CN113748211A - 用于4-羟甲基糠醛及其衍生物的体内合成的方法 - Google Patents

用于4-羟甲基糠醛及其衍生物的体内合成的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113748211A
CN113748211A CN202080032050.1A CN202080032050A CN113748211A CN 113748211 A CN113748211 A CN 113748211A CN 202080032050 A CN202080032050 A CN 202080032050A CN 113748211 A CN113748211 A CN 113748211A
Authority
CN
China
Prior art keywords
clostridium
formylfuran
dehydrogenase
oxidase
ala
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080032050.1A
Other languages
English (en)
Inventor
P·M·拉杜安亚历山德里诺
I·埃斯特拉达古弗
V·莱特奎罗斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Braskem SA
Original Assignee
Braskem SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Braskem SA filed Critical Braskem SA
Publication of CN113748211A publication Critical patent/CN113748211A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/56—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D307/68—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/03—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on phosphates (4.2.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01001—Alcohol dehydrogenase (1.1.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01003—Aldehyde dehydrogenase (NAD+) (1.2.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01004—Aldehyde dehydrogenase (NADP+) (1.2.1.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01005—Aldehyde dehydrogenase [NAD(P)+] (1.2.1.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Furan Compounds (AREA)
  • Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Abstract

本公开提供了用于从碳源产生4‑HMF、2,4‑呋喃二甲醇、呋喃‑2,4‑二甲醛、4‑(羟甲基)糠酸、2‑甲酰基呋喃‑4‑羧酸酯、4‑甲酰基呋喃‑2‑羧酸酯和/或2,4‑FDCA的重组微生物和方法。所述方法提供了表达催化碳源转化为4‑HMF、2,4‑呋喃二甲醇、呋喃‑2,4‑二甲醛、4‑(羟甲基)糠酸、2‑甲酰基呋喃‑4‑羧酸酯、4‑甲酰基呋喃‑2‑羧酸酯和/或2,4‑FDCA的内源和/或外源核酸分子的经工程改造的微生物。本公开进一步提供了产生源自4‑HMF、2,4‑呋喃二甲醇、呋喃‑2,4‑二甲醛、4‑(羟甲基)糠酸、2‑甲酰基呋喃‑4‑羧酸酯、4‑甲酰基呋喃‑2‑羧酸酯和/或2,4‑FDCA的聚合物的方法。

Description

用于4-羟甲基糠醛及其衍生物的体内合成的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年3月1日提交的标题为“用于4-羟甲基糠醛及其衍生物的体内合成的方法(METHOD FOR THE IN VIVO SYNTHESIS OF 4-HYDROXYMETHYLFURFURAL ANDDERIVATIVES THEREOF)”的美国临时申请号62/812,904的优先权，该临时申请的公开内容通过引用并入本文。
技术领域
本申请涉及用于4-HMF、2,4-呋喃二甲醇、呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯和2,4-FDCA中的一种或多种的生物合成的重组微生物以及产生所述重组微生物的方法。本申请还涉及在不存在微生物或基本上不含微生物的情况下，用酶促催化剂产生2,4-呋喃二甲醇、呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯和2,4-FDCA中的一种或多种的方法。本申请进一步涉及从2,4-呋喃二甲醇、呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯和2,4-FDCA中的一种或多种产生聚合物和增塑剂的方法。本申请进一步涉及包含这些化合物中的一种或多种和/或所述重组微生物的组合物。
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本形式提供，代替纸质副本，并且特此通过引用并入说明书中。含序列表的文本文件名称为BRSK-019_01WO_ST25.txt。文本文件为约240KB，创建于2020年2月27日，并且经由EFS-Web以电子形式提交。
背景技术
2,5-呋喃二羧酸(2,5-FDCA)因其在聚酯(特别是聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET))的合成中取代对苯二甲酸的潜力而备受关注(Sousa,Andreia F.等人，"Biobasedpolyesters and other polymers from 2,5-furandicarboxylic acid:a tribute tofuran excellency."Polymer chemistry 6.33(2015):5961-5983)。在PET中将对苯二甲酸取代为呋喃类似物2,5-FDCA可以产生2,5-呋喃二羧酸酯(2,5-PEF)并且这种聚合物与PET相比具有若干优点。一方面，与对应物相比，2,5-PEF具有更好的热学性能、阻隔性能和机械性能(PEP报告294)。此外，众所周知乙二醇可以从可再生资源产生，那么与半可再生PET不同，2,5-PEF可以是100％可再生的。
尽管与对苯二甲酸相比，2,5-FDCA具有所有前述优点，但2,5-FDCA生产成本仍然是目前扩大单体使用的限制。与对苯二甲酸相比，现有技术不具有成本竞争力。为此可能原因之一与所需的几个连续工业步骤有关。可以帮助降低2,5-FDCA生产成本的一个问题是找到从糖到所需分子的直接发酵途径，但从未报道过此类途径。
本公开是2,4-FDCA，即2,5-FDCA的异构体的直接发酵途径。据我们所知，除了本公开以外，还没有描述任何FDCA异构体的直接发酵途径。
重要的是，与充分研究的2,5-FDCA相比，所公开的2,4-FDCA分子具有独特性能。使2,4-FDCA与二醇催化聚合得到由具有有价值的性能的2,4-FDCA组成的聚合物。在一项研究中，Thiyagarajan和合作者(2014)比较了由2,4-FDCA、3,4-FDCA、2,5-FDCA和对苯二甲酸制成的聚酯，并得出结论，可以通过工业上适用的方法制成足够分子量的2,4-FDCA和3,4-FDCA聚酯(Thiyagarajan,Shanmugam等人"Biobased furandicarboxylic acids(FDCAs):effects of isomeric substitution on polyester synthesis and properties."GreenChemistry 16.4(2014):1957-1966)。在另一项研究中，Thiyagarajan和同事得出结论，对2,4-FDCA和2,5-FDCA的结构分析揭示2,4-FDCA具有比2,5-FDCA更多的类似于对苯二甲酸的线性特征。这些特征使得2,4-FDCA成为合成聚酯的令人感兴趣的单体(Thiyagarajan等人“Concurrent formation of furan-2,5-and furan-2,4-dicarboxylic acid:unexpected aspects of the Henkel reaction”RSC Advances 3(2013):15678-15686)。进一步地，这些材料具有不同于2,5-FDCA聚酯的性能(Bourdet等人"Molecular Mobilityin Amorphous Biobased Poly(ethylene 2,5-furandicarboxylate)and Poly(ethylene2,4-furandicarboxylate)."Macromolecules 51.5(2018):1937-1945)。
在某些情况下，已经报道2,4-FDCA聚合物具有优于2,5-FDCA聚合物所具有的那些性能。Cui和合作者(2016)报道称，与中心环连接的双羧基基团之间的键角是影响向列液晶分子(诸如LCD TV、笔记本电脑和其他显示元件中所用的那些)的稳定性的关键因素(Cui,Min-Shu等人"Production of 4-hydroxymethylfurfural from derivatives ofbiomass-derived glycerol for chemicals and polymers."ACS SustainableChemistry&Engineering 4.3(2016):1707-1714)。首次发现的液晶即对苯二甲酸二酯分子在两个羧基基团之间的键角为180°。相比之下，2,5-呋喃二羧酸在两个羧基基团之间的键角为137°。重要的是，2,4-呋喃二羧酸在两个羧基基团之间的键角为160°，使其更适于合成向列液晶分子。
尽管2,4-FDCA聚合物有这些潜在应用，但2,4-FDCA的生产成本也是当前扩大这种单体应用的瓶颈(Cui MS等人(2016)Production of 4-Hydroxymethylfurfural fromDerivatives of Biomass-Derived Glycerol for Chemicals and Polymers.ACSSustainable Chem.Eng.4(3):1707-1714以及WO2011003300A1)。先前合成2,4-取代的呋喃，包括2,4-FDCA，需要多个合成步骤，并且因此通过当前可用的方法和工业技术，2,4-FDCA来源的聚合物是成本高昂的。
本公开首次提供了在重组微生物中获得2,4-FDCA的直接发酵途径。2,4-FDCA从来自于诸如葡萄糖、木糖、甘油等碳原料或来自于任何CO2衍生/捕获技术的甘油醛-3-磷酸(G3P)的新型直接发酵将使得能够生产具有工业规模的商业适用性的新型聚合物和材料。本公开进一步首次提供了用于在重组微生物中产生4-HMF、2,4-呋喃二甲醇、呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯和4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯中的一种或多种的直接发酵途径。本公开还首次证明来自酵母和大肠杆菌(E.coli)的内源磷酸酶能够使(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯去磷酸化为4-HMF并且酶(氧化酶、脱氢酶和/或过加氧酶)能够使4-HMF氧化为2,4FDCA(直接地或通过产生中间产物)。虽然这里部署的一些酶候选物已被表征为对5-HMF异构体底物和中间产物具有活性，但其针对4-HMF(及其中间产物)的活性尚未进行表征。这些新型直接发酵途径将使得能够产生具有商业适用性的2,4-取代的呋喃。参见，Deng等人(2013.Linked Strategy for the Production of Fuels via FormoseReaction.Scientific Reports,3:1244)中4-HMF作为生物燃料前体的示例性应用。参见Zeng等人(2013.Bio-based Furan Polymers with Self-HealingAbility.Macromolecules,46.5:1794-1802)中2,4-呋喃二甲醇在具有高级性能的聚合物中的示例性应用。
发明内容
在某些情况下，已经报道2,4-FDCA聚合物具有优于2,5-FDCA聚合物所具有的那些性能。Cui和合作者(2016)报道称，与中心环连接的双羧基基团之间的键角是影响向列液晶分子(诸如LCD TV、笔记本电脑和其他显示元件中所用的那些)的稳定性的关键因素(Cui,Min-Shu等人"Production of 4-hydroxymethylfurfural from derivatives ofbiomass-derived glycerol for chemicals and polymers."ACS SustainableChemistry&Engineering 4.3(2016):1707-1714)。首次发现的液晶即对苯二甲酸二酯分子在两个羧基基团之间的键角为180°。相比之下，2,5-呋喃二羧酸在两个羧基基团之间的键角为137°。重要的是，2,4-呋喃二羧酸在两个羧基基团之间的键角为160°，使其更适于合成向列液晶分子。
本公开提供了一种通过将甘油醛3-磷酸(G3P)酶促转化为2,4-呋喃二羧酸(2,4-FDCA)来产生2,4-呋喃二羧酸(2,4-FDCA)的方法，所述方法包括：(a)在磷酸甲酯合酶的存在下提供G3P，所述磷酸甲酯合酶催化G3P转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯；(b)向来自(a)的所述(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯提供催化所述(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯转化为4-羟甲基糠醛(4-HMF)的磷酸酶；(c)将来自(b)的所述4-HMF提供给脱氢酶和/或氧化酶，所述脱氢酶和/或氧化酶独立地或协同地催化来自(b)的4-HMF直接地或通过产生中间产物呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯而氧化为2,4FDCA。
在一些实施方案中，2,4-FDCA从呋喃-2,4-二甲醛和/或-(羟甲基)糠酸中间产物产生，其中：(a)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化所述4-HMF转化为呋喃-2,4-二甲醛和/或4-(羟甲基)糠酸；和/或(b)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化来自(a)的所述呋喃-2,4-二甲醛转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯；和/或(c)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化来自(a)的所述4-(羟甲基)糠酸转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯；和/或(d)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化来自(a)的所述呋喃-2,4-二甲醛转化为2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯；和或(e)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化来自(b)和/或(c)的所述4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯或来自(d)的所述2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯转化为2,4-FDCA。
在一些实施方案中，来自(a)的磷酸甲酯合酶被分类为EC编号4.2.3.153。在一些实施方案中，所述磷酸甲酯合酶是(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶。在一些实施方案中，所述(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶选自MfnB1、MfnB7和MfnB14。
在一些实施方案中，所述(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶包含含有SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些实施方案中，来自(b)的所述磷酸酶被分类为EC编号3.1.3。在一些实施方案中，所述磷酸酶被分类为卤代酸脱卤酶。在一些实施方案中，所述磷酸酶是宿主内源性的。
在一些实施方案中，所述宿主内源性的磷酸酶被过表达。在一些实施方案中，其中所述磷酸酶是4-HMF磷酸酶。
在一些实施方案中，所述4-HMF磷酸酶源自天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或大肠杆菌(Escherichia coli)。
在一些实施方案中，所述4-HMF磷酸酶由包含SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:40-52中的任一者或SEQ ID NO:53-68中的任一者的氨基酸序列编码。
在一些实施方案中，来自(c)的所述脱氢酶被分类为EC编号1.1.1.或EC编号1.2.1。在一些实施方案中，所述脱氢酶是醇脱氢酶或醛脱氢酶。在一些实施方案中，来自(c)的所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一些实施方案中，所述氧化酶是5-羟甲基糠醛氧化酶。在一些实施方案中，所述脱氢酶被分类为EC编号1.2.1.或EC编号1.1.1。在一些实施方案中，所述脱氢酶是醛脱氢酶或和醇脱氢酶。
在一些实施方案中，所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一些实施方案中，所述氧化酶是5-羟甲基糠醛氧化酶。在一些实施方案中，所述氧化酶是4-HMF氧化酶。在一些实施方案中，所述4-HMF氧化酶选自HmfH6和HmfH7。在一些实施方案中，所述4-HMF氧化酶包含含有SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:86的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述脱氢酶被分类为EC编号1.2.1。在一些实施方案中，所述脱氢酶是醛脱氢酶。
本公开提供了一种能够从包含碳源的原料产生2,4-呋喃二羧酸(2,4-FDCA)的重组微生物，其中所述重组微生物表达：(a)能够将碳源转化为甘油醛3-磷酸(G3P)的内源和/或外源核酸分子；(b)编码催化来自(a)的G3P转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶的至少一种内源或外源核酸分子；(c)编码催化来自(b)的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯转化为4-羟甲基糠醛(4-HMF)的磷酸酶的至少一种内源或外源核酸分子；(d)编码过加氧酶、脱氢酶或氧化酶的至少一种内源或外源核酸分子，所述过加氧酶、脱氢酶或氧化酶独立地或协同地催化来自(c)的4-HMF直接地或通过产生中间产物呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯而氧化为2,4FDCA。
在一些实施方案中，所述碳源包含己糖、戊糖、甘油、CO2、蔗糖和/或其组合。在一些实施方案中，来自(a)的磷酸甲酯合酶被分类为EC编号4.2.3.153。在一些实施方案中，其中所述合酶是(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶。
在一些实施方案中，来自(c)的所述磷酸酶被分类为EC编号3.1.3。在一些实施方案中，所述磷酸酶被分类为卤代酸脱卤酶。在一些实施方案中，所述磷酸酶是宿主内源性的。在一些实施方案中，所述宿主内源性的磷酸酶被过表达。
在一些实施方案中，来自(d)的所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一些实施方案中，来自(d)的所述氧化酶是5-羟甲基糠醛氧化酶。
在一些实施方案中，来自(d)的所述脱氢酶被分类为EC编号1.1.1.或EC编号1.2.1。在一些实施方案中，所述脱氢酶是醇脱氢酶或醛脱氢酶。
在一些实施方案中，2,4-FDCA从呋喃-2,4-二甲醛和/或-(羟甲基)糠酸中间产物产生，其中：(a)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化来自(c)的所述4-HMF转化为呋喃-2,4-二甲醛和/或4-(羟甲基)糠酸；和/或(b)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化来自(a)的所述呋喃-2,4-二甲醛转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯；和/或(c)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化来自(b)的所述4-(羟甲基)糠酸转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯；和/或(d)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化来自(c)的所述呋喃-2,4-二甲醛转化为2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯；和/或(e)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化来自(b)和/或(c)的所述4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯或来自(d)的所述2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯转化为2,4-FDCA。
在一些实施方案中，来自(a)、(b)、(c)、(d)和/或(e)的脱氢酶被分类为EC编号1.2.1或EC编号1.1.1。在一些实施方案中，所述脱氢酶是醛脱氢酶或醇脱氢酶。在一些实施方案中，来自(a)、(b)、(c)、(d)和/或(e)的所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一些实施方案中，所述氧化酶是5-(羟甲基)糠醛氧化酶。
在一些实施方案中，所述一种或多种重组微生物源自选自由以下组成的组的亲本微生物：梭菌属(Clostridium sp.)、永达尔梭菌(Clostridium ljungdahlii)、产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、嗜甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴氏嗜喊菌(Alkalibaculum bacchii)、德雷克氏梭菌(Clostridium drakei)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、甲酸乙酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermoautotrophica)、长醋丝菌(Acetonema longum)、黏液真杆菌(Blautia producta)、乙二醇梭菌(Clostridiumglycolicum)、大梭菌(Clostridium magnum)、克氏梭菌(Candida krusei)、马永贝梭菌(Clostridium mayombei)、食甲氧基苯甲酸梭菌(Clostridium methoxybenzovorans)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)、凯伍嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter kivui)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata)、嗜热醋杆菌(Thermoacetogenium phaeum)、甲醇醋酸杆菌(Acetobacterium carbinolicum)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、白蚁鼠孢菌(Sporomusa termitida)、甘油穆尔氏菌(Moorella glycerini)、聚集性真杆菌(Eubacterium aggregans)、固氮密螺旋体(Treponema azotonutricium)、库德毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)、大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、芽孢杆菌属(Bacillus sp)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis)和甘油利用泰瑞孢子菌(Terrisporobacter glycolicus)。
在一些实施方案中，所述一种或多种重组微生物源自选自由以下组成的组的亲本微生物：梭菌属、永达尔梭菌、产乙醇梭菌、拉氏梭菌、粘液真杆菌、嗜甲基丁酸杆菌、热醋穆尔氏菌、谷氨酸棒杆菌、醋酸梭菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜喊菌、德雷克氏梭菌、食一氧化碳梭菌、甲酸乙酸梭菌、粪味梭菌、热自养穆尔氏菌、长醋丝菌、黏液真杆菌、乙二醇梭菌、大梭菌、克氏梭菌、马永贝梭菌、食甲氧基苯甲酸梭菌、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、普氏产醋杆菌、凯伍嗜热厌氧菌、卵形鼠孢菌、嗜热醋杆菌、甲醇醋酸杆菌、东方伊萨酵母、白蚁鼠孢菌、甘油穆尔氏菌、聚集性真杆菌、固氮密螺旋体、库德毕赤酵母、大肠杆菌、酿酒酵母、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、解脂耶氏酵母、树干毕赤酵母和甘油利用泰瑞孢子菌。
本公开提供了一种使用如权利要求27所述的重组微生物产生2,4-FDCA的方法，所述方法包括在含有提供碳源的原料的培养基中培育所述重组微生物，直至产生所述2,4-FDCA。
本公开提供了一种产生能够从包含碳源的原料产生2,4-FDCA的重组微生物的方法，所述方法包括将以下分子引入所述重组微生物中和/或在所述重组微生物中过表达：(a)能够将甘油或单糖转化为甘油醛3-磷酸(G3P)的内源和/或外源核酸分子；(b)编码催化来自(a)的G3P转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶的至少一种内源或外源核酸分子；(c)编码催化来自(b)的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯转化为4-羟甲基糠醛(4-HMF)的磷酸酶的至少一种内源或外源核酸分子；(d)编码过加氧酶、脱氢酶或氧化酶的至少一种内源或外源核酸分子，所述过加氧酶、脱氢酶或氧化酶独立地或协同地催化来自(c)的4-HMF直接地或通过产生中间产物呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯而氧化为2,4FDCA。
在一些实施方案中，所述碳源包含己糖、戊糖、甘油、CO2、蔗糖和/或其组合。在一些实施方案中，来自(a)的磷酸甲酯合酶被分类为EC编号4.2.3.153。在一些实施方案中，所述合酶是(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶。在一些实施方案中，来自(c)的所述磷酸酶被分类为EC编号3.1.3。在一些实施方案中，所述磷酸酶被分类为卤代酸脱卤酶。在一些实施方案中，所述磷酸酶是宿主内源性的。在一些实施方案中，所述宿主内源性的磷酸酶被过表达。
在一些实施方案中，来自(d)的所述脱氢酶被分类为EC编号1.1.1.或EC编号1.2.1。在一些实施方案中，所述脱氢酶是醇脱氢酶或醛脱氢酶。在一些实施方案中，来自(d)的所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一些实施方案中，所述氧化酶是(5-(羟甲基)糠醛氧化酶。
在一些实施方案中，2,4-FDCA从呋喃-2,4-二甲醛和/或-(羟甲基)糠酸中间产物产生，其中：(a)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化所述4-HMF转化为呋喃-2,4-二甲醛和/或4-(羟甲基)糠酸；和/或(b)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化来自(a)的所述呋喃-2,4-二甲醛转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯；和/或(c)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化来自(a)的所述4-(羟甲基)糠酸转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯；和/或(d)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化来自(a)的所述呋喃-2,4-二甲醛转化为2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯；和/或(e)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化来自(b)和/或(c)的所述4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯或来自(d)的所述2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯转化为2,4-FDCA。
在一些实施方案中，来自(a)、(b)、(c)、(d)和/或(e)的脱氢酶被分类为EC编号1.2.1或EC编号1.1.1。在一些实施方案中，所述脱氢酶是醛脱氢酶或醇脱氢酶。在一些实施方案中，来自(a)、(b)、(c)、(d)和/或(e)的所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一些实施方案中，所述氧化酶是5-(羟甲基)糠醛氧化酶。
本公开提供了根据本公开的方法产生的2,4-FDCA。
本公开提供了根据本公开的微生物产生的2,4-FDCA。
本公开提供了由本公开的实施方案的2,4-FDCA产生的聚合物。在一些实施方案中，来自2,4-FDCA的所述聚合物在非生物学方法中形成。
本公开提供了一种能够从包含外源性碳源的原料产生4-羟甲基糠醛(4-HMF)的重组微生物，其中所述重组微生物表达：(a)能够将碳源转化为甘油醛3-磷酸(G3P)的内源和/或外源核酸分子；(b)编码催化来自(a)的G3P转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶的至少一种内源或外源核酸分子；和(c)编码催化来自(b)的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯转化为4-羟甲基糠醛(4-HMF)的磷酸酶的至少一种内源或外源核酸分子。
在一些实施方案中，来自(a)的磷酸甲酯合酶被分类为EC编号4.2.3.153。在一些实施方案中，所述合酶是(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶。在一些实施方案中，来自(c)的所述磷酸酶被分类为EC编号3.1.3。在一些实施方案中，所述磷酸酶被分类为卤代酸脱卤酶。在一些实施方案中，所述磷酸酶是宿主内源性的。在一些实施方案中，所述宿主内源性的磷酸酶被过表达。
本公开提供了一种能够从包含碳源的原料产生2,4-呋喃二羧酸(2,4-FDCA)的重组微生物，其中所述重组微生物表达以下的一种或多种分子：(a)能够将甘油或单糖转化为甘油醛3-磷酸(G3P)的内源和/或外源核酸分子；(b)编码催化来自(a)的G3P转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶的至少一种内源或外源核酸分子；(c)编码催化来自(b)的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯转化为4-羟甲基糠醛(4-HMF)的磷酸酶的至少一种内源或外源核酸分子；(d)编码脱氢酶和/或氧化酶的至少一种内源或外源核酸分子，所述脱氢酶和/或氧化酶独立地或协同地催化来自(b)的4-HMF直接地或通过产生中间产物呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯而氧化为2,4FDCA。
在一些方面，本公开总体上涉及一种通过在重组微生物中通过在微生物的存在下用酶促催化剂使甘油醛3-磷酸(G3P)酶促转化为2,4-呋喃二羧酸(2,4-FDCA)来产生2,4-呋喃二羧酸(2,4-FDCA)的方法，所述方法包括：(a)在磷酸甲酯合酶或能够催化G3P转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯的任何酶的存在下提供G3P；(b)将来自(a)的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯提供给磷酸酶或能够催化所述(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯转化为4-羟甲基糠醛(4-HMF)的任何酶；(c)将来自(b)的所述4-HMF提供给氧化酶、脱氢酶或过加氧酶，所述氧化酶、脱氢酶或过加氧酶能够独立地或协同地催化4-HMF直接地或通过产生中间产物呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯而氧化为2,4FDCA。
在这个意义上，步骤C可以通过将来自(b)的4-HMF提供给脱氢酶或氧化酶来进行，所述脱氢酶或氧化酶催化4-HMF转化为以下物质：(i)呋喃-2,4-二甲醛，和/或(ii)4-(羟甲基)糠酸；(d)将(i)来自(c)(i)的呋喃-2,4-二甲醛提供给催化呋喃-2,4-二甲醛转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯的脱氢酶、氧化酶或过加氧酶；将(ii)来自(c)(ii)的4-(羟甲基)糠酸提供给催化4-(羟甲基)糠酸转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯的脱氢酶、氧化酶或过加氧酶；和/或将(iii)来自I(i)的呋喃-2,4-二甲醛提供给催化呋喃-2,4-二甲醛转化为2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯的脱氢酶、氧化酶或过加氧酶；以及(e)将来自(d)(i)和/或(d)(ii)的4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯或来自(d)(iii)的2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯提供给催化来自(d)(i)和/或(d)(ii)的4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯或来自(d)(iii)的2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯转化为2,4-FDCA的脱氢酶或氧化酶。
在一些方面，来自(a)的磷酸甲酯合酶被分类为EC编号4.2.3.153。在一些方面，所述合酶是(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶。
在一些方面，来自(b)的磷酸酶是分类为EC编号3.1.3的磷酸单酯水解酶。在一些方面，磷酸酶被分类为卤代酸脱卤酶(Koonin等人J.Mol.Biol.244(1).1994)。在一些方面，反应b的磷酸酶是宿主内源性的(Offley等人Curr.Gen.65.2019)。在一些方面，所述宿主内源性的磷酸酶被过表达。在一些情况下，使用能够进行所需反应的异源磷酸酶，并且所述异源磷酸酶选自碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、果糖-二磷酸酶、糖-磷酸酶或糖-末端-磷酸酶。
在一些方面，来自(c)的脱氢酶在将醇氧化为羰基时分类为EC编号1.1.1.或在将羰基氧化为酸时分类为EC编号1.2.1.。在一些方面，所述脱氢酶是醇脱氢酶或醛脱氢酶。
在一些方面，来自(c)的所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一些方面，所述氧化酶是5-(羟甲基糠醛氧化酶。在一些方面，5-羟甲基糠醛氧化酶在三步反应中将4-羟甲基糠醛(4-HMF)转化为2,4FDCA。
在一些方面，本公开总体上涉及一种能够从包含碳源的原料产生2,4-呋喃二羧酸(2,4-FDCA)的重组微生物，其中所述重组微生物表达：(a)能够将碳源转化为甘油醛3-磷酸(G3P)的内源和/或外源核酸分子；(b)编码催化来自(a)的G3P转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶的至少一种内源或外源核酸分子；(c)编码催化来自(b)的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯转化为4-羟甲基糠醛(4-HMF)的磷酸酶的至少一种内源或外源核酸分子；(d)编码过加氧酶、脱氢酶或氧化酶的至少一种内源或外源核酸分子，所述过加氧酶、脱氢酶或氧化酶催化来自(c)的4-HMF直接地或通过产生中间产物呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯而转化为2,4FDCA。
在一些方面，可以通过以下方式产生2,4-呋喃二羧酸(2,4-FDCA)：将来自(c)的4-HMF提供给脱氢酶或氧化酶或过加氧酶，所述脱氢酶或氧化酶或过加氧酶催化4-HMF转化为以下物质：(i)呋喃-2,4-二甲醛，和/或(ii)4-(羟甲基)糠酸；(d)将(i)来自(c)(i)的呋喃-2,4-二甲醛提供给催化呋喃-2,4-二甲醛转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯的脱氢酶、氧化酶或过加氧酶；将(ii)来自(c)(ii)的4-(羟甲基)糠酸提供给催化4-(羟甲基)糠酸转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯的脱氢酶、氧化酶或过加氧酶；和/或将(iii)来自I(i)的呋喃-2,4-二甲醛提供给催化呋喃-2,4-二甲醛转化为2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯的脱氢酶、氧化酶或过加氧酶；以及(e)将来自(d)(i)和/或(d)(ii)的4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯或来自(d)(iii)的2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯提供给催化来自(d)(i)和/或(d)(ii)的4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯或来自(d)(iii)的2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯转化为2,4-FDCA的脱氢酶或氧化酶。
在一些方面，对宿主微生物进行遗传修饰，以改善对催化G3P转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶的G3P可用性。可以执行不同的代谢工程改造策略，以通过修饰转录调控(Alper等人PNAS 102(36).2005)、mRNA稳定性和翻译(Ferreira等人PNAS 110(28).2013)(Salis等人Nat.Biotech.27.2009)、蛋白质稳定性(Cameron等人Nat.Biotech.32.2014)或更低或更高效率的直系同源物的基因取代来实现不同水平的基因表达。
在一些方面，所述碳源包含己糖、戊糖、甘油、CO2、蔗糖和/或其组合。
在一些方面，来自(b)的磷酸甲酯合酶被分类为EC编号4.2.3.153。在一些方面，所述合酶是(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶(表1)。
在一些方面，来自(c)的磷酸酶是分类为EC编号3.1.3的磷酸单酯水解酶。在一些方面，磷酸酶被分类为卤代酸脱卤酶(Koonin等人J.Mol.Biol.244(1).1994)。在一些方面，反应c的磷酸酶是宿主内源性的(Offley等人Curr.Gen.65.2019)。在一些方面，所述宿主内源性的磷酸酶被过表达。在一些情况下，使用能够进行所需反应的异源磷酸酶，并且所述异源磷酸酶选自碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、果糖-二磷酸酶、糖-磷酸酶或糖-末端-磷酸酶。
在一些方面，来自(d)的所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一些方面，所述氧化酶是5-羟甲基糠醛氧化酶。在一些方面，5-羟甲基糠醛氧化酶在三步反应中将4-羟甲基糠醛(4-HMF)转化为2,4FDCA。
在一些方面，来自(d)的脱氢酶在将醇氧化为羰基时分类为EC编号1.1.1.或在将羰基氧化为酸时分类为EC编号1.2.1.。在一些方面，所述脱氢酶是醇脱氢酶或醛脱氢酶。
在一些方面，来自(e)的脱氢酶被分类为EC编号1.2.1或EC编号1.1.1。在一些方面，所述脱氢酶是醛脱氢酶或醇脱氢酶。在一些方面，来自(e)的所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一些方面，所述氧化酶是(5-(羟甲基)糠醛氧化酶。在一些方面，来自(f)的脱氢酶被分类为EC编号1.2.1。在一些方面，所述脱氢酶是醛脱氢酶。在一些方面，来自(f)的氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一些方面，所述氧化酶是(5-(羟甲基)糠醛氧化酶。
在一些方面，所述一种或多种重组微生物源自选自由以下组成的组的亲本微生物：梭菌属、永达尔梭菌、产乙醇梭菌、拉氏梭菌、粘液真杆菌、嗜甲基丁酸杆菌、热醋穆尔氏菌、醋酸梭菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜喊菌、德雷克氏梭菌、食一氧化碳梭菌、甲酸乙酸梭菌、粪味梭菌、热自养穆尔氏菌、长醋丝菌、黏液真杆菌、乙二醇梭菌、大梭菌、马永贝梭菌、食甲氧基苯甲酸梭菌、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、普氏产醋杆菌、凯伍嗜热厌氧菌、卵形鼠孢菌、嗜热醋杆菌、甲醇醋酸杆菌、白蚁鼠孢菌、甘油穆尔氏菌、聚集性真杆菌、固氮密螺旋体、大肠杆菌、酿酒酵母、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、解脂耶氏酵母、树干毕赤酵母和甘油利用泰瑞孢子菌。
在一些方面，本公开总体上涉及一种使用本公开的重组微生物产生2,4-FDCA的方法，所述方法包括在含有提供碳源的原料的培养基中培育所述重组微生物，直至产生所述2,4-FDCA。
在一些方面，本公开总体上涉及一种产生能够从包含碳源的原料产生2,4-FDCA的重组微生物的方法，所述方法包括将以下分子引入所述重组微生物中和/或在所述重组微生物中过表达：(a)能够将甘油或单糖转化为甘油醛3-磷酸(G3P)的内源和/或外源核酸分子；(b)编码催化来自(a)的G3P转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶的至少一种内源或外源核酸分子；(c)编码催化来自(b)的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯转化为4-羟甲基糠醛(4-HMF)的磷酸酶的至少一种内源或外源核酸分子；(d)编码过加氧酶、脱氢酶或氧化酶的至少一种内源或外源核酸分子，所述过加氧酶、脱氢酶或氧化酶催化来自(c)的4-HMF转化为：(i)呋喃-2,4-二甲醛和/或(ii)4-(羟甲基)糠酸；(e)编码过加氧酶、脱氢酶或氧化酶的至少一种内源或外源核酸分子，所述过加氧酶、脱氢酶或氧化酶催化：(i)来自(d)(i)的呋喃-2,4-二甲醛转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯和/或(ii)来自(d)(ii)的4-(羟甲基)糠酸转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯；和/或(iii)来自(c)(i)的呋喃-2,4-二甲醛转化为2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯；以及(f)编码过加氧酶、脱氢酶或氧化酶的至少一种内源或外源核酸分子，所述过加氧酶、脱氢酶或氧化酶催化来自(e)(i)和(e)(ii)的4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯或来自(e)(iii)的2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯转化为2,4-FDCA。
在一些方面，所述碳源包含己糖、戊糖、甘油和/或其组合。在一些方面，来自(b)的磷酸甲酯合酶被分类为EC编号4.2.3.153。在一些方面，所述合酶是(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶。在一些方面，来自(c)的磷酸酶是分类为EC编号3.1.3的磷酸单酯水解酶。在一些方面，磷酸酶被分类为卤代酸脱卤酶(Koonin等人J.Mol.Biol.244(1).1994)。在一些方面，反应c的磷酸酶是宿主内源性的(Offley等人Curr.Gen.65.2019)。在一些方面，所述宿主内源性的磷酸酶被过表达。在一些情况下，使用能够进行所需反应的异源磷酸酶，并且所述异源磷酸酶选自碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、果糖-二磷酸酶、糖-磷酸酶或糖-末端-磷酸酶。
在一些方面，来自(d)的脱氢酶在将醇氧化为羰基时分类为EC编号1.1.1.或在将羰基氧化为酸时分类为EC编号1.2.1.。在一些方面，所述脱氢酶是醇脱氢酶或醛脱氢酶。
在一些方面，来自(d)的所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一些方面，所述氧化酶是5-(羟甲基糠醛氧化酶。在一些方面，5-羟甲基糠醛氧化酶在三步反应中将4-羟甲基糠醛(4-HMF)转化为2,4FDCA。
在一些方面，来自(e)的所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一些方面，所述氧化酶是(5-(羟甲基)糠醛氧化酶。在一些方面，来自(f)的脱氢酶被分类为EC编号1.2.1。在一些方面，所述脱氢酶是醛脱氢酶。在一些方面，来自(f)的氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一些方面，所述氧化酶是(5-(羟甲基)糠醛氧化酶。
在一些方面，本公开涉及一种从由微生物产生的2,4-FDCA产生聚合物的方法，其中所述2,4-FDCA和二醇在非生物学方法中催化聚合。在一些方面，2,4-FDCA是增塑剂组合物的一部分，并且其中增塑剂是塑化聚合物组合物的一部分。
在一些方面，本公开总体上涉及一种能够从包含外源性碳源的原料产生4-羟甲基糠醛(4-HMF)的重组微生物，其中所述重组微生物表达：(a)能够将碳源转化为甘油醛3-磷酸(G3P)的内源和/或外源核酸分子；(b)编码催化来自(a)的G3P转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶的至少一种内源或外源核酸分子；和(c)编码催化来自(b)的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯转化为4-羟甲基糠醛(4-HMF)的磷酸酶的至少一种内源或外源核酸分子。
在一些方面，磷酸酶被分类为卤代酸脱卤酶(Koonin等人J.Mol.Biol.244(1).1994)。在一些方面，反应b的磷酸酶是宿主内源性的(Offley等人Curr.Gen.65.2019)。在一些方面，所述宿主内源性的磷酸酶被过表达。在一些情况下，使用能够进行所需反应的异源磷酸酶，并且所述异源磷酸酶选自碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、果糖-二磷酸酶、糖-磷酸酶或糖-末端-磷酸酶。
在一些方面，本公开总体上涉及一种能够从包含碳源的原料产生2,4-呋喃二羧酸(2,4-FDCA)的重组微生物，其中所述重组微生物表达以下的一种或多种分子：(a)能够将甘油或单糖转化为甘油醛3-磷酸(G3P)的内源和/或外源核酸分子；(b)编码催化来自(a)的G3P转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶的至少一种内源或外源核酸分子；(c)编码催化来自(b)的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯转化为4-羟甲基糠醛(4-HMF)的磷酸酶的至少一种内源或外源核酸分子；(d)催化来自(c)的4-HMF直接地或通过产生中间产物呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯而转化为2,4FDCA。
在一些方面，2,4-呋喃二羧酸(2,4-FDCA)可以通过以下方式产生：将来自(c)的4-HMF提供给编码过加氧酶、脱氢酶或氧化酶的至少一种内源或外源核酸分子，所述过加氧酶、脱氢酶或氧化酶催化来自(c)的4-HMF转化为：(i)呋喃-2,4-二甲醛和/或(ii)4-(羟甲基)糠酸；(e)编码过加氧酶、脱氢酶或氧化酶的至少一种内源或外源核酸分子，所述过加氧酶、脱氢酶或氧化酶催化：(i)来自(d)(i)的呋喃-2,4-二甲醛转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯和/或(ii)来自(d)(ii)的4-(羟甲基)糠酸转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯；以及(f)编码过加氧酶、脱氢酶或氧化酶的至少一种内源或外源核酸分子，所述过加氧酶、脱氢酶或氧化酶催化来自(e)的4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯转化为2,4-FDCA。
附图说明
图1是本公开的重组微生物用于G3P向4-HMF的新型转化的生物合成途径的示意性概述。酶促反应行下方的数字表示相应酶的3位EC编号。
图2是利用4-HMF作为底物，所设想的产物的生物合成产生的示意性概述。产物包括但不限于2,4-呋喃二甲醇、呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯和2,4-FDCA。酶促反应行附近的数字表示相应酶的3位EC编号。
图3是将碳源(在该情况下为葡萄糖或甘油)转化为G3P的可能生物合成途径的示意性概述。
图4是表达和纯化的5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶候选物MfnB1的说明性SDS-PAGE图像。
图5是显示阴性对照样品(灰色)和磷酸甲酯合酶反应(黑色)的代表性UV光谱，其显示了从G3P产生的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯。
图6是代表性UV光谱，其显示了在t0(上图)和t2h(下图)通过磷酸甲酯合酶从G3P产生(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯。
图7是代表性UV光谱，其显示了用磷酸酶(上图)、大肠杆菌裂解产物(中图)和酵母裂解产物(下图)从(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯产生4-HMF。
图8是所表达的4-HMF氧化酶候选物HmfH1纯化形式(PE)、纯化前的可溶相(SP)、不溶相(IP)和纯化后的流过(FT)形式的说明性SDS-PAGE图像。
图9是代表性UV光谱，其显示了在孵育16小时后，用4-HMF氧化酶候选物HmfH1(上图)、HmfH6(中图)和HmfH7(下图)从4-HMF产生2,4FDCA。还鉴定并定量了反应中间产物4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯(2,4-FFCA)和呋喃-2,4-二甲醛(2,4-DFF)。通过HPLC-DAD进行色谱分离。
图10是代表性GC-MS色谱图(上图)和质谱图(下图)，其显示了用hMFh7从4-HMF产生的2,4-FDCA的鉴定。
图11是唾液酸化2,4-FDCA的示意图。
图12是显示在2,4-HMF还原为2,4-呋喃二甲醇期间由于其通过4-HMF脱氢酶候选物DH1、DH2或DH6氧化而引起NAD(P)H损耗的代表性图。
图13是显示由于辅因子的还原和2,4-HMF底物氧化成呋喃-2,4-二醛而形成NAD(P)H的代表性图。
图14是显示由于辅因子的还原和2,4-HMF底物通过醛脱氢酶候选物DH8、DH9、DH10和DH11氧化为4-(羟甲基)糠酸而形成NAD(P)H的代表性图。
图15是显示通过醛脱氢酶(DH8)和醇脱氢酶(DH6)的组合从4-HMF产生2,4-FDCA的代表性色谱图。在没有4-HMF底物的情况下进行的阴性对照反应(上图)。与DH8、DH6和4-HMF底物的反应(中图)。在没有DH6和DH8酶的情况下进行的阴性对照反应(下图)。
图16是显示在t0(上图)和t48h(下图)因葡萄糖发酵在体内产生2,4-FDCA的代表性色谱图。
具体实施方式
定义
以下定义和缩写用于解释本公开。
如本文和所附权利要求书中所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一种(个)”和“所述(该)”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种酶”包括多种此类酶并且提及“所述微生物”包括提及一种或多种微生物，等等。
如本文所用，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“含有(contains)”、“含有(containing)”或其任何其他变型旨在涵盖非排他性包含。包含一系列要素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不一定仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备或非固有的其他要素。此外，除非明确陈述相反，否则“或”是指包含性的“或”，而不是排他性的“或”。
如本文中用于修饰数值的术语“约”和“左右”指示该确切值周围的接近范围。如果“X”是该值，则“约X”或“X左右”将指示从0.9X至1.1X的值，或在一些实施方案中，指示从0.95X至1.05X的值。对“约X”或“X左右”的任何提及都至少明确指示值X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X和1.05X。因此，“约X”和“X左右”旨在教授并提供例如“0.98X”的权利要求限制的书面描述支持。
如本文所用，术语“微生物(microbial)”、“微生物生物(microbial organism)”和“微生物(microorganism)”包括作为显微镜细胞存在的古细菌域、细菌域或真核生物域(后者包括酵母和丝状真菌)、原生动物域、藻类域或高等原生生物域内包括的任何生物。因此，该术语旨在涵盖原核或真核细胞或具有微观大小的生物，并且包括所有物种的细菌、古细菌和真细菌以及真核微生物，诸如酵母和真菌。还包括可培养用于产生化学物质的任何物种的细胞培养物。
如本文所述，在一些实施方案中，所述重组微生物是原核微生物。在一些实施方案中，所述原核微生物是细菌。“细菌”或“真细菌”是指原核生物域。细菌包括如下至少十一个不同的类别：(1)革兰氏阳性(革兰氏+)细菌，其中有两个主要分支：(1)高G+C类别(放线菌(Actinomycete)、分枝杆菌(Mycobacteria)、微球菌(Micrococcus)等)，(2)低G+C类别(杆菌(Bacillus)、梭菌(Clostridia)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、葡萄球菌(Staphylococci)、链球菌(Streptococci)、支原体(Mycoplasmas))；(2)变形菌门，例如紫色光合成+非光合成革兰氏阴性细菌(包括大多数“常见”革兰氏阴性细菌)；(3)蓝细菌(Cyanobacteria)，例如氧光养生物；(4)螺旋体(Spirochetes)和相关物种；(5)浮霉状菌(Planctomyces)；(6)拟杆菌(Bacteroides)、黄杆菌(Flavobacteria)；(7)衣原体(Chlamydia)；(8)绿色硫细菌；(9)绿色非硫细菌(也是厌氧光养生物)；(10)抗放射性微球菌和亲缘菌；(11)栖热袍菌(Thermotoga)和嗜热栖热腔菌(Thermosipho thermophiles)。
“革兰氏阴性细菌”包括球菌、非肠杆球菌和肠杆球菌。革兰氏阴性细菌的属包括例如奈瑟氏菌属(Neisseria)、螺菌属(Spirillum)、巴斯德菌属(Pasteurella)、布鲁氏菌属(Brucella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、弗朗西斯菌属(Francisella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、博代氏菌属(Bordetella)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺菌属(Shigella)、克雷白杆菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、弧菌属(Vibrio)、假单胞菌属(Pseudomonas)、拟杆菌属(Bacteroides)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、气杆菌属(Aerobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、固氮菌属(Azotobacter)、螺旋状菌属(Spirilla)、沙雷氏菌属(Serratia)、弧菌属(Vibrio)、根瘤菌属(Rhizobium)、衣原体属(Chlamydia)、立克次体属(Rickettsia)、密螺旋体属(Treponema)和梭杆菌属(Fusobacterium)。
“革兰氏阳性细菌”包括球菌、非孢子化杆球菌和孢子化杆球菌。革兰氏阳性细菌的属包括例如放线菌属(Actinomyces)、杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、乳杆菌属(Lactobacillus)、李斯特菌属(Listeria)、分支杆菌属(Mycobacterium)、粘球菌属(Myxococcus)、诺卡菌属(Nocardia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)和链霉菌属(Streptomyces)。
术语“重组微生物”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用，并且是指已经过遗传修饰以表达或过表达内源酶、表达异源酶，诸如包括在载体、整合构建体中的那些，或在内源基因的表达方面具有改变的微生物。“改变”意指编码一个或多个多肽或多肽亚基的RNA分子或等同RNA分子的基因表达或水平，或一个或多个多肽或多肽亚基的活性上调或下调，使得表达、水平或活性大于或小于在不存在改变的情况下观察到的表达、水平或活性。应理解，术语“重组微生物”和“重组宿主细胞”不仅指特定重组微生物，而且指此类微生物的后代或潜在后代。
关于基因序列的术语“表达”是指基因的转录并且视情况指所得mRNA转录物翻译成蛋白质。因此，正如从上下文中将清楚的，蛋白质的表达由开放阅读框序列的转录和翻译产生。可以基于细胞中存在的相应mRNA的量或由选定序列编码的所需产物的量来确定宿主细胞中所需产物的表达水平。例如，可以通过qRT-PCR或通过Northern杂交来定量从选定序列转录的mRNA(参见Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989))。由选定序列编码的蛋白质可以通过各种方法定量，例如通过ELISA，通过测定蛋白质的生物活性，或通过采用独立于此类活性的测定，诸如蛋白质印迹或放射免疫测定，使用识别并结合蛋白质的抗体来进行。参见Sambrook等人，1989，同上。
术语“减低”或“降低”基因的表达水平或酶活性是指对基因表达或酶活性的部分或完全阻抑。对表达或活性的这种阻抑可以是对基因表达的抑制、基因表达所必需的启动子区的全部或部分的缺失、基因编码区的缺失，或者由较弱的天然或合成启动子置换野生型启动子。例如，基因可以完全缺失，并且可以根据本公开被有利于品系的鉴定、分离和纯化的选择标记基因置换。可替代地，内源基因可以敲除或缺失，以有利于新的代谢途径。在又一个实施方案中，可以通过使用弱启动子或通过引入某些突变来减低或降低基因表达。
如本文所用，术语“非天然存在的”在提及本公开的微生物生物体或酶活性使用时旨在意指该微生物生物体或酶具有在参考物种的天然存在的品系(包括参考物种的野生型品系)中通常未发现的至少一个遗传改变。遗传改变包括例如引入编码代谢多肽的可表达核酸、其他核酸添加、核酸缺失和/或微生物遗传物质的其他功能破坏的修饰。此类修饰包括例如参考物种的异源多肽、同源多肽或异源和同源多肽两者的编码区及其功能片段。另外的修饰包括例如其中修饰改变基因或操纵子的表达的非编码调控区。示例性的非天然存在的微生物或酶活性包括上述羟基化活性。
如本文关于各种分子，例如多核苷酸、多肽、酶等使用的术语“外源”是指自然界中给定的酵母、细菌、生物体、微生物或细胞中不是通常或天然发现的和/或不是由给定酵母、细菌、生物体、微生物或细胞产生的分子。
另一方面，如本文关于各种分子，例如多核苷酸、多肽、酶等使用的术语“内源”或“天然”是指自然界中给定的酵母、细菌、生物体、微生物或细胞中通常或天然发现的和/或由给定酵母、细菌、生物体、微生物或细胞产生的分子。
如本文在经修饰的宿主细胞的上下文中使用的术语“异源”是指各种分子，例如多核苷酸、多肽、酶等，其中以下中的至少一项是真实的：(a)所述一种或多种分子是宿主细胞外来的(“外源的”)(即，天然未发现的)；(b)所述一种或多种分子是给定的宿主微生物或宿主细胞中天然发现的(例如，是“内源的”)，但是在细胞中在非天然位置或以非天然量产生；和/或(c)所述一种或多种分子在核苷酸或氨基酸序列方面与内源性核苷酸或氨基酸序列不同，使得在核苷酸或氨基酸序列方面与内源发现的内源核苷酸或氨基酸不同的分子在细胞中以非天然的量(例如，大于天然发现的量)产生。
如本文关于第一家族或物种的原始酶或基因使用的术语“同源物”是指第二家族或物种的不同酶或基因，通过功能、结构或基因组分析确定是与第一家族或物种的原始酶或基因相对应的第二家族或物种的酶或基因。同源物最常具有功能、结构或基因组相似性。已知可以使用基因探针和PCR容易地克隆酶或基因的同源物的技术。可以使用功能测定和/或通过基因的基因组作图确认克隆序列作为同源物的同一性。
如果由基因编码的氨基酸序列具有与第二基因的氨基酸序列相似的氨基酸序列，则一种蛋白质与第二蛋白质具有“同源性”或与第二蛋白质“同源”。可替代地，如果两种蛋白质具有“相似的”氨基酸序列，则一种蛋白质与第二蛋白质具有同源性。因此，术语“同源蛋白”旨在意指所述两种蛋白具有相似的氨基酸序列。在某些情况下，两种蛋白质之间的同源性指示其因进化相关的共有家系。认为、据信或已知术语“同源序列”或“同源物”是功能上相关的。功能关系可以多种方式中的任一种指示，包括但不限于：(a)序列同一性程度和/或(b)相同或相似的生物学功能。优选地，指示(a)和(b)两者。序列同一性程度可以变化，但在一个实施方案中，为至少50％(当使用本领域已知的标准序列比对程序时)、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少98.5％或至少99％或至少99.5％或至少99.8％或至少99.9％。同源性可以使用本领域中容易获得的软件程序来测定，诸如在Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel etal.,eds.,1987)增刊30，第7.718节，表7.71中讨论的那些。一些比对程序是MacVector(Oxford Molecular Ltd,Oxford,U.K.)和ALIGN Plus(Scientific and EducationalSoftware,Pennsylvania)。其他非限制性的比对程序包括Sequencher(Gene Codes,AnnArbor,Michigan)、AlignX和Vector NTI(Invitrogen,Carlsbad,CA)。相似的生物学功能可以包括但不限于：催化相同或相似的酶促反应；对底物或辅因子具有相同或相似的选择性；具有相同或相似的稳定性；对各种发酵条件(温度、pH等)具有相同或相似的耐受性；和/或对各种代谢底物、产物、副产物、中间产物等具有相同或相似的耐受性。根据本领域技术人员已知用于测定给定生物学功能的一种或多种测定法，生物学功能的相似性程度可以变化，但在一个实施方案中，为至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少98.5％或至少约99％或至少99.5％或至少99.8％或至少99.9％。
术语“变体”是指本文所述的任何多肽或酶。变体还涵盖多聚体的一个或多个组分、包含单独组分的多聚体、包含多个单独组分的多聚体(例如，参考分子的多聚体)、化学分解产物和生物分解产物。具体而言，非限制性实施方案，由于编码参考酶的多肽序列的任何部分中的改变，酶可以是相对于参考酶的“变体”。在用于测量参考酶的制剂的酶活性的标准测定法中，参考酶的变体可以具有至少10％、至少30％、至少50％、至少80％、至少90％、至少100％、至少105％、至少110％、至少120％、至少130％或更高的酶活性。在一些实施方案中，变体也可以指与本公开的全长或未经加工的酶具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的多肽。在一些实施方案中，变体还可以指与本公开的成熟的或经加工的酶具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的多肽。
术语“产率潜力”或如本文所用是指来自生物合成途径的产物的产率。在一个实施方案中，产率潜力可以表示为按最终产物重量/起始化合物重量计的百分比。
如本文所用的术语“热力学最高产率”是指基于与原料相比的产品的能量值从给定原料诸如葡萄糖的发酵获得的产物的最高产率。在正常发酵中，不使用诸如光、氢气或甲烷或电力等额外能源，例如，产品不能含有比原料更多的能量。热力学最高产率表示来自原料的所有能量和质量都转化为产物时的产物产率。该产率可以计算并且不依赖于具体途径。如果朝向产物的具体途径的产率低于热力学最高产率，则其损失质量并且最有可能在用朝向产物的更有效的途径时得到改善或者被朝向产物的更有效的途径替代。
术语“氧化还原平衡”是指给定反应集合中的氧化还原辅因子的总量。当存在氧化还原辅因子短缺时，氧化还原平衡为负，并且此类途径的产率将是不现实的，因为需要燃烧原料以满足辅因子需求。当存在过量氧化还原辅因子时，称氧化还原平衡为正，并且此类途径的产率低于最高产率(Dugar等人“Relative potential of biosynthetic pathwaysfor biofuels and bio-based products”Nature biotechnology 29.12(2011):1074)。另外，当该途径产生与它所消耗的相同量的氧化还原辅因子时，氧化还原平衡为零并且人们可以将该途径称为“氧化还原平衡”。设计代谢途径和工程改造生物体，使得氧化还原辅因子平衡或接近平衡通常引起所需化合物与不平衡途径相比更高效、更高产率的产生。氧化还原反应总是作为同时发生的两个半反应一起进行，一个半反应是氧化反应，另一个半反应是还原反应。在氧化还原过程中，还原剂将电子转移给氧化剂。因此，在反应中，还原剂或还原试剂丢失电子并且被氧化，而氧化剂或氧化试剂获得电子并且被还原。在一个实施方案中，氧化还原反应在生物系统中发生。术语氧化还原状态常常用于描述生物系统诸如微生物细胞中天然或非天然代谢途径的NAD+/NADH和NADP+/NADPH的平衡。氧化还原状态反映在几组代谢物(例如乳酸和丙酮酸、β-羟基丁酸和乙酰乙酸)的平衡中，其相互转化取决于这些比率。在一个实施方案中，外部氢源或电子源，联合使用或不使用能够将氢转化为NAD(P)H的氢化酶，可有利于增加具有负氧化还原平衡的代谢途径中，即当存在氧化还原辅因子诸如NAD(P)H短缺时的产物产率。
