CN112575088B - 一种血浆外泌体miRNA生物标记物及其应用 - Google Patents

一种血浆外泌体miRNA生物标记物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种血浆外泌体miRNA生物标记物及其应用，所述miRNA生物标记物包括miR‑15a‑5p，miR‑106b‑5p，和miR‑107中的一种或多种，具有在制备子宫内膜癌筛查诊断的试剂盒中的应用。在202个测试样本中，通过3个外泌体miRNAs的表达量就能区分子宫内膜癌患者和健康志愿者(AUC＝0.873)，还能和肿瘤标志物CEA以及CA125进行联合(AUC＝0.904)，达到更高的灵敏度和特异性。同时，这三个miRNAs在早期诊断(I期内膜癌患者的诊断)中也有作用，在ROC曲线中它们的联合AUC值为0.869，和肿瘤标志物联合后可进一步提升至0.915。本发明制备的试剂盒由特异性扩增引物以及通用PCR扩增试剂组成，具有较高的临床价值，可以有效用于子宫内膜癌的筛查诊断，包括早期筛查。

Description

一种血浆外泌体miRNA生物标记物及其应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种血浆外泌体miRNA生物标记物及其在制备子宫内膜癌筛查诊断的试剂盒中的应用。
背景技术
一直以来，癌症都是中国乃至世界主要的公共卫生问题。子宫内膜癌作为妇科癌中的常见类型，发病率和死亡率也在逐年攀升。根据Globocan 2018的数据，在中国，子宫内膜癌的发病率和五年流行率均妇科肿瘤中排名第二。2018年大概诊断出了73253个新病例。子宫内膜癌的危险因素包括年龄，肥胖，月经周期增加，高脂饮食和遗传等。目前对子宫内膜癌的诊断的金标准(gold standard)还停留在组织活检。然而，由于宫颈狭窄，活检具有一定的风险性，侵袭性并且有时候对操作的技术有所要求。此外，在之前的研究中已经显示子宫内膜癌具有肿瘤内异质性，这意味着在活检中，可能会丢失一些有价值的信息，比如一些肿瘤亚型。
因此，需要开始关注液体活检，与传统方法相比，液体活检具有无创性，且易于获得，得到的信息也更加全面。一般来说，液体活检主要包括循环肿瘤蛋白，循环肿瘤核酸，循环肿瘤细胞，胞外囊泡和肿瘤血小板。其中胞外囊泡因数量和内容物由脂质膜包裹而具有的稳定性脱颖而出。胞外囊泡主要分为直径较大的微囊泡和直径较小的外泌体。
外泌体是一种纳米级脂质双分子囊泡，可以包裹生物分子(例如蛋白质，脂质，DNA，RNA和miRNA)，在循环中维持其完整性，并将其转移至受体细胞。研究表明，对于同一器官，癌细胞比正常细胞产生更多的外泌体。而miRNA是外泌体中最富集的RNA类型。同时，外泌体miRNA已经被证实通常具有肿瘤特异性，并且在前列腺癌，宫颈癌，结直肠癌和肺癌中都被研究确定为癌症筛选，诊断和检测的生物标志物。
发明内容
基于上述背景，现有的子宫内膜癌诊断方式仍存在一些不足，本发明旨在提供一种血浆外泌体miRNA生物标志物及在子宫内膜癌诊断的微滴式数字PCR试剂盒中的应用，在数据上展现出较高的灵敏度和特异性，并弥补了传统方法的风险性和有创性。
本发明采用了3个miRNAs及其联合效率作为子宫内膜癌筛查的生物标志物。用微滴式数字PCR定量每个样本中的miRNA拷贝数，在灵敏度上优于传统的qRT-PCR。同时，本发明还提出了用于检测这3个miRNAs的诊断试剂盒及检测方法，所述试剂盒由特异性扩增引物以及通用PCR扩增试剂组成，具有较高的子宫内膜癌诊断临床应用价值。
本发明所提供的技术方案：一种血浆外泌体miRNA生物标记物，所述miRNA生物标记物包括miR-15a-5p，miR-106b-5p和miR-107中的一种或多种。miR-15a-5p序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，miR-106b-5p序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，miR-107序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。
进一步地，所述miRNA生物标记物包括miR-15a-5p、mir-106b-5p、miR-107中两种或两种以上的组合。
进一步地，所述miRNA生物标记物还包括其与肿瘤标志物癌胚抗原(CEA)和癌抗原125(CA125)的联合。
进一步地，所述血浆外泌体miRNA生物标记物标准化的内参为miR-26a-5p和let-7b-5p。
进一步地，所述生物标记物来源于血浆外泌体。
