ES2352804T3 - Procedimiento para preparar bicicloprolinatos quirales como intermedios para la preparación de inhibidores de proteasa peptidomiméticos. - Google Patents

Procedimiento para preparar bicicloprolinatos quirales como intermedios para la preparación de inhibidores de proteasa peptidomiméticos. Download PDF

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Shu-Hui Chen
Robert Edward Babine
May Q. Wang
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Abstract

Un procedimiento para preparar un compuesto de bicicloprolinato quiral de fórmula 28 **(Ver fórmula)**que comprende las etapas de: (a) escindir y ciclar un compuesto de fórmula 24 en la que: **(Ver fórmula)**es cicloalquilo opcionalmente sustituido o arilcicloalquilo condensado opcionalmente sustituido; R11 es -CO2R13; R12 es un aducto de derivado de glicinimida imínica; R13 es un grupo protector de ácido o grupo alifático opcionalmente sustituido; en condiciones de escisión y ciclación para formar un compuesto de fórmula 25 **(Ver fórmula)**en la que: R14 es -CONR15R15, -CN; 323 **(Ver fórmula)**o -CO2R16; R15 es un grupo alifático opcionalmente sustituido; R16 es un grupo protector de ácido, arilo opcionalmente sustituido o grupo alifático opcionalmente sustituido; y (b) proteger el nitrógeno del resto lactama en el compuesto de fórmula 25 con un grupo protector de amida para formar un compuesto de fórmula 26 **(Ver fórmula)**en la que: pO es un grupo protector de amida; R14 es como se ha descrito aquí; y (c) reducir el compuesto de fórmula 26 en condiciones reductoras para formar un compuesto de fórmula 27 **(Ver fórmula)**en la que: 324 pO y R14 son como se han descrito aquí; y (d) desproteger el compuesto de fórmula 27 en condiciones de desprotección para formar un compuesto de fórmula 28 **(Ver fórmula)**en la que: R14 es como se ha descrito en el presente documento.

Description

1
La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar bicicloprolinatos quirales como intermedios para la preparación de inhibidores peptidomiméticos de proteasa. Los compuestos peptidomiméticos pueden prepararse por procedimientos sintéticos estereoselectivos descritos en el presente documento. Además, se describen los compuestos peptidomiméticos o composiciones de los mismos como inhibidores de proteasa, particularmente como inhibidores de serina proteasa y más particularmente como inhibidores de la proteasa NS3 del virus de la hepatitis C (“VHC”). Los compuestos peptidomiméticos, tales como inhibidores de proteasa NS3 de VHC, son particularmente útiles para interrumpir el ciclo celular del virus de la hepatitis C y en el tratamiento o prevención de una infección por VHC o afecciones fisiológicas asociadas con la misma. Además, se describen procedimientos de terapia de combinación para inhibir la replicación de VHC en células o para el tratamiento o prevención de una infección de VHC en pacientes usando los compuestos peptidomiméticos o composiciones farmacéuticas o kits y envases farmacéuticos para los mismos. De acuerdo con la presente invención se incluyen como composiciones farmacéuticas las que comprenden un inhibidor de serina proteasa de VHC en combinación con un interferón que tiene actividad anti-VHC; un inhibidor de serina proteasa de VHC en combinación con un compuesto, distinto de interferón, que tiene actividad anti-VHC; o un inhibidor de serina proteasa de VHC en combinación con un interferón que tiene actividad anti-VHC y un compuesto, distinto de interferón, que tiene actividad anti-VHC. Antecedentes de la Invención
La infección por el VHC es un problema médico humano importante y se reconoce ahora el agente causante de la mayoría de los casos de hepatitis no A, no B.
Se cree que el VHC infecta de forma crónica al 3% de la población mundial [A. Alberti y col., “Natural History of Hepatitis C”, J. Hepatology, 31, (Suppl. 1), 17-24 (1999)]. En los Estados Unidos solamente la tasa de infección es del 1,8% o 3,9 millones de personas [MJ. Alter, “Hepatitis C Virus Infection in the United States”, J. Hepatology, 31, (Suppl. 1), 88-91 (1999)]. De todos los pacientes infectados más del 70% desarrollan una infección crónica que se cree que es una causa principal de cirrosis y carcinoma hepatocelular. [D. Lavanchy, “Global Surveillance and Control of Hepatitis C”, J. Viral Hepatitis, 6, 35-47 (1999)]
La replicación del VHC abarca la codificación genómica de una poliproteína de 30103033 aminoácidos [Q.-L. Choo, y col., “Genetic Organization and Diversity of the Hepatitis C Virus”, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 88, 2451-2455 (1991); N. Kato y col., “Molecular Cloning of the Human Hepatitis C Virus Genome From Japanese Patients with Non-A, Non-B Hepatitis", Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 87, 9524-9528 (1990); A. Takamizawa y col.,
2
“Structure and Organization of the Hepatitis C Virus Genome Isolated From Human Carriers”, J. Virol., 65, 1105-1113 (1991)]. Se supone que las proteínas del VHC no estructurales (NS) proporcionan la maquinaria catalítica esencial para la replicación viral. Las proteínas NS derivan por escisión proteolítica de la poliproteína [R. Bartenschlager y col., “Nonstructural Protein 3 of the Hepatitis C Virus Encodes a Serine-Type Proteinase Required for Cleavage at the NS3/4 and NS4/5 Junctions”, J. Virol., 67, 3835-3844 (1993); A. Grakoui y col. “Characterization of the Hepatitis C Virus-Encoded Serine Proteinase: Determination of Proteinase-Dependent Polyprotein Cleavage Sites”, J. Virol., 67, 2832-2843 (1993); A. Grakoui y col., Expression and Identification of Hepatitis C Virus Polyprotein Cleavage Products", J. Virol., 67, 1385-1395 (1993); L. Tomei y col., “NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis C virus polyprotein”, J. Virol., 67, 4017-4026 (1993)]. De hecho, se ha demostrado que los primeros 181 aminoácidos de NS3 (restos 1027-1207 de la poliproteína viral) contienen el dominio serina proteasa de NS3 que procesa los cuatro sitios cadena abajo de la poliproteína de VHC [C. Lin y col., “Hepatitis C Virus NS3 Serine Proteinase: Trans-Cleavage Requirements and Processing Kinetics”, J. Virol., 68, 8147-8157 (1994)].
La proteína NS 3 del VHC (NS3) contiene una actividad de serina proteasa que ayuda en el procesamiento de la mayoría de las enzimas virales y se considera por lo tanto esencial para la replicación e infectividad viral. La esencialidad de la proteasa NS3 se infirió a partir del hecho de que las mutaciones en la proteasa NS3 del virus de la fiebre amarilla disminuyen la infectividad viral [T.J. Chambers y col., “Evidence that the N-terminal Domain of Nonstructural Protein NS3 From Yellow Fever Virus is a Serine Protease Responsible for Site-Specific Cleavages in the Viral Polyprotein”, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 87, 8898-8902 (1990)]. Más recientemente, se demostró que las mutaciones en el sitio activo de la proteasa NS3 del VHC podían suprimir completamente la infección del VHC en un modelo de chimpancé
[C.M. Rice y col. “Hepatitis C virus-encoded enzymatic activities and conserved RNA elements in the 3'-nontranslated region are essential for virus replication in vivo”. J. Virol., 74(4) 2046-51 (2000)]. La serina proteasa NS3 de VHC también se considera esencial para la replicación viral puesto que ella y su cofactor asociado, NS4A, ayudan en el procesamiento de todas las enzimas virales. Este procesamiento parece ser análogo al que lleva a cabo la aspartil proteasa del virus de la inmunodeficiencia humana (“VIH”). Además, el uso demostrado de los inhibidores de la proteasa de VIH como potentes agentes antivirales en el hombre demuestra que la interrupción de la etapa de procesamiento de una proteína proteasa en el ciclo vital viral da como resultado agentes terapéuticamente activos. En consecuencia, la enzima proteasa es un diana atractiva para el descubrimiento de fármacos.
Se han descrito varios inhibidores de proteasa de VHC potenciales. Las Publicaciones
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de PCT Número WO 00/09558, WO 00/09543, WO 99/64442, WO 99107733, WO 99107734, WO 99/50230, WO98/46630, WO 98/17679 y WO 97/43310, la Patente de Estados Unidos Nº: 5.990.276, M. Llinás-Brunet y col., Bioorg. Med. Chem. Lett., 8, 1713-1718 (1998), W. Han y col., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, 711-713 (2000), R. Dunsdon y col., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, 1571-1579 (2000), M. Llinás-Brunet y col., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, 2267-2270 (2000), y S. LaPlante y col., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, 2271-2274 (2000) describen cada una inhibidores potenciales de la proteasa NS3 del VHC. Desafortunadamente, no existen inhibidores de serina proteasa disponibles actualmente como agentes anti-VHC.
De hecho, no existen terapias anti-VHC excepto interferón-α, combinación de interferónα/ribavirina y más recientemente interferón-α pegilado. Las tasas de respuesta prolongada para las terapias de interferón α e interferón-α/ribavirina sin embargo tienden a ser bajas (<50%) y los efectos secundarios mostrados por las terapias tienden a ser significativos y graves [M.A. Walker, “Hepatitis C Virus: an Overview of Current Approaches and Progress”, “DDT, 4, 518529 (1999); D. Moradpour y col., “Current and Evolving Therapies for Hepatitis C”, Eur. J. Gastroenterol. Hepatol., 11, 1199-1202 (1999); H.L.A. Janssen y col., “Suicide Associated with Alfa-Interferón Therapy for Chronic Viral Hepatitis”, J. Hepatol., 21, 241-243 (1994); y P.F. Renault y col., “Side effects of alpha interferón”, Seminars in Liver Disease 9, 273-277, (1989)]. Además, las terapias con interferón sólo inducen remisión a largo plazo en solamente una fracción (∼25%) de los casos. [O. Weiland, “Interferón Therapy in Chronic Hepatitis C Virus Infection”, FEMS Microbiol. Rev., 14, 279-288 (1994)]. Los problemas anteriores con las terapias de interferón-α han conducido incluso al desarrollo y estudio clínico de compuestos de interferón-α derivatizados pegilados como agentes terapéuticos anti-VHC mejorados.
A la vista de la situación actual con respecto a los agentes terapéuticos anti-VHC, está claro que existe la necesidad de terapias más eficaces y mejor toleradas.
Además, la síntesis de compuestos peptidomiméticos complejos se ha visto obstaculizado durante mucho tiempo por la naturaleza no estereoselectiva de la mayoría de los procedimientos sintéticos orgánicos. Se conoce bien que la actividad terapéutica de los enantiómeros de los compuestos peptidomiméticos varía ampliamente. Es por tanto muy beneficioso proporcionar dichos procedimientos sintéticos estereoespecíficos.
Los intentos anteriores para sintetizar intermedios de bicicloprolinato quiralmente específicos, útiles en la síntesis de los presentes inhibidores peptidomiméticos de proteasa terapéuticos, han padecido el defecto de ser no enantioselectivos o diastereoselectivos, o de incluir rutas sintéticas largas o de ser inadecuados para preparar grandes cantidades de producto. De este modo, existe también una necesidad de un medio para preparar grandes cantidades de bicicloprolinatos de una manera diastereoselectiva y en forma enriquecida
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enantioméricamente. Sumario de la Invención Se describe un compuesto peptidomimético de fórmula 1
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5 en la que: R0 es un enlace o difluorometileno; R1 es hidrógeno, grupo alifático opcionalmente sustituido, grupo cíclico opcionalmente sustituido o grupo aromático opcionalmente sustituido; cada uno de R2 y R9 es independientemente un grupo alifático opcionalmente sustituido,
10 grupo cíclico opcionalmente sustituido o grupo aromático opcionalmente sustituido; cada uno de R3, R5 y R7 es independientemente (grupo alifático opcionalmente sustituido, grupo cíclico opcionalmente sustituido o grupo aromático opcionalmente sustituido) (metileno opcionalmente sustituido o etileno opcionalmente sustituido), (1,1
o 1,2-)cicloalquileno opcionalmente sustituido o (1,1-o 1,2-)heterociclileno
15 opcionalmente sustituido; cada uno de R4, R6, R8 y R10 es independientemente hidrógeno o grupo alifático opcionalmente sustituido;
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es azaheterociclilo monocíclico sustituido o azaheterociclilo multicíclico opcionalmente
20 sustituido, o azaheterociclenilo multicíclico opcionalmente sustituido en el que la insaturación está en el anillo distal con respecto al anillo que tiene el resto R9-L-(N(R8)R7-C(O)-)nN(R6)-R5-C(O)-N y al que está unido el resto -C(O)-N(R4)-R3-C(O)C(O)NR2R1; L es -C(O)-, -OC(O)-, -NR10C(O)-, -S(O)2-o -NR10S(O)2-; y n es 0ó 1, o
25 una sal farmacéuticamente aceptable o profármaco del mismo, o un solvato de dicho compuesto, su sal o su profármaco, con la condición de que cuando
5
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es
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sustituido, entonces L es -OC(O)-y R9 es alifático opcionalmente sustituido, o al menos uno de R3, R5 y R7 es (grupo alifático opcionalmente sustituido, grupo cíclico opcionalmente sustituido o grupo aromático opcionalmente sustituido) (etanodiilo opcionalmente sustituido), o R4 es alifático opcionalmente sustituido. La presente invención también proporciona un compuesto que tiene la fórmula
imagen2
en la que: R1 es hidrógeno, grupo alifático opcionalmente sustituido, grupo cíclico opcionalmente sustituido o grupo aromático opcionalmente sustituido; cada uno de R2 y R9 es independientemente un grupo alifático opcionalmente sustituido,
15 grupo cíclico opcionalmente sustituido o grupo aromático opcionalmente sustituido; cada uno de R3, R5 y R7 es independientemente (grupo alifático opcionalmente sustituido, grupo cíclico opcionalmente sustituido o grupo aromático opcionalmente sustituido) (metanodiilo opcionalmente sustituido o etanodiilo opcionalmente sustituido); cada uno de R4, R6, R8 y R10 es independientemente hidrógeno o grupo alifático
20 opcionalmente sustituido;
imagen1
es azaheterociclilo monocíclico sustituido o azaheterociclilo multicíclico opcionalmente sustituido, o azaheterociclenilo multicíclico opcionalmente sustituido en el que la insaturación está en el anillo distal con respecto al anillo que tiene el resto R9-L-(N(R8)R7-C(O)-)nN(R6)-R5-C(O)-N y al que está unido el resto -C(O)-N(R4)-R3-C(O)C(O)NR2R1; L es -C(O)-, -OC(O)-, -NR10C(O)-, -S(O)2-o NR10S(O)2-; y n es 0ó 1, o
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una sal farmacéuticamente aceptable o profármaco del mismo, o un solvato de dicho compuesto, su sal o su profármaco, con la condición de que cuando
imagen1
es
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sustituido, entonces L es -OC(O)-y R9 es alifático opcionalmente sustituido, o al menos uno de R3, R5 y R7 es (grupo alifático opcionalmente sustituido, grupo cíclico opcionalmente
10 sustituido o grupo aromático opcionalmente sustituido) (etanodiilo opcionalmente sustituido), o R4 es alifático opcionalmente sustituido. Se describe una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula 1,
y un procedimiento para usar el compuesto de fórmula 1 para inhibir proteasa del VHC, o tratar
o prevenir una infección por VHC en pacientes o una afección fisiológica relacionada con la 15 infección.
La invención se refiere a un procedimiento estereoselectivo para preparar un compuesto de bicicloprolinato quiral que es un intermedio útil en la preparación de un compuesto de fórmula 1. El procedimiento sintético comprende las etapas de:
imagen3
en la que:
es
cicloalquilo opcionalmente sustituido o arilcicloalquilo condensado opcionalmente
sustituido;
25
R11 es -CO2R13;
R12 es un aducto de glicinamida imínica;
R13 es
un grupo protector de ácido o grupo alifático opcionalmente sustituido; en
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condiciones de escisión y ciclación para formar un compuesto de fórmula 25
imagen1
en la que: R14 es -CONR15R15, -CN;
imagen4
o -CO2R16;
R15 es un grupo alifático opcionalmente sustituido; R16
es un grupo protector de ácido, arilo opcionalmente sustituido o grupo alifático opcionalmente sustituido; y
(b) proteger el nitrógeno del resto lactama en el compuesto de fórmula 25 con un grupo protector de amida para formar un compuesto de fórmula 26
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en la que: po es un grupo protector de amida; R14 es como se describe aquí; y
(c) reducir el compuesto de fórmula 26 en condiciones reductoras para formar un compuesto de fórmula 27
8
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en la que: po y R14 son como se describen aquí; y
(d) desproteger el compuesto de fórmula 27 en condiciones de desprotección para formar un compuesto de fórmula 28
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en la que: R14 es como se describe aquí. La invención también se refiere al procedimiento sintético anterior que comprende 10 adicionalmente la etapa en la que el compuesto de fórmula 24 se prepara realizando una adición de Michael con un compuesto de glicinimida imínica sobre un compuesto de fórmula 29
en la que:
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15 es cicloalquenilo opcionalmente sustituido o arilcicloalquenilo condensado opcionalmente sustituido; R11 es -CO2R13; en el que: el compuesto de fórmula 29 puede prepararse esterificando un compuesto de fórmula 29a
imagen1
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10
15
20
25
30
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en la que:
imagen1
es cicloalquenilo opcionalmente sustituido o arilcicloalquenilo condensado opcionalmente sustituido; R11a es -CHO, -COR15, -C≡N o -CONR15R15; y R15 es como se ha descrito aquí.
En particular, un experto en la materia sabrá que la conversión de cetonas en ésteres puede realizarse, por ejemplo, por una reacción de Bayer-Villiger. La conversión de nitrilos y amidas en ésteres puede realizarse, por ejemplo, por hidrólisis acuosa seguida de esterificación adicional. La conversión de aldehídos en ésteres puede realizarse, por ejemplo, por oxidación del aldehído seguida de esterificación.
Además, se describe un compuesto de fórmula 1 en la que los sustituyentes se seleccionan entre una combinación de realizaciones preferidas o particulares como se definen en el presente documento.
Además, se describe un compuesto de fórmulas 24-29 en las que los sustituyentes se seleccionan entre una combinación de realizaciones preferidas o particulares como se definen en el presente documento.
Además, se describen composiciones farmacéuticas que comprenden, además de uno
o más inhibidores de serina proteasa de VHC, uno o más interferones o compuestos que inducen la producción de interferones que muestran actividad anti-VHC y/o uno o más compuestos que tienen actividad anti-VHC, incluyendo compuestos inmunomoduladores tales como citocinas inmunoestimuladoras que muestran actividad antiviral para VHC y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Además, se describen procedimientos para tratar o prevenir una infección por VHC en un paciente que lo necesite, que comprenden la administración a dicho paciente de una cantidad farmacéuticamente eficaz de una combinación de uno o más inhibidores de serina proteasa de VHC; uno o más interferones o compuestos que inducen la producción de un interferón que muestra actividad anti-VHC; y/o uno o más compuestos que tienen actividad anti-VHC, incluyendo compuestos inmunomoduladores tales como citocinas inmunoestimuladoras que muestran actividad antiviral para VHC.
Además, se describe el uso de uno o más inhibidores de serina proteasa de VHC en combinación con uno o más interferones o compuestos que inducen la producción de un interferón que muestra actividad anti-VHC y/o uno o más compuestos que tienen actividad anti-VHC, incluyendo compuestos inmunomoduladores tales como citocinas inmunoestimuladoras
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que muestran actividad antiviral para VHC, para preparar un medicamento para tratar o prevenir una infección de VHC en un paciente que lo necesite.
Además, se describe un kit o un envase farmacéutico para tratar o prevenir la infección por VHC en un paciente, comprendiendo el kit o envase farmacéutico una pluralidad de recipientes separados, conteniendo al menos uno de dichos recipientes uno o más inhibidores de serina proteasa de VHC (solos o en combinación con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable), conteniendo al menos otro de dichos recipientes uno o más interferones o compuestos que inducen la producción de un interferón que muestra actividad anti-VHC, (solo o en combinación con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable) y, opcionalmente, conteniendo al menos otro de dichos recipientes uno o más compuestos que tienen actividad anti-VHC (solos o en combinación con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable), incluyendo compuestos inmunomoduladores tales como citocinas inmunoestimuladoras que muestran actividad antiviral para VHC.
La cantidad del inhibidor o los inhibidores de serina proteasa del VHC, interferón o interferones o compuesto o compuestos anti-VHC en cualquiera de las aplicaciones anteriores puede ser una cantidad farmacéuticamente eficaz, una cantidad asintomáticamente eficaz anti-VHC o combinaciones de las mismas, siempre que la combinación final del inhibidor o inhibidores de la serina proteasa de VHC, el interferón o interferones o los compuestos que inducen la producción de un interferón que muestra actividad anti-VHC y/o compuesto o compuestos anti-VHC comprenda una cantidad farmacéuticamente eficaz de compuestos que sea eficaz en el tratamiento o prevención de la infección por VHC en un paciente. Breve Descripción de los Dibujos
Los aspectos, características y ventajas anteriores y otros de la presente invención se entenderán mejor a partir de la siguiente descripción detallada tomada junto con los dibujos adjuntos, todos los cuales se dan solamente con el propósito de ilustrar y no son limitantes de la presente invención, en los que:
La Figura 1 muestra la inhibición de la acumulación de ARN del replicón de VHC después
de 48 horas de tratamiento de células que contienen el replicón con Compuesto CU e
interferón alfa 2B, individualmente o en combinación.
La Figura 2 muestra gráficamente la concavidad de la isobola exhibida por los compuestos
usados en combinación que son antagonistas, aditivos y sinérgicos de acuerdo con los
procedimientos de cálculo de sinergia de Greco, Park y Rustom ((1990) Application of a
New Approach for the Quantitation of Drug Synergism to the Combination of cis-
Diamminedichloroplatinum and 1-B-D-Arabinofuranosylcytosine, Cancer Research, 50,
5318-5327).
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La Figura 3 muestra la relación geométrica entre a y la cantidad de curvatura en la isobola. Una isobola hipotética en el nivel de efecto E = 50% se presenta con una isobola en línea recta que sería esperable con propiedades aditivas. M es el punto de intersección de la línea y = x y la isobola hipotética. N es el punto de intersección de la línea y = x y la isobola en línea recta. O es el origen (0,0). S da una medida de la cantidad de curvatura en la isobola, cuando S = ON/OM. ON es la distancia desde O a N y OM es la distancia desde O a M. El parámetro α se relaciona con S por la ecuación α = 4(S2 – S). La Figura 4 muestra los cálculos de isobola usando el procedimiento de Greco y col., mencionado anteriormente, para la combinación de compuesto CU e interferón alfa-2B (Schering-Ploug) usando 6 diluciones de cada compuesto en el Experimento 1. La Figura 5 muestra los cálculos de isobola usando el procedimiento de Greco y col., mencionado anteriormente, para la combinación de compuesto CU e interferón alfa-2A usando 6 diluciones de cada compuesto en el Experimento 2. La Figura 6 muestra los cálculos de isobola usando el procedimiento de Greco y col., mencionado anteriormente, para la combinación de compuesto CU e interferón alfa-2B (Schering-Plough) usando 8 diluciones de cada compuesto en el Experimento 3. La Figura 7 muestra los cálculos de isobola usando el procedimiento de Greco y col., mencionado anteriormente, para la combinación de compuesto CU e interferón alfa-2A usando 8 diluciones de cada compuesto en el Experimento 4. La Figura 8 muestra los cálculos de isobola usando el procedimiento de Greco y col., mencionado anteriormente, para la combinación de compuesto CU e interferón ovino tau usando 8 diluciones de cada compuesto en el Experimento 5. La Figura 9 muestra los cálculos de isobola usando el procedimiento de Greco y col., mencionado anteriormente, para la combinación de compuesto EC e interferón alfa-2B (Schering-Ploug) usando 8 diluciones de cada compuesto en el Experimento 6. La Figura 10 muestra los cálculos de isobola usando el procedimiento de Greco y col., mencionado anteriormente, para la combinación de compuesto EC e interferón alfa-2A usando 8 diluciones de cada compuesto en el Experimento 7. La Figura 11 muestra los cálculos de isobola usando el procedimiento de Greco y col., mencionado anteriormente, para la combinación de compuesto CU e interferón beta usando 8 diluciones de cada compuesto en el Experimento 8. La Figura 12 muestra los cálculos de isobola usando el procedimiento de Greco y col., mencionado anteriormente, para la combinación de compuesto BP e interferón alfa-2B (Schering-Plough) usando 8 diluciones de cada compuesto en el Experimento 9. La Figura 13 muestra los cálculos de isobola usando el procedimiento de Greco y col.,
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mencionado anteriormente, para la combinación de Ribavirina e interferón alfa-2B (Schering-Plough) usando 8 diluciones de cada compuesto en el Experimento 10. La Figura 14 muestra la inhibición de la acumulación de ARN del replicón del VHC causada por el tratamiento de células con replicón con (A) Ribavirina sola o (B) interferón alfa-2B
5 solo. En ambos paneles, se muestra la inhibición medida así como la inhibición corregida con respecto a citotoxicidad de los compuestos. Descripción Detallada de la Invención El contenido de cada uno de los documentos de patente y otras referencias citadas en el presente documento se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.
10 Como se ha usado anteriormente, y como se usa a lo largo de la descripción de la invención, se entenderá que las siguientes abreviaturas, a menos que se indique otra cosa, tienen los siguientes significados:
Designación Reactivo o Fragmento
ACN acetonitrilo AIBN 2,2'-azobisisobutironitrilo BOC o Boc carbamato de terc-butilo BOP hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxitris(dimetilamino)fosfonio n-Bu3SnH hidruro de tri-n-butilestaño t-Bu terc-butilo Cbz carbamato de bencilo PTC quiral catalizador de transferencia de fase quiral 13
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DAST
trifluoruro de (dietilamino)azufre (Et2NSF3)
DCC
diciclocarbodiimida
DCM
diclorometano (CH2Cl2)
DIBAL-H
Hidruro de diisobutilaluminio
(continuación) Designación Reactivo o Fragmento
DIC 1,3-diisopropilcarbodiimida DIPEA diisopropiletilamina DMAP 4-(N,N-dimetilamino)piridina reactivo DMP peryodinano de Dess-Martin
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DMF dimetilformamida DMSO dimetilsulfóxido AE análisis elemental EDCI 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida HCl equiv. equivalente(s) Et etilo Et2O éter dietílico BtOH etanol EtOAc acetato de etilo Et3Si trietilsilano EMOC
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H-Chg-OH HOAt 1-hidroxi-7-azabensotriazol HOBT 1-hidroxibenzotriazol HOSu N-hidroxisuccinamida HPLC cromatografía líquida de alta resolución LAH anhídrido de litio y aluminio Me metilo MeI yoduro de metilo MeOH metanol MeOC(O)Cl cloroformiato de metilo MOMCl cloruro de metoximetilo
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14
(continuación) Designación Reactivo o Fragmento
MOM
metoximetilo
MS
espectroscopía de masas
NaBH4
borohidruro sódico
Na2C4H4O6
tartrato sódico
NMP
N-metil pirrolidinona
RMN
resonancia magnética nuclear
P-
Enlace polimérico
PyBOP
hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxitris-pirrolidino-fosfonio
TBD
1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]-dec-5-eno
RP-HPLC
cromatografía líquida de alta presión en fase inversa
TBSCl
cloruro de terc-butildimetilsililo
TCA
ácido tricloroacético
TFA
ácido trifluoroacético
Tf2O
anhídrido de triflato
THF
tetrahidrofurano
THP
tetrahidropirano
TLC
cromatografía de capa fina
Como se han usado anteriormente, y como se usan a lo largo de la descripción de la invención, se entenderá que los siguientes términos, a menos que se indique otra cosa, tienen los siguientes significados:
"Bioisóstero de ácido" se refiere a un grupo que tiene similitudes químicas y físicas que proporcionan propiedades biológicas muy similares a un grupo carboxi (véase Lipinski, Annual Reports in Medicinal Chemistry, "Bioisosterism In Drug Design" 21, 283 (1986); Yun, Hwahak Sekye, "Application Of Bioisosterism To New Drug Design" 33, 576-579, (1993); Zhao, Huaxue Tongbao, "Bioisosteric Replacement And Development Of Lead Compounds In Drug Design" 34-38, (1995); Graham, Theochem, "Theoretical Studies Applied To Drug Design:ab initio Electronic Distributions In Bioisosteres" 343, 105-109, (1995)). Los bioisósteros de ácidos incluyen -C(O)-NHOH, -C(O)-CH2OH, -C(O)-CH2SH, -C(O)-NH-CN, sulfo, fosfono, alquilsulfonilcarbamoílo, tetrazolilo, arilsulfonilcarbamoílo, N-metoxicarbamoílo, heteroarilsulfonilcarbamoílo, 3-hidroxi-3-ciclobuteno-1,2-diona, 3,5-dioxo-1,2,4-oxadiazolidinilo
o hidroxiheteroarilo, tal como 3-hidroxiisoxazolilo, 3-hidroxi-1-metilpirazolilo y similares. "Grupo funcional ácido" se refiere a un resto que tiene un hidrógeno ácido. Los grupos
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funcionales ácidos ejemplares incluyen carboxilo (-C(O)OH), -C(O)-NHOH, -C(O)-CH2OH, -C(O)-CH2SH, -C(O)-NH-CN, sulfo, fosfono, alquilsulfonilcarbamoílo, tetrazolilo, arilsulfonilcarbamoílo, N-metoxicarbamoílo, heteroarilsulfonilcarbamoílo, 3-hidroxi-3ciclobuteno-1,2-diona, 3,5-dioxo-1,2,4-oxadiazolidinilo o hidroxiheteroarilo, tal como 3hidroxiisoxazolilo, 3-hidroxi-1-metilpirazolilo, imidazolilo, mercapto y similares, y un hidroxi apropiado, tal como un hidroxi aromático, por ejemplo, hidroxifenilo.
"Grupo protector de ácidos" se refiere a un grupo fácilmente retirable que se sabe en la técnica que protege a un hidrógeno ácido de un grupo carboxilo frente a una reacción indeseada durante procedimientos sintéticos, por ejemplo, para bloquear o proteger la funcionalidad ácida mientras se realizan las reacciones que implican otros sitios funcionales del compuesto, y que puede retirarse selectivamente. Dichos grupos protectores de ácidos son bien conocidos por los expertos en la materia, habiéndose usado mucho en la protección de grupos carboxilo, como se describe en las Patentes de Estados Unidos Nº 3.840.556 y 3.719.667, cuyas divulgaciones se incorporan en el presente documento por referencia. Para grupos protectores de ácidos adecuados, véase T.W. Green y P.G.M. Wuts en "Protective Groups in Organic Chemistry" John Wiley y Sons, 1991. El grupo protector de ácido también incluye un grupo protector de ácido lábil a hidrogenación como se define en el presente documento. Los grupos protectores de ácidos ejemplares incluyen ésteres, tales como alquilo C1-8 inferior sustituido y sin sustituir, por ejemplo, metilo, etilo, t-butilo, metoximetilo, metiltiometilo, 2,2,2-tricloroetilo y similar, tetrahidropiranilo, fenilalquilo sustituido y sin sustituir tal como bencilo y derivados sustituidos de los mismos, tales como grupos alcoxi-bencilo o nitrobencilo y similares, cinnamilo, dialquilaminoalquilo, por ejemplo, dimetilaminoetilo y similares, trimetilsililo, amidas e hidrazidas sustituidas y sin sustituir, por ejemplo, amidas e hidrazidas de N,N-dimetilamina, 7-nitroindol, hidrazina, N-fenilhidrazina y similares, grupos aciloxialquilo tales como pivaloiloximetilo o propioniloximetilo y similares, aroiloxialquilo tal como benzoíloxietilo y similares, alcoxicarbonilalquilo tal como metoxicarbonilmetilo, ciclohexiloxicarbonilmetilo y similares, alcoxicarboniloxialquilo, tal como tbutiloxicarboniloximetilo y similares, alcoxicarbonilaminoalquilo tal como tbutiloxicarbonilammometilo y similares, alquilaminocarbonilaminoaminoalquilo tal como metilaminocarbonilaminometilo y similares, acilaminoalquilo tal como acetilaminometilo y similares, helerociclilcarboniloxialquilo tal como 4-metilpiperazinil-carboniloximetilo y similares, dialquilaminocarbonilalquilo tal como dimetilaminocarbonil-metilo y similares, (5-(alquil inferior)2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)alquilo tal como (5-t-butil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)metilo y similares, y (5fenil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)alquilo tal como (5-fenil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)metilo y similares.
"Grupo protector de amina lábil a ácidos" se refiere a un grupo protector de amina como
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se define en el presente documento que se retira fácilmente por tratamiento con ácido mientras sigue siendo relativamente estable a otros reactivos. Un grupo protector de amina lábil a ácidos preferido es BOC.
"Alifático" significa alquilo, alquenilo o alquinilo, como se define en el presente documento.
"Sustituyente(s) de grupo alifático" se refiere a sustituyentes unidos a un grupo alifático, como se ha definido en el presente documento, incluyendo arilo, heteroarilo, hidroxi, alcoxi, cicliloxi, ariloxi, heteroariloxi, acilo o su análogo tioxo, ciclilcarbonilo o su análogo tioxo, aroílo o su análogo tioxo, heteroaroílo o su análogo tioxo, aciloxi, ciclilcarboniloxi, aroiloxi, heteroaroiloxi, halo, nitro, ciano, carboxi (ácido), -C(O)-NHOH, -C(O)-CH2OH, -C(O)-CH2SH, C(O)-NH-CN, sulfo, fosfono, alquilsulfonilcarbamoílo, tetrazolilo, arilsulfonilcarbamoílo, Nmetoxicarbamoílo, heteroarilsulfonilcarbamoílo, 3-hidroxi-3-ciclobuteno-1,2-diona, 3,5-dioxo1,2,4-oxadiazolidinilo o hidroxiheteroarilo, tal como 3-hidroxiisoxazolilo, 3-hidroxi-1metilpirazolilo, alcoxicarbonilo, cicliloxicarbonilo, ariloxicarbonilo, heteroariloxicarbonilo, alquilsulfonilo, ciclilsulfonilo, arilsulfonilo, heteroarilsulfonilo, alquilsulfinilo, ciclilsulfinilo, arilsulfinilo, heteroarilsulfinilo, alquiltio, cicliltio, ariltio, heteroariltio, ciclilo, arildiazo, heteroarildiazo, tiol, metileno (H2C=), oxo (O=), tioxo (S=), Y1Y2N-, Y1Y2NC(O)-, Y1Y2NC(O)O-, Y1Y2NC(O)NY3-, Y1Y2NSO2-o Y3SO2NY1-siendo R2 como se define en el presente documento, Y1 e Y2 son independientemente hidrógeno, alquilo arilo o heteroarilo, e Y3 es alquilo, cicloalquilo, arilo o heteroarilo, o cuando el sustituyente es Y1Y2N-, entonces uno de Y1 e Y2 puede ser acilo, ciclilcarbonilo, aroílo, heteroaroílo, alcoxicarbonilo, cicliloxicarbonilo, ariloxicarbonilo o heteroariloxicarbonilo, como se define en el presente documento, y el otro de Y1 e Y2 es como se ha definido previamente, o cuando el sustituyente es Y1Y2NC(O)-, Y1Y2NC(O)O-, Y1Y2NC(O)NY3-o Y1Y2NSO2-, Y1 e Y2 también pueden tomarse junto con el átomo de N a través del cual están unidos Y1 e Y2 para formar un azaheterociclilo o azaheterociclenilo de 4 a 7 miembros. Los sustituyentes de grupo alifático ácido/amida son carboxi (ácido), -C(O)-NHOH, -C(O)CH2OH, -C(O)-CH2SH, -C(O)-NH-CN, sulfo, fosfono, alquilsulfonilcarbamoílo, tetrazolilo, arilsulfonilcarbamoílo, N-metoxicarbamoílo, heteroarilsulfonilcarbamoílo, 3-hidroxi-3-ciclobuteno-1,2-diona, 3,5-dioxo-1,2,4-oxadiazolidinilo
o hidroxiheteroarilo, tal como 3-hidroxiisoxazolilo, 3-hidroxi-1-metilpirazolilo e Y1Y2NCO-. Son sustituyentes de grupo alifático polar no ácidos hidroxi, oxo (O=), tioxo (S=), acilo o su análogo tioxo, ciclilcarbonilo o su análogo tioxo, aroílo o su análogo tioxo, heteroaroílo o su análogo tioxo, alcoxicarbonilo, cicliloxicarbonilo, ariloxicarbonilo, heteroariloxicarbonilo, aciloxi, ciclilcarboniloxi, aroiloxi, heteroaroiloxi, alquilsulfonilo, ciclilsulfonilo, arilsulfonilo, heteroarilsulfonilo, alquilsulfinilo, ciclilsulfinilo, arilsulfinilo, heteroarilsulfinilo, tiol, Y1Y2N-,
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Y1Y2NC(O)-, Y1Y2NC(O)O-, Y1Y2NC(O)NY3-o Y1Y2NSO2-. Los grupos alifáticos ejemplares que tienen un sustituyente de grupo alifático incluyen metoximetoxi, metoxietoxi, etoxietoxi, (metoxi-, benciloxi-, fenoxi-o etoxi-)carbonil(metilo o etilo), benciloxicarbonilo, piridilmetiloxicarbonilmetilo, metoxietilo, etoximetilo, n-butoximetilo, ciclopentilmetiloxietilo, fenoxipropilo, fenoxialilo, trifluorometilo, ciclopropilmetilo, ciclopentilmetilo, carboxi(metilo o etilo), 2-fenetenilbenciloxi, 1-o 2-naftil-metoxi, 4-piridil-metiloxi, benciloxietilo, 3-benciloxialilo, 4piridilinetil-oxietilo, 4-piridilmetil-oxialilo, bencilo, 2-fenetilo, naftilmetilo, estirilo, 4-fenil-1,3pentadienilo, fenil-propinil 3-fenilbut-2-inilo, pirid-3-ilacetilenilo y quinolin-3-ilacetilenilo, 4-piridiletinilo, 4-piridilvinilo, tieniletenilo, piridiletenilo, imidazoliletenilpiraziniletenilo, piridilpentenilo, piridilhexenilo y piridilheptenilo, tienilmetilo, piridilmetilo, imidazolilmetilo, pirazinilmetilo, tetrahidropiranilmetilo, tetrahidropiranilmetiloximetilo y similares.
"Acilo" se refiere a un grupo H-CO-o (alifático o ciclilo)-CO-en el que el grupo alifático es como se ha descrito en el presente documento. Los acilos preferidos contienen un alquilo inferior. Los grupos acilo ejemplares incluyen formilo, acetilo, propanoílo, 2-metilpropanoílo, butanoílo, palmitoilo, acriloílo, propinoílo, ciclohexilcarbonilo y similares.
"Alquenoílo" se refiere a un grupo alquenil-CO-en el que el alquenilo es como se define en el presente documento.
"Alquenilo" se refiere a un grupo hidrocarburo alifático que contiene un doble enlace carbono-carbono, que puede ser lineal o ramificado, y que tiene de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 átomos de carbono en la cadena. Los grupos alquenilo preferidos tienen de 2 a aproximadamente 12 átomos de carbono en la cadena; y más preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 átomos de carbono en la cadena. Ramificado significa que uno o más grupos alquilo inferior, tales como metilo, etilo o propilo, están unidos a una cadena alquenilo lineal. "Alquenilo inferior" significa de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 átomos de carbono en la cadena, que puede ser lineal o ramificada. Los grupos alquenilo ejemplares incluyen etenilo, propenilo, n-butenilo, i-butenilo, 3-metilbut-2-enilo, n-pentenilo, heptenilo, octenilo, ciclohexilbutenilo, decenilo y similares. "Alquenilo sustituido" se refiere a un grupo alquenilo, como se ha definido anteriormente, que está sustituido con uno o más "sustituyentes de grupo alifático" (preferentemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en el presente documento. Los sustituyentes de grupo alifático alquenilo ejemplares incluyen grupos halo o cicloalquilo.
"Alqueniloxi" se refiere a un grupo alquenil-O-en el que el grupo alquenilo es como se describe en el presente documento. Los grupos alqueniloxi ejemplares incluyen aliloxi, 3buteniloxi y similares.
"Alcoxi" se refiere a un grupo alquil-O-en el que el grupo alquilo es como se describe en
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el presente documento. Los grupos alcoxi ejemplares incluyen metoxi, etoxi, n-propoxi, ipropoxi, n-butoxi, heptoxi y similares.
"Alcoxicarbonilo" se refiere a un grupo alquil-O-CO-, en el que el grupo alquilo es como se define en el presente documento. Los grupos alcoxicarbonilo ejemplares incluyen metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, t-butiloxicarbonilo y similares.
"Alquilo" se refiere a un grupo hidrocarburo alifático que puede ser lineal o ramificado y que tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 átomos de carbono en la cadena. Los grupos alquilo preferidos tienen de 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono en la cadena, más preferentemente son alquilo inferior, como se define en el presente documento. Ramificado significa que uno o más grupos alquilo inferior, tales como metilo, etilo o propilo, están unidos a una cadena alquilo lineal. "Alquilo inferior" significa de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 átomos de carbono en la cadena, que puede ser lineal o ramificada. "Alquilo sustituido" se refiere a un grupo alquilo, como se ha definido anteriormente, que está sustituido con uno o más "sustituyentes de grupo alifático" (preferentemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes, y son como se definen en el presente documento.
"Alquilsulfinilo" se refiere a un grupo alquil-SO-en el que el grupo alquilo es como se ha definido anteriormente. Los grupos preferidos son aquellos en los que el grupo alquilo es alquilo inferior.
"Alquilsulfonilo" se refiere a un grupo alquil-SO2-en el que el grupo alquilo es como se ha definido anteriormente. Los grupos preferidos son aquellos en los que el grupo alquilo es alquilo inferior.
"Alquilsulfonilcarbamoílo" se refiere a un grupo alquil-SO2-NH-C(=O)-en el que el grupo alquilo es como se describe en el presente documento. Los grupos alquilsulfonilcarbamoílo preferidos son aquellos en los que el grupo alquilo es alquilo inferior.
"Alquiltio" se refiere a un grupo alquil-S-en el que el grupo alquilo es como se describe en el presente documento. Los grupos alquiltio ejemplares incluyen metiltio, etiltio, i-propiltio y heptiltio.
"Alquinilo" se refiere a un grupo hidrocarburo alifático que contiene un triple enlace carbono-carbono, que puede ser lineal o ramificado y que tiene de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 átomos de carbono en la cadena. Los grupos alquinilo preferidos tienen de 2 a aproximadamente 12 átomos de carbono en la cadena; y más preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 átomos de carbono en la cadena. Ramificado significa que uno o más grupos alquilo inferior, tales como metilo, etilo o propilo, están unidos a la cadena alquinilo lineal. "Alquinilo inferior" significa de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 átomos de carbono en la cadena, que puede ser lineal o ramificada. El
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grupo alquinilo puede estar sustituido con uno o más halo. Los grupos alquinilo ejemplares incluyen etinilo, propinilo, n-butinilo, 2-butinilo, 3-metilbutinilo, n-pentinilheptinilo, octinilo, decinilo y similares. "Alquinilo sustituido" significa alquinilo, como se ha definido anteriormente, que está sustituido con uno o más "sustituyentes de grupo alifático" (preferentemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes, y son como se definen en el presente documento.
"Grupo protector de amina" se refiere a un grupo fácilmente retirable que se sabe en la técnica que protege a un resto nitrógeno de un grupo amino o amida frente una reacción indeseable durante los procedimientos sintéticos y que puede retirarse selectivamente. El uso de grupos protectores de amina/amida es bien conocido en la técnica para proteger grupos frente a reacciones indeseables durante un procedimiento sintético, y muchos de estos grupos protectores son conocidos, por ejemplo, T.W. Greene y P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2ª edición, John Wiley y Sons, Nueva York (1991), incorporado en el presente documento por referencia. El grupo protector de amina/amida también incluye "grupo protector de amina/amida lábil a ácidos" y " grupo protector de amina/amida lábil a hidrogenación". Son grupos protectores de amina/amida ejemplares acilo, incluyendo formilo, acetilo, cloroacetilo, tricloroacetilo, o-nitrofenilacetilo, o-nitrofenoxiacetilo, trifluoroacetilo, acetoacetilo, 4-clorobutirilo, isobutirilo, o-nitrocinnamoílo, picolinoílo, acilisotiocianato, aminocaproilo, benzoílo y similares, y aciloxi, incluyendo metoxicarbonilo, 9fluorenilmetoxicarbonilo, 2,2,2-trifluoroetoxicarbonilo, 2-trimetilsililetoxicarbonilo, viniloxicarbonilo, aliloxicarbonilo, t-butiloxicarbonilo (BOC), 1,1-dimetil-propiniloxicarbonilo, benciloxicarbonilo (CBZ), p-nitrobenciloxicarbonilo, 2,4-dicloro-benciloxicarbonilo y similares.
"Grupo protector de amida" se refiere a un grupo fácilmente retirable que se sabe en la técnica que protege a un resto nitrógeno de un grupo amida frente a una reacción indeseable durante procedimientos sintéticos y que puede retirarse selectivamente después de su conversión en la amina. El uso de grupos protectores de amida es bien conocido en la técnica para proteger grupos frente a reacciones indeseables durante un procedimiento sintético, y muchos de estos grupos protectores son conocidos, por ejemplo, T.W. Greene y P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2ª edición, John Wiley y Sons, Nueva York (1991), incorporado en el presente documento por referencia. El grupo protector de amida también incluye "grupo protector de amida lábil a ácidos" y "grupo protector de amida lábil a hidrogenación". Son grupos protectores de amida ejemplares o-nitrocinnamoílo, picolinoílo, aminocaproilo, benzoílo y similares, y aciloxi, incluyendo metoxi-carbonilo, 9fluorenilmetoxicarbonilo, 2,2,2-trifluoroetoxicarbonilo, 2-trimetilsililetoxi-carbonilo, viniloxicarbonilo, aliloxicarbonilo, t-butiloxicarbonilo (BOC), 1,1-dimetil-propiniloxicarbonilo, benciloxicarbonilo (CBZ), p-nitrobenciloxicarbonilo, 2,4-dicloro-benciloxicarbonilo y similares.
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"Aminoácido" se refiere a un aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por aminoácidos naturales y no naturales, como se definen en el presente documento. Aminoácido también pretende incluir aminoácidos que tienen la estereoquímica L o D en el carbono α. Los aminoácidos preferidos son los que poseen un grupo α-amino. Los aminoácidos pueden ser neutros, positivos o negativos, dependiendo de los sustituyentes en la cadena lateral. "Aminoácido neutro" se refiere a un aminoácido que contiene sustituyentes de cadena lateral no cargados. Los aminoácidos neutros ejemplares incluyen alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptófano, metionina, glicina, serina, treonina y cisteína. "Aminoácido positivo" se refiere a un aminonácido en el que los sustituyentes de cadena lateral están cargados positivamente a pH fisiológico. Los aminoácidos positivos ejemplares incluyen lisina, arginina e histidina. "Aminoácido negativo" se refiere a un aminoácido en el que los sustituyentes de cadena lateral tienen una carga negativa neta a pH fisiológico. Los aminoácidos negativos ejemplares incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Son aminoácidos preferidos los α-aminoácidos. Son aminoácidos naturales ejemplares isoleucina, prolina, fenilalanina, triptófano, metionina, glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido aspártico y ácido glutámico. "Aminoácido no natural" se refiere a un aminoácido para el que no hay ningún codón de ácido nucleico. Los aminoácidos no naturales ejemplares incluyen, por ejemplo, los isómeros D de los αaminoácidos naturales como se ha indicado anteriormente; Aib (ácido aminobutírico), βAib (ácido 3-amino-isobutírico), Nva (norvalina), β-Ala, Aad (ácido 2-aminoadípico), βAad (ácido 3aminoadípico), Abu (ácido 2-aminobutírico), Gaba (ácido γ-aminobutírico), Acp (ácido 6aminocaproico), Dbu (ácido 2,4-diaminobutírico), ácido α-aminopimélico, TMSA (trimetilsilil-Ala), alle (alo-isoleucina), Nle (norleucina), terc-Leu, Cit(citrulina), Orn, Dpm (ácido 2,2'diaminopimélico), Dpr (ácido 2,3-diaminopropiónico), α-o β-Nal, Cha (ciclohexil-Ala), hidroxiprolina, Sar (sarcosina), y similares; aminoácidos cíclicos; aminoácidos Na-alquilados tales como MeGly (Na-metilglicina), EtGly (Na-etilglicina) y EtAsn (Na-etilasparagina); y aminoácidos en los que el carbono α tiene dos sustituyentes de cadena lateral. Los nombres de aminoácidos naturales y no naturales y restos de los mismos usados en el presente documento siguen las convenciones de nomenclatura sugeridas por la Comisión IUPAC sobre la Nomenclatura de Química Orgánica y la Comisión IUPAC-IUB sobre Nomenclatura Bioquímica como se expone en "Nomenclature of α-Amino Acids (Recommendations, 1974)" Biochemistry, 14(2), (1975). En la medida en que los nombres y abreviaturas de aminoácidos y restos de los mismos empleados en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas difieren de los indicados, se harán claros diferentes nombres y abreviaturas.
"Grupo protector de aminoácidos" se refiere a un grupo que protege a un resto de ácido
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o amina del aminoácido u otro resto reactivo en la cadena lateral de un aminoácido, por ejemplo, hidroxi o tiol. Para ejemplos de "derivados protegidos correspondientes" de cadenas laterales de aminoácidos, véase T.W. Green y P.G.M. Wuts en "Protective Groups in Organic Chemistry" John Wiley y Sons,1991. Los grupos protectores para un grupo ácido en un aminoácido se describen en el presente documento, por ejemplo en las secciones "grupo funcional ácido" y "grupo protector de ácido lábil a hidrogenación". Los grupos protectores para un grupo amina en un aminoácido se describen en el presente documento, por ejemplo en las secciones "grupo protector de amina", "grupo protector de amina lábil a ácidos" y "grupo protector de amina lábil a hidrogenación".
"Resto de aminoácido" se refiere a las unidades de aminoácidos individuales incorporadas en el compuesto de la invención.
"Cadena lateral de aminoácido" se refiere al sustituyente que se encuentra en el carbono que está entre los grupos amino y carboxi en α-aminoácidos. Las cadenas laterales de *-aminoácidos ejemplares incluyen isopropilo, metilo y carboximetilo para valina, alanina y ácido aspártico, respectivamente.
"Equivalente de aminoácido" se refiere a un aminoácido que puede estar sustituido por otro aminoácido en los péptidos de acuerdo con la invención sin ninguna pérdida apreciable de función. En la realización de dichos cambios, las sustituciones de tipo aminoácido se realizan en base a la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral, por ejemplo con respecto al tamaño, carga, hidrofilia, hidropaticidad e hidrofobia, como se describe en el presente documento.
"Grupo aromático" significa arilo o heteroarilo, como se definen en el presente documento. Los grupos aromáticos ejemplares incluyen fenilo, fenilo sustituido con halo, azaheteroarilo y similares.
"Aroílo" se refiere a un grupo aril-CO-en el que el grupo arilo es como se describe en el presente documento. Los grupos aroílo ejemplares incluyen benzoílo, 1-y 2-naftoílo y similares.
"Arilo" se refiere a un sistema de anillos monocíclico o multicíclico, aromático, de aproximadamente 6 a aproximadamente 14 átomos de carbono, preferentemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 10 átomos de carbono. Dentro de arilo se incluyen arilcicloalquenilo condensado, arilcicloalquilo condensado, arilheterociclenilo condensado y arilheterociclilo condensado, como se define en el presente documento, cuando está unido a través de su resto arilo. El arilo está opcionalmente sustituido con uno o más "sustituyentes de grupo de anillos" que pueden ser iguales o diferentes, y son como se definen en el presente documento. Los grupos arilo ejemplares incluyen fenilo o naftilo, o fenilo sustituido o naftilo
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sustituido. "Arilo sustituido" se refiere a un grupo arilo, como se ha definido anteriormente, que está sustituido con uno o más "sustituyentes de grupo de anillos" (preferentemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en el presente documento.
"Arildiazo" se refiere a un grupo aril-diazo-en el que los grupos arilo y diazo son como se definen en el presente documento.
"Arileno" se refiere a un grupo arilo 1,2-, 1,3-, 1,4-, divalente, opcionalmente sustituido, en el que el grupo arilo es como se define en el presente documento. Los grupos arileno ejemplares incluyen fenileno, naftileno e indanileno opcionalmente sustituidos. Un arileno particular es fenileno opcionalmente sustituido. "Arileno sustituido" se refiere a un grupo arileno, como se ha definido anteriormente, que está sustituido con uno o más "sustituyentes de grupo de anillos" (preferentemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en el presente documento.
"Ariloxi" se refiere a un grupo aril-O-en el que el grupo arilo es como se define en el presente documento. Los grupos ariloxi ejemplares incluyen fenoxi y 2-naftiloxi.
"Ariloxicarbonilo" se refiere a un grupo aril-O-CO-en el que el grupo arilo es como se define en el presente documento. Los grupos ariloxi-carbonilo ejemplares incluyen fenoxicarbonilo y naftoxicarbonilo.
"Arilsulfonilo" se refiere a un grupo aril-SO2-en el que el grupo arilo es como se define en el presente documento.
"Arilsulfonilcarbamoílo" se refiere a un grupo aril-SO2-NH-C(=O)-en el que el grupo arilo es como se describe en el presente documento. Un grupo arilsulfonilcarbamoílo ejemplar es fenilsulfonilcarbamoílo.
"Arilsulfinilo" se refiere a un grupo aril-SO-en el que el grupo arilo es como se define en el presente documento.
"Ariltio" se refiere a un grupo aril-S-en el que el grupo arilo es como se describe en el presente documento. Los grupos ariltio ejemplares incluyen feniltio y naftiltio.
"Átomo de nitrógeno básico" se refiere a un átomo de nitrógeno hibridado sp2 o sp3 que tiene un par de electrones no enlazados y que puede estar protonado. Los átomos de nitrógeno básicos ejemplares incluyen grupos imino opcionalmente sustituido, amino opcionalmente sustituido y amidino opcionalmente sustituido.
"Carboxi" se refiere a un grupo HO(O)C-(ácido carboxílico).
"Agente de acoplamiento" se refiere a un compuesto que reacciona con el resto hidroxilo de un resto carboxi, haciéndolo de esta manera susceptible de ataque nucleófilo. Los agentes de acoplamiento ejemplares incluyen DIC, EDCI, DCC y similares.
"Cicloalquenilo" se refiere a un sistema de anillos mono-o multicíclico, no aromático, de
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aproximadamente 3 a aproximadamente 10 átomos de carbono, preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 átomos de carbono, y que contiene al menos un doble enlace carbono-carbono. Dentro de cicloalquenilo se incluyen arilcicloalquenilo condensado y heteroarilcicloalquenilo condensado, como se definen en el presente documento, cuando están unidos a través de su resto cicloalquenilo. Los tamaños de anillo preferidos del sistema de anillos incluyen de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo; y dichos tamaños de anillo preferidos también se denominan "inferiores". "Cicloalquenilo sustituido" se refiere a un grupo cicloalquenilo, como se ha definido anteriormente, que está sustituido con uno o más "sustituyentes de grupo de anillos" (preferentemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en el presente documento. Los cicloalquenilos monocíclicos ejemplares incluyen ciclopentenilo, ciclohexenilo, cicloheptenilo y similares. Un cicloalquenilo multicíclico ejemplar es norbornilenilo.
"Cicloalquilo" se refiere a un sistema de anillos mono-o multicíclico, no aromático, de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 átomos de carbono, preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 átomos de carbono. Los tamaños de anillo preferidos del sistema de anillos incluyen de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo; y dichos tamaños de anillo preferidos también se denominan "inferiores". Dentro de cicloalquilo se incluyen arilcicloalquilo condensado y heteroarilcicloalquilo condensado, como se definen en el presente documento, cuando están unidos a través de su resto cicloalquilo. "Cicloalquilo sustituido" se refiere a un grupo cicloalquilo, como se ha definido anteriormente, que está sustituido con uno o más "sustituyentes de grupo de anillos" (preferentemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en el presente documento. Los cicloalquilos monocíclicos ejemplares incluyen ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y similares. Los cicloalquilos multicíclicos ejemplares incluyen 1-decalina, norbornilo, adamant-(1-o 2-)ilo y similares.
