ES2536437T3 - Métodos basados en microARN para el diagnóstico de cáncer de estómago - Google Patents

Métodos basados en microARN para el diagnóstico de cáncer de estómago Download PDF

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Abstract

Un método para diagnosticar si un sujeto tiene cáncer de estómago, que comprende: medir en una muestra de ensayo del sujeto los niveles de un grupo de productos génicos miR que consiste en, miR-223, miR-21, miR-103-2, miR-136, miR-125b-2, miR-103-1, miR-222, miR-212 prec, miR-125b-1, miR-100, miR-92-1, miR-96, miR-192, miR-23a, miR-215, miR-7-2, miR-138-2, miR-99b, miR-33b, miR-218-2, miR-92-2, miR-25, miR-191, miR-221, miR-214, miR-107, miR-24-1 y miR-24-2 en donde una alteración en los niveles del grupo de productos génicos miR en la muestra de tejido de estómago en relación con los niveles de los productos génicos miR correspondientes en una muestra de control, es indicativa de que el sujeto tiene cáncer de estómago.

Description

Métodos basados en microARN para el diagnóstico de cáncer de estómago
5 Apoyo del gobierno
La presente invención fue apoyada, en su totalidad o en parte, por las Subvenciones del Proyecto de Programa Nº P01CA76259, P01CA81534 y P30CA56036 del Instituto de Cáncer Nacional. El Gobierno tiene ciertos derechos en la presente invención.
Antecedentes de la Invención
El cáncer, el crecimiento incontrolado de células malignas, es un problema de salud importante de la era médica moderna y es una de las principales causas de muerte en los países desarrollados. En los Estados Unidos, una de
15 cada cuatro muertes está provocada por cáncer (Jemal, A. et al., CA Cancer J. Clin. 52: 23-47 (2002)). Entre los cánceres, los que surgen de órganos y tejidos sólidos, conocidos como cánceres sólidos, (por ejemplo, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de estómago, cáncer de próstata, cáncer pancreático) están entre los cánceres humanos más habitualmente identificados.
Por ejemplo, el cáncer de próstata es el tumor maligno no cutáneo diagnosticado más frecuentemente entre hombres en países industrializados y, en los Estados Unidos, 1 de cada 8 hombres desarrollarán cáncer de próstata durante su vida (Simard, J. et al., Endocrinoloy 143(6): 2029-40 (2002)). La incidencia del cáncer de próstata ha aumentado drásticamente durante las últimas décadas y el cáncer de próstata es ahora una causa principal de muerte en los Estados Unidos y en Europa Occidental (Peschel, R. E. y J. W. Colberg, Lancet 4: 233-41 (2003);
25 Nelson, W. G. et al., N. Engl. J. Med 349(4): 3GG-81 (2003)). Los hombres con cáncer de próstata están afectados por una reducción media de 40 % en la esperanza de vida. Si se detecta de forma temprana, antes de la metástasis y propagación local más allá de la cápsula, el cáncer de próstata puede con frecuencia curarse (por ejemplo, usando cirugía). Sin embargo, si se diagnostica después de su propagación y metástasis de la próstata, el cáncer de próstata es normalmente una enfermedad letal con tasas de curación bajas. Aunque la exploración basada en antígeno específico de próstata (PSA) ha ayudado al diagnóstico temprano del cáncer de próstata, no es ni altamente sensible ni específico (Punglia et al., N. Engl. J. Med 349(4): 335-42 (2003)). Esto significa que se asocia con el ensayo un alto porcentaje de diagnósticos de falso negativo y falso positivo. Las consecuencias son tanto muchos casos de cánceres pasados por alto como biopsias de seguimiento innecesarias para las personas sin cáncer.
35 El cáncer de mama sigue siendo la segunda causa principal de muertes relacionadas con cáncer en mujeres, afectando a más de 180.000 mujeres en los Estados Unidos cada año. Para las mujeres en Norteamérica, las probabilidades en tiempo de vida de tener cáncer de mama son ahora de una de cada ocho. Aunque el descubrimiento de BRCA1 y BRCA2 fueron etapas importantes en la identificación de factores genéticos clave implicados en cáncer de mama, se ha hecho evidente que las mutaciones en BRCA1 y BRCA2 representan solamente una fracción de la susceptibilidad heredada a cáncer de mama (Nathanson, K. L., et al., Human Mol. Gen. 10(7): 715-720 (2001); Anglican Breast Cancer Study Group. Br. J. Cancer 83(10): 1301-08 (2000); y Syrjakoski, K., et al., J. Natl. Cancer Inst. 92: 1529-31 (2000)). A pesar de investigación considerable sobre terapias para cáncer de mama, el cáncer de mama sigue siendo difícil de diagnosticar y tratar eficazmente, y la alta mortalidad observada en
45 pacientes con cáncer de mama indica que se necesitan mejoras en el diagnóstico, tratamiento y prevención de la enfermedad.
Excluyendo cáncer de piel, el cáncer colorrectal, es el tercer cáncer diagnosticado con más frecuencia en los Estados Unidos y Canadá (después de pulmón y mama en mujeres, y pulmón y próstata en hombres). La Sociedad Americana del Cáncer estima que habrá aproximadamente 145.000 casos nuevos de cáncer colorrectal diagnosticados en los Estados Unidos en 2005 (Cancer Facts and Figures 2005. Atlanta, GA: American Cancer Society, 2005. Disponibles en wvw.cancer.org/docroot/STT/stt_0.asp, accedida el 19 de diciembre de 2005). El cáncer colorrectal es la segunda causa principal de muerte por cáncer entre hombres y mujeres en los Estados Unidos y Canadá (después del cáncer de pulmón).
55 La incidencia anual del cáncer pancreático es casi equivalente a la mortalidad anual, que se estima que es de
31.860 y 31.270, respectivamente, en los Estados Unidos en 2004 (Cancer Facts and Figures 2004. Atlanta, GA: American Cancer Society, 2004. Disponible en www.cancer.org/docroot/STT/stt_0_2004.asp, accedida el 21 de agosto de 2005). Los pacientes con cáncer pancreático localmente avanzado y metastásico tienen diagnósticos negativos, y el diagnóstico generalmente se realiza demasiado tarde para que la cirugía o la radioterapia sea curativa (Burr, H. A., et al., The Oncologist 10(3): 183-190, (2005)). La quimioterapia puede proporcionar alivio de los síntomas para algunos pacientes con cáncer pancreático avanzado, pero su impacto en la supervivencia ha sido moderado hasta la fecha.
65 En los Estados Unidos, se diagnostica a más de 20.000 individuos cáncer de estómago (gástrico) cada año. La Sociedad Americana del Cáncer estima que habrá 22.710 casos nuevos de cáncer colorrectal diagnosticados en los
Estados Unidos en 2004 (Cancer Facts and Figures 2004. Atlanta, GA: American Cancer Society, 2004. Disponible en wwv.cancer.org/ doc-root/ STT/stt_0_2004.asp, accedida el 21 de agosto de 2005). Debido a que el cáncer de estómago puede aparecer sin síntomas, puede estar en estadios avanzados en el momento en que se realice el diagnóstico. Por tanto el tratamiento se dirige a hacer que el paciente se sienta más cómodo y a mejorar su calidad
5 de vida.
El cáncer de pulmón provoca más muertes en todo el mundo que cualquier otra forma de cáncer (Goodman, G. E., Thorax 57: 994-999 (2002)). En los Estados Unidos, el cáncer de pulmón es la causa principal de muerte por cáncer tanto en hombres como en mujeres. En 2002, la tasa de muerte de cáncer de pulmón fue una estimación de 134.900 muertes, que excede el total combinado de cáncer de mama, próstata y colon. Misma referencia. El cáncer de pulmón también es la causa principal de muerte por cáncer en todos los países Europeos, y los números de muertes relacionadas con cáncer de pulmón están aumentando rápidamente también en los países en desarrollo.
La tasa de supervivencia a cinco años entre todos los pacientes de cáncer de pulmón, independientemente del
15 estadio de la enfermedad en el momento de diagnóstico, es solo de aproximadamente 13 %. Esto se diferencia de una tasa de supervivencia a los cinco años de 46 % entre casos detectados cuando la enfermedad aún está localizada. Sin embargo, solamente 16 % de los cánceres de pulmón se descubren antes de que la enfermedad se haya propagado. La detección temprana es difícil ya que los síntomas clínicos con frecuencia no se observan hasta que la enfermedad ha alcanzado un estadio avanzado. A pesar de la investigación sobre terapias para este y otros cánceres, el cáncer de pulmón sigue siendo difícil de diagnosticar y tratar eficazmente.
Claramente, la identificación de marcadores y genes que son responsables de la susceptibilidad a formas particulares de cáncer sólido (por ejemplo, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer pancreático) es uno de los principales retos a los que se enfrenta la oncología en
25 la actualidad. Existe la necesidad de identificar medios para la detección temprana de individuos que tengan una susceptibilidad genética al cáncer de modo que puedan instituirse regímenes de exploración e intervención más agresivos para la detección y tratamiento temprano del cáncer. Los genes de cáncer también pueden revelar rutas moleculares clave que pueden manipularse (por ejemplo, usando fármacos de peso molecular grande o pequeño) y pueden conducir a tratamientos más eficaces independientemente del estadio de cáncer cuando se diagnostique por primera vez un cáncer particular.
Los microARN son una clase de ARN no codificantes, pequeños que controlan la expresión génica hibridando con y desencadenando la represión de la traducción o, menos frecuentemente, la degradación de una diana de ARN mensajero (ARNm). El descubrimiento y estudio de los miARN ha revelado mecanismos reguladores de genes 35 mediados por miARN que desempeñan papeles importantes en el desarrollo de los organismos y diversos procesos celulares, tales como diferenciación celular, crecimiento celular y muerte celular (Cheng, A. M., et al., Nucleic Acids Res. 33: 1290-1297 (2005)). Estudios recientes sugieren que la expresión aberrante de los miARN particulares puede estar implicada en enfermedades humanas, tales como trastornos neurológicos (Ishizuka, A., et al., Genes Dev. 16: 2497-2508 (2002)) y cáncer. En particular, se ha descubierto expresión errónea de miR-16-1 y/o miR-15a en leucemias linfocíticas crónicas humanas (Calin, G. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 15524-15529 (2002)). Lu J. et al. (Nature 435 7043: 834-838 (2005)) describen el uso de un método de perfil de expresión de miARN citométrico que presenta un análisis de expresión sistemático de 217 miARN de mamíferos de 334 muestras, incluyendo cánceres humanos múltiples. Lu J. et al. descubrieron que los perfiles de miARN reflejaban el estado de diferenciación y linaje evolutivo de los tumores y observaron una regulación negativa general de los miARN en
45 tumores en comparación con tejidos normales. Además, Lu J. et al. pudieron clasificar satisfactoriamente tumores mal diferenciados usando perfiles de expresión de miARN.
El documento WO 2005/118806 desvela métodos y composiciones para aislar, enriquecer y/o marcar moléculas de miARN y para preparar y usar series u otras técnicas de detección de análisis de miARN. Además, el documento WO 2005/118806 se refiere a métodos y composiciones para generar perfiles de miARN y emplear dichos perfiles para aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y pronóstico.
El documento WO 2005/078139 analiza la asociación entre genes de miARN y elementos cromosómicos implicados en la etiología de diferentes cánceres y sugiere que el cáncer puede tratarse restaurando el nivel de expresión del
55 gen de miR al normal.
Petrocca F et al. (Proceedings of the American Association for Cancer Research 47 1338 (2006)) desvelan los resultados de un estudio que investigaba 245 miARN en 20 casos de mucosa de cáncer gástrico y mucosa gástrica normal correspondiente. Petrocca F et al. Identificaron 7 miARN expresados diferencialmente, 5 de los cuales se sobreexpresaban en muestras de cáncer gástrico (miR-223, miR-25, miR-107, miR-24-2 y miR-181b) y 2 se infraexpresaban en muestras de cáncer gástrico (miR-218-2 y miR-130b).
Claramente, existe una gran necesidad en la técnica de métodos mejorados para detectar y tratar cánceres sólidos (por ejemplo, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer 65 pancreático). La presente invención proporciona nuevos métodos para el diagnóstico del cáncer pancreático. También se desvelan métodos para el diagnóstico y tratamiento del cáncer pancreático y composiciones para el
diagnóstico y tratamiento del cáncer pancreático.
Compendio de la invención
5 La presente invención se basa, en parte, en la identificación de miARN específicos que tienen niveles de expresión alterados en cánceres sólidos particulares.
En consecuencia, la invención abarca métodos para diagnosticar si un sujeto tiene cáncer de estómago. En consecuencia con los métodos de la invención, los niveles de un grupo de productos génicos de miR que consisten en miR-223, miR-21, miR-103-2, miR-136, miR-125b-2, miR-103-1, miR-222, miR-212 prec, miR-125b-1, miR-100, miR-92-1, miR-96, miR-192, miR-23a, miR-215, miR-7-2, miR-138-2, miR-99b, miR-33b, miR-218-2, miR-92-2, miR25, miR-191, miR-221, miR-214, miR-107, miR-24-1 y miR-24-2 en una muestra de ensayo del sujeto se comparan con los niveles de los productos génicos de miR correspondientes en una muestra de control. Una alteración (por ejemplo, un aumento, una reducción) en el nivel de los productos génicos de miR en la muestra de ensayo, en
15 relación con el nivel de los productos génicos de miR correspondientes en una muestra de control, es indicativa de que el sujeto tiene cáncer de estómago.
También se describen métodos en los que al menos un producto génico de miR medido en una muestra de ensayo se compara con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en una muestra de control.
El al menos un producto génico de miR medido en la muestra de ensayo puede seleccionarse del grupo que consiste en miR-21, miR-191, miR-17-5p y combinaciones de los mismos. De manera alternativa, el al menos un producto génico de miR medido en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-21, miR-175p, miR-191, miR-29b-2, miR-223, miR-128b, miR-199a-1, miR-24-1, miR-24-2, miR-146, miR-155, miR-181b-1,
25 miR-20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR-30c, miR-25, miR-221, miR-106a y combinaciones de los mismos.
También se describen métodos en los que el cáncer sólido es cáncer de mama o cáncer de pulmón y el al menos un producto génico de miR medido en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-210, miR-213 y una combinación de los mismos.
También se describen métodos en los que el cáncer sólido es cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de próstata o cáncer pancreático y el al menos un producto génico de miR medido en la muestra de ensayo es miR218-2.
35 También se describen métodos en los que el cáncer sólido es cáncer de mama y el al menos un producto génico de miR medido en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-125b-1, miR-125b-2, miR-145, miR-21 y combinaciones de los mismos. Como alternativa, el cáncer sólido es cáncer de mama y el al menos un producto génico de miR en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-21, miR-29b-2, miR146, miR-125b-2, miR-125b-1, miR-10b, miR-145, miR-181a, miR-140, miR-213, miR-29a prec, miR-181b-1, miR199b, miR-29b-1, miR-130a, miR-155, let-7a-2, miR-205, miR-29c, miR-224, miR-100, miR-31, miR-30c, miR-17-5p, miR-210, miR-122a, miR-16-2 y combinaciones de los mismos.
También se describen métodos en los que el cáncer sólido es cáncer de colon y el al menos un producto génico de
45 miR en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-24-1, miR-29b-2, miR-20a, miR-10a, miR-32, miR-203, miR-106a, miR-17-5p, miR-30c, miR-223, miR-126*, miR-128b, miR-21, miR-24-2, miR-99b prec, miR-155, miR-213, miR-150, miR-107, miR-191, miR-221, miR-9-3 y combinaciones de los mismos.
También se describen métodos en los que el cáncer sólido es cáncer de pulmón y el producto génico de miR en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-21, miR-205, miR-200b, miR-9-1, miR-210, miR148, miR-141, miR-132, miR-215, miR-128b, let-7g, miR-16-2, miR-129-1/2 prec, miR-126*, miR-142-as, miR-30d, miR-30a-5p, miR-7-2, miR-199a-1, miR-127, miR-34a prec, miR-34a, miR-136, miR-202, miR-196-2, miR-199a-2, let7a-2, miR-124a-1, miR-149, miR-17-5p, miR-196-1 prec, miR-10a, miR-99b prec, miR-196-1, miR-199b, miR-191, miR-195, miR-155 y combinaciones de los mismos.
55 También se describen métodos en los que el cáncer sólido es cáncer pancreático y el producto génico de miR en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-103-2, miR-103-1, miR-24-2, miR-107, miR-100, miR-125b-2, miR-125b-1, miR-24-1, miR-191, miR-23a, miR-26a-1, miR-125a, miR-130a, miR-26b, miR-145, miR221, miR-126*, miR-16-2, miR-146, miR-214, miR-99b, miR-128b, miR-155, miR-29b-2, miR-29a, miR-25, miR-16-1, miR-99a, miR-224, miR-30d, miR-92-2, miR-199a-1, miR-223, miR-29c, miR-30b, miR-129-1/2, miR-197, miR-17-5p, miR-30c, miR-7-1, miR-93-1, miR-140, miR-30a-5p, miR-132, miR-181b-1, miR-152 prec, miR-23b, miR-20a, miR222, miR-27a, miR-92-1, miR-21, miR-129-1/2 prec, miR-150, miR-32, miR-106a, miR-29b-1 y combinaciones de los mismos.
65 También se describen métodos en los que el cáncer sólido es cáncer de próstata y el producto génico de miR en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en let-7d, miR-128a prec, miR-195, miR-203, let-7a-2 prec,
miR-34a, miR-20a, miR-218-2, miR-29a, miR-25, miR-95, miR-197, miR-135-2, miR-187, miR-196-1, miR-148, miR191, miR-21, let-7i, miR-198, miR-199a-2, miR-30c, miR-17-5p, miR-92-2, miR-146, miR-181b-1 prec, miR-32, miR206, miR-184 prec, miR-29a prec, miR-29b-2, miR-149, miR-181b-1, miR-196-1 prec, miR-93-1, miR-223, miR-16-1, miR-101-1, miR-124a-1, miR-26a-1, miR-214, miR-27a, miR-24-1, miR-106a, miR-199a-1 y combinaciones de los
5 mismos.
También se describen métodos en los que el cáncer sólido es cáncer de estómago y el producto génico de miR en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-223, miR-21, miR-218-2, miR-103-2, miR-92-2, miR-25, miR-136, miR-191, miR-221, miR-125b-2, miR-103-1, miR-214, miR-222, miR-212 prec, miR-125b-1, miR100, miR-107, miR-92-1, miR-96, miR-192, miR-23a, miR-215, miR-7-2, miR-138-2, miR-24-1, miR-99b, miR-33b, miR-24-2 y combinaciones de los mismos.
El nivel del al menos un producto génico de miR puede medirse usando diversas técnicas que se conocen bien por los expertos en la materia (por ejemplo, RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa, análisis de transferencia de
15 Northern, detección de hibridación en solución). En una realización particular, el nivel del grupo de los productos génicos de miR se mide por transcripción inversa de ARN de una muestra de ensayo obtenida del sujeto para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana, hibridando los oligodesoxinucleótidos diana con una microserie que comprenda oligonucleótidos sonda específicos de miARN para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra de ensayo, y comparando el perfil de hibridación de la muestra de ensayo con un perfil de hibridación de una muestra de control. Una alteración en la señal del grupo de productos génicos de miARN en la muestra de ensayo en relación con la muestra de control es indicativa de que el sujeto tiene cáncer de próstata. Los oligonucleótidos diana pueden hibridarse con una microserie que comprenda oligonucleótidos sonda específicos de miARN para uno o más miARN seleccionados del grupo que consiste en miR-21, miR-17-5p, miR-191, miR-29b2, miR-223, miR-128b, miR-199a-1, miR-24-1, miR-24-2, miR-146, miR-155, miR-181b-1, miR-20a, miR-107, miR
25 32, miR-92-2, miR-214, miR-30c, miR-25, miR-221, miR-106a y combinaciones de los mismos.
Esta divulgación también abarca métodos para inhibir la tumorogénesis en un sujeto que tiene, o se sospecha que tiene, un cáncer sólido (por ejemplo, cáncer de próstata, cáncer de estómago, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de colon), en el que al menos un producto génico de miR está desregulado (por ejemplo, regulado negativamente, regulado positivamente) en las células de cáncer del sujeto. Cuando el al menos un producto génico de miR aislado está regulado negativamente en las células de cáncer, el método comprende administrar una cantidad eficaz de un producto génico de miR aislado, una variante aislada o un fragmento biológicamente activo del producto génico de miR o variante, de modo que se inhiba la proliferación de células cancerosas en el sujeto. El al menos un producto génico de miR aislado puede seleccionarse del grupo que consiste 35 en miR-145, miR-155, miR-218-2 y combinaciones de los mismos. El producto génico de miR puede no ser miR-15a
o miR-16-1. Cuando el al menos un producto génico de miR aislado está regulado positivamente en las células cancerosas, el método puede comprender administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos un compuesto para inhibir la expresión del al menos un producto génico de miR (denominado en la presente memoria un “compuesto de inhibición de la expresión de miR”), de modo que se inhibe la proliferación de células cancerosas en el sujeto. El al menos un compuesto de inhibición de la expresión de miR puede ser específico para un producto génico de miR seleccionado del grupo que consiste en miR-21, miR-17-5p, miR-191, miR-29b-2, miR-223, miR-128b, miR-199a-1, miR-24-1, miR-24-2, miR-146, miR-155, miR-181b-1, miR-20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR-30c, miR25, miR-221, miR-106a y combinaciones de los mismos.
45 Los métodos para inhibir la tumorogénesis en un sujeto pueden comprender adicionalmente la etapa de determinar la cantidad de al menos un producto génico de miR en células cancerosas del sujeto, y comparar ese nivel del producto génico de miR en las células con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en células de control. Si la expresión del producto génico de miR está desregulada (por ejemplo, regulada negativamente, regulada positivamente) en células cancerosas, los métodos comprenden además alterar la cantidad del al menos un producto génico de miR expresado en las células cancerosas. La cantidad del producto génico de miR expresado en las células cancerosas puede ser menor que la cantidad de producto génico de miR expresado en una célula de control (por ejemplo, células de control), y se administra al sujeto una cantidad eficaz del producto génico de miR regulado negativamente, variante aislada o fragmento biológicamente activo del producto génico de miR o variante. Los productos génicos de miR adecuados incluyen miR-145, miR-155, miR-218-2 y combinaciones de los mismos,
55 entre otros. El producto génico de miR puede no ser miR-15a o miR-16-1. La cantidad del producto génico de miR expresada en las células cancerosas puede ser mayor que la cantidad del producto génico de miR expresada en la célula de control (por ejemplo, células de control), y al sujeto se le puede administrar una cantidad eficaz de al menos un compuesto para inhibir la expresión del al menos un producto génico de miR regulado positivamente. Los compuestos adecuados para inhibir la expresión del al menos un producto génico de miR incluyen, pero sin limitación, compuestos que inhiben la expresión de miR-21, miR-17-5p, miR-191, miR-29b-2, miR-223, miR-128b, miR-199a-1, miR-24-1, miR-24-2, miR-146, miR-155, miR-181b-1, miR-20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR-30c, miR-25, miR-221, miR-106a y combinaciones de los mismos.
Esta divulgación proporciona además composiciones farmacéuticas para tratar cánceres sólidos (por ejemplo,
65 cáncer de próstata, cáncer de estómago, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de colon). Las composiciones farmacéuticas pueden comprender al menos un producto génico de miR aislado y un vehículo
farmacéuticamente aceptable. El al menos un producto génico de miR puede corresponder a un producto génico de miR que tenga un nivel de expresión reducido en células cancerosas en relación con las células de control. El producto génico de miR aislado puede seleccionarse del grupo que consiste en miR-145, miR-155, miR-218-2 y combinaciones de los mismos.
5 Las composiciones farmacéuticas pueden comprender al menos un compuesto de inhibición de la expresión de miR y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El al menos un compuesto de inhibición de la expresión de miR puede ser específico de un producto génico de miR cuya expresión sea mayor en células cancerosas que en células de control. El compuesto de inhibición de la expresión de miR puede ser específico para uno o más productos génicos de miR seleccionados del grupo que consiste en miR-21, miR-17-5p, miR-191, miR-29b-2, miR-223, miR-128b, miR199a-1, miR-24-1, miR-24-2, miR-146, miR-155, miR-181b-1, miR-20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR30c, miR-25, miR-221, miR-106a y combinaciones de los mismos. También se describen métodos para identificar un inhibidor de tumorogénesis, que comprenden proporcionar un agente de ensayo a una célula y medir el nivel de al menos un producto génico de miR en la célula. El método
15 puede comprender proporcionar un agente de ensayo a una célula y medir el nivel de al menos un producto génico de miR asociado con niveles de expresión reducidos en cánceres sólidos (por ejemplo, cáncer de próstata, cáncer de estómago, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de colon). Un aumento en el nivel del producto génico de miR en la célula, en relación con una célula de control adecuada, es indicativo de que el agente de ensayo es un inhibidor de tumorogénesis. El al menos un producto génico de miR asociado con niveles de expresión reducidos en células de cáncer sólido puede seleccionarse del grupo que consiste en miR-145, miR-155, miR-218-2 y combinaciones de los mismos.
