CN111655253A - 用于用汉黄芩素治疗疼痛的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文描述的本发明涉及用于用汉黄芩素治疗疼痛的组合物和方法。具体地，本文描述用于用汉黄芩素治疗肌肉骨骼疼痛和关节炎的组合物和方法。

Description

用于用汉黄芩素治疗疼痛的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年1月9日提交的美国临时专利申请第62/615,072号和2018年11月6日提交的美国临时专利申请第62/756,188号的权益，所述申请中的每个的全部内容由此以引用的方式并入本文中。

技术领域

本文描述的本发明涉及用于用汉黄芩素治疗疼痛的组合物和方法。具体地，本文描述用于治疗肌肉骨骼疼痛和关节炎的组合物和方法。

背景技术

肌肉骨骼疼痛和关节炎疼痛世界各地人们的主要问题。这些情况引起的疼痛与异常炎症有关。特别有问题的是骨关节炎(OA)，这是一种慢性病，在美国等许多其它地方影响超过2700万人。OA被认为是与危险因素(如肥胖、关节负荷、急性损伤、衰老和关节错位)相关的多因素疾病。随着肥胖症比率升高和人口平均年龄增加，OA的发生率也显著增加。

曾经认为是使关节关节表面物理退化的异常或过度机械应力结果，最近的研究已逐渐将对OA的认识从“磨损”疾病转换到涉及驱动疾病进展的炎性和脂质组学生物标志物的代谢活跃过程。研究人员已证明细胞因子(如HtrA1和Mmp-13)在OA进展中的重要性。作为驱动OA进展的炎性途径的一部分，通过软骨细胞将基质降解蛋白酶HtrA1和MMP-13分泌到细胞周围和细胞外基质中，导致基质完整性和功能降低。

在这种情况下，研究人员寻求强力阻断炎症作为治疗OA的潜在治疗方法。举例来说，如“强力和特异性抗细胞因子治疗”或“阻断”促炎性信号传导的词语已经用于描述治疗OA的答案(参见例如Kapoor M等人,《自然综述风湿病学(Nature ReviewsRheumatology)》.2011；7(1):33-42和Kalaitzoglou E等人,《最新风湿病学报告(CurrRheumatol Rep.)》.2017；19(8))。

然而，迄今为止，没有可逆转与OA相关的疾病病因的成功的治疗选项。因此，迫切需要一种既安全又有效的治疗剂，该治疗剂既可以治疗OA的疼痛也可以治疗潜在的OA疾病，同时又可以促进关节的再生和修复。此外，对于安全有效地治疗肌肉骨骼疼痛引起的疾病的选择有限。

发明内容

通过施用(例如局部施用)低剂量的汉黄芩素或其衍生物来解决对治疗包括OA疼痛和肌肉骨骼疼痛的疼痛的前述限制。因此，本文描述的一些实施例为用于减轻或缓解患者疼痛的方法，其包括以约1μM到约500μM的治疗有效量区域性地向患有疼痛的患者的一个或多个部位区域性施用包括汉黄芩素或其衍生物的组合物以及减轻或缓解疼痛。在一些实施例中，疼痛选自肌肉骨骼疼痛和关节炎疼痛在一些实施例中，待治疗的肌肉骨骼疼痛源于肌肉酸痛、肌肉拉伤、肌肉瘀伤或肌肉撕裂。在其它实施例中，肌肉骨骼疼痛源于肌腱酸痛、肌腱拉伤、肌腱瘀伤或肌腱撕裂。在一些实施例中，关节炎疼痛包括骨关节炎疼痛和类风湿性关节炎疼痛。在一些实施例中，在施用汉黄芩素之后，患者对疼痛的感觉减轻约10％到约100％。

在一些实施例中，用于减轻或缓解疼痛的局部施用为经皮施用。在一些实施例中，汉黄芩素的单剂量为3.73×10^-9g/kg到约1.87×10^-6g/kg，并且汉黄芩素的日剂量为每天1.12×10^-8g/Kg到约5.61×10^-6g/Kg。在一些实施例中，汉黄芩素作为立即释放局部制剂、延迟释放局部制剂、连续释放局部制剂或延长释放局部制剂施用。在一些实施例中，在区域性施用汉黄芩素之前、之后或与其同时施用一种或多种附加抗炎药物。

在一些实施例中，用于用汉黄芩素治疗或减轻疼痛的组合物包括选自以下浓度的汉黄芩素：约1μM、5μM、10μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM、120μM、140μM、160μM、180μM、200μM、220μM、240μM、260μM、280μM、300μM、320μM、340μM、360μM、380μM、400μM、420μM、440μM、460μM、480μM和500μM的汉黄芩素。在一些实施例中，组合物呈液体、擦剂、泡沫、乳膏、溶液、乳液、凝胶、喷雾、擦拭剂、洗剂或贴剂或其组合的形式。在一些实施例中，组合物为乳膏，其中乳膏包括一种或多种经皮渗透促进剂。

本文所描述的一些实施例为用于治疗和促进治愈患者的关节炎关节的方法，包括以约1μM到约500μM的治疗有效量区域性地向患者的一个或多个关节炎关节局部施用包括汉黄芩素的组合物，由此治疗并且促进治愈关节炎关节。在一些实施例中，施用汉黄芩素减轻关节炎关节内的炎症。在一些实施例中，治疗有效量引发包含减少囊肿样病变(CLL)、较低的OARSI评分和抑制软骨退化的原纤毛途径的效果。

在一些实施例中，与不用汉黄芩素治疗的关节炎关节相比，在施用汉黄芩素之后，在关节炎关节(包括软骨和滑膜液)内或其近端周围神经酰胺的表达增加，TGF-β1的表达增加，MMP-13的表达减少，HtrA1的表达减少，NFκB的表达减少，并且AGE的表达减少。在一些实施例中，与不用汉黄芩素治疗的关节炎关节相比，在施用汉黄芩素之后，细胞因子HtrA1、MMP-13、NFκB和AGE的表达降低20％，并且TGF-β1和神经酰胺的表达升高20％。在一些实施例中，关节炎关节为骨关节炎关节。

一些其它实施例为局部疼痛组合物，其包括约1μM到约500μM浓度的汉黄芩素和化妆品上或皮肤病学上可接受的载体。在一些实施例中，汉黄芩素纯度为约90％到约100％。在一些实施例中，局部疼痛组合物呈液体、擦剂、泡沫、乳膏、溶液、乳液、凝胶、喷雾、擦拭剂、洗剂或贴剂或其组合的形式。在一些实施例中，局部疼痛组合物包括选自以下的一种或多种赋形剂：表面活性剂、乳化剂、脂肪、脂肪酸、甘油三酯、溶剂、增稠剂、皮肤调节剂、螯合剂、芳香剂、渗透促进剂和其组合。

在一些实施例中，在局部疼痛组合物中的载体包括选自以下的一种或多种赋形剂：十六十八醇、辛酸/癸酸甘油三酯、甘油、乳木果油、乙氧基二甘醇、硬脂酸甘油酯、peg-100硬脂酸酯、硬脂酸、丁二醇、二甲聚硅氧烷、欧薄荷(薄荷)油、椰子油、聚乙二醇、甜扁桃(甜杏仁)油、丙烯酸羟乙酯/、丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、鲸蜡硬脂醇聚醚-20、二甲基砜、角鲨烷、苯氧基乙醇、辛酰基乙二醇、丙烯酸酯/丙烯酸c10-30烷基酯交联聚合物、黄原胶、乙基己基甘油、己二醇、谷氨酸二乙酸四钠、聚山梨醇酯60、脱水山梨糖醇异硬脂酸酯、芦荟叶汁和薄荷醇和其组合。

在一些实施例中，本文所述的组合物包含二甲基砜、聚乙二醇或聚丙二醇、薄荷油、椰子油和乳木果油。在一些实施例中，本文所述的组合物包含：a).约0.03％到约5％二甲基砜；b).约1％到约8％聚乙二醇或聚丙二醇；c).约1％到约7％薄荷油；d).约0.3％到约50％乳木果油；e).约0.14％到约26％椰子油；和f).约15％到约85％水。

附图说明

图1为比较在接受DMM膝关节失稳手术之后用10μM汉黄芩素或媒剂治疗的小鼠的改良的Mankin评分(*p>0.05)。

图2为在DMM手术之后小鼠膝关节中的HtrA1的组织学染色；图区A随后用媒剂治疗的小鼠，并且图区B代表随后用10μM汉黄芩素治疗的小鼠。

图3为比较在DMM膝关节失稳手术之后用根据表7的测试乳膏组合物(TC)对假乳膏组合物(假)治疗的小鼠的OARSI评分的柱状图(*p>0.05)。

图4为比较在DMM膝关节失稳手术之后用根据表7的测试乳膏组合物(TC)对假乳膏组合物(假)治疗的小鼠的囊肿样病变的数量的柱状图(*p>0.01)。

图5为比较来自在DMM膝关节失稳手术之后用根据表7的测试乳膏组合物(TC)对假乳膏组合物(假)治疗的小鼠膝关节的关节软骨的NFκβ阳性细胞的数量的柱状图(*p>0.01)。

