KR0183029B1

KR0183029B1 - 내성을 유도하기 위한 모노클론 항체류

Info

Publication number: KR0183029B1
Application number: KR1019910701737A
Authority: KR
Inventors: 폴 코볼드 스테판; 웨일드만 헤르만
Original assignee: 폴 코볼드 스테판; 웨일드만 헤르만
Priority date: 1989-05-31
Filing date: 1990-05-31
Publication date: 1999-04-01
Also published as: JPH04505919A; JP2763197B2; DE69029134D1; PT94214B; DK0474691T3; AU5725890A; IE901949L; DD296843A5; MY135673A; NZ233889A; EP0474691A1; ATE145246T1; CA2055615A1; IE80735B1; EP0474691B1; IL94566A0; AU657255B2; HU905134D0; HUT61341A; CA2055615C

Abstract

본 발명은 비-소모성 CD4모노클론 항체와 비-소모성 CD8 모노클론 항체를 피검자에게 투여하여 항원에 대한 내성을 유도하는 것에 관한 것이다.

상기 항원에 대한 내성은 항체의 보호하에 유도될 수 있다.

소모성 CD4 모노클론 항체 및/또는 소모성 CD8 모노클론 항체는 비-소모성 항체 이전에 투여할 수 있다.

Description

내성을 유도하기 위한 모노클론 항체류

[내성을 유도하기 위한 모노클론 항체류]

본 발명은 모노클론 항체를 사용하는 내성 유도작용에 관한 것이다.

이종 항원 또는 이종 조직이나 자신의 항원 또는 자신의 조직에 대해 내성을 갖는다는 것은, 정상의 성숙한 면역계가 정상의(질환이 없는) 신체 조직/구성성분처럼 인식하는 항원/조직에는 특이적으로 응집 반응을 할 수 없지만, 이와 동시에 자가 내성의 자연적인 과정이나 치료적인 내성 유도방법에 의해 특이적으로 내성이 되지 않은 이종 또는 질환성의 항원/조직에는 공격적으로 응집 반응할 수 있는 상태를 의미한다.

내성 테스트는 내성이 있는 피검자가 부적절한 항원/조직에 대해 응답 반응을 보인 이후에, 1회, 바람직하게는 1회 이상의 면역화 시도를 했을 때 동일 피검자 그 부적절한 특정 항원/조직에 대해 면역화되지 못함을 입증하는 테스트이다.

쥐의 CD4 (L3T4) 항원에 대한 모노클론 항체 (mAb)는 체액 면역성, 이식조직 거부 반응 및 자가면역성의 조절에 유효한 면역 억제제로 입증되어 왔다. 또한, CD4 mAb는 생체내에 내성-허용 환경을 조성하여 이식 항원뿐만 아니라 특정한 가용성 단백질 항원에 대해 내성을 제공하는 것으로 나타났다. 그러나 CD4 mAb가 왜 이러한 작용을 나타내게 되는지 그 메카니즘(들)은 아직 명확하게 밝혀지지 않고 있다. 대부분의 종래 보고서에 의하면, 면역 억제는 생체내의 타켓 세포를 결실시킨 조건하에서 얻어졌다. 이와 같이 얻어진 면역 억제는 간단히 말하면 CD4 T세포의 부재로 인한 것이었다.

한편, 시험관내 연구에서는 CD4(및 CD8) mAb가 세포 용해 없이 세포표면상의 항원에 손쉽게 결합함으로써 임파구 기능에 영향을 미칠 수 있는 것으로 입증되었다.

퀸 등[Eur.J.Immunol, 17 : 1159-1165(1987)]은 CD4 항원의 여러 에피토프를 인식하는 1쌍의 결실성 항-CD4 모노클론 항체의 이용에 대하여 연구한 결과, 준용해(sub-lytic) 용량에서 면역억제 효과가 있는 것을 관찰하였다. 다른 연구자들도 세포 결실을 일으킬 수 없을 F(ab')₂단편 형태의 결실성 항-CD4 항체에 대한 연구를 진행해왔다. 굿스타인과 웁시[Gutsein Wofsy. J.Immunol, 137, 3414-3419(1986)]는 소 혈청 알부민에 대한 마우스의 응답 반응시 항-L3T4 항체의 F(ab')₂단편의 효과를 조사하였고, 그 결과 체액 면역을 억제하는 항-L3T4 항체의 능력이 L3T4 세포의 결실에 따라 영향받지는 않는다는 것을 발견하였다. 벤자민 등[Benjamin et al., Eur.J.Immunol., 18, 1079-1088(1988)]은 결실성 항-CD4 항체의 F(ab')₂단편을 연구한 결과, 이 단편들이 세포 결실없이 마우스내에 항원인 인체 IgG에 대해 면역내성원성 환경을 제공할 수 있다는 것을 규명하였다. 카테론 등[Carteron et al., J.Immunol., 140, 713-716(1988)]은 결실성 항-L3T4 항체의 F(ab')₂단편을 사용하여, 이 단편들이 결실성 L3T4 세포에 대한 항체의 성질에 관계없이 마우스내에 항원인 병아리의 오브알부민에 대한 랫트 모노클론 항체에 대한 내성을 유도할 수 있다는 것을 발견하였다. 결실성 항-CD4 항체를 사용하나 세포 결실을 유도하지 않는 방식을 취하는 이 연구로부터, 세포 결실없이 적당한 용량으로 사용된 본래의 비결실성 항-CD4 항체가 내성을 유도할 것이라는 사상은 예측하기는 어렵다.

퀸 등[J.Exp.Med., 169, 779-794(1989)]은 골수 이식 방법으로 골수 이식체를 안정화시키는데 CD4와 CD8의 모노클론 항체 조합물(결실성과 비결실성 모두 사용)을 사용하므로써 성숙한 동물에서 고전적 이식 내성을 유도하는 것에 대하여 개시하였다. 그러나, 이 문헌은 항체 자체가 내성을 유도한다는 사상에 대해서는 전혀 제시된 바가 없다.

챨튼과 맨델[Charlton and Mandel, Immunol.Cell.Biol., 67, 1-7(1989)]은 응집성 인체 IgG와 오브알부민에 대한 내성을 유도하기 위하여 항-L3T4 모노클론 항체를 이용하였다. 이 문헌에서는 결실성과 비결실성 항체 모두를 사용한 것으로 기재되어 있으나, L3T4 T-세포에 대한 항체의 효과는 비장과 흉선에서만 연구되었다. 그 연구 결과 항체가 비장과 흉선내의 T-세포를 결실시키지 않는다는 사실은 순환 T-세포에 대한 항체의 효과를 전혀 입증하지 못하고 있는 것이다.

존커 등[Jonker et al, Transplantation Preceedings, XIX(5), 4308-4314(1987)]은 CD4 항체와 CD8 항체의 면역억제 효과가 항체의 에피토프 특이성과 CD4와 CD8의 서브세트들에 대한 그 효과와 관련이 있는지에 대하여 연구한 것이었다. 하지만, 면역 내성의 유도와 항원에 대한 내성을 유도하기 위하여 비결실성 CD4 항체의 이용에 대하여 제시된 바는 전혀 없다.

종래의 연구에서는 CD4 세포를 결실시키는 항체를 사용해 왔다. 그러나, 현재 본 발명자들은 비결실성 (non-depleting) CD4 항체가 선택적으로 CD8 항체와 함께 병용해서 쓰면 이종 면역글로불린, 골수 및 피부 이식에 대한 내성을 제공할 수 있음을 알게 되었다. 이러한 결과는 모든 항원에 대한 전반적인 이용가능성을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명자들은 결실성 CD4 mAb 및/또는 결실성 CD8 mAb를 투여한 후 비결실성 mAb를 투여하면 내성-허용 환경을 제공하는데 유리하다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명의 제1목적은 환자에게 비결실성 항-CD8 모노클론 항체와 함께 비결실성 항-CD4 모노클론 항체를 투여하여, 항원의 존재하에 전술한 항체들에 의하여 환자내에 면역 내성 허용 환경을 유도하는 방식으로 항원에 대한 면역 내성의 상태를 유도하는 의약 제조에 비결실성 항-CD4 모노클론 항체를 사용하는 방법을 제공하는 것이다.

제2목적으로서, 본 발명은 환자에게 비결실성 항-CD4 모노클론 항체를 단독으로 투여하여, 항원의 존재하에 전술한 항체에 의하여 환자내에 면역 내성 허용 환경을 유도하는 방식으로, 자가항원, 이식 항원 및 면역글로불린중에서 선택되는 항원에 대한 면역 내성의 상태를 유도하는 의약 제조에 비결실성 항-CD4 모노클론 항체를 총 항체(whole antibody)로서 사용하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 약학적 허용성 담체 또는 희석제와 함께 비결실성 항-CD4 항체 또는 비결실성 항-CD8 항체를 투여량당 1 내지 400mg 함유하는, 인간 환자에게 투여하기에 적합한 형태의 약학 조성물을 제공한다.

비결실성 CD4 와 CD8 mAb를 함께 투여하면, 환자에게 일차 항원에 대한 내성이 제공될 수 있다. 그 CD4 와 CD8 mAb 역시 자가면역 질환을 치료하고 장기간 동안 면역 억제 화학 치료의 필요 없이 이식 거부 반응을 예방하는데 사용되므로써 기관 이식이나 골수 이식과 같은 이식에 대한 내성도 얻을 수 있다.

