JP4477701B2 - Ｃｔｌａ―４のシグナル発生に伴うｔリンパ球ダウンレギュレーションの遮断 - Google Patents

Description

本発明は、アメリカ予防衛生研究所により付与されたコントラクトNo.CA40041およびNo.CA09179に基づき政府の支援を受けて達成された。合衆国政府は本発明において一定の権利を有する。
序
免疫療法の実施はヒトの疾患治療では極めて望ましい目標である。通常の薬剤を用いる場合にはほとんど認められない作用の特異性が免疫療法では期待することができる。免疫療法の基本は免疫反応、特にＴ細胞の反応を操作することである。Ｔ細胞は、それらの相互作用を制御し、さらにその進行のために多くのレセプターおよび可溶性因子を利用する複雑で巧妙なシステムを有する。個々のシグナルが免疫反応において有する効果は、関与するこれら因子、レセプターおよび対立レセプターに応じて変化するであろう。
ダウンレギュレーション反応の経路は、活性化のために必要とされる経路と同じように重要である。Ｔ細胞寛容を生じる胸腺感作は、特定の抗原に対する免疫反応を防止する一メカニズムである。他のメカニズム、例えば抑圧性サイトカインの分泌もまた知られている。
Ｔ細胞の活性化には、抗原レセプター（ＴＣＲ）を介した刺激だけでなく、同時刺激性表面分子（例えばＣＤ２８）を介した別のシグナル発生が必要である。ＣＤ２８に対するリガンドはＢ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７２（ＣＤ８６）蛋白で、これらは抗原表出細胞（例えば樹状突起細胞、活性化Ｂ細胞または単球）で発現される。Ｂ７とＣＤ２８との間の相互作用はいくつかの同時刺激性シグナル発生経路の１つであり、抗原特異的Ｔ細胞の成熟と増殖の引き金となるために必要にして十分であると思われている。
同時刺激の欠如（および随伴する不適切なＩＬ−２産生）はその後に続くＴ細胞増殖を妨げ、“アネルギー”と称される無反応状態を誘発する。これは、ＩＬ−２遺伝子転写の遮断および応答Ｔ細胞のＩＬ−２に対する反応の欠如と密接な関係を有する。アネルギーはＩＬ−２刺激の引き延ばしによって克服できるかもしれない。種々のウイルスおよび腫瘍は直接的または間接的手段によるＴ細胞活性化および増殖を遮断し、それによって感染細胞また形質転換細胞に対するホスト免疫系の不十分な反応または無反応状態を誘発する可能性がある。多くのＴ細胞機能障害の中で、とりわけアネルギーは少なくとも部分的にはホストの病原細胞除去不全に起因するものかもしれない。
感染および腫瘍の治療において、同時刺激に必要なレセプターの操作によって強力な細胞性免疫反応を活性化できるとしたら都合のよいことであろう。
抗腫瘍免疫を仲介する場合にＢ７蛋白を使用することが報告されている（Chenら、Cell 71:1093-1102（1992）;Townsend &Allison,Science 259:368（1993））。シュバルツ（Schwartz,Cell 71:1065（1992））は、ＩＬ−２産生におけるＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４およびＢ７の役割並びに免疫療法について概説した。ハーディングら（Hardingら、Nature 356:607-609（1994））は、ＣＤ２８仲介シグナル発生はネズミＴ細胞を同時刺激し、Ｔ細胞コロニーでのアネルギー誘発を防止することを示した。
ＣＴＬＡ−４は、初めはネズミの細胞溶解性Ｔ細胞のｃＤＮＡライブラリーを弁別的にスクリーニングすることによって特定されたＴ細胞表面分子である（Brunetら、Nature 328:267-270（1987））。Ｂ７の第二のレセプターとしてのＣＴＬＡ−４の役割はリンスリーら（Linsleyら、J.Exp.Med.174:561-569（1991））の報告で考察されている。フリーマンら（Freemanら、Science 262:907-909（1993））はＢ７欠陥マウスのＣＴＬＡ−４について考察している。ＣＴＬＡ−４のリガンドはレンショウら（Lenschowら、PNAS 90:11054-11058（1993））が報告している。
ＣＴＬＡ−４の可溶形によるインビボでの免疫抑制についてはリンスリーら（Linsleyら、Science 257:792-795（1992））が報告している。レンショウら（Lenschowら、Science 257:789-792（1992））は、ＣＴＬＡ−４Ｉｇによって誘発された膵島移植片の長期生存について考察している。ウォルナスら（Walunasら、Immunity 1:405-413（1994））は、ＣＴＬＡ−４はＴ細胞活性化で負の調節因子として機能することができると提唱した。
発明の要旨
ＣＴＬＡ−４のシグナル発生の遮断によりＴ細胞活性化を増強させる方法および組成物を提供する。特異的にＣＴＬＡ−４抗原と相互作用するが、シグナル発生は活性化しない結合分子（遮断剤）はインビトロまたはインビボでＴ細胞と結合する。この遮断剤はまた免疫反応刺激因子（例えばサイトカインおよび抗原）とも結合することができる。このようにＣＴＬＡ−４のシグナル発生が遮断されたとき、抗原に対するＴ細胞の反応は抑制から開放される。そのような反応強化は腫瘍、慢性ウイルス感染の治療に有用で、さらに免疫時のアジュバントとして有益である。本発明の特徴の１つでは、この遮断剤は、ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインまたはそのフラグメントに対する抗体以外のものである。
【図面の簡単な説明】
図１Ａは、ＣＴＬＡ−４またはＣＤ２８に対して誘導した抗体の存在下または非存在下における腫瘍細胞株V51Blim10のインビボ増殖を示すグラフである。図１Ｂは、２×１０⁶のV51Blim10細胞および抗体を注射したマウスにおける平均腫瘍サイズを示すグラフである。図１Ｃは、V51Blim10細胞を注射したマウスにおける個々の腫瘍増殖サイズを示すグラフである。
図２は、ＣＴＬＡ−４またはＣＤ２８に対して誘導した抗体の存在下または非存在下での腫瘍細胞株B7-51Blim10腫瘍のインビボ増殖を示すグラフである。
図３は、V51Blim10細胞および抗ＣＴＬＡ−４抗体で予め処置したマウスによる野性型大腸癌細胞の拒絶を示す。
図４は、抗ＣＴＬＡ−４抗体による処置後の定着腫瘍の増殖を示す。
図５は、抗ＣＴＬＡ−４抗体の存在下または非存在下でのネズミ線維肉腫ＳＡ１Ｎのインビボ増殖を示す。
図６Ａはから６Ｆは、ペプチド抗原に対するＴ細胞の反応における抗ＣＴＬＡ−４抗体のアジュバント効果を示す。
図７Ａから７Ｂは、クラス切り換え（class switching）におけるＣＴＬＡ−４遮断の影響を示す。
図８Ａから８Ｄは、精製ＣＤ４＋細胞の増殖におけるＣＴＬＡ−４／Ｂ７遮断の動態分析を示す。図８ＢではＩＬ−２の検出を示す。チミジン取り込みの動態は図８Ｃに示す。図８Ｄに示すように、ＣＴＬＡ−４をも組み込んだ場合にはＩＬ−２産生の強い抑制が観察された。
図９は、種々のＣＴＬＡ−４／Ｂ７遮断ステージにおけるＤＮＡ含有量を測定する目的で透過性にした培養細胞の沃化プロピジウム染色を示す。
図１０は、線維肉腫におけるＣＴＬＡ−４遮断延長の影響を示す。
図１１は、抗ＣＴＬＡ−４単独、ＧＭ−ＣＳＦ形質導入細胞単独またはその組合せによる乳癌処理の影響を示す。
図１２は、腎臓癌におけるＣＴＬＡ−４遮断延長の影響を示す。
図１３は、ＣＴＬＡ−４遮断処置単独、または照射Ｂ１６腫瘍細胞による免疫と組合せた処置のＢ１６腫瘍に対する影響を示す。
図１４は、ＣＴＬＡ−４遮断と照射Ｂ１６細胞および／またはサイトカイン処置との組合せの影響を示す。
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の参照データベース
ヒトＣＴＬＡ−４の完全なｃＤＮＡ配列のGenbank受託番号はL15006である。アミノ酸１−３７の領域はリーダーペプチドで、３８−６１は細胞外Ｖ様ドメインで、１６２−１８７はトランスメンブレンドメインで、１８８−２２３は細胞質ドメインである。これらヌクレオチド配列の変種が報告され、４９位のＧからＡの塩基転移、２７２位のＣからＴの塩基転移、および４３９位のＡからＧの塩基転移が含まれる。マウスＣＴＬＡ−４の完全なＤＮＡ配列のEMBL受託番号はX05719（Brunetら、Nature 328:267-270（1987））である。アミノ酸１−３５の領域はリーダーペプチドである。
ヒトＢ７−１（ＣＤ８０）の完全なＤＮＡ配列のGenbank受託番号はX60958である。マウスの当該配列の受託番号はX60958で、ラット配列のそれはU05593である。ヒトＢ７−２（ＣＤ８６）の完全なｃＤＮＡ配列のGenbank受託番号はL25259で、マウスの当該配列の受託番号はL25606である。
ＣＤ２８をコードする遺伝子の性状は詳しく調べられた。ニワトリのｍＲＮＡ配列のGenbank受託番号はX67915である。ラットのｍＲＮＡ配列のGenbank受託番号はX55288である。ヒトのｍＲＮＡ配列のGenbank受託番号はJ02988である。マウスのｍＲＮＡ配列のGenbank受託番号はM34536である。
発明の詳細な説明
抗原刺激に対するＴ細胞反応のアップレギュレーションのための方法および組成物を提供する。特異的に細胞表面ＣＴＬＡ−４と相互作用するがＣＴＬＡ−４のシグナル発生は活性化しない結合分子（遮断剤）はＴ細胞と結合する。抗原に対するＴ細胞の反応は遮断剤の存在下で増強される。そのような処置は、腫瘍および慢性の病原体感染に対する特異的な免疫反応の増強、並びに免疫時のアジュバントとして有益である。
本発明の実施にはその作用メカニズムの理解は必ずしも必要ではない。結果は、本治療によってＴ細胞はＣＴＬＡ−４によって仲介される抑制シグナルから開放されることを示している。ＣＴＬＡ−４仲介シグナルは、明らかに細胞周期の進行およびＩＬ−２発現を抑制する。抗原および同時刺激性ＣＤ２８シグナル発生に対するＴ細胞の反応はしたがってＣＴＬＡ−４遮断剤の存在下でアップレギュレーションを示す。本方法は非刺激Ｔ細胞の普遍的増殖は促進しない。
本方法は、意図した抗原刺激に対して不適切なＴ細胞仲介反応が存在する場合に有益である。インビトロのＴ細胞仲介反応には細胞溶解性Ｔ細胞の産生および大半の抗体反応（特に免疫グロブリンのアイソタイプのクラス切り換えに含まれるもの）が含まれる。抗原刺激とは、感染細胞上のウイルス抗原の存在；自然には存在しない蛋白もしくは蛋白の組合せを発現する腫瘍細胞；寄生虫もしくは細菌感染；または免疫付与（例えばワクチン接種、単クローン性抗体の調製）であてもよい。インビトロでは、本方法は抗原に対する培養Ｔ細胞の反応の強化に用いられる。そのような活性化Ｔ細胞は、養子免疫療法、活性化メカニズムの研究、薬剤スクリーニングなどで有益である。
ＣＴＬＡ−４遮断剤は、ＣＴＬＡ−４蛋白の細胞外ドメインに特異的に結合してＣＴＬＡ−４とその対立レセプター（例えばＣＤ８０、ＣＤ８６など）との結合を遮断する分子である。遮断剤の結合親和性は、通常少なくとも約１００μＭであろう。遮断剤は、ＣＴＬＡ−４関連分子（例えばＣＤ２８および免疫グロブリン上科の他のもの）とは実質的に反応しないであろう。例えばＣＤ８０およびＣＤ８６のような分子はしたがって遮断剤としては除外される。さらに、遮断剤はＣＴＬＡ−４によるシグナル発生を活性化しない。好都合なことに、これは一価または二価の結合分子によって達成できる。異なる分子間における交叉反応性および競合に関する以下の考察は同一の種に由来する分子を指すことは当業者には理解されよう。例えば、ヒトＣＴＬＡ−４はヒトＣＤ８０および８６と結合する。
候補遮断剤はこの基準に適合するか否かについてその能力をスクリーニングされる。結合親和性および特異性を決定するアッセイは当技術分野では既知であり、それらには競合アッセイおよび非競合アッセイが含まれる。重要なアッセイにはＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フローサイトメトリーなどが含まれる。結合アッセイでは精製もしくは半精製ＣＴＬＡ−４蛋白を用いることができる。また別には、ＣＴＬＡ−４を発現するＴ細胞（例えばＣＴＬＡ−４発現構築物を核酸感染させた細胞）；ＣＤ３およびＣＤ２８の架橋により刺激したＴ細胞；照射異種細胞の添加などを利用することができる。結合アッセイの例としては、精製ＣＴＬＡ−４蛋白を不溶性支持体（例えばマイクロタイタープレート、磁性ビーズなど）に結合させる。候補遮断剤および標識した可溶性ＣＤ８０またはＣＤ８６を該細胞に添加し、続いて未結合成分を洗い流す。結合した標識ＣＤ８０またはＣＤ８６を定量することによって、ＣＴＬＡ−４結合に対してＣＤ８０およびＣＤ８６と競合する遮断剤の能力を決定する。遮断剤がＣＤ２８と交叉反応しないという確認は、ＣＴＬＡ−４をＣＤ２８で置き換えた同様なアッセイを用いて実施できる。適切な分子ではＣＤ２８との結合はＣＴＬＡ−４との結合よりも少なくとも約１０³、より通常は少なくとも１０⁴低い。
一般に、可溶性の一価または二価の結合分子はＣＴＬＡ−４のシグナル発生を活性化しないであろう。Ｔ細胞活性化を検出する機能アッセイを確認に用いてもよい。例えば、候補遮断剤の存在下または非存在下でＣＤ８０またはＣＤ８６を発現している異種照射細胞でＴ細胞集団を刺激することができる。増殖および細胞周期の進行、ＩＬ−２の遊離、ＣＤ２５およびＣＤ６９のアップレギュレーションなどによって測定したとき、ＣＴＬＡ−４シグナル発生を遮断する物質はＴ細胞活性化の増強をもたらすであろう。細胞表面での発現、リポゾーム中への封入、粒子もしくは陥没孔（ウェル）への吸着などは分子の有効価数を増加させるであろう。
遮断剤は、ペプチド、小型の有機分子、ペプチド模倣体、可溶性Ｔ細胞レセプター、抗体などである。抗体は好ましい遮断剤である。抗体は、多クローン性または単クローン性であるか；完全形または短縮形（例えばＦ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ、Ｆｖ）であるか；異種、同種異系、同種またはそれらの修飾形（例えばヒト化、キメラ化など）でもよい。
多くの場合、遮断剤はオリゴペプチド（例えば抗体またはそのフラグメントなど）であろうが、比較的高い特異性および親和性を提供する他の分子もまた用いることができる。組合せ式ライブラリー（combinatory library）は必要な結合特性を有する、オリゴペプチド以外の複合体を提供する。一般に、親和性は少なくとも約１０^-6、より通常は約１０^-8Ｍ（すなわち特異的単クローン性抗体で通常観察される結合親和性）であろう。
多くのスクリーニングアッセイが遮断剤のために利用できる。そのようなアッセイの構成成分には典型的にはＣＴＬＡ−４蛋白が含まれ、場合によってはＣＴＬＡ−４活性化因子（例えばＣＤ８０、ＣＤ８６など）が含まれる。アッセイ混合物はまた候補薬剤を含むであろう。一般に、種々の濃度に対する弁別的反応を得るために異なる薬剤濃度を含む複数のアッセイ混合物を平行して用いる。典型的には、これらの濃度の１つは陰性コントロール（すなわち濃度０または検出レベル未満の濃度）として使用される。
好都合なことに、これらのアッセイでは分子のうちの１つまたは２つ以上が標識に結合され、該標識は直接または間接的に検出可能なシグナルを提供する。種々の標識には放射性同位元素、蛍光、化学発光、酵素、特異的結合分子、粒子（例えば磁性粒子）などが含まれる。特異的結合分子には対形成物質、例えばビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンとアンチジゴキシンなどが含まれる。特異的結合分子類の場合、通常は補足成分が検出手段の分子で既知の方法にしたがって標識される。
重要なスクリーニングアッセイの１つは対立レセプターによるＣＴＬＡ−４の活性化に干渉する物質に向けられる。活性化の定量は当技術分野で既知の多くの方法によって達成されてもよい。例えば、Ｔ細胞活性化の抑制は細胞増殖、サイトカインの遊離などを定量することによって決定されてもよい。
重要な他のアッセイは、その対立レセプターとＣＴＬＡ−４との結合を遮断する物質に向けられる。このアッセイ混合物は、天然の対立レセプターの少なくとも一部分、または特異的結合を可能にする十分な配列類似性を共有するオリゴペプチドおよび候補薬剤を含む。このオリゴペプチドの長さは、アッセイの条件および要求に従ういずれの長さでもよいが、通常は少なくとも８アミノ酸から完全な長さの蛋白またはその融合物である。ＣＴＬＡ−４は不溶性基材と結合させてもよい。該基材は多様な素材を用いて多様な形状に作製してもよい（例えばマイクロタイタープレート、マイクロビーズ、浸漬棒、樹脂粒子など）。基材は、バックグラウンドを最少にし、ノイズ比に対してシグナルを最大にするために選択される。結合は当技術分野で既知の種々の方法によって定量してもよい。結合が平衡に達するために十分な時間保温した後、不溶性支持体を洗浄して残存標識を定量する。結合を妨害する薬剤の場合には検出される標識が減少するであろう。