术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物的聚合形式。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、从连锁分析中定义的多个基因座(一个基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微型RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含一个或多个经修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则可以在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合之后进一步修饰，诸如通过与标记组分缀合。
“互补性”是指核酸通过传统的沃森-克里克(Watson-Crick)或其他非传统类型与另一核酸序列形成氢键的能力。百分比互补性表示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(例如沃森-克里克碱基配对)的残基的百分比(例如，10个中有5、6、7、8、9、10个分别为为50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。“完全互补”意指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数量的连续残基氢键结合。如本文所用，“基本上互补”是指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多个核苷酸的区域上互补程度为至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％，或是指在严格条件下杂交的两个核酸。序列同一性，诸如为了评估百分比互补性的目的，可以通过任何合适的比对算法来测量，包括但不限于Needleman-Wunsch算法(参见例如在www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html上可获得的EMBOSSNeedle比对程序，任选地用默认设置)、BLAST算法(参见例如在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上可获得的BLAST比对工具，任选地用默认设置)或Smith-Waterman算法(参见例如在www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html上可获得的EMBOSSWater比对程序，任选地用默认设置)。可以使用所选算法的任何合适的参数，包括默认参数来评估最佳比对。
术语“生物纯的培养物”或“基本上纯的培养物”是指本文所述的细菌种类的培养物，其所含其他细菌种类的量不足以干扰培养物的复制或通过正常细菌学技术检测不到。
如本文所用，“控制序列”是指操纵子、启动子、沉默子或终止子。
如本文所用，“引入的”是指通过现代生物技术的引入，而不是天然存在的引入。
如本文所用，“组成型启动子”是在大多数条件下和/或在大多数发育阶段期间有活性的启动子。在生物技术中使用的表达载体中使用组成型启动子有若干优点，诸如：用于选择转基因细胞或生物体的蛋白质的高水平产生；报告蛋白或可评分标志物的高表达水平，允许容易的检测和定量；作为调控转录系统的一部分的转录因子的高水平产生；在生物体中需要普遍存在的活性的化合物的产生；以及所有发育阶段期间所需的化合物的产生。
如本文所用，“非组成型启动子”是在某些条件下，在某些类型的细胞中，和/或在某些发育阶段期间有活性的启动子。例如，诱导型启动子和处于发育控制下的启动子是非组成型启动子。
如本文所用，“诱导型”或“阻抑型”启动子是处于化学或环境因素控制下的启动子。可影响诱导型启动子的转录的环境条件的实例包括厌氧条件、某些化学物质、光的存在、酸性或碱性条件等。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指核酸序列在单个核酸片段上的缔合，使得一个的功能受另一个调控。例如，当启动子能够调控编码序列的表达(即，编码序列处于启动子的转录控制下)时，该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以在有义或反义方向上可操作地连接至调控序列。在另一个实例中，本公开的互补RNA区域可以直接或间接可操作地连接至靶mRNA的5'，或靶mRNA的3'，或靶mRNA内，或第一互补区域在5’而其补体在靶mRNA的3'。
如本文所用，术语“催化聚合的”是指其中本公开的单体在非生物或非体内环境中聚合的聚合过程。
如本文所用，术语“信号序列”是指将肽和多肽靶向细胞位置或细胞外环境的氨基酸序列。信号序列通常处于多肽的N端部分处并且通常酶促去除。具有其信号序列的多肽称为全长和/或未加工的。其信号序列去除的多肽称为成熟和/或经加工的。
如本文所用，“微生物组合物”是指包含本公开的一种或多种微生物的组合物。
如本文所用，“载剂”、“可接受的载剂”、“商业上可接受的载剂”或“工业上可接受的载剂”是指可以施用、储存或转移微生物，不会对微生物产生不利影响的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。
如本文所用，术语“生产率”是指每小时产生的生物产物诸如(2,4-FDCA)的总量。
如本文所用，术语“生物合成产物”是指本文所设想的以下产物中的任何一种或多种：4-HMF、2,4-呋喃二甲醇、呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯和2,4-FDCA。
重组微生物
在一个实施方案中，本公开提供了一种能够产生本文所设想的生物合成产物中的任何一种或多种的重组微生物。在一个实施方案中，重组微生物产生4-HMF。在一个实施方案中，重组微生物产生2,4-呋喃二甲醇。在一个实施方案中，重组微生物产生呋喃-2,4-二甲醛。在一个实施方案中，重组微生物产生4-(羟甲基)糠酸。在一个实施方案中，重组微生物产生2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯。在一个实施方案中，重组微生物产生4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯。在一个实施方案中，重组微生物产生2,4-FDCA。
在一个实施方案中，重组微生物产生所述生物合成产物中的任六种。在一个实施方案中，重组微生物产生所述生物合成产物中的任五种。在一个实施方案中，重组微生物产生所述生物合成产物中的任四种。在一个实施方案中，重组微生物产生所述生物合成产物中的任三种。
在一个实施方案中，碳源转化为甘油醛3-磷酸(G3P)。G3P是常见的天然中间代谢物。在一些实施方案中，它可以从葡萄糖经由糖酵解途径产生，或从木糖(如来自戊糖磷酸途径，但不限于此)或从甘油产生。在一些实施方案中，G3P可以源自CO2捕获技术。在一个实施方案中，重组微生物能够利用包含己糖、戊糖、甘油或来自CO2捕获技术的碳源来产生所述生物合成产物中的任何一种或多种。在某些实施方案中，碳源是甘油。
在一个实施方案中，重组微生物包含经由几个酶促催化的连续步骤将G3P转化为所述生物合成产物中的任何一种或多种的新型能力。
在一个实施方案中，对宿主微生物进行遗传修饰，以改善对催化G3P转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶的G3P可用性。
在一个实施方案中，所述重组微生物源自选自由以下组成的组的亲本微生物：梭菌属、永达尔梭菌、产乙醇梭菌、拉氏梭菌、粘液真杆菌、嗜甲基丁酸杆菌、热醋穆尔氏菌、醋酸梭菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜喊菌、德雷克氏梭菌、食一氧化碳梭菌、甲酸乙酸梭菌、粪味梭菌、热自养穆尔氏菌、长醋丝菌、黏液真杆菌、乙二醇梭菌、大梭菌、马永贝梭菌、食甲氧基苯甲酸梭菌、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、普氏产醋杆菌、凯伍嗜热厌氧菌、卵形鼠孢菌、嗜热醋杆菌、甲醇醋酸杆菌、白蚁鼠孢菌、甘油穆尔氏菌、聚集性真杆菌、固氮密螺旋体、大肠杆菌、酿酒酵母、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、解脂耶氏酵母、树干毕赤酵母、食甲基菌属(Methylovorus sp.)、贪铜菌属(Cupriavidus sp.)、甲烷球菌属(Methanocaldococcus sp.)和甘油利用泰瑞孢子菌。
4-HMF
在一个实施方案中，本公开包括将一种或多种碳源转化为甘油醛3-磷酸(G3P)；将G3P转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯(步骤A)；将(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯转化为4-羟甲基糠醛(4-HMF)(步骤B)。
在一个实施方案中，本文公开的实施方案中的任何一个的重组微生物包含能够将碳源转化为甘油醛3-磷酸(G3P)的内源和/或外源核酸分子。在一个实施方案中，甘油通过编码甘油激酶的至少一种内源或外源核酸分子转化为甘油-3-磷酸。在一个实施方案中，甘油-3-磷酸通过编码甘油-3-磷酸脱氢酶的至少一种内源或外源核酸分子转化为二羟丙酮磷酸(DHAP)。在一个实施方案中，甘油通过编码甘油脱氢酶的至少一种内源或外源核酸分子转化为二羟基丙酮。在一个实施方案中，二羟基丙酮通过编码二羟基丙酮激酶的至少一种内源或外源核酸分子转化为二羟丙酮磷酸(DHAP)。在一个实施方案中，DHAP通过编码磷酸丙糖异构酶的至少一种内源或外源核酸分子转化为G3P。参见Zhang等人(2010.Appliedand Environmental Microbiology,76.8:2397-2401)中本文所设想的示例性但非限制性的甘油同化途径。
在一个实施方案中，本文公开的实施方案中的任何一个的重组微生物包含编码(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶的至少一种内源或外源核酸分子，所述合酶催化G3P转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯。在一个实施方案中，(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶被分类为EC编号4.2.3.153。在一些实施方案中，EC 4.2.3.153(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶可以源自基因mfnB。在一些实施方案中，mfnB可源自詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)。在一些实施方案中，(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶可源自表1所列的酶候选物。在一些实施方案中，(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶由表1所列的氨基酸序列编码。在一些实施方案中，(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶与表1所列的酶同源或相似。在一些实施方案中，(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶经演化或工程改造以显著地提高其催化效率kcat。
表1.(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶
Figure BDA0003325727080000221
Figure BDA0003325727080000231
Figure BDA0003325727080000241
Figure BDA0003325727080000251
Figure BDA0003325727080000261
Figure BDA0003325727080000271
在一个实施方案中，本文公开的实施方案中的任何一个的重组微生物包含编码催化(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯转化为(4-HMF)的磷酸酶或激酶的至少一种内源或外源核酸分子。在一个实施方案中，磷酸酶被分类为卤代酸脱卤酶(Koonin等人J.Mol.Biol.244(1).1994)。在一些方面，反应b的磷酸酶是宿主内源性的(Offley等人Curr.Gen.65.2019)。在一些方面，所述宿主内源性的磷酸酶被过表达。在一些情况下，使用能够进行所需反应的异源磷酸酶，并且所述异源磷酸酶选自碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、果糖-二磷酸酶、糖-磷酸酶或糖-末端-磷酸酶。在一些实施方案中，所述磷酸酶可源自表2所列的酶候选物。在一些实施方案中，所述磷酸酶与表2所列的酶同源或相似。在一些实施方案中，4-HMF磷酸酶由表2所列的氨基酸序列编码。在一些实施方案中，磷酸酶经演化或工程改造以改善其催化效率和/或特异性，从而将(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯转化为(4-HMF)。
表2. 4-HMF磷酸酶
Figure BDA0003325727080000281
Figure BDA0003325727080000291
Figure BDA0003325727080000301
Figure BDA0003325727080000311
Figure BDA0003325727080000321
Figure BDA0003325727080000331
Figure BDA0003325727080000341
Figure BDA0003325727080000351
Figure BDA0003325727080000361
因此，在一个实施方案中，本文提供了重组微生物，其包含能够将碳源转化为甘油醛3-磷酸(G3P)的内源和/或外源核酸分子；编码催化G3P转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶的至少一种内源或外源核酸分子；编码催化(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯转化为4-HMF的至少一种内源或外源核酸分子。
2,4-FDCA
在一个实施方案中，本公开提供了能够从碳源产生2,4-呋喃二羧酸(2,4-FDCA)的重组微生物。在图1、图2和图3中呈现了本公开的一些实施方案，其共同详述了碳原料到2,4-FDCA的生物合成转化。
在一个实施方案中，重组微生物包含经由本文所述的几个酶促催化的连续步骤将G3P转化为2,4-FDCA的新型能力。在一个实施方案中，本公开包括直接地或通过产生中间产物呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯将4-HMF转化为2,4FDCA。
在一个实施方案中，本公开包括将4-HMF转化为呋喃-2,4-二甲醛(步骤D)和/或4-(羟甲基)糠酸(步骤E)；将呋喃-2,4-二甲醛转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯(步骤G)和/或2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯(步骤F)和/或将4-(羟甲基)糠酸转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯(步骤H)；将4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯转化为2,4-FDCA(步骤J)和/或将2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯转化为2,4-FDCA(步骤I)。
在一个实施方案中，脱氢酶在将醇氧化为羰基基团时分类为EC编号1.1.1.或在将羰基氧化为酸时分类为EC编号1.2.1.。在一些方面，所述脱氢酶是醇脱氢酶或醛脱氢酶。
在一些方面，来自(c)的所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一些方面，所述氧化酶是5-羟甲基糠醛氧化酶。在一些方面，5-羟甲基糠醛氧化酶在三步反应中将4-羟甲基糠醛(4-HMF)转化为2,4FDCA。
在另一个实施方案中，所述一种或多种碳源可包括甘油或单糖。
在一个实施方案中，微生物包含编码催化4-HMF转化为呋喃-2,4-二甲醛和/或4-(羟甲基)糠酸的脱氢酶、氧化酶或过加氧酶的至少一种内源或外源核酸分子；编码催化呋喃-2,4-二甲醛转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯和/或2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯和/或4-(羟甲基)糠酸转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯的脱氢酶、氧化酶或过加氧酶的至少一种内源或外源核酸分子；编码催化2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯转化为2,4-FDCA和/或4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯转化为2,4-FDCA的脱氢酶、氧化酶或过加氧酶的至少一种内源或外源核酸分子。
在一个实施方案中，本文公开的实施方案中的任何一个的重组微生物包含编码催化4-HMF转化为呋喃-2,4-二甲醛的脱氢酶、氧化酶或过加氧酶的至少一种内源或外源核酸分子。在一个实施方案中，所述脱氢酶被分类为EC编号1.1.1。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.1.1选自醇脱氢酶(EC编号1.1.1.1)或醇脱氢酶(NADP+)(EC编号1.1.1.2)或D-木糖还原酶(EC编号1.1.1.307)或芳基-醇脱氢酶(EC编号1.1.1.90)或芳基-醇脱氢酶(NADP+)(EC编号1.1.1.91)。在一个实施方案中所述脱氢酶可源自表3所列的酶候选物。在一些实施方案中，所述脱氢酶与表3所列的酶同源或相似。在一些实施方案中，4-HMF脱氢酶由表3所列的氨基酸序列编码。在一些实施方案中，脱氢酶经演化或工程改造以提高其针对其预期底物的催化效率。
表3. 4HMF脱氢酶
Figure BDA0003325727080000371
Figure BDA0003325727080000381
Figure BDA0003325727080000391
Figure BDA0003325727080000401
Figure BDA0003325727080000411
在一个实施方案中，所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3为5-(羟甲基糠醛氧化酶(EC编号1.1.3.47)。在一些实施方案中，HMF氧化酶可以源自基因hmfH。在一些实施方案中，HMF氧化酶可源自甲基菌属(Methylovorus sp.)MP688或巴塞尔贪铜菌(Cupriavidus basilensis)。参见Dijkman和Fraaije(2014.AppliedEnvironmental Microbiology,80.3:1082-1090)以及Koopman等人(2010.PNAS,107(11):4919-4924)。在一个实施方案中，HMF氧化酶EC编号1.1.3是芳基-醇氧化酶(EC编号1.1.3.7)。参见Carro等人(2015)。在一个实施方案中，过加氧酶被分类为EC编号1.11.2。在一个实施方案中，过加氧酶EC编号1.11.2是非特异性过加氧酶(EC编号1.11.2.1)。参见Carro等人(2015)。在一些实施方案中，HMF氧化酶可以源自表4所列的酶候选物。在一些实施方案中，HMF氧化酶与表4所列的酶同源或相似。在一些实施方案中，4-HMF氧化酶由表4所列的氨基酸序列编码。在一些实施方案中，HMF氧化酶经演化或工程改造以提高其催化效率(参见Martin等人Biotechnology for Biofuels.(2018)11，第56条)。
表4. 4-HMF氧化酶
Figure BDA0003325727080000421
Figure BDA0003325727080000431
Figure BDA0003325727080000441
Figure BDA0003325727080000451
在一个实施方案中，本文公开的实施方案中的任何一个的重组微生物包含编码催化4-HMF转化为4-(羟甲基)糠酸的脱氢酶或氧化酶或过加氧酶的至少一种内源或外源核酸分子。在一个实施方案中，所述脱氢酶被分类为EC编号1.2.1。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.2.1选自醛脱氢酶(NAD+)(EC编号1.2.1.3)或醛脱氢酶(NADP+)(EC编号1.2.1.4)或醛脱氢酶[NAD(P)+](EC编号1.2.1.5)或4-(γ-谷氨酰基氨基)丁醛脱氢酶(EC编号1.2.1.99)。在一个实施方案中，所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是5-(羟甲基糠醛氧化酶(EC编号1.1.3.47)。在一些实施方案中，EC1.1.3.47氧化酶可以源自基因hmfH。在一些实施方案中，hmfH可源自甲基菌属MP688或巴塞尔贪铜菌。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是芳基-醇氧化酶(EC编号1.1.3.7)。在一个实施方案中，过加氧酶被分类为EC编号1.11.2。在一个实施方案中，过加氧酶EC编号1.11.2是非特异性过加氧酶(EC编号1.11.2.1)。
在一个实施方案中，本文公开的实施方案中的任何一个的重组微生物包含编码催化呋喃-2,4-二甲醛转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯和/或2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯的脱氢酶或氧化酶或过加氧酶的至少一种内源或外源核酸分子。在一个实施方案中，所述脱氢酶被分类为EC编号1.2.1。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.2.1选自醛脱氢酶(NAD+)(EC编号1.2.1.3)或醛脱氢酶(NADP+)(EC编号1.2.1.4)或醛脱氢酶[NAD(P)+](EC编号1.2.1.5)或4-(γ-谷氨酰基氨基)丁醛脱氢酶(EC编号1.2.1.99)。在一个实施方案中，所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是5-(羟甲基糠醛氧化酶(EC编号1.1.3.47)。在一些实施方案中，EC 1.1.3.47氧化酶可以源自基因hmfH。在一些实施方案中，hmfH可源自甲基菌属MP688或巴塞尔贪铜菌。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是芳基-醇氧化酶(EC编号1.1.3.7)。在一个实施方案中，过加氧酶被分类为EC编号1.11.2。在一个实施方案中，过加氧酶EC编号1.11.2是非特异性过加氧酶(EC编号1.11.2.1)。
在一个实施方案中，本文公开的实施方案中的任何一个的重组微生物包含编码催化4-(羟甲基)糠酸转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯的脱氢酶或氧化酶或过加氧酶的至少一种内源或外源核酸分子。在一个实施方案中，所述脱氢酶被分类为EC编号1.1.1。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.1.1选自醇脱氢酶(EC编号1.1.1.1)或醇脱氢酶(NADP+)(EC编号1.1.1.2)或D-木糖还原酶(EC编号1.1.1.307)或芳基-醇脱氢酶(EC编号1.1.1.90)或芳基-醇脱氢酶(NADP+)(EC编号1.1.1.91)。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.1.1是。在一个实施方案中，所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是5-(羟甲基糠醛氧化酶(EC编号1.1.3.47)。在一些实施方案中，EC 1.1.3.47氧化酶可以源自基因hmfH。在一些实施方案中，hmfH可源自甲基菌属MP688或巴塞尔贪铜菌。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是芳基-醇氧化酶(EC编号1.1.3.7)。在一个实施方案中，过加氧酶被分类为EC编号1.11.2。在一个实施方案中，过加氧酶EC编号1.11.2是非特异性过加氧酶(EC编号1.11.2.1)。
在一个实施方案中，本文公开的实施方案中的任何一个的重组微生物包含编码催化4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯和/或2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯转化为2,4-FDCA的脱氢酶或氧化酶或过加氧酶的至少一种内源或外源核酸分子。在一个实施方案中，所述脱氢酶被分类为EC编号1.2.1。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.2.1选自醛脱氢酶(NAD+)(EC编号1.2.1.3)或醛脱氢酶(NADP+)(EC编号1.2.1.4)或醛脱氢酶[NAD(P)+](EC编号1.2.1.5)或4-(γ-谷氨酰基氨基)丁醛脱氢酶(EC编号1.2.1.99)。在一个实施方案中，所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是5-(羟甲基糠醛氧化酶(EC编号1.1.3.47)。在一些实施方案中，EC 1.1.3.47氧化酶可以源自基因hmfH。在一些实施方案中，hmfH可源自甲基菌属MP688或巴塞尔贪铜菌。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是芳基-醇氧化酶(EC编号1.1.3.7)。在一个实施方案中，过加氧酶被分类为EC编号1.11.2。在一个实施方案中，过加氧酶EC编号1.11.2是非特异性过加氧酶(EC编号1.11.2.1)。
在一些方面，在不存在微生物的情况下以酶促方式产生2,4-FDCA。在一些方面，在一个或多个容器中以酶促方式产生2,4-FDCA。在一些方面，所述一个或多个容器基本上不含微生物。在一些方面，2,4-FDCA的酶促产生以与利用重组微生物的方法中所述的相同的逐步方式进行，但基本上不含微生物或不存在微生物。在一些方面，用于酶促产生2,4-FDCA的酶分离自微生物(重组的或其他类型的)，并且提供给其相应的底物，用于逐步产生用于产生2,4-FDCA的中间产物。在一些方面，所述方法的一个或多个步骤在同一容器中进行。在一些方面，一旦由于本文所述的单独方法步骤产生所需产物，就分离并纯化产物，然后用作产生2,4-FDCA的方法的下一步骤中的底物。
2,4-呋喃二甲醇
在一个实施方案中，本公开提供了能够从碳源产生2,4-呋喃二甲醇的重组微生物。在图1、图2和图3中呈现了本公开的一些实施方案，其共同详述了碳原料到2,4-呋喃二甲醇的生物合成转化。
在一个实施方案中，2,4-呋喃二甲醇从4-HMF的生物产生受微生物编码的脱氢酶催化。在一个实施方案中，所述脱氢酶被分类为EC编号1.1.1。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.1.1选自醇脱氢酶(EC编号1.1.1.1)。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.1.1选自醇脱氢酶(NADP+)(EC编号1.1.1.2)。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.1.1选自D-木糖还原酶(EC编号1.1.1.90)。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.1.1选自芳基-醇脱氢酶(EC编号1.1.1.91)。在一个实施方案中所述脱氢酶可源自表5所列的酶候选物。在一些实施方案中，所述脱氢酶与表5所列的酶同源或相似。在一些实施方案中，4-HMF还原酶由表5所列的氨基酸序列编码。在一些实施方案中，脱氢酶经演化或工程改造以提高其将4-HMF还原为2,4-呋喃二甲醇的催化效率。
表5. 4-HMF还原酶(4-HMF还原为2,4-呋喃二甲醇)
Figure BDA0003325727080000471
Figure BDA0003325727080000481
Figure BDA0003325727080000491
在一些方面，在不存在微生物的情况下以酶促方式产生2,4-呋喃二甲醇。在一些方面，在一个或多个容器中以酶促方式产生2,4-呋喃二甲醇。在一些方面，所述一个或多个容器基本上不含微生物。在一些方面，2,4-呋喃二甲醇的酶促产生以与利用重组微生物的方法中所述的相同的逐步方式进行，但基本上不含微生物或不存在微生物。在一些方面，用于酶促产生2,4-呋喃二甲醇的酶分离自微生物(重组的或其他类型的)，并且提供给其相应的底物，用于逐步产生用于产生2,4-呋喃二甲醇的中间产物。在一些方面，所述方法的一个或多个步骤在同一容器中进行。在一些方面，一旦由于本文所述的单独方法步骤产生所需产物，就分离并纯化产物，然后用作产生2,4-呋喃二甲醇的方法的下一步骤中的底物。
呋喃-2,4-二甲醛
在一个实施方案中，本公开提供了能够从碳源产生呋喃-2,4-二甲醛的重组微生物。在图1、图2和图3中呈现了本公开的一些实施方案，其共同详述了碳原料到呋喃-2,4-二甲醛的生物合成转化。
在一个实施方案中，图2中的步骤D是利用4-HMF作为底物的单步反应。在一个实施方案中，呋喃-2,4-二甲醛从4-HMF的生物产生由EC编号1.1.1.-、1.1.3.-和1.11.2.-表示的一种或多种酶催化。
在一个实施方案中，本文公开的实施方案中的任何一个的重组微生物包含编码催化4-HMF转化为呋喃-2,4-二甲醛的脱氢酶、氧化酶或过加氧酶的至少一种内源或外源核酸分子。在一个实施方案中，所述脱氢酶被分类为EC编号1.1.1。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.1.1选自醇脱氢酶(EC编号1.1.1.1)或醇脱氢酶(NADP+)(EC编号1.1.1.2)或D-木糖还原酶(EC编号1.1.1.307)或芳基-醇脱氢酶(EC编号1.1.1.90)或芳基-醇脱氢酶(NADP+)(EC编号1.1.1.91)。在一个实施方案中，所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是5-(羟甲基糠醛氧化酶(EC编号1.1.3.47)。在一些实施方案中，EC 1.1.3.47氧化酶可以源自基因hmfH。在一些实施方案中，hmfH可源自甲基菌属MP688或巴塞尔贪铜菌。参见Dijkman和Fraaije(2014)以及Koopman等人(2010)。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是芳基-醇氧化酶(EC编号1.1.3.7)。参见Carro等人(2015)。在一个实施方案中，过加氧酶被分类为EC编号1.11.2。在一个实施方案中，过加氧酶EC编号1.11.2是非特异性过加氧酶(EC编号1.11.2.1)。参见Carro等人(2015)。
在一些方面，在不存在微生物的情况下以酶促方式产生呋喃-2,4-二甲醛。在一些方面，在一个或多个容器中以酶促方式产生呋喃-2,4-二甲醛。在一些方面，所述一个或多个容器基本上不含微生物。在一些方面，呋喃-2,4-二甲醛的酶促产生以与利用重组微生物的方法中所述的相同的逐步方式进行，但基本上不含微生物或不存在微生物。在一些方面，用于酶促产生呋喃-2,4-二甲醛的酶分离自微生物(重组的或其他类型的)，并且提供给其相应的底物，用于逐步产生用于产生呋喃-2,4-二甲醛的中间产物。在一些方面，所述方法的一个或多个步骤在同一容器中进行。在一些方面，一旦由于本文所述的单独方法步骤产生所需产物，就分离并纯化产物，然后用作产生呋喃-2,4-二甲醛的方法的下一步骤中的底物。
4-(羟甲基)糠酸
在一个实施方案中，本公开提供了能够从碳源产生4-(羟甲基)糠酸的重组微生物。在图1、图2和图3中呈现了本公开的一些实施方案，其共同详述了碳原料到4-(羟甲基)糠酸的生物合成转化。
在一个实施方案中，图2中的步骤E是利用4-HMF作为底物的单步反应。在一个实施方案中，4-(羟甲基)糠酸从4-HMF的生物产生由EC编号1.1.1.-、1.1.3.-和1.11.2.-表示的一种或多种酶催化。
在一个实施方案中，本文公开的实施方案中的任何一个的重组微生物包含编码催化4-HMF转化为4-(羟甲基)糠酸的脱氢酶或氧化酶或过加氧酶的至少一种内源或外源核酸分子。在一个实施方案中，所述脱氢酶被分类为EC编号1.2.1。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.2.1选自醛脱氢酶(NAD+)(EC编号1.2.1.3)或醛脱氢酶(NADP+)(EC编号1.2.1.4)或醛脱氢酶[NAD(P)+](EC编号1.2.1.5)或4-(γ-谷氨酰基氨基)丁醛脱氢酶(EC编号1.2.1.99)。在一个实施方案中，所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是5-(羟甲基糠醛氧化酶(EC编号1.1.3.47)。在一些实施方案中，EC1.1.3.47氧化酶可以源自基因hmfH。在一些实施方案中，hmfH可源自甲基菌属MP688或巴塞尔贪铜菌。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是芳基-醇氧化酶(EC编号1.1.3.7)。在一个实施方案中，过加氧酶被分类为EC编号1.11.2。在一个实施方案中，过加氧酶EC编号1.11.2是非特异性过加氧酶(EC编号1.11.2.1)。
在一些方面，在不存在微生物的情况下以酶促方式产生4-(羟甲基)糠酸。在一些方面，在一个或多个容器中以酶促方式产生4-(羟甲基)糠酸。在一些方面，所述一个或多个容器基本上不含微生物。在一些方面，4-(羟甲基)糠酸的酶促产生以与利用重组微生物的方法中所述的相同的逐步方式进行，但基本上不含微生物或不存在微生物。在一些方面，用于酶促产生4-(羟甲基)糠酸的酶分离自微生物(重组的或其他类型的)，并且提供给其相应的底物，用于逐步产生用于产生4-(羟甲基)糠酸的中间产物。在一些方面，所述方法的一个或多个步骤在同一容器中进行。在一些方面，一旦由于本文所述的单独方法步骤产生所需产物，就分离并纯化产物，然后用作产生4-(羟甲基)糠酸的方法的下一步骤中的底物。
2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯
在一个实施方案中，本公开提供了能够从碳源产生2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯的重组微生物。在图1、图2和图3中呈现了本公开的一些实施方案，其共同详述了碳原料到2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯的生物合成转化。
在一个实施方案中，图2中的步骤F是利用呋喃-2,4-二甲醛作为底物的单步反应。在一个实施方案中，2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯从呋喃-2,4-二甲醛的生物产生由EC编号1.2.1.-、1.1.3.-和1.11.2.-表示的一种或多种酶催化。
在一个实施方案中，本文公开的实施方案中的任何一个的重组微生物包含编码催化呋喃-2,4-二甲醛转化为2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯的脱氢酶或氧化酶或过加氧酶的至少一种内源或外源核酸分子。在一个实施方案中，所述脱氢酶被分类为EC编号1.2.1。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.2.1选自醛脱氢酶(NAD+)(EC编号1.2.1.3)或醛脱氢酶(NADP+)(EC编号1.2.1.4)或醛脱氢酶[NAD(P)+](EC编号1.2.1.5)或4-(γ-谷氨酰基氨基)丁醛脱氢酶(EC编号1.2.1.99)。在一个实施方案中，所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是5-(羟甲基糠醛氧化酶(EC编号1.1.3.47)。在一些实施方案中，EC 1.1.3.47氧化酶可以源自基因hmfH。在一些实施方案中，hmfH可源自甲基菌属MP688或巴塞尔贪铜菌。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是芳基-醇氧化酶(EC编号1.1.3.7)。在一个实施方案中，过加氧酶被分类为EC编号1.11.2。在一个实施方案中，过加氧酶EC编号1.11.2是非特异性过加氧酶(EC编号1.11.2.1)。
在一些方面，在不存在微生物的情况下以酶促方式产生2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯。在一些方面，在一个或多个容器中以酶促方式产生2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯。在一些方面，所述一个或多个容器基本上不含微生物。在一些方面，2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯的酶促产生以与利用重组微生物的方法中所述的相同的逐步方式进行，但基本上不含微生物或不存在微生物。在一些方面，用于酶促产生2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯的酶分离自微生物(重组的或其他类型的)，并且提供给其相应的底物，用于逐步产生用于产生2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯的中间产物。在一些方面，所述方法的一个或多个步骤在同一容器中进行。在一些方面，一旦由于本文所述的单独方法步骤产生所需产物，就分离并纯化产物，然后用作产生2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯的方法的下一步骤中的底物。
4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯
在一个实施方案中，本公开提供了能够从碳源产生4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯的重组微生物。在图1、图2和图3中呈现了本公开的一些实施方案，其共同详述了碳原料到4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯的生物合成转化。
在一个实施方案中，图2中的步骤G是利用呋喃-2,4-二甲醛作为底物的单步反应。在一个实施方案中，4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯从呋喃-2,4-二甲醛的生物产生由EC编号1.2.1.-、1.1.3.-和1.11.2.-表示的一种或多种酶催化。
在一个实施方案中，本文公开的实施方案中的任何一个的重组微生物包含编码催化呋喃-2,4-二甲醛转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯的脱氢酶或氧化酶或过加氧酶的至少一种内源或外源核酸分子。在一个实施方案中，所述脱氢酶被分类为EC编号1.2.1。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.2.1选自醛脱氢酶(NAD+)(EC编号1.2.1.3)或醛脱氢酶(NADP+)(EC编号1.2.1.4)或醛脱氢酶[NAD(P)+](EC编号1.2.1.5)或4-(γ-谷氨酰基氨基)丁醛脱氢酶(EC编号1.2.1.99)。在一个实施方案中，所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是5-(羟甲基糠醛氧化酶(EC编号1.1.3.47)。在一些实施方案中，EC 1.1.3.47氧化酶可以源自基因hmfH。在一些实施方案中，hmfH可源自甲基菌属MP688或巴塞尔贪铜菌。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是芳基-醇氧化酶(EC编号1.1.3.7)。在一个实施方案中，过加氧酶被分类为EC编号1.11.2。在一个实施方案中，过加氧酶EC编号1.11.2是非特异性过加氧酶(EC编号1.11.2.1)。
在一个实施方案中，图2中的步骤H是利用4-(羟甲基)糠酸作为底物的单步反应。在一个实施方案中，4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯从4-(羟甲基)糠酸的生物产生由EC编号1.1.1.-、1.1.3.-和1.11.2.-表示的一种或多种酶催化。
在一个实施方案中，本文公开的实施方案中的任何一个的重组微生物包含编码催化4-(羟甲基)糠酸转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯的脱氢酶或氧化酶或过加氧酶的至少一种内源或外源核酸分子。在一个实施方案中，所述脱氢酶被分类为EC编号1.1.1。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.1.1选自醇脱氢酶(EC编号1.1.1.1)或醇脱氢酶(NADP+)(EC编号1.1.1.2)或D-木糖还原酶(EC编号1.1.1.307)或芳基-醇脱氢酶(EC编号1.1.1.90)或芳基-醇脱氢酶(NADP+)(EC编号1.1.1.91)。在一个实施方案中，所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是5-(羟甲基糠醛氧化酶(EC编号1.1.3.47)。在一些实施方案中，EC 1.1.3.47氧化酶可以源自基因hmfH。在一些实施方案中，hmfH可源自甲基菌属MP688或巴塞尔贪铜菌。参见Dijkman和Fraaije(2014)以及Koopman等人(2010)。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是芳基-醇氧化酶(EC编号1.1.3.7)。参见Carro等人(2015)。在一个实施方案中，过加氧酶被分类为EC编号1.11.2。在一个实施方案中，过加氧酶EC编号1.11.2是非特异性过加氧酶(EC编号1.11.2.1)。参见Carro等人(2015)。
在一些方面，在不存在微生物的情况下以酶促方式产生4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯。在一些方面，在一个或多个容器中以酶促方式产生4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯。在一些方面，所述一个或多个容器基本上不含微生物。在一些方面，4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯的酶促产生以与利用重组微生物的方法中所述的相同的逐步方式进行，但基本上不含微生物或不存在微生物。在一些方面，用于酶促产生4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯的酶分离自微生物(重组的或其他类型的)，并且提供给其相应的底物，用于逐步产生用于产生4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯的中间产物。在一些方面，所述方法的一个或多个步骤在同一容器中进行。在一些方面，一旦由于本文所述的单独方法步骤产生所需产物，就分离并纯化产物，然后用作产生4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯的方法的下一步骤中的底物。
微生物群体的产生
遗传修饰
引入本公开的一种或多种微生物中的遗传修饰可以改变或消除靶基因的调控序列。在一些方面，引入本公开的一种或多种微生物中的遗传修饰可以将新性状或新表型引入到所述一种或多种微生物中。对应于向其中引入遗传变异的微生物，也可以插入一个或多个调控序列，包括异源调控序列和在动物、植物、真菌、酵母、细菌或病毒的基因组内发现的调控序列。而且，可以基于微生物培养物中基因的表达水平来选择调控序列。遗传变异可以是特异性引入靶位点的预定遗传变异。在一些方面，遗传变异是引入到一条或多条微生物染色体中的核酸序列。在一些方面，遗传变异是引入到一个或多个染色体外核酸序列中的核酸序列。遗传变异可以是靶位点内的随机突变。遗传变异可以是一个或多个核苷酸的插入或缺失。在一些情况下，将多个不同的遗传变异(例如，2、3、4、5、10个或更多个)引入一种或多种分离的细菌中。所述多个遗传变异可以是上述类型中的任一种、相同或不同类型，以及任何组合。在一些情况下，连续引入多个不同的遗传变异，在第一分离步骤之后引入第一遗传变异，在第二分离步骤之后引入第二遗传变异，以此类推，以便在微生物中积聚多个所需修饰。
在一些方面，在2,4-FDCA单体和聚合物的产生中阐述的底物中的一种或多种是从碳原料(例如，葡萄糖或甘油)生物合成的。
一般来说，术语“遗传变异”是指相对于参考多核苷酸，诸如参考基因组或其一部分，或参考基因或其一部分引入多核苷酸序列内的任何变化。遗传变异可以称为“突变”，并且包含遗传变异的序列或生物体可以称为“遗传变体”或“突变体”。遗传变异可以具有许多作用，诸如一些生物活性的增加或减少，这些生物活性包括基因表达、代谢和细胞信号传导。
遗传变异可以特异性引入靶位点，或随机引入。多种分子工具和方法可用于引入遗传变异。例如，遗传变异可以经由聚合酶链反应诱变、寡核苷酸定向诱变、饱和诱变、片段改组诱变、同源重组、重组工程、lambda red介导的重组、CRISPR/Cas9系统、化学诱变及其组合来引入。引入遗传变异的化学方法包括将DNA暴露于化学诱变剂，例如，甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、N-硝基尿糖(EN U)、N-甲基-N-硝基-N′-硝基胍、4-硝基喹啉N-氧化物、硫酸二乙酯、苯并芘、环磷酰胺、博来霉素(bleomycin)、三乙基三聚氰胺、丙烯酰胺单体、氮芥、长春新碱、二环氧烷烃(例如，二环氧丁烷)、ICR-170、甲醛、盐酸丙卡巴肼、环氧乙烷、二甲基亚硝胺、7,12二甲基苯并(a)蒽、苯丁酸氮芥、六甲基磷酰胺、白消安等等。辐射突变诱导剂包括紫外辐射、γ-辐照、X射线和快中子轰击。还可以使用例如三甲基补骨脂素与紫外线将遗传变异引入核酸中。随机或靶向插入移动DNA元件，例如转座元件，是产生遗传变异的另一种合适的方法。
遗传变异可以在无细胞的体外系统中在扩增期间引入核酸中，例如使用聚合酶链反应(PCR)技术，诸如易错PCR。可以在体外使用DNA改组技术(例如，外显子改组、结构域交换等)将遗传变异引入核酸中。遗传变异也可以由于细胞中DNA修复酶的缺陷而引入核酸中，例如，预计细胞中存在编码突变型DNA修复酶的突变基因会在该细胞的基因组中产生高频率的突变(即，约1个突变/100个基因-1个突变/10,000个基因)。编码DNA修复酶的基因的实例包括但不限于Mut H、Mut S、Mut L和Mut U，以及它们在其他物种中的同源物(例如，MSH 16、PMS 1 2、MLH 1、GTBP、ERCC-1等)。用于引入遗传变异的各种方法的示例性描述提供于例如Stemple(2004)Nature 5:1-7；Chiang等人(1993)PCR Methods Appl 2(3):210-217；Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747-10751；以及美国专利号6,033,861和6,773,900中。
引入到微生物中的遗传变异可以分类为转基因的、顺基因的、基因组内的、基因内的、基因间的、合成的、演化的、重排的或SNP。
CRISPR/Cas9(规律间隔成簇短回文重复序列)/CRISPR相关(Cas)系统可用于引入所需突变。CRISPR/Cas9通过使用CRISPR RNA(crRNA)引导侵入核酸的沉默，为细菌和古细菌提供针对病毒和质粒的获得性免疫。Cas9蛋白(或其功能等同物和/或其变体，即Cas9样蛋白)天然含有DNA核酸内切酶活性，其取决于蛋白质与称为crRNA和tracrRNA(也称为向导RNA)的两种天然存在的或合成的RNA分子的缔合。在一些情况下，所述两种分子共价连接形成单个分子(也称为单向导RNA(“sgRNA”)。因此，Cas9或Cas9样蛋白与靶向DNA的RNA缔合(该术语涵盖双分子向导RNA构型和单分子向导RNA构型两者)，从而活化Cas9或Cas9样蛋白并将所述蛋白引导到靶核酸序列。如果Cas9或Cas9样蛋白保留其天然酶促功能，则它将会裂解靶DNA以产生双链断裂，这可以导致基因组改变(即，编辑：缺失、插入(当存在供体多核苷酸时)、置换等)，从而改变基因表达。Cas9的一些变体(所述变体被术语Cas9样蛋白所涵盖)已经改变，使得它们具有降低的DNA裂解活性(在一些情况下，它们裂解单链而非靶DNA的两条链，而在其他情况下，它们的DNA裂解活性严重降低或没有DNA裂解活性)。用于引入遗传变异的CRISPR系统的进一步示例性描述可在例如US8795965中找到。
寡核苷酸定向诱变，也称为定点诱变，通常利用合成DNA引物。这种合成引物含有所需突变并且与突变位点周围的模板DNA互补，使其可与目标基因中的DNA杂交。突变可以是单碱基变化(点突变)、多碱基变化、缺失或插入，或这些的组合。然后，使用拷贝基因的其余部分的DNA聚合酶延伸单链引物。这样拷贝的基因含有突变位点，然后可以作为载体引入宿主细胞中并克隆。最后，可以通过DNA测序以检查它们含有所需突变来选择突变体。
可以使用易错PCR引入遗传变异。在这种技术中，在序列复制的保真度不足的条件下，使用DNA聚合酶扩增目标基因。结果是扩增产物在序列中含有至少一个错误。当扩增基因且与模板分子相比时，反应的所得产物在序列中含有一个或多个改变时，所得产物与模板相比是诱变的。引入随机突变的另一种手段是使细胞暴露于化学诱变物，诸如亚硝基胍或甲磺酸乙酯(Nestmann,Mutat Res 1975年6月；28(3):323-30)，然后从宿主中分离含有该基因的载体。
同源重组诱变涉及外源DNA片段与靶向多核苷酸序列之间的重组。在发生双链断裂之后，在称为切除的过程中切掉断裂的5’末端周围的DNA区段。在随后的链侵入步骤中，断裂的DNA分子的突出3'末端然后“侵入”未断裂的相似或相同DNA分子。该方法可用于使基因缺失，去除外显子，添加基因以及引入点突变。同源重组诱变可以是永久性的或条件性的。通常，还提供了重组模板。重组模板可以是另一载体的组分，包含在单独的载体中，或作为单独的多核苷酸提供。在一些方面，将重组模板设计为在同源重组中充当模板，诸如在被位点特异性核酸酶切口或裂解的靶序列内或附近。模板多核苷酸可以具有任何合适的长度，诸如长度为约或超过约10、15、20、25、50、75、100、150、200、500、1000个或更多个核苷酸。在一些方面，模板多核苷酸与包含靶序列的多核苷酸的一部分互补。当最佳比对时，模板多核苷酸可与靶序列的一个或多个核苷酸重叠(例如约或超过约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100个或更多个核苷酸)。在一些方面，当模板序列和包含靶序列的多核苷酸最佳比对时，模板多核苷酸最近的核苷酸在距靶序列约1、5、10、15、20、25、50、75、100、200、300、400、500、1000、5000、10000个或更多个核苷酸内。可用于同源重组方法中的定点核酸酶的非限制性实例包括锌指核酸酶、CRISPR核酸酶、TALE核酸酶和大范围核酸酶。关于此类核酸酶的使用的进一步描述，参见例如US8795965和US20140301990。
引入遗传变异可能是不完整的过程，使得经处理的细菌群体中的一些细菌携带所需突变，而其他细菌则不携带所需突变。在一些情况下，期望施加选择压力，以便富集携带所需遗传变异的细菌。传统上，对成功的遗传变体的选择涉及选择或淘汰遗传变异赋予或消除的一些功能性，诸如在插入抗生素抗性基因或消除能够将非致死性化合物转化为致死性代谢物的代谢活性的情况下。还可以基于多核苷酸序列本身施加选择压力，使得仅需引入所需的遗传变异(例如，也不需要选择标志物)。在这种情况下，选择压力可以包括裂解缺乏引入靶位点的遗传变异的基因组，使得有效地针对设法向其中引入遗传变异的参考序列进行选择。通常，裂解发生在靶位点的100个核苷酸内(例如，在距靶位点75、50、25、10个或更少的核苷酸内，包括在靶位点处或靶位点内裂解)。裂解可以由选自由锌指核酸酶、CRISPR核酸酶、TALE核酸酶(TALEN)或大范围核酸酶组成的组的位点特异性核酸酶定向。此类方法类似于用于增强靶位点处的同源重组的方法，除了不提供用于同源重组的模板之外。因此，缺乏所需遗传变异的细菌更有可能经历裂解，裂解未得到修复，导致细胞死亡。然后可以分离选择中存活的细菌，以评估改善性状的赋予。
CRISPR核酸酶可用作位点特异性核酸酶，以将裂解定向于靶位点。通过使用Cas9杀伤非突变细胞，可以获得突变微生物的改善选择。然后可以从组织中重新分离微生物。用于淘汰非变体的CRISPR核酸酶系统可以采用与上文关于引入遗传变异描述的那些相似的元件，除了不提供用于同源重组的模板之外。因此，定向于靶位点的裂解增强了受影响的细胞的死亡。
可用于特异性诱导靶位点处的裂解的其他选项是可用的，诸如锌指核酸酶、TALE核酸酶(TALEN)系统和大范围核酸酶。锌指核酸酶(ZFN)是通过使锌指DNA结合结构域与DNA裂解结构域融合而产生的人工DNA核酸内切酶。ZFN可以经工程改造以靶向所需DNA序列，并且这使得锌指核酸酶能够裂解独特的靶序列。当引入细胞中时，ZFN可用于通过诱导双链断裂来编辑细胞中的靶DNA(例如，细胞基因组)。转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)是通过使TAL(转录活化因子样)效应物DNA结合结构域与DNA裂解结构域融合而产生的人工DNA核酸内切酶。TALEN可以快速工程改造为结合几乎任何所需的DNA序列，并且当引入细胞中时，TALEN可用于通过诱导双链断裂来编辑细胞中的靶DNA(例如，细胞基因组)。大范围核酸酶(归巢核酸内切酶)是内源脱氧核糖核酸酶，其特征在于大的识别位点(12至40个碱基对的双链DNA序列)。大范围核酸酶可用于以高度靶向的方式置换、消除或修饰序列。通过蛋白质工程改造修饰其识别序列，可以改变靶向序列。大范围核酸酶可用于修饰所有基因组类型，无论是细菌、植物还是动物的，并且通常分为四个家族：LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、His-Cyst盒家族和HNH家族。示例性的归巢核酸内切酶包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。
微生物
如本文所述，在一些方面，重组微生物能够产生4-HMF、2,4-呋喃二甲醇、呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯或2,4-FDA及其任何组合。
如本文所述，在一些方面，所述重组微生物是原核微生物。在一些方面，所述原核微生物是细菌。“细菌”或“真细菌”是指原核生物域。细菌包括如下至少十一个不同的类别：(1)革兰氏阳性(革兰氏+)细菌，其中有两个主要分支：(1)高G+C类别(放线菌(Actinomycete)、分枝杆菌(Mycobacteria)、微球菌(Micrococcus)等)(2)低G+C类别(杆菌(Bacillus)、梭菌(Clostridia)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、葡萄球菌(Staphylococci)、链球菌(Streptococci)、支原体(Mycoplasmas))；(2)变形菌门，例如紫色光合成+非光合成革兰氏阴性细菌(包括大多数“常见”革兰氏阴性细菌)；(3)蓝细菌(Cyanobacteria)，例如氧光养生物；(4)螺旋体(Spirochetes)和相关物种；(5)浮霉状菌(Planctomyces)；(6)拟杆菌(Bacteroides)、黄杆菌(Flavobacteria)；(7)衣原体(Chlamydia)；(8)绿色硫细菌；(9)绿色非硫细菌(也是厌氧光养生物)；(10)抗放射性微球菌和亲缘菌；(11)栖热袍菌(Thermotoga)和嗜热栖热腔菌(Thermosipho thermophiles)。
“革兰氏阴性细菌”包括球菌、非肠杆球菌和肠杆球菌。革兰氏阴性细菌的属包括例如奈瑟氏菌属(Neisseria)、螺菌属(Spirillum)、巴斯德菌属(Pasteurella)、布鲁氏菌属(Brucella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、弗朗西斯菌属(Francisella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、博代氏菌属(Bordetella)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺菌属(Shigella)、克雷白杆菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、弧菌属(Vibrio)、假单胞菌属(Pseudomonas)、拟杆菌属(Bacteroides)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、气杆菌属(Aerobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、固氮菌属(Azotobacter)、螺旋状菌属(Spirilla)、沙雷氏菌属(Serratia)、弧菌属(Vibrio)、根瘤菌属(Rhizobium)、衣原体属(Chlamydia)、立克次体属(Rickettsia)、密螺旋体属(Treponema)和梭杆菌属(Fusobacterium)。
“革兰氏阳性细菌”包括球菌、非孢子化杆球菌和孢子化杆球菌。革兰氏阳性细菌的属包括例如放线菌属(Actinomyces)、杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、乳杆菌属(Lactobacillus)、李斯特菌属(Listeria)、分支杆菌属(Mycobacterium)、粘球菌属(Myxococcus)、诺卡菌属(Nocardia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)和链霉菌属(Streptomyces)。
在一些方面，本公开的微生物是真菌。
在一些方面，重组微生物是真核微生物。在一些方面，真核微生物是酵母。在示例性方面，酵母是选自由以下组成的组的属的成员：耶氏酵母属(Yarrowia)、念珠菌属(Candida)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、管囊酵母属(Pachysolen)、隐球酵母属(Cryptococcus)、毛孢子菌属(Trichosporon)、红酵母属(Rhodotorula)和粘液菌属(Myxozyma)。
在一些方面，重组微生物是原核微生物。在示例性方面，原核微生物是选自由以下组成的组的属的成员：埃希氏菌属(Escherichia)、梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱菌属(Alcaligenes)、克雷白杆菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)和短杆菌属(Brevibacterium)。
在一些方面，用于本公开的方法中的微生物可以选自由以下组成的组：耶氏酵母属、念珠菌属、酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母菌属、伊萨酵母属、接合酵母属、德巴利氏酵母属、裂殖酵母属、管囊酵母属、隐球酵母属、毛孢子菌属、红酵母属、粘液菌属、埃希氏菌属、梭菌属、发酵单胞菌属、沙门氏菌属、红球菌属、假单胞菌属、杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、产碱菌属、克雷白杆菌属、类芽孢杆菌属、节杆菌属、棒状杆菌属和短杆菌属。
在一些方面，由本文所述的方法产生的微生物可以是选自以下属中的任一个属的种：奈瑟氏菌属、螺菌属、巴斯德菌属、布鲁氏菌属、耶尔森氏菌属、弗朗西斯菌属、嗜血杆菌属、博代氏菌属、念珠菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺菌属、克雷白杆菌属、变形菌属、弧菌属、假单胞菌属、拟杆菌属、醋酸杆菌属、气杆菌属、土壤杆菌属、固氮菌属、螺旋状菌属、沙雷氏菌属、弧菌属、根瘤菌属、衣原体属、立克次体属、密螺旋体属、梭杆菌属、放线菌属、杆菌属、梭菌属、棒状杆菌属、丹毒丝菌属、乳杆菌属、李斯特菌属、分支杆菌属、粘球菌属、诺卡菌属、伊萨酵母属、葡萄球菌属、链球菌属、链霉菌属、酵母属、毕赤酵母属和曲霉属(Aspergillus)。
在一些方面，用于本公开的方法中的微生物包括：梭菌属、永达尔梭菌、产乙醇梭菌、拉氏梭菌、粘液真杆菌、嗜甲基丁酸杆菌、热醋穆尔氏菌、谷氨酸棒杆菌、醋酸梭菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜喊菌、德雷克氏梭菌、食一氧化碳梭菌、甲酸乙酸梭菌、粪味梭菌、热自养穆尔氏菌、长醋丝菌、黏液真杆菌、乙二醇梭菌、大梭菌、克氏梭菌、马永贝梭菌、食甲氧基苯甲酸梭菌、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、普氏产醋杆菌、凯伍嗜热厌氧菌、卵形鼠孢菌、嗜热醋杆菌、甲醇醋酸杆菌、东方伊萨酵母、白蚁鼠孢菌、甘油穆尔氏菌、聚集性真杆菌、固氮密螺旋体、库德毕赤酵母、大肠杆菌、酿酒酵母、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、解脂耶氏酵母、树干毕赤酵母和甘油利用泰瑞孢子菌。
术语“重组微生物”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用，并且是指已经过遗传修饰以表达或过表达内源酶、表达异源酶，诸如包括在载体、整合构建体中的那些，或在内源基因的表达方面具有改变的微生物。“改变”意指编码一个或多个多肽或多肽亚基的RNA分子或等同RNA分子的基因表达或水平，或一个或多个多肽或多肽亚基的活性上调或下调，使得表达、水平或活性大于或小于在不存在改变的情况下观察到的表达、水平或活性。例如，术语“改变”可以意指“抑制”，但词语“改变”的使用不限于该定义。应理解，术语“重组微生物”和“重组宿主细胞”不仅指特定重组微生物，而且指此类微生物的后代或潜在后代。因为由于突变或环境影响在下一代中可能出现某些修饰，所以事实上此类后代可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用术语的范围内。
在本公开的方法中使用的微生物的培养可以使用本领域已知的用于使用本公开的微生物培养和发酵底物的许多方法进行。
发酵可以在任何合适的生物反应器中进行，诸如连续搅拌釜式生物反应器、泡罩塔生物反应器、气升式生物反应器、流化床生物反应器、填充床生物反应器、光生物反应器、固定化细胞反应器、滴流床反应器、移动床生物膜反应器、泡罩塔、气升发酵槽、膜反应器(诸如中空纤维膜生物反应器)等。在一些方面，生物反应器包括在其中培养微生物的第一生长反应器和向其中供给来自生长反应器的发酵肉汤并且大部分发酵产物在其中产生的第二发酵反应器。在一些方面，生物反应器同时实现了微生物的培养和从提供的碳源诸如底物和/或原料产生发酵产物。
在一些方面，本公开涉及回收/分离2,4-FDCA单体的方法。在一些方面，本公开涉及回收/分离4-HMF、2,4-呋喃二甲醇、呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯或2,4-FDA及其任何组合的方法。在一些方面，本公开涉及回收/分离2,4-呋喃二甲醇、呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯和/或4-甲酰基呋喃-2-羧酸单体或聚合物的方法。在一些方面，本公开涉及回收/分离4-HMF、2,4-呋喃二甲醇、呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯或2,4-FDA及其任何组合的方法。回收/收集/分离可通过本领域已知的方法，诸如蒸馏、基于膜的分离气提、沉淀、溶剂萃取和扩张床吸附。
原料
在一些方面，原料包括碳源。在一些方面，所述碳源可以选自糖、甘油、醇、有机酸、烷烃、脂肪酸、木质纤维素、蛋白质、二氧化碳和一氧化碳。在一个方面，所述碳源是糖。在一个方面，所述糖是单糖。在一个方面，所述糖是多糖。在一个方面，所述糖是葡萄糖或其葡萄糖寡聚物。在一个方面，葡萄糖的寡聚物选自果糖、蔗糖、淀粉、纤维二糖、麦芽糖、乳糖和纤维素。在一个方面，所述糖是五碳糖。在一个方面，所述糖是六碳糖。在一些方面，原料包含一种或多种五碳糖和/或一种或多种六碳糖。在一些方面，原料包含木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、麦芽糖、果糖、甘露糖、蔗糖和/或其组合中的一种或多种。在一些方面，原料包含木糖和/或葡萄糖中的一种或多种。在一些方面，原料包含阿拉伯糖、半乳糖、麦芽糖、果糖、甘露糖、蔗糖和/或其组合中的一种或多种。
在一些方面，微生物利用一种或多种五碳糖(戊糖)和/或一种或多种六碳糖(己糖)。在一些方面，微生物利用木糖和/或葡萄糖中的一种或多种。在一些方面，微生物利用阿拉伯糖、半乳糖、麦芽糖、果糖、甘露糖、蔗糖和/或其组合中的一种或多种。在一些方面，微生物利用木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、麦芽糖、果糖、甘露糖、蔗糖和/或其组合中的一种或多种。
在一些方面，己糖可选自D-阿洛糖、D-阿卓糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-古洛糖、D-艾杜糖、D-半乳糖、D-塔罗糖、D-塔格糖、D-山梨糖、D-果糖、D-阿洛酮糖和本领域已知的其他己糖。在一些方面，戊糖可选自D-木糖、D-核糖、D-阿拉伯糖、D-来苏糖、D-木酮糖、D-核酮糖和本领域已知的其他戊糖。在一些方面，己糖和戊糖可选自本文公开的任何己糖和戊糖的左旋对映体或右旋对映体。
微生物组合物
在一些方面，将本公开的微生物组合成微生物组合物。
在一些方面，本公开的微生物组合物是固体。当使用固体组合物时，可能需要包括一种或多种载剂材料，包括但不限于：矿物土，诸如二氧化硅、滑石粉、高岭土、石灰石、白垩、粘土、白云石、硅藻土；硫酸钙；硫酸镁；氧化镁；沸石，碳酸钙；碳酸镁；海藻糖；壳聚糖；虫胶；白蛋白；淀粉；脱脂奶粉；甜乳清粉；麦芽糊精；乳糖；菊粉；右旋糖；和植物来源的产品，诸如谷物粉、树皮粉、木粉和果壳粉。
在一些方面，本公开的微生物组合物是液体。在其他方面，液体包含溶剂，所述溶剂可包括水或醇或盐水或碳水化合物溶液。在一些方面，本公开的微生物组合物包括粘合剂，诸如聚合物、羧甲基纤维素、淀粉、聚乙烯醇等。
在一些方面，本公开的微生物组合物包含糖(例如，单糖、二糖、三糖、多糖、寡糖等)、聚合糖、脂质、聚合脂质、脂多糖、蛋白质、聚合蛋白、脂蛋白、核酸、核酸聚合物、二氧化硅、无机盐及其组合。在另一方面，微生物组合物包含琼脂、琼脂糖、脱乙酰吉兰糖胶(gelrite)、吉兰糖胶(gellan gum)等的聚合物。在一些方面，微生物组合物包含塑料胶囊、乳液(例如水和油)、膜和人工膜。在一些方面，乳液或连接的聚合物溶液包含本公开的微生物组合物。参见Harel和Bennett(美国专利8,460,726B2)。
在一些方面，本公开的微生物组合物以固体形式(例如，分散的冻干孢子)或液体形式(散布在储存介质中的微生物)出现。在一些方面，就在使用前将干燥形式的本公开的微生物组合物添加到液体中，以形成悬浮液。
产生生物合成产物的方法
本公开提供了一种使用重组微生物产生一种或多种生物合成产物的方法。生物合成产物包括：4-HMF、2,4-呋喃二甲醇、呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯和2,4-FDCA。在一个实施方案中，所述方法包括在培养基中培养重组微生物。在一个实施方案中，培养基含有包含碳源的原料，重组微生物可利用所述碳源产生所述一种或多种生物合成产物。在一个实施方案中，培养基中的碳源选自包括己糖、戊糖或甘油的组。在某些实施方案中，碳源是甘油。在图1、图2和图3中呈现了本公开的一些实施方案，其共同详述了碳原料到一种或多种生物合成产物的生物合成转化。
本公开提供了一种产生重组微生物的方法，所述重组微生物从包含外源碳源的原料产生4-HMF、2,4-呋喃二甲醇、呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯和2,4-FDA。在一个实施方案中，所述方法包括将能够将碳源转化为4-HMF、2,4-呋喃二甲醇、呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯和2,4-FDCA的内源和/或外源核酸分子引入重组微生物中和/或在重组微生物中过表达所述内源和/或外源核酸分子。在一个实施方案中，碳源可包括甘油和/或单糖。
在一个实施方案中，内源和/或外源核酸分子将甘油或单糖转化为甘油醛3-磷酸(G3P)。G3P是常见的天然中间代谢物。在一些实施方案中，它可以从葡萄糖经由糖酵解途径产生，或从木糖经由戊糖磷酸途径产生，或从甘油产生。在一个实施方案中，能够产生4-HMF、2,4-呋喃二甲醇、呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯和2,4-FDCA的重组微生物利用包含己糖、戊糖或甘油的碳源。在某些实施方案中，碳源是甘油。
