KR101151322B1 - 포유류 피부 관리용의 이중 시클로옥시게나아제 및리폭시게나아제 억제제의 제형 - Google Patents

포유류 피부 관리용의 이중 시클로옥시게나아제 및리폭시게나아제 억제제의 제형 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피부에 관련된 질환 및 질병의 예방 및 치료에 사용하기 위한, 2가지 특정 부류의 화합물, 즉 유리-B-고리 플라보노이드와 플라반의 혼합물을 포함하는 신규 조성물 제공한다. 상기 조성물은 정상, 노화 및 손상된 피부 및 조직에서 시클로옥시게나아제(COX) 및 리폭시게나아제(LOX) 효소 활성을 동시에 억제한다. 본 발명은 또한, 시클로옥시게나아제(COX) 및 리폭시게나아제(LOX)에 의해 매개되는 피부 질환 및 질병의 예방 및 치료를 위한 방법을 제공한다. COX-2 및 5-LO 매개 피부 질환 및 질병을 예방하고 치료하기 위한 방법은 단일 식물 또는 여러 식물, 특히 스쿠텔라리아 및 아카시아 속 식물로부터 합성되고/되거나 단리된 유리-B-고리 플라보노이드와 플라반의 혼합물 및 약제학적 및/또는 미용적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하는 치료적 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 수용자에게 국부 투여하는 것으로 이루어진다. 최종적으로, 본 발명은 선번, 열상, 좌창, 국부 창상, 균, 미생물 및 바이러스 감염에 의해 유발되는 미세 염증 질환, 비틸라고, 전신 홍반성 루프스, 건선, 암종, 흑색종, 및 다른 포유류 피부암, 자외(UV) 방사선, 화학약품, 열, 바람 및 건조 환경에 대한 노출에 의해 유발되는 피부 손상, 주름살, 늘어진 피부, 눈 주변의 주름 및 다크서클, 피부염 및 다른 알레르기 관련 피부 질환이 포함되지만 이들로 제한되지는 않는, COX 및 LOX 매개 질환 및 질병을 예방하고 치료하기 위한 방법을 제공한다. 본원에 기술된 조성물의 사용은 또한 개선된 탄력, 감소되고 지연된 노화, 향상된 젊은 외관 및 결 및 증가된 신축 성, 견고성, 매끄러움 및 유연성을 갖는 매끄럽고 젊은 피부의 잇점을 제공한다.

Description

포유류 피부 관리용의 이중 시클로옥시게나아제 및 리폭시게나아제 억제제의 제형{FORMULATION OF DUAL CYCLOXYGENASE (COX) AND LIPOXYGENASE (LOX) INHIBITORS FOR MAMMAL SKIN CARE}
본 발명은 일반적으로 시클로옥시게나아제(COX) 및 리폭시게나아제(LOX)에 의해 매개되는 질병 및 질환을 예방하고 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 COX 및 LOX 경로에 의해 매개되는 피부 질환 및 질병의 예방 및 치료에 사용하기 위한 2가지 특정 부류의 화합물, 즉 유리 B-고리 플라보노이드와 플라반의 블렌드의 혼합물로 구성된 물질의 신규 조성물에 관한 것이다. 본 발명에는, 선번(sunburn), 열상, 좌창, 국부 창상, 균, 미생물 및 바이러스 감염에 의해 유발되는 미세 염증 질환, 비틸라고(vitilago), 전신 홍반성 루프스, 건선, 암종, 흑색종, 및 다른 포유류 피부암, 자외(UV) 방사선, 화학약품, 열, 바람 및 건조 환경에 대한 노출에 의해 유발되는 피부 손상, 주름살, 늘어진 피부, 눈 주변의 주름 및 다크서클, 피부염 및 다른 알레르기 관련 피부 질환이 포함되지만 이들로 제한되지는 않는다. 본원에 기술되는 조성물의 사용은 개선된 탄력, 감소되고 지연된 노화, 향상된 젊은 외관 및 결 및 증가된 신축성, 견고성, 매끄러움 및 유연성을 갖는 매끄럽고 젊은 피부의 잇점을 제공한다.
일광은 조기 노화를 일으키는 피부, 피부암, 및 홍반 및 타닝(tanning)과 같은 다른 피부 변화를 갖는 호스트에 현저히 작용한다. 일광에 의해 유발되는 손상의 대부분은 파장이 200 내지 400 nm인 자외(UV) 방사선에 기인한다. 자외 방사선은 파장에 따라 3가지 종류, 즉 UVA, UVB 또는 UVC로 분리된다. 파장이 320 내지 400 nm인 UVA는 타닝 및 가벼운 선번을 유발시킬 수 있다. 파장이 290 내지 320 nm인 UVB는 선번을 유발시키고 색소침착을 자극할 수 있다. 파장이 10 내지 290 nm인 UVC는 타닝 이외의 손상을 유발시킬 수 있다. UV 방사선에 대한 피부의 노출은 2-상 반응을 유도한다. 이와 같이, 초기 노출시에, 30분 내에 사라지는 약한 반응인 순간적 홍반 반응이 일어난다. 지연된 홍반 반응이 2 내지 5시간의 노출 후에 일어나고, 약 10 내지 24사긴 만에 최대가 된다. UV, 태양 및 화학약품/열 유발 홍반의 주된 메카니즘은 향상된 프로스타글란딘 및 류코트리엔 생성이다 [Wang (2002) Adv. Dermatol. 18:247].
세포막으로부터의 아라키돈산(AA)의 유리 및 대사작용은 수가지 상이한 경로에 의해 전구염증성 대사물의 생성을 유발시킨다. 거의 틀림없이, 염증에 대한 가장 중요한 경로 중 2가지는 효소 리폭시게나아제(LOX) 및 시클로옥시게나아제(COX)에 의해 매개된다. 이들은 염증 반응의 개시 및 진행에서 중요한 역할을 하는 류코트리엔 및 프로스타글란딘을 각각 생성시키는 평행한 경로이다. 이러한 혈관에 작용하는 화합물은 케모탁신이며, 이들은 조직 내로의 염증 세포의 침윤을 조장하며, 염증 반응을 연장시키는 역할을 한다. 결과적으로, 이들 염증 매개체를 생성시키는 데에 반응성인 효소는 선번, 열상, 화상, 좌창, 국부 창상, 홍반성 루프스, 건선, 암종, 흑색종 및 다른 포유류 피부암과 같은 질병 및 질환의 생리학적 및 병리학적 진행에 기여하는 2가지 경로 모두로부터 유발되는 염증의 이중 억제에 도움을 주는 국부 투여되는 치료제를 개발시키기 위한 본 발명의 목적이 된다.
COX 효소의 억제는 대부분의 비-스테로이드성 항염증약(NSAID)에 기인한 작용의 메카니즘이다. 약 60% 서열 상동성을 공유하지만 발현 프로파일 및 기능이 상이한 COX 효소의 2가지 독특한 이소형(COX-1 및 COX-2)이 있다. COX-1은 혈소판 응집, 위 내에서의 세포 기능의 보호 및 정상 신장 기능의 유지와 같은 정상 생리학적 기능을 조절하는 데에 도움을 주는 생리학적으로 중요한 프로스타글란딘의 생성에 결부된 효소의 구조 형태이다. 제 2 이소형인 COX-2는 인터로이킨-1β(IL-1β) 및 다른 성장 인자와 같은 전구염증성 시토카인에 의해 유도될 수 있는 효소의 한 형태이다 [Herschmann (1994) Cancer Metastasis Rev. 134:241-56; Xie et al . (1992) Drugs Dev. Res. 25:249-65]. 상기 이소형은 아라키돈산(AA)으로부터의 프로스타글란딘 E2(PEG2)의 생성을 촉매한다. COX의 억제는 통상적인 NSAID의 항염증 활성에 대해 반응성이다.
COX 및 LOX에 대한 이중 특이성을 나타내는 억제제는 아라키돈산 대사작용의 다중 경로를 억제하는 데에 명백한 잇점을 갖는다. 이러한 억제제는 프로스타글란딘(PG) 및 다중 류코트리엔(LT)의 생성을 제한함으로써 이들의 염증 작용을 차단한다. 이것은 아나팔락시스(anaphalaxis)의 느린 반응 성분으로서 또한 공지된 PGE2, LTB4, LTD4 및 LTE4의 혈관 확장, 혈관 침투 및 화학유인 작용을 포함한다. 이 중에서, LTB4가 가장 강력한 화학유인 및 화학운동 작용을 갖는다 [Moore (1985) in Prostanoids ; pharmacological , physiological and clinical relevance, Cambridge University Press, N.Y., pp.229-230].
COX 억제제의 작용 메카니즘은 대부분의 통상적인 NSAID의 작용 메카니즘과 중복되기 때문에, 염증이 결정적 역할을 하는 과도적 질병 및 만성 질환에서 염증과 관련된 통증 및 종창을 포함하여 동일한 증상의 대부분을 치료하기 위해 COX 억제제가 사용된다. 과도적 질병은 미세 찰상 또는 접촉 피부염과 관련된 염증의 치료, 뿐만 아니라, 과색소침착, 노화 반점, 비틸라고, 전신 홍반성 루프스, 건선, 암종, 흑색종 및 다른 포유류 피부암과 같은 프로스타글란딘 및 류코트리엔과 직접 관련된 피부질환의 치료를 포함한다. COX 억제제의 사용은 전신 홍반성 루프스(SLE)와 같은 질병[Goebel et al . (1999) Chem. Res. Toxicol. 12:488-500; Patrono et al . (1985) J. Clin. Invest. 76:1011-1018], 및 경피증과 같은 류머티스성 피부질환을 포함한다. COX 억제제는 또한 프로스타글라딘의 과생성으로부터 유발되는 염증을 감소시켜서 직접적 잇점을 제공할 수 있는, 건선과 같은 류머티스성 기원의 질환이 아닌 염증성 피부질환의 경감을 위해 사용된다 [Fo로 et al . (1993) Acta Derm Venerologica 73:191-193]. 최근에는, 전신 경화증에 걸린 환자의 피부에서 5-리폭시게나아제의 과발현이 보고되었다. 이것은 LOX 경로가 전신 경화증의 병인에서 유의성을 나타낼 수 있고 효과적인 치료 목표를 나타낼 수 있다는 제시를 유도하였다 [Kowal-Bielecka (2001) Arthritis Rheum. 44(8):1865]. 최종적으로, 알레르겐 주입 부위에서 COX-2 및 5-LOX 둘 모두의 증가된 효소 활성이 초기 및 말기 피부 알레르기 반응 둘 모두의 증상을 치료하기 위한 이중 COX/LOX 억제제의 사용 가능성을 제시하였다 [Church (2002) Clin. Exp. Allergy. 32(7):1013].
선택성 시클로록시게나아제 억제제의 국부 적용은 단기간 및 장기간 노출 후의 UVB 매개 피부 염증을 억제하는 것으로 입증되었다. 부가적으로, COX 억제제의 국부 적용에 의해 부종, 피부 호중성 백혈구 침윤 및 활성화, PGE2 수준 및 선번 세포의 형성이 감소되었다 [Wilgus (2000) Prostaglandin Other Lipid Mediat. 62(4):367]. COX 억제제 셀레브렉스(상표명)(CelebrexTM)은 전신 투여되는 경우[Wilgus (2002) Adv. Exp. Med. Biol. 507:85] 및 국부 투여되는 경우[Wilgus (2000) Prostaglandin Other Lipid Mediat. 62(4):367]에 UV 매개 염증의 작용을 감소시키는 것으로 입증되었다. 동물 모델에서, 공지된 COX 억제제인 아스피린 및 다양한 리폭시게나아제 억제제는 UV 방사선 조사로부터 유발되는 염증 및 혈관확장에 대해 혈관보호 활성을 나타내었다 [Kuhn (1988) Biomed. Biochim. Acta. 47:S320]. 단기간 또는 장기간 UV 노출은 표피에서 콜라겐의 분해 및 비정상 엘라스틴의 축적을 특징으로 하느 피부 손상 및 광피부노화를 유발시킨다. 이중 COX/LOX 억제제는 혈관확장, 혈관침투, 화학 주성 및 케모탁신인 프로스타글란딘(PG) 및 다중 류코트리엔(LT)를 현저히 감소시킴으로써, 염증성 침윤에 의해 유발되는 콜라겐 분해를 예방하고 치료하기 위해 사용될 수 있다 [Bosset (2003) Br. J. Dermatol. 149(4):826; Hase (2000) Br. J. Dermatol. 142(2):267]. 부가적으 로, 구강 피부에서의 화학적 유도 산화성 스트레스는 COX 및 LOX를 분리 투여시켜서 백혈구 유착, 침윤 및 H2O2 생성을 감소시킴으로써 억제될 수 있다 [Nakamura (2003) Free Radical Biol. Med. 35(9):997].
항염증제로서의 이들의 사용 이외에, COX 억제제에 대한 또다른 가능한 역할은 암의 치료이다. COX의 과발현은 다양한 사람 악성 종양에서 나타났으며, COX의 억제제는 피부 종양에 걸린 동물의 치료에 효과적인 것으로 입증되었다. 작용 메카니즘이 완전히 이해되지는 않았지만, COX의 과발현은 아포토시스를 억제하고 종양 유발 세포형의 침습성을 증가시키는 것으로 입증되었다 [Dempke et al . (2001) J. Can. Res. Clin. Oncol. 127:411-17; Moore and Simmons (2000) Current Med. Chem. 7:1131-1144]. 상향 조절된 COX 생성은 피부에서 화학선 각화증 및 편평상피 세포 암종의 생성에 관련된다. COX의 증가된 양은 또한 DNA 손상에 의해 생성되는 병변에서 발견되었다 [Buckman et al . (1998) Carcinogenesis 19:726]. 따라서, COX의 발현 또는 단백질 기능의 조절이 염증 반응 및 암으로의 최종 진행의 감소를 유도하는 것으로 보인다. 사실상, 인도메타신 및 셀레브렉스(상표명)과 같은 COX 억제제는 UV 유도 홍반 및 종양 형성을 치료하는 데에 효과적인 것으로 밝혀졌다 [Fischer (1999) Mol. Carcinog. 25:231; Pentland (1999) Carcinogenesis 20:1939]. 최근에는, 리폭시게나아제의 과발현이 또한 상피 종양 발달[Muller (2002) Cancer Res. 62(16):4610] 및 흑색종 발암[Winer (2002) Melanoma Res. 12(5):429]에 관련되는 것으로 입증되었다. 리폭시게나아제 경로로부터 생성되는 아라키돈산(AA) 대사물이 종양 성장 관련 징후 변환에서 중요한 역할을 하며, 이는 리폭시게나아제 경로의 억제가 암 진행을 예방하기 위한 효과적인 목표이어야 함을 제시하는 것이다 [Cuendet (2000) Drug Metabol Drug Interact 17(4):109; Steele (2003) Mutat Res. 523-524:137]. 이와 같이, 이중 COX/LOX 억제 활성을 갖는 치료제의 사용은 암의 화학적 예방에서 현저한 장점을 제공한다.
프로스타글란딘 및 류코트리엔은 또한 창상, 화상, 좌창, 미생물 감염, 피부염 및 많은 다른 피부 질환 및 질병의 생리학적 및 병리학적 진행에서 중요한 역할을 한다. 시클로옥시게나아제 및 리폭시게나아제 활성이 현저히 증가된 열상 및 화학적 화상 후의 전구염증성 단계적 반응의 활성화가 널리 보고되었으며, 이는 다중 기관 기능 부전을 유도할 수 있는 후속적인 심각한 증상 및 면역 가능 장애에서 중요한 역할을 한다 [Schwacha (2003) Burns 29(1):1; He (2001) J. Burn Care Rehabil. 22(1):58].
좌창은 피지 생성, 여포성 상피 박리, 박테이아 증식 및 염증에서 이상성을 갖는 털기름샘 주위 조직의 질환이다. 좌창의 염증 성질은 편광 사진술에 으해 검출될 수 있으며, 좌창 정도의 평가를 포함한 임상적 진단을 위해 그리고 치료 효과를 측정하기 위해 이용될 수 있다 [Phillips (1997) J. Am. Acad. Dermatol. 37(6):948]. 좌창의 예방 및 치료를 위한 현재의 치료제는 레티노이드와 같은 항염증제, 항미생물제 및 호르몬성 약제를 포함하다 [Leyden (2003) J. Am. Acad. Dermatol. 49(3 Suppl ):S200]. 레티노이드와 같은 항염증제[Millikan (2003) J. Am. Acad. Dermatol. 4(2):75] 및COX 억제제인 실리실산[Lee (2003) Dermatol Surg 29(12):1196]의 국부 적용은 임상적으로 좌창의 치료를 위한 효과적이고 안전한 치료법인 것으로 입증되었다. 부가적으로, 비-스테로이드성 항염증약(NSAID)의 사용이 좌창, 건선, 선번, 결절성 홍반, 한랭글로불린혈증, 스위트 증후군, 전신 비만세포증, 두드러기, 리베도이드 및 결절성 혈관염을 포함하는 공통적 및 비공통적 피부질환에 대한 치료제로서 널리 보고되었다 [Friedman (2002) J. Cutan Med. Surg. 6(5):449].
플라보노이드 또는 바이오플라보노이드가 널리 분포된 군의 천연 생성물이며, 이들은 항박테리아, 항염증, 항알레르기, 항돌연변이, 항바이러스, 항종양, 항혈전 및 혈관확장 활성을 갖는 것으로 보고되었다. 상기 군의 화합물에 공통적인 구조 단위는 하기 일반식에 의해 도해되는 바와 같이 3-탄소 고리의 어느 한쪽 측면 상에 2개의 벤젠 고리를 포함한다 :
Figure 112005056032241-pct00001
상기 일반적 3-고리 구조에 결합된 수산기, 당, 산소 및 메틸기의 다양한 조합이 플라바놀, 플라본, 플라반-3-올 (카테킨), 안토시아닌 및 이소플라본을 포함하는 다양한 부류의 플라보노이드를 생성시킨다.