候補薬剤は多様な化学薬品類を包含するが、典型的にはそれらは有機分子であり、好ましくは小型の有機化合物で、５０ダルトン以上で約２５００ダルトン未満の分子量を有する。候補薬剤は、蛋白との構造的相互作用に必要な官能基、特に水素結合を含み、さらに典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル、スルフヒドリルまたはカルボキシル基、好ましくはこれら機能的化学基の少なくとも２つを含む。候補薬剤は、しばしば環状炭素または複素環構造および／または芳香族もしくは多環性芳香族構造を含み、これらは上記の官能基の１つまたは２つ以上で置換されている。候補薬剤はまた生物学的分子にも見出され、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造類似体またはそれらの組合せを含む。
候補薬剤は、合成または天然化合物ライブラリーを含む多様な起源から得られる。例えば、任意抽出オリゴヌクレオチドの発現を含む、広範囲の有機化合物および生物分子のランダム合成および誘導合成のための種々の手段を用いることができる。また別には、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態をとる天然化合物ライブラリーは入手可能であり、また容易に作製できる。さらに、天然または合成により製造されるライブラリーおよび化合物は、通常の化学的、物理的および生化学的手段によって容易に改変できる。構造的類似体を作製するために、既知の医薬物質を特異的または任意の化学的修飾、例えばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド付加に付すことができる。
多様な他の試薬をスクリーニングアッセイに包含させることができる。これらには塩、中性蛋白（例えばアルブミン）、洗剤などの試薬が含まれるが、これらは最適な蛋白−ＤＮＡ結合を促進し、および／または非特異的もしくはバックグラウンド反応を減少させるために用いることができる。これとは別にアッセイの効率を改善する試薬、例えばプロテアーゼ抑制物質、ヌクレアーゼ抑制物質、抗菌剤なども用いることができる。
遮断剤として用いられる適切な抗体は、ホストの動物をＣＴＬＡ−４蛋白全体またはその一部分を含むペプチドで免疫して得られる。適切なホスト動物にはマウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ハムスター、ウサギなどが含まれる。免疫原蛋白の由来は、マウス、ヒト、ラット、サルなどであってもよい。ホスト動物は一般に免疫原以外の異なる種で、例えばハムスターの免疫にはマウスＣＴＬＡ−４、マウスの免疫にはヒトＣＴＬＡ−４が用いられる。ヒトおよびマウスＣＴＬＡ−４は高度に保存された部分を細胞外ドメインに含んでいる（Harperら、J.Immunol 147:1037-1044（1991））。そのように高度に保存された領域に由来するペプチドは交差特異的（cross-specific）抗体を作製するために免疫原として用いてもよい。
免疫原は完全な蛋白またはそのフラグメントおよびその誘導体を含むことができる。好ましい免疫原は、ヒトＣＴＬＡ−４の細胞外ドメイン（アミノ酸残基３８−１６１）の全部または一部分を含むが、これらの残基は、天然のＣＴＬＡ−４で見出される翻訳後修飾（例えば糖付加）を含む。細胞外ドメインを含む免疫原は、当技術分野で既知の多様な方法、例えば、通常の組換え方法を用いたクローン化遺伝子の発現、高レベルのＣＴＬＡ−４を発現している分別細胞集団、Ｔ細胞の分離などにより作製される。
組換えまたは修飾蛋白の発現を所望する場合、所望のＣＴＬＡ−４部分をコードするベクターが用いられる。一般に発現ベクターは、ＣＴＬＡ−４分子の細胞外ドメインが核酸感染細胞表面に存在するように、また別には該細胞外ドメインが細胞から分泌されるようにデザインされる。細胞外ドメインを分泌させる場合は、分泌を可能にする配列（シグナルペプチドを含む）と細胞外ドメインのコード配列をフレームに従って融合させる。シグナルペプチドは外来性のものであっても、天然のものであってもよい。免疫のために重要な融合蛋白は、ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインが免疫グロブリンの定常領域に連結されている。例えば、ヒトＣｇ１（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインのヒンジ領域に連結されたマウスＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインを含む融合蛋白はハムスターの免疫に用いることができる。
細胞表面にＣＴＬＡ−４を発現させる場合は、細胞外ドメインを膜内に固定するペプチドをコードする配列およびシグナル配列と細胞外ドメインのコード配列をフレームに従って融合させる。そのようなアンカー配列には天然のＣＴＬＡ−４トランスメンブレンドメイン、または他の細胞の表面蛋白（例えばＣＤ４、ＣＤ８、ｓＩｇなど）由来のトランスメンブレンドメインが含まれる。マウスの免疫にヒトＣＴＬＡ−４遺伝子で核酸感染させたマウス細胞を用い、ヒトＣＴＬＡ−４蛋白に特異的な抗体を作製してもよい。
単クローン性抗体は通常の技術によって製造する。一般に、免疫したホスト動物の脾臓および／またはリンパ節はプラズマ細胞源を提供する。プラズマ細胞をミエローマ細胞と融合させハイブリドーマを作製することによって永続させる。個々のハイブリドーマから得た培養上清を標準的技術でスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマを特定する。ヒト蛋白に対する単クローン性抗体の作製に適した動物にはマウス、ラット、ハムスターなどが含まれる。マウス蛋白に対する抗体を作製する動物は一般にハムスター、モルモット、ウサギなどであろう。抗体はハイブリドーマ細胞上清または腹水から通常の技術、例えば不溶性支持体、蛋白Ａセファロースなどに結合させたＣＴＬＡ−４を用いた親和性クロマトグラフィーによって精製されてもよい。
抗体は通常の多重構造物ではなく単一鎖として作製されてもよい。単一鎖抗体についてはジョストら（Jostら、J.B.C.269:26267-73（1994））および他の研究者が報告している。重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列を小型の中性アミノ酸（グリシンおよび／またはセリン）の少なくとも４つをコードするスペーサーに連結する。この融合によってコードされる蛋白は、本来の抗体の特性と親和性を保持する機能的可変領域の組み立て集合を可能にする。
インビボで使用する場合（特にヒトに注射する場合）、遮断剤の抗原性を減少させることが好ましい。受容者の遮断剤に対する免疫応答は、治療が有効な期間を減少させる可能性が高い。抗体をヒト化させる方法は当技術分野で知られている。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリンの定常領域遺伝子を導入された動物の生成物でもよい（例えば国際特許出願WO90/10077およびWO90/04036号参照）。また別の重要な抗体は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジドメインおよび／または対応するヒト配列を有するフレームワークドメインを置換するために組換えＤＮＡ技術で操作することができる（国際特許出願WO92/02190号参照）。
キメラ免疫グロブリン遺伝子を構築するためにＩｇｃＤＮＡを使用することは当技術分野で既知である（Liuら、P.N.A.S.84:3439（1987）およびJ.Immunol.139:3521（1987））。ｍＲＮＡをハイブリドーマまたは抗体を産生している他の細胞から分離し、ｃＤＮＡを作製するために用いる。問題のｃＤＮＡは特定のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応によって増幅できる（米国特許第4683195および4683202号）。また別には、ライブラリーを作製し、問題の配列を分離するためにスクリーニングする。続いて抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列をヒトの定常領域の配列に融合させる。ヒトの定常領域の配列は文献に記載されている（Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest（免疫学的に重要な蛋白質の配列）、ＮＩＨ刊行物91-3242号）。ヒトのＣ領域遺伝子は既知のクローンから容易に入手できる。アイソタイプは所望のエフェクター機能（例えば補体の固定）または抗体依存細胞性細胞毒性における活性によって選択されるであろう。好ましいアイソタイプはＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４である。ヒト軽鎖定常領域、カッパまたはラムダのいずれかを用いることができる。このヒト化キメラ抗体を続いて通常の方法によって発現させる。
完全な蛋白の切断、例えばプロテアーゼまたは化学的切断によって、抗体フラグメント（例えばＦｖ、Ｆ（ａｂ’）₂およびＦａｂ）を調製することができる。また別には短縮遺伝子が所望される。例えば、Ｆ（ａｂ．’）₂フラグメントの一部分をコードするキメラ遺伝子は、ＣＨ１ドメインおよびＨ鎖のヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列、それに続く翻訳終止コドンを含み、短縮分子を生じるであろう。
ヒトＣ領域セグメントにＶ領域をその後で連結できるようにＪ領域に有用な制限部位を導入するためにプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドを作製するべく、ＨおよびＬＪ領域のコンセンサス配列を用いてもよい。Ｃ領域のｃＤＮＡは、位置特異的変異によって修飾してヒト配列内の類似の場所に制限部位を配置することができる。
発現ベクターにはプラスミド、レトロウイルス、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどが含まれる。好都合なベクターは、機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬ免疫グロブリン配列をコードし、いずれかのＶＨまたはＶＬ配列が容易に挿入され発現されるように操作された適切な制限部位を有するベクターである。そのようなベクターでは、スプライシングは通常は、挿入されたＪ領域内のスプライスドナー部位とヒトＣ領域に先行するスプライスアクセプター部位との間で生じるか、さらにヒトＣＨエクソン内で発生するスプライス領域でも生じる。ボリアデニル化および転写終了は、該コード領域の下流の本来の染色体部位で生じる。得られたキメラ抗体は強力ないずれかのプロモーターと結合させてもよい。強力なプロモーターはレトロウイルスＬＴＲ（例えばＳＶ−４０初期プロモーター（Okayamaら、Mol.Cell Biol.3:280（1983））、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ（Gormanら、P.N.A.S.79:677（1982））およびモロニーネズミ白血病ウイルスＬＴＲ（Grosschedlら、Cell 41:885（1985）））、天然のＩｇプロモーターなどを含む。
ＣＴＬＡ−４遮断剤は単独または免疫反応刺激剤と組み合わせて用いることができる。本明細書で用いられるように、“免疫反応刺激剤”とは、ＣＴＬＡ−４遮断剤と組み合わされて直接または間接的に免疫反応を刺激する一切の作用物質を指す。例えば、免疫反応刺激剤にはサイトカインの他に腫瘍抗原および病原体由来抗原を含む種々の抗原が含まれる。さらに、免疫反応刺激剤は、サイトカイン形質導入腫瘍細胞（例えばＧＭＣＳＦを形質導入した腫瘍細胞）の他に照射腫瘍細胞および／または化学療法剤の生体外もしくは生体内処置腫瘍細胞を含む。幾つかの事例では、既に死んだ腫瘍細胞または死につつある腫瘍細胞から生じる細胞性残屑は、生体内または生体外でＣＴＬＡ−４遮断剤と組み合わされて免疫反応刺激をもたらす。化学療法剤の使用は、間接的手段による免疫反応刺激剤産生の例である。生体外または生体内で腫瘍細胞を照射するためにその供給源を使用することもまた、免疫反応刺激剤を間接的に産生する方法を構成する。実施例９から実施例１２は、ＣＴＬＡ−４遮断剤と合わせて用いた場合に免疫反応刺激剤が腫瘍治療に顕著な効果を有することを示している。
ＣＴＬＡ−４遮断剤とともに化学療法剤を使用する根拠は以下の通りである。実施例で示すように、ＣＴＬＡ−４遮断は成長した腫瘍でより強く機能し、照射腫瘍の免疫原性を高める。この事は、ＣＴＬＡ−４遮断を癌治療のより通常的な方法と組み合わせて相乗効果を生み出すことができることを示唆している。例えば、ＣＴＬＡ−４遮断は化学療法剤の処置後まもなく開始することができる。化学療法剤の用量は、相当量の腫瘍集団を殺し、ＣＴＬＡ−４遮断の結果としてＴ細胞による免疫反応を刺激する作用物質として作用する残屑を生じるレベルに調整する。ＣＴＬＡ−４により促進された免疫反応が残存する腫瘍集団を排除するので、最大の腫瘍細胞の死を得るために現在用いられている用量よりもはるかに低いレベルで化学療法剤を投与することが可能になる。これによって、通常の化学療法の適用に付随するしばしば激烈な副作用（免疫抑制を含む）を最小限に止めることができる。同様なことが放射線療法にも言える。化学療法剤の用量または照射線量は、ＣＴＬＡ−４遮断剤と併用する場合は通常使用される用量の好ましくは２−２０％、より好ましくは５−１０％である。
ＣＴＬＡ−４遮断剤がＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインに対する抗体またはそのフラグメント（例えばＦａｂ’）以外のものである場合は、そのような遮断剤は独立して、すなわち免疫反応刺激剤を併用することなく用いることができる。しかしながら、ＣＴＬＡ−４遮断剤、特にＣＴＬＡ−４の細胞外部分に対する抗体から成るものを、１つまたは２つ以上の免疫反応刺激剤と併用して用いるのが好ましい。ＣＴＬＡ−４遮断剤はまた、間接的に免疫反応刺激剤を産生する照射および／または化学療法と合わせて用いることができる。そのような併用ではＣＴＬＡ−４遮断剤と免疫反応刺激剤の同時使用または連続使用が必要で、さらに異なる部位で実施できる。例えば、腫瘍に直接照射した後、ＣＴＬＡ−４遮断剤は腫瘍から離れた部位に投与できる。また別には、ＣＴＬＡ−４遮断剤の使用に続いて化学療法剤を局所的または全身的に用いて腫瘍を治療することができる。
抗原に対するホストのＴ細胞反応が不完全であることを特徴とする状況は、慢性感染症、腫瘍、ペプチドワクチンによる免疫などを含む。そのようなホストへの本ＣＴＬＡ−４遮断剤の投与は活性化Ｔ細胞の表現型を特異的に変化させ、抗原仲介活性化に対する反応を高める。霊長類、より具体的にはヒトの治療は重要であるが、他の哺乳類、特に家畜（例えばブタ、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ネズミ、ウサギ）もまた治療の恩恵を受けてもよい。
製剤は、抗原刺激に対するＴ細胞の反応の増強に有効な用量で投与される。活性化されたＴ細胞の反応は、休止Ｔ細胞よりもはるかに強く本治療によって影響を受ける。Ｔ細胞反応の測定は処置される条件にしたがって変動するであろう。有用なＴ細胞活性測定は、増殖、サイトカイン（例えばＩＬ−２、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ）の遊離、Ｔ細胞のマーカー（例えばＣＤ２５およびＣＤ６９）発現、および当技術分野で知られているような他のＴ細胞活性測定である。
本治療は、抗原表出細胞を刺激するサイトカイン、例えば顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）などと併用して実施できる。Ｔ細胞増殖およびＴ細胞分泌を強化することが知られているまた別の蛋白および／またはサイトカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、Ｂ７、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８もまた遮断剤と同時にまたは引き続いて用いて免疫反応を高めることができる。本治療は、種々のサイトカインまたは細胞表面レセプターをコードする遺伝子の腫瘍細胞または腫瘍浸潤リンパ球への核酸感染と併用することができる（Ogasawaraら、Cancer Res.53:3561-8（1993）;Townsendら、Science 259:368-370（1993）参照）。例えば、ＣＤ８０をコードするｃＤＮＡを腫瘍細胞に核酸感染させることによって核酸感染腫瘍細胞の拒絶がもたらされ、核酸感染されていない元の腫瘍細胞によるその後の攻撃に対して免疫を誘発することができることが示された（Townsendら、Cancer Res.54:6477-6483（1994））。