在一个实施方案中，本公开设想了产生2,4-FDCA的方法和用于产生2,4-FDCA的多个步骤和过程。在一些实施方案中，本公开设想了用于产生在制备2,4-FDCA的过程中描述的4-HMF、2,4-呋喃二甲醇、呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯和4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯中的一种或多种的单独方法。
在一个实施方案中，所述方法的重组微生物源自选自由以下组成的组的亲本微生物：梭菌属、永达尔梭菌、产乙醇梭菌、拉氏梭菌、粘液真杆菌、嗜甲基丁酸杆菌、热醋穆尔氏菌、谷氨酸棒杆菌、醋酸梭菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜喊菌、德雷克氏梭菌、食一氧化碳梭菌、甲酸乙酸梭菌、粪味梭菌、热自养穆尔氏菌、长醋丝菌、黏液真杆菌、乙二醇梭菌、大梭菌、克氏梭菌、马永贝梭菌、食甲氧基苯甲酸梭菌、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、普氏产醋杆菌、凯伍嗜热厌氧菌、卵形鼠孢菌、嗜热醋杆菌、甲醇醋酸杆菌、东方伊萨酵母、白蚁鼠孢菌、甘油穆尔氏菌、聚集性真杆菌、固氮密螺旋体、库德毕赤酵母、大肠杆菌、酿酒酵母、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、解脂耶氏酵母、树干毕赤酵母和甘油利用泰瑞孢子菌。
4-HMF
在一个实施方案中，本公开包括将一种或多种碳源转化为甘油醛3-磷酸(G3P)；将G3P转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯(步骤A)；将(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯转化为4-羟甲基糠醛(4-HMF)(步骤B)。
在一个实施方案中，本公开涉及产生本文公开的实施方案中的任何一个的重组微生物的方法，所述重组微生物包含能够将碳源转化为甘油醛3-磷酸(G3P)的内源和/或外源核酸分子。在一个实施方案中，甘油通过编码甘油激酶的至少一种内源或外源核酸分子转化为甘油-3-磷酸。在一个实施方案中，甘油-3-磷酸通过编码甘油-3-磷酸脱氢酶的至少一种内源或外源核酸分子转化为二羟丙酮磷酸(DHAP)。在一个实施方案中，甘油通过编码甘油脱氢酶的至少一种内源或外源核酸分子转化为二羟基丙酮。在一个实施方案中，二羟基丙酮通过编码二羟基丙酮激酶的至少一种内源或外源核酸分子转化为二羟丙酮磷酸(DHAP)。在一个实施方案中，DHAP通过编码磷酸丙糖异构酶的至少一种内源或外源核酸分子转化为G3P。参见Zhang等人(2010)。
在一个实施方案中，本公开涉及产生本文公开的实施方案中的任何一个的重组微生物的方法，所述重组微生物包含编码(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶的至少一种内源或外源核酸分子，所述合酶催化G3P转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯。在一个实施方案中，(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶被分类为EC编号4.2.3.153。在一些实施方案中，EC 4.2.3.153(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶可以源自基因mfnB。在一些实施方案中，mfnB可源自詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)。在一些实施方案中，(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶可源自表1所列的酶候选物。在一些实施方案中，(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶与表1所列的酶同源或相似。在一些实施方案中，(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶经演化或工程改造以显著地提高其催化效率kcat。
在一个实施方案中，本公开涉及产生本文公开的实施方案中的任何一个的重组微生物的方法，所述重组微生物包含编码催化(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯转化为(4-HMF)的磷酸酶的至少一种内源或外源核酸分子。在一个实施方案中，磷酸酶被分类为卤代酸脱卤酶(Koonin等人J.Mol.Biol.244(1).1994)。在一些方面，反应b的磷酸酶是宿主内源性的(Offley等人Curr.Gen.65.2019)。在一些方面，所述宿主内源性的磷酸酶被过表达。在一些情况下，使用能够进行所需反应的异源磷酸酶，并且选自所述异源磷酸酶碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、果糖-二磷酸酶、糖-磷酸酶或糖-末端-磷酸酶。在一些实施方案中，所述磷酸酶可源自表2所列的酶候选物。在一些实施方案中，所述磷酸酶与表2所列的酶同源或相似。在一些实施方案中，磷酸酶经演化或工程改造以改善其催化效率和/或特异性，从而将(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯转化为(4-HMF)。
因此，在一个实施方案中，本公开涉及产生重组微生物的方法，所述重组微生物包含能够将碳源转化为甘油醛3-磷酸(G3P)的内源和/或外源核酸分子；编码催化G3P转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶的至少一种内源或外源核酸分子；编码催化(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯转化为4-HMF的至少一种内源或外源核酸分子。
2,4-FDCA
在一个实施方案中，本公开的方法经由几个酶促催化的连续步骤将G3P转化为2,4-FDCA。在一个实施方案中，本公开包括将一种或多种碳源转化为甘油醛3-磷酸(G3P)；将G3P转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯(步骤A)；将(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯转化为4-羟甲基糠醛(4-HMF)(步骤B)；直接地(步骤C)或通过在将4-HMF转化为呋喃-2,4-二甲醛(步骤D)和/或4-(羟甲基)糠酸(步骤E)时产生中间产物将4-HMF转化为2,4FDCA；将呋喃-2,4-二甲醛转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯(步骤G)和/或2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯(步骤F)和/或将4-(羟甲基)糠酸转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯(步骤H)；将4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯转化为2,4-FDCA(步骤J)和/或将2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯转化为2,4-FDCA(步骤I)。在另一个实施方案中，所述一种或多种碳源可包括甘油或单糖。
因此，在一个实施方案中，本文提供了一种产生重组微生物的方法，所述重组微生物包含能够将碳源转化为甘油醛3-磷酸(G3P)的内源和/或外源核酸分子；编码催化G3P转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶的至少一种内源或外源核酸分子；编码催化(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯转化为(4-HMF)的磷酸酶的至少一种内源或外源核酸分子；编码催化4-HMF直接地或通过产生中间产物如呋喃-2,4-二甲醛和/或4-(羟甲基)糠酸而转化为2,4FDCA的脱氢酶或氧化酶或过加氧酶的至少一种内源或外源核酸分子；编码催化呋喃-2,4-二甲醛转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯和/或2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯和/或4-(羟甲基)糠酸转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯的脱氢酶或氧化酶或过加氧酶的至少一种内源或外源核酸分子；编码催化2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯转化为2,4-FDCA和/或4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯转化为2,4-FDCA的脱氢酶或氧化酶或过加氧酶的至少一种内源或外源核酸分子。
在一个实施方案中，本文公开的方法的实施方案中的任何一个的重组微生物包含能够将碳源转化为甘油醛3-磷酸(G3P)的内源和/或外源核酸分子。在一个实施方案中，甘油通过编码甘油激酶的至少一种内源或外源核酸分子转化为甘油-3-磷酸。在一个实施方案中，甘油-3-磷酸通过编码甘油-3-磷酸脱氢酶的至少一种内源或外源核酸分子转化为二羟丙酮磷酸(DHAP)。在一个实施方案中，甘油通过编码甘油脱氢酶的至少一种内源或外源核酸分子转化为二羟基丙酮。在一个实施方案中，二羟基丙酮通过编码二羟基丙酮激酶的至少一种内源或外源核酸分子转化为二羟丙酮磷酸(DHAP)。在一个实施方案中，DHAP通过编码磷酸丙糖异构酶的至少一种内源或外源核酸分子转化为G3P。
在一个实施方案中，本文公开的方法的实施方案中的任何一个的重组微生物包含编码(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶的至少一种内源或外源核酸分子，所述合酶催化G3P转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯。在一个实施方案中，(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶被分类为EC编号4.2.3.153。在一些实施方案中，EC4.2.3.153(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶可以源自基因mfnB。在一些实施方案中，mfnB可源自詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)。在一些实施方案中，EC 4.2.3.153可以源自mfnB的同源物。
在一个实施方案中，本文公开的方法的实施方案中的任何一个的重组微生物包含编码催化(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯转化为(4-HMF)的磷酸酶的至少一种内源或外源核酸分子。在一个实施方案中，所述磷酸酶被分类为EC编号3.1.3。在一个实施方案中，磷酸酶EC编号3.1.3磷酸酶选自碱性磷酸酶(EC编号3.1.3.1)、酸性磷酸酶(EC编号3.1.3.2)、果糖-二磷酸酶(EC编号3.1.3.11)、糖-磷酸酶(EC编号3.1.3.23)或糖-末端-磷酸酶(EC编号3.1.3.58)。在一个实施方案中，激酶被分类为EC编号2.7.1。在一个实施方案中，激酶EC编号2.7.1选自果糖激酶(EC编号2.7.1.4)、核糖激酶(EC编号2.7.1.15)、核酮糖激酶(EC编号2.7.1.16)、木酮糖激酶(EC编号2.7.1.17)或D-核酮糖激酶(EC编号2.7.1.47)。
在一个实施方案中，本文公开的方法的实施方案中的任何一个的重组微生物包含编码催化4-HMF转化为呋喃-2,4-二甲醛的脱氢酶或氧化酶或过加氧酶的至少一种内源或外源核酸分子。在一个实施方案中，所述脱氢酶被分类为EC编号1.1.1。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.1.1选自醇脱氢酶(EC编号1.1.1.1)或醇脱氢酶(NADP+)(EC编号1.1.1.2)或D-木糖还原酶(EC编号1.1.1.307)或芳基-醇脱氢酶(EC编号1.1.1.90)或芳基-醇脱氢酶(NADP+)(EC编号1.1.1.91)。在一个实施方案中，所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是5-(羟甲基糠醛氧化酶(EC编号1.1.3.47)。在一些实施方案中，EC 1.1.3.47氧化酶可以源自基因hmfH。在一些实施方案中，hmfH可源自甲基菌属MP688或巴塞尔贪铜菌。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是芳基-醇氧化酶(EC编号1.1.3.7)。在一个实施方案中，过加氧酶被分类为EC编号1.11.2。在一个实施方案中，过加氧酶EC编号1.11.2是非特异性过加氧酶(EC编号1.11.2.1)。
在一个实施方案中，本文公开的方法的实施方案中的任何一个的重组微生物包含编码催化4-HMF转化为4-(羟甲基)糠酸的脱氢酶或氧化酶或过加氧酶的至少一种内源或外源核酸分子。在一个实施方案中，所述脱氢酶被分类为EC编号1.2.1。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.2.1选自醛脱氢酶(NAD+)(EC编号1.2.1.3)或醛脱氢酶(NADP+)(EC编号1.2.1.4)或醛脱氢酶[NAD(P)+](EC编号1.2.1.5)或4-(γ-谷氨酰基氨基)丁醛脱氢酶(EC编号1.2.1.99)。在一个实施方案中，所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是5-(羟甲基糠醛氧化酶(EC编号1.1.3.47)。在一些实施方案中，EC1.1.3.47氧化酶可以源自基因hmfH。在一些实施方案中，hmfH可源自甲基菌属MP688或巴塞尔贪铜菌。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是芳基-醇氧化酶(EC编号1.1.3.7)。在一个实施方案中，过加氧酶被分类为EC编号1.11.2。在一个实施方案中，过加氧酶EC编号1.11.2是非特异性过加氧酶(EC编号1.11.2.1)。
在一个实施方案中，本文公开的方法的实施方案中的任何一个的重组微生物包含编码催化呋喃-2,4-二甲醛转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯和/或2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯的脱氢酶或氧化酶或过加氧酶的至少一种内源或外源核酸分子。在一个实施方案中，所述脱氢酶被分类为EC编号1.2.1。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.2.1选自醛脱氢酶(NAD+)(EC编号1.2.1.3)或醛脱氢酶(NADP+)(EC编号1.2.1.4)或醛脱氢酶[NAD(P)+](EC编号1.2.1.5)或4-(γ-谷氨酰基氨基)丁醛脱氢酶(EC编号1.2.1.99)。在一个实施方案中，所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是5-(羟甲基糠醛氧化酶(EC编号1.1.3.47)。在一些实施方案中，EC 1.1.3.47氧化酶可以源自基因hmfH。在一些实施方案中，hmfH可源自甲基菌属MP688或巴塞尔贪铜菌。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是芳基-醇氧化酶(EC编号1.1.3.7)。在一个实施方案中，过加氧酶被分类为EC编号1.11.2。在一个实施方案中，过加氧酶EC编号1.11.2是非特异性过加氧酶(EC编号1.11.2.1)。
在一个实施方案中，本文公开的方法的实施方案中的任何一个的重组微生物包含编码催化4-(羟甲基)糠酸转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯的脱氢酶或氧化酶或过加氧酶的至少一种内源或外源核酸分子。在一个实施方案中，所述脱氢酶被分类为EC编号1.1.1。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.1.1选自醇脱氢酶(EC编号1.1.1.1)或醇脱氢酶(NADP+)(EC编号1.1.1.2)或D-木糖还原酶(EC编号1.1.1.307)或芳基-醇脱氢酶(EC编号1.1.1.90)或芳基-醇脱氢酶(NADP+)(EC编号1.1.1.91)。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.1.1是。在一个实施方案中，所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是5-(羟甲基糠醛氧化酶(EC编号1.1.3.47)。在一些实施方案中，EC 1.1.3.47氧化酶可以源自基因hmfH。在一些实施方案中，hmfH可源自甲基菌属MP688或巴塞尔贪铜菌。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是芳基-醇氧化酶(EC编号1.1.3.7)。在一个实施方案中，过加氧酶被分类为EC编号1.11.2。在一个实施方案中，过加氧酶EC编号1.11.2是非特异性过加氧酶(EC编号1.11.2.1)。
在一个实施方案中，本文公开的方法的实施方案中的任何一个的重组微生物包含编码催化4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯和/或2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯转化为2,4-FDCA的脱氢酶或氧化酶或过加氧酶的至少一种内源或外源核酸分子。在一个实施方案中，所述脱氢酶被分类为EC编号1.1.1。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.1.1选自醇脱氢酶(EC编号1.1.1.1)或醇脱氢酶(NADP+)(EC编号1.1.1.2)或D-木糖还原酶(EC编号1.1.1.307)或芳基-醇脱氢酶(EC编号1.1.1.90)或芳基-醇脱氢酶(NADP+)(EC编号1.1.1.91)。在一个实施方案中所述脱氢酶可源自表3所列的酶候选物。在一些实施方案中，所述脱氢酶与表3所列的酶同源或相似。在一些实施方案中，脱氢酶经演化或工程改造以提高其针对其预期底物的催化效率。
在一个实施方案中，所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是5-(羟甲基糠醛氧化酶(EC编号1.1.3.47)。在一些实施方案中，HMF氧化酶可以源自基因hmfH。在一些实施方案中，HMF氧化酶可源自甲基菌属MP688或巴塞尔贪铜菌。参见Dijkman和Fraaije(2014.Applied Environmental Microbiology,80.3:1082-1090)以及Koopman等人(2010.PNAS,107(11):4919-4924)。在一个实施方案中，HMF氧化酶EC编号1.1.3是芳基-醇氧化酶(EC编号1.1.3.7)。参见Carro等人(2015)。在一个实施方案中，过加氧酶被分类为EC编号1.11.2。在一个实施方案中，过加氧酶EC编号1.11.2是非特异性过加氧酶(EC编号1.11.2.1)。参见Carro等人(2015)。在一些实施方案中，HMF氧化酶可源自表4所列的酶候选物。在一些实施方案中，HMF氧化酶与表4所列的酶同源或相似。在一些实施方案中，HMF氧化酶经演化或工程改造以提高其催化效率。
2,4-呋喃二甲醇
在一个实施方案中，本公开涉及产生能够从碳源产生2,4-呋喃二甲醇的重组微生物的方法。在图1、图2和图3中呈现了本公开的一些实施方案，其共同详述了碳原料到2,4-呋喃二甲醇的生物合成转化。
在一个实施方案中，2,4-呋喃二甲醇从4-HMF的生物产生受微生物编码的脱氢酶催化。在一个实施方案中，所述脱氢酶被分类为EC编号1.1.1。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.1.1选自醇脱氢酶(EC编号1.1.1.1)。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.1.1选自醇脱氢酶(NADP+)(EC编号1.1.1.2)。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.1.1选自D-木糖还原酶(EC编号1.1.1.90)。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.1.1选自芳基-醇脱氢酶(EC编号1.1.1.91)。在一个实施方案中所述脱氢酶可源自表5所列的酶候选物。在一些实施方案中，所述脱氢酶与表5所列的酶同源或相似。在一些实施方案中，脱氢酶经演化或工程改造以提高其将4-HMF还原为2,4-呋喃二甲醇的催化效率。
在一些方面，在不存在微生物的情况下以酶促方式产生2,4-呋喃二甲醇。在一些方面，在一个或多个容器中以酶促方式产生2,4-呋喃二甲醇。在一些方面，所述一个或多个容器基本上不含微生物。在一些方面，2,4-呋喃二甲醇的酶促产生以与利用重组微生物的方法中所述的相同的逐步方式进行，但基本上不含微生物或不存在微生物。在一些方面，用于酶促产生2,4-呋喃二甲醇的酶分离自微生物(重组的或其他类型的)，并且提供给其相应的底物，用于逐步产生用于产生2,4-呋喃二甲醇的中间产物。在一些方面，所述方法的一个或多个步骤在同一容器中进行。在一些方面，一旦由于本文所述的单独方法步骤产生所需产物，就分离并纯化产物，然后用作产生2,4-呋喃二甲醇的方法的下一步骤中的底物。
呋喃-2,4-二甲醛
在一个实施方案中，本公开涉及产生能够从碳源产生呋喃-2,4-二甲醛的重组微生物的方法。在图1、图2和图3中呈现了本公开的一些实施方案，其共同详述了碳原料到呋喃-2,4-二甲醛的生物合成转化。
在一个实施方案中，图2中的步骤D是利用4-HMF作为底物的单步反应。在一个实施方案中，呋喃-2,4-二甲醛从4-HMF的生物产生由EC编号1.1.1.-、1.1.3.-和1.11.2.-表示的一种或多种酶催化。
在一个实施方案中，本文公开的实施方案中的任何一个的重组微生物包含编码催化4-HMF转化为呋喃-2,4-二甲醛的脱氢酶、氧化酶或过加氧酶的至少一种内源或外源核酸分子。在一个实施方案中，所述脱氢酶被分类为EC编号1.1.1。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.1.1选自醇脱氢酶(EC编号1.1.1.1)或醇脱氢酶(NADP+)(EC编号1.1.1.2)或D-木糖还原酶(EC编号1.1.1.307)或芳基-醇脱氢酶(EC编号1.1.1.90)或芳基-醇脱氢酶(NADP+)(EC编号1.1.1.91)。在一个实施方案中，所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是5-(羟甲基糠醛氧化酶(EC编号1.1.3.47)。在一些实施方案中，EC 1.1.3.47氧化酶可以源自基因hmfH。在一些实施方案中，hmfH可源自甲基菌属MP688或巴塞尔贪铜菌。参见Dijkman和Fraaije(2014)以及Koopman等人(2010)。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是芳基-醇氧化酶(EC编号1.1.3.7)。参见Carro等人(2015)。在一个实施方案中，过加氧酶被分类为EC编号1.11.2。在一个实施方案中，过加氧酶EC编号1.11.2是非特异性过加氧酶(EC编号1.11.2.1)。参见Carro等人(2015)。
在一些方面，在不存在微生物的情况下以酶促方式产生呋喃-2,4-二甲醛。在一些方面，在一个或多个容器中以酶促方式产生呋喃-2,4-二甲醛。在一些方面，所述一个或多个容器基本上不含微生物。在一些方面，呋喃-2,4-二甲醛的酶促产生以与利用重组微生物的方法中所述的相同的逐步方式进行，但基本上不含微生物或不存在微生物。在一些方面，用于酶促产生呋喃-2,4-二甲醛的酶分离自微生物(重组的或其他类型的)，并且提供给其相应的底物，用于逐步产生用于产生呋喃-2,4-二甲醛的中间产物。在一些方面，所述方法的一个或多个步骤在同一容器中进行。在一些方面，一旦由于本文所述的单独方法步骤产生所需产物，就分离并纯化产物，然后用作产生呋喃-2,4-二甲醛的方法的下一步骤中的底物。
4-(羟甲基)糠酸
在一个实施方案中，本公开涉及产生能够从碳源产生4-(羟甲基)糠酸的重组微生物的方法。在图1、图2和图3中呈现了本公开的一些实施方案，其共同详述了碳原料到4-(羟甲基)糠酸的生物合成转化。
在一个实施方案中，图2中的步骤E是利用4-HMF作为底物的单步反应。在一个实施方案中，4-(羟甲基)糠酸从4-HMF的生物产生由EC编号1.1.1.-、1.1.3.-和1.11.2.-表示的一种或多种酶催化。
在一个实施方案中，本文公开的实施方案中的任何一个的重组微生物包含编码催化4-HMF转化为4-(羟甲基)糠酸的脱氢酶或氧化酶或过加氧酶的至少一种内源或外源核酸分子。在一个实施方案中，所述脱氢酶被分类为EC编号1.2.1。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.2.1选自醛脱氢酶(NAD+)(EC编号1.2.1.3)或醛脱氢酶(NADP+)(EC编号1.2.1.4)或醛脱氢酶[NAD(P)+](EC编号1.2.1.5)或4-(γ-谷氨酰基氨基)丁醛脱氢酶(EC编号1.2.1.99)。在一个实施方案中，所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是5-(羟甲基糠醛氧化酶(EC编号1.1.3.47)。在一些实施方案中，EC1.1.3.47氧化酶可以源自基因hmfH。在一些实施方案中，hmfH可源自甲基菌属MP688或巴塞尔贪铜菌。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是芳基-醇氧化酶(EC编号1.1.3.7)。在一个实施方案中，过加氧酶被分类为EC编号1.11.2。在一个实施方案中，过加氧酶EC编号1.11.2是非特异性过加氧酶(EC编号1.11.2.1)。
在一些方面，在不存在微生物的情况下以酶促方式产生4-(羟甲基)糠酸。在一些方面，在一个或多个容器中以酶促方式产生4-(羟甲基)糠酸。在一些方面，所述一个或多个容器基本上不含微生物。在一些方面，4-(羟甲基)糠酸的酶促产生以与利用重组微生物的方法中所述的相同的逐步方式进行，但基本上不含微生物或不存在微生物。在一些方面，用于酶促产生4-(羟甲基)糠酸的酶分离自微生物(重组的或其他类型的)，并且提供给其相应的底物，用于逐步产生用于产生4-(羟甲基)糠酸的中间产物。在一些方面，所述方法的一个或多个步骤在同一容器中进行。在一些方面，一旦由于本文所述的单独方法步骤产生所需产物，就分离并纯化产物，然后用作产生4-(羟甲基)糠酸的方法的下一步骤中的底物。
2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯
在一个实施方案中，本公开涉及产生能够从碳源产生2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯的重组微生物的方法。在图1、图2和图3中呈现了本公开的一些实施方案，其共同详述了碳原料到2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯的生物合成转化。
在一个实施方案中，图2中的步骤F是利用呋喃-2,4-二甲醛作为底物的单步反应。在一个实施方案中，2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯从呋喃-2,4-二甲醛的生物产生由EC编号1.2.1.-、1.1.3.-和1.11.2.-表示的一种或多种酶催化。
在一个实施方案中，本文公开的实施方案中的任何一个的重组微生物包含编码催化呋喃-2,4-二甲醛转化为2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯的脱氢酶或氧化酶或过加氧酶的至少一种内源或外源核酸分子。在一个实施方案中，所述脱氢酶被分类为EC编号1.2.1。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.2.1选自醛脱氢酶(NAD+)(EC编号1.2.1.3)或醛脱氢酶(NADP+)(EC编号1.2.1.4)或醛脱氢酶[NAD(P)+](EC编号1.2.1.5)或4-(γ-谷氨酰基氨基)丁醛脱氢酶(EC编号1.2.1.99)。在一个实施方案中，所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是5-(羟甲基糠醛氧化酶(EC编号1.1.3.47)。在一些实施方案中，EC 1.1.3.47氧化酶可以源自基因hmfH。在一些实施方案中，hmfH可源自甲基菌属MP688或巴塞尔贪铜菌。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是芳基-醇氧化酶(EC编号1.1.3.7)。在一个实施方案中，过加氧酶被分类为EC编号1.11.2。在一个实施方案中，过加氧酶EC编号1.11.2是非特异性过加氧酶(EC编号1.11.2.1)。
在一些方面，在不存在微生物的情况下以酶促方式产生2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯。在一些方面，在一个或多个容器中以酶促方式产生2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯。在一些方面，所述一个或多个容器基本上不含微生物。在一些方面，2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯的酶促产生以与利用重组微生物的方法中所述的相同的逐步方式进行，但基本上不含微生物或不存在微生物。在一些方面，用于酶促产生2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯的酶分离自微生物(重组的或其他类型的)，并且提供给其相应的底物，用于逐步产生用于产生2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯的中间产物。在一些方面，所述方法的一个或多个步骤在同一容器中进行。在一些方面，一旦由于本文所述的单独方法步骤产生所需产物，就分离并纯化产物，然后用作产生2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯的方法的下一步骤中的底物。
4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯
在一个实施方案中，本公开涉及产生能够从碳源产生4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯的重组微生物的方法。在图1、图2和图3中呈现了本公开的一些实施方案，其共同详述了碳原料到4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯的生物合成转化。
在一个实施方案中，图2中的步骤G是利用呋喃-2,4-二甲醛作为底物的单步反应。在一个实施方案中，4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯从呋喃-2,4-二甲醛的生物产生由EC编号1.2.1.-、1.1.3.-和1.11.2.-表示的一种或多种酶催化。
在一个实施方案中，本文公开的实施方案中的任何一个的重组微生物包含编码催化呋喃-2,4-二甲醛转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯的脱氢酶或氧化酶或过加氧酶的至少一种内源或外源核酸分子。在一个实施方案中，所述脱氢酶被分类为EC编号1.2.1。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.2.1选自醛脱氢酶(NAD+)(EC编号1.2.1.3)或醛脱氢酶(NADP+)(EC编号1.2.1.4)或醛脱氢酶[NAD(P)+](EC编号1.2.1.5)或4-(γ-谷氨酰基氨基)丁醛脱氢酶(EC编号1.2.1.99)。在一个实施方案中，所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是5-(羟甲基糠醛氧化酶(EC编号1.1.3.47)。在一些实施方案中，EC 1.1.3.47氧化酶可以源自基因hmfH。在一些实施方案中，hmfH可源自甲基菌属MP688或巴塞尔贪铜菌。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是芳基-醇氧化酶(EC编号1.1.3.7)。在一个实施方案中，过加氧酶被分类为EC编号1.11.2。在一个实施方案中，过加氧酶EC编号1.11.2是非特异性过加氧酶(EC编号1.11.2.1)。
在一个实施方案中，图2中的步骤H是利用4-(羟甲基)糠酸作为底物的单步反应。在一个实施方案中，4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯从4-(羟甲基)糠酸的生物产生由EC编号1.1.1.-、1.1.3.-和1.11.2.-表示的一种或多种酶催化。
在一个实施方案中，本文公开的实施方案中的任何一个的重组微生物包含编码催化4-(羟甲基)糠酸转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯的脱氢酶或氧化酶或过加氧酶的至少一种内源或外源核酸分子。在一个实施方案中，所述脱氢酶被分类为EC编号1.1.1。在一个实施方案中，脱氢酶EC编号1.1.1选自醇脱氢酶(EC编号1.1.1.1)或醇脱氢酶(NADP+)(EC编号1.1.1.2)或D-木糖还原酶(EC编号1.1.1.307)或芳基-醇脱氢酶(EC编号1.1.1.90)或芳基-醇脱氢酶(NADP+)(EC编号1.1.1.91)。在一个实施方案中，所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是5-(羟甲基糠醛氧化酶(EC编号1.1.3.47)。在一些实施方案中，EC 1.1.3.47氧化酶可以源自基因hmfH。在一些实施方案中，hmfH可源自甲基菌属MP688或巴塞尔贪铜菌。参见Dijkman和Fraaije(2014)以及Koopman等人(2010)。在一个实施方案中，氧化酶EC编号1.1.3是芳基-醇氧化酶(EC编号1.1.3.7)。参见Carro等人(2015)。在一个实施方案中，过加氧酶被分类为EC编号1.11.2。在一个实施方案中，过加氧酶EC编号1.11.2是非特异性过加氧酶(EC编号1.11.2.1)。参见Carro等人(2015)。
在一些方面，在不存在微生物的情况下以酶促方式产生4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯。在一些方面，在一个或多个容器中以酶促方式产生4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯。在一些方面，所述一个或多个容器基本上不含微生物。在一些方面，4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯的酶促产生以与利用重组微生物的方法中所述的相同的逐步方式进行，但基本上不含微生物或不存在微生物。在一些方面，用于酶促产生4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯的酶分离自微生物(重组的或其他类型的)，并且提供给其相应的底物，用于逐步产生用于产生4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯的中间产物。在一些方面，所述方法的一个或多个步骤在同一容器中进行。在一些方面，一旦由于本文所述的单独方法步骤产生所需产物，就分离并纯化产物，然后用作产生4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯的方法的下一步骤中的底物。
本公开提供了能够产生高产率的4-HMF、2,4-呋喃二甲醇、呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯和2,4-FDCA中的一种或多种的方法和重组微生物。在一个实施方案中，根据净方程式1，一个葡萄糖分子和两个ATP分子转化为一个2,4-FDCA分子和三个NAD(P)H分子：
方程式1：1葡萄糖+2ATP→1 2,4-FDCA+3NAD(P)H
净反应产生每克葡萄糖约0.87克2,4-FDCA的质量产率。该产率等于每克葡萄糖1.16克2,4-FDCA的热力学最高产率的75％。在一些实施方案中，2,4-FDCA的产率可为每克葡萄糖约0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.16克。
在一个实施方案中，根据净方程式2，一个葡萄糖分子、两个ATP分子和三个氧分子转化为一个2,4-FDCA分子和三个过氧化氢(H2O2)分子：
方程式2：1葡萄糖+2ATP+3O2→1 2,4-FDCA+3H2O2
在一个实施方案中，根据净方程式3，两个甘油分子和两个ATP分子转化为一个2,4-FDCA分子和五个NAD(P)H分子：
方程式3：2甘油+2ATP→1 2,4-FDCA+5NAD(P)H
净反应产生每克甘油约0.85克2,4-FDCA的质量产率。该产率等于每克甘油1.32克2,4-FDCA的热力学最高产率的64％。在一些实施方案中，2,4-FDCA的产率可为每克甘油约0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.32克。
在一个实施方案中，根据净方程式4，两个甘油分子、两个ATP分子和三个氧分子转化为一个2,4-FDCA分子和三个过氧化氢分子：
方程式4：2甘油+2ATP+3O2→1 2,4-FDCA+3H2O2
制备和分离生物合成产物单体和/或聚合物的方法
在一些方面，对本公开的修饰微生物进行了修饰，使得微生物产生4-HMF、2,4-呋喃二甲醇、呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯和2,4-FDCA单体。在一些方面，对本公开的修饰微生物进行了修饰，使得微生物产生源自4-HMF、2,4-呋喃二甲醇、呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯和2,4-FDCA的聚合物。在一些方面，产生生物合成产物单体和/或聚合物的方法包括使本公开的一种或多种微生物在足以产生生物合成产物单体和/或聚合物的条件下生长/发酵，并且分离/收集所得的4-HMF、2,4-呋喃二甲醇、呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯和2,4-FDCA和/或其聚合物。在一些方面，生物合成单体将在体内聚合成聚合物。在一些方面，生物合成单体和聚合物的产生与微生物发酵过程中利用的细菌数目成比例。在一些方面，细菌在反应室中生长。一旦获得所需数目的细菌，就使废弃培养基经受用于分离生物合成产物单体和/或聚合物的过程。在一些方面，将微生物裂解并且使细胞碎片在离心机中从溶液中沉淀出。在一些方面，借助于溶剂提取过程或梯度超离心过程从细胞沉淀级分或液体级分中收集生物合成产物单体和/或聚合物。在一些方面，生物合成产物聚合物可以通过过滤来分离。
在一些方面，通过在含有提供碳源的原料的培养基中培育重组微生物直到产生单体，产生生物合成产物单体。在一些方面，原料包含一种或多种己糖、一种或多种戊糖或其组合。在一些方面，从培养基中提取单体，并且在催化剂的存在下聚合。本公开提供了一种从通过本公开的重组微生物和方法产生的生物合成产物产生聚合物的方法。在一个实施方案中，所述一种或多种生物合成产物与二醇催化聚合以形成聚合物。
在一些方面，生物合成产物单体在选自以下的催化剂的存在下受到催化：钛基催化剂、锗基催化剂、镁基催化剂、硅基催化剂、铝基催化剂或锑基催化剂。在一些方面，催化剂选自：醋酸锑、三氧化锑、二氧化锗、钛酸四异丙酯和钛酸四正丁酯。
在一些方面，生物合成产物来源的聚合物通过pha合酶在体内聚合。在一些方面，生物合成产物来源的单体通过pha合酶离体聚合。
在一些方面，从培养基中提取生物合成产物4-HMF，并且在催化剂的存在下，使其转化为如现有技术中报道的其他生物合成产物中的一种或多种。参见Van Putten等人(2013.Hydroxymethylfurfural,a Versatile Platform Chemical Made from RenewableResources.Chemical Reviews,113.3:1499-1597)。
在一些方面，从培养基中提取生物合成产物4-HMF，并且在催化剂的存在下使其转化为2,4-二甲基呋喃。参见Deng等人(2013.Linked Strategy for the Production ofFuels via Formose Reaction.Scientific Reports,3:1244)。
在一些方面，将通过本文所述的方法和组合物产生的生物合成产物中的任何一种或多种从它们在其中生物合成的培养基中提取出来，并且使其在化学或生物催化剂的存在下转化。
在一些方面，生物合成产物在化学或生物催化剂存在下的转化是在不存在微生物的情况下进行的。在一些方面，生物合成产物在生物催化剂存在下的转化是在不存在微生物而存在从一种或多种微生物中分离并纯化的一种或多种酶的情况下进行的。
在一些方面，所述一种或多种化学催化剂是已知用于2,4-呋喃二甲醇、呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯和/或2,4-FDCA的非生物合成中的化学物质中的任何一种或多种。
在一些方面，所述一种或多种生物催化剂是图2中反应步骤C、D、E、F、G、H、I或J描述的酶中的一种或多种。
在一些方面，生物合成的4-HMF向2,4-呋喃二甲醇的转化在基本上不含微生物的组合物中以及在本文所述的化学或生物催化剂，诸如EC 1.1.1.-的生物催化剂的存在下发生。
在一些方面，生物合成的4-HMF向呋喃-2,4-二甲醛的转化在基本上不含微生物的组合物中以及在本文所述的化学或生物催化剂，诸如EC 1.1.1.-、EC 1.1.3.-和/或EC1.11.2.-的生物催化剂的存在下发生。
在一些方面，生物合成的4-HMF向4-(羟甲基)糠酸的转化在基本上不含微生物的组合物中以及在本文所述的化学或生物催化剂，诸如EC 1.1.1.-、EC 1.1.3.-和/或EC1.11.2.-的生物催化剂的存在下发生。
在一些方面，生物合成的2,4-呋喃二甲醇向2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯的转化在基本上不含微生物的组合物中以及在本文所述的化学或生物催化剂，诸如EC 1.2.1.-、EC1.1.3.-和/或EC 1.11.2.-的生物催化剂的存在下发生。
在一些方面，生物合成的呋喃-2,4-二甲醛向2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯的转化在基本上不含微生物的组合物中以及在本文所述的化学或生物催化剂，诸如EC 1.2.1.-、EC1.1.3.-和/或EC 1.11.2.-的生物催化剂的存在下发生。
在一些方面，生物合成的呋喃-2,4-二甲醛向4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯的转化在基本上不含微生物的组合物中以及在本文所述的化学或生物催化剂，诸如EC 1.2.1.-、EC1.1.3.-和/或EC 1.11.2.-的生物催化剂的存在下发生。
在一些方面，生物合成的4-(羟甲基)糠酸向4-甲酰基呋喃-3-甲酸酯的转化在基本上不含微生物的组合物中以及在本文所述的化学或生物催化剂，诸如EC 1.2.1.-、EC1.1.3.-和/或EC 1.11.2.-的生物催化剂的存在下发生。
在一些方面，生物合成的2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯向2,4-FDCA的转化在基本上不含微生物的组合物中以及在本文所述的化学或生物催化剂，诸如EC 1.2.1.-、EC 1.1.3.-和/或EC 1.11.2.-的生物催化剂的存在下发生。
在一些方面，生物合成的4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯向2,4-FDCA的转化在基本上不含微生物的组合物中以及在本文所述的化学或生物催化剂，诸如EC 1.2.1.-、EC 1.1.3.-和/或EC 1.11.2.-的生物催化剂的存在下发生。
在一些方面，上述转化中的任何一个或多个可以与另一转化组合，使得第一转化的产物是第二转化的产物的底物。
在一些方面，上述转化中的任何一个或多个可以与另一转化组合，使得第一转化的产物是第二转化的产物的底物，第二转化的产物是第三转化的产物的底物。
用于产生生物合成产物的生物学方法
本公开提供了一种用于产生本文所述的生物合成产物中的一种或多种的生物方法：4-HMF、2,4-呋喃二甲醇、呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯和2,4-FDCA。在一些实施方案中，所述方法包括：向至少一个生物反应器提供一种或多种重组微生物和包含外源碳源的原料，所述重组微生物经工程改造为表达参与来自一个或多个生物合成途径的甘油醛3-磷酸(G3P)以及来自G3P的一种或多种生物合成产物的生物合成的一种或多种酶；在一个或多个阶段在包含所述原料的培养基中培育所述一种或多种重组微生物；使所得培养物在一个或多个阶段在需氧、微需氧和/或厌氧条件下发酵；并且在发酵步骤之后从生物反应器中回收所述一种或多种生物合成产物。
在生物学方法的一些实施方案中，在培养基或原料耗竭之前连续回收所述一种或多种生物合成产物。在一些实施方案中，在培养基或原料耗竭之前分批回收生物合成产物。在一些实施方案中，所述一种或多种重组微生物源自选自由以下组成的组的亲本微生物：梭菌属、永达尔梭菌、产乙醇梭菌、拉氏梭菌、粘液真杆菌、嗜甲基丁酸杆菌、热醋穆尔氏菌、谷氨酸棒杆菌、醋酸梭菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜喊菌、德雷克氏梭菌、食一氧化碳梭菌、甲酸乙酸梭菌、粪味梭菌、热自养穆尔氏菌、长醋丝菌、黏液真杆菌、乙二醇梭菌、大梭菌、克氏梭菌、马永贝梭菌、食甲氧基苯甲酸梭菌、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、普氏产醋杆菌、凯伍嗜热厌氧菌、卵形鼠孢菌、嗜热醋杆菌、甲醇醋酸杆菌、东方伊萨酵母、白蚁鼠孢菌、甘油穆尔氏菌、聚集性真杆菌、固氮密螺旋体、库德毕赤酵母、大肠杆菌、酿酒酵母、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、解脂耶氏酵母、树干毕赤酵母和甘油利用泰瑞孢子菌。
在生物学方法的一些实施方案中，原料包含C6碳水化合物和/或C5碳水化合物。在一些实施方案中，原料包含单糖、二糖、寡糖、多糖或其组合。
在生物学方法的一些实施方案中，培育和发酵步骤在同一阶段发生。在一些实施方案中，培育和发酵步骤在单独的阶段发生。在一些实施方案中，培育和发酵步骤在单独的生物反应器中发生。在一些实施方案中，培育和发酵步骤在同一生物反应器中发生。在一些实施方案中，生物反应器在需氧、微需氧或厌氧条件下操作；或在其组合条件下操作。
在一些实施方案中，所述一个或多个阶段以分批、补料分批或连续模式补料的形式接收培养物和/或培养基。在一些实施方案中，培育阶段以分批、补料分批或连续模式补料的形式接收培养物和/或培养基，并且任何后续阶段以分批、补料分批或连续模式补料的形式操作。
在一些实施方案中，培养基包含由C5碳水化合物、C6碳水化合物和/或二糖提供的碳(C)。在一些实施方案中，培养基包含必需营养素，包括氮(N)、磷(P)、镁(Mg)和铁(Fe)。
在一些实施方案中，其中培育步骤中C:N的比率为至少10:1。在一些实施方案中，其中培育步骤中C:P的比率为至少5:1。在一些实施方案中，培育步骤中C:Mg的比率为至少50:1。在一些实施方案中，培育步骤中C:Fe的比率为至少300:1。
在一些实施方案中，培育步骤操作5至100小时，以培育所述一种或多种重组微生物的细胞。在一些实施方案中，发酵步骤中的培养物包含约1％至约30％的细胞团块，其是从培育步骤中具有一种或多种底物的培养基中转移的。在一些实施方案中，提供至发酵步骤的原料的总量在约100kg/m3至约800kg/m3的范围内。
在一些实施方案中，发酵步骤中C:N的比率为至少50:1。在一些实施方案中，发酵步骤中C:P的比率为至少20:1。在一些实施方案中，发酵步骤中C:Mg的比率为至少200:1。在一些实施方案中，发酵步骤中C:Fe的比率为至少800:1。在一些实施方案中，发酵步骤对于补料分批操作操作10至300小时，而对于连续操作操作长达300小时。
实施例
实施例1：磷酸甲酯合酶的表达和纯化
在酶测定中使用的酶的表达和纯化在以下条件下进行：由GenScript合成编码27(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶候选物(表1)的基因，并将其克隆在表达载体pET28a中的NdeI和BamHI限制性位点中。将表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并且将转化株储存在15％甘油中直至用于酶表达。
将储存的转化株接种到37℃的含有卡那霉素(kanamycin)的50mL TB肉汤中，搅拌16小时以制备种子培养物。将种子培养物添加到300mL含有卡那霉素的TB肉汤中，其初始OD(600nm)为0.2，然后将培养物在37℃下搅拌孵育，直到OD(600nm)达到0.6-0.8，此时在18℃下边搅拌边添加1mM IPTG以诱导过夜表达。
在过夜表达之后，将细胞以6000x rpm离心30分钟，并且在超声破坏之前将沉淀细胞悬浮于冷的裂解缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液和500mM NaCl pH 7.4)中。将细胞裂解物在4℃下以8000rpm再次离心30分钟，并且过滤，之后用亲和色谱法纯化。所利用的柱是用于his标记的蛋白质纯化的HisTrap FF Crude(GE Healthcare)。纯化的蛋白质在柱中结合并用结合缓冲液A(20mM磷酸盐缓冲液、20mM咪唑、500mM NaCl、1mM PMSF和β-巯基乙醇，pH 7.4)洗涤，并且在一定梯度的洗脱缓冲液B(20mM磷酸盐缓冲液、500mM咪唑、500mM NaCl、1mMPMSF和β-巯基乙醇，pH 7.4)中洗脱。然后使用PD-10柱将缓冲液更换为50mM Tris-HCl pH7.4。如图4所示，在12％聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳分析候选物的表达和纯化。
实施例2：从G3P产生(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯
通过在体外用在20mM Tris-HCl、200mM NaCl(pH 7.4)缓冲液中含有5mM甘油醛-3-磷酸(Sigma)的1mL溶液孵育大约450μg纯化候选物，证明用表1中描述的酶候选物从甘油醛-3-磷酸酯(G3P)产生(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯。将反应物在37℃下孵育2小时。将无合酶或底物(G3P)的反应容器用作阴性对照。使用分光光度计(SpectraMax M5,Molecular Devices)通过UV-Vis，与5甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯摩尔吸光系数(ε)280nm相应地，监测反应。还通过HPLC分析确认产物形成。
(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯产生的色谱定量分析在配备有Aminex HPX-87HBiorad柱(300x 7.8mm)的HPLC-DAD(Thermo Ultimate 3000)中进行。将柱维持在50℃下，并且所使用的流动相是流速为0.75mL/分钟的5mM H2SO4溶液(等度梯度模式)。
如表6、图5和图6所示，G3P被磷酸甲酯合酶成功地转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯。在图5中，阴性对照样品(灰色线)在280处显示出低吸光度，表明与含有甲基磷酸酯合酶(黑色线)的反应相比，(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯的存在很少或不存在，表明合酶催化从G3P形成(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯；这些结果汇总在表6中。图6示出了在含有合酶(下图)的反应中而不是在阴性对照反应(上图)中有可检测的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯。表7包含用于阳性检测从G3P产生(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯的磷酸甲酯合酶候选物的列表。
表6.在280nm处获得的磷酸甲酯合酶从G3P产生的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯的吸光度。
280nm处的吸光度
磷酸甲酯合酶阳性反应(MfnB1候选物) 2.97
阴性对照 0.26
表7.阳性检测催化从G3P产生(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶候选物。
Figure BDA0003325727080000751
Figure BDA0003325727080000761
实施例3：从(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯产生4-羟甲基糠醛(4-HMF)
使用市售磷酸酶、大肠杆菌裂解物和酵母裂解物来证明其从(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯产生2,4-HMF的能力，从而证明使用磷酸酶从(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯产生4-HMF。底物(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯通过(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶产生，如实施例2所述。
(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯和4-HMF产生的色谱定量分析在配备有AminexHPX-87H Biorad柱(300x 7.8mm)的HPLC-DAD(Thermo Ultimate 3000)中进行。将柱维持在50℃下，并且所使用的流动相是流速为0.75mL/分钟的5mM H2SO4溶液(等度梯度模式)。在280nm处检测到两种化合物。
为了进行证明使用市售磷酸酶从(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯产生4-HMF的反应，将来自牛肠粘膜的2μL碱性磷酸酶(Sigma)添加到来自实施例2的1mL反应容器中，该反应容器含有大约1-2mM的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯。将反应在37℃下孵育1小时，并且通过HPLC-DAD分析初始样品和最终样品。如图7(上图)和表8所示，市售磷酸酶能够进行(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯向4-HMF的完全转化。
表8.使用磷酸甲酯合酶产生的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯的峰面积。
面积(mAU*分钟)
磷酸甲酯合酶阳性反应 62,1544
阴性对照 0
为了进行证明在大肠杆菌裂解物中使用磷酸酶从(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯产生4-HMF的反应，将大肠杆菌MG1655菌株在37℃下接种到200mL LB肉汤中，搅拌过夜。将培养物以4000rpm离心15分钟，并且将沉淀悬浮于20mL的20mM HEPES缓冲液pH 7.4中，产生70的OD。通过超声破坏进行裂解。将1mL大肠杆菌裂解物与来自实例2的1mL反应混合，并且在37℃下搅拌孵育过夜。在280nm处通过HPLC-DAD分析样品中4-HMF的产生。
为了进行证明在酵母裂解物中使用磷酸酶从(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯产生4-HMF的反应，将酿酒酵母菌株在30℃下接种到200mL YPD肉汤中，搅拌过夜。将培养物以4000rpm离心15分钟，并且将沉淀悬浮于20mL的20mM HEPES缓冲液pH 7.4中，产生120的OD。通过超声破坏进行细胞裂解。将1mL酵母裂解物与来自实例2的1mL反应混合，并且在30℃下搅拌孵育过夜。在280nm处通过HPLC-DAD分析样品中4-HMF的产生。
如图7(中图)和图7(下图)及表9所示，大肠杆菌和酵母裂解物两者均显示出能够进行(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯向4-HMF的转化的内源磷酸酶活性。
表9.用市售磷酸酶在1小时孵育后以及用大肠杆菌l和酵母裂解物分别在37℃和30℃下孵育过夜后从(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯产生4-HMF。
Figure BDA0003325727080000771
Figure BDA0003325727080000781
实施例4：4-HMF氧化酶的表达
由GenScript合成编码7 4-HMF氧化酶候选物(表4)的基因，并将其克隆在表达载体pET28a中的NdeI和BamHI限制性位点中。将表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并且将转化株储存在15％甘油中直至用于酶表达。
将储存的转化株接种到37℃的含有卡那霉素(kanamycin)的50mL TB肉汤中，搅拌16小时以制备种子培养物。将种子培养物添加到300mL含有卡那霉素的TB肉汤中，其初始OD(600nm)为0.2，然后将培养物在37℃下搅拌孵育，直到OD(600nm)达到0.6-0.8，此时在18℃下边搅拌边添加1mM IPTG以诱导过夜表达。
在过夜表达之后，将细胞以6000x rpm离心30分钟，在超声破坏之前将细胞沉淀悬浮于冷的裂解缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液和500mM NaCl pH 7.4)中。将细胞裂解物在4℃下以8000x rpm再次离心30分钟，并且过滤，之后用亲和色谱法纯化。所利用的柱是用于his标记的蛋白质纯化的HisTrap FF Crude(GE Healthcare)。纯化的蛋白质在柱中结合并用结合缓冲液A(20mM磷酸盐缓冲液、20mM咪唑、500mM NaCl、1mM PMSF和β-巯基乙醇，pH 7.4)洗涤，并且在一定梯度的洗脱缓冲液B(20mM磷酸盐缓冲液、500mM咪唑、500mM NaCl、1mM PMSF和β-巯基乙醇，pH 7.4)中洗脱。然后，使用PD-10柱将缓冲液更换为50mM Tris-HCl pH7.4。如图8所示，在12％聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳分析候选物的表达和纯化。
实施例5：通过HmfH氧化酶从2,4-HMF产生2,4-FDCA
在体外通过用来自实施例3的1mL反应容器(使用市售磷酸酶)孵育大约100μg的纯化HmfH氧化酶候选物，证明用表4中描述的酶候选物从2,4-HMF产生2,4-FDCA，所述反应容器含有大约1mM 4-HMF。将反应在30℃下孵育16小时，并且通过HPLC-DAD分析初始样品和最终样品两者。将样品进样在HPLC-DAD中，并且通过GC-MS确认产生的2,4-FDCA及其中间产物。
2,4-FDCA的定量分析使用配备有Aminex HPX-87H Biorad柱(300x 7.8mm)的HPLC-DAD(Thermo Ultimate 3000)进行。将柱维持在50℃下。所使用的流动相是流速为0.6mL/分钟的5mM H2SO4溶液(等度梯度模式)。在245nm处检测分子。
对于GC-MS鉴定，通过添加6M HCl将pH降低至2-3来终止初始样品和最终样品。产物是使用乙酸乙酯提取的液体/液体，并且用Na2SO4干燥以去除水渍。然后将提取的材料在真空浓缩仪(speedvac)中蒸发，并使用双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺在60℃下衍生化2小时。将样品进样在具有HP-5MS柱(Agilent，30m x 0.25mm ID，0.25um膜厚度)与四极质量检测器(ISQ,Thermo)偶联的气体色谱仪中。烘箱程序在110℃下开始进行2分钟，升温速度为20℃/分钟，直至300℃，保持3分钟。以1.2mL/分钟的流速使用氦气作为载气。通过将它们的质谱与文献中的质谱进行比较来鉴定2,4-FDCA。(参考文献：Carro,Juan等人"5-hydroxymethylfurfural conversion by fungal aryl-alcohol oxidase andunspecific peroxygenase.”The FEBS journal 282.16(2015):3218-3229。)还通过其质谱鉴定了4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯(2,4-FFCA)和呋喃-2,4-二甲醛(2,4-DFF)。
如表10和图9、图10和图11所示，用4-HMF氧化酶，特别是能够将2,4-HMF完全转化为2,4-FDCA的酶HmfH7成功地证明了4-HMF向2,4-FDCA的转化。
图9(上图)示出了HmfH1的色谱图，图9(中图)示出了HmfH6的色谱图，并且图9(下图)示出了HmfH7的色谱图。图10(上图)示出了在GC-MS中获得的产物的相对丰度和甲烷硅基化的2,4-FDCA的质谱(下图)(图11)。
表10.用4-HMF氧化酶候选物在孵育16小时后从4-HMF产生2,4FDCA。还鉴定并定量了反应中间产物4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯(2,4-FFCA)和呋喃-2,4-二甲醛(2,4-DFF)a。
Figure BDA0003325727080000791
a阴性对照反应在类似的测定条件下进行，但不存在HMF-氧化酶。
实施例6：从4-HMF产生2,4-呋喃二甲醇-反应C
如实施例1所述产生纯化酶。
在体外通过将大约20μg的纯化酶候选物在100mM磷酸钾缓冲液(pH 7)中与0.5mMNAD(P)H或NADH一起孵育，证明用表5中所述的酶候选物从4-HMF产生2,4-呋喃二甲醇。通过添加如实施例3中所示获得的0.5mM 4-HMF开始反应。在37℃下在UV-Vis分光光度计(SpectraMax M5,Molecular Devices)上，于40分钟内在340nm下监测NAD(P)H的降低。还通过HPLC和GC-MS分析确认产物形成(数据未示出)。将无酶或底物(4-HMF)的反应容器用作阴性对照。
如图12中所展示，通过将NAD(P)H氧化为NAD(P)+来测量酶候选物DH1、DH2和DH6促进2,4-HMF还原为2,4-呋喃二甲醇。
实施例7：从4-HMF产生呋喃-2,4-二甲醛-反应D
如实施例1所述产生纯化酶。在体外通过将大约20μg的纯化酶候选物在100mM磷酸钾缓冲液(pH 7)中与0.5mM NAD(P)+或NAD+一起孵育，证明用表3所述的酶候选物从4-HMF产生呋喃-2,4-二甲醛。通过添加如实施例3中所示获得的0.5mM 4-HMF开始反应。在37℃下在UV-Vis分光光度计(SpectraMax M5,Molecular Devices)上，于40分钟内在340nm下监测NAD(P)H的增加。还通过HPLC和GC-MS分析确认产物形成(数据未示出)。将无酶或底物(4-HMF)的反应容器用作阴性对照。
如关于酶DH2所证明的，所选的脱氢酶能够在体外将4-HMF氧化为呋喃-2,4-二甲醛。图13中所示的数据是在减去基线信号后绘制的并突出显示吸光度增加，以及因此突出显示当使用酶DH2时NAD(P)H还原并且2,4-HMF氧化为呋喃-2,4-二甲醛。
实施例8：从2,4-HMF产生4-(羟甲基)糠酸-反应E
如实施例1所述产生纯化的醛脱氢酶。在体外通过将大约20μg的纯化酶候选物在100mM磷酸钾缓冲液(pH 7)中与0.5mM NAD(P)+或NAD+一起孵育，证明用表3所述的醛脱氢酶候选物从4-HMF产生4-(羟甲基)糠酸。通过添加如实施例3中所示获得的0.5mM 4-HMF开始反应。在37℃下在UV-Vis分光光度计(SpectraMax M5,Molecular Devices)上，于40分钟内在340nm下监测NAD(P)H的增加。还通过HPLC和GC-MS分析确认产物形成(数据未示出)。将无酶或底物(4-HMF)的反应容器用作阴性对照。
如对于酶DH8、DH9、DH10和DH11代表性地证明的，所选的醛脱氢酶能够在体外将4-HMF氧化为4-(羟甲基)糠酸(图14)。图14中所示的数据是在减去基线信号后绘制的并突出显示吸光度增加，以及因此突出显示当使用相应的醛脱氢酶时NAD(P)H还原并且2,4-HMF氧化为4-(羟甲基)糠酸。
实施例9：从4-HMF产生2,4-FDCA的一锅反应
如实施例1所述产生纯化的醛脱氢酶和醇脱氢酶。使用DH8作为代表性醛脱氢酶和DH6作为代表性醇脱氢酶，进行从4-HMF产生2,4-FDCA的一锅氧化反应。
为了进行反应，向来自实施例3的2mL含有0.5mM的2,4-HMF和1mM的NAD(P)H的反应混合物添加20uM的纯化酶候选物DH8和DH6。阳性对照反应如表11所示制备。制备两个阴性对照，一个不含酶，另一个不含底物。将反应在30℃下孵育16小时，并且通过HPLC-DAD分析初始样品和最终样品两者。在HPLC-DAD中进样样品，并且使用以下方法在GC-MS中确认2,4-FDCA的产生。
2,4-FDCA的定量分析使用配备有Aminex HPX-87H Biorad柱(300x 7.8mm)的HPLC-DAD(Thermo Ultimate 3000)进行。将柱维持在50℃下。所使用的流动相是流速为0.6mL/分钟的5mM H2SO4溶液(等度梯度模式)。在245nm处检测分子。
对于GC-MS鉴定，通过添加6M HCl将pH降低至2-3来终止初始样品和最终样品。产物是使用乙酸乙酯提取的液体/液体，并且用Na2SO4干燥以去除水渍。然后将提取的材料在真空浓缩仪(speedvac)中蒸发，并使用双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺在60℃下衍生化2小时。将样品进样在具有HP-5MS柱(Agilent，30m x 0.25mm ID，0.25um膜厚度)与四极质量检测器(ISQ,Thermo)偶联的气体色谱仪中。烘箱程序在110℃下开始进行2分钟，升温速度为20℃/分钟，直至300℃，保持3分钟。以1.2mL/分钟的流速使用氦气作为载气。通过将它们的质谱与文献中的质谱进行比较来鉴定2,4-FDCA。(参考文献：Carro,Juan等人"5-hydroxymethylfurfural conversion by fungal aryl-alcohol oxidase andunspecific peroxygenase.”The FEBS journal 282.16(2015):3218-3229。)还通过其质谱鉴定了4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯(2,4-FFCA)和呋喃-2,4-二甲醛(2,4-DFF)。
如表11和图15(中图)所示，用醛脱氢酶(DH8)和醇脱氢酶(DH6)的协同作用/组合成功地证明4-HMF转化为2,4-FDCA。
表11.用醛脱氢酶(DH8)和醇脱氢酶(DH6)的协同作用/组合在孵育16小时后从4-HMF产生2,4FDCA(2,4FDCA峰面积)。
Figure BDA0003325727080000811
实施例10.在体内从葡萄糖产生2,4-FDCA
在pET28a骨架中构建含有处于OXB20启动子的控制下的MfnB 1基因(表1)的质粒。在pZS*13骨架中构建含有处于OXB20启动子的控制下的两个4-HMF氧化酶基因(HmfH6和HmfH7(表4))的第二质粒。使用融合商用试剂盒构建质粒，并且通过测序来确认。使用大肠杆菌K12菌株MG1655(F-,λ-,rph-1,ilvG-,rfb-50,ΔgapA::gapN(UniProtKB-Q59931),ΔglcDEFGB,ΔaraFGH,ΔxylFGH,ΔfucO作为生产宿主。
在摇瓶发酵中一式三份，使用由2.2g.L-1KH2PO4、9.4g.L-1K2HPO4、1.3g.L-1(NH4)2SO4、10mg.L-1硫胺、320mg.L-1EDTA-NaOH、2mg.L-1CoCl2.6H2O、10mg.L-1MnSO4.H2O、5mg.L- 1CuSO4.5H2O、2mg.L-1H3BO3、2mg.L-1Na2MoO4.2H2O、54mg.L-1ZnSO4.7H2O、1mg.L-1NiSO4.6H2O、100mg.L-1柠檬酸铁(III)、100mg.L-1CaCl2.2H2O、0.3g.L-1MgSO4.H2O组成的限定培养基，评价2,4-FDCA从葡萄糖的体内产生。由10g/L葡萄糖提供碳源并且将硫酸氮用作氮源。锥形烧瓶接种重组菌株达到0.1的初始OD，并且在37℃、225rpm下孵育48小时。通过HPLC对48小时上清液的分析表明产生14±2mg/L 2,4-FDCA(图16)。
序列表
<110> 布拉斯科公司
<120> 用于4-羟甲基糠醛及其衍生物的体内合成的方法
<130> BRSK-019/01WO (331051-2071)
<150> 62/812,904
<151> 2019-03-01
<160> 92