本发明还提供了一种血浆外泌体miRNA生物标记物在制备子宫内膜癌筛查诊断的试剂盒中的应用。
进一步地，所述试剂盒包含以下标记物的引物的一种或多种：miR-15a-5p，miR-106b-5p，miR-107。
进一步地，所述试剂盒包含以下两个内参的引物：miR-26a-5p和let-7b-5p。
本发明的优势在于：以本发明中所述血浆外泌体miRNA分子标记物作为宫颈癌早期诊断标志物，灵敏度高，特异性好。在202个测试样本中，通过外泌体miRNAs的表达量区分子宫内膜癌患者和健康志愿者(AUC＝0.873)，还能和肿瘤标志物CEA以及CA125进行联合(AUC＝0.904)，达到更高的灵敏度和特异性。同时，这三个miRNAs在早期诊断(I期内膜癌患者的诊断)中也有作用，在ROC曲线中它们的联合AUC值为0.869，和肿瘤标志物联合后可进一步提升至0.915。本发明所开发的试剂盒方法由特异性扩增引物以及通用PCR扩增试剂组成，具有较高的临床价值，可以有效用于子宫内膜癌的筛查诊断，包括早期筛查。
附图说明
图1为本发明筛选验证用于子宫内膜癌筛查诊断的血浆外泌体miRNA分子标志物的具体流程图。
图2为6个miRNA组合(miR-15a-5p，miR-106b-5p，miR-107，miR-139-3p，miR-3615和miR-574-3p)在56个样本中的分类能力评估。(A)火山图显示了通过质检的共497个miRNA。(B)通过随机森林算法确定最佳分类效果的miRNAs。(C)6种候选miRNA的层次聚类分析将血浆样品大致分为两个不同的组。(D)ROC曲线以评估6种候选miRNA区分子宫内膜癌患者与健康对照受试者的敏感性和特异性。
图3为血浆外泌体miR-15a-5p，miR-106b-5p和miR-107在微滴式数字PCR体系中的验证结果。(A)通过ddPCR测量的202个独立验证样品中外泌体miR-15a-5p，miR-106b-5p和miR-107的表达水平。(B)ROC曲线以验证外泌体miR-15a-5p，miR-106b-5p，miR-107及其组合的鉴别效率(对于不同分期的所有子宫内膜癌患者与健康志愿者)(AUC＝0.873)。(C)ROC曲线用于验证外泌体miR-15a-5p，miR-106b-5p，miR-107和肿瘤标志物(CEA和CA125)组合的鉴别效率(对于不同分期的所有子宫内膜癌患者与健康志愿者)(AUC＝0.904)。(D)ROC曲线可验证外泌体miR-15a-5p，miR-106b-5p，miR-107及其组合的鉴别效率(针对I期内膜癌患者与健康志愿者)(AUC＝0.869)。(E)ROC曲线用于验证外泌体miR-15a-5p，miR-106b-5p，miR-107，肿瘤标志物(CEA和CA125)及其组合的鉴别效率(针对I期内膜癌患者与健康志愿者)(AUC＝0.915)。
图4为在32对内膜癌及其癌旁组织中miR-15a-5p，miR-106b-5p，miR-107的表达，用qRT-PCR完成。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步阐述，下述说明仅是为了解释本发明，本发明不受限于此。
本发明提供的一种血浆外泌体miRNA生物标记物及其在制备子宫内膜癌筛查诊断的试剂盒中的应用的具体筛选和制备过程如下：
(1)收集56份(包括31个健康志愿者和25个子宫内膜癌患者)的外周血样本及病理信息。
(2)用含有ACD抗凝剂的采血管收集的外周血在采血8小时内4℃条件下1900×g离心10分钟后吸取浅黄色上清，在4℃条件下16000×g离心10分钟，取上层，即血浆，分装至1.5ml无核酸EP管。
(3)将10ml无菌PBS加入到Reconstitute Thromboplastin D*中，放入37℃水浴锅内预热。同时，3000×g离心15分钟去除步骤(2)中无核酸EP管中血浆中的冷凝蛋白，取250μl上清放入灭菌无核酸污染的EP管中。加入等量预热好的Reconstitute ThromboplastinD*，吹打后放入37℃水浴锅中计时15分钟。15分钟后，将EP管放入离心机，10000×g离心5分钟。吸取大约450μl上清到EP管中，注意不要碰到或吸取管底的沉淀。每100μl上清，加入25μl SBI公司的外泌体沉淀溶液(SBI，EXOQ20A-1)，并用枪头吹打混匀。继续加入Sigma公司的RNaseA使最终酶浓度为10μg/mL。4℃放置12个小时后，加入鼠源的RNase抑制剂(150units/mL)，用枪头吹打混合均匀。室温，1500×g离心30分钟。弃去上清，沉淀为外泌体沉淀剂复合体。用500μl无菌的PBS小心的清洗管壁，然后弃去PBS。再次室温1500×g离心5分钟。弃残留液体后用25μl无菌PBS重悬外泌体复合物。
