KR20040025884A - 치료제로서 프리-비-링 플라보노이드와 플라반 혼합물의제형 - Google Patents

치료제로서 프리-비-링 플라보노이드와 플라반 혼합물의제형 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2, COX-2) 및 5-리폭시게나제(5-lipoxygenase, 5-LO) 경로들에 의하여 매개되는 질병들 및 이상 증상들의 예방 및 치료용으로서 2가지 특이한 군들의 화합물들인 --프리-비-링 플라보노이드(free-B-ring flavonoids) 및 플라반(flavans)--의 혼합물을 포함하여 이루어진 신규한 물질 조성물을 제공한다. 본 발명은 이에 더 나아가 COX-2 및 5-LO 효소들을 동시에 억제하고cox-2 mRNA 생성을 감소시키기 위한 신규한 방법을 제공한다. 마지막으로, 본 발명은 체중 감소 및 혈당 조절을 위한 방법을 포함한다. 본 발명의 방법은 본 발명의 조성물의 유효한 양을 약제학적으로 허용되는 운반체와 함께 이를 필요로 하는 호스트에게 투여함을 포함하여 이루어진다. 본 발명은 관절의 이상의 완화와 골관절염, 류마티즘 관절염 및 남용으로 인한 기타 손상들과 같은 이상 증상들과 관련한 통증의 완화를 포함하나, 이에 한정되지 않는 COX-2 및 5-LO 경로들에 의하여 매개되는 질병들 및 이상 증상들의 예방 및 치료에 관한 것이다.

Description

치료제로서 프리-비-링 플라보노이드와 플라반 혼합물의 제형{Formulation of a Mixture of Free-B-Ring Flavonoids and Flavans as a Therapeutic Agent}
세포막으로부터 아라키돈산(arachiconic acid)의 유리 및 대사 작용이 여러가지 다른 경로를 통해서 전-염증성(pro-inflammatory) 대사 산물을 생성한다. 논의된 바와 같이, 염증에 대한 두 가지 중요한 경로는 효소인 5-리폭시게나제(5-lipoxygenase, 5-LO)와 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase, COX)에 의해 매개된다. 이러한 경로들은 각각 염증성 반응의 개시와 진행에 중요한 역할을 하는 루코트리엔(leukotrienes)과 프로스타글란딘(prostaglandine)을 생성하는 경로들과 병해하여 일어난다. 이러한 혈관 활성 화합물이 케모탁신(chemotaxins)인데, 이것이 염증 세포의 조직 침윤을 촉진하고, 염증반응을 연장하는 것이다. 따라서, 이러한 염증 매개자 생성의 원인이 되는 효소가 류마티즘 관절염, 골관절염, 알츠하이머 질병 및 어떤 종류의 암과 같은 질병의 발병의 원인이 되는 염증 치료를 목적으로 하는 많은 신약을 위한 표적이 되어왔다.
대부분의 비스테로이드성 항-염증성 약제(nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDS)에 기여하는 작용 기작은 효소 사이클로옥시게나제를 억제하는 것이다. 사이클로옥시게나제 효소는 사이클로옥시게나제-1(COX-1)과 사이클로옥시게나제-2(COX-2)로 구별되는 2가지 이성체(isomer)가 있는데, 대략 60%의 염기서열 상동성을 보이나, 발현형태와 기능에 있어서 다르다. COX-1은 혈소판 응집과 같은 일반적인 생리학적 기능의 조절, 위장에서 세포 기능의 보호 및 정상적인 신장 기능의 유지를 돕는 등 생리학적으로 중요한 프로스타글란딘의 생성에 관여하는 효소의 구조적 형태이다. (Dannhardt and Kiefer(2001) Eur. J. Med. Chem.36:109-26). 두 번째 이성체인 COX-2는 인터루킨-1β(IL-1β)와 기타 다른 성장 요인들과 같은 전-염증성 시토킨(cytokines)에 의해 유도되는 효소 형태이다.(Herschmann(1994) Cancer Metastasis Rev.134:241-56; Xieet al. (1992) Drugs Dev. Res.25:249-65). 이러한 이성체가 아라키돈산으로부터 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생성을 촉진한다. 따라서, 통상적인 NSAIDs는 COX-2를 억제하는 항-염증 활성을 나타낸다.
COX-1에 대하여 COX-2 선택성을 유지하면서, COX-2 및 5-LO에 대한 이중적 특이성을 나타내는 억제제들이 아라키돈산 물질 대사의 다중적 경로들을 억제하는데 분명한 잇점이 있을 것이다. 그러한 억제제들은 PGE2및 복합 루코트리엔(LT)의 생성을 억제함으로써 그들의 염증성 효능을 방해할 것이다. 이것은 LTB4와 LTD4의 혈관확장, 혈관투과성, 주화성 효과 및 아나팰럭식스(anaphalaxis)를 천천히 반응시키는 물질로서 알려진 LTE4의 효과를 포함한다. 이 중에서 LTB4가 가장 잠재적인 주화성(chemotactic) 및 화학적 역학(chemokinetic)을 가지며(Moore(1985) inProstanoids: Pharmacological, Physiological and Clinical Relevance,Cambridge University Press, N.Y., pp. 229-30), 염증성 내장 질환 환자들의 위장내 점막(Sharon and Stenson(1983) Gastroenterology84:1306-13)과 류마티즘 관절염 환자 활액내(Klickseinet al.(1980) J. Clin. Invest.66:1166-70; Raeet al.(1982) Lancetⅱ:1124-4)에서 증가됨을 나타낸다.
앞서 언급된 이중적 COX-2/5-LO 억제제들의 잇점들 이외에도, 많은 이중적 억제제들은 위장내의 손상 및 전형적인 NSAIDs에 의한 이상을 포함하여 NSAIDS 또는 COX-2 억제제들을 상징하는 어떤 부작용들을 일으키지 않는다. NSAID-유도성위염은 대부분 5-LO의 대사산물, 특별히 LTB4에 기인하며, 이것이 세포가 또 다른 손상을 일으키는 위장의 손상 부위로 유인하는 것으로 알려진다(Kircheret al.(1997) Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids56:417-23). 루코트리엔은 프로스타노이드(prostanoid) 억제 이후의 위장 점막내의 제1차 아라키돈산 대사산물을 대표한다. 이러한 화합물이 NSAIDs의 사용으로부터 발생하는 상당한 양의 위장 상피 조직의 손상의 원인이 되는 것으로 나타난다(Celotti and Laufer(2001) Pharmacol. Res.43:429-36). 또한, COX-2 및 5-LO의 이중적 억제제들은 쥐 모델의 노화한 심장에서 동맥 혈관 수축을 억제하는 것으로 나타났다(Goket al.(2000) Pharmacology60:41-46). 이러한 모든 점들을 고려해 볼 때, 상기 특성들은 증가된 효능 및 감소된 부작용에 있어서, 선택적 COX-2 억제제 및 비선택적 NSAIDs에 대한 COX-2 및 5-LO의 이중적 억제제에 뚜렷한 잇점이 있을 수 있음을 제시한다.
COX 억제제의 반응 기작이 대부분의 통상적인 NSAIDs의 반응기작과 일치하기 때문에, COX 억제제는 염증이 중대한 역할을 하는 일시적 이상 증상과 만성 질병에서 염증으로 인한 통증 및 부종(swelling)과 같은 동일한 많은 증상들을 치료하는데 사용된다. 일시적 이상 증상의 치료는 경미한 찰과상, 일광화상, 접촉성 피부염을 일으키는 염증 치료와 긴장, 편두통, 월경통 등의 통증의 완화를 포함한다. 만성 질병은 류마티즘성 관절염, 골관절염 등의 관절 질병을 포함한다. 비록 류마티즘성 관절염은 대개 자가 면역성 질병이고 골관절염은 관절 연골의 퇴화에 기인하지만 각 질병들과 관련한 염증들의 완화는 그러한 질병들로부터 고통 받는 사람들의 삶의 질을 상당히 증대시킨다. (Wienberg(2001) Immunol.Res.22:319-41; Wollhiem (2000) Curr. Opin. Rheum.13:193-201). 염증은 류마티즘 관절염을 포함한 대부분의 류마티즘성 질병을 구성하기 때문에 COX 억제제는 전신 낭창 적백혈병(systemic lupus erythromatosus (SLE), Goebelet al. (1999) Chem. res. Tox.12:488-500; Patronoet al. (1985) J. Clin. Invest. 76:1011-1018)과 같은 질병뿐만 아니라, 피부경화증과 같은 류마티즘성 피부 이상에까지 사용된다. 또한, COX 억제제는 건선과 같은 류마티즘성이 아닌 염증성 피부 이상의 완화를 위해서도 사용되는데, 이는 프로스타글란딘의 과잉 생산으로 인한 염증을 감소시킴으로서 직접적인 효능을 발휘하는 것이다. (Fogh et al. (1993) Acta Derm Venerologica(Oslo)73:191-3).
COX 억제제는 항-염증성 약제로서의 용도이외에도 암의 치료라는 잠재적 역할을 갖는다. COX-2의 과잉 발현은 다양한 인간의 악성 종양에서 입증되었으며, COX-2 억제제가 피부암, 유방암 및 방광암에 걸린 동물의 치료에 효과적임을 보인다. 그러한 반응기작은 완전히 이해되지는 않지만, COX-2의 과잉 발현이 세포 자살을 억제하고, 발암 세포형의 침입을 증가시킴을 보여 왔다. (Dempkeet al. (2001) J. Can. Res. Clin. Oncol.127:411-17; Moore and Simmons (2000) Current Med. Chem.7:1131-44). COX-2의 과잉 발현으로 인한 프로스타글란딘의 증가된 생성이 세포분열을 촉진하고, 결과적으로 신생혈관생성(angiogenesis)의 증가를 가능하게 한다. (Moore and Simmons (2000) Current Med. Chem. 7:1131-44; Fentonetal. (2001) Am. J. Clin. Oncol.24:453-57).
다른 형태의 암들을 예방 또는 치료하는 데 있어서, COX-2 억제제의 잠재적 용도를 평가하기 위한 많은 임상연구들이 있어왔다. 1999년에 미국에서 130,000가지의 새로운 경우의 대장앙ㅁ이 진단되었다. 비-특이적 NSAID인 아스피린이 직장암 발병율을 40 내지 50%로 감소시키고 (Giovannucciet al. (1995) N Engl J Med.333:609-614), 치사율을 50%로 감소시키는 (Smalleyet al. (1999) Arch Intern Med.159:161-166) 것으로 확인되었다. 1999년에 미국식품의약청(FDA)은 COX-2 억제제 셀레콕시브(CeleCOXib)를 직장암의 치사율을 감소시키기 위한 FAP(Familial Ademonatous Polyposis)에서의 사용을 승인하였다. COX-2가 관여하는 다른 암들도 COX-2 억제제를 사용하여 성공적으로 예방 및/또는 치료되 수 있을 것으로 보인다. 다른 암들로는 식도암, 두경부암, 유방암, 방광암, 경부암, 전립선암, 간장암 및 비-소세포폐암을 포함하나, 이에 한정하지 않는다. (Jaeckelet al. (2001) Arch. Otolarnygol.127:1253-59; Kirschenbaumet al. (2001) Urology58:127-31; Dannhardt and Kiefer (2001) Eur. J. Med. Chem.36:109-26). 또한, COX-2 억제제는 고위험도 환자들의 직장암을 예방하는데도 성공적임을 알 수 있다. COX-2 억제제가 생명을 위협하는 여러 형태의 암을 예방하거나 심지어는 전환할 수 있음을 보이는 연구결과들이 있다. 현재까지, 50여개의 연구들이 COX-2 억제제가 동물에서 악성 전단계의 종양과 악성 종양을 예방할 수 있고, 방과암, 식도암 및 피부암도 예방할 수 있음을 보인다. COX-2 억제는 금세기의 가장 중요한 예방적 의학 성취들 중에 하나임에 틀림없다.
최근의 과학적 진보로 COX-2 발현, 일반적인 염증 및 알츠하이머(Alzheimer's Disease, AD)병의 발병학 사이의 상호관계가 확인되었다. (Hoet al. (2001) Arch. Neurol.58:487-92). 동물 모델에서, COX-2 효소를 과잉 발현하는 유전형질전환 쥐가 훨씬 손상되기 쉬운 뉴런을 갖는다. NIA(National Institute on Aging)는 NSAID가 알츠하이머병의 진행을 늦출 수 있는 지를 측정하기 위한 임상 시험에 착수하였는데, 비-선택적 NSAID인 나프록센(Naproxen)과 COX-2에 특정적으로 선택적인 NSAID로서 로페콕시브(rofecoxib, 상품명: 바이옥스(Vioxx))가 평가될 것이다. 알츠하이머병에 대한 염증의 관여에 대해서도 입증되었고, 알츠하이머 협회와 NIA에 따르면 미국에서 약 4백만 명의 사람들이 알츠하이머병으로 고통 받고 있으며, 약 50년 정도 지나면 14백만 명으로 증가될 것으로 예상된다고 한다.
프로스타글란딘 H2 신타제(prostaglandin H2 synthase)라고도 불리는 COX 효소는 2가지 독립적인 반응을 촉진한다. 첫 번째 사이클로옥시게나제 반응에서는 아라키돈산이 물질 대사하여 불안정한 프로스타글란딘 G2(PGG2)를 형성하며, 두 번째 페록시다아제 반응에서는 PGG2가 엔도페록시드 PGH2로 변한다. PGH2는 곧 비효소적으로 PGE2로 변한다. 여기서 기술하는 화합물들은 신규한 COX 효소의 억제제를 확인하기 위하여 화학적 비복제(chemical dereplication) 과정을 이용한 COX-1 및 COX-2 페록시다아제의 활성 억제를 초점으로 한 분석과 결합한 발견 전략(discovery strategy)의 결과물들이다.
"유전자 발현(gene expression)"은 mRNA의 생성 및 단백질 합성의 광범위한 결과물을 나타내기 위하여 자주 사용되는 용어이다. 사실상, 실제 유전자 발현의변화가 단백질 수준(protenin level)에 있어서 관찰할 수 있는 변화의 결과를 생기게 하지는 않는다. 단백질 수준의 변화가 항상 유전자 발현의 변화로부터 발생하지는 않는다는 결론이 도출될 수도 있다. 유전자 DNA로부터 기능 단백질로 이끄는 경로에 있어서
유전자 DNA(genomic DNA)에서부터 기능성의 단백질로 가는 경로에는 6개의 조절 가능한 요소가 존재한다: (1) pre-mRNA의 생성을 유도하는 핵 인사(nuclear factors) 및 기타 신호 전달에 의한 전사 단계 조절: (2) 엑손 스프라이싱(exon splicing), 5'쇄 캡구조(5' cap structure) 와 3'쇄 폴리 아데닐래이션 서열(3'poly-adenylation sequence)의 형성 및 성숙 mRNA(mature mRNA)를 핵안에서 세포질로 이동과 관련되는 pre-mRNA의 프로세싱 조절; (3) mRNA가 단백질로 번역되는 특정 세포질로 이동하는 것을 조절하는 mRNA 이동 조절;(4) 단백질 번역 이전 또는 특정 mRNA로부터 번역되는 것을 끝내기 위한 수단으로서 mRNA 군의 규모(특정 단백질을 만들어낼 수 있는 mRNA의 갯수들)를 조절하는 mRNA 퇴화(degration) 조절; (5) 단백질 번역 개시의 특정 속도를 조절하는 번역 조절; (6) 다당류부착(glycosylation) 및 단백질 절단(proteolytic cleavage)과 같은 변형(modification)과 관련되는 후-번역 프로세싱(post-translation processing) 조절. 유전자 DNA를 연구하는데 있어서, 이러한 경로들 중에서 후기 단계(예를들면 단백질 수준)들 보다는 초기 단계(예를들면 mRNA 수준)들에 좀더 가까운 유전자발현을 측정하는 기술들을 사용하는 것이 중요하다.
최근의 보고에 의하면 약용 식물 스큐테랄리아 바이칼렌시스(Scutellaria baicalensis)로부터 분리된 플라보노이드가cox-2 유전자 발현 변화와 관여할 수 있다고 한다(Wakabayashi and Yasui (2000) Eur. J. Pharmacol.406:477-481; Chenet al.(2001) Biochem. Pharmacol.61:1417-1427; Chiet al.(2001)61:1195-1203 and Rasoet al.(2001) Life Sci.68:921-931).cox-2 유전자 발현에 대한 상기 인용 연구들은 분자 수준에서의 확인 없이 유전자 발현의 추정되는 변화를 평가하기 위하여 웨스턴 블롯 기술(Western Blot technique)을 사용하였다. 이러한 방법은 단지 단백질 수준(protein level)만을 측정하고 특정 전사 생성물인 mRNA를 측정하지 않기 때문에 관찰되는 단백질 발현의 증가를 유도하는 것과 다른 기작들을 연관시킬 수 있다. 예를 들어, LPS가 mRNAs의 3' 비번역 영역(3' untranslated region, 3'UTR)에서 발견되는 불안정성 서열을 통하여 mRNA의 반감기(half-life)를 조절하는 것으로 보고된 바 있으며(Watkinset al.(1999) Life Sci.65:449-481), 이것이 유전자 전사 속도의 변화 없이 증가되는 단백질 발현을 설명할 수 있다. 또한, 이것은 처치 조건들이 유전자 발현의 중요한 변화를 일으키는지에 관한 의문을 남긴다.
RT-qPCR 및 DNA 마이크로어래이(microarray) 분석과 같은 기술은 분석에 대하여 mRNA 수준에 의존하고, 약제들의 존재 또는 비존재와 같은 다른 조건들 하에서 유전자 발현 수준을 평가하기 위하여 사용될 수 있다. 플라보노이드 또는 플라반을 치료제로 사용하는 문헌에서 mRNA의 양을 직접적으로 또는 간접적으로 명확하게 측정하는 기술들을 이용하는 바에 대해서는 보고된 바가 없다.
플라보노이드는 광범위하게 분류되는 천연물이다. 플라보노이드 흡입의 양과 치매 발생의 위험이 반비례함이 입증되었는데, 그 반응기작은 밝혀지지 않았지만, 플라보노이드의 항-산화 효과에 기인하는 것으로 추측되고 있다. (Commengeset al. (2000) Eur. J. Epidemiol16:357-363). 폴리페놀 플라본(polyphenol flavones)은 예정된 세포사, 특이성 및 COX-2, NFκB(Nuclear Factor kappa B), bcl-X(L)을 함유하는 유전자에 대한 mRNA 일정량에 의하여 암화된 대장암(colonocytes)의 성장 억제를 유발한다. (Wenzelet al. (2000) Cancer Res.60:3823-3831). 또한, 보고된 바에 의하면, 비-링에 존재하는 하이드록실기의 수가 COX-2 전사 활성 억제에 중요한 역할을 한다고 한다. (Mutohet al. (2000) Jnp. J. Cancer Res.91:686-691).
프리-비-링(free-B-ring) 플라보논(flavones)과 프리-비-링 플라보놀(flavonols)은 하기에 도시된 기본 구조식으로 알 수 있는 바와 같이, 방향족들 중에서 비-링 구조에 치환체가 존재하지 않는 플라보노이드(여기서는 프리-비-링 플라보노이드라 불리운다)의 특정 계열의 화합물이다:
상기 구조식에서,
R1, R2, R3, R4및 R5는 -H, -OH, -SH, -OR, -SR, -NH2, -NHR, -NR2, -NR3 +X-, 탄소, 산소, 질소 또는 황, 알도펜토스(aldopentoses), 메틸-알도펜토스(mehtyl-aldopentose), 알도헥소스 (aldohexoses), 케토헥소스(ketohexoses) 및 이들의 화학적 유도체를 포함하나, 이들에 한정되지 않는 다당류 단독 또는 다당류 혼합의 글리코시드(glycoside)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
또한, 여기서 R은 1 내지 10개의 탄소수를 갖는 알킬기이고; 그리고
X는 하이드록실(hydroxyl), 클로라이드(chloride), 요오다이드(iodide), 설페이트(sulfate), 포스페이트(phosphate), 아세테이트(acetate), 플루오라이드(fluoride), 카보네이트(carbonate) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 약제학적으로 허용되는 중심 음이온들의 군으로부터 선택된다.
프리-비-링 플라보노이드는 비교적 드물다. 합성방법에 의하여 얻거나, 또는 천연원료로부터 분리된 총 9,396개의 플라보노이드 중에서 단지 231개의 프리-비-링 플라보노이드만이 알려져 있다. (The Combined Chemical Dictionary,Chapman & Hall/CRC, Version 5:1 June 2001). 프리-비-링 플라보노이드는 다양한 생리학적 활성을 갖는 것으로 보고 되고 있다. 예를 들어, 갤런진(galangin, 3,5,7-trihydorxyflavone)이 항-산화제 및 자유 라디칼 제거제로서 작용하고, 항-유전자 독성 및 암의 화학적 예방에 기대되는 물질이다. (Heoet al. (2001) Mutat. Res.4882(2): 135-150). 이것이 티로시나제 모노페노라제(tyrosinase monophenolase)의 억제제(Kuboet al. (2000) Bioorg. Med. Chem.8(7): 1749-1755)이고, 토끼 심장 카르보닐 환원제의 억제제(Imamuraet al.(2000) J. Biochem.127(4): 653-658)이며, 항-병원균 활성(Afolayan and Meyer (1997) Ethnopharmacol.57(3): 177-181) 및 항-바이러스 활성(Meyeret al. (1997) J. Ethnopharmacol.56(2): 165-169)을 갖는다. 두 가지의 다른 프리-비-링 플라보노이드인 바이칼레인 및 갤런진은 인간 유방암 세포에 대한 항성장성 활성을 갖는다. (Soet al. (1997) Cancer Lett.112(2): 127-133).
전형적으로, 플라보노이드는 유용성을 기초로 한 활성에 대하여 무작위로 시험되었는데, 때때로, 파라-글리코프로틴(p-glycoprotein)에 대한 높은 친화력으로의 결합을 위한 비-링 위의 치환의 필요성(Bounmendijelet al. (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett.11(1): 75-77); 심장 절개의 효과(cardiotonic effect, Itoigawaet al. (1999) J. Ethnopharmacol.65(3):267-272), 리놀레익 산 하이드로페록사이드-유도성 독성에 대한 내피 세포의 방어 효과(Kaneko and Baba (1999) Biosci Biotechnol. Biochem63(2): 323-328), COX-1 억제 활성도(Wang (2000) Phytomedicine7:15-19) 및 프로스타글란딘 엔도페록사이드 신타제(Kalkbrenneret al. (1992) Pharmacology44(1): 1-12)와 같은 비-링 위의 치환의 필요성이 특이한 생리학적 활성을 위하여 강조되었다. 즉, 단지 몇몇의 공지만이 프리-비-링 플라보노이드의 비치환된 비 링의 중요성을 언급하고 있을 뿐이다. 예로서, 잠재적 항응고제로서 NAD(P)H 퀴논 수용체 산화환원제를 억제하는 2-페닐 플라본(2-phenyl flavones) (Chenet al.(2001) Biochem. Pharmacol.61(11): 1417-1427)의 경우을 들 수 있다.
보고된 다양한 프리-비-링 플라보노이드의 항-염증성 활성과 관련한 작용 기작이 논의되고 있다. 프리-비-링 플라보노이드, 크리신(chrysin, Lianget al. (2001) FEBS Lett.496(1): 12-18), 우고닌(wogonin, Chiet al. (2001) Biochem. Pharmacol.61: 1195-1203) 및 해런진(halangin, Raso et al. (2001) Life Sci. 68(8): 921-931)의 항-염증성 활성은 페록시좀-성장제 활성 수용체 감마(peroxisome-proliferator actavated receptor gamma, PPARγ)의 활성화를 통한 유도성 사이클로옥시게나제 및 산화질소 신타제의 억제, 탈과립(degranulaton) 및 AA 방출에 대한 영향과 관련이 있다. (Torderaet al. (1994) Z. Naturforsch [C]49:235-240). 오록실린(oroxylin), 바이칼레인(baicalein) 및 우고닌(wogonin)은 사이클로옥시게나제에 영향을 끼치지 않고 12-리폭시게나제 활성을 억제하는 것으로 보고 되고 있다. (You et al. (1999) Arch. Pharm. Res. 22(1):18-24). 최근에는, 우고닌, 바이칼린 및 바이칼레인의 항염증성 활성이 유도성 산화질소 신타제와 산화질소 억제제 및 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)에 의해 유도된 COX-2 유전자 발현을 통하여 일어나는 것으로 보고 되었다. (Chenet al. (2001) Biochem. Pharmacol.61(11):1417-1427). 또한, 오록실린(oroxylin)이 세포핵 요소-카파 B(necular factor-kappa B) 활성의 억제를 통하여 작용한다고 보고되었다. (Chenet al. (2001) Biochem. Pharmacol.61(11):1417-1427). 결국, 보고된 바에 의하면 우고닌은 대식세포(macrkphages)에서 유도성 PGE2 생성을 억제한다. (Wakabayashi and Yasui (2000) Eur. J. Pharmacol.406(3):477-481).
미토젠-활성화 프로틴 키나제 포스포릴화(phosphorylation of mitogen-activated protein kinase, MAPK)의 억제 및 바이칼레인에 의해 방출되는 Ca2+이오노퍼(ionophore) A23187 유도성 PGE2의 억제는 스큐테랄리아 라딕스(Scutellariae Radix)의 항-염증성 활성기작으로 보고 되었다. (Nakahataet al. (1999) Nippon Yakurigaku Zasshi,114Supp. 11:215P-219P; Nakahataet al. (1998) Am. J. Chin Med.26:311-323). 보고된바에 의하면, 스큐테랄리아 바이칼렌시스(Scutellariae baicalensis)로부터 얻은 바이칼린은 초대형 항원(superantigens)의 스타필로코컬 엑소토신(staphylococcal exotoxins) 자극 T-세포(T-cell) 성장과, IL-1β, IL-6, 종양 세포 사멸 요인-α(tumor necrosis facotor-α, TNF-α) 및 인터페론의 생성을 억제한다. (Krakaueret al. (2001) FEBS Lett.500:52-55). 따라서, 바이칼린의 항-염증성 활성은 초대형 항원에 의해 활성화되는 전-염증성 사이토킨 매개 신호 경로를 억제하는 것과 관련 있다. 그러나, 바이칼린의 항-염증성 활성이 또한 그들의 생물학적 활성을 한정하는 다양한 케모킨의 결합에 기인한다고 제안되었다. (Liet al. (2001) Immunopharmacology49:295-306). 최근에 펩타이드에 대한 트롬빈(thrombin) 및 트롬빈 수용체에 의해 유도된 유착 분자 발현에 대한 바이칼린의 효능(Kimuraet al. (2001) Planta Med.67:331-334) 및 미토젠-활성화 프로틴 키나제 캐스캐이드의 억제(mitogen-activated protein kinase cascade, MAPK cascade)(Nakahataet al. (1999) Nippon Yakurigaku Zasshi,114, Supp 11:215P-219P; Nakahataet al. (1998) Am. J. Chin Med.26:311-323)의 억제에 대하여 보고되었다.
