EA011547B1 - Пептидомиметические ингибиторы протеазы - Google Patents

Пептидомиметические ингибиторы протеазы Download PDF

Info

Publication number
EA011547B1
EA011547B1 EA200300318A EA200300318A EA011547B1 EA 011547 B1 EA011547 B1 EA 011547B1 EA 200300318 A EA200300318 A EA 200300318A EA 200300318 A EA200300318 A EA 200300318A EA 011547 B1 EA011547 B1 EA 011547B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
compound
interferon
mmol
virus
group
Prior art date
Application number
EA200300318A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200300318A1 (ru
Inventor
Роберт Эдвард Бабин
Шу Хьюи Чен
Джейсон Эрик Ламар
Нэнси Джун Снайдер
Ксиченг Дэвид Сун
Марк Джозеф Тебби
Франц Виктор
К. Мей Ванг
Ивонн Йи Май Йип
Иван Колладо
Кристина Гарсиа-Паредес
Реймонд Самьюэл Паркер III
Линг Дзин
Декьи Гуо
Джон Ирвин Гласс
Original Assignee
Вертекс Фармасьютикалз Инкорпорейтед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26923261&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA011547(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Вертекс Фармасьютикалз Инкорпорейтед filed Critical Вертекс Фармасьютикалз Инкорпорейтед
Publication of EA200300318A1 publication Critical patent/EA200300318A1/ru
Publication of EA011547B1 publication Critical patent/EA011547B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/02—Linear peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/212—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/215—IFN-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/52—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring condensed with a ring other than six-membered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0202—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-X-X-C(=0)-, X being an optionally substituted carbon atom or a heteroatom, e.g. beta-amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0205—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-(X)3-C(=0)-, e.g. statine or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C07K5/06052—Val-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0808—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/101—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A61K38/095—Oxytocins; Vasopressins; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Abstract

Данное изобретение касается пептидомиметических соединений формулы BW и CUиполезных в качестве ингибиторов протеазы (1), в частности в качестве ингибиторов сериновой протеазы и более конкретно в качестве ингибиторов NS3 протеазы вируса гепатита. Изобретение также касается фармацевтических композиций и применения указанных соединений для ингибирования протеазы HCV или лечения пациентов, инфицированных HCV, или облегчения связанного с инфекцией физиологического состояния. Также разработаны фармацевтические комбинации, включающие в дополнение к соединениям формулы BW и CU один или более интерферонов, обладающих анти-HCV активностью, и/или одно или более соединений, обладающих анти-HCV активностью, и фармацевтически приемлемый носитель, способы ингибирования репликации вируса гепатита С с применением таких композиций. Настоящее изобретение также касается набора для лечения или профилактики инфекции HCV у пациента.

Description

Данное изобретение касается пептидомиметических соединений, фармацевтических композиций, содержащих пептидомиметические соединения, и применения пептидомиметических соединений или их композиций в качестве ингибиторов протеазы, в частности, в качестве ингибиторов сериновой протеазы, и, более конкретно, в качестве ингибиторов N83 протеазы вируса гепатита С (НСУ). Пептидомиметические соединения, в качестве ингибиторов N83 протеазы НСУ, в особенности полезны для нарушения жизненного цикла вируса гепатита С и для лечения или профилактики инфекции НСУ или вызванных ею физиологических состояний. Настоящее изобретение также касается способов комбинированной терапии для подавления репликации НСУ в клетках, либо для лечения или профилактики инфекции НСУ у пациентов путем применения пептидомиметических соединений или фармацевтических композиций, или наборов и фармацевтических упаковок из них. Настоящее изобретение в качестве фармацевтических композиций охватывает композиции, включающие ингибитор сериновой протеазы НСУ в сочетании с интерфероном, обладающим анти-НСУ активностью; ингибитор сериновой протеазы НСУ в сочетании с соединением, отличным от интерферона, обладающим анти-НСУ активностью; или ингибитор сериновой протеазы НСУ в сочетании как с интерфероном, обладающим анти-НСУ активностью, так и соединением, отличным от интерферона, обладающим анти-НСУ активностью.
