PT865293E - Bloqueio da regulação negativa dos linfócitos t associada à sinalização por ctla-4 - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Bloqueio da regulação negativa dos linfócitos T associada à sinalização por CTLA-4" 0 presente invento foi realizado com apoio governamental ao abrigo dos contratos n.° CA40041 e CA09179 concedidos pelos National Institutes of Health. 0 governo detém determinados direitos neste invento.

Introdução A colocação da imunoterapia em prática é um objectivo extremamente desejado no tratamento da doença humana. Ela promete uma especificidade de acção que raramente é encontrada com a utilização de fármacos convencionais. A base para a imunoterapia é a manipulação da resposta imunitária, particularmente as respostas das células T. As células T possuem sistemas complexos e subtis para controlar as suas interacções, utilizando numerosos receptores e factores solúveis para o processo. 0 efeito que qualquer sinal particular terá na resposta imunitária poderá variar, dependendo dos factores, dos receptores e dos contra-receptores que estão envolvidos.

As vias para as respostas de regulação negativa são tão importantes como aquelas necessárias para a activação. A educação timica conducente à tolerância das células T é um mecanismo para evitar uma resposta imunitária a um antigénio particular. Outros mecanismos, como a secreção de citoquinas supressoras, são também conhecidos. A activação das células T requer não só a estimulação através do receptor de antigénio (TCR), como também uma sinalização adicional através de moléculas co-estimuladoras de superfície, tais como CD28. Os ligandos para CD28 são as proteínas B7-1 (CD80) e B72 (CD86), que são expressas em células apresentadoras de antigénios como sejam as células dendríticas, as células B activadas ou os monócitos. A interacção entre B7 e CD28 é uma de várias vias de sinalização co-estimuladora que parecem ser suficientes para desencadear a 2 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ maturaçao e a proliferação de células T específicas de antigénios. A falta de co-estimulação e a concomitante insuficiência da produção de IL-2 evitam a proliferação subsequente das células T e induzem um estado de não reactividade denominado "anergia". Isto está associado a um bloqueio na transcrição do gene IL-2 e a uma falta de receptividade das células T afectadas a IL-4. A anergia poderá ser ultrapassada por meio de uma estimulação prolongada de IL-2. Uma variedade de vírus e tumores poderá bloquear a activação e a proliferação das células T através de meios directos ou indirectos, induzindo, deste modo, um estado de reactividade insuficiente ou de não reactividade do sistema imunitário do hospedeiro a células infectadas ou transformadas. Entre várias perturbações das células T funcionais, a anergia poderá ser, pelo menos parcialmente, responsável pela incapacidade do hospedeiro para eliminar as células patogénicas.

Seria vantajoso se, no tratamento de infecções e de tumores, fosse possível activar uma resposta imunitária celular forte através da manipulação dos receptores envolvidos na co-estimulação. A utilização da proteína B7 na mediação da imunidade antitumoral está descrita em Chen et al. (1992) Cell 71:1093-1102 e Townsend & Allison (1993) Science 259:368. Schwartz (1992) Cell 71:1065 faz uma revisão do papel de CD28, CTLA-4 e B7 na produção de IL-2 e em imunoterapia. Harding et al. (1994) Nature 356:607-609 demonstra que a sinalização mediada por CD28 co-estimula as células T murinas e previne a indução de anergia em clones de células T. CTLA-4 é uma molécula de superfície das células T que foi originalmente identificada por meio do rastreio diferencial de uma biblioteca de ADNc de células T citolíticas murinas. Brunet et al. (1987) Nature 328:267-270. O papel de CTLA-4 como um segundo receptor para B7 é discutido em Linsley et al. (1991) J. Exp. Med. 174:561-569. Freeman et al. (1993) Science 262:907-909 discute CTLA-4 em ratinhos deficientes em B7. Ligandos para CTLA-4 estão descritos em Lenschow et al. (1993) P.N.A.S. 90:11054-11058. 3 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ

Linsley et al. (1992) Science 257:792-795 descreve a imunossupressão in vivo por uma forma solúvel de CTLA-4. Lenschow et al. (1992) Science 257:789-792 discute a sobrevivência a longo prazo de enxertos de ilhotas pancreáticas induzida por CTLA-4Ig. É sugerido em Walunas et al. (1994) Immunity 1:405-413 que CTLA-4 pode funcionar como um regulador negativo da activação das células T.

Sumário do invento A descrição refere-se a um aumento da activação das células T através de um bloqueio da sinalização por CTLA-4. Moléculas de ligação que interagem especificamente com o antigénio CTLA-4, mas que não activam a sinalização (agentes de bloqueio) são utilizadas no fabrico de medicamentos para o tratamento do carcinoma ou do melanoma de acordo com as reivindicações anexas. Quando a sinalização por CTLA-4 é bloqueada desta forma, a resposta das células T ao antigénio é libertada da inibição.

Breve descrição das figuras A Figura IA é um gráfico ilustrando o crescimento in vivo da linha de células tumorais V51BlimlO, na presença ou na ausência de anticorpos dirigidos contra CTLA-4 ou CD28. A Figura 1B é um gráfico ilustrando o tamanho médio do tumor em ratinhos injectados com 2 x 106 células V51Bliml0 e anticorpos. A Figura 1C é um gráfico ilustrando o tamanho de crescimento do tumor individual em ratinhos injectados com células V51Bliml0. A Figura 2 é um gráfico ilustrando o crescimento in vivo de tumores B7-51BLiml0, na presença ou na ausência de anticorpos dirigidos contra CTLA-4 ou CD28. A Figura 3 ilustra a rejeição de células de carcinoma do cólon de tipo selvagem por ratinhos previamente tratados com células V51Bliml0 e anticorpo anti-CTLA-4. A Figura 4 mostra o crescimento de tumores estabelecidos após tratamento com anticorpo anti-CTLA-4. 4 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ A Figura 5 representa ο crescimento do fibrossarcoma murino SA1N, na ausência ou na presença de anticorpos anti-CTLA-4.

As Figuras 6A a 6F ilustram o efeito adjuvante de anticorpos anti-CTLA-4 na resposta de células T a antigénios peptidicos.

As Figuras 7A a 7B ilustram o efeito do bloqueio de CTLA-4 na comutação isotípica.

As Figuras 8A a 8D apresentam uma análise cinética do bloqueio de CTLA-4/B7 sobre a proliferação de células T CD4+ purificadas. Na Figura 8B está ilustrada a detecção de IL-2. A cinética da incorporação de timidina está representada na Figura 8C. Ilustrada na Figura 8D encontra-se uma inibição pronunciada da produção de IL-2 que foi observada quando CTLA-4 foi também envolvido. A Figura 9 mostra uma coloração com iodeto de propídio de células permeabilizadas para medir o teor de ADN em várias fases do bloqueio de CTLA-4/B7 em cultura. A Figura 10 ilustra o efeito de atrasar o bloqueio de CTLA-4 num fibrossarcoma. A Figura 11 representa o efeito de tratar um carcinoma mamário apenas com anti-CTLA-4, apenas com células transduzidas com GM-CSF ou com uma sua combinação. A Figura 12 demonstra o efeito de um bloqueio atrasado de CTLA-4 sobre um carcinoma renal. A Figura 13 ilustra o efeito do tratamento de bloqueio de CTLA-4 isoladamente ou em combinação com a imunização com células tumorais B16 irradiadas, em tumores B16. A Figura 14 mostra o efeito da combinação do bloqueio de CTLA-4 com células B16 irradiadas e/ou com o tratamento com citoquinas. 5 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ

Referências de bases de dados para as sequências nucleotídicas e de aminoácidos A sequência de ADNc completa de CTLA-4 humana tem o número de acesso ao GenBank L15006. A região de aminoácidos 1-37 é o péptido de comando ("leader"); 38-161 é o domínio de tipo V extracelular; 162-187 é o domínio transmembranar; e 188-223 é o domínio citoplasmático. Foram referidas variantes da sequência nucleotídica, incluindo uma transição G para A na posição 49, uma transição C para T na posição 272 e uma transição A para G na posição 439. A sequência de ADN completa de CTLA-4 de ratinho tem o número de acesso a EMBL X05719 (Brunet et al. (1987) Nature 328:267-270). A região de aminoácidos 1-35 é o péptido de comando. A sequência de ADN completa de B7-1 humana (CD80) tem o número de acesso ao Genbank X60958; o número de acesso para a sequência de ratinho é X60958; o número de acesso para a sequência de rato é U05593. A sequência de ADNc completa de B7-2 humana (CD86) tem o número de acesso ao GenBank L25259; o número de acesso para a sequência de ratinho é L25606.

Os genes que codificam CD28 foram extensamente caracterizados. A sequência do ARNm de galinha tem o número de acesso ao Genbank X67915. A sequência do ARNm de rato tem o número de acesso ao Genbank X55288. A sequência do ARNm humano tem o número de acesso ao Genbank J02988. A sequência do ARNm de ratinho tem o número de acesso ao Genbank M34536.

Descrição detalhada do invento O invento refere-se ao fabrico de medicamentos para tratar o carcinoma ou o melanoma de acordo com as reivindicações anexas. Não é necessário para a prática do invento que o mecanismo de acção seja compreendido. Os resultados indicam que a terapia liberta as células T dos sinais inibitórios mediados através de CTLA-4. Os sinais mediados por CTLA-4 aparentemente inibem a progressão do ciclo celular e a expressão de IL-2. A resposta das células T ao antigénio e a sinalização co-estimuladora via CD28 é, assim, regulada 6 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ positivamente na presença de agentes de bloqueio de CTLA-4. As utilizações não promovem uma proliferação generalizada das células T não estimuladas.

As presentes utilizações são úteis quando, para um objectivo pretendido, existe uma resposta inadequada mediada pelas células T a um estimulo antigénico. As respostas mediadas pelas células T in vivo incluem a geração de células T citoliticas e a maioria das respostas de anticorpos, particularmente aquelas que envolvem uma comutação isotípica dos isotipos das imunoglobulinas. 0 estimulo antigénico poderá consistir em células tumorais que expressam proteínas ou combinações de proteínas num contexto não natural.

Os agentes de bloqueio de CTLA-4 são moléculas que se ligam especificamente ao domínio extracelular da proteína CTLA-4 e bloqueiam a ligação de CTLA-4 aos seus contra-receptores, por exemplo, CD80, CD86, etc. Geralmente, a afinidade de ligação do agente de bloqueio será de pelo menos cerca de 100 μΜ. O agente de bloqueio será substancialmente não reactivo com as moléculas relacionadas com CTLA-4, como CD28 e os outros membros da superfamília das imunoglobulinas. As moléculas como CD80 e CD86 são, desta forma, excluídas como agentes de bloqueio. Adicionalmente, os agentes de bloqueio não activam a sinalização por CTLA-4. Convenientemente, este resultado é alcançado mediante a utilização de moléculas de ligação monovalentes ou bivalentes. O perito na arte compreenderá que as discussões que se seguem sobre reactividade cruzada e competição entre diferentes moléculas pretendem referir-se a moléculas que têm a mesma espécie de origem, por exemplo, a proteína CTLA-4 humana liga-se a CD80 e CD86 humanas, etc.

Os candidatos a agentes de bloqueio são rastreados quanto à capacidade para satisfazer estes critérios. Os ensaios para determinar a afinidade e a especificidade de ligação são conhecidos na arte, incluindo ensaios competitivos e não competitivos. Os ensaios de interesse incluem ELISA, RIA, citometria de fluxo, etc. Os ensaios de ligação poderão utilizar proteína CTLA-4 purificada ou semi-purifiçada ou, em alternativa, poderão utilizar células T que expressam CTLA-4, por exemplo, células transfectadas com uma construção de 7 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ expressão para CTLA-4; células T que foram estimuladas através da reticulação de CD3 e CD28; a adição de células alogénicas irradiadas, etc. Como exemplo de um ensaio de ligação, a proteína CTLA-4 purificada é ligada a um suporte insolúvel; por exemplo, uma placa de microtitulação, esferas magnéticas, etc. 0 candidato a agente de bloqueio juntamente com CD80 ou CD86 marcada e solúvel são adicionados às células, e os componentes não ligados são depois arrastados por lavagem. A capacidade do agente de bloqueio para competir com CD80 e CD86 pela ligação a CTLA-4 é determinada através da quantificação de CD80 ou CD86 marcada e ligada. A confirmação de que o agente de bloqueio não reage de forma cruzada com CD28 poderá ser efectuada com um ensaio similar, substituindo CTLA-4 por CD28. As moléculas adequadas apresentarão uma ligação a CD28 pelo menos cerca de 103 menor que à proteína CTLA-4, mais habitualmente uma ligação pelo menos cerca de 104 menor.

Geralmente, uma molécula de ligação monovalente ou bivalente solúvel não activará a sinalização por CTLA-4. Um ensaio funcional que detecta a activação das células T poderá ser utilizado para confirmação. Por exemplo, uma população de células T poderá ser estimulada com células alogénicas irradiadas expressando CD80 ou CD86, na presença ou ausência do candidato a agente de bloqueio. Um agente que bloqueia a sinalização por CTLA-4 provocará um aumento da activação das células T, tal como medido pela proliferação e progressão do ciclo celular, a libertação de IL-2, a regulação positiva de CD25 e CD69, etc. Um perito na arte compreenderá que a expressão na superfície de uma célula, o empacotamento num lipossoma, a aderência a uma partícula ou um poço, etc. aumentarão a valência efectiva de uma molécula.

Os anticorpos ou seus fragmentos são utilizados como agentes de bloqueio. Os anticorpos poderão ser policlonais ou monoclonais; intactos ou truncados, por exemplo, F(ab')2, Fab, Fv; xenogénicos, alogénicos, singénicos ou formas modificadas destes, por exemplo, anticorpos humanizados, quiméricos, etc.

Geralmente, a afinidade será pelo menos de aproximadamente 1CT6, mais geralmente cerca de 1CT8 M, isto é, as afinidades de ligação normalmente observadas com anticorpos monoclonais específicos. 8 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ

Estão disponíveis vários ensaios de rastreio para os agentes de bloqueio. Os componentes destes ensaios incluirão normalmente a proteína CTLA-4 e, opcionalmente, um agente de activação de CTLA-4, por exemplo, CD80, CD86, etc. A mistura de ensaio também compreenderá um candidato a agente farmacológico. Geralmente, desenvolve-se uma pluralidade de misturas de ensaio em paralelo, com diferentes concentrações de agente, para se obter uma resposta diferencial às várias concentrações. Tipicamente, uma destas concentrações serve de controlo negativo, isto é, à concentração zero ou abaixo do nível de detecção.

Convenientemente, nestes ensaios, uma ou mais das moléculas será ligada a um marcador, em que o marcador pode proporcionar um sinal detectável directa ou indirectamente. Os vários marcadores incluem radioisótopos, agentes fluorescentes, agentes quimioluminescentes, enzimas, moléculas de ligação específicas, partículas, por exemplo, partículas magnéticas, e espécies similares. As moléculas de ligação específicas incluem pares, como a biotina e a estreptavidina, a digoxina e a ant idigoxina, etc. Para os membros de uma ligação específica, o membro complementar seria normalmente marcado com uma molécula que permite a detecção, de acordo com procedimentos conhecidos.

Um ensaio de rastreio de interesse é dirigido para os agentes que interferem com a activação de CTLA-4 pelos seus contra-receptores. A quantificação da activação poderá ser obtida por meio de vários métodos conhecidos na arte. Por exemplo, a inibição da activação das células T poderá ser determinada por quantificação da proliferação celular, libertação de citoquinas, etc.

Outros ensaios de interesse são dirigidos para agentes que bloqueiam a ligação de CTLA-4 aos seus contra-receptores. A mistura de ensaio compreenderá pelo menos uma porção do contra-receptor natural, ou um oligopéptido que partilha uma similaridade de sequência suficiente para permitir uma ligação específica, e o candidato a agente farmacológico. 0 oligopéptido poderá possuir qualquer comprimento compatível com as condições e os requisitos do ensaio, geralmente um comprimento de pelo menos cerca de 8 aa, que pode ir até à 9 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ proteína completa ou a uma fusão desta. A proteína CTLA-4 poderá estar ligada a um substrato insolúvel. 0 substrato poderá ser feito de uma ampla variedade de materiais e formas, por exemplo, uma placa de microtitulação, uma microesfera, uma tira de teste, uma partícula de resina, etc. 0 substrato é seleccionado de modo a minimizar o fundo e maximizar a razão do sinal para o ruido. A ligação poderá ser quantificada por uma variedade de métodos conhecidos na arte. Após um período de incubação suficiente para permitir a ligação e atingir-se o equilíbrio, o suporte insolúvel é lavado, e o marcador remanescente é quantificado. Os agentes que interferem com a ligação diminuirão a quantidade de marcador detectado. É possível incluir uma variedade de outros reagentes no ensaio de rastreio. Estes incluem reagentes como sais, proteínas neutras, por exemplo, a albumina, detergentes, etc. que poderão ser utilizados para facilitar uma ligação proteína-ADN óptima e/ou reduzir as interacções não específicas ou de fundo. Também os reagentes que melhoram a eficácia do ensaio de uma outra forma, como os inibidores de proteases, os inibidores de nucleases, os agentes antimicrobianos, etc., poderão ser utilizados.