图6为比较来自在DMM膝关节失稳手术之后用根据表7的测试乳膏组合物(TC)对假乳膏组合物(假)治疗的小鼠膝关节的关节软骨的Mmp-13阳性细胞的数量的柱状图(*p>0.01)。

图7为比较来自在DMM膝关节失稳手术之后用根据表7的测试乳膏组合物(TC)对假乳膏组合物(假)治疗的小鼠膝关节的关节软骨的TGF-β1阳性细胞的数量的柱状图(*p>0.05)。

图8为比较在使用来自用10μM汉黄芩素、IL-1β或汉黄芩素预治疗随后IL-1β治疗对没有治疗的人软骨细胞的RNA定量RTPCR之后TGF-β1PCR产物的柱状图。

图9为比较在使用来自用10μM汉黄芩素、IL-1β或汉黄芩素预治疗随后IL-1β治疗对没有治疗的人软骨细胞的RNA定量RTPCR之后的BBS 3PCR产物的柱状图。

具体实施方式

以下描述更详细地定义本文描述的本发明的实施例。以下实施例不意指限制本发明或使其范围变窄，因为对于所属领域的普通技术人员将显而易见的是，可在不脱离本发明的范围的情况下对本文所描述的实施例或具体方面进行合适的修改和改编。本文引用的所有专利和公开其全文以引用的方式并入本文中。

出于解释本说明书的目的，以下术语和定义将适用并且每当适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，并且反之亦然。在下文阐述的任何定义与以引用的方式并入本文中的任何文献冲突的情况下，应以下文阐述的定义为准。

术语“患者”是指包括哺乳动物和人的任何受试者。患者可患有疾病或怀疑患有疾病，因此正在用药物治疗。在一些情况下，患者为哺乳动物，如狗、鸡、猫、马或灵长类动物。在一些情况下，如本文所用，术语“患者”是指人(例如男人、女性或儿童)。在一些情况下，如本文所用，术语“患者”是指动物模型研究的实验动物。患者或受试者可为任何年龄、性别或其组合。

如本文所用，术语“活性成分”、“活性医药成分”、“生物活性剂”或“治疗剂”是指提供通常有益的药理学作用的医药试剂、活性成分、化合物、物质或药物、组合物或其混合物。活性成分可为任何药学上可接受的盐、水合物、结晶形式或其多晶型物。

如本文单独或作为另一个基团的一部分使用，术语“烷基”是指含有一个或多个碳原子的直链或支链烃。在一些实施例中，烷基代表在1和4个碳原子之间。烷基的代表性实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基。在一些实施例中，烷基可为直链的。在一些实施例中，烷基可为支链的。

如本文单独或作为另一个基团的一部分使用，术语“烷氧基”是指通过氧基-O-附接到母体分子部分的如本文所定义的烷基(并且因此包括取代的形式，如聚烷氧基)。烷氧基的代表性实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、2-丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、己氧基等。

如本文所用，术语“卤代”或“卤素”是指任何合适的卤素，包括-F、-Cl、-Br和-I。

如本文所用，术语“分离的”和“纯化的”互换使用，并且指不含与化合物天然缔合的蛋白和天然存在的有机分子的为至少约30重量％、40重量％、50重量％、60重量％、70重量％、80重量％、90重量％95％、99％，100重量％的化合物或包括所述化合物的组合物。在本文所描述的一些实施例中，汉黄芩素通过所属领域中已知的或本文所描述的任何方法(包括例如高压液相色谱法、薄层色谱法或)通过合成纯化或分离。

如本文所用，术语“制剂”或“组合物”是指与药学上可接受的赋形剂组合的活性成分或药物。

如本文所用，术语“剂量(dosage或dose)”表示含有足以用单次施用产生治疗效果的量的任何形式的活性成分制剂。

如本文所用，术语“调节释放”是指在生理条件下或在体外测试中以比立即释放制剂的速率慢的速率释放活性成分的组合物。

如本文所用，术语“立即释放”是指在施用之后释放大部分活性成分(例如大于50％的活性成分)的组合物。

如本文所用，术语“持续释放”是指在延长的时间段内(例如几分钟、几小时或几天)释放活性成分的组合物，使得首先释放少于全部活性成分。举例来说，持续释放速率可在生理条件下或在体外测试中提供在某一时间段内从剂型释放某一规定量的药物或活性成分。

如本文所用，术语“延迟释放”是指在延迟的时间段之后根据期望特性释放活性成分的组合物。延迟的时间段可在施用组合物至少约5分钟、10分钟、20分钟、约30分钟、约1小时；约2小时；约4小时；约6小时；约8小时；约10小时；约12小时；约14小时；约16小时；约18小时；约20小时、约24小时；或甚至更长的一段时间之后。在延迟的时间段之后，组合物可立即释放或按照持续或延长释放特性释放。

如本文所用，术语“延长释放”是指在如至少约20分钟、约30分钟、约1小时；约2小时；约4小时；约6小时；约8小时；约10小时；约12小时；约14小时；约16小时；约18小时；约20小时、约24小时；或甚至更长的延长的时间段内释放活性成分的组合物。

术语“治疗”是指以可有效地改进与病症相关的病状、症状或参数的量、方式或模式来施用疗法。在一些实施例中，治疗是指减缓源于关节炎(例如骨关节炎)或肌肉骨骼疼痛的疼痛。在一些实施例中，治疗是指疾病过程(如关节炎(例如骨关节炎))的逆转和永久性治愈。

术语“区域性施用”或“区域化施用”是指向患有OA、OA疼痛或肌肉骨骼疼痛的一个或多个组织施用治疗剂(即，汉黄芩素)。区域性施用意指在不全身施用的情况下，接近病变组织施用治疗剂。在区域性地施用之后，预期活性剂可被淋巴或血管系统吸收并且随后从组织清除。然而，认为作用机理主要通过治疗剂与病变组织的区域性相互作用而发生。

术语“防治”是指到统计显著程度或到所属领域的技术人员可检测的程度预防或减轻病症的进展。

如本文所用，除非另外说明，否则“一(a/an)”意指一个或多个。

如本文所描述，本发明人发现用局部施用的低剂量汉黄芩素(其在一些实施例中为约1μM到约500μM)治疗OA和肌肉骨骼疼痛的出人意料地有效方法。还发现，局部施用汉黄芩素恢复关节稳态和消除OA疾病过程的进展。此外，本发明人发现，局部施用汉黄芩素逆转导致受影响的软骨细胞凋亡的软骨细胞激活，由此促进受损的关节软骨治愈。

来自局部施用汉黄芩素的这些实质效果之前从未实现。汉黄芩素为来源于贝加尔黄芩的根的类黄酮，其为传统的中草药。它已经用于治疗炎性疾病，包括特应性皮炎、高脂血症和动脉粥样硬化。最近，已研究汉黄芩素其通过阻断前列腺素E2、TLR4、NO和MMP产生(这可减少炎症)用于其它炎性疾病、癌症和疼痛管理中。举例来说，美国专利申请公开第2013/0136811号描述在经由腹膜内注射大剂量的汉黄芩素(即，200mg/kg)全身施用之后在小鼠福尔马林测试中疼痛症状的改进。然而，此方法未确定局部和区域性施用在低剂量下的汉黄芩素是否可减轻源于OA或肌肉骨骼疼痛疼痛。此研究也未指示汉黄芩素是否对恢复关节稳态、逆转OA疾病进展可具有任何效果。Park等人,《生物分子与治疗学(Biomolecules&Therapeutics.)》23(5)第442-448页(2015)描述的另一项研究评估关节内注射汉黄芩素对在通过IL-1β(其可参与OA的疾病进展)引发炎症之后在关节软骨中MMP-3表达的效果。虽然作者证明MMP-3表达减少，但是此研究未确定局部施用低剂量的汉黄芩素是否可改善源于骨关节炎或肌肉骨骼疼痛的疼痛或是否导致骨关节炎滑膜关节的功能恢复。

与此相反，本文所述的方法和组合物违反了常规期望，即使用非常有效的抗炎药物和其它全身或通过注射施用的治疗OA的方法。如本文所证明，利用低剂量的局部汉黄芩素可加速关节修复和治愈，其中汉黄芩素最佳地调节炎症，增强自然保护机制以辅助治愈过程。因此，治疗OA的炎性组分就像走到剃刀边缘一样-太少而没有效果，太多而OA恶化。此外，仅治疗炎症也是不够的。软骨细胞也必须从细胞凋亡途径切换为自噬，使得它可继续产生导致关节治愈的蛋白聚糖、胶原原纤维等。因此，本文所描述的方法和组合物适于治疗所有类型的骨关节炎。此外，预期可通过施用低剂量的汉黄芩素改善包括类风湿性关节炎疼痛的其它类型的关节炎。

