TR2021013618T - 4-hi̇droksi̇meti̇lfurfural ve bunun türevleri̇ni̇n i̇n vi̇vo sentezi̇ i̇çi̇n - Google Patents

Abstract

Mevcut tarifname, bir karbon kaynağından 4-HMF, 2,4-furandimetanol, furan-2,4- dikarbaldehit, 4-(hidroksimetil)furoik asit, 2-formilfuran-4-karboksilat, 4-formilfuran-2- karboksilat ve/veya 2,4-FDCA'nın üretimi için bir rekombinant mikroorganizmalar ve metotlar sağlamaktadır. Metot, bir karbon kaynağının 4-HMF, 2,4-furandimetanol, furan-2,4-dikarbaldehit, 4-(hidroksimetil)furoik asit, 2-formilfuran-4-karboksilat, 4-formilfuran-2-karboksilat ve/veya 2,4-FDCA'ya dönüştürülmesini katalize eden endojen ve/veya eksojen nükleik asit moleküllerini eksprese eden mühendislikle tasarlanmış mikroorganizmalar sağlamaktadır. Tarifname bundan başka olarak, 4-HMF, 2,4-furandimetanol, furan-2,4- dikarbaldehit, 4-(hidroksimetil)furoik asit, 2-formilfuran-4-karboksilat, 4-formilfuran-2-karboksilat ve/veya 2,4-FDCA'dan türetilen polimerleri üretmeye yönelik metotlar sağlamaktadır.

Description

TARIFNAME 4-HIDROKSIMETILFURFURAL VE BUNUN TÜREVLERININ IN VIVO SENTEZI IÇIN ILGILI BASVURULARA ÇAPRAZ REFERANS Bu basvuru, açiklamalari buraya referans olarak dahil edilen "4- HIDROKSIMETILFURFURAL VE BUNUN TÜREVLERININ IN VIVO SENTEZI IÇIN METOT" rüçhan talep etmektedir.

BULUSUN ALANI Bu basvuru, 4-HMF, 2,4-furandimetanol, furan-2,4-dikarbaldehit, 4-(hidroksimetil)furoik asit, 2-formiIfuran-4-karb0ksilat, 4-formilfuran-2-karboksilat ve 2,4-FDCA'ten bir ya da daha fazlasinin biyosentezi için rekombinant mikroorganizmalar ile ve rekombinant mikroorganizmalari üretme metotlari ile ilgilidir. Basvuru ayrica 2,4-furandimetanol, furan- karboksilat, ve mikroorganizmalarin yoklugunda ya da büyük ölçüde mikroorganizmalardan ari enzimatik katalizörlere sahip 2,4-FDCA'dan bir ya da daha fazlasinin üretmeye yönelik metotlar ile de ilgilidir. Basvuru bundan baska olarak, 2,4-furandimetanol, turan-2,4- dikarbaldehit, 4-(hidroksimetil)furoik asit, 2-formiIfuran-4-karboksilat, 4-formilfuran-2- karboksilat ve 2,4-FDCA'dan bir ya da daha fazlasindan bir polimer ve bir plastiklestirici madde üretmeye yönelik metotlar ile ile ilgilidir. Basvuru bundan baska olarak. bu bilesiklerin bir ya da daha fazlasini ihtiva eden bilesimler ve/veya rekombinant mikroorganizmalar ile SEKANS LISTESINE ILISKIN AÇIKLAMA Bu basvuru ile Iliskili olan Sekans Listesi, bir kagit kopya yerine metin formatinda saglanmaktadir ve burada tarifname içine referans olarak dahil edilmektedir. Sekans Listesini ihtiva eden metin dosyasinin adi BRSK-019_01WO_ST25.txt'dir. Metin dosyasi yaklasik olarak 240 KB'dir, 27 Subat 2020'de olusturulmustur ve EFS-Web araciligi ile elektronik olarak sunulmaktadir.

(PET) sentezinde tereftalik asidi ikame etme potansiyeli nedeni ile çok dikkat çekmistir (Sousa, Andreia F., et al. "Biyo tabanli polyesterler ve 2,5-furandikarboksilik asitten diger PET'te furan onun analogu 2,5-FDCA'nin yerine tereftalik asit ikamesi 2,5- turandikarboksilat'a ( yol açabilir ve bu polimerin PET ile karsilastirildigi zaman pek çok avantaji vardir. Bir yönü ile 2,5-PEF, kendi muadili ile karsilastirildigi zaman daha iyi termal, bariyer ve mekanik özelliklere sahiptir (PEP Raporu 294). Bundan baska olarak, etilen glikolün yenilenebilir kaynaklardan üretilebilecegi bilindigi için, bu durumda 2,5-PEF yari yenilenebilir PET'in aksine % 100 yenilenebilir olabilir. 2,5-FDCA'nin, tereftalik aside kiyasla yukarida bahsedilen tüm avantajlarina ragmen, 2,5- FDCA üretim maliyeti, monomer kullanimini genisletmede halen mevcut olan bir sinirlamadir. Mevcut teknolojiler, tereftalik asit ile karsilastirildigi zaman maliyet açisindan rekabetçi degildir. Bunun olasi nedenlerinden biri, gerekli olan çesitli sayida ardisik endüstriyel adim ile ilgilidir. 2,5-FDCA üretim maliyetlerini düsürmeye yardimci olabilecek bir husus, sekerden, arzu edilen moleküle dogrudan bir fermantasyon yolu bulmaktir, ancak böyle bir yol hiç bildirilmemistir.

Mevcut tarifname, 2,5-FDCA'nin bir izomeri olan 2,4-FDCA için dogrudan bir fermentasyon yoludur. Bildigimiz kadari ile, mevcut tarifnamenin yani sira, herhangi bir FDCA izomeri için tarif edilmis olan dogrudan fermantasyon yollari mevcut degildir.

Belirgin bir sekilde, açiklanan 2,4-FDCA molekülü, iyi çalisilmis 2,5-FDCA'ya kiyasla benzersiz özelliklere sahiptir. 2,4-FDCA'yi bir diol ile katalitik olarak polimerize etmek, degerli özelliklere sahip olan 2,4-FDCA'dan olusan bir polimer vermektedir. Thiyagarajan ve çalisma yapilmis polyesterleri karsilastirmis ve 2,4-FDCA ve 3,4-FDCA polyesterlerin endüstriyel olarak uygulanabilir yöntemler ile yeterli moleküler agirliklarda yapilabilecegi sonucuna ulasmislardir (Thiyagarajan, Shanmugam ve digerleri. “Biyobazli furandikarboksilik asitler (FDCA'Iar): izomerik ikamenin polyester sentezi ve özellikleri üzerindeki etkileri." Green 2,4-FDCA ve 2,5-FDCA'nin yapisal analizinin, 2,4-FDCA'nin, 2,5-FDCA'dan daha fazla tereftalik aside benzeyen dogrusal özelliklere sahip oldugunu ortaya koydugu sonucuna vardi. Bu özellikler 2,4-FDCA'yi sentetik polyesterler için ilginç bir monomer haline getirmektedir (Thiyagarajan ve digerleri. "Furan-2,5- ve turan-2,4-dikarboksilik asidin es zamanli olusumu: Henkel reaksiyonunun beklenmedik yönleri" RSC Gelismeleri 3 ( 2013): özelliklere sahiptir (Bourdet ve digerleri. "Amorf Biyobazli Poli (etilen 2, 5-furandikarboksilat) ve Poli (etilen 2, 4-furandikarboksilat) içinde Moleküler Hareketlilik.") Makromoleküller 51.5 Belli bazi durumlarda, 2,4-FDCA polimerlerinin, 2,5-FDCA polimerlerinin sahip olduklarindan daha üstün özelliklere sahip oldugu rapor edilmistir. Cui ve çalisma arkadaslari (2016), merkezi halka ile baglanan çift karboksil gruplari arasindaki bag açisinin, örnegin LCD TV'Ierde, dizüstü bilgisayarlarda ve diger görüntüleme elemanlarinda kullanilanlar gibi nematik sivi kristal moleküllerin stabilitesini etkileyen anahtar önemde bir faktör oldugunu bildirmektedir. (Cui, Min-Shu, et al. "Kimyasallar ve polimerler için biyokütle türevli gliserol türevlerinden 4-hidroksimetilfurfural üretimi." ACS Sustainable Chemistry & Engineering 4.3 karboksil grubu arasinda 180°'Iik bir bag açisina sahiptir. Karsilastirilacak olursa, 2,5-furan dikarboksilik asit, iki karboksil grubu arasinda 137°'Iik bir bag açisina sahiptir. Belirgin bir sekilde, 2,4-turan dikarboksilik asit, 160 °'Iik iki karboksil grubu arasinda bir bag açisina sahiptir ve bu da onu nematik sivi kristal moleküllerin sentezi için daha uygun hale getirmektedir. 2,4-FDCA polimerlerinin bu potansiyel uygulamalarina ragmen, ayni zamanda 2,4-FDCA'nin üretim maliyeti de bu monomer uygulamalarinin genisletilmesinde mevcut olan bir darbogazdir (Cui MS, ve digerleri (2016) Kimyasallar ve Polimerler için Biyokütle Türevli Gliserol Türevlerinden 4-Hidroksimetilfurfural Üretimi. ACS Sürdürülebilir Kimya Müh. önceki sentezi, çoklu sentetik adimlar gerektirmistir ve bu nedenle de 2,4-FDCA'dan türetilen polimerler, su anda mevcut metodolojiler ve endüstriyel teknikler tarafindan maliyet açisindan engelleyicidir.

Ilk kez olarak mevcut tarifname rekombinant bir mikroorganizmada 2,4-FDCA'ya dogrudan bir fermantasyon yolu saglamaktadir. bir gliseraldehit-3-fosfattan (G3P) örnegin glikoz, ksiloz, gliserol gibi bir karbon besleme stogundan ya da herhangi bir CO2 türevli/yakalama teknolojisinden özgün dogrudan 2,4-FDCA fermantasyonu, endüstriyel ölçekte ticari uygulanabilirlige sahip olan özgün polimerlerin ve malzemelerin üretimini mümkün kilacaktir.

Mevcut tarifname bundan baska olarak, ilk kez, bir rekombinant mikroorganizmada 4-HMF, 2,4-furandimetanol, turan-2,4-dikarbaldehit, 4-(hidroksimetil)furoik asit, 2-formilfuran-4- karboksilat ve 4-formilfuran-2-karboksilat'tan bir ya da daha fazlasinin üretimi için dogrudan fermantasyon yollari saglar. Mevcut tarifname ayrica ilk kez olmak üzere, maya ve E.coli'den gelen endojen fosfatazlarin (5-f0rmilfuran-3-il)metil fosfati 4-HMF'ye defosforile edebildigini ve enzimlerin (oksidazlar, dehidrojenaz ve/veya peroksijenaz) 4-HMF'yi 2,4 FDCA'ya oksitleyebilir nitelikte oldugunu (dogrudan ya da ara ürünlerin üretimi yolu ile) da göstermektedir. Burada konuslandirilan enzim adaylarindan bazilari, bir 5-HMF izomer substrati ve ara maddeleri üzerinde aktiviteye sahip olarak karakterize edilirken, bunlarin 4- HMF'ye (ve bunun ara maddelerine) karsi aktiviteleri karakterize edilmemistir. Bu yeni dogrudan fermantasyon yollari, ticari olarak uygulanabilirligi olan 2,4-ikameli furanlarin üretimini mümkün kilacaktir. Biyoyakrtiarin bir öncüsü olarak 4-HMF'ni'n örnek teskil eden uygulamalari için Bkz. Deng ve ark. (2013. Formose Reaksiyonu ile Yakitlarin Üretimi için Baglantili Strateji. Bilimsel Raporlar, 3:1244). Gelismis özelliklere sahip poii'merlerde 2,4- furandimetanoiün örnek uyguiamaian için Bkz. Zeng ve ark.Zeng et al. (2013. Kendi Kendini Iyilestirme Yetenegine Sahip Biyo-bazli Furan Polimerleri. Makrome/eküi'ier, 46.5:1794- 1802).

TARIFNAMENIN ÖZETI Belli bazi durumlarda, 2,4-FDCA polimerlerinin, 2,5-FDCA polimerlerinin sahip olduklarindan daha üstün özelliklere sahip oldugu rapor edilmistir. Cui ve çalisma arkadaslari (2016), merkezi halka ile baglanan çift karboksil gruplari arasindaki bag açisinin, örnegin LCD TV'lerde, dizüstü bilgisayarlarda ve diger görüntüleme elemanlarinda kullanilanlar gibi nematik sivi kristal moleküllerin stabilitesini etkileyen anahtar önemde bir faktör oldugunu bildirmektedir. (Cui, Min-Shu, et al. "Kimyasallar ve polimerler için biyokütle türevli gliserol türevlerinden 4-hidroksimetilfurfural üretimi." ACS Sustainable Chemistry & Engineering 4.3 karboksil grubu arasinda 180°'Iik bir bag açisina sahiptir. Karsilastirilacak olursa, 2,5-furan dikarboksilik asit, iki karboksil grubu arasinda 137°'Iik bir bag açisina sahiptir. Belirgin bir sekilde, 2,4-turan dikarboksilik asit, 160 °'Iik iki karboksil grubu arasinda bir bag açisina sahiptir ve bu da onu nematik sivi kristal moleküllerin sentezi için daha uygun hale getirmektedir.

Tarifname, gliseraldehit 3-fosfatin (GBP) enzimatik olarak dönüstürülmesi ile üretmeye yönelik bir metot saglamakta olup, bu metot asagidakileri ihtiva etmektedir: (a) G3P'nin (5-f0rmilfuran-3- iI)metiI fosfata dönüsümünü katalize eden bir metil fosfat sentaz varliginda G3P saglanmasi; (b) (a)'dan (5-f0rmilfuran-S-il)metil fosfatin, (5-f0rmilfuran-3-il)metil fosfatin 4- hidroksimetilfurfural (4-HMF)'ye dönüsümünü katalize eden bir fosfataz saglanmasi; (C) (b)'den 4-HMF'nin bir dehidrojenaza veiveya bagimsiz olarak ya da sinerji içinde (b)'den 4- HMF'nin 2,4 FDCA'ya oksidasyonunu dogrudan ya da turan-2,4-dikarbaldehit, 4- (hidroksimetil)furoik asit, 4-f0rmilfuran-2-karboksilat, 4-formilfuran-2-karboksilat, 2- tormilfuran-4-karboksilat ara ürünlerinin üretimi yolu ile katalize eden bir oksidaza saglanmasi.

Bazi yapilanmalarda fur0ik asit ara ürünlerinden üretilnekte olup, içerisinde: (a) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenaz, 4-HMF'nin furan-2,4-dikarbaldehit'e velveya 4-(hidroksimetil)fur0ik aside dönüsümünü katalize eder; ve/veya (b) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenaz, (a)'dan furan-2,4-dikarbaldehitin 4-f0rmiIfuran-2-karboksilata dönüsümünü katalize eder; vei'veya (0) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenaz, (a)'dan 4- (hidroksimetillfuroik asidin 4-f0rmiIfuran-2-karboksilata dönüsümünü katalize eder; ve/veya (d) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenaz, (a)'dan furan-2,4-dikarbaldehitin 2- iormiIfuran-4-karb0ksilata dönüsümünü katalize eder; ve ya da (e) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenaz, (b) ve/veya (c)'den 4-formilfuran-2-karboksilatin ya da (d)'den 2-formilfuran-4-karb0ksilatin 2,4-FDCA'ya dönüsümünü katalize eder.

Bazi yapilanmalarda (a)'dan gelen metil fosfat sentaz, EC numarasi 4.2.3.153 olarak siniflandirilir. Bazi yapilanmalarda metil fosfat sentaz, (5-f0rmiIfuran-3-il)metil fosfat sentazdir. Bazi yapilanmalarda (5-formilfuran-3-il)metil fosfat sentez, Man1, ManT ve Man14 arasindan seçilir.

Bazi yapilanmalarda (5-formilfuran-3-il)metiI fosfat sentaz, SEK ID NO: 1, SEK ID NO: 7 ya da SEK ID NO: 14'ü ihtiva eden bir amino asit sekansini ihtiva etmektedir. . Bazi yapilanmalarda (b)'den gelen fosfataz, EC numarasi 3.1.3 olarak siniflandirilir. Bazi yapilanmalarda fosfataz, bir haloasit dehalojenaz olarak siniflandirilir. Bazi yapilanmalarda fosfataz, konakçi için endojendir.

Bazi yapilanmalarda konakçiya endojen olan fosfataz enzimi asiri eksprese edilir. Bazi yapilanmalarda, içerisinde fosfataz bir 4-HMF fosfatazdir.

Bazi yapilanmalarda 4-HMF fosfataz, Streptomyces coelicolor, Saccharomyces cerevisiae ya da Escherichia coli'den türetilir.

Bazi yapilanmalarda 4-HMF fosfataz, SEK ID NO: 28, SEK ID NO'Iari 40 - 52'den herhangi biri ya da SEK ID NO'Iari 53 - 68'den herhangi birini ihtiva eden bir amino asit sekansi tarafindan kodlanir.

Bazi yapilanmalarda (C)'den gelen dehidrojenaz. EC numarasi 1.1.1 olarak ya da EC numarasi 1.2.1 olarak siniflandirilir. Bazi yapilanmalarda dehidrojenaz, bir alkol dehidrojenaz ya da bir aldehit dehidrojenazdir. Bazi yapilanmalarda (a)'den gelen oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bazi yapilanmalarda oksidaz, 5-hidroksimetilfurfural oksidazdir. Bazi yapilanmalarda dehidrojenaz, EC numarasi 1.2.1 olarak ya da EC numarasi 1.1.1 olarak siniflandirilir. Bazi yapilanmalarda dehidrojenaz, bir aldehit dehidrojenaz ya da ve bir alkol dehidrojenazdir.

Bazi yapilanmalarda oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bazi yapilanmalarda oksidaz, 5-hidr0ksimetilfurfural oksidazdir. Bazi yapilanmalarda oksidaz, bir 4-HMF oksidazdir. Bazi yapilanmalarda 4-HMF oksidaz, HmfH6 ve HmfHT'den seçilir. Bazi yapilanmalarda 4-HMF oksidaz, SEK ID NO: 85 ya da SEK ID NO: 86'yi ihtiva eden bir amino asit sekansini ihtiva etmektedir. .

Bazi yapilanmalarda dehidrojenaz, EC numarasi 1.2.1 olarak siniflandirilir. Bazi yapilanmalarda dehidrojenaz, bir aldehit dehidrojenazdir.

Tarifname, bir karbon kaynagi ihtiva eden bir besleme stokundan 2,4-furandikarboksilik asit ( üretebilen nitelikte bir rekombinant mikroorganizma saglamakta olup, içerisinde rekombinant mikroorganizma asagidakileri eksprese etmektedir: (a) bir karbon kaynagini gliseraldehit 3-fosfata (G3P) dönüstürebilir kapasitede endojen ve/veya eksojen nükleik asit molekülleri; (b) (a)'dan G3P'nin (5-formilfuran-3-il)metil fosfata dönüsümünü katalize eden bir (5-formilfuran-S-il)metil fosfat sentazini kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; (o) (b)'den (5-formilfuran-3-il)metil fosfatin 4-hidroksimetilfurfural'e (4-HlVlF) dönüsümünü katalize eden bir fosfatazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; (d) dogrudan ya da ara ürünler furan-2,4-dikarbaldehit, 4-(hidroksimetil)furoik asit, 4-formilfuran-2-karboksilat, 4-formiIfuran-2-karboksilat, 2-f0rmilfuran-4-karb0ksilatin üretimi yoluyla (c)'den 4-HMF'nin 2,4 FDCA'ya oksidasyonunu bagimsiz olarak ya da Sinerji içinde katalize eden bir peroksijenaz, dehidrojenaz ya da bir oksidazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü.

Bazi yapilanmalarda karbon kaynagi, bir heksoz, bir pentoz, gliserol, CO2, sakarozlar ve/veya bunlarin kombinasyonlarini ihtiva etmektedir. Bazi yapilanmalarda (a)'dan gelen metil fosfat sentaz, EC numarasi 4.2.3.153 olarak siniflandirilir. Bazi yapilanmalarda, içerisinde sentaz, (5-f0rmiIfuran-3-il)metil fosfat sentazdir.

Bazi yapilanmalarda (c)'den gelen fosfataz, EC numarasi 3.1.3 olarak siniflandirilir. Bazi yapilanmalarda fosfataz, bir haloasit dehalojenaz olarak siniflandirilir. Bazi yapilanmalarda fosfataz, konakçi için endojendir. Bazi yapilanmalarda konakçiya endojen olan fosfataz enzimi asiri eksprese edilir.

Bazi yapilanmalarda (d)'den gelen oksidazi EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bazi yapilanmalarda (d)'den gelen oksidaz, 5-hidroksimetilfurfural oksidazdir.

Bazi yapilanmalarda (d)'den gelen dehidrojenaz, EC numarasi 1.1.1 olarak ya da EC numarasi 1.2.1 olarak siniflandirilir. Bazi yapilanmalarda dehidrojenaz, bir alkol dehidrojenaz ya da bir aldehit dehidrojenazdir.

Bazi yapilanmalarda furoik asit ara ürünlerinden üretilmekte olup, içerisinde: (a) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenaz, (c)'den 4-HMF'nin furan-2,4-dikarbaldehit'e vefveya 4-(hidroksimetil)furoik aside dönüsümünü katalize eder; ve/veya (b) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenaz, (a)'dan furan-2,4-dikarbaldehitin 4-formiIfuran-2-karb0ksilata dönüsümünü katalize eder; ve/veya (0) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenaz, (b)'den 4- (hidroksimetil)furoik asidin 4-formiIfuran-2-karboksilata dönüsümünü katalize eder; ve/veya (d) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenaz, (c)'den turan-2,4-dikarbaldehitin 2- formiIfuran-4-karboksilata dönüsümünü katalize eder; ve veya (e) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenaz, (b) ve/veya (c)'den 4-formilfuran-2-karboksilatin ya da (d)'den 2-formilfuran-4-karboksilatin 2,4-FDCA'ya dönüsümünü katalize eder.

Bazi yapilanmalarda (a), (b), (c), (d) ve/veya (e)'den gelen dehidrojenaz, EC numarasi 1.2.1 ya da EC numarasi 1.1.1 olarak siniflandirilir. Bazi yapilanmalarda dehidrojenaz, bir aldehit dehidrojenaz ya da bir alkol dehidrojenazdir. Bazi yapilanmalarda (a), (b), (c), (d) ve/veya (e)'den gelen oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bazi yapilanmalarda oksidaz, -(hidroksimetil)furfural oksidazdir.

Bazi yapilanmalarda bir ya da daha fazla rekombinant mikroorganizma, Clostridium sp., Clostridium ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ragsdalei, Eubacterium glutamicum, Clostridium acetioum, Acetobacterium wooclii, Alkalibaculum bacchii, Clostridium drakei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium formicoaceticum, Clostridium scatologenes, Moorella thermoautotrophica, Acetonema Iongum, Blautia producta, Clostridium glycolicum, Clostridium magnum, Candida krusei, Clostridium mayombei, Clostridium methoxybenzovorans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Oxobacter pfennigii, Thermoanaerobacter kivui, Sporomusa ovata, Thermoacetogenium phaeum, Acetobacterium carbinolicum, Issatchenkia orientalis, Sporomusa termitida, Moorella glycerini, Eubacterium aggregans, Treponema azotonutricium, Pichia kudriavzevii, Escheriohia coli, Sacoharomyces cerevisiae, Pseudomonas putida, Bacillus sp, Corynebacterium sp., Yarrowia lipolytioa, Scheffersomyces stipitis ve Terrisporobaoter glyoolious'dan olusan grup arasindan seçilen bir ebeveyn mikroorganizmadan türetilir.

Bazi yapilanmalarda bir ya da daha fazla rekombinant mikroorganizma, Clostridium sp., Clostridium Ijungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ragsdalei, Eubacterium limosum, Butyribaoterium methylotrophioum, Moorella thermoacetica, Corynebacterium glutamicum, Clostridium aceticum, Aoetobaoterium woodii, Alkalibaculum baoohii, Clostridium drakei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium formicoacetioum, Clostridium soatologenes, Moorella thermoautotrophica, Acetonema Iongum, Blautia producta, Clostridium glycolicum, Clostridium magnum, Candida krusei, Clostridium mayombei, Clostridium methoxybenzovorans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Oxobacter pfennigii, Thermoanaerobacter kivui, Sporomusa ovata, Thermoacetogenium phaeum, Acetobacterium carbinolicum, Issatchenkia orientalis, Sporomusa termitida, Moorella glycerini, Eubacterium aggregans, Treponema azotonutricium, Pichia kudriavzevii, Escherichia ooli, Saccharomyces cerevisiae, Pseudomonas putida, Bacillus sp, Corynebacterium sp., Yarrowia Iipolytica, Scheffersomyces stipitis, ve Terrisporobacter glycolicus'dan olusan grup arasindan seçilen bir ebeveyn mikroorganizmadan türetilir.

Tarifname, istem 27'ye ait rekombinant bir mikroorganizmayi kullanarak 2,4-FDCA üretmeye yönelik bir metot saglamakta olup, metot, 2,4-FDCA üretilene kadar bir karbon kaynagi saglayan bir besleme stogunu ihtiva eden bir kültür ortaminda rekombinant mikroorganizmanin yetistirilmesini ihtiva etmektedir.

Tarifname, bir karbon kaynagi ihtiva eden bir besleme stokundan 2,4-FDCA üretebilen nitelikte bir rekombinant mikroorganizmanin üretilmesine yeönelik bir metot saglamakta olup, metot asagidakilerin rekombinant mikroorganizmaya dahil edilmesini ve/veya onda asiri eksprese edilmesini ihtiva etmektedir: (a) gliserol ya da bir monosakkariti gliseraldehit 3- fosfata (G3P) dönüstürebilir kapasitede endojen ve/veya eksojen nükleik asit molekülleri; (b) (a)'dan GSP'nin (5-formiIfuran-S-il)metil fosfata dönüsümünü katalize eden bir (5-f0rmilfuran- 3-il)metil fosfat sentazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; (c) (b)'den (5-formilfuran-3-il)metil fosfatin 4-hidroksimetilfurfural'e (4-HMF) dönüsümünü katalize eden bir fosfatazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; (d) dogrudan ya da ara ürünler furan-2,4-dikarbaldehit, 4-(hidr0ksimetil)fur0ik asit, 4- formiIfuran-2-karboksilat, 4-f0rmiIfuran-2-karboksilat, 2-f0rmilfuran-4-karboksilatin üretimi yolu ile (cl'den 4-HMF'nin 2,4 FDCA'ya oksidasyonunu bagimsiz olarak ya da sinerji içinde katalize eden bir peroksijenaz, dehidrojenaz ya da bir oksidazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü.

Bazi yapilanmalarda karbon kaynagi, bir heksoz, bir pentoz, gliserol, C02, sakarozlar ve/veya bunlarin kombinasyonlarini ihtiva etmektedir. Bazi yapilanmalarda (a)'dan gelen metil fosfat sentaz, EC numarasi 4.2.3.153 olarak siniflandirilir. Bazi yapilanmalarda sentaz, (5-f0rmiIfuran-S-il)metil fosfat sentazdir. Bazi yapilanmalarda (c)'den gelen fosfataz, EC numarasi 3.1.3 olarak siniflandirilir. Bazi yapilanmalarda fosfataz, bir haloasit dehalojenaz olarak siniflandirilir. Bazi yapilanmalarda fosfataz, konakçi için endojendir. Bazi yapilanmalarda konakçiya endojen olan fosfataz enzimi asiri eksprese edilir.

Bazi yapilanmalarda (d)'den gelen dehidrojenaz, EC numarasi 1.1.1 olarak ya da EC numarasi 1.2.1 olarak siniflandirilir. Bazi yapilanmalarda dehidrojenaz, bir alkol dehidrojenaz ya da bir aldehit dehidrojenazdir. Bazi yapilanmalarda (d)'den gelen oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bazi yapilanmalarda oksidaz, (5- (hidroksimetil)furfural oksidazdir.

Bazi yapilanmalarda fur0ik asit ara ürünlerinden üretilmekte olup. içerisinde: (a) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenaz, 4-HMF'nin furan-2,4-dikarbaldehit'e ve/veya 4-(hidr0ksimetil)furoik aside dönüsümünü katalize eder; ve/veya (b) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenaz, (a)'dan turan-2,4-dikarbaldehitin 4-f0rmiIfuran-2-karb0ksilata dönüsümünü katalize eder; ve/veya (o) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenaz, (a)'dan 4- (hidroksimetillfuroik asidin 4-formiIfuran-2-karb0ksilata dönüsümünü katalize eder; ve/veya (d) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenaz, (a)'dan furan-2,4-dikarbaldehitin 2- formiIfuran-4-karb0ksilata dönüsümünü katalize eder; ve veya (e) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenaz, (b) ve/veya (c)'den 4-formiIfuran-2-karboksilatin ya da (d)'den 2-formilfuran-4-karb0ksilatin 2,4-FDCA'ya dönüsümünü katalize eder.

Bazi yapilanmalarda (a), (b), (c), (d) ve/veya (e)'den gelen dehidrojenaz, EC numarasi 1.2.1 ya da EC numarasi 1.1.1 olarak siniflandirilir. Bazi yapilanmalarda dehidrojenaz, bir aldehit dehidrojenaz ya da bir alkol dehidrojenazdir. Bazi yapilanmalarda (a), (b), (c), (d) ve/veya (a)'den gelen oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bazi yapilanmalarda oksidaz, -(hidroksimetil)furfural oksidazdir.

Tarifname, tarifnameye ait metotlara göre üretilen bir 2,4-FDCA saglar.

Tarifname, tarifnameye ait mikroorganizmalara göre üretilen bir 2,4-FDCA'yi saglar.

Tarifname, tarifnameye ait yapilanmalarin 2,4-FDCA'sindan üretilen bir polimer saglar. Bazi yapilanmalarda, 2,4-FDCA'dan gelen polimer, biyolojik olmayan bir islemde olusturulur.

Tarifname, bir ekzojen karbon kaynagi ihtiva eden bir besleme stokundan 4- hidroksimetilfurfural (4-HMF) üretebilen nitelikte bir rekombinant mikroorganizma saglamakta olup, içerisinde rekombinant mikroorganizma asagidakileri eksprese eder: (a) karbon kaynagini gliseraldehit 3-fosfat (GSP)'ye dönüstürebilen nitelikte endojen ve/veya eksojen nükleik asit molekülleri; (b) (a)'dan GSP'nin (5-formilfuran-S-il)metil fosfata dönüsümünü katalize eden bir (5-formilfuran-3-il)metil fosfat sentazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; ve (c) (b)'den (5-f0rmilfuran-3-il)metil fosfatin 4- hidroksimetilfurfural'a (4-HMF)'ye dönüsümünü katalize eden bir fosfatazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü.

Bazi yapilanmalarda (a)'dan gelen metil fosfat sentaz, EC numarasi 4.2.3.153 olarak siniflandirilir. Bazi yapilanmalarda sentaz, (5-f0rmilfuran-3-il)metil fosfat sentazdir. Bazi yapilanmalarda (0)'den gelen fosfataz, EC numarasi 3.1.3 olarak siniflandirilir. Bazi yapilanmalarda fosfataz, bir haloasit dehalojenaz olarak siniflandirilir. Bazi yapilanmalarda fosfataz, konakçi için endojendir. Bazi yapilanmalarda konakçiya endojen olan fosfataz enzimi asiri eksprese edilir.

Tarifname, bir karbon kaynagi ihtiva eden bir besleme stokundan 2,4-furandikarboksilik asit ( üretebilen nitelikte bir rekombinant mikroorganizma saglamakta olup, içerisinde rekombinant mikroorganizma asagidakilerden bir ya da daha fazlasini eksprese etmektedir: (a) gliserol ya da bir monosakkariti gliseraldehit 3-fosfata (G3P) dönüstürebilir kapasitede endojen ve/veya eksojen nükleik asit molekülleri; (b) (a)'dan G3P'nin (5-formilfuran-3-il)metil fosfata dönüsümünü katalize eden bir (5-formilfuran-3-il)metil fosfat sentazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; (c) (b)'den (5-f0rmiIfuran-3-il)metil fosfatin 4-hidroksimetilfurfural'e (4-HMF) dönüsümünü katalize eden bir fosfatazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; (d) dogrudan ya da ara ürünler furan-2,4- dikarbaldehit, 4-(hidroksimetil)furoik asit, 4-formilfuran-2-karboksilat, 4-formilfuran-2- karboksilat, 2-formiIfuran-4-karboksilatin üretimi yolu ile (b)'den 4-HMF'nin 2,4 FDCA'ya oksidasyonunu bagimsiz olarak ya da sinerji içinde katalize eden bir dehidrojenaz ve/veya bir oksidazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü.

Bazi yönlerde tarifname genel olarak, mikroorganizmalarin yoklugunda enzimatik katalizörler ile, bir rekombinant mikroorganizmada gliseraldehit 3-fosfatin (GBP)'ün 2,4-furandikarboksilik üretmeye yönelik bir metot saglamaya yönelik olup, metot asagidakileri ihtiva etmektedir: (a) bir metil fosfat sentaz ya da G3P'nin (5-formilfuran-3-il)metil fosfata dönüsümünü katalize edebilen nitelikte herhangi bir enzim varliginda G3P saglanmasi; (b) (a)'dan (5-formilfuran-3- il)metil fosfatin bir fosfataza ya da (5-formilfuran-S-il)metil fosfatin 4-hidroksimetiIfurfural'a (4 -HMF) dönüsümünü katalize edebilen nitelikte herhangi bir enzime saglanmasi; (c) (b)'den 4- HMF'nin, bagimsiz olarak ya da sinerji içinde 4-HMF'nin 2,4 FDCA'ya oksidasyonunu dogrudan ya da furan-2,4-dikarbaldehit, 4-(hidroksimetil)furoik asit, 4-f0rmilfuran-2- karboksilat, 4-formiIfuran-2-karb0ksilat, 2-f0rmiIfuran-4-karboksilat ara ürünlerinin üretimi yolu ile katalize edebilen oksidazlar, dehidrojenaz ya da peroksijenaza saglanmasi.

Bu anlamda, adim C, (b)'den 4-HMF'nin bir dehidrojenaza ya da bir oksidaza saglanmasi ile ya da 4-HMF'nin asagidakilere dönüsümünü katalize ederek gerçeklestirilebilir: (i) furan-2,4- dikarbaldehite ve/ ya da (ii) 4-(hidroksimetil)furoik asit; (d) (i) (c)(i)'den furan-2,4- dikarbaldehitin bir dehidrojenaza, bir oksidaza ya da turan-2,4-dikarbaldehitin 4-formilfuran- 2-karboksilata dönüsümünü katalize eden bir peroksijenaza saglanmasi; (ii) (c)(ii)'den 4- (hidroksimetillfuroik asidin bir dehidrojenaza, bir oksidaza ya da 4-(hidroksimetillfuroik asidin 4-formIIfuran-2-karboksilata dönüsümünü katalize eden bir peroksijenaza; ve/veya (iii) 2-formiIfuran-4-karboksilata dönüsümünü katalize eden bir peroksijenaza saglanmasi; ve (e) (d)(i) velveya (d)(ii)'den 4-formilfuran-2-karboksilatin ya da (d)(iii)'den 2-formilfuran-4- karboksilatin bir dehidrojenaza ya da (d)(i) ve/veya (d)(ii)'den bir 4-f0rmilfuran-2-karboksilatin ya da (d)(iii)'den 2-formilfuran-4-karboksilattan 2,4-FDCA'ya dönüsümünü katalize eden bir oksidaza saglanmasi.

Bazi yönlerde (a)'dan gelen metil fosfat sentaz, EC numarasi 4.2.3.153 olarak siniflandirilir.

Bazi yönlerde sentaz, (5-formilfuran-3-il)metil fosfat sentazdir.

Bazi yönlerde, (b)'deki fosfataz. EC numarasi 3.1.3 olarak siniflandirilan bir Fosforik monoester hidrolazdir. Bazi yönlerde fosfataz, haloasit dehalojenaz olarak siniflandirilir (Koonin ve digerleri, J. Mol. Biol. 244(1). 1994). Bazi yönlerde b reaksiyonunun fosfatazi, konakçi için endojendir (Offley ve digerleri Curr. Gen. 65. 2019). Bazi yönlerde konakçiya endojen olan fosfataz enzimi asiri eksprese edilir. Bazi durumlarda, arzu edilen reaksiyonu gerçeklestirebilen bir heterolog fosfataz kullanilir ve bir alkalin fosfataz, asit fosfataz, fruktoz- bisfosfataz, seker-fosfataz ya da seker-terminaI-fosfataz arasindan seçilir.

Bazi yönlerde, bir alkolü bir karbonile ya da EC numarasi 1.2.1.'e oksitledigi zaman bir karbonili bir aside oksitledigi zaman, (b)'den gelen dehidrojenaz, EC numarasi 1.1.1 olarak siniflandirilir. Bazi yönlerde dehidrojenaz, bir alkol dehidrojenaz ya da bir aldehit dehidrojenazdir.

Bazi yönlerde (c)'den gelen oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bazi yönlerde, oksidaz 5-(hidroksimetilfurfural oksidazdir. Bazi yönlerde, 5-hidroksimetilfurfural oksidaz, 4- hidroksimetilfurfural'i (4-HMF) üç asamali bir reaksiyonda 2,4 FDCA'ya dönüstürür.

Bazi yönlerde tarifnarne genel olarak, bir karbon kaynagi ihtiva eden bir besleme stokundan üretebilen nitelikte bir rekombinant mikroorganizmaya yönelik olup, içerisinde rekombinant mikroorganizma asagidakileri eksprese etmektedir: (a) bir karbon kaynagini gliseraldehit 3-fosfata (GSP) dönüstürebilir kapasitede endojen ve/veya eksojen nükleik asit molekülleri; (b) (a)'dan G3P'nin (5-f0rmilfuran-3-il)metil fosfata dönüsümünü katalize eden bir (5-f0rmilfuran-3-il)metiI fosfat sentazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; (c) (b)'den (5-formilfuran-3-il)metiI fosfatin 4- hidroksimetilfurfural'e (4-HMF) dönüsümünü katalize eden bir fosfatazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; (d) dogrudan ya da ara ürünler furan-2,4- dikarbaldehit, 4-(hidroksimetil)furoik asit, 4-formilfuran-2-karboksilat, 4-formilfuran-2- karboksilat, 2-f0rmiIfuran-4-karboksilatin üretimi yolu ile (b)'den 4-HMF'nin 2,4 FDCA'ya dönüsümünü katalize eden bir oksidazi ya da bir peroksijenaz, dehidrojenazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü.

Bazi yönlerde, 'den 4-HlVIF'nin, 4-HMF'nin asagidakilere dönüsümünü katalize eden bir dehidrojenaza ya da bir oksidaza ya da peroksidaza saglanmasi ile üretilebilir: (i) furan-2,4-dikarbaldehite veil ya da (ii) 4- (hidroksimetil}furoik asit; (d) (i) (C)(i)'den furan-2,4-dikarbaldehitin turan-2,4-dikarbaldehitin 4- formiIfuran-2-karb0ksilata dönüsümünü katalize eden bir dehidrojenaza, bir oksidaza ya da bir peroksijenaza saglanmasi; (ii) (c)(ii)'den 4-(hidroksimetil)furoik asidin 4- (hidroksimetil)furoik asidin 4-f0rmilfuran-2-karboksilata dönüsümünü katalize eden bir dehidrojenaza, bir oksidaza ya da bir peroksijenaza saglanmasi; ve/veya (iii) I(i)'den furan- 2,4-dikarbaldehitin turan-2,4-dikarbaldehitin 2-formilfuran-4-karboksilata dönüsümünü katalize eden bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenaza saglanmasi; ve (e) (d)(i) vei'veya (d)(ii)'den 4-formiIturan-2-karboksilatin ya da (d)(iii)'den 2-formilfuran-4-karboksilatin bir dehidrojenaza ya da (d)(i) ve/veya (d)(ii)'den bir 4-formilfuran-2-karboksilatiri ya da (d)(iii)'den 2-formiIfuran-4-karb0ksilatin 2,4-FDCA'ya dönüsümünü katalize eden bir oksidaza saglanmasi.

Bazi yönlerde, konakçi mikroorganizma, G3P'nin (5-formilfuran-3-il)metil fosfata dönüsümünü katalize eden (5-formilfuran-3-il)metil fosfat sentaz için G3P kullanilabilirligini gelistirmek için genetik olarak degistirilir. Transkripsiyonun düzenlenmesi (Alper ve digerleri Biotech. 32. 2014) ya da daha az ya da daha fazla verimli bir ortolog için gen ikamesi yolu ile çesitli gen ekspresyonu seviyelerine ulasmak için farkli metabolik mühendislik stratejileri gerçeklestirilebilir.

Bazi yönlerde karbon kaynagi, bir heksoz, bir pentoz, gliserol, 002, sakarozlar velveya bunlarin kombinasyonlarini ihtiva etmektedir.

Bazi yönlerde (b)'den gelen metil fosfat sentaz, EC numarasi 4.2.3.153 olarak siniflandirilir.

Bazi yönlerde sentaz, (5-formilfuran-3-il)metil fosfat sentazdir (Tablo 1).

Bazi yönlerde, (e)'den gelen fosfataz, EC numarasi 3.1.3 olarak siniflandirilan bir Fosforik monoester hidrolazdir. Bazi yönlerde, fosfataz haloasit dehalojenaz olarak siniflandirilir (Koonin ve digerleri, J. Mol. Biol. 244(1). 1994). Bazi yönlerde C reaksiyonunun fosfatazi, konakçi için endojendir (Of'fley ve digerleri Curr. Gen. 65. 2019). Bazi yönlerde konakçiya endoien olan fosfataz enzimi asiri eksprese edilir. Bazi durumlarda, arzu edilen reaksiyonu gerçeklestirebilen bir heterolog fosfataz kullanilir ve bir alkalin fosfataz, asit fosfataz, fruktoz- bisfosfataz, seker-fosfataz ya da seker-terminaI-fosfataz arasindan seçilir.