El método puede comprender proporcionar un agente de ensayo a una célula y medir el nivel de al menos un producto génico de miR asociado con aumento de los niveles de expresión en cánceres sólidos. Una reducción en el
25 nivel del producto génico de miR en la célula, en relación con una célula de control adecuada, es indicativa de que el agente de ensayo es un inhibidor de tumorogénesis. El al menos un producto génico de miR asociado con niveles de expresión aumentados en células de cáncer sólido puede seleccionarse del grupo que consiste en miR-21, miR-175p, miR-191, miR-29b-2, miR-223, miR-128b, miR-199a-1, miR-24-1, miR-24-2, miR-146, miR-155, miR-181b-1, miR-20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR-30c, miR-25, miR-221, miR-106a y combinaciones de los mismos.
Breve descripción de los dibujos
El archivo de patente o solicitud contiene al menos un dibujo ejecutado en color. Se proporcionarán copias de esta
35 patente o publicación de solicitud de patente con dibujos a color por la Oficina tras su petición y pago de la tasa necesaria.
La FIGURA 1 representa un análisis de agrupamiento de 540 muestras, que representan 6 cánceres sólidos (parte superior) y los tejidos normales respectivos. Los miARN incluidos en el árbol (n=137) representan aquellos cuyo nivel de expresión (intensidad con fondo restado) fue mayor que el valor umbral (256) en al menos 50 % de las muestras analizadas. Las series se centraron en la mediana y se normalizaron usando Gene Cluster 2.0. Se realizó agrupamiento de enlace medio usando métrica de correlación no centrada. Los colores indican la diferencia en el nivel de expresión de la mediana para los microARN de cada muestra. La FIGURA 2 representa un análisis no supervisado de los datos de expresión de microARN. Los perfiles de
45 microARN de 540 muestras (indicadas en la parte superior del panel) que abarcaban mama, colon, pulmón, páncreas, próstata y estómago (tejidos normales y tumores) se filtraron, centraron y normalizaron para cada característica. Los datos se sometieron a agrupamiento jerárquico tanto en las muestras (orientadas horizontalmente) como en las características (orientadas verticalmente) con enlace medio y correlación de Pearson como una medida de similitud. Los nombres de las muestras se indican en la parte superior de la figura y los nombres de los miARN a la izquierda. El ID de la sonda se indica entre paréntesis, ya que el mismo microARN puede medirse por diferentes oligonucleótidos. Los colores indican la diferencia en los niveles de expresión de la mediana para los microARN en cada muestra. La FIGURA 3 representa la expresión de miARN regulados diferencialmente entre cánceres sólidos (parte superior). Se representan sesenta y un microARN, que están presentes en al menos 90 % de los cánceres
55 sólidos tisulares (derecha del panel). El árbol presenta los valores de expresión absolutos medios para cada uno de los microARN enumerados después de transformación log2. La media se calculó sobre todas las muestras del mismo histotipo tumoral o tejido. Los genes se centraron en la media y se normalizaron usando Gene Cluster 2.0. Se realizó agrupamiento de enlace medio usando la distancia Euclídea. La FIGURA 4 representa el factor de cambio en la expresión de miARN presentes en al menos 75 % de los tumores sólidos con al menos un valor absoluto de tumor mayor que 2 en diferentes muestras de cáncer (parte superior), en relación con muestras normales. El árbol presenta la transformación log2 del factor de cambio medio (cáncer frente a normal). La media se calculó sobre todas las muestras del mismo histotipo tumoral o tejido. Las matrices se centraron en la media y se normalizaron usando Gene Cluster 2.0. Se realizó agrupamiento de enlaces medio usando métrica de correlación no centrada.
65 La FIGURA 5 representa el factor de cambio en la expresión de miARN presentes en los distintivos de al menos 50 % de los tumores sólidos en muestras de cáncer frente a normales. El árbol representa la transformación log2
del factor de cambio medio (cáncer frente a normal). La media se calculó sobre todas las muestras del mismo histotipo tumoral o tejido. Las matrices se centraron en la media y se normalizaron usando Gene Cluster 2.0. Se realizó agrupamiento de enlace medio usando métrica de correlación no centrada. La FIGURA 6A representa gráficas de barra que indican que las UTR 3’ de diferentes genes que codifican
5 proteína de cáncer permiten la regulación del cáncer por microARN. La represión relativa de expresión de luciferasa de luciérnaga (Factor de Cambio) se normalizó a un control de luciferasa de renilla. PLAG1, gen de adenoma pleiomórfico 1; TGFBR2, receptor de factor de crecimiento transformante beta II; Rb, gen de retinoblastoma. Se usó pGL-3 (Promega) como el vector vacío. Se usaron oligoARN miR-20a, miR-26a-1 y miR106 (con sentido y mezclados) para transfecciones. Se muestra en el panel inferior un segundo experimento que
10 usa versiones mutadas de cada ARNm diana que carecen del sitio de complementariedad del extremo de miARN 5’ (MUT). Todos los experimentos se realizaron dos veces por triplicado (n=6). La FIGURA 6B representa transferencias de Western que indican que, en ciertos cánceres (por ejemplo, pulmón, mama, colon, gástrico), los niveles de proteína RB1 (Rb) presentan una correlación inversa con el nivel de expresión de miR-106a. Se usó β actina como un control para normalización. N1, muestra normal; T1 y T2,
15 muestra tumoral. La FIGURA 7 representa transferencias de Northern que muestran regulación negativa de la expresión de miR145 (parte superior) y regulación positiva de la expresión de miR-21 (parte inferior) en muestras de cáncer de mama (serie P y serie numerada) en relación con muestras normales. Se realizó normalización con una sonda específica de U6.
20 La FIGURA 8 representa transferencias de Northern que muestran regulación positiva de la expresión de miR103 y regulación negativa de la expresión de miR-155 (parte superior) en diferentes muestras de cáncer pancreático endocrino (WDET, tumores endocrinos pancreáticos bien diferenciados, WDEC, carcinomas endocrinos pancreáticos bien diferenciados y ACC, carcinomas de células de acinos pancreáticos) en relación con muestras normales (serie K), así como regulación positiva de la expresión de miR-204 (parte inferior) en
25 insulinomas (serie F) en relación con muestras normales (serie K) y muestras no secretoras/no actuantes (serie NF). Se realizó normalización con una sonda específica para ARN 5S.
Descripción detallada de la invención
30 La presente invención se basa, en parte, en la identificación de microARN particulares cuya expresión está alterada en células cancerosas asociadas con diferentes cánceres sólidos, tales como cáncer de colon, de estómago, pancreático, de pulmón, de mama y de próstata, en relación con células de control normales.
Como se usa en la presente memoria de forma intercambiable un “producto génico de miR”, “microARN”, “miR” o
35 “miARN” se refiere al transcrito de ARN no procesado (por ejemplo, precursor) o procesado (por ejemplo, maduro) de un gen de miR. Ya que los productos génicos de miR no se traducen a proteína, la expresión “productos génicos de miR” no incluye proteínas. El transcrito génico de miR no procesado también se denomina un “precursor de miR”
o “miR prec” y normalmente comprende un transcrito de ARN de aproximadamente 70-100 nucleótidos de longitud. El precursor de miR puede procesarse por digestión con una RNAsa (por ejemplo, Dicer, Argonaut o RNAsa III (por
40 ejemplo RNAsa III de E. coli)) en una molécula de ARN de 19-25 nucleótidos activa. Esta molécula de ARN de 19-25 nucleótidos activa también se denomina el transcrito génico de miR “procesado” o miARN “maduro”.
La molécula de ARN de 19-25 nucleótidos activa puede obtenerse del precursor de miR mediante vías de procesamiento naturales (por ejemplo, usando células intactas o lisados celulares) o mediante vías de
45 procesamiento sintéticas (por ejemplo, usando enzimas de procesamiento aisladas, tales como Dicer, Argonaut o RNAsa III aislada). Se entiende que la molécula de ARN de 19-25 nucleótidos activa también puede producirse directamente por síntesis biológica o química, sin haberse procesado a partir del precursor de miR. Cuando se hace referencia a un microARN en la presente memoria por nombre, el nombre corresponde a las formas tanto precursoras como maduras, a no ser que se indique de otro modo.
50 Las Tablas 1a y 1b representan las secuencias de nucleótidos de microARN humanos maduros y precursores particulares.
Tabla 1b-Secuencias de microARN maduro humano.
Nombre de miARN Maduro
Secuencia de miARN Maduro (5’ a 3’) SEC ID Nº microARN precursor correspondiente; véase la Tabla 1a
let-7a
ugagguaguagguuguauaguu 310 let-7a-1; let-7a-2; let-7a-3; let-7a-4
let-7b
ugagguaguagguugugugguu 311
let-7b
let-7c
ugagguaguagguuguaugguu 312
let-7c
let-7d
agagguaguagguugcauagu 313 let-7d; let-7d-v1
let-7e
ugagguaggagguuguauagu 314
let-7e
let-7f
ugagguaguagauuguauaguu 315 let-7f-1; let-7f-2-1; let-7f-2-2
let-7g
ugagguaguaguuuguacagu 316
let-7g
let-7i
ugagguaguaguuugugcu 317
let-7i
miR-1
uggaauguaaagaaguaugua 318 miR-1b; miR-1b-1; miR-1b-2
miR-7
uggaagacuagugauuuuguu 319 miR-7-1; miR-7-1a; miR-7-2; miR-7-3
miR-9
ucuuugguuaucuagcuguauga 320 miR-9-1; miR-9-2; miR-9-3
miR-9*
uaaagcuagauaaccgaaagu 321 miR-9-1; miR-9-2; miR-9-3
miR-10a
uacccuguagauccgaauuugug 322
miR-10a
miR-10b
uacccuguagaaccgaauuugu 323
miR-10b
miR-15a
uagcagcacauaaugguuugug 324 miR-15a; miR-15a-2
miR-15b
uagcagcacaucaugguuuaca 325
miR-15b
miR-16
uagcagcacguaaauauuggcg 326 miR-16-1; miR-16-2; miR-16-13
miR-17-5p
caaagugcuuacagugcagguagu 327 miR-17
miR-17-3p
acugcagugaaggcacuugu 328 miR-17
miR-18
uaaggugcaucuagugcagaua 329 miR-18; miR-18-13
miR-19a
ugugcaaaucuaugcaaaacuga 330 miR-19a; miR-19a-13
miR-19b
ugugcaaauccaugcaaaacuga 331 miR-19b-1; miR-19b-2
miR-20
uaaagugcuuauagugcaggua 332 miR-20 (miR-20a)
miR-21
uagcuuaucagacugauguuga 333 miR-21; miR-21-17
miR-22
aagcugccaguugaagaacugu 334
miR-22
miR-23a
aucacauugccagggauuucc 335
miR-23a
miR-23b
aucacauugccagggauuaccac 336
miR-23b
miR-24
uggcucaguucagcaggaacag 337 miR-24-1; miR-24-2; miR-24-19; miR24-9
miR-25
cauugcacuugucucggucuga 338
miR-25
miR-26a
uucaaguaauccaggauaggcu 339 miR-26a; miR-26a-1; miR-26a-2
miR-26b
uucaaguaauucaggauaggu 340
miR-26b
miR-27a
uucacaguggcuaaguuccgcc 341
miR-27a
miR-27b
uucacaguggcuaaguucug 342 miR-27b-1; miR-27b-2
miR-28
aaggagcucacagucuauugag 343
miR-28
miR-29a
cuagcaccaucugaaaucgguu 344 miR-29a-2; miR-29a
miR-29b
uagcaccauuugaaaucagu 345 miR-29b-1; miR-29b-2
miR-29c
uagcaccauuugaaaucgguua 346
miR-29c
miR-30a-5p
uguaaacauccucgacuggaagc 347 miR-30a
miR-30a-3p
cuuucagucggauguuugcagc 348 miR-30a
miR-30b
uguaaacauccuacacucagc 349 miR-30b-1; miR-30b-2
miR-30c
uguaaacauccuacacucucagc 350
miR-30c
miR-30d
uguaaacauccccgacuggaag 351
miR-30d
miR-30e
uguaaacauccuugacugga 352
miR-30e
miR-31
ggcaagaugcuggcauagcug 353
miR-31
miR-32
uauugcacauuacuaaguugc 354
miR-32
miR-33
gugcauuguaguugcauug 355 miR-33; miR-33b
miR-34a
uggcagugucuuagcugguugu 356
miR-34a
miR-34b
aggcagugucauuagcugauug 357
miR-34b
miR-34c
aggcaguguaguuagcugauug 358
miR-34c
miR-92
uauugcacuugucccggccugu 359 miR-92-2; miR-92-1
miR-93
aaagugcuguucgugcagguag 360 miR-93-1; miR-93-2
miR-95
uucaacggguauuuauugagca 361
miR-95
miR-96
uuuggcacuagcacauuuuugc 362
miR-96
miR-98
ugagguaguaaguuguauuguu 363
miR-98
miR-99a
aacccguagauccgaucuugug 364
miR-99a
miR-99b
cacccguagaaccgaccuugcg 365
miR-99b
miR-100
uacaguacugugauaacugaag 366
miR-100
miR-101
uacaguacugugauaacugaag 367 miR-101-1; miR-101-2
miR-103
agcagcauuguacagggcuauga 368 miR-103-1
miR-105
ucaaaugcucagacuccugu 369
miR-105
miR-106-a
aaaagugcuuacagugcagguagc 370
miR-106-a
miR-106-b
uaaagugcugacagugcagau 371
miR-106-b
miR-107
agcagcauuguacagggcuauca 372
miR-107
miR-122a
uggagugugacaaugguguuugu 373 miR-122a-1; miR-122a-2
miR-124a
uuaaggcacgcggugaaugcca 374 miR-124a-1; miR-124a-2; miR-124a-3
miR-125a
ucccugagacccuuuaaccugug 375 miR-125a-1; miR-125a-2
miR-125b
ucccugagacccuaacuuguga 376 miR-125b-1; miR-125b-2
miR-126*
cauuauuacuuuugguacgcg 377 miR-126-1; miR-126-2
miR-126
ucguaccgugaguaauaaugc 378 miR-126-1; miR-126-2
miR-127
ucggauccgucugagcuuggcu 379 miR-127-1; miR-127-2
miR-128a
ucacagugaaccggucucuuuu 380 miR-128; miR-128a
miR-128b
ucacagugaaccggucucuuuc 381
miR-128b
miR-129
cuuuuugcggucugggcuugc 382 miR-129-1; miR-129-2
miR-130a
cagugcaauguuaaaagggc 383
miR-130a
miR-130b
cagugcaaugaugaaagggcau 384
miR-130b
miR-132
uaacagucuacagccauggucg 385 miR-132-1
miR-133a
uugguccccuucaaccagcugu 386 miR-133a-1; miR-133a-2
miR-133b
uugguccccuucaaccagcua 387
miR-133b
miR-134
ugugacugguugaccagaggg 388 miR-134-1; miR-134-2
miR-135a
uauggcuuuuuauuccuauguga 389 miR-135a; miR-135a-2 (miR-135-2)
miR-135b
uauggcuuuucauuccuaugug 390
miR-135b
miR-136
acuccauuuguuuugaugaugga 391 miR-136-1; miR-136-2
miR-137
uauugcuuaagaauacgcguag 392
miR-137
miR-138
agcugguguugugaauc 393 miR-138-1; miR-138-2
miR-139
ucuacagugcacgugucu 394
miR-139
miR-140
agugguuuuacccuaugguag 395 miR-140; miR-140as; miR-140s
miR-141
aacacugucugguaaagaugg 396 miR-141-1; miR-141-2
miR-142-3p
uguaguguuuccuacuuuaugga 397 miR-142
miR-142-5p
cauaaaguagaaagcacuac 398 miR-142
miR-143
ugagaugaagcacuguagcuca 399 miR-143-1
miR-144
uacaguauagaugauguacuag 400 miR-144-1; miR-144-2
miR-145
guccaguuuucccaggaaucccuu 401 miR-145-1; miR-145-2
miR-146
ugagaacugaauuccauggguu 402 miR-146-1; miR-146-2
miR-147
guguguggaaaugcuucugc 403
miR-147
miR-148a
ucagugcacuacagaacuuugu 404 miR-148a (miR-148)
miR-148b
ucagugcaucacagaacuuugu 405
miR-148b
miR-149
ucuggcuccgugucuucacucc 406
miR-149
miR-150
ucucccaacccuuguaccagug 407 miR-150-1; miR-150-2
miR-151
acuagacugaagcuccuugagg 408
miR-151
miR-152
ucagugcaugacagaacuugg 409 miR-152-1; miR-152-2
miR-153
uugcauagucacaaaaguga 410 miR-153-1-1; miR-153-1-2; miR-153-2-1; miR-153-2-2
miR-154
uagguuauccguguugccuucg 411 miR-154-1; miR-154-2
miR-154*
aaucauacacgguugaccuauu 412 miR-154-1; miR-154-2
miR-155
uuaaugcuaaucgugauagggg 413
miR-155
miR-181a
aacauucaacgcugucggugagu 414
miR-181a
miR-181b
aacauucauugcugucgguggguu 415 miR-181b-1; miR-181b-2
miR-181c
aacauucaaccugucggugagu 416
miR-181c
miR-182
uuuggcaaugguagaacucaca 417 miR-182; miR-182as
miR-182*
ugguucuagacuugccaacua 418 miR-182; miR-182as
miR-183
uauggcacugguagaauucacug 419
miR-183
miR-184
uggacggagaacugauaagggu 420 miR-184-1; miR-184-2
miR-185
uggagagaaaggcaguuc 421 miR-185-1; miR-185-2
miR-186
caaagaauucuccuuuugggcuu 422 miR-186-1; miR-186-2
miR-187
ucgugucuuguguugcagccg 423
miR-187
miR-188
caucccuugcaugguggagggu 424
miR-188
miR-189
gugccuacugagcugauaucagu 425 miR-189-1; miR-189-2
miR-190
ugauauguuugauauauuaggu 426 miR-190-1; miR-190-2
miR-191
caacggaaucccaaaagcagcu 427 miR-191-1; miR-191-2
miR-192
cugaccuaugaauugacagcc 428
miR-192
miR-193
aacuggccuacaaagucccag 429 miR-193-1; miR-193-2
miR-194
uguaacagcaacuccaugugga 430 miR-194-1; miR-194-2
miR-195
uagcagcacagaaauauuggc 431 miR-195-1; miR-195-2
miR-196a
uagguaguuucauguuguugg 432 miR-196a; miR-196a-2 (miR196-2)
miR-196b
uagguaguuuccuguugg 433
miR-196b
miR-197
uucaccaccuucuccacccagc 434
miR-197
miR-198
gguccagaggggagauagg 435
miR-198
miR-199a
cccaguguucagacuaccuguuc 436 miR-199a-1; miR-199a-2
miR-199a*
uacaguagucugcacauugguu 437 miR-199a-1; miR-199a-2; miR-199s; miR-199b
miR-199b
cccaguguuuagacuaucuguuc 438
miR-199b
miR-200a
uaacacugucugguaacgaugu 439
miR-200a
miR-200b
cucuaauacugccugguaaugaug 440
miR-200b
miR-200c
aauacugccggguaaugaugga 441
miR-200c
miR-202
agagguauagggcaugggaaga 442
miR-202
miR-203
gugaaauguuuaggaccacuag 443
miR-203
miR-204
uucccuuugucauccuaugccu 444
miR-204
miR-205
uccuucauuccaccggagucug 445
miR-205
miR-206
uggaauguaaggaagugugugg 446 miR-206-1; miR-206-2
miR-208
auaagacgagcaaaaagcuugu 447
miR-208
miR-210
cugugcgugugacagcggcug 448
miR-210
miR-211
uucccuuugucauccuucgccu 449
miR-211
miR-212
uaacagucuccagucacggcc 450
miR-212
miR-213
accaucgaccguugauuguacc 451
miR-213
miR-214
acagcaggcacagacaggcag 452
miR-214
miR-215
augaccuaugaauugacagac 453
miR-215
miR-216
uaaucucagcuggcaacugug 454
miR-216
miR-217
uacugcaucaggaacugauuggau 455
miR-217
miR-218
uugugcuugaucuaaccaugu 456 miR-218-1; miR-218-2
miR-219
ugauuguccaaacgcaauucu 457 miR-219; miR-219-1; miR-219-2
miR-220
ccacaccguaucugacacuuu 458
miR-220
miR-221
agcuacauugucugcuggguuuc 459
miR-221
miR-222
agcuacaucuggcuacugggucuc 460
miR-222
miR-223
ugucaguuugucaaauacccc 461
miR-223
miR-224
caagucacuagugguuccguuua 462
miR-224
miR-296
agggcccccccucaauccugu 463
miR-296
miR-299
ugguuuaccgucccacauacau 464
miR-299
miR-301
cagugcaauaguauugucaaagc 465
miR-301
miR-302a
uaagugcuuccauguuuugguga 466
miR-302a
miR-302b*
acuuuaacauggaagugcuuucu 467 miR-302b
miR-302b
uaagugcuuccauguuuuaguag 468
miR-302b
miR-302c*
uuuaacauggggguaccugcug 469 miR-302c
miR-302c
uaagugcuuccauguuucagugg 470
miR-302c
miR-302d
uaagugcuuccauguuugagugu 471
miR-302d
miR-320
aaaagcuggguugagagggcgaa 472
miR-320
miR-321
uaagccagggauuguggguuc 473
miR-321
miR-323
gcacauuacacggucgaccucu 474
miR-323
miR-324-5p
cgcauccccuagggcauuggugu 475 miR-324
miR-324-3p
ccacugccccaggugcugcugg 476 miR-324
miR-325
ccuaguagguguccaguaagu 477
miR-325
miR-326
ccucugggcccuuccuccag 478
miR-326
miR-328
cuggcccucucugcccuuccgu 479
miR-328
miR-330
gcaaagcacacggccugcagaga 480
miR-330
miR-331
gccccugggccuauccuagaa 481
miR-331
miR-335
ucaagagcaauaacgaaaaaugu 482
miR-335
miR-337
uccagcuccuauaugaugccuuu 483
miR-337
miR-338
uccagcaucagugauuuuguuga 484
miR-338
miR-339
ucccuguccuccaggagcuca 485
miR-339
miR-340
uccgucucaguuacuuuauagcc 486
miR-340
miR-342
ucucacacagaaaucgcacccguc 487
miR-342
miR-345
ugcugacuccuaguccagggc 488
miR-345
miR-346
ugucugcccgcaugccugccucu 489
miR-346
miR-367
aauugcacuuuagcaaugguga 490
miR-367
miR-368
acauagaggaaauuccacguuu 491
miR-368
miR-369
aauaauacaugguugaucuuu 492
miR-369
miR-370
gccugcugggguggaaccugg 493
miR-370
miR-371
gugccgccaucuuuugagugu 494
miR-371
miR-372
aaagugcugcgacauuugagcgu 495
miR-372
miR-373*
acucaaaaugggggcgcuuucc 496 miR-373
miR-373
gaagugcuucgauuuuggggugu 497
miR-373
miR-374
uuauaauacaaccugauaagug 498
miR-374
La presente invención abarca métodos para diagnosticar si un sujeto tiene cáncer de estómago, que comprenden medir los niveles de un grupo de productos génicos de miR que consisten en miR-223, miR-21, miR-103-2, miR-136, miR-125b-2, miR-103-1, miR-222, miR-212 prec, miR-125b-1, miR-100, miR-92-1, miR-96, miR-192, miR-23a, miR5 215, miR-7-2, miR-138-2, miR-99b, miR-33b, miR-218-2, miR-92-2, miR-25, miR-191, miR-221, miR-214, miR-107, miR-24-1 y miR-24-2 en una muestra de ensayo del sujeto y comparar el nivel del grupo de productos génicos de miR en la muestra de ensayo con el nivel de los productos génicos de miR correspondientes en una muestra de control. Como se usa en la presente memoria, un “sujeto” puede ser cualquier mamífero que tenga, o se sospeche que tenga, un cáncer sólido. En una realización preferida, el sujeto es un ser humano que tiene, o se sospecha que
10 tiene, un cáncer sólido.
En la presente memoria también se desvelan métodos en los que el al menos un producto génico de miR medido en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-21, miR-17-5p, miR-191, miR-29b-2, miR-223, miR-128b, miR-199a-1, miR-24-1, miR-24-2, miR-146, miR-155, miR-181b-1, miR-20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, 15 miR-214, miR-30c, miR-25, miR-221, miR-106a y combinaciones de los mismos. En la presente memoria también se desvelan métodos en los que el producto génico de miR es miR-21, miR-191 o miR-17-5p. En la presente memoria también se desvelan métodos en los que el producto génico de miR no es miR-15a o miR-16-1. En la presente memoria también se desvelan métodos en los que el producto génico de miR no es miR 159-1 o miR-192. En la presente memoria también se desvelan métodos en los que el producto génico de miR no es miR-186, miR-101-1, 20 miR-194, miR-215, miR-106b, miR-25, miR-93, miR-29b, miR-29a, miR-96, miR-182s, miR-182as, miR-183, miR129-1, let-7a-1, let-7d, let-7f-1, miR-23b, miR-24-1, miR-27b, miR-32, miR-159-1, miR-192, miR-125b-1, let-7a-2, miR-100, miR-196-2, miR-148b, miR-190, miR-21, miR-301, miR-142s, miR-142as, miR-105-1 o miR-175. En la presente memoria también se desvelan métodos en los que el producto génico de miR no es miR-21, miR-301, miR142as, miR-142s, miR-194, miR-215 o miR-32. En la presente memoria también se desvelan métodos en los que el
25 producto génico de miR no es miR-148, miR-10a, miR-196-1, miR-152, miR-196-2, miR-148b, miR-10b, miR-129-1, miR-153-2, miR-202, miR-139, let-7a, let-7f o let-7d. En la presente memoria también se desvelan métodos en los que el producto génico de miR no es miR-15a, miR-16-1, miR-182, miR-181, miR-30, miR-15a, miR-16-1, miR-15b, miR-16-2, miR-195, miR-34, miR-153, miR-21, miR-217, miR-205, miR-204, miR-211, miR-143, miR-96, miR-103, miR-107, miR-129, miR-9, miR-137, miR-217, miR-186.