ホストの腫瘍特異Ｔ細胞を本遮断剤および腫瘍抗原とともに生体外で混合し、再度患者に注入することができる。ホストに投与されたとき、この刺激細胞は腫瘍死反応を誘発して腫瘍の退縮をもたらす。ホスト細胞は種々の供給源、例えばリンパ節（例えば鼠径部、腸間膜、表層末梢補助リンパ節など）、骨髄、脾臓または末梢血液から分離でき、また腫瘍、例えば腫瘍浸潤リンパ球からも分離できる。細胞は同種異系または好ましくは自己由来であってもよい。生体外刺激の場合は、ホスト細胞を無菌的に取り出し、当技術分野で既知の適切な培養液に浮遊させる。細胞を遮断剤とともに種々のプロトコル（特にＢ７、抗ＣＤ２８と混合）のいずれかによって刺激する。結合剤、充填剤、担体、保存料、安定剤、乳化剤および緩衝剤のような添加物を含む種々の医薬組成物とともに刺激した細胞を注射（例えば静脈内、腹腔内など）によってホストに再度導入する。適切な希釈剤および賦形剤は水、食塩水、ブドウ糖などである。
本遮断剤の投与によってその増殖が減少する腫瘍細胞は癌腫、例えば腺癌（これらは乳房、卵巣、子宮内膜、子宮頸管、大腸、肺、膵、食道、前立腺、小腸、直腸、子宮または胃に原発腫瘍部位を有していてもよい）、および扁平上皮癌（これらは肺、口腔、舌、喉頭、食道、皮膚、膀胱、子宮頸管、瞼、結膜、膣などに原発部位を有していてもよい）を含む。処置できる他の種類の腫瘍は肉腫（例えば筋原性肉腫）、神経腫、メラノーマ、白血病、ある種のリンパ腫、栄養膜性および胚細胞腫瘍、神経内分泌性および神経外胚葉性腫瘍を含む。
特に重要な腫瘍は腫瘍特異抗原を表出している腫瘍である。そのような抗原は異常な状態で（通常は高レベルで）表出されているか、または変異形であろう。腫瘍抗原は本遮断剤とともに投与され、該腫瘍細胞に対するホストＴ細胞の反応を高めることができる。そのような抗原調製物は精製蛋白または腫瘍細胞由来の溶解物を含む。
腫瘍抗原の例はサイトカイン、特に癌腫の抗原としてはサイトケラチン８、１８および１９である。上皮性膜抗原（ＥＭＡ）、ヒト胎児抗原（ＨＥＡ−１２５）、母乳脂肪球、ＭＢｒ１、ＭＢｒ８、Ｂｅｒ−ＥＰ４、１７−１Ａ、Ｃ２６およびＴ１６もまた既知の癌腫抗原である。デスミンおよび筋特異的アクチンは筋原性肉腫の抗原である。胎盤性アルカリホスファターゼ、β−ヒト絨毛膜性腺刺激ホルモンおよびα−フェトプロテインは栄養膜性および胚細胞腫瘍の抗原である。前立腺特異抗原は、前立腺癌の抗原、大腸腺癌の癌胎児性抗原である。ＨＭＢ−４５はメラノーマの抗原である。クロマグラニン−Ａおよびシナプトフィシンは神経内分泌性および神経外胚葉性腫瘍の抗原である。特に重要なものは、壊死領域を有する固形腫瘍塊を形成する侵襲性腫瘍である。そのような壊死細胞の溶解は抗原表出細胞のための豊富な抗原供給源である。
本遮断剤の投与はある種のリンパ腫については禁忌であろう。特にＴ細胞リンパ腫は活性化の増強によって利益を受けないであろう。ホジキン氏病のリード・スタンバーグ細胞でＣＤ８０抗原は強く発現され、この細胞をしばしばＣＤ２８発現Ｔ細胞が取り巻いている（Delabieら、Blood 82:2845-52（1993））。リード・スタンバーグ細胞の補助的機能はＴ細胞の活性化をもたらしてホジキン氏病症候群をもたらすと言われている。
多くの慣用的な癌療法、例えば化学療法および放射線療法はリンパ球の増殖を激しく減少させる。本療法はこの免疫抑制をある程度緩和することができるが、併用治療の好ましい工程では、そのようなリンパ球毒性治療が本療法の前後で用いられるであろう。
本遮断剤は、病原体へのＴ細胞の反応を高めるために投与できる。ホストの抗ウイルスメカニズムが不完全である場合ある種のウイルス感染は慢性になる。そのような感染は何年も、または感染者の生涯にわたって持続し、しばしば重篤な疾患を引き起こす。高い罹患率と早期の死亡を伴う慢性感染症は２種のヒト肝炎ウイルス（Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）およびＣ型肝炎（ＨＣＶ））によるものを含み、これらは慢性肝炎、肝硬変および肝癌を引き起こす。他のヒト慢性ウイルス感染は、ヒトレトロウイルス、エイズを惹起するヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）並びに、Ｔ細胞白血病およびミエロパシーを惹起するヒトＴリンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２）によるものである。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型および２型、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）およびヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）を含むヒトヘルペスウイルスによる感染は通常ホストのメカニズムニよっては根絶できない。細胞内で増殖する他の病原体（例えば病原性原生動物（例：トリパノソーマ、マラリアおよびトキソプラズマ）、細菌（例：マイコバクテリウム、サルモネラおよびリステリア）および真菌（例：カンジダ））による感染もまた、ホストの防御メカニズムがそれらを排除できないときに慢性になるであろう。
本遮断剤はそのような病原体の慢性感染をもつ患者に投与される。免疫反応を高めるために、遮断剤は該病原体とともに製剤化するのが望ましいであろう。そのような種々の抗原は当技術分野で既知で、該病原体の分離または組換え技術による発現によって入手可能である。例にはＨＩＶｇｐ１２０、ＨＢＶ表面抗原、ウイルスのエンベロープおよびコート蛋白などが含まれる。
アジュバントは抗原に対する免疫反応を高める。ＣＴＬＡ−４遮断剤は、Ｔ細胞活性化を高め、さらに抗体産生細胞のクラス切り換えを高めてそれによって当該免疫原に対する反応で産生されるＩｇＧクラスの抗体濃度をぞうかさせるためにアジュバントとして用いられる。遮断剤は、アジュバントを用いる場合の慣用的な技術にしたがって、生理学的に許容可能な媒体中で免疫原と混合される。免疫原は単一製剤として遮断剤と混合してもよいが、また別々に投与してもよい。免疫原には多糖類、蛋白、蛋白フラグメント、ハプテンなどが含まれる。特に重要なものはペプチド免疫原と使用するものである。ペプチド免疫原には、上記で述べた腫瘍抗原およびウイルス抗原またはそのフラグメントが含まれる。
また重要なものは、遺伝子による免疫と合わせて本遮断剤を使用するものである。問題のペプチドまたは蛋白抗原をコードするＤＮＡ発現ベクターをホスト動物の一般に筋肉または皮膚に注射する。遺伝子生成物は正確に糖付加され、折り畳まれれてホスト細胞によって発現される。この方法は、抗原が所望の純度、量または正確に糖付加された形態で得ることが困難であるか、または遺伝子配列が既知である場合（例えばＨＣＶ）においてのみ有利である。典型的には、ＤＮＡは筋肉内に注射するか、または“遺伝子銃”と称される粒子放出装置によって金に被覆した微粒子を皮膚内に送り込む。遺伝子免疫は特異的な液性免疫反応の誘発だけでなく、癌、マイコプラズマ、ＴＢ、マラリアおよび多くのウイルス感染（インフルエンザおよびＨＩＶを含む）の動物モデルにおいてより広範囲に反応する細胞性免疫をも誘発することを示した。例えば以下の論文を参照されたい（Morら、J.Immunol.155:2039-46（1995）;Xu & Liew,Immunol.84:173-6（1995）;Davisら、Vaccine 12:1503-9（1994））。
本遮断剤は、単クローン性抗体産生のために実験動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギなど）を免疫するときに用いられる。この投与によって抗原に対する反応レベルは増加し、さらにクラス切り換えを受けるプラズマ細胞の割合が増加する。
ＣＴＬＡ−４遮断剤は培養Ｔ細胞の活性化を高めるためにインビトロで投与される。培養Ｔ細胞には一切のインビトロ細胞培養系、例えば永代化細胞株、混合または精製細胞集団、非形質転換細胞の初代培養などが含まれる。特に重要なものは初代Ｔ細胞培養で、この場合細胞は患者または同種異系ドナーから取り出され、生体外で刺激され再び患者に注入される。
種々の投与方法を用いることができる。ＣＴＬＡ−４遮断製剤は血管内、皮下、腹腔内に注射できる。治療用製剤の用量は、疾患の性状、投与頻度、投与態様、投与目的、ホストから薬剤が除去される時間などによって大きく変動するであろう。投与量は既知の因子、例えば特定の製剤の薬理学的消長、投与の態様およびルート、受容者の年令、健康状態および体重、症状の性状および程度、同時に行われる処置、治療頻度並びに所望される効果にしたがって変動するであろう。投与は１週間に１回または２週間に１回の低い頻度で実施されるか、またはより少ない用量に分割して有効な用量レベルを維持するために毎日もしくは１週間に２回投与してもよい。一般に、活性成分の１日の用量は約０．１から１００ｍｇ／ｋｇ体重であろう。体内投与に適した投与形は、一般に１単位当たり約０．１ｍｇから５００ｍｇの活性成分を含む。活性成分は全組成物重量に対して０．５から９５重量％であろう。
いくつかの事例では、過剰なＴ細胞増殖のために治療期間を限定するのが望ましい。期間は、治療に対する患者の反応、患者のＴ細胞数などにしたがって経験的に決定される。患者のＴ細胞の数は当技術分野で既知の方法によってモニターされるが、これらの方法にはＴ細胞特異的抗体による染色およびフローサイトメトリーが含まれる。
本ＴＣＬＡ−４遮断剤は、医薬的に許容できる担体（例えば通常の食塩水、植物油、鉱物油、ＰＢＳなど）中に有効量を有する製剤として調製される。治療用調製物は、生理学的に許容できる液体、ゲルもしくは固形担体、希釈剤、アジュバントおよび賦形剤を含む。添加物には殺菌剤、等張性を維持する添加物（例えばＮａＣｌ）、マンニトール、化学安定剤（例えば緩衝剤）および保存料などが含まれてもよい。ＣＴＬＡ−４遮断剤はカクテルとしてまたは単剤として用いることができる。非経口投与のためには、遮断剤は溶液、懸濁剤、乳濁剤、または医薬的に許容可能な注射用賦形剤を添えた凍結乾燥粉末として製剤化できる。リポゾームまたは非水性賦形剤（例えば不揮発性油）もまた用いることができる。製剤は当技術分野で既知の方法によって滅菌される。
ＣＴＬＡ−４遮断剤の機能効果は、本発明で認められた細胞内シグナル発生における変化を模倣する他の薬剤の投与によってもまた誘発されてもよい。例えば、特定の細胞質キナーゼは細胞外レセプターの結合に反応して活性化できることが知られている。このキナーゼ活性を遮断する薬剤は、遮断レセプター結合と同様な生理学的効果を有するであろう。同様に、サイクリックＡＭＰ、ＧＴＰ濃度および細胞内カルシウムレベルを増加させる薬剤は、細胞外レセプター結合で認められるものと類似する生理学的効果を生じるであろう。
以下の実施例は説明のために提供され、制限を目的として提供されるものではない。
実験
実施例１
マウスＣＴＬＡ−４と反応する単クローン性抗体の作製
ａ）マウスＣＴＬＡ−４免疫原の調製
マウスＣＴＬＡ−４の細胞外部分およびヒトＩｇＧ１の定常領域を含む融合蛋白（ｍＣＴＬＡ４−Ｈｇ１と称する）をレーン博士およびカリャレーネン博士（P.Lane & K.Karjalainen,Base Institute for Immunology,バーゼル、スイス）から入手した。ｍＣＴＬＡ４−Ｈｇ１蛋白を発現することができる発現ベクターを報告にしたがって構築した（Laneら、Immunol.80:56（1993））。簡単に記せば、マウスＣＴＬＡ−４分子の細胞外部分をコードする配列をＰＣＲを用いて作製した。マウスＣＴＬＡ−４配列を含むプラスミドからＣＴＬＡ−４配列を増幅させるために以下のプライマーを用いた：5’-TTACTCTACTCCCTGAGGAGCTCAGCACATTTGCC-3’（配列番号：１）および5’-TATACTTACCAGAATCCGGGCATGGTTCTGGATCA-3’（配列番号：２）。続いてこの増幅ＣＴＬＡ−４配列を発現ベクターに挿入する。発現ベクターは問題の遺伝子をヒトＩｇＧ１蛋白のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインをコードする配列の上流に挿入できるベクターである（Trauneckerら、Trends Biotech.9:109（1991））。各プライマーは、ヒトＩｇＧ１発現ベクターでのサブクローニングのために適切な制限部位を含み、さらにスプライスによって正確なヒトｇ１エクソンを得るために３’プライマー内に３’スプライスドナー部位を含む。ｍＣＴＬＡ４−Ｈｇ１融合蛋白をコードする配列を含むプラスミドをpHβ-APr-1-neo-mCTLA4-Hg1と称した。ｍＣＴＬＡ４−Ｈｇ１蛋白のアミノ酸配列は配列番号：３に挙げた。
ｍＣＴＬＡ４−Ｈｇ１蛋白を発現させるために、pHβ-APr-1-neo-mCTLA4-Hg1発現ベクターをマウスの形質細胞腫株、Ｊ５５８Ｌに標準的なプロトプラスト融合技術を用いて核酸感染させた（Ｊ５５８ＬはＪ５５８細胞株と同一で、後者はＡＴＣＣから入手できる［ATCC TIB6］）。Ｊ５５８Ｌ細胞を５×１０⁴細胞／ｍｌで培養した。核酸感染させたＪ５５８Ｌ細胞をキサンチン（Sigma）およびミコフェノール酸（Calbiochem,ラホイヤ、CA）を含む培地（選択培地）で続いて選別した。選択培地を核酸感染後２４時間用い、２週間してから陽性クローン（すなわち選択培地で増殖するクローン）をスクリーニングした。融合タンパクを分泌するクローンをヒトＩｇＧ１についてＥＬＩＳＡを用いて特定した。良好な分泌クローンを特定し、クローン１５と命名した。クローン１５の細胞を代謝的に〔³⁵Ｓ〕メチオニンで標識し、分泌蛋白を蛋白Ａで免疫沈澱させて沈澱した蛋白をＳＤＳポリアクリルアミドゲルで解離させた。ｍＣＴＬＡ４−Ｈｇ１蛋白は、還元状態では約６００００ＭＷの単量体として、さらに非還元状態では二量体としてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を移動することが分かった。
蛋白Ａ−セファロース（Zymed,サウスサンフランシスコ、CA）カラムでクローン番号の細胞上清を親和性クロマトグラフィーで精製してｍＣＴＬＡ４−Ｈｇ１蛋白の精製調製物を得た。簡単に記せば、ｍＣＴＬＡ４−Ｈｇ１蛋白を発現しているＪ５５８Ｌ細胞を５％ＦＣＳ、グルタミン、２ＭＥおよび抗生物質を補充したＩＭＤＭで増殖させた。培養上清を細胞から採集し、１５００×ｇで遠心して一切の残存細胞を除去し、清澄な上清をポアサイズが０．４ミクロンのフィルターに通した。濾過上清を１ＮのＮａＯＨを用いてｐＨ８．５に調節し、続いてこの上清を２ｍｌ／分の流速で２ｍｌ（集積容積）の蛋白Ａ−セファロースカラムに流した。Ｊ５５８Ｌ細胞株は、蛋白Ｇに結合するまた別の免疫グロブリン（すなわちマウスＣＴＬＡＩｇの他に）を産生し、したがって核酸感染Ｊ５５８Ｌ細胞からｍＣＴＬＡ４−Ｈｇ１蛋白を精製するために蛋白Ｇ樹脂を使用することは推奨できない。
蛋白Ａカラムを２０から３０カラム容積のＰＢＳで洗浄し、融合蛋白を５０ｍＭのジエチルアミン（ｐＨ１１．０）で溶出させた。２ｍｌの分画を０．２ｍｌの１Ｍトリス−ＨＣｌを含む試験管に採集してサンプルのｐＨを中和させた。２８０ｎｍでの吸収を求め、各分画の蛋白濃度を調べるために用いた。蛋白を含む分画を合わせ、ＰＢＳ（１リットル／回、２から３回交換）に対して一晩透析した。ｍＣＴＬＡ４−Ｈｇ１蛋白の存在はＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは約４０ｋＤ（融合蛋白の予想分子量）のバンドを示した。さらに、精製ｍＣＴＬＡ４−Ｈｇ１蛋白は、抗ヒトＩｇＧ１抗体（ＨＰ６０５８；ＨＰ６０５８抗体の供給源としてＨＰ６０５８ハイブリドーマ（ATCC CRL1786）を用いた）を用いてＥＬＩＳＡで調べた。
ｂ）ハムスターの免疫
マウスＣＴＬＡ−４融合蛋白でハムスターを免疫するために、精製ｍＣＴＬＡ４−Ｈｇ１蛋白（以後ＣＴＬＡ−４Ｉｇという）を用いて加熱殺菌した黄色ブドウ球菌（StaphA）菌体（Calbiochem,ラホイヤ、CA）を被覆した。０．２ｍｌのＰＢＳに浮遊させた約１００μｇのＣＴＬＡ−４Ｉｇで被覆した加熱殺菌StaphA菌５０μｌ（集積容積）を６週齢のゴールデンシリアンハムスター（Harlan Sprague Dawley,インジアナポリス、IN）の足裏に注射した。StaphA菌体は以下のように被覆した。