Bazi yönlerde (d)'den gelen oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bazi yönlerde oksidaz, 5-hidroksimetilfurfural oksidazdir. Bazi yönlerde, 5-hidroksimetilfurfural oksidaz, 4- hidroksimetilfurfural'i (4-HMF) üç asamali bir reaksiyonda 2,4 FDCA'ya dönüstürür.

Bazi yönlerde, bir alkolü bir karbonile ya da EC numarasi 1.2.1.'e oksitledigi zaman bir karbonili bir aside oksitledigi zaman, (d)'den gelen dehidrojenaz, EC numarasi 1.1.1 olarak siniflandirilir. Bazi yönlerde dehidrojenaz, bir alkol dehidrojenaz ya da bir aldehit dehidrojenazdir.

Bazi yönlerde (e)'den gelen dehidrojenaz, EC numarasi 1.2.1 ya da EC numarasi 1.1.1 olarak siniflandirilir. Bazi yönlerde dehidrojenaz, bir aldehit dehidrojenaz ya da bir alkol dehidrojenazdir. Bazi yönlerde (e)'den gelen oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bazi yönlerde oksidaz, (5-(hidroksimetiI)furfuraloksidazdir. Bazi yönlerde, (f)'den gelen dehidrojenaz EC numarasi 1.2.1 olarak siniflandirilir. Bazi yönlerde, dehidrojenaz bir aldehit dehidrojenazdir. Bazi yönlerde, (f)'den gelen oksidaz EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir Bazi yönlerde oksidaz (5-(hidroksimetil)furfural oksidazdir.

Bazi yönlerde bir ya da daha fazla rekombinant mikroorganizma, Clostridium sp., Clostridium Butyribacterium methylotrophicum, Moorella thermoacetica, Clostridium aceticum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Clostridium drakei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium formicoaceticum, Clostridium scatologenes, Moorella thermoautotrophica, Acetonema Iongum, Blautia producta, Clostridium glycolicum, Clostridium magnum, Clostridium mayombei, Clostridium methoxybenzovorans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Oxobacter pfennigii, Thermoanaerobacter kivui, Sporomusa ovata, Thermoacetogenium phaeum, Acetobacterium carbinolicum, Sporomusa termitida, Moorella glycerini, Eubacterium aggregans, Treponema azotonutricium, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pseudomonas putida, Bacillus sp., Corynebacterium sp., Yarrowia lipolytica, Scheffersomyces stipitis, and Terrisporobacter glycolicus.'den olusan gruptan seçilen bir ebeveyn mikroorganizmadan türetilir.

Bazi yönlerde tarifname, tarifname'ye ait bir rekombinant mikroorganizmayi kullanarak 2,4- FDCA üretmeye yönelik bir metoada yönelik olup, metot, 2,4-FDCA üretilene kadar bir karbon kaynagi saglayan bir besleme stogunu ihtiva eden bir kültür ortaminda rekombinant mikroorganizmanin yetistirilmesini ihtiva etmektedir.

Bazi yönlerde, tarifname genel olarak, bir karbon kaynagi ihtiva eden bir besleme stokundan 2,4-FDCA üretebilen nitelikte bir rekombinant mikroorganizmayi üretme metoduna yönelik olup, metot, asagidakilerin rekombinant mikroorganizmaya dahil edilmesini ve/veya onda asiri ekspresyonunu ihtiva etmektedir: ( a) gliserolü ya da bir monosakkariti gliseraldehit 3- fosfata (GSP) dönüstürebilen nitelikte endojen vei'veya eksojen nükleik asit molekülleri; (b) (a)'dan GSP'nin (5-f0rmiIfuran-S-il)metil fosfata dönüsümünü katalize eden bir (5-formilfuran- 3-il)metil fosfat sentazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; (c) (b)'den (5-f0rmilfuran-3-il)metil fosfatin 4-hidroksimetilfurfural'e (4-HMF) dönüsümünü katalize eden bir fosfatazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; (cl) (c)'den 4-HMF'nIn asagidakilere dönüsümünü katalize eden bir oksidazi ya da bir peroksijenaz, dehidrojenazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; (i) turan-2,4-dikarbaldehit ve/veya (ii) 4-(hidroksimetil)furoik asit; (e) (i) (d)(i)'den turan-2,4- dikarbaldehitin 4-formiIfuran-2-karboksilata ve/veya (ii) (d)(ii)'den 4-(hidroksimetil)furoik asidin 4-formiIfuran-2-karboksilat'a; vei'veya (iii) (C)(i)'den furan-2,4-dikarbaldehitin 2- formilfuran-4-karboksilat'a dönüsümünü katalize eden bir oksidazi ya da bir peroksijenaz, dehidrojenazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; ve (f) (e)(i) ve (e)(ii)'den 4-f0rmiIfuran-2-karboksilatin ya da (e)(iii)'den 2-formilfuran-4-karboksilatin 2,4- FDCA'ya dönüsümünü katalize eden bir peroksijenaz, dehidrojenaz ya da bir oksidazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü.

Bazi yönlerde karbon kaynagi, bir heksoz, bir pentoz, gliserol, ve/veya bunlarin kombinasyonlarini ihtiva etmektedir. Bazi yönlerde (b)'den gelen metil fosfat sentez, EC numarasi 4.2.3.153 olarak siniflandirilir. Bazi yönlerde sentaz, (5-formiIfuran-3-il)metil fosfat sentazdir. Bazi yönlerde, (c)'deki fosfataz, EC numarasi 3.1.3 olarak siniflandirilan bir Fosforik monoester hidrolazdir. Bazi yönlerde fosfataz, haloasit dehalojenaz olarak siniflandirilir (Koonin ve digerleri, J. Mol. Biol. 244(1). 1994). Bazi yönlerde c reaksiyonunun fosfatazi, konakçi için endojendir (Offley ve digerleri Curr. Gen. 65. 2019). Bazi yönlerde konakçiya endojen olan fosfataz enzimi asiri eksprese edilir. Bazi durumlarda, arzu edilen reaksiyonu gerçeklestirebilen bir heterolog fosfataz kullanilir ve bir alkalin fosfataz, asit fosfataz, fruktoz-bisfosfataz, seker-fosfataz ya da seker-terminaI-fosfataz arasindan seçilir.

Bazi yönlerde, bir alkolü bir karbonile ya da EC numarasi 1.2.1.'e oksitledigi zaman bir karbonili bir aside oksitledigi zaman, (d)'den gelen dehidrojenaz, EC numarasi 1.1.1 olarak siniflandirilir. Bazi yönlerde dehidrojenaz, bir alkol dehidrojenaz ya da bir aldehit dehidrojenazdir.

Bazi yönlerde (d)'den gelen oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bazi yönlerde, oksidaz 5-(hidr0ksimetilfurfural oksidazdir. Bazi yönlerde, 5-hidr0ksimetilfurfural oksidaz, 4- hidroksimetilfurfural'i (4-HMF) üç asamali bir reaksiyonda 2,4 FDCA'ya dönüstürür.

Bazi yönlerde (e)'den gelen oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bazi yönlerde oksidaz, (5-(hidroksimetil)furfural oksidazdir. Bazi yönlerde, (f)'den gelen dehidrojenaz EC numarasi 1.2.1 olarak siniflandirilir. Bazi yönlerde, dehidrojenaz bir aldehit dehidrojenazdir.

Bazi yönlerde, (f)'den gelen oksidaz EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bazi yönlerde oksidaz (5-(h idroksimetil)furfural oksidazdir.

Bazi yönlerde tarifname, mikroorganizma tarafindan üretilen 2,4-FDCA'dan bir polimer üretmeye yönelik bir metoda iliskin olup, içerisinde 2,4-FDCA ve bir diol, biyolojik olmayan bir islemde katalitik olarak polimerize edilir. Bazi yönlerde 2,4-FDCA, bir plastiklestirici madde bilesiminin parçasidir ve burada plastiklestirici madde, plastiklestirilmis bir polimer bilesiminin bir parçasidir.

Bazi yönlerde tarifname genel olarak, bir ekzojen karbon kaynagi ihtiva eden bir besleme stokundan 4-hidroksimetilfurfural (4-HMF) üretebilen nitelikte bir rekombinant mikroorganizmaya yönelik olup. içerisinde rekombinant mikroorganizma asagidakileri eksprese eder: (a) karbon kaynagini gliseraldehit 3-fosfat (GSP)'ye dönüstürebilen nitelikte endojen ve/veya eksojen nükleik asit molekülleri; (b) (a)'dan G3P'nin (5-f0rmiIfuran-3-il)metil fosfata dönüsümünü katalize eden bir (5-formilfuran-3-il)metil fosfat sentazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; ve (c) (b)'den (5-formilfuran-3-il)metil fosfatin 4-hidroksimetilfurfural'a (4-HMF)'ye dönüsümünü katalize eden bir fosfatazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü.

Bazi yönlerde fosfataz, haloasit dehalojenaz olarak siniflandirilir (Koonin ve digerleri, J. Mol.

Biol. 244(1). 1994). Bazi yönlerde b reaksiyonunun fosfatazi, konakçi için endojendir (Offley ve digerleri Curr. Gen. 65. 2019). Bazi yönlerde konakçiya endojen olan fosfataz enzimi asiri eksprese edilir. Bazi durumlarda, arzu edilen reaksiyonu gerçeklestirebilen bir heterolog fosfataz kullanilir ve bir alkalin fosfataz, asit fosfataz, fruktoz-bisfosfataz, seker-fosfataz ya da seker-terminaI-fosfataz arasindan seçilir.

Bazi yönlerde tarifname genel olarak, bir karbon kaynagi ihtiva eden bir besleme stokundan üretebilen nitelikte bir rekombinant mikroorganizmaya yönelik olup, içerisinde rekombinant mikroorganizma asagidakilerden birini ya da daha fazlasini eksprese etmektedir: (a) bir gliserol ve bir monosakkariti gliseraldehit 3-fosfata (GSP) dönüstürebilir kapasitede endojen ve/veya eksojen nükleik asit molekülleri; (b) (a)'dan GSP'nin (5-f0rmiIfuran-3-il)metil fosfata dönüsümünü katalize eden bir (5-f0rmilfuran-3- iI)metiI fosfat sentazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; (c) (b)'den (5-f0rmilfuran-3-il)metil fosfatin 4-hidroksimetilfurfural'e (4-HMF) dönüsümünü katalize eden bir fosfatazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; (d) dogrudan ya da ara ürünler furan-2,4-dikarbaldehit, 4-(hidr0ksimetil)furoik asit, 4- formiIfuran-2-karb0ksilat, 4-f0rmiIfuran-2-karboksilat, 2-f0rmiIfuran-4-karb0ksilatin üretimi yolu ile (c)'den 4-HMF'nin 2,4 FDCA'ya dönüsümünü katalize eden.

Bazi yönlerde, 'den 4-HMF'nin asagidakilere dönüsümünü katalize eden bir peroksijenaz, dehidrojenaz ya da bir oksidazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülüne (c)'den 4-HMF'nin saglanmasi ile üretilebilir: (i) furan-2,4-dikarbaldehit ve/veya (ii) 4-(hidroksimetil)furoik asit; (e) (i) (d)(i)'den turan-2,4-dikarbaldehitin 4-f0rmiIfuran-2-karboksilat'a ve/veya (ii) (d)(ii)'den 4- (hidroksimetilifuroik asidin 4-formilfuran-2-karboksilat'a dönüsümünü katalize eden bir peroksijenaz, dehidrojenaz ya da bir oksidazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; ve (f) (e)'den 4-f0rmiIfuran-2-karb0ksilatin 2,4-FDCA'ya dönüsümünü katalize eden bir peroksijenaz, dehidrojenaz ya da bir oksidazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü.

SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI SEKIL 1, GSP'nin 4-HiVIF'ye özgün dönüsümü için tarifnameye ait rekombinant mikroorganizmalar tarafindan kullanilan biyosantetik yola sematik bir genel bakistir.

Enzymatic reaksiyon siralarinin altindaki sayilar, karsilik gelen enzimler için 3 basamakli EC sayisini gösterir.

SEKIL 2 4-HMF'yi bir substrat olarak kullanarak tasarlanan ürünlerin biyosentetik üretimine sematik bir genel bakistir. Ürünler, bunlar ile sinirli olmamak üzere, 2,4-furandimethanol, turan-2,4-dicarbaldehid, 4-(hidroksimetil)furoik asit, 2-f0rmiIfuran-4-karboksilat, 4-formilfuran- 2-karboksilat ve 2,4-FDCA ihtiva etmektedir. Enzymatic reaksiyon siralarinin yanindaki sayilar, karsilik gelen enzimler için 3 basamakli EC sayisini göstermektedir.

SEKIL 3 bir karbon kaynaginin (bu durumda glikoz ya da gliserol) GSP'ye dönüstürülmesi için olasi biyosentetik yollarin sematik bir genel görünümüdür.

SEKIL 4 eksprese edilmis ve saflastirilmis 5-f0rmilfuran-3-il)metil fosfat sentaz adayi Mant'in açiklayici bir SDS-PAGE görüntüsüdür.

SEKIL 5 bir negatif kontrol numunesini (gri) ve G3P'den üretilen (5-formiIfuran-3-il)metil fosfati gösteren metil fosfat sentaz reaksiyonunu (siyah) gösteren temsili bir UV spektrumudur.

SEKIL 6 to (Üst panel) ve Izh'de (Alt panel) metil fosfat sentazlar ile G3P'den (5-formilfuran-3- iI)metiI fosfat üretimini gösteren temsili bir UV spektrumudur.

SEKIL 7 fosfataz (Üst Panel), E. coli Iizatlari (Orta Panel) ve maya Iizatlari (Alt Panel) ile (5- formilfuran-S-il)metil fosfattan 4-HMF üretimini gösteren temsili bir UV spektrumudur.

SEKIL 8 eksprese edilen 4-HMF oksidaz adayi HmfH1'in, saflastirilmis formda (PE), saflastirma öncesi çözünür fazda (SP), çözünmez fazda (lP) ve saflastirmadan sonra akista (FT) açiklayici bir SDS-PAGE görüntüsüdür.

HmfH6 (Orta Panel) ve HmfH7 (Alt Panel) ile 4-HMF'den 2,4 FDCA üretimini gösteren temsili bir UV spektrumudur. Reaksiyon ara maddeleri 4-formilfuran-2-karboksilat ( ve turan- de ayrica tanimlandi ve miktarlari belirlendi. Kromatografik ayirma, HPLC-DAD ile gerçeklestirilmistir.

SEKIL 10 hMFhT ile 4-HMF'den üretilen 2,4-FDCA'nin tanimlanmasini gösteren temsili bir GC-MS kromatogrami (Üst Panel) ve kütle spektrumudur (Alt Panel).

SEKIL 11 silillenmis 2,4-FDCA'nin bir temsilidir.

SEKIL 12 4-HMF dehidrojenaz adaylari DH1, DH2 ya da DHB tarafindan 2,4-HMF'nin 2,4- furandimetanole indirgenmesi sirasinda oksidasyonu nedeni ile NAD(P)H tükenmesini gösteren temsili bir grafiktir.

SEKIL 13 kofaktörün indirgenmesi ve 2,4-HMF substratinin furan-2,4-dikaraldehite oksidasyonu nedeni ile NAD(P)H olusumunu gösteren temsili bir grafiktir.

SEKIL 14 kofaktörün indirgenmesi ve 2,4-HMF substratinin, aldehit dehidrojenaz adaylari, DH8, DH9, DH10 ve DH11 ile 4-(hidroksimetil)furoik aside oksidasyonu nedeni ile NAD(P)H olusumunu gösteren temsili bir grafiktir.

SEKIL 15 bir aldehit dehidrojenaz (DH8) ve bir alkol dehidrojenaz (DH6) kombinasyonu ile 4-HMF'den 2,4-FDCA üretimini gösteren temsili bir kromatogramdir. 4-HMF substrati Olmadan gerçeklestirilen negatif kontrol reaksiyonu (Üst Panel). DH8, DH6 ve 4-HMF substrati (Orta Panel) ile reaksiyon. DH6 ve DH8 enzimleri olmadan gerçeklestirilen negatif kontrol reaksiyonu (Alt Panel).

SEKIL 16 to (Üst Panel) ve t4gh (Alt Panel)'de glukoz fermentasyonundan in vivo 2,4-FDCA üretimini gösteren temsili bir kromatogramdir.

DETAYLI AÇIKLAMA Tanimlar Tarifnamenin yorumlanmasi için asagida yer alan tanimlar ve kisaltmalar kullanilacaktir.

Burada ve ekte yer alan istemlerde kullanildigi sekli ile "bir" ve buna benzer tekilligi belirten gramer kullanim formlari, baglam açikça aksini belirtmedigi sürece atifta bulunulan çogul olanlari da ihtiva etmektedir. Dolayisi ile de, örnek olarak, "bir enzime" yapilan atif, bu tür enzimlerin çoklugunu ihtiva etmektedir ve "mikroorganizma"ya yapilan atif, bir ya da daha fazla mikroorganizmaya yapilan atiflari ve benzerlerini ihtiva etmektedir.

Burada kullanildigi sekli ile, "içerir , içermektedir , ihtiva eder", "kapsar , vardir", "sahiptir", dahil etmeyi kapsamasi amaçlanmistir. Ögelerin bir listesini ihtiva eden bir bilesim, karisim, islem, metot, esya ya da aparatin, mutlaka sadece bu ögeler ile sinirli olmasi gerekli degildir, ayrica açik olarak Iistelenmemis ya da bu bilesim, karisim, islem, metot, esya ya da aparatin dogasinda var olan diger ögeleri de ihtiva edebilir. Bundan baska olarak, aksi açikça belirtilmedigi süre, "ya da", dislayici nitelikte bir "ya da" degil, kapsayici nitelikte bir "ya da" anlamina gelmektedir.

Burada sayisal bir degeri degistirmek için kullanildigi sekli ile i'yaklasik olarak" ve "civarinda“ terimleri, bu açik degeri çevreleyen yakin bir araligi belirtir. Eger deger "X“ olacak olursa, 0,95X ila 1,05X arasinda bir degeri gösterir. "Yaklasik olarak X" ya da "X civarinda" seklinde civarinda"nin, örnegin "0,98X" gibi bir istem sinirlamasi için yazili açiklama destegini ögretmesi ve saglamasi amaçlanmistir.

Burada kullanildigi sekli ile, "mikrobik", "mikrobik organizma" ve "mikroorganizma" terimleri, arke, bakteri ya da ökarya alanlari içinde yer alan mikroskobik bir hücre olarak var olan herhangi bir organizmayi ihtiva etmekte olup, ikincisi maya ve filamentli mantarlari, protozoayi, yosun ya da daha yüksek Protista'yi ihtiva etmektedir. Bu nedenle de, terimin prokaryotik ya da ökaryotik hücreleri ya da mikroskobik bir boyuta sahip olan organizmalari kapsamasi amaçlanmistir ve örnegin maya ve mantar gibi ökaryotik mikroorganizmalarin yani sira tüm türlerin bakteri, arke ve öbakterilerini ihtiva etmektedir. Ayrica, bir kimyasalin üretimi için kültürlenebilen herhangi bir türün hücre kültürleri de dahildir.

Burada tarif edildigi gibi bazi yapilanmalarda rekombinant mikroorganizmalar prokaryotik mikroorganizmadir. Bazi yapilanmalarda prokaryotik mikroorganizmalar, bakterilerdir. asagida yer aldigi gibi en az on bir farkli grup ihtiva etmektedir: (1) Iki ana alt bölümü bulunan Gram pozitif (gram+) bakteriler: (1) yüksek G+C grubu (Actinomycetes, Mikobakteri, Mikrokok, digerleri) (2) düsük G+C grubu (Basil, Clostridia, Lactobacillus, Stafilokoklar, Streptokoklar, Mikoplazmalar); (2) Proteobakteriler, ör. Mor fotosentetik + fotosentetik olmayan Gram negatif bakteriler (çogu "yaygin" Gram negatif bakterileri ihtiva etmektedir): (3) Siyanobakteriler, örnegin oksijenli fototroflar; (4) Spiroketler ve ilgili türler; (5) Planktomiler; (6) Bacteroides, Flavobacteria; (7) Klamidya; (8) Yesil kükürt bakterileri; (9) Yesil kükürt olmayan bakteriler (ayrica anaerobik fototroflar); (10) Radyo dirençli mikrokoklar ve akrabalari; (11) Thermotoga ve Thermosipho termofilleri. etmektedir. Gram-negatif bakteri cinsleri arasinda, örnek olarak, Neisseria, Spirillum, Pasteurella, Brusella, Yersinia, Francisella, Haemophilus, Bordetella, Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Proteus, Vibrio, Pseudomonas, Bacteroides, Acetobacterium, Aerobacter, Agrobacterium, Azotobacter, Spirilla, Serratia, Vibrio, Rhizobium, Klamidya, Rickettsia, Treponema ve Fusobacterium yer almaktadir. etmektedir. Gram pozitif bakteri cinsleri arasinda örnek olarak Actinomyces, Basil, Clostridium, Corynebacterium, Erysipelothrix, Lactobacillus, Listerya, Mikobakteri, Miksokok, Nocardia, Stafilokok, Streptokok ve streptomiçes bulunur. yerine geçecek sekilde kullanilmaktadir ve endojen enzimleri eksprese etmek ya da asiri eksprese etmek için, örnegin bir vektörde dahil olanlar, bir entegrasyon yapisinda, ya da endojen bir genin ifadesinde bir degisiklige sahip olanlar gibi heterolog enzimleri eksprese etmek için genetik olarak modifiye edilmis mikroorganizmalara atifta bulunur. "Degisiklik" ile, bir genin, ya da bir ya da daha fazla polipeptit ya da polipeptit alt birimini kodlayan bir RNA molekülünün ya da esdeger RNA moleküllerinin ekspresyonunun, ya da bir ya da daha fazla polipeptit ya da polipeptit alt biriminin aktivitesinin, yukari düzenlendigi ya da asagi düzenlendigi anlamina gelmekte olup, böylece ekspresyon, seviye ya da aktivite, degisikligin yoklugunda gözlemlenenden daha büyük ya da daha az olur. "Rekombinant mikroorganizma" ve "rekombinant konak hücre" terimlerinin sadece belirli bir rekombinant mikroorganizmaya degil, ayni zamanda böyle bir mikroorganizmanin soyuna ya da potansiyel soyuna da atifta bulundugu anlasilmaktadir.

Bir gen sekansina iliskin olarak "ekspresyon" terimi, genin transkripsiyonunu ve uygun oldugunda, ortaya çikan mRNA transkriptinin bir proteine translasyonunu ifade etmektedir.

Dolayisi ile de, baglamdan da açikça anlasilacagi gibi, bir proteinin ekspresyonu, açik okuma çerçevesi sekansinin transkripsiyonu ve translasyonundan kaynaklanir. Bir konakçi hücrede arzu edilen bir ürünün ekspresyon seviyesi, hücrede mevcut olan karsilik gelen mRNA miktarina ya da seçilen sekans tarafindan kodlanan arzu edilen ürünün miktarina göre belirlenebilir. Örnek olarak, seçilen bir sekanstan kopyalanmis olan mRNA, qRT-PCR ile ya da Northern melezleme yolu ile nicelendirilebilir (bkz. Sambrook ve digerleri, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Seçilmis bir sekans tarafindan kodlanan protein, çesitli metotlar ile, örnegin ELISA ile, proteinin biyolojik aktivitesi için tahlil yapilmasi ile ya da proteini taniyan ve baglayan antikorlar kullanan, örnegin western blot ya da radyoimmünolojik tahliller gibi bu tür aktiviteden bagimsiz tahliller ile nicelendirilebilir. Bakiniz yukarida zikredilen Sambrook ve digerleri, 1989.

Bir gen ekspresyonunun ya da bir enzim aktivitesinin seviyesinin "azaltilmasi" ya da tamamen baskilanmasini ifade eder. Bu ekspresyon ya da aktivitenin baskilanmasi, ya gen ekspresyonunun bir inhibisyonu, gen ekspresyonu için gerekli olan promotör bölgesinin tamaminin ya da bir kisminin silinmesi, genin kodlama bölgesinde bir silme ya da yabani promotörün daha zayif bir dogal ya da sentetik promotör ile degistirilmesi olabilir. Örnek olarak, bir gen tamamen silinebilir ve mevcut tarifnameye göre suslarin tanimlanmasini, izolasyonunu ve saflastirilmasini kolaylastiran bir seçim isaretleyici gen ile degistirilebilir.

Alternatif olarak, yeni metabolik yolu desteklemek için endojen genler devre disi birakilabilir ya da silinebilir. Yine baska bir yapilanmada genin ekspresyonu, zayif bir promotör kullanilarak ya da belirli mutasyonlar dahil edilerek azaltilabilir ya da düsürülebilir.

Burada kullanildigi sekli ile "dogal olarak olusmayan" terimi, tarifnameye ait bir mikroorganizma organizmaya ya da enzim aktivitesine atifta bulunularak kullanildigi zaman, mikroorganizma organizmasi ya da enziminin, referans verilen türlerin yabani tip suslari dahil olmak üzere, referans alinan türlerin dogal olarak meydana gelen bir susunda normalde bulunmayan en az bir genetik degisiklige sahip oldugu anlamina gelir. Genetik degisiklikler, örnek olarak, metabolik polipeptitleri kodlayan eksprese edilebilir nükleik asitleri, diger nükleik asit ilavelerini, nükleik asit delesyonlarini ve/veya mikroorganizmanin genetik materyalinin diger fonksiyonel bozulmasini ihtiva eden modifikasyonlari ihtiva etmektedir. Bu tür modifikasyonlar arasinda, örnek olarak, referans alinan türler için heterolog, homolog ya da hem heterolog hem de homolog polipeptitler için bunlarin kodlama bölgeleri ve bunlarin fonksiyonel fragmanlarini yer almaktadir. Ek modifikasyonlar arasinda, örnek olarak, modifikasyonlarin bir gen ya da operonun ekspresyonunu degistirdigi kodlamayan düzenleyici bölgeler bulunmaktadir. Örnek teskil eden dogal olarak olusmayan mikroorganizma ya da enzim aktivitesi, yukarida tarif edilen hidroksilasyon aktivitesini ihtiva etmektedir. Örnegin polinükleotitler, polipeptitler, enzimler vb. gibi çesitli moleküllere atifta bulunularak burada kullanilan sekli ile "eksojen" terimi, dogada belirli bir maya, bakteri, organizma, mikroorganizma ya da hücrede normal olarak ya da dogal olarak bulunmayan ve/veya bunlar tarafindan üretilmeyen molekülleri ifade eder. Öte yandan, örnegin polinükleotitler, polipeptitler, enzimler, vb. gibi çesitli moleküllere atifta bulunmak sureti ile burada kullanildigi sekli ile "endojen" ya da "dogal" terimi, dogada belirli bir maya, bakteri, organizma, mikroorganizma ya da hücrede normal olarak ya da dogal olarak bulunan ve/veya onlar tarafindan üretilen moleküllere atifta bulunur.

Burada modifiye edilmis bir konakçi hücre baglaminda kullanildigi sekli ile "heterolog" terimi, örnegin polinükleotidleri, polipeptitleri, enzimleri, vb. gibi çesitli molekülleri ifade etmekte olup, içerisinde asagidakilerden en az biri dogrudur: (a) molekül(ler) konakçi hücreye yabancidir (“eksojen”dir) (diger bir deyis ile, onda dogal olarak bulunmaz); (b) molekül(ler), belirli bir konakçi mikroorganizmada ya da konak hücrede dogal olarak bulunur (örnegin ona üretilir; ve/veya (c) molekül(ler)in nükleotit ya da amino asit sekansi bakimindan endojen nükleotit ya da amino asit sekans(lar)indan farkli olmasi, böylece endojen olarak bulunan, endojen nükleotit ya da amino asitten nükleotit ya da amino asit sekansi bakimindan farklilik gösteren molekül, hücrede dogal olmayan (örnegin, dogal olarak bulunandan daha büyük) bir miktarda üretilir.

Burada birinci familya ya da türün bir orijinal enzimi ya da geni ile ilgili olarak kullanildigi sekli ile “homolog" terimi, fonksiyonel, yapisal ya da genomik analizler ile, ikinci familya ya da türlerin, birinci familya ya da türlerin orijinal enzimine ya da genine karsilik gelen bir enzimi ya da geni olarak belirlenen ikinci familya ya da türlerin farkli enzimleri ya da genleri anlamina gelir. Homologlar çogunlukla islevsel, yapisal ya da genomik benzerliklere sahiptir.

Kendileri vasitasi ile bir enzim ya da genin homologlarinin, genetik problar ve PCR kullanilarak kolaylikla klonlanabilecegi teknikler bilinmektedir. Klonlanmis sekanslarin homologlar olarak özdesligi, fonksiyonel tahliller kullanilarak ve/veya genlerin genomik eslemesi ile teyitedilebilir.

Bir protein "homolojiye" sahiptir ya da eger bir gen tarafindan kodlanan amino asit sekansi ikinci geninkine benzer bir amino asit sekansina sahip ise, ikinci bir proteine "homologdur".

Alternatif olarak, eger iki protein "benzer" amino asit sekanslarina sahip ise, bir protein Ikinci bir proteine homolojiye sahiptir. Bu nedenle de, "homolog proteinler" terimi, iki proteinin benzer amino asit sekanslarina sahip oldugu anlamina gelir. Belli bazi durumlarda, iki protein arasindaki homoloji, evrim ile iliskili ortak atalarinin göstergesidir. "Homolog sekanslar" ya da "homologlar" terimlerinin islevsel olarak iliskili oldugu düsünülür, inanilir ya da bilinir. Islevsel bir iliski, asagidakiler dahil olmak üzere ancak bunlar ile sinirli olmamak üzere, bir dizi çesitli yollardan herhangi biri ile belirtilebilir: (a) sekans özdesligi derecesi ve/veya (b) ayni ya da benzer biyolojik islev. Tercihen, hem (a) hem de (b) belirtilir. Sekans özdesliginin derecesi degisebilir, ancak bir yapilanmada en az % 50 (teknikte bilinen standart sekans hizalama programlari kullanildigi zaman), en az % 60, en az % 65, en az % yaklasik olarak % 92, en az yaklasik olarak % 93, en az yaklasik olarak % 94, en az yaklasik olarak % 95, en az yaklasik olarak % 96, en az yaklasik olarak % 97, en az yaklasik olarak teknikte hali hazirda kolayca bulunabilen yazilim programlari kullanilarak belirlenebilir. Bazi hizalama programlari MacVector (Oxford Molecular Ltd, Oxford, Ingiltere) ve ALIGN Plus'tir (Scientific and Educational Software, Pennsylvania). Diger sinirlayici olmayan hizalama programlari arasinda Sequencher (Gene Codes, Ann Arbor, Michigan), Alian ve Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad, CA) bulunur. Benzer bir biyolojik fonksiyon asagidakileri ihtiva edebilir, ancak bunlar ile sinirli degildir: ayni ya da benzer enzimatik reaksiyonu katalize etmek; bir substrat ya da yardimci faktör için ayni ya da benzer seçicilige sahip olmak; ayni ya da benzer stabiliteye sahip olmak; çesitli fermantasyon kosullarina (sicaklik, pH, vb.) ayni ya da benzer toleransa sahip olmak; ve/veya çesitli metabolik substratlara, ürünlere, yan ürünlere, ara ürünlere vb. karsi ayni ya da benzer toleransa sahip olmak. Biyolojik fonksiyondaki benzerlik derecesi degisebilir, ancak bir yapilanmada, belirli bir biyolojik fonksiyonu belirlemek için teknikte uzmanliga sahip olan kisiler tarafindan bilinen bir ya da daha fazla yaklasik olarak % 91, en az yaklasik olarak % 92, en az yaklasik olarak % 93, en az yaklasik olarak % 94, en az yaklasik olarak % 95 en az yaklasik olarak % 96, en az yaklasik olarak % 97, en az yaklasik olarak % 98 ya da en az % 98,5 ya da en az yaklasik olarak % 99 ya da Bir varyant ayrica bir multimerin bir ya da daha fazla bilesenini, tek bir bilesen ihtiva eden multimerleri, tek bir bilesenin katlarini ihtiva eden multimerleri (örnegin, bir referans molekülünün multimerleri), bir kimyasal parçalanma ürününü ve bir biyolojik parçalanma ürününü kapsar. Özellikle de, sinirlayici olmayan yapilanmalarda, bir enzim, referans enzimi kodlayan polipeptit sekansinin herhangi bir bölümündeki degisiklik(ler) sayesinde bir referans enzime göre bir "varyant" olabilir. Bir referans enzimin bir varyanti, referans enzimin bir müstahzarinin enzim aktivitesini ölçmek için kullanilan standart bir tahlilde en az 110, en az % 120, en az % 130 ya da daha fazlasi enzim aktivitesine sahip olabilir. Bazi yapilanmalarda, bir varyant ayrica, mevcut tarifnamenin tam uzunluktaki ya da islenmemis en az % 99 sekans özdesligine sahip olan polipeptitlere atifta bulunmaktadir. Bazi yapilanmalarda, bir varyant ayrica, mevcut tarifnamenin olgun ya da islenmis enzimlerine, en sekans özdesligine sahip olan polipeptitlere de atifta bulunmaktadir..

Burada kullanildigi sekli ile "verim potansiyeli" terimi, bir biyosentetik yoldan bir ürünün verimini ifade etmektedir. Bir yapilanmada verim potansiyeli, baslangiç bilesiginin agirligi basina son ürünün agirlikça bir yüzdesi olarak ifade edilebilir.

Burada kullanildigi sekli ile "termodinamik maksimum verim" terimi, besleme stoguna kiyasla ürünün enerji degerine dayali olarak örnegin glikoz gibi belirli bir besleme stokunun fermentasyonundan elde edilen bir ürünün maksimum verimini ifade eder. Normal bir fermantasyonda, örnek olarak isik, hidrojen gazi ya da metan ya da elektrik gibi ek enerji kaynaklarinin kullanimi olmadan ürün, besleme stokundan daha fazla enerji içeremez.

Termodinamik maksimum verim, besleme stokundan gelen tüm enerji ve kütlenin ürüne dönüstürüldügü bir ürün verimini belirtir. Bu verim hesaplanabilir ve belirli bir yoldan bagimsizdir. Eger bir ürüne yönelik belirli bir yol, termodinamik maksimum verimden daha düsük bir verime sahip ise, O zaman kütle kaybeder ve büyük olasilikla ürüne yönelik daha verimli bir yol üzerinde gelistirilebilir ya da onun ile ikame edilebilir. ifade eder. Redoks kofaktörleri eksikligi söz konusu oldugu zaman, redoks dengesi negatiftir ve kofaktör talebini karsilamak için besleme stoku yakma ihtiyaci oldugundan dolayi bu yolun verimi gerçekçi olmaz. Redoks kofaktörlerinin fazlaligi söz konusu oldugu zaman, redoks dengesinin pozitif oldugu ve bu tür bir yolun veriminin maksimum verimden daha düsük oldugu söylenir (Dugar ve digerleri. “Biyoyakitlar ve biyo-bazli ürünler için biyosentetik ile ayni miktarda redoks kofaktörü ürettigi zaman, redoks dengesi sifirdir ve bu yola “redoks dengeli” denilebilir. Redoks kofaktörlerinin dengeli ya da dengeli olmaya yakin olacagi bir sekilde metabolik yollarin tasarlanmasi ve bir organizmanin tasarlanmasi, genel olarak, dengesiz bir yola kiyasla arzu edilen bilesiklerin daha etkin, daha yüksek verimli bir üretimi ile sonuçlanir. Redoks reaksiyonlari, her zaman, biri oksidasyon reaksiyonu ve digeri bir indirgeme reaksiyonu olmak üzere, es zamanli olarak meydana gelen iki yari reaksiyon olarak birlikte meydana gelir. Redoks islemlerinde indirgeyici, elektronlari oksitleyiciye aktarir. Dolayisi ile de reaksiyonda, indirgeyici ya da indirgeyici madde elektron kaybeder ve oksitlenir ve oksitleyici ya da oksitleyici madde elektron kazanir ve indirgenir. Bir yapilanmada redoks reaksiyonlari biyolojik bir sistemde gerçeklesir. Redoks durumu terimi genel olarak, örnegin bir mikrobiyal hücre gibi biyolojik bir sistemdeki dogal ya da dogal olmayan metabolik yollarin NAD+/NADH ve NADP+INADPH dengesini tarif etmek için kullanilir. Redoks durumu, karsilikli dönüsümü bu oranlara bagli olan çesitli sayida metabolit setinin (örnegin, Iaktat ve piruvat, beta-hidroksibutirat ve asetoasetat) dengesinde yansitilir.

Bir yapilanmada, hidrojeni NAD(P)H'ye dönüstürebilen hidrojenaz enzimlerinin kullanimi ile kombine edilmis ya da edilmemis bir harici hidrojen ya da elektron kaynagi, negatif redoks dengesi ile, diger bir deyis ile örnegin NAD(P)H gibi redoks kofaktörlerinde yetersizlik söz konusu oldugu zaman, metabolik yollarda ürün verimini artirmak için faydali olabilir. birbirinin yerine geçecek sekilde kullanilmaktadir. Bunlar, deoksiribonükleotitler ya da ribonükleotitler ya da bunlarin analoglari olsun, herhangi bir uzunluktaki nükleotitlerin polimerik bir formuna atifta bulunurlar. Polinükleotitler herhangi bir üç boyutlu yapiya sahip olabilir ve bilinen ya da bilinmeyen herhangi bir islevi yerine getirebilir. Asagidakiler polinükleotitlerin sinirlayici olmayan örnekleridir: bir genin ya da gen fragmaninin kodlayan ya da kodlamayan bölgeleri, baglanti analizinden tanimlanan Iokuslar (Iokus), eksonlar, intronlar, haberci RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), ribozomal RNA (rRNA), küçük karisan RNA (siRNA), kisa saç tokasi RNA (shRNA), mikro-RNA (miRNA), ribozimler, cDNA, rekombinant polinükleotitler, dalli polinükleotitler, plazmitler, vektörler, herhangi bir sekansin izole edilmis DNA'si, herhangi bir sekansin izole edilmis RNA'si, nükleik asit problari ve primerler. Bir polinükleotit, örnegin metillenmis nükleotitler ve nükleotit analoglari gibi bir ya da daha fazla modifiye edilmis nükleotit ihtiva edebilir. Eger mevcut ise, nükleotid yapisindaki modifikasyonlar, polimerin birlestirilmesinden önce ya da sonra verilebilir.

Nükleotidlerin sekansi, nükleotid olmayan bilesenler tarafindan kesintiye ugratilabilir. Bir polinükleotit, polimerizasyondan sonra, örnegin bir etiketleme bileseni ile konjugasyon yolu ile ayrica modifiye edilebilir. olmayan türler yolu ile baska bir nükleik asit sekansi ile hidrojen bagi/baglari olusturma yetenegini ifade eder. Yüzde tamamlayicilik, ikinci bir nükleik asit sekansi ile (örnegin, 10 hidrojen baglari (örnegin Watson-Crick baz eslesmesi) olusturabilen bir nükleik asit molekülündeki kalintilarin yüzdesini belirtir. “Mükemmel tamamlayici", bir nükleik asit sekansinin tüm bitisik kalintilarinin, ikinci bir nükleik asit sekansinda ayni sayida bitisik kalinti ile hidrojen bagi olusturacagi anlamina gelir. Burada kullanildigi sekli ile “büyük ya da siki kosullar altinda melezlesen iki nükleik asit anlamina gelir. Örnegin yüzde tamamlayiciligin degerlendirilmesi amaci ile oldugu gibi sekans özdesligi, bunlar ile sinirli olmamak üzere, Needleman-Wunsch algoritmasi (bkz. örn. www.ebi.ac.uk/TooIs/psa/emboss_needIe/nükleotidehtml internet adresinde bulunan EMBOSS Needle hizalayici, istege bagli olarak varsayilan ayarlar ile), BLAST algoritmasi (öm. bkz. blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi internet adresinde mevcut olan BLAST hizalama araci, istege bagli olarak varsayilan ayarlar ile) ya da Smith-Waterman algoritmasi (bkz. www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html internet adresinde bulunan EMBOSS Water hizalayici, istege bagli olarak varsayilan ayarlar ile) dahil herhangi bir uygun hizalama algoritmasi ile ölçülebilir. Optimal hizalama, varsayilan parametreler dahil olmak üzere, seçilen bir algoritmanin herhangi bir uygun parametresinin kullanilmasi ile degerlendirilebilir. müdahale etmeye ya da normal bakteriyolojik teknikler ile tespit edilmeye yeterli olan miktarlarda baska hiçbir bakteri türü ihtiva etmeyen, burada tarif edilen bir bakteri türünün bir kültürünü ifade eder.

Burada kullanildigi sekli ile bir "kontrol sekansi", bir operatöre, promotöre, susturucuya ya da Burada kullanildigi sekli ile "dahil edilmis", dogal olarak meydana gelen bir ekleme degil, modern biyoteknoloji yolu ilea giris anlamina gelmektedir.

Burada kullanildigi sekli ile, bir "yapici promotör", çogu kosul altinda ve/veya çogu gelistirme asamasinda aktif olan bir promotördür. Biyoteknolojide kullanilan ekspresyon vektörlerinde yapici promotörler kullanmanin çesitli avantajlari vardir, örnegin: transgenik hücreleri ya da organizmalari seçmek için kullanilan proteinlerin yüksek düzeyde üretimi; kolay tespit ve nicellestirmeye olanak taniyan raportör proteinlerin ya da puanlanabilir isaretleyicilerin yüksek düzeyde ekspresyonu; düzenleyici bir transkripsiyon sisteminin parçasi olan bir transkripsiyon faktörünün yüksek düzeyde üretimi; organizmada her yerde bulunan aktiviteyi gerektiren bilesiklerin üretimi; ve gelisimin tüm asamalarinda gerekli olan bilesiklerin üretimi.

Burada kullanildigi sekli ile, bir "yapici olmayan promotör", belirli kosullar altinda, belirli türdeki hücrelerde ve/veya belirli gelistirme asamalarinda aktif olan bir promotördür. Örnek olarak, indüklenebilir promotörler ve gelistirme kontrolü altindaki promotörler, yapici olmayan promotörlerdir.