Os anticorpos adequados para utilizar como agentes de bloqueio são obtidos por imunização de um animal hospedeiro com péptidos que compreendem a totalidade ou uma porção da proteína CTLA-4. Os animais hospedeiros adequados incluem o ratinho, o rato, a ovelha, a cabra, o hamster, o coelho, etc. A origem do imunogénio proteico poderá ser o ratinho, o ser humano, o rato, o macaco, etc. 0 animal hospedeiro será geralmente de uma espécie diferente do imunogénio, por exemplo, a proteína CTLA-4 de ratinho é utilizada para imunizar hamsters, a CTLA-4 humana para imunizar ratinhos, etc. A proteína CTLA-4 humana e de ratinho contém extensões extremamente conservadas no domínio extracelular (Harper et al. (1991) J. Immunol. 147:1037-1044). Os péptidos derivados destas regiões extremamente conservadas poderão ser utilizados como imunogénios para gerar anticorpos com uma especificidade cruzada. 0 imunogénio poderá compreender a proteína completa ou fragmentos e derivados desta. Os imunogénios preferidos 10 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ compreendem a totalidade ou uma parte do domínio extracelular da proteína CTLA-4 humana (resíduos de aminoácidos 38-161), em que estes resíduos contêm as modificações pós-tradução, como seja a glicosilação, encontradas na proteína CTLA-4 nativa. Os imunogénios que compreendem o domínio extracelular são produzidos sob uma variedade de formas conhecidas na arte, por exemplo, a expressão de genes clonados utilizando métodos recombinantes convencionais, o isolamento a partir de células T, populações celulares separadas expressando níveis elevados de CTLA-4, etc.

Quando se pretende a expressão de uma proteína recombinante ou modificada, utilizar-se-á um vector que codifica a porção desejada de CTLA-4. Geralmente, conceber-se-á um vector de expressão de modo que o domínio extracelular da molécula CTLA-4 se encontre na superfície de uma célula transfectada ou, em alternativa, o domínio extracelular seja segregado a partir da célula. Quando o domínio extracelular se destina a ser segregado, a sequência codificante do domínio extracelular será fundida, em fase, com sequências que permitem a secreção, incluindo um péptido sinal. Os péptidos sinal poderão ser exógenos ou nativos. Uma proteína de fusão de interesse para a imunização une o domínio extracelular de CTLA-4 à região constante de uma imunoglobulina. Por exemplo, uma proteína de fusão compreendendo o domínio extracelular de CTLA-4 de ratinho unido à região da charneira do domínio Cgl humano (charneira-CH2-CH3) poderá ser utilizada para imunizar hamsters.

Quando a proteína CTLA-4 se destina a ser expressa na superfície da célula, a sequência codificante do domínio extracelular será fundida, em fase, com sequências que codificam um péptido que efectua a ancoragem do domínio extracelular à membrana e com uma sequência sinal. Estas sequências de ancoragem incluem o domínio transmembranar da proteína CTLA-4 nativa ou domínios transmembranares de outras proteínas da superfície celular, por exemplo, CD4, CD8, slg, etc. Células de ratinho transfectadas com o gene CTLA-4 humano poderão ser utilizadas para imunizar ratinhos e gerar anticorpos específicos para a proteína CTLA-4 humana. 11 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ

Os anticorpos monoclonais são produzidos por meio de técnicas convencionais. Geralmente, o baço e/ou os gânglios linfáticos de um animal hospedeiro imunizado proporcionam uma fonte de células do plasma. As células do plasma são imortalizadas por fusão com células de mieloma para produzir células de hibridoma. 0 sobrenadante de cultura dos hibridomas individuais é rastreado, utilizando técnicas Standard, para identificar aqueles hibridomas que produzem os anticorpos com a especificidade desejada. Os animais adequados para a produção de anticorpos monoclonais contra a proteína humana incluem o ratinho, o rato, o hamster, etc. Para produzir anticorpos contra a proteína de ratinho, o animal será geralmente um hamster, um porquinho-da-índia, um coelho, etc. 0 anticorpo poderá ser purificado a partir dos sobrenadantes das células de hibridoma ou do fluido ascítico por meio de técnicas convencionais, por exemplo, a cromatografia de afinidade utilizando CTLA-4 ligada a um suporte insolúvel, proteína A-sepharose, etc. 0 anticorpo poderá ser produzido como uma cadeia simples, em vez da estrutura multimérica normal. Os anticorpos de cadeia simples estão descritos em Jost et al. (1994) J.B.C. 269:26267-73 e outras referências. As sequências de ADN que codificam a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve são ligadas a um espaçador que codifica pelo menos cerca de 4 aminoácidos constituídos por aminoácidos neutros pequenos, incluindo a glicina e/ou a serina. A proteína codificada por esta fusão permite a construção de uma região variável funcional que conserva a especificidade e a afinidade do anticorpo original.

Para a utilização in vivo, particularmente para injecção em seres humanos, é desejável diminuir a antigenicidade do agente de bloqueio. Uma resposta imunitária do receptor contra o agente de bloqueio diminuirá potencialmente o período de tempo em que a terapia é eficaz. Os métodos de humanização de anticorpos são conhecidos na arte. 0 anticorpo humanizado poderá ser o produto de um animal que possui genes transgénicos da região constante de imunoglobulinas humanas (consultar, por exemplo, os pedidos de patente internacional WO 90/10077 e WO 90/04036). Em alternativa, o anticorpo de interesse poderá ser manipulado por meio de técnicas de ADN 12 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ recombinante para substituir os domínios CHI, CH2, CH3, de charneira e/ou o domínio de estrutura (framework) pela sequência humana correspondente (ver WO 92/02190) . A utilização de ADNc Ig para a construção de genes de imunoglobulinas quiméricas é conhecida na arte (Liu et al. (1987) P.N.A.S. 84:3439 e (1987) J. Immunol. 139:3521). O ARNm é isolado de um hibridoma ou de outra célula produtora do anticorpo e utilizado para produzir o ADNc. O ADNc de interesse poderá ser amplificado pela reacção da polimerase em cadeia, utilizando iniciadores específicos (patente U.S. n.os 4,683,195 e 4,683,202). Em alternativa, uma biblioteca é preparada e rastreada para isolar a sequência de interesse. A sequência de ADN que codifica a região variável do anticorpo é depois fundida com sequências de regiões constantes humanas. As sequências dos genes de regiões constantes humanas poderão ser encontradas em Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. publication no. 91-3242. Os genes da região C humana estão facilmente disponíveis a partir de clones conhecidos. A escolha do isotipo será guiada pelas funções efectoras desejadas, tais como a fixação ao complemento, ou a actividade no processo de citotoxicidade celular dependente de anticorpo. Os isotipos preferidos são IgGl, IgG3 e IgG4. Qualquer uma das regiões constantes da cadeia leve humana, capa ou lambda, poderá ser utilizada. O anticorpo humanizado quimérico é depois expresso por métodos convencionais.

Os fragmentos de anticorpos, como Fv, F(ab')2 e Fab, poderão ser preparados por clivagem da proteína intacta; por exemplo, por clivagem química ou via protease. Em alternativa, é concebido um gene truncado. Por exemplo, um gene quimérico que codifica uma porção do fragmento F(ab')2 incluiria as sequências de ADN que codificam o domínio CHI e a região de charneira da cadeia H, seguidas por um codão de terminação da tradução para originar a molécula truncada.

As sequências consenso das regiões J H e L poderão ser utilizadas para conceber oligonucleótidos utilizáveis como iniciadores, com o objectivo de introduzir sítios de restrição úteis na região J para ligação subsequente dos segmentos da região V aos segmentos da região C humana. O ADNc da região C 13 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ pode ser modificado por mutagénese dirigida para colocar um sitio de restrição na posição análoga na sequência humana.

Os vectores de expressão incluem plasmídeos, retrovírus, YAC, epissomas derivados de EBV e espécies similares. Um vector conveniente é um vector que codifica uma sequência de imunoglobulina CH ou CL humana funcionalmente completa, com sítios de restrição apropriados que foram manipulados de modo que qualquer sequência VH ou VL possa ser facilmente inserida e expressa. Nestes vectores, o "splicing" geralmente ocorre entre o local dador de “splicing" na região J inserida e o local aceitador de "splicing” que antecede a região C humana, e também nas regiões de "splicing" que ocorrem no interior dos exões CH humanos. A poliadenilação e a terminação da transcrição ocorrem nos locais cromossómicos nativos a jusante das regiões codificantes. 0 anticorpo quimérico resultante poderá ser ligado a qualquer promotor forte, incluindo LTR retrovirais, por exemplo, o promotor precoce de SV-40 (Okayama et ai. (1983) Mol. Cell. Bio. 3:280), a LTR do vírus do sarcoma de Rous (Gorman et ai. (1982) P.N.A.S. 79 :6777) e a LTR do vírus da leucemia murina de Moloney (Grosschedl et al. (1985) Cell 41:885); promotores nativos de Ig, etc. O agente de bloqueio de CTLA-4 pode ser utilizado isoladamente ou em combinação com um agente de estimulação da resposta imunitária. Tal como aqui utilizado, um "agente de estimulação da resposta imunitária" refere-se a qualquer agente que, directa ou indirectamente, estimula uma resposta imunitária em combinação com um agente de bloqueio de CTLA-4. Por exemplo, os agentes de estimulação da resposta imunitária compreendem as citoquinas, assim como vários antigénios que incluem antigénios tumorais e antigénios derivados de patogénios. Adicionalmente, os agentes de estimulação da resposta imunitária incluem células tumorais transduzidas com citoquinas, por exemplo, células tumorais transduzidas com GMC-SF, assim como células tumorais que foram irradiadas e/ou tratadas com um agente quimioterapêutico ex vivo ou in vivo. Nalguns casos, os resíduos celulares de células tumorais mortas ou moribundas proporcionam uma estimulação da resposta imunitária, que pode ser combinada in vivo ou ex vivo com um agente de bloqueio de CTLA-4. A utilização de agentes quimioterapêuticos é um exemplo da produção de um agente de 14 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ estimulação da resposta imunitária por meios indirectos. A utilização de uma fonte para irradiar as células tumorais ex vivo ou in vivo também constitui um método que, indirectamente, produz agentes de estimulação da resposta imunitária. Os exemplos 9 a 12 demonstram que os agentes de estimulação da resposta imunitária podem ter um efeito significativo no tratamento do tumor quando são utilizados em combinação com um agente de bloqueio de CTLA-4. A base para a utilização de agentes quimioterapêuticos juntamente com agentes de bloqueio de CTLA-4 é a seguinte. Como indicado nos exemplos, o bloqueio de CTLA-4 funciona melhor com tumores estabelecidos e aumenta a imunogenicidade de células tumorais irradiadas. Isto sugere que o bloqueio de CTLA-4 pode ser combinado com métodos mais convencionais de tratamento do cancro para produzir um efeito sinérgico. Por exemplo, o bloqueio de CTLA-4 poderá ser iniciado pouco tempo após o tratamento com o agente quimioterapêutico. A dose do agente quimioterapêutico é ajustada para um nível que mata uma quantidade razoável da massa tumoral e gera resíduos que actuam como um agente para estimular uma resposta imunitária pelas células T, em resultado do bloqueio de CTLA-4. Isto permite que o agente quimioterapêutico seja administrado em quantidades muito abaixo daquelas agora utilizadas para obter uma morte máxima das células tumorais, uma vez que a resposta imunitária facilitada por CTLA-4 elimina a massa tumoral residual. Isto minimiza os efeitos secundários muitas vezes terríveis, incluindo a imunossupressão, associados à aplicação convencional da quimioterapia. Considerações similares aplicam-se à radioterapia. A dose de agente quimioterapêutico ou de radiação, se utilizado juntamente com um agente de bloqueio de CTLA-4, encontra-se preferencialmente entre 2-20%, mais preferencialmente entre 5-10% da dose habitualmente utilizada.

Os agentes de bloqueio de CTLA-4, especialmente aqueles que consistem num anticorpo para a porção extracelular da proteína CTLA-4, podem ser utilizados em combinação com um ou mais agentes de estimulação da resposta imunitária. Os agentes de bloqueio de CTLA-4 também poderão ser utilizados em conjunção com a radiação e/ou o tratamento quimioterapêutico, que indirectamente produzem agentes de estimulação da resposta 15 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ imunitária. Esta utilização combinada pode envolver a utilização simultânea ou sequencial do agente de bloqueio de CTLA-4 e do agente de estimulação da resposta imunitária e pode ocorrer em diferentes locais. Por exemplo, o agente de bloqueio de CTLA-4 pode ser administrado num local distante de um tumor, após o tumor ter sido directamente irradiado. Em alternativa, um agente quimioterapêutico pode ser utilizado para tratar células tumorais quer local quer sistemicamente, seguido da utilização de um agente de bloqueio de CTLA-4.

As situações caracterizadas por uma resposta deficiente das células T do hospedeiro a um antigénio incluem os tumores. A administração dos bloqueadores de CTLA-4 em questão altera especificamente o fenótipo das células T activadas, resultando numa resposta redobrada à activação mediada por antigénio. 0 tratamento dos primatas, mais particularmente dos seres humanos, tem interesse, mas outros mamíferos também poderão beneficiar do tratamento, particularmente os animais domésticos como sejam os equinos, os bovinos, os ovinos, os felinos, os caninos, os murinos, os lagomorfos e animais similares. A formulação destina-se a ser administrada numa dose eficaz para aumentar a resposta das células T à estimulação antigénica. A resposta das células T activadas será afectada em maior escala por este tratamento que as células T quiescentes. A determinação da resposta das células T variará com a condição que se encontra em tratamento. Medidas úteis da actividade das células T são a proliferação, a libertação de citoquinas, por exemplo, IL-2, IFNg, TNFa; a expressão em células T de marcadores como CD25 e CD69; e outras medidas da actividade das células T são conhecidas na arte. 0 tratamento poderá ser efectuado em combinação com a administração de citoquinas que estimulam as células apresentadores de antigénios, por exemplo, o factor de estimulação de colónias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), o factor de estimulação de colónias de macrófagos (M-CSF), o factor de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF), a interleucina 3 (IL-3), a interleucina 12 (IL-12), etc. Proteínas e/ou citoquinas adicionais que se sabe aumentarem a proliferação das células T e a secreção, como IL-1, IL-2, B7, 16 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ anti-CD3 e anti-CD28, podem ser empregues simultânea ou sequencialmente com os agentes de bloqueio para aumentar a resposta imunitária. A terapia poderá ser combinada com a transfecção de células tumorais ou de linfócitos que se infiltram em tumores com genes que codificam várias citoquinas ou receptores de superfície celular (ver Ogasawara et al. (1993) Câncer Res. 53:3561-8; e Townsend et al. (1993) Science 259:368-370). Por exemplo, foi demonstrado que a transfecção de células tumorais com o ADNc que codifica CD80 conduz à rejeição das células tumorais transfectadas e pode induzir imunidade a uma provocação subsequente pelas células tumorais parentais não transfectadas (Townsend et al. (1994) Câncer Res. 54:6477-6483). A terapia realça este efeito.

As células T do hospedeiro específicas do tumor poderão ser combinadas ex vivo com os presentes agentes de bloqueio e com os antigénios ou as células tumorais, e novamente infundidas no doente. Quando são administradas a um hospedeiro, as células estimuladas induzem uma reacção tumoricida, que resulta na regressão do tumor. As células hospedeiras poderão ser isoladas a partir de uma variedade de fontes, tais como os gânglios linfáticos, por exemplo, os gânglios inguinais, mesentéricos, auxiliares distais superficiais, etc.; a medula óssea; o baço ou o sangue periférico, assim como o tumor, por exemplo, linfócitos que se infiltram no tumor. As células poderão ser alogénicas, preferencialmente autólogas. Para a estimulação ex vivo, as células hospedeiras são removidas assepticamente e são suspensas em qualquer meio adequado, tal como conhecido na arte. As células são estimuladas por qualquer um de uma variedade de protocolos, particularmente combinações de B7, anti-CD28, etc., em combinação com os agentes de bloqueio. As células estimuladas são reintroduzidas no hospedeiro por injecção, por exemplo, intravenosa, intraperitoneal, etc., numa variedade de formulações farmacêuticas que incluem aditivos como ligantes, cargas, vectores, conservantes, agentes de estabilização, emulsionantes e tampões. Os diluentes e os excipientes adequados são a água, a solução salina, a glucose e espécies similares.