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 235
<212> PRT
<213> 詹氏甲烷球菌（Methanocaldococcus jannaschii）MfnB 1
<400> 1
Met Ile Leu Leu Val Ser Pro Ile Asp Val Glu Glu Ala Lys Glu Ala
1 5 10 15
Ile Ala Gly Gly Ala Asp Ile Ile Asp Val Lys Asn Pro Lys Glu Gly
20 25 30
Ser Leu Gly Ala Asn Phe Pro Trp Met Ile Lys Ala Ile Arg Glu Val
35 40 45
Thr Pro Lys Asp Leu Leu Val Ser Ala Thr Val Gly Asp Val Pro Tyr
50 55 60
Lys Pro Gly Thr Ile Ser Leu Ala Ala Val Gly Ala Ala Ile Ser Gly
65 70 75 80
Ala Asp Tyr Ile Lys Val Gly Leu Tyr Gly Val Lys Asn Tyr Tyr Gln
85 90 95
Ala Val Glu Leu Met Lys Asn Val Val Arg Ala Val Lys Asp Ile Asp
100 105 110
Glu Asn Lys Ile Val Val Ala Ala Gly Tyr Ala Asp Ala Tyr Arg Val
115 120 125
Gly Ala Val Glu Pro Leu Ile Val Pro Lys Ile Ala Arg Asp Ala Gly
130 135 140
Cys Asp Val Ala Met Leu Asp Thr Ala Ile Lys Asp Gly Lys Thr Leu
145 150 155 160
Phe Asp Phe Gln Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Phe Val Asp Glu Ala
165 170 175
His Ser Tyr Gly Leu Lys Cys Ala Leu Ala Gly Ser Ile Lys Lys Glu
180 185 190
His Ile Pro Ile Leu Lys Glu Ile Gly Thr Asp Ile Val Gly Val Arg
195 200 205
Gly Ala Ala Cys Lys Gly Gly Asp Arg Asn Asn Gly Arg Ile Asp Arg
210 215 220
Glu Leu Val Lys Glu Leu Lys Glu Leu Cys Lys
225 230 235
<210> 2
<211> 235
<212> PRT
<213> 沸泉甲烷热球菌（Methanocaldococcus fervens）MfnB 2
<400> 2
Met Ile Leu Leu Val Ser Pro Ile Asp Val Glu Glu Ala Lys Glu Ala
1 5 10 15
Ile Ala Gly Gly Ala Asp Ile Ile Asp Val Lys Asn Pro Lys Glu Gly
20 25 30
Ser Leu Gly Ala Asn Phe Pro Trp Met Ile Lys Ala Ile Arg Glu Val
35 40 45
Thr Pro Lys Glu Leu Leu Val Ser Ala Thr Val Gly Asp Val Pro Phe
50 55 60
Lys Pro Gly Thr Ile Ser Leu Ala Ala Val Gly Ala Ala Ile Ser Gly
65 70 75 80
Ala Asp Tyr Ile Lys Val Gly Leu Tyr Gly Val Lys Asn Tyr Tyr Glu
85 90 95
Gly Val Glu Leu Met Lys Asn Val Val Arg Ala Val Lys Asp Ile Asp
100 105 110
Glu Asn Lys Ile Val Val Ala Ala Gly Tyr Ala Asp Ala His Arg Val
115 120 125
Gly Ala Val Glu Pro Leu Ile Ile Pro Lys Ile Ala Arg Asp Ala Gly
130 135 140
Cys Asp Val Ala Met Leu Asp Thr Ala Val Lys Asp Gly Lys Thr Leu
145 150 155 160
Phe Asp Phe Gln Ser Lys Glu Ile Leu Glu Glu Phe Val Gln Glu Ser
165 170 175
His Asp Tyr Gly Leu Lys Cys Ala Leu Ala Gly Ser Ile Lys Lys Glu
180 185 190
His Ile Pro Ile Leu Lys Glu Ile Gly Thr Asp Ile Val Gly Val Arg
195 200 205
Gly Ala Val Cys Lys Gly Gly Asp Arg Asn Asn Gly Arg Ile Asp Arg
210 215 220
Glu Leu Val Arg Glu Leu Lys Glu Leu Cys Lys
225 230 235
<210> 3
<211> 234
<212> PRT
<213> 火神甲烷热球菌（Methanocaldococcus vulcanius）MfnB 3
<400> 3
Met Ile Leu Leu Val Ser Pro Ile Asp Val Asp Glu Ala Arg Glu Ala
1 5 10 15
Ile Ala Gly Gly Ala Asp Ile Ile Asp Val Lys Asn Pro Lys Glu Gly
20 25 30
Ser Leu Gly Ala Asn Phe Pro Trp Met Ile Lys Ala Ile Arg Glu Ile
35 40 45
Thr Pro Lys Glu Leu Leu Val Ser Ala Thr Val Gly Asp Val Pro Tyr
50 55 60
Lys Pro Gly Thr Val Ser Leu Ala Ser Val Gly Ala Ala Met Ser Gly
65 70 75 80
Ala Asp Tyr Ile Lys Val Gly Leu Tyr Gly Val Lys Asn Tyr Tyr Glu
85 90 95
Ala Val Glu Leu Met Lys Asn Val Val Arg Ala Val Lys Asp Val Asp
100 105 110
Glu Asn Lys Ile Val Val Ala Ala Gly Tyr Ala Asp Ala His Arg Val
115 120 125
Gly Ala Val Asp Pro Leu Ile Ile Pro Lys Ile Ala Arg Asp Ala Asp
130 135 140
Cys Asp Val Ala Met Leu Asp Thr Ala Ile Lys Asp Gly Lys Thr Leu
145 150 155 160
Phe Asp Phe Gln Ser Lys Glu Ile Leu Glu Glu Phe Val Glu Glu Thr
165 170 175
His Ser Tyr Gly Leu Lys Cys Ala Leu Ala Gly Ser Ile Lys Lys Glu
180 185 190
His Ile Pro Ile Leu Lys Glu Ile Gly Thr Asp Ile Val Gly Val Arg
195 200 205
Gly Ala Val Cys Lys Gly Gly Asp Arg Asn Lys Gly Arg Ile Asp Arg
210 215 220
Asn Leu Val Lys Glu Leu Lys Glu Leu Val
225 230
<210> 4
<211> 234
<212> PRT
<213> 热液口甲烷热球菌（Methanocaldococcus infernus）MfnB 3
<400> 4
Met Leu Leu Leu Val Ser Pro Ile Asp Val Glu Glu Ala Lys Glu Ala
1 5 10 15
Ile Glu Gly Gly Ala Asp Ile Ile Asp Val Lys Asn Pro Lys Glu Gly
20 25 30
Ser Leu Gly Ala Asn Phe Pro Trp Val Ile Arg Glu Val Arg Lys Ile
35 40 45
Thr Pro Lys Ser Leu Leu Val Ser Ala Thr Val Gly Asp Val Pro Tyr
50 55 60
Lys Pro Gly Thr Val Ser Leu Ala Ala Leu Gly Ala Gly Met Ser Gly
65 70 75 80
Ala Asp Tyr Ile Lys Val Gly Leu Tyr Gly Val Lys Asn Tyr Asn Gln
85 90 95
Ala Val Glu Leu Met Lys Ser Val Val Lys Ala Val Lys Asp Phe Asp
100 105 110
Asp Asn Lys Ile Val Val Ala Ala Gly Tyr Ala Asp Ala Tyr Arg Val
115 120 125
Gly Ala Val Asp Pro Leu Val Ile Pro Lys Ile Ala Arg Asp Ser Gly
130 135 140
Ala Asp Val Ala Met Leu Asp Thr Ala Ile Lys Asp Gly Lys Thr Leu
145 150 155 160
Phe Asp Phe Leu Ser Lys Glu Ile Leu Glu Glu Phe Val Ser Glu Val
165 170 175
His Asp Tyr Gly Leu Lys Cys Ala Leu Ala Gly Thr Ile Lys Lys Asp
180 185 190
His Ile Pro Ile Leu Lys Glu Ile Gly Thr Asp Ile Val Gly Val Arg
195 200 205
Gly Ala Ala Cys Lys Gly Gly Asp Arg Asn Lys Gly Arg Ile Asp Arg
210 215 220
Asn Leu Val Arg Glu Leu Lys Glu Leu Cys
225 230
<210> 5
<211> 235
<212> PRT
<213> 冲绳甲烷球菌（Methanothermococcus okinawensis）MfnB 5
<400> 5
Met Ile Leu Leu Val Ser Pro Lys Asp Val Asn Glu Ala Ile Glu Thr
1 5 10 15
Ile Lys Gly Gly Ala Asp Ile Val Asp Val Lys Asn Pro Pro Glu Gly
20 25 30
Ser Leu Gly Ala Asn Phe Pro Trp Ile Ile Lys Glu Ile Arg Glu Ile
35 40 45
Thr Pro Lys Asn Leu Phe Val Ser Ala Ala Ile Gly Asp Val Pro Tyr
50 55 60
Lys Pro Gly Thr Val Ala Leu Ala Ala Leu Gly Ala Ala Met Ser Gly
65 70 75 80
Ala Asp Tyr Ile Lys Val Gly Leu Tyr Gly Thr Lys Ser Tyr Asn Glu
85 90 95
Ala Val Asp Leu Met Glu Lys Val Val Lys Ala Val Lys Gly Val Asp
100 105 110
Glu Asn Lys Ile Val Val Ala Ala Gly Tyr Ala Asp Ala His Arg Val
115 120 125
Gly Ala Val Glu Pro Leu Ile Val Pro Lys Ile Ala Arg Asp Ala Gly
130 135 140
Cys Asp Val Ala Met Leu Asp Thr Ala Val Lys Asp Gly Lys Thr Leu
145 150 155 160
Phe Asp His Leu Asn Glu Lys Ile Leu Ala Glu Phe Val Glu Glu Thr
165 170 175
His Ser Tyr Gly Leu Lys Cys Ala Leu Ala Gly Ser Ile Lys Lys Glu
180 185 190
Glu Ile Pro Ile Leu Lys Asp Ile Asn Cys Asp Ile Val Gly Val Arg
195 200 205
Gly Ala Ala Cys Thr Lys Gly Asp Arg Asn Asn Gly Thr Ile Lys Ser
210 215 220
Glu Leu Val Lys Glu Leu Ser Lys Leu Cys Lys
225 230 235
<210> 6
<211> 239
<212> PRT
<213> 古生甲烷球菌（Methanococcales archaeon）HHB MfnB 6
<400> 6
Met Arg Ile Leu Ile Ser Pro Lys Asp Ile Glu Glu Ala Lys Glu Ala
1 5 10 15
Ile Glu Gly Gly Ala Asp Ile Ile Asp Val Lys Asn Pro Leu Glu Gly
20 25 30
Ser Leu Gly Ala Asn Phe Pro Trp Val Ile Arg Glu Ile Arg Asn Ile
35 40 45
Thr Pro Lys Asp Arg Leu Val Ser Ala Thr Val Gly Asp Val Pro Tyr
50 55 60
Lys Pro Gly Thr Val Ala Leu Ala Ala Val Gly Ala Ala Ile Ser Gly
65 70 75 80
Ala Asp Tyr Ile Lys Val Gly Leu Tyr Gly Thr Lys Ser Tyr Arg Glu
85 90 95
Ala Val Asp Val Met Asn Lys Val Val Lys Ala Val Lys Glu Ile Asp
100 105 110
Glu Asn Lys Ile Val Val Ala Ala Gly Tyr Ala Asp Ala Tyr Arg Val
115 120 125
Gly Ala Val Asp Pro Leu Ile Ile Pro Lys Val Ala Arg Asp Ser Gly
130 135 140
Cys Asp Val Ala Met Leu Asp Thr Ala Val Lys Asp Gly Lys Arg Leu
145 150 155 160
Phe Asp His Leu Asn Arg Glu Leu Ile Ser Glu Phe Val Glu Glu Val
165 170 175
His Asn Tyr Gly Leu Glu Cys Ala Leu Ala Gly Ser Ile Arg Lys Glu
180 185 190
Asp Ile Pro Val Leu Lys Glu Ile Gly Cys Asp Ile Val Gly Ile Arg
195 200 205
Gly Ala Ala Cys Thr Lys Gly Asp Arg Asn Asn Gly Lys Ile Lys Lys
210 215 220
Glu Leu Val Glu Glu Leu Val Lys Leu Cys Lys Asn Gly Asp Lys
225 230 235
<210> 7
<211> 237
<212> PRT
<213> 史氏甲烷短杆菌（Methanobrevibacter smithii）MfnB 7
<400> 7
Met Leu Leu Leu Ile Ser Pro Ile Asn His Glu Glu Ala Leu Glu Ser
1 5 10 15
Ile Lys Gly Gly Ala Asp Ile Val Asp Val Lys Asn Pro Lys Glu Gly
20 25 30
Ser Leu Gly Ala Asn Phe Pro Trp Val Ile Arg Asp Ile Arg Glu Ile
35 40 45
Thr Pro Glu Asp Lys Leu Val Ser Ala Thr Leu Gly Asp Val Pro Tyr
50 55 60
Lys Pro Gly Thr Val Ser Leu Ala Ala Met Gly Ala His Val Ser Gly
65 70 75 80
Ala Asp Tyr Ile Lys Val Gly Leu Tyr Gly Thr Lys Asp Tyr Asp Glu
85 90 95
Ala Val Glu Val Met Glu Asn Val Ala Lys Thr Ile Lys Asp Val Asp
100 105 110
Asn Asp Thr Ile Val Val Ala Ala Gly Tyr Ala Asp Ala His Arg Val
115 120 125
Gly Ala Val Asp Pro Met Glu Ile Pro Lys Val Ala Lys Asp Ala Gly
130 135 140
Cys Asp Leu Ala Met Leu Asp Thr Ala Val Lys Asp Gly His Thr Leu
145 150 155 160
Phe Asp Tyr Leu Ser Ile Glu Asp Leu Glu Lys Phe Val Asn Glu Ala
165 170 175
His Ser Tyr Gly Leu Lys Thr Ala Leu Ala Gly Ser Val Lys Lys Glu
180 185 190
Gln Leu Lys Pro Leu Asn Asp Ile Gly Cys Asp Val Val Gly Ile Arg
195 200 205
Gly Ala Ala Cys Val Gly Gly Asp Arg Asn Thr Gly Lys Ile His His
210 215 220
Ser Ala Val Ala Glu Leu Lys Glu Leu Cys Asp Ser Phe
225 230 235
<210> 8
<211> 234
<212> PRT
<213> 甲烷杆菌属的种（Methanobacterium sp.）PtaB.Bin024 MfnB 8
<400> 8
Met Leu Leu Leu Ile Ser Pro Ile Asn Thr Gln Glu Ala Arg Glu Ala
1 5 10 15
Ile Asp Gly Gly Ala Asp Ile Val Asp Val Lys Asn Pro Lys Glu Gly
20 25 30
Ser Leu Gly Ala Asn Phe Pro Trp Val Ile Arg Asn Ile Arg Glu Ile
35 40 45
Thr Pro Lys Asn Met Lys Val Ser Ala Thr Leu Gly Asp Val Pro Tyr
50 55 60
Lys Pro Gly Thr Val Ala Leu Ala Ala Ala Gly Ala Ile Val Ser Gly
65 70 75 80
Ala Asp Tyr Ile Lys Val Gly Leu Tyr Gly Thr Thr Asn Tyr Ser Glu
85 90 95
Ala Leu Glu Val Met Glu Asn Val Val Lys Thr Val Asp Glu Phe Asn
100 105 110
Ser Asp Ala Ile Val Val Ala Ala Gly Tyr Ala Asp Ala His Arg Val
115 120 125
Gly Ala Val Asp Pro Met Glu Ile Pro Lys Ile Ala Ala Asp Ser Gly
130 135 140
Ser Asp Leu Ala Met Val Asp Thr Ala Val Lys Asp Gly Lys Thr Leu
145 150 155 160
Phe Asp Phe Met Asn Glu Glu Thr Leu Ser Gln Phe Thr Glu Gln Thr
165 170 175
His Glu Tyr Gly Leu Lys Ser Ala Leu Ala Gly Ser Val Thr Glu Glu
180 185 190
Gln Leu Pro Ile Leu Ala Glu Leu Gly Cys Asp Val Val Gly Ile Arg
195 200 205
Gly Ala Ala Cys Ile Gly Gly Asp Arg Asn Ser Gly Ser Ile His His
210 215 220
Glu Ala Val Ala Arg Leu Lys Gln Ile Val
225 230
<210> 9
<211> 237
<212> PRT
<213> 甲烷嗜高热菌属的种（Methanopyrus sp. ）KOL6 MfnB 9
<400> 9
Met Arg Pro Arg Leu Leu Val Ser Pro Val Asn Arg Asp Glu Ala Leu
1 5 10 15
Glu Ala Val Glu Gly Gly Ala His Ile Ile Asp Val Lys Asn Pro Glu
20 25 30
Glu Gly Ser Leu Gly Ala Asn Phe Pro Trp Val Ile Arg Glu Ile Met
35 40 45
Glu Val Val Pro Glu Asp Arg Glu Val Ser Ala Thr Val Gly Asp Val
50 55 60
Pro Tyr Lys Pro Gly Thr Val Ala Gln Ala Val Leu Gly Val Ala Ala
65 70 75 80
Val Gly Val Asp Tyr Ala Lys Val Gly Leu Tyr Gly Thr Lys Thr Glu
85 90 95
Glu Glu Ala Leu Glu Val Met Arg Ala Cys Ser Arg Ala Val Arg Glu
100 105 110
Phe Gly Tyr Asp Thr Arg Val Val Ala Ala Gly Tyr Ala Asp Ala His
115 120 125
Arg Val Asp Ser Ile Asp Pro Met Ser Val Pro Glu Val Ala Ala Glu
130 135 140
Ala Glu Cys Asp Val Ala Met Val Asp Thr Ala Val Lys Asp Gly Lys
145 150 155 160
Arg Leu Phe Asp Phe Leu Arg Glu Glu Glu Val Gly Glu Phe Val Asp
165 170 175
Leu Ala His Glu His Gly Leu Glu Val Ala Leu Ala Gly Ser Leu Arg
180 185 190
His Glu Asp Met Pro Ile Val Arg Asp Leu Gly Ala Asp Ile Val Gly
195 200 205
Ile Arg Gly Ala Ala Cys Glu Arg Gly Asp Arg Asn Arg Gly Ala Ile
210 215 220
Arg Ser His Leu Val Arg Lys Leu Ala Glu Ala Leu Ala
225 230 235
<210> 10
<211> 234
<212> PRT
<213> 暂定乙烷氧化古菌（Candidatus Argoarchaeum ethanivorans）MfnB 10
<400> 10
Met Thr Met Lys Leu Leu Val Ser Pro Ile Ser Val Glu Glu Ala Arg
1 5 10 15
Ile Ala Leu Asp Gly Gly Ala Asp Ile Ile Asp Val Lys Asn Pro Lys
20 25 30
Glu Gly Ser Leu Gly Ala Asn Phe Pro Asp Val Ile Gln Ser Val Lys
35 40 45
Arg Val Ile Thr Lys Pro Met Ser Val Ala Ile Gly Asp Phe Asn Tyr
50 55 60
Lys Pro Gly Thr Ala Ser Leu Ala Ala Leu Gly Ala Ser Val Ala Gly
65 70 75 80
Ala Asp Tyr Ile Lys Ile Gly Leu Phe Asp Val Gln Thr Arg Glu Gln
85 90 95
Ala Ser Glu Met Thr Glu Arg Val Thr Lys Ala Val Lys Gln Tyr Asp
100 105 110
Ser Lys Lys Lys Val Val Ile Cys Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Arg Ile
115 120 125
Asn Ser Ile Ser Pro Phe Glu Leu Pro Gly Ile Val Ser Asp Ala Gly
130 135 140
Ala Asp Val Val Met Met Asp Thr Gly Val Lys Asp Gly Arg Ser Thr
145 150 155 160
Leu Glu Phe Leu Asn Leu Glu Lys Leu Glu Ser Phe Ile Gly Ser Ala
165 170 175
His Gln Tyr Gly Leu Leu Ala Ala Ile Ala Gly Ser Leu Thr Phe Glu
180 185 190
Asp Ile Glu Ala Leu Lys Glu Val Ala Pro Asp Ile Ile Gly Val Arg
195 200 205
Gly Cys Val Cys Gly Gly Asp Arg Asn Ser Ser Ile Lys Leu Glu Leu
210 215 220
Val Arg Glu Leu Lys Glu Arg Ile His His
225 230
<210> 11
<211> 237
<212> PRT
<213> 刚果甲烷杆菌（Methanobacterium congolense）MfnB 11
<400> 11
Met Leu Leu Leu Ile Ser Pro Ile Asn Thr Glu Glu Ala Arg Glu Ala
1 5 10 15
Ile Glu Gly Gly Ala Asp Ile Val Asp Val Lys Asn Pro Lys Glu Gly
20 25 30
Ser Leu Gly Ala Asn Phe Pro Trp Val Ile Lys Ser Ile Ser Glu Leu
35 40 45
Thr Pro Glu Gly Met Tyr Val Ser Ala Thr Leu Gly Asp Val Pro Tyr
50 55 60
Lys Pro Gly Thr Val Ser Leu Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Ser Gly
65 70 75 80
Ala Asp Tyr Ile Lys Val Gly Leu Tyr Gly Thr Lys Asn Tyr Glu Glu
85 90 95
Ala Leu Glu Val Met Lys Asn Val Val Lys Thr Val Lys Asp Phe Asn
100 105 110
Glu Asp Ala Val Val Val Ala Ala Gly Tyr Ala Asp Ala His Arg Val
115 120 125
Gly Ala Val Asp Pro Met Glu Ile Pro Arg Val Ala Ala Asp Ala Gly
130 135 140
Ala Asp Leu Ala Met Val Asp Thr Ala Val Lys Asp Gly Lys Thr Leu
145 150 155 160
Phe Asp Phe Met Asp Glu Asp Thr Leu Thr Lys Phe Asn Asn Thr Ile
165 170 175
His Asp Tyr Gly Leu Lys Ser Ala Leu Ala Gly Ser Val Lys Lys Glu
180 185 190
Gln Leu Glu Met Leu Tyr Asn Ile Gly Cys Asp Val Val Gly Ile Arg
195 200 205
Gly Ala Ala Cys Val Gly Gly Asp Arg Asn Thr Gly Lys Ile His Arg
210 215 220
Ser Ala Val Gly Glu Leu Lys Lys Met Ile Glu Asn Phe
225 230 235
<210> 12
<211> 238
<212> PRT
<213> 嗜树木甲烷短杆菌（Methanobrevibacter arboriphilus）MfnB 12
<400> 12
Met Leu Leu Leu Ile Ser Pro Ile Asn Asn Glu Glu Ala Leu Glu Ser
1 5 10 15
Ile Glu Gly Gly Ala Asp Ile Val Asp Val Lys Asn Pro Lys Glu Gly
20 25 30
Ser Leu Gly Ala Asn Phe Pro Trp Val Ile Ser Glu Ile Arg Lys Met
35 40 45
Thr Pro Asp Asp Met Leu Val Ser Ala Thr Leu Gly Asp Val Pro Tyr
50 55 60
Lys Pro Gly Thr Val Ser Leu Ala Ala Met Gly Ala Leu Thr Ser Gly
65 70 75 80
Ala Asp Tyr Ile Lys Val Gly Leu Tyr Gly Thr Ser Asn Tyr Asp Glu
85 90 95
Ala Leu Glu Val Met Thr Asn Val Val Lys Thr Val Lys Ser Asn Asn
100 105 110
Pro Asn Ala Thr Val Val Ala Ser Gly Tyr Gly Asp Ala His Arg Val
115 120 125
Gly Ala Val Ser Pro Trp Asp Ile Pro Lys Val Ala Lys Glu Ser Gly
130 135 140
Ser Asp Leu Ala Met Leu Asp Thr Ala Val Lys Asp Gly Lys Thr Leu
145 150 155 160
Phe Asp Tyr Leu Asn Ile Asp Asp Leu Lys Lys Phe Val Glu Glu Thr
165 170 175
His Ser Tyr Gly Leu Lys Ser Ala Leu Ala Gly Ser Val Lys Lys Glu
180 185 190
Gln Leu Lys Pro Leu Tyr Asp Ile Gly Cys Asp Val Val Gly Val Arg
195 200 205
Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Asp Arg Asn Asn Gly Lys Ile Ser Arg
210 215 220
Thr Ala Val Ala Glu Leu Lys Glu Leu Val Asn Ser Phe Asp
225 230 235
<210> 13
<211> 236
<212> PRT
<213> 海沼甲烷球菌（Methanococcus maripaludis）MfnB 13
<400> 13
Met Ile Leu Leu Val Ser Pro Lys Asp Val Ala Glu Ala His Glu Ala
1 5 10 15
Ile Glu Gly Gly Ala Asp Ile Ile Asp Val Lys Asn Pro Pro Glu Gly
20 25 30
Ser Leu Gly Ala Asn Phe Pro Trp Val Ile Lys Glu Thr Arg Glu Ala
35 40 45
Thr Pro Glu Gly Met Leu Val Ser Ala Ala Ile Gly Asp Val Pro Tyr
50 55 60
Lys Pro Gly Thr Val Thr Leu Ala Ala Leu Gly Ala Ala Ile Ser Gly
65 70 75 80
Ala Asp Tyr Ile Lys Val Gly Leu Tyr Gly Thr Arg Ser Tyr Gln Glu
85 90 95
Ala Leu Asp Val Met Lys Asn Val Thr Lys Ala Val Lys Asp Ser Gly
100 105 110
Glu Asn Lys Ile Val Val Ala Ala Gly Tyr Ala Asp Ala Tyr Arg Val
115 120 125
Gly Gly Val Asp Pro Leu Ile Ile Pro Arg Val Ala Arg Asp Ala Gly
130 135 140
Cys Asp Val Ala Met Leu Asp Thr Ala Val Lys Asp Gly Lys Thr Leu
145 150 155 160
Phe Asp His Met Ser Ile Glu Leu Leu Lys Glu Phe Val Glu Glu Thr
165 170 175
His Lys Tyr Gly Met Lys Cys Ala Leu Ala Gly Ser Ile Lys Ile Glu
180 185 190
Glu Ile Pro Met Leu Lys Glu Ile Asn Cys Asp Ile Val Gly Val Arg
195 200 205
Gly Ala Ala Cys Thr Lys Gly Asp Arg Asn Glu Gly Arg Ile Gln Lys
210 215 220
Asp Leu Val Lys Glu Ile Val Lys Val Cys Arg Gln
225 230 235
<210> 14
<211> 236
<212> PRT
<213> 万氏甲烷球菌（Methanococcus vannielii）MfnB 14
<400> 14
Met Ile Leu Leu Val Ser Pro Lys Asp Val Ala Glu Ala Tyr Glu Ala
1 5 10 15
Ile Asn Gly Gly Ala Asp Ile Ile Asp Val Lys Asn Pro Pro Glu Gly
20 25 30
Ser Leu Gly Ala Asn Phe Pro Trp Val Ile Lys Glu Ile Arg Ser Ala
35 40 45
Thr Pro Asn Gly Met Leu Val Ser Ala Ala Ile Gly Asp Val His Tyr
50 55 60
Lys Pro Gly Thr Val Thr Leu Ala Ala Leu Gly Ala Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Ala Asp Tyr Ile Lys Ile Gly Leu Tyr Gly Thr Arg Ser Tyr Gln Glu
85 90 95
Ala Val Asp Val Met Lys Asn Val Ser Asn Ala Val Lys Ser Glu Asp
100 105 110
Pro Lys Lys Ile Val Val Ala Ala Gly Tyr Ala Asp Ala Tyr Arg Val
115 120 125
Gly Ala Val Asp Pro Leu Ile Ile Pro Lys Ile Ala Arg Asp Ser Gly
130 135 140
Cys Asp Val Ala Met Leu Asp Thr Ala Val Lys Asp Gly Lys Thr Leu
145 150 155 160
Phe Asp His Leu Ser Ile Asp Leu Leu Lys Glu Phe Val Glu Glu Thr
165 170 175
His Lys Tyr Gly Met Lys Cys Ala Leu Ala Gly Ser Ile Lys Lys Glu
180 185 190
Glu Ile Pro Met Leu Lys Glu Ile Gly Cys Asp Ile Val Gly Ile Arg
195 200 205
Gly Ala Ala Cys Thr Lys Gly Asp Arg Asn Glu Gly Lys Ile Gln Lys
210 215 220
Asp Leu Val Lys Glu Ile Val Lys Ile Cys Lys Glu
225 230 235
<210> 15
<211> 234
<212> PRT
<213> 嗜乙酸甲烷八叠球菌（Methanosarcina acetivorans）MfnB 15
<400> 15
Met Lys Leu Leu Val Ser Pro Ile Asn Arg Glu Glu Ala Ile Ile Ala
1 5 10 15
Ser Leu Gly Gly Ala Asp Ile Val Asp Val Lys Asn Pro Lys Glu Gly
20 25 30
Ser Leu Gly Ala Asn Phe Pro Trp Val Ile Arg Asp Val Lys Glu Val
35 40 45
Val Asn Gly Arg Gln Pro Ile Ser Ala Thr Ile Gly Asp Phe Asn Tyr
50 55 60
Lys Pro Gly Thr Ala Ser Leu Ala Ala Leu Gly Ala Ala Val Ala Gly
65 70 75 80
Ala Asp Tyr Ile Lys Val Gly Leu Tyr Asp Ile Gln Thr Glu Ala Gln
85 90 95
Ala Leu Glu Leu Leu Thr Lys Ile Thr Leu Ala Val Lys Asp Tyr Asp
100 105 110
Pro Ser Lys Lys Val Val Ala Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Lys Arg Ile
115 120 125
Asn Ser Ile Ser Pro Leu Leu Leu Pro Ala Val Ala Ala Glu Ala Gly
130 135 140
Val Asp Val Val Met Val Asp Thr Gly Ile Lys Asp Gly Lys Ser Thr
145 150 155 160
Phe Glu Phe Met Asp Glu Gln Glu Leu Lys Glu Phe Thr Asp Leu Ala
165 170 175
His Glu His Gly Leu Glu Asn Ala Ile Ala Gly Ser Leu Lys Phe Glu
180 185 190
Asp Leu Pro Val Leu Glu Arg Ile Gly Pro Asp Ile Ile Gly Val Arg
195 200 205
Gly Met Val Cys Gly Gly Asp Arg Arg Thr Ala Ile Arg Gln Glu Leu
210 215 220
Val Glu Lys Leu Val Ala Glu Cys Gln Ile
225 230
<210> 16
<211> 234
<212> PRT
<213> 巴氏甲烷八叠球菌（Methanosarcina barkeri）MfnB 16
<400> 16
Met Lys Leu Leu Ile Ser Pro Ile Asn Lys Glu Glu Ala Ile Ile Ala
1 5 10 15
Ser Arg Gly Gly Ala Asp Ile Val Asp Val Lys Asn Pro Lys Glu Gly
20 25 30
Ser Leu Gly Ala Asn Phe Pro Trp Val Ile Arg Asp Val Lys Gly Ala
35 40 45
Val Asn Gly Arg Gln Pro Ile Ser Ala Thr Ile Gly Asp Phe Asn Tyr
50 55 60
Lys Pro Gly Thr Ala Ser Leu Ala Ala Phe Gly Ala Ala Val Ala Gly
65 70 75 80
Ala Asp Tyr Ile Lys Val Gly Leu Tyr Asp Ile Gln Thr Glu Asp Gln
85 90 95
Ala Leu Glu Leu Ile Thr Lys Ile Thr Gln Ala Val Lys Asp Tyr Asp
100 105 110
Ser Thr Lys Lys Val Val Ala Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Lys Arg Ile
115 120 125
Asn Ser Ile Ser Pro Leu Leu Leu Pro Ser Ile Ala Ala Lys Ala Gly
130 135 140
Ala Asp Val Val Met Val Asp Thr Gly Ile Lys Asp Gly Lys Ser Thr
145 150 155 160
Phe Glu Phe Met Asp Glu Glu Glu Leu Lys Lys Phe Thr Gly Leu Ala
165 170 175
His Glu Cys Gly Leu Glu Asn Ala Ile Ala Gly Ser Leu Lys Phe Glu
180 185 190
Asp Leu Pro Val Leu Glu Arg Ile Gly Pro Asp Ile Ile Gly Val Arg
195 200 205
Gly Met Val Cys Gly Gly Asp Arg Thr Asn Ser Ile Arg Gln Glu Leu
210 215 220
Val Glu Lys Leu Val Ala Glu Cys Gln Ala
225 230
<210> 17
<211> 236
<212> PRT
<213> 扭脱甲基杆菌（Methylorubrum extorquens）MfnB 17
<400> 17
Met Ser Asp Ile Val Ser Ile Ser Ser Ala Arg Pro Arg Leu Leu Val
1 5 10 15
Ser Val Arg Gly Pro Asp Glu Ala Leu Thr Ala Leu Arg Ala Gly Ala
20 25 30
Asp Leu Ile Asp Ala Lys Asp Pro Glu Arg Gly Ala Leu Gly Ala Leu
35 40 45
Pro Pro Glu Thr Val Arg Ala Ile Val Ala Gly Val Gly Gly Arg Ala
50 55 60
Val Thr Ser Ala Val Ala Gly Asp Gly Thr Gly Arg Glu Ile Ala Ala
65 70 75 80
Ala Ile Ala Thr Ile Ala Ala Thr Gly Val Asp Phe Ile Lys Ile Ala
85 90 95
Val Gly Gly Ala Asp Asp Ala Ala Leu Ala Glu Ala Ala Ala Gln Ala
100 105 110
Pro Gly Arg Val Ile Gly Val Leu Phe Ala Glu Asp Asp Val Ala Glu
115 120 125
Asp Gly Pro Ala Arg Leu Ala Ala Ala Gly Phe Val Gly Ala Met Ile
130 135 140
Asp Thr Arg Gly Lys Ser Gly Thr Thr Leu Thr Ser Leu Met Ala Ala
145 150 155 160
Pro Gln Leu Ala Ala Phe Val Ala Gly Cys Arg Thr His Gly Leu Met
165 170 175
Ser Gly Leu Ala Gly Ser Leu Gly Leu Gly Asp Ile Pro Val Leu Ala
180 185 190
Arg Leu Asp Pro Asp Tyr Leu Gly Phe Arg Gly Gly Leu Cys Arg Ala
195 200 205
Ser Asp Arg Arg Gln Ala Leu Asp Gly Ala Arg Val Ala Gln Ala Val
210 215 220
Glu Ala Met Arg Ala Gly Pro Arg Ala Asp Ala Ala
225 230 235
<210> 18
<211> 242
<212> PRT
<213> 甲基杆菌属的种（Methylobacterium sp. ）MfnB 18
<400> 18
Met Thr Arg Pro Glu Pro His Leu Ser Val Arg Ala Ala Pro Arg Leu
1 5 10 15
Leu Val Ser Val Arg Asp Ala Ala Glu Ala Glu Val Ala Arg Ala Ala
20 25 30
Gly Ala Asp Leu Val Asp Ala Lys Asp Pro Ala Arg Gly Ala Leu Gly
35 40 45
Ala Leu Asp Pro Ala Leu Val Arg Ala Met Val Ala Arg Ile Gly Asp
50 55 60
Arg Ala Thr Thr Ser Ala Val Ala Gly Glu Pro Arg Glu Ala Gly Asp
65 70 75 80
Leu Val Ala Lys Val Ala Ala Met Ala Ala Thr Gly Val Asp Tyr Val
85 90 95
Lys Val Ala Leu Pro Pro Gly Leu Arg Ser Gly Arg Asp Gly Leu Arg
100 105 110
Glu Ala Ala Asp Ala Ala Arg Gly Arg Leu Ile Ala Val Leu Phe Ala
115 120 125
Glu Asp Gly Leu Asp Leu Ala Val Leu Pro Thr Leu Ala Asp Ala Gly
130 135 140
Phe Val Gly Ala Met Ile Asp Thr Asn Thr Lys Asp Gly Arg Arg Leu
145 150 155 160
Thr Asp Arg Ile Ala Val Pro Ala Leu Ser Ala Phe Thr Ala Ala Cys
165 170 175
Arg Ala Glu Gly Leu Val Ser Gly Leu Ala Gly Ser Leu Ala Leu Ala
180 185 190
Asp Ile Pro Ala Leu Ser Asp Leu Gly Ala Gly Tyr Leu Gly Phe Arg
195 200 205
Gly Gly Leu Cys Arg Gly Gly Asp Arg Arg Gly Asp Leu Asp Pro Ala
210 215 220
Arg Ile Ala Glu Ala Ala Arg Leu Leu Arg Ala Gly Gly Arg Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala
<210> 19
<211> 234
<212> PRT
<213> 马氏甲烷八叠球菌（Methanosarcina mazei）MfnB 19
<400> 19
Met Lys Leu Leu Val Ser Pro Ile Asn Ser Glu Glu Ala Ile Ile Ala
1 5 10 15
Ser Ile Gly Gly Ala Asp Ile Val Asp Val Lys Asn Pro Lys Glu Gly
20 25 30
Ser Leu Gly Ala Asn Phe Pro Trp Val Ile Arg Glu Val Lys Ala Val
35 40 45
Val Asn Gly Arg Gln Pro Ile Ser Ala Thr Ile Gly Asp Phe Asn Tyr
50 55 60
Lys Pro Gly Thr Ala Ala Leu Ala Ala Leu Gly Ala Ala Val Ala Gly
65 70 75 80
Ala Asp Tyr Ile Lys Val Gly Leu Tyr Asp Ile Gln Thr Glu Ser Gln
85 90 95
Ala Leu Glu Leu Leu Thr Lys Ile Thr Arg Ala Val Lys Asp Tyr Asn
100 105 110
Pro Leu Lys Lys Val Val Ala Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Lys Arg Ile
115 120 125
Asn Ser Ile Ser Pro Leu Leu Leu Pro Ala Val Ala Ala Glu Ala Gly
130 135 140
Val Asp Val Val Met Val Asp Thr Gly Val Lys Asp Gly Lys Ser Thr
145 150 155 160
Phe Glu Phe Met Asp Glu Lys Glu Leu Lys Glu Phe Thr Asp Leu Ala
165 170 175
His Ser Tyr Gly Leu Glu Asn Ala Ile Ala Gly Ser Leu Lys Phe Glu
180 185 190
Asp Ile Pro Leu Leu Glu Arg Ile Gly Pro Asp Ile Ile Gly Val Arg
195 200 205
Gly Met Val Cys Gly Gly Asp Arg Ser Thr Ser Ile Arg Gln Glu Leu
210 215 220
Val Glu Lys Leu Val Ala Glu Cys Gln Ala
225 230
<210> 20
<211> 238
<212> PRT
<213> 广泛嗜甲基营养菌（Methyloversatilis universalis）MfnB 20
<400> 20
Met Ile Arg Met Leu Ala Ser Val Arg Asn Leu Asp Glu Ala Arg Ile
1 5 10 15
Val Leu Glu Ala Gly Val Asp Leu Ile Asp Leu Lys Gln Pro Ala Asp
20 25 30
Gly Ala Leu Gly Ala Leu Pro Ala Glu Val Ile Arg Glu Val Val Asp
35 40 45
Phe Val Ala Gly Arg Thr Leu Thr Ser Ala Thr Ala Gly Asn Val Glu
50 55 60
Pro Asp Ala Gln Ala Val Gln Ser Ala Met Ala Arg Ile Ala Ala Thr
65 70 75 80
Gly Val Asp Tyr Val Lys Ala Gly Leu Phe Pro Gly Asn Trp Gln Gln
85 90 95
Gly Gly Arg Asp Tyr Ala Ala Val Arg Ala Cys Leu Arg Gly Leu Thr
100 105 110
Pro Leu Ala Gly Ala Arg Arg Ile Ala Val Met Phe Ala Asp Leu Ser
115 120 125
Pro Pro Leu Ala Leu Val Asp Ala Val Ala Asp Ala Gly Phe Asp Gly
130 135 140
Val Met Val Asp Thr Ala Leu Lys Thr Gly His Ser Leu Pro Asp Val
145 150 155 160
Ala Ser Thr Glu Trp Leu Ser Gly Phe Val Glu Arg Ala Arg Ala Arg
165 170 175
Gly Leu Leu Cys Gly Leu Ala Gly Ser Leu Arg Val Thr His Ile Pro
180 185 190
Ala Leu Ala Gln Arg Cys Pro Asp Tyr Leu Gly Phe Arg Gly Ala Leu
195 200 205
Cys Ala Gly Gln Ala Arg Ala Gln Ala Leu Asp Ala Arg Ala Val Leu
210 215 220
Ala Val Arg Glu Ala Leu Glu Lys Val Gln Arg Leu Ala Ala
225 230 235
<210> 21
<211> 234
<212> PRT
<213> 瓦氏亚硝化球菌（Nitrosococcus watsonii）MfnB 21
<400> 21
Met Ser Cys Trp Leu Ala Ser Val Arg Asn Leu Glu Glu Ile Ser Cys
1 5 10 15
Leu Leu Ala Glu Gly Pro Asp Ile Ile Asp Phe Lys Glu Pro Lys Glu
20 25 30
Gly Val Leu Gly Ala Leu Pro Leu Glu Thr Val Arg Glu Ala Val Ala
35 40 45
Leu Ile Gly Arg Arg Cys Gln Thr Ser Ala Ala Ile Gly Asp Phe Pro
50 55 60
Val Asp Ser Pro Gln Ile Tyr Gln Arg Val Leu Glu Met Ala Ala Thr
65 70 75 80
Gly Val Asp Tyr Val Lys Ile Gly Leu Pro Ser Asn Ile Gln Gln Ala
85 90 95
Ala Ala Cys Leu Leu Ser Leu Arg Pro Leu Ala Asp Gln Gly Val Ser
100 105 110
Met Val Gly Val Ile Phe Ala Asp Lys Arg Pro Asp Phe Ser Trp Thr
115 120 125
Tyr Leu Ile Gly Gln Ala Gly Phe Lys Gly Ile Met Leu Asp Thr Ala
130 135 140
Ile Lys Asp Asp Phe Gly Leu Leu Ser His Leu Ser Leu Ser Glu Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Val Lys Leu Ala Arg Ser Val Arg Leu Ile Ser Gly Leu
165 170 175
Ala Gly Ser Leu Ser Ile Gln Asp Ile Pro Lys Leu Leu Pro Leu Arg
180 185 190
Ala Asp Tyr Leu Gly Phe Arg Ser Ala Leu Cys Val Ala Ala Arg Asn
195 200 205
Arg Cys Ser Arg Leu Asp Pro Lys Ala Val Leu Leu Ile Lys Gln Ala
210 215 220
Met Arg Glu Asn Leu Arg Ile Phe Glu Ile
225 230
<210> 22
<211> 256
<212> PRT
<213> 牲畜链霉菌（Streptomyces cattleya）NRRL 8057 MfnB22
<400> 22
Met Lys Glu Pro Thr Leu Leu Leu Leu Ile Ser Pro Asp Ser Val Glu
1 5 10 15
Glu Ala Leu Asp Cys Ala Lys Ala Ala Glu His Leu Asp Ile Val Asp
20 25 30
Val Lys Lys Pro Asp Glu Gly Ser Leu Gly Ala Asn Tyr Pro Trp Val
35 40 45
Ile Arg Glu Ile Arg Asp Ala Ile Pro Ala Asp Lys Pro Val Ser Ala
50 55 60
Thr Val Gly Asp Val Pro Tyr Lys Pro Gly Thr Val Ala Gln Ala Ala
65 70 75 80
Leu Gly Ala Val Val Ser Gly Ala Thr Tyr Ile Lys Val Gly Leu Tyr
85 90 95
Gly Cys Thr Thr Pro Asp Gln Val Val Glu Val Met Arg Gly Val Val
100 105 110
Arg Ala Val Lys Asp His Arg Pro Asp Ala Leu Val Val Ala Ser Gly
115 120 125
Tyr Ala Asp Ala His Arg Ile Gly Cys Val Asn Pro Leu Ala Ile Pro
130 135 140
Gly Val Ala Gln Arg Ser Gly Cys Asp Ala Ala Met Leu Asp Thr Ala
145 150 155 160
Val Lys Asp Gly Thr Arg Leu Phe Asp His Val Pro Pro Asp Val Cys
165 170 175
Gly Glu Phe Val Arg Leu Ala His Glu Gly Gly Leu Leu Ala Ala Leu
180 185 190
Ala Gly Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Gly Ala Leu Thr Arg Ile Gly
195 200 205
Thr Asp Ile Val Gly Val Arg Gly Ala Val Cys Glu Gly Gly Asp Arg
210 215 220
Asn Ala Gly Arg Ile Gln Pro His Leu Val Ala Ala Phe Arg Ala Glu
225 230 235 240
Met Asp Arg His Ala Arg Glu His Ala Ala Val Val Thr Pro Thr Gly
245 250 255
<210> 23
<211> 250
<212> PRT
<213> 天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）MfnB 23
<400> 23
Met Leu Leu Leu Ile Ser Pro Asp Gly Val Asp Glu Ala Leu Asp Cys
1 5 10 15
Ala Lys Ala Ala Glu His Leu Asp Ile Val Asp Val Lys Lys Pro Asp
20 25 30
Glu Gly Ser Leu Gly Ala Asn Tyr Pro Trp Val Ile Arg Glu Ile Arg
35 40 45
Ala Ala Val Pro Ala Asp Lys Pro Val Ser Ala Thr Val Gly Asp Val
50 55 60
Pro Tyr Lys Pro Gly Thr Val Ala Gln Ala Ala Leu Gly Ala Ala Val
65 70 75 80
Ser Gly Ala Thr Tyr Ile Lys Val Gly Leu Tyr Gly Cys Ala Thr Pro
85 90 95
Glu Gln Ala Val Glu Val Met Arg Gly Val Val Arg Ala Val Lys Asp
100 105 110
His Arg Ala Asp Ala Phe Val Val Ala Ser Gly Tyr Ala Asp Ala His
115 120 125
Arg Ile Gly Cys Val Asn Pro Leu Ser Leu Pro Asp Ile Ala Arg Arg
130 135 140
Ser Gly Ser Asp Ala Ala Met Leu Asp Thr Ala Ile Lys Asp Gly Thr
145 150 155 160
Arg Leu Phe Asp His Val Pro Pro Asp Val Cys Ala Glu Phe Val Arg
165 170 175
Arg Ala His Asp Cys Gly Leu Leu Ala Ala Leu Ala Gly Ser Val Arg
180 185 190
Ser Gly Asp Leu Gly Glu Leu Ala Arg Ile Gln Thr Asp Ile Val Gly
195 200 205
Val Arg Gly Ala Val Cys Glu Gly Gly Asp Arg Thr Thr Gly Arg Ile
210 215 220
Arg Pro His Leu Val Ala Ala Phe Arg Ala Glu Met Asp Arg His Val
225 230 235 240
Arg Glu His Ala Ala Ala Ala Ala Gln Ser
245 250
<210> 24
<211> 253
<212> PRT
<213> 链霉菌（Streptomyces）EFF88969 MfnB 24
<400> 24
Met Leu Leu Ile Ser Pro Asp Ser Val Glu Glu Ala Leu Glu Cys Ala
1 5 10 15
Lys Ala Ala Gln His Leu Asp Ile Val Asp Val Lys Lys Pro Asp Glu
20 25 30
Gly Ser Leu Gly Ala Asn His Pro Trp Val Ile Arg Ala Val Arg Asp
35 40 45
Ala Val Pro Ala Asp Lys Pro Val Ser Ala Thr Val Gly Asp Val Pro
50 55 60
Tyr Lys Pro Gly Thr Val Ala Gln Ala Ala Leu Gly Ala Thr Val Ser
65 70 75 80
Gly Ala Thr Tyr Ile Lys Val Gly Leu Tyr Gly Cys Thr Thr Pro Asp
85 90 95
Gln Ala Val Glu Val Met Arg Gly Val Val Arg Ala Val Lys Asp Phe
100 105 110
Arg Pro Asp Ala Leu Val Val Ala Ser Gly Tyr Ala Asp Ala His Arg
115 120 125
Ile Gly Cys Val Asn Pro Leu Ala Leu Pro Asp Ile Ala Arg Arg Ser
130 135 140
Gly Ser Asp Gly Ala Met Leu Asp Thr Ala Val Lys Asp Gly Thr Arg
145 150 155 160
Leu Phe Asp His Thr Pro Pro Gln Val Cys Ala Glu Phe Val Arg Leu
165 170 175
Ala His Glu Ala Gly Leu Leu Ala Ala Leu Ala Gly Ser Val Lys Ala
180 185 190
Gly Asp Leu Ala Glu Leu Ala Gly Met Gly Thr Asp Ile Val Gly Val
195 200 205
Arg Gly Ala Val Cys Glu Gly Gly Asp Arg Asn Ala Gly Arg Ile Arg
210 215 220
Pro Glu Leu Val Ala Ala Phe Arg Ala Glu Met Asp Arg Cys Val Gln
225 230 235 240
Gln His Gly Gly Gln Gly Ala Ala Val Ala Ala Ala Ser
245 250
<210> 25
<211> 250
<212> PRT
<213> 灰色链霉菌（Streptomyces griseus）MfnB 25
<400> 25
Met Leu Leu Leu Ile Ser Pro Asp Gly Val Glu Glu Ala Leu Ala Cys
1 5 10 15
Ala Thr Ala Ala Glu His Leu Asp Ile Val Asp Val Lys Lys Pro Asp
20 25 30
Glu Gly Ser Leu Gly Ala Asn Phe Pro Trp Val Ile Arg Glu Ile Arg
35 40 45
Ala Ala Val Pro Ala Asp Lys Pro Val Ser Ala Thr Val Gly Asp Val
50 55 60
Pro Tyr Lys Pro Gly Thr Val Ala Gln Ala Ala Leu Gly Ala Ala Val
65 70 75 80
Ser Gly Ala Thr Tyr Ile Lys Val Gly Leu Tyr Gly Cys Ala Thr Pro
85 90 95
Asp Gln Ala Ile Asp Val Met Arg Gly Val Val Arg Ala Val Lys Asp
100 105 110
Phe Arg Ala Asp Ala Phe Val Val Ala Ser Gly Tyr Ala Asp Ala His
115 120 125
Arg Ile Gly Cys Val Asn Pro Leu Ala Leu Pro Asp Ile Ala Arg Arg
130 135 140
Ala Gly Ala Asp Ala Ala Met Leu Asp Thr Ala Ile Lys Asp Gly Thr
145 150 155 160
Arg Leu Phe Asp His Val Pro Pro Glu Gly Cys Ala Glu Phe Val Arg
165 170 175
Leu Ala His Glu Ala Gly Leu Leu Ala Ala Leu Ala Gly Ser Val Lys
180 185 190
Ala Ala Asp Leu Ala Thr Leu Thr Arg Ile Gly Thr Asp Ile Val Gly
195 200 205
Val Arg Gly Ala Val Cys Glu Gly Gly Asp Arg Asp Ala Gly Arg Ile
210 215 220
Gln Pro Arg Leu Val Ala Ala Phe Arg Ala Glu Met Asp Arg His Ala
225 230 235 240
Arg Ala Phe Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ser
245 250
<210> 26
<211> 251
<212> PRT
<213> 链霉菌属的种（Streptomyces sp. ）DH-12 MfnB 26
<400> 26
Met Leu Leu Leu Ile Ser Pro Asp Gly Val Glu Glu Ala Leu Asp Cys
1 5 10 15
Ala Lys Ala Ala Glu His Leu Asp Ile Val Asp Val Lys Lys Pro Asp
20 25 30
Glu Gly Ser Leu Gly Ala Asn Phe Pro Trp Val Ile Arg Glu Ile Arg
35 40 45
Glu Ala Val Pro Ala Asp Lys Pro Val Ser Ala Thr Val Gly Asp Val
50 55 60
Pro Tyr Lys Pro Gly Thr Val Ala Gln Ala Ala Leu Gly Ala Val Val
65 70 75 80
Ser Gly Ala Thr Tyr Ile Lys Val Gly Leu Tyr Gly Cys Thr Thr Pro
85 90 95