"Cicloalquileno" se refiere a un grupo cicloalquilo bivalente, como se define en el presente documento, que tiene de aproximadamente 4 a aproximadamente 8 átomos de carbono. Los tamaños de anillo preferidos del cicloalquileno incluyen de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo; y dichos tamaños de anillo preferidos también se denominan "inferiores". Los puntos de unión sobre el grupo cicloalquileno incluyen patrones de unión 1,1-, 1,2-, 1,3-o 1,4-, y, cuando sea aplicable, la relación estereoquímica de los puntos de unión es cis o trans. Los grupos cicloalquileno ejemplares incluyen (1,1-, 1,2-o 1,3)ciclohexileno y (1,1-o 1,2-)ciclopentileno. "Cicloalquileno sustituido" se refiere a un grupo cicloalquileno, como se ha definido anteriormente, que está sustituido con uno o más "sustituyentes de grupo de anillos" (preferentemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o
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diferentes y son como se definen en el presente documento
"Cíclico" o "ciclilo" se refiere a cicloalquilo, cicloalquenilo, heterociclilo o heterociclenilo, como se definen en el presente documento. El término "inferiores", como se usa con respecto al término cíclico, es el mismo que se ha indicado en el presente documento con respecto al cicloalquilo, cicloalquenilo, heterociclilo o heterociclenilo.
"Cicliloxi" se refiere a un grupo ciclil-O-en el que el grupo ciclilo es como se describe en el presente documento. Los grupos cicloalcoxi ejemplares incluyen ciclopentiloxi, ciclohexiloxi, quinuclidiloxi, pentametilenosulfideoxi, tetrahidropiraniloxi, tetrahidrotiofeniloxi, pirrolidiniloxi, tetrahidrofuranoiloxi o 7-pxabiciclo[2.2.1]heptaniloxi, hidroxitetrahidropiraniloxi, hidroxi-7oxabiciclo[2.2.1]heptaniloxi y similares.
"Ciclilsulfinilo" se refiere a un grupo ciclil-S(O)-en el que el grupo ciclilo es como se describe en el presente documento.
"Ciclilsulfonilo" se refiere a un grupo ciclil-S(O)2-en el que el grupo ciclilo es como se describe en el presente documento.
"Cicliltio" se refiere a un grupo ciclil-S-en el que el grupo ciclilo es como se describe en el presente documento.
"Diazo" se refiere a un radical -N=N-bivalente.
"Resto desplazable" se refiere a un grupo que, cuando está asociado con L como se define en el presente documento, sufre desplazamiento por un ataque nucleófilo por parte de un resto amina mono-o di-sustituido con o sin presencia de un agente que facilite dicho ataque, por ejemplo, agente de acoplamiento. Los restos desplazables ejemplares incluyen hidroxi, oxi alifático, halo, N-oxisuccinimida, aciloxi y similares.
"Cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de un compuesto/composición de acuerdo con la presente invención eficaz a la hora de producir el efecto terapéutico deseado.
"Arilcicloalquenilo condensado" se refiere a un arilo y cicloalquenilo condensados como se define en el presente documento. Los arilcicloalquenilos condensados preferidos son aquellos en los que el arilo de los mismos es fenilo y el cicloalquenilo consta de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo. Un arilcicloalquenilo condensado como una variable puede estar unido a través de cualquier átomo del sistema de anillos del mismo capaz de ello. "Arilcicloalquenilo condensado sustituido" se refiere a un grupo arilcicloalquenilo condensado, como se ha definido anteriormente, que está sustituido con uno o más "sustituyentes de grupo de anillos" (preferentemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en el presente documento. Los arilcicloalquenilos condensados ejemplares incluyen 1,2-dihidronaftileno, indeno y similares.
"Arilcicloalquilo condensado" se refiere a un arilo y cicloalquilo condensados como se
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define en el presente documento. Los arilcicloalquilos condensados preferidos son aquellos en los que su arilo es fenilo y el cicloalquilo consta de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo. Un arilcicloalquilo condensado como una variable puede estar unido a través de cualquier átomo del sistema de anillos del mismo capaz de ello. "Arilcicloalquilo condensado sustituido" se refiere a un grupo arilcicloalquilo condensado, como se ha definido anteriormente, que está sustituido con uno o más "sustituyentes de grupo de anillos" (preferentemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en el presente documento. Los arilcicloalquilos condensados ejemplares incluye 1,2,3,4tetrahidronaftileno y similares.
"Arilheterociclenilo condensado" se refiere a un arilo y heterociclenilo condensados como se define en el presente documento. Los arilheterociclenilos condensados preferidos son aquellos en los que su arilo es fenilo y el heterociclenilo consta de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo. Un arilheterociclenilo condensado como una variable puede estar unido a través de cualquier átomo del sistema de anillos del mismo capaz de ello. La designación de aza, oxa o tia como un prefijo antes de la porción heterociclenilo del arilheterociclenilo condensado define que está presente al menos un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre, respectivamente, como un átomo del anillo. "Arilheterociclenilo condensado sustituido" se refiere a un grupo arilheterociclenilo condensado, como se ha definido anteriormente, que está sustituido con uno o más "sustituyentes de grupo de anillos" (preferentemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en el presente documento. El átomo de nitrógeno de un arilheterociclenilo condensado puede ser un átomo de nitrógeno básico. El átomo de nitrógeno o azufre de la porción heterociclenilo del arilheterociclenilo condensado también puede estar opcionalmente oxidado al N-óxido, S-óxido
o S,S-dióxido correspondiente. Los arilheterociclenilos condensados ejemplares incluyen 3Hindolinilo, 1H-2-oxoquinolilo, 2H-1-oxoisoquinolilo, 1,2-dihidroquinolinilo, 3,4-dihidroquinolinilo, 1,2-dihidroisoquinolinilo, 3,4-dihidroisoquinolinilo y similares.
"Arilheterociclilo condensado" se refiere a un arilo y heterociclilo condensados como se define en el presente documento. Los arilheterociclilos condensados preferidos son aquellos en los que su arilo es fenilo y el heterociclilo consta de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo. Un arilheterociclilo condensado como una variable puede estar unido a través de cualquier átomo del sistema de anillos del mismo capaz de ello. La designación de aza, oxa o tia como un prefijo antes de la porción heterociclilo del arilheterociclilo condensado define que está presente al menos un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre, respectivamente, como un átomo del anillo. "Arilheterociclilo condensado sustituido" se refiere a un grupo arilheterociclilo condensado, como se ha definido anteriormente, que está sustituido con uno o
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más "sustituyentes de grupo de anillos" (preferentemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en el presente documento. El átomo de nitrógeno de un arilheterociclilo condensado puede ser un átomo de nitrógeno básico. El átomo de nitrógeno o azufre de la porción heterociclilo del arilheterociclilo condensado también puede estar opcionalmente oxidado al N-óxido, S-óxido o S,S-dióxido correspondiente. Los sistemas de anillos arilheterociclilo condensado ejemplares incluyen indolinilo, 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina, 1,2,3,4-tetrahidroquinolina, 1H-2,3-dihidroisoindol-2-ilo, 2,3-dihidrobenz[f]isoindol-2-ilo,1,2,3,4tetrahidrobenz[g]-isoquinolin-2-ilo y similares.
"Heteroarilcicloalquenilo condensado" se refiere a un heteroarilo y cicloalquenilo condensados como se define en el presente documento. Los heteroarilcicloalquenilos condensados preferidos son aquellos en los que su heteroarilo es fenilo y el cicloalquenilo consta de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo. Un heteroarilcicloalquenilo condensado como una variable puede estar unido a través de cualquier átomo del sistema de anillos del mismo capaz de ello. La designación de aza, oxa o tia como un prefijo antes de la porción heteroarilo del heteroarilcicloalquenilo condensado define que está presente al menos un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre, respectivamente, como un átomo del anillo. "Heteroarilcicloalquenilo condensado sustituido" se refiere a un heteroarilcicloalquenilo condensado, como se ha definido anteriormente, que está sustituido con uno o más "sustituyentes de grupo de anillos" (preferentemente de 1 a 30 que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en el presente documento. El átomo de nitrógeno de un heteroarilcicloalquenilo condensado puede ser un átomo de nitrógeno básico. El átomo de nitrógeno de la porción heteroarilo del heteroarilcicloalquenilo condensado también puede estar opcionalmente oxidado al N-óxido correspondiente. Los heteroarilcicloalquenilos
condensados
ejemplares incluyen 5,6-dihidroquinolilo, 5,6-dihidroisoquinolilo, 5,6
dihidroquinoxalinilo,
5,6-dihidroquinazolinilo, 4,5-dihidro-1H-benzoimidazolilo, 4,5
dihidrobenzoxazolilo y similares.
"Heteroarilcicloalquilo condensado" se refiere a un heteroarilo y cicloalquilo condensados como se define en el presente documento. Los heteroarilcicloalquilos condensados preferidos son aquellos en los que su heteroarilo consta de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo y el cicloalquilo consta de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo. Un heteroarilcicloalquilo condensado como una variable puede estar unido a través de cualquier átomo del sistema de anillos del mismo capaz de ello. La designación de aza, oxa o tia como un prefijo antes de la porción heteroarilo del heteroarilcicloalquilo define que está presente al menos un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre, respectivamente, como un átomo del anillo. "Heteroarilcicloalquilo condensado
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sustituido" se refiere a un grupo heteroarilcicloalquilo condensado, como se ha definido anteriormente, que está sustituido con uno o más "sustituyentes de grupo de anillos" (preferentemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en el presente documento. El átomo de nitrógeno de un heteroarilcicloalquilo condensado puede ser un átomo de nitrógeno básico. El átomo de nitrógeno de la porción heteroarilo del heteroarilcicloalquilo condensado también puede estar opcionalmente oxidado al N-óxido correspondiente. Los heteroarilcicloalquilos condensados ejemplares incluyen 5,6,7,8tetrahidroquinolinilo, 5,6,7,8-tetrahidroisoquinolilo, 5,6,7,8-tetrahidroquinoxalinilo, 5,6,7,8tetrahidroquinazolilo, 4,5,6,7-tetrahidro-1H-benzoimidazolilo, 4,5,6,7-tetrahidrobenzoxazolilo, 1H-4-oxa-1,5-diazanaftalen-2-onilo, 1,3-dihidroimidizolo-[4,5]-piridin-2-onilo y similares.
"Heteroarilheterociclenilo condensado" se refiere a un heteroarilo y heterociclenilo condensados como se define en el presente documento. Los heteroarilheterociclenilos condensados preferidos son aquellos en los que su heteroarilo consta de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo y el heterociclenilo consta de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo. Un heteroarilheterociclenilo condensado como una variable puede estar unido a través de cualquier átomo del sistema de anillos del mismo capaz de ello. La designación de aza, oxa o tia como un prefijo antes de la porción heteroarilo o heterociclenilo del heteroarilheterociclenilo condensado define que está presente al menos un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre, respectivamente, como un átomo del anillo. "Heteroarilheterociclenilo condensado sustituido" se refiere a un grupo heteroarilheterociclenilo condensado, como se ha definido anteriormente, que está sustituido con uno o más "sustituyentes de grupo de anillos" (preferentemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en el presente documento. El átomo de nitrógeno de un heteroarilazaheterociclenilo condensado puede ser un átomo de nitrógeno básico. El átomo de nitrógeno o azufre de la porción heteroarilo del heteroarilheterociclilo condensado también puede estar opcionalmente oxidado al N-óxido correspondiente. El átomo de nitrógeno o azufre de la porción heteroarilo o heterociclilo del heteroarilheterociclilo condensado también puede estar opcionalmente oxidado al N-óxido, S-óxido o S,S-dióxido correspondiente. Los heteroarilheterociclenilos condensados ejemplares incluyen 7,8-dihidro[1,7]naftiridinilo,1,2dihidro[2,7]-naftiridinilo, 6,7-dihidro-3H-imidazo[4,5-c]piridilo, 1,2-dihidro-1,5-naftiridinilo. 1,2dihidro-1,6-naftiridinilo,1,2-dihidro-1,7-naftiridinilo, 1,2-dihidro-1,8-naftiridinilo, 1,2-dihidro-2,6naftiridinilo y similares.
"Heteroarilheterociclilo condensado" se refiere a un heteroarilo y heterociclilo condensados como se define en el presente documento. Los heteroarilheterociclilos condensados preferidos son aquellos en los que su heteroarilo consta de aproximadamente 5 a
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aproximadamente 6 átomos en el anillo y el heterociclilo consta de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo. Un heteroarilheterociclilo condensado como una variable puede estar unido a través de cualquier átomo del sistema de anillos del mismo capaz de ello. La designación de aza, oxa o tia como un prefijo antes de la porción heteroarilo o heterociclilo del heteroarilheterociclilo condensado define que está presente al menos un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre, respectivamente, como un átomo del anillo. "Heteroarilheterociclilo condensado sustituido" se refiere a un grupo heteroarilheterociclilo condensado, como se ha definido anteriormente, que está sustituido con uno o más "sustituyentes de grupo de anillos" (preferentemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en el presente documento. El átomo de nitrógeno de un heteroarilheterociclilo condensado puede ser un átomo de nitrógeno básico. El átomo de nitrógeno o azufre de la porción heteroarilo del heteroarilheterociclilo condensado también puede estar opcionalmente oxidado al N-óxido correspondiente. El átomo de nitrógeno o azufre de la porción heteroarilo o heterociclilo del heteroarilheterociclilo condensado también puede estar opcionalmente oxidado al N-óxido, S-óxido o S,S-dióxido correspondiente. Los heteroarilheterociclilos condensados ejemplares incluyen 2,3-dihidro-1H pirrol[3,4-b]quinolin-2ilo, 1,2,3,4-tetrahidrobenz[b][1,7]naftiridin-2-ilo, 1,2,3,4-tetrahidrobenz[b][1,6]naftiridin-2-ilo, 1,2,3,4-tetrahidro-9H-pirido[3,4-b]indol-2-ilo, 1,2,3,4-tetrahidro-9H-pirido[4,3-b]indol-2-ilo, 2,3dihidro-1H-pirrolo[3,4-b]indol-2-ilo, 1H-2,3,4,5-tetrahidroazepino[3,4-b]indol-2-ilo, 1H-2,3,4,5tetrahidroazepino[4,3-b]indol-3-ilo, 1H-2,3,4,5-tetrahidroazepino[4,5-b]indol-2-ilo, 5,6,7,8tetrahidro[1,7]naftiridilo, 1,2,3,4-tetrhidro[2,7]naftiridilo, 2,3-dihidro[1,4]dioxino[2,3-b]piridil-2,3dihidro-[1,4]dioxino[2,3-b]piridilo, 3,4-dihidro-2H-1-oxa[4,6]diazanaftalenilo, 4,5,6,7-tetrahidro3H-imidazo[4,5-c]piridilo, 6,7-dihidro[5,8]diazanaftalenilo, 1,2,3,4-tetrahidro[1,5]-naftiridinilo, 1,2,3,4-tetrahidro[1,6]naftiridinilo, 1,2,3,4-tetrahidro[1,7]naftiridinilo, 1,2,3,4tetrahidro[1,8]naftiridinilo, 1,2,3,4-tetrahidro[2,6]naftiridinilo y similares.
"Halo" significa flúor, cloro, bromo o yodo. Se prefieren flúor, cloro o bromo, y se prefieren más flúor o cloro.
"Heteroaroílo" se refiere a un grupo heteroaril-CO-en el que el grupo heteroarilo es como se describe en el presente documento. Los grupos heteroaroílo ejemplares incluyen tiofenoílo, nicotinoílo, pirrol-2-ilcarbonilo, 1-y 2-naftoílo, piridinoílo y similares.
"Heteroarilo" se refiere a un sistema de anillos monocíclico o multicíclico, aromático, de aproximadamente 5 a aproximadamente 14 átomos de carbono, preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 átomos de carbono, en el que uno o más de los átomos de carbono en el sistema de anillos es/son heteroelementos distintos de carbono, por ejemplo nitrógeno, oxígeno o azufre. Preferentemente, el sistema de anillos incluye de 1 a 3
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heteroátomos. Los tamaños de anillo preferidos de los anillos del sistema de anillos incluyen de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo. Dentro de heteroarilo se incluyen heteroarilcicloalquenilo condensado, heteroarilcicloalquilo condensado, heteroarilheterociclenilo condensado y heteroarilheterociclilo condensado, como se definen en el presente documento, cuando están unidos a través de su resto heteroarilo. "Heteroarilo sustituido" se refiere a un grupo heteroarilo, como se ha definido anteriormente, que está sustituido con uno o más "sustituyentes de grupo de anillos" (preferentemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en el presente documento. La designación de aza, oxa o tia como un prefijo antes de la porción heteroarilo define que está presente al menos un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre, respectivamente, como un átomo del anillo. Un átomo de nitrógeno de un heteroarilo puede ser un átomo de nitrógeno básico y también puede estar opcionalmente oxidado al N-óxido correspondiente. Los grupos heteroarilo y heteroarilo sustituido ejemplares incluyen pirazinilo, tienilo, isotiazolilo, oxazolilo, pirazolilo, furazanilo, pirrolilo, 1,2,4-tiadiazolilo, piridazinilo, quinoxalinilo, ftalazinilo, imidazo[1,2-a]piridina, imidazo[2,1-b]tiazolilo, benzofurazanilo, azaindolilo, benzoimidazolilo, benzotienilo, tienopiridilo, tienopirimidilo, pirrolopiridilo, imidazopiridilo, benzoazaindolilo, 1,2,4-triazinilo, benzotiazolilo, furanilo, imidazolilo, indolilo, indolizinilo, isoxazolilo, isoquinolinilo, isotiazolilo, oxadiazolilo, pirazinilo, piridazinilo, pirazolilo, piridilo, pirimidinilo, pirrolilo, quinazolinilo, quinolinilo, 1,3,4tiadiazolilo, tiazolilo, tienilo, triazolilo y similares. Un grupo heteroarilo preferido es pirazinilo.
"Heteroarildiazo" se refiere a un grupo heteroaril-azo-en el que los grupos heteroarilo y azo son como se definen en el presente documento.
"Heteroarilidiilo" se refiere a un radical bivalente obtenido a partir de un heteroarilo, en el que el heteroarilo es como se describe en el presente documento. Un radical heteroarildiilo ejemplar es piridinadiilo opcionalmente sustituido.
"Heteroarilsulfonilcarbamoílo" se refiere a un grupo heteroaril-SO2-NH-C(=O)-en el que el grupo heteroarilo es como se describe en el presente documento.
"Heterociclenilo" se refiere a un sistemas de anillos de hidrocarburo, monocíclico o multicíclico, no aromático, de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 átomos de carbono, preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 átomos de carbono, en el que uno o más de los átomos de carbono en el sistema de anillos es/son heteroelementos distintos de carbono, por ejemplo nitrógeno, oxígeno o azufre átomos, y que contiene al menos un doble enlace carbono-carbono o un doble enlace carbono-nitrógeno. Preferentemente, el anillo incluye de 1 a 3 heteroátomos. Los tamaños de anillo preferidos de los anillos del sistema de anillos incluyen de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo; y dichos tamaños de anillo preferidos también se denominan "inferiores". Dentro de heterociclenilo se
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incluyen arilheterociclenilo condensado y heteroarilheterociclenilo condensado, como se define en el presente documento, cuando están unidos a través de su resto heterociclenilo. La designación de aza, oxa o tia como un prefijo antes de la porción heterociclenilo define que está presente al menos un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre, respectivamente, como un átomo del anillo. "Heterociclenilo sustituido" se refiere a un grupo heterociclenilo, como se ha definido anteriormente, que está sustituido con uno o más "sustituyentes de grupo de anillos" (preferentemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en el presente documento. El átomo de nitrógeno de un heterociclenilo puede ser un átomo de nitrógeno básico. El átomo de nitrógeno o azufre del heterociclenilo también puede estar opcionalmente oxidado al N-óxido, S-óxido o S,S-dióxido correspondiente. Los grupos azaheterociclenilo monocíclicos ejemplares incluyen 1,2,3,4-tetrahidrohidropiridina, 1,2dihidropiridilo, 1,4-dihidropiridilo, 1,2,3,6-tetrahidropiridina, 1,4,5,6-tetrahidropirimidina, 2pirrolinilo, 3-pirrolinilo, 2-imidazolinilo, 2-pirazolinilo y similares. Los grupos oxaheterociclenilo ejemplares incluyen 3,4-dihidro-2H-pirano, dihidrofuranilo y fluorodihidrofuranilo. Un grupo oxaheterociclenilo multicíclico ejemplar es 7-oxabiciclo[2.2.1]heptenilo. Los anillos tiaheterociclenilo monocíclicos ejemplares incluyen dihidrotiofenilo y dihidrotiopiranilo.
"Heterociclilo" se refiere a un sistema de anillos monocíclico o multicíclico, saturado, no aromático, de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 átomos de carbono, preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 átomos de carbono, en el que uno o más de los átomos de carbono en el sistema de anillos es/son heteroelementos distintos de carbono, por ejemplo nitrógeno, oxígeno o azufre. Preferentemente, el sistema de anillos contiene de 1 a 3 heteroátomos. Los tamaños de anillo preferidos de los anillos del sistema de anillos incluyen de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo; y dichos tamaños de anillo preferidos también se denominan "inferiores". Dentro de heterociclilo se incluyen arilheterociclilo condensado y heteroarilheterociclilo condensado, como se define en el presente documento, cuando están unidos a través de su resto heterociclilo. La designación de aza, oxa o tia como un prefijo antes de la porción heterociclilo define que está presente al menos un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre respectivamente como un átomo del anillo. "Heterociclilo sustituido" se refiere a un grupo heterociclilo, como se ha definido anteriormente, que está sustituido con uno o más "sustituyentes de grupo de anillos" (preferentemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en el presente documento. El átomo de nitrógeno de un heterociclilo puede ser un átomo de nitrógeno básico. El átomo de nitrógeno o azufre del heterociclilo también puede estar opcionalmente oxidado al N-óxido, S-óxido o S,S-dióxido correspondiente. Los anillos heterociclilo monocíclicos ejemplares incluyen piperidilo, pirrolidinilo, piperazinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, tiazolidinilo, 1,3-dioxolanilo, 1,4
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31 dioxanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo y similares.
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como azaheterociclilo monocíclico sustituido está sustituido directamente o a través de un enlazador con al menos un sustituyente, que es, que incluye o que está sustituido con un grupo aromático como se define en el presente documento; por ejemplo, arilo, heteroarilo, ariloxi, heteroariloxi, aroílo o su análogo tioxo, heteroaroílo o su análogo tioxo, aroiloxi, heteroaroiloxi, ariloxicarbonilo, heteroariloxicarbonilo, arilsulfonilo, heteroarilsulfonilo, arilsulfinilo, heteroarilsulfinilo, ariltio, heteroariltio, arildiazo, heteroarildiazo, Y1Y2N-, Y1Y2NC(O)-, Y1Y2NC(O)O-, Y1Y2NC(O)NY3-o Y1Y2NSO2-en los que al menos uno de Y1 e Y2 es, incluye o está sustituido con un resto arilo o heteroarilo. Los conectores preferidos incluyen -C(O)-, OC(O)-, alquilo inferior, alcoxi inferior, alquenilo inferior, -O-, -S-, -C(O)C(O)-, -S(O)-, -S(O)2-,
NR80R80
-, en el que es hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heterociclilo o heteroarilo. Son conectores particularmente preferidos -C(O)-y -OC(O)-. "Azaheterociclilo multicíclico sustituido" se refiere a un grupo azaheterociclilo multicíclico, como se ha definido anteriormente, que está sustituido con uno o más "sustituyentes de grupo de anillos" (preferentemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en el presente documento. "Azaheterociclenilo multicíclico sustituido" se refiere a un grupo azaheterociclenilo multicíclico, como se ha definido anteriormente, que está sustituido con uno o más "sustituyentes de grupo de anillos" (preferentemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en el presente documento.
"Heterociclileno" se refiere a un grupo heterociclilo divalente, como se define en el presente documento, que tiene de aproximadamente 4 a aproximadamente 8 átomos de carbono. Los tamaños de anillo preferidos del heterociclileno incluyen de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos en el anillo; y dichos tamaños de anillo preferidos también se denominan "inferiores". Los puntos de unión sobre el grupo cicloalquileno incluyen patrones de unión 1,1-, 1,2-1,3-o 1,4-, y, cuando sea aplicable, la relación estereoquímica de los puntos de unión es cis o trans. Los grupos heterociclileno ejemplares incluyen (1,1-, 1,2-o 1,3)piperidinileno y (1,1-o 1,2-)tetrahidrofuranoileno. "Heterociclileno sustituido" se refiere a un grupo heterociclileno, como se ha definido anteriormente, que está sustituido con uno o más "sustituyentes de grupo de anillos" (preferentemente de 1 a 3) que pueden ser iguales o diferentes y son como se definen en el presente documento.
"Hidrato" se refiere a un solvato en el que la molécula o moléculas disolventes son H2O.
"Grupo protector de amina lábil a hidrogenación" se refiere a un grupo protector de
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amina como se define en el presente documento que se retira fácilmente por hidrogenación mientras que permanece relativamente estable a otros reactivos. Un grupo protector de amina lábil a hidrogenación preferido es Cbz.
"Grupo protector de ácido lábil a hidrogenación" se refiere a un grupo protector de ácido
5 como se define en el presente documento que se retira fácilmente por hidrogenación mientras que permanece relativamente estable a otros reactivos. Un grupo protector de ácido lábil a hidrogenación preferido es bencilo.
"Higroscopicidad" se refiere a sorción que implica una cantidad o estado adquirido de agua suficiente para afectar a las propiedades físicas o químicas de la sustancia (Eds. J. 10 Swarbrick y J. C. Boylan, Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, 10 33).
"Derivado de glicinimida imínica" se refiere a una base imínica de Schiff de una glicina que es útil en la síntesis de α-aminoácidos, tanto naturales como no naturales. La funcionalidad de éster imínico puede contener uno o más centros asimétricos que pueden ayudar en la estereoinducción durante el procedimiento de formación de enlaces. Además, estos derivados
15 de glicinimida imínica pueden incorporarse en soportes poliméricos para facilitar la síntesis combinatoria. Los derivados de glicinimida imínica pueden prepararse por condensación de un éster de glicina con la cetona apropiada en presencia de un catalizador ácido. La reacción se facilita por la retirada del agua. Los derivados de glicinimida imínica son bien conocidos en la técnica para su uso en procedimientos sintéticos de Adición de Michael, por ejemplo, como se
20 desvela por Guillena, G., y col., J. Org. Chem. 2000, 65, 7310-7322, incorporado en el presente documento por referencia. Los ejemplos particulares de derivados de glicinimida imínica de acuerdo con la invención incluyen uno seleccionado entre el grupo de fórmulas
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25 en las que: M* es un metal de transición, preferentemente CU, más preferentemente CUII . R14 es -CO2R16, -CN
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o -CONR15R15;
R15 es un grupo alifático opcionalmente sustituido; R16
es un grupo protector de ácido, arilo opcionalmente sustituido o grupo alifático opcionalmente sustituido; R17 es arilo opcionalmente sustituido, grupo alifático opcionalmente sustituido,
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R18 es hidrógeno, alquilo o alquiltio; o arilo opcionalmente sustituido; R17 y R18 tomados junto con el carbono al que R17 y R18 están unidos
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y es una fase sólida. "Aducto de derivado de glicinimida imínica" se refiere al compuesto resultante cuando un α-hidrógeno con respecto al nitrógeno y el resto carbonilo de la parte de base de Schiff se
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15 ha retirado y se usa para formar una unión para la formación de un enlace con el mismo. Los ejemplos particulares de aductos del derivado de glicinimida imínica de acuerdo con la invención incluyen uno seleccionado entre el grupo de fórmulas
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o
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en las que: R14, R17 y R18 se definen como se ha descrito en la definición del derivado de glicinimida imínica en el presente documento. "N-oxisuccinimida" se refiere a un resto de la siguiente estructura
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"N-óxido" se refiere a un resto de la siguiente estructura
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"Paciente" incluye tanto seres humanos como otros mamíferos. 10 "Peptidomimético" se refiere a un polímero que incluye restos de aminoácidos unidos entre sí a través de enlaces amida.
"Éster farmacéuticamente aceptable" se refiere a ésteres que se hidrolizan in vivo e incluyen los que se descomponen fácilmente en el cuerpo humano para dejar el compuesto parental o una sal del mismo. Los grupos éster adecuados incluyen, por ejemplo, los obtenidos
15 a partir de ácidos carboxílicos alifáticos farmacéuticamente aceptables, particularmente ácidos alcanoicos, alquenoicos, cicloalcanoicos y alcanodioicos, en los que cada resto alquilo o alquenilo tiene ventajosamente no más de 6 átomos de carbono. Los ésteres ejemplares incluyen formiatos, acetatos, propionatos, butiratos, acrilatos, etilsuccinatos y similares. "Profármacos farmacéuticamente aceptables", como se usa en el presente documento,
20 se refiere a los profármacos de los compuestos de la presente invención que, dentro del alcance del juicio médico, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales inferiores con una toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica y similares, en proporción con una relación beneficio/riesgo razonable, y eficaces para su uso deseado, así como las forma zwiteriónicas, cuando sea posible, de los compuestos de la
25 invención. El término "profármaco" se refiere a compuestos que se transforman rápidamente in vivo para producir el compuesto parental de la fórmula anterior, por ejemplo por hidrólisis en sangre. Los grupos funcionales que pueden transformarse rápidamente, por escisión metabólica, in vivo, forman una clase de grupos reactivos con el grupo carboxilo de los compuestos de la presente invención. Incluyen, pero sin limitación, grupos tales como alcanoílo
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(tal como acetilo, propanoílo, butanoílo y similares), aroílo sin sustituir y sustituido (tal como benzoílo y benzoílo sustituido), alcoxicarbonilo (tal como etoxicarbonilo), trialquilsililo (tal como trimetil-y trietilsililo), monoésteres formados con ácidos dicarboxílicos (tal como succinilo) y similares. Debido a la facilidad con la que se escinden in vivo los grupos escindibles metabólicamente de los compuestos de la presente invención, los compuestos que tienen dichos grupos actúan como profármacos. Los compuestos que tienen los grupos metabólicamente escindibles tienen la ventaja de que pueden mostrar una biodisponibilidad mejorada como resultado de una solubilidad y/o velocidad de absorción mejoradas otorgadas al compuesto parental en virtud de la presencia del grupo metabólicamente escindible. Se proporciona un análisis minucioso en Design of Prodrugs, H. Bundgaard, ed., Elsevier (1985); Methods in Enzymology; K. Widder y col., Ed., Academic Press, 42, 309-396 (1985); A Textbook of Drug Design and Developement, Krogsgaard-Larsen y H. Bandaged, ed., Capítulo 5; "Design and Applications of Prodrugs" 113-191 (1991); Advanced Drug Delivery Reviews, H. Bundgard, 8, 1-38, (1992); J. Pharm. Sci., 77, 285 (1988); Chem. Pharm. Bull., N. Nakeya y col., 32, 692 (1984); Pro-drugs as Novel Delivery Systems, T. Higuchi y V. Stella, 14 A.C.S. Symposium Series, and Bioreversible Carriers in Drug Design, E.B. Roche, ed., American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987, que se incorporan en el presente documento por referencia.
"Sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a las sales de adición de ácidos y sales de adición de bases inorgánicas y orgánicas, relativamente no tóxicas, de compuestos de la presente invención. Estas sales pueden prepararse in situ durante el aislamiento y purificación finales de los compuestos. En particular, las sales de adición de ácidos pueden prepararse por separado haciendo reaccionar el compuesto purificado en su forma de base libre con un ácido orgánico o inorgánico adecuado y aislando la sal formada de esta manera. Las sales de adición de ácidos ejemplares incluyen bromhidrato, clorhidrato, sulfato, bisulfato, fosfato, nitrato, acetato, oxalato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, borato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato, mesilato, glucoheptonato, lactiobionato, sulfamatos, malonatos, salicilatos, propionatos, metilen-bis-β-hidroxinaftoatos, gentisatos, isetionatos, di-p-toluoiltartratos, metanosulfonatos, etanosulfonatos, bencenosulfonatos, p-toluenosulfonatos, ciclohexilsulfamatos y quinatos, sales laurilsulfonato y similares. Véase, por ejemplo S.M. Berge, y col., "Pharmaceutical Salts," J. Pharm. Sci., 66, 1-19 (1977) que se incorpora en el presente documento por referencia. Las sales de adición de bases también pueden prepararse por separado haciendo reaccionar el compuesto purificado en su forma de ácido con una base orgánica o inorgánica adecuada y aislando la sal formada de esta manera. Las sales de adición de bases incluyen sales de
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metales y de amina farmacéuticamente aceptables. Las sales de metales adecuados incluyen las sales de sodio, potasio, calcio, bario, cinc, magnesio y aluminio. Se prefieren las sales de sodio y potasio. Las sales de adición de bases inorgánicas adecuadas se preparan a partir de bases de metales que incluyen hidruro sódico, hidróxido sódico, hidróxido potásico, hidróxido cálcico, hidróxido de aluminio, hidróxido de litio, hidróxido de magnesio, hidróxido de cinc y similares. Las sales de adición de bases de amina adecuadas se preparan a partir de aminas que tienen suficiente basicidad para formar una sal estable, y preferentemente incluyen las aminas que se usan con frecuencia en la química medicinal gracias a su baja toxicidad y aceptabilidad para el uso médico, amoniaco, etilendiamina, N-metil-glucamina, lisina, arginina, ornitina, colina, N,N'-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, dietanolamina, procaína, Nbencilfenetilamina, dietilamina, piperazina, tris(hidroximetil)-aminometano, hidróxido de tetrametilamonio, trietilamina, dibencilamina, efenamina, dehidroabietilamina, N-etilpiperidina, bencilamina, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, aminoácidos básicos de etilamina, por ejemplo, lisina y arginina, y diciclohexilamina y similares.
"Sustituyentes del grupo de anillos" se refiere a sustituyentes unidos a sistemas de anillos aromáticos o no aromáticos que incluyen arilo, heteroarilo, hidroxi, alcoxi, cicliloxi, ariloxi, heteroariloxi, acilo o su análogo tioxo, ciclilcarbonilo o su análogo tioxo, aroílo o su análogo tioxo, heteroaroílo o su análogo tioxo, aciloxi, ciclilcarboniloxi, aroiloxi, heteroaroiloxi, halo, nitro, ciano, carboxi (ácido), -C(O)-NHOH, -C(O)-CH2OH, -C(O)-CH2SH, -C(O)-NH-CN, sulfo, fosfono, alquilsulfonilcarbamoílo, tetrazolilo, arilsulfonilcarbamoílo, N-metoxicarbamoílo, heteroarilsulfonilcarbamoílo, 3-hidroxi-3-ciclobuteno-1,2-diona, 3,5-dioxo-1,2,4-oxadiazolidinilo
o hidroxiheteroarilo tal como 3-hidroxiisoxazolilo, 3-hidroxi-1-metilpirazolilo, alcoxicubonilo, cicliloxicarbonilo, ariloxicarbonilo, heteroariloxicarbonilo, alquilsulfonilo, ciclilsulfonilo, arilsulfonilo, heteroarilsulfonilo, alquilsulfinilo, ciclilsulfinilo, arilsulfinilo, heteroarilsulfinilo, alquiltio, cicliltio, ariltio, heteroariltio, ciclilo, arildiazo, heteroarildiazo, tiol, Y1Y2N-, Y1Y2NC(O)-, Y1Y2NC(O) O-, Y1Y2NC(O)NY3-o Y1Y2NSO2-, en los que Y1, Y2 e Y3 son independientemente hidrógeno, alquilo, arilo o heteroarilo, o cuando el sustituyente es Y1Y2N-, entonces uno de Y1 e Y2 puede ser acilo, ciclilcarbonilo, aroílo, heteroaroílo, alcoxicarbonilo, cicliloxicarbonilo, ariloxicarbonilo o heteroariloxicarbonilo, como se define en el presente documento y el otro de Y1 e Y2 es como se ha definido previamente, o cuando el sustituyente es Y1Y2NC(O)-, Y1Y2NC(O)O-, Y1Y2NC(O)NY3-o Y1Y2NSO2-, Y1 e Y2 también pueden tomarse junto con el átomo de N a través del cual están unidos Y1 e Y2 para formar un azaheterociclilo o azaheterociclenilo de 4 a 7 miembros. Cuando un sistema de anillos está saturado o parcialmente saturado, los "sustituyentes de grupo de anillos" incluyen además metileno (H2C=), oxo (O=) y tioxo (S=). Son sustituyentes ácidos/de amida del grupo de anillos carboxi
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(ácido), -C(O)-NHOH, -C(O)-CH2OH, -C(O)-CH2SH, -C(O)-NH-CN, sulfo, fosfono, alquilsulfonilcarbamoílo, tetrazolilo, arilsulfonilcarbamoílo, N-metoxicarbamoílo, heteroarilsulfonilcarbamoílo, 3-hidroxi-3-ciclobuteno-1,2-diona, 3,5-dioxo-1,2,4-oxadiazolidinilo
o hidroxiheteroarilo, tal como 3-hidroxiisoxazolilo, 3-hidroxi-1-metilpirazolilo e Y1Y2NCO-. Son sustituyentes de grupo de anillos polares no ácidos hidroxi, oxo (O=), tioxo (S=), acilo o su análogo tioxo, ciclilcarbonilo o su análogo tioxo, aroílo o su análogo tioxo, heteroaroílo o su análogo tioxo, alcoxicarbonilo, cicliloxicarbonilo, ariloxicarbonilo, heteroariloxicarbonilo, aciloxi, ciclilcarboniloxi, aroiloxi, heteroaroiloxi, alquilsulfonilo, ciclilsulfonilo, arilsulfonilo, heteroarilsulfonilo, alquilsulfinilo, ciclilsulfinilo, arilsulfinilo, heteroarilsulfinilo, tiol, Y1Y2N-, Y1Y2NC(O)-, Y1Y2NC(O)O-, Y1Y2NC(O)NY3-o Y1Y2NSO2-.
"Solvato" se refiere a una asociación física de un compuesto de la presente invención con una o más moléculas disolventes. Esta asociación física incluye unión a hidrógeno. En ciertos casos, el solvato podrá aislarse, por ejemplo, cuando se incorporan una o más moléculas disolventes en la estructura reticular cristalina del sólido cristalino. "Solvato" incluye tanto solvatos en fase de solución como aislables. Los solvatos ejemplares incluyen hidratos, etanolatos, metanolatos y similares. Realizaciones
A continuación se encuentran las realizaciones particulares y preferidas relacionadas con las invenciones descritas en el presente documento.
Una realización particular es aquella en la que R0 es un enlace.
Otra realización particular es aquella en la que R0 es difluorometileno.
Una realización particular es aquella en la que R1 es hidrógeno o un grupo alifático inferior opcionalmente sustituido.
Otra realización particular es aquella en la que R1 es hidrógeno o alquilo inferior.
Una realización preferida es aquella en la que R1 es hidrógeno.
Una realización particular es aquella en la que R2 es un grupo alifático inferior opcionalmente sustituido o un grupo monocíclico opcionalmente sustituido.
Otra realización particular es aquella en la que R2 es alquilo inferior opcionalmente sustituido, alquenilo inferior opcionalmente sustituido o cicloalquilo monocíclico opcionalmente sustituido.
Una realización particular adicional es aquella en la que R2 es carboximetilo, 1-carboxi2-feniletilo, ciclopropilo, ciclobutilo, 1-ciclohexiletilo, feniletilo, but-2-ilo, 1-pirid-4-iletilo, propen3-ilo o 3-metilbut-2-ilo; más preferentemente ciclopropilo.
Una realización particular es aquella en la que R3 es un grupo alifático inferior metileno
opcionalmente sustituido.
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Otra realización particular es aquella en la que R3 es (alquil o alquenil) inferior metileno opcionalmente sustituido con halo.
Una realización preferida es aquella en la que R3 es propilmetileno, 2,2difluoroetilmetileno, 2,2,2-trifluorometileno o propen-3-ilmetileno; más preferentemente, R3 es propilmetileno o 2,2-difluoroetbilmetileno; aún más preferentemente R3 es propilmetileno.
Una realización particular es aquella en la que R4 es hidrógeno o un grupo alifático inferior opcionalmente sustituido.
Otra realización particular es aquella en la que R4 es hidrógeno o alquilo inferior.
Una realización preferida es aquella en la que R4 es hidrógeno.
Una realización particular es aquella en la que R5 es un grupo alifático inferior metileno opcionalmente sustituido.
Otra realización particular es aquella en la que R5 es (alquil o alquenil) inferior metileno opcionalmente sustituido con (fenilo, carboxi, carboxamido o alcoxicarbonilo).
Una realización preferida es aquella en la que R5 es metilmetileno, isopropilmetileno, tbutilmetileno, but-2-ilmetileno, butilmetileno, bencilmetileno, 3-metilbutilmetileno, 2metilpropilmetileno, carboximetilmetileno, carboxamidometilmetileno, benciloxicarbonilmetilmetileno, benciloxicarbonilpropilmetileno o fenilpropen-3-ilmetileno; más preferentemente, R5 es isopropilmetileno o t-butil-metileno.
Una realización particular es aquella en la que R6 es hidrógeno o un grupo alifático inferior opcionalmente sustituido.
Otra realización particular es aquella en la que R6 es hidrógeno o alquilo inferior.
Una realización preferida es aquella en la que R6 es hidrógeno.
Una realización particular es aquella en la que R7 es un grupo alifático inferior metileno opcionalmente sustituido, grupo cíclico inferior metileno opcionalmente sustituido o (aril o heteroaril)metileno monocíclico opcionalmente sustituido.
Otra realización particular es aquella en la que R7 es alquil inferior metileno opcionalmente sustituido, cicloalquilmetileno inferior opcionalmente sustituido o fenilmetileno opcionalmente sustituido.
Una realización preferida es aquella en la que R7 es metilmetileno, isopropilmetileno, n
propilmetileno,
fenilmetileno, ciclohexilmetileno, ciclopentilmetileno, t-butilmetileno, s
butilmetileno,
ciclohexilmetilmetileno o fenilmetilmetileno; más preferentemente es
isopropilmetileno, ciclohexilmetileno, ciclopentilmetileno, t-butilmetileno o s-butilmetileno.
Una realización preferida también es aquella en la que cada uno de R3, R5, y R7 es metileno monosustituido.
Una realización preferida también es aquella en la que R3 es metileno monosustituido y
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tiene una configuración (S) en el carbono unido al resto -C(O)-R0-C(O)-NR1R2. Una realización particular es aquella en la que R8 es hidrógeno o un grupo alifático inferior opcionalmente sustituido. Otra realización particular es aquella en la que R8 es hidrógeno o alquilo inferior. 5 Una realización preferida es aquella en la que R8 es hidrógeno. Una realización particular es aquella en la que R9 es un grupo alifático inferior opcionalmente sustituido o un grupo aromático monocíclico opcionalmente sustituido. Otra realización particular es aquella en la que R9 es alquilo inferior opcionalmente sustituido o heteroarilo monocíclico opcionalmente sustituido. 10 Otra realización particular es aquella en la que R9 es alquilo inferior opcionalmente sustituido con (carboxi, (alquil inferior)SO2NH-, (alquil inferior)HNCO-, hidroxi, fenilo, heteroarilo
o (alquil inferior)OC(O)NH-) o heteroarilo monocíclico opcionalmente sustituido. Una realización preferida adicional es aquella en la que R9 es alquilo inferior sustituido con (mono-o di-)MeOC(O)NH-; se prefiere más 1,2-di(MeOC(O)NH)etilo o 115 (MeOC(O)NH)etilo.
Una realización particular es aquella en la que R9 es alquilo inferior sustituido con (carboxi, (alquil inferior)HNCO-o tetrazolilo); más preferentemente 3-carboxipropilo, 2-tetrazol5-ilpropilo, 3-(N-metilcarboxamido)propilo o 3-carboxi-2,2-dimetilpropilo; aún más preferentemente es 3-carboxipropilo, 2-tetrazol-5-ilpropilo o 3-(N-metilcarboxamido)propilo.
20 Otra realización preferida es aquella en la que R9 es alquilo inferior opcionalmente sustituido; más preferentemente es 1-hidroxi-2-feniletilo, metilo, isopropilo o t-butilo; aún más preferentemente es metilo, isopropilo o t-butilo.
Otra realización preferida es aquella en la que R9 se selecciona entre el grupo constituido por
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Otra realización preferida más es aquella en la que R9 es pirazinilo. Una realización particular es aquella en la que R10 es hidrógeno o un grupo alifático
inferior opcionalmente sustituido. Otra realización particular es aquella en la que R10 es hidrógeno o alquilo inferior. Una realización particular es aquella en la que R10 es hidrógeno. Una realización preferida es aquella en la que
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como un azaheterociclilo monocíclico sustituido es pirrolidinilo sustituido.
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Una realización preferida es aquella en la que
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como un azaheterociclilo monocíclico sustituido es
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opcionalmente sustituido o
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opcionalmente sustituido,
en el que Ar es R2 que comprende un resto aromático; más preferentemente opcionalmente sustituido; aún más preferentemente es
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imagen1 opcionalmente sustituido.
Aún más preferentemente
imagen1 opcionalmente sustituido es
o
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todavía más preferentemente
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Otra realización preferida es aquella en la que
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como un azaheterociclilo multicíclico opcionalmente sustituido es
imagen1 opcionalmente sustituido;
más preferentemente es
imagen1 opcionalmente sustituido.
10 Son sustituyentes particulares para
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hidroxi, flúor u oxo. Otra realización preferida es aquella en la que
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como un azaheterociclenilo multicíclico opcionalmente sustituido es
imagen1 opcionalmente sustituido;
más preferentemente es
aún más preferentemente es
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Otra realización preferida es aquella en la que
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10 como un azaheterociclenilo multicíclico opcionalmente sustituido es
opcionalmente sustituido.
Una
realización particular es aquella en la que el resto -C(O)-N(R4)-R3-
C(O)R0C(O)NR2R1 unido a
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15 está unido con un carbono al átomo de nitrógeno. Una realización preferida es aquella en la que L es -C(O)-o -OC(O)-. Una realización preferida es aquella en la que n es 0. Otra realización preferida es aquella en la que n es 1. Una realización preferida es aquella en la que R11 es -CO2R13 .
20 Una realización preferida r es aquella en la que R12 es
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Una realización particular es aquella en la que R13 es un grupo alifático opcionalmente sustituido.
Otra realización particular es aquella en la que R3 es un grupo alquilo.
Una realización preferida es aquella en la que R13 es alquilo inferior.
Otra realización preferida es aquella en la que R13 es metilo.
Una realización preferida es aquella en la que R14 es -CO2R16 .
Una realización particular es aquella en la que R15 es alquilo.
Una realización preferida es aquella en la que R15 es alquilo inferior.
Una realización preferida es aquella en la que R15 es metilo.
Una realización particular es aquella en la que R16 es alifático opcionalmente sustituido.
Otra realización particular es aquella en la que R16 es alquilo.
Una realización preferida es aquella en la que R16 es alquilo inferior.
Una realización preferida es aquella en la que R16 es t-Bu.
Una realización particular es aquella en la que R17 es arilo opcionalmente sustituido.
Una realización preferida es aquella en la que R17 es fenilo.
Una realización particular es aquella en la que R18 es arilo opcionalmente sustituido.
Una realización preferida es aquella en la que R18 es fenilo.
Una realización particular es aquella en la que p0 se selecciona entre el grupo constituido por BOC, CBz y -CO2alquilo.
Una realización preferida es aquella en la que p0 es BOC.
Debe apreciarse que la presente invención incluye todas las combinaciones apropiadas de agrupaciones particulares y preferidas referidas en el presente documento.
Los compuestos particulares descritos en el presente documento se seleccionan entre el grupo de compuestos A-FH consecutivamente constituidos por
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o una sal farmacéuticamente aceptable o profármaco de los mismos, o un solvato de dicho
compuesto, su sal o su profármaco. Un compuesto preferido es uno seleccionado entre el grupo constituido por S, U, BW,
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BX, BY, BZ, CE, CU, CW, CY, DZ, BA, EC, EJ, FH, EW, EO, EZ, FG y EN, una sal farmacéuticamente aceptable o profármaco de los mismos, o un solvato de dicho compuesto, su sal o su profármaco.
Otra realización preferida se selecciona entre el siguiente grupo de compuestos:
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o una sal farmacéuticamente aceptable o profármaco de los mismos, o un solvato de dicho
compuesto, su sal o su profármaco. Otra realización preferida es un compuesto de fórmula
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o una sal farmacéuticamente aceptable o profármaco de los mismos, o un solvato de dicho
compuesto, su sal o su profármaco. Otra realización preferida es un compuesto de fórmula 1 en la que: R0 es un enlace;
10 R1 es hidrógeno; R2 es alquilo inferior opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes de grupo alifático; o cicloalquilo inferior opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes de grupo cíclico; cada uno de R3 y R5 es independientemente metileno opcionalmente sustituido con 1 a
15 3 sustituyentes de grupo alifático; R4, R6, R8 y R10 son hidrógeno; R7 es metileno sustituido con cicloalquilo, alquilo inferior o arilo; o o (1,1-o 1,2-)cicloalquenilo opcionalmente sustituido con cicloalquilo, alquilo inferior o arilo;
20 R9 es alquilo inferior opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes de grupo alifático; o heteroarilo opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes de grupo cíclico;
o heterocíclico opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes de grupo cíclico;
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es azaheterociclilo monocíclico, azaheterociclilo multicíclico o azaheterociclenilo multicíclico opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes de grupo cíclico; y L es C(O)-, -OC(O)-. Otra realización preferida es un compuesto seleccionado entre el grupo constituido por:
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o una sal farmacéuticamente aceptable o profármaco de los mismos, o un solvato de dicho compuesto, su sal o su profármaco.
5 Otra realización preferida es un compuesto de fórmula 1 en la que el grupo alifático opcionalmente sustituido, grupo cíclico opcionalmente sustituido o grupo aromático opcionalmente sustituido de R9 está sustituido con al menos un sustituyente heteroarilo.
Otra realización preferida es un compuesto de fórmula 1 en la que el grupo aromático opcionalmente sustituido de R9 es heteroarilo opcionalmente sustituido. 10 Otra realización preferida es un compuesto de fórmula 1 en la que el grupo alifático opcionalmente sustituido de R9 es alquilheteroarilo opcionalmente sustituido.
Otra realización preferida es un compuesto en el que el grupo heteroarilo opcionalmente sustituido de R9 es pirazinilo, tetrazolilo, quinolinilo, imidazolilo, isoxazolilo y piradonilo, opcionalmente sustituido con un sustituyente del grupo de anillos.
15 Los compuestos descritos en el presente documento se suministran opcionalmente en
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forma de sales. Las sales que son farmacéuticamente aceptables son de particular interés ya que son útiles en la administración de los compuestos anteriores para propósitos médicos. Las sales que no son farmacéuticamente aceptables son útiles en los procedimientos de fabricación, para propósitos de aislamiento y purificación, y en algunos casos, para su uso en la separación de formas estereoisoméricas de los compuestos descritos en el presente documento. Esto último es particularmente cierto para sales de amina preparadas a partir de aminas ópticamente activas.
Cuando el compuesto descrito en el presente documento contiene un grupo carboxi, o un bioisóstero suficientemente ácido, pueden formarse sales de adición de bases y son simplemente una forma de uso más conveniente; y en la práctica, el uso de la forma de sal inherentemente es lo mismo que el uso de la forma de ácido libre.
Además, cuando el compuesto descrito en el presente documento contiene un grupo básico, o un bioisóstero suficientemente básico, pueden formarse sales de adición de ácidos y simplemente son una forma de uso más conveniente; y en la práctica, el uso de la forma de sal inherentemente es lo mismo que el uso de la forma de base libre.
Una realización preferida de un procedimiento descrito en el presente documento es para tratar a un paciente que padece una infección de VHC o afecciones fisiológicas relacionadas con la infección que comprenden la administración al paciente de una cantidad farmacéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula 1.
Otra realización preferida de un procedimiento terapéutico descrito en el presente documento es para tratar a un paciente que padece una infección de VHC o afecciones fisiológicas relacionadas con la infección que comprende la administración de una cantidad farmacéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula 1 en combinación con una cantidad farmacéuticamente eficaz de otro agente terapéutico anti-VHC al paciente.
También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden, además de uno o más inhibidores de serina proteasa de VHC, uno o más interferones que muestran actividad anti-VHC y/o uno o más compuestos que tienen actividad anti-VHC, incluyendo compuestos inmunomoduladores tales como citocinas inmunoestimuladoras que muestran la actividad antiviral para VHC, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Además, se describe una composición farmacéutica que es eficaz, por sí misma, para su utilización en una terapia de combinación beneficiosa porque incluye una pluralidad de principios activos.
Además, se describen kits o envases sencillos que combinan dos o más principios activos útiles en el tratamiento o prevención de una infección de VHC en un paciente. Un kit puede proporcionar (solo o en combinación con un diluyente o vehículo farmacéuticamente
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aceptable), el compuesto de fórmula 1 y el principio activo adicional (solo o en combinación con diluyente o vehículo), otro agente terapéutico anti-VHC.
Los compuestos de fórmula 1 pueden prepararse por la aplicación o adaptación de procedimientos conocidos como se han usado hasta ahora o se han descrito en la bibliografía o por procedimientos descritos en el presente documento.
Además, se describen procedimientos para el tratamiento o prevención de una infección de VHC en un paciente que lo necesite, que comprenden la administración a dicho paciente de una cantidad farmacéuticamente eficaz de una combinación de uno o más inhibidores de serina proteasa de VHC; uno o más interferones que muestran actividad anti-VHC; y/o uno o más compuestos que tienen actividad anti-VHC, incluyendo compuestos inmunomoduladores tales como citocinas inmunoestimuladoras que muestran actividad antiviral para VHC.
Además, se describe el uso de uno o más inhibidores de serina proteasa de VHC en combinación con uno o más interferones que muestran actividad anti-VHC y/o uno o más compuestos que tienen actividad anti-VHC, incluyendo compuestos inmunomoduladores tales como citocinas inmunoestimuladoras que muestran actividad antiviral para VHC, para preparar un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección de VHC en un paciente que lo necesite.
Además, se describe un kit o envase farmacéutico para el tratamiento o prevención de la infección de VHC en un paciente, comprendiendo el kit o envase farmacéutico una pluralidad de recipientes separados, en el que al menos uno de dichos recipientes contiene uno o más inhibidores de serina proteasa de VHC, al menos otro de dichos recipientes contiene uno o más interferones o compuestos que inducen la producción de un interferón que muestra actividad anti-VHC (solo o en combinación con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable) y, opcionalmente, al menos otro de dichos recipientes contiene uno o más compuestos que tienen actividad anti-VHC (solo o en combinación con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable), incluyendo compuestos inmunomoduladores tales como citocinas inmunoestimuladoras que muestran actividad antiviral para VHC.
Además, se describe un procedimiento para inhibir la replicación del virus de la hepatitis C en una célula, que comprende poner en contacto dicha célula, un inhibidor de serina proteasa del virus de la hepatitis C y opcionalmente un interferón o compuestos que inducen la producción de un interferón que tiene actividad anti-virus de la hepatitis C.
La cantidad de inhibidor o inhibidores de serina proteasa de VHC, interferón o interferones o compuesto o compuestos anti-VHC en cualquiera de las aplicaciones anteriores puede ser una cantidad farmacéuticamente eficaz, una cantidad eficaz anti-VHC subóptima o combinaciones de las mismas, siempre que la combinación final de inhibidor o inhibidores de
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proteasa de VHC, interferón o interferones y/o compuesto o compuestos anti-VHC comprenda una cantidad farmacéuticamente eficaz de compuestos que son eficaces en el tratamiento o prevención de la infección de VHC en un paciente.
Además, se describe un procedimiento para preparar un compuesto bicicloprolinato 5 quiral que es útil en la preparación del compuesto de fórmula 1. Preparación de Compuestos de la Invención
Los materiales de partida e intermedios de los compuestos descritos en el presente documento pueden prepararse por la aplicación o adaptación de procedimientos conocidos, por ejemplo, procedimientos como los que se describen en los Ejemplos de Referencia o sus
10 equivalentes químicos obvios. El compuesto descrito en el presente documento, puede prepararse por la aplicación o adaptación de procedimientos conocidos, por los que se entienden procedimientos usados hasta ahora o descritos en la bibliografía, por ejemplo, los descritos por R.C. Larock en Comprehensive Organic Transformations, VCH publishers (1989).
15 Un compuesto de fórmula 1, en la que las variables y su resto
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son como se describen en el presente documento, puede prepararse por tratamiento de un
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son como se describen en el presente documento, con un agente de oxidación apropiado y en condiciones apropiadas. Un agente de oxidación particular es reactivo DMP. Las condiciones particulares incluyen realizar la oxidación en un disolvente orgánico apropiado, tal como
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diclorometano aproximadamente a la temperatura ambiente. Un compuesto de fórmula 2, en la que las variables y su resto
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son como se describen en el presente documento, puede prepararse por acoplamiento de un
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son como se describen en el presente documento, y un compuesto de fórmula 4, en la que sus variables
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10 son como se describen en el presente documento, con un agente de acoplamiento apropiado y en condiciones apropiadas. El agente y las condiciones de acoplamiento particulares incluyen el uso de DIC y HOAt en un disolvente orgánico apropiado, tal como DMF aproximadamente a 0ºC o el uso de PyBop y DIPEA en un disolvente orgánico apropiado, tal como diclorometano, aproximadamente a la temperatura ambiente.
