BR112020000442A2 - compostos antiproliferativos e métodos de uso dos mesmos - Google Patents

Abstract

É fornecido aqui 4-(4-(4-(((2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1-oxoisoindolin-4-il)oxi)metil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitrila, ou um enantiômero, uma mistura de enantiômeros, um tautômero ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e métodos para o tratamento, prevenção ou gerenciamento de mieloma múltiplo usando esses compostos. Também são fornecidas composições farmacêuticas compreendendo os compostos e métodos de uso das composições.

Description

COMPOSTOS ANTIPROLIFERATIVOS E MÉTODOS DE USO DOS MESMOS

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US 62/530,778 depositado em 10 de julho de 2017 e Pedido Provisório 62/593,185, depositado em 30 de novembro de 2017 e Pedido Provisório 62/675,581, depositado em 23 de maio de 2018, todos os quais são incorporados aqui por referência na sua totalidade.

1. CAMPO

[002] É fornecido aqui o 4-(4-(4-(((2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1- oxoisoindolin-4-il)oxi)mMetil)benzil)piperazin-1-i1)-3-fluorobenzonitrila, ou um enantiômero, uma mistura de enantiômeros, um tautômero ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e métodos para o tratamento, prevenção ou gerenciamento de mieloma múltiplo usando esses compostos. Também são fornecidas composições farmacêuticas compreendendo os compostos e métodos de uso das composições, incluindo tratamentos combinados.

2. FUNDAMENTOS

[003] O mieloma múltiplo (MM) é um câncer de células plasmáticas na medula óssea. Normalmente, as células plasmáticas produzem anticorpos e desempenham um papel fundamental na função imunológica. No entanto, o crescimento descontrolado dessas células leva a dores e fraturas ósseas, anemia, infecções e outras complicações. O mieloma múltiplo é a segunda neoplasia hematológica mais comum, embora as causas exatas do mieloma múltiplo permaneçam desconhecidas. O mieloma múltiplo causa altos níveis de proteínas no sangue, urina e órgãos, incluindo, entre outros, proteína M e outras imunoglobulinas (anticorpos), albumina e beta-2-microglobulina, exceto em alguns pacientes (estimados em 1% a 5%) cujas células do mieloma não secretam essas proteínas (denominadas mieloma não secretório). A proteína

M, abreviação de proteína monoclonal, também conhecida como paraproteína, é uma proteína particularmente anormal produzida pelas células plasmáticas do mieloma e pode ser encontrada no sangue ou na urina de quase todos os pacientes com mieloma múltiplo, exceto para pacientes que têm mieloma não secretório ou cujas células produzem cadeias leves de imunoglobulina com cadeia pesada.

[004] Os sintomas esqueléticos, incluindo dor óssea, estão entre os sintomas clinicamente mais significativos do mieloma múltiplo. As células plasmáticas malignas liberam fatores estimuladores de osteoclastos (incluindo IL-1, IL-6 e TNF) que fazem com que o cálcio seja lixiviado dos ossos, causando lesões líticas; hipercalcemia é outro sintoma. Os fatores estimuladores dos osteoclastos, também denominados citocinas, podem prevenir a apoptose ou a morte de células do mieloma. Cinquenta por cento dos pacientes apresentam lesões esqueléticas relacionadas ao mieloma detectadas radiologicamente no diagnóstico. Outros sintomas clínicos comuns para mieloma múltiplo incluem polineuropatia, anemia, hiperviscosidade, infecções e insuficiência renal.

[005] A terapia atual de mieloma múltiplo pode envolver uma ou mais cirurgias, transplante de células-tronco, quimioterapia, terapia imunológica e/ou tratamento com radiação para erradicar várias células de mieloma em um paciente. Todas as abordagens atuais de terapia apresentam desvantagens significativas para o paciente.

[006] Na última década, novos agentes terapêuticos, em particular medicamentos imunomoduladores, como lenalidomida e pomalidomida, aumentaram significativamente as taxas de resposta e sobrevida livre de progressão prolongada (PFS) e sobrevida global (OS) em pacientes com mieloma múltiplo. No entanto, níveis persistentes de doença residual abaixo da sensibilidade da morfologia da medula óssea (BM), eletroforese de proteínas com imunofixação e a quantificação da cadeia leve existe em muitos pacientes com mieloma múltiplo, mesmo após atingirem a resposta completa (CR) e, eventualmente, causar recidiva da doença. A doença residual mínima (MRD) no mieloma é um preditor independente de sobrevida livre de progressão (PFS) e está sendo considerada como um desfecho substituto para melhorar a identificação de tratamentos eficazes, particularmente para ensaios de linha de frente, que agora requerem de 5 a 10 anos de acompanhamento para identificar diferenças de sobrevida. O monitoramento da doença residual mínima (MRD) em pacientes com mieloma múltiplo fornece valor prognóstico na previsão de PFS e OS e na tomada de decisões de tratamento. A detecção de doença residual mínima (MRD) no mieloma pode usar um limiar de 0,01% (10º) após o tratamento, isto é, com 10º células ou menos células de mieloma múltiplo uma vez que a proporção das células mononucleares totais da medula óssea são consideradas negativas para MRD e com 10º células ou mais positivas para MRD. O limiar de MRD 10º MRD foi originalmente baseado na capacidade técnica, mas a detecção quantitativa de MRD agora é possível em 10º por citometria de fluxo e 10º por sequenciamento de alto rendimento. (Rawstron et al., Blood 2015;125(12):1932-1935). Os métodos para medir MRD incluem sequenciamento de DNA de VDJ, reação em cadeia da polimerase (PCR) (incluindo PCR específico para alelos, ASO PCR) e citometria de fluxo multiparamétrico (MPF). Os ensaios para MRD, por exemplo, com base na medição do perfil do clonótipo também sãodescrito na Patente US 8.628.927, de Faham et al., que é aqui incorporado por referência.

[007] Existe uma necessidade significativa de compostos e métodos seguros e eficazes para o tratamento, prevenção e gerenciamento de mieloma múltiplo, inclusive para pacientes cujo mieloma múltiplo é recém- diagnosticado ou refratário aos tratamentos padrão, enquanto reduz ou evita as toxicidades e/ou efeitos colaterais associados às terapias convencionais.

[008] A citação ou identificação de qualquer referência na Seção 2 deste pedido não deve ser interpretada como uma admissão de que a referência é técnica anterior ao presente pedido.

3. SUMÁRIO

[009] São aqui fornecidos compostos, composições farmacêuticas contendo os compostos e métodos de uso dos mesmos no tratamento de mieloma múltiplo. EM uma modalidade, o composto para uso nas composições e métodos aqui fornecidos é 4-(4-(4-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1- oxoisoindolin-4-il)oxi)Metil)benzil)piperazin-1-i1)-3-fluorobenzonitrila (Composto 1): o

ES Da: NH NE o o AX, 1 ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0010] Em uma modalidade, o composto para uso nas composições e métodos “aqui fornecidos é (S)4-(4-(4-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1- oxoisoindolin-4-il)oxi)Metil)benzil)piperazin-1-i1)-3-fluorobenzonitrila (Composto 2): o

CO

OU OS NE o 0 A, 2 ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0011] Em uma outra modalidade, o composto para uso nas composições e métodos aqui fornecidos é (R)-4-(4-(4-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1- oxoisoindolin-4-il)oxi)Metil)benzil)piperazin-1-i1)-3-fluorobenzonitrila (Composto 3): o

DAS NE o o AX, 3 ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0012] Também são fornecidas composições farmacêuticas formuladas para administração por uma via apropriada e meios contendo concentrações efetivas dos compostos aqui fornecidos, por exemplo Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos, e opcionalmente compreendendo pelo menos um trasportador farmacêutico.

[0013] Numa modalidade, as composições farmacêuticas distribuem quantidades eficazes para o tratamento de mieloma múltiplo. Numa modalidade, as composições farmacêuticas distribuem quantidades eficazes para a prevenção de mieloma múltiplo. Numa modalidade, as composições farmacêuticas distribuem quantidades eficazes para a melhoria de mieloma múltiplo.

[0014] Também são fornecidas neste documento terapias de combinação utilizando os compostos ou composições aqui fornecidas, ou um enantiômero,

mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos, em combinação com uma terapia, por exemplo, outro agente farmacêutico com atividade contra mieloma múltiplo ou seus sintomas. Exemplos de terapias dentro do escopo dos métodos incluem, entre outros, cirurgia, quimioterapia, radioterapia, terapia biológica, transplante de células- tronco, terapia celular e combinações dos mesmos.

[0015] Os compostos ou composições aqui fornecidas, ou derivados farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, podem ser administrados simultaneamente com, antes ou após a administração de uma ou mais das terapias acima. Também são fornecidas composições farmacêuticas contendo um composto aqui fornecido e uma ou mais das terapias acima.

[0016] Numa modalidade, quantidades eficazes dos compostos ou composições contendo concentrações terapeuticamente eficazes dos compostos são administradas a um indivíduo que exibe os sintomas de mieloma múltiplo a ser tratado. As quantidades são eficazes para melhorar ou eliminar um ou mais sintomas de mieloma múltiplo. Na prática dos métodos de tratamento, quantidades eficazes dos compostos ou composições contendo concentrações terapeuticamente eficazes dos compostos são administradas a um paciente com mieloma múltiplo em necessidade dos mesmos.

[0017] É ainda fornecido um pacote ou kit farmacêutico que compreende um ou mais recipientes cheios com um ou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas. Opcionalmente associado com tal(is) recipientes(s) pode estar um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, cujo aviso reflete a aprovação pela agência da fabricação, uso ou venda para administração em seres humanos. A embalagem ou kit pode ser rotulado com informações sobre o modo de administração, sequência de administração da droga (por exemplo, separadamente, sequencialmente ou simultaneamente) ou semelhantes.

[0018] Estes e outros aspectos do assunto aqui descrito se tornarão evidentes com referência à seguinte descrição detalhada.

4. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A. Definições

[0019] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que é normalmente entendido por um versado na técnica. Todas as patentes, aplicações, aplicações publicadas e outras publicações são incorporadas por referência na sua totalidade. No caso de haver uma pluralidade de definições para um termo neste documento, prevalecerão as que estão nesta secção, a menos que indicado em contrário.

[0020] “IC5o” refere-se a uma quantidade, concentração ou dosagem de um composto de teste específico que atinge uma inibição de 50% de uma resposta máxima, como ligação ao receptor, atividade do receptor, crescimento ou proliferação celular, conforme medido por qualquer um dos ensaios in vitro ou baseados em células descritos neste documento.

[0021] Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a sais de amina, tais como, sem limitação, NN'- dibenziletilenodiamina, cloroprocaína, colina, amônia, dietanolamina e outras hidroxialquilaminas, — etilenodiamina, — N-metilglucamina, — procaina, — N- benzilfenetilamina, — 1-para-clorobenzil-2-pirrolidin-1'-ilmetil- - benzimidazol, dietilamina e outras alquilaminas, piperazina e tris(hidroximetil)aminometano; sais de metais alcalinos, tais como, sem limitação, lítio, potássio e sódio; sais de metais alcalino-terrosos, tais como, sem limitação, bário, cálcio e magnésio; sais de metais de transição, tais como, mas não limitados a zinco; e outros sais de metal, tais como mas não limitado a hidrogenofosfato de sódio e fosfato dissódico; e também incluindo, sem limitação, sais de ácidos minerais, tais como, sem limitação, cloridratos e sulfatos; e sais de ácidos orgânicos, tais como, sem limitação, acetatos, lactatos, malatos, tartaratos, citratos, ascorbatos, succinatos, butiratos, valeratos, fumaratos e sulfonatos orgânicos.

[0022] Salvo indicação em contrário, onde um composto pode assumir formas tautoméricas, regioisoméricas e/ou estereoisoméricas alternativas, todos os isômeros alternativos devem estar incluídos no escopo da matéria reivindicada. Por exemplo, quando um composto pode ter uma de duas formas tautoméricas, pretende-se que ambos os tautômeros sejam aqui abrangidos.

[0023] Assim, os compostos aqui fornecidos podem ser enantiomericamente puros ou ser misturas estereoisoméricas ou diastereoméricas. Como usado neste documento e a menos que indicado de outra forma, o termo “estereoisomericamente puro” significa uma composição que compreende um estereoisômero de um composto e está substancialmente livre de outros estereoisômeros desse compostoPor exemplo, uma composição estereoisomericamente pura de um composto tendo um centro quiral estará substancialmente livre do enantiômero oposto do composto. Uma composição estereoisomericamente pura de um composto com dois centros quirais estará substancialmente livre de outros diastereômeros do composto. Um composto estereoisomericamente puro típico compreende mais que cerca de 80% em peso de um estereoisômero do composto e menos que cerca de 20% em peso de outros estereoisômeros do composto, mais preferencialmente mais que cerca de 90% em peso de um estereoisômero do composto e menos que cerca de 10% em peso dos outros estereoisômeros do composto, ainda mais preferencialmente mais que cerca de 95% em peso de um estereoisômero do composto e menos que cerca de 5% em peso dos outros estereoisômeros do composto, e mais preferencialmente mais que cerca de 97% em peso de um estereoisômero do composto e menos que cerca de 3% em peso dos outros estereoisômeros do composto.

Um composto estereoisomericamente puro, como usado neste documento, compreende mais que cerca de 80% em peso de um estereoisômero do composto, mais preferencialmente mais que cerca de 90% em peso de um estereoisômero do composto, ainda mais preferencialmente mais que cerca de 95% em peso de um estereoisômero do composto e, mais preferencialmente, mais que cerca de 97% em peso de um estereoisômero do composto.

Como usado neste documento e a menos que indicado de outra forma, o termo “estereoisomericamente enriquecido” significa uma composição que compreende mais que cerca de 60% em peso de um estereoisômero de um composto, de preferência mais que cerca de 70% em peso, mais preferencialmente mais que cerca de 80% em peso de um estereoisômero de um composto.

Neste documento e salvo indicação em contrário, o termo “enantiomericamente puro” significa uma composição estereoisomericamente pura de um composto tendo um centro quiral.

Do mesmo modo, o termo “enriquecido estereoisomericamente” significa uma composição estereoisomericamente enriquecida de um composto possuindo um centro quiral.

Como usado neste documento, misturas estereoisoméricas ou diastereoméricas significa uma composição que compreende mais de um estereoisômero de um composto.

Uma mistura estereoisomérica típica de um composto compreende cerca de 50% em peso de um estereoisômero do composto e cerca de 50% em peso de outros estereoisômeros do composto, ou compreende mais que cerca de 50% em peso de um estereoisômero do composto e menos que cerca de 50% em peso de outros estereoisômeros do composto, ou compreende mais que cerca de 45% em peso de um estereoisômero do composto e menos que cerca de 55% em peso dos outros estereoisômeros do composto, ou compreende mais que cerca de 40% em peso de um estereoisômero do composto e menos que cerca de 60% em peso dos outros estereoisômeros do composto, ou compreende mais que cerca de 35% em peso de um estereoisômero do composto e menos que cerca de 65% em peso dos outros estereoisômeros do composto.

[0024] Deve ser entendido que os compostos aqui fornecidos podem conter centros quirais. Tais centros quirais podem ter a configuração (R) ou (S) ou podem ser uma mistura dos mesmos. Deve ser entendido que os centros quirais dos compostos aqui fornecidos podem sofrer epimerização in vivo. Como tal, um versado na técnica reconhecerá que a administração de um composto na sua forma (R) é equivalente, para compostos que sofrem epimerização in vivo, à administração do composto na sua forma (S).

[0025] Os isômeros opticamente ativos (+) e (-), (R) - e (S) - ou (D) - e (L) podem ser preparados usando síntons quirais ou reagentes quirais ou resolvidos usando técnicas convencionais, como cromatografia em uma fase estacionária quiral.

[0026] Como usado neste documento, um “isotopólogo” é um composto isotopicamente enriquecido. O termo “enriquecido isotopicamente” refere-se a um átomo com uma composição isotópica diferente da composição isotópica natural desse átomo. “Enriquecido isotopicamente” também pode se referir a um composto contendo pelo menos um átomo com uma composição isotópica diferente da composição isotópica natural desse átomo. O termo “composição isotópica” refere-se à quantidade de cada isótopo presente para um determinado átomo. Os compostos radiomarcados e enriquecidos isotopicamente são úteis como agentes terapêuticos, por exemplo, agentes terapêuticos de mieloma múltiplo, reagentes de pesquisa, por exemplo, reagentes de ensaio de ligação e agentes de diagnóstico, por exemplo, agentes de imageamento in vivo. Todas as variações isotópicas dos compostos como aqui descritas, sejam radioativas ou não, devem estar incluídas no escopo das modalidades aqui fornecidas. Em algumas modalidades, são fornecidos isotopólogos dos compostos, por exemplo, os isotopólogos do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 são compostos enriquecidos com deutério, carbono 13 ou nitrogênio 15. Em algumas modalidades, os isotopólogos aqui fornecidos são compostos enriquecidos com deutério. Em algumas modalidades, os isotopólogos aqui fornecidos são compostos enriquecidos com deutério, onde o enriquecimento de deutério ocorre no centro quiral.

[0027] Na descrição deste documento, se houver alguma discrepância entre um nome químico e uma estrutura química, a estrutura controla.

[0028] Como usado neste documento “mieloma múltiplo” refere-se a condições hematológicas caracterizadas por células plasmáticas malignas e inclui os seguintes distúrbios: gamopatia monoclonal de significado indeterminado (MGUS); mieloma múltiplo de baixo risco, risco intermediário e alto risco; mieloma múltiplo recentemente diagnosticado (incluindo mieloma múltiplo recém-diagnosticado de baixo risco, risco intermediário e alto risco); mieloma múltiplo elegível para transplante e inelegível para transplante; mieloma múltiplo fumegante (indolente) (incluindo mieloma múltiplo fumegante de baixo risco, risco intermediário e alto risco); mieloma múltiplo ativo; plasmacitoma solitário; plasmacitoma extramedular; leucemia de células plasmáticas; mieloma múltiplo do sistema nervoso central; mieloma de cadeia leve; mieloma não secretório; Mieloma de imunoglobulina D; e Mieloma de imunoglobulina E; e mieloma múltiplo caracterizado por anormalidades genéticas, como translocações de ciclina D (por exemplo, t(11;14)(913;932); t(6;14)(p21;32); t(12;14)(p13;932); ou t(6;20);); translocações MMSET (por exemplo, t (4; 14) (p16; q932)); translocações do MAF (por exemplo, t (14; 16)

(932; 932); t (20; 22); t (16; 22) (911; 913); ou t (14; 20) (932; q11)) ; ou outros fatores cromossômicos (por exemplo, exclusão de 17p13 ou cromossomo 13; del (17/17p), não hiperdiploidia e ganho(1q)).

[0029] Como usado neste documento e a menos que indicado de outra forma, os termos “tratar”, “tratando” e “tratamento” se referem a aliviar ou reduzir a gravidade de um sintoma associado à doença ou condição sendo tratada, por exemplo, mieloma múltiplo.

[0030] O termo “prevenção” inclui a inibição de um sintoma da doença ou distúrbio específico, por exemplo, mieloma múltiplo. Em algumas modalidades, pacientes com histórico familiar de mieloma múltiplo são candidatos a regimes preventivos. Geralmente, o termo “prevenção” refere-se à administração da droga antes do início dos sintomas, principalmente em pacientes com risco de mieloma múltiplo.

[0031] Como usado neste documento e a menos que indicado de outra forma, o termo “gerenciamento” abrange a prevenção da recorrência de uma doença ou distúrbio específico, como mieloma múltiplo, em um paciente que sofreu com isso, prolongando o tempo que um paciente que sofreu com a doença ou o distúrbio permanece em remissão, reduzindo as taxas de mortalidade dos pacientes e/ou mantendo uma redução na gravidade ou na prevenção de um sintoma associado à doença ou condição gerenciada.

[0032] Como usado neste documento, “sujeito” ou “paciente” é um animal, tipicamente um mamífero, incluindo um humano, como um paciente humano.

[0033] O termo “recaída” refere-se a uma situação em que os pacientes, que tiveram uma remissão de mieloma múltiplo após a terapia, têm um retorno de células de mieloma e/ou células normais reduzidas na medula.

[0034] O termo “refratário ou resistente” refere-se a uma circunstância onde os pacientes, mesmo após tratamento intensivo, têm células residuais de mieloma e/ou células normais reduzidas na medula.

[0035] Como usado neste documento, “terapia de indução” refere-se ao primeiro tratamento administrado para uma doença ou ao primeiro tratamento administrado com a intenção de induzir remissão completa em uma doença, como o câncer. Quando utilizada por si só, a terapia de indução é a aceita como o melhor tratamento disponível. Se o câncer residual for detectado, os pacientes serão tratados com outra terapia, denominada reindução. Se o paciente estiver em remissão completa após a terapia de indução, é dada uma consolidação adicional e/ou terapia de manutenção para prolongar a remissão ou potencialmente curar o paciente.

[0036] Como usado neste documento, “terapia de consolidação” refere-se ao tratamento dado a uma doença após a remissão ser alcançada pela primeira vez. Por exemplo, a terapia de consolidação do câncer é o tratamento administrado após o desaparecimento do câncer após a terapia inicial. À terapia de consolidação pode incluir radioterapia, transplante de células-tronco ou tratamento com quimioterapia. A terapia de consolidação também é chamada de terapia de intensificação e terapia pós-remissão.

[0037] Como usado neste documento, “terapia de manutenção” refere-se ao tratamento administrado para uma doença após remissão ou a melhor resposta é alcançada, a fim de impedir ou atrasar a recaída. A terapia de manutenção pode incluir quimioterapia, terapia hormonal ou terapia direcionada.

[0038] “Remissão”, como usado neste documento, é uma diminuição ou desaparecimento de sinais e sintomas de um câncer, por exemplo, mieloma múltiplo. Em remissão parcial, alguns, mas não todos, sinais e sintomas do câncer desapareceram. Em remissão completa, todos os sinais e sintomas do câncer desapareceram, embora o câncer ainda possa estar no corpo.

[0039] Como usado neste documento, “transplante” refere-se à terapia de altas doses com resgate de células-tronco. As células-tronco hematopoiéticas (sangue) ou da medula óssea são usadas não como tratamento, mas para resgatar o paciente após a terapia com altas doses, por exemplo, quimioterapia com altas doses e/ou radiação. O transplante inclui transplante de células- tronco “autólogas” (ASCT), que se refere ao uso das células-tronco dos próprios pacientes que estão sendo colhidas e usadas como células de substituição. Em algumas modalidades, transplante também inclui transplante em tandem ou múltiplos transplantes.

[0040] Como usado neste documento, e a menos que especificado de outra forma, os termos “quantidade terapeuticamente eficaz” e “quantidade eficaz” de um composto referem-se a uma quantidade suficiente para fornecer um benefício terapêutico no tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de uma doença, por exemplo, múltiplos mieloma ou para atrasar ou minimizar um ou mais sintomas associados à doença ou distúrbio a ser tratado. Os termos “quantidade terapeuticamente eficaz” e “quantidade eficaz” podem englobar uma quantidade que melhora a terapia geral, reduz ou evita sintomas ou causas de doenças ou distúrbios, ou aumenta a eficácia terapêutica de outro agente terapêutico.

[0041] Os termos “coadministração” e “em combinação com” incluem a administração de um ou mais agentes terapêuticos (por exemplo, um composto aqui fornecido e outro agente anti-mieloma múltiplo, agente cancerígeno ou agente de cuidados de suporte) simultaneamente, concomitantemente ou sequencialmente, sem limites de tempo específicos. Em algumas modalidades, os agentes estão presentes na célula ou no corpo do paciente ao mesmo tempo ou exercem seu efeito biológico ou terapêutico ao mesmo tempo. Em uma modalidade, os agentes terapêuticos estão na mesma composição ou forma de dosagem unitária. Em outra modalidade, os agentes terapêuticos estão em composições separadas ou formas de dosagem unitárias.

[0042] O termo “agente de cuidados de suporte” refere-se a qualquer substância que trate, impeça ou gerencie um efeito adverso do tratamento com o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero ou uma mistura de enantiômeros, tautômeros, isotopólogo ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0043] O termo “terapia biológica” refere-se à administração de terapêuticas biológicas, como sangue do cordão umbilical, células-tronco, fatores de crescimento e semelhantes.

[0044] No contexto de um câncer, como mieloma múltiplo, a inibição pode ser avaliada pela inibição da progressão da doença, inibição do crescimento do tumor, redução do tumor primário, alívio de sintomas relacionados ao tumor, inibição de fatores secretados pelo tumor, inibição do aparecimento de fatores primários ou secundários. tumores secundários, desenvolvimento lento de tumores primários ou secundários, ocorrência diminuída de tumores primários ou secundários, diminuição ou severidade dos efeitos secundários da doença, crescimento de tumores interrompidos e regressão de tumores, aumento do tempo de progressão (TTP), aumento da sobrevida livre de progressão (PFS), aumento da Sobrevida Global (OS), entre outros. OS, como usado neste documento, significa o tempo desde o início do tratamento até a morte por qualquer causa. TTP, como usado neste documento, significa o tempo desde o início do tratamento até a progressão do tumor; TTP não inclui mortes. Numa modalidade, PFS significa o tempo desde o início do tratamento até a progressão do tumor ou a morte. Numa modalidade,

PFS significa o tempo desde a primeira dose do composto até a primeira ocorrência de progressão da doença ou morte por qualquer causa.

Numa modalidade, as taxas de PFS serão calculadas usando as estimativas de Kaplan- Meier.

Sobrevida livre de eventos (EFS) significa o tempo desde o início do tratamento até qualquer falha do tratamento, incluindo progressão da doença, descontinuação do tratamento por qualquer motivo ou morte.

Numa modalidade, a taxa de resposta geral (ORR) significa a porcentagem de pacientes que alcançam uma resposta.

Numa modalidade, ORR significa a soma da porcentagem de pacientes que obtêm respostas completas e parciais.

Numa modalidade, ORR significa a porcentagem de pacientes cuja melhor resposta > resposta parcial (PR), de acordo com os Critérios de Resposta Uniforme do IMWG.

Numa modalidade, a duração da resposta (DoR) é o tempo de obtenção de uma resposta até recaída ou progressão da doença.

Numa modalidade, o DoR é o tempo decorrido desde a obtenção de uma resposta > resposta parcial (PR) até a recaída ou progressão da doença.

Numa modalidade, DoR é o tempo desde a primeira documentação de uma resposta até a primeira documentação de doença ou morte progressiva.

Numa modalidade, DoR é o tempo desde a primeira documentação de uma resposta > resposta parcial (RP) até a primeira documentação de doença ou morte progressiva.

Numa modalidade, tempo para resposta (TTR) significa o tempo desde a primeira dose do composto até a primeira documentação de uma resposta.

Numa modalidade, TTR significa o tempo desde a primeira dose do composto até a primeira documentação de uma resposta > resposta parcial (PR). No extremo, inibição completa é denominada no presente documento como prevenção ou quimioprevenção.

Nesse contexto, o termo “prevenção” inclui a prevenção do início do câncer clinicamente evidente por completo ou a prevenção do início de um estágio pré-clinicamente evidente do câncer.

Também se pretende incluir nesta definição a prevenção da transformação em células malignas ou para interromper ou reverter a progressão de células pré-malignas para células malignas. Isso inclui tratamento profilático de pessoas em risco de desenvolver um câncer.

[0045] Em certas modalidades, o tratamento de mieloma múltiplo pode ser avaliado pelos Critérios Internacionais de Resposta Uniforme para Mieloma Múltiplo (IURC) (ver Durie BGM, Harousseau J-L, Miguel JS, et al. International uniform response criteria for multiple myeloma. Leukemia, 2006; (10) 10:1-7), usando as definições de resposta e ponto final mostradas abaixo: Subcategoria de Resposta Critérios de resposta? sCR CR conforme definido abaixo mais Razão normal de FLC e Ausência de células clonais na medula óssea” por imuno-histoquímica ou imunofluorescência“s CR Imunofixação negativa no soro e na urina e Desaparecimento de qualquer plasmocitoma de tecido mole e <5% de células plasmáticas na medula óssea” VGPR Proteína M sérica e na urina detectável por imunofixação, mas não por eletroforese ou redução de 90% ou mais na proteína M sérica mais nível de proteína M na urina &lt; 100 mg por 24 h.

>50% redução da proteína M sérica e redução da proteína M urinária de 24 horas em >90% ou em <200 mg por 24 h Se a proteína M sérica e na urina não forem mensuráveis, é necessária uma diminuição de >50% na diferença entre os níveis de CVL envolvidos e não envolvidos, em vez dos critérios de proteína M. Se a proteína M sérica e na urina não forem mensuráveis, e o teste de luz livre de soro também não for mensurável, é necessária uma redução de 250% nas células plasmáticas em vez da proteína M, desde que a porcentagem basal de células plasmáticas da medula óssea seja 230%. Além dos critérios listados acima, se presente na linha de base, também é necessária uma redução >50% no tamanho dos plasmocitomas de tecidos moles SD (não recomendado para uso como | Não atender aos critérios de CR, VGPR, indicador de resposta; a estabilidade PR ou doença progressiva da doença é mais bem descrita mediante a previsão do tempo para a progressão) Abreviações: CR, resposta completa; FLC, cadeia leve livre; PR, resposta parcial; SD, doença estável; sCR, resposta completa rigorosa; VGPR, resposta parcial muito boa.

? Todas as categorias de resposta requerem duas avaliações consecutivas feitas a qualquer momento antes da instituição de qualquer nova terapia; todas as categorias também não exigem evidências conhecidas de lesões ósseas progressivas ou novas se foram realizados estudos radiográficos. Não são necessários estudos radiográficos para atender a esses requisitos de resposta.

b Não é necessária confirmação com biópsia repetida da medula óssea.

“A presença/ausência de células clonais é baseada na razão K«/Ah. Uma razão K/A anormal por imuno-histoquímica e/ou imunofluorescência requer um mínimo de 100 células plasmáticas para análise. Uma razão anormal que reflete a presença de um clone anormal é K/A de >4:1 ou <1:2.

9 Doença mensurável definida por pelo menos uma das seguintes medidas:Células plasmáticas da medula óssea >30%; Proteína M sérica >1 g/dl (210 gm/1)[10 g/I]; Proteína M na urina 2200 mg/24 h; Ensaio FLC sérico:Nível de CVL envolvido >10 mg/dl (>100 mg/l); desde que a razão de FLC sérica seja anormal.

[0046] Como usado neste documento, o status ECOG refere-se ao Status de Desempenho do Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) (Oken M, et al Toxicity and response criteria of the Eastern Cooperative Oncology GroupAm J Clin Oncol 1982; 5 (6): 649-655), como mostrado abaixo: Totalmente ativo, capaz de realizar todo o desempenho pré- doença sem restrição 1 Restrito em atividades fisicamente extenuantes, mas ambulatoriais e capazes de realizar trabalhos de natureza leve ou sedentária, por exemplo, tarefas domésticas leves, trabalho de escritório.

2 Ambulatório e capaz de todo autocuidado, mas incapaz de realizar qualquer atividade laboral. Acima e mais de 50% de horas de vigília.

3 Capaz apenas de autocuidado limitado, confinado à cama ou cadeira mais de 50% de horas de vigília.

Completamente desativado. Não pode continuar com qualquer autocuidado. Totalmente confinado à cama ou cadeira

[0047] O termo “cerca de, como usado neste documento, a menos que indicado de outra forma, refere-se a um valor que não exceda 10% acima ou abaixo do valor que está sendo modificado pelo termo. Por exemplo, o termo “cerca de 10 mg/m”” significa uma faixa de 9 mg/m? a 11 mg/m?.

B. Breve Descrição das Figuras

[0048] Figura 1. (A) Alteração na indução de apoptose, medida pela área sob a curva da indução de Caspase 3 vezes (também conhecido como índice de apoptose) ao longo do tempo em células H929-1051 resistentes à lenalidomida. Abcissa: log nM (composto), ordenadas: índice de apoptose. As linhas de melhor ajuste são uma equação logística de 3 parâmetros calculada no GraphPad Prism. (B) A área sob a curva das curvas de concentração-resposta para as células H929-1051 do composto 1 e do composto A foi usada para comparar a capacidade dos compostos de induzir apoptose após uma exposição de 6 h e depois diluição resultando em cerca de 20 vezes a redução da concentração de composto.

[0049] Figura 2. Comparação da atividade antiproliferativa do tratamento combinado com pomalidomida-dexametasona e agente único Composto 2 (A) e com tratamento combinado com composto 2-dexametasona (B) em células MM resistentes à lenalidomida H929-1051. A proliferação foi avaliada usando um ensaio de determinação de ATP (CellTiter-Glo) após 120 h de tratamento. O controle percentual foi calculado subtraindo o plano de fundo e normalizando para o controle DMSO (100% do controle). Cada ponto de dados representa a média de pelo menos três experiências independentes em duplicado.

[0050] Figura 3. (A) Efeitos antiproliferativos nas PBMCs não estimuladas e (B) THLE-2, tratados com o Composto 2 por 72 h foram avaliados usando um ensaio de determinação de ATP (CellTiter-Glo). O controle percentual foi calculado subtraindo o plano de fundo e normalizando para o controle DMSO (100% do controle).

[0051] Figura 4. Atividade antitumoral do Composto 2 com dosagem contínua no modelo de xenoenxerto H929-1051 resistente à lenalidomida. Camundongos SCID fêmeas foram inoculados com 10 x 10º células tumorais H929-1051 no flanco direito. Os camundongos foram randomizados em grupos de tratamento (n = 10/grupo) no momento do início do tratamento. O tratamento do artigo de teste começou no dia 14, quando os tumores eram de aproximadamente 120 mm?.

[0052] Figura 5: Atividade antiproliferativa do composto 2 em linhagens celulares de mieloma múltiplo agrupadas por translocações cromossômicas. O gráfico representa a área sob a curva (AUC) das curvas de crescimento de resposta à concentração que medem os números de células vivas por citometria de fluxo para linhagens celulares de 15 MM contendo translocações comuns encontradas em MM. O valor da AUC relatado corresponde à área sob a curva de resposta à dose na qual valores O correspondem à redução completa da proliferação/viabilidade em todas as doses e valores de 10.000 correspondem a nenhuma redução da proliferação/viabilidade. As linhagens celulares são agrupadas primeiro pela translocação cromossômica encontrada e, segundo, pelo fato de saber se a translocação é de alto risco ou não.

[0053] Figura 6: Atividade antiproliferativá do Composto 2 e pomalidomida em linhagens celulares de mieloma múltiplo resistentes à lenalidomida e pomalidomida. ICso = concentração do Composto 2 e pomalidomida resultando em 50% de inibição do crescimento celular em comparação com o controle. Gráfico que mostra a comparação do Composto 2 e valores antiproliferativos da pomalidomida de ICso (bars) foram determinados usando o teste CellTitre-Glo nas linhagens celulares parentais (DF15, NCI-H929 e OPM2), resistentes à lenalidomida (NCI-H929-1051) ou resistentes à pomalidomida (NCI-H929-PO01, OPM2-PO1, OPM2-P1, OPM2 -P10 e DF15R)

apresentadas na Tabela 11.

[0054] Figura 7: Estratégia de bloqueio para subpopulações mieloides.

[0055] Figura 8: Últimos estágios da diferenciação in vitro de progenitores neutrófilos - efeitos de exposições diárias curtas ao Composto 2 por até três dias. Células CD34* derivadas de medula óssea de doador saudável foram expostas ao Composto 2 em concentrações de 1, 10 e 100 nM em cada um de 1, 2 ou 3 dias consecutivos. Somente células vivas foram incluídas na análise. Os dados são a média dos resultados para os Doadores 1 e 2 e representam um exemplo de porcentagem de células nos Estágios Ill e IV definidas como CD34 /CD33*/CD11b* e CD34 /CD33/ CD11b*, respectivamente, após 6 h de exposição.

[0056] Figura 9: Maturação tardia dos progenitores neutrófilos após exposições de 6 horas ao Composto 2 em 3 dias consecutivos. Células CD34* derivadas de medula óssea de doador saudável foram expostas ao Composto 2 em concentrações de 1, 10 ou 100 nM por 6 h em cada um dos 3 dias consecutivos a partir do Dia 10. Os dados representam a porcentagem média de células em Estágio Ill definidas como CD347/CD33*/CD11b* e a porcentagem de células em Estágio IV definida como CD34 /CD33"/CD11b* dos Doadores Nº1 e Nº2. As barras de erro representam desvio padrão.

[0057] Figura 10: Maturação tardia dos progenitores neutrófilos após exposições de 6 horas ao Composto 2 em 5 dias consecutivos. Células CD34* derivadas de medula óssea de doador saudável foram expostas ao Composto 2 em concentrações de 1, 10 ou 100 nM por 6 h em cada um dos 5 dias consecutivos a partir do Dia 10. Os dados representam a porcentagem média de células em Estágio Ill definidas como CD34 /CD33*/CD11b* e a porcentagem de células em Estágio IV definida como CD34 /CD33/CD11b* dos Doadores Nº1 e Nº2. As barras de erro representam desvio padrão.

[0058] Figura 11: Diagramas de esquema de tratamento para dexametasona com agente único.

[0059] Figura 12: Porcentagem de neutrófilos maduros durante a diferenciação mieloide após uma exposição à dexametasona ou ao Composto 2 isoladamente ou em combinação em diferentes concentrações. Células CD34* derivadas de medula óssea de doador saudável foram expostas ao Composto 2 (por 6 h) e dexametasona (por 30 h) isoladamente (linha superior) ou em combinação (linha inferior), em concentrações de 1, 10 ou 100 nM no Dia 13. Em cada um dos painéis inferiores, a concentração do Composto 2 foi variada e a concentração de dexametasona foi mantida constante a 1 nM (esquerda), 10 nM (meio) ou 100 nM (direita). Para as combinações, as culturas foram expostas a ambos os agentes simultaneamente por 6 h. As células foram então lavadas e reincubadas com dexametasona pelas próximas 24 h. Em seguida, as células foram lavadas e reincubadas sem o Composto 2 ou dexametasona durante o restante do estudo. Os dados representam a porcentagem de células em Estágio IV definidas comoCD34 /CD33*/CD11b* dos Doadores 3, 4 e 5. A linha vermelha representa 50% do nível de células do Estágio IV no controle DMSO.

[0060] Figura 13: O efeito do tratamento com dexametasona isolada ou em combinação com o Composto 2, lenalidomida e pomalidomida, na apoptose em uma linhagem celular de mieloma múltiplo resistente à lenalidomida. O eixo y mostra a alteração da dobra para a caspase-3 do DMSO e o eixo xé a concentração de logarítmica da dexametasona.

[0061] Figura 14: O Composto 2 ativa diretamente as células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) para lisar as células de leucemia eritromielocítica K5S62 de uma maneira dependente da concentração. (Esquerda) Gráficos representativos de classificação de células ativadas por fluorescência de células K562 co-cultivadas com PBMCs humanas que foram pré-incubadas com o Composto 2, lenalidomida, pomalidomida ou DMSO. (Direita) Dados brutos da porcentagem de células PlI- Anexina V- K562 mostrando uma diminuição dependente da concentração nas células K562 viáveis na co-cultura. Os dados são apresentados como média, com barras de erro representando erro padrão da média.

[0062] Figura 15: As células imunes são ativadas diretamente pelo Composto 2 para lisar linhagens celulares de mieloma múltiplo sensível a lenalidomida e resistente à lenalidomida. As células doadoras mononucleares do sangue periférico (PBMCs) (células efetoras) foram pré-tratadas com os artigos de teste indicados ou Composto 2 por 2 h antes de serem cultivadas em placas revestidas com anticorpo anti-CD3 por 72 h. Antes da co-cultura com múltiplas linhagens celulares de mieloma marcadas com CFSE não tratadas, as PBMCs foram lavadas e colocadas em meio sem nenhum composto presente e depois co-cultivadas com as múltiplas linhagens celulares de mieloma (células alvo) por 24 h. Foi evidente um aumento na morte celular de mieloma múltiplo mediada por células imunes em PBMCs tratadas com o composto 2 co- cultivadas (razão Alvo:Efetor de 1:5) com (A) células NCI-H929 ou (B) células H929-1051.