생체내에서는 비결실성 mAb를 사용하는 것이 유리하다. 예를 들면, 단시간에 비결실성 mAb를 주사하면 차단된 경쟁 세포를 더 빠르게 회복시킬 수 있어, 기회성 간염 및 mAb 처치 이후의 면역 결핍 (예, T-결실된 골수 이식후 백혈병 재발) 위험성을 줄일 수 있다. 또한, CD4 세포들은 상이한 기능성 서브셋트로 분리될 수 있다는 것이 알려졌으며, 그중 일부는 면역 조절과 관련이 있을 것이다. T세포를 다량 제거하면 당연하게 면역이 억제되지만 CD4+ 조절 세포에 의해 일어날 수 있는 가능한 영향을 소멸시킬 수도 있다. 따라서, 더 세밀하게 조작하는 것이 목적하는 면역계를 유도하는데 더 유리할 것이므로, 먼저 결실성 CD4 및/또는 CD8 mAb를 환자에게 투여함으로써 내성을 얻는 것이 바람직하다.

비결실성 CD4 와 CD8 mAb의 배합물을 사용하면 다른 면역 억제제를 별도로 요구하지 않으면서 모든 항원에 대하여 내성을 유도할 수 있다. 비결실성 mAb란 생체내에 존재하는 타겟 세포의 50% 이하, 예를 들면 10 내지 25%, 바람직하게는 10% 미만을 결실시키는 mAb이다. 상기 배합물은 유형 I의 항원 또는 유형 II의 항원에 대한 내성이나, 또는 상기 유형 I의 항원이나 유형Ⅱ의 항원에 의해 제공되는 항원에 대해 내성을 유도하는데 사용할 수 있으며, 또한 상기 두 항원 모두에 대해 내성을 유도하는데 사용할 수 있다. 예를 들면, 이식한 경우에는, 유형 I과 유형 II의 주요 조직 적합성 (MHC) 항원 및 비-MHC 항원이나 부차조직적합성(minors) 항원이 나타날 수 있다. 이식시 나타나는 항원 이외에, 본 발명은 구상 단백질, 당 단백질 (예, 면역 글로불린), 화분 단백질과 같은 입자 상에 운반되는 물질, 치료용으로 사용되는 폴리펩타이드(예, 인터페론, 인터루킨-2 또는 종양 괴사 인자) 또는 호르몬 치환체 (예, 감쇠된 호르몬, 그것의 유사체 및 길항제)에 대한 내성을 유도하기 위해 사용할 수 있다.

또한, 내성이 부여될 수 있는 특이 항원으로는 수용체 차단 보조제와 동종항원으로 사용될 수 있는 단백질 치료제의 합성 펩타이드 유사체를 포함한다.

상기 동종 항원은 조직이식이나 피부이식에 있어서 이종 조직의 거부반응에 책임이 있는 것으로 간주되고 있다.

사용가능한 mAb는 CD4 세포 표면 항원 (CD4 mAb) 또는 CD8 세포표면 항원(CD8 mAb)에 대해 특이성이 있는 mAb이다. CD4 와 CD8 mAb란 인체 CD4 및 CD8 표면 항원에 대해 특이성이 있는 mAb 뿐만 아니라 인체 CD4 항원과 동일한 마우스의 L3T4 항원과 같이 다른 종의 해당 표면 항원에 대해 특이성 있는 mAb를 의미한다. 일반적으로, 이 mAb는 랫트 IgG_2a, 마우스 IgG_2b또는 인체 IgG₂와 같은 IgG₂류이지만, 인체 IgG₄일 수도 있다. 항체 결합 부위를 포함하는 mAb 단편은 Fab 및 F(ab)₂단편을 사용할 수 있다.

상기 CD4와 CD8 mAb를 함께 숙주에 투여한다. 이 mAb는 동일 제제중 일부로서 또는 별개의 제제로서 투여할 수 있다. 보통 상기 두 mAb는 1-7회/주, 바람직하게는 1-4회/주로 투여하며, 예로서 3회/주로 2 내지 4주 동안, 바람직하게는 3주 동안 투여한다. 비결실성 mAb의 유효량을 투여한다. 혈청내의 항체 포화량에 대한 테스트는 충분한 항체가 존재하는지 여부를 나타낼 것이다. 각 비결실성 mAb를 충분히 투여하면, 치료중인 환자는 내성-허용 환경을 유도할 수 있게 된다. 따라서 CD4와 CD8 세포는 차단될 수 있다.

환자에게 투여하는 비결실성 CD4 mAb와 비결실성 CD8 mAb의 양은 환자의 나이와 체중을 비롯한 여러 요인, 치료 받아야 할 질환 상태 및 내성을 유도하고자 하는 항원(들)에 따라 결정된다. 마우스 모델 시스템에 있어서 1μg 내지 2mg, 바람직하게는 400㎍ 내지 1mg의 mAb를 임의로 1회에 투여한다. 인체의 경우 1 내지 400mg, 예를 들면 3 내지 30mg, 바람직하게는 5 내지 20mg의 항체를 투여할 수 있다. 비결실성 mAb인 CD11a mAb를 CD4와 CD8 mAb와 함께 사용하거나 CD4 또는 CD8 mAb 중 어느 하나 또는 둘 모두 대신에 사용할 수 있다.

내성을 유도하는 것이 요구되는 외부 항원(들)은 비결실성 CD4와 비결실성 CD8 mAb의 투여 과정이 개시되기 5일전 부터 이 투여 과정이 완료된 후 5일이나 2 내지 3주 후까지 숙주에 투여할 수 있다. 그러나, 일반적으로 상기 항원은 상기 항체 투여 개시 후 14일 이내, 보통 7일 이내에 투여한다. 상기 항원은 CD4 및 CD8 mAb 처치과정이 개시되는 시점에서 투여할 수도 있다.

따라서, 내성은 비결실성 CD4 mAb 및 비결실성 CD8 mAb와 이 mAb들의 존재하에 항원을 투여함으로써 숙주내에 항원에 대한 내성을 유도할 수 있다. 비결실 CD4 및 CD8 mAb 존재하에서는 골수이식이나 기관 이식과 같은 조직 이식 수술을 환자에게 처치할 수 있다. 또한, 내성은 환자가 이미 보유하고 있는 항원에 대해서도 유도할 수 있다. 장기간의 특이적 내성은 다발성 경화증 또는 류마티스성 관절염과 같은 자가면역 질환을 치료하기 위하여 자가항원(들)에 대해 유도될 수 있다. 이와 같이 하면 자가 면역 질환을 앓는 환자의 상태는 경감될 수 있다.

영구성 항원은 내성을 유지하는데 요구된다. 예를 들면, 조직 이식시에는 그 조직에 대한 내성을 유지하기 위해 항원을 공급해야 한다. 이와 마찬가지로, 자가면역 질환을 치료하는데에는 자가 (자동)항원을 공급해야 한다. 알레르겐과 같은 외인성 이종 항원이 사용되는 경우에, 항원 리마인더(reminder)는 규칙적인 간격으로 제공할 수 있다.

비결실성 mAb로 처치를 개시하기 이전에 결실성 CD4 mAb 및/또는 결실성 CD8 mAb로 숙주를 치료하는 것이 바람직할 수 있다. 결실성 mAb는 생체내에 존재하는 타겟세포를 50%이상, 예를 들면 90 내지 99% 결실시키는 mAb이다. 결실성 항체들은 랫트 IgG_2b또는 IgG₁, 마우스 IgG_2a및 인체 IgG₁ 및 IgG₃를 포함한다. 따라서, 결실성 CD4 mAb 및/또는 결실성 CD8 mAb를 사용하면 관련된 T세포 군을 감소시킬 수 있다. 이와 같이 되면, 비결실성 mAb는 더 소량의 T세포만을 처리하면 된다. 결실(depletion)은 대안적으로 CAMPATH(상표명) 1, 스테로이드류, 시클로스포린, 또는 ALG (항-임파구 글로불린)과 같은 다른 mAb을 투여하는 등의 통상의 면역 억제 치료법이나 방사선 조사를 통해 얻어질 수 있다.

결실성 mAb에 의해 감소되는 T세포 군의 양은 내성을 얻고자 하는 항원(들)에 따라 결정할 수 있다. 환자가 이미 공여체 항원에 노출된 바 있어 항원 자극을 받은(예, 여러회 수혈 받은 환자) 적합성이 낮은 조직 이식의 경우, 또는 환자가 항원 자극을 받아 자신의 자가 면역 상태가 연속적으로 활성화되는 자가 면역 질환의 경우에는 여러 항원에 대해 생성된 T세포 집단을 더 많이 감소시키는 것이 바람직하다. 조직 적합성이 낮은 경우란, 예컨대 유형 I의 1종 이상의 주요 조직 적합성 항원들이 서로 부합하지 않는 경우이다.

따라서, CD4-양성 헬퍼 T세포의 집단은 정상 농도의 약 70%이하, 예를 들면 약 50%이하, 20% 또는 10%까지 감소시키는 것이 필요하다. 내성을 얻는 것이 어려울수록, 필요로 되는 결실 양은 더욱 많다. CD8-양성 T세포도 동일한 방법으로 결실시킬 수 있다.

결실성 CD4 mAb 및/또는 결실성 CD8 mAb는 일반적으로 비결실성 CD4 및 CD8 mAb의 처치를 개시하기 1 내지 7일, 예컨대 1 내지 5일 이전에 1 내지 7회/주, 바람직하게는 2 내지 4회/주, 예를 들면 3 회/주 또는 1 내지 2회/주, 바람직하게는 1회/주 투여한다. 내성을 유도하고자 하는 항원은 상기 결실성 mAb를 투여함과 동시에, 또는 결실성 mAb를 투여한 후 5일 이내에 투여할 수 있다. 결실성 mAb의 투여량은 관련 T세포 군을 감소시키고자 하는 양, 환자의 나이 및 체중, 치료할 상태 및 내성 유도가 요구되는 항원(류)을 비롯한 여러가지 요인에 따라 결정된다. 마우스 모델계에 있어서, 결실성 mAb는 1μg 내지 2mg, 바람직하게는 400μg 내지 1mg의 용량으로 투여할 수 있다. 인체에 대해서는, 1 내지 400mg, 예컨대 3 내지 30mg, 바람직하게는 5 내지 20mg의 항체를 투여할 수 있다.