15 Un compuesto de fórmula 3, en la que las variables y su resto
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son como se describen en el presente documento, puede prepararse por acoplamiento de un compuesto de fórmula 5, en la que sus variables son como se describen en el presente documento, y un compuesto de fórmula 6, en la que P2 es un grupo protector de ácido
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es como se describe en el presente documento, con un agente de acoplamiento apropiado y en
5 condiciones de acoplamiento apropiadas, seguido de un agente de desprotección apropiado y en condiciones de desprotección apropiadas. El agente y las condiciones de acoplamiento particulares incluyen el uso de DIC o DCC y HOAt en un disolvente orgánico apropiado, tal como DMF o diclorometano, de aproximadamente 0ºC a aproximadamente la temperatura ambiente. La desprotección se realiza usando un agente de desprotección apropiado que
10 depende de la naturaleza del agente protector, es decir, si puede retirarse (es lábil) en condiciones ácidas, básicas o de hidrogenación, y otros restos reactivos en el compuesto experimentan desprotección, es decir, se elige un agente de desprotección para realizar la desprotección sin afectar a los otros restos reactivos a menos que se desee una reacción concomitante. Un agente de protección de ácido particular es alquilo inferior de C1 a C8; más
15 particularmente metilo. Un agente de desprotección particular es una base inorgánica tal como un hidróxido de álcali; más particularmente NaOH. Las condiciones de desprotección particulares incluyen realizar la desprotección en un disolvente alcohólico, tal como metanol o etanol aproximadamente a la temperatura ambiente.
Un compuesto de fórmula 5, en la que n es 0 y las otras variables son como se 20 describen en el presente documento, es decir, el compuesto 5a, puede prepararse por desprotección de un compuesto de fórmula 7,
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en la que P2 es un ácido grupo protector y sus otras variables son como se describen en el presente documento, con un agente de desprotección apropiado y en condiciones apropiadas. La desprotección se realiza usando un agente de desprotección apropiado que depende de la 5 naturaleza del agente protector, es decir, si puede retirarse (es lábil) en condiciones ácidas, básicas o de hidrogenación, y otros restos reactivos en el compuesto experimentan desprotección, es decir, se elige un agente de desprotección para realizar la desprotección sin afectar a los otros restos reactivos a menos que se desee una reacción concomitante. Un agente de protección de ácido particular es alquilo inferior de C1 a C8; más particularmente
10 metilo. Un agente de desprotección particular es una base inorgánica, tal como un hidróxido de álcali; más particularmente NaOH. Las condiciones de desprotección particulares incluyen realizar la desprotección m un disolvente alcohólico, tal como metanol o etanol aproximadamente a la temperatura ambiente. Un compuesto de fórmula 7, en la que sus variables son como se describen en el
15 presente documento, puede prepararse por acilación de un compuesto de fórmula 8, en la que sus variables son como se describen en el presente documento, con un compuesto de fórmula 9, en la que M es un resto desplazable y sus otras variables
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son como se describen en el presente documento, en condiciones apropiadas. Las condiciones
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de acoplamiento particulares usan DIC o DCC y HOAt en un disolvente orgánico apropiado, tal como DMF o diclorometano, de aproximadamente 0ºC a aproximadamente la temperatura ambiente, o PyBop y DIPEA en un disolvente orgánico apropiado, tal como DMF o diclorometano aproximadamente a la temperatura ambiente; y preferentemente estas últimas condiciones. Un L particular es carbonilo. Un M particular es hidroxi o N-oxisuccinimida.
Un compuesto de fórmula 5, en la que n es 1 y las otras variables son como se
describen en el presente documento, es decir, el compuesto 5b, puede prepararse por
desprotección de un compuesto de fórmula 10, en la que P2 es un
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10 grupo protector de ácido y sus otras variables son como se describen en el presente documento, con un agente de desprotección apropiado y en condiciones apropiadas. La desprotección se realiza usando un agente de desprotección apropiado que depende de la naturaleza del agente protector de ácido, es decir, si puede retirarse (es lábil) en condiciones ácidas, básicas o de hidrogenación, y otros restos reactivos en el compuesto experimentan
15 desprotección, es decir, se elige un agente de desprotección para realizar la desprotección sin afectar a los otros restos reactivos a menos que se desee una reacción concomitante. Un agente de protección de ácido particular es alquilo inferior de C1 a C8; más particularmente metilo. Un agente de desprotección particular es una base inorgánica, tal como un hidróxido de álcali; más particularmente NaOH. Las condiciones de desprotección particulares incluyen
20 realizar la desprotección en un disolvente alcohólico, tal como metanol o etanol aproximadamente a la temperatura ambiente. Un compuesto de fórmula 10, en la que sus variables son como se describen en el presente documento, puede prepararse por acilación de un compuesto de fórmula 11, en la que sus variables son como se describen en el presente documento, con un compuesto de fórmula
25 9, en la que sus variables son como se describen en el presente documento,
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en condiciones apropiadas. Las condiciones de acoplamiento particulares usan DIC o DCC y HOAt en un disolvente orgánico apropiado, tal como DMF o diclorometano, de aproximadamente 0ºC a aproximadamente la temperatura ambiente, o PyBop y DIPBA en un
5 disolvente orgánico apropiado, tal como DMF o diclorometano aproximadamente a la temperatura ambiente; y preferentemente estas últimas condiciones. Un L particular es carbonilo. Un M particular es hidroxi o N-oxisuccinimida.
Un compuesto de fórmula 11, en la que las variables son como se describen en el presente documento, puede prepararse por desprotección de un compuesto de fórmula 12, en 10 la que P1 es un grupo protector de amina
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y sus otras variables son como se describen en el presente documento, con un agente de desprotección apropiado y en condiciones apropiadas. La desprotección se realiza usando un agente de desprotección apropiado que depende de la naturaleza del agente de protección de 15 amina, es decir, si puede retirarse (es lábil) en condiciones ácidas, básicas o de hidrogenación, y otros restos reactivos en el compuesto experimentan desprotección, es decir, se elige un agente de desprotección para realizar la desprotección sin afectar a los otros restos reactivos a menos que se desee una reacción concomitante. Un agente de protección de amina particular es Cbz o BOC; más particularmente Cbz. Un agente de desprotección particular es un ácido, 20 tal como HCl o H2/Pd(OH)2; más particularmente H2/Pd(OH)2. Las condiciones de
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desprotección particulares incluyen realizar la desprotección en un disolvente alcohólico, tal como metanol o etanol, o un disolvente de alcanoato de alquilo, tal como acetato de etilo aproximadamente a la temperatura ambiente.
Un compuesto de fórmula 12, en la que sus variables son como se describen en el presente documento, puede prepararse por acoplamiento de un compuesto de fórmula 13, en la que sus variables son como se describen en el presente documento, con un compuesto de fórmula 14, en la que sus variables son como se describen en el presente documento,
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en condiciones apropiadas. Las condiciones de acoplamiento particulares usan HOAt/DIC y
10 DIPEA en un disolvente orgánico apropiado, tal como THF aproximadamente a la temperatura ambiente. Un compuesto de fórmula 4, en la que las variables son como se describen en el presente documento, puede prepararse por desprotección de un compuesto de fórmula 15, en la que sus variables son
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como se describen en el presente documento, con un agente de desprotección apropiado y en condiciones apropiadas. La desprotección se realiza usando un agente de desprotección apropiado que depende de la naturaleza del agente de protección de amina, es decir, si puede retirarse (es lábil) en condiciones ácidas, básicas o de hidrogenación, y otros restos reactivos
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en el compuesto experimentan desprotección, es decir, se elige un agente de desprotección para realizar la desprotección sin afectar a los otros restos reactivos a menos que se desee una reacción concomitante. Un agente de protección de amina particular es Cbz o BOC; más particularmente Cbz. Un agente de desprotección particular es un ácido, tal como HCl o
5 H2/Pd(OH)2; más particularmente H2/Pd(OH)2. Las condiciones de desprotección particulares incluyen realizar la desprotección en un disolvente alcohólico, tal como metanol o etanol, o un disolvente de alcanoato de alquilo, tal como acetato de etilo aproximadamente a la temperatura ambiente.
Un compuesto de fórmula 15, en la que sus variables son como se describen en el
10 presente documento, puede prepararse por acoplamiento de un compuesto de fórmula 16, en la que sus variables son como se describen en el presente documento, con un compuesto de fórmula 17, en la que sus variables son como se describen en el presente documento,
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en condiciones apropiadas. Un agente de protección de amina particular es Cbz o BOC; más
15 particularmente Cbz. Las condiciones de acoplamiento particulares usan HOBT, PyBop y DIPEA en un disolvente orgánico apropiado, tal como diclorometano, de aproximadamente 0ºC a aproximadamente la temperatura ambiente.
Un compuesto de fórmula 16, en la que las variables son como se describen en el presente documento, puede prepararse por desprotección de un compuesto de fórmula 18, en 20 la que sus otras variables son
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como se describen en el presente documento, con un agente de desprotección apropiado y en condiciones apropiadas. La desprotección se realiza usando un agente de desprotección apropiado que depende de la naturaleza del agente protector de ácido, es decir, si puede 5 retirarse (es lábil) en condiciones ácidas, básicas o de hidrogenación, y otros restos reactivos en el compuesto experimentan desprotección, es decir, se elige un agente de desprotección para realizar la desprotección sin afectar a los otros restos reactivos a menos que se desee una reacción concomitante. Un agente de protección de amina particular es Cbz. Un agente de protección de ácido particular es alquilo inferior de C1 a C8; más particularmente metilo. Un
10 agente de desprotección particular es una base inorgánica, tal como un hidróxido de álcali; más particularmente NaOH. Las condiciones de desprotección particulares incluyen realizar la desprotección en un disolvente alcohólico, tal como metanol o etanol aproximadamente a la temperatura ambiente. Un compuesto de fórmula 18, en la que R0 es un enlace y sus otras variables son como
15 se describen en el presente documento, puede prepararse por desprotección de un compuesto de fórmula 20, en la que sus variables son como se describen en el presente documento, con un compuesto de fórmula 19, en la que sus variables
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son como se describen en el presente documento, en condiciones apropiadas. Un agente de protección de amina particular es Cbz o BOC. Las condiciones de acoplamiento particulares usan un disolvente orgánico apropiado, tal como diclorometano, de aproximadamente 0ºC a aproximadamente la temperatura ambiente.
Un compuesto de fórmula 20, en la que R4 es hidrógeno y las otras variables son como
se describen en el presente documento, puede prepararse por hidrogenación de un compuesto
de fórmula 21, en la que sus variables
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son como se describen en el presente documento, con un agente de hidrogenación apropiado y
10 en condiciones apropiadas. Un agente de hidrogenación particular es H2/Pd(OH)2. Las condiciones de hidrogenación particulares incluyen realizar la hidrogenación en un disolvente alcohólico, tal como metanol o etanol, o un disolvente de alcanoato de alquilo, tal como acetato de etilo aproximadamente a la temperatura ambiente. Un compuesto de fórmula 20, en la que R4 es alifático opcionalmente sustituido y las
15 otras variables son como se describen en el presente documento, puede prepararse por alquilación de un compuesto 20' en el que las variables son como se describen en el presente documento con el compuesto 22 (agente de alquilación) en el que R4 es alifático opcionalmente sustituido y Q es un grupo desplazable, tal como haluros, tosilatos o sulfonatos, en condiciones
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Los agentes de alquilación apropiados incluyen alifático (haluros, tosilatos o sulfonatos). Las condiciones de alquilación apropiadas incluyen realizar la alquilación en un disolvente orgánico apropiado, tal como un disolvente alcohólico, por ejemplo, metanol o etanol, o
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disolvente etérico, por ejemplo, éter o tetrahidrofurano, de aproximadamente la temperatura ambiente a aproximadamente la temperatura de reflujo.
Un compuesto de fórmula. 21, en la que las variables son como se describen en el presente documento, puede prepararse por alquilación de un compuesto de fórmula 22, en la que su variable es como se describe en el presente documento, con un compuesto de fórmula 23, en la que los R3' son independientemente
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un grupo alifático opcionalmente sustituido, grupo cíclico opcionalmente sustituido o grupo aromático opcionalmente sustituido como se describe en el presente documento, en
10 condiciones apropiadas. Las condiciones de alquilación particulares incluyen realizar la alquilación usando una base fuerte, tal como t-butóxido potásico en un disolvente alcohólico, tal como metanol o etanol, aproximadamente a la temperatura ambiente.
Un compuesto de fórmula 24, en la que sus variables son como se describen en el presente documento, puede prepararse realizando una adición de Michael sobre un aceptor de 15 Michael de fórmula 29, en la que su variable es como se describe en el presente documento,
con un derivado de glicinimida imínica.
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Las adiciones de Michael comprenden disolventes apróticos polares apropiados, bases de hidróxido de metal alcalino y temperaturas apropiadas. Para las adiciones de Michael, véase Corey, E.J.; Noe, M.C.; Xu, F. Tetrahedron Letter 1998, 39, 5347. Para la síntesis de catalizadores de transferencia quiral véase Corey, B.J.; Noe, M.C.; Xu, F. J. Am. Chem. Soc. 5 1997, 119,12414. Los disolventes apropiados incluyen DCM, ACN o THF dependiendo de las condiciones de reacción. Las bases apropiadas incluyen CsOH, NaOH, KOH y LiOH. Las temperaturas apropiadas varían de aproximadamente -78ºC a aproximadamente 0ºC, más particularmente aproximadamente a -60ºC. Las glicinimidas imínicas útiles en la invención se describen en el presente documento. Una glicinimida imínica preferidas es éster terc-butílico de 10 N-(difenilmetileno)glicina. Además, las condiciones de adición de Michael pueden aplicarse con
o sin un catalizador de transferencia de fase (PTC) (quiral y no quiral). Un PTC preferido es bromuro de O-[9] asil-N-9-antracenilmetilcinconidio. Un compuesto de fórmula 25, en la que sus variables son como se describen en el
presente documento, puede prepararse por escisión de imina y ciclación del compuesto de 15 fórmula 24.
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Para los procedimientos de escisión y ciclación, véase Javidan, A.; Schfer, K.; Pyne, S. Synlett 1996, 100; Tatsukawa, A.; Dan, M.; Ohbatake. M.; Kawatake, K.; Fukata, T.; Wada, E.; Kanemase, S.; Kakei, S. J. Org. Chem. 1993, 58, 4221. Las condiciones de escisión y ciclación
20 incluyen el uso de disolventes polares, reactivos ácidos y temperaturas de aproximadamente la temperatura ambiente a aproximadamente 150ºC. Las condiciones preferidas incluyen el uso de EtOH, AcONa y NH2OH·HCl, y una temperatura de aproximadamente el punto de ebullición del disolvente usado. Un compuesto de fórmula 26, en la que sus variables son como se describen en el
25 presente documento, puede prepararse por protección de la amida del compuesto de fórmula 25, en la que sus variables son como se describen en el presente documento, con un grupo protector de amida adecuado, tal como BOC. Otros grupos protectores adecuados incluyen CBz, -CO2alquilo. Además, véase Greene, T.W.; P.G.M en Protective Groups in Organic
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Synthesis, Wiley, Nueva York, 1991 para otros grupos protectores de amina. Las condiciones de protección incluyen el uso de disolventes apróticos polares, bases orgánicas como catalizadores, y temperaturas de aproximadamente 0ºC-100ºC. Las condiciones preferidas incluyen el uso de ACN, dimetil amino piridina y una temperatura de aproximadamente la temperatura ambiente.
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Un compuesto de fórmula 27, en la que sus variables son como se describen en el presente documento, puede prepararse por reducción del compuesto protegido de fórmula 26, en la que sus variables son como se describen en el presente documento.
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De hecho, se realizan dos reacciones. La primera reducción es de la amida en un hemiaminal usando DIBALH o superhidruro [LiBEt3H]. La segunda reducción es del hemiaminal en la amina usando Et3SiH y BF3·OEt2. Véase Collado, I; Ezquerra, J.; Mateo, A.I; Rubio, A., J. Org. Chem. 1998, 63 1995-2001 y Ezqueera, J.; Pedregal, C.; Yruretagoyena, B.; Rubio, A.; Carreno, M.C.;
15 Escribano, A.; Garcia Ruano, J.L. J. Org. Chem. 1995, 60,2925 para condiciones reductoras. Otras condiciones habituales para convertir piroglutamatos en pirrolidinas es el uso de BH3·SMe2.
Un compuesto de fórmula 28, en la que sus variables son como se describen en el presente documento, puede prepararse por desprotección del compuesto de fórmula 27, en la 20 que sus variables son como se describen en el presente documento.
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Véase Gibson, F.G.; Bermeier, S.C.; Rapoport, H., J. Org Chem. 1994, 59, 3216-3218 para las condiciones de retirada selectiva del grupo protector de N-BOC en presencia de éster tercbutílico. Un experto en la materia sabrá qué condiciones de desprotección serán evidentes tras 5 la elección del grupo protector. Por ejemplo, si se usa CBz, pueden usarse condiciones básicas
o de hidrogenación. Preferentemente, si se usa BOC, puede usarse HCl 1 N en acetato de etilo. Véase Greene, T.W.; P.G.M. en Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, Nueva York, 1991.
El experto en la materia apreciará que un compuesto de fórmula 3 puede prepararse por 10 acoplamiento de un compuesto de fórmula 5 con un compuesto de fórmula 28 en condiciones descritas anteriormente en el presente documento.
Los procedimientos para preparar R3, R5 o R7 como restos etanodiilo opcionalmente sustituidos incluyen los conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, los procedimientos descritos en "The organic Chemistry of β-Lactams" editado por G. Georg, VCH
15 Publishers, Inc. (1993), por ejemplo, páginas 240-241 y 303-305. Los Esquemas 1-11 que se muestran a continuación ejemplifican diversos procedimientos para preparar un azaheterociclilo multicíclico opcionalmente sustituido. Los procedimientos de los esquemas que se muestran a continuación también pueden aplicarse a otros azaheterociclilos multicíclicos opcionalmente sustituidos que comprenden sustituyentes
20 compatibles similares.
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Un compuesto de fórmula 1, que incluye un grupo que contiene uno o más átomos de nitrógeno en el anillo, preferentemente imina (=N-), puede convertirse en el compuesto correspondiente en el que uno o más átomos de nitrógeno en el anillo del grupo se oxidan para dar un N-óxido, preferentemente por reacción con un perácido, por ejemplo ácido peracético en ácido acético o ácido m-cloroperoxibenzoico en un disolvente inerte tal como diclorometano, a una temperatura de aproximadamente temperatura ambiente a la temperatura de reflujo, preferentemente a temperatura elevada.
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En las reacciones que se describen más adelante en el presente documento, puede ser necesario proteger grupos funcionales reactivos, por ejemplo, grupos hidroxi, amino, imino, tio
o carboxi, cuando éstos se desean en el producto final, para evitar su participación indeseada en las reacciones. Pueden usarse grupos protectores convencionales de acuerdo con la práctica convencional, por ejemplo, véase T.W. Green y P.G.M. Wuts en "Protective Groups in Organic Chemistry" John Wiley y Sons (1991); JF.W, McOmie en "Protective Groups in Organic Chemistry" Plenum Press, 1973.
Un compuesto que se prepara como se describe en el presente documento puede recuperarse de la mezcla de reacción por medios convencionales. Por ejemplo, los compuestos pueden recuperarse mediante retirada por destilación del disolvente de la mezcla de reacción o, si es necesario, después de la retirada por destilación del disolvente de la mezcla de reacción, vertiendo el residuo en agua seguido de extracción con un disolvente orgánico inmiscible en agua y retirando por destilación el disolvente del extracto. Además, si se desea, el producto puede purificarse adicionalmente mediante varias técnicas bien conocidas, tales como recristalización, reprecipitación o las diversas técnicas de cromatografía, en particular cromatografía en columna o cromatografía preparativa de capa fina.
Además, los compuestos descritos en el presente documento pueden prepararse por interconversión de otros compuestos descritos en el presente documento.
Como un ejemplo del procedimiento de interconversión, los compuestos de fórmula 1 que contienen enlaces sulfóxido pueden prepararse por la oxidación de compuestos correspondientes que contienen enlaces -S-. Por ejemplo, la oxidación puede realizarse convenientemente por medio de reacción con un peroxiácido, por ejemplo, ácido 3cloroperbenzoico, preferentemente en un disolvente inerte, por ejemplo, diclorometano, preferentemente a, o casi a, la temperatura ambiente, o como alternativa por medio de peroxomonosulfato ácido potásico en un medio tal como metanol acuoso, tamponado a aproximadamente pH 5, a temperaturas comprendidas entre aproximadamente 0ºC y la temperatura ambiente. Este último procedimiento se prefiere para compuestos que contienen un grupo lábil para ácidos.
Como otro ejemplo del procedimiento de interconversión, los compuestos de fórmula 1 que contienen enlaces sulfona pueden prepararse por la oxidación de los compuestos correspondientes que contienen enlaces -S-o sulfóxido. Por ejemplo, la oxidación puede realizarse convenientemente por medio de reacción con un peroxiácido, por ejemplo, ácido 3cloroperbenzoico, preferentemente en un disolvente inerte, por ejemplo, diclorometano, preferentemente a, o casi a, la temperatura ambiente.
Se entenderá que la designación de aromaticidad con respecto a arilos y heteroarilos en
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el presente documento incluye cualquier estructura de anillo insaturado altamente resonante. Como alternativa, la ubicación de dobles enlaces, cuando se indique, representa una estructura potencial para el compuesto representado pero se entenderá que incluye otros estados resonantes del compuesto así como especies protonadas y cargadas, de las cuales sólo puede mostrarse una.
Se apreciará que los compuestos descritos en el presente documento pueden contener centros asimétricos. Estos centros asimétricos pueden estar independientemente en la configuración R o S. Será evidente para los expertos en la materia que ciertos compuestos también pueden mostrar isomería geométrica. Los compuestos descritos en el presente documento pueden existir en forma de isómeros geométricos y estereoisómeros individuales y mezclas de los mismos, incluyendo mezclas racémicas. Dichos isómeros pueden separarse de sus mezclas, por la aplicación o adaptación de procedimientos conocidos, por ejemplo técnicas cromatográficas y técnicas de recristalización, o se preparan por separado a partir de los isómeros apropiados de sus intermedios.
Para el propósito del presente documento, se entiende que las formas tautoméricas se incluyen en la recitación de un grupo dado, por ejemplo, tioxo/mercapto u oxo/hidroxilo.
Las sales de adición de ácidos se forman con los compuestos descritos en el presente documento en los que está presente una función básica, tal como un grupo amino, alquilamino
o dialquilamino. Se prefieren sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables, es decir, no tóxicas. Las sales elegidas se seleccionan para que sean óptimamente compatibles con los vehículos farmacéuticos habituales y adaptadas para la administración oral o parenteral. Las sales de adición de ácidos de los compuestos descritos en el presente documento pueden prepararse por reacción de la base libre con el ácido apropiado, por la aplicación o adaptación de procedimientos conocidos. Por ejemplo, las sales de adición de ácidos del compuesto descrito en el presente documento pueden prepararse disolviendo la base libre en agua o una solución alcohólica acuosa u otros disolventes adecuados que contienen el ácido apropiado y aislando la sal por evaporación de la solución, o haciendo reaccionar la base libre y el ácido en un disolvente orgánico, en cuyo caso la sal se separa directamente o puede obtenerse por concentración de la solución. Algunos ácidos adecuados para su uso en la preparación de dichas sales son ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, diversos ácidos orgánicos carboxílicos y sulfónicos, tales como ácido acético, ácido cítrico, ácido propiónico, ácido succínico, ácido benzoico, ácido tartárico, ácido fumárico, ácido mandélico, ácido acórbico, ácido málico, ácido metanosulfónico, ácido toluenosulfónico, ácidos grasos, adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, bisulfato, butirato, lactato,
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laurato, lauril sulfato, malato, yodhidrato, 2-hidroxi-etanosulfonato, glicerofosfato, picrato, pivalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, tiocianato, 2-naftalenosulfonato, undecanoato, nicotinato, hemisulfato, heptonato, hexanoato, canforato, canforsulfonato y otros.
Las sales de adición de ácidos de los compuestos descritos en el presente documento pueden regenerarse a partir de las sales por aplicación o adaptación de procedimientos conocidos. Por ejemplo, los compuestos parentales pueden regenerarse a partir de sus sales de adición de ácidos por tratamiento con un álcali, por ejemplo, solución acuosa de bicarbonato sódico o solución acuosa de amoniaco.
Los compuestos descritos en el presente documento pueden regenerarse a partir de sus sales de adición de bases por la aplicación o adaptación de procedimientos conocidos. Por ejemplo, los compuestos parentales pueden regenerarse a partir de sus sales de adición de bases por tratamiento con un ácido, por ejemplo, ácido clorhídrico.
Las sales de adición de bases pueden formarse cuando el compuesto descrito en el presente documento contiene un grupo carboxi, o un bioisóstero suficientemente ácido. Las bases que pueden usarse para preparar las sales de adición de bases incluyen preferentemente las que producen, cuando se combinan con el ácido libre, sales farmacéuticamente aceptables, es decir, sales cuyos cationes no son tóxicos para el paciente en dosis farmacéuticas de las sales, de manera que los efectos inhibidores beneficiosos inherentes a la base libre no se ven afectados negativamente por los efectos secundarios atribuibles a los cationes. Las sales farmacéuticamente aceptables, incluyendo las obtenidas a partir de sales de metales alcalinos y alcalinotérreos, incluyen las obtenidas a partir de las siguientes bases: hidruro sódico, hidróxido sódico, hidróxido potásico, hidróxido de calcio, hidróxido de aluminio, hidróxido de litio, hidróxido de magnesio, hidróxido de cinc, amoniaco, etilendiamina, N-metil-glucamina, lisina, arginina, ornitina, colina, N,N'-dibenciletilendiamina,
cloroprocaína,
dietanolamina, procaína, N-bencilfenetilamina, dietilamina, piperazina,
tris(hidroximetil)-aminometano, hidróxido de tetrametilamonio y similares.
Los
compuestos descritos en el presente documento pueden prepararse
convenientemente, o formarse, como solvatos (por ejemplo, hidratos). Los hidratos de los compuestos descritos en el presente documento pueden prepararse convenientemente por recristalización a partir de una mezcla de disolventes acuosos/orgánicos, usando disolventes orgánicos tales como dioxano, tetrahidrofurano o metanol.
Los materiales de partida e intermedios pueden prepararse por la aplicación o adaptación de procedimientos conocidos, por ejemplo, procedimientos como los descritos en los Ejemplos de Referencia o sus equivalentes químicos obvios.
Los compuestos descritos en el presente documento, sus procedimientos o preparación
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y su actividad se aclararán después de examinar los siguientes ejemplos que se presentan únicamente como una ilustración y deben considerarse como limitaciones de la invención en su alcance.
Las muestras se analizaron por TLC, RMN, RP-HPLC o AE.
5 Los compuestos descritos en el presente documento, sus procedimientos o preparación y su actividad biológica se aclararán después de examinar los siguientes ejemplos que se presentan únicamente como una ilustración y no deben considerarse como limitaciones de la invención en su alcance. Las muestras se analizaron por TLC, RMN, RP-HPLC o AE.
10 Ejemplo 1 -Compuestos A-E: A una solución en DCM (10 ml) del compuesto xi (310 mg, 0,39 mmol) se le añadió TFA (4 ml). La reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante 5 horas. En este punto, el disolvente se retiró al vacío. El residuo resultante se purificó por HPLC de fase inversa, dando 195 mg (68%) del compuesto A,
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Siguiendo el procedimiento anterior y usando los materiales de partida apropiados, se prepararon los siguientes compuestos consecutivos B-E:
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Ejemplo 2 -Compuestos F-M:
A una solución en DCM (10 ml) del compuesto xii (350 mg, 0,56 mmol) se le añadió reactivo DMP (307 mg, 0,73 mmol). La reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante 2 horas y después se interrumpió con Na2SO3 al 10% durante 30 minutos. Después, la mezcla de reacción se extrajo con EtOAc (75 ml) y se lavó con salmuera. La fase orgánica se secó y se concentró al vacío. El residuo resultante se purificó con cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 80-90%/Hexanos), dando 248 mg (71%) del compuesto F
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Siguiendo el procedimiento anterior y usando los materiales de partida apropiados, se prepararon los siguientes compuestos consecutivos G-M:
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Ejemplo 3 -Compuestos N-R:
A una solución en DCM (4 ml) del compuesto xix (~0,22 mmol) se le añadió reactivo DMP (146 mg, 0,34 mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante 2 horas, la reacción se interrumpió con Na2SO3 al 10% Después. la mezcla de reacción se diluyó con DCM. La fase orgánica se separó y se lavó dos veces con Na2SO3 al 10% y salmuera. La fase orgánica resultante se secó y se concentró al vacío, dando un residuo, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 5%/EtOAc), proporcionando 78 mg (56%) del compuesto deseado N
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Siguiendo el procedimiento anterior y usando los materiales de partida apropiados, se prepararon los siguientes compuestos consecutivos O-R:
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5 Ejemplo 4 -Compuestos S-W:
A una solución en DCM (10 ml) del compuesto xxv (320 mg, 0,5 mmol) se le añadió reactivo DMP (272 mg, 0,65 mmol). La reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante 2 horas y se interrumpió con Na2SO3 al 10% durante 20 minutos. Después, la mezcla resultante se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó y se
10 concentró al vacío. El residuo resultante se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 80%/Hexanos), dando 170 mg (53%) del compuesto S,
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Siguiendo el procedimiento anterior y usando los materiales de partida apropiados, se prepararon los siguientes compuestos consecutivos T-W:
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5 Ejemplo 5 -Compuestos X-AD:
A una solución en DCM (20 ml) del compuesto xxvi (400 mg, 0,6 mmol) se le añadió reactivo DMP (329 mg, 0,78 mmol). La reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante 1,5 horas y se interrumpió con Na2SO3 al 10% durante 20 minutos. Después, la mezcla resultante se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó y se
10 concentró al vacío. El residuo resultante se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 70-100%/Hexanos), dando 210 mg (53%) del compuesto X,
140
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Siguiendo el procedimiento anterior y usando los materiales de partida apropiados, se prepararon los siguientes compuestos consecutivos Y-AD:
141
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Ejemplo 6 -Compuestos AE-AI:
El compuesto xxxiii (150 mg; 0,076 mmol) se disolvió en 5 ml de TFA y se agitó durante
dos días. El producto se purificó por RP-HPLC, dando 40 mg (rendimiento del 33%) del
compuesto AE,
142
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Siguiendo el procedimiento anterior y usando los materiales de partida apropiados, se prepararon los siguientes compuestos consecutivos AF-AL:
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Ejemplo 7 -Compuesto AJ:
El compuesto xxxviii (180 mg, 0,21 mmol) se disolvió en TFA puro (5 ml) y se dejó
durante 3 días aproximadamente a la temperatura ambiente, En este punto, la mezcla de
reacción se concentró al vacío, dando un residuo, que se purificó por HPLC de fase inversa,
143
dando 50 mg (32%) del compuesto AJ,
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Ejemplo 8 -Compuestos AK-AM;
El compuesto xxxxiii (150 mg; 0,16 mmol) se disolvió en 45 ml de TFA y se agitó
durante tres días. El producto se purificó por RP-HPLC, dando 70 mg (rendimiento del 54%) del
compuesto AK,
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Siguiendo el procedimiento anterior y usando los materiales de partida apropiados, se prepararon los siguientes compuestos consecutivos AL-AM:
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10
Ejemplo 9 -Compuestos AN:
El compuesto lii (80 mg) se disolvió en 3 ml de TFA y 3 ml de DCM. La mezcla se agitó
aproximadamente a la temperatura ambiente durante 5 horas. El disolvente se retiró por
evaporación. El residuo resultante se purificó por HPLC, dando 62 mg (83%) del compuesto
15 AN,
144 imagen10
El compuesto liii (160 mg; 0,2 mmol) se disolvió en 5 ml de DCM y se añadió reactivo DMP (170 mg; 0,4 mmol). La mezcla se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente 5 durante tres horas. El disolvente se retiró por evaporación y el residuo se disolvió en
acetonitrilo al 50%/agua y se purificó por RP-HPLC, dando 51 mg (32%) del compuesto AO, imagen11
10 DMP (189 mg; 0,44 mmol). La mezcla se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante 3 horas. El disolvente se retiró por evaporación y el producto se purificó por RP-HPLC, dando 41 mg (25%) del compuesto AP, imagen12
El compuesto lx (70 mg; 0,09 mmol) se disolvió en 5 ml de TFA y 5 ml de DCM. La mezcla se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante 3 horas. El disolvente se retiró al vacío y el residuo se disolvió en acetonitrilo al 50%/agua y se liofilizó, dando el compuesto AQ en forma de un polvo,
145 imagen13
El compuesto lxvi (223 mg, 0326 mmol) se agitó en una solución de TFA (5 ml) y DCM (5 ml) durante 4 horas. El análisis por TLC (gel de sílice; MeOH al 2%/EtOAc) mostró la conversión completa en el producto más lento. El disolvente se retiró a presión reducida y el producto se liofilizó, dando 198 mg (97%) del compuesto AR, imagen1
Siguiendo el procedimiento anterior y usando los materiales de partida apropiados, se prepararon los siguientes compuestos consecutivos AS-BG: imagen1
146 imagen1
147 imagen1
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El compuesto lxxiii (150 mg, 0,15 mmol) se recogió en DCM (3 ml). A esta solución se le añadió TFA (1,5 ml). La solución resultante se agitó durante una noche. En este punto, la reacción se concentró al vacío, dando un residuo. El residuo se purificó por HPLC de fase inversa y se liofilizó, dando 60 mg (50%) del compuesto BH, imagen1
Siguiendo el procedimiento anterior y usando los materiales de partida apropiados, se prepararon los siguientes compuestos consecutivos BI-BS: imagen1
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150 imagen15
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 12 y usando los materiales de partida apropiados, se prepararon los siguientes compuestos consecutivos BT-BU: imagen1
5
Ejemplo 16 -Compuesto BV:
A una solución en diclorometano (4,2 ml) del compuesto lxxvii (143 mg, 0,21 mmol) se le añadió reactivo DMP (165 mg, 0,39 mmol). La reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante 2 horas y se interrumpió con Na2SO3 al 10% (ac.) durante 20
10 minutos. La mezcla resultante se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4 y se concentró, dando un aceite de color amarillo. La purificación por cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 5%/EtOAc) dio 124 mg (79%) del compuesto BV,
151 imagen16
A una solución en diclorometano (20 ml) del compuesto lxxxix (420 mg, 0,62 mmol) se le añadió reactivo DMP (342 mg, 0,81 mmol). La reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante 1 hora y se interrumpió con Na2SO3 al 10% durante 20 minutos. Después, la mezcla resultante se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó y se concentró al vacío. El residuo resultante se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 80%/Hexanos), dando 208 mg (50%) del compuesto BW, imagen1
Siguiendo el procedimiento anterior pero usando los materiales de partida apropiados, se prepararon los siguientes compuestos consecutivos BX-CA: imagen1
152 imagen17
A una solución en diclorometano (6,5 ml) del compuesto lxxxvii (200 mg, 0,3 mmol) se le añadió reactivo DMP (227 mg, 0,54 mmol). La reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante 2 horas y se interrumpió con Na2SO3 al 10% (ac.) durante 20 minutos. La mezcla resultante se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4 y se concentró, dando un aceite de color amarillo. La purificación por cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 5%/EtOAc) dio 138 mg (70%) del compuesto CB, imagen1
Siguiendo el procedimiento anterior pero usando los materiales de partida apropiados, se preparó el siguiente compuesto CC: imagen18
153 imagen19
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 17 y usando los materiales de partida apropiados, se preparó el siguiente compuesto CE: imagen20
Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 14 y usando los materiales de partida
apropiados, se prepararon los siguientes compuestos consecutivos CF-CG: imagen1
10 Ejemplo 22 -Compuesto CH: Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 16 y usando los materiales de partida apropiados, se preparó el siguiente compuesto CH:
154 imagen21
El compuesto cxi (490 mg, 0,75 mmol) se disolvió en DCM (6 ml). A esta solución se le añadió reactivo DMP (380 mg, 0,9 mmol) y se agitó durante 1 hora. La mezcla de reacción se interrumpió con una solución al 10% de Na2SO3 y después la fase orgánica se lavó con NaHCO3 saturado y salmuera. Después de la concentración de la fase orgánica, el residuo resultante se purificó cromatográficamente con EtOAc al 70%/hexanos, dando el compuesto CI (325 mg, 66,4%). imagen1
Siguiendo el procedimiento anterior para preparar el compuesto anterior y
procedimientos relacionados para preparar el intermedio del mismo, pero usando los materiales
de partida apropiados, se prepararon los siguientes compuestos consecutivos CJ-CM:
155
y imagen1
5 Ejemplo 24 -Compuestos CN
A una solución en DCM/THF (3 ml/3 ml) del compuesto cxviii (335 mg, 0,46 mmol) se le añadió reactivo DMP (300 mg, 0,69 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y se interrumpió con Na2SO3 al 10% (ac.) durante 20 minutos. La mezcla resultante se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre
10 MgSO4 y se concentró, dando un aceite de color amarillo. La purificación por cromatografía
156
sobre gel de sílice (EtOAc al 80%/hexanos) dio el compuesto CN (220 mg, 67%). imagen22
A una solución en DCM/THF (1,5 ml/1,5 ml) del compuesto cxix (164 mg, 0,25 mmol) se le añadió reactivo DMP (159 mg, 0,38 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y se interrumpió con Na2SO3 al 10% (ac.) durante 20 minutos. La mezcla resultante se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4 y se concentró, dando un aceite de color amarillo. La purificación por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 70%/hexanos) dio el compuesto CO (100 mg, 61%). imagen1
Siguiendo el procedimiento anterior para preparar el compuesto anterior y
procedimientos relacionados para preparar el intermedio del mismo, pero usando los materiales
de partida apropiados, se prepararon los siguientes compuestos consecutivos CP-CR: imagen1
15 y
157 imagen23
El compuesto cxx se disolvió en DCM (3 ml). A la solución se le añadió reactivo DMP (180 mg, 0,41 mmol) y después se agitó durante 1 hora. La mezcla de reacción se interrumpió con Na2SO3 al 10% y después la fase orgánica se lavó con NaHCO3 saturado y salmuera. Después de la concentración de la fase orgánica, el residuo se purificó cromatográficamente con EtOAc al 100%, dando el compuesto CS (95 mg, 43,7%). imagen1
Siguiendo el procedimiento anterior para preparar el compuesto anterior y 10 procedimientos relacionados para preparar el intermedio del mismo, pero usando los materiales de partida apropiados, se preparó el siguiente compuesto CT: imagen24
15 le añadió reactivo DMP (270 mg, 0,63 mmol) y se agitó durante 1 hora. La mezcla de reacción se interrumpió con Na2SO3 al 10% y después la fase orgánica se separó y se lavó con NaHCO3 saturado y salmuera. Después de la concentración del disolvente orgánico, el residuo se purificó cromatográficamente con EtOAc al 100%, dando el compuesto CU (200 mg, 56,3%).
p.f. 225-235ºC
158 imagen1
Siguiendo el procedimiento anterior para preparar el compuesto anterior y procedimientos relacionados para preparar el intermedio del mismo, pero usando los materiales de partida apropiados, se prepararon los siguientes compuestos consecutivos EI, EK-EM, EOEZ y FA-FH: imagen1
159 imagen1
160 imagen1
161 imagen1
162 imagen1
163 imagen1
164 imagen25
El compuesto cxxx (330 mg, 0,46 mmol) se disolvió en DCM (5 ml). A esta solución se le
añadió reactivo DMP (240 mg, 0,56 mmol) y se agitó durante 1 hora. La mezcla de reacción se
interrumpió con Na2SO3 al 10% y la fase orgánica se lavó con NaHCO3 saturado y salmuera.
Después de la concentración de la fase orgánica, el residuo resultante se purificó cromatográficamente con EtOAc al 100%, dando el compuesto cxxx (280 mg, 85,9%). imagen1
165
Siguiendo el procedimiento anterior para preparar el compuesto anterior y procedimientos relacionados para preparar el intermedio del mismo, pero usando los materiales de partida apropiados, se prepararon los siguientes compuestos consecutivos CW-DC: imagen1
166 imagen26
5 A una solución en DCM (6 ml) del compuesto cxxxviii (400 mg, 0,57 mmol) se le añadió reactivo DMP (362 mg, 0,85 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y se interrumpió con Na2SO3 al 10% (ac.) durante 20 minutos. La mezcla resultante se extrajo con EtOAc. La fase orgánica extraída se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4 y se concentró, dando un aceite de color amarillo. La purificación por gel de sílice
10 (EtOAc al 70%/hexanos) dio el compuesto DD (201 mg, 51%). imagen1
Siguiendo el procedimiento anterior para preparar el compuesto anterior y procedimientos relacionados para preparar el intermedio del mismo, pero usando los materiales imagen27
167
Ejemplo 30 -Compuesto DF
El compuesto cxxxxiii (165 mg, 0,24 mmol) se disolvió en DCM (5 ml). A esta solución se le añadió reactivo DMP (125 mg, 0,29 mmol) y se agitó durante 1 hora. La mezcla de reacción se interrumpió con a Na2SO3 al 10% y la fase orgánica se lavó con NaHCO3 saturado y salmuera. Después de la concentración de la fase orgánica, el residuo resultante se purificó cromatográficamente con EtOAc al 70%/hexanos, dando el compuesto DF (108 mg, 65,6%). imagen28
10 baño de hielo se le añadió reactivo DMP (0,281 g, 0,671 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y después se interrumpió con una solución al 10% de Na2SO3 y se agitó durante 20 minutos. La mezcla resultante se extrajo con DCM (3 x 20 ml) y el extracto orgánico se secó (MgSO4). Después de la filtración para retirar MgSO4, el filtrado se concentró y se purificó por cromatografía en columna (acetato de etilo al 70%/Hexanos), dando
15 el compuesto final DG (0,265 g, 76%) en forma de un sólido de color blanco. imagen1
Siguiendo el procedimiento anterior para preparar el compuesto anterior y procedimientos relacionados para preparar el intermedio del mismo, pero usando los materiales de partida apropiados, se prepararon los siguientes compuestos consecutivos DH-DJ:
168 imagen29
5 Una solución en DCM del compuesto clx (108 mg, 0,123 mmol) se trató con reactivo DMP (78 mg, 0,185 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 1 hora, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (50 ml) y después se interrumpió con Na2SO3 al 10% Después de agitar durante 30 minutos, la fase orgánica se separó y se lavó con NaHCO3 y salmuera. La fase orgánica se secó y se concentró al vacío, dando un residuo que se purificó
10 por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 80%/hexanos), dando el compuesto DK (84 mg, 78%). imagen1
Siguiendo el procedimiento anterior para preparar el compuesto anterior y procedimientos relacionados para preparar el intermedio del mismo, pero usando los materiales 15 de partida apropiados, se prepararon los siguientes compuestos DL-DN.
169 imagen30
Una solución en EtOH (10 ml) del compuesto clxii (174 mg, 0,189 mmol) se hidrogenó usando Pd/C (30% equiv., 60 mg, contenido de paladio del 10%) durante 2,5 horas. Después, el catalizador se retiró por filtración. El filtrado resultante se concentró al vacío, dando un residuo que se purificó por cromatografía semi-preparativa de fase inversa y se liofilizó, imagen31
170
Siguiendo el procedimiento anterior para preparar el compuesto anterior y procedimientos relacionados para preparar el intermedio del mismo, pero usando los materiales de partida apropiados, se prepararon los siguientes compuestos consecutivos DP-DS. imagen4
y imagen32
El compuesto clxiii (175 mg, 0,24 mmol) se recogió en DCM (3 ml). A esta solución se le
añadió reactivo DMP (120 mg, 0-28 mmol) y se agitó durante 1 hora. La reacción se
171
interrumpió con Na2SO3 al 10% y se lavó con NaHCO3 saturado y salmuera. La purificación por EtOAc al 70% dio el compuesto CW (134 mg, 75%). Ejemplo 35 -Compuestos CY y DT-DX:
A una solución en DCM (15 ml) de clxxii (290 mg, 0,43 mmol) se le añadió reactivo DMP
5 (239 mg, 0,56 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y se interrumpió con Na2SO3 al 10% durante 20 minutos. Después, la mezcla resultante se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó y se concentró al vacío. El residuo resultante se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 8-100%/Hexanos), dando el compuesto CY (151 mg, 52%).
10 Siguiendo el procedimiento anterior para preparar el compuesto anterior y procedimientos relacionados para preparar el intermedio del mismo, pero usando los materiales de partida apropiados, se prepararon los siguientes compuestos consecutivos DT-DX. imagen1
172 imagen33
5 El compuesto lxxxv (1,17 mmol) se recogió en DCM (5 ml). A esta solución se le añadió el reactivo DMP (545 mg, 1,3 mmol) y se agitó durante 1 hora. La reacción se interrumpió con P-NaiSO3 (1,5 mmol/g de resina) y se agitó durante una hora. Se añadió resina adsorbente PTBD* (2,5 mmol/g de resina) y se agitó durante 45 minutos. La mezcla resultante se filtró y se purificó con EtOAc al 50%, dando el compuesto DY (440 mg, 50,2% en dos etapas).
10 *Referencia para resina adsorbente P-TBD: J. Parlow y col. Tetrahedron, 55, 6785-6796 (1999).
173 imagen34
5 Después de agitar a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción se vertió en un embudo de decantación que contenía THF Dri Solv (120 ml). La reacción se lavó con Na2SO3 al 10% (50 ml) y después con salmuera (75 ml). Después, la fase orgánica se separó, se secó sobre MgSO4 y el disolvente se retiró a presión reducida. Después, se realizó la cromatografía (gel de sílice: elución con THF Dri Solv al 50%/EtOAc y después MeOH al 4%/THF). Las
10 fracciones se comprobaron por EM. Las fracciones apropiadas se liofilizaron, dando el compuesto DZ (38,8 mg, 41%). imagen35
15 Después, se añadió el reactivo DMP (219 mg, 0,52 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 1 hora. El análisis por TLC mostró la conversión completa en la cetona (MeOH al 5%/THF). La reacción se vertió en un embudo de decantación que contenía THF Dri Solv (120 ml). La reacción se lavó con Na2SO3 al 10% (50 ml) y después con salmuera (75 ml). Después, la fase orgánica se separó, se secó sobre MgSO4 y el disolvente se retiró a presión
20 reducida, dando un residuo que se purificó por cromatografía (gel de sílice: elución con THF Dri Solv al 50%/EtOAc, y después MeOH al 4%/THF) y las fracciones se comprobaron por UV y EM. Las fracciones apropiadas se liofilizaron, dando el compuesto EA (159 mg, 88%).
174 imagen1
Siguiendo el procedimiento anterior para preparar el compuesto anterior y procedimientos relacionados para preparar el intermedio del mismo, pero usando los materiales de partida apropiados, se preparó el siguiente compuesto EB:
5 imagen36
A una solución del compuesto clxxxxviii (0,341 g, 0,503 mmol) en DCM (15 ml) enfriada en un baño de hielo se le añadió reactivo DMP (0,277 g, 0,654 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, después se interrumpió con una solución al 10% de
10 Na2SO3 y se agitó durante 20 minutos. La mezcla resultante se extrajo con DCM (3 x 20 ml) y el extracto orgánico se secó (MgSO4). Después de la filtración para retirar MgSO4, el filtrado se concentró y se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al 70%/Hexano), dando el compuesto EC (0,183 g, 54%) en forma de un sólido de color blanco. imagen1
Siguiendo el procedimiento anterior para preparar el compuesto anterior y
procedimientos relacionados para preparar el intermedio del mismo, pero usando los materiales
de partida apropiados, se preparó el siguiente compuesto ED: imagen1
175
Ejemplo 40 -Compuestos EB-EG:
El compuesto ccii (290 mg, 0,37 mmol) se recogió en DCM (5 ml). A esta solución se le añadió reactivo DMP (175 mg, 0,41 mmol) y se agitó durante 1 hora. La reacción se interrumpió con P-Na2SO3 (1,5 mmol/g de resina) y se agitó durante 1 hora. El reactivo DMP inactivado se adsorbió con P-TBD (2,5 mmol/g de resina) y se agitó durante 1 hora. La mezcla resultante se filtró y se aclaró con DCM antes de concentrarse, dando un residuo. El residuo resultante se purificó con EtOAc al 50%/Hex, dando el compuesto BE (440 mg, 28%). imagen1
Siguiendo el procedimiento anterior para preparar el compuesto anterior y 10 procedimientos relacionados para preparar el intermedio del mismo, pero usando los materiales de partida apropiados, se prepararon los siguientes compuestos EF-EG: imagen37
15 Ejemplo 41 -Compuesto EH: A una solución en DCM (3 ml) del compuesto cciii (140 mg, 0,2 mmol) se le añadió reactivo DMP (133 mg, 0,3 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y se interrumpió con Na2SO3 al 10% (ac.) durante 20 minutos. La mezcla resultante se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4 y se
20 concentró, dando un aceite de color amarillo que se purificó por gel de sílice (EtOAc al 70%/hexano) y después se liofilizó, dando el compuesto EH (50 mg, 38%).
176 imagen38
5 añadió gota a gota el compuesto cdviii (300 mg, 1,2 mmol) en THF (5 ml), seguido de DIPEA (0,22 ml, 1,2 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche en una atmósfera de nitrógeno. En este punto, la reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con NaHCO3 saturado y salmuera. La fase orgánica se secó con MgSO4, se filtró y se concentró, dando el intermedio acoplado en bruto cdix.
10 imagen1
Este intermedio cdix (~1 mmol) se recogió en DCM (10 ml). A esta solución se le añadió peryodinano de Dess-Martin (466 mg, 1,1 mmol). Después de agitar durante 1 hora a temperatura ambiente, la reacción se interrumpió con Na2SO3 unido a polímero (740 mg, 1,5 mmol DMP/g de resina) y se agitó durante 45 minutos. Después, la mezcla de reacción se
15 eliminó con resina TBD unida a polímero (440 mg, 2,5 mmol DMP/g de resina). La mezcla resultante se agitó durante 45 minutos y después se filtró. La purificación se consiguió en EtOH al 5%/EtOAc, dando el compuesto EJ (245 mg, 32% en 2 etapas). Puede encontrarse una referencia bibliográfica para el procedimiento de trabajo en Tetrahedron 55 (1999) 6785-6796. imagen1
20 Ejemplo 43 -Compuesto EN El compuesto intermedio cdvii (415 mg, 0,59 mmol) se recogió en DCM (10 ml) y THF (10 ml). Se añadió t-BuOH (300 µl) seguido de peryodinano de Dess-Martin (750 mg, 1,77
177
mmol). La reacción se agitó durante 50 minutos y después se interrumpió con P-Na2SO3 (1,5 mmol DMP/g de resina). Después de agitar durante 20 minutos a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se eliminó con P-TBD (2,5 mmol DMP/g de resina). Después de agitar durante 1 hora, la mezcla resultante se filtró y se concentró. El producto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc del 50% al 70%/Hexanos), dando el compuesto EN (220 mg, 53%). imagen1
Se obtuvieron los Espectros de Masas [M] para los siguientes compuestos como se muestra en la siguiente Tabla 1. 10 TABLA 1
LY Nº Ejemplo Masa Encontrada A 733,3 B 747,2 C 657,2 D 769,4 E 733,4 F 625,4 G 639,3 H 661,4
I 643,4 J 707,3 K 641,3 L 689,3 M 639,3 N 639,4 O 731,4 P 687,4 Q 653,4 R 701,4
178
(continuación) LY Nº Ejemplo Masa Encontrada
S T U V W X Y Z AA AB AC AD AE AF AG AK AH AI AJ AM AN AP AQ AR AW AX AY BD BE BF BG BU
639,3 747,1 655,4 653,4 703,4 661,3 647,3 663,3 667,4 711,4 725,4 647,3 779,4 689,3 671,4 806,4 687,5 735,4 736,5 870,4 813,3 724,4 653,4 628,2 642,2 614,2 628,3 570,3 520,2 534,3 584,3 890,3
179
(continuación) LY Nº Ejemplo Masa Encontrada
BV BW BX BY BZ CA CB CC CD CE CH CI CJ CK CL CM CN CO CP CQ CR CT CS CU CV CW CX CY CZ DA DB DC DD
685,4 679,3 695,3 697,3 787,4 701,3 669,4 733,5 643,3 653,5 749,4 653,3 717,5 683,4 669,3 675,2 717,2 653,3 683,3 669,3 675,2 661,8 639,3 679,2 709,3 743,3 695,3 665,2 681,3 695,3 701,2 673,3 693,3
180
(continuación) LY Nº Ejemplo Masa Encontrada
DE DF DG DH DI DJ DK DL DM DN DO DP DT DU DV DW DX DY DZ EA EB EC ED EE EF EG EH EI EJ EK EL EM EN
757,4 682,3 676,3 676,2 692,5 605,2 874,4 924,5 924,2 952,7 830 842,5 667,4 639,2 740,3 684,2 678,5 749,3 685,3 649,3 700,3 702,3 730,3 775,3 749,3 722,3 665,2 796,4 744,3 730,5 730,5 757,3 703,5
181
(continuación)
LY Nº Ejemplo Masa Encontrada
EO 715,5
EP 679,2
EQ 651,3
ER 715,3
ES 668,5
ET 732,5
EU 743,3
EV 683,3
EW 750,4
EX 786,4
EY 744,5
EZ 780,4
FB 693,4
FC 655,3
FD 655,3
FE 774,4
FF 681,5
FG 667,5
Se obtuvieron los Espectros de Masas de Alta Resolución (EMAR) de los siguientes compuestos como se muestra en la Tabla 2.