유리-B-고리 플라본 및 플라보노이드는 하기 일반식에 의해 도해되는 바와 같이 방향족 B 고리 상에 치환기를 갖지 않는 특정 부류의 플라보노이드이다 (본원에서는 유리-B-고리 플라보노이이드로 언급함):
Figure 112005056032241-pct00002
상기 식에서,
R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 -H, -OH, -SH, -OR, -SR, -NH2, -NHR, -NR2, -NR3 +X-, 알도펜토오스, 메틸-알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 이들의 화학적 유도체를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 단일 당 또는 여러 당의 조합물의 탄소, 산소, 질소 또는 황 글리코사이드로 구성된 군으로부터 선택되며,
여기에서,
R은 탄소수 1-10개의 알킬기이고;
X는 히드록실, 염화물, 요오드화물, 플루오르화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 카아보네이트 등을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 약제학적으로 허용될 수 있는 카운터 음이온으로 구성된 군으로부터 선택된다.
유리-B-고리 플라보노드는 비교적 희박하다. 천연 공급원으로부터 합성되거나 유리된 총 9,396개의 플라보노이드 중에서, 단지 231개의 유리-B-고리 플라보노이드만이 알려져 있다 [The Combined Chemical Dictionary, Chapman & Hall/CRC, Version 5:1 June 2001]. 유리-B-고리 플라보노이드는 다양한 생물학적 활성을 갖는 것으로 보고되었다. 예를 들어, 갈란긴(3,5,7-트리히드록시플라본)은 산화방지제 및 자유 라디칼 포착제로서 작용하며, 항-유전자독성 및 암의 화학적 예방을 위한 보장된 캔디데이트인 것으로 믿어진다 [Heo et al . (2001) Mutat. Res. 488(2):135-150]. 이것은 티로시나아제 모노페놀라아제의 억제제[Kubo et al . (2000) Bioorg. Med. Chem. 8(7):1749-1755] 및 토끼 심장 카르보닐 환원효소의 억제제[Imamura et al . (2000) J. Biochem. 127(4):653-658]이고, 항미생물 활성[Afolayan and Meyer (1997) Ethnopharmacol. 57(3):177-181] 및 항바이러스 활성[Meyer et al . (1997) Ethnopharmacol. 56(2):165-169]을 갖는다. 바이칼레인 및 2개의 또다른 유리-B-고리 플라보노이드는 사람 유방암 세포에 대해 항증식 활성을 갖는다 [So et al . (1997) Cancer Lett. 112(2):127-133].
전형적으로, 플라보노이드는 이들의 이용성에 근거하여 불규칙적으로 생물학적 활성에 대해 시험되었다. 경우에 따라, p-당단백질에 대한 고친화성 결합에 필요한 B-고리 치환[Boumendjel et al . (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:75-77]; 강심 작용[Itoigawa et al . (2001) J. Ethnopharmacol. 65(3):267-272]; 리놀레산 히드로과산화물-유도 독성에 대한 내피 세포에 대한 보호 작용[Kaneko and Baba (1999) Biosci Biotechnol. Biochemm 63(2):323-328]; COX-1 억제 활성[Wang (2000) Phytomedicine 7:15-19] 및 프로스타글란딘 엔도페록시드 신타아제[Kalkbrenner et al . (1992) Pharmacologyy 44(1):1-12]과 같이, 특이적 생물학적 활성에 대해 B-고리 상의 치환의 요건이 강조되었다. 단지 몇개의 공보만이 유리-B-고리 플라보노이드의 비치환된 B-고리의 중요성을 언급하였다. 한가지 예는 효과적 항응고제로서 NADPH 퀴논 수용체 산화환원 효소를 억제하는 2-페닐 플라본의 사용이다 [Chen et al . (2001) Biochem. Pharmacol. 61(11):1417-1427].
다양한 유리-B-고리 플라보노이드의 항염증 활성에 대한 작용 메카니즘은 논쟁의 여지가 있다. 유리-B-고리 플라보노이드인 크리신[Liang et al. (2001) FEBS Lett. 496(1):12-18], 워고닌[Chi et al. (2001) Biochem. Pharmacol. 61:1195-1203] 및 할란긴[Raso et al. (2001) Life Sci. 68(8):921-931]의 항염증 활성은 페록시솜 증식제 활성화 수용기 감마(PPARγ)의 활성화와 탈과립화 및 AA 방출에 대한 영향을 통한 유도성 시클로옥시게나아제 및 산화질소 신타아제의 억제와 관련되어 있다 [Tordera et al. (194) Z. Naturforsch [C] 49:235-240]. 오로크실린, 바이칼레인 및 워고닌이 시클로옥시게나아제에 영향을 주지 않으면서 12-리폭시게나아제를 억제하는 것으로 보고되었다 [You et al. (1999) Arch. Pharm. Res. 22(1):18-24]. 더욱 최근에는, 워고닌, 바이칼린 및 바이칼레인의 항염증 활성이 유도성 산화질소 신타아제의 억제 및 산화질소 억제제 및 리포다당류에 의해 유도되는 cox-2 유전자 발현을 통해 일어나는 것으로 보고되었다 [Chen et al. (2001) Biochem. Pharmacol. 61(11):1417-1427]. 최종적으로, 보고에 따르면, 워고닌은 대 식 세포에서 유도성 PGE2 생성을 억제한다 [Wakabayashi and Yasui (2000) Eur J. Pharmacol. 406(3):477-481].
미트로겐-활성화 단백질 키나아제의 인산화의 억제 및 바이칼레인에 의한 Ca2+ 이온 투과 담체 A23187 유도 PGE2 방출의 억제는 스쿠텔라리아에 라딕스(Scutellariae radix )의 항염증 활성의 메카니즘인 것으로 보고되었다 [Nakahata et al. (1999) Nippon Yakurigaku Zasshi, 114, Supp. 11:215P-219P; Nakahata et al. (1998) Am. J. Chin Med. 26:311-323]. 보고에 따르면, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스(baicalensis)는 IL-1β, IL-6, 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 및 인터페론-γ(IFN-γ)의 초항원성 포도상구균 외독소 자극 T-세포 증식 및 생성을 억제한다 [Krakauer et al. (2001) FEBS Lett. 500:52-55]. 이와 같이, 바이칼린의 항염증 활성은 초항원에 의해 활성화된 전구염증성 시토카인 매개 징후 경로를 억제하는 것과 관련되었다. 그러나, 또한 바이칼린의 항염증 활성이 다양한 케모카인에 결합되어 이들의 생물학적 활성을 제한하는 것에 기인함이 제안되었다 [Li et al. (2000) Immunopharmacology 49:295-306]. 최근에는, 트롬빈 및 트롬빈 수용체 아고니스트 펩티드에 의해 유도되는 유착 분자 발현에 대한 바이칼린의 작용[Kimura et al. (2001) Planta Med. 67:331-334], 및 미도겐-활성화 단백질 키나아제 단계적 반응(MARK)의 억제[Nakahata et al.. (1999) Nippon Yakurigaku Zasshi, 114, Supp 11:215P=219P; Nakahata et al. (1998) Am. J. Chin Med. 26:311-323]가 보고되었다.
중국의 약용 식물인 스쿠텔라리아 바이칼렌시스(Scutellaria baicalensis)는 바이칼레인, 바이칼린, 워고닌 및 바이칼레노시드를 포함하여 상당한 양의 유리-B-고리 플라보노이드를 함유한다. 통상적으로, 상기 식물은 열 제거, 화염 제거, 습기-온난 및 여름 열 신드롬; 고열로부터 유발되는 조갈증, 종창, 욕창 및 다른 발열성 피부 감염; 급성 편도선염, 후두인두염 및 성홍열과 같은 상부 호흡기 감염; 바이러스성 간염; 신염; 펠비티스(pelvitis); 이질; 토혈 및 코피를 포함하여 많은 질환을 치료하기 위해 사용되어 왔다. 상기 식물은 또한 유산을 방지하기 위해 통상적으로 사용되어 왔다 [Encyclopedia of Chinese Traditional Medicine ShangHai Science and Technology Press, ShangHai, China, 1998]. 임상적으로, 스쿠텔라리아는 현재 소아 폐렴, 소아 박테리아성 설사, 바이러스성 간염, 급성 담낭 염증, 고혈압, 절단 및 수술로부터 유발되는 국부적 급성 염증, 천식 및 상부 호흡기 감염과 같은 질환을 치료하기 위해 사용된다 [Encyclopedia of Chinese Traditional Medicine ShangHai Science and Technology Press, ShangHai, China, 1998]. 보고에 따르면, 천식을 치료하기 위한 스쿠텔라리아 뿌리의 약리 효과는 유리-B-고리 플라보노이드의 존재 및 호산성 물질의 에오탁신 관련 점증의 억제에 관련된다 [Nakajima et al . (2001) Planta Med. 67(2):132-135].
지금까지, 많은 천연 유리-B-고리 플라보노이드가 다양한 용도로 시판되어 왔다. 예를 들어, 스쿠텔라리아 추출물의 리포솜 형성은 피부 보호를 위해 사용되어 왔다 [미합중국 특허 제5,643,598호, 제5,44,983호]. 바이칼린은 암유전자에 대한 이것의 억제 효과로 인해 암을 예방하기 위해 사용되어 왔다 [미합중국 특허 제6,290,995호]. 바이칼린 및 다른 화합물은 항바이러스제, 항박테리아제 및 면역조절제[미합중국 특허 제6,083,921호 및 WO98/42363] 및 천연 산화방지제[WO98/49256 및 폴란드 공보 제9,849,256호]로서 사용되어 왔다. 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리 추출물은 구소용 제형에서 각각의 개별적 성분의 누적 SPF의 첨가제 작용을 하는 보충적 선스크린제로서 제형화되어 왔다. 크리신은 이것의 불안 감소 성질을 위해 사용되어 왔다 [미합중국 특허 제5,756,538호]. 항염증성 플라보노이드는 상부직장 및 결장 질환의 억제 및 치료[미합중국 특허 제5,858,371호] 및 리포시게나아제의 억제[미합중국 특허 제6,217,875호]를 위해 사용되어 왔다. 이들 화합물은 또한 연결 조직의 치유 및 유지를 위해 글루코사민 콜라겐 및 다른 성분들과 제형화된다 [미합중국 특허 제6,333,304호], 플라노보이드 에스테르는 미용 조성물용 활성 성분을 구성한다 [미합중국 특허 제6,235,294호]. 2002년 3월 1일에 출원된 미합중국 특허 출원 제10/091,362호("Identification of Free-B-Ring Flavonoids as Potent Cox-2 Inhibitors") 및 203년 7월 22일에 출원된 미합중국 특허 출원 10/427,746호("Formulation of a Mixture of Free-B-Ring Flavonoids and Flavan as a Therapeutic Agent")는 모두, 유리-B-고리 플라보노이드를 포함하는 조성물 또는 유리-B-고리 플라보노이드의 혼합물을 함유하는 조성물을 이들을 필요로 하는 수용자에게 투여함으로써 시클로옥시게나아제 효소 COX-2를 억제시키는 방법을 기술하고 있다. 이는 유리-B-고리 플라보노이드들 사이의 결합 및 COX-2 억제 활성에 대한 첫 번째 보고이다. 이들 출원은 특히 전체 내용이 본원에 참고문헌으로 인용된다.
일본 특허 제63027435호는 바이칼레인의 추출 및 부화를 기술하고 있으며, 일본 특허 제61050921호는 바이칼린의 정제를 기술하고 있다.
플라반은 하기 일반식에 의해 도해되는 화합물, 이량체, 삼량체 및 다른 중합된 플라반을 포함한다:
Figure 112005056032241-pct00003
상기 식에서,
R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 -H, -OH, -SH, -OCH3, -SCH3, -OR, -SR, -NH2, -NRH, -NR2, -NR3 +X-, 및 갈레이트, 아세테이트, 신나모일 및 히드록실-신나모일 에세테르, 트리히드록실벤조일 에스테르 및 카페오일 에스테르 및 이들의 화학적 유도체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 언급된 치환기의 에스테르; 알도펜토오스, 메틸 알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 이들의 화학적 유도체를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 단일 당 또는 여러 당의 조합물의 탄소, 산소, 질소 또는 황 글리코사이드로 구성된 군으로부터 선택되며,
여기에서,
R은 탄소수 1-10개의 알킬기이고;
X는 히드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물, 카아보네이트 등을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 약제학적으로 허용될 수 있는 카운터 음이온으로 구성된 군으로부터 선택된다.
카테킨은 주로 녹차에서 발견되는 플라반이며, 하기 구조를 갖는다:
Figure 112005056032241-pct00004
카테킨은 단독으로 그리고 차에서 발견된 다른 플라보노이드와 함께 작용하며, 항바이러스 활성 및 산화방지 활성 둘 모두를 갖는다. 카테킨은 바이러스성 간염의 치료에 효과적인 것으로 입증되었다. 이것은 또한 심장, 신장, 폐 및 비장에 대한 산화성 손상을 예방하는 것으로 보이며, 위암 세포의 성장을 억제하는 것으로 입증되었다.
카테킨 및 이것의 이성질체인 에피카테킨은 40 μM의 IC50 값으로 프로스타글란딘 엔도페록시드 신타아제를 억제한다 [Kalkbrenner et al. (1992) Pharmacol. 44:1-12]. 4가지 식물종, 즉 아투나 라세모사(Atuna racemosa), 시지기움 카리노카르품(Syzygium carynocarpum), 시지기움 말라켄세(Syzygium malaccense) 및 반타네아 페루비아나(Vantanea peruviana)로부터 단리된 (+)-카테킨 및 갈로카테킨을 포함하는 5가지의 플라반-3-올 유도체는 3.3 내지 138 μM의 IC50 값으로, COX-1과 비교하여 COX-2에 대해 동일하거나 더 약한 억제 활성을 나타낸다 [Noreen et al. (1998) Planta Med. 64:520-524]. 케이바 펜탄드라(Ceiba pentandra)의 수피로부터 단리된 (+)-카테킨은 80 μM의 IC50 값으로 COX-1을 억제한다 [Noreen et al. (1998) J. Nat. Prod. 61:8-12]. 시판용의 순수한 (+)-카테킨은 실험 조건에 좌우하여 약 183 내지 279 μM의 IC50 값으로 COX-1을 억제하며, COX-2에 대한 선택성은 없다 [Noreen et al. (1998) J. Nat. Prod. 61:1-7].
녹차 카테킨은 스프라그 돌리 숫쥐의 식이물에 보충한 경우에, 혈소판 PLA2의 활성 수준을 저하시켰으며, 혈소판 시클로옥시게나아제 수준을 현저히 감소시켰다 [Yang et al. (1999) J. Nutr. Sci. Vitaminol. 45:337-346]. 보고에 따르면, 카테킨 및 에피카테킨은 사람 결장암 DLD-1 세포에서 cox-2 유전자 전사를 약하게 억제한다 (IC50=415.3 μM) [Mutoh et al. (2000) Jpn. J. Cancer Res. 91:686-691]. 적포도주로부터의 (+)-카테킨의 신경보호 능력은 시클로옥시게나아제, 리폭시게나아제 또는 산화질소 신타아제와같은 세포내 효소에 대한 억제 효과보다는 카테킨의 산화방지 성질로부터 결과된다 [Bastianetto et al. (2000) Br. J. Pharmacol. 131:711-720]. 에피갈로카테킨-3-갈레이트(EGCG), 에피갈로카테킨(EGC), 에피카테킨-3-갈레이트(ECG) 및 테아플라빈과 같은 녹차 및 홍차로부터 정제된 카테킨은 사람 결장 점막 및 결장 종양 조직에서 AA의 시클로옥시게나아제 및 리폭시게나아제 의존성 대사작용의 억제를 나타내었으며[Hong et al. (2001) Biochem. Pharmacol. 62:1175-1183], cox-2 발현 및 PGE2 생성을 유도한다 [Park et al. (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 286:721-725]. 켈라스트루스 오르비쿨라투스(Celastrus orbiculatus)의 기생부로부터 단리된 에피아프젤레킨은 15 μM의 IC50 값으로 COX-1 활성의 투여량-의존성 억제를 나타내었으며, 또한 100 mg/kg의 투여량에서 경구 투여 후에 카라기닌-유도 마우스 발 부종에 대한 항염증 활성을 나타내었다 [Min et al. (1999) Planta Med. 65:460-462].
아카시아는 콩과 나무 및 관목의 속이다. 아카시아 속은 콩과식물의 과 및 미모사아과 식물의 아과에 속하는 1000개보다 많은 종을 포함한다. 아카시아는 중남미, 아프리카, 아시아의 일부 및 가장 많은 풍토성 종을 갖는 오스트레일리아의 열대 및 아열대 지역에 전세계적으로 분포되어 있다. 아카시아는 경제적으로 매우 중요하며, 타닌, 고무, 목재, 연료 및 사료의 공급원을 제공한다. 주로 수피로부터 단리되는 타닌은 가죽 및 모피를 무두질하기 위해 광범위하게 사용된다. 일부 아카시아 수피는 또한 지역 특유의 주정에 향을 더해주기 위해 사용된다. 아카시아 시누아타(A. sinuata)와 같은 일부 자생종은 또한, 물과 혼합하고 교반시켰을 때 비누 거품을 형성시키는 다양한 식물 글루코사이드 중 어느 하나인 사포닌을 생성시킨다. 사포닌은 청정제, 발포제 및 유화제에 사용된다. 일부 아카시아 종의 꽃은 방향성이며, 향료를 만들기 위해 사용된다. 많은 아카시아의 심재는 농기구를 만들기 위해 사용되며, 또한 장작의 공급원을 제공한다. 아카시아 고무는 의약 및 제과에서 그리고 방직 산업에서 사이징재 및 마감재로서 광범위하게 사용되는 것으로 밝혀졌다.
지금까지, 약 330가지 화합물이 다양한 아카시아 종으로부터 단리되었다. 플라보노이드가 아카시아로부터 단리된 주된 부류의 화합물이다. 약 180가지의 상이한 플라보노이드가 확인되었으며, 이 중에서 111가지는 플라반이다. 테르페노이드가 아카시아 속의 종으로부터 단리된 2번째로 많은 부류의 화합물이며, 48가지 화합물이 확인되었다. 아카시아로부터 단리되는 다른 부류의 화합물로는 알칼로이드(28가지), 아미노산/펩티드(20가지), 타닌(16가지), 탄수화물(15가지), 산소 헤테로고리 화합물(15가지) 및 지방족 화합물(10가지)이 있다 [Buckingham, The Combined Chenical Dictionary, Chapman & Hall CRC, version 5:2 Dec. 2001].