결실성 및 비결실성 CD4 및 CD8 mAb는 통상의 방법으로 생성할 수 있으며, 예컨대 Y3/Ag 1. 2. 3과 같은 랫트 골수종 세포주에 면역 랫트의 비장 세포를 융합시키는 통상의 방법으로 제조할 수 있다[클락 및 웨일드만, 모노클론 항체의 1장, 혈액학 방법 시리즈중 P.C.L. 비버리에 의해 편찬된 책. 롱만 (쳐칠 리빙스톤) 1986]. 면역된 마우스의 비장 세포와 마우스, 랫트 또는 인체의 골수종을 융합하거나 재조합 DNA 방법을 이용할 수도 있다.

모든 mAb 투여는 비경구, 예를 들면 정맥내로 투여한다. 일반적으로 mAb는 주사액 또는 주입제로 제공한다. 이 경우, mAb는 약학적 허용 담체 또는 희석제를 함유하는 약학 조성물로 제조한다. 적당한 담체 또는 희석제 (예, 등장성 생리식염수)를 사용할 수 있다. 내성을 부여하고자 하는 특정한 항원은 비경구적으로, 예를 들면 정맥내, 근육내 또는 피하내로 투여할 수 있다. 이 항원은 일반적으로 전술한 약학적 허용 담체 또는 희석제와 함께 조제한다.

mAb YTS 177.9, YTS 191.1, YTS 105.18 및 YTS 169.4를 생성하는 각 하이브리도마는 유럽 동물 세포 배양 수집소 (European Collection of Animal Cell Cultures; 영국, 포톤 다운 소재)에 수탁번호 ECACC 90053005, ECACC 87072282, ECACC 90053004 및 ECACC 87072284로 1990년 5월 30일에 기탁되었다.

이하 실시예에서 본 발명을 상세히 설명한다.

먼저 첨부 도면에 대해 간단히 설명하자면, 제1a도 및 제1b도는 rIgG2a 와 rIgG2b mAb 의 배합물에 의한 보체 분해의 상승 효과 및 간섭효과를 나타낸 것이다.^51-Cr(30 μCi/㎖)로 표지된 CBA/Ca 흉선 세포를 각 막대 그래프 하단에 표시된 mAb 및 보체 제공원으로서 2% 기니아피그혈청과 함께 항온처리하였다. 사용되는 mAb 농도는 (A) 5㎍/㎖; (B) 25㎍/㎖ 이다.

제2도는 T세포 결실이 없이 생체내에 rIgG2a CD4를 주사한 결과를 나타낸 것이다. ATX CBA/Ca 마우스(n=3)에 제시된 mAb를 1회 주사하고 (2㎎/마우스), 1주, 4주 및 8주 후에 채혈하였다. BPL을 CD4 (YTA 3.1 ●), CD8 (YTS 156.7 ▲) 및 Thy-1 (YBM 29.2)에 대하여 비오틴화된 mAb로 염색한 후 스트렙트아비딘-FITC로 염색했다. 그 결과는 유동 혈구계산법에 의해 분석하여 각 개체의 분포율은 시험일마다 미처리된 대조군의 분포율을 100%로하여 측정했다.

제3도는 IgG2a CD4 Mab YTS 177.9에 의해 HGG에 대한 내성이 얼마나 유도될 수 있는지를 나타낸 것이다. 정상의 CBA/Ca 마우스에 -1일, 0일 또는 1일에 제시된 양을 투여했다. 0일째, 열응집된 HGG 1㎎을 주사하였다. 이 마우스에 28일과 35일째에 0.5㎎의 HGG를 재투여했다. 대조군의 마우스에도 다른 마우스와 같이 YTS 177.9 1㎎을 투여하지만, 28일과 35일 째에만 HGG로 면역시켰다. 혈청 항-HG 역가는 ELISA 분석법으로 45일째에 측정했다.

제4도는 랫트 IgG2a에 대한 특이적 내성을 유도하기 위하여 YTS 177.9를 주사한 결과이다. 정상의 CBA/Ca 마우스에 3일 연속적으로, 제시된 양의 YTS 177.9 또는 YTS 191.1을 3회 주사했다. 6주 후, YTH 35.4 (IgG2a 랫트 항-인체) 및 캠퍼스 2(Compath; 등록상표명)(IgG2b 랫트 항-인체)를 먼저 완전 프로인트(Freunds) 보조제중의 주사액으로, 그 후에는 불완전 프로트인 보조제중의 주사액으로 매주 주사하여 재항원투여하였다. 10주째에, 채혈을 하고 항-IgG2a(□)와 항-IgG2b(▧) 역가를 각각 HPLC-정제의 랫트 IgG2a 와 IgG2b의 mAb로 코팅한 평판을 사용하여 ELISA 분석법으로 측정했다.

제5도는 IgG2a CD4 와 CD8 Msb 처치이후 연장된 동종 피부 이식의 생존율을 나타내고 있다. 정상의 CBA/Ca 마우스 (n=6)에게는 0일, 2일 및 4일째에 YTS 177.9와 YTS 105.18 또는 YTS 191.1과 YTS 169.4 (전체 항체, 3㎎/마우스)를 3회 주사했다. 완전한 두께의 BALC/c 꼬리 피부를 0일째에 이식했다. 로그랭크 (Logrank) 방법에 의한 통계값은 다음과 같다 :

IgG2b Mab 처리군(▲)대 비처리된 대조군(●), p〈0.005; IgG2a 처리군(▼)대 대조군, p≤0.001; IgG2b 처리군 p≤0.003.

제6도는 rIgG2a mAb에 의해 나타나는 동종 피부이식에 대한 내성을 나타낸 것이다. 정상의 CBA/Ca 마우스를 B10.BR 피부로 이식하고, (1) 0일 및 2일째에 YTS 177.9와 YTS 105.18의 혼합물 (2㎎/전체 마우스); (2) 3주에 걸쳐 동일한 mAb (9㎎/전체 마우스)를 투여했다. 89일째에, B10.BR (3 과 4) 및 B10.D2 (점선) 유래의 피부를 재이식했다.

제7도는 CD4 와 CD8 항체의 여러 배합물을 처리한 마우스에 있어서 동종 피부 이식 생존률을 나타낸 것이다. 수용체 CBA/Ca 마우스 (8 내지 14마리의 3그룹)에게 0일째에 BALB/c 피부를 이식하고 실시예 2에 기재된 바대로 0-2일째에 모노클론 항체를 처치하였다. 1차 그룹(▼)에는 랫트 IgG2a 항체만을 투여하였고 2차 그룹(◆)에는 랫트 IgG2b 항체들의 혼합물을 투여한 반면, 3차 그룹 (●)에는 랫트 IgG2b 항체 투여 후 랫트 IgG2a 항체를 투여하는 복합 방식으로 투여하였다. 상기 3 그룹의 모든 마우스에게는 더 이상 항체 투여 없이 94일째에 새로운 BALB/c (▲)와 B10 (■) 피부 이식을 처치하였다.

이식 생존율에 대한 분석 :

IgG2a 그룹 MST=28일 : IgG2b 그룹 MST=55일, p〈0.006

복합 투여 방식의 그룹 본래 BALB/c 이식편 MST=121일 : IgG2a 또는 IgG2b 그룹 p〈0.001

복합 투여 방식의 그룹 2차 BALB/c 이식 MST=43일 : 3차 군인 B10 이식 MST=16일 p〈0.04.

제8a도 제8b도는 MHC-부정합 피부 이식에 대한 내성 유도를 나타낸 것이다. 8 내지 12 마리의 CBA/Ca 마우스 그룹에 대해 0일째에 B10 피부를 이식하고 실시예 2에 기술된 바대로, 0 내지 21일째에 모노클론 항체를 처리하였다.

(a) 첫번째 그룹은 항체를 투여하지 않은 대조군 마우스 (▼)였다. 2차 그룹 (◆)은 랫트 IgG2a 항체만을 제공하였으며, 나머지 그룹(●)에는 IgG2b와 IgG2a를 복합 투여 방식으로 제공하였다. 이 마지막 그룹에 대하여 119일째 새로운 B10 피부 이식(▲)과 3차 군인 BALB/c 피부(■)를 이식했다.

이식 생존율에 대한 분석 :

대조군 (항체 비투여) MST=14일 : IgG2a 그룹 MST=48일 p〈0.001.

복합 투여 방식의 본래 B10 이식 MST〉250일 : 2차 B10이식 MST=44일 (119일로부터) p〈0.002.

2차 B10 이식 : 3차 군인 BALB/c 이식 MST=13 p〈0.003.

(b) 8마리의 CBA/Ca 마우스 그룹에 대해 IgG2b 다음에 IgG2a 항체를 복합 투여 방식으로 투여함과 동시에 B10 피부 이식을 실시했다(●). 이 마우스에 대해 91 일째 2차 B10 피부 이식(▲)을 하고 그와 함께 3차 군 B10.BR 피부 이식을 실시했다.

이식 생존율에 대한 분석 : 모든 그룹 MST〉200일.

제9도는 다중 부차 (multi-minor) 항원 부적합성 피부에 대한 내성 유도를 나타낸 것이다. 8마리와 10마리의 CBA/Ca 마우스 2 그룹에 대해 0일째에 AKR/J 피부이식을 실시했다. 대조군 마우스(▼)에는 항체를 제공하지 않았으며 나머지 그룹에게는 랫트 IgG2b에 이어 랫트 IgG2a 항체를 복합 투여 방식(●)으로 투여하고 122일째에 새로운 AKR/J 피부(▲) 및 3차 군인 다른 부차 항원 부적합성 B10.BR 피부(■)를 재이식하였다.

