PT94214B

PT94214B - Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas que contem anticorpos monoclonais

Info

Publication number: PT94214B
Application number: PT94214A
Authority: PT
Inventors: Herman Waldmann
Original assignee: Cobbold Stephen P
Priority date: 1989-05-31
Filing date: 1990-05-31
Publication date: 1997-03-31
Also published as: AU5725890A; ES2096588T3; DE69029134D1; WO1990015152A1; JPH04505919A; CA2055615A1; GB8912497D0; IE80735B1; EP0474691A1; ZA904174B; PT94214A; ATE145246T1; KR0183029B1; NZ233889A; CA2055615C; MY135673A; JP2763197B2; DK0474691T3; AU657255B2; IL94566A0

Description

Resumo: (máx. 150 palavras) ©

A invenção refere-se a um processo para a preparação de uma composição farmacêutica que compreende incorporar-se como ingrediente activo um anticorpo monoclonal anti-CD4 não redutor ou um anticorpo monoclonal anti-CD8 e uma substância veicular ou um diluente farmaceuticamente aceitáveis de modo a formar uma composição numa forma de dosagem unitária adequada para administração a um ser humano e que contém de 1 a 400 mg do anticorpo por dose unitária.

neo a

Descrição referente à patente de invenção de Stephen Paul Cobbold, britânico, imunologista, residente em Lower Fiat, 22 Guest Road, Cambridge CRI 2AL, Inglaterra e de Herman Waldmann, britânico,j imunologista, residente em 11 Gurney Way, Cambridge, Inglaterra para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE

CONTÊM ANTICORPOS MONOCLONAIS.

DESCRIÇÃO

A presente invenção refere-se a induçãao de tolerância mediante o uso de anticorpos monoclonais.

Provou-se que anticorpos monoclonais (Acms) contra o antigene CD4 (L3T4) de murino são agentes;

í .

i imunossupressores potentes para o controlo da imunidade, humoral, a rejeição de transplantes e a autoimunidade. Para^! ; além disso, verificou-se que os Acms contra CD4 criam um ambiente permissivo para a tolerância in vivo com o qual se : .· 1 !pode alcançar tolerância a certos antigenes proteicos solúveis: ! bem como

a antigenes	de	transplantações.	No	entanto,	o.
(ou os mecanismos)	pelo qual os	Acms	contra	CD4,
estes efeitos	não	é ainda claro.	Na	maioria	do si

trabalhos anteriores a imunossupressão era obtida em condiçõesj que provocavam a redução das células alvo in vivo. Uma 'interpretação simples é que a supressão imune conseguida deste modo era devida à ausência das células T CD4.

i

I ^I Por outro lado, foi demonstrado por meio de

II itrabalho in vivo que os Acms contra CD4 (e CDB) podem afectar I as funções dos linfócitos simplesmente através de ligação ao ,antigene sobre a superfície celular sem lise das células. Para ,além disso, obteve-se imunossupressão e indução de tolerância in vivo com o uso de concentrações sublíticas de Ames contra CD4 e por fragmentos F(ab')₂ de Acms contra CD4, o que sugere que para a regulação mediada por Acms a redução das células alvo pode não ser essencial.

Estudos anteriores usaram anticorpos que reduzem as células CD4. Nós verificamos agora que também é possível produzir tolerância à imunoglobulinas e medula óssea 'estranhas e a transplantes de pele estranha com anticorpos contra CD4 e CD8 que não reduzem o número de células. Na verdade, esta observação é de aplicação geral a todos os antigenes. Para além disso, verificámos que a administração de um Acm CD4 redutor e/ou um Acm CD8 redutor antes da administração dos Acms redutores pode ser benéfica para a criação de um ambiente permissivo à tolerância.

A presente invenção por conseguinte 'proporciona produtos que contém um Acm CD4 não redutor e um Acm CD8 não redutor sob a forma de uma preparação combinada para utilização simultânea, separada ou sequencial. Também formam parte da presente invenção um Acm CD4 não redutor para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal por cirurgia ou terapia e um Acm CD8 não redutor para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal por cirurgia ou terapia. A presente invenção para além disso proporciona:

- Acms CD4 e CD8 não redutores para utilização conjunta num método de tratamento do corpo humano ou animal por cirurgia ou terapia, especialmente para utilização na indução de tolerância la um anti gene; e

- uma embalagem que contêm como componentes separados um Acm (CD4 não redutor e um Acm CD8 não redutor, de modo típico em compartimentos separados.

Por administração de Acm CD4 e CD8 não redutores em conjunto é possível conferir tolerância a um lantigene primário num paciente. Os Acms CD4 e CD8 podem ser ! usados a fim de tratar doenças autoimunes e para evitar ; rejeições de enxertos sem necessidade de quimioterapia

Iimunossupressora de longa duração. É possível conseguir tolerância a um enxerto, como por exemplo um enxerto de um órgão ou uma transplantação de medula óssea.

Existem vantagens na utilização de Acms não i

redutores in vivo. Por exemplo, uma injecção de Acms não redutores a curto termo permite uma recuperação rápida de células competentes de um bloqueio e por conseguinte pode diminuir o risco de infecções oportunistas e de outras

I complicações devidas à deficiência imune (por exemplo recidivas de leucemia após transplantação de medula óssea em que se (reduziram as células T) a seguir a um tratamento por Acms. Para além disso, sabe-se agora que as células CD4 podem ainda dividir-se em diferentes subconjuntos funcionais, alguns dos quais podem estar implicados na regulação imune. A eliminação completa das células T pode dar origem evidentemente a uma Η supressão imune, mas também destruirá uma possível influência das células de regulação CD4+. Por conseguinte, uma manipulação mais subtil pode ser mais benéfica para guiar o sistema imune ί

para o estado pretendido.

i

A tolerância pode ser atingida de preferência por administração a um paciente em primeiro lugar de Acms CD4 e/ou CD8 redutores. A presente invenção porl !conseguinte proporciona igualmente: !

- Acms CD4 e CD8 não redutores e Acms CD4 e/ou CD8 redutores para utilização conjunta num método de tratamento do corpo ihumano ou animal por cirurgia ou terapia, mais especificamente por indução de tolerância a um antigene;

- produtos que contêm um Acm CD4 não redutor, um Acm CD8 não redutor e além destes, em alternativa ou um Acm CD4 redutor, ou um Acm CD8 redutor ou ambos, sob a forma de um preparado combinado para utilização simultânea, separada ou sequencial para a indução de tolerância a um antigene; e

- uma embalagem que contem um Acm CD4 não redutor, um Acm CD8 não redutor e além destes, em alternativa ou um Acm CD4 j redutor, ou um Acm CD8 redutor ou ambos, de modo típico cada um num compartimento separado.

É possível usar uma combinação de Acms CD4 e !CD8 não redutores para a indução de tolerância a qualquer' antigene sem necessidade de outros agentes imunossupressores. Um Acm não redutor é um Acm que reduz in vivo em menos de 50%, , por exemplo entre 10 e 25% e de preferência menos do que 10%, o número de células visadas. Estes Acms não redutores podem ser

I usados para induzir tolerância a um antigene da classe II ou ai um antigene apresentado por um antigene da classe 1 ou da classe II. Podem ser usados para induzir tolerância aos dois antigenes. No caso de uma transplantação, por exemplo podem jestar presentes antigenes de histocompatibilidade principal

I ' (major histocompatibility = MHC) da classe I e da classe II e jantigenes não MHC ou de histocompatibilidade secundária ¹ i(minors). Para além dos antigenes das transplantações, a , I jlpresente invenção pode ser utilizada para induzir tolerância a proteínas globulares, glicoproteinas, como por exemplo jimunoglobulinas, materiais transportados sobre partículas, como por exemplo proteínas do pólen, polipeptideos destinados a uso terapêutico, como por exemplo interferâo, interleuquina-2 ou j factor de necrose de tumores, ou hormonas de substituição, como; por exemplo hormona de leutinização, os seus análogos e|

antagonistas. Outros antigenes para os quais é possível ί;

conferir tolerância incluem análogos peptidicos sintéticos de agentes terapêuticos proteicos que são usados para auxílio no bloqueio de receptores e aloantigenes. Pensa-se que são os aloantigenes os responsáveis pela rejeição de tecido estranho em transplantações de tecido ou enxertos de pele.

Os Acms que podem ser usados são Acms que são específicos para o antigene superficial das células CD4 (Acm CD4) ou para o antigene superficial das células CD8 (Acm CD8). Por Acms CD4 e CD8 pretendemos designar não apenas os Acms específicos para os antigenes superficiais das células CD4 e CD8 humanas mas também os Acms específicos para os antigenes superficiais correspondentes em outras espécies, como o ’antigene L3T4 nos ratos que é o equivalente murino do antigene CD4 humano. Os Acms são normalmente da classe IgG₂, como por exemplo IgG₂ de ratazana, IgG_2b de rato ou IgG₂ humano, mas podem ser da classe IgG₄ humana. Podem ser usados fragmentos de Acms que contêm o local de ligação do anticorpo, como por exemplo os fragmentos Fab e F(ab)₂.