StaphA菌体を製造元のプロトコルにしたがって食塩水（０．９％ＮａＣｌ）中で１０％（w/v）の濃度に調製した。この菌体スラリーの１ｍｌを１４００×ｇで遠心して菌を沈澱させ、上清を除去した。ＰＢＳ中に約１００μｇの精製ＣＴＬＡ−４Ｉｇを含む１ｍｌ溶液を前記沈殿物に加え、混合物を攪拌しながら３７℃で２時間保温した。続いて細菌を上記のように遠心して沈澱させ、沈殿物を１回当たり１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した。続いてＣＴＬＡ−４Ｉｇ被覆菌体を約２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁させ、この調製物の５０μｌを足裏に注射した。
ハムスター１匹につき合計５回注射を施した。最後の追加免疫の日の注射前に、実験動物管理室（Office of Laboratory Animal Care）（カリフォルニア大学、バークレー校）の職員による眼内採血によって約１００μｌの血清を得た。この血清を最初の注射前に同一の方法によって得た血清と分析比較した。
ＣＴＬＡ−４Ｉｇ結合ＥＬＩＳＡを用いて、免疫後採血血液中のＣＴＬＡ−４Ｉｇ融合蛋白を認識する抗体の存在を証明した。ＣＴＬＡ−４Ｉｇ結合ＥＬＩＳＡは以下のように実施した。ＣＴＬＡ−４Ｉｇ融合蛋白またはＣＤ４Ｉｇ融合蛋白を用いて、９６ウェルの改変平底ＥＬＩＳＡプレート（Corning,コーニング、NY）のウェルを被覆した。
ＣＤ４Ｉｇは、マウスＣＤ４の細胞外ドメイン並びにヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインから成る融合蛋白である（Trauneckerら、上掲書）。ＣＤ４Ｉｇ蛋白はＥＬＩＳＡアッセイで陰性コントロールとして用いた。ＣＤ４Ｉｇ融合蛋白は核酸感染Ｊ５５８細胞から調製し、上記（ａ）でmCTLA4-Hg1（すなわちＣＴＬＡ−４Ｉｇ）融合蛋白について述べたように蛋白Ａセファロースで親和性クロマトグラフィーによって精製した。
０．４％ゼラチンを含むＰＢＳ中に１μｇ／ｍｌの濃度の融合蛋白５０μｌをウェルに加えた。プレートを３７℃で２−３時間保温して蛋白を吸着させた。続いてプレートを０．０５％トゥイーン２０を含む０．９％ＮａＣｌの１５０μｌを用いて３回洗浄した。さらにウェル中の残存する蛋白結合部位を０．４％ゼラチンを含むＰＢＳ（遮断緩衝液）を用いて３７℃で３０分遮断し、遮断工程に続いてプレートを０．０５％トゥイーン２０を含む０．９％ＮａＣｌで２回洗浄した。抗ＣＴＬＡ−４抗体（すなわち免疫ハムスター由来血清、精製抗体または培養上清）を含む溶液５０μｌを３組ずつウェルに添加し、３７℃で２−３時間プレートを保温した。免疫ハムスターの血清中に存在する抗ＣＴＬＡ−４抗体の量を調べるために、免疫後の最初の採血血液を１：１０００から１：１００の範囲の希釈（０．４％ゼラチン含有ＰＢＳで希釈）を用いて調べた。
続いてウェルを０．０５％トゥイーン２０含有０．９％ＮａＣｌの５０μｌで３回洗浄した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（CalTag、サウスサフランシスコ、CA）結合ヤギ抗ハムスターＩｇＧ多クローン性血清を遮断緩衝液中に１μｇ／ｍｌの濃度で含む溶液５０μｌをウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間保温した。続いてプレートを０．０５％トゥイーン２０含有０．９％ＮａＣｌで４回洗浄した。ＡＢＴＳ〔２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）〕をクエン酸緩衝液（０．１Ｍクエン酸（ｐＨ４．３５））中に０．５５ｍｇ／ｍｌで含有する溶液を加え、プレートを３７℃で約２０分保温した。続いてプレートをバイオテック（BioTech）プレート読み取り装置を用いて４０５ｎｍで読み取り（Beckman Instruments,パロアルト、CA）、緑色の反応生成物の吸収を調べた。
ＣＴＬＡ−４Ｉｇ結合ＥＬＩＳＡの結果によって、免疫後採血血液の１０００倍希釈（免疫前血液を用いた場合、バックグラウンドが検出される希釈よりも高い希釈）でＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合蛋白を認識する抗体が存在することが明らかになった。
ｃ）抗マウスＣＴＬＡ−４抗体を分泌するハイブリドーマ株の分離
最後の注射後３日して流入領域リンパ節をハムスターから取り出した。後肢の液体を排出する膝下リンパ節からリンパ球を分離した。以下のように分離したリンパ節から細胞浮遊液を作製した。１０％ＦＣＳ（BioWhittaker,ウォーカースビル、MD）補充ＲＰＭＩ培養液（GibcoBRL,Gaithersburg,MD）を入れた組織培養皿（Falcon Plastics,マウンテンビュー、CA）に切断したリンパ節を静置した。つや消しを施したガラススライドでリンパ節を穏やかに磨り潰してリンパ球をリンパ節から遊離させた。リンパ球浮遊液は血球計算盤を用いて計測した。
免疫ハムスターから分離したリンパ球を融合細胞の片方（P3X3.Ag8.653（ATCC CRL1580））と融合させた。P3X3.Ag8.653細胞は、融合前に３日に１度２０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清、BioWhittaker,ウォーカースビル、MD）、５０μＭの２−ＭＥ、５０μＭのゲンタマイシンを含むＩＭＤＭ（カリフォルニア大学、サンフランシスコ組織培養施設）中で１：２０に希釈した。
ミエローマ株との融合には標準的なポリエチレングリコール融合技術を用いた（Mckearnら、Immunol.Rev.47:91（1979））。簡単に記せば、無菌的なリンパ球細胞浮遊液を血清を含まないイスコフの改変ダルベッコー培養液（Iscove’s Modified Dulbecco’s Media（IMDM））で調製した。リンパ球を２回１ＭＤＭで洗浄し、濃度を１２．５×１０⁶細胞／ｍｌに調整した。
P3X3.Ag8.653細胞（上記のように増殖させた）を血清非含有ＩＭＤＭで２回洗浄した（これらの細胞は、ＴＪ−６遠心器（Beckman Instruments,パロアルト、CA）で２５℃で５分１０００ｒｐｍで遠心して、細胞を沈澱させた）。P3X3.Ag8.653細胞の濃度は５×１０⁶細胞／ｍｌに調節した。
４ｍｌのリンパ球浮遊液を１ｍｌの洗浄P3X3.Ag8.653細胞と６０ｍｍの組織培養皿（Falcon）で混合した。この組織培養皿をマイクロタイタープレート支持器（Beckman Instruments,パロアルト、CA）に置いて２５０×ｇ（１２００ｒｐｍ、ＴＪ−６遠心器）で５分遠心して培養皿の底に粘着した単層細胞を得た。上清を皿から吸引し、５０％ポリエチレングリコール（PEG1500,Boehringer Mannheim）を含む１ｍｌのＩＭＤＭを手際よく加えた。ＰＥＧ溶液は４ｍｌのＰＥＧ１５００および４ｍｌのＩＭＤＭを別々に６０℃の水槽中で温め、ＰＥＧをピペット中に吸引し続いてＩＭＤＭを吸引して一緒にし、さらに十分に混合して調製した。室温で３０秒してから、培養皿に５ｍｌの血清非含有ＩＭＤＭを加えた。
融合させる日に最後の洗浄を施した後、細胞を６０ｍｍの培養皿にＦＣＳを含む５ｍｌのＩＭＤＭ培養液とともに５％ＣＯ₂下に３７℃１２時間放置した。次の日に２０％ＦＣＳおよび１×ＨＡＴ培養液（Boehringer Mannheim,NJ）を含む１００ｍｌのＩＭＤＭで融合細胞を希釈し、９６ウェルの平底プレートにウェル当たり１００μｌ加えた。５から９日後、さらに５０μｌの培養液を各ウェルに加えた。その後、３日間隔で５０μｌの培養液を取り除き、新しい培養液を加えた。細胞数がウェル当たり１０００−５０００の範囲になったら、ＣＴＬＡ−４Ｉｇに対する反応性とＣＤ４Ｉｇに対する反応欠如について上記（ｂ）で述べたようにハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡで調べた。ＥＬＩＳＡではハイブリドーマ上清は希釈せずに用いた（５０μｌ／ウェル）。
陽性ウェルのハイブリドーマを照射マウス胸腺細胞の養育細胞層（Feeder layer）の存在下で限界希釈によって繰り返しクローニングした。単クローン性抗体（抗体９Ｈ１０と称する）を分泌するハイブリドーマ株は以下の基準で選別した。１）ＥＬＩＳＡでＣＴＬＡ−４Ｉｇに対する反応性を有するが、ＣＤ４Ｉｇに対しては反応性をもたない；２）Ｂ７核酸感染体へのＣＴＬＡ−４Ｉｇ結合を遮断する能力を有する；３）活性化Ｔ細胞を染色する能力を有するが新鮮な分離Ｔ細胞を染色しない；および４）ＣＴＬＡ−４核酸感染体を染色する能力を有するがコントロールの核酸感染体を染色しない。
Ｂ７核酸感染体へのＣＴＬＡ４Ｉｇ結合を遮断する抗体９Ｈ１０の能力は以下のようにして明らかにした。約１０μｌのｍＡｂ９Ｈ１０を１μｇのＣＴＬＡ−４Ｉｇ融合蛋白とともに最終容積５０μｌのＰＢＳを含む溶液中で２２℃３０分保温した。この混合物に１％ウシ血清および０．０５％アジ化ナトリウムを含む氷冷ＰＢＳ１０μｌに懸濁した２×１０⁵Ｂ７−ＥＬ−４細胞を加えた。Ｂ７−ＥＬ−４細胞は、タウンセンドら（Townsendら、Cancer Res.54:6477-83（1994））の報告にしたがって、マウスＢ７細胞表面蛋白をコードする発現ベクターを核酸感染させたＣ５７ＢＬ／６由来ＥＬ４胸腺腫細胞株である。
続いて得られた混合物を氷上で３０分インキュベートし、続いて１％ウシ血清および０．０５％アジ化ナトリウムを含む１０μｌのＰＢＳで４ｍｌ／回で２回洗浄した。さらに細胞をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合抗ヒトＩｇＧ（Caltag,サウスサンフランシスコ、CA）で染色した。この実験の陰性コントロールとしてＣＴＬＡ−４Ｉｇ融合蛋白をコントロールのハムスターＩｇＧまたはＥＬ−４親細胞株のいずれかとともに保温した。細胞をＦＡＣＳｃａｎ（BectonDickinson,マウンテンビュー、CA）で調べた。関連細胞の電子的ゲート作動にはＬＹＳＩＳＩＩプログラム（Becton Dickinson）を用いた。ほとんどの実験で、分析には１００００件の明白なゲート作動を集めた。結果は、９Ｈ１０抗体はＢ７−ＥＬ−４細胞へのＣＴＬＡ−４結合を遮断することを示した。
新しく分離されたＴ細胞は染色しないが活性化Ｔ細胞を染色する９Ｈ１０抗体の能力は、以下のようにして明らかにした。新鮮な脾細胞および活性化脾細胞を作製した。４−６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓を採取して細切し、当技術分野で標準的な技術（Mishell & Shiigi,細胞性免疫学の選別方法（Selected Methods in Cellular Immunology）,W.H.Freeman & Co.,サンフランシスコ（1980）pp.23-24）にしたがって、浮遊液を溶血性ゲイ液で処理して赤血球を除去した。細胞集団の一部分を活性化させるために１０μｇ／ｍｌで添加した可溶性抗ＣＤ−３抗体とともに１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩで細胞を培養した。その他の脾細胞集団は抗ＣＤ３抗体で処理せず新鮮な脾細胞（しかし活性化されていない脾細胞）を代表する。続いてこの２つの細胞集団を次のいずれかで染色した：１）ＦＩＴＣ結合９Ｈ１０（抗ＣＴＬＡ−４抗体、５μｇの抗体）およびＰＥ結合Ｔｈｙ１．２の組合せ、または２）ＦＩＴＣ結合ハムスターＩｇおよびＰＥ結合Ｔｈｙ１．２の組合せ。結果はＦＡＣＳｃａｎで分析し、関連Ｔ細胞集団のみを分析するためにＴｈｙ１．２陽性細胞についてのみ電子的にゲート作動させた。この実験の結果は、９Ｈ１０抗体は活性化（すなわちＣＴＬＡ−４発現）Ｔ細胞を染色するが新鮮な分離Ｔ細胞は染色しないことを示した。
ＣＴＬＡ−４核酸感染体を染色するがコントロール核酸感染体は染色しない９Ｈ１０抗体の能力は以下のようにして明らかにされた。親ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣（Chinese Hamster Ovary）、ＣＨＯ−Ｋ１細胞）細胞株（ATCC CCL61）をpSR1neo.CTLA-4で核酸感染させた。pSR1neo.CTLA-4は、pSR1neo発現ベクターに挿入されたマウスＣＴＬＡ−４蛋白をコードする完全な１．９ｋｂのｃＤＮＡ（Brunetら、Nature 328:267（1987））を含む。pSR1neo.CTLA-4ベクターを核酸感染させた細胞は、細胞表面にマウスＣＴＬＡ−４蛋白を発現する。
親（すなわちＣＨＯ−Ｋ１細胞）および核酸感染細胞を次のいずれかで染色した：１）ＦＩＴＣ結合９Ｈ１０（抗ＣＴＬＡ−４抗体、５μｇの抗体）およびＰＥ結合Ｔｈｙ１．２の組合せ、または２）ＦＩＴＣ結合ハムスターＩｇおよびＰＥ結合Ｔｈｙ１．２の組合せ。データは、関連Ｔ細胞集団のみを分析するためにＴｈｙ１．２陽性細胞について電子的にゲート作動させた。この実験の結果は、９Ｈ１０抗体はＣＴＬＡ−４核酸感染体を染色するがコントロール核酸感染体は染色しないことを示した。
上記の結果は、９Ｈ１０単クローン性抗体は特異的にマウスＣＴＬＡ−４蛋白と反応することを明示した。
実施例２
抗ＣＴＬＡ−４単クローン性抗体はマウスでV51BLim10腫瘍の拒絶を惹起する
抗マウスＣＴＬＡ−４単クローン性抗体（９Ｈ１０）を大腸癌細胞株を注射したマウスを処置するために用いた。V51BLim10腫瘍細胞とともに９Ｈ１０ｍＡｂを注射することによって、この実験動物では腫瘍細胞の完全な拒絶がもたらされた。対照的に、抗ＣＤ２８ｍＡｂおよびV51BLim10細胞を注射したマウス、またはV51BLim10細胞のみを注射したマウスはともに腫瘍が発生し、平均的な腫瘍サイズで４週間にわたって安定した増殖を示した。
ａ）V51BLim10細胞株の作製
V51BLim10細胞株を51BLim10細胞株にSR1neo発現ベクターを核酸感染させて作製した。51BLim細胞株は大腸癌細胞株で、ヒトの大腸癌転移について正確な動物モデル提供する（Bresalierら、Cancer Res.47:1398（1987））。
本実験に用いるV51BLim10細胞株は以下のようにして作製した。コーベットら（Corbettら、Cancer Res.35:2434-9（1975））が樹立したネズミ大腸癌細胞株５１ＢをＢＡＬＢ／ｃマウスの盲腸壁に注射した。得られた大腸癌は注射マウスの少数の肝臓に偶発的に転移することが見出された（Bresalierら、Cancer Res.47:1398（1987））。転移活性が次第に増加する腫瘍細胞株が最初の転移から細胞を採集することによって確立された。続いてこれを用いて新たなマウスの盲腸に連続して再注射した。これらの細胞株を51BLim-1から51BLim-5と名付けた。ダッシュの後の数字は転移サイクルの数である。
ウォーレン博士（Dr.Warren,カリフォルニア大学サンフランシスコ校）から入手した５１Ｂ転移派生株は51BLim10と呼んだ。51BLim10細胞株はブレサリエら（Bresalierら、Cancer Res.47:1398（1987））が記載した51BLiM5細胞株に対応する。
SR1neo発現ベクターを51BLiM-10細胞株に核酸感染させて、記載（Townsendら、Cancer Res.54:6477-83（1994））にしたがってV51BLim10細胞株を作製した。SR1neo発現ベクター（ラニエ（L.Lanier,DNAX Research Institute of Molecular and Cellular Biology,パロアルト、CA））より入手）はＨＴＬＶ−１ＬＴＲの転写制御下で問題の遺伝子の発現を可能にする。SR1neoベクターはまた、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーの転写制御下にあるｎｅｏ遺伝子を含む。ｎｅｏ遺伝子の存在はSR1neoベクターを含む核酸感染細胞の選別を可能にする。
