.
36. O método, de acordo com a modalidade 35, em que a célula somática é uma célula nervosa, uma célula da retina, uma célu- la muscular, uma célula epitelial, uma célula pulmonar, uma célula he- pática, uma célula-tronco ou uma célula epitelial.
37. Uma composição farmacêutica compreendendo o poli- nucleotídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1-8, a pro- teína do capsídeo de AAV, de acordo com a modalidade 11 ou 12, ou o vetor viral AAV, de acordo com qualquer uma das modalidades 13-
30.
38. Um método de tratamento de um distúrbio, compreen- dendo administrar a um sujeito uma quantidade terapeuticamente efi-
caz da composição farmacêutica, de acordo com a modalidade 37.
39. O método, de acordo com a modalidade 38, em que o distúrbio é um distúrbio do SNC, um distúrbio epitelial, um distúrbio pulmonar, um distúrbio muscular, um distúrbio hepático ou um distúr- bio retiniano.
40. O método, de acordo com a modalidade 38 ou 39, em que o distúrbio é a esclerose lateral amiotrófica (ALS, amyotrophic la- teral sclerosis), atrofia muscular espinhal (SMA, spinal muscular atro- phy), Doença de Fabry, doença de Pompe, doença CLN3 (ou lipofus- cinose Ceroide Neuronal Juvenil), epidermólise bolhosa distrófica re- cessiva (RDEB, recessive dystrophic epidermolysis bullosa), doença de Batten juvenil, distúrbio autossômico dominante, distrofia muscular, hemofilia A, hemofilia B, esclerose múltipla, diabetes mellitus, câncer da doença de Gaucher, artrite, atrofia muscular, doença cardíaca, hi- perplasia íntima, epilepsia, doença de Huntington, doença de Parkin- son, doença de Alzheimer, fibrose cística, talassemia, Síndrome de Hurler, Síndrome de Sly, Síndrome de Scheie, Síndrome de Hurler- Scheie, Síndrome de Hunter, Síndrome de Sanfilippo tipo A (mucopo- lissacaridose IIIA ou MPS IIIA), Síndrome de Sanfilippo tipo B (muco- polissacaridose IIIB ou MPS 1IIB), Síndrome de Santfilippo tipo C, Sín- drome de Sanfilippo tipo D, Síndrome de Morquio, Síndrome de Maro- teaux-Lamy, doença de Krabbe, fenilcetonúria, doença de Batten, ata- xia cerebral espinhal, deficiência do receptor de LDL, hiperamonemia, artrite, degeneração macular, retinite pigmentosa, lipofuscinose ceroi- de, neuronal, 1 (CLN1), ou deficiência de adenosina desaminase.
41. O método, de acordo com a modalidade 38, em que o distúrbio é a atrofia muscular espinhal (SMA), epidermólise bolhosa distrófica recessiva (RDEB), doença de Fabry, doença de Pompe, do- ença de CLN3 (ou lipofuscinose Ceroide Neuronal Juvenil), MPS IIIA, MPS IIIB, doença de Batten juvenil e distrofia muscular de Duchenne
(DMD) ou distrofia muscular de Becker.
42. O método, de acordo com a modalidade 38, em que o distúrbio é câncer e o câncer é câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cólon, câncer retal, câncer de endométrio, câncer de rim, câncer de lábio, câncer de boca, câncer de fígado, me- lanoma, mesotelioma, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pele não melanoma, câncer oral, câncer de ovário, câncer de pâncreas, câncer de próstata, sarcoma, câncer de pulmão de célu- las pequenas ou câncer de tireoide.
43. O método, de acordo com as modalidades 37 a 42, em que o sujeito é um mamífero.
44. O método, de acordo com a modalidade 43, em que o sujeito é humano.
45. Um kit compreendendo o polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-8, a célula, de acordo com a modalidade 10, a proteína do capsídeo de AAV, de acordo com a mo- dalidade 12 ou 13 e/ou o vetor viral AAV de acordo com qualquer uma das modalidades 13-30.