Os Acms CD4 e CD8 podem ser administrados em conjunto a um hospedeiro. Podem ser administrados como parte da: mesma formulação ou em formulações separadas. Normalmente os dois Acms são administrados de 1 a 7 vezes por semana, de preferência de 1 a 4 vezes por semana, por exemplo três vezes por semana, durante um período de 2 a 4 semanas, de preferência durante 3 semanas. Administra-se uma quantidade eficaz dos Acms (não redutores. Em consequência administra-se uma quantidadeí suficiente de cada Acm não redutor para a indução de um ambiente permissivo da tolerância num paciente em tratamento. As células CD4 e CD8 podem deste modo ser bloqueadas.

i : A quantidade de Acm CD4 não redutor ou de

Acm CD8 não redutor administrado a um paciente depende de ^vários factores incluindo a idade e o peso do paciente, aí ;condição que se pretende tratar e o antigene ou os antigenes a ,que se pretende induzir tolerância. Num sistema modelo constituído por um rato administra-se entre 1 ug e 2 mg, de preferência entre 400 ug e 1 mg, de um Acm a gualguer hora. Em seres humanos podem ser administrados de 3 a 30 mg, por exemplo de 5 a 20 mg, do anticorpo. Para além dos Acms CD4 e CD8 ou em vez de gualguer dos Acms CD4 e CD8 ou de ambos pode usar-se o ' Acm CDlla, um Acm não redutor.

, Pode ser administrado a um hospedeiro um :antigene estranho (ou vários) ao gual se pretende induzir tolerância desde um máximo de 5 dias antes de se iniciar o tratamento com os Acms CD4 e CD8 não redutores até 5 dias após o tratamento ter sido terminado. Geralmente, no entanto administra-se um antigene no decorrer dos primeiros 14 dias do início do tratamento, normalmente no decorrer dos primeiros 7 dias do início do tratamento. O antigene pode ser dado no momento do início do tratamento com o Acm CD4 e CD8.

Por conseguinte é possível induzir tolerância a um antigene num hospedeiro por administração de Acms CD4 e CD8 não redutores e, sob uma cobertura dos Acms, do antigene. Um paciente pode ser operado cirurgicamente sob uma !

cobertura dos Acms CD4 e CD8 não redutores a fim de receber uma jtransplantação de tecidos como por exemplo um enxerto de um órgão ou uma transplantação de medula óssea. Também pode ser (induzida tolerância a um antigene já existente no paciente. Pede ser induzida uma tolerância de longo termo a um antigenej ou a antigenes próprios a fim de tratar uma doença autoimune, como por exemplo esclerose múltipla ou artrite reumatóide. .Deste modo é possível aliviar o estado de um paciente gue sofra de uma doença autoimune.

Pode ser preferível tratar um hospedeiro com um Acm CD4 redutor e/ou com um Acm CD8 redutor antes de iniciar! o tratamento com os Acms não redutores. Um Acm redutor e um Acm gue reduz in vivo em mais de 50%, por exemplo de 90 a 99%, as 'células visadas. Os anticorpos redutores incluem a IgG₂b ou a

;IgGi da ratazana, a IgG_2a do rato e as IgGi e IgG₃ humanas. Um Acm CD4 redutor e/ou um CD8 redutor pode ser por conseguinte , I :ser usado a fim de reduzir a população de células T relevantes. Os Acms não redutores por conseguinte têm menos células T sobre ique actuar. A redução pode em alternativa ser conseguida por í 1 terapia imunossupressora tradicional, como por exemplo por [ j

^administração de outro Acm como CAMPATH (Marca Registada) 1, !esteroides, cicloesporina, ALG (globulina anti-linfócitos) ou por irradiação.

! 0 nível ao qual a população de células T é ' reduzida por um Acm redutor pode depender do antigene ou dos antigenes a que se pretende conferir tolerância. Pode ser preferível reduzir a população de células T mais para antigenes ίdifíceis, para enxertos de tecido com um grau de afinidade

I reduzido, para receptores que tenham estado anteriormente j expostos a antigenes do dador e estejam sensibilizados (por exemplo pacientes que recebam várias transfusões) ou em doenças autoimunes em que os pacientes estejam simultaneamente sensibilizados e recebendo uma activação contínua do seu estado 'jimune. Um tecido de fraca afinidade, por exemplo, é um tecido 'em que um ou vários antigenes principais de íhistocompatibilidade da classe I não têm correspondência.

d

Pode por conseguinte ser necessário reduzir 'uma população de células T auxiliares positivas em relação a: CD4 a menos de cerca de 7 0%, por exemplo menos do que cerca de 50%, 20% ou mesmo 10%, do seu nível normal. Quanto mais difícilí seja a probabilidade de conseguir a tolerância, maior o grau de iredução que é desejável alcançar. As células T positivas em prelação a CD8 podem ser reduzidas do mesmo modo.

O Acm CD4 redutor e/ou o Acm CD8 redutor é [normalmente administrado de 1 a 7 vezes por semana, de preferência de 2 a 4 vezes por semana, por exemplo três vezes [por semana ou uma vez ou duas, de preferência uma vez, de 1 a 7 dias, por exemplo de 1 a 5 dias, antes do início do tratamento

icom os Acms CD4 e CD8 não redutores. Pode ser administrado um,

Ν antigene ao qual se pretenda induzir tolerância ao mesmo tempo que se administra o Acm redutor ou no decurso de 5 dias desta administração. A quantidade de Acm redutor que é dada depende de vários factores incluindo o nível a que se pretende reduzir a população de células T, a idade e o peso do paciente, a condição que se pretende tratar e o antigene ou antigenes a que se pretende induzir tolerância. Num sistema modelo constituído ί

por um rato, pode-se administrar uma dose de 1 ug a 2 mg, de preferência de 400 ug a 1 mg, de um Acm redutor. Em seres humanos pode-se administrar uma dose de 1 a 400 mg, como por· exemplo de 3 a 30 mg, por exemplo de 5 a 20 mg, de um Acm.

Os Acms CD4 e CD8 redutores e não redutores •podem ser suscitados de qualquer modo conveniente. Estes Acms podem ser preparados pelos métodos normais de fusão de células de baço de ratazana imune com uma linha de células de mieloma de ratazana como por exemplo a linha de células Y3/Ag 1.2.3. (Clark e Waldmann, capítulo 1 de Monoclonal Antibodies, que é 'um livro editado por P.C.L. Beverley na serie Methods in 'jHematology, Longman (Churchill Livingstone), 1986). Pode ser íUtilizado qualquer outro método como por exemplo por fusão de • células de baço de rato imunizado com um mieloma de rato, um

Smieloma de ratazana ou um mieloma humano ou por metodologias de !

ADN recombinante.

Todos os Acms são administrados por via (parenteral, por exemplo por via intravenosa. Os Acms são Igeralmente dados por injecção ou por perfusão. Para este fim 'prepara-se uma formulação de um Acm numa composição farmacêutica que contem uma substância veicular

I i farmaceuticamente aceitável. Pode ser usado qualquer veículo ou' idiluente, por exemplo solução salina isotónica. Quando se( administra antigenes específicos aos quais se pretende conferir· ('tolerância, estes podem ser administrados por via parenteral, (por exemplo por via intravenosa, intramuscular ou subcutânea. O

antigene é normalmente formulado com um veículo ou um diluente farmaceuticamente aceitável, como acima.

' Os respectivos hibridomas que produzem os

Acms YTS 177.9, YTS 191.1, YTS 105.18 e YTS 169.4 foram depositados na European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, G.B. em 30 de Maio de 1990 sob os números de acesso ECACC 90053005, ECACC 87072282, ECACC 90053004 e ECACC ' 87072284.

I

Os exemplos que se seguem destinam-se a j ilustrar a presente invenção. Nos desenhos em anexo: i I

A Figura 1 mostra a sinergia e a interferência de lise por complemento por combinações de Acms rigG2a e rigG2b. Incubaram-se timócitos de CBA/Ca marcados com ⁵¹-Cr (30 ugCi/ml) com Acms conforme indicado sob cada barra e 2% de soro de cobaias como origem do complemento. Concentração :de Acm: (A) 5 ug/ml; (B) 25 ug/ml dos Acms usados.

A Figura 2 mostra os resultados da injecção de rigG2a CD4 in vivo sem redução de células T. Deu-se a ratos ^!ATX CBA/Ca (n = 3) uma única injecção dos Acms indicados (2 mg/rato) e sangraram-se os ratos 1, 4 e 8 semanas mais tarde. Coraram-se BPL com Acms biotinilados contra CD4 (YTA 3,1 ·) , CD8 (YTS 156,7 A) e Thy-1 (YBM 29,2 ▼), e em seguida trataramse com estreptavidina-FITC. Os resultados foram analisados por; citometria de fluxo e calculou-se a percentagem de cada população usando a da amostra de comparação não tratada no dia do ensaio como 100%.