30 Los cánceres sólidos pueden ser cualquier cáncer que surja de órganos y tejidos sólidos. Dichos cánceres se asocian normalmente con la formación y/o presencia de masas tumorales y pueden ser carcinomas, sarcomas y linfomas. Los ejemplos específicos de cánceres sólidos que pueden diagnosticarse por los métodos desvelados en la presente memoria incluyen, pero sin limitación, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de estómago (gástrico),
35 cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer bronquial, cáncer testicular, cáncer ovárico, cáncer uterino, cáncer peniano, melanoma y otros cánceres de la piel, cáncer de hígado, cáncer esofágico, cánceres de la cavidad oral y faringe (por ejemplo, cáncer de lengua, cáncer de boca), cánceres del sistema digestivo (por ejemplo, cáncer intestinal, cáncer de la vesícula biliar), cánceres de huesos y articulaciones, cánceres del sistema endocrino (por ejemplo, cáncer tiroideo), cáncer de cerebro, cáncer de ojo, cánceres del
40 sistema urinario (por ejemplo, cáncer de riñón, cáncer de la vejiga urinaria), enfermedad de Hodgkin y linfoma no de Hodgkin. Los cánceres sólidos pueden no ser uno o más de cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer pancreático o cáncer gastrointestinal.
En la presente memoria también se desvelan métodos en los que el cáncer sólido es cáncer de mama o cáncer de
45 pulmón y el al menos un producto génico de miR medido en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-210, miR-213 y una combinación de los mismos.
En la presente memoria también se desvelan métodos en los que el cáncer sólido es cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de próstata o cáncer pancreático y el al menos un producto génico de miR medido en la muestra
50 de ensayo es miR-218-2.
En la presente memoria también se desvelan métodos en los que el cáncer sólido es cáncer de mama y el al menos un producto génico de miR medido en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-125b-1,
miR-125b-2, miR-145, miR-21 y combinaciones de los mismos. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de mama y el al menos un producto génico de miR en la muestra de ensayo puede seleccionarse del grupo que consiste en miR-21, miR-29b-2, miR-146, miR-125b-2, miR-125b-1, miR-10b, miR-145, miR-181a, miR-140, miR-213, miR-29a prec, miR-181b-1, miR-199b, miR-29b-1, miR-130a, miR-155, let-7a-2, miR-205, miR-29c, miR5 224, miR-100, miR-31, miR-30c, miR-17-5p, miR-210, miR-122a, miR-16-2 y combinaciones de los mismos. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de mama y el al menos un producto génico de miR puede no ser miR-15a o miR-16-1. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de mama y el al menos un producto génico de miR puede no ser miR-145, miR-21, miR-155, miR-10b, miR-125b-1, miR-125b-2, let7a-2, let7a3, let-7d, miR-122a, miR-191, miR-206, miR-210, let-7i, miR-009-1 (miR131-1), miR-34 (miR-170), miR-102 (miR29b), miR-123 (miR-126), miR-140-as, miR-125a, miR-194, miR-204, miR-213, let-7f-2, miR-101, miR-128b, miR136, miR-143, miR-149, miR-191, miR-196-1, miR-196-2, miR-202, miR-103-1, o miR-30c. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de mama y el producto génico de miR puede no ser miR-21, miR-125b-1, let-7a-2, let-7i, miR-100, let-7g, miR-31, miR-32a-1, miR-33b, miR-34a-2, miR-101-1, miR-135-1, miR-142as, miR-142s, miR144, miR-301, miR-29c, miR-30c, miR-106a, o miR-29b-1. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer 15 de mama y el producto génico de miR puede no ser miR-159-1 o miR-192. De manera alternativa, el cáncer sólido es cáncer de mama y el producto génico de miR puede no ser miR-186, miR-101-1, miR-194, miR-215, miR-106b, miR-25, miR-93, miR-29b, miR-29a, miR-96, miR-182s, miR-182as, miR-183, miR-129-1, let-7a-1, let-7d, let-7f-1, miR-23b, miR-24-1, miR-27b, miR-32, miR-159-1, miR-192, miR-125b-1, let-7a-2, miR-100, miR-196-2, miR-148b, miR-190, miR-21, miR-301, miR-142s, miR-142as, miR-105-1 o miR-175. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de mama y el producto génico de miR puede no ser miR-21, miR-301, miR-142as, miR-142s, miR194, miR-215 o miR-32. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de mama y el producto génico de miR puede no ser miR-148, miR-10a, miR-196-1, miR-152, miR-196-2, miR-148b, miR-10b, miR-129-1, miR-153-2, miR-202, miR-139, let-7a, let-7f o let-7d. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de mama y el producto génico de miR puede no ser miR-181b, miR-181c, miR-181d, miR-30, miR-15b, miR-16-2, miR-153-1, miR
25 217, miR-205, miR-204, miR-103, miR-107, miR-129-2, miR-9 o miR-137.
También se desvelan métodos en los que el cáncer sólido es cáncer de colon y el al menos un producto génico de miR en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-24-1, miR-29b-2, miR-20a, miR-10a, miR-32, miR-203, miR-106a, miR-17-Sp, miR-30c, miR-223, miR-126*, miR-128b, miR-21, miR-24-2, miR-99b prec, miR-155, miR-213, miR-150, miR-107, miR-191, miR-221, miR-9-3 y combinaciones de los mismos. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de colon y el producto génico de miR puede no ser miR 159-1 o miR
192. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de colon y el producto génico de miR puede no ser miR-186, miR-101-1, miR-194, miR-215, miR-106b, miR-25, miR-93, miR-29b, miR-29a, miR-96, miR-182s, miR182as, miR-183, miR-129-1, let-7a-1, let-7d, let-7f-1, miR-23b, miR-24-1, miR-27b, miR-32, miR-159-1, miR-192,
35 miR-125b-1, let-7a-2, miR-100, miR-196-2, miR-148b, miR-190, miR-21, miR-301, miR-142s, miR-142as, miR-105-1
o miR-175. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de colon y el producto génico de miR puede no ser miR-21, miR-301, miR-142as, miR-142s, miR-194, miR-215 o miR-32. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de colon y el producto génico de miR puede no ser miR-148, miR-10a, miR-196-1, miR-152, miR196-2, miR-148b, miR-10b, miR-129-1, miR-153-2, miR-202, miR-139, let-7a, let-7f o let-7d. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de colon y el producto génico de miR puede no ser miR-181b, miR-181c, miR181d, miR-30, miR-15b, miR-16-2, miR-153-1, miR-217, miR-205, miR-204, miR-103, miR-107, miR-129-2, miR-9 o miR-137.
También se desvelan métodos en los que el cáncer sólido es cáncer de pulmón y el producto génico de miR en la
45 muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-21, miR-205, miR-200b, miR-9-1, miR-210, miR148, miR-141, miR-132, miR-215, miR-128b, let-7g, miR-16-2, miR-129-1/2 prec, miR-126*, miR-142-as, miR-30d, miR-30a-5p, miR-7-2, miR-199a-1, miR-127, miR-34a prec, miR-34a, miR-136, miR-202, miR-196-2; miR-199a-2, let7a-2, miR-124a-1, miR-149, miR-17-Sp, miR-196-1 prec, miR-10a, miR-99b prec, miR-196-1, miR-199b, miR-191, miR-195, miR-155 y combinaciones de los mismos. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de pulmón y el al menos un producto génico de miR puede no ser miR-15a o miR-16-1. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de pulmón y el al menos un producto génico de miR puede no ser miR-21, miR-191, miR-126*, miR-210, miR-155, miR-143, miR-205, miR-126, miR-30a-5p, miR-140, miR-214, miR-218-2, miR-145, miR-106a, miR-192, miR-203, miR-150, miR-220, miR-192, miR-224, miR-24-2, miR-212, miR-9, miR-17, miR-124a1, miR-95, miR-198, miR-216, miR-219-1, miR-197, miR-125a, miR-26a-1, miR-146, miR-199b, let7a-2, miR-27b,
55 miR-32, miR-29b-2, miR-33, miR-181c, miR-101-1, miR-124a-3, miR-125b-1 o let7f-1. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de pulmón y el al menos un producto génico de miR puede no ser miR-21, miR-182, miR-181, miR-30, miR-15a, miR-143, miR-205, miR-96, miR-103, miR-107, miR-129, miR-137, miR-186, miR-15b, miR-16-2, miR-195, miR-34, miR-153, miR-217, miR-204, miR-211, miR-9, miR-217, let-7a-2 o miR-32. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de pulmón y el producto génico de miR puede no ser let-7c, let-7g, miR-7-3, miR-210, miR-31, miR-34a-1, miR-a-2, miR-99a, miR-100, miR-125b-2, miR-132, miR-135-1, miR-195, miR-34, miR-123, miR-203. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de pulmón y el producto génico de miR puede no ser miR 159-1 o miR-192. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de pulmón y el producto génico de miR puede no ser miR-186, miR-101-1, miR-194, miR-215, miR-106b, miR-25, miR93, miR-29b, miR-29a, miR-96, miR-182s, miR-182as, miR-183, miR-129-1, let-7a-1, let-7d, let-7f-1, miR-23b, miR
65 24-1, miR-27b, miR-32, miR-159-1, miR-192, miR-125b-1, let-7a-2, miR-100, miR-196-2, miR-148b, miR-190, miR21, miR-301, miR-142s, miR-142as, miR-105-1 o miR-175. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer
de pulmón y el producto génico de miR puede no ser miR-21, miR-301, miR-142as, miR-142s, miR-194, miR-215 o miR-32. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de pulmón y el producto génico de miR puede no ser miR-148, miR-10a, miR-196-1, miR-152, miR-196-2, miR-148b, miR-10b, miR-129-1, miR-153-2, miR-202, miR139, let-7a, let-7f o let-7d. De manera alternativa el cáncer sólido puede ser cáncer de pulmón y el producto génico
5 de miR puede no ser miR-181b, miR-181c, miR-181d, miR-30, miR-15b, miR-16-2, miR-153-1, miR-217, miR-205, miR-204, miR-103, miR-107, miR-129-2, miR-9 o miR-137.
También se desvelan métodos en los que el cáncer sólido es cáncer pancreático y el producto génico de miR en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-103-1, miR-103-2, miR-155, miR-204 y combinaciones de los mismos. De manera alternativa, el cáncer sólido es cáncer pancreático y el producto génico de miR en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-103-2, miR-103-1, miR-24-2, miR-107, miR-100, miR-125b-2, miR-125b-1, miR-24-1, miR-191, miR-23a, miR-26a-1, miR-125a, miR-130a, miR-26b, miR145, miR-221, miR-126*, miR-16-2, miR-146, miR-214, miR-99b, miR-128b, miR-155, miR-29b-2, miR-29a, miR-25, miR-16-1, miR-99a, miR-224, miR-30d, miR-92-2, miR-199a-1, miR-223, miR-29c, miR-30b, miR-129-1/2, miR-197, 15 miR-17-5p, miR-30c, miR-7-1, miR-93-1, miR-140, miR-30a-5p, miR-132, miR-181b-1, miR-152 prec, miR-23b, miR20a, miR-222, miR-27a, miR-92-1, miR-21, miR-129-1/2 prec, miR-150, miR-32, miR-106a, miR-29b-1 y combinaciones de los mismos. De manera alternativa, el cáncer sólido es cáncer pancreático y el producto génico de miR puede no ser miR-15a o miR-16-1. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer pancreático y el producto génico de miR puede no ser miR 159-1 o miR-192. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer pancreático y el producto génico de miR puede no ser miR-186, miR-101-1, miR-194, miR-215, miR-106b, miR-25, miR-93, miR-29b, miR-29a, miR-96, miR-182s, miR-182as, miR-183, miR-129-1, let-7a-1, let-7d, let-7f-1, miR-23b, miR-24-1, miR-27b, miR-32, miR-159-1, miR-192, miR-125b-1, let-7a-2, miR-100, miR-196-2, miR-148b, miR-190, miR-21, miR-301, miR-142s, miR-142as, miR-105-1 o miR-175. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer pancreático y el producto génico de miR puede no ser miR-21, miR-301, miR-142as, miR-142s,
25 miR-194, miR-215 o miR-32. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer pancreático y el producto génico de miR puede no ser miR-148, miR-10a, miR-196-1, miR-152, miR-196-2, miR-148b, miR-10b, miR-129-1, miR-153-2, miR-202, miR-139, let-7a, let-7f o let-7d. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer pancreático y el producto génico de miR puede no ser miR-181b, miR-181c, miR-181d, miR-30, miR-15b, miR-16-2, miR-153-1, miR-217, miR-205, miR-204, miR-103, miR-107, miR-129-2, miR-9 o miR-137. También se desvelan métodos en los que el cáncer sólido es cáncer de próstata y el producto génico de miR en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en let-7d, miR-128a prec, miR-195, miR-203, let-7a-2 prec, miR-34a, miR-20a, miR-218-2, miR-29a, miR-25, miR-95, miR-197, miR-135-2, miR-187, miR-196-1, miR-148, miR191, miR-21, let-7i, miR-198, miR-199a-2, miR-30c, miR-17-Sp, miR-92-2, miR-146, miR-181b-1 prec, miR-32, miR206, miR-184 prec, miR-29a prec, miR-29b-2, miR-149, miR-181b-1, miR-196-1 prec, miR-93-1, miR-223, miR-16-1,
35 miR-101-1, miR-124a-1, miR-26a-1, miR-214, miR-27a, miR-24-1, miR-106a, miR-199a-1 y combinaciones de los mismos. De manera alternativa, el cáncer sólido es cáncer de próstata y el producto génico de miR puede no ser miR-15a o miR-16-1. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de próstata y el producto génico de miR puede no ser miR 159-1 o miR-192. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de próstata y el producto génico de miR puede no ser miR-186, miR-101-1, miR-194, miR-215, miR-106b, miR-25, miR-93, miR-29b, miR-29a, miR-96, miR-182s, miR-182as, miR-183, miR-129-1, let-7a-1, let-7d, let-7f-1, miR-23b, miR-24-1, miR-27b, miR-32, miR-159-1, miR-192, miR-125b-1, let-7a-2, miR-100, miR-196-2, miR-148b, miR-190, miR-21, miR-301, miR=142s, miR-142as, miR-105-1 o miR-175. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de próstata y el producto génico de miR puede no ser miR-21, miR-301, miR-142as, miR-142s, miR-194, miR-215 o miR-32. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de próstata y el producto génico de miR puede no ser miR
45 148, miR-10a, miR-196-1, miR-152, miR-196-2, miR-148b, miR-10b, miR-129-1, miR-153-2, miR-202, miR-139, let7a, let-7f o let-7d. De manera alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de próstata y el producto génico de miR puede no ser miR-181b, miR-181c, miR-181d, miR-30, miR-15b, miR-16-2, miR-153-1, miR-217, miR-205, miR-204, miR-103, miR-107, miR-129-2, miR-9 o miR-137.
También se desvelan métodos en los que el cáncer sólido es cáncer de estómago y el producto génico de miR en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-223, miR-21, miR-218-2, miR-103-2, miR-92-2, miR-25, miR-136, miR-191, miR-221, miR-125b-2, miR-103-1, miR-214, miR-222, miR-212 prec, miR-125b-1, miR100, miR-107, miR-92-1, miR-96, miR-192, miR-23a, miR-215, miR-7-2, miR-138-2, miR-24-1, miR-99b, miR-33b, miR-24-2 y combinaciones de los mismos. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de estómago y el 55 producto génico de miR puede no ser miR-15a o miR-16-1. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de estómago y el producto génico de miR puede no ser miR 159-1 o miR-192. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de estómago y el producto génico de miR puede no ser miR-186, miR-101-1, miR-194, miR-215, miR106b, miR-25, miR-93, miR-29b, miR-29a, miR-96, miR-182s, miR-182as, miR-183, miR-129-1, let-7a-1, let-7d, let7f-1, miR-23b, miR-24-1, miR-27b, miR-32, miR-159-1, miR-192, miR-125b-1, let-7a-2, miR-100, miR-196-2, miR148b, miR-190, miR-21, miR-301, miR-142s, miR-142as, miR-105-1 o miR-175. En una realización adicional, el cáncer sólido es cáncer de estómago y el producto génico de miR no es miR-21, miR-301, miR-142as, miR-142s, miR-194, miR-215, o miR-32. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de estómago y el producto génico de miR puede no ser miR-148, miR-10a, miR-196-1, miR-152, miR-196-2, miR-148b, miR-10b, miR-129-1, miR-1532, miR-202, miR-139, let-7a, let-7f o let-7d. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de estómago y el
65 producto génico de miR puede no ser miR-181b, miR-181c, miR-181d, miR-30, miR-15b, miR-16-2, miR-153-1, miR217, miR-205, miR-204, miR-103, miR-107, miR-129-2, miR-9 o miR-137.
El nivel del al menos un producto génico de miR puede medirse en una muestra biológica (por ejemplo, células, tejidos) obtenida del sujeto. Por ejemplo, puede retirarse una muestra tisular (por ejemplo, de un tumor) de un sujeto que se sospecha que tiene un cáncer sólido por técnicas de biopsia convencionales. Como alternativa, puede extraerse una muestra sanguínea del sujeto, y pueden aislarse células sanguíneas (por ejemplo, glóbulos blancos)
5 para extracción de ADN por técnicas convencionales. La muestra de sangre o tejido se obtiene preferentemente del sujeto antes del inicio de la radioterapia, quimioterapia u otro tratamiento terapéutico. Puede obtenerse una muestra de tejido o sangre de control correspondiente de tejidos no afectos del sujeto, de un individuo humano normal o población de individuos normales, o de células cultivadas correspondientes a la mayoría de las células en la muestra del sujeto. La muestra de tejido o sangre de control se procesa después junto con la muestra del sujeto, de modo que los niveles de producto génico de miR producido a partir de un gen de miR dado en células de la muestra del sujeto puede compararse con los niveles de producto génico de miR correspondientes de células de la muestra de control. Puede usarse también un patrón de expresión de miR de referencia para la muestra biológica como un control.
15 Una alteración (por ejemplo, un aumento o reducción) del nivel de un producto génico de miR en la muestra obtenida del sujeto, en relación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en una muestra de control, es indicativa de la presencia de un cáncer sólido en el sujeto. El nivel del al menos un producto génico de miR en la muestra de ensayo puede ser mayor que el nivel del producto génico de miR correspondiente en la muestra de control (es decir, la expresión del producto génico de miR está “regulada positivamente”). Como se usa en la presente memoria, la expresión de un producto génico de miR está “regulada positivamente” cuando la cantidad de producto génico de miR en una muestra celular o tisular de un sujeto es mayor que la cantidad del mismo producto génico en una muestra celular o tisular de control. El nivel del al menos un producto génico de miR en la muestra de ensayo puede ser menor que el nivel del producto génico de miR correspondiente en la muestra de control (es decir, la expresión del producto génico de miR está “regulada negativamente”). Como se usa en la presente memoria, la
25 expresión de un gen de miR está “regulada negativamente” cuando la cantidad de producto génico de miR producida de ese gen en una muestra celular o tisular de un sujeto es menor que la cantidad producida del mismo gen en una muestra celular o tisular de control. La expresión génica de miR relativa en las muestras de control y normales puede determinarse con respecto a uno o más patrones de expresión de ARN. Los patrones pueden comprender, por ejemplo, un nivel de expresión génica de miR cero, el nivel de expresión génica de miR en una línea celular convencional, el nivel de expresión génica de miR en tejidos no afectados del sujeto, o el nivel medio de expresión génica de miR previamente obtenido para una población de controles humanos normales.
El nivel de un producto génico de miR en una muestra puede medirse usando cualquier técnica que sea adecuada para detectar los niveles de expresión de ARN en una muestra biológica. Se conocen bien por los expertos en la
35 materia técnicas adecuadas (por ejemplo, análisis de transferencia de Northern, RT-PCR, hibridación in situ) para determinar los niveles de expresión de ARN en una muestra biológica (por ejemplo, células, tejidos). El nivel de al menos un producto génico de miR puede detectarse usando análisis de transferencia de Northern. Por ejemplo, puede purificarse ARN celular total de células por homogeneización en presencia de tampón de extracción de ácidos nucleicos, seguido de centrifugación. Los ácidos nucleicos se precipitan, y el ADN se retira por tratamiento con DNasa y precipitación. Las moléculas de ARN se separan después por electroforesis en gel en geles de agarosa de acuerdo con técnicas convencionales, y se transfieren a filtros de nitrocelulosa. Después se inmoviliza el ARN en los filtros por calentamiento. Se consigue detección y cuantificación de ARN específico usando sondas de ADN o ARN marcadas de forma apropiada complementarias del ARN en cuestión. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., eds., 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Capítulo 7.
45 Pueden producirse sondas adecuadas para hibridación de transferencia de Northern de un producto génico de miR dado a partir de las secuencias de ácido nucleico proporcionadas en la Tabla 1a y Tabla 1b e incluyen, pero sin limitación, sondas que tienen complementariedad de al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o completa con un producto génico de miR de interés. Se describen métodos para preparación de sondas de ADN y ARN marcadas, y las condiciones para hibridación de las mismas con secuencias de nucleótidos diana en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., eds., 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Capítulos 10 y 11.
Por ejemplo, la sonda de ácido nucleico puede marcarse con, por ejemplo, un radionúclido, tal como 3H, 32P, 33P, 14C
55 o 35S; un metal pesado; un ligando capaz de actuar como un miembro de par de unión específico para un ligando marcado (por ejemplo, biotina, avidina o un anticuerpo); una molécula fluorescente; una molécula quimioluminiscente; una enzima o similares.
Las sondas pueden marcarse a alta actividad específica por el método de traslación de muesca de Rigby et al. (1977), J. Mol. Biol. 113: 237-251 o por el método de cebadores aleatorios de Fienberg et al. (1983), Anal. Biochem.
132: 6-13. Este último es el método elegido para sintetizar sondas marcadas con 32P de alta actividad específica a partir de ADN monocatenario o de moldes de ARN. Por ejemplo, reemplazando nucleótidos preexistentes con nucleótidos altamente radiactivos de acuerdo con el método de traslación de muescas, es posible preparar sondas de ácido nucleico marcadas con 32P con una actividad específica bastante mayor de 108 cpm/microgramo. Después
65 puede realizarse detección autorradiográfica de la hibridación exponiendo los filtros hibridados a película fotográfica. La exploración densitométrica de las películas fotográficas expuestas a los filtros hibridados proporciona una
medición precisa de los niveles de transcrito génico de miR. Usando otro enfoque, los niveles de transcrito génico de miR pueden cuantificarse por sistemas de formación de imágenes computarizada, tales como el Phosphorimager Molecular Dynamics 400-B 2D disponible de Amersham Biosciences, Piscataway, NJ.
5 Cuando el marcaje con radionúclidos de sondas de ADN o ARN no es práctico, puede usarse el método de cebadores aleatorios para incorporar un análogo, por ejemplo, el análogo de dTTP 5-(N-(N-biotinil-épsilonaminocaproil)-3-aminoalil)desoxiuridina trifosfato, en la molécula sonda. El oligonucleótido sonda biotinilado puede detectarse por reacción con proteínas de unión a biotina, tales como avidina, estreptavidina y anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos antibiotina) acoplados a colorantes fluorescentes o enzimas que producen reacciones de color.
Además de Northern y otras técnicas de hibridación de ARN, la determinación de los niveles de transcritos de ARN puede conseguirse usando la técnica de hibridación in situ. Esta técnica requiere menos células que la técnica de transferencia de Northern, e implica depositar células completas en un cubreobjetos de microscopio y explorar el contenido de ácido nucleico de la célula con una solución que contenga sondas de ácido nucleico radiactivas o
15 marcadas de otro modo (por ejemplo, ADNc o ARN). Esta técnica es particularmente adecuada para analizar muestras de biopsia tisular de sujetos. La práctica de la técnica de hibridación in situ se describe en más detalle en la Patente de Estados Unidos Nº 5.427.916. Pueden producirse sondas adecuadas para hibridación in situ de un producto génico de miR dado a partir de las secuencias de ácido nucleico proporcionadas en la Tabla 1a y Tabla 1b, e incluyen, pero sin limitación, sondas que tienen complementariedad de al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o completa con un producto génico de miR de interés, como se ha descrito anteriormente.
