ES2330097T3

ES2330097T3 - Formulacion de una mezcla de flavanos y flavonoides de anillo b libre como un agente terapeutico.

Info

Publication number: ES2330097T3
Application number: ES03726548T
Authority: ES
Inventors: Qi Jia
Original assignee: Unigen Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Unigen Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2002-04-30
Filing date: 2003-04-30
Publication date: 2009-12-04
Anticipated expiration: 2023-04-30
Also published as: US20030232763A1; RU2004135069A; EP1503778A4; KR100621234B1; AU2003228777A1; DK1503778T3; US7514469B2; WO2003092599A3; JP2005529898A; CN100544715C; EP1503778B1; CN101837003B; CA2703698C; CA2484192A1; BRPI0309689B1; NZ535988A; DE60328676D1; US9655940B2; US20030216481A1; CN101837003A

Abstract

Composición que comprende una mezcla de baicalina y catequina, en la que la baicalina se aísla de una planta o plantas del género de plantas Scutellaria y la catequina se aísla de una planta o plantas del género de plantas Acacia.

Description

Formulación de una mezcla de flavanos y flavonoides de anillo B libre como un agente terapéutico.

Campo de la invención

Esta invención se refiere de forma general a la prevención y al tratamiento de enfermedades y afecciones con origen en las vías de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) y la 5-lipoxigenasa (5-LO). Específicamente, la presente invención se refiere a una composición de materia que comprende una mezcla de un preparado de dos clases específicas de compuestos -flavonoides de anillo B libre y flavanos- para su utilización en la prevención y el tratamiento de enfermedades y afecciones con origen en las vías de las enzimas COX-2 y 5-LO. Los usos se basan en la inhibición simultánea de la actividad de la proteína de las enzimas COX-2 y 5-LO, y un método para modular la producción del ARNm mediante la administración de la nueva composición de esta invención. También se incluye en la presente invención una utilización para la prevención y el tratamiento de las enfermedades y afecciones con origen en la COX-2 y la 5-LO, que incluye, pero sin limitarse a ellos, el malestar y el dolor articulares asociados a afecciones tales como la artrosis, la artritis reumatoide y otras lesiones que son resultado de una sobrecarga. En la presente invención se incluye adicionalmente una utilización para reducir la concentración de la glucosa en la sangre y favorecer la pérdida de peso. También se da a conocer una nueva composición que comprende una mezcla de la baicalina aislada del género de plantas Scutellaria, y la catequina aislada del género de plantas Acacia.

Antecedentes de la invención

La liberación y el metabolismo del ácido araquidónico (AA) de la membrana celular da lugar a la generación de metabolitos proinflamatorios por varias vías diferentes. Posiblemente, en dos de las vías más importantes para la inflamación intervengan las enzimas 5-lipoxigenasa (5-LO) y ciclooxigenasa (COX). Estas vías paralelas dan lugar a la generación de leucotrienos y prostaglandinas, respectivamente, que desempeñan funciones importantes en el inicio y el progreso de la respuesta inflamatoria. Estos compuestos vasoactivos son las quimiotaxinas, que favorecen la infiltración de las células inflamatorias en los tejidos y sirven para prolongar la respuesta inflamatoria. En consecuencia, las enzimas que se encargan de generar estos mediadores de la inflamación se han convertido en las dianas de muchos fármacos nuevos destinados al tratamiento de la inflamación que contribuye a la patogenia de enfermedades tales como la artritis reumatoide, la artrosis, la enfermedad del Alzheimer y determinados tipos de cáncer.

La inhibición de la enzima ciclooxigenasa (COX) es el mecanismo de acción atribuido a la mayoría de los antiinflamatorios no esteroideos (AINE). Existen dos isoformas diferentes de la enzima COX (COX-1 y COX-2) que comparten una homología de secuencia del 60% aproximadamente, pero que difieren en los perfiles de expresión y su función. La COX-1 es una forma constitutiva de la enzima que se ha relacionado con la producción de prostaglandinas fisiológicamente importantes implicadas en la regulación de las funciones fisiológicas normales, tales como la agregación plaquetaria, la protección del funcionamiento de las células del estómago y el mantenimiento de la función renal normal (Dannhardt y Kiefer (2001). Eur. J. Med. Chem. 36: 109-26). La segunda isoforma, la COX-2, es una forma de la enzima que es inducible mediante citocinas proinflamatorias, tales como la interleucina-1\beta (IL-1\beta) y otros factores de crecimiento (Herschmann (1994) Cancer Mestastasis Rev. 134: 241-56; Xie et al. (1992) Drugs. Dev. Res. 25: 249-65). Esta isoforma cataliza la producción de la prostaglandina E_{2} (PGE_{2}) a partir del AA. La inhibición de la COX-2 es responsable de la actividad antiinflamatoria de los AINE convencionales.

Los inhibidores que muestren una especificidad dual para la COX-2 y la 5-LO, al mismo tiempo que mantienen la selectividad por la COX-2 respecto a la COX-1, tendrían el beneficio obvio de inhibir varias vías del metabolismo del AA. Tales inhibidores bloquearían los efectos inflamatorios de la PGE_{2} así como los de varios leucotrienos (LT) al limitar su producción. Esto incluye la vasodilatación, la vasopermeabilidad y los efectos quimiotácticos de LTB_{4} y LTD_{4} y los efectos del LTE_{4}, también conocidos como las sustancias de la reacción lenta de la anafilaxia. De ellas, el LTB_{4} tiene los efectos quimiotácticos y quimiocinéticos más potentes (Moore (1985) en "Prostanoids: Pharmacological, Physiological and Clinical Relevance", Cambridge University Press, N.Y., pág. 229-30) y se ha demostrado que es elevada en la mucosa gastrointestinal de los pacientes con enteropatías inflamatorias (Sharon y Stenson (1983) Gastroenterology 84: 1306-13) y dentro del líquido sinovial de los pacientes con artritis reumatoide (Klicksein et al. (1980) J. Clin. Invest. 66: 1166-70; Rae et al., (1982) Lancet ii: 1122-4).

Además de los beneficios antes mencionados de los inhibidores duales COX-2/5-LO, muchos inhibidores duales no ocasionan algunos de los efectos secundarios que son típicos de los AINE o de los inhibidores de la COX-2, que incluyen el daño y el malestar digestivos ocasionados por los AINE tradicionales. Se ha sugerido que la inflamación gástrica inducida por los AINE se debe en gran parte a los metabolitos de la 5-LO, en particular el LTB_{4}, que atrae las células al lugar de una lesión gástrica, lo que ocasiona un daño adicional (Kircher et al., (1997) Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 56: 417-23). Los leucotrienos representan los metabolitos primarios del AA dentro de la mucosa gástrica después de la inhibición de los prostanoides. Resulta que estos compuestos contribuyen a una cantidad significativa de la lesión epitelial gástrica que se deriva de la utilización de los AINE (Celotti y Laufer (2001) Pharmacol. Res. 43: 429-36). También se demostró que los inhibidores duales de la COX-2 y la 5-LO inhibían la vasoconstricción coronaria del corazón de los artríticos en un modelo de ratas (Gok et al. (2000) Pharmacology 60: 41-46). En conjunto, estas características sugieren que pueden existir ventajas específicas de los inhibidores duales de la COX-2 y la 5-LO frente a los inhibidores específicos de la COX-2 y de los AINE inespecíficos con respecto tanto al aumento de la eficacia como a la reducción de los efectos secundarios.

Ya que el mecanismo de acción de los inhibidores de la COX se solapa con el de la mayoría de los AINE convencionales, se utilizan los inhibidores de la COX para tratar muchos síntomas parecidos, tal como el dolor y la tumefacción asociados a la inflamación en las afecciones transitorias y las enfermedades crónicas en las que la inflamación desempeña una función decisiva. Las afecciones transitorias incluyen el tratamiento de la inflamación asociada a rozaduras menores, quemaduras solares o dermatitis de contacto, así como el alivio del dolor asociado a las cefaleas tensionales y las cefaleas migrañosas y la dismenorrea. Las afecciones crónicas incluyen enfermedades artríticas tales como la artritis reumatoide y la artrosis. Aunque la artritis reumatoide es en su mayor parte una enfermedad autoinmunitaria y la artrosis está causada por la degradación del cartílago de las articulaciones, la reducción de la inflamación asociada a cada una de ellas proporciona un aumento significativo de la calidad de vida para los que padecen estas enfermedades (Wienbwerg (2001) Immunol. Res. 22: 319-41; Wollhiem (2000) Curr. Opin. Rheum. 13: 193-201). Como la inflamación es un componente de las enfermedades reumáticas en general, se ha expandido la utilización de los inhibidores de la COX para incluir enfermedades tales como el lupus eritematoso diseminado (LED) (Goebel et al., (1999) Chem. Res. Tox. 12: 488-500; Patrono et al., (1985) J. Clin. Invest. 76: 1011-1018) y afecciones cutáneas reumáticas tales como la esclerodermia. Los inhibidores de la COX también se utilizan para el alivio de las afecciones cutáneas inflamatorias que no son de origen reumático, tales como la psoriasis, en las que a reducción de la inflamación debida a la sobreproducción de prostaglandinas podría proporcionar un beneficio directo (Fogh et al. (1993) Acta Derm. Venereol'' (Oslo) 73: 191-3).

Además de su uso como antiinflamatorios, otra posible función de los inhibidores de la COX es el tratamiento del cáncer. Se ha demostrado que la COX-2 se sobreexpresa en distintas neoplasias malignas humanas, y los inhibidores de la COX-2 han resultado ser eficaces para el tratamiento de animales con tumores cutáneos, en la mama o en la vejiga. Aunque el mecanismo de acción no se comprende completamente, se ha mostrado que la sobreexpresión de la COX-2 inhibe la apoptosis y aumenta la capacidad invasiva de los tipos de las células neoplásicas (Dempke et al. (2001) J. Can. Res. Clin. Oncol.127: 411-17; Moore y Simmons (2000) Current Med. Chem. 7: 1131-44). Es posible que el aumento de la producción de prostaglandinas, de resultas de la sobreexpresión de la COX-2, favorezca la proliferación celular y, por consiguiente, aumente la angiogenia (Moore (1985) en "Prostanoids: Pharmacological, Physiological and Clinical Relevance", Cambridge University Press, N. Y., pág. 229-30; Fenton et al, (2001) Am. J. Clin. Oncol. 24: 453-57).

Se han realizado una serie de estudios clínicos para evaluar los inhibidores de la COX-2 para su posible utilización en la prevención y el tratamiento de diferentes tipos de cáncer. En 1999 se diagnosticaron 130 000 nuevos casos de cáncer colorrectal en los Estados Unidos. Se ha encontrado que el ácido acetilsalicílico, un AINE inespecífico, reduce la incidencia del cáncer colorrectal en torno al 40-50% (Giovannucci et al. (1995) N. Engl. J. Med. 333: 609-614) y la mortalidad hasta el 50% (Smalley et al. (1999) Arch. Intern. Med. 159: 161-166). En 1999, la FDA autorizó la utilización del celecoxib, un inhibidor de la COX-2, en la poliposis adenomatosa familiar (PAF) para reducir la mortalidad del cáncer colorrectal. Se cree que otros cánceres en los que se sabe que la COX-2 interviene se pueden prevenir y/o tratar exitosamente con inhibidores de la COX-2 que incluyen, pero sin limitarse a ellos, el cáncer esofágico, el cáncer de cabeza y cuello, el cáncer de mama, el cáncer de vejiga, el cáncer cervical, el cáncer de próstata, el carcinoma hepatocelular y el cáncer pulmonar no microcítico (Jaeckel et al., (2001) Arch. Otolaryngol. 127: 1253-59; Kirschenbaum et al., (2001) Urology 58: 127-31; Dannhardt y Kiefer (2001) Eur. J. Med. Chem. 36: 109-26). Los inhibidores de la COX-2 también pueden resultar exitosos a la hora de prevenir el cáncer de colon en los pacientes de alto riesgo. También existen pruebas de que los inhibidores de la COX-2 pueden prevenir o incluso revertir varios tipos de cánceres potencialmente mortales. Hasta la fecha, nada menos que 50 estudios demuestran que los inhibidores de la COX-2 pueden prevenir los tumores premalignos y malignos en los animales y, posiblemente, prevenir los cánceres de vejiga, esofágico y cutáneos también. La inhibición de la COX-2 podría resultar ser uno de los logros médicos preventivos más importantes del siglo.

El progreso científico reciente ha identificado la existencia de correlaciones entre la expresión de la COX-2, la inflamación general y la patogenia de la enfermedad de Alzheimer (EA) (Ho et al., (2001) Arch. Neurol. 58: 487-92). En los modelos de animales, los ratones transgénicos que sobreexpresan la enzima COX-2 tienen neuronas que son más susceptibles al daño. El National Institute on Aging (NIA) está llevando a cabo un ensayo clínico para determinar si los AINE pueden enlentecer la progresión de la enfermedad de Alzheimer. Se evaluarán el naproxeno (un AINE no selectivo) y el rofecoxib (Vioxx, un AINE selectivo específico de la COX-2). Los resultados previos habían indicado que la inflamación contribuye a la enfermedad de Alzheimer. De acuerdo con la Asociación del Alzheimer y el NIA, aproximadamente 4 millones de personas padecen la EA en los Estados Unidos y se espera que aumente a 14 millones hacia mediados de siglo.

La enzima COX (también conocida como prostaglandina H_{2} sintasa) cataliza dos reacciones diferentes. En la primera reacción, el AA se metaboliza para formar la prostaglandina G_{2} (PGG_{2}) inestable, que es una reacción de ciclooxigenasa. En la segunda reacción, la PGG_{2} se convierte en el endoperóxido PGH_{2}, que es una reacción de peroxidasa. La PGH_{2} de vida corta se degrada no enzimáticamente a PGE_{2}. Los compuestos descritos en la presente memoria son el resultado de una estrategia de descubrimiento que combinó un ensayo centrado en la inhibición de la actividad peroxidasa de la COX-1 y la COX-2 con un procedimiento de desreplicación química para identificar nuevos inhibidores de las enzimas COX.

A menudo se utiliza la terminología expresión génica para describir el resultado amplio de la producción de ARNm y la síntesis de proteínas. De hecho, los cambios en la expresión génica real puede que nunca den lugar a cambios observables en la cantidad de proteína. La contrapartida, que los cambios en la cantidad de proteína no siempre se deben a los cambios en la expresión génica, también puede ser cierto. Existen seis puntos posibles de regulación en la vía que va del ADN genómico a una proteína funcional: 1) la regulación transcripcional por factores nucleares y otras señales, que conduce a la producción de pre-ARNm; 2) la regulación del procesamiento del pre-ARNm, lo que implica el ayuste de los exones, la adición de una estructura de caperuza en el extremo 5' y de la secuencia de poliadenilación en 3', y el transporte del ARNm maduro desde el núcleo al citoplasma; 3) la regulación del transporte del ARNm, lo que controla la localización del ARN en un sitio citoplasmático específico para que se traduzca en una proteína; 4) la regulación de la degradación del ARN, lo que controla el tamaño del conjunto de ARNm bien antes de que se traduzca una proteína o como un medio para finalizar la traducción desde este ARNm específico; 5) la regulación traduccional de la velocidad específica del inicio de traducción de las proteínas, y 6) la regulación del procesamiento postraduccional que implica modificaciones tales como la glucosilación y la escisión proteolítica. En el contexto de la investigación genómica, es importante utilizar técnicas que midan los niveles de expresión génica cerca de las etapas iniciales (por ejemplo, niveles del ARNm) y no de las etapas posteriores (p. ej., niveles de las proteínas) en esta vía.

Los artículos recientes han tratado la posible implicación de los flavonoides, aislados de la hierba medicinal Scutellaria baicalensis, en las alteraciones de la expresión génica de la COX-2 (Wakabayashi y Yasui (2000) Eur. J. Pharmacol. 406: 477-481; Chen et al., (2001) Biochem. Pharmacol. 61: 1417-1427; Chi et al. (2001) 61: 1195-1203 y Raso et al. (2001) Life Sci. 68: 921-931). Cada uno de los estudios que se acaban de citar sobre la expresión génica de la COX-2 utilizó una técnica de inmunotransferencia para evaluar las posibles alteraciones de la expresión génica sin ninguna validación a escala molecular. Ya que este método sólo mide la cantidad de la proteína y no el producto de transcripción específico, el ARNm, es posible que estén implicados otros mecanismos que conduzcan al aumento observado de la expresión de las proteínas. Por ejemplo, se ha descrito que el LPS modula la semivida de los ARNm mediante las secuencias de inestabilidad encontradas en la región en 3' sin traducir (3'-UTR, por sus siglas en inglés) de los ARNm (Watkins et al (1999) Life Sci 65: 449-481), que podría explicar el aumento de la expresión de las proteínas sin hallar alteraciones en la velocidad de la transcripción de los genes. Por consiguiente, esto deja abierta la cuestión de si estas condiciones de tratamiento dieron lugar o no a un cambio significativo de la expresión génica.

Las técnicas, tales como el análisis de micromatrices de ADN y de RT-qPCR, basan el análisis en los niveles del ARNm y se pueden utilizar para evaluar el nivel de la expresión génica en diferentes condiciones, a saber, en presencia o ausencia de un fármaco. No se conoce en la bibliografía la existencia de artículos que midan específicamente la cantidad de ARNm, directa o indirectamente, cuando se utilizan flavonoides de anillo B libre o flavanos como fármacos terapéuticos.

Los flavonoides son un grupo ampliamente distribuido de productos naturales. Se ha demostrado que la ingesta de flavonoides presenta una relación inversa con el riesgo de demencia nueva. Se ha propuesto que el mecanismo de acción, aunque se desconoce, se debe a los efectos antioxidantes de los flavonoides (Commenges et al., (2000) Eur. J. Epidemiol., 16: 357-363). Las flavonas polifenólicas inducen la muerte celular programada, la diferenciación y la inhibición del crecimiento en colonocitos transformados al actuar sobre el ARNm de genes que incluyen la COX-2, el factor nuclear \kappa B (NF\kappaB) y bcl-X(L) (Wenzel et al., (2000) Cancer. Res. 60: 3823-3831). Se ha descrito que el número de grupos hidroxilo sobre el anillo B es importante para la supresión de la actividad transcripcional de la COX-2 (Mutoh et al., (2000) Jnp. J. Cancer Res. 91: 686-691).

Las flavonas y los flavonoles de anillo B libre son una clase específica de flavonoides que no tienen grupos sustituyentes sobre el anillo B aromático (denominados en la presente memoria como flavonoides de anillo B libre), tal y que se ilustra mediante la estructura general siguiente:

1

en la que

R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -H, -OH, -SH, OR, -SR, -NH_{2}, -NHR, -NR_{2}, -NR_{3}^{+}X^{-}, un carbono, oxígeno, nitrógeno o azufre, glucósido de un solo azúcar o una combinación de varios azúcares que incluye, pero sin limitarse a ellos, aldopentosas, metilaldopentosa, aldohexosas, cetohexosa y los derivados químicos de los mismos;

en la que

R es un grupo alquilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; y

X se selecciona entre del grupo de contraaniones farmacéuticamente aceptables que incluye, pero sin limitarse a ellos, hidroxilo, cloruro, yoduro, sulfato, fosfato, acetato, fluoruro, carbonato, etc.

Los flavonoides de anillo B libre son relativamente raros. De los 9396 flavonoides sintetizados o aislados de fuentes naturales, sólo se conocen 231 flavonoides de anillo B libre (The Combined Chemical Dictionary, Champan & Hall/CRC, versión 5:1, junio de 2001). Se ha descrito que los flavonoides de anillo B libre tienen una variada actividad biológica. Por ejemplo, la galangina (3,5,7-trihidroxiflavona) actúa como un antioxidante y un depurador de radicales libres, y se cree que es un candidato prometedor para la anti-genotoxicidad y la quimioprevención del cáncer (Heo et al., (2001) Mutat. Res. 488: 135-150). Es un inhibidor de la tirosinasa monofenolasa (Kubo et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. 8: 1749-1755), un inhibidor de la carbonilo reductasa de corazón de conejo (Imamura et al., (2000) J. Biochem. 127: 653-658), tiene actividad antimicrobiana (Afolayan y Meyer (1997) Ethnopharmacol. 57: 177-181) y actividad antivírica (Meyer et al., (1997) J. Ethnopharmacol. 56: 165-169). La baicaleína y otros dos flavonoides de anillo B libre tienen actividad antiproliferativa contra las células del cáncer de mama humano (So et al. (1997) Cancer Lett.112: 127-133).