A Figura 3 mostra como se induziu a tolerância a HGG por Acm 177,9 de CD4 igG2a. Administraram-se a ! ratos CBA/Ca normais YTS 177.9 ou YTA 191.1 nas doses indicadas ; , I nos dias -1, 0 e 1. Injectou-se 1 mg de HGG agregada por'

I aquecimento no dia 0. Injectaram-se reforços de 0,5 mg de HGG nos dias 28 e 35. Os ratos de controlo receberam 1 mg de YTS' ;^{1 1}

177.9 como os outros mas foram imunizados com HGG apenas nos

,dias 28 e 35. Os títulos de anti-HGG no soro foram medidos no dia 45 por meio de uma análise de ELISA.

A Figura 4 mostra os resultados da injecção de YTS 177.9 a fim de induzir uma tolerância especifica a IgG2a ;de ratazana. Deram-se a ratos CBA/Ca normais 3 injecções de YTS

177.9 ou YTS 191.1 nas doses indicadas em 3 dias consecutivos.

semanas mais tarde reforçou-se a inoculação com uma injecção bemanal de YTH 35.4 (IgG2a de ratazana anti-humano) e Campath (Marca registada) 2 (IgG2b de ratazana anti-humano) em primeiro lugar em adjuvante de Freund completo e em seguida em adjuvante de Freund incompleto. Na décima semana sangraram-se e mediram-j se os títulos de anti-IgG2a (barras vazias) e de anti-IgG2b (barras a tracejado) por meio de uma análise de ELISA usando i placas revestidas com Acms de IgG2a e de IgG2b, respectivamente, de ratazana purificados por HPLC.

A Figura 5 mostra o padrão de prolongamento de sobrevivência de enxertos de pele alogénica após tratamento com Acms CD4 e CD8 IgG2a. Deram-se a ratos CBA/Ca normais (n = 6) 3 injecções de YTS 177.9 e YTS 105.18 ou YTS 169.4 (quantidades total de anticorpo: 3 mg/rato) nos dias 0, 2 e 4.

I

No dia 0 enxertou-se pele da cauda de rato BALB/c de espessura integral. Valores estatísticos pelo método de Logrank: ratos tratados com Acm IgG2b (▼) em comparação com ratos de controlo não tratados (·) p<0,005; ratos tratados com IgG2a (A) em comparação com ratos não tratados de comparação p<0.001; em comparação com ratos tratados com IgG2b p<0.03. i

A Figura 6 mostra a tolerância a enxertos de pele alogénica por Acms rigG2a. Enxertaram-se ratos CBA/Ca; normais com pele B10.BR e administrou-se (1) uma mistura de YTS

177.9 e YTS 105.18 nos dias 0 e 2 (total: 2 mg/rato); (2) os i 'mesmos Acms durante 3 semanas (total: 9 mg/rato). No dia 89 enxertaram-se novamente com pele de B10.BR (3 e 4) e B10.D2; (linhas ponteadas).

A Figura 7 mostra o padrão de sobrevivência 'de enxertos de pele alogénica em ratos tratados com diferentes ίcombinações de anticorpos contra CD4 e CD8. Enxertaram-se ratos CBA/Ca receptores, em três grupos de 8 a 14, com pele BALB/c no dia 0 e trataram-se com anticorpos monoclonais desde o dia 0 até ao dia 2, como descrito no Exemplo 2. 0 primeiro grupo (▼) recebeu apenas anticorpos de ratazana IgG_2a, o segundo (·) recebeu um cocktail de anticorpos de ratazana IgG_2b, enquanto • que o terceiro grupo (·) recebeu um protocolo de combinação de anticorpos IgG_2b de ratazana seguido de IgG_2a de ratazana. Praticaram-se em todos os ratos deste terceiro grupo novos enxertos de pele de BALB/c (À) e B10 () no dia 94 sem qualquer anticorpo.

Análise de sobrevivência aos enxertos: grupo de IgG_2a TMS = 2 8 dias em comparação com o grupo de IgG_2b TMS = 55 dias; p<grupo do protocolo combinado enxerto original BALB/c ι TMS = 121 dias em comparação com os grupos de IgG_2a ou IgG_2bp<0,001; grupo do protocolo combinado segundo enxerto BALB/c TMS = 43 dias em comparação com o enxerto de terceiro partido B10 TMS = 16 p<0.04.

A Figura 8 mostra a indução da tolerância a enxertos de pele de MHC não correspondente. Enxertaram-se grupos de 8 a 12 ratos CBA/Ca com pele B10 no dia 0 e trataramse com anticorpos monoclonais desde o dia 0 até ao dia 21, como descrito no Exemplo 2.

(a) 0 primeiro grupo era de ratos de controlo (▼) e não recebeu qualquer anticorpo. Um segundo grupo (·) recebeu apenas anticorpos IgG_2a de ratazana, enquanto que no jgrupo restante (·) todos receberam o protocolo combinado de IgG_2b e IgG_2a. Este último grupo recebeu novos enxertos de pele B10 (▲) e um terceiro partido de pele de BALB/c (I) no dia 119.

Análise de sobrevivência de enxertos: grupo de controlo (sem anticorpos) TMS = 14 dias em comparação com o grupo de IgG_2a TMS = 48 dias pcO.OOl: Enxertos B10 originais de protocolo combinado TMS>250 dias em comparação com segundos il enxertos B10 TMS = 44 dias (a partir do dia 119) p<0.002; segundos enxertos B10 em comparação com enxertos de terceiro partido BALB/c TMS = 13, p<0.003.

j (b) Um grupo de 8 ratos CBA/Ca recebeu enxertos de pele B10 em conjunto com o protocolo de anticorpos combinados IgG_2b seguido de IgG_2a (·) . Os ratos receberam segundos enxertos de pele B10 no dia 91 (A) com pele de iterceiro partido BlO.BR(i) .

li Análise de sobrevivência de enxertos: todos os grupos TMS>200 dias.

A Figura 9 mostra a indução de tolerância a pele se correspondência de antigenes secundários múltiplos.Dois ί grupos de 8 e 10 ratos CBS/Ca receberam enxertos de pele AKR/J no dia 0. Os ratos do grupo de controlo (▼) não receberam !' •qualquer anticorpo. Os outros grupos receberam o protocolo jCombinado de anticorpo de IgG₂b de ratazana seguido de IgG_2a (·) 'e foram submetidos a novo enxerto no dia 122 com pele AKR/J fresca (t) e pele B10.BR de diferentes terceiros partidos secundários ().

Análise de sobrevivência de enxertos: nenhum •dos ratos do grupo de controlo TMS = 13 apresentava valores jsemelhantes em comparação com os enxertos de AKR/J original do

N protocolo combinado, TMS>250 dias, pcO.OOl: Os segundos enxertos ^AKR/J TMS>128 dias deram resultados comparáveis com os enxertos

I !

de B10.BR do terceiro partido TMS = 27 dias, p<0.009. i A Figura 10 mostra a indução de tolerância a ípele sem correspondência de antigenes secundários múltiplos em receptores sensibilizados. Sensibilizaram-se ratos CBA/Ca i j receptores a antigenes secundários do dador por meio de . injecção ip com 10⁷ células de baço irradiadas (2000 rad) de

AKR/J (a,b) e de B10.BR (c,d) três semanas antes dos enxertos ,Sde pele. Enxertaram-se grupos de 5 e 13 ratos com pele AKR/J ^!(a,b) e B10.BR (c,d) (·) com cobertura de anticorpos monoclonais /desde o dia 0 até ao dia 21, conforme descrito no Exemplo 2. |doís grupos receberam o protocolo combinado IgG_2b θ IgG_2a (a,c) e Ídois receberam apenas anticorpos de IgG_2a de ratazana. Os ratos foram submetidos a novo enxerto no dia 89 (a,c) ou no dia 96

(b,d) com	enxertos do tipo de	um segundo	dador (A) (AKR/J	nos
grupos a	e b; B10.BR nos grupos c e d)	e pele diferente	de
terceiros	partidos secundários	(!) (B10.	BR nos grupos a e	b;
AKR/J nos	grupos c e d) .
	Análise de	sobrevivência de enxertos:	(a)
enxertos i	de AKR/J original do	protocolo	combinado TMS>225	em

comparação com os enxertos de B10.BR do terceiro partido TMS =

41 dias	(a partir	do	dia 89),	p<0.007. (b) enxertos de AKR/J
original	tratados	com	IgG_2a TMS>200 dias em comparação com os
enxertos	de B10.BR	do	terceiro	partido TMS = 42 dias (a partir
do dia 96) , p<0.02	. ©	todos os	grupos TMS>dias da experiência

(d) todos os grupos TMS>200 dias de experiência.

