ES2813074T3 - Anticuerpos anti-CD3 y métodos de uso - Google Patents

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Xiaocheng Chen
Allen J Ebens
Teemu T Junttila
Robert F Kelley
Mary A Mathieu
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Abstract

Un anticuerpo anti-CD3 que es un anticuerpo biespecífico, en donde el anticuerpo biespecífico comprende un brazo anti-CD3 que comprende un primer dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 184 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 185 y un brazo anti-HER2 que comprende un segundo dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 270 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 271.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-CD3 y métodos de uso
Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos anti-grupo de diferenciación 3 (CD3) y a métodos de uso de los mismos.
Antecedentes
Los trastornos de la proliferación celular, tales como el cáncer, se caracterizan por el crecimiento descontrolado de subpoblaciones de células. Son la principal causa de muerte en los países desarrollados y la segunda principal causa de muerte en los países en desarrollo, diagnosticándose más de 12 millones de nuevos casos de cáncer y produciéndose 7 millones de muertes a causa del cáncer cada año. El National Cancer Institute estima que más de medio millón de estadounidenses fallecerán a causa del cáncer en 2013, lo que representa aproximadamente una de cada cuatro muertes en el país. Debido al aumento de la población de la tercera edad, la incidencia del cáncer ha aumentado concurrentemente, ya que la probabilidad de desarrollar cáncer es más de dos veces mayor superados los setenta años. Por tanto, el tratamiento del cáncer representa una carga para la sociedad significativa y permanentemente creciente.
Desde hace tiempo, las estrategias de tratamiento del cáncer incluyen quimioterapia, radioterapia y cirugía para retirar los tumores sólidos. Recientemente, se han desarrollado inmunoterapias a base de anticuerpos biespecíficos. Dichos anticuerpos biespecíficos tienen la capacidad de unirse simultáneamente a antígenos de la superficie celular en células citotóxicas y células tumorales, con el objetivo de que la célula citotóxica unida destruya a la célula tumoral unida. El documento WO 2008/119566 divulga moléculas biespecíficas que se unen a CD3e y por ejemplo, a HER2. El documento WO 2011/131746 describe proteínas heterodiméricas que contienen Fc de anticuerpo, tales como anticuerpos biespecíficos que incluyen anticuerpos anti-CD3xHER2 heterodiméricos que contienen Fc. Los anticuerpos biespecíficos existentes que en la actualidad se encuentran en ensayo clínico para el tratamiento del cáncer están limitados por sus cortas semividas y/o eficacia variable. Por tanto, hay una necesidad no satisfecha en el campo para el desarrollo de anticuerpos biespecíficos eficaces para su uso en el tratamiento del cáncer.
Sumario
La materia objeto de la invención se define por las reivindicaciones adjuntas. La presente invención se refiere a anticuerpos anti-grupo de diferenciación 3 (CD3) y a usos de los mismos como se define por las reivindicaciones adjuntas.
En un aspecto, la invención presenta un anticuerpo anti-CD3 que es un anticuerpo biespecífico, en donde el anticuerpo biespecífico comprende un brazo anti-CD3 que comprende un primer dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 184 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 185 y un brazo anti-HER2 que comprende un segundo dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 270 y (b) un dominio Vl que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 271.
En algunas realizaciones, el dominio de unión de los anticuerpos anti-CD3 se une a un polipéptido CD3 humano o a un polipéptido CD3 de mono cinomolgo (cino). En algunas realizaciones, el polipéptido de CD3 humano o el polipéptido de CD3 de cino es un polipéptido de CD3e humano o un polipéptido de CD3e de cino, respectivamente. En algunas realizaciones, el polipéptido de CD3 humano o el polipéptido de CD3 de cino es un polipéptido de CD3y humano o un polipéptido de c D3y de cino, respectivamente.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-CD3 pueden comprender una mutación de sitio de aglucosilación. En algunas realizaciones, la mutación de sitio de aglucosilación es una mutación de sustitución. En algunas realizaciones, la mutación de sustitución se encuentra en el resto de aminoácido N297, L234, L235 y/o D265 (numeración de EU). En algunas realizaciones, la mutación de sustitución se selecciona entre el grupo que consiste en N297G, N297A, L234A, L235A y D265A. En algunas realizaciones, la mutación de sustitución es una mutación N297G. En algunas realizaciones, la mutación de sitio de aglucosilación reduce la función efectora del anticuerpo anti-CD3. En algunas realizaciones, la mutación de sitio de aglucosilación reduce la función efectora del anticuerpo anti-CD3. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD3 comprende una mutación de sustitución en la región Fc que reduce la función efectora.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-CD3 pueden ser monoclonales, humanizados o quiméricos. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-CD3 pueden ser un fragmento de anticuerpo que se une a CD3. En algunas realizaciones, el fragmento de anticuerpo se selecciona entre el grupo que consiste en fragmentos Fab, Fab'-SH, Fv, scFv y (Fab')2. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-CD3 es un anticuerpo de longitud completa. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD3 es un anticuerpo IgG (por ejemplo, un anticuerpo IgG1, IgG2 o IgG3). En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD3 es un anticuerpo de acoplamiento a linfocitos T biespecífico (BiTE®).
En algunas realizaciones de la divulgación, el antígeno tumoral es HER2 y el segundo dominio de unión comprende las seis HVR a continuación: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 169; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 170; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 171; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 172; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 173; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 174. En algunas realizaciones, el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 270. En algunas realizaciones, el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 271.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-CD3 pueden comprender uno o más dominios constantes de cadena pesada, en donde los uno o más dominios constantes de cadena pesada se seleccionan entre un primer dominio CH1 (CH11), un primer dominio CH2 (CH2i), un primer dominio CH3 (CH3i), un segundo dominio CH1 (CH12), un segundo dominio CH2 (CH22) y un segundo dominio CH3 (CH32). En algunas realizaciones, al menos uno de los uno o más dominios constantes de cadena pesada se empareja con otro dominio constante de cadena pesada. En algunas realizaciones, cada uno de los dominios CH3i y CH32 comprenden una protuberancia o cavidad y en donde la protuberancia o la cavidad en el dominio CH3i puede posicionarse en la cavidad o protuberancia, respectivamente, en el dominio CH32. En algunas realizaciones, los dominios CH3i y CH32 se encuentran en una interfaz entre dicha protuberancia y cavidad. En algunas realizaciones, cada uno de los dominios CH2i y CH22 comprenden una protuberancia o cavidad y en donde la protuberancia o la cavidad en el dominio CH2i puede posicionarse en la cavidad o protuberancia, respectivamente, en el dominio CH22. En algunas realizaciones, los dominios CH2i y CH22 se encuentran en una interfaz entre dicha protuberancia y cavidad.
En algunas realizaciones, la semivida de uno cualquiera de los anticuerpos anti-CD3 anteriores puede ser de aproximadamente 7 días.
En algunas realizaciones, la invención presenta un inmunoconjugado que comprende los anticuerpos anti-CD3 conjugados a un agente citotóxico. También se proporciona una composición que comprende los anticuerpos anti-CD3. En algunas realizaciones, la composición comprende además un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición es una composición farmacéutica. En algunas realizaciones, la composición comprende además un antagonista de unión al eje de PD-1 o un agente terapéutico adicional. En otro aspecto, la invención presenta un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos anti-CD3 divulgados en el presente documento, que comprende un vector (por ejemplo, un vector de expresión) para expresar el anticuerpo.
En otro aspecto, la invención presenta células hospedadoras que comprenden los ácidos nucleicos y/o vectores anteriores. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula de mamífero (por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO)). En otras realizaciones, la célula hospedadora es una célula procariota (por ejemplo, una célula de E. coli). También se proporciona un método para producir uno cualquiera de los anticuerpos anti-CD3 anteriores, comprendiendo el método cultivar la célula hospedadora que produce el anticuerpo anti-CD3 y recuperar el anticuerpo anti-CD3 de la célula hospedadora o del medio de cultivo.
En algunos aspectos, los anticuerpos anti-CD3 pueden ser para su uso como medicamento. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-CD3 pueden ser para su uso en el tratamiento o el retraso de la progresión de un trastorno proliferativo celular en un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-CD3 pueden ser para su uso en la potenciación de la función inmunitaria en un sujeto que tenga un trastorno proliferativo celular.
Un aspecto adicional de la divulgación es un método para tratar o retrasar la progresión de un trastorno proliferativo celular o un trastorno autoinmunitario en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de uno cualquiera de los anticuerpos anti-CD3 anteriores. En otro aspecto, la invención presenta uno cualquiera de los anticuerpos anti-CD3 anteriores para su uso en un método para potenciar la función inmunitaria en un sujeto que tenga un trastorno proliferativo celular o un trastorno autoinmunitario, comprendiendo el método administrar al sujeto dichos anticuerpos anti-CD3. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD3 se une a (a) una molécula de CD3 ubicada en una célula efectora inmunitaria y (b) una segunda molécula biológica ubicada en una célula diana distinta de la célula efectora inmunitaria. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD3 activa a la célula efectora inmunitaria después de la unión a (a) y (b). En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria activada es capaz de ejercer un efecto citotóxico y/o un efecto apoptótico en la célula diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD3 se administra al sujeto en una dosis de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD3 se administra al sujeto en una dosis de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD3 se administra al sujeto en una dosis de aproximadamente 1 mg/kg. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD3 se administra por vía subcutánea, por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía tópica, por vía oral, por vía transdérmica, por vía intraperitoneal, por vía intraorbital, mediante implante, mediante inhalación, por vía intratecal, por vía intraventricular o por vía intranasal. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD3 se administra por vía subcutánea. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD3 se administra por vía intravenosa.
En algunas realizaciones, el método comprende además administrar al sujeto un antagonista de unión al eje de PD-1 o un agente terapéutico adicional. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional se administra antes o después de la administración del anticuerpo anti-CD3. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional se administra de manera concurrente con el anticuerpo anti-CD3. En algunas realizaciones, el antagonista de unión al eje de PD-1 se selecciona entre el grupo que consiste en un antagonista de unión a PD-1, un antagonista de unión a PD-L1 y un antagonista de unión a PD-L2. En algunas realizaciones, el antagonista de unión al eje de PD-1 es un antagonista de unión a PD-1. En algunas realizaciones, el antagonista de unión al eje de PD-1 se selecciona entre el grupo que consiste en MDX-1106 (nivolumab), MK-3475 (lambrolizumab), CT-011 (pidilizumab) y AMP-224. En otras realizaciones, el antagonista de unión al eje de PD-1 es un antagonista de unión a PD-L1. En algunas realizaciones, el antagonista de unión a PD-L1 se selecciona entre el grupo que consiste en: YW243.55.S70, MPDL3280A, MDX-1105 y MEDI4736. En otras realizaciones, el antagonista de unión al eje de PD-1 es un antagonista de unión a PD-L2. En algunas realizaciones, el antagonista de unión a PD-L2 es un anticuerpo o una inmunoadhesina.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD3 comprende un brazo anti-HER2 que comprende una mutación de sustitución N297G. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD3 comprende un brazo anti-CD3 que comprende las mutaciones de sustitución T366S, L368A, Y407V y/o N297G y un brazo anti-HER2 que comprende las mutaciones de sustitución N297G, N297A, L234A, L235A y/o D265A. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD3 comprende un brazo anti-CD3 que comprende una mutación de sustitución N297G. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD3 comprende un brazo anti-HER2 que comprende las mutaciones de sustitución T366S, L368A, Y407V y/o N297G y un brazo anti-CD3 que comprende las mutaciones de sustitución N297G, N297A, L234A, L235A y/o D265a .
En algunas realizaciones, el método comprende además administrar al sujeto un glucocorticoide. En algunas realizaciones, el glucocorticoide se selecciona entre el grupo que consiste en dexametasona, hidrocortisona, cortisona, prednisolona, prednisona, metilprednisona, triamcinolona, parametasona, betametasona, fludrocortisona y ésteres, sales y complejos farmacéuticamente aceptables de los mismos. En algunas realizaciones, el glucocorticoide es dexametasona. En algunas realizaciones, el glucocorticoide es un éster, sal o complejo farmacéuticamente aceptable de la dexametasona.
En algunas realizaciones, el método comprende además administrar al sujeto rituximab.
En algunas realizaciones, el método comprende además administrar al sujeto obinutuzumab.
En algunas realizaciones, el método comprende además administrar al sujeto un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC).
En cualquiera de los usos anteriores, el trastorno proliferativo celular puede ser cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón no microcítico, linfoma no Hodgkin (NHL), linfoma de linfocitos B, leucemia de linfocitos B, mieloma múltiple, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de ovario, mesotelioma, glioblastoma, DLBCL similar a linfocitos B del centro germinal (GCB), DLBCL similar a linfocitos B activados (ABC), linfoma folicular (FL), linfoma de células del manto (MCL), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfoide crónica (CLL), linfoma de la zona marginal (MZL), leucemia linfocítica microcítica (SLL), linfoma linfoplasmacítico (LL), macroglobulinemia de Waldenstrom (WM), linfoma del sistema nervioso central (CNSL), linfoma de Burkitt (BL), leucemia prolinfocítica de linfocitos B, linfoma esplénico de la zona marginal, tricoleucemia, linfoma/leucemia esplénica, no clasificable, linfoma de linfocitos B pequeños de la pulpa roja difusa esplénica, variante de tricoleucemia, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedades de cadenas pesadas, enfermedad de cadena pesada a, enfermedad de cadena pesada y, enfermedad de cadena pesada p, mieloma de células plasmáticas, plasmacitoma solitario del hueso, plasmacitoma extraóseo, linfoma de la zona marginal extranodal de tejido linfoide asociado a mucosa (linfoma m AlT), linfoma de la zona marginal nodal, linfoma de la zona marginal nodal pediátrico, linfoma folicular pediátrico, linfoma del centro folicular cutáneo primario, linfoma de linfocitos B grandes rico en linfocitos T/histiocitos, DLBCL primario del SNC, DLBCL cutáneo primario, tipo pierna, DLBCL positivo a EBV en ancianos, DLBCL asociado con inflamación crónica, granulomatosis linfomatoide, linfoma de linfocitos B grandes mediastinales (tímicos) primario, linfoma de linfocitos B grandes intravascular, linfoma de linfocitos B grandes positivos a ALK, linfoma plasmablástico, linfoma de linfocitos B grandes que surge en enfermedad de Castleman multicéntrica asociada con HHV8, linfoma de efusión primario: linfoma de linfocitos B, no clasificable, con características intermedias entre el linfoma difuso de linfocitos B grandes y linfoma de Burkitt y linfoma de linfocitos B, no clasificable, con características intermedias entre el linfoma difuso de linfocitos B grandes y el linfoma de Hodgkin clásico. En algunas realizaciones, el cáncer preferido es DLBCL similar a linfocitos B del centro germinal (GCB), DLBCL similar a linfocitos B activados (ABC), linfoma folicular (FL), linfoma de células del manto (MCL), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfoide crónica (CLL), linfoma de la zona marginal (MZL), leucemia linfocítica microcítica (SLL), linfoma linfoplasmacítico (LL), macroglobulinemia de Waldenstrom (WM), linfoma del sistema nervioso central (CNSL) o linfoma de Burkitt (BL).
En cualquiera de los usos anteriores, el trastorno autoinmunitario puede seleccionarse entre el grupo que consiste en artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, lupus eritematoso sistémico (SLE), enfermedad de Wegener, enteropatía inflamatoria, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), trombocitopenia autoinmunitaria, esclerosis múltiple, psoriasis, nefropatía por IgA, polineuropatías por IgM, miastenia grave, vasculitis, diabetes mellitus, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjogren, glomerulonefritis, neuromielitis óptica (NMO) y neuropatía por IgG.
En otro aspecto, la divulgación presenta un kit que comprende: (a) una composición que comprende uno cualquiera de los anticuerpos anti-CD3 anteriores y (b) un prospecto que comprende instrucciones para administrar la composición a un sujeto para tratar o retrasar la progresión de un trastorno proliferativo celular.
En cualquiera de los usos anteriores, el sujeto puede ser un ser humano.
Breve descripción de los dibujos
La FIGURA 1 muestra la secuencia de aminoácidos de CD3ey humano monocatenario con una secuencia enlazadora de 26 mero usada en experimentos de mapeo de epítopos de CD3 (SEQ ID NO: 282).
La FIGURA 2A es una tabla que resume la caracterización de clones de hibridoma seleccionados. La tabla resume los resultados de los experimentos ELISA de unión a CD3 usando CD3e1'27-Fc humano y de cino; experimentos de unión FACS que usan linfocitos T Jurkat, PBMC humanas y PBMC de cino; experimentos de activación de linfocitos T que usan análisis FACS; y experimentos de determinación de isotipo.
La FIGURA 2B es una tabla que resume las afinidades de unión (valores de Kd) de clones de hibridoma seleccionados para un antígeno CD3ey humano comercial.
La FIGURA 3A es una tabla que resume la caracterización de hibridomas seleccionados. La tabla resume los resultados de los experimentos ELISA de unión a CD3 usando CD3£1-27-Fc humano y de cino; experimentos de unión FACS que usan linfocitos T Jurkat, PBMC humanas y PBMC de cino; experimentos de activación de linfocitos T que usan análisis FACS; y experimentos de determinación de isotipo.
Las FIGURAS 3B y 3C son tablas que resumen las afinidades de unión (valores de Kd) de clones de hibridoma seleccionados. La FIGURA 4A muestra las secuencias de aminoácidos de los dominios variables de cadena ligera de los anticuerpos anti-CD3. Las secuencias de HVR están delimitadas por las cajas indicadas para cada uno de los anticuerpos.
La FIGURA 4B muestra las secuencias de aminoácidos de los dominios variables de cadena ligera de los anticuerpos anti-CD3.
La FIGURA 4C muestra las secuencias de aminoácidos de los dominios variables de cadena pesada de los anticuerpos anti-CD3.
La FIGURA 5A muestra las secuencias de aminoácidos de los dominios variables de cadena ligera de los anticuerpos anti-CD3.
La FIGURA 5B muestra las secuencias de aminoácidos de los dominios variables de cadena pesada de los anticuerpos anti-CD3.
La FIGURA 6A muestra las secuencias de aminoácidos de los dominios variables de cadena ligera del anticuerpo anti-CD321A9 y Rab17.
La FIGURA 6B muestra las secuencias de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CD321A9 y Rab17.
La FIGURA 7 es un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera (parte superior) y dominio variable de cadena pesada (parte inferior) de anticuerpos anti-CD3 que muestran la secuencia consenso, 40G5c, procedente de los anticuerpos clonales relacionados.
La FIGURA 8A es un alineamiento de secuencia de las secuencias de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera (parte superior) y dominio variable de cadena pesada (parte inferior) del anticuerpo anti-CD3 13A3 y una variante humanizada del mismo (hu13A3).
La FIGURA 8B es un alineamiento de secuencia de las secuencias de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera (parte superior) y dominio variable de cadena pesada (parte inferior) del anticuerpo anti-CD3 30A1 y una variante humanizada del mismo (hu30A1).
La FIGURA 8C es un alineamiento de secuencia de las secuencias de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera (parte superior) y dominio variable de cadena pesada (parte inferior) del anticuerpo anti-CD341D9a y una variante humanizada del mismo (hu41D9a).
La FIGURA 8D es un alineamiento de secuencia de las secuencias de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera (parte superior) y dominio variable de cadena pesada (parte inferior) del anticuerpo anti-CD3 SP34 y una variante humanizada del mismo (huSP34).
La FIGURA 8E es un alineamiento de secuencia de las secuencias de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera (parte superior) y dominio variable de cadena pesada (parte inferior) del anticuerpo anti-CD3 38E4 y una variante humanizada del mismo (hu38E4).
La FIGURA 8F es un alineamiento de secuencia de las secuencias de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera (parte superior) y dominio variable de cadena pesada (parte inferior) del anticuerpo anti-CD3 40G5 y una variante humanizada del mismo (hu40G5).
La FIGURA 9A es una tabla que resume variantes humanizadas seleccionadas del anticuerpo anti-CD3 13A3 y sus afinidades de unión, ensayadas usando CD3e comercial (Creative Biomart, Shirley, NY; número de catálogo CD3E-2194H).
La FIGURA 9B es una tabla que resume variantes humanizadas seleccionadas del anticuerpo anti-CD3 30A1 y sus afinidades de unión, ensayadas usando CD3e comercial (Creative Biomart, Shirley, NY; número de catálogo CD3E-2194H).
La FIGURA 9C es una tabla que resume variantes humanizadas seleccionadas del anticuerpo anti-CD341D9a y sus afinidades de unión, ensayadas usando CD3e comercial (Creative Biomart, Shirley, NY; número de catálogo CD3E-2194H).
La FIGURA 9D es una tabla que resume variantes humanizadas seleccionadas del anticuerpo anti-CD3 SP34 y sus afinidades de unión, ensayadas usando CD3e comercial (Creative Biomart, Shirley, NY; número de catálogo CD3E-2194H).
La FIGURA 9E es una tabla que resume variantes humanizadas seleccionadas del anticuerpo anti-CD3 38E4 y sus afinidades de unión, ensayadas usando CD3e comercial (Creative Biomart, Shirley, NY; número de catálogo CD3E-2194H).
La FIGURA 9F es una tabla que resume variantes humanizadas seleccionadas del anticuerpo anti-CD340G5c y sus afinidades de unión, ensayadas usando CD3e comercial (Creative Biomart, Shirley, NY; número de catálogo CD3E-2194H).
La FIGURA 10 es una tabla que resume la afinidad de unión de anticuerpos anti-CD3 humanizados por varios antígenos CD3e.
La FIGURA 11 es una tabla que resume la afinidad de unión de los anticuerpos anti-CD3 humanizados 38E4v1 a 38E4v9 y 40G5c, medida mediante Biacore con CD3ey humano sobre placa y anticuerpos anti-CD3 en el flujo pasante.
La FIGURA 12A es una tabla que resume las afinidades de unión relativas para mutantes individuales de alanina, serina, treonina o glutamato del anticuerpo anti-CD3 humanizado 38E4v1 que tiene una sola mutación o bien en la HVR-L3 o en la HVR-H3, en comparación con 38E4v1 usando análisis cinético Biacore de un solo ciclo o convencional de múltiples ciclos.
La FIGURA 12B muestra las secuencias de aminoácidos de HVR-L3 (parte superior) y HVR-H3 (parte inferior) del anticuerpo anti-CD3 humanizado 38E4v1.
La FIGURA 13A es una serie de gráficas que muestran la unidad relativa del anticuerpo anti-CD3 indicado a variantes de alanina de CD3e1'27-Fc.
La FIGURA 13B es una gráfica que muestra la fracción relativa de mutantes de fagémido de barrido de alanina de CD3ey unidos a los anticuerpos anti-CD338E4.v1, 40G5c y SP34.v52, en comparación con la unión a fago CD3ey de tipo silvestre.
La FIGURA 13C es una serie de gráficas que muestran la unión relativa de los anticuerpos anti-CD3 38E4.v1, 40G5c y SP34.v52 a mutantes seleccionados de fagémido de barrido de alanina de CD3ey en función de la concentración de fago.
La FIGURA 13D es un conjunto de tablas que muestran las afinidades de unión relativas de los anticuerpos anti-CD3 SP34.v52 y 38E4v1 a mutantes de barrido de alanina de CD3ey seleccionados, determinadas mediante Biacore. NB = sin unión detectable.
La FIGURA 14A muestra la secuencia del polipéptido 16-mero de CD3e usado en los ensayos de cocristalización con 38E4.v1 Fab. Las FIGURAS 14B-14F son una serie de renderizados de la estructura cristalina que muestran diferentes vistas del complejo hu38E4.v1 Fab/péptido CD3e.
La FIGURA 14G es un alineamiento de secuencia de las secuencias de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera (parte superior) y dominio variable de cadena pesada (parte inferior) de los anticuerpos anti-CD3 hu40G5c y hu38E4.v1, con los restos de cada anticuerpo que son importantes para la unión a CD3 (restos de contacto) rodeados por un círculo en el alineamiento. Se observó que los restos rodeados por un círculo se encuentran a menos de 5 A del péptido de CD3, como se determina mediante el análisis cristalográfico. A indica las posiciones de Vernier (por referencia, véase, por ejemplo, Foote y Winter. JMB. 224: 487, 1992); * indica interacciones FW-HVR (por referencia, véase, por ejemplo, Padlan et al. Mol. Immunol. 31: 169, 1994); y • indica interacciones VH-VL (por referencia, véase, por ejemplo, Padlan et al. Mol. Immunol. 31: 169, 1994).
La FIGURA 14H es un renderizado de la estructura cristalina del polipéptido CD3e unido al Fab hu38E4.v1. Todos los restos de contacto con el antígeno se representan en amarillo. Todos los restos de contacto son idénticos entre hu38E4.v1 y hu40G5, excepto por que G96 (representado en color naranja) es S96 en hu40G5.
Las FIGURAS 14I y 14J son renderizados de diagramas de cintas de las estructuras cristalinas del Fab hu38E4.v1 y el Fab SP34v52, respectivamente, en la misma orientación, superpuestas con la región VL con un RMS = 2,24. La FIGURA 14K es una renderización de modelo de rellenado espacial del Fab hu38E4.v1 en complejo con el péptido N-terminal de CD3e unido en el surco entre las cadenas pesada (cian) y ligera (púrpura).
La FIGURA 14L es una renderización de modelo de rellenado espacial del Fab SP34v52 con el péptido N-terminal de CD3e superpuesto en la misma orientación que en el complejo de CD3E/Fab hu38E4.v1 representado en la figura 14K. Los restos R50 y R52 (en naranja) de la HVR-H2 del Fab SP34v52 son importantes para la unión a CD3. Los choques evidentes del péptido de CD3 con el Fab SP34v52 se indican mediante flechas.
La FIGURA 14M es una renderización de estructura cristalina del hu38E4.v1 en complejo con el péptido N-terminal de CD3ey e ilustra las interacciones intermoleculares clave implicadas en el primer resto de piroglutamato y el sexto resto (E6) en CD3ey. Los potenciales enlaces de hidrógeno se muestran como líneas discontinuas.
La FIGURA 14N es una renderización de modelo de rellenado espacial del Fab hu38E4.v1 en complejo con el péptido N-terminal de CD3ey unido en el surco entre las cadenas pesada (cian) y ligera (púrpura). El quinto resto (E5) ilustrado, está orientado hacia fuera del sitio interactivo que contiene el sexto resto (E6) del complejo del péptido N-terminal de CD3ey y el Fab.
La FIGURA 15 representa una generalización esquemática de la formación de anticuerpo TDB. El TDB particular representado se muestra como un TDB de longitud completa en formato de botón en ojal (KIH), que puede poseer una mutación de aglucosilación, si se produce por una célula eucariota (por ejemplo, una célula CHO). En un formato alternativo, el botón puede estar presente en el brazo de anti-CD3 y el ojal puede estar presente en el brazo de antígeno antitumoral. Este formato también puede poseer una mutación de aglucosilación, si se produce por una célula eucariota (por ejemplo, una célula CHO).
La FIGURA 16 son gráficas que muestran los resultados de ensayos de unión de FACS in vitro de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones brazos de anti-CD3 de la serie UCHT1 y brazos de anti-CD20 de la serie 2H7. Unión a la línea celular de tumor B Bjab (unión a CD20), izquierda. unión a células Jurkat (unión a CD3), derecha.
La FIGURA 17 es un conjunto de tablas que resumen las afinidades de unión monovalentes (parte superior) y (bivalentes) como valores de Kd para diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 de la serie UCHT1 y brazos de anti-CD20 de la serie 2H7.
La FIGURA 18 es una gráfica que muestra los resultados de ensayos FACS de unión a células Jurkat (unión a CD3) in vitro de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16.
La FIGURA 19 es una gráfica que muestra los resultados de ensayos FACS de unión a células Jurkat (unión a CD3) in vitro de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16.
La FIGURA 20 es una gráfica que muestra los resultados de ensayos FACS de unión a células Bjab (unión a CD20) in vitro de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16.
Las FIGURAS 21A y 21B son gráficas que muestran los resultados de ensayos FACS de unión a células Jurkat (unión a CD3) in vitro de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16.
La FIGURA 21C es una tabla que resume la CE50 (pg/ml) para cada TDB para CD3/CD20 ensayado en las figuras 21A y 21B.
Las FIGURAS 22A y 22B son gráficas que muestran los resultados de ensayos FACS de unión a células Bjab (unión a CD20) in vitro de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16.
La FIGURA 23 es una gráfica que muestra los resultados de ensayos FACS de unión a células Jurkat (unión a CD3) in vitro de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16.
La FIGURA 24 es una tabla que resume las afinidades de unión para varios TDB y Fab para CD3/CD20, medidas mediante análisis Biacore con CD3ey humano sobre placa y TDB o Fab para CD3/CD20 en el flujo pasante. La FIGURA 25A es una gráfica que muestra el porcentaje de activación de linfocitos T, medido mediante la expresión superficial de CD69 y CD25, después de 24 horas de incubación de los TDB para CD3/CD20 especificados (serie 2H7) con 20.000 células Bjab y linfocitos T huCD8+ purificados 5x.
La FIGURA 25B es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de Bjab en relación con un control no tratado con TDB, después de 24 horas de incubación de los TDB para CD3/CD20 especificados (serie 2H7) con 20.000 células Bjab y linfocitos T huCD8+ purificados 5x, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 26A es una gráfica que muestra el porcentaje de activación de linfocitos T, medido mediante la expresión superficial de CD69 y CD25, después de 24 horas de incubación de los TDB para CD3/CD20 especificados (serie 2H7) con 200.000 PBMC humanas por pocillo.
La FIGURA 26B es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de linfocitos B endógenos (endo) en relación con un control no tratado con TDB, después de 24 horas de incubación de los TDB para CD3/CD20 especificados (serie 2H7) con 200.000 PBMC humanas por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 27A es una gráfica que muestra el porcentaje de activación de linfocitos T, medido mediante la expresión superficial de CD69 y CD25, después de 24 horas de incubación de los TDB para CD3/CD20 especificados (serie UCHT1) con 20.000 células Bjab y linfocitos T huCD8+ purificados 5x.
La FIGURA 27B es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de Bjab en relación con un control no tratado con TDB, después de 24 horas de incubación de los TDB para CD3/CD20 especificados (serie UCHT1) con 20.000 células Bjab y linfocitos T huCD8+ purificados 5x, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 28A es una gráfica que muestra el porcentaje de activación de linfocitos T, medido mediante la expresión superficial de CD69 y CD25, después de 24 horas de incubación de los TDB para CD3/CD20 especificados (serie UCHT1) con 200.000 PBMC humanas por pocillo.
La FIGURA 28B es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de linfocitos B endo en relación con un control no tratado con TDB, después de 24 horas de incubación de los TDB para CD3/CD20 especificados (serie UCHT1) con 200.000 PBMC humanas por pocillo, medida mediante análisis Fa CS.
La FIGURA 29A es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de linfocitos B endo en relación con un control no tratado con TDB, después de 24 horas de incubación de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16, con 200.000 PBMC humanas (aisladas del donante n.° 3) por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 29B es una gráfica que muestra el porcentaje de activación de linfocitos T, medido mediante la expresión superficial de CD69 y c D25, después de 24 horas de incubación de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16, con 200.000 PBMc humanas (aisladas del donante n.° 3) por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 30A es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de linfocitos B endo en relación con un control no tratado con TDB, después de 24 horas de incubación de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16, con 200.000 PBMC humanas (aisladas del donante n.° 4) por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 30B es una gráfica que muestra el porcentaje de activación de linfocitos T, medido mediante la expresión superficial de CD69 y c D25, después de 24 horas de incubación de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16, con 200.000 PBMc humanas (aisladas del donante n.° 4) por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 31A es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de linfocitos B endo en relación con un control no tratado con TDB, después de 24 horas de incubación de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16, con 200.000 PBMC de cino (aisladas del donante n.° 2) por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 31B es una gráfica que muestra el porcentaje de activación de linfocitos T, medido mediante la expresión superficial de CD69 y CD25, después de 24 horas de incubación de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16, con 200.000 PBMC de cino (aisladas del donante n.° 2) por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 32A es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de linfocitos B endo en relación con un control no tratado con TDB, después de 24 horas de incubación de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16, con 200.000 PBMC de cino (aisladas del donante n.° 3) por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 32B es una gráfica que muestra el porcentaje de activación de linfocitos T, medido mediante la expresión superficial de CD69 y c D25, después de 24 horas de incubación de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16, con 200.000 PBMC de cino (aisladas del donante n.° 3) por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 33A es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de células Bjab en relación con un control no tratado con TDB, después de 24 horas de incubación de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16, con 200.000 PBMC de cino por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 33B es una gráfica que muestra el porcentaje de activación de linfocitos T, medido mediante la expresión superficial de CD69 y CD25, después de 24 horas de incubación de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16, con 200.000 PBMC de cino por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 34A es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de linfocitos B endo en relación con un control no tratado con TDB, después de 24 horas de incubación de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16, con 200.000 PBMC humanas (aisladas del donante n.° 2) por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 34B es una gráfica que muestra el porcentaje de activación de linfocitos T, medido mediante la expresión superficial de CD69 y CD25, después de 24 horas de incubación de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16, con 200.000 PBMc humanas (aisladas del donante n.° 2) por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 35A es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de linfocitos B endo en relación con un control no tratado con TDB, después de 24 horas de incubación de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16, con 200.000 PBMC humanas (aisladas del donante n.° 3) por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 35B es una gráfica que muestra el porcentaje de activación de linfocitos T, medido mediante la expresión superficial de CD69 y CD25, después de 24 horas de incubación de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16, con 200.000 PBMc humanas (aisladas del donante n.° 3) por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 36A es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de linfocitos B endo en relación con un control no tratado con TDB, después de 24 horas de incubación de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16, con 200.000 PBMC humanas (aisladas del donante n.° 4) por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 36B es una gráfica que muestra el porcentaje de activación de linfocitos T, medido mediante la expresión superficial de CD69 y CD25, después de 24 horas de incubación de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16, con 200.000 PBMc humanas (aisladas del donante n.° 4) por pocillo, medida mediante análisis FACS.
Las FIGURAS 37A y 37B son gráficas que muestran el porcentaje de activación de linfocitos T, medido mediante la expresión superficial de CD69 y CD25, después de 24 horas de incubación de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16, con 200.000 PBMC humanas (aisladas del donante n.° 1) por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 37C es una tabla que resume la CE50 de activación de linfocitos T CD8+ (ng/ml) para cada TDB para CD3/CD20 ensayado en las figuras 37A y 37B.
Las FIGURAS 38A y 38B son gráficas que muestran el porcentaje de eliminación de B endo en relación con un control no tratado con TDB, después de 24 horas de incubación de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16, con 200.000 PBMC humanas (aisladas del donante n.° 1) por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 38C es una tabla que resume la CE50 de eliminación de linfocitos B endo (ng/ml) para cada TDB para CD3/CD20 ensayado en las figuras 38A y 38B.
Las FIGURAS 39A y 39B son gráficas que muestran el porcentaje de activación de linfocitos T, medido mediante la expresión superficial de CD69 y CD25, después de 48 horas de incubación de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16, con 200.000 PBMC humanas (aisladas del donante n.° 1) por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 39C es una tabla que resume la CE50 de activación de linfocitos T CD8+ (ng/ml) para cada TDB para CD3/CD20 ensayado en las figuras 39A y 39B.
Las FIGURAS 40A y 40B son gráficas que muestran el porcentaje de eliminación de B endo en relación con un control no tratado con TDB, después de 48 horas de incubación de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16, con 200.000 PBMC humanas (aisladas del donante n.° 1) por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 40C es una tabla que resume la CE50 de eliminación de linfocitos B endo (ng/ml) para cada TDB para CD3/CD20 ensayado en las figuras 40A y 40B.
Las FIGURAS 41a y 41B son gráficas que muestran el porcentaje de activación de linfocitos T, medido mediante la expresión superficial de CD69 y CD25, después de 24 horas de incubación de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16, con 200.000 PBMC humanas (aisladas del donante n.° 2) por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 41C es una tabla que resume la CE50 de activación de linfocitos T CD8+ (ng/ml) para cada TDB para CD3/CD20 ensayado en las figuras 41A y 41B.
Las FIGURAS 42A y 42B son gráficas que muestran el porcentaje de eliminación de B endo en relación con un control no tratado con TDB, después de 24 horas de incubación de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16, con 200.000 PBMC humanas (aisladas del donante n.° 2) por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 42C es una tabla que resume la CE50 de eliminación de linfocitos B endo (ng/ml) para cada TDB para CD3/CD20 ensayado en las figuras 42A y 42B.
Las FIGURAS 43a y 43B son gráficas que muestran el porcentaje de activación de linfocitos T, medido mediante la expresión superficial de CD69 y CD25, después de 48 horas de incubación de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16, con 200.000 PBMC humanas (aisladas del donante n.° 2) por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 43C es una tabla que resume la CE50 de activación de linfocitos T CD8+ (ng/ml) para cada TDB para CD3/CD20 ensayado en las figuras 43A y 43B.
Las FIGURAS 44A y 44B son gráficas que muestran el porcentaje de eliminación de B endo en relación con un control no tratado con TDB, después de 48 horas de incubación de diversos TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16, con 200.000 PBMC humanas (aisladas del donante n.° 2) por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 44C es una tabla que resume la CE50 de eliminación de linfocitos B endo (ng/ml) para cada TDB para CD3/CD20 ensayado en las figuras 44A y 44B.
La FIGURA 45A es una gráfica que muestra que ciertos TDB para CD3/CD20, tales como uno que tenga un brazo anti-CD20 de 2H7v16 y un brazo anti-CD3 de 72H6, no muestran potencia in vitro, evaluada mediante ensayos de eliminación de Bjab.
Las FIGURAS 45b y 45C son gráficas que muestran que ciertos TDB para CD3/CD20, tales como uno que tenga un brazo anti-CD20 de 2H7v16 y un brazo anti-CD3 de 72H6, no muestran potencia in vitro, evaluada por la eliminación de linfocitos B endo (B) y ensayos de activación de linfocitos T (C).
La FIGURA 46A es una gráfica que muestra que ciertos TDB para CD3/CD20, tales como uno que tenga un brazo anti-CD20 de 2H7v16 y un brazo anti-CD3 de 13A3, muestran baja potencia in vitro, evaluada mediante ensayos de eliminación de Bjab.
La FIGURA 46B es una gráfica que muestra que ciertos TDB para CD3/CD20, tales como uno que tenga un brazo anti-CD20 de 2H7v16 y un brazo anti-CD3 de 30A1, muestran baja potencia in vitro, evaluada mediante ensayos de eliminación de Bjab.
La FIGURA 46C es una gráfica que muestra que ciertos TDB para CD3/CD20, tales como uno que tenga un brazo anti-CD20 de 2H7v16 y un brazo anti-CD3 de 41D9a, muestran baja potencia in vitro, evaluada mediante ensayos de eliminación de Bjab. se muestran los valores de CE50 de eliminación de células Bjab (ng/ml) para cada TDB para CD3/CD20 ensayado.
La FIGURA 46D es una gráfica que muestra que ciertos TDB para CD3/CD20, tales como uno que tenga un brazo anti-CD20 de 2H7v16 y un brazo anti-CD3 de 41D9a, muestran baja potencia in vitro, evaluada mediante ensayos de eliminación de linfocitos B endo. Se muestran los valores de CE50 de eliminación de linfocitos B endo (ng/ml) para cada TDB para CD3/CD20 ensayado.
La FIGURA 46E es una gráfica que muestra que ciertos TDB para CD3/CD20, tales como uno que tenga un brazo anti-CD20 de 2H7v16 y un brazo anti-CD3 de 41 D9a, muestran baja potencia in vitro, evaluada mediante ensayos de activación de linfocitos T.
La FIGURA 47A es una gráfica que muestra que ciertos TDB para CD3/CD20, tales como TDB que tienen un brazo anti-CD20 de 2H7v16 y un brazo anti-CD3 de UCHT1v9, 21A9 y 40G5c, muestran alta potencia in vitro, evaluada mediante ensayos de eliminación de linfocitos B endo usando 200.000 PBMC humanas (aisladas del donante n.° 1) por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 47B es una gráfica que muestra que ciertos TDB para CD3/CD20, tales como TDB que tienen un brazo anti-CD20 de 2H7v16 y un brazo anti-CD3 de UCHT1v9, 21A9 y 40G5c, muestran alta potencia in vitro, evaluada mediante ensayos de activación de linfocitos T usando 200.000 PBMC humanas (aisladas del donante n.° 1) por pocilio, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 48A es una gráfica que muestra que ciertos TDB para CD3/CD20, tales como TDB que tienen un brazo anti-CD20 de 2H7v16 y un brazo anti-CD3 de UCHT1v9, 21A9 y 40G5c, muestran alta potencia in vitro, evaluada mediante ensayos de eliminación de linfocitos B endo usando 200.000 PBMC humanas (aisladas del donante n.° 2) por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 48B es una gráfica que muestra que ciertos TDB para CD3/CD20, tales como TDB que tienen un brazo anti-CD20 de 2H7v16 y un brazo anti-CD3 de UCHT1v9, 21A9 y 40G5c, muestran alta potencia in vitro, evaluada mediante ensayos de activación de linfocitos T usando 200.000 PBMC humanas (aisladas del donante n.° 2) por pocillo, medida mediante análisis FACS.
La FIGURA 49 es una tabla que resume las potencias in vitro de varios TDB para CD3/CD20 que tienen diferentes combinaciones de brazos anti-CD3 con el brazo anti-CD20 de 2H7v16.
La FIGURA 50 muestra las secuencias de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera (parte superior) y el dominio variable de cadena pesada (parte inferior) del anticuerpo anti-CD202H7.v16.
La FIGURA 51 muestra las secuencias de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera (parte superior) y el dominio variable de cadena pesada (parte inferior) del anticuerpo anti-CD3 hu40G5c.
Las FIGURAS 52A y 52B muestran que el TDB para CD3/CD20 (40G5c/2H7v16) no tiene formación de agregados detectable determinada mediante cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) (A) y ausencia de formación de homodímero detectable (es decir, formación de anticuerpo para CD3/CD3 o CD20/CD20) evaluada mediante espectrometría de masas (B).
La FIGURA 53A es una gráfica que muestra la farmacocinética de concentraciones séricas de TDB para CD3/CD20 a diversas dosis en ratas Spague Dawley (SD) con el paso del tiempo (en días), evaluada mediante la farmacocinética de inmunoglobulina genérica (GRIP) o un ensayo específico.
La FIGURA 53B es una tabla que resume los valores de eliminación cuantificados (ml/día/kg) de los anticuerpos TDB para CD3/CD20 a cada dosis ensayada en la figura 53A.
La FIGURA 54A es una gráfica que muestra que la porción F(ab')2 del TDB para CD20 conservó la misma potencia que la IgG TDB para CD20 en la eliminación de linfocitos B (eliminación de Bjab) in vitro. Se incubaron 20.000 células Bjab y 200.000 PBMC aisladas de donante sano con diversas concentraciones de TDB para CD20 de longitud completa o F(ab')2 de TDB para CD20 durante 24 horas.
La FIGURA 54B es una gráfica que muestra que la actividad de eliminación de linfocitos B de TDB para CD20 es dependiente de linfocitos T, ya que no se detectó eliminación de linfocitos B con PBMC con reducción de linfocitos T Cd 3+. 20.000 células Bjab y 200.000 PBMC aisladas de un donante sano o 200.000 PBMC con reducción de linfocitos T CD3+, se incubaron con diversas concentraciones de TDB para CD20 durante 24 horas.
La FIGURA 54C es una gráfica que muestra que puede lograrse una eliminación comparable de linfocitos B con linfocitos T CD4+ o CD8+ como efectores. 20.000 células Bjab y 100.000 linfocitos T CD8+ o linfocitos T CD4+ purificados se incubaron con diversas concentraciones de TDB para CD20 durante 24 horas. Se midieron y calcularon la eliminación celular y la activación de linfocitos T marcados como CD69+CD25+ como se describe más adelante.
La FIGURA 54D es una gráfica que muestra que el TDB para CD20 tiene la capacidad de activar linfocitos T tanto CD4+ como CD8+. 20.000 células Bjab y 100.000 linfocitos T CD8+ o linfocitos T CD4+ purificados se incubaron con diversas concentraciones de TDB para CD20 durante 24 horas. Se midieron y calcularon la eliminación celular y la activación de linfocitos T marcados como CD69+CD25+ como se describe más adelante.
La FIGURA 54E es una gráfica que la regulación positiva de granzima es más prevalente entre linfocitos T CD8+ tras la adición de TDB para CD20. 20.000 células Bjab y 100.000 linfocitos T c D8+ o linfocitos T CD4+ purificados se incubaron con diversas concentraciones de TDB para CD20 durante 24 horas. La inducción de granzima B también se detectó mediante FACS.
La FIGURA 54F es una gráfica que muestra que se asocia un mayor nivel de liberación de perforina con los linfocitos T CD8+ tras la adición de TDB para c D20. 20.000 células Bjab y 100.000 linfocitos T CD8+ o linfocitos T CD4+ purificados se incubaron con diversas concentraciones de TDB para CD20 durante 24 horas. La concentración de perforina en los medios se midió mediante ELISA.
La FIGURA 55 es una serie de gráficas de citometría de flujo que muestra que los linfocitos T activados tienen capacidad de proliferación en presencia de TDB para CD20 y de células Bjab.
La FIGURA 56A es una serie de gráficas que muestran las curvas de respuesta a la dosis de eliminación de linfocitos B de 8 líneas celulares tumorales de leucemia/linfoma B (izquierda) y los niveles de expresión de CD20 para las líneas de linfocitos B dadas, con un control de isotipo en gris, medida mediante FACS. Los linfocitos B se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 10%. Para el ensayo de eliminación, se incubaron 20.000 linfocitos B con 200.000 PBMC aisladas de donante sano con diversas concentraciones de TDB para CD20 durante 24 horas.
La FIGURA 56B es una gráfica que muestra una amplio intervalo en la expresión media de CD20 en las 8 líneas de linfocitos B ensayadas en la figura 56A. Se incubaron linfocitos T CD4+ o T CD8+, purificados de sangre entera de donante sano y marcados con CFSE, solos, solo con Bjab, solo con TDB para CD20 o con Bjab y TDB para CD20 durante 24 horas en primer lugar, después se lavaron las células y se pusieron en medio fresco durante otras 48 horas. La intensidad de CFSE de los linfocitos T se detectó mediante FACS, mostrando proliferación de linfocitos T solo en presencia de Bjab y TDB para CD20.
La FIGURA 56C es un conjunto de gráficas que muestran que el TDB para CD20 es potente en la eliminación de las 8 líneas de una manera dependiente de la dosis, con valores de CE50 de eliminación de linfocitos B (ng/ml) (parte superior) y el porcentaje de eliminación de linfocitos B (parte inferior) representado en función de la expresión de CD20 en el linfocito B diana.
La FIGURA 56D es una gráfica que muestra que los TDB dirigidos a 5 antígenos de linfocitos B son comparables a la hora de mediar la eliminación por linfocitos T de células Bjab. Los linfocitos B se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 10 %. Para el ensayo de eliminación, se incubaron 20.000 células Bjab con 100.000 linfocitos T CD8+ purificados de donante sano con un TDB para CD20 (TDB A: 2H7v16/UCHT1v9) o un TDB dirigido a un antígeno de linfocitos B diferente (es decir, los TDB B-E, cada uno dirigido a un antígeno diferente de linfocito B) a una concentración de 1000ng/ml durante 24 horas.
La FIGURA 56E es una gráfica que muestra el alcance de eliminación de linfocitos B para 10 líneas celulares tumorales de leucemia/linfoma B. Los linfocitos B se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 10 %. Para el ensayo de eliminación, se incubaron 20.000 linfocitos B con 100.000 linfocitos T CD8+ purificados de donante sano y 1000ng/ml de TDB para CD20 (2H7v16/UCHT1v9) durante 24 horas.
La FIGURA 56F es una gráfica que muestra las curvas de eliminación de respuesta a la dosis para 8 donantes aleatorios.
La FIGURA 56G es una gráfica de resumen para la CE50 (izquierda) y el alcance de eliminación de linfocitos B (derecha) con 1000ng/ml de anticuerpo en un ensayo de 24 horas para 30 donantes.
La FIGURA 56H es un conjunto de gráficas que muestra que el alcance de la eliminación de linfocitos B en 24 horas por el TDB para CD20 es muy comparable con o mayor que la eliminación de linfocitos B mediante scFv para CD19. Para la eliminación de linfocitos B autólogos, se incubaron 200.000 PBMC aisladas de donante sano durante 24 horas con TDB para CD20 a la concentración indicada. La eliminación celular informada se calculó como se describe más adelante.
La FIGURA 56I es un conjunto de gráficas que muestran que el alcance de la eliminación de linfocitos B en 24 horas por el TDB para CD20 es comparable con o mayor que la eliminación de linfocitos B por CD19-TDB o CD22-TDB (panel superior) o CD79a o CD79b (panel inferior). Para la eliminación de linfocitos B autólogos, se incubaron 200.000 PBMC aisladas de donante sano con 40.000 células Bjab durante 24 horas con TDB para CD20, CD19, CD22, CD79a o CD 79b a la concentración indicada. La eliminación celular informada se calculó como se describe más adelante.
La FIGURA 57A es una serie de gráficas que muestran los valores de expresión relativos para CD3e humano detectado en linfocitos T CD4+ (panel izquierdo) y linfocitos T CD8+ (panel central); y CD20 humano en linfocitos B CD19+ (panel derecho) detectados en PBMC de ratón (mu) o humanas (hu), medidos mediante FACS. Las PBMC de ratón procedían de sangre de ratones dobles transgénicos para huCD3/huCD20; las PBMC humanas procedían de sangre de donante sano.
La FIGURA 57B es una gráfica que muestra que el TDB para CD20 no puede acoplar linfocitos B para reducir los linfocitos B sin expresión de CD3 humano en ratones transgénicos para CD20 humano. Se trataron ratones transgénicos para huCD20 o ratones doble transgénicos para huCD20/CD3 una vez por vía intravenosa con anticuerpos del modo indicado (10 mg/kg para rituximab, 0,5 mg/kg para TDB para CD20 y TDB para HER2). Los bazos de ratón se recogieron en D7 (7 días después del tratamiento con anticuerpo). El anticuerpo anti-CD20 humano, rituximab, se usa como control positivo. TDB para CD3/HER2 se usa como control negativo de isotipo. La FIGURA 57C es una gráfica que muestra que el TDB para CD20 tiene la capacidad de acoplar linfocitos T murinos que expresan huCD3 en ratones doble transgénicos para CD3/CD20 humano para reducir potentemente los linfocitos B murinos que expresan huCD20. Se trataron ratones transgénicos para huCD20 o ratones doble transgénicos para huCD20/CD3 una vez por vía intravenosa con anticuerpos del modo indicado (10 mg/kg para rituximab, 0,5 mg/kg para TDB para CD20 y TDB para HER2). Los bazos de ratón se recogieron en D7 (7 días después del tratamiento con anticuerpo). TDB para CD3/HER2 se usa como control negativo de isotipo.
La FIGURA 58A es una serie de gráficas de un estudio de transcurso temporal que muestra que el tratamiento con TDB para CD20 dio como resultado una reducción sostenida de linfocitos B hasta el D15 (15 días después de la dosis). Se trataron una vez ratones doble transgénicos para huCD20/huCD3 por vía intravenosa con varias dosis de t Db para CD20. Se recogió sangre de ratón (D1, D8 y D15).
La FIGURA 58B es una gráfica que muestra que solo se logró una reducción prácticamente completa de linfocitos B en bazos de ratón en el D7 después de una sola dosis de 0,5 mg/kg, mientras que una dosis menor de 0,05 mg/kg solo dio como resultado una reducción parcial de los linfocitos B en el bazo. Se trataron ratones doble transgénicos para huCD20/CD3 una vez por vía intravenosa con diversas dosis de TDB para CD20. Se recogieron los bazos (D7).
La FIGURA 58C es una gráfica que muestra que se observa una robusta reducción de linfocitos B en el D7 en la circulación de ratones doble transgénicos para huCD3/huCD20 tratados con TDB para CD20. Los ratones doble transgénicos para huCD20/huCD3 se trataron una vez por vía intravenosa con 0,5 mg/kg de TDB para CD20. Se recogió sangre en D0-5 min (5 minutos después del tratamiento), D0-2 h, D0-8 h, D1, D2, D3 y D7. Los linfocitos B que expresan huCD20 se midieron mediante FACS.
La FIGURA 58D es una serie de gráficas que muestran la activación de linfocitos T en ratones doble transgénicos para huCD3/huCD20 tratados con un t Db para CD20. Los ratones doble transgénicos para huCD3/huCD20 tratados mostraron un aumento de hasta el 80 % en el recuento de linfocitos T CD8+ que expresan CD3e humano a las 2 horas después del tratamiento con TDB para CD20, que volvieron al nivel inicial en D2 y D7 (panel superior). De manera similar, los linfocitos T CD4+ que expresan CD3e humano aumentaron en un 80 % 2 horas después del tratamiento con TDB para CD20 y posteriormente volvieron al nivel inicial en D2. Se trataron ratones doble transgénicos para huCD3/huCD20 una vez por vía intravenosa con 0,5 mg/kg de TDB para CD20. Se recogió sangre en D0-5 min (5 minutos después del tratamiento), D0-2 h, D0-8 h, D1, D2, D3 y d 7. Los linfocitos T CD4+ y CD8+ que expresaban CD3e se midieron mediante FACS.
La FIGURA 59A es una serie de gráficas de citometría de flujo que muestran que el TDB para CD20 reduce los linfocitos B de zona marginal (MZB) igual de eficientemente que los linfocitos B foliculares (FOB) después de la administración de TDB a ratones doble transgénicos para huCD3/huCD20. Dos animales doble transgénicos (paneles izquierdo y derecho, respectivamente) se trataron con vehículo (paneles superiores) o una sola dosis intravenosa de 0,5 mg/kg de TDB (paneles inferiores). Los bazos de ratón se recogieron en D7 y se analizaron mediante FACS.