SR1neo発現ベクターを51BLiM-10細胞にＢＴＸＴ８００電気穿孔器（BTX,Inc.,サンディエゴ、CA）を用いて電気穿孔によって核酸感染させた。４５０または６００Ｖで各々９９μｓ、５パルスで実施した。電気穿孔は、２７０ｍＭ蔗糖、７ｍＭのＮａＰＯ₄（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＭｇＣｌ₂、５×１０⁶51BLim-10細胞および５０μｇのSR1neo発現ベクターを含む溶液を最終反応容積７５０μｌで用いて実施した。電気穿孔の後、細胞を完全な培養液（イーグルＭＥＭ（カリフォルニア大学サンフランシスコ校細胞培養施設、サンフランシスコ、CA））で２４時間３７℃で培養した。この完全培養液には、１０％ウシ胎児血清（Sigma）、非必須アミノ酸、ＭＥＭビタミン溶液、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ゲンタマイシン（全てIrvine Scientificより入手、サンタアナ、CA））および７．５％重炭酸ナトリウム（Sigma）が補充されていた。選別培地は１ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（Geneticin）（G418硫酸塩、GIBCO,グランドアイランド、NY）を含む完全な培養液である。選別培養液で１４日間培養した後、薬剤耐性細胞を集め、V51BLim10細胞と称する多クローン性集団としてこの後の実験に用いた。
V51BLim10腫瘍細胞はイーグルＭＥＭ（カリフォルニア大学サンフランシスコ校細胞培養施設、サンフランシスコ、CA）で維持した。この培養液には１０％ウシ胎児血清（Sigma）、非必須アミノ酸、ＭＥＭビタミン溶液、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ゲンタマイシン、ペニシリン−ストレプトマイシン（全てIrvine Scientificより入手、サンタアナ、CA））および１ｍｇ／ｍｌのジェネティシンを補充した。細胞培養は、低継代（すなわち１０継代未満）凍結標本から樹立し、使用前に３０日以上の培養維持は行わなかった。
V51BLim10細胞および親51BLim10細胞は同様なインビトロおよびインビボ増殖速度を示すことが分かった。V51BLim10細胞のネオマイシン耐性遺伝子の発現および様々な他の細胞株は、注射細胞に由来する腫瘍の腫瘍原性または腫瘍の増殖速度に影響を与えなかった。
ｂ）V51BLim10腫瘍細胞および単クローン性抗体のマウスへの注射
V51BLim10腫瘍細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ（Sigma）で組織培養プレートから採取し、血清非含有培養液（イーグルＭＥＭ）で３回洗浄し、濃度２×１０⁷細胞／ｍｌで浮遊液とした。
この実験に用いたマウスは６−８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（Charles River Laboratories,ウィルミントン、MA）であった。５匹ずつのマウスのグループをメトキシフルラン吸入で麻酔して固体特定のために耳に印を入れ、２００μｌのV51BLim10腫瘍細胞浮遊液（４×１０⁶）を左の大腿部外側の皮下に注射した。処置群には１００μｇの上記抗ＣＴＬＡ−４ｍＡｂ、９Ｈ１０、または抗ＣＤ２８ｍＡｂ、３７．５１の腹腔内注射を同日に実施し、さらに腫瘍細胞注射後３日および６日にまた別に５０μｇを腹腔内注射した（図１には黒い矢印で示す）。単クローン性抗ＣＤ２８抗体、３７．５１はマウスＣＤ２８蛋白に対して作製し（Grossら、J.Immunol.149:380（1992））、陰性コントロールとして用いた。
マウスの皮下腫瘍増殖をモニターし、切除した成長腫瘍の直径をカリパスで測定した。未処置のマウス、または抗ＣＤ２８抗体処置マウスの全ては次第に腫瘍が成長し、接種後３５日で安楽死を必要とした。対照的に、抗ＣＴＬＡ−４抗体処置マウスは全て、短い限定的増殖期間の後で腫瘍を完全に拒絶した。図１Ａに示したように、ｍｍ²で示す平均腫瘍面積（ｙ軸）は、腫瘍注射後１４日（ｘ軸）から開始し約２４日で０に達するまで徐々に減少する。抗ＣＴＬＡ−４処置はより低い腫瘍投与量では効果が少ない。図１Ｂは、２×１０⁶腫瘍細胞を注射し、抗ＣＴＬＡ−４抗体または無関係のハムスター抗体で上記のように処置したマウスでの平均腫瘍サイズを示している。抗ＣＴＬＡ−４抗体処置は腫瘍増殖に対して劇的な作用を持ち続けたが、あるマウスでは腫瘍は急速に成長し、別のマウスではよりゆっくりと成長した。図１Ｃは、２×１０⁶のV51BLim10細胞を注射したマウスの個々の増殖を示している。マウスのうち３匹は８０日以上も腫瘍を発生させなかった。ＣＴＬＡ−４遮断はＢ７陰性腫瘍の拒絶を顕著に高めることは明白である。
ｃ）B7-V51BLim10腫瘍細胞と単クローン性抗体のマウスへの注射
51BLim10細胞にネズミＢ７−１の遺伝子を含むプラスミドを上記のように核酸感染させ、限界希釈によってクローニングした。B7-51BLim10腫瘍細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ（Sigma）で組織培養プレートから採取し、血清非含有培養液（イーグルＭＥＭ）で３回洗浄して２×１０⁷細胞／ｍｌで懸濁させた。
この実験に用いたマウスは６−８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（Charles River Laboratories,ウィルミントン、MA）であった。５匹ずつのマウスのグループをメトキシフルラン吸入で麻酔して固体特定のために耳に印を入れ、１００μｌのB7-51BLim10腫瘍細胞浮遊液（４×１０⁶）を左の大腿部外側の皮下に注射した。処置群には１００μｇの上記抗ＣＴＬＡ−４ｍＡｂ、９Ｈ１０、または抗ＣＤ２８ｍＡｂ、３７．５１を腹腔内注射した。１００、５０および５０μｇの注射をそれぞれ０日、３日および６日目に与えた（注射日は図２で黒い矢印で示されている）。単クローン性抗ＣＤ２８抗体、３７．５１はマウスＣＤ２８蛋白に対して作製し（Grossら、J.Immunol.149:380（1992））、陰性コントロールとして使用した。
マウスの皮下腫瘍増殖をモニターし、切除した成長腫瘍の直径をカリパスで測定した。この実験の結果は図２に示す。抗ＣＴＬＡ−４抗体による処置は、抗ＣＤ２８抗体およびコントロール群と比較してB7-51BLim10腫瘍細胞を抑制した。未処置、または抗ＣＤ２８抗体処置群のマウスは全て、５から１０日間に次第に成長する小さな腫瘍を生じた。続いてこの腫瘍は１０匹のマウスのうち８匹で注射後約２３日で完全に退縮した。退縮しなかった２つの小さな腫瘍は９０日間にわたって安定していた。対照的に、抗ＣＴＬＡ−４抗体で処置した５匹のマウスのうち３匹では極めて小さな腫瘍が成長し、さらにこれらの腫瘍の全ては１７日目までに完全に退縮した。
ｄ）抗ＣＴＬＡ−４誘発V51BLim10腫瘍細胞拒絶はその後の野性型大腸癌細胞のチャレンジに対して防御を生じる
完全にV51BLim10腫瘍細胞を拒絶した５匹の抗ＣＴＬＡ−４処置マウスに、４×１０⁶の野性型51BLim10腫瘍細胞を反対側の大腿部外側の皮下に注射して７０日後に再チャレンジした。コントロールとして５匹の無傷のマウスにもまた注射した。腫瘍の直径を測定し、記載したように記録した。無傷のコントロールと比較して、以前に腫瘍を拒絶したものは第二のチャレンジに対して顕著な防御を生じた。全てのコントロールマウスは次第に増殖する腫瘍を成長させ、大きな腫瘍塊を生じ、接種後３５日目に安楽死させた。以前に免疫した５匹のマウスのうち３匹はチャレンジ後７０日間腫瘍を持たなかった。以前に免疫したマウスのうち１匹のみが１４日目に検出可能な腫瘍を有し、この腫瘍の増殖は極めて緩徐であった。最終的には、チャレンジ後４２日目にさらに２つの腫瘍が免疫マウスで発生した。結果は図３に示す。これらの結果はＣＴＬＡ−４遮断により仲介される腫瘍拒絶は免疫の記憶を生じることを示している。
ｅ）抗ＣＴＬＡ−４処置は定着腫瘍の増殖を低下させる
マウスのグループに２×１０⁶51BLim10腫瘍細胞を皮下注射した。図４の上向きの矢印で示したように、コントロール動物（ｎ＝１０）には０、３、６および９日目に無関係のハムスター抗体１００μｇを腹腔内注射した。１つの抗ＣＴＬＡ−４処置群には同じ日に腹腔内注射を実施した。他の処置マウス（ｎ＝５）にはＣＴＬＡ−４抗体の腹腔内注射を７日目に開始し、続いて１０、１３および１６日目（下向き矢印）に注射を実施した。結果は図４に示す。いずれかの時点で抗ＣＴＬＡ−４抗体で処置したマウスでは未処置コントロールと比較して腫瘍の増殖が顕著に低下した。５匹のマウスのうち２匹は接種後３０日を越えても腫瘍を発生させず、より遅い処置は一層効果的であるように思える。
ｆ）抗ＣＴＬＡ−４処置はネズミの線維肉腫ＳＡ１Ｎの増殖を低下させる
抗ＣＴＬＡ−４による処置の効果は癌細胞株に限定されない。同様な結果が急速に増殖するＡ／ＪＣｒマウスの線維肉腫細胞株で得られた。マウスのグループに１×１０⁶のＳＡ１Ｎ線維肉腫細胞浮遊液を皮下注射した。処置群には１００μｇの抗ＣＴＬＡ−４または無関係のハムスターコントロール抗体を図５の矢印で示すように０、３および６日目に腹腔内注射した。全てのコントロール動物は３０日目までに死亡した。５匹の抗ＣＴＬＡ−４処置動物のうち２匹は５５日目には腫瘍を認めなかった。結果は図５に示す。
実施例３
抗ＣＴＬＡ−４単クローン性抗体はアジュバントとして機能する
ａ）免疫原の調製
ＤＮＰ−ＫＬＨはカルビノケム（Calbinochem,サンディエゴ、CA）から入手し、脱イオン水に１ｍｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌまたは１０ｐｇ／ｍｌで懸濁させた。フロイントの完全アジュバント（Difco,MI）１ｍｌをＤＮＰ−ＫＬＨ調製物の各１ｍｌに加えた。続いて、成書（「免疫学の最新プロトコル（Current Protocols in Immunology）」、Colliganら編、2.4節）に記載されているように、両端型ルアーロック連結器で連結した２本の５ｍｌ容量の注射器内を迅速に通過させてこれらを乳化させた。
免疫原を注射する３０分前に、２００μｇの非特異的コントロールハムスター抗体または２００μｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体９Ｈ１０（ともに全容量２００μｌ）を４−６週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスに２３ゲージの注射筒を用いて腹腔内に注射した。続いて、上記の形態の免疫原２００μｌをマウスの背中の２か所に２１ゲージの注射筒を用いて皮下注射した。投与用量はそれぞれ１００μｇ、１０μｇまたは１ｐｇ／マウスであった。
最初の処置の後１０日して動物を安楽死させた。心臓穿刺で血液を採取し、エッペンドルフ管に移した。これらのサンプルを４℃で一晩凝固させ、続いて遠心して血清を得た。
上掲書（「免疫学の最新プロトコル」、2.1節）に記載されているように、標準的なアイソタイプＥＬＩＳＡを用いてＤＮＰを認識するアイソタイプ特異的抗体について血清を調べた。簡単に記せば、９６ウェルのコーニング改造丸底ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００ｎｇ／ｍｌのＤＮＰ（５０μｌ容量）を入れた。ウェルを記載にしたがって緩衝液を用いて遮断した。各血清の３倍段階希釈（１：１００から開始）を各ウェルに添加する。これらを２５℃で１時間保温し、洗浄用緩衝液で洗浄した。アイソタイプは、遮断緩衝液５０μｌ中の１μｇ／ｍｌのマウス特異的抗体を検出剤として用い１時間保温して検出した。アイソタイプ抗体はビオチン付加し、検出はアビジンセイヨウワサビペルオキシダーゼと保温し、洗浄してペルオキシダーゼ基質（ABTS,Sigma,Mo.）を添加して実施する。停止緩衝液を加え、反応停止後５−８分以内に各ウェルの吸収を４９０−４９８ｎｍの波長でＥＬＩＳＡ読み取り装置で読み取った。
結果は図６に示す。各々のパネルは、異なるアイソタイプの血清サンプル中の濃度を示す。ｙ軸はＯＤの読みを示し、この場合ＯＤの増加は当該アイソタイプを含む血清中の抗体濃度の増加を示す。ｘ軸は注射された抗原量、動物につきそれぞれ１００μｇ、１０ｎｇまたは１ｐｇを示す。抗ＣＴＬＡ−４抗体は、より大きい用量の抗原でＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂへのクラス切り換えを高めることが分かる。
Ｔ細胞機能の分析は以下のように実施される。リンパ節細胞を分離し、ＫＬＨで７２時間インビボで刺激する。完全ＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ（Hyclone,モンタナ）、２ｍＭグルタミン、５０μＭのβ−メルカプトエタノール、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン）を含む培養皿に腋窩、鼠径部、腸間膜、上腕、頸部および膝窩リンパ節を取り出した。このリンパ節を細切して単一細胞浮遊液を得た。これをナイテックス（nytex）メッシュに通して濾過し、個々の微粒子を除去して血球計算盤で計測した。細胞を５×１０⁵、２．５×１０⁵または１．２５×１０⁵細胞／ウェルのいずれかで９６ウェルの丸底クラスタープレートに入れた１５０μｌの完全ＲＰＭＩに播種した。完全ＲＰＭＩ中のＫＬＨ溶液を最終濃度１００、１０、１または０μｇ／ｍｌで加え、プレートを湿潤インキュベーターで５％ＣＯ₂とともに３７℃で６４時間保温した。６４時間後、１μＣｉの³Ｈ−チミジンを含む完全ＲＰＭＩの２０μｌを各ウェルに加え、さらにこのプレートをまた８時間保温した。この時点でイノテック（Inotech）９６ウェル採取器を用いてガラス線維フィルター上に培養を採取した。フィルターを乾燥させ、パッカード（Packard）マトリックスカウンターを用いて計測した。各条件につき３組ずつで実施し、結果は３組の値の平均値を示す。
結果を図７に示す。最上段は抗原濃度（ｘ軸に示す）を変化させ細胞数を一定（５×１０⁵細胞）にしたものを示す。ｙ軸は³Ｈ−チミジンの取り込み（細胞増殖の測定）を示す。下方のパネルは細胞数を変動（ｘ軸に示す）させ抗原濃度を一定にした（１０μｇ／ｍｌ）ものを示す。結果は、ＣＴＬＡ−４遮断によってより大きい抗原用量に対してＴ細胞反応は強いアップレギュレーションを受けることを示している。
実施例４
ヒトＣＴＬＡ−４蛋白に対して誘導された抗体の作製
抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体は以下のように作製される。
ａ）ホスト動物免疫用ヒトＣＴＬＡ−４蛋白
ヒトＣＴＬＡ−４蛋白を含む免疫原はヒトＣＴＬＡ−４蛋白の細胞外ドメインの全部または一部分を含む。ヒトＣＴＬＡ−４蛋白の細胞外ドメインは、データベース参照に挙げたようにアミノ酸残基３８−１６１を含む。
ヒトＣＴＬＡ−４免疫原は完全なヒトＣＴＬＡ−４蛋白を含むか、またはヒトＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインおよびその融合相手を含む融合蛋白を含む。この免疫原は細胞の膜に挿入された完全なヒトＣＴＬＡ−４蛋白を含み、ヒトＣＴＬＡ−４蛋白をその表面に発現している細胞はホスト動物の免疫に用いられる。
ヒトＣＴＬＡ−４蛋白の部分を含む免疫原はＰＣＲを用いて、Ｈ３８細胞（ＨＴＬＶＩＩ付随白血病株（R.Gallo,アメリカ国立癌研究所））由来ｍＲＮＡからヒトＣＴＬＡ−４蛋白をコードするＤＮＡ配列を増幅して作製される。このｍＲＮＡは逆転写されて第一鎖ｃＤＮＡを生じる。このｃＤＮＡを続いて増幅させる。文献（Linsleyら、J.Exp.Med.174:561（1991））に記載されたようにこれらの配列を融合相手をコードする配列に連結する。発現ベクターはＣＴＬＡ４Ｉｇと称する融合タンパクをコードする。この融合蛋白は、アミノ末端からカルボキシ末端に向かってオンコスタチンＭ由来のシグナルペプチド、ヒトＣＴＬＡ−４の細胞外ドメイン並びにヒトＩｇＧ１のＨ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。オンコスタチンＭのシグナルペプチドは天然に存在するヒトＣＴＬＡ−４シグナルペプチドの代わりに用いられる。ＣＴＬＡ−４Ｉｇ蛋白をコードするベクター構築物では、ヒトＩｇＧ１分子の野性型ヒンジドメインに見出されるシステイン残基はセリンに変異させられた（Linsleyら、上掲書）。
ｂ）ヒトＣＴＬＡ−４蛋白によるホスト動物の免疫
