ES2325481T9 - Inhibidores peptidomiméticos de proteasa - Google Patents

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Description

Inhibidores peptidomiméticos de proteasa
La presente invención se refiere a compuestos peptidomiméticos y a composiciones farmacéuticas quecontienen los compuestos peptidomiméticos, y al uso de los compuestos peptidomiméticos o composiciones de losmismos en la preparación de un medicamento para inhibir la proteasa, particularmente la serina proteasa y másparticularmente la proteasa NS3 del virus de la hepatitis C ("HCV"). Los compuestos peptidomiméticos, comoinhibidores de la proteasa NS3 de HCV, son particularmente útiles a la hora de interferir con el ciclo de vida del virusde la hepatitis C y en el tratamiento o prevención de una infección por HCV o afecciones fisiológicas asociadas conella. La presente invención también se refiere al uso de los compuestos peptidomiméticos o composicionesfarmacéuticas o kits y paquetes farmacéuticos de los mismos en la preparación de un medicamento para terapia decombinación para inhibir la replicación de HCV en células, o para tratar o prevenir una infección por HCV enpacientes. De acuerdo con la presente invención se incluyen como composiciones farmacéuticas las quecomprenden un inhibidor de serina proteasa de HCV junto con un interferón que tiene actividad anti-HCV; uninhibidor de serina proteasa de HCV junto con un compuesto, distinto de un interferón, que tiene actividad anti-HCV;
o un inhibidor de serina proteasa de HCV junto con un interferón que tiene actividad anti-HCV y un compuesto,distinto de un interferón, que tiene actividad anti-HCV. Los compuestos peptidomiméticos pueden prepararse usando procedimientos estereoselectivos para preparar intermedios de bicicloprolinato quirales útiles en la síntesis de loscompuestos peptidomiméticos.
La infección por el HCV es un problema médico humano fascinante y actualmente se ha reconocido comoel agente causante de la mayoría de los casos de hepatitis no A y no B.
Se cree que el HCV infecta crónicamente al 3% de la población mundial [A, Alberti y col., "Natural History of
Hepatitis C. J. Hepatology, 31, (Supl. 1), 17-24 (1999)]. Sólo en los Estados Unidos el índice de infección es del 1,8% o de 3,9 millones de personas [M.J. After, Hepatitis C Virus Infection in the United States." J. Hepatology, 31, (Supl. 1), 88-91(1999)]. De todos los pacientes infectados, alrededor del 70% desarrollan una infección crónica que se cree que es una causa fundamental de cirrosis y carcinoma hepatocelular. [D. Lavanchy, "Global Surveillance and Control of Hepatitis C, " J. Viral Hepatitis, 6, 35-47 (1999)].
La replicación del VHC incluye la codificación genómica de una poliproteína de 3010-3033 aminoácidos [Q.-
L. Choo, et al., “Genetic Organization and Diversity of the Hepatitis C Virus”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 24512455 (1991); N. Kato et al., “Molecular Cloning of the Human Hepatitis C Virus Genome From Japanese Patients withNon-A, Non-B Hepatitis”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9524-9528 (1990); A. Takamizawa et al., “Structure and Organization of the Hepatitis C Virus Genome Isolated From Human Carriers”, J. Virol., 65, 1105-1113 (1991)]. Sesupone que las proteínas no estructurales (NS) del VHC proporcionan la maquinaria catalítica esencial para lareplicación viral. Las proteínas NS se obtienen por escisión proteolítica de la poliproteína [R. Bartenschlager et al.,“Nonstructural Protein 3 of the Hepatitis C Virus Encodes a Serine-Type Proteinase Required for Cleavage at the NS3/4 and NS4/5 Junctions”, J. Virol., 67, 3835-3844 (1993); A. Grakoui et al. “Characterization of the Hepatitis CVirus-Encoded Serine Proteinase: Determination of Proteinase-Dependent Polyprotein Cleavage Sites”, J. Virol., 67,2832-2843 (1993); A. Grakoui et al., Expression and Identification of Hepatitis C Virus Polyprotein CleavageProducts", J. Virol., 67, 1385-1395 (1993); L. Tomei et al., “NS3 is a serine protease required for processing ofhepatitis C virus polyprotein”, J. Virol., 67, 4017-4026 (1993)]. De hecho, se ha demostrado que los primeros 181 aminoácidos de NS3 (restos 1027-1207 de la poliproteína viral) contienen el dominio de serina proteasa de NS3 que procesa los cuatro sitios cadena abajo de la poliproteína de VHC [C. Lin et al., “Hepatitis C Virus NS3 SerineProteinase: Trans-Cleavage Requirements and Processing Kinetics”, J. Virol., 68, 8147-8157 (1994)]. La proteína 3NS del VHC (NS3) contiene una actividad serina proteasa que ayuda al procesamiento de la mayoría de las enzimasvirales y, por lo tanto, se considera esencial para la replicación e infectividad viral. La esencialidad de la proteasaNS3 se dedujo del hecho de que mutaciones en la proteasa NS3 del virus de la fiebre amarilla reducen la infectividad viral [F.J. Chambers et al., “Evidence that the N-terminal Domain of Nonstructural Protein NS3 From Yellow Fever Virus is a Serine Protease Responsible for Site-Specific Cleavages in the Viral Polyprotein”. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 87, 8898-8902 (1990)]. Más recientemente, se demostró que mutaciones en el sitio activo de la proteasa NS3de VHC podían anular completamente la infección por VHC en un modelo de chimpancé [C.M. Rice et al. “HepatitisC virus-encoded enzymatic activities and conserved RNA elements in the 3’-nontranslated region are essential forvirus replication in vivo.” J. Virol., 74(4) 2046-51 (2000)]. La proteasa de serina NS3 de VHC también se consideraesencial para la replicación viral tal cual y su cofactor asociado, NS4A, ayuda al procesamiento de todas las enzimasvirales. Este procesamiento parece ser análogo al realizado por la aspartil proteasa del virus de la inmunodeficienciahumana (“VIH”). Además, el uso demostrado de inhibidores de proteasas de VIH como potentes agentes antivirales en el ser humano demuestra que la interrupción de una etapa de procesamiento de proteína proteasas en el ciclo devida viral produce agentes terapéuticamente activos. Por consiguiente, la enzima proteasa es una diana atractivapara el descubrimiento de fármacos.
Se han descrito varios posibles inhibidores de proteasas de VHC. Las Publicaciones PCT Número WO00/09558, WO 00/09543, WO 99/64442, WO 99/07733, WO 99/07734, WO 99/50230, W098/46630, WO 98/17679 yWO 97/43310, la Patente de Estados Unidos Nº 5.990.276, M. Llinás-Brunet et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 8, 1713-1718 (1998), W. Han et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, 711-713 (2000). R. Dunsdon et al., Bioorg. Med.Chem. Lett., 10, 1571-1579 (2000), M. Llinás-Brunet et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, 2267-2270 (2000) y S.LaPlante et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, 2271-2274 (2000) describen, cada uno, posibles inhibidores de la proteasa NS3 de VHC. Desafortunadamente, actualmente no se dispone de inhibidores de serina proteasa comoagentes anti-VHC.
De hecho, no existen terapias anti-VHC excepto el interferón-a, la combinación de interferón-a/ribavirina y, más recientemente, el interferón-a pegilado. Sin embargo, los porcentajes de respuesta sostenida para las terapias de interferón-a e interferón-a/ribavirina tienden a ser bajos (<50%) y los efectos secundarios presentados por lasterapias tienden a ser significativos y severos [M.A. Walker,”Hepatitis C Virus: an Overview of Current Approaches
and Progress,” DDT, 4, 518-529 (1999); D. Moradpour et al., “Current and Evolving Therapies for Hepatitis C”, Eur. J.Gastroenterol. Hepatol., 11, 1199-1202 (1999); H.L.A. Janssen et al., “Suicide Associated with Alfa-Interferon Therapy for Chronic Viral Hepatitis”, J. Hepatol., 21, 241-243 (1994); y P.F. Renault et al., “Side effects of alpha interferon”, Seminars in Liver Disease 9, 273-277 (1989)]. Además, las terapias con interferón sólo inducen remisión5 a largo plazo en únicamente una fracción (~25%) de los casos [O. Weiland, “Interferon Therapy in Chronic Hepatitis C Virus Infection”, FEMS Microbiol. Rev., 14, 279-288 (1994)]. Los problemas mencionados anteriormente con lasterapias de interferón-a han llevado al estudio clínico y al desarrollo de compuestos de interferón-a modificados pegilados como agentes terapéuticos mejorados contra el VHC. En vista de la situación actual en relación con lasterapias anti-VHC está claro que existe la necesidad de terapias más eficaces y mejor toleradas. Además, la síntesis10 de compuestos peptidomiméticos complejos ha estado obstaculizada durante mucho tiempo por la naturaleza no estereoselectiva de la mayoría de los procedimientos orgánicos sintéticos. Es bien sabido que la actividad terapéutica de los enantiómeros de los compuestos peptidomiméticos varía ampliamente. Por lo tanto, es muy beneficioso proporcionar estos procedimientos sintéticos estereoespecíficos. Los intentos previos de sintetizarintermedios de bicicloprolinato quiralmente específicos útiles en la síntesis de los presentes inhibidores de proteasa
15 peptidomiméticos terapéuticos han tenido el inconveniente de ser no enatioselectivos o diastereoselectivos, o implicar rutas sintéticas largas, o ser poco adecuados para preparar grandes cantidades de producto. De estamanera, también existe la necesidad de un medio para preparar grandes cantidades de bicicloprolinatos de una manera diastereoselectiva y en una forma enantioméricamente enriquecida.
Sumario de la Invención
20 La presente invención se refiere a un compuesto
o sales farmacéuticamente aceptables y profármacos del mismo, solvatos de dicho compuesto, sus sales y susprofármacos, y
25 o sales farmacéuticamente aceptables y profármacos del mismo, solvatos de dicho compuesto, sus sales y sus profármacos.
La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto BW o CU y el uso del compuesto BW o CU en la preparación de un medicamento para inhibir la proteasa de HCV, o tratar oprevenir una infección por HCV en pacientes o una afección fisiológica relacionada con la infección. Se describe un
30 procedimiento estereoselectivo para preparar un compuesto de bicicloprolinato quiral que es un intermedio útil en la preparación de un compuesto BW y CU. El procedimiento sintético comprende las etapas de:
(a) escindir y ciclar un compuesto de fórmula 24 en la que:
es cicloalquilo opcionalmente sustituido o arilcicloalquilo opcionalmente sustituido condensado; R11 es -CO2R13; R12 es un aducto de glicinimida imínica; R13 es un grupo protector de ácido o un grupo alifático opcionalmente sustituido; en condiciones de escisión y ciclación para formar un compuesto de fórmula 25
en la que: R14 es -CONR13R15, -CN;
15 o-CO2R16;
R15 es un grupo alifático opcionalmente sustituido: R16
es un grupo protector de ácido, arilo opcionalmente sustituido o un grupo alifático opcionalmente sustituido; y
(b) proteger el nitrógeno del resto lactama del compuesto de fórmula 25 con un grupo protector de amida20 para formar un compuesto de fórmula 26
en la que:
pO es un grupo protector de amida;
R14 es como se describe en el presente documento; y
(c) reducir el compuesto de fórmula 26 en condiciones de reducción para formar un compuesto de fórmula 27
en la que: PO y R14 son como se describen en el presente documento: y
(d) desproteger el compuesto de fórmula 27 en condiciones de desprotección para formar un compuesto de fórmula 28
en la que:
R14 es como se describe en el presente documento.
La invención también se refiere al procedimiento sintético anterior que comprende adicionalmente la etapa
en la que el compuesto de fórmula 24 se prepara realizando una adición de Michael con un compuesto de glicinimida
imínica sobre un compuesto de fórmula 29
en la que:
es cicloalquenilo opcionalmente sustituido o arilcicloalquenilo condensado opcionalmente sustituido; R11 es -CO2R13; donde:
el compuesto de fórmula 29 puede prepararse por esterificación de un compuesto de fórmula 29a
en la que:
es cicloalquenilo opcionalmente sustituido o arilcicloalquenilo condensado opcionalmente sustituido;
10 R11a es -CHO, -COR15,-C�N o -CONR15R15; y
R15 es como se describe en este documento.
Particularmente, un especialista en la técnica conocerá que la conversión de cetonas en ésteres puede realizarse, por ejemplo, por una reacción de Bayer-Villiger. La conversión de nitrilos y amidas en ésteres puede realizarse, por ejemplo, por hidrólisis acuosa seguido de esterificación adicional. La conversión de aldehídos en
15 ésteres puede realizarse, por ejemplo, por oxidación del aldehído seguido de esterificación.
Otro aspecto de la invención son composiciones farmacéuticas que comprenden, además de uno o más delos inhibidores de la serina proteasa de HCV BW y CU, uno o más interferones o compuestos que inducen laproducción de interferones que muestran actividad anti-HCV y/o uno o más compuestos que tienen actividad anti-HCV, incluyendo compuestos inmunomoduladores tales como citoquinas inmunoestimuladoras que muestran
20 actividad antiviral de HCV, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la invención es el uso de los compuestos BW y CU para la preparación de un medicamentopara tratar o prevenir una infección por HCV en un paciente que lo necesita, que comprende administrar a dichopaciente una cantidad farmacéuticamente eficaz de una combinación de uno o más de los inhibidores de la serinaproteasa de HCV BW y CU: uno o más interferones o compuestos que inducen la producción de un interferón que
25 muestran actividad anti-HCV; y/o uno o más compuestos que tienen actividad anti-HCV, incluyendo compuestos inmunomoduladores tales como citoquinas inmunoestimuladoras que muestran actividad antiviral de HCV.
La invención también se refiere al uso de uno o más de los inhibidores de la serina proteasa de HCV BW y CU junto con uno o más interferones o compuestos que inducen la producción de un interferón que muestranactividad anti-HCV y/o uno o más compuestos que tienen actividad anti-HCV, incluyendo compuestos
30 inmunomoduladores tales como citoquinas inmunoestimuladoras que muestran actividad antiviral de HCV, para preparar un medicamento para tratar o prevenir una infección por HCV en un paciente que lo necesita.
La presente invención también se refiere a un kit o paquete farmacéutico para tratar o prevenir unainfección por HCV en un paciente, en el que el kit o paquete farmacéutico comprende una pluralidad de recipientesseparados, donde al menos uno de dichos recipientes contiene uno o más de los inhibidores de la serina proteasa
35 de HCV BW y CU (solo o junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable), al menos otro de dichos recipientes contiene uno o más interferones o compuestos que inducen la producción de un interferón que muestranactividad anti-HCV, (solo o junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable) y, opcionalmente, almenos otro de dichos recipientes contiene uno o más compuestos que tienen actividad anti-HCV (solo o junto con unvehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable), incluyendo compuestos inmunomoduladores tales como
40 citoquinas inmunoestimuladoras que muestran actividad antiviral de HCV.
La cantidad del inhibidor(es) de la serina proteasa de HCV, interferón(es) o compuesto(s) anti-HCV encualquiera de las aplicaciones anteriores puede ser una cantidad farmacéuticamente eficaz, una cantidad subclínica eficaz anti-HCV o combinaciones de las mismas, siempre que la combinación final de inhibidor(es) de la serinaproteasa de HCV, interferón(es) o compuestos que inducen la producción de un interferón que muestra actividadanti-HCV, y/o compuesto(s) anti-HCV, comprenda una cantidad farmacéuticamente eficaz de compuestos que seaeficaz en el tratamiento o prevención de una infección por HCV en un paciente.
Breve Descripción de los Dibujos
Lo anterior y otros aspectos, características y ventajas de la presente invención se entenderán mejor a
partir de la siguiente descripción detallada tomada junto con los dibujos adjuntos, todos ellos dados únicamente a
modo de ilustración, y que no son limitantes de la presente invención, en el que:
La Figura 1 muestra la inhibición de la acumulación de ARN del replicón de VHC después de 48 horas detratamiento de células que contienen replicón con el Compuesto CU e interferón alfa-2B, individualmente o en combinación. La Figura 2 muestra gráficamente la concavidad del isobol mostrada por compuestos usados en combinación que son antagonistas,aditivos y sinérgicos de acuerdo con los procedimientos de cálculo de sinergia de Greco, Park y Rustom((1990) Application of a New Approach for the Quantitation of Drug Synergism to the Combination of cis-Diamminedichloroplatinum and 1-1-D-Arabinofuranosylcytosine, Cancer Research, 50, 5318-5327).
La Figura 3 muestra la relación geométrica entre a y la cantidad de curvatura en el isobol. Se representa unisobol hipotético al nivel de efecto E=50% con un isobol de línea recta que se esperaría con aditividad. M es el punto de intersección de la línea y = x y el isobol hipotético, N es el punto de intersección de la línea y = xy el isobol de línea recta, O es el origen (0.0), S proporciona una medida de la cantidad de curvatura en elisobol, donde S = ON/OM. ON es la distancia de O a N y OM es la distancia de O a M. El parámetro a estárelacionado con S por la ecuación a = 4(S2 -S).
La Figura 4 muestra los cálculos de isobol usando el procedimiento de Greco et al., supra, para la combinación del compuesto CU y el interferón alfa-2B (Schering-Plough) usando 6 diluciones de cadacompuesto en el Experimento 1.
La Figura 5 muestra los cálculos de isobol usando el procedimiento de Greco et al., supra, para la combinación del compuesto CU y el interferón alfa-2A usando 6 diluciones de cada compuesto en elExperimento 2.
La Figura 6 muestra los cálculos de isobol usando el procedimiento de Greco et al., supra, para la combinación del compuesto CU y el interferón alfa-2B (Schering-Plough) usando 8 diluciones de cadacompuesto en el Experimento 3.
La Figura 7 muestra los cálculos de isobol usando el procedimiento de Greco et al., supra, para la combinación del compuesto CU y el interferón alfa-2A usando 8 diluciones de cada compuesto en elExperimento 4.
La Figura 8 muestra los cálculos de isobol usando el procedimiento de Greco et al., supra, para la combinación del compuesto CU y el interferón tau ovino usando 8 diluciones de cada compuesto en elExperimento 5.
La Figura 9 muestra los cálculos de isobol usando el procedimiento de Greco et al., supra, para la combinación del compuesto EC y el interferón alfa-2B (Schering-Plough) usando 8 diluciones de cadacompuesto en el Experimento 6.
La Figura 10 muestra los cálculos de isobol usando el procedimiento de Greco et al., supra, para lacombinación del compuesto EC y el interferón alfa-2A usando 8 diluciones de cada compuesto en elExperimento7.La Figura 11 muestra los cálculos de isobol usando el procedimiento de Greco et al., supra, para la combinación del compuesto CU y el interferón beta usando 8 diluciones de cada compuesto en el Experimento 8.
La Figura 12 muestra los cálculos de isobol usando el procedimiento de Greco et al., supra, para lacombinación del compuesto EP y el interferón alfa-2B (Schering-Plough) usando 8 diluciones de cada compuesto en el Experimento 9.
Figura 13 muestra los cálculos de isobol usando el procedimiento de Greco et al., supra, para la combinación de ribavirina e interferón alfa-2B (Schering-Plough) usando 8 diluciones de cada compuesto enel Experimento 10.
La Figura 14 muestra la inhibición de la acumulación de ARN de replicón de VHC causada por tratamientode células que contienen replicón con (A) ribavirina sola o (B) interferón alfa-2B solo. En los dos paneles semuestra la inhibición medida así como la inhibición corregida en relación con la citotoxicidad de los compuestos.
Descripción Detallada de la Invención
Los contenidos de cada uno de los documentos de patente y otras referencias citadas en este documentose incorporan en este documento como referencia en su totalidad.
Como se han usado anteriormente y como se usan a lo largo de la descripción de la invención, se
entenderá que las siguientes abreviaturas, a menos que se indique otra cosa, tienen los siguientes significados:
Designación
Reactivo o Fragmento
ACN
Acetonitrilo
AIBN
2,2'-azobisisobutironitrilo
BOC o Boc
carbamato de terc-butilo
BOP
hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxitris(dimetilamino)fosfonio
n-Bu; SnH
hidruro de tri-n-butilestaño
t-Bu
terc-butilo
Cbz
carbamato de bencilo
PTC quiral
catalizador de transferencia de fase quiral
DAST
trifluoruro de (dietilamino)azufre (Et2NSF3)
DCC diciclocarbodiimida DCM diclorometano (CH2Cl2) DIBAL-H Hidruro de diisobutilaluminio DIC 1,3-diisopropilcarbodiimida DIPEA diisopropiletilamina DMAP 4-(N,N-dimetilamino)piridina reactivo de DMP Reactivo de peryodinano de Dess-Martin Et3Si trietilsilano FMOC 9-fluorenilmetoxicarbonilo H-Chg-OH
DMF
Dimetilformamida
DMSO
Dimetilsulfóxido
AE
análisis elemental
EDCI
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida HCl
equiv.
equivalente(s)
Et
etilo
Et2O
éter dietílico
EtOH
etanol
EtOAc
acetato de etilo
HOAt 1-hidroxi-7-azabenzotriazol HOBT 1-hidroxibenzotriazol HOSu N-hidroxisuccinamida HPLC cromatografía líquida de alta resolución LAH anhídrido de litio y aluminio Me Metilo Mel Yoduro de metilo MeOH Metanol MeOC(O)Cl cloroformiato de metilo MOMCl cloruro de metoximetilo MOM Metoximetilo EM espectroscopía de masas NaBH4 borohidruro sódico Na2C4H4O6 tartrato sódico NMP N-metil pirrolidinona RMN resonancia magnética nuclear P-Unido a polímero PyBOP hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxitris-pirrolidino-fosfonio TBD 1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]-dec-5-eno RP-HPLC cromatografía líquida a alta presión -fase inversa TBSCl cloruro de terc-butildimetilsililo TCA ácido tricloroacético TFA ácido trifluoroacético Tf2O anhídrido de triflato THF tetrahidrofurano THP tetrahidropirano TLC cromatografía de capa fina
Como se han usado anteriormente y como se usan a lo largo de la descripción de la invención, se entiendeque las siguientes expresiones y términos, a menos que se indique otra cosa, tienen los siguientes significados:
"Ácido bioisóstero" se refiere a un grupo que tiene similitudes químicas y físicas que producen propiedadesbiológicas muy similares a un grupo carboxi (véase Lipinski, Annual Reports in Medicinal Chemistry, "Bioisosterism In Drug Design" 21, 283 (1986); Yun, Hwahak Sekye. "Application Of Biolsosterism To NewDrug Design", 33, 576-579, (1993): Zhao, Huaxue Tongbao, "Bioisosteric Replacement And DevelopmentOf Lead Compounds In Drug Design" 34-38, (1995): Graham. Theochem, "Theoretical Studies Applied To Drug Design:ab initio Electronic Distributions In Bio-isosteres" 343, 105-109, (1995)). Los ácidos bioisósteros ejemplares incluyen -C(O)-NHOH, -C(O)-CH2-OH, -C(O)-CH2SH, -C(O)-NH-CN, sulfo, fosfono,alquilsulfonilcarbamoílo, tetrazolilo, arilsulfonilcarbamoílo, N-metoxicarbamoílo, heteroarilsulfonilcarbamoílo,3-hidroxi-3-ciclobuteno-1,2-diona, 3,5-dioxo-1,2,4-oxadiazolidinilo o hidroxiheteroarilo tal como 3hidroxiisoxazolilo, 3-hidroxi-1-metilpirazolilo y similares.
"Grupo funcional ácido" se refiere a un resto que tiene un hidrógeno ácido. Los grupos funcionales ácidosejemplares incluyen carboxilo (-C(O)OH), -C(O)-NHOH, -C(O)-CH2OH, -C(O)-CH2SH, -C(O)-NH-CN, sulfo, fosfono, alquilsulfonilcarbamoílo, tetrazolilo, arilsulfonilcarbamoílo, N-metoxicarbamoílo, heteroarilsulfonilcarbamoílo, 3-hidroxi-3-ciclobuteno-1,2-diona, 3,5-dioxo-1,2,4-oxadiazolidinilo o hidroxiheteroarilo tal como 3-hidroxiisoxazolilo, 3-hidroxi-1-metilpirazolilo, imidazolilo, mercapto y similares,y un hidroxi apropiado tal como un hidroxi aromático, por ejemplo, hidroxifenilo.
"Grupo protector de ácido" se refiere a un grupo fácilmente retirable que se sabe en la técnica que protegea un hidrógeno ácido de un grupo carboxilo frente a una reacción indeseable durante los procedimientossintéticos, por ejemplo, para bloquear o proteger la funcionalidad ácida mientras se realizan las reaccionesque implican otros sitios funcionales del compuesto, y que puede retirarse de forma selectiva. Dichos grupos protectores de ácido se conocen bien por los especialistas en la técnica, y se han usado ampliamente en la protección de grupos carboxilo, como se describe en las Patentes de Estados Unidos Nº
3.840.556 y 3.719.667, cuyas divulgaciones se incorporan en este documento por referencia. Para gruposprotectores de ácido adecuados, véase T.W. Green y P.G.M. Wuts en "Protective Groups in OrganicChemistry" John Wiley y Sons, 1991. El grupo protector de ácido también incluye un grupo protector deácido lábil a la hidrogenación como se define en este documento. Los grupos protectores de ácido ejemplares incluyen ésteres tales como alquilo inferior C1-R sustituido y sin sustituir, por ejemplo, metilo, etilo, t-butilo, metoximetilo, metiltiometilo, 2,2,2-tricloroetilo y similares, tetrahidropiranilo, fenilalquilo sustituido y sin sustituir tal como bencilo y derivados sustituidos de los mismos tales como gruposalcoxibencilo o nitrobencilo y similares, cinnamilo, dialquilaminoalquilo, por ejemplo, dimetilaminoetilo y similares, trimetilsililo, amidas e hidrazidas sustituidas y sin sustituir, por ejemplo, amidas e hidrazidas deN,N-dimetilamina, 7-nitroindol, hidrazina, N-fenilhidrazina y similares, grupos aciloxialquilo tales como pivaloiloximetilo o propioniloximetilo y similares, aroiloxialquilo tal como benzoiloxietilo y similares, alcoxicarbonilalquilo tal como metoxicarbonilmetilo, ciclohexiloxicarbonilmetilo y similares, alcoxicarboniloxialquilo tal como t-butiloxicarboniloximetilo y similares, alcoxicarbonilaminoalquilo tal como tbutiloxi-carbonilaminometilo y similares, alquilaminocarbonilaminoalquilo, tal como metilaminocarbonilaminometilo y similares, acilaminoalquilo tal como acetilaminometilo y similares, heterociclilcarboniloxialquilo tal como 4-metil-piperazinil-carboniloximetilo y similares, dialquilaminocarbonilalquilo tal como dimetilaminocarbonil-metilo y similares, (5-(alquil inferior)-2-oxo-1,3dioxolen-4-il)alquilo tal como (5-t-butil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)metilo y similares, y (5-fenil-2-oxo-1,3dioxolen-4-il)alquilo tal como (5-fenil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)metilo y similares.
"Grupo protector de amina lábil para ácidos" se refiere a un grupo protector de amina como se define eneste documento que se retira fácilmente por tratamiento con un ácido mientras sigue siendo relativamenteestable a otros reactivos. Un grupo protector de amina lábil para ácidos preferido es BOC.
"Alifático" se refiere a alquilo, alquenilo o alquinilo como se define en este documento.
"Sustituyente(s) de grupo alifático" se refieren a sustituyentes unidos a un grupo alifático como se define eneste documento incluyendo arilo, heteroarilo, hidroxi, alcoxi, cicliloxi, ariloxi, heteroariloxi, acilo o su análogotioxo, ciclilcarbonilo o su análogo tioxo, aroílo o su análogo tioxo, heteroaroílo o su análogo tioxo, aciloxi,ciclilcarboniloxi, aroiloxi, heteroaroiloxi, halo, nitro, ciano, carboxi (ácido), -C(O)-NHOH, -C(O) CH2OH, -C(O)-CH2SH, -C(O)-NH-CN, sulfo, fosfono, alquilsulfonilcarbamoílo, tetrazolilo, arilsulfonilcarbamoílo, Nmetoxicarbamoílo, heteroaril-sulfonilcarbamoílo, 3-hidroxi-3-ciclobuteno-1,2-diona, 3,5-dioxo-10,2,4oxadiazolidinilo o hidroxiheteroarilo tal como 3-hidroxiisoxazolilo, 3-hidroxi-1-metilpirazolilo, alcoxicarbonilo,cicliloxicarbonilo, ariloxicarbonilo, heteroariloxicarbonilo, alquilsulfonilo, ciclilsulfonilo, arilsulfonilo, heteroarilsulfonilo, alquilsulfinilo, ciclilsulfinilo, arilsulfinilo, heteroarilsulfinil alquiltio, cicliltio, ariltio, heteroariltio, ciclilo, arildiazo, heteroarildiazo, tiol, metileno (H2C=), oxo (O=), tioxo (S=), Y1Y2N-, Y1Y2NC(O)-, Y1Y2NC(O)O-, Y1Y2NC(O)NY3-, Y1Y2NSO2-, o Y3SO2NY1-donde R2 es como se define en este documento, Y1 e Y2 son independientemente hidrógeno, alquilo, arilo o heteroarilo, e Y3 es alquilo, cicloalquilo arilo o heteroarilo, o para cuando el sustituyente es Y1Y2N-, entonces uno de Y1 e Y2 puede ser acilo, ciclilcarbonilo, aroílo, heteroaroílo, alcoxicarbonilo, cicliloxicarbonilo, ariloxicarbonilo o heteroariloxicarbonilo, como se define en este documento, y el otro de Y1 e Y2 es como se ha definido previamente, o para cuando el sustituyente es Y1Y2NC(O)-, Y1Y2NC(O)O-, Y1Y2NC(O)NY3-o Y1Y2NSO2-, Y1 e Y2 también pueden tomarse junto con el átomo de N a través del cual Y1 e Y2 están unidos para formar unazaheterociclilo o azaheterociclenilo de 4 a 7 miembros. Son sustituyentes de grupo alifático ácidos/de amida carboxi (ácido), -C(O)-NHOH, -C(O)-CH2OH, -C(O)-CH2SH, -C(O)=NH-CN, sulfo, fosfono, alquilsulfonilcarbamoílo, tetrazolilo, arilsulfonilcarbamoílo, N-metoxicarbamoílo, heteroarilsulfonilcarbamoílo,3-hidroxi-3-ciclobuteno-1,2-diona, 3,5-dioxo-1,2,4-oxadiazolidinilo o hidroxiheteroarilo tal como 3hidroxiisoxazolilo, 3-hidroxi-1-metilpirazolilo e Y1Y2NCO-. Son sustituyentes de grupo alifático no ácido polarhidroxi, oxo (O=), tioxo (S=), acilo o su análogo tioxo, ciclilcarbonilo o su análogo tioxo, arilo o su análogotioxo, heteroaroílo o su análogo tioxo, alcoxicarbonilo, cicliloxicarbonilo, ariloxicarbonilo, heteroariloxicarbonilo, aciloxi, ciclilcarboniloxi, aroiloxi, heteroaroiloxi, alquilsulfonilo, ciclilsulfonilo, arilsulfonilo, heteroarilsulfonilo, alquilsulfinilo, ciclilsulfinilo, arilsulfinilo, heteroarilsulfinilo, tiol, Y1Y2N-, Y1Y2NC(O)-, Y1Y2NC(O)O)-, Y1Y2NC(O)NY3-o Y1Y2NSO2-. Los grupos alifáticos ejemplares que tienen unsustituyente de grupo alifático incluyen metoximetoxi, metoxietoxi, etoxietoxi, (metoxi-, benciloxi-, fenoxi-oetoxi-) carbonil(metilo o etilo), benciloxicarbonilo, piridilmetiloxi-carbonilmetilo, metoxietilo, etoximetilo, nbutoximetilo, ciclopentilmetiloxietilo, fenoxipropilo, fenoxialilo, trifluorometilo, ciclopropil-metilo, ciclopentilmetilo, carboxi(metilo o etilo), 2-fenetenilo, benciloxi, 1-o 2-naftil-metoxi, 4-piridil-metiloxi, henciloxietilo, 3-benciloxialilo, 4-piridilmetil-oxietilo, 4-piridilmetil-oxialilo, bencilo, 2-fenetilo, naftilmetilo, estirilo, 4-fenil-1,3-pentadienilo, fenil-propinilo, 3-fenilbut-2-inilo, pirid-3-ilacetilenilo y quinolin-3-ilacetilenilo,4-piridil-etinilo, 4-piridilvinilo, tieniletenilo, piridiletenilo, imidazolil-etenilo, piraziniletenilo, piridilpentenilo, piridilhexenilo y piridilheptenilo, tienilmetilo, piridilmetilo, imidazolilmetilo, pirazinilmetilo, tetrahidropiranilmetilo, tetrahidropiranil metiloximetilo y similares.
"Acilo" se refiere a un grupo H-CO-o (alifático o ciclilo)-CO-en el que el grupo alifático es como se describeen este documento. Los acilo preferidos contienen un alquilo inferior. Los grupos acilo ejemplares incluyenformilo, acetilo, pmpanoílo, 2-metilpropanoílo, butanoílo, palmitoilo, acriloilo, propinoílo, ciclohexilcarbonilo y similares.
"Alquenoílo" se refiere a un grupo alquenil-CO-en el que el alquenilo es como se define en este documento.
"Alquenilo" se refiere a un grupo hidrocarbonado alifático que contiene un doble enlace carbono-carbono,que puede ser lineal o ramificado y que tiene de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 átomos decarbono en la cadena. Los grupos alquenilo preferidos tienen de 2 a aproximadamente 12 átomos decarbono en la cadena; y más preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 átomos decarbono en la cadena. Ramificado significa que uno o más grupos alquilo inferior tales como metilo, etilo opropilo se unen a una cadena alquenilo lineal. "Alquenilo inferior" significa de aproximadamente 2 aaproximadamente 4 átomos de carbono en la cadena que puede ser lineal o ramificada. Los gruposalquenilo ejemplares incluyen etenilo, propenilo, n-butenilo, i-butenilo, 3-metilbut-2-enilo, n-pentenilo,heptenilo, octenilo, ciclohexilbutenilo, decenilo y similares. "Alquenilo sustituido" se refiere a un grupoalquenilo como se ha definido anteriormente que está sustituido con uno o más "sustituyentes de grupoalifático" (preferiblemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en estedocumento. Los sustituyentes de grupo alifático alquenilo ejemplares incluyen grupos halo o cicloalquilo.
"Alqueniloxi" se refiere a un grupo alquenil-O-en el que el grupo alquenilo es como se describe en estedocumento. Los grupos alqueniloxi ejemplares incluyen aliloxi, 3-buteniloxi y similares.
"Alcoxi" se refiere a un grupo alquil-O-donde el grupo alquilo es como se describe en este documento. Losgrupos alcoxi ejemplares incluyen metoxi, etoxi, n-propoxi, i-propoxi, n-butoxi, heptoxi y similares.
"Alcoxicarbonilo" se refiere a un grupo alquil-O-CO-, en el que el grupo alquilo es como se define en este documento. Los grupos alcoxicarbonilo ejemplares incluyen metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, tbutiloxicarbonilo y similares.
"Alquilo" se refiere a un grupo hidrocarbonado alifático que puede ser lineal o ramificado y que tiene deaproximadamente 1 a aproximadamente 20 átomos de carbono en la cadena. Los grupos alquilo preferidostienen de 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono en la cadena, prefiriéndose más alquilo inferiorcomo se define en este documento. Ramificado significa que uno o más grupos alquilo inferior tales como metilo, etilo o propilo están unidos a una cadena alquilo lineal. "Alquilo inferior" significa de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 átomos de carbono en la cadena que puede ser lineal o ramificada. "Alquilo sustituido" se refiere a un grupo alquilo como se ha definido anteriormente que estásustituido con uno o más "sustituyentes de grupo alifático" (preferiblemente de 1 a 3) que pueden seriguales o diferentes, y son como se definen en este documento.
"Alquilsulfinilo" se refiere a un grupo alquil-SO-en el que el grupo alquilo es como se ha definido anteriormente. Los grupos preferidos son aquellos en los que el grupo alquilo es alquilo inferior.
"Alquilsulfonilo" se refiere a un grupo alquil-SO2 en el que el grupo alquilo es como se ha definidoanteriormente. Los grupos preferidos son aquellos en los que el grupo alquilo es alquilo inferior.
"Alquilsulfonilcarbamoílo" se refiere a un grupo alquil-SO2.NH-C(=O)-en el que el grupo alquilo es como se describe en este documento. Los grupos alquilsulfonilcarbamoílo preferidos son aquellos en los que el grupo alquilo es alquilo inferior.
"Alquiltio" se refiere a un grupo alquil-S-en el que el grupo alquilo es como se describe en este documento.Los grupos alquiltio ejemplares incluyen metiltio, etiltio, i-propiltio y heptiltio.
"Alquinilo" se refiere a un grupo hidrocarbonado alifático que contiene un triple enlace carbono-carbono,que puede ser lineal o ramificado y que tiene de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 átomos decarbono en la cadena. Los grupos alquinilo preferidos tienen de 2 a aproximadamente 12 átomos decarbono en la cadena; y más preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 átomos decarbono en la cadena. Ramificado significa que uno o más grupos alquilo inferior tales como metilo, etilo opropilo están unidos a una cadena alquinilo lineal. "Alquinilo inferior" significa de aproximadamente 2 aaproximadamente 4 átomos de carbono en la cadena que puede ser lineal o ramificada. El grupo alquinilopuede estar sustituido con uno o más halo. Los grupos alquinilo ejemplares incluyen etinilo, propinilo, nbutinilo, 2-butinilo, 3-metilbutinilo, n-pentinilo, heptinilo, octinilo, decinilo y similares. "Alquinilo sustituido" serefiere a alquinilo como se ha definido anteriormente que está sustituido con uno o más "sustituyentes degrupo alifático" (preferiblemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes, y son como se definen eneste documento.
"Grupo protector de amina" se refiere a un grupo que puede retirarse fácilmente que se sabe en la técnicaque protege a un resto nitrógeno de un grupo amino o amida frente a una reacción indeseable duranteprocedimientos sintéticos y que puede retirarse de forma selectiva. El uso de grupos protectores de amina/amida se conoce bien en la técnica para grupos protectores frente a reacciones indeseables durante un procedimiento sintético y se conocen muchos grupos protectores de este tipo, por ejemplo, T.W. Greeney P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Syntheses, 2ª edición, John Wiley y Sons, Nueva York (1991),incorporado en este documento como referencia. El grupo protector de amina/amida también incluye "grupoprotector de amina/amida lábil a ácidos" y "grupo protector de amina/amida lábil a la hidrogenación". Songrupos protectores de amina/amida ejemplares acilo, incluyendo formilo, acetilo, cloroacetilo, tricloroacetilo, o-nitrofenilacetilo, o-nitrofenoxi-acetilo, trifluoroacetilo, acetoacetilo, 4-clorobutilo, isobutirilo, onitrocinnainoílo, picolinoílo, acilisotiocianato, aminocaproílo, benzoílo y similares, y aciloxi incluyendometoxi-carbonilo, 9-fluorenilmetoxicarbonilo, 2,2,2-trifluoroetoxicarbonilo, 2-trimetilsililetoxi-carbonilo, viniloxicarbonilo, aliloxicarbonilo, t-butiloxicarbonilo (BOC), 1,1-dimetil-propiniloxicarbonilo, benciloxicarbonilo (CBZ), p-nitrobenciloxicarbonilo, 2,4-dicloro-benciloxicarbonilo y similares.
"Grupo protector de amida" se refiere a un grupo que puede retirarse fácilmente que se sabe en la técnicaque protege a un resto nitrógeno de un grupo amida frente a una reacción indeseable duranteprocedimientos sintéticos y que puede retirarse de forma selectiva después de su conversión en la amina.El uso de grupos protectores de amida se conoce bien en la técnica para grupos protectores frente areacciones indeseables durante un procedimiento sintético y se conocen muchos grupos protectores deeste tipo, por ejemplo, T.W. Greene y P.G.M. Wuts. Protective Groups in Organic Synthesis, 2ª edición,John Wiley y Sons, Nueva York (1991), incorporado en este documento como referencia. Grupo protector de amida también incluye "grupo protector de amida lábil a ácidos" y "grupo protector de amida lábil a lahidrogenación". Son grupos protectores de amida ejemplares o-nitrocinnamoílo, picolinoílo, aminocaproílo, benzoílo y similares, y aciloxi incluyendo metoxi-carbonilo, 9-fluorenilmetoxicarbonilo, 2,2,2trifluoroetoxicarbonilo, 2-trimetilsililetoxi-carbonilo, viniloxicarbonilo, aliloxicarbonilo, t-butitoxicarbonilo (BOC), 1,1-dimetil-propiniloxicarbonilo, benciloxicarbonilo (CBZ), p-nitrobenciloxicarbonilo, 2,4-diclorohenciloxicarbonilo y similares.
"Aminoácido" se refiere a un aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por aminoácidos naturalesy no naturales como se define en este documento. Un aminoácido también pretende incluir aminoácidos que tienen la estereoquímica L o D en el carbono a. Los aminoácidos preferidos son los que poseen un grupo a-amino. Los aminoácidos pueden ser neutros, positivos o negativos dependiendo de los sustituyentes de su cadena lateral. "Aminoácido neutro" se refiere a un aminoácido que contienesustituyentes de la cadena lateral no cargados. Los aminoácidos neutros ejemplares incluyen alanina,valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, tripfófano, metionina, glicina, serina, treonina y cisteína. "Aminoácido positivo" se refiere a un aminoácido en el que los sustituyentes de la cadena lateral estáncargados positivamente a pH fisiológico. Los aminoácidos positivos ejemplares incluyen lisina, arginina ehistidina. "Aminoácido negativo" se refiere a un aminoácido en el que los sustituyentes de la cadena lateraltienen una carga neta negativa a pH fisiológico. Los aminoácidos negativos ejemplares incluyen ácidoaspártico y ácido glutámico. Son aminoácidos preferidos a-aminoácidos. Son aminoácidos naturales ejemplares isoleucina, prolina, fenilalanina, tripfófano, metionina, glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido aspártico y ácido glutámico. "Aminoácido no natural"se refiere a un aminoácido para el que no hay ningún codón de ácido nucleico. Los aminoácidos nonaturales ejemplares incluyen, por ejemplo, los isómeros D de los a-aminoácidos naturales que se han indicado anteriormente; Aib (ácido aminobutírico),  Aib (ácido 3-amino-isobutírico), Nva (norvalina), -Ala, Aad (ácido 2-aminoadípico), Aad (ácido 3-aminoadípico), Abu (ácido 2-aminobutírico), Gaba (ácido yaminobutírico), Acp (ácido 6-aminocaproico), Dbu (ácido 2,4-diaminobutírico), ácido a-aminopimélico,TMSA (trimetilsilil-Ala), alle (alo-isoleucina), Nle (norleucina), terc-Leu, Cit (citrulina), Orn, Dpm (ácido 2,2'diaminopiméjico), Dpr (ácido 2,3-diaminopropiónico), -o -NaI, Cha (ciclohexil-Ala), hidroxiprolina, Sar (sarcosina), y similares; aminoácidos cíclicos; aminoácidos Na-alquilados tales como MeGly (Nametilglicina), EtGly (Na-etilglicina) y EtAsn (Na-etilasparagina); y aminoácidos en los que el� -carbono tiene dos sustituyentes en la cadena lateral. Los nombres de los aminoácidos natural y no naturales y restos delos mismos usados en este documento siguen las convenciones de nombrado sugeridas por la IUPACCommission on the Nomenclature of Organic Chemistry y la IUPAC-IUB Commission on BiochemicalNomenclature que se exponen en "Nomenclature of a-Amino Acids (Recommendations, 1974)"Biochemistry, 14(2), (1975). Cuando los nombres y abreviaturas de aminoácidos y restos de los mismosempleados en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas difieren de los señalados, se especificarán de forma más clara los nombres y abreviaturas diferentes.
"Grupo protector de aminoácidos" se refiere a un grupo que protege a un resto ácido o amina del aminoácido u otro resto reactivo en la cadena lateral de un aminoácido, por ejemplo hidroxi o tiol. Paraejemplos de "derivados protegidos correspondientes" de cadenas laterales de aminoácidos, véase F.W. Green y P.G.M. Wuts en "Protective Groups in Organic Chemistry" John Wiley y Sons. 1991. Los gruposprotectores para un grupo ácido en un aminoácido se describen en este documento, por ejemplo en lassecciones "grupo funcional ácido" y "grupo protector ácido lábil a la hidrogenación". Los grupos protectorespara un grupo amina en un aminoácido se describen en este documento, por ejemplo en las secciones"grupo protector de amina", "grupo protector de amina lábil a ácidos" y " grupo protector de amina lábil a lahidrogenación".
"Resto de aminoácidos" se refiere a las unidades de aminoácidos individuales incorporadas en el compuesto de la invención.
"Cadena lateral de aminoácidos" se refiere a sustituyente que se encuentra en el carbono que está entre losgrupos amino y carboxi en� -aminoácidos. Las cadenas laterales de aminoácidos ejemplares incluyenisopropilo, metilo y carboximetilo para valina, alanina y ácido aspártico, respectivamente.
"Equivalente de aminoácido" se refiere a un aminoácido que puede estar sustituido por otro aminoácido enlos péptidos de acuerdo con la invención sin ninguna pérdida de función apreciable. A la hora de realizartales cambios, se realizan sustituciones de dichos aminoácidos basándose en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral, por ejemplo con respecto al tamaño, carga, hidrofilicidad, hidropaticidad ehidrofobicidad como se describe en este documento.
"Grupo aromático" se refiere a arilo o heteroarilo como se define en este documento. Los grupos aromáticosejemplares incluyen fenilo, halo fenilo sustituido, azaheteroarilo y similares.
"Aroílo" se refiere a un grupo aril-CO-en el que el grupo arilo es como se describe en este documento. Losgrupos aroílo ejemplares incluyen benzoílo, 1-y 2-naftoílo y similares.
"Arilo" se refiere a un sistema de anillos monocíclicos o multicíclicos, aromáticos, de aproximadamente 6 aaproximadamente 14 átomos de carbono, preferiblemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 10átomos de carbono. Por arilo se incluyen arilcicloalquenilo condensado, arilcicloalquilo condensado, ariltheterociclenilo condensado y arilheterociclilo condensado como se definen en este documento cuandose unen a través del resto arilo de los mismos. El arilo está opcionalmente sustituido con uno o más "sustituyentes del grupo del anillo" que pueden ser iguales o diferentes, y son como se definen en estedocumento. Los grupos arilo ejemplares incluyen fenilo o naftilo, o fenilo sustituido o naftilo sustituido. "Arilosustituido" se refiere a un grupo arilo como se ha definido anteriormente que está sustituido con uno o más"sustituyentes del grupo del anillo" (preferiblemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y soncomo se definen en este documento.
"Arildiazo" se refiere a un grupo aril-diazo-en el que los grupos arilo y diazo son como se definen en este documento.
"Arileno" se refiere a un grupo arilo bivalente 1,2-, 1,3-, 1,4-, opcionalmente sustituido, en el que el grupo arilo es como se define en este documento. Los grupos arileno ejemplares incluyen fenileno opcionalmentesustituido, naftileno e indanileno. Un arileno particular es fenileno opcionalmente sustituido.
"Arileno sustituido" se refiere a un grupo arileno como se ha definido anteriormente que está sustituido conuno o más "sustituyentes del grupo del anillo" (preferiblemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en este documento.
"Ariloxi" se refiere a un grupo aril-O-en el que el grupo arilo es como se define en este documento. Losgrupos ariloxi ejemplares incluyen fenoxi y 2-naftiloxi.
"Ariloxicarbonilo" se refiere a un grupo aril-O-CO-en el que el grupo arilo es como se define en estedocumento. Los grupos ariloxicarbonilo ejemplares incluyen fenoxicarbonilo y naftoxicarbonilo.
"Arilsulfonilo" se refiere a un grupo aril-SO2, en el que el grupo arilo es como se define en este documento.
"Arilsulfonilcarbamoílo" se refiere a un grupo aril-SO2,NH-C(=O)-en el que el grupo arilo es como sedescribe en este documento. Un grupo arilsulfonilcarbamoílo ejemplar es fenilsulfonilcarbamoílo.
"Arilsulfinilo" se refiere a un grupo aril-SO-en el que el grupo arilo es como se define en este documento.
"Ariltio" se refiere a un grupo aril-S-en el que el grupo arilo es como se describe en este documento. Losgrupos ariltio ejemplares incluyen feniltio y naftiltio.
"Átomo de nitrógeno básico" se refiere a un átomo de nitrógeno hibridizado sp2 o sp3 que tiene un par deelectrones no unidos que es capaz de protonarse. Los átomos de nitrógeno básicos ejemplares incluyengrupos imino opcionalmente sustituido, amino opcionalmente sustituido y amidino opcionalmente sustituido.
"Carboxi" se refiere a un grupo HO(O)C-(ácido carboxílico).
"Agente de acoplamiento" se refiere a un compuesto que reacciona con el resto hidroxilo de un restocarboxi haciéndolo de esta manera susceptible al ataque nucleofílico. Los agentes de acoplamiento ejemplares incluyen DIC, EDCI, DCC y similares.
"Cicloalquenilo" se refiere a un sistema de anillos mono-o multicíclicos, no aromáticos, de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 átomos de carbono, preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 átomos de carbono, y que contiene al menos un doble enlace carbono-carbono. Porcicloalquenilo se incluyen arilcicloalquenilo condensado y heteroarilcicloalquenilo condensado como sedefine en este documento cando se unen a través del resto cicloalquenilo de los mismos. Los tamaños deanillo preferidos de los anillos del sistema de anillos incluyen de aproximadamente 5 a aproximadamente 6átomos en el anillo; y dichos tamaños de anillo preferidos también se denominan "inferior". "Cicloalquenilosustituido" se refiere a un grupo cicloalquenilo como se ha definido anteriormente que está sustituido conuno o más "sustituyentes del grupo del anillo" (preferiblemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en este documento. Los cicloalquenilos monocíclicos ejemplares incluyenciclopentenilo, ciclohexenilo, cicloheptenilo y similares. Un cicloalquenilo multicíclico ejemplar es norbornilenilo.
"Cicloalquilo" se refiere a un sistema de anillos mono-o multicíclicos, no aromáticos, de aproximadamente 3a aproximadamente 10 átomos de carbono, preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 10átomos de carbono. Los tamaños de anillo preferidos de los anillos del sistema de anillos incluyen deaproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo; y dichos tamaños de anillo preferidostambién se denominan "inferior". Por cicloalquilo se incluyen arilcicloalquilo condensado yheteroarilcicloalquilo condensado como se define en este documento cuando se unen a través del restocicloalquilo de los mismos. "Cicloalquilo sustituido" se refiere a un grupo cicloalquilo como se ha definido anteriormente que está sustituido con uno o más "sustituyentes del grupo del anillo" (preferiblemente de 1 a3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en este documento. Los cicloalquilos monocíclicos ejemplares incluyen ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y similares. Los cicloalquilos multicíclicos ejemplares incluyen 1-decalina, norbornilo, adamant-(1-o 2-)ilo y similares.
"Cicloalquileno" se refiere a un grupo cicloalquilo bivalente como se define en este documento que tiene deaproximadamente 4 a aproximadamente 8 átomos de carbono. Los tamaños de anillo preferidos del cicloalquileno incluyen de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo; y dichos tamañosde anillo preferidos también se denominan "inferior". Los puntos de unión en el grupo cicloalquileno incluyenpatrones de unión 1,1-, 1,2-, 1,3-o 1,4-, y donde sea aplicable la relación estereoquímica de los puntos deunión es cis o trans. Los grupos cicloalquileno ejemplares incluyen (1,1-, 1,2-o 1,3-)ciclohexileno y (1,1-o1,2-)ciclopentileno. "Cicloalquileno sustituido" se refiere a un grupo cicloalquileno como se ha definidoanteriormente que está sustituido con uno o más "sustituyentes del grupo del anillo" (preferiblemente de 1 a3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en este documento.
"Cíclico" o "ciclilo" se refiere a cicloalquilo, cicloalquenilo, heterociclilo o heterociclenilo como se define eneste documento. El término "inferior" como se usa con respecto al término cíclico es el mismo que se haindicado en este documento con respecto al cicloalquilo, cicloalquenilo, heterociclilo o heterociclenilo.
"Cicliloxi" se refiere a un grupo ciclil-O-en el que el grupo ciclilo es como se describe en este documento. Los grupos cicloalcoxi ejemplares incluyen ciclopentiloxi, ciclohexiloxi, quinuclidiloxi, pentametilenosulfuroxi,tetrahidropiraniloxi, tetrahidrotiofeniloxi, pirrolidiniloxi, tetrahidrofuranoiloxi o 7-oxabiciclo [2.2.1]heptaniloxi,hidroxitetrahidropiraniloxi, hidroxil-7-oxabiciclo[2.2.1]heptaniloxi y similares.
"Ciclilsulfinilo" se refiere a un grupo ciclil-S(O)-en el que el grupo ciclilo es como se describe en este documento.
"Ciclilsulfonilo" se refiere a un grupo ciclil-S(O)2 en el que el grupo ciclilo es como se describe en este documento.
"Cicliltio" se refiere a un grupo ciclil-S-en el que el grupo ciclilo es como se describe en este documento.
"Diazo" se refiere a un radical -N=N-bivalente.
"Resto desplazable" se refiere a un grupo que, cuando se asocia con L como se define en este documento,se somete a desplazamiento por ataque nucleofílico mediante un resto amina mono-o di-sustituida con osin presencia de un agente que facilita dicho ataque, por ejemplo, un agente de acoplamiento. Los restos desplazables ejemplares incluyen hidroxi, oxi alifático, halo, N-oxisuccinimida, aciloxi y similares.
"Cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de un compuesto/composición de acuerdo con la presenteinvención eficaz en la producción del efecto terapéutico deseado.
"Arilcicloalquenilo condensado" se refiere a un arilo y cicloalquenilo condensados como se definen en estedocumento. Son arilcicloalquenilos condensados preferidos aquellos en los que el arilo de los mismos esfenilo y el cicloalquenilo consta de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo. Un arilcicloalquenilo condensado como una variable puede unirse a través de cualquier átomo del sistema deanillos del mismo capaz de ello. "Arilcicloalquenilo condensado sustituido" se refiere a un grupo arilcicloalquenilo condensado como se ha definido anteriormente que está sustituido con uno o más "sustituyentes del grupo del anillo" (preferiblemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en este documento. Los arilcicloalquenilo condensados ejemplares incluyen 1,2dihidronaftileno, indeno y similares.
"Arilcicloalquilo condensado" se refiere a arilo y cicloalquilo condensados como se definen en este documento. Son arilcicloalquilos condensados preferidos aquellos en los que el arilo de los mismos esfenilo y el cicloalquilo consta de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo. Un arilcicloalquilo condensado como una variable puede unirse a través de cualquier átomo del sistema deanillos del mismo capaz de ello. "Arilcicloalquilo condensado sustituido" se refiere a un grupo arilcicloalquilocondensado como se ha definido anteriormente que está sustituido con uno o más "sustituyentes del grupodel anillo" (preferiblemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en estedocumento. Arilcicloalquilo condensado ejemplar incluye 1,2,3,4-tetrahidro-naftileno y similares.
"Arileterociclenilo condensado" se refiere a un arilo y heterociclenilo condensados como se define en estedocumento. Son arilheterociclenilos condensados preferidos aquellos en los que el arilo de los mismos esfenilo y el heterociclenilo consta de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo. Unarilheterociclenilo condensado como una variable puede unirse a través de cualquier átomo del sistema deanillos del mismo capaz de ello. La designación de aza, oxa o tia como prefijo antes de la porciónheterociclenilo del arilheterociclenilo condensado define que está presente al menos un átomo de nitrógeno,oxígeno o azufre, respectivamente, como un átomo del anillo. "Arilheterociclenilo condensado sustituido" serefiere a un grupo arilheterociclenilo condensado como se ha definido anteriormente que está sustituido conuno o más "sustituyentes del grupo del anillo" (preferiblemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en este documento. El átomo de nitrógeno de un arilheterociclilenilocondensado puede ser un átomo de nitrógeno básico. El átomo de nitrógeno o azufre de la porciónheterociclenilo del arilheterociclenilo condensado también puede estar opcionalmente oxidado para dar elN-óxido, S-óxido o S,S-dióxido correspondiente. Los arilheterociclenilos condensados ejemplares incluyen3H-indolinilo, 1H-2-oxoquinolilo, 2H-1-oxoisoquinolilo, 1,2-dihidroquinolinilo, 3,4-dihidroquinolinilo, 1,2dihidroisoquinolinilo, 3,4-dihidroisoquinolinilo y similares.