TABLA 2
Ejemplo
Fórmula Molecular (M+1) EM Calculado (M+1) Masa Encontrada (M+1)
L
C37H52N7O6 690,3979 690,3986
M
C33H50N7O6 640,3822 640,3822
Z
C32H48F2N7O6 664,3634 664,3627
AB
C36H48F2N7O6 712,3634 712,3649
CE
C34H52N7O6 654,3979 654,3967
EN
C35H52N7O6F2 704,3947 704,3945
EK
C37H63N6O8S 751,4428 750,4350 (M)
EC
C36H59N6O8 703,4395 703,4382
CA
C35H50N7O6F2 702,3790 702,3801
EZ
C40H55N8O6F2 781,4213 781,4196

182
(continuación)
Ejemplo
Fórmula Molecular (M+1) EM Calculado (M+1) Masa Encontrada (M+1)
EU
C36H52N7O6F2 716,3947 716,3929
CY
C35H52N7O6 666,3979 666,3966
BX
C37H58N7O6 696,4448 696,4432
S
C33H50N7O6 640,3823 640,3831
BW
C36H54N7O6 680,4136 680,4126
CU
C36H54N7O6 680,4136 680,4128
EJ
C40H57N8O6 745,4401 745,4417
EM
C35H54N7O6 668,4136 668,4139
Ninguno
C41H58N7O6 744,4448 744,4691

Ejemplo Intermedio 1-Compuesto ii A una solución en etanol (40 ml) del compuesto i (8,1 g, 24,4 mmol) se le añadió NaBH4 imagen1
5
(924 mg, 24,4 mmol) a -10ºC. La reacción se agitó a esa temperatura durante 30 minutos y después se interrumpió con AcOH (3 ml). La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (250 ml) y se lavó con NaHCO3 y salmuera. La fase orgánica se secó y se concentró al vacío, dando un residuo que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 50%/Hexanos),
10 proporcionando 7,85 g (97%) del compuesto ii, imagen1
Ejemplo Intermedio 2 -Compuesto iii
A una solución en THF (70 ml) del compuesto ii (4,48 g, 13,4 mmol) se le añadió NaH (699 mg, 60%, 17,42 mmol) a 0ºC. Después de agitar a esa temperatura durante 40 minutos,
183
se añadió MeI puro (1,25 ml, 20,1 mmol). La reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. En este punto, la reacción se interrumpió cuidadosamente con una solución saturada de NH4Cl a 0ºC. La mezcla de reacción se extrajo con Et2O y EtOAc. La fase orgánica se lavó con agua y salmuera y se secó con Na2SO4. La fase orgánica obtenida de esta manera se concentró al vacío, proporcionando el compuesto de xatano iii, imagen1
Ejemplo Intermedio 3 -Compuesto iv El compuesto de xantano iii (~13,4 mmol) se disolvió en tolueno (100 ml). A esta
10 solución se le añadió AIBN (216 mg, 1,34 mmol). La solución resultante se desgasificó con nitrógeno seco y después se trató con n-Bu3SnH (5,4 ml, 20,1 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 90ºC durante 3 horas. En este punto, la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se concentró al vacío. El residuo resultante se purificó con cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 15-20%/Hexanos), proporcionando 2,8 g (total de 66% a partir del compuesto ii) del
15 compuesto iv, imagen1
Ejemplo Intermedio 4 -Compuesto v A una solución en etanol (21 ml) del compuesto iv (1 g, 3,15 mmol) se le añadió Pd(OH)2/C (655 mg, 20%, 0,95 mmol) en una corriente de nitrógeno. La mezcla de reacción
20 resultante se sometió a hidrogenación convencional (1,5 atm). Después de 5 horas, la fuente de hidrógeno se retiró y la reacción se filtró. Los filtrados se concentraron al vacío, proporcionando el compuesto de amina libre v,
184 imagen1
Ejemplo Intermedio 5 -Compuesto vi A una solución en DCM (10 ml) del compuesto vii (629 mg, 1,95 mmol) se le añadió HOAt (265 mg, 1,95 mmol)
5 imagen1
aproximadamente a la temperatura ambiente seguido de una solución 1 M de DCC en DCM (1,95 ml, 1,95 mmol). Después de agitar durante 30 minutos, al ácido HOAt-activado anterior se le añadió una solución en DCM (3 ml) del compuesto v (1,5 mmol). La reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. En este punto, la reacción se
10 filtró a través de Celite. Los filtrados se diluyeron con EtOAc (75 ml) y se lavaron con agua y salmuera. La fase orgánica se secó y se concentró al vacío. El residuo resultante se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 70-80%/Hexanos), proporcionando 620 mg (85%) del compuesto vi, imagen1
15 Ejemplo Intermedio 6 -Compuesto viii A una solución en etanol (10 ml) del compuesto vi (615 mg, 1,26 mmol) se le añadió una solución acuosa 2 N de NaOH (1,26 ml, 2,52 mmol). La reacción se agitó durante una noche aproximadamente a la temperatura ambiente y después se acidificó a pH 3 usando resinas ácidas Dowex. Los sólidos se retiraron por filtración y los filtrados se concentraron al vacío,
20 dando un residuo que se disolvió de nuevo en 1:1 de CH3CN/H2O. Esta solución se sometió a liofilización, proporcionando 495 mg (85%) del compuesto viii,
185 imagen1
Ejemplo Intermedio 7 -Compuesto ix
A una solución en DCM (10 ml) del compuesto viii (230 mg, 0,5 mmol) se le añadió PyBop (417 mg, 0,8 mmol). La reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante 30 minutos. Después, a esta solución se le añadió una solución en THF (5,25 ml) del compuesto x (263 mg, 0,75 mmol) seguido de imagen1
DIPEA (0,174 ml, 1 mmol). La reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche y después se interrumpió con agua (30 ml) durante 30 minutos. La mezcla
10 de reacción se extrajo con EtOAc (100 ml). La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó y se concentró al vacío, proporcionando un residuo que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 5%/EtOAc), dando ~400 mg (100%) del compuesto ix, imagen1
Ejemplo Intermedio 8 -Compuesto xi
15 A una solución en DCM (10 ml) del compuesto ix (396 mg, 0,5 mmol) se le añadió reactivo DMP (278 mg, 0,65 mmol). La reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante 1 hora y después se interrumpió con Na2SO3 al 10% durante 30 minutos. Después, la mezcla de reacción se extrajo con EtOAc (75 ml) y se lavó con salmuera. La fase orgánica se secó y se concentró al vacío. El residuo resultante se purificó con cromatografía
20 sobre gel de sílice (EtOAc al 70%/Hexanos), dando 320 mg (81%) del compuesto xi,
186 imagen1
Ejemplo Intermedio 9 -Compuesto xii
A una solución en DCM (10 ml) del compuesto viii (230 mg, 0,5 mmol) se le añadió PyBop (417 mg, 0,8 mmol). La reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante 30 minutos. Después, a esta solución se le añadió una solución en THF (3,5 ml) del compuesto xiii (140 mg, 0,75 mmol) imagen1
seguido de DIPEA (0,174 ml, 1 mmol). La reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche y después se interrumpió con agua (30 ml) durante 30 minutos. La
10 mezcla de reacción se extrajo con EtOAc (75 ml). La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó y se concentró al vacío, proporcionando un residuo que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 5%/EtOAc), dando el compuesto xii con rendimiento cuantitativo, imagen1
Ejemplo Intermedio 10 -Compuesto i'
15 A una solución en metanol (30 ml) del compuesto i (5 g, 15,1 mmol) se le añadieron (BOC)2O (3,3 g, 15,1 mmol) y H2/Pd(OH)2/C (1,6 g, contenido de Pd al 10%). La reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante 2 horas y después se filtró dos veces a través de Celite. El lecho de Celite se aclaró con DCM. Los filtrados combinados se concentraron al vacío, dando un residuo oleoso que se purificó por cromatografía sobre gel de
20 sílice (EtOAc al 40%/Hexanos), dando 3,8 g (85%) del compuesto i',
187 imagen1
Ejemplo Intermedio 11-Compuesto ii'
A una solución en metanol (111 ml) del compuesto i' (3,7 g, 12,5 mmol) se le añadió NaBH4 (0,805 g, 21 mmol) a 0ºC. Después de agitar a 0ºC durante 2,5 horas, el disolvente de reacción se evaporó lentamente al vacío, dando un residuo que se diluyó con EtOAc. Después, esta solución se lavó dos veces con agua. La fase acuosa se extrajo con EtOAc. Las fases orgánicas combinadas se secaron con MgSO4, se filtraron y se concentraron al vacío, dando un residuo que se purificó con cromatografía, proporcionando 3,76 g (99%) del compuesto ii', imagen1
10 Ejemplo Intermedio 12 -Compuesto xiv A una solución en DCM (180 ml) del compuesto ii' (3,76 g, 12,3 mmol) se le añadió DMAP (5 g, 40,1 mmol) a 0ºC, seguido después de Tf2O (4 ml, 23,7 mmol). La reacción se agitó a 0ºC durante 1 hora y aproximadamente a la temperatura ambiente durante 1,5 horas más. Después, la mezcla de reacción se lavó dos veces con NaHCO3 al 5% y se secó con
15 MgSO4. La fase orgánica obtenida de esta manera se concentró al vacío, proporcionando el triflato en bruto. El triflato resultante (2,7 g, 6 mmol) se disolvió en DCM (120 ml). A esta solución se le añadió DMAP (2,5 g, 20,5 mmol). La mezcla de reacción resultante se calentó a reflujo durante una noche. En este punto, la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se lavó dos veces con NaHCO3 al 5%. La mezcla de reacción se secó con MgSO4, se filtró y se
20 concentró al vacío, dando un residuo oleoso de color parduzco que se purificó (MeOH al 1%/DCM), dando 500 mg (30%) del compuesto xiv, imagen1
188
Ejemplo Intermedio 13 -Compuesto xv
El compuesto xiv (500 mg, 1,8 mmol) se disolvió en HCl 4 N en dioxano (6,75 ml). La reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante ~4 horas. En este punto, el disolvente se retiró al vacío. El residuo resultante se tituló dos veces con éter dietílico, dando, con rendimiento casi cuantitativo, la sal HCl del compuesto xv, imagen1
Ejemplo Intermedio 14 -Compuesto xvi A una solución en THF (7 ml) del compuesto vii (579 mg, 1,8 mmol) se le añadieron
HOAt (245 mg, 1,8 mmol) y DCC (1,8 ml, 1 M en DCM). Se produjo como resultado una
10 suspensión. Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante 15 minutos, a la suspensión anterior se le añadió una solución en THF (6 ml) del compuesto xv (1,8 mmol) y DIPEA (0,63 ml, 3,6 mmol). Después, se añadió más cantidad de DIPEA (0,8 ml). La mezcla de reacción se agitó durante una noche aproximadamente a la temperatura ambiente. En ese punto, los sólidos de color blanco así formados se retiraron por filtración. Los
15 sólidos de color blanco se aclararon con THF. Los filtrados y los lavados combinados se concentraron al vacío, dando el producto en bruto que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 100%), proporcionando 665 mg (76%) del compuesto xvi, imagen1
Ejemplo Intermedio 15 -Compuesto xvii
A una solución en etanol (8 ml) de 7 (665 mg, 1,37 mmol) se le añadió NaOH acuoso 1 N (2,4 mmol) a 0ºC. La reacción se agitó durante una noche aproximadamente a la temperatura ambiente y después se acidificó a pH 3 usando resinas ácidas Dowex. Los sólidos se filtraron. Los filtrados resultantes se concentraron al vacío, dando un residuo amarillo pálido que se disolvió de nuevo en 1:1 de CH3CN/H2O y se liofilizó, dando 467 mg (74%) del compuesto xvii,
189 imagen1
Ejemplo Intermedio 16 -Compuesto xix
Una solución en DCM (4 ml) del compuesto xvii (100 mg, 0,22 mmol) se trató con PyBop (207 mg, 0,4 mmol) aproximadamente a la temperatura ambiente durante 20 minutos. En este punto, la solución anterior se trató con una solución en THF (2,6 ml) del compuesto xviii (65 mg, 0,32 mmol), seguido de DIPEA (0,076 ml). imagen1
Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante 7 horas, la reacción se interrumpió con agua. La mezcla de reacción se diluyó con DCM (60 ml). La fase orgánica se
10 separó, se lavó dos veces con salmuera y se secó con MgSO4. Después de la filtración, la concentración y la cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 5%/EtOAc), se obtuvieron 148 mg (~100%) del compuesto xix. imagen1
Ejemplo Intermedio 17 -Compuesto xx
15 A una solución en THF (100 ml) de N-Cbz-L-valina (14,4 g, 57,2 mmol) se le añadieron HOBT (7,72 g, 57,2 mmol) y EDCI (10,98 g, 57,2 mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante 20 minutos, a la solución anterior se le añadió una solución en THF (50 ml) que contenía clorhidrato de éster metílico de terc-L-Leucina (10,4 g, 57,2 mmol) y DIPEA (11,9 ml, 68,7 mmol). La reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente
20 durante una noche. Después del tratamiento acuoso convencional y la cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 30%/Hexanos), se proporcionaron 14 g (64%) del compuesto xx.
190 imagen1
Ejemplo Intermedio 18 -Compuesto xxi A una solución en metanol (80 ml) de xx (6,71 g, 17,7 mmol) se le añadió (en una corriente de N2) Pd/C (1,88 g, contenido de Pd al 10%). El recipiente de reacción se sometió a
5 hidrogenación (1 atm H2) durante una noche aproximadamente a la temperatura ambiente. En este punto, la mezcla de reacción se filtró a través de una capa de Celite y se concentró al vacío, proporcionando la amina libre en bruto correspondiente para la siguiente etapa. Se añadió una solución en THF de esta amina (~17,7 mmol) a una solución en THF (46 ml) y DMF (5 ml) que contenía ácido 2-pirazincarboxílico (2,85 g, 23 mmol), Hobbit (3,12 g, 23 mmol) y
10 EDCI (4,41 g, 23 mmol). Después, a la mezcla resultante se le añadió DIPEA (3,08 g, 17,7 mmol). La reacción se agitó durante una noche aproximadamente a la temperatura ambiente y después se interrumpió con agua. La mezcla de reacción se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se lavó con salmuera y se concentró al vacío, proporcionando un residuo que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 40-50%/Hexanos), proporcionando 3,9
15 g (63%) del compuesto xxi, imagen1
Ejemplo Intermedio 19 -Compuesto xxii A una solución en metanol (40 ml) del compuesto xxi (4,67 g,13,34 mmol) se le añadió NaOH 2 N (10 ml, 20 mmol). La reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente
20 durante 2 horas. En este momento, a la mezcla de reacción se le añadió una cantidad adicional de NaOH 2 N (3,3 ml, 6,67 mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche, la reacción se acidificó a pH 3 usando resina ácida. Después, la reacción se filtró y los filtrados se concentraron al vacío, dando un residuo que se disolvió en
1:1 de CH3CN/H2O para la liofilización. Se obtuvieron 4,15 g (93%) del compuesto xxii.
191 imagen1
Ejemplo Intermedio 20 -Compuesto xxiii
Una solución en DCM (10 ml) del compuesto xxii (917 mg, 2,73 mmol) se trató con HOAt (371 mg, 2,73 mmol) y DCC (2,73 ml, 1 M, 2,73 mmol). Después de agitar durante 30 minutos, la mezcla de reacción se trató con una solución en THF (10 ml) del compuesto v (500 mg, 2,73 mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche, los sólidos de color blanco (urea) se filtraron. Los filtrados se concentraron al vacío, dando un residuo que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 6070%/Hexanos), proporcionando 1,06 g (77%) del compuesto xxiii, imagen1
10
Ejemplo Intermedio 21 -Compuesto xxiv
Una solución en etanol (20 ml) del compuesto xxiii (1,06 g, 2,11 mmol) se trató con NaOH 2 N (2,11 ml, 4,23 mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche, la mezcla de reacción se acidificó a pH 3 con resina ácida. Los
15 sólidos se retiraron por filtración. Los filtrados resultantes se concentraron al vacío, dando un residuo que se liofilizó, dando ~1 g (100%) del compuesto xxiv, imagen1
Ejemplo Intermedio 22 -Compuesto xxv Una solución en DCM (10 ml) del compuesto xxiv (236,7 mg, 0,5 mmol) se trató con
20 PyBop (417 mg, 0,8 mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante 20 minutos, la mezcla de reacción se trató con una solución en DMF (5,6 ml) del compuesto xiii (139,5 mg, 0,75 mmol), seguido de DIPEA (0-174 ml, 1 mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante 8 horas, la reacción se interrumpió con agua y se extrajo con EtOAc. La fase orgánica resultante se lavó con salmuera, se secó y
192
se concentró al vacío, dando un residuo que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 5%/ EtOAc), proporcionando ~320 mg (100%) del compuesto xxv, imagen1
Ejemplo Intermedio 23 -Compuesto xxvi
Una solución en DCM (15 ml) del compuesto xxiv (355 mg, 0,75 mmol) se trató con PyBop (622 mg, 1,2 mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante 20 minutos, la mezcla de reacción se trató con una solución en THF (10 ml) del compuesto xxvii' (156 mg, 0,75 mmol), imagen1
10 seguido de DIPEA (0,26 ml, 1,5 mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche, la reacción se interrumpió con agua y se extrajo con EtOAc. La fase orgánica resultante se lavó con salmuera, se secó y se concentró al vacío, dando un residuo que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 2%/EtOAc), proporcionando ~400 mg (80%) del compuesto xxvi, imagen39
Ejemplo Intermedio 24 -5-Cianopentanoato de metilo
Se disolvió cianuro potásico (4 g, 61,44 mmol) en 70 ml de agua y 200 ml de metanol. A
la solución se le añadieron 10 g (51,2 mmol) de 5-bromopentanoato de metilo y la mezcla se
calentó a reflujo durante una noche. La mezcla de reacción se concentró a sequedad. Al
20 residuo se le añadieron 100 ml de EtOAc para extraer el producto. La fase orgánica se lavó tres
193
veces con agua, se secó y se concentró, dando 5,37 g (74%) de 5-cianopentanoato de metilo en forma de un aceite. Ejemplo Intermedio 25 -5-Tetrazol-5-ilpentanoato de metilo
Se disolvió 5-cianopentanoato de metilo (4,8 g, 34 mmol) se disolvió en tolueno y se añadieron cloruro de trietilamonio (14 g, 102 mmol) y azida sódica (6,63,102 mmol). La mezcla se calentó a reflujo durante una noche. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se añadió agua (3 x 100 ml) para extraer el 5-tetrazol-5-ilpentanoato de metilo de la fase orgánica. A la fase acuosa se le añadió HCl concentrado para ajustar el pH a 2. El producto se extrajo de la solución acuosa con EtOAc (3 x 50 ml). La fase orgánica se combinó, se secó y se concentró, dando 4,25 g (68%) de 5-tetrazol-5-ilpentanoato de metilo. Ejemplo Intermedio 26 -5-[N-(1,1-Dimetilbencil)tetrazol-5-il]pentanoato de metilo
Se disolvieron 5-tetrazol-5-ilpentanoato de metilo (4,23 g, 23 mmol) y ácido tricloroacético (8,69 g, 53 mmol) en 50 ml de CHCl3, a la solución se le añadió gota a gota αmetilestireno (2,72, 23 mmol) y la mezcla de reacción se dejó en agitación aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc hasta alcanzar un volumen de 200 ml y la fase orgánica se lavó con KOH acuoso al 10% y salmuera. La fase orgánica se secó y se concentró. El producto se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida, dando 6,6 g (95%) de 5-[N-(1,1-dimetilbencil)tetrazol-5-il]pentanoato de metilo. Ejemplo Intermedio 27 -Ácido 5-[N-(1,1-dimetilbencil)tetrazol-5-il]pentanoico
Se disolvió 5-[N-(1,1-dimetilbencil)tetrazol-5-il]pentanoato de metilo (6,6 g, 21,8 mmol) en metanol (100 ml) y se añadieron 23 ml de NaOH acuoso 1 N. La mezcla se agitó durante una noche y se concentró para retirar el metanol. El residuo se disolvió en agua (100 ml) y la solución se neutralizó mediante la adición del mismo equivalente de HCl acuoso 1 N. El producto se extrajo con EtOAc (3 x 50 ml). Los extractos orgánicos se secaron y se concentraron, dando 4,75 g (75%) de ácido 5-[N-(1,1-dimetilbencil)tetrazol-5-il]pentanoico. Ejemplo Intermedio 28 -Compuesto xxviii
Se disolvió ácido 5-[N-(1,1-dimetilbencil)tetrazol-5-il]pentanoico (4,75 g, 16,5 mmol) en DCM (100 ml) y se añadieron 4,8 g (24,8 mmol) de EDCI y 6 ml de DIPEA. A la mezcla se le añadió N-hidroxilsuccinimida (3,8 g, 33 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante tres horas aproximadamente a la temperatura ambiente. La mezcla se diluyó con DCM hasta alcanzar un volumen de 200 ml y la solución se lavó tres veces con agua. La fase orgánica se secó y se concentró, dando 4,79 g (75%) del compuesto xxviii,
194 imagen1
Ejemplo Intermedio 29 -Compuesto xxix
El dipéptido H-Val-Val-OH (3,22 g, 14,9 mmol) se suspendió en 50 ml de N,Ndimetilformamida (DMF) y se añadieron 4,75 g (12,42 mmol) del compuesto xxviii seguido de la adición de 3,4 ml (18,63 mmol) de diisopropiletilamina (DIPEA). La mezcla se calentó a 40ºC y se agitó durante una noche. El disolvente se evaporó a alto vacío. El residuo se disolvió en EtOAc y se lavó con HCl 1 N y salmuera, dando 5,52 g (91%) del compuesto xxix, imagen1
Ejemplo Intermedio 30 -Compuesto xxx
10 Se disolvieron 1,6 g (3,29 mmol) del compuesto xxix en 20 ml de DCM y se añadieron 3,3 ml de una solución 1 M de DCC en THF. A la mezcla se le añadieron 500 mg (2,73 mmol) del compuesto v. La mezcla se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. La mezcla se diluyó con EtOAc hasta alcanzar un volumen de 100 ml y se lavó con HCl 1 N, NaHCO3 y salmuera. Se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al 50%/hexano),
15 dando 1,02 g (58%) del compuesto xxx, imagen1
Ejemplo Intermedio 31 -Compuesto xxxi El compuesto xxx (1,02 g, 1,57 mmol) se disolvió en 10 ml de MeOH y se añadieron 2
195
ml de NaOH acuoso 1 N. La mezcla se agitó durante una noche. El metanol se retiró por evaporación y el residuo se disolvió en agua y se neutralizó con 2 ml de HCl. Después de la extracción con EtOAc, se proporcionó 1,00 g (~100%) del compuesto xxxi. imagen1
5 Ejemplo Intermedio 32 -Compuesto xxxii
El compuesto xxxi (300 mg, 0,48 mmol) y PyBop (300 mg, 0,58 mmol) se disolvieron en 10 ml de DCM. A la solución se le añadió el compuesto x (201 mg, 0,58 mmol) y después se añadió DIPEA (104 µl). La mezcla se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. Después, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc hasta alcanzar un
10 volumen de 100 ml y se lavó dos veces con HCl 1 N, dos veces con NaHCO3 y tres veces con salmuera. La fase orgánica se secó y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al 100%), dando 450 mg (98%) del compuesto xxxii, imagen1
Ejemplo Intermedio 33 -Compuesto xxxiii
El compuesto xxxii 360 mg (0,38 mmol) se disolvió en 8 ml de DCM y se añadieron 240 mg (0,57 mmol) de reactivo DMP. La mezcla se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante tres horas. La mezcla se diluyó con EtOAc hasta alcanzar un volumen de 50 ml y se lavó tres veces con salmuera. El producto se purificó por cromatografía en columna (etanol al 25%/EtOAc), dando 300 mg (83%) del compuesto xxxiii,
196 imagen1
Ejemplo Intermedio 34 -Compuesto xxxiv
A una solución en DCM (10 ml) de xxxv (790 mg, 2,80 mmol) se le añadieron PyBop (1,7 g, 3,36 mmol) imagen1
5
y Hobbit (450 mg, 3,36 mmol). La solución resultante se enfrió a 0ºC y se trató con una solución en DCM (3 ml) de (s)-α-(4-piridil)etilamina (410 mg, 3,36 mmol). Esto se siguió de la adición de DIPEA (0,5 ml, 3,36 mmol). La reacción se agitó durante una noche aproximadamente a la temperatura ambiente. En este punto, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc. Todo el
10 conjunto se lavó con NaHCO3 saturado y salmuera. La fase orgánica obtenida de esta manera se secó y se concentró al vacío. El residuo resultante se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 5%/EtOAc), proporcionando 630 mg (58%) del compuesto xxxiv, imagen1
Nota: se obtuvo (s)-α-(4-piridil)etilamina a partir de su sal D-tartrato lavando la base (NaOH 1 15 N) y posterior extracción del EtOAc. El índice de recuperación fue del 89%. Ejemplo Intermedio 35 -Compuesto xxxvi
A una solución en metanol (15 ml) del compuesto xxxiv (630 mg, 1,64 mmol) se le añadió Pd/C (150 mg, contenido de paladio del 10%) en una atmósfera de nitrógeno N2. La reacción se agitó en una atmósfera de H2 durante una noche. La mezcla de reacción se filtró a
20 través de una capa de Celite® 521. Los filtrados se concentraron al vacío, proporcionando 420
197
mg (~100%) del compuesto xxxvi, imagen1
Ejemplo Intermedio 36 -Compuesto xxxvii
A una solución en DCM (3 ml) del compuesto xxxi (270 mg, 0,43 mmol) se le añadió PyBop (270 mg, 0,52 mmol). Esto se siguió de la adición del compuesto xxxvi (160 mg, 0,64 mmol) y DIPEA (0,09 ml, 0,52 mmol). La reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. En este punto, la reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con HCl 0,1 N, seguido de NaHCO3 saturado y salmuera. La fase orgánica resultante se secó y se concentró, dando el compuesto xxxvii (masa total 430 mg) para la siguiente etapa imagen40
Ejemplo Intermedio 37 -Compuesto xxxviii
A una solución en DCM (3 ml) del compuesto xxxvii (370 mg, 0,43 mmol) se le añadió
reactivo DMP (280 mg, 0,65 mmol). La reacción se agitó aproximadamente a la temperatura
ambiente durante 2 horas y después se interrumpió con Na2SO3 al 10% Después de agitar
15 durante 30 minutos, la reacción se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se lavó con NaHCO3 saturado y salmuera. La fase orgánica resultante se secó y se concentró al vacío, dando un residuo que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 5%/EtOAc), proporcionando 180 mg (49% en 2 etapas) del compuesto xxxviii, imagen1
198
Ejemplo Intermedio 38 -Compuesto xxxx
El compuesto xxix (2,5 g, 5 mmol) se disolvió en 40 ml de DCM y a la solución se le añadieron 5,1 ml de una solución 1 M de DCC en THF. A la mezcla se le añadieron 1,08 g (3,53 mmol) del compuesto xxxix. La mezcla se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. imagen1
La mezcla se diluyó con EtOAc hasta alcanzar un volumen de 100 ml, se lavó secuencialmente con HCl 1 N, NaHCO3 y salmuera y después se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al 80%/hexano), dando 2,59 g (95%) del compuesto xxxx, imagen1
10
Ejemplo Intermedio 39 -Compuesto xxxxi
El compuesto xxxx (2,59 g, 3,35 mmol) se disolvió en 20 ml de MeOH y se añadieron 4 ml de NaOH acuoso 1 N. La mezcla se agitó durante una noche y después se sometió a evaporación rotatoria, dejando un residuo. El residuo se disolvió en agua y se neutralizó con 2
15 ml de HCl. Después, la solución neutralizada se extrajo con EtOAc, dando 2,49 g (~100%) del compuesto xxxxi, imagen1
Ejemplo Intermedio 40 -Compuesto xxxxii El compuesto xxxxi (847 mg, 1,16 mmol) y 724 mg (1,39 mmol) de PyBop se disolvieron
199
en 10 ml de DCM. A la solución se le añadió el compuesto xiii (260 mg, 1,39 mmol) seguido posteriormente de la adición de DIPEA (209 µl). La mezcla se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. Después, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc hasta alcanzar un volumen de 100 ml y se lavó dos veces con HCl 1 N, dos veces con NaHCO3 y tres veces con salmuera. La fase orgánica se secó y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna (etanol al 5%/EtOAc), dando 930 mg (86%) del compuesto xxxxii, imagen1
Ejemplo Intermedio 41 -Compuesto xxxxiii El compuesto xxxxii (350 mg, 0,38 mmol) se disolvió en 10 ml de DCM y se añadieron
10 242 mg (0,57 mmol) de reactivo DMP. La mezcla se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante tres horas. La mezcla se diluyó con EtOAc hasta alcanzar un volumen de 50 ml y se lavó tres veces con salmuera. El producto se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al 100%), dando 180 mg (51%) del compuesto xxxxiii, imagen1
15 Ejemplo Intermedio 42 -Compuesto xxxxv Se suspendió H-Val-Val-OH (5 g, 23 mmol) en 100 ml de DMF, se añadió el compuesto xxxxiv imagen1
(8,3 g, 27,6 mmol) y después se añadieron 6,2 ml (35,5 mmol) de DIPEA. La mezcla se agitó a 20 40ºC durante dos días. El disolvente se retiró a alto vacío y el residuo se disolvió en 100 ml de EtOAc y se lavó tres veces con HCl 1 N y dos veces con salmuera. Se proporcionaron 9,14 g
200
(99%) del compuesto xxxxv. imagen1
Ejemplo Intermedio 43 -Compuesto xxxxvi El compuesto xxxxv (2,8 g, 7 mmol) y 954 mg (7 mmol) de HOAt se disolvieron en 100
5 ml de DCM. Se añadieron 7 ml de DCC 1 M/DCM. A la mezcla de reacción se le añadió el compuesto xxxix (2,15 g) y la mezcla de reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. La mezcla se concentró a sequedad y el residuo se disolvió en EtOAc y se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al 100%), dando 457 g (95%) del compuesto xxxxvi,
10 imagen1
Ejemplo Intermedio 44 -Compuesto xxxxvii
El compuesto xxxxvi (4,57 g, 6,65 mmol) se disolvió en 10 ml de TFA y 10 ml de DCM. La mezcla se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante 4 horas. El disolvente se retiró al vacío y el residuo se disolvió en 50:50 de acetonitrilo/agua y se liofilizó, dando el
15 compuesto xxxxvii en forma de un polvo, imagen1
Ejemplo Intermedio 45 -Compuesto xxxxviii
201
El compuesto xxxxvii (1 g, 1,59 mmol) y 990 mg (2,28 mmol) de PyBop se disolvieron en 20 ml de DCM y se añadieron 1,6 ml de 1 M metilamina en THF. La mezcla se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción se diluyó hasta alcanzar un volumen de 100 ml con EtOAc y se lavó con HCl 1 N, NaHCO3 y salmuera. El residuo se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (EtOH al 10%/EtOAc), dando 1 g (98%) del compuesto xxxxviii, imagen1
Ejemplo Intermedio 46 -Compuesto xxxxix El compuesto xxxxviii (1 g, 1,55 mmol) se disolvió en 10 ml de MeOH y se añadieron 2
10 ml de NaOH 1 N. La mezcla se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. El disolvente se retiró por evaporación. El residuo se disolvió en agua, se neutralizó y se extrajo con EtOAc, dando 960 mg (98%) del compuesto xxxxix, imagen1
Ejemplo Intermedio 47 -Compuesto li
El compuesto xxxxix (315 mg, 0,5 mmol) y 312 mg (0,6 mmol) de PyBop se disolvieron
en 10 ml de DCM. Se añadieron el compuesto 1 (56 mg, 0,6 mmol) y 108 µl de DIPEA. La
mezcla imagen1
se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche, se diluyó hasta 20 alcanzar un volumen de 100 ml con EtOAc y se lavó con HCl 1 N, NaHCO3 y salmuera. Se
202
purificó por cromatografía en columna (EtOH al 15%/EtOAc), dando 400 mg (92%) del compuesto li, imagen1
Ejemplo Intermedio 48 -Compuesto lii
El compuesto li (400 mg, 0,46 mmol) se disolvió en 10 ml de DCM y se añadieron 292 mg (0,69 mmol) de reactivo DMP. La mezcla se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante 3 horas. El disolvente se retiró por evaporación y el producto se purificó por RP-HPLC, dando 130 mg (32%) del compuesto lii, imagen1
10 Ejemplo Intermedio 49 -Compuesto liii El compuesto xxxxix (210 mg, 0,33 mmol) y 208 mg (0,4 mmol) de PyBop se disolvieron en 10 ml de DCM. A la solución se le añadió el compuesto xiii (154 mg, 0,83 mmol) seguido de la adición de DIPEA (72 µl, 0,4 mmol). La mezcla se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. La mezcla de reacción se diluyó hasta alcanzar un volumen de
15 100 ml con EtOAc, se lavó con HCl 1 N, NaHCO3 y salmuera y después se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (EtOH al 10%/EtOAc), dando 250 mg (95%) del compuesto liii, imagen1
Ejemplo Intermedio 50 -Compuesto liv
203
El compuesto xxxxv (755 mg, 1,88 mmol) y 255 mg (1,88 mmol) de HOAt se disolvieron en 20 ml de DCM. Se añadieron 1,88 ml de DCC 1 M/DCM. A la mezcla de reacción se le añadió el compuesto v (288 mg) y la mezcla de reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla se concentró a sequedad y el residuo se disolvió en EtOAc y se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al 80%/Hexanos), dando 800 mg (90%) del compuesto liv, imagen1
Ejemplo Intermedio 51 -Compuesto Iv El compuesto liv (800 mg, 1,41 mmol) se disolvió en 10 ml de MeOH y se añadieron 2
10 ml de NaOH. La mezcla se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. El disolvente se retiró al vacío y el residuo se disolvió en agua y se neutralizó con 2 ml HCl 1 N. El producto se extrajo con EtOAc. La evaporación del disolvente de extracción proporcionó 760 mg (~100%) de lv, imagen1
15 Ejemplo Intermedio 52 -Compuesto lvii El compuesto lv (760 mg, 1,41 mmol) y 880 mg (1,69 mmol) de PyBop se disolvieron en 5 ml de DCM. A la solución se le añadió el compuesto lvi (530 mg, 2,12 mmol) y después se añadieron 0,31
204 imagen1
de DIPEA. La mezcla se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. La mezcla de reacción se diluyó hasta alcanzar un volumen de 100 ml con EtOAc, se lavó con HCl 1 N, NaHCO3 y salmuera y después se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (EtOAc al 100%), dando 870 mg (80%) del compuesto lvii, imagen1
Ejemplo Intermedio 53 -Compuesto lviii
El compuesto lvii (350 mg, 0,45 mmol) se disolvió en 5 ml de TFA y 5 ml de DCM y la mezcla se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante 3 horas. El disolvente se 10 retiró por evaporación y el producto se purificó por RP-HPLC, dando 220 mg (69%) del
compuesto lviii, imagen1
Ejemplo Intermedio 54 -Compuesto lix El compuesto lviii (200 mg, 0,28 mmol) y 218 mg (0,42 mmol) de PyBop se disolvieron
15 en 5 ml de DCM. Se añadió metilamina (0,28 ml de 2 M en THF). La mezcla se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. La mezcla se diluyó hasta alcanzar un volumen de 100 ml con EtOAc, se lavó con HCl 1 N, NaHCO3 y salmuera y después se purificó por cromatografía en columna (EtOH al 15%/EtOAc), dando 168 mg (79%) de lix,
205 imagen1
Ejemplo Intermedio 55 -Compuesto lx
El compuesto lviii (200 mg, 0,26 mmol) se disolvió en 4 ml de DCM y se añadieron 165 mg (0,39 mmol) de reactivo DMP. La mezcla se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante 3 horas. El disolvente se retiró por evaporación. El residuo se disolvió en acetonitrilo al 50%/agua, se filtró y se purificó por RP-HPLC, dando 140 mg (70%) del compuesto lx, imagen1
Ejemplo Intermedio 56 -Compuesto ii
10 Una solución en DCM (30 ml) y EtOH (30 ml) del compuesto i (4 g, 12,1 mmol), en una atmósfera de N2, se enfrió a -10ºC. Se añadió NaBH4 (458 mg, 12,1 mmol) y la solución se agitó a -10ºC durante 50 minutos. El análisis por TLC (EtOAc al 50%/Hexano) mostró la conversión total en una mancha de realización más lenta. La reacción se interrumpió cuidadosamente con hielo y después con una solución fría saturada de NH4Cl (10 ml). La
15 mezcla se vertió en DCM (300 ml). La fase orgánica se lavó una vez con una solución saturada de NH4Cl (60 ml) y dos veces con salmuera (60 ml). Después, la fase orgánica se separó, se secó sobre MgSO4 y se concentró al vacío, dando 3,5 g del compuesto ii (87%) Ejemplo Intermedio 57 -Compuesto lxi En un matraz de fondo redondo de 250 ml equipado con un globo de H2, una solución
20 etanólica (50 ml) del compuesto ii (3,5 g,10,5 mmol) se sometió a condiciones de hidrogenación convencionales [Pd(OH)2 al 20%/C (1,47 g, 2,1 mmol)] durante 5 horas aproximadamente a la temperatura ambiente. El catalizador se retiró por filtración a través de Celite y se lavó con DCM. Después, el disolvente se retiró a presión reducida, dando 2 g (96%) del compuesto lxi,
206 imagen1
Ejemplo Intermedio 58 -Compuesto lxii En una atmósfera inerte, una solución del compuesto lxi (200 mg, 1 mmol), el compuesto lxiii,
5 imagen1
(233 mg, 1,1 mmol), HOAt (1-hidroxi-7-azabenzotriazol) (156 mg, 1,15 mmol) en DMF anhidra (6 ml) se agitó durante 20 minutos. Después, la temperatura se puso a 0ºC, seguido de la adición de DIC (0,18 ml, 1,15 mmol). La reacción se agitó durante una noche aproximadamente a la temperatura ambiente. La solución se diluyó con EtOAc y después se lavó dos veces con
10 HCl 1 N, dos veces con NaHCO3 acuoso saturado y salmuera. La fase orgánica se separó, se secó sobre MgSO4 y el disolvente se retiró a presión reducida. El residuo se limpió por cromatografía (gel de sílice: EtOAc al 70%/DCM), dando con un rendimiento del 45% del compuesto lxii. imagen1
15 Ejemplo Intermedio 59 -Compuesto lxiv Una solución del compuesto lxii (777 mg, 2 mmol) en dioxano (6 ml) y NaOH 0,5 M (6 ml) se agitó durante 5 horas aproximadamente a la temperatura ambiente. El examen por TLC (EtOAc al 100%) mostró la completa conversión en una mancha en el origen. La reacción se enfrió con un baño de hielo seguido de la adición de HCl 1 N (4 ml). Después, se añadió NaCl
20 sólido y la mezcla entera se extrajo dos veces con EtOAc (2 x 150 ml). Después, los extractos orgánicos se combinaron, se secaron sobre MgSO4 y el disolvente se retiró a presión reducida, dando el compuesto lxiv con un rendimiento del 92%.
207 imagen1
Ejemplo Intermedio 60 -Compuesto lxv En una atmósfera inerte, una solución del compuesto x (203 mg, 0,58 mmol), el compuesto lxiv (276 mg, 0,775 mmol) y HOAt (1-hidroxi-7-azabenzotriazol) (126 mg, 0,93
5 mmol) en DMF anhidra (6 ml) se agitó durante 20 minutos. Después, la temperatura se redujo a 0ºC, seguido de la adición de DIC (0,14 ml, 0,93 mmol). La reacción se agitó durante una noche aproximadamente a la temperatura ambiente. La solución se diluyó con EtOAc y después se lavó dos veces con HCl 1 N, dos veces con NaHCO3 acuoso saturado y con salmuera. La fase orgánica se separó, se secó sobre MgSO4 y el disolvente se retiró a presión
10 reducida. El residuo se purificó por cromatografía (gel de sílice: de EtOAc al 50%/DCM a
80:19:1 de EtOAc/DCM/MeOH), dando el compuesto lxv con un rendimiento del 62%. imagen1
Ejemplo Intermedio 61 -Compuesto lxvi En una atmósfera inerte, a una solución del compuesto lxv (287 mg, 0,42 mmol) en
15 DCM anhidro (15 ml) se le añadió el reactivo DMP (605 mg, 1,43 mmol). La reacción se agitó durante 2 horas aproximadamente a la temperatura ambiente. (Nota.-La duplicación de la cantidad del reactivo DMP y el tiempo de reacción fue para garantizar que los dos grupos alcohólicos se oxidaban completamente para dar los grupos ceto correspondientes). El examen por TLC (gel de sílice: MeOH al 2%/EtOAc) mostró la conversión completa en el producto más
20 rápido. La reacción se diluyó con DCM (150 ml) y después se lavó dos veces con una solución acuosa al 10% de sulfito sódico (2 x 50 ml), dos veces con NaHCO3 acuoso saturado y con salmuera. La fase orgánica se separó, se secó sobre MgSO4 y el disolvente se retiró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía (gel de sílice: de EtOAc al 50%/DCM a
80:19:1 de EtOAc/DCM/MeOH), dando el compuesto lxvi con un rendimiento del 77%.
208 imagen1
Ejemplo Intermedio 62 -Compuesto lxvii A una solución en DCM (60 ml) de ácido L-3 fenil láctico (2 g, 12 mmol) se le añadió PyBOP (7,5 g, 14,4 mmol). A esta solución se le añadió una solución en DCM (20 ml) que
5 contenía éster metílico de L-valina HCl (2,4 g, 14,4 mmol) y DIPEA (2,6 ml, 14,4 mmol). La mezcla de reacción resultante se agitó durante una noche aproximadamente a la temperatura ambiente. En este punto, la reacción se diluyó con EtOAc (30 ml) y se lavó con NaHCO3 (30 ml) y salmuera (15 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. La purificación se consiguió en EtOAc al 50%/Hex sobre gel de sílice, dando 2,97 g (89%) del
10 compuesto lxvii, imagen1
Ejemplo Intermedio 63 -Compuesto lxviii El compuesto lxvii (2,97 g, 10,6 mmol) se recogió en DCM (50 ml) y se enfrió con un baño de hielo. A esta solución se le añadió TBSCI (2,1 g, 13,8 mmol) seguido de imidazol (0,94
15 g,13,8 mmol). La solución resultante se agitó durante una noche. Después, la reacción se diluyó con EtOAc (50 ml) y se lavó con NaHCO3 y salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. La purificación se consiguió en EtOAc al 20%/Hexano sobre gel de sílice, dando 3,79 g (90%) del compuesto lxviii, imagen1
20 Ejemplo Intermedio 64 -Compuesto lxix A una solución en metanol (50 ml) del compuesto lxviii (3,78 g, 9,6 mmol) se le añadió NaOH acuoso 1 N (14,4 ml, 14,4 mmol). La solución resultante se agitó durante una noche. El disolvente se retiró parcialmente al vacío. Después, el pH de la mezcla de reacción se redujo a
209
3 usando una solución acuosa 1 N de HCl. La solución se diluyó con EtOAc y salmuera. El producto deseado se extrajo con EtOAc (3 x 50 ml). Las fases orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron, dando 3,5 g (96%) del compuesto lxix, imagen1
5 Ejemplo Intermedio 65 -Compuesto lxx
A una solución en DCM (15 ml) que contenía el compuesto lxix (1,1 g, 2,9 mmol) se le añadió HOAt (0,44 g, 3,2 mmol) seguido de una solución 1 M de DCC (3,2 ml, 3,2 mmol) en DCM. Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante 20 minutos, se añadió una solución en DCM (15 ml) del compuesto xxxix (970 mg, 3,2 mmol). Esta reacción se
10 agitó durante una noche en una atmósfera de N2. Después, la reacción se diluyó con EtOAc (30 ml), se filtró a través de una capa de gel de sílice y se lavó con HCl 0,1 N, NaHCO3 y salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró al vacío. La purificación se consiguió en EtOAc al 50%/Hex sobre gel de sílice, dando 1,5 g (77%) del compuesto lxx, imagen1
15 Ejemplo Intermedio 66 -Compuesto lxxi A una solución en metanol (30 ml) del compuesto xx (1,5 g, 2,4 mmol) se le añadió NaOH acuoso 1 N (3,6 ml, 3,6 mmol). La solución resultante se agitó durante una noche. En este punto, el disolvente se retiró parcialmente y el pH de la mezcla de reacción se ajustó a 3 usando HCl acuoso 1 N. Después, la reacción se diluyó con EtOAc (50 ml) y salmuera (20 ml).
20 La fase acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 50 ml). Las fases orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron, proporcionando 1,3 g (92%) del compuesto lxxi,
210 imagen1
Ejemplo Intermedio 67 -Compuesto lxxii A una solución de DCM (2 ml) que contenía el compuesto lxxi (180 mg, 0,28 mmol) se le añadieron PyBOP (175 mg, 0,34 mmol) y DIPEA (0,06 ml, 0,34 mmol), seguido de una solución
5 en DCM (3 ml) del compuesto x (150 mg, 0,41 mmol). La solución resultante se agitó durante una noche en una atmósfera de N2. Después, la reacción se diluyó con EtOAc (30 ml) y se lavó con NaHCO3 y salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. La purificación se consiguió en EtOAc al 100% sobre gel de sílice, dando 270 mg (98%) del compuesto lxxii,
10 imagen1
Ejemplo Intermedio 68 -Compuesto lxxiii
A una solución en DCM (3 ml) del compuesto lxxii (270 mg, 0,27 mmol) se le añadió reactivo DMP (140 mg, 0,33 mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante 1,5 horas, la reacción se interrumpió con Na2SO3 al 10% (10 ml). La reacción
15 se diluyó con EtOAc (30 ml) y se agitó durante 10 minutos. La fase orgánica se lavó con NaHCO3 y salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. La purificación se consiguió en EtOAc al 60%/Hex., dando 150 mg (56%) del compuesto lxxiv,
211 imagen1
Ejemplo Intermedio 69 -Compuesto lxi A una solución en etanol (50 ml) del compuesto ii (3,5 g, 10,5 mmol) se le añadió Pd(OH)2/C (1,47 g, contenido de Pd del 20%, 2,1 mmol) en una corriente de nitrógeno. La
5 reacción se sometió a hidrogenación a una presión de 1 atm. Cuando se completó, los catalizadores se filtraron a través de una capa de Celite y se lavó con diclorometano. Los filtrados se concentraron al vacío, dando 2 g (96%) del compuesto lxi. Ejemplo Intermedio 70 -Compuesto lxxiv
A una solución en DMF (60 ml) del compuesto vii (9,1 g, 28,2 mmol) se le añadieron
10 HOAt (4 g, 29,4 mmol) y 1,3-disiopropilcarbodiimida (3,7 g, 29,4 mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante 30 minutos, a la solución anterior se le añadió una solución en DMF (10 ml) del compuesto lxi (5,1 g, 25,6 mmol). La reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. En este punto, los sólidos de color blanco se retiraron por filtración. Los filtrados se concentraron al vacío, dando un residuo
15 que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice, dando 9,5 g (67%) del compuesto lxxiv, imagen1
Ejemplo Intermedio 71 -Compuesto lxxv A una solución del compuesto lxxiv (1,5 g, 3 mmol) en THF anhidro (25 ml) se le añadió EtiPr2N (0,78 ml, 4,5 mmol) aproximadamente a la temperatura ambiente. La mezcla se enfrió a
20 0ºC y se añadió gota a gota MOMCI (1,5 ml, 19,7 mmol). La reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante una noche. Después, la solución se diluyó con éter y se lavó con agua (3 veces). Las fases acuosas se extrajeron adicionalmente con éter y todas las fases orgánicas se secaron sobre MgSO4 antes de concentrarse, proporcionando un aceite de color amarillo. El isómero deseado del compuesto lxxv se aisló por cromatografía sobre gel
212
de sílice (5/2 de EtOAc/Hexanos) imagen1
con un rendimiento del 40% con una separación limpia de diastereómeros.
Ejemplo Intermedio 72 -Compuesto lxxvi
5 A una solución del compuesto lxxv (502 mg, 0,9 mmol) en EtOH (5 ml) se le añadió gota a gota NaOH acuoso 2 N (0,9 ml, 1,8 mmol) a 0ºC. La reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante una noche. Después de que se completara la saponificación, la solución se acidificó a pH 3 con resina ácida Dowex 50W8X-200. Los sólidos se retiraron por filtración y el filtrado resultante se concentró al vacío, dando un residuo oleoso que se liofilizó,
10 dando 370 mg (80%) del compuesto lxxvi, imagen1
Ejemplo Intermedio 73 -Compuesto lxxvii Una solución en diclorometano (4 ml) del compuesto lxxvi (110 mg, 0,21 mmol) se trató con PyBOP (200 mg, 038 mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura
15 ambiente durante 30 minutos, la mezcla de reacción se cargó con una solución en THF (3,2 ml) del compuesto xiii (60 mg, 0,32 mmol), seguido de EtiPr2N. Después de agitar durante una noche aproximadamente a la temperatura ambiente, la reacción se interrumpió con agua y se extrajo con EtOAc. La fase orgánica resultante se lavó con salmuera y se secó sobre MgSO4, antes de concentrarse para dar un aceite de color amarillo. La purificación por cromatografía
20 sobre gel de sílice (EtOH al 5%/EtOAc) dio 143 mg (100%) del compuesto lxxvii, imagen1
Ejemplo Intermedio 74 -Compuesto lxxviii
213
A una solución en THF (50 ml) de H-Chg-OH 2 (5 g, 19,4 mmol) se le añadieron HOBt (2,63 g, 19,4 mmol) y EDCI (3,72 g, 19,4 mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante 20 minutos, a la solución anterior se le añadió una solución en THF (19 ml) y DMF (10 ml) que contenía clorhidrato de éster metílico de terc-L-Leucina (19,4 mmol) y DIPEA (6,75 ml, 38,8 mmol). La reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. El tratamiento acuoso convencional y la cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 15 -20%/Hexanos) proporcionaron 2,27 g (30%) del compuesto lxxviii, imagen1
Ejemplo Intermedio 75 -Compuesto lxxix
A una solución en THF (12 ml) del compuesto lxxviii (2,27 g, 5,91 mmol) se le añadió una solución 4 N de HCl en dioxano (7,38 ml, 29,5 mmol). La reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. En este punto, el disolvente se retiró a presión reducida, dando el compuesto lxxix que se usó directamente para la siguiente reacción. imagen1
15
Ejemplo Intermedio 76 -Compuesto lxxx
A una solución en THF del compuesto lxxix (5,9 mmol) se le añadió una solución en
THF (20 ml) que contenía ácido 2-pirazincarboxílico (878 mg, 7,08 mmol), HOBt (957 mg, 7,08
mmol) y EDCI (1,36 g, 7,08 mmol). Después, a la mezcla resultante se le añadió DIPEA (2,05
20 ml, 11,8 mmol). La reacción se agitó durante una noche aproximadamente a la temperatura ambiente y después se interrumpió con agua. La mezcla de reacción se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se lavó con salmuera y se concentró al vacío, proporcionando un residuo que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 40-50%/Hexanos), proporcionando 1 g (36%) del compuesto lxxx,
214 imagen1
Ejemplo Intermedio 77 -Compuesto lxxxi
A una solución en metanol (20 ml) del compuesto lxxx (1 g, 2,56 mmol) se le añadió NaOH 2 N (3,2 ml, 6,4 mmol). La reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. En este punto, la reacción se acidificó a pH 3 usando HCl 5 N. La reacción se diluyó con EtOAc (75 ml) y se lavó con agua y salmuera. La fase orgánica obtenida de esta manera se secó y se concentró al vacío, dando un residuo que se disolvió en 1:1 de CH3CN/H2O para la liofilización. Se obtuvo un total de ~1 g (100%) del compuesto lxxxi. imagen1
10 Ejemplo Intermedio 78 -Compuesto lxxxii Una solución en diclorometano (10 ml) del compuesto lxxxi (2,56 mmol) se trató con HOAt (348 mg, 2,56 mmol) y DCC (2,56 ml, 1 M, 2,56 mmol). Después de agitar durante 30 minutos, la mezcla de reacción se trató con una solución en THF (5 ml) del compuesto v (2,56 mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche, los
15 sólidos de color blanco (urea) se retiraron por filtración. Los filtrados se concentraron al vacío, dando un residuo que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice, proporcionando 1,4 g (100%) del compuesto lxxxii, imagen1
Ejemplo Intermedio 79 -Compuesto lxxxiii Una solución en etanol (15 ml) del compuesto lxxxii (1,4 g, 2,58 mmol) se trató con
215
NaOH 2 N (2,58 ml, 5,17 mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche, la mezcla de reacción se acidificó a pH 3 con resina ácida. Los sólidos se retiraron por filtración. Los filtrados resultantes se concentraron al vacío, dando un residuo que se liofilizó, dando 1,32 g (~100%) del compuesto lxxxiii, imagen1
5
Ejemplo Intermedio 80 -Compuesto lxxxiv
Una solución en diclorometano (15 ml) del compuesto lxxxiii (360 mg, 0,7 mmol) se trató con PyBOP (582 mg, 1,12 mmol). Después de agitar aproximadamente a la temperatura ambiente durante 20 minutos, la mezcla de reacción se trató con una solución en THF (10 ml)
10 del compuesto xiii (195,6 mg, 1,05 mmol), seguido de DIPEA (0,25 ml, 1,40 mmol). Después de agitar durante una noche aproximadamente a la temperatura ambiente, la reacción se interrumpió con agua y se extrajo con EtOAc. La fase orgánica resultante se lavó con salmuera, se secó y se concentró al vacío, dando un residuo que se purificó por cromatografía sobre gel imagen41
15
Ejemplo Intermedio 81 -Compuesto ii'"
Una mezcla de diclorometano anhidro y éter (20 ml:20 ml) se enfrió a -78ºC en una
atmósfera de N2 (g). A la solución se le añadió TiCl4 (1 M en diclorometano, 10 ml, 10 mmol) y
posteriormente se le añadió MeLi (1,4 M en éter, 7,1 ml, 10 mmol) con agitación durante 30
20 minutos más a -78ºC. A la mezcla se le añadió gota a gota una solución del compuesto i (2 g, 6 mmol) en 10 ml de diclorometano a la misma temperatura durante 15 minutos. La solución se calentó lentamente a -40ºC durante 10 minutos y después se agitó a 0ºC durante 2 horas. La reacción se interrumpió vertiendo la mezcla en una mezcla de agua/éter (1:1) y después se dejó que las fases se separaran. La fase acuosa se extrajo adicionalmente dos veces con éter.
25 Todas las fases orgánicas se lavaron con agua y salmuera y se secaron sobre MgSO4 antes de
216
concentrarse, dando un aceite de color amarillo. El compuesto deseado ii"' se aisló por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc/Hexanos 2/1) en un 83% imagen1
Ejemplo Intermedio 82 -Compuesto lxi'
Al compuesto ii"' (1,7 g, 5 mmol) se le añadió Pd al 10% en peso sobre C (0,53 g, 0,5 mmol), seguido de la adición de MeOH (17 ml). Se pasó abundantemente gas hidrógeno a través de la mezcla de reacción y el gas hidrógeno se mantuvo para la reacción a 1 atm durante una noche. Después, la mezcla de reacción se filtró y se concentró, proporcionando 929 mg (87%) del compuesto lxi' en forma de un aceite incoloro. imagen1
10
Ejemplo Intermedio 83 -Compuesto lxxxv
A una solución en THF (16 ml) del compuesto xxii (1 g, 3 mmol) se le añadió HOAt (0,41
g, 3 mmol) aproximadamente a la temperatura ambiente seguido de una solución 1 M en DCC
de diclorometano (3 ml, 3 mmol). Después de agitar durante 30 minutos aproximadamente a la
15 temperatura ambiente, al ácido HOAt-activado anterior se le añadió una solución en diclorometano (6 ml) del compuesto lxi'. La reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche. En este punto, la reacción se filtró a través de Celite. El filtrado se diluyó con EtOAc (120 ml) y se lavó con agua y después con salmuera. La fase orgánica se secó y se concentró, dando un aceite de color amarillo que se purificó por
20 cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 100%), dando 1 g (65%) del compuesto lxxxv, imagen1
Ejemplo Intermedio 84 -Compuesto lxxxvi
A una solución en etanol (8 ml) del compuesto lxxxv (920 mg. 1,7 mmol) se le añadió una solución acuosa 2 N de NaOH (1,7 ml, 3,4 mmol). La reacción se agitó durante una noche 25 aproximadamente a la temperatura ambiente y después se acidificó a pH 3 con resina ácida Dowex. Los sólidos se retiraron por filtración y el filtrado se concentró, dando un aceite
217
incoloro, que se disolvió de nuevo en 1:1 de CH3CN/H2O y se liofilizó, proporcionando 800 mg (93%) del compuesto lxxxvi. El análisis por HPLC mostró un solo pico de producto. imagen1
Ejemplo Intermedio 85 -Compuesto lxxxvii
5 A una solución en diclorometano (4 ml) del compuesto lxxxvi (150 mg, 0,3 mmol) se le añadió PyBOP (250 mg, 0,47 mmol). La solución se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante 30 minutos. Después, a esta solución se le añadió una solución en THF (4,5 ml) del compuesto xiii (84 mg, 0,45 mmol) seguido de EtiPr2N (0,1 ml, 0,6 mmol). La reacción se agitó aproximadamente a la temperatura ambiente durante una noche y después se
10 interrumpió con agua (25 ml) durante 30 minutos. Después, la mezcla se extrajo con EtOAc. La fase orgánica resultante se lavó con salmuera y se secó sobre MgSO4, antes de concentrarse, dando un aceite de color amarillo. La purificación por cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 5%/EtOAc) dio 200 mg (100%) del compuesto lxxxvii, imagen1
15 Ejemplo Intermedio 86 -Compuesto lxxxix El compuesto lxxxviii, N-Cbz-L-Valina, (2,5 g, 9,9 mmol) se recogió en THF (30 ml). imagen1
Se añadieron EDCI (2,29 g, 11,9 mmol) y HOBT (1,62 g, 11,9 mmol) y la mezcla se agitó durante cinco minutos. Se añadió clorhidrato de éster metílico de L-terc-Leucina (2,17 g, 11,9
20 mmol) en THF (23,9 ml) seguido de DIPEA (2,1 ml). La mezcla de reacción se agitó durante una noche en una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con HCl 1 N, bicarbonato sódico saturado y salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró. El residuo concentrado se purificó en acetato de etilo al 25%/hexano, proporcionando 1,1 g (29%) del compuesto lxxxix,
218 imagen1
Ejemplo Intermedio 87 -Compuesto lxxxx
El compuesto lxxxix se hidrolizó en condiciones convencionales usando alcohol metílico (0,3 M) y NaOH 1 N (1,5 equiv.), proporcionando 1,03 g (95%) del compuesto lxxxx, imagen1
5
Ejemplo Intermedio 88 -Compuesto lxxxxi
El compuesto lxxxx (385 mg, 1,06 mmol) se recogió en diclorometano (3 ml) y se añadió DCC (1,4 mmol) seguido de HOAt (190 mg, 1,4 mmol). Después, se añadió el compuesto v (260 mg, 1,4 mmol) en diclorometano (3 ml). La mezcla resultante se agitó durante una noche
10 en una atmósfera de nitrógeno. La reacción se diluyó con acetato de etilo, se filtró a través de gel de sílice y se concentró. El residuo se purificó en acetato de etilo al 50%/hexano, proporcionando 440 mg (80%) del compuesto lxxxxi, imagen1
Ejemplo Intermedio 89 -Compuesto lxxxxii
El compuesto lxxxxi se hidrolizó en condiciones convencionales usando alcohol etílico
(0,3 M) y NaOH 1 N (1,5 equiv.), proporcionando 390 mg del compuesto lxxxxii, imagen1
Ejemplo Intermedio 90 -Compuesto lxxxxiii
El compuesto lxxxxii (350 mg, 0,7 mmol) se recogió en diclorometano (3 ml). Se añadió 20 PyBOP (480 mg, 0,91 mmol) seguido del compuesto xiii (170 mg, 0,91 mmol). Se añadió DIPEA (0,16 ml, 0,91 mmol) y mezcla de reacción se agitó durante una noche. La mezcla de
219
reacción se concentró y se purificó en acetato de etilo al 100%, proporcionando 420 mg (90%) del compuesto lxxxxiii, imagen1
Ejemplo Intermedio 91 -Compuesto lxxxxiv
El compuesto lxxxviii se hidrogenó usando Pd al 10%/C (1% mol) en alcohol metílico en
una atmósfera de hidrógeno, proporcionando 335 mg (100%) del compuesto lxxxxiv, imagen1
Ejemplo Intermedio 92 -Compuesto lxxxxv Se recogió 1H-tetrazol-5-acetato de etilo (5 g, 32 mmol) en cloroformo (80 ml). Se
10 añadió ácido tricloroacético (12,03 g, 73,65 mmol) seguido de alfa metil estireno (3,78 g, 32 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante una noche. Al día siguiente, la solución se diluyó con acetato de etilo y se lavó con KOH al 10% y salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró, proporcionando 8 g (96%) del tetrazol-5acetato de etilo N-protegido correspondiente. Este material se sometió a condiciones de
15 hidrólisis convencional usando alcohol etílico (0,3 M) y NaOH 1 N (3 equiv.), proporcionando 7 g (99%) del compuesto lxxxxv,
imagen1
Ejemplo Intermedio 93 -Compuesto lxxxxvi El compuesto lxxxxv (3,62 g, 14,7 mmol) se recogió en diclorometano (50 ml). Se
20 añadieron EDCI (4,32 g, 22,1 mmol) y DIPEA (5,1 ml, 29,4 mmol) y se agitaron durante cinco minutos. Se añadió N-hidroxisuccinimida (3,38 g, 29,4 mmol) y se agitó durante tres horas. La reacción se diluyó con diclorometano y se lavó tres veces con agua. La fase orgánica se secó
220
sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró, proporcionando 3,66 g (73%) del compuesto lxxxxvi,
imagen1
Ejemplo Intermedio 94 -Compuesto lxxxxvii
5 El compuesto lxxxxiv (335 mg, 0,62 mmol) y el compuesto lxxxxvi (343 mg, 1 mmol) se recogieron en diclorometano (6 ml). Se añadió DIPEA (0,17 ml, 1 mmol) y mezcla de reacción se agitó durante una noche. La reacción se diluyó con acetato de etilo, se lavó con bicarbonato sódico saturado y salmuera y se concentró. El residuo se purificó en alcohol etílico al 5%/acetato de etilo, dando 80 mg (16%) del compuesto lxxxxvii,
10
imagen1
Ejemplo Intermedio 95 -Compuesto lxxxxviii
El compuesto lxxxxvii (80 mg, 0,11 mmol) se recogió en diclorometano (3 ml). A esta solución se le añadió reactivo DMP (55 mg, 0,13 mmol) y se agitó durante una hora. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se inactivó con una solución al 10% de sulfito
15 sódico. La fase orgánica se lavó con bicarbonato sódico saturado y salmuera. La fase orgánica se concentró y el residuo resultante se purificó en acetato de etilo al 100%, proporcionando 40 mg (48%) del compuesto lxxxxviii,
imagen1
Ejemplo Intermedio 96 -Compuesto xxxix El compuesto ic, éster metílico de N-Cbz-4-Hidroxi Pro (2,1 g, 7,9 mmol, se preparó con
221
imagen1
rendimiento cuantitativo a partir del compuesto c, N-Cbz-4-hidroxi Pro), se disolvió en DCM (25 ml).
imagen1
5 A la solución se le añadieron CDI (1,54 g, 9,5 mmol) y DIPEA (1,7 ml, 9,5 mmol) y se agitó durante 10 minutos. A la mezcla de reacción se le añadió gota a gota 1,2,3,4Tetrahidroisoquinolina (TIQ) (1,2 ml, 9,5 mmol) y se agitó durante cinco horas. La fase orgánica se lavó con agua, HCl 1 N y salmuera. Después de la concentración de la fase orgánica libre, el residuo resultante se purificó cromatográficamente con EtOAc al 40%/Hexanos, dando el
10 compuesto ci, éster metílico de N-Cbz-4-TIQcarboniloxi-Pro (2,5 g, 75%).
imagen1
El compuesto ci (2,5 g, 5,9 mmol) se disolvió en MeOH (75 ml). La solución se lavó
abundantemente con N2 y se añadió Pd/C (10%, 300 mg). La mezcla de reacción se lavó
abundantemente con H2 y se agitó durante una noche. La mezcla de reacción se filtró a través
15 de Celite y se concentró, dando el compuesto xxxix, éster metílico de 4-(TIQ-carboniloxi)-Pro, (1,49 g, 83%). Ejemplo Intermedio 97 -Compuesto vii El compuesto cii, éster metílico de N-pirazin-2-ilcarbonil-Val-Val, (10,9 g, 32,4 mmol)
imagen1
20 se disolvió en THF (80 ml) y después se añadió NaOH acuoso (48,6 ml, 48,6 mmol). La mezcla
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resultante se agitó durante 48 horas, después se añadió más cantidad de NaOH (16,3 ml, 16,3 mmol) y la mezcla se calentó a 40ºC durante tres horas. Después, el pH de la mezcla de reacción se redujo a 3, y la fase acuosa se extrajo con EtOAc y después se concentró, dando el compuesto en bruto vii, ácido N-pirazin-2-ilcarbonil-Val-Val (10,6 g, 100%).