As células tumorais cujo crescimento poderá ser diminuído pela administração dos agentes de bloqueio em questão incluem 17 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ os carcinomas, por exemplo, os adenocarcinomas, que poderão ter um sítio primário do tumor na mama, ovários, endométrio, cerviz, cólon, pulmão, pâncreas, esófago, próstata, intestino delgado, recto, útero ou estômago; e os carcinomas das células escamosas, que poderão ter um sítio primário nos pulmões, cavidade oral, língua, laringe, esófago, pele, bexiga, cerviz, pálpebras, conjuntiva, vagina, etc. Outras classes de tumores que poderão ser tratados incluem os sarcomas, por exemplo, os sarcomas miogénicos; os neuromas; os melanomas; as leucemias, determinados linfomas, os tumores das células trofoblásticas e germinais; os tumores neuroendócrinos e neuroectodérmicos.

Os tumores de particular interesse são aqueles que apresentam antigénios específicos do tumor. Estes antigénios poderão estar presentes num contexto anormal, em quantidades invulgarmente elevadas, ou poderão ser formas mutadas. 0 antigénio tumoral poderá ser administrado com os presentes agentes de bloqueio para aumentar a resposta das células T do hospedeiro contra as células tumorais. Estas preparações antigénicas poderão compreender a proteína purificada ou lisados de células tumorais.

Os exemplos de antigénios tumorais são as citoqueratinas, particularmente a citoqueratina 8, 18 e 19, na qualidade de um antigénio para os carcinomas. 0 antigénio da membrana epitelial (EMA), o antigénio embrionário humano (HEA-125); os glóbulos de gordura do leite humano, Mbrl, MBr8, Ber-EP4, 17-1A, C26 e T16 também são antigénios conhecidos dos carcinomas. A desmina e a actina específica do músculo são antigénios dos sarcomas miogénicos. A fosfatase alcalina placentária, a beta-gonadotrofina coriónica humana e a alfa-fetoproteína são antigénios dos tumores das células trofoblásticas e germinais. 0 antigénio específico da próstata é um antigénio dos carcinomas da próstata, o antigénio carcinoembrionário é um antigénio dos adenocarcinomas do cólon. HMB-45 é um antigénio de melanomas. A cromagranina A e a sinaptofisina são antigénios dos tumores neuroendócrinos e neuroectodérmicos. De particular interesse são os tumores agressivos que formam massas tumorais sólidas possuindo áreas necróticas. A lise destas células necróticas é uma fonte rica de antigénios para as células apresentadoras de antigénios. 18 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ A administração dos presentes agentes de bloqueio poderá estar contra-indicada para determinados linfornas. Em particular, os linfomas das células T poderão não beneficiar de uma activação acrescida. 0 antigénio CD80 é fortemente expresso pelas células de Reed-Sternberg na doença de Hodgkin, que estão frequentemente rodeadas por células T que expressam CD28 (Delabie et al. (1993) Blood 82:2845-52). Foi sugerido que a função celular acessória das células de Reed-Sternberg conduz à activação das células T e contribui para a síndrome de Hodgkin.

Muitas terapias convencionais do cancro, como a quimioterapia e a terapia de radiação, reduzem seriamente as populações de linfócitos. Embora a presente terapia possa aliviar esta imunossupressão nalguma medida, um rumo preferido de tratamento combinado utilizará estas terapias linfotóxicas antes ou após a presente terapia.

Os adjuvantes potenciam a resposta imunitária a um antigénio. Os agentes de bloqueio de CTLA-4 são utilizados como adjuvante para aumentar a activação das células T e para aumentar a comutação isotípica das células produtoras de anticorpos, aumentando, deste modo, a concentração de anticorpos da classe IgG produzidos em resposta ao imunogénio. Os agentes de bloqueio são combinados com um imunogénio num meio fisiologicamente aceitável, de acordo com as técnicas convencionais para empregar adjuvantes. 0 imunogénio poderá ser combinado numa formulação única com o agente de bloqueio ou poderá ser administrado separadamente. Os imunogénios incluem polissacáridos, proteínas, fragmentos de proteínas, haptenos, etc. A utilização com imunogénios peptídicos é de particular interesse. Os imunogénios peptídicos poderão incluir antigénios tumorais e antigénios virais ou seus fragmentos, tal como descrito acima. É possível empregar vários métodos de administração. A formulação do agente de bloqueio de CTLA-4 poderá ser injectada intravascularmente, subcutaneamente, peritonealmente, etc. A posologia da formulação terapêutica variará grandemente, dependendo da natureza da doença, da frequência de administração, da forma de administração, do objectivo da administração, da eliminação do agente do 19 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ hospedeiro e factores similares. A posologia administrada variará dependendo de factores conhecidos, tais como as caracteristicas farmacodinâmicas do agente particular, o modo e a via de administração, a idade, a saúde e o peso do receptor, a natureza e a extensão dos sintomas, os tratamentos concomitantes, a frequência do tratamento e o efeito desejado. A dose poderá ser administrada tão raramente como semanal ou bissemanalmente, ou fraccionada em doses mais pequenas e administrada diariamente, semi-semanalmente, etc. para manter um nível de dose eficaz. Geralmente, uma dose diária do ingrediente activo pode ser de cerca de 0,1 a 100 mg/kg de peso corporal. As formas farmacêuticas adequadas para administração interna geralmente contêm entre cerca de 0,1 mg e 500 mg de ingrediente activo por unidade. O ingrediente activo poderá variar entre 0,5% e 95% em peso com base no peso total da composição.

Nalguns casos, poderá ser desejável limitar o período de tratamento devido a uma proliferação excessiva das células T. As limitações serão determinadas empiricamente, dependendo da resposta do doente à terapia, do número de células T no doente, etc. 0 número de células T poderá ser monitorizado num doente por métodos conhecidos na arte, incluindo a coloração com anticorpos específicos das células T e a citometria de fluxo.

Os bloqueadores de CTLA-4 são preparados como formulações, numa dose eficaz, em meios farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, solução salina normal, óleos vegetais, óleo mineral, PBS, etc. As preparações terapêuticas poderão incluir líquidos, géis ou vectores sólidos fisiologicamente toleráveis, diluentes, adjuvantes e excipientes. Os aditivos poderão incluir agentes bactericidas, aditivos que mantêm a isotonicidade, por exemplo, NaCl, manitol, e a estabilidade química, por exemplo, tampões e conservantes, ou espécies similares. Os bloqueadores de CTLA-4 poderão ser administrados como um cocktail ou como um agente isolado. Para a administração parentérica, o agente de bloqueio poderá ser formulado como uma solução, suspensão, emulsão ou pó liofilizado em associação com um veículo parentérico farmaceuticamente aceitável. Lipossomas ou veículos não aquosos, tais como óleos fixos, também poderão 20 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ ser utilizados. A formulação é esterilizada por meio de técnicas conhecidas na arte. O efeito funcional do bloqueio de CTLA-4 também poderá ser induzido pela administração de outros agentes que mimetizam a alteração da sinalização intracelular observada com o presente invento. Por exemplo, é sabido que quinases citoplasmáticas especificas poderão ser activadas em resposta à ligação de receptores extracelulares. Os agentes que bloqueiam a actividade de quinase teriam um efeito fisiológico similar ao bloqueio da ligação dos receptores. De forma idêntica, os agentes que aumentam as concentrações de AMP cíclico, GTP e os níveis de cálcio intracelular podem produzir efeitos fisiológicos que são análogos aos observados com a ligação dos receptores extracelulares.

Os exemplos que se seguem são oferecidos como ilustração e não como limitação. O invento é tal como definido nas reivindicações. Os domínios fora do âmbito das reivindicações são para efeitos de referência.

Experimental EXEMPLO 1

Geraçao de anticorpos monoclonais reactivos com CTLA-4 de ratinho a) Preparaçao de um imunogénio CTLA-4 de ratinho

Uma proteína de fusão compreendendo as porções extracelulares do gene CTLA-4 de ratinho e a região constante da IgGl humana, denominada mCTLA4-Hgl, foi obtida dos Drs. P. Lane e K. Karjalainen (Baser Institute for Immunology, Basileia, Suíça). Um vector de expressão capaz de expressar a proteína mCTLA4-Hgl foi construído como descrito [Lane et al. Immunol. 80:56 (1993)]. Resumidamente, as sequências que codificam as porções extracelulares da molécula CTLA-4 de ratinho foram geradas utilizando PCR. O seguinte par de iniciadores foi utilizado para amplificar estas sequências de CTLA-4 a partir de um plasmídeo contendo as sequências de CTLA-4 de ratinho: 5'-TTACTCTACTCCCTGAGGAGCTCAGCACATTTGCC-3' 21 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ

(SEQ ID NO:1) e 5'-TATACTTACCAGAATCCGGGCATGGTTCTGGATCA-3' (SEQ ID ΝΟ:2). As sequências amplificadas de CTLA-4 foram depois inseridas num vector de expressão que permite a inserção de um gene de interesse a montante das sequências que codificam os domínios de charneira, CH2 e CH3 da proteína IgGl humana [Traunecker et al., Trends Biotech. 9:109 (1991)]. Cada iniciador continha sítios de restrição apropriados para subclonagem no vector de expressão da IgGl humana, juntamente com um local 3' dador de " splicing", no interior do iniciador 3', para o "splicing" aos exões gl humanos se processar correctamente. O plasmídeo contendo as sequências que codificam a proteína de fusão mCTLA4-Hgl foi designado por pHP-APr-l-neo-mCTLA4-Hgl.

Para expressar a proteína mCTLA4-Hgl, o vector de expressão pHP-APr-l-neo-mCTLA4-Hgl foi transfectado na linha de plasmacitoma de ratinho, J558L (J558L é idêntica à linha de células J558, que está disponível de ATCC [ATCC TIB 6]), utilizando a técnica Standard de fusão de protoplastos. As células J558L foram cultivadas para 5 x 104 células/ml. As células J558L transfectadas foram depois seleccionadas na presença de meio contendo xantina (Sigma) e ácido micofenólico (Calbiochem, LaJolla, Califórnia) (meio selectivo). O meio selectivo foi aplicado 24 h após a transfecção, e os clones positivos (isto é, os clones que cresceram no meio selectivo) foram rastreados duas semanas mais tarde. Os clones que segregaram a proteína de fusão foram identificados utilizando um ensaio ELISA para a IgGl humana. Identificou-se um bom clone de segregação, que foi designado por clone n.° 15. As células do clone n.° 15 foram marcadas metabolicamente com [35S]-metionina, as proteínas segregadas foram imunoprecipitadas com proteína A e as proteínas precipitadas foram resolvidas num gel de poliacrilamida-SDS. Verificou-se que a proteína mCTLA4-Hgl migrava em géis SDS-PAGE, em condições redutoras como um monómero de PM aproximadamente igual a 60000 e em condições não redutoras como um dímero.

As preparações purificadas da proteína mCTLA4-Hgl foram obtidas por cromatografia de afinidade dos sobrenadantes de cultura das células do clone n.° 15, numa coluna de proteína A-Sepharose (Zymed, South San Francisco, Califórnia). Resumidamente, as células J558 que expressam a proteína 22 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ mCTLA4-Hgl foram crescidas em meio IMDM suplementado com FCS a 5%, glutamina, 2ME e antibióticos. Os sobrenadantes de cultura foram recolhidos das células e centrifugados a 1500 xg para remover guaisguer células remanescentes, e o sobrenadante clarificado foi filtrado através de um tamanho de poro de 0,4 μιη. O sobrenadante filtrado foi ajustado a pH 8,5 utilizando NaOH IN; o sobrenadante foi depois passado por uma coluna de proteina A-Sepharose de 2 ml (volume empacotado), utilizando um caudal de 2 ml/min. Salienta-se que a linha de células J558 produz uma imunoglobulina adicional (isto é, além da proteina de fusão CTLAIg de ratinho) que se liga à proteina G. Desta forma, a utilização de resinas com proteina G não é recomendada para a purificação da proteina mCTLA4-Hgl a partir de células J558 transfectadas. A coluna de proteina A foi lavada com 20 a 30 volumes de coluna de PBS, e a proteina de fusão foi eluida com dietilamina 50 mM (pH 11,0). Recolheram-se fracções de dois mililitros para tubos contendo 0,2 ml de Tris-HCl 1 M para neutralizar o pH da amostra. Determinou-se a absorvância a 280 nm, que foi utilizada para avaliar a concentração de proteina de cada fracção. As fracções contendo proteina foram combinadas e dialisadas durante a noite contra 2 a 3 trocas de PBS (1 litro por troca). A presença de proteina mCTLA4-Hgl foi confirmada por SDS-PAGE, que revelou uma banda de aproximadamente 40 kD (o peso molecular previsto da proteina de fusão). Adicionalmente, a proteina mCTLA4-Hgl purificada foi testada num ensaio ELISA utilizando um anticorpo anti-IgGl humana (HP6058; o hibridoma HP6058 (ATCC CRL 1786) foi utilizado como fonte dos anticorpos HP6058). b) Imunização de hamsters

Para imunizar hamsters com a proteina de fusão de CTLA-4 de ratinho, a proteina mCTLA4-Hgl purificada (aqui a seguir designada por CTLA-4Ig) foi utilizada para revestir células da bactéria Staphylococcus aureus (StaphA) (Calbiochem, LaJolla, Califórnia) mortas pelo calor. Hamsters Golden Syrian com seis semanas de idade (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, Indiana) foram injectados na parte plantar da pata com 50 μΐ (volume empacotado) de bactérias StaphA mortas pelo calor, revestidas com aproximadamente 100 μg de proteina CTLA-4Ig 23 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ suspensa em 0,2 ml de PBS. As células StaphA foram revestidas da forma que se segue.

As células StaphA foram preparadas de acordo com o protocolo do fabricante para uma concentração de 10% p/v em solução salina (NaCl a 0,9%). Um ml da mistura pastosa de células bacterianas foi centrifugado a 1400xg para depositar as bactérias, e o sobrenadante foi removido. Adicionou-se ao depósito 1 ml de uma solução contendo aproximadamente 100 μρ de CTLA-4Ig purificada em PBS, e a mistura foi incubada a 37°C durante 2 horas com agitação. As bactérias foram depois depositadas por centrifugação como descrito acima, e o depósito foi lavado duas vezes com 1 ml de PBS/lavagem. As células bacterianas revestidas com CTLA-4Ig foram depois ressuspensas em aproximadamente 200 μΐ de PBS e injectaram-se 50 μΐ desta preparação por parte plantar da pata.

Administrou-se um total de cinco injecções por hamster. No dia do reforço final e antes da injecção, obtiveram-se aproximadamente 100 μΐ de soro por sangramento intra-ocular, o qual foi efectuado pelos técnicos do gabinete de tratamento de animais laboratoriais (Universidade da Califórnia, Berkeley). Este soro foi analisado em comparação com o soro obtido por uma metodologia idêntica antes da primeira injecção.

Utilizou-se um ensaio ELISA de ligação de CTLA-4Ig para demonstrar a presença, no sangue após a imunização, de anticorpo que reconhece a proteína de fusão CTLA-4Ig. O ensaio ELISA de ligação de CTLA-4Ig foi conduzido da forma que se segue. A proteína de fusão CTLA-4Ig ou a proteína de fusão CD4lg foi utilizada para revestir os poços de placas ELISA de fundo plano modificadas de 96 poços (Corning, Corning, Nova Iorque). A proteína CD4Ig é uma proteína de fusão que consiste no domínio extracelular de CD4 de ratinho e nos domínios de charneira, CH2 e CH3 da IgGl humana [Traunecker et al., supra.]. A proteína CD4Ig foi utilizada como controlo negativo nos ensaios ELISA. A proteína de fusão CD4Ig foi preparada a partir de células J558 transfectadas e purificada por cromatografia de afinidade em proteína A-Sepharose, como 24 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ descrito para a proteína de fusão mCTLA4-Hgl (isto é, a proteína CTLA-4Ig) na secção (a) acima.

Cinquenta microlitros das proteínas de fusão, numa concentração de 1 pg/ml em gelatina a 0,4% em PBS, foram colocados nos poços. As placas foram incubadas a 37°C durante 2-3 horas para permitir que as proteínas absorvessem. As placas foram depois lavadas três vezes utilizando 150 μΐ de NaCl a 0,9% contendo Tween-20 a 0,05%. Os restantes sítios de ligação de proteína nos poços foram depois bloqueados utilizando gelatina a 0,4% em PBS (tampão de bloqueio) durante 30 min a 37°C. Após o passo de bloqueio, as placas foram lavadas duas vezes com NaCl a 0,9% contendo Tween-20 a 0,05%. Cinquenta microlitros de solução contendo anticorpos anti-CTLA-4 (isto é, o soro dos hamsters imunizados, os anticorpos purificados ou os sobrenadantes de cultura) foram adicionados aos poços em triplicado, e as placas foram incubadas durante 2-3 horas a 37°C. Para avaliar a quantidade de anticorpos anti-CTLA-4 presentes no soro dos hamsters imunizados, as amostras de sangue iniciais pós-imunização foram testadas utilizando diluições que variaram entre 1:1000 e 1:100 (diluídas em PBS contendo gelatina a 0,4%).