이식 생존율에 대한 분석 :

항체를 투여하지 않은 대조군 MST=13 : 복합 투여 방식으로 처리된 본래 AKR/J 이식 MST〉250일, p〈0.001.

제2차 AKR/J 이식 MST〉128일 : 3차 군인 B10.BR 이식 MST=27일, p〈0.009.

제10a도 내지 제10d도는 항원자극을 받은 수용체에 있어서 다중 부차 항원 부적합성 피부에 대한 내성 유도를 나타낸 것이다. 수용체 CBA/Ca 마우스는 AKR/J (a,b) 또는 B10.BR (c,d) 유래의 방사선 조사된 (2000 rad) 비장 세포 10⁷을 정맥 주사함으로써 공여체의 부차 항원으로 자극하고, 3주 후 피부 이식하였다. 5 내지 13 마리의 마우스 그룹에 대해서는 실시예 2에 기술된 바대로 0 내지 21일까지 모노클론 항체의 존재하에 AKR/J (a,b) 또는 B10.BR (c,d) 피부(●)를 이식하였다.

두 그룹에는 IgG2b와 IgG2a를 복합 투여 방식으로 투여하였고(a,c), 다른 두 그룹에는 랫트 IgG2a 항체만을 투여하였다(b,d). 89일째 (a,c) 또는 96일째 (b,d)에는 2차 공여체-유형 이식편(▲)을 재이식하였으며(a,b 그룹 = AKR/J; c,d 그룹 = B10.BR), 3차 군인 다른 부차 항원 부적합성 피부(■)를 재이식하였다(a,b그룹 = B10.BR; c,d 그룹 = AKR/J).

이식 생존율에 대한 분석 :

(a) 복합 투여 방식으로 처리된 본래 AKR/J이식 MST〉225일 : 3차 군인 B10.BR 이식 MST=41일 (89일 이후), p〈0.007

(b) IgG2a 처리된 본래 AKR/J 이식 MST200일 : 3차 군인 B10.BR 이식 MST=42일 (96일 이후), p0.02

(c) 실험상의 모든 그룹 MST〉225일

(d) 실험상의 모든 그룹 MST〉200일

제11a도 및 제11b도는 첫번째 피부 이식에 거부 반응을 크게 나타내는 마우스에 있어서 내성 유도를 나타낸 것이다. 6마리와 11마리의 CBA/Ca 마우스 2 그룹에 대해, 임의의 모노클론 항체 처리 없이 0일째에 AKR/J 피부를 이식하였다.

14일째에, 마우스의 거의 1/2이 1차 이식(●)에 대해 거부 반응을 나타내는 경우에는 2차 AKR/J 피부 이식을 새로운 이식층으로 제공하고 모노클론 항체 처치를 개시했다(▲). 그 후, 랫트 IgG2b에 이어 IgG2a를 복합 투여 방식으로 3주간 투여하거나(a) 또는 랫트 IgG 항체 단독물(b)을 투여하였다.

이식 생존율에 대한 분석 :

(a) 1차 AKR/J 이식 MST=12일 : 2차 복합 투여 방식으로 처리된 AKR/J 이식 MST〉92일, p〈0.004

(b) 2차 IgG 처리된 AKR/J 이식 MST〉75일 : (a)와 (b)에서의 모든 1차 이식 MST=12일; p〈0.003.

[재료 및 방법]

[실험 동물]

CBA/Ca, B10.BR 및 BALB/c 마우스로부터 채혈한 후, 병리학 연구실 (캠브리지 대학)에 있는 통상적인 동물 시설에 보관하였고, 성별 및 연령별 그룹으로 사용했다.

[유동 혈구계산에 의한 모노클론 항체의 동정]

랫트 T-세포주 NB2-6TG (J. 하워드에 의해 제공됨)를 마우스 CD4 유전자로 형질감염시켰다(고르만외, PNAS USA 84, 7644, 1987). 얻어진 세포주, NB2.L3T4.Hyg/2.1을 사용하여 랫트 항-마우스 흉선 세포 융합체로부터 신규한 CD4 mAb를 선별하였다. 세포 (1 내지 5 × 10⁶)을 시험 상청액에 이어, FITC-결합된 토끼 항-랫트 Ig 혈청(덴마아크왕국, 골스트럽 소재의 다코사제공)과 함께 항온처리하였다. 형광 염색 후, 시토플루오로그래프(미합중국, 매릴랜드주, 웨스트우드 소재, 모델 50-H 오소)상의 유동 혈구 계측기로 분석하였으며 데이타는 오소 (ortho) 2150 컴퓨터로 처리하였다.

mAb의 경쟁적 결합을 시험하기 위해, 먼저 L3T4/Hyg 2.1 세포를 30분동안 10㎍의 비표지된 mAb 존재하에 얼음 상에서 비오틴화된 mAb(1㎍/10 세포)와 함께 항온처리하였다. 스트렙트아비틴-FITC(영국, 아머샴)를 첨가하고 15분간 더 항온처리하였다. 결과는 오소 (Ortho)시토플루오로그래프로 분석했다.

비오틴화된 제1 mAb, 스트렌트아비딘-홍조소(phycoerythrin)(영국, 키링톤, 세로테크), 제2 mAb 및 FITC-결합된 이소타입(isotype) 특이적 mAb와 함께 마우스 비장 세포를 연속 항온처리함으로써 2색 형광 염색을 실시하였다. 녹색과 적색 형광성은 오소 시토를루오로그래프로 검측하여 로그(log)치로 나타내었다.

[말초 혈액 임파구(PBL)의 면역 형광 염색]

마우스 PBL을 Ficoll (비밀도 (specific density) 1.079, 스웨덴, 파마시아사)상에서 20분동안 3000 x g로 원심분리에 의해 분리했다. 계면에 있는 세포를 수거하고 PBS/BSA/아자이드로 세척했다. 그후, 조직 배양 상청액중의 rIgG2b mAb(이후, FITC 결합된 NORIG 7.16 (항 rIgG2b)로 염색) 또는 비오틴화 mAb(이후, FITC-스트렙트아비딘(아머샴)으로 염색)중 어느 1가지로 염색하였다. 결과는 전술한 바와 같이 유동 혈구 계측기로 분석했다.

[보체 분해(Iysis)]

보체 분해는 전술한 바와 같이 수행했다. 간략히 설명하면, mAb를 희석하고, 보체 제공원으로서 첨가된2% 기니아피그 혈청 및⁵¹Cr표지된 마우스 흉선 세포와 함께 항온처리했다. 37℃에서 45분 후, 상청액을 회수하고 필립스 자동 감마 계수기 (네델란드왕국, 아인호벤 소재의 필립사)로 방사능을 측정했다.

비분해(specific lysis)는 다음 식으로 계산했다 :

분해율(%) = (e-s)/(t-s) x 100

상기 식에서, e=샘플 계수치, s= 자발적인 방출치, t=총 계수치이다.

[인체 감마 글로불린(HGG)에 대한 내성 유도]

HGG에 대한 내성 유도 방법은 이미 공지되어 있다(벤자민 외, J. Exp. Med 163, 1539, 1986). 정상의 CBA/Ca 마우스에게는 1일째 CD4 mAb를 정맥내(i.v.) 투여하고 0일과 1일째에 복강내 (i.p.) 투여하였다. 열-응집성 HGG 1㎎을 0일째에 복강내 투여하고 21일과 31일째에 HGG 0.5㎎을 재투여하였다. 38일째에 IgG 항-HGG 반응을 ELISA 법으로 측정했다.

[ELISA 법에 의한 마우스 항체 반응 측정]

마우스 항체 반응을 측정하기 위하여, 샘플 혈청을, 정제 단백질 항원으로 코팅된 평저의 유연한 판 (미합중국, 벡톤 딕킨슨)을 이용하여 연속 희석하였다. 상기 판을 PBS/0.05% Tween 20 (영국, 푸울, 시그마 제품)으로 세척하고 30분동안 비오틴화된 양 항-마우스 IgG (아머샴)과 함께 항온처리한 후 전술한 바와 같이 세척했다. 스트렙트아비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제(아머샴)을 상기 판에 15분 동안 첨가한 후, 다시 3회 더 세척하고 5㎎/㎖ o-페닐렌디아민과 0.1% 과산화수소로 발색시켰다. 490nm에서의 흡광도를 판독하고 표준의 양성 대조군과 비교하여 역가를 측정했다.

[피부 이식]

피부 이식은 빌링암 등의 변형 방법 (Nature 172, 603, 1953)으로 실시했다. 마우스 수용체를 1㎍/마우스의 하이프노딜(Hyphodil)과 0.2㎍/마우스의 서브리메이즈 (Sublimase; 영국, 옥소포드, 얀센사)를 복강내 주사하여 마취 시켰다. 완전한 두께의 공여체 꼬리 피부 (0.5 cm x 0.5 cm)를 흉부 측벽상의 이식층에 이식하고 와셀린 기아제로 덮고 면 반창고를 붙이고 7일 동안 석고로 보호했다. 이식 생존 여부를 관찰하고 매일 기록하며 살아 있는 이식 조직이 전혀없는 날을 마지막 생존일로 기록했다.

평균 생존 시간(MST)을 계산하고 로그랭크 법 (Peto et al, Br.J.Cancer 35, 1977)으로 분석했다. 모나코 등의 방법 (J. Immunol, 96, 229, 1966)으로 생후 4주된 마우스를 흉선 절제하고 그후 적어도 4주후에 사용했다. 모두 죽은 시점을 체크하였고 불완전하게 흉선 절제된 것은 없었다.