El número relativo de transcritos génicos de miR en células también puede determinarse por transcripción inversa de transcritos génicos de miR, seguido de amplificación de los transcritos de transcripción inversa por reacción en
25 cadena de la polimerasa (RT-PCR). Los niveles de los transcritos génicos de miR pueden cuantificarse en comparación con un patrón interno, por ejemplo, el nivel de ARNm de un gen “constitutivo” presente en la misma muestra. Un gen “constitutivo” adecuado para su uso como un patrón interno incluye, por ejemplo, miosina y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH). Se conocen bien por los expertos en la materia métodos para realizar RT-PCR cuantitativa y semicuantitativa, y variaciones de la misma.
En algunos casos, puede ser deseable determinar simultáneamente el nivel de expresión de una pluralidad de productos génicos de miR diferentes en una muestra. En otros casos, puede ser deseable determinar el nivel de expresión de los transcritos de todos los genes de miR conocidos correlacionados con cáncer. La evaluación de los niveles de expresión específicos de cáncer para cientos de genes o productos génicos de miR consume tiempo y
35 requiere una gran cantidad de ARN total (por ejemplo, al menos 20 µg para cada transferencia de Northern) y técnicas autorradiográficas que requieren isótopos radiactivos.
Para superar estas limitaciones, puede construirse una oligobiblioteca, en formato de microplaca (es decir, una microserie), que contenga un conjunto de sondas oligonucleotídicas (por ejemplo, oligodesoxinucleótidos) que son específicas para un conjunto de genes de miR. Usando dicha microserie, puede determinarse el nivel de expresión de múltiples microARN en una muestra biológica por transcripción inversa de los ARN para generar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana, e hibridarlos para explorar los oligonucleótidos de la microserie para generar un perfil de hibridación, o expresión. El perfil de hibridación de la muestra de ensayo puede después compararse con el de una muestra de control para determinar qué microARN tienen un nivel de expresión alterado en células de cáncer
45 sólido. Como se usa en la presente memoria, “oligonucleótido sonda” u “oligodesoxinucleótido sonda” se refiere a un oligonucleótido que es capaz de hibridar con un oligonucleótido diana. “Oligonucleótido diana” u “oligodesoxinucleótido diana” se refiere a una molécula para detectar (por ejemplo, mediante hibridación). Por “oligonucleótido sonda específico de miR” u “oligonucleótido sonda específico para un miR” se entiende un oligonucleótido sonda que tiene una secuencia seleccionada para hibridar con un producto génico de miR específico, o con un transcrito inverso del producto génico de miR específico.
Un “perfil de expresión” o “perfil de hibridación” de una muestra particular es esencialmente una identificación del estado de la muestra; aunque dos estados pueden tener cualquier gen particular expresado de forma similar, la evaluación de varios genes permite simultáneamente la generación de un perfil de expresión génica que es único 55 para el estado de la célula. Es decir, el tejido normal puede distinguirse del tejido canceroso (por ejemplo, tumoral), y dentro del tejido canceroso, pueden determinarse diferentes estados de pronóstico (por ejemplo, buenas o malas perspectivas de supervivencia a largo plazo). Comparando los perfiles de expresión de tejido de cáncer sólido en diferentes estados, se obtiene información con respecto a qué genes son importantes (incluyendo regulación tanto positiva como negativa de los genes) en cada uno de estos estados. La identificación de secuencias que se expresan diferencialmente en tejido de cáncer sólido, así como la expresión diferencial que da como resultado diferentes resultados de pronóstico, permiten el uso de esta información de varias maneras. Por ejemplo, puede evaluarse un régimen de tratamiento particular (por ejemplo, para determinar si un fármaco quimioterapéutico actúa para mejorar el pronóstico a largo plazo en un paciente particular). De forma similar, el diagnóstico puede realizarse
o confirmarse comparando muestras de pacientes con perfiles de expresión conocidos. Además, estos perfiles de
65 expresión génica (o genes individuales) permiten la exploración de candidatos farmacológicos que suprimen el perfil de expresión de cáncer sólido o convierten un perfil de pronóstico malo en un perfil de pronóstico mejor.
En consecuencia, la invención proporciona métodos para diagnosticar si un sujeto tiene cáncer pancreático, que comprenden transcribir de forma inversa ARN de una muestra de ensayo obtenida del sujeto para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana, hibridar los oligodesoxinucleótidos diana con una microserie que comprende oligonucleótidos sonda específicos de miARN para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra
5 de ensayo, y comparar el perfil de hibridación de la muestra de ensayo con un perfil de hibridación generado a partir de una muestra de control o patrón de referencia, en el que una alteración en la señal del grupo de los productos génicos de miR es indicativa de que el sujeto tiene cáncer pancreático. También se desvelan microseries que comprenden oligonucleótidos sonda específicos de miARN para una parte sustancial de todos los miARN humanos conocidos. La microserie puede comprender oligonucleótidos sonda específicos de miARN para uno o más miARN seleccionados del grupo que consiste en miR-21, miR-17-5p, miR-191, miR-29b-2, miR-223, miR-128b, miR-199a-1, miR-24-1, miR-24-2, miR-146, miR-155, miR-181b-1, miR-20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR-30c, miR25, miR-221, miR-106a y combinaciones de los mismos.
La microserie puede prepararse a partir de sondas oligonucleotídicas específicas de genes generadas de
15 secuencias de miARN conocidas. La serie puede contener dos sondas oligonucleotídicas diferentes para cada miARN, una que contiene la secuencia activa, madura y la otra que es específica para el precursor del miARN. La serie también puede contener controles, tales como una o más secuencias de ratón que difieren de ortólogos humanos en solamente algunas bases, que pueden actuar como controles para las condiciones de rigurosidad de hibridación. También pueden imprimirse ARNt u otros ARN (por ejemplo, ARNr, ARNm) de ambas especies en la microplaca, proporcionando un control positivo interno, relativamente estable, para hibridación específica. También pueden incluirse en la microplaca uno o más controles apropiados para hibridación no específica. Para este fin, las secuencias se seleccionan basándose en la ausencia de cualquier homología con cualquier miARN conocido.
La microserie puede fabricarse usando técnicas conocidas en este campo. Por ejemplo, los oligonucleótidos sonda
25 de una longitud apropiada, por ejemplo, 40 nucleótidos, se modifican con amina 5’ en la posición C6 y se imprimen usando sistemas de microseries disponibles en el mercado, por ejemplo, el Microarrayer GeneMachine OmniGrid™ 100 y portaobjetos activados Amersham CodeLink™. El oligómero de ADNc marcado correspondiente a los ARN diana se prepara por transcripción inversa del ARN diana con cebador marcado. Después de la síntesis de primera cadena, los híbridos de ARN/ADN se desnaturalizan para degradar los moldes de ARN. Los ADNc diana marcados preparados de este modo se hibridan después con la microplaca de microserie en condiciones de hibridación, por ejemplo, SSPE 6X/formamida 30 % a 25 ºC durante 18 horas, seguido de lavado en TNT 0,75X (Tris HCl/NaCl/Tween 20) a 37 ºC durante 40 minutos. En las posiciones de la serie en las que el ADN sonda inmovilizado reconoce un ADNc diana complementario en la muestra, se produce hibridación. El ADNc diana marcado marca la posición exacta en la serie donde se produce unión, permitiendo la detección y cuantificación automática. El
35 resultado consiste en una lista de acontecimientos de hibridación, que indican la abundancia relativa de secuencias de ADNc específicas, y por lo tanto la abundancia relativa de los miR complementarios correspondientes, en la muestra del paciente. El oligómero de ADNc marcado puede ser un ADNc marcado con biotina, preparado a partir de un cebador marcado con biotina. La microserie se procesa después por dirección directa de los transcritos que contienen biotina usando, por ejemplo, conjugado de estreptavidina-Alexa 647, y se explora utilizando métodos de exploración convencionales. Las intensidades de la imagen de cada punto en la serie son proporcionales a la abundancia del miR correspondiente en la muestra del paciente.
El uso de la serie tiene varias ventajas para la detección de expresión de miARN. En primer lugar, la expresión global de varios cientos de genes puede identificarse en la misma muestra en un punto temporal. En segundo lugar,
45 mediante el diseño cuidadoso de las sondas oligonucleotídicas, puede identificarse la expresión de moléculas tanto maduras como precursoras. En tercer lugar, en comparación con análisis de transferencia de Northern, la microplaca requiere una cantidad pequeña de ARN, y proporciona resultados reproducibles usando 2,5 µg de ARN total. El número relativamente limitado de miARN (algunos cientos por especie) permite la construcción de una microserie común para varias especies, con sondas oligonucleotídicas distintas para cada una. Dicha herramienta permitiría el análisis de expresión entre especies para cada miR conocido en diversas condiciones.
Además del uso para los ensayos de nivel de expresión cuantitativa de miR específicos, una microplaca que contiene oligonucleótidos sonda específicos de miARN correspondientes a una parte sustancial del miRNoma, preferentemente el miRNoma completo, puede emplearse para llevar a cabo la determinación de perfiles de
55 expresión génica de miR, para análisis de patrones de expresión de miR. Las identificaciones de miR distintas pueden asociarse con marcadores de enfermedad establecidos, o directamente con una patología.
De acuerdo con los métodos de realizaciones de perfiles de expresión descritos en la presente memoria, el ARN total de una muestra de un sujeto que se sospecha que tiene un cáncer (por ejemplo, un cáncer sólido) se transcribe de forma inversa cuantitativamente para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana marcados complementarios del ARN en la muestra. Los oligodesoxinucleótidos diana se hibridan después con una microserie que comprende oligonucleótidos sonda específicos de miARN para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra. El resultado es un perfil de hibridación para la muestra que representa el patrón de expresión de miARN en la muestra. El perfil de hibridación comprende la señal de la unión de los oligodesoxinucleótidos diana de la muestra 65 con los oligonucleótidos sonda específicos de miARN en la microserie. El perfil puede registrarse como la presencia
o ausencia de unión (señal frente a señal cero). Más preferentemente, el perfil registrado incluye la intensidad de la
señal de cada hibridación. El perfil se compara con el perfil de hibridación generado de una muestra de control normal, es decir, no cancerosa. Una alteración en la señal es indicativa de la presencia de, o propensión a desarrollar, cáncer en el sujeto.
5 Otras técnicas para medir la expresión génica de miR también están dentro de la experiencia de este campo, e incluyen diversas técnicas para medir las tasas de transcripción y degradación de ARN.
Esta divulgación también proporciona métodos para determinar el pronóstico de un sujeto con un cáncer sólido, que comprenden medir el nivel de al menos un producto génico de miR que está asociado con un pronóstico particular 10 en un cáncer sólido (por ejemplo, un pronóstico bueno o positivo, un pronóstico malo a adverso), en una muestra de ensayo del sujeto. De acuerdo con estos métodos, una alteración del nivel de un producto génico de miR que está asociado con un pronóstico particular en la muestra de ensayo, en comparación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en una muestra de control, es indicativa de que el sujeto tiene un cáncer sólido con un pronóstico particular. El producto génico de miR puede asociarse con un pronóstico adverso (es decir, negativo). Los 15 ejemplos de un pronóstico adverso incluyen, pero sin limitación, baja tasa de supervivencia y rápida progresión de enfermedad. El nivel del al menos un producto génico de miR puede medirse por ARN de transcripción inversa a partir de una muestra de ensayo obtenida del sujeto para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana, hibridando los oligodesoxinucleótidos diana con una microserie que comprende oligonucleótidos sonda específicos de miARN para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra de ensayo, y comparando el perfil de
20 hibridación de la muestra de ensayo con un perfil de hibridación generado a partir de una muestra de control.
Sin desear quedar ligado a ninguna teoría, se cree que las alteraciones en el nivel de uno o más productos génicos de miR en células pueden dar como resultado la desregulación de una o más dianas pretendidas para estos miR, lo que puede conducir a la formación de cánceres sólidos. Por lo tanto, la alteración del nivel del producto génico de
25 miR (por ejemplo, reduciendo el nivel de un producto génico de miR que está regulado positivamente en células de cáncer sólido, aumentando el nivel de un producto génico de miR que está regulado negativamente en células de cáncer sólido) puede tratar exitosamente el cáncer sólido. En consecuencia, esta divulgación abarca métodos para inhibir la tumorogénesis en un sujeto que tiene, o se sospecha que tiene, un cáncer sólido en el que al menos un producto génico de miR está desregulado (por ejemplo,
30 regulado positivamente, regulado negativamente) en las células cancerosas del sujeto. Cuando el al menos un producto génico de miR aislado está regulado negativamente en las células cancerosas (por ejemplo, miR-145, miR155, miR-218-2), el método comprende administrar una cantidad eficaz del al menos un producto génico de miR aislado o una variante aislada o fragmento biológicamente activo de los mismos, de modo que se inhiba la proliferación de células cancerosas en el sujeto. El producto génico de miR aislado que se administra puede no ser
35 miR-15a o miR-16-1. Como alternativa, el producto génico de miR puede no ser miR 159-1 o miR-192. Como alternativa, el producto génico de miR puede no ser miR-186, miR-101-1, miR-194, miR-215, miR-106b, miR-25, miR-93, miR-29b, miR-29a, miR-96, miR-182s, miR-182as, miR-183, miR-129-1, let-7a-1, let-7d, let-7f-1, miR-23b, miR-24-1, miR-27b, miR-32, miR-159-1, miR-192, miR-125b-1, let-7a-2, miR-100, miR-196-2, miR-148b, miR-190, miR-21, miR-301, miR-142s, miR-142as, miR-105-1 o miR-175. Como alternativa, el producto génico de miR puede
40 no ser miR-21, miR-301, miR-142as, miR-142s, miR-194, miR-215 o miR-32. Como alternativa, el producto génico de miR puede no ser miR-148, miR-10a, miR-196-1, miR-152, miR-196-2, miR-148b, miR-10b, miR-129-1, miR-1532, miR-202, miR-139, let-7a, let-7f o let-7d. Como alternativa, el producto génico de miR puede no ser miR-30, miR15b, miR-16-2, miR-217, miR-205, miR-204, miR-103, miR-107, miR-9 y miR-137. Como alternativa, el producto génico de miR puede no ser miR-145, miR-21, miR-155, miR-10b, miR-125b-1, miR-125b-2, let7a-2, let7a-3, let-7d,
45 miR-122a, miR-191, miR-206, miR-210, let-7i, miR-009-1 (miR131-1), miR-34 (miR-170), miR-102 (miR-29b), miR123 (miR-126), miR-140-as, miR-125a, miR-194, miR-204, miR-213, let-7f-2, miR-101, miR-128b, miR-136, miR-143, miR-149, miR-191, miR-196-1, miR-196-2, miR-202, miR-103-1 o miR-30c. Como alternativa, el producto génico de miR puede no ser miR-21, miR-125b-1, let-7a-2, let-7i, miR-100, let-7g, miR-31, miR-32a-1, miR-33b, miR-34a-2, miR-101-1, miR-135-1, miR-142as, miR-142s, miR-144, miR-301, miR-29c, miR-30c, miR-106a o miR-29b-1.
50 Por ejemplo, cuando un producto génico de miR está regulado negativamente en una célula cancerosa en un sujeto, la administración de una cantidad eficaz de un producto génico de miR aislado al sujeto puede inhibir la proliferación de la célula cancerosa. El producto génico de miR aislado que se administra al sujeto puede ser idéntico al producto génico de miR natural endógeno (por ejemplo, un producto génico de miR mostrado en la Tabla 1a o Tabla 1b) que
55 está regulado negativamente en la célula cancerosa o puede ser una variante o fragmento biológicamente activo del mismo. Como se define en la presente memoria una “variante” de un producto génico de miR se refiere a un miARN que tiene menos de 100 % de identidad con un producto génico de miR natural correspondiente y posee una o más actividades biológicas del producto génico de miR natural correspondiente. Los ejemplos de dichas actividades biológicas incluyen, pero sin limitación, inhibición de la expresión de la molécula de ARN diana (por ejemplo,
60 inhibiendo la traducción de una molécula de ARN diana, modulando la estabilidad de una molécula de ARN diana, inhibiendo el procesamiento de una molécula de ARN diana) e inhibición de un proceso celular asociado con cáncer sólido (por ejemplo, diferenciación celular, crecimiento celular, muerte celular). Estas variantes incluyen variantes de especie y variantes que son la consecuencia de una o más mutaciones (por ejemplo, una sustitución, una deleción, una inserción) en un gen de miR. La variante puede ser al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %,
65 95 %, 98 % o 99 % idéntica a un producto génico de miR natural correspondiente.
Como se define en la presente memoria, un “fragmento biológicamente activo” de un producto génico de miR se refiere a un fragmento de ARN de un producto génico de miR que posee una o más actividades biológicas de un producto génico de miR natural correspondiente. Como se ha descrito anteriormente, los ejemplos de dichas actividades biológicas incluyen, pero sin limitación, inhibición de la expresión de una molécula de ARN diana e
5 inhibición de un proceso celular asociado con cáncer sólido. El fragmento biológicamente activo puede tener una longitud de al menos aproximadamente 5, 7, 10, 12, 15 o 17 nucleótidos. Un producto génico de miR aislado puede administrarse a un sujeto en combinación con uno o más tratamientos antineoplásicos adicionales. Los tratamientos antineoplásicos adecuados incluyen, pero sin limitación, quimioterapia, radioterapia y combinaciones de las mismas (por ejemplo, quimiorradiación).
Cuando el al menos un producto génico de miR aislado está regulado positivamente en las células cancerosas, el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos un compuesto para inhibir la expresión del al menos un producto génico de miR, denominado en la presente memoria compuesto de inhibición de la expresión génica de miR, de modo que se inhiba la proliferación de células de cáncer sólido. El al menos un compuesto de
15 inhibición de la expresión de miR es específico para un producto génico de miR seleccionado del grupo que consiste en miR-21, miR-17-5p, miR-191, miR-29b-2, miR-223, miR-128b, miR-199a-1, miR-24-1, miR-24-2, miR-146, miR155, miR-181b-1, miR-20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR-30c, miR-25, miR-221, miR-106a y combinaciones de los mismos. Un compuesto de inhibición de la expresión génica de miR puede administrarse a un sujeto en combinación con uno o más tratamientos antineoplásicos adicionales. Los tratamientos antineoplásicos adecuados incluyen, pero sin limitación, quimioterapia, radioterapia y combinaciones de los mismos (por ejemplo, quimiorradiación).
Los términos “tratar”, “tratando” y “tratamiento”, como se usan en la presente memoria, se refieren a aliviar síntomas asociados con una enfermedad o afección, por ejemplo, un cáncer sólido, incluyendo prevenir o retardar la aparición
25 de los síntomas de la enfermedad, y/o reducir la gravedad o frecuencia de los síntomas de la enfermedad o afección. Se define que los términos “sujeto”, “paciente” e “individuo” en la presente memoria incluyen animales, tales como mamíferos, incluyendo, pero sin limitación, primates, vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, conejos, cobayas, ratas, ratones u otras especies bovinas, ovinas, equinas, caninas, felinas, roedoras o murinas. Preferentemente el animal es un ser humano.
Como se usa en la presente memoria, una “cantidad eficaz” de un producto génico de miR aislado es una cantidad suficiente para inhibir la proliferación de una célula cancerosa en un sujeto que padece cáncer sólido. Un experto en la materia puede determinar fácilmente una cantidad eficaz de un producto génico de miR para administrar a un sujeto dado, teniendo en cuenta factores tales como la talla y peso del sujeto; el alcance de la penetración de la
35 enfermedad; la edad, salud y sexo del sujeto; la vía de administración; y si la administración es regional o sistémica.
Por ejemplo, una cantidad eficaz de un producto génico de miR aislado puede basarse en el peso aproximado de una masa tumoral para tratar. El peso aproximado de una masa tumoral puede determinarse calculando el volumen aproximado de la masa, en la que un centímetro cúbico de volumen es aproximadamente equivalente a un gramo. Una cantidad eficaz del producto génico de miR aislado basándose en el peso de una masa tumoral puede estar en el intervalo de aproximadamente 10-500 microgramos/gramo de masa tumoral. La masa tumoral puede ser de al menos aproximadamente 10 microgramos/gramo de masa tumoral, al menos aproximadamente 60 microgramos/gramo de masa tumoral o al menos aproximadamente 100 microgramos/gramo de masa tumoral.
45 Una cantidad eficaz de un producto génico de miR aislado también puede basarse en el peso corporal aproximado o estimado de un sujeto para tratar. Preferentemente, dichas cantidades eficaces se administran por vía parenteral o por vía entérica, como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, una cantidad eficaz del producto génico de miR aislado que se administra a un sujeto puede variar de aproximadamente 53.000 microgramos/kilogramo de peso corporal, de aproximadamente 700-1000 microgramos/kg de peso corporal o más de aproximadamente 1000 microgramos/kg de peso corporal.
Un experto en la materia también puede determinar fácilmente un régimen de dosificación apropiado para la administración de un producto génico de miR aislado a un sujeto dado. Por ejemplo, puede administrarse un producto génico de miR al sujeto una vez (por ejemplo, como una única inyección o deposición). Como alternativa,
55 puede administrarse un producto génico de miR una vez o dos veces al día a un sujeto durante un periodo de aproximadamente tres a aproximadamente veintiocho días, más particularmente de aproximadamente siete a aproximadamente diez días. En un régimen de dosificación particular, se administra un producto génico de miR una vez al día durante siete días. Cuando un régimen de dosificación comprende múltiples administraciones, se entiende que la cantidad eficaz del producto génico de miR administrado al sujeto puede comprender la cantidad total de producto génico administrado durante el régimen de dosificación completo.
Como se usa en la presente memoria, un producto génico de miR “aislado” es uno que se sintetiza, o se altera o retira del estado natural mediante intervención humana. Por ejemplo, un producto génico de miR sintético, o un producto génico de miR parcial o completamente separado de los materiales coexistentes de su estado natural, se 65 considera que está “aislado”. Un producto génico de miR aislado puede existir en forma sustancialmente purificada,
o puede existir en una célula en la que se ha suministrado el producto génico de miR. Por lo tanto, un producto
génico de miR que se suministra deliberadamente a, o se expresa en, una célula se considera un producto génico de miR “aislado”. También se considera que un producto génico de miR producido dentro de una célula a partir de una molécula precursora de miR es una molécula “aislada”. Los productos génicos de miR aislados descritos en la presente memoria pueden usarse para la fabricación de un medicamento para tratar un cáncer sólido en un sujeto
5 (por ejemplo, un ser humano).
Pueden obtenerse productos génicos de miR aislados usando varias técnicas convencionales. Por ejemplo, los productos génicos de miR pueden sintetizarse químicamente o producirse recombinantemente usando métodos conocidos en este campo. Los productos génicos de miR pueden sintetizarse químicamente usando fosforamiditas ribonucleosídicas protegidas apropiadamente y un sintetizador de ADN/ARN convencional. Los proveedores comerciales de moléculas de ARN sintéticas o reactivos de síntesis incluyen, por ejemplo, Proligo (Hamburgo, Alemania), Dharmacon Research (Lafayette, CO, Estados Unidos), Pierce Chemical (parte de Perbio Science, Rockford, IL, Estados Unidos), Glen Research (Sterling, VA, Estados Unidos), ChemGenes (Ashland, MA, Estados Unidos) y Cruachem (Glasgow, Reino Unido).
15 Como alternativa, los productos génicos de miR pueden expresarse a partir de plásmidos de ADN circulares o lineales recombinantes usando cualquier promotor adecuado. Los promotores adecuados para expresar ARN a partir de un plásmido incluyen, por ejemplo, las secuencias promotoras de pol III de ARN U6 o H1, o los promotores de citomegalovirus. La selección de otros promotores adecuados está dentro de la experiencia de la técnica. Los plásmidos recombinantes también pueden comprender promotores inducibles o regulables para expresión de los productos génicos de miR en células cancerosas.
Los productos génicos de miR que se expresan a partir de plásmidos recombinantes pueden aislarse de sistemas de expresión de células cultivadas por técnicas convencionales. Los productos génicos de miR que se expresan a partir
25 de plásmidos recombinantes también pueden suministrarse a, y expresarse directamente en, las células cancerosas. El uso de plásmidos recombinantes para suministrar los productos génicos de miR a células cancerosas se analiza en más detalle posteriormente. Los productos génicos de miR pueden expresarse a partir de un plásmido recombinante separado, o pueden expresarse a partir del mismo plásmido recombinante. Los productos génicos de miR pueden expresarse como moléculas precursoras de ARN a partir de un único plásmido, y las moléculas precursoras se procesan en el producto génico de miR funcional por un sistema de procesamiento adecuado, incluyendo, pero sin limitación, sistemas de procesamiento existentes dentro de una célula cancerosa. Otros sistemas de procesamiento adecuados incluyen, por ejemplo, el sistema de lisado celular de Drosophila in vitro (por ejemplo, como se describe en la Solicitud de Patente Publicada en Estados Unidos N 2002/0086356 de Tuschl et al.) y el sistema de RNAsa III de E.
35 coli (por ejemplo, como se describe en la Solicitud de Patente Publicada de Estados Unidos Nº 2004/0014113 de Yang et al.).