Burada kullanildigi sekli ile "indüklenebilir" ya da "bastirilabilir" promotör, kimyasal ya da çevresel faktörlerin kontrolü altinda olan bir promotördür. Indüklenebilir promotörler ile transkripsiyonu etkileyebilecek çevresel kosullarin örnekleri arasinda anaerobik kosullar, belirli kimyasallar, hafif, asidik veya bazik kosullarin varligi vb. yer almmaktadir.

Burada kullanildigi sekli ile "islevsel olarak bagli" terimi, nükleik asit sekanslarinin tek bir nükleik asit fragmani üzerindeki iliskisini ifade etmekte olup, böylece birinin islevi digeri tarafindan düzenlenir. Örnek olarak, bir promotör, 0 kodlama sekansinin ekspresyonunu düzenleyebilir kapasitede oldugu zaman (diger bir deyis ile, kodlama sekansi promotörün transkripsiyonel kontrolü altinda oldugunda) bir kodlama sekansina islevsel olarak baglidir.

Kodlama sekanslari, bir sene ya da anti sens yönelimde düzenleyici sekanslara islevsel olarak baglanabilir. Baska bir örnekte, tarifnamenin tamamlayici RNA bölgeleri, dogrudan ya da dolayli olarak, hedef mRNA'ya 5' ya da hedef mRNA'ya 3' ya da hedef mRNA içinde islevsel olarak baglanabilir ya da birinci tamamlayici bölge 5' ve onun tamamlayicisi, hedef mRNA'ya göre 3"tür.

Burada kullanildigi sekli ile "katalitik olarak polimerize edilmis" terimi, içerisinde tarifnameye ait monomerlerin biyolojik olmayan ya da in vivo olmayan bir baglamda polimerize edildigi polimerizasyon islemini ifade eder.

Burada kullanildigi sekli ile "sinyal sekansi" terimi, peptitleri ve polipeptitleri hücresel konumlara ya da hücre disi ortama hedefleyen bir amino asit sekansina karsilik gelir. Sinyal sekanslari tipik olarak bir polipeptidin N terminal kismindadir ve tipik olarak enzimatik olarak çikarilir. Kendi sinyal sekanslarina sahip olan polipeptitler, tam uzunlukta ve/veya islenmemis olarak adlandirilir. Kendi sinyal sekanslari çikarilmis olan polipeptitler, olgun vei'veya islenmis olarak ifade edilir.

Burada kullanildigi sekli ile "mikrobik bilesim", mevcut tarifnameye ait bir ya da daha fazla mikrop ihtiva eden bir bilesime karsilik gelir.

Burada kullanildigi sekli ile "tasiyici", "kabul edilebilir tasiyici", "ticari olarak kabul edilebilir tasiyici" ya da “endüstriyel olarak kabul edilebilir tasiyici", mikroplara zararli sekilde etkide bulunmayan, mikrobun kendisi ile birlikte uygulanabilecegi, saklanabilecegi ya da transfer edilebilecegi bir seyreltici, adjuvan, eksipiyan ya da araç anlamina gelir.

Burada kullanildigi sekli ile "verimlilik" terimi, saatte üretilen örnegin ( gibi biyoürün toplam miktarini ifade eder.

Burada kullanildigi sekli ile "biyosentez ürünleri" terimi, burada tasarlanan asagida yer verilen ürünlerden herhangi biri ya da daha fazlasina atifta bulunur: 4-HMF, 2,4- furandimethanol, furan-2,4-dicarbaldehid, 4-(hidr0ksimetil)furoik asit, 2-f0rmilfuran-4- karboksilat, 4-f0rmilfuran-2-karboksilat ve 2,4-FDCA.

Rekombinant Mikroorganizmalar Bir yapilanmada, mevcut tarifname, burada tasarlanan biyosentetik ürünlerden herhangi birini ya da daha fazlasini üretebilen nitelikte bir rekombinant mikroorganizma saglar. Bir yapilanmada, bir rekombinant mikroorganizma bir 4-HMF üretir. Bir yapilanmada, bir rekombinant mikroorganizma bir 2,4,furandimetanol üretir. Bir yapilanmada, bir rekombinant mikroorganizma bir furan-2,4-dikarbaldehit üretir. Bir yapilanmada bir rekombinant mikroorganizma, bir 4-(hidroksimetil)furoik asit üretir. Bir yapilanmada, bir rekombinant mikroorganizma bir 2-formilfuran-4-karboksilat üretir. Bir yapilanmada, bir rekombinant mikroorganizma bir 4-f0rmilfuran-2-karboksilat üretir. Bir yapilanmada, bir rekombinant mikroorganizma bir 2,4-FDCA üretir.

Bir yapilanmada, bir rekombinant mikroorganizma, biyosentetik ürünlerin herhangi altisini üretir. Bir yapilanmada, bir rekombinant mikroorganizma, biyosentetik ürünlerin herhangi besini üretir. Bir yapilanmada, bir rekombinant mikroorganizma, biyosentetik ürünlerin herhangi dördünü üretir. Bir yapilanmada, bir rekombinant mikroorganizma, biyosentetik ürünlerin herhangi üç tanesini üretir.

Bir yapilanmada, karbon kaynagi gliseraldehit 3-fosfata (GSP) dönüstürülür. G3P, yaygin bir dogal ara metabolittir. Bazi yapilanmalarda glikoliz yolu vasitasi ile glukozdan ya da ksilozdan (pentoz fosfat yolundan oldugu gibi ancak sinirli olmamak üzere) ya da gliserolden üretilebilir. Bazi yapilanmalarda G3P, C02 yakalama teknolojilerinden türetilebilir. Bir yapilanmada, bir heksoz, bir pentoz, gliserol ihtiva eden bir karbon kaynagi kullanarak ya da CO2 yakalama teknolojilerinden herhangi bir ya da daha fazla biyosentetik ürünü üretebilen nitelikte rekombinant mikroorganizma. Belli bazi yapilanmalarda karbon kaynagi gliseroldür.

Bir yapilanmada, rekombinant mikroorganizma, G3P'yi, çesitli sayida enzimatik olarak katalize edilmis ardisik adim yolu ile herhangi bir ya da daha fazla biyosentetik ürüne dönüstürmek için yeni kapasiteyi ihtiva etmektedir.

Bir yapilanmada, konakçi mikroorganizma, G3P'nin (5-formiIfuran-3-il)metil fosfata dönüsümünü katalize eden (5-formiIfuran-3-il)metil fosfat sentaz için G3P kullanilabilirligini gelistirmek için genetik olarak degistirilir.

Bir yapilanmada, rekombinant mikroorganizmalar, Clostridium sp., Clostridium Ijungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ragsdalei, Eubacterium Iimosum, Butyribacterium methylotrophicum, Moorella thermoacetica, Clostridium aceticum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Clostridium drakei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium formicoaceticum, Clostridium scatologenes, Moorella thermoautotrophica, Acetonema mayombei, Clostridium methoxybenzovorans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Oxobacter pfennigii, Thermoanaerobacter kivui, Sporomusa ovata, Thermoacetogenium phaeum, Acetobacterium carbinolicum, Sporomusa termitida, Moorella glycerini, Eubacterium aggregans, Treponema azotonutricium Escherichia col, Saccharomyces cerevisiae, Pseudomonas putida, Bacillus sp., Corynebacterium sp., Yarrowia Iipolytica, Scheffersomyces stipitis, Methylovorus sp., Cupriavidus sp., Methanocaldococcus sp and Terrisporobacter glycolicus'dan olusan grup arasindan seçilen bir ebeveyn mikroorganizmadan türetilir.

Bir yapilanmada mevcut tarifname, bir ya da daha fazla karbon kaynaginin gliseraldehit 3- fosfata (G3P) dönüstürülmesini; G3P'nin (5-formilfuran-3-il)metil fosfata dönüstürülmesi (Adim A); (5-f0rmilfuran-3-il)metil fosfatin 4-hidr0ksimetilfurfural (4-HMF)'ye dönüstürülmesi (Adim B) ihtiva etmektedir.

Bir yapilanmada, burada açiklanan yapilanmalardan herhangi birine ait rekombinant mikroorganizma, bir karbon kaynagini gliseraldehit 3-fosfata (GSP) dönüstürebilen nitelikte bir endojen ve/veya eksojen nükleik asit moleküllerini ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada gliserol, bir gliserol kinazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü tarafindan gliseroI-3-fosfata dönüstürülür. Bir yapilanmada gliserol-S-fosfat, bir gliseroI-3- fosfat dehidrojenazi kodlayan en az bir endojen ya da ekzojen nükleik asit molekülü tarafindan dihidroksiaseton fosfata (DHAP) dönüstürülür. Bir yapilanmada gliserol, bir gliserol dehidrejenazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ile glisdihidroksiasetona dönüstürülür. Bir yapilanmada dihidroksiaseton, bir dihidroksiaseton kinazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü tarafindan dihidroksiaseton fosfata (DHAP) dönüstürülür. Bir yapilanmada DHAP, bir trioz fosfat izomerazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü tarafindan G3P'ye dönüstürülür. burada tasarlanan örnek teskil eden ancak sinirlayici olmayan gliserol asimilasyon yollari için Bkz. Zhang ve ark. (2010. Applied and Environmental Microbiology, Bir yapilanmalarda, burada açiklanan yapilanmalarin herhangi birine ait rekombinant mikroorganizma, G3P'nin (5-formilfuran-3-il)metil fosfat'a dönüsümünü katalize eden bir (5- tormilfuran-S-il)metil fosfat sentazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada (5-formilfuran-S-il)metil fosfat sentaz, EC il)metil fosfat sentaz, man geninden türetilebilir. Bazi yapilanmalarda man, Methanocaldococcus jannaschii'den türetilebilir. Bazi yapilanmalarda (5-f0rmilfuran-3-il)metil fosfat sentaz, Tablo 1'de listelenen enzim adaylarindan türetilebilir. Bazi yapilanmalarda (5- formilfuran-S-il)metil fosfat sentaz, Tablo 1'de listelenen bir amino asit sekansi ile kodlanabilir. Bazi yapilanmalarda (5-formIlfuran-3-Il)metil fosfat sentaz, Tablo 1'de listelenen enzimlere homolog ya da benzerdir. Bazi yapilanmalarda, bir (5-f0rmilfuran-3-il)metil fosfat sentaz enzimi, katalitik etkinligini, belirgin sekilde kcat'i gelistirmek üzere gelistirilir ya da tasarlanir.

Tablo 1. (5-formilfuran-S-il)metil fosfat sentaz enzimleri Adi Organizma Sekans MILLVSPIDVEEAKEAIAGGADIIDVKNPKEGSLGANFPW MIKAIREVTPKDLLVSATVGDVPYKPGTISLAAVGAAISG ADYIKVGLYGVKNYYQAVELMKNVVRAVKDIDENKIVVA jannaschii AGYADAYRVGAVEPLIVPKIARDAGCDVAMLDTAIKDG KTLFDFQSKElLAEFVDEAHSYGLKCALAGSIKKEHIPIL KEIGTDIVGVRGAACKGGDRNNGRIDRELVKELKELCK (SEK ID NO: 1) Mant Methanocaldococcus MILLVSPIDVEEAKEAIAGGADIIDVKNPKEGSLGANFPW MIKAIREVTPKELLVSATVGDVPFKPGTISLAAVGAAISG Methanocaldococcus ADYIKVGLYGVKNYYEGVELMKNVVRAVKDIDENKIVVA ManZ fervens AGYADAHRVGAVEPLIIPKIARDAGCDVAMLDTAVKDG KTLFDFQSKEILEEFVQESHDYGLKCALAGSIKKEHIPIL KEIGTDIVGVRGAVCKGGDRNNGRIDRELVRELKELCK (SEK ID NO: 2) Methanocaldococcus vulcanius MILLVSPIDVDEAREAIAGGADIIDVKNPKEGSLGANFP WMIKAIREITPKELLVSATVGDVPYKPGTVSLASVGAAM SGADYIKVGLYGVKNYYEAVELMKNVVRAVKDVDENKl VVAAGYADAHRVGAVDPLIIPKIARDADCDVAMLDTAIK DGKTLFDFQSKEILEEFVEETHSYGLKCALAGSIKKEHIP (SEK ID NO: 3) Methanocaldococcus infernus MLLLVSPIDVEEAKEAIEGGADIIDVKNPKEGSLGANFP WVIREVRKlTPKSLLVSATVGDVPYKPGTVSLAALGAG MSGADYIKVGLYGVKNYNQAVELMKSWKAVKDFDDN KIWAAGYADAYRVGAVDPLVIPKIARDSGADVAMLDTA C (SEK lD NO: 4) Methanothermococcus okinawensis MILLVSPKDVNEAIETIKGGADIVDVKNPPEGSLGANFP WIIKEIREITPKNLFVSAAIGDVPYKPGTVALAALGAAMS GADYIKVGLYGTKSYNEAVDLMEKWKAVKGVDENKIV VAAGYADAHRVGAVEPLIVPKIARDAGCDVAMLDTAVK DGKTLFDHLNEKILAEFVEETHSYGLKCALAGSIKKEEIP K (SEK ID NO: 5) Methanococcales archaeon HHB MRILISPKDIEEAKEAIEGGADIIDVKNPLEGSLGANFPW VIREIRNITPKDRLVSATVGDVPYKPGTVALAAVGAAISG ADYIKVGLYGTKSYREAVDVMNKVVKAVKEIDENKIVVA AGYADAYRVGAVDPLIIPKVARDSGCDVAMLDTAVKDG KRLFDHLNRELISEFVEEVHNYGLECALAGSIRKEDIPVL KEIGCDIVGIRGAACTKGDRNNGKIKKELVEELVKLCKN GDK (SEK ID NO: 6) Methanobrevibacter MLLLISPINHEEALESIKGGADIVDVKNPKEGSLGANFP WVIRDlREITPEDKLVSATLGDVPYKPGTVSLAAIVIGAHV SGADYIKVGLYGTKDYDEAVEVMENVAKTIKDVDNDTIV VAAGYADAHRVGAVDPMEIPKVAKDAGCDLAMLDTAV KDGHTLFDYLSIEDLEKFVNEAHSYGLKTALAGSVKKE QLKPLNDIGCDVVGIRGAACVGGDRNTGKIHHSAVAEL KELCDSF (SEK ID NO: 7) Methanobacterium sp.

PtaB.Bin024 WVIRNIREITPKNMKVSATLGDVPYKPGTVALAAAGAIV SGADYIKVGLYGTTNYSEALEVMENVVKTVDEFNSDAI VVAAGYADAHRVGAVDPMEIPKIAADSGSDLAMVDTAV KDGKTLFDFMNEETLSQFTEQTHEYGLKSALAGSVTEE QLPILAELGCDVVGIRGAACIGGDRNSGSIHHEAVARLK QIV (SEK ID NO: 8) Methanopyrus sp.

MRPRLLVSPVNRDEALEAVEGGAHIIDVKNPEEGSLGA NF PWVI R EI M EWPED R EVSATVG DVPYK PGTVAQAVL GVAAVGVDYAKVGLYGTKTEEEALEVMRACSRAVREF GYDTRWAAGYADAHRVDSIDPMSVPEVAAEAECDVA MVDTAVKDGKRLFDFLREEEVGEFVDLAHEHGLEVALA GSLRHEDMPIVRDLGADIVGIRGAACERGDRNRGAIRS HLVRKLAEALA (SEK ID NO: 9) Candidatus Argoarchaeum ethanivorans MTMKLLVSPISVEEARIALDGGADIIDVKNPKEGSLGAN FPDVIQSVKRVITKPMSVAIGDFNYKPGTASLAALGASV AGADYIKlGLFDVQTREQASEMTERVTKAVKQYDSKKK WlCGYSDYNRINSISPFELPGlVSDAGADWMMDTGVK DGRSTLEFLNLEKLESFIGSAHQYGLLAAIAGSLTFEDIE ALKEVAPDIIGVRGCVCGGDRNSSIKLELVRELKERIHH (SEK ID NO: 10) Methanobacterium congolense MLLLISPINTEEAREAIEGGADIVDVKNPKEGSLGANFP WVIKSISELTPEGMYVSATLGDVPYKPGTVSLAAAGAV VSGADYIKVGLYGTKNYEEALEVMKNVVKTVKDFNEDA WVAAGYADAHRVGAVDPMEIPRVAADAGADLAMVDT AVKDGKTLFDFMDEDTLTKFNNTIHDYGLKSALAGSVK KEQLEMLYNIGCDWGIRGAACVGGDRNTGKIHRSAVG ELKKMlENF (SEK ID NO: 11) Methanobrevibacter arboriphilus MLLLISPINNEEALESIEGGADIVDVKNPKEGSLGANFP WVISEIRKIVlTPDDMLVSATLGDVPYKPGTVSLAAMGAL TSGADYIKVGLYGTSNYDEALEVMTNVVKTVKSNNPNA TWASGYGDAHRVGAVSPWDIPKVAKESGSDLAMLDT AVKDGKTLFDYLNIDDLKKFVEETHSYGLKSALAGSVKK EQLKPLYDIGCDVVGVRGAACTGGDRNNGKISRTAVAE LKELVNSFD (SEK ID NO: 12) Methanococcus maripaludis MILLVSPKDVAEAHEAIEGGADIIDVKNPPEGSLGANFP WVIKETREATPEGMLVSAAIGDVPYKPGTVTLAALGAAI SGADYIKVGLYGTRSYQEALDVMKNVTKAVKDSGENKI VVAAGYADAYRVGGVDPLIIPRVARDAGCDVAMLDTAV KDGKTLFDHMSIELLKEFVEETHKYGMKCALAGSIKIEEI PMLKElNCDIVGVRGAACTKGDRNEGRIQKDLVKEIVKV CRQ (SEK ID NO: 13) Methanococcus vannielii MILLVSPKDVAEAYEAINGGADIIDVKNPPEGSLGANFP WVIKEIRSATPNGMLVSAAlGDVHYKPGTVTLAALGATI SGADYIKIGLYGTRSYQEAVDVMKNVSNAVKSEDPKKI VVAAGYADAYRVGAVDPLIIPKIARDSGCDVAMLDTAVK DGKTLFDHLSIDLLKEFVEETHKYGMKCALAGSIKKEEIP MLKEIGCDIVGIRGAACTKGDRNEGKIQKDLVKEIVKICK E (SEK ID NO: 14) Methanosarcina acetivorans MKLLVSPINREEAIIASLGGADIVDVKNPKEGSLGANFP WVIRDVKEVVNGRQPISATIGDFNYKPGTASLAALGAA VAGADYIKVGLYDIQTEAQALELLTKITLAVKDYDPSKKV VASGYSDYKRINSISPLLLPAVAAEAGVDVVMVDTGIKD GKSTFEFMDEQELKEFTDLAHEHGLENAIAGSLKFEDL PVLERlGPDIIGVRGMVCGGDRRTAIRQELVEKLVAECQ i (SEK ID NO: 15) Methanosarcina barkeri MKLLISPINKEEAIIASRGGADIVDVKNPKEGSLGANFPW VIRDVKGAVNGRQPISATIGDFNYKPGTASLAAFGAAVA GADYIKVGLYDIQTEDQALELITKITQAVKDYDSTKKWA SGYSDYKRINSISPLLLPSIAAKAGADWMVDTGIKDGK STFEFMDEEELKKFTGLAHECGLENAIAGSLKFEDLPVL ERIGPDIIGVRGMVCGGDRTNSIRQELVEKLVAECQA (SEK ID NO: 16) Methylorubrum extorquens MSDIVSISSARPRLLVSVRGPDEALTALRAGADLIDAKD PERGALGALPPETVRAIVAGVGGRAVTSAVAGDGTGR EIAAAIATIAATGVDFIKIAVGGADDAALAEAAAQAPGRVI GVLFAEDDVAEDGPARLAAAGFVGAMIDTRGKSGTTLT SLMAAPQLAAFVAGCRTHGLMSGLAGSLGLGDIPVLAR LDPDYLGFRGGLCRASDRRQALDGARVAQAVEAMRA GPRADAA (SEK ID NO: 17) Methylobacterium sp.

MTR P E P HLSVRAAPR L LVSVR DAAEAEVARAAGAD LV DAK D PAR GAL GAL DPALVRAMVAR I GD RATTSAVAG E P REAGDLVAKVAAMAATGVDYVKVALPPGLRSGRDGLR EAADAARGRLIAVLFAEDGLDLAVLPTLADAGFVGAMID TNTKDGRRLTDRIAVPALSAFTAACRAEGLVSGLAGSL ALADIPALSDLGAGYLGFRGGLCRGGDRRGDLDPARIA EAARLLRAGGRRDAA (SEK ID NO: 18) Methanosarcina mazei MKLLVSPlNSEEAIIASIGGADIVDVKNPKEGSLGANFPW VIREVKAWNGRQPISATIGDFNYKPGTAALAALGAAVA GADYIKVGLYDIQTESQALELLTKITRAVKDYNPLKKVVA SGYSDYKRINSISPLLLPAVAAEAGVDWIVIVDTGVKDG KSTFEFMDEKELKEFTDLAHSYGLENAIAGSLKFEDIPLL ERIGPDIIGVRGMVCGGDRSTSIRQELVEKLVAECQA (SEK ID NO: 19) Methyloversatilis universalis MIRMLASVRNLDEARIVLEAGVDLIDLKQPADGALGALP AEVIREVVDFVAGRTLTSATAGNVEPDAQAVQSAMARI AATGVDYVKAGLFPGNWQQGGRDYAAVRACLRGLTP LAGARRIAVMFADLSPPLALVDAVADAGFDGVMVDTAL KTGHSLPDVASTEWLSGFVERARARGLLCGLAGSLRV THIPALAQRCPDYLGFRGALCAGQARAQALDARAVLAV REALEKVQRLAA (SEK ID NO: 20) Nitrosococcus watsonii MSCWLASVRNLEEISCLLAEGPDIIDFKEPKEGVLGALP LETVREAVALIGRRCQTSAAIGDFPVDSPQIYQRVLEMA ATGVDYVKIGLPSNIQQAAACLLSLRPLADQGVSMVGVI FADKRPDFSWTYLIGQAGFKGIMLDTAIKDDFGLLSHLS LSELNNFVKLARSVRLISGLAGSLSIQDIPKLLPLRADYL GFRSALCVAARNRCSRLDPKAVLLIKQAMRENLRIFEI (SEK ID NO: 21) Streptomyces cattleya MKEPTLLLLISPDSVEEALDCAKAAEHLDIVDVKKPDEG SLGANYPWVIRElRDAIPADKPVSATVGDVPYKPGTVA QAALGAVVSGATYIKVGLYGCTTPDQVVEVMRGVVRA VKDHRPDALVVASGYADAHRIGCVNPLAIPGVAQRSGC DAAMLDTAVKDGTRLFDHVPPDVCGEFVRLAHEGGLL AALAGSVKAEDLGALTRIGTDIVGVRGAVCEGGDRNAG RIQPHLVAAFRAEMDRHAREHAAVVTPTG (SEK ID NO: Streptomyces coelicolor MLLLISPDGVDEALDCAKAAEHLDIVDVKKPDEGSLGAN YPWVIRElRAAVPADKPVSATVGDVPYKPGTVAQAALG AAVSGATYIKVGLYGCATPEQAVEVMRGVVRAVKDHR ADAFVVASGYADAHRIGCVNPLSLPDIARRSGSDAAML DTAIKDGTRLFDHVPPDVCAEFVRRAHDCGLLAALAGS VRSGDLGELARIQTDIVGVRGAVCEGGDRTTGRIRPHL VAAFRAEMDRHVREHAAAAAQS (SEK ID NO: 23) Streptomyces MLLISPDSVEEALECAKAAQHLDIVDVKKPDEGSLGAN HPWVIRAVRDAVPADKPVSATVGDVPYKPGTVAQAAL GATVSGATYIKVGLYGCTTPDQAVEVMRGWRAVKDF RPDALWASGYADAHRIGCVNPLALPDIARRSGSDGAM LDTAVKDGTRLFDHTPPQVCAEFVRLAHEAGLLAALAG SVKAGDLAELAGMGTDIVGVRGAVCEGGDRNAGRlRP ELVAAFRAEIVIDRCVQQHGGQGAAVAAAS (SEK ID NO: Streptomyces griseus MLLL ISPDGVEEALACATAAEHLDIVDVKKPDEGSLGAN FPWVI R E I RAAVPADK PVSATVG DVPYK PGTVAQAALG AAVSGATYIKVGLYGCATP DQAI DVM RGVVRAVK D F RA DAFVVASGYADAHR lGCVNPLALPD IARRAGADAAMLD TAIKDGTRLFDHVPPEGCAEFVRLAHEAGLLAALAGSV KAADLATLTRIGTDIVGVRGAVCEGGDRDAGRIQPRLV AAFRAEMDRHARAFAAAPAAS (SEK ID NO: 25) MLLLISPDGVEEALDCAKAAEHLDIVDVKKPDEGSLGAN FPWVIREIREAVPADKPVSATVGDVPYKPGTVAQAALG AVVSGATYIKVGLYGCTTPDQGIDVMRAVVRAVKEHNP DALVVASGYADAHRIGCVNPLAVPDIAARSGADAAMLD TAVKDGTRLFDHVPPDVCAEFVRLAHASGRLAALAGSV RQDDLGELTRIGTDIVGVRGAVCEGGDRNAGRIQPHLV AAFRAEMDRYDRERTAGLPAAR (SEK ID NO: 26) Man Streptomyces sp. DH- MLLLISPDSVEEALDCVKAAEHLDIVDVKKPDEGSLGAN FPWVIREIRDAVPADKPVSATVGDVPYKPGTVAQAALG AVVSGATYIKVGLYGCTTPEQGIEVMRAVVRAVKDHRP DALVVASGYADAHRVGCVNPLAVPDIAARSGADAAML DTAIKDGTRLFDHVPPDACAEFVRRAHASGLLAALAGSI TQADLGPLTRMGTDIVGVRGAVCAGGDRNAGRIQPHLI TAFRAEMDRQGREYAVGIPAAN (SEK ID NO: 27) Man Streptomyces 27 venezuelae Bir yapilanmada, burada açiklanan yapilanmalarin herhangi birine ait rekombinant mikroorganizma, (5-formilfuran-S-il)metil fosfat'in (4-HMF) dönüsümünü katalize eden bir fosfataz ya da bir kinazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada fosfataz, haloasit dehalojenaz olarak siniflandirilir (Koonin ve digerleri, J. Mol. Biol. 244(1). 1994). Bazi yönlerde b reaksiyonunun fosfatazi, konakçi için endojendir (Offley ve digerleri Curr. Gen. 65. 2019). Bazi yönlerde konakçiya endojen olan fosfataz enzimi asiri eksprese edilir. Bazi durumlarda, arzu edilen reaksiyonu gerçeklestirebilen bir heterolog fosfataz kullanilir ve bir alkalin fosfataz, asit fosfataz, fruktoz- bisfosfataz, seker-fosfataz ya da seker-terminaI-fosfataz arasindan seçilir. Bazi yapilanmalarda fosfataz, Tablo 2'de listelenen enzim adaylarindan türetilebilir. Bazi yapilanmalarda fosfataz, Tablo 2'de listelenen enzimlere homolog ya da benzerdir. Bazi yapilanmalarda 4-HMF fosfataz enzimi, Tablo 2'de listelenen bir amino asit sekansi ile kodlanabilir. Bazi yapilanmalarda, bir fosfataz enzimi, (5-formilfuran-3-il)metiI fosfatin (4- HMF)'ye dönüstürülmesine yönelik katalitik etkinligini ve/veya özgüllügünü gelistirmek üzere Tablo 2. 4-HMF fosfataz enzimleri Adi Organizma Sekans MMPEPPRERRTAANRSPAIRPlAFFDVDETLITAKSMLDFA RQAPHSLRDDITAQASGQRHSADADLTAMRRRGASRVE MNRVYYRRYAGVSLARLQEAGRDWYHAYRTRPDGYVRA Pm Streptomyces GLAALARHRRAGHTIVLISGSARPLLTPLAQDLGADRILCT coelicolor EQFADAQGVLTGEVNRPMlGEAKAEAVTEVMAKRGWPA DCFAYGDHESDFGMLQAVGNPVWGTDLVLVRHAQGSN WPVLPADAGPRCACARRPGPLGHDDPSAIG (SEK ID NO: MMPEPPRERRTAANRSPAIRPIAFFDVDETLITAKSMLDFA Streptomyces sp. RQAPHSLRDDITAQASGQRHSADADLTAMRRRGASRVE E5N91 MNRVYYRRYAGVSLARLQEAGRDWYHAYRTRPDGYVRA GLAALARHRRAGHTIVLISGSARPLLTPLAQDLGADRILCT EQFADAQGVLTGEVDRPMIGEAKAEAVTEVMAKRGWSA DCFAYGDHESDFGMLQAVGNPWVGTDLVLVRHAQASN WPVLPADAGPRCACARRPGPLGHDDPSAIG (SEK ID NO: Streptomyces sp.

MSALRHERRAAVSRPVVIRHIAFFDVDETLITAKSLLDFAQ RVPHGLWEDETGQPIERLRSGEIDLAALQRSGASRAEMN RAYYRRYAGVPLERLQKAGRDWYHAYRMRPDGYITAGL AALARHRRAGHMIVLISGSARPLLTPLSEDLGADRILCTEQ LDDAQGVLTGEVAHPMVGEAKAEAVTEVMAQLRVPTTDC FAYGDHGSDLDMLQAVGSPWVGTDPVLARHAQASNWP MLPADAGPRIARAQHHDTSAQYGPQVIALASGRGAAPRR QERW (SEK ID NO:30) Streptomyces aureus MNASIAPAAFFDVDETLVNTKSMFHFLRFWMARQGDDGS GHEAVMAGVRRAAASGVHRSEINRAYYRRFAGVPYAALL EAGRDWWQEYRRGSDAWVPAWAAATRHRKAGHLWL VSGSFRGCLEPLAQDLGAHRILCSEPLVDTDGRLTGEVVR PMIGSVKADAVRETVAELGLTAADCSCYGDHSSDLDMLG AVGNPVWGGDRVLLEHAQRLDWPVLPATPGHLPSPDAS PARLLTAAERR (SEK ID NO: 31) Saccharothrix syringae MSTPPAVAFFDVDETVIKVKSMFEFLRHWMTAQGDDGSA YESFMAGVRELADAGVPRAEVNRHYYRRYAGASAADVR AAGEDWYASYRRRPDGFLTATVAAVAAHRAAGNRVVLVS GSFLPVLGPLMADVGADEALCGDPEVGPDGRYTGAIAVP MIGENKTAAVRARMAELGVDPADCYAYGDHQSDLGMLE AVGNPVWGEDPVLVGKAEAGGWRRLPATTGPLGVPPR VLSVVE (SEK lD NO: 32) Rhodococcus sp.

MTHTGSRPVQVAFFDVDETLITVKSMFAFLEHWLRERGD DGSEYSRLLAALRRASDEGAPREEVNRSYYRTFRGVPLV ELEESGRRWYREFESTAAPYYADTLAALRDHRDAGAAIVL LSGSFAPALGPIGEAVCADRIVASRPVTDGHGVLTGEVER PMIGKAKAEAVTSVLEELGIDTGNSYGYGDHDSDLAFLEA VGHPGLRGSDPVLRAHAARNRWRVLGSATTGLAGAVPLL AATSTGQRGLR (SEK ID NO: 33) Rhodococcus sp.