[0063] Figura 16: As células imunes iniciadas pelo composto mostram morte celular aumentada quando múltiplas células do mieloma são pré- tratadas com lenalidomida, pomalidomida ou Composto 2 antes da cocultura. As células mononucleares do sangue periférico foram pré-incubadas com lenalidomida, pomalidomida ou Composto 2 por 2 h antes de serem cultivadas em placas revestidas com anticorpo anti-CD3 por 72 h. Ao mesmo tempo, 4 linhagens celulares de mieloma múltiplo (MM) foram cultivadas em meio contendo artigos de teste. Após 72 h, as células foram cocultivadas juntas por

24 h (relação Alvo:Efetor [T:E] de 1:5). Foi evidente um aumento na morte de MM mediada por células imunes nas coculturas (gráficos à direita em cada linhagem) em comparação com as culturas simples de MM (gráficos à esquerda em cada linhagem) em todos os tipos de células testados (A) NCI-H929, (B) linhagens de células H929-1051, (C) OPM2 e (D) OPM2 P10. Os compostos tiveram pouco efeito na viabilidade da PBMC (mostrado nos gráficos do meio de cada linhagem).

[0064] Figura 17: O Composto 2 superregula a expressão de CD38 em linhagens de células MM. A expressão da superfície celular de CD38 foi avaliada em células MM pré-tratadas com o Composto 2 ou pomalidomida por 72 h. Os efeitos da resposta à dose são mostrados para as linhagens celulares OPM-2 e OPM-2. P10.

[0065] Figura 18: O Composto 2 aumenta o ADCC mediado por daratumamabe de células MM. Sete linhagens de células MM foram tratadas com concentrações sub-letais do Composto 2 ou pomalidomida por 72 h antes da cocultura com células NK em uma razão efetor para alvo [E:T] de 10:1 para o ensaio ADCC. Os gráficos ilustram dados representativos obtidos para as linhagens celulares de 7 MM. Os ensaios foram realizados duas vezes com células NK de dois doadores diferentes. O controle DMSO é a atividade das células NK da linha de base com células tumorais não tratadas; o isótipo e o Dara são a atividade das células NK na presença de controle do isotipo e daratumamabe, respectivamente, com células tumorais não tratadas; o isotipo + composto e o Dara + composto são a atividade das células NK na presença de controle de isotipo e daratumumabe, respectivamente, com células tumorais tratadas.

[0066] Figura 19: O Composto 2 aumenta o ADCP mediado por daratumamabe de células MM. Os ensaios de fagocitose foram realizados com uma razão efetor-alvo [E:T] de 2:1. Seis linhagens de células MM +/- Composto 2 ou pré-tratamento com pomalidomida foram submetidas a ADCP mediado por daratumamabe. A) Imagens representativas do ADCP com a linhagem celular OPM2. Os macrófagos estão em vermelho e as células OPM2 estão em verde. B) Quantificação da fagocitose por citometria de fluxo. O controle DMSO é a atividade das células NK da linha de base com células tumorais não tratadas; o isótipo e o Dara são a atividade das células NK na presença de controle do isotipo e daratumamabe, respectivamente, com células tumorais não tratadas; o isotipo + composto e o Dara + composto são a atividade das células NK na presença de controle de isotipo e daratumumabe, respectivamente, com células tumorais tratadas.

[0067] Figura 20: A combinação do Composto 2 com inibidor de proteassoma resulta em aumento da apoptose em modelos de células MM. As linhagens celulares de MM foram tratadas com um pulso de bortezomibe ou DMSO por 1 h, seguido de uma lavagem. As células pré-tratadas foram incubadas com diferentes concentrações do Composto 2 por 72 h, seguidas de coloração das amostras com solução de 7-AAD e anexina-V e análise por citometria de fluxo. A) Porcentagem de células vivas do Composto 2 isoladamente ou com pré-tratamento com bortezomibe. B) Gráficos de dispersão de células OPM2-P10 nas várias condições de tratamento.

[0068] Figura 21: Combinação do Composto 2 com bortezomibe ou carfilzomibe em células MM. Quatro linhagens celulares de MM foram tratadas com um pulso de bortezomibe ou DMSO por 1 h, seguido de uma lavagem. As células pré-tratadas foram incubadas com diferentes concentrações do Composto 2 por 72 horas, seguidas de coloração das amostras com solução de 7-AAD e anexina-V e análise por citometria de fluxo. A) Efeito antiproliferativo do Composto 2 sozinho ou com pré-tratamento com bortezomibe. B) Efeito antiproliferativo do Composto 2 sozinho ou com pré-tratamento com carfilzomibe. DRC = curva dose-resposta

[0069] Figura 22. É mostrado o tratamento de células MM com o Composto 2 em combinação com inibidores de histona desacetilase, agentes quimioterápicos, inibidores de Bcl-2, inibidores de Mcl-1, inibidores de BET ou inibidores de LSD-1. Os cálculos de sinergia foram realizados para o tratamento com o Composto 2 em combinação com 13 inibidores de moléculas pequenas através de um painel de linhagens de células MM. As caixas de cor azul ilustram a porcentagem de poços que são sinérgicos quando combinados com o Composto 2. O * representa o significado da diferença de resposta da superfície do modelo nulo.

[0070] Figura 23: O efeito do tratamento com o Composto 2 (0,1 mg/kg, qd) e dexametasona (0,5 mg/kg, qd) como agentes únicos e em combinação no modelo de xenoenxerto H929-1051 resistente à lenalidomida.

[0071] Figura 24:A atividade antitumoral do Composto 2 sozinho e em combinação com o bortezomibe em um modelo de xenoenxerto de mieloma múltiplo/plasmocitoma resistente à lenalidomida NCI-H929 (H929-1051). Os dias de dosagem são indicados com setas no eixo X.

C. Compostos

[0072] É fornecido aqui o composto 4-(4-(4-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1- oxoisoindolin-4-il)oxi)Metil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitrila referido como “Composto 1”: o

COS

SAS TF NO o o A, 1 ou um enantiômero ou uma mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0073] Em certas modalidades, o composto para uso nas composições e métodos aqui fornecidos é o Composto 1, ou um enantiômero ou uma mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0074] Também é fornecido aqui o composto (S)-4-(4-(4-((2-(2,6- dioxopiperidin-3-il)-1-oxoisoindolin-4-il)oxi)metil)benzil)piperazin-1-i1)-3- fluorobenzonitrila referido como “Composto 2”: o

CO ON NH

DOS AX. 2 ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0075] Em certas modalidades, o composto para uso nas composições e métodos aqui fornecidos é o Composto 2, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0076] Também é fornecido aqui o composto (R)-4-(4-(4-((2-(2,6- dioxopiperidin-3-il)-1-oxoisoindolin-4-il)oxi)metil)benzil)piperazin-1-i1)-3- fluorobenzonitrila referido como “Composto 3”: o

DAS NO o o A, 3 ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0077] Em certas modalidades, o composto para uso nas composições e métodos aqui fornecidos é o Composto 3, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0078] É aqui fornecido o Composto 1. É fornecido aqui um tautômero do Composto 1. É fornecido aqui um enantiômero do Composto 1. É fornecida aqui uma mistura de enantiômeros do Composto 1. É fornecido aqui um sal farmaceuticamente aceitável do Composto 1.

[0079] É aqui fornecido o Composto 2. É fornecido aqui um tautômero de um Composto 2. É fornecido aqui um sal farmaceuticamente aceitável do Composto 2.

[0080] É aqui fornecido o Composto 3. É fornecido aqui um tautômero de um Composto 3. É fornecido aqui um sal farmaceuticamente aceitável do Composto 3.

[0081] Também são aqui fornecidos os análogos isotopicamente enriquecidos dos compostos aqui fornecidos. Enriquecimento isotópico (por exemplo, deuteração ou enriquecimento por deutério) de produtos farmacêuticos para melhorar a farmacocinética (“PK”), farmacodinâmica (“PD”), e perfis de toxicidade, foi demonstrado anteriormente com algumas classes de drogas. Ver, por exemplo, Lijinsky et. al., Food Cosmet. Toxicol., 20:393 (1982); Lijinsky et. al., J. Nat. Cancer Inst., 69:1127 (1982); Mangold et. al., Mutation Res. 308:33 (1994); Gordon et. al., Drug Metab. Dispos., 15:589 (1987); Zello et. al., Metabolism, 43:487 (1994); Gately et. al., J. Nucl. Med, 27:388 (1986); Wade D, Chem. Biol. Interact. 117:191 (1999). Sem ser limitado por nenhuma teoria em particular, o enriquecimento isotópico de um composto pode ser usado, por exemplo, para (1) reduzir ou eliminar metabólitos indesejados, (2) aumentar a meia vida de uma droga parental, (3) diminuir o número de doses necessárias para atingir um efeito desejado, (4) diminuir a quantidade de uma dose necessária para atingir um efeito desejado, (5) aumentar a formação de metabólitos ativos, caso sejam formados, e/ou (6) diminuir a produção de metabólitos deletérios em tecidos específicos, e/ou (g) criar uma droga mais eficaz e/ou mais segura para terapia de combinação, seja a terapia de combinação intencional ou não.

A substituição de um átomo por um de seus isótopos geralmente resultará em uma alteração na taxa de reação de uma reação química.

Esse fenômeno é conhecido como Efeito Isotópico Cinético (“KIE”). Por exemplo, se uma ligação C — H é quebrada durante uma etapa de determinação de taxa em uma reação química (isto é, a etapa com a energia de estado de transição mais alta), a substituição de um hidrogênio por esse hidrogênio causará uma diminuição na taxa de reação e o processo diminuirá.

Esse fenômeno é conhecido como o Efeito Isotópico Cinético de Deutério (“DKIE”). (Ver, por exemplo, Foster et al., Adv.

Drug Res., vol. 14, pp. 1-36 (1985); Kushner et al., Can.

J.

Physiol.

Pharmacol., vol. 77, pp. 79-88 (1999)). A magnitude do DKIE pode ser expressa como a razão entre as taxas de uma dada reação em que a ligação C-H é quebrada, e a mesma reação onde deutério é substituído por hidrogênio.

O DKIE pode variar de cerca de 1 (sem efeito isotópico) a números muito grandes, como 50 ou mais, o que significa que a reação pode ser cinquenta ou mais vezes mais lenta quando o deutério é substituído por hidrogênio.

Sem ser limitado por uma teoria em particular, os altos valores de DKIE podem ser devidos em parte a um fenômeno conhecido como tunelamento, que é uma consequência do princípio da incerteza.

O tunelamento é atribuído à pequena massa de um átomo de hidrogênio, e ocorre porque os estados de transição envolvendo um próton podem às vezes se formar na ausência da energia de ativação requerida.

Como o deutério tem mais massa que o hidrogênio, estatisticamente tem uma probabilidade muito menor de sofrer esse fenômeno.

[0082] O trítio (“T”) é um isótopo radioativo do hidrogênio, utilizado em pesquisas, reatores de fusão, geradores de nêutrons e radiofarmacêuticos. O trítio é um átomo de hidrogênio que tem 2 nêutrons no núcleo e um peso atômico próximo a 3. Ocorre naturalmente no ambiente em concentrações muito baixas, mais comumente encontrado como T7O. O trítio decai lentamente (meia-vida = 12,3 anos) e emite uma partícula beta de baixa energia que não consegue penetrar na camada externa da pele humana. À exposição interna é o principal risco associado a este isótopo, mas deve ser ingerido em grandes quantidades para representar um risco significativo para a saúde. Em comparação com o deutério, uma quantidade menor de trítio deve ser consumida antes de atingir um nível perigoso. A substituição de trítio (“T”) por hidrogênio resulta em uma ligação ainda mais forte do que o deutério e produz efeitos isotópicos numericamente maiores.

[0083] Da mesma forma, a substituição de isótopos por outros elementos, incluindo, mas não limitados a, *C ou “C por carbono, *S, 3ºS, ou ?ºS por enxofre, *N por nitrogênio e O ou *ºO por oxigênio, proporcionará um efeito isotópico cinético semelhante.

[0084] O corpo do animal expressa uma variedade de enzimas com o objetivo de eliminar substâncias estranhas, como agentes terapêuticos, do seu sistema de circulação. Exemplos de tais enzimas incluem as enzimas do citocromo P450 (“CYPs”), esterases, proteases, redutases, desidrogenases e monoamina oxidases, para reagir e converter essas substâncias estranhas em intermediários ou metabólitos mais polares para excreção renal. Algumas das reações metabólicas mais comuns de compostos farmacêuticos envolvem a oxidação de uma ligação carbono-hidrogênio (C-H) a uma ligação pi carbono-

oxigênio (C-O) ou carbono-carbono (C-C). Os metabólitos resultantes podem ser estáveis ou instáveis sob condições psicológicas, e podem ter perfis farmacocinéticos, farmacodinâmicos, e de toxicidade a longo prazo relativas aos compostos de origem. Para muitas drogas, essas oxidações são rápidas. Como resultado, essas drogas geralmente requerem a administração de doses diárias múltiplas ou altas.

[0085] O enriquecimento isotópico em certas posições de um composto aqui fornecido pode produzir um KIE detectável que afeta os perfis farmacocinéticos, farmacológicos e/ou toxicológicos de um composto aqui fornecido em comparação com um composto semelhante com uma composição isotópica natural. Numa modalidade, o enriquecimento de deutério é realizado no sítio da clivagem da ligação C-H durante o metabolismo.

[0086] Numa modalidade, é aqui proporcionado um isotopólogo do Composto 1, ou um enantiômero ou uma mistura de enantiômeros, tautômero ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em algumas modalidades, o isotopólogo do Composto 1 é um Composto 1 enriquecido com deutério, ou um enantiômero ou uma mistura de enantiômeros, tautômero ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em algumas modalidades, o isotopólogo do Composto 1 é um Composto 1 enriquecido com deutério, ou um enantiômero ou uma mistura de enantiômeros, tautômero ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, onde o enriquecimento de deutério ocorre no centro quiral. Numa modalidade, é aqui proporcionado um isotopólogo do Composto 2, ou um tautômero, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em algumas modalidades, o isotopólogo do Composto 2 é um Composto 2 enriquecido com deutério, ou um tautômero ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em algumas modalidades, o isotopólogo do Composto 2 é um Composto 2 enriquecido com deutério, ou um tautômero ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, onde o enriquecimento de deutério ocorre no centro quiral.

[0087] Em certas modalidades, são aqui fornecidos isotopólogos de 4-(4-(4 -(((2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1-oxoisoindolin-4-il)oxi)metil)benzil)piperazin-1- il)-3-fluorobenzonitrila, ou um enantiômero ou uma mistura de enantiômeros, tautômero ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que uma ou mais posições atômicas da mólecula de 4-(4-(4-(((2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1- oxoisoindolin-4-il)oxi)Metil)benzil)piperazin-1-i1)-3-fluorobenzonitrila é/são isotopicamente enriquecidas, por exemplo com deutério. Certas modalidades aqui fornecidas fornecem compostos da seguinte fórmula: Yê o o 7 Yº N NA o NAL 7 Y E Yo Yi Yo Y vVvy Y2 Ys nt Ys Ys 2 vao NL A Ye y2º N ye Es NC Y 20 yo F em que um ou mais átomos Y (isto é, V4, Y2, Y3, W9, NS, WS, W7, W8, 9, YO, VAI, Yº, vB, Y", Y", Y", Y", Y, Yº, Yo, Yo, Yº, YP, YA, Y, Y2, YP, YP, Yº, e Yo) é/são hidrogênio(s) isotopicamente enriquecido com deutério, e qualquer átomo Y restante é/são átomo(s) de hidrogênio não enriquecido(s).

[0088] Numa modalidade, o composto é da seguinte fórmula:

Y oo xP Yº N N=— o Yo r Yo Yi Yi 1 Y 2 3 no vo Y 2 Ys Ns Y"s vs 23 Yx ALA DE vs y2º N Yº2 Yo ó NC Fr Y 20 yo

[0089] Numa modalidade, o composto é da seguinte fórmula: Yê o oO vz Yº N Ni, o 1º e Ys Yi

DR ANTANIS A n Y 28 no voy 2 Ys No Y"ô vs 23 vs AAA 7 vo no y2º N y2 V21 NC r Y 20 yo

[0090] Em certas modalidades, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove, vinte, vinte e um, vinte e um dois, vinte e três, vinte e quatro, vinte e cinco, vinte e seis, vinte e sete, vinte e oito, vinte e nove ou todos os átomos Y indicados são isotopicamente enriquecidos com deutério e qualquer átomo Y restante (s) é/são hidrogênio(s) não enriquecido (s). Numa modalidade, um dos átomos Y indicados é enriquecido isotopicamente com deutério, e quaisquer átomos Y restantes são hidrogênios não enriquecidos. Numa modalidade, Y* é enriquecido com deutério.

[0091] Em certas modalidades, um ou mais átomos Y na porção glutarimida dos compostos (Y%, Y2, Y3, Y%4, Y5, e Y”!) são enriquecidos com deutério. Em certas modalidades, um ou mais átomos Y na porção isoindolinona dos compostos (Y5, YZ, Y8, Yº, e Y*º) são enriquecidos com deutério. Em certas modalidades, um ou mais átomos de Y na porção fenilalquil dos compostos (Y*4, YP2, y13, V4, yº5, yl6, Y!”, e YV8) são enriquecidos com deutério. Em certas modalidades, um ou mais átomos Y na porção piperazina dos compostos (Y*º, Y20, V2L, V22, 23, 24, Yo, e Y?5) são enriquecidos com deutério. Em certas modalidades, um ou mais átomos Y na porção distante do anel fenil dos compostos (Y?8, Yºº, e Y%º) são enriquecidos com deutério. Um composto aqui fornecido pode ser qualquer combinação de enriquecimentos de deutério, como aqui divulgado. Em outras palavras, qualquer combinação da porção glutarimida enriquecida com deutério, porção disoindolina enriquecida com deutério, porção fenilalquil enriquecida com deutério, porção de piperazina enriquecida com deutério e porção distante do anel de fenil enriquecido com deutério é aqui abrangida.

[0092] Numa modalidade, Y* e Y? são enriquecidos com deutério e quaisquer átomos Y restantes são hidrogênios não enriquecidos. Numa modalidade, Y? e Yº são enriquecidos com deutério e quaisquer átomos Y restantes são hidrogênios não enriquecidos. Numa modalidade, Yº é enriquecido com deutério e quaisquer átomos Y restantes são hidrogênios não enriquecidos. Numa modalidade, Y* a Yº são enriquecidos com deutério e quaisquer átomos Y restantes são hidrogênios não enriquecidos. Numa modalidade, Y? a Yº são enriquecidos com deutério e quaisquer átomos Y restantes são hidrogênios não enriquecidos. Numa modalidade, Yº e Y? são enriquecidos com deutério e quaisquer átomos Y restantes são hidrogênios não enriquecidos. Numa modalidade, Y8 a Y*º são enriquecidos com deutério e quaisquer átomos Y restantes são hidrogênios não enriquecidos. Numa modalidade, Y*! e Y"º são enriquecidos com deutério e quaisquer átomos Y restantes são hidrogênios não enriquecidos. Numa modalidade, Y*? a Y"*º são enriquecidos com deutério e quaisquer átomos Y restantes são hidrogênios não enriquecidos. Numa modalidade, Y"? e Y*8 são enriquecidos com deutério e quaisquer átomos Y restantes são hidrogênios não enriquecidos. Numa modalidade, Y"! a Y"8 são enriquecidos com deutério e quaisquer átomos Y restantes são hidrogênios não enriquecidos. Numa modalidade, Y*? a Yºº são enriquecidos com deutério e quaisquer átomos Y restantes são hidrogênios não enriquecidos. Numa modalidade, Y”' é enriquecido com deutério e quaisquer átomos Y restantes são hidrogênios não enriquecidos. Numa modalidade, Y*º a Y*º são enriquecidos com deutério e quaisquer átomos Y restantes são hidrogênios não enriquecidos.

[0093] Numa modalidade, o isotopólogo do Composto 1 é o Composto 1- D: o a Sá” NA o o A, (1-D).

[0094] Numa outra modalidade, o isotopólogo do Composto 1 é uma mistura de o Ne o ON D ) NH CS o º e

NC F P Nº o ON D ) NH

MES A NC F :

[0095] Em ainda uma outra modalidade, o Composto da Fórmula Il é o Composto 2-D o N= o ON D )—NH me me

NC F (2-D).

[0096] Em ainda uma outra modalidade, o isotopólogo do Composto 3 é o Composto 3-D o Nº) o

ON D NH me me

NC F (3-D).

[0097] Em certas modalidades, qualquer uma das posições enriquecidas com deutério possui independentemente uma abundância de deutério de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90 %, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou cerca de 100%. Numa modalidade, Yº é enriquecido com deutério e tem uma abundância de deutério de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos

50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou cerca de 100%.

[0098] Numa modalidade, o D (no centro quiral) no Composto 1-D tem uma abundância de deutério de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou cerca de 100%. Numa modalidade, o D tem uma abundância de deutério de pelo menos 90%.

[0099] Numa modalidade, o D (no centro quiral) no Composto 2-D tem uma abundância de deutério de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou cerca de 100%. Numa modalidade, o D tem uma abundância de deutério de pelo menos 90%.

[00100] Numa modalidade, o D (no centro quiral) no Composto 3-D tem uma abundância de deutério de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou cerca de 100%. Numa modalidade, o D tem uma abundância de deutério de pelo menos 90%.

[00101] Em certas modalidades, um composto enriquecido com deutério fornecido aqui tem excesso enantiomérico de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%. Exemplos adicionais da pureza estereoisomérica incluem um excesso enantiomérico de pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85,

86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99%.

[00102] Numa modalidade, o composto 2-D tem excesso enantiomérico de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70 %, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%. Numa modalidade, o Composto 2-D tem excesso enantiomérico de pelo menos 90%.

[00103] Numa modalidade, o composto 3-D tem excesso enantiomérico de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70 %, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%. Numa modalidade, o composto 3-D tem excesso enantiomérico de pelo menos 90%.

[00104] Os compostos enriquecidos com deutério fornecidos aqui podem ser preparados de acordo com o esquema sintético e os exemplos aqui fornecidos, mas usando o(s) material(is) iniciallis) correspondente(s) enriquecido(s) com deutério correspondente. Os compostos enriquecidos em deutério fornecidos neste documento também podem ser preparados de acordo com a química geral conhecida pelos versados na técnica para preparar compostos de isoindolinona e glutarimida enriquecidos com deutério, incluindo, mas não se limitando, aos descritos em WO 2014/039421 e WO 2014/116573, a totalidade de cada uma das quais é incorporada aqui por referência.

D. Preparação de Composto 1, Composto 2 e Composto 3

[00105] Os compostos aqui fornecidos podem ser preparados por métodos conhecidos por um versado na técnica e seguindo procedimentos semelhantes aos descritos na seção Exemplos aqui e modificações de rotina dos mesmos. Um esquema de reação exemplificativo para a preparação dos compostos é ilustrado abaixo no Esquema 1 para o Composto 1, Composto 2 e Composto 3 e Esquema 2 para o Composto 2.

[00106] Como mostrado no Esquema 1, a proteção do ácido 3-hidroxi-2- metilbenzoico (por, por exemplo, formação de éster metílico e terc- butil(dimetil)sililéter) foi seguida por brominação, por exemplo, usando N- bromossuccinimida e azobisisobutironitrila. Reação com metil-4,5-diamino-5- oxo-pentanoato (também conhecido como H-D,L-Glu(OMe)-NH>2), na presença de uma base (como DIEA), resultou na formação de isoindolina derivatizada, seguida pela desproteção de TBS usando uma base, como carbonato de potássio. A reação da isoindolina derivatizada com 1,4-bis (bromometil) benzeno na presença de uma base (como carbonato de potássio) foi seguida pela formação de glutarimida na presença de terc-butóxido de potássio. Finalmente, a reação com 3-fluoro-4-(piperazin-1-il)benzonitrila proporcionou o Composto 1 alvo. A separação quiral fornece o Composto 2 e o Composto 3.

o o q o o Ve oe O MeoH S" TBS-CI NBS Br H7SO, AIBN oH 2 OH "one si< iPrOAc sí iK OX o Q / N o H-D,L-Glu(OMe)-NH2-HCI Lo —K20Os à ACN, DIEA Dq CANA NH, OH o ” Br, Br o o o CD Br Ç. tBuOK Tv COS ——- N > NH K2CO;, AcN O NH2 = THA 780 Os o o o o

OX NH OO OO - CX

NC F DIEA, AcN Esquema 1

[00107] Alternativamente, como exemplificado no Esquema 2, a reação do intermediário metil 2-(bromometil)-3-[terc-butil (dimetil)silil] oxi-benzoato com o intermediário quiral de terc-butil (4S5)-4,5-diamino-5-oxopentanoato (também conhecido como H-L-Glu(OtBu)-NH>; reação com H-D-Glu(OtBu)-NH, fornece o enantiômero oposto), na presença de uma base (como DIEA), resultou na formação de isoindolina derivatizada, que foi seguida pela desproteção de TBS usando fluoreto de tetrabutilamônio. A reação da isoindolina derivatizada com 4-(4- (4- (clorometil)benzil)piperazin-1-i1)-3- fluorobenzonitrila, ou um sal do mesmo, na presença de uma base (como carbonato de potássio), seguida da desproteção e a formação de glutarimida proporcionaram o Composto 2 alvo.

o o o o Me Me me (ma, CO, MeOH o TBS-CI NBS Br H2SOs Imidazo|, O. 4IBN [oa OH OH DMF X< iPrOAc Pr o o a N o no o o H-L-Glu(OtBu)-NH2-HCI TBAF , ACN, DIEA de 7tBu MeOH N em. X Êo NH? OH o o o o o K2CO3, DMF, 45 ºC N ACN, 85 ºC N o CI NH? Ácido Nº o o benzenossulfônico — O o

FO ON

NE FO ON F ON NO nO

NC NC' NC Esquema 2.

[00108] Um versado na técnica saberia como modificar os procedimentos estabelecidos nos esquemas e exemplos ilustrativos para chegar aos produtos desejados.

[00109] Em um aspecto, são aqui fornecidos métodos para preparar o Composto 1, o N o

ON NH [oa o

NC F

1.

ou um enantiômero ou uma mistura de enantiômeros, tautômero, ou isotopólogo do mesmo, os métodos compreendendo contatar o Composto 1a o

E CO

NH Os o 1a, ou um enantiômero ou uma mistura de enantiômeros, tautômero ou isotopólogo do mesmo, com 3-fluoro-4-(piperazin-1-il)benzonitrila, num solvente orgânico na presença de uma base, em condições adequadas para fornecer o Composto 1; em que X é um grupo de saída.

[00110] Numa modalidade, o método é um método para preparar um enantiômero do Composto 1, por exemplo, Composto 2, o

COS AS TF" NE o o AX. 2, o método compreendendo contatar um enantiômero do Composto 1a, por exemplo, Composto 2a o

UK COS

NH Os o 2a com 3-fluoro-4-(piperazin-1-il)benzonitrila, num solvente orgânico na presença de uma base, em condições adequadas para fornecer o Composto 2; em que X é um grupo de saída.

[00111] Numa modalidade, X é halogênio, por exemplo Br ou Cl. Numa outra modalidade, X é metanossulfonato (também conhecido como -OMs). Numa modalidade, o solvente é acetonitrila, THF ou DMSO. Em outra, a base é

DIEA ou TEA. Em algumas modalidades, o contato é realizado a temperatura elevada, por exemplo, de cerca de 35ºC a cerca de 50ºC.

[00112] Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda preparar o Composto 1a, o * N o

NH . o 1a, ou um enantiômero ou uma mistura de enantiômeros, tautômero, ou isotopólogo do mesmo, os métodos compreendendo contatar o composto 1b / o o o * N NH> o o 1b, ou um enantiômero ou uma mistura de enantiômeros, tautômero ou isotopólogo do mesmo, com potássio tert-butóxido, num solvente orgânico, em condições adequadas para fornecer o Composto 1a.

[00113] Numa modalidade, o método é um método para preparar um enantiômero do Composto 1a, por exemplo, Composto 2a, o * N o

NH o o 29, o método compreendendo contatar um enantiômero do Composto 1b, por exemplo, Composto 2b

/

O o o x

N SL. . o 2b com potássio tert-butóxido, num solvente orgânico, em condições adequadas para fornecer o Composto 2a.

[00114] Em uma modalidade, X é Br. Numa modalidade, o solvente é THF. Em algumas modalidades, o contato é realizado a temperatura reduzida, por exemplo, de cerca de 70ºC a cerca de 80ºC.

[00115] Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda preparar o Composto 1b, / o o o * N NH, o o 1b, ou um enantiômero ou uma mistura de enantiômeros, tautômero, ou isotopólogo do mesmo, os métodos compreendendo contatar o composto 1c / o o o

N NH> OH o lc, ou um enantiômero ou uma mistura de enantiômeros, tautômero, ou isotopólogo do mesmo, com Br x Y ,

num solvente orgânico, na presença de uma base, em condições adequadas para fornecer o Composto 1b.

[00116] Numa modalidade, o método é um método para preparar um enantiômero do Composto 1b, por exemplo, Composto 2b, /

O o o * N NH? o o 2b, o método compreendendo contatar um enantiômero do Composto 1c, por exemplo, Composto 2c / o o o

N NH, OH o 2c com Br x Y num solvente orgânico, na presença de uma base, em condições adequadas para fornecer o Composto 1b.

[00117] Em uma modalidade, X é Br. Numa modalidade, o solvente é acetonitrila. Em algumas modalidades, a base é carbonato de potássio. Em algumas modalidades, o contato é realizado a temperatura elevada, por exemplo, de cerca de 50ºC a cerca de 70ºC.

[00118] Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda preparar o Composto 1c,

/ o o o

N NH? OH o lc, ou um enantiômero ou uma mistura de enantiômeros, tautômero, ou isotopólogo do mesmo, os métodos compreendendo contatar o composto 1d / o o o

N NH? ores O 1d, ou um enantiômero ou uma mistura de enantiômeros, tautômero ou isotopólogo do mesmo, com uma base em um solvente orgânico, em condições adequadas para fornecer o Composto 1c.

[00119] Numa modalidade, o método é um método para preparar um enantiômero do Composto 1c, por exemplo, Composto 2c, / o o o

N NH? OH o 2c, o método compreendendo contatar um enantiômero do Composto 1d, por exemplo, Composto 2d / o o o

N NH> ores O

2d com uma base num solvente, em condições adequadas para proporcionar o Composto 2c.

[00120] Numa modalidade, o solvente é água. Em algumas modalidades, a base é carbonato de potássio.

[00121] EM algumas modalidades, os métodos compreendem ainda preparar o Composto 1d, d o o

ÓS NH? ores O 1d, ou um enantiômero ou uma mistura de enantiômeros, tautômero, ou isotopólogo do mesmo, os métodos compreendendo contatar o composto 1e CcooMe ne o le, ou um enantiômero ou uma mistura de enantiômeros, tautômero ou isotopólogo, com metil 2-(bromometil)-3-[terc-butil (dimetil)sililJoxi-benzoato em um solvente, na presença de uma base, sob condições adequadas para fornecer o Composto 1d.

[00122] Numa modalidade, o método é um método para preparar um enantiômero do Composto 1d, por exemplo, Composto 2d,

dd o o ÓE. NH>2 ores O 2d, o método compreendendo contatar um enantiômero do Composto 1e, por exemplo, Composto 2e CcooMe ho o 2e com metil 2-(bromometil)-3-[terc-butil (dimetil)sililJoxi-benzoato em um solvente, na presença de uma base, sob condições adequadas para fornecer o Composto 2d.

[00123] Numa modalidade, o solvente é acetonitrila. Em algumas modalidades, a base é DIEA. Em algumas outras modalidades, o contato é realizado a temperatura elevada, por exemplo, de cerca de 50ºC a cerca de 70ºC.

[00124] Em um outro aspecto, são aqui fornecidos métodos para preparar o Composto 1, o ALT” NU o o AX.

1.

ou um enantiômero ou uma mistura de enantiômeros, tautômero, ou isotopólogo do mesmo, os métodos compreendendo contatar o Composto 1f o o o

N

ON NH ar A

NC F 1, ou um enantiômero ou uma mistura de enantiômeros, tautômero ou isotopólogo do mesmo, com um ácido, num solvente orgânico, em condições adequadas para fornecer o Composto 1.

[00125] Numa modalidade, o método é um método para preparar um enantiômero do Composto 1, por exemplo, Composto 2, o N o

ON NH e me

NC F 2, o método compreendendo contatar um enantiômero do Composto 1f, por exemplo, Composto 2f o o o

N ON NH, om me

NC F 2f com um ácido, num solvente orgânico, em condições adequadas para fornecer o Composto 2.

[00126] Numa modalidade, o solvente é acetonitrila. Em outro, o ácido é o ácido benzeno sulfônico. Em algumas modalidades, o contato é realizado a temperatura elevada, por exemplo, de cerca de 75ºC a cerca de 95ºC.

[00127] Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda preparar o Composto 1f,

É o o Ó£. DOS SS" NE o o

AX UH, ou um enantiômero ou uma mistura de enantiômeros, tautômero, ou isotopólogo do mesmo, os métodos compreendendo contatar o Composto 1g

É o o ES. NH? OH o 18, ou um enantiômero ou uma mistura de enantiômeros, tautômero ou isotopólogo do mesmo, com 4-(4-(4-(4- (clorometil)benzil)piperazin-1-i1)-3- fluorobenzonitrila ou um sal do mesmo, em um solvente, na presença de uma base, sob condições adequadas para fornecer o Composto 1f.

[00128] Numa modalidade, o método é um método para preparar um enantiômero do Composto 1f, por exemplo, Composto 2f,

É o o br.

CO NH2 NE o o

AX 2f, o método compreendendo contatar um enantiômero do Composto 1g, por exemplo, Composto 2g

É o o ES. NH? OH 9 28 com 4-(4-(4-(clorometil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitrila ou um sal do mesmo, em um solvente, na presença de uma base, sob condições adequadas para fornecer o Composto 2f.

[00129] Numa modalidade, o solvente é DMF. Numa modalidade, o solvente é DMSO. Em outra, a base é carbonato de potássio. Em algumas modalidades, o contato é realizado a temperatura elevada, por exemplo, de cerca de 35ºC a cerca de 55ºC.

[00130] Em algumas modalidades, os métodos para preparar o Composto 1f compreendem ainda um método de purificação, o método de purificação compreendendo (i) contatar o Composto 1f (base livre) com um ácido em um primeiro solvente; (ii) filtrar para proporcionar o sal ácido do Composto 1f; e (iii) lavagem do sal ácido do Composto 1f em um segundo solvente com uma base para fornecer o Composto 1f (base livre). Numa modalidade, o ácido é ácido tartárico (por exemplo, ácido L-tartárico). Numa modalidade, o primeiro solvente é metanol. Numa modalidade, o sal ácido do Composto 1f é um sal tartarato (por exemplo, sal do ácido L-tartárico) do Composto 1f. Numa modalidade, o segundo solvente é 2-metiltetra-hidrofurano. Numa modalidade, a base é carbonato de potássio.

[00131] Em algumas modalidades, os métodos para preparar um enantiômero do Composto 1f, por exemplo, Composto 2f compreendem ainda um método de purificação, o método de purificação compreendendo (i) contatar o Composto 2f (base livre) com um ácido em um primeiro solvente; (ii) filtrar para proporcionar o sal ácido do Composto 2f; e (iii) lavagem do sal ácido do Composto 2f em um segundo solvente com uma base para fornecer o Composto 2f (base livre). Numa modalidade, o ácido é ácido tartárico (por exemplo, ácido L-tartárico). Numa modalidade, o primeiro solvente é metanol. Numa modalidade, o sal ácido do Composto 2f é um sal tartarato (por exemplo, sal do ácido L-tartárico) do Composto 2f. Numa modalidade, o segundo solvente é 2-metiltetra-hidrofurano. Numa modalidade, a base é carbonato de potássio.

[00132] Em algumas modalidades, os métodos compreendem preparar 4- (4-(4-(clorometil)benzil)piperazin-1-il)-3fluorobenzonitrila, ou um sal do mesmo, os métodos compreendendo contatar 4-(clorometil)benzaldeído com 3-fluoro-4-(piperazin-1-il)benzonitrila, num solvente, na presença de um agente redutor, em condições adequadas para proporcionar 4-(4-(4- (clorometil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitrila.

[00133] Numa modalidade, o agente redutor é triacetoxiboro-hidreto de sódio (NaBH(OAc)a). Numa modalidade, o solvente é tolueno. Numa modalidade, o contato é realizado na presença de um ácido. Numa modalidade, o ácido é ácido acético.

[00134] Numa modalidade, o 4-(4-(4-(clorometil)benzil)piperazin-1-il)-3-

fluorobenzonitrila, ou um sal do mesmo, preparado e usado nos métodos aqui fornecidos é um sal de HCl de 4- (4-(4-(clorometil)benzil)piperazin-1-i1)-3- fluorobenzonitrila. Numa modalidade, o sal HCI é preparado contatando a base livre de 4-(4-(4-(clorometil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitrila com ácido clorídrico em isopropanol. E. Método para Tratamento e/ou Prevenção

[00135] Surpreendentemente, verificou-se que o Composto 1, o Composto 2 e o Composto 3 são compostos anti-mieloma muito potentes que possuem características distintivas, como um perfil de segurança aprimorado, incluindo morte celular seletiva de células do mieloma múltiplo em comparação com células normais, atividade reduzida em receptores fora do alvo e inibição reduzida da enzima CYP, reduzindo o potencial de interações medicamentosas adversas.

[00136] Numa modalidade, é aqui fornecido um método de tratamento de mieloma múltiplo, que compreende administrar um paciente do Composto 1, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Numa modalidade, aqui fornecido é o Composto 1, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para uso em um método de tratamento de mieloma múltiplo, em que o método compreende administrar o referido composto a um paciente.

[00137] Numa modalidade, é aqui fornecido um método de tratamento de mieloma múltiplo, que compreende administrar a um paciente o Composto 2, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Numa modalidade, aqui fornecido é o Composto 2, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para uso em um método de tratamento de mieloma múltiplo, em que o método compreende administrar o referido composto a um paciente.

[00138] Numa modalidade, é aqui fornecido um método de tratamento de mieloma múltiplo, que compreende administrar a um paciente o Composto 3, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Numa modalidade, aqui fornecido é o Composto 3, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para uso em um método de tratamento de mieloma múltiplo, em que o método compreende administrar o referido composto a um paciente.

[00139] Numa modalidade, é aqui fornecido um método de prevenção de mieloma múltiplo, que compreende administrar um paciente um composto aqui fornecido, por exemplo, Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Numa modalidade, é aqui fornecido um composto aqui fornecido, por exemplo, Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para uso em um método de prevenção de mieloma múltiplo, em que o método compreende o referido composto para um paciente.

[00140] Numa outra modalidade, é aqui fornecido um método de gerenciamento de mieloma múltiplo, que compreende administrar a um paciente um composto aqui fornecido, por exemplo, Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Numa modalidade, é aqui fornecido um composto aqui fornecido, por exemplo, Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para uso em um método de gerenciamento de mieloma múltiplo, em que o método compreende administrar o referido composto a um paciente.

[00141] Numa modalidade, também são aqui fornecidos métodos para induzir uma resposta terapêutica avaliada com os Critérios Internacionais de Resposta Uniforme para Mieloma Múltiplo (IURC) (ver, Durie BGM, Harousseau J-L, Miguel JS, et al. International uniform response criteria for multiple myeloma. Leukemia, 2006; (10) 10:1-7) de um paciente, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um composto aqui descrito, por exemplo, Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, a um paciente com mieloma múltiplo. Em outra modalidade, são aqui fornecidos métodos para obter uma resposta completa rigorosa, resposta completa ou resposta parcial muito boa, conforme determinado pelos Critérios Internacionais de Resposta Uniforme para Mieloma Múltiplo (IURC) em um paciente, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um composto aqui descrito, por exemplo, Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ao paciente com mieloma múltiplo. Numa outra modalidade, são aqui fornecidos métodos para alcançar um aumento na sobrevida global, sobrevida livre de progressão, sobrevida livre de eventos, tempo para progressão ou sobrevida livre de doença em um paciente, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um composto aqui descrito, por exemplo, Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ao paciente com mieloma múltiplo. Numa outra modalidade, são aqui fornecidos métodos para alcançar um aumento na sobrevida global em um paciente, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um composto aqui descrito, por exemplo, Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, a um paciente com mieloma múltiplo. Numa outra modalidade, são aqui fornecidos métodos para alcançar um aumento na sobrevida livre de progressão em um paciente, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um composto aqui descrito, por exemplo, Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, a um paciente com mieloma múltiplo. Numa outra modalidade, são aqui fornecidos métodos para alcançar um aumento na sobrevida livre de eventos em um paciente, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um composto aqui descrito, por exemplo, Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, a um paciente com mieloma múltiplo. Numa outra modalidade, são aqui fornecidos métodos para alcançar um aumento no tempo da progressão em um paciente, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um composto aqui descrito, por exemplo, Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, a um paciente com mieloma múltiplo. Numa outra modalidade, são aqui fornecidos métodos para alcançar um aumento na sobrevida livre de doenças em um paciente, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um composto aqui descrito, por exemplo, Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, a um paciente com mieloma múltiplo.