"Arilheterociclilo condensado" se refiere a acrilo y heterociclilo condensados como se definen en estedocumento. Son arilheterociclilos condensados preferidos aquellos en los que el arilo de los mismos esfenilo y el heterociclilo consta de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo. Un arilheterociclilo condensado como una variable puede unirse a través de cualquier átomo del sistema deanillos del mismo capaz de ello. La designación de aza, oxa o tia como prefijo antes de la porciónheterociclilo del arilheterociclilo condensado define que está presente al menos un átomo de nitrógeno,oxígeno o azufre, respectivamente, como un átomo del anillo. "Arilheterociclilo condensado sustituido" serefiere a un grupo arilheterociclilo condensado como se ha definido anteriormente que está sustituido conuno o más "sustituyentes del grupo del anillo" (preferiblemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en este documento. El átomo de nitrógeno de un arilheterociclilo condensado puede ser un átomo de nitrógeno básico. El átomo de nitrógeno o azufre de la porciónheterociclilo del arilheterociclilo condensado también puede estar opcionalmente oxidado para dar el Nóxido. S-óxido o S,S-dióxido correspondiente. Los sistemas de anillos arilheterociclilo condensado ejemplares incluyen indolinilo, 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina, 1,2,3,4-tetrahidroquinolina, 1H-2,3dihidroisoindol-2-ilo, 2,3-dihidrobenz[f]isoindol-2-ilo, 1,2,3,4-tetrahidrobenz[g]-isoquinolin-2-ilo y similares.
"Heteroarilcicloalquenilo condensado" se refiere a un heteroarilo y cicloalquenilo condensados como sedefinen en este documento. Los heteroarilcicloalquenilos condensados preferidos son aquellos en los que elheteroarilo de los mismos es fenilo y el cicloalquenilo consta de aproximadamente 5 a aproximadamente 6átomos en el anillo. Un heteroarilcicloalquenilo condensado como una variable puede unirse a través decualquier átomo del sistema de anillos del mismo capaz de ello. La designación de aza, oxa o tia comoprefijo antes de la porción heteroarilo del heteroarilcicloalquenilo condensado define que está presente al menos un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre, respectivamente, como un átomo del anillo. "Heteroarilcicloalquenilo condensado sustituido" se refiere a un grupo heteroarilcicloalquenilo condensadocomo se ha definido anteriormente que está sustituido con uno o más "sustituyentes del grupo del anillo"(preferiblemente de 1 a 30 que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en este documento.El átomo de nitrógeno de un heteroarilcicloalquenilo condensado puede ser un átomo de nitrógeno básico. El átomo de nitrógeno de la porción heteroarilo del heteroarilcicloalquenilo condensado también puede estaropcionalmente oxidado para dar el N-óxido correspondiente. Los heteroarilcicloalquenilo condensados ejemplares incluyen 5,6-dihidroquinolilo, 5,6-dihidroisoquinolilo, 5,6-dihidroquinoxalinilo, 5,6dihidroquinazolinilo, 4,5-dihidro-1H-bencimidazolilo, 4,5-dihidrobenzoxazolilo y similares.
"Heteroarilciclualquilo condensado" se refiere a heteroarilo y cicloalquilo condensados como se definen eneste documento. Son heteroarilcicloalquilos condensados preferidos aquellos en los que el heteroarilo delos mismos consta de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo y el cicloalquilo constade aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo. Un heteroarilcicloalquilo condensadocomo una variable puede unirse a través de cualquier átomo del sistema de anillos del mismo capaz de ello.La designación de aza, oxa o tia como prefijo antes de la porción heteroarilo del heteroarilcicloalquilocondesado define que está presente al menos un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre, respectivamente,como un átomo del anillo. "Heteroarilcicloalquilo condensado sustituido" se refiere a un grupoheteroarilcicloalquilo condensado como se ha definido anteriormente que está sustituido con uno o más"sustituyentes del grupo del anillo" (preferiblemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y soncomo se definen en este documento. El átomo de nitrógeno de un heteroarilcicloalquilo condensado puedeser un átomo de nitrógeno básico. El átomo de nitrógeno de la porción heteroarilo del heteroarilcicloalquilocondensado también puede estar opcionalmente oxidado para dar el N-óxido correspondiente. Los heteroarilcicloalquilos condensados ejemplares incluyen 5,6,7,8-tetrahidroquinolinilo, 5,6,7,8tetrahidroisoquinolilo, 5,6,7,8-tetrahidroquinoxalinilo, 5,6,7,8-tetrahidroquinazolilo, 4,5,6,7-tetrahidro-1Hbencimidazolilo, 4,5,6,7-tetrahidrobenzoxazolilo, 1H-4-oxa-1,5-diazanaftalen-2-onilo, 1,3-dihidroimidizol[4,5]-piridina-2-onilo y similares.
"Heteroarilheterociclenilo condensado" se refiere a un heteroarilo y heterociclenilo condensados como sedefinen en este documento. Son heteroarilheterociclenilos condensados preferidos aquellos en los que elheteroarilo de los mismos consta de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo y elheterociclenilo consta de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo. Un heteroarilheterociclenilo condensado como una variable puede unirse a través de cualquier átomo delsistema de anillos del mismo capaz de ello. La designación de aza, oxa o tia como prefijo antes de laporción heteroarilo o heterociclenilo del heteroarilheterociclenilo condensado define que está presente al menos un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre, respectivamente, como un átomo del anillo. "Heteroarilheterociclenilo condensado sustituido" se refiere a un grupo heteroarilheterociclenilo condensadocomo se ha definido anteriormente que está sustituido con uno o más "sustituyentes del grupo del anillo"(preferiblemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en este documento.El átomo de nitrógeno de un heteroarilazaheterociclenilo condensado puede ser un átomo de nitrógeno básico. El átomo de nitrógeno o azufre de la porción hereroarilo del heteroarilheterociclilo condensadotambién puede estar opcionalmente oxidado para dar el N-óxido correspondiente.
El átomo de nitrógeno o azufre de la porción heteroarilo o heterociclilo del heteroarilheterociclilo condensado también puede estar opcionalmente oxidado para dar el N-óxido, S-óxido o S,S-dióxido correspondiente. Los heteroarilheterociclenilo condensados ejemplares incluyen 7,8-dihidro[1,7]naftiridinilo, 1,2dihidro[2,7]-naftiridinilo, 6,7-dihidro-3H-imidazo[4,5-c]piridilo, 1,2-dihidro-1,5-naftiridinilo, 1,2-dihidro-1,6-naftiridinilo, 1,2-dihidro-1,7-naftiridinilo, 1,2-dihidro 1,8-naftiridinilo, 1,2-dihidro-2,6-naftiridinilo y similares.
"Heteroarilheterociclilo condensado" se refiere a heteroarilo y heterociclilo condensados como se definen eneste documento. Son heteroarilheterociclilos condensados preferidos aquellos en los que el hereroarilo de losmismos consta de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo y el heterociclilo consta deaproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo. Un heteroarilheterociclilo condensado como unavariable puede unirse a través de cualquier átomo del sistema de anillos del mismo capaz de ello. La designación de aza, oxa o tia como prefijo antes de la porción heteroarilo o heterociclilo del heteroarilheterociclilo condensado defineque está presente al menos un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre, respectivamente, como un átomo del anillo.Heteroarilheterociclilo condensado sustituido" se refiere a un grupo heteroarilheterociclilo condensado como se hadefinido anteriormente que está sustituido con uno o más "sustituyentes del grupo del anillo" (preferiblemente de 1 a3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en este documento. El átomo de nitrógeno de unheteroarilheterociclilo condensado puede ser un átomo de nitrógeno básico. El átomo de nitrógeno o azufre de laporción heteroarilo del heteroarilheterociclilo condensado también puede estar opcionalmente oxidado para dar el Nóxido correspondiente. El átomo de nitrógeno o azufre de la porción heteroarilo o heterociclilo del heteroarilheterociclilo condensado también puede estar opcionalmente oxidado para dar el N-óxido, S-óxido o S,Sdióxido correspondiente. Los heteroarilheterociclilos condensados ejemplares incluyen 2,3-dihidro-1H-pirrol [3,4b]quinolin-2-ilo, 1,2,3,4-tetrahidrobenz[b][1,7]naftiridin-2-ilo, 1,2,3,4-tetrahidrobenz[b][1,6]naftiridin-2-ilo, 1,2,3,4tetrahidro-9H-pirido[3,4-b]indol-2-ilo, 1,2,3,4-tetrahidro-9H-pirido[4,3-b]indol-2-ilo, 2,3-dihidro-1H-pirrolo [3,4-b]indol-2ilo, 1H-2,3,4,5-tetrahidroazepino[3,4-b]indol-2-ilo, 1H-2,3,4,5-tertra-hidroazepino[4,3-b]indol-3-ilo, 1H-2,3,4,5tetrahidroazepino[4,5-b]indol-2-ilo, 5,6,7,8-tetra-hidro[1,7]naftiridilo, 1,2,3,4-tetrhidro[2,7]naftiridilo, 2,3dihidro[1,4]dioxino[2,3-b]piridilo, 2,3-dihidro-[1,4]dioxino[2,3-b]piridilo, 3,4-dihidro-2H-1-oxa[4,6]diazanaftalenilo, 4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridilo, 6,7-dihidro[5,8]diazanaftalenilo, 1,2,3,4-tetrahidro[1,5]-naftiridinilo,1,2,3,4-tetrahidro[1,6]naftiridinilo, 1,2,3,4-tetrahidro[1,7]naftiridinilo, 1,2,3,4-tetrahidro[1,8]naftiridinilo, 1,2,3,4-tetrahidro[2,6]naftiridinilo y similares.
"Halo" se refiere a fluoro, cloro, bromo o yodo. Se prefieren fluoro, cloro o bromo, y se prefieren más fluoro o cloro.
"Heteroaroílo" se refiere a un grupo heteroaril-CO-en el que el grupo heteroarilo es como se describe eneste documento. Los grupos heteroaroílo ejemplares incluyen tiofenoílo, nicotinoílo, pirrol-2-ilcarbonilo, 1-y 2naftoílo, piridinoílo y similares.
"Heteroarilo" se refiere a un sistema de anillos monocíclicos o multicíclicos, aromáticos, de aproximadamente 5 a aproximadamente 14 átomos de carbono, preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 átomos de carbono, en el que uno o más de los átomos de carbono del sistema de anillos es oson elementos hetero distintos de carbono, por ejemplo nitrógeno, oxígeno o azufre. Preferiblemente, el sistema deanillos incluye de 1 a 3 heteroátomos. Los tamaños de anillo preferidos de los anillos del sistema de anillos incluyende aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo. Por heteroarilo se incluyen heleroarilcicloalquenilo condensado, heteroarilcicloalquilo condensado, heteroarilhetereciclenilo condensado y heteroarilheterociclilo condensado como se define en este documento cuando se unen a través del resto heteroarilo de los mismos. "Heteroarilo condensado" se refiere a un grupo heteroarilo como se ha definido anteriormente que está sustituidocon uno o más "sustituyentes del grupo del anillo" (preferiblemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en este documento. La designación de aza, oxa o tia como prefijo antes de heteroarilo defineque está presente al menos un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre, respectivamente, como un átomo del anillo.Un átomo de nitrógeno de un heteroarilo puede ser un átomo de nitrógeno básico también puede estar opcionalmente oxidado para dar el N-óxido correspondiente. Los grupos heteroarilo y heteroarilo sustituido ejemplares incluyen pirazinilo, tienilo, isotiazolilo, oxazolilo, pirazolilo, furazanilo, pirrolilo, 1,2,4-tiadiazolilo,piridazinilo, quinoxalinilo, ftalazinilo, imidazo[1,2-a]piridina, imidazo[2,1-b]tiazolilo, benzofurazanilo, azaindolilo,bencimidazolilo, benzotienilo, tienopiridilo, tienopirimidilo, pirrolopiridilo, imidazopiridilo, benzoazaindolilo, 1,2,4triazinilo, benzotiazolilo, furanilo, imidazolilo, indolilo, indolizinilo, isoxazolilo, isoquinolinilo, isotiazolilo, oxadiazolilo,pirazinilpiridazinilo, pirazolilo, piridilo, pirimidinilo, pirrolilo, quinazolinilo, quinolinilo, 1,3,4-tiadiazolilo, tiazolilo, tienilo,triazolilo y similares. Un grupo heteroarilo preferido es pirazinilo.
"Heteroarildiazo" se refiere a un grupo heteroaril-azo-en el que los grupos heteroarilo y azo son como sedefinen en este documento.
"Heteroarildiilo" se refiere a un radical bivalente obtenido a partir de un heteroarilo, donde el heteroarilo escomo se describe en este documento. Un radical heteroarildiilo ejemplar es piridinadiilo opcionalmente sustituido.
"Heteroarilsulfonilcarbamoílo" se refiere a un grupo heteroaril-SO3-NH-C(=O)-en el que el grupo heteroarilo es como se describe en este documento.
"Heterociclenilo" se refiere a un sistema de anillos hidrocarbonados, monocíclicos o multicíclicos, no aromáticos, de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 átomos de carbono, preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 átomos de carbono, en el que uno o más de los átomos de carbono delsistema de anillos es o son elementos hetero distintos de carbono, por ejemplo átomos de nitrógeno, oxígeno oazufre, y que contiene al menos un doble enlace carbono-carbono o un doble enlace carbono-nitrógeno.Preferiblemente, el anillo incluye de 1 a 3 heteroátomos. Los tamaños de anillo preferidos de los anillos del sistemade anillos incluyen de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo; y dichos tamaños de anillopreferidos también se denominan "inferior". Por heterociclenilo se incluyen arilheterociclenilo condensado yheteroarilheterociclenilo condensado como se define en este documento cuando se unen a través del resto heterociclenilo de los mismos. La designación de aza, oxa o tia como prefijo antes de heterociclenilo define que está presente al menos un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre, respectivamente, como un átomo del anillo. "Heterociclenilo sustituido" se refiere a un grupo heterociclenilo como se ha definido anteriormente que está sustituido con uno o más "sustituyentes del grupo del anillo" (preferiblemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en este documento. El átomo de nitrógeno de un heterociclenilo puede ser unátomo de nitrógeno básico. El átomo de nitrógeno o azufre del heterociclenilo también puede estar opcionalmenteoxidado para dar el N-óxido, S-óxido o S,S-dióxido correspondiente. Los grupos azaheterociclenilo monocíclicoejemplares incluyen 1,2,3,4-tetrahidrohidropiridina, 1,2-dihidropiridilo, 1,4-dihidropiridilo, 1,2,3,6-tetrahidropiridina,1,4,5,6-tetrahidropirimidina, 2-pirrolinilo, 3-pirrolinilo, 2-imidazolinilo, 2-pirazolinilo y similares. Los grupos oxaheterociclenilo ejemplares incluyen 3,4-dihidro-2H-pirano, dihidrofuranilo y fluorodihidrofuranilo. Un grupooxaheterociclenilo multicíclico ejemplar es 7-oxabiciclo[2.2.1]heptenilo. Los anillos de tiaheterociclenilo monocíclico ejemplares incluyen dihidrotiofenilo y dihidrotiopiranilo.
"Heterociclilo" se refiere a un sistema de anillos monocíclicos o multicíclicos, saturados, no aromáticos, de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 átomos de carbono, preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 átomos de carbono, en el que uno o más de los átomos de carbono del sistema de anillos es o
5 son elementos hetero distintos de carbono, por ejemplo nitrógeno, oxígeno o azufre. Preferiblemente, el sistema de anillos contiene de 1 a 3 heteroátomos. Los tamaños de anillo preferidos de los anillos del sistema de anillosincluyen de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo; y dichos tamaños de anillo preferidostambién se denominan "inferior". Por heterociclilo se incluyen arilheterociclilo condensado y heteroarilheterociclilocondensado como se define en este documento cuando se unen a través del resto heterociclilo de los mismos. La designación de aza, oxa o tia como prefijo antes de heterociclilo define que está presente al menos un átomo denitrógeno, oxígeno o azufre, respectivamente, como un átomo del anillo. "Heterociclilo sustituido" se refiere a un grupo heterociclilo como se ha definido anteriormente que está sustituido con uno o más "sustituyentes del grupo delanillo" (preferiblemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en este documento. Elátomo de nitrógeno de un heterociclilo puede ser un átomo de nitrógeno básico. El átomo de nitrógeno o azufre del
15 heterociclilo también puede estar opcionalmente oxidado para dar el N-óxido, S-óxido o S,S-dióxido correspondiente. Los anillos heterociclilo monocíclico ejemplares incluyen piperidilo, pirrolidinilo, piperazinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo,tiazolidinilo, 1,3-dioxolanilo, 1,4-dioxanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo y similares,
ya que el azaheterociclilo monocíclico sustituido está sustituido directamente o a través de un enlazador mediante al menos un sustituyente que es, o incluye, o está sustituido con un grupo aromático como se define en este documento; por ejemplo arilo, heteroarilo, ariloxi, heteroariloxi, aroílo o su análogo tioxo, heteroaroílo o su análogotioxo, aroiloxi, heteroaroiloxi, ariloxicarbonilo, heteroariloxicarbonilo, arilsulfonilo, heteroarilsulfonilo, arilsulfinilo, heteroarilsulfinilo, ariltio, heteroariltio, arildiazo, heteroarildiazo, Y1Y2N-, Y1Y2NC(O)-, Y1Y2NC(O)O-, Y1Y2NC(O)NY3
o Y1Y2NSO2-donde al menos uno de Y1 y Y2 está incluido o está sustituido con un resto arilo o heteroarilo. Los
25 enlazadores preferidos incluyen -C(O)-, -OC(O)-, alquilo inferior, alcoxi inferior, alquenilo inferior, -O-, -S-. -C(O)C(O), -S(O)-, -S(O)2-, NR80-, donde R80 es hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heterociclilo o heteroarilo. Sonenlazadores particularmente preferidos -C(O)-y -OC(O)-. "Azaheterociclilo multicíclico sustituido" se refiere a un grupo azaheterociclilo multicíclico como se ha definido anteriormente que está sustituido con uno o más "sustituyentes del grupo del anillo" (preferiblemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como sedefinen en este documento. "Azaheterociclenilo multicíclico sustituido" se refiere a un grupo azaheterociclenilomulticíclico como se ha definido anteriormente que está sustituido con uno o más "sustituyentes del grupo del anillo"(preferiblemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en este documento.
"Heterociclileno" se refiere a un grupo heterociclilo bivalente como se define en este documento que tiene de 4 a aproximadamente 8 átomos de carbono. Los tamaños de anillo preferidos del heterociclileno incluyen de
35 aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo; y dichos tamaños de anillo preferidos también se denominan "inferior". Los puntos de unión en el grupo cicloalquileno incluyen patrones de unión 1,1-, 1,2-, 1,3-o 1,4, y cuando sea aplicable la relación estereoquímica de los puntos de unión es cis o trans. Los grupos heterociclileno ejemplares incluyen (1,1-, 1,2-o 1,3-)piperidinileno y (1,1-o 1,2-)tetrahidrofuranoileno. "Heterociclileno sustituido" serefiere a un grupo heterociclileno como se ha definido anteriormente que está sustituido con uno o más "sustituyentes el grupo del anillo" (preferiblemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como sedefinen en este documento.
"Hidrato" se refiere a un solvato en el que la molécula o moléculas de disolvente es/son H2O.
"Grupo protector de amina lábil a la hidrogenación" se refiere a un grupo protector de amina como se defineen este documento que se retira fácilmente por hidrogenación mientras permanece relativamente estable a otros45 reactivos. Un grupo protector de amina lábil a la hidrogenación es Cbz.
"Grupo protector de ácido lábil a la hidrogenación" se refiere a un grupo protector de ácido como se defineen este documento que se retira fácilmente por hidrogenación mientras que permanece relativamente estable a otrosreactivos. Un grupo protector de ácido lábil a la hidrogenación es bencilo.
"Higroscopicidad" significa sorción, vaciado de una cantidad adquirida o estado de agua suficiente paraafectar a las propiedades físicas o químicas de la sustancia (Eds. J. Swarbrick y J.C. Boylan, Encyclopedia ofPharmaceutical Technolog 10, 33).
"Derivado de glicinimida imínica" se refiere a una base imínica de Schiff de una glicina que es útil en lasíntesis de alfaminoácidos, tanto naturales como no naturales. La funcionalidad de éster imínico puede contener uno
o más centros asimétricos que pueden facilitar la estereoinducción durante el procedimiento de formación de
55 enlaces. Además, estos derivados de glicinimida imínica pueden incorporarse en soportes poliméricos para facilitar la síntesis combinatoria. Los derivados de glicinimida imínica pueden prepararse por condensación de un éster deglicina con la cetona apropiada en presencia de un catalizador ácido. La reacción se facilita por la retirada del agua.Los derivados de glicinimida imínica se conocen bien en la técnica para usarse en procedimientos sintéticos deAdición de Michael, por ejemplo, como se describe por Guillena, G., y col., J. Org. Chem., 2000, 65, 7310-7322,incorporado en este documento como referencia. Los ejemplos particulares de derivados de glicinimida imínica deacuerdo con la invención incluyen uno seleccionado entre
el grupo de fórmulas
en las que: M* es un metal de transición, preferiblemente CU, más preferiblemente CU". R14 es -CO2R16, -CN, o -CONR15R15;
R15 es un grupo alifático opcionalmente sustituido; R16
es un grupo protector de ácido, arilo opcionalmente sustituido o un grupo alifático opcionalmente sustituido;
R17 es arilo opcionalmente sustituido, un grupo alifático opcionalmente sustituido,
R18 es hidrógeno, alquilo o alquiltio; o arilo opcionalmente sustituido; R17 y R18 tomados junto con el carbono al que R17 y R18 están unidos
y
es una fase sólida;
"Aducto del derivado de glicinimida imínica" se refiere al compuesto resultante en el que se retira unhidrógeno para el nitrógeno y un resto carbonilo de la porción base de Schiff y se usa para formar una unión para la formación del enlace. Los ejemplos particulares de aductos del derivado de glicinimida imínica deacuerdo con la invención incluyen uno seleccionado del grupo de fórmulas
10 en las que:
R14, R17 y R18 se definen como se ha descrito en la definición del derivado de glicina imínica en este documento. "N-oxisticeinimida" se refiere a un resto de la siguiente estructura
"N-óxido" se refiere a un resto de la siguiente estructura
"Paciente" incluye tanto seres humanos como otros mamíferos.
"Peptidomimético" se refiere a un polímero que incluye restos de aminoácidos unidos a través de enlaces amida.
"Éster farmacéuticamente aceptable" se refiere a ésteres que se hidrolizan in vivo e incluyen los que se descomponen fácilmente en el cuerpo humano para dejar el compuesto de partida o una sal del mismo. Los gruposéster adecuados incluyen, por ejemplo, los obtenidos as partir de ácidos carboxílicos alifáticos farmacéuticamenteaceptables, particularmente ácidos alcanoico, alquenoico, cicloalcanoico y alcanodioico, en los que cada restoalquilo o alquenilo ventajosamente no tiene más de 6 átomos de carbono. Los ésteres ejemplares incluyen formiatos, acetatos, propionatos, butiratos, acrilatos, etilsuccinatos y similares.
"Profármacos farmacéuticamente aceptables", como se usa en este documento, se refiere a los profármacos de los compuestos de la presente invención que, dentro del alcance del juicio médico, son adecuadospara el uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales inferiores con una toxicidad indebida, irritación,respuesta alérgica y similares en proporción con una relación beneficio/riesgo razonable, y eficaces para su usopretendido, así como las formas zwiteriónicas, cuando sea posible, de los compuestos de la invención. El término"profármaco" se refiere un compuestos que se transforman fácilmente in vivo para producir el compuesto de partidade la fórmula anterior, por ejemplo por hidrólisis en sangre. Los grupos funcionales que pueden transformarserápidamente por escisión metabólica in vivo forman una clase de grupos reactivos con el grupo carboxilo de loscompuestos de la presente invención. Incluyen, pero sin limitación, grupos tales como alcanoílo (tal como acetilo,propanoílo, butanoílo y similares), aroílo sin sustituir y sustituido (tal como benzoílo y benzoílo sustituido), alcoxicarbonilo (tal como etoxicarbonilo), trialquilsililo (tal como trimetil-y trietilsililo), monoésteres formados conácidos dicarboxílicos (tal como succinilo) y similares. Debido a la facilidad con la que se escinden los gruposmetabólicamente escindibles de los compuestos de la presente invención in vivo, los compuestos que tienen dichosgrupos actúan como profármacos. Los compuestos que tienen los grupos metabólicamente escindibles tienen laventaja de que pueden mostrar una mayor biodisponibilidad como resultado de una mayor solubilidad y/o velocidadde absorción conferida al compuesto de partida gracias a la presencia del grupo escindible metabólicamente. Seproporciona un análisis minucioso en Design of Prodrugs, H. Bundgaard, ed., Elsevier (1985); Methods inEnzymology: K. Widder y col., Ed., Academic Press, 42, 309-396 (1985); A Textbook of Drug Design and Developement. Krogsgaard-Larsen and H. Bandaged, ed., Capítulo 5; "Design and Applicationsof Prodrugs" 113191(1991); Advanced Drug Delivery Reviews, H. Bundgard, 8, 1-38, (1992); J. Pharm. Sci.. 77, 285 (1988); Chem.Pharm. Bull., N. Nakeya y col. 32, 692 (1984); Pro-drugs as Novel Delivery Systems. T. Higuchi y V. Stella. 14 A.C.S. Symposium Series, and Bioreversible Carriers in Drug Design. E.B. Roche, ed., American PharmaceuticalAssociation and Pergamon Press. 1987, que se incorporan en este documento como referencia.
"Sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a las sales de adición de ácidos inorgánicas u orgánicas,relativamente no tóxicas, de compuestos de la presente invención. Estas sales pueden prepararse in situ durante el aislamiento y purificación finales de los compuestos. En particular, las sales de adición de ácidos pueden prepararsehaciendo reaccionar por separado el compuesto purificado en su forma de base libre con un ácido orgánico oinorgánico adecuado y aislando la sal formada de esta manera. Las sales de adición de ácidos ejemplares incluyenlas sales bromhidrato, clorhidrato, sulfato, bisulfato, fosfato, nitrato, acetato, oxalato, valerato, oleato, palmitato,estearato, laurato, borato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato, mesilato, glucoheptonato, lactiobionato, sulfamatos, malonatos, salicilatos, propionatos, metileno-bis-hidroxinaftoatos, gentisatos, isetionatos, di-p-toluoiltartratos, metanosulfonatos, etanosulfonatos, bencenosulfonatos, p-toluenosulfonatos, ciclohexilsulfamatos y quinatoslaurilsulfonatos y similares. Véase, por ejemplo S.M. Berge, y col., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci., 66, 1-19 (1977) que se incorpora en este documento como referencia.También pueden prepararse sales de adición de bases haciendo reaccionar por separado el compuesto purificadoen su forma de ácido con una base orgánica o inorgánica adecuada y aislando la sal formada de esta manera. Lassales de adición de bases incluyen sales de metales y aminas farmacéuticamente aceptables. Las sales de metalesadecuadas incluyen las sales de sodio, potasio, calcio, bario, cinc, magnesio y aluminio. Se prefieren las sales desodio y potasio. Las sales de adición de bases inorgánicas adecuadas se preparan a partir de bases de metales que incluyen hidruro sódico, hidróxido sódico, hidróxido potásico, hidróxido de calcio, hidróxido de aluminio, hidróxido delitio, hidróxido de magnesio, hidróxido de cinc y similares. Las sales de adición de aminas adecuadas se preparan apartir de aminas que tienen suficiente basicidad para formar una sal estable, y preferiblemente incluyen las aminasque se usan habitualmente en la química medicinal debido a su baja toxicidad y aceptabilidad para uso médico.Amoniaco, etilendiamina, N-metil-glucamina, lisina, arginina, ornitina, colina, N,N'-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, dietanolamina, procaína, N-bencilfenetilamina, dietilamina, piperazina, tris(hidroximetil)-aminometano,hidróxido de tetrametilanimonio, trietilalnina, dibencilamina, efenamina, deshidroabietilamina, N-etilpiperidina, bencilamina, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, etilamina, aminoácidos básicos, por ejemplo, lisina y arginina, y diciclohexilamina y similares.
"Sustituyentes del grupo del anillo" se refiere a sustituyentes unidos a sistemas de anillos aromáticos o noaromáticos incluyendo arilo, heteroarilo, hidroxi, alcoxi, cicliloxi, ariloxi, heteroariloxi, acilo o su análogo tioxo, ciclilcarbonilo o su análogo tioxo, aroílo o su análogo tioxo, heteroaroílo o su análogo tioxo, aciloxi, ciclilcarboniloxi,aroiloxi, heteroaroiloxi, halo, nitro, ciano, carboxi (ácido), -C(O)-NHOH, -C(O)-CH2OH, -C(O)-CH3SH, -C(O)-NH-CN,sulfo. fosfono, alquilsulfonilcarbamoílo, tetrazolilo, arilsulfonilcarbamoílo, N-metoxicarbamoílo, heteroarilsulfonilcarbamoílo, 3-hidroxi-3-ciclobuteno-1,2-diona, 3,5-dioxo-1,2,4-oxadiazolidinilo o hidroxiheteroarilo tal como 3-hidroxiisoxazolilo, 3-hidroxi-1-metilpirazolilo, alcoxicarbonilo, cicliloxicarbonilo, ariloxicarbonilo, heteroariloxicarbonilo, alquilsulfonilo, ciclilsulfonilo, arilsulfonilo, heteroarilsulfonilo, alquilsulfinilo, ciclilsulfinilo, arilsulfinilo, heteroarilsulfinilo, alquiltio, cicliltio, ariltio, heteroariltio, ciclilo, arildiazo, heteroarildiazo, tiol, Y1Y2N-, Y1Y2C(O)-, Y1Y2NC(O)O-, Y1Y2NC(O)NY3-o Y1Y2NS2-, donde Y1, Y2 e Y3 son independientemente hidrógeno, alquilo, arilo o heteroarilo, o para cuando el sustituyente es Y1Y2N-, entonces uno de Y1 e Y2 puede ser acilo,ciclilcarbonilo, aroílo, heteroaroílo, alcoxicarbonilo, cicliloxicarbonilo, ariloxicarbonilo o heteroariloxicarbonilo, como se define en este documento, y el otro de Y1 e Y2 es como se ha definido previamente, o para cuando el sustituyente es Y1Y2NC(O)-, Y1Y2NC(O)O-, Y1Y2NC(O)NY3-o Y1Y2NSO2-, Y1 e Y2 también pueden tomarse junto con el átomo de N a través del cual Y1 e Y2 se unen para formar un azaheterociclilo o azaheterociclenilo de 4 a 7 miembros. Cuandoun sistema de anillos está saturado o parcialmente saturado, los "sustituyentes del grupo del anillo" incluyen ademásmetileno (H2C=), oxo (O=) y tioxo (S=). Son sustituyentes de ácidos/amidas del grupo del anillo carboxi (ácido), -C(O)-NHOH, C (O)-CH2OH-C(O)-CH2SH, -C(O)-NH-CN, sulfo, fosfono, alquilsulfonilcarbamoílo, tetrazolilo,arilsulfonilcarbamoílo, N-metoxicarbamoílo, heteroarilsulfonilcarbamoílo, 3-hidroxi-3-ciclobuteno-1,2-diona, 3,5-dioxo1,2,4-oxadiazolidinilo o hidroxiheteroarilo tal como 3-hidroxiisoxazolilo, 3-hidroxil-1-metilpirazolilo e Y1Y2NCO-. Son sustituyentes no ácidos polares del grupo del anillo hidroxi, oxo (O=), tioxo (S=), acilo o su análogo tioxo, ciclilcarbonilo o su análogo tioxo, aroílo o su análogo tioxo, heteroaroílo o su análogo tioxo, alcoxicarbonilo, cicliloxicarbonilo, ariloxicarbonilo, heteroariloxicarbonilo, aciloxi, ciclilcarboniloxi, aroiloxi, heteroaroiloxi, alquilsulfonilo, ciclilsulfonilo, arilsulfonilo, heteroarilsulfonilo, alquilsulfinilo, ciclilsulfinilo, arilsulfinilo, heteroarilsulfinilo,tiol, Y1Y2N-, Y1Y2NC(O)-, Y1Y2NC(O)O-, Y1Y2NC(O)NY3-o Y1Y2NSO2-.
"Solvato" se refiere a la asociación física de un compuesto de la presente invención con una o más moléculas de disolventes. Esta asociación física incluye unión de hidrógeno. En ciertos casos, el solvato podráaislarse, por ejemplo cuando se incorporan una o más moléculas de disolventes en la estructura reticular cristalinadel sólido cristalino. "Solvato" incluye tanto solvatos en fase de solución como aislables. Los solvatos ejemplaresincluyen hidratos, etanolatos, metanolatos y similares.
Los compuestos particulares de acuerdo con la invención son los compuestos BW y CU.
Los compuestos de la invención se suministran opcionalmente en forma de sales. Esas sales que sonfarmacéuticamente aceptables son de particular interés ya que son útiles en la administración de los compuestos anteriores para fines médicos. Las sales que no son farmacéuticamente aceptables son útiles en procedimientos defabricación, para fines de aislamiento y purificación, y en algunos casos, para el uso en la separación de formasestereoisoméricas de los compuestos de la presente invención. Esto último es particularmente cierto para sales deaminas preparadas a partir de aminas ópticamente activas.
Cuando el compuesto de la invención contiene un grupo carboxi, o un bioisóstero suficientemente ácido,pueden formarse sales de adición de bases y son simplemente una forma más conveniente para el uso; y en lapráctica, el uso de la forma de sal supone intrínsecamente el uso de la forma de ácido libre.
Además, cuando el compuesto de la invención contiene un grupo básico, o un bioisóstero suficientementebásico, pueden formarse sales de adición de ácidos y son simplemente una forma más conveniente para el uso; y enla práctica, el uso de la forma de sal supone intrínsecamente el uso de la forma de base libre.
Una realización preferida del uso de un compuesto de acuerdo con la invención en un procedimiento para eltratamiento de un paciente que padece una infección por HCV o afecciones fisiológicas relacionadas con la infecciónque comprende administrar al paciente una cantidad farmacéuticamente eficaz de un compuesto BW o CU.
Otra realización preferida del uso de un compuesto de acuerdo con la invención en un procedimientoterapéutico es para el tratamiento de un paciente que padece una infección por HCV o afecciones fisiológicasrelacionadas con la infección que comprende administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de un compuestoBW o CU junto con una cantidad farmacéuticamente eficaz de otro agente terapéutico anti-HCV al paciente.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar composiciones farmacéuticas que comprendan,además de uno o más inhibidores de la serina proteasa de HCV, uno o más interferones que muestran actividadanti-HCV y/o uno o más compuestos que tienen actividad anti-HCV, incluyendo compuestos inmunomoduladorestales como citoquinas inmunoestimuladoras que muestran actividad antiviral de HCV, y un vehículo o diluyentefarmacéuticamente aceptable.
Es otro objeto de la invención proporcionar una composición farmacéutica que sea eficaz, en y por símisma, para la utilización en una terapia de combinación beneficiosa debido a que incluye una pluralidad d ingredientes activos que pueden utilizarse de acuerdo con la invención.
La invención también proporciona kits o paquetes individuales que combinan dos o más ingredientesactivos útiles en el tratamiento o prevención de una infección por HCV en un paciente. Un kit puede proporcionar(solo o junto con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable), el compuesto de BW o CU y el ingredienteactivo adicional (solo o junto con un diluyente o vehículo) distinto de un agente terapéutico anti-HCV.
Los compuestos BW y CU pueden prepararse por aplicación o adaptación de procedimientos conocidoscomo los usados hasta ahora o descritos en la bibliografía, o por procedimientos de acuerdo con la presenteinvención que se encuentran en este documento.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar medicamentos útiles en procedimientos de tratamiento
5 o prevención de una infección por HCV en un paciente que lo necesita, que comprenden administrar a dicho paciente una cantidad farmacéuticamente eficaz de una combinación de uno o más inhibidores de la serina proteasade HCV; uno o más interferones que muestran actividad anti-HCV; y/o uno o más compuestos que tienen actividadanti-HCV, incluyendo compuestos inmunomoduladores tales como citoquinas inmunoestimuladoras que muestranactividad antiviral para HCV.
10 Otro objeto de la presente invención es el uso de uno o más inhibidores de la serina proteasa de HCV junto con uno o más interferones que muestran actividad anti-HCV y/o uno o más compuestos que tienen actividad anti-HCV, incluyendo compuestos inmunomoduladores tales como citoquinas inmunoestimuladoras que muestranactividad antiviral de HCV, para preparar un medicamento para tratar o prevenir una infección por HCV en unpaciente que lo necesita.
15 Un objeto adicional de la presente invención es un kit o paquete farmacéutico para tratar o prevenir una infección por HCV en un paciente, donde el kit o paquete farmacéutico comprende una pluralidad de recipientesseparados, donde al menos uno de dichos recipientes contiene uno o más inhibidores de la serina proteasa de HCV,al menos otro de dichos recipientes contiene uno o más interferones o compuestos que inducen la producción de uninterferón que muestran actividad anti-HCV (solo o junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable),
20 y, opcionalmente, al menos otro de dichos recipientes contiene uno o más compuestos que tienen actividad anti-HCV (solo o junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable), incluyendo compuestosinmunomoduladores tales como citoquinas inmunoestimuladoras que muestran actividad antiviral para HCV.
Otro objeto más de la presente invención es proporcionar medicamentos útiles en un procedimiento deinhibición de la replicación del virus de la hepatitis C en una célula, que comprende poner en contacto dicha célula,25 un inhibidor de la serina proteasa del virus de la hepatitis C y opcionalmente un interferón o compuestos que inducen
la producción de un interferón que tienen actividad anti-virus de la hepatitis C.
La cantidad del inhibidor(es) de la serina proteasa de HCV, interferón(es) o compuesto(s) anti-HCV encualquiera de las solicitudes anteriores puede ser una cantidad farmacéuticamente eficaz, una cantidad eficaz anti-HCV subóptima o combinaciones de las mismas, de manera que la combinación final de inhibidor(es) de la proteasa
30 de HCV, interferón(es) y/o compuesto(s) anti-HCV comprenda una cantidad farmacéuticamente eficaz de compuestos que sea eficaz en el tratamiento o prevención de una infección por HCV en un paciente.
Es un objeto adicional de la invención proporcionar un procedimiento para preparar un compuesto debicicloproinato quiral que sea útil en la preparación de los compuestos de acuerdo con la invención.
Preparación de Compuestos de la Invención
35 Los materiales de partida e intermedios de los compuestos de la invención pueden prepararse por aplicación o adaptación de procedimientos conocidos, por ejemplo, procedimientos como los descritos en losEjemplos de Referencia o sus equivalentes químico obvios.
Los compuestos de la invención pueden prepararse por aplicación o adaptación de procedimientosconocidos, por los que se entienden procedimientos usados hasta ahora o descritos en la bibliografía, por ejemplo,40 los descritos por R.C. Larock en Comprehensive Organic Transformations. VCH publishers (1989).
Un compuesto de fórmula I.
en la que las variables y el resto
45 de las mismas son como se describen en este documento, pueden prepararse por tratamiento de un compuesto de fórmula 2, en la que las variables
de las mismas son como se describen en este documento, con un agente oxidante apropiado y en condicionesapropiadas. Un agente oxidante particular es reactivo de DMP. Las condiciones particulares incluyen realizar la oxidación en un disolvente orgánico apropiado tal como diclorometano aproximadamente a la temperatura ambiente.
En un compuesto peptidomimético de fórmula I
R0 es un enlace de difluorometileno;
10 R1 es hidrógeno, un grupo alifático opcionalmente sustituido, un grupo cíclico opcionalmente sustituido o un grupo aromático opcionalmente sustituido;;
cada uno de R2 y R9 es independientemente un grupo alifático opcionalmente sustituido, un grupo cíclico opcionalmente sustituido o un grupo aromático opcionalmente sustituido;
cada uno de R3, R5 y R7 es independientemente (grupo alifático opcionalmente sustituido, grupo cíclico
15 opcionalmente sustituido o grupo aromático opcionalmente sustituido) (metileno opcionalmente sustituido o etileno opcionalmente sustituido), (1,1-o 1,2-)cicloalquileno opcionalmente sustituido o (1,1-o 1,2-)heterociclileno opcionalmente sustituido;
cada uno de R4, R6, R8 y R10 es independientemente hidrógeno o un grupo alifático opcionalmente sustituido;
20 es azaheterociclilo monocíclico sustituido o azaheterociclilo multicíclico opcionalmente sustituido, o azaheterociclenilo multicíclico opcionalmente sustituido donde la insaturación está en el anillo distal con respecto alanillo que tiene el R9-L-(N(R8)-R7-C(O)-)nN(R6)-R5-C(O)-N y al que está unido el resto -C(O)-N(R4)-R3C(O)C(O)NR2R1: L es -C(O)-, -OC(O)-, -NR10C(O)-, -S(O)2-o -NR10S(O)2-: y
n es 0 o 1, o
25 una sal farmacéuticamente aceptable o profármaco del mismo, o un solvato de dicho compuesto, su sal o su profármaco,
con la condición de que cuando
es
5 sustituido entonces L sea -OC(O) y R9 sea un grupo alifático opcionalmente sustituido, o al menos uno de R3, R5 y R7 sea (grupo alifático opcionalmente sustituido, grupo cíclico opcionalmente sustituido o grupo aromático opcionalmentesustituido) (etandiilo opcionalmente sustituido), o R4 sea un grupo alifático opcionalmente sustituido. 10 La presente invención también proporciona un compuesto que tiene la fórmula estructural:
en la que:
R1 es hidrógeno, un grupo alifático opcionalmente sustituido, un grupo cíclico opcionalmente sustituido o un grupo aromático opcionalmente sustituido;
15 cada uno de R2 y R9 es independientemente un grupo alifático opcionalmente sustituido, un grupo cíclico opcionalmente sustituido o un grupo aromático opcionalmente sustituido;
cada uno de R3, R5 y R7 es independientemente (grupo alifático opcionalmente sustituido, grupo cíclico opcionalmente sustituido o grupo aromático opcionalmente sustituido) (metandiilo opcionalmente sustituido o etandiilo opcionalmente sustituido);
20 cada uno de R4, R6, R8 y R10 es independientemente hidrógeno o un grupo alifático opcionalmente sustituido;
es azeheterociclilo monocíclico sustituido o azahetereociclilo multicíclico opcionalmente sustituido, o azaheterociclenilo multicíclico opcionalmente sustituido donde la insaturación está en el anillo distal con respecto alanillo que tiene el resto R9-L-(N(R8)-R7-C(O)-)nN(R6)-R5-C(O)-N y al que está unido el resto -C(O)-N(R4)-R3
25 C(O)C(O)NR2R1;
L es -C(O)-, -OC(O)-, NR10C(O)-, -S(O)2-o-NR10S(O)2; y
una sal farmacéuticamente aceptable o profármaco del mismo, o un solvato de dicho compuesto, su sal o su profármaco,
con la condición de que
30 cuando es
sustituido
el L sea -OC(O)-y R9 sea un grupo alifático opcionalmente sustituido, o al menos uno de R3, R3 y R7 sea (grupo alifático opcionalmente sustituido, grupo cíclico opcionalmente sustituido o grupo aromático opcionalmente sustituido) (etandiilo opcionalmente sustituido) o R4 sea un grupo alifático opcionalmente sustituido.
Una realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R0 es un enlace.
Otra realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R0 es difluorometileno.
Una realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R1 es hidrógeno o un grupo alifático inferior opcionalmente sustituido.
Otra realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R1 es hidrógeno o alquilo inferior.
Una realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que R1 es hidrógeno.
Una realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R2 es un grupo alifático inferior opcionalmente sustituido o un grupo monocíclico opcionalmente sustituido.
Otra realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R2 es carboximetilo, 1-carboxi2-feniletilo, ciclopropilo, ciclobutilo, 1-ciclohexiletilo, 1-feniletilo, but-2-ilo, 1-pirid-4-iletilo, propen-3-ilo o metilbut-2-ilo;más preferiblemente ciclopropilo.
Una realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R3 es un grupo metileno alifático inferior opcionalmente sustituido.
Otra realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R3 es (alquilo o alquenil)metileno inferior opcionalmente halo-sustituido.
Una realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que R3 es propilmetileno, 2,2difluoroetilmetileno, 2,2,3-trifluorometileno o propen-3-ilmetileno; se prefiere más que R3 sea propilmetileno o 2,2difluoroetilmetileno, prefiriéndose más que R3 sea propilmetileno.
Una realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R4 es hidrógeno o un grupo alifático inferior opcionalmente sustituido.
Otra realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R4 es hidrógeno o alquilo inferior.
Una realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que R4 es hidrógeno.
Una realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R5 es un grupo metileno alifático inferior opcionalmente sustituido.
Otra realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R5 es (alquil o alquenil)metileno inferior opcionalmente sustituido con (fenilo, carboxi, carboxamido o alcoxicarbonilo).
Una realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que R5 es metilmetileno, isopropilmetileno, t-butil-metileno, but-2-ilmetileno, butilmetileno, bencilmetileno, 3-metilbutilmetileno, 2-metilpropilmetileno, carboximetilmetileno, carboxamidometilmetileno benciloxicarbonilmetilmetileno, benciloxicarbonilpropilmetileno, o fenilpropen-3-ilmetileno; más preferiblemente R5 es isopropilmetileno o tbutilmetileno.
Una realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R6 es hidrógeno o un grupo alifático inferior opcionalmente sustituido.
Otra realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R6 es hidrógeno o alquilo inferior.
Una realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que R6 es hidrógeno.
Una realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R7 es un grupo metileno alifático inferior opcionalmente sustituido, un grupo metileno cíclico inferior opcionalmente sustituido o un (aril o heteroaril)metileno monocíclico opcionalmente sustituido.
Otra realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R7 es alquilmetileno inferior opcionalmente sustituido, cicloalquilmetileno inferior opcionalmente sustituido o fenilmetileno opcionalmente sustituido.
Una realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que R7 es metilmetileno, isopropilmetileno, n-propilmetileno, fenilmetileno, ciclohexilmetileno, ciclopentilmetileno, t-butilmetileno, sbutilmetileno, ciclohexilmetilmetileno o fenilmetilmetileno, más preferiblemente es isopropilmetileno, ciclohexilmetileno, ciclopentilmetileno, t-butilmetileno o s-butilmetileno.
Una realización preferida de acuerdo con la invención también es aquella en la que cada uno de R3, R5 y R7 es metileno monosustituido.
Una realización preferida de acuerdo con la invención es también aquella en la que R3 es metileno monosustituido y tiene una configuración (S) en el carbono unido al resto -C(O)-R0-C(O)-NR1R2.
Una realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R8 es hidrógeno o un grupo alifático inferior opcionalmente sustituido.
Otra realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R8 es hidrógeno o alquilo inferior.
Una realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que R8 es hidrógeno.
Una realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R9 es un grupo alifático inferior opcionalmente sustituido o un grupo aromático monocíclico opcionalmente sustituido.
Otra realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R9 es alquilo inferior opcionalmente sustituido o heteroarilo monocíclico opcionalmente sustituido.
Otra realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R9 es alquilo inferior opcionalmente sustituido con (carboxi, (alquil inferior)SO2NH-, (alquil inferior)HNCO-, hidroxi, fenilo, heteroarilo o(alquil inferior)OC(O)NH-), o heteroarilo monocíclico opcionalmente sustituido.
Una realización preferida adicional de acuerdo con la invención es aquella en la que R9 es alquilo inferiorsustituido con (mono-o di-)MeOC(O)NH-; más preferiblemente es 1,2-di(MeOC(O)NH)etilo o 1-(MeOC(O)NH)etilo.
Una realización preferida de acuerdo con la presente invención es aquella en la que R9 es alquilo inferior sustituido con (carboxi, (alquil inferior)HNCO-o tetrazolilo); más preferiblemente es 3-carboxipropilo, 2-tetrazol-5ilpropilo, 3-(N-metilcarboxamido)propilo o 3-carboxi-2,2-dimetilpropilo; más preferiblemente es 3-carboxipropilo, 2tetrazol-5-ilpropilo o 3-(N-metilcarboxamido)propilo.
Otra realización preferida de la invención es aquella en la que R9 es alquilo inferior opcionalmente sustituido; más preferiblemente es 1-hidroxi-2-phenytetilo, metilo, isopropilo o t-butilo; más preferiblemente es metilo, isopropilo o t-butilo.
Otra realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que R9 se selecciona entre el grupo constituido por
Otra realización preferida más de acuerdo con la invención es aquella en la que R9 es pirazinilo. Una
realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R10 es hidrógeno o un grupo alifático inferior
opcionalmente sustituido.
Otra realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R10 es hidrógeno o alquilo inferior.
Una realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que R10 es hidrógeno.
Una realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que
10 como un azaheterociclilo monocíclico sustituido es pirrolidinilo sustituido. Una realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que
como un azaheterociclilo monocíclico sustituido es
opcionalmente sustituido o
opcionalmente sustituido en el que Ar es R2 que comprende un resto aromático; más preferiblemente es
opcionalmente sustituido aún más preferiblemente es
opcionalmente sustituido Aún más preferiblemente
opcionalmente sustituido es
opcionalmente sustituido;
aún más preferiblemente
Otra realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que
como un azaheterociclilo multicíclico opcionalmente sustituido es
opcionalmente sustituido; más preferiblemente es
10 opcionalmente sustituido. Son sustituyentes particulares para
hidroxi, fluoro u oxo. Otra realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que
como un azaheterociclenilo multicíclico opcionalmente sustituido es
opcionalmente sustituido; más preferiblemente es aún más preferiblemente es
Otra realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que
como un azaheterociclenilo multicíclico opcionalmente sustituido es
opcionalmente sustituido.
Una realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que el resto -C(O)-N(R4)-R3C(O)R0C(O)NR2R1 unido a
está unido con el carbono  al átomo de nitrógeno.
Una realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que L es -C(O)-o -OC(O)-.
Una realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que n es 0.
Otra realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que n es 1.
Una realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que R11 es -CO2R13.
Una realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que R12 es
Una realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R13 es un grupo alifático opcionalmente sustituido.
Otra realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R13 es un grupo alquilo.
Una realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que R13 es alquilo inferior.
Otra realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que R13 es metilo.
Una realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que R14 es -CO2R16.
Una realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R15 es alquilo.
Una realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que R15 es alquilo inferior. Una realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que R15 es metilo. Una realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R16 es un grupo alifático
opcionalmente sustituido.
5 Otra realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R16 es alquilo.
Una realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que R10 es alquilo inferior.
Una realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que R16 es t-Bu.
Una realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R17 es arilo opcionalmente
sustituido. 10 Una realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que R17 es fenilo. Una realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que R18 es arilo opcionalmente
sustituido.
Una realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que R18 es fenilo.
Una realización particular de acuerdo con la invención es aquella en la que p0 se selecciona entre el grupo
15 constituido por BOC, CBz y -CO2alquilo.
Una realización preferida de acuerdo con la invención es aquella en la que p0 es BOC.
Debe apreciarse que la presente invención incluye todas las combinaciones apropiadas de las
agrupaciones particulares y preferidas indicada en este documento. Un compuesto de fórmula 2, en la que las variables y el resto
de las mismas son como se describen en este documento, puede prepararse por acoplamiento de un compuesto defórmula 3, en la que las variables y el resto
de las mismas son como se describen en este documento, y un compuesto de fórmula 4, en la que
y las variables de los mismos son como se describen en este documento, con un agente de acoplamiento apropiadoy en condiciones apropiadas. El agente y las condiciones de acoplamiento particulares incluyen el uso de DIC y HOAt en un disolvente orgánico apropiado tal como DMF a aproximadamente 0ºC o usando PyBop y DIPEA en undisolvente orgánico apropiado tal como diclorometano aproximadamente a la temperatura ambiente.
Un compuesto de fórmula 3, en la que las variables y el resto de las mismas son como se describen en este documento, puede prepararse por acoplamiento de un compuesto defórmula 5, en la que las variables de la misma son como se describen en este documento, y un compuesto defórmula 6, en la que P2 es un grupo protector de ácido
y el resto
del mismo es como se describe en este documento, con un agente de acoplamiento apropiado y en condiciones deacoplamiento apropiadas, seguido de un agente de desprotección apropiado y en condiciones de desprotección10 apropiadas. El agente y las condiciones de acoplamiento particulares incluyen el uso de DIC o DCC y HOAt en un disolvente orgánico apropiado tal como DMF o diclorometano de aproximadamente 0ºC a aproximadamente latemperatura ambiente. La desprotección se realiza usando un agente de desprotección apropiado que depende de lanaturaleza del agente protector, es decir, si puede retirarse (lábil) en condiciones ácidas, básicas o de hidrogenación, y de los otros restos reactivos del compuesto que experimenta la desprotección, es decir, se elige un
15 agente de desprotección para realizar la desprotección sin afectar a los otros restos reactivos a menos que se desee una reacción simultánea. Un agente protector de ácido particular es alquilo inferior de C1 a C8; más particularmente metilo. Un agente de desprotección particular es una base inorgánica tal como un hidróxido alcalino; más particularmente NaOH. Las condiciones de desprotección particulares incluyen realizar la desprotección en undisolvente alcohólico tal como metanol o etanol aproximadamente a la temperatura ambiente.
20 Un compuesto de fórmula 5, en la que n es 0 y las otras variables son como se describen en este documento, es decir, compuesto 5a, puede prepararse por desprotección de un compuesto de fórmula 7,
en la que P2 es un ácido grupo protector y las otras variables de la misma son como se describen en estedocumento, con un agente de desprotección apropiado y en condiciones apropiadas. La desprotección se realiza25 usando un agente de desprotección apropiado que depende de la naturaleza del agente protector, es decir, si puede retirarse (lábil) en condiciones ácidas, básicas o de hidrogenación, y de los otros restos reactivos del compuesto queexperimenta la desprotección, es decir, se elige un agente de desprotección para realizar la desprotección sin
afectar a los otros restos reactivos a menos que se desee una reacción simultánea. Un agente protector de ácido particular es alquilo inferior de C1 a C8; más particularmente metilo. Un agente de desprotección particular es unabase inorgánica tal como un hidróxido alcalino; más particularmente NaOH. Las condiciones de desprotecciónparticulares incluyen realizar la desprotección en un disolvente alcohólico tal como metanol o etanol aproximadamente a la temperatura ambiente.
Un compuesto de fórmula 7, en la que las variables de la misma son como se describen en este documento, puede prepararse por acilación de un compuesto de fórmula 8, en la que las variables de la misma soncomo se describen en este documento, con un compuesto de fórmula 9, en la que M es un resto desplazable y lasotras variables
10 del mismo son como se describen en este documento, en condiciones apropiadas. Las condiciones de acoplamientoparticulares usan DIC o DCC y HOAt en un disolvente orgánico apropiado tal como DMF o diclorometano deaproximadamente 0ºC a aproximadamente la temperatura ambiente, o PyBop y DIPEA en un disolvente orgánicoapropiado tal como DMF o diclorometano aproximadamente a la temperatura ambiente; y preferiblemente las últimas
15 condiciones. Un L particular es carbonilo. Un M particular es hidroxi o N-oxisuccinimida.
Un compuesto de fórmula 5, en la que n es 1 y las otras variables son como se describen en estedocumento, es decir, compuesto 5b, puede prepararse por desprotección de un compuesto de fórmula 10, en la queP2 es un grupo protector de ácido
20 y las otras variables de la misma son como se describen en este documento, con un agente de desprotección apropiado y en condiciones apropiadas. La desprotección se realiza usando un agente de desprotección apropiadoque depende de la naturaleza del agente protector de ácido, es decir, si puede retirarse (lábil) en condiciones ácidas,básicas o de hidrogenación, y de los otros restos reactivos del compuesto que experimenta la desprotección, esdecir, se elige un agente de desprotección para realizar la desprotección sin afectar a los otros restos reactivos a
25 menos que se desee una reacción simultánea. Un agente protector de ácido particular es alquilo inferior de C1 a C8; más particularmente metilo. Un agente de desprotección particular es una base inorgánica tal como un hidróxidoalcalino; más particularmente NaOH. Las condiciones de desprotección particulares incluyen realizar ladesprotección en un disolvente alcohólico tal como metanol o etanol aproximadamente a la temperatura ambiente.
Un compuesto de fórmula 10, en la que las variables de la misma son como se describen en este
30 documento, puede prepararse por acilación de un compuesto de fórmula 11, en la que las variables de la misma son como se describen en este documento, con un compuesto de fórmula 9, en la que las variables de la misma soncomo se describen en este documento,
en condiciones apropiadas. Las condiciones de acoplamiento particulares usan DIC o DCC y HOAt en un disolventeorgánico apropiado tal como DMF o diclorometano de aproximadamente 0ºC a aproximadamente la temperaturaambiente, o PyBop y DIPEA en un disolvente orgánico apropiado tal como DMP o diclorometano aproximadamente ala temperatura ambiente; y preferiblemente las últimas condiciones. Un L particular es carbonilo. Un M particular es hidroxi o N-oxisuccinimida.