如本文所描述，本发明人发现，所公开的组合物通过与原纤毛的新颖相互作用表现出保护效果。在软骨细胞上存在的原纤毛和在小鼠软骨细胞中的原纤毛与响应于增加负荷的信号处理相关。原纤毛与软骨稳态相关，包括通过上调OA常见的先前鉴定的HTRA1-DDR2-MMP13降解途径的OA。

另外证实，原纤毛在OA进展中起作用，如Hes1参与上调MMP-13表达。Hes1通过Notch信号传导途径起作用，通过原纤毛调整音猬因子信号传导。

已清楚地示出炎症在OA中的作用，但是使用强效抗炎剂尚未使疾病的进展停止。疾病似乎比简单的炎症更复杂。举例来说，已知脂肪因子(如肽激素瘦素)和炎症在引发OA中的相互作用。在肥胖个体中以高水平表达的参与维持胰岛素敏感性的瘦素通过上调在软骨细胞中的MMP-13表达与骨关节炎相关。在极端肥胖的情况下，在MMP-13的上调和瘦素表达与骨关节炎个体的BMI之间存在强正相关。原纤毛密切参与瘦素稳态。此外，已示出核因子κβ(NFκβ途径)与OA进展密切相关。已知NFκβ通过原纤毛调节。

原纤毛密切参与维持软骨稳态，并且OA的治疗必须考虑这一点，而不能仅依赖于阻断炎症。本文，本发明人证明汉黄芩素组合物通过作用于原纤毛对软骨细胞表现出整体保护效果，并且证明局部施用汉黄芩素减轻OA进展，由此治疗疾病。这是先前不归因于汉黄芩素并且解释当局部施用(例如作为乳膏)时为什么它对骨关节炎关节具有强大的整体益处的新颖途径。

如本文所证明，以局部经皮乳膏施用的汉黄芩素适用于消除OA的进展。根据本文所描述的方法并且以组合物施用的汉黄芩素阻断其中通过膝关节失稳手术诱发的OA疾病的小鼠的OA进展。如本文所描述，如通过若干关键指标证实，恢复关节健康。此外，在诱发疾病并且使其在治疗之前进展之后，根据本文所描述的方法和组合物使用汉黄芩素恢复关节健康。抗炎药已被用于治疗OA的症状(即疼痛)多年，而没有阻断疾病的进展，更不用说恢复关节健康。在此提供的数据指示，局部经皮治疗导致应激软骨细胞从细胞凋亡切换为自噬并且恢复关节健康-用于治疗OA的潜在疾病病理的过程。

所公开的方法和组合物的优点是双重的。第一，方法和组合物提供针对OA的部位特异性(即，关节)治疗。第二，它治疗与OA相关的软骨细胞激活的生理后果。此外，所公开的用汉黄芩素治疗限制或避免使用非甾体抗炎药物和阿片剂，其全身起作用并且具有有害的副作用，如增加或损伤内脏器官。

此外，本文所描述的方法和组合物适于区域性施用和缓解源于酸痛拉伤、肌肉瘀伤或肌肉撕裂的其它非关节炎炎性肌肉骨胳疼痛。同样地，本文所描述的方法和组合物适于区域性施用和缓解源于肌腱酸痛、拉伤、瘀伤或撕裂的疼痛。

本文所描述的一些实施例涉及用于治疗疼痛的化合物汉黄芩素或其衍生物的用途。具体地，本文描述用于治疗OA、OA疼痛和肌肉骨骼疼痛的汉黄芩素或其衍生物的用途。汉黄芩素的示例性衍生物为已知的(参见例如Gurung S K和Kim H P,Park H.《药物研究档案(Arch Pharm Res.)》11月32(11)第1503-8页(2009)，并且根据式I。

式I

其中R¹、R²和R³各自独立地选自-H、-卤、-OH、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、-NO₂和-SX，其中X为C₁-C₄烷基。

在一些实施例中，本文所描述的方法和组合物涉及使用汉黄芩素(5,7-二羟基-8-甲氧基黄酮；CAS登记号632-85-9)(下文显示为式II)治疗疼痛。具体地，本文描述使用根据式II的汉黄芩素治疗O OA疼痛和肌肉骨骼疼痛。

式II

本文描述的一些实施例为用于减轻或缓解源于患者的OA的疼痛的方法，其包括以治疗有效量施用包括汉黄芩素的组合物。适于用汉黄芩素治疗的OA受影响的滑膜关节包括脊柱、上肢、肘部、头部、颈部、胸廓、骨盆、会阴或下肢关节的一个或多个关节。因此，待治疗的滑膜关节包括关节突关节、肩锁关节、手指腕掌关节、拇指腕掌关节、喙锁关节、肘关节、掌间关节、指间关节、掌指关节、腕骨间关节、腕桡腕、远端桡尺骨关节、中间桡尺骨关节、近端桡尺骨关节、肩关节、胸锁关节、手腕关节、颞下颌关节、胸肋关节、剑胸骨关节、骶髂、踝关节、髋关节、指间关节或膝关节关节。

在一些实施例中，汉黄芩素在涉及易患发展OA的一个或多个滑膜关节的手术之后施用。汉黄芩素可在涉及一个或多个滑膜关节的手术之前、同时或之后施用。关节手术的类型包括不限于关节成形术、关节镜手术、滑膜切除术、关节置换术或椎板切除术或其组合。

在一些实施例中，施用汉黄芩素为局部施用，其具有减轻或消除肌肉骨骼疼痛或OA疼痛的有效量。此量的汉黄芩素还可有效地促进患有OA的关节治愈。在一个实施例中，汉黄芩素的量为约1μM到约500μM，包括在所述的范围内的每个整数。在另一个实施例中，汉黄芩素的量为约1μM到约400μM、约1μM到约300μM、约1μM到约200μM、约1μM到约10μM，或约1μM到约50μM，包括在所述范围内的每个整数。在另一个实施例中，汉黄芩素的量为约10μM到约500μM、约10μM到约400μM、约10μM到约300μM、约10μM到约200μM、约10μM到约100，或约10μM到约50μM，包括在所述范围内的每个整数。在另一个实施例中，汉黄芩素的量为约1μM、5μM、10μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM、120μM、140μM、160μM、180μM、200μM、220μM、240μM、260μM、280μM、300μM、320μM、340μM、360μM、380μM、400μM、420μM、440μM、460μM、480μM或约500μM。

在一些实施例中，汉黄芩素作为治疗上可有效地减轻源于OA或肌肉骨骼疼痛的疼痛的单剂量施用。在一个实施例中，剂量为约3.73×10^-9g/Kg到约1.87×10^-6g/Kg，包括在规定范围内的每个整数。在另一个实施例中，剂量为约3.73×10^-9g/Kg到约1.49×10^-6g/Kg，包括在规定范围内的每个整数。在另一个实施例中，剂量为约3.73×10^-9g/Kg到约1.12×10^-6g/Kg，包括在规定范围内的每个整数。在另一个实施例中，剂量为约3.73×10^-9g/Kg到约7.5×10^-7g/Kg，包括在规定范围内的每个整数。在另一个实施例中，剂量为约3.73×10^-9g/Kg到约4.48×10^-7g/Kg，包括在规定范围内的每个整数。在另一个实施例中，剂量为约3.73×10^-9g/Kg到约2.24×10^-7g/Kg，包括在规定范围内的每个整数。在另一个实施例中，剂量为约3.73×10^-9g/Kg、1.87×10^-8g/Kg、3.73×10^-8g/Kg、7.47×10^-8g/Kg、1.49×10^-7g/Kg、2.24×10^-7g/Kg、2.99×10^-7g/Kg、3.73×10^-7g/Kg、4.48×10^-7g/Kg、5.23×10^-7g/Kg、5.97×10^-7g/Kg、6.72×10^-7g/Kg、7.5×10^-7g/Kg、8.2×10^-7g/Kg、8.96×10^-7g/Kg、9.71×10^-7g/Kg、1.05×10^-6g/Kg、1.12×10^-6g/Kg、1.19×10^-6g/Kg、1.27×10^-6g/Kg、1.34×10^{- 6}g/Kg、1.42×10^-6g/Kg、1.49×10^-6g/Kg、1.57×10^-6g/Kg、1.64×10^-6g/Kg、1.72×10^-6g/Kg、1.79×10^-6g/Kg或1.87x10^-6g/Kg。