[00142] Também são fornecidos aqui métodos de tratamento de pacientes que tenham sido previamente tratados quanto ao mieloma múltiplo, mas que não respondem a terapias convencionais, bem como aqueles que não tenham sido previamente tratados. Adicionalmente abrangidos são os métodos de tratamento de pacientes submetidos à cirurgia na tentativa de tratar mieloma múltiplo, bem como aqueles que não o fizeram. Também são fornecidos neste documento métodos de tratamento de pacientes que foram submetidos à terapia de transplante anteriormente, bem como aqueles que não o fizeram.

[00143] Os métodos aqui fornecidos incluem tratar o mieloma múltiplo que é recidivado, refratário ou resistente. Os métodos aqui fornecidos incluem prevenir o mieloma múltiplo que é recidivado, refratário ou resistente. Os métodos aqui fornecidos incluem gerenciar o mieloma múltiplo que é recidivado, refratário ou resistente. Em algumas dessas modalidades, o mieloma é mieloma múltiplo primário, secundário, terciário, quádruplo ou quintuplicado. Numa modalidade, os métodos aqui fornecidos reduzem, mantêm ou eliminam a doença residual mínima (MRD). Numa modalidade, os métodos aqui fornecidos abrangem o tratamento, prevenção Ou gerenciamento de vários tipos de mieloma múltiplo, como gamopatia monoclonal de significado indeterminado (MGUS), mieloma múltiplo de baixo risco, risco intermediário e alto risco, mieloma múltiplo recém-diagnosticado (incluindo mieloma múltiplo recém-diagnosticado de baixo risco, risco intermediário e alto risco), mieloma múltiplo elegível para transplante e inelegível para transplante, mieloma múltiplo fumegante (indolente) (incluindo mieloma múltiplo fumegante de baixo risco, risco intermediário e alto risco), mieloma múltiplo ativo, plasmocitoma solitário, plasmocitoma extramedular, leucemia de células plasmáticas, mieloma múltiplo do sistema nervoso central, mieloma de cadeia leve, mieloma não secretório, mieloma de imunoglobulina

D e mieloma de imunoglobulina E, administrando uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto aqui descrito. Em outra modalidade, os métodos aqui fornecidos englobam o tratamento, prevenção ou gerenciamento de mieloma múltiplo caracterizado por anormalidades genéticas, como translocações de Ciclina D (por exemplo, t (11; 14) (913; 932); t (6; 14) (p21; 32); t (12; 14) (p13; 932); ou t (6; 20);); translocações MMSET (por exemplo, t (4; 14) (p16; q32)); translocações de MAF (por exemplo, t (14; 16) (932; 932); t (20; 22); t (16; 22) (911; 913); ou t (14; 20) (932; q11)); ou outros fatores cromossômicos (por exemplo, deleção de 17p13 ou cromossomo 13; del (17/17p), não hiperdiploidia e ganho(19)), administrando uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto aqui descrito.

[00144] Numa modalidade, os métodos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Numa outra modalidade, os métodos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 2, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Numa modalidade, os métodos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 3, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[00145] Em algumas modalidades, os métodos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como terapia de indução. Numa outra modalidade, os métodos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 2, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como terapia de indução. Numa modalidade, os métodos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 3, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como terapia de indução. Em algumas modalidades, os métodos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como terapia de consolidação. Numa outra modalidade, os métodos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 2, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como terapia de consolidação. Numa modalidade, os métodos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 3, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como terapia de consolidação. Em algumas modalidades, os métodos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como terapia de manutenção. Numa outra modalidade, os métodos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 2, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como terapia de manutenção. Numa modalidade, os métodos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 3, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como terapia de manutenção.

[00146] Numa modalidade particular dos métodos aqui descritos, o mieloma múltiplo é a leucemia de células plasmáticas.

[00147] Numa modalidade dos métodos aqui descritos, o mieloma múltiplo é um mieloma múltiplo de alto risco. Em algumas dessas modalidades, o mieloma múltiplo de alto risco é recidivante ou refratário. Numa modalidade,

o mieloma múltiplo de alto risco é o mieloma múltiplo que é recidivado dentro de 12 meses após o primeiro tratamento. Em ainda outra modalidade, o mieloma múltiplo de alto risco é o mieloma múltiplo que é caracterizado por anormalidades genéticas, por exemplo, um ou mais de del (17/17p) e t(14;16)(932;932). Em algumas dessas modalidades, o mieloma múltiplo de alto risco é recidivante ou refratário a um, dois ou três tratamentos anteriores.

[00148] Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado por uma mutação p53. Numa modalidade, a mutação p53 é uma mutação 0331. Numa modalidade, a mutação p53 é uma mutação R273H. Numa modalidade, a mutação p53 é uma mutação K132. Numa modalidade, a mutação p53 é uma mutação K132N. Numa modalidade, a mutação p53 é uma mutação R337. Numa modalidade, a mutação p53 é uma mutação R337L. Numa modalidade, a mutação p53 é uma mutação W146. Numa modalidade, a mutação p53 é uma mutação S261. Numa modalidade, a mutação p53 é uma mutação S261T. Numa modalidade, a mutação p53 é uma mutação E286. Numa modalidade, a mutação p53 é uma mutação E286K. Numa modalidade, a mutação p53 é uma mutação R175. Numa modalidade, a mutação p53 é uma mutação R175H. Numa modalidade, a mutação p53 é uma mutação E258. Numa modalidade, a mutação p53 é uma mutação E258K. Numa modalidade, a mutação p53 é uma mutação A161. Numa modalidade, a mutação p53 é uma mutação A161T.

[00149] Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado por deleção homozigótica de p53. Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado por deleção homozigótica do tipo selvagem p53.

[00150] Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado por p53 de tipo selvagem.

[00151] Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado por ativação de um ou mais drivers oncogênicos. Numa modalidade, os um ou mais drivers oncogênicos são selecionados do grupo que consiste em C-MAF, MAFB, FGFR3, MMset, Ciclina D1 e Ciclina D. Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado pela ativação de C-MAF. Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado por ativação de MAFB. Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado por ativação de FGFR3 e MMset. Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado pela ativação de C-MAF, FGFR3, e MMset. Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado por ativação de Ciclina D1. Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado por ativação de MAFB e Ciclina D1. Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado por ativação de Ciclina D.

[00152] Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado por uma ou mais translocações cromossômicas. Numa modalidade, a translocação cromossômica é t(14;:16). Numa modalidade, a translocação cromossômica é t(14;20). Numa modalidade, a translocação cromossômica é t(4;14)Numa modalidade, as translocações cromossômicas são t(4;14) e t(14;16). Numa modalidade, a translocação cromossômica é t(11;14)Numa modalidade, a translocação cromossômica é t(6;20). Numa modalidade, a translocação cromossômica é t(20;22). Numa modalidade, as translocações cromossômicas são t(6;20) e t(20;22). Numa modalidade, a translocação cromossômica é t(16;22). Numa modalidade, as translocações cromossômicas são t(14;16) e t(16;22). Numa modalidade, as translocações cromossômicas são t(14;20) e t(11;14).

[00153] Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado por uma mutação p53 0331, por ativação de C-MAF e por uma translocação cromossômica em t(14;:16). Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado por deleção homozigótica de p53, por ativação de C-MAF e por uma translocação cromossômica em t(14;16). Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado por uma mutação p53 K132N, pela ativação de MAFB, e por uma translocação cromossômica em t(14;20). Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado por p53 de tipo selvagem, por ativação de FGFR3 e MMset, e por uma translocação cromossômica em t(4;14). Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado por p53 de tipo selvagem, por ativação de C-MAF, e por uma translocação cromossômica em t(14;16). Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado por deleção homozigótica de p53, por ativação de FGFR3, MMset e C-MAF, e por translocações cromossômicas em t(4;14) e t(14;16). Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado por deleção homozigótica de p53, por ativação de Ciclina D1 e por uma translocação cromossômica em t(11;14). Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado por uma mutação p53 R337L, pela ativação da Ciclina D1 e por uma translocação cromossômica em t(11;14). Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado por uma mutação p53 W146, por ativação de FGFR3 e MMset, e por uma translocação cromossômica em t(4;14). Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado por uma mutação p53 S261T, pela ativação de MAFB, e por translocações cromossômicas em t(6;20) e t(20;22). Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado por uma mutação p53 E286K, por ativação de FGFR3 e MMset, e por uma translocação cromossômica em t(4;14). Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado por uma mutação p53 R175H, por ativação de FGFR3 e MMset, e por uma translocação cromossômica em t(4;14). Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado por uma mutação p53 E258K, por ativação de C-MAF, e por translocações cromossômicas em t(14;16) e t(16;22). Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado por p53 de tipo selvagem, por ativação de MAFB e Ciclina D1, e por translocações cromossômicas em t(14;20) e t(11;14). Numa modalidade, o mieloma múltiplo é caracterizado por uma mutação p53 A1617T, pela ativação da Ciclina D e por uma translocação cromossômica em t(11;14).

[00154] Em algumas modalidades dos métodos aqui descritos, o mieloma múltiplo é um mieloma múltiplo diagnosticado recentemente elegível para transplante. Numa outra modalidade, o mieloma múltiplo é um mieloma múltiplo recém diagnosticado inelegível para transplante.

[00155] Em ainda outras modalidades, o mieloma múltiplo é caracterizado por progressão precoce (por exemplo, menos de 12 meses) após o tratamento inicial. Ainda em outras modalidades, o mieloma múltiplo é caracterizado por progressão precoce (por exemplo, menos de 12 meses) após o transplante autólogo de células-tronco. Numa modalidade, o mieloma múltiplo é refratário à lenalidomida. Numa outra modalidade, o mieloma múltiplo é refratário à pomalidomida. Em algumas dessas modalidades, prevê-se que o mieloma múltiplo seja refratário à pomalidomida (por exemplo, por caracterização molecular). Em outra modalidade, o mieloma múltiplo é recidivado ou refratário a 3 ou mais tratamentos e foi exposto a um inibidor de proteassoma (por exemplo, bortezomibe, carfilzomibe, ixazomibe, oprozomibe ou marizomibe) e um composto imunomodulador (por exemplo, talidomida, lenalidomida, pomalidomida, iberdomida ou avadomida) ou refratários duplos a um inibidor de proteassoma e a um composto imunomodulador. Em ainda outras modalidades, o mieloma múltiplo é recidivado ou refratário a 3 ou mais terapias anteriores, incluindo, por exemplo, um anticorpo monoclonal CD38 (mAb CD38, por exemplo, daratumumabe ou isatuximabe), um inibidor de proteassoma (por exemplo, bortezomibe, carfilzomibe, ixazomibe ou marizomibe) e um composto imunomodulador (por exemplo, talidomida, lenalidomida, pomalidomida, iberdomida ou avadomida) ou refratários duplos a um inibidor de proteassoma ou composto imunomodulador e um mAb CD38.

Em ainda outras modalidades, o mieloma múltiplo é refratário triplo, por exemplo, o mieloma múltiplo é refratário a um inibidor de proteassoma (por exemplo, bortezomibe, carfilzomibe, ixazomibe, oprozomibe ou marizomibe), um composto imunomodulador (por exemplo, talidomida, lenalidomida, pomalidomida, iberdomida ou avadomida) e um outro agente ativo, como aqui descrito.

[00156] Em algumas dessas modalidades, os métodos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como terapia de indução. Numa outra modalidade, os métodos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 2, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como terapia de indução. Numa modalidade, os métodos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 3, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como terapia de indução.

[00157] EM certas modalidades, são aqui fornecidos métodos de tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de mieloma múltiplo, incluindo mieloma múltiplo recidivado/refratário em pacientes com função renal comprometida ou um sintoma do mesmo, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo a um paciente com mieloma múltiplo recidivado/refratário com função renal comprometida.

[00158] Em certas modalidades, são aqui fornecidos métodos de tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de mieloma múltiplo, incluindo mieloma múltiplo recidivado ou refratário em pacientes frágeis ou um sintoma do mesmo, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo a um paciente frágil com mieloma múltiplo. Em algumas dessas modalidades, o paciente frágil é caracterizado por inelegibilidade para terapia de indução ou intolerância ao tratamento com dexametasona. Em algumas dessas modalidades, o paciente frágil é idoso, por exemplo, com mais de 65 anos.

[00159] Em certas modalidades, são aqui fornecidos métodos de tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de mieloma múltiplo, compreendendo administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o mieloma múltiplo é um mieloma múltiplo recidivado/refratário de quarta linha. Em certas modalidades, são aqui fornecidos métodos de tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de mieloma múltiplo, compreendendo administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 2, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o mieloma múltiplo é mieloma múltiplo recidivado/refratário de quarta linha. Em certas modalidades, são aqui fornecidos métodos de tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de mieloma múltiplo, compreendendo administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 3, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o mieloma múltiplo é um mieloma múltiplo recidivado/refratário de quarta linha.

[00160] Em certas modalidades, são aqui fornecidos métodos de tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de mieloma múltiplo,

compreendendo administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como terapia de indução, em que o mieloma múltiplo é mieloma múltiplo elegível para transplante, recém- diagnosticado. Em certas modalidades, são aqui fornecidos métodos de tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de mieloma múltiplo, compreendendo administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 2, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como terapia de indução, em que o mieloma múltiplo é mieloma múltiplo elegível para transplante, recém- diagnosticado,Em certas modalidades, são aqui fornecidos métodos de tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de mieloma múltiplo, compreendendo administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 3, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como terapia de indução, em que o mieloma múltiplo é mieloma múltiplo elegível para transplante, recém- diagnosticado.

[00161] Em certas modalidades, são aqui fornecidos métodos de tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de mieloma múltiplo, compreendendo administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como terapia de manutenção após outra terapia ou transplante, em que o mieloma múltiplo é recém- diagnosticado, mieloma múltiplo elegível para transplante antes da outra terapia ou transplante. Em certas modalidades, são aqui fornecidos métodos de tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de mieloma múltiplo, compreendendo administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 2, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como terapia de manutenção após outra terapia ou transplante, em que o mieloma múltiplo é recém- diagnosticado, mieloma múltiplo elegível para transplante antes da outra terapia ou transplante. Em certas modalidades, são aqui fornecidos métodos de tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de mieloma múltiplo, compreendendo administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 3, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como terapia de manutenção após outra terapia ou transplante, em que o mieloma múltiplo é recém- diagnosticado, mieloma múltiplo elegível para transplante antes da outra terapia ou transplante.

[00162] Em certas modalidades, são aqui fornecidos métodos de tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de mieloma múltiplo, compreendendo administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como terapia de manutenção após outra terapia ou transplante. Em algumas modalidades, o mieloma múltiplo é um mieloma múltiplo elegível para transplante, recém-diagnosticado antes da outra terapia e/ou transplante. Em algumas modalidades, a outra terapia anterior ao transplante é o tratamento com quimioterapia ou Composto 1, Composto 2 ou Composto 3. Em certas modalidades, são aqui fornecidos métodos de tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de mieloma múltiplo, compreendendo administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 2, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como terapia de manutenção após outra terapia ou transplante. Em algumas modalidades, o mieloma múltiplo é um mieloma múltiplo elegível para transplante, recém-diagnosticado antes da outra terapia e/ou transplante. Em algumas modalidades, a outra terapia anterior ao transplante é o tratamento com quimioterapia ou Composto 1, Composto 2 ou Composto 3. Em certas modalidades, são aqui fornecidos métodos de tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de mieloma múltiplo, compreendendo administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 3, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como terapia de manutenção após outra terapia ou transplante. Em algumas modalidades, o mieloma múltiplo é um mieloma múltiplo elegível para transplante, recém-diagnosticado antes da outra terapia e/ou transplante. Em algumas modalidades, a outra terapia anterior ao transplante é o tratamento com quimioterapia ou Composto 1, Composto 2 ou Composto 3.

[00163] Em certas modalidades, são aqui fornecidos métodos de tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de mieloma múltiplo, compreendendo administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o mieloma múltiplo é um mieloma múltiplo de alto risco, que é recidivado ou refratário a um, dois ou três tratamentos anteriores. Em certas modalidades, são aqui fornecidos métodos de tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de mieloma múltiplo, compreendendo administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 2, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o mieloma múltiplo é um mieloma múltiplo de alto risco, que é recidivado ou refratário a um, dois ou três tratamentos anteriores. Em certas modalidades, são aqui fornecidos métodos de tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de mieloma múltiplo,

compreendendo administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 3, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o mieloma múltiplo é um mieloma múltiplo de alto risco, que é recidivado ou refratário a um, dois ou três tratamentos anteriores.

[00164] Em certas modalidades, são aqui fornecidos métodos de tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de mieloma múltiplo, compreendendo administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o mieloma múltiplo é mieloma múltiplo inelegível para transplante, recém-diagnosticado. Em certas modalidades, são aqui fornecidos métodos de tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de mieloma múltiplo, compreendendo administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 2, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o mieloma múltiplo é mieloma múltiplo inelegível para transplante, recém- diagnosticado,Em certas modalidades, são aqui fornecidos métodos de tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de mieloma múltiplo, compreendendo administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 3, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o mieloma múltiplo é mieloma múltiplo inelegível para transplante, recém-diagnosticado.

[00165] Em certas modalidades, uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz do composto é de cerca de 0,01 a cerca de 25 mg por dia, de cerca de 0,01 a cerca de 10 mg por dia, de cerca de 0,01 a cerca de 5 mg por dia, de cerca de 0,01 a cerca de 2 mg por dia, de cerca de 0,01 a cerca de 1 mg por dia, de cerca de 0,01 a cerca de 0,5 mg por dia, de cerca de 0,01 a cerca de 0,25 mg por dia, de cerca de 0,1 a cerca de 25 mg por dia, de cerca de 0,1 a cerca de 10 mg por dia, de cerca de 0,1 a cerca de 5 mg por dia, de cerca de 0,1 a cerca de 2 mg por dia, de cerca de 0,1 a cerca de 1 mg por dia, de cerca de 0,1 a cerca de 0,5 mg por dia, de cerca de 0,1 a cerca de 0,25 mg por dia, de cerca de 0,5 a cerca de 25 mg por dia, de cerca de 0,5 a cerca de 10 mg por dia, de cerca de 0,5 a cerca de 5 mg por dia, de cerca de 0,5 a cerca de 2 mg por dia, de cerca de 0,5 a cerca de 1 mg por dia, de 1 a 25 mg por dia, de 1a 10 mg por dia, de 1 a 5 mg por dia, de 1 a 2,5 mg por dia, ou de cerca de 1 a cerca de 2 mg por dia. Numa modalidade, uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 é de cerca de 0,1 mg por dia a cerca de 0,4 mg por dia.

[00166] Em certas modalidades, a quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz é de cerca de 0,1, cerca de 0,2, cerca de 0,3, cerca de 0,4, cerca de 0,5, cerca de 0,6, cerca de 0,7, cerca de 0,8, cerca de 0,9, cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 15, cerca de 20 ou cerca de 25 mg por dia. Em algumas dessas modalidades, a quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz é de cerca de 0,1, cerca de 0,2, cerca de 0,3, cerca de 0,4, cerca de 0,5, cerca de 0,6 ou cerca de 0,7 mg por dia.

[00167] Em uma modalidade, a faixa de dose diária recomendada do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para as condições aqui descritas, situa-se na faixa de cerca de 0,1 mga cerca de 25 mg por dia, de preferência administrada em dose única uma vez ao dia ou em doses divididas ao longo do dia. Em outras modalidades, a dosagem varia de cerca de 0,1 a cerca de 10 mg por dia. Doses específicas por dia incluem 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,

17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 mg por dia. Doses mais específicas por dia incluem 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 ou 0,5 mg por dia.

[00168] Numa modalidade específica, a dosagem inicial recomendada pode ser 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 ou 25 mg por dia. Numa outra modalidade, a dosagem inicial recomendada pode ser 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 ou 0,5, mg por dia. A dose pode ser aumentada para 1, 2, 3, 4 ou 5 mg por dia.

[00169] Em certas modalidades, a quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz é de cerca de 0,001 a cerca de 5 mg/kg/dia, de cerca de 0,001 a cerca de 4 mg/kg/dia, de cerca de 0,001 a cerca de 3 mg/kg/dia, de cerca de 0,001 para cerca de 2 mg/kg/dia, de cerca de 0,001 a cerca de 1 mg/Kkg/dia, de cerca de 0,001 a cerca de 0,05 mg/kg/dia, de cerca de 0,001 a cerca de 0,04 mg/kg/dia, de cerca de 0,001 a cerca de 0,03 mg/kg/dia, de cerca de 0,001 a cerca de 0,02 mg/kg/dia, de cerca de 0,001 a cerca de 0,01 mg/kg/dia, ou de cerca de 0,001 a cerca de 0,005 mg/kg/dia.

[00170] A dose administrada também pode ser expressa em unidades diferentes de mg/kg/dia. Por exemplo, doses para administração parenteral podem ser expressas como mg/m?/dia. Um versado comum na técnica saberá prontamente como converter doses de mg/kg/dia a mg/m?/dia para dar a altura ou peso de um sujeito ou ambos (ver, www. fda. gov/cder/cancer /animalframe. htm). Por exemplo, uma dose de 1 mg/kg/dia para um humano de 65 kg é aproximadamente igual a 38 mg/m?/dia.

[00171] Em certas modalidades, o paciente a ser tratado com um dos métodos aqui fornecidos não foi tratado com terapia de mieloma múltiplo antes da administração do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 fornecido aqui, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em certas modalidades, o paciente a ser tratado com um dos métodos aqui fornecidos foi tratado com terapia de mieloma múltiplo antes da administração do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 aqui fornecido ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em certas modalidades, o paciente a ser tratado com um dos métodos aqui proporcionados desenvolveu resistência a drogas para a terapia anti-mieloma múltiplo. Em algumas dessas modalidades, o paciente desenvolveu resistência a uma, duas ou três terapias anti mieloma-múltiplo, em que as terapias são selecionadas de um anticorpo monoclonal CD38 (mAb CD38, por exemplo, daratumumabe ou isatuximabe), um inibidor de proteassoma (para exemplo, bortezomibe, carfilzomibe, ixazomibe ou marizomibe) e um composto imunomodulador (por exemplo, talidomida, lenalidomida, pomalidomida, iberdomida ou avadomida).

[00172] Os métodos aqui fornecidos abrangem o tratamento de um paciente, independentemente da idade do paciente. Em algumas modalidades, o sujeito tem 18 anos ou mais. Em outras modalidades, o sujeito tem mais de 18, 25, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou 70 anos de idade. Em outras modalidades, o sujeito tem menos de 65 anos de idade. Em outras modalidades, o sujeito tem mais que 65 anos de idade. Numa modalidade, o sujeito é um sujeito idoso de mieloma múltiplo, tal como um sujeito com mais de 65 anos de idade. Numa modalidade, o sujeito é um sujeito idoso de mieloma múltiplo, tal como um sujeito com mais de 75 anos de idade.

[00173] Dependendo do estado da doença a ser tratada e da condição do indivíduo, o Composto 1, o Composto 2 ou o Composto 3 aqui fornecido, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, podem ser administrados por via oral, via parenteral (por exemplo, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, CIV, injeção ou infusão intracistemal, injeção subcutânea ou implante), vias de administração por inalação, nasal, vaginal, retal, sublingual ou tópica (por exemplo, transdérmica ou local). O Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 aqui fornecido, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, podem ser formulados, sozinhos ou juntos, em unidade de dosagem adequada com excipientes, transportadores, adjuvantes e veículos farmaceuticamente aceitáveis apropriados para cada via de administração.

[00174] Numa modalidade, o Composto 1, o Composto 2 ou o Composto 3 aqui fornecido, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado por via oral. Numa outra modalidade, o composto do Composto 1, o Composto 2 ou o Composto 3 aqui fornecido, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado por via parenteral. Ainda numa outra modalidade, o composto do Composto 1, o Composto 2 ou o Composto 3 aqui fornecido, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado por via intravenosa.

[00175] O Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 aqui fornecido, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, podem ser distribuídos como uma dose única, como, por exemplo, uma única injeção em bolus ou comprimidos orais ou pílulas; ou ao longo do tempo, como, por exemplo, infusão contínua ao longo do tempo ou doses divididas em bolus ao longo do tempo. O composto como descrito aqui pode ser administrado várias vezes se necessário, por exemplo, até que o paciente experimente doença estável ou regressão ou até a progressão da doença do paciente ou toxicidade inaceitável. A doença estável ou a falta dela é determinada por métodos conhecidos na técnica,

como a avaliação dos sintomas do paciente, exame físico, visualização do tumor que foi fotografada usando raios-X, CAT, PET ou ressonância magnética e outras modalidades de avaliação normalmente aceitáveis.

[00176] O Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 aqui fornecido, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, podem ser administrados uma vez ao dia (QD ou qd) ou divididos em várias doses diárias, como duas vezes ao dia (BID ou bid), três vezes ao dia (TID ou tid) e quatro vezes ao dia (QID ou qid). Além disso, a administração pode ser contínua (isto é, diariamente por dias consecutivos ou todos os dias), intermitente, por exemplo, em ciclos (isto é, incluindo dias, semanas ou meses de descanso sem droga). Como usado neste documento, o termo “diariamente” pretende significar que um composto terapêutico, como o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 aqui fornecido, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado uma ou mais de uma vez por dia, por exemplo, por um período de tempo. O termo “contínuo” significa que um composto terapêutico, como o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 fornecido aqui, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado diariamente por um período ininterrupto de pelo menos 7 dias a 52 semanas. O termo “intermitente” ou “intermitentemente”, tal omo aqui utilizado, pretende significar parar e iniciar em intervalos regulares ou irregulares. Por exemplo, a administração intermitente do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 aqui fornecido, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administração por um a seis dias por semana, administração em ciclos (por exemplo, administração diária por duas a oito semanas consecutivas, período de descanso sem administração por até uma semana) ou administração em dias alternados. O termo “ciclagem”, como usado neste documento, pretende significar que um composto terapêutico, como o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 aqui fornecido, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado diariamente ou continuamente, mas com um período de descanso. Em algumas dessas modalidades, a administração é uma vez ao dia por dois a seis dias, depois um período de descanso sem administração por cinco a sete dias.

[00177] Em algumas modalidades, a frequência de administração está na faixa de cerca de uma dose diária para cerca de uma dose mensal. Em certas modalidades, a administração é uma vez ao dia, duas vezes ao dia, três vezes ao dia, quatro vezes ao dia, uma vez a cada dois dias, duas vezes por semana, uma vez a cada semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas ou uma vez a cada quatro semanas. Numa modalidade, o Composto 1, o Composto 2 ou o Composto 3 aqui fornecido, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado uma vez ao dia. Numa outra modalidade, o Composto 1, o Composto 2 ou o Composto 3 aqui fornecido, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado duas vezes ao dia. Em ainda uma outra modalidade, o Composto 1, o Composto 2 ou o Composto 3 aqui fornecido, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado três vezes ao dia. Em ainda outra modalidade, o Composto 1, o Composto 2 ou o Composto 3 aqui fornecido, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado quatro vezes ao dia.

[00178] Numa modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 é administrada num ciclo de tratamento que inclui um período de administração de até 20 dias, seguido de um período de descanso. Numa modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 é administrada num ciclo de tratamento que inclui um período de administração de até 15 dias, seguido de um período de descanso. Numa modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 é administrada num ciclo de tratamento que inclui um período de administração de até 10 dias, seguido de um período de descanso. Numa modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 é administrada num ciclo de tratamento que inclui um período de administração de até 7 dias, seguido de um período de descanso. Numa modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 é administrada num ciclo de tratamento que inclui um período de administração de até 5 dias, seguido de um período de descanso. Numa modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 é administrada num ciclo de tratamento que inclui um período de administração de até 4 dias, seguido de um período de descanso. Numa modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 é administrada num ciclo de tratamento que inclui um período de administração de até 3 dias, seguido de um período de descanso.

[00179] Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui um período de administração de até 14 dias, seguido de um período de descanso. Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui um período de administração de até dias, seguido de um período de descanso. Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui um período de administração de até 7 dias, seguido de um período de descanso. Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui um período de administração de até 5 dias, seguido de um período de descanso. Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui um período de administração de até 4 dias, seguido de um período de descanso. Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui um período de administração de até 3 dias, seguido de um período de descanso.

[00180] Numa modalidade, o período de descanso é de cerca de 2 dias até cerca de 11 dias. Numa modalidade, o período de descanso é de cerca de 2 dias até cerca de 10 dias. Numa modalidade, o período de descanso é de cerca de 2 dias. Numa modalidade, o período de descanso é de cerca de 3 dias. Numa modalidade, o período de descanso é de cerca de 4 dias. Numa modalidade, o período de descanso é de cerca de 5 dias. Numa modalidade, o período de descanso é de cerca de 6 dias. Numa outra modalidade, o período de descanso é de cerca de 7 dias. Numa outra modalidade, o período de descanso é de cerca de 8 dias. Numa outra modalidade, o período de descanso é de cerca de 9 dias. Numa outra modalidade, o período de descanso é de cerca de 10 dias. Numa outra modalidade, o período de descanso é de cerca de 11 dias.

[00181] Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui um período de administração de até 15 dias, seguido de um período de descanso de cerca de 2 dias até cerca de 10 dias. Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui um período de administração de até 10 dias, seguido de um período de descanso de cerca de 2 dias até cerca de 10 dias. Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui um período de administração de até 7 dias, seguido de um período de descanso de cerca de 2 dias até cerca de 10 dias. Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui um período de administração de até 5 dias, seguido de um período de descanso de cerca de 2 dias até cerca de 10 dias. Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui um período de administração de até 3 dias, seguido de um período de descanso de cerca de 10 dias a cerca de 15 dias. Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui um período de administração de até 3 dias, seguido de um período de descanso de cerca de 3 dias até cerca de 15 dias.

[00182] Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui um período de administração de até 15 dias, seguido de um período de descanso de 7 dias. Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui um período de administração de até 10 dias, seguido de um período de descanso de 5 dias. Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui um período de administração de até dias, seguido de um período de descanso de 4 dias. Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui um período de administração de até 10 dias, seguido de um período de descanso de 3 dias. Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui um período de administração de até 10 dias, seguido de um período de descanso de 2 dias. Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui um período de administração de até 7 dias, seguido de um período de descanso de 7 dias. Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui um período de administração de até 5 dias, seguido de um período de descanso de 5 dias. Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui um período de administração de até 3 dias, seguido de um período de descanso de 11 dias. Numa outra modalidade, o ciclo de tratamento inclui um período de administração de até 5 dias, seguido de um período de descanso de 9 dias. Numa outra modalidade, o ciclo de tratamento inclui um período de administração de até 5 dias, seguido de um período de descanso de 2 dias. Numa outra modalidade, o ciclo de tratamento inclui um período de administração de até 3 dias, seguido de um período de descanso de 4 dias.

[00183] Numa — modalidade, o ciclo de tratamento inclui uma administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 nos dias 1 a 5 de um ciclo de 28 dias.

Numa outra modalidade, o ciclo de tratamento inclui uma administração do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 nos dias 1 a 10 de um ciclo de 28 dias.

Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui uma administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 nos dias 1 a 21 de um ciclo de 28 dias.

Numa outra modalidade, o ciclo de tratamento inclui uma administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 nos dias 1 a 5 de um ciclo de 7 dias.

Numa outra modalidade, o ciclo de tratamento inclui uma administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 nos dias 1 a 7 de um ciclo de 7 dias.

Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui uma administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 nos dias 1 a 10 e dias 15 a 24 de um ciclo de 28 dias (aqui referido como ciclo de dosagem 20/28). Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui uma administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 nos dias 1 a 3 e dias 15 a 18 de um ciclo de 28 dias.

Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui uma administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 nos dias 1 a 7 e dias 15a 21 de um ciclo de 28 dias (aqui referido como ciclo de dosagem 14/28). Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui uma administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 nos dias 1a 5 e dias 15 a 19 de um ciclo de 28 dias (aqui referido como ciclo de dosagem 10/28). Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui uma administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1,

Composto 2 ou Composto 3 nos dias 1 a 3 e dias 15 a 17 de um ciclo de 28 dias (aqui referido como ciclo de dosagem 6/28).

[00184] Numa — modalidade, o ciclo de tratamento inclui uma administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 nos dias 1 a 14 de um ciclo de 21 dias. Numa outra modalidade, o ciclo de tratamento inclui uma administração do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 nos dias 1a 4 e 8 a 11 de um ciclo de 21 dias. Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui uma administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 nos dias 1a 5e 8 a 12 de um ciclo de 21 dias. Numa outra modalidade, o ciclo de tratamento inclui uma administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 nos dias 1a 5e 11 a 15 de um ciclo de 21 dias. Numa outra modalidade, o ciclo de tratamento inclui uma administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 nos dias 1 a 5, 8 a 12 e 15 a 19 de um ciclo de 21 dias. Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui uma administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 nos dias 1a 4, 8a 11 e 15a 18 de um ciclo de 21 dias. Numa outra modalidade, o ciclo de tratamento inclui uma administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 nos dias 1 a 4, 8 a 10 e 15 a 17 de um ciclo de 21 dias. Numa outra modalidade, o ciclo de tratamento inclui uma administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 nos dias 1a 3 e 8 a 11 de um ciclo de 21 dias. Numa outra modalidade, o ciclo de tratamento inclui uma administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 nos dias 1a 3 e 11 a 13 de um ciclo de 21 dias.

[00185] Qualquer ciclo de tratamento aqui descrito pode ser repetido durante pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais ciclos. Em certos casos, o ciclo de tratamento como aqui descrito inclui de 1 a cerca de 24 ciclos, de cerca de 2 a cerca de 16 ciclos, ou de cerca de 2 a cerca de 4 ciclos. Em certos casos, um ciclo de tratamento como aqui descrito inclui de 1 a cerca de 4 ciclos. Em certas modalidades, o ciclo 1 a 4 são todos ciclos de 28 dias. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz de Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 é administrada durante 1 a 13 ciclos de 28 dias (por exemplo, cerca de 1 ano). Em certos casos, a terapia de ciclo não se limita ao número de ciclos e a terapia é continuada até a progressão da doença. Os ciclos podem, em certos casos, inclui variar a duração dos períodos de administração e/ou dos períodos de descanso aqui descritos.

[00186] Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui administrar o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 em uma quantidade de dosagem de cerca de 0,1 mg/dia, 0,2 mg/dia, 0,3 mg/dia, 0,4 mg/dia, 0,5 mg/dia, 0,6 mg/dia, 0,7 mg/dia, 0,8 mg/dia, 0,9 mg/dia, 1,0 mg/dia, 5,0 mg/dia ou 10 mg/dia, administrados uma vez por dia. Numa modalidade, o ciclo de tratamento inclui administrar o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 em uma quantidade de dosagem de cerca de 0,1 mg/dia, 0,2 mg/dia, 0,3 mg/dia, 0,4 mg/dia, 0,5 mg/dia, 0,6 mg/dia, 0,7 mg/dia, ou 0,8 mg/dia, administrado uma vez por dia. Em algumas dessas modalidades, o ciclo de tratamento inclui administrar o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 uma vez ao dia em uma quantidade de dosagem de cerca de 0,1 mg, 0,2 mg, 0,3 mg, 0,4 mg ou 0,5 mg nos dias 1 a 10 de um dia ciclo de 28 dias. Em algumas dessas modalidades, o ciclo de tratamento inclui administrar o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 uma vez ao dia em uma quantidade de dosagem de cerca de 0,1 mg, 0,2 mg, 0,3 mg, 0,4 mg ou 0,5 mg nos dias 1 a 10 e 15 a 24 de um dia ciclo de 28 dias.

Em outras modalidades, o ciclo de tratamento inclui a administração do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 a uma quantidade de dosagem de cerca de 0,1 mg nos dias 1 a 10 e 15 a 24 de um ciclo de 28 dias. Em outras modalidades, o ciclo de tratamento inclui administrar o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 duas vezes ao dia em uma quantidade de dosagem de cerca de 0,1 mg, 0,2 mg, 0,3 mg, 0,4 mg ou 0,5 mg nos dias 1 a 3 de um dia ciclo de 28 dias. Em outras modalidades, o ciclo de tratamento inclui administrar o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 duas vezes ao dia em uma quantidade de dosagem de cerca de 0,1 mg, 0,2 mg, 0,3 mg, 0,4 mg ou 0,5 mg nos dias 1 a 3 e 15 a 19 de um dia ciclo de 28 dias. Em outras modalidades, o ciclo de tratamento inclui administrar o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 duas vezes ao dia em uma quantidade de dosagem de cerca de 0,1 mg, 0,2 mg, 0,3 mg, 0,4 mg ou 0,5 mg nos dias 1 a 3 e 15 a 17 de um ciclo de 28 dias. Em outras modalidades, o ciclo de tratamento inclui administrar o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 duas vezes ao dia em uma quantidade de dosagem de cerca de 0,2 mg nos dias 1 a 3 e 15 a 17 de um ciclo de 28 dias. Em uma dessas modalidades, o composto é administrado nos dias 1 a 3 (manhã e tarde), dia 14 (somente tarde), dias 15 e 16 (manhã e tarde) e dia 17 (somente manhã) de um ciclo de 28 dias, por exemplo no Ciclo 1.

F. Combinação Terapia com um segundo agente ativo

[00187] O Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 aqui fornecido, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, também pode ser combinado ou usado em conjunto com (por exemplo, antes, durante ou depois) da terapia convencional, incluindo, mas não limitado a, cirurgia, terapia biológica (incluindo imunoterapia, por exemplo, imunoterapia, por exemplo, com inibidores de ponto de verificação), terapia de radiação, quimioterapia,

transplante de células-tronco, terapia celular ou outra terapia não medicamentosa atualmente usada para tratar, prevenir ou gerenciar mieloma múltiplo. A utilização combinada do composto aqui proporcionado e terapia convencional podem proporcionar um regime de tratamento único que é inesperadamente eficaz em certos pacientes. Sem ser limitado pela teoria, acredita-se que o Composto 1, Componente 2 ou Componente 3 podem proporcionar efeitos aditivos ou sinérgicos quando administrados concomitantemente com a terapia convencional.

[00188] Como discutido aqui noutro local, abrangido aqui está um método para reduzir, tratar e/ou prevenir os efeitos adversos ou indesejados associados com a terapia convencional, incluindo, mas não se limitando a cirurgia, quimioterapia, radioterapia, terapia biológica e imunoterapia. Um composto fornecido neste documento, por exemplo, Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e outro ingrediente ativo pode ser administrado a um paciente antes de, durante ou após a ocorrência do efeito adverso associado à terapia convencional.

[00189] O Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 aqui fornecido, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, também podem ser combinados ou utilizados em combinação com outros agentes terapêuticos úteis no tratamento e/ou prevenção de mieloma múltiplo aqui descrito.

[00190] Em uma modalidade, é aqui proporcionado um método de tratamento, “prevenção ou gerenciamento de mieloma múltiplo, compreendendo administrar a um paciente o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em combinação com um ou mais segundos agentes ativos e, opcionalmente, em combinação com terapia de radiação, transfusões de sangue ou cirurgia.

[00191] Como aqui utilizado, o termo “em combinação” inclui o uso de mais do que uma terapia (por exemplo, um ou mais agentes profiláticos e/ou terapêuticos). No entanto, o uso do termo “em combinação” não restringe a ordem na qual terapias (por exemplo, agentes profiláticos e/ou terapêuticos) são administrados a um paciente com uma doença ou distúrbio. Uma primeira terapia (por exemplo, um agente profilático ou terapêutico, como um composto aqui fornecido, por exemplo, Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo) pode ser administrada antes de (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas antes), concomitantemente ou após (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas), 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas após) a administração de uma segunda terapia (por exemplo, um agente profilático ou terapêutico) ao sujeito. A terapia tripla também é contemplada aqui, como é a terapia quádrupla. Em uma modalidade, a segunda terapia é dexametasona.

[00192] A administração do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um ou mais segundos agentes ativos para um paciente podem ocorrer simultaneamente ou sequencialmente pelas mesmas ou diferentes rotas de administração. A adequabilidade de uma via particular de administração empregue para um agente ativo particular dependerá do próprio agente ativo (por exemplo, se pode ser administrado oralmente sem se decompor antes de entrar na corrente sanguínea).