Un compuesto de fórmula 11, en la que las variables son como se describen en este documento, puedeprepararse por desprotección de un compuesto de fórmula 12, en la que P1 es una grupo protector de amina
10 y las otras variables de la misma son como se describen en este documento, con un agente de desprotección apropiado y en condiciones apropiadas. La desprotección se realiza usando un agente de desprotección apropiadoque depende de la naturaleza del agente protector de amina. es decir, si puede retirarse (lábil) en condicionesácidas, básicas o de hidrogenación, y de los otros restos reactivos del compuesto que experimenta la desprotección,es decir, se elige un agente de desprotección para realizar la desprotección sin afectar a los otros restos reactivos a
15 menos que se desee una reacción simultánea. Un grupo protector de amina particular es Cbz o BOC; más particularmente Cbz. Un agente de desprotección particular es un ácido tal como HCl o H2/Pd(OH)2; más particularmente H2/Pd(OH)2. Las condiciones de desprotección particulares incluyen realizar la desprotección en undisolvente alcohólico tal como metanol o etanol o un disolvente de alcanoato de alquilo tal como acetato de etilo aproximadamente a la temperatura ambiente.
20 Un compuesto de fórmula 12, en la que las variables de la misma son como se describen en este documento, puede prepararse por acoplamiento un compuesto de fórmula 13, en la que las variables de la mismason como se describen en este documento, con un compuesto de fórmula 14, en la que las variables de la misma son como se describen en este documento,
25 en condiciones apropiadas. Las condiciones de acoplamiento particulares usan HOAt/DIC y DIPEA en un disolvente orgánico apropiado tal como THF aproximadamente a la temperatura ambiente.
Un compuesto de fórmula 4, en la que las variables son como se describen en este documento, puede prepararse por desprotección de un compuesto de fórmula 15, en la que las variables de la misma son como sedescriben en este documento,
5 con un agente de desprotección apropiado y en condiciones apropiadas. La desprotección se realiza usando un agente de desprotección apropiado que depende de la naturaleza del agente protector de amina, es decir, si puede retirarse (lábil) en condiciones ácidas, básicas o de hidrogenación, y de los otros restos reactivos del compuesto queexperimenta la desprotección, es decir, se elige un agente de desprotección para realizar la desprotección sinafectar a los otros restos reactivos a menos que se desee una reacción simultánea. Un agente protector de amina
10 particular es Cbz o BOC; más particularmente Cbz. Un agente de desprotección particular es un ácido tal como HCl
o H2/Pd(OH)2; más particularmente H2/Pd(OH)2. Las condiciones de desprotección particulares incluyen realizar ladesprotección en un disolvente alcohólico tal como metanol o etanol o un disolvente de alcanoato de alquilo tal comoacetato de etilo aproximadamente a la temperatura ambiente.
Un compuesto de fórmula 15, en la que las variables de la misma son como se describen en este
15 documento, puede prepararse por acoplamiento un compuesto de fórmula 16, en la que las variables de la misma son como se describen en este documento, con un compuesto de fórmula 17, en la que las variables de la misma son como se describen en este documento
en condiciones apropiadas. Un agente protector de amina particular es Cbz o BOC; más particularmente Cbz. Las20 condiciones de acoplamiento particulares usan HOBT, PyBop y DIPEA en un disolvente orgánico apropiado tal como diclorometano de aproximadamente 0ºC a aproximadamente la temperatura ambiente.
Un compuesto de fórmula 16, en la que las variables son como se describen en este documento puedeprepararse por desprotección de un compuesto de fórmula 18, en la que las otras variables de la misma son
como se describen en este documento, con un agente de desprotección apropiado y en condiciones apropiadas. Ladesprotección se realiza usando un agente de desprotección apropiado que depende de la naturaleza del agenteprotector de ácido, es decir, si puede retirarse (lábil) en condiciones ácidas, básicas o de hidrogenación, y de los5 otros restos reactivos del compuesto que experimenta la desprotección, es decir, se elige un agente de desprotección para realizar la desprotección sin afectar a los otros restos reactivos a menos que se desee una reacción simultánea. Un agente protector de amina particular es Cbz. Un agente protector de ácido particular esalquilo inferior de C1 a C8; más particularmente metilo. Un agente de desprotección particular es una base inorgánicatal como un hidróxido alcalino; más particularmente NaOH. Las condiciones de desprotección particulares incluyen
10 realizar la desprotección en un disolvente alcohólico tal como metanol o etanol aproximadamente a la temperatura ambiente.
Un compuesto de fórmula 18, en la que R0 es un enlace y las otras variables de la misma son como sedescriben en este documento, puede prepararse por protección de un compuesto de fórmula 20, en la que lasvariables de la misma son como se describen en este documento, con un compuesto de fórmula 19, en la que
las variables de la misma son como se describen en este documento, en condiciones apropiadas. Un agenteprotector de amina particular es Cbz o BOC. Las condiciones de acoplamiento particulares usan un disolventeorgánico apropiado tal como diclorometano de aproximadamente 0ºC a aproximadamente la temperatura ambiente.
Un compuesto de fórmula 20, en la que R4 es hidrógeno y las otras variables son como se describen en20 este documento, puede prepararse por hidrogenación de un compuesto de fórmula 21, en la que
las variables de la misma son como se describen en este documento, con un agente de hidrogenación apropiado y en condiciones apropiadas. Un agente de hidrogenación particular es H2/Pd(OH)2. Las condiciones de hidrogenaciónparticulares incluyen realizar la hidrogenación en un disolvente alcohólico tal como metanol o etanol o un disolventede alcanoato de alquilo tal como acetato de etilo aproximadamente a la temperatura ambiente.
Un compuesto de fórmula 20 en la que R4 es un grupo alifático opcionalmente sustituido y las otras variables son como se describen en este documento puede prepararse por alquilación del compuesto 20' en el quelas variables son como se describen en este documento con el compuesto 22 (agente de alquilación) en el que R4 es un grupo alifático opcionalmente sustituido y Q es un grupo desplazable tal como haluros, tosilatos o sulfonatos, encondiciones apropiadas.
Los agentes de alquilación apropiados incluyen grupos alifáticos (haluros, tosilatos o sulfonatos). Lascondiciones de alquilación apropiadas incluyen realizar la alquilación en un disolvente orgánico apropiado tal comoun disolvente alcohólico, por ejemplo, metanol o etanol, o un disolvente entérico, por ejemplo, éter o tetrahidrofuranode aproximadamente la temperatura ambiente a aproximadamente la temperatura de reflujo.
15 Un compuesto de fórmula 21, en la que las variables son como se describen en este documento, puede prepararse por alquilación de un compuesto de fórmula 22, en la que la variable de la misma es como se describe eneste documento, con un compuesto de fórmula 23, en la que los R3 son independientemente un grupo alifático opcionalmente sustituido
20 un grupo cíclico opcionalmente sustituido o un grupo aromático opcionalmente sustituido como se describe en este documento, en condiciones apropiadas. Las condiciones de alquilación particulares incluyen realizar la alquilaciónusando una base fuerte tal como t-butóxido potásico en un disolvente alcohólico tal como metanol o etanol aproximadamente a la temperatura ambiente.
Un compuesto de fórmula 24 en la que las variables de la misma son como se describen en este 25 documento, puede prepararse realizando una adición de Michael sobre un aceptor de Michael de fórmula 29, en la que la variable de la misma es como se describe en este documento, con un derivado de glicinimida imínica.
Condiciones de Adición de Michael
Las adiciones de Michael comprenden disolventes apróticos polares apropiados, bases de hidróxido demetal alcalino y temperaturas apropiadas. Para las adiciones de Michael, véase Corey, E.J.; Noe, M.C.; Xu, F. Tetrahedron Letter 1998, 39, 5347. Para la síntesis de catalizadores de transferencia de fase quiral, véase Corey,E.J.; Noe, M.C.; Xu, F. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 12414. Los disolventes apropiados incluyen DCM, ACN o THF
5 dependiendo de las condiciones de reacción. Las bases apropiadas incluyen CsOH, NaOH, KOH y LiOH. Las temperaturas apropiadas varían de aproximadamente -78ºC a aproximadamente 0ºC, más particularmente aaproximadamente -60ºC. Las glicinimidas imínicas útiles en la invención se describen en este documento. Unaglicinimida imínica preferida es éster terc-butílico de N-(difenilmetileno)glicina. Además, las condiciones de adiciónde Michael pueden influenciarse con o sin un catalizador de transferencia de fase (PTC) (quiral y no quiral). Un PTC
10 preferido es bromuro de O-[9]alil-N-9-antracenilmetilcinconidio.
Un compuesto de fórmula 25, en la que las variables de la misma son como se describen en este documento, puede prepararse por escisión de imina y ciclación del compuesto de fórmula 24,
Para los procedimientos de escisión y ciclación, véase Javidan. A.; Schfer, K.; Pyne, S. Synlett 1996, 100:
15 Tatsukawa, A.; Dan. M.; Ohbatake, M.; Kawatake, K.; Fukata, T.; Wada, E.; Kanemase, S.; Kakei, S. J. Org. Chem. 1993, 58, 4221. Las condiciones de escisión y ciclación incluyen el uso de disolventes polares, reactivos ácidos y temperaturas de aproximadamente la temperatura ambiente a aproximadamente 150ºC. Las condiciones preferidasincluyen el uso de EtOH, AcONa y NH2OH·HCl, y una temperatura de aproximadamente el punto de ebullición para el disolvente usado.
20 Un compuesto de fórmula 26, en la que las variables de la misma son como se describen en este documento, puede prepararse por protección de la amida del compuesto de fórmula 25, en la que las variables de lamisma son como se describen en este documento, con un grupo protector de amida adecuado tal como BOC. Otrosgrupos protectores adecuados incluyen CBz, -CO2alquilo. Véase también Greene, T.W.; P.G.M. en Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, Nueva York, 1991 para otros grupos protectores de amina. Las condiciones de
25 protección incluyen el uso de disolventes apróticos polares, bases orgánicas como catalizadores, y temperaturas de aproximadamente 0ºC-100ºC. Las condiciones preferidas incluyen el uso de ACN, dimetil amino piridina y unatemperatura de aproximadamente la temperatura ambiente.
Un compuesto de fórmula 27, en la que las variables de la misma son como se describen en este 30 documento, puede prepararse por reducción del compuesto protegido de fórmula 26, en la que las variables de la misma son como se describen en este documento.
De hecho, se realizan dos reducciones. La primera reducción es de la amida para dar el hemiaminal usando DIBALH
o superhidruro [LiBEtH]. La segunda reducción es del hemiaminal para dar la amina usando Et3SiH y BF3·OEt2. Véase Collado, I; Ezquerra, J.; Mateo, A.I.; Rubio, A., J. Org. Chem. 1998, 63 1995-2001 y Ezqueera, J.; P-edregal,C.; Yruretagoyena, B.; Rubio, A.; Carreno, M.C.; Escribano, A.; Garcia Ruano, J.L. J. Org. Chem. 1995, 60, 2925para las condiciones reductoras. Otras condiciones habituales para convertir piroglutamatos en pirrolidinas son el uso de BH3·SMe2.
Un compuesto de fórmula 28, en la que las variables de la misma son como se describen en este
documento, puede prepararse por desprotección del compuesto de fórmula 27, en la que las variables de la misma
son como se describen en este documento.
10 Véase Gibson, F.G.; Bermeier, S.C.; Rapoport, H., J. Org Chem. 1994, 59, 3216-3218 para las condiciones de retirada selectiva del grupo protector de N-BOC en presencia de éster terc-butílico. Un especialista en la técnicaconocerá qué condiciones de desprotección dependerán de la elección del grupo protector. Por ejemplos, si se usaCBz, pueden usarse condiciones básicas o de hidrogenación. Preferiblemente, se usa BOC, puede usarse HCl 1 N
15 en acetato de etilo. Véase Greene, T.W.; P.G.M. en Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, Nueva York, 1991.
La persona especialista en la técnica apreciará que un compuesto de fórmula 3 puede prepararse poracoplamiento un compuesto de fórmula 5 con un compuesto de fórmula 28 en las condiciones descritas anteriormente en este documento.
20 Los procedimientos para preparar R3, R5 o R7 como restos etandiilo opcionalmente sustituido incluyen los conocidos por los especialistas en la técnica, por ejemplo, los procedimientos descritos The organic Chemistry of � -Lactams" editado por G. Georg, VCH Publishers. Inc. (1993). por ejemplo, páginas 240-241 y 303-20 305.
Los esquemas 1-11 que se muestran a continuación ejemplifican procedimientos proporcionados parapreparar un azaheterociclilo multicíclico opcionalmente sustituido. Los procedimientos de los siguientes esquemas25 también pueden aplicarse a otros azaheterociclilos multicíclicos opcionalmente sustituidos que comprenden
sustituyentes compatibles del mismo tipo.
Un compuesto de fórmula I que incluye un grupo que contiene uno o más átomos de nitrógeno en el anillo,preferiblemente imina (=N-), puede convertirse en el compuesto correspondiente en el que uno o más átomos denitrógeno del anillo del grupo se oxidan para dar un N-óxido, preferiblemente por reacción con un perácido, por
5 ejemplo ácido peracético en ácido acético o ácido m-cloroperoxibenzoico en un disolvente inerte tal como diclorometano, a una temperatura de aproximadamente temperatura ambiente a la temperatura de reflujo, preferiblemente a temperatura elevada.
En las reacciones que se describen a continuación en este documento, puede ser necesario protegergrupos funcionales reactivos, por ejemplo grupos hidroxi, amino, imino, tio o carboxi, donde éstos se desean en el
10 producto final, para evitar su participación indeseada en las reacciones. Pueden usarse grupos protectores convencionales de acuerdo con la práctica convencional, para ejemplos, véase T.W. Green y P.G.M. Wuts en "Protective Groups in Organic Chemistry" John Wiley y Sons (1991); J.F. W. MrOmie en "Protective Groups inOrganic Chemistry" Plenum Press, 1973.
Un compuesto que se prepara como se describe en este documento puede recuperarse de la mezcla de
15 reacción por medios convencionales. Por ejemplo, los compuestos pueden recuperarse mediante retirada por destilación del disolvente a partir e la mezcla de reacción o, si es necesario, después de la retirada por destilacióndel disolvente a partir de la mezcla de reacción, vertiendo el residuo en agua seguido de extracción con undisolvente orgánico inmiscible en agua y retirando por destilación el disolvente del extracto. Además, si se desea, elproducto puede purificarse adicionalmente por diversas técnicas, tales como recristalización, reprecipitación o
20 diversas técnicas cromatográficas, concretamente cromatografía en columna o cromatografía preparativa de capa fina.
De acuerdo con una característica adicional de la presente invención, los compuestos de la invenciónpueden prepararse por interconversión de otros compuestos de la invención.
Como un ejemplo del procedimiento de interconversión, los compuestos de fórmula I que contienen enlacessulfóxido pueden prepararse por oxidación de los compuestos correspondientes que contienen enlaces S. Porejemplo, la oxidación puede realizarse convenientemente por medio de reacción con un peroxiácido, por ejemplo,ácido 3-cloroperbenzoico, preferiblemente en un disolvente inerte, por ejemplo, diclorometano, preferiblemente a ocasi a la temperatura ambiente, o como alternativa por medio de hidrogenoperoxomonosulfato potásico en un mediotal como metanol acuoso, tamponado a aproximadamente pH 5, a temperaturas comprendidas entre aproximadamente 0ºC y la temperatura ambiente. Este último procedimiento se realiza para compuestos que contienen un grupo lábil a ácidos.
Como otro ejemplo del procedimiento de interconversión, los compuestos de fórmula I que contienenenlaces sulfona pueden prepararse por oxidación de compuestos correspondientes que contienen enlaces -S-osulfóxido. Por ejemplo, la oxidación puede realizarse convenientemente por medio de reacción con un peroxiácido,por ejemplo, ácido 3-cloroperbenzoico, preferiblemente en un disolvente inerte, por ejemplo, diclorometano, preferiblemente a o casi a la temperatura ambiente.
Se entenderá que la designación de la aromaticidad con respecto a arilos y heteroarilos en este documentoincluye cualquier estructura de anillos insaturados muy resonante. Como alternativa, la situación de los doblesenlaces, cuando se indica, representa una estructura potencial para el compuesto representado pero se entenderáque incluye otros estados resonantes del compuesto así como especies protonadas y cargadas, aunque sólo puederepesentarse una de ellas.
Se apreciará que los compuestos de la presente invención pueden contener centros asimétricos. Estoscentros asimétricos pueden estar independientemente en la configuración R o S. Será evidente para losespecialistas en la técnica que ciertos compuestos de la invención también pueden mostrar isomería geométrica.Debe apreciarse que la presente invención incluye isómeros geométricos y estereoisómeros individuales y mezclasde los mismos, incluyendo mezclas racémicas, de compuestos de acuerdo con la invención. Dichos isómerospueden separarse de sus mezclas, por aplicación o adaptación de procedimientos conocidos, por ejemplo técnicascromatográficas y técnicas de recristalización, o se preparan por separado a partir de los isómeros apropiados desus intermedios.
Para el propósito de este documento, se entiende que las formas tautoméricas se incluyen en la indicaciónde un grupo dado, por ejemplo, tioxo/mercapto o oxo/hidroxilo.
Las sales de adición de ácidos se forman con los compuestos de la invención en los que está presente unafunción básica tal como un grupo amino, alquilamino o dialquilamino. Se prefieren sales de adición de ácidosfarmacéuticamente aceptables, es decir, no tóxicas. Las sales elegidas se seleccionan óptimamente para que seancompatibles con los vehículos farmacéuticos habituales y se adaptan para la administración oral o parenteral.Pueden prepararse sales de adición de ácidos de los compuestos de la presente invención por reacción de la baselibre con el ácido apropiado, por aplicación o adaptación de procedimientos conocidos. Por ejemplo, las sales deadición de ácidos de los compuestos de la presente invención puede prepararse disolviendo la base libre en agua oen una solución alcohólica acuosa u otros disolventes adecuados que contienen el ácido apropiado y aislando la salpor evaporación de la solución, o haciendo reaccionar la base libre y el ácido en un disolvente orgánico, en cuyocaso la sal se separa directamente o puede obtenerse por concentración de la solución. Algunos ácidos adecuadospara el uso en la preparación de dichas sales son ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácidosulfúrico, diversos ácidos carboxílicos y sulfónicos orgánicos, tales como ácido acético, ácido cítrico, ácido propiónico, ácido succínico, ácido benzoico, ácido tartárico, ácido fumárico, ácido mandélico, ácido ascórbico, ácidomálico, ácido metanosulfónico, ácido toluenosulfónico, ácidos grasos, adipato, alginato, ascorbato, aspartato,bencenosulfonato, benzoato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, bisulfato, butirato, lactato, laurato,laurilsulfato, malato, yodhidrato, 3-hidroxi-etanosulfonato, glicerofosfato, picrato, pivalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, tiocianato, 2-naftalenosulfonato, undecanoato, nicotinato, hemisulfato, heptonato,hexanoato, canforato, canforsulfonato, y otros.
Las sales de adición de ácidos de los compuestos de la presente invención pueden regenerarse a partir delas sales por aplicación o adaptación de procedimientos conocidos. Por ejemplo, los compuestos de partida de lainvención pueden regenerarse a partir de sus sales de adición de ácidos por tratamiento con un álcali, por ejemplo,solución acuosa de bicarbonato sódico o solución acuosa de amoniaco.
Los compuestos de la presente invención pueden regenerarse a partir de sus sales de adición de bases poraplicación o adaptación de procedimientos conocidos. Por ejemplo, compuestos de partida de la invención puedenregenerarse a partir de sus sales de adición de bases por tratamiento con un ácido, por ejemplo, ácido clorhídrico.
Pueden formarse sales de adición de bases cuando el compuesto de la invención contiene un grupocarboxi, o un bioisóstero suficientemente ácido. Las bases que pueden usarse para preparar las sales de adición debases incluyen preferiblemente las que producen, cuando se combinan con el ácido libre, sales farmacéuticamenteaceptables, es decir, sales cuyos cationes no son tóxicos para el paciente a dosis farmacéuticas de las sales, demanera que los efectos inhibidores beneficiosos inherentes a la base libre no se vean afectados negativamente por los efectos secundarios atribuibles a los cationes. Las sales farmacéuticamente aceptables, incluyendo las obtenidasa partir de sales de metales alcalinos y alcalinotérreos, dentro del alcance de la invención, incluyen las obtenidas apartir de las siguientes bases: hidruro sódico, hidróxido sódico, hidróxido potásico, hidróxido de calcio, hidróxido de aluminio, hidróxido de litio, hidróxido de magnesio, hidróxido de cinc, amoniaco, etilendiamina, N-metil-glucamina,lisina, arginina, ornitina, colina, N,N-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, dietanolamina, procaína, Nbencilfenetilamina, dietilamina, piperazina, tris(hidroximetil)-aminometano, hidróxido de tetrametilaminonio ysimilares.
Los compuestos de la presente invención pueden prepararse convenientemente, o formarse durante el procedimiento de la invención, en forma de solvatos (por ejemplo, hidratos). Los hidratos de los compuestos de la presente invención pueden prepararse convenientemente por recristalización en una mezcla de disolventes acuosos/orgánicos, usando disolventes orgánicos tales como dioxano, tetrahidrofurano o metanol.
Los materiales de partida e intermedios pueden prepararse por aplicación o adaptación de procedimientosconocidos, por ejemplo procedimientos como los descritos en los Ejemplos de Referencia o sus equivalentes 5 químicos obvios.
Los compuestos de la invención, sus procedimientos de preparación y su actividad biológica se verán másclaramente a partir del examen de los siguientes ejemplos que se presentan únicamente como una ilustración y nodeben considerarse como limitación del ámbito de la invención.
Las muestras se analizaron por TLC, RMN, RP-HPLC o AE.
10 Los compuestos de la invención, sus procedimientos de preparación y su actividad biológica se verán más claramente a partir del examen de los siguientes ejemplos que se presentan únicamente como una ilustración y nodeben considerarse como limitación del ámbito de la invención.
Las muestras se analizaron por TLC, RMN, RP-HPLC o AE.
Ejemplo I -Compuestos de comparación A-E:
15 A una solución en DCM (10 ml) del compuesto xi (310 mg, 0,39 mmol) se le añade TFA (4 ml). La reacción se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante 5 horas. En este momento, el disolvente se retira alvacío. El residuo resultante se purifica por HPLC de fase inversa para dar 195 mg (68%) del compuesto A.
Siguiendo el procedimiento anterior y usando los materiales de partida apropiados, se preparan los 20 siguientes compuestos consecutivos B-E:
Ejemplo 2 -Compuestos de comparación F-M:
A una solución en DCM (10 ml) del compuesto xii (350 mg, 0,56 mmol) se le añade reactivo de DMP (307mg, 0,73 mmol). La reacción se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante 2 horas y después se25 interrumpe con Na2SO3 al 10% durante 30 minutos. Después, la mezcla de reacción se extrae con EtOAc (75 ml) y
se lava con salmuera. La fase orgánica se seca y se concentra al vacío. El residuo resultante se purifica concromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 80-90%/Hexanos), dando 248 mg (71%) del compuesto F
Siguiendo el procedimiento anterior y usando los materiales de partida apropiados, se preparan los siguientes ejemplos consecutivos G-M:
Ejemplo 3 -Compuestos de comparación N-R:
A una solución en DCM (4 ml) del compuesto xix (-0,22 mmol) se le añade reactivo de DMP (146 mg, 0,34mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante 2 horas, la reacción se interrumpecon Na2SO3 al 10%. Después. la mezcla de reacción se diluye con DCM. La fase orgánica se separa y se lava dos veces con Na2SO3 al 10% y salmuera. La fase orgánica resultante se seca y se concentra al vacío, dando unresiduo, que se purifica por cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 5%/EtOAc), proporcionando 78 mg (56%) delcompuesto deseado N
Siguiendo el procedimiento anterior y usando los materiales de partida apropiados, se preparan los siguientes ejemplos consecutivos O-R:
Ejemplo 4 -Compuestos de comparación S-W:
A una solución en DCM (10 ml) del compuesto xxv (320 mg, 0,5 mmol) se le añade reactivo de DMP (272 mg, 0,65 mmol). La reacción se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante 2 horas y se interrumpecon Na2SO3 al 10% durante 20 minutos. Después, la mezcla resultante se extrae con EtOAc. La fase orgánica se lava con salmuera, se seca y se concentra al vacío. El residuo resultante se purifica por cromatografía sobre gel desílice (EtOAc al 80%/Hexanos), dando 170 mg (53%) del compuesto S.
Siguiendo el procedimiento anterior y usando los materiales de partida apropiados, se preparan los 10 siguientes ejemplos consecutivos T-W:
Ejemplo 5 -Compuestos de comparación X-AD:
A una solución en DCM (20 ml) del compuesto xxvi (400 mg, 0,6 mmol) se le añade reactivo de DMP (329mg, 0,78 mmol). La reacción se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante 1,5 horas y se interrumpe
15 con Na2SO3 al 10% durante 20 minutos. Después, la mezcla resultante se extrae con EtOAc. La fase orgánica se lava con salmuera, se seca y se concentra al vacío. El residuo resultante se purifica por cromatografía sobre gel desílice (EtOAc al 70-100%/Hexanos), dando 210 mg (53%) del compuesto X.
Siguiendo el procedimiento anterior y usando los materiales de partida apropiados, se preparan los siguientes ejemplos consecutivos Y-AD:
Ejemplo 6 -Compuestos de comparación AE-A1:
El compuesto xxxiii (150 mg; 0,076 mmol) se disuelve en 5 ml de TFA y se agita durante dos días. Elproducto se purifica por RP-HPLC para producir 40 mg (33% de rendimiento) del compuesto AE.
Siguiendo el procedimiento anterior y usando los materiales de partida apropiados, se preparan los siguientes ejemplos consecutivos AF-AI:
Ejemplo 7 -Compuesto de comparación AJ:
El compuesto xxxviii (180 mg, 0,21 mmol) se disuelve en TFA puro (5 ml) y se deja durante 3 días
aproximadamente a la temperatura ambiente. En este momento, la mezcla de reacción se concentra al vacío, dando
un residuo, que se purifica por HPLC de fase inversa, dando 50 mg (32%) del compuesto AJ,
Ejemplo 8 -Compuestos de comparación AK-AM:
El compuesto xxxxiii (150 mg; 0,16 mmol) se disuelve en 4,5 ml de TFA y se agita durante tres días. Elproducto se purifica por RP-HPLC para producir 70 mg (54% de rendimiento) del compuesto AK,
Siguiendo el procedimiento anterior y usando los materiales de partida apropiados, se preparan los siguientes ejemplos consecutivos AL-AM:
Ejemplo 9 -Compuestos de comparación AN:
El compuesto lii (80 mg) se disuelve en 3 ml de TFA y 3 ml de DCM. La mezcla se agita aproximadamente
a la temperatura ambiente durante 5 horas. El disolvente se retira por evaporación. El residuo resultante se purifica
por HPLC, produciendo 62 mg (83%) del compuesto AN.
El compuesto liii (160 mg; 0,2 mmol) se disuelve en 5 ml de DCM y se añade reactivo de DMP (170 mg; 0,4mmol). La mezcla se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante tres horas. El disolvente se retirapor evaporación y el residuo se disuelve en acetonitrilo al 50%/agua y se purifica por RP-HPLC, produciendo 51 mg
15 (32%) del compuesto AO, 0,44 mmol). La mezcla se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante 3 horas. El disolvente se retirapor evaporación y el producto se purifica por RP-HPLC, produciendo 41 mg (25%) del compuesto AP,
El compuesto lx (70 mg; 0,09 mmol) se disuelve en 5 ml de TFA y 5 ml de DCM. La mezcla se agita
aproximadamente a la temperatura ambiente durante 3 horas. El disolvente se retira al vacío y el residuo se disuelve
en acetonitrilo al 50%/agua y se liofiliza, produciendo el compuesto AQ en forma de un polvo,
El compuesto lxvi (223 mg, 0,326 mmol) se agita en una solución de TFA (5 ml) y DCM (5 ml) durante 4
horas. El análisis por TLC (gel de sílice: MeOH al 2%/EtOAc) muestra la completa conversión en el producto más
lento. El disolvente se retira a presión reducida y el producto se liofiliza, dando 198 mg (97%) del compuesto AR.
Siguiendo el procedimiento anterior y usando los materiales de partida apropiados, se preparan los 15 siguientes ejemplos consecutivos AS-BG:
El compuesto lxxiii (150 mg, 0,15 mmol) se recoge en DCM (3 ml). A esta solución se le añade TFA (1,5
ml). La solución resultante se agita durante una noche. En este momento, la reacción se concentra al vacío, dando
un residuo. El residuo se purifica por HPLC de fase inversa y se liofiliza, dando 60 mg (50%) del compuesto BH,
Siguiendo el procedimiento anterior y usando los materiales de partida apropiados, se preparan los siguientes ejemplos consecutivos BI-BS:
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 12 y usando los materiales de partida apropiados, se preparan lossiguientes compuestos consecutivos BT-BU:
A una solución en diclorometano (4,2 ml) del compuesto lxxvii (143 mg, 0,21 mmol) se le añade reactivo deDMP (165 mg, 0,39 mmol). La reacción se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante 2 horas y seinterrumpe con Na2SO3 al 10% (ac.) durante 20 minutos. La mezcla resultante se extrae con EtOAc. La fase orgánica
10 se lava con salmuera, se seca sobre MgSO4 y se concentra para dar un aceite de color amarillo. La purificación por cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 5%/EtOAc) produce 124 mg (79%) del compuesto BV.
A una solución en diclorometano (20 ml) del compuesto lxxxix (420 mg, 0,62 mmol) se le añade reactivo de
15 DMP (342 mg, 0,81 mmol). La reacción se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante 1 hora y se interrumpe con Na2SO3 al 10% durante 20 minutos. Después, la mezcla resultante se extrae con EtOAc. La faseorgánica se lava con salmuera, se seca y se concentra al vacío. El residuo resultante se purifica por cromatografíasobre gel de sílice (EtOAc al 80%/Hexanos), dando 208 mg (50%) del compuesto BW,
Siguiendo el procedimiento anterior pero usando los materiales de partida apropiados, se preparan lossiguientes ejemplos consecutivos BX-CA:
A una solución en diclorometano (6,5 ml) del compuesto lxxxvii (200 mg, 0,3 mmol) se le añade reactivo de DMP (227 mg, 0,54 mmol). La reacción se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante 2 horas y seinterrumpe con Na2SO3 al 10% (ac.) durante 20 minutos. La mezcla resultante se extrae con EtOAc. La fase orgánicase lava con salmuera, se seca sobre MgSO4 y se concentra para dar un aceite de color amarillo. La purificación porcromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 5%/EtOAc) produce 138 mg (70%) del compuesto CB,
Siguiendo el procedimiento anterior pero usando los materiales de partida apropiados, se prepara el siguiente compuesto CC:
Ejemplo 19 -Compuesto de comparación CD:
El compuesto lxxxxviii (40 mg, 0,05 mmol) se recoge en TFA (3 ml). La solución se agita durante dosnoches y se concentra. El residuo se purifica por HPLC de fase inversa, dando 25 mg (74%) del compuesto CD.
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 17 y usando los materiales de partida apropiados, se prepara el siguiente compuesto CE:
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 14 y usando los materiales de partida apropiados, se preparan los10 siguientes ejemplos consecutivos CF-CG:
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 16 y usando los materiales de partida apropiados, se prepara elsiguiente compuesto CH:
El compuesto cxi (490 mg, 0,75 mmol) se disuelve en DCM (6 ml). A esta solución se le añade reactivo deDMP (380 mg, 0,9 mmol) y se agita durante 1 hora. La mezcla de reacción se inactiva con una solución al 10% deNa2SO3, y después la fase orgánica se lava con NaHCO3 saturado y salmuera. Después de la concentración de la fase orgánica, el residuo resultante se purifica cromatográficamente con EtOAc al 70%/hexanos, produciendo elcompuesto CI (325 mg, 66,4%).
Siguiendo el procedimiento anterior para preparar el compuesto anterior y procedimientos relacionados10 para preparar el intermedio del mismo, pero usando los materiales de partida apropiados, se preparan los siguientes compuestos consecutivos CJ-CM:
y
A una solución en DCM/THF (3 ml/3 ml) del compuesto exviii (335 mg, 0,46 mmol) se le añade reactivo deDMP (300 mg, 0,69 mmol). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 2 horas y se interrumpe con Na2SO3 al 10% (ac.) durante 20 minutos. La mezcla resultante se extrae con EtOAc. La fase orgánica se lavacon salmuera, se seca sobre MgSO4 y se concentra, produciendo un aceite de color amarillo. La purificación porcromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 80%/hexanos) produce el compuesto CN (220 mg, 67%).
10 Ejemplo 25 -Compuestos de comparación CO-CR
A una solución en DCM/THF (1,5 ml/1,5 ml) del compuesto cxix (164 mg, 0,25 mmol) se le añade reactivode DMP (159 mg, 0,38 mmol). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 2 horas y seinterrumpe con Na2SO3 al 10% (ac.) durante 20 minutos. La mezcla resultante se extrae con EtOAc. La fase orgánicase lava con salmuera, se seca sobre MgSO4 y se concentra, dando un aceite de color amarillo. La purificación por
15 cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 70%/hexanos) produce el compuesto CO (100 mg, 61%).
Siguiendo el procedimiento anterior para preparar el compuesto anterior y procedimientos relacionadospara preparar el intermedio del mismo, pero usando los materiales de partida apropiados se preparan los siguientescompuestos consecutivos CP-CR:
y
El compuesto cxx se disuelve en DCM (3 ml), a la solución se le añade reactivo de DMP (180 mg, 0,41 mmol) y después se agita durante 1 hora. La mezcla de reacción se inactiva con Na2SO3 al 10% y después la fase orgánica se lava con NaHCO3 saturado y salmuera. Después de la concentración de la fase orgánica, el residuo sepurifica cromatográficamente con EtOAc al 100%, produciendo el compuesto CS (95 mg, 43,7%).
Siguiendo el procedimiento anterior para preparar el compuesto anterior y procedimientos relacionados10 para preparar el intermedio del mismo, pero usando el material de partida apropiado, se prepara el siguiente compuesto CT:
Ejemplo 27-Compuesto CU y compuestos de comparación EI, EK-EM, EO-EZ y FA-FG
El compuesto cxxviii (356 mg, 0,52 mmol) se disuelve en DCM (5 ml), a esta solución se le añade reactivo
15 de DMP (270 mg, 0,63 mmol) y se agita durante 1 hora. La mezcla de reacción se inactiva con Na2SO3 al 10% y después la fase orgánica se separa y se lava con NaHCO3 saturado y salmuera. Después de la concentración deldisolvente orgánico, el residuo se purifica cromatográficamente con EtOAc al 100%, produciendo el compuesto CU(200 mg, 56,3%), p.f. 225-235ºC.
Siguiendo el procedimiento anterior para preparar el compuesto anterior y procedimientos relacionados
para preparar el intermedio del mismo, pero usando los materiales de partida apropiados, se preparan los siguientes
compuestos consecutivos EI, EK-EM, EO-EZ y FA-FH:
El compuesto cxxx (330 mg, 0,46 mmol se disuelve en DCM (5 ml), a esta solución se le añade reactivo de
DMP (240 mg, 0,56 mmol) y se agita durante 1 hora. La mezcla de reacción se inactiva con Na2SO3 al 10% y la fase
orgánica se lava con NaHCO3 saturado y salmuera.
Después de la concentración de la fase orgánica, el residuo resultante se purifica cromatográficamente conEtOAc al 100%, produciendo el compuesto cxxx (280 mg, 85,9%).
Siguiendo el procedimiento anterior para preparar el compuesto anterior y procedimientos relacionadospara preparar el intermedio del mismo, pero usando los materiales de partida apropiados, se preparan los siguientescompuestos consecutivos CW-DC:
y
A una solución en DCM (6 ml) del compuesto cxxxviii (400 mg, 0,57 mmol) se le añade reactivo de DMP (362 mg, 0,85 mmol). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 2 horas y se interrumpe conNa2SO3 al 10% (ac.) durante 20 minutos. La mezcla resultante se extrae con EtOAc. La fase orgánica extraída selava con salmuera, se seca sobre MgSO4 y se concentra, produciendo un aceite de color amarillo. La purificacióncon gel de sílice (EtOAc al 70%/hexanos) produce el compuesto DD (201 mg, 51%).
Siguiendo el procedimiento anterior para preparar el compuesto anterior y procedimientos relacionados
para preparar el intermedio del mismo, pero usando los materiales de partida apropiados se prepara el siguiente
compuesto DE:
El compuesto cxxxxiii (165 mg, 0,24 mmol) se disuelve en DCM (5 ml). a la solución se le añade reactivo deDMP (125 mg, 0,29 mmol) y se agita durante 1 hora. La mezcla de reacción se inactiva con Na2SO3 al 10% y la fase orgánica se lava con NaHCO3 saturado y salmuera. Después de la concentración de la fase orgánica, el residuo resultante se purifica cromatográficamente con EtOAc al 70%/hexanos, produciendo el compuesto DF (108 mg,65,6%).
10 A una solución del compuesto cil (0,350 g, 0,516 mmol) en DCM (15 ml) enfriada en un baño de hielo se le añade reactivo de DMP (0,281 g, 0,671 mmol). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 2 horas, despuésse inactiva con una solución al 10% de Na2SO3 y se agita durante 20 minutos. La mezcla resultante se extrae conDCM (3 x 20 ml) y el extracto orgánico se seca (MgSO4). Después de la filtración para retirar el MgSO4, el filtrado se concentra y se purifica por cromatografía en columna (Acetato de etilo al 70%/Hexanos), produciendo el compuesto
15 final DG (0,265 g, 76%) en forma de un sólido de color blanco.
Siguiendo el procedimiento anterior para preparar el compuesto anterior y procedimientos relacionadospara preparar el intermedio del mismo, pero usando los materiales de partida apropiados, se preparan los siguientescompuestos consecutivos DH-DJ:
y
Una solución en DCM del compuesto clx (108 mg, 0,123 mmol) se trata con reactivo de DMP (78 mg, 0,185 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 1 hora, la mezcla de reacción se diluye con EtOAc (50ml) y después se interrumpe con Na2SO3 al 10%. Después de agitar durante 30 minutos, la fase orgánica se separa y se lava con NaHCO3 y salmuera. La fase orgánica se seca y se concentra al vacío, dando un residuo que sepurifica por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 80%/hexanos), produciendo el compuesto DK (84 mg, 78%).
Siguiendo el procedimiento anterior para preparar el compuesto anterior y procedimientos relacionados
para preparar el intermedio del mismo, pero usando los materiales de partida apropiados, se preparan los siguientes
compuestos DL-DN.
y
Una solución en EtOH (10 ml) del compuesto clxii (174 mg, 0,189 mmol) se hidrogena usando Pd/C (30%equiv., 60 mg, contenido de paladio del 10%) durante 2,5 horas. Después, el catalizador se retira por filtración. El filtrado resultante se concentra al vacío, produciendo un residuo que se purifica por cromatografía semi-preparativade fase inversa y se liofiliza, produciendo el compuesto DO con un rendimiento del 70%.
Siguiendo el procedimiento anterior para preparar el compuesto anterior y procedimientos relacionados10 para preparar el intermedio del mismo, pero usando los materiales de partida apropiados, se preparan los siguientes compuestos consecutivos DP-DS.
5 El compuesto clxiii (175 mg, 0,24 mmol) se recoge en DCM (3 ml). A esta solución se le añade agente DMP (120 mg, 0,28 mmol) y se agita durante 1 hora. La reacción se interrumpe con Na2SO3 al 10% y se lava con NaHCO3 saturado y salmuera. La purificación por EtOAc al 70% produce el compuesto CW (134 mg, 75%).
Ejemplo 35 -Compuestos de comparación CY y DT-DX:
A una solución en DCM (15 ml) de clxxii (290 mg, 0,43 mmol) se le añade reactivo de DMP (239 mg, 0,56
10 mmol). La reacción se agita a temperatura ambiente durante 1 hora y se interrumpe con Na2SO3 al 10% durante 20 minutos. Después, la mezcla resultante se extrae con EtOAc. La fase orgánica se lava con salmuera, se seca y se concentra al vacío. El residuo resultante se purifica por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 8100%/Hexanos), dando el compuesto CY (151 mg, 52%).
Siguiendo el procedimiento anterior para preparar el compuesto anterior y procedimientos relacionados15 para preparar el intermedio del mismo, pero usando los materiales de partida apropiados, se preparan los siguientes compuestos consecutivos DT-DX.
y
5 El compuesto lxxxv (1,17 mmol) se recoge en DCM (5 ml). A esta solución se le añade reactivo de DMP (543 mg, 1,3 mmol) y se agita durante 1 hora. La reacción se interrumpe con P-Na2SO3 (1,5 Mmol/g de resina) y seagita durante una hora. Se añade resina eliminadora P-TBD* (2,5 mmol/g de resina) y se agita durante 45 minutos.La mezcla resultante se filtra y se purifica con EtOAc al 50%, dando el compuesto DY (440 mg, 50,2% en dosetapas).
10 *Referencia para la resina eliminadora P-TBD: J. Parlow y col. Tetrahedron, 55, 6785-6796 (1999).
El compuesto material de partida clxxxxi (94 mg, 0,14 mmol) se disuelve en una mezcla de THF (10 ml) y DCM (20 ml). Después, se añade reactivo de DMP (118 mg, 0,28 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente
5 durante 2 horas. La reacción se vierte en un embudo de decantación que contiene Dri Solv THF (120 ml). La reacción se lava con Na2SO3 al 10% (50 ml) y después con salmuera (75 ml). Después, la fase orgánica se separa, se seca sobre MgSO4 y el disolvente se retira a presión reducida. Después se realiza la cromatografía (gel de sílice:elución con Dri Solv THF al 50%/EtOAc, y después MeOH al 4%/THF). Las fracciones se comprueban medianteanálisis por EM. Las fracciones apropiadas se liofilizan, produciendo el compuesto DZ (38,8 mg, 41%).
El compuesto de partida clxxxxv (185 mg, 0,26 mmol) se disuelve en THF (20 ml). Después, se añade elreactivo de DMP (219 mg, 0,52 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 1 hora, el análisis porTLC muestra la conversión completa en la cetona (MeOH al 5%/THF). La reacción se vierte en un embudo de
15 decantación que contiene Dri Solv THF (120 ml). La reacción se lava con Na2SO3 al 10% (50 ml) y después con salmuera (75 ml). Después, la fase orgánica se separa, se seca sobre MgSO4 y el disolvente se retira a presiónreducida, produciendo un residuo que se purifica por cromatografía (gel de sílice: elución con Dri Solv THF al 50%/EtOAc, y después MeOH al 4%/THF) y las fracciones se comprueban mediante análisis por UV y EM. Lasfracciones apropiadas se liofilizan, produciendo el compuesto EA (159 mg, 88%).
Siguiendo el procedimiento anterior para preparar el compuesto anterior y procedimientos relacionadospara preparar el intermedio del mismo, pero usando los materiales de partida apropiados, se prepara el siguientecompuesto EB:
25 Ejemplo 39 -Compuestos de comparación EC-ED:
A una solución del compuesto clxxxxviii (0,341 g, 0,503 mmol) en DCM (15 ml) enfriada en un baño de hielose le añade reactivo de DMP (0,277 g, 0,654 mmol). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 2 horas,después se inactiva con una solución al 10% de Na2SO3 y se agita durante 20 minutos. La mezcla resultante seextrae con DCM (3 x 20 ml) y el extracto orgánico se seca (MgSO4). Después de la filtración para retirar el MgSO4, el filtrado se concentra y se purifica por cromatografía en columna (EtOAc al 70%/Hexano), dando el compuesto EC (0,183 g, 54%) en forma de un sólido de color blanco.
Siguiendo el procedimiento anterior para preparar el compuesto anterior y procedimientos relacionadospara preparar el intermedio del mismo, pero usando los materiales de partida apropiados, se prepara el siguiente10 compuesto ED:
El compuesto ccii (290 mg, 0,37 mmol) se recoge en DCM (5 ml). A esta solución se le añade reactivo deDMP (175 mg, 0,41 mmol) y se agita durante 1 hora. La reacción se interrumpe con P-Na2SO3 (1,5 mmol/g de
15 resina) y se agita durante 1 hora. El reactivo de DMP inactivado se elimina con P-TBD (2,5 mmol/g de resina) y se agita durante 1 hora. La mezcla resultante se filtra y se aclara con DCM antes de concentrarse para dar un residuo. El residuo resultante se purifica con EtOAc al 50%/Hex, produciendo el compuesto EE (440 mg, 28%).
Siguiendo el procedimiento anterior para preparar el compuesto anterior y procedimientos relacionados20 para preparar el intermedio del mismo, pero usando los materiales de partida apropiados, se preparan los siguientes compuestos EF-EG:
y
A una solución en DCM (3 ml) del compuesto cciii (140 mg, 0,2 mmol) se le añade reactivo de DMP (133mg, 0,3 mmol). La reacción se agita a temperatura ambiente durante 2 horas y se interrumpe con Na2SO3 al 10% (ac.) durante 20 minutos. La mezcla resultante se extrae con EtOAc. La fase orgánica se lava con salmuera, se seca sobre MgSO4 y se concentra, dando un aceite de color amarillo que se purifica con gel de sílice (EtOAc al70%/hexano), y después se liofiliza, produciendo el compuesto EH (50 mg, 38%).
10 El compuesto ixxxiii (520 mg, 1 mmol) se recoge en DCM (5 ml). A la solución anterior se le añade PyBOP (624 mg, 1,2 mmol) y se agita durante 5 minutos. A esta solución se le añade gota a gota el compuesto cdviii (300mg, 1,2 mmol) en THF (5 ml), seguido de DIPEA (0,22 ml, 1,2 mmol). La reacción se agita a temperatura ambientedurante una noche, en atmósfera de nitrógeno. En este momento, la reacción se diluye con EtOAc y se lava conNaHCO3 saturado y salmuera. La fase orgánica se seca con MgSO4, se filtra y se concentra, dando el intermedio
15 acoplado en bruto cdix.
Este intermedio cdix (-1 mmol) se recoge en DCM (10 ml). A esta solución se le añade Peryodinano deDess-Martin (-166 mg, 1,1 mmol). Después de agitar durante 1 hora a temperatura ambiente, la reacción seinterrumpe con Na2SO3 unido a polímero (740 mg, 1,5 mmol DMP/g de resina) y se agita durante 45 minutos.
20 Después, la mezcla de reacción se elimina con resina TBD unida a polímero (440 mg, 2,3 mmol DMP/g de resina). La mezcla resultante se agita durante 45 minutos y después se filtra. La purificación se consigue en EtOH al5%/EtOAc, produciendo el compuesto EJ (245 mg, 32% en 2 etapas). Puede encontrarse una referencia bibliográficapara el procedimiento de trabajo en Tetrahedron 55 (1999) 6785-6796.
25 Ejemplo 43 -Compuesto de comparación EN:
El compuesto intermedio cdvii (415 mg, 0,59 mmol) se recoge en DCM (10 ml) y THF (10 ml) y se añade t-BuOH (300 µl) seguido de Peryodinano de Dess-Martin (750 mg, 1,77 mmol). La reacción se agita durante 50minutos y después se interrumpe con P-Na2SO3 (1,5 mmol DMP/g de resina). Después de agitar durante 20 minutos a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se elimina con P-TBD (2,5 mmol DMP/g de resina). Después de agitar durante 1 hora, la mezcla resultante se filtra y se concentra. El producto se purifica por cromatografía sobregel de sílice (EtOAc del 50% al 70%/Hexanos), produciendo el compuesto EN (220 mg, 53%).
Se obtuvieron Espectros de Masas [M] para los siguientes compuestos como se muestra en la siguiente
Tabla I.
TABLA 1
LY Nº Ejemplo Masa Encontrada
A 733,3
B 747,2
C 657,2
D 769,4
E 733,4
F 625,4
G 639,3
H 661,4
I 643,4
J 707,3
K 641,3
L 689,3
M 639,3
N 639,4
O 731,4
P 687,4
Q 633,4
R 701,4
S 639,3
T 747,1
U 655,4
V 653,4
W 703,4
X 661,3
Y 647,3
Z 663,3
AA 667,4
LY Nº Ejemplo Masa Encontrada
AB 711,4
AC 725,4
AD 647,3
AE 779,4
AF 689,3
AG 671,4
AK 806,4
AH 687,5
AI 735,4
AJ 736,5
AM 870,4
AN 813,3
AP 724,4
AQ 653,4
AR 628,2
AW 642,2
AX 614,2
AY 628,3
BD 570,3
BE 520,2
BF 534,3
BG 584,3
BU 890,3
BV 685,4
BW 679,3
BX 695,3
BY 697,3
BZ 787,4
CA 701,3
CB 669,4
CC 733,5
CD 643,3
CE 653,5
CH 749,4
CI 653,3
CJ 717,5
CK 683,4
CL 669,3
LY Nº Ejemplo Masa Encontrada
CM 675,2 CN 717,2 CO 653,3 CP 683,3 CQ 669,3 CR 675,2 CT 661,8 CS 639,3 CU 679,2 CV 709,3 CW 743,3 CX 695,3 CY 665,2 CZ 681,3 DA 695,3 DB 701,2 DC 673,3 DD 693,3 DE 757,4 DF 682,3 DG 676,3 DH 676,2 DI 692,5 DJ 605,2 DK 874,4 DL 924,5 DM 924,2 DN 952,7 DO 830 DP 842,5 DT 667,4 DU 639,2 DV 740,3 DW 684,2 DX 678,5 DY 749,3 DZ 685,3 EA 649,3
LY Nº Ejemplo Masa Encontrada
EB 700,3
EC 702,3
ED 730,3
EE 775,3
EF 749,3
EG 722,3
EH 665,2
EI 796,4
EJ 744,3
EK 730,5
EL 730,5
EM 757,3
EN 703,5
EO 715,5
EP 679,2
EQ 631,3
ER 715,3
ES 668,5
ET 732,5
EU 743,3
EV 683,3
EW 750,4
EX 786,4
EY 744,5
EZ 780,4
FB 693,4
FC 655,3
FD 655,3
FE 774,4
FF 681,5
FG 667,5
Los Espectros de Masas de Alta Resolución (EMAR) de los siguientes compuestos se obtuvieron como semuestra en la Tabla 2.
TABLA 2
Ejemplo
Fórmula Molecular (M+1) EM Calculado (M+1) Masa Encontrada (M+1)
TABLA 2
Ejemplo
Fórmula Molecular (M+1) EM Calculado (M+1) Masa Encontrada (M+1)
L M Z AB CE EN EK EC CA EZ EU CY BX S BW CU EJ EM Ninguno
C37H52N706 C33H50N706 C32H48F2N706 C36H48F2N706 C34H52N706 C35H52N706F2 C37H63N608S C36H59N608 C35H50N706F2 C40H55N806F2 C36H52N706F2 C35H52N706 C37H58N706 C33H50N706 C36H54N706 C36H54N706 C40H57N806 C35H54N706 C41H58N706 690,3979 640,3822 664,3634 712,3634 654,3979 704,3947 751,4428 703,4395 702,3790 781,4213 716,3947 666,3979 696,4448 640,3823 680,4136 680,4136 745,4401 668,4136 744,4448 690,3986 640,3822 664,3627 712,3649 654,3967 704,3945 750,4350 (M) 703,4382 702,3801 781,4196 716,3929 4666,3966 696,4432 640,3831 680,4126 680,4128 745,4417 668,4139 744,4691
Ejemplo Intermedio 1 -compuesto ii A una solución en etanol (40 ml) del compuesto i (8,1 g, 24,4 mmol)
se le añade NaBH4 (924 mg, 24,4 mmol) a -10ºC. La reacción se agita a esa temperatura durante 30 minutos y después se interrumpe con AcOH (3 ml). La mezcla de reacción se diluye con EtOAc (250 ml), y se lava conNaHCO3 y salmuera. La fase orgánica se seca y se concentra al vacío, produciendo un residuo que se purifica porcromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 50%/Hexanos), proporcionando 7,85 g (97%) del compuesto ii,
Ejemplo Intermedio 2 -compuesto iii
A una solución en THF (70 ml) del compuesto ii (4,48 g, 13,4 mmol) se le añade a 0ºC NaH (699 mg, 60%,17,42 mmol). Después de agitar a esa temperatura durante 40 minutos, se añade Met puro (1,25 ml, 20,1 mmol). Lareacción se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. En este momento, la reacción se interrumpe cuidadosamente con una solución saturada de NH4Cl a 0ºC. La mezcla de reacción se extrae con Et2O yEtOAc. La fase orgánica se lava con agua y salmuera y se seca con Na2SO4. La fase orgánica obtenida de esta manera se concentra al vacío, proporcionando el compuesto xantano iii.