UNC363MFTSU5.1 MTGTGPRPGQVAFFDVDETLITVKSMFAFLEHWLWERGD DGSEYARLLGALRRQSDEGAPREEVNRSYYRTFRGVPLV ELEESGRRWYREFESTNAPYYAATLAALHAHREAGAAIVL LSGSFAPALVPIGEAVGADRIVASRPVTDQGGVLTGEVER PMIGQAKAEAVTSVQAELGVDAENSYGYGDHESDLAFLE AVGHPGLRGDDQVLLARAARDRWRSLGSETTGLAGAGP LAGSASAGLAQRGIL (SEK ID NO: 34) Buttiauxella warm boldiae MHTSAAFFDVDETLITVKSMFDFYDFWCRENNEYDKLQR YMTDFRSAVKNGTPREQLNREYYRQFAGVNYKDLEEAG KNWFRGKKLDSELFISSAVAALKKHQANNMFIVFISGSMH PVLSPVANYLGVTDILCTPLELTGEGIITGEIGTPQTIGIGKK EALINFCSQKKISAADCYAYGDDLSDIPMLESVGYPVCVG KYTELARHAINQRWPVI (SEK ID NO: 35) multitudinisentens MRQTAFYDVDDTLINIKSMFDFFQFWASENGLISQQEQFD SQFSVLARKMSSREELNRAYYRFFKGVPLLKIEQCAERW FKNSFSNTEIFISYTLKSILAHRVLGHNIVLVSGSMTPLLKPI AQLLGITDILCTKLATDQSGWTGEILETQTIGEGKAIVIRQY ALENDINLSACFAYGDDVSDIPMLACVGHPICIGEGTALSH YASNNNWPIVRVE (SEK ID NO: 36) Methylosinus sporium MMEHRSFAFFDVDETLISIKSMFDFFPFWCKWIGAAPEAY SRFETEIASAIARHATREELNRLYYRSFRGAQLPVLEAAGA AWFLQRFGRSPPYRKHWARLEKHRQEGVVPVLVSGSM RPLLRPIARELQAEHCLCTQLWDESGRLTGEIGSPQTIGE GKAEAIRAFLREQGGRPADCLAYGDDISDLAMLELVGAPV VVGAQPDLLSICRQRDWPYLPL (SEK ID NO: 37) Klebsiella oxytoca MQQAAAFFDVDETLINIKSMFDFFDFWCKENNEPIKLHKY MANFQSEVKKGIPREHLNREYYRQFAGISYKALEEAGEK WFRFKLNSELFIGSAVSALKKHQAENMDIVFISGSMLPVLS PVARYLGVKDILCTPLKFTAAGEMTGEIGYPQTIGDGKKD ALLQFCEQRNINPSDCYAYGDDLSDIPMLASTGHPVCVGK HSALARHAITHRWQVI (SEK lD NO: 38) Serratia MTSAAAFFDVDETLIKMKSMFHFYHYWSNVRGNQKAYEE FIKRFQQAVAEGVPREVLNRMYYRQFSGIDIDDVYQVAED WFHKYLHEKEAYIASAVDRFQRHKISGHLTVFISGSMLPLL KPLGQRLGADAILCTQLLLDAKGKLTGEIGEPQTIGQGKQ RALLSFSQSHHIDLAKSFAYGDDLSDIPMLAATGNPVCVG EHSNLAEYARRNNWNMLAENATN (SEK ID NO: 39) Saccharomyces cerevisiae ycr0150 MKTIIISDFDETITRVDTICTIAKLPYLLNPRLKPEWGHFTKT YMDGYHKYKYNGTRSLPLLSSGVPTIISQSNFNKLFADEL KYQNHNRVVELNSVNEITKQQIFKSISLDQMKTFARDQNH EDCLLRDGFKTFCSSVVKNFESDFYVLSINWSKEFIHEVIG DRRLKNSHIFCNDLKKVSDKCSQSYNGEFDCRLLTGSDK VKILGEILDKIDSGCNKEGNSCSYWYIGDSETDLLSILHPST NGVLLINPQENPSKFIKITEKIIGIPKDKISSFEADNGPAWLQ FCEKEGGKGAYLVKSWDSLKDLIMQVTKM (SEK ID NO: Saccharomyces cerevisiae ydl236w MTAQQGVPIKITNKEIAQEFLDKYDTFLFDCDGVLWLGSQ ALPYTLEILNLLKQLGKQLIFVTNNSTKSRLAYTKKFASFGI DVKEEQIFTSGYASAVYIRDFLKLQPGKDKVWVFGESGIG EELKLMGYESLGGADSRLDTPFDAAKSPFLVNGLDKDVS CVIAGLDTKVNYHRLAVTLQYLQKDSVHFVGTNVDSTFPQ KGYTFPGAGSMIESLAFSSNRRPSYCGKPNQNMLNSIISA FNLDRSKCCMVGDRLNTDMKFGVEGGLGGTLLVLSGIET EERALKISHDYPRPKFYIDKLGDIYTLTNNEL (SEK ID NO: Saccharomyces cerevisiae ydl236w MTIAKDYRTIYRNQIKKQIRLNQEHLQSLTHLGSQINFEVD PPKLPDPDPARKVFFFDIDNTLYRKSTKVQLLMQQSLSNF FKYELGFDDDEAERLIESYYQEYGLSVKGLIKNKQIDDVLQ YNTFIDDSLPLQDYLKPDWKLRELLINLKKKKLGKFDKLWL FTNSYKNHAIRCVKILGIADLFDGITYCHYDRPIEEEFICKP DPKFFETAKLQSGLSSFANAWFIDDNESNVRSALSMGMG HVIHLIEDYQYESENIVTKDHKNKQQFSILKDILEIPLIMDVE VYRPSSIAIKEMEELEEEGEAVNWSNQQINVQSS (SEK ID Saccharomyces cerevisiae yer062c MGLTTKPLSLKVNAALFDVDGTIIISQPAIAAFWRDFGKDK PYFDAEHVIQVSHGWRTFDAIAKFAPDFANEEYVNKLEAEI PVKYGEKSIEVPGAVKLCNALNALPKEKWAVATSGTRDM AQKWFEHLGIRRPKYFITANDVKQGKPHPEPYLKGRNGL GYPINEQDPSKSKVVVFEDAPAGIAAGKAAGCKIIGIATTF DLDFLKEKGCDIIVKNHESIRVGGYNAETDEVEFIFDDYLY AKDDLLKW (SEK ID NO: 43) Saccharomyces cerevisiae yfl045c MSIAEFAYKEKPETLVLFDVDGTLTPARLTVSEEVRKTLAK LRNKCCIGFVGGSDLSKQLEQLGPNVLDEFDYSFSENGLT AYRLGKELASQSFlNWLGEEKYNKLAVFILRYLSEIDLPKR RGTFLEFRNGMINVSPIGRNASTEERNEFERYDKEHQIRA KFVEALKKEFPDYGLTFSIGGQISFDVFPAGWDKTYCLQH VEKDGFKEIHFFGDKTMVGGNDYEIFVDERTIGHSVQSPD DTVKILTELFNL (SEK ID NO: 44) Saccharomyces cerevisiae ygl224c MTVEYTASDLATYQNEVNEQIAKNKAHLESLTHPGSKVTF PlDQDISATPQNPNLKVFFFDIDNCLYKSSTRIHDLMQQSIL RFFQTHLKLSPEDAHVLNNSYYKEYGLAIRGLVMFHKVNA LEYNRLVDDSLPLQDILKPDIPLRNMLLRLRQSGKIDKLWL FTNAYKNHAIRCLRLLGIADLFDGLTYCDYSRTDTLVCKPH VKAFEKAMKESGLARYENAYFIDDSGKNIETGIKLGMKTCI HLVENEVNEILGQTPEGAIVISDILELPHWSDLF (SEK ID Saccharomyces cerevisiae yhrO43C MPQFSVDLCLFDLDGTIVSTTTAAESAWKKLCRQHGVDP VELFKHSHGARSQEMMKKFFPKLDNTDNKGVLALEKDMA DNYLDTVSLIPGAENLLLSLDVDTETQKKLPERKWAIVTSG SPYLAFSWFETILKNVGKPKVFITGFDVKNGKPDPEGYSR ARDLLRQDLQLTGKQDLKYWFEDAPVGIKAGKAMGAITV GITSSYDKSVLFDAGADYVVCDLTQVSWKNNENGIVIQV NNPLTRD (SEK ID NO: 46) Saccharomyces cerevisiae yhr044c MAEFSADLCLFDLDGTIVSTTVAAEKAWTKLCYEYGVDPS ELFKHSHGARTQEVLRRFFPKLDDTDNKGVLALEKDIAHS YLDTVSLIPGAENLLLSLDVDTETQKKLPERKWAIVTSGSP YLAFSWFETILKNVGKPKVFITGFDVKNGKPDPEGYSRAR DLLRQDLQLTGKQDLKYVVFEDAPVGIKAGKAMGAITVGIT SSYDKSVLFDAGADYWCDLTQVSWKNNENGIVIQVNNP LTRA (SEK ID NO: 47) Saccharomyces cerevisiae yiI053w MPLTTKPLSLKINAALFDVDGTIIISQPAIAAFWRDFGKDKP YFDAEHVIHISHGWRTYDAIAKFAPDFADEEYVNKLEGEIP EKYGEHSIEVPGAVKLCNALNALPKEKWAVATSGTRDMA KKWFDILKIKRPEYFITANDVKQGKPHPEPYLKGRNGLGF PINEQDPSKSKWVFEDAPAGIAAGKAAGCKIVGIATTFDL DFLKEKGCDIIVKNHESIRVGEYNAETDEVELIFDDYLYAK DDLLKW (SEK ID NO: 48) Saccharomyces cerevisiae ykrOTOw MIGKRFFQTTSKKIAFAFDIDGVLFRGKKPIAGASDALKLLN RNKIPYILLTNGGGFSERARTEFISSKLDVDVSPLQIIQSHT PYKSLVNKYSRILAVGTPSVRGVAEGYGFQDVVHQTDIVR YNRDIAPFSGLSDEQVMEYSRDIPDLTTKKFDAVLVFNDP HDWAADIQIISDAINSENGMLNTLRNEKSGKPSIPIYFSNQ DLLWANPYKLNRFGQGAFRLLVRRLYLELNGEPLQDYTL GKPTKLTYDFAHHVLIDWEKRLSGKIGQSVKQKLPLLGTK PSTSPFHAVFMVGDNPASDIIGAQNYGWNSCLVKTGVYN EGDDLKECKPTLIVNDVFDAVTKTLEKYA (SEK ID NO: 49) Saccharomyces cerevisiae ynIO10w MVKAVIFTDFDGTVTLEDSNDYLTDTLGFGKEKRLKVFEG VLDDTKSFRQGFMEMLESIHTPFPECIKILEKKIRLDPGFK DTFEWAQENDVPVIVVSSGMKPIIKVLLTRLVGQESIHKIDI VSNEVEIDAHDQWKIIYKDESPFGHDKSRSIDAYKKKFEST LKAGEQRPVYFYCGDGVSDLSAAKECDLLFAKRGKDLVT YCKKQNVPFHEFDTFKDILASIVIKQVLAGEKTVAELMEN (SEK ID NO: 50) Saccharomyces cerevisiae y0r131c GLEDKSIDILHFIDTLPTEKEKKEAHDRIELVEAKAMKEMQ PQPGLVDIMRYLTKNGISKNICTRNVGAPVETFVKRFIPSE LSRFDYlVTREFRPTKPQPDPLLHIASKLNIRPLEMIMVGDS FDDMKSGRSAGCFTVLLKNHVNGHLLLEHKELVDVSVED LSEIIELIQNMNKESF (SEK ID NO: 51) Saccharomyces cerevisiae y0r1550 MSSRYRVEYHLKSHRKDEFIDWVKGLLASPFVLHAVSHE GDYNDDLATTQRVRSQYADIFKDIEGLIKDKIEFDSRNMSQ DEIEDGASSQSLNILGQSRLNLLVPSIGTFFTELPLEQAFL WEDSQRAISARRMVAPSFNDIRHILNTAQIFHFKKQENLH NGKVLRLVTFDGDVTLYEDGGSLVYTNPVIPYILKLLRCGI NVGIVTAAGYDEAGTYENRLKGLIVALHDSTDIPVSQKQNL TIMGGESSYLFRYYEDPEEDNFGFRQIDKEEWLLPRMKA WSLEDVEKTLDFAERTLNRLRKRLNLPSEISIIRKVRAVGIV PGERYDEASKRQVPVKLDREQLEEIVLTLQNTLESFAPSR RIQFSCFDGGSDVWCDIGGKDLGVRSLQQFYNPESPIQP SETLHVGDQFAPVGSANDFKARLAGCTLWIASPQETVNY LHRLLETD (SEK ID NO:52) Escherichia coli YniC MSTPRQILAAIFDMDGLLIDSEPLWDRAELDVMASLGVDIS RRNELPDTLGLRIDMWDLWYARQPWNGPSRQEWERVI ARAISLVEETRPLLPGVREAVALCKEQGLLVGLASASPLH MLEKVLTMFDLRDSFDALASAEKLPYSKPHPQVYLDCAAK LGVDPLTCVALEDSVNGMIASKAARMRSIVVPAPEAQNDP RFVLANVKLSSLTELTAKDLLG (SEK ID NO: 53) Escherichia coli YfbT MRCKGFLFDLDGTLVDSLPAVERAWSNWARRHGLAPEE VLAFIHGKQAITSLRHFMAGKSEADIAAEFTRLEHIEATETE GITALPGAIALLSHLNKAGIPWAIVTSGSMPVARARHKIAGL PAPEVFVTAERVKRGKPEPDAYLLGAQLLGLAPQECVVV EDAPAGVLSGLAAGCHVIAVNAPADTPRLNEVDLVLHSLE QITVTKQPNGDVIIQ (SEK ID NO: 54) Escherichia coli YieH MSTPRQILAAIFDMDGLLIDSEPLWDRAELDVMASLGVDIS RRNELPDTLGLRIDMWDLWYARQPWNGPSRQEWERVI ARAISLVEETRPLLPGVREAVALCKEQGLLVGLASASPLH MLEKVLTMFDLRDSFDALASAEKLPYSKPHPQVYLDCAAK LGVDPLTCVALEDSVNGMIASKAARMRSIWPAPEAQNDP RFVLADVKLSSLTELTAKDLLG (SEK lD NO: 55) Escherichia coli YihX MLYIFDLGNVIVDIDFNRVLGAWSDLTRIPLASLKKSFHMG EAFHQHERGEISDEAFAEALCHEMALPLSYEQFSHGWQA VFVALRPEVIAIMHKLREQGHRVWLSNTNRLHTTFWPEE YPEIRDAADHIYLSQDLGMRKPEARIYQHVLQAEGFSPSD TVFFDDNADNIEGANQLGITSILVKDKTTIPDYFAKVLC (SEK ID NO: 56) Escherichia coli ijG MRILLSNDDGVHAPGIQTLAKALREFADVQVVAPDRNRSG ASNSLTLESSLRTFTFENGDIAVQMGTPTDCVYLGVNALM RPRPDIWSGINAGPNLGDDVIYSGTVAAAMEGRHLGFPA LAVSLDGHKHYDTAAAVTCSILRALCKEPLRTGRILNINVP DLPLDQIKGIRVTRCGTRHPADQVIPQQDPRGNTLYWIGP PGGKCDAGPGTDFAAVDEGYVSITPLHVDLTAHSAQDVV SDWLNSVGVGTQW (SEK ID NO: 57) Escherichia coli anB MYERYAGLIFDMDGTILDTEPTHRKAWREVLGHYGLQYDI QAMIALNGSPTWRIAQAIIELNQADLDPHALAREKTEAVRS MLLDSVEPLPLVDWKSWHGRRPMAVGTGSESAIAEALL AHLGLRHYFDAVVAADHVKHHKPAPDTFLLCAQRMGVQP TQCVVFEDADFGIQAARAAGMDAVDVRLL (SEK ID NO: Escherichia coli YigB MRFYRPLGRISALTFDLDDTLYDNRPVILRTEREALTFVQN YHPALRSFQNEDLQRLRQAVREAEPEIYHDVTRWRFRSIE QAMLDAGLSAEEASAGAHAAMINFAKWRSRIDVPQQTHD TLKQLAKKWPLVAITNGNAQPELFGLGDYFEFVLRAGPHG RSKPFSDMYFLAAEKLNVPIGEILHVGDDLTTDVGGAIRSG MQACWIRPENGDLMQTWDSRLLPHLEISRLASLTSLI (SEK ID NO: 59) Escherichia coli erG MHINIAWQDVDTVLLDMDGTLLDLAFDNYFWQKLVPETW GAKNGVTPQEAMEYMRQQYHDVQHTLNWYCLDYWSEQ LGLDlCAMTTEMGPRAVLREDTIPFLEALKASGKQRILLTN AHPHNLAVKLEHTGLDAHLDLLLSTHTFGYPKEDQRLWH AVAEATGLKAERTLFIDDSEAILDAAAQFGIRYCLGVTNPD SGIAEKQYQRHPSLNDYRRLIPSLM (SEK ID NO: 60) Escherichia coli Gph MSTPRQILAAIFDMDGLLIDSEPLWDRAELDVMASLGVDIS RRNELPDTLGLRIDMVVDLWYARQPWNGPSRQEVVERVI ARAISLVEETRPLLPGVREAVALCKEQGLLVGLASASPLH MLEKVLTMFDLRDSFDALASAEKLPYSKPHPQVYLDCAAK LGVDPLTCVALEDSVNGMIASKAARMRSIVVPAPEAQNDP RFVLADVKLSSLTELTAKDLLG (SEK ID NO: 61) Escherichia coli YbiV MSVKVIVTDMDGTFLNDAKTYNQPRFMAQYQELKKRGIK FWASGNQYYQLISFFPELKDEISFVAENGALVYEHGKQLF HGELTRHESRIVIGELLKDKQLNFVACGLQSAYVSENAPE AFVALMAKHYHRLKPVKDYQEIDDVLFKFSLNLPDEQIPLV DLSPQNVVAIGDSGNDAEMLKMARYSFAMGNAAENIKQIA RYATDDNNHEGALNVIQAVLDNTSPFNS (SEK ID NO: 62) Escherichia coli YidA MAIKLIAIDMDGTLLLPDHTISPAVKNAIAAARARGVNWLT TGRPYAGVHNYLKELHMEQPGDYCITYNGALVQKAADGS TVAQTALSYDDYRFLEKLSREVGSHFHALDRTTLYTANRD DQAIARIPQEVKEKYTVLKSAPYFLEILDKRVNKGTGVKSL ADVLGIKPEEIMAIGDQENDIAMIEYAGVGVAMDNAIPSVK EVANFVTKSNLEDGVAFAIEKYVLN (SEK ID NO: 63) Escherichia coli YbhA MTTRVIALDLDGTLLTPKKTLLPSSIEALARAREAGYRLIIVT GRHHVAIHPFYQALALDTPAICCNGTYLYDYHAKTVLEAD PMPVNKALQLIEMLNEHHIHGLMYVDDAMVYEHPTGHVIR TSNWAQTLPPEQRPTFTQVASLAETAQQVNAVWKFALTH DDLPQLQHFGKHVEHELGLECEWSWHDQVDIARGGNSK GKRLTKWVEAQGWSMENVVAFGDNFNDISMLEAAGTGV AMGNADDAVKARANIVIGDNTTDSIAQFIYSHLI (SEK ID Escherichia coli Ybjl MRFYRPLGRISALTFDLDDTLYDNRPVILRTEREALTFVQN YHPALRSFQNEDLQRLRQAVREAEPEIYHDVTRWRFRSIE QAMLDAGLSAEEASAGAHAAMINFAKWRSRIDVPQQTHD TLKQLAKKWPLVAITNGNAQPELFGLGDYFEFVLRAGPHG RSKPFSDMYFLAAEKLNVPIGEILHVGDDLTTDVGGAIRSG MQACWIRPENGDLMQTWDSRLLPHLEISRLASLTSLl (SEK ID NO: 65) Escherichia coli YigL MYQWASDLDGTLLSPDHTLSPYAKETLKLLTARGINFVFA TGRHHVDVGQIRDNLEIKSYMITSNGARVHDLDGNLIFAH NLDRDIASDLFGVVNDNPDIITNVYRDDEWFMNRHRPEE MRFFKEAVFQYALYEPGLLEPEGVSKVFFTCDSHEQLLPL EQAINARWGDRVNVSFSTLTCLEVMAGGVSKGHALEAVA KKLGYSLKDCIAFGDGMNDAEMLSMAGKGCIMGSAHQRL KDLHPELEVIGTNADDAVPHYLRKLYLS (SEK ID NO:66) Escherichia coli OtsB MTEPLTETPELSAKYAWFFDLDGTLAEIKPHPDQVVVPDN HGAERRDINGKTHIVHLPDAIARDISVQLHTVIAQYPGAEL EAKGMAFALHYRQAPQHEDALMTLAQRITQIWPQMALQQ GKCWEIKPRGTSKGEAIAAFMQEAPFIGRTPVFLGDDLT DESGFAWNRLGGMSVKIGTGATQASWRLAGVPDVWSW LEMlTTALQQKRENNRSDDYESFSRSI (SEK ID NO:67) MAKSVPAIFLDRDGTINVDHGYVHEIDNFEFIDGVIDAMRE LKKMGFALVWTNQSGIARGKFTEAQFETLTEWMDWSLA DRDVDLDGIYYCPHHPQGSVEEFRQVCDCRKPHPGMLLS ARDYLHIDMAASYMVGDKLEDMQAAVAANVGTKVLVRTG KPITPEAENAADWVLNSLADLPQAIKKQQKPAQ (SEK ID PH42 Escherichia coli YaeD Buna göre de bir yapilanmada, burada saglanan husus, bir karbon kaynagini gliseraldehit 3- fosfata (GßP) dönüstürebilen nitelikte endojen ve/veya eksojen bir nükleik asit moleküllerini; GSP'nin (5-f0rmiIfuran-3-il)metil fosfata dönüsümünü katalize eden bir (5-f0rmilfuran-3- iI)metiI fosfat sentazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; (5- tormilfuran-S-il)metil fosfatin 4-HMF'ye dönüsümünü katalize eden bir fosfatazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülünü ihtiva eden bir rekombinant mikroorganizmadir. 2 4-FDCA Bir yapilanmada mevcut tarifname, bir karbon kaynagindan 2,4-furandikarboksilik asit (2,4- FDCA) üretebilen nitelikte bir rekombinant mikroorganizma saglar. Mevcut tarifnameye ait bazi yapilanmalar, bir karbon besleme stokunun 2,4-FDCA'ya biyosentetik dönüsümünü toplu olarak detaylandiran SEKIL 1, SEKIL 2, ve SEKIL 3 'de sunulmaktadir.

Bir yapilanmada, rekombinant mikroorganizma, GBP'yi, burada tarif edilen çesitli sayida enzimatik olarak katalize edilmis ardisik adimlar yolu ile 2,4-FDCA'ya dönüstürmek için yeni kapasiteyi ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada mevcut tarifname, dogrudan ya da ara maddeler furan-2,4-dikarbaldehit, 4-(hidroksimetil)furoik asit, 4-formiIfuran-2-karboksilat, 4- formilfuran-2-karb0ksilat, 2-formilfuran-4-karboksilat üretimi yolu ile 4-HMF'nin 2,4 FDCA'ya dönüstürülmesini ihtiva etmektedir.

Bir yapilanmada mevcut tarifnamede, 4-HMF'nin furan-2,4-dikarbaldehit'e (Adim D) ve/veya 4-(hidroksimetil)fur0ik aside (Adim E) dönüstürülmesini; furan-2,4-dikarbaldehitin 4- formilfuran-2-karboksilata (Adim G) ve/veya 2-formiIfuran-4-karboksilata (Adim F) dönüstürülmesi ve/veya 4-(hidroksimetil)furoik asidin 4-formiIfuran-2-karb0ksilata (Adim H) dönüstürülmesi; 4-f0rmilfuran-Z-karboksilatin ve/veya 2-f0rmiIfuran-4-karb0ksilatin ihtiva etmektedir.

Bir yapilanmada, bir alkolü bir karbonil grubuna ya da EC numarasi 1.2.1.'e oksitledigi zaman bir karbonili bir aside oksitledigi zaman, dehidrojenaz, EC numarasi 1.1.1 olarak siniflandirilir. Bazi yönlerde dehidrojenaz, bir alkol dehidrojenaz ya da bir aldehit dehidrojenazdir.

Bazi yönlerde (c)'den gelen oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bazi yönlerde oksidaz, 5-hidroksimetilfurfural oksidazdir. Bazi yönlerde, 5-hidr0ksimetilfurfural oksidaz, 4- hidroksimetilfurfural'i (4-HMF) üç asamali bir reaksiyonda 2,4 FDCA'ya dönüstürür.

Daha baska bir yapilanmada bir ya da daha fazla karbon kaynagi, gliserol ya da bir monosakarit ihtiva edebilir.

Bir yapilanmada bir mikroorganizma, 4-HMF'nin furan-2,4-dikarbaldehite vei'veya 4- (hidroksimetil)fur0ik aside dönüsümünü katalize eden bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenaz kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; turan-2,4- dikarbaldehitin 4-f0rmilfuran-2-karboksilat vei'veya 2-f0rmilfuran-4-karboksilata dönüsümünü vei'veya 4-(hidr0ksimetil)furoik asidin 4-f0rmilfuran-2-karb0ksilata dönüstürülmesini katalize eden bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenaz kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; 2-f0rmilfuran-4-karboksilatin 2,4-FDCA'ya ve/veya 4- tormiIfuran-2-karboksilat'in 2,4-FDCA'ya dönüsümünü katalize eden bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenaz kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva etmektedir.

Bir yapilanmada. burada açiklanan yapilanmalarin herhangi birine ait rekombinant mikroorganizma, 4-HMF'nin furan-2,4-dikarbaldehite dönüsümünü katalize eden bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenaz kodlayan en az bir endojen ya da eksoien nükleik asit molekülü ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, EC numarasi 1.1.1 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, EC numarasi 1.1.1 olan dehidrojenaz, alkol dehidrojenaz (EC numarasi (EC numarasi numarasi .arasindan seçilmektedir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, Tablo 3'te listelenen enzim adaylarindan türetilebilir. Bazi yapilanmalarda dehidrojenazlar, Tablo 3'te listelenen enzimlere homolog ya da benzerdir. Bazi yapilanmalarda 4-HMF dehidrojenaz enzimi, Tablo 3'te listelenen bir amino asit sekansi ile kodlanir. Bazi yapilanmalarda, bir dehidrojenaz, kendisinin arzu edilen substratina karsi katalitik etkinligini gelistirmek için gelistirilir ya da tasarlanir.

Tablo 3. 4 HMF Dehidrojenaz enzimleri Adi Organizma Sekans MLNFDYYNPTHIVFGKGRIAQLDTLLSKDARVLVLYGGSS AQKTGTLDEVRKALGDRTYFEFGGIEPNPSYETLMKAVEQ VKQEKVDFLLAVGGGSVIDGTKFVAAAVPYEGEPWEILET DGKKIKEALPVGTVLTLPATGSEMNRNSVVTRKSIKSKRG FHNDHVFPVFSILDPTKVYTLPPRQLANGVVDSFIHITEQY LTYPVDGMVQDEFAEGLLRTLIKIGPELLKDQKNYDLAANF MWTATLALNGLIGAGVPQDWATHMVGHELTAAFGIDHGR TLAIILPSLLQNQREAKKGKLLQYAKNVWHIDQGSDDERID AAIEKTRHFFESLGIPTHLKDYDVGEESIDMLVKELEAHGM SQLGEHKAITPEVSRAILLASL (SEK ID NO: 69) DH1 Zymomonas mobilis MLNFDYYNPTHIAFGKDSIAKLDTLIPQDACVMVLYGGSSA KKTGTLDEVKTALGSRKIHEFGGIEPNPSYETLMQAVEQV KKEKIDFLLAVGGGSVIDGTKFVAAAVPYEGEPWEILETDG Zymomonas mobilis KKIKKALPLGTVLTLPATGSEMNPNSVVTRKSIKAKRAFHN DH2 subsp. pomaceae KIVFPLFSILDPTKVYTLPPRQIANGIVDSFVHITEQYLTYPV ATCC 29192 EGMVQDEFAEGLLRILINIGPKLLKDQKNYDLAANFMWTA TLALNGLIGAGVPQDWATHMIGHEITAAFGVDHGRTLAIIL PSLLQNQRQVKKDKLLQYAKNVWHIESGSEKERIDAVIAK TRSFFEEMGIPTHLSDYNIGKESIDMLIHELEAHGMTKLGE HNAITPDVSRAILIASL (SEK ID NO: 70) Shewanella baltica MLNFNYYNPTRIRFGKDTIAEIDTLVPSDAKVMILFGGSSA RKTGTLDEVKQSLGNRFIVEFDGIEPNPTYETLMKAVAQV REQKlDFLLAVGGGSVIDGTKFVAAAAVFEGEPWDILTSW GAKVTQAMPFGSVLTLPATGSEMNNASVVTRKSLQAKLP FRNDLVYPQFSILDPTKTFTLPERQVANGWDAFVHITEQY LTYPVNAAVQDRFAEGLLOTLIELGPQVLAQPEDYDIRANL MWVATMALNGTIGVGVPHDWATHMlGHELTALYDlDHAR TLAIVLPALLQCTKEAKREKLLQYADRVWHINTGTDDERID AAIAKTKAFFEAMGIPTHLSAYDLDASHVDTLVKQLELHGM VALGEHGNINPAMSRDILTLAL (SEK ID NO: 71) Burkholderia pseudomallei MLNFDFYNPTRIVFGEKTAARLNDLLPAAARVLVLYGGES ARSNGTLDEVRAALGARDVREFGGIEPNPAYETLMRAVE LARRERVDFLLAVGGGSVIDGTKFVAAAVPFEGDPWTILE THGANVAAALPFGCVLTLPATGSEMNNGAVLTRRATRAK LAFRHPLVFPTFSILDPTKTYTLPPRQVANGWDAFTHIVE QYLTYPADGLAQDRFAEGLLQTLIEIGPKALAEPRDYATRA NLMWVATLALNGLIGAGVPQDRATHMVGHELTARYDIDH ARTLAVVLPSMLDVRRDAKRAKLLQYAARVWNIVDGPED ARIDAAIARTRAFFESLGVKTRLADYGVGADAIDGLIAQLE AHGMTRLGERKDVTLDVSRRVLEASL (SEK ID NO: 72) Saccharomyoes cerevisiae MSIPETQKGVIFYESHGKLEYKDIPVPKPKANELLINVKYS GVCHTDLHAWHGDWPLPTKLPLVGGHEGAGVWGMGE NVKGWKIGDYAGIKWLNGSCMACEYCELGNEPNCPHAD SSGYTHDGSFQQYATADAVQAAHIPQGTDLAEVAPVLCA GITVYKALKSANLMAGHWVAISGAAGGLGSLAVQYAKAM GYRVLGIDGGEGKEELFRSIGGEVFIDFTKEKDIVGAVLKA TDGGAHGVINVSVSEAAIEASTRYVRANGTTVLVGMPAGA KCCSDVFNQVVKSISIVGSCVGNRADTREALDFFARGLVK SPIKVVGLSTLPEIYEKMEKGQIVGRYVVDTSK (SEK ID Saccharomyces cerevisiae ACGVCGSDIHCAAGHWGNMKMPLWGHEIVGKWKLGP KSNSGLKVGQRVGVGAQVFSCLECDRCKNDNEPYCTKF VTTYSQPYEDGYVSQGGYANYVRVHEHFVVPIPENIPSHL AAPLLCGGLTVYSPLVRNGCGPGKKVGIVGLGGIGSMGTL GEKYFDTFDLIVVCASSLTDIDFNIMPKAMKVGGRIVSISIP EQHEMLSLKPYGLKAVSISYSALGSIKELNQLLKLVSEKDIK D (SEK ID NO: 74) Pseudomonas putida MSIEHRLNHlAGQLSGNGEVLLNSVDAHTGEPLPYAFHQA TSDEVDAAVQAAEAAYPAYRSTSPAQRAAFLDAIANELDA LGDDFVQHVMRETALPEARIRGERARTSNQLRLFADVVR RGDFLGARIDRAQPERTPLPRPDLRQYRIGVGPVAVFGAS NFPLAFSTAGGDTASALAAGCPVVFKAHSGHMLTAAHVA AAIDRAVAGSGMPAGVFNMIYGAGVGEVLVKHPAIQAVGF TGSLRGGRALCDMAAARPQPIPVFAEMSSINPVIVLPQAL QARGEQVAGELAASVVLGCGQFCTNPGLWGIKSPQFER FVHTLVARMADQAPQTMLNAGTLRSYQSGVQHLLAHPGI QHLAGQPQAGKQAQPQLFKADVSLLLDSDPLLQEEVFGP TTVVVEVADAQQLAEALRHLQGQLTATLIAEPDDLRAFAA LVPLLERKAGRLLLNGYPTGVEVSDAMVHGGPYPATSDA RGTSVGTLAIDRFLRPVCFQNYPDALLPEALKSANPLGIAR LVDGVASRGAV (SEK ID NO: 75) Pseudomonas putida MSIEHRLNHIAGQLSGNGDVLLNSVDAHTGEPLPYAFHQA TGDEVEAAVQAADAAYPAYRSTSPAQRAAFLDAIANELDA LGDDFIQHVMRETALPEARIRGERSRTSNQLRLFAEVVRR GDFYAARIDRALPQRTPLPRPDLRQYRIGVGPVAVFGASN FPLAFSTAGGDTASALAAGCPVVFKAHSGHMLTAAHVAG AIDRAVATSGMPAGVFNLIYGAGVGEALVKHPAIQAVGFT GSLRGGRALCDMAAARPQPIPVFAEMSSINPVIVLPQALQ ARGEQVAGELAASWMGCGQFCTNPGLVVGIQSPQFEHF VQTLVARMADQGPQTMLNAGTLRSYQNGVQHLLAHPGIQ HLAGQPHTGNQAQPQLFKADVSLLLNGDPLLQEEVFGPT TVVVEVADAEQLAEALRHLOGQLTATLIAEPDDLRAFASLV PLLERKAGRLLLNGYPTGVEVSDAMVHGGPYPATSDARG TSVGTLAIDRFLRPVCFQNYPDALLPDALKNANPLGIARLL DGVNSRDAV (SEK ID NO: 76) Pseudomonas sp.

MSIEHRLNHIAGQLSGHGDVLLHSLDAHTGEALPYAFHQA TGDEVEAAAQAAEVAYPSYRSTRPDQRAAFLDAIASELDA LGDDFIQDVMRETALPEARIRGERSRTSNQLRLFAEVVRR GDFYAARIDRALPQRTPLPRPDLRQYRIGVGPVAVFGASN FPLAFSTAGGDTASALAAGCPVVFKAHSGHMLTAAHVAA AIDRAVTGSGMPAGVFNMIYGAGVGEALVKHPAIQAVGFT GSLRGGRALCDMAAARPQPIPVFAEMSSINPVIVLPQALQ ARGEQVATELAASVVLGCGQFCTNPGLVVGIRSPHFEHFL QTLVARMADQGPQTMLNAGTLRSYQNAVQHLLAHPGIQH LAGQPQTGNQAQPQLFKADVSLLLNGDPLLQEEVFGPCT VVVEVADAQOLAEALRHLQGQLTATLIAEPDDLRAFASLV PLLERKAGRLLLNGYPTGVEVSDAMVHGGPYPATSDARG TSVGTLAIDRFLRPVCFQNYPDALLPDALKNANPLGIARLL EGVSSREAV (SEK ID NO:77) Pseudomonas sp.

MQIQGKNYIGGARSGEGEVRVYSIDATTGEKLPYEFFQAS TAEVDAAARAAEQAAPLYRKLSAEQRATFLDAIADELDAL GDDFVQLVCQETALPAGRIQGERGRTSGQMRLFAKVLRR GDFHGARIDTALPERKPLPRPDLROYRIGLGPVAVFGASN FPLAFSTAGGDTAAALAAGCPVVFKAHSGHMVTAEYVAD AIIRAAEKTGMPKGVFNMIYGGGVGEQLVKHPAIQAVGFT GSLRGGRALCDMAAARPQPIPVFAEMSSINPWVLPEALK ARGDAlTGELAASVVLGCGQFCTNPGLVIGLRSPEFSTFL EGLAAAMNEQAPQTMLNPGTLKSYEKGVAALLAHSGVQH LAGANQEGNQARPQLFKADVSLLLENDELLQEEVFGPTT VVVEVADEAQLHQALQGLHGQLTATLLAEPADLQRFEAII GLLEQKAGRLLLNGYPTGVEVCDAMVHGGPYPATSDAR GTSVGTLAIDRFLRPVCYQNYPDAFLPEALQNANPLGIQR LVNGENTKAAI (SEK ID NO: 78) Pseudomonas Citronellolis MFGHNFIGGARTAQGNLTLQSLDAGTGEALPYSFHQATP EEVDAAALAAEAAFPAYRALPDARRAEFLDAIAAELDALG EDFIAIVCRETALPAARIQGERARTSNQLRLFAQVLRRGDY HGARlDRALPERQPLPRPDLRQCRlGVGPVAVFGASNFPL AFSTAGGDTAAALAAGCPWFKAHSGHMATAEHVASAIV RAAQATGMPAGVFNM IYGGGVGERLVKHPAIQAVGFTGS LKGGRALCDLAAARPQPIPVFAEMSSINPVLALPAALAAR GEQVAADLAASWLGCGQFCTN PG MVIGIASAE FSAFVAS LTGRMADQPAQTMLNAGTLKSYERGIAALHAHPGIRHLAG QPQKGRQALPQLFQADARLLIEGDELLQEEVFGPVTVWE VADAAELQRALQGLRGQLTATLIAEPEDLSCFAALVPLLER KAGRLLLNGYPTGVEVCDAMVHGGPYPATSDARGTSVG TLAIDRFLRPVCYQNYPDALLPPALKDANPLGIARLVDGVA SREPL (SEK ID NO: 79) Bir yapilanmada oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada oksidaz yapilanmalarda HMF oksidaz, hmfH geninden türetilebilir. Bazi yapilanmalarda HMF oksidaz, Methylovorus sp. MP688 ya da Cupriavidus basilensis'den türetilebilir. Bakiniz Koopman ve digerleri (. Bir yapilanmada HMF oksidaz EC numarasi 1.1.3, aril-alkol oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.7). Bakiniz Carro ve digerleri (2015). Bir yapilanmada, peroksijenaz, EC numarasi 1.11.2 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, peroksijenaz EC numarasi 1.112, spesifik olmayan peroksijenazdir (EC numarasi 1.11.2.1). Bakiniz Carro ve digerleri (2015). Bazi yapilanmalarda, HMF oksidaz Tablo 4'te listelenen enzim adaylarindan türetilebilir. Bazi yapilanmalarda 4-HlVlF oksidaz enzimi, Tablo 4'te listelenen enzimler ile homolog ya da benzerdir. Bazi yapilanmalarda, HMF oksidaz enzimi, Tablo 4'te listelenen bir amino asit sekansi tarafindan kodlanir. Bazi yapilanmalarda, HMF oksidaz enzimi, katalitik etkinligini iyilestirmek için gelistirilir ya da tasarlanir (Bakiniz Martin ve ark. Biyoyakitlar için Biyoteknoloji. (2018) 11, Madde numarasi: Tablo 4. 4-HMF oksidaz enzimleri Adi Organizma Sekans MTDTIFDYVIVGGGTAGSVLANRLSARPENRVLLIEAGIDT PENNIPPEIHDGLRPWLPRLSGDKFFWPNLTIHRAAEHPGI TREPQFYEQGRLLGGGSSVNMVVSNRGLPRDYDEWQAL GADGWDWQGVLPYFIKTERDADYGDDPLHGNAGPIPIGR VDSRHWSDFTVAATQALEAAGLPNIHDQNARFDDGYFPP AFTLKGEERFSAARGYLDASVRVRPNLSLWTESRVLKLLT HmfH Methylovorus sp TGNAITGVSVLRGRETLQVQAREVILTAGALQSPAILLRTGI GPAADLHALGIPVLADRPGVGRNLWEHSSIGVVAPLTEQA RADASTGKAGSRHQLGIRASSGVDPATPSDLFLHIGADPV SGLASAVFWVNKPSSTGWLKLKDADPFSYPDVDFNLLSD PRDLGRLKAGLRLITHYFAAPSLAKYGLALALSRFAAPQP GGPLLNDLLQDEAALERYLRTNVGGVWHASGTARIGRAD DSQAVVDKAGRVYGVTGLRVADASlMPTVPTANTNLPTL MDTPRERFDYVIVGGGSAGCVLANRLSQDPAIRVALIEAG VDTPPDAVPAEILDSYPMPLFFGDRYIWPSLQARAVAGGR SKVYEQGRVMGGGSSINVQAANRGLPRDYDEWAASGAS HmfH Cupriavidusbasilensis GWSWQDVLPYFRHLERDVDYGNSPLHGSHGPVPIRRILP 2 QAWPPFCTEFAHAMGRSGLSALADQNAEFGDGWFPAAF SNLDDKRVSTAIAYLDADTRRRANLRIYAETTVRKLWSGR EARGVIAMRADGSRLALDAGEVIVSAGALQSPAILMRAGI GDAGALQALGIEWADRPGVGRNLQDHPALTFCQFLAPQ YRMPLSRRRASMTAARFSSGVPGGEASDMYLSSSTRAG WHALGNRLGLFFLWCNRPFSRGQVSLAGAQPDVPPMVE LNLLDDERDLRRMVAGVRKLVQIVGASALHQHPGDFFPA TFSPRVKALSRVSRGNVLLTELLGAVLDVSGPLRRSLIARF VTGGANLASLLTDESALEGFVRQSVFGVWHASGTCRMG AHADRSAVTDAAGRVHDVGRLRVIDASLMPRLPTANTNIP TIMLAEKlADTMQAERRAVRPASSEVAHPS (SEK ID NO: Cupriavidus necator MDTPRERFDYVIVGGGSAGCVLANRLSQDPAIRVALIEGG VDTPPDAVPVEILDSYPMPLFFGDRYIWPSLQARAVAGGR SKVYEQGRVMGGGSSINVQAANRGLPRDYDEWAASGAP GWSWQDVLPYFRNLERDVDYGNSPLHGSHGPVPIRRILP QAWPPFCTEFAHAMGLSGLSALADQNAEFGDGWFPAAF SNLDDKRVSTAIAYLDADTRRRANLRIYAETTVRKLWSGR EARGVIAIRADGSRLALDAGEVIVSAGALQSPAILMRAGIG DAGALQALGIEVVADRPGVGRNLQDHPALTFCQFLAPQY RMPLSRRRASMTAARFSSGVPGGEASDMYLSSSTRAGW HALGNRLGLFFLWCNRPFSRGQVSLAGAQPDVPPMVEL NLLDDERDLRRMVAGVRKLVQIVGASALHQHPGDFFPAT FSPRVKALSRLSRGNALLTELLGALLDVSGPLRRSLIARFV TGGANLASLLVEESALEGFVRQSVFGVWHASGTCRMGA HADRSAVTDAAGRVHDVGRLRVVDASLMPRLPTANTNIP TIMLAEKIADTMQAERRAVRLASSEVAHQS (SEK ID NO: Cupriavidus pinatubonensis MGTPRDRFDYVIVGGGSAGCVLANRLSRDPGIRVALIEGG VDTPPGAVPAEILDSYPMPLFFGDRYLWPSLQARAVAGG RARLYEQGRVMGGGSSINVQAANRGLPRDYDEWAASGA PGWSWQEVLPYFRKLERDVDFASSPMHGSDGPVPIRRIL PPAWPPFCTAFAQAMGRSGLSALDDQNAEFGDGWFPAA FSNLDGKRVSTAIAYLDANTRKRTNLRIFAETTVKELVVSG REARGVIAVRADGARLALEAAEVIVSAGALQSPAILMRAGI GDAAALQALGIEVVADRPGVGRNLQDHPALTFCQFLAPE YRMPLARRRSSMTAARFSSEVPGGEASDMYLSSSTRAG WHALGNRLGLFFLWCNRPFSRGQVSLAGAQPEVSPLVEL NLLDDERDLRRMVAGVRRLVRIVGASALHQHPDDFFPAIF SPRVKAMSRVSPGNALLTALLGALLDVSGPLRRSLIARFV TGGANLASLLADESALEGFVRQSVFGVWHASGTCRMGA HADRSAVTDTTGRVHDVGRLRWDASLMPRLPTANTNIPT Pandoraea sp. B-6 MPRGHAHRRlRRHSVQNVRERFDYVIIGGGSAGCVLAHR LSANRELRVALIEAGSDTPPGAIPAEILDSYPMPVFCGDRY lWPELKAKATAASPLKVYEOGKVMGGGSSINVQAANRGL PRDYDDWAEQGASGWAWKDVLPYFRKLERDADYGGSA LHGADGPVAIRRIKPDAWPRFCHAFAEGLQRNGLPMLED QNAEFGDGMFPAAFSNLDDKRVSTAVAYLDAATRARTNL RIYSNTTVERLIVTGQRAHGWAMSAGGERLQIDAAEVIVS AGALQSPALLLRAGIGAGSELQALGIPWADRPGVGRNLQ DHPSLTFCHFLDPEFRMPLSRRRASMTAARFSSGLDGCD NADMYLSSATRAAWHALGNRLGLFFLWCNRPFSRGRVQ LTSADPFTPPRVDLNLLDDERDARRMAIGVRRVAQIVQQT ALHRHPDDFFPAAFSPRVKALSRFSAGNAALTKVLGLALD TPAPLRRWIIDTFVTGGIRMSALLADDKELDAFI RKYVFGV WHASGTCRMGPASDRMAVTNQEGLVHDVANLRVVDASL MPKLPSANTNIPTIMMAEKIADAILARRKAPPGVLVSSEA (SEK ID NO: 84) MTDTIFDYVIVGGGTAGSVLANRLSARPENRVLLIEAGIDT PENNIPPEIHDGLRPWLPRLSGDKFFWPNLTIHRAAEHPGI TREPQFYEQGRLLGGGSSVNMVVSNRGLPRDYDEWQAL GADGWDWQGVLPYFIKTERDADYGDDPLHGNAGPIPlGR VDSRHWSDFTVAATQALEAAGLPNIHDQNARFDDGYFPP AFTLKGEERFSAARGYLDASVRVRPNLSLWTESRVLKLLT HmfH Meth Iovorus s TGNAITGVSVLRGRETLQVQAREVILTAGALQSPAILLRTGI y p GPAADLHALGIPVLADRPGVGRNLWEHSSIGVVAPLTEQA RADASTGKAGSRHQLGIRASSGVDPATPSDLFLHIGADPV SGLASARFWVNKPSSTGWLKLKDADPFSYPDVDFNLLSD PRDLGRLKAGLRLITHYFAAPSLAKYGLALALSRFAAPQP GGPLLNDLLQDEAALERYLRTNVGGVFHASGTARIGRAD DSQAWDKAGRVYGVTGLRVADASIMPTVPTANTNLPTL MTDTIFDYVIVGGGTAGSVLANRLSARPENRVLLIEAGIDT PENNIPPEIHDGLRPWLPRLSGDKFFWPNLTVYRAAEHPG LGADGWDWQGVLPYFIKTERDADYGDDPLHGNAGPIPIG RVDSRHWSDFTVAATQALEAAGLPNIHDQNARFDDGYFP PAFTLKGEERFSAARGYLDASVRVRPNLSLWTESRVLKLL HmfH Meth lovorus s MUT TTGNAITGVSVLRGRETLQVQAREVILTAGALQSPAILLRT y p GIGPAADLHALGIPVLADRPGVGRNLWEHSSIGVVAPLTE QARADASTGKAGSRHQLGIRASSGVDPATPSDLFLHIHAD PVSGLASARFWVNKPSSTGWLKLKDADPFSYPDVDFNLL SDPRDLGRLKAGLRLIKHYFAYPSLAKYGLALALSRFEAP QPGGPLLNDLLQDEAALERYLRTNVGGVFHASGTARIGR ADDSQAVVDKAGRVYGVTGLRVADASIMPTVPTANTNLP TLMLAEKIADAILTQA (SEK ID NO: 86) Bir yapilanmada, burada açiklanan yapilanmalarin herhangi birine ait rekombinant mikroorganizma, 4-HMF'nin 4-(hidr0ksimetil)fur0ik asiDe dönüsümünü katalize eden bir dehidrojenaz ya da bir oksidaz ya da bir peroksijenaz kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, EC numarasi 1.2.1 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada dehidrojenaz EC numarasi 1.2.1, aldehit dehidrojenaz (NAD+) (EC numarasi (EC numarasi ya da 4-(y- glutamilamin0)bütanal dehidrojenaz (EC numarasi 1.2.1.99) arasindan seçilir. Bir yapilanmada oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, 5-(hidroksimetilfurfural oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.47). Bazi yapilanmalarda EC 1.1.3.47 oksidaz, hmfH geninden türetilebilir. Bazi yapilanmalarda hmfH, Methylovorus sp. MP688 ya da Cupriavidus basilensis'den türetilebilir. Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, ariI-alkol oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.7). Bir yapilanmada peroksijenaz, EC numarasi 1.11.2 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, peroksijenaz EC numarasi 1.11.2, spesifik olmayan peroksijenazdir (EC numarasi 1.11.21).

Bir yapilanmada, burada açiklanan yapilanmalarin herhangi birine ait rekombinant mikroorganizma, turan-2,4-dikarbaldehitin 4-formilfuran-2-karboksilata vei'veya 2-formilfuran- 4-karboksilata dönüstürülmesini katalize eden bir dehidrojenaz ya da bir oksidaz ya da bir peroksijenaz kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, EC numarasi 1.2.1 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada dehidrojenaz EC numarasi (EC numarasi ya da aldehit dehidrojenaz [NAD(P)+] (EC numarasi 1.2.1.5) ya da 4-(v-glutamilamino)bütanal dehidrojenaz (EC numarasi 1.2.1.99) arasindan seçilir. Bir yapilanmada oksidaz. EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, 5- oksidaz, hmfH geninden türetilebilir. Bazi yapilanmalarda hmfH, Methylovorus sp. MP688 ya da Cupriavidus basilensis'den türetilebilir. Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, aril- alkol oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.7). Bir yapilanmada peroksijenaz, EC numarasi 1.11.2 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, peroksijenaz EC numarasi 1.11.2, spesifik olmayan peroksijenazdir (EC numarasi 1.11.21).

Bir yapilanmada, burada açiklanan yapilanmalarin herhangi birine ait rekombinant mikroorganizma, 4-(hidroksimetil)fur0ik asidin 4-formilfuran-2-karboksilata dönüsümünü katalize eden bir dehidrojenaz ya da bir oksidaz ya da bir peroksijenaz kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, EC numarasi 1.1.1 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, EC numarasi 1.1.1 olan dehidrojenaz, alkol dehidrojenaz (EC numarasi 1.1.1.1) ya da alkol dehidrojenaz alkol dehidrojenaz (EC numarasi (EC numarasi 1.1.1.91).arasindan seçilmektedir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, EC numarasi 1.1.1. Bir yapilanmada oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, 5-(hidroksimetilfurfural oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.47). Bazi yapilanmalarda EC 1.1.3.47 oksidaz, hmfH geninden türetilebilir. Bazi yapilanmalarda hmfH, Methylovorus sp. MP688 ya da Cupriavidus basilensis'den türetilebilir. Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, ariI-alkol oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.7). Bir yapilanmada peroksijenaz, EC numarasi 1.11.2 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, peroksijenaz EC numarasi 1.11.2. spesifik olmayan peroksijenazdir (EC numarasi 1.11.2.1).

Bir yapilanmada, burada açiklanan yapilanmalarin herhangi birine ait rekombinant mikroorganizma, 4-f0rmilfuran-2-karboksilat ve/veya 2-formiIfuran-4-karboksilatin 2,4- FDCA'ya dönüstürülmesini katalize eden bir dehidrojenaz ya da bir oksidaz ya da bir peroksijenaz kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, EC numarasi 1.2.1 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada dehidrojenaz EC numarasi (EC numarasi ya da aldehit dehidrojenaz [NAD(P)+] (EC numarasi 1.2.1.5) ya da 4-(y-glutamilamino)bütanal dehidrojenaz (EC numarasi 1.2.1.99) arasindan seçilir. Bir yapilanmada oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, 5- (hidroksimetilfurfural oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.47). Bazi yapilanmalarda EC 1.1.3.4? oksidaz, hmfH geninden türetilebilir. Bazi yapilanmalarda hmfH, Methylovorus sp. MP688 ya da Cupriavidus basilensis'den türetilebilir. Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, aril- alkol oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.7). Bir yapilanmada peroksijenaz, EC numarasi 1.11.2 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, peroksijenaz EC numarasi 1.112, spesifik olmayan peroksijenazdir (EC numarasi 1.11.21).