중국 의약 식물인 바이칼레인(baicalein), 바이칼린(baicalin), 우고닌(wogonin) 및 바이칼레노사이드(baicalenoside)를 포함한 스큐텔라리아 바이칼렌시스(Scutellaria baicalensis)는 프리-비-링 플라보노이드를 상당량 함유한다. 전통적으로 이러한 식물은 해열(clearing away), 발열제거(purging fire), 댐프니스-웜(dampness-warm) 서머 피버 신드롬(summer fever syndromes); 고열로 인한 조갈증(polydipsia); 등창(carbuncle); 상처(sores) 및 기타 화농성 피부 감염(pyogenic skin infections); 급성 편도선염(acute tonsillitis)과 같은 상부 호흡기 감염(upper respiratory infections), 인후두염(laryngopharyngitis) 및 성홍열(scarlet fever), 바이러스성 간염(viral hepatitis), 신장염(nephritis), (pelvitis); 이질(dysentery); 조혈제(hematemesis) 및 비출혈(코피, epistaxis)을 포함하는 많은 이상 증상들을 치료하는 데 사용되었다. 또한, 이러한 식물은 전통적으로 유산을 예방하는 데 사용되었다. (Encyclopedia of Chinese Traditioal Medicine,ShangHai Science and Technology Press, ShangHai, China, 1998). 임상적으로 스큐테랄리아는 현재 소아기 폐렴(pediatric pneumonia), 소아기 박테리아성 설사(pediatric bacterial diarrhea), 바이러스성 간염(viral hepatitis), 급성 담낭 염증(acute gallbladder inflammation), 고혈압(hypertension), 절개 및 수술로 인한 국부 급성 염증(topical acute inflammation), 기관지의 천식(bronchial asthma) 및 상부 호흡기 염증(upper respiratory infections)과 같은 이상 증상들을 치료하는 데 사용된다. (Encyclopedian of Chinese TraditionalMedicine,ShangHai Science and Technology Press, ShangHai, China, 1998). 기관지의 천식을 치료하기 위한 스큐테랄리아 뿌리의 약리학적 효능은 보고된 바와 같이 프리-비-링 플라보노이드의 존재 및 호산구 점증과 관련 있는 에오탁신(eotaxin)의 억제와 연관이 있다. (Nakajimaet al. (2001) Planta Med.67(2): 132-135).
지금까지, 천연적으로 존재하는 프리-비-링 플라보노이드가 다양한 용도를 위하여 상업화되었다. 예를 들어, 스큐테랄리아 추출물의 리포좀 제제가 피부 보호제(미국 특허 제5,643,598호 및 제5,443,983호)로, 바이칼레인이 종양을 일으키는 유전자에 대한 억제 효과로 인한 암 예방제(미국 특허 제6,290,995)로, 바이칼레인 및 다른 화합물들이 항바이러스, 항박테리아, 면역 조절제(미국 특허 제6,083,921호) 및 천연 항-산화제(폴란드 특허 공개 제9,849,256호)로, 크리신은 안정제(미국 특허 제5,756,538호)로, 항-염증성 플라보노이드는 식욕 감퇴성 질병 및 대장성 질병의 조절제, 치료제(미국 특허 제5,858,371호) 및 리폭시게나제의 억제제(미국 특허 제6,333,304호)로 사용되었다. 또한, 이러한 화합물들은 글루코자민 콜라겐(glucosamine collagen) 및 결합조직의 복구와 유지를 위한 기타 성분들(미국 특허 제6,333,304호)과 함께 제제화된다. 플라보노이드 에스터는 화장품 조성물의 활성 성분이다(미국 특허 제6,235,294호). "사이클로옥시게나제-2 억제제로서 효능있는 프리-비-링 구조를 갖는 플라보노이드의 선별(Identification of Free-B-Ring Flavonoids as Potent COX-2 Inhibitors)" 제목의 2002년 3월 1일자로 출원된 미국 특허출원 제10/091,362호는 프리-비-링 플라보노이드를 포함하여 이루어진 조성물 또는 프리-비-링 플라보노이드들의 혼합물을 함유하는 조성물을 이를 필요로 하는 호스트에게 투여함으로써 사이클로옥시게나제 효소 COX-2를 억제하기 위한 방법을 공개한다. 이러한 출원이 프리-비-링 플라보노이드와 COX-2 억제제 활성 사이의 관계를 보고하는 최초이며, 온전하게 참조로서 특히 포함된다.
일본 특허 제63027435호는 바이칼레인의 추출 및 농축에 대해서, 일본 특허 제61050921호는 바이칼레인의 정제에 대하여 게재한다.
플라반(flavans)은 하기의 일반 구조식에서 도시되는 화합물들을 포함한다:
상기 구조식에서
R1, R2, R3, R4및 R5는 -H, -OH, -SH, -OCH3, -SCH3, -OR, -SR, -NH2, -NRH, -NR2, -NR3 +X-, 갤레이트(gallate), 아세테이트(acetate), 시나모일 에스터(cinnamoyl esters), 하이드록실 시나모일 에스터(hydroxyl cinnamoyl esters), 트리하이드록시벤조일 에스터(trihydroxybenzoyl esters) 및 카페오일 에스터(caffeoyl esters)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 언급된 치환기들의 에스터 및 이들의 화학적 유도체들; 알도펜토스(aldopentoses), 메틸알도펜토스(methylaldopentoses), 알도헥소스(aldohexoses), 케토헥소스(ketohexose) 및 이들의 화학적 유도체들을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다당류 단독 또는 다당류 혼합의 탄소, 산소, 질소 또는 황 글리코시드; 이량체(dimer), 삼량체(trimer) 및 기타 중합된 플라반(polymerized flavans);로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
여기서, R은 1 내지 10개의 탄소수를 갖는 알킬기이며; 그리고
X는 하이드록실(hydroxyl), 클로라이드(chloride), 요오다이드(iodide), 설페이트(sulfate), 포스페이트(phosphate), 아세테이트(acetate), 플루오라이드(fluoride), 카보네이트(carbonate) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 약제학적으로 허용되는 중심 음이온들의 군으로부터 선택된다.
카테친(catechin)은 일종의 플라반으로서 아카시아(Acacia)에서 처음으로 발견되었고, 하기 구조식을 갖는다.
카테친은 단독이나 차에서 발견되는 기타 플라보노이드와 함께 작용하며, 항바이러스성 및 항산화성 활성을 갖는다. 카테친은 바이러스성 간염의 치료에 효과적이며, 또한, 심장, 신장, 폐 및 비장에 산화적 손상을 예방하고, 위암 세포들의 성장을 억제하는 것으로 알려진다.
카테친 및 이들의 이성체 에피카테친(epicatechin)은 40μM의 IC50값(효소 활성도의 50%를 억제하기 위하여 필요한 농도)으로 프로스타글란딘 엔도페록시드 신타제(prostaglandin endoperoxide synthase)를 억제한다(Kalkbernneret al. (1992) Pharmacol.44:1-12). (+)-카테친 및 갈로카테친(gallocatechin)을 포함한 5가지의 플라반-3-올(flavan-3-ol) 유도체들은 4가지 식물 종(species)들인 아투나 라세모사(Atuna racemosa), 시지기움 카리노카퓸(Syzygium carynocarpum), 시지기움 말락센스(Syzygium malaccense) 및 반타니아 페루비아나(Vantanea peruviana)로부터 분리된 것으로, 3.3 내지 138μM 범위의 IC50값으로 COX-1에 대하여 동등한 또는 더 약한 COX-2에 대한 억제 활성을 보인다(Noreenet al. (1998) Planta Med.64:520-524). 세이바 펜탄드라(Ceiba pentandra) 나무 껍질로부터 분리된 (+)-카테친은 80μM의 IC50값으로 COX-1을 억제한다(Noreenet al. (1998) J. Nat. Prod.61:8-12). 통상적으로 구입할 수 있는 순수한 (+)-카테친은 실험조건에 따라 결정되는 대략 183 내지 279μM 범위의 IC50값으로 COX-2에 대한 선택성 없이 COX-1을 억제한다(Noreenet al. (1998) J. Nat. Prod.61:1-7).
스프라그-도레이(Sprague-Dawley) 수컷 쥐의 사료에 첨가된 녹차 카테친이 혈소판의 활성도를 낮추고, 혈소판 사이크로옥시게나제의 양을 감소시켰다(Yanget al.(1999) J. Nutr. Sci. Vitaminol.45:337-346). 보고된 바에 의하면, 카테친 및 에피카테친은 사람의 대장암 DLD-1 세포들의cox-2 유전자 전사를 약하게 억제한다(IC50=415.3μM)(Mutohet al. (2000) Jpn. J. Cancer Res.91:676-691). 적포도주로부터 얻은 (+)-카테친의 신경보호적 능력은 사이클로옥시게나제, 리폭시게나제 또는 산화질소 신타제(nitric oxide synthase)와 같은 세포내의 효소들에 대한 억제 효과 보다는 카테친의 항산화적 성질로부터 기인한다(Bastianettoet al. (2000) Br. J. Pharmacol.131:711-720). 에피갤로카테친-3-갤레이트(epigallocatechin-3-gallate, EGCG), 에피갤로카테친(epigallocatechin, EGC), 에피카테친-3-갤레이트(ECG) 및 띠아플라반(theaflavans)과 같은 카테친 유도체들은 녹차 및 홍차로부터 정제되었고, 인간 대장 점막 및 대장암 조직에서 아라키돈산의 사이클로옥시게나제- 및 리폭시게나제- 의존성 대산산물의 억제를 보였으며(Honget al. (2001) Biochem. Pharmacol.62:1175-1183)cox-2 유전자 발현 및 PGE2 생성을 유발하였다(Parket al.(2001) Biochem. Biophys. Res. Commun.286:721-725). 셀라스트루스 오비큐래터스(Celastrus orbiculatus)의 기생 기관으로부터 분리된 에피아프젤레친(Epiafzelechin)은 15μM의 IC50값으로 COX-1 활성의 투여량 의존 억제를 보였으며, 또한, 100mg/kg의 투여량으로 경구 투여 이후에 나타난 카라기닌-유도성 쥐의 발 부종(carrageenin-induced mouse paw edema)에 대한 항-염증성 활성을 보였다(Minet al.(1999) Planta Med.65:460-462).
다양한 식물원, 특별히 녹차잎으로부터 얻은 카테친 및 이의 유도체들은 HPV에 의한 첨규콘딜롬(Condyloma acuminata)의 치료(미국 특허 제5,795,911호) 및 유두종 바이러스(papilloma virus)에 의한 증생(hyperplasia)의 치료(Cheng, 미국 특허 제5,968,973호 및 제6,197,808호)에 사용되었다. 또한, 카테친 및 이의 유도체들은 포유동물 조직에서 혈관신생, 피부암, 건선(psoriasis), 거미모양 정맥(spider vein) 또는 눈 밑 조직(under eye circles)과 같은 이상 증상들을 억제하기 위하여(Anderson, 미국 특허 제6,248,341호), 쥐에서의 UVB-유도성 종양생성에 대하여(Agarwalet al. (1993) Photochem. Photobiol.58:695-700), 유전자 발현 및 효소 활성 농도에서 산화질소 신타제를 억제하는데(Chan, 미국 특허 제5,922,756호), 그리고 체모 성장제(hair-growing agents)로서 (Takahashi, 미국 특허 제6,126,940호) 국부적으로 사용되었다. 카테친을 주요 성분으로 하는 조성물들은 또한, 기타 추출물 및 좌창(acne) 치료용 비타민(Murad, 미국 특허 제5,962,517호), 소화기관들의 조직을 강화하기 위한 비타민(Shi, 미국 특허 제5,470,589호), 안드로겐 이상과 관련한 질병과 암들을 치료하는데 있어서 5알파-환원효소(5alpha-reductase) 활성을 억제하기 위한 비타민들(Liao, 미국 특허 제5,605,929호)과 함께 제제화되었다. 녹차 추출물은 특정 활성 성분들 중에서 어떤 성분의 선별없이 COX-2 효소를 억제함으로써 염증을 감소하기 위한 7가지의 기타 식물 추출물들과 함께 제제화되었다(Mewmark, 미국 특허 제6,264,995호).
아카시아는 콩과 나무 및 관목의 속(genus)이다. 아카시아 속은 레류미노새(Leguminosae) 과(family) 및 미모소이대(Mimosoideae) 아과(subfamily)에 속하는 1,000종 이상을 포함한다. 아카시아는 중앙아메리카, 남아메리카, 아프리카, 아시아의 일부분 뿐만 아니라, 가장 많은 수의 특산 종들을 갖고 있는 호주의 열대 및 아열대 지역과 같이 전세계적으로 분포한다. 아카시아들은 대개 넓은 가시 관목으로 이루어진 산림지역인 건조하고 메마른 지역에 주로 존재한다. 아카시아 속은 대개 잎 형태학에 근거하여 3가지 아속들(subgenera)- 아카시아(Acacia), 아큐리페륨(Aculiferum) 및 헤테로필륨(Heterophyllum)로 분류된다. 그러나, 아카시아 속은 성장한 나무들의 잎의 성질에 근거하여, 2가지 대중적인 군들-전형적인 이회우상의 종들(bipinnate leaved species) 및 가엽성 종들(phyllodenous species)로 분류될 수 있다. 가옆(phyllode)은 어린 잎을 가지지 않고, 건생 조건 적응 형태로서 잎과 같은 구조로 확장된 변형 잎꼭지이다. 가옆성 종들이 주로 호주에서 발견되는 반면에, 전형적인 이회우상의 종들(bipinnate leaved species)은 주로 열대 지역 도처에서 발견된다. 아카시아의 40종 이상들이 인도에서 보고되었다. 갬블(Gamble)은 "플로라의 마드라스 통할(Flora of Madras Presidency)" 제목의 그의 책에서 23가지의 토종들을 열거하였는데, 이들 중 15가지가 타밀 나두(Tamil Nadu)에서 발견되었다. 그러나 그 때 이후로, 많은 새로운 아카시아 종들이 인도에 소개되었고, 대략 40종들이 지금 타밀 나두에서 발견된다. 토종들은 주로 가시 나물 또는 가시 관목이며, 몇몇은 아카시아 캐시아(A. caesia), 아카시아 페난타(A. pennata) 및 아카시아 시누아타(A. sinuata)와 같은 가시달린 가지들(throny stragglers)이다. 많은 종들이 아프리카 및 호주로부터 소개되었는데, 이들 중에서 아카시아 메아른시(A. mearnsii), 아카시아 피크난타(A. picnantha) 및 아카시아 데알바타(A. dealbata)는 이회우상성 납엽들이고, 아카시아 아우리큘리포미스(A. auriculiformis), 아카시아 홀로세레시아(A.holoserecia) 및 아카시아 만기움(A. mangium)은 가엽성들이다.
아카시아는 타닌(tannins), 검(gum), 목재, 연료 및 사료의 원료로 제공되기 때문에 경제적으로 매우 중요하다. 주로 나무껍질로부터 분리되는 타닌은 동물의 가죽을 무두질하거나 피부를 햇볕에 태우는데 광범위하게 사용된다. 또한, 어떤 아카시아 나무껍질은 토속주(local sprits)의 향을 내기 위하여 사용되기도 한다. 아카시아 시누아타(A. sinuata)와 같은 토속종들은 또한 다양한 식물 글리코시드의 일종인 사포닌(saponins)을 생성하는데, 이는 물과 혼합되어 교반되었을 때 비누 거품을 형성한다. 사포닌은 세제, 기포제 및 유화제에 사용된다. 어떤 아카시아 종들의 꽃들은 방향성이어서 향수를 제조하는데 사용된다. 예를 들어, 캐시 향수(cassie perfume)는 아카시아 페루제니아(A. ferrugenea)로부터 얻어진다. 많은 아카시아의 심재(heratwood)는 농기구를 만드는데 사용되며, 또한 땔나무의 원료로 제공된다. 아카시아 검(gum)은 의학 및 사탕과자 제조에서 광범한 용도를 찾을 수 있으며, 섬유 산업에서 옷감용 풀칠재 및 마감재로서 사용된다. 랙깍지진디(Lac insects)는 아카시아 니로티카(A. nilotica) 및 아카시아 카테츄(A. catecchu)를 포함한 여러 종들 위에서 성장될 수 있다. 침수에 잘 견딜 수 있는 아카시아 닐로티카를 포함한 어떤 종들은 황무지의 식림을 위하여 사용되었었으며, 이러한 지역들 중 몇몇은 새 보호구역이 되었다.
지금까지, 다양한 아카시아 종들로부터 대략 330가지의 화합물들이 분리되었다. 수용성 식물 색소의 형태인 플라보노이드는 아카시아로부터 분리된 화합물들중에서 주요한 클래스(class)다. 대략 180가지의 다른 플라보노이드가 확인되었고, 그 중에서 111가지가 플라반이다. 48가지의 화합물이 확인된 터펜노이드(Tepenoids)는 아카시아 속의 종들로부터 분리된 화합물들 중에서 두번째로 큰 클래스이다.
아카시아로부터 분리된 화합물들 중에서 기타 클래스로는 알칼로이드(alkaloids, 28가지), 아미노산/펩타이드(amino acid/peptides, 20가지), 탄닌(tannins, 16가지), 탄수화물(carbohydrates, 15가지), 산소 헤테로 사이클(oxygen heterocycles, 15가지) 및 지방족 화합물(alphatic compound, 10가지)을 포함한다(Buckingham, inThe Combined Chemical Dictionary, Chapman & Hall CRC, version 5:2, Dec. 2001).
페놀계 화합물 특히, 플라반은 모든 아카시아 종에서 높은 농도로 알맞게 발견된다(Abdulrazaket al. (2000) J. Anim. Sci.13:935-940).
역사적으로 대부분의 식물들과 아카시아 속의 추출물들은 위장내 이상 증상들, 설사, 소화불량을 치료하거나 출혈을 정지시키기 위한 수렴제로서 사용되었다(Vautrin (1996) Universite Bourgogne(France) European abstract 58-01C:177; Saleemet al. (1998) Hamdard Midicus.41:63-67). 아카시아 아라비카 윌드(A. arabica Willd.)의 나무껍질 및 꼬투리(pods)는 많은 양의 탄닌을 함유하며, 수렴제 및 거담약으로 이용되었다(Nadkarni(1996) India Materia Medica, Bombay Popular Pakashan, pp. 9-17). 소말리아(Somalia)산 아카시아 토틸리스(A. tortilis)의 줄기 껍질로부터 분리된 디아릴프로파놀 유도체(diarylpropanol derivatives)는 평활근 이완 효과를 갖는 것으로 보고되었다(Hagoset al.(1987)Planta Med.53:27-31, 1987). 또한, 아카시아 빅토리애(A. victoriae)로부터 분리된 테르페노이드 사포닌(terpenoid saponins)은 디메틸벤자안뜨라센-유도성 쥐과 동물의 피부 발암(dimethylbenz(a)anthracene-induced murine skin carcinogenesis)에 대한 억제 효과를 가지며(Hanauseket al. (2000) Proc. Am. Assoc. Can. Res. Annu. Mtg.41:663), 자발적 세포사(apoptosis)(Haridaset al. (2000) Proc. Am. Assoc. for Can. Res. Annu. Mtg.41:600)를 유발하는 것으로 알려졌다. 아카시아 니로티카(A. nilotica)로부터 얻은 식물 추출물들은 진경성(spasmogenic) 활성, 혈관 수축성(vasoconstrictor) 활성, 항-고혈압(anti-hypertensive) 활성(Amos et al. (1999) Phytotherapy Research 13:683-685; Gilani et al. (1999) Phytotherapy Research 13:665-669), 및 항혈소판 집합성(antiplatelet aggregatory) 활성(Shahet al. (1997) Gen. Pharmacol.29:251-255)을 갖는 것으로 보고되었다. 항-염증성 활성이 아카시아 니로티카인 경우에 대해서 보고되었다. 플라보노이드, 폴리사카라이드 및 유기산들이 잠재적 활성 화합물들인 것으로 추측되었다(Dafallah and Al-mustafa (1996) Am. J. Chin. Med.24:263-269). 지금까지 유일하게 보고된 아카시아로부터 분리된 5-리폭시게나제 억제제는 모노테레페노이달 카복사미드(monoterpenoidal carboxamide)(Seikineet al. (1997) Chem. Pharm. Bull. (Tokyo)45:148-11).
아카시아 검(gum)은 다른 식물 성분들과 함께 제제화되어, 활성 성분들 중에서 어떤 성분들의 선별 없이 궤양 예방을 위해 사용되었다(Fuisz, 미국 특허 제5,651,987호). 아카시아 검은 또한 다른 식물 성분들과 함께 제제화되어, 영양학적 조성물들의 속도를 낮춤으로써(Chancellor, 미국 특허 제5,545,411호) 약의 용해(drug dissolution)를 향상(Blank, 미국 특허 제4,946,684호)시키기 위하여 사용되었다.
아카시아 나무껍질에서 얻은 추출물은 미백제(Abe, 일본 특허 제10025238호), 치과용 글루코실 전이효소 억제제(Abe, 일본 특허 제07242555호), 단백질 합성 억제제(Fukai, 일본 특허 제07165598호), 외피 조제약을 위한 활성 산소 제거제(Honda, 일본 특허 제07017847호, Bindra, 미국 특허 제6,1266,950호) 및 염증, 꽃가루 과민증, 기침을 예방하기 위한 경구 질환용 히알루론니다아제 억제제(Ogura, 일본 특허 제07010768호)와 같은 외용제로서 일본에서 특허되었다.
어떤 문헌도 통증을 경감시키기 위하여 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 혼합물을 사용하거나, 골관절염 치료를 위한 생화학적 임상적 결과를 측정하는 인간 임상학적 적용을 공개하고 있지 않다. 본 보고가 인간에게 있어서 이러한 화합물들의 안정성 및 효능성의 무작위(randomized), 이중-맹검법(double-blind), 플라시보-조절(placebo-controlled) 연구의 최초일 것이다.
발명의 요약
본 발명은 프리-비-링 플라보노이드(free-B-ring flavonoids)와 플라반(flavans)의 혼합물을 포함하여 이루어진 신규한 물질 조성물을 포함한다. 여기에서는 상기 신규한 물질 조성물을 유니베스틴(UnivestinTM)으로 부른다. 상기 물질 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 비율은 특정 질병 또는 이상증상의 예방 및 치료에 대하여 필요한 조치와 특별한 필요에 따라 조절될 수 있다. 일반적으로, 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 비율은 프리-비-링 플라보노이드:플라반가 99:1 내지 1:99의 범위일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예들에서, 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 비율은 대략 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 물질 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비율은 대략 85:15이다. 바람직한 실시예에서 프리-비-링 플라보노이드는 식물들 중에서 스큐테랄리아 속(Scutellaria genus)에서 단일 식물 또는 복합 식물로부터 분리되고, 플라반은 식물들 중에서 아카시아 속(Acacia genus)에서 단일 식물 또는 복합 식물로부터 분리된다.
본 발명은 이에 더 나아가 COX-2 및 5-LO 효소들을 동시에 억제하는데 있어서 효과적인 방법들을 포함한다. COX-2 및 5-LO 경로들의 동시적 이중적 억제를 위한 방법은 합성된 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 혼합물 및/또는 단일 식물 또는 복합 식물들로부터 분리된 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 혼합물을 포함하여 이루어진 조성물을 이를 필요로 하는 호스트에 투여함을 포함하여 이루어진다. 상기 방법은 정제된 효소들을 가지고, 여러 가지 세포주들(cell lines), 다양한 동물 모델들 및 결국에는 인간 임상학적 연구에서 입증되었다. 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 비율은 프리-비-링 플라보노이드:플라반이 99:1 내지 1:99의 범위일 수 있다. 본 발명의 구체적 실시예들에서, 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 비율은 대략 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60,30:70, 20:80 및 10:90로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 물질 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비율은 대략 85:15이다. 바람직한 실시예에서, 프리-비-링 플라보노이드는 식물들 중에서 스큐테랄리아 속에서 단일 식물 또는 복합 식물로부터 분리되고, 플라반은 식물들 중에서 아카시아 속에서 단일 식물 또는 복합 식물로부터 분리된다.
본 발명은 이에 더 나아가 월경통, 동맥경화증, 심장마비, 비만, 당료병, X 증후군, 알츠하이머 질병, 호흡기 알레르기 반응, 만성정맥부전, 치질, 전신성 홍반성 루푸스(Systemic Lupus Erythematosus), 건선, 만성긴장두통, 편두통, 염증성 장 질환; 바이러스, 박테리아 및 균에 의한 국부적 전염병, 일광화상, 화상, 접촉성 피부염, 흑색종 및 암종을 포함하나, 이에 한정되지 않는 COX-2 및 5-LO에 의하여 매개되는 질병들 및 이상 증상들의 예방 및 치료를 위한 방법들을 포함한다. COX-2 및 5-LO에 의하여 매개되는 질병들 및 이상 증상들의 예방 및 치료를 위한 방법은 약제학적으로 허용되는 운반체(carrier)와 함께 합성된 프리-비-링 플라보노이드와 플라본의 혼합물 및/또는 단독 식물 또는 복합 식물로부터 분리된 프리-비-링 플라보노이드와 플라본의 혼합물을 포함하여 이루어지는 조성물을 이를 필요로 하는 호스트에게 유효한 양으로 투여함을 포함하여 이루어진다. 프리-비-링 플라보노이드와 플라본의 비율은 프리-비-링 플라보노이드:플라본이 99:1 내지 1:99의 범위일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 비율은 대략 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 물질조성물에서 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비율은 대략 85:15이다. 바람직한 실시예에서, 프리-비-링 플라보노이드는 식물들 중에서 스큐테랄리아 속에서 단일 식물 또는 복합 식물로부터 분리되고, 플라반은 식물들 중에서 아카시아 속에서 단일 식물 또는 복합 식물로부터 분리된다.