Típicamente, se ha comprobado aleatoriamente la actividad de los flavonoides basándose en su disponibilidad. De vez en cuando se ha hecho hincapié en el requisito de sustitución sobre el anillo B para que tengan actividad biológica específica, tal como la sustitución del anillo B requerida para la unión de gran afinidad a la p-glucoproteína (Boumendjel et al., (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11: 75-77); el efecto cardiotónico (Itoigawa et al., (1999) J. Ethnopharmacol. 65: 267-272), el efecto protector sobre las células endoteliales contra la toxicidad inducida por el hidroperóxido del ácido linoleico (Kaneko y Baba (1999) Biosci. Biotechnol. Biochem. 63: 323-328), la actividad inhibidora de la COX-1 (Wang (2000) Phytomedicine 7: 15-19) y actividad prostaglandina endoperóxido sintasa (Kalkbrenner et al., (1992) 44: 1-12). Sólo unas pocas publicaciones han mencionado la importancia del anillo B sin sustituir de los flavonoides de anillo B libre. Un ejemplo es el uso de las 2-fenilflavonas, que inhiben la NADPH:quinona aceptora oxidorreductasa, como posibles anticoagulantes (Chen et al. (2001) Biochem. Pharmacol. 61: 1417-1427).

Ha sido polémico el mecanismo de acción descrito con respecto a la actividad antiinflamatoria de diferentes flavonoides de anillo B libre. La actividad antiinflamatoria de los flavonoides de anillo B libre crisina (Liang et al. (2001) FEBS Lett. 496: 12-18), wogonina (Chi et al. (2001) Biochem. Pharmacol. 61: 1195-1203) y halangina (Raso et al. (2001) Life Sci. 68: 921-931) se ha asociado a la supresión de la ciclooxigenasa inducible y la óxido nítrico sintasa a través de la activación del receptor \gamma por la proliferación de los peroxisomas (PPAR\gamma) e influyen en la desgranulación y la liberación del AA (Tordera et al., (1994) Z. Naturforsch [C] 49: 235-240). Se ha descrito que la orolixina, la baicaleína y la wogonina inhiben la actividad de la 12-lipoxigenasa sin afectar a las ciclooxigenasas (You et al., (1999) Arch. Pharm. Res. 22: 18-24). Más recientemente,se ha descrito que la actividad antiinflamatoria de la wogonina, la baicalina y la baicaleína se produce por la inhibición de la óxido nítrico sintasa inducible y la producción de la enzima COX-2 inducida por inhibidores del óxido nítrico y lipopolisacáridos (Chen et al., (2001) Biochem. Pharmacol. 61: 1417-1427). También se ha descrito que la oroxilina actúa a través de la supresión de la activación del NF\kappaB (Chen et al., (2001) Biochem. Pharmacol. 61: 1417-1427). Finalmente, se ha descrito que la wogonina inhibe la producción de PGE_{2} inducible en los macrófagos (Wakabayashi y Yasui (2000) Eur. J. Pharmacol. 406: 477-481).

Se ha descrito que la inhibición de la fosforilación de la proteína cinasa activada por mitógenos (MAPK) y la inhibición, por la baicaleína, de la liberación de la PGE_{2} inducida por el ionóforo de Ca^{2+} A23187 es el mecanismo de la actividad antiinflamatoria de Scutellarie radix (Nakahata et al. (1999) Nippon Yakurigaku Zasshi 114, Supp. 11: 215P-219P; Nakahata et al. (1998) Am. J. Chin. Med. 26: 311-323). Se ha descrito que la baicaleína de Scutellaria baicalensis inhibe la proliferación de los linfocitos T y la producción de IL-1\beta, IL-6, el factor \alpha de la necrosis tumoral (TNF-\alpha) y el interferón-\gamma (IFN-\gamma) que se estimula con las exotoxinas estafilocócicas superantigénicas (Krakauer et al. (2001) FEBS Lett. 500: 52-55). Por lo tanto, se ha asociado la actividad antiinflamatoria de la baicalina a la inhibición de las vías de señalización en las que intervienen las citocinas proinflamatorias activadas por superantígenos. Sin embargo, también se ha propuesto que la actividad antiinflamatoria de la baicalina se debe a la unión de numerosas quimiocinas, lo que limita su actividad biológica (Li et al. (2000) Immunopharmacol. 49: 295-306). Recientemente se han descrito los efectos de la baicalina sobre la expresión de la molécula de adhesión inducida por la trombina y el péptido agonista del receptor de la trombina (Kimura et al. (2001) Planta Med. 67: 331-334), así como la inhibición de la cascada de las MAPK (Nakahata et al. (1999) Nippon Yakurigaku Zasshi 114, Supp. 11: 215P-219P; Nakahata et al. (1998) Am. J. Chin. Med. 26:311-323).

La planta medicinal china Scutellaria baicalensis contiene cantidades significativas de flavonoides de anillo B libre, que incluyen la baicaleína, la baicalina, la wogonina y el baicalenósido. Tradicionalmente se ha utilizado esta planta para tratar una serie de afecciones, entre ellas evitar la subida de temperatura, eliminar la fiebre, síndromes de humedad-calor y de fiebre del verano; polidipsia debida a fiebre alta; ántrax; llagas y otras infecciones cutáneas piógenas; infecciones de las vías respiratorias altas tales como amigdalitis aguda, laringofaringitis y escarlatina; hepatitis vírica; nefritis; pelvitis; disentería; hematemesis y epistaxis. Tradicionalmente se ha utilizado esta planta también para prevenir el aborto (véase Encyclopedia of Chinese Traditional Medicine, ShangHai, Science and Technology Press, ShanHai, China, 1998). Clínicamente, Scutellaria se utiliza en la actualidad para tratar afecciones tales como la neumonía infantil, la diarrea bacteriana infantil, la hepatitis vírica, la inflamación de la vesícula biliar, la hipertensión, la inflamación aguda tópica debida a cortes y a la intervención quirúrgica, el asma bronquial y las infecciones de las vías respiratorias altas (Encyclopedia of Chinese Traditional Medicine, ShangHai Science and Technology Press, ShangHai, China, 1998). La eficacia farmacológica de las raíces de Scutellaria a la hora de tratar el asma bronquial se supone que está relacionada con la presencia de flavonoides de anillo B libre y la supresión del reclutamiento de eosinófilos asociado a la eotaxina (Nakajima et al. (2001) Planta Med. 67(2): 132-135).

Hasta la fecha se han comercializado una serie de flavonoides de anillo B libre naturales para diversos usos. Por ejemplo, se han utilizado formulaciones liposómicas de extractos de Scutellaria para el cuidado de la piel (patente de los EE.UU. n.º 5.643.598; n.º 5.443.9S3). La baicalina se ha utilizado para prevenir el cáncer debido a su efecto inhibidor de los oncogenes (patente de los EE.UU. n.º 6.290.995). La baicalina y otros compuestos se han utilizado como antivíricos, antibacterianos e inmunomoduladores (patente de los EE.UU. n.º 6.083.921) y como antioxidantes naturales (publicación de Polonia n.º 9.849.256). Se ha utilizado la crisina por sus propiedades reductoras de la ansiedad (patente de los EE.UU. n.º 5.756.538). Los flavonoides antiinflamatorios se utilizan para el control y el tratamiento de las enfermedades anorrectales y colónicas (patente de los EE.UU. n.º 5.858.371) y la inhibición de la lipoxigenasa (patente de los EE.UU. n.º 6.217.875). Estos compuestos también se formulan con colágeno y glucosamina y otros ingredientes para reparar y mantener el tejido conjuntivo (patente de los EE.UU. n.º 6.333.304). Los ésteres de flavonoides constituyen los ingredientes activos de composiciones cosméticas (patente de los EE.UU. n.º 6.235.294). La solicitud de patente de los EE.UU de n.º de serie 10/091.362, registrada el 1 de marzo de 2002, titulada "Identification of Free-B ring Flavonoids as Potent COX-2 Inhibitors" describe un método para inhibir la enzima ciclooxigenasa COX-2 mediante la administración de una composición que comprende un flavonoide de anillo B libre o una composición que contiene una mezcla de flavonoides de anillo B libre a un hospedador que lo necesite. Es la primera descripción de una relación entre los flavonoides de anillo B libre y la actividad inhibidora de la COX-2. Esta solicitud se incorpora específicamente en la presente invención en su totalidad por referencia.

La patente japonesa n.º 63027435 describe la extracción y el enriquecimiento de la baicaleína, y la patente japonesa n.º 61050921 describe la purificación de la baicalina. Los flavanos incluyen compuestos ilustrados por la estructura general siguiente:

2

en la que

R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -H, -OH, -SH, -OCH_{3}, -SCH_{3}, -OR, -SR, -NH_{2}, -NRH, -NR_{2}, -NR_{3}^{+}X^{-}, ésteres de los grupos de sustitución mencionados, que incluyen, pero sin limitarse a ellos, galato, acetato, ésteres de cinamoílo y de hidroxil-cinamoílo, ésteres de trihidroxibenzoílo y ésteres de cafeoílo, y los derivados químicos de los mismos; un carbono, oxígeno, nitrógeno o azufre, glucósido de un solo azúcar o una combinación de varios azúcares que incluye, pero sin limitarse a ellos, aldopentosas, metilaldopentosa, aldohexosas, cetohexosa y los derivados químicos de los mismos; dímeros, trímeros y otros flavanos polimerizados;

en la que

R es un grupo alquilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; y

X se selecciona del grupo de contraaniones farmacéuticamente aceptables que incluye, pero sin limitarse a ellos, hidroxilo, cloruro, yoduro, sulfato, fosfato, acetato, fluoruro y carbonato, etc.

\newpage

La catequina es un flavano, encontrado principalmente en Acacia, que tiene la estructura siguiente

3

La catequina actúa tanto sola como junto a otros flavonoides encontrados en el té, y tiene tanto actividad antivírica como antioxidante. Se ha demostrado que la catequina es eficaz para el tratamiento de la hepatitis vírica. También parece prevenir el daño oxidativo del corazón, el riñón, los pulmones y el bazo, y se ha demostrado que inhibe el crecimiento de las células del cáncer de estómago.

La catequina y su isómero, la epicatequina, inhiben la prostaglandina endoperóxido sintasa con un valor de CI_{50} de 40 \muM (Kalkbrenner et al., (1992) Pharmacol. 44:1-12). Cinco derivados del 3-flavanol, incluidos (+)-catequina y galocatequina, aislados de cuatro especies vegetales, Atuna racemosa, Syzygium carynocarpum, Syzygium malaccense y Vantenea peruviana, muestran una actividad inhibidora igual o más débil contra COX-2, respecto a la de COX-1, con valores de CI_{50} que oscilan de 3,3 \muM a 138 \muM (Noreen et al. (1998) Planta Med. 64: 520-524). La (+)-catequina, aislada de la corteza de Ceiba pentandra, inhibe la COX-1 con un valor de CI_{50} de 80 \muM (Noreen et al. (1998) J. Nat. Prod. 61: 8-12). La (+)-catequina pura disponible en el mercado inhibe la COX-1 con un valor de CI_{50} en torno a 183 a 279 \muM, según las condiciones experimentales, sin ninguna especificidad por la COX-2 (Noreen et al. (1998) J. Nat. Prod. 61: 1-7).

La catequina del té verde, cuando se añadió a las dietas de las ratas macho Sprague dawley, disminuyó el nivel de actividad PLA_{2} de las plaquetas y redujo significativamente la concentración de ciclooxigenasas plaquetarias (Yang et al. (1999) J. Nutr. Sci. Vitaminol. 45: 337-346). Se ha descrito que la catequina y la epicatequina suprimen débilmente la transcripción del gen cox-2 en las células DLD-1 de cáncer de colon humano (CI_{50} = 415,3 \muM) (Mutoh et al. (2000) Jpn. J. Cancer Res. 91: 686-691). La capacidad neuroprotectora de la (+)-catequina del vino tinto es resultado de las propiedades antioxidantes de la catequina, y no de los efectos inhibidores sobre las enzimas intracelulares, tal como la ciclooxigenasa, la lipoxigenasa o la óxido nítrico sintasa (Bastianetto et al. (2000) Br. J. Pharmacol. 131: 711-720). Los derivados de la catequina purificados del té verde y del té negro, tal como la epigalocatequina-3-galato (EGCG), la epigalocatequina (EGC), la epicatequina-3-galato (ECG) y las teaflavinas mostraron inhibición del metabolismo del AA dependiente de la ciclooxigenasa y la lipoxigenasa en la mucosa del colon humano y en los tejidos tumorales de colon (Hong et al. (2001) Biochem. Pharmacol. 62: 1175-1183) e indujeron la expresión del gen cox-2 y la producción de la PGE_{2} (Park et al. (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 286: 721-725). La epiafcelequina aislada de las partes aéreas de Celastrus orbiculatus mostró una inhibición, dependiente de la dosis, de la actividad de COX-1 con un valor de CI_{50} de 15 \muM y también mostró actividad antiinflamatoria contra el edema en la pata de ratón inducido por la carragenina después de la administración oral a una dosis de 100 mg/kg (Min et al. (1999) Planta Med. 65: 460-462).

Se ha utilizado la catequina y sus derivados obtenidos de diversas fuentes vegetales, especialmente de hojas de té verde, en el tratamiento del condiloma acuminado infectado por el VPH (Cheng, patente de los EE.UU. n.º 5.795.911) y en el tratamiento de la hiperplasia causada por el virus del papiloma (Cheng, patente de los EE.UU. n.º 5.968.973 y 6.197.808). También se han utilizado tópicamente la catequina y sus derivados para inhibir la angiogénesis en tejido de mamíferos, en afecciones tales como el cáncer de piel, la psoriasis, los hemangiomas aracniformes o en las ojeras (Anderson, patente de los EE.UU. n.º 6.248.341), contra la carcinogenia inducida por los UVB en los ratones (Agarwal et al. (1993) Photochem. Photobiol. 58: 695-700), para inhibir la expresión génica y la actividad enzimática de la óxido nítrico sintasa (Chan, patente de los EE.UU. n.º 5.922.756) y como crecepelo (Takahashi, patente de los EE.UU. n.º 6.126.940). También se han formulado composiciones a base de catequina formuladas con otros extractos y vitaminas para el tratamiento del acné (Murad, patente de los EE.UU. n.º 5.962.517), fortalecer el tejido de los órganos digestivos (Shi, patente de los EE.UU. n.º 5.470.589) y para inhibir la actividad de la 5-\alpha-reductasa para el tratamiento del cáncer y de las enfermedades relacionadas con los trastornos andrógenos (Liao, patente de los EE.UU. n.º 5.605.929). Se ha formulado el extracto de té verde con otros siete extractos vegetales para reducir la inflamación al inhibir la enzima COX-2, sin la identificación de ninguno de los compuestos activos específicos (Mewmark, patente de los EE.UU. n.º 6.264.995).

Acacia es un género de leguminosa con árboles y arbustos. El género Acacia incluye más de 1000 especies que pertenecen a la familia Leguminosae y a la subfamilia de Mimosoideae. Las acacias se distribuyen por todo el mundo en lugares tales como las zonas tropicales y subtropicales de América Central y América del Sur, África, partes de Asia así como Australia, que tiene el mayor número de especies endémicas. La acacias aparecen principalmente en regiones secas y áridas en las que las plantas leñosas a menudo se encuentran en forma de arbustos espinosos abiertos. El género Acacia se divide en 3 subgéneros sobre la base principalmente de la forma de la hoja: Acacia, Aculiferum y Heterophyllum. No obstante, según la naturaleza de las hojas de los árboles maduros, el género Acacia se puede dividir en dos grupos "populares": la especie de hoja bipinnada típica y la especie con filodios. Un filodio es un peciolo modificado que se expande en una estructura similar a la hoja sin folíolos, una adaptación a las condiciones xerofíticas. Las especies con hojas bipinnadas típicas se encuentran principalmente en los trópicos, mientras que las especies con filodios aparecen principalmente en Australia. Se han descrito más de 40 especies de Acacia en La India. Gamble, en su manual titulado Flora of Madras Presidency, enumeró 23 especies nativas en el sur de La India, 15 de las cuales se encuentran en Tamil Nadu. Desde entonces, sin embargo, se han introducido muchas nuevas especies de Acacia en La India y, en la actualidad, se encuentran aproximadamente 40 especies en el mismo Tamil Nadu. Las especies indígenas son principalmente árboles y arbustos espinosos y unos cuantos son matorral espinoso, tales como A. caesia, A. pennata y A. sinuata. Se han introducido muchas especies de África y Australia, incluidas A. mearnsii, A. picnantha y A. dealbata, que tienen hojas bipinnadas, y A. auriculiformis, A. holoserecia y A. mangium, que son especies con filodios.

Las acacias son muy importantes desde el punto de vista económico, ya que proporcionan una fuente de taninos, gomas, madera, combustible y forraje. Los taninos, que se aíslan principalmente de la corteza, se utilizan mucho para curtir cueros y pieles. Algunas cortezas de Acacia también se utilizan para aromatizar licores locales. Algunas especies indígenas como A. sinuata también producen saponinas, que son algunos de los diversos glucósidos vegetales que forman espumas jabonosas cuando se mezclan y agitan con agua. Las saponinas se utilizan en detergentes, espumantes y emulsionantes. Las flores de algunas especies de Acacia son olorosas y se utilizan para fabricar perfume. Por ejemplo, el perfume de casia se obtiene de A. ferrugenea. El duramen de muchas acacias se utiliza para fabricar aperos agrícolas y también proporciona una fuente de leña. Las gomas de acacia se utilizan extensivamente en medicina y confitería y para el apresto y el acabado de materiales en la industrial textil. Los insectos de la laca pueden crecer en varias especies, incluidas A. nilotica y A. catechu. Se han utilizado algunas especies para la reforestación de eriales, incluida A. nilotica,
que pueden resistir las inundaciones de agua y unas pocas de tales zonas se han convertido en santuarios de pájaros.

Hasta la fecha se han aislado unos 330 compuestos de distintas especies de Acacia. Los flavonoides, un tipo de pigmento vegetal hidrosoluble, son la principal clase de compuestos que se aíslan de las acacias. Se han identificado aproximadamente 180 flavonoides diferentes, 11 de los cuales son flavanos. Los terpenoides son la segunda clase más grande de compuestos aislados de las especies del género Acacia, de los que se han identificado 48 compuestos. Otras clases de compuestos aislados de Acacia incluyen alcaloides (28), aminoácidos/péptidos (20), taninos (16), glúcidos (15), heterociclos de oxígeno (15) y compuestos alifáticos (10) (Buckingham, en The Combined Chemical Dictionary, Champman & Hall CRC, versión 5:2, diciembre 2001).

Los compuestos fenólicos, particularmente los flavanos, se encuentran en concentraciones de moderadas a elevadas en todas las especies de Acacia (Abdulrazak et al. (2000) J. Anim. Sci. 13: 935-940). Históricamente, la mayoría de las plantas y extractos del género Acacia se han utilizado como astringentes para tratar trastornos digestivos, diarrea, indigestión y para detener las hemorragias (Vautrin (1996) Université Bourgogne (Francia) European abstract 58-01C:177; Saleem et al. (1998) Hamdard Midicus 41: 63-67). La corteza y las vainas de A. arabica Willd. contienen grandes cantidades de taninos y se han utilizado como astringentes y expectorantes (Nadkarni (1996) India Materia Medica, Bombay Popular Prakashan, pág. 9-17). Se ha descrito que los derivados del diarilpropanol, aislados de corteza del tronco de A. tortilis en Somalia, tienen efectos relajantes sobre el músculo liso (Hagos et al. (1987) Planta Med. 53: 27-31, 1987). También se ha descrito que las saponinas terpenoides aisladas de A. victoriae tienen un efecto inhibidor sobre la carcinogenia de la piel murina inducida con dimetilbenz(a)antraceno (Hanausek et al. (2000) Proc. Am. Assoc. Can. Res. Annu. Mtg. 41: 663) e induce la apoptosis (Haridas et al. (2000) Proc. Am. Assoc. for Can. Res. Annu. Mtg. 41:600). Se ha descrito que los extractos vegetales de A. nilotica tienen actividad espasmógena, vasoconstrictora y hipotensora (Amos et al. (1999) Phytotherapy Research 13: 683-685; Gilani et al. (1999) Phytotherapy Research 13: 665-669), y actividad contra la agregación plaquetaria (Shah et al. (1997) Gen. Pharmacol. 29: 251-255). Se ha descrito actividad antiinflamatoria para A. nilotica. Se ha planteado la hipótesis de que los flavonoides, los polisacáridos y los ácidos orgánicos sean los posibles componentes activos (Dafallah y Al-Mustafa (1996) Am. J. Chin. Med. 24: 263-269). Hasta la fecha, el único inhibidor de la 5-lipoxigenasa descrito que se ha aislado de Acacia es una carboxamida monoterpenoidea (Seikine et al. (1997) Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 45: 148-11).