在一些实施例中，每天汉黄芩素的总剂量为每天约1.12×10^-8g/kg到约5.61×10^-6g/kg。在另一个实施例中，剂量为约1.12×10^-8g/Kg到约4.47×10^-6g/Kg，包括在规定范围内的每个整数。在另一个实施例中，剂量为约1.12×10^-8到约3.36×10^-6g/Kg，包括在规定范围内的每个整数。在另一个实施例中，剂量为约1.12×10^-8到约2.3×10^-6g/Kg，包括在规定范围内的每个整数。在另一个实施例中，剂量为约1.12×10^-8到约1.34×10^-6g/Kg，包括在规定范围内的每个整数。在另一个实施例中，剂量为约1.12×10^-8g/Kg到约6.72x10^-7g/Kg，包括在规定范围内的每个整数。在另一个实施例中，剂量为约1.12×10^-8g/Kg、5.61×10^-8g/Kg、1.12×10^-7g/Kg、2.2×10^-7g/Kg、4.47×10^-7g/Kg、6.72×10^-7g/Kg、8.97×10^-7g/Kg、1.12×10^-6g/Kg、1.34×10^-6g/Kg、1.57×10^-6g/Kg、1.8×10^-6g/Kg、2.0×10^-6g/Kg、2.3×10^-6g/Kg、2.5×10^-6g/Kg、2.7×10^-6g/Kg、2.9×10^-6g/Kg、3.1×10^-6g/Kg、3.4×10^-6g/Kg、3.6×10^-6g/Kg、3.8×10^-6g/Kg、4.0×10^-6g/Kg、4.3×10^-6g/Kg、4.5×10^-6g/Kg、4.7×10^-6g/Kg、4.9×10^-6g/Kg、5.1×10^-6g/Kg、5.3×10^-6g/Kg或5.6×10^-6g/Kg。

在一些实施例中，施用汉黄芩素调节一种或多种炎性生物标志物基因(包括但不限于神经酰胺、TGF-β1、MMP-13、HtrA1、NFκB和AGE)的表达。在一些实施例中，与不用汉黄芩素治疗的组织相比，在其中施用汉黄芩素的组织中TGF-β1的表达上调约10％到约40％，包括在规定范围内的每个整数。在一些实施例中，与不用汉黄芩素治疗的组织相比，在其中施用汉黄芩素的组织中神经酰胺的表达上调约10％到约40％，包括在规定范围内的每个整数。在一些实施例中，与不用汉黄芩素治疗的组织相比，在其中施用汉黄芩素的组织中MMP-13的表达上调约10％到约40％，包括在规定范围内的每个整数。在一些实施例中，与不用汉黄芩素治疗的组织相比，在其中施用汉黄芩素的组织中NFκB的表达上调约10％到约40％，包括在规定范围内的每个整数。在一些实施例中，与不用汉黄芩素治疗的组织相比，在其中施用汉黄芩素的组织中AGE的表达上调约10％到约40％，包括在规定范围内的每个整数。基因水平的表达的确定为所属领域中众所周知的。举例来说，基因表达的水平可通过实时聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹法、免疫组织化学等确定。

在一些实施例中，在向组织施用汉黄芩素之后，患有疼痛的一个或多个组织的疼痛感觉减轻。在一些实施例中，在施用汉黄芩素之后，疼痛感觉减轻至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。在一些实施例中，疼痛的减轻为在肌肉骨胳组织中。在一些其它实施例中，疼痛的减轻为患有源于OA的关节炎疼痛的关节的疼痛。在一些其它实施例中，疼痛的减轻为患有源于类风湿性关节炎的关节炎疼痛的关节的疼痛。用于评估疼痛的方法为所属领域中已知的。举例来说，McGill疼痛调查表(MPQ)、间歇性和持续性骨关节炎(ICOAP)调查表或骨关节炎症状量表(OASIS)可用于评估骨关节炎患者的疼痛。

此外，国际骨关节炎学会(OARSI)量表代表用于评估OA进展和关节健康的整体程序，这可用于评估在本文所述方法中的OA疾病。OARSI评分的降低指示关节健康的改进和OA疾病的减轻。因此，在一些实施例中，在施用汉黄芩素之后，OARSI评分降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施例中，OARSI评分降低代表完全愈合的关节或不患有骨关节炎的关节的量。

在一些实施例中，有效剂量为每天向患有疼痛的患者的部位施用一次或多次。剂量可为每天施用例如1次、2次、3次、4次、5次、6次或更多次。在一些实施例中，剂量为每天施用至少3次。可施用一种或多种剂型例如1、2、3、4、5、6、7天或甚至更长。可施用一种或多种剂型，例如1、2、3、4周或更长。可施用一种或多种剂型例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月(1年)、2年、3年、4年、5年、超过5年、十年、数十年或甚至更长。可以规则间隔施用一种或多种剂型，直到受试者或有需要的受试者不需要治疗疼痛。

在一些实施例中，分离并且纯化汉黄芩素，使得化合物基本上不含与汉黄芩素天然缔合的任何其它组分。在一些实施例中，汉黄芩素纯度为至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％。在一些实施例中，合成汉黄芩素，使得汉黄芩素的纯度为至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。汉黄芩素的分离和净化可通过所属领域中已知的方法进行(参见例如美国专公开第号利2013/013681)或可以合成方式制备和来此外可购自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(美国密苏里州，圣路易斯)。

在一些实施例中，汉黄芩素作为组合物的一部分施用。在一些实施例中，组合物被配制成用于局部施用、经皮施用、皮下施用和区域性注射。具体地，本文所描述的组合物被配制成用于经皮施用。不受任何理论限制，一旦施用包括汉黄芩素的经皮组合物，认为汉黄芩素能够传递通过表皮的角质层并且进入表皮的较深组织层、真皮和皮下组织层，其中它可发挥区域性的抗伤痛感受、抗炎和关节治愈效果。

在一些实施例中，汉黄芩素局部施用到一个或多个组织。在一些实施例中，组织为肌肉骨胳组织。在一些实施例中，组织覆盖表现出或易患OA疼痛的一个或多个滑膜关节。汉黄芩素在施用的区域性部位保留一段时间，例如至少约30分钟到8小时或更长，表现出患有疼痛的组织的疼痛的区域性减轻。

在一些实施例中，包括汉黄芩素使经皮组合物作为液体、擦剂、泡沫、乳膏、溶液、乳液、凝胶、喷雾、擦拭剂、洗剂、软膏或贴剂的一部分提供。在一些实施例中，包括汉黄芩素或其衍生物的经皮制剂为乳膏、洗剂、软膏或剂。

合适的局部经皮组合物，如乳膏或擦剂，包括化妆品上或皮肤病学上可接受的赋形剂和载体。汉黄芩素可分散、溶解或悬浮在组合物中。合适的赋形剂和载体包括不限于如所属领域中已知的一种或多种油、表面活性剂、乳化剂、增稠剂、芳香剂、溶剂、螯合剂和渗透促进剂。

合适的渗透促进剂为可渗透到皮肤中并且与角质层的成分相互作用的那些，这是活性物质渗透的主要障碍。渗透促进剂降低皮肤的阻力并且因此增加活性物质通过皮肤的通道(通量)。在大多数情况下，它们还有利地影响在皮肤和媒剂之间的活性物质分配比率。示例性和非限制性渗透促进剂包括二氧戊环衍生物、乙酸乙酯、脲、乙醇、短链一元醇(C₂-C₆)、丙二醇、乙醇、DMSO、DMF、月桂氮卓酮和衍生物、脂肪酸(例如油酸)、表面活性剂(例如癸基甲基亚砜)、萜烯、异丙醇、丙三醇、一元醇(C₈-C₁₄)、烷烃、烷基卤化物、酰胺、吡咯烷酮衍生物、脂肪酸酯、环糊精、聚乙二醇、精油，如薄荷油和所属领域中已知的其它渗透促进剂(参见例如Herman,A和Herman A.P.,《药学与药理学杂志(Journal of Pharmacy andPharmacology.)》,67,第473-485页(2014))。

在一些实施例中，包括汉黄芩素的经皮组合物被配制成调节释放经皮制剂、立即释放经皮制剂、延迟释放经皮制剂、持续释放经皮制剂，或延长释放经皮制剂。适于化合物的经皮施用的示例性和非限制性制剂描述于美国专利第6,238,284号；第5,725,876号；第5,716,635号；第5,633,008号；第5,603,947号；第5,422,361 5,411,739号；第5,364,630号；第5,230,896号；第5,004,610号；第4,943,435号；第4,908,213号；和第4,839,174号。

在表1中提供示例性经皮乳膏组合物。

在一些实施例中，用于局部和经皮施用的组合物包括以下赋形剂或载体一种或多种或全部：十六十八醇、辛酸/癸酸甘油三酯、甘油、乳木果油、乙氧基二甘醇、硬脂酸甘油酯、peg-100硬脂酸酯、硬脂酸、丁二醇、二甲聚硅氧烷、欧薄荷(薄荷)油、椰子油、聚乙二醇、甜扁桃(甜杏仁)油、丙烯酸羟乙酯/、丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、鲸蜡硬脂醇聚醚-20、二甲基砜、角鲨烷、苯氧基乙醇、辛酰基乙二醇、丙烯酸酯/丙烯酸c_10-30烷基酯交联聚合物、黄原胶、乙基己基甘油、己二醇、谷氨酸二乙酸四钠、聚山梨醇酯60、脱水山梨糖醇异硬脂酸酯、芦荟叶汁和薄荷醇和其组合。

