ES2579635T3

ES2579635T3 - Tratamiento de enfermedades mediadas por los linfocitos T

Info

Publication number: ES2579635T3
Application number: ES12005458.0T
Authority: ES
Inventors: David Bar-Or; Raphael Bar-Or; Richard Shimonkevitz
Original assignee: Ampio Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ampio Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2003-05-15
Filing date: 2004-05-14
Publication date: 2016-08-12
Anticipated expiration: 2024-05-14
Also published as: DK2537524T3; US20200030321A1; EP2537524B1; CA2523467C; US20130071436A1; CN102210852A; EP2799114A3; JP2007500747A; CN101947306B; EP2517718A3; IL231142A; CN103142599A; HK1203056A1; EP2517722B1; EP2537524A3; CA3050734A1; US9730924B2; KR20120101164A; HK1178427A1; US8551953B2

Abstract

Una cantidad eficaz de una dicetopiperazina para su uso en el tratamiento de una reacción de hipersensibilidad de tipo diferido no deseada, donde la dicetopiperazina es DA-DKP o una sal fisiológicamente aceptable de la misma.

Description

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Por "hidrófobo" se entiende una cadena lateral o derivado de cadena lateral que no está cargada al pH fisiológico y es repelida por una solución acuosa.

Por "alquilo" se entiende un hidrocarburo ramificado o de cadena lineal saturada que contiene 1-10 átomos de carbono, preferentemente 1-6 átomos de carbono. "Alquilo inferior" significa un hidrocarburo ramificado o de cadena lineal saturada que contiene 1-6 átomos de carbono.

Por "cicloalquilo" se entiende un hidrocarburo cíclico saturado que contiene al menos un anillo, conteniendo cada anillo al menos tres átomos de carbono. Preferentemente, el cicloalquilo contiene un anillo de 4-8 átomos de carbono.

Por "heterocicloalquilo" se entiende un cicloalquilo que tiene uno o más de los átomos de carbono anulares de al menos uno de los anillos reemplazados por un O, S o N.

Por "arilo" se entiende un grupo aromático que tiene al menos un anillo aromático (por ejemplo, fenilo).

Por "alquilarilo" se entiende un alquilo inferior que tiene un H reemplazado por un arilo (por ejemplo, -CH2-C6H5 o -CH3CH(C6H5)CH3).

Por "arilalquilo" se entiende un arilo que tiene un H reemplazado por un alquilo inferior (por ejemplo, -C6H4-CH3).

Por "heteroarilo" se entiende un arilo que tiene uno o más de los átomos de carbono anulares de al menos uno de los anillos reemplazados por un O, S o N.

Por "sustituido" se entiende que el resto está sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del siguiente grupo: OH, NH2, -SH, -COOH y/o un átomo de halógeno.

Por "halógeno" se entiende cloro, flúor, bromo o yodo. El preferido es cloro o bromo.

Las dicetopiperazinas de fórmula I son eficaces en el tratamiento de enfermedades mediadas por los linfocitos T, ya que inhiben la activación de los linfocitos T. Por consiguiente, las dicetopiperazinas de fórmula I también se pueden usar para tratar la inflamación y enfermedades inflamatorias que están causadas por, agravadas por o en las que intervienen linfocitos T activados. "Inhibir" se usa en el presente documento en el sentido de reducir (total o parcialmente) o de prevenir.

Los métodos de fabricación de dicetopiperazinas se conocen bien en la técnica, y estos métodos se pueden emplear para sintetizar las dicetopiperazinas usadas en la invención. Véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.º 4.694.081, 5.817.751, 5.990.112, 5.932.579 y 6.555.543, solicitud de patente estadounidense con número de publicación 2004/0024180, solicitudes PCT WO 96/00391 y WO 97/48685, y Smith et al., Bioorg. Med. Chem. Letters, 8, 2369-2374 (1998).

Por ejemplo, las dicetopiperazinas se pueden preparar sintetizando primero dipéptidos. Los dipéptidos se pueden sintetizar mediante métodos bien conocidos en la técnica usando L-aminoácidos, D-aminoácidos o una combinación de D-y L-aminoácidos. Se prefieren los métodos de síntesis de péptidos en fase sólida. Por supuesto, los dipéptidos también están disponibles en el mercado, en numerosas fuentes, incluyendo DMI Synthesis Ltd., Cardiff, RU (síntesis a petición del cliente), Sigma-Aldrich, St. Louis, MO (principalmente, síntesis a petición del cliente), Phoenix Pharmaceuticals, Inc., Belmont, CA (síntesis a petición del cliente), Fisher Scientific (síntesis a petición del cliente) y Advanced ChemTech, Louisville, KY.

Una vez que se ha sintetizado o adquirido el dipéptido, se cicla para formar una dicetopiperazina. Esto se puede realizar mediante una variedad de técnicas.

Por ejemplo, la solicitud de patente de Estados Unidos con número de publicación 2004/0024180 describe un método de ciclación de dipéptidos. En resumen, se calienta el dipéptido en un disolvente orgánico mientras se retira el agua por destilación. Preferentemente, el disolvente orgánico es un azeótropo de bajo punto de ebullición con el agua, tal como acetonitrilo, alcohol alílico, benceno, alcohol bencílico, n-butanol, 2-butanol, t-butanol, butiléster de ácido acético, tetracloruro de carbono, cloroformo de clorobenceno, ciclohexano, 1,2-dicloroetano, dietilacetal, dimetilacetal, etiléster del ácido acético, heptano, metilisobutilcetona, 3-pentanol, tolueno y xileno. La temperatura depende de la velocidad de reacción a la que se lleve a cabo la ciclación y del tipo de agente de separación azeotrópica usado. La reacción se lleva a cabo preferentemente a 50-200 ºC, más preferentemente a 80-150 ºC. El intervalo de pH en el que tiene lugar la ciclación se puede determinar fácilmente por el experto en la materia. Será ventajosamente de 2 a 9, preferentemente de 3 a 7.