(4)用Qiagen公司的miRNeasy Micro Kit提取外泌体中的miRNA之后，用Qubit2.0荧光计检测miRNA的浓度，然后抽样用安捷伦的small RNA芯片在安捷伦2100生物分析仪去检测外泌体miRNA的片段区间和浓度。
(5)使用NEBNext系列的多通道小RNA文库制备试剂盒构建cDNA文库，6ng左右小RNA作为建库的起始量，采用17个循环数。使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化测序文库，用3％琼脂糖凝胶选择140至180bp的片段，然后在10μl10 mM Tris-HCl中获得miRNA文库。根据安捷伦2100生物分析测定的miRNA浓度和平均大小计算其摩尔质量，每个样本等摩尔质量的比例混合均匀，上机测序。测序使用illumina的HiSeq X10测序仪。
(6)从原始读数中除去adaptor的序列，并用Trim Galore进一步修剪两端的低质量序列(质量＜20)。使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)将修整后的读段与人类参考基因组(GRCH37.p5)对齐，每次读段均不存在错配碱基对。使用bedtools对与miRNA(miRbasev20)对齐的读数进行计数。miRNA表达水平通过每百万读数(RPM)映射的读数进行定量。去掉在超过90％的样品中RPM为零的miRNA。然后RPM值被转换为log2(RPM+1)，进行分位数标准化，并使用R语言中的combat package去除上机的批次效应。此时得到497个miRNA的表达情况。此外，从癌症基因组图谱(TCGA)下载了18对子宫内膜癌和癌旁组织的小RNA测序数据。类似地，如上所述处理和分析TCGA样品中的miRNA。
(7)采用置换T检验来比较血浆健康志愿者和子宫内膜癌患者的miRNA表达，鉴定出49个有显著差异的miRNAs(p＜0.01)(即虚线上方)，如图2中的(A)所示。同时将这49个miRNAs对比TCGA中在癌和癌旁组织中也有差异表达的miRNAs。发现在血浆和组织中趋势一致的18个miRNAs，将这18个miRNAs用随机森林的算法选择最佳特征向量，六个在随机森林树中具有较高重要性的miRNA被确定为候选生物标志物，如图2中的(B)所示。接下来，对6种候选miRNA进行层次聚类分析，可以将血浆样品大致分为两个不同的组。在56个样本中，仅有6个样本被错判，如图2中的(C)。同时，如图2中的(D)所示，ROC曲线以评估6种候选miRNA区分子宫内膜癌患者与健康对照受试者的敏感性和特异性。综合这些信息，最终筛选出6个miRNAs(miR-15a-5p，miR-106b-5p，miR-107，miR-139-3p，miR-3615和miR-574-3p)作为生物标志物的候选miRNAs。
表1 TCGA所用样本编号表
Figure BDA0002868261850000061
Figure BDA0002868261850000071
表2 6个候选miRNAs的AUC，sensiticity及specificity表
AUC sensiticity specificity
miR-139-3p 0.813 0.720 0.839
miR-15a-5p 0.819 0.840 0.710
miR-106b-5p 0.745 0.600 0.935
miR-107 0.726 0.600 0.839
miR-574-3p 0.748 0.840 0.645
miR-3615 0.693 0.560 0.871
6miRs 0.983 0.960 0.935
(8)在202个独立样本(包括87个健康志愿者，115个子宫内膜癌患者)的血浆外泌体中针对上述6个候选miRNAs进行微滴式数字PCR分析。在测试集中，6个miRNAs中的3个显示出和测序数据一样的趋势，如图3中的(A)所示。并且将这三个miRNAs进行联合区分内膜癌和健康人的AUC可达0.873，因此可以将它们作为内膜癌筛查的生物标志物，miR-15a-5p序列如序列表中SEQ ID NO：1：UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG所示，miR-106b-5p序列如序列表中SEQ ID NO：2：UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU所示，miR-107序列如序列表中SEQ ID NO：3：AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA所示。如图3中的(B)所示，进一步地，将202个样本中有肿瘤标志物CEA和CA125的病人挑选出来，将肿瘤标志物和3个miRNAs进行联合之后AUC会升至0.904，如图3中的(C)所示。此外，检测了这三个miRNAs在I期内膜癌患者和健康志愿者的ROC曲线的联合AUC值为0.869，如图3中的(D)所示。同时miRNAs和肿瘤标志物的联合达到了0.915，如图3中的(E)所示。