Os poços foram depois lavados três vezes utilizando 150 μΐ de NaCl a 0,9% contendo Tween-20 a 0,05%. Adicionaram-se cinquenta microlitros de uma solução contendo soros policlonais de cabra anti-IgG de hamster conjugados com peroxidase de rábano (CalTag, South San Francisco, Califórnia), numa concentração de 1 pg/ml em tampão de bloqueio, aos poços, e as placas foram incubadas durante 1 hora a 37°C. As placas foram depois lavadas quatro vezes com NaCl a 0,9% contendo Tween-20 a 0,05%. Adicionou-se uma solução contendo ABTS 0,55 mg/ml [2,2'-azino-bis(ácido 3-etilbenzotiazolino-6-sulfónico)] em tampão citrato [ácido cítrico 0,1 M (pH 4,35)], e as placas foram incubadas durante aproximadamente 20 min a 37°C. As placas foram depois lidas a 405 nm, utilizando um leitor de placas BioTech (Beckman Instruments, Paio Alto, Califórnia) para avaliar a absorvância do produto de reacção verde.

Os resultados do ensaio ELISA de ligação de CTLA-4Ig demonstraram a presença de anticorpo que reconheceu a proteína 25 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ de fusão CTLA-4Ig na amostra de sangue pós-imunização, a diluições do soro lOOOx superiores à diluição à gual o fundo pôde ser detectado utilizando a amostra de sangue pré-imunização . c) Isolamento de linhas de hibridoma que segregam anticorpos anti-CTLA-4 de ratinho

Três dias após a injecção final, os gânglios linfáticos de drenagem foram removidos dos hamsters. Os linfócitos foram isolados dos gânglios linfáticos popliteos, que drenam os membros traseiros. Prepararam-se suspensões celulares a partir dos gânglios linfáticos isolados da forma que se segue. Os gânglios dissecados foram colocados numa placa de cultura de tecidos (Falcon Plastics, Mountain View, Califórnia) contendo meio RPMI (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) suplementado com FCS a 10% (BioWhittaker, Walkersville, MD). Os linfócitos foram soltos dos gânglios por trituração cuidadosa dos gânglios com lamelas de vidro fosco. As suspensões de linfócitos foram contadas utilizando um hemocitómetro.

Os linfócitos isolados a partir dos hamsters imunizados foram fundidos com o parceiro de fusão celular, P3X3.Ag8.653 (ATCC CRL 1580). As células P3X3.Ag8.653 foram divididas de 1:20 a cada 3 dias, antes da fusão em IMDM (Universidade da Califórnia, Unidade de cultura de tecidos de São Francisco) contendo FCS (soro fetal de vitelo) a 20% (BioWhittaker, Walkersville, MD), 2-ME 50 μΜ e gentamicina 50 μΜ. A fusão com a linha de mieloma utilizou uma técnica Standard de fusão com polietilenoglicol [McKearn et al., Immunol. Rev. 47:91 (1979)]. Resumidamente, prepararam-se suspensões celulares estéreis dos linfócitos em meio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) isento de soro. Os linfócitos foram lavados duas vezes com IMDM e ajustados para uma densidade de 12,5 x 106 células/ml.

As células P3X3.Ag8.653 (crescidas como descrito acima) foram lavadas duas vezes com meio IMDM isento de soro [estas células foram centrifugadas durante 5 minutos a 1000 rpm, numa centrífuga TJ-β (Beckman Instruments, Paio Alto, Califórnia), 26 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ a 25°C para depositar as células], e a densidade das células P3X3.Ag8.653 foi ajustada para 5 x 106 células/ml.

Misturaram-se quatro mililitros da suspensão celular dos linfócitos com 1 ml das células P3X3.Ag8.653 lavadas, numa placa de cultura de tecidos de 60 mm (Falcon) . As placas de cultura de tecidos foram colocadas em suportes de placas de microtitulação (Beckman Instruments, Paio Alto, Califórnia) e centrifugadas a 250 xg (1200 rpm; centrífuga TJ-6) durante 5 min para criar uma monocamada aderente de células no fundo da placa. O sobrenadante foi aspirado das placas, e as placas foram habilmente inundadas com 1 ml de polietilenoglicol a 50% (PEG 1500, Boehringer Mannheim) em IMDM. A solução de PEG foi preparada aquecendo separadamente 4 ml de PEG 150 0 e 4 ml de IMDM num banho de água a 60°C e depois combinando-os mediante aspiração do PEG para uma pipeta, seguido do IMDM e misturando-os bem. Após 30 segundos à temperatura ambiente, as placas foram inundadas com 5 ml de meio IMDM isento de soro.

Após a lavagem final no dia da fusão, as células foram deixadas na placa de 60 mm com 5 ml de meio IMDM contendo FCS, durante 12 horas a 37°C, com 5% CO2. No dia seguinte, as células fundidas foram diluídas com 100 ml de IMDM contendo FCS a 20% e meio IX HAT (Boehringer Mannheim, Nova Jérsia) , tendo-se plaqueado 100 μΐ por poço em placas de fundo plano de 96 poços. Após 5 e 9 dias, adicionaram-se 50 μΐ adicionais de meio a cada poço. Em seguida, removeram-se 50 μΐ de meio e adicionou-se meio fresco a intervalos de 3 dias. Quando os números de células se encontraram dentro do intervalo de 1000-5000 por poço, os sobrenadantes dos hibridomas foram testados por ELISA quanto à reactividade para CTLA-4Ig e quanto a uma ausência de reactividade para CD4Ig como descrito na secção (b) acima. Os sobrenadantes dos hibridomas foram utilizados não diluídos no ensaio ELISA (50 μΐ/poço) .

Os hibridomas dos poços positivos foram clonados repetitivamente por diluição limitante, na presença de camadas de células nutritivas à base de timócitos de ratinho irradiados. Uma linha de hibridoma segregando um anticorpo monoclonal, denominado anticorpo 9H10, foi seleccionada pelos seguintes critérios: 27 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ 1) reactividade contra CTLA-4Ig, mas não contra CD4Ig em ensaios ELISA; 2) a capacidade de bloquear a ligação de CTLA-4Ig a transfectantes B7; 3) a capacidade de corar células T activadas, mas não células T acabadas de isolar; e 4) a capacidade de corar um transfectante CTLA-4, mas não os transfectantes de controlo. A capacidade do anticorpo 9H10 para bloquear a ligação de CTLA4Ig a transfectantes B7 foi demonstrada da forma que se segue. Aproximadamente 10 μΐ do AcM 9H10 foram incubados a 22°C durante 30 min com 1 μg da proteína de fusão CTLA-4Ig, num volume final de 50 μΐ de uma solução compreendendo PBS. A esta mistura adicionaram-se 2 x 105 células B7-EL-4 suspensas em 10 μΐ de PBS gelado contendo soro de vitelo a 1% e azida de sódio a 0,05%. As células B7-EL-4 são a linha de células de timoma EL4 derivada de C57BL/6 transfectadas com um vector de expressão que codifica a proteína de superfície celular B7 de ratinho, tal como descrito em Townsend et al., Câncer Res. 54:6477-83 (1994) . A mistura resultante foi depois incubada em gelo durante 30 minutos, seguindo-se duas lavagens com 4 ml/lavagem de PBS contendo soro de vitelo a 1% e azida de sódio a 0,05%. As células foram depois coradas com anticorpo anti-IgG humana conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Caltag, South San Francisco, Califórnia). Como controlo negativo para esta experiência, a proteína de fusão CTLA-4Ig foi incubada quer com uma IgG de hamster de controlo quer com a linha de células parentais EL-4. As células foram analisadas num FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, Califórnia). 0 programa LYSIS II (Becton Dickinson) foi utilizado para estabelecer "gates" electrónicos das populações relevantes. Na maioria das experiências, recolheram-se 10000 eventos "gated" para análise. Os resultados mostraram que o anticorpo 9H10 bloqueou a ligação de CTLA-4 às células B7-EL-4. A capacidade do anticorpo 9H10 para corar as células T activadas, mas não as células T acabadas de isolar foi demonstrada da forma que se segue. Geraram-se esplenócitos frescos e activados. Os baços de ratinhos BALB/c com 4-6 semanas foram recolhidos e picados, e as suspensões foram tratadas com solução hemolítica de Gey para remover os 28 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ glóbulos vermelhos, uma técnica Standard na arte [Mishell & Shiigi, Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Co., San Francisco (1980) pp.23-24]. As células foram cultivadas em meio RPMI contendo soro fetal de vitelo a 10%, tendo-se adicionado anticorpo anti-CD-3 solúvel a 10 μρ/ιηΐ para activar uma porção da população celular. A outra porção dos esplenócitos não foi tratada com anti-CD3 e representa esplenócitos frescos (mas não activados). As duas populações de células foram depois coradas quer com 1) uma combinação de 9H10 conjugado com FITC (o anticorpo anti-CTLA-4; 5 μρ de anticorpo) e de Thyl. 2 conjugado com PE, quer com 2) uma combinação de Ig de hamster conjugada com FITC e de Thyl. 2 conjugado com PE. Os resultados foram analisados num FACScan e foram "gated" electronicamente para as células positivas para Thyl.2 para analisar apenas a população de células T relevantes. Os resultados desta experiência demonstraram que o anticorpo 9H10 corou as células T activadas (isto é, que expressam CTLA-4), mas não as células T acabadas de isolar. A capacidade do anticorpo 9H10 para corar um transfectante CTLA-4, mas não os transfectantes de controlo foi demonstrada da forma que se segue. Uma linha de células parentais CHO (ovário de hamster chinês; células CHO-K1) (ATCC CCL 61) foi transfectada com pSRlneo.CTLA-4. O vector de expressão pSRlneo.CTLA-4 contém o ADNc completo de 1,9 kb que codifica a proteína CTLA-4 de ratinho [Brunet et al., Nature 328:267 (1987)] inserido no vector de expressão pSRlneo. As células transfectadas com o vector pSRlneo.CTLA expressam a proteína CTLA-4 de ratinho na superfície celular.

As células parentais (isto é, as células CHO-K1) e as células transfectadas foram coradas quer com 1) uma combinação de 9H10 conjugado com FITC (o anticorpo anti-CTLA-4; 5 μρ de anticorpo) e de Thyl. 2 conjugado com PE, quer com 2) uma combinação de Ig de hamster conjugada com FITC e de Thyl. 2 conjugado com PE. Os resultados foram "gated" electronicamente para as células positivas para Thyl.2 para analisar apenas a população de células T relevantes. Os resultados desta experiência demonstraram que o anticorpo 9H10 cora os transfectantes CTLA-4, mas não os transfectantes de controlo. 29 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ

Os resultados acima demonstraram que o anticorpo monoclonal 9H10 reage especificamente com a proteína CTLA-4 de ratinho. EXEMPLO 2

Os anticorpos monoclonais anti-CTLA-4 provocam a rejeição de tumores V51BLimlO em ratinhos 0 anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 de ratinho, 9H10, foi utilizado para tratar ratinhos que receberam injecções de uma linha de células de carcinoma do cólon. A injecção do AcM 9H10 juntamente com as células tumorais V51BLimlO resultou na rejeição completa das células tumorais nos animais experimentais. Em contraste, tanto os ratinhos injectados com um AcM anti-CD28 e com células V51BLimlO como os ratinhos injectados apenas com células V51BLimlO desenvolveram tumores que apresentaram um aumento regular do tamanho médio do tumor ao longo de um período de quatro semanas.

a) Geração da linha de células V5lBLimlO A linha de células V51BLimlO foi gerada por transfecção do vector de expressão SRlneo na linha de células 51BLimlO. A linha de células 5lBLim é uma linha de células de carcinoma do cólon que proporciona um modelo animal preciso para a metástase do cancro do cólon nos seres humanos. Bresalier et al., Câncer Res. 47:1398 (1987). A linha de células V51BLimlO nas presentes experiências foi gerada da forma que se segue. A linha de células de cancro do cólon murino 51B estabelecida por Corbett et al., Câncer Res. 35:2434-9 (1975) foi injectada na parede cecal de ratinhos BALB/c. Constatou-se que os tumores colónicos resultantes sofriam metástases espontâneas para o fígado numa minoria dos ratinhos injectados. Bresalier et al., Câncer Res. 47:1398 (1987). Desenvolveram-se linhas de células tumorais com uma actividade metastática progressivamente crescente através da recolha de células das metástases originais, que foram depois utilizadas para re-injecção sucessiva no ceco de ratinhos adicionais. Estas linhas de células foram designadas 30 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ por 51BLim-l até 51BLim-5, em que o número após o hífen se refere ao número de ciclos metastáticos.

Um derivado metastático 51B obtido do Dr. Warren da Universidade da Califórnia, São Francisco, foi designado por 51BLiml0. A linha de células 51BLiml0 corresponde à linha de células 51BLÍM5 descrita por Bresalier et al., Câncer Res. 47 :1398 (1987) .

0 vector de expressão SRlneo foi transfectado na linha de células 51BLÍM-10 para gerar as células V51BLiml0 como descrito [Townsend et al., Câncer Res. 54:6477-83 (1994)]. O vector de expressão SRlneo (obtido de L. Lanier do DNAX Research Institute of Molecular and Cellular Biology, Paio Alto, Califórnia) permite a expressão de um gene de interesse sob o controlo transcricional da LTR de HTLV-1. O vector SRlneo também contém o gene neo sob o controlo transcricional do promotor/amplif icador de SV40. A presença do gene neo permite a selecção das células transfectadas que contêm o vector SRlneo. 0 vector de expressão SRlneo foi transfectado em células 51 BLiM-10 por electroporação, utilizando um electroporador BTX T800 (BTX, Inc., San Diego, Califórnia). Aplicaram-se cinco impulsos, cada um deles durante 99 με, a 450 ou 600 V. A electroporação foi efectuada num volume final de reacção de 750 μΐ de uma solução compreendendo sacarose 270 mM; NaP04 (pH 7,4) 7 mM; MgCl2 1 mM; 5 x 106 células 51B LiM-10 e 50 μρ do vector de expressão SRlneo. Após a electroporação, as células foram cultivadas durante 24 horas em meio completo [MEM de Eagle (Universidade da Califórnia, Unidade de cultura de células de São Francisco, São Francisco, Califórnia) suplementado com FCS a 10% (Sigma), aminoácidos não essenciais, solução de vitaminas MEM, L-glutamina, piruvato de sódio, gentamicina (todos de Irvine Scientific, Santa Ana, Califórnia) e bicarbonato de sódio a 7,5% (Sigma)] a 37°C. Meio de selecção [meio completo contendo geneticina 1 mg/ml (sulfato G418, GIBCO, Grand Island, Nova Iorque)]. Após 14 dias de cultura no meio de selecção, as células resistentes ao fármaco foram combinadas e utilizadas em experiências subsequentes como uma população policlonal designada por V51BLiml0. 31 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ

As células tumorais V51BLimlO foram mantidas em meio MEM de Eagle (Universidade da Califórnia, Unidade de cultura de células de São Francisco, São Francisco, Califórnia) suplementado com FCS a 10% (Sigma), aminoácidos não essenciais, solução de vitaminas MEM, L-glutamina, piruvato de sódio, gentamicina, penicilina-estreptomicina (todos de Irvine Scientific, Santa Ana, Califórnia) e geneticina 1 mg/ml. As culturas de células foram estabelecidas a partir de alíquotas congeladas de baixa passagem (isto é, menos de 10 passagens) e mantidas em cultura durante não mais de 30 dias antes da utilização.

Verificou-se que as células V51BLiml0 e as células parentais 51BLiml0 apresentam taxas de crescimento similares in vitro e in vivo. A expressão do gene de resistência à neomicina nas células V51BLiml0 e numa variedade de outras linhas de células tumorais não teve qualquer efeito na tumorigenicidade ou na taxa de crescimento dos tumores das células injectadas. b) Injecção de ratinhos com células tumorais V51BLiml0 e anticorpos monoclonais

As células tumorais V51BLiml0 foram colhidas de placas de cultura de tecidos com tripsina-EDTA (Sigma), lavadas três vezes com meio isento de soro (MEM de Eagle) e suspensas numa concentração de 2 x 107 células/ml.

Os ratinhos utilizados nesta experiência foram ratinhos BALB/c fêmea com 6-8 semanas de idade (Charles River

Laboratories, Wilmington, MA) . Grupos de cinco ratinhos foram anestesiados por inalação de metoxiflurano, marcados com um entalhe na orelha para identificação e injectados subcutaneamente com 200 μΐ da suspensão de células tumorais V51BLiml0 (4 x 106) no flanco esquerdo. Os grupos tratados receberam injecções intraperitoneais de 100 μρ do AcM anti-CTLA-4 9H10 descrito acima ou, em alternativa, do AcM anti-CD28, 37.51, no mesmo dia, e injecções i.p. adicionais de 50 μρ nos dias 3 e 6 após a injecção das células tumorais (designadas pelas setas escuras na Figura 1). O anticorpo monoclonal anti-CD28, 37.51, é dirigido contra a proteína CD28 32 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ de ratinho [Gross et al., J. Immunol. 149:380 (1992)] e actuou como controlo negativo.