Предпосылки изобретения
Заражение НСУ является и признается в качестве причины возникновения заболевания для большинства случаев, не относящихся к гепатитам А, В.
Считается, что 3% населения мира является носителями хронической формы НСУ [А. А1ЬсгЦ с1 а1., №Иига1 Н181огу о! НерайЙ8 С, 1. Нера1о1оду. 31, (8ирр1. 1), 17-24 (1999)]. Только в Соединенных Штатах процент заражения составляет 1,8% или 3,9 миллиона человек [М.1. А11ег, НерайЙ8 С У1Ш8 1пГесйоп ίη 11е Иш1еб 81а1е8, 1. Нера1о1оду. 31, (8ирр1. 1), 88-91 (1999)]. Более чем у 70% из числа всех инфицированных пациентов обнаружена хроническая инфекция, которая считается основной причиной цирроза и печеночно-клеточного рака. [Ό. Ьауапейу, С1оЬа1 8шуей1апсе апб Соп1то1 о! НерайЙ8 С, 1. У1га1 Нерай118, 6, 35-47 (1999)].
Репликация НСУ охватывает кодирование генома полипротеина из 3010-3033 аминокислот Ю.-Б. С1юо. е1 а1., Сепейс Огдашхайоп апб ОБ'егЩу о! 11е НерайЙ8 С Уйи8, Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А. 88, 2451-2455 (1991); N. Ка1о е1 а1., Мо1еси1аг С1ошпд о! 11е Нитап НерайЙ8 С У1ги8 Сепоте Ртот 1арапе8е Райеп18 \νί11ι Коп-А, Коп-В НерайЙ8, Ргос. N11. Асаб. 8с1. И8А. 87, 9524-9528 (1990); А. Такат1ха\\'а е1 а1., 81гис1иге апб Огдашхайоп о! 11е НерайЙ8 С У1ги8 Сепоте 18о1а1еб Ргот Нитап Сатега, 1. У1го1., 65, 1105-1113 (1991)]. Предполагается, что неструктурированные (N8) протеины НСУ обуславливают основной каталитический механизм вирусной репликации. N8 протеины получают путем протеолитического расщепления полипротеина [К. Ват1еп8сЫадет е1 а1., №п8йис1ига1 Рто1еш 3 о! 11е НерайЙ8 С У1ти8 Епсобе8 а 8еппе-Туре Рто1ета8е Кес.|шгеб !ог С1еауаде а1 11е N83/4 апб N84/5 1ипсйоп8, 1. Уио1., 67, 38353844 (1993); А. Сгакош е1 а1. С11агас1епха1юп о! 11е НерайЙ8 С У1ти8-Епсобеб 8етше Рго1е1па8е: Пе1етттайоп о! Рго1еша8е-Оерепбеп1 Ро1урго1ет С1еауаде 811е8, 1. У1го1., 67, 2832-2843 (1993); А. Сгакош е1 а1., Ехрге88юп апб 1бепййсайоп о! НерайЙ8 С У1ти8 Ро1урто1ет С1еауаде Ргобис18, 1. Уйо1., 67, 1385-1395 (1993); Ь. Тоте1 е1 а1., N83 18 а 8еппе рго1еа8е гес.|шгеб !ог ртосе88тд о! 1ерайЙ8 С У1ти8 ро1урто1еш, 1. У1го1., 67, 4017-4026 (1993)]. Показано, что фактически первые 181 аминокислоты N83 (остатков 10271207 вирусного полипротеина) содержат домен N83 сериновой протеазы, который процессирует все четыре нисходящих участка полипротеина НСУ [С. Бш е1 а1., НерайЙ8 С У1ти8 N83 8еппе Рто1еша8е: Тгап8С1еауаде КецштетепЩ апб Ртосе88тд Ктейс8, 1. Уио1., 68, 8147-8157 (1994)].