5 Ejemplo Intermedio 98 -Compuesto ciii
El compuesto cii (4,1 g, 12,7 mmol) se disolvió en DCM (20 ml). A esta solución se le añadieron HOAt (1,73 g, 12,7 mmol) y DCC (12,7 mmol) y la solución se agitó durante una hora. El compuesto xxxix (3,22 g, 10,6 mmol) se añadió a mezcla de reacción en DCM (10 ml). La mezcla resultante se agitó durante una noche en una atmósfera de N2. La mezcla de
10 reacción se filtró a través de gel de sílice y se concentró. El residuo resultante se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (gradiente de EtOAc del 50% al 80%/Hexanos), dando el compuesto ciii, éster metílico de N-pirazin-2-ilcarbonil-Val-Val-4-(TIQcarboniloxi)-Pro, (5,27 g, 81,7%).
imagen1
15 Ejemplo Intermedio 99 -Compuesto civ El compuesto ciii (650 mg, 1,29 mmol) se disolvió en THF (5 ml). A la solución se le añadió NaOH acuoso (1,42 ml, 1,42 mmol) y después se agitó durante una noche. El pH de la solución se redujo a 3 y la fase orgánica se aisló y se concentró, dando un residuo. El residuo se purificó usando HPLC de fase inversa en acetonitrilo/agua, dando el compuesto civ, ácido N
20 pirazin-2-ilcarbonil-Val-Val-4-(TIQcarboniloxi)-Pro, (600 mg, 95%).
imagen1
Ejemplo Intermedio 100 -Compuesto cv
Se combinaron N-Boc-L-terc-Leucina (2,3 g, 10 mmol) y clorhidrato de éster metílico de L-terc-Leucina (2 g, 11 mmol) en DMF (30 ml). Después, a la solución se le añadió HOAt (1,6 g,
223
11,5 mmol). La mezcla resultante se agitó durante 20 minutos en una atmósfera de N2 y después se redujo a 0ºC, tras lo cual se añadieron DIC (1,8 ml, 11,5 mmol) y 2,4,6-colidina (1,45 ml. 11 mmol). La solución resultante se agitó durante una noche con calentamiento a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y la fase orgánica se lavó con HCl 1 N, NaHCO3 saturado y salmuera. Después de la concentración de la fase orgánica, el residuo resultante se purificó cromatográficamente con un gradiente de EtOAc al 20% 30%/hexanos, dando el compuesto cv (3,3 g, 92%).
imagen1
Ejemplo Intermedio 101 -Compuesto cvi
El compuesto cv (3,3 g, 9,2 mmol) se hidrolizó usando dioxano (40 ml) y NaOH 0,5 N
(37 ml, 18,4 mmol), dando el compuesto cvi (2,9 g, 92%).
imagen1
Ejemplo Intermedio 102 -Compuesto cvii El compuesto cvi (2 g, 5,8 mmol) y el compuesto v (1 g, 5,5 mmol) se disolvieron en
15 DMF (20 ml). Después, a la solución se le añadieron HOAt (832 mg, 6,6 mmol) y DIC (1,1 ml, 6,6 mmol). La solución resultante se agitó durante una noche en una atmósfera de N2. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y la fase orgánica se lavó con HCl 1 N, NaHCO3 saturado y salmuera. Después de la concentración de la fase orgánica, el residuo resultante se purificó cromatográficamente con un gradiente de EtOAc al 20%-30%/hexanos, dando el
20 compuesto cvii (2,4 g, 81%).
imagen1
Ejemplo Intermedio 103 -Compuesto cviii
El compuesto cvii (2,4 g, 4,72 mmol) se disolvió en DCM (10 ml). A la solución se le añadió TFA (10 ml). La solución resultante se agitó durante 4 horas. La mezcla de reacción se
224
concentró, se disolvió en EtOAc y después la fase orgánica se lavó con NaOH 1 N y salmuera. La fase orgánica se concentró, dando el compuesto cviii (1,084 g, 56,1%).
imagen1
Ejemplo Intermedio 104 -Compuesto cix
5 Se disolvieron ácido 2-pirazincarboxílico (181 mg, 1,46 mmol) y el compuesto cviii (541 mg, 1,325 mmol) en DMF (15 ml). A la solución se le añadieron HOAt (207 mg, 1,52 mmol) y DIC (0,24 ml, 1,52 mmol). La solución resultante se agitó durante una noche en una atmósfera de N2. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y la fase orgánica se lavó con HCl 1 N, NaHCO3 saturado y salmuera. Después de la concentración de la fase orgánica, el residuo
10 resultante se purificó cromatográficamente con un gradiente de EtOAc al 20%-30%35%/hexanos, dando el compuesto cix (430 mg, 63%).
imagen1
Ejemplo Intermedio 105 -Compuesto cx El compuesto cix se hidrolizó usando EtOH (7 ml) y NaOH 1 N (4,7 ml, 4,7 mmol), 15 dando el compuesto ex (700 mg, 91,6%).
imagen1
Ejemplo Intermedio 106 -Compuesto cxi El compuesto cx (690 mg, 1,42 mmol) se disolvió en DCM (9 ml). Después, a la solución se le añadió PyBOP (890 mg, 1,7 mmol), seguido de la adición del compuesto xiii' (320 mg, 1,7 20 mmol).
225
imagen1
A la mezcla resultante se le añadió DIPEA (0,3 ml, 1,7 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante una noche en una atmósfera de N2. Después, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con NaHCO3 saturado y salmuera. Después de la concentración de la fase orgánica, el residuo resultante se purificó cromatográficamente con EtOAc al 100%, dando el compuesto cxi (490 mg, 52,7%).
imagen1
Ejemplo Intermedio 107 -Compuesto cxiv El compuesto cxii (1,2 g, 3,06 mmol) se disolvió en MeOH (12 ml). Después de lavar de 10 forma abundante y minuciosa
imagen1
con N2, se añadió Pd(OH)2 al 10% en peso sobre carbono (0,6 g) y la mezcla se hidrogenó durante una noche, después de lo cual se mostró por TLC (EtOAc al 30%/hexanos) que la mezcla de reacción se había completado. La solución se aisló del material sólido por filtración y
15 se concentró, dando el compuesto desprotegido correspondiente cxiii en forma de un aceite incoloro (100%)
imagen1
que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. Se disolvió ácido 2-pirazincarboxílico (400 mg, 3,2 mmol, 1,1 equiv.) en DCM/THF (4 20 ml/4 ml) y después se añadieron HOAt (440 mg, 3,2 mmol) y DCC (343 ml, 1 M en DCM).
226
Después de agitar a temperatura ambiente durante 20 minutos, el compuesto cxiii (0,96 g, 3,2 mmol) obtenido previamente se disolvió en DCM (6,4 ml) y se añadió a la mezcla activada. Después de agitar durante una noche a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtró a través de Celite y el compuesto cxiv se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al 30%/hexanos)
imagen1
produciendo un sólido de color blanco (0,8 g, 80%).
Ejemplo Intermedio 108 -Compuesto cxv El compuesto cxiv (0,8 g, 2,2 mmol) se disolvió en MeOH (10 ml.) y después se añadió
10 NaOH 2 N (ac.) (3,3 ml, 6,6 mmol). La solución se agitó a temperatura ambiente durante una noche, después de lo cual se indicó que la mezcla de reacción se había completado mediante análisis por TLC (EtOAc al 50%/hexanos). La acidificación a pH 3 con HCl 5 N y la dilución con EtOAc se siguieron de extracción de la fase orgánica. La fase orgánica extraída se lavó con salmuera y se secó sobre MgSO4, dando el compuesto cxv (0,74, 95%) después de la
15 concentración.
imagen1
Ejemplo Intermedio 109 -Compuesto cxvi A una solución en DCM (6 ml) del compuesto cxv (0,74 g, 2,1 mmol) a temperatura ambiente se le añadió HOAt (290 mg, 2,1 mmol), seguido de la adición de una solución 1 M de
20 DCC en DCM (2,2 ml, 2,2 mmol). Después de agitar durante 30 minutos a temperatura ambiente, al ácido HOAt-activado anterior se le añadió una solución en THF (10,5 ml, 0,2 M) del compuesto v (2,1 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche. En este punto, la mezcla de reacción se filtró a través de celite. El filtrado se diluyó con EtOAc (120 ml) y se lavó con agua y salmuera. La fase orgánica se secó y se concentró,
25 dando un aceite de color amarillo que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 50%/hexanos), dando el compuesto cxvi (0,714 g, 66%).
227
imagen1
Ejemplo Intermedio 110 -Compuesto cxvii
A una solución en EtOH del compuesto cxvi (0,7 g, 1,4 mmol) se le añadió una solución acuosa 2 N de NaOH (2 ml, 4 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente, después se acidificó a pH 3 con HCl 5 N y se diluyó con EtOAc, seguido de extracción de la fase orgánica. La fase orgánica extraída se lavó con salmuera y se secó sobre MgSO4, dando el compuesto cxvii (95%) después de la concentración.
imagen1
Ejemplo Intermedio 111 -Compuesto cxviii
A una solución en DCM/THF (10 ml/2 ml) del compuesto cvii (300 mg, 0,6 mmol) se le añadió PyBOP (416 mg, 0,8 mmol). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después, a esta solución se le añadió el compuesto xxxvi' (200 mg, 0,8 mmol), seguido de DIPEA
imagen1
15 (0,22 ml, 1,2 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche y después se interrumpió con agua (25 ml) durante 30 minutos. Después, la mezcla se extrajo con EtOAc. La fase orgánica resultante se lavó con salmuera y se secó sobre MgSO4, antes de concentrarse, dando un aceite de color amarillo. La purificación por cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 3-5%/EtOAc) dio el compuesto cxviii (335 mg, 76%).
228
imagen1
Ejemplo Intermedio 112 -Compuesto cxix A una solución en DCM (10 ml) del compuesto cxvii (340 mg, 0,6 mmol) se le añadió PyBOP (470 mg, 0,9 mmol). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos.
5 Después, a esta solución se le añadió el compuesto xiii' (170 mg, 0,9 mmol), seguido de DIPEA (0,24 ml, 1,2 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche y después se interrumpió con agua (25 ml) durante 30 minutos. Después, la mezcla se extrajo con EtOAc. La fase orgánica resultante se lavó con salmuera y se secó sobre MgSO4, antes de concentrarse, dando un aceite de color amarillo. La purificación por cromatografía sobre gel de
10 sílice (EtOH al 3-5%/EtOAc) dio el compuesto cxix (164 mg, 36%).
imagen1
Ejemplo Intermedio 113 -Compuesto xx Se disolvió N-Cbz-L-Valina (6,28 g, 25 mmol) en DCM (30 ml). A esta solución se le
añadieron HOBT (3,38 g, 25 mmol) y DCC (25 ml, solución 1 M) y se agitó durante cinco
15 minutos. A esta mezcla se le añadió clorhidrato de éster metílico de L-terc-Leucina (25 ml, solución 1 M) y se agitó durante una noche en una atmósfera de N2. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con HCl 1 N, NaHCO3 saturado y salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El residuo se purificó cromatográficamente con EtOAc al 20%-30%/hexanos, dando el compuesto xx (2,96 g, 31%).
20 Ejemplo Intermedio 114 -Compuesto xxi El compuesto xx (2,95 g, 7,8 mmol) se hidrogenó usando Pd al 10%/C (800 mg) en MeOH (40 ml) en una atmósfera de H2, dando la amina libre correspondiente que se muestra a continuación (1,9 g, 100%).
229
imagen1
Se disolvió ácido 2-pirazin-carboxílico (970 mg, 7,8 mmol) en DCM (20 ml). A esta solución se le añadió PyBOP (4,06 g, 7,8 mmol). A la solución se le añadió la amina libre (1,9 g, 7,8 mmol) en DCM (15 ml) y después se añadió DIPEA (1,36 ml, 7,8 mmol). La mezcla resultante se agitó durante una noche en una atmósfera de N2. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y la fase orgánica se lavó con NaHCO3 saturado y salmuera. Después de la concentración de la fase orgánica, el residuo se purificó cromatográficamente con EtOAc al 30%-40%/Hexanos, dando el compuesto xxi (2,07 g, 75,8%).
imagen1
10 Ejemplo Intermedio 115 -Compuesto xxii El compuesto xxi se hidrolizó usando MeOH (20 ml) y NaOH 1 N (3 equiv.), dando el compuesto xxii (1,82 g, 93,9%).
imagen1
Ejemplo Intermedio 116 -Compuesto xxiii
15 El compuesto xxii (895 mg, 2,66 mmol) se disolvió en DCM (10 ml). A la solución se le añadió DCC (3,2 mmol) y después se añadió HOAt (435 mg, 3,2 mmol). Después, se añadió el compuesto v (3,2 mmol) en THF (16 ml). La mezcla resultante se agitó durante una noche en una atmósfera de N2. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc, se filtró a través de gel de sílice y se concentró. El residuo resultante se purificó cromatográficamente con EtOAc al
20 50%/hexanos, dando el compuesto xxiii (730 mg, 54,8%). Ejemplo Intermedio 117 -Compuesto xxiv
El compuesto xxiii se hidrolizó usando EtOH (5 ml) y NaOH 1 N (1,5 equiv.) para producir el compuesto xxiv (690 mg, 100%). Ejemplo Intermedio 118 -Compuesto cxx
25 El compuesto xxiv (245 mg, 0,52 mmol) se disolvió en DCM (3 ml). A la solución se le
230
añadió PyBOP (330 mg, 0,62 mmol) y después se añadió el compuesto xiii' (120 mg, 0,62 mmol). A la mezcla resultante se le añadió DIPEA (0,11 ml, 0,62 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante una noche en una atmósfera de N2. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y la fase orgánica se lavó con NaHCO3 saturado y salmuera. Después de la concentración de la fase orgánica, el residuo se purificó cromatográficamente con EtOH al 5%/EtOAc, dando el compuesto cxx (220 mg, 60%).
imagen1
Ejemplo Intermedio 119 -Compuesto xiii' Se disolvió Boc-NVA-OH (24,96 g, 114,9 mmol) en THF (200 ml). A la solución se le 10 añadió en porciones CDI (22,35,137,8 mmol)
imagen1
y la solución se agitó durante 30 minutos. Se disolvió clorhidrato de N,O-Dimetilhidroxilamina (12,33 g, 126,4 mmol) en DMF (50 ml) y después a la solución se le añadió DIPEA (22 ml, 126,4 mmol). La solución en DMF se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 20
15 minutos y después se añadió a la solución en THF. La mezcla resultante se agitó durante un fin de semana en una atmósfera de N2. La mezcla de reacción se concentró al vacío hasta alcanzar un volumen total de 100 ml. Esta fase orgánica se lavó con HCl 1 N, NaHCO3 saturado y salmuera. La fase orgánica se concentró, dando el compuesto en bruto cxxi (25,3 g).
imagen1
20
A un matraz seco de fondo redondo de 1 l se le añadió LAH (107,3 mmol) en una atmósfera de N2 en una solución 1 M de Et2O. Esta solución se redujo a 0ºC y después se le añadió gota a gota el compuesto cxxi (97,5 mmol) en Et2O (100 ml). Después de que se completara la adición, la mezcla resultante se agitó durante 30 minutos. La mezcla de reacción
25 se interrumpió a 0ºC mediante la adición lenta de EtOAc (50 ml), seguido de la adición lenta de
231
una solución al 5% de KHSO4 (50 ml). Esta mezcla se agitó durante 30 minutos. La fase orgánica se lavó con HCl 1 N, NaHCO3 saturado y salmuera. La fase orgánica se concentró, dando el compuesto en bruto cxxii (22,28 g).
imagen1
5 El compuesto cxxii se disolvió en MeOH (100 ml). Se disolvió Na2S2O4 (16,82 g, 96,6 mmol) en agua (100 ml y después se añadió a la solución del compuesto cxxii a 0ºC. Esta mezcla se almacenó en el frigorífico (5ºC) durante una noche. A la mezcla de reacción se le añadió KCN (7,53 g, 115,9 mmol) en agua (100 ml) y se agitó durante 1,5 horas a temperatura ambiente. El compuesto se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml). La fase orgánica se lavó con
10 salmuera (3 x 50 ml), se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró, dando el compuesto en bruto cxxiii (15,86 g).
imagen1
El compuesto cxxiii (15,86 g) se disolvió en dioxano (100 ml). A esta solución se le añadió HCl concentrado (37%, 100 ml) seguido de anisol (10 ml) y se estableció un
15 calentamiento a reflujo (110ºC). La reacción se agitó durante 1,5 horas. Cuando la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, el disolvente se retiró al vacío, dando una pasta seca. El residuo se secó durante una noche a alto vacío, dando el compuesto en bruto cxxiv.
imagen1
El compuesto cxxiv (69,6 mmol) se disolvió en DMF (60 ml) y THF (60 ml). A la mezcla
20 se le añadió N-(Benciloxicarboniloxi)succinimida (17,33 g, 69,6 mmol), seguido de la adición de DIPEA (12,1 ml, 69,6 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante una noche en una atmósfera de N2. La mezcla se concentró a un volumen reducido (50 ml) y se diluyó con EtOAc. La fase orgánica se lavó con HCl 0,1 N (2 x 100 ml) y salmuera, dando el compuesto cxxv (17,5 g, 54,2% en cinco etapas).
232
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El compuesto cxxv (5,66 g, 20,14 mmol) se disolvió en DCM (60 ml). A esta solución se le añadieron PyBOP (12,57 g, 24,2 mmol) y HOBT (3,27 g, 24,2 mmol) y se agitó durante cinco minutos. La mezcla resultante se redujo a 0ºC y después se añadieron ciclopropilamina (1,67
5 ml, 24,2 mmol) y DIPEA (4,2 ml, 24,2 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante una noche con calentamiento a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se lavó con HCl 0,1 N, NaHCO3 saturado y salmuera. La fase orgánica después se concentró y se purificó cromatográficamente usando EtOAc al 70%/Hexanos, dando el compuesto cxxvi (3,18 g, 49,3%).
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El compuesto cxxvi (3,18 g, 9,94 mmol) se hidrogenó usando Pd al 10%/C (600 mg) en MeOH (70 ml). La mezcla de reacción se agitó durante una noche en una atmósfera de H2, se filtró a través de celite y se concentró, dando el compuesto en bruto xiii' (2,1 g, 100%).
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15 Ejemplo Intermedio 120 -Compuesto cxxvii Se disolvió N-Cbz-L-ciclohexilglicina (3 g, 10,3 mmol) en DCM (36 ml). A esta solución se le añadieron HOAt (1,5 g, 11-28 mmol) y DCC (11,28 ml, 11,28 mmol) y se agitó durante cinco minutos. A esta mezcla se le añadió clorhidrato de éster metílico de L-terc-Leucina (103 ml, solución 1 M, 10,3 mmol) y se agitó durante una noche en una atmósfera de N2. La mezcla
20 de reacción se filtró a través de celite, se aclaró con EtOAc y se concentró, dando un residuo que se purificó cromatográficamente usando EtOAc al 20%-30%/hexanos, dando el compuesto cxxvii (2,2 g, 52%).
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Ejemplo Intermedio 121 -Compuesto lxxix'
El compuesto cxxvii (2,2 g, 5,2 mmol) se hidrogenó usando Pd(OH)2 al 20%/C (1 g) en MeOH (15 ml) en una atmósfera de H2, dando el compuesto lxxix' (1,4 g, 98%).
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Ejemplo Intermedio 122 -Compuesto lxxx
Se disolvió ácido 2-pirazincarboxílico (360 mg, 2,9 mmol) en DCM (10 ml). A la solución se le añadió PyBOP (1,81 g, 3,5 mmol). Después, se añadió el compuesto lxxix' (825 mg, 2,9 mmol) en THF (10 ml), seguido de la adición de DIPEA (0,5 ml, 2,9 mmol). La mezcla resultante
10 se agitó durante una noche en una atmósfera de N2. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y la fase orgánica se lavó con NaHCO3 saturado y salmuera. El residuo resultante de la concentración de la fase orgánica se purificó cromatográficamente con EtOAc al 30%/Hexanos, dando el compuesto lxxx (780 mg, 69%). Ejemplo Intermedio 123 -Compuesto lxxxi
15 El compuesto lxxx se hidrolizó usando MeOH (10 ml) y NaOH 1 N (3 equiv.), dando el compuesto lxxxi (615 mg, 81,8%). Ejemplo Intermedio 124 -Compuesto lxxxii El compuesto lxxxi (610 mg, 1,6 mmol) se disolvió en DCM (10 ml). A la solución se le añadió DCC (1,94 ml, 1,94 mmol), seguido de la adición de HOAt (270 mg, 1,94 mmol).
20 Después, a la solución se le añadió el compuesto v (1,94 mmol) en THF (19,4 ml). La mezcla resultante se agitó durante dos noches en una atmósfera de N2. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc, se filtró a través de gel de sílice y se concentró. El residuo resultante se purificó cromatográficamente con EtOAc al 40%/hexanos, dando el compuesto lxxxii (450 mg, 83,4%).
25 Ejemplo Intermedio 125 -Compuesto lxxxiii El compuesto lxxxi se hidrolizó usando EtOH (10 ml) y NaOH 1 N (3 equiv.), dando el compuesto lxxxiii (650 mg, 99%).
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Ejemplo Intermedio 126 -Compuesto cxxviii
El compuesto lxxxiii (400 mg, 0,78 mmol) se disolvió en DCM (5 ml). A la solución se le añadió PyBOP (610 mg, 1,2 mmol), seguido del compuesto xiii' (230 mg, 1,2 mmol). A la mezcla resultante se le añadió DIPEA (0,2 ml, 1,2 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante una noche en una atmósfera de N2. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y la fase orgánica se lavó con NaHCO3 saturado y salmuera. Después de la concentración de la fase orgánica, el residuo se purificó cromatográficamente con un gradiente de EtOAc al 100% a EtOH al 5%/EtOAc, dando el compuesto cxxviii (365 mg, 68,7%).
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10 Ejemplo Intermedio 127 -Compuesto cxxx El compuesto lxxxiii (365 mg, 0,7 mmol) se disolvió en DCM (5 ml). A la solución se le añadió PyBOP (440 mg, 0,84 mmol), seguido de la adición del compuesto cxxix (0,84 mmol)
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en THF (8,4 ml). A la mezcla resultante se le añadió DIPEA (0,1 ml, 0,84 mmol). La mezcla de
15 reacción se agitó durante una noche en una atmósfera de N2. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y la fase orgánica se lavó con NaHCO3 saturado y salmuera. Después de la concentración de la fase orgánica, el residuo resultante se purificó cromatográficamente con EtOAc al 100%, dando el compuesto cxxx (350 mg, 70%).
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20 Ejemplo Intermedio 128 -Compuesto cxxxi El compuesto cxxv (2,54 g, 9,05 mmol) se disolvió en DCM (30 ml). A la solución se le
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añadieron PyBOP (5,65 g, 10,9 mmol) y HOBT (1,47 g, 10,9 mmol) y se agitó durante cinco minutos. La mezcla resultante se redujo a 0ºC, después de lo cual se añadieron (S)-(+)-3-Metil2-butilamina (1,27 ml, 10,9 mmol) y DIPEA (1,9 ml, 10,9 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante una noche con calentamiento a temperatura ambiente. La fase orgánica se lavó con HCl 0,1 N, NaHCO3 saturado y salmuera. Después de la concentración de la fase orgánica, el residuo resultante se purificó cromatográficamente con EtOAc al 30%/hexanos, dando el compuesto cxxxi (1,44 g, 45,5%).
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Ejemplo Intermedio 129 -Compuesto cxxix
El compuesto cxxxi (1,3 g, 3,7 mmol) se hidrogenó usando Pd al 10%/C (500 mg) en MeOH (40 ml). La mezcla de reacción se agitó durante una noche en una atmósfera de H2. La mezcla de reacción se filtró a través de celite y la fase orgánica se concentró, dando el compuesto en bruto cxxix (800 mg, 100%).
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15 Ejemplo Intermedio 130 -Compuesto cxxxiv El compuesto cxxxii (1,6 g, 3,7 mmol) se disolvió en MeOH (12 ml).
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Después de lavar de forma abundante y minuciosa con N2, se añadió Pd(OH)2 al 10% en peso sobre carbono (0,74 g) y la mezcla se hidrogenó durante una noche, después de lo cual se
20 mostró una mezcla de reacción completa mediante análisis por TLC (EtOAc al 30%/hexanos). La solución se aisló del material sólido por filtración y se concentró, dando el compuesto cxxxiii en forma de un aceite incoloro (100%) que se usó en la siguiente etapa
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sin purificación adicional. Se disolvió ácido 2-pirazincarboxílico (400 mg, 3,2 mmol, 1,1 equiv.) en DCM/THF (4 ml/ 4 ml) y después se añadieron HOAt (440 mg, 3,2 mmol) y DCC (3,3 ml, 1 M en DCM). Después de agitar a temperatura ambiente durante 20 minutos, el compuesto cxxxiii
5 (0,96 g, 3,2 mmol) obtenido previamente se disolvió en DCM (6,4 ml) y se añadió a la mezcla activada. Después de agitar durante 2 días a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtró a través de Celite y se concentró, dando un residuo que se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al 50%/hexanos), dando el compuesto cxxxiv en forma de un sólido de color blanco (1,06 g, 83%).
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Ejemplo Intermedio 131 -Compuesto cxxxv
El compuesto cxxxiv (1,06 g, 2,6 mmol) se disolvió en MeOH (10 ml) y después se añadió NaOH 2 N (ac.) (4 ml, 8 mmol). La solución se agitó a temperatura ambiente durante una noche, después de lo cual se indicó que la hidrólisis se había completado mediante
15 análisis por TLC (EtOAc al 50%/hexanos). La solución se acidificó a pH 3 con HCl 5 N, se diluyó con EtOAc y después la fase orgánica se extrajo. La fase orgánica extraída se lavó con salmuera y se secó sobre MgSO4, dando el compuesto cxxxv (100%) después de la concentración.
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20 Ejemplo Intermedio 132 -Compuesto cxxxvi A una solución en DCM (8 ml) del compuesto cxxxv (1,44 g, 3,7 mmol) a temperatura
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ambiente se le añadió HOAt (500 mg, 3,7 mmol) y después se le añadió una solución 1 M de DCC en DCM (3,7 ml, 3,7 mmol). Después de agitar durante 30 minutos a temperatura ambiente, al ácido HOAt-activado anterior se le añadió una solución en THF (18,5 ml, 0,2 M) del compuesto v (3,7 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite. Los filtrados se diluyeron con EtOAc (120 ml) y se lavaron con agua y salmuera. La fase orgánica se secó y se concentró, dando un aceite de color amarillo que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 70%/hexanos), dando el compuesto cxxxvi (1 g, 71%).
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10 Ejemplo Intermedio 133 -Compuesto cxxxvii A una solución en EtOH (8 ml) del compuesto cxxxvi (1 g, 1,8 mmol) se le añadió una solución acuosa 2 N de NaOH (2,7 ml, 5,4 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente, después se acidificó a pH 3 con HCl 5 N, se diluyó con EtOAc y después la fase orgánica se extrajo. La fase orgánica extraída se lavó con salmuera y se secó
15 sobre MgSO4, dando el compuesto cxxxvii (88%) después de la concentración.
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Ejemplo Intermedio 133 -Compuesto cxxxviii A una solución en DCM (10 ml) del compuesto cxxxvii (350 mg, 0,6 mmol) se le añadió PyBOP (450 mg, 0,86 mmol). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos.
20 Después, a esta solución se le añadió el compuesto xiii' (160 mg, 0,86 mmol) seguido de DIPEA (0,23 ml, 1,3 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche y después se interrumpió con agua (25 ml) durante 30 minutos. Después, la mezcla se extrajo con EtOAc. La fase orgánica extraída se lavó con salmuera y se secó sobre MgSO4, antes de concentrarse, dando un aceite de color amarillo. La purificación por cromatografía
25 sobre gel de sílice (EtOH al 5%/EtOAc) dio el compuesto cxxxviii (407 mg, 88%).
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Ejemplo Intermedio 134 -Compuesto cxxxix
Se disolvió ácido 5-metilisoxazol-3-carboxílico (200 mg, 2,05 mmol) en DCM (5 ml). A la solución se le añadió PyBOP (1,07 g, 2,05 mmol). A la solución se le añadió el compuesto lxxix' (582 mg, 2,05 mmol) en DCM (5 ml), seguido de la adición de DIPEA (0,36 ml, 2,05 mmol). La mezcla resultante se agitó durante una noche en una atmósfera de N2. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y la fase orgánica se lavó con NaHCO3 saturado y salmuera. La fase orgánica se concentró y el residuo resultante se purificó cromatográficamente con EtOAc al 30%/hexanos, dando el compuesto cxxxix (495 mg, 61,4%).
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Ejemplo Intermedio 135 -Compuesto cxxxx
El compuesto cxxxix se hidrolizó usando MeOH (10 ml) y NaOH 1 N (3 equiv.), dando el
compuesto cxxxx (430 mg, 90%).
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15 Ejemplo Intermedio 136 -Compuesto cxxxxi El compuesto cxxxx (380 mg, 1 mmol) se disolvió en DCM (5 ml). Después, a la solución se le añadió DCC (1,2 mmol), seguido de la adición de HOAt (165 mg, 1,2 mmol). Después, se añadió el compuesto v (1,2 mmol) en THF (12 ml). La mezcla resultante se agitó durante una noche en una atmósfera de N2. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc, se filtró a través de
20 gel de sílice y se concentró. El residuo resultante se purificó cromatográficamente con EtOAc al 35%/hexanos, dando el compuesto cxxxxi (320 mg, 58%).
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Ejemplo Intermedio 137 -Compuesto cxxxxii
El compuesto cxxxxi se hidrolizó usando EtOH (10 ml) y NaOH 1 N (3 equiv.), dando el compuesto cxxxxii (730 mg, 94,3%).
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Ejemplo Intermedio 138 -Compuesto cxxxxiii
El compuesto cxxxxii (240 mg, 0,46 mmol) se disolvió en DCM (5 ml). A la solución se le añadió PyBOP (295 mg, 0,56 mmol), seguido de la adición del compuesto xiii' (110 mg, 0,56 mmol). A la mezcla resultante se le añadió DIPEA (0,1 ml, 0,56 mmol). La mezcla de reacción
10 se agitó durante dos noches en una atmósfera de N2. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y la fase orgánica se lavó con NaHCO3 saturado y salmuera. Después de la concentración de la fase orgánica, el residuo resultante se purificó cromatográficamente con EtOAc al 90%/hexanos, dando el compuesto cxxxxiii (168 mg, 53%).
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15 Ejemplo Intermedio 139 -Compuesto cxxxxiv A una solución de NaOH (2 N, 42,1 ml, 84,2 mmol) a 5ºC se le añadió L-alanina (5,00 g, 56,1 mmol). Después de agitar durante 10 minutos, se añadieron simultáneamente gota a gota cloroformiato de metilo (6,5 ml, 84,2 mmol) y NaOH (2 N, 42,1 ml, 84,2 mmol). La solución se agitó en un baño de hielo durante 2 horas y después a temperatura ambiente durante 1 hora.
20 La mezcla se lavó con Et2O (2 x 50 ml), la fase acuosa se neutralizó a pH ~2 con HCl 5 N y se
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extrajo con EtOAc (3 x 50 ml). La fase orgánica extraída se lavó con salmuera, se secó con MgSO4 y se concentró, dando el compuesto cxxxxiv,
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N-carbometoxi-L-alanina. (4,54 g, 54%) en forma de un aceite incoloro. Ejemplo Intermedio 140 -Compuesto cxxxxvi Una solución del compuesto cxxxxv (3,57 g, 9,44 mmol) en THF at 5ºC se trató con HOAt (1,28 g, 9,44 mmol)
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y después se añadió DCC (9,50 ml, 9,50 mmol). Después de agitar en un baño de hielo durante
10 45 minutos, se añadió una solución del compuesto v (104 ml, 10,4 mmol) en THF. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla se enfrió a 5ºC y se interrumpió con NaHCO3 saturado. Después de la filtración para retirar el DCU precipitado, la mezcla se disolvió en EtOAc (100 ml), se lavó con NaHCO3 saturado y salmuera y después se secó con MgSO4 y se concentró, dando un residuo que se purificó por cromatografía en columna sobre
15 sílice (EtOAc al 25%/Hexanos), dando el compuesto cxxxxvi (2,91 g, 57%) en forma de una espuma gomosa.
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Ejemplo Intermedio 141 -Compuesto cviii A una solución del compuesto cxxxxvi en MeOH (25 ml) enfriada con un baño de hielo
20 en una corriente de N2 se le añadió lentamente Pd/C. La mezcla se hidrogenó a 1 atm durante una noche. El catalizador se retiró por filtración y el filtrado se combinó con 5 ml de DMF y se secó al vacío, dando el compuesto cviii. Ejemplo Intermedio 142 -Compuesto cxxxxvii
Una solución del compuesto cxxxxiv (0,298 g, 2,03 mmol) y HOAt (0,276 g, 2,03 mmol)
241
en THF enfriada en un baño de hielo se trató con DCC (2,05 ml, 2,05 mmol). Después de agitar en un baño de hielo durante 0,5 horas, se añadió una solución del compuesto cviii en THF y después se añadió DIPEA (0,39 ml, 2,2 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una noche, después se enfrío en un baño de hielo y se inactivó con NaHCO3 saturado. El DCU precipitado se filtró y el filtrado se disolvió en EtOAc (100 ml). La fase orgánica se lavó con NaHCO3 saturado y salmuera y después se secó con MgSO4. Después de la retirada del disolvente orgánico, el residuo se purificó por cromatografía en columna de sílice (EtOAc al 60%/Hexanos), dando el compuesto cxxxvii (0,47 g, 48%) en forma de una espuma gomosa.
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10 Ejemplo Intermedio 143 -Compuesto cxxxxviii A una solución del compuesto cxxxxvii (0,47 g, 0,847 mmol) en EtOH (5 ml) a 5ºC se le añadió NaOH (2 N, 1,31 ml, 2,62 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La solución se acidificó a pH ~2 con HCl (1 N) y el EtOH se retiró por evaporación rotatoria. La mezcla se extrajo con EtOAc (3 x 30 ml) y el extracto combinado se lavó con
15 salmuera y después se secó con MgSO4. El disolvente se retiró y el residuo se secó al vacío, dando el compuesto cxxxxviii (0,366 g, 82%) en forma de una espuma gomosa.
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Ejemplo Intermedio 144 -Compuesto cil Una solución del compuesto cxxxxviii (0,366 g, 0,718 mmol) en DCM se enfrió en un
20 baño de hielo y se trató con PyBop (0,599 g, 1,15 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 0,5 horas, la mezcla se enfrió con un baño de hielo y se trató con una solución del compuesto xiii' (0,200 g,1,08 mmol) en THF y DIPEA (0,250 ml, 1,44 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una noche y después se interrumpió con una solución de NH4Cl. El disolvente se concentró y la mezcla se disolvió en EtOAc (100 ml). La
25 fase orgánica se lavó con NaHCO3 saturado y salmuera y después se secó con MgSO4. Después de la retirada del disolvente orgánico, el residuo se purificó por cromatografía en columna (EtOH al 5%/EtOAc), dando el compuesto cil (0,35 g, 72%)
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Ejemplo Intermedio 145 -Compuesto cxxi
A una solución en THF (85 ml) de N-Boc-Nva-OH (compuesto 1) (8,68 g, 40 mmol) se le añadió CDI (7,79 g, 48 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 30 minutos, la solución anterior se trató con una solución en DMF (25 ml) que contenía clorhidrato de N,Odimetil-hidroxilamina (4,25 g, 44 mmol) y DIPEA (7,66 ml, 44 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. Después, la mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo resultante se diluyó con EtOAc (300 ml). Esta solución se lavó secuencialmente con HCl 0,1 N (50 ml), NaHCO3 saturado (3 x 50 ml) y salmuera. La fase orgánica se concentró al vacío, dando un residuo que se purificó con cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 40%/Hexanos), dando el compuesto cxxi (9,38 g, 94%). Ejemplo Intermedio 146 -Compuesto cxxii
A una solución en dietil Et2O (50 ml) del compuesto cxxi (9,38 g, 31,9 mmol) enfriada a 0ºC se le añadió (lentamente) LAH (34,7 ml, 1 M, 34,7 mmol). La temperatura del matraz de reacción se mantuvo por debajo de 5ºC durante la adición de LAH. Después de que se completara la adición, a la reacción se le añadió EtOAc (20 ml) para inactivar el exceso de LAH. Después, se añadió gota a gota KHSO4 acuoso (5%, 20 ml) para mantener la temperatura por debajo de 5ºC. La fase orgánica se separó y después se lavó secuencialmente con HCl 1 N (3 x 30 ml), NaHCO3 saturado (3 x 30 ml) y salmuera. La fase orgánica se concentró y se secó al vacío, dando el compuesto en bruto cxxii (5,18 g, 69%). Ejemplo Intermedio 147 -Compuesto cl
A una suspensión en THF (25 ml) de Zn (2,75 g, 42 mmol) se le añadieron a la temperatura de reflujo 0,2 ml de EtOC(O)CF2Br. Esto se siguió de la adición lenta de una solución en THF (25 ml) del compuesto cxxii (3,05 g, 15,0 mmol) y EtOC(O)CF2Br (4,84 ml, 37,5 mmol). Después de que se completara la adición de los dos reactivos, la mezcla de reacción se calentó a reflujo adicionalmente durante 30 minutos. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con DCM (200 ml). La fase orgánica se lavó con KHSO4 1 N. La fase orgánica se concentró y se secó al vacío, dando un residuo que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 20%/Hexano), dando el compuesto cl (2,78 g, 57%).
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Esta preparación es esencialmente la misma que la desvelada por Thaisrivongs y col.,
J. Med. Chem., 29, 2080-2087 (1986). Ejemplo Intermedio 148 -Compuesto cli
5 Una solución en THF (40 ml) del compuesto cl (2,78 g, 8,53 mmol) se trató con NaOH 1 N (12,8 ml, 12,8 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante una noche, el disolvente se retiró parcialmente al vacío. La mezcla de reacción restante se diluyó con agua (50 ml) y se liofilizó, dando el compuesto en bruto cli (2,82 g, >100%) en forma de su sal sódica.
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Esta preparación es esencialmente la misma que la desvelada por Thaisrivongs y col.,
J. Med. Chem., 29, 2080-2087 (1986). Ejemplo Intermedio 149 -Compuesto clii Una solución en DCM (10 ml) del compuesto en bruto cli (516 mg, 1,61 mmol) se trató
15 con HOBT (436 mg, 3,23 mmol) y DIC (0,328 ml, 2,09 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 30 minutos, la mezcla de reacción se trató con una solución en DCM (5 ml) que contenía sal TsOH de éster bencílico de glicina (815 mg, 2,42 mmol) y DIPEA (0,422 ml, 2,42 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 12 horas, la mezcla de reacción se interrumpió con agua y se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se secó, se
20 concentró al vacío y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 40%/hexanos), dando el compuesto clii (495 mg, 69%). RMN 1H del compuesto clii (400 MHz, CDCl3): δ 7,297,21 (m, 5H), 5,16 (s a, 2H), 4,89 (s a, 1H), 4,20-3,90 (m, 4H), 3,80 (s a, 1H), 1,75-1,42 (m, 4H), 1,38 (s, 9H), 0,87 (m, 3H).
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Partiendo del compuesto en bruto cli, los compuestos cliii (83%) y cliv (50%) se prepararon en un procedimiento idéntico al descrito para el compuesto clii.
RMN 1H del compuesto cliii (400 MHz, CDCl3): δ 7,49 (s a, 1H), 7,34-7,24 (m, 5H, 5,13
(c AB, J = 12,2 Hz, J' = 23,9 Hz, 2H), 4,88 (d a, J = 8,8 Hz, 1H), 4,53 (m, 1H), 3,98-3-91 (m,
2H), 3,82 (m, 1H), 1,65-1,20 [m, 16H, incluyendo singlete en 1,37 (9H)], 0,86 (t, J = 7,3 Hz, 3H),
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RMN 1H del compuesto cliv (400 MHz, CDCl3): δ 7,60-7,0 (m, 10H), 5,30-5,00 (m, 2H), 5,00-4,75 (m, 2H), 4,15-3,70 (m, 3H), 3,30-3,00 (m, 2H), 1,75-1,20 [m, 13H, incluyendo singlete 10 en 1,36 (9H)], 0,86 (s a, 3H).
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Ejemplo Intermedio 150 -Compuesto clv A una solución en DCM (10 ml) y THF (5 ml) del compuesto en bruto cli (1 g, 3,13 mmol)
se le añadieron HOBT (634 mg, 4,69 mmol) y EDCI (781 mg, 4,07 mmol) y después (s)-α
15 metilbencilamina (0,604 ml, 4,69 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente y después se interrumpió con agua. La mezcla de reacción se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se lavó con salmuera y se secó con Na2SO4. La fase orgánica se concentró al vacío, dando un residuo que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 20%/hexanos), dando el compuesto clv (459 mg, 37%). RMN 1H del compuesto clv
20 (400 MHz, CDCl3): δ 7,32-7,21 (m, 6H), 5,00 (m, 1H), 4,75 (m, 1H), 3,94 (m, 2H), 3,70 (m, 1H), 1,65-1,15 [m, 16H, incluyendo doblete en 1,51 (J = 6,8 Hz, 3H), singlete en 1,39 (9H)], 0,82 (m, 3H).
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Ejemplo Intermedio 151 -Compuesto clvi
El compuesto clv (220 mg, 0,55 mmol) se disolvió en HCl 4 N en dioxano (10 ml). La
mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y después se concentró al
vacío, dando el compuesto en bruto clvi (~100%) en forma de su sal HCl.
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Siguiendo el procedimiento descrito para preparar el compuesto clvi, los compuestos clvii, clviii, y clix se prepararon con un rendimiento casi cuantitativo a partir del compuesto en bruto cli.
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Ejemplo Intermedio 152 -Compuesto clx
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Una solución en DCM (4 ml) de la sal HCl del compuesto vii (96 mg, 0,144 mmol) se trató con PyBOP (120 mg, 0,23 mmol) y DIPEA (0,1 ml, 0,576 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 30 minutos, la solución se trató con una solución en THF (4 ml) que contenía el compuesto clv (0,288 mmol) y DIPEA (0,2 ml, 1,152 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Después, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (50 ml) y después la fase orgánica se lavó con NaHCO3 y salmuera. La fase orgánica se concentró al vacío y el residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 80%/hexanos), dando el compuesto clx (113 mg, 89%).
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10 Ejemplo Intermedio 153 -Compuesto clxi Una solución en DCM (6 ml) del compuesto vii (140 mg, 0,235 mmol) se trató con PyBOP (196 mg, 0,376 mmol) durante 30 minutos. Después, a la solución anterior se le añadió una solución en THF (6 ml) del compuesto clvii (~0,47 mmol) y DIPEA (0,327 ml, 1,88 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche y se inactivó con
15 agua (30 minutos). La mezcla de reacción se extrajo con EtOAc (50 ml). La fase orgánica se lavó con NaHCO3 y salmuera. Las fases acuosas combinadas se extrajeron de nuevo con EtOAc (50 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron y se concentraron al vacío. El residuo resultante se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 80100%/hexanos), dando el compuesto clxi (104 mg, 48%).
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Ejemplo Intermedio 154 -Compuesto clxii
A una solución en DCM (10 ml) del compuesto clxi (280 mg, 0,304 mmol) se le añadió reactivo DMP (193 mg, 0,456 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y se interrumpió con Na2SO3 al 10%. La fase orgánica se lavó con NaHCO3 y
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salmuera. La fase orgánica resultante se secó y se concentró al vacío, dando un residuo que se purificó con cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 80-100%/hexanos), dando el compuesto clxii (271 mg, 97%).
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5 Ejemplo Intermedio 155 -Compuesto clxiii
El compuesto lxxxiii (220 mg, 0,43 mmol) se recogió en DCM (5 ml). A la solución en DCM se le añadió PyBOP (270 mg, 0,51 mmol) y se agitó durante 5 minutos. A la solución se le añadió gota a gota compuesto xxxvi' (0,51 mmol) en THF (5,1 ml). A la mezcla de reacción se le añadió DIPEA (0,09 ml, 0,51 mmol) y se agitó durante una noche en una atmósfera de N2. Al
10 día siguiente, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc, se lavó con NaHCO3 saturado y se lavó con salmuera. La purificación con un gradiente de EtOAc del 70% al 90%/Hexano dio el compuesto clxiii (180 mg, 56%).
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Ejemplo Intermedio 156 -Compuesto clxiv
15 El compuesto cxxv (2,09 g, 7,4 mmol) se recogió en DCM (20 ml). A esta solución se le añadieron PyBOP (4,64 g, 8,9 mmol) y HOBt (1,2 g, 8,9 mmol) y se agitó durante cinco minutos. La mezcla resultante se redujo a 0ºC, momento en el que se añadieron S(-)-αmetilbencilamina (1,15 ml, 8,9 mmol) y DIPEA (1,55 ml, 8,9 mmol). La reacción se agitó durante una noche con calentamiento a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se lavó con HCl
20 0,1 N, NaHCO3 sat. y salmuera. La purificación con EtOAc al 30%/Hexanos dio el compuesto clxiv (1,6 g, 56,3%).
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Ejemplo Intermedio 157 -Compuesto xxxvi'
El compuesto clxiv (1,48 g, 3,8 mmol) se hidrogenó usando Pd al 10%/C (300 mg) en MeOH (50 ml). La mezcla de reacción se agitó durante una noche en una atmósfera de H2. La mezcla de reacción se filtró a través de celite y se concentró, dando el compuesto xxxvi' (895 mg, 94,2%). Ejemplo Intermedio 158 -Compuesto clxvi:
A una solución en DCM (15 ml) del compuesto clxv (2 g, 8,2 mmol) se le añadieron HOAt (1,34 g, 9,84 mmol)
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10
y DCC (9,84 ml, 1 M, 9,84 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 20 minutos, a la solución anterior se le añadió una solución en THF (9,84 ml) que contenía clorhidrato de éster metílico de terc-L-Leucina (9,84 mmol) y DIPEA (1,72 ml, 9,84 mmol). Después, se añadió DMAP (1 g, 8,2 mmol) a temperatura ambiente. La reacción se agitó a
15 temperatura ambiente durante una noche. Después del tratamiento acuoso convencional y la cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 20%/Hexanos), se obtuvo el compuesto clxvi (1,75 g, 58%).
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Ejemplo Intermedio 159 -Compuesto clxvii:
A una solución en THF (35 ml) del compuesto clxvi (1,75 g, 4,73 mmol) se le añadió una solución 4 N de HCl en dioxano (11,8 ml, 47,3 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche. En este punto, el disolvente se retiró a presión reducida, dando el compuesto en bruto clxvii (~100%), que se disolvió de nuevo en DMF y se usó directamente en
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la siguiente reacción.
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Ejemplo Intermedio 160 -Compuesto clxviii: A una solución en DCM (15 ml) que contenía ácido 2-pirazincarboxílico (447 mg, 3,6
5 mmol) y PyBOP (1,87 g, 3,6 mmol) se le añadió una solución en DMF (15 ml) del compuesto clxvii (811 mg, 3 mmol). Después, a la mezcla resultante se le añadió DIPEA (0,63 ml, 3,6 mmol). La reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente y después se interrumpió con agua. La mezcla de reacción se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se lavó con salmuera y se concentró al vacío, proporcionando un residuo que se purificó por
10 cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 40%/Hexanos), dando el compuesto clxviii (0,93 g, 82%).
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Ejemplo Intermedio 161 -Compuesto clxix: A una solución en MeOH (10 ml) del compuesto clxviii (0,93 g, 2,47 mmol) se le añadió
15 NaOH 2 N (3,71 ml, 7,41 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Después, la reacción se acidificó a pH 3 usando HCl 1 N. La reacción se diluyó con EtOAc (75 ml) y se lavó con agua y salmuera. La fase orgánica obtenida de esta manera se secó y se concentró al vacío, dando el compuesto clxix (~100%).
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20 Ejemplo Intermedio 162 -Compuesto clxx: Una solución en DCM (10 ml) del compuesto clxix (2,47 mmol) se trató con HOAt (436 mg, 3,21 mmol) y DCC (3,2 ml, 1 M, 3,2 mmol). Después de agitar durante 30 minutos, la
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mezcla de reacción se trató con una solución en THF (13,6 ml) del compuesto v (499 mg, 2,72 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante una noche, los sólidos de color blanco (urea) se filtraron. Los filtrados se concentraron al vacío, dando un residuo que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice, dando el compuesto clxx (0,99 g, 76%).
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Ejemplo Intermedio 163 -Compuesto clxxi;
Una solución en EtOH (20 ml) del compuesto clxx (0,99 g, 1,88 mmol) se trató con NaOH 2 N (2,81 ml, 5,63 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante una noche, la mezcla de reacción se acidificó a pH 3 con HCl 1 N. La mezcla de reacción se extrajo
10 con EtOAc (75 ml). La fase orgánica se secó y se concentró al vacío, dando el compuesto clxxi (772 mg, 82%).
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Ejemplo Intermedio 164 -Compuesto clxxi: Una solución en DCM (10 ml) del compuesto clxxi (290 mg, 0,58 mmol) se trató con
15 PyBOP (484 mg, 0,93 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 20 minutos, la mezcla de reacción se trató con una solución en THF (7,5 ml) del compuesto xiii' (140 mg, 0,75 mmol), seguido de DIPEA (0,13 ml, 0,75 mmol). Después de agitar durante una noche a temperatura ambiente, la reacción se interrumpió con agua y se extrajo con EtOAc. La fase orgánica resultante se lavó con salmuera, se secó y se concentró al vacío. El residuo resultante
20 se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 5%/EtOAc), dando el compuesto clxxii 290 mg (75%).
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Ejemplo Intermedio 165 -Compuesto clxxiv:
El compuesto lxxxiii (600 mg, 1,17 mmol) se recogió en DCM (4 ml). Se añadió PyBOP
(670 mg, 1,3 mmol), se agitó durante cinco minutos y se enfrió a 0ºC. A esta solución se le
añadió gota a gota el compuesto clxxiii (333 mg, 1,3 mmol) en THF (13 ml).
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A la mezcla de reacción se le añadió DIPEA (0,23 ml, 1,3 mmol) y se dejó calentar a temperatura ambiente con agitación durante dos noches. Al día siguiente, la reacción se concentró y se purificó con EtOH al 2%/EtOAc, dando el compuesto en bruto clxxiv (900 mg,
10 superior al 100%).
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Ejemplo Intermedio 166 -Compuesto clxxxv: El compuesto cxxv (3,01 g, 10,7 mmol) se recogió en DCM (30 ml) y la temperatura se redujo a -78ºC. A esta solución se le añadieron PyBOP (6,1 g 11,7 mmol) y HOBT (1,58 g, 11,7
15 mmol) seguido de (S)-(+)-1-ciclohexiletilamina, compuesto clxxv, (1,74 ml, 11,7 mmol) y DIPEA (2,1 ml, 11,7 mmol). La mezcla resultante se agitó durante una noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con HCl 0,1 N, NaHCO3 saturado y salmuera. El producto se purificó en EtOAc al 40%/Hex, dando 2 g (47,8%) del compuesto clxxvi.