10 Ejemplo Intermedio 3 -compuesto iv
El compuesto de xantano iii (~13,4 mmol) se disuelve en tolueno (100 ml). A esta solución se le añadeAIBN (216 mg, 1,34 mmol). La solución resultante se desgasifica con nitrógeno seco y después se trata con n-Bu3SnH (5,4 ml, 20,1 mmol). La mezcla de reacción se calienta a 90ºC durante 3 horas. En este momento, lareacción se enfría a temperatura ambiente y se concentra al vacío. El residuo resultante se purifica con
15 cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 15-20%/Hexanos), proporcionando 2,8 g (66% total del compuesto ii) del compuesto iv,
Ejemplo Intermedio 4 -compuesto v
A una solución en etanol (31 ml) del compuesto iv (1 g, 3,15 mmol) se le añade Pd(OH)2/C (655 mg, 20%,
20 0,95 mmol) en una corriente de nitrógeno. La mezcla de reacción resultante se somete a hidrogenación convencional (1,5 atm). Después de 5 horas, la fuente de hidrógeno se retira y la reacción se filtra. Los filtrados se concentran alvacío, proporcionando el compuesto de amina libre v,
Ejemplo Intermedio 5 -compuesto vi
A una solución en DCM (10 ml) del compuesto vii (629 mg, 1,95 mmol) se le añade aproximadamente a la temperatura ambiente
HOAt (265 mg, 1,95 mmol) seguido de una solución 1 M de DCC en DCM (1,95 15 ml, 1,95 mmol). Después deagitar durante 30 minutos, al ácido activado con HOAt anterior se le añade una solución en DCM (3 ml) delcompuesto v (1,5 mmol). La reacción se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. Eneste momento, la reacción se filtra a través de Celite. Los filtrados se diluyen con EtOAc (75 ml) y se lavan con agua y salmuera. La fase orgánica se seca y se concentra al vacío. El residuo resultante se purifica por cromatografíasobre gel de sílice (EtOAc al 70-80%/Hexanos), produciendo 620 mg (85%) del compuesto vi,
Ejemplo Intermedio 6 -compuesto viii
10 A una solución en etanol (10 ml) del compuesto vi (615 mg, 1,26 mmol) se le añade una solución acuosa 2 N de NaOH (1,26 ml, 2,52 mmol). La reacción se agita durante una noche aproximadamente a la temperaturaambiente y después se acidifica a pH 3 usando resinas ácidas Dowex. Los sólidos se retiran por filtración y losfiltrados se concentran al vacío, dando un residuo que se disuelve de nuevo en 1:1 de CH3CN/H2O. Esta solución se somete a liofilización, proporcionando 495 mg (85%) del compuesto viii,
Ejemplo Intermedio 7 -compuesto ix
A una solución en DCM (10 ml) del compuesto viii (230 mg, 0,5 mmol) se le añade PyBop (417 mg, 0,8mmol). La reacción se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante 30 minutos. Después, a estasolución se le añade una solución en THF (5,25 ml) del compuesto x (263 mg, 0,75 mmol) seguido de
DIPEA (0,174 ml, 1 mmol). La reacción se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche y después se interrumpe con agua (30 ml) durante 30 minutos. La mezcla de reacción se extrae con EtOAc (100 ml).La fase orgánica se lava con salmuera, se seca y se concentra al vacío, produciendo un residuo que se purifica porcromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 5%/EtOAc), dando 400 mg (100%) del compuesto ix,
Ejemplo Intermedio 8 -compuesto xi
A una solución en DCM (10 ml) del compuesto ix (396 mg, 0,5 mmol) se le añade reactivo de DMP (278 mg,0,65 mmol). La reacción se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante 1 hora y después se interrumpe con Na2SO3 al 10% durante 30 minutos. Después, la mezcla de reacción se extrae con EtOAc (75 ml) y se lava con salmuera. La fase orgánica se seca y se concentra al vacío. El residuo resultante se purifica concromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 70%/Hexanos), dando 320 mg (81%) del compuesto xi,
Ejemplo Intermedio 9 -compuesto xii
A una solución en DCM (10 ml) del compuesto viii (230 mg, 0,5 mmol) se le añade PyBop (417 mg, 0,8
mmol). La reacción se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante 30 minutos. Después, a esta
solución se le añade una solución en THF (3,5 ml) del compuesto xiii (140 mg, 0,75 mmol) y
seguido de DIPEA (0,174 ml, 1 mmol). La reacción se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante
15 una noche y después se interrumpe con agua (30 ml) durante 30 minutos. La mezcla de reacción se extrae con EtOAc (75 ml). La fase orgánica se lava con salmuera, se seca y se concentra al vacío, produciendo un residuo quese purifica por cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 5%/EtOAc), dando el compuesto xii con rendimientocuantitativo,
20 Ejemplo Intermedio 10 -compuesto i'
A una solución en metanol (30 ml) del compuesto i (5 g, 15,1 mmol) se le añaden (BOC)2O (3,3 g, 15,1 mmol) y H2/Pd(OH)2/C (1,6 g, contenido de Pd al 10%). La reacción se agita aproximadamente a la temperaturaambiente durante 2 horas y después se filtra dos veces a través de Celite. El lecho de Celite se aclara con DCM. Los filtrados combinados se concentran al vacío, produciendo un residuo oleoso que se purifica por cromatografía sobregel de sílice (EtOAc al 40%/Hexanos), dando 3,8 g (85%) del compuesto i',
Ejemplo Intermedio 11 -compuesto ii'
A una solución en metanol (111 ml) del compuesto i' (3,7 g, 12,5 mmol) se le añade a 0ºC NaBH4 (0,805 g, 21 mmol). Después de agitar a 0ºC durante 2,5 horas, el disolvente de la reacción se evapora lentamente al vacío,produciendo un residuo que se diluye con EtOAc. Después, esta solución se lava con agua dos veces. La faseacuosa se extrae con EtOAc. Las fases orgánicas combinadas se secan con MgSO4, se filtra y se concentra alvacío, produciendo un residuo que se purifica con cromatografía, proporcionando 3,76 g (99%) del compuesto ii',
Ejemplo Intermedio 12 -compuesto xiv
A una solución en DCM (180 ml) del compuesto ii' (3,76 g, 12,3 mmol) se le añade a 0ºC DMP (5 g, 40,1mmol) seguido después de de TTO2 (4 ml, 23,7 mmol). La reacción se agita a 0ºC durante 1 hora yaproximadamente a la temperatura ambiente durante 1,5 horas más. Después, la mezcla de reacción se lava dos
15 veces con NaHCO3 al 5% y se seca con MgSO4. La fase orgánica obtenida de esta manera se concentra al vacío, proporcionando el triflato en bruto. El triflato resultante (2,7 g, 6 mmol) se disuelve en DCM (120 ml). A esta soluciónse le añade DMAP (2,5 g, 20,5 mmol). La mezcla de reacción resultante se calienta a reflujo durante una noche. Eneste momento, la reacción se enfría a temperatura ambiente y se lava dos veces con NaHCO3 al 5%. La mezcla de reacción se seca con MgSO4, se filtra y se concentra al vacío, produciendo un residuo oleoso de color parduzco que
20 se purifica (MeOH al 1%/DCM), dando 500 mg (30%) del compuesto xiv,
Ejemplo Intermedio 13 -compuesto xv
El compuesto xiv (500 mg, 1,8 mmol) se disuelve en HCl 4 N en dioxano (6,75 ml). La reacción se agitaaproximadamente a la temperatura ambiente durante ~4 horas. En este momento, el disolvente se retira al vacío. El25 residuo resultante se valora dos veces con éter dietílico, dando la sal HCl del compuesto xv con rendimiento casi
cuantitativo, Ejemplo Intermedio 14 -compuesto xvi
A una solución en THF (7 ml) del compuesto vii (579 mg, 1,8 mmol) se le añaden HOAt (245 mg, 1,8 mmol)y DCC (1,8 ml, 1 M en DCM). Se produce como resultado una suspensión. Después de agitar aproximadamente a la5 temperatura ambiente durante 15 minutos, a la suspensión anterior se le añade una solución en THF (6 ml) del compuesto xv (1,8 mmol) y DIPEA (0,63 ml, 3,6 mmol). Después se añade más cantidad de DIPEA (0,8 ml). Lamezcla de reacción se agita durante una noche aproximadamente a la temperatura ambiente. En ese momento, los sólidos de color blanco formados de esta manera se retiran por filtración. Los sólidos de color blanco se aclaran conTHF. Los filtrados y los lavados combinados se concentran al vacío, dando el producto en bruto que se purifica por
10 cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 100%), proporcionando 665 mg (76%) del compuesto xvi.
Ejemplo Intermedio 15 -compuesto xvii
A una solución en etanol (8 ml) de 7 (665 mg, 1,37 mmol) se le añade NaOH acuoso 1 N (2,4 mmol) a 0ºC. La reacción se agita durante una noche aproximadamente a la temperatura ambiente y después se acidifica a pH 3
15 usando resinas ácidas Dowex. Los sólidos se filtran. Los filtrados resultantes se concentran al vacío, dando un residuo de color amarillo pálido que se disuelve de nuevo en 1:1 de CH3CN/H2O y se liofiliza, dando 467 mg (74%) del compuesto xvii,
Ejemplo Intermedio 16 -compuesto xix
Una solución en DCM (4 ml) del compuesto xvii (100 mg, 0,22 mmol) se trata con PyBop 5 (207 mg, 0,4
mmol) aproximadamente a la temperatura ambiente durante 20 minutos. En este momento, la solución anterior se
trata con una solución en THF (2,6 ml) del compuesto xviii (65 mg, 0,32 mmol), seguido de DIPEA
(0,076 ml). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante 7 horas, la reacción se
25 interrumpe con agua. La mezcla de reacción se diluye con DCM (60 ml). La fase orgánica se separa y se lava dos veces con salmuera y se seca con MgSO4. Después de la filtración, se concentra y se cromatografía sobre gel desílice (EtOH al 5%/EtOAc), obteniendo 148 mg (~100%) del compuesto xix.
Ejemplo Intermedio 17 -compuesto xx
A una solución en THF (100 ml) de N-Cbz-L-valina (14,4 g, 57,2 mmol) se le añaden HOBT (7,72 g, 57,2mmol) y EDCl (10,98 g, 57,2 mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante 20minutos, a la solución anterior se le añade una solución en THF (50 ml) que contiene clorhidrato de éster metílico de terc-L-Leucina (10,4 g, 57,2 mmol) y DIPEA (11,9 ml, 68,7 mmol). La reacción se agita aproximadamente a latemperatura ambiente durante una noche. Después del tratamiento acuoso convencional y la cromatografía sobregel de sílice (EtOAc al 30%/Hexanos), se obtienen 14 g (64%) del compuesto xx.
10 Ejemplo Intermedio 18 -compuesto xxi
A una solución en metanol (80 ml) de xx (6,71 g, 17,7 mmol) se le añade (en una corriente de N2) Pd/C (1,88 g, contenido de Pd al 10%). El recipiente de reacción se somete a hidrogenación (1 atm H2) durante una noche aproximadamente a la temperatura ambiente. En este momento, la mezcla de reacción se filtra a través de una capade Celite y se concentra al vacío, proporcionando la amina libre en bruto correspondiente para la siguiente etapa.
15 Una solución en THF de esta amina (~17,7 mmol) se añade a una solución en THF (46 ml) y DMF (5 ml) que contiene ácido 2-pirazinacarboxílico (2,85 g, 23 mmol), Hobbit (3,12 g, 23 mmol) y EDCl (4,41 g, 23 mmol). Después,a la mezcla resultante se le añade PIPEA (3,08 g, 17,7 mmol). La reacción se agita durante una noche aproximadamente a la temperatura ambiente y después se interrumpe con agua. La mezcla de reacción se extraecon EtOAc. La fase orgánica se lava con salmuera y se concentra al vacío, proporcionando un residuo que se
20 purifica por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 40-50%/Hexanos), proporcionando 3,9 g (63%) del compuesto xxi,
Ejemplo Intermedio 19 -compuesto xxii
A una solución en metanol (40 ml) del compuesto xxi (4,67 g, 13,34 mmol) se le añade NaOH 2 N (10 ml,
25 20 mmol). La reacción se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante 2 horas. En este momento, a la mezcla de reacción se le añade una cantidad adicional de NaOH 2 N (3,3 ml, 6,67 mmol). Después de agitaraproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche, la reacción se acidifica a pH 3 usando resina ácida.Después, la reacción se filtra y los filtrados se concentran al vacío, produciendo un residuo que se disuelve en 1:1 deCH3CN/H2O para la liofilización, y se obtienen 4,15 g (93%), del compuesto xxii.
Ejemplo Intermedio 20 -compuesto xxiii
Una solución en DCM (10 ml) del compuesto xxii (917 mg, 2,73 mmol) se trata con HOAt (371 mg, 2,73mmol) y DCC (2,73 ml, I M, 2,73 mmol). Después de agitar durante 30 minutos, la mezcla de reacción se trata conuna solución en THF (10 ml) del compuesto v (500 mg, 2,73 mmol). Después de agitar aproximadamente a latemperatura ambiente durante una noche, los sólidos de color blanco (urea) se filtran. Los filtrados se concentran al vacío, dando un residuo que se purifica por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 60-70%/Hexanos),proporcionando 1,06 g (77%) del compuesto xxiii,
Ejemplo Intermedio 21 -compuesto xxiv
Una solución en etanol (20 ml) del compuesto xxiii (1,06 g, 2,11 mmol) se trata con NaOH 2 N (2,11 ml, 4,23 mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche, la mezcla dereacción se acidifica a pH 3 con resina ácida. Los sólidos se retiran por filtración. Los filtrados resultantes se concentran al vacío, dando un residuo que se liofiliza, dando 1 g (100%) del compuesto xxiv,
15 Ejemplo Intermedio 22 -compuesto xxv
Una solución en DCM (10 ml) del compuesto xxiv (236,7 mg, 0,5 mmol) se trata con PyBop (417 mg, 0,8mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante 20 minutos, la mezcla de reacciónse trata con una solución en DMF (5,6 ml) del compuesto xiii (139,5 mg, 0,75 mmol), seguido de DIPEA (0,174 ml, 1mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante 8 horas, la reacción se interrumpe
20 con agua y se extrae con EtOAc. La fase orgánica resultante se lava con salmuera, se seca y se concentra al vacío, dando un residuo que se purifica por cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 5%/EtOAc), produciendo ~320 mg(100%) del compuesto xxv,
Ejemplo Intermedio 23 -compuesto xxi
25 Una solución en DCM (15 ml) del compuesto xxiv (355 mg, 0,75 mmol) se trata con PyBop (622 mg, 1,2 mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante 20 minutos, la mezcla de reacciónse trata con una solución en THF (10 ml) del compuesto xxvii' (156 mg, 0,75 mmol), seguido de DIPEA (0,26 ml, 1,5mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche, la reacción se interrumpe con agua y se extrae con EtOAc. La fase orgánica resultante se lava con salmuera, se seca y se
30 concentra al vacío, dando un residuo que se purifica por cromatografía sobre gel de sílice (2% EtOH/EtOAc), produciendo ~400 mg (80%) del compuesto xxvi,
Ejemplo Intermedio 24 -Metil 5-cianopentanoato
Se disuelve cianuro potásico (4 g, 61,44 mmol) en 70 ml de agua y 200 ml de metanol. A la solución se leañaden 10 g (51,2 mmol) de 5-bromopentanoato de metilo y la mezcla se calienta a reflujo durante una noche. Lamezcla de reacción se concentra a sequedad. Al residuo se le añaden 100 ml de EtOAc para extraer el producto. La fase orgánica se lava tres veces con agua, se seca y se concentra, produciendo 5,37 g (74%) de 5-cianopentanoatode metilo en forma de un aceite.
Ejemplo Intermedio 25 -5-Tetrazol-5-ilpentanoato de metilo
10 Se disuelve 5-cianopentanoato de metilo (4,8 g, 34 mmol) en tolueno y se añade cloruro de trietilamonio (14 g, 103 mmol) y azida sódica (6,63, 102 mmol). La mezcla se calienta a reflujo durante una noche. La mezcla dereacción se enfría a temperatura ambiente y se añade agua para extraer (3 x 100 ml) el 5-tetrazol-5-ilpentanoato demetilo de la fase orgánica. A la fase acuosa se le añade HCl concentrado para ajustar el pH a 2. El producto seextrae de la solución acuosa con EtOAc (3 x 50 ml). La fase orgánica se combina, se seca y se concentra,
15 produciendo 4,25 g (68%) de 5-tetrazol-5-ilpentanoato de metilo.
Ejemplo Intermedio 26 -5-[N-(1,1-Dimetilbencil)tetrazol-5-il]pentanoato de metilo
Se disuelven 5-tetrazol-5-ilpentanoato de metilo (4,23 g, 23 mmol) y ácido tricloroacético (8,69 g, 53 mmol) en 50 ml de CHCl3. A la solución se le añade gota a gota -metilestireno (2,72, 23 mmol), y la mezcla de reacción sedeja en agitación aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. La mezcla de reacción se diluye
20 con EtOAc hasta alcanzar un volumen de 200 ml y la fase orgánica se lava con KOH acuoso al 10% y salmuera. La fase orgánica se seca y se concentra. El producto se purifica por cromatografía en columna ultrarrápida, produciendo6,6 g (95%) de 5-[N-(1,1-dimetilbencil)tetrazol-5-il]pentanoato de metilo.
Ejemplo Intermedio 27 -Ácido 5-[N-(1,1-dimetilbencil)tetrazol-5-il]pentanoico
Se disuelve 5-[N-(1,1-dimetilbencil)tetrazol-5-il]pentanoato de metilo (6,6 g, 21,8 mmol) en metanol (100 ml)
25 y se añaden 23 ml de NaOH acuoso 1 N.. La mezcla se agita durante una noche y se concentra para retirar el metanol. El residuo se disuelve en agua (100 ml) y la solución se neutraliza mediante la adición del mismoequivalente de HCl acuoso 1 N. El producto se extrae con EtOAc (3 x 50 ml). La fase orgánica se seca y seconcentra, produciendo 4,75 g (75%) de ácido 5-[N-(1,1-dimetilbencil)tetrazol-5-il]pentanoico.
Ejemplo Intermedio 28 -compuesto xxxviii
30 Se disuelve ácido 5-[N-(1,1-dimetilbencil)tetrazol-5-il]pentanoico (4,75 g, 16,5 mmol) en DCM (100 ml) y se añaden 4,8 g (24,8 mmol) de EDCl y 6 ml de DIPEA. A la mezcla se le añade N-hidroxilsuccinimida (3,8 g, 33 mmol).La mezcla de reacción se agita durante tres horas aproximadamente a la temperatura ambiente. La mezcla se diluyecon DCM hasta alcanzar un volumen de 200 ml y la solución se lava tres veces con agua. La fase orgánica se seca y se concentra, produciendo 4,79 g (75%) del compuesto xxxviii,
Ejemplo Intermedio 29 -compuesto xxix
El dipéptido H-Val-Val-OH (3,22 g, 14,9 mmol) se suspende en 50 ml de N,N-dimetilformamida (DMF) y seañaden 4,75 g (12,42 mmol) del compuesto xxviii seguido de la adición de 3,4 ml (18,63 mmol) dediisopropiletilamina (DIPEA). La mezcla se calienta hasta 40ºC y se agita durante una noche. El disolvente seevapora a alto vacío. El residuo se disuelve en EtOAc y se lava con HCl 1 N y salmuera, produciendo 5,52 g (91%) del compuesto xxix,
Ejemplo Intermedio 30 -compuesto xxx
Se disuelven 1,6 g (3,29 mmol) del compuesto xxix en 20 ml de DCM y se añaden 3,3 ml de una solución 1
10 M de DCC en THF. A la mezcla se le añaden 500 mg (2,73 mmol) del compuesto v. La mezcla se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. La mezcla se diluye con EtOAc hasta alcanzar unvolumen de 100 ml y se lava con HCl 1 N, NaHCO3 y salmuera. Se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al50%/hexano), produciendo 1,02 g (58%) del compuesto xxx.
15 Ejemplo Intermedio 31 -compuesto xxxi
El compuesto xxx (1,02 g, 1,57 mmol) se disuelve en 10 ml de MeOH y se añaden 2 ml de NaOH acuoso 1N.. La mezcla se agita durante una noche. El metanol se retira por evaporación y el residuo se disuelve en agua y seneutraliza con 2 ml de HCl. Después de la extracción con EtOAc, se produce 1,00 g (~100%) del compuesto xxxi.
20 Ejemplo Intermedio 32 -compuesto xxxxii
El compuesto xxxi (300 mg, 0,48 mmol) y PyBop (300 mg, 0,58 mmol) se disuelven en 10 ml de DCM. A lasolución se le añade el compuesto x (201 mg, 0,58 mmol) y después se añade DIPEA (104 µl). La mezcla se agitaaproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. Después, la mezcla de reacción se diluye conEtOAc hasta alcanzar un volumen de 100 ml y se lava dos veces con HCl 1 N, dos veces con NaHCO3 y tres veces
25 con salmuera. La fase orgánica se seca y se concentra. El residuo se purifica por cromatografía en columna (EtOAc al 100%), produciendo 450 mg (98%) del compuesto xxxii.
Ejemplo Intermedio 33 -compuesto xxxiii
El compuesto xxxii 360 mg (0,38 mmol) se disuelve en 8 ml de DCM y se añaden 240 mg (0,57 mmol) dereactivo de DMP. La mezcla se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante tres horas. La mezcla sediluye con EtOAc hasta alcanzar un volumen de 50 ml y se lava tres veces con salmuera. El producto se purifica por cromatografía en columna (etanol al 25%/EtOAc), produciendo 300 mg (83%) del compuesto xxxiii,
Ejemplo Intermedio 34-compuesto xxxiv A una solución en DCM (10 ml) de xxxv (790 mg, 2,80 mmol) se le añaden PyBop (1,7 g, 3,36 mmol)
y Hobbit (450 mg, 3,36 mmol). La solución resultante se enfría a 0ºC y se trata con una solución en DCM (3 ml) de(s)--(4-piridil)etilamina (410 mg, 3,36 mmol). Esto se sigue de la adición de DIPEA (0,5 ml, 3,36 mmol). La reacciónse agita durante una noche aproximadamente a la temperatura ambiente. En este momento, la mezcla de reacciónse diluye con EtOAc. Todo se lava con NaHCO3 saturado y salmuera. La fase orgánica obtenida de esta manera se
15 seca y se concentra al vacío. El residuo resultante se purifica por cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 5%/EtOAc), proporcionando 630 mg (58%) del compuesto xxxiv,
Nota: la (s)--(4-piridil)etilamina se obtiene de su sal D-tartrato por lavado con una base (NaOH 1 N) y posteriorextracción con EtOAc. La tasa de recuperación es del 89%.
20 Ejemplo Intermedio 35 -compuesto xxxvi
A una solución en metanol (15 ml) del compuesto xxxiv (630 mg, 1,64 mmol) se le añade en atmósfera de N2 Pd/C (150 mg, contenido de paladio al 10%). La reacción se agita en atmósfera de H2 durante una noche. La mezcla de reacción se filtra a través de una capa de Celite® 521. Los filtrados se concentran al vacío, proporcionando 420 mg (~100%) del compuesto xxxvi.
Ejemplo Intermedio 36 -compuesto xxxvii
A una solución en DCM (3 ml) del compuesto xxxi (270 mg, 0,43 mmol) se le añade PyBop (270 mg, 0,52mmol). Esto se sigue de la adición del compuesto xxxvi (160 mg, 0,64 mmol) y DIPEA (0,09 ml, 0,52 mmol). Lareacción se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. En este momento, la reacción se
10 diluye con EtOAc y se lava con HCl 0,1 N, seguido de NaHCO3 saturado y salmuera. La fase orgánica resultante se seca y se concentra, dando el compuesto xxxvii (masa total de 430 mg) para la siguiente etapa
Ejemplo Intermedio 37 -compuesto xxxviii
A una solución en DCM (3 ml) del compuesto xxxvii (370 mg, 0,43 mmol) se le añade reactivo de DMP (280
15 mg, 0,65 mmol). La reacción se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante 2 horas y después se interrumpe con Na2SO3 al 10%. Después de agitar durante 30 minutos, la reacción se extrae con EtOAc. La faseorgánica se lava con NaHCO3 saturado y salmuera. La fase orgánica resultante se seca y se concentra al vacío,dando un residuo que se purifica por cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 5%/EtOAc), proporcionando 180 mg(49% en 2 etapas) del compuesto xxxviii.
El compuesto xxix (2,5 g, 5 mmol) se disuelve en 40 ml de DCM. A la solución se le añaden 5,1 ml de una solución 1 M de DCC en THF. A la mezcla se le añaden 1,08 g (3,53 mmol) del compuesto xxxix. La mezcla se agitaaproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche.
La mezcla se diluye con EtOAc hasta alcanzar un volumen de 100 ml, se lava secuencialmente con HCl 1N, NaHCO3 y salmuera y después se purifica por cromatografía en columna (EtOAc al 80%/hexano), produciendo2,59 g (95%) del compuesto xxxx,
Ejemplo Intermedio 39 -compuesto xxxxi
El compuesto xxxx (2,59 g, 3,35 mmol) se disuelve en 20 ml de MeOH y se añaden 4 ml de NaOH acuoso 1N.. La mezcla se agita durante una noche y después se evapora por rotación, dejando un residuo. El residuo sedisuelve en agua y se neutraliza con EtOAc, produciendo 2,49 g (~100%) del compuesto xxxxi,
Ejemplo Intermedio 40 -compuesto xxxxii
El compuesto xxxxi (847 mg, 1,16 mmol) y 724 mg (1,39 mmol) de PyBop se disuelven en 10 ml de DCM. A la solución se le añade el compuesto xiii (260 mg, 1,39 mmol) y después se sigue de la adición de DIPEA (209 µl).La mezcla se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. Después, la mezcla de reacción
15 se diluye con EtOAc hasta alcanzar un volumen de 100 ml y se lava dos veces con HCl 1 N, dos veces con NaHCO3 y tres veces con salmuera. La fase orgánica se seca y se concentra. El residuo se purifica por cromatografía encolumna (etanol al 5%/EtOAc), produciendo 930 mg (86%) del compuesto xxxxii,
Ejemplo Intermedio 41 -compuesto xxxxiii El compuesto xxxxii (350 mg, 0,38 mmol) se disuelve en 10 ml de DCM y se añaden 242 mg (0,57 mmol) de
reactivo de DMP. La mezcla se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante tres horas. La mezcla sediluye con EtOAc hasta alcanzar un volumen de 50 ml y se lava tres veces con salmuera. El producto se purifica porcromatografía en columna (EtOAc al 100%), produciendo 180 mg (51%) del compuesto xxxxiii.
Ejemplo Intermedio 42 -compuesto xxxxv Se suspende H-Val-Val-OH (5 g, 23 mmol) en 100 ml de DMF, se añade el compuesto xxxxiv
(8,3 g, 27,6 mmol) y después se añaden 6,2 ml (35,5 mmol) de DIPEA. La mezcla se agita a 40ºC durante dos días.El disolvente se retira a alto vacío y el residuo se disuelve en 100 ml de EtOAc y se lava tres veces con HCl 1 N y 10 dos veces con salmuera. Se producen 9,14 g (99%) del compuesto xxxxv.
Ejemplo Intermedio 43 -compuesto xxxxvi
Se disuelven el compuesto xxxxv (2,8 g, 7 mmol) y 954 mg (7 mmol) de HOAt en 100 ml de DCM. Seañaden 7 ml de DCC 1 M/DCM. A la mezcla de reacción se le añade el compuesto xxxix (2,15 g) y la mezcla de
15 reacción se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. La mezcla se concentra a sequedad y el residuo se disuelve en EtOAc y se purifica por cromatografía en columna (EtOAc al 100%), produciendo 4,57 g (95%) del compuesto xxxxvi,
Ejemplo Intermedio 44 -compuesto xxxxvii
El compuesto xxxxvi (4,57 g, 6,65 mmol) se disuelve en 10 ml de TFA y 10 ml de DCM. La mezcla se agitaaproximadamente a la temperatura ambiente durante 4 horas. El disolvente se retira al vacío y el residuo se disuelveen 50:50 de acetonitrilo/agua y se liofiliza, produciendo el compuesto xxxxvii en forma de un polvo
5 Ejemplo Intermedio 45 -compuesto xxxxviii
El compuesto xxxxvii (1 g, 1,59 mmol) y 990 mg (2,28 mmol) de PyBop se disuelven en 20 ml de DCM y seañaden 1,6 ml de metilamina 1 M en THF. La mezcla se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante4 horas. La mezcla de reacción se diluye con EtOAc hasta alcanzar un volumen de 100 ml y se lava con HCl 1 N,NaHCO3 y salmuera. El residuo se purifica por cromatografía en columna ultrarrápida (EtOH al 10%/EtOAc),
10 produciendo 1 g (98%) del compuesto xxxxviii,
Ejemplo Intermedio 46 -Compuesto xxxxix
El compuesto xxxxviii (1 g, 1,55 mmol) se disuelve en 10 ml de MeOH y se añaden 2 ml de NaOH 1 N. Lamezcla se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. El disolvente se retira por15 evaporación. El residuo se disuelve en agua, se neutraliza y se extrae con EtOAc, produciendo 960 mg (98%) del
compuesto xxxxix,
Ejemplo Intermedio 47 -compuesto li
El compuesto xxxxix (315 mg, 0,5 mmol) y 312 mg (0,6 mmol) de PyBop se disuelven en 10 ml de DCM. Se20 añaden compuesto 1 (56 mg, 0,6 mmol) y 108 µl de DIPEA. La mezcla
se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche y se diluye con EtOAc hasta alcanzar unvolumen de 100 ml y se lava con HCl 1 N, NaHCO3 y salmuera. Se purifica por cromatografía en columna (EtOH al15%/EtOAc), produciendo 400 mg (92%) del compuesto li,
Ejemplo Intermedio 48 -compuesto lii
El compuesto li (400 mg, 0,46 mmol) se disuelve en 10 ml de DCM y se añaden 292 mg (0,69 mmol) reactivo de DMP. La mezcla se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante 3 horas. El disolvente seretira por evaporación y el producto se purifica por RP-HPLC, produciendo 130 mg (32%) del compuesto lii,
Ejemplo Intermedio 49 -compuesto liii
El compuesto xxxxix (210 mg, 0,33 mmol) y 208 mg (0,4 mmol) de PyBop se disuelven en 10 ml de DCM. A la solución se le añade el compuesto xiii (154 mg, 0,83 mmol) seguido de la adición de DIPEA (72 µl, 0,4 mmol). Lamezcla se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. La mezcla de reacción se diluye
15 con EtOAc hasta alcanzar un volumen de 100 ml, se lava con HCl 1 N, NaHCO3 y salmuera y después se purifica por cromatografía en columna ultrarrápida (EtOH al 10%/EtOAc), produciendo 250 mg (95%) del compuesto liii,
Ejemplo Intermedio 50 -compuesto liv
El compuesto xxxxv (755 mg, 1,88 mmol) y 255 mg (1,88 mmol) de HOAt se disuelven en 20 ml de DCM y
20 se añaden 1,88 ml de DCC/DCM 1 M. A la mezcla de reacción, se le añade el compuesto v (288 mg) y la mezcla de reacción se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla se concentra a sequedad y el residuo se disuelve en EtOAc y se purifica por cromatografía en columna (EtOAc al 80%/Hexanos), produciendo800 mg (90%) del compuesto liv,
Ejemplo Intermedio 51 -compuesto Iv
El compuesto liv (800 mg, 1,41 mmol) se disuelve en 10 ml de MeOH y se añaden 2 ml de NaOH. Lamezcla se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. El disolvente se retira al vacío y elresiduo se disuelve en agua y se neutraliza con 2 ml HCl 1 N. El producto se extrae con EtOAc. La evaporación del disolvente de extracción produce 760 mg (~100%) de lv,
Ejemplo Intermedio 52 -compuesto lvii
El compuesto lv (760 mg, 1,41 mmol) y 880 mg (1,69 mmol) de PyBop se disuelven en 5 ml de DCM. A la 10 solución se le añade el compuesto lvi (530 mg, 2,12 mmol) y después se añaden
0,3 l de DIPEA. La mezcla se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. La mezcla dereacción se diluye con EtOAc hasta alcanzar un volumen de 100 ml, se lava con HCl 1 N, NaHCO3 y salmuera y después se purifica por cromatografía en columna ultrarrápida (EtOAc al 100%), produciendo 870 mg (80%) del
15 compuesto lvii,
Ejemplo Intermedio 53 -compuesto lviii El compuesto lvii (350 mg, 0,45 mmol) se disuelve en 5 ml de TFA y 5 ml de DCM y la mezcla se agita
aproximadamente a la temperatura ambiente durante 3 horas. El disolvente se retira por evaporación y el productose purifica por RP-HPLC, produciendo 220 mg (69%) del compuesto lviii,
Ejemplo Intermedio 54 -compuesto lix
El compuesto viii (200 mg, 0,28 mmol) y 218 mg (0,42 mmol) de PyBop se disuelven en 5 ml de DCM. Se añade metilamina (0,28 ml de 2 M en THF). La mezcla se agita aproximadamente a la temperatura ambiente duranteuna noche. La mezcla se diluye con EtOAc hasta alcanzar un volumen de 100 ml, se lava con HCl 1 N, NaHCO3 ysalmuera y después se purifica por cromatografía en columna (EtOH/EtOAc al 15%/EtOAc), produciendo 168 mg(79%) de lix,
Ejemplo Intermedio 55 -compuesto lx
El compuesto lviii (200 mg, 0,26 mmol) se disuelve en 4 ml de DCM y se añaden 165 mg (0,39 mmol) dereactivo de DMP. La mezcla se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante 3 horas. El disolvente seretira por evaporación. El residuo se disuelve en acetonitrilo al 50%/agua, se filtra y se purifica por RP-HPLC,
15 produciendo 140 mg (70%) del compuesto lx,
Ejemplo Intermedio 56 -compuesto ii
Una solución en DCM (30 ml) y EtOH (30 ml) del compuesto i (4 g, 12,1 mmol), en atmósfera de N2 se enfría a -10ºC. Se añade NaBH4 (458 mg, 12,1 mmol) y la solución se agita a -10ºC durante 50 minutos. El análisis
20 por TLC (EtOAc al 50%/Hexano) muestra la conversión total en una mancha de realización más lenta. La reacción se interrumpe cuidadosamente con hielo y después con una solución fría saturada de NH4Cl (10 ml). La mezcla sevierte en DCM (300 ml). La fase orgánica se lava una vez con una solución saturada de NH4Cl (60 ml) y dos veces con salmuera (60 ml). Después, la fase orgánica se separa, se seca sobre MgSO4 y se concentra al vacío, produciendo 3,5 g del compuesto ii (87%)
25 Ejemplo Intermedio 57 -compuesto lxi
En un matraz de fondo redondo de 250 ml equipado con un globo de H2, una solución etanólica (50 ml) delcompuesto ii (3,5 g, 10,5 mmol) se somete a condiciones de hidrogenación convencionales [Pd(OH)2 al 20%/C (147g, 2,1 mmol)] durante 5 horas aproximadamente a la temperatura ambiente. El catalizador se retira por filtración a través de Celite y se lava con DCM. Después, el disolvente se retira a presión reducida, produciendo 2 g (96%) delcompuesto lxi,
Ejemplo Intermedio 58 -compuesto lxii En una atmósfera inerte, una solución del compuesto lxi (200 mg, 1 mmol), el compuesto lxiii,
(233 mg, 1,1 mmol) y HOAt (1-hidroxi-7-azabenzotriazol) (156 mg, 1,15 mmol) en DMF anhidra (6 ml) se agitadurante 20 minutos. Después, la temperatura se disminuye hasta 0ºC, seguido de la adición de DIC (0,18 ml, 1,15mmol). La reacción se agita durante una noche aproximadamente a la temperatura ambiente. La solución se diluye
10 con EtOAc y después se lava dos veces con HCl 1 N, dos veces con NaHCO3 acuoso saturado y con salmuera. La fase orgánica se separa, se seca sobre MgSO4 y el disolvente se retira a presión reducida. El residuo se limpia porcromatografía (gel de sílice: EtOAc al 70%/DCM), dando el compuesto lxii con un rendimiento del 45%.
Ejemplo Intermedio 59 -compuesto lxiv
15 Una solución del compuesto lxii (777 mg, 2 mmol) en dioxano (6 ml) y NaOH 0,5 M (6 ml) se agita durante 5 horas aproximadamente a la temperatura ambiente. El examen por TLC (EtOAc al 100%) muestra la conversióncompleta en una mancha al principio. La reacción se enfría con un baño de hielo seguido de la adición de HCl 1 N (4ml). Después, se añade NaCl sólido y toda la mezcla se extrae dos veces con EtOAc (2 x 150 ml). Después, losextractos orgánicos se combinan, se secan sobre MgSO4 y el disolvente se retira a presión reducida, dando el
20 compuesto lxiv con un rendimiento del 92%.
Ejemplo Intermedio 60 -compuesto lxv
En una atmósfera inerte, una solución del compuesto x (203 mg, 0,58 mmol), el compuesto lxiv (276 mg,0,775 mmol) y HOAt (1-hidroxi-7-azabenzotriazol) (126 mg, 0,93 mmol) en DMF anhidra (6 ml) se agita durante 2025 minutos. Después, la temperatura se disminuye hasta 0ºC, seguido de la adición de DIC (0,14 ml, 0,93 mmol). La reacción se agita durante una noche aproximadamente a la temperatura ambiente. La solución se diluye con EtOAcy después se lava dos veces con HCl 1 N, dos veces con NaHCO3 acuoso saturado y salmuera. La fase orgánica se separa, se seca sobre MgSO4 y el disolvente se retira a presión reducida. El residuo se purifica por cromatografía(gel de sílice: de EtOAc al 50%/DCM a 80:19:1 de EtOAc/DCM/MeOH), dando el compuesto lxv con un rendimiento
30 del 62%.
Ejemplo Intermedio 61 -compuesto lxvi
En una atmósfera inerte, a una solución del compuesto lxv (287 mg, 0,42 mmol) en DCM anhidro (15 ml) se
le añade el reactivo DMP (605 mg, 1,43 mmol). La reacción se agita durante 2 horas aproximadamente a la
5 temperatura ambiente. (Nota -La duplicación de la cantidad de reactivo de DMP y el tiempo de reacción se realiza
para garantizar que los dos grupos alcohol se oxidan completamente para dar los grupos ceto correspondientes). El
examen por TLC (gel de sílice: MeOH al 2%/EtOAc) muestra la completa conversión en el producto más rápido. La
reacción se diluye con DCM (150 ml) y después se lava dos veces con una solución acuosa al 10% de sulfito sódico
(2 x 50 ml), dos veces con NaHCO3 acuoso saturado y con salmuera. La fase orgánica se separa, se seca sobre 10 MgSO4 y el disolvente se retira a presión reducida. El residuo se purifica por cromatografía (gel de sílice: de EtOAc
al 50%/DCM a 80:19:1 de EtOAc/DCM/MeOH), dando el compuesto lxvi con un rendimiento del 77%.
Ejemplo Intermedio 62 -compuesto lxvii
A una solución en DCM (60 ml) de ácido L-3 fenil láctico (2 g, 12 mmol) se le añade PyBOP (7,5 g, 14,4
15 mmol). A esta solución se le añade una solución en DCM (20 ml) que contiene éster metílico de L-valina HCl (2,4 g, 14,4 mmol) y DIPEA (2,6 ml, 14,4 mmol). La mezcla de reacción resultante se agita durante una nocheaproximadamente a la temperatura ambiente. En este momento, la reacción se diluye con EtOAc (30 ml) y se lavacon NaHCO3 (30 ml) y salmuera (15 ml). La fase orgánica se seca sobre Na2SO4, se filtra y se concentra. Lapurificación se realiza en EtOAc al 50%/Hex sobre gel de sílice, dando 2,97 g (89%) del compuesto lxvii,
Ejemplo Intermedio 63 -compuesto lxviii
El compuesto lxvii (2,97 g, 10,6 mmol) se recoge en DCM (50 ml) y se enfría con un baño de hielo. A esta solución se le añade TBSCl (2,1 g, 13,8 mmol) seguido de imidazol (0,94 g, 13,8 mmol). La solución resultante seagita durante una noche. Después, la reacción se diluye con EtOAc (50 ml) y se lava con NaHCO3 y salmuera. La
25 fase orgánica se seca sobre Na2SO4, se filtra y se concentra. La purificación se realiza en EtOAc al 20%/Hexano sobre gel de sílice, dando 3,79 g (90%) del compuesto lxviii,
Ejemplo Intermedio 64 -compuesto lxix
A una solución en metanol (50 ml) del compuesto lxviii (3,78 g, 9,6 mmol) se le añade NaOH acuoso 1 N(14,4 ml, 14,4 mmol). La solución resultante se agita durante una noche. El disolvente se retira parcialmente al vacío.Después, el pH de la mezcla de reacción se disminuye hasta 3 usando una solución acuosa 1 N de HCl. La solución se diluye con EtOAc y salmuera. El producto deseado se extrae con EtOAc (3 x 50 ml). Las fases orgánicas secombinan, se secan sobre Na2SO4, se filtran y se concentran, dando 3,5 g (96%) del compuesto lxix,
Ejemplo Intermedio 65 -compuesto lxx
10 A una solución en DCM (15 ml) que contiene el compuesto lxix (1,1 g, 2,9 mmol) se le añade HOAt 20 (0,44 g, 3,2 mmol) seguido de una solución 1 M de DCC (3,2 ml, 3,2 mmol) en DCM. Después de agitar aproximadamentea la temperatura ambiente durante 20 minutos, se añade una solución en DCM (15 ml) del compuesto xxxix (970 mg,3,2 mmol). Esta reacción se agita durante una noche en atmósfera de N2. Después, la reacción se diluye con EtOAc(30 ml), se filtra a través de una capa de gel de sílice y se lava con HCl 0,1 N, NaHCO3 y salmuera. La fase orgánica
15 se seca sobre Na2SO4, se filtra y se concentra al vacío. La purificación se realiza en EtOAc al 50%/Hex sobre gel de sílice, dando 1,5 g (77%) del compuesto lxx,
Ejemplo Intermedio 66 -compuesto lxxi
A una solución en metanol (30 ml) del compuesto xx (1,5 g, 2,4 mmol) se le añade NaOH acuoso 1 N (3,6
20 ml, 3,6 mmol). La solución resultante se agita durante una noche. En este momento, el disolvente se retira parcialmente y el pH de la mezcla de reacción se ajusta a 3 usando HCl acuoso 1 N. Después, la reacción se diluyecon EtOAc (50 ml) y salmuera (20 ml). La fase acuosa se extrae con EtOAc (3 x 50 ml). Las fases orgánicas secombinan, se secan sobre Na2SO4, se filtran y se concentran, proporcionando 1,3 g (92%) del compuesto lxxi,
Ejemplo Intermedio 67 -compuesto lxxii
A una solución de DCM (2 ml) que contiene el compuesto lxxi (180 mg, 0,28 mmol) se le añaden PyBOP(175 mg, 0,34 mmol) y DIPEA (0,06 ml, 0,34 mmol), seguido de una solución en DCM (3 ml) del compuesto x (150 mg, 0,41 mmol). La solución resultante se agita durante una noche en atmósfera de N2. Después, la reacción se diluye con EtOAc (30 ml) y se lava con NaHCO3 y salmuera. La fase orgánica se seca sobre Na2SO4, se filtra y se concentra. La purificación se realiza en EtOAc al 100% sobre gel de sílice, dando 270 mg (98%) del compuesto lxxii,
Ejemplo Intermedio 68 -compuesto lxxiii
A una solución en DCM (3 ml) del compuesto lxxii (270 mg, 0,27 mmol) se le añade reactivo de DMP (140
10 mg, 0,33 mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante 1,5 horas, la reacción se interrumpe con Na2SO3 al 10% (10 ml). La reacción se diluye con EtOAc (30 ml) y se agita durante 10 minutos. Lafase orgánica se lava con NaHCO3 y salmuera. La fase orgánica se seca sobre Na2SO4, se filtra y se concentra. La purificación se realiza en EtOAc al 60%/Hex., dando 150 mg (56%) del compuesto lxxiii,
15 Ejemplo Intermedio 69 -compuesto lxi
A una solución en etanol (50 ml) del compuesto ii (3,5 g, 10,5 mmol) se le añade, en una atmósfera denitrógeno, Pd(OH)2/C (1,47 g, contenido del Pd al 20%, 2,1 mmol). La reacción se somete a hidrogenación a unapresión de 1 atm. Después de que se complete, los catalizadores se filtran a través de una capa de Celite y se lavancon diclorometano. Los filtrados se concentran al vacío, dando 2 g (96%) del compuesto lxi.
20 Ejemplo Intermedio 70 -compuesto lxxiv
A una solución en DMF (60 ml) del compuesto vii (9,1 g, 28,2 mmol) se le añaden HOAt (4 g, 29,4 mmol) y 1,3-diisopropilcarbodiimida (3,7 g, 29,4 mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambientedurante 30 minutos, a la solución anterior se le añade una solución en DMF (10 ml) del compuesto lxi (5,1 g, 25,6mmol). La reacción se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. En este momento, los
25 sólidos de color blanco se retiran por filtración. Los filtrados se concentran al vacío, dando un residuo que se purifica por cromatografía sobre gel de sílice, dando 9,5 g (67%) del compuesto lxxiv,
Ejemplo Intermedio 71 -compuesto lxxv
A una solución del compuesto lxxiv (1,5 g, 3 mmol) en THF anhidro (25 ml) se le añade EtiPr2N (0,78 ml, 4,5 mmol) aproximadamente a la temperatura ambiente. La mezcla se enfría a 0ºC y se añade gota a gota MOMCl(1,5 ml, 19,7 mmol). La reacción se deja calentar a temperatura ambiente y se agita durante una noche. Después, lasolución se diluye con éter y se lava con agua (3 times). Las fases acuosas se extraen adicionalmente con éter y todas las fases orgánicas se secan sobre MgSO4 antes de concentrarse, produciendo un aceite de color amarillo. Elisómero deseado del compuesto lxxv se aísla por cromatografía sobre gel de sílice (5/2 de EtOAc/Hexanos
con un rendimiento del 40% con separación limpia de los diastereómeros.
10 Ejemplo Intermedio 72 -compuesto lxxvi
A una solución del compuesto lxxv (502 mg, 0,9 mmol) en EtOH (5 ml) se le añade gota a gota NaOHacuoso 2 N (0,9 ml, 1,8 mmol) a 0ºC. La reacción se deja calentar a temperatura ambiente y se agita durante una noche. Después de que se complete la saponificación, la solución se acidifica a pH 3 con resina ácida Dowex 50W8X-200. Los sólidos se retiran por filtración y el filtrado resultante se concentra al vacío, dando un residuo
15 oleoso que se liofiliza, dando 370 mg (80%) del compuesto lxxvi,
Ejemplo Intermedio 73 -compuesto lxxvii
Una solución en diclorometano (4 ml) del compuesto lxxvi (110 mg, 0,21 mmol) se trata con PyBOP (200mg, 0,38 mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante 30 minutos, la mezcla de
20 reacción se carga con una solución en THF (3,2 ml) del compuesto xiii (60 mg, 0,32 mmol), seguido de EtiPr2N. Después de agitar durante una noche aproximadamente a la temperatura ambiente, la reacción se interrumpe conagua y se extrae con EtOAc. La fase orgánica resultante se lava con salmuera y se seca sobre MgSO4, antes de concentrarse para dar un aceite de color amarillo. La purificación por cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al5%/EtOAc) produce 143 mg (100%) del compuesto lxxvii,
Ejemplo Intermedio 74 -compuesto Ixxviii
A una solución en THF (50 ml) de H-Chg-OH 2 (5 g, 19,4 mmol) se le añaden HOBt (2,63 g, 19,4 mmol) y EDCl (3,72 g, 19,4 mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante 20 minutos, a lasolución anterior se le añade una solución en THF (19 ml) y DMF (10 ml) que contiene clorhidrato de éster metílico
30 de terc-L-Leucina (19,4 mmol) y DIPEA (6,75 ml, 38,8 mmol). La reacción se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. El tratamiento acuoso convencional y la cromatografía sobre gel de sílice(EtOAc al 15 -20%/Hexanos) producen 2,27 g (30%) del compuesto lxxviii,
Ejemplo Intermedio 75 -compuesto lxxix
A una solución en THF (12 ml) del compuesto lxxviii (2,27 g, 5,91 mmol) se le añade una solución 4 N deHCl en dioxano (7,38 ml, 29,5 mmol). La reacción se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante unanoche. En este momento, el disolvente se retira a presión reducida, produciendo el compuesto Ixxix que se usa directamente para la siguiente reacción.
Ejemplo Intermedio 76 -compuesto lxxx
Una solución en THF del compuesto lxxix (5,9 mmol) se añade a una solución en THF (20 ml) que contiene
10 ácido 2-pirazinacarboxílico (878 mg, 7,08 mmol), HOBt (957 mg, 7,08 mmol) y EDCl (1,36 g, 7,08 mmol). Después, a la mezcla resultante se le añade DIPEA (2,05 ml, 11,8 mmol). La reacción se agita durante una nocheaproximadamente a la temperatura ambiente y después se interrumpe con agua. La mezcla de reacción se extraecon EtOAc. La fase orgánica se lava con salmuera y se concentra al vacío, proporcionando un residuo que sepurifica por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 40-50%/Hexanos), proporcionando 1 g (36%) del compuesto
15 lxxx,
Ejemplo Intermedio 77 -compuesto lxxxi
A una solución en metanol (20 ml) del compuesto Ixxx (1 g, 256 mmol) se le añade NaOH 2 N 3,2 ml, 6,4mmol). La reacción se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. En este momento, la
20 reacción se acidifica a pH 3 usando HCl 5 N.. La reacción se diluye con EtOAc (75 ml) y se lava con agua y salmuera. La fase orgánica obtenida de esta manera se seca y se concentra al vacío, dando un residuo que sedisuelve en 1:1 de CH3CN/H2O para la liofilización. Se obtiene un total de ~1 g (100%) del compuesto lxxxi.
Ejemplo Intermedio 78 -compuesto Ixxxii
Una solución en diclorometano (10 ml) del compuesto lxxxi (2,56 mmol) se trata con HOAt (348 mg, 2,56mmol) y DCC (2,56 ml, 1 M, 2,56 mmol). Después de agitar durante 30 minutos, la mezcla de reacción se trata conuna solución en THF (5 ml) del compuesto v (2,56 mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperaturaambiente durante una noche, los sólidos de color blanco (urea) se retiran por filtración. Los filtrados se concentran alvacío, dando un residuo que se purifica por cromatografía sobre gel de sílice, proporcionando 1,4 g (100%) del compuesto Ixxxii.
Ejemplo Intermedio 79 -compuesto lxxxiii
Una solución en etanol (15 ml) del compuesto lxxxii (1,4 g, 2,58 mmol) se trata con NaOH 2 N (2,58 ml, 5,17
10 mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche, la mezcla de reacción se acidifica a pH 3 con resina ácida. Los sólidos se retiran por filtración. Los filtrados resultantes se concentran al vacío,dando un residuo que se liofiliza, dando 1,32 g (~100%) del compuesto Ixxxiii,
Ejemplo Intermedio 80 -compuesto lxxxiv
15 Una solución en diclorometano (15 ml) del compuesto Ixxxiii (360 mg, 0,7 mmol) se trata con PyBOP (582 mg, 1,12 mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante 20 minutos, la mezcla dereacción se trata con una solución en THF (10 ml) del compuesto xiii (195,6 mg, 1,05 mmol), seguido de DIPEA(0,25 ml, 1,40 mmol). Después de agitar durante una noche aproximadamente a la temperatura ambiente, lareacción se interrumpe con agua y se extrae con EtOAc. La fase orgánica resultante se lava con salmuera, se seca y
20 se concentra al vacío, dando un residuo que se purifica por cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 3%/EtOAc), produciendo 420 mg (88%) del compuesto Ixxxiv,
Ejemplo Intermedio 81 -compuesto ii"'
Una mezcla de diclorometano anhidro y éter (20 ml:20 ml) se enfría a -78ºC en atmósfera de N2 (g). A la
25 solución se le añade TiCl4 (1 M en diclorometano, 10 ml, 10 mmol) y después se añade MeLi (1,4 M en éter, 7,1 ml, 10 mmol) con agitación durante 30 minutos más a -78ºC. A la mezcla se le añade gota a gota una solución delcompuesto i (2 g, 6 mmol) en 10 ml de diclorometano a la misma temperatura durante 15 minutos. La solución secalienta lentamente a -40ºC durante 10 minutos y después se agita a 0ºC durante 2 horas. La reacción se interrumpevertiendo la mezcla en una mezcla de agua/éter (1:1) y después las fases se dejan separar. La fase acuosa se
30 extrae adicionalmente dos veces con éter. Todas las fases orgánicas se lavan con agua y salmuera y se secan sobre MgSO4 antes de concentrarse para dar un aceite de color amarillo. El compuesto ii"' deseado se aísla porcromatografía sobre gel de sílice (2/1 de EtOAc/Hexanos) con un rendimiento del 83%
Ejemplo Intermedio 82 -compuesto lxi'
Al compuesto ii"' (1,7 g, 5 mmol) se le añade Pd al 10% en peso sobre C (0,53 g, 0,5 mmol), seguido de laadición de MeOH (17 ml). Se pasa gas hidrógeno a través de la mezcla de reacción y el gas hidrógeno se mantienepara la reacción a 1 atm durante una noche. Después, la mezcla de reacción se filtra y se concentra, dando 929 mg (87%) del compuesto lxi' en forma de un aceite incoloro.
Ejemplo Intermedio 83 -compuesto lxxxv
A una solución en THF (16 ml) del compuesto xxii (1 g, 3 mmol) se le añade aproximadamente a la
10 temperatura ambiente HOAt (0,41 g, 3 mmol) seguido de una solución 1 M en DCC de diclorometano (3 ml, 3 mmol). Después de agitar durante 30 minutos aproximadamente a la temperatura ambiente, al ácido activado con HOAtanterior se le añade una solución en diclorometano (6 ml) del compuesto lxi'. La reacción se agita aproximadamentea la temperatura ambiente durante una noche. En este momento, la reacción se filtra a través de Celite. El filtrado sediluye con EtOAc (120 ml) y se lava con agua y después con salmuera. La fase orgánica se seca y se concentra,
15 dando un aceite de color amarillo que se purifica por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 100%), produciendo 1 g (65%) del compuesto lxxxv.
Ejemplo Intermedio 84 -compuesto Ixxxvi
A una solución en etanol (8 ml) del compuesto lxxxv (920 mg, 1,7 mmol) se le añade una solución acuosa 2
20 N de NaOH (1,7 m, 3,4 mmol). La reacción se agita durante una noche aproximadamente a la temperatura ambiente y después se acidifica a pH 3 con resina ácida Dowex. Los sólidos se retiran por filtración y el filtrado se concentra, dando un aceite incoloro, que se disuelve de nuevo en 1:1 de CH3CN/H2O y se liofiliza, proporcionando 800 mg(93%) del compuesto Ixxxvi. El análisis por HPLC muestra un solo pico de producto.
25 Ejemplo Intermedio 85 -compuesto Ixxxvii
A una solución en diclorometano (4 ml) del compuesto Ixxxvi (150 mg, 0,3 mmol) se le añade PyBOP (250 mg, 0,47 mmol). La solución se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante 30 minutos. Después, aesta solución se le añade una solución en THF (4,5 ml) del compuesto xiii (84 mg, 0,45 mmol) seguido de EtiPr2N (0,1 ml, 0,6 mmol). La reacción se agita aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche y después
30 se interrumpe con agua (25 ml) durante 30 minutos. Después, la mezcla se extrae con EtOAc. La fase orgánica resultante se lava con salmuera y se seca sobre MgSO4, antes de concentrarse para dar un aceite de color amarillo.La purificación por cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 5%/EtOAc) produce 200 mg (100%) del compuestolxxxvii,
Ejemplo Intermedio 86 -compuesto lxxxix El compuesto lxxxviii, N-Cbz-L-Valina, (2,5 g, 9,9 mmol) se recoge en THF (30 ml).
5 Se añaden EDCl (2,29 g, 11,9 mmol) y HOBT (1,62 g, 11,9 mmol) y la mezcla se agita durante cinco minutos. Se añade clorhidrato de éster metílico de L-terc-Leucina (2,17 g, 11,9 mmol) en THF (23,9 ml) seguido de DIPEA (2,1ml). La mezcla de reacción se agita durante una noche en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se diluyecon acetato de etilo y se lava con HCl 1 N, bicarbonato sódico saturado y salmuera. La fase orgánica se seca sobresulfato sódico, se filtra y se concentra. El residuo concentrado se purifica en acetato de etilo al 25%/hexano,
10 produciendo 1,1 g (29%) del compuesto lxxxix,
Ejemplo Intermedio 87 -compuesto lxxxx
El compuesto Ixxxix se hidroliza en condiciones convencionales usando alcohol metílico (0,3 M) y NaOH 1N (1,5 equiv.), produciendo 1,03 g (95%) del compuesto lxxxx,
Ejemplo Intermedio 88 -compuesto lxxxxi
El compuesto lxxxx (385 mg, 1,06 mmol) se recoge en diclorometano (3 ml). Se añade DCC (1,4 mmol)seguido de HOAt (190 mg, 1,4 mmol). Después, se añade el compuesto v (260 mg, 1,4 mmol) en diclorometano (3ml). La mezcla resultante se agita durante una noche en atmósfera de nitrógeno. La reacción se diluye con acetato
20 de etilo, se filtra a través de gel de sílice y se concentra. El residuo se purifica en acetato de etilo al 50%/hexano, produciendo 440 mg (80%) del compuesto lxxxxi,
Ejemplo Intermedio 89 -compuesto lxxxxii
El compuesto lxxxxi se hidroliza en condiciones convencionales usando alcohol etílico (0,3 M) y NaOH 1 N 25 (1,5 equiv.), produciendo 390 mg del compuesto lxxxxii,
Ejemplo Intermedio 90 -compuesto lxxxxiii
El compuesto lxxxxii (350 mg, 0,7 mmol) se recoge en diclorometano (3 ml). Se añade PyBOP 15 (480 mg,0,91 mmol) seguido del compuesto xiii (170 mg, 0,91 mmol). Se añade DIPEA (0,16 ml, 0,91 mmol) y mezcla dereacción se agita durante una noche. La mezcla de reacción se concentra y se purifica en acetato de etilo al 100%, produciendo 420 mg (90%) del compuesto lxxxxiii,
Ejemplo Intermedio 91 -compuesto lxxxxiv
El compuesto lxxxxiii se hidrogena usando Pd al 10%/C (1% en mol) en alcohol metílico en atmósfera de10 hidrógeno, produciendo 335 mg (100%) del compuesto lxxxxiv,
Ejemplo Intermedio 92 -compuesto lxxxxv
Se recoge 1H-tetrazol-5-acetato de etilo (5 g, 32 mmol) en cloroformo (80 ml). Se añade ácido tricloroacético (12,03 g, 73,65 mmol) seguido de alfa metil estireno (3,78 g, 32 mmol). La mezcla de reacción se agita
15 durante una noche. Al día siguiente, la solución se diluye con acetato de etilo y se lava con KOH al 10% y salmuera. La fase orgánica se seca sobre sulfato de magnesio, se filtra y se concentra, produciendo 8 g (96%) del tetrazol-5acetato de etilo N-protegido correspondiente. Este material se somete a condiciones de hidrólisis convencionalesusando alcohol etílico (0,3 M) y NaOH 1 N (3 equiv.), produciendo 7 g (99%) del compuesto lxxxxv,
20 Ejemplo Intermedio 93 -compuesto lxxxxvi
El compuesto lxxxxv (3,62 g, 14,7 mmol) se recoge en diclorometano (50 ml). Se añaden EDCl (4,32 g, 22,1mmol) y DIPEA (5,1 ml, 29,4 mmol) y se agita durante cinco minutos. Se añade N-hidroxi succinimida (3,38 g, 29,4mmol) y se agita durante tres horas. La reacción se diluye con diclorometano y se lava tres veces con agua. La faseorgánica se seca sobre sulfato sódico, se filtra y se concentra, produciendo 3,66 g (73%) del compuesto lxxxxvi,
Ejemplo Intermedio 94 -compuesto Ixxxvii
El compuesto lxxxxiv (335 mg, 0,62 mmol) y el compuesto lxxxxvi (343 mg, 1 mmol) se recogen endiclorometano (6 ml). Se añade DIPEA (0,17 ml, 1 mmol) y mezcla de reacción se agita durante una noche. Lareacción se diluye con acetato de etilo, se lava con bicarbonato sódico saturado y salmuera y se concentra. El residuo se purifica en alcohol etílico al 5%/acetato de etilo, dando 80 mg (16%) del compuesto lxxxxvii,
Ejemplo Intermedio 95 -compuesto lxxxxviii
El compuesto lxxxxvii (80 mg, 0,11 mmol) se recoge en diclorometano (3 ml). Se añade reactivo de DMP
10 (55 mg, 0,13 mmol) y se agita durante una hora. La mezcla de reacción se diluye con acetato de etilo y se interrumpe con una solución al 10% de sulfito sódico. La fase orgánica se lava con bicarbonato sódico saturado y salmuera. La fase orgánica se concentra y el residuo resultante se purifica en acetato de etilo al 100%, produciendo 40 mg (48%) del compuesto lxxxxviii,
15 Ejemplo Intermedio 96 -compuesto xxxix Se prepara el compuesto ic, éster metílico de N-Cbz-4-Hidroxi Pro, (2,1 g, 7,9 mmol)
con rendimiento cuantitativo a partir del compuesto c, N-Cbz-4-hidroxi Pro), se disuelve en DCM
(25 ml), a la solución se le añaden CDI (1,54 g, 9,5 mmol) y DIPEA (1,7 ml, 9,5 mmol) y se agita durante 10 minutos.A la mezcla de reacción se le añade gota a gota 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina (TIQ) (1,2 ml, 9,5 mmol) y se agitadurante cinco horas. La fase orgánica se lava con agua, HCl 1 N y salmuera. Después de la concentración de lasfases orgánicas, el residuo resultante se purifica cromatográficamente con EtOAc al 40%/Hexanos, produciendo el compuesto ci, éster metílico de N-Cbz-4-TIQcarboniloxi-Pro, (2,5 g, 75%).