N8 3 (N83) протеин НСУ подавляет активность сериновой протеазы, что способствует процессингу основных вирусных ферментов и, таким образом, считается незаменимым для репликации вируса и инфективности. Заключение о незаменимости N83 протеазы сделано на основании того факта, что мутация в N83 протеазу вируса желтой лихорадки снижает вирусную инфективность [Т.1. С1атЬег8 е1 а1., ’Ένίбепсе 11а1 11е №1егтша1 Оотат о! №п8йис1ига1 Рго1еш N83 Ргот Уе11о\\' Реνе^ У1ги8 18 а 8еппе Рго1еа8е Ке8роп81Ь1е !ог 8йе-8ресШс С1еаνаде8 т 11е Уйа1 Ро1урго1еш, Ргос. №111. Асаб. 8сБ И8А, 87, 8898-8902 (1990)]. Совсем недавно на модели шимпанзе было показано, что мутации по активному участку N83 протеазы НСУ могут полностью устранить инфекцию НСУ [СМ. К1се е1 а1. НерайЙ8 С \'йи8-епсобеб епхутайс ас1Мйе8 апб соп8ег\геб КЫА е1етеп18 ш 11е 3'-поп1гап81а1еб гещоп аге е88епйа1 !ог νίιυ8 герйсайоп т νίνΌ. 1. У1го1., 74(4) 2046-51 (2000)]. N83 сериновая протеаза НСУ считается также незаменимой для репликации вируса, поскольку она и связанный с ней кофактор, №4А, способствуют процессингу всех вирусных ферментов. Очевидно, данный процессинг аналогичен процессингу, осуществляемому аспартил-протеазой вируса иммунодефицита человека (ШУ). В дополнение продемонстрированное на человеке применение ингибиторов протеазы Н1У в качестве эффективных противовирусных средств показывает, что нарушение стадии процессинга протеаза-протеин в жизненном кольце вируса не приводит к терапевтически активным агентам. Следовательно, фермент протеаза является привлекательной мишенью с точки зрения обнаружения лекарственных средств.
Описаны некоторые потенциальные ингибиторы протеазы НСУ. Публикации РСТ заявок под номерами АО 00/09558, АО 00/09543, АО 99/64442, АО 99/07733, АО 99/07734, АО 99/50230, АО 98/46630, АО 98/17679 и АО 97/43310, патент Соединенных Штатов № 5990276, М. Ейпа8-Втипе1 е1 а1.,
- 1 011547
Вюогд. Меб. Сйет. Ьей., 8, 1713-1718 (1998), У. Нап е! а1., Вюощ. Меб. Сйет. Ьей., 10, 711-713 (2000), К. Эшъбоп е! а1., Вюогд. Меб. Сйет. Ьей., 10, 1571-1579 (2000), М. Ьйпаз-Вгипе! е! а1., Вюогд. Меб. Сйет. Ьей., 10, 2267-2270 (2000) и 8. ЬаР1ап!е е! а1., Вюогд. Меб. Сйет. Ьей., 10, 2271-2274 (2000), каждая ссылка описывает потенциальные ингибиторы N83 протеазы НСУ. К сожалению, отсутствуют ингибиторы сериновой протеазы, приемлемые в настоящее время в качестве анти-НСУ агентов.
Фактически отсутствуют анти-НСУ методы лечения, за исключением интерферона-α, комбинации интерферон-а/рибавирин и ставшего известным совсем недавно ПЭГилированного интерферона-α. Однако показатели задержки ответа при лечении интерфероном-α и интерфероном-а/рибавирином являются низкими (<50%), а обнаруживаемые побочные действия значительные и тяжелые [М.А. ХУа1кег Нера!йк С У1ГИ8: ап Оуег\зе\\· оГ Сштеп! Арргоасйез апб Ргодгезз, ΌΌΤ, 4, 518-529 (1999); Ό. Могаброиг е! а1., Сштеп! апб ЕуоМпд Тйегар1е8 Гог Нераййз С, Еиг. 1. Оа81гоеп!его1. Нера!о1., 11, 1199-1202 (1999); Н.Ь.А. 1ап8веп е! а1., 8шс1бе Аз8ос1а!еб \νίΐ1ι А1Га-1п1егГегоп Тйегару Гог Сйгошс Уиа1 Нераййз, 1. Нера!о1., 21, 241-243 (1994) и Р.Е. Кепаи1! е! а1., 81бе еГГесй оГ а1рйа т!егГегоп, 8етшаг5 т Ыуег Океазе 9, 273-277, (1989)]. Кроме того, лечение интерфероном вызывает долговременное облегчение только в части случаев (~25%) [О. ХУеПапб, 1п!егГегоп Тйегару т Сйгошс Нераййз С Уииз 1пГесйоп, ЕЕМ8 М1сгоЫо1. Вег.. 14, 279-288 (1994)]. Указанные выше проблемы, связанные с лечением интерфероном-α, привели к разработке и клиническому испытанию соединений, являющихся ПЭГилированными производными интерферона-α, которые обеспечивают улучшенные методы анти-НСУ лечения.