在一些实施例中，组合物为滚抹局部制剂。在一些实施例中，组合物包括以下赋形剂或载体一种或多种或全部：水、醇、辛酸/癸酸甘油三酯、丙二醇、乙氧基二甘醇、欧薄荷(薄荷)油、二甲聚硅氧烷、十六十八醇、硬脂酸甘油酯、油酰基钾水解燕麦蛋白、十六醇、黄原胶、苯氧基乙醇、辛酰基乙二醇、油酸甘油酯、菌类植物胶、卵磷脂、乙基己基甘油、己二醇、支链淀粉、薄荷醇和植酸钠。

经皮组合物的施用可在患有任何与极为接近感觉的疼痛的皮肤上的任何位置。举例来说，为了治疗肌肉骨骼疼痛，具有汉黄芩素的经皮乳膏可施用在位于其中感觉疼痛的病变组织上方的皮肤。作为附加实例，为了治疗源于膝关节的关节炎疼痛，可将具有汉黄芩素的经皮乳膏施用在膝关节周围的皮肤上。在所属领域中了解用于治疗疼痛和炎症和经皮和局部乳膏的施用，并且可基于疼痛类型调适乳膏的放置。

在一些实施例中，包括汉黄芩素的组合物被配制成用于区域性注射。区域性注射包括接近表现出或易患疼痛的组织提供包括汉黄芩素的组合物的任何注射。举例来说，为了治疗肌肉骨骼疼痛，可在其中感觉疼痛的附近注射包括汉黄芩素的组合物。作为附加实例，关节炎关节的治疗可通过将包括汉黄芩素的组合物关节内注射到关节来完成。用于注射(包括关节内注射)的方法和装置为所属领域的技术人员众所周知的。用于汉黄芩素的区域性注射的示例性可注射组合物包括生理上相容的水溶液，如汉克斯氏溶液、林格氏溶液或415生理盐水缓冲液。

用于肠胃外施用的其它组合物包括以水溶性形式本发明的化合物的水溶液。此外，可按需要汉黄芩素的悬浮液制备为油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒剂包括脂肪油，如芝麻油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射悬浮液含有增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，悬浮液含有合适的稳定剂或增加本发明的化合物的溶解度的试剂，以制备高度浓缩的溶液。

纯化的汉黄芩素可被配制用于通过注射，例如通过快速注射或连续输注进行肠胃外施用。用于注射的制剂可以例如在安瓿或多剂量容器中的单位剂型，任选地具有添加的防腐剂。组合物采取油性或水性媒剂中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂或分散剂。替代地，化合物或提取物呈粉末形式，用于在使用之前用合适的媒剂，例如无菌无热原水复原。含有汉黄芩素的可注射制剂可以便携式试剂盒或包装的形式提供。

在组合物中汉黄芩素的量取决于组合物类型，并且可改变，使得施用本文所描述的期望剂量。因此，在一些实施例中，本文所描述的组合物包括量为总质量的约0.01重量％到约99重量％的汉黄芩素，包括在规定范围内的所有整数。在一个实施例中，汉黄芩素为组合物的总质量的约0.01％到约75％，包括在规定范围内的所有整数。在另一个实施例中，汉黄芩素为组合物的总质量的约0.01％到约50％，包括在规定范围内的所有整数。在另一个实施例中，汉黄芩素为组合物的总质量的约0.01％到约30％，包括在规定范围内所有整数。在另一个实施例中，汉黄芩素为组合物的总质量的约0.01％到约10％，包括在规定范围内的所有整数。在另一个实施例中，汉黄芩素为组合物的总质量的约0.1％到约5％，包括在规定范围内的所有整数。在另一个实施例中，汉黄芩素为组合物的总质量的约0.01％到约1％，包括在规定范围内的所有整数。

在一些实施例中，汉黄芩素以治疗有效量的第二试剂或第三试剂的组合向患者施用。第二试剂可为在治疗或预防受试者的疼痛时已知或疑似受益的任何药剂。举例来说，第二试剂为第二疼痛缓解剂。第二疼痛缓解试剂为所属领域的一般技术人员众所周知的。这类试剂的非限制性实例包括阿司匹林、乙酰胺苯酚(扑热息痛)或被称作非类固醇抗炎药物(nsaids)的其它类似阿司匹林的药物、弱麻醉剂，如可待因(具有可待因的扑热息痛)、氢可酮(维多丁或洛贝特)、盐酸羟考酮和对乙酰氨基酚、复方羟可酮或丙氧芬(达尔丰)、强阿片类药物，如吗啡碱、度冷丁、盐酸二氢吗啡酮、芬太尼(多瑞吉贴剂)和美沙酮。

适合用于本文所提供的医药组合物中治疗剂的附加非限制性实例包括：抗炎和抗风湿活性药物物质，如例如：丁基吡唑烷、苯基丁氮酮、莫非保松、羟布宗、氯非宗、酮保泰松、乙酸衍生物和相关物质、吲哚美辛、舒林酸、托麦汀、佐美酸、双氯芬酸、阿氯芬酸、布马地宗、依托度酸、氯那唑酸、芬替酸、阿西美辛、联苯吡胺、奥沙美辛、丙谷美辛、酮咯酸、乙酰氯芬酸、丁苯羟酸、昔康、吡罗昔康、替诺昔康、屈恶昔康、氯诺昔康、美洛昔康、甲胺喋呤、丙酸衍生物、布洛芬、萘普生、酮基布洛芬、非诺洛芬、芬布芬、苯恶洛芬、舒洛芬、吡洛芬、氟比洛芬、吲哚洛芬、噻洛芬酸、奥沙普嗪、异丁普生、右布洛芬、氟诺洛芬、阿明洛芬、右酮洛芬、芬那酯、甲芬那酸、托芬那酸、氟芬那酸、甲氯芬那酸、昔布类、塞内昔布、罗非考昔、伐地考昔、帕瑞考昔、依托昔布、卢米罗可、萘丁美酮、氟尼酸、阿扎丙宗、葡糖胺、苄达明、葡糖胺聚糖聚硫酸盐、普罗喹宗、奥古蛋白、尼美舒利、非泼拉酮、双醋瑞因、莫尼氟酯、替尼达普、奥沙西罗、硫酸软骨素、非泼拉酮、地匹乙酯、乙酰水杨酸、喹啉、羟辛可芬、金制剂、硫金苹果酸钠、金硫丁二钠、金诺芬、金硫葡糖、aurotioprol、青霉胺或布西拉明。

其它治疗剂可包括镇痛剂，如例如：阿片类药物、天然鸦片生物碱、吗啡碱、鸦片、氢吗啡酮、尼可吗啡、羟考酮、二氢可待酮、二醋吗啡、他喷他多、罂粟碱、罂粟碱、可待因、苯基哌啶衍生物、凯托米酮、哌替啶、芬太尼、二苯丙胺衍生物、右旋吗拉胺、哌腈米特、右丙氧芬、苯腈米特、美沙酮、苯并吗吩衍生物、戊唑星、非那佐辛、东罂粟碱衍生物、丁基原啡因、吗啡喃衍生物、布托啡诺、纳布啡、替利定、曲马多、地佐辛、水杨酸和衍生物、乙酰水杨酸、阿洛普令、水杨酸胆碱、水杨酸钠、水杨酰胺、双水杨酯、乙水杨胺、水杨吗啉、地匹乙酯、贝诺酯、二氟尼柳、水杨酸钾、呱西替柳、卡巴匹林钙、水杨咪唑、吡唑啉酮、安替比林、安乃近、氨基比林、异丙安替比林、尼芬那宗、酰苯胺类、扑热息痛、非那西汀、布西丁、丙帕他莫、其它镇痛剂和退热剂，如例如：利马唑、格拉非宁、夫洛非宁、维米醇、奈福泮、氟吡汀或齐考诺肽。

其它治疗剂可包括麻醉剂，如例如：醚、二乙醚、乙烯醚、卤代烃、氟烷、氯仿、甲氧氟烷、安氟醚、三氯乙烯、异氟醚、地氟烷、七氟醚、巴比妥酸盐、美索比妥、海索比妥、硫喷妥、那可比妥、阿片麻醉剂、芬太尼、阿芬太尼、舒芬尼、苯阿柏尼丁、阿尼利定、瑞芬太尼、其它通用麻醉剂，如例如：氟哌利多、氯胺酮、丙泮尼地、阿法沙龙、甲苄咪唑、丙泊酚、羟基丁酸、一氧化二氮、艾氯胺酮、氙、氨基苯甲酸的酯、美布他明、普鲁卡因、丁卡因、氯普鲁卡因、苯佐卡因、酰胺、布比卡因、利多卡因、甲哌卡因、丙胺卡因、布坦卡因、二丁卡因、依替卡因、阿替卡因、罗比卡因、左布比卡因、苯甲酸的酯、可卡因、其它区域性麻醉剂，如例如：氯乙烷、达克罗宁、苯酚或辣椒碱。