페놀계 화합물, 특히 플라반은 모든 아카시아 종에서 고농도로 적당하게 발견되었다 [Abdulrazak et al. (2000) Journal of Animal Science. 13:935-940]. 역사적으로, 아카시아 속의 식물 및 추출물의 대부분은 위장병, 설사 및 소화불량을 치료하고 출혈을 중단시키기 위해 이용되어 왔다 [Vautrin (1996) Universitee Bourgogne (France) European abstract 58-01C:177; Saleem et al. (1998) Hamdard Midicus. 41:63-67]. 아카시아 아라비카 윌드(Acacia arabica Willd)의 수피 및 꼬투리는 다량의 타닌을 함유하며, 수렴제 및 거담제로서 이용되어 왔다 [Nadkarni (1996) India Materia Medica, Bombay Popular Prakasan, pp. 9-17]. 소말리아로부터의 아카시아 토르틸리스(Acacia tortilis)의 줄기 수피로부터 단리되는 디아릴프로판올 유도체는 평활근 이완 작용을 하는 것으로 보고되었다 [Hagos et al. (1987) Planta Medica. 53:27-31, 1987]. 아카시아 빅토리아에(Acacia victoriae)로부터 단리되는 테르페노이드 사포닌이 디메틸벤즈(아)안트라센-유도 쥐과 피부 발암에 대한 억제 작용을 하며[Hanausek et al. (2000) Proceedings American Association for Cancer Research Annual Meeting. 41:663], 아포토시스를 유도한다[Haridas et al. (2000) Proceedings American Association for Cancer Research Annual Meeting. 41:600]. 아카시아 닐로티카(Acacia nilotica)로부터의 식물 추출물은 경련, 혈관수축 및 항고혈압 활성[Amos et al. (1999) Phytotherapy Research 13:683-685; Gilani et al. (1999) Phytotherapy Research 13:665-669] 및 항-혈소판 응집 활성[Shah et al. (1997) General Pharmacology, 29:251-255]을 갖는 것으로 보고되었다. 아카시아 닐로티카에 대한 항염증 활성이 보고되었다. 플라보노이드, 다당류 및 유기산이 효과적 활성 성분임이 추측되었다 [Dafalah and Al-Mustafa (1996) American Journal of Chinese Medicine. 24:263-269]. 지금까지, 아카시아로부터 단리된 유일하게 보고된 5-리폭시게나아제 억제제는 모노테르페노이드 카르복사미드이다 [Seikine et al. (1997) Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 45:148-11].
아카시아의 수피로부터의 추출물은 표백제로서(Abe, JP10025238), 치과용 글루코실 트랜스퍼라아제로서(Abe, JP07242555), 단백질 합성 억제제로서(Fukai, JP07165598), 외피 제조물용 활성 산소 포착제로서(Honda, JP07017847; Bindra, USP6,1266,950) 그리고 염증, 화분증 및 기침을 예방하기 위하 경구 소비용 히알루로니다아제 억제제로서(Ogura, JP07010768) 외부 용도에 대해 일본에서 특허되었다.
지금까지, 본 출원인은 포유류 피부질환에 대한 현저한 잇점을 제공하는 COX/LOX 효소의 이중 억제를 위한 주된 생물학적 활성 성분으로서 유리-B-고리 플라보노이드 및 플라반만을 조합시킨 제형에 대한 어떠한 보고서도 발견하지 못하였다.
발명의 요약
본 발명은 피부에 관련된 질환 및 질병의 예방 및 치료에 사용하기 위해 시클로옥시게나아제(COX) 및 리폭시게나아제(LOX) 효소 둘 모두를 동시에 억제하는 데에 효과적인 방법을 포함한다. COX 및 LOX 효소를 동시에 이중 억제시키기 위한 방법은 단일 식물 또는 여러 식물로부터 합성되고/되거나 단리된 유리-B-고리 플라보노이드와 플라반의 혼합물을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 수용자에게 바람직하게는 국부 투여하는 것으로 이루어진다. 상기 조성물은 본원에서 솔리프린(상표명)(SoliprinTM)으로 명명된다. 본 방법의 효과는 여러 동물 모델에서 그리고 최종적으로 사람 임상 연구에서, 상이한 세포계에서의 정제된 효소의 사용으로 입증되었다. 조성물 중의 유리-B-고리 플라보노이드 대 플라반의 비는 99.9:0.1 유리-B-고리 플라보노이드 : 플라반 내지 0.1:99.9 유리-B-고리 플라보노이드 : 플라반일 수 있다. 본 발명의 특정 구현에서, 유리-B-고리 플라보노이드 : 플라반의 비는 약 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 구현에서, 조성물의 중의 유리-B-고리 플라보노이드 : 플라반의 비는 80:20이다. 바람직한 구현에서, 유리-B-고리 플라보노이드는 스쿠텔라리아 속 식물에 속하는 식물(들)로부터 단리되고, 플라반은 아카시아 속 식물에 속하는 식물(들)로부터 단리된다.
본 발명은 또한, COX 및 LOX 매개 피부 질환 및 질병의 예방 및 치료를 위한 방법을 포함한다. COX 및 LOX 매개 피부 질환 및 질병을 예방하고 치료하기 위한 방법은 단일 식물 또는 여러 식물로부터 합성되고/되거나 단리된 유리-B-고리 플라보노이드와 플라반의 혼합물 및 약제학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하는 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 수용자에게 바람직하게는 국부 투여하는 것으로 이루어진다. 조성물 중의 유리-B-고리 플라보노이드 대 플라반의 비는 99.9:0.1 유리-B-고리 플라보노이드 : 플라반 내지 0.1:99.9 유리-B-고리 플라보노이드 : 플라반일 수 있다. 본 발명의 특정 구현에서, 유리-B-고리 플라보노이드 : 플라반의 비는 약 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 구현에서, 조성물 중의 유리-B-고리 플라보노이드 : 플라반의 비는 80:20이다. 바람직한 구현에서, 유리-B-고리 플라보노이드는 스쿠텔라리아 속 식물에 속하는 식물(들)로부터 단리되고, 플라반은 아카시아 속 식물에 속하는 식물(들)로부터 단리된다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 본원에서 또한 유리-B-고리 플라본 및 유리-B-고리 플라보놀로서 명명되는 유리-B-고리 플라보노이드는 하기 일반식에 의해 도해되는 화합물을 포함한다:
[화학식 2]
Figure 112005056032241-pct00005
상기 식에서,
R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 -H, -OH, -SH, -OR, -SR, -NH2, -NHR, -NR2, -NR3 +X-, 알도펜토오스, 메틸-알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 이들의 화학적 유도체를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 단일 당 또는 여러 당의 조합물의 탄소, 산소, 질소 또는 황 글리코사이드로 구성된 군으로부터 선택되며,
여기에서,
R은 탄소수 1-10개의 알킬기이고;
X는 히드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물, 카아보네이트 등을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 약제학적으로 허용될 수 있는 카운터 음이온으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 유리-B-고리 플라보노이드는 합성 방법에 의해 수득되거나, 포포나무과(Annonaeae), 국화과(Asteraceae), 능소화과(Bignoniaceae), 콤브레타과(Combretaceae), 국화과(Compositae), 대극과(Euphorbiaceae), 꿀풀과(Labiatae), 라우랜세아에(Lauranceae), 콩과(Leguminosae), 뽕나무과(Moraceae), 소나무과(Pinaceaee), 고사리과(Pteridaceae), 시놉테리다세아에(Sinopteridaceae), 느릅나무과(Ulmaceae) 및 생강과(Zingiberacea)를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 식물의 과로부터 추출될 수 있다. 유리-B-고리 플라보노이드는 데스모스( Desmos ), 아치로클리네(Achyrocline), 오록실룸( Oroxylum ), 부케나비아( Buchenavia ), 아나팔리스(Anaphalis), 코툴라( Cotula ), 그나팔리움( Gnaphalum ), 헤리치숨( Helichysum ), 켄타루레아(Centaurea), 유파토리움( Eupatorium ), 박카리스( Baccharis ), 사피움(Sapium), 스쿠텔라리아( Scutellaria ), 몰사( Molsa ), 콜레브루케아( Colebrookea ), 스타치스(Stachys), 오리가눔( Origanum ), 지지포라( Ziziphora ), 린데라( Lindera ), 악티노다프네(Actinodaphnee), 아카시아( Acacia ), 데리스( Derris ), 글리키르히자(Glycyrrhiza), 밀레티아( Millettia ), 퐁가미아( Pongamia ), 테프로시아(Tephrosia), 아르토카르푸스( Artocarpus ), 피쿠스( Ficus ), 피티로그람마(Pityrogramma), 노톨라에나( Notholaena ), 피누스( Pinus ), 울무스( Ulmis ) 및 알피나(Alpina)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 고등식물의 속으로부터 추출되고, 농축되고 정제될 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 플라반은 하기 일반식에 의해 도해되는 화합물, 이량체, 삼량체 및 다른 중합된 플라반을 포함한다:
[화학식 3]
Figure 112005056032241-pct00006
상기 식에서,
R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 H, -OH, -SH, -OCH3, -SCH3, -OR, -SR, -NH2, -NRH, -NR2, -NR3 +X-, 및 갈레이트, 아세테이트, 신나모일 및 히드록실-신나모일 에세테르, 트리히드록실벤조일 에스테르 및 카페오일 에스테르를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 언급된 치환기의 에스테르; 알도펜토오스, 메틸 알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 이들의 화학적 유도체를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 단일 당 또는 여러 당의 조합물의 탄소, 산소, 질소 또는 황 글리코사이드로 구성된 군으로부터 선택되며,
여기에서,
R은 탄소수 1-10개의 알킬기로부터 선택되고;
X는 히드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물, 카아보네이트 등을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 약제학적으로 허용될 수 있는 카운터 음이온으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 플라반은 아카시아 속으로부터 선택된 식물(들)로부터 수득될 수 있다. 바람직한 구현에서, 식물은 아카시아 카테츄( Acacia . catechu ), 아카시아 콘킨나(Acacia concinna ), 아카시아 파르네시아나( Acacia farnesiana ), 아카시아 세네갈(Acacia Senegal ), 아카시아 스페시오사( Acacia speciosa ), 아카시아 아라비아(Acacia arabia ), 아카시아 카에시아( Acacia caesia ), 아카시아 펜나타( Acacia pennata), 아카시아 시누아타( Acacia sinuata ), 아카시아 메아른시이( Acacia mearrnsii), 아카시아 피크난타( Acacia picnantha ), 아카시아 데알바타( Acacia dealbata), 아카시아 아우리쿨리포르미스( Acacia auriculiformis ), 아카시아 홀로세레시아(Acacia holoserecia ) 및 아카시아 만기움(Acacia mangium)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
하나의 구현에서, 본 발명은 선번, 열상, 좌창, 국부 창상, 균, 미생물 및 바이러스 감염에 의해 유발되는 미세 염증 질환, 비틸라고, 전신 홍반성 루프스, 건선, 암종, 흑색종, 및 다른 포유류 피부암을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 많은 COX 및 LOX 매개 질환 및 질병을 예방하고 치료하기 위한 방법을 포함한다. 본 발명의 또다른 구현에서, 본 발명은 자외(UV) 방사선, 화학약품, 열, 바람 및 건조 환경에 대한 노출로부터 유발되는 피부 손상을 예방하고 치료하기 위한 방법을 포함한다. 본 발명의 또다른 구현에서, 본 발명은 주름살, 늘어진 피부, 눈 주변의 주름 및 다크서클, 피부염 및 다른 알레르기 관련 피부 질환을 예방하고 치료하기 위한 방법을 포함한다.
본 발명은 더욱더, 본 발명의 치료제를 포함하는 치료 조성물을 포함한다. 상기 기술된 피부 질환 및 질병의 예방 및 치료에서의 이들의 사용 이외에, 본원에 기술되는 치료 조성물은 또한, 민감성 피부를 완화시키고, 개선된 탄력, 감소되고 지연된 노화, 향상된 젊은 외관 및 결, 및 증가된 신축성, 견고성, 매끄러움 및 유연성을 갖는 매끄럽고 젊은 피부를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따르는 예방 및 치료 방법은 단일 공급원 또는 여러 공급원으로부터 단리된 치료적으로 유효량의 제형화된 유리-B-고리 플라보노이드와 플라반을 이들을 필요로 하는 수용자에게 국부 투여하는 것을 포함한다. 여러 유리-B-고리 플라보노이드와 플라반의 혼합물 및/또는 개별 성분의 순도는 화합물을 얻기 위해 사용되는 방법에 좌우하여 0.01% 내지 100%를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 바람직한 구현에서, 동일량을 함유하는 유리-B-고리 플라보노이드와 플라반의 혼합물의 투여량은 국부 제형의 총중량을 기준으로 0.001 내지 100%로부터 일반적으로 선택되는 효과적이고 비독성인 양이다. 일상적 임상 실험을 이용하는 당업자는 치료하려는 특정 질병에 대한 최적 투여량을 결정할 수 있다.
본 발명은 제형을 최적화시키고 바람직한 생리학적 활성을 얻기 위해 효소적 및 생체내 모델을 사용하여 유리-B-고리 플라보노이드와 플라반의 여러 조성물을 평가하는 방법을 포함한다. 상기 제형의 효과 및 안전성이 또한 사람 임상 연구에서 입증된다. 본 발명의 조성물은 당업자에게 공지된 방법 중 어느 하나에 의해 투여될 수 있다. 투여 방식은 특정 장내(경구) 투여, 비경구 (정맥내, 피하 및 근내) 투여 및 국부 투여를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 바람직한 구현에서, 본 발명에 따르는 치료 방법은 단일 식물 또는 여러 식물로부터 합성되고/되거나 단리된 치료적 유효량의 유리-B-플라보노이드와 플라반의 혼합물을 이를 필요로 하는 수용자에게 국부 투여하는 것을 포함한다.
상기의 일반적 설명과 하기의 상세한 설명은 단지 대표적이고 설명을 위한 것으로서, 청구되는 바와 같은 발명을 제한하는 것은 아님이 이해되어야 한다.
발명의 상세한 설명
본원에서는 본 발명의 일면을 언급하기 위해 다양한 용어가 사용된다. 본 발명의 구성요소의 설명을 명료하게 하기 위해, 하기의 정의가 제공된다.
용어 "하나" 실재물은 하나 이상의 실재물을 의미하며, 예를 들어, 하나의 플라보노이드는 하나 이상의 플라보노이드를 의미함을 유의해야 한다. "1개", "하나", "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용되는 "유리-B-고리 플라보노이드"는 하기 일반식에 의해 도해되는 바와 같이 방향족 B 고리 상에 치환기를 갖지 않는 특정 부류의 플라보노이드이다:
[화학식 2]
Figure 112005056032241-pct00007
상기 식에서,
R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 -H, -OH, -SH, -OR, -SR, -NH2, -NHR, -NR2, -NR3 +X-, 알도펜토오스, 메틸-알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 이들의 화학적 유도체를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 단일 당 또는 여러 당의 조합물의 탄소, 산소, 질소 또는 황 글리코사이드로 구성된 군으로부터 선택되며,
여기에서,
R은 탄소수 1-10개의 알킬기이고;
X는 히드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물, 카아보네이트 등을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 약제학적으로 허용될 수 있는 카운터 음이온으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본원에 사용되는 "플라반"은 일반적으로 하기 일반식에 의해 표현될 수 있는 특정 부류의 플라보노이드, 이량체, 이량체, 삼량체 및 다른 중합된 플라반을 의미한다:
[화학식 3]
Figure 112005056032241-pct00008
상기 식에서,
R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 H, -OH, -SH, -OCH3, -SCH3, -OR, -SR, -NH2, -NRH, -NR2, -NR3 +X-, 및 갈레이트, 아세테이트, 신나모일 및 히드록실-신나모일 에세테르, 트리히드록실벤조일 에스테르 및 카페오일 에스테르 및 이들의 화학적 유도체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 치환기의 에스테르; 알도펜토오스, 메틸 알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 이들의 화학적 유도체를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 단일 당 또는 여러 당의 조합물의 탄소, 산소, 질소 또는 황 글리코사이드로 구성된 군으로부터 선택되며,
여기에서,
R은 탄소수 1-10개의 알킬기이고;
X는 히드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물, 카아보네이트 등을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 약제학적으로 허용될 수 있는 카운터 음이온으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본원에 사용되는 "치료적"은 치료 및/또는 예방을 포함한다. 사용되는 경우, 치료적은 사람 및 다른 동물에 적용된다.
"약제학적 또는 치료적 유효 투여량 및 유효량"은 원하는 생물학적 결과를 유도하기에 충분한 투여 수준을 의미한다. 그 결과는 질병의 징후, 증상 및 병인의 완화 또는 바람직한 생물계의 임의의 다른 변화일 수 있다.
"위약"은 활성 성분 없이 질병의 징후, 증상 또는 병인을 완화시킬 수 있는 원하는 생물학적 결과를 유도하기에 충분한 약제학적 또는 치료적 유효 투여량 및 유효량의 대체물을 의미한다.
"수용자" 또는 "환자"는 본원에 기술된 조성물이 투여되는 생체, 사람 또는 동물이다. 이와 같이, 본원에 기술되는 발명은 수의용 및 사람용으로 사용될 수 있으며, 용어 "환자" 또는 "수용자"는 제한 방식으로 구성되지 않아야 한다. 수의용의 경우에, 투여량 범위는 동물의 체중을 고려하여 하기 기술되는 바와 같이 결정될 수 있다.
본 출원서 전체를 통해 여러가지 인용문이 제공됨을 유의해야 한다. 각각의 인용문헌은 참고문헌으로서 전체 내용이 상세하게 본원에 인용되었다.
본 발명은 유기 및 수성 용매를 사용하여 유리-B-고리 플라보노이드 및 플라반을 함유하는 식물을 추출하는 방법(실시예 1, 표 1)을 제공한다. 미정제 추출물은 시클로옥시게나아제 억제 활성에 대해 검정된다 (실시예 2, 표 2 및 3). 정제된 유리-B-고리 플라보노이드 및 플라반은 실시예 3 및 4에 나타난 바와 같이, 가각 시클로옥시게나아제(COX) 및 리폭시게나아제(LOX)에 대한 억제 활성을 나타내었다. 추출물을 분석하고 정량화시키기 위한 방법은 실시예 5 및 6에 기술되어 있고, 식물원으로부터 표준화된 유리-B-고리 플라보노이드 및 플라반을 생성시키기 위한 방법은 실시예 7 및 8에 제공되어 있다.