El compuesto ci (2,5 g, 5,9 mmol) se disuelve en MeOH (75 ml). La solución se lava abundantemente con N2 y se añade Pd/C (al 10%, 300 mg). La mezcla de reacción se lava abundantemente con H2 y se agita durante una 10 noche. La mezcla de reacción se filtra a través de Celite y se concentra, produciendo el compuesto xxxix, 4-(TIQ
carboniloxi)-Pro, éster metílico, (1,49 g, 83%).
Ejemplo Intermedio 97 -compuesto vii
El compuesto cii, éster metílico de N-pirazin-2-ilcarbonil-Val-Val, (10,9 g, 32,4 mmol)
15 se disuelve en THF (80 ml) y después se añade NaOH acuoso (48,6 ml, 48,6 mmol). La mezcla resultante se agita 48 horas y después se añade más cantidad de NaOH (16,3 ml, 16,3 mmol) y la mezcla se calienta a 40ºC durantetres horas. Después, el pH de la mezcla de reacción se disminuye hasta 3 y la fase acuosa se extrae con EtOAc y después se concentra, produciendo el compuesto vii en bruto, ácido N-pirazin-2-ilcarbonil-Val-Val (10,6 g, 100%)
Ejemplo Intermedio 98 -compuesto ciii
20 el compuesto cii (4,1 g, 12,7 mmol) se disuelve en DCM (20 ml). A esta solución se le añaden HOAt (1,73 g, 12,7 mmol) y DCC (12,7 mmol) y la solución se agita durante una hora. A la mezcla de reacción se le añade elcompuesto xxxix (3,22 g, 10,6 mmol) en DCM (10 ml). La mezcla resultante se agita durante una noche en atmósferade N2. La mezcla de reacción se filtra a través de gel de sílice y se concentra. El residuo resultante se purifica porcromatografía sobre gel de sílice (gradiente de EtOAc del 50% al 80%/Hexanos), produciendo el compuesto ciii,
25 éster metílico de N-pirazin-2-ilcarbonil-Val-Val-4-(TIQ carboniloxi)-Pro, (5,27 g, 81,7%).
Ejemplo Intermedio 99 -Compuesto civ
El compuesto ciii (650 mg, 1,29 mmol) se disuelve en THF (5 ml). A la solución se le añade NaOH acuoso(1,42 ml, 1,42 mmol) y después se agita durante una noche. El pH de la solución se disminuye hasta 3 y la faseorgánica se aísla y se concentra, produciendo un residuo. El residuo se purifica usando HPLC de fase inversa enacetonitrilo/agua, produciendo el compuesto civ, ácido N-pirazin-2-ilcarbonil-Val-Val-4-(TIQ carboniloxi)-Pro, (600 mg, 95%).
Ejemplo Intermedio 100 -compuesto cv
Se combinan N-Boc-L-terc-Leucina (2,3 g, 10 mmol) y clorhidrato de éster metílico de L-terc-Leucina (2 g,
10 11 mmol) en DMF (30 ml). Después, a la solución se le añade HOAt (1,6 g, 11,5 mmol). La mezcla resultante se agita durante 20 minutos en atmósfera de N2 y después se disminuye su temperatura hasta 0ºC, después de lo cualse añaden DIC (1,8 ml, 11,5 mmol) y 2,4,6-colidina (1,45 ml, 11 mmol). La solución resultante se agita durante unanoche con calentamiento a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluye con EtOAc y la fase orgánica selava con HCl 1 N, NaHCO3 saturado y salmuera. Después de la concentración de la fase orgánica, el residuo
15 resultante se purifica cromatográficamente con un gradiente de EtOAc al 20% -30%/hexanos, produciendo el compuesto cv (3,3 g, 92%).
Ejemplo Intermedio 101 -compuesto cvi
El compuesto cv (3,3 g, 9,2 mmol) se hidroliza usando dioxano (40 ml) y NaOH 0,5 N (37 ml, 18,4 mmol),20 produciendo el compuesto cvi (2,9 g, 92%).
Ejemplo Intermedio 102 -compuesto cvii
El compuesto cvi (2 g, 5,8 mmol) y el compuesto v (1 g, 5,5 mmol) se disuelven en DMF (20 ml). Después,a la solución se le añaden HOAt (832 mg, 6,6 mmol) y DIC (1,1 ml, 6,6 mmol). La solución resultante se agita
25 durante una noche en atmósfera de N2. La mezcla de reacción se diluye con EtOAc y la fase orgánica se lava con HCl 1 N, NaHCO3 saturado y salmuera. Después de la concentración de la fase orgánica, el residuo resultante sepurifica cromatográficamente con un gradiente de EtOAc al 20%-30%/hexanos, produciendo el compuesto cvii (2,4g, 81%).
Ejemplo Intermedio 103 -compuesto cviii
El compuesto cvii (2,4 g, 4,72 mmol) se disuelve en DCM (10 ml). A la solución se le añade TFA (10 ml). Lasolución resultante se agita durante 4 horas. La mezcla de reacción se concentra, se disuelve en EtOAc y después lafase orgánica se lava con NaOH 1 N y salmuera. La fase orgánica se concentra, produciendo el compuesto cviii (1,084 g, 56,1%).
Ejemplo Intermedio 104 -compuesto cix
Se disuelven ácido 2-pirazinacarboxílico (181 mg, 146 mmol) y el compuesto cviii (541 mg, 1,325 mmol) en
10 DMF (15 ml). A la solución se le añaden HOAt (207 mg, 1,52 mmol) y DIC (0,24 ml, 1,52 mmol). La solución resultante se agita durante una noche en atmósfera de N2. La mezcla de reacción se diluye con EtOAc y la fase orgánica se lava con HCl 1 N, NaHCO3 saturado y salmuera. Después de la concentración de la fase orgánica, elresiduo resultante se purifica cromatográficamente con un gradiente de EtOAc al 20%-30%-35%/hexanos,produciendo el compuesto cix (430 mg, 63%).
Ejemplo Intermedio 105 --compuesto cx
El compuesto cix se hidroliza usando EtOH (7 ml) y NaOH 1 N (4,7 ml, 4,7 mmol), produciendo el compuesto cx (700 mg, 9 1,6%).
20 Ejemplo Intermedio 106 -compuesto cxi
El compuesto cx (690 mg, 1,42 mmol) se disuelve en DCM (9 ml). Después, a la solución se le añade PyBOP (890 mg, 1,7 mmol), seguido de la adición de Compuesto xiii' (320 mg,
1,7 mmol). A la mezcla resultante se le añade DIPEA (0,3 ml, 1,7 mmol). La mezcla de reacción se agita durante unanoche en atmósfera de N2. Después. la mezcla de reacción se diluye con EtOAc y se lava con NaHCO3 saturado ysalmuera. Después de la concentración de la fase orgánica, el residuo resultante se purifica cromatográficamentecon EtOAc al 100%, produciendo el compuesto cxi (490 mg, 52,7%).
Ejemplo Intermedio 107 -compuesto cxiv
El compuesto cxii (1,2 g, 3,06 mmol) se disuelve en MeOH (12 ml). Después del lavado abundante y minucioso
con N2, se añade Pd(OH)2 al 10% en peso sobre carbono (0,6 g) y la mezcla se hidrogena durante una noche,después de lo cual se muestra la mezcla de reacción completa por TLC (EtOAc al 30%/hexanos). La solución seaísla del material sólido por filtración y se concentra, dando el compuesto desprotegido correspondiente cxiii enforma de un aceite incoloro (100%)
que se usa en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Se disuelve ácido 2-pirazinacarboxílico (400 mg, 3,2 mmol, 1,1 equiv.) en DCM/THF (4 ml/4 ml) y despuésse añaden HOAt (440 mg, 3,2 mmol) y DCC (343 ml, 1 M en DCM). Después de agitar a temperatura ambientedurante 20 minutos, el compuesto cxiii (0,96 g, 3,2 mmol) obtenido previamente se disuelve en DCM (6,4 ml) y se
20 añade a la mezcla activada. Después de agitar durante una noche a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtra a través de Celite y el compuesto cxiv se purifica por cromatografía en columna (EtOAc al 30%/hexanos)
produciendo un sólido de color blanco (0,8 g, 80%).
Ejemplo Intermedio 108 -compuesto cxv
El compuesto cxiv (0,8 g, 2,2 mmol) se disuelve en MeOH (10 ml) y después se añade NaOH 2 N (ac.) (3,3ml, 6,6 mmol). La solución se agita a temperatura ambiente durante una noche, después de lo cual se indica que lamezcla de reacción se ha completado por TLC (EtOAc al 50%/hexanos). Se realiza la acidificación a pH 3 con HCl 5 N y se diluye con EtOAc, seguido de extracción de la fase orgánica. La fase orgánica extraída se lava con salmueray se seca sobre MgSO4, produciendo el compuesto cxv (0,74, 95%) después de la concentración.
Ejemplo Intermedio 109 -compuesto cxvi
10 A una solución en DCM (6 ml) del compuesto cxv (0,74 g, 2,1 mmol) a temperatura ambiente se le añade HOAt (290 mg, 2,1 mmol), seguido de la adición de una solución 1 M de DCC en DCM (2,2 ml, 2,2 mmol). Despuésde agitar durante 30 minutos a temperatura ambiente, al ácido activado con HOAt anterior se le añade una soluciónen THF (10,5 ml, 0,2 M) del compuesto v (2,1 mmol).
La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante una noche. En este momento, la mezcla de
15 reacción se filtra a través de celite. El filtrado se diluye con EtOAc (120 ml) y se lava con agua y salmuera. La fase orgánica se seca y se concentra, dando un aceite de color amarillo que se purifica por cromatografía sobre gel desílice (EtOAc al 50%/hexanos), produciendo el compuesto cxvi (0,714 g, 66%).
Ejemplo Intermedio 110 -compuesto cxvii
A una solución en EtOH del compuesto cxvi (0,7 g, 1,4 mmol) se le añade una solución acuosa 2 N de NaOH (2 ml, 4 mmol). La mezcla de reacción se agita durante una noche a temperatura ambiente, después seacidifica a pH 3 con HCl 5 N y se diluye con EtOAc, seguido de extracción de la fase orgánica. La fase orgánicaextraída se lava con salmuera y se seca sobre MgSO4, produciendo el compuesto cxvii (95%) después de la concentración.
Ejemplo Intermedio 111 -compuesto cxviii
A una solución en DCM/THF (10 ml/2 ml) del compuesto cvii (300 mg, 0,6 mmol) se le añade PyBOP (416mg, 0,8 mmol). La solución se agita a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después, a esta solución se leañade el compuesto xxxvi' (200 mg, 0,8 mmol), seguido de DIPEA
(0,22 ml, 1,2 mmol). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante una noche y después se interrumpe con agua (25 ml) durante 30 minutos. Después, la mezcla se extrae con EtOAc. La fase orgánicaresultante se lava con salmuera y se seca sobre MgSO4, antes de concentrarse, produciendo un aceite de coloramarillo. La purificación por cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 3-5%/EtOAc) produce el compuesto cxviii (335 mg, 76%).
Ejemplo Intermedio 112 -compuesto cxix
A una solución en DCM (10 ml) del compuesto cxvii (340 mg, 0,6 mmol) se le añade PyBOP (470 mg, 0,9
10 mmol). La solución se agita a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después, a esta solución se le añade el compuesto xiii' (170 mg, 0,9 mmol), seguido de DIPEA (0,24 ml, 1,2 mmol). La mezcla de reacción se agita atemperatura ambiente durante una noche y después se interrumpe con agua (25 ml) durante 30 minutos. Después,la mezcla se extrae con EtOAc. La fase orgánica resultante se lava con salmuera y se seca sobre MgSO4, antes de concentrarse para dar un aceite de color amarillo. La purificación por cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 3
15 5%/EtOAc) produce el compuesto cxix (164 mg, 36%).
Ejemplo Intermedio 113 -compuesto xx
Se disuelve N-Cbz-L-Valina (6,28 g, 25 mmol) en DCM (30 ml). A esta solución se le añaden HOBT (3,38 g,25 mmol) y DCC (25 ml, solución 1 M) y se agita durante cinco minutos. A esta mezcla se le añade clorhidrato de
20 éster metílico de L-terc-Leucina metil (25 ml, solución 1 M) y se agita durante una noche en atmósfera de N2. La mezcla de reacción se diluye con EtOAc y se lava con HCl 1 N, NaHCO3 saturado y salmuera. La fase orgánica se seca sobre Na2SO4, se filtra y se concentra. El residuo se purifica cromatográficamente con EtOAc al 20%30%/hexanos, produciendo el compuesto xx (2,96 g, 31%).
Ejemplo Intermedio 114 -compuesto xxi
25 El compuesto xx (2,95 g, 7,8 mmol) se hidrogena usando Pd al 10%/C (800 mg) en MeOH (40 ml) en atmósfera de H2, produciendo la amina libre correspondiente que se muestra a continuación (1,9 g, 100%).
Se disuelve ácido 2-pirazina-carboxílico (970 mg, 7,8 mmol) en DCM (20 ml). A esta solución se le añade PyBOP(4,06 g, 7,8 mmol). A la solución se le añade la amina libre (1,9 g, 7,8 mmol) en DCM (15 ml) y después se añade30 DIPEA (1,36 ml, 7,8 mmol). La mezcla resultante se agita durante una noche en atmósfera de N2. La mezcla de reacción se diluye con EtOAc y la fase orgánica se lava con NaHCO3 saturado y salmuera. Después de la
concentración de la fase orgánica, el residuo se purifica cromatográficamente con EtOAc al 30%-40%/Hexanos,produciendo el compuesto xxi (2,07 g, 75,8%).
Ejemplo Intermedio 115 -compuesto xxii
El compuesto xxi se hidroliza usando MeOH (20 ml) y NaOH 1 N (3-equiv.), produciendo el compuesto xxii (1,82 g, 93,9%).
Ejemplo Intermedio 116 -compuesto xxiii
El compuesto xxii (895 mg, 2,66 mmol) se disuelve en DCM (10 ml). A la solución se le añade DCC (3,2
10 mmol) y después se añade HOAt (435 mg, 3,2 mmol). Después, se añade el compuesto v (3,2 mmol) en THF (16 ml). La mezcla resultante se agita durante una noche en atmósfera de N2. La mezcla de reacción se diluye conEtOAc, se filtra a través de gel de sílice y se concentra. El residuo resultante se purifica cromatográficamente conEtOAc al 50%/hexanos, produciendo el compuesto xxiii (730 mg, 54,8%).
Ejemplo Intermedio 117 -compuesto xxiv
15 El compuesto xxiii se hidroliza usando EtOH (5 ml) y NaOH 1 N (1,5 equiv.) para producir el compuesto xxiv (690 mg, 100%).
Ejemplo Intermedio 118 -compuesto cxx
El compuesto xxiv (245 mg, 0,52 mmol) se disuelve en DCM (3 ml). A la solución se le añade PyBOP (330mg, 0,62 mmol) y después se añade el compuesto xiii' (120 mg, 0,62 mmol). A la mezcla resultante se le añade
20 DIPEA (0,11 ml, 0,62 mmol). La mezcla de reacción se agita durante una noche en atmósfera de N2. La mezcla de reacción se diluye con EtOAc y la fase orgánica se lava con NaHCO3 saturado y salmuera. Después de la concentración de la fase orgánica, el residuo se purifica cromatográficamente con EtOH al 5%/EtOAc, produciendoel compuesto cxx (220 mg, 60%).
25 Ejemplo Intermedio 119 -compuesto xiii'
Se disuelve Boc-NVA-OH (24,96 g, 114,9 mmol) en THF (200 ml). A la solución se le añade en porcionesCDI (22,35,
137,8 mmol) y la solución se agita durante 30 minutos. Se disuelve clorhidrato de N,O-dimetilhidroxilamina (12,33 g,30 126,4 mmol) en DMF (50 ml) y después a la solución se le añade DIPEA (22 ml, 126,4 mmol). La solución de DMF se deja en agitación a temperatura ambiente durante 20 minutos y después se añade a una solución de THF. Lamezcla resultante se agita durante el fin de semana en atmósfera de N2. La mezcla de reacción se concentra al vacío hasta alcanzar un volumen total de 100 ml. Esta fase orgánica se lava con HCl 1 N, NaHCO3 saturado ysalmuera. La fase orgánica se concentra, produciendo el compuesto cxxi en bruto (25,3 g).
Se añade LAH (107,3 mmol) a un matraz de fondo redondo seco de 1 l en atmósfera de N2 en una solución 1 M de Et2O. Esta solución se disminuye hasta 0ºC y después se añade gota a gota el compuesto cxxi (97,5 mmol) en Et2O (100 ml). Después de que se complete la adición, la mezcla resultante se agita durante 30 minutos. Lamezcla de reacción se inactiva a 0ºC mediante la adición lenta de EtOAc (50 ml), seguido de la adición lenta de una
10 solución al 5% de KHSO (50 ml). Esta mezcla se agita durante 30 minutos. La fase orgánica se lava con HCl 1 N, NaHCO3 saturado y salmuera. La fase orgánica se concentra, produciendo el compuesto cxxii en bruto (22,28 g).
El compuesto cxxii se disuelve en MeOH (100 ml). Se disuelve Na2S2O4 (16,82 g, 96,6 mmol) en agua (100 ml) y después se añade a la solución del compuesto cxxii a 0ºC. Esta mezcla se almacena en el frigorífico (5ºC)
15 durante una noche. A la mezcla de reacción se le añade KCN (7,53 g, 115,9 mmol) en agua (100 ml) y se agita durante 1,5 horas a temperatura ambiente. El compuesto se extrae con EtOAc (3 x 100 ml). La fase orgánica se lavacon salmuera (3 x 50 ml), se seca sobre MgSO4, se filtra y se concentra, produciendo el compuesto cxxiii en bruto (15,86 g).
El compuesto cxxiii (15,86 g) se disuelve en dioxano (100 ml). A esta solución se le añade HCl concentrado (al 37%, 100 ml) seguido de anisol (10 ml) y se establece calentamiento a reflujo (110ºC). La reacción se agitadurante 1,5 horas. Cuando la mezcla de reacción se enfría a temperatura ambiente y el disolvente se retira al vacío,produciendo una pasta seca. El residuo se seca durante una noche a alto vacío, produciendo el compuesto cxxiv enbruto.
El compuesto cxxiv (69,6 mmol) se disuelve en DMF (60 ml) y THF (60 ml). A la mezcla se le añade N(benciloxicarboniloxi)succinimida (17,33 g, 69,6 mmol), seguido de la adición de DIPEA (12,1 ml, 69,6 mmol). Lamezcla de reacción se agita durante una noche en atmósfera de N2. La mezcla se concentra a un volumen reducido (50 ml) y se diluye con EtOAc. La fase orgánica se lava con HCl 0,1 N (2 x 100 ml) y salmuera, produciendo el
30 compuesto cxxv (17,5 g, 54,2% en cinco etapas).
El compuesto cxxv (5,66 g, 20,14 mmol) se disuelve en DCM (60 ml). A esta solución se le añaden PyBOP (12,57 g, 24,2 mmol) y HOBT (3,27 g, 24,2 mmol) y se agita durante cinco minutos. La mezcla resultante sedisminuye hasta 0ºC y después se añaden ciclopropilamina (1,67 ml, 24,2 mmol) y DIPEA (4,2 ml, 24,2 mmol). Lamezcla de reacción se agita durante una noche con calentamiento a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se lava con HCl 0,1 N, NaHCO3 saturado y salmuera. Después, la fase orgánica se concentra y se purificacromatográficamente usando EtOAc al 70%/Hexanos, produciendo el compuesto cxxvi (3,18 g, 49,3%).
El compuesto cxxvi (3,18 g, 9,94 mmol) se hidrogena usando Pd al 10%/C (600 mg) en MeOH (70 ml). La10 mezcla de reacción se agita durante una noche en atmósfera de H2, se filtra a través de celite y se concentra, produciendo el compuesto xiii' en bruto (2,1 g, 100%).
Ejemplo Intermedio 120 -compuesto cxxvii
Se disuelve N-Cbz-L-Ciclohexilglicina (3 g, 10,3 mmol) en DCM (36 ml). A esta solución se le añaden HOAt
15 (1,5 g, 11,28 mmol) y DCC (11,28 ml, 11,28 mmol) y se agita durante cinco minutos. A esta mezcla se le añade clorhidrato de éster metílico de L-terc-Leucina (103 ml, solución 1 M, 10,3 mmol) y se agita durante una noche en atmósfera de N2. La mezcla de reacción se filtra a través de celite, se aclara con EtOAc y se concentra para dar unresiduo que se purifica cromatográficamente usando EtOAc al 20% -30%/hexanos, produciendo el compuesto cxxvii(2,2 g, 52%).
Ejemplo Intermedio 121 -compuesto lxxix'
El compuesto cxxvii (2,2 g, 5,2 mmol) se hidrogena usando Pd(OH)2 al 20%/C (1 g) en MeOH (15 ml) en atmósfera de H2, produciendo el compuesto lxxix' (1,4 g, 98%).
Ejemplo Intermedio 122 -compuesto lxxx
Se disuelve ácido 2-pirazinacarboxílico (360 mg, 2,9 mmol) en DCM (10 ml). A la solución se le añadePyBOP (1,81 g, 3,5 mmol). Después, a la solución se le añade el compuesto lxxix' (825 mg, 2,9 mmol) en THF (10
5 ml), seguido de la adición de DIPEA (0,5 ml, 2,9 mmol). La mezcla resultante se agita durante una noche en atmósfera de N2. La mezcla de reacción se diluye con EtOAc y la fase orgánica se lava con NaHCO3 saturado ysalmuera. El residuo resultante de la concentración de la fase orgánica se purifica cromatográficamente con EtOAcal 30%/Hexanos, produciendo el compuesto lxxx (780 mg, 69%).
Ejemplo Intermedio 123 -compuesto lxxxi
10 El compuesto lxxx se hidroliza usando MeOH (10 ml) y NaOH 1 N (3 equiv.), produciendo el compuesto lxxxi (615 mg, 81,8%).
Ejemplo Intermedio 124 -compuesto lxxxii
El compuesto lxxxi (610 mg, 1,6 mmol) se disuelve en DCM (10 ml). Después, a la solución se le añade DCC (1,94 ml, 1,94 mmol), seguido de la adición de HOAt (270 mg, 1,94 mmol). Después, a la solución se le añade
15 el compuesto v (1,94 mmol) en THF (19,4 ml). La mezcla resultante se agita durante dos noches en atmósfera de N2. La mezcla de reacción se diluye con EtOAc, se filtra a través de gel de sílice y se concentra. El residuo resultante sepurifica cromatográficamente con EtOAc al 40%/hexanos, produciendo el compuesto lxxxii (450 mg, 83,4%).
Ejemplo Intermedio 125 -compuesto lxxxiii
El compuesto lxxxi se hidroliza usando EtOH (10 ml) y NaOH 1 N (3 equiv.) para producir el compuesto 20 lxxxiii (650 mg, 99%).
Ejemplo Intermedio 126 -compuesto cxxviii
El compuesto lxxxiii (400 mg, 0,78 mmol) se disuelve en DCM (5 ml). A la solución se le añade PyBOP (610mg, 1,2 mmol), seguido del compuesto xiii' (230 mg, 1,2 mmol). A la mezcla resultante se le añade DIPEA (0,2 ml,1,2 mmol). La mezcla de reacción se agita durante una noche en atmósfera de N2. La mezcla de reacción se diluye
25 con EtOAc y la fase orgánica se lava con NaHCO3 saturado y salmuera. Después de la concentración de la fase orgánica, el residuo se purifica cromatográficamente con un gradiente de EtOAc al 100% a EtOH al 5%/EtOAc,produciendo el compuesto cxxviii (365 mg, 68,7%).
Ejemplo Intermedio 127 -compuesto cxxx
El compuesto lxxxiii (365 mg, 0,7 mmol) se disuelve en DCM (5 ml). A la solución se le añade PyBOP (440 mg, 0,84 mmol), seguido de la adición del compuesto cxxix
(0,84 mmol) en THF (8,4 ml). A la mezcla resultante se le añade DIPEA (0,1 ml, 0,84 mmol). La mezcla de reacción
se agita durante una noche en atmósfera de N2. La mezcla de reacción se diluye con EtOAc y la fase orgánica se lava con NaHCO3 saturado y salmuera. Después de la concentración de la fase orgánica, el residuo resultante sepurifica cromatográficamente con EtOAc al 100%, produciendo el compuesto cxxx (350 mg, 70%).
5 Ejemplo Intermedio 128 -compuesto cxxxi
El compuesto cxxv (2,54 g, 9,05 mmol) se disuelve en DCM (30 ml). A la solución se le añaden PyBOP (5,65 g, 10,9 mmol) y HOBT (1,47 g, 10,9 mmol) y se agita durante cinco minutos. La mezcla resultante se disminuyehasta 0ºC, después de lo cual se añaden (S)-(+)-3-Metil-2-butilamina (1,27 ml, 10,9 mmol) y DIPEA (1,9 ml, 10,9mmol). La mezcla de reacción se agita durante una noche con calentamiento a temperatura ambiente. La fase
10 orgánica se lava con HCl 0,1 N, NaHCO3 saturado y salmuera. Después de la concentración de la fase orgánica, el residuo resultante se purifica cromatográficamente con EtOAc al 30%/hexanos, produciendo el compuesto cxxxi(1,44 g, 45,5%).
Ejemplo Intermedio 129 -compuesto cxxix
El compuesto cxxxi (1,3 g, 3,7 mmol) se hidrogena usando Pd al 10%/C (500 mg) en MeOH (40 ml). La
mezcla de reacción se agita durante una noche en atmósfera de H2. La mezcla de reacción se filtra a través de celite
y la fase orgánica se concentra, produciendo el compuesto cxxix en bruto (800 mg, 100%).
Ejemplo Intermedio 130 -compuesto cxxxiv
El compuesto cxxxii (1,6 g, 3,7 mmol) se disuelve en MeOH (12 ml). Después del lavado abundante y minucioso
con N2, se añade Pd(OH)2 al 10% en peso sobre carbono (0,74 g) y la mezcla se hidrogena durante una noche, después de lo cual se muestra una mezcla de reacción completa por TLC (EtOAc al 30%/hexanos). La solución se25 aísla del material sólido por filtración y se concentra, produciendo el compuesto cxxxiii en forma de un aceite incoloro (100%) que se usa en la siguiente etapa
sin purificación adicional. Se disuelve ácido 2-pirazinacarboxílico (400 mg, 3,2 mmol, 1,1 equiv.) en DCM/THF (4ml/4 ml) y después se añaden HOAt (440 mg, 3,2 mmol) y DCC (3,3 ml, 1 M en DCM). Después de agitar atemperatura ambiente durante 20 minutos, el compuesto cxxxiii (0,96 g, 3,2 mmol) obtenido previamente se disuelveen DCM (6,4 ml) y se añade a la mezcla activada. Después de agitar durante 2 días a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtra a través de Celite y se concentra para dar un residuo que se purifica por cromatografíaen columna (EtOAc al 50%/hexanos), produciendo el compuesto cxxxiv en forma de un sólido de color blanco (1,06g, 83%).
10 Ejemplo Intermedio 131 -Compuesto cxxxv
El compuesto cxxxiv (1,06 g, 2,6 mmol) se disuelve en MeOH (10 ml) y después se añade NaOH 2 N (ac.)(4 ml, 8 mmol). La solución se agita a temperatura ambiente durante una noche, después de lo cual se indica que la hidrólisis se ha completado por TLC (EtOAc al 50%/hexanos). La solución se acidifica a pH 3 con HCl 5 N, se diluyecon EtOAc y después la fase orgánica se extrae. La fase orgánica extraída se lava con salmuera y se seca sobre
15 MgSO4, produciendo el compuesto cxxxv (100%) después de la concentración.
Ejemplo Intermedio 132 -compuesto cxxxvi
A una solución en DCM (8 ml) del compuesto cxxxv (1,44 g, 3,7 mmol) a temperatura ambiente se le añadeHOAt (500 mg, 3,7 mmol), y después se añade una solución 1 M de DCC en DCM (3,7 ml, 3,7 mmol). Después de
20 agitar durante 30 minutos a temperatura ambiente, al ácido activado con HOAt anterior se le añade una solución en THF (18,5 ml, 0,2 M) del compuesto v (3,7 mmol). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente duranteuna noche. La mezcla de reacción se filtra a través de Celite. Los filtrados se diluyen con EtOAc (120 ml) y se lavancon agua y salmuera. La fase orgánica se seca y se concentra, produciendo un aceite de color amarillo que sepurifica por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 70%/hexanos), produciendo el compuesto cxxxvi (1 g, 71%).
Ejemplo Intermedio 133 -compuesto cxxxvii
A una solución en EtOH (8 ml) del compuesto cxxxvi (1 g, 1,8 mmol) se le añade una solución acuosa 2 Nde NaOH (2,7 ml, 5,4 mmol). La mezcla de reacción se agita durante una noche a temperatura ambiente, despuésse acidifica a pH 3 con HCl 5 N, se diluye con EtOAc y después la fase orgánica se extrae. La fase orgánica extraídase lava con salmuera y se seca sobre MgSO4, produciendo el compuesto cxxxvii (88%) después de la concentración.
Ejemplo Intermedio 133 -compuesto cxxxviii
A una solución en DCM (10 ml) del compuesto cxxxvii (350 mg, 0,6 mmol) se le añade PyBOP (450 mg,0,86 mmol). La solución se agita a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después, a esta solución se le añade
10 el compuesto xiii' (160 mg, 0,86 mmol) seguido de DIPEA (0,23 ml, 1,3 mmol). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante una noche y después se interrumpe con agua (25 ml) durante 30 minutos. Después,la mezcla se extrae con EtOAc. La fase orgánica extraída se lava con salmuera y se seca sobre MgSO4 antes de concentrarse, produciendo un aceite de color amarillo. La purificación por cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al5%/EtOAc) produce el compuesto cxxxviii (407 mg, 88%).
Ejemplo Intermedio 134 -compuesto cxxxix
Se disuelve ácido 5-metilisoxazol-3-carboxílico (200 mg, 2,05 mmol) en DCM (5 ml). A la solución se leañade PyBOP (1,07 g, 2,05 mmol). A la solución se le añade el compuesto lxxix' (582 mg, 2,05 mmol) en DCM (5ml), seguido de la adición de DIPEA (0,36 ml, 2,05 mmol). La mezcla resultante se agita durante una noche en
20 atmósfera de N2. La mezcla de reacción se diluye con EtOAc y la fase orgánica se lava con NaHCO3 saturado ysalmuera. La fase orgánica se concentra, y el residuo resultante se purifica cromatográficamente con EtOAc al30%/hexanos, produciendo el compuesto cxxxix (495 mg, 61,4%).
Ejemplo Intermedio 135 -compuesto cxxxx
El compuesto cxxxix se hidroliza usando MeOH (10 ml) y NaOH 1 N (3 equiv.), produciendo el compuesto cxxxx (430 mg, 90%).
Ejemplo Intermedio 136 -compuesto cxxxxi
El compuesto cxxxx (380 mg, 1 mmol) se disuelve en DCM (5 ml). Después, a la solución se le añade DCC(1,2 mmol), seguido de la adición de HOAt (165 mg, 1,2 mmol). Después, se añade el compuesto v (1,2 mmol) enTHF (12 ml). La mezcla resultante se agita durante una noche en atmósfera de N2. La mezcla de reacción se diluye con EtOAc, se filtra a través de gel de sílice y se concentra. El residuo resultante se purifica cromatográficamentecon EtOAc al 35%/hexanos, produciendo el compuesto cxxxxi (320 mg, 58%).
Ejemplo Intermedio 137 -compuesto cxxxxii
El compuesto cxxxxi se hidroliza usando EtOH (10 ml) y NaOH 1 N (3 equiv.), produciendo el compuesto cxxxxii (730 mg, 94 3%).
Ejemplo Intermedio 138 -compuesto cxxxxiii
El compuesto cxxxxii (240 mg, 0,46 mmol) se disuelve en DCM (5 ml). A la solución se le añade PyBOP
15 (295 mg, 0,56 mmol), seguido de la adición del compuesto xiii' (110 mg, 0,56 mmol). A la mezcla resultante se le añade DIPEA (0,1 ml, 0,56 mmol). La mezcla de reacción se agita durante dos noches en atmósfera de N2. La mezcla de reacción se diluye con EtOAc y la fase orgánica se lava con NaHCO3 saturado y salmuera. Después de laconcentración de la fase orgánica, el residuo resultante se purifica cromatográficamente con EtOAc al 90%/hexanos,produciendo el compuesto cxxxxiii (168 mg, 53%).
Ejemplo Intermedio 139 -compuesto cxxxxiv
A una solución de NaOH (2 N, 42,1 ml, 84,2 mmol) a 5ºC se le añade L-alanina (5,00 g, 56,1 15 mmol).Después de agitar durante 10 minutos, se añaden simultáneamente gota a gota cloroformiato de metilo (6,5 ml, 84,2mmol) y NaOH (2 N, 42,1 ml, 84,2 mmol). La solución se agita en un baño de hielo durante 2 horas y después atemperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla se lava con Et2O (2 x 50 ml) y la fase acuosa se neutraliza a pH ~2con HCl 5 N y se extrae con EtOAc (3 x 50 ml). La fase orgánica extraída se lava con salmuera, se seca con MgSO4 y se concentra para producir
el compuesto cxxxxiv, N-carbometoxi-L-alanina, (4,54 g, 54%) en forma de un aceite incoloro.
Ejemplo Intermedio 140 -compuesto cxxxxvi
Una solución del compuesto cxxxxv (3,57 g, 9,44 mmol) en THF a 5ºC se trata con HOAt
(1,28 g, 9,44 mmol) y después se añade DCC (9,50 ml, 9,50 mmol). Después de agitar en un baño de hielo durante45 minutos, se añade una solución del compuesto v (104 ml, 10,4 mmol) en THF. La mezcla se agita a temperaturaambiente durante una noche. La mezcla se enfría a 5ºC y se interrumpe con NaHCO3 saturado. Después de la
15 filtración para retirar el DCU precipitado, la mezcla se disuelve en EtOAc (100 ml), se lava con NaHCO3 saturado ysalmuera y después se seca con MgSO4 y se concentra para dar un residuo que se purifica por cromatografía encolumna de sílice (EtOAc al 25%/Hexanos), produciendo el compuesto cxxxxvi (2,91 g, 57%) en forma de una espuma gomosa.
20 Ejemplo Intermedio 141 -compuesto cviii
A una solución del compuesto cxxxxvi en MeOH (25 ml) enfriada con un baño de hielo en una corriente de N2 se le añade lentamente Pd/C. La mezcla se hidrogena a 1 atm durante una noche. El catalizador se retira porfiltración y el filtrado se combina con 5 ml de DMF y se seca al vacío, produciendo el compuesto cviii.
Ejemplo Intermedio 142 -compuesto cxxxxvii
25 Una solución del compuesto cxxxxiv (0,298 g, 2,03 mmol) y HOAt (0,276 g, 2,03 mmol) en THF enfriada en un baño de hielo se trata con DCC (2,05 ml, 2,05 mmol). Después de agitar en un baño de hielo durante 0,5 horas,se añade una solución del compuesto cviii en THF y después se añade DIPEA (0,39 ml, 2,2 mmol). La mezcla seagita a temperatura ambiente durante una noche, después se enfría en un baño de hielo y se interrumpe con NaHCO3 saturado. El DCU precipitado se filtra y el filtrado se disuelve en EtOAc (100 ml). La fase orgánica se lava
30 con NaHCO3 saturado y salmuera y después se seca con MgSO4. Después de la retirada del disolvente orgánico, el residuo se purifica por cromatografía en columna de sílice (EtOAc al 60%/Hexanos), produciendo el compuestocxxxxvii (0,47 g, 48%) en forma de una espuma gomosa.
Ejemplo Intermedio 143 -compuesto cxxxxviii
A una solución del compuesto cxxxxvii (0,47 g, 0,847 mmol) en EtOH (5 ml) a 5ºC se le añade NaOH (2 N,1,31 ml, 2,62 mmol). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 4 horas. La solución se acidifica a pH ~2con HCl (1 N) y el EtOH se retira por evaporación rotatoria. La mezcla se extrae con EtOAc (3 x 30 ml) y el extracto combinado se lava con salmuera y después se seca con MgSO4. El disolvente se retira y el residuo se seca al vacío,produciendo el compuesto cxxxxviii (0,366 g, 82%) en forma de una espuma gomosa.
Ejemplo Intermedio 144 -compuesto cil
10 Una solución del compuesto cxxxxviii (0,366 g, 0,718 mmol) en DCM se enfría en un baño de hielo y se trata con PyBop (0,599 g, 1,15 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 0,5 horas, la mezcla seenfría con un baño de hielo y se trata con una solución del compuesto xiii' (0,200 g, 1,08 mmol) en THF y DIPEA (0,250 ml, 1,44 mmol). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante una noche y después se interrumpe conuna solución de NH4Cl. El disolvente se concentra y la mezcla se disuelve en EtOAc (100 ml). La fase orgánica se
15 lava con NaHCO3 saturado y salmuera, y después se seca con MgSO4. Después de la retirada del disolvente orgánico, el residuo se purifica por cromatografía en columna (EtOH al 5%/EtOAc), produciendo el compuesto cil(035 g, 72%)
Ejemplo Intermedio 145 -compuesto cxxi
20 A una solución en THF (85 ml) de N-Boc-Nva-OH (compuesto 1) (8,68 g, 40 mmol) se le añade CDI (7,79 g, 48 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 30 minutos, la solución anterior se trata con unasolución en DMF (25 ml) que contiene clorhidrato de N,O-dimetilhidroxilamina (4,25 g, 44 mmol) y DIPEA (7,66 ml,44 mmol). La mezcla de reacción se agita durante una noche a temperatura ambiente. Después, la mezcla dereacción se concentra al vacío. El residuo resultante se diluye con EtOAc (300 ml). Esta solución se lava
25 secuencialmente con HCl 0,1 N (50 ml), NaHCO3 saturado (3 x 50 ml) y salmuera. La fase orgánica se concentra al vacío, produciendo un residuo que se purifica con cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 40%/Hexanos) paradar el compuesto cxxi (9,38 g, 94%).
Ejemplo Intermedio 146 -compuesto cxxii
A una solución en dietil Et2O (50 ml) del compuesto cxxi (9,38 g, 31,9 mmol) enfriada a 0ºC se le añade
30 (lentamente) LAH (34,7 ml, 1 M, 34,7 mmol). La temperatura del matraz de reacción se mantiene por debajo de 5ºC durante la adición de LAH. Después de que se complete la adición, a la reacción se le añade EtOAc (20 ml) parainactivar el exceso de LAH. Después, se añade gota a gota KHSO4 acuoso (al 5%, 20 ml) con el fin de mantener latemperatura por debajo de 5ºC. La fase orgánica se separa y después se lava secuencialmente con HCl 1 N (3 x 30ml), NaHCO3 saturado (3 x 30 ml) y salmuera. La fase orgánica se concentra y se seca al vacío, produciendo el
35 compuesto cxxii en bruto (5,18 g, 69%).
Ejemplo Intermedio 147 -compuesto cl
A una suspensión en THF (25 ml) de Zn (2,75 g, 42 mmol) se le añaden a la temperatura de reflujo 0,2 ml de EtOC(O)CF2Br. Esto se sigue de la adición lenta de una solución en THF (25 ml) del compuesto cxxii (3,05 g,15,0 mmol) y EtOC(O)CF2Br (4,84 ml, 37,5 mmol). Después de que se complete la adición de los dos reactivos, lamezcla de reacción se calienta a reflujo adicionalmente durante 30 minutos. La mezcla de reacción se enfría atemperatura ambiente y se diluye con DCM (200 ml). La fase orgánica se lava con KHSO4 1 N. La fase orgánica seconcentra y se seca al vacío, produciendo un residuo que se purifica por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 20%/Hexano), produciendo el compuesto cl (2,78 g, 57%).
Esta preparación es esencialmente la misma que la descrita por Thaisrivongs y col., J. Med. Chem. 29,2080-2087 (1986).
10 Ejemplo Intermedio 148 -compuesto cli
Una solución en THF (40 ml) del compuesto cl (2,78 g, 8,53 mmol) se trata con NaOH 1 N (12,8 ml, 12,8mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante una noche, el disolvente se retira parcialmente al vacío.La mezcla de reacción restante se diluye con agua (50 ml) y se liofiliza, produciendo el compuesto cli en bruto (2,82g, >100%) en forma de su sal sódica.
Esta preparación es esencialmente la misma que la descrita por Thaisrivongs y col., J. Med. Chem. 29,2080-2087 (1986).
Ejemplo Intermedio 149 -compuesto clii
Una solución en DCM (10 ml) del compuesto cli en bruto (516 mg, 1,61 mmol) se trata con HOBT (436 mg,
20 3 mmol) y DIC (0,328 ml, 2,09 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 30 minutos, la mezcla de reacción se trata con una solución en DCM (5 ml) que contiene sal TsOH de éster bencílico de glicina (815 mg, 2,42mmol) y DIPEA (0,422 ml, 2,42 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 12 horas, la mezcla dereacción se inactiva con agua y se extrae con EtOAc. La fase orgánica se seca y se concentra al vacío y se purificapor cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 40%/hexanos), produciendo el compuesto clii (495 mg, 69%). 1H
25 RMN del compuesto clii (400 MHz. CDCl3: 8 7,29-7,21 (m, 5H), 5,16 (s a, 2H), 4,89 (s a, 1H), 4,20-3,90 (m, 4H) 3,80 (s a, 1H), 1,75-1,42 (m, 4H), 1,38 (s, 9H), 0,87 (m, 3H).
Partiendo del compuesto cli en bruto, se preparan los compuestos cliii (al 83%) y cliv (al 50%) mediante unprocedimiento idéntico al descrito para el compuesto clii.
1H RMN del compuesto cliii (400 MHz, CDCl3:  7,49 (s a, 1H), 7,34-7,24 (m, 5H), 5,13 (AB c, J = 12,2 Hz,
J-= 23,9 Hz, 2H), 4,88 (d a, J = 8,8 Hz, 1H), 4,53 (m, 1H), 3,98-3,91 (m, 2H), 3,82 (m, 1H), 1,65-1,20 [m 16H,
incluyendo un singlete a 1,37 (9H)], 0,86 (t, J = 7,3 Hz, 3H).
1H RMN del compuesto cliv (400 MHz, CDCl3)8 7,60-7,0 (m, 10H), 5,30-5,00 (m, 2H), 5,00-4,75 (m, 2H),4,15-3,70 (m, 3H), 3,30-3,00 (m, 2H), 1,75-1,20 [m, 13H, incluyendo un singlete a 1,36 (9H)], 0,86 (s a, 3H).
5 Ejemplo Intermedio 150 -compuesto clv
A una solución en DCM (10 ml) y THF (5 ml) del compuesto cli en bruto (1 g, 3,13 mmol) se le añaden HOBT (634 mg, 4,69 mmol), EDCl (781 mg, 4,07 mmol) y después (s)--metilbencilamina (0,604 ml, 4,69 mmol). Lamezcla de reacción se agita durante una noche a temperatura ambiente y después se interrumpe con agua. Lamezcla de reacción se extrae con EtOAc. La fase orgánica se lava con salmuera y se seca con Na2SO4. La fase
10 orgánica se concentra al vacío, produciendo un residuo que se purifica por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 20%/hexanos), produciendo el compuesto clv (459 mg, 37%). 1H RMN del compuesto clv (400 MHz, CDCl3): 7,32-7,21 (m, 6H), 5,00 (m, 1H), 4,75 (m, 1H), 3,94 (m, 2H) 3,70 (m, 1H) 1,65-1,15 [m, 16H, incluyendo un doblete a 1,51 (J = 6,8 Hz, 3H), singlete a 1,39 (9H)], 0,82 (m, 3H).
15 Ejemplo Intermedio 151 -compuesto clvi
El compuesto clv (220 mg, 0,55 mmol) se disuelve en HCl 4 N en dioxano (10 ml). La mezcla de reacción seagita a temperatura ambiente durante 2 horas y después se concentra al vacío, dando el compuesto clvi en bruto(~100%) en forma de su sal HCl.
Siguiendo el procedimiento descrito para preparar el compuesto clvi, se preparan los compuestos clvii, clviii y clix con un rendimiento casi cuantitativo a partir del compuesto cli en bruto.
Ejemplo Intermedio 152 -compuesto clx
Una solución en DCM (4 ml) de la sal HCl del compuesto vii (96 mg, 0,144 mmol) se trata con PyBOP (120mg, 0,23 mmol) y DIPEA (0,1 ml, 0,576 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 30 minutos, lasolución se trata con una solución en THF (4 ml) que contiene el compuesto clv (0,288 mmol) y DIPEA (0,2 ml, 1,152 mmol). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante una noche. Después, la mezcla de reacción se diluye con EtOAc (50 ml) y después la fase orgánica se lava con NaHCO3 y salmuera. La fase orgánica se concentra al vacío y el residuo se purifica por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 80%/hexanos), produciendo el compuesto clx (113 mg, 89%).
Ejemplo Intermedio 153 -compuesto clxi
Una solución en DCM (6 ml) del compuesto vii (140 mg, 0,235 mmol) se trata con PyBOP (196 mg, 0,376mmol) durante 30 minutos. Después, a la solución anterior se le añade una solución en THF (6 ml) del compuestoclvii (~0,47 mmol) y DIPEA (0,327 ml, 1,88 mmol). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante
15 una noche y se interrumpe con agua (30 minutos). La mezcla de reacción se extrae con EtOAc (50 ml). La fase orgánica se lava con NaHCO3 y salmuera. Las capas acuosas combinadas se extraen de nuevo con EtOAc (50 ml). Las fases orgánicas combinadas se secan y se concentran al vacío. El residuo resultante se purifica porcromatografía sobre gel de sílice (80-100 EtOAc/hexanos), produciendo el compuesto clxi (104 mg, 48%).
Ejemplo Intermedio 154 -compuesto clxii
A una solución en DCM (10 ml) del compuesto clxi (280 mg, 0,304 mmol) se le añade reactivo de DMP (193mg, 0,456 mmol). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 3 horas y se interrumpe conNa2SO3 al 10%. La fase orgánica se lava con NaHCO3 y salmuera. La fase orgánica resultante se seca y se concentra al vacío, produciendo un residuo que se purifica con cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 80100%/hexanos), produciendo el compuesto clxii (271 mg, 97%).
Ejemplo Intermedio 155 -compuesto clxiii
10 El compuesto lxxxiii (220 mg, 0,43 mmol) se recoge en DCM (5 ml). A la solución en DCM se le añade PyBOP (270 mg, 0,51 mmol) y se agita durante 5 minutos. A esta solución se le añade gota a gota el compuestoxxxvi’ (0,51 mmol) en THF (5,1 ml). A la mezcla de reacción se le añade DIPEA (0,09 ml, 0,51 mmol) y se agitadurante una noche en atmósfera de N2. Al día siguiente, la mezcla de reacción se diluye con EtOAc, se lava con NaHCO3 saturado y se lava con salmuera. La purificación con un gradiente de EtOAc del 70% al 90%/Hexano
15 produce el compuesto clxiii (180 mg, 56%).
Ejemplo Intermedio 156 -compuesto clxiv
El compuesto cxxv (2,09 g, 7,4 mmol) se recoge en DCM (20 ml). A esta solución se le añaden PyBOP(4,64 g, 8,9 mmol) y HOBt (1,2 g, 8,9 mmol) y se agita durante cinco minutos. La mezcla resultante se disminuye
20 hasta 0ºC, momento en el que se añaden S(-)--metilbencilamina (1,15 ml, 8,9 mmol) y DIPEA (1,55 ml, 8,9 mmol). La reacción se agita durante una noche con calentamiento a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se lavacon HCl 0,1 N, NaHCO3 sat. y salmuera. La purificación con EtOAc al 30%/Hexanos produce el compuesto clxiv (1,6 g, 56,3%).
Ejemplo Intermedio 157 -compuesto xxxvi' El compuesto clxiv (1,48 g, 3,8 mmol) se hidrogena usando Pd al 10%/C (300 mg) en MeOH (50 ml). La
mezcla de reacción se agita durante una noche en atmósfera de H2. La mezcla de reacción se filtra a través de celite y se concentra, dando el compuesto xxxvi (895 mg, 94,2%). Ejemplo Intermedio 158 -compuesto clxvi:
A una solución en DCM (15 ml) del compuesto clxv (2 g, 8,2 mmol) se le añaden HOAt (1,34 g,
9,84 mmol) y DCC (9,84 ml, 1 M, 9,84 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 20 minutos, a la
10 solución anterior se le añade una solución en THF (9,84 ml) que contiene clorhidrato de éster metílico de terc-L-Leucina (9,84 mmol) y DIPEA (1,72 ml, 9,84 mmol). Después, se añade DMAP (1 g, 8,2 mmol) a temperaturaambiente. La reacción se agita a temperatura ambiente durante una noche. Después del tratamiento acuoso convencional y la cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 20%/Hexanos), se obtiene el compuesto clxvi (1,75 g,58%).
Ejemplo Intermedio 159 -compuesto clxvii:
A una solución en THF (35 ml) del compuesto clxvi (1,75 g, 4,73 mmol) se le añade una solución 4 N deHCl en dioxano (11,8 ml, 47,3 mmol). La reacción se agita a temperatura ambiente durante una noche. En estemomento, el disolvente se retira a presión reducida, produciendo clxvii en bruto (~100%), que se disuelve de nuevo
20 en DMF y se usa directamente en la siguiente reacción.
Ejemplo Intermedio 160 -compuesto clxviii:
A una solución en DCM (15 ml) que contiene ácido 2-pirazinacarboxílico (447 mg, 3,6 mmol) y PyBOP (1,87g, 3,6 mmol) se le añade una solución en DMF (15 ml) del compuesto clxvii (811 mg, 3 mmol). Después, a la mezcla
25 resultante se le añade DIPEA (0,63 ml, 3,6 mmol). La reacción se agita durante una noche a temperatura ambiente y después se interrumpe con agua. La mezcla de reacción se extrae con EtOAc. La fase orgánica se lava consalmuera y se concentra al vacío, proporcionando un residuo que se purifica por cromatografía sobre gel de sílice(EtOAc al 40%/Hexanos), produciendo el compuesto clxviii (0,93 g, 82%).
Ejemplo Intermedio 161 -compuesto clxix:
A una solución en MeOH (10 ml) del compuesto clxviii (0,93 g, 2,47 mmol) se le añade NaOH 2 N (3,71 ml,7,41 mmol). La reacción se agita a temperatura ambiente durante una noche. Después, la reacción se acidifica a pH3 usando HCl 1 N.. La reacción se diluye con EtOAc (75 ml) y se lava con agua y salmuera. La fase orgánica obtenida de esta manera se seca y se concentra al vacío, dando el compuesto clxix (~100%).
Ejemplo Intermedio 162 -compuesto clxx:
Una solución en DCM (10 ml) del compuesto clxix (2,47 mmol) se trata con HOAt (436 mg, 3,21 mmol) y
10 DCC (3,2 ml, 1 M, 3,2 mmol). Después de agitar durante 30 minutos, la mezcla de reacción se trata con una solución en THF (13,6 ml) del compuesto v (499 mg, 2,72 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante unanoche, los sólidos de color blanco (urea) se filtran. Los filtrados se concentran al vacío, dando un residuo que sepurifica por cromatografía sobre gel de sílice, produciendo el compuesto clxx (0,99 g, 76%).
15 Ejemplo Intermedio 163 -compuesto clxxi:
Una solución en EtOH (20 ml) del compuesto clxx (0,99 g, 1,88 mmol) se trata con NaOH 2 N (2,81 ml, 5,63mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante una noche, la mezcla de reacción se acidifica a pH 3 con HCl 1 N. La mezcla de reacción se extrae con EtOAc (75 ml). La fase orgánica se seca y se concentra al vacío,dando el compuesto clxxi (772 mg, 82%).
Ejemplo Intermedio 164 -compuesto clxxi:
Una solución en DCM (10 ml) del compuesto clxxi (290 mg, 0,58 mmol) se trata con PyBOP (484 mg, 0,93mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 20 minutos, la mezcla de reacción se trata con unasolución en THF (7,5 ml) del compuesto xiii' (140 mg, 0,75 mmol), seguido de DIPEA (0,13 ml, 0,75 mmol). Después
25 de agitar durante una noche a temperatura ambiente, la reacción se interrumpe con agua y se extrae con EtOAc. La fase orgánica resultante se lava con salmuera, se seca y se concentra al vacío. El residuo resultante se purifica porcromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 5%/EtOAc), produciendo el compuesto clxxii 290 mg (75%).
Ejemplo Intermedio 165 -compuesto clxxiv:
El compuesto lxxxiii (600 mg, 1,17 mmol) se recoge en DCM (4 ml). Se añade PyBOP (670 mg, 1,3 mmol),
se agita durante cinco minutos y se enfría a 0ºC. A esta solución se le añade gota a gota el compuesto clxxiii (333
mg, 1,3 mmol)
en THF (13 ml). A la mezcla de reacción se le añade DIPEA (0,23 ml, 1,3 mmol) y se deja calentar a temperaturaambiente con agitación durante dos noches. Al día siguiente, la reacción se concentra y se purifica con EtOH al2%/EtOAc, dando el compuesto clxxiv en bruto (900 mg, exceso del 100%).
Ejemplo Intermedio 166 -compuesto clxxxv:
El compuesto cxxv (3,01 g, 10,7 mmol) se recoge en DCM (30 ml) y la temperatura se disminuye hasta ~78ºC. A esta solución se le añaden PyBOP (6,1 g, 11,7 mmol) y HOBT (1,58 g, 11,7 mmol) seguido de (S)-(+)-1ciclohexiletilamina, compuesto clxxv, (1,74 ml, 11,7 mmol) y DIPEA (2,1 ml, 11,7 mmol). La mezcla resultante se
15 agita durante una noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, la mezcla de reacción se diluye con EtOAc y se lava con HCl 0,1 N, NaHCO3 saturado y salmuera. El producto se purifica en EtOAc al 40%/Hex, dando 2 g (47,8%) del compuesto clxxvi.
Ejemplo Intermedio 167-compuesto clxxiii:
El compuesto clxxvi (2 g, 5,13 mmol) se hidrogena usando Pd al 10%/C (500 mg) en MeOH (40 ml). La
mezcla de reacción se agita durante una noche en atmósfera de H2. La mezcla de reacción se filtra a través de celite
y se concentra, dando el compuesto clxxiii (1,31 g, 99,8%).
Ejemplo Intermedio 168 -compuesto clxxix:
En un matraz de fondo redondo en una atmósfera inerte, se disuelve en compuesto clxxvii [1-bencil ésterdel ácido (S)-(-)-2-oxo-1,5-imidazolina dicarboxílico]
(290 mg, 1,1 mmol) en DMF anhidra (6 ml). Se añade HOAt (151 mg, 1,2 mmol) y la reacción se agita a temperatura
5 ambiente durante 25 minutos. Después, la reacción se enfría en un baño de hielo. Después, se añade DIC (0,2 ml, 0,16 g, 1,2 mmol) seguido de la adición del compuesto clxxviii (1 mmol, 435 mg.) en DMF anhidra (4 ml). Se deja quela reacción alcance lentamente la temperatura ambiente y se agita durante 2 días. Después, la reacción se vierte enun embudo de decantación que contiene 120 ml de EtOAc y se lava 2 veces con HCl 1 N (50 ml) y 1 vez consalmuera. La fase orgánica se separa y se seca sobre MgSO4. El disolvente se evapora a presión reducida y el
10 residuo se purifica por cromatografía sobre gel de sílice (cargado en DCM y eluyendo con EtOAc al 30% y después al 50%/DCM y después con MeOH al 2%/EtOAc), produciendo el producto clxxix (434 mg, 64%).