下文描述本文所描述的实施例、组合物和方法的实例，并且不旨在限制在本公开中进一步描述的本发明的范围。

实例

实例1.被配制为乳膏的骨关节炎的小鼠模型的汉黄芩素治疗

研究用于治疗骨关节炎(OA)的汉黄芩素的用途。具体地说，研究在具有渗透促进剂的乳膏中使用局部施用的小剂量的汉黄芩素的益处。在本研究中使用在表2中示出的乳膏制剂。在表3中提供用于施用汉黄芩素的附加示例性乳膏制剂。

OA小鼠模型用于确定汉黄芩素治疗的功效。OA样疾病通过实验室小鼠的内侧半月板韧带(DMM)的手术失稳诱发。膝关节的修复使用改良的Mankin评分评估，所述评分广泛认为是通过膝关节的组织学评估客观地比较进展的方法(参见Larkin DJ等人,《生理学前沿(Frontiers in physiology.)》2013；4:121和Mankin HJ.《新英格兰医学杂志(The NewEngland journal of medicine.)》1974；291(24):1285-92)。将小鼠放在连接到计算机的活动轮笼中，以在整个实验持续时间跟踪活动。手术干预后二十四小时，将以下治疗局部施用到受影响的膝关节：0.00000142g汉黄芩素(500μM汉黄芩素)(n＝6)；0.0000000028g汉黄芩素(10μM汉黄芩素)(n＝6)；和10μl媒剂(n＝6)。每隔两天施用一次治疗，持续28天。

在开始实验七天之后，接受媒剂的小鼠的轮子使用率明显高于对照。接受10μM和500μM汉黄芩素的小鼠的车轮使用明显高于对照或仅媒剂。到第14天，接受媒剂的小鼠仍显示比对照高的车轮使用。但是，与相比，接受10μM汉黄芩素的小鼠显示比接受500μM的小鼠高的活动轮使用。

在第28天，重复此模式。结果概括于表4中。

生物标志物表达和Mankin评分

虽然轮使用数据令人鼓舞，但是仅抑制炎症和阻断疼痛不足以阻断OA的进展。实验结束时(第28天)处死小鼠，收集膝关节，固定并研究改良的Mankin评分和HtrA1表达，如先前在Spencer K MS和Jeffrey Z Kartchner W.《关节炎杂志(Journal of Arthritis)》2015；04(03)。HtrA1为与OA进展相关的生物标志物级联中的第一个。

如图1所示，药理剂量的汉黄芩素可挽救经历膝关节失稳手术的关节。通过内侧半月板韧带(DMM手术)的手术失稳诱发小鼠膝关节OA，并且用10μM的汉黄芩素治疗小鼠。对照为DMM加媒剂。给予10μM汉黄芩素治疗的小鼠的OA的改良的Mankin评分统计上(p>0.05)较低。在较低剂量的情况下观察到类似结果。如图2所示，汉黄芩素抑制抑制HtrA1表达，如我评估的经受DMM手术的膝关节中的免疫组织化学染色。对照/媒剂小鼠(A)表现出在软骨细胞中普遍存在的HtrA1染色。注意对照膝关节的裂隙和粗糙的关节软骨表面(见箭头)。在用10μM汉黄芩素(B)治疗小鼠膝关节中基本上不存在HtrA1的表达。没有提到的裂缝关节软骨表面基本上正常。

汉黄芩素处理的膝盖的改良的Mankin评分(图1)和HtrA1表达(图2)遵循与活动轮数据相似的模式，因为减少剂量的汉黄芩素提供对OA的附加保护。适量的抗炎药(如汉黄芩素)可治疗OA疼痛并逆转OA疾病过程的想法与当前想法背道而驰。我们的研究证明，较低剂量的汉黄芩素(与500μM相比，为10μM)在降减轻OA的进展方面提供更大的益处。实际上，我们已经观察到，如通过改良的Mankin评分测量，局部施用1μM汉黄芩素的剂量足以显著减轻OA。我们进一步观察到，低于1μM汉黄芩素的剂量不足以发挥作用。高于500μM的剂量，而存在对炎症和生物标志物过多遏制。因此，与传统观点相反，提供适度剂量的抗炎剂使软骨细胞恢返回到态并表现出软骨修复/稳态。

实例2.被配制在乳膏或液体中的骨关节炎的小鼠模型的汉黄芩素治疗

进行第二次实验，所述实验使用在DMSO或具有渗透促进剂的乳膏中局部施用的小剂量的汉黄芩素。使用在表1中提供的乳膏制剂。在本研究中，OA通过DMM手术诱发。在手术后二十四小时，治疗施用到受影响的膝关节。治疗包括于10μl DMSO中0.00000142g汉黄芩素(500μM汉黄芩素)施用到髌骨韧带位置处的皮肤(n＝5)；将10μl DMSO施用到髌骨韧带的位置处的皮肤(n＝5)；0.0000000028g汉黄芩素(10μl G2乳膏E/10μM汉黄芩素))施用到髌骨韧带位置处的皮肤(n＝5)每隔两天施用一次治疗，持续28天。手术后立即将小鼠放置在活动轮笼中，其中在计算机上记录轮的使用。在开始实验七天之后，接受于DMSO中或于乳膏中的汉黄芩素治疗的小鼠表现出比仅DMSO显著高的轮使用。到第14天，接受乳膏的小鼠仍显示出显著较高的轮使用，而在DMSO或DMSO+汉黄芩素治疗之间没有差异。在第28天，重复此模式。结果概括在表5中。

膝关节的生物标志物和Mankin评分遵循相似的模式，使得首先较高剂量的汉黄芩素为有益的，但是在整个实验中较低剂量保持为有益的。从数据我们推断，汉黄芩素的理想剂量将在1μM到500μM之间。再次，低于1μM，并且汉黄芩素将不足以产生效果。高于500μM，将抑制过多的炎症和神经酰胺。TGF-β1被抑制，并且软骨细胞无法返回到稳态，导致软骨修复。

实例3.用于汉黄芩素施用的滚抹制剂

在表6中提供用于施用汉黄芩素的示例性滚抹制剂。

表6.示例性滚抹组合物
	成分
水
	醇
辛酸/癸酸甘油三酯
	丙二醇
乙氧基二甘醇
	欧薄荷(薄荷)油
二甲聚硅氧烷
	十六十八醇
硬脂酸甘油酯
	油酰基钾水解燕麦蛋白
十六醇
	黄原胶
苯氧基乙醇
	辛酰基乙二醇
油酸甘油酯
	菌类植物胶
卵磷脂
	乙基己基甘油
己二醇
	支链淀粉
薄荷醇
	植酸钠
汉黄芩素

实例4.汉黄芩素乳膏的施用和骨关节炎的膝关节健康

方法

小鼠和关节失稳定程序

将十七只28天大的C57BL/6小鼠(治疗n＝12)(假手术n＝5)按性别随机分配，并与先前描述类似地进行内侧半月板(DMM)程序的失稳(参见Larkin DJ等人,《生理学前沿》2013；4:121和Mankin HJ.《新英格兰医学杂志》1974；291(24):1285-92)。简单地说，使用补充有室内空气的异氟醚气体麻醉小鼠，并通过修剪皮毛并用碘外科手术擦洗，然后用70％酒精清洗来准备右膝关节周围的皮肤。其余步骤在Wild Heerbrugg 355110(瑞士，WildHeerbrugg AG，瑞士)手术显微镜下使用无菌技术进行。通过钝性解剖暴露内侧半月板韧带，并观测关节区域。随后使用11号手术刀切断半月板韧带，以使内侧半月板移位。目视确认弯液面的位移。使用7-0可吸收的Vicryl缝线(美国新泽西州萨默维尔的Ethicon公司)闭合关节囊和皮肤。这些程序根据杨百翰大学IACUC批准的协议16-0501进行的。

乳膏制备

治疗乳膏为含有10μM汉黄芩素的Arthritis

假乳膏为基本上没有汉黄芩素的Arthritis

具体地说，450ml批料由如表7中所示的384mL再蒸馏水、0.128g二甲基砜(MSM)、30.9ml聚乙二醇、35.5ml薄荷油、0.64g椰子油和1.28g乳木果油组成。

组织准备

手术后二十八天处死小鼠，收获右膝关节，并固定在4％多聚甲醛中，然后如前所述将其脱钙并包埋在石蜡中(参见Larkin DJ等人,《生理学前沿》2013；4:121和Mankin HJ.《新英格兰医学杂志》1974；291(24):1285-92))。如前所述(Larkin等人,2013)，将膝关节切成薄片，并用番红精-O和固绿对相应的切片染色。使用与Olympus BX51光学显微镜相关的Olympus DP72数码相机使用