[결과]

[CD4 분자에 대한 rIgG2a mAb 결합 동정]

mAb (YTS 177.9)를 면역-형광염색법을 사용하여, L3T4 형질감염된 세포주에 대한 결합 여부를 근거로 분리했다(표1). 그것의 이소타입(isotype)은 ELISA 법(데이타는 제시 안함)으로 항-rIgG2a mAb, RG 7/1.7 (Springer et al, Hybridoma 1, 257, 1982)과 반응시킴으로써 결정했다. 이 mAb와 전술한 다른 2개의 CD4 mAb를 비교하기 위하여 다른 분석을 실시하였다. 예컨대, 결합 억제 연구는 YTS 177.9가 YTS 191.1 (Cobbold et al., 1984, Nature 312, 548) 및 GK 1.5 (Dialyras et al, Imm. Rev. 74, 29-56, 1983) (둘다 CD4 mAb임)외 동일한 에피토프에 결합하지만, 별개의 에피토프를 인지하는 다른 CD4 mAb YTA 3.1 (Qin et al., Eur. J. Immunol, 17, 1159, 1987)가 결합하는 에피토프와는 다른 것으로 나타났다. 2색 유동 혈구계측기에서, YTS 177.9와 YTA 3.1은 동일한 마우스의 비장 세포군을 염색하였지만, CD8 mAb, YTS 169.4 (Cobbold et al., 1984, Nature 312, 548)에 의해 염색된 것과는 달랐다.

또한, YTS 177.9의 특이성은 특이적^51-Cr 방출 분석법으로 시험했다. 이 mAb는 단독 사용시 분해에 비효과적이지만, CD4 mAb YTA 3.1에 의해 상승작용을 나타내는 것으로 밝혀졌다(제1a도). 한편 YTS 177.9는, 형광 염색시 교차-억제 반응을 나타내는 rIgG2b mAb YTS 191.1에 의한 분해를 방해하였다(제1b도).

[생체내에서 T세포를 결실시키지 않는 rIgG2a CD4 mAb]

생체내 세포 결실에 대한 rIgG2a CD4 mAb의 영향을 확인하기 위하여 흉선 절제된 (ATX) 성숙 마우스를 사용하였는데, 그 이유는 이 마우스가 흉선-의존성 T-세포 재생능이 없는 까닭에 mAb 결실이후 T세포 복원이 정상 마우스의 경우보다 훨씬 더 적기 때문이다. mAb주사 이후 말초 T 세포 변화를 모니터함으로써, 일시적인 항원 조절 또는 임파구 재-분포에 의한 진정한 의미의 결실과 구분하는 것이 가능하다. 각 마우스에게 IgG2a 또는 IgG2b 항체중 하나를 2mg 투여하고, 처치이전 및 처치 이후 여러 경과 시간마다 말초 혈액 임파구를 유동 혈구계측기로 분석하였다. 제2도에서 알 수 있는 바와 같이, IgG2b mAb 치료를 완료한지 1주일 후, 약 90%의 CD4⁺세포가 말초 혈액으로 부터 결실되었다. 이와 함께 총 T세포가 감소하였고 CD8⁺세포가 약간 증가하였다. 대조적으로, IgG2a mAb 처치에 의해 CD4⁺세포의 비율은 감소되었지만, 전체 Thy-1⁺세포의 비율은 크게 변하지 않았으며 CD8⁺세포의 비율도 변하지 않았다. 이것은 항체 결합 후 CD4 분자의 항원 조절 반응 때문인 것으로 간주된다. 처치 4주후, IgG2b 처치 그룹에서의 T-세포수는 여전히 낮은 반면, YTS 177.9로 처치한 그룹에서는 CD4⁺세포가 정상 레벨인 것으로 나타났다.

[rIgG2a CD4 mAb 존재하의 HGG에 대한 내성 유도]

CD4 F(ab')₂mAb 단편을 사용한 종래의 연구에서는 단백질 항원에 대한 내성을 촉진하는 mAb가 CD4⁺T-세포의 결실을 필요로 하지 않음을 제시한 바 있다. 본 연구에서는, F(ab')₂단편과 마찬가지로 비결실성 CD4 mAb가 동일한 효과를 나타낼 수 있는지를 조사했다. 마우스에게 3일 과정으로 YTS 177.9 또는 YTS 191.1을 투여하고 2일째(0일)에 HGG(0.5mg/마우스)를 1회 주사했다. 4주 후 HGG를 재투여하였을 때, YTS 191.1 처치된 마우스와 YTS 177.9를 다량 (1mg/마우스) 투여한 마우스는 HGG에 대해 내성을 갖게 되었다(제3도). 그러나, 0.1mg 이하의 mAb를 투여한 마우스는 여전히 HGG에 대해 반응할 수 있었다.

[rIgG2a mAb에 대해 내성을 유도하는 YTS 177.9의 성질]

이종 항체를 생체내 투여하면 대개 숙주내에서 항글로불린 반응이 유도된다. CD4 mAb의 특징중 하나는 이러한 항 글로불린 반응을 억제하고 더우기 동일한 이소타입의 다른 항체류에 대한 내성을 유도하는 성질이 있다는 점이다. 본 연구에서는 rIgG2a CD4 mAb YTS 177.9가 동일한 성질을 나타낸다는 것을 알았다.

0.1 내지 1 mg/마우스 YTS 177.9를 투여한 마우스는 1차 항 글로불린반응은 나타내지 않았으나 (역가 : 1:20), 0.01 mg/마우스 YTS 177.9를 투여한 마우스는 약한 반응 (1:160)을 나타내었다. 1차 항체 주사한지 6주후, 이 동물들에게 프로인트 보조제중의 '부적절한' (랫트 항-인체) rIgG2a 와 rIgG2b mAb를 재투여하여 적당한 자극을 가하였다. rIgG2a로는 인체 CDw 52에 대한 mAb인 YTH 34.5를 이용하였다(웨일드만, 외, 1985, Adv. Exp. Med. Biol. 186. 869). rIgG2b로는 인체CD3에 대한 mAb인 YTH 12.5를 이용하였다 (웨일드만, 외, 1985). 4주 후 마우스로부터 채혈하고 그것의 혈청 항-랫트 Ig 역가를 ELISA법으로 측정했다. rIgG2b mAb 가 rIgG2b 면역 글로불린에 대해 내성을 제공하는 것처럼, 고 투여량의 YTS 177.9 (1mg)을 마우스에 투여하면 반복되는 추가 항원 자극 이후에도 마우스는 rIgG에 대해 완전히 내성을 갖게 되었다(제4도).

0.1mg의 YTS 177.9는 1차 반응에 대하여 면역 억제를 나타내지만 내성을 유도하기엔 불충분하였다. 0.01mg의 YTS 177.9를 투여한 마우스 또는 비처리 대조군은 2차 유형의 항글로불린 반응을 나타냈다. 그렇게 유도된 내성은, YTS 177.9 처리한 마우스가 여전히 rIgG2b 면역글로불린에 반응하는 반면, YTS 191.1 내성 마우스는 rIgG2a에 반응할 수 있는 바와 같이 선택적이었다.

[rIgG2a mAb 처치에 의한 동종 이식 거부 반응의 지연]

본 발명자들은 단시간 처치한 후 동종 피부 이식 생존을 연장시키는 능력면에서 rIgG2b CD4 mAb 만큼 YTS 177.9가 유효하다는 것을 알았다. 첫번째 실험에서, 정상의 CBA /Ca 마우스에게 rIgG2a (YTS 177.9) 또는 rIgG2b (YTS 191.1) 중 하나를 동종 (BALB/c) 피부 이식하기 3일전부터 시작하여 2주 동안 매일 투여했다 (약 7mg/마우스 총 mAb). YTS 177.9 처치군에 있어서, MST는 20일까지 현저하게 연장되었다 (미처리 대조군 : 11.3일; p≤0.05, 표 2). 이러한 연장된 이식 생존율은 세포를 결실시킨 rIgG2b CD4 mAb에 의해 나타나는 생존을 (MST19일)과 유사하였다.

MHC 유형 I 과 II 부정합으로 인한 이식 거부 반응에 있어서, CD4⁺및 CD8⁺서브셋트 둘모두를 결실시키면 CD4 mAb 단독물의 효과 이상으로 크게 개선된 이식 생존율을 나타내었다(Cobbld et al, Transplantation, 42, 239, 1983). 본 연구에서는 rIgG2a CD4 mAb와 함께, 생체내 세포 결실에 대해 거의 영향을 미치지 않는 다른 rIgG2a CD8 mAb를 사용하였다. 이 CD8 mAb, YTS 105.18은 완전한 동종 피부 이식 생존을 더 연장시키는데 있어서 rIgG2a CD4 mAb, YTS 177.9와 함께 상승 작용을 하는 것으로 나타났다.

비교 목적으로, 2개의 rIgG2b mAb (YTS 191.1 ALC YTS 169.4) 또는 2개의 rIgG2a mAb를 동량 투여했다. 총 3mg/마우스의 mAb를 피부 이식한지 0일, 2일 및 4일째에 투여했다. rIgG2b 처치된 CBA/Ca 마우스는 MST 24일인 BALB/c 피부에 대해 거부 반응을 나타냈다 (비교 : 대조군 10.5일, p≤0.005, 제5도), 놀랍게도, rIgG2a CD4와 CD8 mAb로 처치한 그룹에서의 이식 생존은 rIgG2b mAb로 처치한 마우스의 경우보다도 길었다. rIgG2a-처치한 CBA 마우스중 3/4은 이식이후 45일 까지 BALB/c 피부 이식에 대해 거부반응을 나타내지 않았다 (MST 46.5일; 비교, rIgG2b처치군, p≤0.03).