Cuando uno o los dos aminoácidos del dipéptido tienen, o se derivatizan para que tengan, un grupo carboxilo en su cadena lateral (por ejemplo, ácido aspártico o ácido glutámico), el dipéptido se cicla preferentemente como se describe en la patente de Estados Unidos n.º 6.555.543. En resumen, el dipéptido, con el carboxilo de la cadena

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lateral todavía protegido, se calienta en condiciones neutras. Por lo general, el dipéptido se calentará a de aproximadamente 80 ºC a aproximadamente 180 ºC, preferentemente a aproximadamente 120 ºC. El disolvente será un disolvente neutro. Por ejemplo, el disolvente puede comprender un alcohol (tal como, butanol, metanol, etanol y alcoholes superiores, pero no fenol) y un codisolvente azeotrópico (tal como tolueno, benceno o xileno). Preferentemente, el alcohol es butan-2-ol, y el codisolvente azeotrópico es tolueno. Se prosigue el calentamiento hasta que la reacción se completa, y dichos tiempos se pueden determinar empíricamente. Por lo general, el dipéptido se ciclará por calentamiento a reflujo durante aproximadamente 8 a 24 horas, preferentemente aproximadamente 18 horas. Por último, el grupo protector se retira de la dicetopiperazina. De este modo, se ha de evitar el uso de ácidos fuertes (ácidos minerales tales como ácido sulfúrico o ácido clorhídrico), bases fuertes (bases alcalinas, tales como hidróxido de potasio o hidróxido de sodio) y agentes reductores fuertes (por ejemplo, hidruro de litio y aluminio) con el fin de mantener la quiralidad del compuesto final. Los dipéptidos creados en resinas en fase sólida se pueden ciclar y liberarse de la resina en una etapa. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.º 5.817.751. Por ejemplo, la resina que tiene un dipéptido N-alquilado unido se suspende en tolueno o tolueno/etanol en presencia de ácido acético (por ejemplo, 1 %) o trietilamina (por ejemplo, 4 %). Por lo general, se prefieren las condiciones básicas de ciclación por sus tiempos de ciclación más rápidos.

Para preparar la dicetopiperazina de fórmulas I y II, en las que se derivatizan las cadenas laterales de aminoácidos, se pueden usar derivados de aminoácidos en la síntesis de los dipéptidos, los dipéptidos se pueden derivatizar y/o las dicetopiperazinas se pueden derivatizar como se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, las referencias citadas anteriormente.

En la técnica, se conocen otros métodos de ciclación de dipéptidos y de preparación de dicetopiperazinas, y se pueden usar en la preparación de dicetopiperazinas útiles en la práctica de la invención. Véase, por ejemplo, las referencias mencionadas anteriormente. Además, muchas dicetopiperazinas adecuadas para su uso en la presente invención se pueden preparar como se describe a continuación a partir de proteínas y péptidos. Las dicetopiperazinas para su uso en la práctica de la invención también se pueden obtener comercialmente en, por ejemplo, DMI Synthesis Ltd., Cardiff, RU (síntesis a petición del cliente).

Las dicetopiperazinas de fórmulas I y II incluyen todos los estereoisómeros posibles que se pueden obtener mediante la variación de la configuración de los centros quirales, ejes o superficies individuales. En otras palabras, los dicetopiperazinas de fórmulas I y II incluyen todos los posibles diastereómeros, así como todos los isómeros ópticos (enantiómeros).

También se pueden usar en la práctica de la invención las sales fisiológicamente aceptables de las dicetopiperazinas usadas en la invención. Las sales fisiológicamente aceptables incluyen sales no tóxicas convencionales tales como sales derivadas de ácidos inorgánicos (tales como ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, fosfórico y nítrico), ácidos orgánicos (tales como ácido acético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, glutámico, aspártico, benzoico, salicílico, oxálico y ascórbico) o bases (tales como el hidróxido, carbonato o bicarbonato de un catión metálico farmacéuticamente aceptable o cationes orgánicos derivados de N,N-dibenciletilendiamina, D-glucosamina o etilendiamina). Las sales se preparan de una manera convencional, por ejemplo, por neutralización de la forma de base libre del compuesto con un ácido.

Como se ha señalado anteriormente, una dicetopiperazina usada en la invención, o una sal fisiológicamente aceptable de la misma, se puede usar para tratar una reacción de hipersensibilidad de tipo diferido no deseada o para inhibir la activación de los linfocitos T que tiene lugar en una reacción de hipersensibilidad de tipo diferido no deseada. Para ello, se administra una dicetopiperazina, o una sal fisiológicamente aceptable de la misma, a un animal que la necesita. Preferentemente, el animal es un mamífero, tal como un conejo, cabra, perro, gato, caballo o ser humano. Las formas de dosificación eficaces, los modos de administración y las cantidades de dosificación para los compuestos usados en la invención se pueden determinar empíricamente, y la realización de dichas determinaciones pertenece a la técnica. Los expertos en la materia entienden que la cantidad de dosis variará con el compuesto empleado en particular, la enfermedad o la afección que se vaya a tratar, la gravedad de la enfermedad

o de la afección, la/s vía/s de administración, la velocidad de excreción del compuesto, la duración del tratamiento, la identidad de cualquier otro fármaco que se esté administrando al animal, la edad, el tamaño y la especie del animal, y factores similares conocidos en las técnicas médicas y veterinarias. En general, una dosis diaria adecuada de un compuesto usado en la presente invención será aquella cantidad del compuesto que sea la dosis más baja eficaz para producir un efecto terapéutico. Sin embargo, la dosis diaria será determinada por un médico o veterinario asistente dentro del alcance del juicio médico. Si se desea, la dosis diaria eficaz se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis, administradas por separado a intervalos apropiados durante todo el día. Se ha de continuar con la administración del compuesto hasta que se obtenga una respuesta aceptable.

Los compuestos usados en la presente invención (es decir, las dicetopiperazinas y sales fisiológicamente aceptables de las mismas) se pueden administrar a un paciente animal para terapia por cualquier vía de administración adecuada, incluyendo la vía oral, nasal, rectal, vaginal, parenteral (por ejemplo, por vía intravenosa, intraespinal, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular), intracisternal, transdérmica, intracraneal, intracerebral y tópica (incluyendo bucal y sublingual). Las vías preferidas de administración son la vía oral e intravenosa.

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Aunque un compuesto usado en la presente invención se puede administrar solo, es preferible administrar el compuesto como una formulación farmacéutica (composición). Las composiciones farmacéuticas comprenden un compuesto o compuestos usados en la invención como principio activo en mezcla con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, con uno o más de otros compuestos, fármacos u otros materiales. Cada vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con el resto de ingredientes de la formulación y no perjudicial para el animal. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica. Independientemente de la vía de administración seleccionada, los compuestos usados en la presente invención se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences.

Las formulaciones usadas en la invención adecuadas para la administración oral pueden estar en forma de cápsulas, sellos, píldoras, comprimidos, polvos, gránulos o como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o una emulsión líquida de aceite en agua o de agua en aceite, o como un elixir o jarabe, o como pastillas (usando una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arábiga), conteniendo cada una cantidad predeterminada de un compuesto o compuestos usados en la presente invención como principio activo. Un compuesto o compuestos usados en la presente invención también se pueden administrar en forma de bolo, electuario o pasta.