Ввиду сложившейся в настоящее время ситуации в отношении анти-НСУ лечения, очевидно, что существует потребность в более эффективных и лучше переносимых методах лечения.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение касается пептидомиметического соединения формулы
его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства, или сольвата указанного соединения, его соли или пролекарства.
Настоящими заявителями представлено также соединение, имеющее структурную формулу
или его фармацевтически приемлемая соль или пролекарство, или сольват указанного соединения, его соли или пролекарства.
Изобретение также касается фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы ВХУ или СИ и фармацевтически приемлемый носитель.
Еще один аспект изобретения составляют фармацевтические композиции, содержащие соединение формулы ВХУ или СИ, интерферон, обладающий противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, и фармацевтически приемлемый носитель.
Изобретение также касается вышеуказанной композиции, дополнительно содержащей соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, где указанное соединение отлично от интерферона.
В следующем аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы ВХУ или СИ, соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, и фармацевтически приемлемый носитель, где указанное соединение отлично от интерферона.
Указанное соединение формулы ВХУ или СИ, указанный интерферон и указанное соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, каждый присутствует в вышеуказанной композиции в количестве, выбранном из группы, включающей фармацевтически эффективное количество, субклиническое фармацевтически эффективное количество и их комбинацию.
При этом указанный интерферон предпочтительно выбирают из группы, включающей интерферональфа 2В, пэгилированный интерферон альфа, согласованный интерферон, интерферон-альфа 2А, лимфобластоидный интерферон и интерферон !аи; а указанное соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, выбирают из группы, включающей интерлейкин 2, интер
- 2 011547 лейкин 6, интерлейкин 12, соединения, усиливающие развитие реакции типа 1 Т-хелперных клеток, двунитевую РНК, двунитевую РНК, комплексно связанную с тобрамицином, имиквимод, рибавирин, ингибитор инозин-5'-монофосфатдегидрогеназы, амантадин и римантадин.
В следующем аспекте изобретение касается применения соединения формулы Βν или Си для получения лекарственного средства для ингибирования протеазы НСУ.
Настоящее изобретение также относится к применению соединения формулы Βν или Си для получения лекарственного средства для лечения пациента, страдающего от инфекции, вызванной НСУ, или связанных с инфекцией физиологических состояний.
В следующем аспекте изобретение направлено на применение соединения формулы Βν или Си в комбинации с фармацевтически эффективным количеством другого анти-НСУ терапевтического средства для получения лекарственного средства для лечения пациента, страдающего от инфекции, вызванной НСУ, или связанных с инфекцией физиологических состояний.
Предпочтительным анти-НСУ терапевтическим средством является интерферон или производное интерферона.
Изобретение также относится к применению соединения формулы Βν или Си в комбинации с интерфероном, обладающим противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, для получения лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызванной вирусом гепатита С, у нуждающегося в таком лечении пациента.
Кроме того, в следующем аспекте настоящее изобретение касается применения соединения формулы Βν или СИ в комбинации с соединением, обладающим противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, для получения лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызванной вирусом гепатита С у нуждающегося в таком лечении пациента, где указанное соединение отлично от интерферона.