La selección de plásmidos adecuados para expresar los productos génicos de miR, métodos para insertar secuencias de ácido nucleico en el plásmido para expresar los productos génicos, y métodos para suministrar el plásmido recombinante a las células de interés están dentro de la experiencia de la técnica. Véase, por ejemplo, Zeng et al. (2002), Molecular Cell 9: 1327-1333; Tuschl (2002), Nat. Biotechnol, 20: 446-448; Brummelkamp et al. (2002), Science 296: 550-553; Miyagishi et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 497-500; Paddison et al. (2002), Genes Dev. 16: 948-958; Lee et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 500-505; y Paul et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 505-508.
45 Un plásmido que expresa los productos génicos de miR puede comprender una secuencia que codifica un ARN precursor de miR bajo el control del promotor intermedio-temprano de CMV. Como se usa en la presente memoria, “bajo el control” de un promotor significa que las secuencias de ácido nucleico que codifican el producto génico de miR se localizan 3’ del promotor, de modo que el promotor puede iniciar la transcripción de las secuencias codificantes del producto génico de miR.
Los productos génicos de miR también pueden expresarse a partir de vectores virales recombinantes. Se contempla que los productos génicos de miR pueden expresarse a partir de dos vectores virales recombinantes separados, o del mismo vector viral. El ARN expresado a partir de dos vectores virales recombinantes puede aislarse de sistemas de expresión de células cultivadas por técnicas convencionales, o puede expresarse directamente en células
55 cancerosas. El uso de vectores virales recombinantes para suministrar los productos génicos de miR a células cancerosas se analiza en más detalle posteriormente.
Los vectores virales recombinantes comprenden secuencias que codifican los productos génicos de miR y cualquier promotor adecuado para expresar las secuencias de ARN. Los promotores adecuados incluyen, pero sin limitación, las secuencias promotoras de pol III de ARN U6 o H1, o los promotores de citomegalovirus. La selección de otros promotores adecuados está dentro de la experiencia de la técnica. Los vectores virales recombinantes también pueden comprender promotores inducibles o regulables para la expresión de los productos génicos de miR en una célula cancerosa.
65 Puede usarse cualquier vector viral capaz de aceptar las secuencias codificantes para los productos génicos de miR; por ejemplo, vectores derivados de adenovirus (AV); virus adenoasociados (AAV); retrovirus (por ejemplo, lentivirus
(LV), Rhabdovirus, virus de leucemia murina); virus del herpes y similares. El tropismo de los vectores virales pueden modificarse por seudotipación de los vectores con proteínas de envoltura u otros antígenos superficiales de otros virus, o sustituyendo diferentes proteínas de cápsida viral, según sea apropiado.
5 Por ejemplo, los vectores lentivirales pueden seudotipificarse con proteínas de superficie de virus de estomatitis vesicular (VSV), rabia, Ébola, Mokola y similares. Pueden realizarse vectores de AAV para dirigirse a células diferentes modificando por ingeniería genética los vectores para expresar diferentes serotipos de proteínas de la cápsida. Por ejemplo, un vector de AAV que expresa una cápsida de serotipo 2 en un genoma de serotipo 2 se denomina AAV 2/2. Este gen de cápsida de serotipo 2 en el vector de AAV 2/2 puede reemplazarse por un gen de cápsida de serotipo 5 para producir un vector de AAV 2/5. Las técnicas para construir vectores de AAV que expresan diferentes serotipos de proteínas de la cápsida están dentro de la experiencia de la técnica; véase, por ejemplo, Rabinowitz, J. E., et al. (2002), J. Virol. 76: 791-801.
La selección de vectores virales recombinantes, métodos para insertar secuencias de ácido nucleico para expresar
15 ARN en el vector, métodos para suministrar el vector viral a las células de interés y recuperación de los productos de ARN expresados están dentro de la experiencia de la técnica. Véase, por ejemplo, Domburg (1995), Gene Therapy
2: 301-310; Eglitis (1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller (1990), Hum. Gene Therapy 1: 5-14; y Anderson (1998), Nature 392: 25-30.
Son vectores virales particularmente adecuados los derivados de AV y AAV. Se describen un vector de AV adecuado para expresar los productos génicos de miR, un método para construir el vector de AV recombinante y un método para suministrar el vector a células diana, en Xia et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010. Se describen vectores de AAV adecuados para expresar los productos génicos de miR, métodos para construir el vector de AAV recombinante y métodos para suministrar los vectores a células diana en Samulski et al. (1987), J. Virol. 61: 3096
25 3101; Fisher et al. (1996), J. Virol., 70: 520-532; Samulski et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; Patente de Estados Unidos Nº 5.252.479; Patente de Estados Unidos Nº 5.139.941; Solicitud de Patente Internacional Nº WO 94/13788; y Solicitud de Patente Internacional Nº WO 93/24641. En una realización, los productos génicos de miR se expresan a partir de un único vector de AAV recombinante que comprende el promotor intermedio temprano de CMV.
Un vector viral de AAV recombinante puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifique un ARN precursor de miR en conexión operativa con una secuencia de terminación poliT bajo el control de un promotor de ARN U6 humano. Como se usa en la presente memoria, “en conexión operativa con una secuencia de terminación poliT” significa que las secuencias de ácido nucleico que codifican las cadenas con sentido o antisentido están inmediatamente adyacentes a la señal de terminación poliT en la dirección 5’. Durante la transcripción de las
35 secuencias de miR del vector, las señales de terminación poliT actúan para terminar la transcripción.
Como alternativa, al sujeto se le puede administrar una cantidad eficaz de al menos un compuesto que inhibe la expresión de miR. Como se usa en la presente memoria, “inhibir la expresión de miR” significa que la producción del precursor y/o la forma madura, activa del producto génico de miR después del tratamiento es menor que la cantidad producida antes del tratamiento. Un experto en la materia puede determinar fácilmente si se ha inhibido la expresión de miR en una célula cancerosa, usando, por ejemplo, las técnicas para determinar el nivel de transcrito de miR analizadas anteriormente para el método de diagnóstico. La inhibición puede producirse al nivel de la expresión génica (es decir, inhibiendo la transcripción de un gen de miR que codifica el producto génico de miR) o el nivel de procesamiento (por ejemplo, inhibiendo el procesamiento de un precursor de miR en un miR activo, maduro).
45 Como se usa en la presente memoria, una “cantidad eficaz” de un compuesto que inhibe la expresión de miR es una cantidad suficiente para inhibir la proliferación de una célula cancerosa en un sujeto que padece un cáncer (por ejemplo, un cáncer sólido). Un experto en la materia puede determinar fácilmente una cantidad eficaz de un compuesto de inhibición de la expresión de miR para administrar a un sujeto dado, teniendo en cuenta factores tales como la talla y el peso del sujeto; el alcance de la penetración de la enfermedad; la edad, salud y sexo del sujeto; la vía de administración; y si la administración es regional o sistémica.
Por ejemplo, una cantidad eficaz del compuesto de inhibición de la expresión puede basarse en el peso aproximado de una masa tumoral para tratar, como se describe en la presente memoria. Una cantidad eficaz de un compuesto
55 que inhibe la expresión de miR también puede basarse en el peso corporal aproximado o estimado de un sujeto para tratar, como se describen en la presente memoria.
Un experto en la materia también puede determinar fácilmente un régimen de dosificación apropiado para administrar un compuesto que inhibe la expresión de miR a un sujeto dado.
Los compuestos adecuados para inhibir la expresión génica de miR incluyen ARN bicatenario (tal como ARN de interferencia corto o pequeño o “ARNip”), ácidos nucleicos antisentido y moléculas de ARN enzimático, tales como ribozimas. Cada uno de estos compuestos puede dirigirse a un producto génico de miR dado e interferir con la expresión (por ejemplo, inhibir la traducción, inducir la escisión o destrucción) del producto génico de miR diana.
65 Por ejemplo, la expresión de un gen de miR dado puede inhibirse induciendo la interferencia de ARN del gen de miR
con una molécula de ARN bicatenario (“ARNbc”) aislada que tiene al menos 90 %, por ejemplo al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % de homología de secuencia con al menos una parte del producto génico de miR. La molécula de ARNbc puede ser un “ARN de interferencia corto o pequeño” o “ARNip”.
5 El ARNip útil en los presentes métodos comprende ARN bicatenario corto de aproximadamente 17 nucleótidos a aproximadamente 29 nucleótidos de longitud, preferentemente de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. El ARNip comprende una cadena de ARN con sentido y una cadena de ARN antisentido complementaria, hibridadas entre sí por interacción de formación de pares de bases de Watson-Crick convencionales (en lo sucesivo en la presente memoria “con formación de pares de bases”). La cadena con sentido comprende una secuencia de ácido nucleico que es sustancialmente idéntica a una secuencia de ácido nucleico contenida dentro del producto génico de miR diana.
Como se usa en la presente memoria, una secuencia de ácido nucleico en un ARNip que es “sustancialmente idéntico” a una secuencia diana contenida dentro del ARNm diana es una secuencia de ácido nucleico que es
15 idéntica a la secuencia diana, o que difiere de la secuencia diana en uno o dos nucleótidos. Las cadenas con sentido y antisentido del ARNip pueden comprender dos moléculas de ARN monocatenarias, complementarias, o pueden comprender una única molécula en la que dos partes complementarias forman pares de bases y están ligadas covalentemente por un área de “horquilla” monocatenaria.
El ARNip también puede ser ARN alterado que difiere del ARN de origen natural por la adición, deleción, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como en el extremo o los extremos del ARNip o en uno o más nucleótidos internos del ARNip, o modificaciones que hacen al ARNip resistente a la digestión por nucleasa, o la sustitución de uno o más nucleótidos en el ARNip con desoxirribonucleótidos.
25 Una o ambas cadenas del ARNip también puede comprender un saliente 3’. Como se usa en la presente memoria, un “saliente 3’” se refiere a al menos un nucleótido no emparejado que se extiende desde el extremo 3’ de una cadena de ARN bicatenaria. Por lo tanto, el ARNip puede comprender al menos un saliente 3’ de 1 a aproximadamente 6 nucleótidos (que incluye ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos) de longitud, de 1 a aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, de 1 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud. El saliente 3’ puede estar presente en ambas cadenas del ARNip, y tiene una longitud de 2 nucleótidos. Por ejemplo, cada cadena del ARNip puede comprender salientes 3’ de ácido ditimidílico (“TT”) o ácido diuridílico (“uu”).
35 El ARNip puede producirse de forma química o biológica, o puede expresarse a partir de un plásmido recombinante
o vector viral, como se ha descrito anteriormente para los productos génicos de miR aislados. Se describen métodos ejemplares para producir y ensayar moléculas de ARNbc o ARNip en la Solicitud de Patente Publicada de Estados Unidos Nº 2002/0173478 de Gewirtz y en la Solicitud de Patente Publicada de Estados Unidos Nº 2004/0018176 de Reich et al.
La expresión de un gen de miR dado también puede inhibirse por un ácido nucleico antisentido. Como se usa en la presente memoria, un “ácido nucleico antisentido” se refiere a una molécula de ácido nucleico que se une a ARN diana por medio de interacciones de ARN-ARN, ARN-ADN o ARN-ácido peptidonucleico, que alteran la actividad del ARN diana. Son ácidos nucleicos antisentido adecuados para su uso en los presentes métodos ácidos nucleicos
45 monocatenarios (por ejemplo, ARN, ADN, quimeras de ARN-ADN, ácido peptidonucleico (PNA)) que generalmente comprenden una secuencia de ácido nucleico complementaria de una secuencia de ácido nucleico contigua en un producto génico de miR. El ácido nucleico antisentido puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es 50-100 % complementaria, 75-100 % complementaria o 95-100 % complementaria de una secuencia de ácido nucleico contigua en un producto génico de miR. En las Tablas 1a y 1b se proporcionan secuencias de ácido nucleico para los productos génicos de miR. Sin desear quedar ligado a ninguna teoría, se cree que los ácidos nucleicos antisentido activan RNasa H u otra nucleasa celular que digiere la doble cadena de producto génico de miR/ácido nucleico antisentido.
Los ácidos nucleicos antisentido también pueden contener modificaciones de la cadena principal de ácido nucleico o
55 de los restos de azúcar y base (o su equivalente) para potenciar la especificidad diana, resistencia a nucleasa, suministro u otras propiedades relacionadas con la eficacia de la molécula. Dichas modificaciones incluyen restos de colesterol, intercaladores bicatenarios, tales como acridina, o uno o más grupos resistentes a nucleasa.
Pueden producirse ácidos nucleicos antisentido de forma química o biológica, o pueden expresarse a partir de un plásmido o vector viral recombinante, como se ha descrito anteriormente para los productos génicos de miR aislados. Están dentro de la experiencia de la técnica métodos ejemplares para producir y ensayar; véase, por ejemplo, Stein y Cheng (1993), Science 261: 1004 y Patente de Estados Unidos Nº 5.849.902 de Woolf et al.
La expresión de un gen de miR dado también puede inhibirse por un ácido nucleico enzimático. Como se usa en la
65 presente memoria, un “ácido nucleico enzimático” se refiere a un ácido nucleico que comprende una región de unión a sustrato que tiene complementariedad con una secuencia de ácido nucleico contigua de un producto génico de
miR, y que es capaz de escindir específicamente el producto génico de miR. La región de unión al sustrato de ácido nucleico enzimático puede ser, por ejemplo, 50-100 % complementaria, 75-100 % complementaria o 95-100 % complementaria de una secuencia de ácido nucleico contigua en un producto génico de miR. Los ácidos nucleicos enzimáticos también pueden comprender modificaciones en los grupos de base, azúcar y/o fosfato. Un ácido
5 nucleico enzimático ejemplar para su uso en los presentes métodos es una ribozima.
Los ácidos nucleicos enzimáticos pueden producirse de forma química o biológica, o pueden expresarse a partir de un plásmido o vector viral recombinante, como se ha descrito anteriormente para los productos génicos de miR aislados. Se describen métodos ejemplares para producir y ensayar moléculas de ARNbc o ARNip en Werner y Uhlenbeck (1995), Nucl. Acids Res. 23: 2092-96; Hammann et al. (1999), Antisense and Nucleic Acid Drug Dev. 9: 25-31; y Patente de Estados Unidos Nº 4.987.071 de Cech et al.
La administración de al menos un producto génico de miR, o al menos un compuesto para inhibir la expresión de miR, inhibirá la proliferación de células cancerosas en un sujeto que tiene un cáncer sólido. Como se usa en la 15 presente memoria, “inhibir la proliferación de una célula cancerosa” significa destruir la célula, o detener permanente
o temporalmente o ralentizar el crecimiento de la célula. La inhibición de la proliferación de células cancerosas puede inferirse si el número de dichas células en el sujeto permanece constante o se reduce después de la administración de los productos génicos de miR o los compuestos de inhibición de la expresión del gen de miR. Una inhibición de la proliferación de células cancerosas puede también inferirse si el número absoluto de dichas células aumenta, pero la tasa de crecimiento tumoral disminuye.
El número de células cancerosas en el cuerpo de un sujeto puede determinarse por medición directa, o mediante estimación del tamaño de las masas tumorales primaras o metastásicas. Por ejemplo, el número de células cancerosas en un sujeto puede medirse por métodos inmunohistológicos, citometría de flujo, u otras técnicas
25 diseñadas para detectar marcadores de superficie característicos de células cancerosas.
El tamaño de una masa tumoral puede determinarse por observación visual directa, o por métodos de formación de imágenes de diagnóstico, tales como rayos X, formación de imágenes por resonancia magnética, ultrasonidos y escintigrafía. Pueden emplearse métodos de formación de imágenes de diagnóstico usados para determinar el tamaño de la masa tumoral con o sin agentes de contraste, como se conoce en la técnica. El tamaño de una masa tumoral también puede determinare por medios físicos, tales como palpación de la masa tisular o medición de la masa tisular con un instrumento de medición, tal como un calibrador.
Los productos génicos de miR o compuestos de inhibición de la expresión génica de miR pueden administrarse a un
35 sujeto por cualquier medio adecuado para suministrar estos compuestos a células cancerosas del sujeto. Por ejemplo, los productos génicos de miR o compuestos de inhibición de la expresión de miR pueden administrarse por métodos adecuados para transfectar células del sujeto con estos compuestos, o con ácidos nucleicos que comprenden secuencias que codifican estos compuestos. Las células se transfectan con un vector plasmídico o viral que comprende secuencias que codifican al menos un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de miR.
Se conocen bien en la técnica métodos de transfección para células eucariotas e incluyen, por ejemplo, inyección directa del ácido nucleico en el núcleo o pronúcleo de una célula; electroporación; transferencia de liposomas o transferencia mediada por materiales lipófilos; suministro de ácidos nucleicos mediado por receptor, biobalística o
45 aceleración de partículas; precipitación con fosfato cálcico y transfección mediada por vectores virales.
Por ejemplo, las células pueden transfectarse con un compuesto de transferencia liposómico, por ejemplo, DOTAP (N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetil-amonio metilsulfato, Boehringer-Mannheim) o un equivalente, tal como LIPOFECTINA. La cantidad de ácido nucleico usada no es crítica; pueden conseguirse resultados aceptables con 0,1-100 microgramos de ácido nucleico/105 células. Por ejemplo, puede usarse una relación de aproximadamente 0,5 microgramos de vector plasmídico en 3 microgramos de DOTAP por cada 105 células.
También puede administrarse un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de miR a un sujeto por cualquier vía de administración entérica o parenteral adecuada. Las vías de administración entéricas
55 adecuadas para los presentes métodos incluyen, por ejemplo, suministro oral, rectal o intranasal. Las vías de administración parenterales adecuadas incluyen, por ejemplo, administración intravascular (por ejemplo, inyección de embolada intravenosa, infusión intravenosa, inyección de embolada intraarterial, infusión intraarterial e instilación por catéter en la vasculatura); inyección peri e intratisular (por ejemplo, inyección peritumoral e intratumoral, inyección intrarretinal o inyección subretinal); inyección o deposición subcutánea, incluyendo infusión subcutánea (tal como por bombas osmóticas); aplicación directa al tejido de interés, por ejemplo por un catéter y otro dispositivo de colocación (por ejemplo, un gránulo retinal o un supositorio o un implante que comprenda un material poroso, no poroso o gelatinoso); e inhalación. Son vías de administración particularmente adecuadas inyección, infusión e inyección directa en el tumor.
65 En los presentes métodos, puede administrarse un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión de producto génico de miR al sujeto como ARN desnudo, en combinación con un reactivo de suministro, o
como un ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido recombinante o vector viral) que comprende secuencias que expresan el producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión del producto génico de miR. Los reactivos de suministro adecuados incluyen, por ejemplo, el reactivo lipófilo Mirus Transit TKO; lipofectina; lipofectamina; celfectina; policationes (por ejemplo, polilisina) y liposomas.
5 Se analizan en la presente memoria y/o se conocen bien en la técnica plásmidos recombinantes y vectores virales que comprenden secuencias que expresan los productos génicos de miR o compuestos de inhibición de la expresión génica de miR, y técnicas para suministrar dichos plásmidos y vectores a células cancerosas.
Para suministrar a un sujeto un producto génico de miR o compuestos de inhibición de la expresión génica de miR (o ácidos nucleicos que comprenden secuencias que los codifican) se usan liposomas. Los liposomas también pueden aumentar la semivida en sangre de los productos génicos o ácidos nucleicos. Pueden formarse liposomas adecuados a partir de lípidos formadores de vesículas convencionales, que generalmente incluyen fosfolípidos neutros o cargados negativamente y un esterol, tal como colesterol. La selección de lípidos generalmente se guía
15 por la consideración de factores, tales como el tamaño de liposoma deseado y la semivida de los liposomas en el torrente sanguíneo. Se conocen diversos métodos para preparar liposomas, por ejemplo, como se describe en Szoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467; y Patentes de Estados Unidos Nº 4.235.871, 4.501.728,
4.837.028 y 5.019.369.
Los liposomas para su uso en los presentes métodos pueden comprender una molécula ligando que dirige el liposoma a células cancerosas. Se prefieren ligandos que se unan a receptores prevalentes en células cancerosas, tales como anticuerpos monoclonales que se unen a antígenos celulares tumorales.
Los liposomas para su uso en los presentes métodos también pueden modificarse para evitar la eliminación por el
25 sistema de macrófagos mononucleares (“MMS”) y el sistema reticuloendotelial (“RES”). Dichos liposomas modificados tienen restos de inhibición de la opsonización en la superficie o incorporados en la estructura del liposoma. Un liposoma puede comprender tanto un resto de inhibición de la opsonización como un ligando. Los restos inhibidores de la opsonización para su uso en la preparación de los liposomas son normalmente polímeros hidrófilos grandes que se unen a la membrana del liposoma. Como se usa en la presente memoria, un resto inhibidor de opsonización está “unido” a una membrana del liposoma cuando está química o físicamente unido a la membrana, por ejemplo, por la intercalación de un anclaje soluble en lípidos en la membrana en sí misma, o por unión directamente con grupos activos de lípidos de membrana. Estos polímeros hidrófilos inhibidores de opsonización forman una capa superficial protectora que reduce significativamente la captación de los liposomas por el MMS y RES; por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4.920.016.
35 Los restos inhibidores de opsonización adecuados para modificar liposomas son preferentemente polímeros solubles en agua con un peso molecular medio en número de aproximadamente 500 a aproximadamente 40.000 Dalton, y más preferentemente de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 20.000 Dalton. Dichos polímeros incluyen derivados de polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol (PPG); por ejemplo, metoxi PEG o PPG y estearato de PEG o PPG; polímeros sintéticos, tales como poliacrilamida o poli N-vinil pirrolidona; poliamidoaminas lineales, ramificadas
o dendriméricas; ácidos poliacrílicos; polialcoholes, por ejemplo, polivinilalcohol y polixilitol a los que se unen químicamente grupos carboxílicos o amino, así como gangliósidos, tales como gangliósido GM1. También son adecuados copolímeros de PEG, metoxi PEG o metoxi PPG o derivados de los mismos. Además, el polímero inhibidor de opsonización puede ser un copolímero en bloque de PEG y un poliamino ácido, polisacárido,
45 poliamidoamina, polietilenamina o polinucleótido. Los polímeros inhibidores de opsonización también pueden ser polisacáridos naturales que contienen aminoácidos o ácidos carboxílicos, por ejemplo, ácido galacturónico, ácido glucurónico, ácido manurónico, ácido hialurónico, ácido péctico, ácido neuramínico, ácido algínico, carragenina; polisacáridos u oligosacáridos aminados (lineales o ramificados); o polisacáridos u oligosacáridos carboxilados, por ejemplo, que han reaccionado con derivados de ácidos carbónicos con enlace resultante de grupos carboxílicos. Preferentemente, el resto de inhibición de la opsonización es un PEG, PPG o un derivado de los mismos. Los liposomas modificados con PEG o derivados de PEG se denominan en ocasiones “liposomas PEGilados”.
El resto inhibidor de la opsonización puede estar unido a la membrana del liposoma por una cualquiera de numerosas técnicas bien conocidas. Por ejemplo, un éster de N-hidroxisuccinimida de PEG puede estar unido a un
55 anclaje soluble en lípidos de fosfatidiletanolamina, y después unido a una membrana. De forma similar, un polímero de dextrano puede derivatizarse con un anclaje soluble en lípidos de estearilamina mediante aminación reductora usando Na(CN)BH3 y una mezcla de disolvente, tal como tetrahidrofurano y agua en una relación 30:12 a 60 ºC.
Los liposomas modificados con restos inhibidores de opsonización permanecen en la circulación durante mucho más tiempo que los liposomas no modificados. Por esta razón, dichos liposomas se denominan en ocasiones liposomas “sigilosos”. Se sabe que los liposomas sigilosos se acumulan en tejidos alimentados por microvasculatura porosa o “filtrante”. Por lo tanto, el tejido caracterizado por dichos defectos de microvasculatura, por ejemplo, tumores sólidos, acumularán eficazmente estos liposomas; véase Gabizon, et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 18: 6949-53. Además, la captación reducida por el RES reduce la toxicidad de los liposomas sigilosos evitando la acumulación
65 significativa de los liposomas en el hígado y el bazo. Por lo tanto, los liposomas que se modifican con restos inhibidores de la opsonización son particularmente adecuados para suministrar los productos génicos de miR o
compuestos de inhibición de la expresión génica de miR (o ácidos nucleicos que comprenden secuencias que los codifican) a células tumorales.
Los productos génicos de miR o compuestos de inhibición de la expresión génica de miR pueden formularse como
5 composiciones farmacéuticas, denominadas en ocasiones “medicamentos”, antes de administrarlos a un sujeto, de acuerdo con técnicas conocidas en este campo. En consecuencia, esta divulgación abarca composiciones farmacéuticas para tratar un cáncer sólido. La composición farmacéutica puede comprender al menos un producto génico de miR aislado, o una variante aislada o fragmento biológicamente activo del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El al menos un producto génico de miR puede corresponder a un producto génico de miR que tiene un nivel reducido de expresión en células de cáncer sólido en relación con células de control adecuadas. El producto génico de miR aislado se selecciona del grupo que consiste en miR-145, miR-155, miR-2182 o combinaciones de los mismos.
Las composiciones farmacéuticas pueden comprender al menos un compuesto de inhibición de la expresión de miR.