ヒトＣＴＬＡ−４蛋白を含む免疫原で動物を免疫するために非ヒトホスト動物が用いられる。ヒトＣＴＬＡ−４／ＩｇＧ融合蛋白（例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ）を含む免疫原は、実施例１ｂで述べたように加熱殺菌黄色ブドウ球菌Ａ（StaphA）菌体を被覆するために用いられる。０．２ｍｌのＰＢＳに懸濁させた約１００μｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇで被覆した加熱殺菌StaphA菌の50μｌ（集積容積）を６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの足裏に注射する。
マウスにつき総計５回の注射を施す。最後の追加免疫の日に注射前に、実施例１ｂに記載したように約１００μｌの血清を眼内採血によって得る。この血清を最初の注射前に同じ方法で得た血清（すなわち免疫前血清）とともに分析する。
ヒトＣＴＬＡ−４Ｉｇ結合ＥＬＩＳＡを用いて、免疫後採血血液中のヒトＣＴＬＡ−４Ｉｇ融合蛋白を認識する抗体の存在を明らかにする。ＥＬＩＳＡプレートをヒトＣＴＬＡ−４蛋白で被覆するという点を除いて、ヒトＣＴＬＡ−４Ｉｇ結合ＥＬＩＳＡを上記の実施例１ｂで述べたように実施する。
ヒトＣＴＬＡ−４Ｉｇ融合蛋白を認識する抗体を免疫後採血血液中に、バックグラウンドで検出される希釈よりもはるかに高希釈である１０００倍希釈で含む免疫マウスの血清およびリンパ節を採集する。免疫マウスの流入領域リンパ節からリンパ球を調製し、続いて実施例１ｃで述べたようにヒトＣＴＬＡ−４蛋白に対して誘導された単クローン性抗体を作製するために用いる。
その細胞表面にヒトＣＴＬＡ−４蛋白を発現している形質転換細胞を含む免疫原は以下のように調製される。完全なヒトＣＴＬＡ−４蛋白をコードする発現ベクターを用いてマウスリンパ腫細胞株ＥＬ４（ATCC TIB39）を核酸感染させる。１×１０⁶から１×１０⁷核酸感染細胞／注射で核酸感染ＥＬ４細胞をマウスに注射する。核酸感染細胞はＰＢＳを含む溶液で注射する。マウスの腹腔内または後肢の足裏のいずれかに注射できる。腹腔内注射を施す場合、総計約４回の注射を実施する。注射部位として足裏を用いる場合は、総計約５回の注射を施す。血清を免疫動物から採集し、プレートをヒトＣＴＬＡ−４蛋白で被覆するという点を除いて、実施例１ｂに述べたようにＥＬＩＳＡを用いてヒトＣＴＬＡ−４蛋白に対して誘導された抗体の存在を検査する。
ｃ）抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体を分泌するハイブリドーマ株の分離
リンパ球は、ヒトＣＴＬＡ−４免疫原で免疫した動物の脾臓または流入領域リンパ節から分離し、実施例１ｃで述べたようにＰＥＧ融合プロトコルを用いてP3X3.Ag8.653細胞と融合させてハイブリドーマ細胞株を作製する。１０００−５０００細胞／ウェルを含むウェルから得た培養上清を、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてヒトＣＴＬＡ−４に対する反応性および非ＣＴＬＡ−４蛋白（例えばヒトＣＤ４）に対する反応性の欠如について検査する。
陽性ウェルから得たハイブリドーマを実施例１ｃで述べたように限界希釈によって繰り返しクローニングする。ヒトＣＴＬＡ−４蛋白とは反応するが無関係のヒト蛋白（例えばヒトＣＤ４）とは反応せず、さらにヒトＣＴＬＡ−４核酸感染体を染色するがコントロール核酸感染体は染色しない単クローン性抗体を分泌するハイブリドーマ株を抗ヒトＣＴＬＡ−４単クローン性抗体の産生について選別する。
実施例５
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の生体外刺激
ホスト細胞を生体外で刺激し、それらを腫瘍特異的免疫エフェクター細胞に分化させる。続いてこれらの細胞を同じホストに再導入し、抗癌治療作用を仲介させる。
ａ）腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の分離
腫瘍浸潤リンパ球は標準的な技術を用いて得られる。固形腫瘍（新しく切り出すかまたは凍結保存する）を一晩酵素によって消化（例えば０．０１％ヒアルロニダーゼＶ型、０．００２％ＤＮアーゼＩ型、０．１％コラゲナーゼＩＶ型（Sigma,セントルイス）および抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０中で室温で一晩攪拌）して単一細胞浮遊液に分散させる。続いて腫瘍浮遊液をフィコール・ハイパーク（Ficoll-Hypaque）勾配（リンパ球分離媒体、Organon Teknika Corp.,Durham,NC）を通す。勾配の境界は生きた腫瘍細胞を含む。単核細胞を洗浄し、全細胞濃度を２．５から５．０×１０⁵細胞／ｍｌに調整し、完全培養液で培養する。完全培養液は、熱不活化させた型適合ヒト血清１０％、ペニシリン５０ＩＵ／ｍｌおよびストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ（Biofluids,ロックビル、MD）、ゲンタマイシン５０μｇ／ｍｌ（GIBCO Laboratories,Chagrin Falls,OH）、アンホテリシン２５０ｎｇ／ｍｌ（Funglzone,Squibb,Flow Laboratories,マックリーン、VA）、ＨＥＰＥＳ緩衝液１０ｍＭ（Biofluids）並びにＬ−グルタミン２ｍＭ（MA Bioproducts,Walkersville,MD）を含有するＲＰＭＩを含む。自己由来または同種異系リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞（下記参照）の３−４日培養から得た条件付け培地を最終濃度２０％（ｖ／ｖ）で加える。組換えＩＬ−２を最終濃度１０００Ｕ／ｍｌで添加する。
培養は５％ＣＯ₂の湿潤な雰囲気下で３７℃で維持する。細胞を採取し沈澱させ新鮮な培養液に２．５×１０⁶細胞／ｍｌで再浮遊させることによって培養を毎週液交換する。最初の培養期間（例えば２から３週間）を過ぎるとリンパ球は選択的に増殖し、一方残存する腫瘍細胞は典型的には完全に消失する。
ＬＡＫ細胞培養を作製するために、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を患者または健常ドナーから入手する。フィコール・ハイパーク勾配を通した後、２％ヒト血清、抗生物質、グルタミンおよびＨＥＰＥＳ緩衝液を含むＲＰＭＩ１６４０で１×１０⁶／ｍｌの濃度で細胞を培養する。組換え体ＩＬ−２を１０００Ｕ／ｍｌで添加する。培養を湿潤な６％ＣＯ₂雰囲気中で３７℃で３から７日間維持する。
ｂ）ＴＩＬの生体外刺激
抗ＣＴＬＡ−４ｍＡｂを含む培養液２ｍｌ中の１×１０⁶細胞を２４ウェルプレートのウェルの中で５％ＣＯ₂雰囲気中で３７℃で２日間保温する。培養液は、１０％熱不活化ウシ胎児血清、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１μＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭの新しく調製したＬ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、０．５μｇ／ｍｌのファンギゾン（全てGIBCO（グランドアイランド、NY）より入手）および５×１０^-5Ｍの２−ＭＥ（Sigma）を補充したＲＰＭＩ１６４０培養液を含む。細胞を採取し洗浄する。
組換え体ＩＬ−２（Chiron Corp.,（Emeryville,CA）より入手可能、比活性６から８×１０⁶Ｕ／ｍｇ、２−３国際単位に匹敵する単位）を含む２ｍｌの培養液中で、初めに刺激した細胞を３×１０⁵／ウェルでさらに培養する。ＩＬ−２中で３日間保温した後、細胞を採集し洗浄して増殖の程度を決定するために細胞を数え、さらに静脈内投与に適した媒体（例えば生理学的緩衝食塩溶液）に再浮遊させる。この活性化細胞を再注入する前に、細菌の夾雑の有無を決定するために細菌の培養を実施する。
活性化ＴＩＬを注射に適した培養液に再浮遊させた後、ホストの静脈にアクセスして細胞浮遊液を注入する。場合によって、刺激細胞のインビボ機能および生存を高めるためにホストを薬剤（例えばＩＬ−２）で処理する。
実施例６
本実験では、超抗原、黄色ブドウ球菌内毒素Ｂ（ＳＥＢ）に対するインビトロおよびインビボでのＴ細胞集団の反応におけるＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４シグナルの影響を調べた。結果は、ＣＤ２８はインビトロでのＳＥＢ反応に対して重要な同時刺激を提供すること、さらにＣＴＬＡ−４を介するシグナルはこの反応を抑制することを示した。インビボでは、ＦＡｂフラグメントまたは完全な抗体によるＣＤ２８の遮断は、Ｖβ８＋増大において抗ＣＴＬＡ−４ＦＡｂフラグメントまたは完全な抗体による同様な遮断と反対の作用を有する。この増大の動態の分析によって、ＣＤ２８を介するシグナルはＴ細胞増大を促進し、一方、ＣＴＬＡ−４を介する反対のシグナルはＴ細胞増大時にＳＥＢに対する反応規模を減弱させるように機能することが暗示される。
方法
ネズミ
４−５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスをチャールズリバーから購入し３週間以内に使用した。
抗体および試薬
クローン37.N.51.1由来のハムスター抗マウスＣＤ２８（Grossら、J.Immunol.149:380（1992））、クローン9H10.11D3由来のハムスター抗マウスＣＴＬＡ−４（Krummel & Allison,J.Exp.Med.182 59（1995））、クローン1610.A由来ハムスター抗マウスＢ７−１（Razi-Wolfら、J.Exp.Med.89:4210（1992））、ラット抗マウスＢ７−２（クローンＧＬ−１由来（Hathcockら、Science 262:905（1993））およびクローンF560.31由来の無関係のハムスターＩｇＧは本出願人らの施設で腹水から精製した。ＦＡｂフラグメントは標準的な方法によって固定パパイン（Pierce,ロックフォード、IL）による消化によって作製し、未消化の抗体は蛋白Ａ吸着によって除去した。全てのＦＡｂフラグメントを使用前にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。抗ＣＤ２８ＦＡｂの純度は、アロ−ＭＬＲ中でのＴ細胞増殖阻止能力について機能的にアッセイすることによってさらに検査した。抗Ｖβ８．１，８．２ＦＩＴＣ（クローンＭＲ５−２）はファーミンゲン（Pharmingen,サンディエゴ、CA）から入手した。
インビトロアッセイ
全く実験に使用していない動物から得た脾臓を細切して浮遊液を作製し、ＲＢＣをグレイ溶液で低張処理して溶血させ、続いてＰＢＳで２回洗浄した。２×１０⁵の脾細胞を２００μｌのＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ、５０μＭのβ−メルカプトエタノール、２ｍＭのグルタミンおよび５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含む）中で９６ウェルの丸底プレートに播種した。ＳＥＢを表示濃度で加えた。表示がある場合は抗ＣＤ２８は腹水の１：１０００希釈で、抗Ｂ７−１は５μｇ／ｍｌで、抗Ｂ７−２は２０μｇ／ｍｌで、さらに非特異的コントロール抗体560.31はそれらに匹敵する量で加えた。ＦＡｂ実験では、抗ＣＤ２８、抗ＣＴＬＡ−４またはコントロールＦＡｂフラグメントは１００μｇ／ｍｌで加えた。培養は３７℃で６０時間保温し、１μＣｉの³Ｈチミジンでパルスし、採取前にさらに１２時間保温した。
インビボＳＥＢ反応
マウスの腹腔内に２００μｇの抗体（表示がある場合）を含むＰＢＳ２００μｌを注射した。１−２時間してから、動物につき５０μｇのＳＥＢ（Toxin Technologies,サラソタ・Fl）を含むＰＢＳまたはＰＢＳのみを全容積１００μｌで静注した。
フローサイトメトリー
Ｖβ８発現細胞集団を調べるために、脾臓を細切して浮遊液を作製し、ＲＢＣを低張グレイ溶液で溶血させた。得られた細胞を続いて５ｍｌのＲＰＭＩ−１０％ＦＣＳに再浮遊させ、３組ずつの部分標本を血球計算盤を用いて数えた。この方法の標準誤差は通常平均値の１０％以内であった。染色のために、一部分を０．０１％ＮａＮ₃を含むＰＢＳ／１％ＦＣＳで１回洗浄し、ＰＢＳ／ＦＣＳに１０⁶／５０μｌの濃度で再浮遊させた。抗体を添加し氷上で３０分反応させた。細胞を洗浄し、続いてＬｙｓｉｓＩＩソフト（Becton-Dickinson,マウンテンビュー、CA）を用いてＦＡＣＳｃａｎサイトメーターで分析した。Ｖβ８を発現する割合について１００００件の明白なゲート作動を分析し、これを用いて下記の式によってＶβ８細胞の総数を得た。
＃Ｖβ８＝総細胞収量×サンプル中の％Ｖβ８
結果
ＳＥＢ仲介インビトロ増殖における同時刺激の役割
Ｂ７／ＣＤ２８相互作用の役割を知るためにＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞のＳＥＢに対する増殖反応を調べた。ＳＥＢを脾細胞に添加したとき、当該培養で用量依存性増殖が認められた。抗Ｂ７−１／Ｂ７−２抗体は顕著に当該反応を抑制するので、これらの培養で細胞上のＢ７分子は同時刺激を供給するらしい。さらに、抗ＣＤ２８抗体を介するＣＤ２８のシグナル発生の増加は増殖反応を強化した。このシグナル発生の増加は、ＦｃＲ⁺Ｂ細胞上での抗体の固定によって、または抗体の微小凝集の形成によって仲介されたのかもしれない。興味深いことには、抗ＣＤ２８および抗Ｂ７−１／Ｂ７−２の添加は、抗ＣＤ２８単独と比較してわずかであるが再現可能な増殖の増加を誘発した。このことは、ＣＤ２８の他に別のＢ７リガンド（すなわちＣＴＬＡ−４）がＳＥＢに対するＴ細胞の反応をダウンレギュレートするために重要であることを示唆している。
Ｔ細胞反応におけるＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の相対的貢献を知るために、これらの分子に特異的な抗体ＦａｂフラグメントをＳＥＢ刺激培養に添加した。ＣＤ２８ＦＡｂの添加はＳＥＢ依存増殖を抑制した。ＣＤ２８ＦＡｂ遮断の規模は抗Ｂ７１／２を用いて認められたものと同様であった。このことはコントロール培養における増殖のためにＣＤ２８／Ｂ７はある程度の同時刺激を提供することを示唆している。しかしながら、ＣＴＬＡ−４ＦＡｂの存在下で２から３倍の増殖増加があり、このことは、ＣＴＬＡ−４シグナルは当該反応の調節で重要な部分を演じていることを示唆している。さらに、このことは、ＡＰＣ上のＢ７分子は、ＣＤ２８によるシグナル増幅およびＣＴＬＡ−４によるシグナル減弱の相互作用を作り出していることを強く示唆している。
ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４シグナルはＶβ８ ⁺ Ｔ細胞のインビボ増大に反対の作用を有する
ＳＥＢに対するＴ細胞反応における抗ＣＤ２８および抗ＣＴＬＡ−４抗体の影響を調べた。超抗原に対するＴ細胞のインビボにおける増大は、典型的には注射後２−３日以内で生じる。当該反応に対する抗ＣＤ２８および抗ＣＴＬＡ−４の影響を最初に調べる便利な時間として６０時間を選んだ。動物にＰＢＳまたはＳＥＢおよび関連ｍＡｂまたはＦＡｂフラグメントを注射した。６０時間後に、脾臓の細胞充実性およびＶβ８＋細胞の％を決定するために抗体染色サンプルを計測することによってＶβ８保持ＴＣＲの総数を決定した。ＳＥＢ注射動物の脾臓から分離されるＶβ８保持細胞の総数は、コントロール注射（ＰＢＳ）動物に存在する数の約２−３倍であった。対照的に、ＳＥＢに加えて注射される抗ＣＤ２８の用量の増加は、この時点で認められるＶβ８保持細胞の数を減少させた。５μｇの抗ＣＤ２８の注射によって回収Ｖβ８の数はそこそこに減少し、２０μｇおよび２００μｇの注射ではともにほぼ等しい２倍の減少をもたらした。この結果と抗ＣＤ２８仲介Ｔ細胞反応増幅を示すインビトロの結果の矛盾に注目して、ＣＤ２８抗体のＦＡｂフラグメントの日量をＳＥＢ反応中に注射した。完全な抗体と同様な態様で、これらＦＡｂはＳＥＢに対するＶβ８＋細胞の増大を用量依存性態様で遮断した。完全な抗体の抑制作用はＦＡｂを用いて認められたものと同様で、このことは抗ＣＤ２８抗体およびＦＡｂフラグメントはインビボでともにＢ７／ＣＤ２８シグナルに干渉することを示唆している。これは、二価抗体による非効率的なシグナル発生並びに抗体およびＦＡｂフラグメントの両方による天然のリガンドとの競合の結果かもしれない。