Os ratinhos foram monitorizados quanto ao crescimento subcutâneo do tumor, e os diâmetros de bissecção dos tumores em desenvolvimento foram medidos com compasso. Todos os ratinhos não tratados, ou tratados com o anticorpo anti-CD28, desenvolveram tumores progressivamente crescentes e necessitaram de eutanásia aos 35 dias após a inoculação. Em contraste, todos os ratinhos tratados com o anticorpo anti-CTLA-4 rejeitaram totalmente os seus tumores após um período curto de crescimento limitado. Como ilustrado na Figura IA, a área média do tumor em mm2 (apresentada no eixo yy) diminuiu gradualmente começando aproximadamente no dia 14 após a injecção do tumor (apresentado no eixo xx), tendo diminuído para zero aproximadamente no dia 24. O tratamento com anti-CTLA-4 foi menos eficaz para doses mais pequenas de tumor. A Figura 1B ilustra o tamanho médio do tumor em ratinhos injectados com 2 x 106 células tumorais e tratados como descrito acima com anticorpo anti-CTLA-4 ou com um anticorpo de hamster irrelevante. O tratamento com anticorpo anti-CTLA-4 continuou a ter um efeito dramático sobre o crescimento do tumor, mas um ratinho desenvolveu um tumor rapidamente e outro desenvolveu-o muito mais tarde. A Figura 1C ilustra o crescimento dos tumores individuais em ratinhos injectados com 2 x 106 células V5lBLimlO. Três dos ratinhos permaneceram livres de tumor além dos 80 dias. É evidente que o bloqueio de CTLA-4 aumentou significativamente a rejeição das células tumorais B7-negativas. c) Injecção de ratinhos com células tumorais B7-5lBLimlO e anticorpos monoclonais

As células 51BLimlO foram transfectadas como descrito acima com um plasmídeo contendo o gene da proteína B7-1 murina e clonadas por diluição limitante. As células tumorais B7-51BLiml0 foram colhidas de placas de cultura de tecidos com tripsina-EDTA (Sigma), lavadas três vezes com meio isento de soro (MEM de Eagle) e suspensas numa concentração de 2 x 107 células/ml. 33 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ

Os ratinhos utilizados nesta experiência foram ratinhos BALB/c fêmea com 6-8 semanas de idade (Charles River

Laboratories, Wilmington, MA) . Grupos de cinco ratinhos foram anestesiados por inalação de metoxiflurano, marcados com um entalhe na orelha para identificação e injectados subcutaneamente com 100 μΐ da suspensão de células tumorais B7-51BLimlO (4 x 106) no flanco esquerdo. Os grupos tratados receberam injecções intraperitoneais de 100 μρ do AcM anti-CTLA-4 9H10 descrito acima ou, em alternativa, do AcM anti-CD28, 37.51. Injecções de 100, 50 e 50 μρ foram administradas nos dias 0, 3 e 6, respectivamente (os dias de injecção estão indicados pelas setas escuras na Figura 2). O anticorpo monoclonal anti-CD28, 37.51, é dirigido contra a proteína CD28 de ratinho [Gross et al.r J. Immunol. 149:380 (1992)] e actuou como controlo negativo.

Os ratinhos foram monitorizados quanto ao crescimento subcutâneo do tumor, e os diâmetros de bissecção dos tumores em desenvolvimento foram medidos com compasso. Os resultados desta experiência estão apresentados na Figura 2. O tratamento com anticorpos anti-CTLA-4 inibiu o crescimento do tumor B7-51BLiml0 em comparação com os grupos anti-CD28 e de controlo. Todos os ratinhos no grupo não tratado e no grupo tratado com anti-CD28 desenvolveram pequenos tumores que cresceram progressivamente durante cinco a dez dias e depois, no final, regrediram em oito dos dez ratinhos aproximadamente ao dia 23 após a injecção. Os dois tumores pequenos que não regrediram permaneceram estáticos durante mais de 90 dias. Em contraste, 3 dos 5 ratinhos tratados com anticorpo anti-CTLA-4 desenvolveram tumores muito pequenos, e todos estes regrediram completamente ao dia 17. d) A rejeição induzida por anti-CTLA-4 das células tumorais V51BLimlO resulta em protecção contra uma provocação subsequente com células de carcinoma do cólon de tipo selvagem.

Cinco ratinhos tratados com anticorpo anti-CTLA-4 que haviam rejeitado completamente as células tumorais V51BLiml0 foram novamente provocados 70 dias mais tarde com 4 x 106 células tumorais 51BLimlO de tipo selvagem, injectadas subcutaneamente no flanco oposto. Cinco ratinhos naive foram 34 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ também injectados como controlos. Os diâmetros dos tumores foram medidos e comunicados como descrito. A rejeição anterior do tumor resultou numa protecção significativa contra a provocação secundária em comparação com os controlos naive. Todos os ratinhos de controlo desenvolveram tumores progressivamente crescentes, desenvolveram cargas tumorais massivas e foram eutanizados no dia 35 após a inoculação. 3 dos 5 ratinhos previamente imunizados permaneceram livres de tumores 70 dias após a provocação. Apenas um dos ratinhos previamente imunizados teve um tumor detectável ao dia 14, e o crescimento deste tumor foi muito lento. No final, desenvolveram-se mais dois tumores nos ratinhos imunizados 42 dias após a provocação. Os resultados estão ilustrados na Figura 3. Estes resultados demonstraram que a rejeição do tumor mediada pelo bloqueio de CTLA-4 resultou numa memória imunológica. e) O tratamento anti-CTLA-4 reduz o crescimento de tumores estabelecidos.

Grupos de ratinhos foram injectados subcutaneamente com 2 x 106 células tumorais 51BLimlO.

Os animais de controlo (n=10) foram injectados i.p. com 100 μρ de anticorpo irrelevante de hamster nos dias 0, 3, 6 e 9, como indicado pelas setas em orientação ascendente na Figura 4. Um grupo de tratamento anti-CTLA-4 recebeu injecções i.p. nos mesmos dias. Os outros ratinhos tratados (n=5) receberam injecções i.p. de anticorpo anti-CTLA-4 começando no dia 7 e, subsequentemente, nos dias 10, 13 e 16 (setas em orientação descendente). Os resultados estão apresentados na Figura 4. Os ratinhos tratados com anticorpos anti-CTLA-4 em qualquer momento no tempo apresentaram um crescimento significativamente reduzido do tumor em comparação com os controlos não tratados. O atraso do tratamento pareceu ser mais eficaz, tendo 2 dos 5 ratinhos permanecido livres de tumor além dos trinta dias após a inoculação. f) O tratamento anti-CTLA-4 reduz o crescimento do fibrossarcoma murino SA1N.

Os efeitos do tratamento anti-CTLA-4 não se limitaram a linhas de células de carcinomas. Obtiveram-se resultados 35 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ similares com uma linha celular de fibrossarcoma de crescimento rápido de ratinhos A/JCr. Grupos de ratinhos foram injectados subcutaneamente no flanco com uma suspensão de 1 x 106 células de fibrossarcoma SA1N. Os grupos tratados foram injectados i.p. com 100 μρ de anticorpo anti-CTLA-4 ou com anticorpo de hamster de controlo irrelevante nos dias 0, 3 e 6, tal como indicado pelas setas na Figura 5. Todos os animais de controlo foram mortos no dia 30. Dois dos cinco animais tratados com anti-CTLA-4 permaneciam livres de tumor no dia 55. Os resultados estão apresentados na Figura 5. EXEMPLO 3

Os anticorpos monoclonais anti-CTLA-4 actuam como um adjuvante a) Preparação do imunogénio O DNP-KLH foi obtido de Calbiochem (San Diego, Califórnia) e suspenso em água desionizada para concentrações de 1 mg/ml, 100 ng/ml ou 10 pg/ml. Adicionou-se um ml de adjuvante completo de Freund (Difco, Michigan) a cada 1 ml das preparações de DNP-KLH. Estas foram depois emulsionadas em duas seringas de 5 ml ligadas por um conector luer-lock de extremidade dupla através da passagem rápida pelo luer-lock, como descrito em Current Protocols in Immunology, Colligan et al., eds., section 2.4. 30 minutos antes da injecção do imunogénio, ratinhos C57B1/6 com 4-6 semanas de idade foram injectados no peritoneu, utilizando uma seringa de calibre 23, com 200 μg de anticorpo de hamster de controlo não especifico ou com 200 μρ de anticorpo anti-CTLA-4 9H10 (ambos num volume total de 200 μΐ). Os ratinhos foram subsequentemente injectados subcutaneamente, utilizando uma seringa de calibre 21, em dois locais nas costas, com 2 00 μΐ do imunogénio na forma descrita acima, proporcionando uma dose de 100 \lq, 10 ng ou 1 pg/ratinho, respectivamente. Após três dias, as injecções de anticorpo foram repetidas.

Dez dias após o primeiro tratamento, os animais foram eutanizados. O sangue foi obtido por punção cardíaca e removido para tubos Eppendorf. Permitiu-se que estas amostras 36 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ coagulassem a 4°C durante a noite, tendo-se depois centrifugado para obter os soros.

Os soros foram analisados guanto a anticorpos de isotipos específicos que reconhecem DNP, utilizando um ensaio ELISA Standard para isotipos como descrito em Current Protocols in Immunology (supra.), section 2.1. Resumidamente, o DNP foi plaqueado, numa concentração de 100 ng/ml e num volume de 50 μΐ, em cada poço de uma placa ELISA de fundo redondo modificada de 96 poços de Corning. Os poços foram bloqueados utilizando tampões como já descrito. Adicionaram-se diluições em série de 3X de cada soro, começando em 1:100, a cada poço. Estes foram incubados durante uma hora a 25°C e lavados com tampão de lavagem. Os isotipos foram detectados utilizando anticorpos específicos de ratinho como agentes de detecção, numa concentração de 1 μg/ml, em 50 μΐ de tampão de bloqueio incubado durante uma hora. Os anticorpos de isotipos são biotinilados, e a detecção foi obtida por incubação com avidina-peroxidase de rábano, lavagem e adição do substrato da peroxidase (ABTS, Sigma, Mo.). Adicionou-se tampão de terminação, e a absorvância de cada poço foi lida com um leitor de ELISA a um comprimento de onda de 490-498 nm, no espaço de 5-8 min após a paragem da reacção.

Os resultados estão apresentados na Figura 6. Cada um dos painéis ilustra a concentração de um isotipo diferente na amostra de soro. 0 eixo yy representa a leitura da D.O., em que um aumento da D.O. indica uma maior concentração de anticorpos no soro que tem esse isotipo. O eixo xx ilustra a quantidade de antigénio que foi injectada - 100 μg, 10 ng ou 1 pg por animal, respectivamente. É possível ver que o anticorpo anti-CTLA-4 aumenta a comutação isotípica para IgGl, IgG2a e IgG2b à dose mais elevada de antigénio. A análise da função das células T foi realizada da forma que se segue. As células dos gânglios linfáticos foram isoladas e estimuladas in vitro durante 72 horas com KLH. Os gânglios linfáticos axilares, inguinais, mesentéricos, braquiais, cervicais e poplíteos foram removidos para uma placa contendo meio RPMI completo (FCS a 10% (Hyclone, Montana); glutamina 2 mM; β-mercaptoetanol 50 μΜ; gentamicina 50 μg/ml). Os gânglios linfáticos foram picados para obter 37 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ suspensões de células únicas, filtrados através de uma malha nytex para remover os particulados e contados utilizando um hemocitómetro. As células foram plaqueadas em 150 μΐ de meio RPMI completo em placas cluster de fundo redondo de 96 poços, numa densidade de 5 x 105; 2,5 x 105 ou 1,25 x 105 células/poço. Adicionaram-se soluções de KLH em meio RPMI completo para concentrações finais de 100, 10, 1 ou 0 μρ/ιηΐ, e as placas foram incubadas a 37°C durante 64 horas, em incubadores humidificados com 5% CO2. Após 64 horas, adicionaram-se 20 μΐ de meio RPMI completo contendo 1 μθί de 3H-timidina a cada poço, e as placas foram incubadas durante oito horas adicionais. Nesta altura, as culturas foram colhidas para filtros de fibra de vidro, utilizando um colector de células de 96 poços da Inotech. Os filtros foram secos e contados utilizando um contador Packard Matrix. Cada condição foi realizada em triplicado, e os resultados representam a média dos valores em triplicado.

Os resultados estão apresentados na Figura 7. A fila superior ilustra um número constante de células (5 x 105 células) com concentrações variáveis de antigénio (apresentadas no eixo xx). O eixo yy ilustra a incorporação de 3H-timidina, uma medida da proliferação celular. O painel inferior ilustra uma concentração de antigénio constante (10 μg/ml) com números variáveis de células (apresentados no eixo xx) . Os resultados indicam que o bloqueio de CTLA-4 regula fortemente de forma positiva a resposta das células T às doses mais elevadas de antigénio. EXEMPLO 4

Geraçao de anticorpos dirigidos contra proteínas CTLA-4 humanas

Os anticorpos anti-CTLA-4 humana sao gerados da forma que se segue. a) Proteínas CTLA-4 humanas para imunização de animais hospedeiros.

Os imunogénios compreendendo proteínas CTLA-4 humanas contêm a totalidade ou uma porção do domínio extracelular da 38 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ proteína CTLA-4 humana. Ο domínio extracelular da proteína CTLA-4 humana compreende os resíduos de aminoácidos 38-161, tal como indicados nas referências das bases de dados. O imunogénio CTLA-4 humano compreende a proteína CTLA-4 humana completa ou uma proteína de fusão compreendendo o domínio extracelular da proteína CTLA-4 humana e um parceiro de fusão. 0 imunogénio compreende a proteína CTLA-4 humana completa inserida na membrana de uma célula. A célula que expressa a proteína CTLA-4 humana à superfície é utilizada para imunizar um animal hospedeiro.

Os imunogénios que compreendem porções da proteína CTLA-4 humana são gerados utilizando a reacção de PCR, para amplificar sequências de ADN que codificam a proteína CTLA-4 humana a partir do ARNm de células H38, uma linha de leucemia associada a HTLV II (R. Gallo, National Câncer Institute). 0 ARNm é submetido a transcrição reversa para gerar ADNc de primeira cadeia. 0 ADNc é depois amplificado. Estas sequências são ligadas a sequências que codificam um parceiro de fusão, tal como descrito em Linsley et al. [J. Exp. Med 174:561 (1991)]. 0 vector de expressão codifica uma proteína de fusão denominada CTLA4Ig, que compreende (da extremidade amino- para a extremidade carboxi-) o péptido sinal da oncostatina Μ, o domínio extracelular da proteína CTLA-4 humana e os domínios H, CH2 e CH3 da IgGl humana. 0 péptido sinal da oncostatina M é utilizado em vez do péptido sinal da CTLA-4 humana natural. Os resíduos de cisteína encontrados no domínio de charneira de tipo selvagem da molécula de IgGl humana foram mutados para serinas na construção do vector que codifica a proteína CTLA4Ig (Linsley et al., supra). b) Imunização de animais hospedeiros com proteínas CTLA-4 humanas.

Para imunizar animais com imunogénios compreendendo proteínas CTLA-4 humanas, utilizam-se animais hospedeiros não humanos. 0 imunogénio compreendendo uma proteína de fusão CTLA-4 humana/IgG (por exemplo, CTLA4Ig) é utilizado para revestir células da bactéria Staphylococcus A (StaphA) mortas pelo calor como descrito no Exemplo lb. Ratinhos BALB/c com seis semanas de idade são injectados na parte plantar da pata 39 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ com 50 μΐ (volume empacotado) de bactérias StaphA mortas pelo calor, revestidas com aproximadamente 100 μρ de CTLA-4Ig suspensa em 0,2 ml de PBS.

Administra-se um total de cinco injecções por ratinho. No dia do reforço final e antes da injecção, obtêm-se aproximadamente 100 μΐ de soro por sangramento intra-ocular como descrito no Exemplo lb. O soro é analisado em comparação com o soro obtido por uma metodologia idêntica antes da primeira injecção (isto é, o soro pré-imunização).

Utilizou-se um ensaio ELISA de ligação de CTLA-4Ig humana para demonstrar a presença, na amostra de sangue pós-imunização, de anticorpo que reconhece a proteína de fusão CTLA-4Ig humana. O ensaio ELISA de ligação de CTLA-4Ig humana foi realizado como descrito acima no Exemplo lb, com excepção das placas de ELISA estarem revestidas com a proteína CTLA-4 humana. O soro e os gânglios linfáticos dos ratinhos imunizados, contendo anticorpo que reconhece a proteína de fusão CTLA-4Ig humana na amostra de sangue pós-imunização, em diluições do soro lOOOx superiores à diluição à qual o fundo pôde ser detectado, são recolhidos. Os linfócitos são preparados a partir dos gânglios linfáticos de drenagem dos ratinhos imunizados e são depois utilizados para a geração de anticorpos monoclonais dirigidos contra a proteína CTLA-4 humana como descrito acima no Exemplo lc.