46. Um sistema de empacotamento de AAV, compreenden- do o polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modali- dades 1-8, e uma célula auxiliar.
47. Um sistema de empacotamento de AAV, de acordo com a modalidade 46, em que a célula auxiliar é uma célula de levedura, uma célula de mamífero, ou uma célula de inseto.
48. Um ácido nucleico que codifica uma proteína do capsí- deo de AAV, a proteína do capsídeo de AAV compreendendo um resí- duo de leucina no aminoácido 129, um resíduo de asparagina no ami- noácido 586 e um resíduo de ácido glutâmico no aminoácido 723, em que as posições de aminoácido na proteína do capsídeo de AAV são numeradas em relação às posições de aminoácido na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.
49. O ácido nucleico, de acordo com a modalidade 48, em que a sequência de aminoácidos do capsídeo de AAV codificada é pe- lo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.
50. O ácido nucleico, de acordo com a modalidade 48, em que a sequência de aminoácidos do capsídeo de AAV codificada é pe- lo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2
51. O ácido nucleico, de acordo com a modalidade 48, em que a sequência de ácido nucleico é pelo menos 99% idêntica à se- quência nucleotídica da SEQ ID NO: 15.
52. O ácido nucleico, de acordo com a modalidade 48, em que a sequência de ácido nucleico é 100% idêntica à sequência nu- cleotídica da SEQ ID NO: 15.
53. Um vetor compreendendo o ácido nucleico de acordo com as modalidades 48 a 52.
54. Uma proteína do capsídeo viral de AAV codificada pelo ácido nucleico de acordo com as modalidades 48 a 52.
55. A proteína do capsídeo de AAV, de acordo com a mo- dalidade 54, em que a proteína compreende a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 2.
56. Um vetor viral AAV compreendendo a proteína do cap- sídeo de AAV codificada pelo ácido nucleico de acordo com a modali- dade 54 ou 55, e um vetor AAV, em que o vetor AAV compreende um ácido nucleico heterólogo.
57. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 56, em que o ácido nucleico heterólogo está operacionalmente ligado a um promotor constitutivo.
58. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 56 ou 57, em que o ácido nucleico heterólogo codifica um polipeptídeo.
59. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 56 ou 57, em que o ácido nucleico heterólogo codifica um RNA antisense, mMicroRNA ou RNAi.
60. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 56, em que a proteína do capsídeo de AAV compreende a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 2.
61. Um ácido nucleico que codifica uma proteína do capsí- deo de AAV compreendendo uma porção VP1, uma porção VP2 e uma porção VP3, em que a porção VP3 compreende regiões variáveis (VR) | a IX, em que: (a) VR-Il compreende a sequência de aminoácidos DNNGVK (SEQ ID NO: 54); (b) VR-Ill compreende a sequência de aminoácidos NDGS (SEQ ID NO: 55); (c) VR-IV compreende a sequência de aminoácidos IN- GSGQNQQT (SEQ ID NO: 56); (d) VR-V compreende a sequência de aminoácidos RVSTTTGQNNNSNFAWTA (SEQ ID NO. 57); (e) VR-VI compreende a sequência de aminoácidos HKE- GEDRFFPLSG (SEQ ID NO: 58); (f) VR-VIl compreende a sequência de aminoácidos KQNAARDNADYSDV (SEQ ID NO: 59); (g) VR-VIIl compreende a sequência de aminoácidos ADN- LQQQNTAPOQ! (SEQ ID NO: 60); e (h) VR-IX compreende a sequência de aminoácidos NYYKSTSVDF (SEQ ID NO: 61).
62. O ácido nucleico, de acordo com a modalidade 61, em que a região VR-| compreende SASTGAS (SEQ ID NO: 52).
63. O ácido nucleico, de acordo com a modalidade 61, em que a região VR-I compreende NSTSGGSS (SEQ ID NO: 53) ou
SSTSGGSS (SEQ ID NO: 87).