软件以10倍和20倍放大倍数拍摄关节组织的照片。

关节健康分析

OA评分国际骨关节炎研究学会(OARSI)(参见Glasson,S.S.等人,2010)评分系统用于如先前描述评估OA严重程度(参见Holt,D.W.等人,与HtrA1-Ddr2-Mmp-13降解途径相关的杂合sedc小鼠中的骨关节炎样变化：骨关节炎的新模型(Osteoarthritis-likechanges in the heterozygous sedc mouse associated with the HtrA1-Ddr2-Mmp-13degradative pathway:a new model of osteoarthritis)。《骨关节炎与软骨(Osteoarthritis Cartilage)》,2012.20(5):第430-9页)。

囊肿样病变如先前描述使用ImageJ在10×放大倍数下对囊肿样病变计数(参见Zhang,Z.J.,J.Beckett,和L.Schon,软骨骨连接处的类囊肿样病变(Cyst-Like Lesionsat Chondro-Osseous Junction)。《国际钙化组织(Calcified Tissue International)》,2017.101(5):第549-552页)。

免疫组织化学

在载玻片上NFκβ的免疫组织化学(IHC)代表如先前描述来自所有动物的小鼠膝关节的连续切片(参见Zhang,H.X.等人,沙利度胺通过抗炎途径对链佐霉素诱导的糖尿病大鼠的肾脏保护作用(Renal-protective effect of thalidomide in streptozotocin-induced diabetic rats through anti-inflammatory pathway).《药物设计开发和疗法(Drug Design Development and Therapy)》,2018.12:第89-98页)。简单地说，载玻片脱蜡，并且然后用5％牛血清白蛋白阻断1h。以1:200稀释度的针对NFκβ(ab16502 Abcam，美国马萨诸塞州剑桥)；以1:200稀释度的针对Mmp-13(ab39012美国马萨诸塞州剑桥)；以1:100稀释度的针对TGF-β1(ab64715 Abcam，美国马萨诸塞州剑桥)的兔多克隆初级抗体。将抗体施用到试样，并在4℃下孵育过夜。在第二天，将载玻片用PBS冲洗，并且与山羊抗兔生物素化的二级抗体(ab64256Abcam，美国马萨诸塞州剑桥)一起孵育。将载玻片用PBS冲洗，并且然后与抗生物素蛋白/生物素ABC混合物(Vectastain elite ABC试剂盒)一起孵育。第三次冲洗后，使用过氧化物酶底物(Vector实验室，NovaRED)引发显色反应。通过染色不加初级抗体制备阴性对照。定性地与WT对照比较染色强度的差异。使用ImageJ(NIH，美国马里兰州贝塞斯达)对染色细胞进行盲点计数。

细胞培养

在补充有10％胎牛血清(F-2442-50ML，美国密苏里州圣路易斯西格玛-奥德里奇公司)的

DMEM(SLM-120B美国密苏里州圣路易斯密理博(Millipore))中培养人软骨细胞(TC28a2，美国密苏里州圣路易斯西格玛-奥德里奇公司)到80％汇合。治疗由以下组成：

1.未治疗的培养盘：取出旧培养基，并用10mL新鲜培养基替换。孵育4小时。取出培养基，用PBS冲洗3次，并且根据制造商的规程(R1054ZYMO Research，美国加利福尼亚州尔湾)收集总RNA。

2.用10μM汉黄芩素(溶解在DMSO中)治疗。取出旧培养基，并且用10mL含有汉黄芩素的条件培养基替换。孵育4小时。取出培养基，用PBS冲洗3次，并且根据制造商的规程(R1054 ZYMO Research，美国加利福尼亚州尔湾)收集总RNA。

3.用1ng/mLIL-1β(溶解在dds水)中治疗。取出旧培养基，并且用10mL含有IL-1β的条件培养基替换。孵育4小时。取出培养基，用PBS冲洗3次，并且根据制造商的规程(R1054ZYMO Research，美国加利福尼亚州尔湾)收集总RNA。

4.用10μM汉黄芩素治疗；等待1小时并且添加1ng/mLIL-1β，孵育4小时。取出旧培养基，并且用10mL含有汉黄芩素的条件培养基替换。孵育1小时。添加10μL 1ng/mL IL-1β。在细胞培养皿中上下轻轻吸移培养基3次以混合。孵育4小时。取出培养基，用PBS冲洗3次，并且根据制造商的规程(R1054 ZYMO Research，美国加利福尼亚州尔湾)收集总RNA。

cDNA根据制造商的规程(1725038BIO-RAD，美国加利福尼亚州埃库莱斯)由总RNA制备。

实时定量聚合酶链反应(qRTPCR)使用生命技术一步加序列检测系统和软件(生命技术(Life Technologies))进行。基于SYBR-绿色的PrimeTime测定(IDT)用于检测人TGF-β1和BBS 3。引物序列为：

TGF-β1F 5'-GCACGTGGAGCTGTACCAGA-3'(SEQ ID NO：1)

TGF-β1R 5'-GCCGGTAGTGAACCCGTTG-3'(SEQ ID NO：2)

BBS 3F 5'-ACCAGAAAAACTGCCTGCTCT-3'(SEQ ID NO：3)

BBS 3R 5'-AGCCCAAGGCACAAAACATGA-3'(SEQ ID NO：4)

统计分析

使用双向ANOVA测试获得治疗和未经治疗的28天小鼠的Mankin和OARSI评分的统计显著性。囊肿样病变(CLL)和NFκβ染色的细胞的差异通过混合模型(ANOVA)统计方法得到确定。所有统计分析均由杨百翰大学统计系进行。

结果

骨关节炎评估

国际骨关节炎学会(OARSI)开发了一种更全面的程序来评估关节的OA，代替更传统的Mankin评分系统(参见Glasson,S.S.等人,OARSI组织病理学倡议-对小鼠骨关节炎的组织学评估的建议(The OARSI histopathology initiative-recommendations forhistological assessments of osteoarthritis in the mouse).《骨关节炎与软骨》,2010.18增刊3:第S17-23页)。对用番红精-O染色的膝盖切片进行OARSI评分，以评估关节健康状况。用根据表7(TC)的测试组合物治疗的小鼠的平均评分为0.426，而用假乳膏(SC)治疗的小鼠的平均评分为1.332(图3)。当通过双向ANOVA测试分析时，与SC治疗的小鼠相比，TC治疗的小鼠的OARSI评分P显著较低(P<0.05)。TC的使用显著降低OARSI评分。*P<0.05

囊肿样病变

新鉴定的关节健康的标志物为软骨-骨连接处缺乏或存在囊肿样病变(CLL)，其由潮标、软骨的钙化区域和粘合线组成(参见Zhang,Z.J.,J.Beckett和L.Schon,在软骨-骨连接处的囊肿样病变(Cyst-Like Lesions at Chondro-Osseous Junction).《国际钙化组织》,2017.101(5):第549-552页)。在TC和SC治疗的小鼠的番红精O/固绿染色的膝关节切片中计算CLL的数目。与SC小鼠的11个相比，接受TC的小鼠表现出平均6.2个CLL(图4)。与SC小鼠相比，在TC小鼠中存在显著较少的CLL(p<0.01)，如通过所述模型(ANOVA)统计方法确定。使用TC显著减少CCL的数量。*P<0.01

免疫组织化学分析

进行免疫组织化学以评估汉黄芩素与原性纤毛在TC和SC治疗的小鼠的膝关节切片上的相互作用。载玻片用针对NFκβ、Tgf-β1或Mmp-13的抗体染色。免疫组织化学染色的定性结果通过计算对各个生物标志物染色阳性的细胞百分比和在紧邻胫骨坪远端的限定的200×900像素关节软骨区域中的软骨细胞总数进行定量分析。所有定量分析使用ImageJ(美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达)进行。使用ANOVA测试来检测TC和SC样本之间NFκβ阳性染色的平均百分比和平均软骨细胞计数的差异，我们观察到激活的NFκβ染色阳性的软骨细胞显著较少(图5)。使用TC显著减少了NFκβ的细胞染色数量。*P<0.01

使用ANOVA测试来检测TC和SC样本之间TGF-β1阳性染色的平均百分比和平均软骨细胞计数的差异，我们观察到激活的TGF-β1染色阳性的软骨细胞显著更多(图7)。使用TC显著增加TGF-β1的细胞染色数量。*P<0.05

使用ANOVA测试来检测TC和SC样本之间Mmp-13阳性染色的平均百分比和平均软骨细胞计数的差异，我们观察到激活的Mmp-13染色阳性的软骨细胞显著较少(图5)。使用TC显著减少Mmp-13细胞染色数量。*P<0.01