Asp Gln Gly Ile Asp Val Met Arg Ala Val Val Arg Ala Val Lys Glu
100 105 110
His Asn Pro Asp Ala Leu Val Val Ala Ser Gly Tyr Ala Asp Ala His
115 120 125
Arg Ile Gly Cys Val Asn Pro Leu Ala Val Pro Asp Ile Ala Ala Arg
130 135 140
Ser Gly Ala Asp Ala Ala Met Leu Asp Thr Ala Val Lys Asp Gly Thr
145 150 155 160
Arg Leu Phe Asp His Val Pro Pro Asp Val Cys Ala Glu Phe Val Arg
165 170 175
Leu Ala His Ala Ser Gly Arg Leu Ala Ala Leu Ala Gly Ser Val Arg
180 185 190
Gln Asp Asp Leu Gly Glu Leu Thr Arg Ile Gly Thr Asp Ile Val Gly
195 200 205
Val Arg Gly Ala Val Cys Glu Gly Gly Asp Arg Asn Ala Gly Arg Ile
210 215 220
Gln Pro His Leu Val Ala Ala Phe Arg Ala Glu Met Asp Arg Tyr Asp
225 230 235 240
Arg Glu Arg Thr Ala Gly Leu Pro Ala Ala Arg
245 250
<210> 27
<211> 251
<212> PRT
<213> 委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）MfnB 27
<400> 27
Met Leu Leu Leu Ile Ser Pro Asp Ser Val Glu Glu Ala Leu Asp Cys
1 5 10 15
Val Lys Ala Ala Glu His Leu Asp Ile Val Asp Val Lys Lys Pro Asp
20 25 30
Glu Gly Ser Leu Gly Ala Asn Phe Pro Trp Val Ile Arg Glu Ile Arg
35 40 45
Asp Ala Val Pro Ala Asp Lys Pro Val Ser Ala Thr Val Gly Asp Val
50 55 60
Pro Tyr Lys Pro Gly Thr Val Ala Gln Ala Ala Leu Gly Ala Val Val
65 70 75 80
Ser Gly Ala Thr Tyr Ile Lys Val Gly Leu Tyr Gly Cys Thr Thr Pro
85 90 95
Glu Gln Gly Ile Glu Val Met Arg Ala Val Val Arg Ala Val Lys Asp
100 105 110
His Arg Pro Asp Ala Leu Val Val Ala Ser Gly Tyr Ala Asp Ala His
115 120 125
Arg Val Gly Cys Val Asn Pro Leu Ala Val Pro Asp Ile Ala Ala Arg
130 135 140
Ser Gly Ala Asp Ala Ala Met Leu Asp Thr Ala Ile Lys Asp Gly Thr
145 150 155 160
Arg Leu Phe Asp His Val Pro Pro Asp Ala Cys Ala Glu Phe Val Arg
165 170 175
Arg Ala His Ala Ser Gly Leu Leu Ala Ala Leu Ala Gly Ser Ile Thr
180 185 190
Gln Ala Asp Leu Gly Pro Leu Thr Arg Met Gly Thr Asp Ile Val Gly
195 200 205
Val Arg Gly Ala Val Cys Ala Gly Gly Asp Arg Asn Ala Gly Arg Ile
210 215 220
Gln Pro His Leu Ile Thr Ala Phe Arg Ala Glu Met Asp Arg Gln Gly
225 230 235 240
Arg Glu Tyr Ala Val Gly Ile Pro Ala Ala Asn
245 250
<210> 28
<211> 265
<212> PRT
<213> 天蓝色链霉菌PH1
<400> 28
Met Met Pro Glu Pro Pro Arg Glu Arg Arg Thr Ala Ala Asn Arg Ser
1 5 10 15
Pro Ala Ile Arg Pro Ile Ala Phe Phe Asp Val Asp Glu Thr Leu Ile
20 25 30
Thr Ala Lys Ser Met Leu Asp Phe Ala Arg Gln Ala Pro His Ser Leu
35 40 45
Arg Asp Asp Ile Thr Ala Gln Ala Ser Gly Gln Arg His Ser Ala Asp
50 55 60
Ala Asp Leu Thr Ala Met Arg Arg Arg Gly Ala Ser Arg Val Glu Met
65 70 75 80
Asn Arg Val Tyr Tyr Arg Arg Tyr Ala Gly Val Ser Leu Ala Arg Leu
85 90 95
Gln Glu Ala Gly Arg Asp Trp Tyr His Ala Tyr Arg Thr Arg Pro Asp
100 105 110
Gly Tyr Val Arg Ala Gly Leu Ala Ala Leu Ala Arg His Arg Arg Ala
115 120 125
Gly His Thr Ile Val Leu Ile Ser Gly Ser Ala Arg Pro Leu Leu Thr
130 135 140
Pro Leu Ala Gln Asp Leu Gly Ala Asp Arg Ile Leu Cys Thr Glu Gln
145 150 155 160
Phe Ala Asp Ala Gln Gly Val Leu Thr Gly Glu Val Asn Arg Pro Met
165 170 175
Ile Gly Glu Ala Lys Ala Glu Ala Val Thr Glu Val Met Ala Lys Arg
180 185 190
Gly Val Val Pro Ala Asp Cys Phe Ala Tyr Gly Asp His Glu Ser Asp
195 200 205
Phe Gly Met Leu Gln Ala Val Gly Asn Pro Val Val Val Gly Thr Asp
210 215 220
Leu Val Leu Val Arg His Ala Gln Gly Ser Asn Trp Pro Val Leu Pro
225 230 235 240
Ala Asp Ala Gly Pro Arg Cys Ala Cys Ala Arg Arg Pro Gly Pro Leu
245 250 255
Gly His Asp Asp Pro Ser Ala Ile Gly
260 265
<210> 29
<211> 265
<212> PRT
<213> 链霉菌属的种E5N91 PH2
<400> 29
Met Met Pro Glu Pro Pro Arg Glu Arg Arg Thr Ala Ala Asn Arg Ser
1 5 10 15
Pro Ala Ile Arg Pro Ile Ala Phe Phe Asp Val Asp Glu Thr Leu Ile
20 25 30
Thr Ala Lys Ser Met Leu Asp Phe Ala Arg Gln Ala Pro His Ser Leu
35 40 45
Arg Asp Asp Ile Thr Ala Gln Ala Ser Gly Gln Arg His Ser Ala Asp
50 55 60
Ala Asp Leu Thr Ala Met Arg Arg Arg Gly Ala Ser Arg Val Glu Met
65 70 75 80
Asn Arg Val Tyr Tyr Arg Arg Tyr Ala Gly Val Ser Leu Ala Arg Leu
85 90 95
Gln Glu Ala Gly Arg Asp Trp Tyr His Ala Tyr Arg Thr Arg Pro Asp
100 105 110
Gly Tyr Val Arg Ala Gly Leu Ala Ala Leu Ala Arg His Arg Arg Ala
115 120 125
Gly His Thr Ile Val Leu Ile Ser Gly Ser Ala Arg Pro Leu Leu Thr
130 135 140
Pro Leu Ala Gln Asp Leu Gly Ala Asp Arg Ile Leu Cys Thr Glu Gln
145 150 155 160
Phe Ala Asp Ala Gln Gly Val Leu Thr Gly Glu Val Asp Arg Pro Met
165 170 175
Ile Gly Glu Ala Lys Ala Glu Ala Val Thr Glu Val Met Ala Lys Arg
180 185 190
Gly Val Val Ser Ala Asp Cys Phe Ala Tyr Gly Asp His Glu Ser Asp
195 200 205
Phe Gly Met Leu Gln Ala Val Gly Asn Pro Val Val Val Gly Thr Asp
210 215 220
Leu Val Leu Val Arg His Ala Gln Ala Ser Asn Trp Pro Val Leu Pro
225 230 235 240
Ala Asp Ala Gly Pro Arg Cys Ala Cys Ala Arg Arg Pro Gly Pro Leu
245 250 255
Gly His Asp Asp Pro Ser Ala Ile Gly
260 265
<210> 30
<211> 279
<212> PRT
<213> 链霉菌属的种NRRL S-31 PH3
<400> 30
Met Ser Ala Leu Arg His Glu Arg Arg Ala Ala Val Ser Arg Pro Val
1 5 10 15
Val Ile Arg His Ile Ala Phe Phe Asp Val Asp Glu Thr Leu Ile Thr
20 25 30
Ala Lys Ser Leu Leu Asp Phe Ala Gln Arg Val Pro His Gly Leu Trp
35 40 45
Glu Asp Glu Thr Gly Gln Pro Ile Glu Arg Leu Arg Ser Gly Glu Ile
50 55 60
Asp Leu Ala Ala Leu Gln Arg Ser Gly Ala Ser Arg Ala Glu Met Asn
65 70 75 80
Arg Ala Tyr Tyr Arg Arg Tyr Ala Gly Val Pro Leu Glu Arg Leu Gln
85 90 95
Lys Ala Gly Arg Asp Trp Tyr His Ala Tyr Arg Met Arg Pro Asp Gly
100 105 110
Tyr Ile Thr Ala Gly Leu Ala Ala Leu Ala Arg His Arg Arg Ala Gly
115 120 125
His Met Ile Val Leu Ile Ser Gly Ser Ala Arg Pro Leu Leu Thr Pro
130 135 140
Leu Ser Glu Asp Leu Gly Ala Asp Arg Ile Leu Cys Thr Glu Gln Leu
145 150 155 160
Asp Asp Ala Gln Gly Val Leu Thr Gly Glu Val Ala His Pro Met Val
165 170 175
Gly Glu Ala Lys Ala Glu Ala Val Thr Glu Val Met Ala Gln Leu Arg
180 185 190
Val Pro Thr Thr Asp Cys Phe Ala Tyr Gly Asp His Gly Ser Asp Leu
195 200 205
Asp Met Leu Gln Ala Val Gly Ser Pro Val Val Val Gly Thr Asp Pro
210 215 220
Val Leu Ala Arg His Ala Gln Ala Ser Asn Trp Pro Met Leu Pro Ala
225 230 235 240
Asp Ala Gly Pro Arg Ile Ala Arg Ala Gln His His Asp Thr Ser Ala
245 250 255
Gln Tyr Gly Pro Gln Val Ile Ala Leu Ala Ser Gly Arg Gly Ala Ala
260 265 270
Pro Arg Arg Gln Glu Arg Trp
275
<210> 31
<211> 244
<212> PRT
<213> 金黄色链霉菌（Streptomyces aureus）PH4
<400> 31
Met Asn Ala Ser Ile Ala Pro Ala Ala Phe Phe Asp Val Asp Glu Thr
1 5 10 15
Leu Val Asn Thr Lys Ser Met Phe His Phe Leu Arg Phe Trp Met Ala
20 25 30
Arg Gln Gly Asp Asp Gly Ser Gly His Glu Ala Val Met Ala Gly Val
35 40 45
Arg Arg Ala Ala Ala Ser Gly Val His Arg Ser Glu Ile Asn Arg Ala
50 55 60
Tyr Tyr Arg Arg Phe Ala Gly Val Pro Tyr Ala Ala Leu Leu Glu Ala
65 70 75 80
Gly Arg Asp Trp Trp Gln Glu Tyr Arg Arg Gly Ser Asp Ala Val Val
85 90 95
Val Pro Ala Trp Ala Ala Ala Thr Arg His Arg Lys Ala Gly His Leu
100 105 110
Val Val Leu Val Ser Gly Ser Phe Arg Gly Cys Leu Glu Pro Leu Ala
115 120 125
Gln Asp Leu Gly Ala His Arg Ile Leu Cys Ser Glu Pro Leu Val Asp
130 135 140
Thr Asp Gly Arg Leu Thr Gly Glu Val Val Arg Pro Met Ile Gly Ser
145 150 155 160
Val Lys Ala Asp Ala Val Arg Glu Thr Val Ala Glu Leu Gly Leu Thr
165 170 175
Ala Ala Asp Cys Ser Cys Tyr Gly Asp His Ser Ser Asp Leu Asp Met
180 185 190
Leu Gly Ala Val Gly Asn Pro Val Val Val Gly Gly Asp Arg Val Leu
195 200 205
Leu Glu His Ala Gln Arg Leu Asp Trp Pro Val Leu Pro Ala Thr Pro
210 215 220
Gly His Leu Pro Ser Pro Asp Ala Ser Pro Ala Arg Leu Leu Thr Ala
225 230 235 240
Ala Glu Arg Arg
<210> 32
<211> 237
<212> PRT
<213> 丁香糖丝菌（Saccharothrix syringae）PH5
<400> 32
Met Ser Thr Pro Pro Ala Val Ala Phe Phe Asp Val Asp Glu Thr Val
1 5 10 15
Ile Lys Val Lys Ser Met Phe Glu Phe Leu Arg His Trp Met Thr Ala
20 25 30
Gln Gly Asp Asp Gly Ser Ala Tyr Glu Ser Phe Met Ala Gly Val Arg
35 40 45
Glu Leu Ala Asp Ala Gly Val Pro Arg Ala Glu Val Asn Arg His Tyr
50 55 60
Tyr Arg Arg Tyr Ala Gly Ala Ser Ala Ala Asp Val Arg Ala Ala Gly
65 70 75 80
Glu Asp Trp Tyr Ala Ser Tyr Arg Arg Arg Pro Asp Gly Phe Leu Thr
85 90 95
Ala Thr Val Ala Ala Val Ala Ala His Arg Ala Ala Gly Asn Arg Val
100 105 110
Val Leu Val Ser Gly Ser Phe Leu Pro Val Leu Gly Pro Leu Met Ala
115 120 125
Asp Val Gly Ala Asp Glu Ala Leu Cys Gly Asp Pro Glu Val Gly Pro
130 135 140
Asp Gly Arg Tyr Thr Gly Ala Ile Ala Val Pro Met Ile Gly Glu Asn
145 150 155 160
Lys Thr Ala Ala Val Arg Ala Arg Met Ala Glu Leu Gly Val Asp Pro
165 170 175
Ala Asp Cys Tyr Ala Tyr Gly Asp His Gln Ser Asp Leu Gly Met Leu
180 185 190
Glu Ala Val Gly Asn Pro Val Val Val Gly Glu Asp Pro Val Leu Val
195 200 205
Gly Lys Ala Glu Ala Gly Gly Trp Arg Arg Leu Pro Ala Thr Thr Gly
210 215 220
Pro Leu Gly Val Pro Pro Arg Val Leu Ser Val Val Glu
225 230 235
<210> 33
<211> 248
<212> PRT
<213> 红球菌属的种（Rhodococcus sp.）MTM3W5.2 PH6
<400> 33
Met Thr His Thr Gly Ser Arg Pro Val Gln Val Ala Phe Phe Asp Val
1 5 10 15
Asp Glu Thr Leu Ile Thr Val Lys Ser Met Phe Ala Phe Leu Glu His
20 25 30
Trp Leu Arg Glu Arg Gly Asp Asp Gly Ser Glu Tyr Ser Arg Leu Leu
35 40 45
Ala Ala Leu Arg Arg Ala Ser Asp Glu Gly Ala Pro Arg Glu Glu Val
50 55 60
Asn Arg Ser Tyr Tyr Arg Thr Phe Arg Gly Val Pro Leu Val Glu Leu
65 70 75 80
Glu Glu Ser Gly Arg Arg Trp Tyr Arg Glu Phe Glu Ser Thr Ala Ala
85 90 95
Pro Tyr Tyr Ala Asp Thr Leu Ala Ala Leu Arg Asp His Arg Asp Ala
100 105 110
Gly Ala Ala Ile Val Leu Leu Ser Gly Ser Phe Ala Pro Ala Leu Gly
115 120 125
Pro Ile Gly Glu Ala Val Cys Ala Asp Arg Ile Val Ala Ser Arg Pro
130 135 140
Val Thr Asp Gly His Gly Val Leu Thr Gly Glu Val Glu Arg Pro Met
145 150 155 160
Ile Gly Lys Ala Lys Ala Glu Ala Val Thr Ser Val Leu Glu Glu Leu
165 170 175
Gly Ile Asp Thr Gly Asn Ser Tyr Gly Tyr Gly Asp His Asp Ser Asp
180 185 190
Leu Ala Phe Leu Glu Ala Val Gly His Pro Gly Leu Arg Gly Ser Asp
195 200 205
Pro Val Leu Arg Ala His Ala Ala Arg Asn Arg Trp Arg Val Leu Gly
210 215 220
Ser Ala Thr Thr Gly Leu Ala Gly Ala Val Pro Leu Leu Ala Ala Thr
225 230 235 240
Ser Thr Gly Gln Arg Gly Leu Arg
245
<210> 34
<211> 250
<212> PRT
<213> 红球菌属的种UNC363MFTsu5.1 PH7
<400> 34
Met Thr Gly Thr Gly Pro Arg Pro Gly Gln Val Ala Phe Phe Asp Val
1 5 10 15
Asp Glu Thr Leu Ile Thr Val Lys Ser Met Phe Ala Phe Leu Glu His
20 25 30
Trp Leu Trp Glu Arg Gly Asp Asp Gly Ser Glu Tyr Ala Arg Leu Leu
35 40 45
Gly Ala Leu Arg Arg Gln Ser Asp Glu Gly Ala Pro Arg Glu Glu Val
50 55 60
Asn Arg Ser Tyr Tyr Arg Thr Phe Arg Gly Val Pro Leu Val Glu Leu
65 70 75 80
Glu Glu Ser Gly Arg Arg Trp Tyr Arg Glu Phe Glu Ser Thr Asn Ala
85 90 95
Pro Tyr Tyr Ala Ala Thr Leu Ala Ala Leu His Ala His Arg Glu Ala
100 105 110
Gly Ala Ala Ile Val Leu Leu Ser Gly Ser Phe Ala Pro Ala Leu Val
115 120 125
Pro Ile Gly Glu Ala Val Gly Ala Asp Arg Ile Val Ala Ser Arg Pro
130 135 140
Val Thr Asp Gln Gly Gly Val Leu Thr Gly Glu Val Glu Arg Pro Met
145 150 155 160
Ile Gly Gln Ala Lys Ala Glu Ala Val Thr Ser Val Gln Ala Glu Leu
165 170 175
Gly Val Asp Ala Glu Asn Ser Tyr Gly Tyr Gly Asp His Glu Ser Asp
180 185 190
Leu Ala Phe Leu Glu Ala Val Gly His Pro Gly Leu Arg Gly Asp Asp
195 200 205
Gln Val Leu Leu Ala Arg Ala Ala Arg Asp Arg Trp Arg Ser Leu Gly
210 215 220
Ser Glu Thr Thr Gly Leu Ala Gly Ala Gly Pro Leu Ala Gly Ser Ala
225 230 235 240
Ser Ala Gly Leu Ala Gln Arg Gly Ile Leu
245 250
<210> 35
<211> 217
<212> PRT
<213> 瓦姆波德布丘氏菌（Buttiauxella warmboldiae）PH8
<400> 35
Met His Thr Ser Ala Ala Phe Phe Asp Val Asp Glu Thr Leu Ile Thr
1 5 10 15
Val Lys Ser Met Phe Asp Phe Tyr Asp Phe Trp Cys Arg Glu Asn Asn
20 25 30
Glu Tyr Asp Lys Leu Gln Arg Tyr Met Thr Asp Phe Arg Ser Ala Val
35 40 45
Lys Asn Gly Thr Pro Arg Glu Gln Leu Asn Arg Glu Tyr Tyr Arg Gln
50 55 60
Phe Ala Gly Val Asn Tyr Lys Asp Leu Glu Glu Ala Gly Lys Asn Trp
65 70 75 80
Phe Arg Gly Lys Lys Leu Asp Ser Glu Leu Phe Ile Ser Ser Ala Val
85 90 95
Ala Ala Leu Lys Lys His Gln Ala Asn Asn Met Phe Ile Val Phe Ile
100 105 110
Ser Gly Ser Met His Pro Val Leu Ser Pro Val Ala Asn Tyr Leu Gly
115 120 125
Val Thr Asp Ile Leu Cys Thr Pro Leu Glu Leu Thr Gly Glu Gly Ile
130 135 140
Ile Thr Gly Glu Ile Gly Thr Pro Gln Thr Ile Gly Ile Gly Lys Lys
145 150 155 160
Glu Ala Leu Ile Asn Phe Cys Ser Gln Lys Lys Ile Ser Ala Ala Asp
165 170 175
Cys Tyr Ala Tyr Gly Asp Asp Leu Ser Asp Ile Pro Met Leu Glu Ser
180 185 190
Val Gly Tyr Pro Val Cys Val Gly Lys Tyr Thr Glu Leu Ala Arg His
195 200 205
Ala Ile Asn Gln Arg Trp Pro Val Ile
210 215
<210> 36
<211> 219
<212> PRT
<213> Chania multitudinisentens PH9
<400> 36
Met Arg Gln Thr Ala Phe Tyr Asp Val Asp Asp Thr Leu Ile Asn Ile
1 5 10 15
Lys Ser Met Phe Asp Phe Phe Gln Phe Trp Ala Ser Glu Asn Gly Leu
20 25 30
Ile Ser Gln Gln Glu Gln Phe Asp Ser Gln Phe Ser Val Leu Ala Arg
35 40 45
Lys Met Ser Ser Arg Glu Glu Leu Asn Arg Ala Tyr Tyr Arg Phe Phe
50 55 60
Lys Gly Val Pro Leu Leu Lys Ile Glu Gln Cys Ala Glu Arg Trp Phe
65 70 75 80
Lys Asn Ser Phe Ser Asn Thr Glu Ile Phe Ile Ser Tyr Thr Leu Lys
85 90 95
Ser Ile Leu Ala His Arg Val Leu Gly His Asn Ile Val Leu Val Ser
100 105 110
Gly Ser Met Thr Pro Leu Leu Lys Pro Ile Ala Gln Leu Leu Gly Ile
115 120 125
Thr Asp Ile Leu Cys Thr Lys Leu Ala Thr Asp Gln Ser Gly Val Val
130 135 140
Thr Gly Glu Ile Leu Glu Thr Gln Thr Ile Gly Glu Gly Lys Ala Ile
145 150 155 160
Val Ile Arg Gln Tyr Ala Leu Glu Asn Asp Ile Asn Leu Ser Ala Cys
165 170 175
Phe Ala Tyr Gly Asp Asp Val Ser Asp Ile Pro Met Leu Ala Cys Val
180 185 190
Gly His Pro Ile Cys Ile Gly Glu Gly Thr Ala Leu Ser His Tyr Ala
195 200 205
Ser Asn Asn Asn Trp Pro Ile Val Arg Val Glu
210 215
<210> 37
<211> 222
<212> PRT
<213> 生孢甲基弯曲菌（Methylosinus sporium）PH10
<400> 37
Met Met Glu His Arg Ser Phe Ala Phe Phe Asp Val Asp Glu Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Ile Lys Ser Met Phe Asp Phe Phe Pro Phe Trp Cys Lys Trp
20 25 30
Ile Gly Ala Ala Pro Glu Ala Tyr Ser Arg Phe Glu Thr Glu Ile Ala
35 40 45
Ser Ala Ile Ala Arg His Ala Thr Arg Glu Glu Leu Asn Arg Leu Tyr
50 55 60
Tyr Arg Ser Phe Arg Gly Ala Gln Leu Pro Val Leu Glu Ala Ala Gly
65 70 75 80
Ala Ala Trp Phe Leu Gln Arg Phe Gly Arg Ser Pro Pro Tyr Arg Lys
85 90 95
His Val Val Ala Arg Leu Glu Lys His Arg Gln Glu Gly Val Val Pro
100 105 110
Val Leu Val Ser Gly Ser Met Arg Pro Leu Leu Arg Pro Ile Ala Arg
115 120 125
Glu Leu Gln Ala Glu His Cys Leu Cys Thr Gln Leu Val Val Asp Glu
130 135 140
Ser Gly Arg Leu Thr Gly Glu Ile Gly Ser Pro Gln Thr Ile Gly Glu
145 150 155 160
Gly Lys Ala Glu Ala Ile Arg Ala Phe Leu Arg Glu Gln Gly Gly Arg
165 170 175
Pro Ala Asp Cys Leu Ala Tyr Gly Asp Asp Ile Ser Asp Leu Ala Met
180 185 190
Leu Glu Leu Val Gly Ala Pro Val Val Val Gly Ala Gln Pro Asp Leu
195 200 205
Leu Ser Ile Cys Arg Gln Arg Asp Trp Pro Tyr Leu Pro Leu
210 215 220
<210> 38
<211> 216
<212> PRT
<213> 产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）PH11
<400> 38
Met Gln Gln Ala Ala Ala Phe Phe Asp Val Asp Glu Thr Leu Ile Asn
1 5 10 15
Ile Lys Ser Met Phe Asp Phe Phe Asp Phe Trp Cys Lys Glu Asn Asn
20 25 30
Glu Pro Ile Lys Leu His Lys Tyr Met Ala Asn Phe Gln Ser Glu Val
35 40 45
Lys Lys Gly Ile Pro Arg Glu His Leu Asn Arg Glu Tyr Tyr Arg Gln
50 55 60
Phe Ala Gly Ile Ser Tyr Lys Ala Leu Glu Glu Ala Gly Glu Lys Trp
65 70 75 80
Phe Arg Phe Lys Leu Asn Ser Glu Leu Phe Ile Gly Ser Ala Val Ser
85 90 95
Ala Leu Lys Lys His Gln Ala Glu Asn Met Asp Ile Val Phe Ile Ser
100 105 110
Gly Ser Met Leu Pro Val Leu Ser Pro Val Ala Arg Tyr Leu Gly Val
115 120 125
Lys Asp Ile Leu Cys Thr Pro Leu Lys Phe Thr Ala Ala Gly Glu Met
130 135 140
Thr Gly Glu Ile Gly Tyr Pro Gln Thr Ile Gly Asp Gly Lys Lys Asp
145 150 155 160
Ala Leu Leu Gln Phe Cys Glu Gln Arg Asn Ile Asn Pro Ser Asp Cys
165 170 175
Tyr Ala Tyr Gly Asp Asp Leu Ser Asp Ile Pro Met Leu Ala Ser Thr
180 185 190
Gly His Pro Val Cys Val Gly Lys His Ser Ala Leu Ala Arg His Ala
195 200 205
Ile Thr His Arg Trp Gln Val Ile
210 215
<210> 39
<211> 223
<212> PRT
<213> 沙雷氏菌属（Serratia）PH12
<400> 39
Met Thr Ser Ala Ala Ala Phe Phe Asp Val Asp Glu Thr Leu Ile Lys
1 5 10 15
Met Lys Ser Met Phe His Phe Tyr His Tyr Trp Ser Asn Val Arg Gly
20 25 30
Asn Gln Lys Ala Tyr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gln Gln Ala Val
35 40 45
Ala Glu Gly Val Pro Arg Glu Val Leu Asn Arg Met Tyr Tyr Arg Gln
50 55 60
Phe Ser Gly Ile Asp Ile Asp Asp Val Tyr Gln Val Ala Glu Asp Trp
65 70 75 80
Phe His Lys Tyr Leu His Glu Lys Glu Ala Tyr Ile Ala Ser Ala Val
85 90 95
Asp Arg Phe Gln Arg His Lys Ile Ser Gly His Leu Thr Val Phe Ile
100 105 110
Ser Gly Ser Met Leu Pro Leu Leu Lys Pro Leu Gly Gln Arg Leu Gly
115 120 125
Ala Asp Ala Ile Leu Cys Thr Gln Leu Leu Leu Asp Ala Lys Gly Lys
130 135 140
Leu Thr Gly Glu Ile Gly Glu Pro Gln Thr Ile Gly Gln Gly Lys Gln
145 150 155 160
Arg Ala Leu Leu Ser Phe Ser Gln Ser His His Ile Asp Leu Ala Lys
165 170 175
Ser Phe Ala Tyr Gly Asp Asp Leu Ser Asp Ile Pro Met Leu Ala Ala
180 185 190
Thr Gly Asn Pro Val Cys Val Gly Glu His Ser Asn Leu Ala Glu Tyr
195 200 205
Ala Arg Arg Asn Asn Trp Asn Met Leu Ala Glu Asn Ala Thr Asn
210 215 220
<210> 40
<211> 317
<212> PRT
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）ycr015c PH13
<400> 40
Met Lys Thr Ile Ile Ile Ser Asp Phe Asp Glu Thr Ile Thr Arg Val
1 5 10 15
Asp Thr Ile Cys Thr Ile Ala Lys Leu Pro Tyr Leu Leu Asn Pro Arg
20 25 30
Leu Lys Pro Glu Trp Gly His Phe Thr Lys Thr Tyr Met Asp Gly Tyr
35 40 45
His Lys Tyr Lys Tyr Asn Gly Thr Arg Ser Leu Pro Leu Leu Ser Ser
50 55 60
Gly Val Pro Thr Ile Ile Ser Gln Ser Asn Phe Asn Lys Leu Phe Ala
65 70 75 80
Asp Glu Leu Lys Tyr Gln Asn His Asn Arg Val Val Glu Leu Asn Ser
85 90 95
Val Asn Glu Ile Thr Lys Gln Gln Ile Phe Lys Ser Ile Ser Leu Asp
100 105 110
Gln Met Lys Thr Phe Ala Arg Asp Gln Asn His Glu Asp Cys Leu Leu
115 120 125
Arg Asp Gly Phe Lys Thr Phe Cys Ser Ser Val Val Lys Asn Phe Glu
130 135 140
Ser Asp Phe Tyr Val Leu Ser Ile Asn Trp Ser Lys Glu Phe Ile His
145 150 155 160
Glu Val Ile Gly Asp Arg Arg Leu Lys Asn Ser His Ile Phe Cys Asn
165 170 175
Asp Leu Lys Lys Val Ser Asp Lys Cys Ser Gln Ser Tyr Asn Gly Glu
180 185 190
Phe Asp Cys Arg Leu Leu Thr Gly Ser Asp Lys Val Lys Ile Leu Gly
195 200 205
Glu Ile Leu Asp Lys Ile Asp Ser Gly Cys Asn Lys Glu Gly Asn Ser
210 215 220
Cys Ser Tyr Trp Tyr Ile Gly Asp Ser Glu Thr Asp Leu Leu Ser Ile
225 230 235 240
Leu His Pro Ser Thr Asn Gly Val Leu Leu Ile Asn Pro Gln Glu Asn
245 250 255
Pro Ser Lys Phe Ile Lys Ile Thr Glu Lys Ile Ile Gly Ile Pro Lys
260 265 270
Asp Lys Ile Ser Ser Phe Glu Ala Asp Asn Gly Pro Ala Trp Leu Gln
275 280 285
Phe Cys Glu Lys Glu Gly Gly Lys Gly Ala Tyr Leu Val Lys Ser Trp
290 295 300
Asp Ser Leu Lys Asp Leu Ile Met Gln Val Thr Lys Met
305 310 315
<210> 41
<211> 312
<212> PRT
<213> 酿酒酵母ydl236w PH14
<400> 41
Met Thr Ala Gln Gln Gly Val Pro Ile Lys Ile Thr Asn Lys Glu Ile
1 5 10 15
Ala Gln Glu Phe Leu Asp Lys Tyr Asp Thr Phe Leu Phe Asp Cys Asp
20 25 30
Gly Val Leu Trp Leu Gly Ser Gln Ala Leu Pro Tyr Thr Leu Glu Ile
35 40 45
Leu Asn Leu Leu Lys Gln Leu Gly Lys Gln Leu Ile Phe Val Thr Asn
50 55 60
Asn Ser Thr Lys Ser Arg Leu Ala Tyr Thr Lys Lys Phe Ala Ser Phe
65 70 75 80
Gly Ile Asp Val Lys Glu Glu Gln Ile Phe Thr Ser Gly Tyr Ala Ser
85 90 95
Ala Val Tyr Ile Arg Asp Phe Leu Lys Leu Gln Pro Gly Lys Asp Lys
100 105 110
Val Trp Val Phe Gly Glu Ser Gly Ile Gly Glu Glu Leu Lys Leu Met
115 120 125
Gly Tyr Glu Ser Leu Gly Gly Ala Asp Ser Arg Leu Asp Thr Pro Phe
130 135 140
Asp Ala Ala Lys Ser Pro Phe Leu Val Asn Gly Leu Asp Lys Asp Val
145 150 155 160
Ser Cys Val Ile Ala Gly Leu Asp Thr Lys Val Asn Tyr His Arg Leu
165 170 175
Ala Val Thr Leu Gln Tyr Leu Gln Lys Asp Ser Val His Phe Val Gly
180 185 190
Thr Asn Val Asp Ser Thr Phe Pro Gln Lys Gly Tyr Thr Phe Pro Gly
195 200 205
Ala Gly Ser Met Ile Glu Ser Leu Ala Phe Ser Ser Asn Arg Arg Pro
210 215 220
Ser Tyr Cys Gly Lys Pro Asn Gln Asn Met Leu Asn Ser Ile Ile Ser
225 230 235 240
Ala Phe Asn Leu Asp Arg Ser Lys Cys Cys Met Val Gly Asp Arg Leu
245 250 255
Asn Thr Asp Met Lys Phe Gly Val Glu Gly Gly Leu Gly Gly Thr Leu
260 265 270
Leu Val Leu Ser Gly Ile Glu Thr Glu Glu Arg Ala Leu Lys Ile Ser
275 280 285
His Asp Tyr Pro Arg Pro Lys Phe Tyr Ile Asp Lys Leu Gly Asp Ile
290 295 300
Tyr Thr Leu Thr Asn Asn Glu Leu
305 310
<210> 42
<211> 321
<212> PRT
<213> 酿酒酵母ydl236w PH15
<400> 42
Met Thr Ile Ala Lys Asp Tyr Arg Thr Ile Tyr Arg Asn Gln Ile Lys
1 5 10 15
Lys Gln Ile Arg Leu Asn Gln Glu His Leu Gln Ser Leu Thr His Leu
20 25 30
Gly Ser Gln Ile Asn Phe Glu Val Asp Pro Pro Lys Leu Pro Asp Pro
35 40 45
Asp Pro Ala Arg Lys Val Phe Phe Phe Asp Ile Asp Asn Thr Leu Tyr
50 55 60
Arg Lys Ser Thr Lys Val Gln Leu Leu Met Gln Gln Ser Leu Ser Asn
65 70 75 80
Phe Phe Lys Tyr Glu Leu Gly Phe Asp Asp Asp Glu Ala Glu Arg Leu
85 90 95
Ile Glu Ser Tyr Tyr Gln Glu Tyr Gly Leu Ser Val Lys Gly Leu Ile
100 105 110
Lys Asn Lys Gln Ile Asp Asp Val Leu Gln Tyr Asn Thr Phe Ile Asp
115 120 125
Asp Ser Leu Pro Leu Gln Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Trp Lys Leu Arg
130 135 140
Glu Leu Leu Ile Asn Leu Lys Lys Lys Lys Leu Gly Lys Phe Asp Lys
145 150 155 160
Leu Trp Leu Phe Thr Asn Ser Tyr Lys Asn His Ala Ile Arg Cys Val
165 170 175
Lys Ile Leu Gly Ile Ala Asp Leu Phe Asp Gly Ile Thr Tyr Cys His
180 185 190
Tyr Asp Arg Pro Ile Glu Glu Glu Phe Ile Cys Lys Pro Asp Pro Lys
195 200 205
Phe Phe Glu Thr Ala Lys Leu Gln Ser Gly Leu Ser Ser Phe Ala Asn
210 215 220
Ala Trp Phe Ile Asp Asp Asn Glu Ser Asn Val Arg Ser Ala Leu Ser
225 230 235 240
Met Gly Met Gly His Val Ile His Leu Ile Glu Asp Tyr Gln Tyr Glu
245 250 255
Ser Glu Asn Ile Val Thr Lys Asp His Lys Asn Lys Gln Gln Phe Ser
260 265 270
Ile Leu Lys Asp Ile Leu Glu Ile Pro Leu Ile Met Asp Val Glu Val
275 280 285
Tyr Arg Pro Ser Ser Ile Ala Ile Lys Glu Met Glu Glu Leu Glu Glu
290 295 300
Glu Gly Glu Ala Val Asn Trp Ser Asn Gln Gln Ile Asn Val Gln Ser
305 310 315 320
Ser
<210> 43
<211> 250
<212> PRT
<213> 酿酒酵母yer062c PH16
<400> 43
Met Gly Leu Thr Thr Lys Pro Leu Ser Leu Lys Val Asn Ala Ala Leu
1 5 10 15
Phe Asp Val Asp Gly Thr Ile Ile Ile Ser Gln Pro Ala Ile Ala Ala
20 25 30
Phe Trp Arg Asp Phe Gly Lys Asp Lys Pro Tyr Phe Asp Ala Glu His
35 40 45
Val Ile Gln Val Ser His Gly Trp Arg Thr Phe Asp Ala Ile Ala Lys
50 55 60
Phe Ala Pro Asp Phe Ala Asn Glu Glu Tyr Val Asn Lys Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Ile Pro Val Lys Tyr Gly Glu Lys Ser Ile Glu Val Pro Gly Ala
85 90 95
Val Lys Leu Cys Asn Ala Leu Asn Ala Leu Pro Lys Glu Lys Trp Ala
100 105 110
Val Ala Thr Ser Gly Thr Arg Asp Met Ala Gln Lys Trp Phe Glu His
115 120 125
Leu Gly Ile Arg Arg Pro Lys Tyr Phe Ile Thr Ala Asn Asp Val Lys
130 135 140
Gln Gly Lys Pro His Pro Glu Pro Tyr Leu Lys Gly Arg Asn Gly Leu
145 150 155 160
Gly Tyr Pro Ile Asn Glu Gln Asp Pro Ser Lys Ser Lys Val Val Val
165 170 175
Phe Glu Asp Ala Pro Ala Gly Ile Ala Ala Gly Lys Ala Ala Gly Cys
180 185 190
Lys Ile Ile Gly Ile Ala Thr Thr Phe Asp Leu Asp Phe Leu Lys Glu
195 200 205
Lys Gly Cys Asp Ile Ile Val Lys Asn His Glu Ser Ile Arg Val Gly
210 215 220
Gly Tyr Asn Ala Glu Thr Asp Glu Val Glu Phe Ile Phe Asp Asp Tyr
225 230 235 240
Leu Tyr Ala Lys Asp Asp Leu Leu Lys Trp
245 250
<210> 44
<211> 254
<212> PRT
<213> 酿酒酵母yfl045c PH17
<400> 44
Met Ser Ile Ala Glu Phe Ala Tyr Lys Glu Lys Pro Glu Thr Leu Val
1 5 10 15
Leu Phe Asp Val Asp Gly Thr Leu Thr Pro Ala Arg Leu Thr Val Ser
20 25 30
Glu Glu Val Arg Lys Thr Leu Ala Lys Leu Arg Asn Lys Cys Cys Ile
35 40 45
Gly Phe Val Gly Gly Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Gln Leu Gly
50 55 60
Pro Asn Val Leu Asp Glu Phe Asp Tyr Ser Phe Ser Glu Asn Gly Leu
65 70 75 80
Thr Ala Tyr Arg Leu Gly Lys Glu Leu Ala Ser Gln Ser Phe Ile Asn
85 90 95
Trp Leu Gly Glu Glu Lys Tyr Asn Lys Leu Ala Val Phe Ile Leu Arg
100 105 110
Tyr Leu Ser Glu Ile Asp Leu Pro Lys Arg Arg Gly Thr Phe Leu Glu
115 120 125
Phe Arg Asn Gly Met Ile Asn Val Ser Pro Ile Gly Arg Asn Ala Ser
130 135 140
Thr Glu Glu Arg Asn Glu Phe Glu Arg Tyr Asp Lys Glu His Gln Ile
145 150 155 160
Arg Ala Lys Phe Val Glu Ala Leu Lys Lys Glu Phe Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
Leu Thr Phe Ser Ile Gly Gly Gln Ile Ser Phe Asp Val Phe Pro Ala
180 185 190
Gly Trp Asp Lys Thr Tyr Cys Leu Gln His Val Glu Lys Asp Gly Phe
195 200 205
Lys Glu Ile His Phe Phe Gly Asp Lys Thr Met Val Gly Gly Asn Asp
210 215 220
Tyr Glu Ile Phe Val Asp Glu Arg Thr Ile Gly His Ser Val Gln Ser
225 230 235 240
Pro Asp Asp Thr Val Lys Ile Leu Thr Glu Leu Phe Asn Leu
245 250
<210> 45
<211> 280
<212> PRT
<213> 酿酒酵母ygl224c PH18
<400> 45
Met Thr Val Glu Tyr Thr Ala Ser Asp Leu Ala Thr Tyr Gln Asn Glu
1 5 10 15
Val Asn Glu Gln Ile Ala Lys Asn Lys Ala His Leu Glu Ser Leu Thr
20 25 30
His Pro Gly Ser Lys Val Thr Phe Pro Ile Asp Gln Asp Ile Ser Ala
35 40 45
Thr Pro Gln Asn Pro Asn Leu Lys Val Phe Phe Phe Asp Ile Asp Asn
50 55 60
Cys Leu Tyr Lys Ser Ser Thr Arg Ile His Asp Leu Met Gln Gln Ser
65 70 75 80
Ile Leu Arg Phe Phe Gln Thr His Leu Lys Leu Ser Pro Glu Asp Ala
85 90 95
His Val Leu Asn Asn Ser Tyr Tyr Lys Glu Tyr Gly Leu Ala Ile Arg
100 105 110
Gly Leu Val Met Phe His Lys Val Asn Ala Leu Glu Tyr Asn Arg Leu
115 120 125
Val Asp Asp Ser Leu Pro Leu Gln Asp Ile Leu Lys Pro Asp Ile Pro
130 135 140
Leu Arg Asn Met Leu Leu Arg Leu Arg Gln Ser Gly Lys Ile Asp Lys
145 150 155 160
Leu Trp Leu Phe Thr Asn Ala Tyr Lys Asn His Ala Ile Arg Cys Leu
165 170 175
Arg Leu Leu Gly Ile Ala Asp Leu Phe Asp Gly Leu Thr Tyr Cys Asp
180 185 190
Tyr Ser Arg Thr Asp Thr Leu Val Cys Lys Pro His Val Lys Ala Phe
195 200 205
Glu Lys Ala Met Lys Glu Ser Gly Leu Ala Arg Tyr Glu Asn Ala Tyr
210 215 220
Phe Ile Asp Asp Ser Gly Lys Asn Ile Glu Thr Gly Ile Lys Leu Gly
225 230 235 240
Met Lys Thr Cys Ile His Leu Val Glu Asn Glu Val Asn Glu Ile Leu
245 250 255
Gly Gln Thr Pro Glu Gly Ala Ile Val Ile Ser Asp Ile Leu Glu Leu
260 265 270
Pro His Val Val Ser Asp Leu Phe
275 280
<210> 46
<211> 246
<212> PRT
<213> 酿酒酵母yhr043c PH19
<400> 46
Met Pro Gln Phe Ser Val Asp Leu Cys Leu Phe Asp Leu Asp Gly Thr
1 5 10 15
Ile Val Ser Thr Thr Thr Ala Ala Glu Ser Ala Trp Lys Lys Leu Cys
20 25 30
Arg Gln His Gly Val Asp Pro Val Glu Leu Phe Lys His Ser His Gly
35 40 45
Ala Arg Ser Gln Glu Met Met Lys Lys Phe Phe Pro Lys Leu Asp Asn
50 55 60
Thr Asp Asn Lys Gly Val Leu Ala Leu Glu Lys Asp Met Ala Asp Asn
65 70 75 80
Tyr Leu Asp Thr Val Ser Leu Ile Pro Gly Ala Glu Asn Leu Leu Leu
85 90 95
Ser Leu Asp Val Asp Thr Glu Thr Gln Lys Lys Leu Pro Glu Arg Lys
100 105 110
Trp Ala Ile Val Thr Ser Gly Ser Pro Tyr Leu Ala Phe Ser Trp Phe
115 120 125
Glu Thr Ile Leu Lys Asn Val Gly Lys Pro Lys Val Phe Ile Thr Gly
130 135 140
Phe Asp Val Lys Asn Gly Lys Pro Asp Pro Glu Gly Tyr Ser Arg Ala
145 150 155 160
Arg Asp Leu Leu Arg Gln Asp Leu Gln Leu Thr Gly Lys Gln Asp Leu
165 170 175
Lys Tyr Val Val Phe Glu Asp Ala Pro Val Gly Ile Lys Ala Gly Lys
180 185 190
Ala Met Gly Ala Ile Thr Val Gly Ile Thr Ser Ser Tyr Asp Lys Ser
195 200 205
Val Leu Phe Asp Ala Gly Ala Asp Tyr Val Val Cys Asp Leu Thr Gln
210 215 220
Val Ser Val Val Lys Asn Asn Glu Asn Gly Ile Val Ile Gln Val Asn
225 230 235 240
Asn Pro Leu Thr Arg Asp
245
<210> 47
<211> 246
<212> PRT
<213> 酿酒酵母yhr044c PH20
<400> 47
Met Ala Glu Phe Ser Ala Asp Leu Cys Leu Phe Asp Leu Asp Gly Thr
1 5 10 15
Ile Val Ser Thr Thr Val Ala Ala Glu Lys Ala Trp Thr Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Glu Tyr Gly Val Asp Pro Ser Glu Leu Phe Lys His Ser His Gly
35 40 45
Ala Arg Thr Gln Glu Val Leu Arg Arg Phe Phe Pro Lys Leu Asp Asp
50 55 60
Thr Asp Asn Lys Gly Val Leu Ala Leu Glu Lys Asp Ile Ala His Ser
65 70 75 80
Tyr Leu Asp Thr Val Ser Leu Ile Pro Gly Ala Glu Asn Leu Leu Leu
85 90 95
Ser Leu Asp Val Asp Thr Glu Thr Gln Lys Lys Leu Pro Glu Arg Lys
100 105 110
Trp Ala Ile Val Thr Ser Gly Ser Pro Tyr Leu Ala Phe Ser Trp Phe
115 120 125
Glu Thr Ile Leu Lys Asn Val Gly Lys Pro Lys Val Phe Ile Thr Gly
130 135 140
Phe Asp Val Lys Asn Gly Lys Pro Asp Pro Glu Gly Tyr Ser Arg Ala
145 150 155 160
Arg Asp Leu Leu Arg Gln Asp Leu Gln Leu Thr Gly Lys Gln Asp Leu
165 170 175
Lys Tyr Val Val Phe Glu Asp Ala Pro Val Gly Ile Lys Ala Gly Lys
180 185 190
Ala Met Gly Ala Ile Thr Val Gly Ile Thr Ser Ser Tyr Asp Lys Ser
195 200 205
Val Leu Phe Asp Ala Gly Ala Asp Tyr Val Val Cys Asp Leu Thr Gln
210 215 220
Val Ser Val Val Lys Asn Asn Glu Asn Gly Ile Val Ile Gln Val Asn
225 230 235 240
Asn Pro Leu Thr Arg Ala
245
<210> 48
<211> 250
<212> PRT
<213> 酿酒酵母yil053w PH21
<400> 48
Met Pro Leu Thr Thr Lys Pro Leu Ser Leu Lys Ile Asn Ala Ala Leu
1 5 10 15
Phe Asp Val Asp Gly Thr Ile Ile Ile Ser Gln Pro Ala Ile Ala Ala
20 25 30
Phe Trp Arg Asp Phe Gly Lys Asp Lys Pro Tyr Phe Asp Ala Glu His
35 40 45
Val Ile His Ile Ser His Gly Trp Arg Thr Tyr Asp Ala Ile Ala Lys
50 55 60
Phe Ala Pro Asp Phe Ala Asp Glu Glu Tyr Val Asn Lys Leu Glu Gly
65 70 75 80
Glu Ile Pro Glu Lys Tyr Gly Glu His Ser Ile Glu Val Pro Gly Ala
85 90 95
Val Lys Leu Cys Asn Ala Leu Asn Ala Leu Pro Lys Glu Lys Trp Ala
100 105 110
Val Ala Thr Ser Gly Thr Arg Asp Met Ala Lys Lys Trp Phe Asp Ile
115 120 125
Leu Lys Ile Lys Arg Pro Glu Tyr Phe Ile Thr Ala Asn Asp Val Lys
130 135 140
Gln Gly Lys Pro His Pro Glu Pro Tyr Leu Lys Gly Arg Asn Gly Leu
145 150 155 160
Gly Phe Pro Ile Asn Glu Gln Asp Pro Ser Lys Ser Lys Val Val Val
165 170 175
Phe Glu Asp Ala Pro Ala Gly Ile Ala Ala Gly Lys Ala Ala Gly Cys
180 185 190
Lys Ile Val Gly Ile Ala Thr Thr Phe Asp Leu Asp Phe Leu Lys Glu
195 200 205
Lys Gly Cys Asp Ile Ile Val Lys Asn His Glu Ser Ile Arg Val Gly
210 215 220
Glu Tyr Asn Ala Glu Thr Asp Glu Val Glu Leu Ile Phe Asp Asp Tyr
225 230 235 240
Leu Tyr Ala Lys Asp Asp Leu Leu Lys Trp
245 250
<210> 49
<211> 352
<212> PRT
<213> 酿酒酵母ykr070w PH22
<400> 49
Met Ile Gly Lys Arg Phe Phe Gln Thr Thr Ser Lys Lys Ile Ala Phe
1 5 10 15
Ala Phe Asp Ile Asp Gly Val Leu Phe Arg Gly Lys Lys Pro Ile Ala
20 25 30
Gly Ala Ser Asp Ala Leu Lys Leu Leu Asn Arg Asn Lys Ile Pro Tyr
35 40 45
Ile Leu Leu Thr Asn Gly Gly Gly Phe Ser Glu Arg Ala Arg Thr Glu
50 55 60
Phe Ile Ser Ser Lys Leu Asp Val Asp Val Ser Pro Leu Gln Ile Ile
65 70 75 80
Gln Ser His Thr Pro Tyr Lys Ser Leu Val Asn Lys Tyr Ser Arg Ile
85 90 95
Leu Ala Val Gly Thr Pro Ser Val Arg Gly Val Ala Glu Gly Tyr Gly
100 105 110
Phe Gln Asp Val Val His Gln Thr Asp Ile Val Arg Tyr Asn Arg Asp
115 120 125
Ile Ala Pro Phe Ser Gly Leu Ser Asp Glu Gln Val Met Glu Tyr Ser
130 135 140
Arg Asp Ile Pro Asp Leu Thr Thr Lys Lys Phe Asp Ala Val Leu Val
145 150 155 160
Phe Asn Asp Pro His Asp Trp Ala Ala Asp Ile Gln Ile Ile Ser Asp
165 170 175
Ala Ile Asn Ser Glu Asn Gly Met Leu Asn Thr Leu Arg Asn Glu Lys
180 185 190
Ser Gly Lys Pro Ser Ile Pro Ile Tyr Phe Ser Asn Gln Asp Leu Leu
195 200 205
Trp Ala Asn Pro Tyr Lys Leu Asn Arg Phe Gly Gln Gly Ala Phe Arg
210 215 220
Leu Leu Val Arg Arg Leu Tyr Leu Glu Leu Asn Gly Glu Pro Leu Gln
225 230 235 240
Asp Tyr Thr Leu Gly Lys Pro Thr Lys Leu Thr Tyr Asp Phe Ala His
245 250 255
His Val Leu Ile Asp Trp Glu Lys Arg Leu Ser Gly Lys Ile Gly Gln
260 265 270
Ser Val Lys Gln Lys Leu Pro Leu Leu Gly Thr Lys Pro Ser Thr Ser
275 280 285
Pro Phe His Ala Val Phe Met Val Gly Asp Asn Pro Ala Ser Asp Ile
290 295 300
Ile Gly Ala Gln Asn Tyr Gly Trp Asn Ser Cys Leu Val Lys Thr Gly
305 310 315 320
Val Tyr Asn Glu Gly Asp Asp Leu Lys Glu Cys Lys Pro Thr Leu Ile
325 330 335
Val Asn Asp Val Phe Asp Ala Val Thr Lys Thr Leu Glu Lys Tyr Ala
340 345 350
<210> 50
<211> 241
<212> PRT
<213> 酿酒酵母ynl010w PH23
<400> 50
Met Val Lys Ala Val Ile Phe Thr Asp Phe Asp Gly Thr Val Thr Leu
1 5 10 15
Glu Asp Ser Asn Asp Tyr Leu Thr Asp Thr Leu Gly Phe Gly Lys Glu
20 25 30
Lys Arg Leu Lys Val Phe Glu Gly Val Leu Asp Asp Thr Lys Ser Phe
35 40 45
Arg Gln Gly Phe Met Glu Met Leu Glu Ser Ile His Thr Pro Phe Pro
50 55 60
Glu Cys Ile Lys Ile Leu Glu Lys Lys Ile Arg Leu Asp Pro Gly Phe
65 70 75 80