Las gomas de acacia se han formulado con otros ingredientes vegetales y se han utilizado para prevenir las úlceras sin que se haya identificado ninguno de los componentes activos (Fuisz, patente de los Estados Unidos n.º 5.651.987). También se han formulado las gomas de acacia con otros ingredientes vegetales y se han utilizado para mejorar la disolución de los fármacos (Blank, patente de los Estados Unidos n.º 4.946.684), al disminuir la viscosidad de las composiciones nutritivas (Chancellor, patente de los EE.UU. n.º 5.545.411).

El extracto de la corteza de Acacia se patentó en Japón para uso externo como un blanqueante (Abe, JP10025238), como un inhibidor de la glucosil transferasa para aplicaciones dentales (Abe, JP07242555), como un inhibidor de la síntesis de las proteínas (Fukai, JP 07165598), como un neutralizador del oxígeno activo para preparaciones tópicas para la piel (Honda, JP 07017847, Bindra, patente de los EE.UU. n.º 6.1266.950), y como un inhibidor de la hialuronidasa de consumo oral para prevenir la inflamación, la polinosis y la tos (Ogura, JP 07010768).

La revisión de la bibliografía no ha revelado ninguna aplicación clínica para humanos que utilice mezclas de flavonoides de anillo B libre y flavanos para mitigar el dolor o medir los ensayos de variables bioquímicas para el tratamiento de la artrosis. Esta descripción parece ser el primer estudio controlado con placebo con doble ocultación y aleatorizado de la seguridad y la eficacia de esos compuestos en los humanos.

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Compendio de la invención

La presente invención da a conocer una nueva composición que comprende una mezcla de la baicalina aislada de una planta o plantas en el género de plantas Scutellaria, y la catequina aislada de una planta o plantas en el género de plantas Acacia. Además, la invención da a conocer usos de esta composición para aliviar el dolor y la rigidez articular, y para mejorar la movilidad y la función física; prevenir y tratar la artrosis y la artritis reumatoide; reducir la concentración de glucosa en la sangre debido a un aumento de la actividad física que es resultado de la mejora de la movilidad, la flexibilidad y la función física en unos sujetos; o disminuir el índice de masa corporal y ocasionar la pérdida de peso. La invención da a conocer adicionalmente la utilización de la composición para prevenir y tratar enfermedades y afecciones con origen en las vías de la COX-2 y la 5-LO seleccionadas del grupo que consiste en dismenorrea, arterioesclerosis, infarto de miocardio, obesidad, diabetes, síndrome X, enfermedad de Alzheimer, reacción alérgica respiratoria, insuficiencia venosa crónica, hemorroides, lupus eritematoso diseminado, psoriasis, cefalea tensional crónica, cefalea migrañosa, enteropatía inflamatoria, infecciones tópicas causadas por virus, bacteria u hongo, quemadura solar, quemaduras térmicas, dermatitis de contacto, melanoma y carcinoma.

La presente invención da a conocer adicionalmente los usos de una composición que comprende una mezcla de al menos un flavonoide de anillo B libre y al menos un flavano para aliviar el dolor y la rigidez articular, y mejorar la movilidad y la función física; prevenir y tratar la artrosis y la artritis reumatoide; reducir la concentración de glucosa en la sangre debido a un aumento de la actividad física resultante de la mejora de la movilidad, la flexibilidad y la función física de un sujeto; disminuir el índice de masa corporal y ocasionar la pérdida de peso; y para prevenir y tratar las enfermedades y afecciones con origen en las vías de la COX-2 y la 5-LO seleccionadas del grupo que consiste en dismenorrea, arterioesclerosis, infarto de miocardio, obesidad, diabetes, síndrome X, enfermedad de Alzheimer, reacción alérgica respiratoria, insuficiencia venosa crónica, hemorroides, lupus eritematoso diseminado, psoriasis, cefalea tensional crónica, cefaleas migrañosas, enteropatías inflamatorias, infecciones tópicas causadas por virus, bacterias u hongos, quemaduras solares, quemaduras térmicas, dermatitis de contacto, melanoma y carcinoma.

Una composición de materia se cita en la presente memoria como Universtin^{TM}. La proporción de flavonoides de anillo B libre por flavanos en las composiciones descritas en la presente memoria se puede ajustar basándose en las indicaciones y los requisitos específicos con respecto a la prevención y el tratamiento de una enfermedad o afección específica. Por lo general, la proporción de flavonoides de anillo B libre por flavanos se puede encontrar en el intervalo de 99:1 de flavonoides de anillo B libre:flavanos a 1:99 de flavonoides de anillo B libre:flavanos. En las realizaciones específicas de la presente invención, la proporción de flavonoides de anillo B libre por flavanos se selecciona del grupo que consiste en aproximadamente 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 y 10:90. En una realización preferente de la invención, la proporción de flavonoides de anillo B libre por flavanos en la composición de materia es de aproximadamente 85:15.

La presente invención se basa en composiciones que son eficaces para inhibir simultáneamente ambas enzimas COX-2 y 5-LO.

La eficacia para los usos de la invención se demostró con enzimas purificadas, en diferentes estirpes celulares, con varios modelos de animales y, finalmente, en un estudio clínico humano.

Los flavonoides de anillo B libre, también denominados en la presente memoria como flavonas y flavonoles de anillo B libre, para los usos como que se definen en las reivindicaciones 13 a 18, tienen la estructura general siguiente:

4

en la que

R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -H, -OH, -SH, OR, -SR, -NH_{2}, -NHR, NR_{2}, -NR_{3}^{+}X^{-}, un carbono, oxígeno, nitrógeno o azufre, glucósido de un solo azúcar o una combinación de varios azúcares que incluye, pero sin limitarse a ellos, aldopentosas, metilaldopentosa, aldohexosas, cetohexosa y los derivados químicos los mismos;

en la que

R es un grupo alquilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; y

X se selecciona del grupo de contraaniones farmacéuticamente aceptables que incluye, pero sin limitarse a ellos, hidroxilo, cloruro, yoduro, sulfato, fosfato, acetato, fluoruro, carbonato, etc.

Los flavanos para los usos que se definen en las reivindicaciones 13 a 19 tienen la estructura general siguiente:

5

en la que

R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -H, -OH, -SH, -OCH_{3}, -SCH_{3}, -OR, -SR, -NH_{2}, -NRH, -NR_{2}, -NR_{3}^{+}X^{-}, ésteres de los grupos de sustitución mencionados, que incluyen, pero sin limitarse a ellos, galato, acetato, ésteres de cinamoílo y de hidroxil-cinamoílo, ésteres de trihidroxibenzoílo y ésteres de cafeoílo, y los derivados químicos de los mismos; carbono, oxígeno, nitrógeno o azufre, glucósido de un solo azúcar o una combinación de varios azúcares que incluye, pero sin limitarse a ellos, aldopentosas, metilaldopentosa, aldohexosas, cetohexosa y los derivados químicos de los mismos; dímeros, trímeros y otros flavanos polimerizados;

en la que

R es un grupo alquilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; y

Los flavonoides de anillo B libre para los usos como los definidos en las reivindicaciones 13 a 18 se pueden obtener mediante métodos sintéticos o extraerl de las familias de plantas que incluyen, pero sin limitarse a ellas, Annonaceae, Asteraceae, Bignoniaceae, Combretaceae, Compositae, Euphorbiaceae, Labiatae, Lauranceae, Leguminosae, Moraceae, Pinaceae, Pteridaceae, Sinopteridaceae, Ulmaceae y Zingiberaceae. Los flavonoides de anillo libre se pueden extraer, concentrar y purificar de los géneros de plantas superiores que incluyen, pero sin limitarse a ellas, Desmos, Achyrocline, Oroxylum, Buchenavia, Anaphalis, Cotula, Gnaphalium, Helichrysum, Centaurea, Eupatorium, Baccharis, Sapium, Scutellaria, Molsa, Colebrookea, Stachys, Origanum, Ziziphora, Lindera, Actinodaphne, Acacia, Derris, Glycyrrhiza, Millettia, Pongamia, Tephrosia, Artocarpus, Ficus, Pityrogramma, Notholaena, Pinus, Ulmus y Alpinia.

Tal y como se señaló anteriormente, los flavanos para los usos que se definen en las reivindicaciones 13 a 18 se pueden obtener de una planta o plantas seleccionadas del género Acacia. En una realización preferente, la planta se selecciona del grupo que consiste en Acacia catechu, A. cocinna, A. farnesiana, A. Senegal, A. speciosa, A. arabica, A. caesia, A. pennata, A. sinuata, A. mearnsii, A. picnantha, A. dealbata, A. auriculiformis, A. holoserecia y A. mangium.

La presente invención implica una evaluación de diferentes composiciones de flavonoides de anillo B libre y flavanos mediante modelos enzimáticos e in vivo para optimizar la formulación y obtener la mejor potencia. También se ha demostrado la eficacia y la seguridad de esta formulación en estudios clínicos con humanos. En la presente memoria se describe un procedimiento comercialmente viable para aislar, purificar y combinar los flavanos de Acacia con flavonoides de anillo B libre para producir una composición de materia que tiene una actividad fisiológicamente deseable. Las composiciones para uso de acuerdo con la invención se pueden administrar mediante alguno de los métodos conocidos por el experto en la técnica. Los modos de administración incluyen, pero sin limitarse a ellos, la administración enteral (oral), la administración parenteral (intravenosa, subcutánea e intramuscular) y la aplicación tópica. Los usos de acuerdo con esta invención comprenden la administración interna o tópica de una cantidad terapéuticamente eficaz de una mezcla de flavonoides de anillo B libre y flavanos sintetizados y/o aislados de una sola planta o varias plantas a un paciente que lo necesite.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 describe gráficamente la inhibición de la COX-1 y la COX-2 mediante fracciones HTP de Acacia catechu. Los extractos se prepararon y fraccionaron tal y como se describe en los ejemplos 1 y 3. Se examinó la inhibición de la actividad peroxidásica de la COX-1 ovina recombinante (\ding{110}) o la COX-2 ovina (\blacklozenge) que contenían los extractos tal y como se describe en el ejemplo 2. Los datos se presentan como el porcentaje del control sin tratar.

La figura 2 describe gráficamente la inhibición de la COX-1 y la COX-2 mediante fracciones HTP de Scutellaria baicalensis. Los extractos se prepararon y se fraccionaron tal y como se describe en los ejemplos 1 y 3. Se examinó la inhibición de la actividad peroxidásica de la COX-1 ovina recombinante (\ding{110}) o la COX-2 ovina (\blacklozenge) que contenían los extractos tal y como se describe en el ejemplo 2. Los datos se presentan como porcentaje del control sin tratar.

La figura 3 describe una cromatografía de HPLC de un extracto normalizado aislado de las raíces de Scutellaria baicalensis (lote n.º RM052302-01) que tiene un contenido de flavonoides de anillo B libre del 82,2%. Diez estructuras se elucidaron por HPLC/PDA/MS como baicalina, 7-glucurónido de wogonina, 7-glucurónido de oroxilina A, baicaleína, wogonina, 7-glucurónido de crisina, 7-glucurónido de norwogonina, escutelarina, crisina y oroxilina A.

La figura 4 describe gráficamente un perfil de la inhibición de la COX-1 y la COX-2 por la baicaleína, la cual se aisló y se purificó de Scutellaria baicalensis. Se examinó la inhibición de la actividad peroxidásica de la COX-1 ovina recombinante (\blacklozenge) y la COX-2 ovina (\blacksquare) que tenía el compuesto. Los datos se presentan como el porcentaje de inhibición de los ensayos sin inhibidor frente a la concentración del inhibidor (\mug/ml). Se calculó que la CI_{50} para la COX-1 era de 0,18 \mug/(ml \cdot unidad de enzima) mientras que se calculó que la IC_{50} para la COX-2 era de 0,28 \mug/(ml \cdot unidad).

La figura 5 describe gráficamente un perfil de la inhibición de la COX-1 y la COX-2 por la baicalina, la cual se aisló y purificó de Scutellaria baicalensis. Se examinó la inhibición de la actividad peroxidásica de la COX-1 ovina recombinante (\blacklozenge) y la COX-2 ovina (\blacksquare). Los datos se presentan como el porcentaje de inhibición de los ensayos sin inhibidor frente a la concentración del inhibidor (\mug/ml). Se determinó que la CI_{50} para la COX-1 era de 0,44 \mug/(ml \cdot unidad de enzima) mientras que se determinó que la de la COX-2 era de 0,28 \mug/(ml \cdot unidad).

La figura 6 describe gráficamente un perfil de la inhibición de la COX-1 y la COX-2 mediante un extracto de flavonoides de anillo B libre normalizado (83% de baicalina según la HPLC) aislado de Scutellaria baicalensis. Se examinó la inhibición de la actividad peroxidásica de la COX-1 ovina recombinante (\blacklozenge) y la COX-2 ovina (\blacksquare) que tenía el extracto. Los datos se presentan como el porcentaje de inhibición de los ensayos sin inhibidor frente a la concentración del inhibidor (\mug/ml). Se calculó que la CI_{50} para la COX-1 era de 0,24 \mug/(ml \cdot unidad de enzima) mientras que se calculó que la CI_{50} para la COX-2 era de 0,48 \mug/(ml \cdot unidad).

La figura 7 describe gráficamente un perfil de la inhibición de la COX-1 y la COX-2 por la catequina, la cual se aisló y purificó de Acacia catechu. Se examinó la inhibición de la actividad peroxidásica de la COX-1 ovina recombinante (\blacklozenge) y la COX-2 ovina (\blacksquare) que tenía el compuesto. Los datos se presentan como el porcentaje de inhibición de los ensayos sin inhibidor frente a la concentración del inhibidor (\mug/ml). Se determinó que la CI_{50} para la COX-1 era de 0,11 \mug/(ml \cdot unidad de enzima) mientras que se determinó que la CI_{50} para la COX-2 era de 0,42 \mug/(ml \cdot unidad).

La figura 8 describe gráficamente un perfil de la inhibición de la COX-1 y la COX-2 mediante un extracto estandarizado de flavanos aislado de Acacia catechu que contiene un 50% de catequinas totales. Se examinó la inhibición de la actividad peroxidásica de la COX-1 ovina recombinante (\blacklozenge) y la COX-2 ovina (\blacksquare) que tenía el extracto. Los datos se presentan como el porcentaje de inhibición de los ensayos sin inhibidor frente a la concentración del inhibidor (\mug/ml). Se calculó que la CI_{50} para la COX-1 era de 0,17 \mug/(ml \cdot unidad de enzima) mientras que se determinó que la CI_{50} para la COX-2 era de 0,41 \mug/(ml \cdot unidad).

La figura 9 describe el cromatograma de HPLC de los flavanos extraídos de Acacia catechu con MeOH al 80% en agua.

La figura 10 describe gráficamente un perfil de inhibición de la 5-LO por la catequina, el flavano purificado de Acacia catechu. Se examinó la inhibición de la actividad de la 5-lipoxigenasa de patata recombinante (\blacklozenge) que proporcionaba el compuesto. Los datos se presentan como el porcentaje de inhibición de los ensayos sin inhibidor frente a la concentración del inhibidor (\mug/ml). La CI_{50} para 5-LO era de 1,38 \mug/(ml \cdot unidad de enzima).

La figura 11 describe gráficamente un perfil de la inhibición de la COX-1 y la COX-2 por la composición Univestin^{TM} producida mediante la combinación de los extractos de los flavonoides de anillo B libre y los flavanos en una proporción de 85:15 tal y como se describe en el ejemplo 14. Se examinó la inhibición de la actividad peroxidásica de la COX-1 ovina recombinante (\blacklozenge) y la COX-2 ovina (\blacksquare) que proporcionaba Univestin^{TM}. Los datos se presentan como el porcentaje de inhibición de los ensayos sin inhibidor frente a la concentración del inhibidor (\mug/ml). La CI_{50} para la COX-1 era de 0,76 \mug/(ml \cdot unidad e enzima) mientras que la CI_{50} para la COX-2 era de 0,80 \mug/(ml \cdot unidad).

La figura 12 describe gráficamente un perfil de la inhibición de la COX-1 y la COX-2 mediante la composición Univestin^{TM} producida mediante la combinación de extractos de flavonoides de anillo B libre y flavanos en una proporción de 50:50 tal y como se describe en el ejemplo 14. Se examinó la inhibición de la actividad peroxidásica de la COX-1 ovina recombinante (\blacklozenge) y la COX-2 ovina (\blacksquare) que proporcionó Univestin^{TM}. Los datos se presentan como el porcentaje de inhibición frente a la concentración del inhibidor (\mug/ml). La CI_{50} de la COX-1 era de 0,38 \mug/(ml \cdot unidad de enzima) mientras que la CI_{50} de la COX-2 era de 0,84 \mug/(ml \cdot unidad).

La figura 13 describe gráficamente un perfil de la inhibición de la COX-1 y la COX-2 por la composición Univestin^{TM} producida mediante la combinación de extractos de flavonoides de anillo B libre y flavanos en una proporción de 20:80 tal y como se describe en el ejemplo 14. Se examinó la inhibición de la actividad peroxidásica de la COX-1 ovina recombinante (\blacklozenge) y la COX-2 ovina (\blacksquare) que proporcionaba Univestin^{TM}. Los datos se presentan como el porcentaje de inhibición de los ensayos sin inhibidor frente a la concentración del inhibidor (\mug/ml). La CI_{50} de la COX-1 era de 0,18 \mug/(ml \cdot unidad de enzima) mientras que la CI_{50} de la COX-2 era de 0,41 \mug/(ml \cdot unidad).

La figura 14 describe el efecto que tiene aumentar la concentración de Univestin^{TM} sobre la cantidad del LTB_{4} (\blacklozenge) recién sintetizado inducido por el LPS, que se determinó mediante ELISA en células THP-1 o HT-29 (ATCC). La actividad del extracto de la combinación se expresa como el porcentaje de inhibición de la síntesis inducida del LTB_{4}.

La figura 15 compara la cantidad de LTB_{4} determinada por ELISA que permaneció en las células HT-29 después de tratarlas con 3 \mug/ml de Univestin^{TM} en las células sin inducir frente al tratamiento con 3 \mug/ml de ibuprofeno tal y como se describe en el ejemplo 16.

La figura 16 compara el efecto de diferentes concentraciones de Univestin^{TM} sobre la expresión de los genes cox-1 y cox-2. Los niveles de expresión se estandarizan por el nivel de expresión del ARNr 18S (control interno) y luego se normalizan para la condición sin tratamiento, sin LPS. Esta figura muestra una disminución de la expresión del gen cox-2 pero no del cox-1 después de la estimulación con LPS y la exposición a Univestin^{TM}.

La figura 17 compara el efecto de 3 \mug/ml de Univestin^{TM} sobre la expresión de los genes cox-1 y cox-2 con la concentración equivalente de otros AINE. Los niveles de expresión se estandarizan según los niveles de expresión del ARNr 18S (control interno) y luego se normalizan para la condición sin tratamiento, sin LPS.

La figura 18 ilustra gráficamente los datos de la tumefacción de la oreja como una medida de la inhibición de la inflamación. La Univestin^{TM} producida por la combinación de extractos estandarizados de flavonoides de anillo B libre y flavanos en una proporción de 80:20 se comparó con ratones sin tratar y ratones que recibieron indometacina (50 mg/kg) por sonda nasogástrica. Los datos se presentan como la diferencia de la medida en micrómetros del lóbulo de la oreja sin tratar frente al tratado para cada ratón.

La figura 19 muestra el efecto de 100 mg/kg de la proporción de Univestin^{TM} 80:20 (de extractos estandarizados de flavonoides de anillo B libre por flavanos) sobre las patas de ratón inyectadas con AA (Univestin^{TM} + ácido araquidónico) en comparación con los ratones sin tratar (ningún tratamiento + ácido araquidónico), ratones sin inyecciones de AA (control negativo) o ratones a los que se les inyectó el vehículo líquido (control del vehículo).

La figura 20 ilustra gráficamente el intervalo de confianza del 95% para la puntuación del índice WOMAC del dolor a nivel basal y a 30, 60 y 90 días de tratamiento con Univestin^{TM} a una dosificación de 250 mg/día.

La figura 21 ilustra gráficamente el intervalo de confianza del 95% para la puntuación del índice WOMAC del dolor a nivel basal y a 30, 60 y 90 días de tratamiento con Univestin^{TM} a una dosificación de 500 mg/día.

La figura 22 ilustra gráficamente el intervalo de confianza del 95% para la puntuación del índice WOMAC del dolor a nivel basal y a 30, 60 y 90 días de tratamiento con celecoxib a una dosificación de 200 mg/día.