본 발명의 한 구현에서, 표준화된 유리-B-고리 플라보노이드 추출물은 실시예 1, 2, 5 및 8에 규정된 바와 같이 1 내지 99 중량%의 전체 유리-B-고리 플라보노이드의 순도를 갖는 활성 화합물을 포함한다. 바이칼린은 전체 유리-B-고리 플라보노이드의 약 50 내지 90 중량%인 추출물 중의 주된 활성 성분이다. 바람직한 구현에서, 표준화된 추출물은 70%를 초과하는 전체 유리-B-고리 플라보노이드를 함유하며, 바이칼린이 전체 유리-B-고리 플라보노이드의 75%를 초과한다.
하나의 구현에서, 표준화된 플라반 추출물은 실시예 1, 4, 6 및 7에 규정된 바와 같이 1 내지 99 중량%의 전체 플라반의 순도를 갖는 활성 화합물을 포함한다. 카테킨은 추출물 중의 주된 활ㅎ성 성분이며, 그 양은 전체 플라반의 50 내지 95 중량%이다. 바람직한 구현에서, 표준화된 플라반 추출물은 80%를 초과하는 전체 플라반을 함유하며, 카테킨이 전체 플라반의 70%를 초과한다.
한 구현에서, 솔리프린은 상기 2가지 추출물 또는 합성 화합물을 99:1 내지 1:99의 비로 혼합시킴으로써 생성된다. 유리-B-고리 플라보노이드 대 플라반의 바람직한 비는 실시예 9 및 표 10에 규정한 바에 따르면 80:20이며, 실시예 9에 규정한 바에 따르면 15:85이다.
솔리프린 중의 유리-B-고리 플라보노이드의 농도는 약 1 내지 99%일 수 있으며, 솔리프린 중의 플라반의 농도는 99 내지 1%일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현에서, 솔리프린 중의 유리-B-고리 플라보노이드의 농도는 약 20%이며 바이칼린 함량은 솔리프린의 총중량의 약 15%이고, 솔리프린 중의 플라반의 농도는 약 75%이며 카테킨 함량은 약 70%이다. 상기 구현에서, 솔리프린 중의 전체 활성 성분 (유리-B-고리 플라보노이드와 플라반)은 총중량의 90%를 초과한다.
본 발명은 피부 관련 질환 및 질병의 예방 및 치료에 사용하기 위해 시클로옥시게나아제(COX) 및 리폭시케나아제(LOX) 효소 둘 모두를 동시에 억제하는 데에 효과적인 방법을 포함한다. COX 및 LOX 효소를 동시에 이중 억제시키기 위한 방법은 단일 식물 또는 여러 식물로부터 합성되고/되거나 단리된 유리-B-고리 플라보노이드와 플라반의 혼합물을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 수용자에게 바람직하게는 국부 투여하는 것으로 이루어진다. 상기 조성물은 본원에서 솔리프린으로 명명된다. 본 방법의 효과는 여러 동물 모델에서 그리고 최종적으로 사람 임상 연구에서, 상이한 세포계에서의 정제된 효소의 사용으로 입증되었다. 조성물 중의 유리-B-고리 플라보노이드 대 플라반의 비는 99.9:0.1 유리-B-고리 플라보노이드 : 플라반 내지 0.1:99.9 유리-B-고리 플라보노이드 : 플라반일 수 있다. 본 발명의 특정 구현에서, 유리-B-고리 플라보노이드 : 플라반의 비는 약 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 구현에서, 조성물의 중의 유리-B-고리 플라보노이드 : 플라반의 비는 20:80이다. 바람직한 구현에서, 유리-B-고리 플라보노이드는 스쿠텔라리아 속 식물에 속하는 식물(들)로부터 단리되고, 플라반은 아카시아 속 식물에 속하는 식물(들)로부터 단리된다.
본 발명은 또한, COX 및 LOX 매개 피부 질환 및 질병의 예방 및 치료를 위한 방법을 포함한다. COX 및 LOX 매개 피부 질환 및 질병을 예방하고 치료하기 위한 방법은 단일 식물 또는 여러 식물로부터 합성되고/되거나 단리된 유리-B-고리 플라보노이드와 플라반의 혼합물 및 약제학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하는 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 수용자에게 바람직하게는 국부 투여하는 것으로 이루어진다. 조성물 중의 유리-B-고리 플라보노이드 대 플라반의 비는 99.9:0.1 유리-B-고리 플라보노이드 : 플라반 내지 0.1:99.9 유리-B-고리 플라보노이드 : 플라반일 수 있다. 본 발명의 특정 구현에서, 유리-B-고리 플라보노이드 : 플라반의 비는 약 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 구현에서, 조성물 중의 유리-B-고리 플라보노이드 : 플라반의 비는 20:80이다. 바람직한 구현에서, 유리-B-고리 플라보노이드는 스쿠텔라리아 속 식물에 속하는 식물(들)로부터 단리되고, 플라반은 아카시아 속 식물에 속하는 식물(들)로부터 단리된다.
하나의 구현에서, 본 발명은 선번, 열상, 좌창, 국부 창상, 균, 미생물 및 바이러스 감염에 의해 유발되는 미세 염증 질환, 비틸라고, 전신 홍반성 루프스, 건선, 암종, 흑색종, 및 다른 포유류 피부암을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 많은 COX 및 LOX 매개 질환 및 질병을 예방하고 치료하기 위한 방법을 포함한다. 본 발명의 또다른 구현에서, 본 발명은 자외(UV) 방사선, 화학약품, 열, 바람 및 건조 환경에 대한 노출로부터 유발되는 피부 손상을 예방하고 치료하기 위한 방법을 포함한다. 본 발명의 또다른 구현에서, 본 발명은 주름살, 늘어진 피부, 눈 주변의 주름 및 다크서클, 피부염 및 다른 알레르기 관련 피부 질환을 예방하고 치료하기 위한 방법을 포함한다.
본 발명은 더욱더, 본 발명의 치료제를 포함하는 치료 조성물을 포함한다. 상기 기술된 피부 질환 및 질병의 예방 및 치료에서의 이들의 사용 이외에, 본원에 기술되는 치료 조성물은 또한, 민감성 피부를 완화시키고, 개선된 탄력, 감소되고 지연된 노화, 향상된 젊은 외관 및 결, 및 증가된 신축성, 견고성, 매끄러움 및 유연성을 갖는 매끄럽고 젊은 피부를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 유리-B-고리 플라보노이드는 상기 기술된 일반식에 의해 도해된 화합물을 포함한다. 본 발명의 유리-B-고리 플라보노이드는 합성 방법에 의해 수득되거나, 포포나무과(Annonaceae), 국화과(Asteraceae), 능소화과(Bignoniaceae), 콤브레타과(Combretaceae), 국화과(Compositae), 대극과(Euphorbiaceae), 꿀풀과(Labiatae), 라우랜세아에(Lauranceae), 콩과(Leguminosae), 뽕나무과(Moraceae), 소나무과(Pinaceaee), 고사리과(Pteridaceae), 시놉테리다세아에(Sinopteridaceae), 느릅나무과(Ulmaceae) 및 생강과(Zingiberacea)를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 식물의 과로부터 추출될 수 있다. 유리-B-고리 플라보노이드는 데스모스( Desmos ), 아치로클리네(Achyrocline), 오록실룸( Oroxylum ), 부케나비아( Buchenavia ), 아나팔리스(Anaphalis), 코툴라( Cotula ), 그나팔리움( Gnaphalum ), 헤리치숨( Helichysum ), 켄타루레아(Centaurea), 유파토리움( Eupatorium ), 박카리스( Baccharis ), 사피움(Sapium), 스쿠텔라리아( Scutellaria ), 몰사( Molsa ), 콜레브루케아( Colebrookea ), 스타치스(Stachys), 오리가눔( Origanum ), 지지포라( Ziziphora ), 린데라( Lindera ), 악티노다프네(Actinodaphnee), 아카시아( Acacia ), 데리스( Derris ), 글리키르히자(Glycyrrhiza), 밀레티아( Millettia ), 퐁가미아( Pongamia ), 테프로시아(Tephrosia), 아르토카르푸스( Artocarpus ), 피쿠스( Ficus ), 피티로그람마(Pityrogramma), 노톨라에나( Notholaena ), 피누스( Pinus ), 울무스( Ulmis ) 및 알피나(Alpina)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 고등식물의 속으로부터 추출되고, 농축되고 정제될 수 있다.
플라보노이드는 줄기, 줄기 수피, 가지, 덩이줄기, 뿌리, 뿌리 수피, 어린싹, 종자, 뿌리줄기, 꽃 및 다른 재생성 기관, 잎 및 다른 기부를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 식물의 여러 부분에서 발견될 수 있다. 유리-B-고리 프라보노이드의 단리 및/또는 정제 방법은 본원에 전체 내용이 참고문헌으로 인용된, 2002년 3월 1일에 출원된 미합중국 특허 출원 제10/091,362호("Identification of Free-B-Ring Flavonoids as Potent Cox-2 Inhibitors")에 기술되어 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 플라반은 상기 기술된 일반식에 의해 도해되는 하기 일반식에 의해 도해되는 화합물을 포함한다. 본 발명의 플라반은 아카시아 속으로부터 선택된 식물(들)로부터 단리된다. 바람직한 구현에서, 식물은 아카시아 카테츄(A. catechu ), 아카시아 콘킨나(A. concinna ), 아카시아 파르네시아나(A. farnesiana ), 아카시아 세네갈(A. Senegal ), 아카시아 스페시오사(A. speciosa), 아카시아 아라비아(A. arabia ), 아카시아 카에시아(A. caesia ), 아카시아 펜나타(A. pennata ), 아카시아 시누아타(A. sinuata ), 아카시아 메아른시이(A. mearrnsii), 아카시아 피크난타(A. picnantha ), 아카시아 데알바타(A. dealbata ), 아카시아 아우리쿨리포르미스(A. auriculiformis ), 아카시아 홀로세레시아(A. holoserecia) 및 아카시아 만기움(A. mangium)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
플라반은 줄기, 줄기 수피, 나무줄기, 나무줄기 수피, 가지, 덩이줄기, 뿌리, 뿌리 수피, 어린싹, 종자, 뿌리줄기, 꽃 및 다른 재생성 기관, 잎 및 다른 기부를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 식물의 여러 부분에서 발견될 수 있다. 플라반의 단리 및/또는 정제 방법은 본원에 전체 내용이 참고문헌으로 인용된 2002년 3월 22일에 출원된 미합중국 특허 출원 제10/104,477호("Isolation of Dual CoX-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitor from Acacia)에 기술되어 있다.
본 발명은 COX 및 LOX 효소 활성을 특이적으로 억제하고, mRNA 유전자 발현에 영향을 주고 염증을 감소시키는 활성 식물 추출물을 확인하기 위해 일련의 생체내 염증 및 독성 연구 뿐만 아니라 생체외 생화학적, 세포 및 유전자 발현 스크린을 수행한다. COX 및 LOX를 특이적으로 억제하는 활성 식물 추출물을 확인하기 위해 본원에 사용되는 방법은 실시예 1 및 2에 기술되어 있으며, 본원에 전체 내용이 참고문헌으로 인용된, 2002년 3월 1일에 출원된 미합중국 특허 출원 제10/091,362호("Identification of Free-B-Ring Flavonoids as Potent Cox-2 Inhibitors"), 2002년 3월 22일에 출원된 미합중국 특허 출원 제10/104,477호("Isolation of Dual CoX-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitor from Acacia) 및 2003년 4월 30일에 출원된 미합중국 특허 출원 제10/427,746호("Formulation With Duel Cox-2 And 5-Lipoxygenase Inhibitory Activity")에 기술되어 있다.
COX의 억제를 측정하기 위해 사용되는 생화학적 검정은 환원 헤마틴 및 아라키돈산의 존재하의 환자의 페록시다아제 활성에 의존한다. 실시예 3에 기술된 상기 연구는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스로부터의 정제된 유리-B-고리 플라보노이드인 바이칼린 및 바이칼레인, 아카시아 카테츄로부터 단리된 플라반, 및 고농도의 유리-B-고리 플라보노이드 및 플라반을 함유하는 개별적 표준화 추출물이 COX 활성을 억제함을 보여주었다 (도 1 내지 5). 부가적으로, 실시예 9에 설명된 바와 같이 제조된 상이한 비의 각각의 개별적 표준화 추출물(즉, 80:20, 50:50 및 20:80)을 갖는 조성물은 생체외에서 COX를 억제하는 데에 매우 효과적이었다 (도 6 내지 8). 아카시아 카테츄로부터 단리된 플라반 추출물에 의한 LOX 활성의 억제는 실시예 4에 기술된 바와 같이 생체외에서의 리폭시게나아제 스크리닝 검정을 사용하여 평가하였다. 결과는 도 9에 도시되었다. 그 외에, LOX 경로에서 아라키돈산의 분해에서의 화합물, 즉 류코트리엔의 억제를 목표로 하는 세포 검정은 실시예 10에 기술된 바와 같이 솔리프린 샘플을 사용하여 수행하였다. 솔리프린에 의한 LTB4 억제는 도 11 및 12에 도시하였다.
생체내 효과는 실시예 11에 기술된 바와 같이 AA와 같은 피부 자극 성분을 마우스의 귀 및 발목 관절에 도포하고 솔리프린으로 처리한 마우스에서의 종창의 감소를 측정함으로써 입증되었다. 결과는 도 13 및 14에 나타내었다. 최종적으로, UV 유도 피부 홍반을 예방하고 치료하는 데에 있어서의 솔리프린 제형의 국부 도포는 실시예 12 및 도 15에 기술되어 있다. 실시예 12에 기술된 연구에서, 80:20의 유리-B-고리 플라보노이드:플라반의 배합비에서 솔리프린은 물중에 용해되고, 각각 UV 노출 전 및 후에 대머리 마우스의 피부에 2가지 농도로 국부 도포된다. 2가지 농도 모두에서 그리고 UV 노출 전 및 후에의 도포 시간과 무관하게 4가지 솔리프린 군으로부터의 대머리 마우스의 홍반 스코어는 모두 대조군 및 Sooth-A Cain으로 처리한 군 둘 모두에서의 심하고 확장된 홍반과 비교하여 더 작은 피부에서 훨씬 더 적은 붉은 점을 나타내었다.
실시예 13(표 11 및 12)은 약리학적, 피부학적 및 미용적으로 허용될 수 있는 부형제를 사용하여 솔리프린 크림을 제조하는 일반적 방법을 기술하고 있다. 예시를 휘애, 상기 실시예는 0.5 중량% 및 1.5 중량% 솔리프린 크림 둘 모두의 상세한 제조 방법을 제공한다. 최종적으로, 실시예 13에 기술된 바와 같이 제조한 솔리프린 크림 둘 모두는 잠재적 자극 및 접촉 민감화의 유도에 대해 사람 피부에서 평가되었다. 총 97 및 101명의 피검자에게 각각 0.5% 및 1.5% 솔리프린 크림으로 유도 및 시험을 완료하였다. 시험 결과는 0.5% 및 1.5% 농도에서 솔리프린 크림이 최소 자극을 발생시키고, 유도된 접촉 민감화의 징후를 유도하지 않음을 보여준다.
요약하면, 본 발명은 COX 및 LOX 효소 둘 모두를 동시에 억제하는 데에 효과적인 방법을 포함한다. COX 및 LOX 경로를 동시에 이중 억제시키기 위한 방법은 단일 식물 또는 여러 식물로부터 합성되고/되거나 단리된 유리-B-고리 플라보노이드와 플라반의 혼합물을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 수용자에게 투여하는 것으로 이루어진다. 조성물 중의 유리-B-고리 플라보노이드 대 플라반의 비는 99:1 유리-B-고리 플라보노이드 : 플라반 내지 1:99 유리-B-고리 플라보노이드 : 플라반일 수 있다. 본 발명의 특정 구현에서, 유리-B-고리 플라보노이드 : 플라반의 비는 약 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 구현에서, 조성물의 중의 유리-B-고리 플라보노이드 : 플라반의 비는 20:80이다. 바람직한 구현에서, 유리-B-고리 플라보노이드는 스쿠텔라리아 속 식물에 속하는 식물(들)로부터 단리되고, 플라반은 아카시아 속 식물에 속하는 식물(들)로부터 단리된다.
본 발명은 또한, COX 및 LOX 매개 피부 질환 및 질병의 예방 및 치료를 위한 방법을 포함한다. COX 및 LOX 매개 피부 질환 및 질병을 예방하고 치료하기 위한 방법은 단일 식물 또는 여러 식물로부터 합성되고/되거나 단리된 유리-B-고리 플라보노이드와 플라반의 혼합물을 약제학적으로 허용될 수 있는 담체와 함께 포함하는 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 수용자에게 투여하는 것으로 이루어진다. 유리-B-고리 플라보노이드 대 플라반의 비는 99:1 유리-B-고리 플라보노이드 : 플라반 내지 1:99 유리-B-고리 플라보노이드 : 플라반일 수 있다. 본 발명의 특정 구현에서, 유리-B-고리 플라보노이드 : 플라반의 비는 약 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 구현에서, 조성물 중의 유리-B-고리 플라보노이드 : 플라반의 비는 20:80이다. 바람직한 구현에서, 유리-B-고리 플라보노이드는 스쿠텔라리아 속 식물에 속하는 식물(들)로부터 단리되고, 플라반은 아카시아 속 식물에 속하는 식물(들)로부터 단리된다.