Os imunogénios compreendendo células transformadas que expressam a proteína CTLA-4 humana na superfície celular são preparados como se segue. Utilizam-se vectores de expressão que codificam a proteína CTLA-4 humana completa para transfectar a linha de células de linfoma de ratinho EL4 (ATCC TIB 39). As células EL4 transfectadas são injectadas em ratinhos, utilizando 1 x 106 a 1 x 107 células transfectadas/ injecção. As células transfectadas são injectadas numa solução compreendendo PBS. Os ratinhos poderão ser injectados quer i.p. quer na parte plantar da pata traseira. Quando são administradas injecções i.p., é dado um total de aproximadamente 4 injecções. Quando a parte plantar da pata é utilizada como local de injecção, é administrado um total de aproximadamente 5 injecções. O soro é recolhido dos animais 40 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ imunizados e testado quanto à presença de anticorpos dirigidos contra a proteina CTLA-4 humana, utilizando um ensaio ELISA como descrito no Exemplo lb, com excepção das placas estarem revestidas com proteínas CTLA-4 humanas. c) Isolamento de linhas de hibridoma que segregam anticorpos anti-CTLA-4 humana.

Os linfócitos são isolados dos gânglios linfáticos de drenagem ou dos baços de animais imunizados com o imunogénio CTLA-4 humano e fundidos com células P3X3.Ag8.653, para gerar linhas de células de hibridoma utilizando o protocolo de fusão com PEG descrito no Exemplo lc. Os sobrenadantes de cultura dos poços contendo 1000/5000 células/poço são testados quanto a reactividade para a proteina CTLA-4 humana e quanto a ausência de reactividade para uma proteina diferente de CTLA-4, como seja a CD4 humana, utilizando um ensaio ELISA.

Os hibridomas dos poços positivos são clonados de forma repetitiva por diluição limitante, como descrito no Exemplo lc. As linhas de hibridoma que segregam anticorpos monoclonais reactivos contra as proteinas CTLA-4 humanas, mas não contra as proteinas humanas irrelevantes (por exemplo, CD4 humana), e que têm a capacidade de corar as células de transfectantes contendo CTLA-4 humana, mas não as células dos transfectantes de controlo são seleccionadas para produção de anticorpos monoclonais anti-CTLA-4 humana. EXEMPLO 5

Estimulação ex vivo de linfócitos de infiltração em tumores (TIL)

As células hospedeiras são estimuladas ex vivo, permitindo-se que se diferenciem em células efectoras imunes especificas de tumores. As células são depois reintroduzidas no mesmo hospedeiro para mediar os efeitos terapêuticos anticancerosos. a) Isolamento de linfócitos de infiltração em tumores (TIL)

Os linfócitos de infiltração em tumores são obtidos utilizando técnicas Standard. Os tumores sólidos (que acabaram 41 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ de sofrer ressecção ou que estão crioconservados) são dispersos em suspensões de células únicas por meio de digestão enzimática durante a noite [por exemplo, agitação durante a noite à temperatura ambiente em meio RPMI 1640 contendo hialuronidase tipo V a 0,01%; ADNase tipo I a 0,002%; colagenase tipo IV a 0,1% (Sigma, St. Louis) e antibióticos]. As suspensões dos tumores são depois passadas por gradientes de Ficoll-Hypaque (meio de separação de linfócitos, Organon Teknika Corp., Durham, Carolina do Norte). As interfaces dos gradientes contêm células tumorais viáveis, e as células mononucleares são lavadas, ajustadas para uma concentração total de células de 2,5 a 5,0 x 105 células/ml e cultivadas em meio completo. O meio completo compreende RPMI 1640 com soro humano de tipo compatível inactivado pelo calor a 10%, penicilina 50 Ul/ml e estreptomicina 50 μρ/ιηΐ (Biofluids, Rockville, MD), gentamicina 50 μg/ml (GIBCO Laboratories, Chagrin Falis, Ohio), anfotericina 250 ng/ml (Fungizone, Squibb, Flow Laboratories, McLean, Virgínia), tampão HEPES 10 mM (Biofluids) e L-glutamina 2 mM (MA Bioproducts,

Walkersville, MD) . Adiciona-se meio condicionado proveniente de culturas de células assassinas activadas por linfóquinas (LAK) autólogas ou alogénicas com 3 a 4 dias (ver abaixo) , numa concentração final de 20% (v/v). Adiciona-se IL-2 recombinante numa concentração final de 1000 U/ml.

As culturas são mantidas a 3 7°C numa atmosfera humidificada com 5% C02. As culturas são alimentadas semanalmente por meio de colheita, deposição e ressuspensão das células com uma densidade de 2,5 x 106 células/ml em meio fresco. Ao longo de um período inicial (por exemplo, 2 a 3 semanas) de cultura, os linfócitos proliferam selectivamente, enquanto as restantes células tumorais tipicamente desaparecem completamente.

Para preparar as culturas de células LAK, os linfócitos do sangue periférico (PBL) são obtidos de doentes ou de dadores normais. Após a passagem por gradientes de Ficoll-Hypaque, as células são cultivadas numa concentração de 1 x 106/ml em meio RPMI 1640 com soro humano a 2%, antibióticos, glutamina e tampão HEPES. Adiciona-se IL-2 recombinante a 1000 U/ml. As culturas são mantidas durante 3 a 7 dias numa atmosfera humidificada com 5% C02, a 37°C. 42

ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ b) Estimulação ex vivo de TIL 4 x 106 células, em 2 ml de meio de cultura contendo os AcM anti-CTLA-4, são incubadas num poço de placas de 24 poços a 37°C, numa atmosfera com 5% CO2, durante 2 dias. 0 meio de cultura compreende meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal de vitelo inactivado pelo calor a 10%; aminoácidos não essenciais 0,1 mM; piruvato de sódio 1 μΜ; L-glutamina 2 mM acabada de preparar; estreptomicina 100 μρ/ιηΐ; penicilina 100 U/ml; gentamicina 50 μg/ml; fungizona 0,5 μg/ml, (todos de GIBCO, Grand Island, Nova Iorque) e 2-ME 5 x 10-5 M (Sigma) . As células são colhidas e lavadas.

As células inicialmente estimuladas são adicionalmente cultivadas, numa densidade de 3 x 105 células/poço, em 2 ml de meio de cultura com IL-2 humana recombinante (disponível de Chiron Corp., Emeryville, Califórnia; actividade específica de 6-8 x 106 U/mg proteína; unidades equivalentes a 2-3 U Internacionais) . Após 3 dias de incubação em IL-2, as células são colhidas, lavadas, contadas para determinar o grau de proliferação e ressuspensas em meios apropriados para administração intravenosa (i.v.) (por exemplo, soluções salinas fisiológicas tamponadas). Efectuam-se culturas bacterianas para determinar a existência de contaminação bacteriana antes da re-infusão das células activadas.

Após a ressuspensão dos TIL activados num meio adequado para injecção, o acesso IV é obtido no hospedeiro e a suspensão de células é infundida. Opcionalmente, o hospedeiro é tratado com agentes para promover a função in vivo e a sobrevivência das células estimuladas (por exemplo, IL-2). EXEMPLO 6

Neste estudo, investigou-se o efeito dos sinais CD28 e CTLA-4 nas respostas das populações de células T em resposta ao super-antigénio enterotoxina B de Staphylococcus (SEB), in vitro e in vivo. Os resultados indicam que CD28 proporciona um co-estímulo importante para a resposta a SEB in vitro e que os sinais através de CTLA-4 inibem a resposta. In vivo, o bloqueio de CD28 por fragmentos FAb ou por anticorpos intactos tem os efeitos opostos na expansão de νβδ+ a um bloqueio 43 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ similar com fragmentos FAb ou anticorpos intactos anti-CTLA-4. A análise da cinética da expansão implica que os sinais através de CD28 promovem a expansão das células T, enquanto um sinal oposto através de CTLA-4 actua durante a expansão das células T para atenuar a magnitude da resposta a SEB. Métodos

Ratinhos. Ratinhos BALB/c foram adquiridos com quatro a cinco semanas de idade de Charles River e foram utilizados no espaço de três semanas.

Anticorpos e Reagentes. Anticorpo de hamster anti-CD28 de ratinho do clone 37.N.51.1 (Gross et al. (1992) J. Immunol. 149:380), anticorpo de hamster anti-CTLA-4 de ratinho do clone 9H10.11D3 (Krummel & Allison (1995) J. Exp. Med. 182:459), anticorpo de hamster anti-B7-l de ratinho do clone 1610. A (Razi-Wolf et al. (1992) J. Exp. Med. 89 : 4210), anticorpo de rato anti-B7-2 de ratinho do clone GL-1 (Hathcock et al. (1993) Science 262:905) e IgG irrelevante de hamster do clone F560.31 foram purificados a partir do fluido ascítico nas nossas instalações. Os fragmentos FAb foram obtidos por digestão com papaína imobilizada (Pierce, Rockford, Ilinóis) por meio de uma metodologia Standard, e o anticorpo não digerido foi removido por adsorção em Proteína A. Todos os fragmentos FAb foram analisados por SDS-PAGE antes da utilização. A pureza dos fragmentos FAb anti-CD28 foi adicionalmente testada em ensaios funcionais quanto à capacidade de bloquear a proliferação das células T numa reacção allo-MLR (reacção mista de linfócitos-alogénica). O anticorpo anti-Vp8.1,8.2 FITC (clone MR5-2) foi obtido de Pharmingen (San Diego, Califórnia).

Ensaios in vitro. Os baços obtidos de animais naíve foram picados para obter suspensões, e os glóbulos vermelhos foram lisados por tratamento hipotónico com solução de Gey, seguido de duas lavagens com PBS. Plaquearam-se 2 x 105 esplenócitos em 200 μΐ RPMI (contendo FCS a 10%; β-mercaptoetanol 50 μΜ; glutamina 2 mM e gentamicina 50 μρ/ιηΐ) em placas de fundo redondo de 96 poços. Adicionou-se SEB nas concentrações indicadas. Quando indicado, adicionou-se o anticorpo anti-CD28 numa diluição de 1:1000 do fluido ascítico, o anticorpo anti- 44 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ Β7-1 numa concentração de 5 μg/ml e o anticorpo anti-B7-2 numa concentração de 20 μρ/ιηΐ e adicionaram-se quantidades iguais de anticorpo de controlo não especifico 560.31. Para as experiências com FAb, os fragmentos FAb anti-CD28, anti-CTLA-4 ou de controlo foram adicionados numa concentração de 100 μg/ml. As culturas foram incubadas durante 60 horas a 37°C, pulsadas com 1 μ(3ΐ de 3H-timidina e deixadas em incubação durante mais 12 horas antes da colheita.

Respostas a SEB in vivo. Os ratinhos foram injectados intraperitonealmente com 200 μΐ de PBS contendo, quando indicado, 200 μρ de anticorpo. Após 1-2 horas, os ratinhos foram injectados intravenosamente com 50 μρ por animal de SEB (Toxin Technologies, Sarasota Fl) em PBS ou com PBS sozinho, num volume total de 100 μΐ.

Citometria de fluxo. Para avaliar a população de células que expressam Vp8, os baços foram picados para obter suspensões, e os glóbulos vermelhos foram lisados utilizando uma solução de Gey hipotónica. As células resultantes foram depois ressuspensas em 5 ml de RPMI-FCS a 10% e contaram-se aliquotas em triplicado utilizando um hemocitómetro. O erro padrão para esta contagem situou-se rotineiramente a 10% da média. Para a coloração, as aliquotas foram lavadas uma vez em PBS/FCS a 1% contendo NaN a 0,01% e ressuspensas em PBS/FCS, numa concentração de 106 células/50 μΐ. Adicionaram-se os anticorpos e incubou-se em gelo durante 30 minutos. As células foram lavadas e subsequentemente analisadas utilizando um citómetro FACScan com o software LysisII (Becton-Dickinson, Mountain View, Califórnia). Analisaram-se 10000 eventos "gated" para a percentagem que expressa Vp8+, a qual foi utilizada para obter o número total de células Vp8 através de aplicação da fórmula: N.° Vp8 = Rendimento total de células x %Vp8 na amostra.

Resultados

Papel da co-estimulação na proliferação mediada por SEB in vitro. A resposta proliferativa dos esplenócitos de ratinhos BALB/c a SEB foi investigada para determinar o papel 45 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ das interacções B7/CD28. À medida que SEB foi adicionada aos esplenócitos, observou-se nas culturas uma proliferação dependente da dose. As moléculas B7 em células destas culturas parecem proporcionar uma co-estimulação, uma vez que a adição de anticorpos antÍ-B7-1/B7-2 inibiu significativamente a resposta. Adicionalmente, uma maior sinalização por CD28 via anticorpos anti-CD28 realçou a resposta proliferativa. Este aumento pode ter sido mediado pela imobilização do anticorpo em células B FcR+ ou pela formação de microagregados do anticorpo. De forma interessante, a adição de anti-CD28 e de antÍ-B7-1/B7-2 induziu um aumento ligeiro mas reprodutível da proliferação em comparação com anti-CD28 sozinho, sugerindo que outro ligando de B7 além de CD28 (isto é, CTLA-4) podia ser importante na regulação negativa da resposta das células T a SEB.

Para considerar as contribuições relativas de CD28 e CTLA-4 na resposta das células T, adicionaram-se fragmentos Fab de anticorpos específicos para estas moléculas a culturas estimuladas por SEB. A adição dos fragmentos FAb CD28 inibiu a proliferação dependente de SEB. A magnitude do bloqueio por FAb CD28 é similar àquela observada utilizando anticorpos anti-B7-l/2, o que implica as interacções CD28/B7 no fornecimento de alguma co-estimulação para a proliferação nas culturas de controlo. Contudo, houve um aumento de 2 a 3x da proliferação na presença do fragmento FAb CTLA-4, implicando que os sinais de CTLA-4 desempenham um papel importante na regulação da resposta. Isto acentua adicionalmente o facto das moléculas B7 nas células APC criarem uma interacção de sinais de amplificação através de CD28 e de sinais de atenuação através de CTLA-4.

Os sinais de CD28 e CTLA-4 têm efeitos opostos na expansão in vivo de células T V/jô+. Os efeitos do tratamento com anticorpo anti-CD28 e anti-CTLA-4 na resposta das células T a SEB foram examinados. A expansão das células T em resposta aos super-antigénios in vivo ocorre tipicamente 2-3 dias após a injecção. As 60 horas foram escolhidas como um momento no tempo conveniente para analisar inicialmente os efeitos de anti-CD28 e anti-CTLA-4 na resposta. Os animais foram injectados com PBS ou SEB e com os AcM ou fragmentos FAb relevantes. Após 60 horas, o número total de receptores TCR 46 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ possuindo Vp8 foi determinado por contagem da celularidade do baço e coloração das amostras com anticorpos para determinar a percentagem de células Vp8+. 0 número total de células possuindo Vp8 isoladas do baço de animais injectados com SEB e com os anticorpos de controlo foi aproximadamente 2-3 vezes o número presente nos animais de controlo injectados (PBS). Em contraste, a injecção de doses crescentes de anti-CD28, além de SEB, diminuiu o número de células possuindo Vp8 observado neste momento no tempo. A injecção de 5 μg de anti-CD28 diminuiu modestamente o número de Vp8 recuperado, e ambas as injecções de 20 μg e 200 μg proporcionaram reduções aproximadamente idênticas de 2x. Para considerar a discrepância entre este resultado e os resultados in vitro mostrando uma amplificação mediada por anti-CD28 das respostas das células T, injectaram-se doses diárias de fragmentos FAb do anticorpo CD28 durante a resposta a SEB. De uma forma similar aos anticorpos intactos, estes FAb bloquearam a expansão das células Vp8+ à enterotoxina SEB de uma maneira dependente da dose. Os efeitos inibidores dos anticorpos intactos foram similares aqueles observados utilizando fragmentos FAb, o que implica que ambos os anticorpos anti-CD28 e os fragmentos FAb in vivo interferem com os sinais B7/CD28. Isto poderá ser o resultado de uma sinalização ineficaz por anticorpo bivalente e de competição com o ligando nativo tanto por parte do anticorpo como por parte dos fragmentos FAb.