La figura 23 ilustra gráficamente el intervalo de confianza del 95% para la puntuación del índice WOMAC del dolor a nivel basal y a 30, 60 y 90 días de tratamiento con el placebo.

La figura 24 ilustra gráficamente el intervalo de confianza del 95% para la puntuación del índice WOMAC de la rigidez a nivel basal y a 30, 60 y 90 días de tratamiento con Univestin^{TM} a una dosis de 250 mg/día.

La figura 25 ilustra gráficamente el intervalo de confianza del 95% para la puntuación del índice WOMAC de la rigidez a nivel basal y a 30, 60 y 90 días de tratamiento con Univestin^{TM} a una dosificación de 500 mg/día.

La figura 26 ilustra gráficamente el intervalo de confianza del 95% para la puntuación del índice WOMAC de la rigidez a nivel basal y a 30, 60 y 90 días de tratamiento con celecoxib a una dosis de 200 mg/día.

La figura 27 ilustra gráficamente el intervalo de confianza del 95% para la puntuación del índice WOMAC de la rigidez a nivel basal y a 30, 60 y 90 días de tratamiento con el placebo.

La figura 28 ilustra gráficamente el intervalo de confianza del 95% para la puntuación del índice WOMAC de la pérdida funcional a nivel basal y a 30, 60 y 90 días de tratamiento con Univestin^{TM} a una dosificación de 250 mg/día.

La figura 29 ilustra gráficamente el intervalo de confianza del 95% para la puntuación del índice WOMAC de la pérdida funcional a nivel basal y a 30, 60 y 90 días de tratamiento con Univestin^{TM} a una dosificación de 500 mg/día.

La figura 30 ilustra gráficamente el intervalo de confianza del 95% para la puntuación del índice WOMAC de la pérdida funcional a nivel basal y a 30, 60 y 90 días de tratamiento con celecoxib a una dosificación de 200 mg/día.

La figura 31 ilustra gráficamente el intervalo de confianza del 95% para la puntuación del índice WOMAC de la pérdida funcional a nivel basal y a 30, 60 y 90 días de tratamiento con el placebo.

La figura 32 muestra el efecto de Univestin^{TM} a dosis de 250 y 500 mg/día sobre la disminución del IMC en comparación con el celecoxib a 200 mg/día y con el placebo.

La figura 33 muestra el efecto de Univestin^{TM} a dosis de 250 y 500 mg/día sobre la disminución del peso en comparación con el celecoxib a 200 mg/día y el placebo.

La figura 34 muestra el efecto de Univestin^{TM} a dosis de 250 y 500 mg/día sobre la disminución de la glucosa en la sangre en comparación con el placebo.

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Descripción detallada de la invención

Se utiliza diversa terminología en la presente memoria para hacer referencia a aspectos de la presente invención. Para ayudar a aclarar la descripción de los componentes de esta invención, se proporcionan las definiciones que siguen.

Hay que señalar que la terminología "un" o "una" entidad se refiere a 1 o más de esta entidad; por ejemplo, un flavonoide se refiere a uno o más flavonoides. Como tal, la terminología "un" o "uno", "uno o más" y "al menos uno" se utiliza intercambiablemente en la presente memoria.

"Flavonoides de anillo B libre" tal y como se utiliza en la presente memoria son una clase específica de flavonoides, que no tienen grupos sustituyentes sobre el anillo B aromático, tal y como se ilustra mediante la estructura general siguiente:

6

en la que

R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -H, -OH, -SH, -OR, -SR, -NH_{2}, -NHR, -NR_{2}, -NR_{3}^{+}X^{-}, un carbono, oxígeno, nitrógeno o azufre, glucósido de un solo azúcar o una combinación de varios azúcares que incluye, pero sin limitarse a ellos, aldopentosas, metilaldopentosa, aldohexosas, cetohexosa y los derivados químicos de los mismos;

en la que

R es un grupo alquilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; y

"Flavanos" son una clase específica de flavonoides, que se pueden representar por lo general mediante la estructura general siguiente:

7

en la que

R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -H, -OH, -SH, -OCH_{3}, -SCH_{3}, -OR, -SR, -NH_{2}, -NRH, -NR_{2}, -NR_{3}^{+}X^{-}, ésteres de los grupos de sustitución que incluyen, pero sin limitarse a ellos, galato, acetato, ésteres de cinamoílo y de hidroxil-cinamoílo, ésteres de trihidroxibenzoílo y ésteres de cafeoílo y los derivados químicos de los mismos; carbono, oxígeno, nitrógeno o azufre, glucósido de un solo azúcar o una combinación de varios azúcares que incluye, pero sin limitarse a ellos, aldopentosas, metilaldopentosa, aldohexosas, cetohexosa y los derivados químicos de los mismos; dímeros, trímeros y otros flavanos polimerizados;

en la que

R es un grupo alquilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; y

"Expresión génica" se refiere a la transcripción de un gen en ARNm.

"Expresión de la proteína" se refiere a la traducción del ARNm en una proteína.

"RT-qPCR" es un método para retrotranscribir (RT) una molécula del ARNm en una molécula de ADNc y luego evaluar cuantitativamente (q) el nivel de la expresión génica mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por su nombre en inglés) acoplada a un indicador fluorescente.

"Terapéutico", tal y como se utiliza en la presente memoria, incluye el tratamiento y/o la prevención. Cuando se utiliza, terapéutico se refiere a los humanos así como a otros animales.

"Dosis o cantidad farmacéutica o terapéuticamente eficaz" se refiere a un nivel de dosificación suficiente para inducir un resultado biológico deseado. Ese resultado puede ser el alivio de los signos, síntomas o causas de una enfermedad o cualquier otra alteración de un sistema biológico que se desee.

"Placebo" se refiere a la sustitución de la dosis farmacéuticamente o terapéuticamente eficaz suficiente para inducir un resultado biológico deseado que pueda aliviar los signos, síntomas o causas de una enfermedad con una sustancia que no tiene actividad.

Un "hospedador" o "paciente" es un sujeto vivo, humano o animal, al que se le administran las composiciones descritas en la presente memoria.

Una composición de materia se cita en la presente memoria como Univestin^{TM}. La proporción de flavonoides de anillo B libre por flavanos en las composiciones descritas en la presente memoria se pueden ajustar según las indicaciones y los requisitos específicos con respecto a la prevención y el tratamiento de una enfermedad o afección específica. Por lo general, la proporción de flavonoides de anillo B libre por flavanos puede estar en el intervalo de flavonoides de anillo B libre:flavanos de 99:1 a flavonoides de anillo B libre:flavanos de 1:99. En las realizaciones específicas de la presente invención, la proporción de flavonoides de anillo libre B por flavanos se selecciona del grupo que consiste en aproximadamente 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 y 10:90. En una realización preferente de la invención, la proporción de flavonoides de anillo B libre:flavanos en la composición de materia es aproximadamente 85:15.

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El extracto de flavonoides de anillo B libre estandarizado puede comprender los compuestos activos con una pureza de entre 1-99% (en peso) de flavonoides de anillo B libre totales tal y como se define en los ejemplos 5, 7 y 13; las tablas 5, 7, 8 y 9, y la figura 13. La baicalina es el componente activo principal en el extracto, que representa aproximadamente del 50 al 90% (en peso) de los flavonoides de anillo B libre totales. En una realización preferente, el extracto estandarizado contiene más del 70% de flavonoides de anillo B libre totales en la que más del 75% de los flavonoides de anillo B libre es la baicalina.

El extracto de flavanos estandarizado puede comprender los compuestos activos con una pureza de entre el 1 y el 99% (en peso) del total de flavanos tal y como se define en los ejemplos 8, 9 12; las tablas 4, 6 y 9, y la figura 9. La catequina es el componente activo principal del extracto y representa del 50% al 90% (en peso) del total de flavanos. El extracto de flavanos estandarizado contiene más del 50% del total de flavanos, en el que más del 70% de los flavanos es catequina.

Se produce Univestin^{TM} al mezclar los dos extractos anteriores o los compuestos sintéticos en una proporción de 99:1 a 1:99. La proporción preferente de flavonoides de anillo B libre por flavanos es de 85:15 de flavonoides de anillo B libre:flavanos tal y como se define en el ejemplo 14.

La concentración de flavonoides de anillo B libre en Univestin^{TM} puede ser de aproximadamente 1% al 99% y la concentración de flavanos en Univestin^{TM} puede ser del 99% al 1%.

La concentración del total de flavonoides de anillo B libre en Univestin^{TM} es aproximadamente el 75% con un contenido de baicalina de aproximadamente el 60% del peso total de la Univestin^{TM}; y la concentración del total de flavanos en Univestin^{TM} es aproximadamente el 10% con un contenido de catequina de aproximadamente el 9%. En esta realización, los componentes activos totales (flavonoides de anillo B libre más flavanos) en Univestin^{TM} son más del 80% del peso total. Ziziphora, Lindera, Actinodaphne, Acacia, Derris, Glucyrrhiza, Millettia, Pongamia, Tephrosia, Artocarpus, Ficus, Pityrogramma, Notholaena, Pinus, Ulmus y Alpinia.

Se pueden encontrar flavonoides de anillo B libre en diferentes partes de las plantas, que incluyen, pero sin limitarse a ellas, tallos, corteza del tallo, ramitas, tubérculos, raíces, corteza de las raíces, brotes jóvenes, semillas, rizomas, flores y otros órganos reproductores, hojas y otras partes aéreas. Los métodos para aislar y purificar los flavonoides de anillo B libre tal y como se describe en la solicitud de patente de los EE.UU. n.º 10/091.362, registrada el 1 de marzo de 2002, titulada "Identification of Free-B-ring Flavonoides as Potent COX-2 inhibitors", que se incorpora en la presente memoria por referencia a su totalidad.

Los flavanos que se pueden utilizar de acuerdo con los usos de esta invención son los compuestos ilustrados por la estructura general expuesta anteriormente. Los flavanos para tales usos se pueden obtener mediante métodos sintéticos o se pueden aislar de una planta o plantas seleccionadas del género de plantas Acacia. En una realización preferente, se selecciona la planta del grupo que consiste en Acacia catechu, A. concinna, A. farnesiana, A. senegal, A. speciosa, A. arabica, A. caesia, A. pennata, A. sinuata, A. mearnsii, A. picantha, A. dealbata, A. auriculiformis, A. holoserecia y A. mangium.

Se pueden encontrar flavanos en diferentes partes de las plantas, que incluyen, pero sin limitarse a ellas, tallos, cortezas del tallo, troncos, corteza del tronco, ramitas, tubérculos, raíces, corteza de las raíces, brotes jóvenes, semillas, rizomas, flores y otros órganos reproductores, hojas y otras partes aéreas. Los métodos para aislar y purificar los flavanos se describen en la solicitud de patente de los EE.UU. de n.º de serie 10/104.477, registrada el 22 de marzo de 2002, titulada "Isolation of a Dual COX-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitor from Acacia", que se incorpora en la presente memoria por referencia en su totalidad.

La presente invención pone en práctica una estrategia que combina una serie de estudios in vivo así como detecciones bioquímicas, celulars y de la expresón génica in vitro para identificar extractos y componentes vegetales activos que inhiban específicamente la actividad enzimática de la COX-2 y la 5-LO, y afecten la producción del ARNm de cox-2 pero no el de cox-1. Los métodos utilizados en la presente memoria para identificar los extractos y componentes vegetales activos que inhiben específicamente las vías de la COX-2 y la 5-LO se describen en los ejemplos 1 a 13 (figuras 1 a 10). Estos métodos se describen con más detalle en la solicitud de patente de los EE.UU. de número de serie 10/091.362, registrada el 1 de marzo de 2002, titulada "Identification of Free-B-ring Flavonoids as Potent COX-2 inhibitors" y la solicitud de patente de los EE.UU. de número de serie 10/104.477, registrada el 22 de marzo de 2002, titulada "Isolation of a Dual COX-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitor from Acacia", cada una de las cuales se incorpora específicamente en la presente memoria por referencia en su totalidad.

Estos estudios dieron lugar al descubrimiento de una composición de materia citada en la presente memoria como Univestin^{TM}, que comprende una mezcla propietaria de dos extractos estandarizados, que contienen flavonoides de anillo B libre y flavanos, respectivamente. Un ejemplo general para preparar tal composición se da a conocer en el ejemplo 14 mediante dos extractos estandarizados aislados de Acacia y Scutellaria, respectivamente, junto con uno o más excipientes. El extracto de Acacia utilizado en el ejemplo 14 contenía más del 60% de flavanos totales, como catequina y epicatequina, y el extracto de Scutellaria contenía más del 70% de flavonoides de anillo B libre, que era principalmente baicalina. El extracto de Scutellaria contenía otras cantidades menores de flavonoides de anillo B libre tal y como se expone en la tabla 11. Se añaden uno o más excipientes optativamente a la composición de materia. Se puede ajustar la cantidad de excipiente a añadir según el contenido activo real de cada ingrediente deseado. Hay que generar una tabla de mezcla para cada lote individual de producto según la especificación del producto y los resultados del control de calidad para el lote individual de ingredientes. Se recomiendan cantidades adicionales de los ingredientes activos en el intervalo del 2 al 5% para satisfacer la especificación del producto. El ejemplo 14 ilustra una tabla de mezclas que se generó para un lote de Univestin^{TM} (n.º de lote G1702-COX-2). A diferentes proporciones de mezcla del producto Univestin^{TM} formulado se les evaluó su capacidad para inhibir las actividades enzimáticas de la COX-2 y la 5-LO, y para reducir la producción del ARNm de cox tal y como se describe en los ejemplos 15 a 17.

El ensayo de inhibición de la COX-2 se basó en la actividad peroxidasa de la enzima en presencia de hemo y ácido araquidónico. Para seleccionar los compuestos que inhibían la actividad de la COX-1 y la COX-2, se desarrolló un ensayo in vitro de gran producción que utilizaba la inhibición de la actividad peroxidásica de ambas enzimas tal y como se ilustra en los ejemplos 2 y 6. Después de aislar las fracciones vegetales que inhibían la actividad de la COX-2 en el proceso de detección selectiva, se compararon los dos extractos estandarizados individuales, uno compuesto principalmente de flavonoides de anillo B libre (aislado de Scutellaria) y el otro de flavanos (aislado de Acacia), así como los componentes purificados de cada extracto y las diferentes proporciones de los extractos combinados al valorar frente a una cantidad fija de las enzimas COX-1 y COX-2. Este estudio reveló que los flavonoides de anillo B libre purificados, la baicalina y la baicaleína aisladas de Scutellaria baicalensis, y el flavano purificado, la catequina aislada de Acacia catechu, inhibían la actividad de la COX-2 y de la 5-LO. Adicionalmente, cada uno de los extractos estandarizados individuales, que contenían concentraciones de flavonoides de anillo B libre en el intervalo del 10 al 90% (según la HPLC) y flavanos en el intervalo del 10 al 90% (según la HPLC), también inhibían la actividad de la COX-2 y la 5-LO. Finalmente, el estudio reveló que las composiciones que contenían mezclas de cada uno de los extractos estandarizados individuales que tenían proporciones de flavonoides de anillo B libre por flavanos de aproximadamente 80:90, 50:50 y 20:80 también eran muy eficaces a la hora de inhibir la actividad enzimática de la COX-2 in vitro. Los resultados se exponen en las figuras 11 a 13).

El ejemplo 16 describe los ensayos con células realizados que actúan selectivamente sobre la inhibición de los compuestos de la degradación del ácido araquidónico en la vía de la 5-LO, llamado LTB_{4}. Los resultados se exponen en las figuras 14 y 15.

El ejemplo 17 describe un experimento realizado para determinar la inhibición diferencial del gen cox-2 por Univestin^{TM}. Se obtuvieron los datos de expresión génica para la inhibición de la producción del ARNm de cox-1 y cox-2 en un ensayo de RT-qPCR semicuantitativo. Los resultados se exponen en las figuras 16 y 17. Con referencia a la figura 16, se puede observar que Univestin^{TM} inhibió la producción del ARN de cox-2 sin alterar la expresión del gen cox-1. Además, cuando se comparó con otros fármacos inhibidores de la COX-2, Univestin^{TM} fue capaz de disminuir los aumentos la expresión génica de cox-1 y cox-2 estimulados por el LPS. Es importante señalar que tanto el celecoxib como el ibuprofeno aumentaban la expresión del gen cox-2 (figura 17).

Se demostró la eficacia in vivo mediante la aplicación de sustancias irritantes de la piel, tal como el AA, a las orejas de ratones y midiendo la reducción de la tumefacción en los ratones tratados con Univestin^{TM} tal y como se describe en el ejemplo 18. Los resultados se exponen en la figura 18. Adicionalmente, se determinó la eficacia en el sitio de inflamación y dolor mediante la inyección de un irritante en las articulaciones de los tobillos de los ratones y midiendo la reducción de la tumefacción de los ratones tratados con Univestin^{TM}, tal y como se describe en el ejemplo 19. Los resultados se exponen en la figura 19.

Se evaluaron los extractos estandarizados individuales que contenían concentraciones de flavonoides de anillo B libre en el intervalo del 10 al 99% (según la HPLC) y flavanos en el intervalo del 10 al 99% (según la HPLC) así como el producto Univestin^{TM} por su toxicidad en los ratones con administración continua e intensa (datos sin mostrar). En el protocolo de administración continua, se alimentó a los ratones con los artículos a probar mediante sonda nasogástrica con dosis diarias de 90 mg/kg (equivalente a la dosis diaria humana de 500 mg), 450 mg/kg (cinco veces el equivalente de la dosis diaria) y 900 mg/kg (diez veces el equivalente de la dosis diaria). Los ratones no mostraron ningún efecto adverso en términos de aumento de peso, apariencia física o comportamiento. Los resultados macroscópicos de la autopsia no mostraron ninguna anomalía orgánica, y la histología del estómago, riñón e hígado no mostró ninguna diferencia en comparación con los ratones del control sin tratar. El análisis de sangre completo que mide los electrólitos, las proteínas sanguíneas, las enzimas sanguíneas y las enzimas hepáticas no mostró anomalías en comparación con los ratones del control sin tratar. En el protocolo intenso, cada extracto estandarizado que contenía una concentración de flavonoides de anillo B libre en el intervalo del 10 al 99% (según la HPLC) y los flavanos en el intervalo del 10 al 99% (según la HPLC) así como el producto Univestin^{TM} administrado a 2 g/kg (20 veces el equivalente de la dosis diaria) no mostró ninguna anomalía en el aumento de peso, la apariencia, el comportamiento, la apariencia macroscópica de los órganos en la autopsia, la histología de estómago, riñón e hígado o en el análisis de sangre.

El ejemplo 20 describe un estudio clínico realizado para evaluar la eficacia de Univestin^{TM} para aliviar el dolor causado por la artritis reumatoide o la artrosis de la rodilla y/o cadera. El estudio era un estudio controlado con placebo, con doble ocultación, aleatorio y unicéntrico. Se distribuyeron aleatoriamente 60 sujetos (n = 60) con artritis reumatoide o artrosis de la rodilla y/o la cadera en cuatro grupos y se trataron durante 90 días con un placebo, Univestin^{TM} (250 mg/día o 500 mg/día) o Celebrex^{TM} (también conocido como celecoxib) (200 mg/día). Univestin^{TM}, tal y como se ilustra en el ejemplo 14, tabla 11, consistía en una mezcla propietaria de extracto estandarizado de Scutellaria baicalensis Georgi con un contenido de baicalina del 82,2% (p/p) y un total de flavonoides de anillo B libre mayor del 90% (p/p) y un extracto estandarizado de Acacia catechu con un contenido total de flavanos del 77,2% (p/p) en una proporción de 85:15. Celebrex^{TM} es un nombre comercial para un fármaco recetable que es un inhibidor selectivo de la COX-2. La tabla 12 presenta las puntuaciones del índice WOMAC para el dolor, rigidez y función antes del tratamiento (puntuaciones a nivel basal) y a 30, 60 y 90 días. La tabla 13 presenta los cambios absolutos de las puntuaciones del índice WOMAC para el dolor, rigidez y función después del tratamiento durante 30, 60 y 90 días. Las figuras 20 a 31 ilustran los resultados de este estudio gráficamente en las que se muestran gráficamente los intervalos de confianza del 95% para todos los datos.

Tal y como se muestra en las figuras 20 a 31, las puntuaciones compuestas y las subpuntuaciones individuales del índice WOMAC, relacionadas con el dolor, la rigidez y la función física, mostraron unas mejoras significativas durante la administración de Univestin^{TM} en comparación con el grupo con placebo. Además, Univestin^{TM} mostró una eficacia similar para el alivio del dolor, una mejor eficacia al disminuir la rigidez y una notable mejora de la función física en comparación con el fármaco recetable Celebrex^{TM}. Los datos más significativos se pueden ver al comparar cada dosis de Univestin^{TM} con el placebo y el celecoxib para aliviar el dolor, la rigidez y la pérdida funcional asociada a la artrosis o la artritis reumatoide.