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Ejemplo Intermedio 167 -Compuesto clxxiii: El compuesto clxxvi (2 g, 5,13 mmol) se hidrogenó usando Pd al 10%/C (500 mg) en MeOH (40 ml). La mezcla de reacción se agitó durante una noche en una atmósfera de H2. La
5 mezcla de reacción se filtró a través de celite y se concentró, dando el compuesto clxxiii (1,31 g, 99,8%). Ejemplo Intermedio 168 -Compuesto clxxix,
En un matraz de fondo redondo en una atmósfera inerte, el compuesto clxxvii [1-bencil éster del ácido (S)-(-)-2-oxo-1,5-imidazolidincarboxílico] (290 mg, 1,1 mmol)
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se disolvió en DMF anhidra (6 ml). Se añadió HOAt (151 mg, 1,2 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 25 minutos. Después, la reacción se enfrió en un baño de hielo. Después, se añadió DIC (0,2 ml, 0,16 g, 1,2 mmol) seguido de la adición del compuesto clxxviii (1 mmol, 435 mg.) en DMF anhidra (4 ml). Se dejó que la reacción alcanzara lentamente la 15 temperatura ambiente y se agitó durante 2 días. Después, la reacción se vertió en un embudo de decantación que contenía 120 ml de EtOAc y se lavó dos veces con HCl 1 N (50 ml) y una vez con salmuera. La fase orgánica se separó y se secó sobre MgSO4. El disolvente se evaporó a presión reducida y el residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (se cargó en DCM y se eluyó con EtOAc al 30% y después al 50%/DCM y después con MeOH al
20 2%/ EtOAc), dando el producto clxxix (434 mg, 64%).
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Ejemplo Intermedio 169 -Compuesto clxxx: El material de partida clxxix (434 mg, 0,64 mmol) se disolvió en dioxano (6 ml) y una solución acuosa 0,5 M de NaOH (4 ml, 3 equiv.). La reacción se realizó durante una noche. El
5 análisis por TLC en EtOAc al 100% (usando resina PMA) mostró, además del producto ácido esperado al principio, un producto de realización más rápida. La mezcla de reacción se acidificó a pH 2 con HCl 1 N y después se extrajo 2 veces con EtOAc. A la solución acuosa se le añadió NaCl sólido para facilitar la extracción. Después, los extractos orgánicos se combinaron, se secaron sobre MgSO4 y se evaporaron a presión reducida. El análisis por EM
10 indicó que el grupo CBZ se había retirado por la hidrólisis. El compuesto resultante clxxx (rendimiento cuantitativo) se usó tal cual en la siguiente etapa.
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Ejemplo Intermedio 170 -Compuesto clxxxi: En un matraz de fondo redondo en una atmósfera inerte, el compuesto clxxx (279 mg,
15 0,54 mmol) se disolvió en DMF anhidra (6 ml). Se añadió HOAt (82 mg, 0,65 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 25 minutos. Después, la reacción se enfrió en un baño de hielo. Después, se añadió DIC (0,11 ml, 0,65 mmol), seguido de la adición del compuesto xiii' (0,7 mmol) en DMF anhidra (4 ml). Se dejó que la reacción alcanzara lentamente la temperatura ambiente y se agitó durante 21 horas. Después, la reacción se vertió
20 en un embudo de decantación que contenía 120 ml de EtOAc y se lavó 2 veces con HCl 1 N (50 ml) y 1 vez con salmuera. La fase orgánica se separó y se secó sobre MgSO4. El disolvente se evaporó a presión reducida y el producto se limpió por cromatografía sobre gel de sílice (se
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cargó en DCM y se eluyó con EtOAc al 50%/Hexano, después con MeOH al 3%/EtOAc y después con EtOH al 20%/EtOAc). Después de la retirada del disolvente, el residuo se disolvió de nuevo en THF Dri Solv y se filtró para retirar cualquier cantidad restante de gel de sílice. La retirada del disolvente produjo después el compuesto clxxxi (434 mg, rendimiento del 64%).
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Ejemplo Intermedio 171 -Compuesto clxxxiii: En un matraz de fondo redondo en una atmósfera inerte, se disolvió 6-hidroxipicolínico
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(153 mg, 1,1 mmol) en DMF anhidra (6 ml). Se añadió HOAt (151 mg, 1,2 mmol) y después la
10 reacción se agitó a temperatura ambiente durante 25 minutos. Después, la reacción se enfrió en un baño de hielo. Después, se añadió DIC (0,2 ml, 0,16 g, 1,2 mmol) seguido de la adición del compuesto clxxxii (1,0 mmol, 435 mg.) en DMF anhidra (4 ml).
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Se dejó que la reacción alcanzara lentamente la temperatura ambiente y se agitó durante 2
15 días. Después, la reacción se vertió en un embudo de decantación que contenía 120 ml de EtOAc y se lavó 2 veces con HCl 1 N (50 ml) y 1 vez con salmuera. La fase orgánica se separó y se secó sobre MgSO4. El disolvente se evaporó a presión reducida y el producto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (se cargó en DCM, se eluyó con EtOAc al 30% y después al 50%/DCM y después con MeOH al 2%/EtOAc), dando el compuesto clxxxiii recogido (314
20 mg, 56%).
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Ejemplo Intermedio 172 -Compuesto clxxxiv: El material de partida clxxxiii (314 mg, 0,56 mmol) se disolvió en dioxano (5 ml) y NaOH 0,5 M (3,4 ml, 3 equiv.). La reacción se realizó durante una noche. El análisis por TLC en
5 EtOAc al 100% (usando UV) mostró la conversión completa en el producto ácido de realización lenta del principio. La reacción se acidificó a pH 2 con HCl 1 N y después se extrajo 2 veces con EtOAc. A la fase acuosa se le añadió NaCl sólido para facilitar la extracción. Después, los extractos orgánicos se combinaron, se secaron sobre MgSO4 y después se evaporaron a presión reducida, dando el compuesto clxxxiv (0,5 mmol, 89%) que se usó tal cual en la
10 siguiente etapa.
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Ejemplo Intermedio 173 -Compuesto clxxxv: En un matraz de fondo redondo en una atmósfera inerte, el compuesto ácido clxxxiv
(265 mg, 0,5 mmol) se disolvió en DMF anhidra (6 ml). Se añadió HOAT (75,6 mg, 0,6 mmol) y
15 la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 25 minutos. Después, la reacción se enfrió en un baño de hielo. Después, se añadió DIC (0,1 ml, 0,6 mmol) seguido de la adición del compuesto xiii' (0,65 mmol) en DMF anhidra (4 ml). Se dejó que la reacción alcanzara lentamente la temperatura ambiente y se agitó durante 21 horas. Después, la reacción se vertió en un embudo de decantación que contenía EtOAc (120 ml) y se lavó 2 veces con HCl 1 N (50
20 ml) y 1 vez con salmuera. La fase orgánica se separó, se secó sobre MgSO4. El disolvente se evaporó a presión reducida y el producto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (se cargó en DCM y se eluyó con EtOAc al 50%/Hexano, después con EtOAc puro y después con MeOH al 4%/EtOAc), dando el producto compuesto clxxxv (185 mg, 52%).
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Ejemplo Intermedio 174 -Compuesto cxxxxiv': A una solución de D-alanina (5 g, 56,1 mmol) en NaOH 1 N (152 ml, 152 mmol) a 0ºC se le añadió una solución de MeOC(O)Cl (65 ml, 84,2 mmol) en éter dietílico (30 ml). La mezcla
5 se agitó en un baño de hielo durante 3 horas y después se ajustó a pH 9 con NaOH 1 N. Después de agitar a temperatura ambiente durante 1 hora, la mezcla se lavó con éter (3 x 50 ml), se acidificó a pH ~2 con HCl 5 N y se extrajo con EtOAc (5 x 50 ml). El extracto orgánico se lavó con agua y salmuera y después se secó (MgSO4). El disolvente se retiró, dando el compuesto cxxxiv, N-metoxicarbonil-D-alanina, en forma de un aceite incoloro (6,48 g, 79%).
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Ejemplo Intermedio 175 -Compuesto clxxxvi:
Una solución de N-metoxicarbonil-D-alanina (0,193 g, 1,31 mmol) y HOAt (0,177 g, 1,31 mmol) en DCM (10 ml) enfriada en un baño de hielo se trató con DCC (1,31 ml, 1,31 mmol). Después de agitar en un baño de hielo durante 0,5 horas, se añadió una solución del
15 compuesto preparado clxxxii (0,88 mmol) en THF (8,8 ml). La mezcla se calentó a temperatura ambiente, se agitó durante una noche, después se enfrió en un baño de hielo y se interrumpió con una solución saturada de NaHCO3. Los precipitados se filtraron y el filtrado se recogió en EtOAc (100 ml). La fase orgánica se lavó con una solución saturada de NaHCO3 y salmuera y después se secó (MgSO4). Después de la retirada del disolvente, el residuo se purificó por
20 cromatografía en columna de sílice (EtOAc al 60%/Hexano), dando el compuesto clxxxvi en forma de una espuma gomosa (0,321 g, 68%).
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Ejemplo Intermedio 176 -Compuesto clxxxvii:
A una solución del compuesto clxxxvi (0,321 g, 0,597 mmol) en EtOH (5 ml) a 5ºC se le añadió NaOH 2 N (1,05 ml, 2,1 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La solución se acidificó a pH ~2 con HCl 1 N y el EtOH se retiró por evaporación rotatoria. La mezcla se extrajo con EtOAc (3 x 30 ml) y el extracto combinado se lavó con salmuera y después se secó (MgSO4). El disolvente se retiró y el residuo se secó al vacío, dando el compuesto clxxxvii en forma de una espuma gomosa (0,235 g, 77%).
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Ejemplo Intermedio 177 -Compuesto clxxxviii:
10 Una solución del compuesto clxxxvii (0,363 g, 0,712 mmol) en DCM (10 ml) se enfrió en un baño de hielo y se trató con PyBOP (0,594 g, 1,14 mmol), Después de agitar a temperatura ambiente durante 0,5 horas, la mezcla se enfrió en un baño de hielo y se trató con una solución del compuesto xiii' (1,1 mmol) en THF (11 ml) y DIPEA (0,249 ml, 1,42 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una noche y se interrumpió con una solución de NH4Cl.
15 El disolvente se concentró y la mezcla se recogió en EtOAc (100 ml). La fase orgánica se lavó con una solución saturada de NaHCO3 y salmuera, y después se secó (MgSO4). Después de la retirada del disolvente, el residuo se purificó por cromatografía en columna (EtOH al 5%/EtOAc), dando clxxxviii (0,341 g, 71%). Ejemplo Intermedio 178 -Compuesto clxxxix:
20 Se recogió ácido diaminopropiónico (3 g, 28,7 mmol) en NaOH 1 M (86,2 ml, 86,2 mmol), se enfrió a 0ºC y después se añadió MeOC(O)Cl (5,54 ml, 71,75 mmol) en Et2O (25 ml). La mezcla resultante se agitó durante una noche con calentamiento a temperatura ambiente. El pH de la mezcla de reacción se redujo a 2 y la fase acuosa se extrajo 3 veces con EtOAc. Los extractos se combinaron y se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron, dando el
25 compuesto clxxxix (3,09 g, 48,9%).
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Ejemplo Intermedio 179 -Compuesto cc:
El compuesto clxxxix (340 mg, 1,55 mmol) se recogió en DCM (4 ml). Se añadieron DCC (1,7 mmol) y HOAt (235 mg, 1,7 mmol) seguido del compuesto clxxxii (1,7 mmol) en DCM (3,4 ml). La mezcla de reacción se agitó durante una noche. Al día siguiente, la mezcla de reacción se filtró a través de una capa de sílice y se concentró. La purificación se consiguió en EtOAc al 75%/Hex, dando el compuesto clxxxx (715 mg, 72,4%).
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Ejemplo Intermedio 180 -Compuesto clxxxxi:
El compuesto clxxxx (715 mg,1,12 mmol) se hidrolizó en condiciones convencionales
usando EtOH (4 ml) y NaOH 1 N (3 equiv.), dando el compuesto clxxxxi (600 mg, 88,0%).
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Ejemplo Intermedio 181-Compuesto clxxxxii: El compuesto clxxxxi (550 mg, 0,9 mmol) se recogió en DCM (8 ml). Se añadió PyBOP
15 (675 mg, 1,3 mmol) seguido del compuesto xiii' (1,3 mmol) en THF (1,3 ml), se añadió DIPEA (0,23 ml, 1,3 mmol) y la solución resultante se agitó durante una noche. Al día siguiente, la reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con NaHCO3 saturado y después con salmuera, antes de concentrarse, dando un residuo. El residuo resultante se purificó con EtOH al 5%/EtOAc, dando el compuesto clxxxxii (290 mg, 41,5%).
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Ejemplo Intermedio 182 -Compuesto clxxxxiii:
Se hidrolizó éster metílico de Cbz-ciclohexiglicina-terc-leucina (7,36 g, 17,6 mmol) en
condiciones convencionales usando MeOH (60 ml) y NaOH 1 N (52,8 ml, 3 equiv.), dando
intermedio clxxxxiii (92%).
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Ejemplo Intermedio 183 -Compuesto clxxxxiv: El compuesto clxxxxiii (3,82 g, 9,46 mmol) se recogió en DCM (30 ml). Se añadió DCC (11,35 mmol) en DCM (11,35 ml), seguido de la adición de HOAt (1,54 g, 11,35 mmol). La
10 mezcla resultante se agitó durante cinco minutos y el se añadió el compuesto v (9,46 mmol) en THF (40 ml). La mezcla resultante se agitó durante una noche. Al día siguiente, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con HCl 1 N, con NaHCO3 saturado y después con salmuera, antes de concentrarse, dando un residuo. El residuo resultante se purificó con un gradiente del 20% al 30% sobre gel de sílice, dando el compuesto clxxxxiv (3,03 g, 56,3%).
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Ejemplo Intermedio 183-Compuesto clxxxii:
El compuesto clxxxxiv (3,03 g, 5,33 mmol) se hidrogenó usando Pd al 10%/C (500 mg)
en MeOH (30 ml) en una atmósfera de H2 durante 4 horas, dando el compuesto clxxxii (2,3 g,
99%).
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Ejemplo Intermedio 184-Compuesto clxxxxv:
A una solución de ácido 1-amino-1-ciclohexanocarboxílico (2,86 g, 20 mmol) en MeOH (40 ml) se le añadió gota a gota SOCl2 (3 ml) a 0ºC. La mezcla se calentó lentamente a temperatura ambiente y después se calentó a reflujo durante 5 horas. Después, a la solución transparente añadió Et2O y el precipitado se aísla. El sólido se secó adicionalmente al vacío, dando el compuesto clxxxxv (95%) en forma de un polvo de color blanco.
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Ejemplo Intermedio 185 -Compuesto clxxxxvi: Se disolvió ácido 2-pirazincarboxílico (1 g, 8 mmol, 1 equiv.) en DCM (15 ml) con la
10 adición de HOAt (1,1 g, 8 mmol) y DCC (8 ml, 1 M) en DCM. Después de agitar a temperatura ambiente durante 20 minutos, a la mezcla activada se le añadió el compuesto clxxxxv (1,3 g, 8 mmol). Posteriormente, se añadió DIPEA (2 ml, 12 mmol), seguido de DMAP (1,5 g,12 mmol). Después de agitar durante 3 días a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtró a través de celite, se concentró y el producto deseado clxxxxvi se purificó por cromatografía en
15 columna (EtOAc al 50%/hexano) en forma de un aceite de color amarillo (2,11 g, 100%).
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Ejemplo Intermedio 186 -Compuesto clxxxxvii: El compuesto clxxxxvi (1,06 g, 2,6 mmol) se disolvió en MeOH (30 ml) con la adición de NaOH 2 N (ac.) (12 ml, 24 mmol). La solución se agitó a temperatura ambiente durante una
20 noche antes de que el análisis por TLC (EtOAc al 50%/hexano) indicara que la hidrólisis se había completado. Después, la solución se acidificó a pH 3 con HCl 5 N y se diluyó con EtOAc, seguido de la extracción de la fase orgánica. La fase orgánica se lavó posteriormente con salmuera y se secó sobre MgSO4, dando el compuesto clxxxxvii (84%) después de la concentración.
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Ejemplo Intermedio 187 -Compuesto clxxxxviii: El compuesto clxxxvii (1,6 g, 6,4 mmol) se disolvió en DCM (18 ml) y después se añadieron HOAt (0,96 g, 7 mmol) y DCC (7 ml, 1 M en DCM) a temperatura ambiente. Después
5 de agitar a temperatura ambiente durante 20 minutos, a la mezcla activada se le añadió clorhidrato de éster metílico de L-terc-Ieucina (7 ml, 1 M en THF). Posteriormente, se añadió DIPEA (1,2 ml, 7 mmol), seguido de DMAP (1,2 g, 9,8 mmol). Después de agitar durante 3 días a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtró a través de celite, se purificó por cromatografía en columna y se concentró, dando el compuesto clxxxxviii (EtOAc al
10 60%/hexano) en forma de un sólido de color blanco (1,74 g, 72%).
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Ejemplo Intermedio 188 -Compuesto cic: El compuesto clxxxxviii (1,74 g, 4,6 mmol) se disolvió en MeOH (22 ml) con la adición de NaOH 2 N (ac.) (7 ml, 14 mmol). La solución se agitó a temperatura ambiente durante una
15 noche, antes de que el análisis por TLC (EtOAc al 50%/hexano) indicara que la hidrólisis se había completado. La solución se acidificó a pH 3 con HCl 5 N, se diluyó con EtOAc y después la fase orgánica se extrajo. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4 y después se concentró, dando el compuesto cic (100%).
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20 Ejemplo Intermedio 189 -Compuesto cc: A una solución en DCM (15 ml) del compuesto cic (1,5 g, 4,1 mmol) a temperatura ambiente se le añadió HOAt (610 mg, 4,5 mmol), seguido de una solución 1 M de DCC en
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DCM (4,5 ml, 4,5 mmol). Después de agitar durante 30 minutos a temperatura ambiente, se añadió una solución en THF (20 ml, 0,2 M) del compuesto v (4 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Después, la reacción se filtró a través de celite. El filtrado se concentró, dando un aceite de color amarillo que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 50%/hexano), dando el compuesto cci (660 mg, 32%).
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Ejemplo Intermedio 190 -Compuesto cci: A una solución en EtOH (6 ml) del compuesto cc (600 mg, 1,13 mmol) se le añadió NaOH 2 N (1,7 ml, 3,4 mmol). La reacción se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente y
10 después se acidificó a pH 3 con HCl 5 N. Después, la mezcla se diluyó con EtOAc, seguido de extracción de la fase orgánica. Posteriormente, la fase orgánica se lavó con salmuera y después se secó sobre MgSO4, dando el compuesto cci (92%) después de concentración.
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Ejemplo Intermedio 191 -Compuesto ccii:
15 A una solución en DCM (8 ml) de ccii (310 mg, 0,62 mmol) se le añadió PyBOP (420 mg, 0,8 mmol). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después, a esta solución se le añadió el compuesto xiii' (8 ml, 0,1 M) en THF, seguido de la adición de DIPEA (0,23 ml, 1,3 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche y después se interrumpió con agua (25 ml) durante 30 minutos. Después, la mezcla se extrajo
20 con EtOAc. La fase orgánica resultante se lavó con salmuera y después se secó sobre MgSO4, antes de concentrarse, dando un aceite de color amarillo. La purificación por cromatografía sobre gel de sílice (EtOH al 3%/EtOAc) dio el compuesto ccii (140 mg, 33%).
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Ejemplo Intermedio 192 -Compuesto ccxiv A una solución del compuesto cciii, éster de terc-butil-(N-difenilmetileno)-glicina (6 g, 0,0206 mmol) y PTC quiral (1,08 g, 0,00206 mmol) en DCM seco (48 ml), en una atmósfera de
5 N2, a -60ºC, se le añadió CsOH·H2O (6,9 g, 0,0412 mmol). A la mezcla de reacción se le añadió gota a gota éster metílico de 1-carboxi-1-ciclopenteno (5,2 ml, 0,0412 mmol) en 10 ml de DCM. La mezcla se agitó durante 4 días a -60ºC, después se diluyó con 200 ml de Et2O y se añadieron 15 ml de una solución acuosa saturada de NH4Cl. Las fases se separaron y la fase orgánica se lavó con 15 ml de agua y 15 ml de salmuera. Las fases acuosas se extrajeron con
10 100 ml de Et3O. Las fases orgánicas se combinaron y se secaron sobre Na2SO4. El producto en bruto se obtuvo por retirada del disolvente, se disolvió en 100 ml de EtOH y después se añadieron NH2OH·HCl (1,43 g, 0,0206 mmol) y NaOAc (1,68 g, 0,0206 mmol). La mezcla se calentó a reflujo durante 48 horas. Después, el disolvente se retiró y el residuo en bruto obtenido se purificó directamente por cromatografía ultrarrápida eluyendo con EtOAc al 30%
15 50%/hexano, dando el compuesto cciv (65%) en forma de un sólido de color blanco. C12H19NO3 (PM = 225,29); EM: m/z (M++1) = 226,5. Exceso enantiomérico: 18% de ee, determinado por HPLC quiral.
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Ejemplo Intermedio 193 -Compuesto ccv
20 A una solución del compuesto cciv (2 g, 0,0088 mmol) en 60 ml de ACN se le añadieron una cantidad catalítica de DMAP (0,216 g, 0,0017 mmol) y una solución de dicarbonato de di-terc-butilo (2,49 g, 0,011 mmol) en 30 ml de ACN. La mezcla se agitó durante 14 horas a temperatura ambiente, después se diluyó con 100 ml de DCM y se lavó con NaHCO3 saturado (10 ml) y con salmuera (10 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4. La evaporación del
25 disolvente produjo un producto en bruto que se purificó sobre una columna de gel de sílice eluyendo con EtOAc al 15%/hexano, dando el compuesto ccv (86%) en forma de un sólido de color blanco. C17H27NO5 PM = 325,40 EM: m/z (M+ + 1) = 326,2
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Ejemplo Intermedio 194 -Compuesto ccvi A una solución del compuesto ccv (1,7 g, 0,0052 mmol) en 50 ml de THF (0,14 M) a -78ºC se le añadió DIBAL-H (7,8 ml, 0,0078 mmol). La mezcla se agitó durante 1 hora y
5 después se añadieron 10 ml de MeOH. La mezcla se diluyó con 25 ml de EtOAc y 25 ml de una solución acuosa saturada de tartrato sódico y después se agitó a temperatura ambiente durante una hora. Las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo una vez con 50 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron y se secaron sobre Na2SO4. La evaporación del disolvente dio un residuo en bruto que se usó sin ninguna purificación. El producto en bruto se
10 disolvió en 25 ml de DCM. Se añadió Et3Si (0,84 ml, 0,0052 mmol) y después la mezcla se enfrió a -78ºC antes de la adición gota a gota de BF3OEt2 (0,71 ml, 0,0061 mmol). Después de 30 minutos, se añadieron Et3Si (0,84 ml) y BF3OEt2 (0,71 ml) y la mezcla se agitó durante 2 horas a -78ºC. Después, la reacción se interrumpió con NaHCO3 acuoso saturado (10 ml) y se extrajo con DCM (2 x 20 ml). Las fases orgánicas se combinaron y se secaron sobre Na2SO4.
15 La evaporación del disolvente dio un residuo en bruto que se purificó por cromatografía ultrarrápida eluyendo con EtOAc al 13%/hexano, dando el compuesto ccvi (87%). C17H29NO4 PM = 311,42 EM: m/z (M+ + 1) = 312,6
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Ejemplo Intermedio 195 -Compuesto ccvii
20 El compuesto ccvi (0,5 g, 0,0016 mmol) se disolvió en 8 ml de HCl 1 N en EtOAc (preparado burbujeando HCl seco en EtOAc seco y después diluyendo a 1 N con más cantidad de EtOAc). La mezcla se agitó durante 6 horas a temperatura ambiente. El disolvente se retiró al vacío y el precipitado resultante se disolvió en Et2O. Después de agitar la mezcla durante 15 minutos, el disolvente se retiró a presión reducida. El sólido de color blanco resultante se lavó
25 con Et2O y el compuesto ccvii (0,27 g, rendimiento del 80%) se aisló por filtración. C12H21NO2 PM 211,15 EM: m/z (M+ + 1) = 212,6
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Ejemplo Intermedio 196 -Compuesto v A una solución del compuesto ccxvi (0,230 g, 0, 74 mmol) en DCM (3,7 ml) se le añadió TFA (2,85 ml). La mezcla se agitó durante una noche, después el disolvente se retiró al vacío a
5 sequedad y el residuo se disolvió en EtOH (7,5 ml). La mezcla se enfrió a 0ºC, se añadió gota a gota SOCl2 (0,22 ml, 2,96 mmol) y después se calentó a reflujo durante 2 horas. El EtOH se retiró a presión reducida y el residuo se disolvió en DCM (10 ml). La solución resultante se lavó dos veces con una solución saturada acuosa de NaHCO3 (5 ml). Las fases se separaron, la fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y el disolvente se retiró al vacío, dando el compuesto v
10 (80%) en forma de un aceite. C10H17NO2 P.M.: 183,25 EM: m/z (M+ + 1) = 184,2 Ejemplo Intermedio 197 -Compuesto cd Se recogió 1-bencilimidazol (6 g, 37,9 mmol) en Et2O (180 ml). La solución resultante se redujo a -60ºC y se trató con n-BuLi (1,6 M, 24 ml). La reacción se agitó durante 30 minutos y después se burbujeó CO2 a través de la mezcla durante 15 minutos. El precipitado se filtró, se
15 aclaró con Et2O y después se recogió en H2O. Esta solución acuosa se acidificó a pH 3 con HCl 5 N. El producto deseado, cd, se aisló después de liofilización en forma de un sólido de color blanco.
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Ejemplo Intermedio 198 -Compuesto cdi
20 Una solución en DCM (100 ml) del compuesto i (9,25 g, 27,9 mmol) se trató a 0ºC con DAST (9,2 ml, 69,8 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante una noche, la reacción se interrumpió con hielo y se extrajo con DCM (200 ml). La fase orgánica se lavó con salmuera y se concentró al vacío. El residuo se purificó con cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 30%/hexanos), dando 8,5 g (86%) del intermedio fluorado deseado. Una porción de
25 este intermedio (4,5 g, 14,2 mmol) se disolvió en EtOH (75 ml). Esta solución se sometió a condiciones de hidrogenación convencionales usando Pd(OH)2/C (2,98 g, contenido de Pd del
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20%, 4,26 mmol). Después de agitar durante una noche a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtró a través de Celite. Los filtrados se concentraron al vacío, dando el compuesto cdi (2,5 g, 96%).
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5 Ejemplo Intermedio 199 -Compuesto cdii
A una solución del compuesto cd (890 mg, 4,4 mmol) recogido en DCM (15 ml) se le añadieron HOBT (595 mg, 4,4 mmol) y DCC (4,4 mmol 1 M en DCM) y se agitó durante 20 minutos. A esta mezcla se le añadió una solución en DCM (15 ml) de lxxix' (990 mg, 3,5 mmol). La mezcla resultante se agitó durante una noche en una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de
10 reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con NaHCO3 saturado y salmuera. La fase orgánica se concentró al vacío, dando un residuo, que se purificó en EtOAc al 30%/Hexanos, dando el compuesto cdii (666 mg, 41%).
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Ejemplo Intermedio 200 -Compuesto cdiii
El compuesto cdiii se preparó a partir del compuesto cdii en condiciones de hidrólisis
convencionales usando alcohol metílico (10 ml) y NaOH 1 N (3 equiv.). Se recuperaron 565 mg
del compuesto cdiii (88%).
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Ejemplo Intermedio 201 -Compuesto cdiv El compuesto cdiii (1,24 mmol) se recogió en DCM (5 ml). Se añadió DCC (1,6 mmol, 1 M DCM) seguido de HOAT (1,6 mmol). La mezcla resultante se agitó durante 20 minutos y
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se añadió gota a gota el compuesto cdi (1,6 mmol) en THF (8 ml) La reacción se agitó durante una noche. La reacción se filtró y se aclaró con EtOAc. La fase orgánica combinada se lavó con NaHCO3 saturado y salmuera, se secó sobre MgSO4 y se concentró. La purificación se consiguió en EtOAc al 30%/Hexanos, dando el compuesto cdiv (565 mg, 70%)
10 Ejemplo Intermedio 202 -cdv
El compuesto cdv (565 mg, 0,86 mmol) se preparó a partir del compuesto cdiv en condiciones de hidrólisis convencionales usando alcohol etílico (10 ml) y NaOH 1 N (3 equiv.). Se recuperaron 490 mg (91%) del compuesto cdv.
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15 Ejemplo Intermedio 203 -cdvi
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El compuesto cdv (490 mg, 0,78 mmol) se recogió en DCM (10 ml). A la solución en DCM se le añadió PyBOP (520 mg, 1 mmol) seguido de una solución en THF (10 ml) de xiii (186 mg, 1 mmol). A la mezcla de reacción se le añadió DIEA (0,18 ml, 1 mmol) y se agitó durante una noche en una atmósfera de nitrógeno. Al día siguiente, la reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con NaHCO3 saturado y salmuera. La purificación se consiguió en EtOAc al 100%, dando el compuesto cdvi (478 mg, 77%).
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Ejemplo Intermedio 204 -cdvii El compuesto cdvi (478 mg, 0,6 mmol) se hidrogenó usando Pd(OH)2/C (base en seco
10 del 20%, 100 mg) en MeOH (40 ml). La mezcla de reacción se agitó durante una noche en una atmósfera de hidrógeno. En este punto, la mezcla de reacción se filtró a través de Celite y se concentró, dando el compuesto cdvii (417 mg, 98%).
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Ejemplo Intermedio 205 -cdx
15 El compuesto cxxv (adquirido en Albany Molecular Research Inc., 1,5 g, 5,2 mmol) se recogió en DCM (15 ml). A esta solución se le añadieron PyBOP (2,7 g, 5,2 mmol) y HOBT (700 mg, 5,2 mmol). A la solución anterior se le añadió una solución en THF (15 ml) de (-)-alfa(4-piridil)etilamina (640 mg, 5,2 mmol), seguido de DIEA (0,93 ml, 5,2 mmol). La (-)-alfa-(4piridil)etilamina se obtuvo a partir de la sal tartrato de (-)-alfa-(4-piridil)etilamina (Aldrich) por
20 agitación con NaOH 1 N (2 equiv.) durante 1 hora seguida de extracción con EtOAc (3 x) recuperación del 70%]. La reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se lavó
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con NaHCO3 saturado y salmuera. El producto se purificó en EtOH al 5%/EtOAc, dando 2 g (99%) del compuesto intermedio cdx.
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Ejemplo Intermedio 206 -cdviii
El compuesto cdx (2 g, 5,2 mmol) se hidrogenó usando Pd al 10%/C (500 mg) en MBOH
(50 ml). La mezcla de reacción se agitó durante una noche en una atmósfera de hidrógeno. El
producto se filtró a través de celite y se concentró, dando el compuesto cdviii (1,3,g 98%).
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Farmacología
10 Los compuestos como se describen en el presente documento son útiles por poder inhibir la proteasa de VHC, y por lo tanto, son también útiles para la inhibición de la replicación de VHC.
En consecuencia, se describe un procedimiento para inhibir la proteasa de VHC que comprende poner en contacto una cantidad inhibidora anti-proteasa de VHC de un compuesto 15 de fórmula 1 con una composición que comprende proteasa de VHC.
Además, se describe un procedimiento para inhibir la replicación de VHC que comprende poner en contacto VHC con una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula 1. Además, se describe un procedimiento para tratar a un paciente que padece o está sometido a una infección por VHC que comprende la administración al paciente de una cantidad
20 farmacéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula 1. Debería entenderse que las referencias del presente documento para el tratamiento de una infección de VHC incluyen terapia profiláctica para prevenir o inhibir la infección así como el tratamiento de una infección por VHC establecida aguda o crónica o afecciones fisiológicas asociadas con la infección de VHC para esencialmente curar la infección del paciente, inhibir el grado (cantidad) de infección
25 o mejorar las afecciones fisiológicas asociadas con la misma. “Cantidad eficaz” se entiende que describe una cantidad de compuesto descrita en el presente documento eficaz dentro del ámbito del juicio biológico razonable, adecuado para su uso en contacto con las células de
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seres humanos y otros mamíferos sin toxicidad indebida, irritación, respuesta alérgica y similares y que es adecuada con una relación beneficio/riesgo razonable en el tratamiento de una infección del VHC y que produce por lo tanto el efecto terapéutico deseado.
Las afecciones fisiológicas analizadas en el presente documento incluyen algunas, pero no todas, las posibles situaciones clínicas en las que se garantiza un tratamiento anti-VHC. Los expertos en este campo son bastante conscientes de las circunstancias que requieren un tratamiento anti-VHC.
Además, se describe un compuesto a administrar en forma de una composición farmacéutica, aunque el compuesto puede administrarse solo. “Composición farmacéutica” significa una composición que comprende un compuesto de fórmula 1 y al menos un componente seleccionado del grupo que comprende vehículos, diluyentes, revestimientos, adyuvantes, excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como agentes conservantes, cargas, agentes disgregantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agente de estabilización de la emulsión, agentes de suspensión, agentes isotónicos, agentes edulcorantes, agentes saporíferos, agentes perfumantes, agentes colorantes, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, otros agentes terapéuticos, agentes lubricantes, agentes de retardo o promoción de la adsorción y agentes de reparto, dependiendo de la naturaleza del modo de administración y de las formas farmacéuticas. Las composiciones pueden presentarse en forma de comprimidos, píldoras, gránulos, polvos, soluciones o suspensiones acuosas, soluciones inyectables, elixires o jarabes. Los agentes de suspensión ejemplares incluyen alcoholes de isostearilo etoxilados, polioxietilen sorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y goma de tragacanto o mezclas de estas sustancias. Los agentes antibacterianos y antifúngicos ejemplares para la prevención de la acción de microorganismos incluyen parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. Los agentes isotónicos ejemplares incluyen azúcares, cloruro sódico y similares. Los agentes de retardo de la adsorción ejemplares para prolongar la absorción incluyen monoestearato de aluminio y gelatina. Los agentes promotores de la adsorción ejemplares para mejorar la absorción incluyen dimetil sulfóxido y análogos relacionados. Los vehículos, diluyentes, disolventes, adyuvantes, agentes de solubilización, emulsionantes y estabilizadores de la emulsión ejemplares, incluyen agua, cloroformo, sacarosa, etanol, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, alcohol tetrahidrofurílico, benzoato de bencilo, polioles, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, glicerol, polietilenglicoles, dimetilformamida, Tween® 60, Span® 80, alcohol cetoestearílico, alcohol miristílico, monoestearato de glicerilo y lauril sulfato sódico, ésteres de ácido graso de sorbitán, aceites vegetales (tales como aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de germen de
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maíz, aceite de oliva, aceite de ricino y aceite de sésamo) y ésteres orgánicos inyectables tales como oelato de etilo y similares o mezclas adecuadas de estas sustancias. Los excipientes ejemplares incluyen lactosa, azúcar de leche, citrato sódico, carbonato cálcico, fosfato dicálcico. Los agentes disgregantes ejemplares incluyen almidón, ácidos algínicos y ciertos silicatos complejos. Los lubricantes ejemplares incluyen estearato de magnesio, lauril sulfato sódico, talco, así como polietilenglicoles de alto peso molecular.
Otros agentes terapéuticos pueden usarse en combinación con un compuesto de la presente invención, incluyendo otros agentes anti-VHC. Algunos agentes anti-VHC ejemplares conocidos incluyen agentes inmunomoduladores, tales como interferones α, β o γ; compuestos de interferón α derivatizados pegilados, otros agentes antivirales tales como ribavirina y amantadina; otros inhibidores de la proteasa de hepatitis C; inhibidores de otras dianas en el ciclo vital de VHC incluyendo la helicasa, polimerasa, metaloproteasa, sitio interno de entrada a ribosoma o compuestos antivirales de amplio espectro tales como VX-497, un inhibidor de la inosina monofosfato deshidrogenasa celular, IMPDH, incluida en la Patente de Estados Unidos Nº 5.807.876; o combinaciones de los mismos. Los agentes terapéuticos usados en combinación con un compuesto descritos en el presente documento pueden administrarse de forma separada, simultáneamente o secuencialmente.
La elección de material en la composición farmacéutica distinto del compuesto de fórmula 1 se determina generalmente de acuerdo con las propiedades químicas del compuesto activo tales como solubilidad, el modo particular de administración y las provisiones a observar en la práctica farmacéutica. Por ejemplo, excipientes tales como lactosa, citrato sódico, carbonato cálcico, fosfato dicálcico y agentes disgregantes tales como almidón, ácidos algínicos y ciertos silicatos complejos combinados con lubricantes tales como estearato de magnesio, lauril sulfato sódico y talco pueden usarse para preparar comprimidos.
Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse en formas variadas tales como comprimidos, píldoras, gránulos, polvos, soluciones o suspensiones acuosas, soluciones inyectables, elixires o jarabes.
“Forma farmacéutica líquida” significa que la dosis del compuesto activo para administrar al paciente está en forma líquida, por ejemplo, emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los compuestos activos, las formas farmacéuticas líquidas pueden contener diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica, tales como disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes.
También pueden emplearse composiciones sólidas como cargas en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando excipientes tales como lactosa o azúcar de leche así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
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Cuando se usan suspensiones acuosas éstas pueden contener agentes emulsionantes
o agentes que facilitan la suspensión.
La fase oleosa de la composición farmacéutica en emulsión puede constituirse a partir de ingredientes conocidos de una manera conocida. Aunque la fase puede comprender únicamente un emulsionante (conocido de otro modo como un emulgente), ésta comprende convenientemente una mezcla de al menos un emulsionante con una grasa o un aceite o con tanto una grasa como un aceite. Preferentemente, se incluye un emulsionante hidrófilo junto con un emulsionante lipófilo que actúa como un estabilizador. También se prefiere incluir tanto una grasa como un aceite. Juntos, el emulsionante o los emulsionantes con o sin estabilizador
o estabilizadores forman la cera emulsionante y la cera junto con el aceite y la grasa forman la base de pomada emulsionante que forma la fase oleosa dispersa de las formulaciones de crema.
Si se desea, la fase acuosa de la base de crema puede incluir, por ejemplo, al menos el 30% p/p de un alcohol polihidroxílico, es decir, un alcohol que tiene dos o más grupos hidroxilo tales como propilenglicol, butano 1,3-diol, manitol, sorbitol, glicerol y polietilenglicol (incluyendo PEG 400) y mezclas de los mismos. Las formulaciones tópicas pueden incluir convenientemente un compuesto que mejore la absorción o penetración del principio activo a través de la piel u otras áreas afectadas.
La elección de aceites o grasas adecuadas para una formulación se basa en conseguir las propiedades cosméticas deseadas. De este modo la crema sería preferentemente un producto no graso, que no mancha y lavable con consistencia adecuada para evitar fugas de los tubos u otros recipientes. Pueden usarse alquil ésteres mono o dibásicos de cadena sencilla o ramificada tales como miristato de di-isopropilo, oleato de decilo, palmitato de isopropilo, estearato de butilo, palmitato de 2-etilhexilo o una mezcla de ésteres de cadena ramificada conocida como Crodamol CAP. Éstos pueden usarse solos o en combinación dependiendo de las propiedades requeridas. Como alternativa, pueden usarse lípidos de punto de fusión alto tales como parafina suave blanda y/o parafina líquida u otros aceites minerales.
En la práctica, un compuesto/composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden administrarse en una formulación adecuada a seres humanos y animales por administración tópica o sistémica, incluyendo oral, de inhalación, rectal, nasal, bucal, sublingual, vaginal, colónica, parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal y epidural), intracisternal e intraperitoneal. Se apreciará que la vía preferida puede variar por ejemplo según la afección del receptor.
“Formas farmacéuticas farmacéuticamente aceptables” se refiere a formas farmacéuticas del compuesto descrito en el presente documento e incluye, por ejemplo,
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comprimidos, grageas, polvos, elixires, jarabes, preparaciones líquidas, incluyendo suspensiones, pulverizaciones, comprimidos inhalantes, pastillas para chupar, emulsiones, soluciones, gránulos, cápsulas y supositorios, así como preparaciones líquidas para inyecciones, incluyendo preparaciones de liposomas. Las técnicas y formulaciones pueden encontrarse generalmente en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.
Las “formulaciones adecuadas para administración oral” pueden presentarse como unidades discretas tales como cápsulas, obleas o comprimidos que contienen cada una cantidad predeterminada del principio activo; como un polvo o gránulos; como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o en un líquido no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite. El principio activo también puede presentarse como un bolo, electuario o pasta.
Un comprimido puede prepararse por compresión o moldeado, opcionalmente con uno
o más ingredientes accesorios. Los comprimidos de compresión pueden prepararse comprimiendo en una máquina adecuada el principio activo en forma fluida tal como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, conservante, tensioactivo o dispersante. Los comprimidos moldeados pueden realizarse moldeando en una máquina adecuada una mezcla de los compuestos en polvo humedecidos con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos pueden opcionalmente revestirse o ranurarse y pueden formularse de modo que proporcionen una liberación lenta o controlada del principio activo de los mismos.
Las composiciones sólidas para administración rectal incluyen supositorios formulados de acuerdo con procedimientos conocidos y que contienen al menos un compuesto descrito en el presente documento.
Si se desea, y para una distribución más eficaz, los compuestos pueden microencapsularse o unirse a, sistemas de suministro de liberación lenta o dirigidos tales como matrices biocompatibles, de polímero biodegradable (por ejemplo, poli(d,1-lactida co-glicólido)), liposomas y microesferas e inyectarse por vía subcutánea o intramuscular mediante una técnica llamada depósito subcutáneo o intramuscular para proporcionar una liberación lenta continua del compuesto o de los compuestos durante un periodo de 2 semanas o más. Los compuestos pueden esterilizarse, por ejemplo, por filtración a través de un filtro que retiene bacterias o mediante la incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse en agua estéril o algún otro medio inyectable estéril inmediatamente antes de su uso.
“Formulaciones adecuadas para administración nasal o de inhalación” significa
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formulaciones que están en una forma adecuada para administrarse por vía nasal o por inhalación a un paciente. La formulación puede contener un vehículo, en una forma de polvo, que tiene un tamaño de partícula por ejemplo en el intervalo de 1 a 500 micrómetros (incluyendo tamaños de partícula en un intervalo entre 20 y 500 micrómetros en incrementos de 5 micrómetros, tales como 30 micrómetros, 35 micrómetros, etc.). Las formulaciones adecuadas en las que el vehículo es un líquido, para su administración como por ejemplo un pulverizador nasal o como gotas nasales, incluyen soluciones acuosas u oleosas del principio activo. Las formulaciones adecuadas para su administración en aerosol pueden prepararse de acuerdo con procedimientos convencionales y pueden suministrarse con otros agentes terapéuticos. La terapia de inhalación se administra fácilmente por inhaladores de dosis medidas.
“Formulaciones adecuadas para su administración oral” significa formulaciones que están en una forma adecuada para administrarse por vía oral a un paciente. Las formulaciones pueden presentarse como unidades discretas tales como cápsulas, obleas o comprimidos que contienen, cada una, una cantidad predeterminada de principio activo; como un polvo o gránulos; como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o un líquido no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite. El principio activo también puede presentarse como una embolada, electuario o concentrado.
“Formulaciones adecuadas para administración parenteral” significa formulaciones que están en una forma adecuada para administrarse por vía parenteral a un paciente. Las formulaciones son estériles e incluyen emulsiones, suspensiones, soluciones para inyección acuosas y no acuosas, que pueden contener agentes de suspensión y agentes espesantes y antioxidantes, tampones, bacterioestáticos y solutos que hacen a la formulación isotónica y tienen un pH ajustado de manera adecuada, con la sangre del receptor de destino.
“Formulaciones adecuadas para administraciones rectales o vaginales” significa formulaciones que están en una forma adecuada para administrarse por vía rectal o vaginal a un paciente. La formulación está preferentemente en forma de supositorios que pueden prepararse mezclando los compuestos de la presente invención con excipientes o vehículos no irritantes adecuados tales como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera de supositorios, que son sólidos a temperaturas ambiente pero líquidos a temperaturas corporales y por lo tanto, se funden en el recto o en la cavidad vaginal y liberan el componente activo.
“Formulaciones adecuadas para administración sistémica” significa formulaciones que están en una forma adecuada para administrarse sistémicamente a un paciente. La formulación se administra preferentemente por inyección, incluyendo intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. Para inyección, los compuestos de la invención se formulan en
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soluciones líquidas, preferentemente en tampones compatibles fisiológicamente tales como solución de Hank o solución de Ringer. Además, los compuestos pueden formularse en forma sólida y redisolverse o suspenderse inmediatamente antes de su uso. También se incluyen formas liofilizadas. La administración sistémica también puede ser por medio transmucoso o transdérmico o pueden administrarse los compuestos por vía oral. Para administración transmucosa o transdérmica, se usan penetrantes apropiados para la barrera a atravesar por filtración en la formulación. Dichos penetrantes se conocen generalmente en la técnica e incluyen, por ejemplo, sales biliares y derivados de ácido fusídico para la administración transmucosa. Además, pueden usarse detergentes para facilitar la filtración. La administración transmucosa puede ser a través del uso de pulverizadores nasales, por ejemplo, o supositorios. Para la administración oral, los compuestos se formulan en formas de administración oral convencionales tales como cápsulas, comprimidos y tónicos.
“Formulaciones adecuadas para su administración tópica” significa formulaciones que están en una forma adecuada para administrarse por vía tópica a un paciente. La formulación puede presentarse como una pomada tópica, pomadas balsámicas, polvos, pulverizaciones e inhalantes, geles (basados en agua o en alcohol), cremas, como se conoce generalmente en la técnica o incorporarse a una base de matriz para su aplicación en un parche, lo que permitiría una liberación controlada del compuesto a través de la barrera transdérmica. Cuando se formulan en una pomada, los principios activos pueden emplearse con una base de pomada de parafina o miscible en agua. Como alternativa, los principios activos pueden formularse en una crema con una base de crema de aceite en agua. Las formulaciones adecuadas para su administración tópica en el ojo incluyen colirios en el que el principio activo se disuelve o suspende en un vehículo adecuado, especialmente un disolvente acuoso para el principio activo. Las formulaciones adecuadas para su administración tópica en la boca incluyen pastillas que comprenden el principio activo en una base aromatizada, habitualmente sacarosa y goma arábica o de tragacanto; pastillas que comprenden el principio activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y goma arábica; y elixires bucales que comprenden el principio activo en un vehículo líquido adecuado.
“Forma farmacéutica sólida” significa que la forma farmacéutica del compuesto de la invención está en forma sólida, por ejemplo, cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos, grageas
o gránulos. En dichas formas farmacéuticas sólidas, el compuesto de la invención se mezcla con al menos un excipiente habitual inerte (o vehículo) tal como citrato sódico o fosfato dicálcico o (a) cargas o extensores como, por ejemplo, almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico, (b) aglutinantes como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y goma arábiga (c) humectantes como, por ejemplo,
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glicerol, (d) agentes disgregantes como, por ejemplo, agar-agar, carbonato cálcico, almidón de patata o de yuca, ácido algínico, ciertos silicatos complejos y carbonato sódico, (e) retardantes de la solución como, por ejemplo parafina, (f) aceleradores de absorción como, por ejemplo, compuestos de amonio cuaternario, (g) agentes humectantes como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, (h) adsorbentes como, por ejemplo, caolín y bentonita, (i) lubricantes como, por ejemplo, talco, estearato cálcico, estearato de magnesio, poliletilenglicoles sólidos, lauril sulfato sódico, (j) agentes opacificantes, (k) agentes tamponantes y agentes que liberan el compuesto o los compuestos de la invención en una cierta parte del tracto intestinal de manera retardada.
Los niveles de dosificación reales del principio o de los principios activos en las composiciones de la invención pueden variarse para obtener una cantidad de principio o principios activos que es eficaz para obtener una respuesta terapéutica deseada para una composición y procedimiento de administración particulares para un paciente. Un nivel de dosificación seleccionado para cualquier paciente particular depende por lo tanto de una diversidad de factores que incluyen el efecto terapéutico deseado, la vía de administración, la duración deseada del tratamiento, la etiología y gravedad de la enfermedad, la condición, peso, sexo, dieta y edad del paciente, el tipo y potencia de cada principio activo, las velocidades de absorción, el metabolismo y/o la excreción y otros factores.
La dosis diaria total de los compuestos de la presente invención administrada a un paciente en dosis únicas o divididas puede variar en las cantidades, por ejemplo, de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal diarios y preferentemente de 0,01 a 10 mg/kg/día. Por ejemplo, en un adulto, las dosis generalmente son de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100, preferentemente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal al día por inhalación, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100, preferentemente de 0,1 a 70, más especialmente de 0,5 a 10 mg/kg de peso corporal al día por administración oral y de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50, preferentemente de 0,01 a 10 mg/kg de peso corporal al día por administración intravenosa. El porcentaje del principio activo en una composición puede variarse, aunque debería constituir una proporción tal que se obtenga una dosificación adecuada. Las composiciones unitarias de dosificación pueden contener tales cantidades de tales submúltiplos de las mismas como puedan usarse para realizar la dosis diaria. Obviamente, pueden administrarse varias formas farmacéuticas unitarias aproximadamente al mismo tiempo. Una dosificación puede administrarse tan frecuentemente como sea necesario para obtener el efecto terapéutico deseado. Algunos pacientes pueden responder rápidamente a dosis mayores o menores y pueden resultar adecuadas dosis de mantenimiento más débiles.
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Para otros pacientes, puede ser necesario tener tratamientos a largo plazo con una tasa de 1 a 4 dosis por día, de acuerdo con las necesidades fisiológicas de cada paciente particular. No hace falta decir que, para otros pacientes, será necesario prescribir no más de una o dos dosis por día.
Las formulaciones pueden prepararse en forma farmacéutica unitaria por cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Dichos procedimientos incluyen la etapa de asociar el principio activo con el vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el principio activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos y después, si es necesario, dando forma al producto.
Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de monodosis o de multidosis, por ejemplo, ampollas selladas y frascos con tampones elastoméricos y pueden almacenarse en un estado secado por congelación (liofilizado) que requiere sólo la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Pueden prepararse soluciones y suspensiones para inyección extemporánea a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo previamente descrito.
Los compuestos descritos en el presente documento muestran actividades farmacológicas notables de acuerdo con ensayos descritos en la bibliografía y posteriormente, creyéndose que los resultados de dichos ensayos se relacionan con la actividad farmacológica en seres humanos y otros mamíferos. PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DE ENZIMA IN VITRO Inhibición de serina proteasa NS3 de VHC
El dominio de proteasa NS3 de VHC se expresó y purificó como se ha descrito previamente (Vertex, Publicación de PCT WO98/17679; que se incorpora en el presente documento por referencia). American Peptide Com (Ca) sintetizó el sustrato de péptido cromogénico, EDVVAbuC-p-nitroanilida y el fragmento de cofactor NS4A (KKGSVVIVGRIVLSGK-) para la proteasa NS3 a petición del cliente. Los compuestos descritos en el presente documento se ensayaron con respecto a su capacidad para inhibir la actividad de la proteasa NS3 de VHC usando un ensayo espectrofotométrico con EDVVAbuC-pnitroanilida como sustrato. El ensayo se ejecutó en una placa de microtitulación de 96 pocillos usando un lector SpectraMax 250 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) con capacidad cinética. Se realizó la escisión de sustrato de EDVVAbuC-p-nitroanilida (500 µM) mediante proteasa NS3 de VHC purificada (0,5 µM) a 30ºC en el tampón que contiene fragmento de NS4A 30 µM, Hepes 46 mM, pH 8,0, NaCl 92 mM, glicerol al 18%, DTT 5 mM y DMSO al 7,5% en ausencia o presencia del compuesto del ensayo. La reacción se controló con respecto a la liberación de
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pNA (p-nitroanilina) a 405 nm.
La determinación de los parámetros cinéticos incluyendo Vmáx, Km y Vmáx/Km se realiza en las condiciones descritas anteriormente. Los valores de Ki se calculan a partir de representaciones de velocidad contra [inhibidor], a concentraciones fijas de enzima y sustrato, por un ajuste de mínimos cuadrados no lineal de los datos a la ecuación de Morrison para inhibición competitiva de unión estrecha [J. F. Morrison, Biochim. Biophys. Acta., 185, 269-286 (1969)]. Se usó el programa Prism (GraphPad Software, Inc.) para este procedimiento.
Los inhibidores de serina proteasa de VHC desvelados en el presente documento pueden usarse en combinación con otras moléculas que muestran directamente o inducen indirectamente actividad anti-VHC de forma profiláctica en pacientes en riesgo de contraer infección por VHC o para tratar pacientes que ya están infectados. La expresión “actividad anti-VHC” se refiere a la capacidad de una molécula, cuando está presente, de inhibir completamente o reducir la acumulación de los viriones de VHC en comparación con la acumulación de los viriones de VHC en ausencia de dicha molécula y/o la capacidad de una molécula para reducir o mejorar las afecciones o síntomas asociados con la infección por VHC
o la patogénesis en pacientes. Las moléculas que tienen actividad anti-VHC incluyen las que interrumpen una o más etapas de la infección o replicación por VHC, así como las que provocan acciones inmunomoduladoras y antiproliferativas en las células huésped. Las moléculas que tienen actividad anti-VHC pueden inhibir acontecimientos replicativos específicos de VHC tales como, pero sin limitación, síntesis de ácidos nucleicos o proteínas dirigida por VHC. Las etapas de replicación de VHC en las que las moléculas que tienen actividad anti-VHC pueden actuar incluyen entrada a la célula (por ejemplo, unión; penetración), desprendimiento de la envoltura y liberación del genoma de VHC; replicación del genoma de VHC (por ejemplo, replicación de cualquiera de las cadenas del genoma de ARN viral; transcripción del ARN mensajero viral); traducción de las proteínas de VHC; modificación post-traduccional de proteínas de VHC (por ejemplo, escisión proteolítica; glucosilación); transporte intracelular de las proteínas virales; ensamblaje de componentes de virión; y liberación de las partículas virales (por ejemplo, gemación). Las clases de moléculas que tienen actividad antiviral incluyen, pero sin limitación, receptores señuelo solubles y anticuerpos antirreceptor; bloqueantes del canal de iones, estabilizadores de cápsida e inhibidores de la proteína de fusión; inhibidores de polimerasas virales, transcriptasa inversa, helicasa, primasa
o integrasa; oligonucleótidos antisentido y ribozimas; agentes inmunomoduladores e immunoestimulantes, incluyendo citocinas tales como interferones, así como agonistas de péptidos, esteroides y fármacos clásicos tales como levamisol; inhibidores de proteínas reguladoras; inhibidores de proteasa; inhibidores de proteínas de ensamblaje; y anticuerpos
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antivirales y linfocitos citotóxicos. La expresión “cantidad eficaz anti-VHC” o “cantidad farmacéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de un compuesto o combinación de compuestos como se desvela en el presente documento, eficaz en la reducción o mejora de las afecciones o síntomas asociados con infección por VHC o la patogénesis asociada en pacientes o en la reducción de los niveles virales in vitro o in vivo. Las aplicaciones in vitro incluyen el sistema de ensayo de replicón, descrito posteriormente, en el que dichas cantidades son eficaces en la reducción de la acumulación de ARN del replicón de VHC y/o la acumulación de proteínas codificadas por genes contenidos en el mismo.
Los compuestos que tienen actividad anti-VHC contemplados para su uso en las composiciones y procedimientos de terapia de combinación desvelados en el presente documento incluyen, pero sin limitación, moléculas inmunomoduladoras, incluyendo citocinas inmunoestimuladoras y otros compuestos que se sabe que tienen actividad antiviral para VHC, tal como diversos nucleósidos y nucleótidos antivirales.
Las moléculas inmunomoduladoras contempladas para su uso en combinación con los inhibidores de serina proteasa de VHC desvelados en el presente documento incluyen, pero sin limitación, interferón alfa 2B (Intron A, Schering Plough); Rebatron (Schering Plough, interferón alfa 2B + ribavirina); interferón alfa pegilado (Reddy, K. R. y col. Efficacy and safety of pegylated (40-kd) interferón alfa-2a compared with interferon alfa-2a in noncirrhotic patients with chronic hepatitis C. Hepatology 33, 433-438 (2001)); interferón de consenso (Kao, J.H., Chen, P.J., Lai, M.Y. & Chen, D.S. Efficacy of consensus interferon in the treatament of chronic hepatitis C. J. Gastroenterol. Hepatol. 15, 1418-1423 (2000)); interferón alfa 2A (Roferon A; Roche); interferón de linfoblastoide o “natural”; interferón tau (Clayette, p. y col. IFN-tau, a new interferon type I with antiretroviral activity. Pathol. Biol. (París) 47, 553-559 (1999)); Interleucina 2 (Davis, G.L., Nelson, D.R. & Reyes, G.R. Future options for the management of hepatitis C. Seminars in Liver Disease 19,103-112 (1999)); interleucina 6 (Davis, G.L., Nelson, D.R. & Reyes, G.R. Future options for the management of hepatitis C. Seminars en Liver Disease 19, 103-112 (1999)); interleucina-12 (Davis, G.L., Nelson, D.R. & Reyes, G.R. Future options for the management of hepatitis C. Seminars in Liver Disease 19, 103-112 (1999)); ribavirina; y compuestos que mejoran el desarrollo de una respuesta de linfocitos T colaboradores de tipo 1 (Davis, G.L., Nelson, D.R. & Reyes, G.R. Future options for the management of hepatitis C. Seminars in Liver Disease 19, 103-112 (1999)). Los interferones pueden mejorar las infecciones virales ejerciendo efectos antivirales directos y/o modificando la respuesta inmune a la infección. Los efectos antivirales de los interferones con frecuencia están mediados a través de la inhibición de la penetración viral o desprendimiento de la envoltura, síntesis del ARN viral, traducción de proteínas virales y/o ensamblaje y liberación virales.