La FIGURA 59B-59E es una serie de gráficas que muestran que el TDB para CD20 reduce los linfocitos B de zona marginal (MZB) (B) igual de eficientemente que los linfocitos B foliculares (FOB) (C) después de una sola dosis intravenosa de 0,5 mg/kg de TDB, junto con la activación de linfocitos T CD8+ (D) y la proliferación de linfocitos T CD8+ (E) en el bazo en los puntos de tiempo indicados. Los bazos de ratón se recogieron en D1, D2, D3, D5, D7 y D14.
La FIGURA 60A es una gráfica que muestra que los ratones NSG humanizados tratados con 3 dosis semanales de TDB para CD20 a 0,5 mg/kg (situación de dosis repetida) mostraron niveles reducidos de linfocitos B en la sangre en D7, sin detectarse prácticamente linfocitos B en D21. Se trataron ratones NSG humanizados con 3 dosis de 0,5 mg/kg de TDB para CD20 semanalmente por vía intravenosa. Se recogió sangre en D-5 (5 días antes del tratamiento), D7, D14 y D21. Los recuentos de linfocitos B murinos en sangre se midieron mediante FACS. La FIGURA 60B es una gráfica que muestra que se observa una robusta reducción de linfocitos B en D21 en bazos de ratones NSG humanizados tratados con TDB para CD20. Se trataron ratones NSG humanizados con 3 dosis de 0,5 mg/kg de TDB para CD20 semanalmente por vía intravenosa. Los bazos se recogieron en D21. Los recuentos de linfocitos B murinos en bazo se midieron mediante FACS.
La FIGURA 60C es una serie de gráficas de citometría de flujo que muestran que los linfocitos T huCD8+ humanos proliferan y que los linfocitos B huCD19+ se reducen 7 días después del tratamiento (D7) de los ratones NSG humanizados con TDB para CD20. Los ratones NSG humanizados se trataron con vehículo o 0,5 mg/kg de TDB para CD20 (2H7v16/UCHT1v9). Se recogieron los bazos de ratones NSG humanizados tratados con el control y con TDB para CD20 en D7. Los linfocitos B que expresan huCD19 y los linfocitos T que expresan huCD8 se midieron mediante FACS.
La FIGURA 60D es una gráfica que muestra que los ratones NSG humanizados tratados con 3 dosis semanales de TDB para CD20 a 0,5 mg/kg (situación de dosis repetida) mostraron un aumento de hasta 10 veces en el recuento de linfocitos T CD8+ en D7, que volvieron al nivel inicial o menor en D14 y D21. Se trataron ratones NSG humanizados con 3 dosis de 0,5 mg/kg de TDB para CD20 semanalmente por vía iv. Se recogió sangre en D-5 (5 días antes del tratamiento), D7, D14 y D21. Los recuentos de linfocitos T CD8+ murinos en la sangre y la activación de linfocitos T se midieron mediante FACS.
La FIGURA 60E es una serie de gráficas de citometría de flujo que muestra los niveles iniciales de linfocitos B huCD20+ (paneles centrales) y de linfocitos T huCD8+ y huCD4+ (paneles derechos) de 2 ratones NSG humanizados, medidos mediante FACS.
La FIGURA 60F es una serie de gráficas que muestran los niveles de expresión en la superficie celular de huCD3£ y CD20 en linfocitos B CD19+ (izquierda), linfocitos T CD8+ (centro) y linfocitos T CD4+ (derecha), detectados mediante FACS.
La FIGURA 61A es una gráfica que muestra que el TDB para CD20 es potente a la hora de eliminar linfocitos B de CLL con linfocitos T autólogos. Se incubaron 200.000 PBMC con diversas concentraciones de TDB para CD20 durante 48 horas en medio RPMI suplementado con FBS al 10 %.
La FIGURA 61B es una gráfica que muestra que el TDB para CD20 es potente a la hora de inducir activación de linfocitos T autólogos en presencia de linfocitos B de CLL. Se incubaron 200.000 PBMC con diversas concentraciones de TDB para CD20 durante 48 horas en medio RPMI suplementado con FBS al 10 %.
La FIGURA 61C es un conjunto de gráficas que muestran que el recuento de linfocitos T está altamente correlacionado con la eliminación de linfocitos B de CLL ex vivo.
Se incubaron 200.000 PBMC con 1000ng/ml de TDB para CD20 durante 48 horas, o bien solo o con linfocitos T CD8+ añadidos purificados de un donante sano. El porcentaje de linfocitos B CD19+CD5+ y de linfocitos T CD8+ en PBMC de CLL es del 90/0,55 para la muestra Al645, del 76/3,5 para A1957, del 87/0,63 para A1978, del 69/1,3 para A1980. La eliminación celular, la inducción de granzima B y la activación de linfocitos T se midieron mediante FACS como se describe más adelante.
La FIGURA 62A es un conjunto de gráficas que muestran que la activación de linfocitos T (izquierda) después de dosis de 0,1 mg/kg o 0,5 mg/kg de TDB para CD20 a ratones NSG con injerto de células de leucemia de CLL se correlacionó con la potente eliminación de linfocitos B de CLL injertados (derecha).
La FIGURA 62B es un conjunto de imágenes de inmunohistoquímica de secciones de bazo de ratones NSG con células de leucemia de CLL injertadas, que muestran que pueden detectarse pocos linfocitos B después del tratamiento con TDB para CD20. Los linfocitos B y linfocitos T se injertaron en ratones NSG como se describe más adelante. Los ratones se trataron una vez por vía intravenosa con TDB para HER2 y rituximab a 0,5 mg/kg, TDB para CD20 a 0,1 y 0,5 mg/kg y se recogieron los bazos para el análisis FACS 14 días después del tratamiento. La FIGURA 63 es una gráfica que muestra el volumen tumoral ajustado con el paso del tiempo de tumores injertados de Bjab de ratones SCID para el grupo 1 (vehículo: Histidina/acetato 20 mM a pH 5,5, sacarosa 240 mM, Tween 20 al 0,02%); el grupo 2 (TDB para CD20: 2H7v114/UCHT1.v9; 0,5 mg/kg); el grupo 3 (vehículo: Histidina/acetato 20 mM a pH 5,5, sacarosa 240 mM, Tween 20 al 0,02 %, PBMC); y el grupo 4 (Td B para CD20: CD20 2H7v114/CD3 UCHT1.v9; 0,5 mg/kg, PBMC). Las células efectoras fueron PBMC procedentes de un donante humano sano. Los ratones se trataron una vez a la semana durante dos semanas.
La FIGURA 64A es una gráfica que muestra el nivel relativo de expresión de CD20 en células Bjab, NALM-6, SC 1 y OCI-LY 19. Los linfocitos B y linfocitos T se injertaron en ratones NSG como se describe más adelante. Los ratones se trataron una vez por vía intravenosa con TDB para HER2 y rituximab a 0,5 mg/kg, TDB para CD20 a 0,1 y 0,5 mg/kg y se recogieron los bazos para el análisis IHC 14 días después del tratamiento.
La FIGURA 64B es una gráfica que muestra que rituximab y TDB para CD20 tienen una eficacia comparable para la eliminación de células Bjab in vitro, que expresan un alto nivel de CD20 en su superficie celular. Se redujeron los linfocitos B de las PBMC aisladas de un donante sano y se usaron como células efectoras en el ensayo de eliminación celular in vitro. Se incubaron 20.000 linfocitos B y 200.000 células efectoras con diversas concentraciones de TDB para CD20 o de rituximab durante 24 horas. La expresión de TDB para CD20 se detectó mediante FACS.
La FIGURA 64C es una gráfica que muestra que el TDB para CD20, pero no rituximab, tiene la capacidad de eliminar células NALM-6, SC-1 y OCI-LY 19, que tienen niveles relativamente bajos de CD20 en su superficie celular. Se redujeron los linfocitos B de las PBMC aisladas de un donante sano y se usaron como células efectoras en el ensayo de eliminación celular in vitro. Se incubaron 20.000 linfocitos B y 200.000 células efectoras con diversas concentraciones de TDB para CD20 o de rituximab durante 24 horas. La expresión de TDB para CD20 se detectó mediante FACS.
La FIGURA 64D es una gráfica que muestra los niveles de expresión en la superficie de linfocitos B de antígeno CD20 no bloqueado en función de la concentración de rituximab-DANA, medida mediante FACS. Se trataron ratones doble transgénicos para CD20/CD3 con una sola dosis de rituximab-DANA (10 mg/kg). Los bazos se recogieron 5 días después del tratamiento.
Las FIGURAS 65A y 65B son gráficas que muestran que el TDB para CD20 es activo a la hora de eliminar linfocitos B in vitro en presencia de altos niveles de rituximab (A) o de dexametasona (B). En primer lugar, se incubaron 200.000 PBMC de donante sano con rituximab-DANA a la concentración indicada durante 1 hora, después, se añadió TDB para CD20 y se incubó durante 24 horas. Para el ensayo con dexametasona, se pretrataron las células con dexametasona 1 pM durante una noche antes de añadir TDB para CD20. La eliminación celular se calculó como se describe más adelante.
La FIGURA 66 es un conjunto de gráficas que muestran que el TDB para CD20 es activo a la hora de eliminar linfocitos B en sangre (izquierda) y bazo (derecha) en ratones pretratados con rituximab-DANA. Para el tratamiento con un solo agente, se trataron ratones doble transgénicos para huCD20/CD3 una vez por vía intravenosa a la dosis indicada; para el tratamiento combinado, en primer lugar se trató a los ratones por vía intravenosa con rituximab-DANA y se inyectó el TDB para CD20 por vía intravenosa 30 minutos después. Se recogió sangre en D-7, D0-2h (2 horas después del tratamiento con TDB) y D7; los bazos se recogieron en D7. Los recuentos de linfocitos B se midieron mediante FACS como se describe más adelante.
La FIGURA 67A es un conjunto de gráficas que muestran los recuentos de linfocitos B (izquierda), linfocitos T CD4+ (parte intermedia) y linfocitos T CD8+ (derecha) en muestras de sangre de 3 monos cinomolgos antes y 7 días después del tratamiento con una sola dosis intravenosa de 1 mg/kg de TDB para CD20. Se trataron tres monos cinomolgos una vez por vía intravenosa con 1 mg/kg de TDB para CD20. Se recogió sangre en D-7 (7 días antes de la dosis), D0-4hr (4 justo después de la dosis) y D7.
La FIGURA 67B es un conjunto de gráficas que muestran los niveles de linfocitos B, linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+ en el bazo (izquierda), ganglios linfáticos mandibulares (en medio) y ganglios linfáticos mesentéricos (derecha) de 3 monos cinomolgos 7 días después del tratamiento con una sola dosis intravenosa de 1 mg/kg de TDB para CD20. Se trataron tres monos cinomolgos una vez por vía intravenosa con 1 mg/kg de TDB para CD20. Se recogió sangre en D-7 (7 días antes de la dosis), D0-4hr (4 justo después de la dosis) y D7.
La FIGURA 67C es un conjunto de gráficas que muestran los niveles de linfocitos B, linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+ en el bazo (izquierda), ganglios linfáticos mandibulares (en medio) y ganglios linfáticos mesentéricos (derecha) de 3 monos cinomolgos antes del tratamiento con una sola dosis intravenosa de 1 mg/kg de TDB para CD20. Se trataron tres monos cinomolgos una vez por vía intravenosa con 1 mg/kg de TDB para CD20. Se recogió sangre en D-7 (7 días antes de la dosis), D0-4hr (4 justo después de la dosis) y D7.
La FIGURA 67D es un conjunto de gráficas que muestran los niveles iniciales de linfocitos B y linfocitos T CD4+ y CD8+ como porcentaje de los linfocitos totales detectados en el bazo (izquierda) y los ganglios linfáticos mandibulares (derecha) en animales tratados con control de vehículo.
La FIGURA 68A es un conjunto de gráficas que muestran la concentración sérica de TDB para CD20 de muestras de sangre y suero recogidas de cuatro monos cinomolgos que se trataron 4 veces a la semana con 1 mg/kg de TDB para CD20 mediante administración intravenosa.
La FIGURA 68B es un conjunto de gráficas que muestran la concentración de TDB para CD20 de muestras de suero recogidas de los animales descritos en las figuras 65 y 66A. Se representaron las medias ± d.t.
La FIGURA 69A es un histograma que muestra la expresión de PD-L1 en células A20-huCD20 de ratones Balb/C singénicos para A20-huCD20, evaluada mediante citometría de flujo.
La FIGURA 69B es una gráfica que muestra el volumen tumoral relativo con el paso del tiempo para el grupo 1 (vehículo); el grupo 2 (TDB para CD20 a 0,5 mg/kg); el grupo 3 (anticuerpo anti-PD-L1 a 10 mg/kg); y el grupo 4 (TDB para CD20 a 0,5 mg/kg anticuerpo anti-PD-L1).
La FIGURA 70 es una gráfica que muestra las curvas de unión para cada uno de los tres TDB para FcRH5 ensayados respecto de su unión in vitro a linfocitos T CD8+ que expresan CD3.
La FIGURA 71A es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de células diana MOLP-2 en función de la concentración de TDB para FcRH5, con linfocitos T CD8+ purificados de PBCM humanas del donante n.° 1. La FIGURA 71B es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de células diana MOLP-2 en función de la concentración de TDB para FcRH5, con linfocitos T CD8+ purificados de PBCM humanas del donante n.° 2.
La FIGURA 72A es una gráfica que muestra el porcentaje de linfocitos T CD8+CD69+ en función de la concentración de TDB para FcRH5, evaluado mediante análisis FACS. Las células diana fueron MOLP-2 y los linfocitos T CD8+ se purificaron del donante n.° 1.
La FIGURA 72B es una gráfica que muestra el porcentaje de linfocitos T CD8+CD107a+ en función de la concentración de TDB para FcRH5, evaluado mediante análisis FACS. Las células diana fueron MOLP-2 y los linfocitos T CD8+ se purificaron del donante n.° 1.
La FIGURA 72C es una gráfica que muestra el porcentaje de linfocitos T CD8+CD69+ en función de la concentración de TDB para FcRH5, evaluado mediante análisis FACS. Las células diana fueron MOLP-2 y los linfocitos T CD8+ se purificaron del donante n.° 2.
La FIGURA 72D es una gráfica que muestra el porcentaje de linfocitos T CD8+CD107a+ en función de la concentración de TDB para FcRH5, evaluado mediante análisis FACS. Las células diana fueron MOLP-2 y los linfocitos T CD8+ se purificaron del donante n.° 2.
La FIGURA 73 es un conjunto de gráficas que muestran las curvas de unión para cada uno de los tres TDB para HER2 ensayados respecto de su unión in vitro a células SKBR3 que expresan Her2 (parte superior) y linfocitos T CD8+ que expresan CD3 (parte inferior).
La FIGURA 74A es una gráfica que muestra las curvas de unión para trastuzumab (bivalente), trastuzumab (Fab) y TDB para HER2 (UCHT1v9/hu4D5) (biespecífico) para la unión in vitro a células que SKBR3 que expresan Her2. La FIGURA 74B es una gráfica que muestra el porcentaje de células SKBR3 viables en función de o para la concentración de trastuzumab (bivalente), trastuzumab (Fab) y TDB para HER2 (UCHT1v9/hu4D5) (biespecífico), evaluada mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CELLTITERGLO®.
La FIGURA 74C es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de células diana SKBR mediada por citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) en presencia de trastuzumab (T-mab), trastuzumab producido en E. coli (T-mab E. coli) y TDB para HER2 (UCHT1v9/hu4D5), evaluada mediante liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) de células lisadas.
La FIGURA 75 es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de células diana SKBR3 en función de la concentración de TDB para HER2 (hu4D5-TDB, hu4D5.91A-TDB y hu4D5.Y100A-TDB).
La FIGURA 76A es una serie de paneles. El panel superior es una renderización de la estructura cristalina del dominio extracelular (ECD) de HER2 unido al Fab hu4D5 (trastuzumab), el Fab 2C4 (Pertuzumab) y 7C2. El panel inferior es una estructura de cintas del CD3e unido a 2C11, 38E4v1 y 40G5c.
La FIGURA 76B es una tabla que indica las afinidades de unión, representadas por la constante de disociación Kd (nM), de HER2-TDB para tres brazos de HER2 diferentes: hu4D5, 2C4 y 7C2. El panel inferior derecho es una tabla que indica las afinidades de unión, representadas por la constante de disociación Kd (nM), de HER2-TDB para tres diferentes brazos de CD3e: 38E4v1, 40G5c y 2C1 I.
La FIGURA 76C es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de células diana MCF7 que expresan HER2 en función de la concentración de HER2-TDB (hu4D5-TDB, 2C4-TDB y 7C2-TDB). La citotoxicidad se midió por la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH).
La FIGURA 77 es una gráfica que muestra que los brazos para HER2 de hu4D5 y 2C4 son potentes mediadores de la eliminación celular, mostrada por el porcentaje máximo de eliminación de células diana SKBR3 logrado mediante el tratamiento con las siguientes variantes de HER2-TDB: hu4D5-38E4v1, hu4D5-40G5c, 2C4-38E4v1, 2C4-40G5c, 7C2-38E4v1 y 7C2-40G5c.
La FIGURA 78 es una serie de gráficas que muestran la potencia de variantes de1HER2-TDB en la eliminación de líneas celulares SKBR3 que expresan HER2 (izquierda) y MCF7 que expresan HER2 (derecha) de una manera dependiente de la dosis, con los valores de CE50 de eliminación de células diana (pM).
La FIGURA 79 es una serie de gráficas que muestran el porcentaje de eliminación de células diana SKBR3 que expresan HER2 para diversos TDB con los brazos de HER2 (hu4D5, 2C4 y 7C2) emparejados con brazos de CD3 de alta afinidad (38E4v1) o de baja afinidad (40G5c) en función de la concentración de TDB (ng/ml).
La FIGURA 80 es una serie de paneles. El panel a la izquierda muestra la potencia de las variantes de1HER2-TDB (hu4D5-38E4v1, 2C4-38E4v1, 7C2-38E4v1; hu4D5-40G5c, 2C4-40G5c, 7C2-40G5c) en la eliminación de líneas celulares SKBR3 que expresan HER2 y MCF7 que expresan HER2 de una manera dependiente de la dosis, con los valores de CE50 de eliminación de células diana (pM). El panel a la derecha es una tabla con la relación de la CE50 de las variantes de HER2-TDB dadas en células diana MCF7 frente a SKBR3 para tres experimentos. La FIGURA 81 es una serie de paneles. El panel superior muestra una tabla que lista las variantes del brazo de HER2 de hu4D5 (hu4D5v7, hu4D5v5, hu4D5v10, hu4D5v31, hu4D5.Y100A) para HER2-TDB (brazo de CD3 de 40G5c) y la CE50 correspondiente (ng/ml) para la eliminación de células diana SKBR3, la afinidad de unión a HER2 (Kd, nM) además de la relación de la afinidad de unión HER2 Kd y la CE50 de eliminación de células diana SKBR3 para las variantes de hu4D5 en relación con hu4D5. El panel inferior es una gráfica que muestra la correlación entre la relación de CE50 de SKBR3 para las variantes de HER2-TDB de hu4D5 (hu4D5, hu4D5v7, hu4D5v5, hu4D5v10 y hu4D5v31) y la relación de Kd relativa para las variantes de HER2-TDB de hu4D5.
La FIGURA 82 es una serie de gráficas que muestran el porcentaje de eliminación de células diana SKBR3 y MCF7 en función de la concentración de las siguientes variantes de HER2-TDB: hu4D5-40G5c (superior izquierda), hu4D5v7-40G5c (superior central), hu4D5v5-40G5c (superior derecha), hu4D5v10-40G5c (inferior izquierda), hu4D5v31-40G5c (inferior central), hu4D5.Y100A-40G5c (inferior derecha).
La FIGURA 83 es una serie de gráficas. La gráfica a la izquierda muestra el porcentaje de eliminación de células diana en función de la concentración (pg/ml) de anticuerpos monoespecíficos bivalentes de bloqueo para HER2 específicos para el brazo de HER2 designado del HER2-TDB. (Anticuerpos de bloqueo de HER2: anticuerpos monoespecíficos bivalentes para hu4D5, 2C4 y 7C2. HER2-TDB: hu4D5-40G5c, 2C4-40G5c y 7C2-38E4v1 a una concentración fija: 10 ng/ml). La gráfica a la derecha muestra el porcentaje de células viables en función de la concentración del anticuerpo para HER2 (hu4D5) trastuzumab en presencia y ausencia de1HER2-TDB hu4D5-40G5c.
La FIGURA 84 es una serie de paneles. El panel superior es una tabla que proporciona la reactividad de variantes del brazo de HER2 con HER2, medida mediante diversos ensayos de unión, además de la reactividad de los clones de HER2 con el anticuerpo para hu4D5 trastuzumab. El panel inferior es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de células diana en función de la concentración (pM) de Fab biespecífico para HER2 para los clones dados (hu4D5, 3H4 y 2H11). Se proporcionan valores de CE50 para cada clon en pM.
La FIGURA 85 es una tabla que proporciona información de afinidad y reactividad para las variantes del brazo de CD3 de HER2-TDB (38E4v1, 38E4, SP34, 40G5c y 2C11).
La FIGURA 86 es una gráfica que muestra la eliminación de células diana CT26 que expresan HER2 en función de la concentración (ng/ml) de variantes de HER2-TDB (hu4D5-2C11, hu4D5-SP34, 7C2-2C11 y 2C4-2C11). Células efectoras: linfocitos T procedentes de CD3-TG.
La FIGURA 87A es una gráfica que muestra el volumen tumoral (mm3) medido con el paso del tiempo (0-5 días) en animales tratados con vehículo o HER2-TDB (0,5 mg/kg).
La FIGURA 87B es una serie de gráficas. La gráfica superior izquierda muestra el porcentaje de células CD45+ periféricas por cada 5 células detectadas en el día 6 después del tratamiento con vehículo o con HER2-TDB (0,5 mg/kg). La gráfica superior derecha muestra el porcentaje de células CD45+ periféricas que son células CD8+ detectadas en el día 6 después del tratamiento con vehículo o con HER2-TDB (0,5 mg/kg). La gráfica inferior izquierda muestra el porcentaje de células CD45+ periféricas que son CD4+ detectadas en el día 6 después del tratamiento con vehículo o con HER2-TDB (0,5 mg/kg). La gráfica inferior derecha muestra el porcentaje de células CD8+ periféricas que son IFN+ detectadas en el día 6 después del tratamiento con vehículo o con HER2-TDB (0,5 mg/kg).
La FIGURA 88A es una serie de gráficas. La gráfica superior muestra una gráfica en cascada del porcentaje de cambio en el volumen tumoral en animales tratados con vehículo o con variante de HER2-TDB (hu4D5-SP34 o hu4D5-2C11; 0,5 mg/kg; IV, semanalmente, 5 semanas). La gráfica inferior muestra una gráfica en cascada del porcentaje de cambio en el volumen tumoral en animales tratados con variante de HER2-TDB (2C4-38E4; 0,5 mg/kg; IV, semanalmente, 5 semanas).
La FIGURA 88B es una serie de gráficas. La gráfica superior muestra el volumen tumoral como porcentaje del volumen basal en función del tiempo (días) para los animales tratados con vehículo o HER2-TDB (hu4D5-SP34). La gráfica inferior muestra el volumen tumoral como porcentaje del volumen basal en función del tiempo (días) para los animales tratados con vehículo o HER2-TDB (hu4D5-2C11). (HER2-TDB: 0,5 mg/kg; IV, semanalmente, 5 semanas).
La FIGURA 89 es una gráfica que muestra el porcentaje de linfocitos T CD8+CD107a+ en función de la concentración de TDB para HER2 (hu4D5-TDB, hu4D5.91A-TDB, and hu4D5.Y100A-TDB), evaluado mediante análisis FACS. Las células diana fueron células SKBR3; las células efectoras fueron linfocitos T CD8+; relación de células efectoras:células diana = 3:1.
La FIGURA 90A es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de células diana SKBR3 en función de la concentración de TDB para HER2 (UCHT1v9/hu4D5 y SP34/hu4D5).
La FIGURA 90B es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de células diana SKBR3 en función de la concentración de TDB para HER2 (SP34/hu4D5, 38E4c/hu4D5 y 40G5c/hu4D5).
La FIGURA 90C es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de células diana SKBR3 en función de la concentración de TDB para HER2 (SP34/hu4D5, 38E4c/hu4D5 y 40G5c/hu4D5).
La FIGURA 91A es una gráfica que muestra la curva de unión para cada uno de los tres HER2-TDB (SP34/hu4D5, 38E4c/hu4D5 y 40G5c/hu4D5) ensayados respecto de su unión in vitro a linfocitos T CD8+ que expresan CD3, evaluada mediante análisis FACS.
FIGURE 91B es una gráfica que muestra el porcentaje de linfocitos T CD8+CD69+ en función de la concentración de HER2-TDB (SP34/hu4D5, 38E4c/hu4D5 y 40G5c/hu4D5).
La FIGURA 92A es una gráfica que muestra la curva de unión para los dos TDB para HER2 (38E4c/hu4D5 y 38E4/hu4D5) ensayados respecto de su unión in vitro a linfocitos T CD8+ que expresan CD3, evaluada mediante análisis FACS.
La FIGURA 92B es una gráfica que muestra la curva de unión para los dos TDB para HER2 (38E4c/hu4D5 y 38E4/hu4D5) ensayados respecto de su unión in vitro a células SKBR3 que expresan Her2, evaluada mediante análisis FACS.
La FIGURA 92C es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de células diana SKBR3 en función de la concentración de TDB para HER2 (38E4c/hu4D5 y 38E4/hu4D5) evaluada mediante análisis FACS. Las células efectoras fueron linfocitos T CD8+ humanos; relación de células efectoras:células diana = 3:1.
La FIGURA 92D es una gráfica que muestra el porcentaje de linfocitos T CD8+CD69+ en función de la concentración de HER2-TDB (38E4c/hu4D5 y 38E4/hu4D5).
La FIGURA 93A es una gráfica que muestra el porcentaje de linfocitos T CD8+CD69+GranzimaB+ en función de la concentración de TDB para HER2 (UCHT1v9/hu4D5), evaluado mediante análisis FACS. Las células diana fueron células SKBR3; las células efectoras fueron linfocitos T CD8+; relación de células efectoras:células diana = 3:1.
La FIGURA 93B es una serie de gráficas que muestran la exocitosis de gránulos de células diana mediada por linfocitos T y TDB para HER2 (UCHT1v9/hu4D5) detectada mediante ELISA para perforina y granzima A y B y el porcentaje de eliminación de células diana evaluado mediante liberación de l Dh . Las células diana fueron células SKBR3; las células efectoras fueron PBMC; relación de células efectoras:células diana = 30:1.
La FIGURA 93C es una serie de gráficas que muestran la apoptosis de células diana mediada por linfocitos T y TDB para HER2 (UCHT1v9/hu4D5) medida por las actividades de caspasa-3 y caspasa-7 en un ensayo CASPASE-GLO® 3/7, la apoptosis en un ensayo ELISAplus de detección de muerte celular y la liberación de LDH. Las células diana fueron células SKBR3; las células efectoras fueron PBMC; relación de células efectoras:células diana = 10:1.
La FIGURA 93D es la imagen de una transferencia de Western (parte superior) que muestra la expresión de Her2 en células 3T3 transfectadas y una gráfica (parte inferior) que muestra el porcentaje de eliminación de células diana por linfocitos T activados en función de la concentración de TDB para HER2 (UCHT1v9/hu4D5), medida mediante la liberación de LDH. Las células diana fueron 3T3-Vector y 3T3-HER2; las células efectoras fueron PBMC; relación de células efectoras:células diana = 10:1.
La FIGURA 93E es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de células diana BT474 en función de la concentración de TDB para HER2 (UCHT1v9/hu4D5) en presencia de Fab de trastuzumab (T-Fab) o de dominio extracelular (ECD) soluble de HER2 evaluado mediante la liberación de LDH. Las células efectoras fueron linfocitos T CD8+; relación de células efectoras:células diana = 5:1.
La FIGURA 93F es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de células diana SKBR3 en función de la concentración de TDB para HER2 (UCHT1v9/hu4D5) después de la reducción de células CD3+ de la población de células efectoras PBMC. Relación de células efectoras:células diana = 20:1.
La FIGURA 94A es una serie de gráficas que muestran el porcentaje de linfocitos T CD8+CD69+ (izquierda) y linfocitos T CD8+CD107a+ (en medio) en función de la concentración de TDB para HER2 (UCHT1v9/hu4D5), evaluado mediante análisis FACS y el porcentaje de eliminación de células diana SKBR3 en función de la concentración de TDB para HER2 (UCHT1v9/hu4D5) (derecha). Las células diana fueron células SKBR3; las células efectoras fueron linfocitos T CD8+; relación de células efectoras:células diana = 3:1.
La FIGURA 94B es una serie de gráficas que muestran el porcentaje de eliminación de células diana BT474 en función de la concentración de TDB para HER2 (UCHT1v9/hu4D5) (izquierda) y el porcentaje de linfocitos T CD8+CD69+GranzimaB+ en función de la concentración de TDB para HER2 (UCHT1v9/hu4D5) (derecha), evaluado mediante análisis FACS. Las células diana fueron células BT474; las células efectoras fueron linfocitos T CD8+; relación de células efectoras:células diana como se indica.
La FIGURA 95A es una serie de histogramas que muestran la expresión de CFSE en linfocitos T CD8+ en presencia de células diana SKBR3 y/o TDB para He R2 (UCHT1v9/hu4D5).
La FIGURA 95B es una gráfica que muestra el factor de cambio en el número de células CD8+ en función del tiempo después de la incubación con células diana SKBR3 y TDB para HER2 (UCHT1v9/hu4D5), evaluado mediante análisis FACS.
La FIGURA 95C es una serie de gráficas que muestra el factor de cambio en el número de células CD8+ en función del tiempo después de la incubación con células diana SKBR3, TDB para HER2 (UCHT1v9/hu4D5) y 20 ng/ml de IL-2, evaluado mediante análisis FACS.
La FIGURA 96A es una imagen de una transferencia de Western que muestra el nivel de expresión de Her2 en un panel de líneas celulares tumorales humanas.
La FIGURA 96B es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de células diana en función de la concentración de TDB para HER2 (UCHT1v9/hu4D5) evaluado mediante la liberación de LDH. Las células diana fueron BJAB, MDA435, MDA231, Mc F7, MDA453, SKBR3 y BT474; las células efectoras fueron PBMC; relación de células efectoras:células diana = 25:1.
La FIGURA 96C es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de células diana en función de la concentración de TDB para HER2 (UCHT1v9/hu4D5) evaluado mediante análisis FACS. Las células diana fueron MCF7 y SKBR3; las células efectoras fueron PBMC; relación de células efectoras:células diana = 20:1.
La FIGURA 96D es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de células diana en función de la concentración de TDB para HER2 (UCHT1v9/hu4D5) evaluado mediante análisis FACS. Las células diana fueron BJAB y SKBR3; las células efectoras fueron PBMC; relación de células efectoras:células diana = 20:1.
La FIGURA 96E es una tabla que muestra el número de copias de HER2 para un panel de células diana y para cada uno, la CE50 de TDB para HER2 y el porcentaje de ocupación de HER2 a esa concentración. Las células diana son MDA435, MDA231, MCF7, MDA453, BT474 y SKBR3.
La FIGURA 97A es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de células diana en función de la concentración de TDB para HER2 (UCHT1v9/hu4D5) evaluado mediante la liberación de LDH. Las células diana fueron SKBR3, HCC1569, KPL4, h Cc 202, JIMT1 y c Al U3; las células efectoras fueron PBMC; relación de células efectoras:células diana = 10:1.
La FIGURA 97B es una gráfica que muestra el porcentaje de células diana viables en función de la concentración de trastuzumab emtansina (T-DM1) evaluado mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CELLTITERGLO®. Las células diana fueron BT474-M1 y BT474-M1 resistentes a T-DM1; las células efectoras fueron linfocitos T CD8+; relación de células efectoras:células diana = 3:1.
La FIGURA 97C es una gráfica que muestra el porcentaje de células diana viables en función de la concentración de TDB para HER2 (UCHT1v9/hu4D5) evaluado mediante análisis FACS. Las células diana fueron BT474-M1 y BT474-M1 resistentes a T-DM1; las células efectoras fueron linfocitos T CD8+; relación de células efectoras:células diana = 3:1.
La FIGURA 98 es una gráfica y una tabla que muestran la farmacocinética (PK) de TDB para HER2 (UCHT1v9/hu4D5) en ratas Sprague-Dawley evaluada mediante ELISA.
La FIGURA 99A es una gráfica que muestra el volumen tumoral relativo con el paso del tiempo para el grupo 1 (vehículo a 0,5 mg/kg); el grupo 2 (PBMC(1) vehículo a 0,5 mg/kg); el grupo 3 (PBMC(1) TDB para HER2 (uCHT1v9/hu4D5) a 0,5 mg/kg); el grupo 4 (Pb MC(2) vehículo a 0,5 mg/kg); y el grupo 5 (PBMC(2) TDB para HER2 (UCHT1v9/hu4D5) a 0,5 mg/kg). La FIGURA 99B es una gráfica que muestra el porcentaje de cambio en el volumen tumoral con el paso del tiempo para el grupo 1 (vehículo a 0,5 mg/kg); y el grupo 2 (TDB para HER2 (hu4D5/2C11) a 0,5 mg/kg).
La FIGURA 99C es un histograma que muestra el porcentaje relativo de cambio en el volumen tumoral con el paso del tiempo para el grupo 1 (vehículo a 0,5 mg/kg); y el grupo 2 (TDB para HER2 (hu4D5/2C11) a 0,5 mg/kg). La FIGUrA 99D es una gráfica que muestra el volumen tumoral relativo con el paso del tiempo para el grupo 1 (vehículo a 0,5 mg/kg); y el grupo 2 (TDB para HER2 (hu4D5/2C11) a 0,5 mg/kg). Los tumores con respuesta al tratamiento incluyeron tumores que tenían más de 1000 mm3 al inicio del tratamiento.
La FIGURA 99E es una gráfica que muestra el porcentaje de cambio en el volumen tumoral con el paso del tiempo para el grupo 1 (TDB para HER2 con brazo de control para CD3 (hu4D5/SP34) a 0,5 mg/kg); y el grupo 2 (TDB de control (2C11) a 0,5 mg/kg).
La FIGURA 99F es una gráfica que muestra el volumen tumoral relativo con el paso del tiempo para el grupo 1 (vehículo a 0,5 mg/kg); y el grupo 2 (TDB para HER2 (hu4D5/SP34) a 0,5 mg/kg).
La FIGURA 99G es una gráfica que muestra el volumen tumoral relativo con el paso del tiempo para el grupo 1 (vehículo a 0,5 mg/kg); el grupo 2 (TDB para HER2 (hu4D5/2C11) a 0,5 mg/kg); el grupo 3 (Td B de control (2C11 ) a 0,5 mg/kg); y el grupo 4 (T-DM1 a 15 mg/kg).
La FIGURA 100A es una gráfica que muestra el volumen tumoral relativo con el paso del tiempo para el grupo 1 (sin tratar); el grupo 2 (TDB para HER2 (UCHT1v9/hu4D5) a 0,5 mg/kg).
La FIGURA 100B es una gráfica que muestra el volumen tumoral relativo con el paso del tiempo para el grupo 1 (vehículo a 0,5 mg/kg); el grupo 2 (PBMC(3) vehículo a 0,5 mg/kg); y el grupo 3 (PBMC(3) TDB de control (2C11) a 0,5 mg/kg).
La FIGURA 101A es una gráfica que muestra la afinidad de unión para el anticuerpo CD3-UCHT1 evaluado respecto de su unión in vitro a CD3 humano en linfocitos T humanos, linfocitos T TG para CD3 y linfocitos T de BALB/c, evaluado mediante análisis FACS.
La FIGURA 101B es una gráfica que muestra la afinidad de unión para el anticuerpo CD3-2C11 evaluado respecto de su unión in vitro a CD3 de ratón en linfocitos T TG para CD3 y linfocitos T de BALB/c, evaluado mediante análisis FACS.
La FIGURA 102A es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de células diana CT26-HER2 en función de la concentración de TDB para HER2 (UCHT1v9/hu4D5), evaluado mediante análisis FACS. Las células efectoras fueron linfocitos T aislados de sangre periférica humana, linfocitos T esplénicos transgénicos para huCD3 y linfocitos T esplénicos de BALB/c.
La FIGURA 102B es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de células diana CT26-HER2 en función de la concentración de TDB para HER2 (hu4D5/2C11), evaluado mediante análisis FACS. Las células efectoras fueron linfocitos T aislados de sangre periférica humana, linfocitos T esplénicos transgénicos para huCD3 y linfocitos T esplénicos de BALB/c.
La FIGURA 103 es una gráfica que muestra el volumen tumoral relativo con el paso del tiempo para el grupo 1 (vehículo a 0,5 mg/kg); y el grupo 2 (TDB para HER2 (hu4D5/SP34) a 0,5 mg/kg).
La FIGURA 104 es una gráfica que muestra las curvas de unión para cada uno de los tres TDB para LYPD1 ensayados respecto de su unión in vitro a linfocitos T CD8+ que expresan CD3.
La FIGURA 105 es una gráfica que muestra el porcentaje de eliminación de células diana OVCAR3.Luc en función de la concentración de TDB para LYPD1.
La FIGURA 106 es un conjunto de gráficas que muestran el porcentaje de linfocitos T CD8+CD69+ (izquierda) y CD8+CD25+ (derecha) en función de la concentración de t Db para LYPD1, evaluado mediante análisis FACS. Las células diana fueron células OVCAR3.Luc; relación de células efectoras:células diana = 3:1.
La FIGURA 107 muestra las secuencias de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera (parte superior) y el dominio variable de cadena pesada (parte inferior) del anticuerpo anti-RET 41205.v6.
La FIGURA 108A es una gráfica que muestra el volumen tumoral (mm3) en función del tiempo (días) para el grupo 1 (vehículo, qwx3, IV; n=9); el grupo 2 (TDB para CD20 (2H7-mu2C11), 0,5 mg/kg, qwx3, IV; n=9); el grupo 3 (anti-PD1 (mu8F11 DANA), 10 mg/kg, tiwx3, IP; n=9); y el grupo 4 (anti-PD1 (mu8F11 DANA), 10 mg/kg, tiwx3, IP+ TDB para CD20 (2H7-mu2C11), 0,5 mg/kg, qwx3, iV; n=9).
La FIGURA 108B es una gráfica que muestra el volumen tumoral (mm3) en función del tiempo (días) para el grupo 1 (vehículo, qwx3, IV; n=9); el grupo 2 (TDB para CD20 (2H7-mu2C11), 0,5 mg/kg, qwx3, IV; n=9); el grupo 3 (anti-PD1 (mu8F11 DANA), 10 mg/kg, tiwx3, IP; n=9); y el grupo 4 (anti-PD1 (mu8F11 DANA), 10 mg/kg, tiwx3, IP CD20 TDB (2H7-mu2C11), 0,5 mg/kg, qwx3, IV; n=9). La línea continua más oscura representa el volumen tumoral ajustado para el grupo especificado.
Descripción detallada de las realizaciones de la invención
I. Definiciones
El término "aproximadamente", como se usa en el presente documento, se refiere al intervalo de error habitual para el valor respectivo, fácilmente conocido por los expertos en este campo técnico. La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) realizaciones que se refieren a ese valor o parámetro en sí.
Un "marco aceptor humano", a efectos del presente documento, es un marco que comprende la secuencia de aminoácidos de un marco de dominio variable de cadena ligera (VL) o un marco de dominio variable de cadena pesada (VH) derivado de un marco de inmunoglobulina humana o un marco consenso humano, como se define más adelante. Un marco aceptor humano "derivado de" un marco de inmunoglobulina humana o de un marco consenso humano pueden comprender la misma secuencia de aminoácidos del mismo o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones, el número de cambios de aminoácidos es 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos o 2 o menos. En algunas realizaciones, el marco humano aceptor de VL es idéntico en secuencia a la secuencia del marco de VL de inmunoglobulina humana o a la secuencia de marco consenso humana.
"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y puede estar representada en general por la constante de disociación (Kd). La afinidad puede medirse mediante métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. A continuación se describen realizaciones específicas ilustrativas y a modo de ejemplo para medir la afinidad de unión.
Un anticuerpo "madurado por afinidad" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más de las regiones hipervariables (HVR), en comparación con un anticuerpo precursor que no posee dichas alteraciones, dando como resultado dichas alteraciones una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno.
Las expresiones "anticuerpo anti-CD3" y "anticuerpo que se une a CD3" se refieren a un anticuerpo que es capaz de unirse a CD3 con suficiente afinidad, de tal forma que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse a CD3. En una realización, el alcance de la unión de un anticuerpo anti-CD3 a una proteína no relacionada, distinta de CD3 es menor de aproximadamente el 10 % de la unión del anticuerpo a CD3 medida, por ejemplo, mediante radioinmunoensayo (RIA). En ciertas realizaciones, un anticuerpo que se une a CD3 tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 pM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10-8 M o menor, por ejemplo, de 10-8M a 10-13M, por ejemplo, de 10-9M a 10-13M). En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-CD3 se une a un epítopo de CD3 que está conservado entre CD3 de diferentes especies.
El término "anticuerpo" se usa en el presente documento en el sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo, en tanto que muestren la actividad de unión a antígeno deseada.
Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
Por "dominio de unión" se entiende una parte de un compuesto o una molécula que se une específicamente a un epítopo, antígeno, ligando o receptor diana. Los dominios de unión incluyen, pero sin limitación, anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, policlonales, recombinantes, humanizados y quiméricos), fragmentos de anticuerpo o porciones de los mismos (por ejemplo, fragmentos Fab, Fab'2, anticuerpos scFv, SMIP, anticuerpos de dominio, diacuerpos, minicuerpos, scFv-Fc, aficuerpos, nanocuerpos y dominios VH y/o VL de anticuerpos), receptores, ligandos, aptámeros y otras moléculas que tienen un compañero de unión identificado.
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes, tales como tiotepa y ciclosfosfamida (CITOXAN®); alquilsulfonatos, tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas, tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilmelaminas, incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colchicinas; ácido betulínico; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético de topotecán (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecán, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipósido; criptoficinas (en particular, criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas nitrogenadas, tales como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos, tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina gamma II y calicheamicina omega II (véase, por ejemplo, Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); CDP323, un inhibidor oral de alfa-4 integrina; dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina; así como cromóforo de neocarcinostatina y cromóforos de antibióticos de enediina relacionados con cromoproteína), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluyendo ADRIAMYCIN®, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolinodoxorrubicina, inyección liposómica de doxorrubicina HCl (DOXIL®), doxorrubicina liposomal TLC D-99 (MYOCET®), doxorrubicina liposomal pegilada (CAELYX®) y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos, tales como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), capecitabina (XELODA®), una epotilona y 5-fluorouracilo (5-FU); combretastatina; análogos del ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; agentes antisuprarrenales, tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elformitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides, tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; 2-etilhidracida; procarbazina; complejo polisacarídico PSK® (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxano; rizoxina; sizofurano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); tiotepa; taxoide, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), formulación diseñada en nanopartículas de albúmina de paclitaxel (ABRAXANE™) y docetaxel (TAXOTERE®, Rhome-Poulene Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; agentes de platino, tales como cisplatino, oxaliplatino (por ejemplo, ELOXATIN®) y carboplatino; vincas, que evitan que la polimerización de tubulina forme microtúbulos, incluyendo vinblastina (VELBAN®), vincristina (ONCOVIN®), vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) y vinorelbina (NAVELBINE®); etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; leucovorina; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides, tales como ácido retinoico, incluyendo bexaroteno (TARGRETIN®); bisfosfonatos, tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSt Ac ®), etidronato (DIDROCAL®), NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®), tiludronato (SKELID®) o risedronato (ACTONEL®); troxacitabina (un análogo nucleosídico de 1,3-dioxolano citosina; oligonucleótidos antisentido, particularmente, los que inhiben la expresión de genes en vías de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras y receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) (por ejemplo, erlotinib (Tarceva™)); y VEGF-A que reducen la proliferación celular; vacunas, tales como la vacuna THERATOPE® y vacunas de terapia génica, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; inhibidor de topoisomerasa 1 (por ejemplo, LURTOTECAN®); rmRH (por ejemplo, ABARELIX®); BAY439006 (sorafenib; Bayer); SU-11248 (sunitinib, SUTENT®, Pfizer); perifosina, inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib o etoricoxib), inhibidor del proteasoma (por ejemplo, PS341); bortezomib (VELCADE®); CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; inhibidor de Bcl-2, tal como oblimersen sódico (GENASENSE®); pixantrona; inhibidores de EGFR; inhibidores de tirosina cinasa; inhibidores de serina-treonina cinasa, tales como rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE®); inhibidores de farnesil transferasa, tales como lonafarnib (SCH 6636, SARASAR™); y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura de una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona; y FOLFOX, una abreviatura para un régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovorina y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores.
Los agentes quimioterapéuticos como se definen en el presente documento incluyen "agentes antihormonales" o "agentes terapéuticos endocrinos" que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de hormonas que pueden promover el crecimiento del cáncer. Pueden ser, en sí, hormonas, incluyendo, pero sin limitación: antiestrógenos y moduladores selectivos del receptor de estrógenos (SERM), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y FARESTON.cndot.toremifeno; inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanio, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA® y anastrozol ARIMIDEX®; y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; así como troxacitabina (un análogo nucleosídico de 1,3-dioxolano citosina; oligonucleótidos antisentido, en particular, los que inhiben la expresión de genes en vías de señalización implicadas en la proliferación celular anómala, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf y H-Ras; ribozimas, tales como un inhibidor de la expresión de VEGF (por ejemplo, ribozima a Ng IOZYME®) y un inhibidor de la expresión de HER2; vacunas tales como vacunas para terapia génica, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; inhibidor de la topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; Vinorelbina y Esperamicinas (véase la Patente de los Estados Unidos n.° 4.675.187) y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores.
La expresión anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera procede de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera procede de una fuente o especie diferente.
La expresión "grupo de diferenciación 3" o "CD3", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier CD3 nativo de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos, tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), salvo que se indique de otro modo, incluyendo, por ejemplo, cadenas CD3e, CD3y, CD3a y CD3p. El término abarca CD3 no procesado de "longitud completa" (por ejemplo, CD3e o CD3y no procesado o no modificado), así como cualquier forma de CD3 que sea el resultado de su procesamiento en la célula. El término también abarca variantes de origen natural de CD3, incluyendo, por ejemplo, variantes de corte y empalme o variantes alélicas. CD3 incluye, por ejemplo, la proteína CD3e humana (n.° de RefSeq del NCBI NP_000724), que tiene 207 aminoácidos de longitud y proteína CD3y humana (n.° de RefSeq del NCBI NP_000064), que tiene 182 aminoácidos de longitud.
La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseída por su cadena pesada. Hay cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varias de estas pueden además dividirse en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAt e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, 8, £, y y M, respectivamente.
Se entiende que los aspectos y realizaciones de la invención descritos en el presente documento incluyen aquellos que "comprenden", "consisten", y "consisten esencialmente en" aspectos y realizaciones.
La expresión "agente citotóxico", como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia que inhibe o previene una función celular y/o provoca la muerte o destrucción celular. Los agentes citotóxicos incluyen, pero sin limitación, isótopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu); agentes o fármacos quimioterapéuticos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de las mismas, tales como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas, tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos; y los diversos agentes antitumorales o anticancerosos divulgados más adelante.
Un "trastorno" es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento, incluyendo, pero sin limitación, trastornos o enfermedades agudos y crónicos, incluyendo aquellas patologías que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión.
Las expresiones "trastorno proliferativo celular" y "trastorno proliferativo" se refieren a trastornos que se asocian con algún grado de proliferación celular anormal. En una realización, el trastorno proliferativo celular es cáncer. En una realización, el trastorno proliferativo celular es un tumor.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza normalmente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o tumores linfoides malignos. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen, pero sin limitación, cáncer escamocelular (por ejemplo, cáncer de células escamosas epiteliales), cáncer de pulmón, incluyendo cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma epidermoide de pulmón, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago, incluyendo cáncer gastrointestinal y cáncer estromal gastrointestinal, cáncer de páncreas, glioblastoma, cáncer de cuello de útero, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o uterino, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma del pene, melanoma, melanoma de diseminación superficial, léntigo, melanoma maligno, melanomas lentigosos acrales, melanomas nodulares, mieloma múltiple y linfoma de linfocitos B (incluyendo linfoma no Hodgkin de grado bajo/folicular (NHL); NHL linfocítico de células pequeñas (SL); NHL de grado intermedio/folicular; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de alto grado; NHL linfoblástico de alto grado; NHL de células no escindidas pequeñas de alto grado; NHL con neoplasia maligna; linfoma de células del manto; linfoma relacionado con SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); tricoleucemia; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo posterior a trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores cerebrales), síndrome de Meigs, cáncer de cerebro, así como de cabeza y cuello y las metástasis asociadas. En ciertas realizaciones, los cánceres que son susceptibles al tratamiento mediante los anticuerpos de la invención incluyen cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer de pulmón no microcítico, glioblastoma, linfoma no Hodgkin (NHL), cáncer de células renales, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, sarcoma de partes blandas, sarcoma de Kaposi, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, mesotelioma y mieloma múltiple. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona entre: cáncer microcítico de pulmón, glioblastoma, neuroblastomas, melanoma, carcinoma de mama, cáncer gástrico, cáncer colorrectal (CRC) y carcinoma hepatocelular. No obstante, en algunas realizaciones, el cáncer se selecciona entre: cáncer de pulmón no microcítico, cáncer colorrectal, glioblastoma y carcinoma de mama, incluyendo formas metastásicas de estos cánceres. En otras realizaciones, el cáncer se selecciona entre una clase de cánceres de linfocitos B maduros, excluyendo el linfoma no Hodgkin, pero incluyendo el DLBCL similar a linfocitos B del centro germinal (GCB), DLBCL similar a linfocitos B activados (ABC), linfoma folicular (FL), linfoma de células del manto (MCL), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfoide crónica (CLL), linfoma de la zona marginal (MZL), leucemia linfocítica microcítica (SLL), linfoma linfoplasmacítico (LL), macroglobulinemia de Waldenstrom (WM), linfoma del sistema nervioso central (CNSL), linfoma de Burkitt (BL), leucemia prolinfocítica de linfocitos B, linfoma esplénico de la zona marginal, tricoleucemia, linfoma/leucemia esplénica, no clasificable, linfoma de linfocitos B pequeños de la pulpa roja difusa esplénica, variante de tricoleucemia, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedades de cadenas pesadas, enfermedad de cadena pesada a, enfermedad de cadena pesada y, enfermedad de cadena pesada p, mieloma de células plasmáticas, plasmacitoma solitario del hueso, plasmacitoma extraóseo, linfoma de la zona marginal extranodal de tejido linfoide asociado a mucosa (linfoma MALT), linfoma de la zona marginal nodal, linfoma de la zona marginal nodal pediátrico, linfoma folicular pediátrico, linfoma del centro folicular cutáneo primario, linfoma de linfocitos B grandes rico en linfocitos T/histiocitos, DLBCL primario del SNC, DLBCL cutáneo primario, tipo pierna, DLBCL positivo a EBV en ancianos, DLBCL asociado con inflamación crónica, granulomatosis linfomatoide, linfoma de linfocitos B grandes mediastinales (tímicos) primario, linfoma de linfocitos B grandes intravascular, linfoma de linfocitos B grandes positivos a ALK, linfoma plasmablástico, linfoma de linfocitos B grandes que surge en enfermedad de Castleman multicéntrica asociada con HHV8, linfoma de efusión primario: linfoma de linfocitos B, no clasificable, con características intermedias entre el linfoma difuso de linfocitos B grandes y linfoma de Burkitt y linfoma de linfocitos B, no clasificable, con características intermedias entre el linfoma difuso de linfocitos B grandes y el linfoma de Hodgkin clásico.
"Tumor", como se usa en el presente documento, se refiere a todos los crecimientos y proliferaciones de células neoplásicas, ya sean malignas o benignas y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos. Los términos "cáncer", "canceroso", "trastorno proliferativo celular", "trastorno proliferativo" y "tumor" no son mutuamente excluyentes, como se cita en el presente documento.
La expresión "antígeno tumoral", como se usa en el presente documento, puede entenderse como aquellos antígenos que se presentan en células tumorales. Estos antígenos pueden presentarse sobre la superficie celular con una parte extracelular, que normalmente se combina con una parte transmembrana y citoplasmática de la molécula. Estos antígenos en ocasiones pueden presentarse únicamente por células tumorales y nunca por las normales. Los antígenos tumorales pueden expresarse exclusivamente sobre células tumorales o puede representar una mutación específica de tumores, en comparación con células normales. En este caso, se denominan antígenos específicos de tumores. Los más comunes son los antígenos tumorales que se presentan por células tumorales y células normales y se denominan antígenos asociados a tumores. Estos antígenos asociados a tumores pueden sobreexpresarse en comparación con las células normales o son accesibles para la unión de anticuerpos en células tumorales debido a la estructura menos compacta del tejido tumoral, en comparación con el tejido normal. En un aspecto, el antígeno tumoral se selecciona entre aquellos expuestos en la tabla 1 más adelante.
Las "funciones efectoras" se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC); unión al receptor Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulación negativa de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B); y activación de linfocitos B.