Bazi yönlerde, 2,4-FDCA mikroplarin yoklugunda enzimatik olarak üretilir. Bazi yönlerde, 2,4-FDCA bir ya da daha fazla kapta enzimatik olarak üretilir. Bazi yönlerden, bir ya da daha fazla kap, büyük ölçüde mikrop ihtiva etmez. Bazi yönlerde, 2,4-FDCA'nin enzimatik üretimi, rekombinant mikroorganizmalarin kullanildigi metotlarda tarif edildigi gibi ayni adim adim sekilde, ancak mikroorganizmalardan önemli ölçüde arinmis ya da mikroorganizmalarin yoklugunda gerçeklestirilir. Bazi yönlerde, 2,4-FDCA'nin enzimatik üretiminde kullanilan enzimler, mikroplardan, rekombinant ya da baska bir sekilde izole edilir ve 2,4-FDCA'yi üretmek için kullanilan ara ürünlerin asamali üretimi için ilgili substratlarina saglanir. Bazi yönlerde, metotlarin bir ya da daha fazla adimi ayni kapta gerçeklestirilir. Bazi yönlerde, burada tarif edilen ayri ayri metot adimlarinin bir sonucu olarak arzu edilen ürün üretildigi zaman, ürün izole edilir ve saflastirilir ve daha sonra 2,4-FDCA üretme metodunun bir sonraki adiminda substrat olarak kullanilir. 2,4-furandimetanol Bir yapilanmada mevcut tarifname, bir karbon kaynagindan 2,4-furandimetan0l üretebilen nitelikte bir rekombinant mikroorganizma saglar. Mevcut tarifnameye ait bazi yapilanmalar, bir karbon besleme stokunun 2,4-furandimetanol'e biyosentetik dönüsümünü toplu olarak detaylandiran SEKIL 1, SEKIL 2, ve SEKIL 3'te sunulmaktadir.

Bir yapilanmada, 4-HMF'den 2,4-furandimetanolün biyolojik üretimi, mikroorganizma tarafindan kodlanan bir dehidrojenaz tarafindan katalize edilir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, EC numarasi 1.1.1 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, dehidrojenaz EC numarasi 1.1.1, alkol dehidrojenazdan (EC numarasi 1.1.1.1) seçilir. Bir yapilanmada, dehidrojenaz EC numarasi seçilir. Bir yapilanmada, dehidrojenaz EC numarasi 1.1.1, D-ksiloz redüktazdan (EC numarasi 1.1.1.90) seçilir. Bir yapilanmada, dehidrojenaz EC numarasi 1.1.1, ariI-alkol dehidrojenazdan (EC numarasi 1.1.1.91) seçilir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, Tablo 5'te listelenen enzim adaylarindan türetilebilir. Bazi yapilanmalarda dehidrojenazlari Tablo 5'te listelenen enzimlere homolog ya da benzerdir. Bazi yapilanmalarda 4-HMF redüktaz enzimi, Tablo 5'te listelenen bir amino asit sekansi ile kodlanir.

Bazi yapilanmalarda, bir dehidrojenaz, 4-HMF'nin 2,4-furandimetanole indirgenmesi için katalitik etkinligini iyilestirmek üzere gelistirilir ya da tasarlanir.

Tablo 5. 4-HMF redüktaz enzimleri (4-HMF'nin 2,4-turandimetanole indirgenmesi) Organizma Sekans Zymomonas mobilis MLNFDYYNPTHIVFGKGRIAQLDTLLSKDARVLVLYGGSS AQKTGTLDEVRKALGDRTYFEFGGIEPNPSYETLMKAVEQ VKQEKVDFLLAVGGGSVIDGTKFVAAAVPYEGEPWEILET DGKKIKEALPVGTVLTLPATGSEMNRNSWTRKSIKSKRG FHNDHVFPVFSILDPTKVYTLPPRQLANGVVDSFIHITEQY LTYPVDGMVQDEFAEGLLRTLIKlGPELLKDQKNYDLAANF MWTATLALNGLIGAGVPQDWATHMVGHELTAAFGIDHGR TLAIILPSLLQNQREAKKGKLLQYAKNVWHIDQGSDDERID AAIEKTRHFFESLGIPTHLKDYDVGEESIDMLVKELEAHGM SQLGEHKAITPEVSRAILLASL (SEK ID NO: 87) Zymomonas mobilis su bsp. pomaceae MLNFDYYNPTHIAFGKDSIAKLDTLIPQDACVMVLYGGSSA KKTGTLDEVKTALGSRKIHEFGGlEPNPSYETLMQAVEQV KKEKIDFLLAVGGGSVlDGTKFVAAAVPYEGEPWEILETDG KKIKKALPLGTVLTLPATGSEMNPNSVVTRKSIKAKRAFHN KIVFPLFSILDPTKVYTLPPRQIANGIVDSFVHITEQYLTYPV EGMVQDEFAEGLLRILINIGPKLLKDQKNYDLAANFMWTA TLALNGLIGAGVPQDWATHMIGHEITAAFGVDHGRTLAIIL PSLLQNQRQVKKDKLLQYAKNVWHIESGSEKERIDAVIAK TRSFFEEMGIPTHLSDYNIGKESIDMLIHELEAHGMTKLGE HNAITPDVSRAILIASL (SEK ID NO: 88) Shewanella baltica MLNFNYYNPTRIRFGKDTIAEIDTLVPSDAKVMILFGGSSA RKTGTLDEVKQSLGNRFIVEFDGIEPNPTYETLMKAVAQV REQKlDFLLAVGGGSVIDGTKFVAAAAVFEGEPWDILTSW GAKVTQAMPFGSVLTLPATGSEMNNASVVTRKSLQAKLP FRNDLVYPQFSILDPTKTFTLPERQVANGWDAFVHITEQY LTYPVNAAVQDRFAEGLLQTLIELGPQVLAQPEDYDIRANL MWVATMALNGTIGVGVPHDWATHMIGHELTALYDIDHAR TLAIVLPALLQCTKEAKREKLLQYADRVWHlNTGTDDERID AAIAKTKAFFEAMGIPTHLSAYDLDASHVDTLVKQLELHGM VALGEHGNINPAMSRDILTLAL (SEK ID NO: 89) Burkholderia pseudomallei MLNFDFYNPTRIVFGEKTAARLNDLLPAAARVLVLYGGES ARSNGTLDEVRAALGARDVREFGGIEPNPAYETLMRAVE LARRERVDFLLAVGGGSVIDGTKFVAAAVPFEGDPWTILE THGANVAAALPFGCVLTLPATGSEMNNGAVLTRRATRAK LAFRHPLVFPTFSILDPTKTYTLPPRQVANGWDAFTHIVE QYLTYPADGLAQDRFAEGLLQTLIEIGPKALAEPRDYATRA NLMWVATLALNGLIGAGVPQDRATHMVGHELTARYDIDH ARTLAVVLPSMLDVRRDAKRAKLLQYAARVWNIVDGPED ARIDAAIARTRAFFESLGVKTRLADYGVGADAIDGLIAQLE AHGMTRLGERKDVTLDVSRRVLEASL (SEK ID NO: 90) Saccharomyces cerevisiae GVCHTDLHAWHGDWPLPTKLPLVGGHEGAGVWGMGE NVKGWKIGDYAGIKWLNGSCMACEYCELGNEPNCPHAD SSGYTH DGSFQQYATADAVQAAH l PQGTDLAEVAPVLCA GITVYKALKSANLMAGHWVAISGAAGGLGSLAVQYAKAM GYRVLGIDGGEGKEELFRSIGGEVFIDFTKEKDIVGAVLKA TDGGAHGVINVSVSEAAIEASTRYVRANGTTVLVGMPAGA KCCSDVFNQVVKSISIVGSCVGNRADTREALDFFARGLVK SPIKVVGLSTLPEIYEKMEKGQIVGRYVVDTSK (SEK ID MSYPEKFEGIAIQSHEDWKNPKKTKYDPKPFYDHDIDIKIE ACGVCGSDIHCAAGHWGNMKMPLWGHEIVGKWKLGP KSNSGLKVGQRVGVGAQVFSCLECDRCKNDNEPYCTKF VTTYSQPYEDGYVSQGGYANYVRVHEHFWPIPENIPSHL Saccharomyces AAPLLCGGLTVYSPLVRNGCGPGKKVGIVGLGGIGSMGTL cerevisiae ISKAMGAETYVISRSSRKREDAMKMGADHYIATLEEGDW GEKYFDTFDLIWCASSLTDIDFNIMPKAMKVGGRIVSISIP EQHEMLSLKPYGLKAVSISYSALGSIKELNQLLKLVSEKDIK D (SEK ID NO: 92) Bazi yönlerde, 2,4-furandimetanol, mikroplarin yoklugunda enzimatik olarak üretilir. Bazi yönlerde, 2,4-furandimetanol bir ya da daha fazla kapta enzimatik olarak üretilir. Bazi yönlerden, bir ya da daha fazla kap, büyük ölçüde mikrop ihtiva etmez. Bazi yönlerde, 2,4- furandimetanol'ün enzimatik üretimi, rekombinant mikroorganizmalarin kullanildigi metotlarda tarif edildigi gibi ayni adim adim sekilde, ancak mikroorganizmalardan önemli ölçüde arinmis ya da mikroorganizmalarin yoklugunda gerçeklestirilir. Bazi yönlerde, 2,4- furandimetanol'ün enzimatik üretiminde kullanilan enzimler, mikroplardan, rekombinant ya da baska bir sekilde izole edilir ve 2,4-furandimetanolü üretmek için kullanilan ara ürünlerin adim adim üretimi için ilgili substratlarina saglanir. Bazi yönlerde, metotlarin bir ya da daha fazla adimi ayni kapta gerçeklestirilir. Bazi yönlerde, burada tarif edilen ayri ayri metot adimlarinin bir sonucu olarak arzu edilen ürün üretildigi zaman, ürün izole edilir ve saflastirilir ve daha sonra 2,4-furandimetanol üretme metodunun bir sonraki adiminda substrat olarak kullanilir.

Furan-2,4-dikarbaldehit Bir yapilanmada mevcut tarifname, bir karbon kaynagindan turan-2,4-dikarbaldehit üretebilen nitelikte bir rekombinant mikroorganizma saglar. Mevcut tarifnameye ait bazi yapilanmalar, bir karbon besleme stokunun turan-2,4-dikarbaldehite biyosentetik dönüsümünü toplu olarak detaylandiran SEKIL 1, SEKIL 2 ve SEKIL 3'te sunulmaktadir.

Bir yapilanmada, Sekil 2'deki D adimi, bir substrat olarak 4-HlVlF kullanan tek adimli bir reaksiyondur. Bir yapilanmada, 4-HMF'den furan-2,4-dikarbaldehitin biyolojik üretimi, EC katalize edilir.

Bir yapilanmada, burada açiklanan yapilanmalarin herhangi birine ait rekombinant mikroorganizma, 4-HMF'nin furan-2,4-dikarbaldehite dönüsümünü katalize eden bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenaz kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, EC numarasi 1.1.1 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, EC numarasi 1.1.1 olan dehidrojenaz, alkol dehidrojenaz (EC numarasi (EC numarasi numarasi .arasindan seçilmektedir. Bir yapilanmada oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, 5-(hidroksimetilfurfural oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.47). Bazi yapilanmalarda EC 1.1.3.4? oksidaz, hmfH geninden türetilebilir. Bazi yapilanmalarda hmfH, Methylovorus sp. MP688 ya da Cupriavidus basilensis'den türetilebilir.

Bakiniz Dijkman ve Fraaije (2014) ve Koopman ve ark. (2010). Bir yapilanmada, oksidaz EC yapilanmada peroksijenaz, EC numarasi 1.112 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, peroksijenaz EC numarasi 1.11.2, spesifik olmayan peroksijenazdir (EC numarasi 1.11.2.1).

Bakiniz Carro ve ark. (2015).

Bazi yönlerde, furan-2,4-dikarbaldehit, mikroplarin yoklugunda enzimatik olarak üretilir. Bazi yönlerde, furan-2,4-dikarbaldehit bir ya da daha fazla kapta enzimatik olarak üretilir. Bazi yönlerden, bir ya da daha fazla kap, büyük ölçüde mikrop ihtiva etmez. Bazi yönlerde, furan- 2,4-dikarbaldehitin enzimatik üretimi, rekombinant mikroorganizmalarin kullanildigi metotlarda tarif edildigi gibi ayni adim adim sekilde, ancak mikroorganizmalardan önemli ölçüde arinmis ya da mikroorganizmalarin yoklugunda gerçeklestirilir. Bazi yönlerde, furan- 2,4-dikarbaldehitin enzimatik üretiminde kullanilan enzimler, mikroplardan, rekombinant ya da baska bir sekilde izole edilir ve furan-2,4-dikarbaldehiti üretmek için kullanilan ara ürünlerin adim adim üretimi için ilgili substratlarina saglanir. Bazi yönlerde, metotlarin bir ya da daha fazla adimi ayni kapta gerçeklestirilir. Bazi yönlerde, burada tarif edilen ayri ayri metot adimlarinin bir sonucu olarak arzu edilen ürün üretildigi zaman, ürün izole edilir ve saflastirilir ve daha sonra furan-2,4-dikarbaldehit üretme metodunun bir sonraki adiminda substrat olarak kullanilir. 4-(hidroksimetil)furoik asit Bir yapilanmada mevcut tarifname, bir karbon kaynagindan 4-(hidroksimetil)furoik asit üretebilen nitelikte bir rekombinant mikroorganizma saglar. Mevcut tarifnameye ait bazi yapilanmalar, bir karbon besleme stokunun 4-(hidr0ksimetil)furoik aside biyosentetik dönüsümünü toplu olarak detaylandiran SEKIL 1, SEKIL 2, ve SEKIL 3'te sunulmaktadir.

Bir yapilanmada, Sekil 2'deki E adimi, bir substrat olarak 4-HMF kullanan tek adimli bir reaksiyondur. Bir yapilanmada, 4-HMF'den 4-(hidr0ksimetil)furoik asidin biyolojik üretimi, EC katalize edilir.

Bir yapilanmada, burada açiklanan yapilanmalarin herhangi birine ait rekombinant mikroorganizma, 4-HMF'nin 4-(hidroksimetil)furoik asiDe dönüsümünü katalize eden bir dehidrojenaz ya da bir oksidaz ya da bir peroksijenaz kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, EC numarasi 1.2.1 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada dehidrojenaz EC numarasi 1.2.1, aldehit dehidrojenaz (NAD+) (EC numarasi (EC numarasi ya da 4-(y- glutamilamino)bütanal dehidrojenaz (EC numarasi 1.2.1.99) arasindan seçilir. Bir yapilanmada oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, 5-(hidroksimetilfurfural oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.47). Bazi yapilanmalarda EC 1.1.3.47 oksidaz, hmfH geninden türetilebilir. Bazi yapilanmalarda hmfH, Methylovorus sp. MP688 ya da Cupriavidus basilensis'den türetilebilir. Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, ariI-alkol oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.7). Bir yapilanmada peroksijenaz, EC numarasi 1.11.2 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, peroksijenaz EC numarasi 1.11.2, spesifik olmayan peroksijenazdir (EC numarasi 1.11.21).

Bazi yönlerde 4-(hidroksimetil)furoik asit mikroplarin yoklugunda enzimatik olarak üretilir.

Bazi yönlerde, 4-(hidroksimetil)furoik asit, bir ya da daha fazla kapta enzimatik olarak üretilir.

Bazi yönlerden, bir ya da daha fazla kap, büyük ölçüde mikrop ihtiva etmez. Bazi yönlerde, 4-(hidroksimetil)furoik asidin enzimatik üretimi, rekombinant mikroorganizmalarin kullanildigi metotlarda tarif edildigi gibi ayni adim adim sekilde, ancak mikroorganizmalardan önemli ölçüde arinmis ya da mikroorganizmalarin yoklugunda gerçeklestirilir. Bazi yönlerde, 4- (hidroksimetil)fur0ik asidin enzimatik üretiminde kullanilan enzimler, mikroplardan, rekombinant ya da baska bir sekilde izole edilir ve 4-(hidr0ksimetil)furoik asidi üretmek Için kullanilan ara ürünlerin adim adim üretimi için ilgili substratlarina saglanir. Bazi yönlerde, metotlarin bir ya da daha fazla adimi ayni kapta gerçeklestirilir. Bazi yönlerde, burada tarif edilen ayri ayri metot adimlarinin bir sonucu olarak arzu edilen ürün üretildigi zaman, ürün izole edilir ve saflastirilir ve daha sonra 4-(hidr0ksimetil)fur0ik asit üretme metodunun bir sonraki adiminda substrat olarak kullanilir. 2-formiIfuran-4-karboksilat Bir yapilanmada mevcut tarifname, bir karbon kaynagindan 2-formiIfuran-4-karboksilat üretebilen nitelikte bir rekombinant mikroorganizma saglar. Mevcut tarifnameye ait bazi yapilanmalar, bir karbon besleme stokunun 2-formilfuran-4-karboksilata biyosentetik dönüsümünü toplu olarak detaylandiran SEKIL 1, SEKIL 2 ve SEKIL 3'te sunulmaktadir.

Bir yapilanmada, Sekil 2'deki F adimi, bir substrat olarak furan-2,4-dikarbaldehit kullanan tek adimli bir reaksiyondur. Bir yapilanmada, furan-2,4-dikarbaldehitten 2-f0rmilfuran-4- ya da daha fazla enzim tarafindan katalize edilir.

Bir yapilanmada, burada açiklanan yapilanmalarin herhangi birine ait rekombinant mikroorganizma, furan-2,4-dikarbaldehitin 2-formiIfuran-4-karboksilata dönüstürülmesini katalize eden bir dehidrojenaz ya da bir oksidaz ya da bir peroksijenaz kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, EC numarasi 1.2.1 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada dehidrojenaz EC numarasi ya da aldehit dehidrojenaz (NADP+) (EC numarasi +] (EC arasindan seçilir. Bir yapilanmada oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, 5-(hidr0ksimetilfurfural oksidazdir (EC numarasi yapilanmalarda hmfH, Methylovorus sp. MP688 ya da Cupriavidus basilensis'den türetilebilir.

Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, ariI-alkol oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.7). Bir yapilanmada peroksijenaz, EC numarasi 1.11.2 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, peroksijenaz EC numarasi 1.112, spesifik olmayan peroksijenazdir (EC numarasi 1.11.2.1).

Bazi yönlerde, 2-f0rmilfuran-4-karboksilat, mikroplarin yoklugunda enzimatik olarak üretilir.

Bazi yönlerde, 2-f0rmiIfuran-4-karb0ksilat bir ya da daha fazla kapta enzimatik olarak üretilir.

Bazi yönlerden, bir ya da daha fazla kap, büyük ölçüde mikrop ihtiva etmez. Bazi yönlerde, 2-f0rmiIfuran-4-karb0ksilat'in enzimatik üretimi, rekombinant mikroorganizmalarin kullanildigi metotlarda tarif edildigi gibi ayni adim adim sekilde, ancak mikroorganizmalardan önemli ölçüde arinmis ya da mikroorganizmalarin yoklugunda gerçeklestirilir. Bazi yönlerde, 2- formiIfuran-4-karboksilat'in enzimatik üretiminde kullanilan enzimler, mikroplardan, rekombinant ya da baska bir sekilde izole edilir ve 2-f0rmiIfuran-4-karboksilati üretmek için kullanilan ara ürünlerin adim adim üretimi için ilgili substratlarina saglanir. Bazi yönlerde, metotlarin bir ya da daha fazla adimi ayni kapta gerçeklestirilir. Bazi yönlerde, burada tarif edilen ayri ayri metot adimlarinin bir sonucu olarak arzu edilen ürün üretildigi zaman, ürün izole edilir ve saflastirilir ve daha sonra 2-f0rmilfuran-4-karboksilat üretme metodunun bir sonraki adiminda substrat olarak kullanilir. 4-formilfuran-2-karb0ksilat Bir yapilanmada mevcut tarifname, bir karbon kaynagindan 4-formilfuran-2-karboksilat üretebilen nitelikte bir rekombinant mikroorganizma saglar. Mevcut tarifnameye ait bazi yapilanmalar, bir karbon besleme stokunun 4-f0rmiIfuran-2-karb0ksilata biyosentetik dönüsümünü toplu olarak detaylandiran SEKIL 1, SEKIL 2 ve SEKIL 3'te sunulmaktadir.

Bir yapilanmada, Sekil 2'deki G adimi, bir substrat olarak furan-2,4-dikarbaldehit kullanan tek adimli bir reaksiyondur. Bir yapilanmada, furan-2,4-dikarbaldehitten 4-formilfuran-2- ya da daha fazla enzim tarafindan katalize edilir.

Bir yapilanmada, burada açiklanan yapilanmalarin herhangi birine ait rekombinant mikroorganizma, turan-2,4-dikarbaldehitin 4-formiIfuran-2-karb0ksilata dönüstürülmesini katalize eden bir dehidrojenaz ya da bir oksidaz ya da bir peroksijenaz kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, EC numarasi 1.2.1 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada dehidrojenaz EC numarasi ya da aldehit dehidrojenaz (NADP+) (EC numarasi +] (EC arasindan seçilir. Bir yapilanmada oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, 5-(hidr0ksimetilfurfural oksidazdir (EC numarasi yapilanmalarda hmfH, Methylovorus sp. MP688 ya da Cupriavidus basilensis'den türetilebilir.

Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, ariI-alkol oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.7). Bir yapilanmada peroksijenaz, EC numarasi 1.11.2 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, peroksijenaz EC numarasi 1.112, spesifik olmayan peroksijenazdir (EC numarasi 1.11.21).

Bir yapilanmada, Sekil 2'deki H adimi, bir substrat olarak 4-(hidr0ksimetil)fur0ik asit kullanan tek adimli bir reaksiyondur. Bir yapilanmada, 4-(hidr0ksimetil)furoik asitten 4- temsil edilen bir ya da daha fazla enzim tarafindan katalize edilir.

Bir yapilanmada, burada açiklanan yapilanmalarin herhangi birine ait rekombinant mikroorganizma, 4-(hidr0ksimetil)furoik asidin 4-formilfuran-2-karboksilata dönüsümünü katalize eden bir dehidrojenaz ya da bir oksidaz ya da bir peroksijenaz kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, EC numarasi 1.1.1 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, EC numarasi 1.1.1 olan dehidrojenaz, alkol dehidrojenaz (EC numarasi 1.1.1.1) ya da alkol dehidrojenaz alkol dehidrojenaz (EC numarasi (EC numarasi 1.1.1.91).arasindan seçilmektedir. Bir yapilanmada oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, 5-(hidroksimetilfurfural oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.47). Bazi yapilanmalarda EC 1.1.3.4? oksidaz, hmfH geninden türetilebilir. Bazi yapilanmalarda hmfH, Methylovorus sp. MP688 ya da Cupriavidus basilensis'den türetilebilir. Bakiniz Dijkman ve Fraaije (2014) ve Koopman ve ark. (2010). Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, ariI-alkol oksidazdir (EC numarasi olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, peroksijenaz EC numarasi 1.11.2, spesifik olmayan peroksijenazdir (EC numarasi 1.11.21). Bakiniz Carro ve ark. (2015).

Bazi yönlerde, 4-formilfuran-2-karboksilat, mikroplarin yoklugunda enzimatik olarak üretilir.

Bazi yönlerde, 4-formilfuran-2-karboksilat bir ya da daha fazla kapta enzimatik olarak üretilir.

Bazi yönlerden, bir ya da daha fazla kap, büyük ölçüde mikrop ihtiva etmez. Bazi yönlerde, 4-formilfuran-2-karboksilat'in enzimatik üretimi, rekombinant mikroorganizmalarin kullanildigi metotlarda tarif edildigi gibi ayni adim adim sekilde, ancak mikroorganizmalardan önemli ölçüde arinmis ya da mikroorganizmalarin yoklugunda gerçeklestirilir. Bazi yönlerde, 4- formilfuran-2-karboksilat'iri enzimatik üretiminde kullanilan enzimler, mikroplardan, rekombinant ya da baska bir sekilde izole edilir ve 4-formilfuran-2-karboksilati üretmek için kullanilan ara ürünlerin adim adim üretimi için ilgili substratlarina saglanir. Bazi yönlerde, metotlarin bir ya da daha fazla adimi ayni kapta gerçeklestirilir. Bazi yönlerde, burada tarif edilen ayri ayri metot adimlarinin bir sonucu olarak arzu edilen ürün üretildigi zaman, ürün izole edilir ve saflastirilir ve daha sonra 4-f0rmilfuran-2-karboksilat üretme metodunun bir sonraki adiminda substrat olarak kullanilir.

Mikrobiyal Popülasyonlarin Üretimi Genetik modifikasyon Mevcut tarifnameye ait bir ya da daha fazla mikrop içine dahil edilen genetik modifikasyon, bir hedef genin düzenleyici sekansini degistirebilir ya da ortadan kaldirabilir. Bazi yönlerde, mevcut tarifnameye ait bir ya da daha fazla mikrop içine dahil edilen genetik modifikasyon, bir ya da daha fazla mikroba yeni bir özellik ya da fenotip katabilir. Genetik varyasyonun kendisine dahil edildigi mikroba karsilik gelen bir hayvan, bitki, mantar, maya, bakteri ya da virüsün genomu içinde bulunan heterolog düzenleyici sekanslar ve düzenleyici sekanslar dahil olmak üzere bir ya da daha fazla düzenleyici sekans eklenebilir. Buna ilave olarak, mikrobiyal bir kültürdeki bir genin ekspresyon düzeyine bagli olarak düzenleyici sekanslar seçilebilir. Genetik varyasyon, özellikle bir hedef bölgeye dahil edilen önceden belirlenmis bir genetik varyasyon olabilir. Bazi yönlerde genetik varyasyon, bir ya da daha fazla mikrobiyal kromozoma dahil edilen bir nükleik asit sekansidir. Bazi yönlerde, genetik varyasyon bir ya da daha fazla ekstrakromosomal nükleik asit sekansi içine dahil edilen bir nükleik asit sekansidir. Genetik varyasyon hedef bölge içinde rastgele bir mutasyon olabilir. Genetik varyasyon, bir ya da daha fazla nükleotitin eklenmesi ya da silinmesi olabilir. Bazi durumlarda, izole edilmis bakterilerden birine ya da daha fazlasina çok sayida farkli genetik varyasyonlar (örnegin 2, 3, 4, 5, 10 ya da daha fazlasi) dahil edilir. Çok sayida genetik varyasyonlar yukaridaki tiplerden herhangi biri, ayni ya da farkli türlerde ve herhangi bir kombinasyonda olabilir. Bazi durumlarda, çok sayida farkli genetik varyasyonlar seri olarak dahil edilir, bir birinci izolasyon adimindan sonra bir birinci genetik varyasyon, ikinci bir izolasyon adimindan sonra ikinci bir genetik varyasyon ve böylece devam eder, böylece mikroplarda arzu edilen çok sayidaki degisiklik biriktirilir.

Bazi yönlerde, 2,4-FDCA monomerlerin ve polimerlerin üretiminde belirtilen bir ya da daha fazla substrat, bir karbon besleme stokundan (örnegin, glikoz ya da gliserol) biyosentezlenir.

Genel olarak, "genetik varyasyon" terimi, örnegin referans genomu ya da bunun bir kismi ya da referans geni ya da bunun bir bölümü gibi bir referans polinükleotide göre bir polinükleotid sekansina dahil edilen herhangi bir degisikligi ifade eder. Genetik bir varyasyon bir gen ekspresyonu, metabolizma ve hücre sinyallemesi dahil olmak üzere bazi biyolojik aktivitelerin artmasi ya da azalmasi gibi herhangi bir sayida etkiye sahip olabilir.

Genetik varyasyonlar özellikle bir hedef bölgeye dahil edilebilir ya da rastgele dahil edilebilir.

Genetik varyasyonu dahil etmek için çesitli moleküler araçlar ve metotlar mevcuttur. Örnek olarak, genetik varyasyon polimeraz zincir reaksiyonu mutajenezi, oligonükleotid yönlendirilmis mutajenezi, doygunluk mutajenezi, parça karistirma mutajenezi, homolog rekombinasyon, yeniden birlestirme/tasarlama, Iambda kirmizi aracili rekombinasyon, CRlSPR/CasQ sistemleri, kimyasal mutajenez ve bunlarin kombinasyonlari vasitasi ile dahil edilebilir. Genetik varyasyonu dahil etmeye yönelik kimyasal metotlar arasinda DNA'nin kimyasal bir mutagene maruz kalmasi, örnegin etil metansülfonat (EMS), metil metansülfonat (MMS), N-nitrozüre (EN U), N-metiI-N-nitro-N'-nitrosoguanidin, 4- nitroquinoline N-oksit, dietilsülfat, benzopiren, siklofosfamid, bleomisin, trietilslmelamin, akrilamid monomer, azot hardal, vinkristin, diepoksialkanlar (örnek olarak diepoksibütan), dimetilbenz(a)sarbon, klorambucil, hekzametilfosforamid, bisulfan ve benzerleri yer almaktadir. Radyasyon mutasyonu indükleyen ajanlar arasinda ultraviyole radyasyon, v isinlama, X isini röntgen ve hizli nötron bombardimani bulunur. Ayrica genetik varyasyon, örnegin ultraviyole isikli trimetilpsoralen kullanilarak nükleik bir asit içine de dahil edilebilir. Örnegin transpoze edilebilir bir eleman gibi bir mobil DNA elemaninin rastgele ya da hedefli olarak yerlestirilmesi, genetik varyasyon olusturmak için baska bir uygun metottur.

Genetik varyasyonlar, hücre içermeyen bir in vitro sistemde amplifikasyon sirasinda bir nükleik asit içine, örnegin hataya egilimli PCR gibi bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) teknigi kullanilarak dahil edilebilir. Genetik varyasyonlar, DNA karistirma teknikleri (örnegin, ekson karistirma, alan degistirme ve benzeri) kullanilarak bir nükleik asit içine in vitro olarak dahil edilebilir. Ayrica genetik varyasyonlar, bir hücredeki bir DNA onarim enziminde bir eksikligin bir sonucu olarak da bir nükleik asit içine dahil edilebilir, örnegin, bir mutant DNA onarim enzimini kodlayan bir mutant genin bir hücresinde bulunmasinin, hücrenin genomunda yüksek bir siklikta mutasyonlar (diger bir deyis ile, yaklasik olarak 1 mutasyonf100 gen - 1 mutasyon/10.000 gen) meydana getirmesi beklenir. DNA onarim enzimlerini kodlayan genlerin örnekleri arasinda, bunlar ile sinirli olmamak üzere Mut H, Mut S, Mut L ve Mut U ve diger türlerdeki bunlarin homologlari (örnegin, MSH 1 6, PiVIS 1 2, MLH 1, GTBP, ERCO-1 ve benzerleri) yer almaktadir. Genetik varyasyonlari dahil etmek için çesitli metotlarin örnek açiklamalari, örnegin Stemple (2004) Nature 5:1-7; Chiang ve digerleri. ( Proc. Natl. sayili belgelerde saglanmaktadir.

Mikroplar içine dahil edilen genetik varyasyonlar transgenik, cisgenik, intragenomik, intragenerik, intergenerik, sentetik, evrimlesmis, yeniden düzenlenmis ya da SNP'Ier olarak siniflandirilabilir.

CRISPR/CasQ (Kümelenmis düzenli aralikli kisa palindromik tekrarlar) /CRISPR iliskili (Cas) sistemler arzu edilen mutasyonlari dahil etmek için kullanilabilir. CRISPR/Cas9, istilaci nükleik asitlerin susturulmasini yönlendirmek için CRISPR RNA'Iarin (chNA'Iar) kullanilmasi ile bakterilere ve arkealara virüslere ve plazmidlere karsi adaptif bagisiklik saglar. CasQ proteini (ya da fonksiyonel esdegeri ve/veya bunun varyanti, diger bir deyis ile Cas9 benzeri protein), dogal olarak proteinin, chNA ve trachNA (ayni zamanda kilavuz RNA'Iar olarak da adlandirilir) adi verilen iki dogal olarak olusan ya da sentetik RNA molekülü ile iliskisine bagli olarak DNA endonucleaz aktivitesi ihtiva etmektedir. Bazi durumlarda, iki molekül tek bir molekül (ayni zamanda tek bir kilavuz RNA ("sgRNA" olarak da adlandirilir) olusturmak için kovalent olarak baglanir. Dolayisi ile de Ca59 ya da Ca59 benzeri protein, Ca39 ya da CasQ benzeri proteini aktive eden ve proteini bir hedef nükleik asit sekansina yönlendiren DNA hedefli bir RNA (bu terim hem iki moleküllü kilavuz RNA konfigürasyonunu hem de tek moleküllü kilavuz RNA konfigürasyonunu kapsar) ile iliskilenir. Eger CasQ ya da CasQ benzeri protein kendi dogal enzimatik islevini korur ise, genom degisikligine (diger bir deyis ile düzenleme: silme, ekleme (donör polinükleotid mevcut oldugu zaman), degistirme vb.) yol açabilecek bir çift zincirli kirilma meydana getirmek için hedef DNA'yi ayirir, böylece gen ekspresyonunu degistirir. CasQ'un bazi varyantlari (bu varyantlar ca59 benzeri terimin kapsami içinde yer almaktadir), bunlarin azalmis bir DNA bölünme aktivitesine sahip olacaklari bir sekilde degistirilmistir (bazi durumlarda, bunlar hedef DNA'nin her iki zinciri yerine tek bir zincirini ayirirken, diger bazi durumlarda isi, hiç DNA bölünme aktivitesi olmayacak hale ciddi bir sekilde indirgenmistir). Crispr sistemlerinin genetik varyasyonu dahil etmek için daha baska örnek teskil eden açiklamalar, örnegin U88795965 sayili belgede bulunabilir.

Ayni zamanda bölgeye yöneltilmis mutajenez olarak da adlandirilan oligonükleotit yönelimli mutajenez, tipik olarak sentetik bir DNA primeri kullanir. Bu sentetik primer, arzu edilen mutasyonu ihtiva etmektedir ve ilgilenilen gendeki DNA ile hibritlesebilecegi bir bir sekilde mutasyon bölgesi etrafindaki sablon DNA'yi tamamlayicidir. Mutasyon, tek bir baz degisikligi (bir nokta mutasyonu), çoklu baz degisiklikleri, silme ya da ekleme ya da bunlarin bir kombinasyonu olabilir. Tek zincirli primer daha sonra, genin geri kalanini kopyalayan bir DNA polimeraz kullanilarak uzatilir. Bu sekilde kopyalanmis olan gen, mutasyona ugramis bölgeyi ihtiva etmektedir ve daha sonra bir vektör olarak bir konakçi hücre içine dahil edilebilir ve klonlanabilir. Son olarak, mutantlar, bunlarin arzu edilen mutasyonu ihtiva edip etmediklerini kontrol etmek için DNA sekanslamasi ile seçilebilir.

Hata egilimli PCR kullanilarak genetik varyasyonlar dahil edilebilir. Bu teknikte, ilgilenilen gen, sekansin replikasyonunun aslina uygunlugu açisindan eksik olan kosullar altinda bir DNA polimeraz kullanilarak amplifiye edilir. Sonuç, amplifikasyon ürünlerinin sekansta en az bir hata ihtiva etmesidir. Bir gen amplifiye edildigi zaman ve reaksiyonun nihai ürünü/ürünleri, sablon molekül ile kiyaslandigi zaman sirali olarak bir ya da daha fazla degisiklik ihtiva ettigi zaman, sonuçta elde edilen ürünler, sablon ile karsilastirildiginda mutajenize edilir.

Rastgele mutasyonlari dahil etmenin baska bir yolu, hücreleri örnegin nitrozguanidin ya da etil metansülfonat gibi bir kimyasal mutajene maruz birakmaktir (Nestmann, Mutat Res 1975 Haziran; 28(3):323-30) ve geni ihtiva eden vektör daha sonra konakçidan izole edilir.

Homolog rekombinasyon mutagenezi, bir ekzojen DNA fragmani ile hedeflenen polinükleotid sekansi arasindaki rekombinasyonu gerektirmektedir. Çift sarmalli bir kopma meydana geldikten sonra, kopmanin 5' uçlari etrafindaki DNA bölümleri, rezeksiyon adi verilen bir islemde kesilir. Takip eden zincir istilasi adiminda, daha sonra, kirik DNA molekülünün sarkan 3' ucu, kirilmamis olan benzer ya da özdes bir DNA molekülünü "istila eder". Metot, bir geni silmek, ekzonlari çikarmak, bir gen Ilave etmek ve nokta mutasyonlarini dahil etmek için kullanilabilir. Homolog rekombinasyon mutagenezi kalici ya da kosullu olabilir. Tipik olarak, bir rekombinasyon sablonu da ayrica saglanmaktadir. Bir rekombinasyon sablonu, ayri bir vektörde bulunan ya da ayri bir polinükleotit olarak saglanan baska bir vektörün bir bileseni olabilir. Bazi yönlerde, bir rekombinasyon sablonu, bölgeye özgü bir nükleaz tarafindan çentiklenen ya da bölünen bir hedef sekansin içinde ya da yakininda olma durumu gibi, homolog rekombinasyonda bir sablon olarak hizmet etmek üzere tasarlanmistir.

Bir sablon polinükleotit, yaklasik olarak örnegin yaklasik olarak ya da ya da yaklasik olarak fazla uzunlukta nükleotit gibi herhangi bir uygun uzunlukta olabilir. Bazi yönlerde, sablon polinükleotit, hedef sekansi ihtiva eden bir polinükleotidin bir bölümünü tamamlayicidir.

Optimal olarak hizalandigi zaman, bir sablon polinükleotit, bir hedef sekansin bir ya da daha fazla nükleotidi ile örtüsebilir (örnegin yaklasik olarak ya da ya da yaklasik olarak bundan daha fazla nükleotid). Bazi yönlerde, bir sablon sekans ve bir hedef sekansi ihtiva eden bir polinükleotit optimal olarak hizalandigi zaman, sablon polinükleotidin en yakin nükleotidi 5000, 10000 ya da daha fazla nükleotid araligi içindedir. Homolog rekombinasyon metotlarinda yararli olan bölgeye yönelik nükleazlarin sinirlayici olmayan örnekleri arasinda çinko parmak nükleazlari, CRISPR nükleazlari, TALE nükleazlari ve meganükleaz yer alir.

Bu tür nükleazlarin kullanimina iliskin daha fazla açiklama için, örnegin U88795965 ve Genetik varyasyonun dahil edilmesi, tamamlanmamis bir süreç olabilir, böylece, islem gören bir bakteri popülasyonundaki bazi bakteriler arzu edilen mutasyonu tasirken digerleri tasimaz. Bazi durumlarda, arzu edilen bir genetik varyasyonu tasiyan bakterileri zenginlestirmek için bir seçim baskisinin uygulanmasi arzu edilir. Geleneksel olarak, basarili genetik varyantlar için seçim, örnegin, antibiyotik direnç geninin eklenmesi ya da ölümcül olmayan bir bilesigi ölümcül bir metabolite dönüstürebilen nitelikte bir metabolik aktivitenin ortadan kaldirilmasi durumunda oldugu gibi, genetik varyasyon tarafindan verilen ya da ortadan kaldirilan bir kisim islevsellik için ya da bunlara karsi seçimi ihtiva etmekteydi.

Ayni zamanda, bir polinükleotid sekansinin kendisine dayali olarak bir seçim baskisi uygulamak da mümkündür, böylece sadece arzu edilen bir genetik varyasyonun dahil edilmesi gerekir (örnegin ayrica seçilebilir bir isaretçi gerektirmeden). Bu durumda, seçim baskisi, bir hedef bölgeye dahil edilen genetik varyasyondan yoksun genomlarin bölünmesini ihtiva edebilir, böylece seçim, genetik varyasyonun kendisine dahil edilmek istendigi referans sekansa karsi etkili bir sekilde yönlendirilir. Tipik olarak, bölünme, hedef sitenin 100 nükleotidi içinde (örnegin, hedef sitede ya da hedef site içindeki bölünme dahil olmak üzere, hedef bölgeden 75, 50, 25, 10 ya da daha az nükleotit içinde) meydana gelir.

Bölünme, bir Çinko Parmak nükleazi, bir CRISPR nükleazi, bir TALE nükleazi (TALEN) ya da bir meganükleazdan olusan grup arasindan seçilen bir bölgeye özgü nükleaz tarafindan yönlendirilebilir. Bu tür bir proses, homolog rekombinasyon için hiçbir sablon saglanmamasi disinda, bir hedef bölgede homolog rekombinasyonu güçlendirme proseslerine benzer.

Sonuç olarak da, arzu edilen genetik varyasyona sahip olmayan bakterilerin, onarilmadan birakildiginda hücre ölümü ile sonuçlanan bölünme geçirme olasiligi daha yüksektir.

Seçimden kurtulan bakteri daha sonra gelistirilmis bir özelligin verilmesini degerlendirmek için izole edilebilir.