A Figura 11 mostra a indução de tolerância ,/em ratos em fase de rejeição activa de um primeiro enxerto de ! pele. Enxertaram-se dois grupos de 6 e 12 ratos CBA/Ca com pele’ AKR/J no dia 0, sem qualquer tratamento de anticorpos | : . I monoclonais. No dia 14, quando aproximadamente cerca de metade 'dos ratos tinham rejeitado estes primeiros enxertos (·), deram'se segundos enxertos de pele AKR/J num leito de enxerto fresco, j I p iniciou-se um tratamento com anticorpos monoclonais (Á) . Em μ j iseguida os ratos receberam o protocolo de três semanas de IgG_2bde ratazana seguido de IgG_2a (a) ou anticorpos IgG_2a de ratazana !

(isolados (b). ;

I Análise de sobrevivência de enxertos: (a) (primeiros enxertos de AKR/J TMS = 12 dias, em comparação com os i

! segundos enxertos do protocolo combinado de AKR/J tratados

TMS>92 dias, p<0.004. (b) segundos enxertos de AKR/J tratados com IgG_2a TMS>75 dias, em comparação com todos os primeiros enxertos em (a) e (b) TMS = 12; p<0.003.

EXEMPLO 1

MATERIAIS E MÉTODOS

Animais de experiência

Os ratos CBA/Ca, B10.BR e BALB/c foram criados e conservados na secção de criação de animais no Departamento de Patologia da Universidade de Cambridge e foram usados em grupos separados por idade e por sexo.

Identificação de anticorpos monoclonais por citometria de fluxo ratazana NB2-6TG (cedida amavelmente pelo Dr.

de	células	T de
J.	Howard)	com o
84,	7644,	1987) .
seleccionar	novos

Acms CD4 a partir de uma fusão de tomocitos anti-rato de ratazana. Incubaram-se células (1 a 5xlO^ê) com os sobrenadantes do ensaio e trataram-se com soro Ig anti-ratazana de coelho conjugado com FITC (Dako, Glostrup, Dinamarca). Analisou-se a coloração fluorescente por citometria de fluxo num Cytofluorograph (modelo 50-H Ortho, Westwood, MA, USA) e processaram-se os resultados num computador Ortho 2150.

I Para a ligação competitiva dos Acms, ίincubaram-se células L3T4/Hyg 2.1 em primeiro lugar com Acms (1 pg/10⁵ células) em gelo na presença de 10 pg de marcados durante 30 minutos. Adicionou-se ι

'estreptavidina-FITC (Amersham, Reino Unido) e incubou-se i i idurante um período adicional de 15 minutos. Os resultados foram ί

'analisados pelo Cytofluorograph Ortho.

biotinilados Acms não

Efectuou-se uma coloração por fluorescência Ibi-color por incubação seriada de células de baço de rato com Hum primeiro Acm biotinilado, estreptavidina-ficoeritrina (serotech, Kidlington, Reino Unido), um segundo Acm e Acms específicos isotipo conjugados com FITC. Detectou-se a 'fluorescência verde e vermelha e observou-se numa escala logarítmica pelo Cytofluorograph Ortho.

Coloração por imunofluorescência de linfócitos de sangue periférico (LSP)

Separaram-se LSP de rato por centrifugação em Picoll (densidade específica 1,079, Pharmacia, Suécia) a 3000 x g durante 20 minutos. Recolheram-se as células na interface e lavaram-se em LSP/BSA/azida. Em seguida coraram-se ^!com Acms rigG_2b em sobrenadante da cultura de tecidos, seguida de NORIG 7,16 (anti-rigG_2b) conjugado com FITC ou com Acms ^biotinilado e seguidos de estreptavidina-FITC (Amersham). Os iresultados foram analisados por citometria como anteriormente.

' Lise em complemento

Efectuou-se a lise em complemento como descrito anteriormente. Em resumo, diluíram-se Acms e incubaram-se com timócitos de rato marcados com ⁵¹Cr e soro de pobaia a 2%, que serviu de fonte de complemento. Após 45 jminutos a 37°C, recolheu-se o sobrenadante e mediu-se a Sradioactividade por meio de um Philips Automatic Gamma Counter : (Philips, Eindhoven, Países Baixos). A lise específica foi calculada por % de lise = (e-s)/(t-s)xlOO, em que e é a contagem obtida com a amostra, s é a libertação ! espontânea e t é a contagem total.

í Indução de tolerância a globulina gama humana (HGG)

O método da indução de tolerância a HGG já foi descrito anteriormente (Benjamin et al., J. Exp. Med. 163, 1539, 1986). Injectaram-se ratos CBA/Ca normais com Acms CD4

I por via intravenosa (i.v.) no dia 1 e por via intraperitoneal (i.p.) no dia 0 e no dia 1. Administrou-se i.p. 1 mg de HGG agregada por calor no dia 0. Os ratos foram re-sensibilizados icom 0,5 mg de HGG nos dias 21 e 31. No dia 38 mediu-se a iresposta de IgG anti-HGG por ELISA.

Detecção de respostas a anticorpo de rato por ELISA

A fim de medir as respostas ao anticorpo murino, diluiram-se amostras de soro em série em placas flexíveis de fundo plano (Becton Dickinson, EUA) revestidas com antigenes proteicos purificados e incubou-se durante 30 minutos. Lavaram-se as placas com PBS/Tween 20 a 0,5% (Sigma, Poole, Reino Unido) e em seguida incubaram-se com IgG anti-rato de carneiro biotinilado (Amersham) durante 30 minutos e lavaram-se como anteriormente. Adicionou-se estreptavidinaperoxidase de rabano bastardo (Amersham) às placas durante 15 minutos e após mais 3 lavagens, revelou-se com 5 mg/ml de ofenolenodiamina e peróxido de hidrogénio a 0,1%. Mediu-se a absorvância a 490 nm e determinaram-se os títulos por comparação com uma amostra de comparação positiva padrão.

Transplantação de pele

Transplantaram-se enxertos de pele por um método de Billingham et al. (Natura 172, 603, 1953) modificado. Anestesiaram-se os ratos receptores com 1 μg de Hypnodil/rato e 0,2 pg de Sublimase (Jassen, Oxford, Reino Unido)/rato por

I injecção por via i.p.. Transplantou-se um enxerto de espessura i

íintegral da cauda do dador (0,5 em x 0,5 cm) para um leito de transplantação na parede toráxica lateral), cobriu-se com gaze e vaselina e uma ligadura de algodão e protegeu-se com gesso 'durante 7 dias. Observou-se a sobrevivência do enxerto e registou-se diariamente em seguida, sendo considerado como

I limite de sobrevivência o último dia em que não era possível observar qualquer tecido vivo no enxerto.

Calculou-se o tempo medido de sobrevivência (TMS) e analisou-se pelo método de Logrank (Peto et al., Br. J. Câncer 35, 1, 1977) . Retirou-se o timo a ratos às 4 semanas de

idade pelo método de Mónaco et al. (J. Immunol. 96, 29, 1966) e usaram-se estes ratos pelo menos 4 semanas mais tarde. Observaram-se quando se sacrificaram e verificou-se que nenhum tinha ficado com restos de timo.

ί

RESULTADOS

Identificação da ligação do Acm rigÇ_2a à molécula CD4 j

Isolou-se um Acm, YTS 177.9, na base da suai ligação a uma linha de células transfectada L3T4 usando J coloração por imuno-fluorescência (Quadro 1) . Determinou-se o respectivo isótopo por reacção com um Acm anti-rigG_2a, RG 7/1.7 (Springer et al., Hybridoma 3^, 257, 1982) por ELISA (resultados; não apresentados). Efectuaram-se outras análises a fim de comparar este Acm com outros dois Acms CD4 descritos anteriormente. Por meio de estudos de inibição da ligação verificou-se que o Acm YTS 177.9 se ligava ao mesmo epítopo que o Acm YTS 191.1 (Cobbold et al., 1984, Nature, 312, 548) e GK

1.5 (ambos Acms CD4) mas diferente do epítopo a que se liga outro Acm CD4 YTA 3.1 (Qin et al., Eur. J. Immunol., 17, 1159, 1987) que reconhece um epítopo separado. Em citometria de fluxo ;bicolor os Acms YTS 177.9 e YTA 3.1 coraram a mesma população jde células de baço de rato, população esta diferente da corada pelo Acm CD8 YTS 169.4 (Cobbold et al., 1984, Nature 312, 548).

A especificidade do Acm YTS 177.9 foi também experimentada por análise especifica de libertação de ⁵¹-Cr. Se ^!;bem que o Acm não tenha sido eficaz na lise quando usado jjisoladamente, apresentou sinergia com o Acm CD4 YTA 3.1. (Fig. ί j J jla). Por outro lado, o Acm YTS 177.9 interferiu com a lise 'mediada pelo Acm rigG_2b YTS 191.1, o qual apresentou inibição cruzada em coloração de fluorescência (Fig. Ib).