Varias comparaciones a posteriori de cada par de grupo de tratamiento dentro de los modelos de análisis de la varianza mostraron que Univestin^{TM} a 500 mg/día era significativamente más eficaz que el celecoxib a 200 mg/día para reducir el dolor causado por la artrosis a los 30 días (p = 0,020) de tratamiento. Además, la administración de una dosis de 500 mg/día de Univestin^{TM} también era significativamente más eficaz que el placebo a la hora de reducir el dolor a los 30 días (p = 0,044), 60 días (p = 0,032) y 90 días (p = 0,001) de tratamiento. El celecoxib a 200 mg/día no mostró una reducción significativa del dolor frente al placebo a los 60 días (p = 0,009) de tratamiento. A los 90 días, los 500 mg/día de la dosis de Univestin^{TM} mostraron una eficacia significativamente mayor en comparación con la dosis de 250 mg/día a los 90 días (p = 0,038) de tratamiento.

Univestin^{TM} a 250 mg/día era significativamente más eficaz que el placebo a la hora de reducir la rigidez, causada por la artrosis, a los 30 días (p = 0,00), 60 días (p = 0,027) y 90 días (p = 0,015) de tratamiento. Además, Univestin^{TM} a una dosis de 500 mg/día era significativamente más eficaz que el placebo a la hora de reducir la rigidez causada por la artrosis, a los 30 días (p = 0,001) y 90 días (p = 0,005) de tratamiento. El celecoxib a 200 mg/día mostró una eficacia significativamente mayor que el placebo a la hora de reducir la rigidez causada por la artrosis a tan solo 30 días (p = 0,023) de tratamiento.

Para reducir la pérdida funcional ocasionada por la artrosis, Univestin^{TM} resultó significativamente más eficaz que el celecoxib a 200 mg/día a los 30 días (p = 0,010) de tratamiento. Además, la dosis de Univestin^{TM} de 250 mg/día también fue significativamente más eficaz que el placebo a la hora de reducir la pérdida funcional causada por la artrosis a los 30 días (p = 0,010), 60 días (p = 0,043) y 90 días (p = 0,039) de tratamiento. La dosis de Univestin^{TM} de 500 mg/día era más eficaz que el celecoxib a 200 mg/día a los 30 días (p = 0,015), 60 días (p = 0,043) y 90 días (0,039) de tratamiento. Finalmente, la dosis de Univestin^{TM} de 500 mg/día también fue significativamente más eficaz que el placebo a la hora de reducir la pérdida funcional causada por la artrosis a los 30 días (p =0,015), 60 días (p = 0,016) y 90 días (p = 0,003) de tratamiento.

Estos resultados sugieren que Univestin^{TM}, particularmente a una dosificación de 500 mg/día, es mucho más eficaz que el placebo y el celecoxib para aliviar el dolor, la rigidez y para mejorar la pérdida funcional causada por la artrosis. Adicionalmente, la administración de Univestin^{TM} a una dosis de 250 mg/día también es muy eficaz para aliviar la rigidez y mejorar la pérdida funcional ocasionada por la artrosis en comparación con el placebo y el celecoxib. El celecoxib también mostró solo una mejora marginal global a la hora de aliviar el dolor, la rigidez y la pérdida funcional causada por la artrosis.

Además de los efectos de Univestin^{TM} sobre el dolor, la rigidez y la pérdida funcional causada por la artrosis, el ejemplo 21 muestra un efecto medible debido a Univestin^{TM} sobre el índice de masa corporal (IMC) y el adelgazamiento. Aunque no está limitado por esta teoría, este efecto se puede deber a un aumento en la movilidad como resultado de la administración de un antiinflamatorio o también se puede deber a un mecanismo específico que aumenta el metabolismo o reduce la utilización de grasas y glúcidos en el cuerpo. La tabla 14 muestra el efecto de la administración de Univestin^{TM} a una dosis de 250 y 500 mg/día así como del celecoxib y el placebo sobre el peso y el IMC después de 30 y 90 días de tratamiento. Los resultados se ilustran gráficamente en las figuras 32 y 33. En relación con las figuras 32 y 33, se puede observar que la administración de Univestin^{TM} a una dosis tanto de 250 como de 500 mg/día dio lugar a una caída significativa del peso y del IMC después de 30 días, y casi el doble de adelgazamiento después de 90 días. El celecoxib tenía un efecto menor sobre el peso y el IMC en comparación con Univestin^{TM}.

También se realizaron numerosas comparaciones a posteriori de cada par de grupo de tratamiento con los modelos del análisis de varianza para el adelgazamiento y el IMC tal y como se describe en el ejemplo 21. Estos análisis demostraron que Univestin^{TM} a dosis de 250 mg/día y 500 mg/día ocasionaba un adelgazamiento estadísticamente significativo (p = 0,011 frente a p = 0,118) frente al placebo después de 30 días de tratamiento. El celecoxib no causó una pérdida de peso significativa frente al placebo a los 30 días. La pérdida de peso continuó a lo largo de los 90 días de tratamiento con Univestin^{TM} a 250 y 500 mg/día con una significación estadística frente a placebo (p = 0,001 y 0,01, respectivamente). El celecoxib seguía sin mostrar significación respecto al placebo. La disminución del IMC siguió una tendencia similar durante la dosficación de Univestin^{TM} a 250 mg/día, que era significativa respecto al placebo después de 30 días (p = 0,008) así como de 90 días (p = 0,001). La dosis de 500 mg/día de Univestin^{TM} mostró una disminución del IMC sin significación estadística a los 30 días de tratamiento. Sin embargo, la disminución del IMC alcanzó una significación estadística a los 90 días de tratamiento (p = 0,011). De nuevo, después de 90 días de tratamiento, el grupo de tratamiento con el celecoxib no mostró cambios estadísticamente significativos del IMC frente al placebo.

El ejemplo 22 sugiere que la administración de Univestin^{TM} puede afectar a la concentración de la glucosa en la sangre así como a su efecto sobre el adelgazamiento y el IMC. Las diferencias medibles en la concentración de la glucosa en la sangre se detectan a los 30 días de iniciar el tratamiento con Univestin^{TM}. A los 90 días, los grupos tratados con Univestin^{TM} a 250 y 500 mg/día mostraron unas caídas significativas de la concentración de glucosa en la sangre. El efecto del celecoxib sobre la glucosa de la sangre fue menos llamativo. Los resultados se presentan en la tabla 15 y se ilustran gráficamente en la figura 34.

También se realizaron de nuevo varias comparaciones a posteriori de cada par de grupo de tratamiento con los modelos de análisis de la varianza para la glucosa en la sangre tal y como se describe en el ejemplo 22. Sólo la dosis de 500 mg/día de Univestin^{TM} mostró una significación estadísticamente relevante frente al grupo con placebo (después de 30 días, p = 0,028; después 90 días, p = 0,022). La dosis de 250 mg/día de Univestin^{TM}, sin embargo, mostró cambios clínicamente significativos de la concentración de glucosa en la sangre frente al placebo.

El solicitante cree que la solicitud de patente de los EE.UU. n.º 10/104.477, registrada el 22 de marzo de 2002, titulada Isolation of a Dual COX-2 and 5-Lypoxygenase inhibitor from Acacia es la primera descripción de una composición de materia aislada del género de plantas Acacia que demuestra una especificidad dual por la COX-2 y la 5-LO, y que la solicitud de patente de los EE.UU. de n.º de serie 10/091.362, registrada el 1 de marzo de 2002, titulada Identification of Free-B-ring flavonoids as Potent COX-2 inhibitors es la primera descripción de una correlación entre la estructura de los flavonoides de anillo B libre y la actividad inhibidora de la COX-2. Estos descubrimientos condujeron a una mezcla de dos clases de compuestos específicos -flavonoides de anillo B libre y flavanos- para producir una composición de materia, citada en la presente memoria como Univestin^{TM}, que se puede utilizar para aliviar el dolor articular y la rigidez, mejorar la movilidad y la función física, y prevenir y tratar las afecciones patológicas de la artrosis, y la artritis reumatoide.

Aunque no está limitado por esta teoría, se cree que el mecanismo de acción de esta formulación identificado es la inhibición directa de la actividad peroxidásica de la enzima COX-2 y la actividad enzimática de 5-LO, junto con una disminución de la producción del ARNm de cada una de estas enzimas. También se puede utilizar Univestin^{TM} para prevenir y tratar las enfermedades y las afecciones con origen en la COX-2 y la 5-LO que incluyen, pero sin limitarse a ellas, artrosis, artritis reumatoide, dismenorrea, arterioesclerosis, infarto de miocardio, obesidad, diabetes, síndrome X, enfermedad de Alzheimer, reacción alérgica respiratoria, insuficiencia venosa crónica, hemorroides, lupus eritematoso diseminado, psoriasis, cefalea tensional crónica, cefaleas migrañosas, enteropatía inflamatoria; infecciones tópicas causadas por virus, bacterias u hongos, quemaduras solares, quemaduras térmicas, dermatitis de contacto, melanoma y carcinoma. Finalmente, en un estudio clínico con humanos se ha encontrado que Univestin^{TM} puede ocasionar la pérdida de peso y reducir la concentración de la glucosa en la sangre debido a la mejora de la flexibilidad, la movilidad y el aumento de la actividad física.

La presente invención también se refiere a las composiciones terapéuticas que comprenden los agentes terapéuticos de la presente invención. Los agentes terapéuticos de la presente invención se pueden administrar mediante un modo adecuad, que incluye, por ejemplo, administración parenteral, tópica, oral o local, tal como la vía intradérmica, mediante inyección, o mediante aerosol. El modo de administración particular dependerá de la afección a tratar. Se contempla que la administración de los fármacos de la presente invención pueda ser a través de algún líquido corporal, o alguna diana o algún tejido accesible a través de un líquido corporal. En la realización preferida de la invención se administra el fármaco mediante inyección. Se puede administrar tal inyección localmente en un área afectada. Se puede administrar una composición terapéutica en numerosas formas farmacéuticas unitarias según el método de administración. Por ejemplo, las formas farmacéuticas unitarias adecuadas para la administración oral a un animal incluyen polvos, comprimidos, píldoras y cápsulas. Los métodos de administración preferentes para una composición terapéutica de la presente invención incluyen la administración intravenosa y la administración local, por ejemplo la inyección o la administración tópica. Un reactivo terapéutico de la presente invención se puede administrar a un animal, preferiblemente a los mamíferos y más preferiblemente a los humanos.

Para los modos particulares de administración se puede formular una composición terapéutica de la presente invención para que incluya otros componentes tal como un excipiente farmacéuticamente aceptable, un adyuvante, y/o un vehículo. Por ejemplo, se pueden formular las composiciones de la presente invención en un excipiente que el animal a tratar pueda tolerar. Ejemplos de tales excipientes incluyen, pero sin limitarse a ellos, celulosa, dióxido de sílice, dextratos, sacarosa, glicolato sódico de almidón, fosfato de calcio, sulfato de calcio, agua, disolución salina, disolución de Ringer, disolución de dextrosa, manitol, disolución de Hank y otras disoluciones acuosas de sales equilibradas fisiológicamente. También se pueden utilizar vehículos no acuosos, tales como aceites no volátiles, aceite de sésamo, oleato de etilo o triglicéridos. Otras formulaciones útiles incluyen suspensiones que contienen potenciadores de la viscosidad, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Los excipientes también pueden contener cantidades menores de aditivos, tales como sustancias que mejoran la isotonicidad y la estabilidad química. Ejemplos de tampones incluyen tampón de fosfato, tampón de bicarbonato, tampón de Tris, histidina, citrato y glicina, o mezclas de los mismos, mientras que los ejemplos de conservantes incluyen timerosal, m- o o-cresol, formol y fenol. La formulaciones estándares pueden ser o bien líquidos inyectables o sólidos, que se pueden recoger en un líquido adecuado como una suspensión o una disolución para inyección. Por lo tanto, en una formulación no líquida, el excipiente puede comprender dextrosa, seroalbúmina humana, conservantes, etc., a la que se puede añadir agua estéril o disolución salina antes de la administración.

En una realización de la presente invención, la composición puede también incluir un adyuvante o un vehículo. Los adyuvantes son típicamente sustancias que generalmente mejoran la función de la fórmula para prevenir y tratar las indicaciones relacionadas con las vías de la COX y la LO. Los adyuvantes adecuados incluyen, aunque sin limitarse a ellos, adyuvante de Freund; otros compuestos de la pared celular de las bacterias; sales a base de aluminio; sales a base de calcio; sílice; boro; histidina; sulfatos de glucosamina; sulfato de condroitina, gluconato de cobre, polinucleótidos; vitamina D, vitamina K, toxoides; cartílago bovino y de tiburón; proteínas séricas; proteínas de las cubiertas víricas; otras preparaciones obtenidas de bacterias; interferón \gamma; adyuvantes de copolímeros de bloque, tal como el adyuvante Titermax de Hunter (Vaxcel TM, Inc. Norcross, Ga); adyuvantes de Ribi (disponible en Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont.); y saponinas y sus derivados, tales como Quil A (disponible en Superfos Biosector A/S, Dinamarca). Los vehículos son típicamente compuestos que aumentan la semivida de una composición terapéutica en el animal tratado. Los vehículos adecuados incluyen, aunque sin limitarse a ellos, formulaciones de liberación controlada poliméricas, implantes biodegradables, liposomas, bacterias, virus, aceites, ésteres y glicoles.

Una realización de la presente invención es una formulación de liberación controlada que es capaz de liberar lentamente una composición de la presente invención en un animal. Tal y como se utiliza en la presente memoria, una formulación de liberación controlada comprende una composición de la presente invención en un vehículo de liberación controlada. Los vehículos de liberación controlada adecuados incluyen, aunque sin limitarse a ellos, polímeros biocompatibles, otras matrices poliméricas, cápsulas, microcápsulas, micropartículas, preparaciones de bolos, bombas osmóticas, dispositivos de difusión, liposomas, lipoesferas y sistemas de administración transdérmica. Otras formulaciones de liberación controlada de la presente invención incluyen líquidos que, una vez administrados a un animal, forman un sólido o un gel in situ. Las formulaciones de liberación controlada preferentes son biodegradables (por ejemplo, bioerosionables).

Una vez que se ha formulado la composición terapéutica, se puede almacenar en viales estériles como una disolución, suspensión, gel, emulsión, sólido o polvo deshidratado o liofilizado; o encapsular y/o comprimir directamente con otros vehículos inertes para la administración oral. Tales formulaciones se pueden almacenar tanto en una forma lista para usar o una que requiera su reconstitución inmediatamente antes de la administración. El modo de administrar las formulaciones que contienen las composiciones para la administración sistémica puede ser por vía oral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intranasal o por supositorio vaginal o rectal.

La cantidad de la composición que será eficaz para el tratamiento de un trastorno o afección determinados dependerá de la naturaleza del trastorno o de la afección, que se puede determinar mediante técnicas clínicas estándares. Además, se pueden emplear optativamente ensayos in vitro o in vivo para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración, y la gravedad o el avance de la enfermedad o afección, y se debe decidir según el criterio del médico de cabecera y las circunstancias de cada paciente. Se pueden extrapolar las dosis eficaces a partir de la curva de respuesta a la dosis obtenida en los sistemas de análisis de modelos in vitro o con animales. Por ejemplo, se puede determinar fácilmente una cantidad eficaz de la composición al administrar dosis escalonadas de la composición y observar el efecto deseado.

La utilización de acuerdo con esta invención comprende administrar interna o tópicamente, a un paciente que lo necesita, una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición que comprende una mezcla de flavonoides de anillo B libre y flavanos. La pureza de la mezcla incluye, pero sin limitarse a ello, del 0,01 al 100%, según la metodología utilizada para obtener el(los) compuesto(s). En una realización preferente, las dosis de la mezcla de flavonoides de anillo B libre y flavanos y las composiciones farmacéuticas que contienen lo mismo son una cantidad atóxica eficaz por lo general seleccionada del intervalo de 0,01 a 200 mg/kg de masa corporal. Las personas expertas en la técnica, mediante la utilización de análisis clínicos convencionales, son capaces de determinar las dosis óptimas para la dolencia determinada a tratar.

Se proporcionan los ejemplos siguientes solo con el propósito de ilustrar y no con la pretensión de limitar el alcance de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de extractos orgánicos y acuosos de plantas de Acacia y Scutellaria

El material vegetal de cortezas de Acacia catechu (L) Willd., raíces de Scutellaria orthocalyx, raíces de Scutellaria baicalensis o la planta entera de Scutellaria lateriflora se redujo a polvo con un tamaño de partícula de no más de 2 mm. A continuación se transfirió el material vegetal molido y seco (60 g) a un matraz Erlenmeyer y se le añadieron 600 ml de metanol:diclorometano (1:1). La mezcla se agitó durante una hora, se filtró, y la biomasa se extrajo de nuevo con metanol:diclorometano (1:1) (600 ml). Se reunieron los extractos orgánicos y se evaporaron al vacío para proporcionar el extracto orgánico (véase la tabla 1 más abajo). Después de la extracción orgánica, la biomasa se secó al aire y se extrajo una vez con agua ultrapura (600 ml). La disolución acuosa se filtró y se liofilizó para proporcionar el extracto acuoso (véase la tabla 1 más abajo).

TABLA 1 Rendimiento de los extractos orgánicos y acuosos de especies de Acacia y Scutellaria

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Ejemplo 2 Inhibición de la actividad peroxidásica de COX-2 y COX-1 mediante extractos vegetales de Acacia catechu, varias especies de Scutellaria y otras plantas

El procedimiento de detección selectiva dirigido por bioensayo para identificar inhibidores específicos de la COX-2 se diseñó para que se analizara la actividad peroxidásica de la enzima tal y como se describe más abajo.

Ensayo de la peroxidasa. El ensayo para detectar inhibidores de la COX-2 se modificó para convertirlo en una plataforma de gran producción (Raz). Brevemente, se incubó la COX-2 ovina recombinante (Cayman) en el tampón de peroxidasa (TBS a 100 mM, EDTA a 5 mM, hemo a 1 \muM, epinefrina a 1 mg y fenol al 0,094%) con el extracto (dilución a 1:500) durante 15 minutos. Se añadió el sustrato Quantablu (Pierce) y se dejó revelar durante 45 minutos a 25ºC. A continuación se leyó la luminiscencia con un lector de placas Victor 2 de Wallac. Los resultados se presentan en la tabla 2.

La tabla 2 presenta la inhibición de la enzima mediante los extractos orgánicos y acuosos obtenidos de cinco especies vegetales, que incluyen la corteza de Acacia catechu, raíces de dos especies de Scutellaria y extractos de otras tres especies vegetales, que comprenden flavonoides de anillo B libre de estructuras similares. Los datos se presentan como el porcentaje de la actividad peroxidásica respecto a la enzima COX-2 ovina recombinante y el sustrato solo. El porcentaje de inhibición ocasionada por el extracto orgánico oscilaba del 30% al 90%.

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TABLA 2 Inhibición de la actividad peroxidásica de COX-2 ocasionada por diversas especies

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La comparación de la inhibición relativa de las isoformas Cox-1 y Cox-2 requiere la generación de valores de CI_{50} para cada una de estas enzimas. La CI_{50} se define como la concentración a la cual un inhibidor particular consigue una inhibición del 50% de la actividad enzimática en relación con el control. En estos experimentos, se encontró que los valores de CI_{50} oscilaban de 6 a 50 \mug/ml y de 7 a 80 \mug/ml para las enzimas COX-2 y COX-1, respectivamente, tal y como se presenta en la tabla 3. La comparación de los valores de CI_{50} para la COX-2 y la COX-1 muestra la especificidad de los extractos orgánicos de distintas plantas para cada una de estas enzimas. Por ejemplo, el extracto orgánico de Scutellaria lateriflora muestra una inhibición preferencial de la COX-2 sobre la COX-1, con valores de CI_{50} de 30 y 80 \mug/ml, respectivamente. Mientras que algunos extractos muestran una inhibición preferencial de la COX-2, otros no. Es necesario examinar las fracciones por HTP y los compuestos purificados de estas fracciones para determinar la especificidad real de la inhibición de estos extractos y compuestos.