Bir CRISPR nükleazi, bölünmeyi bir hedef bölgeye yönlendirmek için bölgeye özgü nükleaz olarak kullanilabilir. Mutasyona ugramamis hücreleri öldürmek için Casg kullanilarak gelismis bir mutasyona ugramis mikrop seçimi elde edilebilir. Mikroplar daha sonra dokulardan yeniden izole edilebilir. Varyant olmayanlara karsi seçim için kullanilan CRISPR nükleaz sistemleri, homolog rekombinasyon için hiçbir sablon saglanmamasi disinda, genetik varyasyonun dahil edilmesi ile ilgili olarak yukarida tarif edilenlere benzer elemanlar kullanabilir. Dolayisi ile de hedef bölgeye yönlendirilen bölünme, etkilenen hücrelerin ölümünü arttirir. Örnegin çinko parmak nükleazlari, TALE nükleaz (TALEN) sistemleri ve meganükleaz gibi bir hedef bölgede spesifik olarak bölünmeyi indüklemek için diger seçenekler mevcuttur. Çinko parmak nükleazlari (ZFN'Ier), bir çinko parmak DNA baglama alanini bir DNA bölünme alanina kaynastirmak sureti ile üretilen yapay DNA endonükleazlaridir. ZFN'Ier, arzu edilen DNA sekanslarini hedefleyecek bir sekilde tasarlanabilir ve bu da, çinko parmak nükleazlarinin benzersiz hedef sekanslari bölmesine olanak tanir. Bir hücre içine dahil edildigi zaman, ZFN'ler, çift sarmalli kirilmalari indükleyerek hücredeki (örnegin hücrenin genomu) hedef DNA'yi düzenlemek için kullanilabilir. Transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleazlar (TALEN'Ier), bir TAL (Transkripsiyon aktivatörü benzeri) efektör DNA baglama alaninin bir DNA bölünme alanina kaynastirilmasi ile olusturulan yapay DNA endonükleazlaridir. TALEN'Ier, arzu edilen herhangi bir DNA sekansini pratik olarak baglamak için hizli bir sekilde tasarlanabilir ve bir hücre içine dahil edildigi zaman, TALEN'Ier, çift zincir kirilmalarini indükleyerek hücredeki (örnegin hücrenin genomu) hedef DNA'yi düzenlemek için kullanilabilir. Meganükleazlar (hedeflenen endonükleaz), genis bir tanima bölgesi (12 ila 40 baz çiftinden olusan çift sarmalli DNA sekanslari) ile karakterize edilen endodeoksiribonükleazlardir. Meganükleazlar, sekanslari yüksek bir oranda hedeflenmis bir sekilde yerine degistirmek, ortadan kaldirmak ya da modifiye etmek için kullanilabilir. Bunlarin tanima sekanslarini protein mühendisligi yolu ile degistirmek sureti ile hedeflenen sekans degistirilebilir. Meganükleazlar, bakteri, bitki ya da hayvan olsun tüm genom tiplerini degistirmek için kullanilabilir ve yaygin olarak dört aileye halinde gruplandirilir: LAGLIDADG ailesi, GIY-YIG ailesi, His-Kist kutusu ailesi ve HNH ailesi. Örnek teskil eden hedeflenen endonükleazlar arasinda, I-Scel, I-Ceul, PI-Pspl, PI-Sce, l-ScelV, l- Csml, I-Panl, I-Scell, I-Ppol, I-Scelll, I-Crel, I- Tevl, I-TevII ve I-TevIII bulunmaktadir.

Mikroplar Burada tarif edildigi sekli ile, bazi yönlerde rekombinant mikroorganizmalar, 4-HMF, 2,4- furandimetanol, turan-2,4-dikarbaldehit, 4-(hidroksimetil)furoik asit, 2-formilfuran-4- karboksilat, 4-f0rmilfuran-2-karboksilat ya da 2,4-FDCA ve bunlarin herhangi bir kombinasyonunu üretebilir kapasitededir.

Burada tarif edildigi gibi bazi yönlerde rekombinant mikroorganizmalar prokaryotik mikroorganizmadir. Bazi yönlerde prokaryotik mikroorganizmalar, bakterilerdir. "Bakteriler" ya da "öbakteriler", prokaryotik organizmalarin bir alanini ifade eder. Bakteriler, asagida yer aldigi gibi en az on bir farkli grup ihtiva etmektedir: (1) Iki ana alt bölümü bulunan Gram pozitif (gram+) bakteriler: (1) yüksek G+C grubu (Actinomycetes, Mikobakteri, Mikrokok, digerleri) (2) düsük G+C grubu (Basil, Clostridia, Lactobacillus, Stafilokoklar, Streptokoklar, Mikoplazmalar); (2) Proteobakteriler, ör. Mor fotosentetik + fotosentetik olmayan Gram negatif bakteriler (çogu i“yaygin" Gram negatif bakterileri ihtiva etmektedir); (3) Siyanobakteriler, örnegin oksijenli fototroflar; (4) Spiroketler ve ilgili türler; (5) Planktomiler; (6) Bacteroides, Flavobacteria; (7) Klamidya; (8) Yesil kükürt bakterileri; (9) Yesil kükürt olmayan bakteriler (ayrica anaerobik fototroflar); (10) Radyo dirençli mikrokoklar ve akrabalari; (11) Thermotoga ve Thermosipho termofilleri. etmektedir. Gram-negatif bakteri Cinsleri arasinda, örnek olarak, Neisseria, Spirillum, Pasteurella, Brusella, Yersinia, Francisella, Haemophilus, Bordetella, Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Proteus, Vibrio, Pseudomonas, Bacteroides, Acetobacterium, Aerobacter, Agrobacterium, Azotobacter, Spirilla, Serratia, Vibrio, Rhizobium, Klamidya, Rickettsia, Treponema ve Fusobacterium yer almaktadir. etmektedir. Gram pozitif bakteri cinsleri arasinda örnek olarak Actinomyces, Basil, Clostridium, Corynebacterium, Erysipelothrix, Lactobacillus, Listerya, Mikobakteri, Miksokok, Nocardia, Stafilokok, Streptokok ve streptomiçes bulunur.

Bazi yönlerde mevcut tarifnameye ait mikroorganizmalar mantarlardir.

Bazi yönlerde rekombinant mikroorganizma, ökaryotik bir mikroorganizmadir. Bazi yönlerde ökaryotik mikroorganizma bir mayadir. Örnek teskil eden yönlerde maya, Yarrowia, Candida, Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Issatchenkia, Zygosaccharomyces, Debaryomyces, Schizosaccharomyces, Pachysolen, Cryptocoocus, Trichosporon, ve Rhodotorula ve Myxozyma'dan olusan grup arasindan seçilen bir cinsin bir üyesidir.

Bazi yönlerde rekombinant mikroorganizma, bir prokaryotik bir mikroorganizmadir. Örnek teskil eden yönlerde, prokaryotik mikroorganizma. Escherichia, Clostridium, Zymomonas, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthroiumbacter, Corvinebacter ve Brevibacterium'dan olusan grup arasindan seçilen bir cinsin bir üyesidir.

Bazi yönlerde, mevcut tarifnameye ait metotlarda kullanim için olan mikroorganizma, Yarrowia, Candida, Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Issatchenkia, Zygosaccharomyces, Debaryomyces, Schizosaccharomyces, Pachysolen, Cryptococcus, Trichosporon, Rhodotorula, Myxozyma, Escherichia, Clostridium, Zymomonas, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium ve Brevibacterium'dan olusan grup arasindan seçilebilir.

Bazi yönlerde, burada tarif edilen metotlardan kaynaklanan bir mikrop, asagidaki cinslerin herhangi birinden seçilen bir tür olabilir: Neisseria, Spirillum, Pasteurella, Brucella, Yersinia, Francisella, Haemophilus, Bordetella, Candida, Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Proteus, Vibrio, Pseudomonas, Bacteroides, Acetobacter, Aerobacter, Agrobacterium, Azotobacter, Spirilla, Serratia, Vibrio, Rhizobium, Chlamydia, Rickettsia, Treponema, Fusobacterium, Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Erysipelothrix, Lactobacillus, Listerya, Mikobakteri, Miksokok, Nocardia, lssatchenkia, Stafilokok, Streptokok, Streptomiçes, Saccharomyces, Pichia ve Aspergillus.

Bazi yönlerde mevcut tarifnameye ait metotlarda kullanim için olan mikroorganizmalar arasinda, Clostridium sp., Clostridium Ijungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ragsdalei, Eubacterium Iimosum, Butyribacterium methylotrophicum, Moorella thermoacetica, Corynebacterium glutamicum, Clostridium aceticum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Clostridium drakei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium formicoaceticum, Clostridium scatologenes, Moorella thermoautotrophica, Acetonema longum, Blautia producta, Clostridium glycolicum, Clostridium magnum, Candida krusei, Clostridium mayombei, Clostridium methoxybenzovorans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Oxobacter pfennigii, Thermoanaerobacter kivui, Sporomusa ovata, Thermoacetogenium phaeum, Acetobacterium carbinolicum, Issatchenkia orientalis, Sporomusa termitida, Moorella glycerini, Eubacterium aggregans, Treponema azotonutricium, Pichia kudriavzevii, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pseudomonas putida, Bacillus sp, Corynebacterium sp., Yarrowia Iipolytica, Scheffersomyces stipitis ve Terrisporobacter glycolicus yer almaktadir. yerine geçecek sekilde kullanilmaktadir ve endojen enzimleri eksprese etmek ya da asiri eksprese etmek Için, örnegin bir vektörde dahil olanlar, bir entegrasyon yapisinda, ya da endojen bir genin ifadesinde bir degisiklige sahip olanlar gibi heterolog enzimleri eksprese etmek için genetik olarak modifiye edilmis mikroorganizmalara atifta bulunur. "Degisiklik" ile, bir genin, ya da bir ya da daha fazla polipeptit ya da polipeptit alt birimini kodlayan bir RNA molekülünün ya da esdeger RNA moleküllerinin ekspresyonunun, ya da bir ya da daha fazla polipeptit ya da polipeptit alt biriminin aktivitesinin, yukari düzenlendigi ya da asagi düzenlendigi anlamina gelmekte olup, böylece ekspresyon, seviye ya da aktivite, degisikligin yoklugunda gözlemlenenden daha büyük ya da daha az olur. Örnek olarak, "degistirmek" terimi "engellemek" anlamina gelebilir, ancak "degistirmek" kelimesinin kullanimi bu tanimla sinirli degildir. "Rekombinant mikroorganizma" ve "rekombinant konak hücre" terimlerinin sadece belirli bir rekombinant mikroorganizmaya degil, ayni zamanda böyle bir mikroorganizmanin soyuna ya da potansiyel soyuna da atifta bulundugu anlasilmaktadir.

Sonraki kusaklarda ya mutasyon ya da çevresel etkiler nedeni ile belirli degisiklikler meydana gelebileceginden dolayi, bu tür bir döl, aslinda, ana hücre ile özdes olmayabilir, ancak yine de burada kullanildigi sekli ile terimin kapsami içinde yer alir.

Tarifnameye ait metotlarda kullanilan mikroorganizmalarin kültürlenmesi, mevcut tarifnameye ait mikroorganizmalar kullanilarak substratlarin kültürlenmesi ve fermente edilmesi için teknikte bilinen herhangi bir sayida islem kullanilarak gerçeklestirilebilir.

Fermentasyon, örnegin Sürekli Karistirilmis Tank Biyoreaktörü, Kabarcik Kolonlu Biyoreaktör, Hava Kaldirma Biyoreaktörü, Akiskan Yatakli Biyoreaktör, Paketlenmis Yatakli Biyoreaktör, Foto-Biyoreaktör, Hareketsizlestirilmis Hücre Reaktörü, Damlama Yatakli Reaktör, Hareketli Yatakli Biyofilm Reaktörü, Kabarcik Kolonlu, Gaz Kaldirma Fermentörü, Içi Bos Fiber Membran Biyoreaktör gibi Membran Reaktörler gibi herhangi bir uygun biyoreaktörde gerçeklestirilebilir. Bazi yönlerde, biyoreaktör, içinde mikroorganizmalarin kültürlendigi bir birinci, büyüme reaktörü ve büyüme reaktöründen gelen fermentasyon sivisinin kendisine beslendigi ve içinde fermentasyon ürününün çogunun üretildigi bir ikinci, fermantasyon reaktörü ihtiva etmektedir. Bazi yönlerde, biyoreaktör, mikroorganizmanin kültürlenmesini ve saglanan bu tür substratlar ve/veya besleme stoklari gibi karbon kaynaklarindan fermentasyon ürününün üretilmesini es zamanli olarak gerçeklestirir.

Bazi yönlerden, tarifname, bir 2,4-FDCA monomerini geri kazanma / izole etmenin bir metoduna yöneliktir. Bazi yönlerde tarifname, 4-HMF, 2,4-furandimetanol, furan-2,4- dikarbaldehit, 4-(hidroksimetil)furoik asit, 2-formilfuran-4-karboksilat, 4-formilfuran-2- karboksilat ya da 2,4-FDCA ve bunlarin herhangi bir kombinasyonunu geri kazanma / izole etmenin bir metoduna yöneliktir. Bazi yönlerde tarifname, bir 2,4-furandimetan0l, furan-2,4- dikarbaldehit, 4-(hidroksimetil)fur0ik asit, 2-f0rmiIfuran-4-karb0ksilat vei'veya 4-formilfuran-2- karboksilat monomer ya da polimeri geri kazanma /izole etmenin bir metoduna yöneliktir.

Bazi yönlerde tarifname, 4-HMF, 2,4-furandimetanol, furan-2,4-dikarbaldehit, 4- (hidroksimetillfuroik asit, 2-formilfuran-4-karboksilat, 4-formilfuran-2-karboksilat ya da 2,4- FDCA ve bunlarin herhangi bir kombinasyonunu geri kazanma / izole etmenin bir metoduna yöneliktir. Geri kazanma f toplama i' izolasyon, örnegin damitma, membran bazli ayirma gazi siyirma, çökeltme, solvent ekstraksiyonu ve genisletilmis yatak adsorpsiyonu gibi teknikte Besleme Stoku Bazi yönlerden, besleme stoku bir karbon kaynagi ihtiva etmektedir. Bazi yönlerde, karbon kaynagi sekerler, gliserol, alkoller, organik asitler, alkanlar, yag asitleri, Iignoselüloz, proteinler, karbon dioksit ve karbon monoksit arasindan seçilebilir. Bir yönde karbon kaynagi bir sekerdir. Bir yönde seker bir monosakkarittir. Bir yönde seker bir polisakkarittir. Bir yönde seker, glikoz ya da bunun glikoz oligomerleridir. Bir yönde, glikoz oligomerleri, fruktoz, sakaroz, nisasta, selobiyoz, maltoz, Iaktoz ve selülozdan seçilir. Bir yönde seker, bes karbonlu bir sekerdir. Bir yönde seker, alti karbonlu bir sekerdir. Bazi yönlerde, besleme stoku bir ya da daha fazla bes karbonlu sekeri ve/veya bir ya da daha fazla alti karbonlu sekeri ihtiva etmektedir. Bazi yönlerde, besleme stoku bir ya da daha fazla ksiloz, glikoz, arabinoz, galaktoz, maltoz, fruktoz, mannoz, sukroz ve/veya bunlarin kombinasyonlarini ihtiva etmektedir. Bazi yönlerde, besleme stoku ksiloz ve/veya glikozdan bir ya da daha fazlasini ihtiva etmektedir. Bazi yönlerde, besleme stoku arabinoz, galaktoz, maltoz, fruktoz, mannoz, sukroz vei'veya bunlarin kombinasyonlarinin bir ya da daha fazlasini ihtiva etmektedir.

Bazi yönlerde, mikroplar bir ya da daha fazla bes karbonlu sekeri (pentoz) ve/veya bir ya da daha fazla alti karbonlu sekeri (heksoz) kullanir. Bazi yönlerde, mikroplar ksiloz ve/veya glikozdan bir ya da daha fazlasini kullanir. Bazi yönlerde, mikroplar, arabinoz, galaktoz, maltoz, fruktoz, mannoz, sukroz ve/veya bunlarin kombinasyonlarinin bir ya da daha fazlasini kullanir. Bazi yönlerde, mikroplar ksiloz, glikoz, arabinoz, galaktoz, maltoz, fruktoz, mannoz, sukroz ve/veya bunlarin kombinasyonlarinin bir ya da daha fazlasini kullanmaktadir.

Bazi yönlerde, heksozlar, D-alloz, D-altroz, D-glukoz, D-mannoz, D-guloz, D-idoz, D- galaktoz, D-taloz, D-tagtoz, D-sorboz, D- fruktoz, D-psikoz ve teknikte bilinen diger heksozlar arasindan seçilebilir. Bazi yönlerde, pentozlar D-ksiloz, D-riboz, D-arabinoz, D-Iiksoz, D- ksilüloz, D-ribuloz ve teknikte bilinen diger pentozlar arasindan seçilebilir. Bazi yönlerde, heksozlar ve pentozlar, burada açiklanan heksozlarin ve pentozlarin herhangi birinin sola dogru dönen ya da saga dogru dönen enantiyomerinden seçilebilir.

Mikrobiyal Bilesimler Bazi yönlerde, tarifnameye ait mikroplar, mikrobiyal bilesimler halinde birlestirilir.

Bazi yönlerde mevcut tarifnameye ait mikrobiyal bilesimler katidir. Kati bilesimlerin kullanildigi durumlarda, asagidakiler dahil olmak üzere, ancak bunlar ile sinirli olmamak üzere bir ya da daha fazla tasiyici materyalin dahil edilmesi arzu edilebilir: örnegin silis, talk, kaolin, kireçtasi, tebesir, kil, dolomit, diyatomlu toprak gibi mineral topraklar; kalsiyum sülfat; magnezyum sülfat; magnezyum oksit; zeolitler, kalsiyum karbonat; magnezyum karbonat; trehaloz; kitosan; gomalak; albüminler; nisasta; yagsiz süt tozu; tatli peynir alti suyu tozu; maltodekstrin; Iaktoz; inülin; dekstroz; ve örnegin tahil unu, agaç kabugu unu, odun unu ve findik kabugu unu gibi bitkisel kaynakli ürünler.

Bazi yönlerde mevcut tarifnameye ait mikrobiyal bilesimler sividir. Daha baska yönlerde sivi, su ya da bir alkol ya da bir salin ya da karbonhidrat çözeltisi ihtiva edebilen bir çözücü ihtiva etmektedir. Bazi yönlerde, mevcut tarifnameye ait mikrobiyal bilesimler arasinda, baglayicilar örnegin polimerler, karboksimetilselüloz, nisasta, polivinil alkol ve benzerleri yer almaktadir.

Bazi yönlerde, mevcut tarifnameye ait mikrobiyal bilesimler, sakkaritler (örnegin monosakaritler, disakaritler, trisakaritler, polisakaritler, oligosakaritler ve benzerleri), polimerik sakkaritler, Iipitler, polimerik Iipitler, Iipopolisakaritler, proteinler, polimerik proteinler, Iipoproteinler, nükleik asitler, nükleik asit polimerleri, silika, inorganik tuzlar ve bunlarin kombinasyonlarini ihtiva etmektedir. Daha baska bir yönde mikrobiyal bilesimler, agar, agaroz, gelrit, jellan zamki ve benzerlerinin polimerlerini ihtiva etmektedir. Bazi yönlerde, mikrobiyal bilesimler plastik kapsüller, emülsiyonlar (örnegin su ve yag), zarlar ve yapay zarlar ihtiva etmektedir. Bazi yönlerde, emülsiyonlar ya da bagli polimer çözeltileri, mevcut tarifnameye ait mikrobiyal bilesimleri ihtiva etmektedir. Bakiniz Harel ve Bennett (ABD Patenti 8,460,726 82 sayili belge).

Bazi yönlerde, mevcut tarifnameye ait mikrobiyal bilesimler, bir kati formda (örnegin, dagilmis liyofilize sporlar) ya da bir sivi formda (bir depolama ortaminda serpistirilmis mikroplar) meydana gelir. Bazi yönlerde, mevcut tarifnameye ait mikrobiyal bilesimler, kullanimdan hemen önce bir süspansiyon olusturmak için bir siviya kuru biçimde ilave edilir.

Biyosentez Ürünleri Üretim Metotlari Mevcut tarifname, bir rekombinant mikroorganizma kullanilarak bir ya da daha fazla biyosentez ürününün üretilmesine yönelik bir metot saglar. Biyosentez ürünleri sunlari ihtiva etmektedir: 4-HMF, 2,4-furandimethanol, furan-2,4-dicarbaldehid, 4-(hidroksimetil)furoik asit, 2-formiIfuran-4-karb0ksilat, 4-f0rmilfuran-2-karboksilat ve 2,4-FDCA. Bir yapilanmada metot, rekombinant mikroorganizmanin bir kültür ortaminda yetistirilmesini ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada kültür ortami, rekombinant mikroorganizmanin bir ya da daha fazla biyosentez ürünü üretmek için kullanabilecegi bir karbon kaynagi ihtiva eden bir besleme stoku ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada, kültür ortamindaki karbon kaynagi, bir heksoz, bir pentoz ya da gliserol ihtiva eden grup arasindan seçilir. Belli bazi yapilanmalarda karbon kaynagi gliseroldür. Mevcut tarifnameye ait bazi yapilanmalar, bir karbon besleme stokunun bir ya da daha fazla biyosentez ürününe biyosentetik dönüsümünü toplu olarak detaylandiran SEKIL 1, SEKIL 2 ve SEKIL 3'te sunulmaktadir.

Mevcut tarifname, bir eksojen karbon kaynagi ihtiva eden bir besleme stokundan 4-HMF, 2,4-furandimetanol, turan-2,4-dikarbaldehit, 4-(hidroksimetil)furoik asit, 2-formilfuran-4- karboksilat, 4-formilfuran-2-karboksilat ve 2,4-FDCA üreten bir rekombinant mikroorganizma üretmeye yönelik bir metot saglamaktadir. Bir yapilanmada metot, bir karbon kaynagini 4- HMF, 2,4-furandimetanol, furan-2,4-dikarbaldehit, 4-(hidr0ksimetil)furoik asit, 2-formilfuran-4- karboksilat, 4-formilfuran-2-karboksilat ve 2,4-FDCA'ya dönüstürebilen nitelikte endojen ve/veya eksojen nükleik asit moleküllerinin rekombinant mikroorganizma içine dahil edilmesini ve/veya onda asiri eksprese edilmesini ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada karbon kaynagi, gliserol ve/veya bir monosakaritler ihtiva edebilir.

Bir yapilanmada endojen ve/veya eksojen nükleik asit molekülleri, gliserolü ya da bir monosakkariti gliseraldehit 3-fosfat (G3P) haline dönüstürür. G3P, yaygin bir dogal ara metabolittir. Bazi yapilanmalarda glikoliz yolu vasitasi ile glukozdan ya da pentoz fosfat yolu ile ksilozdan ya da gliserolden üretilebilir. Bir yapilanmada, 4-HMF, 2,4-furandimetanol, turan-2,4-dikarbaldehit, 4-(hidroksimetil)furoik asit, 2-formilfuran-4-karboksilat, 4-formilfuran- 2-karboksilat ve 2,4-FDCA üretebilen nitelikte rekombinant mikroorganizma, bir heksoz, bir pentoz ya da gliserol ihtiva eden bir karbon kaynagi kullanmaktadir. Belli bazi yapilanmalarda karbon kaynagi gliseroldür.

Bir yapilanmada mevcut tarifname, 2,4-FDCA üretme metotlarini ve 2,4-FDCA üretmeye yönelik çoklu adimlari ve süreçleri tasarlar. Bazi yapilanmalarda mevcut tarifname, 2,4- FDCA yapma sürecinde tarif edilmis olan, 4-HMF, 2,4-furandimetanol, iman-2,4- dikarbaldehit, 4-(hidroksimetil)furoik asit, 2-f0rmilfuran-4-karboksilat ve 4-formilfuran-2- karboksilatin bir ya da daha fazlasinin üretilmesine yönelik ayri ayri metotlari ihtiva etmektedir.

Bir yapilanmada metoda ait rekombinant mikroorganizmalar, Clostridium sp., Clostridium Butyribacterium methylotrophicum, Moorella thermoacetica, Corynebacterium glutamicum, Clostridium aceticum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Clostridium drakei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium formicoaceticum, Clostridium scatologenes, Moorella thermoautotrophica, Acetonema Iongumi Blautia producta, Clostridium glycolicum, Clostridium magnum, Candida krusei, Clostridium mayombei, Clostridium methoxybenzovorans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Oxobacter pfennigii, Thermoanaerobacter kivui, Sporomusa ovata, Thermoacetogenium phaeum, Acetobacterium carbinolicum, Issatchenkia orientalis, Sporomusa termitida, Moorella glycerini, Eubacterium aggregans, Treponema azotonutricium, Pichia kudriavzevii, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pseudomonas putida, Bacillus sp, Corynebacterium sp., Yarrowia Iipolytica, Scheffersomyces stipitis ve Terrisporobacter glycolicus'dan olusan grup arasindan seçilen bir ebeveyn mikroorganizmadan türetilir.

Bir yapilanmada mevcut tarifname, bir ya da daha fazla karbon kaynaginin gliseraldehit 3- fosfata (GBP) dönüstürülmesini; G3P'nin (5-formilfuran-3-il)metil fosfata dönüstürülmesi (Adim A); (5-formilfuran-3-il)metil fosfatin 4-hidroksimetilfurfural (4-HMF)'ye dönüstürülmesi (Adim B) ihtiva etmektedir.

Bir yapilanmada tarifname, bir karbon kaynagini gliseraldehit 3-fosfata (GBP) dönüstürebilen nitelikte bir endojen ve/veya eksojen nükleik asit moleküllerini ihtiva eden burada açiklanan yapilanmalardan herhangi birine ait bir rekombinant mikroorganizma üretmeye yöneliktir. Bir yapilanmada gliserol, bir gliserol kinazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü tarafindan gliserol-S-fosfata dönüstürülür. Bir yapilanmada gliserol-3-fosfat, bir gliserol-S-fosfat dehidrojenazi kodlayan en az bir endojen ya da ekzojen nükleik asit molekülü tarafindan dihidroksiaseton fosfata (DHAP) dönüstürülür. Bir yapilanmada gliserol, bir gliserol dehidrejenazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ile glisdihidroksiasetona dönüstürülür. Bir yapilanmada dihidroksiaseton, bir dihidroksiaseton kinazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü tarafindan dihidroksiaseton fosfata (DHAP) dönüstürülür. Bir yapilanmada DHAP, bir trioz fosfat izomerazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü tarafindan GSP'ye dönüstürülür. Bkz. Zhang ve ark. (2010).

Bir yapilanmada tarifname, GBP'nin (5-formilfuran-3-il)metil fosfat'a dönüsümünü katalize eden bir (5-formilfuran-3-il)metiI fosfat sentazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva eden burada açiklanan yapilanmalarin herhangi birine ait bir rekombinant mikroorganizma üretmenin bir metoduna yöneliktir. Bir yapilanmada (5- formilfuran-S-il)metil fosfat sentaz, EC numarasi 4.2.3.153 olarak siniflandirilir. Bazi yapilanmalarda EC 4.2.3.153 (5-f0rmilfuran-S-il)metil fosfat sentaz, man geninden türetilebilir. Bazi yapilanmalarda man, Methanocaldococcus jannaschii'den türetilebilir. Bazi yapilanmalarda (5-formilfuran-3-il)metil fosfat sentaz, Tablo 1'de listelenen enzim adaylarindan türetilebilir. Bazi yapilanmalarda (5-formilfuran-3-il)metil fosfat sentaz, Tablo 1'de listelenen enzimlere homolog ya da benzerdir. Bazi yapilanmalarda, bir (5-formilfuran- 3-il)metil fosfat sentaz enzimi, katalitik etkinligini, belirgin sekilde kcat'i gelistirmek üzere Bir yapilanmada tarifname, (5-formilfuran-3-il)metil fosfat'in (4-HMF)'ye dönüsümünü katalize eden bir fosfatazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva eden burada açiklanan yapilanmalarin herhangi birine ait bir rekombinant mikroorganizma üretmenin bir metoduna yöneliktir. Bir yapilanmada fosfataz, haloasit dehalojenaz olarak siniflandirilir (Koonin ve digerleri, J. lVIoI. Biol. 244(1). 1994). Bazi yönlerde b reaksiyonunun fosfatazi, konakçi için endojendir (Of'iley ve digerleri Curr. Gen. 65. 2019). Bazi yönlerde konakçiya endojen olan fosfataz enzimi asiri eksprese edilir. Bazi durumlarda, arzu edilen reaksiyonu gerçeklestirebilen bir heterolog fosfataz kullanilir ve bir alkalin fosfataz, asit fosfataz, fruktoz-bisfosfataz, seker-fosfataz ya da seker-terminal-fosfataz arasindan seçilir.

Bazi yapilanmalarda fosfataz, Tablo 2'de listelenen enzim adaylarindan türetilebilir. Bazi yapilanmalarda fosfataz, Tablo 2'de listelenen enzimlere homolog ya da benzerdir. Bazi yapilanmalarda, bir fosfataz enzimi, (5-formilfuran-3-iI)metil fosfatin (4-HMF)'ye dönüstürülmesine yönelik katalitik etkinligini ve/veya özgüllügünü gelistirmek üzere gelistirilir ya da tasarlanir.

Buna göre de bir yapilanmada tarifname, bir karbon kaynagini gliseraldehit 3-fosfata (G3P) dönüstürebilen nitelikte endojen ve/veya eksojen nükleik asit moleküllerini; G3P'nin (5- formilfuran-B-il)metil fosfata dönüsümünü katalize eden bir (5-formilfuran-3-il)metil fosfat sentazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; (5-formilfuran-3- il)metil fosfatin 4-HIVIF'ye dönüsümünü katalize eden bir fosfatazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülünü ihtiva eden bir rekombinant mikroorganizma üretmenin bir metoduna yöneliktir. 2 4-FDCA Bir yapilanmada, tarifnameye ait metotlar, çesitli sayida enzimatik olarak katalize edilmis ardisik adim yolu ile GBP'yi 2,4-FDCA'ya dönüstürür. Bir yapilanmada mevcut tarifname, bir ya da daha fazla karbon kaynaginin gliseraldehit 3-fosfata (G3P) dönüstürülmesini; G3P'nin (5-formilfuran-S-il)metil fosfata dönüstürülmesi (Adim A); (5-f0rmilfuran-3-il)metil fosfatin 4- hidroksimetilfurfural (4-HMF)'ye dönüstürülmesi (Adim 8); 4-HMF'yi dogrudan ya da 4- HMF'yi turan-2,4-dikarbaldehite (Adim D) ve/veya 4-(hidr0ksimetillfur0ik aside dönüstürülmesi (Adim E) gibi ara ürünlerin üretimi yolu ile 2,4 FDCA'ya dönüstüriümesi (Adim C); furan-2,4-dikarbaldehitin 4-f0rmilfuran-2-karboksilata (Adim G) vei'veya 2- formilfuran-4-karboksilata (Adim F) dönüstürülmesi ve/veya 4-(hidroksimetil)furoik asidin 4- formilfuran-2-karb0ksilata (Adim H) dönüstürülmesi ; 4-f0rmilfuran-2-karb0ksilatin 2,4- FDCA'ya dönüstürülmesi (Adim J) ve/veya 2-f0rmilfuran-4-karboksilatin 2,4-FDCA'ya dönüstürülmesi (Adim I) ihtiva etmektedir. Daha baska bir yapilanmada bir ya da daha fazla karbon kaynagi, gliserol ya da bir monosakarit ihtiva edebilir.

Buna göre de bir yapilanmada, bir karbon kaynagini gliseraldehit 3-fosfata (G3P) dönüstürebilen nitelikte bir endojen ve/veya eksojen nükleik asit molekülü; G3P'nin (5- t0rmilfuran-3-il)metil fosfata dönüsümünü katalize eden bir (5-f0rmilfuran-3-il)metil fosfat sentazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; (5-f0rmilfuran-3- il)metil fosfatin (4-HMF)'ye dönüsümünü katalize eden bir fosfatazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; 4-HMF'nIn dogrudan ya dafuran-2,4- dikarbaldehit vei'veya 4-(hidr0ksimetil)fur0ik asit gibi ara ürünlerin üretimi yolu ile 2,4- FDCA'ya dönüsümünü katalize eden bir dehidrojenazi ya da bir oksidazi ya da bir peroksijenazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; furan-2,4- dikarbaldehitin 4-f0rmilfuran-2-karb0ksilata ve/veya 2-formilfuran-4-karb0ksilat'a dönüsümünü ve/veya 4-(hidroksimetil)furoik asidin 4-f0rmilfuran-2-karboksilat'a dönüsümünü katalize eden bir dehidrojenazi ya da bir oksidazi ya da bir peroksijenazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; 2-formilfuran-4-karb0ksiIatin 2,4-FDCA'ya Velveya 4-formilfuran-2-karb0ksilatin 2,4-FDCA'ya dönüsümünü katalize eden bir dehidrojenazi ya da bir oksidazi ya da bir peroksijenazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva eden bir rekombinant mikroorganizmayi üretmenin bir metodu burada saglanmaktadir.

Bir yapilanmada, burada açiklanan metoda ait yapilanmalardan herhangi birine ait rekombinant mikroorganizma, bir karbon kaynagini gliseraldehit 3-fosfata (GSP) dönüstürebilen nitelikte bir endojen velveya eksojen nükleik asit moleküllerini ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada gliserol, bir gliserol kinazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü tarafindan gliserol-S-fosfata dönüstürülür. Bir yapilanmada gliserol-3-fosfat, bir gliserol-3-fosfat dehidrojenazi kodlayan en az bir endojen ya da ekzojen nükleik asit molekülü tarafindan dihidroksiaseton fosfata (DHAP) dönüstürülür. Bir yapilanmada gliserol, bir gliserol dehidrejenazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ile glisdihidroksiasetona dönüstürülür. Bir yapilanmada dihidroksiaseton, bir dihidroksiaseton kinazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü tarafindan dihidroksiaseton fosfata (DHAP) dönüstürülür. Bir yapilanmada DHAP, bir trioz fosfat izomerazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü tarafindan GSP'ye dönüstürülür.

Bir yapilanmada, burada açiklanan metoda ait yapilanmalarin herhangi birine ait rekombinant mikroorganizma, G3P'nin (5-formilfuran-3-il)metil fosfat'a dönüsümünü katalize eden bir (5-f0rmilfuran-3-il)metiI fosfat sentazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada (5-formilfuran-S-il)metil fosfat formilfuran-S-il)metil fosfat sentaz, man geninden türetilebilir. Bazi yapilanmalarda man, Methanocaldococcus jannaschii'den türetilebilir. Bazi yapilanmalarda EC 4.2.3.153, man'nin homologlarindan türetilebilir.

Bir yapilanmada, burada açiklanan metoda ait yapilanmalarin herhangi birine ait rekombinant mikroorganizma, (5-f0rmilfuran-3-il)metil fosfatin (4-HMF)'ye dönüsümünü katalize eden fosfatazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada fosfataz, EC numarasi 3.1.3 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, fosfataz EC numarasi 3.1.3, bir alkalin fosfataz (EC numarasi 3.1.3.1), asit fosfataz (EC numarasi 3.1.3.2), fruktoz-bisfosfataz (EC numarasi 3.1.3.11), seker-fosfataz seçilir. Bir yapilanmada kinaz, EC numarasi 2.7.1 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, kinaz EC numarasi 2.7.1, fruktokinaz (EC numarasi 2.7.1.4), ribokinaz (EC numarasi ribulokinaz (EC numarasi 2.7.1.47) arasindan seçilmektedir.

Bir yapilanmada, burada açiklanan metoda ait yapilanmalarin herhangi birine ait rekombinant mikroorganizma, 4-HMF'nin turan-2,4-dikarbaldehite dönüsümünü katalize eden bir dehidrojenaz ya da bir oksidaz ya da bir peroksijenaz kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, EC numarasi 1.1.1 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, EC numarasi 1.1.1 olan dehidrojenaz, alkol dehidrojenaz (EC numarasi (EC numarasi numarasi .arasindan seçilmektedir. Bir yapilanmada oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, 5-(hidroksimetilfurfural oksidazdir (EC numarasi yapilanmalarda hmfH, Methylovorus sp. MP688 ya da Cupriavidus basilensis'den türetilebilir.

Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, ariI-alkol oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.7). Bir yapilanmada peroksijenaz, EC numarasi 1.11.2 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, peroksijenaz EC numarasi 1.11.2, spesifik olmayan peroksijenazdir (EC numarasi 1.11.21).

Bir yapilanmada, burada açiklanan metoda ait yapilanmalarin herhangi birine ait rekombinant mikroorganizma, 4-HMF'nin 4-(hidroksimetil)furoik aside dönüsümünü katalize eden bir dehidrojenaz ya da bir oksidaz ya da bir peroksijenaz kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, EC numarasi 1.2.1 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada dehidrojenaz EC numarasi 1.2.1, aldehit dehidrojenaz (NAD+) (EC numarasi (EC numarasi ya da 4-(y- glutamilamino)bütanal dehidrojenaz (EC numarasi 1.2.1.99) arasindan seçilir. Bir yapilanmada oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, 5-(hidroksimetilfurfural oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.47). Bazi yapilanmalarda EC 1.1.3.47 oksidaz, hmfH geninden türetilebilir. Bazi yapilanmalarda hmfH, Methylovorus sp. MP688 ya da Cupriavidus basilensis'den türetilebilir. Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, ariI-alkol oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.7). Bir yapilanmada peroksijenaz, EC numarasi 1.11.2 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, peroksijenaz EC numarasi 1.11.2, spesifik olmayan peroksijenazdir (EC numarasi 1.11.2.1).

Bir yapilanmada, burada açiklanan metoda ait yapilanmalarin herhangi birine ait rekombinant mikroorganizma, turan-2,4-dikarbaldehitin 4-f0rmilfuran-2-karboksilata ve/veya 2-f0rmiIfuran-4-karboksilata dönüstürülmesini katalize eden bir dehidrojenaz ya da bir oksidaz ya da bir peroksijenaz kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, EC numarasi 1.2.1 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada dehidrojenaz EC numarasi 1.2.1, aldehit dehidrojenaz (NAD+) (EC numarasi ya da aldehit dehidrojenaz [NAD(P)+] (EC numarasi 1.2.1.5) ya da 4-(y- glutamilamino)bütanal dehidrojenaz (EC numarasi 1.2.1.99) arasindan seçilir. Bir yapilanmada oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, 5-(hidroksimetilfurfural oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.47). Bazi yapilanmalarda EC 1.1.3.47 oksidaz, hmfH geninden türetilebilir. Bazi yapilanmalarda hmfH, Methylovorus sp. MP688 ya da Cupriavidus basilensis'den türetilebilir. Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, ariI-alkol oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.7). Bir yapilanmada peroksijenaz, EC numarasi 1112 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, peroksijenaz EC numarasi 1.11.2, spesifik olmayan peroksijenazdir (EC numarasi 1.11.2.1).

Bir yapilanmada, burada açiklanan metoda ait yapilanmalarin herhangi birine ait rekombinant mikroorganizma, 4-(hidroksimetil)furoik asidin 4-formilfuran-2-karboksilata dönüsümünü katalize eden bir dehidrojenaz ya da bir oksidaz ya da bir peroksijenaz kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, EC numarasi 1.1.1 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, EC numarasi 1.1.1 olan dehidrojenaz, alkol dehidrojenaz (EC numarasi 1.1.1.1) ya da alkol dehidrojenaz (NADP+) (EC numarasi 1.1.1.2) ya da D-ksiloz redüktaz (EC numarasi (NADP+) (EC numarasi 1.1.1.91).arasindan seçilmektedir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, EC numarasi 1.1.1. Bir yapilanmada oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, 5-(hidroksimetilfurfural oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.47). Bazi yapilanmalarda EC 1.1.3.4? oksidaz, hmfH geninden türetilebilir. Bazi yapilanmalarda hmfH, Methylovorus sp. MP688 ya da Cupriavidus basilensis'den türetilebilir.

Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, aril-alkol oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.7). Bir yapilanmada peroksijenaz, EC numarasi 1.11.2 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, peroksijenaz EC numarasi 1.11.2, spesifik olmayan peroksijenazdir (EC numarasi 1.11.2.1).

Bir yapilanmada, burada açiklanan metoda ait yapilanmalarin herhangi birine ait rekombinant mikroorganizma, 4-formilfuran-2-karb0ksilat ve/veya 2-formilfuran-4- karboksilatin 2,4-FDCA'ya dönüstürülmesini katalize eden bir dehidrojenaz ya da bir oksidaz ya da bir peroksijenaz kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, EC numarasi 1.1.1 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, EC numarasi 1.1.1 olan dehidrojenaz, alkol dehidrojenaz (EC numarasi ya da D-ksiloz redüktaz alkol dehidrojenaz (NADP+) (EC numarasi 1.1.1.91).arasindan seçilmektedir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, Tablo 3'te listelenen enzim adaylarindan türetilebilir. Bazi yapilanmalarda dehidrojenazlar, Tablo 3'te listelenen enzimlere homolog ya da benzerdir.

Bazi yapilanmalarda, bir dehidrojenaz, kendisinin arzu edilen substratina karsi kendi katalitik etkinligini gelistirmek için gelistirilir ya da tasarlanir.

Bir yapilanmada oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, 5-(hidroksimetilfurfural oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.47). Bazi yapilanmalarda HMF oksidaz, hmfH geninden türetilebilir. Bazi yapilanmalarda hmfH oksidaz, Methylovorus sp. MP688 ya da Cupriavidus basilensis'den türetilebilir. Bakiniz Koopman ve ark. (. Bir yapilanmada, HMF oksidaz EC yapilanmada peroksijenaz, EC numarasi 1.11.2 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, peroksijenaz EC numarasi 1.11.2, spesifik olmayan peroksijenazdir (EC numarasi 1.11.2.1).

Bakiniz Cario ve ark. (2015). Bazi yapilanmalarda HMF oksidaz, Tablo 4'te listelenen enzim adaylarindan türetilebilir. Bazi yapilanmalarda HMF oksidaz, Tablo 4'te listelenen enzimlere homolog ya da benzerdir. Bazi düzeneklerde HMF oksidaz enzimi, katalitik etkinligini gelistirmek için gelistirilir ya da tasarlanir. 2,4-furandimetanol Bir yapilanmada mevcut tarifname, bir karbon kaynagindan 2,4-furandimetan0l üretebilen nitelikte bir rekombinant mikroorganizma üretmenin bir metoduna yöneliktir. Mevcut tarifnameye ait bazi yapilanmalar, bir karbon besleme stokunun 2,4-furandimetanol'e biyosentetik dönüsümünü toplu olarak detaylandiran SEKIL 1, SEKIL 2, ve SEKIL 3'te sunulmaktadir.

Bir yapilanmada, 4-HlVlF'den 2,4-furandimetanolün biyolojik üretimi, mikroorganizma tarafindan kodlanan bir dehidrojenaz tarafindan katalize edilir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, EC numarasi 1.1.1 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, dehidrojenaz EC numarasi 1.1.1, alkol dehidrojenazdan (EC numarasi 1.1.1.1) seçilir. Bir yapilanmada, dehidrojenaz EC numarasi seçilir. Bir yapilanmada, dehidrojenaz EC numarasi 1.1.1, D-ksiloz redüktazdan (EC numarasi 1.1.1.90) seçilir. Bir yapilanmada, dehidrojenaz EC numarasi 1.1.1, ariI-alkol dehidrojenazdan (EC numarasi 1.1.1.91) seçilir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, Tablo 5'te listelenen enzim adaylarindan türetilebilir. Bazi yapilanmalarda dehidrojenazlar, Tablo 5'te listelenen enzimlere homolog ya da benzerdir. Bazi yapilanmalarda, bir dehidrojenaz, 4- HMF'nin 2,4-furandimetanole indirgenmesi için katalitik etkinligini iyilestirmek üzere gelistirilir ya da tasarlanir.