Lys Asp Thr Phe Glu Trp Ala Gln Glu Asn Asp Val Pro Val Ile Val
85 90 95
Val Ser Ser Gly Met Lys Pro Ile Ile Lys Val Leu Leu Thr Arg Leu
100 105 110
Val Gly Gln Glu Ser Ile His Lys Ile Asp Ile Val Ser Asn Glu Val
115 120 125
Glu Ile Asp Ala His Asp Gln Trp Lys Ile Ile Tyr Lys Asp Glu Ser
130 135 140
Pro Phe Gly His Asp Lys Ser Arg Ser Ile Asp Ala Tyr Lys Lys Lys
145 150 155 160
Phe Glu Ser Thr Leu Lys Ala Gly Glu Gln Arg Pro Val Tyr Phe Tyr
165 170 175
Cys Gly Asp Gly Val Ser Asp Leu Ser Ala Ala Lys Glu Cys Asp Leu
180 185 190
Leu Phe Ala Lys Arg Gly Lys Asp Leu Val Thr Tyr Cys Lys Lys Gln
195 200 205
Asn Val Pro Phe His Glu Phe Asp Thr Phe Lys Asp Ile Leu Ala Ser
210 215 220
Met Lys Gln Val Leu Ala Gly Glu Lys Thr Val Ala Glu Leu Met Glu
225 230 235 240
Asn
<210> 51
<211> 218
<212> PRT
<213> 酿酒酵母yor131c PH24
<400> 51
Met Thr Lys Leu Gln Gly Leu Gln Gly Leu Lys His Ile Lys Ala Val
1 5 10 15
Val Phe Asp Met Asp Gly Thr Leu Cys Leu Pro Gln Pro Trp Met Phe
20 25 30
Pro Ala Met Arg Asn Ala Ile Gly Leu Glu Asp Lys Ser Ile Asp Ile
35 40 45
Leu His Phe Ile Asp Thr Leu Pro Thr Glu Lys Glu Lys Lys Glu Ala
50 55 60
His Asp Arg Ile Glu Leu Val Glu Ala Lys Ala Met Lys Glu Met Gln
65 70 75 80
Pro Gln Pro Gly Leu Val Asp Ile Met Arg Tyr Leu Thr Lys Asn Gly
85 90 95
Ile Ser Lys Asn Ile Cys Thr Arg Asn Val Gly Ala Pro Val Glu Thr
100 105 110
Phe Val Lys Arg Phe Ile Pro Ser Glu Leu Ser Arg Phe Asp Tyr Ile
115 120 125
Val Thr Arg Glu Phe Arg Pro Thr Lys Pro Gln Pro Asp Pro Leu Leu
130 135 140
His Ile Ala Ser Lys Leu Asn Ile Arg Pro Leu Glu Met Ile Met Val
145 150 155 160
Gly Asp Ser Phe Asp Asp Met Lys Ser Gly Arg Ser Ala Gly Cys Phe
165 170 175
Thr Val Leu Leu Lys Asn His Val Asn Gly His Leu Leu Leu Glu His
180 185 190
Lys Glu Leu Val Asp Val Ser Val Glu Asp Leu Ser Glu Ile Ile Glu
195 200 205
Leu Ile Gln Asn Met Asn Lys Glu Ser Phe
210 215
<210> 52
<211> 450
<212> PRT
<213> 酿酒酵母yor155c PH25
<400> 52
Met Ser Ser Arg Tyr Arg Val Glu Tyr His Leu Lys Ser His Arg Lys
1 5 10 15
Asp Glu Phe Ile Asp Trp Val Lys Gly Leu Leu Ala Ser Pro Phe Val
20 25 30
Leu His Ala Val Ser His Glu Gly Asp Tyr Asn Asp Asp Leu Ala Thr
35 40 45
Thr Gln Arg Val Arg Ser Gln Tyr Ala Asp Ile Phe Lys Asp Ile Glu
50 55 60
Gly Leu Ile Lys Asp Lys Ile Glu Phe Asp Ser Arg Asn Met Ser Gln
65 70 75 80
Asp Glu Ile Glu Asp Gly Ala Ser Ser Gln Ser Leu Asn Ile Leu Gly
85 90 95
Gln Ser Arg Leu Asn Leu Leu Val Pro Ser Ile Gly Thr Phe Phe Thr
100 105 110
Glu Leu Pro Leu Glu Gln Ala Phe Leu Trp Glu Asp Ser Gln Arg Ala
115 120 125
Ile Ser Ala Arg Arg Met Val Ala Pro Ser Phe Asn Asp Ile Arg His
130 135 140
Ile Leu Asn Thr Ala Gln Ile Phe His Phe Lys Lys Gln Glu Asn Leu
145 150 155 160
His Asn Gly Lys Val Leu Arg Leu Val Thr Phe Asp Gly Asp Val Thr
165 170 175
Leu Tyr Glu Asp Gly Gly Ser Leu Val Tyr Thr Asn Pro Val Ile Pro
180 185 190
Tyr Ile Leu Lys Leu Leu Arg Cys Gly Ile Asn Val Gly Ile Val Thr
195 200 205
Ala Ala Gly Tyr Asp Glu Ala Gly Thr Tyr Glu Asn Arg Leu Lys Gly
210 215 220
Leu Ile Val Ala Leu His Asp Ser Thr Asp Ile Pro Val Ser Gln Lys
225 230 235 240
Gln Asn Leu Thr Ile Met Gly Gly Glu Ser Ser Tyr Leu Phe Arg Tyr
245 250 255
Tyr Glu Asp Pro Glu Glu Asp Asn Phe Gly Phe Arg Gln Ile Asp Lys
260 265 270
Glu Glu Trp Leu Leu Pro Arg Met Lys Ala Trp Ser Leu Glu Asp Val
275 280 285
Glu Lys Thr Leu Asp Phe Ala Glu Arg Thr Leu Asn Arg Leu Arg Lys
290 295 300
Arg Leu Asn Leu Pro Ser Glu Ile Ser Ile Ile Arg Lys Val Arg Ala
305 310 315 320
Val Gly Ile Val Pro Gly Glu Arg Tyr Asp Glu Ala Ser Lys Arg Gln
325 330 335
Val Pro Val Lys Leu Asp Arg Glu Gln Leu Glu Glu Ile Val Leu Thr
340 345 350
Leu Gln Asn Thr Leu Glu Ser Phe Ala Pro Ser Arg Arg Ile Gln Phe
355 360 365
Ser Cys Phe Asp Gly Gly Ser Asp Val Trp Cys Asp Ile Gly Gly Lys
370 375 380
Asp Leu Gly Val Arg Ser Leu Gln Gln Phe Tyr Asn Pro Glu Ser Pro
385 390 395 400
Ile Gln Pro Ser Glu Thr Leu His Val Gly Asp Gln Phe Ala Pro Val
405 410 415
Gly Ser Ala Asn Asp Phe Lys Ala Arg Leu Ala Gly Cys Thr Leu Trp
420 425 430
Ile Ala Ser Pro Gln Glu Thr Val Asn Tyr Leu His Arg Leu Leu Glu
435 440 445
Thr Asp
450
<210> 53
<211> 222
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）YniC PH26
<400> 53
Met Ser Thr Pro Arg Gln Ile Leu Ala Ala Ile Phe Asp Met Asp Gly
1 5 10 15
Leu Leu Ile Asp Ser Glu Pro Leu Trp Asp Arg Ala Glu Leu Asp Val
20 25 30
Met Ala Ser Leu Gly Val Asp Ile Ser Arg Arg Asn Glu Leu Pro Asp
35 40 45
Thr Leu Gly Leu Arg Ile Asp Met Val Val Asp Leu Trp Tyr Ala Arg
50 55 60
Gln Pro Trp Asn Gly Pro Ser Arg Gln Glu Val Val Glu Arg Val Ile
65 70 75 80
Ala Arg Ala Ile Ser Leu Val Glu Glu Thr Arg Pro Leu Leu Pro Gly
85 90 95
Val Arg Glu Ala Val Ala Leu Cys Lys Glu Gln Gly Leu Leu Val Gly
100 105 110
Leu Ala Ser Ala Ser Pro Leu His Met Leu Glu Lys Val Leu Thr Met
115 120 125
Phe Asp Leu Arg Asp Ser Phe Asp Ala Leu Ala Ser Ala Glu Lys Leu
130 135 140
Pro Tyr Ser Lys Pro His Pro Gln Val Tyr Leu Asp Cys Ala Ala Lys
145 150 155 160
Leu Gly Val Asp Pro Leu Thr Cys Val Ala Leu Glu Asp Ser Val Asn
165 170 175
Gly Met Ile Ala Ser Lys Ala Ala Arg Met Arg Ser Ile Val Val Pro
180 185 190
Ala Pro Glu Ala Gln Asn Asp Pro Arg Phe Val Leu Ala Asn Val Lys
195 200 205
Leu Ser Ser Leu Thr Glu Leu Thr Ala Lys Asp Leu Leu Gly
210 215 220
<210> 54
<211> 216
<212> PRT
<213> 大肠杆菌YfbT PH27
<400> 54
Met Arg Cys Lys Gly Phe Leu Phe Asp Leu Asp Gly Thr Leu Val Asp
1 5 10 15
Ser Leu Pro Ala Val Glu Arg Ala Trp Ser Asn Trp Ala Arg Arg His
20 25 30
Gly Leu Ala Pro Glu Glu Val Leu Ala Phe Ile His Gly Lys Gln Ala
35 40 45
Ile Thr Ser Leu Arg His Phe Met Ala Gly Lys Ser Glu Ala Asp Ile
50 55 60
Ala Ala Glu Phe Thr Arg Leu Glu His Ile Glu Ala Thr Glu Thr Glu
65 70 75 80
Gly Ile Thr Ala Leu Pro Gly Ala Ile Ala Leu Leu Ser His Leu Asn
85 90 95
Lys Ala Gly Ile Pro Trp Ala Ile Val Thr Ser Gly Ser Met Pro Val
100 105 110
Ala Arg Ala Arg His Lys Ile Ala Gly Leu Pro Ala Pro Glu Val Phe
115 120 125
Val Thr Ala Glu Arg Val Lys Arg Gly Lys Pro Glu Pro Asp Ala Tyr
130 135 140
Leu Leu Gly Ala Gln Leu Leu Gly Leu Ala Pro Gln Glu Cys Val Val
145 150 155 160
Val Glu Asp Ala Pro Ala Gly Val Leu Ser Gly Leu Ala Ala Gly Cys
165 170 175
His Val Ile Ala Val Asn Ala Pro Ala Asp Thr Pro Arg Leu Asn Glu
180 185 190
Val Asp Leu Val Leu His Ser Leu Glu Gln Ile Thr Val Thr Lys Gln
195 200 205
Pro Asn Gly Asp Val Ile Ile Gln
210 215
<210> 55
<211> 222
<212> PRT
<213> 大肠杆菌YieH PH28
<400> 55
Met Ser Thr Pro Arg Gln Ile Leu Ala Ala Ile Phe Asp Met Asp Gly
1 5 10 15
Leu Leu Ile Asp Ser Glu Pro Leu Trp Asp Arg Ala Glu Leu Asp Val
20 25 30
Met Ala Ser Leu Gly Val Asp Ile Ser Arg Arg Asn Glu Leu Pro Asp
35 40 45
Thr Leu Gly Leu Arg Ile Asp Met Val Val Asp Leu Trp Tyr Ala Arg
50 55 60
Gln Pro Trp Asn Gly Pro Ser Arg Gln Glu Val Val Glu Arg Val Ile
65 70 75 80
Ala Arg Ala Ile Ser Leu Val Glu Glu Thr Arg Pro Leu Leu Pro Gly
85 90 95
Val Arg Glu Ala Val Ala Leu Cys Lys Glu Gln Gly Leu Leu Val Gly
100 105 110
Leu Ala Ser Ala Ser Pro Leu His Met Leu Glu Lys Val Leu Thr Met
115 120 125
Phe Asp Leu Arg Asp Ser Phe Asp Ala Leu Ala Ser Ala Glu Lys Leu
130 135 140
Pro Tyr Ser Lys Pro His Pro Gln Val Tyr Leu Asp Cys Ala Ala Lys
145 150 155 160
Leu Gly Val Asp Pro Leu Thr Cys Val Ala Leu Glu Asp Ser Val Asn
165 170 175
Gly Met Ile Ala Ser Lys Ala Ala Arg Met Arg Ser Ile Val Val Pro
180 185 190
Ala Pro Glu Ala Gln Asn Asp Pro Arg Phe Val Leu Ala Asp Val Lys
195 200 205
Leu Ser Ser Leu Thr Glu Leu Thr Ala Lys Asp Leu Leu Gly
210 215 220
<210> 56
<211> 199
<212> PRT
<213> 大肠杆菌YihX PH29
<400> 56
Met Leu Tyr Ile Phe Asp Leu Gly Asn Val Ile Val Asp Ile Asp Phe
1 5 10 15
Asn Arg Val Leu Gly Ala Trp Ser Asp Leu Thr Arg Ile Pro Leu Ala
20 25 30
Ser Leu Lys Lys Ser Phe His Met Gly Glu Ala Phe His Gln His Glu
35 40 45
Arg Gly Glu Ile Ser Asp Glu Ala Phe Ala Glu Ala Leu Cys His Glu
50 55 60
Met Ala Leu Pro Leu Ser Tyr Glu Gln Phe Ser His Gly Trp Gln Ala
65 70 75 80
Val Phe Val Ala Leu Arg Pro Glu Val Ile Ala Ile Met His Lys Leu
85 90 95
Arg Glu Gln Gly His Arg Val Val Val Leu Ser Asn Thr Asn Arg Leu
100 105 110
His Thr Thr Phe Trp Pro Glu Glu Tyr Pro Glu Ile Arg Asp Ala Ala
115 120 125
Asp His Ile Tyr Leu Ser Gln Asp Leu Gly Met Arg Lys Pro Glu Ala
130 135 140
Arg Ile Tyr Gln His Val Leu Gln Ala Glu Gly Phe Ser Pro Ser Asp
145 150 155 160
Thr Val Phe Phe Asp Asp Asn Ala Asp Asn Ile Glu Gly Ala Asn Gln
165 170 175
Leu Gly Ile Thr Ser Ile Leu Val Lys Asp Lys Thr Thr Ile Pro Asp
180 185 190
Tyr Phe Ala Lys Val Leu Cys
195
<210> 57
<211> 253
<212> PRT
<213> 大肠杆菌YjjG PH31
<400> 57
Met Arg Ile Leu Leu Ser Asn Asp Asp Gly Val His Ala Pro Gly Ile
1 5 10 15
Gln Thr Leu Ala Lys Ala Leu Arg Glu Phe Ala Asp Val Gln Val Val
20 25 30
Ala Pro Asp Arg Asn Arg Ser Gly Ala Ser Asn Ser Leu Thr Leu Glu
35 40 45
Ser Ser Leu Arg Thr Phe Thr Phe Glu Asn Gly Asp Ile Ala Val Gln
50 55 60
Met Gly Thr Pro Thr Asp Cys Val Tyr Leu Gly Val Asn Ala Leu Met
65 70 75 80
Arg Pro Arg Pro Asp Ile Val Val Ser Gly Ile Asn Ala Gly Pro Asn
85 90 95
Leu Gly Asp Asp Val Ile Tyr Ser Gly Thr Val Ala Ala Ala Met Glu
100 105 110
Gly Arg His Leu Gly Phe Pro Ala Leu Ala Val Ser Leu Asp Gly His
115 120 125
Lys His Tyr Asp Thr Ala Ala Ala Val Thr Cys Ser Ile Leu Arg Ala
130 135 140
Leu Cys Lys Glu Pro Leu Arg Thr Gly Arg Ile Leu Asn Ile Asn Val
145 150 155 160
Pro Asp Leu Pro Leu Asp Gln Ile Lys Gly Ile Arg Val Thr Arg Cys
165 170 175
Gly Thr Arg His Pro Ala Asp Gln Val Ile Pro Gln Gln Asp Pro Arg
180 185 190
Gly Asn Thr Leu Tyr Trp Ile Gly Pro Pro Gly Gly Lys Cys Asp Ala
195 200 205
Gly Pro Gly Thr Asp Phe Ala Ala Val Asp Glu Gly Tyr Val Ser Ile
210 215 220
Thr Pro Leu His Val Asp Leu Thr Ala His Ser Ala Gln Asp Val Val
225 230 235 240
Ser Asp Trp Leu Asn Ser Val Gly Val Gly Thr Gln Trp
245 250
<210> 58
<211> 188
<212> PRT
<213> 大肠杆菌YqaB PH32
<400> 58
Met Tyr Glu Arg Tyr Ala Gly Leu Ile Phe Asp Met Asp Gly Thr Ile
1 5 10 15
Leu Asp Thr Glu Pro Thr His Arg Lys Ala Trp Arg Glu Val Leu Gly
20 25 30
His Tyr Gly Leu Gln Tyr Asp Ile Gln Ala Met Ile Ala Leu Asn Gly
35 40 45
Ser Pro Thr Trp Arg Ile Ala Gln Ala Ile Ile Glu Leu Asn Gln Ala
50 55 60
Asp Leu Asp Pro His Ala Leu Ala Arg Glu Lys Thr Glu Ala Val Arg
65 70 75 80
Ser Met Leu Leu Asp Ser Val Glu Pro Leu Pro Leu Val Asp Val Val
85 90 95
Lys Ser Trp His Gly Arg Arg Pro Met Ala Val Gly Thr Gly Ser Glu
100 105 110
Ser Ala Ile Ala Glu Ala Leu Leu Ala His Leu Gly Leu Arg His Tyr
115 120 125
Phe Asp Ala Val Val Ala Ala Asp His Val Lys His His Lys Pro Ala
130 135 140
Pro Asp Thr Phe Leu Leu Cys Ala Gln Arg Met Gly Val Gln Pro Thr
145 150 155 160
Gln Cys Val Val Phe Glu Asp Ala Asp Phe Gly Ile Gln Ala Ala Arg
165 170 175
Ala Ala Gly Met Asp Ala Val Asp Val Arg Leu Leu
180 185
<210> 59
<211> 238
<212> PRT
<213> 大肠杆菌YigB PH33
<400> 59
Met Arg Phe Tyr Arg Pro Leu Gly Arg Ile Ser Ala Leu Thr Phe Asp
1 5 10 15
Leu Asp Asp Thr Leu Tyr Asp Asn Arg Pro Val Ile Leu Arg Thr Glu
20 25 30
Arg Glu Ala Leu Thr Phe Val Gln Asn Tyr His Pro Ala Leu Arg Ser
35 40 45
Phe Gln Asn Glu Asp Leu Gln Arg Leu Arg Gln Ala Val Arg Glu Ala
50 55 60
Glu Pro Glu Ile Tyr His Asp Val Thr Arg Trp Arg Phe Arg Ser Ile
65 70 75 80
Glu Gln Ala Met Leu Asp Ala Gly Leu Ser Ala Glu Glu Ala Ser Ala
85 90 95
Gly Ala His Ala Ala Met Ile Asn Phe Ala Lys Trp Arg Ser Arg Ile
100 105 110
Asp Val Pro Gln Gln Thr His Asp Thr Leu Lys Gln Leu Ala Lys Lys
115 120 125
Trp Pro Leu Val Ala Ile Thr Asn Gly Asn Ala Gln Pro Glu Leu Phe
130 135 140
Gly Leu Gly Asp Tyr Phe Glu Phe Val Leu Arg Ala Gly Pro His Gly
145 150 155 160
Arg Ser Lys Pro Phe Ser Asp Met Tyr Phe Leu Ala Ala Glu Lys Leu
165 170 175
Asn Val Pro Ile Gly Glu Ile Leu His Val Gly Asp Asp Leu Thr Thr
180 185 190
Asp Val Gly Gly Ala Ile Arg Ser Gly Met Gln Ala Cys Trp Ile Arg
195 200 205
Pro Glu Asn Gly Asp Leu Met Gln Thr Trp Asp Ser Arg Leu Leu Pro
210 215 220
His Leu Glu Ile Ser Arg Leu Ala Ser Leu Thr Ser Leu Ile
225 230 235
<210> 60
<211> 222
<212> PRT
<213> 大肠杆菌YrfG PH34
<400> 60
Met His Ile Asn Ile Ala Trp Gln Asp Val Asp Thr Val Leu Leu Asp
1 5 10 15
Met Asp Gly Thr Leu Leu Asp Leu Ala Phe Asp Asn Tyr Phe Trp Gln
20 25 30
Lys Leu Val Pro Glu Thr Trp Gly Ala Lys Asn Gly Val Thr Pro Gln
35 40 45
Glu Ala Met Glu Tyr Met Arg Gln Gln Tyr His Asp Val Gln His Thr
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Ser Glu Gln Leu Gly Leu Asp
65 70 75 80
Ile Cys Ala Met Thr Thr Glu Met Gly Pro Arg Ala Val Leu Arg Glu
85 90 95
Asp Thr Ile Pro Phe Leu Glu Ala Leu Lys Ala Ser Gly Lys Gln Arg
100 105 110
Ile Leu Leu Thr Asn Ala His Pro His Asn Leu Ala Val Lys Leu Glu
115 120 125
His Thr Gly Leu Asp Ala His Leu Asp Leu Leu Leu Ser Thr His Thr
130 135 140
Phe Gly Tyr Pro Lys Glu Asp Gln Arg Leu Trp His Ala Val Ala Glu
145 150 155 160
Ala Thr Gly Leu Lys Ala Glu Arg Thr Leu Phe Ile Asp Asp Ser Glu
165 170 175
Ala Ile Leu Asp Ala Ala Ala Gln Phe Gly Ile Arg Tyr Cys Leu Gly
180 185 190
Val Thr Asn Pro Asp Ser Gly Ile Ala Glu Lys Gln Tyr Gln Arg His
195 200 205
Pro Ser Leu Asn Asp Tyr Arg Arg Leu Ile Pro Ser Leu Met
210 215 220
<210> 61
<211> 222
<212> PRT
<213> 大肠杆菌Gph PH35
<400> 61
Met Ser Thr Pro Arg Gln Ile Leu Ala Ala Ile Phe Asp Met Asp Gly
1 5 10 15
Leu Leu Ile Asp Ser Glu Pro Leu Trp Asp Arg Ala Glu Leu Asp Val
20 25 30
Met Ala Ser Leu Gly Val Asp Ile Ser Arg Arg Asn Glu Leu Pro Asp
35 40 45
Thr Leu Gly Leu Arg Ile Asp Met Val Val Asp Leu Trp Tyr Ala Arg
50 55 60
Gln Pro Trp Asn Gly Pro Ser Arg Gln Glu Val Val Glu Arg Val Ile
65 70 75 80
Ala Arg Ala Ile Ser Leu Val Glu Glu Thr Arg Pro Leu Leu Pro Gly
85 90 95
Val Arg Glu Ala Val Ala Leu Cys Lys Glu Gln Gly Leu Leu Val Gly
100 105 110
Leu Ala Ser Ala Ser Pro Leu His Met Leu Glu Lys Val Leu Thr Met
115 120 125
Phe Asp Leu Arg Asp Ser Phe Asp Ala Leu Ala Ser Ala Glu Lys Leu
130 135 140
Pro Tyr Ser Lys Pro His Pro Gln Val Tyr Leu Asp Cys Ala Ala Lys
145 150 155 160
Leu Gly Val Asp Pro Leu Thr Cys Val Ala Leu Glu Asp Ser Val Asn
165 170 175
Gly Met Ile Ala Ser Lys Ala Ala Arg Met Arg Ser Ile Val Val Pro
180 185 190
Ala Pro Glu Ala Gln Asn Asp Pro Arg Phe Val Leu Ala Asp Val Lys
195 200 205
Leu Ser Ser Leu Thr Glu Leu Thr Ala Lys Asp Leu Leu Gly
210 215 220
<210> 62
<211> 271
<212> PRT
<213> 大肠杆菌YbiV PH36
<400> 62
Met Ser Val Lys Val Ile Val Thr Asp Met Asp Gly Thr Phe Leu Asn
1 5 10 15
Asp Ala Lys Thr Tyr Asn Gln Pro Arg Phe Met Ala Gln Tyr Gln Glu
20 25 30
Leu Lys Lys Arg Gly Ile Lys Phe Val Val Ala Ser Gly Asn Gln Tyr
35 40 45
Tyr Gln Leu Ile Ser Phe Phe Pro Glu Leu Lys Asp Glu Ile Ser Phe
50 55 60
Val Ala Glu Asn Gly Ala Leu Val Tyr Glu His Gly Lys Gln Leu Phe
65 70 75 80
His Gly Glu Leu Thr Arg His Glu Ser Arg Ile Val Ile Gly Glu Leu
85 90 95
Leu Lys Asp Lys Gln Leu Asn Phe Val Ala Cys Gly Leu Gln Ser Ala
100 105 110
Tyr Val Ser Glu Asn Ala Pro Glu Ala Phe Val Ala Leu Met Ala Lys
115 120 125
His Tyr His Arg Leu Lys Pro Val Lys Asp Tyr Gln Glu Ile Asp Asp
130 135 140
Val Leu Phe Lys Phe Ser Leu Asn Leu Pro Asp Glu Gln Ile Pro Leu
145 150 155 160
Val Ile Asp Lys Leu His Val Ala Leu Asp Gly Ile Met Lys Pro Val
165 170 175
Thr Ser Gly Phe Gly Phe Ile Asp Leu Ile Ile Pro Gly Leu His Lys
180 185 190
Ala Asn Gly Ile Ser Arg Leu Leu Lys Arg Trp Asp Leu Ser Pro Gln
195 200 205
Asn Val Val Ala Ile Gly Asp Ser Gly Asn Asp Ala Glu Met Leu Lys
210 215 220
Met Ala Arg Tyr Ser Phe Ala Met Gly Asn Ala Ala Glu Asn Ile Lys
225 230 235 240
Gln Ile Ala Arg Tyr Ala Thr Asp Asp Asn Asn His Glu Gly Ala Leu
245 250 255
Asn Val Ile Gln Ala Val Leu Asp Asn Thr Ser Pro Phe Asn Ser
260 265 270
<210> 63
<211> 270
<212> PRT
<213> 大肠杆菌YidA PH37
<400> 63
Met Ala Ile Lys Leu Ile Ala Ile Asp Met Asp Gly Thr Leu Leu Leu
1 5 10 15
Pro Asp His Thr Ile Ser Pro Ala Val Lys Asn Ala Ile Ala Ala Ala
20 25 30
Arg Ala Arg Gly Val Asn Val Val Leu Thr Thr Gly Arg Pro Tyr Ala
35 40 45
Gly Val His Asn Tyr Leu Lys Glu Leu His Met Glu Gln Pro Gly Asp
50 55 60
Tyr Cys Ile Thr Tyr Asn Gly Ala Leu Val Gln Lys Ala Ala Asp Gly
65 70 75 80
Ser Thr Val Ala Gln Thr Ala Leu Ser Tyr Asp Asp Tyr Arg Phe Leu
85 90 95
Glu Lys Leu Ser Arg Glu Val Gly Ser His Phe His Ala Leu Asp Arg
100 105 110
Thr Thr Leu Tyr Thr Ala Asn Arg Asp Ile Ser Tyr Tyr Thr Val His
115 120 125
Glu Ser Phe Val Ala Thr Ile Pro Leu Val Phe Cys Glu Ala Glu Lys
130 135 140
Met Asp Pro Asn Thr Gln Phe Leu Lys Val Met Met Ile Asp Glu Pro
145 150 155 160
Ala Ile Leu Asp Gln Ala Ile Ala Arg Ile Pro Gln Glu Val Lys Glu
165 170 175
Lys Tyr Thr Val Leu Lys Ser Ala Pro Tyr Phe Leu Glu Ile Leu Asp
180 185 190
Lys Arg Val Asn Lys Gly Thr Gly Val Lys Ser Leu Ala Asp Val Leu
195 200 205
Gly Ile Lys Pro Glu Glu Ile Met Ala Ile Gly Asp Gln Glu Asn Asp
210 215 220
Ile Ala Met Ile Glu Tyr Ala Gly Val Gly Val Ala Met Asp Asn Ala
225 230 235 240
Ile Pro Ser Val Lys Glu Val Ala Asn Phe Val Thr Lys Ser Asn Leu
245 250 255
Glu Asp Gly Val Ala Phe Ala Ile Glu Lys Tyr Val Leu Asn
260 265 270
<210> 64
<211> 272
<212> PRT
<213> 大肠杆菌YbhA PH38
<400> 64
Met Thr Thr Arg Val Ile Ala Leu Asp Leu Asp Gly Thr Leu Leu Thr
1 5 10 15
Pro Lys Lys Thr Leu Leu Pro Ser Ser Ile Glu Ala Leu Ala Arg Ala
20 25 30
Arg Glu Ala Gly Tyr Arg Leu Ile Ile Val Thr Gly Arg His His Val
35 40 45
Ala Ile His Pro Phe Tyr Gln Ala Leu Ala Leu Asp Thr Pro Ala Ile
50 55 60
Cys Cys Asn Gly Thr Tyr Leu Tyr Asp Tyr His Ala Lys Thr Val Leu
65 70 75 80
Glu Ala Asp Pro Met Pro Val Asn Lys Ala Leu Gln Leu Ile Glu Met
85 90 95
Leu Asn Glu His His Ile His Gly Leu Met Tyr Val Asp Asp Ala Met
100 105 110
Val Tyr Glu His Pro Thr Gly His Val Ile Arg Thr Ser Asn Trp Ala
115 120 125
Gln Thr Leu Pro Pro Glu Gln Arg Pro Thr Phe Thr Gln Val Ala Ser
130 135 140
Leu Ala Glu Thr Ala Gln Gln Val Asn Ala Val Trp Lys Phe Ala Leu
145 150 155 160
Thr His Asp Asp Leu Pro Gln Leu Gln His Phe Gly Lys His Val Glu
165 170 175
His Glu Leu Gly Leu Glu Cys Glu Trp Ser Trp His Asp Gln Val Asp
180 185 190
Ile Ala Arg Gly Gly Asn Ser Lys Gly Lys Arg Leu Thr Lys Trp Val
195 200 205
Glu Ala Gln Gly Trp Ser Met Glu Asn Val Val Ala Phe Gly Asp Asn
210 215 220
Phe Asn Asp Ile Ser Met Leu Glu Ala Ala Gly Thr Gly Val Ala Met
225 230 235 240
Gly Asn Ala Asp Asp Ala Val Lys Ala Arg Ala Asn Ile Val Ile Gly
245 250 255
Asp Asn Thr Thr Asp Ser Ile Ala Gln Phe Ile Tyr Ser His Leu Ile
260 265 270
<210> 65
<211> 238
<212> PRT
<213> 大肠杆菌YbjI PH39
<400> 65
Met Arg Phe Tyr Arg Pro Leu Gly Arg Ile Ser Ala Leu Thr Phe Asp
1 5 10 15
Leu Asp Asp Thr Leu Tyr Asp Asn Arg Pro Val Ile Leu Arg Thr Glu
20 25 30
Arg Glu Ala Leu Thr Phe Val Gln Asn Tyr His Pro Ala Leu Arg Ser
35 40 45
Phe Gln Asn Glu Asp Leu Gln Arg Leu Arg Gln Ala Val Arg Glu Ala
50 55 60
Glu Pro Glu Ile Tyr His Asp Val Thr Arg Trp Arg Phe Arg Ser Ile
65 70 75 80
Glu Gln Ala Met Leu Asp Ala Gly Leu Ser Ala Glu Glu Ala Ser Ala
85 90 95
Gly Ala His Ala Ala Met Ile Asn Phe Ala Lys Trp Arg Ser Arg Ile
100 105 110
Asp Val Pro Gln Gln Thr His Asp Thr Leu Lys Gln Leu Ala Lys Lys
115 120 125
Trp Pro Leu Val Ala Ile Thr Asn Gly Asn Ala Gln Pro Glu Leu Phe
130 135 140
Gly Leu Gly Asp Tyr Phe Glu Phe Val Leu Arg Ala Gly Pro His Gly
145 150 155 160
Arg Ser Lys Pro Phe Ser Asp Met Tyr Phe Leu Ala Ala Glu Lys Leu
165 170 175
Asn Val Pro Ile Gly Glu Ile Leu His Val Gly Asp Asp Leu Thr Thr
180 185 190
Asp Val Gly Gly Ala Ile Arg Ser Gly Met Gln Ala Cys Trp Ile Arg
195 200 205
Pro Glu Asn Gly Asp Leu Met Gln Thr Trp Asp Ser Arg Leu Leu Pro
210 215 220
His Leu Glu Ile Ser Arg Leu Ala Ser Leu Thr Ser Leu Ile
225 230 235
<210> 66
<211> 266
<212> PRT
<213> 大肠杆菌YigL PH40
<400> 66
Met Tyr Gln Val Val Ala Ser Asp Leu Asp Gly Thr Leu Leu Ser Pro
1 5 10 15
Asp His Thr Leu Ser Pro Tyr Ala Lys Glu Thr Leu Lys Leu Leu Thr
20 25 30
Ala Arg Gly Ile Asn Phe Val Phe Ala Thr Gly Arg His His Val Asp
35 40 45
Val Gly Gln Ile Arg Asp Asn Leu Glu Ile Lys Ser Tyr Met Ile Thr
50 55 60
Ser Asn Gly Ala Arg Val His Asp Leu Asp Gly Asn Leu Ile Phe Ala
65 70 75 80
His Asn Leu Asp Arg Asp Ile Ala Ser Asp Leu Phe Gly Val Val Asn
85 90 95
Asp Asn Pro Asp Ile Ile Thr Asn Val Tyr Arg Asp Asp Glu Trp Phe
100 105 110
Met Asn Arg His Arg Pro Glu Glu Met Arg Phe Phe Lys Glu Ala Val
115 120 125
Phe Gln Tyr Ala Leu Tyr Glu Pro Gly Leu Leu Glu Pro Glu Gly Val
130 135 140
Ser Lys Val Phe Phe Thr Cys Asp Ser His Glu Gln Leu Leu Pro Leu
145 150 155 160
Glu Gln Ala Ile Asn Ala Arg Trp Gly Asp Arg Val Asn Val Ser Phe
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Cys Leu Glu Val Met Ala Gly Gly Val Ser Lys Gly
180 185 190
His Ala Leu Glu Ala Val Ala Lys Lys Leu Gly Tyr Ser Leu Lys Asp
195 200 205
Cys Ile Ala Phe Gly Asp Gly Met Asn Asp Ala Glu Met Leu Ser Met
210 215 220
Ala Gly Lys Gly Cys Ile Met Gly Ser Ala His Gln Arg Leu Lys Asp
225 230 235 240
Leu His Pro Glu Leu Glu Val Ile Gly Thr Asn Ala Asp Asp Ala Val
245 250 255
Pro His Tyr Leu Arg Lys Leu Tyr Leu Ser
260 265
<210> 67
<211> 266
<212> PRT
<213> 大肠杆菌OtsB PH41
<400> 67
Met Thr Glu Pro Leu Thr Glu Thr Pro Glu Leu Ser Ala Lys Tyr Ala
1 5 10 15
Trp Phe Phe Asp Leu Asp Gly Thr Leu Ala Glu Ile Lys Pro His Pro
20 25 30
Asp Gln Val Val Val Pro Asp Asn Ile Leu Gln Gly Leu Gln Leu Leu
35 40 45
Ala Thr Ala Ser Asp Gly Ala Leu Ala Leu Ile Ser Gly Arg Ser Met
50 55 60
Val Glu Leu Asp Ala Leu Ala Lys Pro Tyr Arg Phe Pro Leu Ala Gly
65 70 75 80
Val His Gly Ala Glu Arg Arg Asp Ile Asn Gly Lys Thr His Ile Val
85 90 95
His Leu Pro Asp Ala Ile Ala Arg Asp Ile Ser Val Gln Leu His Thr
100 105 110
Val Ile Ala Gln Tyr Pro Gly Ala Glu Leu Glu Ala Lys Gly Met Ala
115 120 125
Phe Ala Leu His Tyr Arg Gln Ala Pro Gln His Glu Asp Ala Leu Met
130 135 140
Thr Leu Ala Gln Arg Ile Thr Gln Ile Trp Pro Gln Met Ala Leu Gln
145 150 155 160
Gln Gly Lys Cys Val Val Glu Ile Lys Pro Arg Gly Thr Ser Lys Gly
165 170 175
Glu Ala Ile Ala Ala Phe Met Gln Glu Ala Pro Phe Ile Gly Arg Thr
180 185 190
Pro Val Phe Leu Gly Asp Asp Leu Thr Asp Glu Ser Gly Phe Ala Val
195 200 205
Val Asn Arg Leu Gly Gly Met Ser Val Lys Ile Gly Thr Gly Ala Thr
210 215 220
Gln Ala Ser Trp Arg Leu Ala Gly Val Pro Asp Val Trp Ser Trp Leu
225 230 235 240
Glu Met Ile Thr Thr Ala Leu Gln Gln Lys Arg Glu Asn Asn Arg Ser
245 250 255
Asp Asp Tyr Glu Ser Phe Ser Arg Ser Ile
260 265
<210> 68
<211> 191
<212> PRT
<213> 大肠杆菌YaeD PH42
<400> 68
Met Ala Lys Ser Val Pro Ala Ile Phe Leu Asp Arg Asp Gly Thr Ile
1 5 10 15
Asn Val Asp His Gly Tyr Val His Glu Ile Asp Asn Phe Glu Phe Ile
20 25 30
Asp Gly Val Ile Asp Ala Met Arg Glu Leu Lys Lys Met Gly Phe Ala
35 40 45
Leu Val Val Val Thr Asn Gln Ser Gly Ile Ala Arg Gly Lys Phe Thr
50 55 60
Glu Ala Gln Phe Glu Thr Leu Thr Glu Trp Met Asp Trp Ser Leu Ala
65 70 75 80
Asp Arg Asp Val Asp Leu Asp Gly Ile Tyr Tyr Cys Pro His His Pro
85 90 95
Gln Gly Ser Val Glu Glu Phe Arg Gln Val Cys Asp Cys Arg Lys Pro
100 105 110
His Pro Gly Met Leu Leu Ser Ala Arg Asp Tyr Leu His Ile Asp Met
115 120 125
Ala Ala Ser Tyr Met Val Gly Asp Lys Leu Glu Asp Met Gln Ala Ala
130 135 140
Val Ala Ala Asn Val Gly Thr Lys Val Leu Val Arg Thr Gly Lys Pro
145 150 155 160
Ile Thr Pro Glu Ala Glu Asn Ala Ala Asp Trp Val Leu Asn Ser Leu
165 170 175
Ala Asp Leu Pro Gln Ala Ile Lys Lys Gln Gln Lys Pro Ala Gln
180 185 190
<210> 69
<211> 385
<212> PRT
<213> 运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）DH1
<400> 69
Met Leu Asn Phe Asp Tyr Tyr Asn Pro Thr His Ile Val Phe Gly Lys
1 5 10 15
Gly Arg Ile Ala Gln Leu Asp Thr Leu Leu Ser Lys Asp Ala Arg Val
20 25 30
Leu Val Leu Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Gln Lys Thr Gly Thr Leu Asp
35 40 45
Glu Val Arg Lys Ala Leu Gly Asp Arg Thr Tyr Phe Glu Phe Gly Gly
50 55 60
Ile Glu Pro Asn Pro Ser Tyr Glu Thr Leu Met Lys Ala Val Glu Gln
65 70 75 80
Val Lys Gln Glu Lys Val Asp Phe Leu Leu Ala Val Gly Gly Gly Ser
85 90 95
Val Ile Asp Gly Thr Lys Phe Val Ala Ala Ala Val Pro Tyr Glu Gly
100 105 110
Glu Pro Trp Glu Ile Leu Glu Thr Asp Gly Lys Lys Ile Lys Glu Ala
115 120 125
Leu Pro Val Gly Thr Val Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gly Ser Glu Met
130 135 140
Asn Arg Asn Ser Val Val Thr Arg Lys Ser Ile Lys Ser Lys Arg Gly
145 150 155 160
Phe His Asn Asp His Val Phe Pro Val Phe Ser Ile Leu Asp Pro Thr
165 170 175
Lys Val Tyr Thr Leu Pro Pro Arg Gln Leu Ala Asn Gly Val Val Asp
180 185 190
Ser Phe Ile His Ile Thr Glu Gln Tyr Leu Thr Tyr Pro Val Asp Gly
195 200 205
Met Val Gln Asp Glu Phe Ala Glu Gly Leu Leu Arg Thr Leu Ile Lys
210 215 220
Ile Gly Pro Glu Leu Leu Lys Asp Gln Lys Asn Tyr Asp Leu Ala Ala
225 230 235 240
Asn Phe Met Trp Thr Ala Thr Leu Ala Leu Asn Gly Leu Ile Gly Ala
245 250 255
Gly Val Pro Gln Asp Trp Ala Thr His Met Val Gly His Glu Leu Thr
260 265 270
Ala Ala Phe Gly Ile Asp His Gly Arg Thr Leu Ala Ile Ile Leu Pro
275 280 285
Ser Leu Leu Gln Asn Gln Arg Glu Ala Lys Lys Gly Lys Leu Leu Gln
290 295 300
Tyr Ala Lys Asn Val Trp His Ile Asp Gln Gly Ser Asp Asp Glu Arg
305 310 315 320
Ile Asp Ala Ala Ile Glu Lys Thr Arg His Phe Phe Glu Ser Leu Gly
325 330 335
Ile Pro Thr His Leu Lys Asp Tyr Asp Val Gly Glu Glu Ser Ile Asp
340 345 350
Met Leu Val Lys Glu Leu Glu Ala His Gly Met Ser Gln Leu Gly Glu
355 360 365
His Lys Ala Ile Thr Pro Glu Val Ser Arg Ala Ile Leu Leu Ala Ser
370 375 380
Leu
385
<210> 70
<211> 385
<212> PRT
<213> 运动发酵单胞菌苹果汁亚种（Zymomonas mobilis subsp. pomaceae）ATCC29192 DH2
<400> 70
Met Leu Asn Phe Asp Tyr Tyr Asn Pro Thr His Ile Ala Phe Gly Lys
1 5 10 15
Asp Ser Ile Ala Lys Leu Asp Thr Leu Ile Pro Gln Asp Ala Cys Val
20 25 30
Met Val Leu Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Lys Thr Gly Thr Leu Asp
35 40 45
Glu Val Lys Thr Ala Leu Gly Ser Arg Lys Ile His Glu Phe Gly Gly
50 55 60
Ile Glu Pro Asn Pro Ser Tyr Glu Thr Leu Met Gln Ala Val Glu Gln
65 70 75 80
Val Lys Lys Glu Lys Ile Asp Phe Leu Leu Ala Val Gly Gly Gly Ser
85 90 95
Val Ile Asp Gly Thr Lys Phe Val Ala Ala Ala Val Pro Tyr Glu Gly
100 105 110
Glu Pro Trp Glu Ile Leu Glu Thr Asp Gly Lys Lys Ile Lys Lys Ala
115 120 125
Leu Pro Leu Gly Thr Val Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gly Ser Glu Met
130 135 140
Asn Pro Asn Ser Val Val Thr Arg Lys Ser Ile Lys Ala Lys Arg Ala
145 150 155 160
Phe His Asn Lys Ile Val Phe Pro Leu Phe Ser Ile Leu Asp Pro Thr
165 170 175
Lys Val Tyr Thr Leu Pro Pro Arg Gln Ile Ala Asn Gly Ile Val Asp
180 185 190
Ser Phe Val His Ile Thr Glu Gln Tyr Leu Thr Tyr Pro Val Glu Gly
195 200 205
Met Val Gln Asp Glu Phe Ala Glu Gly Leu Leu Arg Ile Leu Ile Asn
210 215 220
Ile Gly Pro Lys Leu Leu Lys Asp Gln Lys Asn Tyr Asp Leu Ala Ala
225 230 235 240
Asn Phe Met Trp Thr Ala Thr Leu Ala Leu Asn Gly Leu Ile Gly Ala
245 250 255
Gly Val Pro Gln Asp Trp Ala Thr His Met Ile Gly His Glu Ile Thr
260 265 270
Ala Ala Phe Gly Val Asp His Gly Arg Thr Leu Ala Ile Ile Leu Pro
275 280 285
Ser Leu Leu Gln Asn Gln Arg Gln Val Lys Lys Asp Lys Leu Leu Gln
290 295 300
Tyr Ala Lys Asn Val Trp His Ile Glu Ser Gly Ser Glu Lys Glu Arg
305 310 315 320
Ile Asp Ala Val Ile Ala Lys Thr Arg Ser Phe Phe Glu Glu Met Gly
325 330 335
Ile Pro Thr His Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gly Lys Glu Ser Ile Asp
340 345 350
Met Leu Ile His Glu Leu Glu Ala His Gly Met Thr Lys Leu Gly Glu
355 360 365
His Asn Ala Ile Thr Pro Asp Val Ser Arg Ala Ile Leu Ile Ala Ser
370 375 380
Leu
385
<210> 71
<211> 385
<212> PRT
<213> 波罗的海希瓦氏菌（Shewanella baltica）DH3
<400> 71
Met Leu Asn Phe Asn Tyr Tyr Asn Pro Thr Arg Ile Arg Phe Gly Lys
1 5 10 15
Asp Thr Ile Ala Glu Ile Asp Thr Leu Val Pro Ser Asp Ala Lys Val
20 25 30
Met Ile Leu Phe Gly Gly Ser Ser Ala Arg Lys Thr Gly Thr Leu Asp
35 40 45
Glu Val Lys Gln Ser Leu Gly Asn Arg Phe Ile Val Glu Phe Asp Gly
50 55 60
Ile Glu Pro Asn Pro Thr Tyr Glu Thr Leu Met Lys Ala Val Ala Gln
65 70 75 80
Val Arg Glu Gln Lys Ile Asp Phe Leu Leu Ala Val Gly Gly Gly Ser
85 90 95
Val Ile Asp Gly Thr Lys Phe Val Ala Ala Ala Ala Val Phe Glu Gly
100 105 110
Glu Pro Trp Asp Ile Leu Thr Ser Trp Gly Ala Lys Val Thr Gln Ala
115 120 125
Met Pro Phe Gly Ser Val Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gly Ser Glu Met
130 135 140
Asn Asn Ala Ser Val Val Thr Arg Lys Ser Leu Gln Ala Lys Leu Pro
145 150 155 160
Phe Arg Asn Asp Leu Val Tyr Pro Gln Phe Ser Ile Leu Asp Pro Thr
165 170 175
Lys Thr Phe Thr Leu Pro Glu Arg Gln Val Ala Asn Gly Val Val Asp
180 185 190
Ala Phe Val His Ile Thr Glu Gln Tyr Leu Thr Tyr Pro Val Asn Ala
195 200 205
Ala Val Gln Asp Arg Phe Ala Glu Gly Leu Leu Gln Thr Leu Ile Glu
210 215 220
Leu Gly Pro Gln Val Leu Ala Gln Pro Glu Asp Tyr Asp Ile Arg Ala
225 230 235 240
Asn Leu Met Trp Val Ala Thr Met Ala Leu Asn Gly Thr Ile Gly Val
245 250 255
Gly Val Pro His Asp Trp Ala Thr His Met Ile Gly His Glu Leu Thr
260 265 270
Ala Leu Tyr Asp Ile Asp His Ala Arg Thr Leu Ala Ile Val Leu Pro
275 280 285
Ala Leu Leu Gln Cys Thr Lys Glu Ala Lys Arg Glu Lys Leu Leu Gln
290 295 300
Tyr Ala Asp Arg Val Trp His Ile Asn Thr Gly Thr Asp Asp Glu Arg
305 310 315 320
Ile Asp Ala Ala Ile Ala Lys Thr Lys Ala Phe Phe Glu Ala Met Gly
325 330 335
Ile Pro Thr His Leu Ser Ala Tyr Asp Leu Asp Ala Ser His Val Asp
340 345 350
Thr Leu Val Lys Gln Leu Glu Leu His Gly Met Val Ala Leu Gly Glu
355 360 365
His Gly Asn Ile Asn Pro Ala Met Ser Arg Asp Ile Leu Thr Leu Ala
370 375 380
Leu
385
<210> 72
<211> 385
<212> PRT
<213> 类鼻疽伯克氏菌（Burkholderia pseudomallei）DH4
<400> 72
Met Leu Asn Phe Asp Phe Tyr Asn Pro Thr Arg Ile Val Phe Gly Glu
1 5 10 15
Lys Thr Ala Ala Arg Leu Asn Asp Leu Leu Pro Ala Ala Ala Arg Val
20 25 30
Leu Val Leu Tyr Gly Gly Glu Ser Ala Arg Ser Asn Gly Thr Leu Asp
35 40 45
Glu Val Arg Ala Ala Leu Gly Ala Arg Asp Val Arg Glu Phe Gly Gly
50 55 60
Ile Glu Pro Asn Pro Ala Tyr Glu Thr Leu Met Arg Ala Val Glu Leu
65 70 75 80
Ala Arg Arg Glu Arg Val Asp Phe Leu Leu Ala Val Gly Gly Gly Ser
85 90 95
Val Ile Asp Gly Thr Lys Phe Val Ala Ala Ala Val Pro Phe Glu Gly
100 105 110
Asp Pro Trp Thr Ile Leu Glu Thr His Gly Ala Asn Val Ala Ala Ala
115 120 125
Leu Pro Phe Gly Cys Val Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gly Ser Glu Met
130 135 140
Asn Asn Gly Ala Val Leu Thr Arg Arg Ala Thr Arg Ala Lys Leu Ala
145 150 155 160
Phe Arg His Pro Leu Val Phe Pro Thr Phe Ser Ile Leu Asp Pro Thr
165 170 175
Lys Thr Tyr Thr Leu Pro Pro Arg Gln Val Ala Asn Gly Val Val Asp
180 185 190
Ala Phe Thr His Ile Val Glu Gln Tyr Leu Thr Tyr Pro Ala Asp Gly
195 200 205
Leu Ala Gln Asp Arg Phe Ala Glu Gly Leu Leu Gln Thr Leu Ile Glu
210 215 220
Ile Gly Pro Lys Ala Leu Ala Glu Pro Arg Asp Tyr Ala Thr Arg Ala
225 230 235 240
Asn Leu Met Trp Val Ala Thr Leu Ala Leu Asn Gly Leu Ile Gly Ala
245 250 255
Gly Val Pro Gln Asp Arg Ala Thr His Met Val Gly His Glu Leu Thr
260 265 270
Ala Arg Tyr Asp Ile Asp His Ala Arg Thr Leu Ala Val Val Leu Pro
275 280 285
Ser Met Leu Asp Val Arg Arg Asp Ala Lys Arg Ala Lys Leu Leu Gln
290 295 300
Tyr Ala Ala Arg Val Trp Asn Ile Val Asp Gly Pro Glu Asp Ala Arg
305 310 315 320
Ile Asp Ala Ala Ile Ala Arg Thr Arg Ala Phe Phe Glu Ser Leu Gly
325 330 335
Val Lys Thr Arg Leu Ala Asp Tyr Gly Val Gly Ala Asp Ala Ile Asp
340 345 350
Gly Leu Ile Ala Gln Leu Glu Ala His Gly Met Thr Arg Leu Gly Glu
355 360 365
Arg Lys Asp Val Thr Leu Asp Val Ser Arg Arg Val Leu Glu Ala Ser
370 375 380
Leu
385
<210> 73
<211> 348
<212> PRT
<213> 酿酒酵母DH5
<400> 73
Met Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu Ser His
1 5 10 15
Gly Lys Leu Glu Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys Ala Asn
20 25 30
Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu
35 40 45
His Ala Trp His Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro Leu Val
50 55 60
Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Gly Met Gly Glu Asn Val
65 70 75 80
Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Tyr Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Ser Cys Met Ala Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Gly Asn Glu Pro Asn Cys
100 105 110
Pro His Ala Asp Ser Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln Gln
115 120 125
Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala His Ile Pro Gln Gly Thr
130 135 140
Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr
145 150 155 160
Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Met Ala Gly His Trp Val Ala Ile
165 170 175
Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr Ala Lys
180 185 190
Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Gly Gly Glu Gly Lys Glu
195 200 205
Glu Leu Phe Arg Ser Ile Gly Gly Glu Val Phe Ile Asp Phe Thr Lys
210 215 220
Glu Lys Asp Ile Val Gly Ala Val Leu Lys Ala Thr Asp Gly Gly Ala
225 230 235 240
His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Ala Ala Ile Glu Ala Ser
245 250 255
Thr Arg Tyr Val Arg Ala Asn Gly Thr Thr Val Leu Val Gly Met Pro
260 265 270
Ala Gly Ala Lys Cys Cys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val Lys Ser
275 280 285
Ile Ser Ile Val Gly Ser Cys Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr Arg Glu
290 295 300
Ala Leu Asp Phe Phe Ala Arg Gly Leu Val Lys Ser Pro Ile Lys Val
305 310 315 320
Val Gly Leu Ser Thr Leu Pro Glu Ile Tyr Glu Lys Met Glu Lys Gly
325 330 335
Gln Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys
340 345
<210> 74
<211> 360
<212> PRT
<213> 酿酒酵母DH6
<400> 74
Met Ser Tyr Pro Glu Lys Phe Glu Gly Ile Ala Ile Gln Ser His Glu
1 5 10 15
Asp Trp Lys Asn Pro Lys Lys Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Pro Phe Tyr
20 25 30
Asp His Asp Ile Asp Ile Lys Ile Glu Ala Cys Gly Val Cys Gly Ser
35 40 45
Asp Ile His Cys Ala Ala Gly His Trp Gly Asn Met Lys Met Pro Leu
50 55 60
Val Val Gly His Glu Ile Val Gly Lys Val Val Lys Leu Gly Pro Lys
65 70 75 80
Ser Asn Ser Gly Leu Lys Val Gly Gln Arg Val Gly Val Gly Ala Gln
85 90 95
Val Phe Ser Cys Leu Glu Cys Asp Arg Cys Lys Asn Asp Asn Glu Pro
100 105 110
Tyr Cys Thr Lys Phe Val Thr Thr Tyr Ser Gln Pro Tyr Glu Asp Gly
115 120 125
Tyr Val Ser Gln Gly Gly Tyr Ala Asn Tyr Val Arg Val His Glu His
130 135 140
Phe Val Val Pro Ile Pro Glu Asn Ile Pro Ser His Leu Ala Ala Pro
145 150 155 160
Leu Leu Cys Gly Gly Leu Thr Val Tyr Ser Pro Leu Val Arg Asn Gly
165 170 175
Cys Gly Pro Gly Lys Lys Val Gly Ile Val Gly Leu Gly Gly Ile Gly
180 185 190
Ser Met Gly Thr Leu Ile Ser Lys Ala Met Gly Ala Glu Thr Tyr Val
195 200 205
Ile Ser Arg Ser Ser Arg Lys Arg Glu Asp Ala Met Lys Met Gly Ala
210 215 220
Asp His Tyr Ile Ala Thr Leu Glu Glu Gly Asp Trp Gly Glu Lys Tyr
225 230 235 240
Phe Asp Thr Phe Asp Leu Ile Val Val Cys Ala Ser Ser Leu Thr Asp
245 250 255
Ile Asp Phe Asn Ile Met Pro Lys Ala Met Lys Val Gly Gly Arg Ile
260 265 270
Val Ser Ile Ser Ile Pro Glu Gln His Glu Met Leu Ser Leu Lys Pro
275 280 285
Tyr Gly Leu Lys Ala Val Ser Ile Ser Tyr Ser Ala Leu Gly Ser Ile
290 295 300
Lys Glu Leu Asn Gln Leu Leu Lys Leu Val Ser Glu Lys Asp Ile Lys
305 310 315 320
Ile Trp Val Glu Thr Leu Pro Val Gly Glu Ala Gly Val His Glu Ala
325 330 335
Phe Glu Arg Met Glu Lys Gly Asp Val Arg Tyr Arg Phe Thr Leu Val
340 345 350
Gly Tyr Asp Lys Glu Phe Ser Asp
355 360
<210> 75
<211> 526
<212> PRT
<213> 恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）DH7
<400> 75
Met Ser Ile Glu His Arg Leu Asn His Ile Ala Gly Gln Leu Ser Gly
1 5 10 15
Asn Gly Glu Val Leu Leu Asn Ser Val Asp Ala His Thr Gly Glu Pro
20 25 30
Leu Pro Tyr Ala Phe His Gln Ala Thr Ser Asp Glu Val Asp Ala Ala
35 40 45
Val Gln Ala Ala Glu Ala Ala Tyr Pro Ala Tyr Arg Ser Thr Ser Pro
50 55 60
Ala Gln Arg Ala Ala Phe Leu Asp Ala Ile Ala Asn Glu Leu Asp Ala
65 70 75 80
Leu Gly Asp Asp Phe Val Gln His Val Met Arg Glu Thr Ala Leu Pro
85 90 95
Glu Ala Arg Ile Arg Gly Glu Arg Ala Arg Thr Ser Asn Gln Leu Arg
100 105 110
Leu Phe Ala Asp Val Val Arg Arg Gly Asp Phe Leu Gly Ala Arg Ile
115 120 125
Asp Arg Ala Gln Pro Glu Arg Thr Pro Leu Pro Arg Pro Asp Leu Arg
130 135 140
Gln Tyr Arg Ile Gly Val Gly Pro Val Ala Val Phe Gly Ala Ser Asn
145 150 155 160
Phe Pro Leu Ala Phe Ser Thr Ala Gly Gly Asp Thr Ala Ser Ala Leu
165 170 175
Ala Ala Gly Cys Pro Val Val Phe Lys Ala His Ser Gly His Met Leu
180 185 190
Thr Ala Ala His Val Ala Ala Ala Ile Asp Arg Ala Val Ala Gly Ser
195 200 205
Gly Met Pro Ala Gly Val Phe Asn Met Ile Tyr Gly Ala Gly Val Gly
210 215 220
Glu Val Leu Val Lys His Pro Ala Ile Gln Ala Val Gly Phe Thr Gly
225 230 235 240
Ser Leu Arg Gly Gly Arg Ala Leu Cys Asp Met Ala Ala Ala Arg Pro
245 250 255
Gln Pro Ile Pro Val Phe Ala Glu Met Ser Ser Ile Asn Pro Val Ile
260 265 270
Val Leu Pro Gln Ala Leu Gln Ala Arg Gly Glu Gln Val Ala Gly Glu
275 280 285
Leu Ala Ala Ser Val Val Leu Gly Cys Gly Gln Phe Cys Thr Asn Pro
290 295 300
Gly Leu Val Val Gly Ile Lys Ser Pro Gln Phe Glu Arg Phe Val His
305 310 315 320
Thr Leu Val Ala Arg Met Ala Asp Gln Ala Pro Gln Thr Met Leu Asn
325 330 335
Ala Gly Thr Leu Arg Ser Tyr Gln Ser Gly Val Gln His Leu Leu Ala
340 345 350
His Pro Gly Ile Gln His Leu Ala Gly Gln Pro Gln Ala Gly Lys Gln
355 360 365
Ala Gln Pro Gln Leu Phe Lys Ala Asp Val Ser Leu Leu Leu Asp Ser
370 375 380
Asp Pro Leu Leu Gln Glu Glu Val Phe Gly Pro Thr Thr Val Val Val
385 390 395 400
Glu Val Ala Asp Ala Gln Gln Leu Ala Glu Ala Leu Arg His Leu Gln
405 410 415
Gly Gln Leu Thr Ala Thr Leu Ile Ala Glu Pro Asp Asp Leu Arg Ala
420 425 430
Phe Ala Ala Leu Val Pro Leu Leu Glu Arg Lys Ala Gly Arg Leu Leu
435 440 445
Leu Asn Gly Tyr Pro Thr Gly Val Glu Val Ser Asp Ala Met Val His
450 455 460
Gly Gly Pro Tyr Pro Ala Thr Ser Asp Ala Arg Gly Thr Ser Val Gly
465 470 475 480
Thr Leu Ala Ile Asp Arg Phe Leu Arg Pro Val Cys Phe Gln Asn Tyr
485 490 495
Pro Asp Ala Leu Leu Pro Glu Ala Leu Lys Ser Ala Asn Pro Leu Gly
500 505 510
Ile Ala Arg Leu Val Asp Gly Val Ala Ser Arg Gly Ala Val
515 520 525
<210> 76
<211> 526
<212> PRT
<213> 恶臭假单胞菌DH8
<400> 76
Met Ser Ile Glu His Arg Leu Asn His Ile Ala Gly Gln Leu Ser Gly
1 5 10 15
Asn Gly Asp Val Leu Leu Asn Ser Val Asp Ala His Thr Gly Glu Pro
20 25 30
Leu Pro Tyr Ala Phe His Gln Ala Thr Gly Asp Glu Val Glu Ala Ala
35 40 45
Val Gln Ala Ala Asp Ala Ala Tyr Pro Ala Tyr Arg Ser Thr Ser Pro
50 55 60
Ala Gln Arg Ala Ala Phe Leu Asp Ala Ile Ala Asn Glu Leu Asp Ala
65 70 75 80
Leu Gly Asp Asp Phe Ile Gln His Val Met Arg Glu Thr Ala Leu Pro
85 90 95
Glu Ala Arg Ile Arg Gly Glu Arg Ser Arg Thr Ser Asn Gln Leu Arg
100 105 110
Leu Phe Ala Glu Val Val Arg Arg Gly Asp Phe Tyr Ala Ala Arg Ile
115 120 125
Asp Arg Ala Leu Pro Gln Arg Thr Pro Leu Pro Arg Pro Asp Leu Arg
130 135 140
Gln Tyr Arg Ile Gly Val Gly Pro Val Ala Val Phe Gly Ala Ser Asn
145 150 155 160
Phe Pro Leu Ala Phe Ser Thr Ala Gly Gly Asp Thr Ala Ser Ala Leu
165 170 175
Ala Ala Gly Cys Pro Val Val Phe Lys Ala His Ser Gly His Met Leu
180 185 190
Thr Ala Ala His Val Ala Gly Ala Ile Asp Arg Ala Val Ala Thr Ser
195 200 205
Gly Met Pro Ala Gly Val Phe Asn Leu Ile Tyr Gly Ala Gly Val Gly
210 215 220
Glu Ala Leu Val Lys His Pro Ala Ile Gln Ala Val Gly Phe Thr Gly
225 230 235 240
Ser Leu Arg Gly Gly Arg Ala Leu Cys Asp Met Ala Ala Ala Arg Pro
245 250 255
Gln Pro Ile Pro Val Phe Ala Glu Met Ser Ser Ile Asn Pro Val Ile
260 265 270
Val Leu Pro Gln Ala Leu Gln Ala Arg Gly Glu Gln Val Ala Gly Glu
275 280 285
Leu Ala Ala Ser Val Val Met Gly Cys Gly Gln Phe Cys Thr Asn Pro
290 295 300
Gly Leu Val Val Gly Ile Gln Ser Pro Gln Phe Glu His Phe Val Gln
305 310 315 320
Thr Leu Val Ala Arg Met Ala Asp Gln Gly Pro Gln Thr Met Leu Asn
325 330 335
Ala Gly Thr Leu Arg Ser Tyr Gln Asn Gly Val Gln His Leu Leu Ala
340 345 350
His Pro Gly Ile Gln His Leu Ala Gly Gln Pro His Thr Gly Asn Gln
355 360 365
Ala Gln Pro Gln Leu Phe Lys Ala Asp Val Ser Leu Leu Leu Asn Gly
370 375 380
Asp Pro Leu Leu Gln Glu Glu Val Phe Gly Pro Thr Thr Val Val Val
385 390 395 400
Glu Val Ala Asp Ala Glu Gln Leu Ala Glu Ala Leu Arg His Leu Gln
405 410 415
Gly Gln Leu Thr Ala Thr Leu Ile Ala Glu Pro Asp Asp Leu Arg Ala
420 425 430
Phe Ala Ser Leu Val Pro Leu Leu Glu Arg Lys Ala Gly Arg Leu Leu
435 440 445
Leu Asn Gly Tyr Pro Thr Gly Val Glu Val Ser Asp Ala Met Val His
450 455 460
Gly Gly Pro Tyr Pro Ala Thr Ser Asp Ala Arg Gly Thr Ser Val Gly
465 470 475 480
Thr Leu Ala Ile Asp Arg Phe Leu Arg Pro Val Cys Phe Gln Asn Tyr
485 490 495
Pro Asp Ala Leu Leu Pro Asp Ala Leu Lys Asn Ala Asn Pro Leu Gly
500 505 510
Ile Ala Arg Leu Leu Asp Gly Val Asn Ser Arg Asp Ala Val
515 520 525
<210> 77
<211> 526
<212> PRT
<213> 假单胞菌属的种（Pseudomonas sp.）NBRC 111139 DH9
<400> 77
Met Ser Ile Glu His Arg Leu Asn His Ile Ala Gly Gln Leu Ser Gly
1 5 10 15
His Gly Asp Val Leu Leu His Ser Leu Asp Ala His Thr Gly Glu Ala
20 25 30
Leu Pro Tyr Ala Phe His Gln Ala Thr Gly Asp Glu Val Glu Ala Ala
35 40 45
Ala Gln Ala Ala Glu Val Ala Tyr Pro Ser Tyr Arg Ser Thr Arg Pro
50 55 60
Asp Gln Arg Ala Ala Phe Leu Asp Ala Ile Ala Ser Glu Leu Asp Ala
65 70 75 80
Leu Gly Asp Asp Phe Ile Gln Asp Val Met Arg Glu Thr Ala Leu Pro
85 90 95
Glu Ala Arg Ile Arg Gly Glu Arg Ser Arg Thr Ser Asn Gln Leu Arg
100 105 110
Leu Phe Ala Glu Val Val Arg Arg Gly Asp Phe Tyr Ala Ala Arg Ile
115 120 125
Asp Arg Ala Leu Pro Gln Arg Thr Pro Leu Pro Arg Pro Asp Leu Arg
130 135 140
Gln Tyr Arg Ile Gly Val Gly Pro Val Ala Val Phe Gly Ala Ser Asn
145 150 155 160
Phe Pro Leu Ala Phe Ser Thr Ala Gly Gly Asp Thr Ala Ser Ala Leu
165 170 175
Ala Ala Gly Cys Pro Val Val Phe Lys Ala His Ser Gly His Met Leu
180 185 190
Thr Ala Ala His Val Ala Ala Ala Ile Asp Arg Ala Val Thr Gly Ser
195 200 205
Gly Met Pro Ala Gly Val Phe Asn Met Ile Tyr Gly Ala Gly Val Gly
210 215 220
Glu Ala Leu Val Lys His Pro Ala Ile Gln Ala Val Gly Phe Thr Gly
225 230 235 240
Ser Leu Arg Gly Gly Arg Ala Leu Cys Asp Met Ala Ala Ala Arg Pro
245 250 255
Gln Pro Ile Pro Val Phe Ala Glu Met Ser Ser Ile Asn Pro Val Ile
260 265 270
Val Leu Pro Gln Ala Leu Gln Ala Arg Gly Glu Gln Val Ala Thr Glu
275 280 285
Leu Ala Ala Ser Val Val Leu Gly Cys Gly Gln Phe Cys Thr Asn Pro
290 295 300
Gly Leu Val Val Gly Ile Arg Ser Pro His Phe Glu His Phe Leu Gln
305 310 315 320
Thr Leu Val Ala Arg Met Ala Asp Gln Gly Pro Gln Thr Met Leu Asn
325 330 335
Ala Gly Thr Leu Arg Ser Tyr Gln Asn Ala Val Gln His Leu Leu Ala
340 345 350
His Pro Gly Ile Gln His Leu Ala Gly Gln Pro Gln Thr Gly Asn Gln
355 360 365
Ala Gln Pro Gln Leu Phe Lys Ala Asp Val Ser Leu Leu Leu Asn Gly
370 375 380
Asp Pro Leu Leu Gln Glu Glu Val Phe Gly Pro Cys Thr Val Val Val
385 390 395 400
Glu Val Ala Asp Ala Gln Gln Leu Ala Glu Ala Leu Arg His Leu Gln
405 410 415
Gly Gln Leu Thr Ala Thr Leu Ile Ala Glu Pro Asp Asp Leu Arg Ala
420 425 430
Phe Ala Ser Leu Val Pro Leu Leu Glu Arg Lys Ala Gly Arg Leu Leu
435 440 445
Leu Asn Gly Tyr Pro Thr Gly Val Glu Val Ser Asp Ala Met Val His
450 455 460
Gly Gly Pro Tyr Pro Ala Thr Ser Asp Ala Arg Gly Thr Ser Val Gly
465 470 475 480
Thr Leu Ala Ile Asp Arg Phe Leu Arg Pro Val Cys Phe Gln Asn Tyr
485 490 495
Pro Asp Ala Leu Leu Pro Asp Ala Leu Lys Asn Ala Asn Pro Leu Gly
500 505 510
Ile Ala Arg Leu Leu Glu Gly Val Ser Ser Arg Glu Ala Val
515 520 525
<210> 78
<211> 525
<212> PRT
<213> 假单胞菌属的种JUb52 DH10
<400> 78
Met Gln Ile Gln Gly Lys Asn Tyr Ile Gly Gly Ala Arg Ser Gly Glu
1 5 10 15
Gly Glu Val Arg Val Tyr Ser Ile Asp Ala Thr Thr Gly Glu Lys Leu
20 25 30
Pro Tyr Glu Phe Phe Gln Ala Ser Thr Ala Glu Val Asp Ala Ala Ala
35 40 45
Arg Ala Ala Glu Gln Ala Ala Pro Leu Tyr Arg Lys Leu Ser Ala Glu
50 55 60
Gln Arg Ala Thr Phe Leu Asp Ala Ile Ala Asp Glu Leu Asp Ala Leu
65 70 75 80
Gly Asp Asp Phe Val Gln Leu Val Cys Gln Glu Thr Ala Leu Pro Ala
85 90 95
Gly Arg Ile Gln Gly Glu Arg Gly Arg Thr Ser Gly Gln Met Arg Leu
100 105 110
Phe Ala Lys Val Leu Arg Arg Gly Asp Phe His Gly Ala Arg Ile Asp
115 120 125
Thr Ala Leu Pro Glu Arg Lys Pro Leu Pro Arg Pro Asp Leu Arg Gln
130 135 140
Tyr Arg Ile Gly Leu Gly Pro Val Ala Val Phe Gly Ala Ser Asn Phe
145 150 155 160
Pro Leu Ala Phe Ser Thr Ala Gly Gly Asp Thr Ala Ala Ala Leu Ala
165 170 175
Ala Gly Cys Pro Val Val Phe Lys Ala His Ser Gly His Met Val Thr
180 185 190
Ala Glu Tyr Val Ala Asp Ala Ile Ile Arg Ala Ala Glu Lys Thr Gly
195 200 205
Met Pro Lys Gly Val Phe Asn Met Ile Tyr Gly Gly Gly Val Gly Glu
210 215 220
Gln Leu Val Lys His Pro Ala Ile Gln Ala Val Gly Phe Thr Gly Ser
225 230 235 240
Leu Arg Gly Gly Arg Ala Leu Cys Asp Met Ala Ala Ala Arg Pro Gln
245 250 255
Pro Ile Pro Val Phe Ala Glu Met Ser Ser Ile Asn Pro Val Val Val
260 265 270
Leu Pro Glu Ala Leu Lys Ala Arg Gly Asp Ala Ile Thr Gly Glu Leu
275 280 285
Ala Ala Ser Val Val Leu Gly Cys Gly Gln Phe Cys Thr Asn Pro Gly
290 295 300
Leu Val Ile Gly Leu Arg Ser Pro Glu Phe Ser Thr Phe Leu Glu Gly
305 310 315 320
Leu Ala Ala Ala Met Asn Glu Gln Ala Pro Gln Thr Met Leu Asn Pro
325 330 335
Gly Thr Leu Lys Ser Tyr Glu Lys Gly Val Ala Ala Leu Leu Ala His
340 345 350
Ser Gly Val Gln His Leu Ala Gly Ala Asn Gln Glu Gly Asn Gln Ala
355 360 365
Arg Pro Gln Leu Phe Lys Ala Asp Val Ser Leu Leu Leu Glu Asn Asp
370 375 380
Glu Leu Leu Gln Glu Glu Val Phe Gly Pro Thr Thr Val Val Val Glu
385 390 395 400
Val Ala Asp Glu Ala Gln Leu His Gln Ala Leu Gln Gly Leu His Gly
405 410 415
Gln Leu Thr Ala Thr Leu Leu Ala Glu Pro Ala Asp Leu Gln Arg Phe
420 425 430
Glu Ala Ile Ile Gly Leu Leu Glu Gln Lys Ala Gly Arg Leu Leu Leu
435 440 445
Asn Gly Tyr Pro Thr Gly Val Glu Val Cys Asp Ala Met Val His Gly
450 455 460
Gly Pro Tyr Pro Ala Thr Ser Asp Ala Arg Gly Thr Ser Val Gly Thr
465 470 475 480
Leu Ala Ile Asp Arg Phe Leu Arg Pro Val Cys Tyr Gln Asn Tyr Pro
485 490 495
Asp Ala Phe Leu Pro Glu Ala Leu Gln Asn Ala Asn Pro Leu Gly Ile
500 505 510
Gln Arg Leu Val Asn Gly Glu Asn Thr Lys Ala Ala Ile
515 520 525
<210> 79
<211> 523
<212> PRT
<213> 香茅醇假单胞菌（Pseudomonas citronellolis）DH11
<400> 79
Met Phe Gly His Asn Phe Ile Gly Gly Ala Arg Thr Ala Gln Gly Asn
1 5 10 15
Leu Thr Leu Gln Ser Leu Asp Ala Gly Thr Gly Glu Ala Leu Pro Tyr
20 25 30
Ser Phe His Gln Ala Thr Pro Glu Glu Val Asp Ala Ala Ala Leu Ala
35 40 45
Ala Glu Ala Ala Phe Pro Ala Tyr Arg Ala Leu Pro Asp Ala Arg Arg
50 55 60
Ala Glu Phe Leu Asp Ala Ile Ala Ala Glu Leu Asp Ala Leu Gly Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ile Ala Ile Val Cys Arg Glu Thr Ala Leu Pro Ala Ala Arg
85 90 95
Ile Gln Gly Glu Arg Ala Arg Thr Ser Asn Gln Leu Arg Leu Phe Ala
100 105 110
Gln Val Leu Arg Arg Gly Asp Tyr His Gly Ala Arg Ile Asp Arg Ala
115 120 125
Leu Pro Glu Arg Gln Pro Leu Pro Arg Pro Asp Leu Arg Gln Cys Arg
130 135 140
Ile Gly Val Gly Pro Val Ala Val Phe Gly Ala Ser Asn Phe Pro Leu
145 150 155 160
Ala Phe Ser Thr Ala Gly Gly Asp Thr Ala Ala Ala Leu Ala Ala Gly
165 170 175
Cys Pro Val Val Phe Lys Ala His Ser Gly His Met Ala Thr Ala Glu
180 185 190
His Val Ala Ser Ala Ile Val Arg Ala Ala Gln Ala Thr Gly Met Pro
195 200 205
Ala Gly Val Phe Asn Met Ile Tyr Gly Gly Gly Val Gly Glu Arg Leu
210 215 220
Val Lys His Pro Ala Ile Gln Ala Val Gly Phe Thr Gly Ser Leu Lys
225 230 235 240
Gly Gly Arg Ala Leu Cys Asp Leu Ala Ala Ala Arg Pro Gln Pro Ile
245 250 255
Pro Val Phe Ala Glu Met Ser Ser Ile Asn Pro Val Leu Ala Leu Pro
260 265 270
Ala Ala Leu Ala Ala Arg Gly Glu Gln Val Ala Ala Asp Leu Ala Ala
275 280 285
Ser Val Val Leu Gly Cys Gly Gln Phe Cys Thr Asn Pro Gly Met Val
290 295 300
Ile Gly Ile Ala Ser Ala Glu Phe Ser Ala Phe Val Ala Ser Leu Thr
305 310 315 320
Gly Arg Met Ala Asp Gln Pro Ala Gln Thr Met Leu Asn Ala Gly Thr
325 330 335
Leu Lys Ser Tyr Glu Arg Gly Ile Ala Ala Leu His Ala His Pro Gly
340 345 350
Ile Arg His Leu Ala Gly Gln Pro Gln Lys Gly Arg Gln Ala Leu Pro
355 360 365
Gln Leu Phe Gln Ala Asp Ala Arg Leu Leu Ile Glu Gly Asp Glu Leu
370 375 380
Leu Gln Glu Glu Val Phe Gly Pro Val Thr Val Val Val Glu Val Ala
385 390 395 400
Asp Ala Ala Glu Leu Gln Arg Ala Leu Gln Gly Leu Arg Gly Gln Leu
405 410 415
Thr Ala Thr Leu Ile Ala Glu Pro Glu Asp Leu Ser Cys Phe Ala Ala
420 425 430
Leu Val Pro Leu Leu Glu Arg Lys Ala Gly Arg Leu Leu Leu Asn Gly
435 440 445
Tyr Pro Thr Gly Val Glu Val Cys Asp Ala Met Val His Gly Gly Pro
450 455 460
Tyr Pro Ala Thr Ser Asp Ala Arg Gly Thr Ser Val Gly Thr Leu Ala
465 470 475 480
Ile Asp Arg Phe Leu Arg Pro Val Cys Tyr Gln Asn Tyr Pro Asp Ala
485 490 495
Leu Leu Pro Pro Ala Leu Lys Asp Ala Asn Pro Leu Gly Ile Ala Arg
500 505 510
Leu Val Asp Gly Val Ala Ser Arg Glu Pro Leu
515 520
<210> 80
<211> 531
<212> PRT
<213> 甲基菌属的种（Methylovorus sp）HmfH1
<400> 80
Met Thr Asp Thr Ile Phe Asp Tyr Val Ile Val Gly Gly Gly Thr Ala
1 5 10 15
Gly Ser Val Leu Ala Asn Arg Leu Ser Ala Arg Pro Glu Asn Arg Val
20 25 30
Leu Leu Ile Glu Ala Gly Ile Asp Thr Pro Glu Asn Asn Ile Pro Pro
35 40 45
Glu Ile His Asp Gly Leu Arg Pro Trp Leu Pro Arg Leu Ser Gly Asp
50 55 60
Lys Phe Phe Trp Pro Asn Leu Thr Ile His Arg Ala Ala Glu His Pro
65 70 75 80
Gly Ile Thr Arg Glu Pro Gln Phe Tyr Glu Gln Gly Arg Leu Leu Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Ser Val Asn Met Val Val Ser Asn Arg Gly Leu Pro Arg
100 105 110
Asp Tyr Asp Glu Trp Gln Ala Leu Gly Ala Asp Gly Trp Asp Trp Gln
115 120 125
Gly Val Leu Pro Tyr Phe Ile Lys Thr Glu Arg Asp Ala Asp Tyr Gly
130 135 140
Asp Asp Pro Leu His Gly Asn Ala Gly Pro Ile Pro Ile Gly Arg Val
145 150 155 160
Asp Ser Arg His Trp Ser Asp Phe Thr Val Ala Ala Thr Gln Ala Leu
165 170 175
Glu Ala Ala Gly Leu Pro Asn Ile His Asp Gln Asn Ala Arg Phe Asp
180 185 190
Asp Gly Tyr Phe Pro Pro Ala Phe Thr Leu Lys Gly Glu Glu Arg Phe
195 200 205
Ser Ala Ala Arg Gly Tyr Leu Asp Ala Ser Val Arg Val Arg Pro Asn
210 215 220
Leu Ser Leu Trp Thr Glu Ser Arg Val Leu Lys Leu Leu Thr Thr Gly
225 230 235 240
Asn Ala Ile Thr Gly Val Ser Val Leu Arg Gly Arg Glu Thr Leu Gln
245 250 255
Val Gln Ala Arg Glu Val Ile Leu Thr Ala Gly Ala Leu Gln Ser Pro
260 265 270
Ala Ile Leu Leu Arg Thr Gly Ile Gly Pro Ala Ala Asp Leu His Ala
275 280 285
Leu Gly Ile Pro Val Leu Ala Asp Arg Pro Gly Val Gly Arg Asn Leu
290 295 300
Trp Glu His Ser Ser Ile Gly Val Val Ala Pro Leu Thr Glu Gln Ala
305 310 315 320
Arg Ala Asp Ala Ser Thr Gly Lys Ala Gly Ser Arg His Gln Leu Gly
325 330 335
Ile Arg Ala Ser Ser Gly Val Asp Pro Ala Thr Pro Ser Asp Leu Phe
340 345 350
Leu His Ile Gly Ala Asp Pro Val Ser Gly Leu Ala Ser Ala Val Phe
355 360 365
Trp Val Asn Lys Pro Ser Ser Thr Gly Trp Leu Lys Leu Lys Asp Ala
370 375 380
Asp Pro Phe Ser Tyr Pro Asp Val Asp Phe Asn Leu Leu Ser Asp Pro
385 390 395 400
Arg Asp Leu Gly Arg Leu Lys Ala Gly Leu Arg Leu Ile Thr His Tyr
405 410 415
Phe Ala Ala Pro Ser Leu Ala Lys Tyr Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ser
420 425 430
Arg Phe Ala Ala Pro Gln Pro Gly Gly Pro Leu Leu Asn Asp Leu Leu
435 440 445
Gln Asp Glu Ala Ala Leu Glu Arg Tyr Leu Arg Thr Asn Val Gly Gly
450 455 460
Val Trp His Ala Ser Gly Thr Ala Arg Ile Gly Arg Ala Asp Asp Ser
465 470 475 480
Gln Ala Val Val Asp Lys Ala Gly Arg Val Tyr Gly Val Thr Gly Leu
485 490 495
Arg Val Ala Asp Ala Ser Ile Met Pro Thr Val Pro Thr Ala Asn Thr
500 505 510
Asn Leu Pro Thr Leu Met Leu Ala Glu Lys Ile Ala Asp Ala Ile Leu
515 520 525
Thr Gln Ala
530
<210> 81
<211> 579
<212> PRT
<213> 巴塞尔贪铜菌（Cupriavidus basilensis）HmfH2
<400> 81
Met Asp Thr Pro Arg Glu Arg Phe Asp Tyr Val Ile Val Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gly Cys Val Leu Ala Asn Arg Leu Ser Gln Asp Pro Ala Ile
20 25 30
Arg Val Ala Leu Ile Glu Ala Gly Val Asp Thr Pro Pro Asp Ala Val
35 40 45
Pro Ala Glu Ile Leu Asp Ser Tyr Pro Met Pro Leu Phe Phe Gly Asp
50 55 60
Arg Tyr Ile Trp Pro Ser Leu Gln Ala Arg Ala Val Ala Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ser Lys Val Tyr Glu Gln Gly Arg Val Met Gly Gly Gly Ser Ser Ile
85 90 95
Asn Val Gln Ala Ala Asn Arg Gly Leu Pro Arg Asp Tyr Asp Glu Trp
100 105 110
Ala Ala Ser Gly Ala Ser Gly Trp Ser Trp Gln Asp Val Leu Pro Tyr
115 120 125
Phe Arg His Leu Glu Arg Asp Val Asp Tyr Gly Asn Ser Pro Leu His
130 135 140
Gly Ser His Gly Pro Val Pro Ile Arg Arg Ile Leu Pro Gln Ala Trp
145 150 155 160
Pro Pro Phe Cys Thr Glu Phe Ala His Ala Met Gly Arg Ser Gly Leu
165 170 175
Ser Ala Leu Ala Asp Gln Asn Ala Glu Phe Gly Asp Gly Trp Phe Pro
180 185 190
Ala Ala Phe Ser Asn Leu Asp Asp Lys Arg Val Ser Thr Ala Ile Ala
195 200 205
Tyr Leu Asp Ala Asp Thr Arg Arg Arg Ala Asn Leu Arg Ile Tyr Ala
210 215 220
Glu Thr Thr Val Arg Lys Leu Val Val Ser Gly Arg Glu Ala Arg Gly
225 230 235 240
Val Ile Ala Met Arg Ala Asp Gly Ser Arg Leu Ala Leu Asp Ala Gly
245 250 255
Glu Val Ile Val Ser Ala Gly Ala Leu Gln Ser Pro Ala Ile Leu Met
260 265 270
Arg Ala Gly Ile Gly Asp Ala Gly Ala Leu Gln Ala Leu Gly Ile Glu
275 280 285
Val Val Ala Asp Arg Pro Gly Val Gly Arg Asn Leu Gln Asp His Pro
290 295 300
Ala Leu Thr Phe Cys Gln Phe Leu Ala Pro Gln Tyr Arg Met Pro Leu
305 310 315 320
Ser Arg Arg Arg Ala Ser Met Thr Ala Ala Arg Phe Ser Ser Gly Val
325 330 335
Pro Gly Gly Glu Ala Ser Asp Met Tyr Leu Ser Ser Ser Thr Arg Ala
340 345 350
Gly Trp His Ala Leu Gly Asn Arg Leu Gly Leu Phe Phe Leu Trp Cys
355 360 365
Asn Arg Pro Phe Ser Arg Gly Gln Val Ser Leu Ala Gly Ala Gln Pro
370 375 380
Asp Val Pro Pro Met Val Glu Leu Asn Leu Leu Asp Asp Glu Arg Asp
385 390 395 400
Leu Arg Arg Met Val Ala Gly Val Arg Lys Leu Val Gln Ile Val Gly
405 410 415
Ala Ser Ala Leu His Gln His Pro Gly Asp Phe Phe Pro Ala Thr Phe
420 425 430
Ser Pro Arg Val Lys Ala Leu Ser Arg Val Ser Arg Gly Asn Val Leu
435 440 445
Leu Thr Glu Leu Leu Gly Ala Val Leu Asp Val Ser Gly Pro Leu Arg
450 455 460
Arg Ser Leu Ile Ala Arg Phe Val Thr Gly Gly Ala Asn Leu Ala Ser
465 470 475 480
Leu Leu Thr Asp Glu Ser Ala Leu Glu Gly Phe Val Arg Gln Ser Val
485 490 495
Phe Gly Val Trp His Ala Ser Gly Thr Cys Arg Met Gly Ala His Ala
500 505 510
Asp Arg Ser Ala Val Thr Asp Ala Ala Gly Arg Val His Asp Val Gly
515 520 525
Arg Leu Arg Val Ile Asp Ala Ser Leu Met Pro Arg Leu Pro Thr Ala
530 535 540
Asn Thr Asn Ile Pro Thr Ile Met Leu Ala Glu Lys Ile Ala Asp Thr
545 550 555 560
Met Gln Ala Glu Arg Arg Ala Val Arg Pro Ala Ser Ser Glu Val Ala
565 570 575
His Pro Ser
<210> 82
<211> 579
<212> PRT
<213> 钩虫贪铜菌（Cupriavidus necator）HmfH3
<400> 82
Met Asp Thr Pro Arg Glu Arg Phe Asp Tyr Val Ile Val Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gly Cys Val Leu Ala Asn Arg Leu Ser Gln Asp Pro Ala Ile
20 25 30
Arg Val Ala Leu Ile Glu Gly Gly Val Asp Thr Pro Pro Asp Ala Val
35 40 45
Pro Val Glu Ile Leu Asp Ser Tyr Pro Met Pro Leu Phe Phe Gly Asp
50 55 60
Arg Tyr Ile Trp Pro Ser Leu Gln Ala Arg Ala Val Ala Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ser Lys Val Tyr Glu Gln Gly Arg Val Met Gly Gly Gly Ser Ser Ile
85 90 95
Asn Val Gln Ala Ala Asn Arg Gly Leu Pro Arg Asp Tyr Asp Glu Trp
100 105 110
Ala Ala Ser Gly Ala Pro Gly Trp Ser Trp Gln Asp Val Leu Pro Tyr
115 120 125
Phe Arg Asn Leu Glu Arg Asp Val Asp Tyr Gly Asn Ser Pro Leu His
130 135 140
Gly Ser His Gly Pro Val Pro Ile Arg Arg Ile Leu Pro Gln Ala Trp
145 150 155 160
Pro Pro Phe Cys Thr Glu Phe Ala His Ala Met Gly Leu Ser Gly Leu
165 170 175
Ser Ala Leu Ala Asp Gln Asn Ala Glu Phe Gly Asp Gly Trp Phe Pro
180 185 190
Ala Ala Phe Ser Asn Leu Asp Asp Lys Arg Val Ser Thr Ala Ile Ala
195 200 205
Tyr Leu Asp Ala Asp Thr Arg Arg Arg Ala Asn Leu Arg Ile Tyr Ala
210 215 220
Glu Thr Thr Val Arg Lys Leu Val Val Ser Gly Arg Glu Ala Arg Gly
225 230 235 240
Val Ile Ala Ile Arg Ala Asp Gly Ser Arg Leu Ala Leu Asp Ala Gly
245 250 255
Glu Val Ile Val Ser Ala Gly Ala Leu Gln Ser Pro Ala Ile Leu Met
260 265 270
Arg Ala Gly Ile Gly Asp Ala Gly Ala Leu Gln Ala Leu Gly Ile Glu
275 280 285
Val Val Ala Asp Arg Pro Gly Val Gly Arg Asn Leu Gln Asp His Pro
290 295 300
Ala Leu Thr Phe Cys Gln Phe Leu Ala Pro Gln Tyr Arg Met Pro Leu
305 310 315 320
Ser Arg Arg Arg Ala Ser Met Thr Ala Ala Arg Phe Ser Ser Gly Val
325 330 335
Pro Gly Gly Glu Ala Ser Asp Met Tyr Leu Ser Ser Ser Thr Arg Ala
340 345 350
Gly Trp His Ala Leu Gly Asn Arg Leu Gly Leu Phe Phe Leu Trp Cys
355 360 365
Asn Arg Pro Phe Ser Arg Gly Gln Val Ser Leu Ala Gly Ala Gln Pro
370 375 380
Asp Val Pro Pro Met Val Glu Leu Asn Leu Leu Asp Asp Glu Arg Asp
385 390 395 400
Leu Arg Arg Met Val Ala Gly Val Arg Lys Leu Val Gln Ile Val Gly
405 410 415
Ala Ser Ala Leu His Gln His Pro Gly Asp Phe Phe Pro Ala Thr Phe
420 425 430
Ser Pro Arg Val Lys Ala Leu Ser Arg Leu Ser Arg Gly Asn Ala Leu
435 440 445
Leu Thr Glu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Asp Val Ser Gly Pro Leu Arg
450 455 460
Arg Ser Leu Ile Ala Arg Phe Val Thr Gly Gly Ala Asn Leu Ala Ser
465 470 475 480
Leu Leu Val Glu Glu Ser Ala Leu Glu Gly Phe Val Arg Gln Ser Val
485 490 495
Phe Gly Val Trp His Ala Ser Gly Thr Cys Arg Met Gly Ala His Ala
500 505 510
Asp Arg Ser Ala Val Thr Asp Ala Ala Gly Arg Val His Asp Val Gly
515 520 525
Arg Leu Arg Val Val Asp Ala Ser Leu Met Pro Arg Leu Pro Thr Ala
530 535 540
Asn Thr Asn Ile Pro Thr Ile Met Leu Ala Glu Lys Ile Ala Asp Thr
545 550 555 560
Met Gln Ala Glu Arg Arg Ala Val Arg Leu Ala Ser Ser Glu Val Ala
565 570 575
His Gln Ser
<210> 83
<211> 579
<212> PRT
<213> 皮纳图博火山贪铜菌（Cupriavidus pinatubonensis）HmfH4
<400> 83
Met Gly Thr Pro Arg Asp Arg Phe Asp Tyr Val Ile Val Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gly Cys Val Leu Ala Asn Arg Leu Ser Arg Asp Pro Gly Ile
20 25 30
Arg Val Ala Leu Ile Glu Gly Gly Val Asp Thr Pro Pro Gly Ala Val
35 40 45
Pro Ala Glu Ile Leu Asp Ser Tyr Pro Met Pro Leu Phe Phe Gly Asp
50 55 60
Arg Tyr Leu Trp Pro Ser Leu Gln Ala Arg Ala Val Ala Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ala Arg Leu Tyr Glu Gln Gly Arg Val Met Gly Gly Gly Ser Ser Ile
85 90 95
Asn Val Gln Ala Ala Asn Arg Gly Leu Pro Arg Asp Tyr Asp Glu Trp
100 105 110
Ala Ala Ser Gly Ala Pro Gly Trp Ser Trp Gln Glu Val Leu Pro Tyr
115 120 125
Phe Arg Lys Leu Glu Arg Asp Val Asp Phe Ala Ser Ser Pro Met His
130 135 140
Gly Ser Asp Gly Pro Val Pro Ile Arg Arg Ile Leu Pro Pro Ala Trp
145 150 155 160
Pro Pro Phe Cys Thr Ala Phe Ala Gln Ala Met Gly Arg Ser Gly Leu
165 170 175
Ser Ala Leu Asp Asp Gln Asn Ala Glu Phe Gly Asp Gly Trp Phe Pro
180 185 190
Ala Ala Phe Ser Asn Leu Asp Gly Lys Arg Val Ser Thr Ala Ile Ala
195 200 205
Tyr Leu Asp Ala Asn Thr Arg Lys Arg Thr Asn Leu Arg Ile Phe Ala
210 215 220
Glu Thr Thr Val Lys Glu Leu Val Val Ser Gly Arg Glu Ala Arg Gly
225 230 235 240
Val Ile Ala Val Arg Ala Asp Gly Ala Arg Leu Ala Leu Glu Ala Ala
245 250 255
Glu Val Ile Val Ser Ala Gly Ala Leu Gln Ser Pro Ala Ile Leu Met
260 265 270
Arg Ala Gly Ile Gly Asp Ala Ala Ala Leu Gln Ala Leu Gly Ile Glu
275 280 285
Val Val Ala Asp Arg Pro Gly Val Gly Arg Asn Leu Gln Asp His Pro
290 295 300
Ala Leu Thr Phe Cys Gln Phe Leu Ala Pro Glu Tyr Arg Met Pro Leu
305 310 315 320
Ala Arg Arg Arg Ser Ser Met Thr Ala Ala Arg Phe Ser Ser Glu Val
325 330 335
Pro Gly Gly Glu Ala Ser Asp Met Tyr Leu Ser Ser Ser Thr Arg Ala
340 345 350
Gly Trp His Ala Leu Gly Asn Arg Leu Gly Leu Phe Phe Leu Trp Cys
355 360 365
Asn Arg Pro Phe Ser Arg Gly Gln Val Ser Leu Ala Gly Ala Gln Pro
370 375 380
Glu Val Ser Pro Leu Val Glu Leu Asn Leu Leu Asp Asp Glu Arg Asp
385 390 395 400
Leu Arg Arg Met Val Ala Gly Val Arg Arg Leu Val Arg Ile Val Gly
405 410 415
Ala Ser Ala Leu His Gln His Pro Asp Asp Phe Phe Pro Ala Ile Phe
420 425 430
Ser Pro Arg Val Lys Ala Met Ser Arg Val Ser Pro Gly Asn Ala Leu
435 440 445
Leu Thr Ala Leu Leu Gly Ala Leu Leu Asp Val Ser Gly Pro Leu Arg
450 455 460
Arg Ser Leu Ile Ala Arg Phe Val Thr Gly Gly Ala Asn Leu Ala Ser
465 470 475 480
Leu Leu Ala Asp Glu Ser Ala Leu Glu Gly Phe Val Arg Gln Ser Val
485 490 495
Phe Gly Val Trp His Ala Ser Gly Thr Cys Arg Met Gly Ala His Ala
500 505 510
Asp Arg Ser Ala Val Thr Asp Thr Thr Gly Arg Val His Asp Val Gly
515 520 525
Arg Leu Arg Val Val Asp Ala Ser Leu Met Pro Arg Leu Pro Thr Ala
530 535 540
Asn Thr Asn Ile Pro Thr Ile Met Leu Ala Glu Lys Ile Ala Asp Ala
545 550 555 560
Met Leu Ala Glu Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ala Leu Ser Glu Val Ala
565 570 575
Asp Pro Gly
<210> 84
<211> 591
<212> PRT
<213> 潘多拉菌属的种（Pandoraea sp.）B-6 HmfH5
<400> 84
Met Pro Arg Gly His Ala His Arg Arg Ile Arg Arg His Ser Val Gln
1 5 10 15
Asn Val Arg Glu Arg Phe Asp Tyr Val Ile Ile Gly Gly Gly Ser Ala
20 25 30
Gly Cys Val Leu Ala His Arg Leu Ser Ala Asn Arg Glu Leu Arg Val
35 40 45
Ala Leu Ile Glu Ala Gly Ser Asp Thr Pro Pro Gly Ala Ile Pro Ala
50 55 60
Glu Ile Leu Asp Ser Tyr Pro Met Pro Val Phe Cys Gly Asp Arg Tyr
65 70 75 80
Ile Trp Pro Glu Leu Lys Ala Lys Ala Thr Ala Ala Ser Pro Leu Lys
85 90 95
Val Tyr Glu Gln Gly Lys Val Met Gly Gly Gly Ser Ser Ile Asn Val
100 105 110
Gln Ala Ala Asn Arg Gly Leu Pro Arg Asp Tyr Asp Asp Trp Ala Glu
115 120 125
Gln Gly Ala Ser Gly Trp Ala Trp Lys Asp Val Leu Pro Tyr Phe Arg
130 135 140
Lys Leu Glu Arg Asp Ala Asp Tyr Gly Gly Ser Ala Leu His Gly Ala
145 150 155 160
Asp Gly Pro Val Ala Ile Arg Arg Ile Lys Pro Asp Ala Trp Pro Arg
165 170 175
Phe Cys His Ala Phe Ala Glu Gly Leu Gln Arg Asn Gly Leu Pro Met
180 185 190
Leu Glu Asp Gln Asn Ala Glu Phe Gly Asp Gly Met Phe Pro Ala Ala
195 200 205
Phe Ser Asn Leu Asp Asp Lys Arg Val Ser Thr Ala Val Ala Tyr Leu
210 215 220
Asp Ala Ala Thr Arg Ala Arg Thr Asn Leu Arg Ile Tyr Ser Asn Thr
225 230 235 240
Thr Val Glu Arg Leu Ile Val Thr Gly Gln Arg Ala His Gly Val Val
245 250 255
Ala Met Ser Ala Gly Gly Glu Arg Leu Gln Ile Asp Ala Ala Glu Val
260 265 270
Ile Val Ser Ala Gly Ala Leu Gln Ser Pro Ala Leu Leu Leu Arg Ala
275 280 285
Gly Ile Gly Ala Gly Ser Glu Leu Gln Ala Leu Gly Ile Pro Val Val
290 295 300
Ala Asp Arg Pro Gly Val Gly Arg Asn Leu Gln Asp His Pro Ser Leu
305 310 315 320
Thr Phe Cys His Phe Leu Asp Pro Glu Phe Arg Met Pro Leu Ser Arg
325 330 335
Arg Arg Ala Ser Met Thr Ala Ala Arg Phe Ser Ser Gly Leu Asp Gly
340 345 350
Cys Asp Asn Ala Asp Met Tyr Leu Ser Ser Ala Thr Arg Ala Ala Trp
355 360 365
His Ala Leu Gly Asn Arg Leu Gly Leu Phe Phe Leu Trp Cys Asn Arg
370 375 380
Pro Phe Ser Arg Gly Arg Val Gln Leu Thr Ser Ala Asp Pro Phe Thr
385 390 395 400
Pro Pro Arg Val Asp Leu Asn Leu Leu Asp Asp Glu Arg Asp Ala Arg
405 410 415
Arg Met Ala Ile Gly Val Arg Arg Val Ala Gln Ile Val Gln Gln Thr
420 425 430
Ala Leu His Arg His Pro Asp Asp Phe Phe Pro Ala Ala Phe Ser Pro
435 440 445
Arg Val Lys Ala Leu Ser Arg Phe Ser Ala Gly Asn Ala Ala Leu Thr
450 455 460
Lys Val Leu Gly Leu Ala Leu Asp Thr Pro Ala Pro Leu Arg Arg Trp
465 470 475 480
Ile Ile Asp Thr Phe Val Thr Gly Gly Ile Arg Met Ser Ala Leu Leu
485 490 495
Ala Asp Asp Lys Glu Leu Asp Ala Phe Ile Arg Lys Tyr Val Phe Gly
500 505 510
Val Trp His Ala Ser Gly Thr Cys Arg Met Gly Pro Ala Ser Asp Arg
515 520 525
Met Ala Val Thr Asn Gln Glu Gly Leu Val His Asp Val Ala Asn Leu
530 535 540
Arg Val Val Asp Ala Ser Leu Met Pro Lys Leu Pro Ser Ala Asn Thr
545 550 555 560
Asn Ile Pro Thr Ile Met Met Ala Glu Lys Ile Ala Asp Ala Ile Leu
565 570 575
Ala Arg Arg Lys Ala Pro Pro Gly Val Leu Val Ser Ser Glu Ala
580 585 590
<210> 85
<211> 531
<212> PRT
<213> 食甲基菌属的种（Methylovorus sp）HmfH6
<400> 85
Met Thr Asp Thr Ile Phe Asp Tyr Val Ile Val Gly Gly Gly Thr Ala
1 5 10 15
Gly Ser Val Leu Ala Asn Arg Leu Ser Ala Arg Pro Glu Asn Arg Val
20 25 30
Leu Leu Ile Glu Ala Gly Ile Asp Thr Pro Glu Asn Asn Ile Pro Pro
35 40 45
Glu Ile His Asp Gly Leu Arg Pro Trp Leu Pro Arg Leu Ser Gly Asp
50 55 60
Lys Phe Phe Trp Pro Asn Leu Thr Ile His Arg Ala Ala Glu His Pro
65 70 75 80
Gly Ile Thr Arg Glu Pro Gln Phe Tyr Glu Gln Gly Arg Leu Leu Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Ser Val Asn Met Val Val Ser Asn Arg Gly Leu Pro Arg
100 105 110
Asp Tyr Asp Glu Trp Gln Ala Leu Gly Ala Asp Gly Trp Asp Trp Gln
115 120 125
Gly Val Leu Pro Tyr Phe Ile Lys Thr Glu Arg Asp Ala Asp Tyr Gly
130 135 140
Asp Asp Pro Leu His Gly Asn Ala Gly Pro Ile Pro Ile Gly Arg Val
