CN102018965A

CN102018965A - miRNA-10a在制备抑制结肠癌的侵袭和转移药物中的应用

Info

Publication number: CN102018965A
Application number: CN 201010285274
Authority: CN
Inventors: 汤华; 李欣; 吴海东; 刘涛; 万海英; 李怡璇; 王芳; 刘民
Original assignee: Tianjin Medical University
Current assignee: Tianjin Medical University
Priority date: 2010-09-17
Filing date: 2010-09-17
Publication date: 2011-04-20

Abstract

本发明公开了miRNA-10a在制备抑制结肠癌的侵袭和转移药物中的应用，所述miRNA-10a是序列表中SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列。通过实验表明：与低转移性细胞株SW480相比，miRNA-10a在高转移性细胞株SW620是低水平表达的；Northern blot和实时定量PCR实验也证明：在高转移性结肠癌细胞株及临床标本中miRNA-10a也是低水平表达的；转染pri-miR-10a提高SW620细胞miRNA-10a水平则使该细胞的侵袭活性显著下降，在其它高转移性结肠癌细胞株也出现类似结果。实验结果表明miRNA-10a在体外抑制结肠癌细胞的侵袭，在体内抑制结肠癌细胞的转移。

Description

miRNA-10a在制备抑制结肠癌的侵袭和转移药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医学材料技术领域。涉及一种miRNA-10a的用途。

背景技术

肿瘤的发生与转移涉及非常复杂的机制和过程，由转移产生的继发性肿瘤是人类癌症高发病率和死亡率的主要原因。转移是恶性肿瘤最重要的特征，转移造成细胞外基质的破坏，使肿瘤细胞迁徙和基质微环境的改变，这些过程与一些特定基因的失调相关。近来发现：微小RNA家族(miRNA)具有基因调控子的作用，它们是一群18-26nt的非编码RNA，通过与靶mRNA的3’非编码区(UTR)互补位点的相互作用在转录后水平调节基因的表达(Bartel DP.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function.Cell 2004；116：281-297)。最新研究表明：一些miRNA参与乳腺癌的转移，miR-10b通过抑制HOXD10间接活化前转移基因RHOC，导致肿瘤的侵袭和转移(Ma L，et al.Tumour invasion and metastasis initiatedby microRNA-10b in breast cancer.Nature 2007；449：682-688)；而miR-335通过靶定转录因子SOX4和tenascinC抑制转移和迁徙(Tavazoie SF，et al.Endogenous humanmicroRNAs that suppress breast cancer metastasis.Nature 2008；451：147-152)；miR-373和miR-520促进转移(Huang Q，et al.The microRNAs miR-373and miR-520c promote tumourinvasion and metastasis.Nat Cell Biol 2008；10：202-210)；miR-21不仅在乳腺癌而且在结肠癌和神经胶质瘤中均刺激侵袭和转移(Zhu S，et al.MicroRNA-21 targets tumorsuppressor genes in invasion and metastasis.Cell Res 2008；18：350-359.AsanganiIA，et al.MicroRNA-21(miR-21) post-transcriptionally downregulates tumorsuppressor Pdcd4 and stimulates invasion，intravasation and metastasis in colorectalcancer.Oncogene 2008；27：2128-2136.Gabriely G，et al.MicroRNA 21promotes gliomainvasion by targeting matrix metalloproteinase regulators.)。

结肠癌的肝转移是导致患者死亡的首要因素，但其分子机制尚未阐明，早期报道提示：原始肿瘤是异质性的，高转移性的肿瘤细胞存在于原始的肿瘤细胞群中(Fidler IJ，KripkeML.Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor.Science 1977；197：893-895.)

两个结肠癌细胞株，SW480和SW620是从同一患者分离得到的，SW480细胞由原始癌演化而来，而SW620则由淋巴结转移部位培养得到，这两个细胞株差别在于转移潜能的变化，因而成为研究肿瘤转移机制的理想模型。

我们以这两个细胞株为主要研模型进行研究。

发明内容

本发明的目的在于提供miRNA-10a在制备抑制结肠癌的侵袭和转移药物中的应用。

本发明的技术方案概述如下：

miRNA-10a在制备抑制结肠癌的侵袭和转移药物中的应用，其特征是所述miRNA-10a是序列表中SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列。