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TABLA 3 Valores de CI_{50} de los extractos orgánicos para la COX-2 y la COX-1 humana y ovina

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Ejemplo 3 Fraccionamiento por HTP de los extractos activos

Se cargó el extracto orgánico (400 mg) de una planta activa en una columna de cromatografía rápida preempaquetada (2 cm (DI) x 8,2 cm, 10 g de gel de sílice). La columna se eluyó mediante un sistema de purificación de gran producción (HTP, por su nombre en inglés) de Hitachi con una fase móvil en gradiente de (A) 50:50 EtOAc:hexano y (B) metanol desde A al 100% a B al 100% en 30 minutos a una velocidad de flujo de 5 ml/min. La separación se monitorizó mediante un detector de UV de longitud de onda de banda ancha y se recogieron las fracciones en una placa de 96 pocillos profundos a 1,9 ml/pocillo mediante un recolector de fracciones de Gilson. La placa de muestras se secó al vacío bajo y se centrifugó. Se utilizó DMSO (1,5 ml) para disolver las muestras en cada célula y se tomó una porción de 100 \mul para el ensayo de inhibición de COX.

Se disolvió extracto acuoso (750 mg) de la planta activa en agua (5 ml), se filtró por un filtro de 1 \mum de jeringuilla y se transfirió a un vial de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) a 4 ml. A continuación se inyectó la disolución mediante un inyector automático en una columna de fase inversa preempaquetada (C-18, tamaño de las partículas: 15 \mum, 2,5 cm (DI) x 10 cm con un inserto de precolumna). Se eluyó la columna mediante un sistema de purificación de gran producción (HTP) de Hitachi con una fase móvil en gradiente de agua (A) y metanol (B) desde A al 100% a B al 100% en 20 minutos, seguido de metanol al 100% durante 5 minutos a una velocidad de flujo de 10 ml/min. Se monitorizó la separación mediante un detector UV de longitud de onda de banda ancha y se recogieron las fracciones en una placa de 96 pocillos profundos a 1,9 ml/pocillo mediante un recolector de fracciones de Gilson. Se liofilizó la placa de muestras. Se utilizó agua ultra pura (1,5 ml) para disolver la muestra que hay en cada celda y se tomó una porción (100 \mul) para el análisis de inhibición de COX.

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Ejemplo 4 Inhibición de la actividad peroxidásica de COX mediante fracciones por HTP de especies de Acacia y Scutellaria

Los extractos orgánicos bioactivos individuales se caracterizaron adicionalmente mediante el examen de su capacidad para inhibir la actividad peroxidásica de ambas enzimas recombinantes COX-1 y COX-2 que tenían cada una de las fracciones de HTP. Se presentan los resultados en las figuras 1 y 2, que describen la inhibición de la actividad de COX-2 y COX-1 por las fracciones de HTP de los extractos orgánicos de la corteza de Acacia catechu y por las raíces de Scutellaria baicalensis aisladas tal y como se describe en los ejemplos 1 y 3, y se analizaron tal y como se describe en el ejemplo 2. Los perfiles descritos en las figuras 1 y 2 muestran numerosos picos de inhibición que indican numerosos componentes activos en cada extracto. Varios picos activos son muy específicos de la COX-2. Otras Scutellaria sp. que incluyen Scutellaria orthocalyx y Scutellaria lateriflora muestran un pico de inhibición parecido (datos sin mostrar). No obstante, ambas enzimas COX-1 y COX-2 muestran numerosos picos de inhibición, lo que sugiere que más de una molécula contribuye a los perfiles de inhibición iniciales.

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Ejemplo 5 Aislamiento y purificación de los flavonoides de anillo B libre activos a partir del extracto orgánico de Scutellaria

El extracto orgánico (5 g) de las raíces de Scutellaria orthocalyx, aisladas tal y como se describe en el ejemplo 1, se cargó en una columna de cromatografía rápida preempaquetada (120 g de sílice, tamaño de las partículas: 40 \mum de 32 a 60 \mum, 25 cm x 4 cm) y se eluyó con una fase móvil en gradiente de EtOAc:hexano a 50:50 (A) y metanol (B) desde A al 100% a B al 100% en 60 minutos a una velocidad de flujo de 15 ml/min. Las fracciones se recogieron en tubos de ensayo a 10 ml/fracción. Se evaporó el disolvente al vacío y se disolvió la muestra de cada fracción en 1 ml de DMSO, y se transfirió una alícuota de 20 \mul a una placa de 96 pocillos poco profunda y se le analizó la actividad inhibidora de COX. Según los resultados del ensayo de COX, las fracciones activas n.º 31 a n.º 39 se reunieron y se evaporaron. El análisis mediante HPLC/PDA y LC/MS mostró un compuesto principal con un tiempo de retención de 8,9 minutos y un pico de MS a 272 m/e. El producto se purificó adicionalmente en una columna semipreparativa C18 (25 cm x 1 cm), con una fase móvil en gradiente de agua (A) y metanol (B), durante 45 minutos a una velocidad de flujo de 5 ml/minuto. Se recogieron 88 fracciones para producir 5,6 mg de un sólido amarillo claro. Se determinó la pureza mediante HPLC/PDA y LC/MS, y se comparó con estándares y datos de RMN. ^{1}H RMN : \delta ppm (DMSO-d6) 8,088 (2H, m, H-3', 5'), 7,577 (3H, m, H-2', 4', 6'), 6,932 (1H, s, H-8), 6,613 (1H, s, H-3). MS: [M+1]^{+} = 271 m/e. Se identificó el compuesto como baicaleína. Se determinó que la CI_{50} de la baicaleína frente a la enzima COX-2 era de 10 \mug/ml.

Mediante una cromatografía preparativa en columna C-18 se aislaron otros flavonoides de anillo B libre y se identificaron mediante un extracto estandarizado aislado de las raíces de Scutellaria baicalensis (n.º de lote RM 052302-01), que tiene un contenido de flavonoides de anillo B libre del 82,2%. Se elucidaron 11 estructuras mediante HPLC/PDA/MS tal y como se ilustra en la figura 3. En cuanto a la figura 3, los 11 compuestos identificados fueron baicaleína, 7-glucurónido de wogonina, 7-glucurónido de oroxilina A, baicaleína, wogonina, 7-glucurónido de crisina, 7-glucurónido de 5-metilwogonina, escutelarina, norwogonina, crisina y oroxilina A.

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Ejemplo 6 Inhibición de COX mediante flavonoides de anillo B libre purificados

Se han obtenido varios flavonoides de anillo B libre y se les analizó la actividad inhibidora de COX-2 a una concentración de 20 \mug/ml mediante los métodos descritos en el ejemplo 2. Los resultados se resumen en la tabla 4.

Se realizó la medición de la CI_{50} de la baicaleína, baicalina y un extracto estandarizado de flavonoides de anillo B libre aislado de las raíces de Scutellaria baicalensis mediante el método que sigue. En el ensayo se incluyó un cromóforo peroxidado y escindible para visualizar la actividad peroxidásica de cada enzima en presencia de ácido araquidónico como cofactor. Típicamente, los ensayos se realizaron en un formato de 96 pocillos. Cada inhibidor, tomado de una solución concentrada a 10 mg/ml en DMSO al 100%, se analizó por triplicado a temperatura ambiente con el intervalo de concentraciones siguientes: 0, 0,1, 1, 5, 10, 20, 50, 100 y 500 \mug/ml. A cada pocillo se le añadieron 150 \mul de Tris-HCl a 100 mM, pH 7,5, junto con 10 \mul de hematina a 22 \muM diluida en tampón de tris, 10 \mul de inhibidor diluido en DMSO y 25 unidades de la enzima COX-1 o la enzima COX-2. Se mezclaron los componentes durante 10 segundos en una plataforma rotatoria, tras lo cual se añadieron 20 \mul de dihidrocloruro de N,N,N'N'-tetrametil-p-fenilendiamina (TMPD) a 2 mM y 20 \mul de AA a 1,1 mM para iniciar la reacción. Se agitó la placa durante 10 segundos y a continuación se incubó durante 5 minutos antes de leer la absorbencia a 570 nm. Se representó en un gráfico la concentración del inhibidor frente al porcentaje de inhibición y se determinó la CI_{50} tomando el punto semimáximo a lo largo de la isoterma e interpolando la concentración en el eje x. A continuación se normalizó la CI_{50} por número de unidades enzimáticas en el ensayo. En las figuras 4, 5 y 6 se dan a conocer la respuesta a la dosis y los resultados de la CI_{50} para la baicaleína, la baicalina y un extracto estandarizado de flavonoides de anillo B libre aislado de las raíces de Scutellaria baicalensis, respectivamente.

TABLA 4 Inhibición de la actividad enzimática de COX mediante los flavonoides de anillo B libre purificados

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Ejemplo 7 Cuantificación por HPLC de los flavonoides de anillo B libre en los extractos activos aislados de Scutellaria orthocalyx (raíces), Scutellaria baicalensis (raíces) y Oroxylum indicum (semillas)

Se ha confirmado la presencia y la cantidad de flavonoides de anillo B libre en cinco extractos activos aislados de tres especies de plantas diferentes y se presentan en la tabla 5. Se analizaron cuantitativamente los flavonoides de anillo B libre por HPLC mediante una columna Luna C-18 (250 x 4,5 mm, 5 \mum), mediante un gradiente de ácido fosfórico al 1% y acetonitrilo desde el 80% al 20% en 22 minutos. Los flavonoides de anillo B libre se detectaron mediante un detector de UV a 254 nm y se identificaron según el tiempo de retención por comparación con los estándares de flavonoides de anillo B libre.

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TABLA 5 Contenido de flavonoides de anillo B libre en los extractos vegetales activos

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Ejemplo 8 Aislamiento y purificación de los compuestos activos del extracto orgánico de Acacia catechu

Se cargó el extracto orgánico (5 g) de la corteza de A. catechu, aislada tal y como se describe en el ejemplo 1, en una columna de cromatografía rápida preempaquetada (120 g de sílice, tamaño de las partículas: 40 \mum de 32 a 60 \mum, 25 cm x 4 cm) y se eluyó con una fase móvil en gradiente de EtOAc:hexano a 50:50 (A) y metanol (B) desde A al 100% a B al 100% en 60 minutos a una velocidad de flujo de 15 ml/min. Se recogieron las fracciones en tubos de ensayo a 10 ml/fracción. Se evaporó el disolvente al vacío y se disolvió la muestra de cada fracción en DMSO (1 ml) y se transfirió una alícuota de 20 \mul a una placa de 96 pocillos poco profundos y se le evaluó la actividad inhibidora de COX. Basándose en los resultados del ensayo de COX, se reunieron las fracciones activas n.º 32 a n.º 41 y se evaporaron para producir 2,6 g de sólido. El análisis por HPLC/PDA y LC/MS mostró dos compuestos principales con tiempos de retención de 15,8 y 16,1 minutos, respectivamente. El producto se purificó adicionalmente en una columna semipreparativa C18 (25 cm x 1 cm), se cargó con 212,4 mg de producto y se eluyó con una fase móvil en gradiente de agua (A) y acetonitrilo (ACN) (B), durante 60 minutos a una velocidad de flujo de 5 ml/minuto. Se recogieron 88 fracciones y se aislaron dos compuestos activos. Compuesto 1 (11,5 mg) y compuesto 2 (16,6 mg). Se determinó la pureza por datos de HPLC/PDA y de LC/MS al compararlos con datos de los estándares (catequina y epicatequina) y RMN.

Compuesto 1. ^{13}C RMN: \delta ppm (DMSO-d6) 27,84 (C4), 66,27 (C3), 80,96 (C2), 93,78 (C9), 95,05 (C7), 99,00 (C5), 114,48 (C12), 115,01 (C15), 118,36 (C16), 130,55 (C11), 144,79 (C14), 155,31 (C6), 156,12 (C10), 156,41 (C8). ^{1}H RMN: \delta ppm. (DMSO-d6) 9,150 (1H, s, OH), 8,911 (1H, s, OH), 8,835 (1H, s, OH), 8,788 (1H, s, OH), 6,706 (1H, d, J = 2 Hz, H2'), 6,670 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6'), 6,578 (1H, dd, J = 2,8 Hz, H-5'), 5,873 (1H, d, J = 2 Hz, H8), 5,670 (1H, d, J = 2 Hz, H6), 4,839 (1 H, d, J = 4 Hz, OH), 4,461 (1H, d, J = 7,3 Hz, H2), 3,798 (1H, m, H3), 2,625 (1H, m, H4b), 2,490 (1H, m, H4a). MS: [M+1]^{+} = 291 m/e. Se identificó este compuesto como catequina.

Compuesto 2. ^{13}C RMN: \delta ppm (DMSO-d6) 28,17 (C4), 64,87 (C3), 78,02 (C2), 94,03 (C9), 95,02 (C7), 98,44 (C5), 114,70 (C12), 114,85 (C15), 117,90 (C16), 130,56 (C11), 144,39 (C14), 155,72 (C6), 156,19 (C10), 156,48 (C8). ^{1}H RMN: \delta ppm (DMSO-d6) 9,083 (1H, s, OH), 8,873 (1H, s, OH), 8,777 (1H, s, OH), 8,694 (1H, s, OH), 6,876 (1H, d, J = 2 Hz, H2'), 6,646 (2H, s, H-5', 6'), 5,876 (1H, d, J = 2 Hz, H8), 5,700 (1H, d, J = 2 Hz, H6), 4,718 (1H, s, OH), 4,640 (1H, d, J = 4,5 Hz, H2), 3,987 (1H, d, J = 4,5 Hz, H3), 2,663 (1H, dd, J = 4,6, 6,3 Hz, H4b), 2,463 (1H, dd, J = 4,6, 6,3 Hz, H4a). MS: [M + 1]^{+} = 291 m/e. Se identificó este compuesto como epicatequina.

En las figuras 7 y 8 se ilustra la respuesta a la dosis y los resultados de la CI_{50} para la catequina y un extracto estandarizado de flavanos aislado de la corteza de A. catechu, mediante el método descrito en el ejemplo 6. Los valores CI_{50} de la epicatequina frente a las enzimas COX-1 y COX-2 son 7 \mug/ml y 20 \mug/ml, respectivamente.

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Ejemplo 9 Cuantificación por HPLC de los extractos activos de Acacia catechu

Se cuantificó el contenido de flavanos de los extractos orgánicos y acuosos aislados de Acacia catechu por HPLC mediante un detector PhotoDiode Array (HPLC/PDA) y una columna Luna C18 (250 mm x 4,6 mm). Se eluyeron los flavanos de la columna mediante un gradiente de acetonitrilo del 10% al 30% de ACN durante 20 minutos, seguido de ACN al 60% durante cinco minutos. En la tabla 6 se presentan los resultados. En la figura 9 se muestra un perfil de la purificación por HPLC. Los flavanos se cuantificaron según el tiempo de retención y los datos de PDA utilizando la catequina y la epicatequina como estándares. El tiempo de retención de los dos flavanos principales fue de 12,73 minutos y 15,76 minutos, respectivamente.

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TABLA 6 Contenido de flavonoides de anillo B libre en los extractos vegetales activos

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Ejemplo 10 Estudio in vitro de la actividad inhibidora de COX que tienen los extractos orgánicos de Acacia catechu y de especies de Scutellaria

Se evaluó la eficacia in vitro y la especificidad por COX-2 de los extractos orgánicos aislados de Acacia catechu y distintas especies de Scutellaria en sistemas de células por su capacidad para inhibir la generación de metabolitos del AA. A las estirpes celulares HOSC, que expresa constitutivamente la COX-2, y THP-1, que expresa COX-1, se les analizó su capacidad para generar la PGE_{2} en presencia del AA.

Ensayo celular de COX-2. Se cultivaron las células HOSC (ATCC n.º 8304-CRL) a una confluencia del 80 al 90%. Las células se trataron con tripsina, se lavaron y se resuspendieron en 10 ml a 1 x 10^{6} células/ml en medio de cultivo de tejidos (MEM). La suspensión celular (200 \mul) se sembró en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos y se incubaron durante 2 horas a 37ºC y CO_{2} al 5%. A continuación se reemplazó el medio con medio HOSC nuevo que contenía 1 ng/ml de IL-1b y se incubó durante una noche. El medio se retiró de nuevo y se reemplazó con 190 ml de medio HOSC. Después se le añadieron los compuestos a analizar en 10 \mul de medio HOSC y se incubaron durante 15 minutos a 37ºC. Se añadió ácido araquidónico en medio HOSC (20 ml, 100 \muM) y se incubó la mezcla durante 10 minutos en un agitador a temperatura ambiente. Se transfirió el sobrenadante (20 \mul) a placas nuevas que contenían 190 \mul/pocillo de indometacina a 100 \muM en tampón de ELISA. Se analizaron los sobrenadantes tal y como se describe más abajo mediante ELISA.

Ensayo celular de COX-1. Las células THP-1 se suspendieron en un volumen de 30 ml (5 x 10^{5} células/ml). Se añadió TPA a una concentración final de TPA de 10 nM y se cultivó durante 48 horas para que las células se diferenciasen en macrófagos (adherentes). Se resuspendieron las células en HBSS (25 ml) y se añadieron a placas de 96 pocillos en volúmenes de 200 ml a 5 x 10^{5} células/pocillo. A continuación se añadieron los compuestos a analizar en RPMI 1640 (10 \mul) y se incubaron durante 15 minutos a 37ºC. Después se añadió el ácido araquidónico en RPMI (20 \mul) y se incubó la mezcla durante 10 minutos en un agitador a temperatura ambiente. El sobrenadante (20 \mul) se añadió a un tampón de ELISA (190 \mul) que contiene indometacina (100 \muM). A continuación, los sobrenadantes se analizaron por ELISA, tal y como se describe más adelante.

Ensayo de COX-2 con sangre completa. Se recogió sangre periférica de donantes sanos normales mediante venopunción. Se incubó la sangre completa (500 \mul) con los compuestos a analizar y los extractos durante 15 minutos a 37ºC. Se añadió el lipopolisacárido (LPS, del serotipo de E. coli 0111:B4) a una concentración final de 100 \mug/ml y se incubó durante una noche a 37ºC. Se centrifugó la sangre (12000 x g) y se recogió el plasma. Se añadió el plasma (100 \mul) a metanol (400 \mul) para que las proteínas precipitaran. Se midió la producción de la PGE_{2} de los sobrenadantes mediante ELISA. Este procedimiento es una modificación de los métodos descritos por Brideau et al (1996) Inflamm. Res. 45: 68-74.

Ensayo de COX-1 con sangre completa. Se recogió la sangre nueva en tubos que no contenían anticoagulantes e inmediatamente se distribuyó en alícuotas de 500 \mul en tubos de microcentrifugación siliconizados. Se añadieron las muestras a analizar, se mezclaron vorticialmente y se dejó que coagularan durante 1 hora a 37ºC. A continuación se centrifugaron las muestras (12000 x g) y se recogió el plasma. Se añadió el plasma (100 \mul) a metanol (400 \mul) para que las proteínas precipitaran. Se midió la producción del TXB_{2} en los sobrenadantes mediante ELISA. Este procedimiento es una modificación de los métodos descritos por Brideau et al. (1996) Inflamm. Res. 45: 68-74.

Ensayos de ELISA. Las placas de ELISA Inmunolon-4 se recubrieron con 0,5 a 4 \mug/ml de anticuerpo de captura en tampón de carbonato (pH 9,2) durante una noche a 4ºC. Se lavaron las placas y se incubaron durante 2 horas con tampón de bloqueo (PBS + SAB al 1%) a temperatura ambiente. Se lavaron de nuevo las placas y se les añadió la muestra a analizar (100 \mul) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente mientras se agitaban. Se añadió el anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa en un volumen de 50 \mul que contenía de 0,5 a 4 mg/ml y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente mientras se agitaba. A continuación se lavaron las placas tres veces y se añadió el sustrato TOMB (100 \mul). Se dejó que las placas se revelaran durante 30 minutos, tras lo cual se detuvo la reacción con la adición de ácido fosfórico a 1 M (100 \mul). Después se leyeron las placas a 450 nm mediante un lector de placas Victor 2 de Wallac.

Citotoxicidad. Se evaluó la citotoxicidad celular mediante un kit colorimétrico (Oxford Biochemical Research) que mide la liberación de lactato deshidrogenasa en las células dañadas. Los ensayos se completaron de acuerdo con las directrices del fabricante. Se analizaron tanto los flavanos purificados como el extracto estandarizado de Acacia catechu. No se observó que ninguno de los compuestos analizados produjera citotoxicidad.