En las formas de dosificación sólidas usadas en la invención para la administración oral (cápsulas, comprimidos, píldoras, grageas, polvos y gránulos), se mezcla el principio activo (es decir, uno o más dicetopiperazinas de la invención y/o sales fisiológicamente aceptables de las mismas) con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como citrato de sodio o fosfato dicálcico y/o cualquiera de los siguientes: (1) cargas o diluyentes tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y/o ácido silícico; (2) aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y/o goma arábiga; (3) humectantes tales como glicerol; (4) agentes disgregantes tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o de tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato de sodio; (5) agentes retardantes de la disolución tales como parafina; (6) aceleradores de la absorción tales como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes humectantes tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol; (8) absorbentes tales como caolín y arcilla de bentonita; (9) lubricantes tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio y mezclas de los mismos; y (10) agentes colorantes. En el caso de las cápsulas, los comprimidos y las píldoras, las composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes de tamponamiento. Se pueden emplear composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando excipientes tales como lactosa o azúcares de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular.

Se puede fabricar un comprimido por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes auxiliares. Los comprimidos fabricados por compresión se pueden preparar usando agente aglutinante (por ejemplo, gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa), lubricante, diluyente inerte, conservante, desintegrante (por ejemplo, glicolato de almidón de sodio o carboximetilcelulosa de sodio reticulada), tensioactivo o dispersante. Los comprimidos moldeados se pueden fabricar moldeando en una máquina adecuada una mezcla de compuesto en polvo humedecida con un diluyente líquido inerte.

Los comprimidos, y otras formas de dosificación sólidas de las composiciones farmacéuticas usadas en la presente invención, tales como grageas, cápsulas, píldoras y gránulos, opcionalmente, se pueden marcar o preparar con recubrimientos y cubiertas tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica. También pueden formularse de manera que proporcionen una liberación lenta o controlada del principio activo en su interior usando, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa en proporciones variables para proporcionar el perfil de liberación deseado, otras matrices poliméricas, liposomas y/o microesferas. Se pueden esterilizar mediante, por ejemplo, filtración a través de un filtro de retención de bacterias. Estas composiciones también pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y pueden ser de una composición tal que liberen el principio activo solo, o preferentemente, en una cierta parte del tracto gastrointestinal, opcionalmente, de una manera retardada. Los ejemplos de composiciones de inclusión que se pueden usar incluyen sustancias poliméricas y ceras. El principio activo también puede estar en forma microencapsulada.

Las formas de dosificación líquidas para la administración oral de los compuestos usados en la invención incluyen emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además del principio activo, las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes usados comúnmente en la técnica tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, de cacahuete, de maíz, de germen, de oliva, de ricino y de sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán, y mezclas de los mismos.

Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, emulsionantes y de suspensión, edulcorantes, aromatizantes, colorantes, perfumantes y conservantes.

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Los ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que se pueden emplear en las composiciones farmacéuticas usadas en la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol y polietilenglicol), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos tales como azúcares y cloruro de sodio en las composiciones. Además, se puede conseguir la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable mediante la inclusión de agentes que retarden la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

En algunos casos, para prolongar el efecto de un fármaco, es deseable ralentizar la absorción del fármaco desde la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo que tenga poca hidrosolubilidad. La velocidad de absorción del fármaco depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. Como alternativa, la absorción retardada de un fármaco administrado parenteralmente se logra disolviendo o suspendiendo el fármaco en un vehículo oleoso.

Las formas de depósito inyectables se elaboran formando matrices microencapsuladas del fármaco en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicólido. Dependiendo de la proporción del fármaco con respecto al polímero y de la naturaleza del polímero empleado en particular, se puede controlar la velocidad de liberación del fármaco. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con el tejido corporal. Los materiales inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias.

Las formulaciones se pueden presentar en recipientes sellados de dosis unitarias o de múltiples dosis, por ejemplo, ampollas y viales, y pueden conservarse en un estado liofilizado que solo requiera la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyección, inmediatamente antes del uso. Las soluciones y suspensiones para la inyección extemporánea se pueden preparar a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos del tipo descrito anteriormente.

Se ha encontrado que las dicetopiperazinas adecuadas para su uso en la presente invención están presentes en algunas composiciones farmacéuticas intravenosas disponibles en el mercado que contienen albúmina, inmunoglobulina y eritropoyetina. Las dicetopiperazinas presentes en estas preparaciones farmacéuticas se forman mediante las etapas de calentamiento que se usan a menudo en la fabricación de estas composiciones farmacéuticas. El calentamiento produce la escisión y la ciclación de los dos aminoácidos N-terminales y/o dos aminoácidos C-terminales de las proteínas para formar dicetopiperazinas.

Por consiguiente, las dicetopiperazinas para su uso en la presente invención se pueden preparar mediante el calentamiento de soluciones de albúmina, inmunoglobulina, eritropoyetina, y otras proteínas y péptidos. Por ejemplo, se prepara una solución de albúmina, inmunoglobulina, eritropoyetina, u otra proteína o péptido en tampón de fosfato a pH neutro. Preferentemente, la solución es una solución concentrada (por ejemplo, aproximadamente 100500 mM) para lograr la protonación de los aminoácidos N-terminales y/o C-terminales. La solución se calienta a 60 ºC durante de aproximadamente 2 horas a varios días, preferentemente aproximadamente 4 días, para generar la formación de las dicetopiperazinas. Preferentemente, se debería evitar la desnaturalización de la proteína. Esto se puede lograr mediante el uso de tiempos más cortos y/o mediante la adición de ácido caprílico o N-acetiltriptófano a aproximadamente 0,02 M para cada uno.

Las dicetopiperazinas para su uso en la presente invención también se pueden preparar poniendo en contacto una solución de albúmina, inmunoglobulina, eritropoyetina, u otra proteína o péptido con una enzima que pueda escindir los dos aminoácidos N-terminales de la proteína o del péptido (por ejemplo, dipeptidil peptidasas) o una enzima que pueda escindir los dos aminoácidos C-terminales de la proteína o del péptido (por ejemplo, carboxipeptidasas). Las dipeptidil peptidasas y carboxipeptidasas adecuadas se encuentran disponibles en el mercado, por ejemplo, en Sigma. La reacción debe realizarse a un pH de 6-8, preferentemente en un tampón, tal como tampón de fosfato, a una temperatura lo suficientemente alta como para acelerar la reacción, pero no tan alta como para provocar la desnaturalización de la proteína (por ejemplo, 37 ºC).