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Los compuestos que estimulan la síntesis de interferón en las células (Tazulakhova, E.B., Parshina, O.V., Gusev, T.S. & Ershov, F.I. Russian Experience in Screening, Analysis, and Clinical Application of Novel Interferon Inducers. J. Interferón Cytokine Res. 21,65-73)) incluyen, sin limitación, ARN bicatenario, solo o en combinación con tobramicina e Imiquimod (3M Pharmaceuticals) (Sauder, D.N. Immunomodulatory and pharmacologic properties of imiquimod. J. Am. A cad. Dermatol. 43, S6-11 (2000)).
Otros compuestos que se sabe que tienen, o que pueden tener, actividad antiviral para VHC en virtud de mecanismos no inmunomoduladores incluyen, pero sin limitación, ribavirina (ICN Pharmaceuticals); inhibidores de la inosina 5'-monofosfato deshidrogenasa (VX-497, en desarrollo por Vertex Pharmaceuticals); amantadina y rimantadina (Younossi, A. M y Perillo,
R.P. The roles of amantadine, rimantadine, ursodeoxicholic acid, NSAIDs, alone or in combination with alpha interferons, in the treatment of chronic hepatitis C. Seminars in Liver Disease 19, 95-102 (1999)); LY217896 (Patente de Estados Unidos 4.835.168) (Colacino, J.M. y col. Evaluation of the anti-influenza virus activities of 1,3,4-tiadiazol-2-ilcianamida (LY217896) and its sodium salt. Antimicrobial Agents & Chemotherapy 34, 2156-2163 (1990)); y éster metílico del ácido 9-hidroximino-6-metoxi-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahidrofenantreno-1-carboxílico; clorhidrato de éster metílico del ácido 6-metoxi-1,4a-dimetil-9-(4-metilpiperazin-1-ilimino)-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahidro-fenantreno-1-carboxílico; 1-(2-cloro-fenil)-3(2,2-difenil-etil)-urea) (Patente de Estados Unidos 6.127.422).
Las formulaciones, dosis y vías de administración para las moléculas anteriores se enseñan en las referencias citadas posteriormente o se conocen bien en la técnica como se desvela, por ejemplo, en F.G. Hayden, en Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, Hardman y col, Eds., McGraw-Hill, Nueva York (1996), Capítulo 50, páginas 1191-1223, y las referencias citadas en la misma. Como alternativa, una vez que se ha identificado un compuesto que muestra actividad antiviral para VHC, pude determinarse una cantidad farmacéuticamente eficaz de ese compuesto usando técnicas que el experto en la materia conoce bien. Obsérvese, por ejemplo, Benet y col, en Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, Hardman y col, Eds., McGraw-Hill, Nueva York (1996), capítulo 1, páginas 3-27 y las referencias citadas en la misma. Por lo tanto, las formulaciones, intervalos de dosis y pautas posológicas apropiadas de dicho compuesto pueden determinarse fácilmente por procedimientos rutinarios.
Las combinaciones de fármacos descritas en el presente documento pueden proporcionarse a una célula o células o a un paciente humano, en formulaciones separadas farmacéuticamente aceptables administradas de forma simultánea o secuencial, formulaciones que contienen más de un agente terapéutico o por una variedad de formulaciones de agente
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sencillo y agente múltiple. Independientemente de cómo se administren, estas combinaciones de fármacos forman una cantidad eficaz anti-VHC de componentes.
Un gran número de otros inmunomoduladores e inmunoestimulantes que pueden usarse en los procedimientos descritos en el presente documento están disponibles actualmente e incluyen: AA-2 G; dipéptido de adamantilamida; adenosina desaminasa, Enzon; adyuvantes, Alliance; adyuvantes, Ribi; adyuvantes, Vaxcel; Adjuvax; agelasfina-11; terapia de SIDA, Chiron; glucano algal, SRI; algamulina, Anutech; Anginlyc; factores anticelulares, Yeda; Anticort; inmunógeno de antigastrina-17, Ap; sistema de suministro de antígenos, Vac; formulación de antígenos, IDBC; inmunógeno antiGnRH, Aphton; Antiherpin; Arbidol; azarol; Bay-q-8939; Bay-r-1005; BCH-1393; Betafectina; Biostim; BL-001; BL-009; Broncostat; Cantastim; CDRI-84-246; cefodizima; inhibidores de quimiocuina, ICOS; péptidos CMV, City of Hope; CN-5888; agente de liberación de citocina, St; DHEAS, Paradigm; DISC-TA-HSV; J07B; I01A; I01Z; ditiocarb sódico; ECA-10-142; ELS-1; endotoxina, Novartis; FCE-20696; FCE24089; FCE-24578; ligando FLT-3, Immunex; FR-900483; FR-900494; FR-901235; FTS-Zn; Proteínas G, Cadus; gludapcina; glutaurina; glucofosfopeptical; GM-2; GM-53; GMDP; vacuna de factor de crecimiento, EntreM; H-BIG, NABI; H-CIG, NABI; HAB-439; vacuna de Helicobacter pylori; factor inmune específico de herpes; terapia para VIH, United Biomed; HyperGAM + CF; ImmuMax; BCG inmunes, terapia inmune, Connective; inmunomodulador, Evans; inmunomoduladores, Novacell; imreg-1; imreg-2; Indomune; Inosina pranobex; interferón, Dong-A (alfa2); interferón, Genentech (gamma); interferón, Novartis (alfa); interleucina-12, Genetics Ins; interleucina-15, Immunex; interleucina-16, Research Cor; ISCAR1; J005X; L-644257; ácido licomarasmínico; LipoTher; LK-409; LK-410; LP-2307; LT (R1926); LW-50020; MAF, Shionogi; derivados de MDP, Merck; met-encefalina, TNI; metilfurilbutirolactonas; MIMP; mirimostim; vacuna bacterial mixta, Tem; MM-1; moniliastat; MPLA, Ribi; MS-705; murabutida; murabutida, Vacsyn; derivado del dipéptido de muramilo; mielopid derivado de péptido de muramilo; -563; NACOS-6; NH-765; NISV, Proteus; NPT16416; NT-002; PA-485; PEFA-814; péptidos, Scios; péptidoglucano, Pliva; Perthon, Advanced Plant; derivado de PGM, Pliva; Pharmaprojects Nº 1099; Nº 1426; Nº 1549; Nº 1585; Nº 1607; Nº 1710; Nº 1779; Nº 2002; Nº 2060; Nº 2795; Nº 3088; Nº 3111; Nº 3345; Nº 3467; Nº 3668; Nº 3998; Nº 3999; Nº 4089; Nº 4188; Nº 4451; Nº 4500; Nº 4689; Nº 4833; Nº 494; Nº 5217; Nº 530; pidotimod; pimelautida; pinafida; PMD-589; podofilotoxina, Conpharm; POL-509; poli-ICLC; poli-ICLC, Yamasa Shoyu; PolyA-PolyU; Polisacárido A; proteína A, Berlox Bioscience; PS34WO; Mab de Pseudomonas, Teijin; Psomaglobina; PTL-78419; Pirexol; piriferona; Retrogen; Retropep; RG-003; Rhinostat; rifamaxil; RM-06; Rollin; romurtida; RU-40555; RU41821; anticuerpos de Rubella, ResCo; S-27609; SB-73; SDZ-280-636; SDZ-MRL-953; SK&F
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107647; SL04; SL05; SM-4333; Soluteína; SRI-62-834; SRL-172; ST-570; ST-789; lisado de staphage; Stimulon; supresina; T-150R1; T-LCEF; tabilautida; tenmrtida; Theradigm-HBV; Theradigm-HPV; Theradigm-HSV; THF, Pharm & Upjohn; THF, Yeda; timalfasina; fracciones de hormonas del timo; timocartina; timolinfotropina; timopentina; análogos de timopentina; timopentina, Peptech; fracción 5 de timosina, Alpha; timoestimulina; timotrinano; TMD-232; TO115; factor de transferencia, Viragen; tuftsina, Selavo; ubenimex; Ulsastat; ANGG-; CD-4+; Collag+; COLSF+; COM+; DA-A+; GAST-; GF-TH+; GP-120-; IF+; IF A,+; IP-A-2+; IF-B+; IFG+; IF-G-1B+; IL-2+; IL-12+; IL-15+; IM+; LHRH-; LIPCOR+LLYM-B+; LYM-NK+; LYM-T+; OPI+; PEP+; PHG-MA+; RNA-SYN-; SY-CW-; TH-A-1+; TH-5+; TNF+; UN.
Los compuestos de nucleósidos y nucleótidos representativos útiles en la presente invención incluyen, pero sin limitación: (+)-cis-5-fluoro-1-[2-(hidroxi-metil)-[1,3-oxatiolan-5-il] citosina; (-)-2'-desoxi-3'-tiocitidina-5'-trifosfato (3TC); (-) -cis-5-fluoro-1-[2-(hidroxi-metil)-[1,3oxatiolan-5-il]citosina (FTC); (-) 2',3',didesoxi-3'-tiacitidina [(-)-SddC]; 1-(2-desoxi-2-fluoro-betaD-arabinofuranosil)-yodocitosina (FIAC); 1-(2'-desoxi-2'-fluoro-beta-D-arabinofuranosil)-5-yodocitosina trifosfato (FIACTP); 1-(2'-desoxi-2'-fluoro-beta-D-arabinofuranosil)-5-metiluracilo (FMAU); 1-beta-D-ribofuranosil-1,2,4-triazol-3-carboxamida; 2',3'-didesoxi-3'fluoro-5-metil-dexocitidina (FddMeCyt); 2',3'-didesoxi-3'-cloro-5-metil-dexocitidina (ClddMeCyt); 2',3'-didesoxi-3'-amino-5-metil-dexocitidina (AddMeCyt); 2',3'-didesoxi-3'-fluoro-5-metil-citidina (FddMeCyt); 2',3'-didesoxi-3'-cloro-5-metil-citidina (ClddMeCyt); 2',3'-didesoxi-3'-amino-5-metil-citidina (AddMeCyt); 2',3'-didesoxi-3'-fluorotimidina (FddThd); 2',3'-didesoxi-beta-L-5-fluorocitidina (beta-L-FddC); 2',3'-didesoxi-beta-L-5-tiacitidina; 2',3'-didesoxi-beta-L-5-citidina (beta-L-ddC); 9-(1,3-dihidroxi2-propoximetil) guanina; 2'-desoxi-3'-tia-5-fluorocitosina; 3'-amino-5-metil-dexocitidina (AddMeCyt); 2-amino-1,9-[(2-hidroximetil-1-(hidroximetil) etoxi] metil]-6H-purin-6-ona (ganciclovir); 2-[2-(2amino-9H-purin-9y) etil] -1,3-propandil diacetato (famciclovir); 2-amino-1,9-dihidro -9-[(2-hidroxi-etoxi) metil] 6H-purin-6-ona (aciclovir); 9-(4-hidroxi-3-hidroximetil-but-1-il) guanina (penciclovir); 9-(4-hidroxi-3-hidroximetil-but-1-il)-6-desoxi-guanina diacetato (famciclovir); 3'-azido-3-desoxitimidina (AZT); 3'-cloro-5-metil-dexocitidina (ClddMeCyt); 9-(2-fosfonil-metoxietil) –2',6'-diaminopurina-2',3'-didesoxirribósido; 9-(2-fosfonilmetoxietil) adenina (PMEA); aciclovir trifosfato (ACVTP);
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2'-desoxiguanosina D-carbocíclica (CdG); didesoxi-citidina; didesoxi-citosina (ddC); didesoxiguanina (ddG); didesoxi-inosina (ddI); E-5-(2-bromovinil)-2'-desoxiuridina trifosfato; fluoroarabinofuranosil-yodouracilo; 1-(2'-desoxi-2'-fluoro-1-beta-D-arabinofuranosil)-5-yodo-uracilo (FIAU); estavudina; 9-beta-D-arabinofuranosil-9H-purina-6-amina monohidrato (Ara-A); 9-beta-D-arabinofuranosil-9H-purina-6-amina-5'-monofosfato monohidrato (Ara-AMP); 2-desoxi3'-tia-5-fluorocitidina; 2',3'-didesoxi-guanina; y 2',3'-didesoxi-guanosina.
En la técnica se conocen bien procedimientos sintéticos para la preparación de nucleósidos y nucleótidos útiles en la presente invención como se desvela en Acta Biochim. Pol, 43, 25-36 (1996); Swed. Nucleosides Nucleotides 15, 361-378 (1996); Synthesis 12,14651479 (1995); Carbohyd. Chem. 27, 242-276 (1995); Chem. Nucleosides Nucleotides 3, 421-535 (1994); Ann. Reports in Med. Chem., Academic Press; y Exp. Opin. Invest. Drugs 4, 95-115 (1995).
Las reacciones químicas descritas en las referencias citadas anteriormente se desvelan generalmente en términos de su aplicación más amplia a la preparación de los compuestos descritos en el presente documento. Ocasionalmente, las reacciones pueden no ser aplicables como se describe para cada compuesto incluido dentro del ámbito de compuestos desvelados en el presente documento. Los compuestos para los que sucede esto se reconocerán fácilmente por los expertos en la materia. En todos los casos tales, las reacciones pueden realizarse de manera exitosa mediante modificaciones convencionales conocidas para los expertos en la materia, por ejemplo, mediante protección apropiada de los grupos de interferencia, cambiando a reactivos alternativos convencionales, mediante modificación rutinaria de las condiciones de reacción y similares o se podrán aplicar otras reacciones desveladas en el presente documento o convencionales de otro modo a la preparación de los compuestos correspondientes de la presente invención. En todos los procedimientos preparatorios, todos los materiales de partida se conocen o se pueden preparar fácilmente a partir de materiales de partida conocidos.
Aunque generalmente se emplean análogos de nucleósidos como agentes antivirales tal cual, los nucleótidos (nucleósido fosfatos) a veces deben convertirse a nucleósidos para facilitar su transporte a través de las membranas celulares. Un ejemplo de un nucleótido modificado químicamente capaz de entrar en las células es S-1-3-hidroxi-2-fosfonilmetoxipropil citosina (HPMPC, Gilead Sciences). Los compuestos de nucleósidos y nucleótidos descritos en el presente documento que son ácidos pueden formar sales. Los ejemplos incluyen sales con metales alcalinos o metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, calcio o magnesio o con bases orgánicas o sales básicas de amonio cuaternario.
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Los inmunomoduladores e inmunoestimulantes útiles en los procedimientos de terapia de combinación descritos en el presente documento pueden administrarse en cantidades más pequeñas que las convencionales en la técnica. Por ejemplo, el interferón alfa se administra típicamente a seres humanos para el tratamiento de infecciones por VHC en una cantidad de aproximadamente 1 x 106 unidades/persona tres veces por semana a aproximadamente 10 x 106 unidades/persona tres veces por semana (Simon y col, Hepatology: 25: 445-448 (1997)). En los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento, esta dosis puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,1 x 106 unidades/persona tres veces por semana a aproximadamente 7,5 x 106 unidades/persona tres veces por semana; más preferentemente de aproximadamente 0,5 x 106 unidades/persona tres veces por semana a aproximadamente 5 x 106 unidades/persona tres veces por semana; más preferentemente de aproximadamente 1 x 106 unidades/persona tres veces por semana a aproximadamente 3 x 106 unidades/persona tres veces por semana. Debido a la eficacia antiviral para el virus de hepatitis C mejorada de los inmunomoduladores e inmunoestimulantes en presencia de los inhibidores de serina proteasa de VHC descritos en el presente documento, pueden emplearse cantidades reducidas de estos inmunomoduladores/inmunoestimulantes en los procedimientos y composiciones desvelados en el presente documento. De forma similar, debido a la eficacia mejorada de los antivirales para el virus de la hepatitis C de los presentes inhibidores de serina proteasa del VHC en presencia de inmunomoduladores e inmunoestimulantes, pueden emplearse cantidades reducidas de estos inhibidores de serina proteasa de VHC en los procedimientos y composiciones desvelados en el presente documento. Dichas cantidades reducidas pueden determinarse por control rutinario de las titulaciones del virus de la hepatitis C en pacientes infectados que se someten a terapia. Esto puede llevarse a cabo mediante, por ejemplo, control del ARN de VHC en el suero de los pacientes mediante técnicas de transferencia por ranuras, transferencia puntual o RT-PCR o mediante la medida de los antígenos de superficie del VHC u otros antígenos. Los pacientes pueden controlarse de forma similar durante la terapia de combinación empleando los inhibidores de serina proteasa de VHC desvelados en el presente documento y otros compuestos que tienen actividad anti-VHC, por ejemplo agentes antivirales de nucleósidos y/o nucleótidos, para determinar las dosis eficaces más bajas de cada uno cuando se usan en combinación.
En los procedimientos de terapia de combinación desvelada en el presente documento, los compuestos antivirales de nucleósidos o nucleótidos, o mezclas de los mismos, pueden administrarse a seres humanos en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/persona/día a aproximadamente 500 mg/persona/día; preferentemente de aproximadamente 10 mg/persona/día a aproximadamente 300 mg/persona/día; más
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preferentemente de aproximadamente 25 mg/persona/día a aproximadamente 200 mg/persona/día; incluso más preferentemente de aproximadamente 50 mg/persona/día a aproximadamente 150 mg/persona/día; y más preferentemente en el intervalo de aproximadamente 1 mg/persona/día a aproximadamente 50 mg/persona/día.
Las dosis de los compuestos pueden administrarse a un paciente en una dosis única o en subdosis múltiples proporcionales. En el segundo caso, las composiciones unitarias de dosificación pueden contener tales cantidades de submúltiplos de las mismas para completar la dosis diaria. Múltiples dosis al día pueden aumentar también la dosis diaria total si así lo deseara la persona que prescribe el fármaco.
La pauta para tratar a un paciente que padece una infección por VHC con los compuestos y/o composiciones descritos en el presente documento se selecciona de acuerdo con una diversidad de factores, incluyendo la edad, peso, sexo, dieta y condición médica del paciente, la gravedad de la infección, la vía de administración, consideraciones farmacológicas tales como la actividad, eficacia, farmacocinética y perfiles toxicológicos de los compuestos particulares empleados y si se utiliza un sistema de suministro de fármaco. La administración de las combinaciones de fármacos desveladas en el presente documento generalmente debería continuarse durante un período de varias semanas a varios meses o años hasta que las titulaciones del virus alcancen niveles aceptables, lo que indica que la infección se ha controlado o erradicado. Los pacientes que se someten a tratamiento con las combinaciones de fármacos desveladas en el presente documento pueden controlarse rutinariamente midiendo el ARN viral de la hepatitis en el suero de los pacientes mediante técnicas de transferencia por ranuras, transferencia puntual o RT-PCR o mediante la medida de los antígenos virales de hepatitis C, tales como antígenos de superficie, en suero para determinar la eficacia de la terapia. El análisis continuo de los datos obtenidos por estos procedimientos permite la modificación del régimen de tratamiento durante la terapia de modo que se administren cantidades óptimas de cada componente en la combinación y de modo que la duración del tratamiento pueda también determinarse. De este modo, el programa de régimen/dosificación del tratamiento puede modificarse de forma racional durante el transcurso de la terapia de modo que se administren las cantidades más bajas de cada uno de los compuestos antivirales usados en combinación que muestran juntos eficacia satisfactoria antivirus de la hepatitis C y de modo que la administración de dichos compuestos antivirales en combinación se continúe durante tanto tiempo como sea necesario para tratar de forma exitosa la infección.
Además, se describe el uso de los inhibidores de serina proteasa de VHC desvelados en el presente documento en diversas combinaciones con los tipos de compuestos anteriores y
286
similares que tienen actividad anti-VHC para tratar o prevenir infecciones por VHC en pacientes. Por ejemplo, pueden usarse uno o más inhibidores de serina proteasa de VHC en combinación con: uno o más interferones o derivados de interferón que tienen actividad anti-VHC; uno o más compuestos sin interferón que tienen actividad anti-VHC; o uno o más interferones o derivados de interferón que tienen actividad anti-VHC y uno o más compuestos sin interferón que tienen actividad anti-VHC. Cuando se usan en combinación para tratar o prevenir la infección por VHC en un paciente humano, cualquiera de los inhibidores de serina proteasa de VHC desvelados en el presente documento y los compuestos anteriores que tienen actividad anti-VHC pueden estar presentes en una cantidad anti-VHC o farmacéuticamente eficaz. En virtud de sus efectos aditivos o sinérgicos, cuando se usan en las combinaciones descritas anteriormente, cada uno puede también estar presente en una cantidad farmacéuticamente eficaz o eficaz anti-VHC subclínica, es decir, una cantidad que, si se usa sola, proporciona una eficacia farmacéutica reducida en la inhibición completa o reducción de la acumulación de viriones de VHC y/o la reducción o mejora de las afecciones o síntomas asociados con la infección por VHC o patogenia en pacientes en comparación con dichos inhibidores de serina proteasa de VHC y compuestos que tienen actividad anti-VHC cuando se usan en cantidades farmacéuticamente eficaces. Además, se describe el uso de combinaciones de inhibidores de serina proteasa de VHC y compuestos que tienen actividad anti-VHC como se describe anteriormente para tratar o prevenir infecciones por VHC, en las que uno o más de estos inhibidores o compuestos están presentes en una cantidad farmacéuticamente eficaz y el otro o los otros están presentes en una cantidad o unas cantidades farmacéuticamente eficaces o eficaces anti-VHC subclínicas debido a sus efectos aditivos o sinérgicos. Como se usa en el presente documento, la expresión “efecto aditivo” describe el efecto combinado de dos (o más) agentes farmacéuticamente activos que es igual a la suma del efecto de cada agente por sí solo. Un efecto sinérgico es uno en el que el efecto combinado de dos (o más) agentes farmacéuticamente activos es mayor que la suma del efecto de cada agente por sí solo. Ejemplo 42
La terapia convencional actual para la infección por virus de la hepatitis C (VHC) es el tratamiento con el inmunomodulador interferón alfa (Chronic Hepatitis C: Current Disease Management, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health, 1999). Esta terapia es ineficaz en la mayoría de los pacientes de VHC, que no muestran respuesta o muestran una recaída incluso después de una terapia con interferón prolongada. Adicionalmente, existen efectos secundarios graves asociados con la terapia con interferón.
A la vista de la urgente necesidad de nuevos fármacos antivirales más eficaces para
287
tratar a pacientes infectados con VHC, los presentes inventores han desarrollado una serie de compuestos que inhiben la serina proteasa de VHC (un complejo de proteínas virales NS3 y NS4A de VHC). Estos compuestos pueden usarse por sí solos, juntos y en combinación con otras clases de compuestos para tratar o prevenir la infección por VHC. Este ejemplo describe el ensayo de tres inhibidores de serina proteasa de VHC representativos, es decir, compuesto CU, compuesto EP y compuesto EC, solos y en combinación con miembros individuales de un grupo de interferones (interferón alfa-2B (Schering-Plough), interferón alfa-2A (PBL Biomedical Laboratories, New Brunswick, NJ), interferón beta (Research Diagnostics Inc, Flanders, NJ) e interferón ovino tau (Research Diagnostic Inc., Flanders, NJ)) en un ensayo de replicón de ARN subgenómico de VHC (ensayo de replicón) para determinar si los dos compuestos actúan de forma común para disminuir la acumulación de ARN de VHC. El ensayo de replicón mide la cantidad de ARN subgenómico de VHC (ARN de replicón) que permanece en las células con replicón (Lohmann y col. Science 285:110-113 (1999)) después de dos días del tratamiento con fármaco en relación con la cantidad de ARN de replicón en células no tratadas. En este ensayo, la potencia de los compuestos como fármacos antivirales para VHC es directamente proporcional al nivel de inhibición de la acumulación de ARN del replicón.
Los dos fármacos se ensayan en combinaciones en el sistema de ensayo de replicón in vitro para determinar si, cuando se usan juntos, muestran actividad anti-VHC aditiva o sinérgica. El ensayo de replicón se emplea como un modelo sustituto para la infección de VHC in vitro para evaluar los efectos combinados del inmunomodulador, por ejemplo, interferón alfa 2B ((Intron A); Schering Plough) y el inhibidor de serina proteasa de VHC, por ejemplo el compuesto CU. Como se muestra posteriormente, los resultados demuestran que existe un claro efecto sinérgico anti-VHC de estos dos tipos de fármacos según se midió usando determinaciones matemáticas formales de sinergia para analizar su capacidad de reducción de los niveles de ARN de VHC en el ensayo de replicón. El Ensayo de Replicón
El ensayo de replicón que emplea una línea celular que contiene el ARN subgenómico de VHC autorreplicativo (replicón) se describe en Lohmann y col. Science 285:110-113 (1999). El número de acceso de GenBank para la secuencia del replicón usado en los experimentos descritos en el presente documento se indica en esta referencia como AJ242654. Este articulo desvela procedimientos para la transcripción in vitro de ARN del ADNc de replicón, la transfección del ARN del replicón en células de Huh7 por electroporación y la selección de células que contienen el ARN de replicón usando el antibiótico G418. Las células Huh7 son una línea de celular de hepatoma obtenida del Dr. William Mason en el Centro para la Investigación del Cáncer en Fox Chase (Filadelfia). Estas células están disponibles públicamente de Fox
288
Chase y se han descrito exhaustivamente en la bibliografía científica (Nakabayashi y col. Cancer Res. 42:3858-3863 (1982)). En los experimentos descritos en el presente documento, todo el ADN molde se retira de la preparación ARN del replicón transcrito in vitro antes de la electroporación de este ARN en células Huh7 por tratamiento múltiple con DNasa (tres tratamientos secuenciales).
El ensayo del replicón se realiza como se describe en detalle posteriormente. Brevemente, las células con replicón se colocan en bandejas de 96 pocillos a una densidad de
10.000 células por pocillo y se incuban a 37ºC. Las células se incuban en DMEM (Medio Esencial Mínimo de Dulbecco) complementado con suero bovino fetal al 10%, glutamina, aminoácidos no esenciales y el antibiótico G418 (0,25 mg/ml). Después de la incubación durante una noche, el medio se reemplaza con DMEM que contiene suero bovino fetal al 2% y diversas concentraciones del inhibidor de serina proteasa, tal como compuesto CU y/o un interferón tal como interferón alfa 2B (Intron A, Schering Plough). Cada compuesto se ensaya de seis a ocho concentraciones diferentes. Para un extremo del intervalo de concentraciones se seleccionan concentraciones altas de los compuestos que darán como resultado una inhibición casi completa de la acumulación de ARN del replicón después de dos días de tratamiento. A partir de estas concentraciones de partida, se realizan diluciones en serie de modo que los intervalos de concentración ensayados en el ensayo de replicón incluyen concentraciones a las que los compuestos son altamente eficaces, así como concentraciones a las que no hay efecto significativo. Cada concentración de inhibidor de serina proteasa de VHC se ensaya sin ningún interferón añadido, así como con la adición de seis a ocho dosis de interferón diferentes. De forma similar, se ensaya el interferón sin ningún inhibidor de serina proteasa de VHC añadido. Después de una incubación de 48 horas con los compuestos, el medio se retira de las placas y se extrae el ARN celular total de las células usando el kit RNeasy-96 fabricado por Qiagen Inc. (Valencia, CA). Este ARN se analiza después por RTPCR cuantitativa o TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City CA). La diana de RT-PCR de TaqMan® es el gen de resistencia a neomicina en el ARN del replicón. Las placas se configuran de modo que hay 5 repeticiones de cada muestra de tratamiento farmacológico y 16 repeticiones de las muestras no tratadas. Esto permite una mayor aceptación estadística de los datos de la RT-PCR cuantitativa.
El análisis de los datos del ensayo de replicón produce dos valores que son útiles en la evaluación de la potencia de los agentes antivirales para VHC potenciales. En cada concentración de compuesto ensayada, se determina el nivel de inhibición en la acumulación de ARN del replicón causada por el compuesto durante dos días de tratamiento en relación con la cantidad de ARN del replicón en células no tratadas. Esto se presenta como inhibición
289
porcentual. Cuando se ha obtenido una serie de puntos de datos generados por tratamientos de células a un intervalo de concentraciones, se generan valores de CI50, es decir, la concentración del compuesto a la que el compuesto disminuye la acumulación de ARN del replicón de VHC en un 50%. A través de ensayos repetidos de los inhibidores de serina proteasa del VHC en el ensayo de replicón, se determina que la CI50 tiene un coeficiente porcentual de variación (% CV o 100% x desviación típica en el CI50/CI50 media) de aproximadamente el 20%. La CI50 es el valor usado para clasificar compuestos individuales ensayados en este ensayo basándose en su potencia como agentes antivirales para VHC. Las determinaciones simples de CI50 son inadecuadas para evaluar la utilidad de compuestos usados en combinación. El análisis más eficaz de la serie de datos generados usando todas las combinaciones de diferentes interferones e inhibidores de serina proteasa requiere la evaluación de las inhibiciones porcentuales como se muestra en la Tabla 7 usando métodos matemáticos descritos posteriormente que se diseñan para determinar si los tratamientos de combinación son agonistas, aditivos o sinérgicos. Los Detalles del Ensayo de Replicón son los siguientes:
Procedimiento para el Análisis Cuantitativo del ARN del Replicón de VHC en el Ensayo de Replicón de VHC Usando RT-PCR de TaqMan®
El Ensayo de Replicón se usa para medir la capacidad de compuestos antivirales para VHC potenciales para inhibir la acumulación de una molécula de replicón de ARN subgenómica de VHC en una línea celular de Huh7 (Lohmann y col. Replication of Subgenomic Hepatitis C Virus RNAs in a Hepatoma Cell Line. Science 285, 110-113 (1999)). Este ensayo comprende tres componentes operativos: (1) Mantenimiento de la célula con replicón, preparación de la placa de ensayo y aplicación del compuesto; (2) Extracción de ARN celular total de células con replicón; y (3) RT-PCR a tiempo real (TaqMan®) para medir la cantidad de ARN del replicón en cada muestra. El Ensayo de Replicón requiere al menos 4 días para realizarse; sin embargo, el procedimiento puede interrumpirse y pueden congelarse las muestras entre las etapas. Cada componente de ensayo se describe posteriormente.
1. Preparación de la placa de ensayo para mantenimiento de células con replicón y aplicación del compuesto
1.1 mantenimiento de la línea celular con replicón
La línea celular usada en el Ensayo de Replicón se produce como se describe en Lohmann y col. (Replication of Subgenomic Hepatitis C Virus RNAs in a Hepatoma Cell Line. Science 285, 110-113 (1999)). Después de incubar matraces de cultivo celular de 150 cm2 (Costar) que contienen células con replicón a 37ºC y CO2 al 5% y llegar hasta la confluencia, se diluyen las células 1:10, v/v, en matraces de cultivo celular de 150 cm2 nuevos. El medio es
290
DMEM que contiene suero bovino fetal al 10% (FBS), aminoácidos no esenciales 1X (NEAA), Glutamina 1X (Glu) y G418 0,25 mg/ml. Se realizan tres pases seriados, permitiendo cada vez que las células lleguen a confluir, seguido de dilución de las células en nuevos matraces de cultivo celular de 150 cm2. Estas células, denominadas “células originales” se separan después en alícuotas y se almacenan para su uso futuro en el Ensayo de Replicón. Se realiza un análisis basado en TaqMan® para determinar el número de genomas de replicón de VHC por célula, lo que revela la presencia de 150 copias del replicón por célula. Esto se basa en la relación de copias de ARN de replicón con dos veces las copias del gen apoB humano (número de genomas haploides).
1.1.1 Las células originales se almacenan en N2 líquido. Para las células usadas en el Ensayo de Replicón, después de 20 pases en serie, se abandonan las células y se revive un lote nuevo a partir de almacenamiento en N2 líquido.
1.2 Siembra en placas de las células en bandejas de 96 pocillos para el Ensayo de Replicón
1.2.1. Para la preparación de placas de 96 pocillos, se tripsinizan células que contienen replicón en un matraz de 75 cm2 confluyentes al 75% y se resuspenden en 10 ml de Medio A. La tripsinización se realiza retirando el medio, añadiendo 1 ml de tripsina-EDTA al 0,25%, p/v y retirando después la tripsina-EDTA. Después de 5-10 minutos las células se liberan del matraz y se resuspenden en medio.
1.2.2. Las células se cuentan usando un hemacitómetro y la concentración celular se ajusta a 105 células/ ml.
1.2.3. Cada pocillo se siembra con 100 µl de suspensión celular usando una pipeta multicanal Impact2 (Matrix), sin sembrar nunca más de cuatro placas de 96 pocillos a partir de una única suspensión celular.
1.2.4. Se incuban las placas de 96 pocillos a 37ºC durante una noche. 1.3. Dilución del compuesto y aplicación a las bandejas celulares del replicón
1.3.1. Se disuelven los compuestos de inhibidor de serina proteasa de VHC en dimetilsulfóxido (DMSO) hasta una concentración final de 20 mM. Los interferones se suspenden en solución salina tamponada con fosfato que contiene albúmina de suero bovino al 0,1% p/v.
1.3.2. Se diluye la solución del compuesto 20 mM hasta 1 mM con DMSO.
1.3.3. Se añaden 50 µl del compuesto disuelto en DMSO a 10 ml de Medio B (la concentración del compuesto es 5 mM y la concentración de DMSO es ahora del 0,5%)
o 20 µl de compuesto 1 mM y 30 µl de DMSO se añaden a 10 ml de Medio B (la concentración del compuesto es de 2 µM).
291
1.3.4. La dilución del compuesto hasta la concentración final se completa mezclando
solución de compuesto/Medio B con Medio C (contiene DMSO al 0,5%). Se realizan
diluciones seriadas de 1 a 5 del compuesto con Medio C en un bloque de 96 pocillos de
2 ml de polipropileno para obtener las concentraciones finales deseadas del compuesto.
5
1.3.5. La placa celular se retira del incubador a 37ºC y se marca en la esquina superior
derecha de la tapa y el lateral derecho de la base. El medio se vierte fuera de las placas
de 96 pocillos.
1.3.6. Se añaden 100 µl de soluciones de compuesto/medio de cada pocillo del bloque
de dilución de 96 pocillos a la placa celular de 96 pocillos usando una pipeta Impact2.
10
1.3.7. Se añaden 100 µl de Medio C a todos los pocillos no tratados de acuerdo con la
Tabla 3 para los compuestos de ensayo a 1, 3 ó 6 diferentes concentraciones. “Untx” se
refiere a células tratadas de forma simulada (DMSO añadido a la misma concentración
que en las células tratadas): “Con.” Se refiere a una concentración de compuesto.
TABLA 3
15
2 compuestos, 6 concentraciones, 5 repeticiones
Compuesto 1
Compuesto 2
1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
untx untx untx untx untx untx untx untx untx untx
B
con.1 con.1 con.1 con.1 con.1 con.1 con.1 con.1 con.1 con.1
C
con.2 con.2 con.2 con.2 con.2 con.2 con.2 con.2 con.2 con.2
D
con.3 con.3 con.3 con.3 con.3 con.3 con.3 con.3 con.3 con.3
E
con.4 con.4 con.4 con.4 con.4 con.4 con.4 con.4 con.4 con.4
F
con.5 con.5 con.5 con.5 con.5 con.5 con.5 con.5 con.5 con.5
G
con.6 con.6 con.6 con.6 con.6 con.6 con.6 con.6 con.6 con.6
H
untx untx untx untx untx untx untx untx untx untx
4 compuestos, 3 concentraciones, 5 repeticiones
Compuesto 1
Compuesto 2
1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
untx untx untx untx untx untx untx untx untx untx
B
con.1 con.1 con.1 con.1 con.1 con.1 con.1 con.1 con.1 con.1
C
con.2 con.2 con.2 con.2 con.2 con.2 con.2 con.2 con.2 con.2
D
con.3 con.3 con.3 con.3 con.3 con.3 con.3 con.3 con.3 con.3
E
con.1 con.1 con.1 con.1 con.1 con.1 con.1 con.1 con.1 con.1
F
con.2 con.2 con.2 con.2 con.2 con.2 con.2 con.2 con.2 con.2
G
con.3 con.3 con.3 con.3 con.3 con.3 con.3 con.3 con.3 con.3
292
(continuación) H untx untx untx untx untx untx untx untx untx untx Compuesto 3 Compuesto 4
16 compuestos, 1 concentración, 4 repeticiones
2 compuestos, 6 concentraciones, 5 repeticiones
1234 5 6 7 8 9 10 11 12 A untx cmp.1 cmp.2 cmp.3 cmp.4 cmp.5 cmp.6 cmp.7 cmp.8 untx B untx cmp.1 cmp.2 cmp.3 cmp.4 cmp.5 cmp.6 cmp.7 cmp.8 untx C untx cmp.1 cmp.2 cmp.3 cmp.4 cmp.5 cmp.6 cmp.7 cmp.8 untx D untx cmp.1 cmp.2 cmp.3 cmp.4 cmp.5 cmp.6 cmp.7 cmp.8 untx E untx cmp.9 cmp.10 cmp.11 cmp.12 cmp.13 cmp.14 cmp.15 cmp.16 untx F untx cmp.9 cmp.10 cmp.11 cmp.12 cmp.13 cmp.14 cmp.15 cmp.16 untx G untx cmp.9 cmp.10 cmp.11 cmp.12 cmp.13 cmp.14 cmp.15 cmp.16 untx H untx cmp.9 cmp.10 cmp.11 cmp.12 cmp.13 cmp.14 cmp.15 cmp.16 untx
12 compuestos, 1 concentración, 5 repeticiones
1234 5 6 7 8 9 10 11 12 A untx untx untx untx untx untx untx untx untx untx B cmp.1 cmp.1 cmp.1 cmp.1 cmp.1 cmp.7 cmp.7 cmp.7 cmp.7 cmp.7 C cmp.2 cmp.2 cmp.2 cmp.2 cmp.2 cmp.8 cmp.8 cmp.8 cmp.8 cmp.8 D cmp.3 cmp.3 cmp.3 cmp.3 cmp.3 cmp.9 cmp.9 cmp.9 cmp.9 cmp.9 E cmp.4 cmp.4 cmp.4 cmp.4 cmp.4 cmp.10 cmp.10 cmp.10 cmp.10 cmp.10 F cmp.5 cmp.5 cmp.5 cmp.5 cmp.5 cmp.11 cmp.11 cmp.11 cmp.11 cmp.11 G cmp.6 cmp.6 cmp.6 cmp.6 cmp.6 cmp.12 cmp.12 cmp.12 cmp.12 cmp.12 H untx untx untx untx untx untx untx untx untx untx
1.4. Las places se incuban durante 48 horas a 37ºC y después se someten a extracción
de ARN. 5 TABLA 4
Sumario de equipamiento y materiales usados para el cultivo celular y la preparación del compuesto
Pipeta Impact2 de 8 canales, 1250 µl
nº cat 2004 Matrix
Bloque de pocillos profundos de 2 ml de polipropileno, 96 pocillos, estéril
nº cat 4222 Matrix
Depósitos de 25 ml de reactivo, estéril
nº cat 8096 Matrix
Puntas de pipeta extralargas de 1250 µl
nº cat 8255 Matrix
293
(continuación)
Sumario de equipamiento y materiales usados para el cultivo celular y la preparación del compuesto
Placa de 96 pocillos
nº cat 3595 Costar
Hemacitómetro
Neubauer mejorado con línea brillante de 0,1 mm de profundidad Reichert
DMEM
nº cat 51444-79P JRH
L-glutamina (Glu)
nº cat 12403-010 GIBCO-BRL
Aminoácidos no esenciales (NEAA)
nº cat 11140-050 GIBCO-BRL
Suero de Bovino Fetal (FBS)
nº cat 16250-078 GTBCO-BRL
G418
nº cat 55-0273 Invitrogen
DMSO
nº cat D-2650 Sigma
Medio A
DMEM, FBS al 10%, NEAA 1X, Glu 1X, G418 0,25 mg/ml
Medio B
DMEM, FBS al 2%, NEAA 1X, Glu 1X
Medio C
DMEM, FBS al 2%, NEAA 1X, Glu 1X, DMSO al 0,5%
Tripsina-EDTA 0,25%
GIBCO-BRL
2. Extracción de ARN total celular de células con replicón 2.1 Introducción
La meta del procedimiento es extraer ARN de muestras de cultivo de tejido in vitro de 5 modo que el ARN viral o celular se recupere de forma cuantitativa y suficientemente puro como para analizarse por ensayo de RT-PCR de VHC cualitativo.
Para permitir la detección de variaciones en la eficacia de la extracción de ARN, se añaden cantidades convencionales de virus de la diarrea viral bobina (BVDV), un virus de ARN que tiene alguna similitud con el VHC, a cada muestra celular antes de la extracción de ARN. De este modo,
10 el nivel de ARN de BVDV detectado en la reacción de RT-PCR final múltiple debería ser consistente entre todos los pocillos dentro de los límites de variabilidad asociados con el Ensayo de Replicón. Este control interno de la eficacia de la extracción del ARN se analiza adicionalmente en la sección de TaqMan® posterior. El enfoque de la extracción de ARN usado en el procedimiento de RNeasy-96 fabricado
294
por Qiagen Inc. (Valencia, CA). Este procedimiento emplea 96 minicolumnas basadas en sílice que se posicionan en una agrupación compatible con operaciones de cultivo tisular de 96 pocillos. La tecnología de extracción de ARN es una modificación del procedimiento Boom, en el que todas las proteínas y ácidos nucleicos celulares, incluyendo nucleasas, se desnaturalizan primero con 5 una sal caotrópica fuerte (tiocianato de guanadinio). En este ambiente, los ácidos nucleicos tienen una fuerte afinidad por la sílice, el material en los discos de la minicolumna; sin embargo, las proteínas y otros contaminantes no se unen a la sílice y pasan a través de las columnas. Después de lavar las columnas con soluciones de sal caotrópica/etanol, las muestras se secan parcialmente y se libera después el ácido nucleico de la columna en un pequeño volumen de
10 agua. Para reducir la variabilidad en la recuperación del ARN de VHC, se tiene cuidado con las condiciones del lavado en columna y del secado parcial. La presencia de una cantidad pequeña de etanol en una columna contaminará el ARN final e interferirá con el sistema de detección de RT-PCR. Se requiere precaución en todas las fases de este procedimiento debido a que las
15 muestras de partida pueden presentar un riesgo biológico, la sal caotrópica es altamente cáustica y como tiocianato, puede generar gas venenoso de cianuro si se permite que entre en contacto con ambientes ácidos.
TABLA 5
Sumario del Equipamiento y Materiales Necesarios para los Procedimientos de extracción de ARN del VHC
Kit RNeasy 96 (24)
nº cat 74183 Qiagen
Colector QIAvac 96
nº cat 19504 Qiagen
Centrífuga 4-15C, para 2x96 placas, 6000 x g
nº cat 81010 Qiagen
Rotor de placa para 2x96 placas
nº cat 81031 Qiagen
Alcohol Etílico de Grado 200
Pipeta Impact2 de 8 canales, 250 µl
nº cat 2002 Matrix
Pipeta Impact2 de 8 canales, 1250 µl
nº cat 2004 Matrix
Bloque de pocillo profundo de 2 ml de polipropileno, 96 pocillos estéril
nº cat 4222 Matrix
Depósitos de Reactivo de 25 ml, estéril
nº cat 8096 Matrix
Puntas de pipeta extralarga de 1250 µl
nº cat 8255 Matrix
Puntas de pipeta de 200 µl
nº cat 7275 Matrix
Medio MEM sin suero
nº cat 11095-80 GIBCOBRL
295
2.2 Procedimiento: 2.2.1 Lisis Celular
2.2.1.1. Preparar el tampón de lisis: Para una placa de 96 pocillos, añadir 150 µl de β-mercaptoetanol (β-ME) y 1 µl de reserva de BVDV (agitar en vórtex la reserva antes de añadir) a 15 ml de tampón RLT (un componente del kit RNeasy, Qiagen). Esta reserva se prepara infectando células MDBK (células de riñón bovino, número CCL-22 disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas VA) con BVDV y recolectando el cultivo cuando tenga el efecto citopático máximo (CPE). Esta reserva tiene una titulación de infecciones de aproximadamente 1x107 ufc/ml. Esto proporciona a BVDV, un ciclo umbral (C) de aproximadamente 22 en el ensayo de TaqMan®. La reserva de BVDV se almacena en un congelador a -80ºC.
2.2.1.2. Se lavan las células con 150 µl de medio MEM sin suero (programa 4 en la pipeta electrónica de 8 canales P1250: Llenado 1250, Disp 150 x 8). Se añaden 150 µl de tampón de lisis a cada pocillo (mismo programa).
2.2.1.3. Se extrae ARN inmediatamente o se congelan las células a -80ºC.
2.2.2. Preparación de reactivos y materiales para la extracción de ARN.
2.2.2.1. Anotar el número de lote del RPE y kit RNeasy 96.
2.2.2.2. RPE: se añaden 720 ml de etanol al 100% a una botella de RPE (Qiagen) y se mezclan bien; las botellas de RPE siempre se agitan bien antes de su uso.
2.2.2.3. Etanol al 70%: se añaden 150 ml de agua con dietilpirocarbonato (DEPC) a 350 ml de etanol al 100% y se mezclan bien.
2.2.3. Preparación de ARN con Kit RNeasy 96
2.2.3.1. Se descongelan a temperatura ambiente muestras congeladas durante 40 minutos. Al mismo tiempo, se descongela una columna de Controles de Extracción para cada placa (Controles de Extracción: Los controles de Extracción del RNeasy son un conjunto de 8 tubos conectados entre sí. Dentro de cada tubo hay 170 µl de lisado celular con una cierta relación de células positivas y negativas para VHC. Desde la parte superior hasta el fondo hay dos de cada control de número bajo, medio, alto y cero respectivamente. (Véase sección 2.3 del protocolo posterior).
2.2.3.2. Las muestras se mezclan pipeteando 100 µl arriba y abajo cinco veces. La muestra completa se transfiere a columnas 1-10 del bloque de pocillos cuadrados de 2 ml de Matrix (programa 1 en P250: Mezcla 100 x 5, Llenado 170, Eliminar).
2.2.3.3. Se transfieren 150 µl del patrón de replicón a una columna 11 (sin muestras en la columna 12).
2.2.3.4. Se añaden 150 µl de etanol al 70% (EtOH) a cada muestra (programa 4 en
296
P1250: Llenado 1250, Disp 150).
2.2.3.5. Se coloca una placa de RNeasy 96 marcada con el número de placa apropiado en el colector de vacío. Mezclar y transferir el lisado/BtOH a la placa RNeasy 96 (programa 1 en P1250: Mezcla 200, Veces 5, Llenado 330 y Eliminación). Todos los pocillos no usados se sellan con cinta transparente (proporcionada por Qiagen), habitualmente la columna 12.
2.2.3.6. Se aplica vacío (aproximadamente 80 kPa) para cargar la muestra en las minicolumnas.
2.2.3.7. La placa de RNeasy 96 se lava con 1000 µl de tampón RW1 (Qiagen)/pocillo (programa 2 en P1250: Llenado 1000, Disp 1000).
2.2.3.8. Se aplica vacío al filtro a través del tampón RW1 y se vacía el flujo continuo.
2.2.3.9. Se lava la placa RNeasy 96 con 1000 µl de tampón RPE/pocillo (programa 2 en P1250).
2.2.3.10. Se aplica vacío para filtrar a través del tampón RPE.
2.2.3.11. Se repite la etapa 2.2.3.9.
2.2.3.12. Se aplica vacío al filtro a través del tampón RPE, manteniendo el vacío aplicado durante 3 minutos.
2.2.3.13. Secar la placa RNeasy 96: Se coloca la placa RNeasy 96 en una rejilla de microtubos de recogida (proporcionada por Qiagen), cubierta con la cinta AirPore proporcionada y se centrifuga la unidad durante 10 minutos a 6000 x g (centrífuga Qiagen Sigma; 4-15ºC).
2.2.3.15. Eluir el ARN de la placa de 96 pocillos RNeasy: La placa RNeasy 96 se transfiere a la parte superior de una nueva rejilla de microtubos de recogida. Se añaden 70 µl de agua sin RNasa a la mitad de cada pocillo (programa 3 en P1250: Llenado 850, Disp 70).
2.2.3.16. Incubar 1 minuto a temperatura ambiente y después colocar una cinta nueva AirPore sobre la placa.
2.2.3.17. La unidad se centrifuga después durante 4 minutos a 6000 x g en una centrífuga Sigma a 4-15ºC. El volumen eluido es de entre 28 µl y 50 µl.
2.2.3.18. La placa RNeasy 96 se descarta y se sella la rejilla de tubos de recogida con los tapones proporcionados por Qiagen (8 por banda).
2.2.3.19. El ARN eluido se almacena a -80ºC o se analiza inmediatamente en el ensayo TaqMan®.
2.3 Preparación de los Controles de Extracción
297
Día 1
2.3.1.1. Se deponen 25 x 107 células productoras de replicón en un matraz de cultivo tisular de 150 cm2 (T-150).
2.3.1.2. Se deponen 2,0 x 106 células Huh7 en un matraz de cultivo tisular de 75 cm2 (T75).
2.3.1.3. Incubar durante una noche a 37ºC.
Día 2
2.3.1.4. Lisar las células con tampón de lisis.
2.3.1.5. Retirar el sobrenadante de las células Huh7 y productoras de replicón y lavar la monocapa con 10 ml de medio sin suero (MEM).
2.3.1.6. Añadir 30 ml de tampón de lisis (con 1 µl de reserva de BVDV/15 ml de tampón de lisis) a las células Huh7, mezclar pipeteando repetidamente y colocar el lisado celular en un tubo de centrífuga de cultivo tisular de fondo cónico de 50 ml.
2.3.1.7. Añadir 10,5 ml de tampón de lisis a las células productoras de replicón, mezclar pipeteando repetidamente y colocar el lisado celular en un tubo de centrífuga de cultivo tisular de fondo cónico de 15 ml.
2.3.2. Para el Patrón de Extracción ALTO: Se colocan alícuotas de 170 µl del lisado celular de células productoras de replicón en las filas 5 y 6 de dos rejillas de tubos de 0,75 ml de Matrix.
2.3.3. Para el Patrón de Extracción MEDIO: Añadir 1,0 ml del lisado celular de células productoras de replicón a 9 ml del lisado de Huh7 y mezclar bien. Colocar alícuotas de 170 µl de esta mezcla en las filas 3 y 4 de dos rejillas de tubos de 0,75 ml de Matrix.
2.3.4. Para el Patrón de Extracción BAJO: Añadir 50 µl del lisado celular de células productoras de replicón a 10 ml del lisado de Huh7 y mezclar bien. Colocar alícuotas de 170 µl de esta mezcla en las filas 1 y 2 de dos rejillas de tubos de 0,75 ml de Matrix.
2.3.5. Control de Extracción CERO: Poner alícuotas de 170 µl del lisado celular de Huh7 en las filas 7 y 8 de dos rejillas de tubos de 0,75 ml de Matrix.
2.3.6. Almacenar los controles a -80ºC.
3. RT-PCR TaqMan® y Análisis de los Datos
3.1 Introducción: Se usa RT-PCR cuantitativa en tiempo real para medir la cantidad de ARN del replicón de VHC en cada muestra. Esta tecnología también se denomina ensayo de nucleasa 5' basado en PCR y TaqMan®. El instrumento analítico es el Sistema de Detección de Secuencia Applied Biosystems 7700 Prism (Applied Biosystems, Foster City, CA). Este instrumento es esencialmente un espectrógrafo de fluorescencia inducida por láser en multiplexación en tiempo acoplado con un ciclador térmico. Controla la acumulación del
298
amplicón de PCR en cada pocillo de una bandeja de muestras de 96 pocillos a lo largo del ciclo del procedimiento de PCR.
3.2. Uso de Control Interno de BVDV: Como se menciona en la sección anterior, se incorpora un control positivo interno en cada muestra. Este sirve como una medida de la eficacia de 5 extracción del ARN e indica si la muestra contiene contaminantes que inhiben la PCR de TaqMan®. BVDV se mezcla con el tampón caotrópico de lisis celular antes de aplicar el tampón de lisis a las células. Aunque el control positivo está en cada muestra, el ensayo de control positivo interno de BVDV se realiza solamente cuando los datos del ensayo de ARN del replicón de VHC quedan fuera de los límites esperados, lo que sugiere que podría haber un
10 problema con las muestras. El 7700 es capaz de controlar simultáneamente la acumulación de dos amplicones de PCR diferentes en el mismo tubo usando sondas de detección marcadas con dos colorantes indicadores fluorescentes diferentes (“multiplexación”). Los criterios específicos que inducen un análisis de TaqMan® para el control positivo interno BVDV de una placa de muestras se describen en la sección sobre el análisis de los datos (3.6).
15 3.3 Sonda y cebadores de TaqMan® para ARN del Replicón de VHC. Debido a la estabilidad genética esperada y la falta general de estructura secundaria de ARN en el gen de resistencia neomicina (neo) codificado en el replicón, se emplean cebadores y una sonda que se unen a esa región. Este segmento del ARN del replicón se extiende desde las bases 342 a 1193 del
imagen43
299
3.4. Procedimientos
3.4.1. Procedimiento para Preparar Mezclas Maestras 1 x para RT-PCR de NEO y BVDV
TABLA 6
Sumario del equipamiento y materiales para la preparación de una Mezcla Maestra de 10 placas para RT-PCR
Equipamiento y materiales
Número de Encargo Proveedor
Pipeta de 0,5-10 µl
Serie 22 47 005-1 2000 Eppendorf
Pipeta de 2-20 µl
Serie 22 47 015-9 2000 Eppendorf
Pipeta de 10-100 µl
Serie 22 47 020-5 2000 Eppendorf
Pipeta de 50-200 µl
Serie 22 47 025-6 2000 Eppendorf
Pipeta de 100-1000 µl
Serie 22 47 030-2 2000 Eppendorf
Puntas de 1250 µl Matrix
nº cat 8255 Matrix
Puntas de 200 µl Matrix
nº cat 7275 Matrix Molecular Bioproducts Molecular Bioproducts Molecular Bioproducts
Puntas de 0 µl ART
nº cat 2140
Puntas de 20 µl ART
nº cat 2149P
Puntas de 100 µl ART
nº cat 2065E
Puntas de 200 µl ART
nº cat 2069 Molecular Bioproducts Molecular Bioproducts Matrix
Puntas de 1000 µl ART
nº cat 2079E
Pipeta electrónica, Impact2
nº cat 2001
Tubos de microcentrífuga sin RNasa de 1,5 ml
nº cat 12450 Ambion
Tubos de Polipropileno de 14 ml
nº cat 352059 Falcon
Depósito de reactivo de25 ml
nº cat 8096 Matrix
Placa de reacción de 96 pocillos
nº cat N801-0560 Applied Biosystems
Tiras de tapones ópticas
nº cat N801-0935 Applied Biosystems
Batas Estériles Desechables
nº cat 9515-E Baxter
Ácido
HCl 0,1N Fisher
RNAseZap
nº cat 9780 Ambion
RNAse away
nº cat 7005 Molecular Bioproducts
300
(continuación)
Equipamiento y materiales
Número de Encargo Proveedor
Envase de 10, kit de reactivos principales de RT-PCR EZ, tampón de reacción 5x, Acetato de Manganeso, 25 mM, desoxi NTP
nº cat 403028 Applied Biosystems
Sonda VIC NEO, 2 µM (=10x), 550 µl por alícuota
nº cat 450003, a petición del cliente, 5'-VIC-CTG TGG CCG GCT GGG TGT GGTAMRA -3' (SEC ID Nº:2) Applied Biosystems
Sonda VIC BVDV, 2 µM (=10x), 550 µl por alícuota (Vertex)
nº cat 450003, a petición del cliente,5'-VIC-CCC TCG TCC ACG TGG CAT CTC GATAMRA -3'(SEC ID Nº:3) Applied Biosystems
Cebador directo de NEO, mezcla de cebador directo/inverso 31 µM (=10x) 550 µl por alícuota
nº cat 4304972, a petición del cliente, 5'-CCG CTT TTC TGG ATT CAT CG-3' (SEC ID Nº:4) Applied Biosystems
Cebador directo de NEO, mezcla de cebador directo/inverso 3 µM (=10x) 550 µl por alícuota
nº cat 4304972, a petición del cliente, 5'-CCC ATT CGC CGC CAA-3'(SEC ID Nº: 5) Applied Biosystems
Cebador directo de BVDV, mezcla de cebador directo/inverso 3 µM (=10x) 550 µl por alícuota
A petición del cliente, 5'-CAG GGT AGT CGT CAG TGG TTC G-3'(SEC ID Nº:6), escala de 1,0 µM con purificación de gel Oligos etc
Cebador directo de BVDV, mezcla de cebador directo/inverso 3 µM (=10x) 550 µl por alícuota
a petición del cliente, 5'-GGC CTC TGC AGC ACC CTA TC3' (SEC ID Nº:7), escala de 1,0 µM con purificación de gel Oligos etc
301 (continuación)
Equipamiento y materiales
Número de Encargo Proveedor
Patrones de ARN de NEO
ARN transcrito in vitro de la porción del gen neo de la ARN polimerasa de VHC. El cuantificado in vitro se basó en transcritos conocidos y la absorbancia de UV de la solución del transcrito. Este ARN almacenado a -80ºC. Ensayo de TaqMan® individual. Un plásmido que contiene el ARN del replicón usando ARN transcrito por T7 que es peso molecular del purificado se diluye, se separa en alícuotas y las alícuotas se descongelan para cada uno.