15 El al menos un compuesto de inhibición de la expresión génica de miR puede ser específico para un gen de miR cuya expresión es mayor en células de cáncer sólido que en células de control. El compuesto de inhibición de la expresión génica de miR es específico para uno o más productos génicos de miR seleccionados del grupo que consiste en miR-21, miR-17-5p, miR-191, miR-29b-2, miR-223, miR-128b, miR-199a-1, miR-24-1, miR-24-2, miR146, miR-155, miR-181b-1, miR-20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR-30c, miR-25, miR-221, miR-106a y combinaciones de los mismos.
Las composiciones farmacéuticas se caracterizan como al menos estériles y sin pirógenos. Como se usa en la presente memoria, las “composiciones farmacéuticas” incluyen formulaciones para uso humano y veterinario. Los métodos para preparar las composiciones farmacéuticas están dentro de la experiencia de la técnica, por ejemplo
25 como se describe en Remington’s Pharmaceutical Science, 17ª ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985).
Las presentes composiciones farmacéuticas comprenden al menos un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de miR (o al menos un ácido nucleico que comprende secuencias que los codifican) (por ejemplo, de 0,1 a 90 % en peso), o una sal fisiológicamente aceptable de los mismos, mezclados con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender adicionalmente uno o más agentes antineoplásicos (por ejemplo, agentes quimioterapéuticos). Las formulaciones farmacéuticas también pueden comprender al menos un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de miR (o al menos un ácido nucleico que comprende secuencias que los codifican), que están encapsulados por liposomas y un vehículos farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender un gen o
35 producto génico de miR que no es miR-15 y/o miR-16.
Son vehículos farmacéuticamente aceptables especialmente adecuados agua, agua tamponada, solución salina normal, solución salina 0,4 %, glicina 0,3 %, ácido hialurónico y similares.
Las composiciones farmacéuticas pueden comprender al menos un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de miR (o al menos un ácido nucleico que comprende secuencias que los codifican) que es resistente a la degradación por nucleasas. Un experto en la materia puede sintetizar fácilmente ácidos nucleicos que son resistentes a nucleasa, por ejemplo, incorporando uno o más ribonucleótidos que se modifican en la posición 2’ en el producto génico de miR. Los ribonucleótidos modificados 2’ adecuados incluyen los
45 modificados en la posición 2’ con flúor, amino, alquilo, alcoxi y O-alilo.
Las composiciones farmacéuticas pueden comprender también excipientes y/o aditivos farmacéuticos convencionales. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen estabilizadores, antioxidantes, agentes de ajuste de la osmolalidad, tampones y agentes de ajuste de pH. Los aditivos adecuados incluyen, por ejemplo, tampones fisiológicamente biocompatibles (por ejemplo, clorhidrato de trometamina), adiciones de quelantes (tales como, por ejemplo, DTPA o DTPA-bisamida) o complejos de quelado de calcio (tales como, por ejemplo, DTPA de calcio, CaNaDTPA-bisamida) u, opcionalmente, adiciones de sales de calcio o sodio (por ejemplo cloruro cálcico, ascorbato cálcico, gluconato cálcico o lactato cálcico). Las composiciones farmacéuticas pueden envasarse para su uso en forma líquida, o pueden liofilizarse.
55 Para composiciones farmacéuticas sólidas pueden usarse vehículos farmacéuticamente aceptables sólidos no tóxicos convencionales; por ejemplo, usos farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares.
Por ejemplo, una composición farmacéutica sólida para administración oral puede comprender cualquiera de los vehículos y excipientes enumerados anteriormente y 10-95 %, preferentemente 25 %-75 %, del al menos un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de miR (o al menos un ácido nucleico que comprende secuencias que los codifican). Una composición farmacéutica para administración por aerosol (de inhalación) puede comprender 0,01-20 % en peso, preferentemente 1 %-10 % en peso, del al menos un producto 65 génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de miR (o al menos un ácido nucleico que comprende secuencias que los codifican) encapsulado en un liposoma como se ha descrito anteriormente, y un
propulsor. También puede incluirse un vehículo según se desee; por ejemplo, lecitina para suministro intranasal.
Las composiciones farmacéuticas pueden comprender además uno o más agentes antineoplásicos. Las composiciones comprenden al menos un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica 5 de miR (o al menos un ácido nucleico que comprende secuencias que los codifican) y al menos un agente quimoterapéutico. Los agentes quimioterapéuticos que son adecuados para los métodos divulgados en la presente memoria incluyen, pero sin limitación, agentes alquilantes de ADN, agentes antibióticos antitumorales, agentes antimetabólicos, agentes estabilizadores de tubulina, agentes desestabilizadores de tubulina, agentes antagonistas de hormonas, inhibidores de topoisomerasa, inhibidores de proteína quinasa, inhibidores de HMG-CoA, inhibidores de CDK, inhibidores de ciclina, inhibidores de caspasa, inhibidores de metaloproteinasa, ácidos nucleicos antisentido, ADN de triple hélice, aptámeros de ácidos nucleicos y agentes virales, bacterianos y exotóxicos modificados molecularmente. Los ejemplos de agentes adecuados para las composiciones incluyen, pero sin limitación, arabinósido de citidina, metotrexato, vincristina, etopósido (VP-16), doxorrubicina (adriamicina), cisplatino (CDDP), dexametasona, arglabina, ciclofosfamida, sarcolisina, metilnitrosourea, fluorouracilo, 5-fluorouracilo (5FU),
15 vinblastina, camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C, peróxido de hidrógeno, oxaliplatino, irinotecán, topotecán, leucovorina, carmustina, estreptozocina, CPT-11, taxol, tamoxifeno, dacarbacina, rituximab, daunorrubicina, 1-β-Darabinofuranosilcitosina, imatinib, fludarabina, docetaxel, FOLFOX4.
También se desvelan métodos para identificar un inhibidor de tumorogénesis, que comprenden proporcionar un agente de ensayo a una célula y medir el nivel de al menos un producto génico de miR en la célula. El método comprende proporcionar un agente de ensayo a una célula y medir el nivel de al menos un producto génico de miR asociado con niveles de expresión reducidos en células cancerosas. Un aumento del nivel del producto génico de miR de la célula después de que se proporcione el agente, en relación con una célula de control adecuada (por ejemplo, no se proporciona agente), es indicativo de que el agente de ensayo es un inhibidor de tumorogénesis. Al
25 menos un producto génico de miR asociado con los niveles de expresión reducidos en células cancerosas puede seleccionarse del grupo que consiste en miR-145, miR-155, miR-218-2 y combinaciones de los mismos.
Como alternativa, el método puede comprender proporcionar un agente de ensayo a una célula y medir el nivel de al menos un producto génico de miR asociado con niveles de expresión aumentados en células cancerosas. Una reducción del nivel del producto génico de miR en la célula después de que se proporciones el agente, en relación con una célula de control adecuada (por ejemplo, no se proporciona agente) es indicativa de que el agente de ensayo es un inhibidor de tumorogénesis. Al menos un producto génico de miR puede asociarse con niveles de expresión aumentados en células cancerosas se selecciona del grupo que consiste en miR-21, miR-17-5p, miR-191, miR-29b-2, miR-223, miR-128b, miR-199a-1, miR-24-1, miR-24-2, miR-146, miR-155, miR-181b-1, miR-20a, miR
35 107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR-30c, miR-25, miR-221, miR-106a.
Los agentes adecuados incluyen, pero sin limitación fármacos (por ejemplo, moléculas pequeñas, péptidos) y macromoléculas biológicas (por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos). El agente puede producirse de forma recombinante, sintética o puede aislarse (es decir purificarse) de una fuente natural. Se conocen bien en la técnica diversos métodos para proporcionar dichos agentes a una célula (por ejemplo, transfección), y varios de dichos métodos se han descrito anteriormente en la presente memoria. También se conocen bien en la técnica métodos para detectar la expresión de al menos un producto génico de miR (por ejemplo, transferencia de Northern, hibridación in situ, RT-PCR, perfiles de expresión). Varios de estos métodos también se han descrito anteriormente en la presente memoria.
45 La invención se ilustrará ahora por los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplificación
Los siguientes Materiales y Métodos se usaron en los Ejemplos:
Muestras
Se usaron un total de 540 muestras, incluyendo 363 muestras de tumores primarios y 177 tejidos normales, en este
55 estudio (Tabla 2). Se representaron los siguientes cánceres sólidos: carcinoma de pulmón, carcinoma de mama, carcinoma de próstata, carcinoma de estómago, carcinoma de colon y tumores endocrinos pancreáticos. Todas las muestras se obtuvieron con el consentimiento informado de cada paciente y se confirmaron histológicamente. Las muestras normales se emparejaron con muestras de individuos aquejados de carcinoma de pulmón y estómago, y de individuos normales para el resto de los tejidos. Todas las muestras de mama normales se obtuvieron agrupando 5 tejidos normales no relacionados. El ARN total se aisló de tejidos usando reactivo TRIzol™ (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones de fabricante.
Microseries de microARN
65 Se realizó análisis de microseries como se ha descrito previamente (Liu, C.-G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
101: 11755-11760 (2004)). Brevemente, se usaron 5 µg de ARN total para la hibridación en microplacas de
microseries de miARN. Estas microplacas contienen sondas oligonucleotídicas de 40 unidades específicas de gen, aplicadas puntualmente por tecnologías de contacto y unidas covalentemente a una matriz polimérica. Las microseries se hibridaron en SSPE 6x (NaCl 0,9 M/NaH2PO4 60 mM ⋅ H2O/EDTA 8 mM, pH 7,4)/formamida 30 % a 25 ºC durante 18 h, se lavaron en TNT 0,75x (Tris⋅HCl/NaCl/Tween 20) a 37 ºC durante 40 minutos, y se procesaron
5 usando detección directa en los transcritos marcados con biotina por conjugado de estreptavidina-Alexa647 (Molecular Probes). Los portaobjetos procesados se exploraron usando un explorador de microseries (GenePix Pro, Axon), con el láser ajustado a 635 nm, a ajustes de PMT fijos y una resolución de exploración de 10 mm. Los datos se confirmaron por transferencia de Northern como se describe (Calin, G. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 11755-11760 (2004); Iorio, M. V., et al., Cancer Res. 65: 7065-7070 (2005)).
10 Tabla 2. Muestras usadas en el estudio (tumores y normales correspondientes). Tipo de tumor Muestras de cáncer Muestras Normales
Carcinoma de pulmón 123 123 Carcinoma de mama 79 6* Carcinoma de colon 46 8 Carcinoma gástrico 20 21 Tumores pancreáticos endocrinos 39 12 Cáncer de próstata 56 7
Todos los tejidos (527) 363 177
* Grupos de 5 tejidos de mama normales no relacionados por muestra (para un total de 30 individuos no relacionados).
Análisis computacional
15 Se analizaron imágenes de microseries usando GenePix Pro (Axon). De los valores medios de los puntos repetidos de cada miARN se restó el fondo, se normalizaron y se sometieron a análisis adicional. Se realizó normalización usando un método de normalización de mediana por microplaca, usando la mediana de la serie como una referencia. Finalmente, se seleccionaron los miARN medidos como presentes en al menos la menor de la dos clases en un conjunto de datos. Las ausencias tuvieron un umbral de 4,5 antes del análisis estadístico. Este nivel es el nivel
20 de intensidad mínimo medio detectado en los experimentos. La nomenclatura de microARN fue de acuerdo con el Buscador del Genoma (www.genome.ucsc.edu) y la base de datos de microARN en el Centro Sanger (Griffiths-Jones, S., Nucleic Acids Res 32: D109-11(2004)); en caso de discrepancias los inventores siguieron la base de datos de microARN. Se identificaron microARN expresados diferencialmente usando el procedimiento de ensayo de t dentro de análisis significativo de microseries (SAM) (Tusher, V. G., et al., Proc Natl Acad Sci USA 98: 5116-21
25 (2001). SAM calcula una puntuación para cada gen basándose en el cambio de la expresión en relación con la desviación típica de todas las mediciones. Dentro de SAM, se usó el ensayo de t. Los distintivos de microARN se determinaron aplicando el método de centroides hundidos más cercanos. Este método identifica un subgrupo de genes que caracteriza mejor cada cáncer sólido de su homólogo normal respectivo. Se calculó el error de predicción por medio de validación cruzada 10 veces, y para cada cáncer se obtuvo el distintivo de miR que daba como
30 resultado el error mínimo de predicción. Se realizó un ensayo de nueva toma de muestras por análisis de permutación aleatoria para calcular el p valor del distintivo compartido.
Ejemplo 1: Identificación de un distintivo de expresión de microARN en cánceres sólidos humanos
35 Estadística
La comparación de cánceres combinados/tejido normal se realizó usando un número reducido de muestras de pulmón (80 muestras de cáncer y 40 normales), para equilibrar los diferentes tejidos numéricamente, produciendo un total de 404 muestras. Para análisis estadístico, se retuvieron 137 miR, cuyos valores de expresión estaban por 40 encima de 256 (valor umbral) en al menos 30 % de las muestras, de las 228 que se midieron. Se usó un ensayo de T para identificar microARN expresados diferencialmente (Tabla 3). Los p valores del ensayo de T se corrigieron para múltiples procedimientos de ensayo y para controlar las tasas de error de Tipo I. Se obtuvieron p valores ajustados realizando una nueva toma de muestras con 500.000 permutaciones (Jung, S. H., et al. Biostatistics 6: 157-69 (2005)). Este análisis se realizó para evaluar los resultados usando el mismo método que Lu y colaboradores
45 (Lu, J., et al., Nature 435: 834-8(2005)).
Como una alternativa al ensayo de T, se usó análisis de significación de microseries (SAM) para identificar microARN expresados diferencialmente. Este procedimiento permite el control de la tasa de detección falsa (FDR). El delta se eligió para dar como resultado una FDR menor de o igual a 0,01. Después se identificaron los 50 subconjuntos de microARN que daban como resultado la mejor clasificación tumoral, es decir, que predecían mejor las dos clases (cáncer y normal), usando el método de los centroides hundidos más cercanos, como se implementa en PAM (análisis de predicción de microseries). Se calculó el error de predicción por medio de validación cruzada 10 veces. Los microARN se seleccionaron produciendo el error de clasificación equivocada mínimo después de
validación cruzada.
Resultados
5 Por el ensayo de T, se obtuvieron 43 miR expresados diferencialmente con un p valor ajustado por debajo de 0,05 (Tabla 3). Se sobreexpresaron 26 miR y 17 se infraexpresaron en relación con tejidos normales correspondientes cuando los seis cánceres sólidos se agruparon entre sí (mama, colon, pulmón, páncreas, próstata, estómago). Estos resultados indicaron que el espectro de miARN expresados en cánceres sólidos es muy diferente del de células normales (43 de 137 miARN, 31 %). Usando SAM, se identificaron 49 miARN expresados diferencialmente, de los
10 cuales 34 estaban regulados positivamente (Tabla 4). Usando PAM, se identificaron 36 miARN sobreexpresados en cáncer (indicado por puntuaciones de cáncer positivas) y 21 miR regulados negativamente (indicados por puntuaciones de cáncer negativas) como expresados diferencialmente (Tabla 5). Sin embargo, estos análisis no están adaptados para identificar alteraciones en la expresión de miR que da como resultado uniformemente transformación, debido a que la expresión de miR es muy específica de tejido (He, L., et al. Nature 435: 828-833
15 (2005); véase también FIG. 1 y FIG. 2).
En la FIGURA 1 se muestra el agrupamiento de los miR basado en perfiles de expresión derivados de 363 muestras de cáncer sólido y 177 normales usando los 228 miR. El árbol, que muestra una muy buena separación entre los diferentes tejidos, se construyó usando 137 miARN diferentes que se expresaron en al menos 50 % de las muestras
20 usadas en el estudio.
Tabla 3. miR regulados diferencialmente en 6 tipos de cáncer sólido frente a tejidos normales (estadística de ensayo de T)*. miR ID Media de Cáncer Media Normal Estadística de ensayo p sin procesar p Aj
miR-21
Nº 17 11,538663 9,648338 7,861136 2,00E-06 2,00E-06
miR-141
Nº 137 9,024091 7,905398 6,238014 2,00E-06 2,00E-06
miR-212
Nº 208 13,540651 14,33617 -6-57942 2,00E-06 2,00E-06
miR-128a
Nº 113 12,32588 13,522675 -6,76388 2,00E-06 2,00E-06
prec
miR-138-2
Nº 133 11,739557 13,144746 -7,01204 2,00E-06 2,00E-06
miR-228-2
Nº 221 11,279787 12,539366 -7,40557 2,00E-06 2,00E-06
miR-23b
Nº 51 14,169748 15,949736 -8,37744 2,00E-06 2,00E-06
miR-195
Nº 184 10,343991 9,172985 5,763262 2,00E-06 1,00E-05
miR-213
Nº 209 12,686966 13,661763 -5,83132 4,00E-06 1,00E-05
prec
miR-29b-2
Nº 95 11,27556 9,940731 3,660854 2,00E-06 1,40E-05
miR-199a-1 Nº 191
10,032008 8,920183 5,528849 2,00E-06 3,00E-05
miR-9-3
Nº 28 11,461922 12,570412 -5,43006 2,00E-06 4,60E-05
miR-12Sa
Nº 114 13,024235 13,856624 -5,35102 6,00E-06 7,20E-05
let-7a-1
Nº 1 12,616569 13,455246 -5,35346 2,00E-06 7,20E-05
let-7b
Nº 5 13.43636 14,068521 -5,17701 1,00E-05 0,000146
miR-16-2
Nº 39 10,460707 9,305895 5,048375 4,00E-06 0,000224
miR-199a-2 Nº 192
9,714225 9,759237 4,862553 1,00E-05 0,000494
miR-152
Nº 151 11,388676 12,357529 -4,83716 2,00E-06 0,00053
prec
miR-16-1
Nº 38 10,443169 9,338182 4.755258 1,00E-05 0,00071
miR-30d
Nº 72 13,982017 14,775206 -4,5707 1,50E-05 0,001476
miR-34a
Nº 78 10,675566 9,63769 4,467301 2,60E-05 0,00217
miR-17-5p
Nº 41 11,567244 10,281468 4,341834 3,80E-05 0,0034
miR-128b
Nº 115 10,930395 9,947746 4,304764 3,80E-05 0,03912
miR-20a
Nº 46 11,409852 10,19284 4,304678 3,20E-05 0,003912
miR-181b-1
Nº 211 9,577504 8,804294 4,285968 4,80E-05 0,004126
prec
miR-132
Nº 121 9,599947 8,175966 4,254737 5,60E-05 0,004126
miR-200b
Nº 195 9,475221 8,527243 4,221511 4,00E-05 0,0052
let-7a-3
Nº 4 10,436089 9,511546 4,08952 0,000104 0,008242
miR-138-1
Nº 132 8,299613 9,200253 -4,05204 5,60E-05 0,00931
miR-29c
Nº 65 11,291005 10,326912 4,019385 0,000144 0,010312
miR-29a
Nº 62 11,3818359 10,461075 4,013697 0,00015 0,010398
miR-96
Nº 86 11,37218 12,136636 -3,94825 0,000138 0,012962
miR-191
Nº 177 13,498207 12,729872 3,817228 0,000158 0,02015
miR-37a
Nº 59 10,399338 9,548582 3,715048 0,000344 0,028096
let-7g
Nº 15 10,819688 10,01157 3,653239 0,000426 0,033874
miR-9-1
Nº 24 10,102819 9,212988 3,651886 0,000388 0,033874
miR-125a
Nº 107 10,960998 10,005312 3,651356 0,000452 0,033874
miR-95
Nº 84 9,435733 8,751331 3,59406 0,000478 0,039594
miR-155
Nº 157 12,505359 13,231221 -3,58369 0,000614 0,040394
miR-199b
Nº 194 9,755066 9,082751 3,55934 0,000588 0,04314
miR-24-2
Nº 54 12,611696 11,612557 3,518774 0,00087 0,048278
let-7e
Nº 11 12,497795 13,055093 -3,51589 0,00054 0,048354
miR-92-1
Nº 81 16,081074 16,592426 -3,50446 0,000928 0,49828
* -Cuarenta y tres miR tienen un p valor ajustado menor de 0,05. Veintiséis miR están sobreexpresados y 17 regulados negativamente en carcinomas de mama, colon, pulmón, páncreas, próstata, estómago.
Tabla 4. miR regulados diferencialmente en 6 tipos de cáncer sólido frente a tejidos normales (SAM, análisis de
significación de microseries)*.
miR
ID Valor d. devtip Valor p Valor q Factor de R
miR-21
Nº 47 3,156 0,24 0 0 2,593
miR-23b
Nº 51 -3,117 0,212 0 0 0,443
miR-138-2
Nº 133 -3,514 0,2 0 0 0,402
miR-218-2
Nº 221 -2,383 0,17 0 0 0,384
miR-29h·2
Nº 95 2,246 0,236 0 0 1,868
miR-128a
Nº 113 -2,235 0,177 0 0 0,368
prec
miR-195
Nº 184 2,085 0,203 0 0 1,695
miR-141
Nº 137 2,08 0,179 0 0 2,459
miR-199a-1
Nº 191 1,987 0,201 0 0 1,945
miR-9-3
Nº 28 -1,97 0,204 0 0 0,433
miR-16-3
Nº 39 1,966 0,229 0 0 1,788
miR-17-5p
Nº 41 1,964 0,296 0 0 0,725
miR-20a
Nº 46 1,898 0,283 0 0 0,969
miR-16-1
Nº 33 1,87 0,332 0 0 1,447
miR-212
Nº 209 -1,854 0,167 0 0 0,509
prec
miR-34a
Nº 78 1,756 0,232 0 0 1,219
miR-152
Nº 151 -1734 0,2 0 0 0,46
prec
miR-199a-2
Nº 192 1,731 0,196 0 0 1,838
miR-128b
Nº 115 1,674 0,238 0 0 1,266
miR-212
Nº 208 -1,659 0,121 0 0 0,627
let-7a-1
Nº 1 -1,628 0,157 0 0 0,461
miR-200b
Nº 195 1,626 0,225 0 0 1,432
miR-128a
Nº 114 -1,619 0,156 0 0 0,511
miR-29c
Nº 65 1,611 0,24 0 0 1,225
let-7a-3
Nº 4 1,581 0,226 0 0 1,109
miR-29a
Nº 62 1,563 0,329 0 0 1,706
miR-24-2
Nº 54 1,555 0,284 0 0 0,831
miR-138-1
Nº 132 -1,551 0,222 0 0 0,432
miR-125a
Nº 107 1,541 0,262 0 0 1,164
miR-106a
Nº 99 1,514 0,275 0 0 0,952
miR-132
Nº 121 1,496 0,192 0 0 2,158
miR-30d
Nº 72 -1,491 0,174 0 0 0,424
miR-9-1
Nº 24 1,478 0,244 0 0 0,763
miR-27a
Nº 59 1,448 0,229 0 0 1,174
miR-181b-1
Nº 211 1,435 0,18 0 0 1,525
prec
let-7g
Nº 15 1,394 0,221 0 0 1,072
miR-96
Nº 86 -1,384 0,194 0 0 0,519
miR-191
Nº 177 1,372 0,201 0 0 1,165
miR-93-1
Nº 83 1,363 0,266 0 0 0,775
miR-136
Nº 130 -1,355 0,267 0 0 0,364
miR-205
Nº 201 1,343 0,309 0 0 1,281
miR-185
Nº 170 1,287 0,222 0,001 0,001 0,609
miR-125b-1
Nº 109 1,262 0,283 0,001 0,001 1,215
miR-10a
Nº 30 1,252 0,227 0,001 0,001 1,643
miR-95
Nº 84 1,247 0,19 0,001 0,001 1,509
miR-199b
Nº 194 1,228 0,189 0,001 0,001 1,246
miR-10b
Nº 32 1,219 0,232 0,002 0,001 1,342
let-7i
Nº 10 1,216 0,203 0,002 0,001 1,026
miR-210
Nº 205 1,213 0,237 0,002 0,001 1,088
* -Treinta y cinco miR están sobreexpresados y 14 están regulados negativamente en carcinomas de mama, colon, pulmón, páncreas, próstata, estómago (Delta = 0,9, FDR=0,001).
