JP2023073245A5 - - Google Patents

Claims (23)

1. （ａ）Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
   （ｂ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ＲＮＡであって、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ＲＮＡは、真核細胞の核内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する標的配列にハイブリダイズすることができるガイド配列、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズすることができるｔｒａｃｒメイト配列、およびｔｒａｃｒ配列を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ＲＮＡ；
   を含む、真核細胞を改変するためのエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であって、
   Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質のカルボキシル末端に連結された少なくとも１つのＮＬＳおよびＣａｓ９タンパク質のアミノ末端に連結された少なくとも１つのＮＬＳを含む、少なくとも２つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）に連結され、
   ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質とＣＲＩＳＰＲ複合体を形成し、Ｃａｓ９タンパク質を真核細胞内の標的配列に指向することができる、
   ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
2. 各ＮＬＳが、独立して、ＰＫＫＫＲＫＶ、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ、ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ、ＶＳＲＫＲＰＲＰ、ＰＰＫＫＡＲＥＤ、ＰＯＰＫＫＫＰＬ、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ、ＤＲＬＲＲ、ＰＫＱＫＫＲＫ、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ、およびＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫからなる群より選択される、請求項１に記載の系。
3. Ｃａｓ９タンパク質がＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９であり、ＰＡＭがＮＧＧを含む、請求項１または２に記載の系。
4. Ｃａｓ９タンパク質がＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９であり、ＰＡＭがＮＮＡＧＡＡＷを含む、請求項１または２に記載の系。
5. Ｃａｓ９タンパク質がＳ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９であり、ＰＡＭがＮＮＧＲＲを含む、請求項１または２に記載の系。
6. ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ＲＮＡが、ガイド配列およびｔｒａｃｒメイト配列を含むｃｒＲＮＡと、ｔｒａｃｒ配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡとを含む、請求項１～５のいずれかに記載の系。
7. ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ＲＮＡが、ガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列およびｔｒａｃｒ配列を５’から３’に含むキメラＲＮＡである、請求項１～５のいずれかに記載の系。
8. ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ＲＮＡが１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～７のいずれかに記載の系。
9. Ｃａｓ９タンパク質が、触媒ドメインに少なくとも１つの変異を含み、１本のＤＮＡ鎖を切断する能力を欠くニッカーゼである、請求項１～８のいずれかに記載の系。
10. Ｃａｓ９タンパク質が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のＤ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８６３Ａに対応する少なくとも１つの変異を含む、請求項９に記載の系。
11. Ｃａｓ９タンパク質が、２つ以上の触媒ドメインに少なくとも１つの変異を含み、すべてのＤＮＡ切断活性を実質的に欠く、請求項１～８のいずれかに記載の系。
12. Ｃａｓ９タンパク質が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のＤ１０Ａに対応する変異を含み、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のＨ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８６３Ａに対応する少なくとも１つの変異をさらに含む、請求項１１に記載の系。
13. Ｃａｓ９タンパク質が少なくとも１つの異種タンパク質ドメインに連結されている、請求項１～１２のいずれかに記載の系。
14. 異種タンパク質ドメインが、エピトープタグ、レポータードメイン、または以下の活性：メチラーゼ活性、脱メチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性および核酸結合活性のうちの１つ以上を有するタンパク質ドメインを含む、請求項１３に記載の系。
15. 系がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質を含む、請求項１～１４のいずれかに記載の系。
16. Ｃａｓ９タンパク質がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ＲＮＡと複合体化されている、請求項１５に記載の系。
17. 系が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ＲＮＡと、真核細胞での発現にコドン最適化されているＣａｓ９タンパク質をコードするｍＲＮＡとを含む、請求項１～１４のいずれかに記載の系。
18. （ａ）および（ｂ）が、真核細胞への送達のためのリポソーム、ビロソーム、イムノリポソーム、人工ビリオン、ウイルスベクター、またはウイルス粒子中に含まれている、請求項１～１７のいずれかに記載の系。
19. 系が、複数の異なる標的配列を標的とする複数のガイド配列を含む、請求項１～１８のいずれかに記載の系。
20. 系が、標的配列の少なくとも５ヌクレオチドとオーバーラップする鋳型ポリヌクレオチドを含む、請求項１～１９のいずれかに記載の系。
21. 真核細胞が哺乳動物細胞またはヒト細胞である、請求項１～２０のいずれかに記載の系。
22. ゲノムエンジニアリングのための、請求項１～２１のいずれか１項に記載の系の使用であって、ただし前記使用がヒトの生殖細胞系列の遺伝的同一性を改変するためのプロセスを含まず、かつ前記使用がヒトまたは動物の身体の処置のための方法ではない、使用。
23. 非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物の製造における、請求項１～２１のいずれか１項に記載の系の使用。