Para comparar os efeitos de CD28 versus CTLA-4, os anticorpos anti-CTLA-4 foram co-injectados com SEB. Em contraste com o que foi observado com o tratamento anti-CD28, a administração de anti-CTLA-4 resultou num aumento dependente da dose da acumulação de células esplénicas Vp8+. A dose mais elevada de anti-CTLA-4 produziu um aumento de 2-3x do número de células Vp8 + em relação aquele observado apenas com SEB. A injecção diária de fragmentos FAb anti-CTLA-4 também proporcionou aumentos significativos do número de células Vp8 + detectadas às 60 horas. O facto tanto de anti-CTLA-4 intacto como do seu fragmento FAb monovalente terem produzido o mesmo resultado sugere que, nestas condições, ambas as formas do anticorpo estavam a bloquear as interacções CTLA-4/B7. Além disso, a observação de que ocorreu um aumento das células Vp8 + 47 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ nestas condições é consistente com a noção de que os anticorpos bloqueiam um sinal inibitório.

Análise cinética de populações que respondem a SEB. Efectuou-se uma análise cinética para averiguar se CD28 e CTLA-4 afectam a magnitude da resposta ou o seu timing. Utilizou-se uma dose de anticorpo de 204 μρ/ί^ε^ύο, uma vez que esta dose estava no intervalo exigido para a saturação de CD28, tal como determinado por citometria de fluxo. A resposta a SEB e aos anticorpos de controlo foi a esperada. A fase de expansão atingiu o seu valor máximo no dia 3, seguida por um declínio uniforme. Em contraste, os ratinhos tratados com anti-CD28 e SEB apresentaram apenas uma expansão mínima, sendo o pico às 72 horas menos de um terço dos níveis de controlo. Contudo, estas células parecem ter sofrido uma expansão, e os números de células decaem ao longo dos sete dias subsequentes.

Os ratinhos que recebem SEB e AcM anti-CTLA-4 apresentaram números mais elevados de células em relação aos animais tratados com o anticorpo de controlo ao longo do período de duração da experiência. O número de células aumentou dramaticamente ao longo dos primeiros três dias, com uma diminuição rápida do número de células que atingiu níveis similares aos animais injectados com controlo/SEB no dia 10. No pico da resposta, os animais tratados com CTLA-4 tinham aproximadamente o dobro das células T Vp8+ em relação aos animais tratados com anticorpo de controlo. Finalmente, para averiguar se CTLA-4 ou CD28 apresentam um sinal dominante, ambos os anticorpos foram adicionados simultaneamente. Ao longo do tempo, este tratamento produziu resultados idênticos aos obtidos com animais tratados apenas com anti-CD28.

As interacções B7/CD28/CTLA-4 são importantes para regular a resposta a SEB in vitro. Os resultados aqui apresentados sugerem um papel importante para os sinais co-estimuladores na resposta das células T murinas ao super-antigénio SEB. As interacções endógenas de B7-1/B7-2 com CD28 são importantes para promover a proliferação, uma vez que o bloqueio quer com anticorpos anti-B7-l/2 quer com fragmentos FAb anti-CD28 reduziu drasticamente a proliferação induzida por SEB. Em contraste, o envolvimento de CD28 por anticorpos anti-CD28 intactos aumenta a proliferação acima do limiar 48 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ proporcionado pelas células APC. Este aumento é provavelmente devido a microagregação ou a agregação mediada por FcR dos anticorpos anti-CD28, conduzindo a uma reticulação eficiente de CD2 8.

Em contraste com CD28, as interacções de CTLA-4 com as moléculas B7 diminuem a resposta das células T a SEB. A observação de que os fragmentos FAb anti-CTLA-4 aumentam a proliferação indica que as interacções CTLA-4/B7 inibem a resposta proliferativa das células T a SEB. Além disso, os anticorpos anti-B7-l/2 aumentam a proliferação na presença de estimulação óptima com os anticorpos CD28, proporcionando um suporte adicional para a noção de que os sinais inibidores são mediados através de interacções CTLA-4-B7. CD28 e CTLA-4 têm efeitos opostos sobre a expansão das células T induzida por SEB in vivo. A manipulação da co-estimulação em ratinhos tratados com SEB através de interferência directa com os sinais transduzidos através de CD28 ou CTLA-4 tem efeitos opostos sobre a expansão das células T νβ8+. Este resultado apoia resultados prévios in vitro que sugerem que estas moléculas poderiam competir para determinar o resultado proliferativo na presença de um nível fixo de sinal TCR. Parece haver um requisito de sinais CD28 nas respostas óptimas a SEB. 0 bloqueio com fragmentos FAb anti-CD28 ou anticorpos anti-CD28 intactos diminui efectivamente a expansão proliferativa. A observação de que o bloqueio de CTLA-4 permite analogamente uma maior expansão das células de resposta apoia adicionalmente a ideia de uma semelhança nos requisitos de co-estimulação para as respostas ao super-antigénio e aos antigénios peptídicos in vivo. Além disso, a análise cinética implica que a competição entre CD28 e CTLA-4 pelas moléculas B7 determina um parâmetro muito precoce da resposta das células T. Nesta experiência, verificou-se uma modificação dependente de CTLA-4 na expansão nos primeiros dois dias. Embora seja evidente que o bloqueio de CTLA-4 aumenta a resposta a SEB quando é permitido o envolvimento de CD28, ele não tem qualquer efeito sobre a proliferação residual quando CD28 é bloqueado.

Os resultados demonstram que CTLA-4 desempenha um papel na diminuição da resposta a SEB, ao opor-se aos efeitos de 49 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ CD28. Embora isto possa representar um mecanismo para a tolerância das células T, a inibição também poderá estar envolvida na alteração do fenótipo. Por exemplo, os sinais gerados por sinais B7/CTLA-4 poderiam induzir células de memória ou a expressão de linfóquinas e uma função efectora alternativas. EXEMPLO 7

Análise cinética dos efeitos da ligação de CTLA-4 sobre a proliferação, a produção de IL-2, a morte celular, a progressão do ciclo celular e o aparecimento de marcadores de activação das células T.

Materiais e Métodos

Anticorpos e Reagentes. Os anticorpos utilizados para a activação foram: hibridoma 500A2 anti-CD3 (Allison et al. (1987) in The T Cell Receptor, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series. Alan R Liss, Inc., New York. 33-45), hibridoma 37.N.51.1 anti-CD28 (Gross et al., supra.), hibridoma 9H10.11G3 anti-CTLA-4 (Krummel et al., supra.) e hibridoma 536 anti-Va3 (Havran et al. (1989) P.N.A.S. 86:4185-4189). CTLA-4Ig está descrita em Lane et al. (1994) Immunol. 80:56-61). A diminuição de APC e de CD8 foi obtida utilizando hibridomas 28-16-8s anti-MHC de Classe II (Ozato & Sachs (1981) J. Immunol. 126:317-323) e BP107 (Symington & Sprent (1981) Immunogenetics 14:53-61) e anticorpos anti-CD8 de hibridoma 3.155 (Sarmiento et al. (1980) J. Immunol. 125:2665-2672). As microesferas de látex à base de poliestireno com grupos sulfato, possuindo um diâmetro médio de 5 |lm +0,1 μιη, foram obtidas de Interfacial Dynamics Corp. (Portland, Oregon).

Preparação de linfócitos T CD4+. As células dos gânglios linfáticos foram isoladas de ratinhos BALB/c com 6-8 semanas de idade obtidos de NCI (Bethesda, MD). Os linfócitos isolados foram obtidos por picagem do tecido e filtração da suspensão resultante através de nytex. As preparações enriquecidas em células T CD4+ foram obtidas por tratamento com anticorpos anti-Classe II e anticorpos anti-CD8. As preparações típicas 50 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ consistiram em 95% CD4+ com menos de 0,75% de células positivas para B220.

Activação de células T CD4+ utilizando anti-CD3 imobilizado. Placas de fundo redondo de 96 poços foram revestidas com anti-CD3, numa concentração de 0,1 μρ/ιηΐ, em volumes de 50 μΐ durante 2 horas a 37°C e depois foram extensamente lavadas e bloqueadas, durante 30 min a 37°C, com meio RPMI-1640 completo (contendo FCS a 10%; β-mercaptoetanol 50 μΜ; glutamina 2 mM; e gentamicina 50 μΐ/ml). Adicionaram-se as células T, numa densidade de 1 χ 105 por poço, em 200 μΐ de meio RPMI-1640 completo, e todas as culturas foram incubadas a 37°C com 5% CO2. Quando indicado, o anticorpo anti-CD28 foi adicionado numa concentração de 10 μg/ml, a proteína CTLA-4Ig foi adicionada numa concentração de 5 μg/ml e os fragmentos FAb de controlo ou anti-CTLA-4 foram adicionados numa concentração de 50 μg/ml. Doze horas antes da colheita, os poços foram pulsados com 20 μΐ de meio RPMI completo contendo 1 μθί de 3H-timidina. As placas foram colhidas para suportes filtrantes em vidro, e a incorporação de 3H foi medida utilizando um contador de fase gasosa (Packard, Meriden, Ct.) .

Activação de células T utilizando microesferas de látex. As microesferas de látex (contas) foram revestidas como descrito em Krummel et al. (1995). Resumidamente, 1 χ 107 contas/ml foram suspensas em PBS com os anticorpos indicados e incubadas durante 1,5 h a 37°C, seguidas de lavagem com PBS e bloqueio com FCS a 10%. O anticorpo anti-CD3 foi adicionado numa concentração de 0,5 μg/ml, o anticorpo anti-CD28 foi adicionado numa concentração de 1 μρ/ιηΐ, o anticorpo anti-CTLA-4 foi adicionado numa concentração de 4 μρ/ιηΐ, e as soluções de ligação foram normalizadas com anticorpo de controlo 536 para manter uma concentração constante de anticorpo total de 6 μg/ml durante a ligação. As células T (1χ105/200 μΐ) foram cultivadas com 1x10 contas num volume total de 200 μΐ/poço. Utilizaram-se placas de fundo redondo de 96 poços para todos os ensaios. As culturas foram incubadas a 37°C com 5% de CO2 e pulsadas com 1 μ3ί de H-timidina durante as 12 horas finais antes da colheita. A acção inibidora de CTLA-4 parece ser específica para os 51 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ anticorpos anti-CTLA-4, dado que outros anticorpos de ligação às células T, incluindo anti-L-selectina (Mel-14), anti-Thy 1.2 e anticorpos irrelevantes, não mostram qualquer efeito ou mostram efeitos de aumento quando co-imobilizados com anti-CD3 e anti-CD28.

Análise da viabilidade celular. As células T foram cultivadas de forma idêntica à utilizada para os ensaios de proliferação. A viabilidade celular foi avaliada por adição de um décimo do volume de azul de tripano a 0,4% (Sigma, St. Louis, Mo.), e os números de células foram determinados utilizando um hemocitómetro. 10^4 ml de cada cultura foram contados a partir de poços em duplicado, e o valor para este volume foi multiplicado por 2 para se obter um valor para a percentagem de input (input de 50xl04 células/ml). Os desvios padrão foram sempre inferiores a 10%.

Análise do ciclo celular. A análise com iodeto de propidio do estado do ciclo celular foi efectuada como descrito anteriormente (Telford et al. (1992) Cytometry 13:137-143). Resumidamente, as células foram activadas como descrito, utilizando microesferas em placas de 96 poços. Aos tempos indicados, três poços idênticos (input de 3xl05 no início da cultura por amostra) foram colhidos, lavados com PBS e fixados com 1,0 ml de etanol a 80%. As células foram incubadas em gelo durante 30 minutos, depositadas por centrifugação e ressuspensas em 0,4 ml de uma solução aquosa contendo Triton X-100 a 0,1%; EDTA 0,1 mM; ARNase A 0,05 mg/ml (50 U/mg) e iodeto de propidio 50 μρ/ιηΐ. As amostras foram armazenadas em gelo no escuro até à análise, e cada amostra foi analisada com um caudal constante durante dois minutos. Os resultados foram analisados utilizando um sistema EPICS de Coulter.

Determinação de IL-2. Utilizou-se um ensaio ELISA para detectar IL-2 nos sobrenadantes das células. Resumidamente, placas ELISA de Corning (Corning, Nova Iorque) foram revestidas com anticorpos de captura, numa concentração de 1 μρ/ιηΐ em tampão borato (borato de sódio 0,2 M; pH 8,0), durante 2 h a 37°C. Estas placas foram depois lavadas extensamente, bloqueadas com gelatina a 0,4%/PBS durante 30 min, e os sobrenadantes de cultura das células T (50 μΐ) 52 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ foram adicionados e incubados durante 2 h a 37°C. As placas foram novamente lavadas, adicionaram-se anticorpos de detecção biotinilados em PBS/Tween a 0,5% e incubou-se durante lha 37°C. As placas foram novamente lavadas, adicionaram-se 50 μΐ de uma solução 1 μρ/ιηΐ de estreptavidina-HRPO em PBS/Tween e incubou-se durante 30 min a 37°C. Adicionaram-se 50 μΐ de reagente de desenvolvimento (ABTS 0,55 mg/ml; (2,2'-azino-bis(ácido 3-etilbenzotiazolino-6-sulfónico)) em tampão citrato (ácido cítrico 0,1M; pH 4,35), incubou-se a 25°C durante 15 min e determinou-se a absorvância a 405 nm. A IL-2 recombinante foi obtida de Boerringer Mannheim e foi diluída em série para desenvolver uma curva padrão. Os valores de absorvância em triplicado das amostras de teste foram, deste modo, convertidos para quantidades de linfóquina medidas em nanoqramas por mililitro. Os anticorpos (captura: JES6-1A12 e detecção: JES6-5H4 biotinilado) foram obtidos de PharMingen (San Dieqo, Califórnia).

Análise da expressão de CD25 e CD69. 2xl05 células foram suspensas em 50 μΐ de PBS/soro de vitelo a 1%/azida de sódio a 0,05% qelado. Adicionaram-se os anticorpos anti-CD25.FITC, anti-CD69 ou IgG-FITC de rato de controlo e incubou-se em gelo durante 30 min, seguindo-se duas lavagens com 4 ml de PBS/soro de vitelo/azida de sódio. Adquiriram-se 5000 eventos "gated" num FACScan de Becton-Dickinson, e o programa LYSIS II foi utilizado para analisar as populações relevantes.

Resultados O envolvimento de CTLA-4 inibe a proliferação e a produção de IL-2. Foi previamente demonstrado que os

anticorpos solúveis dirigidos para CTLA-4 ou B7 aumentavam a incorporação de timidina e a produção de IL-2 por células T activadas por anti-CD3 e anti-CD28 imobilizados, em ensaios Standard com uma duração de três dias. Estes resultados indicaram que o bloqueio das interacções CTLA-4/B7 entre as próprias células T aumentou as respostas ao remover os sinais inibidores. Uma vez que as culturas foram analisadas num único ponto no tempo, não foi possível determinar quando ocorreu o efeito no decurso das culturas. Uma análise cinética dos resultados do bloqueio de CTLA-4/B7 sobre a proliferação de células T CD4+ purificadas está apresentada na Figura 8A. A 53 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ inclusão quer de CTLA-4Ig quer de fragmentos Fab de anti-CTLA-4 nas culturas estimuladas com anti-CD3 e anti-CD28 resultou num aumento da proliferação. 0 efeito foi ligeiro às 26 horas, altura em que houve apenas uma proliferação marginal em qualquer uma das culturas. Em pontos posteriores, o bloqueio de CTLA-4/B7 resultou num aumento de 1,5 a 2x da proliferação. 0 efeito de aumento deste bloqueio foi ainda mais evidente ao nível da produção de IL-2. Como ilustrado na Figura 8B, a IL-2 foi detectável, embora em baixas quantidades, em culturas estimuladas por anti-CD3/CD28 às 26 horas. A adição quer de Fab anti-CTLA-4 quer de CTLA-4Ig resultou num aumento de cerca de 6x da quantidade de IL-2 acumulada às 26 h e num aumento de quase lOx às 40 h. A cinética da inibição da proliferação e da produção de IL-2 foi examinada por reticulação de CTLA-4 juntamente com CD3 e CD28, utilizando microesferas revestidas com anticorpos. A cinética da incorporação de timidina está ilustrada na Figura 1C. Foi detectável uma incorporação significativa às 26 horas em culturas estimuladas por anti-CD3 e anti-CD28. Não houve praticamente incorporação detectável às 26 horas quando CTLA-4 também esteve envolvido, e a proliferação foi 3-4x inferior nestas culturas ao longo da duração do ensaio. Como ilustrado na Figura 8D, observou-se uma inibição ainda mais pronunciada da produção de IL-2. IL-2 foi prontamente detectável em culturas estimuladas por anti-CD3/CD28 às 16 h e aumentou até às 40 h. Quando CTLA-4 também esteve envolvido, a IL-2 foi apenas escassamente detectável, mesmo após 30 h, e atingiu um nível somente de cerca de 1/5 daquele existente nas culturas de controlo no seu máximo às 42 horas.

Estes resultados indicam que os efeitos inibidores de CTLA-4, sejam eles mediados pelo seu ligando natural ou por reticulação de anticorpos, podem ser detectados precocemente no decurso da activação e não se devem a uma terminação precipitada das respostas em fases mais tardias do processo. O envolvimento de CTLA-4 não induz morte celular, mas impede o ciclo celular.