Tabla 5. MicroARN seleccionados por PAM (análisis de predicción de microserie) en 6 tipos de cáncer sólido frente a
tejidos normales
miR
ID Puntuación de cáncer sólido Puntuación de tejidos normales
miR-21
Nº 47 0,0801 -0,2643
miR-138-3
Nº 133 -0,055 0,1815
miR-218-2
Nº 221 -0,0535 0,1765
miR-23b
Nº 51 -0,0516 0,17
miR-128a prec
Nº 113 -0,0498 0,1642
miR-29b-2
Nº 95 0,0457 -0,1508
miR-195
Nº 184 0,0404 -0,1333
miR-17-5p
Nº 41 0,0383 -0,1263
miR-9-3
Nº 28 -0,0357 0,1176
miR-212 prec
Nº 209 -0,0342 0,1129
miR-20a
Nº 46 0,0322 -0,1061
miR-141
Nº 137 0,0322 -0,1061
miR-199-1
Nº 191 0,0319 -0,1053
miR-16-2
Nº 39 0,0315 -0,1037
miR-152 prec
Nº 151 -0,0283 0,0933
miR-16-1
Nº 138 0,0277 -0,0913
miR-34a
Nº 78 0,0269 -0,0886
miR-212
Nº 208 -0,0265 0,0875
let-7a-1
Nº 1 -0,0264 0,0872
miR-128a
Nº 114 -0,0259 0,0855
miR-128b
Nº 115 0,0254 -0,0839
miR-24-2
Nº 54 0,0244 -0,0803
miR-29c
Nº 65 0,0234 -0,0738
miR-199a-2
Nº 192 0,0323 -0,0736
let-7a-3
Nº 4 0,0321 -0,073
miR-191
Nº 177 0,0188 -0,062
miR-125a
Nº 107 0,0186 -0,0613
miR-30d
Nº 72 -0,0185 0,061
miR-29a
Nº 62 0,0184 -0,0608
miR-106a
Nº 99 0,0177 -0,0584
miR-93-1
Nº 83 0,0163 -0,0537
miR-200b
Nº 195 0,0159 -0,0524
let-7g
Nº 15 0,0158 -0,0521
miR-27a
Nº 59 0,0157 -0,0518
miR-96
Nº 86 -0,0156 0,0514
let-7b
Nº 5 -0,0152 0,0501
miR-138-1
Nº 132 -0,0151 0,0499
miR-9-1
Nº 24 0,0136 -0,0448
miR-181b-1 prec
Nº 211 0,0134 -0,0442
miR-155
Nº 157 -0,0128 0,0423
miR-132
Nº 121 0,0127 -0,0418
miR-136
Nº 130 -0,0112 0,037
let-7i
Nº 10 0,0103 -0,034
miR-210
Nº 205 0,0074 -0,0245
miR-205
Nº 201 0,0073 -0,024
*. miR-185
Nº 170 0,0071 -0,0234
miR-24-1
Nº 52 0,007 -0,023
miR-199b
Nº 194 0,0064 -0,021
miR-125b-1
Nº 109 0,006 -0,0199
miR-206 prec
Nº 203 -0,005 0,0166
miR-10a
Nº 30 0,0045 -0,015
miR-95
Nº 84 0,0045 -0,0149
let-7c
Nº 11 -0,0039 0,013
miR-124a-3
Nº 106 -0,0028 0,0091
miR-10b
Nº 32 0,002 -0,0066
miR-185 prec.
Nº 171 -0,0014 0,0047
miR-92-1
Nº 81 -2,00E-04 5,00E-04
* -T=1,5 y error de clasificación equivocada = 0,176. Treinta y seis miR sobreexpresados en cáncer están indicados por puntuaciones de cáncer positivas; 21 miR regulados negativamente están indicados por puntuaciones de cáncer negativas.
Ejemplo 2: Identificación de distintivos de expresión de microARN asociados con diversos cánceres sólidos humanos.
5 Resultados
Para identificar microARN que son pronóstico de estado de cáncer asociado con tumores sólidos, sin incurrir en una desviación debido a la especificidad de tejido, se usó un enfoque alternativo. En primer lugar, se obtuvieron seis distintivos específicos de tejido, uno para cada histotipo de cáncer, realizando ensayos de PAM independientes 10 (resumidos en las Tablas 6 y 7). Se muestran distintivos específicos para cada cáncer en las Tablas 8-13: por ejemplo, mama-Tabla 8; colon-Tabla 9; pulmón-Tabla 10; páncreas-Tabla 11; próstata-Tabla 12; estómago-Tabla 13. Usando estos datos, se identificaron microARN desregulados que se compartían entre los distintivos de miARN de diferentes histotipos (Tabla 14). Para calcular los p valores para este análisis comparativo, se realizó un ensayo de nueva toma de muestras con 1.000.000 de permutaciones aleatorias sobre la identidad del miARN. El p valor se
15 definió como la frecuencia relativa de puntuaciones de simulación que sobrepasaban la puntuación real. Se identificaron 21 microARN regulados erróneamente que eran comunes de al menos 3 tipos de cánceres sólidos (p valor = 2,5x10-3) (Tabla 14).
Tabla 6. MicroARN usados para clasificar cánceres humanos y tejidos normales*.
Cáncer miR regulados miR regulados Error de clasificación equivocada después de positivamente negativamente validación cruzada 10 veces
Mama 15 12 0,08 Colon 21 1 0,09 Pulmón 35 3 0,31 Páncreas 55 2 0,02 Próstata 39 6 0,11 Estómago 22 6 0,19
* -Se realizó normalización de la mediana y se usó el método de los centroides hundidos más cercanos para seleccionar miARN predictivos.
Tabla 7. microARN desregulados en cánceres comunes sólidos*.
Cáncer
Regulados positivamente por PAM Regulados positivamente por SA M Regulados negativamente por PAM Regulados negativamente por SAM
Mama
15 3 (FDR=0,33) 12 47
Colon
21 42 (FDR<=0,06) 1 5
Pulmón
35 38 (FDR<=0,01) 3 3
Páncreas
55 50 (FDR<=0,01) 2 8
Estómago
22 22 (FDR=0,06) 6 4
Próstata
39 49 (FDR=0,06) 6 3
* -El análisis de predicción de microseries (PAM) identifica los genes que caracterizan mejor cánceres y tejidos normales, mientras que el análisis de significación de microseries (SAM) identifica los que tienen expresión diferencial en las dos clases. Las tasas de detección falsa (FDR) calculadas en SAM se indican entre paréntesis.
Tabla 8. MicroARN seleccionados por análisis de predicción de microserie (PAM) en cáncer de mama (cáncer frente a tejidos normales)*. miR Puntuación de cáncer Puntuación normal
miR-21 (Nº 47)
0,0331 -0,4364
miR-29b-2 (Nº 95)
0,0263 -0,3467
miR-146 (Nº 144)
0,0182 -0,2391
miR-125b-2 (Nº 111)
-0,0174 0,2286
miR-125b-1 (Nº 109)
-0,0169 0,222
miR-10b (Nº 32)
-0,0164 0,2166
miR-145 (Nº 143)
-0,0158 0,2076
miR-181a (Nº 158)
0,0153 -0,201
miR-140 (Nº 136)
-0,0122 0,1613
miR-213 (Nº 160)
0,0116 -0,1527
miR-29a prec (Nº 63)
0,0109 -0,1441
miR-181b-1 (Nº 210)
0,0098 -0,1284
miR-199b (Nº 194)
0,0089 -0,1172
miR-29b-1 (Nº 64)
0,0084 -0,1111
miR-130a (Nº 120)
-0,0076 0,1001
miR-155 (Nº 157)
0,0072 -0,0951
let-7a-2 (Nº 3)
-0,0042 0,0554
miR-205 (Nº 201)
-0,004 0,0533
miR-29c (Nº 65)
0,0032 -0,0423
miR-224 (Nº 228)
-0,003 0,0399
miR-100 (Nº 91)
-0,0021 0,0283
miR-31 (Nº 73)
0,0017 -0,022
miR-30c (Nº 70)
-7,00E-04 0,009
miR-17-5p (Nº 41)
7,00E-04 -0,0089
miR-210 (Nº 205)
4,00E-04 -0,0057
miR-122a (Nº 101)
4,00E-04 -0,005
miR-16-2 (Nº 39)
-1,00E-04 0,0013
* 27 miR seleccionados, error de clasificación equivocada después de validación cruzada de 0,008. Diecisiete miR sobreexpresados en cáncer se indican por puntuaciones de cáncer positivas; 12 miR regulados negativamente se indican por puntuaciones de cáncer negativas.
Tabla 9. MicroARN seleccionados por análisis de predicción de microserie (PAM) en colon (cáncer frente a tejidos normales)*. miR Puntuación de cáncer Puntuación normal
miR-24-1 (Nº 52)
0,0972 -0,5589
miR-29b-2 (Nº 95)
0,0669 -0,3845
miR-20a (Nº 46)
0,0596 -0,3424
miR-10a (Nº 30)
0,0511 -0,2938
miR-32 (Nº 75)
0,0401 -0,2306
miR-203 (Nº 197)
0,0391 -0,2251
miR-106a (Nº 99)
0,0364 -0,2094
miR-17-5p (Nº 41)
0,0349 -0,2005
miR-30c (Nº 70)
0,0328 -0,1888
miR-223 (Nº 227)
0,0302 -0,1736
miR-126* (Nº 102)
0,0199 -0,1144
miR-128b (Nº 115)
0,0177 -0,102
miR-21 (Nº 47)
0,0162 -0,0929
miR-24-2 (Nº 54)
0,0145 -0,0835
miR-99b prec (Nº 88)
0,0125 -0,0721
miR-155 (Nº 157)
0,0092 -0,0528
miR-213 (Nº 160)
0,0091 -0,0522
miR-150 (Nº 148)
0,0042 -0,0243
miR-107 (Nº 100)
0,003 -0,0173
miR-191 (Nº 177)
0,0028 -0,0159
miR-221 (Nº 224)
0,002 -0,0116
miR-9-3 (Nº 28)
-0,0014 0,0083

Tabla 10. MicroARN seleccionados por análisis de predicción de microserie (PAM) en cáncer de pulmón (cáncer frente a tejidos normales)*. miR Puntuación de cáncer Puntuación normal
* 22 miR seleccionados, error de clasificación equivocada después de validación cruzada de 0,09. Veintiún miR sobreexpresados en cáncer se indican por puntuaciones de cáncer positivas; 1 miR regulado negativamente se indica por una puntuación de cáncer negativa
miR-21 (Nº 47)
0,175 -0,175
miR-205 (Nº 201)
0,1317 -0,1317
miR-200b (Nº 195)
0,1127 -0,1127
miR-9-1 (Nº 24)
0,1014 -0,1014
miR-210 (Nº 205)
0,0994 -0,0994
miR-148 (Nº 146)
0,0737 -0,0737
miR-141 (Nº 137)
0,0631 -0,0631
miR-132 (Nº 121)
0,0586 -0,0586
miR-128b (Nº 115)
0,0559 -0,0559
let-7g (Nº 15)
0,0557 -0,0557
miR-16-2 (Nº 39)
0,0547 -0,0547
miR-129-1/2 prec (Nº 118)
0,0515 -0,0515
miR-126* (Nº 102)
-0,0406 0,0406
miR-142-as (Nº 139)
0,0366 -0,0366
miR-30d (Nº 72)
-0,0313 0,0313
miR-30a-5p (Nº 66)
-0,0297 0,0297
miR-7-2 (Nº 21)
0,0273 -0,0273
miR-199a-1 (Nº 191) 0,0256 -0,0256 miR-127 (Nº 112) 0,0254 -0,0254 miR-34a prec (Nº 79) 0,0214 -0,0214 miR-34a (Nº 78) 0,0188 -0,0188 miR-136 (Nº 130) 0,0174 -0,0174 miR-202 (Nº 196) 0,0165 -0,0165 miR-196-2 (Nº 188) 0,0134 -0,0134 miR-199a-2 (Nº 192) 0,0126 -0,0126 let-7a-2 (Nº 3) 0,0109 -0,0109 miR-124a-1 (Nº 104) 0,0081 -0,0081 miR-149 (Nº 147) 0,0079 -0,0079 miR-17-5p (Nº 41) 0,0061 -0,0061 miR-196-1 prec (Nº 186) 0,0053 -0,0053 miR-10a (Nº 30) 0,0049 -0,0049 miR-99b prec (Nº 88) 0,0045 -0,0045 miR-196-1 (Nº 185) 0,0044 -0,0044 miR-199b (Nº 194) 0,0039 -0,0039 miR-195 (Nº 184) 7,00E-04 -7,00E-04 miR-155 (Nº 157) 7,00E-04 -7,00E-04
* 38 miR seleccionados, error de clasificación equivocada después de validación cruzada de 0,31. Treinta y cinco miR sobreexpresados en cáncer se indican por puntuaciones de cáncer positivas; 3 miR regulados negativamente se indican por una puntuaciones de cáncer negativas.
Tabla 11. MicroARN seleccionados por análisis de predicción de microserie (PAM) en cáncer pancreático (cáncer frente a tejidos normales)*. miR Puntuación de cáncer Puntuación normal
miR-103-2 (Nº 96)
0,4746 -1,582
miR-103-1 (Nº 97)
0,4089 -1,3631
miR-24-2 (Nº 54)
0,4059 -1,3529
miR-107 (Nº 100)
0,3701 -1,2336
miR-100 (Nº 91)
0,3546 -1,182
miR-125b-2 (Nº 111)
0,3147 -1,0489
miR-125b-1 (Nº 109)
0,3071 -1,0237
miR-24-1 (Nº 52)
0,2846 -0,9488
miR-191 (Nº 177)
0,2661 -0,887
miR-23a (Nº 50)
0,2586 -0,8619
miR-26a-1 (Nº 56)
0,2081 -0,6937
miR-125a (Nº 107)
0,1932 -0,644
miR-130a (Nº 120)
0,1891 -0,6303
miR-26b (Nº 58)
0,1861 -0,6203
miR-145 (Nº 143)
0,1847 -0,6158
miR-221 (Nº 224)
0,177 -0,59
miR-126* (Nº 102)
0,1732 -0,5772
miR-16-2 (Nº 39)
0,1698 -0,5659
miR-146 (Nº 144)
0,1656 -0,552
miR-214 (Nº 212)
0,1642 -0,5472
miR-99b (Nº 89)
0,1636 -0,5454
miR-128b (Nº 115)
0,1536 -0,512
miR-155 (Nº 157)
-0,1529 0,5098
miR-29b-2 (Nº 95)
0,1487 -0,4956
miR-29a (Nº 62)
0,1454 -0,4848
miR-25 (Nº 55)
0,1432 -0,4775
miR-16-1 (Nº 38)
0,1424 -0,4746
miR-99a (Nº 90)
0,1374 -0,4581
miR-224 (Nº 228)
0,1365 -0,4549
miR-30d (Nº 72)
0,1301 -0,4336
miR-92-2 (Nº 82)
0,116 -0,3865
miR-199a-1 (Nº 191)
0,1158 -0,3861
miR-223 (Nº 227)
0,1141 -0,3803
miR-29c (Nº 65)
0,113 -0,3768
miR-30b (Nº 68)
0,1008 -0,3361
miR-129-112 (Nº 117)
0,1001 -0,3337
miR-197 (Nº 189)
0,0975 -0,325
miR-17-5p (Nº 41)
0,0955 -0,3185
miR-30c (Nº 70)
0,0948 -0,316
miR-7-1 (Nº 19) 0,0933 -0,311 miRs-93-1 (Nº 83) 0,0918 -0,3061 miR-140 (Nº 136) 0,0904 -0,3015 miR-30a-5p (Nº 66) 0,077 -0,2568 miRs-132 (Nº 121) 0,0654 -0,2179 miR-181b-1 (Nº 210) 0,0576 -0,1918 miR-152 prec (Nº 151) -0,0477 0,1591 miR-23b (Nº 51) 0,0469 -0,1562 miR-20a (Nº 46) 0,0452 -0,1507 miRs-222 (Nº 225) 0,0416 -0,1385 miR-21a (Nº 59) 0,0405 -0,1351 miRs-92-1 (Nº 81) 0,0332 -0,1106 miRs-21 (Nº 47) 0,0288 -0,0959 miR-129-112 prec (Nº 118) 0,0282 -0,0939 miR-150 (Nº 148) 0,0173 -0,0578 miR-32 (Nº 75) 0,0167 -0,0558 miR-106a (Nº 99) 0,0142 -0,0473 miR-29b-1 (Nº 64) 0,0084 -0,028
* 57 miR seleccionados, error de clasificación equivocada después de validación cruzada de 0,02. Cincuenta y siete miR se sobreexpresan y 2 se regulan negativamente en cáncer (indicado por puntuaciones positivas y negativas, respectivamente).
Tabla 12. MicroARN seleccionados por análisis de predicción de microserie (PAM) en cáncer de próstata (cáncer frente a tejidos normales)*. miR Puntuación de cáncer Puntuación normal
let-7d (Nº 8)
0,0528 -0,4227
miR-128a prec (Nº 113)
-0,0412 0,3298
miR-195 (Nº 184)
0,04 -0,3199
miR-203 (Nº 197)
0,0356 -0,2851
let-7a-2 prec (Nº 2)
-0,0313 0,2504
miR-34a (Nº 78)
0,0303 -0,2428
miR-20a (Nº 46)
0,029 -0,2319
miR-218-2 (Nº 221)
-0,0252 0,2018
miR-29a (Nº 62)
0,0247 -0,1978
miR-25 (Nº 55)
0,0233 -0,1861
miR-95 (Nº 84)
0,0233 -0,1861
miR-197 (Nº 189)
0,0198 -0,1587
miR-135-2 (Nº 128)
0,0198 -0,1582
miR-187 (Nº 173)
0,0192 -0,1535
miR-196-1 (Nº 185)
0,0176 -0,1411
miR-148 (Nº 146)
0,0175 -0,1401
miR-191 (Nº 177)
0,017 -0,136
miR-21 (Nº 47)
0,0169 -0,1351
let-7i (Nº 10)
0,0163 -0,1303
miR-198 (Nº 190)
0,0145 -0,1161
miR-199a-2 (Nº 192)
0,0136 -0,1088
miR-30c (Nº 70)
0,0133 -0,1062
miR-11-5p (Nº 41)
0,0132 -0,1053
miR-92-2 (Nº 82)
0,012 -0,0961
miR-146 (Nº 144)
0,0113 -0,0908
miR-181b-1 prec (Nº 211)
0,011 -0,0878
miR-32 (Nº 75)
0,0109 -0,0873
miR-206 (Nº 202)
0,0104 -0,083
miR-184 prec (Nº 169)
0,0096 -0,0764
miR-29a prec (Nº 63)
-0,0095 0,076
miR-29b-2 (Nº 95)
0,0092 -0,0739
miR-149 (Nº 147)
-0,0084 0,0676
miR-181b-1 (Nº 210)
0,0049 -0,0392
miR-196-1 prec (Nº 186)
0,0042 -0,0335
miR-93-1 (Nº 83)
0,0039 -0,0312
miR-223 (Nº 227)
0,0038 -0,0308
miR-16-1 (Nº 38)
0,0028 -0,0226
miR-101-1 prec (Nº 92)
0,0015 -0,0123
miR-124a-1 (Nº 104)
0,0015 -0,0119
miR-26a-1 (Nº 56)
0,0015 -0,0119
miR-214 (Nº 212) 0,0013 -0,0105 miR-27a (Nº 59) 0,0011 -0,0091 miR-24-1 (Nº 53) -8,00E-04 0,0067 miR-106a (Nº 99) 7,00E-04 -0,0057 miR-199a-1 (Nº 191) 4,00E-04 -0,0029
* -T=1, 45 miR seleccionados, error de clasificación equivocada después de validación cruzada de 0,11. Treinta y nueve miR sobreexpresados en cáncer se indican por puntuaciones de cáncer positivas; 6 miR regulados negativamente se indican por puntuaciones de cáncer negativas.
Tabla 13. MicroARN seleccionados por análisis de predicción de microserie (PAM) en cáncer de estómago (cáncer frente a tejidos normales)*.
miR
Puntuación de cáncer Puntuación normal
miR-223 (Nº 227)
0,1896 -0,1806
miR-21 (Nº 47)
0,1872 -0,1783
miR-218-2 (Nº 221)
-0,1552 0,1478
miR-103-2 (Nº 96)
0,1206 -0,1148
miR-92-2 (Nº 82)
0,1142 -0,1088
miR-25 (Nº 55)
0,1097 -0,1045
miR-136 (Nº 130)
-0,1097 0,1045
miR-191 (Nº 177)
0,0946 -0,0901
miR-221 (Nº 224)
0,0919 -0,0876
miR-125b-2 (Nº 111)
0,0913 -0,0869
miR-103-1 (Nº 97)
0,0837 -0,0797
miR-214 (Nº 212)
0,0749 -0,0713
miR-222 (Nº 225)
0,0749 -0,0713
miR-212 prec (Nº 209)
-0,054 0,0514
miR-125b-1 (Nº 109)
0,0528 -0,0503
miR-100 (Nº 91)
0,0526 -0,0501
miR-107 (Nº 100)
0,0388 -0,0369
miR-92-1 (Nº 81)
0,0369 -0,0351
miR-96 (Nº 86)
-0,0306 0,0291
miR-192 (Nº 178)
0,0236 -0,0224
miR-23a (Nº 50)
0,022 -0,021
miR-2.15 (Nº 213)
0,0204 -0,0194
miR-7-2 (Nº 21)
0,0189 -0,018
miR-138-2 (Nº 133)
-0,0185 0,0176
miR-24-1 (Nº 52)
0,0151 -0,0144
miR-99b (Nº 89)
0,0098 -0,0093
miR-33b (Nº 76)
-0,0049 0,0046
miR-24-2 (Nº 54)
0,0041 -0,0039

Tabla 14. Los microARN compartidos por los distintivos de los 6 cánceres sólidos*.
* -T=1, 28 miR seleccionados, error de clasificación equivocada después de validación cruzada de 0,19. Veintidós miR sobreexpresados en cáncer se indican por puntuaciones de cáncer positivas; 6 miR regulados negativamente se indican por puntuaciones de cáncer negativas.
miR
N Tipo de Tumor
miR-21
6 Mama Colon Pulmón Páncreas Próstata Estómago
miR-17-5p
5 Mama Colon Pulmón Páncreas Próstata
miR-191
5 Colon Pulmón Páncreas Próstata Estómago
miR-29b-2
4 Mama Colon Páncreas Próstata
miR-223
4 Colon Páncreas Próstata Estómago
miR-128b
3 Colon Pulmón Páncreas
miR-199a-1
3 Pulmón Páncreas Próstata
miR-24-1
3 Colon Páncreas Estómago
miR-24-2
3 Colon Páncreas Estómago
miR-146
3 Mama Páncreas Próstata
miR-155
3 Mama Colon Pulmón
miR-181b-1
3 Mama Páncreas Próstata
miR-20a
3 Colon Páncreas Próstata
miR-107
3 Colon Páncreas Estómago
miR-32
3 Colon Páncreas Próstata
miR-92-2
3 Páncreas Próstata Estómago
miR-214
3 Páncreas Próstata Estómago
miR-30c
3 Colon Páncreas Próstata
miR-25
3 Páncreas Próstata Estómago
miR-221
3 Colon Páncreas Estómago
miR-106a
3 Colon Páncreas Próstata
* -La lista incluye 21 microARN regulados positivamente habitualmente en 3 o más (N) tipos de cánceres sólidos (p valor = 2,5x10-3).
Para maximizar la concisión, se calcularon los niveles de expresión absolutos medios de los miR desregulados para los 6 pares de cáncer/normal. Usando el nivel de expresión de los miR en el subconjunto exhaustivo, los diferentes tejidos se clasificaron correctamente independientemente de su estado de enfermedad (FIGURA 3).
5 La FIGURA 4 muestra la expresión diferencial de los microARN comunes entre los diferentes tejidos tumorales, en relación con los tejidos normales. El árbol presenta los diferentes tipos de cáncer según el factor de cambio en el subconjunto de miARN. Los tejidos de próstata, colon, estómago y pancreático son más similares entre ellos, mientras que los tejidos de pulmón y de mama se representaron por un distintivo bastante diferente (FIGURA 4).
10 Este árbol claramente muestra qué miARN están asociados con un histotipo de cáncer particular.
Sorprendentemente, miR-21, miR-191 y miR-17-5p están significativamente sobreexpresados en todos, o en 5 de 6, de los tipos tumorales que se consideraron. Se indicó que miRs-21 estaba sobreexpresado en glioblastoma y que tenía propiedades antiapoptóticas (Chan, J. A., et al., Cancer Res. 65: 6029-6033 (2005)). El cáncer de pulmón
15 comparte una parte de su distintivo con el cáncer de mama y una parte con los otros tumores sólidos, incluyendo miR-17/20/92, los tres de los cuales son miembros del grupo de microARN que coopera activamente con c-Myc para acelerar la linfomagénesis (He, L., et al., Nature 435: 828-833 (2005)). La identificación de estos microARN como sobreexpresados es una excelente confirmación del enfoque de los inventores. Un segundo grupo de miARN que está activado incluye miR-210 y miR-213, junto con miR-155, que ya se había indicado que estaba amplificado en
20 linfomas de células grandes (Eis, P. S., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 102: 3627-3632 (2005)), niños con linfoma de Burkitt (Metzler, M., et al., Genes Chromosomes Cancer 39: 167-169 (2004)) y diversos linfomas de linfocitos B (Kluiver, J, et al., J. Pathol., publicado digitalmente en línea, 22 de julio de 2005). Estos microARN son los únicos regulados positivamente en cáncer de mama y pulmón. El miR-218-2 está uniformemente regulado negativamente en cánceres de colon, estómago, próstata y páncreas, pero no en carcinomas de pulmón y mama.