Se conocen las secuencias de aminoácidos de numerosas proteínas y péptidos, y se puede seleccionar una proteína o un péptido con la secuencia N-terminal y/o C-terminal deseada para dar la/s dicetopiperazina/s deseada/s usando cualquiera de los métodos. Además, los péptidos con una secuencia deseada se pueden sintetizar mediante métodos bien conocidos y usados.

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contenía aproximadamente 1 mg de Asp-Ala dicetopiperazina (DA-DKP) o 1,4 mg de Glu-Ala dicetopiperazina (EA-DKP) mediante inyección en el lumen del duodeno.

Tras la dosificación, se recogieron muestras seriadas del líquido de perfusión a intervalos de tiempo de hasta 2 horas posteriores a la dosificación. Se centrifugaron dichas muestras y se ensayaron los plasmas para ambos dipéptidos cíclicos por espectrometría de masas de cromatografía líquida (LC-MS).

Los resultados mostraron que, tras solo 2 horas de perfusión, las cantidades de DA-DKP y EA-DKP que habían sido absorbidas desde el lumen intestinal al sistema circulatorio correspondían al 95 % y 100 % (en realidad, al 112 %), respectivamente, de la dosis administrada.

Por lo tanto, ambos péptidos cíclicos se absorben rápidamente y de manera eficaz desde el lumen intestinal a la sangre, sin pruebas de metabolismo durante el transporte a través de la pared intestinal. Por lo tanto, estos posibles productos terapéuticos se pueden administrar por vía oral.

La rápida absorción de DA-DKP y EA-DKP sin cambios desde el tracto gastrointestinal a la sangre, combinada con la falta de aclaramiento hepático de primer paso de ambos compuestos en el hígado de rata perfundido aislado (datos no mostrados) demuestra que el aclaramiento presistémico es bajo. Por consiguiente, la dosificación oral será una vía ideal de administración.

Por otra parte, los estudios con aislados de riñón de rata perfundido mostraron que, a diferencia de muchos péptidos de cadena lineal, que son ampliamente metabolizados por las peptidasas renales, el aclaramiento renal de los dos dipéptidos cíclicos es relativamente lento.

En conjunto, estos datos sugieren que es probable que una pauta de dosificación de dosis diarias bajas de dicetopiperazinas sea adecuada para los propósitos terapéuticos.

Los datos farmacocinéticos preliminares en ratas tras la administración oral coincidieron con lo anterior para ambos dipéptidos cíclicos, con valores de Tmáx de 30-60 minutos y valores de Cmáx de 4-6 μg/ml (DA-DKP) y 0,6-1,1 μg/ml (EA-DKP) después de la dosificación oral a 1,1-3,7 mg/kg de peso corporal (DA-DKP) y 1,5-4,8 mg/kg de peso corporal (EA-DKP) (Tmáx es el tiempo en el que la concentración alcanza un máximo, y Cmáx es la concentración máxima alcanzada; ambos se calcularon a partir de una ecuación de ajuste de curva para los datos obtenidos).

Los datos preliminares sugieren que DA-DKP y otras dicetopiperazinas atraviesan la barrera hematoencefálica. Por lo tanto, DA-DKP y otras dicetopiperazinas de la invención deben ser útiles para tratar trastornos del sistema nervioso, tales la como esclerosis múltiple.

Ejemplo 2: Inhibición de la producción de citocinas de linfocitos T humanas in vitro mediante fracciones de calostro humano que contienen Met-Arg DKP (MR-DKP) y mediante Asp-Ala DKP (DA-DKP)

A. Materiales

El presente ejemplo demuestra que DA-DKP, calostro humano (HC 2626) que contiene MR-DKP y una fracción de bajo peso molecular de calostro humano (HC RBL; una fracción de calostro humano que contiene componentes de pesos moleculares inferiores a 3.000 preparada mediante filtración Centricon de calostro desgrasado) que también contiene MR-DKP, inhibieron la producción de citocinas de linfocitos T humanas. DA-DKP y MR-DKP se obtuvieron de DMI Synthesis, Ltd, Cardiff, RU. Estas dos dicetopiperazinas son pequeños compuestos de origen natural generados durante la respuesta fisiológica a la inflamación. A veces también se encuentran en la inmunoglobulina intravenosa humana (IVIg), albúmina humana y otros preparados biológicos.

B. Inhibición de la producción de citocinas de linfocitos T

Se ensayaron dos clones humanos de linfocitos T CD4 positivos diferentes. Una de las líneas celulares (TRiPS) se aisló de un donante inmunizado de la gripe, y es específica del péptido de hemaglutinina 307-319. La otra línea celular (H4#9.25) se aisló del tejido cerebral de la autopsia de un donante con esclerosis múltiple, y es específica de la proteína básica de la mielina (aminoácidos 87-99). Ambos clones de linfocitos T producen interleucina 8 (IL-8), IL16, interferón-gamma (IFN-γ) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) tras la estimulación in vitro bien con (1) antígeno específico más células presentadoras de HLA DR2 positivas; (2) anticuerpos anti-CD3 más anti-CD28.

Se estimularon las líneas celulares de linfocitos T para el paso usando aproximadamente 4 x 105 células el día 18-20 después de una estimulación previa. Se lavaron las células una vez en medio esencial mínimo de Dulbecco modificado de Iscove frío (IMDM, Sigma) más suero bovino fetal al 10 % (FBS; Colección americana de cultivos tipo (ATCC)) y se volvieron a suspender en 1,0 ml de medio IMDM frío que contenía una dilución 1:500 de anticuerpo monoclonal OKT3 anti-CD3 (preparado a partir de fluido de ascitis de ratón). Se incubaron las células con el anticuerpo durante 30 minutos en hielo, después se lavaron con medio frío sin FBS y se combinaron con aproximadamente 2 x 106 leucocitos de sangre periférica de donantes humanos normales irradiados con 4000R

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(PBL), como células de alimentación, en un medio más 50 U/ml de IL-2 humana (Xenometrix). Los cultivos se expandieron mediante la adición de medio IMDM recién preparado con FBS más IL-2 el día 3. El día del cultivo se midió desde el día de la estimulación con OKT3. Las células se pueden usar para los experimentos a partir del día 7 (en la proliferación máxima), normalmente en el día 14 (más sensible a la reestimulación) y hasta el día 21 (células de reposo que se aproximan a la senescencia).