다른 실시예에서, 본 발명은 운동성 및 신체 기능을 향상시키면서 일반적인 관절의 통증 및 경직성을 치료하기 위한 방법과 골관절염 및 류마티즘 관절염의 병리학적 이상 증상들을 치료하기 위한 방법을 포함한다. 운동성 및 신체 기능을 향상시키면서 일반적인 관절의 통증 및 경직성을 치료하기 위한 방법과 골관절염 및 류마티즘 관절염의 병리학적 이상 증상들을 치료하기 위한 방법은 약제학적으로 허용되는 운반체와 함께 합성된 프리-비-링 플라보노이드와 플라본의 혼합물 및/또는 단독 식물 또는 복합 식물로부터 분리된 프리-비-링 플라보노이드와 플라본의 혼합물을 포함하여 이루어지는 조성물을 이를 필요로 하는 호스트에게 유효한 양으로 투여함을 포함하여 이루어진다. 프리-비-링 플라보노이드와 플라본의 비율은 프리-비-링 플라보노이드:플라본이 99:1 내지 1:99의 범위일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 비율은 대략 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 물질 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비율은 대략 85:15이다. 바람직한 실시예에서, 프리-비-링 플라보노이드는 식물들 중에서 스큐테랄리아 속에서 단일 식물 또는 복합 식물로부터 분리되고, 플라반은 식물들 중에서 아카시아 속에서 단일 식물 또는 복합 식물로부터 분리된다.
본 발명은 운동성, 유연성 및 신체 기능의 향상으로 증진된 신체의 활동도로 인한 체중 감소 및 혈당 조절을 위한 방법을 포함하는데, 상기 방법은 약제학적으로 허용되는 운반체와 함께 합성된 프리-비-링 플라보노이드와 플라본의 혼합물 및/또는 단독 식물 또는 복합 식물로부터 분리된 프리-비-링 플라보노이드와 플라본의 혼합물을 포함하여 이루어지는 조성물을 이를 필요로 하는 호스트에게 유효한 양으로 투여함을 포함하여 이루어진다. 프리-비-링 플라보노이드와 플라본의 비율은 프리-비-링 플라보노이드:플라본이 99:1 내지 1:99의 범위일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 비율은 대략 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 물질 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비율은 대략 85:15이다. 바람직한 실시예에서, 프리-비-링 플라보노이드는 식물들 중에서 스큐테랄리아 속에서 단일 식물 또는 복합 식물로부터 분리되고, 플라반은 식물들 중에서 아카시아 속에서 단일 식물 또는 복합 식물로부터 분리된다.
또한, 본 발명은 통증 경로에 연관된 mRNA의 생성을 조절하기 위한 방법을 포함하는데, 상기 방법은 약제학적으로 허용되는 운반체와 함께 합성된 프리-비-링 플라보노이드와 플라본의 혼합물 및/또는 단독 식물 또는 복합 식물로부터 분리된 프리-비-링 플라보노이드와 플라본의 혼합물을 포함하여 이루어지는 조성물을 이를 필요로 하는 호스트에게 유효한 양으로 투여함을 포함하여 이루어진다. 이론에 의해 한정되지는 않지만, 본 출원인은 mRNA의 생성을 조절하기 위한 능력은 프리-비-링/플라반 조성물의 활성 성분들에 의하여,cox-1 유전자가 아닌cox-2 유전자에 의한 mRNA의 생성에서의 감소를 통하여 달성된다고 생각한다. 프리-비-링 플라보노이드와 플라본의 비율은 프리-비-링 플라보노이드:플라본이 99:1 내지 1:99의 범위일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 비율은 대략 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 물질 조성에서 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비율은 대략 85:15이다. 바람직한 실시예에서, 프리-비-링 플라보노이드는 식물들 중에서 스큐테랄리아 속(Scutellaria genus)에서 단일 식물 또는 복합 식물로부터 분리되고, 플라반은 식물들 중에서 아카시아 속(Acacia genus)에서 단일 식물 또는 복합 식물로부터 분리된다.
또한, 여기에서 프리-비-링 플라보논(free-B-ring flavones)과 프리-비-링 플라보놀(free-B-ring flavonols)로 불려지며, 이하의 발명에 따라 사용될 수 있는 프리-비-링 플라보노이드는 하기 일반 구조식에 의하여 도시되는 화합물들을 포함한다.
상기 구조식에서,
R1, R2, R3, R4및 R5는 -H, -OH, -SH, -OR, -SR, -NH2, -NHR, -NR2, -NR3 +X-, 탄소, 산소, 질소 또는 황, 알도펜토스(aldopentoses), 메틸-알도펜토스(mehtyl-aldopentose), 알도헥소스 (aldohexoses), 케토헥소스(ketohexoses) 및 이들의 화학적 유도체를 포함하나, 이들에 한정되지 않는 다당류 단독 또는 다당류 혼합의 글리코시드(glycoside)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
또한, 여기서 R은 1 내지 10개의 탄소수를 갖는 알킬기이고; 그리고
X는 하이드록실(hydroxyl), 클로라이드(chloride), 요오다이드(iodide), 설페이트(sulfate), 포스페이트(phosphate), 아세테이트(acetate), 플루오라이드(fluoride), 카보네이트(carbonate) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 약제학적으로 허용되는 중심 음이온들의 군으로부터 선택된다.
이하 본 발명에 따라 사용될 수 있는 플라반은 하기의 일반 구조식에서 도시되는 화합물들을 포함한다:
상기 구조식에서
R1, R2, R3, R4및 R5는 -H, -OH, -SH, -OCH3, -SCH3, -OR, -SR, -NH2, -NRH, -NR2, -NR3 +X-, 갤레이트(gallate), 아세테이트(acetate), 시나모일 에스터(cinnamoyl esters), 하이드록실 시나모일 에스터(hydroxyl cinnamoyl esters), 트리하이드록시벤조일 에스터(trihydroxybenzoyl esters) 및 카페오일 에스터(caffeoyl esters)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 언급된 치환기들의 에스터 및 이들의 화학적 유도체들; 알도펜토스(aldopentoses), 메틸알도펜토스(methylaldopentoses), 알도헥소스(aldohexoses), 케토헥소스(ketohexose) 및 이들의 화학적 유도체들을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다당류 단독 또는 다당류 혼합의 탄소, 산소, 질소 또는 황 글리코시드; 이량체(dimer), 삼량체(trimer) 및 기타 중합된 플라반(polymerized flavans);로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
여기서, R은 1 내지 10개의 탄소수를 갖는 알킬기이며; 그리고
X는 하이드록실(hydroxyl), 클로라이드(chloride), 요오다이드(iodide), 설페이트(sulfate), 포스페이트(phosphate), 아세테이트(acetate), 플루오라이드(fluoride), 카보네이트(carbonate) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 약제학적으로 허용되는 중심 음이온들의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 프리-비-링 플라보노이드는 합성 방법 또는 앤노나시아(Annonaceae), 아스테라시아(Asteraceae), 비그노니아시아(Bignoniaceae), 콤브레타시아(Combretaceae), 콤포지테(compositae), 유퍼비애시아(Euphorbiaceae), 라비애때(Labiatae), 라우란시아(Lauranceae), 레규미노새(Leguminosae), 모래시아(Moraceae),피난시아(Pinaceae), 프테리대시아(Pteridaceae), 시노프테리대시아(Sinopteridaceae), 울마시아(Ulmaceae) 및 진기베라시아(Zingiberacea)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 식물 과(plant family)로부터 추출되는 방법에 의하여 얻을 수 있다. 프리-비-링 플라보노이드는 데즈모스(Desmos), 아키로클린(Achyrocline), 오록시룸(Oroxylum), 부체나비아(Buchenavia), 아나팔리스(Anaphalis), 코튤라(Cotula), 가나팔륨(Gnaphalium), 헬리크리쥼(Helichrysum), 센타우레아(Centaurea), 유파토리움(Eupatorium), 바카리스(Baccharis), 사피움(Sapium), 스큐텔라리아(Scutellaria), 몰사(Molsa), 콜레브룩키아(Colebrookea), 스타키스(Stachys), 오리가늄(Origanum), 지지피라(Ziziphira), 린데라(Lindera), 액티노대픈(Actinodaphne), 아카시아(Acacia), 데리스(Derris), 글라이시리자(Glycyrrhiza), 밀레치아(Millettia), 퐁미아(Pongmia), 테프로시아(Tephrosia), 아토카푸스(Artocarpus), 피큐스(Ficus), 피티로그래머(Pityrogramma), 노또래나(Notholaena), 피너스(Pinus), 울머스(Ulmus), 알피니아(Alpinia)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 고지 식물 속(genus)으로부터 추출, 농축 및 정제될 수 있다.
상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 플라반은 아카시아 속으로부터 선택된 단일 식물 또는 복합 식물로부터 얻을 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 식물로는 아카시아 카테츄(Acacia catechu), 아카시아 콘시나(A. concinna), 아카시아 파네시아나(A. farnesiana), 아카시아 세네갈 (A. Senegal), 아카시아 스페시오사(A. speciosa), 아카시아 아라비카(A. arabica), 아카시아 캐시아(A. caesia), 아카시아 페나타(A. pennata), 아카시아 시누아타(A. sinuata), 아카시아 메아른시(A. mearnsii), 아카시아 픽난사(A. picnantha), 아카시아 데알바타(A. dealbata), 아카시아 아우리큘리포미스(A. auriculiformis), 아카시아 홀로세레시아(A. holoserecia) 및 아카시아 망기움(A. mangium)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 제제를 최적화하고, 우수한 효능을 얻기 위한 효소 모델과 생체내 모델을 이용하여 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 다양한 조성물들의 평가를 포함한다. 또한, 제제의 효능 및 안정성은 인간 임상 연구들에서 입증된다. 본 발명은 바람직한 생리학적 활성도를 갖는 물질 조성물을 생산하기 위하여 분리, 정제 및 프리-비-링 플라보노이드와 아카시아 플라반의 혼합을 위한 통상적으로 실행가능한 과정을 제공한다. 본 발명의 조성물들은 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에게 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여 방식은 장(경구)투여, 장관외(정맥내, 피하 및 근육내) 투여 및 국부적 투여를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 따르는 치료 방법은 합성된 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 혼합물 및/또는 단독 식물 또는 복합 식물로부터 분리된 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 혼합물을 치료학적으로 유효한 양으로 이들을 필요로 하는 환자들에게 내부로 또는 국부적으로 투여하는 방법을 포함하여 이루어진다.
이상의 대략적인 설명과 이하의 상세한 설명은 단지 대표적으로 설명되는 것으로 청구된 바와 같은 발명에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2, COX-2) 경로 및 5-리폭시게나제(5-lipoxygenase, 5-LO) 경로에 의해 매개되는 질병 및 이상 증상의 예방 및 치료에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 COX-2 경로 및 5-LO 경로에 의해 매개되는 질병 및 이상 증상의 예방 및 치료용으로서 2가지 특정 계열(specific class)의 화합물인 프리-비-링 플라보노이드(free-B-ring flavonoids)와 플라반(flanans)의 혼합물로 이루어진 물질의 신규 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 COX-2 효소와 5-LO 효소의 단백질 기능을 동시에 억제하기 위한 방법 및 본 발명의 신규 조성물 투여에 의한 mRNA의 생성을 조절하기 위한 방법을 포함한다. 또한, 관절 이상 및 골관절염, 류마티즘 관절염, 남용으로 인한 기타 손상들과 같은 이상 증상들과 관련있는 통증을 포함하나, 이에 한정되지 않는 COX-2 경로 및 5-LO 경로에 의해 매개되는 질병 및 이상 증상의 예방 및 치료을 위한 방법을 포함한다. 이에 더 나아가, 본 발명은 혈당량을 감소시키고 체중 감소를 향상시키기 위한 방법을 포함한다.
도 1은 아카시아 카테츄(Acacia catechu)로부터 얻은 HTP 분취물들에 의한 COX-1 및 COX-2의 억제도를 그래프로 도시한 것이다. 추출물은 실시예 1 및 3에서 설명된 바대로 준비하여 분취하였다. 추출물은 실시예 2에서 설명한 바대로 재조합 양의 COX-1(■) 또는 양의 COX-2(◆)의 페록시다아제 활성의 억제도에 대하여 시험되었다. 시험 결과 값은 처리되지 않은 대조군에 대한 % 값으로 제시된다.
도 2는 스큐테랄리아 바이칼렌시스(Scutellaria baicalensis)로부터 얻은 HTP 분취물들에 의한 COX-1 및 COX-2의 억제도를 그래프로 도시한 것이다. 추출물은 실시예 1 및 3에서 설명된 바대로 준비하여 분취하였다. 추출물은 실시예 2에서 설명한 바대로 재조합 양의 COX-1(■) 또는 양의 COX-2(◆)의 페록시다아제 활성의 억제도에 대하여 시험되었다. 시험 결과 값은 처리되지 않은 대조군에 대한 % 값으로 제시된다.
도 3은 스큐테랄리아 바이칼렌시스의 뿌리로부터 분리된 82.2% 함량의 프리-비-링 플라보노이드를 함유하는 표준화된 추출물(lot # RM052302-01)의 고성능 액체크로마토그래피(high pressure liquid chromatography, HPLC) 크로마토그램을 도시한 것이다. HPLC/PDA/MS를 이용하여 바이칼린(baicalin), 우고닌-7-글루쿠로나이드(wogonin-7-glucuronide), 오록실린 에이 7-글루쿠로나이드(oroxylin A 7-glucuronide), 바이칼레인(baicalein), 우고닌(wogonin), 크리신-7-글루쿠로나이드(chrysin-7-glucuronide), 노르우고닌-7-글루쿠로나이드(norwogonin-7-glucuronide),스큐테랄린(scutellarin), 크리신(chrysin) 및 오록실린 A(oroxylin A)의 10가지 구조가 밝혀졌다.
도 4는 스큐테랄리아 바이칼렌시스로부터 분리되어 정제된 바이칼레인(baicalein)에 의한 COX-1 및 COX-2 억제도의 내용분석(profile)을 그래프로 도시한 것이다. 화합물은 재조합 양의 COX-1(◆) 및 양의 COX-2(■)의 페록시다아제 활성의 억제도에 대하여 시험되었다. 시험 결과 값은 억제제 농도(㎍/mL) 대 억제제 없는 분석물의 % 억제도로 제시된다. COX-1에 대한 IC50값은 효소의 0.18㎍/mL/unit로 계산되었고, COX-2에 대한 IC50값은 0.28㎍/mL/unit로 계산되었다.
도 5는 스큐테랄리아 바이칼렌시스로부터 분리되어 정제된 바이칼린(baicalin)에 의한 COX-1 및 COX-2 억제도의 내용분석을 그래프로 도시한 것이다. 화합물은 재조합 양의 COX-1(◆) 및 양의 COX-2(■)의 페록시다아제 활성의 억제도에 대하여 시험되었다. 시험 결과 값은 억제제 농도(㎍/mL) 대 억제제 없는 분석물의 % 억제도로 제시된다. COX-1에 대한 IC50값은 효소의 0.44㎍/mL/unit로 결정되었고, COX-2에 대한 IC50값은 0.28㎍/mL/unit로 결정되었다.
도 6은 스큐테랄리아 바이칼렌시스로부터 분리된 표준화된 프리-비-링 플라보노이드 추출물(HPLC에 의하여 83% 바이칼린)에 의한 COX-1 및 COX-2 억제도의 내용분석을 그래프로 도시한 것이다. 추출물은 재조합 양의 COX-1(◆) 및 양의 COX-2(■)의 페록시다아제 활성의 억제도에 대하여 시험되었다. 시험 결과 값은 억제제 농도(㎍/mL) 대 억제제 없는 분석물의 % 억제도로 제시된다. COX-1에 대한 IC50값은 효소의 0.24㎍/mL/unit로 계산되었고, COX-2에 대한 IC50값은 0.48㎍/mL/unit로 계산되었다.
도 7은 아카시아 카테츄로부터 분리되어 정제된 카테친(catechin)에 의한 COX-1 및 COX-2 억제도의 내용분석을 그래프로 도시한 것이다. 화합물은 재조합 양의 COX-1(◆) 및 양의 COX-2(■)의 페록시다아제 활성의 억제도에 대하여 시험되었다. 시험 결과 값은 억제제 농도(㎍/mL) 대 억제제 없는 분석물의 % 억제도로 제시된다. COX-1에 대한 IC50값은 효소의 0.11㎍/mL/unit로 계산되었고, COX-2에 대한 IC50값은 0.42㎍/mL/unit로 계산되었다.
도 8은 아카시아 카테츄로부터 분리된 50% 총량의 카테친을 함유한 표준화된 플라반(flavan) 추출물에 의한 COX-1 및 COX-2 억제도의 내용분석을 그래프로 도시한 것이다. 추출물은 재조합 양의 COX-1(◆) 및 양의 COX-2(■)의 페록시다아제 활성의 억제도에 대하여 시험되었다. 시험 결과 값은 억제제 농도(㎍/mL) 대 억제제 없는 분석물의 % 억제도로 제시된다. COX-1에 대한 IC50값은 효소의 0.17㎍/mL/unit로 계산되었고, COX-2에 대한 IC50값은 0.41㎍/mL/unit로 결정되었다.
도 9는 물에서 80%인 메탄올로 아카시아 카테츄로부터 추출된 플라반의 HPLC크로마토그램을 도시한 것이다.
도 10은 아카시아 카테츄로부터 정제된 플라반 카테친에 의한 5-리폭시게나제(5-lipoxygenase, 5-LO) 억제도의 내용분석을 그래프로 도시한 것이다. 화합물은 재조합 감자 5-LO 활성(◆)에 대하여 시험되었다. 시험 결과 값은 억제제 농도(㎍/mL) 대 억제제 없는 분석물의 % 억제도로 제시된다. 5-LO에 대한 IC50값은 효소의 1.38㎍/mL/unit였다.
도 11은 실시예 14에서 설명한 바대로 85:15 비율의 프리-비-링 플라보노이드와 플라반 추출물의 혼합에 의하여 제조된 유니베스틴(UnivestinTM) 조성물에 의한 COX-1 및 COX-2 억제도의 내용분석을 그래프로 도시한 것이다. 유니베스틴은 재조합 양의 COX-1(◆) 및 양의 COX-2(■)의 페록시다아제 활성의 억제도에 대하여 시험되었다. 시험 결과 값은 억제제 농도(㎍/mL) 대 억제제 없는 분석물의 % 억제도로 제시된다. COX-1에 대한 IC50값은 효소의 0.76㎍/mL/unit로 계산되었고, COX-2에 대한 IC50값은 0.80㎍/mL/unit로 결정되었다.
도 12는 실시예 14에서 설명한 바대로 50:50 비율의 프리-비-링 플라보노이드와 플라반 추출물의 혼합에 의하여 제조된 유니베스틴 조성물에 의한 COX-1 및 COX-2 억제도의 내용분석을 그래프로 도시한 것이다. 유니베스틴은 재조합 양의 COX-1(◆) 및 양의 COX-2(■)의 페록시다아제 활성의 억제도에 대하여 시험되었다. 시험 결과 값은 억제제 농도(㎍/mL) 대 억제제 없는 분석물의 % 억제도로 제시된다. COX-1에 대한 IC50값은 효소의 0.38㎍/mL/unit였고, COX-2에 대한 IC50값은 0.84㎍/mL/unit였다.
도 13은 실시예 14에서 설명한 바대로 20:80 비율의 프리-비-링 플라보노이드와 플라반 추출물의 혼합에 의하여 제조된 유니베스틴 조성물에 의한 COX-1 및 COX-2 억제도의 내용분석을 그래프로 도시한 것이다. 유니베스틴은 재조합 양의 COX-1(◆) 및 양의 COX-2(■)의 페록시다아제 활성의 억제도에 대하여 시험되었다. 시험 결과 값은 억제제 농도(㎍/mL) 대 억제제 없는 분석물의 % 억제도로 제시된다. COX-1에 대한 IC50값은 효소의 0.18㎍/mL/unit였고, COX-2에 대한 IC50값은 0.41㎍/mL/unit였다.
도 14는 THP-1 또는 HT-29 세포에서 ELISA(ATCC)에 의하여 결정된 LPS-유도성 신규 합성 LTB4(◆) 양에 대한 유니베스틴 농도 증가의 효과를 도시한 것이다. 혼합 추출물의 활성도는 유도성 LTB4합성의 %억제도로 제시된다.
도 15는 실시예 16에서 설명한 바대로 3㎍/mL의 이부프로펜(ibuprofen)으로 처치에 대한 비-유도성 세포에서 3㎍/mL 유니베스틴으로 처치한 이후의 HT-29 세포에 남아 있는 ELISA에 의하여 결정된 LTB4수준을 비교한다.
도 16은cox-1 및cox-2 유전자 발현에 있어서 유니베스틴의 다양한 농도에서의 효과를 비교한다. 발현 수준은 18S rRNA의 발현 수준(internal control)으로 표준화한 후, 처리하지 않고 LPS가 없는 상태의 것과 비교된다. 도 16은 LPS-자극및 유니베스틴의 작용으로 인하여cox-1이 아니라,cox-2 유전자 발현의 감소를 설명한다.
도 17은 다른 NSAIDs와 동일한 농도의cox-1 및cox-2 유전자 발현에 있어서 3㎍/㎖의 유니베스틴의 효과를 비교한다. 발현 수준은 18S rRNA의 발현 수준(internal control)으로 표준화한 후, 처리하지 않고 LPS가 없는 상태의 것과 비교된다.
도 18은 염증 억제도의 측정으로서 귀-부종(ear-swelling) 결과 값을 그래프로 도시한 것이다. 80:20 비율의 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 표준화된 추출물들의 혼합에 의하여 제조된 유니베스틴이, 처치되지 않은 쥐 및 경구적 관 투여(oral gavage)에 의하여 인도메타신(indomethacin, 50㎎/㎏)이 투여된 쥐에 대하여 비교되었다. 그 결과값은 처치되지 않은 쥐의 귓볼과 처치된 쥐의 귓볼을 마이크로 단위로 측정하여 그 차이값들로 제시된다.
도 19는 처치되지 않은 쥐(비처치+아라키돈산), 아라키돈산이 주사되지 않은 쥐(음성 대조군) 또는 액체 운반체가 주사된 쥐(운반체 대조군)에 대하여 비교되는 아라키돈산이 주사된 쥐의 발목 관절(유니베스틴+아라키돈산)에 대한 100㎎/㎏ 유니베스틴(80:20 비율의 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 표준화된 추출물들의 혼합에 의하여 제조된)의 효과를 나타낸다.
도 20은 250㎎/일 투여량의 유니베스틴으로 처치한 이후의 기준선(처치전), 30일, 60일, 90일에서의 통증 지수(pain index) WOMAC(Western Ontario and McMaster Universities Osteoarthritis) 값에 대한 95% 신뢰구간(confidenceinterval)을 그래프로 도시한 것이다.
도 21은 500㎎/일 투여량의 유니베스틴으로 처치한 이후의 기준선(처치전), 30일, 60일, 90일에서의 통증 지수 WOMAC 값에 대한 95% 신뢰구간을 그래프로 도시한 것이다.
도 22는 200㎎/일 투여량의 셀레콕시브(Celecoxib)로 처치한 이후의 기준선(처치전), 30일, 60일, 90일에서의 통증 지수 WOMAC 값에 대한 95% 신뢰구간을 그래프로 도시한 것이다.
도 23은 플라시보로 처치한 이후의 기준선(처치전), 30일, 60일, 90일에서의 통증 지수 WOMAC 값에 대한 95% 신뢰구간을 그래프로 도시한 것이다.
도 24는 250㎎/일 투여량의 유니베스틴으로 처치한 이후의 기준선(처치전), 30일, 60일, 90일에서의 경직성 지수(stiffness index) WOMAC 값에 대한 95% 신뢰구간을 그래프로 도시한 것이다.
도 25는 500㎎/일 투여량의 유니베스틴으로 처치한 이후의 기준선(처치전), 30일, 60일, 90일에서의 경직성 지수 WOMAC 값에 대한 95% 신뢰구간을 그래프로 도시한 것이다.
도 26은 200㎎/일 투여량의 셀레콕시브로 처치한 이후의 기준선(처치전), 30일, 60일, 90일에서의 경직성 지수 WOMAC 값에 대한 95% 신뢰구간을 그래프로 도시한 것이다.
도 27은 플라시보로 처치한 이후의 기준선(처치전), 30일, 60일, 90일에서의 경직성 지수 WOMAC 값에 대한 95% 신뢰구간을 그래프로 도시한 것이다.
도 28은 250㎎/일 투여량의 유니베스틴으로 처치한 이후의 기준선(처치전), 30일, 60일, 90일에서의 기능 손상 지수(functionl impairment index) WOMAC 값에 대한 95% 신뢰구간을 그래프로 도시한 것이다.
도 29는 500㎎/일 투여량의 유니베스틴으로 처치한 이후의 기준선(처치전), 30일, 60일, 90일에서의 기능 손상 지수 WOMAC 값에 대한 95% 신뢰구간을 그래프로 도시한 것이다.
도 30은 200㎎/일 투여량의 셀레콕시브로 처치한 이후의 기준선(처치전), 30일, 60일, 90일에서의 기능 손상 지수 WOMAC 값에 대한 95% 신뢰구간을 그래프로 도시한 것이다.
도 31은 플라시보로 처치한 이후의 기준선(처치전), 30일, 60일, 90일에서의 기능 손상 지수 WOMAC 값에 대한 95% 신뢰구간을 그래프로 도시한 것이다.
도 32는 체질량 지수(Body Mass Index, BMI)에 있어서, 200㎎/일 투여량에서의 셀레콕시브 및 플라시보에 대하여 비교되는 250 및 500㎎/일의 투여량에서의 유니베스틴의 효능을 나타낸다.
도 33은 체중 감소에 있어서, 200㎎/일 투여량에서의 셀레콕시브 및 플라시보에 대하여 비교되는 250 및 500㎎/일의 투여량에서의 유니베스틴의 효능을 나타낸다.