Предпочтительно указанное соединение формулы Βν или Си и указанный интерферон, каждый, присутствует в количестве, выбранном из группы, включающей фармацевтически эффективное количество, субклиническое фармацевтически эффективное количество и их комбинацию.
Указанный интерферон выбирают из группы, включающей интерферон-альфа 2В, пэгилированный интерферон альфа, согласованный интерферон, интерферон-альфа 2А, лимфобластоидный интерферон и интерферон 1аи.
Изобретение также относится к применению соединения формулы Βν или Си в комбинации с интерфероном, обладающим противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, и соединением, обладающим противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, для получения лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызванной вирусом гепатита С у нуждающегося в таком лечении пациента, где указанное соединение отлично от интерферона.
Указанное соединение формулы Βν или СИ, указанный интерферон и указанное соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, каждый присутствует в количестве, выбранном из группы, включающей фармацевтически эффективное количество, субклиническое фармацевтически эффективное количество и их комбинацию.
Указанный интерферон выбирают из группы, включающей интерферон-альфа 2В, пэгилированный интерферон альфа, согласованный интерферон, интерферон-альфа 2А, лимфобластоидный интерферон и интерферон 1аи; и указанное соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, выбирают из группы, включающей интерлейкин 2, интерлейкин 6, интерлейкин 12, соединение, усиливающее развитие реакции типа 1 Т-хелперных клеток, двунитевую РНК, двунитевую РНК, комплексно связанную с тобрамицином, имиквимод, рибавирин, ингибитор инозин-5'-монофосфатдегидрогеназы, амантадин и римантадин.
В следующем аспекте изобретение направлено на применение соединения формулы Βν или СИ, и интерферона, обладающего противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С для получения лекарственного средства для ингибирования репликации вируса гепатита С в клетке.
Указанное лекарственное средство может дополнительно содержать соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, где указанное соединение отлично от интерферона.
Изобретение касается также применения соединения формулы Βν или Си и соединения, обладающего противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, где указанное соединение отлично от интерферона, для получения лекарственного средства для ингибирования репликации вируса гепатита С в клетке.
Указанное соединение формулы Βν или СИ, указанный интерферон и указанное соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, каждый присутствует в количестве, выбранном из группы, включающей фармацевтически эффективное количество, субклиническое фармацевтически эффективное количество и их комбинацию.
Предпочтительно указанный интерферон выбирают из группы, включающей интерферон-альфа 2В, пэгилированный интерферон альфа, согласованный интерферон, интерферон-альфа 2А, лимфобластоидный интерферон и интерферон 1аи; и указанное соединение, обладающее противовирусной активностью
- 3 011547 в отношении вируса гепатита С, выбирают из группы, включающей интерлейкин 2, интерлейкин 6, интерлейкин 12, соединение, усиливающее развитие реакции типа 1 Т-хелперных клеток, двунитевую РНК, двунитевую РНК, комплексно связанную с тобрамицином, имиквимод, рибавирин, ингибитор инозин-5'монофосфатдегидрогеназы, амантадин и римантадин.
Настоящее изобретение касается также способа ингибирования репликации вируса гепатита С в клетке ίη νίίτο, включающего контактирование указанной клетки с соединением формулы Βν или Си, и интерфероном, обладающим противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С.
Причем способ по изобретение может дополнительно включать контактирование указанной клетки с соединением, обладающим противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, где указанное соединение отлично от интерферона.
В следующем аспекте нпастоящее изобретение направлено на способ ингибирования репликации вируса гепатита С в клетке ίη νίίτο, включающий контактирование указанной клетки с соединением формулы Βν или СИ, и соединением, обладающим противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, где указанное соединение отлично от интерферона.
При этом указанное соединение формулы Βν или СИ, указанный интерферон и указанное соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, каждый присутствует в количестве, выбранном из группы, включающей фармацевтически эффективное количество, субклиническое эффективное количество и их комбинацию, а указанный интерферон выбирают из группы, включающей интерферон-альфа 2В, пэгилированный интерферон альфа, согласованный интерферон, интерферон-альфа 2А, лимфобластоидный интерферон и интерферон 1аи; и указанное соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, выбирают из группы, включающей интерлейкин 2, интерлейкин 6, интерлейкин 12, соединение, усиливающее развитие реакции типа 1 Тхелперных клеток, двунитевую РНК, двунитевую РНК, комплексно связанную с тобрамицином, имиквимод, рибавирин, ингибитор инозин-5'-монофосфатдегидрогеназы, амантадин и римантадин.