Una "cantidad eficaz" de un compuesto, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3 de la invención o una composición (por ejemplo, composición farmacéutica) del mismo, es al menos la cantidad mínima necesaria para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado, tal como una mejora o prevención medible de un trastorno particular (por ejemplo, un trastorno proliferativo celular, por ejemplo, cáncer). En el presente documento, una cantidad eficaz puede variar de acuerdo con factores tales como la patología, la edad, el sexo y el peso del paciente y de la capacidad del anticuerpo para desencadenar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad eficaz es también una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del tratamiento se ve superado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Para uso profiláctico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados tales como la eliminación o la reducción del riesgo, la disminución de la gravedad o el retraso del inicio de la enfermedad, incluyendo los síntomas bioquímicos, histológicos y/o de comportamiento de la enfermedad, sus complicaciones y los fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. Para uso terapéutico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados clínicos tales como la disminución de uno o más síntomas resultantes de la enfermedad, aumentar la calidad de vida de aquellos que padecen la enfermedad, reducir la dosis de otras medicaciones necesarias para tratar la enfermedad, potenciando el efecto de otra medicación tal como dirigiendo, retrasando la progresión de la enfermedad y/o prolongando la supervivencia. En el caso de un cáncer o tumor, una cantidad eficaz del fármaco puede tener efecto a la hora de reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño tumoral; inhibir (es decir, frenar hasta cierto punto o deseablemente detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, frenar hasta cierto punto y deseablemente detener) la metástasis tumoral; inhibir hasta cierto punto el crecimiento tumoral; y/o aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones. Para los fines de la presente invención, una cantidad eficaz de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para llevar a cabo el tratamiento profiláctico o terapéutico tanto directa como indirectamente. Como se entiende en el contexto clínico, una cantidad eficaz de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica puede conseguirse o no junto con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Por tanto, una "cantidad eficaz" puede considerarse en el contexto de la administración de uno o más agentes terapéuticos y puede considerarse que se administra un solo agente en una cantidad eficaz si, junto con uno o más agentes diferentes, puede lograrse o se logra un resultado deseable.
La expresión "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. La expresión incluye regiones Fc de secuencia nativa y regiones Fc variantes. En una realización, una región Fc de cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226 o desde Pro230, hasta el extremo carboxilo de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C-terminal (Lys447) de la región Fc puede estar o no presente. A menos que se especifique lo contrario en el presente documento, la numeración de los restos de aminoácidos en la región Fc o en la región constante es de acuerdo con el sistema de numeración de EU, también llamado índice de EU, tal como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
"Marco" o "FR" se refiere a restos de dominio variable distintos de restos de la región hipervariable (HVR). La región FR de un dominio variable consiste de cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. Por consiguiente, las secuencias de HVR y FR aparecen generalmente en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Las expresiones "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento.
Un "agente inhibidor del crecimiento", cuando se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, ya sea in vitro o in vivo. En una realización, el agente inhibidor del crecimiento es un anticuerpo inhibidor del crecimiento que previene o reduce la proliferación de una célula que expresa un antígeno al que se une el anticuerpo. En otra realización, el agente inhibidor del crecimiento puede ser uno que reduzca significativamente el porcentaje de células en fase S. Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un punto distinto de la fase S), tales como agentes que inducen la detención en G1 y la detención en la fase M. Los bloqueadores de la fase M clásicos incluyen los agentes de la vinca (vincristina y vinblastina), taxanos e inhibidores de topoisomerasa II, tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido y bleomicina. Aquellos agentes que detienen la fase G1 y también se pasan a la detención de la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN, tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Puede encontrarse información adicional en Mendelsohn e Israel, eds., The Molecular Basis of Cancer, Capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (W.B. Saunders, Filadelfia, 1995), por ejemplo, pág. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anticáncer ambos derivados del tejo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), procedente del tejo europeo, es un análogo semisintético del paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). El paclitaxel y el docetaxel promueven el ensamblaje de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos impidiendo su despolimerización, lo que da como resultado la inhibición de la mitosis en las células.
La expresión cáncer "positivo a HER2" comprende células cancerosas que tienen niveles por encima de lo normal de HER2. Los ejemplos de cáncer positivo a HER2 incluyen cáncer de mama positivo a HER2 y cáncer gástrico positivo a HER2. Opcionalmente, el cáncer positivo a HER2 tiene una puntuación de inmunohistoquímica (IHC) de 2+ o 3+ y/o una relación de amplificación de hibridación in situ (ISH) > 2,0.
Las expresiones "célula hospedadora", "línea celular hospedadora" y "cultivo de células hospedadoras" se usan indistintamente y se refiere a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células hospedadoras incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen a la célula primaria transformada y a la descendencia procedente de esta, independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en el contenido de ácido nucleico a una célula progenitora, pero puede contener mutaciones. Se incluye en el presente documento la descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica detectada sistemáticamente o seleccionada en la célula transformada originalmente.
Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que se corresponde con la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o que procede de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpo humanos u otras secuencias codificantes de anticuerpo humanas. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprenda restos de unión a antígeno no humanos. Los anticuerpos humanos se pueden producir también usando varias técnicas conocidas en la técnica, incluyendo bibliotecas de presentación en fagos. Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Para la preparación de anticuerpos monoclonales también se dispone de los métodos descritos en Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Véase también van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Pueden prepararse anticuerpos humanos administrando el antígeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir dichos anticuerpos en respuesta a la exposición a antígenos, pero cuyos loci endógenos se han desactivado, por ejemplo, ratones xenomouse (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 6.075.181 y 6.150.584 referentes a la tecnología XENOMOUSE™). Véase también, por ejemplo, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) que se refiere a anticuerpos humanos generados mediante la tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos.
Un "marco consenso humano" es un marco que representa los restos de aminoácidos más comunes en una selección de secuencias marco de VL o VH de inmunoglobulina humana. En general, la selección de secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humanas es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, NIH Publicación 91-3242, Bethesda MD (1991), vol. 1-3. En una realización, para la VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I como en Kabat et al., anteriormente citado. En una realización, para la Vh , el subgrupo es el subgrupo III como en Kabat et al., anteriormente citado.
Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende restos de aminoácido de HVR no humanas y restos de aminoácidos de FR humanas. En ciertas realizaciones, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno y generalmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a aquellas de un anticuerpo no humano y la totalidad o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado puede comprender opcionalmente al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización.
La expresión "región hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en cuanto a su secuencia ("regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR") y/o de bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables") y/o que contienen los restos de contacto con el antígeno ("contactos de antígeno"). En general, los anticuerpos comprenden seis HVR: tres en la VH (H1, H2, H3) y tres en la VL (L1, L2, L3). Las HVR a modo de ejemplo en el presente documento incluyen:
(a) bucles hipervariables que aparecen en los restos de aminoácido 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) CDR que aparecen en los restos de aminoácido 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) contactos con el antígeno que tienen lugar en los restos de aminoácido 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) y 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); y
(d) combinaciones de (a), (b) y/o (c), incluyendo los restos de aminoácido de HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) y 94-102 (H3).
A menos que se indique otra cosa, los restos de HVR y otros restos en el dominio variable (por ejemplo, restos de FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabat et al., anteriormente citado.
Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado a una o más moléculas heterólogas, incluyendo, pero sin limitación, un agente citotóxico.
Un "sujeto" o un "individuo" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero sin limitación, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, primates humanos y no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En ciertas realizaciones, el sujeto o individuo es un ser humano.
Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha separado de un componente de su ambiente natural. En algunas realizaciones, un anticuerpo se purifica hasta una pureza mayor del 95 % o 99 % determinada mediante, por ejemplo, métodos electroforéticos (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatográficos (por ejemplo, intercambio iónico o HPLC en fase reversa). Para una revisión de los métodos para la evaluación de la pureza de anticuerpos, véase, por ejemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su ambiente natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que normalmente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de manera extracromosómica o en una ubicación cromosómica que es diferente de su ubicación cromosómica natural.
Un "ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-CD3" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo (o fragmentos de las mismas), incluyendo dichas moléculas de ácido nucleico en un solo vector o vectores separados y dichas moléculas de ácido nucleico presentes en una o más ubicaciones de una célula hospedadora.
La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, salvo por posibles variantes de anticuerpos, por ejemplo, que contienen mutaciones de origen natural o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpo monoclonal, estando presentes dichas variantes generalmente en cantidades menores. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que incluyen generalmente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales está dirigido contra un solo determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se ha obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no debe interpretarse como que requiera la producción del anticuerpo por ningún método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para su uso de acuerdo con la presente invención pueden producirse mediante diversas técnicas, incluyendo pero, sin limitación, el método de hibridoma, métodos de ADN recombinante, métodos de presentación en fagos y métodos que utilizan animales transgénicos que contienen la totalidad o parte de los loci de inmunoglobulinas humanas, describiéndose dichos métodos y otros métodos a modo de ejemplo para producir anticuerpos monoclonales en el presente documento.
Un "anticuerpo desnudo" se refiere a un anticuerpo que no está conjugado a un resto heterólogo (por ejemplo, un resto citotóxico) o radiomarcador. El anticuerpo no marcado puede estar presente en una formulación farmacéutica.
Los "anticuerpos nativos" se refieren a moléculas de inmunoglobulina de origen natural con diversas estructuras. Por ejemplo, los anticuerpos IgG nativos son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 Dalton, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que están unidas por enlaces disulfuro. Del extremo N al extremo C-terminal, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también denominada dominio pesado variable o dominio variable de cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). De manera similar, del extremo N al extremo C-terminal, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también denominada dominio variable ligero o dominio variable de cadena ligera, seguida de un dominio variable constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo puede asignarse a uno de dos tipos, denominados kappa (k) y lambda (A), basándose en la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.
El término "prospecto" se usa para referirse a instrucciones habitualmente incluidas en los envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, el uso, la dosificación, la administración, terapia combinada, las contraindicaciones y/o las advertencias en referencia al uso de dichos productos terapéuticos.
La expresión "antagonista de unión al eje de PD-1" se refiere a una molécula que inhibe la interacción de un compañero de unión del eje de PD-1 con uno o más de sus compañeros de unión, a fin de eliminar la disfunción de linfocitos T resultante de la señalización en el eje de señalización de PD-1, siendo un resultado la restauración o potenciación de la función de linfocitos T (por ejemplo, la proliferación, la producción de citocinas, la eliminación de células diana). Como se usa en el presente documento, un antagonista de unión al eje de PD-1 incluye un antagonista de unión a PD-1, un antagonista de unión a PD-L1 y un antagonista de unión a PD-L2.
La expresión "antagonista de unión a PD-1" se refiere a una molécula que reduce, bloquea, inhibe, suprime o interfiere con la transducción de señales resultante de la interacción de PD-1 con uno o más de sus compañeros de unión, tal como PD-L1, PD-L2. En algunas realizaciones, el antagonista de unión a PD-1 es una molécula que inhibe la unión de PD-1 a uno o más de sus compañeros de unión. En un aspecto específico, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a PD-L1 y/o PD-L2. Por ejemplo, los antagonistas de unión a PD-1 incluyen anticuerpos anti-PD-1, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, inmunoadhesinas, proteínas de fusión, oligopéptidos y otras moléculas que reducen, bloquean, inhiben, anulan o interfieren con la transducción de señales resultante de la interacción de PD-1 con PD-L1 y/o PD-L2. En una realización, un antagonista de unión a PD-1 reduce la señal coestimuladora negativa mediada por o a través de la señalización mediada por proteínas de la superficie celular expresadas en linfocitos T a través de PD-1 para hacer que un linfocito T disfuncional sea menos disfuncional (por ejemplo, potenciando las respuestas efectoras al reconocimiento de antígenos). En algunas realizaciones, el antagonista de unión a PD-1 es un anticuerpo anti-PD-1. En un aspecto específico, un antagonista de unión a PD-1 es MDX-1106 (nivolumab), descrito en el presente documento. En otro aspecto específico, un antagonista de unión a PD-1 es MK-3475 (lambrolizumab), descrito en el presente documento. En otro aspecto específico, un antagonista de unión a PD-1 es CT-011 (pidilizumab), descrito en el presente documento. En otro aspecto específico, un antagonista de unión a PD-1 es AMP-224, descrito en el presente documento.
La expresión "antagonista de unión a PD-L1" se refiere a una molécula que reduce, bloquea, inhibe, suprime o interfiere con la transducción de señales resultantes de la interacción de PD-L1 con uno o más de sus compañeros de unión, tal como PD-1, B7-1. En algunas realizaciones, un antagonista de unión a PD-L1 es una molécula que inhibe la unión de PD-L1 a sus compañeros de unión. En un aspecto específico, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a PD-1 y/o b 7-1. En algunas realizaciones, los antagonistas de unión a PD-L1 incluyen anticuerpos anti-PD-L1, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, inmunoadhesinas, proteínas de fusión, oligopéptidos y otras moléculas que reducen, bloquean, inhiben, anulan o interfieren con la transducción de señales resultante de la interacción de PD-L1 con uno o más de sus compañeros de unión, tal como PD-1, B7-1. En una realización, un antagonista de unión a PD-L1 reduce la señal coestimuladora negativa mediada por o a través de la señalización mediada por proteínas de la superficie celular expresadas en linfocitos T a través de PD-L1 para hacer que un linfocito T disfuncional sea menos disfuncional (por ejemplo, potenciando las respuestas efectoras al reconocimiento de antígenos). En algunas realizaciones, un antagonista de unión a PD-L1 es un anticuerpo anti-PD-L1. En un aspecto específico, un anticuerpo anti-PD-L1 es YW243.55.S70, descrito en el presente documento. En otro aspecto específico, un anticuerpo anti-PD-L1 es MDX-1105, descrito en el presente documento. En otro aspecto específico más, un anticuerpo anti-PD-L1 es MPDL3280A, descrito en el presente documento. En otro aspecto específico más, un anticuerpo anti-PD-L1 es MEDI4736, descrito en el presente documento.
La expresión "antagonista de unión a PD-L2" se refiere a una molécula que reduce, bloquea, inhibe, suprime o interfiere con la transducción de señales resultantes de la interacción de PD-L2 con uno o más de sus compañeros de unión, tal como PD-1. En algunas realizaciones, un antagonista de unión a PD-L2 es una molécula que inhibe la unión de PD-L2 a uno o más de sus compañeros de unión. En un aspecto específico, el antagonista de unión a PD-L2 inhibe la unión de PD-L2 a PD-1. En algunas realizaciones, los antagonistas de PD-L2 incluyen anticuerpos anti-PD-L2, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, inmunoadhesinas, proteínas de fusión, oligopéptidos y otras moléculas que reducen, bloquean, inhiben, anulan o interfieren con la transducción de señales resultante de la interacción de PD-L2 con uno o más de sus compañeros de unión, tal como PD-1. En una realización, un antagonista de unión a PD-L2 reduce la señal coestimuladora negativa mediada por o a través de la señalización mediada por proteínas de la superficie celular expresadas en linfocitos T a través de PD-L2 para hacer que un linfocito T disfuncional sea menos disfuncional (por ejemplo, potenciando las respuestas efectoras al reconocimiento de antígenos). En algunas realizaciones, un antagonista de unión a PD-L2 es una inmunoadhesina.
El término "proteína", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier proteína nativa procedente de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos, tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique otra cosa. El término abarca la proteína de "longitud completa" no procesada, así como cualquier forma de la proteína que sea el resultado de su procesamiento en la célula. El término también abarca variantes de origen natural de la proteína, por ejemplo, variantes de corte y empalme o variantes alélicas. Las proteínas de acuerdo con la invención incluyen, por ejemplo, cualquier proteína listada en la tabla 1.
El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" respecto de la secuencia de un polipéptido de referencia se define como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos en la secuencia de polipéptido de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia y sin tomar en consideración cualquier sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse de varias maneras que se encuentran dentro de las capacidades de la técnica, por ejemplo, usando programas informáticos disponibles de manera pública, tales como los programas BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros necesarios para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr una alineación máxima a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se estén comparando. A efectos del presente documento, sin embargo, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 fue programado por Genentech, Inc. y el código fuente, junto con las documentación para usuarios, se han depositado en la Oficina de Derechos de Autor de los Estados Unidos (U.S. Copyright Office), Washington D.C., 20559, donde está registrada con el n.° de Registro de Derechos de Autor de los Estados Unidos TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible al público a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California o puede compilarse a partir de su código fuente. El programa ALIGN-2 debe compilarse para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencia se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.
En las situaciones donde se emplea ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada para, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada (que puede, como alternativa, citarse como una secuencia de aminoácidos A que tiene o comprende un % determinado de identidad de secuencia de aminoácidos para, con o frente a una secuencia de aminoácidos B) se calcula del modo siguiente:
100 veces la fracción X/Y
donde X es el número de restos de aminoácidos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación del programa de A y B y donde Y es el número total de restos de aminoácidos en B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de A respecto de B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B respecto de A. A menos que se afirme específicamente lo contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa informático ALIGN-2.
La expresión "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que se encuentra en una forma tal que permite que sea eficaz la actividad biológica de un principio activo contenido en la misma y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la formulación.
Un "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto del principio activo, que no es tóxico para un sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, pero sin limitación, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.
Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y las variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "tratando") se refiere a la intervención clínica con el objetivo de alterar el transcurso natural del individuo que se esté tratando y puede efectuarse tanto para profilaxis como durante el transcurso de la patología. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero sin limitación, prevenir la aparición o recidiva de la enfermedad, el alivio de los síntomas, la disminución de cualesquiera consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, prevenir la metástasis, disminuir la velocidad de progresión de la enfermedad, mejora o paliación de la patología y remisión o pronóstico mejorado. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para frenar la progresión de una enfermedad.
Como se usa en el presente documento, "retrasar la progresión" de un trastorno o enfermedad significa diferir, impedir, ralentizar, retardar, estabilizar y/o postponer el desarrollo de la enfermedad o el trastorno (por ejemplo, un trastorno proliferativo celular, por ejemplo, cáncer). Este retraso puede ser de diferentes períodos de tiempo, dependiendo de los antecedentes de la enfermedad y/o del individuo que se trate. Como es evidente para un experto en la materia, un retraso suficiente o significativo puede, en efecto, incluir la prevención, en el sentido de que el individuo no desarrolla la enfermedad. Por ejemplo, un cáncer en estadio avanzado, tal como el desarrollo de metástasis, puede retrasarse.
Por "reducir" o "inhibir" se entiende la capacidad de provocar una reducción general, por ejemplo, del 20 % o más, del 50 % o más o del 75 %, 85 %, 90 %, 95 % o más. En ciertas realizaciones, reducir o inhibir pueden referirse a la función efectora de un anticuerpo que está mediada por la región Fc del anticuerpo, incluyendo dichas funciones efectoras específicamente la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y la fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP).
La expresión "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicada en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo nativo tienen generalmente estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones marco conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR). (Véase, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007)). Un solo dominio VH o Vl puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, pueden aislarse anticuerpos que se unen a un antígeno particular usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para efectuar una detección sistemática de una biblioteca de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véase, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al que está unida. El término incluye el vector en forma de una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula hospedadora en la que se ha introducido. Determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los que están enlazados operativamente. Dichos vectores se citan en el presente documento como "vectores de expresión".
Como se usa en el presente documento, "administrar" se entiende como un método para administrar una dosis de un compuesto (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3 de la invención o un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-CD3 de la invención) o una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica, por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye un anticuerpo anti-CD3 de la invención) a un sujeto. Las composiciones utilizadas en los métodos descritos en el presente documento pueden administrarse, por ejemplo, por vía intramuscular, por vía intravenosa, por vía intradérmica, por vía percutánea, por vía intraarterial, por vía intraperitoneal, por vía intralesional, por vía intracraneal, por vía intraarticular, por vía intraprostática, por vía intrapleural, por vía intratraqueal, por vía intranasal, por vía intravítrea, por vía intravaginal, por vía intrarrectal, por vía tópica, por vía intratumoral, por vía peritoneal, por vía subcutánea, por vía subconjuntiva, por vía intravesicular, por vía mucosa, por vía intrapericárdica, por vía intraumbilical, por vía intraocular, por vía oral, por vía tópica, por vía local, mediante inhalación, mediante inyección, mediante infusión, mediante infusión continua, mediante perfusión localizada bañando directamente las células diana, mediante catéter, mediante lavado, en cremas o en composiciones lipídicas. El método de administración puede variar dependiendo de varios factores (por ejemplo, el compuesto o la composición que se esté administrando y la gravedad de la afección, enfermedad o trastorno que se esté tratando).
II. COMPOSICIONES Y MÉTODOS
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-CD3 que es un anticuerpo biespecífico, en donde el anticuerpo biespecífico comprende un brazo anti-CD3 que comprende un primer dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 184 y (b) un dominio Vl que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 185 y un brazo anti-HER2 que comprende un segundo dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 270 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 271. Los anticuerpos de la invención son útiles, por ejemplo, para tratar o retrasar la progresión de un trastorno proliferativo celular (por ejemplo, cáncer) o para potenciar la función inmunitaria en un sujeto que tenga dicho trastorno.
A. Anticuerpos anti-CD3 a modo de ejemplo
En un aspecto, la divulgación proporciona anticuerpos aislados que se unen a CD3 (por ejemplo, CD3e y/o CD3y).
Por ejemplo, en un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-CD3 que tiene un dominio de unión que tiene al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis regiones hipervariables (HVR) seleccionadas entre (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO: 2; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. En algunos casos, el anticuerpo anti-CD3 comprende al menos una (por ejemplo, 1,2, 3 o 4) de las regiones marco de cadena pesada FR-H1, FR-H2, FR-H3 y FR-H4 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID n O: 301-304, respectivamente y/o al menos una (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4) de las regiones marco de cadena ligera FR-L1, FR-L2, FR-L3 y FR-L4 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 305-308, respectivamente. En algunos casos, el anticuerpo anti-CD3 puede tener un dominio variable de cadena pesada (VH) que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) respecto de o la secuencia de, SEQ ID NO: 184 y/o un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) respecto de o la secuencia de, SEQ ID NO: 185. En otros casos, el anticuerpo anti-CD3 comprende al menos una (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4) de las regiones marco de cadena pesada FR-H1, FR-H2, FR-H3 y FR-H4 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 293-296, respectivamente y/o al menos una (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4) de las regiones marco de cadena ligera FR-L1, FR-L2, FR-L3 y FR-L4 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 297-300, respectivamente. En algunos casos, el anticuerpo anti-CD3 puede tener un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) respecto de o la secuencia de, SEQ ID NO: 186 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) respecto de o la secuencia de, SEQ ID NO: 187. En un caso particular, el anticuerpo anti-CD3 puede ser 40G5c o un derivado o pariente clonal del mismo.
En otro aspecto, un anticuerpo de la divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas entre (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 3; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas entre (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. En algunos casos, el anticuerpo antic D3 puede tener un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 184 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 185. En algunos casos, el anticuerpo anti-CD3 puede tener un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 186 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187. En un caso particular, el anticuerpo anti-CD3 puede ser 40G5c o un derivado o pariente clonal del mismo.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, un anticuerpo anti-CD3 está humanizado. En una realización, un anticuerpo anti-CD3 comprende las HVR como en cualquiera de las realizaciones anteriores y además comprende un marco humano aceptor, por ejemplo, un marco de inmunoglobulina humano o un marco consenso humano.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-CD3, en donde el anticuerpo comprende una VH como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente y una VL como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente, en donde una o ambas de las secuencias de dominio variable incluyen modificaciones postraduccionales.
En un aspecto adicional, la divulgación proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-CD3 proporcionado en el presente documento. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-CD3 que comprende una secuencia VH de SEQ ID NO: 184 y una secuencia VL de SEQ ID NO: 185. En ciertas realizaciones de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo dentro de un fragmento de CD3 (por ejemplo, CD3e humano) que consiste en los aminoácidos 1-26 (SEQ ID NO: 283) o 1-27 (SEQ ID NO: 278) de CD3e humano.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo único de CD3. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-CD3 de la divulgación efectúa contactos únicos con los aminoácidos de CD3e humano a una distancia de 3,5 Angstrom, 3,25 Angstrom, 3,00 Angstrom, 2,75 Angstrom o menos. En ciertas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo que consiste en uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos de CD3e humano a una distancia de 3,5 Angstrom, 3,25 Angstrom, 3,00 Angstrom, 2,75 Angstrom o menos. En uno de la divulgación, el anticuerpo anti-CD3 de la invención efectúa contactos únicos con los aminoácidos de CD3e humano a una distancia de 3,5 Angstrom o menos. En ciertas realizaciones de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo que consiste en uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos de CD3e humano a una distancia de 3,5 Angstrom o menos. Por ejemplo, en ciertas realizaciones de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo que consiste en aminoácidos de CD3e humano seleccionados entre Gln1, Asp2, Asn4, Glu6 y Met7. En una realización particular de la divulgación, el anticuerpo anti-CD3 se une a un epítopo que incluye específicamente Glu6. En otras realizaciones concretas de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que no se une a un epítopo que incluye el aminoácido Glu5 de CD3e humano. En otras realizaciones concretas de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que no se une a un epítopo que incluye los aminoácidos Gly3 y Glu5 de CD3e humano.
Puede determinarse un epítopo de anti-CD3 mediante la unión del anticuerpo anti-CD3 a fragmentos peptídicos del epítopo. Como alternativa, puede determinarse un epítopo de anti-CD3 mediante mutagénesis de barrido de alanina. En una realización de la divulgación, una reducción en la unión de un anticuerpo anti-CD3 a CD3 mutado en un 20 %, 30 %, 50 %, 80 % o más indica que el resto de aminoácido de CD3 mutado en un ensayo de mutagénesis de barrido de alanina es un resto de epítopo para dicho anticuerpo anti-CD3. Como alternativa, puede determinarse un epítopo de anti-CD3 mediante espectrometría de masas. En algunas realizaciones de la divulgación, el epítopo se determina mediante cristalografía (por ejemplo, los métodos de cristalografía descritos en los ejemplos).
En algunas realizaciones de la divulgación, el epítopo determinado mediante cristalografía se determina usando los aminoácidos Q1-M7 de CD3. En algunas realizaciones, el epítopo determinado mediante cristalografía se determina usando los aminoácidos QDGNEEMGGITQTPYK (SEQ ID NO: 284) de CD3.
En algunas realizaciones de la divulgación, el epítopo determinado mediante cristalografía puede efectuarse combinando el Fab de anticuerpo anti-CD3, disuelto en NaCl 0,15 M, Tris 25 mM, pH 7,5 a 10 mg/ml, con un exceso molar de 2 veces (1 mg) de péptido CD3e y detectando sistemáticamente una matriz dispersa de precipitantes en un formato de difusión de vapor de gota sedente. Los cristales optimizados pueden crecerse a partir de una mezcla 1:1 con una solución de depósito que contiene un 70% v/v de metil-pentanodiol y tampón HEPES 0,1 M a pH 7,5. El depósito puede usarse como crioprotector. Los cristales pueden transferirse a temperatura criogénica mediante inmersión rápida en nitrógeno líquido.
Los datos de difracción para los cristales pueden recogerse en un dispositivo de línea de haz de fuente de fotones avanzada 22ID, usando un detector CCD MAR300. Las difracciones registradas pueden integrarse y escalarse usando el programa HKL2000.
La estructura puede organizarse mediante un método de reemplazo molecular (MR) usando el programa Phaser. Por ejemplo, el modelo de búsqueda de MR es una subunidad de Fab procedente de una estructura cristalina del complejo de HGFA/Fab (código de PDB: 2R0L). El péptido de CD3e se incorpora en la estructura basándose en un mapa de Fo-Fc. Posteriormente, puede refinarse la estructura con los programas REFMAC5 y PHENIX usando las funciones diana de máxima probabilidad, el método de refinado de factor B individual anisotrópico y el método de refinado de TLS, para lograr la convergencia.
En otros aspectos concretos de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que incluye un parátopo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-CD3 proporcionado en el presente documento. Por ejemplo, se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un parátopo de anticuerpo anti-CD3 que comprende aminoácidos que forman contactos a una distancia de 3,5 Angstrom o menos. Por ejemplo, se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un parátopo de anticuerpo anti-CD3 que consiste en los aminoácidos de la región VH de un anticuerpo anti-CD3 seleccionados entre el grupo que consiste en 33Tyr, 35His, 50Trp, 97Tyr y 98Ser. Por ejemplo, se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un parátopo de anticuerpo anti-CD3 que consiste en uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos de la región Vh de un anticuerpo anti-CD3 seleccionados entre el grupo que consiste en 33Tyr, 35His, 50Trp, 97Tyr y 98Ser. Por ejemplo, se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un parátopo de anticuerpo anti-CD3 que consiste en los aminoácidos de la región Vl de un anticuerpo anti-CD3 seleccionados entre el grupo que consiste en 27Arg, 27Asn, 30Lys, 32Tyr, 92Phe, 94Leu y 96Arg. Por ejemplo, se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un parátopo de anticuerpo anti-CD3 que consiste en uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete aminoácidos de la región VL de un anticuerpo anti-CD3 seleccionados entre el grupo que consiste en 27Arg, 27Asn, 30Lys, 32Tyr, 92Phe, 94Leu y 96Arg. Por ejemplo, se proporciona un anticuerpo que no se une al mismo epítopo que un parátopo de anticuerpo anti-CD3 que consiste en los aminoácidos de la región VL que comprenden 91Ser. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3 de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores es un anticuerpo monoclonal, que comprende un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En una realización de la divulgación, un anticuerpo anti-CD3 es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fv, Fab, Fab', scFv, diacuerpo o F(ab')2. En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo IgG intacto (por ejemplo, un anticuerpo IgG1 intacto) u otra clase o isotipo de anticuerpo como se define en el presente documento.
En un aspecto adicional, un anticuerpo anti-CD3 puede incorporar cualquiera de las características, por separado o en combinación, descritas en las secciones 1-7 a continuación.
1. Afinidad del anticuerpo
En una realización de la divulgación, la Kd se mide mediante un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA). En una realización, se lleva a cabo un RIA con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno. Por ejemplo, se mide la afinidad de unión en solución de los Fab por el antígeno equilibrando el Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125I) en presencia de una serie de valoración de antígeno no marcado, capturando después el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubren durante una noche placas multipocillo MICROTITER® (Thermo Scientific) con 5 pg/ml de un anticuerpo de captura anti-Fab (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6) y posteriormente se bloquea con seroalbúmina bovina al 2 % (p/v) en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente (Nunc n.° 269620), se mezclan 100 pM o 26 pM de [125I]-antígeno con diluciones seriadas de un Fab de interés (por ejemplo, consistente con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). Después, el Fab de interés se incuba durante una noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un periodo más largo (por ejemplo, aproximadamente 65 horas) para asegurarse de que se alcanza el equilibrio. Posteriormente, se transfieren las mezclas a la placa de captura para su incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). Después, la solución se retira y la placa se lava ocho veces con polisorbato 20 al 0,1 % (TWEEN-20®) en PBS. Cuando las placas se han secado, se añaden 150 pl/pocillo de centelleante (MICROSCINT-20™; Packard) y se cuentan las placas en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Se eligen las concentraciones de cada Fab que proporcionan menos o igual al 20 % de la unión máxima para su uso en ensayos de unión competitiva.
De acuerdo con otra realización de la divulgación, la Kd se mide usando un ensayo de resonancia de plasmón superficial BIACORE®. Por ejemplo, un ensayo que usa un dispositivo BIACORE®-2000 o BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) se lleva a cabo a 25 °C con placas CM5 de antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). En una realización de la divulgación, las placas biosensoras de dextrano carboximetiladas (CM5, BIACORE, Inc.) se activan con clorhidrato de W-etil-W-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y A/-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, a 5 pg/ml (~0,2 pM) antes de la inyección a un caudal de 5 pl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección del antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos que no han reaccionado. Para las mediciones de cinética, se inyectan diluciones seriadas de factor dos de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo de polisorbato 20 al 0,05 % (TWEEN-20™) (PBST) a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 pl/min. Las velocidades de asociación (kon) y las velocidades de disociación (koff) se calculan usando un modelo de unión de Langmuir de uno a uno (BIACORE® Evaluation Software, versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la relación kon/koff. Véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la velocidad de asociación supera 106M' V mediante el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, puede determinarse la velocidad de asociación usando una técnica de inactivación fluorescente que mide el aumento o la reducción en la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medidas en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con detención de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ de serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
2. Fragmentos de anticuerpo
En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 , Fv y scFv y otros fragmentos descritos más adelante. Para una revisión de algunos fragmentos de anticuerpo, véase Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Pluckthün, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., (Springer-Verlag, Nueva York), págs. 269-315 (1994); véase también el documento WO 93/16185; y las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden restos de epítopo de unión a receptor silvestre y que tienen semivida in vivo aumentada, véase la Patente de los Estados Unidos n.° 5.869.046.
Los "diacuerpos" son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véase, por ejemplo, el documento EP 404.097; el documento WO 1993/01161; Hudson et al. Nat. Med.
9:129-134 (2003); y Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003).
Los anticuerpos de un solo dominio son fragmentos de anticuerpo que comprenden la totalidad o una porción del dominio variable de cadena pesada o la totalidad o una porción del dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo. En ciertas realizaciones, un anticuerpo de un solo dominio es un anticuerpo de un solo dominio humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos n.° 6.248.516 B1).
Los fragmentos de anticuerpo pueden prepararse mediante diversas técnicas, incluyendo, pero sin limitación, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto así como la producción por células hospedadoras recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.
3. Anticuerpos quiméricos y humanizados
En ciertas realizaciones de la divulgación, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo quimérico. Se describen ciertos anticuerpos quiméricos, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos n.° 4.816.567; y Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable procedente de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "con la clase cambiada" en el que se ha cambiado la clase o subclase con respecto a la del anticuerpo precursor. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
En ciertas realizaciones de la divulgación, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Normalmente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad para seres humanos, a la vez que se conserva la especificidad y la afinidad del anticuerpo no humano precursor. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, las CDR (o porciones de las mismas) proceden de un anticuerpo no humano y las FR (o porciones de las mismas) proceden de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante humana. En algunas realizaciones de la divulgación, se sustituyen algunos restos de FR en un anticuerpo humanizado por restos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que proceden los restos de la HVR), por ejemplo, para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.
Los anticuerpos humanizados y los métodos para producirlos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) y se describen adicionalmente, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); Patentes de los Estados Unidos n.° 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (que describen el injerto de regiones determinantes de la especificidad (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que describe la "modificación de la superficie"); Dall'Acqua et al., Methods 36: 43-60 (2005) (que describen el "reordenamiento de FR"); y Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (que describen la estrategia de "selección guiada" para el reordenamiento de FR).
Las regiones marco humanas que pueden usarse para la humanización incluyen, pero sin limitación: regiones marco seleccionadas usando el método de "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); regiones marco procedentes de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada (véase, por ejemplo, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); y Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiones marco maduras humanas (mutadas somáticamente) o regiones marco de línea germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); y regiones marco procedentes de la detección sistemática de bibliotecas de FR (véase, por ejemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) y Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).
4. Anticuerpos humanos
En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo humano. Pueden producirse anticuerpos humanos usando diversas técnicas conocidas en la especialidad. Se describen anticuerpos humanos, de manera general, en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).
Pueden prepararse anticuerpos humanos administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a la exposición a antígenos. Dichos animales normalmente contienen la totalidad o una parte de los loci de inmunoglobulina humanos, que reemplazan a los loci de inmunoglobulina endógenos o que están presentes extracromosómicamente o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En dichos ratones transgénicos, generalmente se han inactivado los loci de inmunoglobulina endógenos. Para una revisión de los métodos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos, véase Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Véase también, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 6.075.181 y 6.150.584, que describen la tecnología XENOMOUSE™; la Patente de los Estados Unidos n.° 5.770.429 que describe la tecnología HUMAB®; la Patente de los Estados Unidos n.° 7.041.870 que describe la tecnología K-M MOUSE® y la Publicación de Patente de los Estados Unidos n.° US 2007/0061900, que describe la tecnología VELOCIMOUSE®). Las regiones variables humanas procedentes de anticuerpos intactos generados por dichos animales pueden modificarse además, por ejemplo, por combinación con una región constante humana diferente.
También pueden prepararse anticuerpos humanos mediante métodos basados en hibridoma. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Véase, por ejemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)). También se describen anticuerpos humanos generados mediante la tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos en Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Los métodos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos n.° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales de líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (que describen hibridomas de humano-humano). La tecnología de hibridoma humano (tecnología de Trioma) también se describe en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).
También pueden generarse anticuerpos humanos aislando secuencias de dominio variable de clon de Fv seleccionadas entre bibliotecas de presentación en fago de origen humano. Posteriormente, pueden combinarse dichas secuencias de dominio variable con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de bibliotecas de anticuerpos se describen a continuación.
5. Anticuerpos procedentes de bibliotecas
Los anticuerpos de la divulgación pueden aislarse mediante detección sistemática de bibliotecas combinatorias respecto de anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, se conocen en la técnica diversos métodos para generar bibliotecas de presentación en fagos y para la detección sistemática de dichas bibliotecas respecto de anticuerpos que poseen las características de unión deseadas. Dichos métodos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) y se describen adicionalmente, por ejemplo, en McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks y Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).
En ciertos métodos de presentación en fagos, se clonan por separado repertorios de genes de VH y VL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en fagotecas, que posteriormente pueden someterse a detección sistemática respecto de fagos de unión a antígeno como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Los fagos normalmente presentan fragmentos de anticuerpo, ya sea en forma de fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o en forma de fragmentos Fab. Las bibliotecas de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad para el inmunógeno sin necesidad de construir hibridomas. Como alternativa, puede clonarse el repertorio no expuesto previamente (por ejemplo, de ser humano) para proporcionar una sola fuente de anticuerpos para una gran variedad de antígenos no propios y propios sin inmunización alguna, como se describe en Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Por último, también pueden producirse sintéticamente bibliotecas sin exposición previa clonando segmentos de gen V no reorganizados de células madre y usando cebadores para la PCR que contienen secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para lograr la reorganización in vitro, como se describe por Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Las publicaciones de patente que describen fagotecas de anticuerpo humano incluyen, por ejemplo: la Patente de los Estados Unidos n.° 5.750.373 y las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos n.° 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de bibliotecas de anticuerpo humanas se consideran en el presente documento anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpos humanos.
6. Anticuerpos multiespecíficos
En cualquiera de los aspectos anteriores de la divulgación, el anticuerpo anti-CD3 proporcionado en el presente documento es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios diferentes. En ciertas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos epítopos diferentes de CD3 (por ejemplo, CD3e o CD3y). En determinados aspectos de la divulgación, una de las especificidades de unión es para CD3 (por ejemplo, CD3e o CD3y) y la otra es para cualquier otro antígeno (por ejemplo, una segunda molécula biológica, por ejemplo, un antígeno de la superficie celular, por ejemplo, un antígeno tumoral). Por consiguiente, un anticuerpo anti-CD3 biespecífico puede tener especificidades de unión para CD3 y una segunda molécula biológica, tal como una segunda molécula biológica (por ejemplo, un antígeno tumoral) listado en la tabla 1 y descrito en la Publicación de los Estados Unidos n.° 2010/0111856.
TABLA^ 1. Dianas de antí eno tumoral de los anticuer os anti-CD3 bies ecíficos de la invención
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El anticuerpo anti-CD3 biespecífico (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos anti-CD3 descritos anteriormente) pueden tener especificidades de unión por CD3 y una segunda molécula biológica, tal como complejo de antígeno leucocitario humano (HLA)-péptido presentado sobre la superficie celular por el MHC. El anticuerpo anti-CD3 biespecífico (por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos anti-CD3 descritos anteriormente) puede tener especificidades de unión por CD3 y una segunda molécula biológica que comprende un complejo de HLA-péptido seleccionado entre el grupo que consiste en 0772P (CA125, MUC16; n.° de referencia de GenBank AF36148); adipofilina (perilipina-2, proteína relacionada con la diferenciación adiposa, ADRP, ADFP, MGC10598; referencia de secuencia del n Cb I: NP_001113.2); AIM-2 (Ausente en melanoma 2, PYHIN4, proteína AIM2 inducible por interferón; referencia de secuencia del NCBI: NP_004824.1); ALDH1A1 (familia de aldehído deshidrogenasa 1, miembro A1, ALDH1, PUMB1, retinaldehído deshidrogenasa 1, ALDC, ALDH-E1, ALHDII, RALDH 1, EC 1.2.1.36, ALDH11, HEL-9, HEL-S-53e, HEL12, RALDH1, acetaldehído deshidrogenasa 1, aldehído deshidrogenasa 1, soluble, aldehído deshidrogenasa, citosólica hepática, ALDH clase 1, proteína luminal epididimaria 12, proteína luminal epididimaria 9, proteína de unión a esperma secretoria de epidídimo Li 53e, deshidrogenasa retinal 1, RaIDH1, aldehído deshidrogenasa familia 1 miembro A1, aldehído deshidrogenasa, citosólica, EC 1.2.1; referencia de secuencia del NCBI: NP_000680.2); alfa-actinina-4 (ACTN4, actinina, alfa 4, FSGS1, glomeruloesclerosis focal segmentaria 1, alfa actinina 4 no muscular, proteína reticulante con F-actina, GEFS, ACTININ-4, isoforma de actinina alfa4, alfa-actinina-4; referencia de secuencia del NCBI: NP_004915.2); alfa-fetoproteína (AFP, HPAFP, FETA, alfa-1-fetoproteína, alfafetoglobulina, alfa-1-fetoproteína, alfa-fetoglobulina, HP; GenBank: AAB58754.1); anfirregulina (AREG, SDGF, factor de crecimiento derivado de Schwannoma, factor de crecimiento derivado de células colorrectales, AR, CRDGF; Gen­ Bank: AAA51781.1); ARTC1 (ART1, ADP-ribosiltransferasa 1, Mono(ADP-ribosil)transferasa 1, ADP-ribosiltransferasa C2 y C3 similar a toxina 1, a Rt 2, CD296, RT6, ADP-ribosiltransferasa 2, NAD(P)(+)-arginina ADP-ribosiltransferasa 1 ligada a GPI, EC 2.4.2.31, antígeno CD296; NP); ASLG659; ASPHD1 (contenedor 1 de dominio aspartato betahidroxilasa, proteína 1 que contiene dominio de aspartato beta-hidroxilasa, EC 1.14.11.-, EC 1.14.11; GenBank: AAI44153.1); B7-H4 (VTCN1, inhibidor de activación de linfocitos T 1 que contiene dominio V-Set, B7H4, miembro 1 de la superfamilia de B7, proteína coestimuladora inmunitaria B7-H4, B7 h.5, molécula coestimuladora de linfocitos T B7x, B7S1, B7X, VCTN1, H4, miembro de la familia de B7, PRO1291, miembro de la familia de B7, H4, molécula coestimuladora de linfocitos T B7x, inhibidor de activación de linfocitos T 1 que contiene dominio V-Set, Proteína B7S1; GenBank: AAZ17406.1); BAFF-R (TNFRSF13C, superfamilia de receptor de factor de necrosis tumoral, miembro 13C, BAFFR, receptor de factor activador de linfocitos B, receptor de BAFF, receptor 3 de BLyS, CVID4, BRO-MIX, CD268, receptor de factor activador de linfocitos B, prolixina, miembro 13C de la superfamilia de receptor de factor de necrosis tumoral, BR3, antígeno CD268; referencia de secuencia del NCBI: NP_443177.1); BAGE-1; BCLX (L); proteína de fusión BCR-ABL (b3a2); beta-catenina (CTNNB1, Catenina (proteína asociada con cadherina), Beta 1,88kDa, CTNNB, MRD19, Catenina (proteína asociada con cadherina), Beta 1 (88kD), armadillo, Catenina Beta-1; GenBank: CAA61107.1); BING-4 (WDR46, dominio de repetición de WD 46, C6orf11, BING4, proteína BING4 que contiene repetición de WD, marco abierto de lectura 11 del cromosoma 6, FP221, UTP7, proteína 46 que contiene repetición de WD; NP); BMPR1B (receptor de tipo IB de proteína morfogenética ósea, n.° de referencia de GenBank NM_00120; NP); B-RAF (Brevican (BCa N, BEHAB, n.° de referencia de GenBank AF22905); Brevican (BCAN, proteoglucano 7 de sulfato de condroitina, proteína de unión a hialuronano enriquecida en cerebro, BEHAB, CSPG7, proteoglucano de brevican, proteína core de brevican, proteoglucano BEHAB de sulfato de condroitina; GenBank: AAH27971.1); CALCA (polipéptido alfa relacionado con calcitonina, CALC1, Calcitonina 1, calcitonina, CGRP de tipo alfa, péptido I relacionado con gen de calcitonina, CGRP-I, CGRP, CGRP1, CT, KC, Calcitonina/polipéptido relacionado con calcitonina, alfa, katacalcina; NP); CASP-5 (CASP5, Caspasa 5, cisteína peptidasa relacionada con la apoptosis, Caspasa 5, cisteína proteasa relacionada con la apoptosis, Proteasa ICH-3, Proteasa TY, ICE(rel)-III, ICE(rel)MI, ICEREL-III, ICH-3, caspasa-5, proteasa TY, EC 3.4.22.58, ICH3, EC 3.4.22; NP); CASP-8; CD19 (CD19 - precursor de isoforma 2 de antígeno de linfocitos B CD19, B4,CVID3 [Homo sapiens], referencia de secuencia del NCBI: NP_001761.3); CD20 (CD20 - antígeno de linfocitos B CD20, 4 dominios transmembrana, subfamilia A, miembro 1, B1, Bp35, CD20, CVID5, LEU-16, MS4A2, S7; referencia de secuencia del NCBI: NP_690605.1); CD21 (CD21 (CR2 (receptor de complemento o C3DR (C3d/receptor del virus de Epstein-Barr) o Hs.73792 n.° de referencia de GenBank M2600); (CD22 (isoforma B del receptor de linfocitos B CD22, BL-CAM, Lyb-8, Lyb8, SIGLEC-2, FLJ22814, n.° de referencia de GenBank AK02646); CD22; CD33 (molécula de CD33, antígeno Cd 33 (Gp67), lectina 3 similar a Ig de unión a ácido siálico, lectina 3 similar a Ig de unión a ácido siálico, SIGLEC3, gp67, SIGLEC-3, antígeno CD33 de la superficie de células mieloides, p67, Siglec-3, antígeno CD33; GenBank: AAH28152.1); CD45; CD70 (CD70 -superfamilia de (ligando) de factor de necrosis tumoral, miembro 7; antígeno de superficie CD70; antígeno Ki-24; ligando de CD27; CD27-L; miembro 7 de la superfamilia de ligando de factor de necrosis tumoral; referencia de secuencia del NCBI para la especie Homo sapiens: NP_001243.1); CD72 (CD72 (antígeno de diferenciación de linfocitos B CD72, Lyb-; 359 aa, pl: 8,66, PM: 40225, TM: 1 [P] Cromosoma del gen: 9p13.3, n.° de referencia de GenBank NP_001773); CD79a (CD79a (CD79A, CD79a, alfa asociado a inmunoglobulina, una proteína específica de linfocitos B que interactúa covalentemente con la Ig beta (CD79B) y forma un complejo sobre la superficie con moléculas de IgM, transduce una señal implicada en la diferenciación de linfocitos B), pl: 4,84, PM: 25028 TM: 2 [P] Cromosoma del gen: 19q13.2, n.° de referencia de GenBank NP_001774.1); CD79b (CD79b (CD79B, CD79b, IGb (inmunoglobulina beta-asociada), B29, n.° de referencia de GenBank NM_000626 o 1103867); Cdc27 (ciclo de división celular 27, D0S1430E, D17S978E, subunidad 3 de complejo promotor de anafase, subunidad 3 de complejo - promotor de anafase, ANAPC3, APC3, CDC27Hs, H-NUC, homólogo de CDC27, homólogo de ciclo de división celular 27 (S. Cerevisiae), HNUC, NUC2, complejo promotor de anafase, proteína 3, homólogo de ciclo de división celular 27, homólogo de proteína 27 de ciclo de división celular, homólogo de Nuc2; GenBank: AAH11656.1); CDK4 (cinasa 4 dependiente de ciclina, proteína cinasa 4 de división celular, PSK-J3, EC 2.7.11.22, CMM3, EC 2.7.11; referencia de secuencia del NCBI: n P_000066.1); CDKN2A (inhibidor 2A de cinasa dependiente de ciclina, MLM, CDKN2, MTS1, inhibidor 2A de cinasa dependiente de ciclina (melanoma, P16, inhibe a CDK4), inhibidor A de cinasa 4 dependiente de ciclina, supresor tumoral múltiple 1, CDK4I, MTS-1, CMM2, P16, ARF, INK4, INK4A, P14, P14ARF, P16-INK4A, P16INK4, P16INK4A, P19, P19ARF, TP16, inhibidor P16-INK4 de CDK4, regulador beta negativo del ciclo celular, p14ARF, p16-INK4, p16-INK4a, p16INK4A, p19ARF; NP); CEA; CLL1 (CLL-1 (CLEC12A, MICL y DCAL, codifica un miembro de la lectina de tipo C/superfamilia de dominio similar a lectina de tipo C (CTL/CTLD). Los miembros de esta familia comparten un pliegue de proteína común y tienen diversas funciones, tales como adhesión celular, señalización entre células, renovación de glucoproteínas y papeles en la inflamación y la respuesta inmunitaria. La proteína codificada por este gen es un regulador negativo de la función de granulocitos y monocitos. Se han descrito varias variantes de transcrito de corte y empalme alternativo de este gen, pero aún no se ha determinado la naturaleza de longitud completa de estas variantes. Este gen está estrechamente relacionado con otros miembros de la superfamilia de CTL/CTLD en la región de complejo génico eliminador natural en el cromosoma 12p13 (Drickamer K Curr. Opin. Struct. Biol. 9):585-90; van Rhenen A, et al., Blood 110):2659-66; Chen CH, et al. Blood 107):1459-67; Marshall AS, et al. Eur. J. Immunol. 36):2159-69; Bakker AB, et al Cancer Res. 64:8443-50; Marshall AS, et al J. Biol. Chem.