Los experimentos de activación se realizaron mediante la retirada de una parte alícuota de células y el lavado dos veces con medio IMDM (37 ºC) calentado. Para cada ensayo específico, se incubaron previamente 2 x 105 células viables en un volumen total de 0,9 ml de medio IMDM calentado que contenía la cantidad especificada de aditivo de tratamiento (por ejemplo, HC 2626, DA-DKP, PMA, etc.) durante 15 minutos a 37 ºC. A continuación, se añadió una parte alícuota de 2 x 105 Dynabeads CD3/CD28 (Dynal), como estímulo de activación, en 0,1 ml de IMDM calentado, y se incubaron los cultivos durante la noche (18 horas) a 37 ºC. Se recogieron los sobrenadantes de los cultivos celulares tras la aglomeración de las células por centrifugación. El contenido de citocinas se ensayó mediante ELISA específica (por ejemplo, TNFα, IFNγ, IL-8, IL-16; Endogen).

Como se muestra en las Figuras 1-5, el calostro humano (HC 2626) inhibió la producción de citocinas in vitro por ambas líneas celulares de linfocitos T de una manera dependiente de la dosis. Como también se muestra en las Figuras 1-5, HC RBL y DA-DKP inhibieron la producción de citocinas in vitro por ambas líneas de linfocitos T de una manera dependiente de la dosis al principio del ciclo de estimulación. Sin embargo, los efectos de HC RBL y DA-DKP en un momento posterior del ciclo (día 14 o posterior) fueron estimulantes (véase la Figura 4). Tanto HC 2626 como HC RBL contienen MR-DKP (según lo determinado por espectrometría de masas), pero HC 2626 contiene otros componentes (incluyendo las caseínas, que son proteínas relativamente desfosforiladas que, por tanto, pueden ser antiinflamatorias, como se describe en la solicitud en trámite junto con la presente 10/723.247, presentada el 25 de noviembre de 2003), además de MR-DKP, que puede ser responsable de sus efectos inhibidores en un momento posterior del ciclo celular. Por consiguiente, HC RBL y HC 2626 (conteniendo ambos MR-DKP), MR-DKP y DA-DKP deben ser útiles en la modulación por disminución de la respuesta inflamatoria de las citocinas en las enfermedades mediadas por los linfocitos T y/o autoinmunes, tales como la esclerosis múltiple, ya que todos ellos inhiben la producción de citocinas por parte de los linfocitos T al principio del ciclo de estimulación. Estos resultados también sugieren que HC RBL, HC 2626, MR-DKP y DA-DKP afectarán de forma selectiva a los linfocitos T específicos del antígeno sin afectar a los linfocitos T en reposo.

C. Mecanismo de acción

Se investigó el mecanismo de acción de DA-DKP y HC 2626 (con contenido de MR-DKP). Para ello, se incubaron 1 x 106 células TriPS del día 18 durante 30 minutos a 37 ºC, bien sin ninguna adición ("Sin nada"), con adición de Dynabeads CD3/CD28 (perlas CD3/CD28), con perlas CD3/CD28 y DA-DKP 0,5 mM, o con adición de perlas CD3/CD28 y dilución de 1:500 de HC 2626. Tras la incubación, las células se lisaron en reactivo de extracción de células de mamífero Cell-Lytic (Sigma).

A continuación, se incubaron los extractos celulares por separado con matrices Hypromatrix por duplicado durante 2 horas a temperatura ambiente, seguido de dos lavados siguiendo el protocolo del fabricante (Hypromatrix). La matriz Hypromatrix es una membrana de nylon transferida con anticuerpos contra los factores de transcripción que figuran en la Tabla 1 (fabricados a petición del cliente por Hypromatrix). Se añadió un cóctel de anticuerpos específico de la tirosina fosforilada, serina fosforilada y treonina fosforilada (Zymed), y se incubó durante 1 hora. Después, se añadió un anticuerpo anti-inmunoglobulina marcado con biotina. Tras separar por lavado la biotina anti-inmunoglobulina, se añadió estreptavidina-peroxidasa, y se lavaron las matrices una última vez antes de la adición de un sustrato luminiscente reactivo a la peroxidasa.

Los resultados se visualizaron mediante la exposición a la película y se calificaron como 0 (negativo) o + a ++++ (positivos) como se presenta en la Tabla 2. Como se muestra en la Tabla 2, alguna activación de factores de transcripción de citocinas (ERK1/2) y liberación de citocinas preformadas fueron inhibidas por HC 2626 (que contenía MR-DKP) y DA-DKP.

TABLA 1: MATRIZ HYPROMATRIX (A PETICIÓN DEL CLIENTE): PROTEÍNAS PARA LA FOSFORILACIÓN

NUMERO: ACRÓNIMO COMPUESTO

1: Akt 1/2 proteína quinasa B, quinasa antiapoptótica

2: c-Cbl vía de inhibición de TcR; la fosforilación en Tyr292 activa la unión y la inactivación de Syk y ZAP-70

3: CBP proteína de unión a csk (PAG); proteína de la membrana integral desfosforilada en Tyr transitoriamente (y a bajo nivel) para liberar csk

4: CREB proteína de unión al elemento de respuesta de cAMP; fosforilada (unk) para activar/regular por disminución el promotor de IL-2

5: csk quinasa src del extremo COOH; fosforilada en Ser364, también fosforilada en Tyr (¿actividad?)-fosforila e inactiva lck

NUMERO: ACRÓNIMO COMPUESTO

6: ERK1 quinasa relacionada con las señales extracelulares

7: c-fos constituyente de AP-1 activado por la estimulación de TcR; fosforilado en ambos restos N-y C-unk

8: NFATC factor nuclear de linfocitos T activados; anergia intacta

9: c-jun constituyente de AP-1 activado por la activación de TcR; fosforilado por JNK-MAPK en Ser63

10: IκB-α inhibidor de NFκB

11: pIκB-α inhibidor de NFκB fosforilado en Ser e inactivado

12: p38 MAPK proteína quinasa activada con mitógenos

13: quinasa pI3 /p85 activada por glucocorticoides y R β2-adrenérgico

14: pten 3'-inositol fosfatasa citoplasmática; el gen supresor de tumores antagoniza la PI 3’quinasa volviendo a convertir PI-PO en formas inactivas

15: c-Raf-1

16: Rap1 GTPasa reguladora de TcR negativa

17: Ras quinasa; inactivada durante la anergia

18: fyn quinasa de señales de TcR inmediatas unida a la membrana celular

19: lck quinasa de señales de TcR inmediatas unida a la membrana celular, la forma activa está fosforilada en Tyr395; inactivada por la fosforilación de csk en Tyr C-terminal

20: Quinasa ZAP70 señalizador de CD3ζ; fosforilada en ? por lck/fyn, ZAP70 fosforila LAT (enlazador para la activación de linfocitos T) en Tyr y Tyr en SLP-76