所述核苷酸序列为化学合成获得或通过构建真核细胞表达载体进行表达获得。

通过研究实验表明：与低转移性细胞株SW480相比，miRNA-10a(miR-10a)在高转移性细胞株SW620是低水平表达的；Northern blot和实时定量PCR实验也证明：在高转移性结肠癌细胞株及临床标本中miR-10a也是低水平表达的；转染pri-miR-10a提高SW620细胞miR-10a水平则使该细胞的侵袭活性显著下降，在其它高转移性结肠癌细胞株(HT-29和THC8307细胞)也出现类似结果。裸鼠体内实验结果表明：转染pri-miR-10a后，高转移结肠癌细胞株SW620形成转移瘤的能力明显降低，说明miR-10a在体外抑制结肠癌细胞的侵袭，在体内抑制结肠癌细胞的转移。

附图说明

图1为miR-10a在SW480细胞和未转移的结肠癌标本中高表达；

图2miR-10a抑制结肠癌细胞的体外侵袭和体内的肝转移；

图3miR-10a在体外并不影响细胞活性及增殖；

图4用EGFP报告载体实验验证miRNA-10a靶基因；

图5miR-10a对靶基因表达的调节。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

1.细胞培养

结肠癌细胞株SW480、SW620和HT-29均培养在含10％FBS的Dulbecco’s培养基中，结肠癌THC8307细胞株培养在含10％FBS的RPMI 1640培养基中，两种培养基均添加100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素，所有细胞均置含5％CO₂的37℃培养箱内，2-3天传代一次。

2.结肠癌细胞小RNA的提取纯化

使用mir^TMmiRNA Isolation(Ambion，Austin，TX)试剂盒从结肠癌细胞以及未转移和肝转移的结肠癌临床标本提取小RNA，并将其溶于无RNase的水中，通过测定OD260、OD280数值，并经琼脂糖凝胶电泳确定提取的小RNA含量和质量。

3.miRNA微阵列分析

使用mirVana^TMmiRNA探针系统和mirVana^TMmiRNA标记试剂盒(Ambion，Austin，TX，USA)，按照说明书方法进行探针点样、miRNA荧光标记和杂交。玻片用

Expressmicroarray进行扫描，扫描出的图象用

Express version 1.0分析系统进行数据的采集和输出。

4.实时定量PCR分析

用SYBR Premix Ex Taq^TM试剂盒(TaKaRa，Otsu，Shiga，Japan)在Applied Biosystems 7500实时定量PCR系统上进行，茎环RT-PCR方法按常规进行(Chen C，et al.Real-timequantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.Nucleic Acids Res.2005；33：e179)。进行数据处理分析，将所得数据标准化后比较各组之间目的基因的变化，绘制柱状图：

Folds＝2^-ΔΔCt ΔΔCt＝(Ct1-Ct2)-(Ct3-Ct4)

Ct1：处理样品待测基因(miR-9)的临界循环数

Ct2：处理样品持家基因(U6)的临界循环数

Ct3：对照样品待测基因(miR-9)的临界循环数

Ct4：对照样品持家基因(miR-9)的临界循环数。

5.Northern blot

在8M尿素变性的18％聚丙烯酰胺凝胶分离小RNA，将小RNA电转移到带正电荷的BrightStar尼龙膜上，经紫外交联、预杂交后，与P³²标记探针杂交，形成20-30bp的杂交片段，冲洗并曝光到X胶片上，然后扫描。以U6基因探针与膜进行杂交，其杂交信号作为内参。

6.Western blot

24孔板培养细胞，细胞成片后每孔加入100μl RIPA，置于4℃裂解25min；收集裂解液反复吹打，4℃12000rpm，离心10min，收集上清；考马司亮蓝G-250法测定蛋白含量，各样品均取出50μg进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳；至目的蛋白有效分离后停止电泳，取出聚丙烯酰胺凝胶进行硝酸纤维素膜电转移；4℃，100mA，转移过夜；出硝酸纤维素膜，置于Blotto封闭液中，室温下封闭3h；加入一抗(兔抗ACTG1蛋白抗体或兔抗MMP14蛋白抗体)，室温下孵育2h；TBST清洗4次，每次5min；加入二抗(羊抗兔IgG抗体)，室温下孵育1h；TBST清洗4次，每次5min；加入增强化学发光试剂，作用3min，曝光，然后进行显影、定影处理；观察结果，胶片用LabWorks^TM凝胶成像及分析系统进行摄像，分析各组蛋白条带的亮度值。

7.细胞转染

将SW480或SW620细胞铺于细胞培养板，待细胞生长至70％-80％成片时(约18-24h后)，分别转染甲氧基寡核苷酸和miRNA前体，转染所用试剂为Lipofectamine2000(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，按常规方法并参照说明书进行转染。寡核苷酸和siRNA的工作浓度200nm/L，转染所用核苷酸见下述序列。

pri-miR-10a包含miR-10a序列。

miR-10a序列为5’uacccuguagauccgaauuugug3’(SEQ ID NO：1)

antisense miR-10a 5’cacaaattcggatctacagggta3’(SEQ ID NO：2)

antisense control 5’gactacacaaatcagcgattt3’(SEQ ID NO：3)