25 Varias observaciones refuerzan estos resultados. En primer lugar, en el presente estudio, los niveles de expresión tanto del pre-miARN precursor como del miARN maduro se determinaron para la mayoría de los genes. Debe observarse que con la excepción de miR-212 y miR-128a, en todos los otros casos, la región expresada de forma anómala era la correspondiente al producto génico activo. En segundo lugar, como se muestra en la FIGURA 3, la
30 variación de expresión de los miARN en el subconjunto exhaustivo era con frecuencia unívoca (concretamente regulación positiva o negativa) entre los diferentes tipos de cánceres, lo que sugiere un mecanismo común en la tumorogénesis humana. En tercer lugar, los datos de microseries se validaron por hibridación de solución para 12 muestras de mama (miR-125b, miR-145 y miR-21; Iorio, M. V., et al., Cancer Res. 65: 7065-7070 (2005)) y 17 muestras normales y pancreáticas endocrinas (miR-103, miR-155 y miR-204; datos no mostrados), lo que confirma
35 fuertemente la precisión de los datos de microseries.
Ejemplo 3: Identificación de dianas predichas para microARN que están desregulados en tumores sólidos.
Materiales y métodos:
Predicciones de diana de oncogén y supresor de tumores
Se usaron las predicciones de TargetScan más recientes (Abril de 2005) para identificar dianas de microARN potenciales. Estas incluyen esencialmente las dianas de UTR 3’ indicadas por Lewis et al. (Lewis, B. P., et al, Cell
45 120: 15-20 (2005)), con algunos cambios que surgen de las definiciones de límite génico actualizadas del mapeo del Buscador de Genoma de UCSC de Abril de 2005 de los ARNm RefSeq para el ensamblaje de genoma humano hg17. Entre las dianas potenciales, se especificaron genes de cáncer conocidos (supresores de tumores y oncogenes) de acuerdo con su identificación en el Censo Génico del Cáncer, al que puede accederse en el sitio de Internet www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census/, o como se indica por OMIM en www.ncbi.nlm.nih.gov.
Ensayos in vitro de diana
Para experimentos de indicador de luciferasa, se amplificaron segmentos UTR 3’ de Rb1, TGFBR2 y Plag1 que se predice que interaccionarán con microARN asociados con cáncer específico por PCR a partir de ADN genómico
55 humano y se insertaron en el vector de control pGL3 (Promega) usando el sitio XbaI inmediatamente cadena abajo del codón de terminación de la luciferasa. La línea celular megacariocítica humana, MEG-01, se cultivó en FBS 10 % en medio RPMI 1640, complementado con aminoácido no esencial 1x y 1 mmol de piruvato sódico a 37 ºC en una atmósfera humidificada de CO2 5 %. Las células se cotransfectaron en placas de 12 pocillos usando siPORT neoFX (Ambion, Austin, TX), de acuerdo con el protocolo del fabricante, con 0,4 µg del vector indicador de luciferasa de luciérnaga y 0,08 µg del vector de control que contiene luciferasa de Renilla, pRL-TK (Promega). Para cada pocillo, se usaron oligonucleótidos de microARN (Dharmacon Research, Lafayette, CO) y oligonucleótidos antisentido o mezclados (Ambion) a una concentración de 10 nM. Las actividades de luciferasa de luciérnaga y Renilla se midieron consecutivas a las 24 horas después de la transfección usando ensayos de luciferasa dobles (Promega).
Transferencia de Western para RB1
Los niveles de proteína RB1 se cuantificaron usando un anticuerpo anti-RB1 monoclonal de ratón (Santa Cruz, CA) usando procedimientos convencionales para transferencia de Western. La normalización se realizó con anticuerpo anti Actina monoclonal de ratón (Sigma).
Resultados
Es necesario entender la importancia funcional de la desregulación del microARN en cáncer. En tumores sólidos, parece que el acontecimiento de microARN más habitual es la ganancia de expresión, mientras que la pérdida de expresión en cáncer es un acontecimiento más limitado, y más específico de tejido. Los inventores usaron un enfoque consecuente de tres etapas en el siguiente orden: en primer lugar, predicción informática de dianas, después ensayo de luciferasa para la primera validación de dianas relevantes para cáncer y, finalmente, correlación de tumor ex vivo entre la expresión del miARN (por microserie) y expresión de proteína diana (por transferencia de Western) para un par de interacción miARN:ARNm específico. Las dianas relevantes para miARN de cáncer podrían ser genes de cáncer recesivos (por ejemplo, supresores de tumores) o dominantes (por ejemplo, oncogenes). Para ensayar la hipótesis de que los microARN que se desregulan en tumores sólidos se dirigen a oncogenes o supresores de tumores conocidos, las dianas predichas para estos miARN se determinaron usando Target-Scan, una base de datos de dianas de microARN de UTR 3’ conservadas (Lewis, B. P., et al, Cell 120: 15-20 (2005)). TargetScan contenía 5.121 predicciones para 18 miARN que están desregulados en tumores sólidos, en las 22.402 predicciones totales (26,5 %). Se predijeron ciento quince de 263 (44 %) genes de cáncer bien conocidos como dianas para estos 18 miARN (Tabla 15). Debido a que un alto porcentaje de genes de cáncer son dianas de miR que están desregulados en tumores sólidos, es poco probable que estas predicciones se deban a la casualidad (P<0,0001 en ensayo exacto de Fisher).
Las predicciones informáticas para tres genes de cáncer diferentes, Retinoblastoma (Rb), receptor de TGF-beta-2 (TGFBR2) y gen de adenoma pleiomórfico 1 (PLAG1), se confirmaron experimentalmente por ensayos in vitro. Usando un ensayo de indicador de luciferasa, tres microARN ensayados (miR-106a, miR-20a y miR-26a-1) provocaron una reducción significativa de la traducción de proteínas en relación con los oligoARN de control mezclados en células MEG-01 transfectadas (FIGURA 6). Se descubrió, por ejemplo, que las UTR 3’ de retinoblastoma interaccionaban funcionalmente con miR-106a. La importancia biológica de esta interacción miARN:ARNm se refuerza por informes previos que muestran que el gen de Rb1 se transcribe de forma normal en cánceres de colon, mientras que diversas fracciones de células no expresan proteína Rb1 (Ali, A.A., et al., FASEB J.
7: 931-937 (1993)). Este hallazgo sugiere la existencia de un mecanismo postranscripcional para regular Rb1 que podría explicarse por sobreexpresión de miR-106a conjunta en carcinoma de colon (FIGURA 4). Además, mir-20a está regulado negativamente en cáncer de mama (FIGURA 4) y la proteína TFGBR2 se expresa en el epitelio de células de cáncer de mama (Buck, M. B., et al., Clin. Cancer Res. 10: 491-498 (2004)). Por el contrario, la sobreexpresión de mir-20a en cáncer de colon puede representar un mecanismo nuevo para regular negativamente TGFBR2, además de inactivación mutacional (Biswas, S., et al., Cancer Res. 64: 687-692 (2004)).
Finalmente, se ensayó un conjunto de muestras de paciente para verificar si la expresión de la proteína RB1 se correlacionaba con la expresión de miR-106a (FIGURA 5 y FIGURA 6B). Como se esperaba, en muestras de tumor gástrico, de próstata y de pulmón RB1 estaba regulado negativamente (con respecto al normal emparejado) y se descubrió que miR-106a estaba sobreexpresado, mientras que en muestras de tumor de mama, donde miR-106a está ligeramente regulado negativamente (FIGURA 5 y FIGURA 6B), RB1 se expresa a niveles ligeramente mayores que en el control normal emparejado.
Estas pruebas experimentales refuerzan la hipótesis de que genes clave del cáncer están regulados por expresión aberrante en miR en cánceres sólidos. Estos datos añaden nuevos ejemplos a la lista de microARN con importantes dianas de genes de cáncer, como se ha mostrado previamente por Johnsson et al. (Johnson, S. M., et al., Cell 120: 635-647 (2005)) para la interacción let-7:Ras, O’Donnell et al. (O’Donnell, K. A., et al., Nature 435: 839-843 (2005)) para la interacción miR-17-5p:cMyc, y Cimmino et al. (Cimmino, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 1394413949 (2005)) para la interacción mir-16:Bc12. Notablemente, miR-17-5p y miR-16 son miembros del distintivo de cáncer sólido de miARN descrito en la presente memoria.

Tabla 15. Oncogenes y genes supresores de tumores predichos por TargetScanS como dianas de microARN del
subconjunto de cáncer exhaustivo.*
Gen de miARN
Nombre del Descripción del gen
gen
homólogo de oncogén viral de leucemia murina de Abelson v-abl 2
miR-26a, miR-146
ABL2 (arg, gen relacionado con Abelson)
miR-107
AF5q31 gen fusionado con ALL1 de 5q31
miR-20, miR-125b
AKT3 homólogo de oncogén viral de timoma murino v-akl 3
miR-26a, miR-155 miR-125b
APC poliposis adenomatosa de colon
miR-26a, miR-218
ARHGEF12 factor de intercambio de nucleótidos de guanina de RHO (GEF) 12 (LARG)
miR-107, miR-221
ARNT translocador nuclear de receptores de hidrocarburos de arilo
miR-192
ATF1 factor de transcripción activador 1
miR-26a
ATM ataxia telangiectasia mutada (incluye grupos de complementación A, C
y D)
miR-24
AXL tirosina quinasa receptora de AXL
miR-26a, miR-107, miR-146,
miR-155 miR-138, miR-92
BCL11A CLL de linfocitos B/linfoma 11A
miR-20
BCL11B CLL de linfocitos B/linfoma 11B (CTIP2)
miR-21
BCL2 CLL de linfocitos B/linfoma 2
miR-26a, miR-26a, miR-20,
BCL6 CLL de linfocitos B/linfoma 6 (proteína de dedo de cinc 51)
BCL9
CLL de linfocitos B/linfoma 9
miR-26a, miR-223, miR-221,
CBFB subunidad beta del factor de unión al núcleo
miR-125b
miR-218
CCDC6 Dominio superenrollado que contiene 6 ciclinas D1
(PRAD1:adenomatosis paratiroidea 1)
miR-20
CCND1
miR-26a, miR-20
CCND2 ciclina D2
miR-26a, miR-107, miR-92
CDK6 quinasa dependiente de ciclina 6
miR-20
CDKN1A inhibidor de quinasa dependiente de ciclina 1A (p21, Cip1)
miR-221, miR-92
CDKN1C inhibidor de quinasa dependiente de ciclina 1C (p57, Kip2)
miR-24
CDX2 factor de transcripción de caja homeótica de tipo caudal 2
miR-92
CEBPA CCAAT/proteína de unión potenciadora (C/EBP), alfa
miR-26a
CLTC clatrina, polipéptido pesado (Hc)
miR-218
COL1A1 colágeno, tipo I, alfa 1
miR-26a
CREBBP proteína de unión a CREB (CBP)
miR-20
CRK homólogo del oncogén CT10 del virus del sarcoma aviar v-crk
miR-20
CSF1 factor estimulante de colonias 1(macrófagos)
miR-221, miR-192
DDX6 polipéptido 6 de la caja DEAD/H (Asp-Glu-Ala-Asp/His) (helicasa de
ARN, 54 kD)
miR-138
DEK oncogén DEK (unión a ADN)
miR-20
E2F1 factor de transcripción de E2F 1
miR-20
ELK3 ELK3, proteína de dominio ETS (proteína accesoria de SRF 2)
miR-24
ELL gen de ELL (gen de leucemia rica en lisina 11-19)
miR-26a, miR-138
ERBB4 tipo homólogo de oncogén viral de leucemia eritroblástica aviar v-erb-a
4
miR-221, miR-155, miR-125b
ETS1 homólogo 1 del oncogén E26 de virus de eritroblastosis aviar v-ets
miR-20
ETV1 gen variante de ets 1
miR-125b
ETV6 gen variante de ets 6 (oncogén TEL)
miR-223
FAT homólogo de supresor de tumores FAT (Drosophila)
miR-223, miR-125b, miR-218
FGFR2 receptor de factor de crecimiento de fibroblastos 2
miR-92
FLI1 integración de virus de leucemia de Friend 1
miR-24, miR-20
FLT1 tirosina quinasa 1 relacionada con fins (factor de crecimiento endotelial
vascular/receptor de factor de permeabilidad vascular)
miR-221
FOS homólogo del oncogén viral de osteosarcoma murino v-fos FBJ
miR-92
FOXG1B G1B de caja forkhead
miR-223
FOXO3A O3A de caja forkhead box
miR-125b
VOLGA5 autoantígeno de golgi, subfamilia a de golgina, 5 (PTC5)
miR-138
GPHN gefirina (GPH)
miR-107, miR-223, miR-20,
HLF factor de leucemia hepática
miR-216
miR-26a, miR-107
HMGA1 gancho AT de grupo de alta movilidad 1
miR-20
HOXA13 A13 de caja homeótica
miR-92
HOXA9 A9 de caja homeótica
miR-125b
IRF4 factor regulador de interferón 4
miR-146, miR-20, miR-138
JAZF1 yuxtapuesto con otro gen de dedo de cinc 1
miR-92
JUN homólogo del oncogén 17 del virus de sarcoma aviar v-jun
miR-155
KRAS homólogo del oncogén viral de sarcoma de rata de Kirsten 2 v-Ki-ras 2
miR-218
LASP1 proteína LIM y SH3 1
miR-218
LHFP compañero de fusión de HMGIC de lipoma
miR-125b, miR-218
LIFR receptor de factor inhibidor de leucemia
miR-223
LMO2 dominio de LIM solamente 2 (tipo rombotina 1) (RBTN2)
miR-223, miR-155, miR-125b, MAF homólogo del oncogén de fibrosarcoma musculoaponeurótico (aviar) v
miR-92 maf
miR-92 MAP2K4 proteína quinasa quinasa activada por mitógeno 4
miR-146, miR-20 MAP3K8 proteína quinasa quinasa activada por mitógeno 8
miR-125b MAX proteína MAX
miR-218 MCC mutada en cánceres colorrectales
miR-24 MEN1 neoplasia endocrina múltiple I
miR-138 MLLT6 leucemia mieloide/linfoide o de linaje mixto (homólogo de trithorax, Drosophila) translocado a 6 (AF17) miR-192 MSN moesina MYB homólogo del oncogén viral de mieloblastosis aviar v-myb
miR-107, miR-223, miR-146, MYBL1 tipo homólogo de oncogén viral de mieloblastosis aviar v-myb 1
miR-221, miR-155, miR-218
miR-107, miR-20 MYCN derivado de neuroblastoma de oncogén relacionado con virus de mielocistomatosis aviar v-myc
miR-107, miR-92 MYH9 miosina, polipéptido pesado 9, no muscular
miR-24 MYST4 histona acetiltransferasa MYST (leucemia monocítica) 4 (MORF)
miR-20 NBL1 neuroblastoma, supresión de tumorogenicidad 1
miR-125b NIN nineína (proteína que interacciona con GSK3B)
miR-26a, miR-107 NKTR secuencia de reconocimiento de tumor de citolítica natural
miR-92 NOTCH1 homólogo de Notch 1, asociado a translocación (Drosophila) (TAN1)
miR-24 NTRK3 tirosina quinasa neurotrófica, receptor, tipo 3
miR-125b PCSK7 subtilisina de proproteína convertasa/quexina tipo 7
miR-24, miR-146 PER1 homólogo de periodo 1 (Drosophila)
miR-146, miR-125b. miR-138, PHOX28 homeocaja de tipo emparejado 2b
miR-155 P/CALM proteína de ensamblaje de clatrina de unión a fosfatidilinositol (CALM)
miR-24, miR-26a PIM1 oncogén pim-1
miR-24, miR-26a, miR-21, PLAG1 gen de adenoma pleiomórfico 1
miR-107, miR-20, miR-155
miR-218 RAB8A RAB8A, miembro de la familia de oncogén RAS
miR-24, miR-221 RALA homólogo A del oncogén viral de leucemia de simio v-ral (relacionado
con ras)
miR-138 RARA receptor de ácido retinoico, alfa
miR-20, miR-192 RB1 retinoblastoma 1 (incluyendo osteosarcoma)
miR-20 RBL1 tipo retinoblastoma 1 (p107)
miR-20 RBL2 tipo retinoblastoma 2 (p130)
miR-155, miR-138 REL homólogo de oncogén viral de reticuloendoteliosis aviar v-rel
miR-20, miR-138 RHOC familia del gen homólogo de ras, miembro C
miR-20, miR-192 RUNX1 factor de transcripción relacionado con runt 1 (AML1)
miR-107, miR-223 SEPT6 septina 6
miR-146, miR-20, miR-125b SET translocación de SET
miR-21, miR-20, miR-155, SKI homólogo de oncogén viral de sarcoma aviar v-ski
miR-218
miR-26a, miR-146 SMAD4 SMAD, homólogo 4 de madres contra DPP (Drosophila)
miR-155 SPI1 oncogén de integración proviral de virus formador de focos de bazo
(SFFV) spi1
miR-125b SS18 translocación de sarcoma sinovial, cromosoma 18
miR-107, miR-155 SUFU supresor de homólogo fusionado (Drosophila)
miR-92 TAF15 ARN polimerasa II TAF15, factor asociado a proteína de unión a caja TATA (TBP), 68 kDa
miR-26a, miR-221, miR-138 TCF12 factor de transcripción 12 (HTF4, factores de transcripción de hélicebucle-hélice 4)
miR-21, miR-20 TGFBR2 factor de crecimiento transformante, receptor beta II (70-80 kD)
miR-24, miR-26a, miR-92 TOP1 topoisomerasa (ADN) I
miR-138 TPM4 tropomiosina 4
miR-120 TRIP11 factor de interacción con el receptor de hormona tiroidea 11
miR-92 TSC1 esclerosis tuberosa 1
miR-20 TSG101 gen de susceptibilidad tumoral 101 miR-20 TUSC2 candidato supresor de tumores 2 miR-24 VAV1 oncogén vav 1 miR-125b VAV2 oncogén vav 2 miR-107 WHSC1 candidato de síndrome de Wolf-Hirschhorn 1 (MMSET) miR-138 WHSC1L1 tipo candidato 1 de síndrome de Wolf-Hirschhorn 1 (NSD3) miR-26a WNT5A familia del sitio de integración de MNDTV de tipo wingless, miembro
5A miR-26a, miR-20, miR-125b YES1 homólogo del oncogén viral de sarcoma de Yamaguchi 1 v-yes-1 miR-107, miR-221 ZNF198 proteína de dedo de cinc 198 miR-218 ZNFN1A1 proteína de dedo de cinc, subfamilia 1A, 1 (Ikaros)
* -Los genes de cáncer conocidos (por ejemplo, supresores de tumores, oncogenes) comprenden los identificados en el Censo de Genes de Cáncer en www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census o presentados por OMIM en www.ncbi.nlm.nih.gov.
Aunque esta invención se ha mostrado particularmente y se ha descrito con referencia a realizaciones preferidas de la misma, los expertos en la materia entenderán que pueden realizarse diversos cambios en la forma y detalles de la misma sin alejarse del alcance la invención abarcada por las reivindicaciones adjuntas.
5 LISTADO DE SECUENCIAS
<110> CROCE, CARLO M.
CALIN, GEORGE A. 10 VOLINIA, STEFANO
<120> MÉTODOS BASADOS EN MICRO ARN Y COMPOSICIONES PARA EL DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE CÁNCERES SÓLIDOS
15 <130> 1-28349
<140> 12/160.061
<141>
20 <150> PCT/US07/000159
<151>
<150> 60/756.585
<151> 25
<160> 498
<170> PatentIn versión 3.5
30 <210> 1
<211> 90
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35 <400> 1
<210> 2 40 <211> 72
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23
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22
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22
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22
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22
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22
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22
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22
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22
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22
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23
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21
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23
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21
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23
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22
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22
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22
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23
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22
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22
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22
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22
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21
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21
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22
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uuuaacaugg ggguaccugc ug
22
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23
<210> 471 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 471 uaagugcuuc cauguuugag ugu
23
<210> 472 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
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23
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21
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22
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20
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22
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23
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21
<210> 482 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
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23
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23
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23
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21
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24
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22
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22
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21
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21
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23
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22

Claims (3)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un método para diagnosticar si un sujeto tiene cáncer de estómago, que comprende:
    medir en una muestra de ensayo del sujeto los niveles de un grupo de productos génicos miR que consiste en, miR-223, miR-21, miR-103-2, miR-136, miR-125b-2, miR-103-1, miR-222, miR-212 prec, miR-125b-1, miR-100, miR-92-1, miR-96, miR-192, miR-23a, miR-215, miR-7-2, miR-138-2, miR-99b, miR-33b, miR-218-2, miR-92-2, miR-25, miR-191, miR-221, miR-214, miR-107, miR-24-1 y miR-24-2 en donde una alteración en los niveles del grupo de productos génicos miR en la muestra de tejido de estómago en relación con los niveles de los productos génicos miR correspondientes en una muestra de control, es indicativa de que el sujeto tiene cáncer de estómago.
  2. 2.
    Un método para diagnosticar si un sujeto tiene cáncer de estómago de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la medición de los niveles del grupo de productos génicos miR comprende:
    i) un aumento en los niveles de los productos génicos miR-223, miR-21, miR-103-2, miR-125b-2, miR-103-1, miR-222, miR-125b-1, miR-100, miR-92-1, miR-192, miR-23a, miR-215, miR-7-2, miR-99b, miR-92-2, miR-25, miR-191, miR-221, miR-214, miR-107, miR-24-I and miR-24-2 en la muestra de ensayo, en relación con los niveles del producto o productos génicos correspondientes, y ii) una disminución en los niveles de los productos génicos miR-218-2, miR-136, miR-212 prec, miR-96, miR-1382 y miR-33b en la muestra de ensayo, en relación con el producto o productos génicos correspondientes.
  3. 3.
    Un método para diagnosticar si un sujeto tiene cáncer de estómago de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la medición de los niveles del grupo de productos génicos miR comprende:
    (1) transcribir de forma inversa:
    miR-223, miR-21, miR-103-2, miR-136, miR-125b-2, miR-103-1, miR-222, miR-212 prec, miR-125b-1, miR100, miR-92-1, miR-96, miR-192, miR-23a, miR-215, miR-7-2, miR-138-2, miR-99b, miR-33b, miR-218-2, miR92-2, miR-25, miR-191, miR-221, miR-214, miR-107, miR-24-1 y miR-24-2 provenientes de una muestra de ensayo obtenida del sujeto para proporcionar oligodesoxinucleótidos diana de miR-223, miR-21, miR-103-2, miR136, miR-125b-2, miR-103-1, miR-222, miR-212 prec, miR-125b-1, miR-100, miR-92-1, miR-96, miR-192, miR23a, miR-215, miR-7-2, miR-138-2, miR-99b, miR-33b, miR-218-2, miR-92-2, miR-25, miR-191, miR-221, miR214, miR-107, miR-24-1 y miR-24-2; e
    (2)
    hibridar:
    los oligodesoxinucleótidos diana de ARN miR-223, miR-21, miR-103-2, miR-136, miR-125b-2, miR-103-1, miR222, miR-212 prec, miR-125b-1, miR-100, miR-92-1, miR-96, miR-192, miR-23a, miR-215, miR-7-2, miR-138-2, miR-99b, miR-33b, miR-218-2, miR-92-2, miR-25, miR-191, miR-221, miR-214, miR-107, miR-24-1 y miR-24-2 con una microserie que comprende oligonucleotidos sonda específicos de miRNA que incluye oligonucleotidos sonda específicos de miR-223, miR-21, miR-103-2, miR-136, miR-125b-2, miR-103-1, miR-222, miR-212 prec, miR-125b-1, miR-100, miR-92-1, miR-96, miR-192, miR-23a, miR-215, miR-7-2, miR-138-2, miR-99b, miR-33b, miR-218-2, miR-92-2, miR-25, miR-191, miR-221, miR-214, miR-107, miR-24-1 y miR-24-2 para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra de ensayo; y en donde la determinación de una alteración de los niveles de los productos génicos miR-223, miR-21, miR103-2, miR-136, miR-125b-2, miR-103-1, miR-222, miR-212 prec, miR-125b-1, miR-100, miR-92-1, miR-96, miR-192, miR-23a, miR-215, miR-7-2, miR-138-2, miR-99b, miR-33b, miR-218-2, miR-92-2, miR-25, miR-191, miR-221, miR-214, miR-107; miR-24-1 y miR-24-2 en la muestra de ensayo, en relación con los niveles de los productos génicos miR-223, miR-21, miR-103-2, miR-136, miR-125b-2, miR-103-1, miR-222, miR-212 prec, miR-125b-1, miR-100, miR-92-1, miR-96, miR-192, miR-23a, miR-215, miR-7-2, miR-138-2, miR-99b, miR-33b, miR-218-2, miR-92-2, miR-25, miR-191, miR-221, miR-214, miR-107, miR-24-1 y miR-24-2 en una muestra de control comprende:
    (3)
    comparar:
    el perfil de hibridación de la muestra de ensayo con un perfil de hibridación generado a partir de una muestra de control, en donde una alteración en los niveles de los productos génicos miR-223, miR-21, miR-103-2, miR136, miR-125b-2, miR-103-1, miR-222, miR-212 prec, miR-125b-1, miR-100, miR-92-1, miR-96, miR-192, miR23a, miR-215, miR-7-2, miR-138-2, miR-99b, miR-33b, miR-218-2, miR-92-2, miR-25, miR-191, miR-221, miR214, miR-107, miR-24-1 y miR-24-2 es indicativa de que el sujeto tiene cáncer de estómago.
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