Ejemplo Intermedio 169 -compuesto clxxx:
El material de partida clxxix (434 mg, 0,64 mmol) se disuelve en dioxano (6 ml) y una solución acuosa 0,5 M
15 de NaOH (4 ml, 3 equiv.). La reacción se deja proceder durante una noche. El análisis por TLC en EtOAc al 100% (usando tinción con PMA) muestra además del producto ácido esperado del principio, un producto de realizaciónmás rápida. La mezcla de reacción se acidifica a pH 2 con HCl 1 N y después se extrae 2 veces con EtOAc. A lasolución acuosa se le añade NaCl sólido para facilitar la extracción. Después, los extractos orgánicos se combinan,se secan sobre MgSO4 y se evaporan a presión reducida. El análisis por EM indica que el grupo CBZ se retira por
20 hidrólisis. El compuesto resultante clxxx (rendimiento cuantitativo) se usa tal cual en la siguiente etapa.
Ejemplo Intermedio 170-compuesto clxxxi:
En un matraz de fondo redondo en una atmósfera inerte, el compuesto clxxx (279 mg, 0,54 mmol) sedisuelve en DMF anhidra (6 ml). Se añade HOAt (82 mg, 0,65 mmol) y la reacción se agita a temperatura ambiente25 durante 25 minutos. Después, la reacción se enfría en un baño de hielo. Después, se añade DIC (0,11 ml, 0,65
mmol), seguido de la adición del compuesto xiii' (0,7 mmol) en DMF anhidra (4 ml). Se deja que la reacción alcancelentamente la temperatura ambiente y se agita durante 21 horas. Después, la reacción se vierte en un embudo dedecantación que contiene 120 ml de EtOAc y se lava 2 veces con HCl 1 N (50 ml) y 1 vez con salmuera. La faseorgánica se separa y se seca sobre MgSO4. El disolvente se evapora a presión reducida y el producto se limpia porcromatografía sobre gel de sílice (cargado en DCM y eluyendo con EtOAc al 50%/Hexano, después MeOH al 3%/EtOAc, después EtOH al 20%/EtOAc). Después de la retirada del disolvente, el residuo se disuelve de nuevo enDri Solv THF y se filtra para retirar cualquier cantidad residual de gel de sílice. Después, la retirada del disolventeproduce el compuesto clxxxi (434 mg, 64% de rendimiento).
10 Ejemplo Intermedio 171 -compuesto clxxxiii: En un matraz de fondo redondo en una atmósfera inerte, se disuelve 6-hidroxi picolínico
(153 mg, 1,1 mmol) en DMF anhidra (6 ml). Se añade HOAt (151 mg, 1,2 mmol) y después la reacción se agita atemperatura ambiente durante 25 minutos. Después, la reacción se enfría en un baño de hielo. Después, se añade 15 DIC (0,2 ml, 0,16 g, 1,2 mmol) seguido de la adición del compuesto clxxxii (1,0 mmol, 435 mg.) en DMF anhidra (4 ml).
Se deja que la reacción alcance lentamente la temperatura ambiente y se agita durante 2 días. Después, la reacción se vierte en un embudo de decantación que contiene 120 ml de EtOAc y se lava 2 veces con HCl 1 N (50
20 ml) y 1 vez con salmuera. La fase orgánica se separa y se seca sobre MgSO4. El disolvente se evapora a presión reducida y el producto se purifica por cromatografía sobre gel de sílice (cargado en DCM, eluyendo con EtOAc al 30y después al 50%/DCM, y después con MeOH al 2%/EtOAc), produciendo el compuesto clxxxiii recogido (314 mg,56%).
25 Ejemplo Intermedio 172 -compuesto clxxxiv:
El material de partida clxxxiii (314 mg, 0,56 mmol) se disuelve en dioxano (5 ml) y NaOH 0,5 M (3,4 ml, 3equiv.). La reacción se realiza durante una noche. El análisis por TLC en EtOAc al 100% (usando UV) muestra laconversión completa en el producto ácido de realización lenta en el origen. La reacción se acidifica a pH 2 con HCl 1 N y después se extrae 2 veces con EtOAc. Se añade NaCl sólido para facilitar la extracción. Después, los extractosorgánicos se combinan, se secan sobre MgSO4 y después se evaporan a presión reducida, produciendo el compuesto clxxxiv (0,5 mmol, 89%) que se usa tal cual en la siguiente etapa.
5 Ejemplo Intermedio 173 -compuesto clxxxv:
En un matraz de fondo redondo en una atmósfera inerte, el compuesto ácido clxxxiv (265 mg, 0,5 mmol) sedisuelve en DMF anhidra (6 ml). Se añade HOAT (75,6 mg, 0,6 mmol) y la reacción se agita a temperatura ambientedurante 25 minutos. Después, la reacción se enfría en un baño de hielo. Después, se añade DIC (0,1 ml, 0,6 mmol)seguido de la adición del compuesto xiii’ (0,65 mmol) en DMF anhidra (4 ml). Se deja que la reacción alcance
10 lentamente la temperatura ambiente y se agita durante 21 horas. Después, la reacción se vierte en un embudo de decantación que contiene EtOAc (120 ml) y se lava 2 veces con HCl 1 N (50 ml) y 1 vez con salmuera. La faseorgánica se separa y se seca sobre MgSO4. El disolvente se evapora a presión reducida y el producto se purifica porcromatografía sobre gel de sílice (cargado en DCM, eluyendo con EtOAc al 50%/Hexano, después con EtOAc puro y después con MeOH al 4%/EtOAc), produciendo el producto compuesto clxxxv (185 mg, 52%).
Ejemplo Intermedio 174 -compuesto cxxxxiv':
A una solución de D-alanina (5 g, 56,1 mmol) en NaOH 1 N (152 ml, 152 mmol) a 0ºC se le añade una solución de MeOC(O)Cl (6,5 ml, 84,2 mmol) en éter dietílico (30 ml). La mezcla se agita en un baño de hielo durante3 horas y después se ajusta a pH 9 con NaOH 1 N. Después de agitar a temperatura ambiente durante 1 hora, la
20 mezcla se lava con éter (3 x 50 ml), se acidifica a pH ~2 con HCl 5 N y se extrae con EtOAc (5 x 50 ml). El extracto orgánico se lava con agua y salmuera y después se seca (MgSO4). El disolvente se retira, produciendo el compuestocxxxiv, N-metoxicarbonil-D-alanina, en forma de un aceite incoloro (6,48 g, 79%).
Ejemplo Intermedio 175 -compuesto clxxxvi:
25 Una solución de N-metoxicarbonil-D-alanina (0,193 g, 1,31 mmol) y HOAt (0,177 g, 1,31 mmol) en DCM (10 ml) enfriada en un baño de hielo se trata con DCC (1,31 ml, 1,31 mmol). Después de agitar en un baño de hielodurante 0,5 horas, se añade una solución del compuesto preparado clxxxii (0,88 mmol) en THF (8,8 ml). La mezclase calienta a temperatura ambiente y se agita durante una noche, después se enfría en un baño de hielo y seinterrumpe con una solución saturada de NaHCO3. Los precipitados se filtran y el filtrado se recoge en EtOAc (100
30 ml). La fase orgánica se lava con una solución saturada de NaHCO3 y salmuera y después se seca (MgSO4).Después de la retirada del disolvente, el residuo se purifica por cromatografía en columna de sílice (EtOAc al60%/Hexano), produciendo el compuesto clxxxvi en forma de una espuma gomosa (0,32 1 g, 68%).
Ejemplo Intermedio 176 -compuesto clxxxvii:
A una solución del compuesto clxxxvi (0,321 g, 0,597 mmol) en EtOH (5 ml) a 5ºC se le añade NaOH 2 N(1,05 ml, 2,1 mmol). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 4 horas. La solución se acidifica a pH ~2con HCl 1 N y el EtOH se retira por evaporación rotatoria. La mezcla se extrae con EtOAc (3 x 30 ml) y el extracto combinado se lava con salmuera y después se seca MgSO4. El disolvente se retira y el residuo se seca al vacío,dando el compuesto clxxxvii en forma de una espuma gomosa (0,235 g, 77%).
Ejemplo Intermedio 177 -compuesto clxxxviii:
10 Una solución del compuesto clxxxvii (0,363 g, 0,712 mmol) en DCM (10 ml) se enfría en un baño de hielo y se trata con PyBOP (0,594 g 1,14 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 0,5 horas, la mezcla seenfría en un baño de hielo y se trata con una solución del compuesto xiii' (1,1 mmol) en THF (11 ml) y DIPEA (0,249 ml, 1,42 mmol). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante una noche y se interrumpe con una solución deNH4Cl. El disolvente se concentra y la mezcla se recoge en EtOAc (100 ml). La fase orgánica se lava con una
15 solución saturada de NaHCO3 y salmuera y después se seca (MgSO4). Después de la retirada del disolvente, el residuo se purifica por cromatografía en columna (EtOH al 5%/EtOAc), dando clxxviii (0,341 g, 71%).
Ejemplo Intermedio 178 -compuesto clxxxix:
Se recoge ácido diaminopropiónico (3 g, 28,7 mmol) en NaOH 1 M (86,2 ml, 86,2 mmol), se enfría a 0ºC y después se añade MeOC(O)Cl (5,54 ml, 71,75 mmol) en Et2O(25 ml). La mezcla resultante se agita durante una
20 noche con calentamiento a temperatura ambiente. El pH de la mezcla de reacción se disminuye hasta 2 y la fase acuosa se extrae 3 veces con EtOAc. Los extractos se combinan y se secan sobre Na2SO4, se filtran y se concentran, produciendo el compuesto clxxxix (3,09 g, 48,9%).
Ejemplo Intermedio 179 -compuesto cc:
El compuesto clxxxix (340 mg, 1,55 mmol) se recoge en DCM (4 ml). Se añaden DCC (1,7 mmol) y HOAt (235 mg 1,7 mmol) seguido del compuesto clxxxii (1,7 mmol) en DCM (3,4 ml). La mezcla de reacción se agitadurante una noche. Al día siguiente, la mezcla de reacción se filtra a través de una capa de sílice y se concentra. Lapurificación se realiza en EtOAc al 75%/Hex, dando el compuesto clxxxx (715 mg, 72,4%).
Ejemplo Intermedio 180 -compuesto clxxxxi:
El compuesto clxxxx (715 mg, 1,12 mmol) se hidroliza en condiciones convencionales usando EtOH (4 ml) y NaOH 1 N (3 equiv.), produciendo el compuesto clxxxxi (600 mg, 88,0%).
Ejemplo Intermedio 181 -compuesto clxxxxii:
El compuesto clxxxxi (550 mg, 0,9 mmol) se recoge en DCM (8 ml). Se añade PyBOP (675 mg, 1,3 mmol)seguido del compuesto xiii' (1,3 mmol) en THF (1,3 ml). Se añade DIPEA (0,23 ml, 1,3 mmol) y la solución resultantese agita durante una noche. Al día siguiente, la reacción se diluye con EtOAc y se lava con NaHCO3 saturado y
10 después con salmuera, antes de concentrarse, produciendo un residuo. El residuo resultante se purifica con EtOH al 5%/EtOAc, produciendo el compuesto clxxxxii (290 mg, 41,5%).
Ejemplo Intermedio 182 -compuesto clxxxxiii:
Se hidroliza éster metílico de Cbz-ciclohexiglicina-terc-leucina (7,36 g, 17,6 mmol) en condiciones15 convencionales usando MeOH (60 ml) y NaOH 1 N (52,8 ml, 3 equiv.), produciendo intermedio clxxxxiii (92%).
Ejemplo Intermedio 183 -compuesto clxxxxiv:
El compuesto clxxxxiii (3,82 g, 9,46 mmol) se recoge en DCM (30 ml). Se añade DCC (11,35 mmol) enDCM (11,35 ml), seguido de la adición de HOAt (1,54 g, 11,35 mmol). La mezcla resultante se agita cinco minutos y se añade el compuesto v (9,46 mmol) en THF (40 ml). La mezcla resultante se agita durante una noche. Al díasiguiente, la mezcla de reacción se diluye con EtOAc y se lava con HCl 1 N, NaHCO3 saturado y después con salmuera, antes de concentrarse, produciendo un residuo. El residuo resultante se purifica con un gradiente del 20% al 30% sobre gel de sílice, dando el compuesto clxxxxiv (3,03 g, 56,3%).
Ejemplo Intermedio 183-compuesto clxxxii:
10 El compuesto clxxxxiv (3,03 g, 5,33 mmol) se hidrogena usando Pd al 10%/C (500 mg) en MeOH (30 ml) en atmósfera de H2 durante 4 horas, produciendo el compuesto clxxxii (2,3 g, 99%).
Ejemplo Intermedio 184-compuesto clxxxxv:
A una solución de ácido 1-amino-1-ciclohexanocarboxílico (2,86 g, 20 mmol) en MeOH (40 ml) se le añadegota a gota SOCl2 (3 ml) a 0ºC. La mezcla se calienta lentamente a temperatura ambiente y después se calienta a 15 reflujo durante 5 horas. Después, a la solución transparente se le añade Et2O y el precipitado se aísla. El sólido se
seca adicionalmente al vacío, produciendo el compuesto clxxxxv (95%) en forma de un polvo de color blanco.
Ejemplo Intermedio 185 -compuesto clxxxxvi:
Se disuelve ácido 2-pirazinacarboxílico (1 g, 8 mmol, 1 equiv.) en DCM (15 ml) con la adición de HOAt (1,1
20 g, 8 mmol) y DCC (8 ml, 1 M) en DCM. Después de agitar a temperatura ambiente durante 20 minutos, a la mezcla activada se le añade el compuesto clxxxxv (1,3 g, 8 mmol). Posteriormente, se añade DIPEA (2 ml, 12 mmol), seguido de DMAP (1,5 g, 12 mmol). Después de agitar durante 3 días a temperatura ambiente, la mezcla dereacción se filtra a través de celite, se concentra y el producto deseado clxxxxvi se purifica por cromatografía encolumna (EtOAc al 50%/hexano) en forma de un aceite de color amarillo (2,1 g, 100%).
Ejemplo Intermedio 186 -compuesto clxxxxvii:
El compuesto clxxxxvi (1,06 g, 2,6 mmol) se disuelve en MeOH (30 ml) con la adición de NaOH 2 N (ac.)(12 ml, 24 mmol). La solución se agita a temperatura ambiente durante una noche antes de que el análisis por TLC(EtOAc al 50%/hexano) indique que la hidrólisis se ha completado. Después, la solución se acidifica a pH 3 con HCl
30 5 N y se diluye con EtOAc y seguido de extracción de la fase orgánica. Posteriormente, la fase orgánica se lava con salmuera y se seca sobre MgSO4, produciendo el compuesto clxxxxvii (84%) después de la concentración.
Ejemplo Intermedio 187 -compuesto clxxxxviii:
El compuesto clxxxvii (1,6 g, 6,4 mmol) se disuelve en DCM (18 ml) y después se añaden HOAt (0,96 g, 7mmol) y DCC (7 ml, 1 M en DCM) a temperatura ambiente. Después de agitar a temperatura ambiente durante 20minutos, a la mezcla activada se le añade clorhidrato de éster metílico de L-terc-leucina (7 ml, 1 M en THF). Posteriormente, se añade DIPEA (1,2 ml, 7 mmol), seguido de DMAP (1,2 g, 9,8 mmol). Después de agitar durante 3días a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtra a través de celite, se purifica por cromatografía encolumna y se concentra, produciendo el compuesto clxxxxviii (EtOAc al 60%/hexano) en forma de un sólido de colorblanco (1,74 g, 72%).
Ejemplo Intermedio 188 -compuesto cic:
El compuesto clxxxxviii (1,74 g, 4,6 mmol) se disuelve en MeOH (22 ml) con adición de NaOH 2 N (ac.) (7 ml, 14 mmol). La solución se agita a temperatura ambiente durante una noche antes de que el análisis por TLC(EtOAc al 30%/hexano) indique que la hidrólisis se ha completado. La solución se acidifica a pH 3 con HCl 5 N y se
15 diluye con EtOAc y después se extrae la fase orgánica. La fase orgánica se lava con salmuera, se seca sobre MgSO4 y después se concentra, produciendo el compuesto cic (100%).
Ejemplo Intermedio 189 -compuesto cc:
A una solución en DCM (15 ml) del compuesto cic (1,5 g, 4,1 mmol) a temperatura ambiente se le añade
20 HOAt (610 mg, 4,5 mmol), seguido de una solución 1 M de DCC en DCM (4,5 ml, 4,5 mmol). Después de agitar durante 30 minutos a temperatura ambiente, y después se añade una solución en THF (20 ml, 0,2 M) del compuestov (4 mmol). La reacción se agita a temperatura ambiente durante una noche. Después, la reacción se filtra a travésde celite. El filtrado se concentra para dar un aceite de color amarillo que se purifica por cromatografía sobre gel desílice (EtOAc al 50%/hexano), produciendo el compuesto cci (660 mg, 32%).
Ejemplo Intermedio 190 -compuesto cci: A una solución en EtOH (6 ml) del compuesto cc (600 mg, 1,13 mmol) se le añade NaOH 2 N (1,7 ml, 3,4
mmol). La reacción se agita durante 2 horas a temperatura ambiente y después se acidifica a pH 3 con HCl 5 N.Después, la mezcla se diluye con EtOAc, seguido de la extracción de la fase orgánica. Posteriormente, la faseorgánica se lava con salmuera y después se seca sobre MgSO4, produciendo el compuesto cci (92%) después de la concentración.
Ejemplo Intermedio 191 -compuesto ccii:
A una solución en DCM (8 ml) de ccii (310 mg, 0,62 mmol) se le añade PyBOP (420 mg, 0,8 mmol). Lasolución se agita a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después, a esta solución se le añade el compuestoxiii' (8 ml, 0,1 M) en THF, seguido por la adición de DIPEA (0,23 ml, 1,3 mmol). La reacción se agita a temperatura
10 ambiente durante una noche y después se interrumpe con agua (25 ml) durante 30 minutos. Después, la mezcla se extrae con EtOAc. La fase orgánica resultante se lava con salmuera y después se seca sobre MgSO4 antes de concentrarse, produciendo un aceite de color amarillo. La purificación por cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al3%/EtOAc) produce el compuesto ccii (140 mg, 33%).
15 Ejemplo Intermedio 192 -compuesto ccxiv
A una solución del compuesto cciii, (N-difenilmetileno)-glicina éster de terc-butilo, (6 g, 0,0206 mmol) y PTC quiral (1,08 g, 0,00206 mmol) en DCM seco (48 ml), en atmósfera de N2, a -60ºC, se le añade CsOH·H2O (6,9 g,0,0412 mmol). A la mezcla de reacción se le añade gota a gota éster metílico de 1-carboxi-1-ciclopenteno (5,2 ml,0,0412 mmol) en 10 ml de DCM. La mezcla se agita durante 4 días a -60ºC y después se diluye con 200 ml de Et2O
20 y se añaden 15 ml de una solución acuosa saturada de NH4Cl. Las fases se separan y la fase orgánica se lava con 15 ml de agua y 15 ml de salmuera. Las fases acuosas se extraen con 100 ml de Et2O. Las fases orgánicas se unen y se secan sobre Na2SO4. El producto en bruto se obtiene por retirada del disolvente, se disuelve en 100 ml de EtOHy después se añaden NH2OH·HCl (1,43 g, 0,0206 mmol) y NaOAc (1,68 g, 0,0206 mmol). La mezcla se calienta areflujo durante 48 horas. Después, el disolvente se retira y el residuo en bruto obtenido se purifica directamente por
25 cromatografía ultrarrápida eluyendo con EtOAc al 30%-50%/hexano, produciendo el compuesto cciv (65%) en forma de un sólido de color blanco. C12H19NO3 (PM = 225,29); EM: m/z (M+ 1) = 226,5. Exceso Enantiomérico: 18% de ee, determinado por HPLC quiral.
Ejemplo Intermedio 193 -compuesto ccv
30 A una solución del compuesto cciv (2 g, 0,0088 mmol) en 60 ml de ACN se le añaden una cantidad catalítica de DMAP (0,216 g, 0,0017 mmol) y una solución de dicarbonato de di-terc-butilo (2,49 g, 0,011 mmol) en30 ml de ACN La mezcla se agita durante 14 horas a temperatura ambiente, después se diluye con 100 ml de DCMy se lava con NaHCO3 saturado (10 ml) y con salmuera (10 ml). La fase orgánica se seca sobre Na2SO4. La evaporación del disolvente produce un producto en bruto que se purifica sobre una columna de gel de sílice
35 eluyendo con EtOAc al 15%/hexano, dando el compuesto ccv (86%) en forma de un sólido de color blanco. C17H27NO5 PM = 325,40 EM: m/z (M+ + 1) = 326,2
Ejemplo Intermedio 194 -compuesto ccvi
A una solución del compuesto ccv (1,7 g, 0,0052 mmol) en 50 ml de THF (0,14 M) a -78ºC se le añadeDIBAL-H (7,8 ml, 0,0078 mmol). La mezcla se agita durante 1 hora y después se añaden 10 ml de MeOH. La mezcla se diluye con 25 ml de EtOAc y 25 ml de una solución acuosa saturada de tartrato sódico, y después se agita a temperatura ambiente durante una hora. Las fases se separan y la fase acuosa se extrae una vez con 50 ml deEtOAc. Las fases orgánicas se combinan y se secan sobre Na2SO4. La evaporación del disolvente da un residuo enbruto que se usa sin purificación. El producto en bruto se disuelve en 25 ml de DCM, se añade Et3Si (0,84 ml, 0,0052mmol) y después la mezcla se enfría a -78ºC antes de la adición gota a gota de BF3OEt2 (0,71 ml, 0,0061 mmol). Después de 30 minutos, se añaden Et3Si (0,84 ml) y BF3OEt2 (0,71 ml) y la mezcla se agita durante 2 horas a -78ºC. Después, la reacción se interrumpe con NaHCO3 acuoso saturado (10 ml) y se extrae con DCM (2 x 20 ml). Lasfases orgánicas se combinan y se secan sobre Na2SO4. La evaporación del disolvente da un residuo en bruto que sepurifica por cromatografía ultrarrápida eluyendo con EtOAc al 13%/hexano, produciendo el compuesto ccvi (87%).C17H29NO4 PM = 311,42 EM: m/z (M+ + 1) = 312,6
Ejemplo Intermedio 195 -compuesto ccvii
El compuesto ccvi (0,5 g, 0,0016 mmol) se disuelve en 8 ml de HCl 1 N en EtOAc (preparado burbujeandoHCl seco en EtOAc seco y después diluyéndolo a 1 N con más cantidad de EtOAc). La mezcla se agita durante 6horas a temperatura ambiente. El disolvente se retira al vacío y el precipitado resultante se disuelve en Et2O. Después de agitar la mezcla durante 15 minutos, el disolvente se retira a presión reducida. El sólido de color blanco resultante se lava con Et2O y el compuesto ccvii (0,27 g, 80% de rendimiento) se aísla por filtración. C12H21NO2 PM 211,15 EM: m/z (M+ + 1) = 212,6
Ejemplo Intermedio 196 -compuesto v
A una solución del compuesto ccxvi (0,230 g, 0, 74 mmol) en DCM (3,7 ml) se le añade TFA (2,85 ml). La mezcla se agita durante una noche, después el disolvente se retira al vacío a sequedad y el residuo se disuelve enEtOH (7,5 ml). La mezcla se enfría a 0ºC, se añade gota a gota SOCl2 (0,22 ml, 2,96 mmol) y después se calienta areflujo durante 2 horas. El EtOH se retira a presión reducida y el residuo se disuelve en DCM (10 ml). La soluciónresultante se lava dos veces con una solución saturada acuosa de NaHCO3 (5 ml). Las fases se separan, la fase orgánica se seca sobre Na2SO4 y el disolvente se retira al vacío, produciendo el compuesto v (80%) en forma de un aceite. C10H17NO2 PM: 183,25 MS: m/z (M+ + 1) 184,2
Ejemplo Intermedio 197 -compuesto cd
Se recoge 1-bencilimidazol (6 g, 37,9 mmol) en Et2O (180 ml). La temperatura de la solución resultante se disminuye hasta -60ºC y se trata con n-BuLi (1,6 M, 24 ml). La reacción se agita durante 30 minutos y después se burbujea CO2 a través de la mezcla durante 15 minutos. El precipitado se filtra, se aclara con Et2O y después se recoge en H2O. Esta solución acuosa se acidifica a pH 3 con HCl 5 N. El producto deseado, cd, se aísla después dela liofilización en forma de un sólido de color blanco.
Ejemplo Intermedio 198 -compuesto cdi
Una solución en DCM (100 ml) del compuesto i (9,25 g, 27,9 mmol) se trata a 0ºC con DAST (9,2 ml, 69,8mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante una noche, la reacción se interrumpe con hielo y se5 extrae con DCM (200 ml). La fase orgánica se lava con salmuera y se concentra al vacío. El residuo se purifica con cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 30%/hexanos), produciendo 8,5 g (86%) del intermedio fluoradodeseado. Una porción de este intermedio (4,5 g, 14,2 mmol) se disuelve en EtOH (75 ml). Esta solución se somete acondiciones de hidrogenación convencionales usando Pd (OH)2/C (2,98 g, contenido de Pd al 20%, 4,26 mmol).Después de agitar durante una noche a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtra a través de Celite. Los
10 filtrados se concentran al vacío, produciendo el compuesto cdi (2,5 g, 96%).
Ejemplo Intermedio 199 -compuesto cdii
A una solución del compuesto cd (890 mg, 4,4 mmol) recogido en DCM (15 ml) se le añaden HOBT (595mg, 4,4 mmol) y DCC (4,4 mmol, I M en DCM) y se agita durante 20 minutos. A esta mezcla se le añade una
15 solución en DCM (15 ml) de lxxix' (990 mg, 3,5 mmol). La mezcla resultante se agita durante una noche en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se diluye con EtOAc y se lava con NaHCO3 saturado y salmuera. Lafase orgánica se concentra al vacío, dando un residuo, que se purifica en EtOAc al 30%/Hexanos, produciendo elcompuesto cdii (666 mg, 41%).
20 Ejemplo Intermedio 200 -compuesto cdiii
El compuesto cdiii se prepara a partir del compuesto cdii en condiciones de hidrólisis convencionalesusando alcohol metílico (10 ml) y NaOH 1 N (3 equiv.). Se recuperan 565 mg del compuesto cdiii (88%).
Ejemplo Intermedio 201 -compuesto cdiv
El compuesto cdiii (124 mmol) se recoge en DCM (5 ml). Se añade DCC (1,6 mmol, DCM 1 M) seguido deHOAT (1,6 mmol). La mezcla resultante se agita 20 minutos y
se añade gota a gota el compuesto cdi (1,6 mmol) en THF (8 ml). La reacción se agita durante una noche. Lareacción se filtra y se aclara con EtOAc. La fase orgánica combinada se lava con NaHCO3 saturado y salmuera, se seca sobre MgSO4 y se concentra. La purificación se realiza en EtOAc al 30%/Hexanos, produciendo el compuestocdiv (565 mg, 70%).
10 Ejemplo Intermedio 202 -cdv
El compuesto cdv (565 mg, 0,86 mmol) se prepara a partir del compuesto cdiv en condiciones de hidrólisisconvencionales usando alcohol etílico (10 ml) y NaOH 1 N (3 equiv.). Se recuperan 490 mg (91%) del compuestocdv.
15 Ejemplo Intermedio 203 -cdvi
El compuesto cdv (490 mg, 0,78 mmol) se recoge en DCM (10 ml). A la solución en DCM se le añade PyBOP (520 mg, 1 mmol) seguido de una solución en THF (10 ml) de xiii (186 mg, 1 mmol). A la mezcla de reacción se le añade DIEA (0,18 ml, 1 mmol) y se agita durante una noche en atmósfera de nitrógeno. Al día siguiente, lareacción se diluye con EtOAc y se lava con NaHCO3 saturado y salmuera. La purificación se realiza en EtOAc al
20 100%, produciendo el compuesto cdvi (478 mg, 77%).
Ejemplo Intermedio 204 -cdvii
El compuesto cdvi (478 mg, 0,6 mmol) se hidrogena usando Pd(OH2)/C (base seca al 20%, 100 mg) en
MeOH (40 ml). La mezcla de reacción se agita durante una noche en atmósfera de hidrógeno. En este momento, la
mezcla de reacción se filtra a través de Celite y se concentra, produciendo el compuesto cdvii (417 mg, 98%).
Ejemplo Intermedio 205-cdx
El compuesto cxxv (adquirido en Albany Molecular Research Inc., 15 g, 5,2 mmol) se recoge en DCM (15ml). A esta solución se le añaden PyBOP (2,7 g, 5,2 mmol) y HOBT (700 mg, 5,2 mmol). A la solución anterior se le
10 añade una solución en THF (15 ml) de (-)-alfa-(4-piridil)etil amina (640 mg, 5,2 mmol), seguido de DIEA (0,93 ml, 5,2 mmol). [La (-)-alfa-(4-piridil)etil amina se obtiene a partir de la sal tartrato de (-)-alfa-(4-piridil)etil amina (Aldrich) por agitación con NaOH 1 N (2 equiv.) durante 1 hora seguido de extracción con EtOAc (3 x), recuperación del 70%]. Lareacción se agita durante una noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se lava con NaHCO3 saturado y salmuera. El producto se purifica en EtOH al 5%/EtOAc, produciendo 2 g (99%) del compuesto intermedio cdx.
Ejemplo Intermedio 206 -cdviii
El compuesto cdx (2 g, 5,2 mmol) se hidrogena usando Pd al 10%/C (500 mg) en MeOH (50 ml). La mezclade reacción se agita durante una noche en atmósfera de hidrógeno. El producto se filtra a través de celite y seconcentra, dando el compuesto cdviii (1,3 g, 98%).
Farmacología
Los compuestos de acuerdo con la invención descritos en este documento son útiles porque pueden inhibirla proteasa de VHC y, por lo tanto, también son útiles para inhibir la replicación del VHC.
Por consiguiente, una invención del presente documento se refiere al uso de los compuestos de acuerdocon la invención en la fabricación de un medicamento para inhibir proteasas de VHC que comprende poner encontacto una cantidad inhibidora anti-proteasa de VHC de un compuesto BW o CU con una composición quecomprende proteasa de VHC.
Otra invención del presente documento se refiere al uso de los compuestos de acuerdo con la invención enla fabricación de un medicamento para inhibir la replicación de VHC, que comprende poner contacto VHC con unacantidad eficaz de un compuesto BW o CU. Además, otra invención del presente documento se refiere al uso de loscompuestos de acuerdo con la invención en la fabricación de un medicamento para tratar a un paciente que padece
o está expuesto a una infección por VHC, que comprende administrar al paciente una cantidad farmacéuticamenteeficaz de compuesto BW o CU. Debe entenderse que las referencias en este documento al tratamiento de unainfección por VHC incluyen terapia profiláctica para prevenir o inhibir la infección así como el tratamiento de unainfección aguda o crónica por VHC establecida o situaciones fisiológicas asociadas con la infección por VHCpara curar la infección en el paciente, inhibir el grado (cantidad) de infección o mejorar las condiciones fisiológicasasociadas con dicha infección. Se entiende que “cantidad eficaz” describe una cantidad del compuesto de la presente invención eficaz dentro del alcance de un criterio biológico razonable, adecuada para uso en contacto conlas células de seres humanos y otros mamíferos sin toxicidad indebida, irritación, respuesta alérgica y similares, y que está proporcionada con una relación razonable de beneficios/riesgos en el tratamiento de una infección por VHCy, por lo tanto, que produce el efecto terapéutico deseado.
Las situaciones fisiológicas descritas en este documento incluyen algunas, pero no todas las situacionesclínicas posibles en las que se justifica un tratamiento anti-VHC. Los especialistas en este campo serán conscientesde las circunstancias que requieren un tratamiento anti-VHC.
Un aspecto particular de la invención proporciona un compuesto de acuerdo con la invención que deberá administrarse en forma de una composición farmacéutica, aunque el compuesto puede administrarse solo.“Composición farmacéutica” significa una composición que comprende un compuesto BW o CU y al menos uncomponente seleccionado entre el grupo que comprende soportes, diluyentes, recubrimientos, adyuvantes, excipientes, o vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como agentes conservantes, cargas, agentesdisgregantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes estabilizadores de la emulsión, agentes desuspensión, agentes isotónicos, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes de perfume, agentescolorantes, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, otros agentes terapéuticos, agentes lubricantes, agentes para promover o retrasar la adsorción y agentes de distribución, dependiendo de la naturaleza del modo de administración y las formas farmacéuticas. Las composiciones pueden presentarse en forma de comprimidos, píldoras, gránulos, polvos, soluciones o suspensiones acuosas, soluciones inyectables, elixires o jarabes. Losejemplos de agentes de suspensión incluyen alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilen-sorbitol y ésteres desorbitano, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, o mezclas de estassustancias. Los ejemplos de agentes antibacterianos y antifúngicos para la prevención de la acción de microorganismos incluyen parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. Los ejemplos de agentesisotónicos incluyen azúcares, cloruro sódico y similares. Los ejemplos de agentes para retrasar la adsorción paraprolongar la absorción incluyen monoestearato de aluminio y gelatina. Los ejemplos de agentes promotores de laadsorción para mejorar la absorción incluyen dimetil sulfóxido y análogos relacionados. Los ejemplos de soportes,diluyentes, disolventes, vehículos, agentes solubilizantes, emulsionantes y estabilizadores de la emulsión incluyenagua, cloroformo, sacarosa, etanol, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, alcoholtetrahidrofurfurílico, polioles de benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, glicerol, polietilenglicoles, dimetilformamida, Tween® 60, Span® 80, alcohol cetoestearílico, alcohol miristílico, monoestearato de glicerilo y lauril sulfato sódico, ésteres de ácidos grasos de sorbitán, aceites vegetales (tales como aceite de algodón, aceite de cacahuete, aceite de germen de maíz, aceite de oliva, aceite de ricino y aceite de sésamo) y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo y similares, o mezclas adecuadas de estas sustancias. Los excipientesilustrativos incluyen lactosa, azúcar de la leche, citrato sódico, carbonato cálcico y fosfato dicálcico. Los ejemplos deagentes disgregantes incluyen almidón, ácidos algínicos y ciertos silicatos complejos. Los ejemplos de lubricantesincluyen estearato de magnesio, laurilsulfato sódico, talco, así como polietilenglicoles de alto peso molecular.
Pueden usarse otros agentes terapéuticos en combinación con un compuesto de la presente invención,incluyendo otros agentes anti-VHC. Algunos ejemplos de agentes anti-VHC conocidos incluyen agentes inmunomoduladores tales como interferones a, 1 o y; compuestos de interferón-a modificados pegilados, otrosagentes antivirales tales como ribavirina y amantadina; otros inhibidores de proteasa de hepatitis C; inhibidores deotras dianas en el ciclo de vida del VHC incluyendo la helicasa, polimerasa, metaloproteasa, la entrada de ribosomasinternos o compuestos antivirales de amplio espectro tales como VX 497, un inhibidor de la inosina monofosfatodeshidrogenasa celular, IMPDH, mencionado por la Patente de Estados Unidos Nº 5.807.876; o combinaciones delos mismos. Los agentes terapéuticos usados en combinación con un compuesto de la presente invención pueden administrarse por separado, de forma simultánea o secuencial.
La elección de un material en la composición farmacéutica distinto del compuesto BW o CU generalmentese determina de acuerdo con propiedades químicas del compuesto activo tales como solubilidad, el modo particularde administración y las disposiciones a cumplir en la práctica farmacéutica. Por ejemplo, para preparar comprimidospueden usarse excipientes tales como lactosa, citrato sódico, carbonato cálcico, fosfato dicálcico y agentesdisgregantes tales como almidón, ácidos algínicos y ciertos silicatos complejos combinados con lubricantes talescomo estearato de magnesio, lauril sulfato sódico y talco.
Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse en formas diversas tales como comprimidos, píldoras, gránulos, polvos, soluciones o suspensiones acuosas, soluciones inyectables, elixires o jarabes.
“Forma de dosificación líquida” significa que la dosis del compuesto activo a administrar al paciente está enforma líquida, por ejemplo, emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables.Además de los compuestos activos, las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes usadoscomúnmente en la técnica tales como disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes.
También pueden emplearse composiciones sólidas como cargas en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando excipientes talescomo lactosa o azúcar de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso moleculary similares.
Cuando se usan suspensiones acuosas, pueden contener agentes emulsionantes o agentes que faciliten lasuspensión.
La fase oleosa de la composición farmacéutica en emulsión puede constituirse a partir de ingredientesconocidos de una manera conocida. Aunque la fase puede comprender simplemente un emulsionante (conocido deotra manera como emulgente), deseablemente comprende una mezcla de al menos un emulsionante con una grasa
o un aceite o tanto con una grasa como con un aceite. Preferiblemente, se incluye un emulsionante hidrófilo juntocon un emulsionante lipófilo que actúa como estabilizante. También se prefiere incluir tanto un aceite como unagrasa. Conjuntamente, el o los emulsionantes con o sin el o los estabilizantes constituyen la cera emulsionante, y éstos junto con el aceite y la grasa constituyen la base de pomada emulsionante que forma la fase dispersa oleosade las formulaciones en crema.
Si se desea, la fase acuosa de la base de crema puede incluir, por ejemplo, al menos un 30% p/p de unalcohol polihidroxílico, es decir, un alcohol que tiene dos o más grupos hidroxilo tal como propilenglicol, butano-1,3diol, manitol, sorbitol, glicerol y polietilenglicol (incluyendo PEG 400) y mezclas de los mismos. Las formulacionestópicas deseablemente pueden incluir un compuesto que aumenta la absorción o penetración del ingrediente activoa través de la piel u otras áreas afectadas.
La elección de los aceites o grasas adecuados para una formulación se basa en conseguir las propiedadescosméticas deseadas. De esta manera, la crema preferiblemente debe ser no grasa, no debe manchar y debe ser unproducto lavable con consistencia adecuada para evitar las fugas desde tubos u otros recipientes. Pueden usarseésteres alquílicos mono o dibásicos de cadena lineal o ramificada tales como miristato de diisopropilo, oleato dedecilo, palmitato de isopropilo, estearato de butilo, palmitato de 2-etilhexilo o una mezcla de ésteres de cadenaramificada conocida como Crodamol CAP. Éstos pueden usarse solos o en combinación dependiendo de laspropiedades necesarias. Como alternativa, pueden usarse lípidos con un alto punto de fusión tales como parafina blanda blancay/o parafina líquida u otros aceites minerales.
En la práctica, un compuesto/composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse enuna formulación adecuada a seres humanos y animales mediante administración tópica o sistémica, incluyendo lavía oral, por inhalación, rectal, nasal, bucal, sublingual, vaginal, colónica, parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal y epidural), intracisternal e intraperitoneal. Se apreciará que la víapreferida puede variar, por ejemplo, con el estado del receptor.
“Formas de dosificación farmacéuticamente aceptables” se refiere a formas de dosificación del compuestode la invención e incluye, por ejemplo, comprimidos, grageas, polvos, elixires, jarabes, preparaciones líquidas,incluyendo suspensiones, pulverizaciones, inhaladores, comprimidos, pastillas, emulsiones, soluciones, gránulos,cápsulas y supositorios, así como preparaciones líquidas para inyección, incluyendo preparaciones de liposomas.Pueden encontrarse técnicas y formulaciones, en general, en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.
Las “formulaciones adecuadas para administración oral” pueden presentarse como unidades discretas talescomo cápsulas, obleas o comprimidos que contienen, cada uno, una cantidad predeterminada del ingrediente activo;como un polvo o gránulos; como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o un líquido no acuoso; ocomo una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite. Los ingredientes activostambién pueden presentarse como un bolo, electuario o pasta.
Un comprimido puede obtenerse por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientesauxiliares. Los comprimidos de compresión pueden prepararse comprimiendo en una máquina adecuada el ingrediente activo en una forma fluida tal como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con un aglutinante,lubricante, diluyente inerte, conservante, tensioactivo o agente de dispersión. Los comprimidos moldeados puedenobtenerse por moldeo en una máquina adecuada de una mezcla de los compuestos en polvo humedecidos con undiluyente líquido inerte. Los comprimidos opcionalmente pueden recubrirse o marcarse y se pueden formular paraproporcionar la liberación lenta o controlada del ingrediente activo contenido en los mismos.
Las composiciones sólidas para administración rectal incluyen supositorios formulados de acuerdo conprocedimientos conocidos y que contienen al menos un compuesto de la invención.
Si se desea, y para una distribución más eficaz, los compuestos pueden microencapsularse o unirse a unsistema de liberación lenta o de liberación dirigida tal como una matriz polimérica biodegradable biocompatible (porejemplo, poli(d,l-lactida co-glicolida)), liposomas y microesferas e inyectarse por vía subcutánea o intramuscular poruna técnica denominada depósito subcutáneo o intramuscular para proporcionar la liberación lenta continua delcompuesto o los compuestos durante un período de 2 semanas o más. Los compuestos pueden esterilizarse, porejemplo, por filtración a través de un filtro que retiene bacterias o incorporando agentes de esterilización en forma decomposiciones sólidas estériles que pueden disolverse en agua estéril, o algún otro medio inyectable estéril inmediatamente antes del uso.
“Formulaciones adecuadas para administración nasal o por inhalación” significa formulaciones que están enuna forma adecuada para administrarse por vía nasal o por inhalación a un paciente. La formulación puede contenerun vehículo, en forma de polvo, que tiene un tamaño de partículas, por ejemplo, en el intervalo de 1 a 500micrómetros (incluyendo tamaños de partículas en un intervalo comprendido entre 20 y 500 micrómetros en incrementos de 5 micrómetros tales como 30 micrómetros, 35 micrómetros, etc.). Las formulaciones adecuadas enlas que el vehículo es un líquido para la administración, por ejemplo, como una pulverización nasal o como gotas nasales, incluyen soluciones acuosas u oleosas del ingrediente activo. Pueden prepararse formulaciones adecuadaspara la administración en aerosol de acuerdo con procedimientos convencionales y pueden administrarse con otrosagentes terapéuticos. La terapia por inhalación se administra fácilmente por medio de inhaladores dosificadores.
“Formulaciones adecuadas para administración oral” significa formulaciones que están en una forma adecuada para administrarse por vía oral a un paciente. Las formulaciones pueden presentarse como unidadesdiscretas tales como cápsulas, obleas o comprimidos que contienen, cada uno, una cantidad predeterminada delingrediente activo; como un polvo o gránulos, como una solución o suspensión en un líquido acuoso o un líquido noacuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite. El ingredienteactivo también puede presentarse como un bolo, electuario o pasta.
“Formulaciones adecuadas para administración parenteral” significa formulaciones que están en una forma adecuada para administrarse por vía parenteral a un paciente. Las formulaciones son estériles e incluyen emulsiones, suspensiones, soluciones de inyección acuosas y no acuosas que puede contener agentes de suspensión y agentes espesantes y anti-oxidantes, tampones, bacteriostatos y solutos que hacen que la formulaciónsea isotónica y tienen un pH ajustado de forma adecuada, con la sangre del receptor para el que están destinadas.
“Formulaciones adecuadas para administraciones rectales o vaginales” se refiere a formulaciones que estánen una forma adecuada para administrarse por vía rectal o vaginal a un paciente. La formulación preferiblementeestá en forma de supositorios que pueden prepararse mezclando los compuestos de la presente invención conexcipientes o vehículos no irritantes adecuados tales como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera de supositorio, que son sólidos a las temperaturas normales pero líquidos a la temperatura ambiente y, por lo tanto, sefunden en el recto o en la cavidad vaginal y liberan el componente activo.
“Formulaciones adecuadas para administración sistémica” significa formulaciones que están en una formaadecuada para administrarse por vía sistémica a un paciente. La formulación preferiblemente se administra por inyección, incluyendo inyección intransmuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. Para la inyección, loscompuestos de la invención se formulan en soluciones líquidas, preferiblemente en tampones fisiológicamentecompatibles tales como solución de Hank o solución de Ringer. Además, los compuestos pueden formularse enforma sólida y redisolverse o suspenderse inmediatamente antes del su uso. También se incluyen formas liofilizadas.La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos, o los compuestos pueden administrarse por vía oral. Para la administración transmucosa o transdérmica, en la formulación se usan penetrantes apropiados para la barrera a atravesar. Estos penetrantes se conocen generalmente en la técnica eincluyen, por ejemplo, sales biliares y derivados de ácido fusídico para la administración transmucosa. Además,pueden usarse detergentes para facilitar la infiltración. La administración transmucosa puede realizarse por mediodel uso de pulverizaciones nasales, por ejemplo, o supositorios. Para administración oral, los compuestos se formulan en formas de administración oral convencionales tales como cápsulas, comprimidos y tónicos.
“Formulaciones adecuadas para administración tópica” significa formulaciones que están en una formaadecuada para administrarse tópicamente a un paciente. La formulación puede presentarse como una pomadatópica, ungüentos, polvos, pulverizaciones e inhalantes, geles (basados en agua o alcohol) o cremas, como seconoce generalmente en la técnica, o puede incorporarse en una base de matriz para la aplicación en un parche, locual permite la liberación controlada del compuesto a través de la barrera transdérmica. Cuando se formulan en una pomada, los ingredientes activos pueden emplearse con una base de pomada parafínica o miscible con agua. Comoalternativa, los ingredientes activos pueden formularse en una crema con una base de crema de aceite en agua. Lasformulaciones adecuadas para la administración tópica en el ojo incluyen gotas oftálmicas en las que el ingredienteactivo se disuelve o suspende en un vehículo adecuado, especialmente un disolvente acuoso para el ingrediente activo. Las formulaciones adecuadas para la administración tópica en la boca incluyen grageas que comprenden elingrediente activo en una base aromatizada, normalmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto; pastillas quecomprenden el ingrediente activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y goma arábiga; y colutorios que comprenden el ingrediente activo en un vehículo líquido adecuado.
“Forma de dosificación sólida” significa que la forma de dosificación del compuesto de la invención es unaforma sólida, por ejemplo cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos, grageas o gránulos. En estas formas de dosificación sólidas, el compuesto de la invención se mezcla con al menos un excipiente inerte habitual (o vehículo)tal como citrato sódico o fosfato dicálcico o (a) cargas o diluyentes tales como, por ejemplo, almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico, (b) aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos,gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y goma arábiga, (c) humectantes tales como, por ejemplo, glicerol, (d) agentesdisgregantes tales como, por ejemplo, agar-agar, carbonato cálcico, almidón de patata o tapioca, ácido algínico,ciertos silicatos complejos y carbonato sódico, (e) retardadores de la solución tales como, por ejemplo, parafina, (f)aceleradores de la absorción tales como, por ejemplo, compuestos de amonio cuaternario, (g) agentes humectantestales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, (h) adsorbentes tales como, por ejemplo, caolíny bentonita, (i) lubricantes tales como, por ejemplo, talco, estearato cálcico, estearato de magnesio, polietilenglicolessólidos, lauril sulfato sódico, (j) agentes opacificadores, y (k) agentes tamponantes y agentes que liberan el o loscompuesto de la invención en una cierta parte del tracto intestinal de una manera retardada.
Los niveles de dosificación reales del ingrediente o ingredientes activos en las composiciones de la invención pueden variarse para obtener una cantidad de ingrediente o ingredientes activos que sea eficaz para obtener una respuesta terapéutica deseada para una composición y procedimiento de administración particular paraun paciente. Un nivel de dosificación seleccionado para cualquier paciente particular, por lo tanto, depende de unadiversidad de factores que incluyen el efecto terapéutico deseado, la vía de administración, la duración deseada deltratamiento, la etiología y la gravedad de la enfermedad, el estado del paciente, el peso, sexo, dieta y edad, el tipo y potencia de cada ingrediente activo, las velocidades de absorción, metabolismo y/o excreción y otros factores.
La dosis diaria total de los compuestos de la presente invención administrada a un paciente en una soladosis o en dosis divididas puede estar en cantidades, por ejemplo, de aproximadamente 0,001 a aproximadamente100 mg/kg de peso corporal al día y preferiblemente de 0,01 a 10 mg/kg/día. Por ejemplo, en un adulto, las dosis generalmente son de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100, preferiblemente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal al día por inhalación, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente100, preferiblemente de 0,1 a 70, más especialmente de 0,5 a 10 mg/kg de peso corporal al día por administraciónoral y de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50, preferiblemente de 0,01 a 10 mg/kg de peso corporal al díapor administración intravenosa. El porcentaje de ingrediente activo en una composición puede variarse, aunque debeconstituir una proporción tal que se obtenga una dosificación adecuada. Las composiciones de dosificación unitariapueden contener tales cantidades o submúltiplos de las mismas como pueden usarse para constituir la dosis diaria.Evidentemente, pueden administrarse varias formas de dosificación unitarias aproximadamente al mismo tiempo.Una dosificación puede administrarse tan frecuentemente como sea necesario para obtener el efecto terapéuticodeseado. Algunos pacientes pueden responder rápidamente a una dosis mayor o menor y pueden encontrar adecuadas dosis de mantenimiento mucho más débiles. Para otros pacientes, puede ser necesario tenertratamientos a largo plazo en una proporción de 1 a 4 dosis al día de acuerdo con los requisitos fisiológicos de cadapaciente particular. No necesita decirse que, para otros pacientes, no será necesario prescribir más de una o dosdosis al día.
Las formulaciones pueden prepararse en forma de dosificación unitaria por cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Estos procedimientos incluyen la etapa de asociar elingrediente activo con el vehículo que constituye uno o más ingredientes auxiliares. En general, las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el ingrediente activo con vehículos líquidos o vehículos sólidosfinamente divididos, o ambos, y después si es necesario dando forma al producto.
Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de una sola dosis o de múltiples dosis, por ejemplo,ampollas y viales cerrados herméticamente con tapones elastoméricos y pueden almacenarse en un estado secado por congelación (liofilizado) que sólo necesita la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyección, inmediatamente antes del uso. Pueden prepararse soluciones y suspensiones de inyección extemporáneas a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito previamente.
Los compuestos dentro del alcance de la presente invención presentan actividades farmacológicasdestacadas de acuerdo con los ensayos descritos en la bibliografía y más adelante, donde los resultados de dichosensayos se cree que se correlacionan con la actividad farmacológica en seres humanos y otros mamíferos.
PROCEDIMIENTO DE ENSAYO ENZIMÁTICO IN VITRO
Inhibición de la Serina Proteasa NS3 de VHC
Se expresó el dominio de proteasa NS3 de VHC y se purificó como se ha descrito previamente (Vertex, publicación PCT W098/17679; que se incorpora en este documento por referencia). El sustrato peptídicocromogénico, EDVVAbuC-p-nitroanilida y el fragmento de cofactor NS4A (-KKGSVVIVGRIVLSGK-) para la proteasaNS3 se sintetizó por encargo por American Peptide Corn (Ca). Los compuestos de la presente invención se ensayaron con respecto a su capacidad de inhibir la actividad proteasa NS3 de VHC usando un ensayo espectrofotométrico con EDVVAbuC-p-nitroanilida como sustrato. El ensayo se realizó en una placa de microtitulación de 96 pocillos usando un lector SpectraMax 250 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) con capacidad cinética. La escisión del sustrato EDVVAbuC-p-nitroanilida (500 !M) por la proteasa NS3 de VHC purificada (0,5 !M)se realizó a 30ºC en el tampón que contenía fragmento de NS4A 30 !M, Hepes 46 mM, pH 8,0, NaCl 92 mM, glicerolal 18%, DTT 5 mM y DMSO al 7,5% en ausencia o presencia del compuesto de ensayo. La reacción se controló conrespecto a la liberación de pNA (p-nitroanilina) a 405 nm.
La determinación de los parámetros cinéticos incluyendo Vmax, Km y Vmax/Km se realiza en las condiciones descritas anteriormente. Los valores de Ki se calculan a partir de los gráficos de velocidad frente [inhibidor] aconcentraciones fijas de enzima y sustrato, por medio de un ajuste no lineal de mínimos cuadrados de los datos a laecuación de Morrison para una inhibición competitiva de unión fuerte [J. F. Morrison, Biochem. Biophys. Acta. 185 269-286 (1969)]. Para este procedimiento se usa el programa Prism (GraphPad Software, Inc.).
Los inhibidores de serina proteasa de VHC descritos en este documento pueden usarse en combinacióncon otras moléculas que presentan directamente o inducen indirectamente una actividad anti-VHC profilácticamenteen pacientes con riesgo de contraer una infección por VHC o para tratar pacientes que ya están infectados. Laexpresión “anti-actividad de VHC” se refiere a la capacidad de una molécula, cuando está presente, de inhibircompletamente o reducir la acumulación de viriones de VHC en comparación con la acumulación de viriones de VHCen ausencia de dicha molécula, y/o la capacidad de una molécula de reducir o mejorar afecciones o síntomasasociados con la infección o patogénesis por VHC en pacientes. Las moléculas que tienen actividad anti-VHCincluyen las que interrumpen una o más etapas en la infección o replicación por VHC, así como las que inducenacciones inmunomoduladoras y antiproliferativas en las células hospedadoras. Las moléculas que tienen actividadanti-VHC pueden inhibir acontecimientos de replicación específicos de VHC tales como, pero sin limitación, síntesisde proteínas o de ácidos nucleicos dirigida a VHC. Las etapas de replicación de VHC en las que pueden actuarmoléculas que tienen actividad anti-VHC incluyen la entrada en la célula (por ejemplo unión; penetración);descapsulación y liberación del genoma de VHC; replicación del genoma de VHC (por ejemplo replicación decualquier cadena del genoma de ARN viral; transcripción del ARN mensajero viral); traducción de proteínas de VHC; modificación postraduccional de proteínas de VHC (por ejemplo, escisión proteolítica; glicosilación); transporteintracelular de proteínas virales; montaje de los componentes del virión; y liberación de partículas virales (porejemplo, gemación). Las clases de moléculas que tienen actividad antiviral incluyen, pero sin limitación, receptores“señuelo” solubles y anticuerpos anti-receptor; bloqueantes de canales iónicos, estabilizadores de la cápsida einhibidores de proteínas de fusión; inhibidores de polimerasas virales, transcriptasa inversa, helicasa, primasa ointegrasa; oligonucleótidos antisentido y ribozimas; agentes inmunomoduladores e inmunoestimuladores, incluyendo citoquinas tales como interferones, así como agonistas peptídicos, esteroides y fármacos clásicos tales comolevamisol; inhibidores de proteínas reguladoras; inhibidores de proteasa; inhibidores del ensamblaje de proteínas; y anticuerpos antivirales y linfocitos citotóxicos. La expresión “cantidad eficaz anti-VHC” o “cantidad farmacéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de un compuesto, o combinación de compuestos como sedescriben en este documento, eficaz para reducir o mejorar las afecciones o síntomas asociados con la infección porVHC o la patogénesis asociada en pacientes, o para reducir los niveles virales in vitro o in vivo. Las aplicaciones in vitro incluyen el Sistema de Ensayo de Replicón descrito más adelante donde dichas cantidades son eficaces parareducir la acumulación de ARN del replicón de VHC y/o la acumulación de proteínas codificadas por genes contenidos en su interior.
Los compuestos que tienen actividad anti-VHC contemplados para uso en las composiciones yprocedimientos de terapia combinada descritos en este documento incluyen, pero sin limitación, moléculas inmunomoduladoras, incluyendo citoquinas inmunoestimuladoras y otros compuestos que se sabe que tienen actividad antiviral para VHC, tales como diversos nucleósidos y nucleótidos antivirales.