Los resultados de los ensayos se presentan en la tabla 7. Los datos se presentan como valores de CI_{50} para la comparación directa. En cuanto a la tabla 5, los valores de CI_{50} son por lo general más bajos para COX-1 que para COX-2. Adicionalmente, también se midió en la sangre completa la inhibición diferencial de la generación de la PGE_{2} (una medición de COX-2 en este sistema) o el tromboxano B2 (TXB_{2}) (una medición de la activación de COX-1). En cuanto a la tabla 7, estos estudios demuestran claramente la especificidad de la inhibición de COX-2 dentro de los ensayos que utilizan células de la sangre completa. No obstante, los estudios que utilizan el sistema modelo basado en las estirpes THP-1 y HOSC realmente demostraron una mayor selectividad para la COX-1. Las posibles razones de esta discrepancia son las diferencias fundamentales entre las estirpes celulares inmortalizadas que expresan constitutivamente cada una de las enzimas y las células primarias obtenidas de la sangre completa que son inducidas a expresar las enzimas COX. Las células primarias son un modelo más relevante para estudiar la inflamación in vivo. Adicionalmente, los compuestos utilizados para identificar la actividad de COX-1 frente a la de COX-2 varían en cada uno de estos sistemas y, por lo tanto, no son directamente comparables.

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TABLA 7 Inhibición de la actividad de la COX en sistemas celulares ocasionada por extractos orgánicos

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Ejemplo 11 Inhibición de la 5-lipoxigenasa por la catequina de Acacia catechu

Tal y como se observó anteriormente, una de las vías más importantes implicadas en la respuesta inflamatoria la producen las lipoxigenasas que contienen hierro no hémico (5-LO, 12-LO y 15-LO), que catalizan la adición de oxígeno molecular en ácidos grasos, tal como ácido araquidónico (AA), para producir los hidroperóxidos 5-, 12- y 15-HPTE, que luego se convierten en leucotrienos. Desde un principio existían indicaciones de que el extracto de flavanos de A. catechu puede proporcionar cierto grado de inhibición de la 5-LO, por lo que previene la formación de 5-HPETE. Se utilizó un kit Lipoxygenase Inhibitor Screening Assay (Cayman Chemical, Inc., n.º de catálogo 760700) para evaluar si la catequina, flavano purificado de Acacia catechu, inhibía directamente la 5-LO in vitro. La 15-LO de soja utilizada normalmente en el kit se reemplazó con la 5-LO de patata, después de realizar un cambio de tampón de fosfato a tampón a base de tris mediante una microfiltración. Este ensayo detecta la formación de hidroperóxidos a través de un cromógeno sensible al oxígeno. Brevemente, se realizó el ensayo por triplicado añadiendo 90 \mul de la 5-LO de patata a 0,17 unidades/\mul, 20 \mul de AA a 1,1 mM, 100 \mul de cromógeno sensible al oxígeno y 10 \mul de flavano inhibidor purificado a concentraciones finales que oscilan de 0 a 500 \mug/ml. Se determinó que la CI_{50} de la catequina para la inhibición de la 5-LO era de 1,38 \mug/(ml \cdot unidad de enzima).

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Ejemplo 12 Preparación de un extracto estandarizado de Acacia catechu

Acacia catechu (500 mg de corteza molida) se extrajo con los sistemas disolventes siguientes: 1) agua al 100%, 2) agua:metanol al 80:20, 3) agua:metanol al 60:40, 4) agua:metanol a 40:60, 5) agua:metanol a 20:80, 6) metanol al 100%, 7) metanol:THF a 80:20, y 8) metanol:THF a 60:40. Los extractos se concentraron y se secaron con vacío poco intenso. Se consiguió la identificación de los compuestos químicos en cada extracto por HPLC mediante un detector PhotoDiode Array (HPLC/PDA) y una columna C18 de 250 mm x 4,6 mm. Se cuantificaron los compuestos químicos según el tiempo de retención y los datos de PDA utilizando la catequina y la epicatequina como estándares. Los resultados se presentan en la tabla 8 y la figura 9. Tal y como se muestra en la tabla 6, el extracto de flavanos generado a partir de la extracción con disolventes con metanol al 80%/agua proporcionó la mejor concentración de los componentes de flavano.

TABLA 8 Disolventes para generar extractos estandarizados de flavanos de Acacia catechu

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Ejemplo 13 Preparación de extractos estandarizados de flavonoides de anillo B libre de distintas especies de Scutellaria

Se extrajo Scutellaria orthocalyx (500 mg de raíz molida) dos veces con 25 ml de los sistemas de disolventes siguientes: 1) agua al 100%, 2) agua:metanol a 80:20, 3) agua:metanol a 60:40, 4) agua:metanol a 40:60, 5) agua:metanol a 20:80, 6) metanol al 100%, 7) metanol:THF a 80:20, y 8) metanol:THF a 60:40. Los extractos se combinaron, se concentraron y se secaron con un vacío poco intenso. Se realizó la identificación de los componentes químicos de cada extracto por HPLC mediante un detector PhotoDiode Array (HPLC/PDA) y una columna C18 de 250 mm x 4,6 mm. Los componentes químicos se cuantificaron según el tiempo de retención y los datos de PDA utilizando baicaleína, baicalina, escutelarina y wogonina como estándares. Los resultados se presentan en la tabla 9.

TABLA 9 Cuantificación de flavonoides de anillo B libre extraídos de Scutellaria orthocalyx

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Se extrajo Scutellaria baicalensis (1000 mg de raíz molida) dos veces con 50 ml de una mezcla de metanol y agua como sigue: 1) agua al 100%, 2) agua:metanol a 70:30, 3) agua:metanol a 50:50, 4) agua:metanol a 30:70, y 5) metanol al 100%. Los extractos se reunieron, se concentraron y se secaron con un vacío poco intenso. Se identificaron los componentes químicos por HPLC mediante un detector PhotoDiode Array (HPLC/PDA) y una columna C18 de 250 mm x 4,6 mm Los componentes químicos en cada extracto se cuantificaron según el tiempo de retención y los datos del PDA utilizando como estándares baicaleína, baicalina, escutelarina y wogonina. Los resultados se presentan en la tabla 10.

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TABLA 10 Cuantificación de los flavonoides de anillo B libre extraídos de Scutellaria baicalensis

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Ejemplo 14 Preparación de una formulación con un extracto estandarizado de flavonoides de anillo B libre de las raíces de Scutellaria baicalensis y un extracto estandarizado de flavanos de la corteza de Acacia catechu

Se ha formulado una nueva composición de materia, citada en la presente memoria como Univestin^{TM}, utilizando dos extractos estandarizados aislados de Acacia y Scutellaria, respectivamente, junto con uno o más excipientes. Más adelante se presenta un ejemplo general para preparar tal composición. El extracto de Acacia utilizado en este ejemplo contenía más del 60% del total de flavanos, como catequina y epicatequina, y el extracto de Scutellaria contenía más del 70% de flavonoides de anillo B libre, que era principalmente baicalina. El extracto de Scutellaria contenía otras cantidades menores de flavonoides de anillo B libre tal como se presenta en la tabla 11. Se añaden uno o más excipientes a la composición de materia. Se puede ajustar la proporción de flavanos y de flavonoides de anillo B libre según las indicaciones y los requisitos específicos con respecto a la inhibición de la COX-2 frente a la 5-LO y los requisitos de potencia del producto. Se puede ajustar la cantidad de los excipientes según el contenido activo real de cada ingrediente. Se debe generar una tabla de mezclas para cada lote individual del producto según la especificación del producto y los resultados del control de calidad del lote individual de ingredientes. Se recomiendan cantidades adicionales de ingredientes activos en el intervalo del 2 a 5% para satisfacer la especificación del producto. La tabla 11 ilustra una tabla de mezclas que se generó para un lote de Univestin^{TM} (Lote n.º G1702-COX-2).

Se combinaron el extracto de raíz de Scutellaria baicalensis (38,5 kg) (lote n.º RM052302-1) que tiene un contenido de flavonoides de anillo B libre del 82,2% (baicalina); el extracto de corteza de Acacia catechu (6,9 kg) (lote n.º RM052902-01) con un contenido total de flavanos del 80,4%; y el excipiente (5,0 kg de Candex) para proporcionar una formulación de Univestin^{TM} (50,4 kg) que tiene una proporción de mezcla de 85:15. La tabla 9 proporciona la cuantificación de los flavonoides de anillo B libre y los flavanos activos de este lote específico de Univestin^{TM} (lote n.º G1702-COX-2), que se determinó mediante los métodos proporcionados en los ejemplos 7 y 9.

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TABLA 11 Contenido de flavonoides de anillo B libre y flavanos de la formulación de Univestin^{TM}

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En cuanto a la tabla 9, este lote específico de Univestin^{TM} contiene un 86% de ingredientes activos totales, que incluye un 75,7% de flavonoides de anillo B libre y un 10,3% de flavanos. De este lote de Univestin^{TM} (50,0 kg) se produjeron dos niveles de dosificación diferentes del producto final en forma de cápsula: 125 mg por dosis (60 cápsulas) y 250 mg por dosis (60 cápsulas). Se evaluó el producto final en un ensayo clínico con humanos tal y como se describe en el ejemplo 15.

Con la misma estrategia se prepararon otros dos lotes de Univestin^{TM} mediante una combinación de un extracto de flavonoides de anillo B libre estandarizado de las raíces de Scutellaria baicalensis y un extracto de flavanos estandarizado de la corteza de Acacia catechu que tenían una proporción de mezcla de 50:50 y 20:80, respectivamente.

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Ejemplo 15 Mediciones de la respuesta a la dosis y los valores de CI_{50} de las inhibiciones de las enzimas COX de tres formulaciones de Univestin^{TM}

A las tres formulaciones diferentes de Univestin^{TM} producidas tal y como se da a conocer en el ejemplo 14 se les ensayó la actividad inhibidora de COX-1 y COX-2 tal y como se describe en el ejemplo 6. Las tres formulaciones muestran una inhibición de respuesta a la dosis significativa de las actividades enzimáticas COX tal y como se ilustra en las figuras 11, 12 y 13.

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Ejemplo 16 Mediciones de la respuesta a la dosis y los valores CI_{50} de la inhibición de la enzima LO a una formulación de Univestin^{TM}

Se produjo una muestra de Univestin^{TM} tal y como se esbozó en el ejemplo 14, mediante una combinación de un extracto estandarizado de flavonoides de anillo B libre de las raíces de Scutellaria baicalensis y un extracto estandarizado de flavanos de la corteza de Acacia catechu con una proporción de mezcla de 80:20. La muestra se valoró en un medio de cultivo de tejidos que contenía células THP-1 o HT-29, estirpes celulares de monocitos que expresan COX-1, COX-2 y 5-LO. Se utilizó un ELISA competitivo para el LTB_{4} (LTB_{4}; Neogen, Inc., n.º de catálogo 406110) para evaluar el efecto de Univestin^{TM} sobre la cantidad de LTB_{4} recién sintetizada presente en cada estirpe celular como una medida del efecto inhibidor de Univestin^{TM} sobre la vía de la 5-LO. Se llevó a cabo el ensayo por duplicado añadiendo de 160 000 a 180 000 células por pocillo en placas de 6 pocillos. Se añadió Univestin^{TM} a los cultivos de THP-1 a 3, 10, 30 y 100 \mug/ml, y se incubó durante una noche (aproximadamente de 12 a 15 horas) a 37ºC con CO_{2} al 5% en un medio humidificado. Se presentan los resultados en la figura 14, que muestra que la producción de LTB_{4} nuevo inducido por el LPS se veía casi completamente inhibido por la adición de Univestin^{TM} entre 3 y 10 \mug/ml a los cultivos de THP-1.

Se añadieron Univestin^{TM} e ibuprofeno, otro inhibidor conocido de la 5-LO, a las células HT-29 a 3 \mug/ml y se incubó durante 48 horas a 37ºC con CO_{2} al 5% en un entorno humidificado. A continuación se recogió cada estirpe celular tratada mediante centrifugación y se rompieron mediante lisis por homogeneización suave en un Dounce en tampones fisiológicos. Tal y como se muestra en la figura 15, Univestin^{TM} inhibió la generación del 80% del LTB_{4} recién sintetizado en las células H-29. El ibuprofeno mostró sólo una reducción del 20% en la cantidad de LTB_{4} durante el mismo periodo de tiempo.

Ejemplo 17 Inhibición diferencial de la expresión del gen cox-2, pero no del cox-1, por Univestin^{TM} frente a otros AINE

Para evaluar si Univestin^{TM} opera a nivel genómico, los monocitos de sangre periférica (MCSP) aislados humanos se estimularon con lipopolisacárido (LPS), se trataron con Univestin^{TM} tal y como se ilustra en el ejemplo 14, celecoxib, ibuprofeno o paracetamol, y se recogió el ARN total producido y se evaluó mediante RT-qPCR semicuantitativa. Específicamente, se construyó el ensayo añadiendo 130 000 células por pocillo en placas de 6 pocillos. A continuación se estimularon las células con LPS a 10 ng/ml y se coincubó con Univestin^{TM} a 1, 3, 10, 30 y 100 \mug/ml y celecoxib, ibuprofeno y paracetamol a 3 \mug/ml durante 18 horas a 37ºC con CO_{2} al 5% en un entorno humidificado. Después se recogió cada condición de tratamiento celular mediante centrifugación y se aisló el ARN total producido mediante el reactivo TRIzol® (Invitrogen^{TM} Life Technologies, n.º de catálogo 15596-026) y el protocolo recomendado para el reactivo TRIzol®. El ARN total se retrotranscribió utilizando la transcriptasa inversa del virus de leucemia murina de Moloney (M-MLV RT; Promega Corp., n.º de catálogo M1701) mediante hexámeros aleatorios (Promega Corp., n.º de catálogo C1181). Se realizaron los experimentos de qPCR en un sistema de detección de secuencias ABI Prism® 7700 mediante productos de ensayo por encargo (AOD por sus siglas en inglés) validados en las fases previas de desarrollo (AOD de Applied Biosystems, Inc., n.º de catálogo 4331182) para el estándar interno del ARNr 18S y los ensayos específicos de los genes. Se estandarizaron los valores de expresión específicos de gen por sus respectivos valores de expresión del gen del ARNr 18S (control interno) y luego la condición de tratamiento sin fármaco y sin LPS normalizada a 100. Las condiciones de tratamiento son relativas a esta condición nula.

Univestin^{TM} disminuyó la expresión génica normalizada de cox-2 unas 100 veces, mientras que la expresión normalizada del gen cox-1 mostró poca variación. Cuando se trataron los MCSP con 3 \mug/ml de Univestin^{TM}, celecoxib, ibuprofeno o paracetamol, sólo Univestin^{TM} no consiguió aumentar la expresión génica de cox-2. Se cree que es la primera descripción de cambios en los niveles de expresión génica de los eicosinoides, citocinas, quimiocinas y otros genes implicados en el dolor y las vías de inflamación después del tratamiento con una mezcla de flavonoides de anillo B libre y flavanos con el uso de técnicas de RT-qPCR semicuantitativa. Este trabajo se ha combinado con ensayos de ELISA para evaluar los cambios en la cantidad de proteínas así como ensayos de la función enzimática para evaluar las alteraciones en la función proteica. Como resultado de estos estudios, se ha demostrado la existencia de efectos genómicos y proteómicos acoplados después del tratamiento con Univestin^{TM}. Otros estudios citados en la bibliografía han utilizado métodos específicos de proteínas para inferir la expresión génica en vez de mostrarla directamente. Los resultados se presentan en las figuras 16 y 17.

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Ejemplo 18 Evaluación de la eficacia de Univestin^{TM} con un modelo de tumefacción de oreja de ratón in vivo

Para evaluar si se podría utilizar Univestin^{TM} para tratar la inflamación in vivo, la composición, preparada como se describe en el ejemplo 14, se administró mediante sonda nasogástrica a ratones ICR (Harlan Labs) de 4 a 5 semanas un día antes del tratamiento de las orejas con AA. Los ratones del ensayo se alimentaron con equivalentes de dosis de 50, 100 y 200 mg/kg de Univestin^{TM} suspendidas en aceite de oliva, mientras que los ratones de control se alimentaron sólo con aceite de oliva. Al día siguiente se aplicaron 20 \mul de AA a 330 mM en alcohol al 95% en una oreja de cada ratón, mientras que se aplicó alcohol a la otra oreja como control. Los ratones tratados con Univestin^{TM} mostraron una respuesta a la dosis medible cuyo comportamiento se mantuvo con dosis crecientes de Univestin^{TM}, tal y como se demuestra en la figura 18. En relación con la figura 18, la dosis de 200 mg/kg reduce la tumefacción un 50% en comparación con el control sin Univestin^{TM}. La dosis de 50 mg/kg de Univestin^{TM} fue tan eficaz como la dosis a 50 mg/kg de otro antiinflamatorio potente, la indometacina.

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Ejemplo 19 Evaluación de la eficacia de Univestin^{TM} con un modelo de tumefacción articular de la pata de ratón in vivo

Ya que Univestin^{TM} se ha diseñado para actuar selectivamente contra el dolor articular, se inyectó una disolución de 20 \mul de AA a 100 mM en etanol al 95% en las articulaciones de las patas posteriores de ratones ICR (Harlan Labs) de 4 a 5 semanas para generar la tumefacción. El grupo del prueba se alimentó con 100 mg/kg de Univestin^{TM} suspendido en aceite de oliva unas 12 horas antes, mientras que al otro grupo no se le administró Univestin^{TM}. Los grupos de control incluían ratones que no habían recibido inyecciones de ácido araquidónico (control negativo) y un grupo que tenía etanol al 95% sin inyección de AA (control del vehículo). A estos grupos no se les administró Univestin^{TM}. Los resultados se presentan en la figura 19. En relación con la figura 19, a los ratones a los que se les administró Univestin^{TM} y que se les inyectó AA mostraron un nivel basal de tumefacción en comparación con los controles y el grupo inyectado con ácido araquidónico y sin tratar. Estos resultados demuestran que Univestin^{TM} resulta eficaz para reducir la tumefacción de las articulaciones, el sitio de acción.

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Ejemplo 20 Evaluación clínica de la eficacia de los flavonoides de anillo B libre y los flavanos sobre el alivio del dolor ocasionado por la artritis reumatoide o la artrosis de la rodilla y/o la cadera

Este estudio clínico era un estudio controlado con placebo, de doble ocultación, aleatorizado y unicéntrico. Sesenta sujetos (n = 60) con artritis reumatoide o artrosis de la rodilla y/o la cadera se distribuyeron al azar a uno de los cuatro grupos siguientes:

A_{0}: Placebo n = 15 Placebo

A_{1}: Dosis 1 n = 15 Univestin^{TM} 250 mg/día (125 mg dos veces al día)

A_{2}: Dosis 2 n = 15 Univestin^{TM} 500 mg/día (250 mg dos veces al día)

A_{3}: Control activo n = 15 Celecoxib 200 mg/día (100 mg dos veces al día)

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Se preparó Univestin^{TM} tal y como se describe en el ejemplo 14. Este lote específico de Univestin^{TM} (lote n.º G1702-COX-2) contiene un 86% de ingredientes activos totales, que incluye un 75,7% de flavonoides de anillo B libre y un 10,3% de flavanos. El celecoxib, también conocido como Celebrex^{TM}, es un nombre comercial para un fármaco que es un inhibidor selectivo de la COX-2.

Se emparejó a los sujetos según el sexo y se reclutaron por edades de 40 a los 75. El tratamiento consistía en la administración oral durante 90 días del placebo o el compuesto activo (Univestin^{TM} o celecoxib) según la posología anterior. Los sujetos que tomaban los AINE requirieron un periodo de eliminación de dos semanas antes de comenzar el estudio. No se limitó la actividad física, ni se proporcionó a los sujetos ningún consejo en cuanto a la dieta. Los sujetos eran libres de abandonar el estudio en cualquier momento por cualquier motivo. Se evaluó la eficacia de los tratamientos a los 30, 60 y 90 días de administración oral por los médicos, utilizando el índice de artrosis de la Western Ontario and McMaster Universities (WOMAC) (véase Lingard et al., (2001) J. Bone & Joint. Surg. 83: 1856-1864; Sodermand y Malchau (200) Acta Orthop. Scand. 71 (1): 39-46). Se revisó este protocolo y fue aprobado por un comité institucional de revisión (IRB en inglés) de la Universidad de Montreal.