279:14792-80. Se ha demostrado que CLL-1 es un receptor transmembrana de tipo II que comprende un solo dominio similar a lectina de tipo C (que no se ha predicho que se una a calcio o azúcar), una región de tallo, un dominio transmembrana y una cola citoplasmática corta que contiene un motivo ITIM); CLPP (subunidad proteolítica de peptidasa de matriz mitocondrial caseinolítica, endopeptidasa Clp, EC 3.4.21.92, PRLTS3, proteasa CIpAP dependiente de ATP (E. coli), ClpP (proteasa caseinolítica, dependiente de ATP, subunidad proteolítica, E. coli) homólogo, peptidasa caseinolítica ClpP, dependiente de ATP, homólogo de subunidad proteolítica (E. coli), ClpP proteasa caseinolítica, dependiente de ATP, homólogo de subunidad proteolítica (E. coli), humano, subunidad proteolítica, proteasa CIpAP dependiente de ATP, subunidad proteolítica, humano, peptidasa caseinolítica ClpP dependiente de ATP, subunidad proteolítica, peptidasa caseinolítica ClpP, dependiente de ATP, homólogo de subunidad proteolítica, ClpP proteasa caseinolítica, dependiente de ATP, homólogo de subunidad proteolítica, supuesta subunidad proteolítica de proteasa CIp dependiente de ATP, mitocondrial; NP); COA-1; CPSF; CRIPTO (CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, factor de crecimiento derivado de teratocarcinoma, n.° de referencia de GenBank NP_003203 o NM_00321); Cw6; CXCR5 CXCR5 (receptor 1 de linfoma de Burkitt, un receptor acoplado a proteína G que se activa por la quimiocina CXCL13, funciona en la migración de linfocitos y la defensa humoral, tiene un papel en la infección por VIH-2 y quizás en el desarrollo de SIDA, linfoma, mieloma y leucemia); 372 aa, pl: 8,54 PM: 41959 TM: 7 [P] Cromosoma del gen: 11q23.3, n.° de referencia de GenBank NP_001707); CXORF61 CXORF61 - marco abierto de lectura 61 del cromosoma X [Homo sapiens], referencia de secuencia del NCBI: NP_001017978.1); ciclina D1 (CCND1, BCL1, PRAD1, D11S287E, CLL/linfoma de linfocitos B 1, proteína de linfoma de linfocitos B 1, oncogén BCL-1, oncogén PRAD1, ciclina D1 (PRAD1: adenomatosis paratiroidea 1), ciclina D1 específica de G1/S, adenomatosis paratiroidea 1, U21B31, ciclina D1 específica de G1/S, BCL-1; referencia de secuencia del NCBI: NP_444284.1); ciclina-A1 (CCNA1, CT146, ciclina A1; GenBank: AAH36346.1); proteína de fusión dek-can; DKK1 (inhibidor 1 de la vía de señalización de Dickkopf WNT, SK, hDkk-1, homólogo 1 de Dickkopf (Xenopus Laevis), homólogo de Dickkopf 1 (Xenopus Laevis), DKK-1, homólogo de DIckkopf 1, proteína-1 relacionada con Dickkopf, similar a Dickkopf-1, proteína 1 similar a Dickkopf, proteína 1 relacionada con Dickkopf, Dickkopf-1, Dkk-1; GenBank: AAQ89364.1); DR1 (regulador negativo de la transcripción 1, unión a TBP (cofactor negativo 2), cofactor negativo 2-Beta, fosfoproteína asociada a proteína de unión a TATA, NC2, NC2-BETA, proteína Dr1, NC2-beta, regulador negativo de la transcripción 1; referencia de secuencia del NCBI: NP_001929.1); DR13 (complejo principal de histocompatibilidad, Clase II, DR Beta 1, HLA-DR1B, DRw10, DW2.2/DR2.2, SS1, DRB1, HLA-DRB, antígeno de histocompatibilidad de clase II de HLA, cadena beta de DR-1, antígeno de leucocitos humanos DRB1, antígeno de linfocitos DRB1, antígeno de la clase II del MCH, cadena beta 1 de HLA-DR de clase II del MHC, glucoproteína de superficie celular de HLA-DR-beta de clase II del MHC, HLA-DRw10-beta de clase II del MHC, DR-1, DR-12, DR-13, DR-14, DR-16, DR-4, DR-5, DR-7, DR-8, DR-9, DR1, DR12, DR13, DR14, DR16, DR4, DR5, DR7, DR8, DR9, DRw11, DRw8, HLA-DRB2, Clon P2-Beta-3, antígeno de clase II del MHC DRB1*1, antígeno de clase II del MHC DRB1*10, antígeno de clase II del MHC DRB1*11, antígeno de clase II del MHC DRB1*12, antígeno de clase II del MHC DRB1*13, antígeno de clase II del MHC DRB1*14, antígeno de clase II del MHC DRB1*15, antígeno de clase II del MHC DRB1*16, antígeno de clase II del MHC DRB1*3, antígeno de clase II del MHC DRB1*4, antígeno de clase II del MHC DRB1*7, antígeno de clase II del MHC DRB1*8, antígeno de clase II del MHC DRB1*9; NP); E16 (E16 (LAT1, SLC7A5, n.° de referencia de GenBank NM_00348); EDAR (EDAR - precursor EDAR de miembro de la superfamilia de receptor de factor de necrosis tumoral, receptor EDA-A1; homólogo de downless; receptor de ectodisplasina-A; receptor de displasia ectodérmico; receptor 1 de ectodisplasina anhidrótica, DL; ECTD10A; ECTD10B; e D1R; ED3; ED5; EDA-A1R; EDA1R; EDA3; HRM1 [Homo sapiens]; referencia de secuencia del NCBI: NP_071731.1); EFTUD2 (contenedor 2 de dominio de unión a GTP de factor de elongación Tu, proteína 2 que contiene dominio de unión a GTP de factor de elongación Tu, hSNU114, homólogo de SNU114, proteína U5 específica de SnRNP, 116 KDa, MFDGA, KIAA0031, 116 KD, proteína U5 específica de SnRNP, componente de ribonucleoproteína nuclear pequeña U5 de 116 kDa, MFDM, SNRNP116, Snrp116, Snu114, U5-116KD, SNRP116, U5-116 KDa; GenBank: AAH02360.1); EGFR (receptor de factor de crecimiento epidérmico, ERBB, Proto-oncogén C-ErbB-1, proteína tirosina cinasa receptora ErbB-1, ERBB1, HER1, EC 2.7.10.1, receptor de factor de crecimiento epidérmico (homólogo de oncogén de la leucemia eritroblástica vírica aviar (V-Erb-B)), homólogo de oncogén de leucemia eritroblástica vírica (V-Erb-B) (aviar), PIG61, homólogo de oncogén de la leucemia eritroblástica vírica aviar (V-Erb-B), proteína inhibidora del crecimiento celular 40, proteína inductora de proliferación celular 61, mENA, EC 2.7.10; GenBank: AAH94761.1); EGFR-G719A; EGFR-G719C; EGFR-G719S; EGFR-L858R; EGFR-L861Q; EGFR-S768I; EGFR-T790M; factor de elongación 2 (EEF2, factor de elongación de la traducción eucariota 2, EF2, polipeptidil-ARNt translocasa, EF-2, SCA26, EEF-2; referencia de secuencia del NCBI: NP_001952.1); ENAH (hMena) (homólogo de Enabled (Drosophila), MENA, Enabled de mamífero, ENA, NDPP1, homólogo de proteína Enabled; GenBank: AAH95481.1) - resultados solo para "ENAH" no "ENAH (hMena)"; EpCAM (molécula de adhesión celular epitelial, M4S1, MIC18, transductor de señal de calcio asociado a tumores 1, TACSTD1, TROP1, antígeno asociado con adenocarcinoma, glucoproteína Trop-1 de la superficie celular, glucoproteína epitelial 314, proteína principal asociada con tumor gastrointestinal GA733-2, EGP314, KSA, DIAR5, HNPCC8, antígeno identificado por el anticuerpo monoclonal AUA1, EGP-2, EGP40, ESA, KS1/4, MK-1, glucoproteína epitelial humana-2, componente de membrana, cromosoma 4, marcador de superficie (glucoproteína de 35kD), EGP, Ep-CAM, GA733-2, M1S2, antígeno CD326, antígeno de la superficie celular epitelial, hEGP314, antígeno KS 1/4, ACSTD1; GenBank: AAH14785.1); EphA3 (receptor A3 de EPH, ETK1, ETK, TYRO4, HEK, tirosina cinasa 1 similar a Eph, proteína tirosina cinasa receptora ETK1, EK4, cinasa 4 similar a EPH, EC 2.7.10.1, EPHA3, HEK4, receptor 3 de efrina de tipo A, cinasa embrionaria humana 1, proteína tirosina cinasa TYRO4, hEK4, cinasa embrionaria humana, proteína tirosina cinasa TYRO4, EC 2.7.10; GenBank: AAH63282.1); EphB2R; Epirregulina (EREG, ER, proepirregulina; GenBank: AAI36405.1); ETBR (EDNRB, receptor de endotelina de tipo B, HSCR2, HSCR, receptor de endotelina de tipo no selectivo, ET-B, ET-BR, ETRB, ABCd S, WS4A, ETB, receptor B de endotelina; NP); proteína de fusión ETV6-AML1; EZH2 (potenciador de homólogo 2 de Zeste (Drosophila), lisina N-metiltransferasa 6, ENX-1, KMT6 EC 2.1.1.43, EZH1, WVS, potenciador de homólogo 2 de Zeste (Drosophila), ENX1, EZH2b, KMT6A, WVS2, Histona-lisina N-metiltransferasa EZH2, potenciador de homólogo 2 de Zeste, EC 2.1.1; GenBank: AAH10858.1); FcRH1 (FCRL1, similar 1 a receptor de Fc, FCRH1, homólogo 1 de receptor de Fc, proteína 1 similar a FcR, proteína 5 asociada con la traslocación de receptor inmunitario, IFGP1, IRTA5, hFGP1, proteína 1 de la familia de IFGP, CD307a, proteína 1 similar a receptor de Fc, receptor de Fc de la superfamilia de inmunoglobulina, Gp42, FcRL1, antígeno CD307a; GenBank: AAH33690.1); FcRH2 (f Cr L2, similar 2 a receptor de Fc, SPAP1, proteína 1 de anclaje a fosfato que contiene dominio SH2, homólogo 2 de receptor de Fc, proteína 2 similar a FcR, proteína 4 asociada con la traslocación de receptor de inmunoglobulina, FCRH2, IFGP4, IRTA4, proteína 4 de la familia de IFGP, SPAP1A, SPAP1B, SPAP1C, CD307b, proteína 2 similar a receptor de Fc, proteína 4 asociada con la traslocación de receptor inmunitario, receptor de Fc de la superfamilia de inmunoglobulina, Gp42, proteína 1 de anclaje a fosfato que contiene dominio SH2, FcRL2, antígeno CD307b; GenBank: AAQ88497.1); FcRH5 (FCRL5, similar 5 a receptor de Fc, IRTA2, homólogo 5 de receptor de Fc, proteína 5 similar a FcR, proteína 2 asociada con la traslocación de receptor inmunitario, BXMAS1, FCRH5, CD307, CD307e, PRO820, proteína 5 similar a receptor de Fc, asociada 2 con la traslocación del receptor de la superfamilia de inmunoglobulina (IRTA2), FcRL5, antígeno CD307e; GenBank: AAI01070.1); FLT3-ITD; FN1 (Fibronectina 1, globulina insoluble en frío, FN, factor estimulante de la migración, CIG, FNZ, GFND2, LETS, ED-B, FINC, GFND, MSF, fibronectina; GenBank: AAI43764.1); G250 (MN, CAIX, anhidrasa carbónica IX, deshidratasa carbónica, proteína G250 asociada con RCC, carbonato deshidratasa IX, antígeno de membrana MN, antígeno G250 asociado con carcinoma de células renales, CA-IX, P54/58N, pMW1, Antígeno G250 asociado con RCC, anhidrasa carbónica 9; NP); - resultados de seudónimos para "G250" no "G250 / MN / CAIX"; GAGE-1.2,8; GAGE-3,4,5,6,7; GDNF-Ra1 (receptor alfa 1 de la familia de GDNF; GFRA1; GDNFR; GDNFRA; RETL1; TRNR1; RET1L; GDNFR-alfa1; GFR-alfa-; U95847; BC014962; NM_145793 NM_005264); GEDA (n.° de referencia de GenBank AY26076); GFRA1 - receptor alfa-1 de la familia de GDNF; receptor alfa-1 de GDn F; GDNFR-alfa-1; GFR-alfa-1; ligando 1 de RET; receptor 1 de factor neurotrófico relacionado con TGF-beta [Homo sapiens]; ProtKB/SwissProt: P56159.2; glipicano-3 (GPC3, glipicano 3, SDYS, proteoglucano de glipicano 3, proteína intestinal OCI-5, GTR2-2, MXR7, SGBS1, DGSX, OCI-5. SGB, SGBS, proteoglucano de heparán sulfato, glipicano-3 secretado, OCI5; GenBank: AAH35972.1); GnTVf; gp100 (PMEL, proteína premelanosoma, SILV, D12S53E, PMEL17, SIL, proteína de melanocitos Pmel 17, antígeno específico de linaje de melanocitos GP100, antígeno ME20 asociado a melanoma, homólogo de proteína de locus de Silver, ME20-M, ME20M, P1, P100, similar a Silver (homólogo de ratón), homólogo de Silver (ratón), ME20, SI, proteína de melanocitos Mel 17, proteína de melanocitos PMEL, proteína17 de matriz melanosómica, Silver, Ratón, homólogo de; GenBank: AAC60634.1); GPC; GPNMB (glucoproteína (transmembrana) Nmb, glucoproteína NMB, proteína similar a glucoproteína Nmb, osteoactivina, glucoproteína transmembrana HGFIN, HGFIN, NMB, glucoproteína transmembrana, glucoproteína transmembrana NMB; GenBank: AAH32783.1); GPR172A (receptor 172A acoplado a proteína G; GPCR41; FLJ11856; D15Ertd747e); NP_078807.1; NM_024531.3); GPR19 (receptor 19 acoplado a proteína G; Mm.478; NP_006134.1; NM_006143.2); GPR54 (receptor KISS1; KISS1R; GPR54; HOT7T175; AXOR1; NP_115940.2; NM_032551.4); HAVCR1 (receptor celular 1 del virus de la hepatitis A, miembro 1 de la familia de inmunoglobulina de linfocitos T, molécula 1 de lesión renal, KIM-1, KIM1, TIM, TIM-1, TIM1, TIMD-1, TIMD1, receptor 1 de mucina de inmunoglobulina de linfocitos T, proteína 1 de membrana de linfocitos T, HAVCR, HAVCR-1, proteína 1 de dominio de inmunoglobulina de linfocitos T y de dominio de mucina, HAVcr-1, proteína 1 que contiene dominio de inmunoglobulina de linfocitos T y de mucina; Gen-Bank: AAH13325.1); HER2 (ERBB2, homólogo 2 del oncogén vírico de leucemia eritroblástica aviar V-Erb-B2, NGL, NEU, homólogo de oncogén derivado de neuro/glioblastoma, proteína de gen 19 de ganglio linfático metastásico, Proto-oncogén C-ErbB-2, Proto-oncogén Neu, receptor HER2 de la superficie celular de tipo tirosina cinasa, MLN 19, p185erbB2, EC 2.7.10.1, homólogo 2 del oncogén vírico de leucemia eritroblástica aviar V-Erb-B2 (homólogo de oncogén derivado de neuro/glioblastoma), CD340, HER-2, HER-2/neu, TKR1, proteína C-Erb B2/Neu, herstatina, homólogo de oncogén derivado de neuroblastoma/glioblastoma, proteína tirosina cinasa receptora ErbB-2, homólogo 2 del oncogén vírico de leucemia eritroblástica V-Erb-B2, homólogo de oncogén derivado de neuro/glioblastoma, MLN19, antígeno CD340, EC 2.7.10; NP); HER-2 / neu - alias del anterior; HERV-K-MEL; HLA-DOB (subunidad beta de la molécula de clase II del MHC (antígeno Ia) que se une a péptidos y los presenta a linfocitos T CD4+); 273 aa, pl: 6,56, PM: 30820.TM: 1 [P] Cromosoma del gen: 6p21.3, n.° de referencia de GenBank NP_002111); hsp70-2 (h SpA2, proteína de choque térmico 2 de 70KDa, proteína de choque térmico 2 de 70KD, HSP70-3, proteína 2 relacionada con choque térmico de 70 KDa, proteína de choque térmico 2 de 70 KDa; GenBank: AAD21815.1); IDO1 (Indolamina 2,3-dioxigenasa 1, IDO, INDO, Indolamina-Pirrol 2,3-dioxigenasa, IDO-1, Indolamina-Pirrol 2,3 dioxigenasa, Indolamina 2,3 dioxigenasa, indol 2,3 dioxigenasa, EC 1.13.11.52; referencia de secuencia del NCBI: NP_002155.1); IGF2B3; IL13Ralfa2 (IL13RA2, receptor de interleucina 13, alfa 2, antígeno 19 de cáncer/testículo, proteína de unión a interleucina-13, IL-13R-alfa-2, IL-13RA2, subunidad alfa-2 del receptor de IL-13, subunidad alfa-2 de IL-13R, CD213A2, CT19, IL-13R, IL13BP, proteína de unión a interleucina 13, cadena alfa 2 de receptor de interleucina 13, subunidad alfa-2 del receptor de interleucina-13, IL13R, antígeno CD213a2; NP); IL20Ra; Carboxil esterasa intestinal; IRTA2 (seudónimo de FcRH5); Calicreína 4 (KLK4, peptidasa 4 relacionada con calicreína, PRSS17, EMSP1, serina proteasa 1 de matriz del esmalte, proteína 1 similar a Calicreína, serina proteasa 17, KLK-L1, PSTS, AI2A1, Calicreína 4 (prostasa, matriz del esmalte, próstata), ARM1, EMSP, mensaje regulado por andrógenos 1, serina proteasa 1 de matriz del esmalte, calicreína, calicreína-4, prostasa, EC 3.4.21.-, Prostasa, EC 3.4.21; GenBank: AAX30051.1); KIF20A (miembro 20A de la familia de cinesina, RAB6KIFL, interacción con RAB6, similar a cinesina (Rabcinesina6), mitótica a; LAGE-1; proteína de fusión LDLR-fucosiltransferasa AS; Lengsina (LGSN, Lengsina, proteína de la lente con dominio de glutamina sintetasa, GLULD1, Proteína 1 que contiene dominio de glutamato-amoniaco liasa, LGS, contenedor 1 de dominio de glutamato-amoniaco ligasa (glutamina sintetasa), contenedor 1 de dominio de glutamato-amoniaco ligasa (glutamina sintasa), similar a glutamina sintasa de la lente; GenBank: AAF61255.1); LGR5 (receptor 5 acoplado a proteína G que contiene repeticiones ricas en leucina; GPR49, GPR6; NP_003658.1; NM_003667.2; LY64 (antígeno linfocitario 64 (RP10, proteína de membrana de tipo I de la familia de repeticiones ricas en leucina (LRR), regula la activación y la apoptosis de linfocitos B, la pérdida de función se asocia con un aumento de la actividad de la enfermedad en pacientes con lupus eritematoso sistémico); 661 aa, pl: 6,20, PM: 74147 TM: 1 [P] Cromosoma del gen: 5q12, n.° de referencia de GenBank NP_005573.; Ly6E (complejo de antígeno linfocitario 6, locus E; Ly67, RIG-E, SCA-2, TSA-; NP_002337.1; NM_002346.2); Ly6G6D (complejo de antígeno linfocitario 6, locus G6D; Ly6-D, MEGT; NP_067079.2; NM_021246.2); LY6K (complejo de antígeno linfocitario 6, locus K; LY6K; HSJ001348; FLJ3522; NP_059997.3; NM_017527.3); LyPD1 - contenedor 1 de dominio LY6/PLAUR, PHTS [Homo sapiens], GenBank: AAH17318.1); MAGE-A1 (familia A de antígenos de melanoma, 1 (dirige la expresión del antígeno MZ2-E, MAGE1, familia A 1 de antígenos de melanoma, MAGEA1, antígeno de melanoma MAGE-1, antígeno 1 asociado con melanoma, antígeno MZ2-E asociado con melanoma, antígeno MZ2-E, antígeno 1,1 de cáncer/testículo, CT1.1, antígeno MAGE-1, familia 1 de antígeno de cáncer/testículo, miembro 1, familia 1 de antígeno de cáncer/testículo, miembro 1, MAGE1A; referencia de secuencia del NCBI: NP_004979.3); MAGE-A10 (MAGEA10, familia A de antígenos de melanoma, 10, MAGE10, antígeno MAGE-10, antígeno 10 asociado con melanoma, antígeno 1,10 de cáncer/testículo, CT1.10, familia 1 de antígeno de cáncer/testículo, miembro 10, familia 1 de antígeno de cáncer/testículo, miembro 10; referencia de secuencia del NCBI: NP_001238757.1); MAGE-A12 (MAGEA12, familia A de antígenos de melanoma, 12, MAGE12, antígeno 1,12 de cáncer/testículo, CT1.12, antígeno MAGE12F, familia 1 de antígeno de cáncer/testículo, miembro 12, familia 1 de antígeno de cáncer/testículo, miembro 12, antígeno 12 asociado con melanoma, antígeno MAGE-12; referencia de secuencia del NCBI: NP_001159859.1); MAGE-A2 (MAGEA2, familia A de antígenos de melanoma, 2, MAGE2, antígeno 1,2 de cáncer/testículo, CT1.2, MAGEA2A, antígeno MAGE-2, familia 1 de antígeno de cáncer/testículo, miembro 2, familia 1 de antígeno de cáncer/testículo, miembro 2, antígeno 2 de melanoma, antígeno 2 asociado con melanoma; referencia de secuencia del NCBI: NP_001269434.1); MAGE-A3 (MAGEA3, familia A de antígenos de melanoma, 3, MAGE3, antígeno MAGE-3, antígeno MZ2-D, antígeno 3 asociado con melanoma, antígeno 1,3 de cáncer/testículo, CT1.3, familia 1 de antígeno de cáncer/testículo, miembro 3, HIP8, HYPD, MAGEA6, familia 1 de antígeno de cáncer/testículo, miembro 3; referencia de secuencia del NCBI: NP_005353.1); MAGE-A4 (MAGEA4, familia A de antígenos de melanoma, 4, MAGE4, antígeno 4 asociado con melanoma, antígeno 1,4 de cáncer/testículo, CT1.4, antígeno MAGE-4, antígeno MAGE-41, antígeno MAGE-X2, MAGE4A, MAGE4B, familia 1 de antígeno de cáncer/testículo, miembro 4, MAGE-41, MAGE-X2, familia 1 de antígeno de cáncer/testículo, miembro 4; referencia de secuencia del NCBI: NP_001011550.1); MAGE-A6 (MAGEA6, familia A de antígenos de melanoma, 6, MAGE6, antígeno MAGE-6, antígeno 6 asociado con melanoma, antígeno 1,6 de cáncer/testículo, CT1.6, antígeno MAGE3B, familia 1 de antígeno de cáncer/testículo, familia A 6 de antígenos de melanoma, miembro 6, MAGE-3b, MAGE3B, familia 1 de antígeno de cáncer/testículo, miembro 6; referencia de secuencia del NCBI: NP_787064.1); MAGE-A9 (MAGEA9, familia A de antígenos de melanoma, 9, MAGE9, antígeno MAGE-9, antígeno 9 asociado con melanoma, antígeno 1,9 de cáncer/testículo, CT1.9, familia 1 de antígeno de cáncer/testículo, miembro 9, familia 1 de antígeno de cáncer/testículo, miembro 9, MAGEA9A; referencia de secuencia del NCBI: NP_005356.1); MAGE-C1 (MAGEC1, familia C de antígenos de melanoma, 1, antígeno 7.1 de cáncer/testículo, CT7.1, antígeno MAGE-C1, familia 7 de antígeno de cáncer/testículo, miembro 1, CT7, familia 7 de antígeno de cáncer/testículo, miembro 1, antígeno C1 asociado con melanoma; referencia de secuencia del NCBI: NP_005453.2); MAGE-C2 (MAGEC2, familia C de antígenos de melanoma, 2, MAGEE1, antígeno 10 de cáncer/testículo, CT10, HCA587, antígeno de melanoma, familia E, 1, específico para cáncer/testículo, antígeno 587 asociado con carcinoma hepatocelular, antígeno MAGE-C2, antígeno MAGE-E1, antígeno 587 de cáncer hepatocelular, antígeno C2 asociado con melanoma; referencia de secuencia del NCBI: NP_057333.1); mammaglobina-A (SCGB2A2, Secretoglobina, familia 2A, miembro 2, MGB1, Mammaglobina 1, UGB2, Mammaglobina A, mammaglobina-A, Mammaglobina-1, miembro 2 de la familia 2A de secretoglobina; NP); MART2 (HHAT, aciltransferasa de Hedgehog, SKI1, antígeno de melanoma reconocido por linfocitos T 2, proteína Skinny Hedgehog 1, Skn, antígeno de melanoma reconocido por linfocitos T 2, proteína-cisteína N-palmitoiltransferasa HHa T, EC 2.3.1.-; GenBank: AAH39071.1); M-CSF (CSF1, factor estimulante de colonias 1 (macrófagos), MCSF, CSF-1, lanimostim, factor estimulante de colonias de macrófagos 1, Lanimostim; GenBank: AAH21117.1); MCSP (SMCP, proteína rica en cisteína asociada con mitocondrias de esperma, MCS, selenoproteína de la cápsula mitocondrial, HSMCSGEN1, proteína rica en cisteína asociada con mitocondrias del esperma; referencia de secuencia del NCBI: NP_109588.2); XAGE-1 b/GAGED2a; WT1 (tumor de Wilms 1, WAGR, GUD, WIT-2, WT33, dominio aminoterminal de EWS, NPHS4, últimos tres dedos de cinc del dominio de unión a ADN de WT1, AWT1, proteína de tumor de Wilms, EWS-WT1; GenBank: AAB33443.1); VEGF; tirosinasa (TYR; OCAIA; OCA1A; tirosinasa; SHEP; NP_000363.1; NM_000372.4; GenBank: AAB60319.1); TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, receptor potencial transitorio del canal de cationes, subfamilia M, miembro 4, n.° de referencia de GenBank NM_01763); TRP2-INT2; TRP-2; TRP-1 / gp75 (proteína 1 relacionada con tirosinasa, oxidasa del ácido 5,6-dihidroxiindol-2-carboxílico, CAS2, CATB, TYRP, Oc A3, Catalasa B, b-PROTEIN, glucoproteína 75, EC 1.14.18., antígeno de melanoma Gp75, TYRP1, TRP, TYRRP, TRP1, SHEP11, DHICA Oxidasa, EC 1.14.18, GP75, EC 1.14.18.1; triosafosfato isomerasa (triosafosfato isomerasa 1, TPID, triosa-fosfato isomerasa, HEL-S-49, TIM, proteína secretora epididimaria Li 49, TPI, triosafosfato isomerasa, EC 5.3.1.1; TRAG-3 (miembro 2 de la familia de CSAG, familia 24 de antígeno de cáncer/testículo, CSAG3B, miembro 2, miembro 3B de la familia de CSAG, miembro 2 de la familia 24 de antígeno de cáncer/testículo, antígeno 24.2 de cáncer/testículo, proteína del gen 2/3 asociado con condrosarcoma, proteína de gen 3 asociada con resistencia a taxol, similar a proteína del gen 2/3 asociado con condrosarcoma, CT24.2, gen 3 asociado con la resistencia al taxol, TRAG-3, CSAG3A, TRAG3; ); TMEM46 (homólogo 2 de shisa (Xenopus laevis); SHISA; NP_001007539.1; NM_001007538.1; TMEM118 (proteína de dedo anular, transmembrane2; RNFT2; FLJ1462; NP_001103373.1; NM_001109903.1; TMEFF1 (proteína transmembrana con dominios similares a EGF y dos similares a folistatina 1; Tomoregulina-; H7365; C9orf2; C9ORF2; U19878; X83961; NM_080655; NM_003692; TGF-betaRII (TGFBR2, factor de crecimiento transformante, Beta Receptor II (70/80kDa), TGFbeta-RII, MFS2, tbetaR-II, TGFR-2, TGF-Beta Receptor tipo IIB, TGF-Beta tipo II receptor, TGF-Beta receptor tipo-2, EC 2.7.11.30, receptor beta de factor de crecimiento transformante de tipo IIC, AAT3, TbetaR-II, factor de crecimiento transformante, Beta Receptor II (70-80kD), TGF-Beta Receptor tipo II, FAA3, receptor beta de factor de crecimiento transformante de tipo II, LDS1B, HNPCC6, LDS2B, LDS2, RIIC, EC 2.7.11, TAAD2; TENB2 (TMEFF2, tomorregulina, TPEF, HPP1, t R, supuesto proteoglucano transmembrana, relacionado con la familia de factores de crecimiento de EGF/herregulina y folistatina); 374 aa, registro del NCBI: AAD55776, AAF91397, AAG49451, RefSeq del NCBI: NP_057276; Gen del NCBI: 23671; OMIM: 605734; SwissProt Q9UIK5; n.° de referencia de GenBank AF179274; AY358907, CAF85723, CQ782436; TAG-2; TAG-1 (Contactina 2 (Axonal), TAG-1, AXT, molécula de adhesión celular axonina-1, TAX, Contactina 2 (expresada transitoriamente), TAX1, Contactina-2, glucoproteína axonal TAG-1, glucoproteína axonal expresada transitoriamente, glucoproteína axonal transitoria, Axonina-1, TAX-1, TAG1, FAME5; PRF: 444868); proteína de fusión SYT-SSX1 o -SSX2; survivina; STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gen 1 asociado con cáncer de próstata, proteína 1 asociada con cáncer de próstata, antígeno epitelial de próstata 2 de seis transmembrana, proteína seis transmembrana de la próstata, n.° de referencia de GenBank AF45513; STEAP1 (antígeno epitelial de próstata de seis transmembrana, n.° de referencia de GenBank NM_01244; SSX-4; SSX-2 (SSX2, sarcoma sinovial, X Breakpoint2, X Breakpoint 2, SSX, X Breakpoint 2B, antígeno 5.2 de cáncer/testículo, relacionado 2 con el cromosoma X, antígeno tumora1HOM-MEL-40, CT5.2, HD21, familia 5 de antígeno de cáncer/testículo, HOM-MEL-40, Isoforma B, miembro 2a de la familia 5 de antígeno de cáncer/testículo, miembro 2a, proteína SSX2, sarcoma, sarcoma, Sinovial, relacionado 2 con el cromosoma X, sinovial, sarcoma sinovial, X Breakpoint 2B, sarcoma sinovial, SSX2A; Sp17; SOX10 (SRY (región determinante del sexo Y)-caja 10, ratón, PCWH, d Om , WS4, WS2E, WS4C, megacolon dominante, ratón, homólogo de humano, megacolon dominante, gen 10 de caja de HMG relacionado con SRY, homólogo de humano, factor de transcripción SOX-10; GenBank: CAG30470.1); SNRPD1 (ribonucleoproteína nuclear pequeña D1, ribonucleoproteína nuclear pequeña D1, polipéptido de 16kDa, polipéptido (16kD), SNRPD, HsT2456, Sm-D1, SMD1, autoantígeno Sm-D, pseudogén del polipéptido de 16kDa de ribonucleoproteína nuclear pequeña D1, proteína core D1 de SnRNP, ribonucleoproteína nuclear pequeña Sm D1; SLC35D3 (familia de transportadores de soluto 35, miembro D3, FRCL1, proteína 1 similar a conexión de Fringe, bA55K22.3, Frc, similar a Fringe 1, familia de transportadores de soluto 35 miembro D3; NCBI GenBank: NC_000006.11 NC_018917.2 NT_025741.16); SIRT2 (Sirtuina 2, sirtuina-2 desacetilasa dependiente de NAD, SIRL2, regulador de información silente 2, homólogo 2 de proteína reguladora SIR2, proteína de tipo 2 relacionada con Sir2, proteína 2 similar a SIR2, Sirtuina tipo 2, Sirtuina (homólogo de regulación de la información 2 de tipo emparejamiento silente) 2 (S. cerevisiae), Sirtuina-2, Sirtuina (regulación de la información 2 de tipo emparejamiento silente, S. cerevisiae, homólogo) 2, EC 3.5.1., SIR2; GenBank: AAK51133.1); Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, semaforina 5b Hlog, dominio sema, siete repeticiones de trombospondina (tipo 1 y similar a tipo 1), dominio transmembrana (TM) y dominio citoplasmático corto, (semaforina) 5B, n.° de referencia de GenBank a B04087; secernina 1 (SCRN1, s Es 1, KIAA0193, secerina-1; GenBank: EAL24458.1); SAGE (SAGE1, antígeno 1 de sarcoma, antígeno 14 de cáncer/testículo, CT14, supuesto antígeno tumoral; referencia de secuencia del NCBI: NP_061136.2); RU2AS (KAAG1, antígeno 1 asociado con riñón, RU2AS, proteína génica antisentido RU2, antígeno 1 asociado con riñón; GenBank: AAF23613.1); RNF43 - precursor RNF43 de ubiquitinaproteína ligasa E3 [Homo sapiens], RNF124; URCC; referencia de secuencia del NCBI: NP_060233.3; RhoC (RGS5 (regulador 5 de la señalización de proteína G, MSTP032, regulador 5 de la señalización de proteína G, MSTP092, MST092, MSTP106, MST106, MSTP129, MST129; GenBank: AAB84001.1); RET (protooncogén ret; MEN2A; HSCR1; MEN2B; MTC1; PTC; CDHF12; Hs.168114; RET51; RET-ELE; NP_066124.1; NM_020975.4); RBAF600 (UBR4, componente N de ubiquitina proteína ligasa E3-recognina 4, dedo de cinc, UBR1 tipo 1, ZUBR1, E3 ubiquitina-proteína ligasa UBR4, RBAF600, factor asociado con proteína de retinoblastoma de 600 kDa, proteína 1 de tipo UBR1 de dedo de cinc, EC 6.3.2., N-recognina-4, KIAA0462, p600, EC 6.3.2, KIAA1307; GenBank: AAL83880.1); RAGE-1 (MOK, MOK proteína cinasa, antígeno de tumor renal, RAGE, cinasa solapante MAPK/MAK/MRK, antígeno de tumor renal 1, antígeno de carcinoma de células renales, RAGE-1, EC 2.7.11.22, Ra GE1; UniProtKB/Swiss-Prot: Q9UQ07.1); RAB38 / NY-MEL-1 (RAB38, NY-MEL-1, RAB38, miembro de la familia de oncogenes RAS, antígeno de melanoma Ny -MEL-1, proteína de unión a GTP relacionada con RAB, proteína Rab-38 relacionada con Ras, rrGTPbp; GenBank: AAH 15808.1); PTPRK (DJ480J14.2.1 (proteína tirosina fosfatasa, tipo receptor, K R-PTP-KAPPA, proteína tirosina fosfatasa Kappa, proteína tirosina fosfatasa Kappa), proteína tirosina fosfatasa, tipo receptor, K, proteína tirosina fosfatasa Kappa, proteína tirosina fosfatasa, tipo receptor, Kappa, R-PTP-kappa, tirosina proteína fosfatasa Kappa de tipo receptor, EC 3.1.3.48, PTPK; GenBank: AAI44514.1); PSMA; PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN ADNc 2700050C12, RIKEN ADNc 2700050C12 gen, n.° de referencia de GenBank AY358628); PSCA (precursor de antígeno de células madre de próstata, n.° de referencia de GenBank AJ29743; PRDX5 (Peroxirredoxina 5, EC 1.11.1.15, TPx tipo VI, B166, enzima antioxidante B166, HEL-S-55, tejido hepático 2D-Page Spot 71B, PMP20, enzima antioxidante peroxisómica, PRDX6, tiorredoxina peroxidasa PMP20, PRXv , AOEB166, proteína secretora epididimaria Li 55, correpresor de Alu 1, Peroxirredoxina-5, mitocondrial, Peroxirredoxina V, prx-V, Tiorredoxina Reductasa, Prx-V, ACR1, correpresor de Alu, PLP; GenBank: CAG33484.1); PRAME (antígeno expresado preferencialmente en melanoma, antígeno expresado preferencialmente de melanoma, MAPE, OIP-4, OIPA, CT130, antígeno 130 de cáncer/testículo, antígeno de melanoma expresado preferencialmente en tumores, Proteína 4 que interactúa con Opa, Proteína OIP4 que interactúa con Opa; GenBank: CAG30435.1); proteína de fusión pml-RARalfa; PMEL17 (homólogo de silver; SILV; D12S53E; PMEL17; SI; SIL); ME20; gp10 BC001414; BT007202; M32295; M77348; Nm_006928; PBF (ZNF395, proteína de dedo de cinc 395, Pr F-1, regulador de la enfermedad de Huntington, proteína de unión a la región reguladora del gen de HD, proteína de unión a la región 2, proteína 2, factor 1 regulador de papilomavirus, factor 2 regulador de HD, factor regulador de papilomavirus, PRF1, HDBP-2, Si-1-8-14, HDBP2, proteína 2 de unión a la región reguladora del gen de la enfermedad de Huntington, HDRF-2, factor PRF-1 regulador de papilomavirus, PBF; GenBank: AAH01237.1); PAX5 (caja emparejada 5, gen homeótico 5 de caja emparejada, BSAP, proteína Pax-5 de caja emparejada, activador específico del linaje de linfocitos B, gen 5 de dominio emparejado, gen 5 de caja emparejada (proteína activadora específica del linaje de linfocitos B), factor de transcripción específico de linfocitos B, gen 5 de caja emparejada (activador específico del linaje de linfocitos B); PAP (REG3A, derivada 3 de islote de regeneración alfa, INGAP, PAP-H, proteína pancreática hepatointestinal, PBBCGF, péptido proislote humano, REG-III, proteína 1 asociada con pancreatitis, Reg3, Reg III-alfa, hepatocarcinoma-intestino-páncreas, proteína III-alfa derivada de islote de regeneración, factor de crecimiento de células beta pancreáticas, HIP, proteína homóloga de PAP, HIP/PAP, proteína inductora de proliferación 34, PAP1, proteína inductora de proliferación 42, REG-3-alfa, proteína 3-alfa derivada de islote de regeneración, proteína asociada con pancreatitis; GenBank: AAH36776.1); p53 (TP53, proteína tumoral P53, TPR53, P53, antígeno tumoral celular P53, antígeno NY-CO-13, proteína tumoral mutante 53, fosfoproteína P53, supresor tumoral P53, BCC7, proteína 53 relacionada con la transformación, LFS1, proteína tumoral 53, síndrome de Li-Fraumeni, supresor tumoral P53; P2X5 (canal de iones 5 activado por ligando P2X de receptor prurinérgico, un canal de iones activado por ATP extracelular, puede estar implicado en la transmisión sináptica y la neurogénesis, su deficiencia puede contribuir a la fisiopatología de la inestabilidad del detrusor idiopática); 422 aa), pl: 7,63, PM: 47206 TM: 1 [P] Cromosoma del gen: 17p13.3, n.° de referencia de GenBank NP_002552.; OGT (N-acetilglucosamina (GlcNAc) transferasa unida a O, subunidad P110 de O-GlcNAc transferasa, N-acetilglucosamina (GlcNAc) transferasa unida a O (UDP-N-acetilglucosamina:polipéptido-N-acetilglucosaminil transferasa, subunidad de 110 KDa de UDP-N-acetilglucosamina-péptido N-acetilglucosaminiltransferasa, UDP-N-acetilglucosamina:polipéptido-N-acetilglucosaminil transferasa, uridinafosfo-N-acetilglucosamina:polipéptido beta-N-acetilglucosaminil transferasa, subunidad P110 de O-GlcNAc transferasa, EC 2.4.1.255, subunidad de 110 KDa de N-acetilglucosamina transferasa unida a O, EC 2.4.1, HRNT1, EC 2.4.1.186, O-GLCNAC; GenBank: AAH38180.1); OA1 (artrosis QTL 1, OASD; GenBank: CAA88742.1); NY-ESO-1/lAGE-2 (antígeno 1B de cáncer/testículo, CTAG1B, NY-ESO-1, LAGE-2, ESO1, CTAG1, CTAG, LAGE2B, antígeno 1 de cáncer/testículo, antígeno NY-ESO-1 de cáncer/testículo autoinmunogénico, antígeno de cáncer 3, antígeno 6.1 de cáncer/testículo, Carcinoma escamocelular esofágico 1 de Nueva York, miembro 2 de la familia de antígeno L, LAGE2, CT6.1, LAGE2A; GenBank: AAI30365.1); NY-BR-1 (ANKRD30A, dominio de repetición de anquirina 30A, antígeno de cáncer de mama NY-BR-1, antígeno NY-BR-1 de cáncer de mama serológicamente definido, proteína 30A que contiene dominio de repetición de anquirina; referencia de secuencia del NCBI: NP_443723.2); N-ras (NRAS, homólogo de oncogén vírico RAS (V-Ras) de neuroblastoma, NRAS1, proteína N-Ras transformante, GTPasa NRas, ALPS4, parte 4 de proteína N-Ras, NS6, homólogo de oncogén, HRAS1; GenBank: AAH05219.1); NFYC (factor de transcripción nuclear Y, Gamma, HAP5, HSM, factor de transcripción nuclear Y subunidad C, Transactivador HSM-1/2, subunidad C de factor de unión a CCAAT, NF-YC, subunidad gamma de unión a factor de transcripción CCAAT, subunidad C de proteína de unión a ADN de caja de CAAT, subunidad 2A grande de factor de transcripción H1 de histonas, CBFC, factor de transcripción nuclear Y subunidad gamma, CBF-C, Transactivador HSM-1, H1TF2A, factor de transcripción NF-Y, subunidad C; neo-PAP (PAPOLG, Poli(A) polimerasa gamma, Neo-poli(A) polimerasa, Poli(A) polimerasa gamma nuclear, polinucleótido adenililtransferasa gamma, enzima de adenilación 3' de ARN SRP/Pap2, PAP-gamma, Neo-PAP, enzima de adenilación 3' de ARN SRP, PAP2, EC 2.7.7.19, PAPG; referencia de secuencia del NCBI: NP_075045.2); NCA (CEACAM6, n.° de referencia de GenBank M1872); Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familia de transportadores de soluto 34 (fosfato de sodio), miembro 2, transportador 3b de fosfato dependiente de sodio de tipo II, n.° de referencia de GenBank NM_00642); Clase I de miosina; MUM-3; MUM-2 (TRAPPC1, complejo 1 de tráfico de partículas de proteína, BET5, homólogo de BET5, MUM2, mutada 2 ubicua en melanoma, proteína 2 de mieloma múltiple, subunidad 1 de complejo de tráfico de partículas de proteína; MUM-1f; Mucina (MUC1, Mucina 1, asociada con la superficie celular, PEm T, PUM, CA 15-3, MCKD1, ADMCKD, enfermedad quística medular de riñón 1 (autosómica dominante), ADMCKD1, Mucina 1, Transmembrana, CD227, antígeno DF3 asociado con carcinoma de mama, MAM6, antígeno de cáncer 15-3, MCD, mucina asociada con carcinoma, MCKD, Krebs Von Den Lungen-6, MUC-1/SEC, mucina urinaria reactiva con cacahuete, MUC1/ZD, antígeno de membrana epitelial asociado a tumores, antígeno DF3, mucina asociada a tumores, episialina, EMA, antígeno H23, H23AG, Mucina-1, KL-6, mucina epitelial asociada a tumores, MUC-1, Episialina, PEM, antígeno CD227; UniProtKB/Swiss-Prot: P15941.3); MUC5AC (Mucina 5AC, oligomérica formadora de moco/gel, Mucina tranqueobronquial MUC5, TBM, Mucina 5, subtipos A y C, traqueobronquial/gástrica, leB, mucina gástrica, Mucina 5AC, pseudogen de oligomérica formadora de moco/gel, antígeno del grupo sanguíneo B de Lewis, LeB, glucoproteína principal de las vías respiratorias, MUC-5AC, Mucina-5 subtipo AC, Traqueobronquial; MUC1 (Mucina 1, asociada con la superficie celular, PEMT, PUM, CA 15-3, MCKD1, ADMCKD, enfermedad quística medular de riñón 1 (autosómica dominante), ADMCKD1, Mucina 1, Transmembrana, CD227, antígeno DF3 asociado con carcinoma de mama, MAM6, antígeno de cáncer 15-3, MCD, mucina asociada con carcinoma, MCKD, Krebs Von Den Lungen-6, MUC-1/SEC, mucina urinaria reactiva con cacahuete, MUC-1/X, mucina epitelial polimórfica, MUC1/ZD, antígeno de membrana epitelial asociado a tumores, antígeno DF3, mucina asociada a tumores, episialina, EMA, antígeno h23, H23AG, mucina-1, KL-6, mucina epitelial asociada a tumores, MUC-1, Episialina, PEM, antígeno CD227; MSG783 (RNF124, proteína teórica FLJ20315, n.° de referencia de GenBank Nm -01776; MRP4 - isoforma 3 de proteína 4 asociada a la multirresistencia farmacológica, MOAT-B; MOATB [Homo sapiens]; referencia de secuencia del NCBI: NP_001288758.1; MPF (MPF, MSLN, SMR, factor potenciador de megacariocitos, mesotelina, n.° de referencia de GenBank NM_00582; MMP-7 (MMP7, matrilisina, MPSL1, matrina, metaloproteinasa de matriz 7 (matrilisina, uterina), matrilisina uterina, metaloproteinasa de matriz-7, EC 3.4.24.23, proteasa Pump-1, Matrina, metaloproteinasa uterina, PUMP1, MMP-7, EC 3.4.24, PUMP-1; GenBank: AAC37543.1); MMP-2 (MMP2, metalopeptidasa de matriz 2 (gelatinasa A, gelatinasa de 72kDa, colagenasa de tipo IV de 72kDa), MONA, CLG4A, metaloproteinasa de matriz 2 (Gelatinasa A, gelatinasa de 72kD, colagenasa de tipo IV de 72kD), CLG4, gelatinasa de 72kDa, colagenasa de tipo IV de 72kDa), metaloproteinasa de matriz-2, MMP-II, gelatinasa de 72 KDa, colagenasa de tipo IV-A, MMP-2, metaloproteinasa de matriz-II, TBE-1, gelatinasa de neutrófilos, EC 3.4.24.24, EC 3.4.24; GenBank: AAH02576.1); y Meloe.
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD3 que tiene un primer dominio de unión que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis regiones hipervariables (HVR) seleccionadas entre (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 5; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, tal como 40G5c, puede tener un segundo dominio de unión que se une a HER2. El segundo dominio de unión que se une a HER2 puede, por ejemplo, comprender al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis regiones hipervariables (HVR) seleccionadas entre (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 169; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 170; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 171; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 172; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 173; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 174, como la poseída por el anticuerpo anti-HER2, hu4D5. En algunos casos, el segundo dominio de unión que se une a HER2 comprende al menos una (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4) de las regiones marco de cadena pesada FR-H1, FR-H2, FR-H3 y FR-H4 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 549-552, respectivamente y/o al menos una (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4) de las regiones marco de cadena ligera FR-L1, FR-L2, FR-L3 y FR-L4 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 553-556, respectivamente. En algunos casos, el segundo dominio de unión que se une a HER2 puede, por ejemplo, comprender (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) respecto de o la secuencia de, SEQ ID NO: 270; (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) respecto de o la secuencia de, SEQ ID NO: 271; o (c) un dominio VH como en (a) y un dominio VL como en (b).
En algunos aspectos de la divulgación, también pueden usarse anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos a células que expresan un antígeno tumoral, tal como un antígeno listado en la tabla 1 (por ejemplo, CD20, FcRH5, HER2, LYPD1, LY6G6D, PMEL17, LY6E, CD19, CD33, CD22, CD79A, CD79B, EDAR, GFRA1, MRP4, RET, Steap1 o TenB2). También pueden prepararse anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o como fragmentos de anticuerpo.
Las técnicas para producir anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero sin limitación, coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades (véase Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983)), el documento WO 93/08829 y Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), y la modificación de "botón en ojal" (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 5.731.168). La modificación de "botón en ojal" de anticuerpos multiespecíficos puede utilizarse para generar un primer brazo que contiene un botón y un segundo brazo que contiene el ojal en el que puede unirse el botón del primer brazo. El botón de los anticuerpos multiespecíficos de la invención puede encontrarse en un brazo de anti-CD3 en una realización. Como alternativa, el botón de los anticuerpos multiespecíficos de la invención puede encontrarse en un brazo de anti-diana/antígeno en una realización. El ojal de los anticuerpos multiespecíficos de la invención puede encontrarse en un brazo de anti-CD3 en una realización. Como alternativa, el ojal de los anticuerpos multiespecíficos de la invención puede encontrarse en un brazo de anti-diana/antígeno en una realización. También pueden diseñarse anticuerpos multiespecíficos usando la tecnología de sobrecruzamiento de inmunoglobulinas (también conocido como intercambio de dominio Fab o formato CrossMab) (véase, por ejemplo, el documento WO2009/080253; Schaefer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108:11187-11192 (2011)). También pueden producirse anticuerpos multiespecíficos diseñando efectos de direccionamiento electrostático para producir moléculas heterodiméricas de anticuerpo Fc (documento WO 2009/089004A1); sobrecruzando dos o más anticuerpos o fragmentos (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 4.676.980 y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); usando cremalleras de leucina para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); usando la tecnología de "diacuerpo" para producir fragmentos de anticuerpo (véase, por ejemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); y usando dímeros de Fv monocatenario (sFv) (véase, por ejemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); y preparando anticuerpos triespecíficos, como se describe, por ejemplo, en Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
Los anticuerpos modificados con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, incluyendo "anticuerpos Octopus", también se incluyen en el presente documento (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576A1).
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de los mismos, también pueden incluir un "Fab de acción dual" o "DAF", que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a CD3 así como a otro antígeno diferente (por ejemplo, una segunda molécula biológica) (véase, por ejemplo, el documento US 2008/0069820).
7. Variantes de anticuerpos
En determinados aspectos de la divulgación, se contemplan variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos anti-CD3 de la invención (por ejemplo, anticuerpos anti-CD3 biespecíficos de la invención que se unen a CD3 y a una segunda molécula biológica, por ejemplo, un antígeno de la superficie celular, por ejemplo, un antígeno tumoral, tal como anticuerpos TDB de la invención o variantes de los mismos). Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Pueden prepararse variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo mediante la introducción de modificaciones adecuadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o mediante síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, eliminaciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de restos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo.
Puede prepararse cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución para obtener la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno.
a. Variantes de sustitución, inserción y eliminación
En determinados aspectos de la divulgación, se proporcionan variantes de anticuerpos que tienen una o más sustituciones de aminoácidos. Los sitios de interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y las FR. En la tabla 2 se muestran sustituciones conservativas bajo el encabezado "sustituciones preferidas". Se proporcionan cambios más sustanciales en la tabla 2 bajo el encabezado "sustituciones a modo de ejemplo", y como se describen más adelante en referencia a las clases de las cadenas laterales de aminoácidos. Pueden introducirse sustituciones de aminoácidos en un anticuerpo de interés y los productos pueden someterse a detección sistemática respecto de una actividad deseada, por ejemplo, unión a antígeno conservada/mejorada, inmunogenicidad reducida o ADCC o CDC mejorada.
TABLA 2. i i n min i m m l r f ri
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Los aminoácidos pueden agruparse de acuerdo con las propiedades comunes de la cadena lateral:
(1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) ácidos: Asp, Glu;
(4) básicos: His, Lys, Arg;
(5) restos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;
(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservativas implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.
Un tipo particular de variante de sustitución implica sustituir uno o más restos de la región hipervariable de un anticuerpo precursor (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado). En general, las variantes resultantes seleccionadas para su estudio posterior tendrán modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad mejorada, inmunogenicidad reducida) en relación con el anticuerpo precursor y/o tendrán determinadas propiedades biológicas conservadas del anticuerpo precursor. Una variante sustitucional a modo de ejemplo es un anticuerpo madurado por afinidad, que puede generarse de manera conveniente, por ejemplo, usando técnicas de maduración por afinidad basadas en presentación de fagos, tales como aquellas descritas en el presente documento. En resumen, se mutan uno o más restos de HVR y los anticuerpos variantes se presentan sobre fagos y se someten a detección sistemática de una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión).
Pueden efectuarse alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Dichas alteraciones pueden efectuarse en "puntos calientes" de la HVR, es decir, restos codificados por codones que sufren mutación con elevada frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)) y/o restos que entran en contacto con el antígeno, evaluándose la afinidad de unión de la VH o VL variante resultante. La maduración por afinidad mediante la construcción y reselección de bibliotecas secundarias se ha descrito, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). En algunos aspectos de la maduración por afinidad, se introduce diversidad en los genes variables seleccionados para su maduración mediante cualquiera de diversos métodos (por ejemplo, PCR propensa a errores, reordenamiento de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). Después, se crea una biblioteca secundaria. Posteriormente, se somete la biblioteca a detección sistemática para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad implica estrategias dirigidas a las HVR, en las que se aleatorizan varios restos de HVR (por ejemplo, 4-6 restos a la vez). Pueden identificarse específicamente restos de HVR implicados en la unión al antígeno, por ejemplo, usando mutagénesis o modelado de barrido de alanina. Normalmente se usan como diana, en particular, CDR-H3 y CDR-L3.
En determinados aspectos de la divulgación, pueden producirse sustituciones, inserciones o eliminaciones en una o más HVR en tanto que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno. Por ejemplo, pueden efectuarse alteraciones conservativas (por ejemplo, sustituciones conservativas, tal como se proporcionan en el presente documento) que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión en las HVR. Por ejemplo, dichas alteraciones pueden encontrarse fuera de los restos de contacto con el antígeno en las HVR. En ciertos aspectos de la divulgación de las secuencias de VH y VL variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR está o bien no alterada o contiene más de una, dos o tres sustituciones de aminoácidos.
Un método útil para la identificación de restos o regiones de un anticuerpo que pueden usarse como diana para mutagénesis se denomina "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este método, se identifica un resto o un grupo de restos diana (por ejemplo, restos cargados, tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y se reemplaza por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si se ve afectada la interacción del anticuerpo con el antígeno. Pueden introducirse sustituciones adicionales en las ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. Como alternativa o además, puede usarse una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos restos de contacto y restos vecinos pueden usarse como diana o eliminarse como candidatos para sustitución. Las variantes pueden someterse a detección sistemática para determinar si contienen las propiedades deseadas.
Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxilo terminales que varían en su longitud, desde un resto hasta polipéptidos que contienen cien o más restos, así como inserciones intrasecuencia de restos de aminoácidos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un resto de metionilo N-terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C-terminal del anticuerpo de una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.
b. Variantes de glucosilación
En ciertas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos anti-CD3 de la invención (por ejemplo, anticuerpos anti-CD3 biespecíficos de la invención que se unen a CD3 y a una segunda molécula biológica, por ejemplo, un antígeno de la superficie celular, por ejemplo, un antígeno tumoral, tales como los anticuerpos TDB de la invención) pueden alterarse para aumentar o reducir el alcance de glucosilación del anticuerpo. La adición o eliminación de sitios de glucosilación a un anticuerpo anti-CD3 de la invención puede lograrse convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos, de tal forma que se crean o eliminan uno o más sitios de glucosilación.
Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, puede alterarse el carbohidrato unido a esta. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero comprenden normalmente un oligosacárido ramificado biantenario que está unido generalmente mediante un enlace N al Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir varios carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetil glucosamina (GIcNAc), galactosa y ácido siálico, así como fucosa unida a un GlcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenaria. En algunas realizaciones, pueden efectuarse modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención a fin de crear variantes de anticuerpos con ciertas propiedades mejoradas.
En una realización de la divulgación, se proporcionan variantes de anticuerpo anti-CD3 que tienen una estructura de carbohidratos que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fc. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en dicho anticuerpo puede ser del 1 % al 80 %, del 1 % al 65 %, del 5 % al 65 % o del 20 % al 40 %. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena de azúcar en Asn297, en relación con la suma de todas las glucoestructuras acopladas a un Asn 297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y ricas en manosa) medidas mediante espectrometría de masas mA l DI-TOF, como se describe en el documento WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al resto de asparagina ubicado aproximadamente en la posición 297 en la región Fc (numeración de EU de los restos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también puede estar ubicado a aproximadamente ± 3 aminoácidos cadena arriba o cadena abajo de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia menores en los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilación pueden tener una función de ADCC mejorada. Véanse, por ejemplo, las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos n.° US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpos "desfucosilados" o "deficientes en fucosa" incluyen: el documento US 2003/0157108; el documento WO 2000/61739; el documento WO 2001/29246; el documento US 2003/0115614; el documento US 2002/0164328; el documento US 2004/0093621; el documento US 2004/0132140; el documento US 2004/0110704; el documento US 2004/0110282; el documento US 2004/0109865; el documento WO 2003/085119; el documento WO 2003/084570; el documento WO 2005/035586; el documento WO 2005/035778; el documento WO2005/053742; el documento WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos desfucosilados incluyen células Lec13 CHO deficientes en la fucosilación de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Solicitud de Patente de los Estados Unidos n.° 2003/0157108 A1, Presta, L; y el documento WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente en el ejemplo 11) y líneas celulares con supresión génica, tal como para el gen de la alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO con supresión génica (véase, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); y el documento WO2003/085107).
Además, se proporcionan variantes de anticuerpos anti-CD3 con oligosacáridos bisectados, por ejemplo, en los que un oligosacárido biantenario unido a la región Fc del anticuerpo se bisecciona mediante GIcNAc. Dichas variantes de anticuerpos pueden tener una fucosilación reducida y/o una función de ADCC mejorada. Se describen ejemplos de dichas variantes de anticuerpo, por ejemplo, en el documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); la patente de los Estados Unidos n.° 6.602.684 (Umana et al.); y el documento US 2005/0123546 (Umana et al.). También se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un resto de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener función CDC mejorada. Dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en el documento WO 1997/30087 (Patel et al.); el documento WO 1998/58964 (Raju, S.); y el documento Wo 1999/22764 (Raju, S.).
c. Variantes de región Fc
En ciertas realizaciones, pueden introducirse una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc de un anticuerpo anti-CD3 de la invención (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3 anti-HER2 biespecífico de la invención que se une a CD3 y a HER2, tal como un anticuerpo TDB de la invención), generando de este modo una variante de región Fc (véase, por ejemplo, el documento US 2012/0251531). La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácido (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos.
En ciertas realizaciones, la invención contempla una variante de anticuerpo anti-CD3 anti-HER2 biespecífico que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, que la hacen un candidato deseable para aplicaciones en las que es importante la semivida del anticuerpo in vivo mientras que ciertas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Pueden llevarse a cabo ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/eliminación de las actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, pueden llevarse a cabo ensayos a receptor de Fc (FcR) para asegurarse de que el anticuerpo carece de actividad de unión a FcyR (por tanto, careciendo probablemente de actividad ADCC), pero conserva la capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar en la ADCC, células NK, expresan únicamente Fc(RIII, mientras que los monocitos expresan Fc(RI, Fc(RII y Fc(RIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Se describen ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés en la Patente de los Estados Unidos n.° 5.500.362 (véase, por ejemplo, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5.821.337 (véase Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Como alternativa, pueden emplearse métodos de ensayo no radiactivos (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radiactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, California; y el ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). Como alternativa o además, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede determinarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal, como se divulga en Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Pueden llevarse a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo es incapaz de unirse a C1q y por tanto, carece de actividad CDC. Véanse, por ejemplo, los ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación de complemento, puede llevarse a cabo un ensayo de CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al. J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al. Blood. 101:1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. y M.J. Glennie Blood. 103:2738-2743 (2004)). También pueden llevarse a cabo determinaciones de unión a FcRn y de eliminación/semivida in vivo también puede llevarse a cabo usando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova, S.B. et al. Int'I. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)).
Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen aquellos con la sustitución de uno o más de los restos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (Patentes de los Estados Unidos n.° 6.737.056 y 8.219.149). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el mutante de Fc denominado "DANA" con sustitución de los restos 265 y 297 por alanina (Patentes de los Estados Unidos n.° 7.332.581 y 8.219.149).
En ciertas realizaciones, la prolina en la posición 329 de una región Fc humana de tipo silvestre en el anticuerpo se sustituye por glicina o arginina o un resto de aminoácido lo suficientemente grande para destruir el sándwich de prolina entre la interfaz de Fc/Fc gamma que se forma entre la prolina 329 del Fc y los restos de triptófano Trp 87 y Trp 110 de FcgRIII (Sondermann et al.: Nature 406, 267-273 (20 de julio de 2000)). En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende al menos una sustitución de aminoácidos adicional. En una realización, la sustitución de aminoácidos adicional es S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D o P331S y en otra realización más, la al menos una sustitución de aminoácidos adicional es L234A y L235A de la región Fc de IgG1 humana o S228P y L235E de la región Fc de IgG4 humana (véase, por ejemplo, el documento US 2012/0251531) y en otra realización más, la al menos una sustitución de aminoácidos adicional es L234A y L235A y P329G de la región Fc de IgG1 humana.
Se describen determinadas variantes de anticuerpo con unión mejorada o reducida a FcR. (Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 6.737.056; el documento WO 2004/056312 y Shields et al., J. Biol. chem. 9(2): 6591-6604 (2001)).
En ciertas realizaciones, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones de aminoácidos que mejoran la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración de EU de los restos).
En algunas realizaciones, se efectúan alteraciones en la región Fc que dan como resultado una alteración (es decir, mejora o reducción) de la unión a C1q y/o la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos n.° 6.194.551, el documento WO 99/51642 e Idusogie et al. J. Immunol.
164: 4178-4184 (2000).
Los anticuerpos con semividas aumentadas y unión mejorada al receptor Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), se describen en el documento US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Dichos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Dichas variantes de Fc incluyen aquellas que tienen sustituciones en uno o más de los siguientes restos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, la sustitución del resto 434 de la región Fc (Patente de los Estados Unidos n.° 7.371.826).
Véase también Duncan y Winter, Nature 322:738-40 (1988); la Patente de los Estados Unidos n.° 5.648.260; la Patente de los Estados Unidos n.° 5.624.821; y el documento WO 94/29351 que se refieren a otros ejemplos de variantes en la región Fc.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD3 biespecífico comprende una región Fc que comprende una mutación N297G. En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo anti-CD3 que comprende la mutación N297G comprende un brazo de anti-CD3 que comprende un primer dominio de unión que comprende las seis HVR a continuación: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; y un brazo anti-CD20 que comprende un segundo dominio de unión que comprende las seis HVR a continuación: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 157; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 158; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 160; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 161; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 162.
En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo anti-CD3 que comprende la mutación N297G comprende un brazo anti-CD3 que comprende un primer dominio que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 184 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 185 y un brazo anti-CD20 que comprende un segundo dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 266 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 267.
En algunas realizaciones de la divulgación, el anticuerpo anti-CD3 que comprende la mutación N297G comprende uno o más dominios constantes de cadena pesada, en donde los uno o más dominios constantes de cadena pesada se seleccionan entre un primer dominio CH1 (CH1-i), un primer dominio CH2 (CH2-i), un primer dominio CH3 (CH3-i), un segundo dominio CH1 (CH12), un segundo dominio c H2 (CH22) y un segundo dominio CH3 (CH32). En algunos casos, al menos uno de los uno o más dominios constantes de cadena pesada se empareja con otro dominio constante de cadena pesada. En algunos casos, cada uno de los dominios CH3í y CH32 comprenden una protuberancia o cavidad y en donde la protuberancia o la cavidad en el dominio CH3í puede posicionarse en la cavidad o protuberancia, respectivamente, en el dominio CH32. En algunos casos, los dominios CH3í y CH32 se encuentran en una interfaz entre dicha protuberancia y cavidad. En algunos casos, cada uno de los dominios CH2í y CH22 comprenden una protuberancia o cavidad y en donde la protuberancia o la cavidad en el dominio CH2í puede posicionarse en la cavidad o protuberancia, respectivamente, en el dominio CH22. En otros casos, los dominios CH2í y CH22 se encuentran en una interfaz entre dicha protuberancia y cavidad. En algunos casos, el anticuerpo anti-CD3 es un anticuerpo IgG1.
En otros aspectos, el anticuerpo anti-CD3 que comprende la mutación N297G comprende un brazo anti-CD3 que comprende un primer dominio que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 184 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 185 y un brazo anti-CD20 que comprende un segundo dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 266 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 267, en donde (a) el brazo anti-CD3 comprende las mutaciones de sustitución T366S, L368A, Y407V y N297G y (b) el brazo anti-CD20 comprende las mutaciones de sustitución T366W y N297G.
d. Variantes de anticuerpo modificadas con cisterna
En ciertas realizaciones de la divulgación, puede ser deseable crear anticuerpos modificados con cisteína, por ejemplo, "tioMAb", en los que se sustituyen uno o más restos de un anticuerpo por restos de cisteína. En realizaciones particulares, los restos sustituidos se producen en sitios accesibles del anticuerpo. Mediante la sustitución de esos restos con cisteína, los grupos tiol reactivos se colocan por tanto en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden utilizar para conjugar el anticuerpo con otros restos, tales como restos de fármacos o enlazadores-restos de fármaco, para crear un inmunoconjugado, como se describe adicionalmente en el presente documento. En ciertas realizaciones, puede sustituirse uno cualquiera o más de los siguientes restos por cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración de EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración de EU) de la región Fc de la cadena pesada. Pueden generarse anticuerpos modificados con cisteína como se describe, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos n.° 7.521.541.
e. Derivados de anticuerpos
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-CD3 biespecífico de la invención que se une a CD3 y a HER2, tal como un anticuerpo TDB de la invención proporcionado en el presente documento, puede modificarse adicionalmente para que contenga restos no proteicos adicionales que se conocen en la técnica y se encuentran fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero sin limitación, polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles incluyen, pero sin limitación, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrano o poli (n-vinilpirrolidona) polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico y mezclas de los mismos. El propionaldehído de polietilenglicol puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede tener cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. La cantidad de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y si se une más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización se puede determinar basándose en consideraciones que incluyen, pero sin limitación, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo a mejorar, si el derivado de anticuerpo se usará en una terapia en condiciones definidas, etc.
En otra realización, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y un resto no proteico que pueden calentarse selectivamente por exposición a radiación. En una realización, el resto no proteico es un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda e incluye, pero sin limitación, longitudes de onda que no dañan a las células ordinarias, pero que calientan el resto no proteico a una temperatura a la que las mueren células proximales al anticuerpo-resto no proteico.
B. Métodos y composiciones recombinantes
Los anticuerpos anti-CD3 biespecíficos de la invención que se unen a CD3 y HER2, tales como los anticuerpos TDB de la invención o variantes de los mismos, pueden producirse usando métodos y composiciones recombinantes, por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 4.816.567. En una realización, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-CD3 de la invención. Dicho ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprenda el VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprenda el VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligera y/o pesada del anticuerpo). En una realización adicional, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. En una realización adicional, se proporciona una célula hospedadora que comprende dicho ácido nucleico. En una de dichas realizaciones, una célula hospedadora comprende (por ejemplo, se ha transformado con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo. En una realización, la célula hospedadora es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula linfoide (por ejemplo, una célula Y0, NS0, Sp20). En una realización, se proporciona un método para producir un anticuerpo anti-CD3, en donde el método comprende cultivar una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, según lo dispuesto anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y opcionalmente, recuperar el anticuerpo de la célula hospedadora (o del medio de cultivo de la célula hospedadora).
Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-CD3, el ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente, se aísla e inserta en uno o más vectores para la clonación y/o expresión adicional en una célula hospedadora. Dicho ácido nucleico puede aislarse y secuenciarse fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo).
Las células hospedadoras adecuadas para la clonación o expresión de los vectores que codifican anticuerpos incluyen células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, los anticuerpos pueden producirse en bacterias, en particular, cuando no se necesitan glucosilación y función efectora de Fc. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.648.237, 5.789.199 y 5.840.523. (Véase también Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), págs. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli). Después de la expresión, el anticuerpo puede aislarse de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y puede purificarse adicionalmente.
Además de procariotas, los microbios eucariotas, tales como hongos filamentosos o levaduras, son hospedadores de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican anticuerpos, incluyendo cepas de hongos y levaduras cuyas vías de glucosilación se han "humanizado", lo que da como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véase Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004) y Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).
Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de anticuerpo glucosilado también proceden de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas baculovíricas que pueden usarse en conjunción con células de insecto, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.
También pueden utilizarse cultivos de células vegetales como hospedadores. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).
Las células de vertebrado también pueden usarse como hospedadoras. Por ejemplo, pueden ser útiles células de mamífero que están adaptadas para crecer en suspensión. Otros ejemplos de células de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono trasformada mediante SV40 (COS-7); la línea de riñón embrionario humano (293 o células 293, como se describen, por ejemplo, en Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK); células de Sertoli de ratón (células TM4, como se describen, por ejemplo, en Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma de cuello de útero humano (HELA); células de riñón canino (MDCK; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); tumor de mama de ratón (MMT 060562); células TRI, como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); células Mc R 5; y células FS4. Otras líneas celulares de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO DHFR' (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma, tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas celulares de mamífero hospedadoras adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), págs. 255-268 (2003).
C. Ensayos
Los anticuerpos anti-CD3 biespecíficos de la invención que se unen a CD3 y HER2, tales como los anticuerpos TDB de la invención proporcionados en el presente documento pueden identificarse, someterse a detección sistemática o caracterizarse respecto de sus propiedades fisicoquímicas y/o sus actividades biológicas mediante diversos ensayos conocidos en la técnica.
1. Ensayos de unión y otros ensayos
En un aspecto, de la divulgación, se evalúa la actividad de unión a antígeno de un anticuerpo anti-CD3 de la invención, por ejemplo, mediante métodos conocidos, tales como ELISA, transferencia de Western, etc.
En otro aspecto de la divulgación, pueden usarse ensayos de competición para identificar un anticuerpo que compite con un anticuerpo anti-CD3 de la invención por la unión a CD3.
En un ensayo de competición a modo de ejemplo, se incuba CD3 inmovilizado en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une a c D3 y un segundo anticuerpo no marcado que se está evaluando respecto de su capacidad para competir con el primer anticuerpo por la unión a CD3. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, se incuba CD3 inmovilizado en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado, pero no el segundo anticuerpo marcado. Después de la incubación en condiciones que permitan la unión del primer anticuerpo a CD3, se retira el exceso de anticuerpo no unido y se mide la cantidad de marcador asociado con CD3 inmovilizado. En caso de que la cantidad de marcador asociado con CD3 inmovilizado se reduzca sustancialmente en la muestra de ensayo en relación con la muestra de control, esto indica que el segundo anticuerpo compite con el primer anticuerpo por la unión a CD3. Véanse, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual. cap. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
2. Ensayos de actividad
En un aspecto de la divulgación, se proporcionan ensayos para identificar anticuerpos anti-CD3 que tienen actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, unión a CD3 (por ejemplo, CD3 en la superficie de un linfocito T) o un fragmento peptídico del mismo, ya sea in vivo, in vitro o ex vivo. En el caso de un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, biespecífico) anti-CD3 de la invención (por ejemplo, un anticuerpo TDB que tiene un brazo anti-CD3 y un brazo que reconoce a una segunda molécula biológica, por ejemplo, un antígeno de la superficie celular, por ejemplo, un antígeno tumoral), la actividad biológica también puede incluir, por ejemplo, la activación de células efectoras (por ejemplo, activación de linfocitos T (por ejemplo, linfocitos T CD8+ y/o CD4+)), expansión de la población de células efectoras (es decir, un aumento en el recuento de linfocitos T), reducción de la población de células diana (es decir, una reducción en la población de células que expresan la segunda molécula biológica en sus superficies celulares) y/o eliminación de células diana. Se proporcionan anticuerpos que tienen dicha actividad biológica in vivo y/o in vitro. En ciertas realizaciones, se evalúa dicha actividad biológica en un anticuerpo de la invención, como se describe detalladamente en los ejemplos más adelante en el presente documento.
En algunas realizaciones de la divulgación, la actividad comprende la activación de los linfocitos T citotóxicos. En algunas realizaciones de cualquiera de estos ensayos de actividad, pueden aislarse PBMC de sangre completa de donantes sanos mediante separación con Ficoll. En particular, puede recogerse sangre humana en jeringas heparinizadas y las PBMC se aíslan usando Leucosep y Ficoll Paque Plus. En caso necesario, pueden separarse linfocitos T CD4+ y T CD8+ con kits de Miltenyi de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Además, las células pueden lavarse en medio RPMI que contiene FBS al 10 %, suplementado con GlutaMax, penicilina y estreptomicina y se añaden ~0,2 millones de células en suspensión a una placa de fondo en U de 96 pocillos. Las células pueden cultivarse en RPMI1640 suplementado con FBS al 10 % a 37 °C en una estufa de incubación para cultivo celular convencional humidificada. Para los ensayos de eliminación de células BJAB, pueden incubarse 20.000 células BJAB con células efectoras, ya sean como huPBMC o linfocitos T purificados, a las relaciones indicadas por el ensayo, en presencia de diversas concentraciones de anticuerpos TDB durante 24 horas. Para los ensayos de eliminación de linfocitos B endógenos, pueden incubarse 200.000 huPBMC con diversas concentraciones de anticuerpos TDB durante 24 horas.
Después del cultivo, las células pueden lavarse con tampón de FACS (BSA al 0,5 %, azida de Na al 0,05 % en PBS). Después, las células pueden teñirse en tampón de FACS, lavarse con tampón de FACS y suspenderse en 100 pl de tampón de FACS que contiene 1 pg/ml de yoduro de propidio. Pueden recogerse datos en un citómetro de flujo FACSCalibur y analizarse usando FlowJo. Los linfocitos B vivos pueden seleccionarse como linfocitos B PI-CD19+ o PI-CD20+ mediante FACS y puede obtenerse el recuento absoluto con perlas de FITC añadidas a la mezcla de reacción como control interno de recuento. Puede calcularse el porcentaje (%) de eliminación celular basándose en los controles no tratados con TDB. Los linfocitos T activados pueden detectarse mediante la expresión superficial de CD69 y CD25 usando anti-CD69-FITC y anti-CD25-PE.
D. Inmunoconjugados
La invención también proporciona inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-CD3 de la invención conjugado a uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes o fármacos quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal o fragmentos de las mismas) o isótopos radiactivos.
En una realización, un inmunoconjugado es un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) en el que se conjuga un anticuerpo a uno o más fármacos, incluyendo, pero sin limitación, un maitansinoide (véanse las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.208.020, 5.416.064 y la Patente Europea EP 0 425 235 B1); una auristatina, tales como los restos DE y DF de monometilauristatina (MMAE y MMAF) (véanse las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.635.483 y 5.780.588 y 7.498.298); una dolastatina; una calicheamicina (véanse las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001 y 5.877.296; Hinman et al., Cancer Res.
53:3336-3342 (1993); y Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); una antraciclina, tal como daunomicina o doxorrubicina (véase Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem.
45:4336-4343 (2002); y la Patente de los Estados Unidos n.° 6.630.579); metotrexato; vindesina; un taxano, tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.
En otra realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo anti-CD3 de la invención conjugado a una toxina enzimáticamente activa o un fragmento de la misma, incluyendo, pero sin limitación, cadena A de difteria, fragmentos activos sin unión de toxina de la difteria, cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de ricina, la cadena A de abrina, la cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAPS), el inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, el inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos.
En otra realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo anti-CD3 de la invención conjugado a un átomo radiactivo para formar un radioconjugado. Se encuentra disponible varios isótopos radiactivos para la producción de radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212e isótopos radioactivos de Lu. Cuando el radioconjugado se usa para detección, puede comprender un átomo radiactivo para estudios de centellografía, por ejemplo, tc99m o I123 o un marcador de spin para obtención de imágenes por resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como obtención de imágenes por resonancia magnética, IRM), tales como nuevamente, yodo-123, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.
Pueden prepararse conjugados de un anticuerpo y un agente citotóxico usando varios agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidioésteres (tales como dimetil adipimidato HCI), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de bis-fluorina activa (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina tal como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono-14 es un agente quelante a modo de ejemplo para la conjugación del radionucleótido con el anticuerpo. Véase el documento WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede usarse un enlazador lábil por ácido, enlazador sensible a peptidasa, enlazador fotolábil, enlazador de dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); Patente de los Estados Unidos n.° 5.208.020).
Los inmunoconjugados o ADC del presente documento contemplan expresamente, pero sin limitación, dichos conjugados preparados con reactivos reticulantes que incluyen, pero sin limitación, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que se encuentran disponibles comercialmente (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EE. UU.).
E. Métodos y composiciones para diagnósticos y detección
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-CD3 biespecíficos de la invención que se unen a CD3 y a HER2, tales como anticuerpos TDB de la invención, son útiles para detectar la presencia de CD3 en una muestra biológica. El término "detectar", como se usa en el presente documento, abarca la detección cuantitativa o cualitativa. En ciertas realizaciones, una muestra biológica comprende una célula o un tejido.
En ciertas realizaciones de la divulgación, se proporcionan anticuerpos anti-CD3 marcados. Los marcadores incluyen, pero sin limitación, marcadores o restos que se detectan directamente (tal como marcadores fluorescentes, cromóforos, densos a electrones, quimioluminiscentes y radiactivos), así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, mediante una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores a modo de ejemplo incluyen, pero sin limitación, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos, tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbelliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (Patente de los Estados Unidos n.° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalacinadionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, pgatactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas como uricasa y xantina oxidasa, acoplados con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de colorante, tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables y similares.
F. Formulaciones farmacéuticas
Las formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo anti-CD3 biespecífico de la invención que se une a CD3 y a HER2, tal como un anticuerpo TDB de la invención, se preparan mezclando dicho anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16.a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores farmacéuticamente aceptables normalmente son no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas e incluyen, pero sin limitación: tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos, tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos, tales como polietilenglicol (PEG). Los portadores a modo de ejemplo farmacéuticamente aceptables en el presente documento incluyen adicionalmente agentes de dispersión de fármacos intersticiales, tales como glucoproteínas de hialuronidasa neutros-activos solubles (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas de hialuronidasa PH-20 solubles humanas, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinados sHASEGP a modo de ejemplo y métodos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos n.° 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, se combina un sHASEGP con una o más glucosaminoglucanasas adicionales, tales como condroitinasas.
Las formulaciones de anticuerpo ilustrativas se describen en la Patente de los Estados Unidos n.° 6.267.958. Las formulaciones acuosas de anticuerpo incluyen aquellas descritas en la Patente de los Estados Unidos n.° 6.171.586 y en el documento WO2006/044908, incluyendo estas últimas formulaciones un tampón de histidina-acetato.
La formulación en el presente documento también puede contener más de un principio activo según sea necesario para la indicación particular que se esté tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar adicionalmente un agente terapéutico adicional (por ejemplo, un agente quimioterápico, un agente citotóxico, un agente inhibidor del crecimiento y/o un agente antihormonal, tales como los citados anteriormente en el presente documento). Dichos principios activos están presentes de manera adecuada en combinaciones en cantidades que son eficaces para el fin previsto.
Los principios activos pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edición, Osol, A. Ed. (1980).
Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, teniendo dichas matrices una forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas.
Las formulaciones que se van a usar para la administración in vivo son, generalmente, estériles. Puede lograrse fácilmente la esterilidad, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de esterilización por filtración.
G. Métodos y composiciones terapéuticos
Cualquiera de los anticuerpos anti-CD3 biespecíficos de la invención que se unen a CD3 y a HER2, tales como anticuerpos TDB de la invención, pueden usarse en métodos terapéuticos.
En un aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-CD3 biespecífico para su uso como medicamento. En aspectos adicionales, se proporciona un anticuerpo anti-CD3 biespecífico de la invención para su uso en el tratamiento o retraso de la progresión de un trastorno proliferativo celular (por ejemplo, cáncer) o un trastorno autoinmunitario (por ejemplo, artritis). En ciertas realizaciones, se proporciona un anticuerpo anti-CD3 biespecífico de la invención para su uso en un método de tratamiento. En ciertas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo anti-CD3 biespecífico de la invención para su uso en un método de tratamiento de un individuo que tiene un trastorno proliferativo celular, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-CD3. En una de dichas realizaciones, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-CD3 biespecífico de la invención se proporciona para su uso en la potenciación de la función inmunitaria en un individuo que tiene un trastorno proliferativo celular. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-CD3 de la invención se proporciona para su uso en un método para potenciar la función inmunitaria en un individuo que tiene un trastorno proliferativo celular, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-CD3 para activar células efectoras (por ejemplo, linfocitos T, por ejemplo, linfocitos T CD8+ y/o CD4+), expandir (aumentar) una población de células efectoras, reducir la población de células diana (por ejemplo, una célula que expresa HER2 reconocida por el anticuerpo TDB biespecífico de la invención) y/o eliminar una célula diana (por ejemplo, célula diana tumoral). Un "individuo" de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores puede ser un ser humano.
En un aspecto adicional, la divulgación posibilita el uso de un anticuerpo anti-CD3 en la fabricación o preparación de un medicamento. En una realización de la divulgación, el medicamento es para el tratamiento de un trastorno proliferativo celular (por ejemplo, cáncer). En una realización más de la divulgación, el medicamento es para su uso en un método de tratamiento de un trastorno proliferativo celular, que comprende administrar a un individuo que tenga un trastorno proliferativo celular o un trastorno autoinmunitario una cantidad eficaz del medicamento. En una realización de este tipo de la divulgación, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación. En una realización más de la divulgación, el medicamento es para activar células efectoras (por ejemplo, linfocitos T, por ejemplo, linfocitos T CD8+ y/o CD4+), expandir (aumentar) una población de células efectoras, reducir una población de células diana (por ejemplo, una célula que expresa una segunda molécula biológica reconocida por un anticuerpo anti-CD3 de la invención, tal como un anticuerpo TDB biespecífico de la invención) y/o eliminar células diana (por ejemplo, células tumorales diana) en el individuo. En una realización más de la divulgación, el medicamento es para su uso en un método para potenciar la función inmunitaria en un individuo que tiene un trastorno proliferativo celular, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para activar células efectoras (por ejemplo, linfocitos T, por ejemplo, linfocitos T CD8+ y/o CD4+), expandir (aumentar) una población de células efectoras, reducir una población de células diana (por ejemplo, una célula que expresa h ER2 reconocida por el anticuerpo anti-CD3 biespecífico de la invención y/o eliminar una célula diana (por ejemplo, célula diana tumoral). Un "individuo" de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores puede ser un ser humano.
En un aspecto adicional, la divulgación proporciona un método para tratar un trastorno proliferativo celular (por ejemplo, cáncer) o un trastorno autoinmunitario (por ejemplo, artritis). En una realización de la divulgación, el método comprende administrar a un individuo que tiene dicho trastorno proliferativo celular, una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-CD3. En una realización de este tipo de la divulgación, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación. Un "individuo" de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores puede ser un ser humano.
En un aspecto adicional, la divulgación proporciona un método para potenciar la función inmunitaria en un individuo que tiene un trastorno proliferativo celular o un trastorno autoinmunitario. En una realización de la divulgación, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-CD3 para activar células efectoras (por ejemplo, linfocitos T, por ejemplo, linfocitos T CD8+ y/o CD4+), expandir (aumentar) una población de células efectoras, reducir una población de células diana (por ejemplo, una célula que expresa HER2 reconocida por un anticuerpo anti-CD3 biespecífico de la invención y/o eliminar una célula diana (por ejemplo, célula diana tumoral). En una realización de la divulgación, un "individuo" es un ser humano.
En un aspecto adicional de la divulgación, la terapia adicional comprende un agente alquilante. En una realización, el agente alquilante es ácido 4-[5-[Bis(2-cloroetil)amino]-1-metilbencimidazol-2-il]butanoico y sales del mismo. En una realización, el agente alquilante es bendamustina.
En un aspecto adicional de la divulgación, la terapia adicional comprende un inhibidor de BCL-2. En una realización, el inhibidor de BCL-2 es 4-(4-{[2-(4-clorofenil)-4,4-dimetilciclohex-1-en-1-il]metil}piperazin-1-il)-N-({3-nitro-4-[(tetrahidro-2H-piran-4-ilmetil)amino]fenil}sulfonil)-2-(1H-pirrolo[2,3-b]piridin-5-iloxi)benzamida y sales de la misma. En una realización, el inhibidor de BCL-2 es venetoclax (n.° CAS: 1257044-40-8).
En un aspecto adicional de la divulgación, la terapia adicional comprende un inhibidor de fosfoinosítido 3-cinasa (PI3K). En una realización, el inhibidor de PI3K inhibe la isoforma delta de PI3K es decir, P1105). En algunos casos, el inhibidor de PI3K es 5-fluoro-3-fenil-2-[(1S)-1-(7H-purin-6-ilamino)propil]-4(3H)-quinazolinona y sales de los mismos. En algunos casos, el inhibidor de PI3K es idelalisib (n.° CAS: 870281-82-6). En un caso, el inhibidor de PI3K inhibe a las isoformas alfa y delta de PI3K. En algunos casos, el inhibidor de PI3K es 2-{3-[2-(1-isopropil-3-metil-1H-1,2-4-triazol-5-il)-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oxazepin-9-il]-1H-pirazol-1-il}-2-metilpropanamida y sales de la misma.
En un aspecto adicional de la divulgación, la terapia adicional comprende un inhibidor de tirosina cinasa de Bruton (BTK). En un caso, el inhibidor de BTK es 1-[(3R)-3-[4-amino-3-(4-fenoxifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il]piperidin-1-il]prop-2-en-1-ona y sales de la misma. En un caso, el inhibidor de BTK es ibrutinib (n.° CAS: 936563-96-1).
En un aspecto adicional de la divulgación, la terapia adicional comprende talidomida o un derivado de la misma. En un caso, la talidomida o un derivado de la misma es (RS)-3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidin-2,6-diona y sales de la misma. En un caso, la talidomida o un derivado de la misma es lenalidomida (n.° CAS: 191732-72­ 6).
En un aspecto adicional de la divulgación, la terapia adicional comprende uno o más de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina o prednisolona (CHOP). En un caso, la terapia adicional comprende además un anticuerpo anti-CD20 como se ha descrito anteriormente (por ejemplo, GA-101 y/o Rituxan®). Puede usarse cualquiera de los métodos y terapias anteriores, sin limitación, para cualquier cáncer, incluyendo, por ejemplo, el tratamiento de un cáncer de linfocitos B o cáncer de mama.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico de la invención para su uso en un método para tratar cánceres positivos a HER2. En una realización, el método comprende administrar a un individuo que tenga dicho cáncer una cantidad eficaz de un anticuerpo TDB biespecífico anti-HER2 con un brazo de direccionamiento anti-HER2 y un brazo de direccionamiento anti-CD3. El HER2-TDB posee un perfil de toxicidad aceptable cuando se administra en una dosis eficaz a un paciente. El brazo de CD3 del HER2-TDB con un perfil de toxicidad aceptables es un brazo de CD3 de baja afinidad, concretamente, 40G5c.
En una realización preferida, el cáncer positivo para HER2 es un cáncer de mama positivo para HER2 o cáncer gástrico positivo para HER2. En una realización, se coadministra un TDB para HER2 con uno o más agentes terapéuticos adicionales que se dirigen a la vía de HER. En una realización, el agente terapéutico que se dirige a la vía de HER se selecciona entre un inhibidor de EGFR, un inhibidor de HER2, un inhibidor de HER3 y/o un inhibidor de HER4. En una realización, se coadministra un TDB para HER2 con uno o más agentes terapéuticos adicionales seleccionados entre trastuzumab (Herceptin®), T-DM1 (Kadcyla®) y pertuzumab (Perjeta®). En una realización, se coadministra un TDB para HER2 con trastuzumab. En una realización, se coadministra un TDB para HER2 con T-DM1. En una realización, se coadministra un TDB para HER2 con pertuzumab. En una realización, se coadministra un TDB para HER2 con trastuzumab y pertuzumab. En una realización, se coadministra un TDB para HER2 con T-DM1 y pertuzumab.
En un aspecto adicional, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprende cualquiera de los anticuerpos anti-CD3 de la invención, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los métodos terapéuticos anteriores. En una realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-CD3 de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-CD3 de la invención y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe en el presente documento.
Los anticuerpos de la invención pueden usarse o bien solos o en combinación con otros agentes en una terapia. Por ejemplo, puede coadministrarse un anticuerpo de la invención con al menos un agente terapéutico adicional. En ciertas realizaciones, un agente terapéutico adicional es un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor del crecimiento, un agente citotóxico, un agente usado en radioterapia, un agente antiangiogénico, un agente apoptótico, un agente antitubulina u otro agente, tal como un antagonista del receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (por ejemplo, un inhibidor de tirosina cinasa), un inhibidor de HER1/EGFR (por ejemplo, erlotinib (Tarceva™), inhibidor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (por ejemplo, Gleevec™ (Imatinib mesilato)), un inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib), un interferón, una citocina, un anticuerpo distinto del anticuerpo anti-CD3 de la invención, tal como un anticuerpo que se une a una o más de las siguientes dianas, ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BlyS, APRIL, BCMA VEGF o receptores de VEGF, TRAIL/Apo2, PD-1, PD-L1, PD-L2 u otro agente bioactivo o químico orgánico.
En algunas realizaciones, la invención posibilita el uso en un método en donde el agente terapéutico adicional es un glucocorticoide. En una realización, el glucocorticoide es dexametasona.
Dichas terapias combinadas indicadas anteriormente abarcan la administración combinada (donde se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma formulación o en formulaciones separadas) y la administración por separado, en cuyo caso, la administración del anticuerpo de la invención puede producirse antes de, de manera simultánea y/o después de, la administración del agente o los agentes terapéuticos adicionales. En una realización, la administración del anticuerpo anti-CD3 y la administración de un agente terapéutico adicional se producen en aproximadamente un mes o en aproximadamente una, dos o tres semanas o en aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis días, entre sí. Los anticuerpos anti-CD3 de la invención (por ejemplo, anticuerpos anti-CD3 biespecíficos de la invención que se unen a CD3 y HER2, tal como un anticuerpo TDB de la invención) también pueden usarse en combinación con radioterapia.
Un anticuerpo de la invención (y/o cualquier agente terapéutico adicional) para su uso en un método de terapia puede administrarse por cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para un tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. En algunos casos, el anticuerpo se administra mediante administración subcutánea. En algunos casos, un anticuerpo anti-CD3 administrado por inyección subcutánea muestra una respuesta menos tóxica en un paciente que el mismo anticuerpo anti-CD3 administrado por inyección intravenosa. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, mediante inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. Se contemplan en el presente documento varias pautas posológicas que incluyen, pero sin limitación administraciones individuales o múltiples a lo largo de varios puntos de tiempo, administración embolada e infusión pulsada.
Los anticuerpos de la invención pueden formularse, dosificarse y administrarse de una manera consistente con la buena práctica médica. Los factores a tener en cuenta en este contexto incluyen el trastorno particular que se va a tratar, el mamífero particular que se va a tratar, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, la pauta de administración y otros factores conocidos por los profesionales sanitarios. Aunque no es necesario, el anticuerpo se formula opcionalmente con uno o más agentes usados en la actualidad para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores descritos anteriormente. Estos se usan generalmente con las mismas dosis y por rutas de administración como las descritas en el presente documento o de aproximadamente el 1 al 99 % de las dosis descritas en el presente documento o en cualquier dosis y por cualquier vía que se haya determinado empíricamente/clínicamente como adecuada.
Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosis adecuada de un anticuerpo de la invención (cuando se usa solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales diferentes) dependerá del tipo de enfermedad que se vaya a tratar, el tipo de anticuerpo, la gravedad y la evolución de la enfermedad, de si el anticuerpo se administra con fines preventivos o terapéuticos, de la terapia previa, de la historia clínica del paciente y de la respuesta al anticuerpo y del criterio del médico responsable. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente una vez o en una serie de tratamientos.
Como regla general, la cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD3 administrado al ser humano se encontrará en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100mg/kg de peso corporal del paciente mediante una o más administraciones. En algunas realizaciones, el anticuerpo se usa a de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 25 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 15 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 mg/kg o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1 mg/kg administrado a diario, por ejemplo. En una realización, un anticuerpo anti-CD3 descrito en el presente documento se administra a un ser humano a una dosis de aproximadamente 100 mg, aproximadamente 200 mg, aproximadamente 300 mg, aproximadamente 400 mg, aproximadamente 500 mg, aproximadamente 600 mg, aproximadamente 700 mg, aproximadamente 800 mg, aproximadamente 900 mg, aproximadamente 1000 mg, aproximadamente 1100 mg, aproximadamente 1200 mg, aproximadamente 1300 mg o aproximadamente 1400 mg en el día 1 de ciclos de 21 días. La dosis puede administrarse como una sola dosis o como múltiples dosis (por ejemplo, 2 o 3 dosis), tales como infusiones. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o un periodo mayor, dependiendo de la afección, se continuará generalmente el tratamiento hasta que suceda una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Una dosis a modo de ejemplo del anticuerpo se encontrará en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Por tanto, pueden administrarse una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas) al paciente. Dichas dosis pueden administrarse de manera intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de tal forma que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte o, por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo anti-CD3). Puede administrarse una dosis de carga inicial superior, seguida de una o más dosis inferiores. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.
En algunos casos, los métodos pueden comprender además una terapia adicional. La terapia adicional puede ser radioterapia, cirugía, quimioterapia, terapia génica, terapia de ADN, terapia vírica, terapia de ARN, inmunoterapia, trasplante de médula ósea, nanoterapia, terapia con anticuerpos monoclonales o una combinación de los anteriores. La terapia adicional puede ser en forma de una terapia adyuvante o neoadyuvante. En algunos casos, la terapia adicional es la administración de inhibidor enzimático de molécula pequeña o un agente antimestastásico. En algunos casos, la terapia adicional es la administración de agentes limitadores de los efectos secundarios (por ejemplo, agentes pensados para aminorar la aparición y/o gravedad de los efectos secundarios del tratamiento, tales agentes contra las náuseas, etc.). En algunos casos, la terapia adicional es radioterapia. En algunos casos, la terapia adicional es cirugía. En algunos casos, la terapia adicional es una combinación de radioterapia y cirugía. En algunos casos, la terapia adicional es irradiación gamma. En algunos casos, la terapia adicional puede ser una administración separada de uno o más de los agentes terapéuticos descritos anteriormente.
H. Artículos de fabricación
En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, la prevención y/o el diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un envase y una etiqueta o prospecto sobre o asociado al envase. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, bolsas de solución IV, etc. Los recipientes pueden formarse a partir de diversos materiales tales como vidrio o plástico. El envase contiene una composición que está sola o combinada con otra composición eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la invención. La etiqueta o prospecto indica que la composición se usa para tratar la dolencia de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer envase con una composición contenida en este, en donde la composición comprende un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo envase con una composición contenida en este, en donde la composición comprende un agente citotóxico o de otro modo terapéutico adicional. El artículo de fabricación en esta realización de la invención puede comprender adicionalmente un prospecto que indica que las composiciones pueden usarse para tratar una afección concreta. Como alternativa o además, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) envase que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI, por sus siglas en inglés), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
111. Ejemplos
Lo siguiente son ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Se entiende que pueden ponerse en práctica varias realizaciones diferentes, dada la descripción general proporcionada anteriormente.
Ejemplo 1. Generación de anticuerpos anti-CD3
Antígenos CD3c
A. CD3e CD3y humano y de cino biespecífico fusionado a IgG2a-Fc de ratón (CD3£Y-muFc)
Se fusionó ADNc que codifica porciones extracelulares de CD3e o CD3y de ser humano o de mono cinomolgo (cino) en el extremo C-terminal a un Fc de IgG2a de ratón para generar fusiones de CD3-Fc. Los ADNc que codifican los dominios extracelulares de CD3e y CD3y de ser humano y de cino se generaron usando ARN total de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) activadas anti-CD3/anti-CD28. Se activaron PBMC normales mediante anti-CD3 y anti-CD28 inmovilizado en placa en RPMI suplementado con FBS al 10 % durante 72 h. El ARNm total se aisló usando un kit RNeasy mini de Qiagen. El ADNc se clonó usando cebadores para genes específicos mediante RT-PCR en vectores TOPO usando productos de la PCR amplificados con polimerasa Taq siguiendo el protocolo proporcionado con el kit de clonación TOPO TA de Invitrogen. Los fragmentos resultantes se introdujeron en un vector de expresión de mamífero que contenía un dominio de Fc de IgG2a mediante subclonación sin restricción usando ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (New England Biolabs, n.° de catálogo M0530L). De este modo, se amplificaron los fragmentos de CD3 con regiones solapantes contenidas en el plásmido molde para orientarlos directamente cadena debajo de la secuencia de señal y en N-terminal respecto del Fc murino.
Para las construcciones tanto humanas como de cino, el plásmido que contenía CD3£-Fc se coexpresó transitoriamente con el plásmido que contenía CD3y-Fc en células de mamífero CHO. Los heterodímeros de CD3e/y se purificaron mediante Proteína A-Sefarosa (Pharmacia Biotech).
B. Conjugados de péptido N-terminal-KLH (CD3e-KLH)
Se sintetizaron fragmentos peptídicos que contenían secuencias N-terminales de CD3e de cino y de ser humano. Los fragmentos pensados para inmunización se conjugaron a hemocianinas de lapa californiana (KLH), una proteína portadora ampliamente usada para generar una respuesta inmunitaria sustancial. El saliente de la cisteína de origen natural en la posición 28 para CD3e de cino y de humano permitió el acoplamiento de KLH activada por maleimida a la cisteína C-terminal que contiene tiol.
C. CD3e-26mero-CD3Y (CD3sy) monocatenario
Se generaron mediante la PCR los ADNc que codificaban porciones extracelulares de subunidades de CD3e y CD3y humanas. Se conectaron los aminoácidos 1-97 de CD3e humano y los aminoácidos 1-81 de CD3y humano usando un enlazador peptídico flexible de 26 aminoácidos para formar una construcción de CD3£-26mero-CD3Y (CD3ey) (figura 1). La construcción se clonó en un vector de expresión con un marcador de His para su secreción por E. coli usando el promotor de fosfatasa alcalina y la secuencia de señal de secreción STIII. Se purificó CD3ey en una columna de Ni y posteriormente se volvió a plegar. Posteriormente, se purificó CD3ey adecuadamente legado usando una columna de afinidad OKT3.
Además, para algunos experimentos de unión, se adquirió CD3e comercial de Creative Biomart, Shirley, Nueva York 11967 (Número de catálogo CD3E-2194H).
Inmunizaciones
A. Inmunizaciones de ratón
Se inmunizaron ratones BALB/c o C57BL/6 (2 |jg o 10 jg/inyección por ratón). Los antígenos, suspendidos en adyuvante de lípido A de monofosforilo/dicorinomicolato de trehalosa, se inyectaron en la almohadilla plantar a intervalos de 3 a 4 días hasta un total de 12-15 refuerzos. Tres días después del último refuerzo previo a la infusión, se recogieron linfocitos de bazos y ganglios linfáticos de ratones inmunizados. Los linfocitos de ratón aislados se fusionaron con células de mieloma SP2/0-Ag14 (Colección Americana de Cultivos Tipo) usando el aparato Cyto Pulse CEEF-50 (Cyto Pulse Sciences). En resumen, después de lavar dos veces con el medio Cytofusion C (n.° de cat. LCM-C), se mezclaron las células de bazo aisladas y las células SP2/0-Ag14 a una relación 1:1 y después se suspendieron a razón de 10 millones de células/ml en medio Cytofusion C, la electrofusión se llevó a cabo de acuerdo con las guías del fabricante. Las células fusionadas se cultivaron en medio ClonaCell-HY C (n.° de cat. 03803) durante una noche en una estufa de incubación a 37 °C con CO2 al 7 %. Al día siguiente, se centrifugaron las células fusionadas y después se suspendieron en 10 ml de medio ClonaCell-HY C y después se mezclaron cuidadosamente con 90 ml de medio ClonaCell-HY D a base de metilcelulosa (n.° de cat. 03804) que contenía componentes de HAT. Las células se sembraron en placas OmniTray (Thermo Scientific) y se dejaron crecer en una estufa de incubación a 37 °C con CO2 al 7 %. Después de 6-7 días de incubación, se recogieron clones de hibridoma individuales mediante ClonePiz FL (Molecular Devices) y se transfirieron a placas de cultivo celular de 96 pocillos (n.° 353075, Becton Dickinson) con 200 j l/pocillo de medio ClonaCell-HY E (n.° de cat. 03805). Los medios de cultivo de hibridoma se cambiaron antes de la detección sistemática por ELISA.
B. Inmunizaciones de conejos
Se llevaron a cabo inmunizaciones de conejo usando 0,5 mg/inyección de CD3e-KLH de ser humano y de cino con CFA/IFA cada 2 semanas durante 5 inyecciones (d0, d14, d28, d42, d56). Se tomaron muestra de sangre en los días 52 y 66.
Las fusiones con PEG y la detección sistemática se llevaron a cabo como se expone a continuación. Los clones se sometieron a detección sistemática de la unión a la porción N-terminal de CD3e conjugado a tiroglobulina (THY) mediante ELISA. Se observó que todos los clones positivos reaccionaban de manera cruzada con CD3e de cino mediante ELISA y se seleccionaron 16 clones únicos para subclonación. El ARN total se extrajo de sedimentos celulares congelados y se purificó usando un kit Qiagen RNeasy siguiendo las instrucciones del fabricante. Se sintetizó la primera hebra de ADNc usando RT-PCR en una etapa (Qiagen). Los dominios VH y VL de conejo se amplificaron adicionalmente mediante la PCR usando un protocolo descrito para generar bibliotecas inmunitarias de conejo (Kontermann y Dubel. Antibody Engineering. 1: 115-123, 2010). Se diseñó una degeneración moderada para representar los genes de inmunoglobulina de línea germinal de conejo.
Detección sistemática de anticuerpos
A. Detección sistemática de hibridoma de ratón
3 días después del cambio de medio, los sobrenadantes de hibridoma se sometieron a detección sistemática mediante ELISA para la unión a CD3e tanto humano como de cino, como se describe a continuación. Todos los clones positivos para ELISA se sometieron adicionalmente a detección sistemática mediante citometría de flujo para la unión a linfocitos T Jurkat humanos, a PBMC humanas y a PBMC de cino (figuras 2 y 3). Los sobrenadantes de hibridoma se purificaron mediante cromatografía de afinidad de proteína A, después se esterilizaron por filtración (tamaño de poro de 0,2 jm , Nalge Nunc International, NY, EE. UU.) y se almacenaron a 4 °C en PBS. Los mAb purificados se confirmaron mediante ELISA antes de evaluarlos adicionalmente en ensayos funcionales. El isotipo del mAb se determinó usando un kit de isotipado de anticuerpos monoclonales de ratón de Roche Diagnostics Corporation.
En la figura 4A se muestran las secuencias de aminoácidos de los dominios variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos anti-CD3 13A3, 72H6 y 19B1. La figura 4A también delimita las secuencias de HVR para cada uno de los tres anticuerpos. Las figuras 4B, 4C, 5A y 5B muestran secuencias de aminoácidos adicionales de los dominios variables de cadena ligera y pesada de los otros anticuerpos anti-CD3.
B. Detección sistemática después de las inmunizaciones de conejo
Se clonaron ocho secuencias únicas de cadena pesada y seis secuencias únicas de cadena ligera de las líneas celulares de hibridoma. La figura 7 muestra las secuencias de cadena pesada y de cadena ligera para uno de estos anticuerpos, Rab17. La alta similitud de secuencia hizo que se tomase la decisión de centrarse en 6 pares de cadena pesada y ligera. Los 6 anticuerpos resultantes se expresaron como IgG quiméricas de conejo/humano a pequeña escala (cultivos de 100 ml de 293S) y se sometieron a detección sistemática de la unión a CD3 épsilon mediante ELISA.
Caracterización de anticuerpos - Ensayos de afinidad de unión y de actividad de activación de linfocitos T
A. Ensayo de ELISA de unión a CD3ey
El ensayo de ELISA de unión a CD3ey se llevó a cabo en placas ELISA de microtitulación de 96 pocilios (Greiner, Alemania) recubiertas con los aminoácidos N-terminales de CD3e de humano/cino conjugados a THY o de CD3e/y de humano/cino fusionados a Fc murino a 2 pg/ml en tampón carbonato 0,05 M (pH 9,6), 4 °C durante una noche. Después de lavar tres veces con tampón de lavado (Tween 20 al 0,05 % en PBS), las placas se bloquearon con 200 pl de diluyentes de ensayo ELISA con BSA. Se añadieron 100 pl de sobrenadantes de cultivo o mAb purificados diluidos y se incubaron durante 1h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces y se incubaron con anticuerpo de cabra anti-Fc de IgG de ratón conjugado con HRP durante 1 hora. Después de lavar tres veces, la enzima unida se detectó mediante la adición de 100 pl/pocillo de sustrato TMB (BioFX Laboratories, MD, EE. UU.) durante 5 min. Las reacciones se detuvieron añadiendo 100 pl/pocillo de reactivo de paro (BioFX, Laboratories, MD, EE. UU.) y detección de color a A630 nm.
B. Análisis por citometría de flujo
Se lavaron dos veces linfocitos T Jurkat, PBMC humanas o PBMC de cino con tampón de tinción de FACS (suero salino tamponado con fosfato que contenía suero fetal bovino al 1 %) y después se suspendieron en tampón de tinción de FACS a una concentración final de 5 x 106 células/ml. Se añadieron 100 pl de células a una placa de cultivo tisular de 96 pocillos de fondo en U (n.° 353077, Becton Dickinson) y se añadieron 100 pl de sobrenadantes de hibridoma o de mAb purificados diluidos. Después de 30 min de incubación sobre hielo, se lavaron las células dos veces con tampón de tinción de FACS y posteriormente se tiñeron con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con FITC o aloficocianina (APC) (n.° 1012-11, Southern Biotech) a una dilución 1:300 durante 30 min. Después de lavar dos veces con tampón de tinción de FACS, se analizaron las células con un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences). Los datos se analizaron usando el programa informático FlowJo (Tree Star, Inc.).
C. Ensayo de activación de linfocitos T humanos
Se recogió sangre humana en jeringas heparinizadas y las PBMC se aislaron usando Leucosep (Greiner Bioone, n.° de cat. 227290P) y Ficoll Paque Plus (GE Healthcare Biosciences, n.° de cat.95038-168), como se recomienda por el fabricante. Las células se lavaron en medio RPMI que contenía FBS al 10 %, suplementado con GlutaMax (Gibco, n.° de cat. 35050-061), penicilina y estreptomicina (Gibco, n.° de cat. 15140-122) y se añadieron ~0,2 millones de células en suspensión a una placa de 96 pocillos de fondo en U. Se añadieron anticuerpos anti-CD3 a entre 10 y 0,01 pg/ml. Después de cultivar durante ~20 horas, las células se lavaron con tampón de FACS (BSA al 0,5 %, azida de Na al 0,05 % en PBS). Después, se tiñeron las células con anti-CD69-FITC (BD, n.° de cat. 555530), anti-CD25-PE (BD, n.° de cat. 555432) anti-CD4-APC (BD, n.° de cat. 555349) o anti-CD8-APC (BD, n.° de cat.555369) en tampón de FACS, se lavaron con tampón de FACS y se suspendieron en 100 pl de tampón de FACS que contenía 1 pg/ml de yoduro de propidio. Los datos se recogieron en un citómetro de flujo FACSCalibur y se analizaron usando FlowJo. Se determinó el alcance de la activación de linfocitos T en comparación con el porcentaje de la población CD69+ y CD25+ en los linfocitos T CD4+ y CD8+.
D. Ensayo de activación de linfocitos T de cino
Se recogió sangre de cino en tubos heparinizados. Los glóbulos rojos se lisaron dos veces con tampón de lisis de glóbulos rojos sanguíneos ACK (NH4Cl al 0,874 %, KHCO3 al 0,1 %, EDTA disódico 0,00368). Las células se lavaron en medio RPMI que contenía FBS al 10 %, suplementado con GlutaMax (Gibco, n.° de cat. 35050-061), penicilina y estreptomicina (Gibco, n.° de cat. 15140-122) y se añadieron ~0,2 millones de células en suspensión a una placa de 96 pocillos de fondo en U. Se añadieron anticuerpos anti-CD3 a 10 pg/ml. Después de cultivar durante ~20 horas, las células se lavaron con tampón de FACS (BSA al 0,5 %, azida de Na al 0,05 % en PBS). Después, se tiñeron las células con anti-CD69-FITC (BD, n.° de cat. 555530), anti-CD25-PE (BD, n.° de cat. 555432) anti-CD4-APC (BD, n.° de cat.
551980) en tampón de FACS, se lavaron con tampón de FACS y se suspendieron en 100 pg de tampón de FACS que contenía 1 pg/ml de yoduro de propidio. Los datos se recogieron en un citómetro de flujo FACSCalibur y se analizaron usando FlowJo. Se determinó el alcance de activación de linfocitos T comparando el porcentaje de población CD69+ y CD25+ en los linfocitos T CD4+.
Generación de variantes de anticuerpo anti-CD3
A. Clonación y secuenciación de hibridomas con reactividad cruzada con CD3ey de humano/cino
Se extrajo el ARN total de células de hibridoma de ratón con el kit RNeasy (Qiagen) y se sintetizó la primera de ADNc usando un kit de RT SuperScript III (Invitrogen). Los genes de anticuerpo se amplificaron mediante p Cr de polimerasa Taq a prueba de errores con una mezcla de cebadores 5' degenerados y cebadores específicos para 3' Cy, Ck, CA. Los productos de la PCR se purificaron y se obtuvieron las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo secuenciando el producto de la PCR. Se digirieron las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo con enzimas de restricción adecuadas y se clonaron en los respectivos vectores de expresión pRK. Los anticuerpos murinos se expresaron en células 293.
B. Humanización
Se alinearon secuencias de hibridomas con reactividad cruzada con CD3ey de humano/cino con los dominios variables de cadena ligera y pesada consenso o de línea germinal más homólogos (figura 7). Una secuencia consenso denominada mu40G5c se obtuvo de dominios variables de cadena ligera y pesada de clones de hibridoma relacionados (figura 7). Las regiones hipervariables (HVR) se introdujeron por ingeniería genética en marcos aceptores de cadena ligera y pesada humana para generar injertos de CDR humanizados (véanse, por ejemplo, las figuras 8A-8F). Las variantes humanizadas se evaluaron en forma de fragmentos Fab o como IgG. Las posiciones del dominio VL 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) y las posiciones del dominio VH 26-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) se usaron para los injertos (figuras 8A-8F). También se generaron variantes adicionales que incluían varias combinaciones de una o más posiciones de Vernier de ratón y se evaluó su afinidad de unión (véanse, por ejemplo, las figuras 9A-9F). Los restos de dominio variable murino en posiciones de Vernier seleccionados se incorporaron en una secuencia humanizada final basándose en su capacidad para mejorar la afinidad de unión. Las afinidades de unión monovalente para anticuerpos humanizados seleccionados por diferentes antígenos CD3e se muestran en la figura 10. Las afinidades de unión para las variantes de afinidad del anticuerpo anti-CD3 humanizado 38E4 (38E4v1-38E4v9) y 40G5c se muestran en la figura 11.
C. Mapeo de parátopos
Se mutó cada resto en HVR-L3 y HVR-H3 de hu38E4 por separado a alanina usando mutagénesis de Kunkle. Además, la posición 95 en HVR-H3 también se mutó a serina, treonina o glutamato. Las variantes con estas mutaciones puntuales se expresaron como Fab en células HEK293 y se sometieron a detección sistemática inicialmente con un método cinético de un solo ciclo en un dispositivo Biacore T100. También se aumentó la escala de variantes seleccionadas y se purificaron para un método cinético multiciclo convencional. Para la cinética de un solo ciclo, se inmovilizaron microplacas sensoras CM5 serie S de Biacore con anticuerpos anti-Fab humano (kit de captura de Fab humano, GE Healthcare). Cada Fab se capturó del sobrenadante de cultivo y se inyectaron concentraciones crecientes (en el intervalo de 3 nM a 250 nM en tampón HSBP) de CD3ey humano secuencialmente a un caudal de 30 pl/min en un solo ciclo de análisis sin regeneración de la superficie entre inyecciones; se adquirieron 10 min de disociación por cada ciclo. Para la cinética convencional multiciclo, se inmovilizaron CD3ey humano, CD3ey de cino o un péptido 27 mero sobre una microplaca sensora CM5 de serie S de Biacore usando el kit de acoplamiento de amina de Biacore. Se inyectaron diluciones seriadas de factor 3 de cada variante Fab a un caudal de 30 pl/min. Cada muestra se analizó con un protocolo de 3 minutos de asociación y 3 minutos de disociación. En ambos métodos, las microplacas de Biacore se regeneraron usando glicina 10 mM (pH 1,7). La respuesta de unión se corrigió restando el blanco y se usó un modelo 1:1 de Langmuir de ajuste simultáneo de kon y koff para el análisis cinético. Los efectos de estas mutaciones, resumidos en la figura 12, indican que el resto R96 de cadena ligera y los restos de cadena pesada Y97, R99 y F100b desempeñan papeles críticos en la unión a CD3ey.