Las moléculas inmunomoduladoras contempladas para uso en combinación con los inhibidores de serinaproteasa de VHC descritos en este documento incluyen, pero sin limitación, interferón-alfa 2B (Intron A, ScheringPlough); Rebatron (Schering Plough, Interferon-alfa 2B + Ribavirina); interferón alfa pegilado (Reddy, K.R. et al.Efficacy and safety of pegylated (40-kd) interferon alpha-2a compared with interferon alpha-2a in noncirrhotic patientswith chronic hepatitis C. Hepatology 33, 433-438 (2001)), interferón consenso (Kao, J. H., Chen, P. J., Lai, M. Y. & Chen, D. S. Efficacy of consensus interferon in the treatment of chronic hepatitis C. J. Gastroenterol. Hepatol. 15,1418-1423 (2000)); interferón alpha-2A (Roferon A; Roche); linfoblastoide o interferón “natural”; interferón tau (Clayette, P. et al. IFN-tau, a new interferon type I with antiretroviral activity. Pathol. Biol. (Paris) 47, 553-559 (1999));interleuquina 2 (Davis, G.L., Nelson, D.R. & Reyes, G.R. Future options for the management of hepatitis C. Seminarsin Liver Disease 19, 103-112 (1999)); Interleuquina 6 (Davis, G.L., Nelson, D.R. & Reyes, G.R. Future options for themanagement of hepatitis C. Seminars in Liver Disease 19, 103-112 (1999)); interleuquina 12 (Davis, G.L., Nelson,
D.R. & Reyes, G.R. Future options for the management of hepatitis C. Seminars in Liver Disease 19, 103-112(1999)); ribavirina y compuestos que potencian la aparición de una respuesta de células T coadyuvantes de tipo I(Davis, G.L., Nelson, D.R. & Reyes, G.R. Future options for the management of hepatitis C. Seminars in LiverDisease 19, 103-112 (1999)). Los interferones pueden mejorar las infecciones virales ejerciendo efectos antiviralesdirectos y/o modificando la respuesta inmune a la infección. Los efectos antivirales de los interferones a menudoestán mediados por la inhibición de la penetración viral o la descapsulación, síntesis del ARN viral, traducción deproteínas virales y/o el ensamblaje y la liberación de virus.
Los compuestos que estimulan la síntesis de interferón en las células (Tazulakhova, E.B., Parshina, O.V., Gusev, T.S. & Ershov, F.I. Russian Experience in Screening, Analysis, and Clinical Application of Novel Interferon Inducers. J. Interferon Cytokine Res. 21, 65-73)) incluyen, pero sin limitación, ARN bicatenario, solo o en combinación con tobramicina e imiquimod (3M Pharmaceuticals) (Sauder, D.N. Immunomodulatory and pharmacologic properties of imiquimod. J. Am. Acad. Dermatol. 43, S6-11 (2000)).
Otros compuestos que se sabe que tienen o que puedan tener actividad antiviral contra VHC gracias amecanismos no inmunomoduladores incluyen, pero sin limitación, ribavirina (ICN Pharmaceuticals); inhibidores deinosina 5’-monofosfato deshidrogenasa (VX-497, que se está desarrollando por Vertex Pharmaceuticals; amantadina y rimantadina (Younossi, A.M. and Perillo, R.P. The roles of amantadine, rimantadine, ursodeoxycholic acid, NSAIDs,alone or in combination with alpha interferons, in the treatment of chronic hepatitis C. Seminars in Liver Disease 19,95-102 (1999)); LY217896 (Patente de Estados Unidos 4.835.168) (Colacino, J.M. et al. Evaluation of the antiinfluenza virus activities of 1,3,4-thiadiazol-2-ylcyanamide (LY217896) and its sodium salt. Antimicrobial Agents & Chemotherapy 34, 2156-2163 (1990)) y éster metílico del ácido 9-hidroxiimino-6-metoxi-1,4a-dimetil1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahidro-fenantreno-1-carboxilico; clorhidrato de éster metílico del ácido 6-metoxi-1,4a-dimetil9-(4-metil-piperazina-1-ilimino)-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahidrofenantreno-1-carboxílico; 1-(2-cloro-fenil)-3-(2,2-difeniletil)-urea (Patente de Estados Unidos Nº 6.127.422).
Las formulaciones, dosis y vías de administración para las moléculas anteriores se enseñan en las referencias citadas más adelante o son bien conocidas en la técnica como se describe, por ejemplo, en F.G. Hayden, en Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, Novena Edición, Hardman et al., Eds., McGraw-Hill, New York (1996), Capítulo 50, páginas 1191-1223, y las referencias citadas en este documento. Comoalternativa, una vez que se ha identificado un compuesto que presenta actividad antiviral contra VHC, puede determinarse una cantidad farmacéuticamente eficaz de ese compuesto usando técnicas que son bien conocidaspara el especialista en la técnica. Véase, por ejemplo, Benet et al, en Goodman & Gilman’s The PharmacologicalBasis of Therapeutics, Novena Edición, Hardman et al, Eds., McGraw-Hill, New York (1996). Capítulo 1, páginas 327, y las referencias citadas en este documento. De esta manera, las formulaciones, intervalos de dosificación y regímenes de dosificación apropiados de dicho compuesto pueden determinarse fácilmente por procedimientosrutinarios.
Las combinaciones de fármacos de la presente invención pueden proporcionarse a una célula o células, o a un paciente humano, en formulaciones farmacéuticamente aceptables separadas administradas simultánea o secuencialmente, en formulaciones que contienen más de un agente terapéutico, o por una diversidad de formulaciones de un solo agente o múltiples agentes. Sin embargo, estas combinaciones de fármacos una vezadministradas forman una cantidad eficaz de componentes contra VHC.
Actualmente se dispone de un gran número de otros inmunomoduladores e inmunoestimuladores quepueden usarse en los procedimientos de la presente invención e incluyen: AA-2G; dipéptido de adamantilamida;adenosina desaminasa, Enzon; adyuvante, Alliance; adyuvantes, Ribi; adyuvantes, Vaxcel; Adjuvax; agelasphin-11;terapia para el SIDA. Chiron; algal glucan, SRI; algammulin, Anutech; Anginlyc; factores anticelulares, Yeda; Anticort;inmunógeno antigastrin-17, Ap; sistema de liberación de antígeno, Vac; formulación de antígeno, IDBC; inmunógenoantiGnRH, Aphton; Antiherpin; Arbidol; azarole; Bay-q-8939; Bayr-1005; BCH-1393; Betafectin; Biostim; BL-001, BL009; Broncostat; Cantastim; CDR1-84-246; cefodizime; inhibidores de quimioquinas. ICOS; péptidos de CMV, City ofHope; CN-5888; agente de liberación de citoquinas, St; DHEAS, Paradigm; DISC TA-HSV; JO7B; IOIA; IOIZ; ditiocarb sódico, ECA-10-142; ELS-1; endotoxina, Novartis, FCE-20696; FCE-24089; FCE-24578; ligando FLT-3,Immunex; FR-900483; FR-900494; FR-901235; proteínas G FTS-Zn, Cadus; gludapcin; glutaurina;glycophosphopeptical; GM-2; MM-53; GMDP; vacuna de factor de crecimiento, EntreM; H-BIG, NABI; H-CIG, NABI; HAB-439; vacuna de Helicobacter pylori, factor inmune específico de herpes; terapia para VIH, United Biomed; HyperGAM+CF; Immu-Max; Immun BCG; terapia inmune, Connective; inmunomodulador, Evans; inmunomoduladores, Novacell; imreg-1; imreg-2; Indomune; inosine pranobex; interferón, Dong-A (alfa2); interferón,Genentech (gamma), interferón, Novartis (alfa), interleuquina-12, Genetics Ins; interleuquina-15, Immunex;interleuquina-16, Research Cor; ISCAR-1; JOO5X, L-644257; ácido licomarasmínico; LipoTher, LK409, LK-410, LP2307; LT(R1926), LW-50020, MAF, Shionogi; derivados de MDP, Merck, met-encefalina, TNT; metilfurilbutirolactonas; MIMP; mirimostim; vacuna bacteriana mixta, Tem; MM1; moniliastat; MPLA, Ribi; EM-705; murabutide; murabutide, Vacsyn; derivado de muramil dipéptido; derivados de muramil péptido myelopid; -563; NACOS-6; NH-765; NISV, Proteus; NPT-16416; NT-002, AP-485; PEFA-814; péptidos, Scios; peptidoglicano, Pliva;Perthon, Advanced Plant; derivado de PGM, Pliva; Pharmaprojects Nº 1099; Nº 1426; Nº 1549; Nº 1585; Nº 1607; Nº1710; Nº 1779; Nº 2002; Nº 2060; Nº 2795; Nº 3088; Nº 3111; Nº 3345; Nº 3467; Nº 3668; Nº 3998; Nº 3999; Nº 4089; Nº 4188; Nº 4451; Nº 4500; Nº 4689; Nº 4833; Nº 494; Nº 5217; Nº 530; pidotimod; pimelautide; pinafide; ipodofilotoxina PMD-589, Conpharm; POL-509; poly-ICLC; poly-ICLC, Yamasa Shoyu; polisacárido A PolyA-PolyU;proteína A, Berlox Bioscience; PS34WO: MAb de Pseudomonas, Teijin; Psomaglobin; PTL-78419 Pyrexol; piriferona;Retrogen; Retropep; RG-003; Rhinostat; rifamaxil; RM-06; Rollin; romurtide; RU-40555; RU-41821; anticuerpos deRubella, ResCo; S-27609; SB-73; SDZ-280-636; SDZ-MRL-953; SK&F-107647; SL04; SL05; SM-4333; Solutein; SRI-62-834; SRL-172; ST-570; ST-789; staphage lysate; Stimulon; supresina; T-150RI; T-LCEF; tabilautide; temurtide; Theradigm-HBV; Theradigm-HPV; Theradigm-HSV; THF, Pharm & Upjohn; THF, Yeda; thymalfasin; fracciones de hormona tímica; thymocartin; timolinfotropina; timopentina; analogos de timopentina; timopentina,Peptech; fracción de timosina 5, Alpha; timoestimulina; timotrinan; TMD-232; TO-115; factor de transferencia, Viragen; tuftsin. Selavo; ubenimex; Ulsastat; ANGG-; CD-4+; Collag+; COLSF+; COM+; DA-A+; GAST-; GF-TH+; GP-120-; IF+; IF-A+; IF-A-2+; IF-B+; IP-G-+-; IF-G-1B+; IL-2+; IL-12+; IL-15+; IM+; LHRH-; LIPCOR+L LYM-B+; LYM-Nk+; LYM-T+; OPI+; PEP+; PHG-MA+; RNA-SYN-; SY-CW-; TH-A-1+; TH-5+; TNF+; UN.
Los compuestos nucleosídicos y nucleotídicos representativos útiles en la presente invención incluyen, pero sin limitación: (+)-cis-5-fluoro-1-[2-(hidroxi-metil)-1,3-oxatiolan-5-il]citosina; (-)-2’-desoxi-3’-tiocitidina-5’-trifosfato(3TC); (-)-cis-5-fluoro-1-[2-(hidroxi-metil)-[1,3-oxatiolan-5-il]citosina (FTC); (-) 2’,3’,didesoxi-3’-tiacitidina[(-)-Sddc]; 1(2’-desoxi-2’-fluoro-beta-D-arabinofuranosil)-5-yodocitosina (FIAC); 1-(2’-desoxi-2’-fluoro-beta-D-arabinofuranosil)-5yodocitosinatrifosfato (FIACTP); 1-(2’-desoxi-2’-fluoro-beta-D-arabinofuranosil-5-metiluracilo (FMAU);
1-beta-D-ribofuranosil-1,2,4-triazol-3-carboxamida; 2’,3’-didesoxi-3’fluoro-5-metil-dexocitidina (FddMeCyt);
2’,3’-didesoxi-3‘-cloro-5-metil-dexocitidina (ClddMeCyt);
2’,3’-didesoxi-3’-amino-5-metil-dexocitidina (AddMeCyt);
2’,3’-didesoxi-3’-fluoro-5-metil-citidina (FddMeCyt);
2’,3’-didesoxi-3’-cloro-5-metil-citidina (ClddMeCyt);
2’,3’-didesoxi-3’-amino-5-metil-citidina (AddMeCyt);
2’,3’-didesoxi-3’-fluorotimidina (FddThd); 2’,3’-didesoxi-beta-L-5-fluorocitidina (beta-L-FddC)
2’,3’-didesoxi-beta-L-5-tiacitidina; 2’,3’-didesoxi-beta-L-5-citidina (beta-L-ddC), 9-(1,3-dihidroxi-2propoximetil)guanina; 2’-desoxi-3’-tia-5-fluorocitosina-3-amino-5-metil-dexocitidina (AddMeCyt);
2-amino-1,9-[(2-hidroximetil-1-(hidroximetil)etoxi]metil)-6H-purina-6 ona (ganciclovir); diacetato de 2-(2-amino-9Hpurin-9-il)etil]-1,3-propandil (famciclovir); 2-amino-1,9-dihidro-9-[(2-hidroxi)metil]6H-purina-6-ona (aciclovir);
9-(4-hidroxi-3-hidroximetil-but-1-il)guanina (penciclovir);
diacetato de 9-(4-hidroxi-3-hidroximetil-but-1-il)-6-desoxi-guanina (famciclovir);
3’-acido-3'-desoxitimidina (AZT); 3’-cloro-5-metil-dexocitidina (ClddMeCyt);
9-(2-fosfonilo-metoxietil)-2’,6’-diaminopurina-2’,3’-didesoxirribósido;
9-(2-fofonilmetoxietil)adenina (PMEA); aciclovir trifosfato (ACVTP);
D-carbociclo-2-desoxiguanosina (CdG); didesoxi-citidina; didesoxi-citosina (ddC);
didesoxi-guanina (DDG); didesoxi-inosina (ddI), E-5-(2-bromovinil)-2-desoxiuridina trifosfato; fluoro-arabinofuranosilyodouracilo;
1-(2’-desoxi-2’-fluoro-1-beta-D-arabinofuranosil)-5-yodo-uracilo (FIAU);
estavudina: 9-beta-D-arabinofuranosil-9H-purina-6-amina monohidrato (Ara-A);
9-beta-D-arabinofuranosil-9H-purina-6-amino-5’-monofosfato monohidrato (Ara-AMP); 2-desoxi-3’-tia-5-fluorocitidina;2’,3’-didesoxi-guanina; y 2’,3-didesoxi-guanosina.
Los procedimientos de síntesis para la preparación de nucleósidos y nucleótidos útiles en la presenteinvención son bien conocidos en la técnica como se describe en Acta Biochim. Pol., 43, 25-36 (1996); Swed.Nucleosides Nucleotides 15, 361-378 (1996), Synthesis 12, 1465-1479 (1995); Carbohyd. Chem. 27, 242-276 (1995);Chem. Nucleosides Nucleotides 3, 421-535 (1994), Ann. Reports in Med. Chem., Academic Press; and Exp. Opin.Invest. Drugs 4, 95-115 (1995).
Las reacciones químicas descritas en las referencias citadas anteriormente generalmente se describen en términos de su aplicación más amplia a la preparación de los compuestos de la presente invención. Ocasionalmente,las reacciones pueden no ser aplicables como se describe a cada compuesto incluido dentro del alcance de loscompuestos descritos en este documento. Los compuestos para los que esto ocurre se reconocerán fácilmente porlos especialistas en la técnica. En todos estos casos, las reacciones pueden realizarse satisfactoriamente pormodificaciones convencionales conocidas para los especialistas en la técnica, por ejemplo, por medio de unaprotección apropiada de grupos interferentes, por cambio a reactivos convencionales alternativos, por modificaciónrutinaria de las condiciones de reacción y similares, o a la preparación de los compuestos correspondientes de lapresente invención serán aplicables otras reacciones descritas en este documento o convencionales de otra forma.En todos los procedimientos preparativos, todos los materiales de partida son conocidos o se pueden prepararfácilmente a partir de materiales de partida conocidos.
Aunque los análogos de nucleósidos generalmente se emplean como agentes antivirales tal cual, losnucleótidos (nucleósido fosfatos) algunas veces tienen que convertirse en nucleósidos para facilitar su transporte através de las membranas celulares. Un ejemplo de un nucleótido modificado químicamente capaz de entrar en lascélulas es S-1-3-hidroxi-2-fosfonilmetoxipropilcitosina HPMPC, Gilead Sciences). Los compuestos nucleosídicos y nucleotídicos de la presente invención que son ácidos pueden formar sales. Los ejemplos incluyen sales conmetales alcalinos o metales alcalinotérreos tales como sodio, potasio, calcio o magnesio, o sales con bases orgánicas o sales básicas de amonio cuaternario.
Los inmunomoduladores e inmunoestimuladores útiles en los procedimientos de terapia combinada de lapresente invención pueden administrarse en cantidades menores que las que son convencionales en la técnica. Porejemplo, el interferón alfa típicamente se administra a seres humanos para el tratamiento de infecciones por VHC enuna cantidad de aproximadamente 1 x 106 unidades/persona tres veces por semana a aproximadamente 10 x 106 unidades/persona tres veces por semana (Simon et al., Hepatology 25:445-448 (1997)). En los procedimientos y composiciones de la presente invención, esta dosis puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,1 x 106 unidades/persona tres veces por semana a aproximadamente 7,5 x 106 unidades/persona tres veces por semana; más preferiblemente de aproximadamente 0,5 x 106 unidades/persona tres veces por semana a aproximadamente 5 x 106 unidades/persona tres veces por semana; más preferiblemente de aproximadamente 1 x 106 unidades/persona tres veces por semana a aproximadamente 3 x 106 unidades/persona tres veces por semana. Debido a la mayoreficacia antiviral contra el virus de la hepatitis C de los inmunomoduladores e inmunoestimuladores en presencia delos inhibidores de la serina proteasa de VHC de la presente invención, en los procedimientos y composicionesdescritos en este documento pueden emplearse cantidades reducidas de estos inmunomoduladores/inmunoestimuladores. De forma similar, debido a la mayor eficacia antiviral contra el virus de lahepatitis C de los inhibidores de serina proteasa de VHC de la presente invención en presencia de inmunomoduladores e inmunoestimuladores, en los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento pueden emplearse cantidades reducidas de estos inhibidores de serina proteasa de VHC. Estas cantidades reducidas pueden determinarse por un control rutinario de los títulos de virus de hepatitis C en pacientes infectados sometidos a terapia. Esto puede realizarse, por ejemplo, controlando el ARN de VHC en el suero de lospacientes por transferencia en ranura (slot-blot), transferencia puntual (dot-blot) o técnicas de RT-PCR, o pormedición de antígenos de la superficie de VHC u otros antígenos. De forma similar, puede controlarse a lospacientes durante la terapia combinada empleando los inhibidores de serina proteasa de VHC descritos en estedocumento y otros compuestos que tienen actividad anti-VHC, por ejemplo, agentes antivirales nucleosídicos y/onucleotídicos, para determinar las menores dosis eficaces de cada uno cuando se usan en combinación.
En los procedimientos de terapia de combinada descritos en el presente documento, los compuestosantivirales nucleosídicos o nucleotídicos, o mezclas de los mismos, pueden administrarse a los seres humanos enuna cantidad en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/persona/día a aproximadamente 500 mg/persona/día;preferiblemente de aproximadamente 10 mg/persona/día a aproximadamente 300 mg/persona/día; más preferiblemente de aproximadamente 25 mg/persona/día a aproximadamente 200 mg/persona/día; incluso más preferiblemente de aproximadamente 50 mg/persona/día a aproximadamente 150 mg/persona/día; y aún máspreferiblemente en el intervalo de aproximadamente 1 mg/persona/día a aproximadamente 50 mg/persona/día.
Las dosis de los compuestos pueden administrarse a un paciente en una sola dosis o en múltiples subdosisproporcionadas. En el último caso, las composiciones de dosificación unitaria pueden contener tales cantidades o submúltiplos de las mismas para constituir la dosis diaria. Múltiples dosis al día también pueden aumentar la dosisdiaria total si esto se desea por la persona que receta el fármaco.
El régimen para tratar a un paciente que padece una infección por VHC con los compuestos y/ocomposiciones de la presente invención se selecciona de acuerdo con una diversidad de factores, incluyendo laedad, peso, sexo, dieta y situación médica del paciente, la gravedad de la infección, la vía de administración,consideraciones farmacológicas tales como la actividad, eficacia, farmacocinética y perfiles toxicológicos de loscompuestos particulares empleados, y si se utiliza un sistema de administración de fármaco. La administración de las combinaciones de fármaco descritas en este documento debe continuarse generalmente durante un período devarias semanas a varios meses o años hasta que los títulos de virus alcancen niveles aceptables, que indiquen que la infección se ha controlado o erradicado. Los pacientes sometidos a tratamiento con las combinaciones defármacos descritas en este documento pueden controlarse rutinariamente mediendo el ARN del virus de la hepatitisen el suero de los pacientes por técnicas de transferencia por ranuras, transferencia puntual o RT-PCR o midiendolos antígenos del virus de la hepatitis C, tales como antígenos superficiales, en el suero para determinar la eficaciade la terapia. El análisis continuo de los datos obtenidos por estos procedimientos permite la modificación delrégimen de tratamiento durante la terapia de forma que se administren cantidades óptimas de cada componente enla combinación, y de esta forma también puede determinarse la duración del tratamiento. De esta manera, elrégimen de tratamiento/programa de dosificación puede modificarse racionalmente durante el transcurso de laterapia de forma que se administren las menores cantidades de cada uno de los compuestos antivirales usados encombinación que conjuntamente presentan eficacia contra el virus de la hepatitis C satisfactoria y de forma que laadministración de esos compuestos antivirales en combinación se continúe sólo cuando sea necesario para tratarsatisfactoriamente la infección.
La presente invención incluye el uso de inhibidores de serina proteasa de VHC descritos en este documentoen diversas combinaciones con los tipos anteriores y similares de compuestos que tienen actividad anti-VHC paratratar o prevenir infecciones por VHC en pacientes. Por ejemplo, pueden usarse uno o más inhibidores de serinaproteasa de VHC en combinación con: uno o más interferones o derivados de interferón que tienen actividad anti-VHC; uno o más compuestos distintos de interferón que tienen actividad anti-VHC; uno o más interferones o derivados de interferón que tienen actividad anti-VHC y uno o más compuestos no interferón que tienen actividadanti-VHC. Cuando se usan en combinación para tratar o prevenir una infección por VHC en un paciente humano,cualquiera de los inhibidores de serina proteasa de VHC descritos en el presente documento y los compuestosanteriores que tienen actividad anti-VHC pueden estar presentes en una cantidad farmacéutica o eficaz contra VHC.Gracias a sus efectos aditivos o sinérgicos, cuando se usan en las combinaciones descritas anteriormente, cada unotambién puede estar presente en una cantidad subclínica farmacéuticamente eficaz o eficaz anti-VHC, es decir, una cantidad que si se usa sola, proporciona una eficacia farmacéutica en la inhibición completa o reducción de laacumulación de viriones de VHC y/o en la reducción o mejora de las afecciones o síntomas asociados con lainfección o la patogénesis de VHC en los pacientes menor que dichos inhibidores de serina proteasa de VHC y compuestos que tienen actividad anti-VHC cuando se usan en cantidades farmacéuticamente eficaces. Además, lapresente invención incluye el uso de combinaciones de inhibidores de serina proteasa de VHC y compuestos quetienen actividad anti-VHC como se ha descrito anteriormente para tratar o prevenir infecciones por VHC, dónde uno
o más de estos inhibidores o compuestos está presente en una cantidad farmacéuticamente eficaz y el otro u otrosinhibidores o compuestos están presentes en una cantidad farmacéuticamente eficaz subclínica o una cantidad eficaz anti-VHC debido a sus efectos aditivos o sinérgicos. Como se usa en este documento, el término “efectoaditivo” describe el efecto combinado de dos (o más) agentes farmacéuticamente activos que es igual a la suma delefecto de cada agente administrado individualmente. Un efecto sinérgico es uno en que el efecto combinado de dos(o más) agentes farmacéuticamente activos es mayor que la suma del efecto de cada agente administrado solo.
Ejemplo 42
La terapia actual convencional para la infección por el virus de la hepatitis C (VHC) es el tratamiento con elinmunomodulador alfa-interferón (Chronic Hepatitis C: Current Disease Management, U.S. Department of Health andHuman Services, National Institutes of Health, 1999). Esta terapia es ineficaz en la mayoría de los pacientes conVHC, que no muestran respuesta o presentan una recaída después de una terapia prolongada con interferón.Además, hay varios efectos secundarios severos asociados con la terapia con interferón. En vista de la apremiantenecesidad de nuevos fármacos antivirales más eficaces para tratar pacientes infectados con VHC, los presentesinventores han desarrollado una serie de compuestos que inhiben la serina proteasa de VHC (un complejo deproteínas NS3 y NS4A del virus VHC). Estos compuestos pueden usarse solos, juntos entre sí y en combinación conotras clases de compuestos para tratar o prevenir la infección por VHC. Este ejemplo describe el ensayo de tresinhibidores representativos de serina proteasa de VHC, es decir el Compuesto CU, el Compuesto Comparativo EP y el Compuesto Comparativo EC, solos y en combinación con miembros individuales de una serie de interferones(interferón alfa-2B (Schering Plough), interferón alfa-2A (PBL Biomedical Laboratories, New Brunswick, NJ),interferón beta (Research Diagnostics Inc, Flandes, NJ)) e interferón ovino tau (Research Diagnostics Inc, Flandes,NJ)) en un ensayo de replicón de ARN subgenómico de VHC (Replicon Assay) para determinar si los dos compuestos actúan de acuerdo para disminuir la acumulación de ARN de VHC. El Ensayo de Replicón mide lacantidad o el ARN subgenómico de VHC (replicón R que queda en las células que contienen replicón (Lohmann etal. Sciences 285: 110-113 (1999)) después de dos días de tratamiento con fármaco con respecto a la cantidad deARN de replicón en las células no tratadas. En este ensayo la potencia de los compuestos como fármacos antiviralescontra VHC es directamente proporcional al nivel de inhibición de acumulación del ARN del replicón.
Los dos fármacos se ensayan en combinaciones en el sistema de Ensayo de Replicón in vitro paradeterminar si, cuando se usan juntos, presentan actividad anti-VHC aditiva o sinérgica. El Ensayo de Replicón seemplea como un modelo sustituto para la infección por VHC in vitro para evaluar los efectos combinados delinmunomodulador, por ejemplo, interferón-alfa 2B ((Intron A), Schering Plough) y el inhibidor de serina proteasa deVHC, por ejemplo Compuesto CU. Como se muestra más adelante, los resultados demuestran que hay un claroefecto sinérgico anti-VHC de estos dos tipos de fármacos, que se mide usando determinaciones matemáticasformales de sinergia para analizar su capacidad para reducir los niveles de ARN de VHC en el Ensayo de Replicón.
El Ensayo de Replicón
El Ensayo de Replicón que emplea una línea celular que contiene el ARN subgenómico de VHC autoreplicativo (replicón) se describe en Lohmann et al. Science 285:110-113 (1999). El número de acceso del Genbankpara la secuencia del replicón usado en los experimentos descritos en este documento se presenta en estareferencia como AJ242654. Este documento describe procedimientos para la transcripción in vitro de ARN a partir del ADNc del replicón, la transfección del ARN del replicón en células Huh7 por electroporación y la selección de las células que contienen el ARN del replicón usando el antibiótico G418. Las células Huh7 son una línea celular dehepatoma obtenidas del Dr. William Mason en Fox Chase Cancer Research Center (Philadelfia). Estas células estándisponibles públicamente en Fox Chase y se han descrito extensivamente en la bibliografía científica (Nakabayashi et al. Cancer Res. 42:3858-3863 (1982)). En los experimentos descritos en este documento, todo el ADN de laplantilla se retira de la preparación de ARN de replicón transcrito in vitro antes de la electroporación de este ARN encélulas Huh7 por múltiple tratamiento con DNasa (tres tratamientos secuenciales).
El Ensayo de Replicón se realiza como se describe con detalle más adelante. En resumen, se ponencélulas de replicón en bandejas de 96 pocillos a una densidad de 10.000 células por pocillo y se incuban a 37ºC. Lascélulas se incuban en DMEM (Medio Esencial Mínimo de Dulbecco) suplementado con suero bovino fetal al 10%,glutamina, aminoácidos no esenciales y el antibiótico G418 (0,25 mg/ml). Después de la incubación durante unanoche, el medio se reemplaza por DMEM que contiene suero bovino fetal al 2% y diversas concentraciones delinhibidor de serina proteasa, tal como el Compuesto CU, y/o un interferón tal como el interferón alfa 2B (Intron A,Schering Plough). Cada compuesto se ensaya a seis-ocho concentraciones diferentes. Para un extremo del intervalode concentraciones, se seleccionan concentraciones elevadas de los compuestos que darán como resultado unainhibición casi completa de la acumulación de ARN del replicón después de dos días de tratamiento. A partir deestas concentraciones de partida, se realizan diluciones seriadas de forma que los intervalos de concentracionesensayados en el Ensayo de Replicón incluyan concentraciones a las que los compuestos son muy eficaces, asícomo concentraciones a las que no hay un efecto significativo. Cada concentración de inhibidor de serina proteasade VHC se ensaya sin ningún interferón añadido, así como con la adición de seis a ocho dosis de interferones diferentes. De forma similar, el interferón se ensaya sin ningún inhibidor de serina proteasa de VHC añadido.Después de 48 horas de incubación con los compuestos, el medio se retira de las placas y se extrae el ARN celulartotal de las células usando el kit RNeasy-96 fabricado por Qiagen Inc. (Valencia, CA). Este ARN después se analizapor RT-PCR cuantitativa, o TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City CA). La diana de RT-PCR TaqMan® es el gen de resistencia a neomicina en el ARN del replicón. Las placas se configuran de forma que haya 5 réplicas decada muestra de tratamiento de fármaco y 16 réplicas de las muestras no tratadas. Esto permite mayor confianzaestadística en los datos de la RT-PCR cuantitativa.
El análisis de los datos del Ensayo de Replicón produce dos valores que son útiles para evaluar la potenciade posibles agentes antivirales contra VHC. A cada concentración de compuesto ensayada, se determina el nivel deinhibición en la acumulación de ARN de replicón causada por el compuesto durante dos días de tratamiento conrespecto a la cantidad de ARN de replicón en las células no tratadas. Esto se presenta como porcentaje deinhibición. Cuando se ha obtenido una serie de puntos de datos generados por tratamientos de las células a unintervalo de concentraciones, se generan valores de CI50, es decir, la concentración de compuesto a la que laacumulación de ARN de replicón de VHC se reduce en un 50% por el compuesto. Por medio del ensayo repetido delos inhibidores de serina proteasa de VHC en el Ensayo de Replicón, se determina que la CI50 tiene un porcentaje de coeficiente de variación (%CV o 100% x desviación típica en CI50/CI50 media) de aproximadamente un 20%. La CI50 es el valor usado para clasificar los compuestos individuales ensayados en este ensayo basándose en su potenciacomo agentes antivirales contra VHC. Las determinaciones sencillas de la CI50 son inadecuadas para evaluar lautilidad de los compuestos usados en combinación. El análisis más eficaz de la serie de datos generados usando todas las combinaciones de interferones diferentes e inhibidores de serina proteasa requiere la evaluación delporcentaje de inhibiciones que se muestra en la Tabla 7 usando procedimientos matemáticos descritos más adelanteque están diseñados para determinar si los tratamientos combinados son agonistas, aditivos o sinérgicos.
A continuación se proporcionan detalles del Ensayo de Replicón:
Procedimiento para el Análisis Cuantitativo de ARN de Replicón de VHC en el Ensayo de Replicón de VHCUsando RT-PCR TaqMan
El ensayo de replicón se usa para medir la capacidad de posibles compuestos antivirales contra VHC parainhibir la acumulación de una molécula de replicón de ARN subgenómico de VHC en una línea celular Huh7(Lohmann et al. Replication of Subgenomic Hepatitis C Virus RNAs in a Hepatoma Cell Line. Science 285, 110-113(1999)). Este ensayo comprende tres componentes funcionales: (1) el mantenimiento de las células de replicón, lapreparación de las placas de ensayo y la aplicación del compuesto; (2) extracción del ARN celular total de las célulasde replicón; y (3) RT-PCR a tiempo real (TaqMan®) para medir la cantidad de ARN de replicón en cada muestra. ElEnsayo de Replicón requiere al menos 4 días para realizarse; sin embargo, el procedimiento puede interrumpirse ylas muestras congelarse entre las etapas. Cada componente de ensayo se describe más adelante.
1. Mantenimiento de la célula de replicón, preparación de las placas de ensayo y aplicación del compuesto 1.1 Mantenimiento de la línea de células de replicón
La línea celular usada en el Ensayo de Replicón se produce como se describe en Lohmann et al. (Replication of Subgenomic Hepatitis C Virus RNAs in a Hepatoma Cell Line. Science 285, 110-113 (1999)).Después se incuban matraces de cultivo de células de 150 cm2 (Costar) que contienen células dereplicón a 37ºC ycon 5% de CO2 hasta la confluencia, las células se diluyen 1:10, v/v, en matraces de cultivo de células de 150 cm2 limpios. El medio es DMEM que contiene suero bovino fetal al 10% (FBS), aminoácidos no esenciales 1X (NEAA),glutamina 1X (Glu) y G418 a 0,25 mg/ml. Se realizan tres pases seriados, cada vez dejando que las células alcancenla confluencia, seguido de dilución de las células en matraces de cultivo de células de 150 cm2 limpios. Estascélulas, denominadas “células originales”, después se reparten en alícuotas y se almacenan para el uso futuro en elEnsayo de Replicón. El análisis basado en TaqMan® se realiza para determinar el número de genomas de replicónde VHC por célula, que revela la presencia de ~150 copias del replicón por célula. Esto se basa en la relación decopias de ARN de replicón con respecto al doble de las copias del gen apoB humano (número de genomas haploides).
1.1.1 Las células originales se almacenan en N2 líquido. Para las células usadas en el Ensayo de Replicón,
después de 20 pases seriados, las células se abandonan y se revive un lote nuevo a partir del almacenamiento enN2 líquido.
1.2 Cultivo de células en bandejas de 96 pocillos para el Ensayo de Replicón
1.2.1. Para la preparación de placas de 96 pocillos, se tripsiniza un matraz de 75 cm2 con una confluencia
5 del 75% de células que contienen replicón, y se resuspenden en 10 ml de Medio A. La tripsinización se realiza retirando el medio, añadiendo 1 ml de tripsina-EDTA al 0,25%, p/v, y después retirando la tripsina-EDTA. Despuésde 5-10 minutos, las células se liberan del matraz y se resuspenden en medio.
1.2.2. Las células se cuentan usando un hemacitómetro, y la concentración celular se ajusta a 105 células/ml.
10 1.2.3. Cada pocillo se siembra con 100 !l de suspensión celular usando una pipeta multicanal Impact2 (Matrix), nunca cultivando más de cuatro placas de 96 pocillos desde una sola suspensión celular.
1.2.4. Se incuban placas de 96 pocillos a 37ºC durante una noche.
1.3. Dilución de compuesto y aplicación en bandejas de células de replicón
1.3.1. Se disuelven compuestos inhibidores de serina proteasa de VHC en dimetilsulfóxido (DMSO) a una
15 concentración final de 20 mM. Los interferones se suspenden en solución salina tamponada con fosfato que contiene albúmina de suero bovino al 0,1% p/v.
1.3.2. La solución de compuesto 20 mM se diluye a 1 mM con DMSO.
1.3.3. Se añaden 50 !l de compuesto disuelto en DMSO en 10 ml de Medio B (la concentración del compuesto es 5
mM y la concentración de DMSO es ahora de 0,5%) o se añaden 20 !l de compuesto 1 mM y 30 !l de DMSO a 10 20 ml de Medio B (la concentración de compuesto es de 2 !M).
1.3.4. La dilución de compuesto hasta la concentración final se completa mezclando compuesto/solución de Medio Bcon Medio C (contiene DMSO al 0,5%). Se realizan de una a cinco diluciones seriadas del compuesto con Medio C en un bloque de polipropileno de 2 ml de 96 pocillos para obtener las concentraciones finales deseadas de compuesto.
25 1.3.5. La placa celular se retira del incubador de 37ºC y se marca en la esquina superior derecha de la tapa y en el lado derecho de la base. El medio se vierte de las placas de 96 pocillos.
1.3.6. Se añaden 100 !l de soluciones de compuesto/medio de cada pocillo del boque de dilución 96 pocillos a laplaca de células de 96 pocillos usando una pipeta Impact2.
1.3.7. Se añaden 100 !l de medio C a todos los pocillos no tratados de acuerdo con la Tabla 3 para ensayar
30 compuestos a 1, 3, o 6 concentraciones diferentes. “Untx” se refiere a las células tratadas de forma simulada (DMSO añadido a la misma concentración que en las células tratadas) “Con.” se refiere a la concentración de compuesto.
TABLA 3 2 Compuestos, 6 concentraciones, 5 réplicas
Compuesto 1 Compuesto 2 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A untx untx untx untx untx untx untx untx untx untx
B
con.1 con.1 con. con con.1 con.1 con.1 con. con.1 con.1
1
1
1
C
con.2 con.2 con. con. con.2 con.2 con.2 con. con.2 con.2
2
2
2
D
con.3 con.3 con. con. con.3 con.3 con.3 con. con.3 con.3
3
3
3
E
con.4 con.4 con. con. con.4 con.4 con.4 con. con.4 con.4
4
4
4
F
con.5 con.5 con. con. con.5 con.5 con.5 con. con.5 con.5
5
5
5
G
con.6 con.6 con. con. con.6 con.6 con.6 con. con.6 con.6
66 6
H untx untx untx untx untx untx untx untx untx untx
4 Compuestos, 3 concentraciones, 5 réplicas
Compuesto 1
Compuesto 2
1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
untx untx untx untx untx untx untx untx untx untx
B
con.1 con.1 con.1 con. con. con.1 con.1 con.1 con. con.1
1
1
1
C
con.2 con.2 con.2 con. con. con.2 con.2 con.2 con. con.2
2
2
2
D
con.3 con.3 con.3 con. con. con.3 con.3 con.3 con. con.3
3
3
3
E
con.1 con.1 con.1 con. con. con.1 con.1 con.1 con. con.1
1
1
1
F
con.2 con.2 con.2 con. con. con.2 con.2 con.2 con. con.2
2
2
2
G
con.3 con.3 con.3 con. con. con.3 con.3 con.3 con. con.3
3
3
3
H
untx untx untx untx untx untx untx untx untx untx
Compuesto 3
Compuesto 4
16 Compuestos, 1 concentración, 4 réplicas
1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
untx comp.1 comp.2 comp. comp. comp.5 comp.6 comp.7 comp.8 untx
3
4
B
untx comp.1 comp.2 comp. comp. comp.5 comp.6 comp.7 comp.8 untx
3
4
C
untx comp.1 comp.2 comp. comp. comp.5 comp.6 comp.7 comp.8 untx
3
4
D
untx comp..1 comp.2 comp. comp. comp.5 comp.6 comp.7 comp.8 untx
3
4
E
untx comp.9 comp. comp. comp. comp. comp. comp. comp. untx
10
11 12 13 14 15 16
F
untx comp.9 comp. comp. comp. comp. comp. comp. comp. untx
10
11 12 13 14 15 16
G
untx comp.9 comp. comp. comp. comp. comp. comp. comp. untx
10
11 12 13 14 15 16
H
untx comp.9 comp. comp. comp. comp. comp. comp. comp. untx
10 111213 14 15
12 Compuestos, 1 concentración, 5 réplicas
1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
untx untx untx untx untx untx untx untx untx untx
B
comp1 comp1 comp1 comp. comp. comp.7 comp7 comp7 comp7 comp7
1
1
C
comp2 comp2 comp2 comp. comp. comp.8 comp8 comp8 comp8 comp8
2
2
D
comp3 comp3 comp3 comp. comp. comp.9 comp9 comp9 comp9 comp9
3
3
E
comp4 comp4 comp4 comp. comp. comp. comp. comp. comp. comp.
4
4
10 10 10 10 10
F
comp5 comp5 comp5 comp. comp. comp. comp. comp. comp. comp.
5
5
11 11 11 11 11
G
comp6 comp6 comp6 comp. comp. comp. comp. comp. comp. comp.
6
6
12 12 12 12 12
H
untx untx untx untx untx untx untx untx untx untx
5
1.4. Las placas se incuban durante 48 horas a 37ºC y después a someten a extracción de ARN.
TABLA 4
Resumen del equipo y suministros usados para el cultivo celular y la preparación de los compuestos
Pipeta Impact de 8 canales, 1250 !l
Nº de catálogo 2004 Matrix
Bloque de pocillos profundos de polipropileno de2 ml, 96 pocillos, estéril
Nº de catálogo 4222 Matrix
Depósitos de reactivos, de 25 ml, estéril
Nº de catálogo 8096 Matrix
Puntas de pipeta Inng X-tra 1250 !l
Nº de catálogo 8255 Matrix
Placa de 96 pocillos
Nº de catálogo 3595 Costar
Hemacitómetro
Línea brillante mejorada. Neubatter, profundidad 0,1 mm. Reichen
DMEM
Nº de catálogo 51444-798 JRH
L-glutamina (Glu)
Nº de catálogo 12403-010 GIBCO-BRL
Aminoácidos no esenciales (NEAA)
Nº de catálogo 11140-050 GIBCO-BRL
Suero bovino fetal (FBS)
Nº de catálogo 16250-078 GIBCO-BRL
GHS
Nº de catálogo 55-0273 Invitrogen
DMSO
Nº de catálogo D-2650 Sigma
Medio A
DMEM, FBS al 10%, NEAA 1X, Glu 1X, G418 0,25 mg/ml
Medio B
DMEM, FBS al 2%, NEAA 1X, Glu 1X
Medio C
DMEM, FBS al 2%, NEAA 1X, Glu 1X, DMSO 0,5%
Tripsina-EDTA 0,25%
GIBCO-BRL
2. Extracción de ARN celular total a partir de células que contienen replicón
2.1 Introducción
El objetivo del procedimiento es extraer ARN a partir de muestras de cultivo de tejidos in vitro de forma que 5 el ARN viral o celular se recupere cuantitativamente y sea suficientemente puro para analizarse por un ensayo de RT-PCR de VHC cuantitativo.
Para permitir la detección de variaciones en la eficacia de la extracción del ARN, se añaden cantidadesconvencionales de virus de la diarrea viral bovina (BVDV) un virus de ARN con alguna similitud con VHC, a cadamuestra de células antes de la extracción del ARN. De esta manera, el nivel de ARN de BVDV detectado en la
10 reacción RT-PCR múltiple final debe ser consistente entre todos los pocillos dentro de los límites de variabilidad asociados con el Ensayo de Replicón. Este control interno de eficacia de extracción de ARN se discute adicionalmente en la sección de TaqMan® presentada más adelante.
La estrategia de extracción de ARN usada es el procedimiento RNeasy fabricado por Qiagen Inc. (Valencia,CA). Este procedimiento emplea 96 minicolumnas basadas en sílice que están colocadas en una matriz compatible15 con operaciones de cultivo de tejidos de 96 pocillos. La tecnología de extracción de ARN es una modificación del procedimiento de Boom en el que todas las proteínas y ácidos nucleicos celulares, incluyendo las nucleasas, primerose desnaturalizan con una sal caotrópica fuerte (tiocianato de guanidinio). En este medio, los ácidos nucleicos tienenuna fuerte afinidad por la sílice, el material presente en los discos de las minicolumnas; sin embargo, las proteínas y otros contaminantes no se unen a la sílice y pasan a través de las columnas. Después de lavar las columnas con
20 soluciones caotrópicas/etanol, las muestras se secan parcialmente y el ácido nucleico después se libera de la columna en un pequeño volumen de agua.
Para reducir la variabilidad en la recuperación del ARN de VHC, debe tenerse cuidado con las condicionesde lavado y secado parcial de la columna. La presencia de una pequeña cantidad de alcohol en una columnacontaminará el ARN final e interferirá con el sistema de detección de RT-PCR. Se requiere precaución en todas las
25 fases de este procedimiento porque las muestras de partida pueden llevar riesgos biológicos, la sal caotrópica es muy cáustica y, como un tiocianato, puede generar gas cianuro venenoso si se deja en contacto con medios ácidos.
TABLA 5
Resumen del equipo y suministros necesarios para los procedimientos de Extracción de ARN de VHC
Kit RNeasy 96 (24)
Nº de catálogo 74183 Qiagen
Colector QIAvane 96
Nº de catálogo 19504 Qiagen
Centrífuga 4-15C para 2x96 placas 6000 x g
Nº de catálogo 81010 Qiagen
Rotor de placas para 2x96 placas
Nº de catálogo 81031 Qiagen
Alcohol etílico 200 Proof
Pipeta Impact2 de 8 canales, 250 !l
Nº de catálogo 2002 Matrix
Pipeta Impact2 de 8 canales, 1250 !l
Nº de catálogo 2004 Matrix
Bloque de pocillos profundos de polipropileno de 2 ml, 96 pocillos, estéril
Nº de catálogo 4222 Matrix
Depósitos de reactivo de 25 ml, estériles
Nº de catálogo 8096 Matrix
Puntas de Pipeta largas X-tra de 1250 !l
Nº de catálogo 8255 Matrix
Puntas de Pipetas de 200 !l
Nº de catálogo 7275 Matrix
medio MEM sin suero
Nº de catálogo 11095-80 GIBCOBRL
2.2 Procedimiento:
2.2.1 Lisis Celular
2.2.1.1. Preparar tampón de lisis: Para una placa de 96 pocillos, añadir 150 !l de �-mercaptoetanol (�-ME) y 1 !l de solución madre de BVDV (agitar vorticialmente la solución madre antes de la
5 adición) a 15 ml de tampón RLT (un componente del kit RNeasy. Qiagen). Esta solución madre se prepara infectando células MDBK (células de riñón de bovino, nº CCL-22, disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo. Manassas VA) con BVDV y recogiendo el cultivo al efecto citopático máximo (CPE). Esta solución madre tiene un título infeccioso de aproximadamente 1x107 ufc/ml. Esto proporciona a BVDV un ciclo umbral (Ct) de aproximadamente 22 en el ensayo TaqMan®. La solución madre de BVDV se almacena en un congelador a -80ºC.
2.2.1.2. Las células se lavan con 150 !l de medio MEM sin suero (programa 4 en una pipetaelectrónica de 8 canales. P1250: rellenar 1250, Disp 150 x 8). Se añaden 150 !l de tampón de lisis a cada pocillo (mismo programa).
2.2.1.3. Se extrae ARN inmediatamente, o las células se congelan a -80ºC.
2.2.2. Preparación de reactivos y materiales para la extracción del ARN.
2.2.2.1. Anotar el número de lote del RPE y del Kit RNeasy 96.
2.2.2.2. RPE: se añaden 720 ml de etanol al 100% a un frasco de RPE (Qiagen) y se mezcla bien;los frascos de RPE siempre se agitan bien antes del uso.
2.2.2.3. Se añade etanol al 70%:150 ml de dietilpirocarbonato (DEPC) acuoso a 350 ml de etanolal 100% y se mezcla bien.
2.2.3. Preparación de ARN con el kit RNeasy 96
2.2.3.1. Las muestras congeladas se descongelan a temperatura ambiente durante 40 minutos. Almismo tiempo, se descongela una columna de controles de extracción para cada placa (Controles
25 de Extracción: los controles de extracción RNeasy son una serie de 8 tubos todos conectados entre sí. Dentro de cada tubo hay 170 !l de lisado celular con una cierta relación entre células positivas y negativas para VHC. Desde la parte superior a la inferior hay dos de cada uno de lossiguientes controles: bajo, medio, alto y cero, respectivamente. (Véase la sección 2.3 del protocolomostrado más adelante)).
2.2.3.2. Las muestras se mezclan aspirando y liberando cinco veces con una pipeta 100 !l. La muestra entera se transfiere a las columnas 1-10 del bloque de pocillos cuadrados de Matrix de 2ml (programa I en P250: Mezcla 100 x 5, Relleno 170, Purga).
2.2.3.3. Se transfieren 150 !l del patrón de replicón a la columna 11 (sin muestras en la columna 12).
35 2.2.3.4. Se añaden 150 !l de etanol (EtOH) al 70% a cada muestra (programa 4 en P1250: Relleno 1250, Disp 150).
2.2.3.5. Una placa de RNeasy 96 marcada con el número de placa apropiado se pone en elcolector de vacío. Se mezcla y se transfiere el lisado/EtOH a la placa RNeasy 96 (programa I enP1250: Mezcla 200, Tiempos 5, Relleno 330 y Purga). Todos los pocillos que no se hayan usadose cierran herméticamente con una cinta transparente (suministrada por Qiagen), normalmente enla columna 12.
2.2.3.6. Se aplica vacío (aproximadamente 800 mbar) para cargar la muestra en las minicolumnas.
2.2.3.7. La placa RNeasy-96 se lava con 1000 !l de tampón RW1 (Qiagen)/pocillo (programa 2 en 45 P1250: Relleno 1000, Disp 1000).
2.2.3.8. Se aplica vacío al filtro a través del tampón RW1 y se vacía el flujo.
2.2.3.9. La placa RNeasy-96 se lava con 1000 !l de tampón RPE/pocillo (programa 2 en P1250).
2.2.3.10. Se aplica vacío para filtrar a través del tampón RPE.
2.2.3.11. Repetir la etapa 2.2.3.9
2.2.3.12. Se aplica vacío al filtro a través del tampón RPE, manteniendo el vacío aplicado durante3 minutos.
2.2.3.13. Secar la placa RNeasy-96: la placa RNeasy-96 se pone en una rejilla de microtubos derecogida (suministrada por Qiagen), se cubre con la cinta AirPore suministrada y la unidad secentrifuga durante 10 min a 6000 x g (Centrífuga Qiagen Sigma; 4-15ºC).
2.2.3.15. Eluir el ARN de la placa de 96 pocillos RNeasy: la placa RNeasy se transfiere a la partesuperior de una nueva rejilla de microtubos de recogida. Se añaden 70 !l de agua sin RNasa en la mitad de cada pocillo (programa 3 en P1250: Relleno 850, Disp 70).
2.2.3.16. Incubar 1 minuto a temperatura ambiente y después poner una cinta AirPore limpia sobrela placa.
2.2.3.17. La unidad después se centrifuga durante 4 minutos a 6000 x g en un centrífuga Sigma 415C. El volumen eluido mide entre 28 !l y50 !l.
2.2.3.18. Se desecha la placa RNeasy-96 y la rejilla de tubos de recogida se cierra herméticamentecon las tapas proporcionadas por Qiagen (8 por tira).
2.2.3.19. El ARN eluido se almacena a -80º C o se analiza inmediatamente en el ensayo TaqMan®.
2.3 Preparación de Controles de Extracción
Día 1
2.3.1.1. Cultivar 2,5 x 107 células productoras de replicón en un matraz de cultivo de tejidos de 150 cm2 (T-150).
2.3.1.2. Cultivar 2,0 x 106 células Huh7 en un matraz de cultivo de tejidos de 75 cm2 (T-75).
2.3.1.3 Incubar durante una noche a 37ºC.
Día 2
2.3.1.4. Lisar las células con tampón de lisis.
2.3.1.5. Retirar el sobrenadante de las células Huh7 y las células productoras de replicón y lavar lamonocapa con 10 ml de medio sin suero (MEM).
2.3.1.6. Añadir 30 ml de tampón de lisis (con 1 !l de solución madre de BVDV/15 ml de tampón delisis) a las células Huh7, mezclar pipeteando de forma repetida y poner el lisado celular en un tubo de centrífuga de cultivo de tejidos de fondo cónico de 50 ml.
2.3.1.7. Añadir 10,5 ml de tampón de lisis a las células productoras de replicón, mezclarpipeteando repetidamente y poner el lisado celular en un tubo de centrífuga de cultivo de tejidos defondo cónico de 15 ml.
2.3.2. Para el patrón de extracción de HIGH: recoger alícuotas de 170 !l de células productoras dereplicón y lisarlas en las filas 5 y 6 de dos rejillas de tubos de 0,75 ml Matrix.
2.3.3. Para el patrón de extracción MEDIO: Añadir 1,0 ml del lisado de células productoras de replicón a 9 ml del lisado de Huh7 y mezclar bien. Añadir una alícuota de 170 !l de esta mezcla a las filas 3 y 4 de dos rejillas de tubos de 0,75 ml Matrix.
2.3.4. Para el patrón de extracción BAJO: Añadir 50 !l del lisado de células productoras de replicón a 10 ml del lisado de Huh7 y mezclar bien. Añadir alícuotas de 170 !l de esta mezcla a las filas 1 y 2 de dos rejillas de tubos de 0,75 ml Matrix.
2.3.5. Control de extracción CERO: añadir alícuotas de 170 !l del lisado de células Huh7 a las filas 7 y 8 de dos rejillas de tubo de 0,75 ml Matrix.
2.3.6. Almacenar los controles a -80ºC
3. RT-PCR TaqMan y Análisis de Datos
3.1 Introducción: Se usa RT-PCR cuantitativa a tiempo real para medir la cantidad de ARN de replicón deVHC en cada muestra. Esta tecnología también se denomina ensayo de nucleasa 5’ basado en PCR y TaqMan®.El instrumento analítico es el Applied Biosystems 7700 Prism Sequence Detection System (Applied Biosystems, FosterCity, CA). Este instrumento es esencialmente un espectrógrafo de fluorescencia inducido por láser multiplexado entiempo acoplado con un aparato de ciclos térmicos. Controla la acumulación de amplicón de PCR en cada pocillo deuna bandeja de muestras de 96 pocillos a lo largo del transcurso del procedimiento de PCR.
3.2. Uso de control interno de BVDV: Como se ha mencionado en la sección previa, en todas lasmuestras se incorpora un control positivo interno. Sirve como medida de la eficacia de la extracción del ARN y demuestra si la muestra contiene contaminantes que inhiban la PCR TaqMan®. BVDV se mezcla con el tampón delisis celular caotrópico antes de aplicar el tampón de lisis a las células. Aunque en todas las muestras está el controlpositivo, el ensayo del control positivo interno de BVDV sólo se realiza cuando los datos del ensayo de ARN dereplicón de VHC están fuera de los límites esperados, lo que sugiere que podría haber un problema con lasmuestras. El 7700 puede controlar simultáneamente la acumulación de dos amplicones de PCR diferentes en elmismo tubo usando sondas de detección marcadas con dos colorantes indicadores fluorescentes diferentes (“multiplexación”). Los criterios específicos que inducen un análisis TaqMan® para el control positivo interno deBVDV de una placa de muestras se describen en la sección de análisis de datos (3.6).
3.3 ARN de replicón de VHC, sonda y cebadores de TaqMan . Debido a la estabilidad genética esperada y a lafalta general de ARN, se emplean la estructura secundaria del gen de resistencia a neomicina (neo) codificado en elreplicón, cebadores y una sonda que se une a esa región. Este segmento del ARN del replicón se extiende desde labase 342-1193 del replicón de 8001 pares de bases. (SEC ID Nº: 1):
3.4. Procedimientos
3.4.1. Procedimiento para preparar mezclas maestras 1x para RT-PCR de NEO y BVDV
Tabla 6
10 Resumen de equipo y suministros para preparar mezclas maestras de 10 placas de RT-PCR
Equipo y suministros
Nº de pedido Proveedor
Pipeta de 0,5-10 !l
22 47 005-1 2000 Series Eppendorf
Pipeta de 2-20 !l
22 47 005-9 2000 Series Eppendorf
Pipeta de 10-100 !l
22 47 020-5 2000 Series Eppendorf
Pipeta de 50-200 !l
22 47 025-6 2000 Series Eppendorf
Pipeta de 100-1000 !l
22 47 230-2 2000 Series Eppendorf
Puntas Matrix de 1250 !l
Nº de catálogo 8255 Matrix
Puntas Matrix de 200 !l
Nº de catálogo 7275 Matrix
Puntas ART de 10 !l
Nº de catálogo 2140 Molecular Bioproducts
Puntas ART de 20 !l
Nº de catálogo 2149 P Molecular Bioproducts
Puntas ART de 100 !l
Nº de catálogo 2065 M Molecular Bioproducts
Puntas ART de 200 !l
Nº de catálogo 2069 Molecular Bioproducts
Puntas ART de 1000 !l
Nº de catálogo 2079 E Molecular Bioproducts
Pipeta electrónica, Impact2
Nº de catálogo 2001 Matrix
Tubos de microcentrífuga sin RNasa de 1,5 ml
Nº de catálogo 12450 Anibion
Tubos de polipropileno de 14 ml
Nº de catálogo 352059 Falcon
Depósito de reactivo de 25 ml
Nº de catálogo 8096 Matrix
Placa de reacción de 96 pocillos
Nº de catálogo N801-0560 Applied Biosystems
Tiras de protección óptica
Nº de catálogo N801-0935 Applied Biosystems
Revestimientos estériles desechables
Nº de catálogo 9515-E Baxter
Reactivos
Nº de pedido Proveedor
Ácido
HCl 0,1 N Fisher
RNAse Zap
Nº de catálogo 9780 Ambion
RNAse away
Nº de catálogo 7005 Molecular Bioproducts
10-pak, kit de reactivos nucleares EZRT-PCR, tampón de reacción 5x,acetato de manganeso 25 mM, desoxiNTPs
Nº de catálogo 403028 Applied Biosystems
Sonda VIC NEO 2 !M, (=10x), 550 !l por alícuota
Nº de catálogo 450003, adaptado, 5’-VIC-CTG TGG CCGGCT OGG TGT GGTAMRA-3’(SEC ID Nº2) Applied Biosystems
Sonda VIC NEO 2 !M, (=10x), 550 !l por alícuota (Vertex)
Nº de catálogo 450003, adaptado, 5’-VIC-CCTCG TCC ACG TGG CAT CTC GATAMRA-3’(SEC ID Nº 3) Applied Biosystems
Cebador directo de NEO 3 !M (=10s)mezcla de cebador directo/inverso, 550 !l por alícuota
Nº de catálogo 4301972, adaptado, 5’-CCG CCT TTC TGG ATT CAT CG-3’ (SEC ID Nº 4) Applied Biosystems
Cebador directo de NEO 3 !M (=10x) mezcla de cebador directo/inverso, 350 !l por alícuota
Nº de catálogo 430.1972, adaptado, 5’-CCC ATT CGCCGC CAA-3’ (SEC ID Nº 5) Applied Biosystems
Cebador directo de BVDV 3 !M (=10x) mezcla de cebador directo/inverso, 550 !l por alícuota
adaptado, 5-CAG GGT AGT CGT CAG TGG TTC G-3’ (SEC ID Nº 6). Purificación en gel aescala 1,0 !M Oligos, etc.