64. O ácido nucleico, de acordo com as modalidades 61 a 63, em que a porção VP3 compreende adicionalmente um ou mais de: (i) uma asparagina (N) no aminoácido 223; (ii) um resíduo de alanina (A) no aminoácido 224; (iii) um resíduo de treonina (T) no aminoácido 410; (iv) um resíduo de histidina no aminoácido 724; e (v) um resíduo de prolina (P) no aminoácido 734, em que as posições de aminoácidos na proteína do capsí- deo de AAV são numeradas em relação às posições de aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.
65. O ácido nucleico, de acordo com as modalidades 61 a 64, em que a sequência de aminoácidos do capsídeo de AAV codifica- da é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, 30, 31, 32, 33, 34, 49 ou 84.
66. O ácido nucleico, de acordo com as modalidades 61 a 65, em que a sequência de aminoácidos do capsídeo de AAV codifica- da é pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, 30, 31, 32, 33, 34, 49 ou 84.
67. O ácido nucleico, de acordo com as modalidades 61 a 66, em que a sequência de ácido nucleico é pelo menos 99% idêntica à sequência nucleotídica selecionada da SEQ ID NO:18, 19, 20, 21, 22,23,47,82 ou 98.
68. O ácido nucleico, de acordo com a modalidade 61, em que a sequência de ácido nucleico é 100% idêntica à sequência nu- cleotídica selecionada da SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 47, 82 ou
98.
69. Um vetor compreendendo o ácido nucleico de acordo com as modalidades 61 a 68.
70. Uma proteína do capsídeo viral de AAV codificada pelo ácido nucleico de acordo com as modalidades 61 a 68.
71. A proteína do capsídeo de AAV, de acordo com a mo- dalidade 70, em que a proteína compreende a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 3, 30, 31, 32, 33, 34, 49 ou 84.
72. Um vetor viral AANV compreendendo a proteína do cap- sídeo de AAV codificada pelo ácido nucleico de acordo com as moda- lidades 61 a 68, e um vetor AAV, em que o vetor AAV compreende um ácido nucleico heterólogo.
73. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 72, em que o ácido nucleico heterólogo está operacionalmente ligado a um promotor constitutivo.
74. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 72 ou 73, em que o ácido nucleico heterólogo codifica um polipeptídeo.
75. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 72 ou 73, em que o ácido nucleico heterólogo codifica um RNA antisense, mMicroRNA ou RNAi.
76. O vetor viral AAV, de acordo com as modalidade 72 a 75, em que a proteína do capsídeo de AAV compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, 30, 31, 32, 33, 34, 49 ou 84.
77. Um ácido nucleico que codifica uma proteína do capsí- deo de AAV compreendendo uma porção VP1, uma porção VP2 e uma porção VP3, em que a porção VP3 compreende regiões variáveis (VR) | a IX, em que: (a) VR-I compreende a sequência de aminoácidos SASTGAS (SEQ |D NO: 52) (b) VR-Il compreende a sequência de aminoácidos DNNGVK (SEQ ID NO: 54); (c) VR-Ill compreende a sequência de aminoácidos NDGS (SEQ ID NO: 55); (d) VR-IV compreende a sequência de aminoácidos IN-
GSGQNQQT (SEQ ID NO: 56); (e) VR-V compreende a sequência de aminoácidos RVSTTTGQNNNSNFAWTA (SEQ |D NO: 57); (f) VR-VI compreende a sequência de aminoácidos HKE- GEDRFFPLSG (SEQ ID NO: 58); (9) VR-VIl compreende a sequência de aminoácidos KQNAARDNADYSDV (SEQ ID NO: 59); (h) VR-VIIl compreende a sequência de aminoácidos ADN- LQQQNTAPOQ! (SEQ ID NO: 60)e (i) VR-IX compreende a sequência de aminoácidos NYYKSTSVDF (SEQ ID NO: 61).