TABLA 2: RESULTADOS COMPUESTO NADA CD3/CD28 DKP HC2626

Akt 1/2: + ++ +++ ++

c-Cbl: - - - --

CBP: + ++ ++ ++

CREB: - - - -

csk: + ++ + +

ERK1: + + + +

c-fos: - - - --

NFATC: - - - -

c-jun: ++ + + +

IκB-α: ++ ++ + +

pIκB-α: - - - -

p38 MAPK: ++ +++ +++ +++

quinasa pI3/p85: + ++ + ++

pten: - - - -

c-Raf-1: - - - --

Rap1: + ++ ++ +

Ras: - - - -

fyn: + + + +

lck: - - - -

quinasa ZAP70: - - - --

Ejemplo 3: Inhibición de la producción de los linfocitos T citocina humana in vitro por Gly-Leu DKP (GL-DKP) y DKP Ala-Pro (AP-DKP)

Se ensayaron GL-DKP y AP-DKP (obtenidos en DMI Synthesis, Ltd, Cardiff, RU) como se describe en el Ejemplo 2 usando líneas celulares TriPS y H4#9.25. GL-DKP y AP-DKP resultaron inhibir la producción in vitro de citocinas por

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(a): una cadena lateral de un aminoácido, en la que el aminoácido es glicina, alanina, valina, norvalina, ácido αaminoisobutírico, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido 2,3-diaminobutírico, leucina, isoleucina, norleucina, serina, homoserina, treonina, ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico, glutamina, lisina, hidroxilisina, histidina, arginina, homoarginina, citrulina, fenilalanina, p-aminofenilalanina, tirosina, triptófano, tiroxina, cisteína, homocisteína, metionina, penicilamina u ornitina; sin embargo, siempre que, cuando R1 sea la cadena lateral de asparagina o glutamina, entonces R2 no pueda ser la cadena lateral de lisina u ornitina, y cuando R1 sea la cadena lateral de lisina u ornitina, entonces R2 no pueda ser la cadena lateral de asparagina o glutamina;

(b): R1 es -CH2-CH2-CH2-o -CH2-CH(OH)-CH2-y, junto con el nitrógeno del anillo adyacente, forma prolina o hidroxiprolina, R2 es -CH2-CH2-CH2-o -CH2-CH(OH)-CH2-y, junto con el nitrógeno del anillo adyacente, forma prolina

: o hidroxiprolina; o tanto R1 como R2 son cada uno, de manera independiente, -CH2-CH2-CH2-o -CH2-CH(OH)-CH2-, y, junto con los nitrógenos de anillos adyacentes forman prolina e hidroxiprolina; o

(c): un derivado de una cadena lateral de un aminoácido, en el que el aminoácido es uno de los citados en (a), y la cadena lateral derivatizada tiene:

(i): un grupo -NH2 reemplazado por un grupo -NHR3 o -N(R3)2, en el que cada R3 puede ser, de manera independiente, un alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, alquilarilo, arilalquilo o heteroarilo sustituido o no sustituido;

(ii): un grupo -OH reemplazado por un grupo -O-PO3H2 u -OR3, en el que cada R3 puede ser, de manera independiente, un alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, alquilarilo, arilalquilo o heteroarilo sustituido o no sustituido;

(iii) un grupo -COOH reemplazado por un grupo -COOR3, en el que cada R3 puede ser, de manera independiente, un alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, alquilarilo, arilalquilo o heteroarilo sustituido o no sustituido;

(iv): un grupo -COOH reemplazado por un grupo -CON(R4)2, en el que cada R4 pueden ser, de manera independiente, H, o un alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, alquilarilo, arilalquilo o heteroarilo sustituido o no sustituido;

(v): un grupo -SH reemplazado por -S-S-CH2-CH(NH2)-COOH o -S-S-CH2-CH2-CH(NH2)-COOH;

(vi): un grupo -CH2-reemplazado por un grupo -CH(NH2)-o un grupo -CH(OH)-;

(vii) un grupo -CH3 reemplazado por un grupo -CH2-NH2 o un grupo -CH2-OH; y/o

(viii) un H que está unido a un átomo de carbono reemplazado por un halógeno; o

una sal fisiológicamente aceptable de la misma.

2.: El método de la Cláusula 1, en el que R1, R2 o ambos es la cadena lateral de ácido aspártico, la cadena lateral de ácido glutámico o un derivado de una cadena lateral de ácido aspártico o ácido glutámico, en el que el grupo -COOH está reemplazado por un grupo -COOR3 o un grupo -CON(R4)2.

3.: El método de la Cláusula 2, en el que R1 es la cadena lateral de ácido aspártico o un derivado de la cadena lateral de ácido aspártico, en el que el grupo -COOH está reemplazado por un grupo -COOR3 o un grupo -CON(R4)2, y R2 es la cadena lateral de alanina.

4.: El método de la Cláusula 2, en el que R1 es la cadena lateral de ácido aspártico o un derivado de la cadena lateral de ácido aspártico, en el que el grupo -COOH está reemplazado por un grupo -COOR3 o un grupo -CON(R4)2, y R2 es la cadena lateral de tirosina.

5.: El método de la Cláusula 2, en el que R1 es la cadena lateral de ácido glutámico o un derivado de la cadena lateral de ácido glutámico, en el que el grupo -COOH está reemplazado por un grupo -COOR3 o un grupo -CON(R4)2, y R2 es la cadena lateral de alanina.

6.: El método de la Cláusula 2, en el que R1 es la cadena lateral de ácido glutámico o un derivado de la cadena lateral de ácido glutámico, en el que el grupo -COOH está reemplazado por un grupo -COOR3 o un grupo -CON(R4)2, y R2 es la cadena lateral de tirosina.

7.: El método de la Cláusula 2, en el que R1 es la cadena lateral de ácido aspártico o ácido glutámico, y R2 es la cadena lateral de alanina.

8.: El método de la Cláusula 2, en el que R1 es la cadena lateral de ácido aspártico o ácido glutámico, y R2 es la cadena lateral de tirosina.

9. El método de la Cláusula 1, en el que R1 y R2 son ambos una cadena lateral hidrófoba o un derivado de cadena lateral hidrófoba.