[00193] A via de administração do Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é independente da via de administração de uma segunda terapia. Numa modalidade, o Composto 1, o Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado por via oral. Em outra modalidade, o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 é administrado por via intravenosa. Assim, de acordo com essas modalidades, o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado por via oral ou intravenosa, e a segunda terapia pode ser administrada por via oral, parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intra-arterial, transdérmica, sublingual, intramuscular, retal, transbucal, intranasal, lipossômica, via inalação, vaginal, intraocular, via administração local por cateter ou stent, subcutaneamente, intra- adiposalmente, intra-articularmente, intratecalmente, ou forma de dosagem de liberação lenta. Numa modalidade, o Composto 1, o Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e uma segunda terapia é administrada pelo mesmo modo de administração, por via oral ou IV. Em outra modalidade, o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado por um modo de administração, por exemplo, por IV, enquanto o segundo agente (um anti- mieloma múltiplo) é administrado por outro modo de administração, por exemplo, por via oral.

[00194] Em uma modalidade, o segundo agente ativo é administrado por via intravenosa ou por via subcutânea e, uma vez ou duas vezes por dia em uma quantidade de cerca de 1 a cerca de 1000 mg, de cerca de 5 a cerca de 500 mg, de cerca de 10 a cerca de 350 mg ou de cerca de 50 a cerca de 200 mg. À quantidade específica do segundo agente ativo dependerá do agente específico usado, do tipo de mieloma múltiplo sendo tratado ou gerenciado, da gravidade e do estágio da doença e da quantidade de Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável! do mesmo, aqui proporcionados e quaisquer agentes ativos adicionais opcionais administrados simultaneamente ao paciente.

[00195] Um ou mais segundos ingredientes ativos ou agentes podem ser utilizados em conjunto com o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 nos métodos e composições aqui proporcionados. Os segundos agentes ativos podem ser moléculas grandes (por exemplo, proteínas) ou moléculas pequenas (por exemplo, moléculas inorgânicas sintéticas, organometálicas ou orgânicas), ou terapias celulares (por exemplo, células CAR).

[00196] Exemplos de segundos agentes ativos que podem ser utilizados nos métodos e composições aqui descritos incluem um ou mais de melfalano, vincristina, —ciclofosfamida, etoposídeo, doxorrubicinay bendamustina, obinutuzmabe, um inibidor de proteassoma (por exemplo, bortezomibe, carfilzomibe, ixazomibe, oprozomibe ou marizomib), um inibidor da histona desacetilase (por exemplo, panobinostat, ACY241), um inibidor da BET (por exemplo, GSK525762A, OTX015, BMS-986158, TEN-O10, CPI-O610, INCB54329, BAY1238097, FT-1101, ABBV-075, BI 894999, GS-5829, GSK1210151A (|-BET- 151), CPI-203, RVX-208, XD46, MS436, PFI-1, RVX2135, ZEN3365, XD14, ARV-

771, MZ1, PLX5117, 4-[2-(ciclopropilmetoxi)-5-(metanossulfonil)fenil]-2- metilisoquinolin-1(2H)-ona, EP11313 e EP11336), um inibidor de BCL2 (por exemplo, venetoclax ou navitoclax), um inibidor de MCL-1 (por exemplo, AZD5991, AMG176, MIK665, S64315, ou S63845), um inibidor de LSD-1 (por exemplo, ORY-1001, ORY-2001, INCB-59872, IMG-7289, TAK-418, GSK- 2879552, 4-[2-(4-amino-piperidin-1-i1)-5-(3-fluoro-4-metoxi-fenil)-1-metil-6- ox0-1,6-di-hidropirimidin-4-i1]-2-fluoro-benzonitrila ou um sal do mesmo), um corticosteroide (por exemplo, prednisona), dexametasona; um anticorpo (por exemplo, um anticorpo CS1, como elotuzumabe; um anticorpo CD38, como daratumumabe ou isatuximabe; ou um anticorpo BCMA ou conjugado de anticorpo, como GSK2857916 ou BI 836909), um inibidor de ponto de verificação (como descrito aqui), ou células CAR (como descrito aqui).

[00197] Numa modalidade, o segundo agente ativo usado em conjunto com o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, nos métodos e composições aqui descritos é dexametasona.

[00198] Em algumas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 4 mg nos dias 1 e 8 de um ciclo de 21 dias. Em algumas outras modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 4 mg nos dias 1,4, 8 e 11 de um ciclo de 21 dias. Em algumas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 4 mg nos dias 1, 8 e 15 de um ciclo de 28 dias. Em algumas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 4 mg nos dias 1, 4, 8, 11, 15 e 18 de um ciclo de 28 dias. Em algumas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 4 mg nos dias 1, 8, 15 e 22 de um ciclo de 28 dias. Em uma dessas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 4 mg nos dias 1, 10, 15 e 22 do Ciclo 1. Em algumas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 4 mg nos dias 1, 3, 15 e 17 de um ciclo de 28 dias. Em uma dessas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 4 mg nos dias 1, 3, 14 e 17 do Ciclo 1.

[00199] Em algumas outras modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 8 mg nos dias 1 e 8 de um ciclo de 21 dias. Em algumas outras modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 8 mg nos dias 1,4, 8 e 11 de um ciclo de 21 dias. Em algumas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 8 mg nos dias 1, 8 e 15 de um ciclo de 28 dias. Em algumas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 8 mg nos dias 1, 4, 8, 11, 15 e 18 de um ciclo de 28 dias. Em algumas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 8 mg nos dias 1, 8, 15 e 22 de um ciclo de 28 dias. Em uma dessas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 8 mg nos dias 1, 10, 15 e 22 do Ciclo 1. Em algumas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 8 mg nos dias 1, 3, 15 e 17 de um ciclo de 28 dias. Em uma dessas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 8 mg nos dias 1, 3, 14 e 17 do Ciclo 1.

[00200] Em algumas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 10 mg nos dias 1 e 8 de um ciclo de 21 dias. Em algumas outras modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 10 mg nos dias 1,4, 8 e 11 de um ciclo de 21 dias. Em algumas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 10 mg nos dias 1, 8 e 15 de um ciclo de 28 dias. Em algumas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 10 mg nos dias 1, 4, 8, 11, 15 e 18 de um ciclo de 28 dias. Em algumas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 10 mg nos dias 1, 8, 15 e 22 de um ciclo de 28 dias. Em uma dessas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 10 mg nos dias 1, 10, 15 e 22 do Ciclo 1. Em algumas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 10 mg nos dias 1, 3, 15 e 17 de um ciclo de 28 dias. Em uma dessas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 10 mg nos dias 1, 3, 14 e 17 do Ciclo 1.

[00201] Em algumas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 20 mg nos dias 1 e 8 de um ciclo de 21 dias. Em algumas outras modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 20 mg nos dias 1,4, 8 e 11 de um ciclo de 21 dias. Em algumas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 20 mg nos dias 1, 8 e 15 de um ciclo de 28 dias. Em algumas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 20 mg nos dias 1, 4, 8, 11, 15 e 18 de um ciclo de 28 dias. Em algumas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 20 mg nos dias 1, 8, 15 e 22 de um ciclo de 28 dias. Em uma dessas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 20 mg nos dias 1, 10, 15 e 22 do Ciclo 1. Em algumas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 20 mg nos dias 1, 3, 15 e 17 de um ciclo de 28 dias. Em uma dessas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 20 mg nos dias 1, 3, 14 e 17 do Ciclo 1.

[00202] Em algumas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 40 mg nos dias 1 e 8 de um ciclo de 21 dias. Em algumas outras modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 40 mg nos dias 1,4, 8 e 11 de um ciclo de 21 dias. Em algumas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 40 mg nos dias 1, 8 e 15 de um ciclo de 28 dias. Em uma dessas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 40 mg nos dias 1, 10, 15 e 22 do Ciclo 1. Em algumas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 40 mg nos dias 1, 4, 8, 11, 15 e 18 de um ciclo de 28 dias. Em outras dessas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 40 mg nos dias 1, 8, 15 e 22 de um ciclo de 28 dias. Em outras dessas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 40 mg nos dias 1, 3, e 17 de um ciclo de 28 dias. Em uma dessas modalidades, a dexametasona é administrada na dose de 40 mg nos dias 1, 3, 14 e 17 do Ciclo 1.

[00203] Numa outra modalidade, o segundo agente ativo usado em conjunto com o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, nos métodos e composições aqui descritos é bortezomibe. Em ainda uma outra modalidade, o segundo agente ativo usado em conjunto com o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, nos métodos e composições aqui descritos é daratumumabe. Em algumas dessas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente administrar dexametasona. Em algumas modalidades, os métodos compreendem administrar o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, com um inibidor de proteassoma como aqui descrito, um inibidor de CD38 como aqui descrito e um corticosteroide como aqui descrito.

[00204] Numa outra modalidade, o segundo agente ativo usado em conjunto com o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável! do mesmo, nos métodos e composições aqui descritos é panobinostat. Em algumas dessas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente administrar dexametasona.

[00205] Numa outra modalidade, o segundo agente ativo usado em conjunto com o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, nos métodos e composições aqui descritos é ACY241. Em algumas dessas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente administrar dexametasona.

[00206] Numa outra modalidade, o segundo agente ativo usado em conjunto com o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, nos métodos e composições aqui descritos é vincristina. Em algumas dessas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente administrar dexametasona.

[00207] Numa outra modalidade, o segundo agente ativo usado em conjunto com o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável! do mesmo, nos métodos e composições aqui descritos é ciclofosfamida. Em algumas dessas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente administrar dexametasona.

[00208] Numa outra modalidade, o segundo agente ativo usado em conjunto com o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, nos métodos e composições aqui descritos é etoposídeo. Em algumas dessas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente administrar dexametasona.

[00209] Numa outra modalidade, o segundo agente ativo usado em conjunto com o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável! do mesmo, nos métodos e composições aqui descritos é doxorrubicina. Em algumas dessas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente administrar dexametasona.

[00210] Numa outra modalidade, o segundo agente ativo usado em conjunto com o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, nos métodos e composições aqui descritos é venetoclax. Em algumas dessas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente administrar dexametasona.

[00211] Numa outra modalidade, o segundo agente ativo usado em conjunto com o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, nos métodos e composições aqui descritos é AMG176. Em algumas dessas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente administrar dexametasona.

[00212] Numa outra modalidade, o segundo agente ativo usado em conjunto com o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, nos métodos e composições aqui descritos é MIK665. Em algumas dessas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente administrar dexametasona.

[00213] Numa outra modalidade, o segundo agente ativo usado em conjunto com o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável! do mesmo, nos métodos e composições aqui descritos é GSK525762A. Em algumas dessas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente administrar dexametasona.

[00214] Numa outra modalidade, o segundo agente ativo usado em conjunto com o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, nos métodos e composições aqui descritos é OTXO015. Em algumas dessas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente administrar dexametasona.

[00215] Numa outra modalidade, o segundo agente ativo usado em conjunto com o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, nos métodos e composições descritos aqui é 4-[2- (ciclopropilmetoxi)-5-(metanossulfonil)fenil]-2-metilisoquinolin-1(2H)-ona. Em algumas dessas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente administrar dexametasona.

[00216] Numa outra modalidade, o segundo agente ativo usado em conjunto com o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, nos métodos e composições descritos aqui é 4-[2-(4- amino-piperidin-1-i1)-5-(3-fluoro-4-metoxi-fenil)-1-metil-6-0x0-1,6-di- hidropirimidin-4-il]-2-fluoro-benzonitrila ou um sal do mesmo (por exemplo, um sal de besilato. Em algumas dessas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente administrar dexametasona.

[00217] Em certas modalidades, o Composto 1, o Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado em combinação com inibidores do ponto de verificação. Numa modalidade, um inibidor de ponto de verificação é usado em combinação com o Composto 1, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em conexão com os métodos aqui fornecidos. Numa outra modalidade, dois inibidores de pontos de verificação são utilizados em combinação com o Composto 1, ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em conexão com os métodos aqui fornecidos. Em ainda outra modalidade, três ou mais inibidores de ponto de verificação são usados em combinação com o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3, ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em conexão com os métodos aqui fornecidos.

[00218] Como usado neste documento, o termo “inibidor do ponto de verificação imunológico” ou “inibidor do ponto de verificação” refere-se a moléculas que reduzem total ou parcialmente, inibem, interferem ou modulam uma ou mais proteínas do ponto de verificação. Sem ser limitado por uma teoria em particular, as proteínas do ponto de verificação regulam a ativação ou função das células T. Numerosas proteínas de ponto de verificação são conhecidas, tais como CTLA-4 e seus ligandos CD80 e CD86; e PD-1 com seus ligandos PD-L1 e PD-L2 (Pardoll, Nature Reviews Cancer, 2012, 12, 252-264). Estas proteínas parecem responsáveis por interações coestimulatórias ou inibitórias das respostas das células T. As proteínas do ponto de verificação imunológico parecem regular e manter a autotolerância e a duração e a amplitude das respostas imunológicas fisiológicas. Inibidores do ponto de verificação imunológico incluem anticorpos ou são derivados de anticorpos.

[00219] Numa modalidade, o inibidor de ponto de verificação é um inibidor de CTLA-4. Numa modalidade, o inibidor de CTLA-4 é um anticorpo anti-CTLA-4. Exemplos de anticorpos anti-CTLA-4 incluem, mas não estão limitados a, aqueles descritos nas Patentes US 5.811.097; 5.811.097; 5.855.887;

6.051.227; 6.207.157; 6.682.736; 6.984.720; e 7.605.238, todos eles aqui incorporados na sua totalidade. Numa modalidade, o anticorpo anti-CTLA-4 é tremelimumabe (também conhecido como ticilimumabe ou CP-675206). Numa outra modalidade, o anticorpo anti-CTLA-4 é ipilimumabe (também conhecido como MDX-010 ou MDX-101). O ipilimumabe é um anticorpo IgG monoclonal totalmente humano que se liga ao CTLA-4. O ipilimumabe é comercializado sob o nome comercial Yervoy"".

[00220] Numa modalidade, o inibidor de ponto de verificação é um inibidor de PD-1/PD-L1. Exemplos de inibidores de PD-1/PD-L1 incluem, mas não estão limitados a, aqueles descritos nas Patentes US 7.488.802; 7.943.743;

8.008.449; 8.168.757; 8.217.149, e Publicações de Pedido de Patente PCT WO2003042402, —“WO2008156712, WO2010089411, WO2010036959, WO2011066342, WO2011159877, WO2011082400 e WO2011161699, todas as quais são aqui incorporadas na sua totalidade.

[00221] Numa modalidade, o inibidor de ponto de verificação é um inibidor de PD-1. Numa modalidade, o inibidor de PD-1 é um anticorpo anti-PD-

1. Numa modalidade, o anticorpo anti-PD-1 é BGB-A317, nivolumabe (também conhecido como ONO-4538, BMS-936558 ou MDX1106) ou pembrolizumabe (também conhecido como MK-3475, SCH 900475 ou lambrolizumabe). Numa modalidade, o anticorpo anti-PD-1 é nivolumabe. O nivolumabe é um anticorpo monoclonal anti-PD-1 IgG4 humano e é comercializado sob o nome comercial Opdivo"“. Numa outra modalidade, o anticorpo anti-PD-1 é o pembrolizumabe. O pembrolizumabe é um anticorpo IgG4 monoclonal humanizado e é comercializado sob o nome comercial Keytruda"”. Em ainda outras modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é CT-011, um anticorpo humanizado. CT- 011 administrado sozinho não conseguiu mostrar resposta no tratamento de leucemia mieloide aguda (AML) na recidiva. Em ainda uma outra modalidade, o anticorpo anti-PD-1 é AMP-224, uma proteína de fusão. Em outra modalidade, o anticorpo PD-1 é BGB-A317. O BGB-A317 é um anticorpo monoclonal no qual a capacidade de se ligar ao receptor gama Fc | é projetada especificamente e possui uma assinatura de ligação exclusiva ao PD-1 com alta afinidade e especificidade de alvo superior.

[00222] Numa modalidade, o inibidor de ponto de verificação é um inibidor de PD-L1. Numa modalidade, o inibidor de PD-L1 é um anticorpo anti-

PD-L1. Numa modalidade, o anticorpo anti-PD-L1 é MEDI4736 (durvalumabe). Numa outra modalidade, o anticorpo anti-PD-L1 é BMS-936559 (também conhecido como MDX-1105-01). Ainda noutra modalidade, o inibidor de PD-L1 é atezolizumabe (também conhecido como MPDL3280A e Tecentrigº).

[00223] Numa modalidade, o inibidor de ponto de verificação é um inibidor de PD-L2. Numa modalidade, o inibidor de PD-L2 é um anticorpo anti- PD-L2. Numa modalidade, o anticorpo anti-PD-L2 é rHlIgM12B7A.

[00224] Numa modalidade, o inibidor de ponto de verificação é um inibidor do gene de ativação de linfócito-3 (LAG-3). Numa modalidade, o inibidor de LAG-3 é IMP321, uma proteína de fusão de Ig solúvel (Brignone et al., |. Immunol., 2007, 179, 4202-4211). Numa outra modalidade, o inibidor de LAG-3 é BMS-986016.

[00225] Numa modalidade, os inibidores de ponto de verificação são um inibidor de B7. Numa modalidade, o inibidor de B7 é um inibidor B7-H3 ou um inibidor B7-H4. Numa modalidade, o inibidor de B7-H3 é MGA271, um anticorpo anti-B7-H3 (Loo et al., Clin. Cancer Res., 2012, 3834).

[00226] Numa modalidade, os inibidores do ponto de verificação são inibidores de TIM3 (domínio de imunoglobulina de células T e domínio de mucina 3) (Fourcade et al., J. Exp. Med., 2010, 207, 2175-86; Sakuishi et al., J. Exp. Med., 2010, 207, 2187-94).

[00227] Numa modalidade, o inibidor de ponto de verificação é um agonista de OX40 (CD134). Numa modalidade, o inibidor de ponto de verificação é um anticorpo anti-OX40. Numa modalidade, o anticorpo anti- OXA40 é anti-OX-40. Noutra modalidade, o anticorpo anti-OX40 é MEDI6469.

[00228] Numa modalidade, o inibidor de ponto de verificação é um agonista de GITR. Numa modalidade, o inibidor de ponto de verificação é um anticorpo anti-GITR. Numa modalidade, o anticorpo anti-GITR é TRX518.

[00229] Numa modalidade, o inibidor de ponto de verificação é um agonista de CD137. Numa modalidade, o inibidor de ponto de verificação é um anticorpo anti-CD137. Numa modalidade, o anticorpo anti-CD137 é urelumabe. Numa outra modalidade, o anticorpo anti-CD137 é PF-05082566.

[00230] Numa modalidade, o inibidor de ponto de verificação é um agonista de CD40. Numa modalidade, o inibidor de ponto de verificação é um anticorpo anti-CD40. Numa modalidade, o anticorpo anti-CD40 é CF-870,893.

[00231] Numa modalidade, o inibidor do ponto de verificação é a interleucina-15 humana recombinante (rhlL-15).

[00232] Numa modalidade, o inibidor de ponto de verificação é um inibidor de IDO. Numa modalidade, o inibidor de IDO é INCBO24360. Noutra modalidade, o inibidor de IDO é indoximod.

[00233] Em certas modalidades, as terapias de combinação aqui fornecidas incluem dois ou mais inibidores de pontos de verificação aqui descritos (incluindo inibidores de ponto de verificação da mesma classe ou de classes diferentes). Além disso, as terapias combinadas aqui descritas podem ser usadas em combinação com um ou mais segundos agentes ativos como aqui descrito, quando apropriado, para o tratamento de doenças aqui descritas e entendidas na técnica.

[00234] Em certas modalidades, o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 pode ser utilizado em combinação com uma ou mais células imunes que expressam um ou mais receptores de antígeno quiméricos (CARs) na sua superfície (por exemplo, uma célula imune modificada). Geralmente, os CARs compreendem um domínio extracelular de uma primeira proteína (por exemplo, uma proteína de ligação ao antígeno), um domínio transmembranar e um domínio de sinalização intracelular. Em certas modalidades, uma vez que o domínio extracelular se liga a uma proteína alvo, como um antígeno associado ao tumor (TAA) ou antígeno específico do tumor (TSA),um sinal é gerado através do domínio de sinalização intracelular que ativa a célula imune, por exemplo, para atingir e matar uma célula que expressa a proteína alvo.

[00235] Domínios extracelulares:Os domínios extracelulares dos CARs se ligam a um antígeno de interesse. Em certas modalidades, o domínio extracelular da CAR compreende um receptor, ou uma porção de um receptor, que se liga ao referido antígeno. Em certas modalidades, o domínio extracelular compreende, ou é, um anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo. Em modalidades específicas, o domínio extracelular compreende, ou é, um domínio Fv (scFv) de cadeia única. O domínio Fv de cadeia única pode compreender, por exemplo, um V. ligado a Vy por um ligante flexível, em que o referido V. e Vu são de um anticorpo que se liga ao referido antígeno.

[00236] Em certas modalidades, o antígeno reconhecido pelo domínio extracelular de um polipeptídeo aqui descrito é um antígeno associado a tumores (TAA) ou um antígeno específico de tumor (TSA). Em várias modalidades, o antígeno associado ao tumor ou o antígeno específico de tumor é, sem limitação, Her2, antígeno de células-tronco da próstata (PSCA), alfa- fetoproteína (AFP), antígeno carcinoembrionário (CEA), antígeno de câncer-125 (CA-125), CA19-9, calretinina, MUC-1, antígeno de maturação de células B (BCMA), proteína de membrana epitelial (EMA), antígeno de tumor epitelial (ETA), tirosinase, antígeno associado ao melanoma-24 (MAGE), CD19, CD22, CD27, CD30, CD34, CD45, CD70, CD99, CD117, EGFRvIll (variante do fator de crescimento epidérmico |ll),mesotelina, PAP (fosfatase ácida prostática), prosteína, TARP (proteína de estrutura de leitura alternativa do receptor de células T gama), Trp-p8, STEAPI (antígeno epitelial de seis transmembranas da próstata 1), cromogranina, citoqueratina, desmina, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), proteína fluida da doença cística grossa (GCDFP-15), antígeno HMB-45,

proteína melan-A (antígeno de melanoma reconhecido por linfócitos T; MART- |, myo-D1, actina músculo-específica (MSA), neurofilamento, enolase específica de neurônio (NSE), fosfatase alcalina da placenta, sinaptófese, tiroglobulina, fator 1 de transcrição da tiroide, a forma dimérica da isoenzima do tipo piruvato quinase M2 (tumor M2-PK), uma proteína ras anormal ou uma proteína p53 anormal. Em certas outras modalidades, o TAA ou TSA reconhecido pelo domínio extracelular de um CAR é integrina avB3 (CD61), galactina ou Ral-B.

[00237] Em certas modalidades, o TAA ou TSA reconhecido pelo domínio extracelular de um CAR é um antígeno de câncer/testículo (CT), por exemplo, BAGE, CAGE, CTAGE, FATE, GAGE, HCA661, HOM-TES-85, MAGEA, MAGEB, MAGEC, NA88, NY-ESO-1, NY-SAR-35, OY-TES-1, SPANXBI, SPA17, SSX, SYCPI ou TPTE.

[00238] Em certas outras modalidades, o TAA ou TSA reconhecido pelo domínio extracelular de um CAR é um carboidrato ou gangliosídeo, por exemplo, fuc-GMl, GM2 (antígeno oncofético-imunogênico-1; OFA-I-1); GD2 (OFA-I-2), GM3, GD3 e semelhantes.

[00239] Em certas outras modalidades, o TAA ou TSA reconhecido pelo domínio extracelular de um CAR é alfa-actinina-4, Bage-l, BCR-ABL, proteína de fusão Bcr-Abl, beta-catenina, CA 125, CA 15-3 (CA 27. 29)BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, Casp-8, cdc27, cdk4, cdkn2a, CEA, coa-l, proteína de fusão dek-can, EBNA, EF2, antígenos do vírus Epstein Barr, proteína de fusão ETV6- AML1, HLA-A2, HLA-AII, hsp70-2, KIAAO205, Mart2, Mum-1, 2 e 3, neo-PAP, miosina de classe |, OS-9, proteína de fusão pml-RARa, PTPRK, K-ras, N-ras, triosefosfato isomerase, Gage 3,4,5,6,7, GnTV, Herv-K-mel, Lage-1, NA-88, NY- Eso-1/Lage-2, SP17, SSX-2, TRP2-Int2, gp100 (Pmel17), tirosinase, TRP-1, TRP-2, MAGE-Il, MAGE-3, RAGE, GAGE-I, GAGE-2, p15(58), RAGE, SCP-1, Hom/Mel-40,

PRAME, p53, HRas, HER-2/neu, EZ2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MVYL-RAR, papilomavírus humano (HPV) antígenos E6 e E7, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17. 1, NuMa, K-ras, 13-Catenina, Mum-1, p16, TAGE, PSMA, CT7, telomerase, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 13HCG, BCA225, BTAA, CD68WKP1, C0-029, FGF-5, G250, Ga733 (EpcCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOVI18, NBY70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90, TAAL6, TAG72, TLP, ou TPS.

[00240] Em várias modalidades específicas, o antígeno associado ao tumor ou o antígeno específico de tumor são antígenos tumorais relacionados com a AML, como descrito em S. Anguille et al, Leukemia (2012), 26, 2186-

2196.

[00241] Outros antígenos associados a tumores e específicos de tumores são conhecidos dos versados na técnica.

[00242] Receptores, anticorpos e scFvs que se ligam a TSAs e TAAs, úteis na construção de receptores de antígeno quiméricos, são conhecidos na técnica, assim como as sequências de nucleotídeos que as codificam.

[00243] Em certas modalidades específicas, o antígeno reconhecido pelo domínio extracelular de um receptor de antígeno quimérico é um antígeno geralmente não considerado como sendo um TSA ou um TAA, mas que está contudo associado a células tumorais, ou danos causados por um tumor. Em certas modalidades, por exemplo, o antígeno é, por exemplo, um fator de crescimento, citocina ou interleucina, por exemplo, um fator de crescimento, citocina ou interleucina associada à angiogênese ou vasculogênese. Tais fatores de crescimento, citocinas ou interleucinas podem incluir, por exemplo, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento de hepatócitos (HGF), fator de crescimento semelhante à insulina (IGF) ou interleucina-8 (IL-8). Os tumores também podem criar um ambiente hipóxico local para o tumor. Como tal, em outras modalidades específicas, o antígeno é um fator associado à hipoxia, por exemplo, HIF-1a, HIF-1B, HIF-20, HIF-2B, HIF-3a ou HIF-3B. Os tumores também podem causar danos localizados ao tecido normal, causando a liberação de moléculas conhecidas como moléculas de padrão molecular associadas a danos (DAMPs; também conhecidas como alarminas) Em certas outras modalidades específicas, portanto, o antígeno é um DAMP, por exemplo, uma proteína de choque térmico, grupo 1 de alta mobilidade de proteína associada à cromatina (HMGB 1), S100A8 (MRP8, calgranulina A), S100A9 (MRP14, calgranulina B), amiloide do soro A (SAA), ou pode ser um ácido desoxirribonucleico, trifosfato de adenosina, ácido úrico ou sulfato de heparina.

[00244] Domínio transmembranar:Em certas modalidades, o domínio extracelular do CAR é ligado ao domínio transmembranar do polipeptídeo por uma sequência ligante, espaçadora ou polipeptídica de dobradiça, por exemplo, uma sequência de CD28 ou uma sequência de CTLA4. O domínio transmembranar pode ser obtido ou derivado do domínio transmembranar de qualquer proteína transmembranar e pode incluir toda ou uma porção desse domínio transmembranar. Em modalidades específicas, o domínio transmembranar pode ser obtido ou derivado de, por exemplo, CD8, CD16, um receptor de citocina e receptor de interleucina, ou um receptor de fator de crescimento, ou semelhantes.

[00245] Domínios de sinalização intracelular:Em certas modalidades, o domínio intracelular de um CAR é ou compreende um domínio ou motivo intracelular de uma proteína que é expressa na superfície de células T e desencadeia a ativação e/ou proliferação das referidas células T. Tal domínio ou motivo é capaz de transmitir um sinal de ligação ao antígeno primário que é necessário para a ativação de um linfócito T em resposta à ligação do antígeno à porção extracelular do CAR. Tipicamente, este domínio ou motivo compreende, ou é, um ITAM (motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptora). Os polipeptídeos contendo ITAM adequados para CARs incluem, por exemplo, a cadeia zeta CD3 (CD37) ou suas porções contendo ITAM. Numa modalidade específica, o domínio intracelular é um domínio de sinalização intracelular de CD37. Em outras modalidades específicas,o domínio intracelular é de uma cadeia de receptores de linfócitos, uma proteína complexa de TCR/CD3, uma subunidade do receptor de Fe ou uma subunidade do receptor de 1L-2. Em certas modalidades, o CAR compreende adicionalmente um ou mais domínios ou motivos coestimuladores, por exemplo, como parte do domínio intracelular do polipeptídeo. O um ou mais domínios ou motivos coestimuladores podem ser, ou podem compreender, uma ou mais de uma sequência polipeptídica CD27 coestimuladora, uma sequência polipeptídica CD28 coestimuladora, uma sequência polipeptídica OX40 coestimuladora (CD134), uma sequência polipeptídica 4-1BB (CD137) coestimuladora, ou uma sequência polipeptídica coestimuladora indutível de células T coestimuladoras (ICOS), ou outro domínio ou motivo coestimulador, ou qualquer combinação dos mesmos.

[00246] O CAR pode também compreender um motivo de sobrevida de células T. O motivo de sobrevida de células T pode ser qualquer sequência ou motivo polipeptídico que facilite a sobrevida do linfócito T após estimulação por um antígeno. Em certas modalidades, o motivo de sobrevida de células T é ou é derivado de CD3, CD28, um domínio de sinalização intracelular do receptor de IL-7 (IL-7R), um domínio de sinalização intracelular do receptor de IL-12, um domínio de sinalização intracelular do receptor de IL-15, um domínio de sinalização intracelular do receptor de IL-21, ou um domínio de sinalização intracelular do receptor do fator de crescimento de transformação B (TGFB).

[00247] As células imunes modificadas que expressam os CARs podem ser, por exemplo, linfócitos T (células T, por exemplo, células T CD4+ ou células T CD8+), linfócitos citotóxicos (CTLs) ou células assassinas naturais (NK). Os linfócitos T utilizados nas composições e métodos aqui proporcionados podem ser linfócitos T naive ou linfócitos T restritos a MHC. Em certas modalidades, os linfócitos T são linfócitos infiltrantes de tumores (TILs). Em certas modalidades, os linfócitos T foram isolados a partir de uma biópsia de tumor ou foram expandidos a partir de linfócitos T isolados de uma biópsia de tumor. Em certas outras modalidades, as células T foram isoladas ou são expandidas a partir de linfócitos T isolados de sangue periférico, sangue do cordão umbilical ou linfa. Células imunológicas a serem usadas para gerar células imunes modificadas expressando um CAR podem ser isoladas usando métodos de rotina aceitos pela técnica, por exemplo, coleta de sangue seguida de aférese e, opcionalmente, isolamento ou triagem de células mediadas por anticorpos.

[00248] As células imunes modificadas são preferencialmente autólogas a um indivíduo a quem as células imunes modificadas devem ser administradas. Em certas outras modalidades, as células imunes modificadas são alogênicas a um indivíduo a quem as células imunes modificadas devem ser administradas. Quando linfócitos T alogênicos ou células NK são usados para preparar linfócitos T modificados, é preferível selecionar linfócitos T ou células NK que reduzam a possibilidade de doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD) no indivíduo. Por exemplo, em certas modalidades, os linfócitos T específicos de vírus são selecionados para a preparação de linfócitos T modificados; espera-se que tais linfócitos tenham uma capacidade nativa grandemente reduzida de se ligar a, e assim tornarem-se ativados por quaisquer antígenos receptores. Em certas modalidades, a rejeição mediada por receptores de linfócitos T alogênicos pode ser reduzida por coadministração ao hospedeiro de um ou mais agentes imunossupressores, por exemplo, ciclosporina, tacrolimus, sirolimus, ciclofosfamida ou semelhantes.

[00249] Linfócitos T, por exemplo, linfócitos T não modificados, ou linfócitos T expressando CD3 e CD28, ou compreendendo um polipeptídeo compreendendo um domínio de sinalização CD36 e um domínio coestimulador CD28, podem ser expandidos usando anticorpos para CD3 e CD28, por exemplo, anticorpos ligados a grânulos ; ver, por exemplo, Patentes US

5.948.893; 6.534.055; 6.352.694; 6.692.964; 6.887.466; e 6.905.681.

[00250] As células imunes modificadas, por exemplo, linfócitos T modificados, podem opcionalmente compreender um “gene suicida” ou “interruptor de segurança” que permite a morte de substancialmente todas as células imunes modificadas quando desejado. Por exemplo, os linfócitos T modificados, em certas modalidades, podem compreender um gene de timidina-quinase de HSV (HSV-TK), que causa a morte dos linfócitos T modificados por contato com o ganciclovir. Numa outra modalidade, os linfócitos T modificados compreendem uma caspase induzível, por exemplo, uma caspase 9 induzível (icaspase 9), por exemplo, uma proteína de fusão entre caspase 9 e proteína de ligação a FK506 humana permitindo a dimerização utilizando uma molécula pequena específica farmacêutica. Ver Straathof et al., Blood 1 O5 (11): 4247-4254 (2005).

[00251] Em certas modalidades, o Composto 1, Composto 2 ou Composto 3 como aqui fornecido é administrado a pacientes com vários tipos ou estágios de mieloma múltiplo em combinação com células T do receptor de antígeno quimérico (CAR). Em certas modalidades, a célula T CAR na combinação tem como alvo o antígeno de maturação das células B (BCMA) e, em modalidades mais específicas, a célula T CAR é bb2121 ou bb21217. Em algumas modalidades, a célula T CAR é JCARH125.

G. Composições Farmacêuticas

[00252] As composições — farmacêuticas aqui fornecidas contêm quantidades terapeuticamente eficazes de um ou mais dos compostos aqui fornecidos e, opcionalmente, um transportador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00253] Os compostos podem ser formulados em preparações farmacêuticas adequadas, como soluções, suspensões, comprimidos, comprimidos dispersíveis, pílulas, cápsulas, pós, formulações ou elixires de liberação sustentada, para administração oral ou em soluções ou suspensões estéreis para administração oftálmica ou parenteral, bem como preparação de adesivo transdérmico e inaladores de pó seco. Tipicamente, os compostos descritos acima são formulados em composições farmacêuticas que usam técnicas e procedimentos bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Sétima Edição (1999). .

[00254] Nas composições, as concentrações efetivas de um ou mais compostos ou sais farmaceuticamente aceitáveis são misturadas com um carreador ou veículo farmacêutico adequado. Em certas modalidades, as concentrações dos compostos nas composições são eficazes para a distribuição de uma quantidade, mediante administração, que trata, previne ou melhora um ou mais dos sintomas e/ou progressão do mieloma múltiplo.

[00255] Tipicamente, as composições são formuladas para administração de dosagem única. Para formular uma composição, a fração de peso do composto é dissolvida, suspensa, dispersa ou misturada em um veículo selecionado a uma concentração eficaz, de modo que a condição tratada seja aliviada ou melhorada. Veículos ou carreadores farmacêuticos apropriados para administração dos compostos aqui fornecidos incluem quaisquer transportadores conhecidos pelos versados na técnica para que sejam adequados para o modo de administração específico.

[00256] Além disso, os compostos podem ser formulados como ingrediente ativo farmaceuticamente único na composição ou podem ser combinados com outros ingredientes ativos. As suspensões lipossomais, incluindo lipossomas direcionados aos tecidos, tais como lipossomas direcionados aos tumores, podem também ser adequados como transportadores farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos dos versados na técnica. Por exemplo, as formulações de lipossomas podem ser preparadas como conhecido na técnica. Resumidamente, lipossomas como vesículas multilamelares (MLV's) podem ser formados secando fosfatidilcolina de ovo e fosfatidil serina cerebral (razão molar de 7:3) no interior de um frasco. Uma solução de um composto aqui proporcionado em solução salina tamponada com fosfato sem cátions divalentes (PBS) é adicionada e o frasco agitado até que o filme de lipídeo seja disperso. As vesículas resultantes são lavadas para remover o composto não encapsulado, peletizado pela centrifugação, e em seguida ressuspenso em PBS.

[00257] O composto ativo é incluído no veículo farmaceuticamente aceitávelÀ em uma quantidade suficiente para exercer um efeito terapeuticamente útil na ausência de efeitos colaterais indesejáveis no paciente tratado. A concentração terapeuticamente eficaz pode ser determinada empiricamente testando os compostos em sistemas in vitro e in vivo aqui descritos e depois extrapolados para dosagens para seres humanos.

[00258] A concentração do composto ativo na composição farmacêutica dependerá das taxas de absorção, distribuição do tecido, inativação, metabolismo e excreção do composto ativo, as características físico-químicas do composto, o esquema de dosagem e a quantidade administrada, bem como outros fatores conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, a quantidade distribuída é suficiente para melhorar um ou mais dos sintomas do câncer, incluindo tumores sólidos e tumores transmitidos pelo sangue.

[00259] As soluções ou suspensões utilizadas para aplicação parenteral, intradérmica, subcutânea ou tópica podem incluir quaisquer dos seguintes componentes: um diluente estéril, tal como água para injeção, solução salina, óleo fixo, polietilenoglicol, glicerina, propileno glicol, dimetilacetamida ou outros solvente sintéticos; agentes antimicrobianos, tal como álcool benzílico e parabenos de metil; antioxidantes, tais como ácido ascórbico e bissulfito de sódio; agentes quelantes, tais como ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA); tampões, tais como acetatos, citratos e fosfatos; e agentes para o ajustamento da tonicidade tais como cloreto de sódio ou dextrose. As preparações parenterais podem ser encerradas em ampolas, canetas, seringas descartáveis ou frascos de dose única ou múltipla feitos de vidro, plástico ou outro material adequado.

[00260] Nos casos em que os compostos exibem solubilidade insuficiente, podem ser usados métodos para solubilizar os compostos. Tais métodos são conhecidos dos versados nesta técnica, e incluem, mas não estão limitados a utilização de co-solventes, tais como dimetilsulfóxido (DMSO), usando tensoativos, tais como TWEENº, ou dissolução em bicarbonato de sódio aquoso.

[00261] Após a mistura ou adição dos compostos, a mistura resultante pode ser uma solução, suspensão, emulsão ou semelhantes. A forma da mistura resultante depende de um número de fatores, incluindo o modo de administração pretendido e a solubilidade do composto no transportador ou veículo selecionado. A concentração eficaz é suficiente para atenuar os sintomas da doença, distúrbio ou condição tratada e pode ser empiricamente determinada.

[00262] As composições farmacêuticas são fornecidas para administração a seres humanos e animais em formas de dosagem unitárias, como comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões parenterais estéreis e soluções ou suspensões orais e emulsões orais e emulsões de água e óleo contendo quantidades adequadas dos compostos ou sais —farmaceuticamente — aceitáveis dos mesmos. Os compostos farmaceuticamente terapeuticamente ativos e sais dos mesmos são formulados e administrados em formas de dosagem unitárias ou múltiplas formas de dosagem. As formas de dose unitária, conforme aqui utilizadas, referem-se a unidades fisicamente distintas, adequadas para indivíduos humanos e animais e embaladas individualmente, como é conhecido na técnica. Cada dose unitária contém uma quantidade predeterminada do composto terapeuticamente ativo suficiente para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o transportador, veículo ou diluente farmacêutico necessário. Exemplos de formas unitárias de dosagem incluem ampolas e seringas e comprimidos embalados individualmente ou cápsulas. As formas unitárias de dosagem podem ser administradas em frações ou múltiplos das mesmas. Uma forma de dosagem múltipla é uma pluralidade de formas unitárias de dosagem idênticas embaladas num único recipiente a serem administrados em forma de dosagem unitária segregada. Exemplos de formas de dosagem múltipla incluem frascos, frascos de comprimidos ou cápsulas ou garrafas de litros ou galões. Assim, a forma de dosagem múltipla é um múltiplo de dosagem unitária que não são segregadas em embalagens.