본 출원인은 2002년 3월 22일에 출원된 미합중국 특허 출원 제10/104,477호("Isolation of Dual CoX-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitor from Acacia)가 COX 및LOX에 대한 이중 특이성을 나타내는 아카시아 속 식물로부터 단리된 물질의 조성물에 대한 첫 번째 보고이고, 2002년 3월 1일에 출원된 미합중국 특허 출원 제10/091,362호("Identification of Free-B-Ring Flavonoids as Potent Cox-2 Inhibitors")가 유리-B-고리 플라보노이드 구조와 COX 억제 활성 사이의 상관관계에 대한 첫 번째 보고라고 믿는다. 이들 발견은 2003년 4월 30일에 출원된 미합중국 특허 출원 제10/427,746호("Formulation With Duel Cox-2 And 5-Lipoxygenase Inhibitory Activity")에 기술된 바와 같이 COX 및 LOX 매개 질환 및 질병의 예방 및 치료에 사용될 수 있는, 본원에 솔리프린으로서 명명되는 물질의 조성물을 생성시키기 위한 2가지 부류의 특정 화합물인 유리-B-고리 플라보노이드와 플라반의 신규 배합물을 유도하였다. COX 및 LOX 매개 질환 및 질병으로는, 선번, 열상, 좌창, 국부 창상, 균, 미생물 및 바이러스 감염에 의해 유발되는 미세 염증 질환, 비틸라고, 전신 홍반성 루프스, 건선, 암종, 흑색종, 및 다른 포유류 피부암을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 질환 및 질명, 자외(UV) 방사선, 화학약품, 열, 바람 및 건조 환경에 대한 노출로부터 유발되는 피부 손상, 주름살, 늘어진 피부, 눈 주변의 주름 및 다크서클, 피부염 및 다른 알레르기 관련 피부 질환이 포함되지만 이들로 제한되지는 않는다. 이론적으로 제한되지는 않지만, 상기 부류의 화합물의 작용 메카니즘이 COX 및 LOX 효소 활성 둘 모두의 직접적 이중 억제인 것으로 믿어진다.
본 발명은 더욱더, 다양한 제형을 포함하는 본 발명의 치료제를 포함하는 치료 조성물을 포함한다. 이들 조성물의 제조 방법은 이들의 순도 및 특정 조성의 결정 방법과 함께 실시예 5 내지 9 및 도 10에 기술되어 있다.
바람직한 구현에서, 본 발명에 따르는 COX 및 LOX 매개 피부 질환 및 질병의 예방 및 치료 방법은 단일 공급원 또는 여러 공급원으로부터 단리된 치료적 유효량의 제형화된 유리-B-고리 플라보노이드와 플라반을 이들을 필요로 하는 수용자에게 국부 투여하는 것을 포함한다. 유리-B-고리 플라보노이드와 플라반의 혼합물 및/또는 개별 성분의 순도는 화합물을 얻기 위해 사용되는 방법에 좌우하여 0.01% 내지 100%를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 바람직한 구현에서, 동일량을 함유하는 유리-B-고리 플라보노이드 및/또는 플라반의 혼합물의 투여량은 국부 제형의 총중량을 기준으로 0.001 내지 100%로부터 일반적으로 선택되는 효과적이고 비독성인 양이다. 일상적 임상 실험을 이용하는 당업자는 치료하려는 특정 질병에 대한 최적 투여량을 결정할 수 있다.
본 발명은 하기에 기술되는 바와 같이 제형을 최적화시키고 가장 큰 효과를 얻기 위해 효소적 및 생체내 항염증 모델을 사용하여 유리-B-고리 플라보노이드와 플라반의 여러 조성물을 평가하는 방법을 포함한다. 본 발명은 바람직한 생리학적 활성을 갖는 물질의 조성물을 수득하기 위해 아카시아 플라반과 유리-B-고리 플라보노이드의 단리, 정제 및 조합을 위한 상용 방법을 제공한다. 본원에 상기 기술된 피부 질환 및 질병의 예방 및 치료에서의 이들의 사용 이외에, 본원에 기술되는 치료 조성물은 또한, 민감성 피부를 완화시키고, 개선된 탄력, 감소되고 지연된 노화, 향상된 젊은 외관 및 결, 및 증가된 신축성, 견고성, 매끄러움 및 유연성을 갖는 매끄럽고 젊은 피부를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적 및/또는 미용적으로 허용될 수 있는 부형제, 보조제 및 또는 담체와 같은 다른 성분을 포함하는 약제 조성물로서 제형화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 치료하려는 수용자에게 허용될 수 있는 부형제 중에서 제형화될 수 있다. 부형제는 약제용 희석제 또는 비히클로서 사용되는 비활성 성분이다. 이러한 부형제의 예로는 물, 완충제, 식염, 링거액, 덱스트로오스 용액, 만니톨, 행크 용액, 방부제 및 다른 생리학적 균형 염 수용액이 포함되지만 이들로 제한되지는 않는다. 고정유, 참기름, 에틸 올레에이트 또는 트리글리세라이드와 같은 비수성 부형제가 또한 사용될 수 있다. 다른 유용한 제형은 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트린과 같은 점도 향상제를 함유하는 현탁액을 포함한다. 부형제는 또한, 등장성 및 화학적 안정성을 향상시키는 성분과 같은 첨가제를 소량 함유할 수 있다. 완충제의 예로는 인산염 완충제, 중탄산염 완충제, 트리스 완충제, 히스티딘, 시트레이트 및 글리신 또는 이들의 혼합물이 포함되며, 방부제의 예로는 티메로살, m- 또는 o-크레졸, 프로말린 및 벤질 알코올이 포함되지만 이들로 제한되지는 않는다. 표준 제형은 투여용 현탁액 또는 용액으로서 적합한 액체 중에 용해될 수 있는 액체이거나 고체일 수 있다. 이와 같이, 비-액체 제형에서, 부형제는 덱스트로오스, 사람 혈청 알부민, 방부제 등을 포함할 수 있으며, 투여 전에 무균수 또는 무균 식염이 첨가될 수 있다.
본 발명의 한 구현에서, 조성물은 또한 보조제 또는 담체를 포함할 수 있다. 보조제는 대표적으로, 특이적 생활성제에 대한 포유류의 생물학적 반응을 일반적으로 향상시키는 성분이다. 적합한 보조제로는, 프로인트 보조제; 다른 박테리아 세포벽 성분; 알루미늄 기재 염; 칼슘 기재 염; 실리카; 폴리누클레오티드; 톡소이드; 혈청 단백질; 바이러스성 피막 단백질; 다른 박테리아 유도 제조물; 감마 인터페론; 헌터 티터맥스(Hunter's Titermax) 보조제(Vaxcel. TM., Inc. Norcross, Ga.)와 같은 블록 공중합체 보조제; 리비(RiBi) 보조제(RiBi ImmunoChem Research, Inc. Hamilton, Mont.); 및 Quil A(Superfos Biosector A/S, Denmark)와 같은 사포닌 및 이것의 유도체가 포함되지만 이들로 제한되지는 않는다. 담체는 대표적으로, 치료된 수용자에게서 치료 조성물의 반감기를 증가시키는 화합물이다. 적합한 담체로는, 중합체 조절 방출 제형, 생분해 이식물, 리포솜, 박테리아, 바이러스, 오일, 에스테르 및 글리콜이 포함되지만 이들로 제한되지는 않는다.
한 구현에서, 조성물은 본 발명의 조성물을 수용자에게 서서히 방출시키는 조절 방출 제형으로서 제조된다. 본원에 사용되는 바와 같이, 조절 방출 제형은 조절 방출 부형제 중의 본 발명의 조성물을 포함한다. 적합한 조절 방출 부형제는 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 바람직한 조절 방출 제형은 생분해성(즉, 생체침식성)이다.
본 발명의 치료제는 연고, 겔, 로션, 크림 베이스, 에멀션, 패치, 드레싱, 마스크, 비점착 거즈, 밴드, 면봉 또는 클로쓰 와이프를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는, 치료 조성물을 국부 투여하기 위해 당업자들에게 공지된 적합한 수단에 의해 국부 투여되는 것이 바람직하다. 이러한 국부 도포는 국부 투여용으로 공지된 임의의 표준 수단을 사용하여 임의의 감염 부위에 국소 투여될 수 있다. 치료 조성물은 투여 방법에 좌우하여 다양한 단위 투여 형태로 투여될 수 있다. 특정 전달 방식에 대해, 본 발명의 치료 조성물은 본 발명의 부형제 중에서 제형화될 수 있다. 본 발명의 치료제는 임의의 수용자, 바랍직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 사람에게 투여될 수 있다. 특정 투여 방식은 치료하려는 질병에 좌우할 것이다.
하나의 구현에서, 적합한 연고는 국부 제형의 총중량을 기준으로 0.001% 내지 100%로부터 일반적으로 선택되는 효과적인 비독성량인 바람직한 농도의 유리-B-플라보노이드와 플라반의 혼합물, 65 내지 100%(바람직하게는 75 내지 96%)의 백색 연질 파라핀, 0 내지 15%의 액체 파라핀, 및 0 내지 7%(바람직하게는 3 내지 7%)의 라놀린 또는 이들의 유도체 또는 합성 등가물을 포함한다. 또다른 구현에서, 연고는 폴리에틸렌-액체 파라핀 매트릭스를 포함할 수 있다.
하나의 구현에서, 적합한 크림은 상기 제공된 바와 같은 바람직한 농도의 유리-B-플라보노이드와 플라반의 혼합물과 함께 유화계를 포함할 수 있다. 유화계는 2 내지 10%의 폴리옥시에틸렌 알코올(예를 들어, 상표명 카토매크로골(Catomacrogol)로 시판되는 혼합물), 10 내지 25%의 스테아릴 알코올, 20 내지 60%의 액체 파라핀 및 10 내지 65%의 물을 하나 이상의 방부제, 예를 들어 0.1 내지 1%의 N,N''-메틸렌비스[N'-[3-(히드록시메틸)-2,5-디옥소-4-이미다졸리디닐]우레아](이미드우레아 USNF로 시판됨), 0.1 내지 1%의 알킬 4-히드록시벤조에이트(에를 들어, 상표명 니파스타트(Nipastat)으로 니파 라보라토리즈로(Nipa Laboratories)부터 시판되는 혼합물), 0.01 내지 0.1%의 나트륨 부틸 4-히드록시벤조에이트(상표명 니파부틸 소디움(Nipabutyl sodium)으로 니파 라보라토리즈로부터 시판됨) 및 0.1 내지 2%의 페녹시에탄올과 함께 포함하는 것이 바람직하다. 실시예 13은 크림으로서 2가지 상이한 농도의 본 발명의 조성물의 제형을 기술하고 있으며, 실시예 14는 피부의 자극 및 민감화에 대해 크림을 평가하기 위해 수행된 연구를 기술하고 있다. 상기 연구로부터, 솔리프린이 피부의 자극 또는 민감화를 야기시키지 않으면서 효과적인 농도로 국부 도포될 수 있는 안전한 조성물임이 입증되었다.
하나의 구현에서, 적합한 겔은 액체상이 고도의 교차결합으로 3차원 중합체 매트릭스 내에 포함되어 있는 반고체계를 포함한다. 액체상은 바람직한 양의 유리-B-고리 플라보노이드와 플라반의 혼합물, 0 내지 20%의 수-혼화성 첨가제, 예를 들어 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 또는 프로필렌 글리콜, 및 천연 생성물일 수 있는 0.1 내지 10%의, 바람직하게는 0.5 내지 2%의 점도부여제, 예를 들어 트래거캔스, 펙틴, 카라긴, 한천 및 알긴산, 또는 합성 또는 반합성 화합물, 예를 들어 메틸셀룰로오스 및 카르복시폴리메틸렌(카르보폴); 하나 이상의 방부제, 예를 들어 0.1 내지 2%의 메틸 4-히드록시벤조에이트(메틸 파라벤) 또는 페톡시에탄올-미분과 함께 물을 포함할 수 있다. 또다른 적합한 베이스는 70 내지 90%의 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어, 미합중국 국내 규정(USNF)에 따라 제조한 40%의 폴리에틸렌 글리콜 3350 및 60%의 폴리에틸렌 글리콜을 함유하는 폴리에틸렌 글리콜 연고), 5 내지 20%의물, 0.02 내지 0.25%의 산화방지제(예를 들어, 부틸화된 히드록시톨루엔) 및 0.005 내지 0.1%의 킬레이트화제(예를 들어, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA))와 함께 바람직한 양의 유리-B-고리 플라보노이드와 플라반의 혼합물을 포함한다.
상기에 사용된 용어 "연질 파라핀"은 크림 또는 연고 베이스 백색 고체 파라핀 및 황색 연질 파라핀을 포함한다. 용어 "라놀린"은 천연 양모지 및 정제된 양모지를 포함한다. 라놀린의 유도체는 특히, 라놀린의 물리적 및 화학적 성질을 변경시키기 위해 화학적으로 개질된 라놀린을 포함하며, 라놀린의 합성 등가물은 특히, 라놀린에 대한 대안으로서 약제 및 미용 분야에 공지되고 사용되며 예를 들어 라놀린 대체물로서 명명될 수 있는 합성 또는 반합성 화합물을 포함한다.
사용될 수 있는 하나의 적합한 라놀린의 합성 등가물은 소피산(Sofisan) 649로서 공지된 상표명 소피산으로 시판되는 물질이다. 다이나밋 노벨 악티엔게젤샤프트에서 시판하는 소피산 649는 천연 식물성 지방산, 이소스테아르산 및 아디프산의 글리세린 에스테르이며, 이것의 성질은 문헌[H. Hermsdorf In Fette, Seifen, Anstrichmittel, Issue No. 84, No.3 (1982), pp. 3-6]에 기술되어 있다.
적합한 연고 또는 크림 베이스의 구성성분으로서 상기 언급된 나머지 성분 및 이들의 성질은 표준 참고문헌, 예를 들어 약전에 기술되어 있다. 케토매크로골 1000은 화학식 CH3(CH2)m(OCH2CH2)nOH를 가지며, 여기에서 m은 15 내지 17일 수 있고, n은 20 내지 24일 수 있다. 부틸화된 히드록시톨루엔은 2,6-디-3차-부틸-p-크레졸이다. 니파스타트는 메틸, 에틸, 프로필 및 부틸 4-히드록시벤조에이트의혼합물이다.
본 발명의 조성물은 통상적인 약제학적 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 상기 언급된 조성물은 승온에서, 바람직하게는 60 내지 70℃에서, 연질 파라핀, 존재하는 경우 액체 파라핀, 및 라놀린 또는 이것의 유도체 또는 합성 등가물을 함께 혼합시킴으로써 제조하는 것이 편리할 수 있다. 그 다음, 혼합물은 실온으로 냉각되고, 코르티코스테로이드 및 임의의 다른 성분과 함께 무피로신의 수화된 결정질 칼슘염의 첨가 후에 교반되어 적합한 분산액을 생성시킨다.
투여 방식과는 무관하게, 특정 투여량은 사용자의 대략적 체중에 따라 계산된다. 상기 언급된 제형을 각각 사용하는 치료를 위한 적합한 투여량을 결정하기 위해 필요한 추가의 계산 방식은 당업자들에 의해 일상적으로 이루어지며, 특히 본원에 기술되는 투여량 정보 및 검정에 비추어 부적절한 실험 없이 당업자들에 의해 일상적으로 수행되는 작업의 범위 내에 있다. 이들 투여량은 적절한 투여량-반응 데이터와 함께 사용되는 투여량을 결정하기 위해 확립된 검정의 사용으로 통해 확인된다.
본원에 기술된 발명은 사람용으로 뿐만 아니라 수의용으로도 사용될 수 있으며, 용어 "수용자"는 제한 방식으로 구성되지 않음을 유의해야 한다. 수의용인 경우에, 투여량은 동물의 체중을 고려하여 상기 기술된 바와 같이 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 당업자에게 공지된 어떠한 방법에 의해서도 투여될 수 있다. 투여 방법은 장내(경구) 투여, 비경구 (정맥내, 피하 및 근내) 투여 및 국부 투여를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명에 따르는 치료 방법은 단일 식물 또는 여러 식물로부터 합성되고/되거나 단리된 유리-B-플라보노이드와 플라반의 치료적 유효량의 혼합물을 이를 필요로 하는 수용자에게 내부 또는 국부 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 구현에서, 조성물은 국부 투여된다.
도 1은 스쿠텔라리아 바이칼렌시스로부터 단리시킨 표준화된 유리-B-고리 플라보노이드 추출물(HPLC를 기준으로 83% 바이칼린)에 의한 COX-1 및 COX-2의 억제의 프로파일을 그래프로 나타낸 도면이다. 추출물을 재조합 양 COX-1(◆) 및 양 COX-2(■)의 페록시다아제 활성의 억제에 대해 시험하였다. 데이터는 억제율(%) 대 억제제 농도(㎕/mL)로서 나타내었다. COX-1에 대한 IC50은 0.24㎍/mL/단위 효소로서 계산되었으며, COX-2에 대한 IC50은 0.48㎍/mL/단위로서 계산되었다.
도 2는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스로부터 단리시킨 정제된 성분인 바이칼린에 의한 COX-1 및 COX-2의 억제의 프로파일을 그래프로 나타낸 도면이다. 화합물을 재조합 양 COX-1(◆) 및 양 COX-2(■)의 페록시다아제 활성의 억제에 대해 시험하였다. 데이터는 억제율(%) 대 억제제 농도(㎕/mL)로서 나타내었다. COX-1에 대한 IC50은 0.44㎍/mL/단위 효소인 것으로 측정되었으며, COX-2에 대한 IC50은 0.28㎍/mL/단위인 것으로 측정되었다.
도 3은 스쿠텔라리아 바이칼렌시스로부터 단리시킨 정제된 성분인 바이칼레인에 의한 COX-1 및 COX-2의 억제의 프로파일을 그래프로 나타낸 도면이다. 화합물을 재조합 양 COX-1(◆) 및 양 COX-2(■)의 페록시다아제 활성의 억제에 대해 시험하였다. 데이터는 억제율(%) 대 억제제 농도(㎕/mL)로서 나타내었다. COX-1에 대한 IC50은 0.18㎍/mL/단위 효소인 것으로 측정되었으며, COX-2에 대한 IC50은 0.28㎍/mL/단위인 것으로 측정되었다.
도 4는 아카시아 카테츄로부터 단리시킨 전체 플라반을 50% 함유하는 표준화된 플라반 추출물에 의한 COX-1 및 COX-2의 억제의 프로파일을 그래프로 나타낸 도면이다. 추출물을 재조합 양 COX-1(◆) 및 양 COX-2(■)의 페록시다아제 활성의 억제에 대해 시험하였다. 데이터는 억제율(%) 대 억제제 농도(㎕/mL)로서 나타내었다. COX-1에 대한 IC50은 0.17㎍/mL/단위 효소로서 계산되었으며, COX-2에 대한 IC50은 0.41㎍/mL/단위로서 계산되었다.