Настоящее изобретение также касается набора, включающего ряд отдельных контейнеров, где по меньшей мере один из указанных контейнеров содержит ингибитор сериновой протеазы вируса гепатита С формулы Βν или СИ и по меньшей мере еще один из указанных контейнеров содержит интерферон, обладающий противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к набору, включающему ряд отдельных контейнеров, где по меньшей мере один из указанных контейнеров содержит ингибитор сериновой протеазы вируса гепатита С формулы Βν или Си и по меньшей мере еще один из указанных контейнеров содержит соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, где указанное соединение отлично от интерферона, а также к набору, включающему ряд отдельных контейнеров, где по меньшей мере один из указанных контейнеров содержит ингибитор сериновой протеазы вируса гепатита С формулы Βν или СИ, по меньшей мере еще один из указанных контейнеров содержит интерферон, обладающий противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, и по меньшей мере еще один из указанных контейнеров содержит соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, где указанное соединение отлично от интерферона.
Предпочтительно указанный ингибитор сериновой протеазы вируса гепатита С, указанный интерферон и указанное соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, каждый присутствует в количестве выбранном из группы, включающей фармацевтически эффективное количество, субклиническое фармацевтически эффективное количество и их комбинацию.
Предпочтительно указанный интерферон выбирают из группы, включающей интерферон-альфа 2В, пэгилированный интерферон альфа, согласованный интерферон, интерферон-альфа 2А, лимфобластоидный интерферон и интерферон 1аи; и указанное соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, выбирают из группы, включающей интерлейкин 2, интерлейкин 6, интерлейкин 12, соединение, усиливающее развитие реакции типа 1 Т-хелперных клеток, двунитевую РНК, двунитевую РНК, комплексно связанную с тобрамицином, имиквимод, рибавирин, ингибитор инозин-5'монофосфатдегидрогеназы, амантадин и римантадин.
Соединения настоящего изобретения вышеуказанных формлу Βν или Си входят в группу новых пептидомиметических соединений формулы 1, разработанную авторами настоящего изобретения:
где
В0 означает связь или дифторметилен;
В1 означает водород, необязательно замещенную алифатическую группу, необязательно замещенную циклическую группу или необязательно замещенную ароматическую группу;
каждый из В2 и В9 независимо означает необязательно замещенную алифатическую группу, необя- 4 011547 зательно замещенную циклическую группу или необязательно замещенную ароматическую группу; каждый из В3, В5 и В7 независимо означает (необязательно замещенную алифатическую группу, необязательно замещенную циклическую группу или необязательно замещенную ароматическую группу)(необязательно замещенный метилен или необязательно замещенный этилен), необязательно замещенный (1,1- или 1,2-)циклоалкилен или необязательно замещенный (1,1- или 1,2-)гетероциклилен;
каждый из В4, В6, В8 и В10 независимо означает водород или необязательно замещенную алифатическую группу;
означает замещенный моноциклический азагетероциклил или необязательно замещенный полициклический азагетероциклил, или необязательно замещенный полициклический азагетероцикленил, где ненасыщенность находится в кольце, дистальном по отношению к кольцу, несущему В9-Ь-(Ы(В8)-В7С(О)-)ПМ(В6)-В5-С(О)-М группу, и к которому присоединена группа -С(О)-М(В4)-В3-С(О)С(О)НВ2В1;
Ь означает -С(О)-, -Ос(О)-, -№В10С(О)-, -8(О)2- или -Ж'°8(О)2- и η равно 0 или 1, или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства, или сольвата указанного соединения, его соли или пролекарства, при условии, что когда
означает замещенный
то Ь означает -ОС(О)- и В9 означает необязательно замещенную алифатическую группу или по меньшей мере один из В3, В5 и В7 означает (необязательно замещенную алифатическую группу, необязательно замещенную циклическую группу или необязательно замещенную ароматическую группу)(необязательно замещенный этандиил), или В4 означает необязательно замещенную алифатическую группу.