Acm CD4 rigG2a não reduz as células T in vivo

A fim de determinar o efeito do Acm CD4 rigG2a na redução das células in vivo, usámos ratos adultos a í

que se tinha praticado a ablação do timo (ATX) porque nestes animais a recuperação das células T após a redução por Acms é muito menos eficiente do que em ratos normais devido à ausência de regeneração de células T dependente do timo. Por meio da í

determinação da alteração das células T periféricas após injecção de Acms, foi possível distinguir a verdadeira redução da modulação antigénica temporária ou da redistribuição dos linfócitos. Cada rato recebeu 2 mg de um dos anticorpos igG2a ou igG2b e analisaram-se os linfócitos do sangue periférico por citometria de fluxo antes e várias vezes depois do tratamento. Como se pode verificar na Fig. 2, uma semana depois de completar a terapia por Acm IgG2b, cerca de 90% das células CD4 + foram reduzidas na periferia. Esta redução foi acompanhada por uma diminuição na percentagem de células T totais e por um ligeiro aumento das células CDB+. Pelo contrário, se bem que o tratamento por Acm IgG2a tenha reduzido a percentagem de células CD4+, a percentagem total de células Thy-1⁺ e de células CD8⁺ não se alteraram significativamente. Esta circunstância éi considerada como o resultado da modulação antigénica das moléculas CD4 a seguir à ligação do anticorpo. Quatro semanas^ após o tratamento, o número de células T nos grupos tratados por IgG2b permaneciam ainda baixos, enquanto que o grupo tratado por YTS 177.9 apresentava um nível normal de células CD4⁺.

Indução de tolerância de HGG com cobertura de Acm Cd4 rigG2a

Investigações anteriores usando fragmentos de Acm CD4 F(ab')₂ tinha sugerido que a tolerância facilitada pelo Acm a antigenes proteicos não necessita da redução das icélulas T CD4⁺. No presente estudo, nós investigámos se os Acms CD4 não redutores, como os fragmentos de F(ab')₂, podiam ter o mesmo efeito. Administraram-se os Acms YTS 177.9 ou YTS 191.1 a ι

ratos durante um período de 3 dias e uma injecção de HGG (0,5 mg/rato) no segundo dia (dia 0). Quando ressensibilizados com HGG 4 semanas mais tarde, os ratos tratados com YTS 191.1 e os ratos que tinham recebido uma dose elevada (1 mg/rato) de YTS:

177.9 tinham-se tornado tolerantes a HGG (Fig. 3). No entanto, os ratos que tinham recebido 0, 1 mg ou menos do Acm ainda; tinham capacidade para responder a HGG. |

Capacidade do Acm YTS 177.9 para induzir tolerância a Acms rigG2a I

A administração in vivo de anticorpos; xenogenica normalmente suscita respostas antiglobulina nos; hospedeiros. Uma das características dos Acms CD4 é a sua capacidade para suprimir esta resposta antiglobulina e mesmo para induzir tolerância a outros anticorpos do mesmo epítopo. No presente estudo verificou-se que o Acm CD4 rigG2a YTS 177.9 tinha a mesma propriedade.

Ratos a que tinha administrado 0,1 a 1 mg/rato de YTS 177.9 não apresentaram qualquer resposta primária antiglobulina, (título: <1:2). No entanto, ratos a que' se tinha administrado 0,01 mg/rato de YTS 177.9 apresentaram ainda uma resposta fraca (1:160). Seis semanas após a primeira injecção de Acm, estes animais foram ressensibilizados com Acms; rigG2a e rigG2b irrelevantes (de ratazana anti-humanos) em adjuvante de Freund a fim de assegurar um estímulo adequado. 0 Acm rigG2a era YTH 34.5, que é um Acm contra Cdw52 humano (Waldmann et al., 1985, Adv. Exp. Med. Biol. 186, 869) . O Acm' i

rigG2b era YTH 12,5, que é um Acm contra CD3 humano (Waldmann et al., 1985). Sangraram-se os ratos 4 semanas mais tarde e mediram-se os respectivos títulos de Ig anti-ratazana no soro por ELISA. Verificou-se que os ratos a que se tinha administrado uma dose elevada de YTS 177.9 (1 mg) tinham-se í

tornado completamente tolerantes a rigG2a mesmo depois de vários reforços (Fig. 4), tal como os Acms rigG2b tornaram os ratos tolerantes a imunoglobulinas de rigG2b. =, 1 mg de YTS

177.9 foi insuficiente para induzir tolerância se bem que tenha uma acção imunossupresora para respostas primárias. Os ratos a; que se tinha administrado 0,01 mg de YTS 177.9 ou os ratos de

controlo não tratados apresentaram respostas antiglobulinas de tipo secundário. A tolerância induzida deste modo era especifica, uma vez gue os ratos tratados por YTS 177.9 eram ainda capazes de responder a imunoglobulina rigG2b, enquanto que os ratos tolerantes a YTS 191.1 ainda eram capazes de responder a rigG2a.

Atraso de rejeição a aloenxertos por tratamento com Acm rigG2a

Verificámos que o Acm YTS 177.9 era tão eficaz como os Acms CD4 rigG2b na respectiva capacidade para! prolongar a sobrevivência de enxertos de pele alogénicos após um curto período de tratamento. Na primeira experiência, administraram-se a ratos CBA/Ca normais injecções diárias de rigG2a (YTS 177.9) ou de rigG2b (YTS 191.1) durante 2 semanas, começando 2 dias antes da transplantação alogénica (BALB/c) de pele (aproximadamente 7 mg/rato de Acm totais). No grupo tratado com YTS 177.9, o TMS foi prolongado de modo significativo para 20 dias (animal de controlo não tratado:

11,3 dias; p<0,05, Quadro 2). Este prolongamento de sobrevivência do enxerto é muito semelhante ao conseguido por Acm CD4 rigG2b que reduz as células (TMS 19 dias).

Na rejeição de enxertos com as classes I e II de MHC sem correspondência, verificou-se que a redução dos subconjuntos CD4⁺ e CD8⁺ melhorava significativamente a sobrevivência do enxerto para além dos efeitos dos Acms CD4 :isoladamente (Cobbold et al., Transplantação, 42, 239, 1986).

No presente estudo usamos outro Acm CD8 rigG2a que também tinha um pequeno efeito sobre a redução das células in vivo juntamente com o Acm CD4 rigG2a. Verificou-se que este Acm CD8, YTS 105.18, tinha um efeito de sinergia com o Acm CD4 rigG2a no prolongamento adicional· da sobrevivência de enxertos de pele: alogénicos. Com o objectivo de comparação, administraram-se quantidades iguais de dois Acms rigG2b (YTS 191.1 e YTS 169.4) ou dos dois Acms rigG2a. Administrou-se um total de 3 mg/rato dos Acms nos dias 0, 2 e 4 relativamente ao enxerto de pele. Os

ratos CBA/Ca tratados com rigG2b rejeitaram a pele BALB/c com o i

TMS de 24 dias (em comparação com o TMS do animal de controlo de 10,5 dias, p<0.005, Fig. 5). Surpreendentemente, a sobrevivência do enxerto no grupo tratado com os Acms CD4 e CD8 rigG2a foi ainda mais longa que a dos ratos tratados com Acms rigG2b. De 4 ratos CBA tratados com rigG2a, 3 não rejeitaram os enxertos de pele BALB/c até 45 dias após a transplantação (TMS

46,5 dias; em comparação com o grupo tratado com IgG2b, p<0,03).

Tolerância a aloenxertos de pele

Se bem que tenha havido trabalhos que documentam a sobrevivência permanente de certos aloenxertos como do coração e do pâncreas após tratamento com Acms CD4, geralmente verificou-se que era mais difícil manter um enxerto de pele durante longos períodos com tratamento com Acm isolado. Mostramos anteriormente que o tratamento com Acms redutores CD4 permite a aceitação de medula óssea sem correspondência de múltiplo menor, e estes ratos eram então tolerantes à pele do dador. No presente estudo, nós enxertámos pele de ratos B10.BR em ratos CBA/Ca e tratámos os receptores com YTS 177.9 (CD4) e com YTS 105.18 (CD8). Nesta combinação sem correspondência de antigenes transplantados multimenor compatíveis em relação a H2, todos os ratos que se tinham submetido a um tratamento com Acms de 3 semanas de duração aceitaram a primeira pele durante 90 dias. Neste momento, transplantou-se pele do tipo de um segundo dador em conjunto com um enxerto de um terceiro partido (B10.BR). Os dados apresentados na Fig. 6 mostram que o jprimeiro e o segundo enxerto continuaram a sobreviver indefinidamente (>90+ dias) enquanto que a pele B10.D2 foi rejeitada rapidamente. Dos 6 ratos que tinham recebido apenas 2 injecções dos Acms, 3 mantinham a pele B10.BR durante 90 dias mas esta foi lentamente rejeitada depois do segundo enxerto de pele.