[피부 동종이식에 대한 내성]

CD4 mAb 처치이후 심장이나 췌장과 같은 특정한 동종 이식물의 영구 생존에 대한 보고서가 있었지만, 일반적으로 mAb 단독 처치만으로 장기간 피부 이식을 유지하는 것은 더 어려운 것으로 나타났다. 본 발명자가 이미 제시한 바와 같이 CD4 결실성 mAb로 처치하면 다중의 부차 (multiple minor) 부적합성 골수 허용치가 얻어졌으며, 이 마우스는 공여체 피부에 내성을 갖게 되었다. 본 연구에서는, B10.BR 마우스의 피부를 CBA/Ca 마우스에게 이식했으며 YTS 177.9 (CD4)와 YTS 105.18 (CD8)으로 수용체를 처치했다. 이러한 H-2 적합성, 다중-부차 이식 항원의 부적합성 배합에 있어서, 3주동안 mAb 처치받은 모든 마우스는 1차 피부 이식편에 대해서는 90일 동안 허용적이었다.

이 시점에서 2차 공여체 유형의 피부를 3차군 (B10.D2) 이식편과 함께 이식했다. 제6도에서 볼 수 있는 바와 같이, 1차 및 2차 이식은 모두 무한계로 (90+일)계속 생존했지만 B10.D2 피부는 즉시 거부 되었다. mAb로 2회만 주사한 마우스의 경우 6마리중 3마리만이 90일 동안 B10.BR 피부를 유지했지만 두번째 피부 이식 이후 이 피부도 서서히 거부 반응을 나타냈다.

[실시예 2]

[재료 및 방법]

[마우스]

CBA/Ca, C57BI.10/Pc, BALB/c, B10.BR 및 AKR/J 마우스를 채혈하고 캠브리지 대학, 병리학부의 동물 시설에 보관했다. 생후 6주 내지 12주령의 성별 마우스 군을 사용했다.

[모노클론 항체류]

이 실험에서 사용되는 모든 랫트 모노클론 항체는 표 3에 요약하고 있다. 항체는 프리스테인-자극을 받은 (DAxLOU) F₁랫트에서 생성된 복수로부터 제조하고, 50% 포화 황산 암모늄으로 침전시킨 후 인산염 완충식염수(PBS; pH 7.2)로 투석함으로써 얻었다. 단백질 농도는 10 ㎎/㎖로 조절하며 (OD으로 측정), 이는 2-5㎎/㎖의 모노클론 항체를 포함한다. 모든 항체 제제는 마우스에 투여하기 전에 0.2마이크론 필터를 통과시켰다.

[피부 이식]

피부 이식을 종래 보고된 바대로 실시했다 (Cobbold et al., 1986, Transplation, 41, 634). 간략히 설명하면, 공여체 꼬리 피부 이식편 (0.5 ㎠ 내지 1.0 ㎠)을 마취 상태하의 수용체 마우스의 흉부 측벽에 이식시켰다.

상기 이식편을 가아제로 덮고 7일 동안 석고 반창고를 붙였다. 첫달 동안에는 매주 3회, 그후는 매주 거의 1회씩 이식편의 상태를 기록했다. 로그-랭크법(Peto et al., 1977, Br. J. Cancer, 35,1)을 사용하여 생존율 차이를 분석했다. 일정 범위의 공여체로부터 여러회 재-이식을 실시하는 경우, 보통 원래의 피부 조직편에 접한 반대쪽상에, 1회 제조된 이식층에 이식했다 (Cobbvld et al., 1986, Nature, 323, 164). 이식편의 상태는 처음에는 3회/주, 그후는 1회/주로 관찰했다. 평균 이식 생존 시간 (MST)은 거부 반응이 끝날 때까지의 일 수로 기록되며, 내성화된 조직 이식은 무한정한 생존 시간을 나타내면서 일반적으로 모발 성장이 정상적인 우수한 상태를 보였다.

[피부 이식에 대한 내성 유도]

피부 이식편을 항원/내성원의 제공원으로 단독 사용하여, 모노클론 항체 처치의 개시일에 전술한 바와 같이 이식했다. 모노클론 항체를 0 내지 21 일 (포함) 까지 3회/주 투여했으며, 처음에는 정맥내로 2회 주사 (0일과 2일)하며, 그 이외에는 복강내 주사했다. 주사액중의 총 항체 투여량은 0.2㎖ PBS 중의 복수 면역글로불린 분획 2mg 이었다. 랫트 IgG 항체로는, YTS 191.1.2, YTA 3.1.2, YTS 169.4.2 및 YTS 156.7.7 각각을 0.5mg 사용하였다 (상승작용을 나타내는 결실성 CD4 및 CD8 모노클론 항체의 혼합물; Qin et al, 1987, Eur. J. Immunol. 17, 1159). 랫트 IgG2a 항체로는, YTS 177.9.6 (CD4) 및 YTS 105.18.10 (CD8) 각각을 1mg 사용했다. 결실성 및 차단성의 복합 방식으로 투여시, 상승 작용을 갖는 랫트 IgG2b 혼합물은 0일과 2일째에 정맥내 투여했으며 그후 21일까지는 랫트 IgG2a CD4와 CD8을 3회/주 복강내 투여했다.

[혈청내의 활성 모노클론 항체의 레벨]

모노클론 항체 투여중 및 투여 후 여러 시간에서 마우스 개체로부터 취한 혈청 샘플을, 1% w/v 소혈청 알부민 (BSA)+5% v/v 열 불활성화된 정상의 토끼 혈청을 함유하는 PBS 1/5 희석액 25㎕중에서, 5x10⁵CD4 또는 CD8 형질감염된 세포에 첨가했다. CD4 형질감염체는 랫트 NB2-6TG 주 발현 마우스 L3/T4 (실시예 1)인 반면 CD8 (Lyt-2) 유전자는 마우스 L-세포 내에서 다량으로 형질발현되었다(Zamoyska, 1985, Cell, 43, 153).

결합한 항체는 제조자에 의해 지시된 희석상태에서 FITC (MARG2A-FITC; 영국, 옥스포드, 세로테크사)에 결합된 모노클론 항-랫트 IgG2a를 사용하여 검출하였으며, 1250 컴퓨터가 구비된 오소 50H 시토플루오로 그래프 (미합중국, 메사츄세츠, 웨스트우드사)로 분석했다. 얻은 편균 형광도를 정상 마우스 혈청중에 존재하는 정제 CD4 또는 CD8 항체 (YTS 177.9.6 또는 YTS 105.18.10)의 일련의 표준 희석액과 비교하여 혈청 샘플에 존재하는 등가 농도 값을 유도해 내었다. 형광도가 포화 항체를 나타내는 경우 또는 기준치 이상의 측정 가능한 형광도가 아닌 경우, 그 결과는 표준 곡선의 역가 범위 정도인 것으로서 추측된다.

[말초 혈액 백혈구의 제조]

1U 헤파린을 함유한 멸균관에 마우스의 꼬리 정맥으로부터 각각 채혈하였다 (약 0.1 ㎖). 2분간 마이크로퓨즈로 원심분리 (6000 rpm)한후 혈장을 분리하였다. 적혈구 세포는 실온에서 10초 동안 물 0.9㎖을 첨가한 후 10X 인산염 완충염수 0.1㎖를 첨가함으로써 2회 분해했고 7분 동안 1000 rpm으로 원심분리하여 백혈구를 회수했다 (Chandler et al., 1979, J. Immunol. Methods 31, 341).

[T-세포 서브셋트 결실에 대한 모니터]

말초 혈액 백혈구는 전술한 바와 같이 처치된 마우스 개체로부터 제조했다. 이것을 CD4 (YTS 191.1.2 + YTA 3.1.2) 또는 CD8 (YTS 169.4.2 + YTS 156.7.7)항원에 대한 모노클론 항체를 함유하는 상청액으로 염색했다. 다른 모노클론 항체들 (참고, 표 6)도 또한 대조군으로 사용했다.

결합된 항체들은 모노클론 항-랫트 IgG-FITC (NORIG-7.16-FITC; Clark, 1986, Methods Enzymol. 121, 548)과 모노클론 항-랫트 카파 경쇄(MAR-18.5-FITC; Lanier et al., 1982, Hybridoma, 1, 125)의 혼합물을 사용하여 검출했다. 형광분석을 위해 1250 컴퓨터와 선형 증폭기 (amplifiers)를 구비하고 전진 및 90°산란값을 갖는 오소 50H 시토플루오로그래프를 사용하여 살아 있는 임파구를 선별했다.

[임파구 혼합 배양]

반응 세포는 전술한 바와 같이 물 분해법을 이용하여 각 마우스 혈액샘플 5(약 0.2㎖)로부터 수득했다. 4 x 10⁵개의 잘 세척된, 미토마이신-C (영국, 푸울소재의 시그마사; 25㎍/㎖) 처리의 자극 비장 세포를 함유하는 3개의 U자 바닥의 조직 배양 미세적정 웰 (약 4 x 10⁵백혈구 세포/웰)에, 상기 세포를 나누어 놓음으로써 증식에 대하여 각 샘플을 분석했다. 10% 열-불활성화 인체 AB 혈청을 함유한 이스코브 변형된 둘베코 배지 (IMDM)의 최종 부피는 0.1 ㎖였다. 5% CO 제고 배양기(37℃) 중에서 3일 경과후 5㎕의 I-데옥시우리딘 (IUDR; 10μCi/㎖, 영국의 아머샴)을 6시간 동안 첨가 했다. I-결합은 유리 섬유 필터로 상기 세포를 회수하고 필립스 자동 감마 계수기로 계측하였다.