도 5는 아카시아 카테츄로부터 단리시킨 플라반을 90% 초과하여 포함하는 조성물에 의한 COX-1 및 COX-2의 억제의 프로파일을 그래프로 나타낸 도면이다. 조성물을 재조합 양 COX-1(◆) 및 양 COX-2(■)의 페록시다아제 활성의 억제에 대해 시험하였다. 데이터는 억제율(%) 대 억제제 농도(㎕/mL)로서 나타내었다. COX-1에 대한 IC50은 0.11㎍/mL/단위 효소로서 계산되었으며, COX-2에 대한 IC50은 0.41㎍/mL/단위로서 계산되었다.
도 6은 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리로부터 단리시킨 유리-B-고리 플라보노이드의 추출물과 아카시아 카테츄의 수피로부터 단리시킨 플라반의 추출물을 약 80:20의 비로 조합시킴으로써 생성되는 제형에 의한 COX-1 및 COX-2의 억제의 프로파일을 그래프로 나타낸 도면이다. 하기에서 솔리프린으로서 명명되는 상기 조성물을 재조합 양 COX-1(◆) 및 양 COX-2(■)의 페록시다아제 활성의 억제에 대 해 시험하였다. 데이터는 억제율(%) 대 억제제 농도(㎕/mL)로서 나타내었다. COX-1에 대한 IC50은 0.76㎍/mL/단위 효소로서 계산되었으며, COX-2에 대한 IC50은 0.80㎍/mL/단위로서 계산되었다.
도 7은 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리로부터 단리시킨 유리-B-고리 플라보노이드의 추출물과 아카시아 카테츄의 수피로부터 단리시킨 플라반의 추출물을 약 50:50의 비로 조합시킴으로써 생성되는 제형에 의한 COX-1 및 COX-2의 억제의 프로파일을 그래프로 나타낸 도면이다. 조성물, 즉 솔리프린을 재조합 양 COX-1(◆) 및 양 COX-2(■)의 페록시다아제 활성의 억제에 대해 시험하였다. 데이터는 억제율(%) 대 억제제 농도(㎕/mL)로서 나타내었다. COX-1에 대한 IC50은 0.38㎍/mL/단위 효소로서 계산되었으며, COX-2에 대한 IC50은 0.84㎍/mL/단위인 것으로 측정되었다.
도 8은 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리로부터 단리시킨 유리-B-고리 플라보노이드의 추출물과 아카시아 카테츄의 수피로부터 단리시킨 플라반의 추출물을 약 20:80의 비로 조합시킴으로써 생성되는 제형에 의한 COX-1 및 COX-2의 억제의 프로파일을 그래프로 나타낸 도면이다. 조성물, 즉 솔리프린을 재조합 양 COX-1(◆) 및 양 COX-2(■)의 페록시다아제 활성의 억제에 대해 시험하였다. 데이터는 억제율(%) 대 억제제 농도(㎕/mL)로서 나타내었다. COX-1에 대한 상기 조성물의 IC50은 0.18㎍/mL/단위 효소이었으며, COX-2에 대한 IC50은 0.41이었다.
도 9는 아카시아 카테츄로부터의 플라반 추출물에 의한 5-LO의 억제의 프로 파일을 그래프로 나타낸 도면이다. 조성물을 실시예 4에 기술된 바와 같이 재조합 감자 5-리폭시게나아제 활성(◆)의 억제에 대해 시험하였다. 데이터는 억제제의 부재하의 검정의 억제율(%)로 나타내었다. 5-LO에 대한 IC50은 1.38㎍/mL/단위 효소이었다.
도 10은 실시예 9에 기술된 바와 같은 조건하에서 수행한, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리로부터 단리시킨 유리-B-고리 플라보노이드와 아카시아 카테츄의 수피로부터 단리시킨 플라반의 80:20 혼합물을 포함하는 대표적 제형의 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 크포마토그램을 도시한 도면이다.
도 11은 실시예 10에 기술된 바와 같이 THF-1 또는 HT-29 세포(ATCC) 중에서 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 새로 합성된 LPS-유도 LTB4(◆)의 양에 대한 솔리프린의 농도의 증가의 효과를 그래프로 나타낸 도면이다. 솔리프린은 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리로부터 단리시킨 유리-B-고리 플라보노이드와 아카시아 카테츄의 수피로부터 단리시킨 플라반의 표준화된 추출물을 80:20의 비로 조합시킴으로써 생성시켰다. 솔리프린 제형의 활성은 유도된 LTB4 합성의 억제율(%)로 표현하였다.
도 12는 비-유도 세포 중에서 3㎍/mL 솔리프린으로 처리한 후에 HT-29 세포 중에 잔류하는 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 LTB4 수준을 실시예 10에 기술된 바와 같이 3㎍/mL 이소프로펜으로 처리한 후의 LTB4 수준과 비교한 도면이다. 솔리프린 제형은 처리 2일 후에 HT-29 세포 중에서 LTB4 생성의 80% 억제를 나타내었다.
도 13은 실시예 11에 기술된 바와 같이 염증의 억제의 측정값으로서 귀 종창 데이터를 그래프로 도시한 도면이다. 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리로부터 단리시킨 유리-B-고리 플라보노이드와 아카시아 카테츄의 수피로부터 단리시킨 플라반의 표준화된 추출물을 80:20의 비로 조합시킴으로써 생성되는 솔리프린을 비처리 마우스와 경구 위관 영양법을 통해 인도메타신(1.5㎍/kg)을 공급한 마우에 대해 비교하였다. 데이터는 각각의 마우스에 대해 비처리 대 처리된 귓불의 마이크로 측정값의 차로서 나타내었다.
도 14는 비처리 마우스(비처리+아라키돈산), AA를 주입하지 않은 마우스(네거티브 대조군) 및 액체 담체와 함께 주입한 마우스(부형제 대조군)와 비교하여, AA 주입 발목에 대한, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리로부터 단리시킨 유리-B-고리 플라보노이드와 아카시아 카테츄의 수피로부터 단리시킨 플라반의 표준화된 추출물을 80:20의 비로 조합시킴으로써 생성되는 솔리프린 100mg/kg의 효과(솔리프린+아라키돈산)의 효과를 그래프로 나타낸 도면이다.
도 15는 실시예 12에 기술된 바와 같이 UV 광으로 마우스를 방사선 조사한 후의 시간의 함수로서 여러 처리군에서의 대머리 마우스 피부 홍반의 변화를 그래프로 나타낸 도면이다. 군 B-1, A-1, B-2 및 A-2에서의 마우스를 방사선 조사 전(군 B-1 및 B-2) 또는 후(A-1 및 A-2)에 솔리프린으로 처리하였다. 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리로부터 단리시킨 유리-B-고리 플라보노이드와 아카시아 카테츄의 수피로부터 단리시킨 플라반의 표준화된 추출물을 80:20의 비로 조합시킴으로써 생성되는 솔리프린은 방사선 조사 전과 후 둘 모두에서 대조군 및 표준 처리제인 수쓰-어-케인(Sooth-a-caine)을 투여한 군과 비교하여 홍반 스코어를 현저히 감소시켰다.
하기의 실시예는 예시를 목적으로 제공되는 것이며, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니다.
실시예 1. 아카시아 및 스쿠텔라리아 식물로부터의 유기 및 수성 추출물의 제조
아카시아 카테츄(L) 윌드 수피, 스쿠텔라리아 오르토칼릭스(orthocalyx) 뿌리, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리 또는 스쿠텔라리아 라테리플로라(lateriflora)(전체 식물)로부터의 식물 재료를 2mm 이하의 입자 크기로 분쇄하였다. 건조시킨 분쇄된 식물 재료(60g)을 삼각 플라스크에 옮긷고, 메탄올:디클로로메탄(1:1)(600mL)을 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 진탕시키고, 여과시키고, 메탄올:디클로로메탄(1:1)(600mL)을 사용하여 바이오매스를 추출시켰다. 유기 추출물을 모으고 진공하에 증발시켜서 유기 추출물을 수득하였다 (하기 표 1 참조). 유기 추출 후에, 바이오매스를 공기 건조시키고, 초정제수로(600mL)로 1회 추출하였다. 수용액을 여과시키고, 동결 건조시켜서 수성 추출물을 수득하였다 (하기 표 1 참조).
아카시아 및 스쿠텔라리아 종의 유기 및 수성 추출물의 수득량
식물원 양 유기 추출물 수성 추출물
아카시아 수피 60g 27.2g 10.8g
스쿠텔라리아 오르토칼릭스 뿌리 60g 4.04g 8.95g
스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리 60g 9.18g 7.18g
스쿠텔라리아 라테리플로라 (전체 식물) 60g 6.54g 4.08g
실시예 2. 아카시아 카테츄 , 다양한 스쿠텔라리아 종 및 다른 식물로부터의 식물 추출물에 의한 COX -2 및 COX -1 페록시다아제 활성의 억제
특정 COX-2 억제제의 확인울 위한 스크린 공정에 관한 생물검정을 수행하여 하기에 기술된 바와 같이 효소의 페록시다아제 활성을 검정하였다.
페록시다아제 검정. COX-2의 억제제를 검출하기 위한 검정을 높은 전에 플랫폼(Raz)에 대해 변경시켰다. 간략하게, 페록시다아제 완충제(100mM EDTA, 1μM 환원 헤마틴, 1mg 에피네프린, 0.094% 페놀) 중의 재조합 양 COX-2(Cayman)를 15분 동안 추출물(1:500 희석)로 인큐베이팅시켰다. 퀀타블루(Quantablu)(Pierce) 기질을 첨가하고, 25℃에서 45분 동안 전개시켰다. 그 다음, 발광은 월랙 빅터(Wallac Victor) 2 플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다. 결과를 표 2에 기재하였다.
표 2는 아카시아 카테츄의 수피, 2가지 스쿠텔라리아 종의 뿌리 및 구조적으로 유사한 유리-B-고리 플라보노이드를 포함하는 3가지 다른 식물종으로부터의 추출물을 포함하여 5가지의 식물종으로부터 수득한 유기 및 수성 추출물에 의한 효소의 억제를 기재한 것이다. 데이터는 재조합 양 COX-2 효소 및 기질 단독과 비교하여 페록시다아제 활성의 %로서 나타내었다. 유기 추출물에 의한 억제율(%)은 30 내지 90%이다.
다양한 종에 의한 COX-2 페록시다아제 활성의 억제
식물원 유기 추출물에 의한 COX-2의 억제 수성 추출물에 의한 COX-2의 억제
아카시아 카테츄(수피) 75% 30%
스쿠텔라리아 오르토칼릭스
(뿌리)
55%
77%
스쿠텔라리아 바이칼렌시스
(뿌리)
75%
0%
데스모디움 삼부엔세
(Desmodium sambuense)
(전체 식물)
55%
39%
유칼룹투스 글로불루스
(Eucaluptus globulus)
(잎)
30%
10%
무리카 나나(Murica nana)(잎) 90% 0%
COX-1 및 COX-2 이소형의 상대적 억제의 비교는 이들 효소 각각에 대한 IC50 값의 생성을 필요로 한다. IC50 값은 대조군과 비교하여 효소 활성의 50% 억제가 특정 억제제에 의해 달성되는 농도로서 규정된다. 이 실험에서, IC50 값은 표 3에 기재된 바와 같이 각각 COX-2 COX-1에 대해 6 내지 50㎍/mL 및 7 내지 80 ㎍/m인 것으로 밝혀졌다. COX-2와 COX-1의 IC50 값의 비교는 이들 효소 각각에 대한 여러 식물로부터의 유기 추출물의 특이성을 입증하는 것이다. 예를 들어 스쿠텔라리아 라테리플로라의 유기 추출물은 각각 30 및 80㎍/mL의 IC50 값으로 COX-1보다 우세한 COX-2의 억제를 나타내었다. 일부 추출물은 COX-2의 우세한 억제를 입증하였지만, 다른 일부는 그렇지 않았다. HTP 분획 및 이들 분획으로부터의 정제된 화합물의 시험은 이들 추출물 및 화합물에 대한 진정한 억제 특이성을 결정하는 데에 필요하다.
사람 및 양 COX-2 및 COX-1에 대한 유기 추출물의 IC50 값
식물원 IC50 사람
COX-2 (㎍/mL)		 IC50 양
COX-2 (㎍/mL)		 IC50 양
COX-1 (㎍/mL)
아카시아 카테츄(수피) 3 6.25 2.5
스쿠텔라리아 오르토칼릭스
(뿌리)		 비수행 10 10
스쿠텔라리아 바이칼렌시스
(뿌리)		 30 20 20
스쿠텔라리아 라테리플로라
(전체 식물)		 20 30 80
유칼룹투스 글로불루스(잎) 비수행 50 50
무리카 나나(잎) 5 6 7
실시예 3. COX -1 및 COX -2 페록시다아제 활성의 억제
COX-1 및 COX-2를 억제하는 화합물을 스크리닝하기 위해, 두 효소 모두의 페록시다아제 활성의 억제를 이용하는 고처리 생체외 검정을 전개하였다 [Needleman et al. (1986) Annu Rev Biochem. 55:69]. 간략하게, 시험되는 조성물 또는 화합물을 고정량의 COX-1 및 COX-2 효소에 대해 적정하였다. 분해성 페록시다아제 케로포어르를 검정에 포함시켜서 공동 인자로서 아라키돈산의 존재하에 각각의 효소의 페록시다아제 활성을 가시화하였다. 대표적으로, 검정을 96-웰 포맷으로 수행하였다. 100% DMSO 중의 10mg/mL 원액으로부터 수득한 각각의 억제제를 0, 0.1, 1, 5, 10, 20, 50, 100 및 500㎍/mL의 농도를 사용하여 실온에서 삼중으로 시험하였다. 각각의 웰에, 150μL의 100mM 트리스-HCl(pH 7.5)을 트리스 완충제 중에서 희석된 10μL의 22μM 헤마틴, DMSO 중에서 희석된 10μL 억제제 및 25 단위의 COX-1 또는 COX-2 효소과 함께 첨가하였다. 성분들을 회선 플랫포옴 상에서 10초동안 혼합시킨 후, 20μL의 2mM N,N,N',N'-테트라메틸-p-페닐렌디아민 이염화물(TMPD) 및 20μL의 1.1mM 아라키돈산을 첨가하여 반응을 개시하였다. 플레이트를 10초 동안 진탕시킨 후, 570nm에서 흡수도를 판독하기 전에 5분동안 인큐베이팅시켰다. 억제제 농도 대 억제율(%)를 플롯팅하고, 등온선을 따라 반-최대 포인트를 취하고, X-축 상에서 농도를 교차시킴으로써 IC50 값을 결정하였다. 그 다음, IC50을 검정에서의 효소 단위의 수로 표준화시켰다. 결과를 표 4에 요약하였다.
정제된 유리-B-고리 플라보노이드에 의한 COX 효소 활성의 억제
유리-B-고리 플라보노이드 COX-1의 억제 COX-2의 억제
바이칼레인 107% 109%
5,6-디히드록시-7-메톡시플라본 75% 59%
7,8-디히드록시플라본 74% 63%
바이칼린 95% 97%
워고닌 16% 12%
스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리로부터 단리된 표준화된 유리-B-고리 플라보노이드 추출물인 바이칼린 및 바이칼레인에 대한 투여량 반응 및 IC50 값을 각각 도 1, 2 및 3에 제공하였다. 아카시아 카테츄의 심재로부터 단리된 2가지 표준화된 플라반 추출물(각각 50% 및 90% 초과 플라반)에 대한 투여량 반응 및 IC50 값을 각각 도 4 및 5에 제공하였다. 조성을 변화시킨 유리-B-고리 플라보노이드 및 플라반의 3가지 제형에 대한 투여량 반응 및 IC50 값을 도 6(80:20 배합), 도 7(50:50 배합) 및 도 8(20:80 배합)에 제공하였다.
실시예 4. 아카시아 카테츄로부터 단리된 카테킨에 의한 5- 리폭시게나아제의 억제
염증 반응에 수반되는 가장 중요한 경로 중 하나를 AA와 같은 지방산에 대한 분자 산소의 첨가를 촉매하여 류코트리엔으로 전환되는 히드로과산화물 5-, 12- 및 15-HPETE를 생성시키는 비-환원 헤마틴 철-함유 리폭시게나아제(5-LO, 12-LO 및15-LO)에 의해 생성시켰다. 아카시아 카테츄로부터의 플라반 추출물이 어느 정도의 LOX 억제를 제공하여 5-HPETE의 생성을 방지할 수 있다는 것이 초기 징후이었다. 리폭시게나아제 억제제 스크리닝 검정 키트(Cayman Chemical, Inc., Ca# 760700)d을 사용하여 90%를 초과한 플라을 함유하는 아카시아 카테츄로부터 단리된 추출물이 생체외에서 LOX를 직접 억제하는 지를 평가하였다. 미소여과를 사용하여 인산염으로부터 트리스-기재 완충제로의 완충제 변화를 수행한 후에, 키트에 일반적으로 사용되는 콩으로부터의 15-LO를 감자 LOX로 대체시켰다. 상기 검정은 산소 감지 크로마겐을 통한 히드로과산화물의 생성을 검출하였다. 간략하게, 검정을 90 μL의 0.1 단위/μL 감자 5-LO, 20μL의 1.1mM AA, 100vμL의 산소 감지 크로마겐 및 10μL의 정제된 플라반 억제제를 0 내지 500㎍/mL의 최종 농도로 첨가하여 삼중으로 수행하였다. 상기 조성물로부터의 5-LO에 대한 IC50은 1.38㎍/mL/단위 효소인 것으로 결정되었다. 결과를 도 9에 도시하였다.
실시예 5. 스쿠텔라리아 오르토칼릭스 (뿌리), 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 (뿌리) 및 오록실룸 인디쿰(종자)로부터 단리된 활성 추출물 중의 유리-B-고리 플라보노이드의 HPLC 정량화
실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이 3개의 상이한 식물종으로부터 단리된 5가지의 활성 추출물 중의 유리-B-고리 플라보노이드의 존재 및 양을 HPLC에 의해 측정하고, 결과를 하기의 표 5에 기재하였다. 유리-B-고리 플라보노이드를 22분 내에 80%로부터 20%로의 1% 인산 및 아세토니트릴 그래디언트를 사용하여 루나(Luna) C-18 칼럼(250x4,5mmm 5㎛) 상에서 HPLC에 의해 정량적으로 분석하였다. 유리-B-고리 플라보노이드를 254nm에서 UV 검출기를 사용하여 검출하고, 바이칼린, 바이칼레인 및 다른 유리-B-고리 플라보노이드와의 비교에 의해 체류 식산을 기준으로 확인하였다.