EXEMPLO 2

MATERIAIS E MÉTODOS

Ratos

Os ratos CBA/Ca, C57BI.10/Pc, BALB/c B1O.BR> e AKR/J foram criados e conservados na secção de criação de animais no Departamento de Patologia da Universidade de Cambridge. Usaram-se em grupos separados por sexo com idades de 6 a 12 semanas.

Anticorpos monoclonais

Todos os Acms de ratazana usados nestas experiências encontram-se listados no Quadro 3. Os anticorpos foram preparados a partir do líquido ascético produzido em ratazanas sensibilizados por pristano (DAxLOU)F, por precipitação com sulfato de amónio a 50% de saturação seguida de diálise em salina tamponizada com fosfato (PBS;pH7.2). A concentração proteica foi ajustada a 10 mg/ml de acordo com a avaliação por OD₂so contendo 2 a 5 mg/ml de anticorpo monoclonal. Todas as preparações de anticorpos foram feitas passar através de um filtro de 0,2 mierometros antes da administração aos ratos.

Enxertos de pele

Os enxertos de pele foram realizados como descrito anteriormente (Cobbold et al., 1966, Transplatation, 41, 634). Em resumo, transplantaram-se enxertos de pele do dador (quadrados de 0,5 cm a 1,0 cm) na parede lateral toráxica de ratos receptores anestesiados. Cobriram-se os enxertos com gaze e ligaduras com gesso durante 7 dias. Observou-se o estado dos enxertos três vezes por semana durante o primeiro mês e aproximadamente uma vez por semana após esse prazo. Analisaramse as diferenças de sobrevivência usando o método de Log-Rank (Peto et al., 1977, Br. J. Câncer, 35, 1). Quando se praticaram

novos enxertos múltiplos a partir de uma série de dadores, j estes foram transplantados num único leito preparado para !enxertos, normalmente no lado oposto ao do enxerto de pele original (Cobbold et al., 1986, Nature, 323, 164). Observaramse os enxertos três vezes por semana inicialmente e depois semanalmente. Os tempos de sobrevivência média dos enxertos (TSM) são dados como o número de dias até à rejeição ser completa, mas os enxertos tolerados com tempos de sobrevivência i

indefinidos estavam em geral em boas condições e com crescimento normal de pelos.

Indução de tolerância a enxertos de pele

Usaram-se enxertos de pele como origem única de antigene/tolerogene e efectuaram-se conforme descrito anteriormente, no mesmo dia do início do tratamento com os anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais foram administrados três vezes por semana desde o dia 0 até ao dia 21 I (inclusive) , sendo as duas primeiras injecções (dia 0 e dia 2) por via intravenosa e as restantes por via intra-peritoneal. A dose total de todos os anticorpos dados por injecção foi de 2 jmg de fracção de imunoglobulina ascítica em 0,2 ml de PBS. Para os anticorpos IgG2b de ratazana esta dose era de 0,5 mg de cada ;um dos anticorpos YTS 191.1.2, YTA 3.1.2, VTS 169.4.2 e YTS í156.7.7 (um cocktail sinergistico redutor de anticorpos monoclonais CD4 e CD8; (Qin et al., 1987, Eur. J. Immunol. 17, 1159) ) . No caso dos anticorpos IgG2a de ratazana, usou-se 1 mg de cada um dos anticorpos YTS 177.9.6 (CD4) e YTS 105.18.10 i (CD8) . Para o protocolo combinado de redução e bloqueamento, jadministrou-se o cocktail de IgG2b de ratazana sinergistico por ! I |ivia i.v. nos dias 0 e 2 e o IgG2a de ratazana CD4 e CD8 subsequentemente três vezes por semana por via i.p. até ao dia 21.

Níveis de anticorpo monoclonal activo no soro ί Adicionaram-se amostras tomadas a partir de ratos individuais em vários momentos durante e após a administração de anticorpo monoclonal, 25 ul a uma diluição de 1/5 em PBS que continha 1% p/v de albumina de soro de bovino (ASB) e 5% v/v de soro de coelho normal inactivado pelo calor, a 5 χ 10⁵ células transfectadas por CD4 ou CD8. 0 transfectante CD4 era a linha NB2-6TG de ratazana que expressava L3/T4 de rato (Exemplo 1) enquanto que o gene de CD8 (Lyt-2) era expresso em níveis elevados em células L de rato (Zamoyska) 1985, Cell, 43, 153) . Detectou-se anticorpo ligado usando IgG2a í

anti-ratazana monoclonal acoplado a FITC (MARG2A-FITC; Serotec, Oxford, Reino Unido) na diluição recomendada pelo fabricante e a análise foi realizada num Cytofluorograf Ortho 50H com o computador 1250) (Ortho, Westwood, MA, EUA) . A fluorescência média foi comparada com uma série de diluições padrão de anticorpos contra CD4 e CD8 purificados (YTS 177.9.6 ou YTS, 105.18.10) em soro normal de rato a fim de derivar os valores! de concentração equivalente para as amostras de soro. Quando a fluorescência correspondia a anticorpo em saturação ou a fluorescência não detectável acima do ruído de fundo, admitiuse que o resultado era superior ou inferior à gama titulável da curva padrão.

Preparação de leucócitos de sangue periférico

Sangraram-se os ratos individualmente na veia da cauda (aproximadamente 0,1 ml) para tubos estéreis que continham 1 U de heparina. Em seguida eliminou-se o plasma após centrifugação numa microcentrífuga (6000 rpm) durante 2 min. Lisaram-se os glóbulos vermelhos duas vezes por adição de 0,9 ml de água durante 10 s à temperatura ambiente seguida de 0,1 ml de salina tamponizada por fosfato 10 x e recuperaram-se os glóbulos brancos por centrifugação a 1000 rpm durante 7 minutos (Chandler et al., 1979, J. Immunol. Methods 31, 341).

Análise de subconjuntos de células T para verificação da redução Prepararam-se leucólitos de sangue periférico a partir de ratos individuais tratados conforme descrito anteriormente. Coraram-se os leucócitos com sobrenadantes que continham anticorpos monoclonais contra antigenes CD4 (YTS 191.1.2 e YTA 3.1.2) ou CD8 (YTS 169.4.2 e YTS 156.7.7). Usaram-se também outros anticorpos monoclonais (ver Quadro 6) como amostras de referência. Detectaram-se os anticorpos ligados usando uma mistura de IgG2b-FITC antiratazana monoclonal (NORIG-7.16-FITC; Clark, 1986, Methods Enzymol. 121, 548) e a cadeia ligeira kapa anti-ratazana (MAR18.5-FITC; Lanier et al. 1982, Hybridoma 125). Analisou-se a fluorescência usando um Cytofluorograf Ortho 50H com um computador 1250 e amplificadores lineares, com aberturas frontais e difusores de noventa graus a fim de seleccionar os linfocitos vivos.

Culturas mistas de linfocitos

Obtiveram-se células sensíveis a partir de amostras de sangue de ratos individuais (aprox. 0,2 ml) por lise em água conforme descrito anteriormente. Analisou-se cada amostra para verificação da proliferação por divisão das células em três alvéolos de microtitulação de cultura de tecido com fundo em U (aprox. 4 x 10⁵ glóbulos brancos por alvéolo contendo por alvéolo 4 x 10⁵ células de baço estimuladoras tratadas com mitomicina C (Sigma, Poole, Reino Unido; 25 ug/ml) . O volume final de meio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) contendo 10% de soro AB humano inactivado por calor era de 0,1 ml. Após 3 dias a 37°C num incubador com uma atmosfera com 5% de CO₂, adicionaram-se 5 ul de ¹²⁵Idesoxiuridina (IUDR; 10 uCi/ml, Amersham, Reino Unido) durante 6 horas. A incorporação de ¹²⁵I medida por separação das células em filtros de fibra de vidro e contagem num Contador Gama Automático Philips.

Uma combinação de anticorpos contra CD4 e CD8 redutores e bloqueadores é permissiva para a tolerância a enxertos de pele sem correspondência de MHC

Exemplo 1 mostrou que três semanas de;

I terapia com anticorpos contra CD4 e CD8 não redutores permitiamí a tolerância a enxertos de pele menores múltiplos incompatíveis. A fim de estabelecer um protocolo de tratamento que pudesse promover a tolerância através de diferenças de MHC importantes nós comparámos os efeitos da administração de anticorpos contra CD4 e CD8 redutores (igG2b de ratazana), não redutores (igG2a de ratazana bloqueadores) e uma combinação de redutores seguidos de bloqueadores a ratos CBA/Ca (H-2^a) enxertados com pele de BALB/c (H-2^d) (Figura 7) . Conforme tínhamos descrito anteriormente, um protocolo estrito de redução atrasou a rejeição de forma significativa, mas todos os ratos apresentaram rejeição num período de 70 dias (TSM = 55 dias). Os anticorpos não redutores eram neste caso menos eficazes (TMS = 28 dias), mas uma combinação de duas doses redutoras seguidas por bloqueamento com anticorpos IgG2a de ratazana permitiu a sobrevivência mais prolongada dos enxertos (TMS > 100 dias), se bem que a maioria (mas não todos) dos enxertos tenha sido rejeitada no decurso de 200 dias. Nesta experiência praticaram-se segundos enxertos de ensaio BALB/c no dia 94 juntamente com pele de terceiro partido B10 (H-2^b) . Estes enxertos de terceiro partido foram rapidamente rejeitados (TMS = 16 dias), demonstrando que os ratos tinham voltado à imunocompetência, enquanto que os segundos enxertos de BALB/c ίsobreviveram durante uma média de 43 dias. Este facto mostra que deve ter havido algum grau de falta de resposta específica aos antigenes do enxerto de BALB/c.