ＣＤ２８対ＣＴＬＡ−４の作用を比較するために、抗ＣＴＬＡ−４抗体をＳＥＢと同時注射した。抗ＣＤ２８処理で認められたものとは対照的に、抗ＣＴＬＡ−４の投与は、用量依存性態様で脾臓のＶβ８＋細胞の蓄積増加をもたらした。最大投与量の抗ＣＴＬＡ−４によってＳＥＢのみで認められたものより２−３倍のＶβ８＋細胞数の増加が得られた。抗ＣＴＬＡ−４ＦＡｂフラグメントの毎日の注射によってもまた、６０時間で検出されるＶβ８＋細胞数にかなりの増加が認められた。完全な抗ＣＴＬＡ−４および一価のＦＡｂフラグメントの両方が同じ結果をもたらしたという事実は、これらの条件下で両形態の抗体がＣＴＬＡ−４／Ｂ７相互作用を遮断していたということを示唆している。さらに、これらの条件下でＶβ８＋細胞の増加が認められたという事実は、当該抗体は抑制シグナルを遮断するという考えと一致する。
ＳＥＢ反応性集団の動態分析
ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４が反応の規模またはそのタイミングに影響するか否かを知るために動態分析を実施した。フローサイトメトリーで測定したときその量がＣＤ２８の飽和に必要な範囲にあったので、２００μｇ／注射の抗体投与量を用いた。ＳＥＢおよびコントロール抗体に対する反応は期待されたようなものであった。増大相は３日目にピークとなり、続いて着実に下降した。対照的に、抗ＣＤ２８およびＳＥＢで処理したマウスは、ピークが７２時間の極めて小さな増大を示し、これはコントロールレベルの１／３未満であった。しかしながら、これらの細胞は増大を経たように見え、細胞数はその後７日にわたって低下した。
ＳＥＢと抗ＣＴＬＡ−４ｍＡｂを投与されたマウスは、実験の経過時間中コントロール抗体で処理した動物と比較して細胞数の増加を示した。細胞数は最初の３日間劇的に増加し、さらに１０日目までにコントロール／ＳＥＢ注射動物と同じレベルまで細胞数は急速に減少した。反応のピークでは、ＣＴＬＡ−４処理動物は、コントロール抗体処理動物と比較して約２倍のＶβ８＋Ｔ細胞を有した。最後にＣＴＬＡ−４またはＣＤ２８が優勢なシグナルをもたらすか否かを知るために、両方の抗体を同時に加えた。実験の経過時間中、この処理は抗ＣＤ２８のみで処理した動物で得られたものと同一の結果を生じた。
Ｂ７／ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４相互作用はインビトロＳＥＢ反応調節に重要である
ここに提示する結果は、超抗原ＳＥＢに対するネズミＴ細胞の反応における同時刺激性シグナルのための重要な役割を示唆する。抗Ｂ７−１／２抗体または抗ＣＤ２８ＦＡｂフラグメントのいずれかによる遮断はＳＥＢ誘発増殖を劇的に低下させるので、Ｂ７−１／Ｂ７−２のＣＤ２８との内在性相互作用は増殖を促進させるために重要である。対照的に、完全な抗ＣＤ２８抗体によるＣＤ２８の嵌合はＡＰＣによって提供される閾値以上に増殖を増加させる。この増加は、おそらく効果的なＣＤ２８の架橋を生じる抗ＣＤ２８抗体の微小凝集またはＦｃＲ仲介凝集のためである。
ＣＤ２８とは対照的に、Ｂ７分子とのＣＴＬＡ−４の相互作用はＳＥＢに対するＴ細胞反応を鈍らせる。抗ＣＴＬＡ−４ＦＡｂフラグメントが増殖を強化するという観察は、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７相互作用はＳＥＢに対するＴ細胞の増殖反応を抑制することを示唆している。さらに、抗Ｂ７−１／２抗体は、ＣＤ２８抗体による最適刺激の存在下で増殖を増大させるが、このことは、抑制性シグナルはＣＴＬＡ−４・Ｂ７相互作用を介して仲介されるという考えに対して更なる指示を提供する。
ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４はＳＥＢ誘発Ｔ細胞増大に対してインビボで反対の作用を有する
ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４により誘導されたシグナルと直接干渉させることによるＳＥＢ処理マウスでの同時刺激の操作は、Ｖβ８＋Ｔ細胞の増大に対して反対の作用をもつ。この結果は、これらの分子は固定されたレベルのＴＣＲシグナルの存在下で増殖の開始を決定するために競合するかもしれないということを示唆する以前のインビトロのデータを支持する。ＳＥＢに対する最適な反応のためにＣＤ２８シグナルに対する必要性が存在するようで、抗ＣＤ２８ＦＡｂフラグメントまたは完全な抗ＣＤ２８抗体による遮断は増殖の増大を効果的に低下させる。ＣＴＬＡ−４遮断は反応性細胞の増大増加を同様に可能にするという観察は、インビボでの超抗原およびペプチド抗原反応のための同時刺激の必要性における類似性をさらに指示する。さらに、動態分析によって、Ｂ７分子に対するＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４との間の競合はＴ細胞反応の極めて初期のパラメーターを決定することが暗示される。すなわち、本実験では増大におけるＣＴＬＡ−４依存性変化は最初の２日以内に生じた。ＣＴＬＡ−４遮断は、ＣＤ２８嵌合が許容されるときＳＥＢに対する反応を増大させ、一方、それは、ＣＤ２８が遮断されるとき残余のものの増殖に対する影響をもたない。
このデータは、ＣＴＬＡ−４は、ＣＤ２８の作用に対抗することによってＳＥＢに対する反応の減弱における役割を果たすことを示している。これはＴ細胞寛容のメカニズムを示しているのかもしれないが、この抑制はまた表現型の変化に必要とされるかもしれない。例えば、Ｂ７／ＣＴＬＡ−４シグナルによって生じるシグナルはメモリー細胞または別のリンホカイン発現およびエフェクター機能を誘発することが可能かもしれない。
実施例７
増殖、ＩＬ−２産生、細胞死、細胞周期の進行およびＴ細胞活性化マーカーの出現に対するＣＴＬＡ−４連結の影響の動態分析
材料と方法
抗体および試薬
活性化に用いた抗体は以下の通りである：抗ＣＤ３ハイブリドーマ500A2（Allisonら、The T-cell Receptor（Ｔ細胞レセプター）、分子および細胞生物学のＵＣＬＡシンポジウム、ニューシリーズ、Alan R.Liss,Inc.,ニューヨーク33-45（1987））、抗ＣＤ２８ハイブリドーマ37.N.51.1（Grossら、上掲書）、抗ＣＴＬＡ−４ハイブリドーマ9H10.11G3（Krummelら、上掲書）、および抗Ｖａ３ハイブリドーマ536（Havranら、P.N.A.S.86:4185-4189（1989））。ＣＴＬＡ−４Ｉｇはレーンらの文献に記載されている（Laneら、Immunol.80:56-61（1994））。ＡＰＣおよびＣＤ８枯渇は、抗クラスＩＩＭＨＣハイブリドーマ28-16-8s（Ozato & Sachs,J.Immunol.126:317-323（1981））およびＢＰ１０７（Symington & Sprent,Immunogenetics 14:53-61（1981））、並びに抗ＣＤ８抗体ハイブリドーマ3.155（Sarmientoら、J.Immunol.125:2665-2672（1980））を用いて達成された。平均直径が５μＭ±０．１μＭのスルフェートポリスチレンラテックス微小球はメーカーから入手した（Interfacial Dynamics Corp.ポートランド、Or）。
ＣＤ４＋Ｔリンパ球の調製
リンパ節細胞は、ＮＣＩ（ベセスダ、MD）から入手した６−８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスから分離した。分離リンパ球は、組織を細切して生じた浮遊液をナイテックスで濾過して得た。ＣＤ４＋Ｔ細胞に富む調製物は、補体、抗クラスＩＩ抗体および抗ＣＤ８抗体で処理して得た。典型的な調製物は９５％ＣＤ４＋でＢ２２０陽性細胞は０．７５％未満であった。
固定抗ＣＤ３を用いたＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化
丸底の９６ウェルプレートを０．１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３の５０μｌで２時間３７℃で被覆し、続いて十分に洗浄し、完全なＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ、５０μＭのβ−メルカプトエタノール、２ｍＭのグルタミンおよび５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含む）で３７℃で３０分遮断処理した。２００μｌの完全ＲＰＭＩ１６４０中のＴ細胞１×１０⁵をウェル当たり加え、全ての培養を３７℃、５％ＣＯ₂下で保温した。表示がある場合は、抗ＣＤ２８を１０μｇ／ｍｌで、ＣＴＬＡ−４Ｉｇを５μｇ／ｍｌで、コントロールまたは抗ＣＴＬＡ−４ＦＡｂフラグメントを５０μｇ／ｍｌで加えた。採取の１２時間前に、１μＣｉの³Ｈチミジンを含む２０μｌの完全ＲＰＭＩでウェルをパルスした。プレーからガラス線維マットに細胞を採取し、³Ｈの取り込みをガス相カウンター（Packard,メリデン、Ct）を用いて測定した。
ラテックス微小球を用いたＴ細胞の活性化
ラテックス微小球（ビーズ）を文献（Krummelら、（1995））にしたがって被覆した。簡単に記せば、１×１０⁷ビーズ／ｍｌを表示した抗体とともにＰＢＳ中に浮遊させ、１．５時間３７℃で保温し、続いてＰＢＳで洗浄して１０％ＦＣＳによる遮断を施した。抗ＣＤ３を０．５μｇ／ｍｌで、抗ＣＤ２８を１μｇ／ｍｌで、抗ＣＴＬＡ−４を４μｇ／ｍｌで添加した。さらに、結合溶液はコントロール抗体５３６で標準化して結合時の全抗体濃度を６μｇ／ｍｌの一定濃度に保った。Ｔ細胞（１×１０⁵／２００μｌ）を１×１０のビーズとともに全容積を２００μｌ／ウェルとして培養した。全アッセイについて丸底の９６ウェルプレートを用いた。培養を５％ＣＯ₂中で３７℃で保温し、１μＣｉの³Ｈチミジンで採取前の最後の１２時間パルス標識した。ＣＴＬＡ−４の抑制作用は抗ＣＴＬＡ−４抗体に特異的なようであった。なぜならば、抗Ｌセレクチン（Mel-14）、抗Thy1.2および無関係の抗体を含む他のＴ細胞結合抗体は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８とともに同時固定したとき効果を示さないかまたは増大効果を示すからである。
細胞の生命活性の分析
Ｔ細胞は増殖アッセイの場合と同じように培養した。１／１０容積の０．４％トリパンブルー（Sigma,セントルイス、Mo）を加えて細胞の生命活性をアッセイし、細胞数は血球計算盤で測定した。各培養の１０^-4ｍｌを２組のウェルで数え、この容積の数値を２倍してインプット（５０×１０⁴細胞／ｍｌがインプットであった）に対する％値を得た。標準偏差は常に１０％未満であった。
細胞周期分析
以前に報告（Telfordら、Cytometr y 13:137-143（1992））されたように沃化プロピジウムによる細胞周期相の分析を実施した。簡単に記せば、細胞を９６ウェルプレートで微小球を用いて記載にしたがって活性化した。表示の時間に、３つの同一のウェル（培養開始時にサンプルにつき３×１０⁵をインプット）を採取し、ＰＢＳで洗浄して１．０ｍｌの８０％エタノールで固定した。細胞を氷上で３０分保ち、遠心によって沈澱させ、さらに、０．１％トリトンＸ１００、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５ｍｇ／ｍｌのＲＮアーゼ（５０Ｕ／ｍｇ）および５０μｇ／ｍｌの沃化プロピジウムを含む水溶液０．４ｍｌに再浮遊させた。分析までサンプルを暗所の氷上で保存し、各サンプルは一定の流速で２分間分析した。データはコウルター（Coulter）ＥＰＩＣＳシステムを用いて分析した。
ＩＬ−２の測定
ＥＬＩＳＡを用いて細胞上清中のＩＬ−２を検出した。簡単に記せば、捕捉抗体をホウ酸緩衝液（０．２Ｍのホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．０）中に１μｇ／ｍｌの濃度で用いてコーニング（Cornig,NY）ＥＬＩＳＡプレートを３７℃で２時間被覆した。続いてこれらのプレートを十分に洗浄し、０．４％のゼラチン／ＰＢＳで３０分遮断処理した。Ｔ細胞上清（５０μｌ）を加え、３７℃で２時間保温した。再びプレートを洗浄し、ビオチン付加検出抗体をＰＢＳ／０．５％トゥイーン中で添加し３７℃１時間保温した。再度プレートを洗浄し、１μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ＨＲＰＯを含むＰＢＳ／トゥイーン溶液５０μｌを加え、さらに３７℃で３０分保温した。クエン酸緩衝液（０．１Ｍクエン酸、ｐＨ４．３５）中の反応進行試薬（０．５５ｍｇ／ｍｌのＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）５０μｌを加え、２５℃１５分保温して、４０５ｎｍでの吸収を測定した。組換えＩＬ−２はベーリンガーマンハイムから入手し、連続希釈して標準曲線を作製した。それに基づいて被験サンプルの３組の吸収値をｎｇ／ｍｌで測定したリンホカイン量に変換した。抗体（捕捉用:JES6-1A12、検出用：ビオチン付加JES6-5H4）はファーミンゲン（PharMingen,サンディエゴ、CA）から入手した。
ＣＤ２５およびＣＤ６９発現の分析
２×１０⁵細胞を５０μｌの氷冷ＰＢＳ／１％ウシ血清／０．０５％アジ化ナトリウム中に懸濁させた。抗ＣＤ２５・ＦＩＴＣ、抗ＣＤ９６またはコントロールラットＩｇＧ・ＦＩＴＣ抗体を添加し、氷上で３０分保ち、続いて２回４ｍｌのＰＢＳ／ウシ血清／アジ化ナトリウム中で洗浄した。５０００件の本物のゲート作動をベクトン−ディッキソンファックスキャン（Becton-Dickinson FACScan）で捕捉し、リシス（Lysis）ＩＩプログラムを用いて関連集団を分析した。
結果
ＣＴＬＡ−４嵌合は増殖およびＩＬ−２産生を抑制する
ＣＴＬＡ−４またはＢ７に対する可溶性抗体は、標準的な３日アッセイでは固定抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８によって活性化されたＴ細胞によるチミジンの取り込みおよびＩＬ−２産生を高めることが以前に示された。これらの結果は、Ｔ細胞自身間のＣＴＬＡ−４／Ｂ７相互作用の遮断は、抑制シグナルを除去することによって反応を増大させることを示している。培養はただ１時点でアッセイされるので、培養中のどの時点でその作用が生じるかを決定することは不可能であった。精製したＣＤ４＋のＴ細胞の増殖に対するＣＴＬＡ−４／Ｂ７の遮断の動態分析は図８Ａに提示する。ＣＴＬＡ−４Ｉｇまたは抗ＣＴＬＡ−４のＦａｂフラグメントのいずれかを抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激した培養に加えることによって増殖の増加がもたらされた。この作用は２６時間ではわずかで、この時期にはいずれの培養にも極めてわずかの増殖があっただけである。より後の時期では、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７遮断は１．５倍または２倍の増殖増加をもたらした。この遮断強化作用はＩＬ−２産生レベルでさらに一層明白であった。図８Ｂに示したように、ＩＬ−２は、２６時間までに抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激培養で低レベルではあるが検出可能であった。抗ＣＴＬＡ−４Ｆａｂまたは抗ＣＴＬＡ−４Ｉｇのいずれかの添加は、２６時間までに蓄積されたＩＬ−２の量を約６倍増加させ、４０時間までに１０倍近く増加させた。
増殖およびＩＬ−２産生の抑制の動態は、ＣＴＬＡ−４を抗体被覆微小球を用いてＣＤ３およびＣＤ２８と架橋することによって調べた。チミジン取り込みの動態は図１Ｃに示す。顕著な取り込みは抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８によって刺激された培養で２６時間までに検出された。またＣＴＬＡ−４が嵌合されたときは２６時間では本質的に取り込みは検出されず、これらの培養ではアッセイを通して増殖は３−４倍低かった。図８Ｄに示したように、さらに強いＩＬ−２産生抑制が観察された。ＩＬ−２は抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激培養では１６時間までに容易に検出され、４０時間まで増加した。ＣＴＬＡ−４が嵌合されたときは、ＩＬ−２は３０時間後にもほとんど検出されず、４２時間のピークではコントロール培養のそれのわずかに約１／５のレベルであった。
これらの結果は、その天然のリガンドによって仲介されるかまたは抗体架橋によって仲介されるかにかかわらず、ＣＴＬＡ−４の抑制作用は活性化の初期に検出可能で、その過程の後期の反応の急激な停止によるものではないことを示唆している。
ＣＴＬＡ−４嵌合は細胞死を誘発しないが、細胞周期の進行を妨げる