Соединения формулы 1 могут быть получены из промежуточного соединения - хирального соединения бициклопролината, который, в свою очередь, может быть получен стереоселективным способом включающим следующие стадии:
(а) расщепления и циклизации соединения формулы 24
«М) где
означает необязательно замещенный циклоалкил или необязательно замещенный конденсированный арилциклоалкил;
В11 означает -СО2В13;
В12 означает иминный аддукт глицинимида;
В13 означает кислотную защитную группу или необязательно замещенную алифатическую группу;
в условиях расщепления и циклизации, с образованием соединения формулы 25
- 5 011547 или -СО2Я16;
Я15 означает необязательно замещенную алифатическую группу; Я16 означает кислотную защитную группу, необязательно замещенную арильную группу или необязательно замещенную алифатическую группу; и (Ь) защиты азота лактамовой группы в соединении формулы 25 амидной защитной группой с образованием соединения формулы 26
где р° означает амидную защитную группу; Я14 принимает вышеуказанные значения; и (с) восстановления соединения формулы 26 в условиях восстановления с образованием соединения формулы 27
ст , где р° и Я14 принимают указанные выше значения; и (6) снятия защиты соединения формулы 27, в условиях для снятия защиты, с образованием соединение формулы 28
ст ;
где Я14 принимает указанные выше значения.
Указанный выше способ синтеза может дополнительно включать стадию, где соединение формулы получают, осуществляя присоединение иминного соединения глицинимида к соединению формулы 29 по реакции Михаэля
где
означает необязательно замещенный циклоалкенил или необязательно замещенный конденсированный арилциклоалкенил;
Я11 означает -СО2Я13;
где соединение формулы 29 может быть получено этерификацией соединения формулы 29а
(2»·>
где
означает необязательно замещенный циклоалкенил или необязательно замещенный конденсированный арилциклоалкенил;
Я11а означает -СНО, -СОЯ15, -С N или -СОК1Я15Я15 и
Я15 принимает указанные выше значения.
Следует отметить, что специалисту в данной области хорошо известно, что конверсия кетонов до сложных эфиров может быть осуществлена, например, по реакции Байера-Виллигера. Конверсия нитрилов и амидов до сложных эфиров может быть осуществлена, например, путем водного гидролиза с последующей этерификацией. Конверсия альдегидов до сложных эфиров может быть осуществлена, например, окислением альдегида с последующий этерификацией.
Краткое описание чертежей
Указанные выше и другие аспекты, особенности и преимущества настоящего изобретения будут лучше поняты из последующего подробного описания, рассматриваемого в совокупности с приложен ными чертежами, все из которых приведены только с целью иллюстрации и не ограничивают настоящее изобретение.
- 6 011547
На фиг. 1 показано ингибирование аккумуляции НСУ репликона РНК после 48-часовой обработки репликонсодержащих клеток соединением Си и интерфероном-альфа 2В, по отдельности или в комбинации.
На фиг. 2 графически представлены вогнутые изоболические кривые, даваемые соединениями, используемыми в комбинации, являющимися антагонистическими, аддитивными и синергическими, согласно методам синергического расчета Сгесо, Рагк апб КиЧот ((1990) АррйсаГюп оГ а Νο\ν Арргоасй Гог Гйе ОнапШаОоп оГ Эгид 8упегд15т Ю Гйе СотЫпаГюп оГ с18-О1атт1пебюЫогор1аГтит апб 1-β-ΌАгаЬтоГигапокукуГокше, Сапсег Кекеагсй, 50, 5318-5327).