[MHC-부적합성 피부 이식에 대해 내성을 허용하는 결실성 및 차단성 CD4와 CD8 항체 배합물]

실시예 1은 비결실성 CD4와 CD8 항체로 3주간 치료하면 다중 부차 부적합성 피부 이식에 대해 내성을 제공한다는 것을 제시한 것이다. 심한 MHC 차이에 대하여 내성을 제공하는 치료 프로토콜을 얻기 위하여, 결실성(랫트IgG), 비결실성(차단성 랫트 IgG) 및 결실 이후 차단하는 CD4 와 CD8 항체 배합물을, BALB/c (H-2^d) 피부 이식된 CBA/Ca (H-2^k) 마우스에 투여함으로써 그 효과를 비교했다(제7도).

이미 본 발명자에 의해 보고된 바에 의하면, 완전한 결실성 프로토콜은 거부 반응을 현저하게 지연시켰지만, 모든 마우스는 70일이내에 거부 반응을 나타냈다 (MST=55일). 비결실성 항체들은 덜 유효했고(MST=28일), 2가지 결실성 항체 배합물을 투여한 후 랫트 IgG항체로 차단한 결과, 가장 긴 이식 생존율을 얻을 수 있었으나(MST100일), 대부분(전부는 아님)의 이식편들은 200일경에는 거부 반응을 나타냈다. 본 실험에서, 2차 BALB/c 시험 이식편을 94일째에, 3차 군인 B10(H-2^b) 피부와 함께 이식했다. 이 3차 군의 이식은 즉시 거부 반응을 나타냈으며 (MST=16일), 이는 상기 마우스는 면역 효력을 회복했음을 입증하는 반면, 2차 BALB/c 이식은 평균 43일 동안 생존했다. 이는 BALB/c 이식 항원에 대한 특이적 비반응성이 다소 존재한다는 것을 암시하는 것이다.

이러한 균주 배합물에서 완전한 내성은 얻지 못했지만 동일한 배합 프로토콜이 B10 (H-2^b)피부를 MHC 부적합성 CBA/Ca (H-2^k) 마우스에 이식시켰을 때 완전히 내성을 허용한다는 사실을 알았다. 제8도를 통해 수용체 마우스 8마리중 6마리는 그것의 본래 피부이식편을 무한하게 (250일) 유지할 수 있는 반면 모든 마우스는 119일째에 이식된 3차 군인 BALB/c 피부에 대해 15일 이내에 거부반응을 나타냄을 알 수 있다. 2차 B10이식은 생존 시간 (MST=44일)이 상당히 연장되었으나, 유전학적으로 동일한 것으로 추정되는 1차 이식이 유지될 때에도 결구 모두 거부반응을 나타냈다. 재현적으로 나타나는 이 결과는 2차 이식편을 거부할 수 있는 작동 세포의 존재에도 불구하고 내성화된 1차 이식편은 명백히 유지될 수 있음을 나타낸다. 메카니즘에 무관하게, 본래의 피부 이식편은 그 자체에 대해 비반응성인 상태를 유도하여 유지하는 것으로 예상된다. 1차와 2차 B10 이식편을 구분할 수 있는 마우스의 능력은 3차 군 피부의 거부 반응에 대해 의존성이 있는 것으로 예상되는데, 그 이유는 BALB/c 이식 대신 B10.BR을 이식한 8마리 마우스중 5마리가 모든 이식에 대해 내성을 유지하였기 때문이다(제8도). 이것은 상기 수용체 마우스가 두가지 공여체 MHC하에서도 B10 부차 항원에 내성이 있다는 것을 나타내는 바, 상기 이식편이 내셩적인 수용체형 M HC로 존재할 수 있다는 것을 의미하며, 이것은 본래 이식 항원의 재처리 및 수용체 APC에 의한 내성 제공의 결과일 것이다.

이러한 결과는 내성체 제공원으로서 고 면역성 피부 이식을 사용하는 완전한 MHC 차단체를 통한 항체 매개의 내성에 대한 첫 보고로서, 이식 자체가 내성 유도에 필요한 모든 항원을 제공한다는 것이 주요 요점이다.

[MHC에 대해 적합성이나 다중 비MHC 부차 항원에 대해서는 부적합성인 피부에 대해 내성을 제공하는 결실성 및 차단성 항체 배합물]

실시예 1에서, CD4와 CD8에 대한 모노클론 항체로 항원을 차단하는 경우에도 다중 부차 항원 (CBA/Ca 상의 B10/BR)에 있어서 상이한 피부 이식편에 대해서도 내성을 충분히 얻을 수 있음을 입증했다. 제11a도 및 제11b도에서는, 결실성 항체에 이어 차단성 항체의 복합 투여 방식이 AKR/J 이식편을 무한적으로 유지하는 CBA/Ca 마우스 10마리중 8마리에 있어서 유효하다는 것을 제시하고 있다. 이 마우스중 6마리는 2차 AKR/J 이식편(더이상 항체 치료없이 122일째에 이식된 피부)을 유지할 수 있는 반면, 모든 마우스는 3차 군인 부차 부적합성 피부(B10.BR)에 대해 거부 반응을 나타냈다. 그러나, 이러한 3차 군인 피부의 거부반응은 정상의 CBA 대조군보다 다소 느렸다(정상 대조군은 14일인데 비해 27일임; Cobbold et al., 1986, Transplantation, 41, 634). 역배합물(CBA/Ca 상의 B10.BR)도 역시 결실성 항체에 이어 차단성 항체 프로토콜을 사용하여 내성을 갖게 되었다 (4/5 이식220일). 그러나, 5마리 마우스중 2마리는 2차 B10.BR이식 (자료 제시 안됨) 뿐만 아니라 3차 군인 부차 부적합성 AKR/J 피부도 수용하였다. 이것은 다수의 공통 부차 항원에 의한 것이며 상이한 실험 모델(Zamoyska et al., 1989, Eur.J.Immunol.19,111)에 있어서 주요내성이 있음을 예상할 수 있다.

요약하자면, CD4 와 CD8 항체는, 적당하게 사용했을 때, 피부 이식편에 대해 MHC 및 MHC 항원 차이에 따라 내성을 유도할 수 있으며, 추가의 조혈원성 항원이나 다른 골수 제거 치료가 필요하지 않다. 따라서, 피부 이식은 말초 T 세포에 직접 항원을 제공할 수 있어, 거부 반응을 유도하는 활성화 또는 수용 및 내성을 유도하는 불활성화되는 것이 분명하다.

[순환성 T-세포에 대한 랫트 IgG2a 와 IgG2b 항체 배합의 효과]

전술한 실험에서 알 수 있는 현저한 내성원적인 효과를 고려하여, 순환성 CD4⁺및 CD8⁺T-세포에 대한 모노클론 항체의 효과를 확인하는 것이 중요하다. CD4 또는 CD8에 대한 랫트 IgG2b 항체가 그것의 타겟 T-세포를 결실시킨다는 것은 이미 제시하였다 (Cobbold et al., 1984, Nature, 312,548). 실시예 1에서는, 랫트 IgG2b CD4 와 CD8 모노클론 항체의 초기 투여량은 예상했던 바대로 다수의 T-세포를 감소시키며, 그후 CD4⁺와 CD8⁺세포의 비율은 IgG2a 항체로 연속 처치하는 동안에도 실질적으로 회복되지만(표 4), 그러나 발현되는 항원의 양은 훨씬 감소한다(데이타 제시 안함). 나머지 항체는 투여기간 동안 T-세포에 존재하여, CD4⁺와 CD8⁺세포를 정확하게 측정하는 것은 어렵다. 그후 말초 혈액 중의 T-세포 비율은 항체 투여지를 정지시킨후 적어도 1달 동안 감소하였는데, 이러한 효과는 IgG2a 항체를 단독으로 동량 투여했을 때에는 나타나지 않았다 (데이타 제시 안함).

비결실성 모노클론 항체에 의한 이식 거부 반응의 억제 메카니즘중 하나는 항원 제공 과정중 T-세포 표면에 CD4 및 CD8 보조 분자의 작용을 차단하는 것이다. 이것은 혈청 항체가 항원 양성 세포를 포화시키기에 충분한 레벨로 유지되는 경우만이 가장 효과적이다. 처치된 마우스의 활성 항체 레벨은 처치 3주 동안에 걸쳐서 타겟 CD4 와CD8 항원을 포화시키는데 충분한 양이며, 그 중 몇마리는 항체투여 정지 이후 3주까지도 충분하였다(표5). 그러나, 60일에는 비특이성 면역억제가 유지되지 않는 혈청중에 남아있는 검출 가능한 양 (0.5 ng/㎖ CD4 및 10ng/㎖ CD8)의 모노클론 항체는 존재하지 않았다. ELISA 법으로 측정되는 검출 가능한 항글로불린 (항-종이나 항-유전인자형이 아님)은 마우스에 전혀 존재하지 않았으며, 이는 상기 마우스가 이 프로토콜에 의해 랫트 면역글로불린에 내성을 갖게 되었음을 시사한다.

[시험관내에서도 반응가능한 내성의 마우스]

전술한 B10피부에 내성이 있는 CBA 마우스는 시험관내에서 B10 자극성비장 세포에서도 증식할 수 있었는데 (표6), 이는 다수의 동종-반응성 T-세포가 결실되지 않았음을 나타낸다. 명백한 것은, 수용체 면역 시스템은 원래의 이식에 의해 제공된 항원에 내성이 있으나, 시험관내에서 비장 자극 세포 또는 2차 피부 이식에 의해 제공된 항원에도 반응할 수 있다는 것이다.