78. O ácido nucleico, de acordo com a modalidade 77, em que a porção VP3 compreende adicionalmente um ou mais de: (i) uma asparagina (N) no aminoácido 223; (ii) um resíduo de alanina (A) no aminoácido 224; (iii) um resíduo de treonina (T) no aminoácido 410; (iv) um resíduo de histidina no aminoácido 724; e (v) um resíduo de prolina (P) no aminoácido 734, em que as posições de aminoácidos na proteína do capsí- deo de AAV são numeradas em relação às posições de aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.
79. O ácido nucleico, de acordo com a modalidade 77 ou 78, em que a porção VP3 tem a sequência de SEQ ID NO: 41.
80. O ácido nucleico, de acordo com as modalidades 77 a 79, em que a porção VP1 e VP2 da sequência de aminoácidos do capsídeo de AAV codificada é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da porção VP1e VP2 da SEQ ID NO: 3, 31, 32, 33 ou
34.
81. O ácido nucleico, de acordo com a modalidade 77 a 80, em que a sequência de aminoácidos do capsídeo de AAV codificada é pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, 31, 32, 33 ou 34.
82. O ácido nucleico, de acordo com a modalidade 77 a 81, em que a sequência de ácido nucleico é pelo menos 99% idêntica à sequência nucleotídica selecionada das SEQ ID NOS: 18, 20, 21, 22 ou 23.
83. O ácido nucleico, de acordo com as modalidades 77 a 82, em que a sequência de ácido nucleico é 100% idêntica à sequên- cia nucleotídica selecionada da SEQ ID NO: 18, 20, 21, 22 ou 23.
84. Um vetor compreendendo o ácido nucleico de acordo com as modalidades 57 a 83.
85. Uma proteína do capsídeo de AAV codificada pelo áci- do nucleico de acordo com as modalidades 77 a 83.
86. A proteína do capsídeo de AAV, de acordo com a mo- dalidade 85, em que a proteína compreende a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 3, 31, 32, 33 ou 34.
87. Um vetor viral AAV que a proteína do capsídeo de AAV codificada pelo ácido nucleico de acordo com a modalidade 88, e um vetor AAV, em que o vetor AAV compreende um ácido nucleico heteró- logo.
88. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 87, em que o ácido nucleico heterólogo está operacionalmente ligado a um promotor constitutivo.
89. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 87 ou 88, em que o ácido nucleico heterólogo codifica um polipeptídeo.
90. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 87 ou 88, em que o ácido nucleico heterólogo codifica um RNA antisense, mMicroRNA ou RNAi.
91. O vetor viral AAV, de acordo com as modalidade 87 a 90, em que a proteína do capsídeo de AAV compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, 31, 32, 33 ou 34.
92. Um ácido nucleico que codifica uma proteína do capsí- deo de AAV compreendendo uma porção VP1, uma porção VP2 e uma porção VP3, em que a porção VP1 compreende um resíduo de leucina (L) no aminoácido 129, em que a porção VP2 compreende um resíduo de treonina (T) ou asparagina (N) no aminoácido 157 e um re- síduo de lisina (K) ou serina (S) no aminoácido 162, e em que a por- ção VP3 compreende resíduo de asparagina (N) no aminoácido 223, um resíduo de alanina (A) no aminoácido 224, um resíduo de histidina (H) no aminoácido 272, um resíduo de treonina (T) no aminoácido 410, um resíduo de histidina (H) no aminoácido 724 e um resíduo de prolina (P) no aminoácido 734, em que as posições de aminoácidos na proteí- na do capsídeo de AAV são numeradas em relação às posições de aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.
93. O ácido nucleico, de acordo com a modalidade 92, em que a porção VP3 compreende regiões variáveis (VR) | a IX, em que: (a) VR-| compreende a sequência de aminoácidos SASTGAS (SEQ ID NO: 52); (b) VR-Il compreende a sequência de aminoácidos DNNGVK (SEQ ID NO: 54); (c) VR-Ill compreende a sequência de aminoácidos NDGS (SEQ ID NO: 55); (d) VR-IV compreende a sequência de aminoácidos IN- GSGQNQQT (SEQ ID NO: 56); (e) VR-V compreende a sequência de aminoácidos RVSTTTGQNNNSNFAWTA (SEQ ID NO: 57); (f) VR-VI compreende a sequência de aminoácidos HKE- GEDRFFPLSG (SEQ ID NO: 58); (9) VR-VIl compreende a sequência de aminoácidos KQNAARDNADYSDV (SEQ ID NO: 59);
(h) VR-VIIl compreende a sequência de aminoácidos ADN- LQQQNTAPOQ! (SEQ ID NO: 60)e (i) VR-IX compreende a sequência de aminoácidos NYYKSTSVDF (SEQ ID NO: 61).