도 34는 혈당 감소에 있어서, 플라시보에 대하여 비교되는 250 및 500㎎/일 투여량에서의 유니베스틴의 효능을 나타낸다.
이하에서 사용되는 다양한 용어들은 본 발명의 여러 관점을 나타내기 위함이다. 본 발명을 명확하게 설명하기 위하여 본 발명의 화합물들을 아래와 같이 정의한다.
"a" 또는 "an" 존재는 1개 이상의 존재를 의미하는 것으로, 예를 들면, "a flavonoid"는 1개 이상의 플라보노이드를 의미한다. "a" 또는 "an", "one or more", "at least one"는 여기서 상호 교환적으로 사용된다.
"프리-비-링 플라보노이드(Free-B-Ring Flavonoids)"는 하기 일반 구조식으로 도시된 바와 같이, 방향족들 중에서 비 링상에 치환기를 갖고 있지 않은 특정 계열(specific class)의 화합물이다.
상기 구조식에서,
R1, R2, R3, R4및 R5는 -H, -OH, -SH, -OR, -SR, -NH2, -NHR, -NR2, -NR3 +X-, 탄소, 산소, 질소 또는 황, 알도펜토스(aldopentoses), 메틸-알도펜토스(mehtyl-aldopentose), 알도헥소스 (aldohexoses), 케토헥소스(ketohexoses) 및 이들의 화학적 유도체를 포함하나, 이들에 한정되지 않는 다당류 단독 또는 다당류 혼합의 글리코시드(glycoside)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
또한, 여기서 R은 1 내지 10개의 탄소수를 갖는 알킬기이고; 그리고
X는 하이드록실(hydroxyl), 클로라이드(chloride), 요오다이드(iodide), 설페이트(sulfate), 포스페이트(phosphate), 아세테이트(acetate), 플루오라이드(fluoride), 카보네이트(carbonate) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 약제학적으로 허용되는 중심 음이온들의 군으로부터 선택된다.
"플라반(flavan)"은 하기 일반 구조식으로 나타낼 수 있는 특정 계열의 플라보노이드 화합물이다.
상기 구조식에서
R1, R2, R3, R4및 R5는 -H, -OH, -SH, -OCH3, -SCH3, -OR, -SR, -NH2, -NRH, -NR2, -NR3 +X-, 갤레이트(gallate), 아세테이트(acetate), 시나모일 에스터(cinnamoyl esters), 하이드록실 시나모일 에스터(hydroxyl cinnamoyl esters), 트리하이드록시벤조일 에스터(trihydroxybenzoyl esters) 및 카페오일 에스터(caffeoyl esters를 포함하나, 이에 한정되지 않는 언급된 치환기들의 에스터 및 이들의 화학적 유도체들; 알도펜토스(aldopentoses), 메틸알도펜토스(methylaldopentoses), 알도헥소스(aldohexoses), 케토헥소스(ketohexose) 및 이들의 화학적 유도체들을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다당류 단독 또는 다당류 혼합의 탄소, 산소, 질소 또는황 글리코시드; 이량체(dimer), 삼량체(trimer) 및 기타 중합된 플라반(polymerized flavans);로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
여기서, R은 1 내지 10개의 탄소수를 갖는 알킬기이며; 그리고
X는 하이드록실(hydroxyl), 클로라이드(chloride), 요오다이드(iodide), 설페이트(sulfate), 포스페이트(phosphate), 아세테이트(acetate), 플루오라이드(fluoride), 카보네이트(carbonate) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 약제학적으로 허용되는 중심 음이온들의 군으로부터 선택된다.
"유전자 발현(Gene expression)"은 mRNA으로의 유전자 전사를 의미한다.
"단백질 발현(protein expression)"은 단백질로의 유전사 번역을 의미한다.
"RT-qPCR"은 mRNA 분자를 cDNA 분자로 역전사(reverse transcribing)하여, 형광성 표지(fluorescent reporter)가 결합된 폴리머라아제 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 유전자 발현 수준을 정량적으로 평가하는 방법이다.
"치료학의(Therapeutic)"는 치료 및 예방을 포함한다. 인간뿐만 아니라 동물에 사용되었을 때의 "치료학의"를 의미한다.
"약제학적 또는 치료학적 유효량(Pharmaceutically or therapeutically effective dose or amount)은 바람직한 생물학적 결과를 유도하기에 충분한 투여량을 의미한다. 그러한 결과는 징후, 증상 또는 질병의 원인의 경감 또는 바람직한 생물학적 시스템의 다른 변화일 수 있다.
"플라시보(Placebo)"는 약제학적으로 또는 치료학적으로 유효한 투여량 또는증후, 증상 또는 비-활성 물질을 갖는 질병의 원인을 경감시킬 수 있는 바람직한 생물학적 약제를 유도하기에 충분한 양의 대용어이다.
"호스트(host)"는 여기서 설명되는 조성물이 투여되는 생명체, 인간, 또는 동물을 의미한다.
본 출원에서 제시되는 다양한 인용문들은 온전히 그대로 참조용으로 여기에 포함된다.
본 발명은 프리-비-링 플라보노이드(free-B-ring flavonoids) 및 플라반(flavans)의 혼합물을 포함하여 이루어지는 신규한 물질 조성물을 포함한다. 상기 신규한 물질 조성물을 여기에서는 유니베스틴(UnivestinTM)으로 부른다. 상기 물질 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 비율은 특정 질병 또는 이상 증상의 예방 및 치료에 대하여 필요한 조치와 특별한 필요에 따라 조절될 수 있다. 일반적으로, 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 비율은 프리-비-링 플라보노이드:플라반가 99:1 내지 1:99의 범위일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예들에서, 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 비율은 대략 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 물질 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비율은 대략 85:15이다. 바람직한 실시예에서 프리-비-링 플라보노이드는 식물들 중에서 스큐테랄리아 속(Scutellaria genus)에서 단일 식물 또는 복합 식물로부터 분리되고, 플라반은 식물들 중에서 아카시아 속(Acacia genus)에서 단일 식물또는 복합 식물로부터 분리된다.
본 발명의 일실시예에서, 표준화된 프리-비-링 플라보노이드 추출물은 실시예 5, 7 및 13; 표 5, 7, 8 및 9; 도 3에서 정의된 바대로, 총 프리-비-링 플라보노이드들 중에서 1 내지 99중량%의 순도를 갖는 활성 화합물들로 구성된다. 추출물에서 주요 활성 성분인 바이칼린(baicalin)은 총 프리-비-링 플라보노이드들 중에서 대략 50 내지 90중량%의 비율을 차지한다. 바람직한 실시예에서, 표준화된 추출물은 75% 초과의 총 프리-비-링 플라보노이드들 함유하며, 상기 총 프리-비-링 플라보노이드는 바이칼린이 75% 초과하여 함유한다.
일실시예에서, 표준화된 플라반 추출물은 실시예 8, 9 및 12; 표 4, 6 및 9; 도 9에서 정의된 바대로 1 내지 99% 순도의 총 플라반들을 갖는 활성 화합물들로 구성된다. 추출물에서 주요 활성 성분인 카테친(catechin)은 총 플라반들 중에서 50 내지 90중량%의 비율을 차지한다. 바람직한 실시예에서, 표준화된 플라반 추출물은 50% 초과의 총 플란반을 함유하며, 상기 총 플라반은 카테친이 70% 초과하여 함유한다.
일실시예에서 유니베스틴은 상기 2가지 추출물들이 혼합되어 제조되거나, 99:1 내지 1:99 비율의 합성 화합물이다. 실시예 14에서 정의된 바대로 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 바람직한 비율은 프리-비-링 플라보노이드:플라반=85:15이다.
유니베스틴에서 프리-비-링 플라보노이드의 농도는 약 1 내지 99%일 수 있고, 유니베스틴에서 플라반의 농도는 99 내지 1%일 수 있다. 본 발명의 바람직한실시예에서, 유니베스틴에서 총 프리-비-링 플라보노이드의 농도는 대략 75%이며, 상기 총 프리-비-링 플라보노이드는 총 유니베스틴에 대하여 약 60중량%의 바이칼린을 함유한다; 그리고 유니베스틴에서 총 플라반의 농도는 대략 10%이며, 상기 총 플라반은 대략 9%의 카테친을 함유한다. 상기 실시예에서, 유니베스틴에서 총 활성 성분들(프리-비-링 플라보노이드와 플라반)은 총 중량의 80%를 초과한다.
또한, 본 발명은 사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2, COX-2) 및 5-리폭시게나제(5-lipoxigenase, 5-LO) 효소들을 동시에 억제하는데 있어서 효과적인 방법들을 포함한다. COX-2 및 5-LO 경로들의 동시적 이중적 억제를 위한 방법은 합성된 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 혼합물 및/또는 단일 식물 또는 복합 식물들로부터 분리된 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 혼합물을 포함하여 이루어진 조성물을 이를 필요로 하는 호스트에 투여함을 포함하여 이루어진다. 상기 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 비율은 프리-비-링 플라보노이드:플라반이 99:1 내지 1:99의 범위일 수 있다. 본 발명의 구체적 실시예들에서, 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 비율은 대략 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 물질 조성물에 있어서 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비율은 대략 85:15이다. 바람직한 실시예에서, 프리-비-링 플라보노이드는 식물들 중에서 스큐테랄리아 속에서 단일 식물 또는 복합 식물로부터 분리되고, 플라반은 식물들 중에서 아카시아 속에서 단일 식물 또는 복합 식물로부터 분리된다.
본 발명은 이에 더 나아가 COX-2 및 5-LO에 의하여 매개되는 질병들 및 이상증상들의 예방 및 치료를 위한 방법들을 포함한다. 상기 COX-2 및 5-LO에 의하여 매개되는 질병들 및 이상 증상들의 예방 및 치료를 위한 방법은 약제학적으로 허용되는 운반체(carrier)와 함께 합성된 프리-비-링 플라보노이드와 플라본의 혼합물 및/또는 단독 식물 또는 복합 식물로부터 분리된 프리-비-링 플라보노이드와 플라본의 혼합물을 포함하여 이루어지는 조성물을 이를 필요로 하는 호스트에게 유효한 양으로 투여함을 포함하여 이루어진다. 상기 프리-비-링 플라보노이드와 플라본의 비율은 프리-비-링 플라보노이드:플라본이 99:1 내지 1:99의 범위일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 비율은 대략 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 물질 조성에서 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비율은 대략 85:15이다. 바람직한 실시예에서, 프리-비-링 플라보노이드는 식물들 중에서 스큐테랄리아 속에서 단일 식물 또는 복합 식물로부터 분리되고, 플라반은 식물들 중에서 아카시아 속에서 단일 식물 또는 복합 식물로부터 분리된다.
또한, 다른 실시예에서, 본 발명은 운동성 및 신체 기능을 향상시키면서 일반적인 관절의 통증 및 경직성을 치료하기 위한 방법과 골관절염 및 류마티즘 관절염의 병리학적 이상 증상들을 치료하기 위한 방법을 포함한다. 상기 운동성 및 신체 기능을 향상시키면서 일반적인 관절의 통증 및 경직성을 치료하기 위한 방법과 골관절염 및 류마티즘 관절염의 병리학적 이상 증상들을 치료하기 위한 방법은 약제학적으로 허용되는 운반체와 함께 합성된 프리-비-링 플라보노이드와 플라본의혼합물 및/또는 단독 식물 또는 복합 식물로부터 분리된 프리-비-링 플라보노이드와 플라본의 혼합물을 포함하여 이루어지는 조성물을 이를 필요로 하는 호스트에게 유효한 양으로 투여함을 포함하여 이루어진다. 상기 프리-비-링 플라보노이드와 플라본의 비율은 프리-비-링 플라보노이드:플라본이 99:1 내지 1:99의 범위일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 비율은 대략 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 물질 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비율은 대략 85:15이다. 바람직한 실시예에서, 프리-비-링 플라보노이드는 식물들 중에서 스큐테랄리아 속에서 단일 식물 또는 복합 식물로부터 분리되고, 플라반은 식물들 중에서 아카시아 속에서 단일 식물 또는 복합 식물로부터 분리된다.
또한, 본 발명은 통증 경로들과 연관된 mRNA의 생성을 조절하기 위한 방법을 포함하는데, 상기 방법은 약제학적으로 허용되는 운반체와 함께 합성된 프리-비-링 플라보노이드와 플라본의 혼합물 및/또는 단독 식물 또는 복합 식물로부터 분리된 프리-비-링 플라보노이드와 플라본의 혼합물을 포함하여 이루어지는 조성물을 이를 필요로 하는 호스트에게 유효한 양으로 투여함을 포함하여 이루어진다. 상기 프리-비-링 플라보노이드와 플라본의 비율은 프리-비-링 플라보노이드:플라본이 99:1 내지 1:99의 범위일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 비율은 대략 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 물질 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비율은 대략 85:15이다. 바람직한 실시예에서, 프리-비-링 플라보노이드는 식물들 중에서 스큐테랄리아 속에서 단일 식물 또는 복합 식물로부터 분리되고, 플라반은 식물들 중에서 아카시아 속에서 단일 식물 또는 복합 식물로부터 분리된다.
또한, 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 프리-비-링 플라보노이드는 앞서 기재된 일반 구조식에 의하여 도시되는 화합물들을 포함한다. 본 발명의 프리-비-링 플라보노이드는 합성 방법 또는 앤노나시아(Annonaceae), 아스테라시아(Asteraceae), 비그노니아시아(Bignoniaceae), 콤브레타시아(Combretaceae), 콤포지테(compositae), 유퍼비애시아(Euphorbiaceae), 라비애때(Labiatae), 라우란시아(Lauranceae), 레규미노새(Leguminosae), 모래시아(Moraceae), 피난시아(Pinaceae), 프테리대시아(Pteridaceae), 시노프테리대시아(Sinopteridaceae), 울마시아(Ulmaceae) 및 진기베라시아(Zingiberacea)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 식물 과(plant family)로부터 추출되는 방법에 의하여 얻을 수 있다. 또한, 프리-비-링 플라보노이드는 데즈모스(Desmos), 아키로클린(Achyrocline), 오록시룸(Oroxylum), 부체나비아(Buchenavia), 아나팔리스(Anaphalis), 코튤라(Cotula), 가나팔륨(Gnaphalium), 헬리크리쥼(Helichrysum), 센타우레아(Centaurea), 유파토리움(Eupatorium), 바카리스(Baccharis), 사피움(Sapium), 스큐텔라리아(Scutellaria), 몰사(Molsa), 콜레브룩키아(Colebrookea), 스타키스(Stachys), 오리가늄(Origanum),지지피라(Ziziphira), 린데라(Lindera), 액티노대픈(Actinodaphne), 아카시아(Acacia), 데리스(Derris), 글라이시리자(Glycyrrhiza), 밀레치아(Millettia), 퐁미아(Pongmia), 테프로시아(Tephrosia), 아토카푸스(Artocarpus), 피큐스(Ficus), 피티로그래머(Pityrogramma), 노또래나(Notholaena), 피너스(Pinus), 울머스(Ulmus), 알피니아(Alpinia)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 고지 식물 속(plant genus)으로부터 추출, 농축 및 정제될 수 있다.
본 발명의 프리-비-링 플라보노이드는 줄기, 줄기껍질, 가지, 괴경, 뿌리, 뿌리껍질, 어린순, 씨, 근경, 꽃 및 기타 생식기관, 잎, 기타 기생부분을 포함하나, 이에 한정되지 않는 식물의 다양한 부분에서 얻을 수 있다. 프리-비-링 플라보노이드의 분리 및 정제를 위한 방법은 "사이클로옥시게나제-2 억제제로서 효능있는 프리-비-링 구조를 갖는 플라보노이드의 선별(Identification of Free-B-Ring Flavonoids as Potent COX-2 Inhibitors)" 제목의 2002년 3월 1일자로 출원된 미국 특허출원 제10/091,362호에 게재되며, 여기에 온전히 참조로서 포함된다.
본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 플라반은 앞서 기재된 일반 구조식에서 도시되는 화합물들을 포함한다. 본 발명의 플라반은 합성 방법에 의하여 얻거나, 또는 아카시아 속으로부터 선택된 단일 식물 또는 복합 식물로부터 분리될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 식물로는 아카시아 카테츄(Acacia catechu), 아카시아 콘시나(A. concinna), 아카시아 파네시아나(A. farnesiana), 아카시아 세네갈 (A. Senegal), 아카시아 스페시오사(A. speciosa), 아카시아 아라비카(A.arabica), 아카시아 캐시아(A. caesia), 아카시아 페나타(A. pennata), 아카시아 시누아타(A. sinuata), 아카시아 메아른시(A. mearnsii), 아카시아 픽난사(A. picnantha), 아카시아 데알바타(A. dealbata), 아카시아 아우리큘리포미스(A. auriculiformis), 아카시아 홀로세레시아(A. holoserecia) 및 아카시아 망기움(A. mangium)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 플라반은 줄기, 줄기껍질, 나무몸통, 나무몸통껍질, 가지, 괴경, 뿌리, 뿌리껍질, 어린순, 씨, 근경, 꽃 및 기타 생식기관, 잎, 기타 기생부분을 포함하나, 이에 한정되지 않는 식물의 다양한 부분에서 얻을 수 있다. 플라반의 분리 및 정제를 위한 방법은 "아카시아로부터 이중적 사이클로옥시게나제-2 및 5-리폭시게나제 억제제의 분리(Isolation of a Dual COX-2 and 5-Lipoxygenanse Inhibitor from Acacia)" 제목의 2002년 3월 22일자로 출원된 미국 특허출원 제10/104,477호에 게재되며, 여기에 온전히 참조로서 포함된다.
본 발명은 활성 식물 추출물들과 COX-2 및 5-LO 효소 활성을 선택적으로 억제하고,cox-1 mRNA 생성이 아닌cox-2 mRNA 생성에 영향을 미치는 성분들을 확인하기 위하여 생체 밖의 생화학적, 세포학적, 유전자 발현 검색 뿐만 아니라, 일련의 생체 내의 연구들을 결합하는 전략을 수행한다. 활성 식물 추출물들과 COX-2 및 5-LO 효소 활성을 선택적으로 억제하는 성분들을 확인하기 위하여 본 발명에서 사용되는 방법은 실시예 1 내지 13(도 1 내지 10)에서 설명된다. 이러한 방법들은 "사이클로옥시게나제-2 억제제로서 효능있는 프리-비-링 구조를 갖는 플라보노이드의 선별(Identification of Free-B-Ring Flavonoids as Potent COX-2 Inhibitors)"제목의 2002년 3월 1일자로 출원된 미국 특허출원 제10/091,362호 및 "아카시아로부터 이중적 사이클로옥시게나제-2 및 5-리폭시게나제 억제제의 분리(Isolation of a Dual COX-2 and 5-Lipoxygenanse Inhibitor from Acacia)" 제목의 2002년 3월 22일자로 출원된 미국 특허출원 제10/104,477호에 더욱 자세하게 설명되며, 여기에 특별히 온전하게 참조로서 포함된다.
본 연구들이 여기서 유니베스틴(UnivestinTM)이라고 불리는 신규 물질 조성물 발견의 결과를 가져오며, 상기 유니베스틴은 2가지 표준화된 추출물들을 특허 비율로 혼합됨으로써 구성되며, 상기 표준화된 추출물은 각각 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반을 함유한다. 상기의 조성물을 제조하기 위한 개괄적인 예가 실시예 14에 제공되는데, 각각의 아카시아 및 스큐테랄리아로부터 분리된 2가지 표준화된 추출물들과 1가지 이상의 부형물을 함께 사용한다. 실시예 14에서 사용된 아카시아 추출물은 카테친(catechin), 에피카테친(epicatechin)과 같은 총 플라반을 60% 초과하여 함유하고, 스큐테랄리아 추출물은 주로 바이칼린(baicalin)인 총 프리-비-링 플라보노이드를 70% 초과하여 함유한다. 상기 스큐테랄리아 추출물은 표 11에서 나타난 바와 같이 기타 소량의 프리-비-링 플라보노이드를 함유하였다. 1가지 이상의 부형물들이 선택적으로 물질 조성물에 첨가될 수 있다. 첨가되는 부형물의 양은 원하는 각 성분들의 실제 활성 함량에 따라 조절될 수 있다. 제제의 각 개별적인 배치(batch)에 대한 혼합표(blending table)는 제제의 설명서(specification) 및 성분들의 개별적인 배치에 대한 QC 결과에 따라 만들어진다. 제제의 설명서를충족하기 위해서 2 내지 5% 범위내의 활성 성분의 첨가량이 권고된다. 실시예 14는 유니베스틴의 하나의 배치에 대하여 만들어진 혼합표를 나타낸다(Lot#G1702-COX-2). 다양한 혼합 비율로 제조된 유니베스틴 제제의 COX-2 및 5-LO 효소 활성 억제에 대한 능력 및 실시예 15 내지 17에서 설명되는coxmRNA 생성을 감소시키는 능력에 대하여 평가되었다.
COX-2 억제 분석은 헴(heme) 및 아라키돈산의 존재 하의 효소 페록시다아제의 활성에 의존한다. 고 처리량으로 COX-1 및 COX-2 활성을 억제하는 화합물들에 대하여 검색(screen)하기 위하여, 2가지 효소들의 페록시다아제 활성 억제를 이용한 생체밖 분석이 전개되며, 이는 실시예 2 및 6에서 설명된다. 검색 과정 중에 COX-2 활성을 억제하였던 식물 분취물을 분리한 후에 2가지 개별적인 표준화된 추출물들, 즉, 하나는 주로 프리-비-링 플라보노이드로 구성된 추출물(스큐테랄리아로부터 분리된), 다른 하나는 플라반으로 구성된 추출물(아카시아로부터 분리된)이 비교되었고, 각 추출물로부터 얻은 정제된 조성물과 다양한 비율의 혼합 추출물들을 COX-1 및 COX-2의 고정된 양에 대하여 적정함으로써 비교하였다. 본 연구가 정제된 프리-비-링 플라보노이드, 스큐테랄리아 바이칼렌시스로부터 분리된 바이칼린 및 바이칼레인과 정제된 플라반, 아카시아 카테츄로부터 분리된 카테친이 COX-2 및 5-LO 활성을 억제하였음을 나타내었다. 게다가, 프리-비-링 플라보노이드의 농도가 10 내지 90%(HPLC에 의한)이고, 플라반의 농도가 10 내지 90%(HPLC에 의한)인 개개의 표준화된 추출물 역시 COX-2 및 5-LO 활성을 억제하였다. 마지막으로, 본 연구는 프리-비-링 플라보노이드 대 플라본의 비율이 대략 80:20, 50:50 및 20:80인 개개의 표준화된 추출물들 각각의 혼합물을 함유하는 조성물들 모두가 생체 밖에서 COX-2 효소 활성을 억제하는데 매우 효과적임을 나타내었다. 결과는 도 11 내지 13에 도시된다.
실시예 16은 5-LO 경로, 즉, LTB4에서 아라키돈산의 소멸로 인한 화합물들의 억제를 목표로 하여 수행되는 세포 분석을 설명한다. 그 결과는 도 14 및 15에 도시된다.
실시예 17은 유니베스틴에 의한cox-2 유전자의 구별되는 억제도를 결정하기 위하여 수행되는 시험을 설명한다. 유전자 발현 결과는 반-정량적 RT-qPCR 분석에서cox-1 및cox-2 mRNA 생성의 억제도로부터 얻었다. 그 결과는 도 16 및 도 17에 도시된다. 도 16은 유니베스틴이cox-1 유전자 발현에 영향을 미치지 않으면서cox-2 mRNA 생성을 억제함을 보인다. 더욱이, 다른 COX-2 억제 제약과 비교하였을 때, 유니베스틴이cox-1 및cox-2 유전자 발현에서 LPS-자극성 증가를 감소시킬 수 있었다. 중요한 것은 셀레콕시브(celecoxib) 및 이부로프로센(ibuprofen) 모두cox-2 유전자 발현을 증가시켰다(도 17) .
생체 내의 효능은 아라키돈산과 같은 피부 자극성 물질을 쥐의 귀에 투여한 후 유니베스틴으로 처치된 쥐의 부종(swelling) 감소를 측정함으로써 설명되는데, 이는 실시예 18에서 설명된다. 그 결과는 도 18에 도시된다. 또한, 염증 및 통증 부위에서의 효능은 쥐의 발목 관절에 자극제를 투여한 후 유니베스틴으로 처치된 쥐의 부종의 감소를 측정함으로써 결정되는데, 이는 실시예 19에서 설명된다. 그결과는 도 19에 도시된다.
프리-비-링 플라보노이드의 농도가 10 내지 90%(HPLC에 의한)이고, 플라반의 농도가 10 내지 90%(HPLC에 의한)인 개개의 표준화된 추출물들 및 이들의 제품인 유니베스틴은 장기 및 단기 투여한 쥐에서의 독성이 시험되었다. 장기 투여 프로토콜(protocol)에서, 쥐는 90㎎/㎏(500㎎의 사람 1일 투여량에 해당), 450㎎/㎏(1일 투여량의 5배에 해당) 및 900㎎/㎏(1일 투여량의 10배에 해당)의 1일 투여량으로 경구 관 투여방법(oral gavage)에 의하여 시험 품목들이 주입되었다. 쥐들은 체중 증가, 체형 또는 행동에 있어서 불리한 효과를 보이지 않았다. 총체적인 시체 부검의 결과 기관의 이상을 보이지 않았으며, 위장, 신장 및 간장의 조직에 있어서도 처치되지 않은 쥐에 비교하여 어떤 차이점을 보이지 않았다. 전해질, 혈액 단백질, 혈액 효소 및 간 효소를 측정하는 전체 혈액 작용(full blood work)이 처치되지 않은 쥐에 비교하여 어떤 비정상적인 결과를 보이지 않았다. 단기 프로토콜에서, 프리-비-링 플라보노이드의 농도가 10 내지 90%(HPLC에 의한)이고, 플라반의 농도가 10 내지 90%(HPLC에 의한)인 개개의 표준화된 추출물들 및 이들의 제품인 유니베스틴은 2g/㎏(1일 투여량의 20배에 해당) 투여로 인하여 체중 증가, 외모, 행동, 기관들의 총체적인 시체 부검 양상, 위장의 조직, 신장의 조직, 간장의 조직, 또는 혈액 작용에 있어서 처치되지 않은 쥐에 비교하여 어떤 비정상적인 결과를 보이지 않았다.