Se administró el WOMAC a sujetos preferiblemente en la consulta del médico. Se les pidió leer y responder a un cuestionario por sí mismos o por medio de un representante en la sala de espera de la consulta del médico, o fueron entrevistados por el personal del proyecto por teléfono, y se transcribieron los datos en la base de datos informática. Esto ofreció un entorno estable entre los pacientes y redujo la posibilidad de un sesgo debido a los diferentes entornos domésticos entre los pacientes. Las diferencias entre grupos que presentaron todas las mediciones se evaluaron con un análisis de varianza unidireccional y con la diferencia menos significativa de Tukey para las comparaciones múltiples. A todas las cuestiones se les asignó una ponderación de 0 a 4 según la gravedad del dolor, la rigidez o la pérdida funcional. A continuación se convirtieron estos valores en porcentajes normalizados a 100 y se describieron como puntuaciones de WOMAC. Los valores más elevados indican una afectación mayor. La tabla 12 presenta las medias de las puntuaciones del índice WOMAC para el dolor, la rigidez y la función para 250 mg y 500 mg al día de Univestin^{TM} en comparación con el celecoxib a 200 mg al día y el placebo antes del tratamiento (basal) y a 30, 60 y 90 días después del tratamiento. Cuanto menor es la puntuación, menos dolor y rigidez tiene un paciente y mejor es la función.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 12 Puntuaciones del índice WOMAC a nivel basal y a 30, 60 y 90 días

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La tabla 13 presenta la media del cambio absoluto en las puntuaciones del WOMAC para el dolor, la rigidez y la función. Se expresan como la diferencia entre el nivel basal y las puntuaciones obtenidas a los 30, 90 y 60 días. Cuánto más negativa es la puntuación, mayor es la mejora.

TABLA 13 Media del cambio absoluto en las puntuaciones WOMAC a los 30, 60 y 90 días*

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Es muy difícil atribuir una desviación estándar a una media de grupo en un ensayo clínico debido a las diferencias importantes que aparecen en los datos. Es más, se prefieren límites de confianza para la media porque ofrecen un límite inferior y superior para la media y, cuanto más estrecho el intervalo, más precisa es la estimación de la media. Los límites de confianza se expresan en términos de un coeficiente de confianza. El intervalo de confianza del 95% es el intervalo que se utiliza con más frecuencia para describir una media en este tipo de análisis estadístico. Esto no implica que haya una probabilidad del 95% de que el intervalo contenga la media real. En lugar de eso, el nivel de confianza se asocia al método de calcular el intervalo. El coeficiente de confianza es simplemente la proporción de muestras de un tamaño determinado que se puede esperar que contenga la media verdadera. Es decir, para un intervalo de confianza del 95%, si se recogieran muchas muestras y se calculara el intervalo de confianza, a largo plazo aproximadamente el 95% de estos intervalos contendrán la media verdadera. Con esto en mente, se calculó el intervalo de confianza del 95% para las puntuaciones del índice WOMAC para el dolor, la rigidez y la función a los 30, 60 y 90 días.

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Se escogieron puntuaciones brutas/no estandarizadas para las puntuaciones del índice WOMAC en una escala Likert de cinco puntos con un intervalo entre 1 y 5 para representar los índices finales del dolor, la rigidez y la pérdida de la función (figuras 20 a 31). Se utilizó una estandarización a una escala entre 0 y 100 en otras secciones para dar uniformidad (véase las tablas 12 y 13) y para mejorar la apreciación de las magnitudes de los cambios. Sin embargo, dado que todas las figuras se basan en las mismas escalas del 1 al 5, los datos en bruto se representaron gráficamente porque reflejan de manera más precisa los métodos mediante los cuales se obtuvieron estas puntuaciones a partir de los cuestionarios de los pacientes. En otras palabras, ya que se les dijo a los pacientes que eligieran entre 1 y 5, estas representaciones reflejan mejor la respuesta del paciente frente a la puntuación estandarizada o transformada de 0 a 100 que no refleja la percepción del paciente del posible intervalo de respuestas.

Existen tendencias claras que demuestran que el índice del dolor se reducía con Univestin^{TM} a 250 y 500 mg/día a lo largo de un tratamiento de 90 días basándose en las respuestas del paciente. El celecoxib también reduce el dolor durante este mismo periodo de tiempo en comparación con el placebo, que no lo reduce. No obstante, el celecoxib no parece ser tan eficaz como Univestin^{TM} a ambas dosis para reducir la rigidez, ya que los intervalos de confianza se solapan mucho con los del placebo. Finalmente, Univestin^{TM} a ambas dosis mejoró claramente la pérdida funcional, pero no el celecoxib, en comparación con el placebo. Las representaciones gráficas contienen a todos los sujetos aunque no completaran el estudio. Sin embargo, cada intervalo de confianza se basa de forma válida en el número de sujetos que estaban presentes en el momento en el que se realizaron las pruebas del índice WOMAC, por lo que las tendencias todavía se mantienen. Estos datos se representan gráficamente en las figuras 21 a 31.

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Ejemplo 21 Evaluación clínica de la eficacia de los flavonoides de anillo B libre y los flavanos sobre el IMC y la pérdida de peso debido a un aumento de la función

Las mediciones adicionales tomadas durante el ensayo clínico fueron la altura y el peso. Se midieron y pesaron los sujetos de los grupos (véase el ejemplo 20) a los 30 y 90 días de tratamiento. No se les ofreció a los sujetos ninguna recomendación sobre la dieta o el ejercicio para no sesgar los resultados hacia la reducción del IMC y la pérdida de peso. La tabla 14 ilustra los cambios de peso y del IMC que se produjeron después del tratamiento durante 30 y 90 días.

TABLA 14 Cambio en la media del peso (kg) y del IMC (kg/m^{2}) a los 30 y 90 días

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Según estos datos, la dosis de 250 mg/día de Univestin^{TM} ofreció la mayor pérdida de peso y cambio del IMC tras la dosis de 500 mg/día de Univestin^{TM} y luego el celecoxib. El placebo no afectó al peso ni al IMC.

No se cree que haya en la bibliografía ninguna otra descripción de compuestos antiinflamatorios que se utilicen para adelgazar o realizar cambios en el IMC. Aunque a los sujetos no se les ofreció ningún consejo sobre el ejercicio, las mayores capacidades funcionales adquiridas después del tratamiento, especialmente con Univestin^{TM}, les puede haber permitido hacer más ejercicio por propia voluntad. Alternativamente, Univestin^{TM} puede aumentar la termogénesis, la lipólisis o causar una infrautilización de los glúcidos o las grasas de la dieta. Las figuras 32 y 33 ilustran el IMC y la pérdida de peso observados con Univestin^{TM} después de 30 y 90 días de tratamiento.

Ejemplo 22 Evaluación clínica de la eficacia de los flavonoides de anillo B libre y los flavanos para disminuir la glucemia debido a un aumento de la función

También se midió la glucemia a 0 (nivel basal), 30 y 90 días después del tratamiento (véase el ejemplo 20). Estas mediciones se describieron en milimoles por litro. Los datos también se muestran en mg/dl. La tabla 15 presenta la concentración de glucosa en la sangre después de 30 y 90 días de tratamiento con Univestin^{TM} a 250 y 500 mg/día.

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TABLA 15 Cambio en la glucemia después de 30 y 90 días de tratamiento

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Estos datos sugieren que las dosis a 250 y 500 mg/día de Univestin^{TM} reducen significativamente la concentración de glucosa en la sangre con el tiempo. Este impacto puede estar o no relacionado con la pérdida de peso observada anteriormente o con el presumible aumento en la actividad por la mejora de la pérdida funcional. También puede ser posible que Univestin^{TM} actúe directamente para mejorar el metabolismo de la glucosa al disminuir la tolerancia a la glucosa o utilizar los glúcidos con más eficacia.

Claims

1. Composición que comprende una mezcla de baicalina y catequina, en la que la baicalina se aísla de una planta o plantas del género de plantas Scutellaria y la catequina se aísla de una planta o plantas del género de plantas Acacia.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que la proporción de baicalina:catequina en la composición es aproximadamente 85:15.

3. Composición según las reivindicaciones 1 ó 2, en la que la baicalina y la catequina se aíslan de una parte de la planta seleccionada del grupo que consiste en tallos, corteza de tallos, troncos, corteza de troncos, ramitas, tubérculos, raíces, corteza de raíces, brotes jóvenes, semillas, rizomas, flores y otros órganos reproductores, hojas y otras partes aéreas.

4. Composición según la reivindicación 3, en la que la catequina se aísla de una especie de plantas seleccionada del grupo que consiste en Acacia catechu, Acacia concinna, Acacia famesiana, Acacia senegal, Acacia speciosa, Acacia arabica, A. caesia, A. pennata, A. sinuata, A. meamsii, A. picnantha, A. dealbata, A. auriculiformis, A. holoserecia y A. mangium.

5. Utilización de la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para preparar una composición farmacéutica para:

a) aliviar el dolor y la rigidez articulares y mejorar la movilidad y la función física;

b) prevenir y tratar la artrosis y la artritis reumatoide;

c) reducir la concentración de glucosa en la sangre debido al aumento de la actividad física que es resultado de mejorar la movilidad, flexibilidad y función física en un sujeto; o

d) disminuir el índice de masa corporal y ocasionar pérdida de peso.

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6. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para utilizarla para:

b) prevenir y tratar la artrosis y la artritis reumatoide;

c) reducir la concentración de glucosa en la sangre debido a un aumento de la actividad física que es resultado de mejorar la movilidad, la flexibilidad y la función física en un sujeto; o

d) disminuir el índice de masa corporal y ocasionar pérdida de peso.

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7. Utilización de la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para preparar una composición farmacéutica para prevenir y tratar las enfermedades y afecciones con origen en las vías de la COX-2 y la 5-LO seleccionadas del grupo que consiste en dismenorrea, arterioesclerosis, infarto de miocardio, obesidad, diabetes, síndrome X, enfermedad de Alzheimer, reacción alérgica respiratoria, insuficiencia venosa crónica, hemorroides, lupus eritematoso diseminado, psoriasis, cefalea tensional crónica, cefaleas migrañosas, enteropatía inflamatoria, infecciones tópicas ocasionadas por virus, bacterias u hongos, quemadura solar, quemadura térmica, dermatitis de contacto, melanoma y carcinoma.

8. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para la utilización en la prevención y el tratamiento de las enfermedades y las afecciones con origen en las vías de la COX-2 y la 5-LO seleccionadas del grupo que consiste en dismenorrea, arterioesclerosis, infarto de miocardio, obesidad, diabetes, síndrome X, enfermedad de Alzheimer, reacción alérgica respiratoria, insuficiencia venosa crónica, hemorroides, lupus eritematoso diseminado, psoriasis, cefalea tensional crónica, cefaleas migrañosas, enteropatía inflamatoria; infecciones tópicas ocasionadas por virus, bacterias u hongos, quemaduras solares, quemaduras térmicas, dermatitis de contacto, melanoma y carcinoma.

9. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en la que se mezclan un extracto de una planta que contiene baicalina y un extracto de una planta que contiene catequina para formar una mezcla que se añade a uno o varios adyuvantes, excipientes o vehículo para formar la composición.

10. Utilización según la reivindicación 9, en la que el adyuvante, excipiente o vehículo se selecciona del grupo que consiste en sales a base de calcio, sílice, boro, histidina, sulfatos de glucosamina, sulfatos de condroitina, gluconato de cobre, celulosa, vitamina D, vitamina K, cartílago de tiburón y bovino.

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11. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en la que la composición se ha de administrar en una dosificación que se selecciona de 0,01 a 200 mg/kg de masa corporal.

12. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, en la que las vías de administración se seleccionan del grupo que consiste en administración oral, tópica, por medio de supositorio, intravenosa, intradérmica, intragástrica, intramuscular, intraperitoneal e intravenosa.

13. Utilización de una composición que comprende una mezcla de flavonoides de anillo B libre y flavanos, en la que los flavonoides de anillo B libre tienen la estructura siguiente:

29

en la que

R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -H, -OH, -SH, -OR, SR, -NH_{2}, -NHR, -NR_{2}, -NR_{3}^{+}X^{-}, un carbono, oxígeno, nitrógeno o azufre, glucósido de un sólo azúcar o de una combinación de varios azúcares que incluye aldopentosas, metilaldopentosa, aldohexosas, cetohexosa;

en la que

R es un grupo alquilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; y

X se selecciona del grupo de contraaniones farmacéuticamente aceptables que incluye hidroxilo, cloruro, yoduro, sulfato, fosfato, acetato, fluoruro y carbonato,

y en la que los flavanos tienen la estructura siguiente:

30

en la que

R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -H, -OH, -SH, -OCH_{3}, -SCH_{3}, -OR, -SR, -NH_{2}, -NRH, -NR_{2}, -NR_{3}^{+}X^{-}, ésteres de los grupos de sustitución, seleccionados independientemente del grupo que consiste en galato, acetato, ésteres de cinamoílo y de hidroxil-cinamoílo, ésteres de trihidroxibenzoílo y ésteres de cafeoílo; un carbono, oxígeno, nitrógeno o azufre, glucósido de un solo azúcar o una combinación de varios azúcares que incluye aldopentosas, metilaldopentosa, aldohexosas, cetohexosa; dímero, trímero y otros flavanos polimerizados;

en la que

R es un grupo alquilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; y

X se selecciona del grupo de contraaniones farmacéuticamente aceptables que incluye, pero sin limitarse a ellos, hidroxilo, cloruro, yoduro, sulfato, fosfato, acetato, fluoruro, carbonato

para la preparación de una composición farmacéutica para aliviar el dolor y la rigidez articulares y mejorar la movilidad y la función física.

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14. Una composición que comprende una mezcla de flavonoides de anillo B libre y flavanos, en la que los flavonoides de anillo B libre tienen la estructura siguiente:

31

en la que

R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, y R_{5} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -H, -OH, -SH, -OR, -SR, -NH_{2}, -NHR, -NR_{2}, NR_{3}^{+}X^{-}, un carbono, oxígeno, nitrógeno o azufre, glucósido de un sólo azúcar o de una combinación de varios azúcares que incluye aldopentosas, metilaldopentosa, aldohexosas, cetohexosa;

en la que

R es un grupo alquilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; y

y en la que los flavanos tienen la estructura siguiente:

32

en la que

R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -H, -OH, -SH, -OCH_{3}, -SCH_{3}, -OR, -SR, -NH_{2}, NRH, -NR_{2}, -NR_{3}^{+}X^{-}, ésteres de los grupos de sustitución, seleccionados independientemente del grupo que consiste en galato, acetato, ésteres de cinamoílo y de hidroxil-cinamoílo, ésteres de trihidroxibenzoílo y ésteres de cafeoílo; un carbono, oxígeno, nitrógeno o azufre, glucósido de un sólo azúcar o de una combinación de varios azúcares que incluye aldopentosas, metilaldopentosa, aldohexosas, cetohexosa; dímeros, trímeros y otros flavanos polimerizados;

en la que

R es un grupo alquilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; y

para utilizarla para aliviar el dolor y la rigidez articulares y mejorar la movilidad y la función física.

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15. Utilización de una composición que comprende una mezcla de al menos un flavonoide de anillo B libre y al menos un flavano, en la que el flavonoide de anillo B libre tiene la estructura siguiente:

33

en la que

R_{1,} R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -H, -OH, -SH, -OR, -SR, -NH_{2}, -NHR, -NR_{2}, -NR_{3}^{+}X^{-}, un carbono, oxígeno, nitrógeno o azufre, glucósido de un sólo azúcar o de una combinación de varios azúcares que incluye aldopentosas, metilaldopentosa, aldohexosas, cetohexosa;

en la que

R es un grupo alquilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; y

y en la que el flavano tiene la estructura siguiente:

34

en la que

R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -H, -OH, -SH, -OCH_{3}, -SCH_{3}, -OR, -SR, -NH_{2}, -NRH, -NR_{2}, -NR_{3}^{+}X^{-}, ésteres de los grupos de sustitución, seleccionados independientemente del grupo que consiste en galato, acetato, ésteres de cinamoílo y de hidroxil-cinamoílo, ésteres de trihidroxibenzoílo y ésteres de cafeoílo; un carbono, oxígeno, nitrógeno o azufre, glucósido de un sólo azúcar o de una combinación de varios azúcares que incluyen aldopentosas, metilaldopentosa, aldohexosas, cetohexosa; dímeros, trímeros y otros flavanos polimerizados;

en la que

R es un grupo alquilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; y

X se selecciona del grupo de contraaniones farmacéuticamente aceptables que incluye, pero sin limitarse a ellos, hidroxilo, cloruro, yoduro, sulfato, fosfato, acetato, fluoruro, carbonato,

para preparar una composición farmacéutica para

a) prevenir y tratar la artrosis y la artritis reumatoide;

b) reducir la concentración de glucosa en la sangre debido al aumento de la actividad física que es resultado de mejorar la movilidad, la flexibilidad y la función física en un sujeto; o

c) disminuir el índice de masa corporal y ocasionar pérdida de peso.

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16. Composición que comprende una mezcla de al menos un flavonoide de anillo B libre y al menos un flavano, en la que el flavonoide de anillo B libre tiene la estructura siguiente:

35

en la que

R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -H, -OH, -SH, -OR, -SR, -NH_{2}, -NHR, -NR_{2}, -NR_{3}^{+}X^{-}, un carbono, oxígeno, nitrógeno o azufre, glucósido de un sólo azúcar o de una combinación de varios azúcares que incluye aldopentosas, metilaldopentosa, aldohexosas, cetohexosa;

en la que

R es un grupo alquilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; y

y en la que el flavano tiene la estructura siguiente:

36

en la que

R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} se seleccionan independiente del grupo que consiste en -H, -OH, -SH, -OCH_{3}, -SCH_{3}, -OR, -SR, -NH_{2}, -NRH, -NR_{2}, NR_{3}^{+}X^{-}, ésteres de los grupos de sustitución, seleccionados independientemente del grupo que consiste en galato, acetato, ésteres de cinamoílo y de hidroxil-cinamoílo, ésteres de trihidroxibenzoílo y ésteres de cafeoílo; un carbono, oxígeno, nitrógeno o azufre, glucósido de un sólo azúcar o de una combinación de varios azúcares que incluye aldopentosas, metilaldopentosa, aldohexosas, cetohexosa; dímeros, trímeros y otros flavanos polimerizados;

en la que

R es un grupo alquilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; y

para utilizarla para

a) prevenir y tratar la artrosis y la artritis reumatoide;

b) reducir la concentración de glucosa en la sangre debido a un aumento de la actividad física que es resultado de mejorar la movilidad, la flexibilidad y la función física en un sujeto; o

c) disminuir el índice de masa corporal y ocasionar pérdida de peso.

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17. Utilización de una composición que comprende una mezcla de al menos un flavonoide de anillo B libre y al menos un flavano, en la que el flavonoide de anillo B libre tiene la estructura siguiente:

37

en la que

R es un grupo alquilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; y

y en la que el flavano tiene la estructura siguiente:

38

en la que

R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -H, -OH, -SH, -OCH_{3}, -SCH_{3}, -OR, -SR, -NH_{2}, -NRH, -NR_{2}, -NR_{3}^{+}X^{-}, ésteres de los grupos de sustitución, seleccionados independientemente del grupo que consiste en galato, acetato, ésteres de cinamoílo y de hidroxil-cinamoílo, ésteres de trihidroxibenzoílo y ésteres de cafeoílo; un carbono, oxígeno, nitrógeno o azufre, glucósido de un sólo azúcar o de una combinación de varios azúcares que incluye aldopentosas, metilaldopentosa, aldohexosas, cetohexosa; dímeros, trímeros y otros flavanos polimerizados;

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en la que

R es un grupo alquilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; y

para la preparación de una composición farmacéutica para prevenir y tratar las enfermedades y afecciones con origen en las vías de la COX-2 y la 5-LO seleccionadas del grupo que consiste en dismenorrea, arterioesclerosis, infarto de miocardio, obesidad, diabetes, síndrome X, enfermedad de Alzheimer, reacción alérgica respiratoria, insuficiencia venosa crónica, hemorroides, lupus eritematoso diseminado, psoriasis, cefalea tensional crónica, cefaleas migrañosas, enteropatía inflamatoria; infecciones tópicas causadas por virus, bacterias u hongos, quemaduras solares, quemaduras térmicas, dermatitis de contacto, melanoma y carcinoma.

18. Composición que comprende una mezcla de al menos un flavonoide de anillo B libre y al menos un flavano, en la que el flavonoide de anillo B libre tiene la estructura siguiente:

39

en la que

R es un grupo alquilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; y

X se selecciona del grupo de contraaniones farmacéuticamente aceptables que incluye, hidroxilo, cloruro, yoduro, sulfato, fosfato, acetato, fluoruro y carbonato,

y en la que el flavano tiene la estructura siguiente:

40

en la que

R es un grupo alquilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; y

para su utilización en la prevención y el tratamiento de las enfermedades y afecciones con origen en las vías de la COX-2 y la 5-LO seleccionadas del grupo que consiste en dismenorrea, arterioesclerosis, infarto de miocardio, obesidad, diabetes, síndrome X, enfermedad de Alzheimer, reacción alérgica respiratoria, insuficiencia venosa crónica, hemorroides, lupus eritematoso diseminado, psoriasis, cefalea tensional crónica, cefalea migrañosas, enteropatía inflamatoria; infecciones tópicas causadas por virus, bacterias u hongos, quemaduras solares, quemaduras térmicas, dermatitis de contacto, melanoma y carcinoma.