ACTG1-targeting siRNA 5’gacucagcagaugcguagcauuu tt 3’(SEQ IDNO：4)

3’tt cugagucgucuacgcaucguaaa5’(SEQ ID NO：5)

MMP14-targeting siRNA 5’cacuuucugcauccagaauuatt 3’(SEQ ID NO：6)

3’ttgugaaagacguaggucuuaau 5’(SEQ ID NO：7)

control siRNA 5’uucuccgaacgugucacgutt3’(SEQ ID NO：8)

3’ttaagaggcuugcacagugca5’(SEQ ID NO：9)

8.侵袭实验

在Transwell的每个上层小室加30μl Matrigel(2μg/μL)，37℃孵箱1h，使胶重组成为模拟基底膜结构，将100μL含5×10⁴SW480或SW620细胞的无血清Dulbecco’s MEM细胞悬液加到上层小室，下层小室加入600μl 10％FBS的Dulbecco’s MEM培养液，放入37℃孵箱中。60h后用棉签擦除上层小室里面的未侵袭的细胞，再用PBS冲洗2次，下层带有侵袭细胞的膜用固定液固定，然后染色。

9.动物实验研究

BALB/c无胸腺雌性裸鼠购自中国科学院动物研究所，在天津医科大学实验动物部在SPF条件下饲养。6-8周龄时进行脾注射，实验分SW620细胞组、SW620细胞转染载体对照组、SW620细胞转染pri-miR-10a表达载体组，每组6只裸鼠，用10％水合氯醛按3μL/g剂量麻醉小鼠，左侧腹部剪口，找到脾脏；25μL Dulbecco’s MEM含1×10⁶细胞的悬液与25μLmatrigel(1mg/mL)混匀，用BD超细针(BD Biosciences产品)缓慢注射进脾脏下极内侧，为防止感染腹腔注射庆大霉素注射液400μL。注射完成后，继续饲养，6周后处死小鼠，解剖尸体，观察脾脏肿瘤生长状况，肝脏、肺脏及其他器官是否有转移瘤形成。所有可疑组织均做好标记，拍照，若有表面结节，计数后，冻于液氮中。视结果情况用10％甲醛溶液固定过夜后做病理。

10.生物信息学筛选靶基因

利用网站预测：miRanda，TargetScan和PicTar查找miRNA-10a的靶基因，并依据各基因功能(与肿瘤的关系)筛出侯选靶基因。

11.载体构建

①构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告载体：以pEGFP-N2(Clontech，Mountain View，CA，USA)为模板，通过PCR扩增克隆得到全长719bp的EGFP片段，所用上游引物序列：5’-gcagccaagcttgccaccatgtgtagcaagggc-3’，下游引物序列：5’-cgcggatcctttacttgtacagctcgtcc-3’，扩增的片段通过HindIII、BamH I克隆到pcDNA3.1(+)载体上，形成pcDNA3/EGFP表达载体。

②含靶基因作用位点的EGFP报告载体的构建：PCR扩增ACTG1的3’UTR片段(含预测的miR-10a结合位点)，扩增的片段通过BamH I、EcoR I插入到pcDNA3/EGFP的EGFP编码区的下游，构建成pEGFP/ACTG1-UTR载体；类似地，可将MMP14-UTR片段、ACTG13’UTR突变片段和MMP143’UTR突变片段通过BamH I、EcoR I插入到pcDNA3/EGFP的EGFP编码区的下游，构建成pEGFP/MMP14-UTR载体、pEGFP/ACTG1-UTR-M和pEGFP/MMP14-UTR-M载体。

③miR-10a原始转录物表达载体的构建：PCR扩增pri-miR-10a片段，扩增的片段通过BamH I、EcoR I克隆到pcDNA3.1(+)载体上，形成pcDNA3(+)/pri-miR-10a vector表达载体。

12.荧光报告载体实验

SW480和SW620细胞各自接种到24孔板，次日分别转染miR-10a ASO、ASO对照或pri-miR-10a、无关寡核苷酸对照，24h后再转染含靶基因作用位点(包括突变的靶基因作用位点)的EGFP的各个报告载体；所有各个实验组及对照组细胞均同时转染红色荧光蛋白(RFP)表达载体作为内参，以便标准化，72h后用RIPA裂解细胞，收取蛋白，用荧光分光光度计F-4500(HITACHI)。