D. Mapeo de epítopos de CD3
Se introdujeron mutaciones de alanina en CD3e1'27-Fc para evaluar el reconocimiento de epítopos de anticuerpos anti-CD3e unidos en N-terminal. Cada variante CD3e1'27-Fc se inmovilizó sobre placas Nunc Maxisorp durante una noche en PBS a 2 pg/ml a 4 °C. Después de bloquear las placas con leche en polvo al 2 % en PBS que contenía Tween 20 al 0,05 % durante 1 h, se añadieron 100 pl de anti-CD3£ 3 nM a cada pocillo y se dejaron unir durante 1h a 25 °C. Después de 6 lavados con PBS que contenía Tween 20 al 0,05 %, se detectó la unión de anticuerpo mediante la adición de anticuerpo secundario anti-IgG de ratón-HRP, como se representa en la figura 13A.
Se subclonó CD3ey en un fagémido M13 que contiene un marcador gD C-terminal seguido de un codón de parada amber, de tal forma que puede mostrarse sobre un fago o expresarse en una cepa no supresora de E. coli. Este fagémido de CD3ey se usó como molde para producir mutaciones individuales de alanina en CD3e mediante mutagénesis de Kunkel. Cada mutante de alanina de CD3e presentado sobre fago, se confirmó mediante secuenciación de ADN, se aisló de una sola colonia, se cultivó durante una noche en 2YT/Carb más fago auxiliar KO7 y se purificó mediante precipitación con PEG. El efecto de la mutación de alanina en CD3ey en la unión del anticuerpo anti-CD3 se evaluó usando un ELISA para fago. Cada anticuerpo anti-CD3 se inmovilizó sobre una placa NUNc maxisorp a 2 pg/ml en tampón PBS durante una noche a 4 °C. El sobrenadante de fago purificado que mostraba una variante de alanina de CD3ey (DO450 de 1,0) se añadió a la placa y se dejó unir a temperatura ambiente con agitación durante 1 h. Después del lavado, el fago unido se detectó con anti-M13-HRP (GE Healthcare, n.° de cat. 45-001-419). La unión de cada variante de alanina de CD3ey se comparó con la unión a fago de CD3ey de tipo silvestre (figura 13B). Las variantes de alanina que tuvieron impacto en la unión del anticuerpo anti-CD3, se caracterizaron adicionalmente evaluando la unión en función de la concentración de fago (figura 13C).
Para cuantificar el impacto de mutaciones de alanina en CD3 en la unión del anticuerpo, se expresaron mutantes de alanina de CD3 seleccionados en una cepa no supresora de E. coli. Las variantes de CD3ey secretadas se capturaron de la fracción periplásmica en bruto usando el anticuerpo anti-CD3 UCHT1v9. Se inmovilizó UCHT1v9 sobre una microplaca sensora CM5 serie S mediante acoplamiento de amina usando el kit de captura de anticuerpo anti-IgG humana (Fc) (BR-1008-39) de GE Healthcare. Las mediciones de SPR se llevaron a cabo en el instrumento Biacore 4000, utilizando el programa informático de evaluación cinética. Para medir las afinidades de unión monovalentes, se usaron anticuerpos anti-CD3 biespecíficos en los que un brazo era el anti-CD3 a ensayar y el otro brazo reconocía un antígeno irrelevante. Los anticuerpos anti-CD3 biespecíficos se pasaron sobre el sobrenadante capturado en una serie de concentraciones de diluciones de factor dos de 0,39 a 100 nM. Las cinéticas resultantes (figura 13D) se midieron y calcularon usando el programa informático Biacore 4000 BIAevaluation (código de producto 28-9664-57).
E. Mapeo estructural del sitio de unión de CD3c
1. Fab Hu38E4.v1
Fab Hu38E4.v1, disuelto en NaCl 0,15 M, Tris 25 mM, pH 7,5 a 10 mg/ml y un exceso molar de factor 2 (1 mg) de péptido CD3e, QDGNEEMGGITQTPYK (SEQ ID NO: 284) (figura 14A), se mezclaron y se sometieron a ensayos de cristalización. La detección sistemática inicial se efectuó con una matriz dispersa de precipitantes en un formato de difusión de vapor de gota sedente. Los cristales optimizados crecieron a partir de una mezcla 1:1 con una solución de depósito que contenía un 70 % v/v de metil-pentanodiol y tampón HEPEs 0,1 M a pH 7,5. El depósito se usó como crioprotector. Los cristales se transfirieron a temperatura criogénica mediante inmersión rápida en nitrógeno líquido.
Los datos de difracción para el cocristal de Fab hu38E4.v1 y péptido CD3e se recogieron en un dispositivo de línea de haz de fuente de fotones avanzada 22ID, usando un detector CCD MAR300. Después, las difracciones registradas se integraron y escalaron usando el programa HKL2000.
La estructura se organizó mediante un método de reemplazo molecular (MR) usando el programa Phaser. El modelo de búsqueda de MR fue una subunidad de Fab procedente de una estructura cristalina del complejo de HGFA/Fab (código de PDB: 2R0L). El péptido de CD3e se incorporó en la estructura basándose en un mapa de Fo-Fc. Posteriormente, se refinó la estructura con los programas REFMAC5 y PHENIX usando las funciones diana de máxima probabilidad, el método de refinado de factor B individual anisotrópico y el método de refinado de TLS, para lograr la convergencia. Los datos y las estadísticas de refinado se muestran en la tabla 3A.
TABLA A. R i í i r fin r l m l h E4.v1 D
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La estructura cristalina del complejo de Fab hu38E4.v1/péptido de CD3e se determinó a una resolución de 1,9Á. La estructura reveló que el péptido CD3e produce un pequeño giro y se inserta profundamente entre el surco entre las cadenas pesada y ligera del Fab 38E4.v1 (figuras 14B y 14C). La unión entierra 666 Á2 de área superficial accesible al disolvente entre el péptido y el fragmento Fab e implica una compleja red de interacciones hidrófobas, de unión a hidrógeno e iónicas (figura 14D). El anillo de piroglutamato (piroglu) N-terminal se empaqueta contra Tyr33 de la cadena pesada y forma un enlace de hidrógeno con His35 de cadena pesada en la HVR-H1. La cadena lateral voluminosa del resto F100b en la HVR-H3 empuja la His35 en una orientación adecuada para su interacción con piroglu y explica la pérdida de unión observada cuando se muta F100b a alanina, un resto con cadena lateral pequeña. Además, de manera consistente con los resultados de barrido de alanina, R96 en la CDR-L3 produce un enlace de hidrógeno crítico con el grupo carboxilo en el piroglu, mientras que Y97 en la CDR-H3 produce un enlace de hidrógeno con Met7 del péptido CD3e (figura 14E). De manera interesante, aunque la sustitución por alanina en R99 en la CDR-H3 tiene un efecto dramático en la unión al antígeno, la estructura revela que esta cadena lateral está orientada hacia fuera del péptido CD3e y no implica ninguna interacción con el péptido. En cambio, R99 efectúa contactos extensos con varios restos en la CDR-H3, incluyendo un enlace de hidrógeno con D101 y empaquetado hidrófobo contra Y100a, que tiene impacto adicional en el resto de Vernier, LC Y49 (figura 14F). Probablemente, estas interacciones son importantes para el soporte y la disposición general de los bucles de CDR en el Fab 38E4.v1 organizando el surco central crítico entre las cadenas pesada y ligera para posibilitar la unión al péptido CD3e.
La FIGURA 14G identifica todos los restos del Fab 38E4.v1 que se determinó que residen a 5 A del péptido CD3e. Estos restos de contacto con el antígeno son idénticos entre hu38E4.v1 y hu40G5c, excepto por que el resto G96 de hu38E4.v1 es un resto de serina (S96) en hu40G5 (véase la figura 14H, que representa la ubicación del resto de contacto G96 de hu38E4.v1).
Los contactos entre el anti-CD3 (38E4.v1) y el péptido CD3ey se calcularon basándose en el barrido de alanina. Los epítopos reconocidos por el anti-CD338E4v1 son contactos con una distancia de 3,5 Angstrom o más corta, como se proporciona en la tabla 3B a continuación. A partir de este análisis, se observó que los epítopos de CD3 Gln1 (PCA1, ácido piroglutámico), Asp2, Glu6 y Met7 eran restos formadores de contactos importantes con los parátopos de la cadena ligera y las regiones variables de cadena pesada del anticuerpo para CD3.
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continuación
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*Representa enlace de hidrógeno entre dos cadenas laterales.
Las celdas sombreadas en gris representan contactos de enlace de hidrógeno fiables.
Los contactos en negrita son enlaces de hidrógeno formados entre cadenas laterales y armazones de cadena principal.
2. Fab SP34v52
Se disolvió el Fab SP34v52 en NaCI 0,25 M, MES 25 mM a pH 5,5 a 10mg/ml. La detección sistemática de cristalización inicial se efectuó con una detección sistemática de matriz dispersa (PEGII, Qiagen) en un formato de difusión de vapor de gota sedente. Se encontró un acierto de cristalización en una gota con el depósito que contenía CaCl20,2 M, HEPES 0,1 M a pH 7,5, y PEG 4000 al 30 % p/v. Los cristales optimizados crecieron a partir de una mezcla de 2 pl de proteína y 2 pl de solución de depósito que contenía PEG 3350 al 20-23 % p/v, HEPES 0,1 M a pH 7,2, CaCl20,1 M. Se usó el método de difusión de vapor de gota colgante y la gota de cristalización final se incubó a 18 °C.
Se recogieron los datos de difracción para el Fab SP34v52 en la línea 12-2 de haz de fuente de luz del sincrotrón de Stanford, usando un detector PILATUS. Las difracciones registradas se integraron posteriormente usando el programa XDS y se escalaron usando el programa SCALA. La estructura se organizó mediante un método de reemplazo molecular (MR) usando el programa Phaser. El modelo de búsqueda de MR fue una subunidad de Fab procedente de una estructura cristalina del complejo de HGFA/Fab (código de PDB: 2R0L). El péptido de CD3e se incorporó en la estructura basándose en un mapa de Fo-Fc. Posteriormente, se refinó la estructura con los programas REFMAC5 y PHENIX usando las funciones diana de máxima probabilidad, el método de refinado de factor B individual anisotrópico y el método de refinado de TLS, para lograr la convergencia. Los datos y las estadísticas de refinado se muestran en la tabla 4 a continuación.
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En las figuras 14I -14L, se compararon las estructuras cristalinas de los Fab hu38E4.v1 y SP34v52 en la misma orientación. Cuando se superpuso el péptido de CD3e sobre el Fab SP34v52 con la misma orientación que en el hu38E4.v1, se observaron choques evidentes del péptido con SP34v52 (figura 14L). Los restos de HVR-H2 R50 y R52 de SP34v52, que no estaban presentes ni en hu38E4.v1 ni en hu40G5c, se observó que eran importantes para la unión de CD3 con SP34v52 (figura 14L). Estos datos demuestran que hu38E4.v1 y hu40G5c se unen a CD3 de un modo distinto al de SP34v52.
La estructura cristalina de hu38E4.v1 en complejo con el péptido N-terminal de CD3ey se ilustra en las figuras 14M y 14N. La figura 14M proporciona una vista ampliada de las interacciones intermoleculares clave implicadas en el contacto con el sexto resto en CD3EY. En una vista ampliada, la figura 14N representa un modelo de relleno de espacio del complejo de Fab/péptido de CD3, donde el quinto resto está apuntando completamente hacia fuera del sitio de interacción. El sexto resto, como se muestra, está implicado en las interacciones con el Fab y apunta hacia el sitio activo.
Ejemplo 2. Generación y selección de anticuerpos biespecíficos dependientes de linfocitos T (TDB)
Una estrategia para abordar el alto potencial citotóxico de los linfocitos T a la hora de erradicar células tumorales ha sido el uso de anticuerpos biespecíficos dependientes de linfocitos T (TDB). Se han comunicado respuestas clínicas prometedoras con moléculas tales como blinatumomab dirigido a linfocitos B, el anticuerpo BiTE biespecífico para CD19/CD3. Sin embargo, el potencial terapéutico de muchas modalidades de anticuerpo biespecífico comunicadas se ha visto limitado por problemas que incluyen una farmacocinética (PK) desfavorable, toxicidad y/o problemas de producción. Por consiguiente, los presentes inventores generaron y caracterizaron inicialmente anticuerpos TDB anti-CD3 que tienen diversas combinaciones de brazos anti-CD3 y de antígeno antitumoral (por ejemplo, anti-CD20, anti-FcRH5, anti-HER2, anti-LYPDI, anti-LY6E, anti-LY6G6D, anti-PMEL17, anti-CD19, anti-CD22, anti-CD33, anti-CD79A, anti-CD79B, anti-EDAR, anti-GFRAI, anti-MRP4, anti-RET, anti-Steapl, anti-TenB2), producidos como anticuerpos de longitud completa en el formato de botón en ojal. Inesperadamente, los presentes inventores observaron que combinaciones particulares (pares) de brazos anti-CD3 y anti-antígeno tumoral dieron como resultado TDB que mostraban actividad favorable con respecto a otros TDB.
Los anticuerpos TDB se produjeron como anticuerpos de longitud completa en el formato de botón en ojal en forma de una IgG1 humana, como se ha descrito anteriormente (Atwell et al. J. Mol. Biol. 270: 26-35, 1997). Los medios anticuerpos se expresaron o bien en E. coli o en células de ovario de hámster chino (CHO), se purificaron mediante cromatografía de afinidad de proteína A y se hibridaron los pares de medios anticuerpos adecuados in vitro como se ha descrito anteriormente (Spiess et al., Nat. Biotechnol. 2013). En caso de llevarse a cabo la producción del anticuerpo TDB en células CHO, el anticuerpo puede incluir una mutación de aglucosilación, por ejemplo, en el resto N297 (por ejemplo, N297G), de tal forma que el anticuerpo TDB era una variante sin función efectora y era incapaz de iniciar la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC). La figura 15 muestra una descripción general esquemática de la producción del TDB para CD3/CD20.
Después de la hibridación, los TDB para CD3/CD20 se purificaron mediante cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) y se caracterizaron mediante filtración en gel analítica, espectrometría de masas y electroforesis en gel de poliacrilamida. Los anticuerpos purificados corrieron como un solo pico (>99 % de la señal) en la filtración en gel con menos de un 0,2 % de agregados. No se detectaron homodímeros mediante espectrometría de masas. Los brazos de anti-CD20 evaluados en la generación de los TDB para CD3/CD20 incluyeron 2h 7v16, 2H7v114, 2H7v511 y GA101. Los brazos de anti-CD3 evaluados en la generación de los TDB para CD3/CD20 incluyeron UCHT1v1, UCHT1v9, UCHT1vM1, 72H6, 13A3, 30A1, 41D9a, SP34v52, 40G5c, 38E4v1-38E4v9, 21B2, 125A1 y 21A9. Se evaluó la unión a CD3 de los TDB para CD3/CD20, así como su actividad, evaluada mediante ensayos de eliminación de linfocitos B y ensayos de activación de linfocitos T in vitro.
A. Afinidad de unión
Se evaluaron las afinidades de unión para cada uno de los TDB para CD3/CD20 mediante análisis Biacore o FACS, como se ha descrito anteriormente para los anticuerpos anti-CD3. En resumen, para los ensayos de unión Biacore, se inmovilizó CD3ey humano en una microplaca sensora CM5 Biacore serie S usando el kit de acoplamiento de amina de Biacore y los TDB para CD3/CD20 o las variantes Fab de los mismos en el flujo pasante. Para los análisis de unión de FACS, se incubaron o bien células Bjab (para antígenos de linfocitos B) o células Jurkat (para el antígeno CD3) con diversas concentraciones de anticuerpos TDB a 4 °C durante 30 minutos, después, las células se lavaron y se incubaron con un 2.° anticuerpo (anti-hulgG-PE; BD Bioscience) durante otros 15 minutos, antes de lavarse nuevamente las células y estuviesen listas para el análisis FACS. La figura 16 muestra los resultados de los ensayos de unión de FACS in vitro de los TDB para CD3/CD20. Los resultados demuestran que algunas combinaciones particulares del brazo de anticuerpo anti-CD3 y el brazo de anti-antígeno tumoral (por ejemplo, brazo anti-CD20) dan como resultado anticuerpos TDB con propiedades de unión más favorables. La figura 17 muestra las afinidades de unión monovalentes y bivalentes para estos TDB para CD3/CD20 particulares. El emparejamiento particular de 2H7v16 con brazos anti-CD3 (por ejemplo, UCHT1v9), por ejemplo, dio como resultado un TDB para CD3/CD20 que mostró una unión inesperadamente fuerte a células tanto Bjab como Jurkat en comparación con los otros TDB para CD3/CD20 ensayados que tenían diferentes brazos anti-CD20. También se evaluó la afinidad de unión otros TDB para CD3/CD20 que tienen un brazo anti-CD20 de 2H7v16 y diversos brazos anti-CD3 (véanse las figuras 18-24).
B. Ensayos in vitro de eliminación de linfocitos B y de activación de linfocitos T
También se evaluó la capacidad de los TDB para CD3/CD20 generados para soportar la eliminación de linfocitos B y la activación del efecto citotóxico de linfocitos T. En estos ensayos, se obtuvieron líneas celulares de tumores de linfocitos B (Bjab) de la ATCC y se aislaron PBMC de sangre completa de donantes sanos mediante separación de Ficoll. En caso de necesitarse, se separaron los linfocitos T CD4+ y T CD8+ con kits de Miltenyi de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se cultivaron en RPMI1640 suplementado con FBS al 10 % (Sigma-Aldrich) a 37 °C en una estufa de incubación de cultivo celular convencional humidificada. Para los ensayos de eliminación de células Bjab, se incubaron 20.000 células Bjab con células efectoras o bien como huPBMC o como linfocitos T purificados a las relaciones indicadas por el ensayo, en presencia de diversas concentraciones de anticuerpos TDB durante un periodo de tiempo como se indica en el ensayo. Para los ensayos de eliminación de linfocitos B endógenos, se incubaron 200.000 huPBMC con diversas concentraciones de anticuerpos TDB durante las horas indicadas por el ensayo. Al final de cada ensayo, los linfocitos B vivos se seleccionaron como linfocitos B PI-CD19+ o PI-CD20+ mediante FACS y se obtuvo el recuento celular absoluto con perlas de FITC añadidas a la mezcla de reacción como control interno de recuento. El % de eliminación celular se calculó basándose en los controles no tratados con TDB. Los linfocitos T activados se detectaron mediante la expresión superficial de CD69 y CD25.
Las diversas eficacias de los anticuerpos TDB generados con biespecificidad por CD3 y una segunda molécula biológica (en este caso, CD20), destacan las contribuciones críticas e impredecibles de ambos brazos de anticuerpo en la generación de un TDB a modo de ejemplo que posee alta eficacia (véanse las figuras 25-49).
Ejemplo 3. Caracterización de TDB para CD3/CD20 a modo de ejemplo (TDB para CD20)
Los presentes inventores caracterizaron adicionalmente dos de los TDB para CD3/CD20 a modo de ejemplo (TDB para CD20) descritos anteriormente, que mostraron alta eficacia en los ensayos de eliminación de linfocitos B y los ensayos de activación de linfocitos T in vitro. El brazo para CD20 de cada anticuerpo TDB fue el clon de anti-CD20 2H7.v16 (véase la figura 50), mientras que el brazo para CD3 fue el clon UCHT1v9 (véase, por ejemplo, Zhu et al. Int. J. Cancer. 62: 319-324, 1995) o el clon 40G5c con reactividad cruzada con cino (véase, por ejemplo, la figura 51), que comparte actividades comparables.
Materiales y métodos
A. Producción de anticuerpos
Los anticuerpos biespecíficos dependientes de linfocitos T (TDB) se produjeron como anticuerpos de longitud completa en el formato de botón en ojal en forma de una IgG1 humana, como se ha descrito anteriormente (Atwell et al. J. Mol. Biol. 270: 26-35, 1997). Los medios anticuerpos se expresaron en E. coli y por lo tanto, estaban aglucosilados, se purificaron mediante cromatografía de afinidad de proteína A y se hibridaron los pares de medios anticuerpos adecuados in vitro como se ha descrito anteriormente (Spiess et al., Nat. Biotechnol. 2013). Después de la hibridación, los anticuerpos se purificaron mediante cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) y se caracterizaron mediante filtración en gel analítica, espectrometría de masas y electroforesis en gel de poliacrilamida. Los anticuerpos purificados corrieron como un solo pico (>99 % de la señal) en la filtración en gel sin agregados detectables (figura 52A) y no se detectaron homodímeros mediante espectrometría de masas (figura 52B).
B. Ensayos in vitro de eliminación de linfocitos B y de activación de linfocitos T
Se obtienen líneas celulares de linfocitos B de la ATCC y se aislaron PBMC de sangre completa de donantes sanos mediante separación de Ficoll. Se separaron los linfocitos T CD4+ y T CD8+ con kits de Miltenyi de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se cultivaron en RPMI1640 suplementado con FBS al 10 % (Sigma-Aldrich). Para los ensayos de eliminación de linfocitos B, los linfocitos B vivos se seleccionaron como linfocitos B PI-CD19+ mediante FACS y se obtuvo el recuento celular absoluto con perlas de FITC añadidas a la mezcla de reacción como control interno de recuento. Los linfocitos T activados se detectaron mediante la expresión superficial de CD69 y CD25. La inducción de granzima B intracelular se detectó mediante FACS. La concentración de perforina en el medio se detecta mediante ELISA (eBioscience). Todos los anticuerpos se adquirieron de BD Bioscience.
C. Estudios de eficacia in vivo en modelos murinos
Se adquirieron ratones NSG y SCID humanizados de Jackson Labs. Se produjeron ratones transgénicos para CD20 humano y ratones transgénicos para CD3 humano como se ha descrito anteriormente (Gong et al. J. Immunol. 174: 817-826, 2005 y de la Here et al. J. Exp. Med. 173: 7-17, 1991) y se produjeron ratones doble transgénicos para CD20/CD3 mediante cruzamiento de los dos ratones transgénicos para un solo rasgo. Los modelos de ratón de linfoma humano se generaron inyectando 5 x 106 células Bjab-luciferasa solas o mezcladas con 10 x 106 PBMC de donante humano en HBSS por vía subcutánea en los flancos derechos de 40 ratones hembra. Los ratones fueron tratados por vía intravenosa con vehículo o con 0,5 mg/kg de TDB para CD20 una hora después de la inoculación y una semana después del tratamiento inicial. Los tumores se midieron 1-2 veces a la semana y los pesos corporales se midieron dos veces a la semana hasta 7 días después del tratamiento final. En caso de no observarse pérdida de peso, se dejaron de registrar los pesos para un animal dado. En caso de que la pérdida de peso fuese mayor de un 15 % del peso corporal total, los ratones afectados se pesaron a diario y se sacrificaron (o se remitieron al personal veterinario para su observación) en caso de que la pérdida de peso fuese mayor del 20 %. Se llevaron a cabo observaciones clínicas dos veces a la semana durante la duración del estudio para monitorizar la salud de los animales; se sacrificó a cualquier animal con un tumor de un tamaño o condición que pudiera interferir con la salud o la actividad del animal. De otro modo, se sacrificó a los animales 6 meses después del tratamiento del tumor o en caso de que se ulcerase el tumor o su volumen superase 2500 mm3
Se generaron modelos de ratón de leucemia linfocítica crónica (CLL) procedentes de pacientes como se ha descrito anteriormente (Bagnara et al. Blood. 117: 5463-5472, 2011). En resumen, se purificaron 5 x 105 linfocitos T activados de PBMC de CLL y se inyectaron por vía retroorbital en ratones NSG. Después del injerto de linfocitos T, se inyectaron 2 x 107 PBMC de CLL por vía retroorbital. Después de 14 días, se confirmó la circulación de linfocitos B y T trasplantados mediante análisis FACS. Los animales injertados con éxito se trataron posteriormente 3,5 semanas después con anticuerpos TDB administrados por vía intravenosa mediante inyección en la vena caudal. Los animales fueron sacrificados 6 o 14 días después del tratamiento. Se recogió sangre completa mediante punción del seno retroorbital usando pipetas heparinizadas y se transfirió inmediatamente a tubos heparinizados, mientras los animales se mantenía bajo anestesia o mediante punción cardiaca terminal, con una jeringa heparinizada después del sacrificio con CO2. Se recogieron los bazos después del sacrificio con CO2. Para cada estudio, se llevaron a cabo observaciones clínicas dos veces a la semana para monitorizar la salud de los animales. Se registraron los pesos corporales de los animales al menos una vez a la semana. Las PBMC se aislaron después de la lisis de glóbulos rojos y se analizaron mediante FACS seleccionando linfocitos B (muCD45+CD19+) y linfocitos T (muCD90.2+CD4+ o muCD90.2+CD8+). Todos los anticuerpos usados se adquieren o bien de BD Biosciences o de eBiosciences.
D. Estudio PK/PD en monos cinomolgos
Todos los estudios en monos cinomolgos se llevaron a cabo usando monos cinomolgos criados expresamente, no sometidos a experimentación, de origen chino. Para el estudio PK/PD de una sola dosis, se administró a 3 monos cinomolgos macho una sola dosis IV por infusión intravenosa lenta de 1 mg/kg de TDB para CD20; para el estudio de dosis repetida, se administró a 4 monos cinomolgos una dosis por infusión IV lenta de 1 mg/kg de TDB para CD20 una vez a la semana hasta un total de 4 dosis. La sangre completa o los tejidos se recogieron en puntos de tiempo seleccionados para el recuento de linfocitos B y linfocitos T mediante FACS. Se recogió suero y se almacenó a -70c hasta que se ensayó usando un ELISA para determinar la cantidad de artículo de ensayo en cada muestra de suero. Se usaron los perfiles de concentración sérica-tiempo de cada animal para estimar los parámetros farmacocinéticos (PK) usando el programa informático WinNonlin (Phasight; Mountain View, CA).
TDB para CD20 de alta calidad producido como IgG humanizada de longitud completa con propiedades PK de anticuerpo convencional
Para explorar las propiedades de direccionamiento que podrían afectar a la potencia de direccionamiento del TDB a linfocitos B, incluyendo la identidad del antígeno, el tamaño del dominio extracelular y la distancia del epítopo respecto de la membrana, los presentes inventores crearon más de 40 TDB diferentes dirigidos a epítopos en CD3e, CD19, CD20, CD22, CD79a y CD79b. Los resultados representativos se muestran en la figura 56I. Los presentes inventores observaron que los TDB más potentes eran aquellos dirigidos contra antígenos diana de cáncer con dominios extracelulares (ECD) pequeños y epítopos próximos a la membrana celular. Entre las mejores dianas se encontraban CD20, CD79a y CD79b con potencias próximas a 10 ng/ml o 67 pM para la eliminación de linfocitos B de donante por linfocitos T autólogos.
El TDB anti-CD20/CD3 (CD20-TDB) se describe en este caso como una molécula de prueba de concepto que destaca la actividad farmacológica de estos TDB dirigidos a linfocitos B. Los TDB para CD20 se produjeron como IgG de longitud completa totalmente humanizadas con la arquitectura de anticuerpo natural de las bacterias, libres de homodímeros y agregados (figura 52). Las propiedades farmacocinéticas (PK) del TDB para CD20 en ratas, una especie sin unión, se asemeja a la de otros anticuerpos IgG humanos, con una semivida de aproximadamente 7 días (figura 53).
La eliminación de linfocitos B con TDB para CD20 es dependiente de linfocitos T mediante la vía de granzimaperforina
Para evaluar el TDB para CD20 como una terapia potencial para trastornos proliferativos celulares, tales como neoplasias malignas de linfocitos B CD20+, en primer lugar se investigó su mecanismo de acción como anticuerpo biespecífico de reclutamiento de linfocitos T. De manera distinta a la actividad ADCC, que es el mecanismo principal de acción para la terapia clásica con anticuerpos monoclonales, el TDB para CD20 no necesita la región Fc para su actividad. La porción F(ab')2 del TDB para CD20 conservó la misma potencia que el TDB para CD20 de IgG de longitud completa en la eliminación de linfocitos B (figura 54A). El TDB para CD20 es un agonista condicional, que requiere expresión de la diana, linfocitos T y anticuerpo para su actividad. La actividad de eliminación de linfocitos B del TDB para CD20 es dependiente de linfocitos T, ya que no se detectó eliminación de linfocitos B con PBMC con reducción de linfocitos T CD3+ (figura 54B). Es necesaria la expresión de diana para la activación de linfocitos T, ya que la ausencia de expresión de CD20 da como resultado linfocitos T no activados (figura 54C). El TDB para CD20 es capaz de activar linfocitos T tanto CD4+ como CD8+, medidos por la inducción tanto de CD69 como de CD25 en linfocitos T (figura 54D). Puede lograrse una eliminación comparable de linfocitos B con cualquiera de los linfocitos T como efectores, aunque los linfocitos T CD8+ parecen ser más potentes a la hora de eliminar células BJAB, ya que los linfocitos T CD8+ dieron como resultado un mayor alcance de la eliminación celular que un número igual de linfocitos T CD4+ (figura 54C). Sin embargo, la regulación positiva de granzima es más prevalente en linfocitos T CD8+ (figura 54E), además de detectarse mediante ELISA mayores niveles de liberación en los medios de perforina y de las granzimas A y B (no mostradas) asociada con linfocitos T CD8+ (figura 54F). Los linfocitos T activados tienen capacidad proliferativa (figura 55). El recuento de linfocitos T general, sin embargo, no aumentó significativamente después de 24 horas en presencia de TDB para CD20 y de linfocitos B sin suplemento de citocinas in vitro, probablemente debido a las condiciones de cultivo. De hecho, se observó una robusta expansión de linfocitos T in vivo en los estudios de eficacia con modelos murinos y en monos cinomolgos (figuras 58A y 67C).
El TDB para CD20 es potente a la hora de eliminar linfocitos B de leucemia/linfoma y a la hora de eliminar linfocitos B autólogos in vitro
También se evaluó la potencia de eliminación de linfocitos B del TDB para CD20 con más de una docena de líneas celulares de linfocitos B de leucemia/linfoma in vitro. Para evaluar la potencia del CD20-TDB, se seleccionaron 8 líneas que representan células con un amplio intervalo de nivel de expresión de CD20 (figura 56B). Se muestran las curvas de eliminación de linfocitos B de respuesta a la dosis con las 8 líneas celulares, con PBMC aisladas de donante sano como células efectoras (figura 56A). De manera significativa, el CD20-TDB no tuvo actividad contra células SU-DHL1 que están desprovistas de expresión de CD20. La potencia del CD20-TDB estaba hasta cierto punto correlacionada con los diversos niveles de c D20 superficial detectados mediante citometría de flujo (56A). No obstante, el TDB para CD20 es potente a la hora de eliminar las 8 líneas de una manera dependiente de la dosis, con una CE50 en el intervalo de 0,38 a 11ng/ml para un ensayo de 24 horas. El alcance de la eliminación celular varía en cierto modo del 60 al 90 %, con hasta 1000ng/ml de TDB en un ensayo de 24 horas (figura 56C). En general, puede lograrse una eliminación completa de linfocitos B con una mayor concentración de anticuerpo o un tiempo de ensayo extendido. Las células SU-DHL-1 se incluyen en el ensayo de eliminación como control negativo de CD20, donde no se observó eliminación, lo que demuestra la necesidad de expresión de diana para la actividad del TDB para CD20. La actividad del TDB para CD20 parece requerir un nivel muy bajo de expresión de diana, ya que las células Nalm-6 y SC-1 mostradas en este caso tienen una muy baja expresión superficial de CD20 (figura 56B). La afinidad de unión monovalente a CD20 del TDB para CD20 es más débil que la afinidad de unión del anti-CD20 precursor, con una Kd de 54 nM determinada mediante Scatchard. Tomando juntos el valor de KDy la potencia de eliminación de linfocitos B del TDB para CD20, la ocupación del receptor necesaria para la actividad del TDB para CD20 es únicamente menor del 0,1 %. Los TDB generados para dirigirse a diferentes antígenos de linfocitos B también son eficaces a la hora de mediar la eliminación de linfocitos B, como se muestra en la figura 56D, donde los TDB dirigidos a 5 antígenos diferentes de linfocitos B, incluyendo un TDB para CD20 (TDB A: 2H7v16/UCHT1v9), eliminaron de un 75 % a un 90 % de los linfocitos B. Los TDB para CD20 pueden mediar además la eliminación de líneas de linfoma B adicionales con expresión de antígeno CD20 superficial variable (figura 56E).
El TDB para CD20 también es altamente potente a la hora de eliminar linfocitos B autólogos, evaluándose con PBMC humanas aisladas de sangre periférica de donantes sanos (figura 56F). En la figura 56F se muestran las curvas de eliminación de respuesta a la dosis para 8 donantes aleatorios, así como una gráfica resumen para la CE50 y el alcance de la eliminación de linfocitos B (figura 56G) con 1000ng/ml de anticuerpo en un ensayo de 24 horas para 30 donantes. De las 30 muestras ensayadas, se eliminó de un 57 a un 96 % de los linfocitos B con hasta 1000ng/ml de anticuerpo en 24 horas, con una CE50 en el intervalo de 0,43 a 135ng/ml, con una mediana del valor menor de 3ng/ml. El alcance de la eliminación de linfocitos B en 24 horas por el TDB para CD20 es muy comparable o mayor que la eliminación de linfocitos B por un scFv anti-CD3/anti-CD19 (figura 56H).
El TDB para CD20 es potente a la hora de eliminar linfocitos B in vivo en modelos murinos
Ya que el TDB para CD20 ensayado no reconoce los antígenos CD20 y CD3 murinos, los presentes inventores aprovecharon los ratones transgénicos para CD20 humano y CD3 humano (descritos anteriormente) para producir ratones doble transgénicos para CD3/CD20 humano para los posteriores estudios de eficacia in vivo. Como se muestra en la figura 57A, los ratones doble transgénicos para CD3/CD20 humano expresan huCD3£ en la superficie de linfocitos T CD4+ y CD8+, además de huCD20 en la superficie de linfocitos B CD19+ a niveles detectables, en comparación con linfocitos T y B de origen humano. Con los ratones transgénicos para CD20 humano, solo rituximab es capaz de reducir los linfocitos B, ya que el TDB para CD20 no puede acoplarse a linfocitos T murinos sin expresión de CD3 humano (figura 57B). Sin embargo, con ratones doble transgénicos para CD3/CD20 humano, el TDB para CD20 es capaz de acoplarse a linfocitos T que expresan huCD3 y es potente a la hora de reducir los linfocitos B murinos que expresan huCD20 (figura 57C). El TDB para CD20 parece ser más potente a la hora de reducir los linfocitos B in vivo, ya que se detectan menos linfocitos B en bazos de ratón 7 días después de una sola dosis IV de TDB para CD20 a 0,5 mg/kg, en comparación con después de una sola dosis de rituximab a 10 mg/kg. Un TDB para HER2, que tiene el mismo brazo para CD3 mientras que el otro brazo se une a HER2, se usó en este caso como control de isotipo y no mostró actividad de citorreducción.
Para explorar la dosis mínima eficaz del TDB para CD20 a la hora de reducir los linfocitos B con ratones doble transgénicos para CD3/CD20 humano, se trató a los ratones con una sola dosis de TDB para CD20, comenzando a 0,5 mg/kg hasta 0,00005 mg/kg. Después, se monitorizó el recuento de linfocitos B en D1 (24 horas después de la dosis), D8 y D15. Se observó un recuento reducido de linfocitos B en D1 y la reducción de linfocitos B se mantuvo hasta D15 después del tratamiento con TDB para CD20 (figura 58A). De manera consistente con esta observación de recuento de linfocitos B en sangre, se logró una reducción prácticamente completa de linfocitos B en bazos de ratón en el D7 después de una sola dosis de 0,5 mg/kg, mientras que una dosis menor de 0,05 mg/kg dio como resultado una reducción parcial de linfocitos B de bazo y se aproximó al nivel de dosis de DE50 (figura 58B). Un estudio de transcurso temporal con los ratones doble transgénicos reveló que la reducción de linfocitos B es prácticamente completa en bazos tan pronto como 3 días después del tratamiento con una sola dosis a 0,5 mg/kg, sin signos significativos de recuperación de los linfocitos B hasta D14 (figura 58A). Como se observa en la figura 58C, el TDB para CD20 media la reducción de linfocitos B en la sangre periférica de dobles transgénicos para huCD20/huCD3, que se detecta en la sangre tan pronto como dos horas después del tratamiento y se mantiene durante hasta siete días después del tratamiento. Además, los linfocitos T CD8+ y CD4+ son detectables en la sangre a las dos horas de la administración de TDB para CD20 y después se reducen dos días después del tratamiento (figura 58D).
Además, el TDB para CD20 redujo los linfocitos B de la zona marginal (MZB) (figura 59A y figura 59B) con la misma eficiencia que linfocitos B foliculares (FOB) (figura 59A y figura 59C) en bazos de ratón, después de una sola dosis IV de 0,5 mg/kg. Los presentes inventores observaron que los linfocitos B de bazo se redujeron en ~50 % con respecto del valor inicial en el día 1 (24 horas después de la dosis) y continuaron reduciéndose rápidamente hasta alcanzar un mínimo en el día 3 que se mantuvo a lo largo del estudio. Esto es aparentemente diferente a informes previos con rituximab, donde se cree que el microambiente desempeña un papel en la eficacia de rituximab, lo que sugiere un modo de acción diferente para el TDB para CD20 in vivo que para rituximab. Normalmente se observa activación de linfocitos T murinos tan pronto como 30 minutos después del tratamiento con TDB para CD20 en sangre y principalmente, en las primeras 24 horas en el bazo (figuras 59D y 59E). Después de la activación de linfocitos T, se observó un aumento en el recuento de linfocitos T aproximadamente en D2-D3 (figuras 59D y 59E), como resultado de la proliferación celular. En el día 2, la mayoría de linfocitos T dejaron de ser positivos para c D69, aunque los niveles de CD69+CD8+ continuaron en el intervalo del 10-30 % durante el resto del estudio de dos semanas. Sin embargo, posiblemente debido a la muerte celular inducida por activación, el recuento de linfocitos T tiende a reducirse después de la fase de expansión. Eventualmente, el recuento de linfocitos T se recuperará después del tratamiento con TDB, lo que sugiere la ausencia de efecto inhibidor en el tratamiento con TDB para CD20 en la regeneración de linfocitos T murinos.
También se usaron ratones NSG humanizados para validar adicionalmente la potencia del TDB para CD20 en la reducción de linfocitos B en modelos murinos y en una situación de dosis repetida. Los ratones reales reclutados en el estudio mostrado en las figuras 60A-60D tuvieron un 35-80 % de células CD45+ humano en sangre periférica y el intervalo de células CD4+, CD8+ y CD20+ fue del 12-25, 2,1-8,7 y 32-60 %, respectivamente (porcentaje comunicado como selección entre leucocitos viables). Los ejemplos representativos de esta caracterización inicial se muestran en la figura 60E. Se compararon los niveles de antígenos diana CD3 y CD20 de estos ratones con los de donantes humanos normales y se observó que no eran significativamente diferentes (figura 60F). Como se muestra en la figura 59, los ratones NSG humanizados se trataron con 3 dosis semanales de TDB para CD20 a 0,5 mg/kg. Los linfocitos B se redujeron en sangre en D7, sin apenas detectarse linfocitos B en D21 (figura 60A). También se observó una robusta reducción de linfocitos B en bazos de los ratones tratados con TDB en D21 (figura 60B). Además, el tratamiento de ratones NSG humanizados con TDB para CD20 estimuló la proliferación de linfocitos T y ocasionó la reducción de linfocitos B, como se muestra en la figura 60C. Para linfocitos T CD8+, sus recuentos celulares aumentaron hasta 10 veces en sangre en D7 y volvieron al valor inicial o menor en D14 y D21 (figura 60D). También se observó una tendencia similar para linfocitos T CD4+.
El TDB para CD20 es potente para eliminar linfocitos B de CLL in vitro e in vivo
Los presentes inventores también evaluaron la potencia del TDB para CD20 en la eliminación de linfocitos B de leucemia con linfocitos T autólogos de pacientes con CLL, donde la carga tumoral B es normalmente alta, mientras que el recuento de linfocitos T es bajo y la función de linfocitos T puede verse potencialmente comprometida (Riches et al., Semin. Cancer Biol.20(6): 431-438, 2010). Se incubaron PBMc aisladas de sangre periférica de nueve pacientes de CLL con una sola dosis elevada de 1000 ng/ml de TDB para CD20 durante hasta 48 horas. Como se muestra en la figura 61A, el TDB para CD20 es potente a la hora de eliminar linfocitos B de CLL con linfocitos T autólogos. Para las 2 muestras mostradas, la carga tumoral de leucemia B es del 70 % con un 8,4 % de linfocitos T CD8+ en las PBMC para la muestra de paciente n.° 1 y del 80 % con un 4,4 % de linfocitos T CD8+ para la muestra de paciente n.° 2. Aparentemente, el TDB para CD20 puede lograr una eficiente eliminación de linfocitos B con relaciones de efector a diana muy bajas (1:8 y 1:18 con las 2 muestras mostradas en este caso). La eliminación de linfocitos B de CLL con linfocitos T autólogos por el TDB para CD20 está altamente correlacionada con el recuento de linfocitos T CD8+ (figura 61B). Los presentes inventores observaron que el contenido de linfocitos T varió significativamente (entre un 0,4 y un 8 % de células mononucleadas) y sorprendentemente, se observó que el alcance de la citólisis de linfocitos B en comparación con los valores antes del tratamiento estaba altamente correlacionado con el contenido de linfocitos T.
Al suplementar los linfocitos T CD8+ purificados con PBMC de CLL, donde hay muy pocos linfocitos T autólogos disponibles, se eliminaron eficientemente los linfocitos B de leucemia por el TDB para CD20 de una manera dependiente de linfocitos T (figura 61C).
El TDB para CD20 también es potente para eliminar células de leucemia de CLL injertadas en ratones (figura 62A). En resumen, se injertaron en ratones NSG células de leucemia de pacientes después del injerto de linfocitos T activados autólogos procedentes de pacientes y el tratamiento se inicia después de confirmarse el establecimiento del injerto de leucemia. La tinción IHC de los ejemplos representativos de bazos de ratón mostraron un injerto exitoso de linfocitos B de leucemia y linfocitos T autólogos de pacientes de CLL en ratones NSG. Después de una sola dosis de tratamiento con CD20-TDB a 0,1 o 0,5 mg/kg, se pudieron detectar pocos linfocitos B. También se observó reducción de linfocitos B con el tratamiento con rituximab, mientras que no se detecta reducción de linfocitos B con HER2-TDB como un control de isotipo. (Figura 62B).
En el contexto de la progresión tumoral, el tratamiento con TDB para CD20 es eficaz para prevenir el crecimiento de tumores de linfoma de linfocitos B en presencia de PBMC de donante humano. Los ratones SCID (con inmunodeficiencia combinada severa) con trasplante de células Bjab humanas desarrollaron tumores detectables cuando se trataron con vehículo o con solo t Db para CD20 en el día 12 después de la inoculación. Además, el trasplante solo de PBMC retrasó el recrecimiento tumoral, pero estos ratones desarrollaron tumores detectables en el día 25 después de la inoculación. Por tanto, el TDB para CD20 también es eficaz a la hora de prevenir el crecimiento tumoral in vivo en presencia de células efectoras PBMC (figura 63).
La potencia de TDB para CD20 requiere un muy bajo nivel de expresión de CD20
Además de la diferente necesidad de la región Fc de anticuerpo para la actividad del TDB para CD20 en comparación con un anti-CD20 convencional y posiblemente la diferente dependencia del microambiente tumoral, el TDB para CD20 también parece necesitar un menor nivel de expresión de antígeno para una eficiente eliminación de linfocitos B. Para células Bjab, que tienen un alto nivel de expresión de CD20 (figura 64A), se logró una eliminación celular comparable con rituximab y TDB para CD20 (figura 64B). Sin embargo, las células Nalm-6, SC-1 y OCI-Ly19 con un nivel de expresión de CD20 muy reducido (figura 64A) se eliminaron únicamente por el TDB para CD20, mientras que no se detectó eliminación celular con rituximab (figura 64C). El número estimado de copias de CD20 para estas líneas celulares con baja expresión de CD20 es menor de 500, basándose en los datos de unión de Scatchard y FACS en comparación con células BJAB (datos no mostrados). Además, la afinidad de unión monovalente del CD20-TDB por CD20 es de -50-100 nM, significativamente menor de la afinidad de 1-5 nM de rituximab (ambos medidos mediante Scatchard). En conjunto, la potencia del CD20-TDB es consistente con la intuición de que la activación del TCR requiere tan solo una baja ocupación del receptor de 10-100 moléculas (Purbhoo, M.A., et al. Nat Immunol 5:524-530, 2004; Irvine, D.J., et al. Nature 419:845-849, 2002; Sykulev, Y., et al. Immunity 4:565-571, 1996).
El TDB para CD20 es activo en presencia de rituximab y esteroides
La que rituximab y su combinación con quimioterapia se usan ampliamente en el tratamiento de neoplasias malignas de linfocitos B en la práctica clínica, es importante explorar cómo puede usarse el TDB para CD20 en este contexto, ya que el TDB para CD20 y rituximab se dirigen al mismo antígeno. Los presentes inventores aprovecharon rituximab-DANa , una variante de rituximab sin función efectora (rituximab que contiene en los restos 265 y 297 a alanina (las mutaciones DANA se describen en las Patentes de los Estados Unidos n.° 7.332.581 y 8.219.149)), que solo se une a CD20 sin actividad de eliminación de linfocitos B, evaluado en ratones doble transgénicos para CD20/CD3 humano (figura 64D). El pretratamiento de las células diana de linfocitos B de donante con esta molécula de rituximab inerte que compite con la unión del CD20-TDB tuvo un efecto notablemente mínimo en la anulación de la actividad del CD20-TDB. A concentraciones de hasta 250 pg/ml de rituximab-DANA (un exceso de 5000 veces con respecto al nivel de dosis de CE50 de 42ng/ml), los presentes inventores observaron cambios tan solo modestos en las curvas de respuesta a la dosis in vitro (cambio menor de 7 veces en la CE50, 42 frente a 320 ng/ml). De manera notable, el TDB para CD20 sigue siendo activo en esta situación. Aunque la CE50 para el CD20-TDB aumentó hasta ~7 veces mayor que la concentración de rituximab-DANA, el alcance de la eliminación de linfocitos B no cambia significativamente (figura 65A). Esto es consistente con los hallazgos previos de los presentes inventores de que se necesita un nivel de expresión de antígeno muy bajo o una ocupación del receptor muy baja para la potencia del TDB para CD20. Las observaciones in vitro se recapitularon in vivo en ratones transgénicos duales para CD3/CD20 que se pretrataron con 2 o 10 mg/kg de la proteína rituximab-DANA y posteriormente se les expuso al CD20-TDB. En el presente caso, se demuestra in vivo que el TDB para CD20 sigue siendo activo a la hora de reducir los linfocitos B en ratones pretratados con rituximab-DANA (figura 66). Estos resultados indican gran versatilidad en posibles terapias combinadas para neoplasias malignas de linfocitos B.
El TDB para CD20 es un anticuerpo reclutador de linfocitos T y su potencia es dependiente de la activación de linfocitos T. También se exploró para observar si el pretratamiento con esteroides, que potencialmente podría tener un impacto en la respuesta inmunitaria de linfocitos T, afectaría a la actividad del t Db para CD20. In vitro, el TDB para CD20 seguía siendo activo en la eliminación de linfocitos B en presencia de una alta concentración de dexametasona (figura 65B).
Validación preclínica del TDB para CD20 como una potente terapia para las neoplasias malignas de linfocitos B CD20+ en monos cinomolgos
También se llevó a cabo un estudio piloto de PKPD con el TDB para CD20 en monos cinomolgos. En un estudio de una sola dosis, donde se trató una vez a 3 animales por vía intravenosa con 1 mg/kg de TDB para CD20, se observó una reducción completa de linfocitos B en la sangre (figura 67A), así como en los bazos y ganglios linfáticos (figuras 67B y 67C), 7 días después del tratamiento con anticuerpos. Los históricos de controles de vehículo se muestran como la media y desviación típica de 4 animales tratados con vehículo (figura 67D). No se observó una pérdida evidente de linfocitos T, la que tanto los linfocitos T CD8+ como los linfocitos T CD4+ se encontraban a un nivel comparable o mayor que en los controles, cuando se calculó como el % de linfocitos. Se detectó activación de linfocitos T en sangre 4 horas después de la administración. No se observó pérdida de linfocitos T y se detectó un recuento aparentemente mayor de linfocitos T CD8+ en sangre 7 días después del tratamiento (figura 67A).
También se evaluó el efecto a largo plazo del tratamiento con TDB para CD20 en células inmunitarias con un estudio de dosis repetida de 4 semanas seguido de un periodo de recuperación de 8 semanas. En sangre de 4 animales tratados con una dosis semanal de 1 mg/kg, se midieron los recuentos de linfocitos B y T, así como la concentración sérica de TDB para CD20 y se representaron para cada animal individual a lo largo de 77 días (figura 68A). En los 4 animales, no se detectaron linfocitos B en sangre poco después del tratamiento y no reaparecieron en tanto que la concentración sérica de TDB para CD20 permaneció por encima de 100 ng/ml (animal 4502 frente a los animales 4001, 4002 y 4503). Los recuentos de linfocitos T CD8+, así como los de linfocitos T CD4+ en menor medida, aumentaron significativamente después de la primera dosis y gradualmente volvieron a entre un 25-150 % de los valores iniciales. En conjunto, el TDB para CD20 es altamente activo a la hora de reducir linfocitos B, sin comprometer a los linfocitos T.
En la figura 68B también se resumen las propiedades PK del TDB para CD20, midiéndose la concentración sérica del TDB para CD20 de ambos estudios. Como se demuestra para el estudio de dosis repetida, el TDB para CD20 mantuvo una buena exposición durante todo el periodo, con CL a aproximadamente 17 ml/día/kg durante la primera dosis (D0-D7). La eliminación mediada por diana parece ser mayor durante la primera dosis (DO-D7), ya que el valor de CL se redujo a aproximadamente 6 ml/día/kg durante la cuarta dosis (D21-28).
Combinación de TDB para CD20 con antagonista de PD-L1 en un modelo de tumor singénico
También se evaluó la eficacia in vivo de un TDB para CD20 en combinación con un antagonista de PD-L1 (un anticuerpo anti-PD-L1 de isotipo IgG2a murino, 25A1, con mutaciones DANA) en un modelo de tumor singénico. En este estudio, se utilizaron linfocitos B de linfoma de ratón A20-huCD20 que expresan CD20 humano y PD-L1 de ratón en su superficie para generar un modelo de tumor singénico (véase, por ejemplo, la figura 69A). El TDB para CD20 usado fue un TDB 2H7v16/2C11 de isotipo IgG2a murino producido en formato de botón en ojal (K&H) (véase, por ejemplo, Atwell et al., J Mol Biol., 270:26-35, 1997), en donde el brazo de "botón" es 2H7v16 anti-CD20 y el brazo de "ojal" es 2C11 anti-CD3 (Leo et al., Proc Natl Acad Sci USA, 84:1374-8, 1987). El antagonista de PD-L1 usado fue un anticuerpo anti-PD-L1 de isotipo IgG2a con mutaciones de Fc DANA (sustitución de los restos 265 y 297 a alanina; véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 7.332.581 y 8.219.149).
En el día -7, se inoculó por vía subcutánea en el área torácica unilateral derecha de 65 ratones Balb/C 2,5 millones de células A20pRK-CD20-GFP en HBSS en un volumen de 100 j l (para no superar 200 jl). Se dejó que los ratones desarrollasen tumores. Posteriormente, se pesaron y midieron los ratones 1-2 veces a la semana hasta que los tumores alcanzaron un volumen tumoral medio de aproximadamente 100-200 mm3 (aproximadamente 7 días después de la inoculación). Después, se dividieron los animales en los cuatro grupos de tratamiento a continuación: Grupo 1: 2,5 millones de A20/c D20, Vehículo, qwx3, IV, n=9; Grupo 2: 2,5 millones de A20/CD20, TDB anti-CD20xCD3 K&H (IgG2 murina 2H7v16-2C11), 0,5 mg/kg, qwx3, IV, n=9; Grupo 3: 2,5 millones de A20/CD20, aPDL1 (25A1, mlgG2a DANA), 10 mg/kg, tiwx3, IP, n=9; y Grupo 4: 2,5 millones de A20/CD20, aPDL1 (25A1, mlgG2a DANA), 10 mg/kg, tiwx3, IP TDB anti-CD20xCD3 K&H (IgG2 murina 2H7-2C11), 0,5 mg/kg, qwx3, IV, n=9. Se sacrificó a los ratones no reclutados en uno de los grupos de tratamiento anteriores debido a un volumen tumoral disímil. El tratamiento comenzó en el día 0 y todas las dosis de anticuerpo se llevaron a cabo por vía intravenosa en un volumen de 100 ml, como se ha descrito anteriormente.
Los tumores se midieron 1-2 veces a la semana. Los pesos corporales se midieron dos veces a la semana hasta 7 días después del tratamiento final. En caso de no observarse pérdida de peso, se dejaron de registrar los pesos. En caso de que la pérdida de peso observada fuese >15 %, los ratones afectados se pesaron a diario y se sacrificaron en caso de que la pérdida de peso fuese mayor o igual al 20 %. Durante todo el estudio, se llevaron a cabo observaciones clínicas dos veces a la semana para monitorizar la salud de los animales y se sacrificó a cualquier animal con un tumor que tuviese un tamaño o condición que pudiera interferir con la salud o actividad del animal.
Como se representa en la figura 69B, el tratamiento combinado de TDB para CD20 con el anticuerpo anti-PD-L1 (grupo 4) mostró un efecto inesperado y sinérgico a la hora de inhibir el crecimiento tumoral cuando se comparó con el tratamiento con TDB para CD20, el anticuerpo anti-PD-L1 o solo vehículo.
Combinación de TDB para CD20 con antagonista de PD-1 en un modelo de tumor singénico
Adicionalmente, también se evaluó la eficacia in vivo de un TDB para CD20 en combinación con un antagonista de PD-1 (un anticuerpo anti-PD1 de isotipo IgG2 murino, 8F11, con mutaciones DANA) en el modelo de linfoma B singénico A20/huCD20 de ratón. En este estudio, el TDB para CD20 usado fue un TDB 2H7v16/2C11 de isotipo IgG2a murino y el antagonista de PD-1 usado fue un anticuerpo anti-PD-1 de isotipo IgG2 murino con mutaciones DANA de Fc.
Se transfectaron células de linfoma B de ratón A20 para que expresasen CD20 y GFP y posteriormente, se clasificaron en células individuales para la selección clonal y la expansión para su implante. Se inoculó por vía subcutánea a ratones Balb/C hembra (Charles River; Hollister, CA) de 8-10 semanas de edad en la región torácica unilateral derecha 2,5 millones de células A20.hCD20-GFP. Cuando los tumores alcanzaron un volumen tumoral medio de 100-200 mm3, se reclutaron los ratones y se asignaron aleatoriamente a uno de cuatro grupos de tratamiento (n=9 ratones/grupo) y se comenzó el tratamiento con anticuerpo al día 1 siguiente: Grupo 1 (2,5 millones de A20/CD20, vehículo, qwx3, IV); Grupo 2 (2,5 millones de A20/CD20, TDB anti-CD20xCD3 K&H (IgG2 murina 2H7v16-2C11), 0,5 mg/kg, qwx3, IV); Grupo 3 (2,5 millones de A20/CD20, anti-PD1 (8F11, mlgG2a Da Na ), 10 mg/kg, tiwx3, IP); y Grupo 4 (2,5 millones de A20/CD20, anti-PD1 (8F11, mlgG2a DANA), 10 mg/kg, tiwx3, IP TDB anti-CD20xCD3 K&H (IgG2 murina 2H7v16-2C11), 0,5 mg/kg, qwx3, IV).
Los ratones fueron tratados con vehículo o TDB para CD20 a 0,5 mg/kg semanalmente por vía IV durante 3 semanas y/o anticuerpo anti-PD-1 a 10 mg/kg por vía IV para la primera dosis, seguido de administración IP 3 veces a la semana durante 3 semanas. (N=9 ratones/grupo)
Como se representa en las figuras 108A y 108B, el tratamiento combinado de TDB para CD20 con el anticuerpo anti-PD-1 (grupo 4) mostró un efecto inesperado y sinérgico a la hora de inhibir el crecimiento tumoral cuando se comparó con el tratamiento con TDB para CD20, el anticuerpo anti-PD-1 o solo vehículo.
Ejemplo 4. Generación y caracterización de TDB para CD3/FcRH5 a modo de ejemplo (TDB para FcRH5)
Los presentes inventores también exploraron la capacidad de los anticuerpos TDB para reclutar las actividades citotóxicas de los linfocitos T a la hora de erradicar células tumorales mediante el reconocimiento de un antígeno de la superficie celular diferente, FcRH5. Con este fin, se generaron y caracterizaron anticuerpos anti-CD3 biespecíficos que tienen un brazo de anti-CD3 y un brazo de anti-FcRH5 (TDB para FcRH5). Como se ha descrito anteriormente, Los TDB para FcRH5 se produjeron como anticuerpos de longitud completa en el formato de botón en ojal en forma de una IgG1 humana, como se ha descrito anteriormente (Atwell et al. J. Mol. Biol. 270: 26-35, 1997). Los medios anticuerpos se expresaron en E. coli, se purificaron mediante cromatografía de afinidad de proteína A y se hibridaron los pares de medios anticuerpos adecuados in vitro como se ha descrito anteriormente (Spiess et al., Nat. Biotechnol.
2013). Después de la hibridación, los TDB para FcRH5 se purificaron mediante cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) y se caracterizaron mediante filtración en gel analítica, espectrometría de masas y electroforesis en gel de poliacrilamida, como se ha descrito anteriormente. El brazo anti-FcRH5 usado en la generación de los TDB para FcRH5 fue el del anticuerpo anti-FcRH5 1G7, que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 268 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 269. Los brazos anti-CD3 evaluados en la generación de TDB para FcRH5 incluyeron UCHT1v9, 40G5c y 38E4v1.
Se evaluó la unión de los TDB para FcRH5 específicos a linfocitos T CD8+ (unión a CD3), así como su actividad, evaluada mediante ensayos de citotoxicidad y ensayos de activación de linfocitos T in vitro.
A. Afinidad de unión
Las afinidades de unión para cada uno de los TDB para FcRH5 se evaluó mediante análisis FACS, como se ha descrito anteriormente para los TDB para CD20. En resumen, para los ensayos de unión de FACS, se incubaron linfocitos T CD8+ con diversas concentraciones de anticuerpos TDB para FcRH5 a 4 °C durante 30 minutos, después, las células se lavaron y se incubaron con un 2.° anticuerpo (anti-huIgG-PE; BD Bioscience) durante otros 15 minutos, antes de lavarse nuevamente las células y estuviesen listas para el análisis FACS. La figura 70 muestra los resultados de los ensayos de unión de FACS in vitro de los TDB para FcRH5. Los resultados demuestran que la combinación particular del brazo de anticuerpo anti-CD3, 38E4v1, emparejado con el brazo anti-FcRH5, 1G7, da como resultado un anticuerpo para FcRH5 con mayor afinidad de unión a células efectoras.
B. Ensayos in vitro de eliminación de células diana MOLP-2 y de activación de linfocitos T
También se evaluó la capacidad de los TDB para FcRH5 para soportar la eliminación de células diana MOLP-2 que expresan FcRH5 y la activación del efecto citotóxico de los linfocitos T. La citotoxicidad in vitro se monitorizó mediante citometría de flujo. Las células diana se marcaron con CFSE de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen, n.° C34554). Las células diana marcadas con succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE) y los linfocitos T CD8+ purificados procedentes de PBMC humanas se mezclaron a una relación 3:1, con o sin TDB durante 48 horas. Las células se resuspendieron en un volumen igual de PBS FBS al 2 % EDTA 1 mM yoduro de propidio (PI). El análisis por citometría de flujo se realizó en un dispositivo FACSCalibur en formato automatizado. Se contó el número de células diana vivas seleccionando células CFSE+/PI negativas. El porcentaje de citotoxicidad se calculó del siguiente modo: % de citotoxicidad (número de células diana vivas sin TDB - número de células diana vivas con TDB) / (número de células diana vivas sin TDB) x 100. Como se representa en las figuras 71A y 71B, Los TDB para FcRH5 con UCHT1v9 o 38E4v1 en su brazo anti-CD3 mostraron una robusta eliminación de células diana MOLP-2 in vitro en comparación con el TDB para FcRH5 que tiene 40G5c como brazo anti-CD3.
Cuando se evaluaron para ensayos de activación de linfocitos T, las figuras 72A-72D muestran que los TDB para FcRH5 con UCHT1v9 o 38E4v1 en su brazo anti-CD3 eran capaces de producir una robusta actividad de linfocitos T in vitro, en comparación con el TDB para FcRH5 que tenía 40G5c como brazo anti-CD3. En estos ensayos, se mezclaron las células diana y los linfocitos T CD8+ purificados en presencia o ausencia de TDB y se analizó la activación de linfocitos T mediante citometría de flujo. Al final de la incubación, se tiñeron las células con CD8-FITC (BD Bioscience, 555634) CD69-PE (BD Bioscience, 555531) y CD107a-Alexa-Fluor647 (eBioscience, 51-1079). Como alternativa, después de teñirse la superficie con CD8-FITC y CD69-PE, se fijaron las células y se permeabilizaron con solución Cytofix/CytoPerm (BD Bioscience, 554722) y se tiñeron intracelularmente con anti-granzima B-Alexa-Fluor647 (BD Bioscience, 560212). La activación de linfocitos T se evaluó mediante el porcentaje de células CD8+CD69+, CD8+CD107a+ y CD8+CD69+GranzimaB+.
Ejemplo 5. Generación y caracterización de TDB para CD3/HER2 a modo de ejemplo (TDB para HER2)
Los presentes inventores también exploraron la capacidad de los anticuerpos TDB para reclutar las actividades citotóxicas de los linfocitos T a la hora de erradicar células tumorales mediante el reconocimiento de un antígeno de la superficie celular diferente, HER2. Con este fin, se generaron y caracterizaron anticuerpos anti-CD3 biespecíficos que tienen un brazo de anti-CD3 y un brazo de anti-HER2 (TDB para HER2). Como se ha descrito anteriormente, Los TDB para HER2 se produjeron como anticuerpos de longitud completa en el formato de botón en ojal en forma de una IgG1 humana, como se ha descrito anteriormente (Atwell et al. J. Mol. Biol. 270: 26-35, 1997). Los medios anticuerpos se expresaron o bien en E. coli o en células de ovario de hámster chino (CHO), se purificaron mediante cromatografía de afinidad de proteína A y se hibridaron los pares de medios anticuerpos adecuados in vitro como se ha descrito anteriormente (Spiess et al., Nat. Biotechnol. 2013). En caso de llevarse a cabo la producción del anticuerpo TDB en células CHO, el anticuerpo incluyó una mutación de aglucosilación, por ejemplo, en el resto N297 (por ejemplo, N297G), de tal forma que el anticuerpo TDB era una variante sin función efectora y era incapaz de iniciar la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC). Después de la hibridación, los t Db para HER2 se purificaron mediante cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) y se caracterizaron mediante filtración en gel analítica, espectrometría de masas y electroforesis en gel de poliacrilamida, como se ha descrito anteriormente. Un brazo antih ER2 usado en la generación de los TDB para HER2 fue el del anticuerpo anti-HER2 hu4D5, que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 270 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 271. Se generaron TDB para HER2 adicionales para dirigirse a diferentes regiones del dominio extracelular (ECD) de HER2. Un anticuerpo anti-HER2, 2C4, se usó como brazo anti-Her2 que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 593 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 594. Otro anticuerpo anti-HER2 usado como brazo anti-HER2 fue el del anticuerpo anti-HER2, 7C2, que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 595 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 596. Otros brazos anti-HER2 usados en la generación de TDB para HER2 incluyeron variantes de afinidad de hu4D5, hu4D5.91A y hu4D5.Y100A (descritos en el documento US 7.435.797).
Se evaluó la unión de los TDB para HER2 específicos a linfocitos T CD8+ (unión a CD3) y a células SKBR3 (unión a Her2), así como su actividad, evaluada mediante ensayos de citotoxicidad y ensayos de activación de linfocitos T in vitro.
A. Afinidad de unión
Las afinidades de unión para cada uno de los TDB para HER2 se evaluó mediante análisis mediante FACS, como se ha descrito anteriormente para los TDB para CD20. En resumen, para los ensayos de unión de FACS, Se incubaron células Jurkat (para el antígeno CD3), células CD8+ humanas (para el antígeno CD3) o SKBR3 (para el antígeno Her2) con diversas concentraciones de anticuerpos TDB para HER2 a 4 °C durante 30 minutos, después, las células se lavaron y se incubaron con un 2.° anticuerpo (anti-huIgG-PE, BD Bioscience; o anti-hulgG-AlexaFluor647, Southern Biotech) durante otros 15 minutos, antes de lavarse nuevamente las células y estuviesen listas para el análisis FACS. La media geométrica de la fluorescencia se leyó mediante citometría de flujo. Las figuras 73, 76A, 78A-78C, 79A y 80A-80B muestran los resultados de los ensayos de unión de FACS in vitro de los TDB para HER2. Se evaluaron múltiples brazos para HER2 que se unen a diferentes regiones de HER2 en combinación con múltiples brazos para CD3 que se unen a diversas regiones de CD3e para caracterizar las propiedades de unión de cada combinación. La figura 76A proporciona la estructura cristalina del ECD de HER2 y la de CD3e y destaca las regiones en cada una a las que se unen los diferentes brazos para HER2 y CD3. El anticuerpo para HER2 hu4D5 se conoce como trastuzumab y se une a un epítopo en el dominio IV de HER2 que es la región de proteína más próxima a la membrana celular. El anticuerpo monoclonal humanizado 2C4 (rhuMAb 2C4) también se conoce como pertuzumab y se une a un epítopo en el dominio II de HER2 que se encuentra a 50 Angstrom del sitio de unión de hu4D5. Pertuzumab (PERJETA®, Genentech, Inc, South San Francisco) representa el primero de una nueva clase de agentes conocidos como inhibidores de la dimerización de HER (HDI) y funciona inhibiendo la capacidad de HER2 para formar heterodímeros u homodímeros activos con otros receptores de HER (tales como EGFR/HER1, HER2, HER3 y HER4) (Harari y Yarden. Oncogene 19:6102-6114, 2000; Yarden y Sliwkowski. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2:127-137, 2001; Sliwkowski. Nat. Struct. Biol. 10:158-159, 2003; Cho et al. Nature 421:756-60, 2003; y Malik et al. Pro. Am. Soc. Cancer Res.
44:176-177, 2003). El anticuerpo murino anti-HER2 7C2 se une a un epítopo en el dominio I de HER2 (Publicación PCT n.° WO 98/17797) que se encuentra a 100 Angstrom de distancia de la región de HER2 a la que se une hu4D5 (figura 76A).Adicionalmente, se evaluó la afinidad de unión del TDB para HER2 con múltiples brazos de anti-CD3. Uno de los brazos anti-HER2 dados se combinó con brazos de direccionamiento a CD3 humano de alta afinidad, tales como SP34 y 38E4v1. Otras combinaciones de TDB para HER2 incluyeron los brazos de direccionamiento a CD3 humano de baja afinidad 40G5c o el brazo de direccionamiento a CD3 murino de 2C11. UCHT1v9 por su brazo anti-CD3 y hu4D5 por su brazo anti-HER2, citado en el presente documento como TDB para HER2 (uCHT1v9/hu4D5) o TDB para HER2, se comparó con el anticuerpo anti-HER2, trastuzumab y los fragmentos Fab de trastuzumab en un ensayo de Scatchard competitivo (Ramirez-Carrozzi et al. Nature Immunology. 12: 1159-1166, 2011). En este ensayo, se determinó la unión a SKBR-3 mediante unión competitiva a Fab 125I-trastuzumab con trastuzumab, trastuzumab-Fab o TDB para HER2 biespecífico. La figura 74A muestra los resultados del ensayo de Scatchard competitivo in vitro del TDB para HER2.
B. Ensayos in vitro de eliminación de células diana SKBR3 y MCF7 y de activación de linfocitos T
Las combinaciones de TDB para HER2 de uno de los tres brazos anti-HER2 (hu4D5, 2C4 y 7C2) con el brazo anti-CD3 o bien de alta afinidad, 38E4v1 o de baja afinidad, 40G5c se ensayaron in vitro respecto de su capacidad para mediar la eliminación de células diana de células SKBR3 o MCF7 que expresan HER2 (figura 77). La actividad in vitro de los TDB de hu4D5 con cualquiera de los brazos anti-CD3 demostró ser más eficaz que los TDB con 2C4 y 7C2 a la hora de mediar la eliminación máxima de células SKBR3 y MCF7, medida mediante su CE50 (figura 78). Esta actividad de eliminación también dependía del brazo para CD3 utilizado. La combinación del brazo anti-CD3 38E4v1 con uno cualquiera de los brazos anti-HER2 hu4D5, 2C4 o 7C2 fue más eficaz que la de las combinaciones de TDB para HER2 con 40G5c (figura 79). Las pruebas adicionales de las 6 combinaciones de TDB para HER2 revelaron que su actividad de eliminación de células diana no era dependiente del nivel de expresión de HER2 en células diana. La figura 80 muestra que los TDB para HER2 no eran selectivos para células diana SKBR3 con alta expresión de HER2 frente a células diana MCF7 con baja expresión de HER2. En cambio, la actividad del TDB para h ER2 dependía de la afinidad del brazo anti-HER2 por HER2 (figura 81). Los TDB con baja afinidad para HER2 mantuvieron la actividad en células MCF7 con baja expresión de HER2 y no fueron capaces de eliminar de manera selectiva a células SKBR3 con amplificación de HER2 (figura 82).
También se evaluó la especificidad de los TDB para HER2 del brazo anti-HER2 por sus respectivos epítopos de HER2. La actividad de eliminación del HER2-TDB hu4D5-40G5c se limitó cuando se combinó con concentraciones crecientes de trastuzumab (hu4D5). Sin embargo, la eficacia de trastuzumab no se ve afectada por la combinación del TDB con hu4D5 con el anticuerpo hu4D5 (figura 83). Por el contrario, la eliminación de células diana mediada por 2C4-40G5c o 7C2 38E4v1 se bloqueó mediante la coadministración de los anticuerpos monoespecíficos bivalentes pertuzumab (2C4) o 7C2, respectivamente (figura 83). Cuando se evaluaron brazos anti-HER2 adicionales en múltiples ensayos de afinidad, todos los clones que demostraban actividad de TDB para HER2 alta o media compitieron con trastuzumab o pertuzumab (figura 84). Para la identificación de TDB candidatos para su ensayo in vivo, se ensayaron brazos para CD3 de alta (38E4v1, 38E4 y SP34) y baja afinidad (40G5c y 2C11 ) in vitro con linfocitos T c D3+ humanizados procedentes de ratón en combinación con los brazos anti-HER2 de hu4D5, 2C4 y 7C2 (figuras 85-86). A partir de este ensayo, se seleccionaron tres TDB candidatos basándose en su actividad de eliminación para su caracterización adicional in vivo: hu4D5-SP34, hu4D5-2C11 y 2C4-38E4. El tratamiento de animales portadores de tumores que expresan HER2 con el TDB para HER2 hu4D5-2C11 dio como resultado un aumento en las células CD45+ y CD8+ en el tumor tan pronto como 4 horas después del tratamiento. Tras un análisis adicional, los tumores tratados con HER2-TDB revelaron un aumento en los linfocitos T IFNy+ y PD1+ CD8+, así como una presencia aumentada de linfocitos T reguladores (Treg) (figura 87B). La detección del aumento de infiltrados inmunitarios en tumores también se correlacionó con una reducción en el volumen tumoral de los animales tratados con HER2-TDB, en comparación con el tratamiento de control de vehículo (figura 87A). En la figura 88A, el brazo anti-HER2 de hu4D5 combinado con el brazo anti-CD3 de baja afinidad, 2C11 o el brazo anti-CD3 de alta afinidad, SP34, dieron como resultado regresión tumoral en ratones transgénicos para HER2. Sin embargo, no se observó esta respuesta con el brazo anti-HER2 de 2C4, combinado con el brazo anti-CD3 de alta afinidad de 38E4 (figuras 88A-88B).
También se comparó el TDB para HER2 con trastuzumab bivalente y fragmentos Fab de trastuzumab respecto de su capacidad para inhibir directamente la proliferación de SKBR3. Las células diana SKBR3 que expresan HER2 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5x103 células/pocillo y se incubaron durante una noche para la adherencia celular antes del tratamiento con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo indicado. La proliferación/viabilidad celular se analizó después de 6 días de tratamiento mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CELLTITERGLO® (Promega, Madison, WI). Los resultados de este ensayo se muestran en la figura 74B. Adicionalmente, se llevó a cabo un ensayo de citotoxicidad in vitro con trastuzumab, trastuzumab producido en E. coli y TDB para HER2 para medir su capacidad para inducir citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) mediada por células NK (Jefferis Trends in Pharmacological Sciences. 30: 356-362, 2009; Simmons et al.
Journal of Immunological Methods. 263: 133-147, 2002). Los anticuerpos producidos en E. coli no están glucosilados, lo que da como resultado una unión impedida a FcyR, que es necesaria para mediar la ADCC. El ensayo de citotoxicidad se llevó a cabo como en Junttila et al. (Cancer Research. 70: 4481-4489, 2010) con un kit de detección de citotoxicidad; LDH (Roche, Mannheim, Alemania). En resumen, se detectaron las células lisadas mediante liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) después de 4 horas de tratamiento con el anticuerpo especificado. Los resultados se muestran en la figura 74C.
También se evaluó la capacidad de los TDB para HER2 para soportar la eliminación de células diana SKBR3 que expresan HER2 y la activación del efecto citotóxico de los linfocitos T. La citotoxicidad in vitro se monitorizó mediante citometría de flujo. Las células diana se marcaron con succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen, n.° C34554). Las células diana marcadas con CFSE y los linfocitos T CD8+ purificados de PBMC humanas se mezclaron a una cierta relación E:T (como se indica en las leyendas de la figura), con o sin TDB durante 24 horas. Al final de la incubación, las células se desprendieron con tripsina y se recogieron de la placa. Las células se resuspendieron en un volumen igual de PBS FBS al 2 % EDTA 1 mM yoduro de propidio (PI). El análisis por citometría de flujo se realizó en un dispositivo FACSCalibur en formato automatizado. Se contó el número de células diana vivas seleccionando células CFSE+/PI negativas. El porcentaje de citotoxicidad se calculó del siguiente modo: % de citotoxicidad (número de células diana vivas sin TDB - número de células diana vivas con TDB) / (número de células diana vivas sin TDB) x 100. Como se representa en la figura 75, el TDB para HER2 mostró una robusta eliminación de células diana SKBR3 in vitro en comparación con el TDB para HER2 que tenía la variante de afinidad de hu4D5 91A o Y100A como su brazo anti-HER2 (CE50 de hu4D5/ UCHT1v9 TDB = 0,1 ng/ml; hu4D5.91A/ UCHT1v9 TDB = 25,5 ng/ml; hu4D5.Y100A/ UCHT1v9 TDB = no se pudo determinar).
Adicionalmente, la afinidad de la variante hu4D5 anti-HER2 (0,4 nM) al dominio extracelular (ECD) de HER2 es mayor que la de los brazos para HER22C4 (2,0 nM) y 7C2 (1,7 nM), que se muestra en la figura 76b . Además, la figura 76C muestra que el HER2-TDB hu4D5 es un mediador más potente de la eliminación de células diana MCF7 que e1HER2-TDB 2C4 y el HER2-TDB 7C2. Además, se ensayó la cinética de la eliminación inducida por el TDB para HER2. Como se observa en la figura 94A, no se detectó una actividad de eliminación significativa a las 4-12 horas. Se detectó una eliminación robusta a las 24 horas y la actividad de eliminación aumentó con el paso del tiempo. Como se muestra en las figuras 90A - 90C y 92C, la comparación adicional de los brazos anti-CD3 de1HER2-TDB hu4D5 demostró la eficacia de los distintos clones a la hora de mediar la eliminación de células SKBR3 que expresan HER2. En particular, dos TDB para HER2, hu4D5/38E4c y hu4D5/40G5c, fueron sorprendentemente tan eficaces o mejores a la hora de mediar la eliminación de células diana que el TDB para HER2 hu4D5/SP34 (figuras 90B y 90C).
Cuando se evaluaron para ensayos de activación de linfocitos T, la figura 89 muestra que el TDB para HER2 era capaz de inducir de manera robusta la actividad de linfocitos T in vitro, en comparación con el TDB para HER2 que tenía la variante de afinidad de hu4D591A o Y100A como su brazo anti-HER2. Tres brazos anti-CD3 (SP34, 38E4c y 40G5c) del HER2-TDB hu4D5 ensayados mostraron diferentes afinidades de unión por el antígeno CD3 en linfocitos T CD8+ humanos, como se observa en la figura 91A. No obstante, los tres HER2-TDB fueron capaces de mediar la activación de linfocitos T CD8+ (figura 91B). Los análisis adicionales de los brazos anti-CD338E4 y 38E4c de1HER2-TDB de hu4D5 para mediar la activación de linfocitos T CD8+ se muestran en la figura 92D. Se ensayó adicionalmente la cinética de la activación de linfocitos T inducida por el TDB para HER2. Aparecen signos tempranos de activación de linfocitos T (CD69) 4h después del tratamiento con TDB para HER2. Sin embargo, los marcadores de activación tardía (CD107a extracelular) se detectaron más tarde, en el punto de tiempo de 24 horas (figura 94A). Adicionalmente, no se detectó activación de linfocitos T después de 48 horas cuando se incubaron las células CD8+ con TDB para HER2 o células diana que no expresan HER2 humano (células BJAB). Se observó una robusta activación de linfocitos T cuando se usaron células SKBR3 HER2+ como dianas, acompañada por la liberación de gránulos citotóxicos (figura 93A).
Los presentes inventores también evaluaron la capacidad del TDB para HER2 a la hora de inducir la eliminación de células diana BT474 y activar linfocitos T para las cinco relaciones a continuación de linfocitos T CD8+ efectores a células diana: 1:5, 1:2, 1:1, 3:1 y 5:1. Este experimento revela que la citotoxicidad medida por la liberación de LDH se reducía significativamente por la titulación de células efectoras; sin embargo, incluso con una relación E:T de <1:1, se detectó una débil señal de LDH y una robusta activación de linfocitos T (figura 94B).
En estos ensayos, se mezclaron las células diana y los linfocitos T CD8+ purificados en presencia o ausencia de TDB y se analizó la activación de linfocitos T mediante citometría de flujo. Al final de la incubación, se tiñeron las células con CD8-FITC (BD Bioscience, 555634) CD69-PE (BD Bioscience, 555531) y CD107a-Alexa-Fluor647 (eBioscience, 51-1079). Opcionalmente, las células se tiñeron con CD8-FITC y CD69-PE, donde se evaluó la activación de linfocitos T por el porcentaje de CD8+CD69+ en células CD8+. Como alternativa, después de teñirse la superficie con CD8-FITC y CD69-PE, se fijaron las células y se permeabilizaron con solución Cytofix/CytoPerm (BD Bioscience, 554722) y se tiñeron intracelularmente con anti-granzima B-Alexa-Fluor647 (BD Bioscience, 560212). Se evaluó la activación de linfocitos T mediante el porcentaje de células CD8+CD107a+.
Otra medida para la citotoxicidad mediada por linfocitos T para el TDB para HER2 (UCHT1v9/hu4D5) medida es un ensayo de exocitosis de gránulos. La figura 93B muestra los resultados para perforina soluble (Cell Sciences), granzima A y granzima B (eBioscience) detectados del medio de crecimiento mediante ELISA de acuerdo con los protocolos del fabricante. En este ensayo, se usó un TDB de control (10 ng/ml), uno que comparte el mismo brazo para CD3 que el TDB para HER2 pero que tiene un brazo diana irrelevante o TDB para HER2 (10 ng/ml). Los anticuerpos se incubaron individualmente durante 18 horas con células diana SKBR3 y células mononucleares efectoras de sangre periférica (PBMC), que se separaron de la sangre de voluntarios sanos usando medio de separación de linfocitos (MP Biomedicals, Solon, OH). La citotoxicidad in vitro se midió mediante liberación de LDH como se ha descrito anteriormente. Se llevó a cabo una serie de ensayos de apoptosis con TDB para HER2 (1 ng/ml), PBMC efectoras y células diana SKBR3. Después de 24 horas de tratamiento, la exocitosis de gránulos coincidió con una significativa elevación inducida por TDB para HER2 de la actividad de caspasa 3/7 (ensayo CASPASE-GLO® 3/7, Promega), la apoptosis (ensayo ELISAplus de detección de muerte celular, Roche) y la citotoxicidad, medida mediante liberación de lactato deshidrogenasa (LDH), que se ha descrito anteriormente (figura 93C).
Se midió la capacidad del TDB para HER2 a la hora de inducir la eliminación de células 3T3 transfectadas con HER2 o vector mediante el ensayo de citotoxicidad de LDH anteriormente mencionado, donde no se detectó eliminación de células 3T3 transfectadas con vector después de 19 horas; por el contrario, las células 3T3 transfectadas con HER2 se eliminaron con elevada eficiencia (figura 93D). Se modificó el ensayo de eliminación para bloquear la unión del brazo de HER2 usando Fab de trastuzumab (1 pg/ml) o dominio extracelular de HER2 soluble (ECD de HER2) (1 pg/ml) y esto dio como resultado la inhibición eficiente de la actividad de eliminación después de 24 horas (figura 93E). Para confirmar que la eliminación depende de linfocitos T, se redujeron las células CD3+ de las PBMC usando MicroPerlas para CD3+ de Miltenyi (n.° 130-050-101). La figura 93F muestra que la reducción dio como resultado pérdida de actividad de eliminación de células diana después de 19 horas, evaluada mediante análisis FACS en presencia de TDB para HER2.
El TDB para HER2 induce proliferación de linfocitos T
Para investigar si el TDB para HER2 induce proliferación de linfocitos T, se cocultivaron linfocitos T CD8+, células diana (SKBR3) y 0,1 pg/ml de TDB para HER2, seguido de cultivo de linfocitos T en ausencia de células diana y de TDB para HER2. Se midió la proliferación de linfocitos T en el día 3 mediante citometría de flujo como una dilución de CFSE en células CD8+/PI- con divisiones celulares. Después de 3 días, un 75 % de los linfocitos T pulsados con TDB para HER2 y células diana sufrieron una división celular, como se muestra en la figura 95A. Se evaluó el número de linfocitos T inducido por el TDB para HER2 marcando linfocitos T CD8+ purificados con CFSE de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen, n.° C34554). Se incubaron linfocitos T CD8+ marcados con CFSE con células diana en presencia o ausencia de TDB durante 19 horas. Se recogieron linfocitos T, se lavaron y se cultivaron durante 2-7 días (RPMI FBS al 10 %). Se detectó mediante FACS el número de células CD8+ vivas (CD8+/PI-) y el porcentaje de células CFSE dim. En la figura 95B, el número de células no aumentó. La suplementación adicional del medio de crecimiento con IL-2 (20 ng/ml) proporcionó una señal de supervivencia a las células CD8+ y se detectó una robusta proliferación de linfocitos T en los linfocitos T, pero solo si se les expone tanto al TDB para HER2 como a las células diana (figura 95C). De manera importante, no se detectó efecto de vecindad en células expresoras no diana en condiciones donde se eliminó a la mayoría de células HER2+ en el mismo cultivo. El TDB para HER2 indujo la proliferación y la expansión policlonal de los linfocitos T, lo que puede ser crítico para la amplificación de linfocitos infiltrantes en tumores.
La actividad de TDB para HER2 se correlaciona con el nivel de expresión de HER2 en células diana
Para investigar la relación entre el número de copias de la diana y la actividad del TDB, se seleccionó un panel de líneas celulares de cáncer con un número predeterminado de receptores HER2 en la membrana (Aguilar et al. Oncogene. 18:6050-62, 1999). Los niveles de expresión de proteína HER2 en una línea celular negativa para HER2 (BJAB LUC), 3 líneas celulares con baja expresión de He R2 (MDA435, MDA231, MCF7) y 3 líneas celulares que sobreexpresan/con amplificación de HER2 (MD453, SKBR3, BT474) se detectaron mediante transferencia de Western (figura 96A). Se incubaron líneas celulares negativas para HER2, con baja expresión de HER2 y que sobreexpresan HER2 con TDB para HER2 y con PBMC efectoras a una relación de E:T de 25:1 durante 26 horas. En este punto de tiempo, se detectó la citotoxicidad usando el ensayo de liberación de LDH. La figura 96B muestra que las células con amplificación/sobreexpresión de HER2 eran significativamente más sensibles a la eliminación mediada por TDB (p=0,015, prueba de la t) y se lisaron eficazmente a concentraciones de femtomolar a bajo picomolar (CE50=0,8-3 pM). Las líneas celulares que expresaban bajos niveles de HER2 fueron significativamente menos sensibles al anticuerpo TDB para HER2 (CE50=33-51 pM). Fueron suficientes tan pocas como <1000 copias de antígeno diana para soportar la eliminación de linfocitos T.
Para los estudios efectuados en las figuras 96C-96D, se usó como diana conjunta la línea celular MCF7 o la línea celular BJAB con células SKBR3 en presencia de TDB para HER2 en el mismo ensayo de eliminación. En este ensayo, se marcaron células MCF7 o BJAB con CFSE y se mezclaron con SKBR3 y PBMC (E:T de 20:1), seguido de 19 horas de tratamiento con TDB para HER2. Las células se tiñeron con APC anti-HER2 y PI. La figura 96C muestra el porcentaje de células SKBR3 vivas (HER2 alto, PI-) y MCF7 (CFSE+. PI-) detectadas mediante FACS y normalizadas a las perlas fluorescentes. No se pudo detectar eliminación de células MCF7 a la CE50 para la eliminación de SKBR3. Se muestra el porcentaje de células SKBR3 (HER2 alto, PI-) y BJAB (CFSE+ PI-) vivas detectado mediante FACS y normalizado a las perlas fluorescentes. No se pudo detectar eliminación significativa de células BJAB a ninguna concentración de TDB para HER2 (figura 96D).
Una muy baja ocupación de la diana es suficiente para la actividad del TDB
A continuación, se calculó la ocupación de HER2 a la CE50 para el TDB para HER2 usando la fórmula [D]/[D]+Kd (donde D = fármaco y la Kd para el TDB para HER2 fue de 5,4 nM). El número de copias de HER2 se ha comunicado con anterioridad (Aguilar et al. Oncogene. 18: 6050-6062, 1999). Los valores de CE50 se calcularon a partir de datos de respuesta a la dosis en la figura 97B. La figura 96E muestra que en todas las líneas celulares ensayadas, fue suficientemente una ocupación de la diana menor de un 1 % para una eliminación eficiente. En el caso de las líneas celulares que expresan HER2, la ocupación necesaria fue incluso menor (0,01-0,05 %). El número absoluto calculado de TDB para HER2 unido a HER2 a la CE50 fue tan bajo como de 10-150 en las líneas celulares con baja expresión. Estos resultados destacan la extrema potencia del TDB para HER2 y son consistentes con estudios de activación de TCR, que sugieren que se necesita el acoplamiento a tan pocos como 1-25 TCR para activar respuestas de linfocitos T (Irvine et al. Nature. 419: 845-849, 2002; Purbhoo et al. Nature Immunology. 5: 524-530, 2004; Sykulev et al. Immunity. 4: 565-571, 1996). La potencia del TDB para HER2 se encontró consistentemente en el intervalo de bajo picomolar a femtomolar. Además, fueron suficientes tan pocos como 10-500 TDB unidos a HER2 para inducir una citotoxicidad in vitro significativa. Fueron suficientes tan pocas como ~1000 copias de HER2 en la membrana plasmática para inducir la eliminación. Estos estudios también demostraron una correlación entre los niveles de expresión de la diana y la sensibilidad in vitro al TDB para HER2.
El TDB para HER2 es eficiente a la hora de eliminar células de cáncer HER2+ resistentes a las terapias con anti-HER2
A continuación, se examinaron líneas celulares que se había demostrado con anterioridad que expresan altos niveles de HER2 pero que son insensibles a los efectos celulares directos de trastuzumab y lapatinib in vitro (Junttila et al., Cancer Cell, 15:429-40, 2009; Junttila et al. Breast Cancer Res Treat, 2010). Para algunas líneas celulares, la activación de la vía de PI3K causada por mutaciones activantes adquiridas en la subunidad catalítica de PI3K (KPL4, HCC202) o por la pérdida de PTEN (HCC1596) puede provocar resistencia. Un panel de seis líneas celulares (5 de mama, 1 de pulmón) se ensayó respecto de su liberación de LDH como una medida de la citotoxicidad en presencia de PBMC efectoras, a una relación de 10:1 y TDB para HER2 durante 19 horas. La CE50 para la eliminación mediada por TDB para HER2 se encontraba en el intervalo femtomolar o de picomolar bajo (figura 97A). Se trataron clones de BT474-M1 precursoras y resistentes a T-DM1 con T-DM1 durante 3 días. En este punto de tiempo, se midió la viabilidad celular usando CELLTITERGLO® (figura 97B). Se ha comunicado con anterioridad la sensibilidad de las líneas celulares a T-DM1 (Junttila et al. Breast Cancer Res Treat. 2010; Lewis Phillips et al. Cancer Research. 68: 9280-9290, 2008). En comparación, los clones BT474-M1 precursores y resistentes a T-DM1 se trataron con TDB para HER2 en presencia de linfocitos T CD8+ efectores a una relación de 3:1 durante 24 horas. La citotoxicidad se detectó usando ensayo FACS (figura 97C). Además, el TDB para HER2 fue eficaz para eliminar células de cáncer de pulmón HER2+. Usando dos modelos de línea celular independientes KPL4 y BT474, (figura 97B-97C), la resistencia adquirida a T-DM1 no afectó la sensibilidad al TDB para HER2.
El reclutamiento de actividad de eliminación de linfocitos T con TDB para HER2 es dependiente de la expresión de HER2, pero independiente de la vía de señalización de HER2, lo que sugiere que el TDB para HER2 puede ser eficiente en el tratamiento de tumores que son refractarios a las terapias anti-HER2 actuales. De manera acorde, los datos demostraron una actividad igual en el tratamiento de líneas celulares multirresistentes a trastuzumab/lapatinib en comparación con las células sensibles. La resistencia en estas células se genera mediante diversos mecanismos que afectan a la vía de HER2. Los datos presentados en este caso sugieren que el intercambio a un mecanismo de acción alternativo usando el TDB para HER2 puede permitir ampliamente superar la resistencia a los conjugados de anticuerpo-fármaco (por ejemplo, T-DM1), inhibidores de molécula pequeña dirigidos (por ejemplo, lapatinib) y a anticuerpos monoclonales terapéuticos que bloquean la vía de señalización (por ejemplo, trastuzumab).
Farmacocinética del TDB para HER2 en ratas
Para evaluar el perfil farmacocinético (PK) del TDB para HER2, se utilizaron ratas Sprague-Dawley. Los animales fueron separados en los dos grupos a continuación: Grupo 1: TDB para HER2 (10 mg/kg, IV individual, n = 4); Grupo 2: trastuzumab (10 mg/kg, IV individual, n = 4). Se tomaron muestras de 4 ratas por grupo en puntos de tiempo a lo largo de 35 días después de la dosis. Se recogieron aproximadamente 0,2 ml de sangre completa a través de la vena yugular (bajo anestesia con CO2/O2). Se dejaron coagular las muestras y se centrifugaron con refrigeración (5 °C durante 10 minutos a 2000 x g) para obtener el suero. Las muestras de suero se ensayaron respecto de IgG mediante ELISA, donde se usó anti-huFc de burro recubierto en una placa de microtitulación para capturar los anticuerpos anti-HER2 humanizados en circulación y anticuerpo de cabra anti-huFc-HRP (adsorbido a ratón) para su detección. Los parámetros PK se determinaron con un método de 2 compartimentos (Modelo 7) usando WINNONLIN®, versión 5.2.1 (Pharsight Corp., Mountain View, CA). El TDB para HER2 no reacciona de manera cruzada con CD3 de rata o HER2 de rata y mostró una disposición bifásica típica de una IgG1 con una corta fase de distribución y una lenta fase de eliminación (figura 98). Tanto la eliminación como la semivida del TDB para HER2 fueron similares a trastuzumab y dentro del intervalo esperado de una IgG1 típica en ratas.
El TDB para HER2 inhibe el crecimiento tumoral in vivo en ratones inmunocomprometidos
La eficacia in vivo del TDB para HER2 se ensayó en ratones NOD-SCID, que carecen de linfocitos T y B funcionales endógenos y tienen niveles reducidos de los tipos celulares NK, DC y de macrófagos. En este experimento, se implantó en ratones NOD/SCID (NOD.CB17-Prkdcscid/J, Jackson Labs West) 0,36 mg de gránulos de estrógeno de liberación sostenida durante 60 días (Innovative Research of America) 1 a 3 días antes de la inoculación de células, por vía subcutánea en el flanco opuesto al de inoculación del tumor. En el día 0, se inyectaron 5x106 células MCF7-neo/HER2 o bien solas o junto con 10x106 PBMC humanas no estimuladas de uno de dos donantes sanos (PBMC 1,2) en HBSS-matrigel en los panículos adiposos mamarios 2/3 derechos. Los ratones inoculados se dividieron en los cinco grupos a continuación: Grupo 1: vehículo (TDB de control, 0,5 mg/kg, qwk x 3, IV, comenzando en el día 0, n=5-10); Grupo 2: PBMC(1) (PBMC (1) TDB de control, 0,5 mg/kg, qwk x 3, IV, comenzando en el día 0, n=5-10); Grupo 3: PBMC (1) TDB para HER2 (Pb MC (1) TDB para HER2, 0,5 mg/kg, qwk x 3, IV, comenzando en el día 0, n=5-10); Grupo 4: PBMC(2) (PBMC (2) TDB de control, 0,5 mg/kg, qwk x 3, IV, comenzando en el día 0, n=5-10); y Grupo 5: PBMC (2) TDB para HER2 (PBMC (2) TDB para HER2, 0,5 mg/kg, qwk x 3, IV, comenzando en el día 0, n=5-10). Los primeros tratamientos se administraron 2 horas después de la inoculación. Los volúmenes tumorales de ratones individuales y los volúmenes tumorales ajustados de los grupos de tratamiento se presentan en la figura 99A, donde el TDB para HER2 previno el crecimiento de tumores que expresan HER2.
Se evaluó adicionalmente la dependencia de las PBMC humanas en el TDB para HER2 en un modelo de ratón inmunocomprometido similar. De nuevo, se inyectaron 5x106 células MCF7-neo/HER2 o bien solas o junto con 10x106 PBMC humanas no estimuladas de uno de un donante sano (PBMC 3) en HBSS-matrigel en los panículos adiposos mamarios 2/3 derechos y se administraron los primeros tratamientos 2 horas después de la inoculación. En la figura 100A, los ratones inoculados se dividieron en los dos grupos a continuación: Grupo 1: sin tratar (n=7); Grupo 2: TDB para HER2 (TDB para HER2, 0,5 mg/kg, qwk x 3, IV, comenzando en el día 0, n=7). En la figura 100B, los ratones inoculados se dividieron en los tres grupos a continuación: Grupo 1: sin tratar (n=7); Grupo 2: PBMC(3) (PBMC (3) vehículo, 0,5 mg/kg, qwk x 3, IV, comenzando en el día 0, n=7); Grupo 3: PBMC(3) TDB de control (PBMC(3) TDB-2C11 de control, 0,5 mg/kg, qwk x 3, IV, comenzando en el día 0, n=7). Las medidas de volumen tumoral resultantes no revelan efecto en el crecimiento tumoral en los animales tratados con TDB de control.
El TDB para HER2 provoca regresión de los tumores mamarios grandes en ratones transgénicos para huHER2
Para modelar la actividad del TDB para HER2 en ratones inmunocompetentes, se usaron ratones transgénicos para MMTV-huHER2 humano (Finkle et al. Clinical Cancer Research. 10: 2499-2511; 2004) y un supuesto TDB para HER2 que comprende un clon de anticuerpo reactivo con CD3 de IgG2A murino, clon 2C11 (Leo et al. Proc Natl Acad Sci USA. 84: 1374-1378, 1987) se generó para evitar la respuesta inmunitaria contra el TDB. Para la expresión como mulgG2a, se introdujeron mutaciones de botón en ojal equivalentes (Atwell et al. J Mol Biol. 270: 26-35, 1997) en la región Fc, así como D265A y N297G (numeración de EU) para suprimir la función efectora. En los TDB para HER2 de mulgG2a, el brazo de "botón" es el hu4D5 murino anti-HER2 y el "ojal" es o bien 2C11 quimérico anti-CD3 murino (Leo et al. Proc Natl Acad Sci USA. 84: 1374-1378, 1987) (TDB 2C11/hu4D5) o SP34 de ratón anti-huCD3 (Pessano et al. The EMBO Journal. 4: 337-344, 1985) (TDB SP34/hu4D5). Los anticuerpos biespecíficos mulgG2a se expresaron en células CHO y se ensamblaron mediante ensamblaje in vitro. Se purificaron los anticuerpos biespecíficos de los contaminantes mediante cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) como se ha descrito en otras partes (Speiss et al. Nat Biotechnology. 31: 753-758, 2013). El material resultante se analizó respecto de los niveles de endotoxina usando un sistema de ensayo portátil ENDOSAFE® (Charles River, EE. UU.) y cuando fuese necesario, se redujo el contenido de endotoxina lavando la proteína con TRITON™ X-114 al 0,1 %. La actividad in vitro de hu4D5/2C11-TDB fue similar a la del TDB para HER2 reactivo con CD3 humano (figura 101).
En las figuras 99B-99D, se dividieron los animales transgénicos para MMTV-huHER2 con tumores mamarios establecidos en los dos grupos a continuación: Grupo 1: vehículo (0,5 mg/kg, qwk x 5, IV, comenzando en el día 0, n=7); y Grupo 2: TDB para HER2 (TDB para HER2 (2C11/hu4D5), 0,5 mg/kg, qwk x 5, IV, comenzando en el día 0, n=7). La figura 99B muestra que se detectó regresión en un 57 % de los ratones y un 43 % de los ratones no tuvieron tumor detectable después del tratamiento. La figura 99C muestra que el TDB para HER2 (2C11/hu4D5) dio como resultado una regresión tumoral mayor del 50 %, con la excepción de un tumor. Los tumores sensibles incluyeron tumores que tenían >1000 mm3 al comienzo del tratamiento, como se observa en la figura 99D. En un experimento similar, se usaron dos TDB de control, donde uno es un TDB de control de brazo para CD3, uno con el brazo específico para CD3 cambiado al brazo para CD3 específico de humano (TDB para HER2 (SP34/hu4D5)) y uno es un TDB de control, uno que comparte el mismo brazo para CD3 que el TDB para HER2 (2C11/hu4D5), pero tiene un brazo para una diana irrelevante (CTRL TDB-2C11). En la figura 99E, se dividieron los animales transgénicos para m Mt V-huHER2 con tumores mamarios establecidos en los dos grupos a continuación: Grupo 1: TDB de control de brazo para CD3 (TDB para HER2 (SP34/hu4D5), 0,5 mg/kg, qwk x 5, IV, comenzando en el día 0, n=5); y Grupo 2: TDB de control (TDB-2C11 de control, 0,5 mg/kg, qwk x 5, IV, comenzando en el día 0, n=5). El crecimiento de los tumores transgénicos MMTV-huHER2 no se vio afectado por los TDB de control.
Se evaluó adicionalmente la eficacia in vivo del TDB para HER2 en ratones transgénicos para huCD3. Los ratones transgénicos para CD3e humano se han descrito anteriormente ((transgénicos para huCD3), de la Hera et al. J Exp Med. 173: 7-17, 1991). En este estudio, se inyectaron 0,1 millones de células CT26-HER2 por vía subcutánea en ratones transgénicos para huCD3. Una vez se establecieron los tumores CT26-HER2, los animales se dividieron en los dos grupos a continuación: Grupo 1: vehículo (0,5 mg/kg, qwk x 3, IV, comenzando en el día 0, n=7); Grupo 2: TDB para HER2 (TDB para HER2 (SP34/hu4D5), 0,5 mg/kg, qwk x 3, IV, comenzando en el día 0, n=7). El Td B para HER2 inhibió el crecimiento de tumores establecidos, pero el efecto fue transitorio y no se observaron respuestas completas (figura 99F). El estudio demostró la potente actividad in vivo del TDB para HER2, incluyendo respuestas dramáticas en ratones transgénicos para MMTV-huHER2.
En un experimento similar, se evaluó la eficacia in vivo del TDB para HER2 reactivo con ratón (2C11/hu4D5) en ratones Balb/c. De nuevo, se establecieron tumores singénicos en ratones Balb/c inyectando 1x105 células CT26-HER2 por vía subcutánea. Los ratones portadores de tumores se dividieron en uno de los cuatro grupos a continuación: Grupo 1: vehículo (0,5 mg/kg, qwk x 3, IV, comenzando en el día 0, n=10); Grupo 2: TDB para HER2 (TDB para He R2 (2C11/hu4D5), 0,5 mg/kg, qwk x 3, IV, comenzando en el día 0, n=10); Grupo 3: TDB de control (CTRL TDB (2C11/hu4D5), 0,5 mg/kg, qwk x 3, IV, comenzando en el día 0, n=10); y Grupo 4: TDM-1 (TDM-1, 15 mg/kg, qwk x 3, IV, comenzando en el día 0, n=10). La figura 99G muestra que a pesar de las respuestas incompletas, el t Db para HER2 prolongó significativamente el tiempo hasta la progresión tumoral (valor de p de rangos logarítmicos < 0,0001). Por el contrario, el TDB de control con un brazo irrelevante para el tumor no tuvo efecto en el crecimiento tumoral. Además, los tumores fueron insensibles a TDM-1.
El TDB para HER2 inhibe el crecimiento de tumores establecidos en ratones inmunocompetentes
Se usaron ratones transgénicos para CD3e humano (de la Hera et al. J Exp Med. 173: 7-17, 1991) para modelar la actividad del TDB para HER2 en ratones inmunocompetentes. En este experimento, se extrajeron linfocitos T transgénicos para huCD3 de bazos de ratones transgénicos para huCD3 y ratones BALB/c o de la sangre periférica de donantes humanos sanos. Las células se tiñeron con CD8 de ratón o humano y o bien CD3 humano (clon UCHT1) en la figura 101A o CD3 de ratón (clon 2C11) en la figura 101B. Las células CD8+ se detectaron mediante citometría de flujo. La figura 101A muestra que los linfocitos T transgénicos para huCD3 expresan CD3 humano a aproximadamente un 50% del nivel de los linfocitos T humanos y la figura 101B muestra que los linfocitos T transgénicos para huCD3 expresan CD3 murino a aproximadamente un 50 % del nivel de los ratones BALB/c.
A continuación, se ensayó la capacidad de los linfocitos T transgénicos para huCD3 para eliminar células diana CT26 que expresan HER2 humano in vitro. En este estudio, se extrajeron linfocitos T de bazos de ratones transgénicos para huCD3, ratones BALB/c o de sangre periférica de donantes sanos. Se evaluó la actividad de eliminación in vitro de células CT26-HER2 usando TDB para HER2 específico para CD3 (UCHT1v9/hu4D5) en la figura 102A o TDB para HER2 específico para CD3 de ratón (2C11/hu4D5) en la figura 102B. Se añadieron linfocitos T efectores a una relación de 20:1 con respecto a las células diana en presencia del TDB para HER2 indicado durante 40 horas. La citotoxicidad in vitro se monitorizó mediante citometría de flujo. Aunque la actividad de eliminación de linfocitos T esplénicos de ratón (CE50 = 2,4 ng/ml) fue consistentemente menor en comparación con linfocitos T periféricos (CE50 = 0,4 ng/ml), los linfocitos T transgénicos para huCD3 eliminaron células diana que expresan HER2 in vitro, como se observa en la figura 102A. El TDB para HER2 específico de ratón (2C11/hu4D5) indujo eliminación de células diana por linfocitos T tanto de ratones transgénicos para huCD3 (CE50 = 11 ng/ml) y BALB/c (CE50 = 10 ng/ml), como se observa en la figura 102B.
Se evaluó adicionalmente en un modelo de tumor singénico si la actividad antitumoral del TDB para HER2 depende de linfocitos T. Como se ha descrito anteriormente, se inyectaron 1x105 células CT26-HER2 por vía subcutánea en ratones BALB/c. Los ratones con tumores establecidos se dividieron en uno de los dos grupos a continuación: Grupo 1: vehículo (n=10); Grupo 2: TDB para HER2 (SP34/hu4D5) (TDB para HER2 (SP34/hu4D5), 0,5 mg/kg, qwx3, IV, n=10). La figura 103 muestra que la actividad del TDB para HER2 era dependiente de linfocitos T, ya que el TDB para HER2 no tuvo efecto en ratones no transgénicos para huCD3. Este estudio demostró que los ratones transgénicos para huCD3 pueden usarse como un nuevo modelo de eficacia para moléculas dirigidas a huCD3.
Ejemplo 6. Generación y caracterización de TDB para CD3/lYPD1 a modo de ejemplo (TDB para LYPD1)
Los presentes inventores también exploraron la capacidad de los anticuerpos TDB para reclutar las actividades citotóxicas de los linfocitos T a la hora de erradicar células tumorales mediante el reconocimiento de un antígeno de la superficie celular diferente, LYPD1. Con este fin, se generaron y caracterizaron anticuerpos anti-CD3 biespecíficos que tienen un brazo de anti-CD3 y un brazo de anti-LYPD1 (TDB para LYPD1). Como se ha descrito anteriormente, Los TDB para LYPD1 se produjeron como anticuerpos de longitud completa en el formato de botón en ojal en forma de una IgG1 humana, como se ha descrito anteriormente (Atwell et al. J. Mol. Biol. 270: 26-35, 1997). Los medios anticuerpos se expresaron o bien en E. coli o en células de ovario de hámster chino (CHO), se purificaron mediante cromatografía de afinidad de proteína A y se hibridaron los pares de medios anticuerpos adecuados in vitro como se ha descrito anteriormente (Spiess et al., Nat. Biotechnol. 2013). En caso de llevarse a cabo la producción del anticuerpo TDB en células CHO, el anticuerpo incluyó una mutación de aglucosilación, por ejemplo, en el resto N297 (por ejemplo, N297G), de tal forma que el anticuerpo TDB era una variante sin función efectora y era incapaz de iniciar la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC). Después de la hibridación, los TDB para LYPD1 se purificaron mediante cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) y se caracterizaron mediante filtración en gel analítica, espectrometría de masas y electroforesis en gel de poliacrilamida, como se ha descrito anteriormente. El brazo anti-LYPD1 usado en la generación de los TDB para LYPD1 fue el del anticuerpo anti-LYPD1 YWO.49.H6, que comprende

Claims (33)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti-CD3 que es un anticuerpo biespecífico, en donde el anticuerpo biespecífico comprende un brazo anti-CD3 que comprende un primer dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 184 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 185 y un brazo anti-HER2 que comprende un segundo dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 270 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 271.
2. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1, en donde el dominio de unión se une a un polipéptido de CD3 humano o a un polipéptido de CD3 de mono cinomolgo (cino).
3. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 2, en donde (a) el polipéptido de CD3 humano es un polipéptido de CD3e humano o un polipéptido de CD3y humano; o (b) el polipéptido de CD3 de cino es un polipéptido de CD3e de cino o un polipéptido de CD3y de cino.
4. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el anticuerpo biespecífico comprende una mutación de sitio de aglucosilación.
5. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 4, en donde la mutación de sitio de aglucosilación (a) es una mutación de sustitución y/o (b) reduce la función efectora del anticuerpo biespecífico.
6. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el anticuerpo biespecífico comprende una mutación de sustitución en la región Fc que reduce la función efectora.
7. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 5, parte (a) o la reivindicación 6, en donde la mutación de sustitución se encuentra en el resto de aminoácido N297, L234, L235 y/o D265 (numeración de UE).
8. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 7, en donde la mutación de sustitución se selecciona entre el grupo que consiste en N297G, N297A, L234A, L235A y D265A.
9. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el anticuerpo biespecífico es: (i) monoclonal, humanizado o quimérico; (ii) un anticuerpo de longitud completa; y/o (iii) un anticuerpo IgG.
10. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el anticuerpo biespecífico comprende un primer dominio CH1 (CH1-i), un primer dominio CH2 (CH2-i), un primer dominio CH3 (CH3-i), un segundo dominio CH1 (CH12), un segundo dominio CH2 (CH22) y un segundo dominio CH3 (CH32), en donde
(i) el dominio CH31 se empareja con el dominio CH32, en donde cada uno de los dominios CH31 y CH32 comprende una protuberancia o una cavidad y en donde la protuberancia o la cavidad en el dominio CH31 puede situarse en la cavidad o protuberancia, respectivamente, en el dominio CH32; o
(ii) el dominio CH21 se empareja con el dominio CH22, en donde cada uno de los dominios CH21 y CH22 comprende una protuberancia o una cavidad y en donde la protuberancia o la cavidad en el dominio CH21 puede situarse en la cavidad o la protuberancia, respectivamente, en el dominio CH22.
11. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 10, en donde el anticuerpo biespecífico comprende la mutación de sitio de aglucosilación N297G o N297A y en donde el brazo anti-CD3 comprende la cavidad y el brazo anti-HER2 comprende la protuberancia.
12. Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11.
13. Un vector que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 12.
14. Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 13.
15. Un método para producir el anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, comprendiendo el método cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 14 en un medio de cultivo y recuperar el anticuerpo biespecífico de la célula hospedadora o del medio de cultivo.
16. Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y un agente citotóxico.
17. Una composición que comprende el anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
18. La composición de la reivindicación 17, en donde la composición comprende además un antagonista de unión al eje de PD-1 o un agente terapéutico adicional.
19. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para su uso en un método de terapia
(i) tratando o retrasando la progresión de un trastorno proliferativo celular en un sujeto que lo necesite o (ii) potenciando la función inmunitaria en un sujeto que tiene un trastorno proliferativo celular.
20. El anticuerpo biespecífico para el uso de la reivindicación 19, en donde el trastorno proliferativo celular es un cáncer positivo para HER2.
21. El anticuerpo biespecífico para el uso de la reivindicación 20, en donde el cáncer positivo para HER2 es un cáncer de mama positivo para HER2 o un cáncer gástrico positivo para HER2.
22. El anticuerpo biespecífico para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 19-21, en donde el anticuerpo biespecífico se une a (a) una molécula de CD3 ubicada en una célula efectora inmunitaria y (b) una molécula de HER2 ubicada en una célula diana distinta de la célula efectora inmunitaria.
23. El anticuerpo biespecífico para el uso de la reivindicación 22, en donde el anticuerpo biespecífico activa a la célula efectora inmunitaria después de la unión a (a) y (b).
24. El anticuerpo biespecífico para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 19-23, en donde el anticuerpo biespecífico se formula para su administración a un sujeto:
(i) en una dosis de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg, de 0,1 mg/kg a 10 mg/kg o de 1 mg/kg; o
(ii) en combinación con la administración de un antagonista de unión al eje de PD-1 y/o un agente terapéutico adicional.
25. El anticuerpo biespecífico para el uso de la reivindicación 24, parte (ii), en donde el antagonista de unión al eje de PD-1 se selecciona entre el grupo que consiste en un antagonista de unión a PD-1, un antagonista de unión a PD-L1 y un antagonista de unión a PD-L2.
26. El anticuerpo biespecífico para el uso de la reivindicación 24, parte (ii), en donde el antagonista de unión al eje de PD-1 es:
(i) un antagonista de unión a PD-1 seleccionado entre el grupo que consiste en MDX-1106 (nivolumab), MK-3475 (lambrolizumab) y AMP-224;
(ii) un antagonista de unión a PD-L1 seleccionado entre el grupo que consiste en: MPDL3280A, YW243.55.S70, MDX-1105 y MEDI4736; o
(iii) un antagonista de unión a PD-L2, en donde el antagonista de unión a PD-L2 es un anticuerpo o una inmunoadhesina.
27. El anticuerpo biespecífico para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 19-26, en donde el anticuerpo biespecífico está formulado para su administración en combinación con la administración de un glucocorticoide o un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC).
28. El anticuerpo biespecífico para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 19-27, en donde el anticuerpo biespecífico está formulado para su coadministración con uno o más agentes terapéuticos adicionales que se dirigen a la vía de HER.
29. El anticuerpo biespecífico para el uso de la reivindicación 28, en donde los uno o más agentes terapéuticos adicionales se seleccionan entre trastuzumab, T-DM1 y pertuzumab.
30. El anticuerpo biespecífico para el uso de la reivindicación 29, en donde el agente terapéutico adicional es trastuzumab.
31. El anticuerpo biespecífico para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 19-30, en donde el anticuerpo biespecífico está formulado para su administración a un sujeto por vía subcutánea, por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía tópica, por vía oral, por vía transdérmica, por vía intraperitoneal, por vía intraorbital, mediante implante, mediante inhalación, por vía intratecal, por vía intraventricular o por vía intranasal.
32. El anticuerpo biespecífico para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 19-31, en donde el sujeto es un ser humano.
33. Un kit que comprende:
(a) la composición de las reivindicaciones 17 o 18; y
(b) un prospecto que comprende instrucciones para administrar la composición a un sujeto para tratar o retrasar el progreso de un trastorno proliferativo celular, preferentemente un cáncer positivo para HER2 y más preferentemente, un cáncer de mama positivo para HER2 o un cáncer gástrico positivo para HER2.
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Families Citing this family (224)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103429737B (zh) 2010-11-30 2020-07-14 中外制药株式会社 细胞毒诱导治疗剂
CN107586340B (zh) 2011-08-23 2022-01-21 罗切格利卡特公司 对t细胞活化性抗原和肿瘤抗原特异性的双特异性抗体及使用方法
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
CN104662044B (zh) 2012-08-24 2018-10-30 加利福尼亚大学董事会 用于治疗ror1癌症并抑制转移的抗体和疫苗
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
KR20150064068A (ko) 2012-10-08 2015-06-10 로슈 글리카트 아게 2개의 Fab 단편을 포함하는 FC-부재 항체 및 이용 방법
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
WO2014110601A1 (en) 2013-01-14 2014-07-17 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
TWI635098B (zh) 2013-02-01 2018-09-11 再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
MY192312A (en) 2013-02-26 2022-08-17 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
CN105143270B (zh) 2013-02-26 2019-11-12 罗切格利卡特公司 双特异性t细胞活化抗原结合分子
SG11201506244VA (en) * 2013-03-13 2015-09-29 Prothena Biosciences Ltd Tau immunotherapy
US10351626B2 (en) 2013-03-14 2019-07-16 The Scripps Research Institute Targeting agent antibody conjugates and uses thereof
DK2970486T3 (en) 2013-03-15 2018-08-06 Xencor Inc MODULATION OF T-CELLS WITH BISPECIFIC ANTIBODIES AND FC-FUSIONS
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
UY35468A (es) 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
AR096687A1 (es) 2013-06-24 2016-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti-fcrh5
EP3693385A1 (en) * 2013-07-05 2020-08-12 Genmab A/S Humanized or chimeric cd3 antibodies
ES2811923T3 (es) 2013-12-17 2021-03-15 Genentech Inc Anticuerpos anti-CD3 y métodos de uso
RU2016129517A (ru) 2013-12-20 2018-01-25 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Биспецифические антитела к her2 и способы применения
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
TWI680138B (zh) 2014-01-23 2019-12-21 美商再生元醫藥公司 抗ｐｄ-ｌ１之人類抗體
US9394365B1 (en) 2014-03-12 2016-07-19 Yeda Research And Development Co., Ltd Reducing systemic regulatory T cell levels or activity for treatment of alzheimer's disease
US10519237B2 (en) 2014-03-12 2019-12-31 Yeda Research And Development Co. Ltd Reducing systemic regulatory T cell levels or activity for treatment of disease and injury of the CNS
US10618963B2 (en) 2014-03-12 2020-04-14 Yeda Research And Development Co. Ltd Reducing systemic regulatory T cell levels or activity for treatment of disease and injury of the CNS
KR102248804B1 (ko) 2014-03-12 2021-05-11 예다 리서치 앤드 디벨럽먼트 캄파니 리미티드 Cns의 질환 및 손상을 치료하기 위한 전신적 조절 t 세포 수준 또는 활성의 감소
TWI701042B (zh) 2014-03-19 2020-08-11 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
EP3122778A1 (en) * 2014-03-26 2017-02-01 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Use of cd-64-blocking agents as enhancer of an anti-tnf-alpha antibody therapy
ME03666B (me) 2014-03-28 2020-10-20 Xencor Inc Bispecifična antitela koja se vezuju za cd38 i cd3
IL247715B (en) * 2014-04-07 2022-07-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen binding molecules that activate the immune system
HUE054588T2 (hu) * 2014-04-07 2021-09-28 Novartis Ag Rák kezelése CD19 elleni, kiméra antigénreceptor alkalmazásával
EP3144388B1 (en) 2014-05-13 2020-07-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha T cell-redirecting antigen-binding molecule for cells having immunosuppression function
EP3195168B1 (en) * 2014-07-31 2022-09-07 The University Of Western Australia A method for the identification of immunotherapy-drug combinations using a network approach
DK3608337T3 (da) 2014-08-04 2024-06-17 Hoffmann La Roche Bispecifikke T-celleaktiverende antigenbindende molekyler
WO2016019969A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Ludwig-Maximilians-Universität München Subcutaneously administered bispecific antibodies for use in the treatment of cancer
CA2958479A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Anti-cll-1 antibodies and immunoconjugates
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
KR102614189B1 (ko) * 2014-11-17 2023-12-18 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. Cd3xcd20 이특이적 항체를 이용한 종양의 치료 방법
PL3221355T3 (pl) 2014-11-20 2021-03-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Terapia skojarzona składająca się z dwuswoistych aktywujących limfocyty T cząsteczek wiążących antygen CD3 i receptor folianowy 1 (FolR1) oraz antagonistów wiązania osi PD-1
KR20170084326A (ko) 2014-11-26 2017-07-19 젠코어 인코포레이티드 Ｃｄ3 및 종양 항원과 결합하는 이종이량체 항체
EP3223907A2 (en) 2014-11-26 2017-10-04 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cd38
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
BR112017011326A2 (pt) 2014-12-05 2018-07-31 Genentech, Inc. anticorpo, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, método para produzir o anticorpo, imunoconjugado, composição farmacêutica, usos do anticorpo, métodos para tratar ou retardar a progressão de distúrbio proliferativo celular e para intensificar a função imune
US10428155B2 (en) 2014-12-22 2019-10-01 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
CA2973159A1 (en) * 2015-01-08 2016-07-14 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20
WO2016141387A1 (en) 2015-03-05 2016-09-09 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
CA2981312C (en) 2015-03-30 2023-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Heavy chain constant regions with reduced binding to fc gamma receptors
EP4056588A1 (en) 2015-04-08 2022-09-14 Novartis AG Cd20 therapies, cd22 therapies, and combination therapies with a cd19 chimeric antigen receptor (car)- expressing cell
DK3283106T3 (da) * 2015-04-13 2022-01-10 Pfizer Terapeutiske antistoffer og anvendelser deraf
JP2018520642A (ja) 2015-05-01 2018-08-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド マスク抗ｃｄ３抗体及びその使用方法
RU2748943C2 (ru) * 2015-06-16 2021-06-02 Дженентек, Инк. ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА И АНТИТЕЛА С СОЗРЕВШЕЙ АФФИННОСТЬЮ ПРОТИВ FcRH5 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
EP3310811B1 (en) 2015-06-16 2021-06-16 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
TW201718647A (zh) 2015-06-16 2017-06-01 建南德克公司 抗-cll-1抗體及使用方法
JP2018524312A (ja) 2015-06-17 2018-08-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｈｅｒ２抗体及び使用方法
CR20170562A (es) 2015-06-24 2018-02-01 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-receptor de transferrina con afinidad diseñada.
EP3320773B9 (en) * 2015-07-10 2023-10-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Mouse having human cd3 gene substituted for endogenous cd3 gene
KR20180040138A (ko) 2015-07-13 2018-04-19 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. 항pd-1 항체, 활성화 가능한 항pd-1 항체, 및 이들의 사용 방법
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
TWI717375B (zh) * 2015-07-31 2021-02-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｃｄ７０及ｃｄ３抗體構築體
TWI744242B (zh) 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
CR20180162A (es) 2015-10-02 2018-05-25 Hoffmann La Roche Moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de células t
EP3356406A1 (en) 2015-10-02 2018-08-08 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific anti-human cd20/human transferrin receptor antibodies and methods of use
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
US11649293B2 (en) 2015-11-18 2023-05-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for enhancing humoral immune response
JP6931329B2 (ja) 2015-11-18 2021-09-01 中外製薬株式会社 免疫抑制機能を有する細胞に対するｔ細胞リダイレクト抗原結合分子を用いた併用療法
CN108699136B (zh) 2015-12-07 2022-03-18 Xencor股份有限公司 结合cd3和psma的异二聚抗体
CA2997406C (en) 2015-12-09 2024-05-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies or cytokine release
BR112018011781A2 (pt) 2015-12-14 2018-12-04 Macrogenics Inc molécula biespecífica possuindo um ou mais sítios de ligação a epítopo capazes de ligação imunoespecífica a (um) epítopo(s) de pd-1 e um ou mais sítios de ligação a epítopo capazes de ligação imunoespecífica a (um) epítopo(s) de ctla-4, e composição farmacêutica
CN108473578A (zh) 2015-12-22 2018-08-31 瑞泽恩制药公司 治疗癌症的抗pd-1抗体和双特异性抗cd20/抗cd3抗体组合
AU2017205089B2 (en) 2016-01-08 2023-10-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods of treating CEA-positive cancers using PD-1 axis binding antagonists and anti-CEA/anti-CD3 bispecific antibodies
EP3400013A4 (en) * 2016-01-09 2019-09-11 Arbele Limited CADHERIN-17 SPECIFIC ANTIBODIES AND CYTOTOXIC CELL TREATMENT CELLS
EA039859B1 (ru) 2016-02-03 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
CN109069635B (zh) * 2016-02-04 2023-09-26 斯克利普斯研究所 人源化抗cd3抗体、偶联物及其用途
MY191649A (en) 2016-03-04 2022-07-05 Jn Biosciences Llc Antibodies to tigit
DK3433280T3 (da) 2016-03-22 2023-06-19 Hoffmann La Roche Protease-aktiverede T-celle-bispecifikke molekyler
PE20190208A1 (es) 2016-05-02 2019-02-07 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos que reconocen tau
DK3452507T3 (da) 2016-05-02 2022-11-14 Prothena Biosciences Ltd Tau-immunoterapi
BR112018072389A2 (pt) 2016-05-02 2019-02-19 Prothena Biosciences Limited anticorpos que reconhecem tau
TWI755395B (zh) 2016-05-13 2022-02-21 美商再生元醫藥公司 抗-pd-1抗體與輻射治療癌症之組合
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
BR112019022558A2 (pt) * 2016-06-02 2020-05-19 Hoffmann La Roche anticorpos, métodos para tratar ou retardar a progressão de uma doença proliferativa e para tratar ou retardar a progressão do câncer em um indivíduo, composições farmacêuticas, kit, usos de uma combinação de um anticorpo anti-cd20 e de um anticorpo e invenção
JP2019517539A (ja) * 2016-06-07 2019-06-24 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 併用療法
EP4257613A3 (en) 2016-06-14 2023-12-13 Xencor, Inc. Bispecific checkpoint inhibitor antibodies
KR102379464B1 (ko) 2016-06-20 2022-03-29 키맵 리미티드 항-pd-l1 항체
MX2018016330A (es) 2016-06-27 2020-02-17 Univ California Combinaciones para tratamiento del cáncer.
EP3475304B1 (en) 2016-06-28 2022-03-23 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
WO2018018031A1 (en) * 2016-07-22 2018-01-25 New York University Specific murine and humanized monoclonal antibodies detecting pathology associated secondary structure changes in proteins and peptides
JP7125347B2 (ja) 2016-08-22 2022-08-24 中外製薬株式会社 ヒトｇｐｃ３ポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
US20180064758A1 (en) * 2016-09-05 2018-03-08 Ucl Business Plc Chimeric antigen receptor
US10621236B2 (en) * 2016-09-16 2020-04-14 At&T Intellectual Property I, L.P. Concept based querying of graph databases
JP2019529418A (ja) * 2016-09-16 2019-10-17 バイオノミックス リミテッド 抗体およびチェックポイント阻害剤の併用療法
SI3515487T1 (sl) * 2016-09-23 2023-09-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecifična protitelesa proti-MUC16-CD3 in konjugati zdravil proti-MUC16
JP7022123B2 (ja) 2016-09-30 2022-02-17 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｃｄ３に対する二重特異性抗体
PE20191034A1 (es) 2016-10-14 2019-08-05 Xencor Inc Proteinas de fusion heterodimericas biespecificas que contienen proteinas de fusion fc il-15/il-15r y fragmentos de anticuerpo pd-1
CN109923128A (zh) * 2016-11-15 2019-06-21 基因泰克公司 用于用抗cd20/抗cd3双特异性抗体进行治疗的给药
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US20180206726A1 (en) 2016-12-07 2018-07-26 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
PL3559034T3 (pl) 2016-12-20 2021-04-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Terapia skojarzona dwuswoistymi przeciwciałami anty-CD20/anty-CD3 i agonistami 4-1BB (CD137)
US11292842B2 (en) 2017-02-21 2022-04-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-PD-1 antibodies for treatment of lung cancer
WO2018174274A1 (ja) * 2017-03-24 2018-09-27 全薬工業株式会社 抗ＩｇＭ／Ｂ細胞表面抗原二重特異性抗体
US20210138213A1 (en) 2017-03-30 2021-05-13 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device
US11603407B2 (en) 2017-04-06 2023-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stable antibody formulation
KR102329635B1 (ko) * 2017-04-24 2021-11-22 재단법인 목암생명과학연구소 Her3 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항체
SG11201910066QA (en) 2017-05-02 2019-11-28 Prothena Biosciences Ltd Antibodies recognizing tau
JP2020518584A (ja) * 2017-05-02 2020-06-25 中外製薬株式会社 細胞傷害誘導治療剤
WO2018208864A1 (en) * 2017-05-08 2018-11-15 Adimab, Llc Anti-cd3-binding domains and antibodies comprising them, and methods for their generation and use
WO2018223004A1 (en) * 2017-06-01 2018-12-06 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind cd20 and cd3
EP3409322A1 (en) 2017-06-01 2018-12-05 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment method
EP3645122A1 (en) 2017-06-30 2020-05-06 Xencor, Inc. Targeted heterodimeric fc fusion proteins containing il-15/il-15ra and antigen binding domains
WO2019012141A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 Immatics Biotechnologies Gmbh IMPROVED POLYPEPTIDE MOLECULE WITH DOUBLE SPECIFICITY
JP7305624B2 (ja) 2017-09-21 2023-07-10 ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド 新規抗ＣＤ３ε抗体
ES2759622T3 (es) 2017-10-02 2020-05-11 Certest Biotec S L Anticuerpos anti-Dps y dispositivos de prueba para la detección de bacterias del género Campylobacter
KR101973060B1 (ko) * 2017-10-20 2019-04-26 주식회사 녹십자 항-cd3 항체 및 이를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물
CN111372947A (zh) 2017-10-30 2020-07-03 豪夫迈·罗氏有限公司 在体内从单特异性抗体产生多特异性抗体的方法
AU2018358904A1 (en) 2017-11-01 2020-04-16 F. Hoffmann-La Roche Ag TriFab-contorsbody
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
JP2021502100A (ja) 2017-11-08 2021-01-28 ゼンコア インコーポレイテッド 新規抗ｐｄ−１配列を用いた二重特異性および単一特異性抗体
AU2018390418B2 (en) 2017-12-19 2023-12-21 Xencor, Inc. Engineered IL-2 Fc fusion proteins
BR112020011469A2 (pt) 2017-12-21 2020-11-24 F. Hoffmann-La Roche Ag anticorpos, molécula de ligação ao antígeno biespecífica, um ou mais polinucleotídeos isolados, um ou mais vetores, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo, composição farmacêutica, uso do anticorpo, método de tratamento de uma doença e invenção
WO2019139888A1 (en) * 2018-01-09 2019-07-18 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Compositions and methods for targeting clec12a-expressing cancers
WO2019143636A1 (en) * 2018-01-16 2019-07-25 Lakepharma, Inc. Bispecific antibody that binds cd3 and another target
US11866498B2 (en) 2018-02-08 2024-01-09 Genentech, Inc. Bispecific antigen-binding molecules and methods of use
CN110218256B (zh) * 2018-03-02 2020-12-08 广西医科大学 抗CD3的纳米抗体CD3/Nb29及其制备方法与应用
CN110218253B (zh) * 2018-03-02 2020-12-04 广西医科大学 抗CD3的纳米抗体CD3/Nb14及其制备方法与应用
CA3093330A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Novimmune Sa Anti-cd3 epsilon antibodies and methods of use thereof
CN110305217B (zh) * 2018-03-27 2022-03-29 广州爱思迈生物医药科技有限公司 双特异性抗体及其应用
EP3773911A2 (en) 2018-04-04 2021-02-17 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
TW202012440A (zh) 2018-04-13 2020-04-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 包含4-1bbl之靶向her2的抗原結合分子
EP3781598A1 (en) 2018-04-18 2021-02-24 Xencor, Inc. Tim-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and tim-3 antigen binding domains
AU2019256539A1 (en) 2018-04-18 2020-11-26 Xencor, Inc. PD-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra Fc-fusion proteins and PD-1 antigen binding domains and uses thereof
PE20210132A1 (es) * 2018-05-24 2021-01-19 Janssen Biotech Inc Anticuerpos anti-cd3 y usos de estos
SG11202011633SA (en) 2018-05-24 2020-12-30 Janssen Biotech Inc Psma binding agents and uses thereof
WO2019228406A1 (en) * 2018-05-29 2019-12-05 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. A novel anti-cd3/anti-cd20 bispecific antibody
TW202016151A (zh) * 2018-06-09 2020-05-01 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 針對癌症治療之多特異性結合蛋白
US20230041197A1 (en) 2018-06-20 2023-02-09 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
WO2019246317A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue originating from the endoderm
US11845797B2 (en) 2018-07-03 2023-12-19 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
TWI728400B (zh) * 2018-07-26 2021-05-21 美商美國禮來大藥廠 Cd226促效劑抗體
CN112771077A (zh) 2018-08-31 2021-05-07 瑞泽恩制药公司 针对cd3/c20双特异性抗体的减轻细胞因子释放综合征的给药策略
CN110872356B (zh) * 2018-09-03 2023-06-13 广西慧宝源健康产业有限公司 双特异性抗体及其使用方法
US11573226B2 (en) 2018-09-10 2023-02-07 Genentech, Inc. Systems and methods for affinity capillary electrophoresis
BR112021004436A2 (pt) 2018-09-10 2021-05-25 Genentech, Inc. sistema e método para separar proteínas de múltiplas subunidades em uma amostra, método para isolar uma proteína alvo em uma mistura de amostra e ligante de eletroforese capilar de afinidade
AU2019355971A1 (en) 2018-10-03 2021-05-06 Xencor, Inc. IL-12 heterodimeric Fc-fusion proteins
TW202028244A (zh) 2018-10-09 2020-08-01 美商建南德克公司 用於確定突觸形成之方法及系統
US20210340273A1 (en) 2018-10-11 2021-11-04 Inhlbrx, inc. 5t4 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
WO2020077257A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. Pd-1 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
CA3115089A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. Dll3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
CN113166261A (zh) 2018-10-11 2021-07-23 印希比股份有限公司 B7h3单域抗体及其治疗性组合物
CN109400710A (zh) * 2018-11-02 2019-03-01 山西大医院（山西医学科学院） 一种靶向kif20a阳性胰腺癌双特异性抗体及其制备方法和应用
EP3877420A4 (en) * 2018-11-05 2022-08-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha HER2-S310F-SPECIFIC ANTIGEN BINDING MOLECULE
WO2020106704A2 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Progenity, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
EP3898682A1 (en) 2018-12-21 2021-10-27 F. Hoffmann-La Roche AG Tumor-targeted agonistic cd28 antigen binding molecules
GB201901305D0 (en) * 2019-01-30 2019-03-20 Immunocore Ltd Specific binding molecules
CA3132185A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind enpp3 and cd3
TW202100550A (zh) 2019-03-03 2021-01-01 愛爾蘭商普羅帝納生物科學公司 識別ｔａｕ之抗體
AU2020236015A1 (en) 2019-03-14 2021-09-09 Genentech, Inc. Treatment of cancer with HER2XCD3 bispecific antibodies in combination with anti-HER2 MAB
KR102239781B1 (ko) * 2019-04-08 2021-04-13 주식회사 녹십자 Gpnmb 및 cd3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체 및 이의 용도
CN113747944A (zh) 2019-04-19 2021-12-03 詹森生物科技公司 用抗psma/cd3抗体治疗前列腺癌的方法
EP3725370A1 (en) 2019-04-19 2020-10-21 ImmunoBrain Checkpoint, Inc. Modified anti-pd-l1 antibodies and methods and uses for treating a neurodegenerative disease
JP7137696B2 (ja) 2019-05-14 2022-09-14 プロヴェンション・バイオ・インコーポレイテッド １型糖尿病を予防するための方法および組成物
US20230002487A1 (en) * 2019-06-07 2023-01-05 Adimab, Llc High affinity anti-cd3 antibodies, and methods for their generation and use
MX2021015271A (es) * 2019-06-21 2022-01-18 Regeneron Pharma Uso de moleculas biespecificas de union a antigeno que se unen a psma y cd3 en combinacion con la estimulacion conjunta de 4-1bb.
TWI809286B (zh) 2019-07-05 2023-07-21 日商小野藥品工業股份有限公司 以pd-1/cd3雙特異性蛋白質所進行之血液性癌症治療
DE102019121007A1 (de) 2019-08-02 2021-02-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Antigenbindende Proteine, die spezifisch an MAGE-A binden
TW202112364A (zh) * 2019-08-16 2021-04-01 美商蜻蛉治療股份有限公司 投與替司他賽(tesetaxel)與cyp3a4誘導劑之糖皮質素之方法
TW202135860A (zh) * 2019-12-10 2021-10-01 美商再生元醫藥公司 含有抗ｃｄ２０ｘ抗ｃｄ３雙特異性抗體之穩定調配物
WO2021119482A1 (en) 2019-12-13 2021-06-17 Progenity, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
AU2020403145A1 (en) 2019-12-13 2022-07-07 Genentech, Inc. Anti-Ly6G6D antibodies and methods of use
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
US10981996B1 (en) * 2020-06-01 2021-04-20 Abexxa Biologics, Inc. Antibodies targeting a complex comprising non-classical HLA-I and neoantigen and their methods of use
US11976120B2 (en) * 2020-06-01 2024-05-07 Boehringer Ingelheim International Gmbh Antibodies targeting a complex comprising non-classical HLA-I and neoantigen and their methods of use
PE20231078A1 (es) 2020-06-02 2023-07-17 Arcus Biosciences Inc Anticuerpos anti-tigit
WO2021252917A2 (en) 2020-06-11 2021-12-16 Provention Bio, Inc. Methods and compositions for preventing type 1 diabetes
AU2021291011A1 (en) 2020-06-19 2023-01-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to CD3 and CD19
CN111705084B (zh) * 2020-08-18 2020-12-08 江苏集萃药康生物科技有限公司 一种稳定表达荧光素酶及人cd20敲除鼠cd20的小鼠b细胞淋巴瘤细胞系构建方法
KR102607909B1 (ko) 2020-08-19 2023-12-01 젠코어 인코포레이티드 항-cd28 조성물
BR112023004327A2 (pt) 2020-09-10 2023-04-04 Genmab As Método para tratar leucemia linfocítica crônica em um sujeito humano
EP4210744A1 (en) 2020-09-10 2023-07-19 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
CA3189883A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 Brian Elliott Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating follicular lymphoma
BR112023004351A2 (pt) 2020-09-10 2023-04-04 Genmab As Método para tratar linfoma folicular em um sujeito humano
EP4210747A1 (en) 2020-09-10 2023-07-19 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
US20230374160A1 (en) 2020-10-02 2023-11-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Combination of antibodies for treating cancer with reduced cytokine release syndrome
US20220153842A1 (en) * 2020-11-04 2022-05-19 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and anti-cd79b antibody drug conjugates
WO2022098638A2 (en) * 2020-11-04 2022-05-12 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies
US20220218614A1 (en) 2020-12-04 2022-07-14 Tidal Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles, and methods of synthesis and use thereof
MX2023007846A (es) 2021-01-06 2023-07-07 Hoffmann La Roche Tratamiento conjunto que usa un anticuerpo biespecifico contra pd1-lag3 y un anticuerpo biespecifico de linfocitos t cd20.
KR20230137393A (ko) 2021-01-28 2023-10-04 얀센 바이오테크 인코포레이티드 Psma 결합 단백질 및 이의 용도
IL305736A (en) 2021-03-09 2023-11-01 Xencor Inc Heterodimeric antibodies that bind CD3 and CLDN6
EP4305065A1 (en) 2021-03-10 2024-01-17 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and gpc3
BR112023020832A2 (pt) 2021-04-08 2023-12-19 Marengo Therapeutics Inc Moléculas multifuncionais ligadas a tcr e seus usos
TW202243689A (zh) 2021-04-30 2022-11-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３雙特異性抗體及抗ｃｄ７８ｂ抗體藥物結合物的組合治療之給藥
KR20240005722A (ko) 2021-04-30 2024-01-12 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-cd20/항-cd3 이중특이적 항체를 사용한 치료를 위한 투약
CA3217180A1 (en) * 2021-05-06 2022-11-10 Amgen Research (Munich) Gmbh Cd20 and cd22 targeting antigen-binding molecules for use in proliferative diseases
CN117957256A (zh) 2021-06-17 2024-04-30 勃林格殷格翰国际有限公司 新颖三特异性结合分子
CN115490770A (zh) * 2021-06-17 2022-12-20 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 一种能与人eta和人cd3结合的双特异性抗体及其应用
CN115558023A (zh) * 2021-07-02 2023-01-03 安源医药科技（上海）有限公司 抗cd3抗体及其用途
CN117897407A (zh) * 2021-08-27 2024-04-16 石药集团巨石生物制药有限公司 抗Nectin-4抗体、药物缀合物及其制备方法和用途
WO2023056391A1 (en) * 2021-09-30 2023-04-06 City Of Hope Anti-cd3 antibodies and uses thereof
CN118076387A (zh) * 2021-10-08 2024-05-24 艾贝乐医药科技有限公司 靶向表达cdh17的肿瘤的多特异性抗体及其制备和使用方法
WO2023091887A1 (en) * 2021-11-16 2023-05-25 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating systemic lupus erythematosus (sle) with mosunetuzumab
CA3240046A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 Cdr-Life Ag Dual mhc-targeting t cell engager
US20230295310A1 (en) * 2022-03-20 2023-09-21 Abcellera Biologics Inc. CD3 T-Cell Engagers and Methods of Use
TW202346365A (zh) 2022-03-23 2023-12-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３雙特異性抗體及化學療法之組合治療
TW202346337A (zh) 2022-03-29 2023-12-01 美商恩格姆生物製藥公司 Ilt3及cd3結合劑以及其使用方法
WO2023198727A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Pharmaceutical compositions of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and methods of use
TW202408562A (zh) 2022-04-13 2024-03-01 美商建南德克公司 治療性蛋白質之醫藥組成物及使用方法
US11958906B2 (en) 2022-04-13 2024-04-16 Genentech, Inc. Pharmaceutical compositions of mosunetuzumab and methods of use
WO2023219613A1 (en) * 2022-05-11 2023-11-16 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2023219120A1 (ja) * 2022-05-12 2023-11-16 アステラス製薬株式会社 抗ｃｄ３７－抗ｃｄ３二重特異性抗体
WO2023240156A1 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Tidal Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles, and methods of synthesis and use thereof
WO2024020564A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Genentech, Inc. Anti-steap1 antigen-binding molecules and uses thereof
WO2024086617A2 (en) * 2022-10-18 2024-04-25 Adimab, Llc Ph-dependent anti-cd3 antibodies and methods relating thereto
WO2024088987A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy for the treatment of cancer
WO2024094741A1 (en) 2022-11-03 2024-05-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with anti-cd19/anti-cd28 bispecific antibody
WO2024104988A1 (en) 2022-11-15 2024-05-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant binding proteins with activatable effector domain
WO2024112867A1 (en) 2022-11-23 2024-05-30 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods of use thereof for increasing immune responses

Family Cites Families (214)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4675187A (en) 1983-05-16 1987-06-23 Bristol-Myers Company BBM-1675, a new antibiotic complex
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
JP3040121B2 (ja) 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
WO1991003493A1 (en) 1989-08-29 1991-03-21 The University Of Southampton Bi-or trispecific (fab)3 or (fab)4 conjugates
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
CA2405246A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with alterred binding properties
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
CA2103059C (en) * 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
CA2129663C (en) 1992-02-06 2005-07-05 James S. Huston Biosynthetic binding protein for cancer marker
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
EP0731106B1 (en) 1993-10-01 2004-11-17 Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd. Dolastatin derivatives
US5798100A (en) 1994-07-06 1998-08-25 Immunomedics, Inc. Multi-stage cascade boosting vaccine
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
DE69830901T2 (de) 1997-05-02 2006-05-24 Genentech Inc., San Francisco ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen
US20030060407A1 (en) 1997-06-16 2003-03-27 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
DE69830315T2 (de) 1997-06-24 2006-02-02 Genentech Inc., San Francisco Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung
US6248564B1 (en) 1997-08-29 2001-06-19 Harvard University Mutant MHC class I molecules
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
DK1034298T3 (da) 1997-12-05 2012-01-30 Scripps Research Inst Humanisering af murint antistof
JP2002510481A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗体変異体及びその断片
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ATE458007T1 (de) 1998-04-20 2010-03-15 Glycart Biotechnology Ag Glykosylierungs-engineering von antikörpern zur verbesserung der antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxizität
EA004107B1 (ru) 1998-08-11 2003-12-25 Айдек Фармацевтикалс Корпорэйшн Комбинированная терапия в-клеточных лимфом, предусматривающая введение антитела против cd20
WO2000027428A1 (en) 1998-11-09 2000-05-18 Idec Pharmaceuticals Corporation Treatment of hematologic malignancies associated with circulating tumor cells using chimeric anti-cd20 antibody
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2694002T3 (es) 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
JP4668498B2 (ja) 1999-10-19 2011-04-13 協和発酵キリン株式会社 ポリペプチドの製造方法
US7105149B1 (en) 1999-11-29 2006-09-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Isolation of five novel genes coding for new Fc receptors-type melanoma involved in the pathogenesis of lymphoma/myeloma
EP2363403B1 (en) 1999-11-29 2016-04-20 The Trustees of Columbia University in the City of New York Isolation of five novel genes coding for new fc receptors-type melanoma involved in the pathogenesis of lymphoma/melanoma
US20030180714A1 (en) 1999-12-15 2003-09-25 Genentech, Inc. Shotgun scanning
US20040005561A1 (en) 2000-03-01 2004-01-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
AU2001247616B2 (en) 2000-04-11 2007-06-14 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
HU231090B1 (hu) 2000-10-06 2020-07-28 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antitest-kompozíciót termelő sejt
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20040018194A1 (en) 2000-11-28 2004-01-29 Francisco Joseph A. Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof
US7041870B2 (en) 2000-11-30 2006-05-09 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
PE20020574A1 (es) 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
CU23007A1 (es) 2001-04-06 2004-12-17 Ct De Inmunologia Molecular Ct De Inmunologia Mole Combinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiencombinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiento de tumores que sobre-expresan gangliósidos to de tumores que sobre-expresan gangliósidos
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
DE60233509D1 (de) 2001-06-20 2009-10-08 Fibron Ltd Fgfr3 blockierende antikörper, verfahren zum screening darauf und verwendungen davon
CA2838062C (en) 2001-08-03 2015-12-22 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
NZ531674A (en) 2001-09-18 2009-03-31 Genentech Inc Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US7888478B2 (en) 2002-09-11 2011-02-15 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
US7858330B2 (en) 2001-10-19 2010-12-28 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
US20050226869A1 (en) 2001-10-19 2005-10-13 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
EP1482972A4 (en) 2001-11-20 2005-11-23 Seattle Genetics Inc TREATMENT OF IMMUNOLOGICAL DISORDERS USING ANTI-CD30 ANTIBODIES
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
JPWO2003084569A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物含有医薬
US20040259150A1 (en) 2002-04-09 2004-12-23 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to Fcgamma receptor IIIa
WO2003084570A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Medicament contenant une composition d'anticorps appropriee au patient souffrant de polymorphisme fc$g(g)riiia
BR0309145A (pt) 2002-04-09 2005-02-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Células das quais o genoma é modificado
JPWO2003085118A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物の製造方法
AU2003236020B2 (en) 2002-04-09 2009-03-19 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in GDP-fucose transport
DK1501856T3 (da) 2002-04-10 2013-03-25 Genentech Inc Anti-HER2 antistofvarianter
EP1513879B1 (en) 2002-06-03 2018-08-22 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
CA2494104A1 (en) 2002-07-31 2004-04-22 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
TWI335821B (en) 2002-12-16 2011-01-11 Genentech Inc Immunoglobulin variants and uses thereof
US20050079574A1 (en) 2003-01-16 2005-04-14 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
EP1629001A2 (en) * 2003-06-05 2006-03-01 Genentech, Inc. Blys antagonists and uses thereof
US20080241884A1 (en) 2003-10-08 2008-10-02 Kenya Shitara Fused Protein Composition
EP1705251A4 (en) 2003-10-09 2009-10-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PROCESS FOR PRODUCING ANTIBODY COMPOSITION BY RNA INHIBITION OF FUNCTION OF $ G (A) 1,6-FUCOSYLTRANSFERASE
WO2005044859A2 (en) 2003-11-05 2005-05-19 Glycart Biotechnology Ag Cd20 antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
SI1725249T1 (sl) 2003-11-06 2014-04-30 Seattle Genetics, Inc. Spojine monometilvalina, sposobne konjugacije na ligande
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
AU2004308972C1 (en) 2003-12-24 2009-11-26 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
WO2005082023A2 (en) 2004-02-23 2005-09-09 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
GB0404187D0 (en) 2004-02-25 2004-03-31 Biotransformations Ltd Binding agents
AU2005230848B9 (en) 2004-03-31 2011-06-02 Genentech, Inc. Humanized anti-TGF-beta antibodies
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
ES2403055T3 (es) 2004-04-13 2013-05-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos anti-P-selectina
EP2286844A3 (en) 2004-06-01 2012-08-22 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
WO2006034488A2 (en) 2004-09-23 2006-03-30 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
US7999077B2 (en) 2004-09-30 2011-08-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services IRTA2 antibodies and methods of use
US20070134243A1 (en) 2004-12-01 2007-06-14 Gazzard Lewis J Antibody drug conjugates and methods
US7947839B2 (en) 2004-12-01 2011-05-24 Genentech, Inc. Heterocyclic-substituted bis-1,8 naphthalimide compounds, antibody drug conjugates, and methods of use
US20080247944A1 (en) 2005-01-12 2008-10-09 Robert Graziano Irta-2 Antibodies and Their Uses
EP3623473A1 (en) 2005-03-31 2020-03-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for production of polypeptide by regulation of assembly
WO2006114115A1 (de) 2005-04-26 2006-11-02 Trion Pharma Gmbh Kombination von antikörpern mit glukokortikoiden zur behandlung von krebs
AU2006252733A1 (en) 2005-06-02 2006-12-07 Astrazeneca Ab Antibodies directed to CD20 and uses thereof
CA2611778C (en) 2005-06-20 2012-11-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US8219149B2 (en) 2005-06-29 2012-07-10 Nokia Corporation Mobile communication terminal
KR101411165B1 (ko) * 2005-07-01 2014-06-25 메다렉스, 엘.엘.시. 예정 사멸 리간드 1 (피디-엘1)에 대한 인간 모노클로날항체
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
AU2006301492B2 (en) 2005-10-11 2011-06-09 Amgen Research (Munich) Gmbh Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
EP2465870A1 (en) 2005-11-07 2012-06-20 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus VH/VL hypervariable sequences
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
EP1820513A1 (en) 2006-02-15 2007-08-22 Trion Pharma Gmbh Destruction of tumor cells expressing low to medium levels of tumor associated target antigens by trifunctional bispecific antibodies
PT1999154E (pt) 2006-03-24 2013-01-24 Merck Patent Gmbh Domínios proteicos heterodiméricos modificados
CA2651567A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
MX2008015524A (es) 2006-06-12 2009-01-13 Trubion Pharmaceuticals Inc Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora.
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
WO2008109533A2 (en) 2007-03-02 2008-09-12 Medarex, Inc. Human antibodies that bind multiple irta family proteins, and uses thereof
RS53008B2 (sr) 2007-04-03 2022-12-30 Amgen Res Munich Gmbh Interspecijski specifičan cd3-epsilon vezujući domen
MX2009010611A (es) * 2007-04-03 2010-03-26 Micromet Ag Enlazadores biespecificos, especificos para especies.
PT2520590T (pt) 2007-04-03 2018-11-14 Amgen Res Munich Gmbh Domínio de ligação específico de espécies cruzadas
NZ580746A (en) 2007-04-03 2012-05-25 Micromet Ag Cross-species-specific bispecific binders
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
EP3492488A1 (en) 2007-08-22 2019-06-05 The Regents of The University of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
JP5490714B2 (ja) 2007-11-28 2014-05-14 メディミューン，エルエルシー タンパク質製剤
CN101945890A (zh) 2007-12-21 2011-01-12 健泰科生物技术公司 抗cd20抗体的结晶
WO2009080831A1 (en) 2007-12-26 2009-07-02 Biotest Ag Method of decreasing cytotoxic side-effects and improving efficacy of immunoconjugates
WO2009099741A1 (en) 2008-02-01 2009-08-13 Genentech, Inc. Nemorubicin metabolite and analog reagents, antibody-drug conjugates and methods
WO2009106096A1 (en) * 2008-02-27 2009-09-03 Fresenius Biotech Gmbh Treatment of resistant tumors with trifunctional antibodies
ES2532635T3 (es) 2008-07-15 2015-03-30 Genentech, Inc. Conjugados de antraciclina, proceso para su preparación y su uso como compuestos antitumorales
US20110178279A1 (en) 2009-08-03 2011-07-21 Williams John C Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects: application to anti-egfr antibodies
WO2010077643A1 (en) 2008-12-08 2010-07-08 Tegopharm Corporation Masking ligands for reversible inhibition of multivalent compounds
US8895702B2 (en) 2008-12-08 2014-11-25 City Of Hope Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects; application to anti-EGFR antibodies
MX2011010265A (es) 2009-04-01 2011-10-11 Genentech Inc Anticuerpos anti-fcrh5 e inmunoconjugados y metodos de uso.
US8466260B2 (en) 2009-04-01 2013-06-18 Genentech, Inc. Anti-FcRH5 antibodies and immunoconjugates and methods of use
CN102459346B (zh) * 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
EP2445936A1 (en) * 2009-06-26 2012-05-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
BR112012006727A2 (pt) 2009-09-25 2019-09-24 Shanghai National Engineering Res Center Of Antibody Medicine Co Ltd método de aquisição de proteínas com alta afinidade por um desenho auxiliado por computador
US20130129723A1 (en) * 2009-12-29 2013-05-23 Emergent Product Development Seattle, Llc Heterodimer Binding Proteins and Uses Thereof
ME02505B (me) * 2009-12-29 2017-02-20 Aptevo Res & Development Llc Heterodimerni vezujući proteini i njihove upotrebe
TWI653333B (zh) 2010-04-01 2019-03-11 安進研究（慕尼黑）有限責任公司 跨物種專一性之ＰＳＭＡｘＣＤ３雙專一性單鏈抗體
PE20130342A1 (es) 2010-04-15 2013-04-20 Spirogen Sarl Pirrolobenzodiacepinas y conjugados de las mismas
US9150663B2 (en) * 2010-04-20 2015-10-06 Genmab A/S Heterodimeric antibody Fc-containing proteins and methods for production thereof
EP2569337A1 (en) * 2010-05-14 2013-03-20 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
EP2575880B1 (en) 2010-05-27 2019-01-16 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2 epitope
EP3539988A3 (en) * 2010-05-27 2019-12-04 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2
US9193791B2 (en) 2010-08-03 2015-11-24 City Of Hope Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects
KR101612999B1 (ko) 2010-08-24 2016-04-15 로슈 글리카트 아게 활성화가능 이중특이적 항체
US8962804B2 (en) 2010-10-08 2015-02-24 City Of Hope Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof
RS59589B1 (sr) 2010-11-05 2019-12-31 Zymeworks Inc Dizajniranje stabilnog heterodimernog antitela sa mutacijama u fc domenu
CN103533943B (zh) 2010-11-10 2018-02-13 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 由cd3特异性结合结构域导致的不良作用的预防
CN103429737B (zh) 2010-11-30 2020-07-14 中外制药株式会社 细胞毒诱导治疗剂
CA2818635C (en) 2010-12-06 2021-06-15 National Reseach Council Of Canada Antibodies selective for cells presenting erbb2 at high density
US10689447B2 (en) * 2011-02-04 2020-06-23 Genentech, Inc. Fc variants and methods for their production
ES2676878T3 (es) 2011-03-03 2018-07-25 Zymeworks Inc. Diseño de armazón de heteromultímero multivalente y constructos
MX342135B (es) 2011-03-17 2016-09-14 Ramot At Tel-Aviv Univ Ltd Anticuerpos asimetricos, biespecificos y monoespecificos, y metodos para generar los mismos.
BR112013023918A2 (pt) 2011-03-25 2016-12-13 Glenmark Pharmaceuticals Sa imunoglobulina hetero-dimérica ou fragmento hetero-dimérico da mesma, método para produzir uma imunoglobulina hetero-dimérica ou fragmento hetero-dimérico da mesma, método para construir uma interface proteína-proteína de um domínio de uma proteína de múltiplos domínios e uso de um domínio doador de um primeiro e de um segundo membro de uma super-família de imunoglobulina de ocorrência natural
KR20160044598A (ko) 2011-03-29 2016-04-25 로슈 글리카트 아게 항체 Fc 변이체
US20140170148A1 (en) 2011-04-20 2014-06-19 Genmab A/S Bispecific antibodies against her2
AU2012245116A1 (en) 2011-04-20 2013-11-07 Genmab A/S Bispecific antibodies against HER2 and CD3
CN103842383B (zh) 2011-05-16 2017-11-03 健能隆医药技术（上海）有限公司 多特异性fab融合蛋白及其使用方法
ME03440B (me) 2011-05-21 2020-01-20 Macrogenics Inc Cd3-vezujući molekuli sposobni za vezivanje za humani i nehumani cd3
EP2578230A1 (en) 2011-10-04 2013-04-10 Trion Pharma Gmbh Removal of Tumor Cells from Intraoperative Autologous Blood Salvage
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
US20130165638A1 (en) * 2011-12-27 2013-06-27 Development Center For Biotechnology Light chain-bridged bispecific antibody
GB201203442D0 (en) 2012-02-28 2012-04-11 Univ Birmingham Immunotherapeutic molecules and uses
WO2013128027A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Amgen Research (Munich) Gmbh Long life polypeptide binding molecules
CN104736174B (zh) 2012-07-06 2019-06-14 根马布私人有限公司 具有三重突变的二聚体蛋白质
WO2014022540A1 (en) 2012-08-02 2014-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
CA2874864C (en) 2012-08-14 2023-02-21 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
US9562110B2 (en) 2012-11-21 2017-02-07 Wuhan Yzy Biopharma Co., Ltd. Bispecific antibody
CA2889298C (en) 2012-11-30 2024-01-02 Anton Belousov Identification of patients in need of pd-l1 inhibitor cotherapy
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
JO3529B1 (ar) 2013-02-08 2020-07-05 Amgen Res Munich Gmbh مضاد التصاق خلايا الدم البيض من أجل التخفيف من الاثار السلبية الممكنة الناتجة عن مجالات ارتباط cd3- المحدد
CA2901115A1 (en) 2013-02-15 2014-08-21 The Regents Of The University Of California Heterodimeric conditionally active chimeric antigen receptor and methods of use thereof
US10351626B2 (en) 2013-03-14 2019-07-16 The Scripps Research Institute Targeting agent antibody conjugates and uses thereof
US20140302037A1 (en) 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
JP6541581B2 (ja) 2013-03-15 2019-07-10 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、（ナンバー２）、リミテッドＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ （Ｎｏ．２） Ｌｉｍｉｔｅｄ 低濃度抗体製剤
WO2014170063A1 (en) 2013-04-19 2014-10-23 Covagen Ag Novel bispecific binding molecules with antitumoral activity
AU2014273475A1 (en) 2013-05-28 2015-11-19 Numab Innovation Ag Novel antibodies
AU2014274215B2 (en) 2013-05-28 2019-02-28 Dcb-Usa Llc Antibody locker for the inactivation of protein drug
AR096687A1 (es) 2013-06-24 2016-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti-fcrh5
KR20160029128A (ko) 2013-07-12 2016-03-14 자임워크스 인코포레이티드 이중특이적 cd3 및 cd19 항원 결합 구조체
WO2015013671A1 (en) 2013-07-25 2015-01-29 Cytomx Therapeutics, Inc. Multispecific antibodies, multispecific activatable antibodies and methods of using the same
SG11201603244VA (en) 2013-11-04 2016-05-30 Glenmark Pharmaceuticals Sa Production of t cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins
AU2014357292B2 (en) 2013-11-27 2020-06-25 Zymeworks Bc Inc. Bispecific antigen-binding constructs targeting HER2
ES2811923T3 (es) 2013-12-17 2021-03-15 Genentech Inc Anticuerpos anti-CD3 y métodos de uso
CN112353943A (zh) 2013-12-17 2021-02-12 豪夫迈·罗氏有限公司 用pd-1轴结合拮抗剂和紫杉烷治疗癌症的方法
TWI701042B (zh) 2014-03-19 2020-08-11 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
RU2718692C2 (ru) 2014-05-29 2020-04-13 Мэкроудженикс, Инк. Триспецифичные связывающие молекулы, которые специфически связывают антигены множества злокачественных опухолей, и способы их применения
US9611325B2 (en) 2014-07-21 2017-04-04 Wuhan Yzy Biopharma Co., Ltd. Construction and application of bispecific antibody HER2xCD3
EP3172235A2 (en) 2014-07-25 2017-05-31 Cytomx Therapeutics Inc. Anti-cd3 antibodies, activatable anti-cd3 antibodies, multispecific anti-cd3 antibodies, multispecific activatable anti-cd3 antibodies, and methods of using the same
US10519248B2 (en) 2014-07-25 2019-12-31 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Bispecific HER2 and CD3 binding molecules
DK3608337T3 (da) 2014-08-04 2024-06-17 Hoffmann La Roche Bispecifikke T-celleaktiverende antigenbindende molekyler
WO2016019969A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Ludwig-Maximilians-Universität München Subcutaneously administered bispecific antibodies for use in the treatment of cancer
WO2016036678A1 (en) 2014-09-02 2016-03-10 Medimmune, Llc Formulations of bispecific antibodies
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
KR102614189B1 (ko) 2014-11-17 2023-12-18 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. Cd3xcd20 이특이적 항체를 이용한 종양의 치료 방법
BR112017011326A2 (pt) 2014-12-05 2018-07-31 Genentech, Inc. anticorpo, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, método para produzir o anticorpo, imunoconjugado, composição farmacêutica, usos do anticorpo, métodos para tratar ou retardar a progressão de distúrbio proliferativo celular e para intensificar a função imune
CA2973159A1 (en) 2015-01-08 2016-07-14 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20
KR20230109773A (ko) 2015-02-24 2023-07-20 바이오아트라, 인코퍼레이티드 조건부 활성 생체 단백질
WO2016135239A1 (en) 2015-02-25 2016-09-01 Biotecnol Limited Fusion protein comprising three binding domains to her2
JP2018520642A (ja) 2015-05-01 2018-08-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド マスク抗ｃｄ３抗体及びその使用方法
EP3795679A1 (en) 2015-05-28 2021-03-24 Genentech, Inc. Cell-based assay for detecting anti-cd3 homodimers
AU2016274989A1 (en) 2015-06-12 2017-11-02 Immunomedics, Inc. Disease therapy with chimeric antigen receptor (car) constructs and t cells (car-t) or nk cells (car-nk) expressing car constructs
TW201718647A (zh) 2015-06-16 2017-06-01 建南德克公司 抗-cll-1抗體及使用方法
RU2748943C2 (ru) 2015-06-16 2021-06-02 Дженентек, Инк. ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА И АНТИТЕЛА С СОЗРЕВШЕЙ АФФИННОСТЬЮ ПРОТИВ FcRH5 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
EP3310811B1 (en) 2015-06-16 2021-06-16 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
JP2018524312A (ja) 2015-06-17 2018-08-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｈｅｒ２抗体及び使用方法
WO2016210447A1 (en) 2015-06-26 2016-12-29 University Of Southern California Masking chimeric antigen receptor t cells for tumor-specific activation
CA2997406C (en) 2015-12-09 2024-05-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies or cytokine release
JP7438662B2 (ja) 2016-01-25 2024-02-27 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｔ細胞依存性二重特異的抗体をアッセイするための方法
CN109923128A (zh) 2016-11-15 2019-06-21 基因泰克公司 用于用抗cd20/抗cd3双特异性抗体进行治疗的给药
US10561686B2 (en) 2018-01-12 2020-02-18 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expansion and uses thereof
WO2019143636A1 (en) 2018-01-16 2019-07-25 Lakepharma, Inc. Bispecific antibody that binds cd3 and another target

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