我们观察到在暴露于IL-1β之后，在人软骨细胞中TGF-β1的基因表达下降80％，如通过实时PCR测定。然而，如果细胞用汉黄芩素预治疗，那么存在小于40％下降。单独的汉黄芩素产生了类似的结果。

我们观察到在暴露于汉黄芩素之后，在人软骨细胞中BBS 3的基因表达增加125％。IL-1β对BBS 3基因表达没有效果，但是确实使汉黄芩素反应降低将近一半。

尽管在膝关节失稳手术之后显著较高的转轮使用，但是较少CLL，较低OARSI评分与较少NFκβ、Mmp-13和较多Tgf-β1激活表明含有低水平的汉黄芩素的TC阻断软骨降解的原纤毛途径，以促进软骨稳态。

BBS 3为BBSome的组分(参见Zhang等人,巴德-毕德(Bardet-Biedl)综合症3(Bbs3)基因敲除小鼠模型揭示常见BBS相关的表型和Bbs3独特表型(Bardet-Biedlsyndrome 3(Bbs3)knockout mouse model reveals common BBS-associated phenotypesand Bbs3 unique phenotypes).《美国国家科学院院刊(PNAS)》108(51):20678-20683)。BBSome进入纤毛需要BBS3。BBSome可在将纤毛蛋白带入纤毛或从纤毛去除纤毛蛋白中起作用。因此，在存在纤毛的情况下，BBS3的增加可为取决于BBSome的运输什么和其方向的抗炎反应。无论如何，这些结果清楚地证明汉黄芩素对原纤毛具有显著效果(BBS 3表达增加1.25倍)。在局部乳膏中适度剂量的汉黄芩素促进关节健康并且代表疾病的新颖治疗。

我们证明，在膝关节失稳手术后，经由Arthritis

用汉黄芩素的局部施用治疗小鼠的OARSI评分和CLL显著降低。我们进一步证明，原纤毛密切参与维持软骨稳态，并且通过NFκβ的细胞染色阳性数量显著降低或TGF-β1的细胞染色阳性数量显著增加来证实，两者均通过与治疗相关的原纤毛调节。OA的治疗必须原纤毛在关节稳态中起的作用并且不仅依赖于阻断炎症。我们证明汉黄芩素通过作用于原纤毛对软骨细胞表现出整体保护效果，并且证明局部施用汉黄芩素减轻OA进展，治疗疾病。这是先前不归因于汉黄芩素并且解释当在乳膏中局部施用时为什么它对骨关节炎关节具有强大的整体益处的新颖途径。

尽管本文已结合其所描述的实施例描述了本发明，但是所属领域的技术人员应了解，可在不脱离如所附权利要求书中定义的本发明的精神和范围的情况下进行未特别描述的添加、修改、替换和删除。因此，预期前述详细描述应被看作是说明性而非限制性的，并且应理解，希望所附权利要求书(包括所有等效物)限定本发明的精神和范围。

序列表

<110> 杨百翰大学

<120> 用于用汉黄芩素治疗疼痛的组合物和方法

<130> PPI20019056US

<160> 4

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TGF-β1 F引物

<400> 1

gcacgtggag ctgtaccaga 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TGF-β1反向引物

<400> 2

gccggtagtg aacccgttg 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BBS 3正向引物

<400> 3

accagaaaaa ctgcctgctc t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BBS 3反向引物

<400> 4

agcccaaggc acaaaacatg a 21

Claims (31)

1.一种用于减轻或缓解患者疼痛的方法，其包含以约1μM到约500μM的治疗有效量向所述患有疼痛的患者的一个或多个部位区域性地施用包含汉黄芩素或其衍生物的组合物以及减轻或缓解所述疼痛。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述疼痛选自肌肉骨骼疼痛和关节炎疼痛。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述肌肉骨骼疼痛源于肌肉酸痛、肌肉拉伤、肌肉瘀伤或肌肉撕裂。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述肌肉骨骼疼痛源于肌腱酸痛、肌腱拉伤、肌腱瘀伤或肌腱撕裂。

5.根据权利要求2所述的方法，其中所述关节炎疼痛为骨关节炎疼痛。

6.根据权利要求2所述的方法，其中所述关节炎疼痛为类风湿性关节炎疼痛。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用选自局部施用、经皮施用、皮下施用和区域性注射。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用为经皮施用。

9.根据权利要求1所述的方法，其中汉黄芩素的单剂量为3.73×10^-9g/Kg到约1.87×10^-6g/Kg。

10.根据权利要求1所述的方法，其中汉黄芩素的日剂量为每天1.12×10^-8g/Kg到约5.61×10^-6g/Kg。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述汉黄芩素作为立即释放局部制剂、延迟释放局部制剂、连续释放局部制剂或延长释放局部制剂施用。

12.根据权利要求1所述的方法，其中在施用汉黄芩素之前、之后或与其同时施用一种或多种附加抗炎药物。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含选自以下浓度的汉黄芩素：约1μM、5μM、10μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM、120μM、140μM、160μM、180μM、200μM、220μM、240μM、260μM、280μM、300μM、320μM、340μM、360μM、380μM、400μM、420μM、440μM、460μM、480μM和500μM的汉黄芩素。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物呈液体、擦剂、泡沫、乳膏、溶液、乳液、凝胶、喷雾、擦拭剂、洗剂或贴剂或其组合的形式。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述组合物为乳膏。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述乳膏包含一种或多种经皮渗透促进剂。

17.根据权利要求1所述的方法，其中在施用所述汉黄芩素之后，所述患者对所述疼痛的感觉减轻约10％到约100％。

18.一种用于治疗和促进治愈患者的关节炎关节的方法，其包含以约1μM到约500μM的治疗有效量区域性地向所述患者的一个或多个关节炎关节施用包含汉黄芩素或其衍生物的组合物，由此治疗并且促进治愈所述关节炎关节。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述施用选自局部施用、经皮施用、皮下施用和区域性注射。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述施用减轻所述关节炎关节内的炎症。

21.根据权利要求18所述的方法，其中与不用汉黄芩素治疗的关节炎关节相比，在包含软骨和滑膜液的所述关节炎关节内或其近端周围神经酰胺的表达增加，TGF-β1的表达增加，MMP-13的表达减少，HtrA1的表达减少，NFκB的表达减少，并且AGE的表达减少。

22.根据权利要求21所述的方法，其中与不用汉黄芩素治疗的关节炎关节相比，细胞因子HtrA1、MMP-13、NFκB和AGE的所述表达降低20％，并且TGF-β1、神经酰胺和BBS 3的所述表达升高20％。

23.根据权利要求18所述的方法，其中所述关节炎关节为骨关节炎关节。

24.根据权利要求18所述的方法，其中所述治疗有效量引发包含以下中的一个或多个的效果：减少囊肿样病变(CLL)、较低的OARSI评分和抑制软骨退化的原纤毛途径。

25.一种局部疼痛组合物，其包含约1μM到约500μM浓度的汉黄芩素或其衍生物和化妆品上或皮肤病学上可接受的载体。

26.根据权利要求24所述的组合物，其中所述组合物呈液体、擦剂、泡沫、乳膏、溶液、乳液、凝胶、喷雾、擦拭剂、洗剂或贴剂或其组合的形式。

27.根据权利要求24所述的组合物，其中所述组合物包含选自以下的一种或多种赋形剂：表面活性剂、乳化剂、脂肪、脂肪酸、甘油三酯、溶剂、增稠剂、皮肤调节剂、螯合剂、芳香剂、渗透促进剂和其组合。

28.根据权利要求26所述的组合物，其中所述一种或多种赋形剂选自：十六十八醇、辛酸/癸酸甘油三酯、甘油、乳木果油、乙氧基二甘醇、硬脂酸甘油酯、peg-100硬脂酸酯、硬脂酸、丁二醇、二甲聚硅氧烷、欧薄荷(薄荷)油、椰子油、聚乙二醇、甜扁桃(甜杏仁)油、丙烯酸羟乙酯/、丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、鲸蜡硬脂醇聚醚-20、二甲基砜、角鲨烷、苯氧基乙醇、辛酰基乙二醇、丙烯酸酯/丙烯酸c10-30烷基酯交联聚合物、黄原胶、乙基己基甘油、己二醇、谷氨酸二乙酸四钠、聚山梨醇酯60、脱水山梨糖醇异硬脂酸酯、芦荟叶汁和薄荷醇和其组合。

29.根据权利要求24所述的组合物，其包含以下中的一种或多种：二甲基砜、聚乙二醇或聚丙二醇、薄荷油、椰子油和乳木果油。

30.根据权利要求28所述的组合物，其中所述组合物包含：

a)约0.03％到约5％二甲基砜；

b)约1％到约8％聚乙二醇或聚丙二醇；

c)约1％到约7％薄荷油；

d)约0.3％到约50％乳木果油；

e)约0.14％到约26％椰子油；和

f)约15％到约85％水。

31.根据权利要求24所述的组合物，其中所述汉黄芩素纯度为约90％到约100％。

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