Cebador directo de BVDV 3 !M (=10x) mezcla de cebador directo/inverso, 550 !l por alícuota
adaptado, 5’ GGC CTC TGC AGC ACC CTA TC-3’ (SEC ID Nº 7), en gel, escala depurificación 1,5 !M Oligos, etc.
Patrones de ARN de NEO
ARN transcrito in vitro a partir de un plásmido que contiene la parte del gen neo de ARN del replicón de VHC usando ARNpolimerasa de T7. El ARN transcrito in vitro se cuantifica basándose en un peso molecular conocido de los transcritos y la absorbancia UV de la solución de transcrito purificada. Este ARN se diluye, se reparte en alícuotas y se almacena a -80ºC. Se descongelan alícuotas individuales para cada ensayo TaqMan®.
Muestras de ARN a ensayar aisladas a partir de células de replicón de VHC (sección 2 de este protocolo), 10 !l/placa de 96 pocillos
Agua sin nucleasa (no tratada DEPC)
Nº de catálogo 9930 Ambion
3.4.2. Preparación de Reactivos para la Mezcla Maestra
3.4.2.1. Limpiar el banco de trabajo siguiendo las dos etapas indicadas a continuación y limpiar las pipetascon RNAse away.
5 RNAse Zap (Ambion, Austin, TX) RNAse Away (Molecular Bioproducts, San Diego, CA)
3.4.2.2. Abrir los reactivos nucleares de EZ RT-PCR (Applied Biosystems) y poner el tampón 5x en hielo,descongelar los reactivos congelados a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos y después ponerlos en hielo. Un kit de reactivos EZ RT-PCR puede usarse para analizar dos extracciones de
10 ARN de 96 pocillos.
3.4.2.3. Coger un tubo de sonda VIC 2 !M (NEO o BVDV, 550 !l por tubo) a -20ºC y ponerlo en hielo.
3.4.2.4. Coger un tubo de mezcla de cebador directo/inverso 3 !M (NEO o BVDV, 550 !l por tubo) a -20ºC y ponerlo en hielo.
3.4.2.5. Coger un tubo (30 !l) de transcrito de ARN patrón (108 copias/10 !l) a -80ºC y ponerlo en hielo.
3.4.2.6. Coger un tubo de agua Ambion a temperatura ambiente.
3.4.3. Montaje de mezcla maestra para una reacción en placa 96 de pocillos.
3.4.3.1. Usar una pipeta de 1 ml para transferir tampón 5x (Applied Biosystems) a un tubo de 14 ml; elvolumen total añadido es 1100 !l.
3.4.3.2. Usar una pipeta de 1 ml para añadir Mn(OAc)2 25 mM (Applied Biosystems) a un tubo de 14 ml; el volumen total añadido es 660 !l.
3.4.3.3. Usar una pipeta de 200 !l para añadir 165 !l de dATP 10 mM al tubo de 14 ml. Hacer lo mismo para dCTP 10 mM, dUTP 20 mM y dGTP y 10 mM.
3.4.3.4. Usar una pipeta de 1 ml para añadir 550 !l de mezcla de cebador directo/inverso 10x3M.
3.4.3.5. Usar una pipeta de 1 ml para añadir 550 !l de sonda 10x2 !M.
3.4.3.6. Usar una pipeta de 1 ml para añadir 220 !l de ADN polimerasa de rTth (Applied Biosystems).
3.4.3.7. Usar una pipeta de 100 !l, para añadir 55 !l de AmpErase UNG (Applied Biosystems).
3.4.3.8. Usar una pipeta de 1 ml para añadir 605 !l de H2O Ambion al tubo de 14 ml: el volumen final es de 4400 !l en total.
3.4.3.9. Transferir los 4400 !l de mezcla maestra a un depósito de reactivo de 25 ml.
3.4.3.10. Distribuir 40 !l por pocillo en los 96 pocillos usando una pipeta de 8 canales.
3.4.3.11. Transferir 10 !l de muestras desconocidas extraídas a pocillos de la placa de reacción usando unapipeta de 8 canales, columna por columna, de la columna 1 a la columna 11. Tapar cada columna despuésde la transferencia.
3.4.3.12. Añadir 270 !l de H2O Ambion a los 30 !l de 108 copias/10 !l de transcrito de ARN para uso en la curva patrón y mezclar. Ahora hay 107 copias del ARN del patrón de cuantificación del replicón de VHC/10 !l.
3.4.4. Preparación del ABI 7700 para cada ensayo
3.4.4.1 Antes de cada ensayo, reiniciar el ordenador para el ABI 7700 y reconstruir el escritorio.
3.4.4.2 Cerrar y retirar cualquier programa redundante del disco duro, eliminar los datos sobrantes.
3.4.4.3 Abrir el programa Secuence Detector v1.7 (SDS software).
3.4.4.5 Abrir la carpeta “Replicon Assay Runs”.
3.4.4.6 Abrir la placa de plantilla de “Ensayo de Replicón”. Las condiciones de los ciclos térmicos programadas en la plantilla son las siguientes: Etapa I: 50ºC durante 2 minutos. Etapa 2: 60ºC durante 30 minutos. Etapa 3: 95ºC durante 5 minutos. Etapa 4: 95ºC durante 15 segundos. Etapa 5: 60ºC durante 60 segundos. Número de repetición de ciclos de las etapas: 4-5: 40. Instrumento de plantilla: diagnóstico: opciones avanzadas: Selección de vistas: mostrar mse.
Selección de vistas: mostrar el mejor ajuste. Selección de misceláneo: colorante de referencia ROX.
3.4.4.7 “Grabar” (no “grabar como”) el archivo en la carpeta de “Ejecución de Ensayo de Replicón”.
3.4.4.8 Mostrar el setup: presionar EJECUTAR.
3.5 Preparar los datos ABI 7700 después de una ejecución usando el software SDS.
3.5.1. Las placas de ensayo se retiran del ABI 7700 y se desechan sin haberse abierto. Esto reduce en gran medidalo problemas de laboratorio con la contaminación cruzada de la PCR.
3.5.2. Los datos se analizan usando el software Sequence Detector System V1.7.
3.5.3. Los niveles umbral se establecen inicialmente usando parámetros por defecto.
3.5.4. Criterios de rechazo de datos: pueden rechazarse puntos de datos o series de placas enteras. Si ha habidouna desviación significativa del protocolo, fallo del reactivo o contratiempos, o fallos en la ejecución del ABI 770, losdatos deben descartarse. Para rechazar cualquier punto de datos de una ejecución aparentemente normal, debencumplirse uno o más de estos criterios.
3.5.4.1. Cálculos del ciclo umbral. Normalmente usar los valores por defecto para el software SDS. Si elCt de la muestra más concentrada es menor de 15, cambiar el límite de parada del valor umbral cuado sea necesario a un valor menor de forma que el Ct de la muestra de mayor concentración sea mayor que el valor de parada. Actualizar los cálculos después de hacer este cambio.
3.5.3.2. Considerar el rechazo de un ensayo TaqMan® anormal entero como se indica por unadesviación de los valores medios para la pendiente y la intersección con el eje y de la línea generadapor análisis de los patrones de ARN de neo. Los intervalos aceptables para estos valores son:
Los valores dependientes deben estar comprendidos entre 3,0 y 3,6
Los ciclos de intersección con el eje y deben estar comprendidos entre 36 y 41 ciclos.
3.5.4.3. Los pocillos TaqMan® individuales aberrantes indicados por Rn/iRn extremos puedensuprimirse antes del análisis de los datos de forma que no afecten a los cálculos del software de SDS.
3.5.4.4. Examinar y registrar los valores de Ct de control sin plantilla y confirmar que son >7,0 Cr (>100X) mayores que el Ct para cualquier muestra tratada con compuesto.
3.5.5. Los valores de Ct de patrones de ARN de VHC se comparan con resultados previos.
3.5.6. La curva patrón de ARN de VHC se compara con resultados previos.
3.5.7. Si es evidente una amplificación aberrante en pocillos individuales, esos pocillos se identifican y se anotan.
3.5.8. El archivo de “resultados” se exporta y se transfiere desde el ordenador 7700 a otro ordenador para el análisisusando Microsoft Excel.
3.5.9. Se presenta cualquiera de los siguientes cambios en preparaciones de reactivos o diluciones usadas. Síntesis de nueva sonda o cebador del vendedor. Dilución y alícuotas de nueva sonda o cebador. Preparación de nuevos transcritos de ARN de plantilla. Dilución y alícuotas de transcritos de ARN de plantilla. Nueva preparación viral de BVDV. Nueva preparación de 11 patrones de columna
3.6 Análisis de datos TaqMan
3.6.1. Copiar y pasar el número de Ct de VHC de TaqMan® y el número de copias del archivo de resultados de TaqMan® a las celdas apropiadas del macro de Microsoft Excel del análisis de datos de Ensayo de Replicón, y ejecutar el macro.
3.6.2. Copiar la tabla de resultados TaqMan® de la hoja de macro en otra hoja, introducir el número de serie del compuesto y el número de lote.
3.6.3 A partir de esta hoja de Excel, se calcularán la media, desviación típica y CV en porcentaje de laactividad inhibidora del compuesto, así como el número de copias de VHC, el número de Ct de VHC y elnúmero de Ct de BVDV (si está disponible) de todos los puntos de dilución en 5 réplicas y en un control sin compuesto.
3.6.4. Criterios para el rechazo de datos y realización de TaqMan® de control de BVDV. Comprobar todoslos cálculos. Los puntos de datos o series de placas enteras pueden rechazarse. Si hay una desviaciónsignificativa del protocolo, fallo del reactivo o contratiempos, o fallo de la ejecución de ABI 7700, los datosdeben desecharse. Para rechazar cualquier punto de datos de un ensayo aparentemente normal, deben satisfacerse uno o más de estos criterios. La desviación típica del porcentaje de inhibición debe ser menordel 30% en los compuestos activos. El % CV del número de copias de VHC debe ser menor del 30%. Ladesviación típica de Ct de VHC de todas las muestras debe ser menor de 0,5; esto es normalmente de aproximadamente 0,1 a 0,3 en la mayoría de las muestras. Si la desviación típica de Ct de VHC es mayorde 0,5, volver a la tabla de datos de partida y comprobar el número de Ct de 5 réplicas. Si el número de Ct de cualquier pocillo es 2 Ct diferente del número medio de Ct de 5 réplicas, entonces este pocillo debeomitirse del análisis. Si más de 3 pocillos (no en la misma columna) tienen números de Ct inusuales,
5 entonces debe realizarse el ensayo de control interno del TaqMan® de BVDV. Si los datos de BVDV muestran irregularidad, entonces el compuesto debe ensayarse de nuevo.
3.6.5. Cálculo de CI50: Copiar y pasar los datos de inhibición media y desviación típica a una dosisrespuesta sigmoidea con un calculador de pendientes variables que usa métodos de regresión no lineal.Usando esta herramienta, calcular el valor de CI50 usando los dos métodos: fijar el máximo a un 100% de
10 inhibición únicamente, o fijar el máximo a un 100% de inhibición y el mínimo a un 0% de inhibición. Después se presenta para cada compuesto el método que proporciona el ajuste más claro. El valor de CI50 más fiable procede del cálculo que tiene el menor error típico. Si los valores de CI50 calculados a partir de estas dos opciones de ajuste de curva muestran más de una diferencia de una vez, o si el CI50 de SD es mayor que el CI50, el compuesto debe ensayarse de nuevo a las concentraciones ajustadas.
15 Cálculo del Efecto de Inhibidores de Serina Proteasa de VHC en Combinación con Interferones
El efecto de un inhibidor de serina proteasa de VHC (HSPI) y un interferón en combinación puede evaluarseen el Ensayo de Replicón generando una curva de dosis-respuesta para el HSPI en presencia de diversos niveles deinterferón o determinando una curva de dosis respuesta para un interferón en presencia de varios niveles de HSPI. El objetivo es evaluar si hay más o menos inhibición de la acumulación de ARN viral de la que sería de esperar si los
20 dos fármacos produjeran efectos aditivos en el ARN. Más específicamente, se usa la definición de aditividad de Lowe ((1928) Die Quantitation Probleme der Pharmakologie Ergebn. Physiol., 27, 47-187). Ésta se define como seindica a continuación. Supongamos que DE,INF es la concentración de interferón que produce un efecto E y supongamos que DE,HSPI es la concentración de inhibidor de proteasa que produce un efecto E.
Entonces no hay interacción o la aditividad de Lowe se define por la siguiente relación, donde la 25 combinación de concentración D de U y D de HSPI produce el efecto E.
Después, la falta de interacción o aditividad de Lowe se define por la siguiente relación, donde la combinación de concentración D1 de INF y D2 de HSPI produce el efecto E.
El grado de sinergia o antagonismo se expresa en términos de curvas de iso-efecto o Isoboles. La
30 combinación (D1, D2) es un punto en un gráfico en el que los ejes son las concentraciones de interferón y HSPI (Fig. 2). Todas estas combinaciones que producen un nivel de efecto E forman el efecto E Isobol. Necesariamente(DE,INF,0) y (0,DE,HSPI) son puntos en el Isobol. Los Isoboles son líneas rectas que conectan puntos (DE,INF,0) y(0,DE,HSPI) cuando se satisface la relación de aditividad (1).
Los Isoboles cóncavos hacia arriba indican sinergia, y los Isoboles cóncavos hacia abajo indican
35 antagonismo. Siguiendo las directrices de Berenbaum, M.C. ((1985) The expected effect of a combination of agents: the general solution. J. Theor. Biol., 114, 413-431), y Greco, Park and Rustom ((1990) Application of a NewApproach for the Quantitation of Drug Synergism to the Combination of cis-Diamminedichloroplatinum and 1-1-D Arabinofuranosylcytosine, Cancer Research, 50, 5318-5327) se añade un término para (1) justificar la sinergia o elantagonismo. La ecuación define una superficie de respuesta que puede ajustarse a los valores de control en
40 porcentaje a todas las combinaciones de tratamiento. Los gráficos del contorno de esta superficie de respuesta ajustada son los Isoboles.
El modelo de superficie de respuesta asume una respuesta a la dosis sigmoidea para cada compuestodefinida por (2).
Las concentraciones que proporcionan un nivel de actividad E especificado solo se proporcionan por (3)
Para cumplir el modelo de Greco et al. (1990), la acción combinada de los fármacos debe satisfacer la ecuación (4) para cada combinación de fármacos que produce el nivel de respuesta E.
El parámetro a mide la cantidad de interacción. Un valor cero de alfa significa que no hay interacción oaditividad ya que la ecuación se reduce a (1) cuando a=0. Dados los valores de CI50, las pendientes de Hill (m), el valor máximo (Emax) y el valor mínimo (B), esta ecuación puede solucionarse para proporcionar el efecto resultantede cualquier combinación de tratamiento [INF] y [HSPI]. Por lo tanto, esta ecuación define una superficie de respuesta. Dado un experimento en el que se varían [INF] y [HSPI], los parámetros pueden elegirse usando regresión de mínimos cuadrados ponderada no lineal. El parámetro a puede relacionarse con una medida desinergia S (Hewlett, P. S. (1969) Measurement of potencies of drug mixtures, Biometrics, 25, 477-487) que se tomadirectamente a partir de los Isoboles a un efecto del 50%. S es la relación de la distancia desde el origen al Isobolque define la aditividad, a la distancia desde el origen al Isobol de los datos ajustados, a lo largo de la línea a 45grados de los ejes. (S=ON/OM véase la Figura 3). La relación es a = 4 (S2-S).
El método descrito en Greco et al. (1990) anteriormente para ajustar la superficie de respuesta y determinarel parámetro de sinergia a con su nivel de significado se sigue para evaluar el grado de sinergia en una serie deexperimentos ensayando HSPI en combinación con varios interferones diferentes. Sin embargo, existe la necesidadde ponderar observaciones con menos recuentos más que las que tienen mayores recuentos. Los recuentos serelacionan directamente con el porcentaje de control, que es el efecto E. Usando métodos descritos en Carroll, R.J. y Rupert, D. ((1988) (Transformation and Weighting in Regression, Chapman and Hall, New York) puede verse que lavariabilidad de un pocillo a otro aumenta con el cuadrado del porcentaje medio del valor de control. Por lo tanto, lasobservaciones se ponderan por uno con respecto al cuadrado del valor de control en porcentaje (E) ajustado. La varianza y ponderación usadas para analizar estos experimentos es coherente con relaciones de variabilidad observadas por los investigadores que investigan métodos para el analizar ensayos de radioligando (Finney, D.J.,(1976), Radioligand Assay, Biometrics, 32, 721-740, and Dudley, R. A. Edwards, P., Ekins, R. P., McKinzie, I. G. M.,Raab, G.M., Rodbard, D. and Rodgers, R. P. C. (1985), Guidelines for Immunoassay Data Processing, ClinicalChemistry, 31/8, 1264-1271).
Resultados
En un experimento inicial, se ensaya el inhibidor de serina proteasa de VHC, Compuesto CU, en unintervalo de concentraciones de 3 !M a 0,0123 !M, es decir, un intervalo de 244 veces. Las concentraciones de interferón-alfa 2B varían de 30 unidades por muestra a 0,0096 unidades por muestra, es decir, un intervalo de 3125veces. Como se muestra en la Tabla 7, cuando se usa como un solo tratamiento de fármaco, el Compuesto CUpresenta un valor de CI50 de 0,48 !M y el interferón CI50 es 2,19 U. Dentro de la precisión del Ensayo de Replicón,que es de aproximadamente un 20%, la adición del interferón alfa 2B produce un aumento en la inhibición de laacumulación de ARN del replicón de una manera dependiente de la dosis. Por ejemplo, el tratamiento de las célulascon Compuesto CU 0,333 !M produce una inhibición del 28% de la acumulación de ARN del replicón. El tratamientode las células con una combinación de Compuesto CU 0,333 !M, que es un 71% de la dosis de CI50 (0,469 !M) y0,24 U de interferón alfa 2B, que es un 11% de la CI50 del interferón alfa 2B (2,05 !M) produce una inhibición del49% de la acumulación de ARN del replicón. De esta manera, el 71% de una dosis CI50 en combinación con el 11% de la otra produce una inhibición del 49% de la acumulación de ARN del replicón. Usando una estrategia intuitivapara determinar si un tratamiento combinado es sinérgico o aditivo o antagonista, se podría predecir que si el efectodel tratamiento combinado fuera sólo aditivo, sería de esperar que las fracciones combinadas de las dos dosis deCI50 necesitaran obtener una inhibición del 49% de la acumulación del ARN del replicón para ser del 98%. Losresultados experimentales de los presentes solicitantes demuestran que el nivel de inhibición de la acumulación deARN del replicón se consigue usando el 71% más el 11%, es decir, el 82% de la dosis de CI50 en lugar del 98%,como se predice para los efectos aditivos del tratamiento combinado. De esta manera, a estas concentraciones decompuestos, el efecto parece ser sinérgico porque se usan dosis fraccionales más pequeñas de la dosis de CI50 de cada compuesto para obtener una inhibición del 49% del ARN del replicón de VHC que la que se requeriría con cadacompuesto solo, donde se necesitaría el 98% de las dosis CI50. Los resultados de este tratamiento combinado se muestran en la Tabla 8 y gráficamente en la Figura 1.
TABLA 7
Inhibición de acumulación de ARN del replicón después de 48 horas de tratamiento con Compuesto CU e interferón alfa 2B, individualmente o en combinación Interferón-alfa 2B (unidades) Compuesto CU
30 U 6 U 1,2 U 0,24 U 0,048 U 0,0096 U 0 U (conc.)
3 !M
99% 99% 99% 99% 98% 98% 98% 1 !M
99% 98% 96% 95% 92% 93% 88% 0,333 !M
94% 87% 66% 49% 33% 27% 28% 0,111 !M
93% 79% 46% 29% 12% 15% 11% 0,0370 !M
92% 78% 44% 21% 2% 7% 8% 0,0123 !M
92% 78% 44% 20% 19% 19% 5% 0 !M
89% 73% 38% 16% 8% 12% 0%
Estos resultados iniciales, obtenidos como se ha indicado anteriormente por medio del uso del Ensayo deReplicón in vitro y un análisis de aditividad sencillo de los datos generados por ese ensayo, demuestran que eltratamiento combinado de células de replicón con un inhibidor de serina proteasa de VHC y un interferón produce almenos un efecto antiviral aditivo y probablemente un efecto antiviral sinérgico.
Los datos anteriores se han reanalizado usando las herramientas matemáticas formales descritas anteriormente para determinar si la relación entre el inhibidor de la serina proteasa de VHC CU y el interferón alfa-2Bes sinérgica, aditiva o antagonista. Los datos reanalizados se muestran numéricamente en la Tabla 8 y gráficamenteen la Figura 4.
La Tabla 8 resume resultados adicionales obtenidos en el Ensayo de Replicón después del tratamiento de las células que contienen replicón durante 48 horas con diversos inhibidores de serina proteasa de VHC de lapresente invención y varios interferones diferentes, individualmente o en combinación. Se indica que la desviacióntípica de los valores medidos para la inhibición del ARN del replicón de VHC en el Ensayo de Replicón es del ~ 20%.Los compuestos se ensayan en un amplio intervalo de concentraciones y a concentraciones de compuesto menoresque no producen una inhibición significativa de la concentración de ARN del replicón de VHC. A causa de la desviación típica del ~ 20% del ensayo, algunos puntos de datos generarán números negativos. Los números deinhibición negativos indican en un experimento particular que hay en promedio más moléculas de ARN de replicónde VHC en las muestras tratadas con el compuesto que en las muestras tratadas de forma simulada.
TABLA 8
INHIBICIÓN DE LA ACUMULACIÓN DE ARN DEL REPLICÓN DESPUÉS DE 48 HORAS DE TRATAMIENTO CON INHIBIDORES DE SERINA PROTEASA DE VHC Y DIFERENTES INTERFERONES, INDIVIDUALMENTE O EN
0,000
Compuesto CU ( M)
0,012 0,037 0,111 0,333
1,000
3,000
COMBINACIÓN
EXPERIMENTO 1
IFN alfa-2B (unidades)
30,00
6,00 1,20 0,24 0,048 0,0096 0,000
89%
73% 38% 16% 8% 12% 0%
92%
78% 44% 20% 19% 19% 6%
92%
78% 25% 21% 2% 7% 8%
93%
79% 46% 29% 12% 15% 11%
94%
87% 66% 49% 33% 27% 28%
99%
98% 96% 95% 92% 93% 88%
99%
99%
99%
99%
98% 98% 98%
EXPERIMENTO 2
IFN alfa-2A (unidades)
30
6 1,2 0,24 0,048 0,0096 0
n
66% 61% 27% 1% 4% 5% 0%
Compuesto
0,0123 57% 66% 17% 22% 8% 8% 10%
CU
0,37 83% 62% 13% 2% 60% -10% 1%
( M)
0,1111 51% 68% 37% 20% 6% 12% 10%
0,233
92% 77% 38% 41% 26% 25% 11%
96%
1
25% 36% 44% 31% 43% 85%
3
99% 99% 38% 98% 43% 48% 43%
EXPERIMENTO 3
Compuesto CU ( M)
3
1,5 0,75 0,375 0,1875 0,0938 0,0469 0,0234 0
0
98% 93% 62% 23% 12% -2% -4% 2%
0
0,049
98% 95% 70% 39% 12% 2% 6% 9% 3%
Interferón
0,123 98% 95% 70% 43% 15% 7% 2% 5% 2%
alfa-2B
0,307 98% 95% 73% 46% 16% 14% 7% 49% -3%
(unidades)
0,768 98% 95% 82% 56% 43% 34% 28% 32% 28%
1,920
98% 98% 87% 71% 51% 54% 49% 52% 45%
4,8
99% 98% 92% 82% 74% 71% 69% 71% 59%
12,0
99% 98% 96% 89% 87% 85% 85% 65% 80%
30,0
99% 99% 98% 95% 93% 92% 92% 93% 89%
EXPERIMENTO 4
Compuesto CU ( M)
3
1,5 0,75 0,375 0,1875 0,0938 0,0469 0,0234 0
0
98% 94% 74% 38% 17% 3% -1% 6% 0%
0,0049
98% 93% 60% 22% 29% 21% -9% -6% 6%
Interferón
0,1234 98% 93% 67% 29% 21% 12% 3% 2% -8%
Alfa-2A
0,307 98% 93% 66% 29% 22% 4% -3% -4% 10%
(unidades)
0,768 98% 95% 67% 46% 24% 21% 20% 9% 15%
1,920
98% 96% 73% 48% 41% 44% 27% 33% 29%
4,8
98% 97% 82% 61% 61% 59% 52% 55% 43%
12,0
99% 98% 91% 75% 76% 72% 71% 74% 73%
30,0
99% 98% 96% 89% 86% 85% 84% 84% 83%
EXPERIMENTO 5
Compuesto CU ( M)
3
1,5 0,75 0,375 0,1875 0,0938 0,0469 0,0234 0
0,0
98% 95% 65% 24% -1% -14% -14% -12% 0
0,9375
97% 95% 72% 41% 17% 11% 12% 6% 17%
Orina
1,875 97% 95% 71% 40% 31% 18% 18% 11% 4%
Interferón
3,75 98% 96% 75% 44% 38% 25% 34% 18% 17%
tau
7,5 98% 96% 82% 61% 42% 37% 25% 26% 36%
(unidades)
15 98% 97% 84% 61% 59% 61% 56% 51% 53%
30
98% 98% 90% 79% 72% 68% 65% 68% 68%
60
98% 98% 93% 87% 80% 80% 74% 77% 82%
120
98% 98% 95% 92% 86% 87% 86% 86% 87%
EXPERIMENTO 6
Comparación de Compuesto EC ( M)
3
1,5 0,75 0,375 0,1875 0,0938 0,0469 0,0234 0
0
96% 93% 81% 56% 29% 23% 19% 1%
0
0,0492
96% 92% 80% 60% 31% 15% 19% 29% 6%
Interferón
0,1229 96% 94% 78% 58% 32% 13% 20% 20% 4%
Alfa 2B
0,3072 97% 95% 82% 60% 38% 32% 34% 42% 23%
(unidades)
0,768 97% 95% 87% 66% 43% 41% 46% 43% 25%
1,92
98% 97% 90% 73% 62% 51% 94% 58% 47%
4,8
98% 97% 94% 87% 76% 73% 78% 76% 69%
12,0
98% 98% 96% 92% 86% 86% 86% 85% 84%
30,0
98% 98% 96% 96% 93% 92% 92% 95% 91%
EXPERIMENTO 7
Compuesto CU ( M)
3,0
1,5 0,75 0,375 0,1875 0,0938 0,0469 0,0234 0
0
96% 92% 81% 47% 28% 17% 1% -8%
0
0,0492
96% 93% 78% 58% 21% 8% -12% 10% -17%
Interferón
0,1229 95% 93% 79% 64% 14% 5% 14% 7% -22%
Alfa 2A
0,3072 95% 91% 80% 64% 22% 15% 5% 2% -5%
(unidades)
0,768 96% 95% 81% 64% 34% 21% 19% 20% 4%
1,92
96% 95% 88% 78% 44% 41% 19% 33% 21%
4,8
97% 95% 91% 85% 60% 58% 60% 53% 49%
12,0
97% 97% 95% 91% 77% 72% 76% 70% 71%
30,0
98% 98% 97% 94% 91% 86% 85% 85% 84%
EXPERIMENTO 8
Compuesto CU ( M)
3,0
1,5 0,75 0,375 0,1875 0,0938 0,0469 0,0234 0
0,0
97% 95% 77% 34% 16% 6% -7% 0% 0
0,2344
96% 97% 83% 49% 31% 19% -21% 7% 1%
Interferón
0,4688 98% 96% 84% 56% 39% 27% 10% -3% 21%
Beta
0,9375 98% 97% 91% 73% 54% 42% 31% 15% 30%
(unidades)
1,875 98% 98% 95% 80% 65% 58% 65% 60% 60%
3,75
98% 98% 97% 92% 86% 81% 77% 73% 79%
7,5
99% 98% 98% 96% 93% 93% 93% 90% 92%
15,0
99% 99% 99% 97% 97% 96% 97% 95% 96%
30,0
99% 99% 99% 99% 98% 99% 98% 98% 97%
EXPERIMENTO 9
Comparación Comparativo EP ( M)
8
4 2 1 0,5 0,25 0,125 0,0625 0
0
94% 96% 96% 92% 64% 36% 23% 8%
0
Interferón
0,0492 95% 96% 96% 91% 67% 25% 28% 3% 3%
alfa-2B
0,1229 95% 97% 96% 91% 65% 44% 4% 11% 4%
(unidades)
0,3072 95% 97% 96% 91% 71% 46% 20% 8% 20%
0,7680
96% 97% 97% 93% 75% 49% 36% 24% 24%
1,92
96% 97% 97% 94% 82% 67% 49% 52% 54%
4,8
96% 98% 97% 96% 90% 79% 75% 75% 70%
12
97% 98% 98% 97% 94% 89% 89% 87% 83%
30
97% 98% 98% 98% 96% 94% 94% 95% 92%
EXPERIMENTO 10
Ribavirina ( M)
200
80 32 12,8 5,12 2,048 0,8192 0,3277 0
0
85% 62% 43% 3% -8% -17% -22% -6%
0
Interferón
0,0492 87% 66% 48% 44% 11% -4% -10% 11% -7%
alfa-2B
0,1229 84% 64% 53% 40% 26% -12% -5% 11% -9%
(unidades)
0,3072 86% 70% 62% 44% 28% 1% 6% 14% 7%
0,7680
90% 30% 72% 65% 38% 30% 28% 44% 29%
1,92
93% 85% 77% 76% 61% 57% 58% 50% 16%
4,8
96% 92% 87% 83% 82% 74% 71% 77% 72%
12
97% 95% 93% 91% 90% 89% 90% 89% 85%
30
98% 97% 96% 95% 94% 94% 93% 95% 94%
Como se muestra en las Figuras 4-13, que representan gráficamente los datos de la Tabla 8 representadosusando el método matemático descrito anteriormente para medir la sinergia, la curvas Isobol para todas las combinaciones de inhibidores de serina proteasa de VHC e interferones ensayadas son cóncavas hacia arriba,indicando que el efecto antiviral de los tratamientos en el Ensayo de Replicón es sinérgico. Estos resultados se
5 presentan en la Tabla 9, que muestra los niveles relativos de sinergia para el tratamiento combinado y los valores de CI50 para los compuestos antivirales usados individualmente. Los elementos clave en la Tabla 9 son los valores a, ylos valores p para las determinaciones. El término a es una medida de la inflexión máxima de las Isoboles para cadatratamiento combinado. Un valor a de cero indica aditividad, un valor negativo indica antagonismo y como ocurre en los tratamientos combinados con los inhibidores de serina proteasa de VHC y los interferones mostrados
10 anteriormente, un valor mayor de uno indica sinergia. Cuanto mayor es el parámetro a, mayor es la sinergia. Como se muestra en la Tabla 9 para las combinaciones de inhibidores de serina proteasa de VHC e interferones, inclusoignorando los niveles de significado en cada experimento, un ensayo t basado en los 9 experimentos para el valoralfa medio de 0 (sin interacción) tiene un valor de p de 0,00014, indicando que los resultados son muy significativos.
El cálculo de sinergia basado en el método de Greco Rustom ((1990) Application of a New Approach for the
15 Quantitation of Drug Synergism to the Combination of cis Diamminedichloroplatinium and 1-1-D-Arabinofuranosylcytosine, Cancer Research, 50, 5318-5327) usado en este análisis es una herramienta ideal para la evaluación deltipo de datos experimentales que pueden generarse usando el Ensayo de Replicón de VHC. Hay otros métodos quese aplican a estudios de compuestos antivirales tales como Pritchard y Shipman (Prichard, M. N., y Shipman, C. Jr.,(1990) “A three-dimensional model to analyze drug-drug interactions (review), “Antiviral Res. 14: 181-206). La
20 aplicación de su método de cálculo de sinergia a los datos mostrados en la Tabla 8 también indica el tratamiento combinado de las células de replicón con un inhibidor de serina proteasa de VHC e interferón que producen unainhibición sinérgica de la acumulación de ARN del replicón de VHC (datos no mostrados).
TABLA 9
NIVEL RELATIVO DE SINERGIA PARA EL TRATAMIENTO COMBINADO Y VALORES DE CI50 PARA COMPUESTOS ANTIVIRALES USADOS INDIVIDUALMENTE
Inhibidor de Serina Proteasa de VHC (HSPI)
Interferón CI50 INF (unidades) CI50 SPI ( M) a (SE)1 P-amina a>0
Experimento 1
Compuesto CU IFN alfa 2B 2,05 0,469 0,477(0,69) <0,0001
Experimento 2
Compuesto CU IFN alfa 2A 3,72 0,446 0,770(0,12) <0,0001
Experimento 3
Compuesto CU IFN alfa 2B 2,36 0,587 0,730(0,08) <0,0001
Experimento comparativo 4
Compuesto CU IFN alfa 2A 5,67 0,633 0,4,38(0,08) <0,0001
Experimento 5
Compuesto CU IFN tau 13,22 0,605 0,328(0,07) <0,0001
Experimento comparativo 6
Compuesto EC IFN alfa 2B 2,53 0,384 0,0516(0,10) <0,0001
Experimento comparativo 7
Compuesto EC IFN alfa 2A 5,50 0,312 1,24(0,20) <0,0001
Experimento comparativo 8
Compuesto CU IFN beta 1,82 0,466 0,551(0,09) <0,0001
Experimento comparativo 9
Compuesto EP IFN alfa 2B 3,06 0,426 0,4900(0,12) <0,0001
Experimento 10
Ribavirina IFN alfa 2B 1,22 145 0,24(0,067) 0,0004
1(SE) Error típico
25 Otra medida para evaluar la naturaleza sinérgica del tratamiento con fármaco anti-VHC usando los presentes inhibidores de serina proteasa de VCH e interferones es usar los mismos métodos que se han descritoanteriormente para evaluar la terapia combinada convencional actual para el VHC, es decir, el interferón alfa-2B encombinación con Ribavirina en el Ensayo de Replicón. La última línea de la Tabla 9 demuestra que el parámetro a para una mezcla de interferón alfa-2B y Ribavirina es un número negativo, que indica que hay una pequeña cantidad
30 de antagonismo entre estos dos fármacos. Esto subraya además el significado de los tratamientos combinados descritos en este documento que emplean los presentes inhibidores de serina proteasa de VHC en combinación coninterferones, ya que estos tratamientos producen claramente sinergia, mientras que la terapia combinada convencional en uso para VHC (interferón alfa-2B en combinación con Ribavirina) no es sinérgica en el Ensayo deReplicón.
La comparación anterior de los tratamientos combinados que emplean los presentes inhibidores de serinaproteasa de VHC más interferones frente a Ribavirina más interferón en el Ensayo de Replicón indica claramenteque los primeros son sinérgicos, mientras que el último no lo es. Los resultados experimentales obtenidos usando elEnsayo de Replicón indican que sería eficaz una dosis mucho menor de interferón si el interferón se usara encombinación con un inhibidor de serina proteasa de VHC, en comparación con la dosis que se necesita cuando elinterferón alfa-2B se usa en combinación con ribavirina. El Ensayo de Replicón es un sistema modelo útil en el quese ensayan posibles compuestos anti-VHC y actualmente se considera en sentido amplio un agente de prediccióneficaz de actividad anti-VHC. Véase, por ejemplo, Blight et al. (2000) Efficient Initiation of HCV RNA Replication inCell Culture. Science 8; 290:1972-1974, and Chung et al. (2001) Hepatitis C virus replication is directly inhibited byIFN-a in a full-length binary expression system. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17):9847-52. La ribavirina sola esmarginalmente eficaz para reducir la acumulación de ARN de replicón de VHC en el Ensayo de Replicón (Tabla 8,Experimento 10 y última línea de la Tabla 9). Este resultado está en aparente conflicto con los estudios in vivo en los que, cuando se usa por sí misma, la ribavirina no tiene ningún valor terapéutico significativo para el tratamiento deVHC. Por el contrario, en el ensayo de replicón, con corrección en relación con la citotoxicidad como se describemás adelante, la ribavirina tiene un valor de CI50 de 145 !M. Este resultado puede explicarse reconociendo que elEnsayo de Replicón permite la evaluación de altas concentraciones de Ribavirina que no serían posibles en terapiahumana debido a la citotoxicidad in vivo (Chutaputti A. (2000) Adverse effects and other safety aspects of thehepatitis C antivirals. Journal of Gastroenterology and Hepatology, 15 Suppl:E156-63).
Esta evaluación necesariamente requiere la determinación de la citotoxicidad de la ribavirina. Esta toxicidadse produce en pacientes y en ensayos celulares (Shiffman M. L., Verbeke S. B., Kimball P. M. (2000) Alphainterferon combined with ribavirin potentiates proliferative suppression but not cytokine production in mitogenically stimulated human lymphocytes. Antiviral Research, 48(2):91-9). En los experimentos descritos en este documento, lacitotoxicidad de la ribavirina en el Ensayo de Replicón se observa y se mide de dos formas. Tanto en el ensayometabólico de XTT para determinar la viabilidad de las células con replicón (Roehm NW., Rodgers G. H., Hatfield S.M., Glasebrook A. L. (1991) An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazoliumsalt XTT. Journal of Immunol Methods. 142(2):257-65) como en el ensayo de RT-PCR cuantitativo TaqMan® quemide los niveles de ARNm de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) en células tratadas frente a notratadas en el Ensayo de Replicón (Brink N., Szamel M., Young A.R., Wittern K.P., Bergemann J. (2000)Comparative quantification of IL-lbeta. IL-10, IL-10r, TNFalpha and IL-7 mRNA levels in UV-irradiated human skin invivo. Inflamation Research, 49(6):290-6), se observa una citotoxicidad significativa inducida por ribavirina, pero secorrige como se indica a continuación. Se supone que el nivel de ARNm de GAPDH, que es un gen de mantenimiento (constitutivo) expresado constitutivamente, es igual en todas las células viables. Se sabe por medidasde los niveles de ARNm de GAPDH en células tratadas con el inhibidor de la transcripción actinomicina D que lasemivida del ARNm de GAPDH es tan sólo de unas pocas horas (datos no mostrados). De esta manera, se postula, como se hace por otros usando la tecnología TaqMan® para determinar los niveles de ARNm particulares en célulashumanas, que los niveles de ARNm de GAPDH son proporcionales a los números de células viables (VCN) encualquier muestra dada, con la relación de VCN = 2^(40-CtCAPDHmRNA). El VCN se calcula para cada uno de lospocillos de muestra del Ensayo de Replicón y después se divide el número de copias de ARN de replicón de VHCpara un pocillo específico por el VCN para ese pocillo. Una vez calculada, esta relación se usa en lugar del númerode copias de VHC para calcular la inhibición (“Inhibición media usando relación”: Fig. 14A). Sin corregir los datos del Ensayo de Replicón para esta citotoxicidad, dicha citotoxicidad se lee como una inhibición falsa positiva de laacumulación del replicón de ARN de VHC. En el Ensayo de Replicón, se supone que la inhibición medida de laacumulación del replicón de ARN de VHC es la suma de la inhibición real de la acumulación del replicón de ARN deVHC y la inhibición aparente de la acumulación del replicón de ARN de VHC debido a citotoxicidad. Además, sesupone que, basándose en la correlación de las mediciones de ARNm de GAPDH TaqMan® y XTT como medidasde citotoxicidad, la inhibición de la acumulación del ARNm de GAPDH causada por compuestos ensayados en elEnsayo de Replicón es una medida fiable de la inhibición aparente de la acumulación del replicón de ARN de VHCdebido a la citotoxicidad. De esta manera, la verdadera actividad anti-VHC de un compuesto en el Ensayo deReplicón corregida con respecto a la citotoxicidad general puede estimarse dividiendo el número de moléculas deARN de replicón de VHC medidas en cada muestra por el VCN, normalizándose de esta manera con respecto alnúmero de células viables en cada muestra. Usando este método, la Fig. 14A muestra una estimación de laverdadera actividad anti-VHC de ribavirina en el Ensayo de Replicón (“Inhibición media usando la relación”). Laestimación de la CI50 para la Ribavirina se calcula mejor usando este método. En la Fig. 14A, la “Inhibición mediaoriginal” muestra el valor de CI50 no corregido para la Ribavirina, que es aproximadamente 80 !M, mientras que el valor de CI50 calculado corregido a partir de la curva de “Inh. Media. usando la relación” es aproximadamente 145 !M. Obsérvese que la diferencia entre la inhibición corregida y medida de la acumulación del replicón de ARN deVHC como resultado del tratamiento con interferón alfa-2B (Fig. 14B) es insignificante en vista del % CV de ~20% del Ensayo de Replicón. Al igual que el interferón alfa-2B, los inhibidores de serina proteasa de VHC ensayados enel presente ejemplo no muestran una citotoxicidad significativa a las concentraciones empleadas. Esto se determinausando ensayos XTT, en los que los valores de TC50 para los diversos compuestos son: CU = 64,7 !M, EP> 10 !M yEC> 50 !M. Estos valores de TC50 son de 20-140 veces mayores que los valores de CI50 mostrados en la Tabla 9. De esta manera, la citotoxicidad de estos compuestos no tiene unefecto significativo sobre la acumulación de ARN de VHC en el Ensayo de Replicón dentro de la precisión delensayo porque dicha citotoxicidad se produce únicamente a las concentraciones de inhibidor de serina proteasa deVHC significativamente mayores que las ensayadas en el Ensayo de Replicón.
Conclusiones en Relación con la Eficacia de Inhibidores de Serina Proteasa de VHC e Interferones,Individualmente y en Combinación
Las actividades anti-VHC de los presentes inhibidores de serina proteasa de VHC y diversos interferones cuando se usan solos en el Ensayo de Replicón de VHC se muestran en las columnas y líneas de los experimentos individuales que constituyen la Tabla 8que emplea sólo el agente antiviral. La Tabla 9 indica los valores de CI50 medidos para cada compuesto antiviralcuando se ensaya solo. Los resultados anteriores, obtenidos por el uso del Ensayo de Replicón in vitro, también demuestran que el tratamiento combinado de las células de replicón con los inhibidores de serina proteasa de VHC de la presente invención y diversos interferones produce efectos antivirales sinérgicos. Es de esperar que estosefectos se traduzcan en una eficacia in vivo.
La terapia combinada que emplea inhibidores de serina proteasa de VHC de la presente invención poseevarias ventajas importantes con respecto a la terapia con un solo fármaco. En primer lugar, haciendo posible el5 tratamiento con dosis menores de los fármacos individuales que las que se emplearían si se usaran solos, sería de esperar una reducción en toxicidad y efectos secundarios asociados con el tratamiento. Esto es especialmenteimportante en el caso de la terapia con interferón, donde los efectos secundarios son severos, y se ha demostrado que son proporcionales a la dosis administrada a los pacientes. Los datos anteriores indican que una dosis deinhibidor de serina proteasa de VHC tal como CU a un nivel de CI95 podía combinarse con una dosis de interferón alfa, por ejemplo, al nivel de CI50, y el resultado sería una terapia mucho más eficaz que la que podría conseguirse con el inhibidor de serina proteasade VHC solo sin los efectos adversos producidos por altas dosis de interferón alfa. Un segundo efecto beneficiosoimportante de la terapia combinada es que, como los dos fármacos actúan independientemente, existe menosprobabilidad de desarrollo de cepas mutantes de VHC que resistan al tratamiento. El desarrollo de resistencia es una
15 preocupación importante con los virus de ARN tales como VHC. Debido a su alta tasa de mutación, estos virus pueden adaptarse fácilmente a condiciones de estrés ambiental. Un tercer efecto beneficioso de la terapiacombinada puede ser el coste reducido, debido a la necesidad de menores cantidades de agentes terapéuticos paraconseguir un tratamiento eficaz.
Otros inmunomoduladores que pueden emplearse en los métodos descritos en la presente invenciónincluyen, por ejemplo, el interferón alfa 2A, interferón consenso, interferón tau, interferón + Ribavirina (Rebatron),interferón pegilado y promotores de la expresión de genes de interferón. Se prevé adicionalmente que la actividadanti-VHC de estos compuestos se mejorará cuando se usen en combinación con inhibidores de serina proteasa deVHC tales como los descritos en este documento. Como se sabe que los interferones son activos in vivo y en el Ensayo de Replicón, es de esperar que los presentes inhibidores de serina proteasa de VHC también sean activos in
25 vivo, y lo que es más importante, sean capaces de inducir actividad sinérgica cuando se usan en combinación con interferones, estimuladores del sistema inmune de los mismos u otros compuestos que tengan actividad antiviralcontra VHC que actúan por un mecanismo distinto de la inhibición de la serina proteasa de VHC.
La mejor terapia actual para VHC emplea interferón alfa y el análogo de nucleósido Ribavirina. Estetratamiento sólo es marginalmente eficaz y produce efectos secundarios significativos que reducen el seguimiento dela terapia por parte de los pacientes (Chronic Hepatitis C: Current Disease Management, U.S. Department of Healthand Human Services, National Institutes of Health, 1999). Además, en pacientes con trasplantes, no está claro sifuncionan las combinaciones de ribavirina-interferón y, de hecho, pueden ser peores que el interferón solo (ChronicHepatitis C: Current Disease Management, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes ofHealth, 1999).
35 Los resultados presentados anteriormente demuestran un efecto combinado sinérgico cuando se usan interferones con una nueva clase de antivirales contra VHC, los inhibidores de serina proteasa de la presenteinvención. Es de esperar que los resultados in vitro descritos en este documento conduzcan a un tratamiento más eficaz de los pacientes con VHC que el que se puede conseguir actualmente usando el interferón solo. Las dosissubterapéuticas del interferón podrían movilizar el sistema inmune del paciente para luchar mejor contra el virus, y elinhibidor de serina proteasa podría atacar al virus directamente, proporcionando al virus un ataque a dos bandas pormecanismos de acción diferentes. De esta forma, se podría conseguir un tratamiento de la infección por VHC a uncoste reducido para el paciente en términos de la disminución de efectos secundarios y menores pagos por agentesfarmacéuticos necesarios, ya que se necesitan menos cantidades de los dos fármacos para conseguir una terapiaantiviral eficaz contra el VHC.
45 LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Vertex Pharmaceuticals Incorporation
<120> INHIBIDORES DE PROTEASA PEPTIDOMIMÉTICOS
<130> EP 01968040.4
<160> 7
<170> Patentln versión 3.5
<210> 1
<211> 900
<212> ADN
<213> virus de la Hepatitis C
55 <400> 1 <210> 2
<211> 28
<212> ADN
<213> ser humano
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> a representa inosina
<400> 2 vacctgtggc cggctgggtg tggtamra 28
<210> 3
<211> 31
<212> ADN
<213> ser humano
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> a representa inosina
<400> 3 vacccctcgt ccacgtggca tctcgatamr a 31
<210> 4
<211> 20
<212> ADN
<213> ser humano
<400> 4 ccgcttttct ggattcatcg 20
<210> 5
<211> 15
<212> ADN
<213> ser humano
<400> 5 cccattcgcc gccaa 15
<210> 6
<211> 22
<212> ADN
<213> ser humano
<400> 6 cagggtagtc gtcagtggtt cg 22
<210> 7
<211> 20
<212> ADN
<213> ser humano
<400> 7 ggcctctgca gcaccctatc 20

Claims (26)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto
    o una sal farmacéuticamente aceptable o profármaco del mismo, o un solvato de dicho compuesto, su sal o suprofármaco.
  2. 2. Un compuesto
    o una sal farmacéuticamente aceptable o profármaco del mismo, o un solvato de dicho compuesto, su sal o suprofármaco.
    10 3. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente aceptable del compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  3. 4. Una composición farmacéutica, que comprende un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, un interferón que tiene actividad anti-virus de la hepatitis C, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  4. 5. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, que comprende además un compuesto que tiene15 actividad anti-virus de la hepatitis C, en la que dicho compuesto es distinto de un interferón.
  5. 6.
    Una composición farmacéutica, que comprende un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, un compuesto que tiene actividad anti-virus de la hepatitis C, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que dicho compuesto es distinto de un interferón.
  6. 7.
    La composición farmacéutica de la reivindicación 5, en la que dicho compuesto de cualquiera de las
    20 reivindicaciones 1 o 2, dicho interferón y dicho compuesto que tiene actividad anti-virus de la hepatitis C está cada uno presente en una cantidad seleccionada entre el grupo constituido por una cantidad farmacéuticamente eficaz,una cantidad subclínica farmacéuticamente eficaz y una combinación de las mismas.
  7. 8. La composición farmacéutica de la reivindicación 7, en la que dicho interferón se selecciona entre el grupoconstituido por interferón alfa 2B, interferón alfa pegilado, interferón consenso, interferón alfa 2A, interferón
    25 limboblastoide e interferón tau; y dicho compuesto que tiene actividad anti-virus de la hepatitis C se selecciona entre el grupo constituido por interleuquina 2, interleuquina 6, interleuquina 12, un compuesto que potencia el desarrollo deuna respuesta de células T helper de tipo I, ARN bicatenario, ARN bicatenario en combinación con tobramicina,Imiquimod, ribavirina, un inhibidor de inosina 5'-monofosfato deshidrogenasa, amantadina y rimantadina.
  8. 9. Uso de un compuesto de la reivindicación 1 o 2 en la fabricación de un medicamento para inhibir la30 proteasa de HCV.
  9. 10.
    Uso de un compuesto de la reivindicación 1 o 2 en la fabricación de un medicamento para tratar a unpaciente que padece una infección por HCV o afecciones fisiológicas relacionadas con la infección.
  10. 11.
    Uso de un compuesto de la reivindicación 1 o 2 junto con una cantidad farmacéuticamente eficaz de un
    compuesto de otro agente terapéutico anti-HCV, en la fabricación de un medicamento para tratar a un paciente que35 padece una infección por HCV o afecciones fisiológicas relacionadas con la infección.
  11. 12.
    El uso de la reivindicación 11 en el que el agente terapéutico anti-HCV es interferón o un interferónderivatizado.
  12. 13.
    Uso del compuesto de la reivindicación 1 o 2 en combinación con un interferón que tiene actividad anti-virusde la hepatitis C para preparar un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección por el virus de lahepatitis C en un paciente que lo necesita.
  13. 14.
    Uso del compuesto de la reivindicación 1 o 2 en combinación con un compuesto que tiene actividad antivirus de la hepatitis C para preparar un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección por el virusde la hepatitis C en un paciente que lo necesita, en la que dicho compuesto es distinto de un interferón.
  14. 15.
    Uso de un compuesto de la reivindicación 1 o 2 junto con un interferón que tiene actividad anti-virus de lahepatitis C y un compuesto que tiene actividad anti-virus de la hepatitis C para preparar un medicamento para eltratamiento o prevención de una infección por el virus de la hepatitis C en un paciente que lo necesita, en la quedicho compuesto es distinto de un interferón.
  15. 16.
    El uso de la reivindicación 15, en la que dicho compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, dichointerferón y dicho compuesto que tiene actividad anti-virus de la hepatitis C está cada uno presente en una cantidad seleccionada entre el grupo constituido por una cantidad farmacéuticamente eficaz, una cantidad subclínica farmacéuticamente eficaz y una combinación de las mismas.
  16. 17.
    El uso de la reivindicación 16, donde dicho interferón se selecciona entre el grupo constituido por interferónalfa 2B, interferón alfa pegilado, interferón consenso, interferón alfa 2A, interferón limboblastoide e interferón tau; y dicho compuesto que tiene actividad anti-virus de la hepatitis C se selecciona entre el grupo constituido porinterleuquina 2, interleuquina 6, interleuquina 12, un compuesto que potencia el desarrollo de una respuesta decélulas T helper de tipo I, ARN bicatenario, ARN bicatenario complejado con bramicina, Imiquimod, ribavirina, uninhibidor de inosina 5'-monofosfato deshidrogenasa, amantadina, y rimantadina.
  17. 18.
    Uso de un compuesto de la reivindicación 1 o 2 y un interferón que tiene actividad anti-virus de la hepatitisC, en la preparación de un medicamento para inhibir la replicación del virus de la hepatitis C en una célula.
  18. 19.
    El uso de la reivindicación 18, que comprende adicionalmente poner en contacto dicha célula con uncompuesto que tiene actividad anti-virus de la hepatitis C, en la que dicho compuesto es distinto de un interferón.
  19. 20.
    Uso de un compuesto de la reivindicación 1 o 2, y un compuesto que tiene actividad anti-virus de lahepatitis C, en la que dicho compuesto es distinto de un interferón, en la fabricación de un medicamento para inhibirla replicación del virus de la hepatitis C en una célula.
  20. 21.
    El uso de la reivindicación 19, en la que dicho inhibidor de la serina proteasa del virus de la hepatitis C,dicho interferón y dicho compuesto que tiene actividad anti-virus de la hepatitis C está cada uno presente en unacantidad seleccionada entre el grupo constituido por una cantidad farmacéuticamente eficaz, una cantidad subclínicafarmacéuticamente eficaz y una combinación de las mismas.
  21. 22.
    El uso de la reivindicación 21, en la que dicho interferón se selecciona entre el grupo constituido porinterferón alfa 2B, interferón alfa pegilado, interferón consenso, interferón alfa 2A, interferón limboblastoide e interferón tau; y dicho compuesto que tiene actividad anti-virus de la hepatitis C se selecciona entre el grupoconstituido por interleuquina 2, interleuquina 6, interleuquina 12, un compuesto que potencia el desarrollo de unarespuesta de células T helper de tipo I, ARN bicatenario, ARN bicatenario complejado con bramicina, Imiquimod, ribavirina, un inhibidor de inosina 5'-monofosfato deshidrogenasa, amantadina y rimantadina.
  22. 23.
    Un kit o paquete farmacéutico que comprende una pluralidad de recipientes separados, en la que al menosuno de dichos recipientes contiene un inhibidor de la serina proteasa del virus de la hepatitis C de la reivindicación 1
    o 2 y al menos otro de dichos recipientes contiene un interferón que tiene actividad anti-virus de la hepatitis C.
  23. 24. Un kit o paquete farmacéutico que comprende una pluralidad de recipientes separados, en la que al menosuno de dichos recipientes contiene un inhibidor de la serina proteasa del virus de la hepatitis C de la reivindicación 1
    o 2 y al menos otro de dichos recipientes contiene un compuesto que tiene actividad anti-virus de la hepatitis C, en laque dicho compuesto es distinto de un interferón.
  24. 25. Un kit o paquete farmacéutico que comprende una pluralidad de recipientes separados, en la que al menosuno de dichos recipientes contiene un inhibidor de la serina proteasa del virus de la hepatitis C de la reivindicación 1
    o 2, al menos otro de dichos recipientes contiene un interferón que tiene actividad anti-virus de la hepatitis C, y almenos otro de dichos recipientes contiene un compuesto que tiene actividad anti-virus de la hepatitis C, en la que dicho compuesto es distinto de un interferón.
  25. 26.
    El kit o paquete farmacéutico de la reivindicación 25, en el que dicho inhibidor de la serina proteasa delvirus de la hepatitis C, dicho interferón y dicho compuesto que tiene actividad anti-virus de la hepatitis C está cadauno presente en una cantidad seleccionada entre el grupo constituido por una cantidad farmacéuticamente eficaz,una cantidad subclínica farmacéuticamente eficaz y una combinación de las mismas.
  26. 27.
    El kit o paquete farmacéutico de la reivindicación 26 en el que dicho interferón se selecciona entre el grupoconstituido por interferón alfa 2B, interferón alfa pegilado, interferón consenso, interferón alfa 2A, interferón limboblastoide e interferón tau; y dicho compuesto que tiene actividad anti-virus de la hepatitis C se selecciona entreel grupo constituido por interleuquina 2, interleuquina 6, interleuquina 12, un compuesto que potencia el desarrollo de una respuesta de células T helper de tipo I, ARN bicatenario, ARN bicatenario complejado con tobramicina, Imiquimod, ribavirina, un inhibidor de inosina 5'-monofosfato deshidrogenasa, amantadina y rimantadina.
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