I Se bem que nós não tivéssemos obtido uma (tolerância completa nesta combinação de estirpes, verificamos que o mesmo protocolo combinado era totalmente permissivo quando se enxertava pele de B10 (H-2^b) em ratos CBA/Ca (H-2^a) (incompatíveis no que respeita a MHC. A Figura 8 mostra que 6/8 dos ratos receptores conservaram os seus enxertos de pele originais indefinidamente ( > 250 dias), enquanto que os ratos ! rejeitaram a pele de BALB/c enxertados no dia 119 num periodo de 15 dias. Os segundos enxertos B10 apresentaram períodos dei sobrevivência substancialmente prolongados (TMS = 44 dias), mas acabaram todos por ser rejeitados mesmo quando os primeiros enxertos, que se admite serem genericamente idênticos, foram conservados. Este resultado é reprodutível e mostra claramente ; que o primeiro enxerto tolerado goza de um privilégio dei i

conservação, apesar da presença de células efectoras comj i

capacidade de rejeição do segundo enxerto. Qualquer que seja o; i mecanismo, o enxerto de pele original deve ter induzido, ej !mantido, um estado de insensibilidade para com ele próprio. A; capacidade dos ratos para distinguirem entre os primeiros e os segundos enxertos B10 parece dependente da rejeição da pele de terceiro partido, uma vez que 5/8 dos ratos que receberam enxertos B10.BR em vez de BALB/c conservaram-se tolerantes a todos os três enxertos (Figura 10). Este facto demonstra que os receptores eram tolerantes a antigenes B10 secundários tanto no contexto do MHC do dador, o que significa que o enxerto pode

I jele próprio apresentar tolerância, como também no contexto do

MHC do tipo do receptor, o que deve ter sido através de reprocessamento dos antigenes do enxerto original e da apresentação de tolerância pelos APCs dos receptores.

Esta é a primeira descrição de tolerância mediado por anticorpos através de barreiras completas de MHC usando enxertos de pele altamente imunogénicos como a única [fonte de tolerogene. Deve notar-se que o próprio enxerto deve proporcionar toda a apresentação de antigenes necessária para que ocorra tolerância.

A combinação de anticorpos redutores e bloqueadores também permite a tolerância a pele com correspondência de MHC mas sem correspondência para múltiplos antigenes secundários não MHC

No Exemplo 1 demonstrámos que o bloqueamento

I

I com anticorpos monoclonais a CD4 e CD8 era suficiente para

obter tolerância a enxertos de pele com diferenças em múltiplos antigenes secundários (B10.BR em CBA/Ca). Na Figura 11 pode observar-se que o protocolo combinado de redução seguida de 'bloqueamento também era eficaz com 8/10 dos ratos CBA/Ca que ίconservaram os seus enxertos AKR/J indefinidamente. Seis destes ratos também conservaram os segundos enxertos AKR/J (pele enxertada no dia 122 sem terapia por anticorpos adicional), enquanto que todos os ratos rejeitaram a pele sem correspondência secundária de terceiro partido (B10.BR). AÍ μ

ιrejeição desta pele de terceiro partido foi, no entanto, um ipouco mais lenta que nas experiências de referência com CBA :normais (27 dias em vez do período normal de 14 dias; Cobbold et al., 1986, Transplantation, 41, 634). A combinação inversa^ (B10.BR em CBA/Ca) também foi tornada tolerante usando o protocolo de redução seguida de bloqueamento (4/5 dos enxertos > 220 dias), mas 2/5 dos ratos aceitaram tanto a pele AKR/J com' diferenças secundárias de terceiro partido como também o segundo enxerto B10.BR (dados não apresentados). Este facto reflecte presumivelmente o grande número de antigenes ii jsecundários compartilhados e é reminescente da descoberta da ^; ί ι tolerância dominante vista num modelo experimental diferente j I (Zamoyska et al. 1989, Eur. J. Immunol. 19, 111).

Como resumo desta secção, desejaríamos ^concluir que os anticorpos contra CD4 e CD8, quando usados de ,modo apropriado, permitem que seja induzida tolerância através j tanto de diferenças de MHC como de diferenças não MHC, a :enxertos de pele isolados, sem a necessidade de qualquer outra 'origem hematopoiética de antigene, nem outra terapia mieloablativa. Torna-se evidente que os enxertos de pele podem apresentar antigenes directamente às células T do sangue 'periférico seja para activação, o que leva à rejeição, seja para activação, o que pelo contrário leva a aceitação e| | tolerância.

Efeitos de anticorpos IgG2b e IgG2b de ratazana i combinados sobre as células T em circulação

Tendo em vista os notáveis efeitos 'tolerogénicos vistos nas experiências anteriores, é importante i

ι avaliar os efeitos dos anticorpos monoclonais nas células T CD4 ⁺ j e CD8⁺ em circulação. Mostrámos anteriormente que os anticorpos de ratazana IgG2b contra CD4 e CD8 reduzem as suas células Tj alvo (Cobbold et al., 1984, Nature, 312, 548). No exemplo 1, os’ janticorpos IgG2a de ratazana, nas doses administradas, tendiam : apenas a modular o antigene a partir da superfície da célula.! No caso do protocolo combinado, as doses iniciais de anticorpos monoclonais IgG2b CD4 e CD8 causaram a redução do número de células T conforme previsto, e em seguida a proporção de células CD4⁺ e CD8⁺ começou realmente a recuperar durante a continuação do tratamento com anticorpos IgG2a (Quadro 4), se bem que a quantidade de antigene expresso fosse muito reduzida (dados não apresentados). Estava presente anticorpo residualj nas células T durante todo o período de administração, tornando difícil a determinação precisa de células CD4⁺ e CD8⁺. Em ' seguida a proporção de células T no sangue periférico permaneceu reduzida durante pelo menos um mês depois de ter parado a administração de anticorpo, um efeito não observado í :

!quando se administraram anticorpos IgG2a isoladamente em doses equivalentes (resultados não apresentados).

Pensa-se que um mecanismo para a supressão !da rejeição de enxertos por anticorpos monoclonais não i

'redutores bloqueia a função das moléculas CD4 e CD8 sobre a superfície das células T durante a apresentação do antigene. ,

j.Este bloqueio é mais eficaz apenas se os anticorpos no soro sei mantém em níveis suficientes para saturar as células positivas em relação ao antigene. Verificou-se que os níveis de anticorpos activos em ratos tratados era sem dúvida suficiente para saturar os antigenes CD4 e CD8 alvo durante as três semanas de tratamento e em alguns ratos até três semanas depois tolerantes a capazes de estimuladoras significativo suprimido. É de terminar a administração do anticorpo (Quadro 5) . No entanto no dia 60 já não havia qualquer anticorpo monoclonal detectável ( < 0,5 mg/ml de CD4 e < 10 ng/ml de CD8) no soro, que de outroi modo poderia ter mantido uma imunossupressão não específica. Deve notar-se que nenhum dos ratos produziu qualquer antiglobulina detectável (nem anti-espécie nem anti-idiotipo) de acordo com a determinação por uma análise de ELISA de captura, indicando que os ratos também se tinham tornado tolerantes a imunoglobulina de ratazana neste protocolo.

Os ratos tolerantes ainda podem responder in vitro

Verificamos que os ratos CBA tornados pele B10 conforme descrito acima eram ainda proliferação in vitro a células de baço B10 (Quadro 6) , mostrando que um número de células T alo-reactivas não tinha sido evidente que o sistema imune dos receptores é tolerante aos antigenes apresentados pelo enxerto original, mas é ainda capaz de reagir a apresentação in vitro por células estimuladores de baço ou um segundo enxerto de pele.

Indução de tolerância em ratos previamente sensibilizados a antigenes secundários

Tendo em atenção que é possível tornar tolerantes células T virgens no sistema imune periférico por antigenes provenientes de enxertos, experimentados determinar se as células T sensibilizadas também eram susceptíveis a tolerância. Verificámos que os dois protocolos de tratamento (apenas bloqueamento ou redução seguida de bloqueamento) eram ambos eficazes para a indução de tolerância tanto a pele AKR/J !

icomo a pele B10.Br em ratos CBA/Ca previamente sensibilizados ^!com células de baço de dador irradiadas (Figuras 10a a lOd) . Pelo contrário, tínhamos anteriormente mostrado que a redução das células CD4⁺ e CD8⁺, se bem que igualmente imunossupressora em ratos sensibilizados ou não, não era permissiva em relação â tolerância a pele sem correspondência de antigenes secundários

múltiplos, uma vez que todos os enxertos foram por fim rejeitados (Cobbold et al., 1986, Transplantation, 41, 634).