[00263] Podem ser preparadas formas de dosagem ou composições contendo ingrediente ativo na faixa de 0,005% a 100% com o saldo constituído por veículo não tóxico. Para administração oral, uma composição não tóxica farmaceuticamente aceitável está formada pela incorporação de qualquer um dos excipientes normalmente empregues, tais como, por exemplo graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, talco, derivados de celulose, croscarmelose de sódio, glicose, sacarose, carbonato de magnésio ou sacarina de sódio. Tais composições incluem soluções, suspensões, comprimidos, cápsulas, pós e formulações de libertação sustentada, tais como, mas não limitado aos implantes e sistemas de entrega microencapsulados, e, polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, tais como colágeno, etileno acetato de vinili polianidridos, ácido poliglicólico, poliortoésteres, ácido polilático e outros. Os métodos para a preparação destas composições são conhecidos pelos versados na técnica.

[00264] Os compostos ativos ou sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser preparados com veículos que protegem o composto contra a rápida eliminação do corpo, como formulações ou revestimentos de liberação no tempo.

[00265] As composições podem incluir outros compostos ativos para obter combinações desejadas de propriedades. Os compostos aqui fornecidos, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, conforme descrito aqui, também podem ser vantajosamente administrados para fins terapêuticos ou profiláticos, juntamente com outro agente farmacológico conhecido na técnica em geral como sendo de valor no tratamento de uma ou mais das doenças ou condições médicas referidas acima, como doenças relacionadas ao estresse oxidativo. É para ser entendido que tal terapia de combinação constitui um outro aspecto das composições e métodos de tratamento aqui proporcionados.

H. Avaliação da atividade e propriedades dos compostos

[00266] Estão disponíveis procedimentos fisiológicos, farmacológicos e bioquímicos padrão para testar os compostos para identificar aqueles que possuem as propriedades desejadas, incluindo atividade proliferativa de anti mieloma-múltiplo e perfil de segurança adequado.

Tais ensaios incluem, por exemplo, ensaios bioquímicos, tais como ensaios de ligação, ensaios de incorporação de radioatividade, bem como uma variedade de ensaios baseados em células.

[00267] Derivados de isoindolinona e seus usos terapêuticos foram descritos em, por exemplo,Patente US 8. 518. 972. Surpreendentemente, o Composto 1, Composto 2 e Composto 3 exibem propriedades inesperadas e benéficas, como mostrado na seção Exemplos. Essas propriedades benéficas incluem um aumento significativo da potência do anti mieloma-múltiplo, níveis aumentados de apoptose e uma resposta mais potente e eficaz à combinação com dexametasona e surpreendentemente um perfil de segurança aprimorado, como mostrado pela atividade funcional reduzida nos receptores al adrenérgicos e D2 dopamina (in vitro, bem como in vivo), seletividade melhorada de morte celular (como mostrado pela morte reduzida de células não mieloma) e inibição reduzida de CYP3A4.

[00268] Entende-se que a descrição detalhada citada acima e os exemplos anexos são meramente ilustrativos e não devem ser considerados como limitações sobre o escopo da matéria. Várias mudanças e modificações nas modalidades divulgadas serão evidentes para os versados na técnica. Tais alterações e modificações, incluindo, sem limitação, aquelas relacionadas às estruturas — químicas, substituintes, derivados, intermediários, sínteses, formulações e/ou métodos de uso aqui fornecidos, podem ser feitas sem se afastar do espírito e do escopo. As patentes e publicações dos EUA aqui mencionadas são incorporadas por referência.

6. EXEMPLOS

[00269] Certas modalidades da invenção são ilustradas nos seguintes exemplos não limitativos.

Abreviações: ACN/ACN Acetonitrila AIBN Azobisisobutironitrila Boc terc-Butiloxicarbonil Boc2O0 di-terc-Butil dicarbonato tBuOK Terc-butóxido de potássio DIEA Di-isopropiletilamina DMF N,Nº-Dimetilformamida DMSO Dimetilsulfóxido EtOAc Acetato de etil IPA Isopropanol ou 2-propanol MeOH Metanol MM Mieloma Múltiplo NBS N-bromossuccinimida, NMR Ressonância magnética nuclear PBMC Célula mononuclear do sangue periférico humano i-PrOAc Acetato de isopropil TBS terc-Butil dimetilsilil TBSCI terc-Butil dimetilsililcloreto THF tetra-hidrofurano TLC Cromatografia em camada fina TMSCICIoreto de trimetilsilil Exemplo 1:Síntese de 4-(4-(4-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1-oxoisoindolin- 4-il)oxi)metil)benzil)piperazin-1-i1)-3-fluorobenzonitrila (Composto 1).

o Ox CO: NH NO o o A.

[00270] Ácido 2-amino-5-metoxi-5-oxopentanoico. A uma suspensão de ácido 2-aminopentanodioico (250 g, 1,70 mol) em metanol seco (2,5 L) sob nitrogênio foi adicionado cloreto de trimetilsilil (277 g, 2,55 mol) durante 30 minutos. A solução límpida resultante foi agitada à temperatura ambiente (20ºC) durante 30 minutos. *H NMR mostrou que o material de partida foi consumido completamente. A mistura de reação foi utilizada na etapa seguinte sem mais tratamento. *H NMR:400 MHz CD3OD 65:4,17-4,15 (m, 1H), 3,71 (s, 3H), 2,70-2,60 (m, 2H), 2,33-2,25 (m, 2H).

[00271] Ácido 2-((terc-butoxicarbonil)amino)-5-metoxi-5-oxopentanoico. À solução acima foi adicionada trietilamina (275 g, 2,72 mol) e di-terc-butil dicarbonato (447,35 g, 2,05 mol). A mistura de reação foi agitada a 25ºC por 2 h. A solução foi concentrada até a secura, em seguida foi adicionada água (2,5 L) para dissolver o resíduo. A solução aquosa resultante foi lavada com acetato de etil (200 mL), depois acidificada a pH = 3 por HCI (1 N) e extraída com acetato de etil (1 L x 3). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (800 mL), secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas para oferecer ácido 2-(terc-butoxicarbonilamino)-5-metoxi-5-oxo-pentanoico (250 g 56% de rendimento, duas etapas) como um sólido branco. *H NMR:400 MHz CD30D 6:4,18-4,11 (m, 1H), 3,69 (s, 3H), 2,48-2,43 (m, 2H), 2,21-2,15 (m, 1H), 1,95-1,91 (m, 1H), 1,46 (s, 9H).

[00272] Metil 5-amino-4-(terc-butoxicarbonilamino) -5-oxo-pentanoatoA uma solução de ácido 2-(terc-butoxicarbonilamino)-5-metoxi-5-0xo-pentanoico (200 g, 765 mmol) em 1,4-dioxano (1,5 L) foram adicionados di-terc-butil dicarbonato (267 g 1,22 mol) e piridina (121 g, 1,53 mol). Depois que a mistura de reação foi agitada a 25ºC por 30 min, carbonato de amônio (182 g, 2,30 mol) foi adicionado à mistura e agitado por mais 16 horas a 25ºC. O solvente orgânico foi removido por evaporação rotativa, o resíduo foi acidificado por HCI (6 M) até pH = 3 e depois extraído com acetato de etil (800 mL x 3). A fase orgânica combinada foi lavada com salmoura (800 mL), seca com sulfato de sódio e filtrada. Os orgânicos voláteis foram removidos sob pressão reduzida para oferecer metil 5-amino-4-(terc-butoxicarbonilamino)-5-oxo-pentanoato (180 g, 90% de rendimento) como um sólido branco. *H NMR:400 MHz CDCl3 6: 6,51 (s, 1H), 5,94 (s, 1H), 5,43 (s, 1H), 4,21 (s, 1H), 3,63 (s, 3H), 2,59-2,40 (m, 2H), 2,15-2,11 (m, 1H), 1,94-1,90 (m, 1H), 1,42 (s, 9H).

[00273] Metil 4,5-diamino-5-oxo-pentanoato cloridrato. Uma mistura de 5-amino-4-(terc-butoxicarbonilamino)-5-oxo-pentanoato (180 g, 692 mmol) e HCl/acetato de etil (300 mL, 4 M) foi agitada a 25ºC durante 12 h. O sólido precipitado foi coletado por filtração a vácuo e lavado com acetato de etil (500 mL) para dar metil 4,5-diamino-5-oxo-pentanoato cloridrato (130 g, 95% de rendimento) como um sólido branco. *H NMR:400 MHz CD3O0D 65:4,00-3,96 (m, 1H), 3,70 (s, 3H), 2,59-2,52 (m, 2H), 2,22-2,13 (m, 2H).

[00274] Metil 3-hidroxi-2-metil-benzoato. Quatro lotes (200 g cada) foram executados em paralelo. A uma solução de ácido 3-hidroxi-2-metil-benzoico (200 g, 1,31 mol) em metanol (4,0 L) foi adicionado ácido sulfúrico concentrado (47,7 g, 486 mmol). A mistura de reação foi agitada a 60ºC por 17 h e foi concentrada para 800 mL. A mistura resultante foi resfriada a 20ºC e vertida lentamente em água (400 mL) durante 30 minutos. Foi adicionada água (1200 mL) a 20ºC durante 3 h e a mistura resultante foi agitada a 20ºC por 1h. O sólido precipitado foi coletado por filtração a vácuo (quatro lotes combinados) e foi lavado três vezes com água/metanol (1000 mL, 9:1) ou até o filtrado ter pH> 3. O sólido foi seco sob vácuo a 45ºC para dar 3-hidroxi-2-metil-benzoato (700 g, 80,4% de rendimento) como um sólido cinzento. *H NMR:400 MHz DMSO-ds 5:9,70 (s, 1H), 7,18 (t, J] = 6,8 Hz, 1H), 7,09 (t, | = 7,6 Hz, 1H), 7,00 (t, J = 6,8 Hz, 1H), 3,81 (s, 3H), 2,29 (s, 3H).

[00275] Metil/ 3-[terc-butil(dimetil)sililJoxi-2-metil-benzoato. Dois lotes (240 g cada) foram executados em paralelo. A uma solução de metil 3-hidroxi- 2-metil-benzoato (240 g, 1,44 mol) em DMF (1,40 L) foi adicionado imidazol (246 g, 3,61 mol) e cloreto de terc-butil dimetilsilil (238 g, 1,58 mol) a 5ºC. Após a adição, a mistura foi aquecida a 20ºC e agitada durante 6 h. Foi adicionado acetato de isopropil (1700 mL) e, em seguida, foi adicionada água (2000 mL) lentamente enquanto a temperatura foi mantida abaixo de 30ºC. A mistura resultante foi agitada e a fase orgânica foi separada. A fase orgânica combinada (dois lotes combinados) foi lavada com água (1700 mL x 3) e concentrada a * 1500 mL (KF<0,05%). O produto foi armazenado como uma solução de acetato de isopropil que foi utilizada na etapa seguinte sem purificação adicional.

[00276] Metil 2-(bromometil)-3-[terc-butil(dimetil)silil]oxi-benzoato. Dois lotes (“375 g cada) foram executados em paralelo. À solução de acetato de isopropil de metil 3-[terc-butil(dimetil)silil]oxi-2-metilbenzoato (* 375 g, 1,34 mol) foi adicionada N-bromossuccinimida (274 g 154 mol) e azobisisobutironitrila (4,40 g 26,8 mmol). A mistura de reação foi aquecida a 70ºC durante pelo menos 1 h e agitada a 70ºC por 4 h. A mistura de reação foi resfriada a 20ºC e mantida a 20ºC por pelo menos 1 h. Os dois lotes de sólido (succinimida) foram removidos por filtração e lavados com acetato de isopropil (700 mL). O filtrado foi lavado com solução de sulfito de sódio (700 g) em água (6000 mL), seguido de água (1500 mL). A camada orgânica foi destilada sob vácuo a 45ºC até à secura para dar metil 2-(bromometil)-3-[terc- butil(dimetil)sililJoxi-benzoato (920 g, 95,5% de rendimento) como um óleo laranja escuro. *H NMR:400 MHz DMSO-dçs 6:7,45 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 7,36 (t, | = 8,0 Hz, 1H), 7,13 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 4,95 (s, 2H), 1,02 (s, 9H), 0,29 (s, 6H).

[00277] Metil 5-amino-4-[4-[terc-butil(dimetil)sililJoxi-1-oxo-isoindolin-2- il]-5-oxo-pentanoato. A uma solução agitada de metil 4,5-diamino-5-0x0- pentanoato cloridrato (74,5 g, 379 mmol) em acetonitrila (2,50 L) foi adicionado 2-(bromometil)-3-[terc-butil(dimetil)silil] oxi-benzoato (125 g, 348 mmol). À suspensão foi adicionada di-isopropiletilamina (89,9 g, 696 mmol) através de um funil de adição ao longo de 10 min e depois a mistura foi agitada a 60ºC por 16 h. A mistura de reação foi diluída com acetato de etil (1,0 L), lavada com HCI (1 N, 1,0 L), bicarbonato de sódio (sat. 1,0 L) e salmoura (1,0 L) sucessivamente. A camada orgânica foi concentrada para dar metil 5-amino-4- [4-[terc-butil(dimetil)silil]oxi-1-0xo-isoindolin-2-il]-5-0xo-pentanoato bruto (108 8, bruto) como um sólido amarelo claro. LCMS: m/z 407,3 [M+1]”*.

[00278] Metil 5-amino-4-(4-hidroxi-1-0xo-isoindolin-2-i1)-5-0x0- pentanoato. A uma solução fria agitada de metil 5-amino-4-[4-[terc- butil(dimetil)sililJoxi-1-oxo-isoindolin-2-il]-5-0xo-pentanoato (108 g, 266 mmol) em N N-dimetilformamida (350 mL) foi adicionado carbonato de potássio (14,7 8, 106 mmol) em água (40 mL) em porções ao longo de 5 min. A mistura de reação resultante foi agitada a 15ºC por 15 h. A mistura de reação foi resfriada em um banho de gelo e HCI (12 M, 15 mL) foi adicionado lentamente a 0-5ºC. Foi adicionada acetonitrila (200 mL) à mistura e formou-se um precipitado. À suspensão foi agitada à temperatura ambiente durante 10 min. e filtrada. À torta de filtração foi lavada com acetato de etil (200 mL x 5) para dar o produto (55 g). O filtrado foi concentrado sob alto vácuo para dar um produto em bruto (100 g) que foi dissolvido em diclorometano (1,0 L) e deixado repousar a 15ºC durante 16 horas. Foi formado um sólido branco que foi filtrado para dar 5 g de produto. Os sólidos foram combinados para dar 5-amino-4-(4-hidroxi-1-0x0-

isoindolin-2-il)-5-0xo-pentanoato (60 g, 77% de rendimento) como um sólido branco. *H NMR:400 MHz DMSO-ds 6:7,58 (s, 1H), 7,31 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 7,19- 7,14 (m, 2H), 7,01 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,75-4,71 (m, 1H), 4,50 (d, ) = 17,6 Hz, 1H), 4,32 (d,J =17,6 Hz, 1H), 3,51 (s, 3H), 2,29-2,18 (m, 3H), 2,09-1,99 (m, 1H).

[00279] Metil 5-amino-4-[4-[[4-(bromometil)fenil]J]metoxi]-1-0x0-iso- indolin-2-il]-5-0xo-pentanoato. Duas reações (25 g, 85,5 mmol) foram realizadas em paralelo. Uma mistura de 1,4-bis(bromometil)benzeno (67,78, 257 mmol), carbonato de potássio (11,8 g, 85,5 mmol) e metil 5-amino-4-(4- hidroxi-1-oxo-isoindolin-2-il)-5-oxo-pentanoato (25 g 855 mmol) em acetonitrila (1 L) foi agitada a 60ºC durante 16 h. Os dois lotes foram combinados e a mistura foi resfriada a 15ºC e filtrada. O filtrado foi concentrado e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (eluído com éter de petróleo a 50% em acetato de etil a 100% de acetato de etil) para proporcionar metil 5-amino-4-[4-[[4-(bromometil)fenil]Jmetoxi]-1-0x0- iso-indolin-2-il]-5-o0xo-pentanoato (52 g, 63% de rendimento) como um sólido branco. *H NMIR:400 MHz DMSO-ds 6:7,59 (s, 1H), 7,50-7,44 (m, 5H), 7,32-7,28 (m, 2H), 7,19 (s, 1H), 5,26 (s, 2H), 4,79-4,71 (m, 3H), 4,55 ( d, | = 17,6 Hz, 1H), 4,43 (d, J = 17,6 Hz, 1H), 3,52 (s, 3H), 2,30-2,19 (m, 3H), 2,10-2,08 (m, 1H).

[00280] 3-[4-[[4-(bromometil)fenil]Jmetoxi]l-1-0xo-isoindolin-2- il]piperidina-2,6-diona. Duas reações (28,5 g, 60,0 mmol) foram realizadas em paralelo. Metil 5-amino-4-[4-[[4-(bromometil)fenil]metoxi]-1-ox0-isoindolin-2- il])-5-oxo-pentanoato (28,5 g, 60,0 mmol) foi dissolvido em tetra-hidrofurano (720 mL) e a solução foi resfriada em banho de gelo seco/acetona a -70ºC. Enquanto se agitava, foi adicionado terc-butóxido de potássio (7,4 g, 66,0 mmol) em uma porção à solução transparente. A mistura de reação ficou amarela pálida e a agitação foi continuada por mais 2 h a -70ºC. Uma solução resfriada de HCI (1 N, 260 mL) foi rapidamente transferida para a mistura de reação, mantendo a temperatura a -70ºC. A mistura ficou imediatamente leitosa e o banho de gelo seco/acetona foi removido. A mistura foi concentrada para remover a maior parte do tetra-hidrofurano. Após concentração da mistura de reação, um sólido branco precipitou. A pasta branca foi diluída com água (500 mL) e depois filtrada. A torta de filtração foi lavada com água (500 mL) e seca em estufa de vácuo a 40ºC por 12 h, depois lavada com acetato de etil (500 mL). Os lotes foram combinados para dar 3-[4-[[4- (bromometil)fenil]metoxi]-1-oxo-isoindolin-2-il]piperidina-2,6-diona (49,85 g, 93%) como sólido amarelo claro. *H NMR:400 MHz DMSO-ds 5:10,95 (s, 1H), 7,51-7,41 (m., 5H), 7,35-7,28 (m, 2H), 5,23 (s, 2H), 5,12-5,07 (m, 1H), 4,70 (s, 2H), 4,41 (d, J = 17,6 Hz, 1H), 4,25 (d, J = 17,6 Hz, 1H), 2,90-2,84 (m, 1H), 2,58- 2,53 (m, 1H), 2,44-2,41 (m, 1H), 1,98-1,95 (m, 1H).

[00281] 4-(4-(4-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1-oxoisoindolin-4- il)oxi)metil)benzil)piperazin-1-i1)-3-fluorobenzonitrila3-(4-((4- (bromometil)benzil)oxi)-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona (5,0 g, 11,28 mmol) foi colocado em um frasco com 3-fluoro-4-(piperazin-1-il)benzonitrila (2,315 g, 11,28 mmol), di-isopropiletilamina (5,91 ml, 33,8 mmol) e acetonitrila (100 ml). A mistura de reação foi agitada a 40ºC por 18 h. Os orgânicos voláteis foram removidos sob pressão reduzida e a purificação por métodos padrão proporcionou 4-(4-(4-(((2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1-oxoisoindolin-4- il)oxi)]Metil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitrila. *H NMR (400 MHz, DMSO-ds) 5 10,97 (s, 1H), 7,68 (dd, J = 1,96, 13,45 Hz, 1H), 7,56 (dd, | = 1,77, 8,38 Hz, 1H), 7,43-7,52 (m, 3H), 7,30-7,38 (m, 4H), 7,11 (t, J = 8,80 Hz, 1H), 5,24 (s, 2H), 5,11 (dd, J = 5,14, 13,33 Hz, 1H), 4,37-4,46 (m, 1H), 4,22-4,30 (m, 1H), 3,54 (s, 2H), 3,12-3,23 (m, 4H), 2,84-2,98 (m, 1H), 2,52-2,62 (m, 5H), 2,36-2,48 (m, 1H), 1,92-2,04 (m, 1H). MS (ESI) m/z 568,2 [M+1]*. Anal. Calcd para C32H30oFN5O24:C, 67,71; H, 5,33; N, 12,34. Encontrado:C, 67,50; H, 5,44; N 12,34.

Exemplo 2:Síntese de S)-4-(4-(4-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1- oxoisoindolin-4-il)oxi)]metil)benzil)piperazin-1-i1)-3-fluorobenzonitrila Composto 2).

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[00282] terc-Butil (45)-5-amino-4-(benziloxicarbonilamino)-5-0x0- pentanoato. A uma solução de ácido (2S)-2-(benziloxicarbonilamino)-5-terc- butoxi-5-oxo-pentanoico (150 g, 445 mmol) em 1,4-dioxano (1,50 L) foi adicionado di-terc-butil dicarbonato (155 g, 711 mmol), piridina (70,3 g, 889 mmol) e bicarbonato de amônio (105 g, 1,33 mol). A mistura de reação foi agitada a 18ºC por 16 h e, depois concentrado. O resíduo foi dissolvido em acetato de etil (5,0 L) e água (5,0 L), a camada orgânica foi separada e lavada com HCl (3,0 mL, 1 N), bicarbonato de sódio saturado (3,0 L), salmoura (3,0 L), seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrado e concentrado para dar terc-butil (485)-5-amino-4-(benziloxicarbonilamino)-5-oxo-pentanoato bruto (450 g, bruto) como um sólido branco, que foi utilizado na etapa seguinte sem purificação adicional. *H NMR 400 MHz DMSO-ds 6:7,35-7,30 (m, 5H), 7,02 (s, 1H), 5,01 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 3,93-3,90 (m, 1H), 2,20 (t, J) = 8,0 Hz, 2H), 1,88 -1,84 (m, 1H), 1,72-1,69 (m, 1H), 1,35 (s, 9H).

[00283] terc-Butil (4S5)-4,5-diamino-5-oxopentanoato. A uma solução de terc-butil (45)-5-amino-4- (benziloxicarbonilamino)-5-oxo-pentanoato (112 g&, 333 mmol) em metanol (1,0 L) foi adicionado paládio a 10% em carbono (15 g) sob nitrogênio. A suspensão foi desgaseificada sob vácuo e purgada com hidrogênio várias vezes. A mistura foi agitada sob hidrogênio gasoso (40 psi) a 30ºC por 16 h. A mistura de reação foi filtrada e o filtrado foi concentrado para dar terc-butil (45)-4,5-diamino-5-oxopentanoato bruto como um óleo incolor. 2H NMR 400 MHz DMSO-ds 5:7,30 (s, 1H), 6,95 (s, 1H), 3,10-3,07 (m, 1H), 2,27- 2,23 (m, 2H), 1,69-1,78 (m, 1H), 1,59-1,55 (m, 1H), 1,38 (s, 9H).

[00284] Metil 3-hidroxi-2-metil-benzoato. Quatro lotes (200 g cada) foram executados em paralelo. A uma solução de ácido 3-hidroxi-2-metil-benzoico (200 g, 1,31 mol) em metanol (4,0 L) foi adicionado ácido sulfúrico concentrado (47,7 g, 486 mmol). A mistura de reação foi agitada a 60ºC por 17 h. A mistura de reação foi concentrada para 800 mL. A mistura resultante foi resfriada a 20ºC e vertida lentamente em água (400 mL) durante 30 minutos. Foi adicionada água (1200 mL) a 20ºC durante 3 h e a mistura resultante foi agitada a 20ºC por 1 h. O sólido precipitado foi coletado por filtração a vácuo (quatro lotes combinados) e foi lavado três vezes com água/metanol (1000 mL, 9:1) ou até que o filtrado tivesse pH> 3. O sólido foi seco sob vácuo a 45ºC para dar 3- hidroxi-2-metil-benzoato (700 g, 80,4% de rendimento) como um sólido cinzento. *H NMR:400 MHz DMSO-dçs 65:9,70 (s, 1H), 7,18 (t, ] = 6,8 Hz, 1H), 7,09 (t, ] =7,6 Hz, 1H), 7,00 (t, ) = 6,8 Hz, 1H), 3,81 (s, 3H), 2,29 (s, 3H).

[00285] Metil/ 3-[terc-butil(dimetil)sililJoxi-2-metil-benzoato. Dois lotes (240 g cada) foram executados em paralelo. A uma solução de metil 3-hidroxi- 2-metil-benzoato (240 g, 1,44 mol) em N,N-dimetilformamida (1,40 L) foram adicionados imidazol (246 g, 3,61 mol) e cloreto de terc-butil dimetilsilil (238 g, 1,58 mol) a 5ºC. Após a adição, a mistura foi aquecida até 20ºC e agitada durante 6 h. Foi adicionado acetato de isopropil (1700 mL) e, em seguida, foi adicionada água (2000 mL) lentamente enquanto a temperatura foi mantida abaixo de 30ºC. A mistura resultante foi agitada seguido de separação da fase orgânica. Os orgânicos combinados (dois lotes combinados) foram lavados com água (1700 mL x 3) e concentrados a “ 1500 mL (KF<0,05%). O produto foi armazenado como uma solução de acetato de isopropil que foi utilizada na etapa seguinte sem purificação adicional.

[00286] Metil 2-(bromometil)-3-[terc-butil(dimetil)silil]oxi-benzoato. Dois lotes (“375 g cada) foram executados em paralelo. À solução de acetato de isopropil de metil 3-[terc-butil(dimetil)sililJoxi-2-metilbenzoato (> 375 g, 1,34 mol) foi adicionada N-bromossuccinimida (274 g 154 mol) e azobisisobutironitrila (4,40 g 26,8 mmol). A mistura de reação foi aquecida a 70ºC durante pelo menos 1 h e agitada a 70ºC por 4 h. A mistura de reação foi resfriada a 20ºC e mantida a 20ºC por pelo menos 1 h. Os dois lotes de sólido (succinimida) foram removidos por filtração e lavados com acetato de isopropil (700 mL). O filtrado foi lavado com solução de sulfito de sódio (700 g) em água (6000 mL), seguido de água (1500 mL). A camada orgânica foi destilada sob vácuo a 45ºC até à secura para dar metil 2-(bromometil)-3-[terc- butil(dimetil)sililJoxi-benzoato (920 g, 95,5% de rendimento) como um óleo laranja escuro. *H NMR:400 MHz DMSO-dçs 6:7,45 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 7,36 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 7,13 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 4,95 (s, 2H), 1,02 (s, 9H), 0,29 (s, 6H).

[00287] terc-Butil (48)-5-amino-4-[4-[terc-butil(dimetil)sililJoxi-1-0x0- isoindolin-2-il]-5-0xo-pentanoato. A uma solução de terc-butil (45)-4,5- diamino-5-oxo-pentanoato (130 g, 643 mmol) em acetonitrila (4,0 L) foi adicionado metil 2-(bromometil)-3-[terc-butil(dimetil)silil]oxi-benzoato (210 g, 584 mmol) e di-isopropiletilamina (113 g, 877 mmol). A mistura de reação foi agitada a 50ºC por 16 h. A mistura de reação foi concentrada para remover a maior parte da acetonitrila, o resíduo foi dissolvido em éter metil terc-butílico (2,0 L) e água (1,5 L), a camada orgânica foi lavada com fosfato monopotássico saturado (1,0 L x 2), salmoura (1,0 L), seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada para dar terc-butil (4S)-5-amino-4-[4-[terc- butil(dimetil)sililJoxi-1-oxo-isoindolin-2-il]- 5-0xo-pentanoato bruto (524 g), que foi utilizada na etapa seguinte sem purificação adicional.

[00288] terc-Butil — (45)-5-amino-4-(4-hidroxi-1-0xo-isoindolin-2-i1)-5-0x0- pentanoato. A uma solução de (45)-5-amino-4-[4-[terc-butil(dimetil)sililJoxi-1- oxo-isoindolin -2-il])-5-0xo-pentanoato (275 g, 613 mmol) em metanol (2,0 L) foi adicionado tri-hidrato de fluoreto de tetrabutilamônio (38,7 g, 123 mmol). À mistura foi agitada a 18ºC por 16 h. A mistura de reação foi concentrada para remover a maior parte do metanol, o resíduo foi dissolvido em diclorometano/água (3 L/2 L), a camada orgânica foi separada e lavada com salmoura (1,0 L), seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada, e concentrada para dar o produto bruto, que foi purificado por coluna de sílica gel para dar o produto (260 g). O produto foi adicionado a acetonitrila (750 mL) e a mistura foi agitada a 60ºC por 2 h, resfriada a 18ºC e agitada por mais 2 h. O sólido foi filtrado e a torta foi seca para dar butil (4585)-5-amino-4-(4-hidroxi-1-0x0- isoindolin-2-il)-5-oxo-pentanoato (248 g, 60,5 % de rendimento) como um sólido cinza. *H NMR 400 MHz DMSO-ds 5: 10,00 (s, 1H), 7,54 (s, 1H), 7,29 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,14 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 4,72-4,68 (m, 1H), 4,49-4,28 (m, 2H), 2,17- 1,97 (m, 4H), 1,31 (s, 9H).

[00289] 4-(4-(4-(clorometil)benzil)piperazin-1-i1)-3-fluorobenzonitrila. 1,4- bis(clorometil)benzeno (51,2 g, 292 mmol) foi colocado em um frasco com acetonitrila (195 mL) e N,N-dimetilformamida (195 mL). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente até que todos os sólidos se dissolvessem. Adicionou-se então di-isopropilamina (51,1 mL, 292 mmol) juntamente com 3- fluoro-4-(piperazin-1-il)benzonitrila (20 g, 97 mmol). A reação foi aquecida a 60ºC por 1 h. A acetonitrila foi removida sob pressão reduzida. A mistura restante foi particionada entre acetato de etil (1,0 L), água (700 mL) e salmoura (300 mL). A camada orgânica foi separada e a camada aquosa foi extraída com acetato de etila duas vezes. Os orgânicos voláteis foram combinados e removidos sob pressão reduzida. O sólido foi dissolvido em diclorometano mínimo e purificado em coluna de sílica gel (0-100% de acetato de etil em hexanos acima de 3 L). As frações contendo o produto desejado foram combinadas e os orgânicos voláteis foram removidos sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em diclorometano mínimo e purificado uma segunda vez em coluna de sílica gel (acetato de etil isocrático a 10% em hexanos acima de 800 mL seguido por acetato de etil 20-80% em hexanos acima de 4 L). As frações contendo o produto desejado foram combinadas e os orgânicos voláteis foram removidos sob pressão reduzida para proporcionar 4-(4-(4- (clorometil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitrila (22,7 g, 66,0 mmol, 67,7% de rendimento) como um sólido esbranquiçado. *H NMR (400 MHz, CDCI3) 5 ppm 7,33 - 7,39 (m, 5 H) 7,29 (d, J = 1,96 Hz, 1 H) 7,25 (d, J) = 1,96 Hz, 1 H) 6,91 (t, J = 8,56 Hz, 1 H) 4,60 (s, 2 H) 3,58 (s, 2 H) 3,19 - 3,27 (m, 4 H) 2,58 - 2,66 (m, 4 H). MS (ESI) m/2z 344,2 [M+1]*.

[00290] (S)-terc-butil 5-amino-4-(4-((4-(4-(4-ciano-2-fluorofenil)piperazin- 1-il)Mmetil)benzil)oxi)-1-oxoisoindolin- 2-il)-5-oxopentanoato. (S)-terc-butil 5- amino-4-(4-hidroxi-1-oxoisoindolin-2-il)-5-oxopentanoato (22,05 g, 65,9 mmol) foi colocado num frasco com 4-(4-(4-(clorometil)benzil)piperazin-1-il)-3- fluorobenzonitrila (22,67 g, 65,9 mmol), carbonato de potássio (18,23 g, 132 mmol) e N,N-dimetilformamida (330 mL). A mistura de reação foi aquecida até 45ºC por 16 h. A reação foi diluída com acetato de etila (50 mL) e filtrada. O filtrado foi particionado com acetato de etil (900 mL) e água (600 mL) e salmoura (200 mL). A camada orgânica foi isolada e lavada com água (600 mL). A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio e os voláteis foram removidos sob pressão reduzida. O resíduo foi tratado com 20% de acetato de etil em hexanos e os voláteis foram removidos sob pressão reduzida para proporcionar (S)-terc-butil 5-amino-4-(4-((4-((4-(4-ciano-2-fluorofenil)piperazin- 1-il)ÕMmetil)benzil)oxi)-1-oxoisoindolin-2-il)-5-oxopentanoato (44,02 g 686 mmol, 104% de rendimento) como um sólido esbranquiçado. O rendimento foi um pouco acima do quantitativo, com a permanência de algum DMF. *H NMR (400 MHz, CDCI3) 6 ppm 7,43 - 7,49 (m, 2 H) 7,40 (s, 4 H) 7,36 (dd, J = 8,38, 1,28 Hz, 1 H) 7,29 (d, J) = 1,96 Hz, 1 H) 7,26 (d, J) = 1,83 Hz, 1 H) 7,11 (dd, J =7,64, 1,16 Hz, 1 H) 6,92 (t, ] = 8,50 Hz, 1 H) 6,23 (br s, 1 H) 5,24 - 5,32 (m, 1 H) 5,15 (s, 2 H) 4,86 - 4,94 (m, 1 H) 4,38 - 4,55 (m, 2 H) 3,61 (s, 2 H) 3,18 - 3,32 (m, 4 H) 2,58 - 2,70 (m, 4 H) 2,09 - 2,47 (m, 4H) 1,43 (s, 8H). MS (ESI) m/z 642,4 [M+1]*.

[00291] (S)-4-(4-(4-((2-(2,6-Dioxopiperidin-3-il)-1-oxoisoindolin-4- il)oxi)metil)benzil)piperazin-1-i1)-3-fluorobenzonitrila(S)-terc-butil 5-amino-4-(4- ((4-((4-(4-ciano-2-fluorofenil)piperazin-1-il)metil)benzil)oxi)-1-0xoisoindolin-2- il)-5-oxopentanoato (12,1 g, 18,86 mmol) foram colocados em um frasco com acetonitrila (189 mL) e ácido benzenossulfônico (3,96 g, 24,51 mmol). A mistura de reação foi colocada sob vácuo e purgada com nitrogênio. Isso foi repetido mais uma vez e a mistura foi então aquecida a 85ºC durante a noite sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura de reação quente foi vertida diretamente em 2 funis de separação contendo diclorometano (1000 mL) e acetato de etil (300 mL). A esta mistura foi adicionada uma solução saturada de bicarbonato de sódio (900 mL), água (100 mL) e salmoura (450 mL). A camada orgânica foi isolada e a camada aquosa foi extraída com diclorometano (800 mL) e acetato de etil (200 mL). As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de magnésio anidro e concentradas. A purificação por métodos padrão forneceu o composto do título. *H NMR (400 MHz, DMSO-ds) 5 ppm 10,96 (s, 1 H) 7,68 (dd, J = 13,45, 1,83 Hz, 1 H) 7,56 (dd, J = 8,44, 1,83 Hz, 1 H) 7,43 - 7,52 (m, 3 H) 7,29 - 7,39 (m, 4 H) 7,11 (t, J = 8,80 Hz, 1 H) 5,24 (s, 2 H) 5,11 (dd, J| = 13,20, 5,14 Hz, 1 H) 4,22 - 4,46 (m, 2 H) 3,54 (s, 2 H) 3,12 - 3,22 (m, 4 H) 2,85 - 2,97 (m, 1 H) 2,53 - 2,62 (m, 2 H) 2,38 - 2,48 (m, 2 H) 1,93 - 2,03 (m, 1 H). MS (ESI) m/z 568,2 [M+1]*.

Exemplo 3: Síntese de (S)4-(4-(4-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1- oxoisoindolin-4-il)oxi)]metil)benzil)piperazin-1-i1)-3-fluorobenzonitrila Composto 2).

o

CO CO: NH NU) o o AX,

[00292] 4-(4-(4-(Clorometil)benzil)piperazin-1-i1)-3-fluorobenzonitrila cloridrato. A uma solução de 3-fluoro-4-(piperazin-1-il)benzonitrila (100 g) em tolueno (1400 mL) foi carregado ácido acético (28 mL) a 25ºC e a mistura de reação foi mantida por 30 min. 4-(Clorometil)benzaldeído (79 g) a 25º'Ce a mistura foi mantida por 2 h. Triacetoxiboro-hidreto de sódio (52 g cada) foi carregado a 25ºC a cada 30 minutos três vezes. A mistura de reação foi agitada a 25ºC por cerca de 10 h. A água (600 mL) foi carregada durante 1 hora, mantendo a temperatura do lote abaixo de 30ºC. A maior parte da camada inferior foi separada. A mistura foi filtrada e a camada inferior foi separada. À camada orgânica foi lavada com água (200 mL). À camada orgânica foi carregado IPA (75 mL), HCI 5-6 N em IPA (8 mL), depois uma pasta de sementes de 4-(4-(4-(clorometil) benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitrila cloridrato (2 g) em tolueno (20 ml). À mistura foi carregado HCI 5-6 N em IPA (115 ml) a 25ºC durante 2 h. A mistura foi mantida por cerca de 10 h, depois filtrada para dar um sólido em bruto. O sólido foi lavado com tolueno (400 ml) e seco em um forno a vácuo para dar 4-(4-(4-(clorometil)benzil)piperazin-1-i1)-3- fluorobenzonitrila cloridrato como um sólido amarelo pálido (152 g, 82% de rendimento). *H NMR (300 MHz, DMSO-ds) 6 ppm 11,82 (s, 1H), 7,50-7,79 (m, 6H), 7,18-7,24 (m, 1H), 4,80 (s, 2H), 4,38-4,39 (m, 2H), 3,44-3,70 (m, 2H), 3,14- 3,44 (m, 6H).

[00293] terc-Butil (S)-5-amino-4-(4-((4-(4-(4-ciano-2-fluorofenil)piperazin- 1-il)]Mmetil)benzil)oxi)-1-oxoisoindolin- 2-il)-5-oxopentanoato tartarato. A uma mistura de 4-(4-(4-(clorometil)benzil)piperazin-1-i1)-3-fluorobenzonitrila cloridrato (100 g) e terc-butil (S)-5-amino-4-(4-hidroxi)-1-oxoisoindolin-2-il)-5- oxopentanoato (97 g) em DMF (600 ml) foi carregado com carbonato de potássio (K2CO3) (75 g) a 35ºC e a mistura de reação foi mantida por 24 h. À mistura foi carregada trietilamina (11 ml) e a mistura foi agitada a 45ºC durante cerca de 2 h. À mistura foi carregado EtOAc (1 L) e solução aquosa de carbonato de potássio (5%, 500 mL). A camada orgânica foi lavada com solução aquosa de cloreto de sódio (5%, 500 mL). À mistura foi carregado Ecosorb C948 E-pak (30 g) e a mistura foi mantida durante 2 h. A mistura foi filtrada. À mistura foi carregada uma solução de ácido L-tartárico (47 g) em metanol (850 mL) a 45ºC e a mistura foi mantida por 2 h. A mistura foi resfriada a 25ºC. Os sólidos foram filtrados para dar o sal tartarato de terc-butil (S)-5-amino-4-(4- ((4-((4-(4-ciano-2-fluorofenil)piperazin-1-il)metil)benzil)oxi)-1-0xoisoindolin-2- il)-5-oxopentanoato. (145 mg, 70% de rendimento)'H NMR (300 MHz, DMSO- ds) 5 ppm 1,31 (s, 9H), 1,87 - 2,27 (m, 4H), 2,55 (br s, 4H), 3,18 (br s, 4H), 4,29 (s, 2H), 4,36 - 4,62 (m, 2H), 4,71 ( dd, J = 4,2, 10,0 Hz, 1H), 5,22 (s, 2H), 7,10 (t, J = 8,8 Hz, 1H), 7,18 (s, 1H), 7,29 (d, J = 7,7 Hz, 2H), 7,33 - 7,40 (m, 2H), 7,40 - 7,51 (m, 3H), 7,51 - 7,63 (m, 2H).