실시예 20은 무릅 및/또는 둔부의 류마티즘 관절염이나 골관절염으로 인한 통증의 경감에 대한 유니베스틴의 효능을 평가하기 위하여 수행되는 임상학적 연구를 설명한다. 상기 연구는 단일-중심(single-center), 무작위(randomized), 이중-맹검법(double-blind), 플라시보-조절(placebo-controlled)에 의한 연구였다. 무릅 및/또는 둔부의 류마티즘 관절염이나 골관절염을 앓고 있는 60명의 피시험자(n=60)들이 무작위로 4 그룹으로 나뉘어졌으며, 플라시보, 유니베스틴(250㎎/일 또는 500㎎/일) 또는 셀레브렉스(또는 셀레콕시브로 알려진, 250㎎/일)로 90일 동안 처치되었다. 상기 유니베스틴은 실시예 7 및 표 11에서 설명되며, 바이칼린의 함량이 82.2%이고, 총 프리-비-링 플라보노이드가 90%를 초과하여 함유된 스큐테랄리아 바이칼렌시스 게오르기(Scutellaria baicalensis Georgi)의 표준화된 추출물 및 총 플라반의 함량이 77.2%인 아카시아 카테츄의 표준화된 추출물을 85:15의 비율로 구성되었다. 셀레브렉스는 COX-2 선택적 억제제인 처방약에 대한 상표명이다. 표 12는 처치전(기준선의 값), 30일, 60일 및 90일 후의 통증, 경직성 및 기능에 대한 WOMAC 지수 값들을 나타낸다. 표 13은 30일, 60일 및 90일 동안 처치후의 통증, 경직성 및 기능에 대한 WOMAC지수 값들에 있어서의 절대 변화값들을 나타낸다. 도 20 내지 31이 모든 결과 값들에 대한 95% 신뢰구간을 그래프로 도시하여 본 연구의 결과를 설명한다.
도 20 내지 31에서 나타나는 바와 같이, 종합적인 WOMAC 지수 값들 및 통증, 경직성 및 신체 기능과 관련한 개개의 세부적 지수값들이 플라시보 그룹에 비교하여 유니베스틴의 투여 동안에 상당한 향상을 보였다. 또한, 유니베스틴은 처방약 셀레브렉스에 비하여 통증 경감에 있어서의 효과가 유사하고, 경직성 감소에 있어서 더 효과적이며, 신체 기능이 더욱 향상됨을 보였다. 가장 큰 의미가 골관절염이나 류마티즘 관절염과 관련한 통증, 경직성 및 신체 손상을 완화시키는데 있어서, 플라시보 및 셀레콕시브에 대하여 유니베스틴의 각각의 투여량을 비교함으로써 나타날 수 있다.
분산모양 분석(Analysis of models)내에서 각각의 처치군 쌍들에 대한 다중 사후-혹(multiple post-hoc) 비교값들이 30일 처치(p=0.009) 동안의 골관절염에 의한 통증 감소에 있어서, 200㎎/일 투여량의 셀레콕시브 보다는 500㎎/일 투여량의 유니베스틴이 훨씬 더 효과적임을 나타내었다. 또한, 500㎎/일 투여량의 유니베스틴의 투여가 30일(p=0.044), 60일(p=0.032), 90일(p=0.001) 처치 동안의 통증 감소에 있어서, 플라시보 보다 훨씬 더 효과적이었다. 200㎎/일 투여량의 셀레콕시브가 60일(p=0.009) 처치 동안의 통증 감소에 있어서, 플라시보 보다 훨씬 효과적임을 보였다. 90일 처치 동안의 500㎎/일 유니베스틴 투여량이 90일 처치 동안(p=0.038)의 250㎎/일에 비하여 훨씬 더 효과적임을 보였다.
250㎎/일 투여량의 유니베스틴이 30일(p=0.00), 60일(p=0.027), 90일(p=0.015) 처치 동안의 골관절염에 의한 경직성 통증 감소에 있어서, 플라시보 보다 훨씬 더 효과적이었다. 또한, 500㎎/일 투여량의 유니베스틴이 30일(p=0.001), 90일(p=0.005) 처치 동안의 골관절염에 의한 경직성 통증 감소에 있어서, 플라시보 보다 훨씬 더 효과적이었다. 200㎎/일 투여량의 셀레콕시브가 단지 30일(p=0.0023) 처치 동안의 골관절염에 의한 경직성 통증 감소에 있어서, 플라시보 보다 훨씬 더 효과적이었다.
골관절염에 의한 기능 손상의 완화에 있어서, 200㎎/일 투여량으로30일(p=0.0010) 처치 동안에서 유니베스틴이 셀레콕시브 보다 훨씬 더 효과적이다. 또한, 250㎎/일 투여량의 유니베스틴이 30일(p=0.010), 60일(p=0.043), 90일(p=0.039) 처치 동안의 골관절염에 의한 기능 손상 완화에 있어서, 플라시보 보다 훨씬 더 효과적이었다. 500㎎/일 투여량의 유니베스틴이 30일(p=0.015), 60일(p=0.043), 90일(p=0.039) 처치 동안의 골관절염에 의한 기능 손상 완화에 있어서, 200㎎/일 투여량의 플라시보 보다 훨씬 더 효과적이었다. 마지막으로, 500㎎/일 투여량의 유니베스틴이 30일(p=0.015), 60일(p=0.016), 90일(p=0.003) 처치 동안의 골관절염에 의한 기능 손상 완화에 있어서, 플라시보 보다 훨씬 더 효과적이었다.
이러한 결과들이 유니베스틴이 특별히, 500㎎/일으로 투여될 때, 골관절염에 의한 통증, 경직성, 기능 손상 완화에 있어서, 플라시보 및 셀레콕시브 보다 훨씬 더 효과적임을 제시한다. 또한, 250㎎/일의 투여량으로 투여된 유니베스틴이 골관절염에 의한 통증, 경직성, 기능 손상 완화에 있어서, 플라시보 및 셀레콕시브 보다 훨씬 더 효과적임을 제시한다. 셀레콕시브는 골관절염에 의한 통증, 경직성, 기능 손상 완화에 있어서, 전반적으로 극히 적은 정도의 향상을 보였다.
골관절염에 의한 통증, 경직성, 기능 손상 완화에 있어서 유니베스틴의 효과뿐만 아니라, 실시예 2는 체질량 지수(body mass index, BMI) 및 체중 감소에 있어서 유니베스틴의 측정할 만한 효과를 보인다. 이론에 의해 한정되지는 않지만, 상기의 효과는 항-염증성 제제 투여의 결과로서 운동성의 증가에 기인하거나, 대사작용의 증가 또는 체내에서의 지방과 탄수화물의 이용을 감소시키는 특이한 기작에기인한다. 표 14는 250㎎/일 및 500㎎/일의 투여량으로 투여된 유니베스틴, 셀레콕시브 및 플라시보의 효과인 30일 및 90일 동안의 처치 후의 체중 및 BMI룰 나타낸다. 결과는 도 32 및 33에 그래프로 도시된다. 도 32 및 33은 250㎎/일 및 500㎎/일의 투여량으로 투여된 유니베스틴이 30일 처치 이후의 체중 및 BMI의 상당한 감소를 가져오는데, 90일 처치 이후에는 거의 2배의 체중 감소가 일어남을 보인다. 셀레콕시브는 유니베스틴에 비하여 체중 및 BMI에 있어서 적은 효과를 나타내었다.
분산 분석 모델(Analysis of Variance models)을 이용한 각 처치군 쌍들에 대한 다중 사후-혹(multiple post-hoc) 비교가 실시예 21에서 설명되는 체중 감소 및 체질량 지수에 대하여 수행되었다. 이러한 분석이 250㎎/일 및 500㎎/일의 투여량으로 투여된 유니베스틴이 30일 동안의 처치 이후에 플라시보에 대하여 통계학적으로 의미있는 체중 감소(p=0.011 대 p=0.118)를 일으킴을 보인다. 셀레콕시브는 30일 동안의 처치 이후에 플라시보에 대하여 의미있는 체중 감소를 일으키지 않았다. 50㎎/일 및 500㎎/일의 투여량으로 투여된 유니베스틴이 90일 동안의 처치 이후에도 플라시보에 대하여 통계학적으로 의미있는 체중 감소(p=0.001 대 p=0.01)를 일으켰다. 셀레콕시브는 여전히 플라시보에 대하여 의미있는 체중 감소를 일으키지 않았다. 250㎎/일의 투여량으로 투여된 유니베스틴이 30일(p=0.008) 및 90일(p=0.001) 동안의 처치 이후에 플라시보에 대하여 통계학적으로 의미있는 체질량 지수의 감소를 일으켰다. 500㎎/일의 투여량으로 투여된 유니베스틴이 30일 동안의 처치 이후에 플라시보에 대하여 통계학적 의미없는 체질량 지수의 감소를 일으켰다. 그러나, 90일 동안의 처치 이후에는 통계학적으로 의미있는 체질량 지수의 감소를 일으켰다(p=0.011). 90일 처치 이후에 셀레콕시브 처치군은 플라시보에 대하여 통계학적으로 의미있는 체질량 지수의 감소를 일으키지 않았다.
실시예 22는 유니베스틴의 투여가 체중 감소 및 체질량 지수와 마찬가지로 혈당량에 영향을 끼칠 수 있음을 나타낸다. 측정할 수 있는 혈당량의 변화가 유니베스틴 처치 30일에서 검출된다. 250㎎/일 및 500㎎/일의 투여량으로 유니베스틴이 처치된 군들은 90일에서 현저한 혈당량의 저하를 보였다. 셀레콕시브는 혈당에 대하여 영향을 적게 끼쳤다. 그 결과들이 표 15에 나타나며, 도 34에 그래프로 도시하였다.
분산 분석 모델(Analysis of Variance models)을 이용한 각 처치군 쌍들에 대한 다중 사후-혹(multiple post-hoc) 비교가 실시예 22에서 설명되는 혈당에 대해서도 수행되었다. 단지 500㎎/일의 투여량으로 투여된 유니베스틴만이 플라시보에 대하여 통계학적으로 의미있는 혈당량의 감소를 일으켰다(30일 처치후: p=0.028, 90일 처치후: p=0.022). 그러나, 250㎎/일의 투여량으로 투여된 유니베스틴은 플라시보에 대하여 임상적으로 의미있는 혈당량의 감소를 일으켰다.
출원인은 "아카시아로부터 이중적 사이클로옥시게나제-2 및 5-리폭시게나제 억제제의 분리(Isolation of a Dual COX-2 and 5-Lipoxygenanse Inhibitor from Acacia)" 제목의 2002년 3월 22일자로 출원된 미국 특허출원 제10/104,477호가 아카시아 속으로부터 분리된 물질 조성물이 COX-2 및 5-LO에 대하여 이중적 특이성이 있음을 공지하는 최초의 보고이며, "사이클로옥시게나제-2 억제제로서 효능있는 프리-비-링 구조를 갖는 플라보노이드의 선별(Identification of Free-B-RingFlavonoids as Potent COX-2 Inhibitors)" 제목의 2002년 3월 1일자로 출원된 미국 특허출원 제10/091,362호가 프리-비-링 플라보노이드 구조와 COX-2 억제제 활성 사이의 상호관계를 공지하는 최초의 보고라고 생각한다. 이러한 발견들이 여기서 유니베스틴이라 불리며, 관절 통증 및 경직성을 완화시키고, 운동성 및 신체 기능을 향상시키며, 골관절염 및 류마티즘 관절염의 병리학적 이상 증상들을 예방하고 치료할 수 있는데 사용될 수 있는 물질 조성물을 제조하기 위한 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 신규 혼합물을 유도하였다.
이론에 의해 한정되지는 않지만, 이러한 제제의 확인된 작용 기작이 COX-2 효소 및 5-LO 효소 활성의 페록시다아제 활성을 직접 억제하고, 각 효소들의 mRNA 생성을 감소시킨다고 생각한다. 또한, 유니베스틴은 골관절염, 류마티즘 관절염, 월경통, 동맥경화증, 심장마비, 비만, 당료병, X 증후군, 알츠하이머 질병, 호흡기 알레르기 반응, 만성 정맥 부전, 치질, 전신성 홍반성 루푸스(Systemic Lupus Erythematosus), 건선, 만성 긴장 두통, 편두통, 염증성 장 질환; 바이러스, 박테리아 및 균에 의한 국부적 전염병, 일광화상, 화상, 접촉성 피부염, 흑색종 및 암종을 포함하나, 이에 한정되지 않는 COX-2 및 5-LO에 의하여 매개되는 질병들 및 이상 증상들을 예방하고 치료하는데 이용될 수 있다. 마지막으로, 유니베스틴은 인간의 임상적 연구에서 유연성 및 운동성의 향상으로 인하여 체중 감소를 일으키고, 혈당량를 감소시키며, 신체 활동을 향상킬 수 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 치료 제제를 포함하여 이루어진 치료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 치료 제제는 주사 또는 분사에 의한 방법에 의하여, 피부내로, 장관외 투여, 국부적 투여, 경구 투여 또는 국소 투여 등과 같은 적절한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 구체적인 투여 방법은 치료될 증상들에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 제제는 일종의 체액을 통하여 또는 체액을 통하여 도달할 수 있는 표적이나 조직을 통하여 투여될 수 있을 것이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 제제는 주사에 의하여 투여된다. 그러한 주사는 효과적인 부위에 국소적으로 투여될 수 있다. 치료 조성물은 투여 방법에 따라 다양한 단위 투여 형태(unit dosage forms)로 투여될 수 있다. 예를 들어, 동물의 경구 투여에 알맞은 단위 투여 형태는 분말, 정제(tablets), 알약(pill) 및 캡슐(capsules)을 포함한다. 본 발명의 치료 조성물의 바람직한 전달 방법은 정맥 투여 및 주사나 국부 투여에 의한 국소 투여를 포함한다. 본 발명의 치료 제제는 동물에 투여될 수 있는데, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 투여될 수 있다.
구체적인 전달 방식에서, 본 발명의 치료 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제(excipient), 보조제(adjuvant) 및/또는 운반체(carrier)와 같은 기타 성분들을 포함하도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 치료할 동물이 허용할 수 있는 부형제로 제제화될 수 있다. 그러한 부형제들의 예로는 셀룰로오스(cellulose), 이산화규소(silcon dioxide), (dextrates), 설탕(sucrose), 글리콜산 전분 나트륨(sodium starch glycolate), 인산 칼슘(calcium phosphate), 황산 칼슘(calcium sulfate), 물, 살린(salin), 링거 용액(Ringer's solution), 포도당 용액(dextrose solution), 마니톨(mannitol), 한크 용액(Hank's solution) 및 기타 수용성 생리 균형 염 용액(acqueous physiologically balanced salt solution)을포함하나, 이에 한정되지 않는다. 고정유(fixed oil), 참기름(sesame oil), 에틸 올레이트(ethyl oleate) 또는 트리글리세라이드(triglycerides)와 같은 비수용성 운반체가 사용될 수 있다. 기타 유용한 제제로는 소디움 카복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose), 소비톨(sorbitol) 또는 덱스트란(dextrane)과 같은 점도 증강제(viscosity-enhancing agents)를 함유하는 현탁액을 포함한다. 또한 부형제로는 등장성(isotonicity) 및 화학적 안정성을 증가시키는 물질과 같은 첨가제를 소량으로 함유할 수 있다. 버퍼의 예로는 인산 버퍼(phosphate buffer), 바이카보네이트 버퍼(bicarbonate buffer), 트리스 버퍼(tris buffer), 히스티딘(histidine), 사이트래이트(citrate), 글리신(glycine) 또는 이들의 혼합 형태의 버퍼를 들 수 있으며, 보존제의 예로는 티메로살(thimerosal), m-크레졸(m-cresol), o-크레졸, 포르말린(formalin) 및 벤질 알콜(benzyl alchol)을 들 수 있다. 표준 제제는 액상의 주사 가능 물질 또는 고체상일 수 있는데, 현탁액이나 주사용 용액과 같은 적절한 액체 형태로 취할 수 있다. 따라서, 액상이 아닌 제제에서, 부형제가 포도당, 인간 혈청 알부민, 보존제를 포함할 수 있으며, 투여 이전에 멸균수(sterile water)나 살린(saline)이 첨가될 수 있다.
본 발명의 바람직한 하나의 실시예에서, 조성물은 또한 보조제나 운반체를 포함할 수 있다. 보조제로는 일반적으로 COX 및 LO 경로들과 관련한 증상들을 예방하고 치료하는 제제의 기능을 증대시키는 전형적인 물질들이다. 적합한 보조제로는 프런드 보조제(Freund's adjuvant); 세균 세포 벽 조성물(bacterial cellwall components); 알루미늄을 주성분으로 하는 염(aluminum-based salts); 칼슘을 주성분으로 하는 염(calcium-based salts); 실리카; 붕소, 히스티딘, 글루코자민 설페이트(glucosamin sulfate), 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate), 커퍼 글루코내이트(copper gluconate), 폴리뉴클레오티드(polunucleotides); 비타민 D, 비타민 K, 톡소이드(toxoids); 상어와 소의 연골; 혈청 단백질; 바이러스 피막 단백질(viral coat proteins); 기타 세균 유도성 제약; 감마 인터페론(gamma interferon); 헌터 티터맥스 보조제와 같은 블락 공중합체 보조제(Hunter's Titermax adjuvant, Vaxcel.TM., Inc. Norcross, Ga.); 리비 보조제(Ribi adjuvants, available from Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont.); 및 사포닌(saponins)과 퀼 A(Quil A, available from Superfos Biosector A/S, Denmark)와 같은 사포닌 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 운반체는 치료되는 동물내에서 치료 조성물의 반감기(half-life)를 증가시키는 전형적인 조성물이다. 적합한 운반체로는 고분자성 조절 방출 제제(polymeric controlled release formulations), 생분해성 임플란트(biodegradable implants), 리포좀(liposomes), 세균(bacteria), 바이러스(viruses), 오일, 에스터 및 글리콜이다.
본 발명의 바람직한 일실시예는 동물 체내에서 본 발명의 조성물을 천천히 방출할 수 있는 고분자성 조절 방출 제제이다. 여기서 사용되는 고분자성 조절 방출 제제는 조절 방출 운반체(controlled release vehicle)내에 있는 본 발명의 조성물을 포함한다. 적합한 조절 방출 운반체로는 생체 적합성고분자(biocompatible polymers), 기타 고분자성 세포간질(polyneric matrices), 캡슐, 미소캡슐(microcapsules), 미립자(microparticles), 큰 환약 제제(bolus preparations), 삼투압 제제(osmotic pumps), 확산 제제(diffusion devices), 리포좀(liposomes), 리포스페어(lipospheres), 및 경피성 운반 체계(transdermal delivery systems)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 기타 조절 방출 운반체는 동물에 투여되된 위치에서 고체나 겔을 형성하는 액체를 포함한다. 바람직한 조절 방출 운반체는 생체 침식 가능성(bioerodible)과 같은 생분해성이다
치료 조성물이 제제화된 후 멸균 바이알에 용액, 현탁액, 겔, 유탁액, 고체, 탈수된 분말 또는 감압 동결 건조된 분말; 직접 캐슐화 및/또는 경구 투여용으로서 다른 불활성 운반체로 정제화된 형태로 저장될 수 있다. 제제들은 바로 사용할 수 있는 형태 또는 분말의 형태를 투여 바로 전에 물에 타서 액상으로 전환되는 형태로 저장될 수 있다. 전신으로 전달하기 위한 조성물을 함유한 제제의 투여 방법은 경구 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 정맥내 투여, 비경 투여, 질 좌약식 투여 또는 직장 좌약식 투여일 수 있다.
특정 질병이나 이상 질환을 치료하는데 효능을 나타내는 조성물의 양은 그 질병이나 이상 질환의 성질에 따라 다를 것이며, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있을 것이다. 게다가, 생체밖 또는 생체내에서의 분석 방법이 선택적으로 최적의 투여량의 범위를 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 또한, 제제내의 정확한 투여 용량은 투여 경로, 질병 또는 이상 질환의 심각성이나 향상 정도에 따라 다를 것이며, 치료하는 사람과 환자의 환경에 의하여 결정되어야 한다. 유효 투여량은 생체밖 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 끌어낸 투여량에 따른 반응 곡선으로부터 외삽하여 추정될 수 있다. 예를 들어, 조성물의 유효량은 조성물의 등급별 투여량과 바라던 효과를 관찰함으로써 쉽게 결정될 수 있다.
본 발명에 따르는 치료 방법은 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 혼합물 을 치료학적으로 유효한 양으로 이들을 필요로 하는 환자들에게 내부로 또는 국부적으로 투여하는 방법을 포함하여 이루어진다. 혼합물의 순도는 0.01 내지 100%를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 화합물을 얻기 위하여 사용되는 방법론에 따라 다를 수 있다. 바람직한 실시예에서, 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 혼합물과 이를 함유하는 약제학적 조성물의 투여량은 체중에 대하여 0.01 내지 200㎎/㎏의 범위에서 일반적으로 선택되는 약효를 내면서, 비독성의 양이 된다. 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에게 치료되어야할 구체적인 질병에 따라 최적의 투여량이 결정될 수 있다.
이상의 대략적인 설명과 이하의 상세한 설명은 단지 대표적으로 설명되는 것으로 청구된 바와 같은 발명에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 아카시아 및 스큐테랄리아 식물들로부터 얻은 유기 및 수용성 추출물의 제조
아카시아 카테츄(Acacia catechu(L) Willd.) 나무껍질, 스큐텔라리아 오르또칼릭스(Schtellaria orthocalyx) 뿌리, 스큐텔라리아 바이칼렌시스(Schtellaria baicalensis) 뿌리 또는 스큐텔라리아 라테리플로라(Schtellaria lateriflora) 식물 전체로부터 얻은 식물 원료를 2mm 이하의 입자 크기로 분쇄하였다. 분쇄한 식물 원료를 건조한 후 60g을 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크(삼각 플라스크)에 옮기고 1:1 비율의 메탄올과 디클로로메탄의 혼합용매 600ml을 첨가하여 혼합물을 준비하였다. 준비된 혼합물을 1시간 동안 교반한 후 여과하였고, 바이오매스를 1:1 비율의 메탄올과 디클로로메탄의 혼합용매 600ml로 다시 추출하였다. 유기 추출물들을 혼합하여 진공 증착하여 하기 표 1의 유기 추출물을 제조하였다. 유기 추출 후에 바이오매스는 공기 건조하여 초순수(ultra pure water) 600ml로 한 번 추출하였다. 수용액은 여과하여 냉동 건조한 후 하기 표 1의 수용성 추출물을 제조하였다.
다양한 스큐텔라리아 종들의 유기 및 수용성 추출물들의 수율
식물 원료 식물 원료의 양 유기 추출물 수용성 추출물
아카시아 카테츄 나무껍질 60g 27.2g 10.8g
스큐텔라리아 오르또칼릭스 뿌리 60g 4.04g 8.95g
스큐텔라리아 바이칼렌시스 뿌리 60g 9.18g 7.18g
스큐텔라리아 라테리플로라 식물 전체 60g 6.54g 4.08g
실시예 2. 아카시아 카테츄, 다양한 스큐텔라리아 종들 및 기타 식물들로부터 얻은 식물 추출물들에 의한 COX-2 및 COX-1 페록시다아제 활성의 억제도
하기에서 설명되는 바와 같이 특정 COX-2 억제제들의 선별을 위한 생물학적 정량(bioassay)에 의한 검색과정(screening process)이 효소의 페록시다아제 활성을 분석하고자 하였다.
페록시다아제 분석(Peroxidase Assay).COX-2 억제제를 검출하기 위한 분석이 고생산량 플랫트폼(platform, Raz)에 대하여 변형되었다. 간략히 말하면, 페록시다아제 버퍼(100mM TBS, 5mM EDTA, 1μM 헴(Heme), 0.01mg 에피네프린(epinephrine), 0.094% 페놀)내의 재결합 양의 COX-2(캐이먼사, Cayman)를 1:500의 비율로 희석된 추출물과 함께 15분 동안 배양시켰다. 배양시킨 후 쿠안타블루(Quantablu, 피어스(Pierce)사) 기질을 첨가하여 25℃에서 45분 동안 성숙시켰다. 성숙시킨 후 월락 빅토 2 플레이트 판독기(Wallac Victor plate reader)로 발광(Luminescence)을 판독하여 그 결과를 표 2에 나타내었다.
표 2는 구조적으로 유사한 프리-비-링 플라보노이드로 구성되며, 아카시아 카테츄 나무껍질, 2가지 스큐테랄리아 종들의 뿌리와 3가지 다른 식물 종들로부터 얻은 추출물들을 포함하는 다섯 가지 식물 종들로부터 얻은 유기 추출물과 수용성 추출물에 의한 효소의 억제도를 나타낸다. 그 결과 값은 재결합 양(ovine)의 COX-2 효소 및 기질 단독에 대한 페록시다아제 활성의 % 값으로 제시된다. 유기 추출물에 의한 % 억제도는 30 내지 90% 범위였다.
다양한 종들에 의한 COX-2 페록시다아제 활성에 대한 억제도
식물원료 유기 추출물에 의한 COX-2의 억제도 수용성 추출물에 의한 COX-2의 억제도
아카시아 카테츄 나무뿌리 75% 30%
스큐텔라리아 오르또칼릭스 뿌리 55% 77%
스큐텔라리아 바이칼렌시스 뿌리 75% 0%
데스모디움 삼부엔스 식물 전체 55% 39%
유칼루푸투스 글로불러스 잎 30% 10%
뮤리카 나나 잎 90% 0%
COX-1과 COX-2 이성체의 상대적인 억제도를 비교하기 위해서는 이러한 효소들 각각에 대한 IC50값을 얻을 필요가 있다. IC50값이란 대조군에 대한 효소 활성의 억제 정도가 특정 억제제에 의하여 50% 달성되었을 때의 농도로서 정의된다. 본 실시예의 경우, 표 3에서 나타나는 바와 같이 COX-2 및 COX-1 효소 각각에 대한 IC50값이 6 내지 50μg/mL 및 7 내지 80μg/mL의 범위 내에 있는 것으로 나타났다. 이러한 COX-2 및 COX-1의 IC50값의 차이가 효소 각각에 대한 다양한 식물들로부터 얻은 유기추출물의 특이성을 입증한다. 예를 들어, 스큐텔라리아 라테리플로라로부터 얻은 유기 추출물의 COX-2 및 COX-1에 대한 IC50값이 각각 30 및 80μg/mL으로 COX-1 보다는 COX-2의 억제도가 더 우세함을 알 수 있다. 즉, 어떤 추출물은 COX-2의 억제도가 우세하며, 다른 추출물은 그렇지 않음을 알 수 있다. 본 실시예의 추출물들과 화합물들에 대한 억제의 본래 특이성을 결정하기 위하여 HTP 분취를 시행한 후 분취된 화합물을 정제하였다.