ＣＴＬＡ−４による増殖抑制の説明となりうる１つのメカニズムは細胞死の抑制または増強であろう。培養期間を通して抑制が検出できたので、Ｔ細胞培養で生じる細胞死の動態を調べた。生体染色色素（トリパンブルー）で染色された細胞の血球計算盤による計測によって、培養から回収された全細胞は本質的にはインプットの１００％で、増殖が生じなかったものについても同様であった。非刺激培養では、生命活性のない細胞の数は培養期間を通じて増加し５４時間後には５０％に達した。抗ＣＤ３のみで刺激された培養から回収した死細胞の数は、特に初期の時点でわずかに増加した。増殖データと一致して、抗ＣＤ２８で同時刺激された培養は、４２時間後に生細胞が増加し全収量は７８時間で３００％を越えた。抗ＣＤ３＋抗ＣＴＬＡ−４による刺激は、非刺激培養または抗ＣＤ３のみで刺激された培養で認められたものを越える死細胞の増加をもたらさなかった。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の存在下で抗ＣＴＬＡ−４で刺激された培養からもまた、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激された培養のそれを越える死細胞の回収増加は認められなかった。培養期間を通して、生命活性を有する細胞の回収は、非刺激培養または抗ＣＤ３単独刺激培養からのそれよりも実際高かった。これらのデータは、ＣＴＬＡ−４の架橋は、膜透過性レベルで検出できるような細胞死を誘発しないことを示唆している。
細胞死および細胞周期相のより直接的でより感度の高い測定として、透過性細胞の沃化プロピジウム染色を用いて種々のステージの培養におけるＤＮＡ含有量を測定した。回収細胞のＧ₀／Ｇ₁、Ｓ／Ｇ₂、およびサブディプロイド集団における絶対数の比較を可能にするために、培養は同一数の細胞で開始し、等しい培養分画を分析した。結果は図９に示す。全ての刺激条件下で全細胞回収は本質的にインプットの１００％またはそれより高かった。インプット細胞の９９％以上はＧ₀／Ｇ₁期であった。非刺激培養では、アポプトシスを示唆するサブディプロイド量のＤＮＡを含む細胞の数は、培養期間を通して全体の５０％よりわずかに増加した。同様なパターンが抗ＣＤ３のみで刺激した培養で認められたが、ただしＳ／Ｇ₂期の細胞数はわずかに高かった。抗ＣＤ２８で同時刺激された培養では、Ｓ／Ｇ₂期の細胞数は早くも２０時間で顕著に増加し、この数はアッセイ期間を通して次第に増加した。抗ＣＴＬＡ−４とともに抗ＣＤ３で刺激された細胞のＤＮＡプロフィールは本質的にはアッセイ期間を通して非刺激または抗ＣＤ３刺激培養と同じで、アポプトシス細胞の数には顕著な違いは無かった。しかしながら、抗ＣＤ３のみでの刺激と比較して抗ＣＤ３と抗ＣＴＬＡ−４で刺激された培養ではＳ／Ｇ₂期の細胞は顕著に減少した。抗ＣＴＬＡ−４および抗ＣＤ３とともに抗ＣＤ２８で刺激された培養は、培養期間を通してサブディプロイド集団の細胞数は同じかまたは他のいずれの条件よりも少なかった。したがって、活性化のいずれの時期においても抗ＣＴＬＡ−４の架橋によってアポプトシスによる細胞死が誘発される証拠は存在しない。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激された細胞に対する架橋ＣＴＬＡ−４の主要な作用は、生細胞（特にＳ／Ｇ₂期の細胞）総数の増加の抑制である。またこれらの結果は、ＣＴＬＡ−４の嵌合は細胞周期の進行を抑制し、細胞をＧ₀／Ｇ₁期に止めることを示唆している。
ＣＴＬＡ−４嵌合はＩＬ−２レセプターのアルファ鎖発現の誘発を部分的に抑制する
Ｔ細胞活性化のもう１つの特徴は、ＣＤ２５（ＩＬ−２レセプターのアルファ鎖）の発現のアップレギュレーションである。フローサイトメトリーを用いて、ＣＴＬＡ−４同時連結の存在下、非存在下でＣＤ２８同時刺激の条件の下でＴ細胞上のＣＤ２５の発現を調べた。抗ＣＤ３のみによるＴ細胞の刺激は、２４時間以内にＴ細胞の約６０％にＣＤ２５の発現を誘発した。抗ＣＤ２８による同時刺激は、２４時間での陽性細胞の数および発現レベルの両方について発現増加をもたらし、発現は培養６０時間でさらに増強した。ＣＴＬＡ−４がまた組み込まれたときには、ＣＤ２５の発現はより少ない細胞分画（４７％対８０％）で認められ、平均発現レベルは、抗ＣＤ２８で同時刺激された培養と比較して２４時間（平均螢光インデックス１６２対１９４）および６０時間（ＭＦＩ３３２対６６９）ではるかに低かった。このデータは、ＣＴＬＡ−４嵌合は活性化の間中ＣＤ２５のアップレギュレーションを抑制することを明らかにした。
ＣＴＬＡ−４嵌合は初期活性化マーカーＣＤ６９の発現を部分的に抑制する
ＣＤ６９はＴ細胞活性化の初期一過性マーカーである。ＣＤ６９発現の誘発に対するＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４嵌合の影響の動態分析を実施した。ＣＤ３単独または抗ＣＤ２８との同時刺激により活性化したＴ細胞の５０％以上が１２時間でＣＤ６９を発現し、一方、ＣＴＬＡ−４嵌合に付した同時刺激細胞の１５％未満が陽性であった。異質なパターンではあるが、２４時間でＣＤ６９の発現はＣＤ２８同時刺激細胞の７５％以上で検出できた。この時点で、ＣＴＬＡ−４も組み込まれた培養中の細胞の４５％未満がＣＤ６９を発現し、発現レベルは低下した。３６時間までに全ての培養でＣＤ６９の発現は本質的に休止レベルまで復帰した。ＣＤ２８同時刺激はＣＤ６９の発現を増大させ延長させるが、一方、ＣＴＬＡ−４連結はＣＤ６９の最初のアップレギュレーション抑制する。この結果は、ＣＤ６９レベルはＣＴＬＡ−４欠陥マウスから分離したＴ細胞上で構造的に上昇するという観察と合致し、さらにＴ細胞活性化の初期誘発を妨げるＣＴＬＡ−４の役割を示唆するさらなる証拠を提供する。
これらのデータは、ＣＴＬＡ−４は、ＣＴＬＡ−４によって仲介される細胞死をもたらすことなくＴ細胞を休止させることによって増殖抑制およびＩＬ−２産生抑制を仲介することを明示する。生細胞および生命活性をもたない細胞の抗ＣＴＬＡ−４抑制培養からの回収は、コントロール抗体または抗ＣＤ３刺激培養において観察されたものと同様である。ＣＴＬＡ−４架橋の抑制作用が増殖レベルおよびＩＬ−２産生レベルで最初に観察されてから１−２日後でさえ、細胞のアポプトシスに付随するサブディプロイド量のＤＮＡを含む細胞の蓄積は認められない。最後に、ＣＴＬＡ−４架橋はＴ細胞を細胞周期のＧ₀／Ｇ₁期に止める。総合すれば、これらのデータは、ＣＴＬＡ−４によるＴ細胞増殖抑制およびＩＬ−２分泌抑制は細胞死が存在しなくとも生じることを明瞭に示している。ここに提示したこれらのデータが示唆する重要な事柄は、ＣＴＬＡ−４はＴ細胞の反応過程の初期ステージでＴ細胞反応を調節する役割を有するということである。本出願人らのデータは、進行する反応の急激な停止ではなく、むしろＴ細胞活性化の進行に付随する事象の抑制および遅延を示す。
上記の結果は、ＣＴＬＡ−４遮断剤による本処置は、抗原刺激に対するＴ細胞の反応を高めることを示している。インビボでの腫瘍細胞の増殖は本遮断剤の存在下で強く低下する。この効果は、操作されていない野性型の腫瘍に対して認められる。ＣＴＬＡ−４遮断剤は腫瘍の治療に対する新規な対処方法となるだけでなく、競合の可能性がある抑制シグナルを除去することによって同時刺激経路を含む他の治療方法に対する特に有用な補助となるかもしれない。免疫グロブリン産生細胞によるクラス切り換え（Ｔ細胞による支援の尺度）は大きく増加する。ペプチド抗原による免疫に対するＴ細胞の反応もまた本薬剤による処置によって大きく増加する。
実施例８
定着腫瘍に対する有効性
ＳＡ１は線維肉腫である。図１０に示すように、１投与量当たり１０⁰μｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体を用いたＣＴＬＡ−４遮断は、腫瘍移植後７日または１４日後でさえ有効である。このことは、ＣＴＬＡ−４遮断は定着腫瘍の治療に有効であることを示している。
実施例９
免疫反応刺激剤との協力作用
ＳＭ１は免疫原性の乏しい乳癌である。それはＢ７の核酸感染によってもたらされる拒絶に抵抗性を示す。しかしながら、Ｂ７およびＩＦＮｇを用いてある程度の増殖抑制が得られた。図１１に示した実験では、マウスの皮下に非修飾ＳＭ１腫瘍を移植し、表示の処置を０、３および６日目に施した。図示したように、抗ＣＴＬＡ−４（１０⁰μｇ／用量）単独処置は腫瘍の増殖に対して影響を与えなかった。照射したＧＭ−ＣＳＦ形質導入細胞を用いて反対側の部位で免疫しても効果はなかった。しかしながら、この２つの組合せによって、５匹のマウスのうち４匹で完全な拒絶が得られた。このことは、ＣＴＬＡ−４遮断は、ＧＭ−ＣＳＦ（およびおそらく他のリンホカイン）と協力することができることを明示した。
実施例１０
ＣＴＬＡ−４遮断の遅延
ＲＥＮＣＡはゆっくりと増殖する免疫原性の乏しい腫瘍である。図１２に示すように、ＣＴＬＡ−４遮断（抗ＣＴＬＡ−４抗体１００μｇ／用量）は、腫瘍移植時に開始したときは極めて有効性が乏しい。しかしながら、腫瘍移植後９日で開始する場合には極めて効果的である。このことは、効果的な拒絶を得るために免疫反応を刺激する因子として比較的大きな腫瘍塊から腫瘍屑が生成されることが重要であることを示唆している。このことは、ＣＴＬＡ−４遮断は、照射または化学療法時またはその直ぐ後で用いることができることを示唆する。
実施例１１
ＣＴＬＡ−４遮断は腫瘍フラグメントの免疫原性を高める
Ｂ１６は免疫原性が非常に乏しいメラノーマで、Ｂ７発現によって誘発される拒絶に抵抗する。出願人らはＣＴＬＡ−４遮断によって当該腫瘍を攻撃する方法を探索した。図１３に示した実験では、マウスの皮下に非修飾腫瘍細胞を移植し、表示の処置を０、３および６日目に実施した。ＣＴＬＡ−４単独（９Ｈ１０、１００μｇ／用量）では無効で、照射Ｂ１６細胞で反対側の部位に免疫しても効果はなかった。しかしながら、両方を用いた処置によって小さいが明瞭で再現性のある腫瘍増殖抑制が示された。しかし治癒は得られなかった。
このアプローチはまた防御免疫設定で用いた。図１４に示した実験では、ＣＴＬＡ−４遮断（９Ｈ１０、１００μｇ／用量）もしくは非遮断下で、さらにサイトカイン含有ゼラチン微小球（５０ｎｇのγインターフェロンおよび５０ｎｇのＧＭ−ＣＳＦ）の存在下もしくは非存在下でマウスを照射Ｂ１６細胞で免疫した。このマウスを生きている非修飾腫瘍細胞で２週間後に再度チャレンジした。ＣＴＬＡ−４遮断とともに照射細胞で免疫したマウスは、照射細胞のみを投与されたマウスと比べて腫瘍の増殖は顕著に低下した。最良の防御効果は、ＣＴＬＡ−４遮断と組合せたサイトカイン含有微小球で得られた。
総合すれば、ＣＴＬＡ−４遮断は、修飾腫瘍細胞または腫瘍フラグメントによる能動的免疫を用いる免疫方法を強化し、さらにサイトカインとの協力作用を有することをこれらのデータは示している。
本明細書に引用した全ての刊行物および特許出願は、それらが限定的にかつ個々に表示されるのと全く同様に参照により本明細書に含まれる。
前述の発明は、理解を明確にする目的で図面および実施例である程度詳細に述べてきたが、本発明の教示によってある種の変更および修飾を添付の請求の範囲から外れることなく実施できることは当業者には極めて明白であろう。
配列表
（2）配列番号：１の情報
（i）配列の特性
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）記載：／デスク＝“プライマー”
（xi）配列：配列番号：１

（2）配列番号：２の情報
（i）配列の特性
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）記載：／デスク＝“プライマー”
（xi）配列：配列番号：２

Claims (28)

1. メラノーマを治療するための薬剤の製造における、抗ＣＴＬＡ−４抗体またはそのフラグメントの使用であって、前記抗ＣＴＬＡ−４抗体またはそのフラグメントがＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインに特異的に結合し、かつＣＴＬＡ−４シグナル発生を抑制するという特徴を有する、上記使用。
2. 前記薬剤の製造において少なくとも一つの免疫反応刺激剤の使用を更に含み、前記免疫反応刺激剤が、（i）既に死んだ腫瘍細胞または死につつある腫瘍細胞、（ii）Ｂ７、（iii）抗ＣＤ３、（iv）抗ＣＤ２８、及び（v）顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１（ＩＬ−１）及びインターロイキン２（ＩＬ−２）から成る群から選ばれるサイトカイン、から成る群から選ばれる、請求の範囲第１項記載の使用。
3. 免疫反応刺激剤が既に死んだ腫瘍細胞または死につつある腫瘍細胞を含む請求の範囲第２項記載の使用。
4. 腫瘍細胞が照射細胞を含む請求の範囲第３項記載の使用。
5. 免疫反応刺激剤がサイトカインを更に含む、請求の範囲第１〜４項のいずれか一項に記載の使用。
6. サイトカインがサイトカインにより形質導入された腫瘍細胞として提供される請求の範囲第５項記載の使用。
7. サイトカインがＧＭ−ＣＳＦである請求の範囲第５または６項記載の使用。
8. 前記薬剤がヒトを治療するためのものである、請求の範囲第１〜７項のいずれか一項に記載の使用。
9. 抗体がモノクローナル抗体である、請求の範囲第１〜８項のいずれか一項に記載の使用。
10. 抗体がヒト化抗体である、請求の範囲第１〜９項のいずれか一項に記載の使用。
11. 癌腫を治療するための薬剤の製造における、抗ＣＴＬＡ−４抗体またはそのフラグメントと少なくとも一つの免疫反応刺激剤の使用であって、前記抗ＣＴＬＡ−４抗体またはそのフラグメントがＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインに特異的に結合し、かつＣＴＬＡ−４シグナル発生を抑制するという特徴を有し、前記免疫反応刺激剤が、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含む、上記使用。
12. 前記薬剤がヒトを治療するためのものである、請求の範囲第１１項に記載の使用。
13. 抗体がモノクローナル抗体である、請求の範囲第１１または１２項に記載の使用。
14. 抗体がヒト化抗体である、請求の範囲第１１〜１３項のいずれか一項に記載の使用。
15. 抗ＣＴＬＡ−４抗体またはそのフラグメントを含むメラノーマ治療用医薬組成物であって、前記抗ＣＴＬＡ−４抗体またはそのフラグメントが、ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインに特異的に結合し、かつＣＴＬＡ−４シグナル発生を抑制するという特徴を有する前記組成物。
16. 免疫反応刺激剤を更に含み、前記免疫反応刺激剤が、（i）既に死んだ腫瘍細胞または死につつある腫瘍細胞、（ii）Ｂ７、（iii）抗ＣＤ３、（iv）抗ＣＤ２８、及び（v）顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１（ＩＬ−１）及びインターロイキン２（ＩＬ−２）から成る群から選ばれるサイトカイン、から成る群から選ばれる、請求の範囲第１５項記載の組成物。
17. 免疫反応刺激剤が既に死んだ腫瘍細胞または死につつある腫瘍細胞を含む請求の範囲第１６項記載の組成物。
18. 腫瘍細胞が照射細胞である請求の範囲第１７項記載の組成物。
19. 免疫反応刺激剤がサイトカインを更に含む、請求の範囲第１５〜１８項のいずれか一項に記載の組成物。
20. サイトカインがサイトカインにより形質導入された腫瘍細胞として提供される請求の範囲第１９項記載の組成物。
21. サイトカインがＧＭ−ＣＳＦである請求の範囲第１９または２０項記載の組成物。
22. 前記薬剤がヒトを治療するためのものである、請求の範囲第１５〜２１項のいずれか一項に記載の組成物。
23. 抗体がモノクローナル抗体である、請求の範囲第１５〜２２項のいずれか一項に記載の組成物。
24. 抗体がヒト化抗体である、請求の範囲第１５〜２３項いずれか一項に記載の組成物。
25. 抗ＣＴＬＡ−４抗体またはそのフラグメントと免疫反応刺激剤を含む癌腫治療用医薬組成物であって、前記抗ＣＴＬＡ−４抗体またはそのフラグメントが、ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインに特異的に結合し、かつＣＴＬＡ−４シグナル発生を抑制するという特徴を有し、前記免疫反応刺激剤が、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含む、前記組成物。
26. 前記薬剤がヒトを治療するためのものである、請求の範囲第２５項に記載の組成物。
27. 抗体がモノクローナル抗体である、請求の範囲第２５または２６項記載の組成物。
28. 抗体がヒト化抗体である、請求の範囲第２５〜２７項いずれか一項に記載の組成物。

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