활성 식물 추출물 중의 유리-B-고리 플라보노이드 함량
활성 추출물 추출물의 중량 바이오매스로부터의 추출성(%) 유리-B-고리 플라보노이드의 총량 추출물 중의 유리-B-고리 플라보노이드(%)
스쿠텔라리아 오르토칼릭스
(수성 추출물)		 8.95g 14.9% 0.2mg 0.6%
스쿠텔라리아 오르토칼릭스
(유기 추출물)		 3.43g 5.7% 1.95mg 6.4%
스쿠텔라리아 바이칼렌시스
(수성 추출물)		 7.18g 12.0% 0.03mg 0.07%
스쿠텔라리아 바이칼렌시스
(유기 추출물)		 9.18g 15.3% 20.3mg 35.5%
오록실룸 인디쿰
(유기 추출물)		 6.58g 11.0% 0.4mg 2.2%
실시예 6. 효소 아카시아 카테츄로부터의 활성 추출물의 HPLC 정량화
실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이 아카시아 카테츄로부터 단리된 유기 및 수성 추출물 중의 플라반을 포토다이오드 어레이 검출기를 사용하는 HPLC(HPLC/PDA) 및 루나 C18 칼럼(250x4,6mm)에 의해 정량화시켰다. 플라반을 20분 이상 동안의 10% 내지 30% ACN, 그 다음으로 5분 동안의 60% ACN의 아세토니트릴 그래디언트를 사용하여 칼럼으로부터 용리시켰다. 결과를 표 6에 기재하였다. 플라반을 표준 물질로서 카테킨 및 에피카테킨을 사용하여 체류시간 및 PDA 데이터를기준으로 정량화시켰다. 2가지 주된 플라반에 대한 체류 시간은 각각 12.73분 및 15.76분이었다.
활성 식물 추출물 중의 유리-B-고리 플라보노이드 함량
아카시아 카테츄로부터의
활성 추출물		 추출물의 중량 바이오매스로부터의 추출성(%) 추출물 중의 플라반(%)
수성 추출물 10.8g 18.0% 0.998%
유기 추출물 27.2g 45.3% 30.37%
실시예 7. 아카시아 카테츄로부터의 표준화된 추출물의 제조
아카시아 카테츄(500ng의 분쇄 뿌리)를 25mL(2x25mL)의 하기의 용매계로 2회 추출하였다. (1) 100% 물, (2) 80:20 물:메탄올, (3) 60:40 물:메탄올, (4) 40:60 물:메탄올, (5) 20:80 물:메탄올, (6) 100% 메탄올, (7) 80:20 메탄올:THF, (8) 60:40 메탄올:THF. 각각의 개별적 추출로부터의 2가지 추출물을 모으고, 농축시키고, 저진공하에 건조시켰다. 각각의 추출물 중의 화학적 성분의 확인을 포토다이오드 어레이 검출기를 사용하는 HPLC(HPLC/PDA) 및 250mm x 4.6mm C18 칼럼에 의해 수행하였다. 화학적 성분을 표준물질로서 카테킨 및 에피카테킨을 사용하여 체류 시간 및 PDA 데이터를 기준으로 정량화시켰다. 결과를 표 7에 기재하였다. 표 7에 기재한 바와 같이, 80% 메탄올/물을 사용한 용매 추출로부터 생성된 플라반 추출물이 가장 높은 농도의 플라반 성분을 제공하였다.
아카시아 카테츄로부터 표준화된 플라반 추출물을 생성시키기 위한 용매
추출 용매 추출물의 중량 바이오매스로부터의 추출성(%) 카테킨의 총량 추출물 중의 카테킨(%)
100% 물 292.8mg 58.56% 13mg 12.02%
물:메탄올
(80:20)		 282.9mg 56.58% 13mg 11.19%
물:메탄올
(60:40)		 287.6mg 57.52% 15mg 13.54%
물:메탄올
(40:60)		 264.8mg 52.96% 19mg 13.70%
물:메탄올
(20:80)		 222.8mg 44.56% 15mg 14.83%
100% 메탄올 215.0mg 43.00% 15mg 12.73%
메탄올:THF
(80:20)		 264.4mg 52.88% 11mg 8.81%
메탄올:THF
(60:40)Z		 259.9mg 51.98% 15mg 9.05%
재결정화 용매로서 알코올/물 및/또는 수성 용매를 사용하여 8 내지 15%의 카테킨 함량을 갖는 추출물의 재결정화에 의해 고순도 물질을 수득할 수 있다. 추출물의 가열된 포화 용액에 활성탄 또는 다른 탈색제를 첨가함으로써 재결정화 전에 탈색하는 것이 필요할 수 있다. 고순도 카테킨은 가열된 포화 용액의 냉각시에 결정화된다. 결정을 여과하여 용매를 제거하고, 건조시키고, 미세 분말로 분쇄시켰다. 재결정화를 필요에 따라 반복하여 바람직한 수준의 순도(60 내지 100%의 카테킨 플라반)를 달성하였다.
실시예 8. 다양한 스쿠텔라리아 종으로부터의 표준화된 유리-B-고리 플라보노이드의 제조
스쿠텔라리아 오르토칼릭스(500mg의 분쇄 뿌리)를 25mL의 하기의 용매계로 2회 추출하였다. (1) 100% 물, (2) 80:20 물:메탄올, (3) 60:40 물:메탄올, (4) 40:60 물:메탄올, (5) 20:80 물:메탄올, (6) 100% 메탄올, (7) 80:20 메탄올:THF, (8) 60:40 메탄올:THF. 추출물을 모으고, 농축시키고, 저진공하에 건조시켰다. 각각의 추출물 중의 화학적 성분의 확인을 포토다이오드 어레이 검출기를 사용하는 HPLC(HPLC/PDA) 및 250mm x 4.6mm C18 칼럼에 의해 수행하였다. 화학적 성분을 표준물질로서 바이칼레인, 바이칼린, 스쿠텔라레인 및 워고닌을 사용하여 체류 시간 및 PDA 데이터를 기준으로 정량화시켰다. 결과를 표 8에 기재하였다.
스쿠텔라리아로부터 추출된 유리-B-고리 플라보노이드의 정량화
추출 용매 추출물의 중량 바이오매스로부터의 추출성(%) 플라보노이드의 총량 추출물 중의 플라보노이드(%)
100% 물 96mg 19.2% 0.02mg 0.20%
물:메탄올
(80:20)		 138.3mg 27.7% 0.38mg 0.38%
물:메탄올
(60:40)		 169.5mg 33.9% 0.78mg 8.39%
물:메탄올
(40:60)		 142.2mg 28.4% 1.14mg 11.26%
물:메탄올
(20:80)		 104.5mg 20.9% 0.94mg 7.99%
100% 메탄올 57.5mg 11.5% 0.99mg 10.42%
메탄올:THF
(80:20)		 59.6mg 11.9% 0.89mg 8.76%
메탄올:THF
(60:40)Z		 58.8mg 11.8% 1.10mg 10.71%
스쿠텔라리아 바이칼렌시스(1000mg의 분쇄 뿌리)를 하기와 같은 50mL의 메탄올과 물의 혼합물을 사용하여 2회 추출하였다. (1) 100% 물, (2) 70:30 물:메탄올, (3) 50:50 물:메탄올, (4) 30:70 물:메탄올, (5) 100% 메탄올. 추출물을 모으고, 농축시키고, 저진공하에 건조시켰다. 화학적 성분의 확인을 포토다이오드 어레이 검출기를 사용하는 HPLC(HPLC/PDA) 및 250mm x 4.6mm C18 칼럼에 의해 수행하였다. 각각의 추출물 중의 화학적 성분을 바이칼레인, 바이칼린, 스쿠텔라레인 및 워고닌 표준물질을 사용하여 체류 시간 및 PDA 데이터를 기준으로 정량화시켰다. 결과를 표 9에 기재하였다.
스쿠텔라리아로부터 추출된 유리-B-고리 플라보노이드의 정량화
추출 용매 추출물의 중량 바이오매스로부터의 추출성(%) 플라보노이드의 총량 추출물 중의 플라보노이드(%)
100% 물 277.5mg 27.8% 1mg 0.09%
물:메탄올
(70:30)		 338.6mg 33.9% 1.19mg 11.48%
물:메탄올
(50:50)		 304.3mg 30.4% 1.99mg 18.93%
물:메탄올
(30:70)		 293.9mg 29.4% 2.29mg 19.61%
100% 메탄올 204.2mg 20.4% 2.73mg 24.51%
재결정화 용매로서 알코올/물을 사용하여 8 내지 15%의 유리-B-고리 플라보노이드 함량을 갖는 추출물의 재결정화에 의해 고순도 유리-B-고리 플라보노이드를 수득할 수 있다. 추출물의 가열된 포화 용액에 활성탄 또는 다른 탈색제를 첨가함으로써 재결정화 전에 탈색하는 것이 필요할 수 있다. 유리-B-고리 플라보노이드는 냉각시에 결정화된다. 결정을 여과하고, 건조시키고, 미세 분말로 분쇄시켰다. 재결정화를 필요에 따라 반복하여 바람직한 수준의 순도(60 내지 100%의 유리-B-고리 플라보노이드)를 달성하였다.
실시예 9. 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리로부터의 표준화된 유리-B-고리 플라보노이드 및 아카시아 카테츄의 수피로부터의 표준화된 플라반을 사용한 제형의 제조
본원에 솔리프린으로서 명명되는 신규 조성물을 하나 이상의 부형제와 함께 각각 아카시아 및 스쿠텔라리아로부터 단리된 2가지 표준화된 추출물을 사용하여 제형화시켰다. 이러한 조성물을 제조하기 이한 일반적인 예는 하기에 기재되어 있다. 본 실시예에 사용되는 아카시아 추출물은 카테킨 및 에피카테킨으로서 80%를 초과하는 전체 플라반을 함유하고, 스쿠텔라리아 추출물은 주로 바이칼린인 80%를 초과하는 유리-B-고리 플라보노이드를 함유하였다. 스쿠텔라리아 추출물은 또한, 표 11에 기재된 바와 같이 다른 소량의 유리-B-고리 플라보노이드를 함유하였다. 하나 이상의 부형제/방부제가 또한 조성물에 첨가되었다. 플라반과 유리-B-고리 플라보노이드의 비는 COX 대LO의 억제에 대한 징후 및 특이적 요건, 피부 침투의 요건 및 요구되는 효과의 지속기간 등과 같은 생성물의 효과 요건을 기준으로 조절될 수 있다. 부형제의 양은 각각의 성분의 실제 활성 함량을 기준으로 조절될 수 있다. 생성물의 각각의 개별적 패치에 대한 배합 표는 성분의 개별적 배치에 대한 생성물 명세 및 QC 결과를 기준으로 만들어져야 한다. 2 내지 5%의 추가량의 활성 성분이 생성물 명세를 충족시키기 위해 추천된다.
82.2%의 유리-B-고리 플라보노이드 함량을 갖는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리 추출물(38.5kg)(lot#RM052302-01)(바이칼린); 80.4%의 전체 플라반 함량을 갖는 아카시아 카테츄 수피 추출물(6.9kg)(lot#RM052902-01), 및 부형제(5.0kg의 칸덱스)를 조합시켜서 855:15 배합 중량비의 활성 유리-B-고리 플라보노이드와 플라반을 갖는 솔리프린 제형(50.4kg)을 수득하였다. 표 10은 실시예 6 및 8에 제공된 방법을 사용하여 결정된, 상기 특정 배치의 솔리프린(Lot#G1702-COX-2)의 활성 유리-B-고리 플라보노이드 및 플라반의 정량화를 제공한다. 표 10을 참조하면, 상기 특정 배치의 솔리프린은 75.7% 유리-B-고리 플라보노이드와 10.3% 플라반을 포함하는 86%의 전체 활성 성분을 함유한다. 표 10은 80:20 배합 중량비의 활성 유리-B-고리 플라보노이드와 플라반을 갖는 대표적 솔리프린 샘플의 HPLC 크로마토그램을 도시한 것이다.
솔리프린 제형의 유리-B-고리 플라보노이드 및 플라반 함량
활성 성분 함량(%)
1. 플라보노이드
a 바이칼린 62.5%
b. 소량의 플라보노이드
i. 워고닌-7-글루쿠로나이드 6.7%
ii. 오로크실린 A 7-글루쿠로나이드 2.0%
iii. 바이칼레인 1.5%
iv. 워고닌 1.1%
v 크리신-7-글루쿠로나이드 0.8%
vi. 5-메틸-워고닌-7-글루쿠로나이드 0.5%
vii. 스쿠텔라린 0.3%
viii. 노르워고닌 0.3%
ix. 크리신 0.2% 미만
x 오로크실린 A 0.2% 미만
c. 전체 유리-B-고리 플라보노이드 75.7%
2. 플라반
a. 카테킨 9.9%
b. 에피카테킨 0.4%
c. 소계 플라반 10.3%
3. 전체 활성 성분 86%
동일한 방법을 사용하여, 하기 배치의 솔리프린을 각각 12:88 및 15:85의 배합비를 갖는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리로부터의 표준화된 유리-B-고리 플라보노이드 추출물과 아카시아 카테츄로부터 수피로부터의 표준화된 플라반 추출물의 조합물을 사용하여 제조하였다.
87.9%의 유리-B-고리 플라보노이드 함량을 갖는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리 추출물(58.0g)(lot#RM021203-01)(바이칼린) 및 84.9%의 전체 플라반 함량을 갖는 아카시아 카테츄 수피 추출물(442.0g)(lot#RM050603-01)를 배함하여 12:88의 배합 중량비를 갖는 솔리프린 조성물(500g, lot#QJ205-19)를 수득하였다. 실시예 6 및 8에 제공된 방법을 사용하여, 상기 특정 배치의 솔리프린(lot#QJ205-19)에서 유리-B-고리 플라보노이드 함량(바이칼린)은 9.65%이었고 플라반 함량(전체 카테킨 및 에피카테킨)은 73.2%이었다.
82.9%의 유리-B-고리 플라보노이드 함량을 갖는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리 추출물(300g)(lot#RM060403-01)(바이칼린) 및 90.8%의 전체 플라반 함량을 갖는 아카시아 카테츄 수피 추출물(1700g)(lot#RM050603-01)를 배함하여 15:85의 배합 중량비를 갖는 솔리프린 조성물(2000g, lot#A1904)를 수득하였다. 실시예 6 및 8에 제공된 방법을 사용하여, 상기 특정 배치의 솔리프린(lot#A1904)에서 유리-B-고리 플라보노이드 함량(바이칼린)은 15.6%이었고 플라반 함량(전체 카테킨 및 에피카테킨)은 75.0%이었다.
실시예 10. 솔리프린의 제형으로부터의 5- LO 효소 억제의 투여량 반응 및 IC 50 값의 측정
80:20의 배합비를 갖는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리로부터의 표준화된 유리-B-고리 플라보노이드 추출물과 아카시아 카테츄로부터 수피로부터의 표준화된 플라반 추출물의 조합물을 사용하여 솔리프린 제형(80:20)을 실시예 9에 기술된 바와 같이 제조하였다 [참조: 본원에 참고문헌으로 인용된 2003년 4월 30일에 출원된 미합중국 특허 출원 제10/427,746호("Formulation With Duel Cox-2 And 5-Lipoxygenase Inhibitory Activity")의 실시예 14]. 샘플을 THF-1 또는 HT-29 세포; COX-1, COX-2 및 5-LOX를 발현시키는 단핵세포계를 함유하는 조직 배양기 중에서 적정하였다. 류코트리엔 B4(LTB4; Neogen Inc., Cat#406110)에 대한 길항적 ELISA를 사용하여 5-LOX 경로에 대한 솔리프린의 억제 효과의 측정값으로서 각각의 세포계에 존재하는 새로 합성된 수준의 LTB4에 대한 상기 솔리프린 제형의 효과를 평가하였다. 검정을 6-웰 플레이트에서 웰당 160,000 내지 180,000개의 세포를 첨가함으로써 이중으로 수행하였다. 솔리프린 제형을 3, 10, 30 및 100 ㎍/mL로 THF-1 배양액 중에 첨가하고, 습식 환경에서 5% CO2를 사용하여 37℃에서 밤새(약 12 내지 15시간) 인큐베이팅시켰다. 결과를 도 11에 나타내었으며, 이는 새로 LPS-유도된 LTB4의 생성이 솔리프린을 3 내지 10㎍/mL로 THF-1 배양액에 첨가함으로써 거의 완전히 억제됨을 보여준다.
솔리프린 및 또다른 공지된 5-LOX 억제제인 이부프로펜을 3㎍/mL로 HT-29 세포에 첨가하고, 습식 환경에서 5% CO2를 사용하여 37℃에서 48시간 동안 인큐베이팅시켰다. 각각의 처리된 세포계를 원심분리에 의해 수득하고, 생리학적 완충액 중에서 서서히 다운스(dounce) 균질화 용해시킴으로써 분열시켰다. 도 12에 도시된 바와 같이, 솔리프린은 HT-29 세포에서 새로 합성된 LTB4의 생성을 80% 억제하였다. 이부프로펜만으로는, 동일한 시간에 걸쳐 LTB4의 양의 20%만이 감소되었다.