本发明还提供了血浆外泌体miRNA生物标记物在制备子宫内膜癌筛查诊断的试剂盒中的应用，所述试剂盒进行检测的具体方法为：
1.血液处理、血浆外泌体分离及外泌体RNA的提取及逆转录
用含有ACD抗凝剂的采血管收集的外周血在采血8小时内4℃条件下1900×g离心10分钟后吸取浅黄色上清，在4℃条件下16000×g离心10分钟，取上层，即血浆，分装至1.5ml无核酸EP管。
将10ml无菌PBS加入到Reconstitute Thromboplastin D*中，放入37℃水浴锅内预热。同时，3000×g离心15分钟去除无核酸EP管里血浆中的冷凝蛋白，取250μl上清放入灭菌无核酸污染的EP管中。加入等量预热好的Reconstitute Thromboplastin D*，吹打后放入37℃水浴锅中计时15分钟。15分钟后，将EP管放入离心机，10000×g离心5分钟。吸取大约450μl上清到EP管中，注意不要碰到或吸取管底的沉淀。每100μl上清，加入25μl SBI公司的外泌体沉淀溶液(SBI，EXOQ20A-1)，并用枪头吹打混匀。继续加入Sigma公司的RNaseA使最终酶浓度为10μg/mL。4℃放置12个小时后，加入鼠源的RNase抑制剂(150units/mL)，用枪头吹打混合均匀。室温，1500×g离心30分钟。弃去上清，沉淀为外泌体沉淀剂复合体。用500μl无菌的PBS小心的清洗管壁，然后弃去PBS。再次室温1500×g离心5分钟。弃残留液体后用25μl无菌PBS重悬外泌体复合物。
按照说明书用Qiagen公司的miRNeasy Micro Kit提取外泌体中的miRNA之后，用Qubit 2.0荧光计检测miRNA的浓度。并用miRNA First Strand cDNA Synthesis(TailingReaction)(Sangon Biotech)进行逆转录。逆转录体系为如表3所示。
表3逆转录体系
Figure BDA0002868261850000081
Figure BDA0002868261850000091
37℃加热变性60分钟，然后85℃加热5分钟使酶失活，4℃保存。
2.血浆外泌体RNA的微滴式数字PCR检测
使用miR-15a-5p，miR-106b-5p，miR-107和2个内参miR-26a-5p和let-7b-5p的特异性引物(表4)检测血浆外泌体中各miRNAs的表达。根据Qubit 2.0荧光计检测的miRNA浓度，将每个样本稀释到在预实验过程中摸索好的相应适合的浓度，保证每个miRNA的ddPCR的阳性液滴数在可信范围内。利用Biorad QX200微滴数字PCR系统进行数字PCR扩增。使用染料法配套的Biorad QX200TM ddPCRTM EvaGreen Supermix来测定血浆外泌体中miRNA的表达值。每个ddPCR反应液的体系为20μl，具体配比为：逆转录cDNA模板：1-8ul，QX200ddPCR EvaGreen Supermix(2x)：10ul，miRNA的F端引物(1μM)：1ul，miRNA的F端引物(1μM)：1ul，最后用无菌水定容至20ul。将20μl混合液移取到一次性液滴发生器管中，每个样本的相应位置加入70μl液滴生成油，用QX200液滴生成器产生大约40μl的油包水液滴。将生成的40μl微滴移入96孔板中，用铝膜封好后，避光放置4℃保存。将混合液放入热循环仪中，进行如下反应：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，60℃退火加延伸1分钟，以上两步循环40次，然后4℃预冷5分钟，90℃使酶失活10分钟，最后设置在4℃保存以加强染料的稳定性。所有以上步骤的升降温速度保持在2℃/s，较慢升降温速度是为了保证油包水液滴升降温的一致性。
表4 miRNA引物序列表
Figure BDA0002868261850000092
Figure BDA0002868261850000101
根据扩增完成后，阳性液滴与阴性液滴的比例，来计算其初始样本中miRNA的绝对表达值。数字PCR的R端引物，建议配合逆转录试剂盒一起使用。