本发明通过miRNA芯片发现：miRNA-10a在人结肠癌低转移细胞SW480中高表达，而在人结肠癌高转移细胞SW620中非常显著地低表达，Northern blot和实时定量PCR实验不仅验证了miRNA芯片的结果，并且还显示：在结肠癌的临床标本中，未转移组miRNA-10a表达量同样显著地高于转移组(见表1和图1)。

表1、SW480与SW620细胞miRNAs表达差异

表1通过miRNAs微阵列分析SW480与SW620细胞几种miRNAs表达的差异；基因与背景比值≥1.5就被认为表达阳性，若比值＜1.5则表达阴性，显示SW480与SW620细胞几种miRNAs差异表达与背景的比值。

图1A是用实时定量PCR检测miR-10a在SW480与SW620细胞中的表达水平；

图1B用Northern blot检测miR-10a在SW620、SW480细胞、肝转移的结肠癌标本(MT)与未转移的结肠癌标本(NMT)中的表达水平，U6snRNA作为内参。

通过表1图1表明：与低转移性细胞株SW480相比，miR-10a在高转移性细胞株SW620是低水平表达的；Northern blot和实时定量PCR实验也证明：在高转移性结肠癌细胞株及临床标本中miR-10a也是低水平表达的。

标本miR-10a表达量的验证结果显示出与细胞模型高度一致的趋势。因此可以推论：miR-10a在结肠癌淋巴结转移过程中扮演着重要角色。

为研究miR-10a在结肠癌中所起的作用，本发明采用了细胞模型和动物实验来观察miR-10a与结肠癌侵袭和转移的关系。研究结果表明，SW620细胞具有比SW480细胞更高的侵袭活性，并且用2’甲氧基miR-10a的反义链(miR-10a ASO)封闭SW480细胞中的miR-10a，其侵袭活性显著增强，而转染pri-miR-10a提高SW620细胞miR-10a水平则使该细胞的侵袭活性显著下降，在其它高转移性结肠癌细胞株(HT-29和THC8307细胞)也出现类似结果(见图2)；

在图2中：

图2A用Matrigel侵袭实验检测SW480和SW620细胞侵袭活性；

图2B、图2C用Matrigel侵袭实验检测SW480细胞、转染2’甲氧基miR-10a ASO或转染对照寡核苷酸(Ctrl-ASO)的SW480细胞的侵袭活性，侵袭的细胞经结晶紫染色后记数，图2C为200×的图象；

图2D用Matrigel侵袭实验检测SW620细胞、转染pri-miR-10a或载体对照的SW620细胞的侵袭活性；

图2E用Matrigel侵袭实验检测SW620细胞、转染靶定ACTG1的siRNA(ACTGi-siR)、转染靶定MMP14的siRNA(MMP14-siR)和转染对照siRNA(Ctrl-siR)的SW620细胞的侵袭活性；

图2F-1、图2F-2用Matrigel侵袭实验检测miR-10a过表达对HT-29和THC8307侵袭的影响(*p＜0.05；**p＜0.01)

图2G用实时定量PCR实验证实pri-miR-10a载体的有效性，将pri-miR-10a表达载体转染到高转移SW620、HT-29和THC8307细胞系，然后用实时定量PCR检测miR-10a表达水平，直方图显示miR-10a在这些细胞的相对表达水平；

图2H动物体内实验检测miR-10a过表达对结肠癌肝转移调节的作用，SW620细胞分别转染pri-miR-10a(SW620-pri-miR-10a)和载体对照(SW620-Ctrl)，各自注射到裸鼠脾脏，图中列出了形成两组实验裸鼠的肝脏转移瘤裸鼠数、肝表面结节总数和肝重与体重的比值。

图2I脾脏注射分别转染载体对照(1，2)和pri-miR-10a(3，4)SW620细胞的裸鼠肝脏的大体观察和H-E染色(200×)。在1组中的黑箭头表示在肝脏表面的转移结；在2组中低分化SW620细胞围绕大片坏死组织排列，肿瘤组织与肝组织边界清晰可见；pri-miR-10a处理的SW620细胞组仅出现很少的转移灶(3，4)。(N：正常肝组织；M：转移瘤组织。)

图3，miR-10a并不影响细胞的活性和增殖。

细胞活性检测；用2’甲氧基miR-10a ASO封闭SW480细胞的mir-10a(图3A)，在SW620细胞中转染pri-miR-10a使mir-10a过表达(图3B)，用MTT方法检测细胞活性，直方图显示三次独立实验A₅₇₀均值±SD；