실시예 11. 생체내 마우스 귀 종창 모델을 사용한 솔리프린의 효과의 평가
실시예 9에 기술된 바와 같이, 80:20의 배합비를 갖는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리로부터의 표준화된 유리-B-고리 플라보노이드 추출물과 아카시아 카테츄로부터 수피로부터의 표준화된 플라반 추출물의 조합물을 사용하여 솔리프린 제형(80:20)을 제조하였다. 상기 조성물이 생체내에서 염증을 치료하기 위해 사용될 수 있는 지를 시험하기 위해, 조성물을 아라키돈산(AA)로 귀를 처리하기 1일 전에 생후 4 내지 5주된 ICR 마우스(Harlan Labs)에 위관 영양법에 의해 투여하였다. 시험 미우스에 올리브유 중에 현탁된 50, 100 및 200mg/kg의 솔리프린의 투여 등가물을 공급하였으며, 대조군 마우스에는 올리브유만을 공급하였다. 다음날, 95% 알코올 중의 20μL의 330mM AA를 각각의 마우스의 한쪽 귀에 도포하였으며, 대조준으로서 나머지 귀에 알코올을 도포하였다. 솔리프린으로 처리한 마우스는 도 13에 나타낸 바와 같이 솔리프린의 투여량의 증가에 따라 트랙킹되는 측정할 수 있는 투여량 반응을 나타내었다. 도 13을 참조하면, 200mg/kg 투여량은 종창을 비처리 대조군과 비교하여 50% 이상 까지 감소시켰다. 50mg/kg 투여량의 솔리프린은 50mg/kg 투여량의 또다른 강한 항염증제인 인도메타신만큼 효과적이었다.
솔리프린의 항염증 활성을 입증하기 위해 설계된 또다른 동물 모델에서, 상기 기술된 80:20 제형을 생후 4 내지 5주된 ICR 마우ㅎ스(Harlan Labs)의 뒷발목 관절에 95% 에탄올 중의 20μL의 100mM AA를 주입하기 약 12시간 전에 올리브유 중에 현탁시킨 100mg/kg의 투여량으로 마우스에 경구 투여하였다. 시험군에 솔리프린 제형을 공급하였으며, 또다른 군에는 제형을 공급하지 않았다. 대조군은 아라키돈산 주사액을 공급하지 않는 마우스(네거티브 대조군) 및 AA 없이 95% 에탄올이 주사된 군(비히클 대조군)을 포함하였다. 이들 군에는 또한 솔리프린을 공급하지 않았다. 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14를 참조하면, AA와 함께 주사된 솔리프린을 공급한 마우스는 대조군 및 비처리 아라키돈산 주사군과 비교하여 백그라운드 수준의 종창을 나타내었다. 이들 결과는 작용 부위에서 관절 중의 종창을 감소시키기 위한 솔리프린의 효과를 입증하는 것이다.
실시예 12. UV 방사선에 대한 피부의 노출로부터 유발되는 손상을 예방하고 치료하는 데에 있어서의 솔리프린의 효과의 평가
대머리 마우스 암컷의 6개의 군(군당 5마리의 마우스)(품종 SKH-1, Harlan Labs)를 방사선 조사하면서, 0.026mW/cm2으로 연속 3일에 걸쳐 3분 동안 마취시켜서, UV 방사선에 대한 피부의 노출로부터 유발되는 손상을 예방하고 치료하는 데에 있어서의 솔리프린 제형의 효과를 시험하였다. 소리프린 제형은 실시예 기술된 바와 같이, 80:20의 배합비를 갖는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리로부터의 표준화된 유리-B-고리 플라보노이드 추출물과 아카시아 카테츄로부터 수피로부터의 표준화된 플라반 추출물의 조합물을 사용하여 제조하였다. 6개의 처리군은 하기와 같다:
군#
1. 대조군 : UV 방사선 조사 전 또는 후에 비처리
2. 포지티브 대조군 : UV 방사선 조사 후에 수쓰-어-카인(Banana Boat)의 국부 도포에 의해 처리함
3. 솔리프린 처리 B-1: UV 방사선 조사 전에 수중의 1mg/mL 솔리프린의 국부 도포에 의해 처리함
4. 솔리프린 처리 A-1: UV 방사선 조사 후에 수중의 1mg/mL 솔리프린의 국부 도포에 의해 처리함
5. 솔리프린 처리 B-2: UV 방사선 조사 전에 수중의 5mg/mL 솔리프린의 국부 도포에 의해 처리함
6. 솔리프린 처리 A-2: UV 방사선 조사 후에 수중의 5mg/mL 솔리프린의 국부 도포에 의해 처리함
UV 노출 및 처리 3일 후에, 마우스를 하기의 척도를 사용하여 홍반(붉은 점)의 수준에 대해 스코어를 매겼다 : 0 - 가시적 홍반은 없음; 1 - 매우 약한 홍반; 2- 잘 규정된 홍반; 3 - 심한 홍반; 및 4 - 종양 생성. 홍반을 각각의 군에 대해 눈에 의해 스코어를 매겼다. 결과를 도 15에 나타내었다. 도 15를 참조하면, 대조군(군 1)이 3일째(UV 방사선에 대한 노출 3일후, 72시간)에 심한 붉은 점을 나나내었음을 알 수 있다. 수쓰-어-카인 군은 도한 3일째에 최대 붉은 점을 나타내었다(군 2). 솔리프린 처리 군(군 3내지 6)에 대한 붉은 점은 2의 스코어를 초과하지 않았다. 이들 스코어는 개별적일 지라도, 솔리프린이 UV 유발 피부 홍반을 예방하고 치료하는 데에 효과적임을 보여준다.
4일째의 대표적 마우스의 사진은 대조군, 수쓰-어-카인 처리군 및 솔리프린 처리군 사이의 차이를 명백하게 입증한다 (데이터는 도시되지 않음). 대조군 및 수쓰-어-카인 처리 동물은 UV 방사선 노출 전 및 후에 솔리프린 제형으로 처리한 동물과 비교하여 홍반의 매우 심한 패턴 및 붉은 점을 나타내었다. UV 방사선 조사 전에 5mg/mL 솔리프린으로 처리한 동물은 나머지 동물 모두와 비교하여 최소량의 홍반만을 나타내었다.
실시예 13. 솔리프린의 조성물의 크림으로의 제형화
2가지 상이한 농도의 솔리프린(0.5 중량% 및 1.5 중량%의 솔리프린)(실시예 9에 기술된 바와 같은 lot#A1904)를하기의 방법 및 표 11 및 12에 기재된 바와 같이 크림으로서 제형화시켰다.
솔리프렌(lot#A1904)를 실온에서 수중에 용해시키고, 용액 중에 완전히 분산될 때까지(약 5분) 배합기에서 균질화시켰다. 실온에서, 용액을 교반시키나 휘젓지 않으면서, Ultrez-21 카르보머를 용액의 표면 상에 살포에 의해 첨가하고, 완전히 습식시키고(백색 부위가 보이지 않음), 용액 내로 떨어뜨렸다. 서서히 교반시키면서, 용액을 40℃로 가열하고, 글리세린을 첨가하였다 (파트 A). 그 다음, 혼합물을 추가로 5분 동안 교반시켰다. 잔류 성분(파트 B)을 칭량하고 40℃로 가열하면서 혼합시켰다. 40℃에서, 잔류 성분(파트 B)을 파트 A에 첨가하고, 생성된 조성물을 균질화될 때까지(약 5분) 잘 혼합하였다. 에멀션을 30℃로 냉각시키고, 중화제를 사용한 적정에 의해 pH를 약 5.5(5.3 내지 5.7)로 조절하면서, 교반 막대 및/또는 스파쿨라로 교반시켰다. 에멀션은 카르보머의 중화-유도 구조 변화로 인해 고도로 점성이 되었다. 에멀션은 최종적으로 에멀션 크림에 적합한 점도에 도달하였다. 에멀션 크림을 균일해질 때까지 혼합시킨 후에, 깨끗한 저장 용기 내에 붓고, 1개월 동안 2 내지 8℃에서 저장하였다.
0.5% 솔리프린 크림용 성분 리스트
상 성분 중량% 중량(g)
수성


 정제된 물 85.00 1275.0
솔리프린(Lot#A1904) 0.50 7.5
Ultrez 21 카르보머 0.50 7.5
글리세린 8.00 120.0
오일
 PEG-7 글리세릴 코코에이트 3.00 45.0
카프릴산/카프르산 트리글리세라이드 2.67 40.0
pH 중화제 수산화나트륨(18% wv), 분자생물학 등급 0.00 0.0
합 7개의 성분 99.7 1495.0
1.5% 솔리프린 크림 중의 성분 리스트
상 성분 중량% 중량(g)
수성


 정제된 물 84.00 1260.0
솔리프린(Lot#A1904) 1.50 22.5
Ultrez 21 카르보머 0.50 7.5
글리세린 8.00 120.0
오일
 PEG-7 글리세릴 코코에이트 3.00 45.0
카프릴산/카프르산 트리글리세라이드 2.67 40.0
pH 중화제 수산화나트륨(18% wv), 분자생물학 등급
합 7개의 성분 99.7 1495.0
실시예 14. 사람 피부에 대한 반복적 도포에 의한 자극 및 접촉 민감화의 유도에 대한 솔리프린 크림의 평가
솔리프린을 드레이즈 패치 테스트(Draize Patch Test)[Marzulli and Maibach (1997) Contact Allergy: Predictive Testing in Human. In Advances in Modern Toxicology, Dermatotoxicology and Pharmacology. Eds. Marzulli, F.N and Maibach, H.I. 4, 353-372]의 개조법을 사용하여 사람 피부에 대해 시험하였다. 시험 자리는 상부 팔 또는 등의 척수 부위에 위치하였다. 각각의 시험체는 유도 자리 및 공격 자리를 가졌다. 유도 자리는 2개의 서브-자리, 즉 원래의 자리 및 이동 자리를 포함한다. 각각의 패치 상에 0.2mL의 솔리프린 크림을 함유하는 패치를 충분히 강한 자극 반응이 발달하여 패치를 이동 자리에 도포시킬 필요가 없는 한은, 반복적으로 원래의 자리에 도포하였다. 패치를 임상 연구 규정에 따라 도포하였으며, 약 24시간 또는 48/72시간 후에 환자에 의해 제거하고 폐기하였다. 유도 단계에서, 시험체를 피부 상의 동일 자리에 반복적으로 도포하고, 총 9개의 유도 패치를 4주 기간 내에 도포하였다. 나머지 기간은 최종 유도 패치의 도포와 공격 패치의 도포 사이의 10 내지 21일이었다. 이 기간 동안 시험체 또는 어떠한 다른 물질도 시험 부위에 도포하지 않았다. 공격 단계에서, 시험체를 신체의 반대면에 있는 새로운 자리에 도포하고, 약 24시간 또는 48시간 후에 환자에 의해 페기하였다.
각각의 패치 도포에 대한 피부 반응을 지정된 스코어 척도에 따라 100와트 백열 청색 벌브에 의해 공급되는 광 하에서 시험하고 등급을 매겼다. 강한 자극 반응이 이동 자리에 대한 시험체의 도포를 필요로 하는 경우에, 모든 사전 노출된 자리에 대해 유도의 종료를 통해 (또는 유도가 완결된 후에 반응이 지속되는 경우에는 해결될 때까지) 잔여 스코어를 기록하였다. 모든 피부 반응을 기록하였다. 공격 단계 동안, 피부 반응을 패치 도포 후 약 48시간 및 72 또는 96시간 후에 평가하였다. 유도된 민감성에 대한 결론은 일차적으로 공격 평가로부터 유도하였다.
0.5% 및 1.5% 솔리프린 농도에서 실시예 13에서와 같이 제조한 2가지 솔리프린 크림을 상기 프로토콜에 따라 평가하였다. 총 120명의 환자를 각각의 군에 대해 모집하였다. 97명의 환자는 0.5% 솔리프린 군에 대한 연구를 완수하였고, 101명의 환자는 1.5% 솔리프린 군에 대한 연구를 완수하였다. 0.5% 및 1.5% 솔리프린 크림에 대해 민감화 반응의 징후는 없었다. 0.5% 솔리프린에 대해, 유도 동안, 16명의 환자가 약하거나 가변운 정도의 홍반(+ 및/또는 1의 스코어)의 우발적 발생을 나타내었다. 공격시에, 4명의 환자가 48시간에 약하거나 가변운 정도의 홍반을 나타냈으며, 96시간 만에 사라졌다. 1.5% 솔리프린에 대해, 유도 동안, 26명의 환자가 약하거나 가변운 정도의 홍반(+ 및/또는 1의 스코어)의 우발적 발생을 나타내었다. 공격시에, 1명의 환자는 48시간에 약하거나 가변운 정도의 홍반을 나타냈으며, 96시간 만에 사라졌다.
본 연구는 솔리프린이 자극 또는 민감화를 유발시키지 않으면서 효과적인 농도에서 사람 피부에 국부 도포될 수 있는 안전한 성분임을 입증하는 것이다.
본 발명의 조성물 및 방법은 선번, 열상, 좌창, 국부 창상, 균, 미생물 및 바이러스 감염에 의해 유발되는 미세 염증 질환, 비틸라고, 전신 홍반성 루프스, 건선, 암종, 흑색종, 및 다른 포유류 피부암을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 질환 및 질명, 자외(UV) 방사선, 화학약품, 열, 바람 및 건조 환경에 대한 노출로부터 유발되는 피부 손상, 주름살, 늘어진 피부, 눈 주변의 주름 및 다크서클, 피부염 및 다른 알레르기 관련 피부 질환의 치료 및 예방에 사용될 수 있다.

Claims (44)

  1. 바이칼레인, 5,6-디히드록시-7-메톡시플라본, 7,8-디히드록시플라본, 바이칼린, 워고닌, 워고닌-7-글루쿠로나이드, 오로크실린 A-7-글루쿠로나이드, 크리신-7-글루쿠로나이드, 5-메틸-워고닌-7-글루쿠로나이드, 스쿠텔라린, 노르워고닌, 크리신, 오로크실린 A, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유리-B-고리 플라보노이드와, 카테킨, 에피카테킨 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 플라반의 혼합물을 포함하는, 선번(sunburn), 열상, 좌창, 국부 창상, 진균, 미생물 및 바이러스 감염에 의해 유발되는 미세 염증 질환, 비틸라고(vitilago), 건선, 암종, 흑색종, 및 다른 포유류 피부암, 자외(UV) 방사선, 화학약품, 열, 바람 및 건조 환경에 대한 노출에 의해 유발되는 피부 손상, 주름살, 늘어진 피부, 눈 주변의 주름 및 다크서클, 및 피부염으로 이루어진 군에서 선택되는 시클로옥시게나아제(COX) 및 리폭시게나아제(LOX) 매개 피부 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 조성물 중의 유리-B-고리 플라보노이드 대 플라반의 중량비가 99:1 내지 1:99의 범위로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 조성물 중의 유리-B-고리 플라보노이드 대 플라반의 중량비가 20:80인 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 유리-B-고리 플라보노이드가 바이칼레인, 5,6-디히드록시-7-메톡시플라본, 7,8-디히드록시플라본, 바이칼린, 워고닌 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되고, 플라반이 카테킨, 에피카테킨 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 약제학적 조성물.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 유리-B-고리 플라보노이드 및 플라반이 유기 합성에 의해 수득되거나 식물로부터 단리되는 약제학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 유리-B-고리 플라보노이드 및 플라반이 줄기, 줄기 수피, 나무줄기, 나무줄기 수피, 가지, 덩이줄기, 뿌리, 뿌리 수피, 어린싹, 종자, 뿌리줄기, 꽃 및 다른 재생성 기관, 잎 및 다른 기부로 구성된 군으로 선택된 식물 부분으로부터 단리되는 약제학적 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 유리-B-고리 플라보노이드가 포포나무과(Annonaceae), 국화과(Asteraceae), 능소화과(Bignoniaceae), 콤브레타과(Combretaceae), 국화과(Compositae), 대극과(Euphorbiaceae), 꿀풀과(Labiatae), 라우랜세아에(Lauranceae), 콩과(Leguminosae), 뽕나무과(Moraceae), 소나무과(Pinaceae), 고사리과(Pteridaceae), 시놉테리다세아에(Sinopteridaceae), 느릅나무과(Ulmaceae) 및 생강과(Zingiberacea)로 구성된 군으로부터 선택된 식물과로부터 단리되는 약제학적 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 상기 유리-B-고리 플라보노이드가 데스모스(Desmos), 아치로클리네(Achyrocline), 오록실룸(Oroxylum), 부케나비아(Buchenavia), 아나팔리스(Anaphalis), 코툴라(Cotula), 그나팔리움(Gnaphalium), 헤리치숨(Helichrysum), 켄타우레아(Centaurea), 유파토리움(Eupatorium), 박카리스(Baccharis), 사피움(Sapium), 스쿠텔라리아(Scutellaria), 몰사(Molsa), 콜레브루케아(Colebrookea), 스타치스(Stachys), 오리가눔(Origanum), 지지포라(Ziziphora), 린데라(Lindera), 악티노다프네(Actinodaphne), 아카시아(Acacia), 데리스(Derris), 글리키르히자(Glycyrrhiza), 밀레티아(Millettia), 퐁가미아(Pongamia), 테프로시아(Tephrosia), 아르토카르푸스(Artocarpus), 피쿠스(Ficus), 피티로그람마(Pityrogramma), 노톨라에나(Notholaena), 피누스(Pinus), 울무스(Ulmis) 및 알피니아(Alpinia)로 구성된 군으로부터 선택된 식물속으로부터 단리되는 약제학적 조성물.
  10. 제6항에 있어서, 플라반이 아카시아 카테츄(Acacia catechu), 아카시아 콘킨나(Acacia concinna), 아카시아 파르네시아나(Acacia farnesiana), 아카시아 세네갈(Acacia Senegal), 아카시아 스페시오사(Acacia speciosa), 아카시아 아라비카(Acacia arabica), 아카시아 카에시아(A. caesia), 아카시아 펜나타(A. pennata), 아카시아 시누아타(A. sinuata), 아카시아 메아른시이(A. mearnsii), 아카시아 피크난타(A. picnantha), 아카시아 데알바타(A. dealbata), 아카시아 아우리쿨리포르미스(A. auriculiformis), 아카시아 홀로세레시아(A. holoserecia) 및 아카시아 만기움(A. mangium)으로 구성된 군으로부터 선택된 식물종으로부터 단리되는 약제학적 조성물.
  11. 제6항에 있어서, 유리-B-고리 플라보노이드가 스쿠텔라리아속에 속하는 식물로부터 단리되고, 플라반이 아카시아속에 속하는 식물로부터 단리되는 약제학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용될 수 있는 부형제 및 임의로 보조제 또는 담체를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 국부 적용 용으로 제형화되는 약제학적 조성물.
  14. 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 규칙적 또는 방출 조절 비히클 중에서 제형화되는 약제학적 조성물.
  15. 삭제
  16. 삭제
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