10. El método de la Cláusula 9, en el que: 5

(a) R1 y R2, que pueden ser iguales o diferentes, es cada uno la cadena lateral de glicina, alanina, valina, norvalina, ácido α-aminobutírico, leucina, isoleucina, norleucina o fenilalanina;

(b) R1 es -CH2-CH2-CH2-y, junto con el átomo de nitrógeno adyacente, forma prolina, y R2 es -CH2-CH2-CH2-y, junto 10 con el átomo de nitrógeno adyacente, forma prolina; o

(c): R1 es la cadena lateral de glicina, alanina, valina, norvalina, ácido α-aminobutírico, leucina, isoleucina, norleucina

: o fenilalanina, y R2 es -CH2-CH2-CH2-y, junto con el átomo de nitrógeno adyacente, forma prolina.

15 11. El método de la Cláusula 10, en el que R1 es la cadena lateral de glicina, y R2 es la cadena lateral de leucina.

12. El método de la Cláusula 10, en el que R1 es -CH2-CH2-CH2-y, junto con el átomo de nitrógeno adyacente, forma prolina, y R2 es la cadena lateral de fenilalanina.

20 13. El método de la Cláusula 10, en el que R1 es -CH2-CH2-CH2-y, junto con el átomo de nitrógeno adyacente, forma prolina, y R2 es la cadena lateral de alanina.

14. El método de la Cláusula 1, en el que R1, R2 o ambos es la cadena lateral de metionina, la cadena lateral de

arginina o un derivado de estas cadenas laterales. 25

15.: El método de la Cláusula 14, en el que R1 es la cadena lateral de metionina y R2 es la cadena lateral de arginina.

16.: El método de una cualquiera de las Cláusulas 1-15, en el que el animal es un ser humano.

30 17. El método de una cualquiera de las Cláusulas 1-15, en el que la enfermedad mediada por los linfocitos T es rechazo de injertos, enfermedad de injerto contra huésped, una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado no deseada, enfermedad pulmonar mediada por los linfocitos T o una enfermedad autoinmune.

18. El método de una cualquiera de las Cláusulas 1-15, en el que la enfermedad mediada por los linfocitos T es

35 esclerosis múltiple, neuritis, polimiositis, soriasis, vitíligo, síndrome de Sjögren, artritis reumatoide, diabetes de tipo 1, pancreatitis autoinmune, enfermedades inflamatorias del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad celíaca, glomerulonefritis, escleroderma, sarcoidosis, enfermedades autoinmunes de la tiroides, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, miastenia grave, enfermedad de Addison, uveorretinitis autoinmune, pénfigo vulgar, cirrosis biliar primaria, anemia perniciosa, o lupus eritematoso sistémico.

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19. El método de una cualquiera de las Cláusulas 1-15, en el que la enfermedad mediada por los linfocitos T es fibrosis pulmonar o fibrosis pulmonar idiopática.

20. Un método de inhibición de la activación de los linfocitos T que comprende administrar, a un animal que la 45

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en la que:

R1 y R2, que pueden ser iguales o diferentes, es cada uno: 50

(a) una cadena lateral de un aminoácido, en la que el aminoácido es glicina, alanina, valina, norvalina, ácido αaminoisobutírico, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido 2,3-diaminobutírico, leucina, isoleucina, norleucina, serina, homoserina, treonina, ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico, glutamina, lisina, hidroxilisina, histidina, arginina, homoarginina, citrulina, fenilalanina, p-aminofenilalanina, tirosina, triptófano, tiroxina, cisteína, homocisteína,

55 metionina, penicilamina u ornitina; sin embargo, siempre que, cuando R1 sea la cadena lateral de asparagina o

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glutamina, entonces R2 no pueda ser la cadena lateral de lisina u ornitina, y cuando R1 sea la cadena lateral de lisina u ornitina, entonces R2 no pueda ser la cadena lateral de asparagina o glutamina;

(vi): un grupo -CH2-reemplazado por un grupo -CH(NH2)-o un grupo -CH(OH)-;

(vii) un grupo -CH3 reemplazado por un grupo -CH2-NH2 o un grupo -CH2-OH; y/o

una sal fisiológicamente aceptable de la misma.

21.: El método de la Cláusula 20, en el que R1, R2 o ambos es la cadena lateral de ácido aspártico, la cadena lateral de ácido glutámico o un derivado de una cadena lateral de ácido aspártico o ácido glutámico, en el que el grupo -COOH está reemplazado por un grupo -COOR3 o un grupo -CON(R4)2.

22.: El método de la Cláusula 21, en el que R1 es la cadena lateral de ácido aspártico o un derivado de la cadena lateral de ácido aspártico, en el que el grupo -COOH está reemplazado por un grupo -COOR3 o un grupo -CON(R4)2, y R2 es la cadena lateral de alanina.

23.: El método de la Cláusula 21, en el que R1 es la cadena lateral de ácido aspártico o un derivado de la cadena lateral de ácido aspártico, en el que el grupo -COOH está reemplazado por un grupo -COOR3 o un grupo -CON(R4)2, y R2 es la cadena lateral de tirosina.

24.: El método de la Cláusula 21, en el que R1 es la cadena lateral de ácido glutámico o un derivado de la cadena lateral de ácido glutámico, en el que el grupo -COOH está reemplazado por un grupo -COOR3 o un grupo -CON(R4)2, y R2 es la cadena lateral de alanina.

25.: El método de la Cláusula 21, en el que R1 es la cadena lateral de ácido glutámico o un derivado de la cadena lateral de ácido glutámico, en el que el grupo -COOH está reemplazado por un grupo -COOR3 o un grupo -CON(R4)2, y R2 es la cadena lateral de tirosina.

26.: El método de la Cláusula 21, en el que R1 es la cadena lateral de ácido aspártico o ácido glutámico, y R2 es la cadena lateral de alanina.

27.: El método de la Cláusula 21, en el que R1 es la cadena lateral de ácido aspártico o ácido glutámico, y R2 es la cadena lateral de tirosina.

28.: El método de la Cláusula 20, en el que R1 y R2 son ambos una cadena lateral hidrófoba o un derivado de cadena lateral hidrófoba.

29.: El método de la Cláusula 28, en el que:

(b): R1 es -CH2-CH2-CH2-y, junto con el átomo de nitrógeno adyacente, forma prolina, y R2 es -CH2-CH2-CH2-y, junto 5 con el átomo de nitrógeno adyacente, forma prolina; o

(c) R1 es la cadena lateral de glicina, alanina, valina, norvalina, ácido α-aminobutírico, leucina, isoleucina, norleucina

: o fenilalanina, y R2 es -CH2-CH2-CH2-y, junto con el átomo de nitrógeno adyacente, forma prolina. 10 30. El método de la Cláusula 29, en el que R1 es la cadena lateral de glicina, y R2 es la cadena lateral de leucina.