인간과 양의 COX-2 및 COX-1에 대한 유기 추출물들의 IC50값
식물 원료 IC50인간 COX-2(㎍/㎖) IC50양 COX-2(㎍/㎖) IC50양 COX-1(㎍/㎖)
아카시아 카테츄 나무뿌리 3 6.25 2.5
스큐텔라리아 오르또칼릭스 뿌리 Not done 10 10
스큐텔라리아 바이칼렌시스 뿌리 30 20 20
스큐텔라리아 라테리플로라 식물 전체 20 30 80
유칼루푸투스 글로불러스 잎 Not done 50 50
뮤리카 나나 잎 5 6 7
실시예 3. 활성 추출물들의 HTP 분취
실리카 겔로 미리 충전된 플래시 칼럼 (2cm ID×8.2 cm, 10g silica gel)에 활성 식물로부터 얻은 유기 추출물(400mg)을 로딩(loading)한 후 (A) 50:50의 에틸아세테이트:헥산 용리액 100%에서 (B) 메탄올 용리액 100%까지의 변화에 따른 이동상(gradient mobile phase)의 HTP 시스템(Hitachi High throughput purification system)을 이용하여 5mL/min의 유속으로 30분 동안 용리하였다. 용리하여 분리한 분리액을 브로드밴드(broadband) 파장 UV 검출기로 검출한 후 분취액을 길슨 분취 수집기(Gilson fraction collector)를 이용하여 96-딥-웰 풀레이트(96-deep-well plate)에 1개의 웰 당 1.9mL의 양으로 수집하였다. 시료 플레이트를 낮은 진공 하에서 건조하고 원심분리하였다. 각 셀에 있는 시료를 DMSO(1.5mL)로 용해하여 그 중 100μL를 취하여 COX 억제 분석을 위하여 사용하였다.
활성 식물로부터 얻은 수용액 추출물(750mg)을 물(5mL)로 녹인 후 1μm 시린지(syringe) 여과기로 여과하고 4mL HPLC 바이알(vial)에 옮겨 담았다. 그 용액을 자동시료주입기(autosampler)로 미리 충전된 역상 컬럼에 주입하였다 (C-18, 15μm 입자 크기, 2.5cm ID×10cm with precolumn insert). 그 칼럼을 HTP(Hitachi high throughput purification) 시스템을 이용하여 용리하는데, (A) 물 100%에서 (B) 메탄올 100%까지의 변화량에 따른 이동상으로 20분 동안 흘려준 후 100% 메탄올로 5분 동안 10mL/min의 유속으로 용리시켰다. 분리액을 브로드밴드 파장 UV 검출기(broadband wavelength UV detector)로 검출한 후 그 분획물을 길슨 분할 수집기(Gilson fraction collector)를 이용하여 96-딥-웰 플레이트(96-deep well plate)에 1개의 웰 당 1.9mL의 양으로 수집하였다. 시료 플레이트를 냉각 건조한후 각 셀(cell)의 시료를 초순수(Ultra pure water, 1.5mL)로 용해한 후 100μL를 취하여 COX 억제 분석을 위하여 사용하였다.
실시예 4. 아카시아 및 스큐테랄리아 종들로부터 얻은 HTP 분취액에 의한 COX 페록시다아제 활성의 억제도
개개의 생활성 유기 추출물들은 COX-1 및 COX-2 재결합 효소의 페록시다아제 활성을 억제하는 능력에 대하여 HTP 분취물의 각각을 시험함으로써 더욱 특징화되었다. 그 결과를 도시한 도 1 및 2에 의하면, 실시예 1 및 3에서 설명한바 대로 분리한 아카시아 카테츄 나무 껍질 및 스큐테랄리아 바아칼렌시스 뿌리의 유기 추출물로부터 얻은 HTP 분취물에 의한 COX-2 및 COX-1 활성의 억제도를 나타내며, 실시예 2에서 설명한 바대로 분석되었다. 도 1 및 도 2에 도시한 내용분석(profile)이 각 추출물에서 다수의 활성 화합물들을 나타내는 억제도에 대한 다수의 피크들을 보인다. 다수의 활성 피크들이 COX-2에 대하여 매우 선택적이다. 스큐테랄리아 오르또칼릭스 및 스큐테랄리아 라테리플로라을 포함한 기타 스큐테랄리아 종은 결과 값을 나타내지는 않았지만, 유사한 피크의 억제도를 보인다. 그러나, COX-1 및 COX-2 효소에 대하여 다수의 피크가 보임에 따라 이들의 개시적 억제 내용분석에 기여하는 분자가 하나 이상일 것임을 추측할 수 있다.
실시예 5. 스큐테랄리아의 유기 추출물로부터 얻은 활성 프리-비-링 플라보노이드의 분리 및 정제
상기 실시예 1에서 분리된 스큐테랄리아 오르또칼릭스의 뿌리로부터 얻은 유기 추출물(5g)을 실리카 겔로 미리 충전된 플래쉬 칼럼(120g silica, 40μm 입자 크기 32-60μm, 25cm×4cm)에다 로딩(loading)한 후, (A) 50:50 에틸아세테이트:헥산 100%에서 (B) 메탄올로 100%까지의 변화량에 따른 이동상으로 60분 동안 15mL/min의 유속으로 용리하였다. 용리하여 분취한 분취액(fraction) 중에서 10mL을 시험용 튜브에 수집하였다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 각 분취액에서 용매를 증발시켜 얻은 시료를 1mL의 DMSO에 용해하여 20μL의 분취량(aliquot)을 96 웰 샐로우 디쉬 플레이트(96 well shallow dish plate)에 옮겨 담은 후, COX 억제 활성에 대하여 시험하였다. COX 분석을 근거로 하여 활성 분취액(fractions) #31에서 #39을 혼합하여 증착시켰다. HPLC/PDA 및 LC/MS에 의한 분석이 주요 화합물의 체류 시간(retention time)이 8.9분이고, MS 피크가 272m/e임을 보였다. 그 생성물을 (A) 물과 (B) 메탄올을 비율 변화에 따른 이동상을 이용하여 5mL/분의 유속으로 45분 동안 C18 반-준비 칼럼(semi-preparation column, 25cm×1cm)에서 더 정제하였다. 88개의 분취액을 수집하여 연한 노란색 고체 5.6mg을 얻었다. 순도는 표준물 및 NMR 데이터를 기준으로 HPLC/PDA 및 LC/MS에 의해서 결정되었다.1H NMR: δ ppm. (DMSO-d6) 8.088 (2H, m, H-3',5'), 7.577(3H, m, H-2',4',6'), 6.932(1H, s, H-8), 6.613(1H, s, H-3). MS: [M+1]+=271m/e. 그 화합물이 바이칼레인(Baicalein)임을 확인하였다. 또한, COX-2 효소에 대한 바이칼레인의 IC50값은 10μg/mL로 결정되었다.
예비(preparative) C-18 칼럼 크로마토그래피를 이용하여, 다른 프리-비-링 플라보노이드가 분리되었고, 82.2%의 프리-비-링 플라보노이드 함량을 갖는 스큐테랄리아 바이칼렌시스(Scutellaria baicalensis의 뿌리로부터 분리된 표준화된 추출물(Lot#RM052302-01을 이용하여 확인되었다. 11가지 구조들이 HPLC/PDA/MS를 이용하여 밝혀졌고, 도 3에 도시된다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 확인된 11가지 화합물들이 바이칼린(bacalin), 우고닌-7-글루쿠로나이드(wogonin-7-glucuronide), 오록실린 A 7-글루쿠로나이드(oroxylin A 7-glucuronide), 바이칼린(baicalein), 우고닌(wogonin), 크리신-7-글루쿠로나이드(chrysin-7-glucuronide), 5-메틸-우고닌-7-글루쿠로나이드(5-methyl-wogonin-7-glucuronide), 스큐테랄린(scutellarin), 노르우고닌(norwogonin), 크릿신(chrysin) 및 오록실린 A(oroxylin A)였다.
실시예 6. 정제된 프리-비-링 플라보노이드의 COX 억제도
여러 가지 프리-비-링 플라보노이드를 제조한 후, 실시예 2에서 설명된 방법을 이용하여 COX-2 억제 활성에 대하여 20μg/mL의 농도에서 시험하였다. 그 결과를 표 4에 요약하였다.
바이칼레인, 바이칼린 및 스큐테랄리아 바이칼렌시스의 뿌리로부터 분리된 표준화된 프리-비-링 플라보노이드 추출물의 IC50이 하기의 방법으로 수행되어 측정되었다. 쪼갤수 있는 페록사이드 크로모퍼(peroxide chromophore)가 공동인자(cofactor)로서의 아라키돈산의 존재 하에서 각 효소의 페록시다아제 활성을 알아보기 위하여 포함되었다. 전형적인 방법에 따라, 분석은 96-웰 판(96-well format)에서 수행되었다. 100% DMSO에 있는 10㎎/㎖ 저장용액(stock)에서 취한 각 억제제는 0, 0.1, 1, 5, 10, 20, 50, 100 및 500㎍/㎖의 농도와 실온에서 3번 반복하여 시험되었다. 각각의 웰에 100mM의 Tris-HCL 150㎕, pH7.5을 트리스 버퍼에 용해되어 있는 22μM의 헤마틴(Hematin) 10㎕, DMSO에 용해되어 있는 억제제 10㎕, 각 COX-1 또는 COX-2 효소 25units와 함께 첨가하였다. 상기 성분들이 10초 동안 회전 플래트폼(rotating platform) 위에서 혼합된 후, 반응을 개시하기 위하여 2mM의 TMPD(N,N,N',N'-Tetramethyl-p-phenylenediaminedihydrochloride) 20㎕ 및 1mM의 아라키돈산 20㎕가 첨가되었다. 플레이트(plate)를 10초 동안 교반시킨 후 5분 동안 배양시킨 후 570nm에서의 흡광도를 측정하였다. 억제제의 농도 대 % 억제도를 도시한 후 IC50이 등선(isotherm)에서의 반-최대 점(half-maximal point) 및 X축에서의 농도 절편을 취하여 결정되었다. 분석에서 IC50이 효소 units의 수로 표준화(normalization)되었다. 바이칼레인, 바이칼린 및 스큐테랄리아 바이칼렌시스의 뿌리로부터 분리된 표준화된 프리-비-링 플라보노이드 추출물의 투여량에 따른 반응 및 IC50의 결과값이 도 4, 5 및 6에 각각 도시되었다.
정제화된 프리-비-링 플라보노이드에 의한 COX 효소의 억제도
프리-비-링 플라보노이드 COX-1의 억제도 COX-2의 억제도
바이칼레인 107% 109%
5,6-디하이드록시-7-메톡시플라본 75% 59%
7,8-디하이드록시플라본 74% 63%
바이칼린 95% 97%
우고닌 16% 12%
실시예 7. 스큐텔라리아 오르또칼릭스 뿌리, 스큐텔라리아 바이칼렌시스 뿌리 및 오록시룸 인디컴 씨로부터 분리된 활성 추출물에서의 프리-비-링 플라보노이드의 HPLC 정량분석
세 가지 다른 식물 종들로부터 분리된 다섯 가지 활성 추출물내의 프리-비-링 플라보노이드의 존재와 양을 확인하여 하기 표 5에 나타내었다. 프리-비-링 플라보노이드를 1%의 인산(phosphoric acid) 및 아세토니트릴(acetonitrile)을 80%에서 20%까지의 변화량에 따른 이동상으로 22분 동안 루나 C-18 칼럼(Luna C-18 column, 250×4.5mm, 5μm)을 이용한 HPLC에 의하여 용리하여 정량적으로 분석하였다. 프리-비-링 플라보노이드는 UV 검출기를 통하여 254nm에서 검출하였고, 프리-비-링 플라보노이드 표준물을 기준으로 하여 체류 시간으로 확인하였다.
활성 식물 추출물에서의 프리-비-링 플라보노이드 함량
활성 추출물 추출물의무게 (g) 바이오매스로부터 추출할 수 있는 (%) 플라보노이드의 총양 (mg) 추출물내에서의 플라보노이드(%)
스큐텔라리아 오르또칼릭스(AE)* 8.95 14.9 0.2 0.6
스큐텔라리아 오르또칼릭스(OE)* 3.43 5.7 1.95 6.4
스큐텔라리아 바이칼렌시스(AE)* 7.18 12.0 0.03 0.07
스큐텔라리아 바이칼렌시스(OE)* 9.18 15.3 20.3 35.5
오록시룸 인디컴(OE)* 6.58 11.0 0.4 2.2
*AE: 수용성 추출물,*OE: 유기 추출물
실시예 8. 아카시아 카테츄의 유기 추출물로부터 얻은 활성 화합물들의 분리 및 정제
상기 실시예 1에서 분리된 아카시아 카테츄 뿌리로부터 얻은 유기 추출물(5g)을 실리카 겔로 미리 충전된 플래쉬 칼럼(120g silica, 40μm 입자 크기 32-60μm, 25cm×4cm)에 로딩(loading)한 후, (A) 50:50 에틸아세테이트:헥산 100%에서 (B) 메탄올로 100%까지의 변화량에 따른 이동상으로 60분 동안 15mL/min의 유속으로 용리하였다. 용리하여 분취한 분취액(fraction) 중에서 10mL을 시험용 튜브에 수집하였다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 각 분취액에서 용매를 증발시켜 얻은 시료를 1mL의 DMSO에 용해하여 20μL의 분취량(aliquot)을 96 웰 샐로우 디쉬 플레이트(96 well shallow dish plate)에 옮겨 담은 후, COX 억제 활성에 대하여 시험하였다. COX 분석을 근거로 하여 활성 분취액(fractions) #32 에서 #41을 혼합한 후 증착하여 고체 2.6g을 얻었다. HPLC/PDA 및 LC/MS에 의한 분석이 두 가지 중요 화합물의 체류 시간(retention time)이 각각 15.8분과 16.1분임을 보였다. 그 생성물을 C18 반-준비 칼럼(semi-preparation column, 25cm×1cm)에서 더 정제하고, 생성물 212.4mg을 로딩(loading)하고, (A) 물과 (B) 아세토니트릴(ACN)을 비율 변화에 따른 이동상을 이용하여 5mL/분의 유속으로 60분 동안 용리하였다. 88개의 분취액을 수집하여 두 개의 활성 화합물인 화합물 1(11.5mg)과 화합물 2(16.6mg)가 분리되었다. 순도는 표준물(카테친과 에피카테친) 및 NMR 데이터를 기준으로 HPLC/PDA 및 LC/MS에 의해서 결정되었다.
화합물 1. 13C NMR: δppm.(DMSO-d6) 27.84(C4), 66.27(C3), 80.96(C2), 93.78(C9), 95.05(C7), 99.00(C5), 114.48(C12), 115.01(C15), 118.36(C16), 130.55(C11), 144.79(C14), 155.31(C6), 156.12(C10), 156.41(C8), 118.36(C16), 130.55(C11), 144.79(C14), 155.31(C6), 156.12(C10), 156.41(C8).1H NMR:δppm.(DMSO-d6) 9.150(1H,s,OH), 8.911(1H,s,OH), 8.835(1H,s,OH), 8.788(1H,s,OH), 6.706(1H,d,J=2Hz,H2'), 6.670(1H,d,J=8.0Hz,H-6'), 6.578(1H,dd,J=2,8Hz,H-5'), 5.873(1H,d,J=2Hz,H8), 5.670(1H,d,J=2Hz,H8), 4.839(1H,d,J=4Hz,OH), 4.461(1H,d,J=7.3Hz,H2), 3.798(1H,m,H3), 2.625(1H,m,H4b), 2.490(1H,m,H4a). MS: [M+1]+=291m/e. 이러한 화합물이 카테친임이 확인되었다.
화합물 2. 13C NMR: δppm.(DMSO-d6) 28.17(C4), 64.87(C3), 78.02(C2), 94.03(C9), 95.02(C7), 98.44(C5), 114.70(C12), 114.85(C15), 117.90(C16), 130.56(C11), 144.39(C14), 155.72(C6), 156.19(C10), 156.48(C8).1H NMR:δppm.(DMSO-d6)9.083(1H,s,OH), 8.873(1H,s,OH), 8.777(1H,s,OH), 8.694(1H,s,OH), 6.876(1H,d,J=2Hz,H2'), 6.646(2H,s,H-5',6'), 5.876(1H,d,J=2Hz,H8), 5.700(1H,d,J=2Hz,H6), 4.718(1H,s,OH), 4.640(1H,d,J=4.5Hz,H2), 3.987(1H,d,J=4.5Hz,H3), 2.663(1H,dd,J=4.6, 6.3Hz,H4b), 2.463(1H,dd,J=4.6, 6.3Hz,H4a). MS: [M+1]+=291m/e. 이러한 화합물이 에피카테친임이 확인되었다.
실시예 6에서 설명된 방법에 따라 카테친 및 아카시아 카테츄의 나무껍질로부터 분리된 표준화된 플라반 추출물에 대한 투여량에 따른 반응 및 IC50값을 표 7 및 8에 나타내었다. COX-1 및 COX-2 효소들에 대한 에피카테친의 IC50값들이 각각 7㎍/㎖ 및 20㎍/㎖이다.
실시예 9. 아카시아 카테츄로부터 얻은 활성 추출물의 HPLC 정량분석
아카시아 카테츄로부터 분리된 유기 및 수용성 추출물에서의 플라반 함량은 포토다이오드에래이(PhotoDiode Array) 검출기(HPLC/PDA)와 루나(Luna) C18 컬럼(250mm× 4.6 mm)를 사용하여 HPLC에 의해 정량되었다. 플라반이 10%에서 30%까지의 변화량에 따른 아세토니트릴 이동상으로 20분 동안, 60%의 아세토니트릴 이동상으로 5분 동안 컬럼으로 용리되었다. 그 결과가 표 6에 나타된다. HPLC 정제의 내용분석이 도 9에 도시된다. 플라반이 표준물로서 카테친과 에피카테친을 사용하여 체류 시간 및 PDA 값을 근거로 하여 정량되었다. 두 가지 주요 플라반의 체류 시간은 각각 12.73분과 15.76분이었다.
활성 식물 추출물에서 프리-비-링 플라보노이드(Free-B-Ring Flavonoid) 함량
아카시아 카테츄의 나무껍질로 부터 얻은 활성 추출물 추출물의 무게(g) 바이오매스로부터추출할 수 있는 % 추출물에서의플라반 %
수용성 추출물 10.8 18.0 0.998
유기 추출물 27.2 45.3 30.37
실시예 10. 아카시아 카테츄 및 스큐텔라리아 종들로부터 얻은 유기 추출물의 COX 억제 활성도의 생체밖 연구
아카시아 카테츄 및 다양한 스큐테랄리아 종으로부터 분리된 유기 추출물들의 생체밖에서의 효능 및 COX-2 특이성이 아라키돈산 대사산물의 생성을 억제하는 능력에 대하여 세포에 의한 시스템(cell-based system)에서 시험되었다. 구조적으로 COX-2를 발현하는 세포주(cell lines) HOSC와 COX-1을 발현하는 THP-1가 아라키돈산 존재 하에 프로스타글라딘 E2(PGE 2)를 생성하는 추출물의 능력에 대하여 시험되었다.
COX-2 세포에 의한 분석(COX-1 Cell Based Assay).HOSC(ATCC#8304-CRL)세포들을 80 내지 90%까지 충분히 배양시킨 후, 배양시킨 세포를 트립신 처리(trypsinize)하여 세척하고, 조직 배양 배지(MEM)에서 1×106cells/mL의 농도의 10mL로 재현탁하였다. 그 세포 현탁액(200μL)을 96 웰 조직 배양 플레이트에 옮겨 담은 후 37℃의 온도 및 5% CO2인큐베이터에서 2시간 동안 배양하였다. 그 배지를 1ng/mL의 IL-1b를 함유하는 새로운 HOSC 배지로 교체한 후 밤새 배양하였다. 그 배지를 다시 제거한 후 190mL의 HOSC 배지로 교체하였다. 시험 화합물을 10μL의 HOSC 배지에 첨가하고 37℃에서 15분 동안 인큐베이터에서 배양하였다. HOSC 배지(20mL, 100μM)에 있는 아라키돈산을 첨가한 혼합물을 세이커(shaker) 위에서 실온에서 10분 동안 배양하였다. 상층액(20μL)을 엘리사 버퍼(ELISA buffer)에 있는 100μM 인도메타신(indomethacin) 190μL/well을 함유하는 새로운 플레이트에 옮겨 담았다. 하기에 설명되는 바와 같이 엘리사(ELISA)에 의하여 분석하였다.
COX-1 세포에 의한 분석(COX-1 Cell Based Assay).THP-1 세포를 5×105cells/mL 농도의 30mL 부피량으로 현탁시켰다. TPA를 최종농도가 10nM이 되도록 첨가한 후 세포들을 대식세포(macrophage, adherent)에서 분화시키기 위하여 48시간 동안 배양하였다. 세포들을 HBSS(25mL)에 재현탁시킨 후 200mL 부피의 96 웰 플레이트(96 well plates)에 5×105cell/wel의 양으로 첨가하였다. RPMI 1640 (10μL)에 있는 시험 화합물을 첨가한 후 37℃에서 15분 동안 이큐베이트에서 배양하였다. RPMI(20μL)에 있는 아라키돈산을 첨가한 혼합물을 세이커 위에서 10분 동안 실온에서 배양하였다. 상층액(20μL)을 인도메타신을 함유하는 엘리사 버퍼(190μL)에 첨가한 후, 그 상층액을 하기에 설명되는 바와 같이 엘리사에 의하여 분석하였다.
COX-2 완전 혈액 분석(Whole Blood Assay).정상적이고 건강한 헌혈자로부터 얻은 말초 혈액(peripheral blood)을 정맥천자(venipuncture)에 의하여 수집하였다. 완전 혈액(500μL)을 시험 시료와 함께 인큐베이터에서 배양하여 37℃에서 15분 동안 추출하였다. 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, fromE. Coliserotype 0111:B4)를 100μg/mL의 최종 농도에 첨가한 후 37℃에서 밤새 동안 배양하였다. 혈액을 원심분리(12,000×g)하여 수집한 플라즈마(100μL)에 메탄올(400μL)을 첨가하여 단백질을 침전시키고, 상부층은 엘리사에 의하여 PGE2 생성에 대하여 측정되었다. 이러한 처리 과정은 브리디아우(Brideauet al. (1996) Inflamm. Res.45:68-74)에 의해서 보고된 방법을 변형하여 사용한 것이다.
COX-1 완전 혈액 분석(COX-1 Whole Blood Assay).항응고제를 함유하지 않는 튜브에 신선한 혈액을 수집한 후, 즉시 실리콘화된 마이크로 원심분리기의 500μL 분취기에 분취하였다. 시험 시료를 첨가하여 와동시킨 후 37℃에서 1시간 동안 응고시켰다. 시료를 원심분리(12,000×g)하여 플라즈마를 수집하였다. 수집한 플라즈마(100μL)에 메탄올(400μL)을 첨가하여 단백질을 침전시켰다. 상부층액은 엘리사에 의하여 TXB2생성에 대하여 측정되었다. 이러한 처리 과정은브리디아우(Brideauet al. (1996) Inflamm. Res.45:68-74)에 의해서 보고된 방법을 변형하여 사용한 것이다.
엘리사 분석(ELISA Assays).이뮤놀론-4(Immunolon-4) 엘리사 플레이트를 pH 9.2 카보네이트 버퍼(carbonate buffer)에 0.5-4μg/mL의 포획 항체로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 코팅한 플레이트를 세척하고 실온에서 2시간 동안 블로킹 버퍼(blocking buffer, PBS+1% BSA)로 배양하였다. 배양한 플레이트를 다시 세척한 후 시험 시료(100μL)를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 흔들면서(shking) 배양하였다. 두 번째 항체와 결합된 페록시다아제를 0.5-4mg/mL의 양으로 50μL의 체적에 가한 후 실온에서 1시간 동안 흔들면서 배양하였다. 배양한 플레이트를 3번 세척한 후 TMB 기질(100μL)을 첨가하였다. 이러한 플레이트를 30분 동안 성장하도록 하고, 1M의 인산(100μL)을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응을 정지시킨 후 월랙 빅토 2 플레이트 판독기(Wallac Victor 2 plate reader) 450nm에서 판독하였다.
세포독성에 의한 세포파괴(Cytotoxicity).세포 독성에 의한 세포파괴가 손상세포내에서 락테이트 디하이드로게나제(lactate dehydrogenase)의 방출을 측정하는 측색계 키트(옥스포드 생화학 연구소)를 이용하여 평가되었다. 분석은 제조자의 사용지침에 따라 수행되었다. 정제된 플라반과 아카시아 카테츄로부터 얻은 표준화된 추출물이 시험되었다. 시험된 화합물에서는 세포독성에 의한 세포파괴가 발견되지 않았다.
위의 분석들의 결과를 표 7에 나타내었다. 그 결과 값은 직접적인 비교를위한 IC50값으로 제시된다. 표 7에서 알 수 있는 바와 같이, IC50값은 대개 COX-2 보다는 COX-1의 값이 더 낮다. 또한, 완전 혈액은 구별되는 PGE2생성의 억제 (이러한 시스템내에서의 COX-2의 측정) 또는 트롬복산 B2(thromboxane B2, TXB2, COX-1 활성의 측정)에 대하여 측정되었다. 표 7에 의하면, 이러한 연구가 완전 혈액 세포에 의한 분석내에서 COX-2 억제에 대한 특이성을 명확하게 보여준다. 그러나, THP-1 및 HOSC를 주요 성분으로 하는 모델 시스템을 이용한 연구들은 실제로 COX-1에 대하여 더 큰 선택성을 보였다. 이러한 특이성에 대한 가능한 이유는 효소 각각을 구조적으로 발현하는 영구 세포 계열과 COX 효소가 발현되도록 하는 완전 혈액으로부터 유도되는 프라이머리 세포 사이에서의 근본적인 차이 때문이다. 프라이머리 세포는 생체내의 염증 과정을 연구하는 데 매우 적절한 모델이다. 또한, 이러한 시스템들의 각각에서 COX-1 대 COX-2의 활성 변화를 확인하기 위하여 본 화합물들을 사용하였고, 그 결과가 직접 비교되지 않는다.