[00294] (S)-4-(4-(4-((2-(2,6-Dioxopiperidin-3-il)-1-oxoisoindolin-4- il)oxi)]Metil)benzil)piperazin-1-i1)-3-fluorobenzonitrilaA solução do sal tartarato de terc-butil (S)-5-amino-4-(4-((4-((4-(4-ciano-2-fluorofenil)piperazin-1- il)]Metil)benzil))oxi)-1-oxoisoindolin-2-il)-5-oxopentanoato (100 g) em 2- metiltetra-hidrofurano (1 L) foi lavado com solução aquosa de carbonato de potássio (10%, 85 mL). A camada inferior foi separada. O solvente 2-metiltetra- hidrofurano foi trocado por acetonitrila para proporcionar uma solução. À solução foi adicionado ácido benzenossulfônico (60 g) em acetonitrila (200 ml) a 70ºC durante 2 h. A purificação por métodos padrão forneceu o composto do título. *H NMR (400 MHz, DMSO-ds) 8 ppm 10,96 (s, 1 H) 7,68 (dd, J = 13,45, 1,83 Hz, 1 H) 7,56 (dd, J = 8,44, 1,83 Hz, 1 H) 7,43 - 7,52 (m, 3 H) 7,29 - 7,39 (m, 4 H) 7,11 (t, ) = 8,80 Hz, 1 H) 5,24 (s, 2 H) 5,11 (dd, J = 13,20, 5,14 Hz, 1 H) 4,22 - 4,46 (m, 2 H) 3,54 (s, 2 H) 3,12 - 3,22 (m, 4 H) 2,85 - 2,97 (m, 1 H) 2,53 - 2,62 (m, 2 H) 2,38 - 2,48 (m, 2 H) 1,93 - 2,03 (m, 1 H). MS (ESI) m/z 568,2 [M+1]*.

Exemplo 4: Síntese de (S)4-(4-(4-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1- oxoisoindolin-4-il)oxi)]Metil)benzil)piperazin-1-i1)-3-fluorobenzonitrila Composto 2).

o

COS

OU OS NE o 0 A.

[00295] 4-(4-(4-(Clorometil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitrila cloridrato. A uma solução de 3-fluoro-4-(piperazin-1-il)benzonitrila (100 g) em tolueno (1400 mL) foi carregado ácido acético (28 mL) a 25ºC e a mistura foi mantida por 30 min. 4-(Clorometil)benzaldeído (79 g) a 25ºC e a mistura foi mantida por 2 h. Triacetoxiboro-hidreto de sódio (52 g cada) foi carregado a 25ºC a cada 30 minutos três vezes. A mistura de reação foi agitada a 25ºC por cerca de 10 h. A água (600 mL) foi carregada durante 1 hora, mantendo a temperatura do lote abaixo de 30ºC. A maior parte da camada inferior foi separada. A mistura foi filtrada e a camada inferior foi separada. A camada orgânica foi lavada com água (200 mL). À camada orgânica foi carregado IPA (75 mL), HCI 5-6 N em IPA (8 mL), depois uma pasta de sementes de 4-(4-(4- (clorometil) benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitrila cloridrato (2 g) em tolueno (20 mL). À mistura foi carregado HCl 5-6 N em IPA (115 mL) a 25ºC durante 2 h. A mistura foi mantida por cerca de 10 h, depois filtrada para dar um sólido em bruto. O sólido foi lavado com tolueno (400 mL) e seco em um forno a vácuo para dar 4-(4-(4-(clorometil)benzil)piperazin-1-i1)-3- fluorobenzonitrila cloridrato como um sólido branco (152 g, 82% de rendimento). *H NMR (300 MHz, DMSO-ds) 5 ppm 11,82 (s, 1H), 7,50-7,79 (m, 6H), 7,18-7,24 (m, 1H), 4,80 (s, 2H), 4,38-4,39 (m, 2H), 3,44-3,70 (m, 2H), 3,14- 3,44 (m, 6H).

[00296] terc-Butil (S)-5-amino-4-(4-((4-(4-(4-ciano-2-fluorofenil)piperazin- 1-il)]Mmetil)benzil)oxi)-1-oxoisoindolin- 2-il)-5-oxopentanoato. A uma mistura de 4-(4-(4-(clorometil)benzil)piperazin-1-i1)-3-fluorobenzonitrila cloridrato (100 g) e terc-butil (S)-5-amino-4-(4-hidroxi)-1-oxoisoindolin-2-il)-5-oxopentanoato (88 g) em dimetilsulfóxido (DMSO) (700 mL) foi carregado carbonato de potássio (K2CO3) (73 g) a 35ºC e a mistura foi mantida por 24 h. À mistura foi carregado EtOAc (1,2 L) e água (1,1 L). A camada orgânica foi lavada com solução aquosa de cloreto de sódio (5%, 1 L). À mistura foi carregado n-heptano (200 mL). À mistura foi lavada com ácido acético aquoso (3%, 1 L), água (1 L), solução de K3POa. aquoso (20%, 10 L), e água (10 L). O solvente foi destilado a cerca de 1,2 L. A mistura foi cristalizada com n-heptano para dar terc-butil (S)-5-amino-4-(4- ((4-(4-(4-ciano-2-fluorofenil)piperazin-1-il)metil)benzil)oxi)-1-oxoisoindolin- - 2- il)-5-oxopentanoato (143 g, 85% de rendimento). *H NMR (400 MHz, CDCI3) 6 ppm 7,43 - 7,49 (m, 2 H) 7,40 (s, 4 H) 7,36 (dd, J = 8,38, 1,28 Hz, 1 H) 7,29 (d, J = 1,96 Hz, 1 H) 7,26 (d, J = 1,83 Hz, 1 H) 7,11 (dd, ) = 7,64, 1,16 Hz, 1 H) 6,92 (t, | = 8,50 Hz, 1 H) 6,23 (br s, 1 H) 5,24 - 5,32 (m, 1 H) 5,15 (s, 2 H) 4,86 - 4,94 (m, 1H) 4,38 - 4,55 (m, 2 H) 3,61 (s, 2 H) 3,18 - 3,32 (m, 4 H) 2,58 - 2,70 (m, 4 H) 2,09 - 2,47 (m, 4H) 1,43 (s, 8H).

[00297] (S)-4-(4-(4-((2-(2,6-Dioxopiperidin-3-il)-1-oxoisoindolin-4- il)oxi)]Metil)benzil)piperazin-1-i1)-3-fluorobenzonitrilaA solução de terc-butil (S)-

5-amino-4-(4-((4-((4-(4-ciano-2-fluorofenil)piperazin-1-il)metil)benzil)oxi)-1- oxoisoindolin-2-il)-5-oxopentanoato (100 g) em acetonitrila (1 L) foi mantida a 70ºC. À solução, foi adicionado ácido benzenossulfônico (74 g) em acetonitrila (200 mL) a 70ºC ao longo de 2 h. A purificação por métodos padrão forneceu o composto do título. *H NMR (400 MHz, DMSO-ds) 5 ppm 10,96 (s, 1 H) 7,68 (dd, J=13,45, 1,83 Hz, 1 H) 7,56 (dd, ) = 8,44, 1,83 Hz, 1 H) 7,43 - 7,52 (m, 3 H) 7,29 - 7,39 (m, 4 H) 7,11 (t, | = 8,80 Hz, 1 H) 5,24 (s, 2 H) 5,11 (dd, J = 13,20, 5,14 Hz, 1 H) 4,22 - 4,46 (m, 2 H) 3,54 (s, 2 H) 3,12 - 3,22 (m, 4 H) 2,85 - 2,97 (m, 1 H) 2,53 - 2,62 (m, 2 H) 2,38 - 2,48 (m, 2 H) 1,93 - 2,03 (m, 1 H). MS (ESI) m/z 568,2 [M+1]".

Exemplo 5: 4-(4-(4-((2-(2,6-Dioxopiperidin-3-il)-1-oxoisoindolin-4- i)oxi)metil)benzil)piperazin-1-i1-2,2,3,3,5,5,6,6-dº)-3-fluorobenzonitrila o

DD LS p Dº

[00298] 3-Fluoro-4-(piperazin-1-i1-2,2,3,3,5,5,6,6-d8)benzonitrila. Uma solução de 3,4-difluorobenzonitrila (278 mg, 2,00 mmol) e piperazina- 2,2,3,3,5,5,6,6-dº (942 mg, 10,0 mmol) em DMA seco (6 mL) foi agitada a 110ºC por 16 h. A mistura foi resfriada à temperatura ambiente e foi lentamente adicionada a H2O (60 mL) com mistura. A mistura foi extraída com EtOAc (3X) e as porções orgânicas foram combinadas, lavadas com NaCl saturado (3X), seca sobre MgSOa, filtrada e concentrada. O xarope incolor residual foi seco sob vácuo para proporcionar o produto bruto como um sólido branco (599 mg). O sólido foi dissolvido em EtOAc e a solução foi lavada com H2O (3X), NaCl aquoso saturado (3X) e seco sobre MgSO2a. A solução seca foi filtrada, concentrada e o resíduo seco em vácuo para proporcionar o composto do título (447 mg, 105%) como um sólido branco. LCMS (ESI) m/z 214,2 [M+H]*.

[00299] 4-(4-(4-((2-(2,6-Dioxopiperidin-3-il)-1-oxoisoindolin-4- il)oxi)]Metil)benzil)piperazin-1-i1-2,2,3,3,5,5,6,6-d8)-3-fluorobenzonitrila. A uma solução de 3-[4-[[4-(bromometil)fenil]Jmetoxi]-1-oxo-isoindolin-2-il]piperidina- 2,6-diona (736 mg, 1,66 mmol) e 3-fluoro-4-(piperazin-1-i1-2,2,3,3,5,5,6,6- dº)benzonitrila (425 mg, 1,99 mmol) em DMF seco (5,0 mL) foi adicionado DIEA (0,870 mL, 4,99 mmol) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 4 h. A mistura foi filtrada (membrana de nylon de 0,45 um) e a solução foi purificada por métodos padrão para dar o produto do título (532 mg, 56%). LCMS (ESI) m/z 576,4 [M+H]*.

Exemplo 6: Efeitos antiproliferativos e proapoptóticos no mieloma múltiplo.

[00300] Materiais de cultura celular:As linhagens celulares de mieloma múltiplo humano foram adquiridas dos fornecedores e cultivadas a 37ºC com 5% de CO? no meio, conforme indicado na Tabela 1. As linhagens celulares resistentes à lenalidomida e à pomalidomida foram obtidas por métodos geralmente descritos anteriormente (Lopez-Girona et al Leukemia 2012; 26(11):2335). Todas as linhagens celulares foram mantidas em fase logarítmica e a densidade e viabilidade celular foram monitorizadas por exclusão de azul tripano utilizando o analisador de viabilidade celular Vicell XR (Beckman Coulter, Brea, CA).

Tabela 1: Linhagens celulares de mieloma múltiplo testadas Linhagem de Fornecedor/Fonte Número de Condições da mm o ame ame NCI-H929 ATCC (Manassas, CRL-9068 RPMI-1640, 10 % o e SS ÇÕO

Linhagem de Fornecedor/Fonte Número de Condições da mm o dae e NCI-H929-1051 desenvolvido NA RPMI-1640, 10 % internamente, FBS resistente à lenalidomida OPM2 DSMZ ACC-50 RPMI-1640, 10 % (Braunschweig, FBS Germany) OPM2-P10 desenvolvido NA RPMI-1640, 10 % internamente, FBS resistente a 10 uM de lenalidomida

[00301] Preparação de Soluções de Artigo de Teste:Os compostos foram plaqueados em placas pretas de 384 poços (Corning Inc. ) a um volume final de DMSO de 0,1%, assumindo um volume máximo de 50 ul. Uma resposta de dose de 10 pontos começando com 10 UM com uma diluição de 1:3 foi impressa em duplicado por dispensa acústica usando a plataforma EDC ATS-

100. Alternativamente, foi utilizada a resposta à dose de 10 pontos, começando em 10 uM com uma diluição de 1:10 ou começando em 100 nM com diluições de 1:3.

[00302] Ensaios de Proliferação Celular:O efeito dos compostos na proliferação/viabilidade das linhagens celulares hematológicas (Tabela 1) foi avaliado após 120 h de incubação usando CTG (Promega), de acordo com as instruções do fabricante. As linhagens celulares hematológicas foram distribuídas em placas de compostos por um Dispensador de Reagente

Combinado Multidrop (Thermo Scientific, Waltham, MA) a uma concentração de 0,1 x 10º células por mL num volume total de 50 ul. Às 120 h, 25 uL por poço de CTG foram dispensados por um Dispensador de Reagente Combi Multidrop e a liberação de adenosina trifosfato (ATP) por células viáveis foi medida como unidades de luminescência relativa após 30 minutos usando a plataforma Envision.

[00303] Ensaios de Apoptose Celular:A capacidade dos compostos para induzir apoptose foi avaliada em linhagens de células MM selecionadas nos pontos de tempo e nas concentrações dos compostos indicados. Como marcador de apoptose, o nível de atividade da Caspase-3 foi medido em células MM usando imageamento de células vivas. Para visualizar as células em suspensão, as placas de 96 poços foram revestidas com fibronectina, para que as células aderissem e fiquem planas no fundo da placa. As células foram adicionadas a placas de 96 poços usando um dispensador de reagentes Multidrop Combi (Thermo Scientific, Waltham, MA) na noite anterior à adição do composto. Os compostos foram identificados no topo das células no poço apropriado de placas de 96 poços usando um Hewlett-Packard D300 Digital Dispenser (Tecan, Mannedorf, Switzerland). As linhagens celulares de MM foram tratadas com o composto e às 6 h o meio foi alterado para imitar a renovação do composto in vivo, resultando em uma diluição de cerca de 20 vezes a concentração do composto. As células foram cultivadas na presença do substrato de enzima NucView 488 Caspase-3 (Biotium) e incubadas em um sistema de análise de células vivas IncuCyte ZOOM (Essen Bioscience, Ann Arbor, MI) alojado em uma incubadora padrão. A clivagem do substrato da enzima Caspase-3 e a confluência celular em cada poço foram detectadas por imageamento em 10x no Sistema IncuCyte ZOOM a cada 4-6 h por 5 dias. Cada poço/condição foi executado em replicação na mesma placa e cada condição foi a média de 4 imagens 10x capturadas em cada momento.

[00304] Resultados. O Composto 1 e o Composto 2 demonstram atividade antiproliferativa contra linhagens de células MM. As linhagens de células MM selecionadas para este estudo eram sensíveis e resistentes à lenalidomida e/ou pomalidomida (Tabela 1), dois agentes utilizados na clínica para tratar pacientes com mieloma. A proliferação foi avaliada usando o ensaio CellTitre- Glo” . Os resultados para culturas incubadas com os compostos foram normalizados para resultados para culturas de controle para cada linhagem celular. O ICso para inibição do crescimento celular pelos compostos foi determinado para cada linhagem celular utilizando o software ActivityBase. O Composto 1 e o Composto 2 inibiram potentemente a proliferação celular nas quatro linhagens celulares, conforme determinado pela avaliação quantitativa dos níveis de ATP presentes nos meios após 120 h. Os valores de ICso antiproliferativo de Composto 1 e Composto 2 variaram entre 0,07 nM e 19 nM (Tabela 2). O Composto 1 e o Composto 2 mostraram atividade antiproliferativa de mieloma múltiplo muito potente, mesmo em linhagens celulares resistentes à lenalidomida e/ou pomalidomida.

Tabela 2:Inibição do crescimento celular pelo Composto 1 e Composto 2 em linhagens de células MM em cultura líquida NCI-H929 —INCI-H929. 1051 OPM-2 OPM-2. P10 CompostoNº 120h 120h 120h 120h 1Cs9 ICs, ICso 1Cso

[00305] Apoptose induzida pelo composto 1 em linhagens celulares de mieloma múltiplo. Os efeitos dos compostos na apoptose em linhagens de células MM foram investigados. Para determinar a capacidade dos compostos de induzir apoptose e caracterizar cineticamente o início desse processo, a indução de Caspase-3 foi medida ao longo do tempo em células H929-1051 resistentes à lenalidomida (Figura 1). As células H929-1051 foram incubadas com os compostos em concentrações de 1 nM, 10 nM, 100 nM e 1000 nM e a apoptose foi avaliada ao longo do tempo. Os resultados mostraram que, para as células H929-1051, todas as concentrações do Composto 1 induziram apoptose começando em cerca de 48 h e atingindo uma indução máxima perto de * 72 h de incubação. Em seguida, a área sob a curva (AUC) foi calculada para cada concentração e usada para gerar as curvas de concentração-resposta para cada composto. Isto proporcionou evidência quantitativa da capacidade do Composto 1 de induzir apoptose em H929-1051. Surpreendentemente, a indução de apoptose pelo Composto 1 foi significativamente maior que a indução de apoptose observada para o composto relatado anteriormente 3-(4- ((4-((4-(2,4(difluorofenil)piperazin-1-il) metil)benzil)oxi)-1-oxoisoindolin-2- il)piperidina-2,6-diona (Exemplo 5. 285 na Patente US 8. 518. 972) (Composto A). Como mostrado na Fig. 1B, a indução apoptótica (medida pela AUC total) pelo Composto 1 foi aumentada em quase 30% (126%) em comparação com a indução apoptótica pelo Composto A.

[00306] Combinação com Dexametasona. A atividade da pomalidomida com a do Composto 2 isoladamente ou em combinação com a dexametasona foi avaliada através de um painel de linhagens de células MM. Figura 2 é um conjunto representativo de curvas de dose-resposta na linhagem celular H929- 1051 resistente à lenalidomida, demonstrando que o composto único 2 é 10 vezes mais potente que uma combinação pomalidomida-dexametasona e quase tão eficaz (Figura 2, painel A). Surpreendentemente, quando o Composto 2 é combinado com dexametasona, ele não apenas cria uma resposta mais potente, mas a eficácia também é dramaticamente aprimorada (Figura 2,

painel B); a morte celular quase completa é alcançada. Tabela 3 resume a potência (ICso) dos estudos de combinação de agente único e dexametasona realizados na linhagem celular H929-1051. Os IC5os da pomalidomida de agente único ou do Composto 2 e a combinação de dexametasona 1, 0,1 ou 0,01 uM (Dex) em células resistentes à lenalidomida (H929-1051). Cada ICso é a média de pelo menos três experiências independentes. A proliferação foi monitorada no Dia 5 usando Cell Titer-Glo. Consistentemente, o Composto 2 em combinação com a dexametasona foi dramaticamente mais ativo que a pomalidomida em combinação com a dexametasona, e esse aumento da atividade foi alcançado em concentrações 10-100 vezes menores de dexametasona. Juntos, esses dados indicam o potencial para maior segurança do tratamento combinado do Composto 2 e dexametasona, permitindo o uso de doses mais baixas de dexametasona, mantendo a eficácia e a sinergia. Tabela 3:Comparação de valores de ICso anti-proliferativos para o Composto 2 e pomalidomida como agentes únicos ou em combinação com dexametasona na linhagem celular H929-1051 resistente à lenalidomida ICso de agente [ 1 uM Dex/i01 uM Dex 0,01 UM Dex único Combo ICso Combo ICso Combo ICso uM

[00307] Avaliação de segurança in vitro avaliada por seletividade antiproliferativa em células normais. Para demonstrar que o Composto 2 geralmente não é citotóxico, um contra-rastreio contra a linhagem celular derivada de hepatócitos humanos imortalizada (mas não tumorigênica) THLE-2 (Pfeifer et al, Proc Natl Acad Sci USA. 1993; 90(11):5123-7) e contra PBMCs humanas primárias e saudáveis (Figure 3) foi realizado. O Composto 2 teve pouco efeito antiproliferativo nas células THLE-2 (ICso > 10 uM) ou em PBMCs primárias humanas não estimuladas (ICso > 10 uM) comparado com as linhagens de células MM mostradas acima.

[00308] Atividade antitumoral do Composto 2 no modelo de xenoenxerto de mieloma múltiplo resistente à lenalidomida. O objetivo do estudo foi testar a atividade antitumoral de agente único do Composto 2 em um modelo de xenoenxerto H929-1051 com dosagem uma vez ao dia (QD) a 1, 3, 10 e 30 mg/kg. Atividade antitumoral significativa (p <0,0001) foi observada em todos os níveis de dose com uma redução no volume do tumor de 75%, 86%, 84% e 85% em 1, 3, 10 e 30 mg/kg, respectivamente (Figura 4).

[00309] Conclusão: juntos esses dados mostram que o Composto 1 e Composto 2 mostram atividade de mieloma anti-múltiplo muito potente e surpreendentemente mostram níveis significativamente aumentados de apoptose em comparação com os compostos relatados anteriormente, Composto A e pomalidomida. Além disso, o Composto 2 combinado com a dexametasona não apenas cria uma resposta mais potente, mas a eficácia também é dramaticamente melhorada. Além disso, foi demonstrada a morte celular seletiva de mieloma múltiplo em comparação com células normais Exemplo 7:Efeitos fora do alvo do Composto 1/Composto 2 e implicações.

[00310] Receptores a1 adrenérgicos e dopamina D2. Métodos:Os ensaios de ligação e funcionais para receptores a1 adrenérgicos e dopamina D2 foram realizados pela Eurofins Cerep de acordo com seus métodos.

[00311] Receptor al adrenérgico. Ligação a 10 uM. O ensaio de ligação avaliou a afinidade do artigo de teste para o receptor adrenérgico al não seletivo no córtex cerebral de rato. Os homogenatos de membrana do córtex cerebral foram incubados em duplicado por 60 minutos à temperatura ambiente com 0,25 nM de [?H]prazosina na ausência ou presença de artigos de teste a 10 uM. Após o período de incubação, as amostras foram filtradas através de filtros de fibra de vidro, os filtros secos e depois contados quanto à radioatividade usando um contador de cintilação. Os resultados são expressos como inibição percentual média da ligação de radioligando de controle.

[00312] ICso de ligação. Para determinar o ICso de ligação para o receptor al adrenérgico não seletivo, concentrações variáveis do artigo de teste foram incubadas em duplicado com 0,25 nM de [?H]prazosina. O Composto A foi testado a 0,01-30 uM. O Composto B, o enantiômero S do Composto A, foi testado a 0,0003-10 uM. O Composto 1 e o Composto 2, o enantiômero S do Composto 1, foram analisados a 0,03-100 UM. A radioatividade foi medida como descrito acima. O ICso foi definido como a concentração que causa inibição semi-máxima da ligação específica de controle.

[00313] Atividade antagonistaOs efeitos antagonísticos dos compostos de teste nos receptores dia e ag adrenérgicos foram medidos usando células de ovário de hamster chinês (CHO) transfectadas com receptor humano. A atividade antagonista foi determinada pela medição do efeito composto na mobilização de cálcio induzida por agonista (epinefrina) no ensaio de receptor Qa OU Nos níveis de CAMP no ensaio de receptor ag . essas experiências, as células CHO foram incubadas em duplicado à temperatura ambiente com artigo de teste e adrenalina a 3 nM nos ensaios de receptor aa a 3000 nM no ensaio de receptor aus . O Composto A foi testado no ensaio de receptor aa a 0,01-30 uM. O Composto B foi testado no ensaio de receptor aa e ensaios de receptor OB a O. 0003-30 uM. O Composto 1 e Composto 2 foram testados entre 0,03 e uM no ensaio de receptor aa e 0,03 a 100 uM no ensaio de receptor ae. No ensaio de receptor aa, os níveis de cálcio citosólico foram medidos fluorometricamente usando a sonda fluorescente Fluo4 Direct. Os níveis intracelulares de CAMP no ensaio de receptor auge adrenérgico foram medidos por fluorescência homogênea resolvida no tempo (HTRF). O 1Cso de antagonismo foi definido como a concentração que causa inibição semi- máxima da resposta do agonista de controle.

[00314] Receptor dopamina D2. Ligação a 10 uM. O ensaio de ligação avaliou a afinidade dos artigos de teste para o receptor de dopamina D2 em células de rim embrionário humano transfectado (HEK)-293. Para determinar a ligação no ensaio de receptor Ds, o artigo de teste foi incubado com 0,3 nM de [PH] metilspiperona ou 1 nM de [?H] 7-hidroxi-2-N,N-dipropilaminotetralina (7- OH-DPAT). [?H] Metilspiperona a 0,3 nM também foi usada como ligando de controle no ensaio de ligação de Dx . Os homogenatos da membrana celular foram incubados em duplicado à temperatura ambiente por 60 minutos com ligando na ausência ou presença de artigos de teste a 10 uM. Após o período de incubação, as amostras foram filtradas através de filtros de fibra de vidro, os filtros secos e depois contados quanto à radioatividade usando um contador de cintilação. Os resultados são expressos como inibição percentual média da ligação de radioligando de controle.

[00315] ICso de ligação. Para determinar o ICso de ligação nos ensaios do receptor D2, o HEK-293 foi testado como descrito acima, mas com concentrações variáveis do artigo de teste. O Composto A foi testado a 0,01-30 UM no ensaio de ligação de rádioligando Das . O Composto B foi testado a 0,0003-10 uM em ambos os ensaios de ligação Das e Dx . O Composto 1 foi analisado a 0,03-100 uM em ambos os ensaios D>2s e D2,, enquanto o Composto 2 foi testado a 0,03-100 uM no ensaio Ds e 0,01-100 uM no ensaio Da. . O ICso foi definido como a concentração que causa inibição semi-máxima da ligação específica de controle.

[00316] Atividade agonista. O agonismo dos compostos de teste no receptor de dopamina D>s foi avaliado usando células HEK-293 transfectadas com receptor humano. A atividade agonista foi determinada medindo o efeito do composto na modulação da impedância. Nestas experiências, as células HEK-293 foram incubadas em duplicado a 28ºC com o artigo de teste. O Composto A foi testado a 0,01-30 uM. O composto B foi testado a 0,0003-10 uM, enquanto o Composto 1 e o Composto 2 foram testados a 0,01-10 uM À Dopamina (3 uM) foi usada como controle agonista. As medições de impedância foram monitoradas por 10 minutos após a adição do ligando usando espectroscopia dielétrica celular. O ECso foi definido como a concentração que causa uma resposta semi-máxima, comparada à resposta do agonista de controle (dopamina).

[00317] Resultados. A ligação a 10 UM nos receptores al adrenérgicos e dopamina D2 foi avaliada para o Composto 1, Composto 2, Composto A, Composto B e um número de compostos exemplificados na Patente US

8.518.972 (Tabela 4). Enquanto os compostos divulgados anteriormente inibiram completamente a ligação do ligando em ambos os receptores, surpreendentemente, o Composto 1 e o Composto 2 mostraram uma capacidade significativamente reduzida de inibir a ligação ao ligando, mostrando apenas 67/62% (receptor a1 adrenérgico) e 55/52% (dopamina Das) de inibição da ligação ao ligando, respectivamente. O efeito diferenciado do Composto 1 e do Composto 2, em comparação com o Composto A e o Composto B nos receptores al adrenérgicos e dopamina D2 foi, portanto, analisado posteriormente.

Tabela 4. Efeitos do Composto A, Composto B, Composto 1 e Composto 2 e compostos anteriormente relatados no Receptor a1 Adrenérgico e Dopamina D2 o N o ON x Se NO o o al Dopamina Compos- adrenérgico | Ds R Rº X Estéreo to Nº % Inib. % Inib. (a 10 uM) (a 10 uM) poe e ee de e e » . >» “ so Ee de e os “ a

[00318] Os efeitos detalhados do Composto A, Composto B, Composto 1 e Composto 2 no receptor al adrenérgico estão resumidos na Tabela 5. O Composto A inibiu a ligação do ligando ao receptor a1 adrenérgico em 102%. O ICso de ligação para o Composto A para o receptor foi de 0,064 uM. O Composto A demonstrou ser um forte antagonista do receptor aa adrenérgico, com um ICso de 0,014 uM. Da mesma forma, o Composto B inibiu a ligação do ligando ao receptor adrenérgico al em 98-100% a 10 uM e tinha um ICso de ligação de 0,024 uM. Foi observado forte antagonismo do receptor adrenérgico al com o Composto B, com valores ICso de 0,0064 e 0,078 uM nos receptores

Qua E Og respectivamente. Surpreendentemente, em contraste, ambos o Composto 1 e Composto 2 demonstraram ter uma atividade fraca no receptor al adrenérgico. Os valores de ICso para o antagonismo do receptor pelo Composto 1 foram 0,98 uM e 6,9 UM para os receptores ais E Ole, respectivamente. Resultados comparáveis foram observados para o Composto

2.

Tabela 5. Efeitos do Composto A, Composto B, Composto 1 e Composto 2 no Receptor a1 Adrenérgico Composto al (não seletivos) al (não ICso de % de inibição seletivos) antagonismo (10 uM) ICso de ligação (uM) een | Gs en ss ? Experimentos independentes.

[00319] Receptor dopamina D2. Os efeitos do Composto A, Composto B, Composto 1 e Composto 2 no receptor de dopamina D2 estão resumidos na Tabela 6. O Composto A inibiu a ligação do ligando ao receptor de dopamina D2s em 99%. O ICso de ligação para o Composto A para o receptor Ds foi de 0,15 uM. O Composto A mostrou ser um agonista parcial do receptor de dopamina D2s, com um ECso de 0,016 uM. Da mesma forma, o Composto B inibiu o receptor Das em 99% a 10 uM e tinha um ICso de ligação de 0,084 e 0,016-0,047 UM nos receptores Dx e Ds, respectivamente. Surpreendentemente, ao contrário, o Composto 1 e o Composto 2 mostraram atividade fraca no receptor de dopamina D2, com inibição a 10 a uM de < 55% e valores de ICso de ligação > 2 uM. O agonismo funcional (ECso) do Composto B no receptor de dopamina Ds em três estudos independentes foi > 10, 2,7 e 1,9 uM. Embora a extensão do agonismo do Composto B no receptor Ds fosse inferior ao observado para o Composto A, houve uma tendência para maior agonismo do Composto B em comparação com o Composto 1 e o Composto 2. Tomados em conjunto, a % de inibição da ligação a 10 uM, os dados de ICs5o de ligação e o ICso de agonismo demonstraram atividade mais forte do Composto A e do Composto B no receptor de dopamina D2 em comparação com o Composto 1 e o Composto 2. Esta observação é consistente com a evidência de agonismo da dopamina D2 (isto é, diminuição da motilidade/esvaziamento gástrico) em ratos com o Composto A, mas não com o Composto 1 (como discutido abaixo). Tabela 6. Efeitos do Composto A, Composto B, Composto 1 e Composto 2 no Receptor de Dopamina D2 Composto % de inibição ICso de ligação Dx D>2s Dx D>s de D>s NERNBArY ame dm e e os es Composto B 103 99, 0,084 0,016, 0,021, >10, 2,7, e iz Mae Rs Composto 2 ND 52 3 2 (estimado) >10 ma

[00320] Estudos de toxicologia exploratória por 7 dias em ratos machos. Métodos. Ratos machos CD-IGS (n = 5/grupo para avaliação toxicológica; n =

4/grupo para avaliação toxicocinética) foram doseados uma vez ao dia por gavagem oral (10 mL/kg) com veículo (HPMC a 0,5%/Tween-80 a 0,25% em Citrato 50 mM, pH 2,6-2,8) ou artigos de teste (Composto A ou Composto 1) a 100, 300 ou 1000 mg/kg/dia durante 7 dias consecutivos. Amostras de sangue para toxicocinética foram coletadas nos Dias 1 e 7. Todos os ratos foram observados quanto a sinais clínicos de toxicidade na pré-dose, aproximadamente 1 hora após a dose nos Dias 1 a 7 e antes da necropsia no Dia 8. O peso corporal foi registrado na randomização, antes da administração nos Dias 1 a 7 e antes da necropsia. Amostras para análises hematológicas e químicas séricas foram coletadas no Dia 8, aproximadamente 24 horas após a última dose. Os ratos foram sacrificados no Dia 8 para necropsia. A avaliação da patologia anatômica consistiu em observação bruta, peso do órgão e exame histopatológico de tecidos selecionados.

[00321] Resultados. Após administração oral diária do Composto A por 7 dias consecutivos, a exposição sistêmica (AUCo+) aumentou de maneira dependente da dose de 100 para 1.000 mg/kg. A exposição no Dia 7 foi aproximadamente 3 a 7 vezes maior que o dia 1. AUCsno Dia 7 foram 441, 1230 e 1760 uM-h a 100, 300, e 1.000 mg/kg, respectivamente. Os sinais clínicos de toxicidade (postura curvada, piloereção e diminuição da atividade) e diminuição do peso corporal foram observados a > 300 mg/kg. Não foi observado ganho de peso corporal em 100 mg/kg. O conteúdo estomacal anormal (material seco e de ração) foi observado grosseiramente em > 100 mg/kg, sem correlação microscópica. Essa descoberta sugere diminuição da motilidade/esvaziamento gástrico e é consistente com a atividade agonística no receptor de dopamina D>2. As descobertas microscópicas relacionadas ao artigo de teste foram limitadas a necrose miocárdica multifocal mínima e infiltração celular mista em corações de ratos em todos os níveis de dose.

Embora a causa exata dessa lesão cardíaca deva ser determinada, a descoberta é consistente com o agonismo do receptor de dopamina D> e/ou antagonismo do receptor al-adrenérgico. Alterações desses receptores podem levar à vasodilatação, resultando em diminuição do fluxo sanguíneo, hipotensão e taquicardia reflexa. A localização das lesões cardíacas (ápice, superfície endocárdica dos ventrículos) suporta ainda um mecanismo de isquemia. Para o Composto 1, a exposição (AUCo:+) também aumentou de maneira dependente da dose de 100 para 1000 mg/kg e as exposições no Dia 7 foram aproximadamente 2 a 6 vezes maiores que no Dia 1. No Dia 7, as AUCs em 100, 300 e 1.000 mg/kg foram 143, 514 e 1220 uM - h, respectivamente. Não houve observações clínicas relacionadas ao artigo de teste. Foram observadas diminuições mínimas no ganho de peso corporal em > 300 mg/kg. Surpreendentemente, ao contrário do Composto A, não foram observados efeitos no estômago ou no coração em ratos tratados com o Composto 1, consistente com atividades reduzidas no receptor al adrenérgico e dopamina D2 observadas pelo Eurofins Cerep, descrito acima.

[00322] Avaliação in vitro do Composto 2 e do Composto B como um inibidor das enzimas do citocromo p450 humano. O objetivo foi avaliar o potencial do Composto B e do Composto 2 para atuar como um inibidor direto ou dependente do tempo das atividades do citocromo P450 (CYP) em microssomas hepáticos humanos combinados. Neste estudo, investigou-se a inibição de nove enzimas do citocromo P450 humano, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 e CYP3A4/5 (usando dois substratos).

[00323] Metódos. Para examinar o potencial dos compostos de atuarem como inibidores diretos das enzimas CYP, os microssomas hepáticos humanos reunidos foram incubados com substratos da sonda, em concentrações aproximadamente iguais ao seu Km aparente, na ausência ou na presença do Composto B (0,03 a 30 uM) ou Composto 2 (0,03 a 30 uM) e NADPH (1 mM). Além disso, os compostos foram avaliados quanto ao seu potencial de atuar como inibidores dependentes do tempo nas mesmas concentrações mencionadas acima. Ao avaliar a inibição dependente do tempo, os compostos foram pré-incubados com microssomas de fígado humano e NADPH (1 mM) por 30 minutos antes da adição de um substrato da sonda. Além dos controles apropriados do veículo, inibidores diretos conhecidos e inibidores dependentes do tempo das isoformas do CYP foram incluídos como controles positivos. Após a incubação, quantificaram-se as concentrações dos metabólitos do substrato da sonda usando métodos estabelecidos de LC/MS/MS. A extensão da inibição foi expressa como a porcentagem de atividade de controle.

[00324] Resultados. Composto B. Sob as condições experimentais usadas para examinar a inibição direta, o Composto B (até 30 uM) teve pouco (< 30%) a nenhum efeito inibitório sobre CYP1A2, CYP2A6, CYP2C8, CYP2D6, CYP2E1 e CYP3A4/5 (midazolam). A 30 uM, o Composto B inibiu a atividade de CYP2B6, CYP2C9 e CYP2C19 em 59, 38 e 45%, respectivamente. O Composto B inibiu o CYP3A4/5 (testosterona) com um valor de ICso de 2,92 uM. Sob as condições usadas para testar a inibição dependente do tempo, o Composto B (até 30 uM) mostrou uma inibição dependente do tempo do CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 e CYP2E1 após uma pré-incubação de 30 minutos com ou sem NADPH. O Composto B inibiu o CYP3A4/5 de uma maneira dependente do tempo. O valor de ICso alterado (com NADPH) foi de 2,23 e 1,93 UM para midazolam e testosterona como substratos, respectivamente.

[00325] Composto 2. Sob as condições experimentais usadas para examinar a inibição direta, o Composto 2 (até 30 uM) teve pouco (< 30%) a nenhum efeito inibitório sobre CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9,

CYP2D6, CYP2E1 e CYP3A4/5 (midazolam) . A 30 uM, o Composto 2 inibiu a atividade de CYP2C19 e CYP3A4/5 (testosterona) em 41 e 46%, respectivamente. Sob as condições usadas para testar a inibição dependente do tempo, o Composto 2 (até 30 uM) mostrou inibição pouco ou nenhuma inibição dependente do tempo do CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 e CYP3A4/5 (midazolam) após uma pré-incubação de 30 minutos com ou sem NADPH. O Composto 2 (a 30 uM) inibiu a atividade do CYP3A4/5 (testosterona) em 59% (com NADPH) e 23% (sem NADPH), o que indicou que o Composto 2 era um inibidor fraco dependente do tempo de CYP3AA4/5.

[00326] Conclusão. Em resumo, o Composto B (até 30 uM) teve pouco (< 30%) a nenhum efeito inibitório direto sobre CYP1A2, CYP2A6, CYP2C8, CYP2D6, CYP2E1 e CYP3A4/5 (midazolam). O Composto B inibiu o CYP3A4/5 (testosterona) com um valor de ICso de 2,92 uM. O Composto B inibiu a atividade de CYP2B6, CYP2C9 e CYP2C19 em 59, 38 e 45%, respectivamente a uM. O Composto B (até 30 uM) não é um inibidor dependente do tempo de CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 e CYP2E1, mas é um inibidor dependente do tempo de CYP3A4/5.

[00327] Surpreendentemente, em contraste, o Composto 2 (até 30 uM) teve pouco (< 30%) a nenhum efeito inibitório em qualquer uma das enzimas CYP testadas e, a 30 UM, o Composto 2 inibiu a atividade de CYP2C19 e CYP3A4/5 (testosterona) apenas por 41 e 46% (isto é, ICso > 30 uM), respectivamente. O Composto 2 (até 30 uM) também é apenas um inibidor fraco dependente do tempo de CYP3A4/5. A atividade inibitória reduzida para CYP2C19 e CYP3A4/5 resulta em um efeito reduzido no metabolismo incluindo outras drogas e, portanto, um potencial reduzido para interações medicamentosas adversas.

[00328] Sumário:A combinação da atividade potente do anti -mieloma múltiplo ao poupar células normais, os níveis significativamente aumentados de apoptose e a resposta da combinação mais potente e eficaz com a dexametasona, indica que o Composto 1 e o Composto 2 serão úteis no tratamento do mieloma múltiplo. Além dissoy os resultados surpreendentemente aprimorados in vitro e in vivo do perfil fora do alvo e do CYP, em combinação com o potencial de usar doses mais baixas de dexametasona, indicam que o Composto 1 e o Composto 2 devem ter perfis de segurança aprimorados em relação aos compostos relatados anteriormente.

Exemplo 8:Apoptose induzida pelo Composto 2 em linhagens celulares de mieloma múltiplo, caracterizadas por drivers oncogênicos, translocações cromossômicas e mutações p53.

[00329] Metódos. O efeito de compostos na proliferação e indução de apoptose de linhagens de células MM representativas possuindo mutações oncogênicas comuns e translocações cromossômicas, incluindo aquelas consideradas translocações ou mutações de alto risco encontradas em pacientes com MM, foi avaliado utilizando um ensaio de citometria de fluxo em placa de 96 poços após 120 h de incubação com os compostos. Vinte linhagens de células MM (Tabela 7 e 8) (incluindo as linhagens celulares de leucemia de célula do plasma (PCL) L363, JJN-3, ARH-77 e SKMM-2) foram tratadas em duplicado com concentrações crescentes de Composto 2 ou pomalidomida, variando de 0,015 a 100 nM. Utilizando estoques de 5 mM, os compostos foram pré-manchados nos poços apropriados de placas de 96 poços usando um Distribuidor Digital Hewlett-Packard D300. As células foram adicionadas a placas de 96 poços usando um Dispensador de Reagentes Multidrop Combi. Após 5 dias de tratamento, a análise citométrica de fluxo foi usada para determinar o número de células que estavam vivas, mortas ou apoptóticas.