31. El método de la Cláusula 29, en el que R1 es -CH2-CH2-CH2-y, junto con el átomo de nitrógeno adyacente, forma prolina, y R2 es la cadena lateral de fenilalanina.

15 32. El método de la Cláusula 29, en el que R1 es -CH2-CH2-CH2-y, junto con el átomo de nitrógeno adyacente, forma prolina, y R2 es la cadena lateral de alanina.

33. El método de la Cláusula 20, en el que R1, R2 o ambos es la cadena lateral de metionina, la cadena lateral de

arginina o un derivado de estas cadenas laterales. 20

34.: El método de la Cláusula 33, en el que R1 es la cadena lateral de metionina y R2 es la cadena lateral de arginina.

35.: El método de una cualquiera de las Cláusulas 20-34, en el que el animal es un ser humano.

25 36. El método de una cualquiera de las Cláusulas 20-34 en el que la dicetopiperazina se usa para tratar la inflamación o una enfermedad inflamatoria que está causada o agravada, al menos en parte, por la activación de los linfocitos T.

37. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una dicetopiperazina 30 que tiene la siguiente fórmula:

en la que:

35 R5 y R6, que pueden ser iguales o diferentes, es cada uno:

(a) una cadena lateral de un aminoácido, en la que el aminoácido es glicina, alanina, valina, norvalina, ácido αaminoisobutírico, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido 2,3-diaminobutírico, leucina, isoleucina, norleucina, serina, homoserina, treonina, lisina, hidroxilisina, histidina, arginina, homoarginina, citrulina, fenilalanina, p

40 aminofenilalanina, tirosina, triptófano, tiroxina u ornitina; sin embargo, siempre que, cuando R5 sea la cadena lateral de asparagina o glutamina, entonces R6 no pueda ser la cadena lateral de lisina u ornitina, y cuando R5 sea la cadena lateral de lisina u ornitina, entonces R6 no pueda ser la cadena lateral de asparagina o glutamina;

(b): R5 es -CH2-CH2-CH2-o -CH2-CH(OH)-CH2-y, junto con el nitrógeno del anillo adyacente, forma prolina o 45 hidroxiprolina, R6 es -CH2-CH2-CH2-o -CH2-CH(OH)-CH2-y, junto con el nitrógeno del anillo adyacente, forma prolina

o hidroxiprolina; o tanto R5 como R6 son cada uno, de manera independiente, -CH2-CH2-CH2-o -CH2-CH(OH)-CH2-, y, junto con los nitrógenos de anillos adyacentes forman prolina e hidroxiprolina; o

(c): un derivado de una cadena lateral de un aminoácido, en el que el aminoácido es uno de los citados en (a), y la 50 cadena lateral derivatizada tiene:

(i) un grupo -NH2 reemplazado por un grupo -NHR3 o -N(R3)2, en el que cada R3 puede ser, de manera independiente, un alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, alquilarilo, arilalquilo o heteroarilo sustituido o no sustituido;

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(ii) un grupo -OH reemplazado por un grupo -O-PO3H2 u -OR3, en el que cada R3 puede ser, de manera independiente, un alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, alquilarilo, arilalquilo o heteroarilo sustituido o no sustituido;

(iii) un grupo -CH2-reemplazado por un grupo -CH(NH2)-o un grupo -CH(OH)-;

(iv): un grupo -CH3 reemplazado por un grupo -CH2-NH2 o un grupo -CH2-OH; y/o

(v): un H que está unido a un átomo de carbono reemplazado por un halógeno; o una sal fisiológicamente aceptable de la misma.

38.: El método de la Cláusula 37, en el que R5 y R6 son ambos una cadena lateral hidrófoba o un derivado de cadena lateral hidrófoba.

39.: La composición de la Cláusula 38, en la que:

(a): R5 y R6, que pueden ser iguales o diferentes, es cada uno la cadena lateral de glicina, alanina, valina, norvalina, ácido α-aminobutírico, leucina, isoleucina, norleucina o fenilalanina;

(b): R5 es -CH2-CH2-CH2-y, junto con el átomo de nitrógeno adyacente, forma prolina, y R6 es -CH2-CH2-CH2-y, junto con el átomo de nitrógeno adyacente, forma prolina; o

(c): R5 es la cadena lateral de glicina, alanina, valina, norvalina, ácido α-aminobutírico, leucina, isoleucina, norleucina

: o fenilalanina, y R6 es -CH2-CH2-CH2-y, junto con el átomo de nitrógeno adyacente, forma prolina.

40.: La composición de la Cláusula 39, en la que R5 es la cadena lateral de glicina y R6 es la cadena lateral de leucina.

41.: La composición de la Cláusula 39, en la que R5 es -CH2-CH2-CH2-y, junto con el átomo de nitrógeno adyacente, forma prolina, y R6 es la cadena lateral de fenilalanina.

42.: La composición de la Cláusula 39, en la que R5 es -CH2-CH2-CH2-y, junto con el átomo de nitrógeno adyacente, forma prolina, y R6 es la cadena lateral de alanina.

43.: La composición de la Cláusula 37, en la que R5, R6 o ambos es la cadena lateral de metionina, la cadena lateral de arginina o un derivado de estas cadenas laterales.

44.: La composición de la Cláusula 43, en la que R5 es la cadena lateral de metionina y R6 es la cadena lateral de arginina.

45.: Un método de tratamiento de una enfermedad mediada por los linfocitos T, que comprende administrar, a un animal que la necesita, una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende una proteína o un péptido que se encuentra normalmente en el animal, habiendo sido tratados la proteína o el péptido de manera que la composición también comprenda al menos una dicetopiperazina derivada de la proteína o del péptido.

46.: El método de la Cláusula 45, en el que la proteína es albúmina.

47.: El método de la Cláusula 45, en el que la proteína es inmunoglobulina.

48.: El método de la Cláusula 45, en el que la proteína es eritropoyetina.

49.: El método de una cualquiera de las Cláusulas 45-48, en el que la composición farmacéutica se administra por vía oral.

50.: El método de una cualquiera de las Cláusulas 45-48, en el que el animal es un ser humano y la proteína o el péptido es una proteína humana o un péptido humano.

51.: Un método de inhibición de la activación de los linfocitos T que comprende administrar, a un animal que la necesita, una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende una proteína o un péptido que se encuentra normalmente en el animal, habiendo sido tratados la proteína o el péptido de manera que la composición también comprenda al menos una dicetopiperazina derivada de la proteína o del péptido.

52.: El método de la Cláusula 51, en el que la proteína es albúmina.

53.: El método de la Cláusula 51, en el que la proteína es inmunoglobulina.

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Claims

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