유기 추출물들에 의한 세포 시스템에서의 COX 활성의 억제도
유기 추출물의 식물 원료 세포주에 의한 분석 완전 혈액 분석
IC50COX-2(㎍/㎖) IC50COX-1(㎍/㎖) IC50COX-2(㎍/㎖) COX-1(㎍/㎖)
아카시아 카테츄(나무껍질) 78 22 40 ＞50
스큐텔라리아 오르또칼릭스(뿌리) 50 18 10 ＞50
스큐텔라리아 바이칼렌시스(뿌리) 82 40 20 8
스큐텔라리아 라테리플로라(식물 전체) 60 30 8 20
실시예 11. 아카시아 카테츄로부터 얻은 카테친에 의한 5-리폭시게나제의 억제도
상기에서 언급된 바와 같이, 염증성 반응과 관련하여 매우 중요한 경로들 중의 하나가 비-헴(non-hem), 철 함유 리폭시게나제(5-LO, 12-LO 및 15-LO)에 의하여 생성되며, 상기 경로가 아라키돈산과 같은 지방산 위에 분자성 산소가 첨가(addition)되는 것을 촉진하여 형성된 하이드로퍼옥사이드(hydroperoxides) 5-HPETE, 12-HPETE 및 15-HPETE가 루코트리엔(leukotrienes)으로 전환된다. 아카시아 카테츄로부터 얻은 플라반 추출물이 어느 정도의 5-LO을 억제하는 것이 나타났고, 이에 의하여 5-HPETE의 형성이 억제된다. 리폭시게나제 억제제 검색 분석 키트(Lipoxygenase Inhibitor Screening Assay Kit, Cayman Chemical, Inc., Cat#760700)가 아카시아 카테츄로부터 얻은 정제된 플라반 카테친이 생체 밖에서 직접 5-LO를 억제하는지를 분석하기 위하여 사용되었다. 마이크로여과(microfiltration)을 이용하여 인산염버퍼에서 트리스 버퍼로 바꾼 후, 일반적인 키트에서 사용되는 대두 15-LO을 감자 5-LO로 대체하였다. 이러한 분석은 산소를 감지하는 크로마겐(chromagen)을 통하여 하이드로퍼옥시드의 형성을 검출하는 것이다. 대략적으로 말하면, 0.17units/㎕의 감자 5-LO 90㎕, 1.1mM의 아라키돈산 20㎕, 산소 감지 크로마겐 100㎕ 및 정제된 플라반 억제제 10㎕를 첨가하는 것을 3회 처리하여 최종 농도가 0 내지 500㎍/㎕가 되도록 수행하였다. 카테친으로부터 얻은 5-LO 억제도에 대한 IC50값이 효소의 1.38㎍/㎕/unit로 결정되었다.
실시예 12. 아카시아 카테츄로부터 얻은 표준화된 추출물의 제조
(1) 100%의 물, (2) 80:20의 물:메탄올, (3) 60:40의 물:메탄올, (4) 40:60의 물:메탄올, (5) 20:80의 물:메탄올, (6) 100%의 메탄올, (7) 80:20의 메탄올:THF, (8) 60:40의 메탄올:THF 용매 시스템에 의하여 아카시아 카테츄(분쇄한 나무껍질 500㎎)를 추출하였다. 그 추출물이 낮은 진공 하에서 농축 및 건조되었다. 각각의 추출물의 화학적 성분들의 확인은 HPLC/PDA 및 250mm×4.6mm C18 컬럼을 이용하여 확인되었다. 화학적 성분들의 정량분석은 표준물로서 카테친 및 에피카테친을 이용하여 체류시간 및 PDA 값을 근거로 하여 수행되었다. 그 결과들이 표 8 및 도 9에 나타난다. 표 8에서 나타내는 바와 같이, 80%의 메탄올/물의 용매로 추출된 플라반 추출물이 가장 높은 농도의 플라반 성분을 제공하였다.
아카시아 카테츄로부터 표준화된 플라반 추출물을 얻기 위한 용매
추출 용매 추출물의무게(㎎) 바이오매스로부터 추출될 수 있는 (%) 카테친의총양(㎎) 추출물에서카테친 (%)
100%의 물 292.8 58.56 13 12.02
80:20의 물:메탄올 282.9 56.58 13 11.19
60:40의 물:메탄올 287.6 57.52 15 13.54
40:60의 물:메탄올 264.8 52.96 19 13.70
20:80의 물:메탄올 222.8 44.56 15 14.83
100%의 메탄올 215.0 43.00 15 12.73
80:20의 메탄올:THF 264.4 52.88 11 8.81
60:40의 메탄올:THF 259.9 51.98 15 9.05
실시예 13. 다양한 스큐테랄리아 종들로부터 얻은 표준화된 프리-비-링 플라보노이드의 제조
(1) 100%의 물, (2) 80:20의 물:메탄올, (3) 60:40의 물:메탄올, (4) 40:60의 물:메탄올, (5) 20:80의 물:메탄올, (6) 100%의 메탄올, (7) 80:20의 메탄올:THF, (8) 60:40의 메탄올:THF 용매 시스템 25㎖로 2회에 의하여 스큐테랄리아 오르또칼릭스(분쇄한 뿌리 500㎎)를 추출하였다. 혼합된 추출물들이 낮은 진공 하에서 농축 및 건조되었다. 각각의 추출물의 화학적 성분들의 확인은 HPLC/PDA 및 250mm×4.6mm C18 컬럼을 이용하여 확인되었다. 화학적 성분들의 정량분석은 표준물로서 바이칼레인, 바이칼린, 스큐테랄레인(scutellarein) 및 우고닌을 이용하여 체류시간 및 PDA 값을 근거로 하여 수행되었다. 그 결과들이 표 9에 나타난다.
스큐테랄리아 오르또칼릭스로부터 추출된 프리-비-링 플라보노이드의 정량분석
추출 용매 추출물의무게(㎎) 바이오매스로부터 추출될 수 있는 (%) 플라보노이드의 총양(㎎) 추출물에서플라보노이드 (%)
100%의 물 96.00 19.20 0.02 0.20
80:20의 물:메탄올 138.30 27.70 0.38 0.38
60:40의 물:메탄올 169.50 33.90 0.78 8.39
40:60의 물:메탄올 142.20 28.40 1.14 11.26
20:80의 물:메탄올 104.50 20.90 0.94 7.99
100%의 메탄올 57.50 11.50 0.99 10.42
80:20의 메탄올:THF 59.60 11.90 0.89 8.76
60:40의 메탄올:THF 58.80 11.80 1.10 10.71
(1) 100%의 물, (2) 70:30의 물:메탄올, (3) 50:50의 물:메탄올, (4) 30:70의 물:메탄올, (5) 100%의 메탄올 용매 시스템 50㎖로 2회에 의하여 스큐테랄리아 바이칼렌시스(분쇄한 뿌리 1000㎎)를 추출하였다. 혼합된 추출물들이 낮은 진공 하에서 농축 및 건조되었다. 각각의 추출물의 화학적 성분들의 확인은 HPLC/PDA 및 250mm×4.6mm C18 컬럼을 이용하여 확인되었다. 화학적 성분들의 정량분석은표준물로서 바이칼레인, 바이칼린, 스큐테랄레인(scutellarein) 및 우고닌을 이용하여 체류시간 및 PDA 값을 근거로 하여 수행되었다. 그 결과들이 표 10에 나타난다.
스큐테랄리아 바이칼렌시스로부터 추출된 프리-비-링 플라보노이드의 정량분석
추출 용매 추출물의무게(㎎) 바이오매스로부터 추출될 수 있는 (%) 플라보노이드의 총양(㎎) 추출물에서플라보노이드 (%)
100%의 물 277.5 27.8 1.00 0.09
70:30의 물:메탄올 338.6 33.9 1.19 11.48
50:50의 물:메탄올 304.3 30.4 1.99 18.93
30:70의 물:메탄올 293.9 29.4 2.29 19.61
100%의 메탄올 204.2 20.4 2.73 24.51
실시예 14. 스큐테랄리아 바이칼렌시스의 뿌리로부터 얻은 표준화된 프리-비-링 플라보노이드 추출물 및 아카시아 카테츄의 나무껍질로부터 얻은 표준화된 플라반으로 이루어진 제제의 제조
여기서 유니베스틴(UnivestinTM)으로 불려지는 신규 물질 조성물은 각각 아카시아 및 스큐테랄리아로부터 분리된 2가지의 표준화된 추출물들과 1가지 이상의 부형제들을 함께 사용하여 제제화되었다. 이러한 조성물을 제조하는 일반적인 예가 하기에 설명된다. 이러한 예에서 사용되는 아카시아 추출물은 카테친과 에피카테친으로서 총 플라반을 60% 초과하여 함유하고, 스큐테랄리아 추출물은 주로 바이칼린인 프리-비-링 플라보노이드를 70% 초과하여 함유하였다. 스큐테랄리아 추출물은 표 11에서 나타낸 바와 같이 기타 소량의 프리-비-링 플라보노이드를 함유하였다. 1가지 이상의 부형제들이 물질 조성물에 첨가된다. 플라반과 프리-비-링 플라보노이드의 비율은 COX-2 대 5-LO의 억제에 대한 증상과 특정 필요량 및 생성물의 유효한 필요량에 따라 조절될 수 있다. 부형제들의 양은 각 성분들의 실제 활성 함량에 따라 조절될 수 있다. 생성물 각각의 개별적인 배치(batch)에 대한 혼합표(blending table)는 생성물의 설명서 및 성분들의 개별적인 배치에 대한 QC 결과에 따라 만들어짐에 틀림없다. 생성물의 설명서를 충족하기 위해서 2 내지 5% 범위내의 활성 성분의 첨가량이 권고된다. 표 11이 유니베스틴의 1 배치에 대하여 만들어진 혼합표를 설명한다(Lot # G1702-COX-2).
82.2%의 프리-비-링 플라보노이드(바이칼린)를 함유하는 스큐테랄리아 바이칼렌시스 뿌리 추출물(38.5㎏, Lot #RM052302-01); 80.4%의 총 플라반을 함유하는 아카시아 카테츄 나무뿌리 추출물(6.9 ㎏, Lot #RM052902-01); 및 부형물(캔덱스의 5.0㎏)가 혼합되어 85:15 혼합 비율의 유니베스틴 제제(50.4kg)를 제공하였다. 표 11이 실시예 7 및 9에서 제공된 방법에 의한 특정 배치 유니베스틴(Lot # G1702-COX-2)의 활성 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 함량을 제공한다.
유니베스틴 제제의 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 함량
활성 성분들 % 함량
1. 플라보노이드
a. 바이칼린 62.5%
b. 소량의 플라보노이드
ⅰ. 우고니-7-글루쿠로나이드 6.7%
ⅱ. 오록실린 A 7-글루쿠로나이드 2.0%
ⅲ. 바이칼린 1.5%
ⅳ. 우고닌 1.1%
ⅴ. 크리신-7-글루쿠로나이드 0.8%
ⅵ. 5-메틸-우고닌-7-글루쿠로나이드 0.5%
ⅶ. 스큐테랄린 0.3%
ⅷ. 노르우고닌 0.3%
ⅸ. 크리신 ＜0.2%
ⅹ. 오록실린 A ＜0.2%
c. 총 프리-비-링 플라보노이드 75.7%
2. 플라반
a. 카테친 9.9%
b. 에피카테친 0.4%
c. 총 플라반 10.3%
3. 총 활성 성분들 86%
상기 표 11의 특정 배치의 유니베스틴은 75.7%의 프리-비-링 플라보노이드 및 10.3%의 플라반을 함유하는 86%의 총 활성 성분들로 이루어진다. 2가지 다른 투여량의 캡슐 형태의 최종 제제가 이러한 배치의 유니베스틴(50.0㎏)으로부터 제조되었다: 125㎎/dose(60개의 캡슐), 250㎎/dose(60개의 캡슐). 최종 제제가 실시예 15에서 설명한 바대로 인간 임상학적 시험으로 평가되었다.
위와 같은 방법으로, 2가지의 다른 배치의 유니베스틴이 제조될 수 있는데, 스큐테랄리아 바이칼렌시스의 뿌리로 부터 얻은 표준화된 프리-비-링 플라보노이드 추출물 및 아카시아 나무껍질로부터 얻은 표준화된 플라반 추출물이 각각 50:50 및 20:80의 혼합 비율로 혼합되어 제조된 것이다.
실시예 15. 3가지 유니베스틴 제제로부터 COX 효소 억제에 대한 투여량에 따른 반응 및 IC 50 값의 측정
실시예 14에서 제조된 3가지의 다른 유니베스틴 제제가 실시예 6에서 설명된 바대로 COX-1 및 COX-2 억제제 활성에 대하여 시험되었다. 3가지 모두가 COX 효소 활성의 투여량에 따른 상당한 반응을 보였으며, 이러한 결과를 도 11, 12 및 13에 도시하였다.
실시예 16. 유니베스틴 제제로부터 LO 효소 억제에 대한 투여량에 따른 반응 및 IC 50 값의 측정
실시예 14의 방법에 따라, 스큐테랄리아 바이칼렌시스의 뿌리로 부터 얻은 표준화된 프리-비-링 플라보노이드 추출물 및 아카시아 나무껍질로부터 얻은 표준화된 플라반 추출물이 80:20의 혼합 비율로 혼합되어 제조된 유니베스틴 시료가 준비되었다. 유니베스틴 시료가 THP-1 또는 HT-29 세포를 함유하는 조직 배양 배지에서 적정되었다; COX-1, COX-2 및 5-LO를 발현하는 단핵 세포의 세포주. 5-LO 경로에 대한 유니베스틴의 억제 효과의 측정으로서 각 세포주에 존재하는 새로이 합성된 양의 LTB4에 대한 유니베스틴의 효과를 평가하기 위하여 LTB4(LTB4; Neogen, Inc., Cat#406110)에 대한 길항적 ELISA가 사용되었다. 분석은 6-웰 플레이트에 웰당 160,000 내지 180,000개의 세포를 첨가하는 것을 2회 반복하여 수행되었다. 유니베스틴을 THP-1 배양에 3, 10, 30 및 100㎍/㎖의 양으로 첨가한 후 습윤 환경, 5% CO2, 37℃의 인큐베이터에서 밤새(~12 내지 15시간 동안) 배양하였다. 그 결과를 도시한 도 14가 새로운 LPS-유도성 LTB4의 생성이 THP-1 배양에 3 내지 10㎍/㎖의 양으로 첨가된 유니베스틴에 의하여 거의 완벽하게 억제됨을 보였다.
유니베스틴 및 다른 5-LO 억제제로 알려진 이부프로펜을 HT-29 세포에 3㎍/㎖의 양으로 첨가한 후 습윤 환경, 5% CO2, 37℃의 인큐베이터에서 48시간 동안 배양하였다. 각각의 처치된 세포주가 원심분리에 의하여 수집되고, 생리 버퍼에서 서서히 다운스(dounce) 균일 라이신 용해에 의하여 분해되었다(lysis). 도 15에 도시된 바와 같이, 유니베스틴이 HT-29 세포에서 새로이 합성된 LTB4의 80% 생성을 억제하엿다. 이부프로펜은 같은 기간 동안에 LTB4의 양에 있어서 단지 20%의 감소를 보였다.
실시예 17. 유니베스틴 대 다른 NSAIDs에 의한 cox -1이 아닌 cox -2의 유전자 발현의 특이 억제
유니베스틴이 유전자 수준(genomic level)에 작용하는지를 평가하기 위하여인간에게서 분리된 말초혈액내 단핵구(peripheral blood monocytes, PBMCs)를 리포폴리사카라이드(lopopolysaccride, LPS)로 자극하고, 실시예서 14에서 설명된 유니베스틴, 셀레콕시브(celecoxib), 이부프로펜(ibuprofen) 또는 아세타미노펜(acetaminophen)으로 처치한 후, 생성된 총 RNA가 수집되어 반정량적 RT-qPCR(semi-quantitative RT-qPCR)에 의하여 평가되었다. 구체적으로, 그 분석은 웰 당 130,000개의 세포가 첨가된 6-웰 플래이트(6-well plates)가 준비되었다. 준비된 세포들은 10ng/㎖ LPS로 자극된 후, 1, 3, 10, 30 및 100㎍/㎖의 유니베스틴과 3㎍/㎖의 셀로콕시브, 이부프로펜 및 아세타미노펜과 함께 37℃, 5% CO2, 습윤 상태의 인큐베이터에서 18시간 동안 배양되었다. 각각의 세포-처치 상태들이 원심분리에 의하여 수집된 후, 생성된 총 RNA가 트리졸 시약(Trizolⓡreagent, InvitrogenTMLife Technologies, Cat#15596-026) 및 제시된 트리졸 시약 프로토콜을 이용하여 분리되었다. 총 RNA가 역전사되었는데, 랜덤 헥사머(random hexamers)를 이용하는 몰로네이 뮤린 루케미아 바이러스 역전사제(Moloney Murine Leukemia Virus reverse transciptase, M-MLV RT; Promega Corp., Cat#M1701)를 이용하였다. qPCR이 ABI 프리즘 7700 시퀀스 디텍션 시스템(ABI Prismⓡ7700 Sequence Detection System)에서 수행되었는데, 18S rRNA 내부 표준 및 유전자 특이 분석용으로서 사전-전개되어 입증된 어새이-온-디맨드 제품(pre-developed validated Assays-on-Demand procucts, AOD from Applied Biosystem, Inc., Cat#4331182)을 이용하였다. 유전자 특이 발현 값은 각각의 18S rRNA 유전자 발현값으로 표준화(standardization)된 후 LPS가 존재하지 않고 처치되지 않은 상태에 대하여 비교되었다(normalization). 처치된 상태들은 이러한 처치되지 않은 상태들에 대한 상대적인 값이다.
유니베스틴이 상대적으로 비교되는cox-2의 유전자 발현을 100배 이상까지 감소시켰으나,cox-1의 유전자 발현에서는 약간의 변화를 보였다. PBMCs가 3㎍/㎖의 유니베스틴, 셀레콕시브, 이부프로펜 또는 아세타미노펜으로 처치되었을 때, 단지 유니베스틴만이cox-2의 유전자 발현을 증가시키지 않았다. 이것이 반정량적 RT-qPCT 기술을 이용하여 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 혼합물로 처치한 후 통증 및 염증 경로에 관여하는 아이코시노이드(eicosinoids), 시토킨(cytokines), 케모킨(chemokines) 및 다른 유전자의 유전자 발현 수준에서의 변화를 보고하는 최초의 것이라고 생각한다. 이러한 작업은 단백질 수준에서의 변화를 평가하기 위한 엘리사를 기초로 하는 분석 및 단백질 기능에서의 변화를 평가하기 위한 효소 기능 분석과 함께 이루어졌다. 이러한 연구의 결과로서, 유니베스틴 처치 이후의 유전자 및 단백질이 결부된 효과가 설명되었다. 문헌에서 인용되는 기타 연구들은 유전자 발현을 직접 보여주기 위해서가 아니라 유전자 발현을 추정하기 위하여 단백질 특이 방법을 사용하였다. 그 결과가 도 16 및 17에 도시된다.
실시예 18. 쥐 귀 부종 모델로부터 유니베스틴의 생체내 효능 평가
유니베스틴이 생체내에서 염증을 치료하는데 사용될 수 있는지를 시험하기 위하여, 4에서 5주된 ICR 쥐(Harlan Labs)의 귀에 아라키돈산을 주사하여 1일 후에, 실시에 14에서 설명한 바대로 제조된 조성물을 경구적 관 투여(oral gavage)에 의하여 쥐들에 투여하였다. 올리브 오일에 현탁시틴 유니베스틴을 시험쥐에 50, 100 및 200㎎/㎏ 투여량으로 투여하였고, 대조군의 쥐에는 단지 올리브 오일만이 투여되었다. 다음날, 95% 알콜에 330mM 아라키돈산 20㎕을 각 쥐들의 한쪽 귀에 주사하였고, 대조군으로서 다른 쪽 귀에는 알콜을 주사하였다. 유니베스틴으로 처치된 쥐들은 유니베스틴의 투여량이 증가함에 따라 측정할 수 있는 투여량에 따른반응을 보였다. 이러한 결과들을 도시한 도 18이 나타내는 바와 같이, 200㎎/㎏의 유니베스틴이 투여된 경우가 (-) 유니베스틴 대조군에 비교하였을 때, 부종을 50% 이상으로 감소시킨다. 50㎎/㎏의 유니베스틴이 투여된 경우는 50㎎/㎏의 다른 항-염증성 제제인 인도메타신을 투여한 경우와 같은 효능을 나타내었다.
실시예 19. 쥐 발목 관절 부종 모델로부터 유니베스틴의 생체내 효능 평가
유니베스틴을 관절 통증의 표적으로 하기 위하여, 95% 에탄올에서 100mM 아라키돈산 20㎕의 용액을 4에서 5주된 ICR 쥐(Harlan Labs)의 뒤 발목 관절에 부종을 생성시키기 위하여 주사하였다. 올리브 오일에 12시간 동안 현탁시킨 유니베스틴을 시험군에 100㎎/㎏ 투여량으로 투여하였고, 다른 시험군에는 유니베스틴을 투여하지 않았다. 대조군들로는 아라키돈산이 주사되지 않은 쥐들의 음성적 대조군과 아라키돈산이 없는 95% 에탄올이 주사된 쥐들의 운반체 대조군을 포함한다. 그 결과들을 도시한 도 19가 나타내는 바와 같이, 아라키돈산이 주사된 후 유니베스틴을 처치한 쥐는 대조군들 및 처치되지 않은 아라키돈산 주사군들에 비하여 부종의 바탕 수준(background level)의 부종을 보였다. 이러한 결과가 운동 분위인 관절에서의 부종을 감소시키는 유니베스틴의 효능을 설명한다.
실시예 20. 무릅 및/또는 둔부의 류마티즘 관절염 또는 골관절염으로 인한 통증의 완화에 대한 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반 효능의 임상 평가
단일-중심(single-center), 무작위(randomized), 이중-맹검법(double-blind), 플라시보-조절(placebo-controlled) 방법을 통하여 임상 연구를 하였다. 무릅 및/ 또는 둔부의 류마티즘 관절염 또는 골관절염을 앓는 60명의 피시험자(n=60)들을 무작위로 다음 4 그룹으로 나누었다.
A0 플라시보 n=15 플라시보
A1 투여1 n=15 유니베스틴 250mg/일(1일 125mg씩 2회 투여)
A2 투여2 n=15 유니베스틴 500mg/일(1일 250mg씩 2회 투여)
A3 활성 대조군 n=15 셀레콕시브 200mg/일(1일 100mg씩 2회 투여)
유니베스틴은 실시예 14에서 설명한 바대로 제조되었다. 이러한 특정 배치의 유니베스틴(lot#G1702-COX-2)은 75.7%의 프리-비-링 플라보노이드와 10.3%의 플라반을 포함하면서 86%의 총 활성 성분을 함유한다. 셀레콕시브는 셀레브렉스라고도 알려져 있으며, 일종의 COX-2 선택적 억제제인 처방약의 상표명이다.
피시험자들은 남성과 여성의 쌍으로 이루어지며 40 내지 75세 나이의 사람들이었다. 처치 방법은 상기 투여 스케줄에 따라 플라시보 또는 활성 화합물(유니베스틴 또는 셀레브렉스)을 90일 동안 경구 투여하는 방식으로 하였다. 본 연구를 시작하기 전에 NSAIDs를 복용한 피시험자들을 2주간의 장세척 기간에 참여하게 했다. 신체적 활동은 제한하지 않았고, 식이요법에 있어서도 어떤 조언도 하지 않았다. 피시험자들은 어떤 이유, 어떤 때에 그 시험으로부터 철회할 수 있도록 하였다. 시험자는 WOMAC(Western Ontario and McMaster Universities) 골관절염 지수를 이용하여 경구 투여 후 30일, 60일 및 90일 동안 처치의 효능을 평가하였다. (Lingardet al. (2001) the Journal of Bone & Joint Surgery83(12):1856-1864;Soderman & Malchau (2000) Acta Orthop Scand.71(1):39-46). 몬트리올 대학(University for Montreal)의 IRB 위원회가 상기와 같은 프로토콜(protocol, 환자 치료 실험계획안)을 검토하여 승인하였다.
WOMAC이 바람직하게 병원에서 피시험자들에 대해서 관리되었다. 피시험자들은 진찰실에서 스스로 또는 대리인을 통하여 질문 사항들을 읽고 답하거나, 전화를 통하여 전문가에 의하여 인터뷰한 후 그 결과가 컴퓨터의 데이터베이스에 기록되었다. 이것이 환자들에게 안전한 환경을 제공하였고, 다른 가정의 환경으로 인한 오차의 가능성을 감소시켰다. 모든 측정에 있어서 군들의 차이는 다중비교로서 일원 분산 분석(One-Way Analysis of Variance) 및 터키 최소 유의차 (Turkey's Least Significant Difference) 방법에 의하여 평가되었다. 모든 질물들에 대하여 통증, 경직성 또는 손상된 기능의 정도에 따라 0 부터 4의 등급을 부여하였다. 이러한 값들을 %로 변환하였고, WOMAC 값으로 기록하였는데, 값이 클수록 더 큰 손상을 의미한다. 표 12가 통증, 경직성 및 기능에 대하여 250㎎/일, 500㎎/일 투여량의 유니베스틴 및 200㎎/일 투여량의 셀레콕시브로 처치한 후 처치 전(기준선), 처치 후 30일, 60일, 90일에서의 평균 WOMAC 지수 값을 나타낸다. 이러한 값들이 낮을 수록 환자들의 통증과 경직성이 덜하고 기능이 좋아진다.