Após 5 dias de tratamento, as células foram incubadas com anexina V para manchar a fosfatidilserina exposta, um marcador apoptótico da superfície celular e o corante vital 7-AAD, que é excluído das células com membranas celulares intactas e analisado por citometria de fluxo (Attuneº, Thermo Fisher). A análise foi então realizada para determinar o número de células vivas (células de coloração negativa dupla da anexina V e 7-AAD) e foi calculada a porcentagem de células apoptóticas (células positivas para a anexina V) para cada condição, em relação ao controle tratado com DMSO.

Todos os valores descritos foram normalizados para células tratadas apenas com DMSO.

Todas as curvas de proliferação e indução de apoptose foram processadas e representadas graficamente como porcentagem de controle usando XLFit (IDBS, Alameda, CA) e GraphPad Prism 7. 03 (GraphPad Software, La Jolla, CA). A contagem de células vivas para cada concentração foi normalizada para o controle DMSO (considerado como 100%) no Microsoft Excel para gerar as curvas de proliferação.

O ICso (a concentração do composto que atinge 50% de inibição) foi calculada realizando log(inibidor) vs. resposta normalizada - Análise de inclinação variável e os valores de área sob a curva (AUC) foram calculados realizando análise de área sob curva no GraphPad Prism 7. 03. Da mesma forma, para a análise da apoptose, a porcentagem de apoptose induzida por droga foi calculada para todas as doses, combinando valores de apoptose “precoce” (positiva para a anexina V e negativa para 7-AAD) e apoptose “tardia” (positiva para anexina V e 7-AAD) e subtraindo valores de fundo (célula tratada com DMSO de controle de veículo). Os valores da AUC para as curvas de apoptose foram calculados através da análise da área sob curva no GraphPad Prism 7. 03. A área sob a curva dose-resposta (AUC) foi calculada, pois integra a potência e a eficácia das drogas para representar a apoptose em um único parâmetro.

Os valores de ICso para o Composto 2 e pomalidomida nos ensaios de citometria de fluxo são apresentados Tabela 9. A Tabela 10 mostra a área sob as curvas dose-resposta (AUC) comparando a atividade do Composto 2 e da pomalidomida usando o ensaio citométrico de fluxo no painel de linhagens celulares de MM.

Tabela 7:Linhagens celulares de mieloma múltiplo Linhagem de Fornecedor/Fonte Número de Condições da mem DO ame | oe | ANBL-6 Jelinek, Ahmann et NA RPMI-1640, 10 % al.

Cancer Res FBS, IL-6 (1993) 53(21):5320-5327 ARH-77 ATCC (Manassas, CRL-1621 RPMI-1640, 10 % o wo SS SS) CAG Borset, et al.

Blood NA RPMI-1640, 10 % (2000) 96(7):2528- FBS 2536 DF15 Shaughnessy, et al.

NA RPMI-1640, 10 % o e us EJM DSMZ ACC-560 RPMI-1640, 10 % (Braunschweig, FBS Germany) NCI-H929 ATCC (Manassas, CRL-9068 RPMI-1640, 10 % o o SS ÇÕO

Linhagem de Fornecedor/Fonte Número de Condições da mem |O am | oe | H929-1051 Desenvolvido RPMI-1640, 10 % internamente, FBS tornou-se resistente a 10 uM de lenalidomida ATCC (Manassas, CCL-159 RPMI-1640, 10 %

A A JJN-3 DSMZ ACC-541 RPMI-1640, 10 % (Braunschweig, FBS Germany) KMS-11 Japanese JRCB-1179 RPMI-1640, 10 % Collection of FBS Research Bioresources Cell Bank (Osaka, Japan) KMS-12-PE DSMZ ACC-606 RPMI-1640, 10 % (Braunschweig, FBS Germany) KMS-34 Japanese JRCB-1195 RPMI-1640, 10 % Collection of FBS Research Bioresources Cell Bank (Osaka, Japan)

Linhagem de Fornecedor/Fonte Número de Condições da mem o sue | cas | L363 DSMZ ACC-49 RPMI-1640, 10 % (Braunschweig, FBS Germany) LP-1 DSMZ ACC-41 RPMI-1640, 10 % (Braunschweig, FBS Germany) MM. 15 ATCC (Manassas, CRL-2174 RPMI-1640, 10 % So NS. OPM2 DSMZ ACC-50 RPMI-1640, 10 % (Braunschweig, FBS Germany) OPM2-P10 Desenvolvido RPMI-1640, 10 % internamente, FBS resistente a 10 uM de lenalidomida RPM1-8226 ATCC (Manassas, CCL-155 RPMI-1640, 10 % A ue SS |V SKMM-2 DSMZ ACC-430 RPMI-1640, 10 % (Braunschweig, FBS Germany) U266 ATCC (Manassas, TIB-196 RPMI-1640, 10 %

A A A ATCC = Coleta de Tecidos do Tipo Americano; DSMZ = Coleção Alemã de Micro-organismos e Culturas de Células; SFB = soro bovino fetal; I|L-6 = interleucina 6; JCRB = Banco Japonês de Células de Biorecursos de Pesquisa;

MM = mieloma múltiplo; N/A = não aplicável.

Tabela 8:Drivers oncogênicos, translocações cromossômicas e mutações p53 encontradas em um painel de linhagens celulares de mieloma múltiplo Linhagem de | status p53 Drivers Translocações mm o am o | ro ee o essa 1 o eee | KMS-11 tipo selvagem, HD | FGFR3/MMSET, C- | t(4;14),t(14;16) o mi ÇA SS KMS-12-PE tipo selvagem | Ciclina D1 t(11; 14) men |

Linhagem de | status p53 Drivers Translocações ce o me o | HD = deleção homozigótica; mut = mutação; wt = tipo selvagem; - = não disponível. º = mutação sem sentido. "= relatórios conflitantes na literatura se p53 de tipo selvagem com apenas 1 cópia ou mutação.

Fontes:Bergsagel, et al. Oncogene (2001);20:5611-5622; Berglind, et al. Cancer Biology Therapeutics (2008);5:699-708; Keats, J. Common Genetics of Myeloma Cell Lines [Internet]. Jonathan Keats Laboratory. Translational Genomics Research Institute (TGen) - Integrated Cancer Genomics Division. 2012 — [cited O5 Jan 2017].

[00330] Resultados. A atividade antiproliferativa do Composto 2 foi avaliada através de um painel de linhagens de células MM representativas possuindo mutações oncogênicas comuns e translocações cromossômicas (Tabela 8), incluindo aquelas consideradas translocações ou mutações de alto risco encontradas em pacientes com MM (Johnson, et al. Int J Hematol. (2011);94:321-333; Zhou, et al. Leukemia (2009);23:1941-1956; Terpos, et al. Leuk Lymphoma (2006);47:803-814; Tonon, Hematol Oncol Clin North Am. (2007);21:985-1006). As curvas de resposta da concentração foram obtidas usando citometria de fluxo para medir o número de células vivas para demonstrar a atividade antiproliferativa do composto 2 em comparação com a pomalidomida. Os valores de ICso para o Composto 2 e pomalidomida são apresentados na Tabela 9.

Tabela 9:Atividade antiproliferativa do composto 2 em linhagens celulares de mieloma múltiplo Atividade antiproliferativa(Citometria de fluxo)

Atividade antiproliferativa(Citometria de fluxo) a E

CEEE A

[00331] O efeito de indução da apoptose do Composto 2 foi avaliado usando citometria de fluxo após 120 h de tratamento e comparado com o tratamento com pomalidomida. A porcentagem de controle foi calculada normalizando para o controle DMSO (100% do controle) para gerar as curvas de resposta à dose e calcular a área sob essas curvas (AUC). O valor da AUC relatado corresponde à área sob a curva de resposta à dose, na qual valores de

10.000 correspondem à indução completa de apoptose em todas as doses e valores de O correspondem a nenhuma indução de apoptose. Cada ponto de dados representa 2 experimentos independentes com pelo menos duas amostras em cada experimento. (Tabela 10). Tabela 10:Apoptose induzida pelo composto 2 em linhagens celulares de mieloma múltiplo. E ge

CR FR E E

[00332] Conclusão. O Composto 2 foi amplamente ativo na maioria das linhagens de células MM e foi diferenciado da pomalidomida, mostrando forte atividade nas linhagens celulares que têm sensibilidade intermediária à pomalidomida e nas linhagens celulares resistentes à pomalidomida. O Composto 2 foi amplamente ativo em toda essa faixa de linhagens de células MM com status variável de p53, drivers oncogênicos ou translocações cromossômicas. Por exemplo, as células OPM2, LP-1, EJM, U266 e RPM1I-8226 têm o mutante p53 e eram sensíveis ao Composto 2. Além disso, todas as linhagens de células NCI-H929, KMS-11, KMS 34, OPM2 e LP-1 contêm a translocação cromossômica MM t(4;14) de “alto risco” e eram sensíveis ao Composto 2. As células SK-MM-2 e EJM também eram sensíveis ao Composto 2 e contêm outra translocação cromossômica MM de “alto risco”, t (14; 20). (Figura 5) A capacidade do Composto 2 de induzir apoptose após exposições curtas e definidas pode permitir que o controle da doença seja alcançado usando esquemas intensivos e intermitentes. Tais esquemas também podem melhorar o índice terapêutico, reduzindo o potencial do Composto 2 para induzir as citopenias que são observadas em doses mais contínuas dos atuais compostos MM.

Exemplo 9: O Composto 2 possui atividade em várias linhagens celulares de mieloma que adquiriram resistência à lenalidomida ou à pomalidomida

[00333] A atividade do Composto 2 foi testada em células que adquiriram resistência à lenalidomida ou pomalidomida devido à exposição contínua ao composto e, no processo, adquiriram níveis de cereblon desregulados (Tabela 11). As células foram tratadas por 5 dias e depois avaliadas usando um ensaio de determinação de ATP (CellTiter-Glo). O controle de porcentagem foi calculado subtraindo o plano de fundo e normalizando para o controle DMSO (100% do controle). A porcentagem relativa de cereblon em linhagens celulares com resistência adquirida à lenalidomida ou pomalidomida foi determinada por Western Blot e é apresentada, com a quantidade em linhagens celulares parentais designada como 100%.

[00334] Resultados. A Figura 6 mostra ICsos das curvas de resposta à concentração comparando a atividade do Composto 2 e da pomalidomida, para medir a proliferação nas linhagens parentais (DF15, NCI-H929 e OPM2), uma linhagem celular resistente à lenalidomida (NCI-H929-1051) ou cinco linhagens celulares resistentes à pomalidomida (NCI-H929-PO01, OPM2-PO1, OPM2-P1, OPMZ2-P10 e DF15R).

Tabela 11:Composto e concentração de composto usado para desenvolver resistência à droga em linhagens celulares de mieloma múltiplo e adquirir alterações na expressão da proteína Cereblon Linhagem celular Resistência Cereblon (%) (Normalizado para Linhagem Parental)

Linhagem celular Resistência Cereblon (%) (Normalizado para Linhagem Parental) N/A = não aplicável; Pom = pomalidomida; * nível de fundo, CRBN não real, que está ausente nesta linhagem celular

[00335] Conclusão:O efeito mais marcante do Composto 2 foi a ampla e potente atividade antiproliferativa através das linhagens de células MM, mas não nas células não tumorigênicas. O Composto 2 possui potente atividade antiproliferativa em linhagens de células MM contendo translocações de alto risco, como t(4;14), t(14;16) e outras. Comparado com lenalidomida e pomalidomida, o Composto 2 é significativamente mais potente para matar a maioria das linhagens de células MM. Além disso, o Composto 2 induziu apoptose, medida pela indução da atividade da caspase-3, em linhagens de células MM que adquiriram resistência à lenalidomida e pomalidomida.

Exemplo 10:Efeito Ex Vivo do Composto 2 na maturação de progenitores mieloides em neutrófilos adultos

[00336] Métodos:Culturas ex vivo de células (BM) CD34*de medula óssea de doadores saudáveis (HD) foram utilizados para investigar a maturação ex vivo específica de neutrófilos. A diferenciação in vitro de progenitores de neutrófilos foi induzida pela adição de fator de células-tronco (SCF), ligando tirosina quinase 3 relacionado a fms (FIt3-L) e fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) ao meio de cultura. A diferenciação celular foi avaliada por citometria de fluxo como a porcentagem de células em 5 subpopulações:

células-tronco hematopoiéticas (HSC, CD34*/CD33/CD11b) e Estágio | (CD34*/CD33*/CD11b7), Estágio Il (CD34/CD33*/CD11b”), Estágio Ill (CD34" /CD33*/ CD11b*), e Estágio IV (CD34//CD33/CD11b*) (de imaturo a maduro), como mostra a Figura 7. Os efeitos do Composto 2 na maturação dos progenitores de neutrófilos foram avaliados e diferentes esquemas de dosagem foram avaliados para se obter uma percepção da dependência do cronograma desses eventos.

[00337] Resultados. Exposições diárias curtas do Composto 2. Os efeitos de diferentes períodos de exposição (2, 4 e 6 h) a 1, 10 e 100 nM do Composto 2 por até 3 dias consecutivos na maturação dos progenitores de neutrófilos foram avaliados em pontos de tempo pré-especificados usando citometria de fluxo. Os resultados mostraram que a maturação tardia dos progenitores neutrófilos foi bloqueada pelo Composto 2, com células maduras significativamente reduzidas em número nas concentrações mais altas após um ou mais dias de exposiçãoA parada maturacional parece ocorrer principalmente no desenvolvimento do progenitor de neutrófilos no Estágio II, como evidenciado por um acúmulo de células com o imunofenótipo de superfície celular do Estágio Ill e uma redução na população de células com o imunofenótipo de superfície celular do Estágio IV (neutrófilos maduros). Conforme mostrado na Figura 8, em um exemplo para a incubação de 6 horas, esse efeito de maturação dependia da concentração e aumentou com o número de dias de exposição, mas não foi alterado pela duração (2, 4 ou 6 h) das exposições individuais. É importante ressaltar que a viabilidade de progenitores de neutrófilos e neutrófilos maduros expostos ao Composto 2 não foi afetada, como evidenciado pela ausência de qualquer aumento detectável na proporção de células positivas para Anexina V ou 7-aminoactinomicina D, que se acumula em células mortas.

[00338] A recuperação de neutrófilos maduros após a exposição ao Composto 2 também foi avaliada no sistema. A recuperação dos níveis maduros de neutrófilos para pelo menos 50% do nível de controle não tratado no sistema de ensaio utilizado no presente estudo está correlacionada com a ausência de indução ou recuperação de neutropenia clinicamente significativa. De fato, após um período de uma semana sem o Composto 2, a proporção de células do Estágio IV se recuperou em pelo menos 50% de seu nadir (Figura 8, painéis inferiores), com uma tendência para uma recuperação mais rápida e completa em concentrações mais baixas.

[00339] Conclusão:Os resultados indicam que o gerenciamento bem- sucedido da neutropenia em pacientes com MM tratados com o Composto 2 pode ser possível com o uso de esquemas de dosagem apropriados.

[00340] Exposições diárias mais longas do composto 2. Para caracterizar ainda mais os possíveis impactos de diferentes programações na interrupção da maturação do progenitor de neutrófilos e recuperação subsequente, as alterações nas proporções relativas de cada um dos estágios acima mencionados de maturação do progenitor mieloide em neutrófilos adultos foram avaliadas por citometria de fluxo após 3 ou 5 dias consecutivos de exposição 1, 10 ou 100 nM de Composto 2 por 6 ou 24 h por dia. Células CD34* BM derivadas de doadores saudáveis foram expostos ao Composto 2 em 3 ou 5 dias consecutivos, começando no Dia 10 por 6 h (Doadores Nº 1 e 2) ou por 24 h (Doadores Nº 3 e 4) a cada dia. Após a conclusão da exposição final, as células foram lavadas e reincubadas na ausência do Composto 2 até o Dia 22. As exposições de 6 e 24 horas ao Composto 2 por 3 ou 5 dias consecutivos resultaram em um acúmulo da população de neutrófilos no Estágio Il! com uma diminuição correspondente na população no Estágio IV, consistente com um bloqueio na maturação do Estágio Ill para o Estágio IV. Como mostrado na

Figura 9 e Figure 10, em exemplos de exposições de 6 horas por 3 e 5 dias, respectivamente, o ritmo de recuperação da parada maturacional era dependente da concentração e influenciado pelo número de exposições diárias, sendo mais prolongado em concentrações mais altas do Composto 2 e após 5 vs 3 dias de exposição, mas uma mudança na duração (6 vs 24 h) das exposições diárias teve pouco impacto no ritmo aparente de recuperação.

[00341] Após a exposição ao Composto 2 por 3 dias consecutivos, observou-se recuperação de 50% ou mais da maturação normal após um feriado de medicamentos de 8 a 10 dias, em todas as condições testadas (Figura 10, painel direito). Em contraste, após a exposição ao Composto 2 por 5 dias consecutivos, foi observada uma recuperação de 50% ou mais da maturação normal após uma parada de drogas de 8 a 10 dias apenas para as concentrações de 1 e 10 nM. Com a concentração mais alta do Composto 2 (100 nM), pode ser necessário um período mais livre de drogas para recuperar a maturação dos progenitores de neutrófilos. No entanto, apesar dessa recuperação incompleta da maturação, nenhuma perda de viabilidade foi observada em nenhuma das condições testadas, incluindo exposições contínuas (24 horas) por até 5 dias. Esta observação contrasta com a indução de apoptose nas células do mieloma, que foi otimizada pela exposição contínua ao Composto 2 por mais de 6 h.

[00342] Durante os 6 a 8 dias após a última exposição no cronograma de 5 dias, foram observados estágios iniciais de recuperação do Estágio |V (neutrófilos maduros) após a exposição ao Composto 2 apenas na concentração de 10 nM, enquanto nenhuma recuperação foi observada nesse período de tempo em culturas expostas a 100 nM de Composto 2 durante 5 dias. Esses dados sugerem que as exposições a concentrações mais altas do Composto 2, durante um número crescente de dias consecutivos, prenunciam uma parada maturacional mais prolongada dos precursores de neutrófilos (e neutropenia) e que o ritmo de recuperação é independente da duração (6 x 24 h) das exposições diárias.

[00343] Conclusão: Tomados em conjunto, os dados sugerem que a indução e recuperação de neutropenia em pacientes não podem ser afetadas adversamente por uma dosagem mais intensiva do Composto 2 (doses múltiplas por dia) em comparação com uma dose diária.

Exemplo 11:Efeito da dexametasona na maturação |h Vitro de progenitores neutrófilos como agente único e em combinação com Composto 2

[00344] Metódos. Para entender os efeitos da dexametasona na neutropenia, culturas in vitro de células BM CD34* de doadores saudáveis foram utilizados para avaliar os eventos neutropênicos mediados pela dexametasona como um agente único e em combinação com o Composto 2. Para definir os efeitos da monoterapia com dexametasona nesse modelo, a exposição a 1, 10 ou 100 nM de dexametasona foi mantida por 30 h comparando 7 diferentes esquemas de dosagem (Figura 11). Para estudos de combinação, o composto 2 (1, 10 ou 100 nM) e dexametasona de exposição única foram mantidos por 6 e 30 h, respectivamente, a partir do Dia 13 da cultura.

[00345] Resultados. Os resultados mostraram que a maturação dos progenitores de neutrófilos não foi afetada pela exposição à dexametasona de agente único sob qualquer esquema testado, enquanto a maturação dos precursores de neutrófilos de estágio tardio foi bloqueada pelo Composto 2 (Figura 12), com o número de células maduras reduzidas em todas as concentrações testadas após uma exposição. Esta parada de maturação também foi observada quando o Composto 2 foi combinado com dexametasona. O bloco de maturação dependia da concentração do Composto

2, mas não foi alterado pela variação da concentração de dexametasona. A viabilidade dos neutrófilos imaturos e maduros não foi afetada pela dexametasona ou pelo Composto 2, isoladamente ou em combinação. Após a lavagem da droga, foi observada recuperação total da maturação normal em todas as condições testadas após um período de férias de uma semana.

[00346] Conclusão. Estes dados indicam que a neutropenia causada pelo Composto 2 pode ser passível de tratamento, modificando os esquemas de dosagem, mas é previsto que não seja aliviado nem exacerbado pelo tratamento concomitante com dexametasona.

Exemplo 12:Efeito do composto 2 sozinho e em combinação com a dexametasona no mieloma múltiplo resistente à lenalidomida.

[00347] Métodos: A dexametasona foi avaliada quanto à sua capacidade de induzir apoptose como um agente único ou em combinação com o Composto 2, pomalidomida ou lenalidomida. A indução de apoptose foi media usando Caspase-Glo em células de mieloma múltiplas resistentes a lenalidomida (H929-1051). A dexametasona foi dispensada em 20 concentrações, utilizando um dispensador acústico. Os artigos de teste foram adicionados como concentrações únicas aos poços de dexametasona com um Dispensador Digital Hewlett-Packard D300. As concentrações finais dos compostos para o ensaio foram: dexametasona (0,8 uM a 0,00002 uM), lenalidomida (1 uM), pomalidomida (0,1 uM) e composto 2 (0,001, 0,01 ou 0,1 uM). As células foram dispensadas nas placas de ensaio com um distribuidor Multidrop e foram feitas placas duplicadas para o ensaio. A leitura da apoptose foi realizada 72 horas após o tratamento composto usando um Caspase-Glo 3/7 e Ensaios CellTiter-Glo. A luminescência Caspase-Glo 3/7 foi normalizada para a luminescência CellTiter-Glo para explicar as diferenças no número de células. À alteração de dobra da amostra tratada foi calculada da seguinte forma: caspase normalizada da amostra tratada/média do controle DMSO normalizado.

[00348] Resultados:A atividade de apoptose da dexametasona sozinha ou em combinação com lenalidomida, pomalidomida ou Composto 2 foi medida por indução de caspase-3. O Composto 2 sinergizou com a dexametasona para reduzir a viabilidade celular e potencializou a capacidade apoptótica da dexametasona de uma maneira dependente da concentração. O início da atividade da dexametasona foi alterado em 1 log na presença do Composto 2.

[00349] Conclusão:O Composto 2 potencia a atividade apoptótica da dexametasona, indicando o potencial de redução da dose de dexametasona quando utilizado em combinação com o Composto 2 na clínica.

[00350] Como mostrado na Figura 13, uma sinergia bidirecional dramática é observada após o tratamento com o Composto 2 em combinação com dexametasona. Tão pouco quanto 10 nM de dexametasona aumentam a capacidade de matar células do Composto 2 e concentrações baixas a sub- nanomolares do Composto 2 potencializam os efeitos apoptóticos da dexametasona.

Exemplo 13:0 Composto 2 aumenta a atividade antitumoral de células imunes de experiências de cocultura com doadores humanos saudáveis

[00351] com células mononucleares do sangue periférico e células K562. Métodos:Preparação de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC):As PBMCs isoladas de doadores saudáveis foram cultivadas em meio RPMI 1640 com 10% de FBS a uma densidade de 1 x 10º células/mL.

[00352] Cultura celular:As células K562 foram mantidas em fase logarítmica e a densidade e viabilidade celular foram monitorizadas por exclusão de azul tripano utilizando o analisador de viabilidade celular Vi-CELLº XR (Beckman Coulter, Brea, CA).

[00353] Procedimentos de ensaio:As PBMC humanas isoladas recentemente foram cultivadas com IL-2 recombinante a uma concentração de unidades/mL por 72 h. As células mononucleares do sangue periférico foram então centrifugadas e ressuspensas em meio completo RPMI fresco para 2x10º células/mL. As células foram então tratadas com DMSO ou compostos nas concentrações indicadas e incubadas por mais 72 h. As PBMCs foram então lavadas duas vezes em meio completo RPMI fresco antes da cocultura. As células K562 foram ressuspensas para uma densidade celular de 1 x 10º/mL e manchada com 1 uM CellTrace CFSE de acordo com as instruções do fabricante. As células K562 marcadas foram então semeadas em uma placa de fundo redondo de 96 poços em 1 x 10º células/poços. As células mononucleares do sangue periférico foram então transferidas para a mesma placa de 96 poços na razão 1:15, em triplicado e incubadas a 37ºC por 4 h. A lise específica da célula alvo por células PBMC foi medida usando isotiocianato de anexina V- fluoresceína (FITC) e iodeto de propídio (PI) de acordo com as instruções do fabricante e as amostras foram executadas no scan FACS Array. Células K562 não marcadas, células KS62 marcadas com CellTrace CFSE e células K562 não tratadas marcadas com anexina V-FITC e PI foram incluídas em cada ensaio como controle.

[00354] Ensaios de co-cultura com células mononucleares do sangue periférico humano tratadas com composto e linhagens celulares de mieloma não tratado. Métodos:Cultura celular. Todas as linhagens celulares de mieloma foram mantidas em fase logarítmica, e a densidade e viabilidade celular foram monitoradas por exclusão de azul de fibra usando o analisador de viabilidade celular Vi-CELL XR.

[00355] Procedimento de Ensaio de Tratamento PBMC. Noventa e seis poços foram pré-revestidos com anticorpo anti-CD3 (OKT3, 3 ug/mL) e incubados a 4ºC durante a noite antes do início do experimento. Os doadores de PBMC congelados foram descongelados a 37ºC por 2 minutos em meio RPMI com 10% de FBS e as contagens e viabilidade celular foram medidas no Vi- CELLº (Beckman Coulter). As células mononucleares do sangue periférico foram lavadas e diluídas para 1 x 10º células/mL e dispensado para as placas tratadas com composto em um volume total de 200 uL. As células foram incubadas com compostos por 2 h antes de serem transferidas para placas revestidas com anti- CD3 e incubadas por mais 72 h a 37ºC. Após 72 h, as PBMCs foram centrifugadas e as células foram lavadas duas vezes em meio RPMI + 10% de FBS. As linhagens de células MM não tratadas (H929 e H929-1051) foram marcadas com CellTrace CFSE de acordo com as instruções do fabricante e ressuspensas a uma concentração total de 0,1x10º células/mL em uma placa de 96 poços com fundo em U em um volume total de 100 ul. As células mononucleares do sangue periférico foram contadas e adicionadas às células MM na razão alvo:efetor (T:E) de 1:5. Após 24 h de co-cultura, a lise específica das células-alvo por PBMCs foi medida usando a Anexoina V-AF647 e 7-AAD de acordo com as instruções do fabricante e as amostras foram executadas no citômetro Attune NxT (Thermo Fisher).

[00356] Procedimento de Ensaio de Tratamento com Células PBMC e MM. Noventa e seis poços foram pré-revestidos com anticorpo anti-CD3 (OKT3, 3 ug/mL) e incubados a 4ºC durante a noite antes do início do experimento. Os doadores de células PBMC congeladas foram descongelados a 37ºC por 2 minutos em meio RPMI com 10% de FBS e as contagens e viabilidade celular foram medidas no analisador Vi-CELL. As células mononucleares do sangue periférico foram lavadas e diluídas para 1x105 células/mL e dispensadas para as placas tratadas com composto em um volume total de 200 ul. As células foram incubadas com compostos por 2 h antes de serem transferidas para placas revestidas com anti-CD3 e incubadas por mais 72 h. Ao mesmo tempo, as linhagens celulares MM (NCI-H929, H929-1051, OPM2, OPM2-P10) foram diluídas para uma concentração final de 0,1 x 10º células/mL e rotuladas com CellTrace CFSE de acordo com as instruções do fabricante. Linhagens celulares de mieloma múltiplo foram então dispensadas em placas tratadas com composto a um volume total de 200 ul e incubadas por 72 h. Após 72 h, as células PBMCs e MM foram contadas e transferidas para uma placa de 96 poços de fundo em U na razão T:E final de 1:5. Após 24 h de co-cultura, a lise específica das células-alvo por células PBMCs foi medida usando a Anexoina V- AF647 e 7-AAD de acordo com as instruções do fabricante e as amostras foram executadas no citômetro Attune NxT.

[00357] Resultados. O modelo de cocultura foi utilizado para determinar os efeitos diretos do Composto 2 na atividade antitumoral de PBMCs retiradas de doadores saudáveis. O tratamento do Composto 2 de PBMCs ativados por IL-2 induziu a morte de células K562 não tratadas de maneira dependente da concentração (Figura 14, painel direito). PBMCs tratadas com Composto 2 (ICso = 5,9 pM) eram * 600 vezes mais potentes que as tratadas com pomalidomida (POM; ICso = 0,004 uM) e * 2600 vezes mais potente que as PBMCs tratadas com lenalidomida (LEN; ICso = 0,02 uM) na obtenção de 50% de morte celular direta K562. Embora o Composto 2 seja mais potente que a lenalidomida e a pomalidomida, a magnitude da resposta foi semelhante entre os compostos (Figura 14, painel direito).

[00358] Os efeitos do Composto 2 na atividade de células anti-MM de PBMCs incubadas com o Composto 2 foram examinados mais adiante em linhagens celulares que exibiam o fenótipo de resistência para comparar com a resposta em células sensíveis. Em um modelo de cocultura diferente, as células doadoras de PBMC foram pré-tratadas com o Composto 2, lenalidomida ou pomalidomida por 2 h antes de serem cultivadas em placas revestidas com anticorpo anti-CD3 por 72 h. As PBMCs ativadas por anticorpo anti-CD3 tratadas com o Composto 2 demonstraram um aumento dependente da concentração na lise das células tumorais de linhagens de células MM sensíveis à lenalidomida não tratadas (NCI-H929; ICso = 0,005 uM) e resistentes à lenalidomida (H929-1051; ICso = 0,0002 uM) em um grau semelhante (Figura 15). O Composto 2 foi mais potente que a lenalidomida e a pomalidomida em relação à redução da porcentagem de células MM viáveis. Um nível semelhante de morte de células tumorais por PBMCs foi observado contra as células tumorais cocultivadas sensíveis à lenalidomida e resistentes à lenalidomida, mostrando que as PBMCs foram preparadas para matar células tumorais independentemente de seu fenótipo de resistência.

[00359] Como a pré-incubação de células imunes com o Composto 2 melhorou o direcionamento e a lise de células MM, também foi explorado o efeito da pré-incubação de células MM com o Composto 2 em sua suscetibilidade à morte imuno-mediada (Figura 16, Tabela 12). Quatro linhagens de células MM e PBMCs ativadas por anticorpo anti-CD3 foram pré- incubadas separadamente com o Composto 2, lenalidomida ou pomalidomida por 72 h. Quando PBMCs e linhas MM ativadas por anticorpo anti-CD3 foram pré-tratadas com Composto 2, lenalidomida ou pomalidomida, seguidas de cocultura, os efeitos na lise de células MM induzidas por PBMC foram aprimorados tanto na potência quanto na magnitude da resposta da morte. Comparando os valores de ICso a partir de culturas de células MM únicas versus as coculturas de células imunes e tumorais, o Composto 2 aumentou a morte das células NCI-H929 em * 7000 vezes e aumentou a morte das células H929- 1051 em * 6000 vezes. Para a linhagem celular OPM2-P10 resistente à pomalidomida, o tratamento do Composto 2 das células MM aumentou a morte imuno-mediada em * 3000 vezes (Tabela 12).

Tabela 12:Morte celular mediada por imunidade em linhagens celulares de mieloma múltiplo em culturas únicas versus coculturas Linhagem Morte de células imunomediadas!Cso (uM) celular de Condições da | Lenalidomida | Pomalidomida | Composto 2 mieloma Cultura múltiplo NCI-H929 0,3173 0,0444 8,702e-005 H929-1051 0,8782 0,0713 0,0001 OPM?2 1,722 0,1685 9. 3616-005 OPM2-P10 8,094 1,181 0,0031 00 RPMI1I-8226 0,1245 0,0676 8,387e-005 ICso = concentração resultando em 50% de morte celular.

[00360] Conclusão:As PBMCs tratadas com o Composto 2 induziram a lise tumoral de linhagens celulares K562 e MM não tratadas na mesma extensão que a lenalidomida e a pomalidomida, embora com uma potência muito maior. Além disso, a morte de células tumorais foi grandemente aumentada se ambas as linhagens celulares PBMCs e MM foram pré-tratadas com o Composto 2, indicando que, além de seus efeitos autônomos de células potentes, o Composto 2 também pode aumentar a imunogenicidade das linhagens celulares de MM. A combinação dos efeitos potentes imunogênicos e autônomos de células e nas células MM, além de suas propriedades imunomoduladoras, fazem do Composto 2 um candidato potencial à clínica.

Exemplo 14:Efeito do Composto 2 em combinação com daratumumabe no mieloma múltiplo

[00361] O daratumumabe, um anticorpo anti-CD38 aprovado para o tratamento de mieloma múltiplo, exerce sua atividade anti-mieloma por citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC). O efeito do Composto 2 ou pomalidomida em combinação com daratumumabe foi avaliado em linhagens de células MM.

[00362] Ensaio ADCC:O efeito do Composto 2 ou pomalidomida no ADCC mediado por daratumumabe foi avaliado in vitro por citometria de fluxo em um painel de linhagens celulares MM. As células NK foram cultivadas durante a noite em meio de cultura NK contendo 10 U/mL de IL-2 humana recombinante antes do início do ensaio. As células NK foram lavadas e ressuspensas novamente em meio de cultura de células NK a 3,75 x 10º células/mL. As células MM foram pré-tratadas com concentrações sub-letais do Composto 2 ou pomalidomida por 72 h antes de serem utilizadas no ensaio ADCC. As células MM foram lavadas e marcadas com Tag-it Violet'Y Proliferation and Cell Tracking Dye de acordo com as instruções do fabricante, seguido de ressuspensão em meio de cultura NK a uma concentração de 0,75 x 10º células/ml. O ensaio ADCC foi realizado em triplicado com uma razão efetor/tumor de 10:1 em uma placa de 96 poços. As células MM (10 JL) foram misturadas com 10 ul de 2x de concentração de daratumumabe nos poços antes da adição de 20 uL de células NK. As coculturas foram incubadas a 37ºC por 3 h, seguidas pela adição de 50 ul de solução de 7-AAD à temperatura ambiente por 15 minutos. A análise foi realizada em um citômetro de fluxo BD Celesta.

[00363] Ensaio ADCP:O efeito do Composto 2 ou pomalidomida no ADCP mediado por daratumumabe foi determinado num painel de linhagens celulares MM. Os monócitos foram plaqueados em uma placa de 96 poços a

40. 000 células por poço em volume de 100 ul de meio AIM-V completo contendo 50 ng/mL de M-CSF. As células foram deixadas assentar na placa por minutos em temperatura ambiente antes de colocá-las em 37ºC, 5% de incubador de CO, por 9 dias para permitir a diferenciação em macrófagos. Os meios de cultura foram reabastecidos com novos meios completos a cada 3-4 dias. Na manhã do ensaio ADCP, os macrófagos foram submetidos à privação de soro por 2-4 horas a 37ºC, 5% de CO, antes da cocultura com as células MM. As células MM foram pré-tratadas com concentrações sub-letais do Composto 2 ou pomalidomida por 72 h. No dia do ensaio, as células MM foram lavadas com PBS e marcadas com CSFE por 15 minutos. A reação foi parada com um volume igual de 20% de FBS. As células foram lavadas duas vezes com PBS e ressuspensas em meio AIM-V a 1,6 x 10º células/mL. Em seguida, 50 ul de células MM foram misturadas com 50 ul de 2 ug/mL de daratumumabe por 10 minutos em temperatura ambiente antes de adicionar aos macrófagos famintos no soro. Cada condição foi testada em triplicado. O volume final do ensaio foi de 200 ul contendo 10% de soro humano com uma razão efetor-alvo de 2:1. A placa foi centrifugada a 500 rpm por 1 minuto seguida de incubação a 37ºC, 5% de CO, durante 3 h. No final da incubação, a placa foi lavada com 100 ul de PBS e as células restantes foram coradas com anti-CD14 e anti-CD138 para identificar os macrófagos e as células MM, respectivamente. A placa foi lavada e os poços foram preenchidos com 100 ul de PBS. Os macrófagos foram destacados do fundo dos poços com a adição de 50 ul de tripsina a 0,25%. As amostras foram neutralizadas com a adição de 50 ul de meio AIM-V completo. As amostras foram analisadas em citômetro de fluxo. A porcentagem de fagocitose foi determinada pelas células positivas duplas CSFE/CD14 divididas pelo número total de células CD14 + vezes 100.

[00364] Resultados:O tratamento de células MM com o Composto 2 e pomalidomida resultou em um aumento dependente da dose da expressão de CD38 (Figura 17). A extensão da expressão de CD38 foi maior com o Composto 2 e ocorreu em concentrações mais baixas em comparação com a pomalidomida. As células MM +/- Composto 2 ou pré-tratamento com pomalidomida foram avaliadas em ensaios ADCC com daratumumabe. As células MM tratadas com o Composto 2 demonstraram um maior grau de lise tumoral com daratumumabe em comparação com as células não tratadas (Figura 18). As células tratadas com o Composto 2 também foram mais sensíveis ao ADCC mediado por daratumumabe em comparação com as células tratadas com pomalidomida. A capacidade do Composto 2 e da pomalidomida em modular o ADCP mediado por daratumumabe também foi testada. As células MM tratadas com o Composto 2 eram mais sensíveis ao ADCP mediado por daratumumabe em comparação com as células não tratadas e tratadas com pomalidomida (Figura 19). Apenas uma linhagem celular testada, ARH-77, não apresentou ADCP aprimorado com o Composto 2 ou pomalidomida, mas demonstrou ADCC aprimorado com o Composto 2.

[00365] Conclusão:O Composto 2 superregula a expressão de CD38 em células MM, resultando em aumento de ADCC e ADCP mediado por daratumumabe em comparação com pomalidomida ou células não tratadas. Estes dados sugerem que a combinação de daratumumabe com o Composto 2 pode ser mais eficaz no tratamento de MM em comparação à combinação com pomalidomida ou daratumumabe isoladamente.

Exemplo 15:Efeito do Composto 2 em combinação com inibidores de proteassoma no mieloma múltiplo

[00366] Vinte e quatro horas antes do tratamento com um inibidor de proteassoma e composto de teste, um número apropriado de células foi dividido para uma concentração de 0,2x10º/mL em meio fresco para permitir crescimento exponencial. No dia do tratamento, os compostos foram recentemente solvatados em DMSO. Os inibidores de proteassoma bortezomibe ou carfilzomibe foram diluídos e adicionados ao meio de cultura pré-aquecido nas concentrações finais de trabalho de 150 nM ou 300 nM para o bortezomibe e 300 nM ou 550 nM para o carfilzomibe. As concentrações de inibidor de proteassoma foram determinadas com base nas concentrações clínicas de Cmax, bem como em estudos anteriores em cada linhagem celular, que determinaram a duração e a concentração de PI necessárias para inibir uma quantidade específica de atividade do proteassoma p5. As células foram contadas e um número apropriado foi colocado no meio contendo inibidor de proteassoma e completamente misturado. Após incubação por 1 hora a 37ºC, 5% de CO,, as células foram lavadas duas vezes com 40 mL de meio completo para remover o inibidor do proteassoma. Alíquotas de cada tratamento com proteassoma foram testadas para confirmar a extensão da inibição das subunidades B5, B2 e B1. As células foram ressuspensas em 0,1x10º/mL e plaqueadas a 100 ul/poço em material de cultura fresco contendo titulações em triplicado do Composto 2 ou pomalidomida. As células plaqueadas foram cultivadas em 37ºC, 5% de CO,, pelo restante do experimento, até 72 h. A cada 24 h, a inibição do proteassoma era monitorada pelo ensaio Proteasome-Glo baseado em células. A proliferação e apoptose foram medidas às 72 h por citometria de fluxo. As células foram manchadas com APC Annexin-V e 7-AAD para enumerar o número de células viáveis restantes na cultura.

[00367] Resultados. Foi estabelecido um ensaio celular in vitro para imitar a farmacocinética clínica (PK) e a farmacodinâmica (PD) da exposição aos inibidores do proteassoma bortezomibe e carfilzomibe. O modelo emprega exposições curtas do inibidor de proteassoma, seguido de lavagem completa do composto para dosar células com concentrações clinicamente relevantes de inibidor de proteassoma, ao mesmo tempo em que obtém a rápida depuração observada in vivo. Além disso, um nível comparável de inibição de B5 proteassoma pode ser alcançado em todas as linhagens celulares. Este modelo foi usado para avaliar os efeitos combinados do Composto 2 em combinação com o bortezomibe ou o carfilzomibe em um painel de linhagens celulares de mieloma múltiplo e leucemia de células plasmáticas (OPM2.P10 resistente à Pomalidomida), RPMI.8226 e linhagens de leucemia de células plasmáticas L363 e JJN -3).