细胞增殖活性检测；用2’甲氧基miR-10a ASO封闭SW480细胞的mir-10a(图3C)，在SW620细胞中转染pri-miR-10a使mir-10a过表达(图3D)，用细胞生长曲线实验检测细胞增殖活性。

图2图3表明，miR-10a在体外抑制结肠癌细胞的侵袭而不是抑制细胞的生长。裸鼠体内实验结果表明：转染pri-miR-10a后，高转移结肠癌细胞株SW620形成转移瘤的能力明显降低即miR-10a在体内抑制结肠癌的转移。

本发明探讨了miR-10a抑制结肠癌细胞的侵袭和转移的机制，通过靶位点预测数据库预测miR-10a可能的靶基因，并结合基因的功能，筛选出γ1-肌动蛋白(actin，gamma 1，ACTG1)和基质金属蛋白酶14(matrix metallopeptidase 14，MMP14)是miR-10a最可能的功能靶基因。

在哺乳动物中，miRNA引起mRNA的降解或翻译抑制是通过与靶mRNA的3’UTR碱基配对并相互作用实现的，成熟mRNA的第2-8碱基是靶向识别的最重要区域，因而被称为种子区域。通过Targetscan数据库分析我们找到了miR-10a与ACTG1和MMP14的mRNA在3’UTR上的功能结合位点，为了证实这一点，本发明采用荧光报告载体实验进行验证，实验表明：与仅转染EGFP表达载体相比，将带有靶基因3’UTR的EGFP表达载体转染SW480细胞后，荧光表达信号的强度显著降低(图4)。

图4A从TargetScan数据库获得的ACTG1mRNA和MMP14mRNA的3’UTR与miR-10a互补序列；

图4B转染各组荧光报告载体的SW480细胞中EGFP荧光强度的检测结果；

图4C、图4D封闭miR-10a的SW480细胞EGFP荧光强度的检测结果，在SW480细胞中抑制miR-10a会增加带有ACTG1mRNA 3’UTR或MMP14mRNA 3’UTR的EGFP的表达，而对带有ACTG1mRNA突变的3’UTR或MMP14mRNA突变的3’UTR的EGFP的表达没有影响；

图4E、图4F在过表达miR-10a的SW620细胞中，带有ACTG1mRNA 3’UTR or或MMP14mRNA 3’UTR的报告载体，EGFP的表达受到抑制，而带有ACTG1mRNA突变的3’UTR or或MMP14mRNA突变的3’UTR的报告载体，EGFP的表达不受影响。(*p＜0.05；**p＜0.01；

)

图5为miR-10a对靶基因表达的调节

图5中：图5A，图5B分别在SW480细胞和SW620细胞中检测的ACTG1和MMP14表达，

图5A实时定量RT-PCR检测结果，图5B Western blotting检测结果；

图5C、图5D在SW480细胞转染2’甲氧基miR-10a ASO或转染对照寡核苷酸(Ctrl-ASO)后ACTG1和MMP14的表达，(C)实时定量RT-PCR检测结果，(D)Western blotting检测结果。(*p＜0.05；**p＜0.01)

实时定量PCR和Western blot检测表明：无论从mRNA水平还是蛋白水平，SW620细胞的ACTG1和MMP14表达都显著高于SW480细胞；用2’甲氧基-miR-10a ASO封闭miR-10a SW480细胞的miR-10a，无论从mRNA水平还是蛋白水平ACTG1和MMP14的表达均显著上升。这就证明ACTG1和MMP14是miR-10a的直接靶基因。

本发明探讨了ACTG1和MMP14的侵袭相关功能，分别合成ACTG1和MMP14各自特异性的siRNA，转染到SW620细胞以分别下调原来高表达的ACTG1和MMP14，结果SW620细胞的侵袭活性大幅度地被抑制(图2E)。这表明ACTG1和MMP14能够增加结肠癌细胞的侵袭活性；进而说明在结肠癌肝转移调节中，这两个基因是miR-10a的功能靶基因。

综合上述结果：miR-10a抑制结肠癌的侵袭和转移，它是通过下调靶基因ACTG1和MMP14发挥作用的；在高转移的结肠癌细胞和肝转移结肠癌患者标本中，miR-10a是低水平表达的。因而通过检测miR-10a可以预测结肠癌的转移性。并可以利用miRNA-10a来制备抑制结肠癌的侵袭和转移的药物。

Claims

1.miRNA-10a在制备抑制结肠癌的侵袭和转移药物中的应用，其特征是所述miRNA-10a是序列表中SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述miRNA-10a在制备抑制结肠癌的侵袭和转移药物中的应用，其特征是所述核苷酸序列为化学合成获得或通过构建真核细胞表达载体进行表达获得。