94. O ácido nucleico, de acordo com a modalidade 92 ou 93, em que a porção VP1 compreende adicionalmente um resíduo de ácido aspártico (D) ou alanina (A) no aminoácido 24, em que as posi- ções de aminoácidos na proteína do capsídeo de AAV são numeradas em relação às posições de aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.
95. O ácido nucleico, de acordo com a modalidade 92 a 94, em que a porção VP2 compreende adicionalmente um ou mais de (i) um resíduo de prolina (P) no aminoácido 148; (ii) um resíduo de arginina (R) inserido no aminoácido 152; (iii) um resíduo de arginina (R) no aminoácido 168; (iv) um resíduo de isoleucina (1) no aminoácido 189; e (v) um resíduo de serina (S) no aminoácido 200, em que as posições de aminoácidos na proteína do capsí- deo de AAV são numeradas em relação às posições de aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.
96. O ácido nucleico, de acordo com as modalidades 92 a 96, em que a sequência de aminoácidos do capsídeo de AAV codifica- da é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ NO:31, 32, 33 ou 34.
97. O ácido nucleico, de acordo com as modalidades 92, em que a sequência de aminoácidos do capsídeo de AAV codificada é pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 31, 32, 33 ou 34.
98. O ácido nucleico, de acordo com a modalidade 92, em que a sequência de ácido nucleico é pelo menos 99% idêntica à se-
quência nucleotídica selecionada da SEQ ID NO: 20, 21, 22 ou 23.
99. O ácido nucleico, de acordo com a modalidade 98, em que a sequência de ácido nucleico é 100% idêntica à sequência nu- cleotídica selecionada da SEQ ID NO: 20, 21, 22 ou 23.
100. Um vetor compreendendo o ácido nucleico de acordo com as modalidades 92 a 99.
101. Uma proteína do capsídeo viral de AAV codificada pe- lo ácido nucleico de acordo com as modalidades 92 a 99.
102. A proteína do capsídeo de AAV, de acordo com a mo- dalidade 101, em que a proteína compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 31, 32, 33 ou 34.
103. Um vetor viral AAV compreendendo a proteína do capsídeo de AAV codificada pelo ácido nucleico de acordo com a mo- dalidade 101 ou 102, e um vetor AAV, em que o vetor AAV compreen- de um ácido nucleico heterólogo.
104. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 103, em que o ácido nucleico heterólogo está operacionalmente ligado a um promotor constitutivo.
105. O vetor viral AAV, de acordo com a modalidade 103 ou 104, em que o ácido nucleico heterólogo codifica um polipeptídeo, um RNA antisense, microRNA ou RNAi.

Claims (28)

REIVINDICAÇÕES
1. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que codifica uma proteína do capsídeo de AAV compreendendo uma porção VP1, uma porção VP2 e uma porção VP3, em que a porção VP3 compreen- de regiões variáveis (VR) | a IX, em que: (a) VR-Il compreende a sequência de aminoácidos DNNGVK (SEQ ID NO: 54), (b) VR-Ill compreende a sequência de aminoácidos NDGS (SEQ ID NO:55), (c) VR-IV compreende a sequência de aminoácidos IN- GSGQNQQT (SEQ ID NO: 56), (d) VR-V compreende a sequência de aminoácidos RVSTTTGQNNSNFAWTA (SEQ ID NO: 57), (e)VR-VI compreende a sequência de aminoácidos HKE- GEDRFFPLSG (SEQ ID NO: 58), (f) VR-VIl compreende a sequência de aminoácidos KQNAARDNADYSDV (SEQ ID NO: 59), (g) VR-VIIIl compreende a sequência de aminoácidos ADN- LQQQNTAPOQ! (SEQ ID NO: 60), e (h) VR-IX compreende a sequência de aminoácidos NYYKSTSVDF (SEQ ID NO: 61).
2. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizado pelo fato de que a região VR-| compreende NSTSGGSS (SEQ ID NO: 53) ou SSTSGGSS (SEQ ID NO. 87).
3. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ca- racterizado pelo fato de que a região VR-I compreende SASTGAS (SEQ ID NO: 52).
4. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a porção VP3 tem a se- quência da SEQ ID NO:41.
5. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 2, caracte- rizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos do capsídeo de AAV codificada é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoáci- dos da SEQ NO:30 ou SEQ ID NO:84.
6. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 3, caracte- rizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos do capsídeo de AAV codificada é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, ou SEQ ID NO: 34.
7. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 4, caracte- rizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico é pelo menos 95% idêntica à sequência nucleotídica selecionada das SEQ ID NOS:18-23.
8. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 7, caracte- rizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico é 100% idêntica à sequência nucleotídica selecionada das SEQ ID NOS:18-23.
9. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o áci- do nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
10. Proteína do capsídeo de AAV, caracterizada pelo fato de que é codificada pelo ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
11. Proteína do capsídeo de AAV, de acordo com a reivin- dicação 10, caracterizada pelo fato de que a proteína compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, ou SEQ ID NO: 34.
12. Vetor viral AAV, caracterizado pelo fato de que compre- ende a proteína do capsídeo de AAV codificada pelo ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e um vetor AAV, em que o vetor AAV compreende, na orientação 5' para 3', (a) uma primeira repetição terminal invertida de
AAV, (b) um promotor, (c) um ácido nucleico heterólogo, (d) uma cauda poli-A; e (e) uma segunda repetição terminal invertida de AAV.
13. Vetor viral AAV, de acordo com a reivindicação 12, ca- racterizado pelo fato de que o ácido nucleico heterólogo está operaci- onalmente ligado a um promotor constitutivo.
14. Vetor viral AAV, de acordo com a reivindicação 12, ca- racterizado pelo fato de que o ácido nucleico heterólogo codifica um polipeptídeo.
15. Vetor viral AAV, de acordo com a reivindicação 12, ca- racterizado pelo fato de que o ácido nucleico heterólogo codifica um RNA antisense, microRNA ou RNAi.
16. Vetor viral AAV, de acordo com a reivindicação 12, ca- racterizado pelo fato de que a proteína do capsídeo de AAV compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, ou SEQ ID NO: 34.
17. Vetor viral AAV, caracterizado pelo fato de que compre- ende (i) uma proteína do capsídeo de AAV tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, ou SEQ ID NO: 34, e (ii) um vetor AAV, em que o vetor AAV compreende, na ori- entação 5' para 3, (a) uma primeira repetição terminal invertida de AAV, (b) um promotor, (c) um ácido nucleico heterólogo, (d) uma cauda poli-A; e
(e) uma segunda repetição terminal invertida de AAV.
18. Vetor viral AAV, de acordo com a reivindicação 12 ou 17, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico heterólogo codifica um mRNA, siRNA, gRNA, ou microRNA.
19. Vetor viral AAV, de acordo com a reivindicação 12 ou 17, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico heterólogo codifica um polipeptídeo.
20. Vetor viral AAV, de acordo com a reivindicação 19, ca- racterizado pelo fato de que a sequência gênica heteróloga codifica um regulador de condutância transmembrana da fibrose cística (CFTR), uma proteína CLN3, uma alfa-galactosidase A (GLA) ou uma alfa-glicosidase ácida (GAA).
21. Vetor viral AAV, de acordo com a reivindicação 20, ca- racterizado pelo fato de que a sequência heteróloga codifica um CFTR.