Muestras de ARN a ensayar aisladas de células con replicón de VHC (sección 2 de este Protocolo), 10 µl/placa de 96 pocillos
Agua sin nucleasa (No Tratada con DEPC)
nº cat 9930 Ambion
3.4.2. Preparación de Reactivos para la Mezcla Maestra
3.4.2.1. Limpiar la superficie de trabajo de acuerdo con las dos etapas posteriores y limpiar las pipetas con RNAse away.
5 RNAse Zap (Ambion, Austin, TX) RNAse Away (Molecular Bioproducts, San Diego, CA)
3.4.2.2. Abrir los reactivos principales de RT-PCR EZ (Applied Biosystems) y poner el tampón 5x en hielo, descongelar los reactivos congelados a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos y después ponerlos en hielo. Puede usarse un kit
10 de reactivos de RT-PCR EZ para analizar dos extracciones de 96 pocillos.
3.4.2.3. Tomar un tubo de sonda VIC 2 µM (NEO o BVDV, 550 µl por tubo) de -20ºC y ponerlos en hielo.
3.4.2.4. Tomar un tubo de mezcla de cebador directo/inverso 3 µM (NEO o BVDV, 550 µl por tubo) de -20ºC y ponerlo en hielo.
15 3.4.2.5. Tomar un tubo (30 µl) de patrones de transcrito de ARN (108 copias/10 µl) de 80ºC y ponerlos en hielo.
3.4.2.6. Tomar un tubo de agua Ambion a temperatura ambiente.
302
3.4.3. Ensamblaje de mezcla maestra para una reacción en placa de 96 pocillos.
3.4.3.1. Usar una pipeta de 1 ml para transferir tampón 5x (Applied Biosystems) a un tubo de 14 ml; el volumen total añadido es de 1100 µl.
3.4.3.2. Usar una pipeta de 1 ml para añadir Mn(OAc)2 25 mM (Applied Biosystems) a un tubo de 14 ml; el volumen total añadido es de 660 µl.
3.4.3.3. Usar una pipeta de 200 µl para añadir 165 µl de dATP 10 mM al tubo de 14 ml. Hacer lo mismo para dCTP 10 mM, dUTP 20 mM y dGTP 10 mM.
3.4.3.4. Usar una pipeta de 1 ml para añadir 550 µl de mezcla de cebador directo/inverso 3 µM 10x.
3.4.3.5. Usar una pipeta de 1 ml para añadir 550 µl de sonda 2 µM 10x.
3.4.3.6. Usar una pipeta de 1 ml para añadir 220 µl de rTth ADN polimerasa (Applied Biosystems).
3.4.3.7. Usar una pipeta de 100 µl para añadir 55 µl de AmpErase UNG (Applied Biosystems).
3.4.3.8. Usar una pipeta de 1 ml para añadir 605 µl de H2O Ambion al tubo de 14 ml; el volumen final es de 4400 µl en total.
3.4.3.9. Transferir la mezcla maestra de 4400 µl a un depósito de reactivo de 25 ml.
3.4.3.10. Distribuir 40 µl por pocillo de los 96 pocillos usando una pipeta de 8 canales.
3.4.3.11. Transferir 10 µl de muestras desconocidas extraídas a pocillos de la placa de reacción usando una pipeta de 8 canales, columna por columna, desde la columna 1 hasta la columna 11. Tapar cada columna después de la transferencia.
3.4.3.12. Añadir 270 µl de H2O Ambion a los 30 µl de transcrito de ARN 108 copias/10 µl para su uso en la curva convencional y mezclar. Hay ahora 107 copias del patrón de ARN de cuantificación del replicón de VHC/10 µl.
3.4.4. Preparar el ABI 7700 para cada ciclo
3.4.4.1. Antes de cada ciclo, reiniciar el ordenador para el ABI 7700 y reconstruir el escritorio.
3.4.4.2. Cerrar y retirar cualquier programa redundante del disco duro; enviar los datos de sobrecarga a la papelera.
3.4.4.3. Abrir Programa Sequence Detector versión 1.7 (software SDS).
3.4.4.5. Abrir la carpeta “Ciclos de Ensayo de Replicón”.
3.4.4.6. Abrir la placa de plantilla “Ensayo de Replicón”. Las condiciones del
termociclador programadas en la plantilla son las siguientes: Etapa 1: 50ºC durante 2 minutos. Etapa 2: 60ºC durante 30 minutos.
303
Etapa 3: 95ºC durante 5 minutos. Etapa 4: 95ºC durante 15 segundos. Etapa 5: 60ºC durante 60 segundos. Número de repeticiones en ciclo de las etapas 4-5: 40. Instrumento de plantilla: diagnóstico: opciones avanzadas: Seleccionar vistas: presentar mse. Seleccionar vistas: presentar mejor ajuste. Seleccionar miscelánea: colorante de referencia ROX,
3.4.4.7. “Guardar” (no “guardar como”) el archivo en la carpeta de “Ciclos de Ensayos de Replicón”.
3.4.4.8. Mostrar ajuste: pulsar EJECUTAR.
3.5. Preparar los datos de ABI7700 después de un ciclo usando software SDS.
3.5.1. Las placas de ensayo se retiran del ABI7700 y se descartan sin haberse abierto. Esto reduce en gran medida los problemas de laboratorio con la contaminación cruzada de PCR.
3.5.2. Los datos se analizan usando el software Sequence Detector System versión 1.7.
3.5.3. Los niveles umbral se ajustan inicialmente usando los ajustes por defecto.
3.5.4. Criterios de rechazo de datos: Pueden rechazarse puntos o series de datos de placas completas. Si ha habido una desviación significativa del protocolo, fallo del reactivo o accidente o fallo de ejecución de ABI 7700, puede descartarse datos. Para el rechazo de cualquier punto de datos de un ciclo aparentemente normal, deben cumplirse uno o más de los siguientes criterios.
3.5.4.1. Cálculos de ciclo umbral. Normalmente usar los valores por defecto para el software SDS. Si el Ct de la muestra más concentrada es menor de 15, entonces cambiar el límite de parada del valor umbral según se necesite para un valor menor de modo que la Ct de la muestra de mayor concentración sea mayor que el valor de parada. Actualizar los cálculos después de realizar este cambio.
3.5.3.2. Considerar rechazar un ciclo de TaqMan® anómalo completo según se indica por una desviación de los valores medios para la pendiente y punto de corte con el eje y de la línea generada por análisis de los patrones de ARN neo. Los intervalos aceptables para esos valores son:
Los valores de pendiente deberían estar entre 3,0 y 3,6 Los ciclos en la ordenada en el origen deberían estar entre 36 y 41 ciclos.
3.5.4.3. Pueden eliminarse pocillos individuales de TaqMan® aberrantes como se indica por un Rn/ΔRn extremo antes del análisis de los datos de modo que no
304
afecten a los cálculos del software SDS.
3.5.4.4. Examinar y registrar los valores de Ct control sin molde y confirmar que son >7,0 Ct (>100X) mayores que la Ct para cualquier muestra tratada con el compuesto.
3.5.5. Los valores de Ct de los patrones de ARN de VHC se comparan con los resultados anteriores.
3.5.6. La curva patrón de ARN de VHC se comparan con los resultados anteriores.
3.5.7. Si hay una evidente amplificación aberrante en pocillos individuales, esos pocillos se identifican y anotan.
3.5.8. El archivo de “resultados” se exporta y transfiere desde el ordenador del 7700 a otro ordenador para su análisis usando Microsoft Excel.
3.5.9. Se indica cualquiera de los siguientes cambios en preparaciones del reactivo o dilución usadas. Nueva síntesis de sonda o cebador del proveedor. Nueva dilución de sonda o cebador y alícuotas. Nueva preparación del transcrito de ARN de los patrones. Nueva dilución y alícuotas del transcrito de ARN de los patrones. Nueva reparación viral de BVDV. Nueva preparación de patrones de columna 11.
3.6. Análisis de datos de TaqMan®
3.6.1. Copiar y pegar el número de Ct de VHC de TaqMan® y copiar el número del archivo de los resultados de TaqMan® en las celdas apropiadas de la macro de Microsoft Excel para análisis de los datos del Ensayo de Replicón y ejecutar la macro.
3.6.2. Copiar la tabla de resultados de TaqMan® de la hoja de macro en otra hoja, introducir el número de serie del compuesto y el número de lote.
3.6.3. A partir de esta hoja de Excel, se calcularán la media, desviación típica y porcentaje de CV o actividad inhibidora del Compuesto, así como el número de copias de VHC, el número de Ct de VHC y el número de Ct de BVDV (si estuviera disponible) de todos los puntos de dilución en 5 repeticiones y control sin compuesto.
3.6.4. Criterios para el rechazo de datos e implementación de TaqMan® de control de BVDV. Comprobar todos los cálculos. Los puntos o series de datos de placas completas pueden rechazarse. Si existe una desviación significativa del protocolo, fallo del reactivo
o accidente o un fallo de la ejecución de API 7700, pueden descartarse datos. Para el rechazo de cualquier punto de datos de una ejecución aparentemente normal, deben cumplirse uno o más de estos criterios. La desviación típica del porcentaje de inhibición
305
debería ser menor del 30% en los compuestos activos. El % de CV o número de copias de VHC debería ser menor del 30%. La desviación típica de Ct de VHC de todas las muestras debería ser menor de 0,5; esta es habitualmente de 0,1 a 0,3 en la mayoría de las muestras. Si la desviación típica de Ct de VHC es mayor de 0,5, debe volverse a la tabla de los datos sin tratar y comprobar los números de Ct de 5 repeticiones. Si el número de Ct de cualquier pocillo difiere en 2 Ct del número de Ct medio de 5 repeticiones, entonces este pocillo debería omitirse del análisis. Si más de 3 pocillos (que no están en la misma columna) tienen números de Ct inusuales, entonces debería llevarse a cabo el ensayo de control interno de TaqMan® de BVDV. Si los datos del BVDV muestran irregularidad, entonces el compuesto debería ensayarse de nuevo.
3.6.5. Cálculo de CI50: Copiar y pegar los datos de inhibición media y desviación típica en una respuesta de dosis sigmoidal con un calculador de pendiente variable que usa procedimientos de regresión no lineal. Usando esta herramienta, calcular la CI50 usando uno de dos métodos: fijar la parte superior a 100% de inhibición solamente o fijar la parte superior a 100% de inhibición y la inferior a 0% de inhibición. El procedimiento que da el ajuste más claro se presenta después para cada compuesto. La CI50 más fiable viene del cálculo que tiene el error típico más bajo. Si las CI50 calculadas a partir de estas dos opciones de ajuste de curva muestran una diferencia de más de una vez o si la DT de CI50 es mayor que la CI50, el compuesto debería ensayarse de nuevo a concentraciones ajustadas.
Cálculo del Efecto de los Inhibidores de Serina Proteasa de VHC en Combinación con Interferones
El efecto de un inhibidor de serina proteasa de VHC (HSPI) y un interferón en combinación puede evaluarse en el Ensayo del Replicón generando una curva de respuesta a dosis para el HSPI en presencia de diversos niveles de interferón o determinando una curva de respuesta a dosis para un interferón en presencia de diversos niveles de HSPI. La meta es evaluar si hay más o menos inhibición de acumulación del ARN viral de la que se esperaría si los dos fármacos producen efectos aditivos en el ARN. De forma más específica, se usa la definición de propiedad aditiva de Lowe ((1928) Die Quantitation Probleme der Pharmakologic, Ergebn. Physiol, 27, 47-187). Esta se define como sigue. Siendo DE,INF la concentración de interferón que da como resultado un efecto E y siendo DE,HSPI la concentración de inhibidor de proteasa que da como resultado el efecto E.
D1 D1 (1)
1 =+
DD
E ,INF E ,HSPI
Se define no interacción o propiedad aditiva de Lowe por la siguiente relación, en la que la
306
5
10
15
20
25
combinación de concentración D1 de INF y D2 de HSPI produce el efecto E.
El grado de sinergia o antagonismo se expresa en términos de curvas de isoefecto o Isobolas. La combinación (D1, D2) es un punto en una gráfica en la que los ejes son las concentraciones de interferón y HSPI (Figura 2). Todas las combinaciones tales que producen un nivel de efecto E forman la Isobola del efecto E. Necesariamente sucede que (DE,INF, 0) y (0, DE,HSPI) son puntos de la Isobola. Las Isobolas son líneas rectas que conectan puntos (DE,INF, 0) y (0, DE,HSPI) cuando se satisface la relación de la propiedad de adición (1).
Las Isobolas cóncavas hacia arriba indican sinergia y las Isobolas cóncavas hacia abajo indican antagonismo. Siguiendo las directrices de Berenbaum, M. C. ((1985) The expected effect of a combination of agents: the general solution. J. Theor. Biol., 114, 413-431), y Greco, Park y Rustom ((1990) Application of a New Approach for the Quantitation of Drug Synergism to the Combination of cis-Diamminedicloroplatinum and 1-B-D-Arabinofuranosylcytosine, Cancer Research, 50, 5318-5327), añadir un término a (1) para explicar la sinergia o antagonismo. La ecuación define una superficie de respuesta que puede ajustarse a los valores de control porcentuales en todas las combinaciones del tratamiento. Las representaciones de contorno de esta superficie de respuesta ajustada son las Isobolas.
El modelo de superficie de respuesta asume una respuesta a dosis sigmoidal para cada compuesto definido por (2).
Emáx
E = m + B (2) ⎛ [Fármaco ] ⎞
1 + ⎜⎟
⎝ CI 50 ⎠
Las concentraciones que dan un nivel especificado de actividad E sola se proporcionan por (3)
1/ 1/ m
mINF 310
⎛ E − B ⎞⎛ E − B ⎞ DE ,INF = CI 50 INF ⎜⎜ ⎟⎟ DE ,HSPI = CI 50 HSPI ⎜⎜ ⎟⎟ (3)
⎝ Emáx − E + BE − E + B
⎠⎝ máx ⎠
Para satisfacer el modelo de Greco y col. (1990), la acción combinada de los fármacos debe satisfacer por lo tanto la ecuación (4) para cada combinación de fármacos que produce un nivel de respuesta E.
[INF ] [HSPI ]
1 =+
1/ m 1/ m
INF 310
⎛ E − B ⎞⎛ E − B ⎞
CI 50 ⎜⎟ CI 50 ⎜⎟
INF ⎜⎟HSPI ⎜⎟
Emáx − E + B Emáx − E + B
⎝⎠ ⎝⎠
(4)
α[INF ][ HSPI ]
+
1/ 2 m 1/ 2 m
INF 310
⎛ E − B ⎞⎛ E − B ⎞
CI 50 CI 50 ⎜ ⎟⎜ ⎟
INF HSPI ⎜⎟⎜⎟
⎝ Emáx − E + B ⎝ Emáx − E + B ⎠
⎠
El parámetro α mide la cantidad de interacción. Un valor cero de alfa significa propiedad
307
aditiva o no interacción puesto que la ecuación se reduce a (1) cuando α = 0. Dadas la CI50, pendientes de Hill (m), valor máximo (Emáx), y valor mínimo (B), esta ecuación puede resolverse para dar el efecto que resulta de cualquier combinación de tratamiento de [INF] y [HSPI]. Por lo tanto, esta ecuación define una superficie de respuesta. Dado un experimento en el que se varían [INF] y [HSPI], los parámetros pueden seleccionarse usando regresión de mínimos cuadrados ponderados no lineal. El parámetro α puede relacionarse con una medida de sinergia S (Hewlett, P. S. (1969) Measurement of potencies of drug mixtures. Biometrics, 25, 477-487), que se toma directamente de las Isobolas a un efecto del 50%. S es la relación de la distancia del origen a la Isobola que define la propiedad aditiva con la distancia desde el origen a la Isobola de los datos ajustados, a lo largo de la línea a 45 grados de los ejes (S=ON/OM véase Figura 3). La relación es α = 4(S2 -S).
Se sigue el procedimiento analizado en Greco y col. (1990), anteriormente, para ajustar la superficie de respuesta y determinar el parámetro de sinergia α con su nivel de significación al evaluar el grado de sinergia en una serie de experimentos que ensayan los HSPI en combinación con varios interferones diferentes. Sin embargo, existe la necesidad de ponderar observaciones con cuentas menores más que las que tienen cuentas mayores. Las cuentas se relacionan directamente con el control porcentual, que es el efecto E. Usando los procedimientos descritos en Carroll, R.J. y Rupert, D. ((1988) (Transformation and Weighting in Regression, Chapman and Hall, Nueva York), puede verse que la variabilidad de pocillo a pocillo aumenta con el cuadrado de la media del valor del control porcentual. Por lo tanto, las observaciones se ponderan por uno sobre el valor de control porcentual ajustado (E) al cuadrado. La varianza y la ponderación usadas para analizar estos experimentos son coherentes con las relaciones de variabilidad observadas por los investigadores que investigan los procedimientos para analizar los ensayos de Radioligando (Finney, D. J., (1976), Radioligand Assay, Biometrics, 32,721-740, y Dudley, R. A. Edwards, P., Ekins, R.P., McKinzie, L G. M., Raab, G.M., Rodbard, D. y Rodgers, R.P.C. (1985), Guidelines for Immunoassay Data Processing, Clinical Chemistry, 31/8, 1264-1271). Resultados
En un experimento inicial, se ensaya un compuesto CU inhibidor de la serina proteasa del VHC sobre un intervalo de concentración de 3 µM a 0.0123 µM, es decir, un intervalo de 244 veces. Las concentraciones de interferón-alfa 2B varían de 30 unidades por muestra a 0.0096 unidades por muestra, es decir, un intervalo de 3125 veces. Como se muestra en la Tabla 7, cuando se usa como un tratamiento farmacológico único, el compuesto CU muestra una CI50 de 0,48 µM y la CI50 del interferón es 2,19 U. Dentro de la precisión del Ensayo de Replicón, que es de aproximadamente del 20%, la adición de interferón-alfa 2B da como
308
resultado un aumento de la inhibición de la acumulación del ARN del replicón de una manera dependiente de dosis. Por ejemplo, el tratamiento de células con compuesto CU 0,333 µM da como resultado un 28% de inhibición de la acumulación de ARN del replicón. El tratamiento de las células con una combinación de compuesto CU 0,333 µM, que es el 71% de la dosis de CI50 5 (0,469 µM) y 0,24 U de interferón-alfa 2B, que es el 11% de la CI50 de interferón-alfa 2B (2,05 µM) da como resultado una inhibición del 49% de la acumulación de ARN del replicón. Por lo tanto, el 71% de una dosis de CI50 en combinación con el 11% de la otra da como resultado un 49% de inhibición de la acumulación de ARN del replicón. Usando un enfoque intuitivo para determinar si un tratamiento de combinación es sinérgico o aditivo o antagonista, se puede 10 predecir que si el efecto del tratamiento de combinación fuera sólo aditivo, se esperarían que las fracciones combinadas de las dos dosis de CI50 necesarias para obtener un 49% de inhibición de la acumulación de ARN del replicón fuera del 98%. Nuestros resultados experimentales demuestran que el nivel de inhibición de la acumulación de ARN del replicón se consigue usando 71% más 11%, es decir 82% de la dosis de CI50 en lugar de 98%, como se 15 predice por efectos aditivos del tratamiento de combinación. De este modo a estas concentraciones de compuestos, el efecto parece ser sinérgico debido a que dosis en fracciones más pequeñas de la dosis de CI50 de cada compuesto se usan para obtener el 49% de inhibición del ARN del replicón de VHC de lo que se requeriría de cada compuesto por sí sólo, cuando serían necesarias dosis de CI50 del 98%. Los resultados de este tratamiento de
20 combinación se muestran en la Tabla 8 y gráficamente en la Figura 1.
TABLA 7
Inhibición de la acumulación del ARN de replicón después de un tratamiento de 48 horas con compuesto CU e interferón-alfa 2B, individualmente o en combinación Interferón-alfa 2B (unidades)
Compuesto 30U 6U 1,2 U 0,24 U 0,048 U 0,0096 U 0 U CU (conc.)
3 imagen44 M 99% 99% 99% 99% 98% 98% 98%
1 imagen44 M
99% 98% 96% 95% 92% 93% 88%
0,333 imagen44 M
94% 87% 66% 49% 33% 27% 28%
0,1111 imagen44 M
93% 79% 46% 29% 12% 15% 11%
0,0370 imagen44 M
92% 78% 44% 21% 2% 7% 8%
0,0123 imagen44 M
92% 78% 44% 20% 19% 19% 5%
0 imagen44 M 89% 73% 38% 16% 8% 12% 0%
5
10
15
20
25
309
Estos resultados iniciales, derivados como se ha indicado anteriormente mediante el uso del Ensayo de Replicón in vitro y un análisis de propiedad aditiva simple de los datos generados por ese ensayo, demuestran que el tratamiento de combinación de las células con replicón con un inhibidor de serina proteasa del VHC y un interferón producen al menos un efecto antiviral aditivo y probablemente un efecto antiviral sinérgico.
Los datos anteriores se han reanalizado usando las herramientas matemáticas formales descritas anteriormente para determinar si la relación entre el CU inhibidor de la serina proteasa de VHC y el interferón alfa-2B es sinérgica, aditiva o antagonista. Los datos reanalizados se muestran de forma numérica en la Tabla 8 y gráficamente en la Figura 4.
La Tabla 8 resume resultados adicionales obtenidos en el Ensayo de Replicón después de tratamiento de las células que contienen replicón durante 48 horas con diversos inhibidores de la serina proteasa de VHC de la presente invención y varios interferones diferentes, individualmente
o en combinación. Remarcamos que la desviación típica de los valores medidos con respecto a inhibición del ARN del replicón de VHC en el Ensayo de Replicón es del -20%. Los compuestos se ensayan sobre un amplio intervalo de concentraciones y a concentraciones de compuesto menores que no provocan inhibición significativa de la concentración de ARN del replicón de VHC. Debido a la desviación típica del -20% del ensayo, algunos puntos de datos generarán números negativos. Los números de inhibición negativa indican en un experimento particular que existen de media más moléculas de ARN de replicón de VHC en las muestras tratadas con compuesto que en las muestras tratadas de forma simulada.
TABLA 8
INHIBICIÓN DE LA ACUMULACIÓN DE ARN DEL REPLICÓN DESPUÉS DE 48 HORAS DE
TRATAMIENTO CON INHIBIDORES DE SERINA PROTEASA DE VHC Y DIFERENTES
INTERFERONES, INDIVIDUALMENTE O EN COMBINACIÓN
EXPERIMENTO 1
IFN alfa-2B (unidades)
30,00 6,00 1,20 0,24 0,048 0,0096 0,000
0,000
89% 73% 38% 16% 8% 12% 0%
0,012
92% 78% 44% 20% 19% 19% 5%
Compuesto 0,037
92% 78% 44% 21% 2% 7% 8%
CU 0,111
93% 79% 46% 29% 12% 15% 11%
(imagen44 M)
0,333
94% 87% 66% 49% 33% 27% 28%
1
99% 98% 96% 95% 92% 93% 88%
3
99% 99% 99% 99% 98% 98% 98%
310
EXPERIMENTO 2
IFN alfa-2B (unidades)
30
6 1,2 0,24 0,048 0,0096 0
0
86% 61% 27% 4% -7% 5% 0%
0,0123
87% 66% 17% -23% 8% 8% 10%
Compuesto
0,037 85% 62% 13% -2% 0% -1% 1%
CU
0,111 87% 68% 37% 20% -6% 12% 10%
( imagen44 M)
0,333 92% 77% 58% 41% 26% 25% 44%
1
98% 96% 90% 86% 84% 83% 85%
3
99% 99% 98% 98% 98% 98% 98%
EXPERIMENTO 3
Compuesto CU ( imagen44 M)
3
1,5 0,75 0,375 0,1875 0,0938 0,0469 0,0234 0
0
98% 93% 62% 23% 12% -2% -4% -2%
0
0,049
98% 95% 70% 39% 12% 2% 6%. 9% 3%
Interferón
0,123 98% 95% 70% 43% 15% 7% 2% 5% 2%
alfa-2B
0,307 98% 95% 73% 46% 16% 14% 7% 19% -3%
(unidades)
0,768 98% 95% 82% 56% 43% 34% 28% 32% 28%
1,920
98% 98% 87% 71% 51% 54% 49% 52% 45%
4,8
99% 98% 92% 82% 74% 71% 69% 71% 59%
12,0
99% 98% 96% 89% 87% 85% 85% 85% 80%
30,0
99% 99% 98% 95% 93% 92% 92% 93% 89%
EXPERIMENTO 4
Compuesto CU ( imagen44 M)
3
1,5 0,75 0,375 0,1875 0,0938 0,0469 0,0234 0
0
98% 94% 74% 38% 17% 3% -1% 6% 0%
0,049
98% 93% 60% 22% 29% 21% -9% -6% 6%
0,123
98% 93% 67% 29% 21% 12% 3% 2% -8%
Interferón
0,307 98% 93% 66% 29% 22% 4% -3% -4% 10%
alfa-2B
0,768 98% 95% 67% 46% 24% 21% 20% 9% 15%
(unidades)
1,920 98% 96% 73% 48% 43% 44% 27% 33% 29%
4,8
98% 97% 82% 61% 61% 59% 52% 55% 43%
12,0
99% 98% 91% 75% 76% 72% 71% 74% 73%
30,0
99% 98% 96% 89% 86% 85% 84% 84% 83%
5
311
EXPERIMENTO 5
Compuesto CU ( imagen44 M)
3
1,5 0,75 0,375 0,1875 0,0938 0,0469 0,0234 0
0
98% 95% 65% 24% -1% -14% -14% -12%
0
0,9375
97% 95% 72% 41% 17% 11% 12% 6% 17%
Interferón
1,875 97% 95% 71% 40% 31% 18% 18% 11% 4%
Ovino tau
3,75 98% 96% 75% 44% 38% 25% 34% 18% 17%
(unidades)
7,5 98% 96% 82% 61% 42% 37% 25% 26% 36%
15
98% 97% 84% 64% 59% 61% 56% 51% 53%
30
98% 98% 90% 79% 72% 68% 65% 68% 68%
60
98% 98% 93% 87% 80% 80% 74% 77% 82%
120
98% 98% 95% 92% 86% 87% 86% 86% 87%
EXPERIMENTO 6
Compuesto EC ( imagen44 M)
3
1,5 0,75 0,375 0,1875 0,0938 0,0469 0,0234 0
0
96% 93% 81% 56% 29% 23% 19% 1%
0
0,0492
96% 92% 80% 60% 31% 15% 19% 29% 6%
Interferón
0,1229 96% 94% 78% 58% 32% 13% 20% 20% 4%
alfa-2B
0,3072 97% 95% 82% 60% 38% 32% 34% 42% 23%
(unidades)
0,768 97% 95% 87% 66% 43% 41% 46% 43% 25%
1,92
98% 97% 90% 73% 62% 51% 54% 58% 47%
4,8
98% 97% 94% 87% 76% 73% 78% 76% 69%
12,0
98% 98% 96% 92% 86% 86% 86% 85% 84%
30,0
98% 98% 96% 96% 93% 92% 92% 95% 91%
312
EXPERIMENTO 7
Compuesto EC ( imagen44 M)
3
1,5 0,75 0,375 0,1875 0,0938 0,0469 0,0234 0
0
96% 92% 81% 47% 28% 17% -1% -8%
0
0,0492
96% 93% 78% 58% 21% 8% -12% 10% -17%
Interferón
0,1229 95% 93% 79% 64% 14% 5% 14% 7% -22%
alfa-2B
0,3072 95% 91% 80% 64% 22% 15% 5% 2% -5%
(unidades)
0,768 96% 95% 81% 64% 34% 21% 19% 20% 4%
1,92
96% 95% 88% 78% 44% 41% 19% 33% 21%
4,8
97% 95% 91% 85% 60% 58% 60% 53% 49%
12,0
97% 97% 95% 91% 77% 72% 76% 70% 71%
30,0
98% 98% 97% 94% 91% 86% 85% 85% 84%
EXPERIMENTO 8
Compuesto CU ( imagen44 M)
3,0
1,5 0,75 0,375 0,1875 0,0938 0,0469 0,0234 0
0
97% 95% 77% 34% 16% 6% -7% 0%
0
0,2344
98% 97% 83% 49% 31% 19% -21% -7% 1%
Interferón
0,4688 98% 96% 84% 56% 39% 27% 10% -3% 21%
beta
0,9375 98% 97% 91% 73% 54% 42% 31% 15% 30%
(unidades)
1,875 98% 98% 95% 80% 65% 58% 65% 60% 60%
3,75
98% 98% 97% 92% 86% 81% 77% 73% 79%
7,5
99% 98% 98% 96% 93% 93% 93% 90% 92%
15,0
99% 99% 99% 97% 97% 96% 97% 95% 96%
30,0
99% 99% 99% 99% 98% 99% 98% 98% 97%
313
EXPERIMENTO 9 Compuesto EP (imagen44 M) 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0,0625 0 0
94% 96% 96% 92% 64% 36% 23% 8% 0
0,0492
95% 96% 96% 91% 67% 25% 28% 8% 3%
Interferón 0,1229
95% 97% 96% 91% 65% 44% 4% 11% 4%
alfa-2B 0,3072
95% 97% 96% 91% 71% 46% 20% 8% 20%
(unidades) 0,7680
96% 97% 97% 93% 75% 49% 36% 24% 24%
1,92
96% 97% 97% 94% 82% 67% 49% 52% 54%
4.8
96% 98% 97% 96% 90% 79% 75% 75% 70%
12
97% 98% 98% 97% 94% 89% 89% 87% 83%
30
97% 98% 98% 98% 96% 94% 94% 95% 92%
EXPERIMENTO 10 Ribavirina (imagen44 M) 200 80 32 12,8 5,12 2,048 0,8192 0,3277 0 0
85% 62% 43% 3% -8% -17% -22% -6% 0
0,0492
87% 66% 48% 44% 11% -4% -10% 11% -7%
Interferón 0,1229
84% 64% 53% 40% 26% -12% -5% 11% -9%
alfa-2B 0,3072
86% 70% 62% 44% 28% 1% 6% 14% 7%
(unidades) 0,768
90% 80% 72% 65% 38% 30% 28% 44% 29%
1,92
93% 85% 77% 76% 61% 57% 58% 50% 46%
4.8
96% 92% 87% 83% 82% 74% 71% 77% 72%
12
97% 95% 93% 91% 90% 89% 90% 89% 85%
30
98% 97% 96% 95% 94% 94% 93% 95% 94%
Como se muestra en las Figuras 4-13, que representan gráficamente los datos de la Tabla
5 8 representados usando el procedimiento matemático descrito anteriormente para medir la sinergia, las curvas de Isobolas para todas las combinaciones de inhibidores de serina proteasa de VHC e interferones estudiados son cóncavas hacia arriba, lo que indica que el efecto antiviral de los tratamientos en el Ensayo de Replicón es sinérgico. Estos resultados se tabulan en la Tabla 9, que muestra los niveles relativos de sinergia para el tratamiento de combinación y los valores
10 de CI50 para compuestos antivirales usados individualmente. Los elementos clave de la Tabla 9 son los valores α y los p valores para las determinaciones. El término α es una medida de la inflexión máxima de las Isobolas para cada tratamiento de combinación. Un valor α de cero indica propiedad aditiva, un valor negativo indica antagonismo y como es el caso en los tratamientos de
314
combinación con los inhibidores de serina proteasa de VHC y los interferones mostrados anteriormente, un valor mayor que uno indica sinergia. Cuanto mayor es el parámetro a, mayor es la sinergia. Como se muestra en la Tabla 9 para las combinaciones de inhibidores de serina proteasa de VHC e interferones, incluso ignorando los niveles de significación para cada
5 experimento, un ensayo de t basado en los 9 experimentos para los que el valor alfa medio es 0 (sin interacción) tiene un p valor de 0,00014, lo que indica que los resultados son altamente significativos.
El cálculo de sinergia basándose en el procedimiento de Greco Rustom ((1990) Application of a New Approach for the Quantitation of Drug Synergism to the Combination of 10 cis-Diamminedicloroplatinum and 1-β-D-Arabinofuranosyl-cytosine, Cancer Research, 50, 53185327) usado en el presente análisis es una herramienta ideal para la evaluación del tipo de datos experimentales que pueden generarse usando el Ensayo de Replicón de VHC. Existen otros procedimientos que se aplican a estudios de compuestos antivirales tales como Pritchard y Shipman (Prichard, M.N., y Shipman, C. Jr., (1990) "A three-dimensional model to analyze
15 drug-drug interactions (review)," Antiviral Res. 14: 181-206). La aplicación de su procedimiento de cálculo de sinergia a los datos mostrados en la Tabla 8 también indica que el tratamiento de combinación de las células refcon con un inhibidor de serina proteasa de VHC e interferón dará como resultado una inhibición sinérgica de la acumulación de ARN del replicón de VHC (datos no mostrados).
20 TABLA 9
NIVELES RELATIVOS DE SINERGIA PARA EL TRATAMIENTO DE COMBINACIÓN Y VALORES DE CI50 PARA COMPUESTOS ANTIVIRALES USADOS INDIVIDUALMENTE Inhibidor de Serina Proteasa de VHC (HSPI) Interferón CI50 de INF (unidades) CI50 de HSPI ( imagen44 M) a (ET)1 valor P imagen45 >0
Experimento 1 Compuesto CU IFN alfa-2B 2,05 0469 0,477 (0,09) <0,0001 Experimento 2 Compuesto CU IFN alfa-2A 3,72 0,446 0,770 (0,12) <0,0001 Experimento 3 Compuesto CU IFN alfa-28 2,36 0,587 0,730 (0,08) <0,0001 Experimento 4 Compuesto CU IFN alfa-2A 5,67 0,633 0,438 (0,08) <0,0001
315
(continuación)
NIVELES RELATIVOS DE SINERGIA PARA EL TRATAMIENTO DE COMBINACIÓN Y VALORES DE CI50 PARA COMPUESTOS ANTIVIRALES USADOS INDIVIDUALMENTE Inhibidor de Serina Proteasa de VHC (HSPI) Interferón CI50 de INF (unidades) CI50 de HSPI ( imagen44 M) a (ET)1 valor P imagen45 >0 Experimento 5 Compuesto CU IFN tau 13,22 0,605 0,328 (0,07) <0,0001 Experimento 6 Compuesto EC IFN alfa-2B 2,53 0,384 0,516(0,10) <0,0001 Experimento 7 Compuesto BC IFN alfa-2A 5,50 0,312 1,24 (0,20) <0,0001 Experimento 8 Compuesto CU IFN beta 1,82 0,466 0,551 (0,09) <0,0001 Experimento 9 Compuesto EP IFN alfa-2B 3,06 0,426 0,490 (0,12) <0,0001
Experimento 10 Ribavirina IFN alfa-2B 1,22 145 -0,24 (0,067) 0,0004
1(ET) Error Típico
Otra medida para evaluar la naturaleza sinérgica del tratamiento de fármacos anti-VHC usando los presentes inhibidores de serina proteasa de VHC e interferones es usar los mismos 5 procedimientos descritos anteriormente para evaluar la terapia de combinación convencional actual para VHC, es decir, interferón alfa-2B en combinación con Ribavirina en el Ensayo de Replicón. La última línea de la Tabla 9 muestra que el parámetro α para una mezcla de interferón de alfa-2B y Ribavirina es un número negativo, lo que indica que hay una pequeña cantidad de antagonismo entre estos dos fármacos. Esto pone de relieve la significación de los tratamientos de
10 combinación desvelados en el presente documento que emplean los presentes inhibidores de serina proteasa de VHC en combinación con interferones en tanto que estos tratamientos claramente producen sinergia, mientras que la terapia de combinación convencional en uso para VHC (interferón alfa-2B en combinación con Ribavirina) no es sinérgica en el Ensayo de Replicón. La comparación anterior de tratamientos de combinación que emplean los presentes
15 inhibidores de serina proteasa de VHC más interferones contra Ribavirina más interferón en el
316
Ensayo de Replicón claramente indica que los primeros son sinérgicos mientras que los segundos no lo son. Los resultados experimentales obtenidos usando el Ensayo de Replicón indican que una dosis mucho menor de interferón sería eficaz si el interferón se usa en combinación con un inhibidor de serina proteasa de VHC que la que se necesita cuando el interferón alfa-2B se usa en combinación con Ribavirina. El Ensayo de Replicón es un sistema modelo útil en el que ensayar compuestos anti-VHC potenciales y actualmente se confía ampliamente en él como un indicador eficaz de actividad de compuestos anti-VHC. Obsérvese, por ejemplo, Blight y col. (2000) Efficient Initiation of HCV RNA Replication in Cell Culture. Science 8; 290:1972-1974, y Chung y col. (2001) Hepatitis C virus replication is directly inhibited by IFN-α in a full-length binary expression system. Proc. Nat. Acad. Sci. Estados Unidos 98(17):9847-52. Ribavirina por sí sola es marginalmente eficaz en la reducción de la acumulación de ARN del replicón de VHC en el Ensayo de Replicón (Tabla 8, experimento 10 y última línea de la Tabla 9). Este resultado está en aparente conflicto con estudios in vivo en los que, cuando se usa por sí misma, la Ribavirina no tiene un valor terapéutico significativo para el tratamiento de VHC. Por el contrario, en el Ensayo de Replicón, corrigiendo con respecto a citotoxicidad como se analiza posteriormente, la Ribavirina tiene una CI50 de 145 µM. Este resultado puede explicarse reconociendo que el Ensayo de Replicón permite una evaluación de altas concentraciones de Ribavirina que no serían posibles en terapia humana debido a la citotoxicidad in vivo (Chutaputti A. (2000) Adverse effects and other safety aspects of the hepatitis C antivirals. Journal of Gastroenterology and Hepatology.15 Suppl:E156-63).
Esta evaluación requiere necesariamente la valoración de la citotoxicidad de Ribavirina. Dicha toxicidad aparece en pacientes y en ensayos celulares (Shiffman M. L., Verbeke S. B., Kimball P. M. (2000) Alpha interferon combined con ribavirin potentiates proliferative suppression but not cytokine production in mitogenically stimulated human lymphocytes. Antiviral Research. 48(2):91-9). En los experimentos desvelados en el presente documento, la citotoxicidad de Ribavirina en el Ensayo de Replicón se observa y se mide de dos maneras. En el ensayo metabólico de XTT para determinar la viabilidad de células con replicón (Roehm N.W., Rodgers G. H., Hatfield S. M., Glasebrook A. L. (1991) An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability using the tetrazolium salt XTT. Journal of Immunol. Methods. 142(2):257-65) y en el ensayo de RT-PCR cuantitativa TaqMan® que mide los niveles de ARNm de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) en células tratadas contra no tratadas en el Ensayo de Replicón (Brink N., Szamel M., Young A.R., Wittern K.P., Bergemann J. (2000) Comparative quantification of IL-1beta, IL-10, IL-10r, TNFalfa and IL-7 mRNA levels in UVirradiated human skin in vivo. Inflamation Research. 49(6):290-6), se observa una citotoxicidad inducida por Ribavirina significativa, pero se corrige como sigue. Se asume que el nivel de
317
ARNm de GAPDH, que es un gen constitutivo expresado de forma constitutiva, es el mismo en todas las células viables. Se sabe a partir de medidas de niveles de ARNm de GAPDH en células tratadas con el inhibidor de transcripción actinomicina D que la semivida del ARNm de GAPDH es sólo de unas pocas horas (datos no mostrados). De este modo, se postula, como han hecho otros usando tecnología TaqMan® para determinar los niveles de ARNm en particular en células humanas, que los niveles de ARNm de GAPDH son proporcionales a los números de células viables (VCN) en cualquier muestra dada, con la relación de VCN= 2^(40CtGAPDH mRNA). El VCN se calcula para cada uno de los pocillos de muestra del Ensayo de Replicón y después dividimos el número de copias de ARN del replicón de VHC para un pocillo específico por el VCN de ese pocillo. Una vez calculada, esta relación se usa en lugar del número de copias de VHC para calcular la inhibición (“relación de uso inhibidor medio”; Figura 14.A). Sin corregir los datos de Ensayo de Replicón para esta citotoxicidad dicha citotoxicidad se lee como un falso positivo de inhibición de la acumulación de replicón de ARN de VHC. En el Ensayo de Replicón se asume que la inhibición medida de la acumulación del replicón de ARN de VHC es la suma de la inhibición real de la acumulación del replicón de ARN de VHC y la inhibición aparente de acumulación del replicón de ARN de VHC debido a la citotoxicidad. Se asume además que, basándose en la relación cercana de las medidas de citotoxicidad de XTT y de ARNm de GAPDH de TaqMan®, la inhibición de la acumulación de ARNm de GAPDH causada por los compuestos ensayados en el Ensayo de Replicón es una medida fiable de la inhibición aparente de la acumulación del replicón de ARN de VHC debido a citotoxicidad. De este modo, se puede estimar la verdadera actividad anti VHC de un compuesto en el Ensayo de Replicón corregido con respecto a la citotoxicidad general dividiendo el número de moléculas de ARN del replicón de VHC medidas en cada muestra por el VCN, normalizando de este modo el número de células viables en cada muestra. Usando este procedimiento la Figura
14.A muestra una estimación de actividad verdadera anti VHC de la Ribavirina en el Ensayo de Replicón (“relación de uso inhibidor medio”). La estimación de la CI50 para Ribavirina se calcula mejor usando este procedimiento. La Figura 14.A “inhibición media original” muestra la CI50 no corregida para Ribavirina, que es aproximadamente 80 µM, mientras que el valor de CI50 corregido a partir de la curva de “inhibición media usando la relación” es de aproximadamente 145 µM. Obsérvese que la diferencia entre la inhibición corregida y medida de la acumulación del replicón de ARN de VHC como un resultado del tratamiento con interferón alfa-2B (Figura 14.B) es insignificante a la vista del % de CV del -20% del Ensayo de Replicón. Como el interferón alfa-2B, los inhibidores de serina proteasa de VHC ensayados en el presente ejemplo no muestran una citotoxicidad significativa a las concentraciones empleadas. Esto se determina usando ensayos de XTT, en los que los valores de CT50 para los diversos componentes son:
318
CU=64,7 µM, EP>10 µM, y EC>50 µM. Estos valores de CT50 son 20-140 veces mayores que los valores de CI50 mostrados en la Tabla 9. De este modo, la citotoxicidad de estos compuestos no tiene un efecto significativo en la acumulación de ARN de VHC en el Ensayo de Replicón dentro de la precisión del ensayo debido a que dicha citotoxicidad sólo aparece en concentraciones del inhibidor de serina proteasa de VHC significativamente mayores que las ensayadas en el Ensayo de Replicón.
Conclusiones Respecto a la Eficacia de los Inhibidores de Serina Proteasa de VHC e Interferones, Individualmente y en Combinación
Las actividades anti VHC de los presentes inhibidores de serina proteasa de VHC y diversos interferones cuando se usan solos en el Ensayo de Replicón de VHC se muestran en las columnas y líneas de los experimentos individuales que componen la Tabla 8 que emplea sólo un agente antiviral. La Tabla 9 enumera los valores de CI50 medidos para cada compuesto antiviral cuando se ensayan solos. Los resultados anteriores, derivados mediante el uso del Ensayo de Replicón in vitro, también demuestran que el tratamiento de combinación de células con replicón con inhibidores de serina proteasa de VHC de la presente invención y diversos interferones produce efectos antivirales sinérgicos. Se espera plenamente que estos efectos se traduzcan en eficacia in vivo.
La terapia de combinación que emplea inhibidores de serina proteasa de VHC descritos en el presente documento posee varias ventajas principales frente a la terapia de fármaco sencillo. Primero, haciendo el tratamiento posible con dosis menores de los fármacos individuales de lo que sería posible si se usaran solos, se esperaría una reducción en la toxicidad y en los efectos secundarios asociados con el tratamiento. Esto es especialmente importante en el caso de terapia con interferón, en el que los efectos secundarios son graves y se ha demostrado que son proporcionales a la dosis administrada a los pacientes. Los datos anteriores indican que una dosis de inhibidor de serina proteasa de VHC tal como CU en el nivel de CI50 podría combinarse con una dosis de interferón alfa, por ejemplo en el nivel de CI50, y el resultado sería una terapia mucho más eficaz que la que podría conseguirse con el inhibidor de serina proteasa de VHC por sí solo sin los efectos secundarios adversos causados por dosis altas de interferón alfa. Un segundo beneficio principal de la terapia de combinación es que debido a que los dos fármacos actúan de manera independiente, hay menos posibilidades de desarrollo de cepas mutantes de VHC que resistan el tratamiento. El desarrollo de resistencia es una preocupación principal con los virus de ARN tales como VHC. Debido a su alta velocidad de mutación, dichos virus pueden adaptarse rápidamente a presiones ambientales. Un tercer beneficio de la terapia de combinación puede ser el coste reducido, debido a la necesidad de cantidades menores de agentes terapéuticos requeridos
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para el tratamiento eficaz.
Los inmunomoduladores adicionales que pueden emplearse en los procedimientos desvelados en el presente documento incluyen , por ejemplo, interferón alfa 2A, interferón consenso, interferón tau, interferón + Ribavirina (Rebatron), interferón pegilado y promotores de la expresión génica de interferón. Se anticipa plenamente que la actividad anti-VHC de estos compuestos se mejore cuando se usan en combinación con inhibidores de serina proteasa de VHC tal como los desvelados en el presente documento. Puesto que se sabe que los interferones son activos in vivo y en el Ensayo de Replicón, se espera que los presentes inhibidores de serina proteasa de VHC también estén activos in vivo y, de manera más importante, sean capaces de inducir actividad sinérgica cuando se usan en combinación con interferones, estimuladores del sistema inmune de los mismos u otros compuestos que tienen actividad antiviral para VHC que actúan por un mecanismo distinto de la inhibición de la serina proteasa del VHC.
La mejor terapia actual para VHC emplea interferón alfa y el análogo de nucleósido Ribavirina. Este tratamiento sólo es eficaz marginalmente y da como resultado efectos secundarios significativos que disminuyen el seguimiento de la terapia por parte del paciente (Chronic Hepatitis C: Current Disease Management, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health, 1999). Adicionalmente, en pacientes con trasplante, no está claro que la combinación Ribavirina-interferón funcione y puede ser de hecho peor que el interferón por sí sólo (Chronic Hepatitis C: Current Disease Management, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health, 1999).
Los resultados presentados anteriormente demuestran un efecto de combinación sinérgico en el que los interferones se usan con una nueva clase de antivirales para VHC, los inhibidores de serina proteasa de la presente invención. Esperamos plenamente que los resultados in vitro desvelados en el presente documento conduzcan a un tratamiento más eficaz de los pacientes de VHC que el que actualmente es posible usando interferón por sí sólo. Dosis subterapéuticas de interferón podrían movilizar el sistema inmune del paciente para luchar mejor contra el virus y el inhibidor de serina proteasa podría atacar al virus directamente, infligiendo al virus un ataque doble mediante diferentes mecanismos de acción. El tratamiento de la infección por VHC podría conseguirse de este modo a un coste reducido para el paciente en términos de efectos secundarios disminuidos y pagos menores para agentes farmacéuticos necesarios puesto que se necesitarían menos de ambos fármacos para una terapia antiviral para VHC eficaz.
La presente invención puede materializarse en otras formas específicas sin separarse del espíritu o atributos esenciales de la misma.
320
LISTA DE SECUENCIAS
<110> VERTEX PHARMACEUTICALS INC.
5 <120> INHIBIDORES PEPTIDOMIMETICOS DE PROTEASA
<130> 040187EP4
<140> 07 012 485.4 10 <141> 25-07-2007
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
15
<210> 1
<211> 900
<212> ADN
<213> Virus de la Hepatitis C 20 <400> 1
321

322

Claims (8)

1. Un procedimiento para preparar un compuesto de bicicloprolinato quiral de fórmula 28
imagen1
que comprende las etapas de:
(a) escindir y ciclar un compuesto de fórmula 24
en la que:
imagen1
10 es cicloalquilo opcionalmente sustituido o arilcicloalquilo condensado opcionalmente sustituido; R11 es -CO2R13; R12 es un aducto de derivado de glicinimida imínica;
R13
es un grupo protector de ácido o grupo alifático opcionalmente sustituido; en 15 condiciones de escisión y ciclación para formar un compuesto de fórmula 25
imagen1
en la que: R14 es -CONR15R15, -CN;
323
imagen1
o -CO2R16;
R15 es un grupo alifático opcionalmente sustituido; R16
es un grupo protector de ácido, arilo opcionalmente sustituido o grupo alifático opcionalmente sustituido; y
(b) proteger el nitrógeno del resto lactama en el compuesto de fórmula 25 con un grupo protector de amida para formar un compuesto de fórmula 26
imagen1
en la que: pO es un grupo protector de amida; R14 es como se ha descrito aquí; y
(c) reducir el compuesto de fórmula 26 en condiciones reductoras para formar un compuesto de fórmula 27
imagen1
15 en la que:
324
pO y R14 son como se han descrito aquí; y
(d) desproteger el compuesto de fórmula 27 en condiciones de desprotección para formar un compuesto de fórmula 28
imagen1
5
en la que:
R14 es como se ha descrito en el presente documento.
2.
El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 en el que:
son
grupos alifáticos opcionalmente sustituidos alquilo, alquenilo o alquinilo
10
opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes de grupo alifático;
arilo
opcionalmente sustituido se refiere a un sistema de anillos monocíclico o
multicíclico, aromático, de 6 a 14 átomos de carbono, opcionalmente sustituido con uno
o más sustituyentes de grupo de anillos;
cicloalquilo opcionalmente
sustituido se refiere a un sistema de anillos mono- o
15
multicíclico, no aromático, de 3 a 10 átomos de carbono, opcionalmente sustituido con
uno o más sustituyentes de grupo de anillos;
arilcicloalquilo condensado opcionalmente sustituido
se refiere a un arilcicloalquilo
condensado opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes de grupo de anillos;
un aducto de derivado de glicinimida imínica es un compuesto seleccionado entre el
20
grupo constituido por
imagen1
en el que: R16
es un grupo protector de ácido, arilo opcionalmente sustituido o grupo alifático opcionalmente sustituido;
5
10
15
20
25
30
imagen2
325 R17 es arilo opcionalmente sustituido, grupo alifático opcionalmente sustituido,
aromáticos o no aromáticos, incluyendo arilo, heteroarilo, hidroxi, alcoxi, cicliloxi, ariloxi, heteroariloxi, acilo o su análogo tioxo, ciclilcarbonilo o su análogo tioxo, aroílo o su análogo tioxo, heteroaroílo o su análogo tioxo, aciloxi, ciclilcarboniloxi, aroiloxi, heteroaroiloxi, halo, nitro, ciano, carboxi (ácido), -C(O)-NHOH, -C(O)-CH2OH, -C(O)CH2SH, -C(O)-NH-CN, sulfo, fosfono, alquilsulfonilcarbamoílo, tetrazolilo, arilsulfonilcarbamoílo, N-metoxicarbamoílo, heteroarilsulfonilcarbamoílo, 3-hidroxi-3ciclobuteno-1,2-diona, 3,5-dioxo-1,2,4-oxadiazolidinilo o hidroxiheteroarilo tal como 3hidroxiisoxazolilo, 3-hidroxi-1-metilpirazolilo, alcoxicarbonilo, cicliloxicarbonilo, ariloxicarbonilo, heteroariloxicarbonilo, alquilsulfonilo, ciclilsulfonilo, arilsulfonilo, heteroarilsulfonilo, alquilsulfinilo, ciclilsulfinilo, arilsulfinilo, heteroarilsulfinilo, alquiltio, cicliltio, ariltio, heteroariltio, ciclilo, arildiazo, heteroarildiazo, tiol, Y1Y2N-, Y1Y2NC(O)-, Y1Y2NC(O)O, Y1Y2NC(O)NY3-o Y1Y2NSO2-, en los que Y1, Y2 e Y3 son independientemente hidrógeno, alquilo, arilo o heteroarilo, o cuando el sustituyente es Y1Y2N-, entonces uno de Y1 e Y2 puede ser acilo, ciclilcarbonilo, aroílo, heteroaroílo, alcoxicarbonilo, cicliloxicarbonilo, ariloxicarbonilo o heteroariloxicarbonilo, como se define en el presente documento, y el otro de Y1 e Y2 es como se ha definido previamente, o para cuando el sustituyente es Y1Y2NC(O)-, Y1Y2NC(O)O-, Y1Y2NC(O)NY3-o Y1Y2NSO2-, Y1 e Y2 también pueden tomarse junto con el átomo de N a través del cual están unidos Y1 e Y2 para formar un azaheterociclilo o azaheterociclenilo de 4 a 7 miembros, o cuando el sistema de anillos está saturado o parcialmente saturado, los sustituyentes de grupo de anillos incluyen adicionalmente metileno (H2C=), oxo (O=) y tioxo (S=); y sustituyentes de grupo alifático se refiere a arilo, heteroarilo, hidroxi, alcoxi, cicliloxi, ariloxi, heteroariloxi, acilo o su análogo tioxo, ciclilcarbonilo o su análogo tioxo, aroílo o su análogo tioxo, heteroaroílo o su análogo tioxo, aciloxi, ciclilcarboniloxi, aroiloxi, heteroaroiloxi, halo, nitro, ciano, carboxi (ácido), -C(O)-NHOH, -C(O)-CH2OH, -C(O)
326
CH2SH, -C(O)-NH-CN, sulfo, fosfono, alquilsulfonilcarbamoílo, tetrazolilo, arilsulfonilcarbamoílo, N-metoxicarbamoílo, heteroarilsulfonilcarbamoílo, 3-hidroxi-3ciclobuteno-1,2-diona, 3,5-dioxo-1,2,4-oxadiazolidinilo o hidroxiheteroarilo tal como 3hidroxiisoxazolilo, 3-hidroxi-1-metilpirazolilo, alcoxicarbonilo, cicliloxicarbonilo, 5 ariloxicarbonilo, heteroariloxicarbonilo, alquilsulfonilo, ciclilsulfonilo, arilsulfonilo, heteroarilsulfonilo, alquilsulfinilo, ciclilsulfinilo, arilsulfinilo, heteroarilsulfinilo, alquiltio, cicliltio, ariltio, heteroariltio, ciclilo, arildiazo, heteroarildiazo, tiol, metileno (H2C=), oxo (O=), tioxo (S=),Y1Y2N-, Y1Y2NC(O)-, Y1Y2NC(O)O-, Y1Y2NC(O)NY3-, Y1Y2NSO2-o Y3SO2NY1-, Y1 e Y2 son independientemente hidrógeno, alquilo, arilo o heteroarilo, e Y3 10 es alquilo, cicloalquilo arilo o heteroarilo, o para cuando el sustituyente es Y1Y2N-, entonces uno de Y1 e Y2 puede ser acilo, ciclilcarbonilo, aroílo, heteroaroílo, alcoxicarbonilo, cicliloxicarbonilo, ariloxicarbonilo o heteroariloxicarbonilo, como se define en el presente documento y el otro de Y1 e Y2 es como se ha definido previamente, o para cuando el sustituyente es Y1Y2NC(O)-, Y1Y2NC(O)O-,
15 Y1Y2NC(O)NY3-o Y1Y2NSO2-, Y1 e Y2 también pueden tomarse junto con el átomo de N a través del cual están unidos Y1 e Y2 para formar un azaheterociclilo o azaheterociclenilo de 4 a 7 miembros.
3. El procedimiento de la reivindicación 2 que comprende adicionalmente la etapa en la 20 que el compuesto de fórmula 24 se prepara realizando una adición de Michael con un
imagen3
en el que:
25 es cicloalquenilo opcionalmente sustituido o arilcicloalquenilo condensado opcionalmente sustituido; en la que:
el compuesto de fórmula 29 puede prepararse por esterificación de un compuesto de fórmula 29a
327
imagen1
en la que: R11a es -CHO, -COR15, -C≡N o -CONR15R15 .
5 4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el procedimiento se realiza a una temperatura comprendida entre 0ºC y -78ºC.
5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el procedimiento se realiza a -60ºC.
10 6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el procedimiento se cataliza con un catalizador de transferencia de fase quiral.
7. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el procedimiento se cataliza con un catalizador de transferencia de fase no quiral.
15
8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el grupo protector es BOC.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la glicinimida imínica es éster terc20 butílico de (N-difenilmetileno)-glicina.
10. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el compuesto de fórmula 29 es éster metílico de 1-carboxi-1-ciclopenteno.
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