Bazi yönlerde, 2,4-furandimetanol, mikroplarin yoklugunda enzimatik olarak üretilir. Bazi yönlerde, 2,4-furandimetanol bir ya da daha fazla kapta enzimatik olarak üretilir. Bazi yönlerden, bir ya da daha fazla kap, büyük ölçüde mikrop ihtiva etmez. Bazi yönlerde, 2,4- furandimetanol'ün enzimatik üretimi, rekombinant mikroorganizmalarin kullanildigi metotlarda tarif edildigi gibi ayni adim adim sekilde, ancak mikroorganizmalardan önemli ölçüde arinmis ya da mikroorganizmalarin yoklugunda gerçeklestirilir. Bazi yönlerde, 2,4- furandimetanol'ün enzimatik üretiminde kullanilan enzimler, mikroplardan, rekombinant ya da baska bir sekilde izole edilir ve 2,4-furandimetan0lü üretmek için kullanilan ara ürünlerin adim adim üretimi için ilgili substratlarina saglanir. Bazi yönlerde, metotlarin bir ya da daha fazla adimi ayni kapta gerçeklestirilir. Bazi yönlerde, burada tarif edilen ayri ayri metot adimlarinin bir sonucu olarak arzu edilen ürün üretildigi zaman, ürün izole edilir ve saflastirilir ve daha sonra 2,4-furandimetanol üretme metodunun bir sonraki adiminda substrat olarak kullanilir.

Furan-2 4-dikarbaldehit Bir yapilanmada mevcut tarifname, bir karbon kaynagindan turan-2,4-dikarbaldehit üretebilen nitelikte bir rekombinant mikroorganizma üretmenin bir metoduna yöneliktir.

Mevcut tarifnameye ait bazi yapilanmalar, bir karbon besleme stokunun furan-2,4- dikarbaldehite biyosentetik dönüsümünü toplu olarak detaylandiran SEKIL 1, SEKIL 2 ve SEKIL 3'te sunulmaktadir.

Bir yapilanmada, Sekil 2'deki D adimi, bir substrat olarak 4-HMF kullanan tek adimli bir reaksiyondur. Bir yapilanmada, 4-HMF'den turan-2,4-dikarbaldehitin biyolojik üretimi, EC katalize edilir.

Bir yapilanmada, burada açiklanan yapilanmalarin herhangi birine ait rekombinant mikroorganizma, 4-HMF'nin furan-2,4-dikarbaldehite dönüsümünü katalize eden bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenaz kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, EC numarasi 1.1.1 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, EC numarasi 1.1.1 olan dehidrojenaz, alkol dehidrojenaz (EC numarasi (EC numarasi numarasi .arasindan seçilmektedir. Bir yapilanmada oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, 5-(hidr0ksimetilfurfural oksidazdir (EC numarasi yapilanmalarda hmfH, Methylovorus sp. MP688 ya da Cupriavidus basilensis'den türetilebilir.

Bakiniz Dijkman ve Fraaije (2014) ve Koopman ve ark. (2010). Bir yapilanmada, oksidaz EC yapilanmada peroksijenaz, EC numarasi 1.11.2 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, peroksijenaz EC numarasi 1.11.2, spesifik olmayan peroksijenazdir (EC numarasi 1.11.21).

Bakiniz Carro ve ark. (2015).

Bazi yönlerde, furan-2,4-dikarbaldehit, mikroplarin yoklugunda enzimatik olarak üretilir. Bazi yönlerde, furan-2,4-dikarbaldehit bir ya da daha fazla kapta enzimatik olarak üretilir. Bazi yönlerden, bir ya da daha fazla kap, büyük ölçüde mikrop ihtiva etmez. Bazi yönlerde, furan- 2,4-dikarbaldehitin enzimatik üretimi, rekombinant mikroorganizmalarin kullanildigi metotlarda tarif edildigi gibi ayni adim adim sekilde, ancak mikroorganizmalardan önemli ölçüde arinmis ya da mikroorganizmalarin yoklugunda gerçeklestirilir. Bazi yönlerde, furan- 2,4-dikarbaldehitin enzimatik üretiminde kullanilan enzimler, mikroplardan, rekombinant ya da baska bir sekilde izole edilir ve furan-2,4-dikarbaldehiti üretmek için kullanilan ara ürünlerin adim adim üretimi için ilgili substratlarina saglanir. Bazi yönlerde, metotlarin bir ya da daha fazla adimi ayni kapta gerçeklestirilir. Bazi yönlerde, burada tarif edilen ayri ayri metot adimlarinin bir sonucu olarak arzu edilen ürün üretildigi zaman, ürün izole edilir ve saflastirilir ve daha sonra furan-2,4-dikarbaldehit üretme metodunun bir sonraki adiminda substrat olarak kullanilir. 4-(hidr0ksimetil)fur0ik asit Bir yapilanmada mevcut tarifname, bir karbon kaynagindan 4-(hidroksimetil)furoik asit üretebilen nitelikte bir rekombinant mikroorganizma üretmenin bir metoduna yöneliktir.

Mevcut tarifnameye ait bazi yapilanmalar, bir karbon besleme stokunun 4- (hidroksimetil)furoik aside biyosentetik dönüsümünü toplu olarak detaylandiran SEKIL 1, SEKIL 2, ve SEKIL 3'te sunulmaktadir.

Bir yapilanmada, Sekil 2'deki E adimi, bir substrat olarak 4-HMF kullanan tek adimli bir reaksiyondur. Bir yapilanmada, 4-HMF'den 4-(hidroksimetil)fur0ik asidin biyolojik üretimi, EC katalize edilir.

Bir yapilanmada, burada açiklanan yapilanmalarin herhangi birine ait rekombinant mikroorganizma, 4-HMF'nin 4-(hidroksimetil)furoik asiDe dönüsümünü katalize eden bir dehidrojenaz ya da bir oksidaz ya da bir peroksijenaz kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, EC numarasi 1.2.1 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada dehidrojenaz EC numarasi 1.2.1, aldehit dehidrojenaz (NAD+) (EC numarasi (EC numarasi ya da 4-(y- glutamilamin0)bütanal dehidrojenaz (EC numarasi 1.2.1.99) arasindan seçilir. Bir yapilanmada oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, 5-(hidroksimetilfurfural oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.47). Bazi yapilanmalarda EC 1.1.3.4? oksidaz, hmfH geninden türetilebilir. Bazi yapilanmalarda hmfH, Methylovorus sp. MP688 ya da Cupriavidus basilensis'den türetilebilir. Bir yapilanmada. oksidaz EC numarasi 1.1.3, ariI-alkol oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.7). Bir yapilanmada peroksijenaz, EC numarasi 1.11.2 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, peroksijenaz EC numarasi 1.11.2, spesifik olmayan peroksijenazdir (EC numarasi 1.11.2.1).

Bazi yönlerde 4-(hidroksimetil)fur0ik asit mikroplarin yoklugunda enzimatik olarak üretilir.

Bazi yönlerde, 4-(hidroksimetil)furoik asit, bir ya da daha fazla kapta enzimatik olarak üretilir.

Bazi yönlerden, bir ya da daha fazla kap, büyük ölçüde mikrop ihtiva etmez. Bazi yönlerde, 4-(hidroksimetil)furoik asidin enzimatik üretimi, rekombinant mikroorganizmalarin kullanildigi metotlarda tarif edildigi gibi ayni adim adim sekilde, ancak mikroorganizmalardan önemli ölçüde arinmis ya da mikroorganizmalarin yoklugunda gerçeklestirilir. Bazi yönlerde, 4- (hidroksimetil)furoik asidin enzimatik üretiminde kullanilan enzimler, mikroplardan, rekombinant ya da baska bir sekilde izole edilir ve 4-(hidroksimetil)fur0ik asidi üretmek için kullanilan ara ürünlerin adim adim üretimi için ilgili substratlarina saglanir. Bazi yönlerde, metotlarin bir ya da daha fazla adimi ayni kapta gerçeklestirilir. Bazi yönlerde, burada tarif edilen ayri ayri metot adimlarinin bir sonucu olarak arzu edilen ürün üretildigi zaman, ürün izole edilir ve saflastirilir ve daha sonra 4-(hidroksimetil)fur0ik asit üretme metodunun bir sonraki adiminda substrat olarak kullanilir. 2-f0rmiIfuran-4-karb0ksilat Bir yapilanmada mevcut tarifname, bir karbon kaynagindan 2-formilfuran-4-karboksilat üretebilen nitelikte bir rekombinant mikroorganizma üretmenin bir metoduna yöneliktir.

Mevcut tarifnameye ait bazi yapilanmalar, bir karbon besleme stokunun 2-f0rmilfuran-4- karboksilata biyosentetik dönüsümünü toplu olarak detaylandiran SEKIL 1, SEKIL 2 ve SEKIL 3'te sunulmaktadir.

Bir yapilanmada, Sekil 2'deki F adimi, bir substrat olarak turan-2,4-dikarbaldehit kullanan tek adimli bir reaksiyondur. Bir yapilanmada, furan-2,4-dikarbaldehitten 2-formilfuran-4- ya da daha fazla enzim tarafindan katalize edilir.

Bir yapilanmada, burada açiklanan yapilanmalarin herhangi birine ait rekombinant mikroorganizma, furan-2,4-dikarbaldehitin 2-f0rmiIfuran-4-karb0ksilata dönüstürülmesini katalize eden bir dehidrojenaz ya da bir oksidaz ya da bir peroksijenaz kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, EC numarasi 1.2.1 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada dehidrojenaz EC numarasi ya da aldehit dehidrojenaz (NADP+) (EC numarasi +] (EC arasindan seçilir. Bir yapilanmada oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, 5-(hidr0ksimetilfurfural oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.47). Bazi yapilanmalarda EC 1.1.3.4? oksidaz, hmfH geninden türetilebilir. Bazi yapilanmalarda hmfH, Methylovorus sp. MP688 ya da Cupriavidus basilensis'den türetilebilir.

Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, ariI-alkol oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.7). Bir yapilanmada peroksijenaz, EC numarasi 1.11.2 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, peroksijenaz EC numarasi 1.11.2, spesifik olmayan peroksijenazdir (EC numarasi 1.11.21).

Bazi yönlerde, 2-f0rmiIfuran-4-karb0ksilat, mikroplarin yoklugunda enzimatik olarak üretilir.

Bazi yönlerde, 2-f0rmiIfuran-4-karb0ksilat bir ya da daha fazla kapta enzimatik olarak üretilir.

Bazi yönlerden, bir ya da daha fazla kap, büyük ölçüde mikrop ihtiva etmez. Bazi yönlerde, 2-formilfuran-4-karboksilat'in enzimatik üretimi, rekombinant mikroorganizmalarin kullanildigi metotlarda tarif edildigi gibi ayni adim adim sekilde, ancak mikroorganizmalardan önemli ölçüde arinmis ya da mikroorganizmalarin yoklugunda gerçeklestirilir. Bazi yönlerde, 2- formilfuran-4-karboksilat'in enzimatik üretiminde kullanilan enzimler, mikroplardan, rekombinant ya da baska bir sekilde izole edilir ve 2-f0rmiIfuran-4-karb0ksilati üretmek için kullanilan ara ürünlerin adim adim üretimi için ilgili substratlarina saglanir. Bazi yönlerde, metotlarin bir ya da daha fazla adimi ayni kapta gerçeklestirilir. Bazi yönlerde, burada tarif edilen ayri ayri metot adimlarinin bir sonucu olarak arzu edilen ürün üretildigi zaman, ürün izole edilir ve saflastirilir ve daha sonra 2-formilfuran-4-karboksilat üretme metodunun bir sonraki adiminda substrat olarak kullanilir. 4-formiIfuran-2-karb0ksilat Bir yapilanmada mevcut tarifname, bir karbon kaynagindan 4-formilfuran-2-karboksilat üretebilen nitelikte bir rekombinant mikroorganizma üretmenin bir metoduna yöneliktir.

Mevcut tarifnameye ait bazi yapilanmalar, bir karbon besleme stokunun 4-formilfuran-2- karboksilata biyosentetik dönüsümünü toplu olarak detaylandiran SEKIL 1, SEKIL 2 ve SEKIL 3'te sunulmaktadir.

Bir yapilanmada, Sekil 2'deki G adimi, bir substrat olarak furan-2,4-dikarbaldehit kullanan tek adimli bir reaksiyondur. Bir yapilanmada, furan-2,4-dikarbaldehitten 4-formilfuran-2- ya da daha fazla enzim tarafindan katalize edilir.

Bir yapilanmada, burada açiklanan yapilanmalarin herhangi birine ait rekombinant mikroorganizma, furan-2,4-dikarbaldehitin 4-formIlfuran-2-karb0ksilata dönüstürülmesini katalize eden bir dehidrojenaz ya da bir oksidaz ya da bir peroksijenaz kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, EC numarasi 1.2.1 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada dehidrojenaz EC numarasi ya da aldehit dehidrojenaz (NADP+) (EC numarasi +] (EC arasindan seçilir. Bir yapilanmada oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, 5-(hidroksimetilfurfural oksidazdir (EC numarasi yapilanmalarda hmfH, Methylovorus sp. MP688 ya da Cupriavidus basilensis'den türetilebilir.

Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, ariI-alkol oksidazdir (EC numarasi 1.1.3.7). Bir yapilanmada peroksijenaz, EC numarasi 1.11.2 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, peroksijenaz EC numarasi 1.11.2, spesifik olmayan peroksijenazdir (EC numarasi 1.11.21).

Bir yapilanmada, Sekil 2'deki H adimi, bir substrat olarak 4-(hidroksimetil)furoik asit kullanan tek adimli bir reaksiyondur. Bir yapilanmada, 4-(hidroksimetil)furoik asitten 4- temsil edilen bir ya da daha fazla enzim tarafindan katalize edilir.

Bir yapilanmada, burada açiklanan yapilanmalarin herhangi birine ait rekombinant mikroorganizma, 4-(hidroksimetil)furoik asidin 4-f0rmilfuran-2-karb0ksilata dönüsümünü katalize eden bir dehidrojenaz ya da bir oksidaz ya da bir peroksijenaz kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü ihtiva etmektedir. Bir yapilanmada dehidrojenaz, EC numarasi 1.1.1 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, EC numarasi 1.1.1 olan dehidrojenaz, alkol dehidrojenaz (EC numarasi 1.1.1.1) ya da alkol dehidrojenaz alkol dehidrojenaz (EC numarasi (EC numarasi 1.1.1.91).arasindan seçilmektedir. Bir yapilanmada oksidaz, EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, 5-(hidroksimetilfurfural geninden türetilebilir. Bazi yapilanmalarda hmfH, Methylovorus sp. MP688 ya da Cupriavidus basilensis'den türetilebilir. Bakiniz Dijkman ve Fraaije (2014) ve Koopman ve ark. (2010). Bir yapilanmada, oksidaz EC numarasi 1.1.3, ariI-alkol oksidazdir (EC numarasi olarak siniflandirilir. Bir yapilanmada, peroksijenaz EC numarasi 1.11.2, spesifik olmayan peroksijenazdir (EC numarasi 1.11.21). Bakiniz Carro ve ark. (2015).

Bazi yönlerde, 4-formiIfuran-2-karboksilat, mikroplarin yoklugunda enzimatik olarak üretilir.

Bazi yönlerde, 4-formilfuran-2-karboksilat bir ya da daha fazla kapta enzimatik olarak üretilir.

Bazi yönlerden, bir ya da daha fazla kap, büyük ölçüde mikrop ihtiva etmez. Bazi yönlerde, 4-formiIfuran-2-karboksilat'in enzimatik üretimi, rekombinant mikroorganizmalarin kullanildigi metotlarda tarif edildigi gibi ayni adim adim sekilde, ancak mikroorganizmalardan önemli ölçüde arinmis ya da mikroorganizmalarin yoklugunda gerçeklestirilir. Bazi yönlerde, 4- formiIfuran-2-karboksilat'in enzimatik üretiminde kullanilan enzimler, mikroplardan, rekombinant ya da baska bir sekilde izole edilir ve 4-formiIfuran-2-karboksilati üretmek için kullanilan ara ürünlerin adim adim üretimi için ilgili substratlarina saglanir. Bazi yönlerde, metotlarin bir ya da daha fazla adimi ayni kapta gerçeklestirilir. Bazi yönlerde, burada tarif edilen ayri ayri metot adimlarinin bir sonucu olarak arzu edilen ürün üretildigi zaman, ürün izole edilir ve saflastirilir ve daha sonra 4-formilfuran-2-karboksilat üretme metodunun bir sonraki adiminda substrat olarak kullanilir.

Mevcut tarifname, 4-HMF, 2,4-furandimetanol, furan-2,4-dikarbaldehit, 4-(hidr0ksimetil)furoik asit, 2-formilfuran-4-karb0ksilat, 4-formilfuran-2-karboksilat ve 2,4-FDCA'dan birini ya da daha fazlasini yüksek verimlerde üretebilir nitelikte metotlar ve rekombinant mikroorganizmalar saglamaktadir. Bir yapilanmada, bir glikoz molekülü ve iki ATP molekülü, net denklem 1'e göre bir H molekülüne dönüstürülür: Denklem 1: 1 glikoz + 2 ATP -› H Net reaksiyon, gram glikoz basina yaklasik olarak 0,87 gram 2,4-FDCA'Iik bir kütle verimi ile sonuçlanir. Bu verim, glikoz basina 1,16 gram 2,4-FDCA'Iik maksimum termodinamik verimin % 75'ine esdegerdir. Bazi yapilanmalarda 2,4-FDCA verimi, glikozun grami basina Bir yapilanmada, bir glikoz molekülü ve iki ATP molekülü ve üç oksijen molekülü net denklem 2'ye göre bir molekülüne dönüstürülür: Bir yapilanmada, iki glikoz molekülü ve iki ATP molekülü, net denklem 3'e göre bir 2,4-FDCA molekülüne ve bes NAD(P)H molekülüne dönüstürülür: Denklem 3: 2 gliserol + 2 ATP -› H Net reaksiyon, gram gliserol basina yaklasik olarak 0,85 gram 2,4-FDCA'Iik bir kütle verimi ile sonuçlanir. Bu verim, gliserol basina 1,32 gram 2,4-FDCA'Iik maksimum termodinamik verimin % 64'üne esdegerdir. Bazi yapilanmalarda 2,4-FDCA verimi, gliserolün grami basina Bir yapilanmada, iki gliserol molekülü ve iki ATP molekülü ve üç oksijen molekülü net denklem 4'e göre bir 2,4-FDCA molekülüne ve üç hidrojen peroksit molekülüne dönüstürülür: Biyosentez Ürünü Monomerleri velveya Polimerleri Üretme ve Izole Etme Metotlari Bazi yönlerde, mevcut tarifnameye ait modifiye edilmis mikroplar, mikroplarin 4-HMF, 2,4- furandimetanol, furan-2,4-dikarbaldehit, 4-(hidr0ksimetiljfur0ik asit, 2-f0rmilfuran-4- karboksilat, 4-f0rmilfuran-2-karboksilat ve 2,4-FDCA monomerleri üretecegi bir sekilde modifiye edilir. Bazi yönlerde, mevcut tarifnameye ait modifiye edilmis mikroplar, mikroplarin 4-HMF, 2,4-furandimetanol, furan-2,4-dikarbaldehit, 4-(hidr0ksimetil)fur0ik asit, 2-formilfuran- 4-karb0ksilat, 4-f0rmilfuran-2-karb0ksilat ve 2,4-FDCA'dan türetilen polimerler üretecegi bir sekilde modifiye edilir. Bazi yönlerde, biyosentez ürünü monomerleri ve/veya polimerleri üretmeye yönelik bir metot, biyosentez ürünü monomerleri vei'veya polimerleri üretmek için yeterli kosullar altinda mevcut tarifnameye ait bir ya da daha fazla mikrobun büyütülmesini f fermente edilmesini ve sonuçta ortaya çikan 4-HMF, 2,4-furandimetanol, furan-2,4- dikarbaldehit, 4-(hidr0ksimetil)furoik asit, 2-f0rmilfuran-4-karb0ksilat, 4-formilfuran-2- karboksilat ve 2,4-FDCA ve/veya bunlarin polimerlerinin izole edilmesini / toplanmasini ihtiva etmektedir. Bazi yönlerde, biyosentez monomerleri, in vivo olarak polimerlere polimerize olacaktir. Bazi yönlerde, biyosentez monomerlerinin ve polimerlerinin üretimi, mikrobiyal fermantasyon isleminde kullanilan bakteri sayisi ile orantilidir. Bazi yönlerde, bakteriler bir reaksiyon odasinda büyütülür. Arzu edilen bir sayida bakteri elde edildigi zaman, harcanan ortam, biyosentez ürünü monomerlerin ve/veya polimerlerin izole edilmesi için bir isleme tabi tutulur. Bazi yönlerde, mikroplar Iizlenir ve hücresel artiklar bir santrifüjde çözeltinin disinda peletlenir. Bazi yönlerde, biyosentez ürünü monomerleri ve/veya polimerleri, hücre pelet fraksiyonundan ya da sivi fraksiyondan bir çözücü ekstraksiyon prosesi ya da bir gradyan ultra santrifüj prosesi yardimi ile toplanir. Bazi yönlerde biyosentez ürünü polimeri süzme yolu ile izole edilebilir.

Bazi yönlerde, bir biyosentez ürünü monomeri, rekombinant mikroorganizmanin, monomer üretilene kadar bir karbon kaynagi saglayan bir besleme stogu ihtiva eden bir kültür ortaminda yetistirilmesi ile üretilir. Bazi yönlerde, besleme stogu bir ya da daha fazla heksoz, bir ya da daha fazla pentoz ya da bunlarin bir kombinasyonunu ihtiva etmektedir. Bazi yönlerde, monomer kültür ortamindan ekstrakte edilir ve bir katalizör varliginda polimerize edilir. Mevcut tarifname, rekombinant mikroorganizmalar tarafindan üretilen biyosentez ürününden bir polimer üretme metodunu ve tarifnameye ait metotlari saglamaktadir. Bir yapilanmada, bir ya da daha fazla biyosentez ürünü, bir polimer olusturmak üzere bir diol ile katalitik olarak polimerize edilir.

Bazi yönlerde, biyosentez ürünü monomeri, bir titanyum bazli katalizör, germanyum bazli katalizör, magnezyum bazli katalizör, silikon bazli katalizör, alüminyum bazli katalizör ya da antimon bazli bir katalizör arasindan seçilen bir katalizör varliginda katalize edilir. Bazi yönlerde, katalizör sunlardan seçilir: antimon asetat, antimon trioksit, germanyum dioksit, tetra-izopropil titanat ve tetra-n-bütil titanat.

Bazi yönlerde, biyosentez ürününden türetilen polimer, bir pha sentaz ile in vivo polimerize edilir. Bazi yönlerde, biyosentez ürününden türetilen monomer, bir pha sentaz ile ex vivo polimerize edilir.

Bazi yönlerde, biyosentez ürünü 4-HMF kültür ortamindan ekstrakte edilir ve bir katalizör varliginda, teknigin bilinen durumunda bildirildigi gibi bir ya da daha fazla diger biyosentez ürünü haline dönüstürülür. Bkz. Van Putten ve ark. (2013. Hidroksimetilfurfural, Yenilenebilir Kaynaklardan Yapilan Çok Yönlü Bir Platform Kimyasali. Chemical Reviews, 113.3:1499- 1597).

Bazi yönlerde biyosentez ürünü 4-HlVIF, kültür ortamindan ekstrakte edilir ve bir katalizör varliginda 2,4-dimetilfuran haline dönüstürülür. Bkz. Deng ve ark. (2013. Formoz Reaksiyonu Vasitasiyla Yakitlarin Üretimi Için Baglantili Strateji. Scientific Reports, 3:1244).

Bazi yönlerde, tarif edilen metotlar ve bilesimler ile üretilen biyosentezlenmis ürünlerin herhangi bir tanesi ya da daha fazlasi, içinde bunlarin biyosentezlendikleri kültür ortamindan çikarilir ve bir kimyasal ya da biyolojik katalizörün/katalizörlerin mevcudiyetinde dönüstürülür.

Bazi yönlerde, biyosentezlenen ürünlerin bir kimyasal ya da biyolojik katalizör(ler) varliginda dönüstürülmesi mikroorganizmalarin yoklugunda gerçeklestirilir. Bazi yönlerde, biyosentezlenen ürünlerin bir biyolojik katalizör(ler) varliginda dönüstürülmesi mikroorganizmalarin yoklugunda ve bir ya da daha fazla mikroorganizmadan izole edilen ve saflastirilan bir ya da daha fazla enzimin varliginda gerçeklestirilir.

Bazi yönlerde, kimyasal katalizör ya da katalizörler, 2,4-furandimetanol, iman-2,4- dikarbaldehit, 4-(hidroksimetil)furoik asit, 2-formiIfuran-4-karb0ksilat, 4-formilfuran-2- karboksilat ve/veya 2,4-FDCA'nin biyolojik olmayan sentezinde kullanildigi bilinen herhangi bir ya da daha fazla kimyasaldir.

Bazi yönlerde, biyolojik katalizör ya da katalizörler, SEKIL 2'de C, D, E, F, G, H, I veya J reaksiyon adimlari için burada tarif edilen enzimlerden herhangi bir tanesi ya da daha fazlasidir.

Bazi yönlerde, biyosentezlenmis 4-HMF'nin 2,4-furandimetanole dönüsümü, mikroorganizmalardan büyük ölçüde arindirilmis bir bilesimde ve örnegin EC 1.1.1-'in biyolojik katalizörleri gibi burada tarif edilen kimyasal ya da biyolojik bir katalizörün varliginda gerçeklesir.

Bazi yönlerde, biyosentezlenmis 4-HMF'nin furan-2,4-dikarbaldehite dönüsümü, mikroorganizmalardan büyük ölçüde arinmis bir bilesimde ve örnegin EC 1.1.1-, EC 1.1.3.- ve/veya EC 1.11.2.-'in biyolojik katalizörleri gibi burada tarif edilen kimyasal ya da biyolojik bir katalizör varliginda gerçeklesir.

Bazi yönlerde, biyosentezlenmis 4-HiViF'nin 4-(hidroksimetil)furoik aside dönüsümü, mikroorganizmalardan büyük ölçüde arinmis bir bilesimde ve örnegin EC 1.1.1-, EC 1.1.3.- ve/veya EC 1.11.2.-'in biyolojik katalizörleri gibi burada tarif edilen kimyasal ya da biyolojik bir katalizör varliginda gerçeklesir.

Bazi yönlerde, biyosentezlenmis 2,4-furandimetan0lün, 2-formiIfuran-4-karboksilata dönüsümü, mikroorganizmalardan büyük ölçüde arinmis bir bilesimde ve örnegin EC 1.2.1-, EC 1.1.3.- ve/veya EC 1.11.2.-'in biyolojik katalizörleri gibi burada tarif edilen kimyasal ya da biyolojik bir katalizör varliginda gerçeklesir.

Bazi yönlerde, biyosentezlenmis furan-2,4-dikarbaldehitin 2-f0rmilfuran-4-karb0ksilata dönüsümü, mikroorganizmalardan büyük ölçüde arinmis bir bilesimde ve örnegin EC 1.2.1-, EC 1.1.3.- ve/veya EC 1.11.2.-'in biyolojik katalizörleri gibi burada tarif edilen kimyasal ya da biyolojik bir katalizör varliginda gerçeklesir.

Bazi yönlerde, biyosentezlenmis furan-2,4-dikarbaldehitin, 4-f0rmilfuran-2-karboksilata dönüsümü, mikroorganizmalardan büyük ölçüde arinmis bir bilesimde ve örnegin EC 1.2.1-, EC 1.1.3.- ve/veya EC 1.11.2.-'in biyolojik katalizörleri gibi burada tarif edilen kimyasal ya da biyolojik bir katalizör varliginda gerçeklesir.

Bazi yönlerde, biyosentezlenmis 4-(hidroksimetil)furoik asidin, 4-formiIfuran-3-karboksilata dönüsümü, mikroorganizmalardan büyük ölçüde arinmis bir bilesimde ve örnegin EC 1.2.1-, EC 1.1.3.- ve/veya EC 1.11.2.-'in biyolojik katalizörleri gibi burada tarif edilen kimyasal ya da biyolojik bir katalizör varliginda gerçeklesir.

Bazi yönlerde, biyosentezlenmis 2-formilfuran-4-karboksilatin 2,4-FDCA'ya dönüsümü, mikroorganizmalardan büyük ölçüde arinmis bir bilesimde ve örnegin EC 1.2.1-, EC 1.1.3.- ve/veya EC 1.11.2.-'in biyolojik katalizörleri gibi burada tarif edilen kimyasal ya da biyolojik bir katalizör varliginda gerçeklesir.

Bazi yönlerde, biyosentezlenmis 4-formilfuran-2-karboksilatin 2,4-FDCA'ya dönüsümü, mikroorganizmalardan büyük ölçüde arinmis bir bilesimde ve örnegin EC 1.2.1-, EC 1.1.3.- ve/veya EC 1.11.2.-'in biyolojik katalizörleri gibi burada tarif edilen kimyasal ya da biyolojik bir katalizör varliginda gerçeklesir.

Bazi yönlerde, yukarida tarif edilen dönüsümlerden herhangi biri ya da daha fazlasi, birinci dönüsümün ürününün, ikinci dönüsümün ürünü için substrat olacagi bir sekilde baska bir Bazi yönlerde, yukarida tarif edilen dönüsümlerden herhangi bir tanesi ya da daha fazlasi, birinci dönüsümün ürününün, onun ürünü de üçüncü dönüsümün ürünü için substrat olan ikinci dönüsümün ürünü için substrat olacagi bir sekilde baska bir dönüsüm ile birlestirilebilir.

Biyosentez ürünlerini üretmek için biyolojik islemler Mevcut tarifname, burada tarif edilen biyosentez ürünlerinden biri ya da daha fazlasinin üretimine yönelik bir biyolojik proses saglamaktadir: 4-HMF, 2,4-furandimetan0l, furan-2,4- dikarbaldehit, 4-(hidroksimetil)furoik asit, 2-formilfuran-4-karboksilat ve 4-formilfuran-2- karboksilat ve 2,4-FDCA. Bazi yapilanmalarda proses sunlari ihtiva etmektedir: en az bir biyoreaktöre, bir ya da daha fazla biyosentez yolundan gliseraldehit 3-fosfat (GBP) biyosentezinde yer alan bir ya da daha fazla enzimi eksprese etmek için tasarlanmis olan bir ya da daha fazla rekombinant mikroorganizmanin ve G3P'den bir ya da daha fazla biyosentez ürünleri ve bir eksojen karbon kaynagi ihtiva eden bir besleme stoku saglanmasi; besleme stokunu ihtiva eden bir kültür ortaminda bir ya da daha fazla asamada bir ya da daha fazla rekombinant mikroorganizmanin yetistirilmesi; elde edilen kültürün aerobik, mikroaerobik ve/veya anaerobik kosullar altinda bir ya da daha fazla asamada fermente edilmesi; ve fermentasyon asamasindan sonra bir ya da daha fazla biyosentez ürününün biyoreaktörden geri kazanilmasi.

Biyolojik islemin bazi yapilanmalarinda, bir ya da daha fazla biyosentez ürünü, kültür ortaminin ya da besleme stokunun tükenmesinden önce sürekli olarak geri kazanilir. Bazi yapilanmalarda biyosentez ürünleri, kültür ortaminin ya da besleme stokunun tükenmesinden önce partiler halinde geri kazanilir. Bazi yapilanmalarda bir ya da daha fazla rekombinant mikroorganizma, Iostridium sp., Clostridium Ijungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ragsdalei, Eubacterium Iimosum, Butyribacterium methylotrophicum, Moorella thermoacetica, Corynebacterium glutamicum, Clostridium aceticum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Clostridium drakei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium formicoaceticum, Clostridium scatologenes, Moorella thermoautotrophica, Acetonema Iongum, Blautia producta, Clostridium glycolicum, Clostridium magnum, Candida krusei, Clostridium mayombei, Clostridium methoxybenzovorans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Oxobacter pfennigii, Thermoanaerobacter kivui, Sporomusa ovata, Thermoacetogenium phaeum, Acetobacterium carbinolicum, lssatchenkia orientalis, Sporomusa termitida, Moorella glycerini, Eubacterium aggregans, Treponema azotonutricium, Pichia kudriavzevii, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pseudomonas putida, Bacillus sp, Corynebacterium sp., Yarrowia Iipolytica, Scheffersomyces stipitis ve Terrisporobaoter glycolicus'den olusan gruptan seçilen bir ebeveyn mikroorganizmadan türetilir.

Biyolojik islemin bazi yapilanmalarinda besleme stoku, C6 karbonhidratlari ve/veya C5 karbonhidratlari ihtiva etmektedir. Bazi yapilanmalarda, besleme stoku monosakaritler, disakaritler, oligosakaritler, polisakaritler ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva etmektedir.

Biyolojik islemin bazi yapilanmalarinda, yetistirme ve fermente etme adimlari ayni asamada gerçeklesir. Bazi yapilanmalarda, yetistirme ve fermente etme adimlari ayri asamalarda gerçeklesir. Bazi yapilanmalarda, yetistirme ve fermente etme asamalari ayri biyoreaktörlerde gerçeklesir. Biyolojik islemin bazi yapilanmalarinda, yetistirme ve fermente etme adimlari ayni reaktörde gerçeklesir. Bazi yapilanmalarda biyoreaktör, aerobik, mikroaerobik ya da anaerobik kosullar ya da bunlarin bir kombinasyonu altinda çalisir.

Bazi yapilanmalarda, bir ya da daha fazla asama kültür ve/veya kültür ortamini bir parti, bir beslemeli parti ya da bir sürekli mod beslemesi olarak alir. Bazi yapilanmalarda, yetistirme asamasi kültür ve/veya kültür ortamini bir parti, bir beslemeli parti ya da bir sürekli mod beslemesi olarak alir ve sonraki herhangi bir asama bir parti, bir beslemeli parti ya da bir sürekli mod beslemesi olarak çalisir.

Bazi yapilanmalarda kültür ortami, C5 karbonhidratlarindan, CB karbonhidratlarindan ve/veya disakkaritlerden saglanan karbon (C) ihtiva etmektedir. Bazi yapilanmalarda kültür ortami, nitrojen (N), fosfor (P), magnezyum (Mg) ve demir (Fe) dahil olmak üzere temel besinleri ihtiva etmektedir.

Bazi yapilanmalarda yetistirme adiminda bir CzN orani en az 10:1'dir. Bazi yapilanmalarda yetistirme adiminda bir C:P oraninin en az 5:1'dir. Bazi yapilanmalarda yetistirme adiminda bir C:Mg orani en az 50:1'dir. Bazi yapilanmalarda yetistirme adiminda bir C:Fe orani en az 300:1'dir.

Bazi yapilanmalarda, yetistirme adimi, bir ya da daha fazla rekombinant mikroorganizmanin hücrelerinin yetistirilmesi için 5 ila 100 saate kadar arasinda çalisir. Bazi yapilanmalarda, fermente etme adimindaki kültür, bir ya da daha fazla substratin oldugu kültür ortamindaki yetistirme adimindan transfer edilen hücre kütlesinin yaklasik olarak % 1 ila yaklasik olarak % 30'unu olusturmaktadir. Bazi yapilanmalarda, fermentasyon adimina saglanan toplam besleme stoku miktari, yaklasik olarak 100 kgi'm3 ila yaklasik olarak 800 kg/m3 araliginda degismektedir.

Bazi yapilanmalarda fermente etme adimindaki bir C:N orani en az 50:1'dir. Bazi yapilanmalarda fermente etme adimindaki bir C:P orani en az 20:1'dir. Bazi yapilanmalarda fermente etme adimindaki bir CzMg orani en az 200:1'dir. Bazi yapilanmalarda fermente etme adimindaki bir C:Fe orani en az 800:1'dir. Bazi yapilanmalarda, fermente etme adimi, kesikli besleme islemi için 10 ila 300 saat arasinda ve sürekli islem için 300 saate kadar çalisir. ÖRNEKLER Örnek 1: Metil fosfat sentazin ekspresyonu ve saflastirilmasi Enzimatik deneylerde kullanilan enzimlerin ekspresyonu ve saflastirilmasi asagida yer alan kosullar altinda gerçeklestirilmistir: 27 (5-f0rmilfuran-3-il)metil fosfat sentaz adayini (Tablo 1) kodlayan genler, GenScript ile sentezlendi ve Ndel ve BamHl kisitlama bölgelerinde pET28a ekspresyon vektörü içinde klonlandi. Ekspresyon vektörü, E. coli BL21'e (DES) dönüstürülmüs ve transformant, enzim ekspresyonu için kullanilana kadar % 15 gliserol içinde saklanmistir.

Depolanan transformant, bir tohum kültürü hazirlamak için 16 saat süre ile çalkalanarak 37 °C'de kanamisin ihtiva eden 50 mL TB sivi besi yerine asilandi. Tohum kültürü, ilk CD (600 nm) 0,2 ile kanamisin ihtiva eden 300 mL TB sivi besi yerine ilave edildi, kültür daha sonra mIVI IPTG ekspresyonu indüklemek için 18 °C'de gece boyunca çalkalanarak ilave edildi.

Gece boyunca ekspresyonun ardindan hücreler, 30 dakika boyunca 6000x rpm'de santrifüjlendi ve pelet hücresi, ultrasonik bozulmadan önce soguk Iizis tamponu (20 mM fosfat tamponu ve ( rpm'de 30 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjlendi ve afinite kromatografisi ile saflastirmadan önce süzüldü. Kullanilan kolon, his-etiketli protein saflastirmasi için bir HisTrap FF Crude (GE Healthcare) idi. Saflastirilan protein baglandi ve kolonda, baglama tamponu A (20 mM fosfat tamponu, 20 mM imidazol, 500 mM NaCI, 1 mM PMSF ve beta-merkaptoetanol, pH NaCI, 1 mM PMSF ve beta-merkaptoetanol, pH 7,4) gradyaninda yikandi. Daha sonra, bir PD-10 kolonu kullanilarak tampon, bir 50 mM Tris-HCI pH 7,4'e degistirildi. Adaylarin ekspresyonu ve saflastirilmasi, Sekil 4'de gösterildigi gibi elektroforez ile % 12 poliakrilamid jel üzerinde analiz edildi. Örnek 2: G3P'den (5-formilfuran-3-il)metil fosfat üretimi Tablo 1'de tarif edilen enzim adaylari tarafindan gIiseraldehit-S-fosfattan (G3P) (5- formilfuran-S-il)metil fosfat üretimi, yaklasik olarak 450 pg saflastirilmis adayin, 5 mM 20 mM Tris-HCl, ihtiva eden 1 mL'Iik bir çözelti ile inkübe edilmesi ile in vitro olarak gösterildi. Reaksiyon, 37 °C'de 2 saat süre ile inkübe edildi. Negatif kontroller olarak, sentaz ya da substrat (GSP) içermeyen reaksiyon kaplari kullanildi. Reaksiyon, 5-formilfuran-3-il)metil fosfat Molar absorpsiyon katsayisi (s) 280 nm'ye uygun olarak bir spektrofotometre (SpectraMax M5, Molecular Devices) kullanilarak UV-Vis ile izlendi. Ürün olusumu ayrica, HPLC analizi ile de teyit edildi. (5-f0rmilfuran-S-il)metil fosfat üretiminin kromatografik kantitatif analizi, bir Aminex HPX-87H Biorad kolonu ( içinde gerçeklestirilmistir. Kolon 50 °C'de tutuldu ve kullanilan mobil faz, 0,75 mL/dk (izokratik gradyan modu) olan akis hizina sahip 5 mlVl H2804 çözeltisiydi.

Tablo 6, Sekil 5 ve Sekil 6'da gösterildigi gibi, GSP, metil fosfat sentazlari ile basarili bir sekilde (5-formilfuran-3-il)metil fosfata dönüstürüldü. Sekil 5'te, negatif kontrol numunesi (gri çizgi) 280'de düsük bir absorbans göstermektedir ve bu, metil fosfoat sentazi (siyah çizgi) ihtiva eden reaksiyona kiyasla (5-formilfuran-3-il)metil fosfatin varliginin çok az oldugunu ya da hiç olmadigini gösterir, sentazin G3P'den (5-formilfuran-3-iI)metil fosfat olusumunu katalize ettigini gösterir; bu sonuçlar Tablo 6'da özetlenmistir. Sekil 6, sentaz ihtiva eden reaksiyonda (Alt Panel) saptanabilir (5-f0rmilfuran-3-il)metil fosfati oldugunu, ancak negatif kontrol reaksiyonunda (Üst Panel) olmadigini göstermektedir. Tablo 7 G3P'den (5- formilfuran-S-il)metil fosfat üretimi için pozitif olarak test edilen metil fosfat sentaz adaylarinin bir listesini ihtiva etmektedir.

Tablo 6. G3P'den (5-formilfuran-3-il)metil fosfatin metil fosfat sentaz üretimi için 280 nm'de elde edilen absorbans. 280 nm'de absorbans Metil fosfat sentaz pozitif reaksiyonu (Mant adayi) 2,97 Negatif kontrol 0,26 Tablo 7. G3P'den (5-f0rmilfuran-3-il)metil fosfat üretiminin katalizlenmesi için pozitif olarak test edilen (5-formilfuran-3-il)metiI fosfat sentaz adaylari.

Adi Organizma Man 1 Methanocaldococcus jannaschii Man 2 Methanocaldococcus fervens Man 3 Methanocaldococcus vulcanius Man 4 Methanocaldococcus infernos Man 5 Methanothermococcus okinawensis Man 6 Methanococcales archaeon HHB Man 7 Methanobrevibacter smithii Man 8 Methanobacterium sp. PtaB.Bin024 Man 9 Methanopyrus sp. KOLG Man 10 Candidatus Argoarchaeum ethanivorans Man 12 Methanobrevibacter arboriphilus Man 13 Methanococcus maripaludis Man 15 Methanosarcina acetivorans Man 16 Methanosarcina barkeri Man 17 Methylorubrum extorquens Man 18 Methylobacterium sp.