22. Vetor viral AAV, de acordo com a reivindicação 21, ca- racterizado pelo fato de que o CFTR compreende a sequência de ami- noácidos codificada pela SEQ ID NO: 4.
23. Vetor viral AAV, de acordo com a reivindicação 19, ca- racterizado pelo fato de que a sequência gênica heteróloga codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, 80%, 90% ou 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 5,8, 11 e 14.
24. Vetor viral AAV, de acordo com a reivindicação 19, ca- racterizado pelo fato de que a sequência gênica heteróloga compreen- de uma sequência com pelo menos 70%, 80%, 90% ou 99% de identi- dade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 4, 5, 6,7, 9, 10, 12, e 13.
25. Vetor viral AAV, de acordo com a reivindicação 12 ou 17, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor LTR do vírus do sarcoma de Rous (RSV) (opcionalmente com o potenciador de RSV), um promotor de citomegalovírus (CMV), um promotor de SVA40, um promotor de di-hidrofolato redutase, um promotor de beta- actina, um promotor de fosfoglicerol quinase (PGK), um promotor U6, um promotor H1, um promotor CAG, um promotor híbrido de beta- actina de frango, um promotor de MeCP2, um promotor de EF1, um promotor híbrido de B-actina de galinha (CBh), um promotor U1a, um promotor U1b, um promotor de MeCP2, um promotor de MeP418, um promotor de MeP426, um promotor mínimo de MeCP2, um promotor de VMD2, um promotor de mRho, promotor de EFla, promotor de Ubc, promotor de B-actina humana, promotor de TRE, promotor de Ac5, promotor de poliedrina, promotor de CaMKlla, promotor de Gal1, pro- motor de TEF1, promotor de GDS, promotor de ADH1, promotor de Ubi, ou promotor de a-1-antitripsina (DAAT).
26. Método de tratamento de uma doença ou distúrbio, ca- racterizado pelo fato de que compreende a administração do vetor viral AAV, como definido em qualquer uma das reivindicações 12 a 25, a um sujeito.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracteriza- do pelo fato de que o vetor viral AAV é administrado ao sujeito por via oral, retal, transmucosa, inalatória, transdérmica, parenteral, intrave- nosa, subcutânea, intradérmica, intramuscular, intrapleural, intracere- bral, intratecal, intracerebral, intraventricular, intranasal, intra-auricular, intraocular, ou periocular, tópica, intralinfática, intracisternal, ou intraví- trea.
28. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracteriza- do pelo fato de que a doença ou distúrbio é a esclerose lateral amiotró- fica (ALS, amyotrophic lateral sclerosis), atrofia muscular espinhal (SMA, spinal muscular atrophy), Doença de Fabry, doença de Pompe, doença CLN3 (ou lipofuscinose Ceroide Neuronal Juvenil), epidermóli- se bolhosa distrófica recessiva (RDEB, recessive dystrophic epider-
molysis bullosa), doença de Batten juvenil, distúrbio autossômico do- minante, distrofia muscular, hemofilia A, hemofilia B, esclerose múlti- pla, diabetes mellitus, câncer da doença de Gaucher, artrite, atrofia muscular, doença cardíaca, hiperplasia íntima, epilepsia, doença de Huntington, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, fibrose císti- ca, talassemia, Síndrome de Hurler, Síndrome de Sly, Síndrome de Scheie, Síndrome de Hurler-Scheie, Síndrome de Hunter, Síndrome de Sanfilippo tipo A (mucopolissacaridose IIIA ou MPS IIIA), Síndrome de Sanfilippo tipo B (mucopolissacaridose IIIB ou MPS IIIB), Síndrome de Sanfilippo tipo C, Síndrome de Sanfilippo tipo D, Síndrome de Morquio, Síndrome de Maroteaux-Lamy, doença de Krabbe, fenilcetonúria, do- ença de Batten, ataxia cerebral espinhal, deficiência do receptor de LDL, hiperamonemia, artrite, degeneração macular, retinite pigmento- sa, lipofuscinose ceroide, neuronal, 1 (CLN1), ou deficiência de ade- nosina desaminase.
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