Progressão. Um mecanismo que poderia explicar a inibição da proliferação por CTLA-4 seria a indução ou o aumento da 54 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ morte celular. Uma vez que a inibição foi detectável ao longo de todo o período de cultura, avaliou-se a cinética da morte celular que tem lugar nas culturas de células T. A contagem hematocitométrica de células coradas com o corante vital azul de tripano mostrou que a recuperação total das células provenientes das culturas foi essencialmente 100% do input, mesmo naquelas em que não ocorreu proliferação. Nas culturas não estimuladas, o número de células não viáveis aumenta ao longo do período de cultura, atingindo 50% após 54 horas. Houve um ligeiro aumento do número de células mortas recuperadas a partir das culturas estimuladas apenas com anti-CD3, especialmente nos pontos no tempo mais precoces. Consistente com os resultados de proliferação, as culturas co-estimuladas com anti-CD28 proporcionaram um aumento das células viáveis após 42 horas, com um rendimento total superior a 300% às 78 horas. A estimulação com anti-CD3 mais anti-CTLA-4 não resultou num aumento das células mortas em relação aquele observado em culturas não estimuladas ou em culturas estimuladas apenas com anti-CD3. Também não houve nenhum aumento na recuperação de células mortas a partir das culturas estimuladas com anti-CTLA-4, na presença de anti-CD3 e anti-CD28, em relação às culturas estimuladas por anti-CD3 e anti-CD28. Ao longo do período de cultura, a recuperação de células viáveis foi de facto superior à recuperação de culturas não estimuladas ou de culturas estimuladas apenas com anti-CD3. Estes resultados indicam que a reticulação de CTLA-4 não induz uma morte celular tão detectável ao nível da permeabilidade da membrana.

Como medida mais directa e sensível da morte celular e do estado do ciclo celular, utilizou-se a coloração com iodeto de propídio de células permeabilizadas para medir o teor de ADN em várias fases nas culturas. Cada cultura foi iniciada com um número idêntico de células e analisaram-se fracções iguais das culturas para permitir uma comparação do número absoluto de células recuperadas nas populações G0/Gi, S/G2 e subdiplóide. Os resultados estão apresentados na Figura 9. A recuperação de células totais foi essencialmente 100% do input ou superior em todas as condições de estimulação. Mais de 99% das células de input estavam em Go/Gi. Nas culturas não estimuladas, o número de células com quantidades de ADN subdiplóide indicativas de apoptose aumentou para ligeiramente mais de 50% do total ao 55 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ longo do período de duração da cultura. Observou-se um padrão similar em culturas estimuladas apenas com anti-CD3, embora se tenham obtido números ligeiramente superiores de células em S/G2. Nas culturas co-estimuladas com anti-CD28, houve um aumento significativo do número de células em S/G2 tão cedo quanto às 20 horas, e este número aumentou progressivamente ao longo do período do ensaio. Os perfis de ADN das células estimuladas com anti-CD3 juntamente com anti-CTLA-4 foram essencialmente os mesmos das culturas não estimuladas ou estimuladas com anti-CD3 ao longo do período do ensaio, sem diferenças significativas no número de células apoptóticas. Contudo, houve significativamente menos células em S/G2 nas culturas estimuladas com anti-CD3 mais anti-CTLA-4 em relação à estimulação apenas com anti-CD3. As culturas estimuladas com anti-CTLA-4 e anti-CD3 mais anti-CD28 tiveram números similares ou mesmo menos células na população subdiplóide que qualquer uma das outras condições ao longo de todo o período de cultura. Assim, não há qualquer evidência de indução de morte celular apoptótica por reticulação de anti-CTLA-4 em nenhum momento durante a activação. O efeito principal da reticulação de CTLA-4 nas células estimuladas com anti-CD3 e anti-CD28 é uma inibição do aumento das células viáveis totais, especialmente aquelas em S/G2. No seu conjunto, estes resultados indicam que o envolvimento de CTLA-4 inibe a progressão do ciclo celular e uma paragem das células em G0/G1. O envolvimento de CTLA-4 inibe parcialmente a indução da expressão da cadeia alfa do receptor da IL-2. Outro traço distintivo da activação das células T é a regulação positiva da expressão de CD25, a cadeia alfa do receptor da IL-2. Utilizou-se a citometria de fluxo para avaliar a expressão de CD25 nas células T em condições de co-estimulação com CD28, com e sem ligação concomitante de CTLA-4. A estimulação das células T apenas com anti-CD3 resultou na indução da expressão de CD25 em cerca de 60% das células T no espaço de 24 horas. A co-estimulação com anti-CD28 aumentou esta expressão em relação tanto ao número de células positivas como ao nível de expressão às 24 horas, e a expressão foi adicionalmente realçada às 60 horas de cultura. Quando se envolveu também CTLA-4, CD25 foi expresso por uma fracção mais pequena das células (47% versus 80%) e o nível médio de expressão foi 56 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ muito mais baixo às 24 horas (índice de fluorescência médio de 162 versus 194) e às 60 horas (IFM de 332 versus 669) em relação às culturas co-estimuladas com anti-CD28. Estes resultados demonstram que o envolvimento de CTLA-4 inibe a regulação positiva de CD25 ao longo de toda a activação. O envolvimento de CTLA-4 inibe parcialmente a expressão do marcador de activação precoce CD69. CD69 é um marcador precoce e transitório da activação das células T. Efectuou-se uma análise cinética dos efeitos de CD28 e do envolvimento de CTLA-4 na indução da expressão de CD69. Às 12 horas, CD69 foi expresso por mais de 50% das células T activadas apenas com CD3 ou co-estimuladas com anti-CD28, ao passo que menos de 15% das células co-estimuladas também sujeitas a ligação de CTLA-4 se revelaram positivas. Às 24 horas, a expressão de CD69 foi detectável, se bem que num padrão heterogéneo, em mais de 75% das células co-estimuladas com CD28. Neste ponto, menos de 45% das células provenientes de culturas nas quais CTLA-4 também esteve envolvido expressaram CD69, e o nível de expressão foi reduzido. Às 36 horas, a expressão de CD69 tinha voltado para níveis praticamente de repouso em todas as culturas. A co-estimulação com CD28 aumenta e prolonga a expressão de CD69, enquanto a ligação de CTLA-4 inibe a regulação positiva inicial de CD69. Este resultado é consistente com a observação de que os níveis de CD69 são constitutivamente elevados em células T isoladas de ratinhos deficientes em CTLA-4 e proporciona indícios adicionais que sugerem um papel para CTLA-4 na prevenção da indução precoce da activação das células T.

Estes resultados demonstram que CTLA-4 medeia a inibição da proliferação e da produção de IL-2 ao promover o repouso das células T na ausência de morte celular mediada por CTLA-4. A recuperação de células viáveis e não viáveis a partir de culturas inibidas por anti-CTLA-4 é similar aquela observada nas culturas com o anticorpo de controlo ou estimuladas com anti-CD3. Não há acumulação de células com quantidades de ADN subdiplóide associadas a morte celular apoptótica, mesmo 1-2 dias após os efeitos inibidores da reticulação de CTLA-4 serem inicialmente observados ao nível da proliferação e da produção de IL-2. Finalmente, a reticulação de CTLA-4 detém as células T numa fase G0/G1 do ciclo celular. No seu conjunto, 57 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ estes resultados demonstram claramente que a inibição da proliferação das células T e da secreção de IL-2 por CTLA-4 pode ocorrer na ausência de morte celular. Uma implicação importante dos resultados aqui apresentados é o facto de CTLA-4 poder ter um papel na regulação das respostas das células T em fases precoces do processo. Os nossos resultados não revelam uma terminação precipitada de respostas em curso, mas antes uma inibição e um atraso de eventos associados à progressão da activação das células T.

Os resultados acima demonstram que o presente tratamento com agentes de bloqueio de CTLA-4 aumenta a resposta das células T à estimulação antigénica. 0 crescimento das células tumorais in vivo é grandemente reduzido na presença destes agentes de bloqueio. Os efeitos são observados contra tumores de tipo selvagem não manipulados. Os agentes de bloqueio de CTLA-4 não só representam uma nova abordagem à terapia tumoral, como também, ao remover sinais inibidores potencialmente competidores, poderão ser um auxiliar particularmente útil para outras abordagens terapêuticas envolvendo a via co-estimuladora. A comutação isotipica por células produtoras de imunoglobulinas, uma medida da ajuda às células T, é grandemente incrementada. A resposta das células T à imunização com antigénios peptídicos é também bastante incrementada pelo tratamento com os presentes agentes. EXEMPLO 8

Eficácia contra um tumor estabelecido SAI é um f ibrossarcoma. Como ilustrado na Figura 10, o bloqueio de CTLA-4 utilizando 10 μg de anticorpo anti-CTLA-4 por dose é eficaz, mesmo quando atrasado 7 ou 14 dias após o implante do tumor. Isto indica que o bloqueio de CTLA-4 pode ser eficaz no tratamento de tumores estabelecidos. 58 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ EXEMPLO 9

Sinergia com agente de estimulação da resposta imunitária SM1 é um carcinoma mamário que é fracamente imunogénico. Ele é resistente à rejeição por transfecção com B7. Contudo, tem-se obtido alguma inibição do crescimento utilizando B7 e IFNg. Na experiência ilustrada na Figura 11, ratinhos receberam implantes subcutâneos de células tumorais SM1 não modificadas e os tratamentos indicados nos dias 0, 3 e 6. Como representado, o tratamento com anti-CTLA-4 (10 μρ/άοεε) por si só não teve qualquer efeito sobre o crescimento do tumor. A imunização num local contralateral com células transduzidas com GM-CSF e irradiadas também não teve qualquer efeito. Contudo, a combinação dos dois resultou em rejeição completa em 4 de 5 ratinhos. Isto demonstra claramente que o bloqueio de CTLA-4 pode apresentar sinergia com GM-CSF e, provavelmente, com outras linfóquinas para obter a rejeição do tumor. EXEMPLO 10

Bloqueio de CTLA-4 atrasado RENCA é um tumor fracamente imunogénico de crescimento lento. Como representado na Figura 12, o bloqueio de CTLA-4 (100 μg de anticorpo anti-CTLA-4 por dose) é apenas fracamente eficaz quando iniciado no momento do implante do tumor. Contudo, ele é bastante eficaz se iniciado 9 dias após o implante do tumor. Isto sugere que a geração de residuos do tumor a partir de uma massa tumoral relativamente grande é importante como agente para estimular uma resposta imunitária, no sentido de obter uma rejeição eficaz. Isto sugere que o bloqueio de CTLA-4 poderia ser utilizado no momento, ou pouco tempo após, a irradiação ou a quimioterapia. 59 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ EXEMPLO 11 Ο bloqueio de CTLA-4 realça a imunogenicidade de fragmentos de tumor B16 é um melanoma muito fracamente imunogénico que é resistente à rejeição induzida pela expressão de B7. Nós explorámos formas de atacá-lo através de bloqueio de CTLA-4. Na experiência ilustrada na Figura 13, os ratinhos receberam implantes subcutâneos de células tumorais não modificadas e os tratamentos indicados nos dias 0, 3 e 6. O bloqueio de CTLA-4 por si só (100 μρ 9H10/dose) não teve qualquer efeito, assim como não teve a imunização com células B16 irradiadas num sitio contralateral. Contudo, o tratamento com ambos mostrou uma pequena, mas significativa e reprodutível inibição do crescimento do tumor, embora não se tenham obtido curas.

Esta abordagem também foi utilizada num cenário de imunização protectora. Na experiência apresentada na Figura 14, os ratinhos foram imunizados com células B16 irradiadas, com e sem bloqueio de CTLA-4 (100 μg 9H10/dose) e com e sem microesferas de gelatina contendo citoquinas (contendo 50 ng de interferão γ e 50 ng GM-CSF) . Os ratinhos foram novamente provocados com células tumorais vivas e não modificadas duas semanas mais tarde. Os ratinhos imunizados com células irradiadas e com bloqueio de CTLA-4 apresentaram um crescimento do tumor significativamente enfraquecido em comparação com os ratinhos que receberam apenas as células irradiadas. O melhor efeito protector foi obtido com microesferas contendo citoquinas juntamente com o bloqueio de CTLA-4.

No seu conjunto, estes resultados indicaram que o bloqueio de CTLA-4 pode melhorar as estratégias de imunização que empregam uma imunização activa com células tumorais ou com fragmentos de tumores modificados e pode ter um efeito sinérgico com as citoquinas. 60 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÕES GERAIS (i) REQUERENTE: Os regentes da Universidade da Califórnia (ii) TÍTULO DO INVENTO: Bloqueio da regulação negativa dos linfócitos T associada à sinalização por CTLA-4 (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA:

(A) DESTINATÁRIO: FLEHR, HOHBACH, TEST, ALBRITTON & HERBERT (B) RUA: 4 Embarcadero Center, Suite 3400 (C) CIDADE: São Francisco (D) ESTADO: Califórnia (E) PAÍS: Estados Unidos da América (F) CÓDIGO POSTAL: 94111-4187

(v) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: PC IBM-compativel

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (vi) DADOS DO PEDIDO ACTUAL:

(A) NÚMERO DO PEDIDO: US (viii) INFORMAÇÕES SOBRE REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Trecartin, Richard F. (B) NÚMERO DE REGISTO: 31,801 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/PROCESSO: FP-62731-3 (ix) INFORMAÇÕES PARA TELECOMUNICAÇÃO: (A) TELEFONE: (415) 781-1989 (B) TELEFAX: (415) 398-3249 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 34 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO:/desc = "Iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:l: TTACTCTACT CCCTGAGGAG CTCAGCACAT TTGCC 34 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO:2: 61 ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ (ί) .11 CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO:/desc = "Iniciador" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2: TATACTTACC AGAATCCGGG CATGGTTCTG GATCA 34

Lisboa, 2009-02-26

Claims (26)

1. ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um anticorpo anti-CTLA-4 ou de um seu fragmento no fabrico de um medicamento para o tratamento do melanoma.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda a utilização de uma preparação de antigénio tumoral no fabrico do referido medicamento.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 2, em que a referida preparação de antigénio tumoral compreende células tumorais.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 3, em que as células tumorais são células irradiadas.
5. 5. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, compreendendo ainda a utilização de uma citoquina no fabrico do referido medicamento.
6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que a referida citoquina é proporcionada como células tumorais transduzidas com a citoquina.
7. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 5 ou a reivindicação 6, em que a referida citoquina compreende GM-CSF.
8. 8. Utilização de um anticorpo anti-CTLA-4 ou de um seu fragmento e de GM-CSF, no fabrico de um medicamento para o tratamento de carcinoma.
9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o referido GM-CSF é proporcionado como células tumorais transduzidas com GM-CSF.
10. 10. Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que as células tumorais são células irradiadas. ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ 2/3
11. 11. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o referido medicamento se destina ao tratamento de um ser humano.
12. 12. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal.
13. 13. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o referido anticorpo é um anticorpo humanizado.
14. 14. Anticorpo anti-CTLA-4 ou um seu fragmento para utilização num método de tratamento de melanoma.
15. 15. Anticorpo de acordo com a reivindicação 14, para utilização com uma preparação de antigénio tumoral no referido método de tratamento.
16. 16. Anticorpo de acordo com a reivindicação 15, em que a referida preparação de antigénio tumoral compreende células tumorais.
17. 17. Anticorpo de acordo com a reivindicação 16, em que as células tumorais são células irradiadas.
18. 18. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, para utilização com uma citoquina no referido método de tratamento.
19. 19. Anticorpo de acordo com a reivindicação 18, em que a referida citoquina é proporcionada como células tumorais transduzidas com a citoquina.
20. 20. Anticorpo de acordo com a reivindicação 18 ou a reivindicação 19, em que a referida citoquina compreende GM-CSF.
21. 21. Anticorpo anti-CTLA-4 ou um seu fragmento e GM-CSF, para utilização num método de tratamento de carcinoma. ΕΡ Ο 865 293/ΡΤ 3/3
22. 22. Anticorpo anti-CTLA-4 ou um seu fragmento e GM-CSF, para utilização num método de acordo com a reivindicação 21, em que o referido GM-CSF é proporcionado como células tumorais transduzidas com a citoquina.
23. 23. Anticorpo anti-CTLA-4 ou um seu fragmento e GM-CSF, para utilização num método de acordo com a reivindicação 22, em que as células tumorais são células irradiadas.
24. 24. Anticorpo anti-CTLA-4 ou um seu fragmento e GM-CSF, para utilização num método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 23, em que o referido medicamento se destina ao tratamento de um ser humano.
25. 25. Anticorpo anti-CTLA -4 ou um seu fragmento e GM-CSF, para utilização num método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 24, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal.
26. 26. Anticorpo anti-CTLA -4 ou um seu fragmento e GM-CSF, para utilização num método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 25, em que o referido anticorpo é um anticorpo humanizado. Lisboa, 2009-02-26