[부차 항원으로 미리 자극된 마우스에 있어서 내성 유도]

말초혈액 면역 시스템에 있어서, 본래의 T-세포가 이식에 의한 항원에 의해 내성화되는 것이 제시되었는 바, 항원자극된 T-세포도 내성을 가질 수 있는지 여부를 측정하고자 하였다. 상기의 두가지 처지 프로토콜은 모두(차단성 프로토콜 단독, 또는 결실성 프로토콜 이후 차단성 프로토콜)은 모두 방사선 조사된 공여체 비장 세포로 미리 항원자극된 CBA/Ca 마우스에 있어서 AKR/J 또는 B10.BR 피부에 대해 내성을 유도하기에 효과적임을 알았다(제10a도 내지 제12b도). 대조적으로, 결실성 CD4⁺및 CD8⁺T-세포는 원상태 또는 자극된 마우스에 있어서 동일하게 면역억제성이지만, 다중의 부차 항원 부정합 피부에 대해서는 내성을 유도하지 않았으며, 모든 이식은 결국 거부 반응을 나타냈다(Cobbld et al, 1986, Transplantation, 41, 634).

제9도의 원상태 마우스와 제10도의 자극된 마우스간의 유일한 차이점은 재항원투여 이후 나타났다. AKR/J로 항원자극되고 내성화된 마우스 그룹중 1/2은 결국 1차 및 2차 AKR/J 이식에 대해 사실상 거부 반응을 나타냈으며, 이 반응은 B10/BR 3차 군의 이식 경우보다는 더 서서히 나타났다 (각각 MST=63일 및 21일; 제10a도). CBA상의 B10.BR 배합에 있어서, 대부분의 마우스는 무한적으로 원래의 이식편을 보유한 반면, 몇몇 마우스의 경우 2차 B10.BR 및 AKR/J 이식은 서서히 거부 반응을 나타냈다 (제10c). 이러한 균주 배합에 의한 차이는 본래의 마우스에서 나타나는 적합성이며(참고, 제9도), 이것은 특정한 공통 부차 항원의 복합적인 양상에 의한 것일 가능성이 있다.

[피부 이식의 활성 거부 반응중의 내성 유도]

민감성 T-세포도 내성화될 수 있다는 사실은 임상적 의미를 지닌다.

진행중인 면역 반응에 있어서, 특히 이식 이후 자가 면역이나 기관 거부반응 위기중에서 내성을 유도하는데 유리하다. 제11a도 및 제11b도에서는, 다중의 부차항원 부적합성 피부 이식의 진행중인 거부 반응을 역전시키고 장기간 생존 (어떤 경우, 1차 및 2차 이식의 두 경우에도 )할 수 있는 가능성을 제시하였다. 본 실험에 있어서, 결실과 이후 차단을 병행하는 것이 가장 효과적이지만(제11a도), 차단성(비결실성) 항체를 투여한 6마리의 마우스중 3마리가 역시 2차 이식편을 유지하는 바와 같이 (제11b도), 작동 T 세포도 불활성 또는 내성화하는 것이 가능함이 명백하였다.

^a각 mAb로 염색시킨 후 유동 혈구계산법으로 분석한 L3/T4 형질 감염 세포.

^b조직 배양 상청액으로 부터 FITC 결합된 토끼 항-랫트 Ig으로 사용된 mAb.

^c비오틴화된 mAb; 이하 제시된 'Cold' mAb 과량과 함께 항온처리됨.

형광분석은 FITC-스트렙트아비딘으로 발색시킴.

a) 정상의 CBA/Ca 마우스에게 피부 이식 3일전부터 시자하여 2주 동안 CD4 mAb(약 7mg/마우스)를 투여함.

b) 마지막 mAb 주사하고 4일후 회수한 말초 혈액을 비오틴화 YTA 3.1 (CD4), YTS 156.7 (CD8) 및 YTS 154.7 (Thy-1)으로 염색한후, 스트렙트아비딘-FITC 로 염색함. 결과는 유동 혈류 계측기로 분석함.

c) B10.BR 이식편의 MST : 비-처리된 대조군 : 12일; YTS 191.1 처리군 : 32일 (비교, 대조군; p≤0.005)

YTS 177 처리군 : 22일 (비교, 대조군 p≤ 0.004 : 비교, YTS 191.1 그룹, p≤0.7).

BALB/c 이식편의 MST : 비처리 대조군 : 10.5일 : YTS 191.1 처리군 19일 (비교, 대조군 p≤0.006);

YTS 177.9 처리군 : 20일 (비교, 대조군 p≤ 0.006; 비교, YTS 191.1 그룹, p≤0.4).

Vβ6+ 세포의 무감증과 관련된 MIs-1 항원에 대한 MIs-1 마우스의 내성 정상의 CBA/Ca 마우스는 총 mAb 10mg/마우스로 3주 동안 rIgG CD4 (YTS 17.9)와 rIgG CD8 (YTS 156.7)로 처치했다. 2 x 10 AKR/J 골수 세포를 주사했다. 4주후, 상기 마우스의 비장 세포를 유동 혈구계산법을 위해 스테인 (stained) 한 형광 물질 및 MLC 시험했다. 도면에서는 3샘플의 평균값으로 표시했다.

*항-랫트 Ig 은 MAR-18.5-FITC 및 NORIG-7.16-FITC의 혼합물이다.

모든 마우스에게 실시예 2에 기재된 바대로 랫트 IgG2b CD4 와 CD8 이후에 랫트 IgG2a CD4 및 CD8를 0-20일에 투여하였다.

모노클론 항체 처치는 0 내지 2일째에 랫트 IgG2b CD4 와 CD8, 이어서 랫트 IgG2a CD4 와 CD8을 21일까지 주3회 투여했다(총 2mg/주사액).

B10 내성의 CBA/Ca 마우스 개체, 또는 정상의 대조군으로부터는 78일째 꼬리 정맥으로부터 채혈했다.

말초 혈액 세포의 증식은 실시예 2에서와 같이 측정했다.

도면은 그룹마다 6마리 마우스의 로그 평균값 및 표준 편차로 나타내었다.

Claims

CD4 항원에 대해 유발되는 비결실성 (non-depleting) 모노클론 항체를 함유하며, 인체 검체에 비결실성 항-CD4 모토클론 항체를 비결실성 항-CD8 모노클론 항체와 함께 투여하여 상기 항원의 존재하에 상기 항체들에 의하여 상기 검체내에 면역학적 내성 허용성 환경을 유도하는 것으로 구성되는 방법에 의해 상기 검체내에 상기 CD4 항원에 대한 면역학적 내성의 상태를 유도하여, 상기 검체를 치료하는 치료제.
제1항에 있어서, 항원이 자가항원인 것을 특징으로 하는 치료제.
제2항에 있어서, 류마티스양 관절염 또는 다발성 경화증의 치료에 내성을 유도하기 위한 치료제.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 비결실성 항-CD4 항체가 재조합 항체인 치료제.
CD8 항원에 대해 유발되는 비결실성(non-depleting) 모노클론 항체를 함유하며, 인체 검체에 비결실성 항-CD8 모노클론 항체를 비결실성 항-CD4 모노클론 항체와 함께 투여하여 상기 항원의 존재하에 상기 항체들에 의하여 상기 검체내에 면역학적 내성 허용성 환경을 유도하는 것으로 구성되는 방법에 의해 상기 검체내에 상기 CD8 항원에 대한 면역학적 내성의 상태를 유도하여, 상기 검체를 치료하는 치료제.
제5항에 있어서, 항원이 자가항원인 것을 특징으로 하는 치료제.
제6항에 있어서, 류마티스양 관절염 또는 다발성 경화증의 치료에 내성을 유도하기 위한 치료제.
제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 비결실성 항-CD8 항체가 재조합 항체인 치료제.
CD4 항원에 대해 유발되는 비결실성(non-depleting) 모노클론 항체를 총항체로서 함유하며, 이러한 비결실성 항-CD4 모노클론 항체를 인간 검체에 투여하여, 자가항원, 이식 항원 및 면역글로불린중에서 선택되는 항원의 존재하에 상기 항체에 의하여 상기 검체내에 면역학적 내성 허용성 환경을 유도하는 것으로 구성되는 방법에 의해 상기 항원에 대한 면역학적 내성의 상태를 유도하여, 상기 검체를 치료하는 치료제.
제9항에 있어서, 항체가 1종 이상의 면역 억제성 치료제와 함께 투여되는 치료제.
제9항 또는 제10항에 있어서, 비결실성 항체를 투여하기 전에 결실성 항-CD4 모노클론 항체 및/또는 결실성 항-CD8 모노클론 항체를 투여하는 것을 특징으로 하는 치료제.
제9항 또는 제10항에 있어서, 비결실성 항-CD4 항체가 재조합 항체인 치료제.
제9항 또는 제10항에 있어서, 항원이 자가항원인 치료제.
제13항에 있어서, 류마티스양 관절염 또는 다발성 경화증의 치료에 내성을 유도하기 위한 치료제.
단위 투여량당 비결실성 항-CD4 항체 또는 비결실성 항-CD8 항체 1 내지 400 mg과 함께 의약적 허용성 담체 또는 희석제를 인체 검체에게 투여하기에 적합한 형태로 함유하는 단위 투여량 형태의 항원에 대한 면역학적 내성을 유도하는 의약 조성물.
제15항에 있어서, 단위 투여량 형태가 항체 20 내지 400mg을 함유하는 의약 조성물.
제16항에 있어서, 단위 투여량 형태가 항체 30 내지 400mg을 함유하는 의약 조성물.
제15항 내지 제17항중 어느 한 항에 있어서, 항체가 항-CD4 항체인 의약 조성물.