选择miR-26a-5p和let-7b-5p作为内参，用它们的平均拷贝数来校正上样误差。具体地，每个miRNA的表达量计算公式为：miRNA拷贝数/内参平均拷贝数。
表5 3个筛选出的内膜癌生物标志物miRNA的AUC，sensiticity及specificity表
Figure BDA0002868261850000102
Figure BDA0002868261850000111
(9)通过对独立的32对子宫内膜癌组织及其癌旁组织中这3个miRNA的qRT-PCR验证。3个都与外泌体miNRA的变化趋势一致，且均为极显著。进一步说明，血浆外泌体miRNAs可以反映该miRNA在组织中的表达，如图4所示。
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江大学医学院附属妇产科医院
<120> 一种血浆外泌体miRNA生物标记物及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
uagcagcaca uaaugguuug ug 22
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
uaaagugcug acagugcaga u 21
<210> 3
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
agcagcauug uacagggcua uca 23
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cacgtagcag cacataatgg tttgtg 26
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aggtaaagtg ctgacagtgc agat 24
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agcagcattg tacagggcta tca 23
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgtgaggtag taggttgtgt ggtt 24
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccgttcaagt aatccaggat aggct 25

Claims (7)

1.一种血浆外泌体miRNA生物标记物在制备子宫内膜癌筛查诊断的试剂盒中的应用，所述生物标记物为miR-15a-5p，miR-106b-5p和miR-107的组合。
2.根据权利要求1所述的血浆外泌体miRNA生物标记物在制备子宫内膜癌筛查诊断的试剂盒中的应用，其特征在于，miR-15a-5p序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，miR-106b-5p序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，miR-107序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。
3.根据权利要求1所述的血浆外泌体miRNA生物标记物在制备子宫内膜癌筛查诊断的试剂盒中的应用，其特征在于，所述miRNA生物标记物还包括其与肿瘤标志物癌胚抗原（CEA）和癌抗原125（CA125）的联合。
4.根据权利要求1所述的血浆外泌体miRNA生物标记物在制备子宫内膜癌筛查诊断的试剂盒中的应用，其特征在于，所述血浆外泌体miRNA生物标记物标准化的内参为miR-26a-5p和let-7b-5p。
5.根据权利要求1所述的血浆外泌体miRNA生物标记物在制备子宫内膜癌筛查诊断的试剂盒中的应用，其特征在于，所述生物标记物来源于血浆外泌体。
6.根据权利要求1所述的血浆外泌体miRNA生物标记物在制备子宫内膜癌筛查诊断的试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒包含以下标记物的引物：miR-15a-5p, miR-106b-5p, miR-107。
7.根据权利要求1所述的血浆外泌体miRNA生物标记物在制备子宫内膜癌筛查诊断的试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒包含以下两个内参的引物：miR-26a-5p和let-7b-5p。
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