A única diferença entre os ratos não sensibilizados da Figura 9 e os ratos sensibilizados da Figura! 10 foi verificada após o reforço. Cerca de metade dos ratos no! grupo que tinham sido sensibilizados e tornados tolerantes a AKR/J acabaram por rejeitar tanto o primeiro enxerto de AKR/J como o segundo, se bem que mais lentamente que os enxertos de terceiro partido de B10.BR (TMS = 63 e 21 dias, respectivamente; Figura 10a). Na combinação B10.BR sobre CBA a maioria dos ratos conservou os enxertos originais indefinidamente, enquanto que em alguns ratos tanto os segundos enxertos de B10.BR como os enxertos AKR/J foram rejeitados: lentamente (Figura 10c). Esta diferença de comportamento das; combinações de estirpes é compatível com a verificada em ratos não sensibilizados (ver Figura 9) e provavelmente está relacionada com o padrão complexo de antigenes secundários; partilhados e específicos.

Indução de tolerância durante rejeição activa de um enxerto de pele

A verificação de que mesmo as células T sensibilizadas podem ser tornadas tolerantes tem implicações clínicas óbvias. Seria evidentemente vantajoso induzir tolerância perante uma resposta imune em progressão, especialmente em casos de autoimunidade ou durante uma crise de rejeição de um órgão após transplantação. Na Figura 11 é possível verificar que é realmente possível inverter uma rejeição em progressão de enxertos de pele sem correspondência de antigenes secundários múltiplos e estabelecer uma sobrevivência de longo termo, em alguns casos tanto no primeiro! como no segundo enxertos. Nesta experiência, a combinação de

I redução seguida por bloqueio foi mais eficaz (Figura 11a), mas como 3/6 dos ratos que receberam os anticorpos bloqueadores (não redutores) conservaram os seus segundos enxertos (Figura

5' 11b) , deve ser possível tornar inactivas ou tolerantes mesmo as !

; células T efectoras.

QUADRO I

I Ligação de YTS 177.9 em células L3T4 transfectadas

Acm % de células positivas

L3T4^a i YTS 177.9^b

YTS 191.l^b

YTS 177.9^C e

YTS 191.1

YTS 177.9^C e

YTA 3.1

98.7

99.1

1.1

98.1 a Linhas de células L3/T4 transfectadas com os respectivos

Acms e analisadas por citometria de fluxo. ’ b Usaram-se Acms sob a forma de sobrenadantes de culturas de ι tecidos seguidos de Ig anti-ratazana de coelho conjugada com FITC.

c Acms biotinilados, que foram incubados com uma quantidade j em excesso de Acms frios administrados abaixo. A fluorescência foi desenvolvida com FITC-estreptavidina.

QUADRO II

Atraso da rejeição de enxertos de pele por Acms

CD4 IgG2a e IgG2b

Tratamento Sobrevivência dos por Acms % de células enxertos (dias)

	CD4 ⁺	CD8 ⁺	Thy-Γ	B10.Br BALB/c
YTS	191.1	1.9+1.5	17.3+1.7	20.2+4.4	28,29,32 ί 58,65.
YTS	191.1	1.2+1.1	18.1+2.3	24.5+3.6	15, 18,19, 19,20,21.
YTS	177.9	28.3+9.8	15.3+0.4	48.8+5.0	15,20,22,>120, >120,>120.
YTS	177.9	27.5+10.1	16.1+1.2	46.9+4.2	19.19.20, 20.21.21.
nenhum	39.8+3.0	12.5+1.5	47.0+2.8	10,11,12, 9,10,10, 12,13. 11,12,12.
a)	Administraram-	se Acms CD4	durante 2	semanas a ratos CBA/Ca

normais (aprox. 7 mg/rato) com início no 3° dia antes do enxerto de pele.

b) Corou-se sangue periférico recolhido 4 dias depois da última injecção de Acm com YTA 3.1 (CD4), YTS 156.7 (CD8) e YTS 154.7 (Thy-1) biotinilados, seguidos por estreptavidina-PITC. Os resultados foram analisados por citometria de fluxo.

c) TMS dos enxertos de B10.BR: animal de referência não tratado: 12 dias; tratado com YTS 191.1: 32 dias (v.s. referênciaa: p<0,005); tratados com YTS 177: 22 dias (v.s.i referência p<0,004, v.s. grupo YTS 191.1, p<0,7).

TMS dos enxertos de BALB/c: animal de referência não tratado: 10,5 dias; tratado com YTS 191.1: 19 dias (v.sj referência p<0,006); tratado com YTS 177.9: 20 dias (v.s.; referência p<0,006, v.s. grupo YTS 191.1, p<0,4).

QUADRO 3

Anticorpos monoclonais usados

Anticorpo monoclonal	Especificidade	Epitopo	Isotipo	Referência
YTS 191.1.2	CD4 de rato	a	igG_2b	Cobbold et al 1984, Nature, 312, 548
YTA 3.1.2 YTS 177.9.6	CD4 de rato CD4 de rato	b a	igG_2b I gG_2a	Qin et al, Eur.J.Immunol 17,1159,1987
YTS 169.4.2	CD8 de rato	Lyt-2 (a)	igG_2b	Cobbold et al 1984, Nature 312, 548
YTS 156.7.7	CD8 de rato	Lyt-2 ©	igc_2a
YTS 154.7.7	Thy-1 de rato	IgG2b monomorfico	Cobbold et al 1984, Nature 312, 548
YTS 121.5.2	CD5 de rato	Lyt-1	IgG_2b	Cobbold et al 1984, Nature 312, 548

QUADRO 5

Níveis no soro de anticorpos monoclonais

CD4 e CD8 IgG_2a activos

Anticorpo no soro CD4 (ng/ml) [Quatro ratos individuais]

Anticorpo no soro CD8 (ng/ml) [Quatro ratos individuais]

Tempo

Dia	0	<0.5	<0.5	<0.5	<0.5	<10	<10	<10	<10
Dia	12	>100	>100	>100	>100	>100	120	150	>1000
Dia	19	50	>100	>100	>100	190	>1000	>1000	>1000
Dia	29	50	>100	>100	>100	75	250	>1000	>1000
Dia	32	80	90	>100	>100	500	600	>1000	>1000
Dia	36	5	100	>100	>100	60	85	500	>1000
Dia	43	<0.5	15	70	>100	<10	<10	12	25
Dia	46	<0.5	<0.5	<0.5	1.0	<10	<10	<10	<10
Dia	60	<0.5	<0.5	<0.5	<0.5	<10	<10	<10	<10
Dia	78	<0.5	<0.5	<0.5	<0.5	<10	<10	<10	<10

tratamento com anticorpos monoclonais foi feito com anticorpos contra CD4 e CD8 IgG_2b de ratazana nos dias 0 e 2, seguido de anticorpos contra CD4 e CD8 IgG_2a de ratazana três vezes por semana até ao dia 21 (total de 2 mg por injecçãao).

QUADRO 6

Proliferação de linfócitos de sangue periférico de ratos CBA tolerantes a B10

Proliferação	(incorporação de	¹²⁵IUDR) a estimuladores
Grupo	CBA	BALB/c	B10
	(cpm)	(cpm)	(cpm)

Controlo CBA normais	370+236	4952+5236	2210+2622
	-121	-2624	-1285
CBA tolerantes a B10	716+800	4952+3470	3592+2875
	-448	-2091	-1656

Sangraram-se ratos CBA/Ca tolerantes a B10, ou ratos de controlo normais, na veia da cauda no dia 78.

A proliferação das células de sangue periférico foi determinada como no Exemplo 2.

Os números dados são médias logarítmicas e desvios padrão de seis ratos por grupo.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se incorporar como ingrediente activo um anticorpo monoclonal anti-CD4 não redutor ou um anticorpo monoclonal anti-CD8 e uma substância veicular ou um diluente farmaceuticamente aceitáveis de modo a formar uma composição numa forma de dosagem unitária adequada para administração a um ser humano e que contém de 1 a 400 mg do anticorpo por dose unitária.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a composição conter de 3 a 30 mg do anticorpo por dose unitária.
3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a composição conter de 5 a 20 mg do anticorpo por dose unitária.
4. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o anticorpo ser um anticorpo monoclonal anti-CD-4.

Os requerentes reivindicam a prioridade do pedido britânico apresentado em 31 de Maio de 1989, sob o N°. 8912497.8.

Lisboa, 31 de Maio de 1990.

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