[00368] O bortezomibe e o Composto 2 demonstraram um efeito de combinação nas duas linhagens MM testadas, OPM2. P10 e RPMI. 8226, bem como em uma das linhagens celulares de leucemia de células plasmáticas, JJN-

3. Os efeitos de combinação na linhagem celular L363 não puderam ser avaliados, pois o bortezomibe não teve atividade de agente único na viabilidade celular nas condições deste ensaio in vitro (Figura 20 e Figura 214).

[00369] Embora os tratamentos com carfilzomibe entre as experiências tenham sido variáveis na porcentagem de morte celular que eles alcançaram ao longo dos tratamentos de 1 h, efeitos de combinação com o Composto 2 foram demonstrados em todas as 4 linhagens celulares (Figura 21B).

[00370] Conclusão: Surpreendentemente, o Composto 2 mantém sua capacidade de matar células em níveis clinicamente relevantes de inibição de proteassoma. Combinação do Composto 2 com bortezomibe ou carfilzomibe demonstrou um aumento na apoptose e atividade antiproliferativa contra células MM.

Exemplo 16: Efeito do Composto 2 em combinação com inibidores de histona desacetilase, agentes de quimioterapia, inibidores de Bcl-2, inibidores de Mcl-1, inibidores de BET ou inibidores de LSD-1.

[00371] O efeito da combinação do tratamento com o Composto 2 e inibidores de pequenas moléculas com vários mecanismos foi avaliado em um painel de linhagens celulares MM. Treze inibidores de moléculas pequenas foram selecionados para estudos de combinação com o Composto 2 com base em sua atividade pré-clínica e/ou contra MM. As linhagens celulares H929- 1051, KMS11, KMS-12PE, L363, OPM-P10 e RPMI8226 foram selecionadas para este estudo para representar os diferentes grupos de agrupamento genético nas linhagens celulares de MM. As concentrações de compostos para os tratamentos combinados foram selecionadas na faixa de 1 log acima e 2 logs abaixo do ICso do agente único. Os agentes de combinação foram doseados em uma curva dose-resposta de 6 pontos (DRC) em uma diluição de 1:3, o Composto 2 foi dosado em um DRC de 10 pontos, também em uma diluição de 1:3. As experiências de combinação foram realizadas duas vezes, cada vez com dados replicados em placas separadas. Os compostos foram previamente detectados nos poços apropriados de placas de 384 poços usando um dispensador acústico. Todas as linhagens celulares MM foram cultivadas em uma incubadora a 37ºC com 5% de CO, utilizando o meio de cultura celular indicado contendo 1x Penicilina-Estreptomicina. As células foram adicionadas ao composto contendo placas de 384 poços usando um Dispensador de Reagentes Multidrop Combi e deixadas incubar por 3 dias a 37ºC com 5% de CO». Após 3 dias, as células foram avaliadas quanto ao seu nível de teor de ATP via Cell Titer-Glo medido em um detector de luminescência (PerkinElmer Envision).

[00372] O método do Agente Único Mais Alto (HAS) foi usado para detectar sinergia nos dados da curva de resposta à dose. As combinações foram analisadas a partir de uma perspectiva da superfície de resposta. À statistical framework (Van Der Borght, K., et al., BIGL:Biochemically Intuitive Generalized Loewe null model for prediction of the expected combined effect compatible with partial agonism and antagonism; Scientific Reports, 7 (1), 17935-1-17935-9 (2017)) foi incorporado à análise sobre o modelo nulo HAS com dois testes estatísticos:1) A superfície de resposta completa difere do modelo nulo, 2) O poço único difere do modelo nulo.

[00373] Resultados: O efeito do tratamento com o Composto 2 em combinação com inibidores de pequenas moléculas foi avaliado num painel de múltiplas linhagens celulares de mieloma. O Composto 2 foi pesquisado em combinação com 14 compostos e a sinergia foi calculada em todos os poços para 6 linhagens celulares. Dexametasona e etoposídeo mostraram sinergia significativa em combinação com o Composto 2 em cinco das seis linhagens celulares testadas (Figura 22). A combinação do Composto 2 com inibidores de BET (4- [2-(ciclopropilmetoxi)-S-(metanossulfonil)fenil]-2-metilisoquinolin- 1(2H)-ona (Composto D), birabresibe e GSK525762A) também demonstrou atividade sinérgica nas células MM, com diferentes graus de sinergia entre os três inibidores. A combinação do Composto 2 com AMG176 (inibidor da MCL-1) mostrou atividade sinérgica em três linhagens celulares (KMS11, KMS12-PE, L363) enquanto a combinação do Composto 2 com ACY241 e panobinostat (inibidores da histona desacetilase) foi sinérgica em L363/OPM2- P10 e L363/H929-1051, respectivamenteO Composto 2 em combinação com 4-[2-(4- amino-piperidin-1-i1)-5-(3-fluoro-4-metoxi-fenil)-1-metil-6-0x0-1,6-di- hidropirimidin-4-il]-2-fluoro-benzonitrila (Composto E) foi sinérgico nas células L363 e KMS12-PE. O MIK665, um inibidor da MCL-1, foi o único composto que não mostrou sinergia significativa nas linhagens celulares de 6 MM testadas.

[00374] Conclusões: O tratamento com o Composto 2 em combinação com 12 das 14 moléculas pequenas demonstrou atividade sinérgica em pelo menos uma ou mais das linhagens celulares MM testadas. A combinação com seis dos compostos mostrou sinergia em pelo menos 3 linhagens de células MM testadas (Figura 22). Estes dados sugerem que o tratamento combinado com o Composto 2 com os inibidores de pequenas moléculas testados representa um paradigma de tratamento potencial para MM, incluindo alguns com atividade sinérgica.

Exemplo 17: Atividade antitumoral in vivo do Composto 2 sozinho e em combinação com dexametasona.

[00375] Métodos: O estudo do xenoenxerto foi realizado com camundongos SCID fêmeas portadores de tumores de mieloma múltiplo/plasmocitoma resistentes à lenalidomida NCI-H929 (H929-1051). Camundongos SCID fêmeas foram inoculados subcutaneamente com células H929-1051 na região do flanco acima da perna traseira direita. Após a inoculação dos animais, os tumores foram deixados crescer até aproximadamente 100 mm? antes da randomização. No dia 13 após a inoculação das células tumorais, os camundongos portadores de tumores H929-1051 variaram entre 79 e 157 mm? foram reunidos e randomizados em vários grupos de tratamento. O Composto 2 foi formulado em 2% de HPMC em água (como uma suspensão). A dexametasona foi formulada em 0,5% de CMC/0,25% de Tween 80 em água deionizada. O Composto 2 (0,1 mg/kg) e dexametasona (0,5 mg/kg) foram administrados por via oral uma vez ao dia durante o estudo a partir do dia 13 após a inoculação das células tumorais. No grupo de combinação, os animais receberam o Composto 2 (0,1 mg/kg/dia) e dexametasona (0,5 mg/kg/dia) simultaneamente durante a duração do estudo a partir do dia 13 após a inoculação das células tumorais. Os tumores foram medidos duas vezes por semana usando pinças e os volumes tumorais foram calculados usando a fórmula W? x L/2. A análise estatística foi realizada usando uma análise de variância unidirecional ou bidirecional (ANOVA). Os cálculos de sinergia foram realizados usando o método fracionário do produto.

[00376] Resultados: O tratamento com Composto 2 de agente único significativamente (p<0,01) inibiu (-34%) o crescimento do tumor de mieloma múltiplo H929-1051. O tratamento com dexametasona como agente único inibiu marginalmente (-20%) o crescimento do tumor no xenoenxerto H929-

1051. O tratamento com o Composto 2 a 0,1 mg/kg administrado em combinação com dexametasona a 0,5 mg/kg produziu uma significativa (p < 0,0001) diminuição do volume do tumor quando comparado ao controle do veículo, exibindo uma redução no volume do tumor de 84%. Em uma ANOVA de duas vias com o pós-teste de Bonferroni, essa atividade antitumoral combinada foi significativamente melhor do que o Composto 2 sozinho (84% versus 34% de TVR; p < 0,0001) ou dexametasona sozinha (84% versus 20% de TVR; p <0,0001). Utilizando o método do produto fracionado, determinou-se que a atividade antitumoral combinada do Composto 2 a 0,1 mg/kg e dexametasona a 0,5 mg/kg é sinérgica na diminuição do volume do tumor. (Figura 23)

[00377] Conclusão: O Composto 2 em combinação com a dexametasona exibiu sinergismo na redução do volume tumoral no modelo de tumor de mieloma múltiplo/plasmocitoma NCI-H929, indicando que o tratamento combinado do Composto 2 e dexametasona mostrou atividade antitumoral sinérgica em um modelo de MM resistente à lenalidomida. O Composto 2 potencia a atividade apoptótica da dexametasona, indicando o potencial de redução da dose de dexametasona quando utilizado em combinação com o Composto 2 na clínica.

Exemplo 18: Atividade antitumoral in vivo do Composto 2 sozinho e em combinação com Bortezomibe.

[00378] Métodos: O estudo do xenoenxerto foi realizado com camundongos SCID fêmeas portadores de tumores de mieloma múltiplo/plasmocitoma resistentes à lenalidomida NCI-H929 (H929-1051). Camundongos SCID fêmeas foram inoculados subcutaneamente com células H929-1051 na região do flanco acima da perna traseira direita. Após a inoculação dos animais, os tumores foram deixados crescer até aproximadamente 500 mm? antes da randomização. No Dia 31 após a inoculação das células tumorais, os camundongos portadores de tumores H929-1051 variaram entre 366 e 535 mm? foram reunidos e randomizados em vários grupos de tratamento. O Composto 2 foi formulado em 2% de HPMC em água (como uma suspensão). O Bortezomibe foi formulado em 1% de DMSO em solução salina (como uma solução). O Composto 2 (1 mg/kg) foi administrado por via oral uma vez ao dia por 3 dias consecutivos a partir do dia 31 após a inoculação das células tumorais. O Bortezomibe (1 mg/kg) foi administrado em dose única por via intravenosa no dia 31 após a inoculação das células tumorais. grupo de combinação, os animais receberam o composto 2 (1 mg/kg/dia) por via oral nos dias 31-33 e o bortezomibe foi administrado por via intravenosa como dose única no dia 31. No dia 31, o bortezomibe foi administrado 1 h antes da primeira dose do Composto 2. Os tumores foram medidos duas vezes por semana usando pinças e os volumes tumorais foram calculados usando a fórmula W? x L/2. Os animais foram sacrificados quando os volumes do tumor atingiram um objetivo predeterminado de aproximadamente 2000 mm?. A análise estatística foi realizada até o dia 50 usando uma análise de variância unidirecional ou bidirecional (ANOVA). Os cálculos de sinergia foram realizados usando o método fracionário do produto.

[00379] Resultados: O tratamento com o Composto 2 de agente único, quando administrado uma vez ao dia por 3 dias consecutivos (qdx3) nos dias

31-33 após a inoculação das células tumorais, significativamente (p<0,0001) inibiu (-44%) o crescimento do tumor de mieloma múltiplo H929-1051 no dia

50. Ao longo do tempo, os tumores animais tratados com o composto 2 (1 mg/kg) cresceram e atingiram aproximadamente 2000 mm? no dia 58. O tratamento com bortezomibe como agente único quando administrado em dose única no dia 31, significativamente (p<0,0001)inibiu (-60%) o crescimento do tumor no xenoenxerto H929-1051 no dia 50. Com o tempo, os tumores de animais tratados com bortezomibe (1 mg/kg) cresceram e atingiram aproximadamente 2000 mm? no dia 66. O tratamento com o Composto 2 a 1 mg/kg (qdx3) quando administrado em combinação com bortezomibe a 1 mg/kg (dose única) produziu uma significativa (p < 0,0001) diminuição do volume do tumor quando comparado ao controle do veículo, exibindo uma redução do volume do tumor de 98% no dia 50. Em uma ANOVA de duas vias com o pós-teste de Bonferroni, essa atividade antitumoral combinada foi significativamente melhor do que o Composto 2 sozinho (98% versus 44% TVR; p < 0,0001) ou bortezomibe sozinho (98% versus 60% de TVR; p < 0,0001). Utilizando o método do produto fracionado, determinou-se que a atividade antitumoral combinada do Composto 2 a 1 mg/kg e dexametasona a 1 mg/kg é sinérgica na diminuição do volume do tumor. Surpreendentemente, no dia 53 da inoculação de células tumorais, 7 de 9 animais tratados com a combinação do Composto 2 e bortezomibe ficaram livres de tumor e permaneceram livres de tumor. (Figura 24)

[00380] Conclusão: O Composto 2 em combinação com o bortezomibe exibiu sinergismo na redução do volume do tumor no modelo de tumor de plasmocitoma NCI-H929 resistente à lenalidomida e surpreendentemente produziu animais livres de tumor.

Exemplo 19: Estudo clínico de fase 1 - mieloma múltiplo recidivado e refratário.

[00381] Um estudo de marcação aberta, multicêntrico, de fase 1 é conduzido para avaliar a segurança, farmacocinética e eficácia preliminar do Composto 2 em combinação com dexametasona em sujeitos com mieloma múltiplo recidivado e refratário (RRMM).

[00382] Objetivos: O objetivo principal do estudo é avaliar a farmacocinética (PK), segurança/tolerabilidade e definir a dose máxima tolerada (MTD)/dose recomendada da Parte 2 (RP2D) do Composto 2 em combinação com dexametasona em conjunto com um mínimo de dois esquemas de dosagem de Composto 2. O objetivo secundário é avaliar a eficácia preliminar do Composto 2 em combinação com dexametasona.

[00383] Projeto do estudo: Este é um estudo de fase 1 internacional, de marcação aberta e multicêntrico, para avaliar a segurança, PK/PD e eficácia preliminar do Composto 2 em combinação com dexametasona em sujeitos com RRMM. Todos os sujeitos elegíveis devem ter falhado, ser intolerantes ou não serem candidatos às terapias disponíveis que conferem benefício clínico no RRMM.

[00384] O estudo é realizado em duas partes: A Parte 1 avalia a PK/PDe a segurança de doses crescentes do Composto 2 com dose padrão simultânea de dexametasona e determina o MTD/RP2D para a combinação quando administrado de acordo com um mínimo de dois esquemas de dosagem diferentes. A Parte 2 consiste em uma coorte de expansão de braço único do Composto 2 no RP2D mais dexametasona para ambos os esquemas de dosagem. Além das avaliações de segurança, PK e PD, todos os sujeitos são submetidos a avaliações de resposta mensal por Critérios de Resposta Uniforme do Grupo Internacional de Trabalho em Mieloma (IMWG) (Rajkumar et al., Consensus recommendations for the uniform reporting of clinical trials:

report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 1. Blood, 2011, 117(18):4691-5; Kumar et al., International Myeloma Working Group consensus criteria for response and minimal residual disease assessment in multiple myeloma, Lancet Oncology, 2016, 17:e328-46) e podem continuar o tratamento do estudo até a progressão da doença, toxicidade intolerável ou decisão do médico ou do sujeito de interromper o tratamento do estudo.

[00385] O estudo é conduzido em conformidade com os Requisitos Técnicos do Conselho Internacional de Harmonização (ICH) para Registro de Produtos Farmacêuticos para Uso Humano/Boas Práticas Clínicas (GCP) e requisitos regulamentares aplicáveis.

[00386] Parte 1 (escalonamento da dose): Coortes de sujeitos com RRMM recebem doses crescentes de Composto 2 mais uma dose fixa de dexametasona (40 mg/dose; 20 mg/dose em sujeitos > 75 anos) para avaliar sua segurança, os perfis MTD/RP2D e PK/PD. Um mínimo de dois esquemas de dosagem diferentes é avaliado na Parte 1, o primeiro consistindo em 10 dias consecutivos de dosagem uma vez ao dia (QD) seguidos por 4 dias sem tratamento x 2 a cada ciclo de 28 dias (referido como o esquema 20/28) . O segundo esquema consiste em uma dose duas vezes ao dia (BID) por 3 dias consecutivos, seguidos por 11 dias sem tratamento do estudo x 2 por ciclo (referido como o esquema 6/28). As coortes de dose inicial recebem 0,1 mg/dia de Composto 2 QD no esquema 20/28 e 0,2 mg BID na programação de 28/06. A alocação de sujeito é atribuída pelo Patrocinador, dependendo da disponibilidade de slots de sujeito para um ou ambos os horários. Não é permitido alternar entre programações de dosagem. Podem ser explorados esquemas de dosagem adicionais (por exemplo, 5 dias de administração do Composto 2 seguidos por 9 dias sem tratamento x 2 OU 7 dias após a administração seguido de 7 dias sem tratamento x 2 por ciclo de 28 dias) sob os termos de uma emenda ao protocolo até o resultado dos resultados iniciais de segurança e PK/PD em associação com os cronogramas 20/28 e 6/28.

[00387] Para todos os esquemas de dosagem, os Dias 1 a 28 do Ciclo 1 constituem o período de avaliação da toxicidade limitativa da dose (DLT) para fins de determinação do MTD. Os indivíduos são avaliados para DLT se receberem a dose prescrita do Composto 2 em pelo menos 16 dos 20 dias de dose no esquema 20/28 e pelo menos 5 dos 6 dias de dose (10 doses) no esquema 6/28 no Ciclo 1 ou experimentarem um DLT. Os sujeitos avaliados que não são DLT são substituídos.

[00388] Em cada programação, coortes de três ou mais sujeitos recebem o Composto 2 em doses que aumentam em incrementos de 100% em coortes sucessivas até a ocorrência de dois eventos adversos emergentes do tratamento de Grau 2 que não podem ser atribuídos de forma clara e incontroversa a causas estranhas. Posteriormente, os incrementos da dose não devem exceder 50% até a ocorrência de um primeiro DLT. Uma metodologia bayesiana de escalonamento de doses usando regressão logística é utilizada após a ocorrência de um primeiro DLT em qualquer esquema de dosagem, com a dose atribuída do Composto 2, o número de doses por dia (QD vs BID) e número de dias consecutivos de dose para cada esquema (3 vs 10) como covariáveis. A taxa de toxicidade alvo para a combinação do Composto 2 mais dexametasona é de 20% para todos os esquemas.

[00389] Não é permitido o aumento da dose intra-sujeito durante o período de avaliação de DLT, no entanto, no Ciclo 2 e além, os sujeitos sem evidência de progressão da doença que tolerem a dose designada do Composto 2 podem critério do investigador e em consulta com o monitor médico do estudo) subir para o nível de dose mais alto demonstrado ser adequadamente tolerado por pelo menos uma coorte de sujeitos dentro do cronograma de dosagem designado.

[00390] Parte 2 (Expansão da coorte): Após a conclusão da Parte 1, um estudo de expansão de braço único do Composto 2 mais dexametasona é realizado em 20 sujeitos por esquema de dosagem para avaliar ainda mais sua segurança, PD e eficácia no RP2D e cronograma.

[00391] Após a determinação do RP2D para o Composto 2 mais dexametasona, uma avaliação da segurança/tolerabilidade, PK e eficácia preliminar do Composto 2/dexametasona em combinação com outros agentes anti-mieloma de interesse, por exemplo, anti-CD38 em uma ou mais coortes de sujeitos com diferentes históricos de tratamento prévio e/ou características prognósticas, também podem ser iniciados em paralelo como parte deste protocolo.

[00392] População de Estudo: Os sujeitos com idade > 18 anos com MM refratários à sua última linha de tratamento falharam ou são intolerantes ou não candidatos a terapias disponíveis que são conhecidas por conferir benefício clínico a sujeitos com doença refratária e recidivante, têm um Status de Desempenho do Grupo de Oncologia Cooperativa do Leste (ECOG PS) 0-2, doença mensurável e medula óssea, função renal e cardíaca adequadas. Os sujeitos com histórico de transplante alogênico, MM ou oligossecretório ou não, leucemia de células plasmáticas ou MM refratário primário (isto é, sem histórico de pelo menos uma resposta menor a um regime de tratamento anterior) são excluídos.

[00393] Critérios de inclusão: Os sujeitos devem atender os seguintes critérios para serem inscritos no estudo:

1. O sujeito tem > 18 anos ou mais no momento da assinatura do termo de consentimento informado (ICF).

2. O sujeito deve compreender e assinar voluntariamente um ICF antes de realizar quaisquer avaliações/procedimentos relacionados ao estudo.

3. O sujeito deve estar disposto e capaz de cumprir com o cronograma de visita do estudo e outros requisitos protocolares.

4. Classificação do status de desempenho do Grupo de Oncologia Cooperativa Oriental (ECOG) de O, 1 ou 2.

5. Os sujeitos devem ter um diagnóstico documentado de MM e doença mensurável no momento da inscrição. A doença mensurável é definida como: a. Quantidades de proteína M > 0,5 g/dL por sPEP ou b. > 200 mg/24 h de coleta de urina por uPEP ou c. Níveis séricos de FLC> 100 mg/L (miligramas/litro) envolveram cadeia leve e uma razão kappa/lambda anormal (K/A) em sujeitos sem proteína M sérica ou urinária detectável ou d. para sujeitos com imunoglobulina classe A (IgA), mieloma cuja doença só pode ser mensurada com segurança por medição quantitativa de imunoglobulina, um nível sérico de IgA > 0,50 g/dL.

6. Todos os sujeitos devem: a. ter documentado a progressão da doença nos 60 dias seguintes à última dose de sua última terapia com mieloma e, b. ter falhado no tratamento com, serem intolerantes ou não serem candidatos a terapias disponíveis que são conhecidas por conferir benefício clínico a sujeitos com RRMM.

Observação:As linhas de terapia anteriores devem incluir (no mínimo) um inibidor de proteassoma e um agente modulador do cereblon administrado individualmente (em qualquer ordem) ou em conjunto.

7. Os participantes devem ter os seguintes valores laboratoriais: + Contagem absoluta de neutrófilos (ANC) > 1,25 x 10º/L sem suporte ao fator de crescimento por > 7 dias (> 14 dias para pegfilgrastim).

e Hemoglobina (Hgb) > 8 g/dL.

+ Plaquetas (plt) > 75 x 10º/L sem transfusão por > 7 dias (> 50 x 10º/L para sujeitos com > 50% de células plasmáticas na medula óssea).

e Cálcio sérico corrigido < 13,5 mg/dL (< 3,4 mmol/L).

e Depuração da creatinina de 24 horas (CrCl) > 45 mL/min.

e AST/SGOT e ALT/SGPT < 3,0 x limite superior do normal (ULN).

+ Bilirrubina sérica < 1,5 x LSN.

e Ácido úrico < 7,5 mg/dL (446 umol/L).

e PT/INR < 1,5 x ULN e tempo parcial de tromboplastina (PTT) <1,5 x LSN (para sujeitos que não recebem anticoagulação terapêutica).

Observação:Os sujeitos que recebem terapia para um evento tromboembólico que ocorreu > 3 meses antes da inscrição são elegíveis desde que estejam em um regime estável de anticoagulação com varfarina, heparina de baixo peso molecular ou outro regime de anticoagulação terapêutica aprovado.

8. As mulheres com potencial para engravidar (FCBP) devem: a. Ter dois testes de gravidez negativos, conforme verificado pelo investigador antes de iniciar a terapia do estudo. Ela deve concordar com o teste de gravidez em andamento durante o curso do estudo e após a descontinuação do Composto 2. Isso se aplica mesmo que o sujeito pratique verdadeira abstinência * do contato heterossexual.

b. Comprometer-se à verdadeira abstinência* de contato heterossexual (que deve ser revisado mensalmente e documentado na fonte) ou concordar em usar e poder cumprir duas formas confiáveis de contracepção sem interrupção, 28 dias antes do início do Composto 2, durante a terapia do estudo (incluindo durante interrupções de dose) e por 28 dias após a descontinuação do tratamento em estudo.

Observação: Uma mulher com potencial para engravidar (FCBP) é uma mulher que:1) alcançou a menarca em algum momento e 2) não foi submetido à histerectomia ou ooforectomia bilateral, ou 3) não foi naturalmente pós- menopáusica (a amenorreia após a terapia contra o câncer não exclui o potencial de engravidar) por pelo menos 24 meses consecutivos (isto é, teve menstruação a qualquer momento nos 24 meses consecutivos anteriores).

9. Os sujeitos do sexo masculino devem: a. Praticar a abstinência verdadeira* (que deve ser revisada mensalmente) ou aceitar o uso de preservativo durante o contato sexual com uma mulher grávida ou com potencial para engravidar enquanto estiver participando do estudo (mesmo durante interrupções de dose) e por pelo menos três meses após a descontinuação do Composto 2, mesmo que ele tenha sido submetido a uma vasectomia bem-sucedida.

*A verdadeira abstinência é aceitável quando está alinhada com o estilo de vida preferido e usual do sujeito. A abstinência periódica (por exemplo, calendário, ovulação, métodos sintotérmicos, pós-ovulação) e coito interrompido (retirada) não são métodos aceitáveis de contracepção.

10. Os machos devem concordar em abster-se de doar espermatozoides enquanto estiverem no Composto 2 e por 90 dias após sua descontinuação.

11. Todos os sujeitos devem concordar em não doar sangue enquanto estiverem no Composto 2 e por 28 dias após a descontinuação.

[00394] Critérios de exclusão: A presença de qualquer um dos seguintes exclui o sujeito da inscrição:

1.0 sujeito tem uma condição médica significativa, anormalidade laboratorial ou doença psiquiátrica que impeça o participante de participar do estudo.

2.0 sujeito tem qualquer condição, incluindo a presença de anormalidades laboratoriais, o que coloca o sujeito em risco inaceitável se participar do estudo.

3.O sujeito tem qualquer condição que confunda a capacidade de interpretar dados do estudo.

4. O sujeito tem mieloma múltiplo oligossecretório ou não.

5.0 sujeito tem leucemia de células plasmáticas ou mielomatose leptomeníngea ativa.

6.O sujeito documentou amiloidose sistêmica de cadeia leve ou polineuropatia, organomegalia, endocrinopatia, gamopatia monoclonal e síndrome de alterações cutâneas (POEMS).

7. O sujeito tem mieloma de classe M (IgM) de imunoglobulina.

8. O sujeito tem um histórico de transplante alogênico de medula óssea.

9. O sujeito está em diálise.

10. Sujeitos com neuropatia periférica > Grau 2.

11. Sujeitos com doença gastrointestinal que podem alterar significativamente a absorção do Composto 2.

12.O sujeito tem função cardíaca prejudicada ou doenças cardíacas clinicamente significativas, incluindo qualquer uma das seguintes situações: e LVEF < 45% conforme determinado pelo scan ECHO ou MUGA no Rastreio.

* Ramificação completa do feixe esquerdo, bloqueio bifascicular ou outro achado eletrocardiográfico anormal clinicamente significativo (ECG) no Rastreio.

* Um prolongamento do intervalo QT no ECG de rastreio, conforme definido pela demonstração repetida de um intervalo QTc > 480 milissegundos (ms) usando a fórmula de correção do QT de Fredericia; um histórico ou fatores de risco atuais para Torsades de Pointe (por exemplo, insuficiência cardíaca,

hipocalemia ou histórico familiar de síndrome do QT Longo); e administração simultânea de medicamentos que prolongam o intervalo QT/QTc.

e Insuficiência cardíaca congestiva (Classe Ill ou IV da New York Heart Association).

e Infarto do miocárdio < 6 meses antes do início do Composto 2.

e Angina de peito instável ou mal controlada, incluindo a variante Prinzmetal de angina de peito.

13. Administração simultânea de moduladores fortes do CYP3A.

14. O sujeito teve tratamento prévio com mieloma sistêmico (aprovado ou em investigação) < 5 semi-vidas ou 4 semanas antes do início do Composto 2, o que for menor.

15. O sujeito teve cirurgia de grande porte < 2 semanas antes do início do Composto 2. Observação: Os sujeitos devem ter se recuperado de quaisquer efeitos clinicamente significativos da cirurgia recente.

16. O sujeito é uma mulher grávida ou amamentando ou pretende engravidar durante a participação no estudo.

17. O sujeito tem infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV).

18. O sujeito tem infecção ativa pelo vírus da hepatite B ou C crônica (HBV/HCV).

19. O sujeito tem um histórico de segundo câncer simultâneo que requer tratamento sistêmico contínuo.

20. O sujeito tem um histórico de malignidade anterior diferente de MM, a menos que o sujeito esteja livre de doença por >3 anos, exceto pelas seguintes neoplasias não invasivas tratadas com intenção curativa: e Carcinoma basocelular ou escamoso da pele.

e Carcinoma in situ do colo do útero ou mama.

e Câncer de bexiga Estágio 1 e Descobertas histológicas incidentais de câncer de próstata localizado, como estágio de tumor la ou 1b (Tla ou T1b), usando a classificação Tumor/Nó/Metástase (TNM) de tumores malignos OU câncer de próstata que foi tratado com intenção curativa.

21. O sujeito tem um histórico de anafilaxia com talidomida, lenalidomida, pomalidomida ou dexametasona.

22. O sujeito tem hipersensibilidade conhecida ou suspeita aos excipientes contidos na formulação do Composto 2 ou dexametasona.

23. O sujeito sofreu um dos seguintes procedimentos dentro de 14 dias após o início do Composto 2: e Plasmaférese.

e Radioterapia diferente da terapia local para alívio sintomático das lesões Ósseas associadas ao MM.

24. O sujeito recebeu medicação imunossupressora dentro de 14 dias antes da primeira dose do Composto 2. A seguir, há exceções a este critério: e Injeções intranasais, inaladas, tópicas ou locais de corticosteroides (por exemplo, injeção intra-articular).

e Corticosteroides sistêmicos em doses que não excedam 10 mg/dia de prednisona ou equivalente.

e Esteroides como pré-medicação para reações de hipersensibilidade (por exemplo, pré-medicação por tomografia computadorizada (TC)).

25. O sujeito é incapaz ou não quer se submeter à profilaxia necessária para o protocolo de tromboembolismo venoso (VTE).

[00395] Duração do estudo: A duração média da participação no estudo por sujeito é de aproximadamente 6 meses. A inscrição completa deve levar aproximadamente 21 meses para ser concluída (18 meses para a Parte 1 e 3 meses para a Parte 2). Espera-se que a conclusão do tratamento ativo e do acompanhamento pós-tratamento leve de 6 a 12 meses adicionais. Espera-se que todo o estudo continue por aproximadamente 33 meses.

[00396] O Fim do Ensaio é definido como a data da última visita do último sujeito para completar o acompanhamento pós-tratamento ou a data de recebimento do último ponto de dados do último sujeito que é necessário para as análises primária, secundária e/ou exploratória, como pré-especificado no protocolo, aquele que for mais recente.

[00397] Tratamentos de estudo: O Composto 2 é administrado por via oral uma vez ao dia para sujeitos inscritos no cronograma 20/28 ou duas vezes ao dia para sujeitos inscritos no cronograma 6/28. Para sujeitos inscritos no esquema de dosagem 20/28, o Composto 2 é administrado de manhã com pelo menos 240 mL de água após um jejum noturno de duração de pelo menos 6 h. Os sujeitos devem abster-se de ingestão de alimentos ou outros medicamentos por pelo menos 2 h após cada dose da manhã. Os sujeitos inscritos no esquema 28/6 seguem as instruções acima mencionadas, conforme descrito no esquema 20/28 para a primeira dose de cada dia da dose. A segunda dose é administrada 12 + 2 h após a dose da manhã, pelo menos 4 h após e 2 h antes da ingestão de alimentos. A título de exemplo, os sujeitos inscritos no esquema de dosagem de 6/28 poderiam receber a dose inicial de Composto 2 às 7:00 da manhã, seguido de café da manhã às 9:00 da manhã, almoço ao meio-dia e a segunda dose do Composto 2 o mais cedo possível às 17:00 com a refeição da noite tomada 2 h depois (ou seja, antes das 19:00). Observe que somente no Ciclo 1, o Composto 2 é administrado nos Dias 1 a 3 (manhã e tarde), Dia 14 (somente à noite), Dias 15 e 16 (manhã e tarde) e Dia 17 (somente na manhã).

[00398] Para ambos os esquemas de dosagem, a dexametasona é administrada com o Composto 2 no estado de jejum ou pelo menos 2 h após o Composto 2 com alimentos (exceto nos dias de avaliação da farmacocinética,

quando ambos devem ser administrados ao mesmo tempo). Dexametasona administrada nos Dias 1, 8 (Dia 10 apenas no Ciclo 1), 15 e 22 ou Dias 1, 3, 15 (Dia 14 apenas no Ciclo 1) e 17 de cada ciclo nos esquemas de dosagem 20/28 ou 6/28 respectivamente, podem ser administrados no estado de jejum simultaneamente com o Composto 2. Alternativamente (em sujeitos com histórico de irritação gástrica induzida por dexametasona), ele pode ser administrado com alimentos pelo menos 2 h após o Composto 2, exceto nos dias de avaliação da farmacocinética, quando ambos devem ser administrados simultaneamente a todos os sujeitos. Para todos os sujeitos, cada dose de dexametasona é de 40 mg para sujeitos <75 anos de idade e 20 mg para aqueles > 75 anos de idade.

[00399] Visão geral das principais avaliações de eficácia: A variável de eficácia primária é a melhor taxa de resposta global (ORR) definida como a porcentagem de indivíduos cuja melhor resposta é > PR, conforme determinado pelos Critérios de Resposta Uniforme do IMWG (Rajkumar et al Blood 2011; 117 (18): 4691-5). Os sujeitos passam por avaliações de resposta mensalmente. A resposta do mieloma é determinada pelo investigador do local do estudo com base em investigações laboratoriais (eletroforese de proteínas séricas (sPEP), eletroforese de proteínas na urina (uPEP), eletroforese de imunofixação (IFE), níveis séricos de cadeia leve livre (sFLC), imunoglobulina quantitativa A (IgA), medula óssea para quantificação de células plasmáticas, conforme apropriado) avaliada em um laboratório central de referência e/ou localmente (por exemplo, cálcio sérico corrigido, tomografia por emissão de pósitrons/varredura — computadorizada (PET/CT) ou imageamento de ressonância magnética (MRI) para avaliação de plasmacitoma e/ou CT ou pesquisa esquelética para avaliação de lesões ósseas). Variáveis de eficácia adicionais incluem tempo de resposta (tempo desde a 1º dose do Composto 2 até a primeira documentação de resposta > PR), duração da resposta (tempo desde a primeira documentação de resposta (> PR) até a primeira documentação de PD ou morte) e sobrevida livre de progressão (tempo desde a 1º dose do Composto 2 até a primeira ocorrência de progressão da doença ou morte por qualquer causa).

[00400] Todos os sujeitos de segurança com uma linha de base válida e pelo menos uma avaliação de resposta pós-linha de base é incluída nas análises de eficácia. Se o tratamento for interrompido por outros motivos que não a progressão da doença, os sujeitos devem continuar as avaliações de resposta de acordo com o cronograma de avaliação especificado até a progressão, retirada do consentimento, morte ou início da nova terapia anti-mieloma sistêmica, o que ocorrer primeiro.

[00401] Visão geral das principais avaliações de segurança: As variáveis de segurança para este estudo incluem eventos adversos emergentes do tratamento (TEAEs) e alterações desde a linha de base nas descobertas físicas/sinais vitais, analitos laboratoriais selecionados e eletrocardiogramas de 12 derivações (ECGs). Métricas de segurança adicionais incluem a extensão da exposição ao tratamento do estudo (Composto 2 e dexametasona), avaliações do uso concomitante de medicamentos e testes de gravidez para mulheres com potencial para engravidar (FCBP).

[00402] Visão geral das avaliações farmacocinéticas: Os perfis de PK (dose inicial e estado estacionário) são avaliados para o Composto 2, seu enantiômero R (Composto 3) e dexametasona. As análises de resposta à exposição podem ser realizadas, conforme apropriado, para auxiliar na identificação do RP2D do Composto 2.

[00403] As modalidades descritas acima são destinadas a serem meramente exemplificadoras, e aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar usando não mais do que a experimentação de rotina, inúmeros equivalentes de compostos específicos, materiais e procedimentos.

Todos esses equivalentes são considerados dentro do escopo da invenção e são abrangidos pelas reivindicações anexas.

Claims (42)

REIVINDICAÇÕES

1. Um composto, em que o composto é o Composto 1 de fórmula o

CO

OA NU o o

AX 1 ou um enantiômero, mistura de enantiômeros, tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

2. Um composto em que o composto é o Composto 2 de fórmula o

DAS NU o o AX. 2 ou um tautômero, isotopólogo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

3. O composto da reivindicação 1, em que o composto é um tautômero do Composto 1.

4. O composto da reivindicação 1, em que o composto é um enantiômero do Composto 1.

5. O composto da reivindicação 1, em que o composto é uma mistura de enantiômeros do Composto 1.

6.O composto da reivindicação 1, em que o composto é um sal farmaceuticamente aceitável do Composto 1.

7. O composto da reivindicação 2, em que o composto é um tautômero de um Composto 2.

8.0 composto da reivindicação 2, em que o composto é um sal farmaceuticamente aceitável do Composto 2.

9. Composição farmacêutica compreendendo o composto da reivindicação

1.

10. Composição — farmacêutica — compreendendo o composto da reivindicação 2.

11. Método de tratamento de mieloma múltiplo compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto da reivindicação 1 a um paciente em necessidade do mesmo.

12.0 método da reivindicação 11, em que o mieloma múltiplo é recidivado, refratário ou resistente.

13. O método da reivindicação 12, em que o mieloma múltiplo é refratário ou resistente à lenalidomida.

14. O método da reivindicação 12, em que o mieloma múltiplo é refratário ou resistente à pomalidomida.

15. O método da reivindicação 11, em que o mieloma múltiplo é mieloma múltiplo recém-diagnosticado.

16. O método de qualquer uma das reivindicações 11-15, compreendendo adicionalmente administrar um segundo agente ativo.

17. O método da reivindicação 16, em que o segundo agente ativo é a dexametasona.

18. O método da reivindicação 16, em que o segundo agente ativo é bortezomibe.

19. Um método de tratamento de mieloma múltiplo, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto da reivindicação 2 a um paciente em necessidade do mesmo.

20.O método da reivindicação 19, em que o mieloma múltiplo é recidivado, refratário ou resistente.

21. O método da reivindicação 20, em que o mieloma múltiplo é refratário ou resistente à lenalidomida.

22. O método da reivindicação 20, em que o mieloma múltiplo é refratário ou resistente à pomalidomida.

23. O método da reivindicação 19, em que o mieloma múltiplo é mieloma múltiplo recém-diagnosticado.

24. O método de qualquer uma das reivindicações 19-23, compreendendo adicionalmente administrar um segundo agente ativo.

25. O método da reivindicação 24, em que o segundo agente ativo é a dexametasona.

26. O método da reivindicação 24, em que o segundo agente ativo é bortezomibe.

27.0 composto da reivindicação 1 para uso em um método de tratamento de mieloma múltiplo, em que o método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do referido composto a um paciente em necessidade do mesmo.

28. O composto para uso da reivindicação 27, em que o mieloma múltiplo é recidivado, refratário ou resistente.

29. O composto para uso da reivindicação 28, em que o mieloma múltiplo é refratário ou resistente à lenalidomida.

30. O composto para uso da reivindicação 28, em que o mieloma múltiplo é refratário ou resistente à pomalidomida.

31. O composto para uso da reivindicação 27, em que o mieloma múltiplo é mieloma múltiplo recém-diagnosticado.

32. O composto para uso de quaisquer uma das reivindicações 27-31, em que o método compreende adicionalmente administrar um segundo agente ativo.

33. O composto para uso da reivindicação 32, em que o segundo agente ativo é a dexametasona.

34. O composto para uso da reivindicação 32, em que o segundo agente ativo é bortezomibe.

35.0 composto da reivindicação 2 para uso em um método de tratamento de mieloma múltiplo, em que o método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do referido composto a um paciente em necessidade do mesmo.

36. O composto para uso da reivindicação 35, em que o mieloma múltiplo é recidivado, refratário ou resistente.

37. O composto para uso da reivindicação 36, em que o mieloma múltiplo é refratário ou resistente à lenalidomida.

38. O composto para uso da reivindicação 36, em que o mieloma múltiplo é refratário ou resistente à pomalidomida.

39. O composto para uso da reivindicação 35, em que o mieloma múltiplo é mieloma múltiplo recém-diagnosticado.

40. O composto para uso de quaisquer uma das reivindicações 35-39, em que o método compreende adicionalmente administrar um segundo agente ativo.

41. O composto para uso da reivindicação 40, em que o segundo agente ativo é a dexametasona.

42. O composto para uso da reivindicação 40, em que o segundo agente ativo é bortezomibe.