145 150 155 160
Asp Ser Arg His Trp Ser Asp Phe Thr Val Ala Ala Thr Gln Ala Leu
165 170 175
Glu Ala Ala Gly Leu Pro Asn Ile His Asp Gln Asn Ala Arg Phe Asp
180 185 190
Asp Gly Tyr Phe Pro Pro Ala Phe Thr Leu Lys Gly Glu Glu Arg Phe
195 200 205
Ser Ala Ala Arg Gly Tyr Leu Asp Ala Ser Val Arg Val Arg Pro Asn
210 215 220
Leu Ser Leu Trp Thr Glu Ser Arg Val Leu Lys Leu Leu Thr Thr Gly
225 230 235 240
Asn Ala Ile Thr Gly Val Ser Val Leu Arg Gly Arg Glu Thr Leu Gln
245 250 255
Val Gln Ala Arg Glu Val Ile Leu Thr Ala Gly Ala Leu Gln Ser Pro
260 265 270
Ala Ile Leu Leu Arg Thr Gly Ile Gly Pro Ala Ala Asp Leu His Ala
275 280 285
Leu Gly Ile Pro Val Leu Ala Asp Arg Pro Gly Val Gly Arg Asn Leu
290 295 300
Trp Glu His Ser Ser Ile Gly Val Val Ala Pro Leu Thr Glu Gln Ala
305 310 315 320
Arg Ala Asp Ala Ser Thr Gly Lys Ala Gly Ser Arg His Gln Leu Gly
325 330 335
Ile Arg Ala Ser Ser Gly Val Asp Pro Ala Thr Pro Ser Asp Leu Phe
340 345 350
Leu His Ile Gly Ala Asp Pro Val Ser Gly Leu Ala Ser Ala Arg Phe
355 360 365
Trp Val Asn Lys Pro Ser Ser Thr Gly Trp Leu Lys Leu Lys Asp Ala
370 375 380
Asp Pro Phe Ser Tyr Pro Asp Val Asp Phe Asn Leu Leu Ser Asp Pro
385 390 395 400
Arg Asp Leu Gly Arg Leu Lys Ala Gly Leu Arg Leu Ile Thr His Tyr
405 410 415
Phe Ala Ala Pro Ser Leu Ala Lys Tyr Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ser
420 425 430
Arg Phe Ala Ala Pro Gln Pro Gly Gly Pro Leu Leu Asn Asp Leu Leu
435 440 445
Gln Asp Glu Ala Ala Leu Glu Arg Tyr Leu Arg Thr Asn Val Gly Gly
450 455 460
Val Phe His Ala Ser Gly Thr Ala Arg Ile Gly Arg Ala Asp Asp Ser
465 470 475 480
Gln Ala Val Val Asp Lys Ala Gly Arg Val Tyr Gly Val Thr Gly Leu
485 490 495
Arg Val Ala Asp Ala Ser Ile Met Pro Thr Val Pro Thr Ala Asn Thr
500 505 510
Asn Leu Pro Thr Leu Met Leu Ala Glu Lys Ile Ala Asp Ala Ile Leu
515 520 525
Thr Gln Ala
530
<210> 86
<211> 531
<212> PRT
<213> 食甲基菌属的种MUT HmfH7
<400> 86
Met Thr Asp Thr Ile Phe Asp Tyr Val Ile Val Gly Gly Gly Thr Ala
1 5 10 15
Gly Ser Val Leu Ala Asn Arg Leu Ser Ala Arg Pro Glu Asn Arg Val
20 25 30
Leu Leu Ile Glu Ala Gly Ile Asp Thr Pro Glu Asn Asn Ile Pro Pro
35 40 45
Glu Ile His Asp Gly Leu Arg Pro Trp Leu Pro Arg Leu Ser Gly Asp
50 55 60
Lys Phe Phe Trp Pro Asn Leu Thr Val Tyr Arg Ala Ala Glu His Pro
65 70 75 80
Gly Ile Thr Arg Glu Pro Gln Phe Tyr Glu Gln Gly Arg Leu Leu Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Ser Val Asn Met Val Val Ser Asn Arg Gly Leu Pro Arg
100 105 110
Asp Tyr Asp Glu Trp Gln Ala Leu Gly Ala Asp Gly Trp Asp Trp Gln
115 120 125
Gly Val Leu Pro Tyr Phe Ile Lys Thr Glu Arg Asp Ala Asp Tyr Gly
130 135 140
Asp Asp Pro Leu His Gly Asn Ala Gly Pro Ile Pro Ile Gly Arg Val
145 150 155 160
Asp Ser Arg His Trp Ser Asp Phe Thr Val Ala Ala Thr Gln Ala Leu
165 170 175
Glu Ala Ala Gly Leu Pro Asn Ile His Asp Gln Asn Ala Arg Phe Asp
180 185 190
Asp Gly Tyr Phe Pro Pro Ala Phe Thr Leu Lys Gly Glu Glu Arg Phe
195 200 205
Ser Ala Ala Arg Gly Tyr Leu Asp Ala Ser Val Arg Val Arg Pro Asn
210 215 220
Leu Ser Leu Trp Thr Glu Ser Arg Val Leu Lys Leu Leu Thr Thr Gly
225 230 235 240
Asn Ala Ile Thr Gly Val Ser Val Leu Arg Gly Arg Glu Thr Leu Gln
245 250 255
Val Gln Ala Arg Glu Val Ile Leu Thr Ala Gly Ala Leu Gln Ser Pro
260 265 270
Ala Ile Leu Leu Arg Thr Gly Ile Gly Pro Ala Ala Asp Leu His Ala
275 280 285
Leu Gly Ile Pro Val Leu Ala Asp Arg Pro Gly Val Gly Arg Asn Leu
290 295 300
Trp Glu His Ser Ser Ile Gly Val Val Ala Pro Leu Thr Glu Gln Ala
305 310 315 320
Arg Ala Asp Ala Ser Thr Gly Lys Ala Gly Ser Arg His Gln Leu Gly
325 330 335
Ile Arg Ala Ser Ser Gly Val Asp Pro Ala Thr Pro Ser Asp Leu Phe
340 345 350
Leu His Ile His Ala Asp Pro Val Ser Gly Leu Ala Ser Ala Arg Phe
355 360 365
Trp Val Asn Lys Pro Ser Ser Thr Gly Trp Leu Lys Leu Lys Asp Ala
370 375 380
Asp Pro Phe Ser Tyr Pro Asp Val Asp Phe Asn Leu Leu Ser Asp Pro
385 390 395 400
Arg Asp Leu Gly Arg Leu Lys Ala Gly Leu Arg Leu Ile Lys His Tyr
405 410 415
Phe Ala Tyr Pro Ser Leu Ala Lys Tyr Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ser
420 425 430
Arg Phe Glu Ala Pro Gln Pro Gly Gly Pro Leu Leu Asn Asp Leu Leu
435 440 445
Gln Asp Glu Ala Ala Leu Glu Arg Tyr Leu Arg Thr Asn Val Gly Gly
450 455 460
Val Phe His Ala Ser Gly Thr Ala Arg Ile Gly Arg Ala Asp Asp Ser
465 470 475 480
Gln Ala Val Val Asp Lys Ala Gly Arg Val Tyr Gly Val Thr Gly Leu
485 490 495
Arg Val Ala Asp Ala Ser Ile Met Pro Thr Val Pro Thr Ala Asn Thr
500 505 510
Asn Leu Pro Thr Leu Met Leu Ala Glu Lys Ile Ala Asp Ala Ile Leu
515 520 525
Thr Gln Ala
530
<210> 87
<211> 385
<212> PRT
<213> 运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）DH1
<400> 87
Met Leu Asn Phe Asp Tyr Tyr Asn Pro Thr His Ile Val Phe Gly Lys
1 5 10 15
Gly Arg Ile Ala Gln Leu Asp Thr Leu Leu Ser Lys Asp Ala Arg Val
20 25 30
Leu Val Leu Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Gln Lys Thr Gly Thr Leu Asp
35 40 45
Glu Val Arg Lys Ala Leu Gly Asp Arg Thr Tyr Phe Glu Phe Gly Gly
50 55 60
Ile Glu Pro Asn Pro Ser Tyr Glu Thr Leu Met Lys Ala Val Glu Gln
65 70 75 80
Val Lys Gln Glu Lys Val Asp Phe Leu Leu Ala Val Gly Gly Gly Ser
85 90 95
Val Ile Asp Gly Thr Lys Phe Val Ala Ala Ala Val Pro Tyr Glu Gly
100 105 110
Glu Pro Trp Glu Ile Leu Glu Thr Asp Gly Lys Lys Ile Lys Glu Ala
115 120 125
Leu Pro Val Gly Thr Val Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gly Ser Glu Met
130 135 140
Asn Arg Asn Ser Val Val Thr Arg Lys Ser Ile Lys Ser Lys Arg Gly
145 150 155 160
Phe His Asn Asp His Val Phe Pro Val Phe Ser Ile Leu Asp Pro Thr
165 170 175
Lys Val Tyr Thr Leu Pro Pro Arg Gln Leu Ala Asn Gly Val Val Asp
180 185 190
Ser Phe Ile His Ile Thr Glu Gln Tyr Leu Thr Tyr Pro Val Asp Gly
195 200 205
Met Val Gln Asp Glu Phe Ala Glu Gly Leu Leu Arg Thr Leu Ile Lys
210 215 220
Ile Gly Pro Glu Leu Leu Lys Asp Gln Lys Asn Tyr Asp Leu Ala Ala
225 230 235 240
Asn Phe Met Trp Thr Ala Thr Leu Ala Leu Asn Gly Leu Ile Gly Ala
245 250 255
Gly Val Pro Gln Asp Trp Ala Thr His Met Val Gly His Glu Leu Thr
260 265 270
Ala Ala Phe Gly Ile Asp His Gly Arg Thr Leu Ala Ile Ile Leu Pro
275 280 285
Ser Leu Leu Gln Asn Gln Arg Glu Ala Lys Lys Gly Lys Leu Leu Gln
290 295 300
Tyr Ala Lys Asn Val Trp His Ile Asp Gln Gly Ser Asp Asp Glu Arg
305 310 315 320
Ile Asp Ala Ala Ile Glu Lys Thr Arg His Phe Phe Glu Ser Leu Gly
325 330 335
Ile Pro Thr His Leu Lys Asp Tyr Asp Val Gly Glu Glu Ser Ile Asp
340 345 350
Met Leu Val Lys Glu Leu Glu Ala His Gly Met Ser Gln Leu Gly Glu
355 360 365
His Lys Ala Ile Thr Pro Glu Val Ser Arg Ala Ile Leu Leu Ala Ser
370 375 380
Leu
385
<210> 88
<211> 385
<212> PRT
<213> 运动发酵单胞菌苹果汁亚种（Zymomonas mobilis subsp. pomaceae）ATCC29192 DH2
<400> 88
Met Leu Asn Phe Asp Tyr Tyr Asn Pro Thr His Ile Ala Phe Gly Lys
1 5 10 15
Asp Ser Ile Ala Lys Leu Asp Thr Leu Ile Pro Gln Asp Ala Cys Val
20 25 30
Met Val Leu Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Lys Thr Gly Thr Leu Asp
35 40 45
Glu Val Lys Thr Ala Leu Gly Ser Arg Lys Ile His Glu Phe Gly Gly
50 55 60
Ile Glu Pro Asn Pro Ser Tyr Glu Thr Leu Met Gln Ala Val Glu Gln
65 70 75 80
Val Lys Lys Glu Lys Ile Asp Phe Leu Leu Ala Val Gly Gly Gly Ser
85 90 95
Val Ile Asp Gly Thr Lys Phe Val Ala Ala Ala Val Pro Tyr Glu Gly
100 105 110
Glu Pro Trp Glu Ile Leu Glu Thr Asp Gly Lys Lys Ile Lys Lys Ala
115 120 125
Leu Pro Leu Gly Thr Val Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gly Ser Glu Met
130 135 140
Asn Pro Asn Ser Val Val Thr Arg Lys Ser Ile Lys Ala Lys Arg Ala
145 150 155 160
Phe His Asn Lys Ile Val Phe Pro Leu Phe Ser Ile Leu Asp Pro Thr
165 170 175
Lys Val Tyr Thr Leu Pro Pro Arg Gln Ile Ala Asn Gly Ile Val Asp
180 185 190
Ser Phe Val His Ile Thr Glu Gln Tyr Leu Thr Tyr Pro Val Glu Gly
195 200 205
Met Val Gln Asp Glu Phe Ala Glu Gly Leu Leu Arg Ile Leu Ile Asn
210 215 220
Ile Gly Pro Lys Leu Leu Lys Asp Gln Lys Asn Tyr Asp Leu Ala Ala
225 230 235 240
Asn Phe Met Trp Thr Ala Thr Leu Ala Leu Asn Gly Leu Ile Gly Ala
245 250 255
Gly Val Pro Gln Asp Trp Ala Thr His Met Ile Gly His Glu Ile Thr
260 265 270
Ala Ala Phe Gly Val Asp His Gly Arg Thr Leu Ala Ile Ile Leu Pro
275 280 285
Ser Leu Leu Gln Asn Gln Arg Gln Val Lys Lys Asp Lys Leu Leu Gln
290 295 300
Tyr Ala Lys Asn Val Trp His Ile Glu Ser Gly Ser Glu Lys Glu Arg
305 310 315 320
Ile Asp Ala Val Ile Ala Lys Thr Arg Ser Phe Phe Glu Glu Met Gly
325 330 335
Ile Pro Thr His Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gly Lys Glu Ser Ile Asp
340 345 350
Met Leu Ile His Glu Leu Glu Ala His Gly Met Thr Lys Leu Gly Glu
355 360 365
His Asn Ala Ile Thr Pro Asp Val Ser Arg Ala Ile Leu Ile Ala Ser
370 375 380
Leu
385
<210> 89
<211> 385
<212> PRT
<213> 波罗的海希瓦氏菌（Shewanella baltica）DH3
<400> 89
Met Leu Asn Phe Asn Tyr Tyr Asn Pro Thr Arg Ile Arg Phe Gly Lys
1 5 10 15
Asp Thr Ile Ala Glu Ile Asp Thr Leu Val Pro Ser Asp Ala Lys Val
20 25 30
Met Ile Leu Phe Gly Gly Ser Ser Ala Arg Lys Thr Gly Thr Leu Asp
35 40 45
Glu Val Lys Gln Ser Leu Gly Asn Arg Phe Ile Val Glu Phe Asp Gly
50 55 60
Ile Glu Pro Asn Pro Thr Tyr Glu Thr Leu Met Lys Ala Val Ala Gln
65 70 75 80
Val Arg Glu Gln Lys Ile Asp Phe Leu Leu Ala Val Gly Gly Gly Ser
85 90 95
Val Ile Asp Gly Thr Lys Phe Val Ala Ala Ala Ala Val Phe Glu Gly
100 105 110
Glu Pro Trp Asp Ile Leu Thr Ser Trp Gly Ala Lys Val Thr Gln Ala
115 120 125
Met Pro Phe Gly Ser Val Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gly Ser Glu Met
130 135 140
Asn Asn Ala Ser Val Val Thr Arg Lys Ser Leu Gln Ala Lys Leu Pro
145 150 155 160
Phe Arg Asn Asp Leu Val Tyr Pro Gln Phe Ser Ile Leu Asp Pro Thr
165 170 175
Lys Thr Phe Thr Leu Pro Glu Arg Gln Val Ala Asn Gly Val Val Asp
180 185 190
Ala Phe Val His Ile Thr Glu Gln Tyr Leu Thr Tyr Pro Val Asn Ala
195 200 205
Ala Val Gln Asp Arg Phe Ala Glu Gly Leu Leu Gln Thr Leu Ile Glu
210 215 220
Leu Gly Pro Gln Val Leu Ala Gln Pro Glu Asp Tyr Asp Ile Arg Ala
225 230 235 240
Asn Leu Met Trp Val Ala Thr Met Ala Leu Asn Gly Thr Ile Gly Val
245 250 255
Gly Val Pro His Asp Trp Ala Thr His Met Ile Gly His Glu Leu Thr
260 265 270
Ala Leu Tyr Asp Ile Asp His Ala Arg Thr Leu Ala Ile Val Leu Pro
275 280 285
Ala Leu Leu Gln Cys Thr Lys Glu Ala Lys Arg Glu Lys Leu Leu Gln
290 295 300
Tyr Ala Asp Arg Val Trp His Ile Asn Thr Gly Thr Asp Asp Glu Arg
305 310 315 320
Ile Asp Ala Ala Ile Ala Lys Thr Lys Ala Phe Phe Glu Ala Met Gly
325 330 335
Ile Pro Thr His Leu Ser Ala Tyr Asp Leu Asp Ala Ser His Val Asp
340 345 350
Thr Leu Val Lys Gln Leu Glu Leu His Gly Met Val Ala Leu Gly Glu
355 360 365
His Gly Asn Ile Asn Pro Ala Met Ser Arg Asp Ile Leu Thr Leu Ala
370 375 380
Leu
385
<210> 90
<211> 385
<212> PRT
<213> 类鼻疽伯克氏菌（Burkholderia pseudomallei）DH4
<400> 90
Met Leu Asn Phe Asp Phe Tyr Asn Pro Thr Arg Ile Val Phe Gly Glu
1 5 10 15
Lys Thr Ala Ala Arg Leu Asn Asp Leu Leu Pro Ala Ala Ala Arg Val
20 25 30
Leu Val Leu Tyr Gly Gly Glu Ser Ala Arg Ser Asn Gly Thr Leu Asp
35 40 45
Glu Val Arg Ala Ala Leu Gly Ala Arg Asp Val Arg Glu Phe Gly Gly
50 55 60
Ile Glu Pro Asn Pro Ala Tyr Glu Thr Leu Met Arg Ala Val Glu Leu
65 70 75 80
Ala Arg Arg Glu Arg Val Asp Phe Leu Leu Ala Val Gly Gly Gly Ser
85 90 95
Val Ile Asp Gly Thr Lys Phe Val Ala Ala Ala Val Pro Phe Glu Gly
100 105 110
Asp Pro Trp Thr Ile Leu Glu Thr His Gly Ala Asn Val Ala Ala Ala
115 120 125
Leu Pro Phe Gly Cys Val Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gly Ser Glu Met
130 135 140
Asn Asn Gly Ala Val Leu Thr Arg Arg Ala Thr Arg Ala Lys Leu Ala
145 150 155 160
Phe Arg His Pro Leu Val Phe Pro Thr Phe Ser Ile Leu Asp Pro Thr
165 170 175
Lys Thr Tyr Thr Leu Pro Pro Arg Gln Val Ala Asn Gly Val Val Asp
180 185 190
Ala Phe Thr His Ile Val Glu Gln Tyr Leu Thr Tyr Pro Ala Asp Gly
195 200 205
Leu Ala Gln Asp Arg Phe Ala Glu Gly Leu Leu Gln Thr Leu Ile Glu
210 215 220
Ile Gly Pro Lys Ala Leu Ala Glu Pro Arg Asp Tyr Ala Thr Arg Ala
225 230 235 240
Asn Leu Met Trp Val Ala Thr Leu Ala Leu Asn Gly Leu Ile Gly Ala
245 250 255
Gly Val Pro Gln Asp Arg Ala Thr His Met Val Gly His Glu Leu Thr
260 265 270
Ala Arg Tyr Asp Ile Asp His Ala Arg Thr Leu Ala Val Val Leu Pro
275 280 285
Ser Met Leu Asp Val Arg Arg Asp Ala Lys Arg Ala Lys Leu Leu Gln
290 295 300
Tyr Ala Ala Arg Val Trp Asn Ile Val Asp Gly Pro Glu Asp Ala Arg
305 310 315 320
Ile Asp Ala Ala Ile Ala Arg Thr Arg Ala Phe Phe Glu Ser Leu Gly
325 330 335
Val Lys Thr Arg Leu Ala Asp Tyr Gly Val Gly Ala Asp Ala Ile Asp
340 345 350
Gly Leu Ile Ala Gln Leu Glu Ala His Gly Met Thr Arg Leu Gly Glu
355 360 365
Arg Lys Asp Val Thr Leu Asp Val Ser Arg Arg Val Leu Glu Ala Ser
370 375 380
Leu
385
<210> 91
<211> 348
<212> PRT
<213> 酿酒酵母DH5
<400> 91
Met Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu Ser His
1 5 10 15
Gly Lys Leu Glu Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys Ala Asn
20 25 30
Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu
35 40 45
His Ala Trp His Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro Leu Val
50 55 60
Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Gly Met Gly Glu Asn Val
65 70 75 80
Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Tyr Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Ser Cys Met Ala Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Gly Asn Glu Pro Asn Cys
100 105 110
Pro His Ala Asp Ser Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln Gln
115 120 125
Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala His Ile Pro Gln Gly Thr
130 135 140
Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr
145 150 155 160
Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Met Ala Gly His Trp Val Ala Ile
165 170 175
Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr Ala Lys
180 185 190
Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Gly Gly Glu Gly Lys Glu
195 200 205
Glu Leu Phe Arg Ser Ile Gly Gly Glu Val Phe Ile Asp Phe Thr Lys
210 215 220
Glu Lys Asp Ile Val Gly Ala Val Leu Lys Ala Thr Asp Gly Gly Ala
225 230 235 240
His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Ala Ala Ile Glu Ala Ser
245 250 255
Thr Arg Tyr Val Arg Ala Asn Gly Thr Thr Val Leu Val Gly Met Pro
260 265 270
Ala Gly Ala Lys Cys Cys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val Lys Ser
275 280 285
Ile Ser Ile Val Gly Ser Cys Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr Arg Glu
290 295 300
Ala Leu Asp Phe Phe Ala Arg Gly Leu Val Lys Ser Pro Ile Lys Val
305 310 315 320
Val Gly Leu Ser Thr Leu Pro Glu Ile Tyr Glu Lys Met Glu Lys Gly
325 330 335
Gln Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys
340 345
<210> 92
<211> 360
<212> PRT
<213> 酿酒酵母DH6
<400> 92
Met Ser Tyr Pro Glu Lys Phe Glu Gly Ile Ala Ile Gln Ser His Glu
1 5 10 15
Asp Trp Lys Asn Pro Lys Lys Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Pro Phe Tyr
20 25 30
Asp His Asp Ile Asp Ile Lys Ile Glu Ala Cys Gly Val Cys Gly Ser
35 40 45
Asp Ile His Cys Ala Ala Gly His Trp Gly Asn Met Lys Met Pro Leu
50 55 60
Val Val Gly His Glu Ile Val Gly Lys Val Val Lys Leu Gly Pro Lys
65 70 75 80
Ser Asn Ser Gly Leu Lys Val Gly Gln Arg Val Gly Val Gly Ala Gln
85 90 95
Val Phe Ser Cys Leu Glu Cys Asp Arg Cys Lys Asn Asp Asn Glu Pro
100 105 110
Tyr Cys Thr Lys Phe Val Thr Thr Tyr Ser Gln Pro Tyr Glu Asp Gly
115 120 125
Tyr Val Ser Gln Gly Gly Tyr Ala Asn Tyr Val Arg Val His Glu His
130 135 140
Phe Val Val Pro Ile Pro Glu Asn Ile Pro Ser His Leu Ala Ala Pro
145 150 155 160
Leu Leu Cys Gly Gly Leu Thr Val Tyr Ser Pro Leu Val Arg Asn Gly
165 170 175
Cys Gly Pro Gly Lys Lys Val Gly Ile Val Gly Leu Gly Gly Ile Gly
180 185 190
Ser Met Gly Thr Leu Ile Ser Lys Ala Met Gly Ala Glu Thr Tyr Val
195 200 205
Ile Ser Arg Ser Ser Arg Lys Arg Glu Asp Ala Met Lys Met Gly Ala
210 215 220
Asp His Tyr Ile Ala Thr Leu Glu Glu Gly Asp Trp Gly Glu Lys Tyr
225 230 235 240
Phe Asp Thr Phe Asp Leu Ile Val Val Cys Ala Ser Ser Leu Thr Asp
245 250 255
Ile Asp Phe Asn Ile Met Pro Lys Ala Met Lys Val Gly Gly Arg Ile
260 265 270
Val Ser Ile Ser Ile Pro Glu Gln His Glu Met Leu Ser Leu Lys Pro
275 280 285
Tyr Gly Leu Lys Ala Val Ser Ile Ser Tyr Ser Ala Leu Gly Ser Ile
290 295 300
Lys Glu Leu Asn Gln Leu Leu Lys Leu Val Ser Glu Lys Asp Ile Lys
305 310 315 320
Ile Trp Val Glu Thr Leu Pro Val Gly Glu Ala Gly Val His Glu Ala
325 330 335
Phe Glu Arg Met Glu Lys Gly Asp Val Arg Tyr Arg Phe Thr Leu Val
340 345 350
Gly Tyr Asp Lys Glu Phe Ser Asp
355 360

Claims (75)

1.一种通过将甘油醛3-磷酸(G3P)酶促转化为2,4-呋喃二羧酸(2,4-FDCA)以产生2,4-呋喃二羧酸(2,4-FDCA)的方法，所述方法包括：
(a)在磷酸甲酯合酶的存在下提供G3P，所述磷酸甲酯合酶催化G3P转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯；
(b)向来自(a)的所述(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯提供催化所述(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯转化为4-羟甲基糠醛(4-HMF)的磷酸酶；
(c)将来自(b)的所述4-HMF提供给脱氢酶和/或氧化酶，所述脱氢酶和/或氧化酶独立地或协同地催化来自(b)的4-HMF直接地或通过产生中间产物呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯而氧化为2,4FDCA。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述2,4-FDCA由呋喃-2,4-二甲醛和/或-(羟甲基)糠酸中间产物产生，其中：
(a)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化所述4-HMF转化为呋喃-2,4-二甲醛和/或4-(羟甲基)糠酸；和/或
(b)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化来自(a)的所述呋喃-2,4-二甲醛转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯；和/或
(c)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化来自(a)的所述4-(羟甲基)糠酸转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯；和/或
(d)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化来自(a)的所述呋喃-2,4-二甲醛转化为2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯；和或
(e)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化来自(b)和/或(c)的所述4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯或来自(d)的所述2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯转化为2,4-FDCA。
3.如权利要求1所述的方法，其中来自(a)的所述磷酸甲酯合酶被分类为EC编号4.2.3.153。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述磷酸甲酯合酶是(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶选自MfnB1、MfnB7和MfnB14。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
7.如权利要求1所述的方法，其中来自(b)的所述磷酸酶被分类为EC编号3.1.3。
8.如权利要求5所述的方法，其中所述磷酸酶被分类为卤代酸脱卤酶。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述磷酸酶是宿主内源性的。
10.如权利要求11所述的方法，其中所述宿主内源性的磷酸酶被过表达。
11.如权利要求5-8中任一项所述的方法，其中所述磷酸酶是4-HMF磷酸酶。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述4-HMF磷酸酶源自天蓝色链霉菌、酿酒酵母或大肠杆菌。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中所述4-HMF磷酸酶由包含SEQ ID NO:28、SEQID NO:40-52中的任一者或SEQ ID NO:53-68中的任一者的氨基酸序列编码。
14.如权利要求1所述的方法，其中来自(c)的所述脱氢酶被分类为EC编号1.1.1.或EC编号1.2.1。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述脱氢酶是醇脱氢酶或醛脱氢酶。
16.如权利要求1所述的方法，其中来自(c)的所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述氧化酶是5-羟甲基糠醛氧化酶。
18.如权利要求2所述的方法，其中所述脱氢酶被分类为EC编号1.2.1.或EC编号1.1.1。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述脱氢酶是醛脱氢酶或和醇脱氢酶。
20.如权利要求2所述的方法，其中所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述氧化酶是5-羟甲基糠醛氧化酶。
22.如权利要求1所述的方法，其中所述氧化酶是4-HMF氧化酶。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述4-HMF氧化酶选自HmfH6和HmfH7。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述4-HMF氧化酶包含含有SEQ ID NO:85或SEQ IDNO:86的氨基酸序列。
25.如权利要求2所述的方法，其中所述脱氢酶被分类为EC编号1.2.1。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述脱氢酶是醛脱氢酶。
27.一种能够从包含碳源的原料产生2,4-呋喃二羧酸(2,4-FDCA)的重组微生物，其中所述重组微生物表达：
(a)能够将碳源转化为甘油醛3-磷酸(G3P)的内源和/或外源核酸分子；
(b)编码催化来自(a)的G3P转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶的至少一种内源或外源核酸分子；
(c)编码催化来自(b)的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯转化为4-羟甲基糠醛(4-HMF)的磷酸酶的至少一种内源或外源核酸分子；
(d)编码过加氧酶、脱氢酶或氧化酶的至少一种内源或外源核酸分子，所述过加氧酶、脱氢酶或氧化酶独立地或协同地催化来自(c)的4-HMF直接地或通过产生中间产物呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯而氧化为2,4FDCA。
28.如权利要求27所述的重组微生物，其中所述碳源包含己糖、戊糖、甘油、CO2、蔗糖和/或其组合。
29.如权利要求27所述的重组微生物，其中来自(a)的所述磷酸甲酯合酶被分类为EC编号4.2.3.153。
30.如权利要求29所述的重组微生物，其中所述合酶是(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶。
31.如权利要求27所述的重组微生物，其中来自(c)的所述磷酸酶被分类为EC编号3.1.3。
32.如权利要求31所述的重组微生物，其中所述磷酸酶被分类为卤代酸脱卤酶。
33.如权利要求31所述的重组微生物，其中所述磷酸酶是宿主内源性的。
34.如权利要求33所述的重组微生物，其中所述宿主内源性的磷酸酶被过表达。
35.如权利要求27所述的重组微生物，其中来自(d)的所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。
36.如权利要求35所述的重组微生物，其中来自(d)的所述氧化酶是5-羟甲基糠醛氧化酶。
37.如权利要求36所述的重组微生物，其中来自(d)的所述脱氢酶被分类为EC编号1.1.1.或EC编号1.2.1。
38.如权利要求37所述的重组微生物，其中所述脱氢酶是醇脱氢酶或醛脱氢酶。
39.如权利要求27所述的重组微生物，其中所述2,4-FDCA由呋喃-2,4-二甲醛和/或-(羟甲基)糠酸中间产物产生，其中：
(a)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化来自(c)的所述4-HMF转化为呋喃-2,4-二甲醛和/或4-(羟甲基)糠酸；和/或
(b)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化来自(a)的所述呋喃-2,4-二甲醛转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯；和/或
(c)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化来自(b)的所述4-(羟甲基)糠酸转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯；和/或
(d)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化来自(c)的所述呋喃-2,4-二甲醛转化为2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯；和或
(e)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化来自(b)和/或(c)的所述4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯或来自(d)的所述2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯转化为2,4-FDCA。
40.如权利要求39所述的重组微生物，其中来自(a)、(b)、(c)、(d)和/或(e)的所述脱氢酶被分类为EC编号1.2.1.或EC编号1.1.1。
41.如权利要求40所述的重组微生物，其中所述脱氢酶是醛脱氢酶或醇脱氢酶。
42.如权利要求39所述的重组微生物，其中来自(a)、(b)、(c)、(d)和/或(e)的所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。
43.如权利要求42所述的重组微生物，其中所述氧化酶是5-(羟甲基)糠醛氧化酶。
44.如权利要求27所述的重组微生物，其中所述一种或多种重组微生物源自选自由以下组成的组的亲本微生物：梭菌属(Clostridium sp.)、永达尔梭菌(Clostridiumljungdahlii)、产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、拉氏梭菌(Clostridiumragsdalei)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、嗜甲基丁酸杆菌(Butyribacteriummethylotrophicum)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴氏嗜喊菌(Alkalibaculum bacchii)、德雷克氏梭菌(Clostridium drakei)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、甲酸乙酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermoautotrophica)、长醋丝菌(Acetonema longum)、黏液真杆菌(Blautiaproducta)、乙二醇梭菌(Clostridium glycolicum)、大梭菌(Clostridium magnum)、克氏梭菌(Candida krusei)、马永贝梭菌(Clostridiummayombei)、食甲氧基苯甲酸梭菌(Clostridium methoxybenzovorans)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)、凯伍嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter kivui)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata)、嗜热醋杆菌(Thermoacetogenium phaeum)、甲醇醋酸杆菌(Acetobacterium carbinolicum)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、白蚁鼠孢菌(Sporomusa termitida)、甘油穆尔氏菌(Moorella glycerini)、聚集性真杆菌(Eubacterium aggregans)、固氮密螺旋体(Treponema azotonutricium)、库德毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)、大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、芽孢杆菌属(Bacillus sp)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis)和甘油利用泰瑞孢子菌(Terrisporobacter glycolicus)。
45.如权利要求44所述的重组微生物，其中所述一种或多种重组微生物源自选自由以下组成的组的亲本微生物：梭菌属、永达尔梭菌、产乙醇梭菌、拉氏梭菌、粘液真杆菌、嗜甲基丁酸杆菌、热醋穆尔氏菌、谷氨酸棒杆菌、醋酸梭菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜喊菌、德雷克氏梭菌、食一氧化碳梭菌、甲酸乙酸梭菌、粪味梭菌、热自养穆尔氏菌、长醋丝菌、黏液真杆菌、乙二醇梭菌、大梭菌、克氏梭菌、马永贝梭菌、食甲氧基苯甲酸梭菌、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、普氏产醋杆菌、凯伍嗜热厌氧菌、卵形鼠孢菌、嗜热醋杆菌、甲醇醋酸杆菌、东方伊萨酵母、白蚁鼠孢菌、甘油穆尔氏菌、聚集性真杆菌、固氮密螺旋体、库德毕赤酵母、大肠杆菌、酿酒酵母、恶臭假单胞菌、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、解脂耶氏酵母、树干毕赤酵母和甘油利用泰瑞孢子菌。
46.一种使用如权利要求27所述的重组微生物产生2,4-FDCA的方法，所述方法包括在含有提供碳源的原料的培养基中培育所述重组微生物，直至产生所述2,4-FDCA。
47.一种产生能够从包含碳源的原料产生2,4-FDCA的重组微生物的方法，所述方法包括将以下分子引入所述重组微生物中和/或在所述重组微生物中过表达：
(a)能够将甘油或单糖转化为甘油醛3-磷酸(G3P)的内源和/或外源核酸分子；
(b)编码催化来自(a)的G3P转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶的至少一种内源或外源核酸分子；
(c)编码催化来自(b)的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯转化为4-羟甲基糠醛(4-HMF)的磷酸酶的至少一种内源或外源核酸分子；
(d)编码过加氧酶、脱氢酶或氧化酶的至少一种内源或外源核酸分子，所述过加氧酶、脱氢酶或氧化酶独立地或协同地催化来自(c)的4-HMF直接地或通过产生中间产物呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯而氧化为2,4FDCA。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述碳源包含己糖、戊糖、甘油、CO2、蔗糖和/或其组合。
49.如权利要求47所述的方法，其中来自(a)的所述磷酸甲酯合酶被分类为EC编号4.2.3.153。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述合酶是(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶。
51.如权利要求47所述的方法，其中来自(c)的所述磷酸酶被分类为EC编号3.1.3。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述磷酸酶被分类为卤代酸脱卤酶。
53.如权利要求47所述的方法，其中所述磷酸酶是宿主内源性的。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述宿主内源性的磷酸酶被过表达。
55.如权利要求39所述的方法，其中来自(d)的所述脱氢酶被分类为EC编号1.1.1.或EC编号1.2.1。
56.如权利要求47所述的方法，其中所述脱氢酶是醇脱氢酶或醛脱氢酶。
57.如权利要求39所述的方法，其中来自(d)的所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。
58.如权利要求49所述的方法，其中所述氧化酶是(5-(羟甲基)糠醛氧化酶。
59.如权利要求39所述的方法，其中所述2,4-FDCA由呋喃-2,4-二甲醛和/或-(羟甲基)糠酸中间产物产生，其中：
(a)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化所述4-HMF转化为呋喃-2,4-二甲醛和/或4-(羟甲基)糠酸；和/或
(b)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化来自(a)的所述呋喃-2,4-二甲醛转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯；和/或
(c)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化来自(a)的所述4-(羟甲基)糠酸转化为4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯；和/或
(d)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化来自(a)的所述呋喃-2,4-二甲醛转化为2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯；和或
(e)脱氢酶、氧化酶或过加氧酶催化来自(b)和/或(c)的所述4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯或来自(d)的所述2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯转化为2,4-FDCA。
60.如权利要求59所述的方法，其中来自(a)、(b)、(c)、(d)和/或(e)的所述脱氢酶被分类为EC编号1.2.1.或EC编号1.1.1。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述脱氢酶是醛脱氢酶或醇脱氢酶。
62.如权利要求59所述的方法，其中来自(a)、(b)、(c)、(d)和/或€的所述氧化酶被分类为EC编号1.1.3。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述氧化酶是5-(羟甲基)糠醛氧化酶。
64.一种2,4-FDCA，其根据权利要求1-26或46-63中任一项所述的方法产生。
65.一种2,4-FDCA，其根据权利要求27-45或66-73中任一项所述的重组微生物产生。
66.一种聚合物，其由权利要求64或65所述的2,4-FDCA产生。
67.如权利要求66所述的聚合物，其中来自2,4-FDCA的所述聚合物在非生物学方法中形成。
68.一种能够从包含外源性碳源的原料产生4-羟甲基糠醛(4-HMF)的重组微生物，其中所述重组微生物表达：
(a)能够将所述碳源转化为甘油醛3-磷酸(G3P)的内源和/或外源核酸分子；
(b)编码催化来自(a)的G3P转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶的至少一种内源或外源核酸分子；和
(c)编码催化来自(b)的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯转化为4-羟甲基糠醛(4-HMF)的磷酸酶的至少一种内源或外源核酸分子。
69.如权利要求68所述的重组微生物，其中来自(a)的所述磷酸甲酯合酶被分类为EC编号4.2.3.153。
70.如权利要求69所述的重组微生物，其中所述合酶是(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶。
71.如权利要求68所述的重组微生物，其中来自(c)的所述磷酸酶被分类为EC编号3.1.3。
72.如权利要求71所述的重组微生物，其中所述磷酸酶被分类为卤代酸脱卤酶。
73.如权利要求68所述的重组微生物，其中所述磷酸酶是宿主内源性的。
74.如权利要求73所述的重组微生物，其中所述宿主内源性的磷酸酶被过表达。
75.一种能够从包含碳源的原料产生2,4-呋喃二羧酸(2,4-FDCA)的重组微生物，其中所述重组微生物表达以下的一种或多种分子：
(a)能够将甘油或单糖转化为甘油醛3-磷酸(G3P)的内源和/或外源核酸分子；
(b)编码催化来自(a)的G3P转化为(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯合酶的至少一种内源或外源核酸分子；
(c)编码催化来自(b)的(5-甲酰基呋喃-3-基)磷酸甲酯转化为4-羟甲基糠醛(4-HMF)的磷酸酶的至少一种内源或外源核酸分子；
(d)编码脱氢酶和/或氧化酶的至少一种内源或外源核酸分子，所述脱氢酶和/或氧化酶独立地或协同地催化来自(b)的4-HMF直接地或通过产生中间产物呋喃-2,4-二甲醛、4-(羟甲基)糠酸、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯、4-甲酰基呋喃-2-羧酸酯、2-甲酰基呋喃-4-羧酸酯而氧化为2,4FDCA。
CN202080032050.1A 2019-03-01 2020-03-02 用于4-羟甲基糠醛及其衍生物的体内合成的方法 Pending CN113748211A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962812904P 2019-03-01 2019-03-01
US62/812,904 2019-03-01
PCT/BR2020/050064 WO2020176958A1 (en) 2019-03-01 2020-03-02 Method for the in vivo synthesis of 4-hydroxymethylfurfural and derivatives thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113748211A true CN113748211A (zh) 2021-12-03

Family

ID=70189623

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080032050.1A Pending CN113748211A (zh) 2019-03-01 2020-03-02 用于4-羟甲基糠醛及其衍生物的体内合成的方法

Country Status (9)

Country Link
US (5) US11339414B2 (zh)
EP (1) EP3921435A1 (zh)
JP (1) JP2022523540A (zh)
KR (1) KR20210136044A (zh)
CN (1) CN113748211A (zh)
BR (1) BR112021016818A2 (zh)
CA (1) CA3132051A1 (zh)
MX (1) MX2021010457A (zh)
WO (1) WO2020176958A1 (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11541105B2 (en) 2018-06-01 2023-01-03 The Research Foundation For The State University Of New York Compositions and methods for disrupting biofilm formation and maintenance
US20210371622A1 (en) * 2020-05-29 2021-12-02 Braskem S.A. Production and use of plasticizers based on 2,4-isomer of furandicarboxylic acid diesters
US11692210B2 (en) 2020-09-01 2023-07-04 Braskem S.A. Anaerobic fermentative production of furandicarboxylic acid
JP2023544969A (ja) 2020-09-01 2023-10-26 ブラスケム エス．エー． フランジメタノールの嫌気的発酵産生とフランジカルボン酸の酵素的産生
KR20230152013A (ko) 2021-01-29 2023-11-02 브라스켐 에세.아. 결정화 제어가 증가된 2,4-fdca의 코폴리에스테르
US20230002363A1 (en) 2021-06-16 2023-01-05 Braskem S.A. Furanic diglycidyl ethers and esters and use thereof
CN113913448B (zh) * 2021-07-23 2023-10-20 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种提高甲基营养菌吡咯喹啉醌产量的方法及应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6740506B2 (en) 1995-12-07 2004-05-25 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US6033861A (en) 1997-11-19 2000-03-07 Incyte Genetics, Inc. Methods for obtaining nucleic acid containing a mutation
WO2008076975A1 (en) 2006-12-18 2008-06-26 Advanced Bionutrition Corporation A dry food product containing live probiotic
EP2495239B1 (en) 2009-07-09 2016-11-16 University of Science and Technology of China Method for preparing 4-hydroxymethylfurfural
NL2006359C2 (en) * 2011-03-08 2012-04-24 Bird Engineering B V Genetically modified cell and process for use of said cell.
CN114634950A (zh) 2012-12-12 2022-06-17 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的crispr-cas组分系统、方法以及组合物
CA2906970C (en) 2013-03-21 2021-05-18 Ospedale San Raffaele Srl Targeted disruption of t cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
NL2011027C2 (en) * 2013-06-24 2014-12-29 Univ Delft Tech Process for the preparation of 2,5-furandicarboxylic acid.
BR112017017525A2 (pt) 2015-02-17 2018-04-17 Purac Biochem Bv produção de fdca catalisada por desidrogenase
EP3378931A1 (en) * 2017-03-21 2018-09-26 Purac Biochem B.V. Fdca-decarboxylating monooxygenase-deficient host cells for producing fdca

Also Published As

Publication number Publication date
US11566269B2 (en) 2023-01-31
US11566270B2 (en) 2023-01-31
MX2021010457A (es) 2021-12-10
US20220298535A1 (en) 2022-09-22
KR20210136044A (ko) 2021-11-16
US20200277639A1 (en) 2020-09-03
CA3132051A1 (en) 2020-09-10
US20220090153A1 (en) 2022-03-24
JP2022523540A (ja) 2022-04-25
BR112021016818A2 (pt) 2021-11-16
US20210238639A1 (en) 2021-08-05
US11339414B2 (en) 2022-05-24
WO2020176958A1 (en) 2020-09-10
US20210222217A1 (en) 2021-07-22
EP3921435A1 (en) 2021-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11566270B2 (en) Method for the in vivo synthesis of 4-hydroxymethylfurfural and derivatives thereof
EP3039149B1 (en) Microorganisms engineered to use unconventional sources of phosphorus or sulfur
US20120244588A1 (en) Method of producing 3-hydroxypropionic acid using malonic semialdehyde reducing pathway
WO2007140816A1 (en) Glycolic acid production by fermentation from renewable resources
US11746361B2 (en) Metabolic engineering for simultaneous consumption of Xylose and glucose for production of chemicals from second generation sugars
US10006064B2 (en) Biosynthetic pathways, recombinant cells, and methods
US20170183670A1 (en) Strain and bioprocess engineering for high lipid production
US20120301935A1 (en) Recombinant microorganism for simultaneously producing 3-hydroxypropionic acid and 1,3 propanediol
JP2022515078A (ja) マロン酸セミアルデヒドからの３－ＨＰおよびアセチル－ＣｏＡ誘導体の共産生経路
WO2019060527A1 (en) HETEROLOGOUS PRODUCTION OF 10-METHYLSTEARIC ACID BY CELLS EXPRESSING RECOMBINANT METHYLTRANSFERASE
JP2017534268A (ja) 有用産物の生産のための改変微生物および方法
CN112469813A (zh) 用于产生甲基丙烯酸酯的方法
CN105296371B (zh) 具有改进的生产力的酵母和产生产物的方法
EP0955375A2 (en) Method for producing optically active 4-Halo-3-hydroxybutyric acid ester
US10227617B2 (en) Sequestration of carbon dioxide with hydrogen to useful products
US20140248687A1 (en) Methods for expressing polypeptides in hyperthermophiles
TR2021013618T (tr) 4-hi̇droksi̇meti̇lfurfural ve bunun türevleri̇ni̇n i̇n vi̇vo sentezi̇ i̇çi̇n
Seo Engineering Modularity of Ester Biosynthesis Across Biological Scales
CN116783289A (zh) 用于生产挥发性化合物的方法和细胞

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination