KR102329635B1 - Her3 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 HER3 및 CD3에 결합하는 이중특이적 항체에 관한 것으로서, 서열번호 1의 제1폴리펩타이드, 서열번호 2 의 제2폴리펩타이드, 서열번호 3, 5, 31, 33 및 35로 이루어진 군에서 선택되는 제3폴리펩타이드, 및 서열번호 4, 6, 32, 34 및 36으로 이루어진 군에서 선택되는 제4폴리펩타이드를 포함함으로써 면역세포의 HER3-양성 세포에 대한 특이적 유도(engaging) 효과가 우수하고, HER3-양성 세포의 성장 억제 및 사멸 효과가 우수하며, 비특이적 세포 독성에 의한 부작용을 유발하지 않는 항체에 관한 것이다.
Description
본 발명은 HER3 및 CD3에 결합하는 이중특이적 항체 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
대부분의 인체 암은 특정 암유전자 및 암 억제 유전자의 변이만으로 발생하지 않으며 여러 과정의 다양한 유전적 변화를 동반한다. 인간 게놈 프로젝트 (human genome project)의 결과로 암 환자의 혈청이나 암조직으로 cDNA 마이크로어레이 (microarray)를 이용하여 다양한 유전자들의 변화를 신속하고 경제적으로 분석할 수 있게 되었다.
그러나 유전자 분석의 결과를 이용하여 동정한 여러 유전자들의 증폭 또는 결손이 특정 질환에 관여하는가의 여부는 일정 모수 이상의 동일 질환에서 특정 유전자의 발현 변화를 분석하여 확인하는 것이 필수 과정이다. 이러한 과정을 거쳐 특정 암질환에 관여하는 것이 확인된 유전자는 암의 진단뿐 아니라 치료 약제의 개발에도 이용되고 있다.
암 치료를 위해 수술, 방사선 치료, 화학요법 등의 다양한 치료법이 개발되어 사용되고 있으나, 항암요법은 독성이 강하여 심각한 부작용 등의 문제점이 있고, 암의 종류 및 환자의 상태에 따라서는 상기 치료법의 적용이 어려운 경우가 있으며, 재발 가능성이 높다는 단점이 있다.
이에 따라, 환자의 면역기능을 이용한 면역치료(immunotherapy)에 대한 관심이 높아지고 있는데, 면역치료는 다양한 기능을 가진 면역세포들의 복잡한 상호작용을 통해 종양을 제거하는 특성을 이용하는 것이다. 암세포를 직접 제거하는 면역세포로는 NK 세포와 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL) 등이 있으며, 이들 효력세포(effector cell)에게 항원을 제시해 주는 항원제시세포(antigenpresenting cell)로는 수지상세포(dendritic cell, DC)나 B 세포가 있다. 그밖에 각종 사이토카인(cytokine)을 분비하는 보조 T 세포(Helper T cell, Th cell), 조절 T 세포(Regulatory T cell, Treg cell) 등이 함께 관여하게 된다.
CD3은, T 세포 수용체 복합체(TCR)와 관련하여 T 세포 상에 발현되는 동종이량체성 또는 이종이량체성 단백질이고, T 세포 활성화를 위해 요구된다. 기능성 CD3은 4개의 상이한 쇄들: 엡실론, 제타, 델타 및 감마 중 2개의 이량체성 회합으로부터 형성된다. CD3 이량체성 배열로는 감마/엡실론, 델타/엡실론 및 제타/제타가 포함된다.
CD3에 대한 항체는, T 세포 상에 CD3을 클러스터링함으로써 펩타이드-부하된 MHC 분자에 의한 TCR의 연결(engagement)과 유사한 방식으로 T 세포 활성화를 야기하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 항-CD3 항체는, T 세포의 활성화를 포함하는 치료학적 목적을 위해 사용될 수 있다.
한편, 인간 표피 성장 인자 수용체 3 (HER3, ErbB3)으로 알려진 ErbB 패밀리의 세 번째 멤버는 1989년에 Kraus 등에 의해 확인되었으며 (Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86: 9193-9197), 암 성장에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. (Horst et al. (2005) 115, 519-527; Xue et al. (2006) CancerRes. 66, 1418-1426). HER3는 유방암, 폐암 및 골육종 등의 여러가지 암에서 암세포의 성장, 증식, 항암제 내성 및 암 전이에 관여하는 것으로 알려져 있다 (Cancer Cell 2009 15:353, Oncogene 2001 20, 1465, Nat Med Rev 2007 13(6):675, Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Jan 15; 105(2):692-7., Science 2007 316, 1039).
HER3 유전자는 EGFR 및 HER2와 현저한 구조적 유사성을 지니는 1342개 아미노산의 단백질을 엔코딩한다. 전체 크기, 2개의 시스테인 클러스터(도메인 II 및 IV)를 갖는 4개의 세포외 서브도메인(I-IV), 및 티로신 키나제 도메인과 같은 특징은 EGFR 및 HER2와 구조적 유사성을 나타낸다 (Cho and Leahy (2002) Science, 297: 1330-1333). HER3의 티로신 키나제 도메인은 EGFR의 티로신 키나제 도메인과 59%의 서열 상동성을 나타낸다 (Brennan et al. (2000) Oncogene, 19: 6093-6101).
이중특이적 항체는 두 가지의 서로 다른 항체에 동시에 결합할 수 있는 항체를 말한다. 이러한 이중특이적 항체는 면역치료에 있어서 T세포 등의 면역세포가 특정 타겟 세포 (예컨대, 특정 암세포)에 대해서만 독성을 나타내고 그 외의 정상세포들에 대해서는 독성을 나타내지 않게 할 수 있으므로, 치료 효과를 극대화 하면서도 부작용을 최소화할 수 있어 T-세포 매개된 사멸이 요구되는 치료 현장에서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명자들은 CD3 및 HER3에 특이적으로 결합하는 새로운 이중특이적 항체를 개발하고 우수한 항암 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 HER3를 발현하는 세포에 CD3를 발현하는 면역세포를 효과적으로 유도(engaging)하여, HER3-특이적 세포 사멸을 효과적으로 유도할 수 있는 항체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 HER3 발현, 과발현 및 활성화에 의한 암 또는 암 전이를 효과적으로 예방 또는 치료하기 위한 항체, 항체-약물 접합체, 약학 조성물 및 치료방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 위와 같은 항체를 제조하기 위한 유전자를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
1. 서열번호 1의 제1폴리펩타이드; 서열번호 2 의 제2폴리펩타이드; 서열번호 3, 5, 31, 33, 및 35로 이루어진 군에서 선택되는 제3폴리펩타이드; 및 서열번호 4, 6, 32, 34 및 36으로 이루어진 군에서 선택되는 제4폴리펩타이드를 포함하는 항체.
2. 위 1에 있어서, 상기 제1폴리펩타이드는 제1경쇄가변영역이고, 상기 제2폴리펩타이드는 제1중쇄가변영역이고, 상기 제3폴리펩타이드는 제2경쇄가변영역이고, 상기 제4폴리펩타이드는 제2중쇄가변영역인, 항체.
3. 위 1에 있어서, 상기 항체는 서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄; 및 서열번호 9를 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 10을 포함하는 제2중쇄, 서열번호 11을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 12를 포함하는 제2중쇄, 서열번호 37을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 38을 포함하는 제2중쇄, 서열번호 39를 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 40를 포함하는 제2중쇄, 또는 서열번호 41을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 42를 포함하는 제2중쇄;를 포함하는 것인, 항체.
4. 위 1에 있어서, 상기 항체는 제1경쇄중쇄접합체 및 제2경쇄중쇄접합체를 포함하는 것인, 항체.
5. 위 4에 있어서, 상기 제1경쇄중쇄접합체는 서열번호 1의 제1폴리펩타이드 및 서열번호 2 의 제2폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제2경쇄중쇄접합체는 서열번호 3, 5, 31, 33, 및 35로 이루어진 군에서 선택되는 제3폴리펩타이드 및 서열번호 4, 6, 32, 34 및 36으로 이루어진 군에서 선택되는 제4폴리펩타이드를 포함하는 것인, 항체.
6. 위 5에 있어서, 상기 제1폴리펩타이드는 제1경쇄가변영역이고, 상기 제2폴리펩타이드는 제1중쇄가변영역이고, 상기 제3폴리펩타이드는 제2경쇄가변영역이고, 상기 제4폴리펩타이드는 제2중쇄가변영역인, 항체.
7. 위 4에 있어서, 상기 제1경쇄중쇄접합체는 서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄를 포함하고, 상기 제2경쇄중쇄접합체는 서열번호 9를 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 10을 포함하는 제2중쇄, 서열번호 11을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 12를 포함하는 제2중쇄, 서열번호 37을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 38을 포함하는 제2중쇄, 서열번호 39를 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 40를 포함하는 제2중쇄, 또는 서열번호 41을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 42를 포함하는 제2중쇄를 포함하는 것인, 항체.
8. 위 4에 있어서, 상기 제1경쇄중쇄접합체는 서열번호 13을 포함하고, 상기 제2경쇄중쇄접합체는 서열번호 14, 15, 43, 44 및 45로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 포함하는 것인, 항체.
9. 위 4에 있어서, 상기 제1경쇄중쇄접합체 및 상기 제2경쇄중쇄접합체는 놉-인투-홀(knob-into-hole)로 결합된 것인, 항체.
10. 위 1에 있어서, 상기 항체는 HER3의 세포외 도메인 및 CD3의 엡실론 도메인에 결합하는 것인, 항체.
11. 위 1 내지 10 중 어느 하나의 항체와 약물이 결합된 항체-약물 접합체.
12. 위 11에 있어서, 상기 약물은 독소, 화학요법제, 항암제, 항생제, ADP-라이보실 트랜스퍼라제(ADP-ribosyl transferase), 핵산 분해 효소, 마이크로투불린 억제제, 유사분열 억제제, 토포이소머라아제 억제제, DNA 인터컬레이터, 단백질제제, miRNA, shRNA, siRNA, 및 방사성 동위원소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나인, 항체-약물 접합체.
13. 위 11에 있어서, 상기 약물은 마이탄시노이드, 아우리스타틴, 돌라스타틴, 트리코테센, CC1065(세포독성화합물), 칼리케아미신 및 다른 에네디인 항생제, 탁산, 안트라시클린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈데신, 빈카 알카로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신, 다우노마이신, 에토포시드, 테니포시드, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 블레오마이신류, 에스페라미신류, 5-플루오로우라실, 멜팔란 및 기타 질소 머스타드, 그의 입체이성질체, 동배체, 동족체 또는 유도체, 시스-백금 및 시스-백금 동족체, 기타 삽입제인 효소 및 그의 단편, 예를 들어 핵산 분해 효소, 항생제, 독소(세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 소분자 독소), 시스플라틴, CPT-11, 독소루비신, 파클리탁셀 및 도세탁셀로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나인, 항체-약물 접합체.
14. 위 1 내지 10 중 어느 하나의 항체를 포함하는 암 또는 암 전이의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
15. 위 14에 있어서, 상기 암은 HER3-양성 고형암 및 전이암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
16. 위 14에 있어서, 상기 암은 HER3-양성 위암, 유방암, 폐암, 식도암, 갑상선, 두경부암, 췌장암, 대장암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
17. 위 14에 있어서, 상기 항체는 독소, 화학요법제, 항암제, 항생제, ADP-라이보실 트랜스퍼라제(ADP-ribosyl transferase), 핵산 분해 효소, 마이크로투불린 억제제, 유사분열 억제제, 토포이소머라아제 억제제, DNA 인터컬레이터, 단백질제제, miRNA, shRNA, siRNA, 및 방사성 동위원소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나와 결합된 것인, 약학 조성물.
18. 위 14에 있어서, 상기 항체는 마이탄시노이드, 아우리스타틴, 돌라스타틴, 트리코테센, CC1065(세포독성화합물), 칼리케아미신 및 다른 에네디인 항생제, 탁산, 안트라시클린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈데신, 빈카 알카로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신, 다우노마이신, 에토포시드, 테니포시드, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 블레오마이신류, 에스페라미신류, 5-플루오로우라실, 멜팔란 및 기타 질소 머스타드, 그의 입체이성질체, 동배체, 동족체 또는 유도체, 시스-백금 및 시스-백금 동족체, 기타 삽입제인 효소 및 그의 단편, 예를 들어 핵산 분해 효소, 항생제, 독소(세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 소분자 독소), 시스플라틴, CPT-11, 독소루비신, 파클리탁셀 및 도세탁셀로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나와 결합된 것인, 약학 조성물.
19. 서열번호 16 내지 30, 및 46 내지 60으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자.
본 발명에 따른 항체는 HER3에 높은 특이성 및 높은 결합력으로 결합하는 동시에 CD3에 높은 특이성 및 높은 결합력으로 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 HER3를 발현하는 세포의 사멸을 효과적으로 유도할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 HER3를 발현하는 세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 암세포의 사멸을 효과적으로 유도할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 암세포의 증식 및 전이를 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 HER3-양성 고형암 및 전이암의 사멸을 효과적으로 유도할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 HER3-양성 고형암 및 전이암의 증식 및 전이를 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 항암제에 내성을 갖는 HER3-양성 고형암 및 전이암 세포의 사멸을 효과적으로 유도할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 항암제에 내성을 갖는 HER3-양성 고형암 및 전이암의 증식 및 전이를 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 HER3-양성 암세포가 존재하는 조건에서만, HER3-양성 암세포에 대해서만 특이적으로 높은 수준의 세포 사멸 효능을 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 비특이적 세포 독성 (예컨대, 항체-의존적 세포 독성)에 의한 부작용을 유발하지 않을 수 있다.
도 1은 HER3 표적 항체를 발현 후 사이즈 배제 크로마토그래피로 정제하는 과정을 보여준다.
도 2는 CD3 표적 항체를 발현 후 사이즈 배제 크로마토그래피로 정제하는 과정을 보여준다.
도 3은 HER3/CD3 이중표적항체를 발현 후 사이즈 배제 크로마토그래피로 정제하는 과정을 보여준다.
도 4는 정제된 HER3/CD3 이중항체가 HER3 항체 절편 또는 CD3 항체 절편을 포함하지 않음을 보여준다.
도 5 는 SNU719, BT-20, T47D, MDA-MB-453의 암세포주에서 HER3의 상대적 발현량을 보여준다.
도 6은 IgG 형태의 카이메릭 OKT3 항체, Hu38 항체, A15, E15, A07 항체와 이중 항체로 제작한 Y1103/cOKT3-LALA, Y1103/Hu38-LALA, Y1103/A15-LALA, Y1103/E15-LALA, Y1103/A07-LALA의 H9세포주에 대한 결합 양상을 보여준다.도 7은 실시예 4에 따른 T세포관여항체 후보의 인비트로 세포 사멸 효능 평가 실험을 나타내는 개요도이다.도 8은 실시예 4에 따른 Y1103/Hu38-LALA, Y1103/A15-LALA, Y1103/E15-LALA의 인비트로 세포 사멸 효능을 나타낸다.
도 9는 실시예 4에 따른 Y1103/Hu38-LALA와 Y1103/OKT3-LALA의 인비트로 세포 사멸 효능을 나타낸다.
도 10은 HER3/CD3 이중항체에 의한 MDA-MB-453, T47D에서 T cell activation을 나타낸다.
도 2는 CD3 표적 항체를 발현 후 사이즈 배제 크로마토그래피로 정제하는 과정을 보여준다.
도 3은 HER3/CD3 이중표적항체를 발현 후 사이즈 배제 크로마토그래피로 정제하는 과정을 보여준다.
도 4는 정제된 HER3/CD3 이중항체가 HER3 항체 절편 또는 CD3 항체 절편을 포함하지 않음을 보여준다.
도 5 는 SNU719, BT-20, T47D, MDA-MB-453의 암세포주에서 HER3의 상대적 발현량을 보여준다.
도 6은 IgG 형태의 카이메릭 OKT3 항체, Hu38 항체, A15, E15, A07 항체와 이중 항체로 제작한 Y1103/cOKT3-LALA, Y1103/Hu38-LALA, Y1103/A15-LALA, Y1103/E15-LALA, Y1103/A07-LALA의 H9세포주에 대한 결합 양상을 보여준다.도 7은 실시예 4에 따른 T세포관여항체 후보의 인비트로 세포 사멸 효능 평가 실험을 나타내는 개요도이다.도 8은 실시예 4에 따른 Y1103/Hu38-LALA, Y1103/A15-LALA, Y1103/E15-LALA의 인비트로 세포 사멸 효능을 나타낸다.
도 9는 실시예 4에 따른 Y1103/Hu38-LALA와 Y1103/OKT3-LALA의 인비트로 세포 사멸 효능을 나타낸다.
도 10은 HER3/CD3 이중항체에 의한 MDA-MB-453, T47D에서 T cell activation을 나타낸다.
본 발명은 HER3 및 CD3에 결합하는 이중특이적 항체에 관한 것으로서, 서열번호 1의 제1폴리펩타이드; 서열번호 2 의 제2폴리펩타이드; 서열번호 3, 5, 31, 33, 및 35로 이루어진 군에서 선택되는 제3폴리펩타이드; 및 서열번호 4, 6, 32, 34 및 36으로 이루어진 군에서 선택되는 제4폴리펩타이드를 포함함으로써 면역세포의 HER3-양성 세포에 대한 특이적 유도(engaging) 효과가 우수하고, HER3-양성 세포의 성장 억제 및 사멸 효과가 우수하며, 비특이적 세포 독성에 의한 부작용을 유발하지 않는 항체에 관한 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 항체는, 서열번호 1의 제1폴리펩타이드; 서열번호 2 의 제2폴리펩타이드; 서열번호 3, 5, 31, 33, 및 35로 이루어진 군에서 선택되는 제3폴리펩타이드; 및 서열번호 4, 6, 32, 34 및 36으로 이루어진 군에서 선택되는 제4폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명의 항체는 HER3에 특이적으로 결합하는 동시에 CD3에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 항체는 HER3에 특이적으로 결합하는 항원결합부와 CD3에 특이적으로 결합하는 항원결합부를 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 제1폴리펩타이드 및 제2폴리펩타이드는 HER3에 대해 특이적으로 결합하는 항원결합부를 형성할 수 있으며, 제3폴리펩타이드 및 제4폴리펩타이드는 CD3에 대해 특이적으로 결합하는 항원결합부를 형성할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 항체의 제1 내지 제4폴리펩타이드는 각각 항체의 경쇄가변영역 또는 중쇄가변영역일 수 있다.
예컨대, 제1폴리펩타이드는 제1경쇄가변영역이고, 제2폴리펩타이드는 제1중쇄가변영역이고, 제3폴리펩타이드는 제2경쇄가변영역이고, 제4폴리펩타이드는 제2중쇄가변영역일 수 있다.
또한 예컨대, 제1폴리펩타이드는 제1중쇄가변영역이고, 제2폴리펩타이드는 제1경쇄가변영역이고, 제3폴리펩타이드는 제2경쇄가변영역이고, 제4폴리펩타이드는 제2중쇄가변영역일 수 있다.
또한 예컨대, 제1폴리펩타이드는 제1경쇄가변영역이고, 제2폴리펩타이드는 제1중쇄가변영역이고, 제3폴리펩타이드는 제2중쇄가변영역이고, 제4폴리펩타이드는 제2경쇄가변영역일 수 있다.
또한 예컨대, 제1폴리펩타이드는 제1중쇄가변영역이고, 제2폴리펩타이드는 제1경쇄가변영역이고, 제3폴리펩타이드는 제2중쇄가변영역이고, 제4폴리펩타이드는 제2경쇄가변영역일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 제1경쇄가변영역과 제1중쇄가변영역은 각각 별도의 폴리펩타이드 사슬에 포함되는 것일 수도 있고 (예컨대, 일반적인 IgG의 형태), 하나의 폴리펩타이드 사슬에 포함되는 것일 수도 있다 (예컨대, 경쇄중쇄접합체 또는 단일사슬항체절편(ScFv)의 형태). 경쇄중쇄접합체는 경쇄와 중쇄가 하나의 폴리펩타이드 사슬에 포함되는 것일 수 있다. 단일사슬항체절편은 경쇄가변영역과 중쇄가변영역이 하나의 폴리펩타이드 사슬에 포함되는 것일 수 있다.
제1경쇄가변영역과 제1중쇄가변영역이 각각 별도의 폴리펩타이드 사슬에 포함되는 경우, 제1경쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드 사슬과 제1중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드 사슬은 서로 이황화결합 등으로 결합될 수 있다.
제1경쇄가변영역과 제1중쇄가변영역이 하나의 폴리펩타이드 사슬에 포함되는 경우, 제1경쇄가변영역과 제1중쇄가변영역은 직접 연결되거나, 링커에 의해 연결되거나, 그 외 추가적인 폴리펩타이드 서열에 의해 연결될 수 있다.
제2경쇄가변영역과 제2중쇄가변영역은 각각 별도의 폴리펩타이드 사슬에 포함되는 것일 수도 있고 (예컨대, 일반적인 IgG의 형태), 하나의 폴리펩타이드 사슬에 포함되는 것일 수도 있다 (예컨대, 경쇄중쇄접합체 또는 단일사슬항체절편(ScFv)의 형태).
제2경쇄가변영역과 제2중쇄가변영역이 각각 별도의 폴리펩타이드 사슬에 포함되는 경우, 제2경쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드 사슬과 제2중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드 사슬은 서로 이황화결합 등으로 결합될 수 있다.
제2경쇄가변영역과 제2중쇄가변영역이 하나의 폴리펩타이드 사슬에 포함되는 경우, 제2경쇄가변영역과 제2중쇄가변영역은 직접 연결되거나, 링커에 의해 연결되거나, 그 외 추가적인 폴리펩타이드 서열에 의해 연결될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 항체는 서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄; 및 서열번호 9를 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 10을 포함하는 제2중쇄를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 항체는 서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄; 및 서열번호 11을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 12를 포함하는 제2중쇄를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 항체는 서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄; 및 서열번호 37을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 38을 포함하는 제2중쇄를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 항체는 서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄; 및 서열번호 39를 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 40을 포함하는 제2중쇄를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 항체는 서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄; 및 서열번호 41을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 42를 포함하는 제2중쇄를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 항체는 제1경쇄중쇄접합체 및 제2경쇄중쇄접합체를 포함하는 것일 수 있다.
구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 제1경쇄중쇄접합체는 서열번호 1의 제1폴리펩타이드 및 서열번호 2 의 제2폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제2경쇄중쇄접합체는 서열번호 3, 5, 31, 33, 및 35로 이루어진 군에서 선택되는 제3폴리펩타이드 및 서열번호 4, 6, 32, 34 및 36으로 이루어진 군에서 선택되는 제4폴리펩타이드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 제1 내지 제4폴리펩타이드는 각각 항체의 경쇄가변영역 또는 중쇄가변영역일 수 있다. 예컨대, 상기 제1폴리펩타이드는 제1경쇄가변영역이고, 상기 제2폴리펩타이드는 제1중쇄가변영역이고, 상기 제3폴리펩타이드는 제2경쇄가변영역이고, 상기 제4폴리펩타이드는 제2중쇄가변영역일 수 있다.
구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 제1경쇄중쇄접합체는 서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄를 포함하고, 상기 제2경쇄중쇄접합체는 서열번호 9를 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 10을 포함하는 제2중쇄를 포함하는 것일 수 있다.
구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 제1경쇄중쇄접합체는 서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄를 포함하고, 상기 제2경쇄중쇄접합체는 서열번호 11을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 12를 포함하는 제2중쇄를 포함하는 것일 수 있다.
구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 제1경쇄중쇄접합체는 서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄를 포함하고, 상기 제2경쇄중쇄접합체는 서열번호 37을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 38을 포함하는 제2중쇄를 포함하는 것일 수 있다.
구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 제1경쇄중쇄접합체는 서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄를 포함하고, 상기 제2경쇄중쇄접합체는 서열번호 39를 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 40을 포함하는 제2중쇄를 포함하는 것일 수 있다.
구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 제1경쇄중쇄접합체는 서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄를 포함하고, 상기 제2경쇄중쇄접합체는 서열번호 41을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 42를 포함하는 제2중쇄를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 제1경쇄중쇄접합체와 제2경쇄중쇄접합체는 서로 이황화결합 또는 놉-인투-홀(knob-into-hole) 등으로 결합될 수 있다. 보다 구체적인 일 실시예에 따르면 제1경쇄중쇄접합체와 제2경쇄중쇄접합체는 서로 놉-인투-홀(knob-into-hole)로 결합될 수 있다. 놉-인투-홀(knob-into-hole)로 결합되는 경우, 제1경쇄중쇄접합체에 놉(knob)이 형성되고 제2경쇄중쇄접합체에 홀(hole)이 형성될 수 있으며, 보다 구체적인 일 실시예에 따르면 제1경쇄중쇄접합체의 중쇄(예컨대 중쇄불변영역)에 놉이 형성되고 제2경쇄중쇄접합체의 중쇄(예컨대 중쇄불변영역)에 홀이 형성될 수 있다. 제1경쇄중쇄접합체와 제2경쇄중쇄접합체가 이와 같이 놉-인투-홀(knob-into-hole)로 결합되는 경우, 제조 공정에 있어서 제1경쇄중쇄접합체와 제2경쇄중쇄접합체의 이형이합체(heterodimer) 형성 효율이 향상될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 항체는 위에 기술한 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역에 더하여 경쇄불변영역 및 중쇄불변영역을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 항체는 제1경쇄가변영역, 제1경쇄불변영역, 제1중쇄가변영역 및 제1중쇄불변영역을 포함하는 것일 수 있다. 제1중쇄불변영역은 2개 이상 (예컨대 3개) 포함될 수 있다. 예컨대, 항체는 제1경쇄가변영역, 제1경쇄불변영역, 제1중쇄가변영역, 제1중쇄불변영역A, 제1중쇄불변영역B 및 제1중쇄불변영역C를 포함하는 것일 수 있다. 또한 예컨대, 항체는 제2경쇄가변영역, 제2경쇄불변영역, 제2중쇄가변영역 및 제2중쇄불변영역을 포함하는 것일 수 있다. 제2중쇄불변영역은 2개 이상 (예컨대 3개) 포함될 수 있다. 예컨대, 항체는 제2경쇄가변영역, 제2경쇄불변영역, 제2중쇄가변영역, 제2중쇄불변영역A, 제2중쇄불변영역B 및 제2중쇄불변영역C를 포함하는 것일 수 있다.
제1경쇄가변영역과 제1중쇄가변영역은 HER3에 특이적으로 결합하는 제1항원결합부를 형성하는 것일 수 있으며, 제2경쇄가변영역과 제2중쇄가변영역은 CD3에 특이적으로 결합하는 제2항원결합부를 형성하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 HER3에 높은 특이성 및 높은 결합력으로 결합하는 동시에 CD3에 높은 특이성 및 높은 결합력으로 결합할 수 있어, CD3를 발현하는 면역세포(예컨대 T세포, 자연살해세포 등)를 HER3를 발현하는 세포(예컨대 암세포)에 효과적으로 표적화(targeting) 또는 유도(engaging)할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 항체는 Fc 부분에 LALA 돌연변이 (L243A, L245A)가 존재하는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따른 Fc 부분에 LALA 돌연변이가 존재하는 항체는, 항체-의존적 세포독성 효능 (ADCC, antibody-dependent cell cytotoxicity efficacy)을 나타내지 않아, HER3를 발현 또는 과발현 하는 세포(예컨대, 암세포)가 존재할 때만 해당 암세포에 대해 선택적으로 세포 독성(예컨대 세포 사멸 효능)을 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 항체는, HER3를 발현 또는 과발현하는 세포의 사멸을 유도하거나 증식을 억제거나 전이를 억제할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 항체는 암세포의 사멸을 유도하거나, 증식을 억제하거나, 전이를 억제할 수 있다. 일 실시예에 따르면, 위의 암세포는 HER3-양성 고형암 및 전이암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 암세포일 수 있으며, 예컨대 유방암, 폐암 또는 골육종 세포일 수 있으며, 예컨대 전이성 암세포일 수 있고, 또한 예컨대 항암제에 저항성이 있는 암세포일 수 있다. 위의 항암제는 예컨대 라파티닙 (lapatinib)일 수 있다.
한편, 본 발명은 본 발명에 따른 항체와 약물이 결합된 항체-약물 접합체 (antibody-drug conjugate, ADC)를 제공한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 약물은 독소, 화학요법제, 항암제, 항생제, ADP-라이보실 트랜스퍼라제(ADP-ribosyl transferase), 핵산 분해 효소, 마이크로투불린 억제제, 유사분열 억제제, 토포이소머라아제 억제제, DNA 인터컬레이터, 단백질제제, miRNA, shRNA, siRNA, 및 방사성 동위원소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적인 일 실시예에 따르면 상기 약물은 마이탄시노이드, 아우리스타틴, 돌라스타틴, 트리코테센, CC1065(세포독성화합물), 칼리케아미신 및 다른 에네디인 항생제, 탁산, 안트라시클린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈데신, 빈카 알카로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신, 다우노마이신, 에토포시드, 테니포시드, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 블레오마이신류, 에스페라미신류, 5-플루오로우라실, 멜팔란 및 기타 질소 머스타드, 그의 입체이성질체, 동배체, 동족체 또는 유도체, 시스-백금 및 시스-백금 동족체, 기타 삽입제인 효소 및 그의 단편, 예를 들어 핵산 분해 효소, 항생제, 독소(세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 소분자 독소), 시스플라틴, CPT-11, 독소루비신, 파클리탁셀 및 도세탁셀로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또 다른 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 방사성 동위원소는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I 및 186Re 로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
구체적인 일 실시예에 따르면 상기 독소는 에토포시드, 테니포시드, 아드리아마이신, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프 테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 시스-백금 및 시스-백금 동족체, 블레오마이신류, 에스페라미신류, 5-플루오로우라실, 멜팔란 및 기타 질소 머스타드로부터 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 항체는, 인체에 적용하기 위하여 면역원성을 감소시킨 카이메릭 항체 및 인간화 항체 등으로 전환될 수 있다. 예컨대, 카이메릭 항체는 본 발명의 경쇄가변영역을 인간 항체의 경쇄불변영역 및 중쇄불변영역과 재조합한 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체 및 항체-약물 접합체를 포함하는 암 또는 암 전이의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 또한, 상기 항암 조성물은 전형적으로 막을 통과한 이동을 용이하게 하는 계면활성제를 포함할 수 있다. 이러한 계면활성제는 스테로이드에서 유도된 것이거나 N-[1-(2,3-디올레오일)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTMA) 등의 양이온성 지질, 또는 콜레스테롤 헤미숙시네이트, 포스파티딜 글리세롤 등의 각종 화합물 등이 있다.
본 발명의 약학 조성물은 0.1mg/kg(body) 내지 100mg/kg(body)로 투여될 수 있다. 예컨대, 0.5 mg/kg(body) 내지 50mg/kg(body), 또한 예컨대 1mg/kg(body) 내지 10 mg/kg(body)으로 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체, 항체-약물 접합체 및 이를 포함하는 약학 조성물을 개체에 유효량으로 투여하여 암 또는 암 전이를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 예컨대, 유효량은 암 종류, 환자의 연령, 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 치료 회수, 투여 형태 및 경로 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다. 또한 예컨대, 본 발명의 항체, 항체-약물 접합체 및 이를 포함하는 약학 조성물은 그 이외의 약리학적 또는 생리학적 성분과 병용 투여 (예컨대, 동시에 또는 순차적으로 투여)될 수 있으며, 이러한 투여는 단일 또는 다중 투여일 수 있다.
본 발명에서, "개체"는 본 발명에 따른 항체, 항체-약물 접합체 및 이를 포함하는 약학 조성물을 투여하여 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태 또는 질환을 앓고 있거나 그러한 위험이 있는 포유동물 (예컨대, 인간)일 수 있다.
본 발명에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 예컨대, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 신규한 유전자를 제공한다.
본 발명의 유전자는 서열번호 16 내지 30, 및 46 내지 60으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자이다.
서열번호 16 내지 30의 유전자는 서열번호 1 내지 15의 아미노산 서열에 대응되는 뉴클레오티드 서열이고, 서열번호 46 내지 60의 유전자는 서열번호 31 내지 45에 대응되는 뉴클레오티드 서열이다.
전술한 바와 같이, 상기 아미노산 서열들은 항체에 구성요소로서 포함될 수 있는 것들로서, 본 발명의 유전자는 그러한 구성요소들을 코딩하는 유전자이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 예시한 것들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. HER3/CD3 이중특이적 항체 발현, 정제, 분석
1. 항체 발현을 위한 벡터 transfection
1.1. Transfection 수행 24 시간 전에 Expi293F 세포를 2.0X106 cells/㎖로 Expi293 media 를 이용하여 예상 필요량에 맞추어 37℃, 8% CO2 shaking incubator에서 125±10 rpm으로 계대한다.
1.2. Transfection 수행 당일, 세포 수와 세포 생존율(viability)을 측정한다. 세포 생존율은 95% 이상이어야 한다.
1.3. 500 ㎖ 배양 플라스크에 5 X 108cell 을 넣고, Expi293 배지를 첨가하여 최종 170 ㎖ 로 조정한다. (200 ㎖ 기준)
1.4. 200 ㎍의 항체 발현 벡터를 Opti-MEM I 배지를 이용하여 총 1500 ㎕가 되도록 섞어 주고 실온에서 5분간 incubation 한다.
1.5. 540 ㎕의 transfection reagent 를 Opti-MEM I 배지를 이용하여 총 1500 ㎕가 되도록 섞어주고 상온에서 5 분간 incubation 한다.
1.6. 벡터와 transfection reagent가 각각 들어있는 Opti-MEM I 을 부드럽게 섞어주고 20분간 상온에서 반응시킨 후, 미리 준비해 놓은 Expi293F 세포가 있는 플라스크에 넣어준다.
1.7. 37℃, 8% CO2 shacking incubator에서 125±10 rpm으로 16~20 시간 동안 배양한 후에 transfection enhancer I을 1㎖, enhancer II 를 10㎖ 첨가하고, 6일간 배양 후 harvest 한다.
2. Protein A resin을 이용한 항체 정제
2.1. 배양액을 4000 rpm 에서 30분간 원심분리하고, 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 cell debris 를 제거하고 상등액을 얻는다.
2.2. MabselectXtra resin 1 ㎖을 컬럼에 넣고, resin volume 의 10배에 해당하는 Protein A binding buffer 를 이용하여 평형을 수행한다.
2.3. 상등액을 gravity 를 이용하여 컬럼에 loading 한다.
2.4. Loading 이 끝나면 resin volume 의 10배에 해당하는 Protein A binding buffer 를 이용하여 컬럼을 washing 한다.
2.5. IgG elution buffer 를 컬럼에 elution 수행하여, Eppen tube 에 1 ㎖씩 분취하여, 1.5M Tris-Cl 을 eluate 1 ㎖ 당 25 ㎕를 넣어 중화한 후, OD 280 nm 에서 농도를 측정한다.
2.6. 농도가 측정된 eluate 는 dialysis 를 통해 PBS 로 buffer 를 치환하였다.
3. 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용한 항체 정제
3.1. 시료를 약 1.0~2.0 g/L이 되도록 농축 또는 희석하고, 이를 AKTA purifier 900에 장착된 HiLoad 16/600 Superdex 200 pg 컬럼에 로딩한다.
3.2. 이동상은 200 mM의 염화나트륨을 포함하는 20 mM sodium phosphate (pH 7.0)을 사용하고, 유속 1.0 ㎖/min로 흘려주었다. AKTA system의 peak 값을 기준으로 약 50~70분후에 용출되는 피크를 1㎖ 단위로 수집한다. 해당 elution fraction을 4-12% Bis-Tris PAGE를 사용하여 coomassie blue staining을 통해 확인한다. Staining gel의 band pattern을 기준으로 150 kDa의 항체가 포함된 fraction을 모아서 30kDa Amicon 원심 필터 유닛을 사용하여 농축하였다.
4. 이중항체 순도를 확인하기 위한 isoelectric focusing(IEF)
4.1. 정제된 항체 8~10㎍을 샘플버퍼를 사용하여 IEF 젤에 로딩하였다. 러닝은 100V로 1시간, 200V로 1시간, 500V로 30분간 러닝하였다.
4.2. 러닝된 gel은 12% TCA 용액을 이용하여 30분간 단백질을 고착(fixation) 하였다. 이 후 coomassie blue staining solution을 이용하여 30분간 염색한 후 탈색 버퍼를 이용하여 탈색을 한 다음 band intensity를 통해 이중항체의 순도를 계산할 수 있었다.
5. 결과 및 고찰
5.1. HER3 타겟 항체 발현 벡터를 Expi293F에 transfection하여 배양한 상등액으로부터 protein A로 항체를 정제하고, 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 시료를 분취한 후 150kDa에 해당하는 단백질 시료만을 취하였다. (도 1)
5.2. CD3 타겟 항체 발현 벡터를 Expi293F에 transfection하여 배양한 상등액으로부터 protein A로 항체를 정제하고, 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 시료를 분취한 후 150kDa에 해당하는 단백질 시료만을 취하였다. (도 2)
5.3. HER3 타겟 항체 발현 벡터와 CD3 타겟 항체 발현 벡터를 Expi293F에 transfection하여 배양한 상등액으로부터 protein A로 항체를 정제하고, 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 시료를 분취한 후 150kDa에 해당하는 단백질 시료만을 취하였다. (도 3)
5.4. 도면 1, 2, 3에서 얻은 3 종류의 단백질 시료를 IEF gel analysis를 통해 분석한 결과 HER3/CD3 이중항체 시료에는 HER3 항체 절편, 또는 CD3 항체 절편이 거의 없음을 확인하였다. (도 4)
실시예 2. HER3를 발현하는 암종 선별을 위한 flow cytometry 분석
1. FACS analysis
1.1. 5㎖ tube에 2x105cells을 100㎕의 FACS buffer(2% FBS/sheath buffer)에 준비한다.
1.2. 1차 항체를 튜브당 1 ㎍씩 처리하고, 30분간 빛을 차단하고, 4℃에서 incubation한다.
1.3. 3㎖ FACS buffer를 넣어주고, 4℃, 2000 rpm에서 3분간 원심분리하여 상등액을 제거한다.
1.4. 1차 항체에 특이적으로 결합할 수 있는, 형광색소로 표지된 2차 항체를 100㎕의 FACS buffer에 0.2 ㎍씩 처리하고 30분간 빛을 차단하고, 4℃에서 incubation한다.
1.5. 3㎖ FACS buffer를 넣어주고, 4℃, 2000 rpm에서 3분간 원심분리하여 상등액을 제거한다.
1.6. 200㎕의 BD CytofixTM를 넣어주고 cell을 suspension하여 LSR Fortessa로 분석한다.
2. 결과 및 고찰
2.1. SNU719, BT-20, T47D, MDA-MB-453, 총 4종의 암세포주에 대해 HER3 항원의 발현정도를 비교한 결과 BT-20 < SNU719 < T47D < MDA-MB-453순으로 HER3의 발현이 높은 것으로 확인되었다. 그리고 irrelevant control로 사용하는 negative control 항체에 대해서는 4종 세포 모두 binding하지 않았다(도 5).
실시예 3. HER3/CD3 이중특이적 항체의 T 세포에 대한 결합력 분석
H9 (ATCC, HTB-176TM, T lymphoma) 세포주를 이용해 CD3에 대한 항체의 결합력을 평가하고자 하였다.
1. FACS analysis
1.1. 5㎖ tube에 2x105cells을 100㎕의 FACS buffer(2% FBS/sheath buffer)에 준비한다.
1.2. 1차 항체를 튜브당 5, 1, 0.2, 0.04, 0.008 ㎍/mL로 처리하고, 30분간 빛을 차단하고, 4℃에서 incubation한다.
1.3. 3㎖ FACS buffer를 넣어주고, 4℃, 2000 rpm에서 3분간 원심분리하여 상등액을 제거한다.
1.4. 1차 항체에 특이적으로 결합할 수 있는, 형광색소로 표지된 2차 항체를 100㎕의 FACS buffer에 0.2 ㎍씩 처리하고 30분간 빛을 차단하고, 4℃에서 incubation한다.
1.5. 3㎖ FACS buffer를 넣어주고, 4℃, 2000 rpm에서 3분간 원심분리하여 상등액을 제거한다.
1.6. 200㎕의 BD CytofixTM 를 넣어주고 cell을 suspension하여 LSR Fortessa로 분석한다.
2. 결과 및 고찰
2.1. H9세포주에 대하여 IgG 형태의 카이메릭 OKT3 항체, Hu38 항체, A15, E15, A07 항체와 이중 항체로 제작한 Y1103/cOKT3-LALA, Y1103/Hu38-LALA, Y1103/A15-LALA, Y1103/E15-LALA, Y1103/A07-LALA의 결합을 비교한 결과, 이중항체의 CD3에 대한 결합 정도가 Y1103/Hu38에서 가장 높고 Y1103/A15와 Y1103/E15가 다음순서로 높게 나타남을 확인하였다. Y1103/cOKT3의 경우 낮은 결합력을 보였으며, Y1103/A07은 결합력을 거의 보이지 않았다. (도6).
실시예 4. 종양 세포주에 대한 이중특이적 항체의 세포 사멸 효능 평가
본 실험에서는 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cell)와 항 HER3/CD3 이중특이적 항체를 이용하여 HER3+ 종양 세포(MDA-MB-453)에 대해 HER3-특이적 종양 세포 사멸 효능을 확인하고자 하였다 (도 7).
1. 실험방법
1.1. 타겟 세포주 준비
1.1.1. 1x Trypsin-EDTA 용액으로 세포들을 수확(harvest)한 후, 1200 rpm으로 4 ℃에서 5분간 원심분리 하였다.
1.1.2. 상층액을 제거한 후 cRPMI (RPMI, A10491-01+10% FBS+55 μM β-ME)에 재현탁하고, 세포 수를 정량하고, 각 세포주 현탁액을 2x105/㎖로 준비하고, 96-웰 플레이트에 100 ㎕/well씩 넣고, 플레이트들을 37℃ CO2 인큐베이터에서 하루 동안 배양하였다.
1.2. 말초혈액단핵세포 준비
1.2.1. 냉동보존된(Cryopreserved) 말초혈액단핵세포(PBMC)를 37℃ 수조에서 신속하게 녹인 후 50 ㎖ 코니컬 튜브(conical tube)로 옮겨, 튜브를 흔들어주면서 해동 배지(thawing media)(RPMI, 11875-093+10% FBS+55 μM β-ME)를 한 방울씩 점적하여 잘 섞어 주었다.
1.2.2. 1200 rpm으로 4 ℃에서 10분간 원심분리하여, 상층액을 제거하고 30㎖의 해동 배지에 재현탁한 다음, 세포 수를 정량 하였다.
1.2.3. 각 공여자(donor)별로 cRPMI에 현탁 하여 1x106cells/㎖ 농도로 맞추었다.
1.3. 말초혈액단핵세포 및 항체 플레이팅
1.3.1. 각 항체를 cRPMI로 희석한 후 10nM에서부터 1/5씩 희석하여 하루 전에 타겟 세포를 플레이팅한 웰에 처리하였다.
1.3.2. 위에서 준비한 PBMC를 타겟 : PBMC = 1 : 5 비율이 되도록 100 ㎕/well씩 넣어 주고, 37℃, CO2 인큐베이터에서 2일 동안 배양하였다.
1.4. MTT 에세이
1.4.1. 멀티채널마이크로파이펫을 이용해 CBA 에세이용 상층액을 50 ㎕/well씩 덜어내어 96-웰 플레이트에 옮겼다. 그리고, 멀티채널마이크로파이펫을 이용해 CellTiter 96® AQueous One Solution을 30 ㎕/well씩 넣어주었다. 그리고, 37℃ CO2 인큐베이터에서 1~2시간 동안 배양하였다. 그리고, 마이크로플레이트 리더기(Microplate reader)로 측정하였다 (490nm).
2. 결과 및 고찰
2.1. HER3를 발현하는 MDA-MB-453 암세포에 대해 HER3/CD3 이중항체에 의한 HER3 특이적 세포 사멸이 용량 의존적으로(dose dependent) 나타남을 확인하였다(도 8, 9). Irrelevant Ab와 Hu38항체를 연결한 이중항체((-)/Hu38-LALA)는 사멸을 유도하지 않았다.
실시예 5. HER3/CD3 이중항체에 의한 T세포 활성화 분석
HER3-CD3 target 이중항체에 의한 T cell activation 효능을 보기 위해 HER3 발현 암세포주 2종에 대해 IL2-luc2P Jurkat cell line(Promega)을 이용하여 T cell activation 효능을 분석하였다.
1. 실험 방법
1.1. 타겟 세포주 준비 : HER3를 발현하는 유방암 세포주인 MDA-MB-453, T47D 세포를 각각 96 well plate에 well당 3x104 세포로 100㎕ 컬쳐 배지(Culture Medium)를 이용해 깔아주고, 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터(humidified incubator)에서 18시간동안 배양하였다.
1.2. Effector 세포주 준비 : 37℃ 수조에서 2분간 GloResponseTM Frozen Thaw and Use (FTU) IL-2-luc2P Jurkat Effector Cells를 녹이고, 15㎖ 코니컬 원심분리 튜브(conical centrifuge tube)에 4㎖ pre-warmed Assay Medium (10%FBS가 포함된 RPMI medium)을 넣은 후, 녹여놓은 effector cell 1㎖을 첨가해 천천히 섞어주었다.
1.3. 항체와 effector 세포주 처리
1.3.1. 타겟 세포가 깔려있는 96-웰 플레이트에서 배지 75㎕를 제거하고, FTU IL2-Luc2P Jurkat cells을 웰당 1x105세포가 되도록 25㎕를 플레이트에 첨가하였다.
1.3.2. 항체는 1 nM에서부터 1/3씩 희석하여 3X 도즈(dose)를 10 포인트(points) 만들어 준비하였다. 그리고, 위에서 준비한 FTU IL2-Luc2P Jurkat 세포가 포함된 96-웰 플레이트에 준비된 10개 농도의 항체를 1X 도즈(dose)가 되도록 25㎕씩 넣어주었다.
1.3.3. 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터(humidified incubator)에서 5시간동안 인큐베이션 한 후에 인큐베이터에서 꺼내 실온에 맞게 10~15분간 방치하였다. 그리고, Bio-Glo™ 시약을 웰당 75㎕ 씩 넣어주었다. 그리고, 5분간 방치하였다가 GloMax™ Multi 및 멀티웰 플레이트 리더(multiwell plate reader)를 사용하여 측정하였다.
2. 결과 및 고찰
2.1. 실험결과 HER3/CD3 이중항체에 의해 MDA-MB-453, T47D에서 T cell activation을 확인할 수 있었다. Irrelevant Ab와 Hu38을 이용하여 제작한 이중항체는 T cell activation을 유도하지 않았다(도 10). 이는 HER3/CD3 이중표적 항체가 항원특이적으로 암세포와 T 세포를 연결한다는 것을 보여주는 결과라고 생각한다.
<110> Green Cross Corporation
Mogam Institute for Biomedical Research
<120> Bispecific antibody binding HER3 and CD3
<130> 04004
<150> KR 10-2017-0052449
<151> 2017-04-24
<160> 60
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y1103-CEW-LALA Variable Light
<400> 1
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Lys Ile Glu Asn Lys Ile Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Val Leu Phe
35 40 45
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Val Gly Ile Pro Glu Arg Ile Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Gly Gly Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Gly Leu Met Asp Pro
85 90 95
Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly
100 105
<210> 2
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y1103-CEW-LALA Variable Heavy
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Thr
20 25 30
Asn Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Glu Leu Gly Leu Asp Ala Leu Asp Ile
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OKT3-RCVT-LALA Variable Light
<400> 3
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gln
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg
100 105
<210> 4
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OKT3-RCVT-LALA Variable Heavy
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hu38-RCVT-LALA Variable Light
<400> 5
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 6
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hu38-RCVT-LALA Variable Heavy
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 212
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y1103-CEW-LALA Light chain
<400> 7
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Lys Ile Glu Asn Lys Ile Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Val Leu Phe
35 40 45
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Val Gly Ile Pro Glu Arg Ile Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Gly Gly Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Gly Leu Met Asp Pro
85 90 95
Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala
100 105 110
Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala
115 120 125
Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala
130 135 140
Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val
145 150 155 160
Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser
165 170 175
Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr
180 185 190
Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala
195 200 205
Pro Thr Glu Cys
210
<210> 8
<211> 452
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y1103-CEW-LALA Heavy chain
<400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Thr
20 25 30
Asn Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Glu Leu Gly Leu Asp Ala Leu Asp Ile
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225 230 235 240
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Glu Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Trp Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly
450
<210> 9
<211> 213
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OKT3-RCVT-LALA Light chain
<400> 9
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gln
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 10
<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OKT3-RCVT-LALA Heavy chain
<400> 10
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Arg Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Val Ser Asp Gly Ser Phe Thr Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 11
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hu38-RCVT-LALA Light chain
<400> 11
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 12
<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hu38-RCVT-LALA Heavy chain
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
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Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
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Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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115 120 125
Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala
130 135 140
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145 150 155 160
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Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly
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Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Glu Val Gln
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y1103-CEW-LALA Heavy chain DNA
<400> 23
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cagtttagtc tgcagctgaa tagcgttaca cctgaggata ccgccgtata ttactgcgcc 300
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<223> OKT3-RCVT-LALA Light chain DNA
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atgacctgct ctgcctccag cagcgtatca tacatgaact ggtaccagca gaagagtggg 120
acaagtccaa aaaggtggat atatgataca agcaaactgg ccagtggagt ccccgcgcat 180
ttcagaggtt ccggcagcgg cactagctat agcctgacga tctctggaat ggaggccgag 240
gacgctgcta cctactattg tcagcagtgg tcgagcaacc cctttacatt cggaagcggc 300
actaagctag agataaacag aaccgtcgct gcaccatcag tgtttatctt ccctccatca 360
gatgagcaac tgaaaagcgg tacagcaagt gttgtgtgtc tcttaaacaa tttctatccg 420
cgggaagcca aagtccagtg gaaggttgac aatgccctgc aatcaggtaa ttctcaagaa 480
tccgtcactg agcaggactc taaagactct acttactctc tttcctctac cctgactttg 540
agtaaggctg attatgaaaa acacaaagtg tacgcatgcg aggtgaccca ccagggcctc 600
agcagccctg tgacaaagag cttcaatcgc ggggaatgc 639
<210> 25
<211> 1344
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OKT3-RCVT-LALA Heavy chain DNA
<400> 25
caggtccaac tgcagcagtc cggagcagaa cttgcgagac caggagctag tgtgaagatg 60
tcctgcaaag catctggata tacttttaca aggtacacca tgcattgggt gaagcagaga 120
cccggacagg gattagagtg gatcggatac attaatccta gcagaggata cacaaactac 180
aatcagaagt tcaaagacaa agccaccttg acgaccgaca agtcgtcttc aaccgcctat 240
atgcaactgt caagtctgac tagcgaggat agtgccgtgt actactgtgc tagatattat 300
gacgatcact attgcctgga ttactgggga cagggaacaa ctctcacagt ttcctccgcc 360
tccaccaagg gcccaagcgt ctttccctta gcaccctcga gcaaatccac tagcgggggc 420
accgccgcac tcggatgtct ggtgaaggat tattttcctg aacctgtgac cgtaagttgg 480
aatagcggcg ccctgaccag cggtgttcat acgttccccg ctgtattgca atccagcggc 540
ctctactcac tgagcagtgt ggtgacagtg ccatcaagca gccttggaac gcagacttat 600
atatgtaacg ttaaccacaa gccatctaac actaaagtgg acaaaaaggt cgagcctaag 660
agctgtgata agacccacac atgccccccc tgcccagccc ccgaggcggc tggtggcccc 720
agtgttttcc tgtttcctcc taagcctaaa gacaccctga tgatctcaag gacaccggag 780
gtcacctgtg ttgtggtgga cgtgtcccac gaggacccag aggtcaagtt taactggtac 840
gtggacggtg tggaagttca taacgcaaaa acaaagccac gcgaggaaca gtacaattca 900
acatacagag tggtgtctgt gctgacagtg ctgcaccagg attggctgaa tgggaaagag 960
tacaagtgca aggtgtccaa taaagccctc cccgccccga ttgagaagac aattagcaaa 1020
gctaaaggac agccaagaga acctagagta tacaccctcc ctccctgccg ggatgagttg 1080
acaaagaatc aagtgtcttt aacctgtctg gttaaaggct tctacccctc ggacatcgct 1140
gtggaatggg aaagcaatgg gcagcccgaa aacaactata agaccactcc tcccgtcctg 1200
gtatcagatg gctccttcac cctgtatagc aaactgactg tggataaaag cagatggcag 1260
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aaaagcctta gtctgagtcc cggc 1344
<210> 26
<211> 657
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hu38-RCVT-LALA Light chain DNA
<400> 26
gacattgtga tgacccagtc acccgacagc ctggccgtgt cactgggcga acgcgccacc 60
atcaactgca agagtagcca gtctctgtta aatagcagaa ctagaaagaa ttatctagcc 120
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atttccagct tacaggctga agacgtggca gtctattatt gcaaacagtc ttttatcctt 300
agaacctttg gacagggcac aaaggttgaa attaaaagaa ccgtagctgc accaagcgtg 360
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agttctacac ttaccctgag caaggctgac tatgagaaac acaaggtgta tgcttgcgaa 600
gtcacacatc agggactctc tagcccggtg acaaagagct tcaacagagg agagtgt 657
<210> 27
<211> 1344
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hu38-RCVT-LALA Heavy chain DNA
<400> 27
gaagttcaat tagtacaaag cggcgcagag gtgaaaaaac ctggtgcaag tgttaaggtc 60
agttgcaaag ccagcggatt cacctttacc tcgtactaca ttcattgggt aagacaagcc 120
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aatgaaaaat tcaaagaccg cgtgaccata acagctgata cctctacgag cacagcctat 240
ctggagttgt ccagcctgcg ttcagaggat accgcggtgt actattgtgc tagagatggc 300
tatagcagat actacttcga ctactggggc cagggtactc tggtgactgt gtcatcagcc 360
tccaccaagg gcccaagcgt ctttccctta gcaccctcga gcaaatccac tagcgggggc 420
accgccgcac tcggatgtct ggtgaaggat tattttcctg aacctgtgac cgtaagttgg 480
aatagcggcg ccctgaccag cggtgttcat acgttccccg ctgtattgca atccagcggc 540
ctctactcac tgagcagtgt ggtgacagtg ccatcaagca gccttggaac gcagacttat 600
atatgtaacg ttaaccacaa gccatctaac actaaagtgg acaaaaaggt cgagcctaag 660
agctgtgata agacccacac atgccccccc tgcccagccc ccgaggcggc tggtggcccc 720
agtgttttcc tgtttcctcc taagcctaaa gacaccctga tgatctcaag gacaccggag 780
gtcacctgtg ttgtggtgga cgtgtcccac gaggacccag aggtcaagtt taactggtac 840
gtggacggtg tggaagttca taacgcaaaa acaaagccac gcgaggaaca gtacaattca 900
acatacagag tggtgtctgt gctgacagtg ctgcaccagg attggctgaa tgggaaagag 960
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acaaagaatc aagtgtcttt aacctgtctg gttaaaggct tctacccctc ggacatcgct 1140
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cagggaaacg ttttcagctg ctccgtgatg cacgaggccc ttcataatca ttatacccag 1320
aaaagcctta gtctgagtcc cggc 1344
<210> 28
<211> 2094
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y1103-CEW-LALA Light chain and heavy chain fusion DNA
<400> 28
cagagcgtgc tgactcagcc gcctagcgtg agtgtggccc ccggcaagac cgctagaata 60
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caggctcctc tgttagtgtt gttcgacgac tcagacaggc ccgtgggcat ccccgaaaga 180
atcagtggct ccaatagcgg taataccgct actctgacta ttggaggcgt tgaggcagag 240
gatgaagcag actattactg tcaggtatgg gatggcctga tggatccctt gtttggaggc 300
ggcacacagc tgacagtcct gggccagcct aaagcaaacc caacagtgac cttgttccct 360
ccctcctctg aggaactgca ggccaataag gccaccctgg tgtgcctgat cagtgacttc 420
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agccaaacac tgagcctgac gtgtgccatt tcaggcgaca gcgtgagcag cacaaacgcc 840
gcctggaact ggataagaca aagccccagc cgaggcctgg aatggcttgg cagaacatat 900
tatagatcta agtggtacaa cgattacgct gtgagcgtca agtccagaat caccatcaac 960
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tggctgaccg tggataagtc tagatggcag caggggaatg tctttagctg ttctgtgatg 2040
cacgaggcgc tccataacca ctacacccag aagagcttga gcttgagccc agga 2094
<210> 29
<211> 2085
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OKT3-RCVT-LALA Light chain and heavy chain fusion DNA
<400> 29
cagattgtgc tcacccaatc ccccgctatc atgtcagcca gccctcagga gaaggtaacg 60
atgacctgct ctgcctccag cagcgtatca tacatgaact ggtaccagca gaagagtggg 120
acaagtccaa aaaggtggat atatgataca agcaaactgg ccagtggagt ccccgcgcat 180
ttcagaggtt ccggcagcgg cactagctat agcctgacga tctctggaat ggaggccgag 240
gacgctgcta cctactattg tcagcagtgg tcgagcaacc cctttacatt cggaagcggc 300
actaagctag agataaacag aaccgtcgct gcaccatcag tgtttatctt ccctccatca 360
gatgagcaac tgaaaagcgg tacagcaagt gttgtgtgtc tcttaaacaa tttctatccg 420
cgggaagcca aagtccagtg gaaggttgac aatgccctgc aatcaggtaa ttctcaagaa 480
tccgtcactg agcaggactc taaagactct acttactctc tttcctctac cctgactttg 540
agtaaggctg attatgaaaa acacaaagtg tacgcatgcg aggtgaccca ccagggcctc 600
agcagccctg tgacaaagag cttcaatcgc ggggaatgct cggggggagg aagtggcggg 660
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ggatcaggcg gaggaagcgg acaggtccaa ctgcagcagt ccggagcaga acttgcgaga 780
ccaggagcta gtgtgaagat gtcctgcaaa gcatctggat atacttttac aaggtacacc 840
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cttcataatc attataccca gaaaagcctt agtctgagtc ccggc 2085
<210> 30
<211> 2103
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hu38-RCVT-LALA Light chain and heavy chain fusion DNA
<400> 30
gacattgtga tgacccagtc acccgacagc ctggccgtgt cactgggcga acgcgccacc 60
atcaactgca agagtagcca gtctctgtta aatagcagaa ctagaaagaa ttatctagcc 120
tggtatcagc aaaagccagg acagtctcct aaactgttga tctactggac ttctacaaga 180
aagagcgggg tgccagatag atttagcgga tctggcagcg gaactgattt caccctgacg 240
atttccagct tacaggctga agacgtggca gtctattatt gcaaacagtc ttttatcctt 300
agaacctttg gacagggcac aaaggttgaa attaaaagaa ccgtagctgc accaagcgtg 360
ttcatattcc cccccagcga tgaacagctt aagtcaggca ctgccagcgt cgtgtgtctg 420
ttgaataact tttatcccag agaggccaag gtccagtgga aagtggacaa tgccctgcag 480
tctggcaaca gccaagagag tgttaccgag caagactcta aggacagtac gtattctctg 540
agttctacac ttaccctgag caaggctgac tatgagaaac acaaggtgta tgcttgcgaa 600
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tttcccttag caccctcgag caaatccact agcgggggca ccgccgcact cggatgtctg 1200
gtgaaggatt attttcctga acctgtgacc gtaagttgga atagcggcgc cctgaccagc 1260
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ccatctaaca ctaaagtgga caaaaaggtc gagcctaaga gctgtgataa gacccacaca 1440
tgccccccct gcccagcccc cgaggcggct ggtggcccca gtgttttcct gtttcctcct 1500
aagcctaaag acaccctgat gatctcaagg acaccggagg tcacctgtgt tgtggtggac 1560
gtgtcccacg aggacccaga ggtcaagttt aactggtacg tggacggtgt ggaagttcat 1620
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ctgacagtgc tgcaccagga ttggctgaat gggaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaat 1740
aaagccctcc ccgccccgat tgagaagaca attagcaaag ctaaaggaca gccaagagaa 1800
cctagagtat acaccctccc tccctgccgg gatgagttga caaagaatca agtgtcttta 1860
acctgtctgg ttaaaggctt ctacccctcg gacatcgctg tggaatggga aagcaatggg 1920
cagcccgaaa acaactataa gaccactcct cccgtcctgg tatcagatgg ctccttcacc 1980
ctgtatagca aactgactgt ggataaaagc agatggcagc agggaaacgt tttcagctgc 2040
tccgtgatgc acgaggccct tcataatcat tatacccaga aaagccttag tctgagtccc 2100
ggc 2103
<210> 31
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A15-RCVT-LALA Variable Light
<400> 31
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
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Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 32
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A15-RCVT-LALA Variable heavy
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 33
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E15-RCVT-LALA Variable Light
<400> 33
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 34
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E15-RCVT-LALA Variable heavy
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 35
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A07-RCVT-LALA Variable Light
<400> 35
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
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Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
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Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 36
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A07-RCVT-LALA Variable heavy
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
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Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 37
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A15-RCVT-LALA Light chain
<400> 37
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
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420 425 430
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
435 440 445
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
450 455 460
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
465 470 475 480
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
485 490 495
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
500 505 510
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
515 520 525
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
530 535 540
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
545 550 555 560
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
565 570 575
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
580 585 590
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Arg Val Tyr Thr Leu Pro
595 600 605
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
610 615 620
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
625 630 635 640
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Val Ser
645 650 655
Asp Gly Ser Phe Thr Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
660 665 670
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
675 680 685
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
690 695 700
<210> 46
<211> 330
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A15-RCVT-LALA Variable Light DNA
<400> 46
caggccgtgg ttacgcagga gccctccctc acagtgagtc caggagggac agttacactg 60
acatgtagaa gctctactgg agccgtgact acctcaaatt acgcaaactg ggttcagcag 120
aagccaggcc aggcacctag aggcctgatc ggcggcacca ataaaagagc cccctggact 180
cccgctagat tttccggcag cctgctgggc ggcaaagccg ctctgacact ttctggcgct 240
cagcccgaag acgaggccga atactattgc gcgctgtggt atagcaatct gtgggtcttt 300
ggcggtggca ccaaactgac cgtgttgggt 330
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<211> 375
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A15-RCVT-LALA Variable heavy DNA
<400> 47
gaagtgcaac tggtggaaag cggcggcggc ctcgtgcagc ccggtggatc gcttaagtta 60
agttgtgccg ccagtgggtt caccttcaac acctatgcaa tgaactgggt tagacaagcc 120
agcggcaaag gactagaatg ggtaggcaga atacgatcta aatacaacaa ttatgctacc 180
tattacgctg actctgtcaa ggatagattt acaatctcac gcgatgactc taagaacaca 240
gcatacctcc aaatgaattc attgaaaacc gaggacaccg ctgtgtacta ctgcgtgaga 300
cacggaaatt tcggcaatag ctatgttagc tggttcgcat actggggcca aggtacccta 360
gtgactgtgt catca 375
<210> 48
<211> 330
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E15-RCVT-LALA Variable Light DNA
<400> 48
caagcagttg taacacaaga gcctagtctg accgtctctc ccggcggcac cgtgactctt 60
acatgcagaa gttccaccgg agccgtcaca acctcaaatt acgccaactg ggtccagcag 120
aaacccgggc aggccccaag aggattgatc ggcggtacta acaagcgagc accatggacc 180
cccgccagat ttagtggcag ccttctgggc ggcaaagcag cactgacctt atcaggcgcc 240
cagcctgagg atgaggccga gtattattgt gccctgtggt acagcaattt gtgggtattc 300
ggcggcggga cgaaactcac tgttctcggc 330
<210> 49
<211> 375
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E15-RCVT-LALA Variable heavy DNA
<400> 49
gaagtccaac tggtggagtc aggaggaggc ctggttcagc ccggcggcag cctgaagctg 60
agctgcgcag cgagcggatt cacattcaac acctacgcca tgaactgggt tagacaggcc 120
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tattacgctg actcggtgaa agatagattc acaatcagca gagacgacag taagaatact 240
gcctatctgc agatgaacag cttgaagact gaagacacgg ctgtgtatta ctgcgtgaga 300
cacggcaact ttgggaattc ttacgtgtct tggtttgctt attggggcca gggcaccttg 360
gtgacagtca gtagc 375
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<211> 330
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A07-RCVT-LALA Variable Light DNA
<400> 50
caggcggtgg tgacccagga accatctctc actgtatcac ctggaggaac cgtaaccctt 60
acctgcagat ccagcaccgg ggctgtcaca acaagcaact acgctaattg gtttcagcag 120
aaaccgggcc aagcacctag aggtttaatc ggaggcacga ataaacgggc accttggacg 180
ccagccagat ttagtggttc acttctggga gggaaagcgg ctctgactct gagcggtgca 240
cagccagaag atgaggcgga gtattattgt gctctgtggt acagcaactt gtgggttttt 300
ggtggcggca caaagttgac tgtgctaggg 330
<210> 51
<211> 375
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A07-RCVT-LALA Variable heavy DNA
<400> 51
gaagtgcagc tggtagagtc tggcggaggc ctagttcagc ctgggggcag cctgaagttg 60
agctgtgctg ccagcggctt caccttcaac acatacgcca tgaattgggt gcgacaggca 120
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tattacgccg actcggtcaa agatagattc accatcagta gagacgatag caagaacacc 240
gcctatctgc agatgaactc attaaaaaca gaagatacag ccgtgtacta ctgtgtgaga 300
cacggaaact ttggcaatag ctatgtttca tggttcgcct attggggcca gggaactctc 360
gttactgtgt ctagc 375
<210> 52
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A15-RCVT-LALA Light chain DNA
<400> 52
caggccgtgg ttacgcagga gccctccctc acagtgagtc caggagggac agttacactg 60
acatgtagaa gctctactgg agccgtgact acctcaaatt acgcaaactg ggttcagcag 120
aagccaggcc aggcacctag aggcctgatc ggcggcacca ataaaagagc cccctggact 180
cccgctagat tttccggcag cctgctgggc ggcaaagccg ctctgacact ttctggcgct 240
cagcccgaag acgaggccga atactattgc gcgctgtggt atagcaatct gtgggtcttt 300
ggcggtggca ccaaactgac cgtgttgggt cagccaaaag ctaaccctac agtaacattg 360
tttcctccaa gttccgaaga attgcaggcc aataaagcaa ctctggtgtg tctgattagc 420
gatttctatc caggcgccgt gaccgtggcc tggaaagcag atggaagccc tgtgaaagct 480
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gagggaagta ctgtagagaa aaccgttgct cctaccgaat gt 642
<210> 53
<211> 1362
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A15-RCVT-LALA heavy chain DNA
<400> 53
gaagtgcaac tggtggaaag cggcggcggc ctcgtgcagc ccggtggatc gcttaagtta 60
agttgtgccg ccagtgggtt caccttcaac acctatgcaa tgaactgggt tagacaagcc 120
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tattacgctg actctgtcaa ggatagattt acaatctcac gcgatgactc taagaacaca 240
gcatacctcc aaatgaattc attgaaaacc gaggacaccg ctgtgtacta ctgcgtgaga 300
cacggaaatt tcggcaatag ctatgttagc tggttcgcat actggggcca aggtacccta 360
gtgactgtgt catcagcctc caccaagggc ccaagcgtct ttcccttagc accctcgagc 420
aaatccacta gcgggggcac cgccgcactc ggatgtctgg tgaaggatta ttttcctgaa 480
cctgtgaccg taagttggaa tagcggcgcc ctgaccagcg gtgttcatac gttccccgct 540
gtattgcaat ccagcggcct ctactcactg agcagtgtgg tgacagtgcc atcaagcagc 600
cttggaacgc agacttatat atgtaacgtt aaccacaagc catctaacac taaagtggac 660
aaaaaggtcg agcctaagag ctgtgataag acccacacat gccccccctg cccagccccc 720
gaggcggctg gtggccccag tgttttcctg tttcctccta agcctaaaga caccctgatg 780
atctcaagga caccggaggt cacctgtgtt gtggtggacg tgtcccacga ggacccagag 840
gtcaagttta actggtacgt ggacggtgtg gaagttcata acgcaaaaac aaagccacgc 900
gaggaacagt acaattcaac atacagagtg gtgtctgtgc tgacagtgct gcaccaggat 960
tggctgaatg ggaaagagta caagtgcaag gtgtccaata aagccctccc cgccccgatt 1020
gagaagacaa ttagcaaagc taaaggacag ccaagagaac ctagagtata caccctccct 1080
ccctgccggg atgagttgac aaagaatcaa gtgtctttaa cctgtctggt taaaggcttc 1140
tacccctcgg acatcgctgt ggaatgggaa agcaatgggc agcccgaaaa caactataag 1200
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gataaaagca gatggcagca gggaaacgtt ttcagctgct ccgtgatgca cgaggccctt 1320
cataatcatt atacccagaa aagccttagt ctgagtcccg gc 1362
<210> 54
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E15-RCVT-LALA Light chain DNA
<400> 54
caagcagttg taacacaaga gcctagtctg accgtctctc ccggcggcac cgtgactctt 60
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ggcggcggga cgaaactcac tgttctcggc cagccaaagg ccaaccctac ggtcactctt 360
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gaaggctcca ccgtggagaa gacagtggcc cccactgaat gc 642
<210> 55
<211> 1362
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E15-RCVT-LALA Heavy chain DNA
<400> 55
gaagtccaac tggtggagtc aggaggaggc ctggttcagc ccggcggcag cctgaagctg 60
agctgcgcag cgagcggatt cacattcaac acctacgcca tgaactgggt tagacaggcc 120
tctgggaaag gattagagtg ggtggccaga attagaagta agtacaacaa ttacgctact 180
tattacgctg actcggtgaa agatagattc acaatcagca gagacgacag taagaatact 240
gcctatctgc agatgaacag cttgaagact gaagacacgg ctgtgtatta ctgcgtgaga 300
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cctgtgaccg taagttggaa tagcggcgcc ctgaccagcg gtgttcatac gttccccgct 540
gtattgcaat ccagcggcct ctactcactg agcagtgtgg tgacagtgcc atcaagcagc 600
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cataatcatt atacccagaa aagccttagt ctgagtcccg gc 1362
<210> 56
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A07-RCVT-LALA Light chain DNA
<400> 56
caggcggtgg tgacccagga accatctctc actgtatcac ctggaggaac cgtaaccctt 60
acctgcagat ccagcaccgg ggctgtcaca acaagcaact acgctaattg gtttcagcag 120
aaaccgggcc aagcacctag aggtttaatc ggaggcacga ataaacgggc accttggacg 180
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<210> 57
<211> 1362
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A07-RCVT-LALA Heavy chain DNA
<400> 57
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tattacgccg actcggtcaa agatagattc accatcagta gagacgatag caagaacacc 240
gcctatctgc agatgaactc attaaaaaca gaagatacag ccgtgtacta ctgtgtgaga 300
cacggaaact ttggcaatag ctatgtttca tggttcgcct attggggcca gggaactctc 360
gttactgtgt ctagcgcctc caccaagggc ccaagcgtct ttcccttagc accctcgagc 420
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cctgtgaccg taagttggaa tagcggcgcc ctgaccagcg gtgttcatac gttccccgct 540
gtattgcaat ccagcggcct ctactcactg agcagtgtgg tgacagtgcc atcaagcagc 600
cttggaacgc agacttatat atgtaacgtt aaccacaagc catctaacac taaagtggac 660
aaaaaggtcg agcctaagag ctgtgataag acccacacat gccccccctg cccagccccc 720
gaggcggctg gtggccccag tgttttcctg tttcctccta agcctaaaga caccctgatg 780
atctcaagga caccggaggt cacctgtgtt gtggtggacg tgtcccacga ggacccagag 840
gtcaagttta actggtacgt ggacggtgtg gaagttcata acgcaaaaac aaagccacgc 900
gaggaacagt acaattcaac atacagagtg gtgtctgtgc tgacagtgct gcaccaggat 960
tggctgaatg ggaaagagta caagtgcaag gtgtccaata aagccctccc cgccccgatt 1020
gagaagacaa ttagcaaagc taaaggacag ccaagagaac ctagagtata caccctccct 1080
ccctgccggg atgagttgac aaagaatcaa gtgtctttaa cctgtctggt taaaggcttc 1140
tacccctcgg acatcgctgt ggaatgggaa agcaatgggc agcccgaaaa caactataag 1200
accactcctc ccgtcctggt atcagatggc tccttcaccc tgtatagcaa actgactgtg 1260
gataaaagca gatggcagca gggaaacgtt ttcagctgct ccgtgatgca cgaggccctt 1320
cataatcatt atacccagaa aagccttagt ctgagtcccg gc 1362
<210> 58
<211> 2106
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A15-RCVT-LALA Light chain and heavy chain fusion DNA
<400> 58
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acatgtagaa gctctactgg agccgtgact acctcaaatt acgcaaactg ggttcagcag 120
aagccaggcc aggcacctag aggcctgatc ggcggcacca ataaaagagc cccctggact 180
cccgctagat tttccggcag cctgctgggc ggcaaagccg ctctgacact ttctggcgct 240
cagcccgaag acgaggccga atactattgc gcgctgtggt atagcaatct gtgggtcttt 300
ggcggtggca ccaaactgac cgtgttgggt cagccaaaag ctaaccctac agtaacattg 360
tttcctccaa gttccgaaga attgcaggcc aataaagcaa ctctggtgtg tctgattagc 420
gatttctatc caggcgccgt gaccgtggcc tggaaagcag atggaagccc tgtgaaagct 480
ggagttgaga ctactaagcc cagcaaacag agcaacaaca agtacgcagc gagtagctac 540
cttagcttaa ctccggagca gtggaagagc catagaagct attcttgcca ggtgacccac 600
gagggaagta ctgtagagaa aaccgttgct cctaccgaat gttcgggtgg cggtagtggc 660
ggaggcagcg agggcggcgg aagcgagggc gggggtagcg agggtggcgg cagcgagggc 720
ggcggcagcg gaggcggctc aggcgaagtg caactggtgg aaagcggcgg cggcctcgtg 780
cagcccggtg gatcgcttaa gttaagttgt gccgccagtg ggttcacctt caacacctat 840
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tctaaataca acaattatgc tacctattac gctgactctg tcaaggatag atttacaatc 960
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accgctgtgt actactgcgt gagacacgga aatttcggca atagctatgt tagctggttc 1080
gcatactggg gccaaggtac cctagtgact gtgtcatcag cctccaccaa gggcccaagc 1140
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gacgtgtccc acgaggaccc agaggtcaag tttaactggt acgtggacgg tgtggaagtt 1620
cataacgcaa aaacaaagcc acgcgaggaa cagtacaatt caacatacag agtggtgtct 1680
gtgctgacag tgctgcacca ggattggctg aatgggaaag agtacaagtg caaggtgtcc 1740
aataaagccc tccccgcccc gattgagaag acaattagca aagctaaagg acagccaaga 1800
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ttaacctgtc tggttaaagg cttctacccc tcggacatcg ctgtggaatg ggaaagcaat 1920
gggcagcccg aaaacaacta taagaccact cctcccgtcc tggtatcaga tggctccttc 1980
accctgtata gcaaactgac tgtggataaa agcagatggc agcagggaaa cgttttcagc 2040
tgctccgtga tgcacgaggc ccttcataat cattataccc agaaaagcct tagtctgagt 2100
cccggc 2106
<210> 59
<211> 2106
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E15-RCVT-LALA Light chain and heavy chain fusion DNA
<400> 59
caagcagttg taacacaaga gcctagtctg accgtctctc ccggcggcac cgtgactctt 60
acatgcagaa gttccaccgg agccgtcaca acctcaaatt acgccaactg ggtccagcag 120
aaacccgggc aggccccaag aggattgatc ggcggtacta acaagcgagc accatggacc 180
cccgccagat ttagtggcag ccttctgggc ggcaaagcag cactgacctt atcaggcgcc 240
cagcctgagg atgaggccga gtattattgt gccctgtggt acagcaattt gtgggtattc 300
ggcggcggga cgaaactcac tgttctcggc cagccaaagg ccaaccctac ggtcactctt 360
ttcccgccta gcagtgagga actgcaggca aacaaggcaa cactggtgtg tctgattagc 420
gacttttatc ctggggcggt gactgtggcc tggaaagctg atggctcccc agttaaggcc 480
ggcgtggaaa ccaccaagcc cagcaaacag agcaataata agtatgccgc gtcaagctac 540
ctgagcctta caccagagca atggaaaagc catagatcat acagctgtca agtaacacac 600
gaaggctcca ccgtggagaa gacagtggcc cccactgaat gctcgggtgg cggtagtggc 660
ggaggcagcg agggcggcgg aagcgagggc gggggtagcg agggtggcgg cagcgagggc 720
ggcggcagcg gaggcggctc aggcgaagtc caactggtgg agtcaggagg aggcctggtt 780
cagcccggcg gcagcctgaa gctgagctgc gcagcgagcg gattcacatt caacacctac 840
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ctggtgaagg attattttcc tgaacctgtg accgtaagtt ggaatagcgg cgccctgacc 1260
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gtggtgacag tgccatcaag cagccttgga acgcagactt atatatgtaa cgttaaccac 1380
aagccatcta acactaaagt ggacaaaaag gtcgagccta agagctgtga taagacccac 1440
acatgccccc cctgcccagc ccccgaggcg gctggtggcc ccagtgtttt cctgtttcct 1500
cctaagccta aagacaccct gatgatctca aggacaccgg aggtcacctg tgttgtggtg 1560
gacgtgtccc acgaggaccc agaggtcaag tttaactggt acgtggacgg tgtggaagtt 1620
cataacgcaa aaacaaagcc acgcgaggaa cagtacaatt caacatacag agtggtgtct 1680
gtgctgacag tgctgcacca ggattggctg aatgggaaag agtacaagtg caaggtgtcc 1740
aataaagccc tccccgcccc gattgagaag acaattagca aagctaaagg acagccaaga 1800
gaacctagag tatacaccct ccctccctgc cgggatgagt tgacaaagaa tcaagtgtct 1860
ttaacctgtc tggttaaagg cttctacccc tcggacatcg ctgtggaatg ggaaagcaat 1920
gggcagcccg aaaacaacta taagaccact cctcccgtcc tggtatcaga tggctccttc 1980
accctgtata gcaaactgac tgtggataaa agcagatggc agcagggaaa cgttttcagc 2040
tgctccgtga tgcacgaggc ccttcataat cattataccc agaaaagcct tagtctgagt 2100
cccggc 2106
<210> 60
<211> 2106
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A07-RCVT-LALA Light chain and heavy chain fusion DNA
<400> 60
caggcggtgg tgacccagga accatctctc actgtatcac ctggaggaac cgtaaccctt 60
acctgcagat ccagcaccgg ggctgtcaca acaagcaact acgctaattg gtttcagcag 120
aaaccgggcc aagcacctag aggtttaatc ggaggcacga ataaacgggc accttggacg 180
ccagccagat ttagtggttc acttctggga gggaaagcgg ctctgactct gagcggtgca 240
cagccagaag atgaggcgga gtattattgt gctctgtggt acagcaactt gtgggttttt 300
ggtggcggca caaagttgac tgtgctaggg cagccaaagg ctaatcccac tgtcacactg 360
tttcctccct cgagtgagga attgcaggcc aacaaggcta cactggtctg tctgattagc 420
gacttctacc ccggcgctgt gaccgtcgcc tggaaagccg acggttcacc cgtgaaggcc 480
ggagtggaga ccaccaagcc gagcaagcaa agcaataaca aatatgcagc aagcagctac 540
ttaagtctga ccccagaaca atggaagagc catcggtctt atagctgcca agtgacccac 600
gagggctcta ccgtggaaaa gactgttgct cccactgaat gctcgggtgg cggtagtggc 660
ggaggcagcg agggcggcgg aagcgagggc gggggtagcg agggtggcgg cagcgagggc 720
ggcggcagcg gaggcggctc aggcgaagtg cagctggtag agtctggcgg aggcctagtt 780
cagcctgggg gcagcctgaa gttgagctgt gctgccagcg gcttcacctt caacacatac 840
gccatgaatt gggtgcgaca ggcaagcggc aaaggcctgg agtgggtggg aagaattagg 900
agcaaatata acaattacgc cacctattac gccgactcgg tcaaagatag attcaccatc 960
agtagagacg atagcaagaa caccgcctat ctgcagatga actcattaaa aacagaagat 1020
acagccgtgt actactgtgt gagacacgga aactttggca atagctatgt ttcatggttc 1080
gcctattggg gccagggaac tctcgttact gtgtctagcg cctccaccaa gggcccaagc 1140
gtctttccct tagcaccctc gagcaaatcc actagcgggg gcaccgccgc actcggatgt 1200
ctggtgaagg attattttcc tgaacctgtg accgtaagtt ggaatagcgg cgccctgacc 1260
agcggtgttc atacgttccc cgctgtattg caatccagcg gcctctactc actgagcagt 1320
gtggtgacag tgccatcaag cagccttgga acgcagactt atatatgtaa cgttaaccac 1380
aagccatcta acactaaagt ggacaaaaag gtcgagccta agagctgtga taagacccac 1440
acatgccccc cctgcccagc ccccgaggcg gctggtggcc ccagtgtttt cctgtttcct 1500
cctaagccta aagacaccct gatgatctca aggacaccgg aggtcacctg tgttgtggtg 1560
gacgtgtccc acgaggaccc agaggtcaag tttaactggt acgtggacgg tgtggaagtt 1620
cataacgcaa aaacaaagcc acgcgaggaa cagtacaatt caacatacag agtggtgtct 1680
gtgctgacag tgctgcacca ggattggctg aatgggaaag agtacaagtg caaggtgtcc 1740
aataaagccc tccccgcccc gattgagaag acaattagca aagctaaagg acagccaaga 1800
gaacctagag tatacaccct ccctccctgc cgggatgagt tgacaaagaa tcaagtgtct 1860
ttaacctgtc tggttaaagg cttctacccc tcggacatcg ctgtggaatg ggaaagcaat 1920
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accctgtata gcaaactgac tgtggataaa agcagatggc agcagggaaa cgttttcagc 2040
tgctccgtga tgcacgaggc ccttcataat cattataccc agaaaagcct tagtctgagt 2100
cccggc 2106
Claims (19)
- 서열번호 1의 제1폴리펩타이드;
서열번호 2 의 제2폴리펩타이드;
서열번호 3, 5, 31, 33, 및 35로 이루어진 군에서 선택되는 제3폴리펩타이드; 및
서열번호 4, 6, 32, 34 및 36으로 이루어진 군에서 선택되는 제4폴리펩타이드;
를 포함하는 항체. - 청구항 1에 있어서,
상기 제1폴리펩타이드는 제1경쇄가변영역이고, 상기 제2폴리펩타이드는 제1중쇄가변영역이고, 상기 제3폴리펩타이드는 제2경쇄가변영역이고, 상기 제4폴리펩타이드는 제2중쇄가변영역인,
항체. - 청구항 1에 있어서,
상기 항체는
서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄; 및
서열번호 9를 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 10을 포함하는 제2중쇄, 서열번호 11을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 12를 포함하는 제2중쇄, 서열번호 37을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 38을 포함하는 제2중쇄, 서열번호 39를 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 40를 포함하는 제2중쇄, 또는 서열번호 41을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 42를 포함하는 제2중쇄;
를 포함하는 것인,
항체. - 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 제1경쇄중쇄접합체 및 제2경쇄중쇄접합체를 포함하는 것인, 항체.
- 청구항 4에 있어서,
상기 제1경쇄중쇄접합체는 서열번호 1의 제1폴리펩타이드 및 서열번호 2 의 제2폴리펩타이드를 포함하고,
상기 제2경쇄중쇄접합체는 서열번호 3, 5, 31, 33, 및 35로 이루어진 군에서 선택되는 제3폴리펩타이드 및 서열번호 4, 6, 32, 34 및 36으로 이루어진 군에서 선택되는 제4폴리펩타이드를 포함하는 것인,
항체. - 청구항 5에 있어서,
상기 제1폴리펩타이드는 제1경쇄가변영역이고, 상기 제2폴리펩타이드는 제1중쇄가변영역이고, 상기 제3폴리펩타이드는 제2경쇄가변영역이고, 상기 제4폴리펩타이드는 제2중쇄가변영역인,
항체. - 청구항 4에 있어서,
상기 제1경쇄중쇄접합체는 서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄를 포함하고,
상기 제2경쇄중쇄접합체는 서열번호 9를 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 10을 포함하는 제2중쇄, 서열번호 11을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 12를 포함하는 제2중쇄, 서열번호 37을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 38을 포함하는 제2중쇄, 서열번호 39를 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 40를 포함하는 제2중쇄, 또는 서열번호 41을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 42를 포함하는 제2중쇄를 포함하는 것인,
항체. - 청구항 4에 있어서,
상기 제1경쇄중쇄접합체는 서열번호 13을 포함하고,
상기 제2경쇄중쇄접합체는 서열번호 14, 15, 43, 44 및 45로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 포함하는 것인,
항체. - 청구항 4에 있어서, 상기 제1경쇄중쇄접합체 및 상기 제2경쇄중쇄접합체는 놉-인투-홀(knob-into-hole)로 결합된 것인, 항체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 HER3의 세포외 도메인 및 CD3의 엡실론 도메인에 결합하는 것인, 항체.
- 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항의 항체와 약물이 결합된 항체-약물 접합체.
- 청구항 11에 있어서, 상기 약물은 독소, 화학요법제, 항암제, 항생제, ADP-라이보실 트랜스퍼라제(ADP-ribosyl transferase), 핵산 분해 효소, 마이크로투불린 억제제, 유사분열 억제제, 토포이소머라아제 억제제, DNA 인터컬레이터, 단백질제제, miRNA, shRNA, siRNA, 및 방사성 동위원소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나인, 항체-약물 접합체.
- 청구항 11에 있어서, 상기 약물은 마이탄시노이드, 아우리스타틴, 돌라스타틴, 트리코테센, CC1065, 칼리케아미신, 에네디인 항생제, 탁산, 안트라시클린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈데신, 빈카 알카로이드, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신, 다우노마이신, 에토포시드, 테니포시드, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 블레오마이신류, 에스페라미신류, 5-플루오로우라실, 멜팔란, 질소 머스타드, 질소 머스타드의 입체이성질체, 시스-백금, 시스플라틴, CPT-11, 독소루비신, 파클리탁셀 및 도세탁셀로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나인, 항체-약물 접합체.
- 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 암 또는 암 전이의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 청구항 14에 있어서, 상기 암은 HER3-양성 고형암 및 전이암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
- 청구항 14에 있어서, 상기 암은 HER3-양성 위암, 유방암, 폐암, 식도암, 갑상선, 두경부암, 췌장암, 대장암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
- 청구항 14에 있어서, 상기 항체는 독소, 화학요법제, 항암제, 항생제, ADP-라이보실 트랜스퍼라제(ADP-ribosyl transferase), 핵산 분해 효소, 마이크로투불린 억제제, 유사분열 억제제, 토포이소머라아제 억제제, DNA 인터컬레이터, 단백질제제, miRNA, shRNA, siRNA, 및 방사성 동위원소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나와 결합된 것인, 약학 조성물.
- 청구항 14에 있어서, 상기 항체는 마이탄시노이드, 아우리스타틴, 돌라스타틴, 트리코테센, CC1065, 칼리케아미신, 에네디인 항생제, 탁산, 안트라시클린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈데신, 빈카 알카로이드, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신, 다우노마이신, 에토포시드, 테니포시드, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 블레오마이신류, 에스페라미신류, 5-플루오로우라실, 멜팔란, 질소 머스타드, 질소 머스타드의 입체이성질체, 시스-백금, 시스플라틴, CPT-11, 독소루비신, 파클리탁셀 및 도세탁셀로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나와 결합된 것인, 약학 조성물.
- 서열번호 16 내지 30, 및 46 내지 60으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 핵산.
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