기준선, 30일, 60일 및 90일에서의 WOMAC 지수 값
WOMAC 지수 유니베스틴 250 유니베스틴 500 셀레콕시브 200 플라시보
평균 표준편차 평균 표준편차 평균 표준편차 평균 표준편차
통증-기준선 54.33 19.9 60.33 23.34 55.00 22.28 49.33
통증-30일 41.33 19.22 36.00 22.93 50.00 23.09 41.67 15.55
통증-60일 40.71 16.62 40.77 19.77 30.00 16.46 57.31 16.66
통증-90일 41.79 16.36 27.69 21.57 31.67 16.42 50.00 14.43
경직성-기준선 63.33 26.92 61.67 23.84 47.50 21.75 46.67 21.37
경직성-30일 41.67 16.14 44.17 21.06 39.42 18.29 59.17 20.85
경직성-60일 37.50 18.99 39.42 19.66 37.50 29.76 46.15 24.68
경직성-90일 39.29 20.72 28.85 21.28 29.17 25.19 49.04 18.01
기능-기준선 58.41 22.74 62.92 17.68 49.38 10.33 52.82 8.29
기능-30일 42.09 14.51 47.59 17.18 48.43 9.29 51.88 14.80
기능-60일 41.47 7.75 41.59 7.34 41.23 9.12 49.64 7.16
기능90일 42.44 17.08 38.12 13.21 44.41 11.06 50.95 12.73
표 13은 통증, 경직성 및 기능에 대한 WOMAC 값들에 있어서 평균 절대 변화값을 나타낸다. 이들 값들은 30일, 60일 및 90일에서 기준선과 WOMAC 값들 사이의 차로서 나타내며, 이들 값들이 (-)일 수록 향상 정도가 큰것이다.
기준선, 30일, 60일 및 90일에서의 WOMAC 지수 값에 있어서 평균 절대 변화값 (이러한 값들은 본 연구를 완료한 피시험자들을 포함한다)
절대변화값 유니베스틴 250 유니베스틴 500 셀레콕시브 200 플라시보
평균 표준편차 평균 표준편차 평균 표준편차 평균 표준편차
통증-30일 -13.00 24.41 -24.33 18.70 -4.23 15.92 -7.67 26.98
통증-60일 -14.64 26.85 -17.31 35.27 -22.31 22.51 5.00 13.54
통증-90일 -13.57 22.91 -30.38 21.06 -16.67 21.36 -2.31 15.89
경직성-30일 -21.67 24.31 -17.50 18.18 -8.65 20.66 12.50 29.88
경직성-60일 -28.57 27.05 -21.15 33.61 -9.62 29.82 -1.92 30.55
경직성-90일 -26.79 27.67 -31.73 20.17 -13.54 37.48 -0.96 26.74
기능-30일 -16.32 19.58 -15.33 18.28 -0.37 6.86 -0.94 14.05
기능-60일 -18.11 24.36 -21.40 19.79 -6.97 13.66 -3.49 11.81
기능90일 -17.13 23.69 -24.87 23.25 -2.78 8.34 -2.18 11.27
상기 값들에서 나타나는 큰 차이들 때문에 표준 편차를 군 평균으로 하기는 어렵다. 차라리, 평균들에 대한 신뢰한계(confidence limits)가 바람직한데, 이들이 평균에 대한 하한과 상한을 주며, 구간이 좁을 수록 평균의 추정이 더 정확하기 때문이다. 신뢰한계는 신뢰계수(confidence coefficient)로 표현된다. 95% 신뢰구간은 이러한 형태의 통계학적 분석에 있어서 평균값을 설명하는데 가장 일반적으로 사용되는 구간이다. 이것은 그 구간(interval)이 참 평균값을 가질 확률이 95%임을 의미하지는 않는다. 대신에, 신뢰수준이 구간을 계산하는 방법과 관련이 있다. 신뢰계수는 단순히 참 평균값을 가질 것으로 기대되는 주어진 크기의 표본들의 비율이다. 즉, 많은 표본들이 수집된 후 그 신뢰구간이 계산되었을 때, 95% 신뢰구간은 결국 이러한 구간들 중 약 95%가 참 평균값들을 가진다는 것이다. 이러한 점을 염두에 두고서, 95% 신뢰구간이 30일, 60일 및 90일에서 통증, 경직성 및 기능에 대한 WOMAC 값들에 대하여 계산되었다.
1 에서 5사이의 5점 리커트 척도법에 (five point Likert scale)에 근거하는 WOMAC 값들에 대한 저/비 표준화된 값들이 최종 통증, 경직성 및 손상 기능 지수를 나타내는데 선택된다(도 20 내지 도 31). 0 에서 100 사이의 표준화된 값들이 균등성을 위한 기타 구획(section)에서 사용되었고, 변화값 크기의 감지를 향상시키켰다(표 12 및 13 참조). 그러나, 모든 수치들이 1 에서 5 사이의 점수값으로 주어졌으며, 원자료 값들(raw date)이 도시되었는데, 이러한 값들이 환자 질물사항들로부터 얻은 점수들에 의하는 방법을 더 잘 반영하기 때문이다. 바꾸어 말하면, 환자들은 1 에서 5 사이의 대표값을 선택하기 때문에, 이러한 대표값들이 가능한 범위의 답변들에 대한 환자들의 인지를 반영하지 않는 0에서 100까지의 표준화된 또는 변환된 점수에 대조되는 환자들의 반응을 더 잘 반영한다.
통증 지수에서 뚜렷한 경향을 볼 수 있는데, 250 및 500㎎/일의 투여량의 유니베스틴이 환자 반응에 근거하는 90일 처치 동안의 통증을 감소시킨다. 또한, 셀레콕시브는 플라시보에 비교하여 같은 기간 동안에 통증을 감소시킨다. 그러나, 셀레콕시브는 경직성을 경감시키는데 있어서, 두 가지 투여량 모두에서 유니베스틴 만큼 효과적인 것으로 나타나지 않는데, 이는 신뢰구간이 플라시본의 것들과 크게 겹치기 때문이다. 마지막으로, 두 가지 투여량 모두에서 유니베스틴은 기능적 손상을 뚜렷하게 향상시켰으나, 셀레콕시브는 플라시보와 비교하여 그렇지 않았다. 그래프의 값들은 본 연구를 완료하지 않은 피시험자들 모두를 포함한다. 그러나, 각 신뢰구간이 WOMAC 시험이 시행되었던 시점에 참여하였던 피시험자들의 수에 근거하여 유효하기 때문에 그 경향이 여전히 유지된다. 이러한 결과가 도 20 내지 도 31에 도시된다.
실시예 21. 기능 증가로 인한 체질량 지수(Body Mass Index, BMI) 및 체중 감소에 대한 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 효능에 대한 임상 평가
임상 시험 동안에 키 및 체중이 측정되었다. 모든 군의 피시험자들(실시예 20 참조) 처치 30일 및 90일 후의 키와 체중이 측정되었다. 피시험자들은 BMI 및 체중 감소에 대한 결과들의 오차를 줄이기 위하여 식이요법이나 운동이 권고되지 않았다. 표 14가 30일 및 90일 동안의 처치 후에 발생하는 체중 및 BMI의 변화를 나타낸다.
30일 및 90일에서 평균 체중(㎏) 및 BMI(㎏/㎡)의 변화
군
유니베스틴 250 유니베스틴 500 셀레콕시브 200 플라시보
평균 표준편차 평균 표준편차 평균 표준편차 평균 표준편차
체중-30일 -3.60 3.76 -2.40 3.31 -2.00 3.08 -0.60 1.99
체중-90일 -5.36 3.43 -4.15 4.81 -3.17 4.88 -0.08 1.50
BMI-30일 -1.28 1.33 -0.80 1.13 -0.68 1.06 -0.20 0.64
BMI-90일 -1.84 1.14 -1.39 1.64 -1.07 1.67 -0.02 0.54
결과들을 보면, 250㎎/일 투여량의 유니베스틴이 가장 큰 체중 감소 및 BMI 변화가 있고, 500㎎/일 투여량의 유니베스틴과 셀레콕시브가 그 뒤를 따르며, 플라시보는 체중 및 BMI에 대한 어떤 효과도 나타나지 않았다. 체중 감소 및 BMI 변화에 영향을 끼치는 다른 항-염증성 화합물에 관하여 공지된 바가 없다고 생각된다. 피시험자들이 운동에 대하여 권고되지 않았지만, 특별히 유니베스틴으로 처치된 후의 향상된 기능이 피시험자들의 운동성을 저절로 증진시킨다. 또는 유니베스틴이 열발생(thermogenesis), 지방분해(lipolysis)를 증가시키거나 또는 음식물의 탄수화물이나 지방이 이용되도록 한다. 도 32 및 도 33에 처치 30일 및 90일 이후의 유니베스틴에서 나타나는 BMI 및 체중 감소를 도시하였다.
실시예 22. 기능 증가로 인한 혈당 감소에 대한 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 효능에 대한 임상 평가
또한, 혈당을 처치후의 0(기준선)일, 30일 및 90일에서 취한 후(실시예 20 참조) mmole/ℓ단위로 측정하여, ㎎/㎗로도 나타내었다. 표 15가 250㎎/일 및 500㎎/일 투여량의 유니베스틴을 처치한 후의 30 및 90일에서의 혈당량을 나타낸다.
처치 30일 및 90일 후의 혈당 변화
군
유니베스틴 250 유니베스틴 500 플라시보
mmole/ℓ ㎎/㎗ 표준편차 mmole/ℓ ㎎/㎗ 표준편차 mmole/ℓ ㎎/㎗ 표준편차
기준선 5.24 94.32 0.74 5.09 91.62 0.67 4.82 86.76 0.80
30일 5.10 91.80 0.71 4.75 85.50 0.55 5.08 91.44 0.54
90일 4.88 87.84 0.72 4.34 78.12 0.36 4.71 84.78 0.56
90일까지의 %변화 -7.52 -12.79 0.94
이와 같은 결과가 250㎎/일 및 500㎎/일 투여량의 유니베스틴 처치가 투여한 시간에 따라 혈당량을 상당히 감소시킴을 나타낸다. 이러한 효과는 체중 감소나 예상되는 증진된 기능 손상으로 예상되는 활성 증가와 관련이 있을 수도 있거나, 또는 없을 수 있다. 또한, 유니베스틴이 당 허용량을 감소시키거나 탄수화물을 더욱 효과적으로 이용함으로써 당의 대사를 향상시키는데 직적접으로 작용할 수 있을 것이다.

Claims (39)

  1. 적어도 하나의 프리-비-링 플라보노이드(free-B-ring) 및 적어도 하나의 플라반(flavan)의 혼합물을 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 프리-비-링 플라보노이드와 플라반 혼합물의 제형.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 프리-비-링 플라보노이드와 플라반 혼합물의 제형에서 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 비율이 프리-비-링 플라보노이드:플라반이 99:1 내지 1:99임을 특징으로 하는 프리-비-링 플라보노이드와 플라반 혼합물의 제형.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 프리-비-링 플라보노이드와 플라반 혼합물의 제형에서 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비율이 약 85:15임을 특징으로 하는 프리-비-링 플라보노이드와 플라반 혼합물의 제형.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 프리-비-링 플라보노이드가 하기 구조식을 가지는 화합물들의 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 프리-비-링 플라보노이드와 플라반 혼합물의 제형.
    상기 구조식에서,
    R1, R2, R3, R4및 R5는 -H, -OH, -SH, -OR, -SR, -NH2, -NHR, -NR2, -NR3 +X-, 탄소, 산소, 질소 또는 황, 알도펜토스(aldopentoses), 메틸-알도펜토스(mehtyl-aldopentose), 알도헥소스 (aldohexoses), 케토헥소스(ketohexoses) 및 이들의 화학적 유도체를 포함하는 다당류 단독 또는 다당류 혼합의 글리코시드(glycoside)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    여기서 R은 1 내지 10개의 탄소수를 갖는 알킬기이고; 그리고
    X는 하이드록실(hydroxyl), 클로라이드(chloride), 요오다이드(iodide), 설페이트(sulfate), 포스페이트(phosphate), 아세테이트(acetate), 플루오라이드(fluoride), 카보네이트(carbonate) 등을 포함하는 약제학적으로 허용되는 중심 음이온들의 군으로부터 선택된다.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 플라반이 하기 구조식을 가지는 화합물들의 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 프리-비-링 플라보노이드와 플라반 혼합물의 제형.
    상기 구조식에서
    R1, R2, R3, R4및 R5는 -H, -OH, -SH, -OCH3, -SCH3, -OR, -SR, -NH2, -NRH, -NR2, -NR3 +X-, 갤레이트(gallate), 아세테이트(acetate), 시나모일 에스터(cinnamoyl esters), 하이드록실 시나모일 에스터(hydroxyl cinnamoyl esters), 트리하이드록실벤조일 에스터(trihydroxybenzoyl esters) 및 카페오일 에스터(caffeoyl esters)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 언급된 치환기들의 에스터 및 이들의 화학적 유도체들; 알도펜토스(aldopentoses), 메틸알도펜토스(methylaldopentoses), 알도헥소스(aldohexoses), 케토헥소스(ketohexose) 및 이들의 화학적 유도체들을 포함하는 다당류 단독 또는 다당류 혼합의 탄소, 산소, 질소 또는 황 글리코시드; 이량체(dimer), 삼량체(trimer) 및 기타 중합된 플라반(polymerized flavans);로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    R은 1 내지 10개의 탄소수를 갖는 알킬기이며; 그리고
    X는 하이드록실(hydroxyl), 클로라이드(chloride), 요오다이드(iodide), 설페이트(sulfate), 포스페이트(phosphate), 아세테이트(acetate), 플루오라이드(fluoride) 및 카보네이트(carbonate)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 약제학적으로 허용되는 중심 음이온들의 군으로부터 선택된다.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 프리-비-링 플라보노이드 및 상기 플라반이 유기 합성에 의하여 얻어지거나, 식물로부터 분리됨을 특징으로 하는 프리-비-링 플라보노이드와 플라반 혼합물의 제형.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 프리-비-링 플라보노이드 및 상기 플라반이 줄기, 줄기껍질, 나무몸통, 나무몸통껍질, 가지, 괴경, 뿌리, 뿌리껍질, 어린순, 씨, 근경, 꽃 및 기타 생식기관, 잎, 기타 기생부분으로 이루어진 군으로부터 선택된 식물의 부분으로부터 분리됨을 특징으로 하는 프리-비-링 플라보노이드와 플라반 혼합물의 제형.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 프리-비-링 플라보노이드가
    앤노나시아(Annonaceae), 아스테라시아(Asteraceae), 비그노니아시아(Bignoniaceae), 콤브레타시아(Combretaceae),콤포지테(compositae), 유퍼비애시아(Euphorbiaceae), 라비애때(Labiatae), 라우란시아(Lauranceae), 레규미노새(Leguminosae), 모래시아(Moraceae), 피난시아(Pinaceae), 프테리대시아(Pteridaceae), 시노프테리대시아(Sinopteridaceae), 울마시아(Ulmaceae) 및 진기베라시아(Zingiberacea)로 이루어진 군으로 부터 선택된 식물 과(plant family)로부터 분리됨을 특징으로 하는 프리-비-링 플라보노이드와 플라반 혼합물의 제형.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 프리-비-링 플라보노이드가 데즈모스(Desmos), 아키로클린(Achyrocline), 오록시룸(Oroxylum), 부체나비아(Buchenavia), 아나팔리스(Anaphalis), 코튤라(Cotula), 가나팔륨(Gnaphalium), 헬리크리쥼(Helichrysum), 센타우레아(Centaurea), 유파토리움(Eupatorium), 바카리스(Baccharis), 사피움(Sapium), 스큐텔라리아(Scutellaria), 몰사(Molsa), 콜레브룩키아(Colebrookea), 스타키스(Stachys), 오리가늄(Origanum), 지지피라(Ziziphira), 린데라(Lindera), 액티노대픈(Actinodaphne), 아카시아(Acacia), 데리스(Derris), 글라이시리자(Glycyrrhiza), 밀레치아(Millettia), 퐁미아(Pongmia), 테프로시아(Tephrosia), 아토카푸스(Artocarpus), 피큐스(Ficus), 피티로그래머(Pityrogramma), 노또래나(Notholaena), 피너스(Pinus), 울머스(Ulmus) 및 알피니아(Alpinia)로 이루어진 군으로부터 선택된 식물 속(plant genus)으로부터 분리됨을 특징으로 하는 프리-비-링 플라보노이드와 플라반 혼합물의 제형.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 플라반이 아카시아 카테츄(Acacia catechu), 아카시아 콘시나(A. concinna), 아카시아 파네시아나(A. farnesiana), 아카시아 세네갈 (A. Senegal), 아카시아 스페시오사(A. speciosa), 아카시아 아라비카(A. arabica), 아카시아 캐시아(A. caesia), 아카시아 페나타(A. pennata), 아카시아 시누아타(A. sinuata), 아카시아 메아른시(A. mearnsii), 아카시아 픽난사(A. picnantha), 아카시아 데알바타(A. dealbata), 아카시아 아우리큘리포미스(A. auriculiformis), 아카시아 홀로세레시아(A. holoserecia) 및 아카시아 망기움(A. mangium)로 이루어진 군으로 선택된 식물 종(plant species)으로부터 분리됨을 특징으로 하는 프리-비-링 플라보노이드와 플라반 혼합물의 제형.
  11. 제6항에 있어서,
    상기 프리-비-링 플라보노이드가 식물들 중에서 스큐테랄리아 속(Scutellaria genus)에서 단일 식물 또는 복합 식물로부터 분리되고, 상기 플라반이 식물들 중에서 아카시아 속(Acacia genus)에서 단일 식물 또는 복합 식물로부터 분리됨을 특징으로 하는 프리-비-링 플라보노이드와 플라반 혼합물의 제형.
  12. 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반 혼합물을 포함하여 이루어지는 조성물의 유효한 양을 이를 필요로 하는 호스트(host)에게 투여함을 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 관절 통증과 경직성 경감 및 운동성과 신체 기능 향상을 위한 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 조성물이 체중에 대하여 0.01 내지 200㎎/㎏의 투여량으로 투여됨을 특징으로 하는 관절 통증과 경직성 경감 및 운동성과 신체 기능 향상을 위한 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 투여 경로가 경구적(oral) 투여, 국부적(topical) 투여, 좌약식(suppository) 투여, 정맥내(intravenous) 투여 및 내피(intradermic) 투여, 위내(intragaster) 투여, 근육내(intramusclar) 투여, 복막내(intraperitoneal) 투여 및 정맥내(intravenous) 투여 경로로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 관절 통증과 경직성 경감 및 운동성과 신체 기능 향상을 위한 방법.
  15. 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물을 포함하여 이루어지는 조성물의 유효한 양을 약제학적으로 허용되는 운반체와 함께 이를 필요로 하는 호스트에게 투여하는 것을 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 골관절염 및 류마티즘 관절염과 관련한 병리학적 이상 증상들의 예방 및 치료 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 조성물이 체중에 대하여 0.01 내지 200㎎/㎏의 투여량으로 투여됨을 특징으로 하는 골관절염 및 류마티즘 관절염과 관련한 병리학적 이상 증상들의 예방 및 치료 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 투여 경로가 경구적(oral) 투여, 국부적(topical) 투여, 좌약식(suppository) 투여, 정맥내(intravenous) 투여 및 내피(intradermic) 투여, 위내(intragaster) 투여, 근육내(intramusclar) 투여, 복막내(intraperitoneal) 투여 및 정맥내(intravenous) 투여 경로로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 골관절염 및 류마티즘 관절염과 관련한 병리학적 이상 증상들의 예방 및 치료 방법.
  18. 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물을 포함하여 이루어지는 조성물의 유효한 양을 이를 필요로 하는 호스트에게 투여하는 것을 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 사이클로옥시게나제-2 효소의 효소적 활성을 억제하는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 조성물이 체중에 대하여 0.01 내지 200㎎/㎏의 투여량으로 투여됨을 특징으로 하는 사이클로옥시게나제-2 효소의 효소적 활성을 억제하는 방법.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 투여 경로가 경구적(oral) 투여, 국부적(topical) 투여, 좌약식(suppository) 투여, 정맥내(intravenous) 투여 및 내피(intradermic) 투여, 위내(intragaster) 투여, 근육내(intramusclar) 투여, 복막내(intraperitoneal) 투여 및 정맥내(intravenous) 투여 경로로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 사이클로옥시게나제-2 효소의 효소적 활성을 억제하는 방법.
  21. 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물을 포함하여 이루어지는 조성물의 유효한 양을 이를 필요로 하는 호스트에게 투여하는 것을 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 5-리폭시게나제 효소의 효소적 활성을 억제하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 조성물이 체중에 대하여 0.01 내지 200㎎/㎏의 투여량으로 투여됨을 특징으로 하는 5-리폭시게나제 효소의 효소적 활성을 억제하는 방법.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 투여 경로가 경구적(oral) 투여, 국부적(topical) 투여, 좌약식(suppository) 투여, 정맥내(intravenous) 투여 및 내피(intradermic) 투여, 위내(intragaster) 투여, 근육내(intramusclar) 투여, 복막내(intraperitoneal) 투여 및 정맥내(intravenous) 투여 경로로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 5-리폭시게나제 효소의 효소적 활성을 억제하는 방법.
  24. 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물을 포함하여 이루어지는 조성물의 유효한 양을 이를 필요로 하는 호스트에게 투여함을 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 사이클로옥시게나제-2 효소 및 5-리폭시게나제 효소의 효소적 활성을 동시에 억제하는 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 조성물이 체중에 대하여 0.01 내지 200㎎/㎏의 투여량으로 투여됨을 특징으로 하는 사이클로옥시게나제-2 효소 및 5-리폭시게나제 효소의 효소적 활성을 동시에 억제하는 방법.
  26. 제24항에 있어서,
    상기 투여 경로가 경구적(oral) 투여, 국부적(topical) 투여, 좌약식(suppository) 투여, 정맥내(intravenous) 투여 및 내피(intradermic) 투여, 위내(intragaster) 투여, 근육내(intramusclar) 투여, 복막내(intraperitoneal) 투여 및 정맥내(intravenous) 투여 경로로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 사이클로옥시게나제-2 효소 및 5-리폭시게나제 효소의 효소적 활성을 동시에 억제하는 방법.
  27. 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물을 포함하여 이루어지는 조성물의 유효한 양을 이를 필요로 하는 호스트에게 투여함을 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는cox-2 mRNA 생성의 억제 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 조성물이 체중에 대하여 0.01 내지 200㎎/㎏의 투여량으로 투여됨을 특징으로 하는cox-2 mRNA 생성의 억제 방법.
  29. 제27항에 있어서,
    상기 투여 경로가 경구적(oral) 투여, 국부적(topical) 투여, 좌약식(suppository) 투여, 정맥내(intravenous) 투여 및 내피(intradermic) 투여, 위내(intragaster) 투여, 근육내(intramusclar) 투여, 복막내(intraperitoneal) 투여 및 정맥내(intravenous) 투여 경로로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는cox-2 mRNA 생성의 억제 방법.
  30. 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물을 포함하여 이루어지는 조성물의 유효한 양을 이를 필요로 하는 호스트에게 투여함을 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 COX-2 및 5-LO 경로에 의해 매개되는 질병 및 이상 증상의 예방 및 치료 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 조성물이 체중에 대하여 0.01 내지 200㎎/㎏의 투여량으로 투여됨을 특징으로 하는 COX-2 및 5-LO 경로에 의해 매개되는 질병 및 이상 증상의 예방 및 치료 방법.
  32. 제30항에 있어서,
    상기 투여 경로가 경구적(oral) 투여, 국부적(topical) 투여, 좌약식(suppository) 투여, 정맥내(intravenous) 투여 및 내피(intradermic) 투여, 위내(intragaster) 투여, 근육내(intramusclar) 투여, 복막내(intraperitoneal) 투여 및 정맥내(intravenous) 투여 경로로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 COX-2 및 5-LO 경로에 의해 매개되는 질병 및 이상 증상의 예방 및 치료 방법.
  33. 제30항에 있어서,
    상기 COX-2 및 5-LO 경로에 의해 매개되는 생리학적 및 병리학적 이상 증상이 월경통, 동맥경화증, 심장마비, 비만, 당료병, X 증후군, 알츠하이머 질병, 호흡기 알레르기 반응, 만성 정맥 부전, 치질, 전신성 홍반성 루푸스(Systemic Lupus Erythematosus), 건선, 만성 긴장 두통, 편두통, 염증성 장 질환; 바이러스, 박테리아 및 균에 의한 국부적 전염병, 일광화상, 화상, 접촉성 피부염, 흑색종 및 암종으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 COX-2 및 5-LO 경로에 의해 매개되는 질병 및 이상 증상의 예방 및 치료 방법.
  34. 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물을 포함하여 이루어지는 조성물의 유효한 양을 이를 필요로 하는 호스트에게 투여함을 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 혈당 농도를 감소시키는 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 조성물이 체중에 대하여 0.01 내지 200㎎/㎏의 투여량으로 투여됨을 특징으로 하는 혈당 농도를 감소시키는 방법.
  36. 제34항에 있어서,
    상기 투여 경로가 경구적(oral) 투여, 국부적(topical) 투여, 좌약식(suppository) 투여, 정맥내(intravenous) 투여 및 내피(intradermic) 투여, 위내(intragaster) 투여, 근육내(intramusclar) 투여, 복막내(intraperitoneal) 투여 및 정맥내(intravenous) 투여 경로로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 혈당 농도를 감소시키는 방법.
  37. 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물을 포함하여 이루어지는 조성물의 유효한 양을 이를 필요로 하는 호스트에게 투여함을 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 체질량 지수(body mass index, BMI) 감소 및 체중 감소를 위한 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 조성물이 체중에 대하여 0.01 내지 200㎎/㎏의 투여량으로 투여됨을 특징으로 하는 체질량 지수(body mass index, BMI) 감소 및 체중 감소를 위한 방법.
  39. 제37항에 있어서,
    상기 투여 경로가 경구적(oral) 투여, 국부적(topical) 투여, 좌약식(suppository) 투여, 정맥내(intravenous) 투여 및 내피(intradermic) 투여, 위내(intragaster) 투여, 근육내(intramusclar) 투여, 복막내(intraperitoneal) 투여 및 정맥내(intravenous) 투여 경로로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 체질량 지수(body mass index, BMI) 감소 및 체중 감소를 위한 방법.
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