Man 19 Methanosarcina mazei Man 20 Methyloversatilis universalis Man 22 Streptomyces cattleya NRRL 8057 Man 24 Streptomyces EFF88969 Man 25 Streptomyces griseus Man 26 Streptomyces sp. DH-12 Örnek 3: (5-formiIfuran-3-il)metil fosfattan 4-hidroksimetilfurfural (4-HMF) üretimi Fosfatazlar kullanilarak (5-f0rmilfuran-3-il)metil fosfattan 4-HMF üretimi, ticari olarak temin edilebilen fosfataz, E. coli Iizatlari ve maya Iizatlari kullanilarak, (5-formilfuran-S-il)metil fosfat'tan 2,4-HMF üretme kabiliyetlerini göstermek için, gösterilmistir. Substrat (5- formilfuran-3-il)metil fosfat, Örnek 2'de tarif edildigi gibi (5-f0rmiIfuran-3-il)metil fosfat sentazlari ile üretildi. (5-f0rmilfuran-S-il)metil fosfat ve 4-HMF üretiminin kromatografik kantitatif analizi, bir Aminex HPX-87H Biorad kolonu (300 x 7,8 mm) ile donatilmis olan bir HPLC-DAD (Thermo Ultimate 3000) içinde gerçeklestirilmistir. Kolon 50 “C'de tutuldu ve kullanilan mobil faz, 0,75 mL/dk (izokratik gradyan modu) olan akis hizina sahip 5 mM H2804 çözeltisiydi. Her iki bilesik de 280 nm'de tespit edildi.

Ticari olarak temin edilebilen bir fosfataz kullanilarak (5-formilfuran-3-il)metil fosfattan 4-HMF üretimini gösteren reaksiyonu gerçeklestirmek için, Örnek 2'den yaklasik olarak 1-2 mM (5- formilfuran-S-il)metil fosfat ihtiva eden 1 mL reaksiyon kabina, sigir bagirsak mukozasindan 2 uL alkalin fosfataz (Sigma) ilave edildi. Reaksiyon 1 saat süre ile 37 °C'de inkübe edildi ve ilk ve nihai numuneler HPLC-DAD ile analiz edildi. Sekil 7'de (Üst Panel) ve Tablo 8'de gösterildigi gibi, ticari olarak temin edilebilen fosfataz, (5-f0rmiIfuran-3-il)metil fosfatin 4- HMF'ye tam dönüsümünü gerçeklestirebildi.

Tablo 8. Metil fosfat sentaz kullanilarak üretilen (5-formilfuran-3-il)metil fosfatin tepe alani.

Alan (mAU*dak) Metil fosfat sentaz pozitif reaksiyonu 62,1544 Negatif kontrol O Bir E. coli lizat içindeki fosfatazlar kullanilarak (5-formilfuran-3-il)metil fosfattan 4-HMF üretimini gösteren reaksiyonu gerçeklestirmek için, bir E. coli M81655 susu, 200 mL LB sivi besi yerine 37 °C'de gece boyunca çalkalanarak asilandi. Kültür, 15 dakika boyunca 4000 rpm'de santrifüjlendi ve pelet, 20 mL 20 mM HEPES tamponu pH 7,4'te süspanse edildi ve 70'lik bir CD ile sonuçlandi. Liziz, ultrasonik bozulma ile gerçeklestirildi. 1 mL E. coli Iizati, Örnek 2'deki 1 mL reaksiyon ile karistirildi ve gece boyunca 37 °C'de çalkalama ile inkübe edildi. Örnekler, 4-HMF üretimi için 280 nm'de HPLC-DAD ile analiz edildi.

Bir maya lizat içindeki fosfatazlar kullanilarak (5-formilfuran-3-il)metil fosfattan 4-HMF üretimini gösteren reaksiyonu gerçeklestirmek için, bir Saccharomyces cerevisiae susu, 200 mL YPD sivi besi yerine 30 °C'de gece boyunca çalkalanarak asilandi. Kültür, 15 dakika süspanse edildi ve 120'Iik bir CD ile sonuçlandi. Hücre Iizizi, ultrasonik bozulma ile gerçeklestirildi. 1 mL maya Iizati, Örnek 2'deki 1 mL reaksiyon ile karistirildi ve gece boyunca 30 °C'de çalkalama ile inkübe edildi. Örnekler, 4-HMF üretimi için 280 nm'de HPLC- DAD ile analiz edildi.

Sekil 7'de (Orta Panel) ve Sekil 7'de (Alt Panel) ve Tablo 9'da gösterildigi gibi, hem E. coli hem de maya Iizatlari, (5-formilfuran-3-il)metil fosfatin 4-HMF'ye dönüsümünü gerçeklestirebilen endojen fosfataz aktivitesi gösterdi.

Tablo 9. Sirasi ile 1 saat inkübasyondan sonra ticari olarak temin edilebilen fosfataz ve 37 formilfuran-ß-il)metil fosfattan 4-HMF üretimi.

Numune (5-formiIfuran-3-il)metil fosfat 4-HMF alan (mAU*dak) alan (mAU*dak) Sigma fosfataz n.a. 385,3242 E. coli negatif kontrol reaksiyonu (5-f0rmilfuran-3-n.a. n.a. il)metil fosfat substrati yoklugu) Maya negatif kontrol reaksiyonu substrati yoklugu) Örnek 4: 4-HMF oksidaz enzimlerinin ekspresyonu ve BamHI kisitlama bölgelerinde pET28a ekspresyon vektörü içinde klonlandi. Ekspresyon vektörü, E. coli BL21'e (DE3) dönüstürülmüs ve transformant, enzim ekspresyonu için kullanilana kadar % 15 gliserol içinde saklanmistir.

Depolanan transformant, bir tohum kültürü hazirlamak için 16 saat süre ile çalkalanarak 37 °C'de kanamisin ihtiva eden 50 mL TB sivi besi yerine asilandi. Tohum kültürü, ilk CD (600 nm) 0,2 ile kanamisin ihtiva eden 300 mL TB sivi besi yerine ilave edildi, kültür daha sonra mM IPTG ekspresyonu Indüklemek Için 18 °C'de gece boyunca çalkalanarak ilave edildi.

Gece boyunca ekspresyonun ardindan hücreler, 30 dakika boyunca 6000x rpm'de santrifüjlendi, hücre peleti, ultrasonik bozulmadan önce soguk Iizis tamponu (20 mM fosfat tamponu ve içinde süspanse edildi. Hücre Iizati tekrar 8000x rpm'de dakika boyunca 4 “C'de santrifüjlendi ve afinite kromatografisi ile saflastirmadan önce süzüldü. Kullanilan kolon, his-etiketli protein saflastirmasi için bir HisTrap FF Crude (GE Healthcare) idi. Saflastirilan protein baglandi ve kolonda, baglama tamponu A (20 mM fosfat tamponu, 20 mIVl imidazol, ile yikandi ve bir elüsyon tamponu B (20 mM fosfat tamponu, 500 mM imidazol, 500 mM NaCI, 1 mM PMSF ve beta-merkaptoetanol, pH 7,4) gradyaninda yikandi. Daha sonra, bir PD-10 kolonu kullanilarak tampon, bir 50 mM Tris-HCI pH 7,4'e degistirildi. Adaylarin ekspresyonu ve saflastirilmasi, Sekil 8'de gösterildigi gibi elektroforez ile % 12 poliakrilamid jel üzerinde analiz edildi. Örnek 5: HmfH oksidazlar ile 2,4-HMF'den 2,4-FDCA üretimi Tablo 4'te tarif edilen enzim adaylari tarafindan 2,4-HMF'den 2,4-FDCA üretimi, yaklasik olarak 100 ug saflastirilmis HmfH oksidaz adaylarinin, yaklasik olarak 1 mM 4-HMF ihtiva eden Örnek 3'ten 1 mL reaksiyon kabi (ticari olarak temin edilebilen fosfataz kullanilarak) ile inkübe edilmesi ile in vitro olarak gösterildi. Reaksiyon 16 saat süre ile 30 °C'de inkübe edildi ve hem ilk hem de nihai numuneler HPLC-DAD ile analiz edildi. Örnekler HPLC-DAD'a enjekte edildi ve 2,4-FDCA ve onun ara ürünlerinin üretimi GC-MS ile teyit edildi. donatilmis olan bir HPLC-DAD (Thermo Ultimate 3000) kullanarak gerçeklestirilmistir. Kolon 50 °C'de tutuldu. Kullanilan mobil faz, izokratik gradyan modunun oldugu 0,6 mL/dk akis hizina sahip 5 mIVl H2804 çözeltisi idi. Molekül 245 nm'de tespit edildi.

GC-MS tanimlamasi için, pH'i 2 - 3'e düsürmek için BM HCI ilave edilmesi ile ilk ve son numuneler durduruldu. Ürünler, etil asetat kullanilarak sivi/sivi özütlendi ve su izlerini gidermek için Na2804 ile kurutuldu. Ekstrakte edilen materyal daha sonra bir speedvac içinde buharlastirildi ve 2 saat boyunca 60 °C'de bis-(trimetilsilil)triflor0asetamid kullanilarak türevlendirildi. Numuneler, dört kutuplu bir kütle detektörü (ISQ, Thermo) ile birlestirilmis HP- SMS kolonlu (Agilent, 30 m x 0,25 mm ID, 0,25 um film kalinligi) bir gaz kromatografina enjekte edildi. Firin programi 2 dakika boyunca 110 °C'de baslatilmis, 20 °C/dk'lik bir artis ile 3 dakika sürdürülmüs olan 300 °C'ye ulasana kadar devam etmistir. Tasiyici gaz olarak 1,2 mL/dk akis hizina sahip olan helyum kullanildi. 2,4-FDCA, bunlarin kütle spektrumlari FFCA) ve furan- de ayrica kendi kütle spektrumlari ile tanimlandi. dönüsümü, özellikle 2,4-HMF'yi 2,4-FDCA'ya tam olarak dönüstürebilen HmfH? enzimi ile, 4- HMF oksidazlar ile basarili bir sekilde gösterildi.

Sekil 9 (Üst Panel), HmfH1'in kromatogramini, Sekil 9 (Orta Panel) HmfH6 kromatogramini ve Sekil 9 (Alt Panel) HmfHT'nin kromatogramini göstermektedir. Sekil 10 (Üst Panel), GC- MS'de elde edilen ürünlerin nispi bollugunu ve silillenmis 2,4-FDCA'nin kütle spektrumlarini (Alt Panel) gösterir (Sekil 11).

Tablo 10. 16 saatlik inkübasyondan sonra 4-HMF oksidaz adaylari ile 4-HMF'den 2,4 FDCA üretimi. Reaksiyon ara maddeleri 4-f0rmilfuran-2-karb0ksilat ( ve furan-2,4- dikarbaldehit ( de ayrica tanimlandi ve miktarlari belirlendia.

Reaksiyon 21;?” 2,4-FDCA alani 2,4-FFCA alani 2,4-DFF alani Kosulu (mAU*dak) (mAU dak) (mAU dak) (mAu dak) negatif 100 na. na. na. kontrol reaksiyonu a Negatif kontrol reaksiyonu, benzer tahlil kosullarinda ama HMF-oksidaz enzimlerinin yoklugunda gerçeklestirilmistir. Örnek 6: 4-HMF'den 2,4-furandimetanol üretimi - Reaksiyon C Saflastirilmis enzimler, Örnek 1'de tarif edildigi gibi üretildi.

Tablo 5'te tarif edilen enzim adaylari ile 4-HMF'den 2,4-furandimetanol üretimi, yaklasik olarak 20 pg saflastirilmis enzim adaylarinin, içinde H ya da NADH ile inkübe edilmesi ile in vitro gösterildi. Reaksiyonlar, Örnek 3'te gösterildigi gibi elde edilen 0,5 mM 4-HMF'nin ilave edilmesi ile baslatildi.

NAD(P)H'nin azalmasi, bir UV-Vis spektrofotometresinde (SpectraMax M5, Molecular Devices) 37 °C'de 40 dakika boyunca 340 nm'de izlendi. Ürün olusumu ayrica HPLC ve GC- da substrat (4-HIVIF) içermeyen reaksiyon kaplari kullanildi.

Sekil 12'de gösterildigi gibi, DH1, DH2 ve DHB enzim adaylari, NAD(P)H'nin NAD(P)+'ya oksidasyonu ile ölçüldügünde, 2,4-HIVIF'nin 2,4-furandimetan0le indirgenmesini destekledi. Örnek 7: 4-HMF'den furan-2,4-dikarbaldehit üretimi - Reaksiyon D Saflastirilmis enzimler, Örnek 1'de tarif edildigi gibi üretildi. Tablo 3'te tarif edilen enzim adaylari ile 4-HMF'den furan-2,4-dikarbaldehit üretimi, yaklasik olarak 20 ug saflastirilmis enzim adaylarinin, H ya da NADH ile inkübe edilmesi ile in vitro gösterildi. Reaksiyonlar, Örnek 3'te gösterildigi gibi elde edilen H'nin artisi, bir UV-Vis spektrofotometresinde (SpectraMax M5, Molecular Devices) 37 °C'de 40 dakika boyunca 340 nm'de izlendi. Ürün olusumu ayrica HPLC ve GC-MS analizi ile de teyit edildi (veriler gösterilmemistir). Negatif kontroller olarak, enzimler ya da substrat (4-HMF) içermeyen reaksiyon kaplari kullanildi.

DH2 enzimi için gösterildigi gibi, seçilen dehidrojenazlar in vitro olarak 4-HIVlF'yi furan-2,4- dikarbaldehite oksitleyebilir nitelikte idi. Sekil 13'de gösterilen veriler, referans hatti sinyalinin çikarilmasindan sonra çizilmistir ve DH2 enzimi kullanildigi zaman, absorbans artisini ve sonuç olarak da NAD(P)H'nin indirgenmesini ve 2,4-HMF'nin furan-2,4-dikarbaldehite oksidasyonunu vurgulamaktadir. Örnek 8: furoik asit üretimi - Reaksiyon E Saflastirilmis aldehit dehidrojenaz enzimleri, Örnek 1'de tarif edildigi gibi üretildi. Tablo 3'te tarif edilen aldehit dehidrojenaz adaylari ile 4-HMF'den 4-(hidr0ksimetil)furoik asit üretimi, yaklasik olarak 20 pg saflastirilmis enzim adaylarinin, 100 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7) içinde H ya da NADH ile inkübe edilmesi ile in vitro gösterildi.

Reaksiyonlar, Örnek 3'te gösterildigi gibi elde edilen 0,5 mM 4-HMF'nin ilave edilmesi ile baslatildi. NAD(P)H'nin artisi, bir UV-Vis spektrofotometresinde (SpectraMax M5, Molecular Devices) 37 °C'de 40 dakika boyunca 340 nm'de izlendi. Ürün olusumu ayrica HPLC ve GC- MS analizi ile de teyit edildi (veriler gösterilmemistir). Negatif kontroller olarak, enzimler ya da substrat (4-HMF) içermeyen reaksiyon kaplari kullanildi.

DH8, DH9, DH10 ve DH11 enzimleri için temsili olarak gösterildigi gibi, seçilen aldehit dehidrojenazlar, in vitro olarak 4-HIVIF'yi 4-(hidroksimetil)furoik aside oksitleyebilir yetenekte idi (Sekil 14). Sekil 14'te gösterilen veriler, referans hatti sinyalinin çikarilmasindan sonra çizilmistir ve ilgili aldehit dehidrojenazlari kullanildigi zaman, absorbans artisini ve sonuç olarak da NAD(P)H'nin indirgenmesini ve furoik aside oksidasyonunu vurgulamaktadir. Örnek 9: 4-HMF'den 2,4-FDCA üretimi için tek kap reaksiyonu Saflastirilmis aldehit dehidrojenaz enzimleri ve alkol dehidrojenaz enzimleri, Örnek 1'de tarif edildigi gibi üretildi. 4-HMF'den 2,4-FDCA üretimi için tek kap oksidatif reaksiyon, temsili aldehit dehidrojenaz olarak DH8 ve temsili alkol dehidrojenaz olarak DH6 kullanilarak gerçeklestirilmistir.

Reaksiyonu gerçeklestirmek için, H ihtiva eden Örnek 3'ten 2 mL bir reaksiyon karisimina, 20 uM saflastirilmis enzim adaylari DH8 ve DH6 ilave edildi. Pozitif kontrol reaksiyonlari Tablo 11'de gösterildigi gibi hazirlandi. Biri enzimsiz, digeri substratsiz iki negatif kontrol hazirlandi. Reaksiyon 16 saat süre ile 30 °C'de inkübe edildi ve hem ilk hem de nihai numuneler HPLC-DAD ile analiz edildi. Örnekler HPLC-DAD'a enjekte edildi ve 2,4-FDCA üretimi, asagida yer alan metot kullanilarak GC-MS'de teyit donatilmis olan bir HPLC-DAD (Thermo Ultimate 3000) kullanarak gerçeklestirilmistir. Kolon 50 °C'de tutuldu. Kullanilan mobil faz, izokratik gradyan modunun oldugu 0,6 mL/dk akis hizina sahip 5 mM H2804 çözeltisi idi. Molekül 245 nm'de tespit edildi.

GC-MS tanimlamasi için, pH'i 2 - 13'e düsürmek için ESM HCI ilave edilmesi ile ilk ve son numuneler durduruldu. Ürünler, etil asetat kullanilarak sivi/sivi özütlendi ve su izlerini gidermek için Na2804 ile kurutuldu. Ekstrakte edilen materyal daha sonra bir speedvac içinde buharlastirildi ve 2 saat boyunca 60 °C'de bis-(trimetilsilil)trifloroasetamid kullanilarak türevlendirildi. Numuneler, dört kutuplu bir kütle detektörü (ISQ, Thermo) ile birlestirilmis HP- SMS kolonlu (Agilent, 30 m x 0,25 mm ID, 0,25 um film kalinligi) bir gaz kromatografina enjekte edildi. Firin programi 2 dakika boyunca 110 °C'de baslatilmis, 20 °C/dk'lik bir artis ile 3 dakika orada tutuldugu 300 °C'ye ulasana kadar devam etmistir. Tasiyici gaz olarak 1,2 mL/dk akis hizina sahip olan helyum kullanildi. 2,4-FDCA, bunlarin kütle spektrumlari FFCA) ve furan- de ayrica kendi kütle spektrumlari ile tanimlandi.

Tablo 11 ve Sekil 15'te (Orta Panel) gösterildigi gibi, 4-HMF'nin 2,4-FDCA'ya dönüsümü, bir aldehit dehidrojenaz (DH8) ve bir alkol dehidrojenazin (DH6) sinerjik etkisi/kombinasyonu ile basarili bir sekilde gösterildi.

Tablo 11. 16 saatlik inkübasyondan sonra bir aldehit dehidrojenaz (DH8) ve bir alkol dehidrojenazin (DH6) sinerjik etkisi/kombinasyonu ile 4-HMF'den 2,4 FDCA üretimi (.

Reaksiyon Kosulu 2,4-FDCA alani (mAU*dak) DH8+DH6 enzimleri ile pozitif reaksiyon 26,1823 Negatif kontrol - Enzim yok 0,3357 Negatif kontrol - Substrat yok n.a. Örnek 10. Glikozdan 2,4-FDCA'nin in vivo üretimi OXB20 promotörünün kontrolü altinda Man 1 genini (Tablo 1) ihtiva eden bir plazmit, bir pET28a omurgasinda yapilandirildi. OXBZO promotörünün kontrolü altinda iki 4-HMF oksidaz genini (HmfHB ve HmfHT (Tablo 4)) ihtiva eden ikinci bir plazmit, bir pZS*13 omurgasinda yapilandirildi. Plazmitler, In-fusion ticari kit kullanilarak yapildi ve dizileme ile dogrulandi. Bir E. coli K12 susu MG1655 (F-, A-, rph-1, ilvG-, rfb-50, AgapA::gapN (UniProtKB - Q59931)), AgIcDEFGB, AaraFGH, AxyIFGH, AfuCO, üretim konakçisi olarak kullanildi. 1ZnSO, 100 mg.L'1CaCI2.2H20, 0,3 g.L"'MgSO4.H20'dan olusan tanimlanmis bir ortam kullanilarak üç kopya halinde çalkalama sisesi fermentasyonlarinda degerlendirildi. Karbon kaynagi 10 gi'L glikoz ile saglandi ve azot kaynagi olarak azot sülfat kullanildi. Erlenmeyer siseleri, rekombinant sus ile 0,1'Iik bir ilk OD'ye asilandi ve 48 saat boyunca 37 ”C, 225 rpm'de inkübe edildi.

Süpernatantin 48 saatte HPLC ile analizi, 14 ± 2 mg/L 2,4-FDCA üretimini gösterdi (Sekil).

Claims (7)

ISTEMLER

1. Gliseraldehit 3-fosfatin (GBP)'ün 'ya enzimatik olarak dönüstürülmesi ile üretmeye yönelik bir metot olup, özelligi; metodun asagidakileri ihtiva etmesidir: (a) GSP'nin (5-formiIfuran-3-il)metil fosfata dönüsümünü katalize eden bir metil fosfat sentazin varliginda GBP saglanmasi; (b) (a)'dan (5-formilfuran-3-il)metiI fosfatin, (5-formiIfuran-S-il)metil fosfatin 4- hidroksimetilfurfural (4-HMF)'ye dönüsümünü katalize eden bir fosfataza saglanmasi; (c) (b)'den 4-HMF'nin. bagimsiz olarak ya da Sinerji içinde (b)'den 4-HMF'nin 2,4 FDCA'ya oksidasyonunu dogrudan ya da ara ürünleri turan-2,4-dikarbaldehit, 4- (hidroksimetil)furoik asit, 4-formiIfuran-2-karb0ksilat, 4-f0rmiIfuran-2-karboksilat, 2- formiIfuran-4-karb0ksilatin üretimi yolu ile katalize eden bir dehidrojenaza ve/veya bir oksidaza saglanmasi.

2. Istem 1'e ait metot olup, özelligi; içerisinde 2,4-FDCA'nin furan-2,4-dikarbaldehit vei'veya -(hidroksimetil)furoik asit ara ürünlerinden üretilmesi olup, içerisinde: (a) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenazin, 4-HMF'nin turan-2,4- dikarbaldehite ve/veya 4-(hidr0ksimetil)furoik aside dönüsümünü katalize etmesi; ve/veya (b) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenazin, (a)'dan furan-2,4- dikarbaldehitin, 4-formilfuran-2-karboksilata dönüsümünü katalize etmesi; ve/veya (o) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenazin, (a)'dan 4- (hidroksimetil)furoik asidin, 4-f0rmIlfuran-2-karb0ksilata dönüsümünü katalize etmesi; (d) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenazin, (a)'dan furan-2,4- dikarbaldehitin, 2-f0rmilfuran-4-karboksilata dönüsümünü katalize etmesi; ve/veya (e) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenazin, (b) ve/veya (c)'den 4- formiIfuran-2-karboksilatin ya da (d)'den 2-f0rmiIfuran-4-karboksilatin 2,4-FDCA'ya

3. istem 1'e ait metot olup, özelligi; içerisinde (a)'dan gelen metil fosfat sentazin EC numarasi 4.2.3.153 olarak siniflandirilmasidir.

4. istem 3'e ait metot olup, özelligi; içerisinde metil fosfat sentazin (5-f0rmilfuran-3-il)metil fosfat sentaz olmasidir.

5. Istem 4'e ait metot olup, özelligi; içerisinde (5-formilfuran-3-il)metil fosfat sentazin, Man1, Man? ve Man14 arasindan seçilmesidir.

6. Istem 5'e ait metot olup, özellligi; içerisinde (5-formilfuran-3-il)metil fosfat sentazin, SEK ID NO: 1, SEK ID NO: 7 ya da SEK lD NO: 14'ü ihtiva eden bir amino asit sekansini ihtiva etmesidir.

7.Istem 1'e ait metot olup, özelligi; içerisinde (b)'den gelen fosfatazin EC numarasi 3.1.3 olarak siniflandirilmasidir.

8. Istem 5'e ait metot olup, özelligi; içerisinde fosfatazin bir haloasit dehalojenaz olarak siniflandirilmasidir.

9. Istem 1'e ait metot olup, özelligi; içerisinde fosfatazin konakçi için endojen olmasidir.

10. Istem 11'e ait metot olup, özelligi; içerisinde konakçi için endojen olan fosfataz enziminin asiri eksprese edimesidir.

11. Istem 5 - 8'den herhangi birine ait metot olup, özelligi; içerisinde fosfatazin bir 4-HMF fosfataz olmasidir.

12. Istem 11'e ait metot olup, özelligi; içerisinde 4-HMF fosfataz,in Streptomyces coelicolor, Saccharomyces oerevisiae ya da Escherichia coli'den türetilmesidir.

13. Istem 11 ya da 12'ye ait metot olup, özelligi; içerisinde 4-HMF fosfatazin, SEK ID NO: ihtiva eden bir amino asit sekansi tarafindan kodlanmasidir.

14. Istem 1'e ait metot olup, özelligi; içerisinde (c)'den gelen dehidrojenazin EC numarasi 1.1.1 ya da EC numarasi 1.2.1 olarak siniflandirilmasidir.

15. Istem 14'e ait metot olup, özelligi; içerisinde dehidrojenazin bir alkol dehidrojenaz ya da bir aldehit dehidrojenaz olmasidir.

16. Istem 1'e ait metot olupi özelligi; içerisinde (o)'den gelen oksidazin EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilmasidir.

17. Istem 16'ya ait metot olup, özelligi; içerisinde oksidazin 5-hidroksimetilfurfural oksidaz olmasidir.

18. Istem 2'ye ait metot olup, özelligi; içerisinde dehidrojenazin EC numarasi 1.2.1 ya da EC numarasi 1.1.1 olarak siniflandirilmasidir.

19. istem 18'e ait metot olup, özelligi; içerisinde dehidrojenazin bir aldehit dehidrojenaz ya da bir alkol dehidrojenaz olmasidir.

20. Istem 2'ye ait metot olup, özelligi; içerisinde oksidazin EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilmasidir.

21. Istem 20'ya ait metot olup, özelligi; içerisinde oksidazin 5-hidroksimetilfurfural oksidaz olmasidir.

22. Istem 1'e ait metot olup, özelligi; içerisinde oksidazin 4-HMF oksidaz olmasidir.

23. istem 22'ye ait metot olup, özelligi; içerisinde 4-HMF oksidazin HmfH6 ve HmfHT'den seçilmesidir.

24. istem 23'e ait metot olup, özelligi; içerisinde 4-HMF oksidazin SEK ID NO: 85 ya da SEK

25. Istem 2'ye ait metot olup, özelligi; içerisinde dehidrojenazin EC numarasi 1.2.1 olarak siniflandirilmasidir.

26. Istem 25'e ait metot olup, özelligi; içerisinde dehidrojenazin bir aldehit dehidrojenaz olmasidir.

27. Bir karbon kaynagi ihtiva eden bir besleme stokundan 2,4-furandikarboksilik asit (2,4- FDCA) üretebilen nitelikte bir rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde rekombinant mikroorganizmanin asagidakileri eksprese etmesidir: (a) bir karbon kaynagini gliseraldehit 3-fosfata (GBP) dönüstürebilen nitelikte endojen ve/veya eksojen nükleik asit molekülleri; (b) (a)'dan GSP'nin (5-formiIfuran-3-il)metil fosfat'a dönüsümünü katalize eden bir (5- formilfuran-ß-Il)metil fosfat sentazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; (c) (b)'den (5-formilfuran-3-il)metil fosfatin 4-hidroksimetilfurfural'e (4-HMF) dönüsümünü katalize eden bir fosfatazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; (d) dogrudan ya da ara ürünler furan-2,4-dikarbaldehit, 4-(hidr0ksimetil)furoik asit, 4- formilfuran-2-karboksilat, 4-f0rmilfuran-2-karboksilat, 2-formilfuran-4-karboksilatin üretimi yolu ile (C)'den 4-HMF'nin 2,4 FDCA'ya oksidasyonunu bagimsiz olarak ya da sinerji içinde katalize eden bir peroksijenaz, dehidrojenaz ya da bir oksidazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü.

28. istem 27'ye ait rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde karbon kaynaginin, bir heksoz, bir pentoz, gliserol, C02, sakarozlar ve/veya bunlarin kombinasyonlarini ihtiva etmesidir.

29. Istem 27'ye ait rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde (a)'dan gelen metil fosfat sentazin EC numarasi 4.2.3.153 olarak siniflandirilmasidir.

30. Istem 29'a ait rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde sentazin (5- formilfuran-3-il)metil fosfat sentaz olmasidir.

31. Istem 27'ye ait rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde (0)'den gelen fosfatazin EC numarasi 3.1.3 olarak siniflandirilmasidir.

32. Istem 31'e ait rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde fosfatazin bir haloasit dehalojenaz olarak siniflandirilmasidir.

33. Istem 31'ye ait rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde fosfatazin konakçi için endojen olmasidir.

34. Istem 33'ye ait rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde konakçi için endojen olan fosfataz enziminin asiri eksprese edilmesidir.

35. Istem 27'ye ait rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde (d)'den gelen oksidazin EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilmasidir.

36. Istem 35'e ait rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde (d)'den gelen oksidazin bir 5-hidr0ksimetilfurfural oksidaz olmasidir.

37. Istem 36'ya ait rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde (d)'den gelen dehidrojenazin EC numarasi 1.1.1 ya da EC numarasi 1.2.1 olarak siniflandirilmasidir.

38. Istem 37'ye ait rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde dehidrojenazin bir alkol dehidrojenaz ya da bir aldehit dehidrojenaz olmasidir.

39. Istem 27'ye ait rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde 2,4-FDCA'nin, furan-2,4-dikarbaldehit vei'veya-(hidroksimetil)furoik asit ara ürünlerinden üretilmesi olup, içerisinde: (3) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenazin, (c)'den 4-HMF'nin furan-2,4- dikarbaldehite ve/veya 4-(hidroksimetil)furoik aside dönüsümünü katalize etmesi; ve/veya (b) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenazin, (a)'dan furan-2,4-dikarbaldehitin, 4- formilfuran-2-karboksilata dönüsümünü katalize etmesi; ve/veya (o) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenazin, (b)'den 4-(hidroksimetil)furoik asidin, 4-formiIfuran-2-karboksilata dönüsümünü katalize etmesi; ve/veya (d) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenazin, (e)'den furan-2,4- dikarbaldehitin, 2-formilfuran-4-karboksilata dönüsümünü katalize etmesi; ve/veya (e) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenazin, (b) ve/veya (e)'den 4-formilfuran-2- karboksilatin ya da (d)'den 2-formiIfuran-4-karboksilatin 2,4-FDCA'ya dönüsümünü katalize etmesidir.

40. Istem 39'a ait rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde (a), (b), (c), (d) ve/veya (e)'den gelen dehidrojenazin EC numarasi 1.2.1 ya da EC numarasi 1.1.1 olarak siniflandirilmasidir.

41. Istem 40'ye ait rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde dehidrojenazin bir aldehit dehidrojenaz ya da bir alkol dehidrojenaz olmasidir.

42. Istem 39'a ait rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde (a), (b), (0), (d) ve/veya (e)'den gelen oksidazin EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilmasidir.

43. istem 42'e ait rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde oksidazin bir 5- (hidroksimetil)furfural oksidaz olmasidir.

44. istem 27'ye ait rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde bir ya da daha fazla rekombinant mikroorganizmanin Clostridium sp., Clostridium Ijungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ragsdalei, Eubacterium Iimosum, Butyribacterium methylotrophicum, Moorella thermoacetica, Corynebacterium glutamicum, Clostridium aceticum, Acetobaoterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Clostridium drakei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium formicoaceticum, Clostridium soatologenes, Moorella thermoautotrophica, Acetonema Iongum, Blautia producta, Clostridium glycolicum, Clostridium magnum, Candida krusei, Clostridium mayombei, Clostridium methoxybenzovorans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Oxobacter pfennigii, Thermoanaerobacter kivui, Sporomusa ovata, Thermoacetogenium phaeum, Acetobacterium carbinolicum, Issatchenkia orientalis, Sporomusa termitida, Moorella glycerini, Eubacterium aggregans, Treponema azotonutricium, Pichia kudriavzevii, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pseudomonas putida, Bacillus sp, Corynebacterium sp., Yarrowia Iipolytica, Scheffersomyces stipitis ve Terrisporobacter glycolicus'dan olusan gruptan seçilen bir ebeveyn mikroorganizmadan türetilmesidir.

45. Istem 44'ye ait rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde bir ya da daha fazla rekombinant mikroorganizmanin Clostridium sp., Clostridium Ijungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ragsdalei, Eubacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Moorella thermoacetica, Corynebacterium glutamicum, Clostridium aceticum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Clostridium drakei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium formicoaceticum, Clostridium scatologenes, Moorella thermoautotrophica, Acetonema Iongum, Blautia producta, Clostridium glycolicum, Clostridium magnum, Candida krusei, Clostridium mayombei, Clostridium methoxybenzovorans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Oxobacter pfennigii, Thermoanaerobacter kivui, Sporomusa ovata, Thermoacetogenium phaeum, Acetobacterium carbinolicum, Issatchenkia orientalis, Sporomusa termitida, Moorella glycerini, Eubacterium aggregans, Treponema azotonutricium, Pichia kudriavzevii, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pseudomonas putida, Bacillus sp, Corynebacterium sp., Yarrowia Iipolytica, Scheffersomyces stipitis, ve Terrisporobacter glycolicus'dan olusan gruptan seçilen bir ebeveyn mikroorganizmadan türetilmesidir.

46. Istem 27'ye ait rekombinant bir mikroorganizmayi kullanarak 2,4-FDCA üretmeye yönelik bir metot olup, özelligi; metodun, 2,4-FDCA üretilene kadar bir karbon kaynagi saglayan bir besleme stokunu ihtiva eden bir kültür ortaminda rekombinant mikroorganizmanin yetistirilmesini ihtiva etmesidir.

47. Bir karbon kaynagi ihtiva eden bir besleme stokundan 2,4-FDCA üretebilen nitelikte bir rekombinant mikroorganizma üretmenin bir metodu olup, özelligi; metodun, asagidakilerin rekombinant mikroorganizma içine dahil edilmesini vei'veya asiri ekspresyonunu ihtiva etmesidir: (a) gliserolü ya da bir monosakkariti gliseraldehit 3-fosfat (GSF) haline dönüstürebilen nitelikte endojen ve/veya eksojen nükleik asit molekülleri; (b) (a)'dan G3P'nin (5-f0rmiIfuran-3-il)metil fosfat'a dönüsümünü katalize eden bir (5- tormilfuran-S-il)metil fosfat sentazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; (c) (b)'den (5-formilfuran-3-il)metil fosfatin 4-hidroksimetilfurfural'e (4-HMF) dönüsümünü katalize eden bir fosfatazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; (d) dogrudan ya da ara ürünler furan-2,4-dikarbaldehit, 4-(hidroksimetil)fur0ik asit, 4- tormiIfuran-2-karb0ksilat, 4-formiIfuran-2-karboksilat, 2-formilfuran-4-karboksilatiri üretimi yolu ile (c)'den 4-HMF'nin 2,4 FDCA'ya oksidasyonunu bagimsiz olarak ya da Sinerji içinde katalize eden bir peroksijenaz, dehidrojenaz ya da bir oksidazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü.

48. Istem 47'ye ait metot olup, özelligi; içerisinde karbon kaynaginin, bir heksoz, bir pentoz, gliserol, 002, sakarozlar ve/veya bunlarin kombinasyonlarini ihtiva etmesidir.

49. Istem 47'e ait metot olup, özelligi; içerisinde (a)'dan gelen metil fosfat sentazin EC numarasi 4.2.3.153 olarak siniflandirilmasidir.

50. Istem 49'a ait metot olup, özelligi; içerisinde sentazin (5-formilfuran-3-il)metil fosfat sentaz olmasidir.

51. Istem 47'ye ait metot olup, özelligi; içerisinde (c)'den gelen fosfatazin EC numarasi 3.1.3 olarak siniflandirilmasidir.

52. Istem 51'e ait metot olup, özelligi; içerisinde fosfatazin bir haloasit dehalojenaz olarak siniflandirilmasidir.

53. Istem 47'e ait metot olup, özelligi; içerisinde fosfatazin konakçi için endojen olmasidir.

54. Istem 53'e ait metot olup, özelligi; içerisinde konakçi için endojen olan fosfataz enziminin asiri eksprese edilmesidir.

55. Istem 39'a ait metot olup, özelligi; içerisinde (d)'den gelen dehidrojenazin EC numarasi 1.1.1 ya da EC numarasi 1.2.1 olarak siniflandirilmasidir.

56. Istem 47'e ait metot olup, özelligi; içerisinde dehidrojenazin bir alkol dehidrojenaz ya da bir aldehit dehidrojenaz olmasidir.

57. Istem 39'a ait metot olup, özelligi; içerisinde (d)'den gelen oksidazin EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilmasidir.

58. Istem 49'a ait metot olup, özelligi; içerisinde oksidazin (5-(hidroksimetil)furfural oksidaz olmasidir.

59. Istem 39'e ait metot olup, özelligi; içerisinde 2,4-FDCA'nin, furan-2,4-dikarbaldehit vei'veya-(hidroksimetil)furoik asit ara ürünlerinden üretilmesi olup, içerisinde: (a) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenazin, 4-HMF'nin furan-2,4-dikarbaldehite ve/veya 4-(hidr0ksimetil)furoik aside dönüsümünü katalize etmesi; vei'veya (b) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenazin, (a)'dan furan-2,4-dikarbaldehitin, 4- formiIfuran-2-karb0ksilata dönüsümünü katalize etmesi; ve/veya (o) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenazin, (a)'dan 4-(hidroksimetil)furoik asidin, 4-formiIfuran-2-karboksilata dönüsümünü katalize etmesi; ve/veya (d) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenazin, (a)'dan furan-2,4- dikarbaldehitin, 2-formilfuran-4-karb0ksilata dönüsümünü katalize etmesi; ve/veya (e) bir dehidrojenaz, bir oksidaz ya da bir peroksijenazin, (b) ve/veya (e)'den 4- formilfuran-2-karboksilatin ya da (d)'den 2-formilfuran-4-karboksilatiri 2.4-FDCA'ya

60. Istem 59'a ait metot olup, özelligi; içerisinde (a), (b), (c), (d) ve/veya (e)'den gelen dehidrojenazin EC numarasi 1.2.1 ya da EC numarasi 1.1.1 olarak siniflandirilmasidir.

61. Istem 60'a ait metot olup, özelligi; içerisinde dehidrojenazin bir aldehit dehidrojenaz ya da bir alkol dehidrojenaz olmasidir.

62. istem 59'a ait metot olup, özelligi; içerisinde (a), (b), (c), (d) ve/veya (e)'den gelen oksidazin EC numarasi 1.1.3 olarak siniflandirilmasidir.

63. istem 62'ye ait metot olup, özelligi; içerisinde oksidazin 5-(hidroksimetil)furfural oksidaz olmasidir. göre üretilmesidir. rekombinant mikroorganizmaya göre üretilmesidir.

66. Bir polimer olup, özelligi; istem 64 ya da 65'ya ait 2,4-FDCA'dan üretilmesidir.

67. istem 66'ya ait polimer olup, özelligi; içerisinde 2,4-FDCA'dan gelen polimerin, biyolojik olmayan bir islemde olusturulmasidir.

68. Bir eksojen karbon kaynagi ihtiva eden bir besleme stokundan 4-hidroksimetilfurfural (4- HMF) üretebilen nitelikte bir rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde rekombinant mikroorganizmanin asagidakileri eksprese etmesidir: (a) karbon kaynagini gliseraldehit 3-fosfata (G3P) dönüstürebilen nitelikte endojen ve/veya eksojen nükleik asit molekülleri; (b) (a)'dan G3P'nin (5-formiIfuran-3-il)metil fosfat'a dönüsümünü katalize eden bir (5- tormilfuran-S-il)metil fosfat sentazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; ve (c) (b)'den (5-formilfuran-3-il)metil fosfatin 4-hidroksimetilfurfural'e (4-HMF) dönüsümünü katalize eden bir fosfatazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü.

69. Istem @B'ye ait rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde (a)'dan gelen metil fosfat sentazin EC numarasi 4.2.3.153 olarak siniflandirilmasidir.

70. Istem 69'e ait rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde sentazin (5- formilfuran-S-il)metil fosfat sentaz olmasidir.

71. Istem 68'ye ait rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde (0)'den gelen fosfatazin EC numarasi 3.1.3 olarak siniflandirilmasidir.

72. Istem 71'e ait rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde fosfatazin bir haloasit dehalojenaz olarak siniflandirilmasidir.

73. Istem 68'ye ait rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde fosfatazin konakçi için endojen olmasidir.

74. Istem 73'ye ait rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde konakçi için endojen olan fosfataz enziminin asiri eksprese edilmesidir.

75. Bir karbon kaynagi ihtiva eden bir besleme stokundan 2,4-furandikarboksilik asit (2,4- FDCA) üretebilen nitelikte bir rekombinant mikroorganizma olup, özelligi; içerisinde rekombinant mikroorganizmanin asagidakilerden birini ya da daha fazlasini eksprese etmesidir: (a) gliserolü ya da bir monosakkariti gliseraldehit 3-fosfat (GBP) haline dönüstürebilen nitelikte endojen ve/veya eksojen nükleik asit molekülleri; (b) (a)'dan G3P'nin (5-formiIfuran-S-il)metil fosfat'a dönüsümünü katalize eden bir (5- formilfuran-S-il)metil fosfat sentazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; (c) (b)'den (5-f0rmilfuran-3-il)metil fosfatin 4-hidroksimetilfurfural'e (4-HMF) dönüsümünü katalize eden bir fosfatazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü; (cl) dogrudan ya da ara ürünler furan-2,4-dikarbaldehit, 4-(hidr0ksimetil)furoik asit, 4- formilfuran-2-karb0ksilat, 4-formiIfuran-2-karboksilat, 2-formiIfuran-4-karb0ksilatin üretimi yolu ile (b)'den 4-HMF'nin 2,4 FDCA'ya oksidasyonunu bagimsiz olarak ya da Sinerji içinde katalize eden bir dehidrojenaz ve/veya bir oksidazi kodlayan en az bir endojen ya da eksojen nükleik asit molekülü.