На фиг. 3 показана геометрическая зависимость между а и величиной кривизны изоболы. Гипотетическая изобола при уровне эффекта Е=50% изображается прямолинейной изоболой, которая ожидается при аддитивности. М является точкой пересечения линии у=х и гипотетической изоболы. N является точкой пересечения линии у=х и прямолинейной изоболы. О означает исходную точку (0,0). 8 является мерой степени кривизны изоболы, где 8=ΟΝ/ΟΜ. ΟΝ означает расстояние от О до N и ОМ означает расстояние от О до М. Параметр а связан с 8 уравнением α =4(82-8).
На фиг. 4 приведены расчеты изобол по методу Сгесо и др., см. выше, для комбинации соединения СИ и интерферона-альфа 2В (8сйегтд-Р1оидй) с использованием 6 разбавлений каждого соединения согласно эксперименту 1.
На фиг. 5 приведены расчеты изобол по методу Сгесо и др., см. выше, для комбинации соединения СИ и интерферона-альфа 2А с использованием 6 разбавлений каждого соединения согласно эксперименту 2.
На фиг. 6 приведены расчеты изобол по методу Сгесо и др., см. выше, для комбинации соединения СИ и интерферона-альфа 2В (8сйегтд-Р1оидй) с использованием 8 разбавлений каждого соединения согласно эксперименту 3.
На фиг. 7 приведены расчеты изобол по методу Сгесо и др., см. выше, для комбинации соединения СИ и интерферона-альфа 2А с использованием 8 разбавлений каждого соединения согласно эксперименту 4.
На фиг. 8 приведены расчеты изобол по методу Сгесо и др., см. выше, для комбинации соединения СИ и овечьего интерферона Гаи с использованием 8 разбавлений каждого соединения согласно эксперименту 5.
На фиг. 9 приведены расчеты изобол по методу Сгесо и др., см. выше, для комбинации соединения ЕС и интерферона-альфа 2В (8сйегтд-Р1оидй) с использованием 8 разбавлений каждого соединения согласно эксперименту 6.
На фиг. 10 приведены расчеты изобол по методу Сгесо и др., см. выше, для комбинации соединения ЕС и интерферона-альфа 2А с использованием 8 разбавлений каждого соединения согласно эксперименту 7.
На фиг. 11 приведены расчеты изобол по методу Сгесо и др., см. выше, для комбинации соединения СИ и интерферона бета с использованием 8 разбавлений каждого соединения согласно эксперименту 8.
На фиг. 12 приведены расчеты изобол по методу Сгесо и др., см. выше, для комбинации соединения ЕР и интерферона-альфа 2В (8сйегтд-Р1оидй) с использованием 8 разбавлений каждого соединения согласно эксперименту 9.
На фиг. 13 приведены расчеты изобол по методу Сгесо и др., см. выше, для комбинации рибавирина и интерферона альфа-2В (8сйегтд-Р1оидй) с использованием 8 разбавлений каждого соединения согласно эксперименту 10.
На фиг. 14 показано ингибирование аккумуляции НСУ репликона РНК, вызванное обработкой содержащих репликон клеток либо (А) только рибавирином, либо (В) только интерфероном альфа-2В. Для обеих групп показаны как измеренное ингибирование, так и ингибирование с поправкой на цитотоксичность соединений.
Подробное описание изобретения
Содержание каждого из патентных документов и других приведенных ссылок полностью включено в данное описание посредством ссылок.
Как использовано выше и во всем описании изобретения, следует считать, что указанные ниже оббревиатуры, если не оговорено особо, имеют следующие значения:
- 7 011547
Обозначение
АСЫ
ΑΙΒΝ
ВОС или Вос
ВОР п-ВизЗпН
Ь-Ви
СЬг хиральный РТС
Реагент или фрагмент ацетонитрил
2,2’-азобисизобутиронитрил трет-бутилкарбамат бензотриазол-1-илокситрис(диметиламино)фосфонийгексафторфосфат гидрид три-н-бутилолова
(хиральный МФК
БАЗТ
ВСС
ОСИ ϋΙΒΆΙ,-Η
Ц1С ϋΙΡΞΑ
ОМАР
ЭМР реагент (диэтиламино) сератрифторид (ЕРгЫЗГз) дициклокарбодиимид дихлорметан (СНгСХг) диизобутилалюминийгидрид
1,3-диизопропилкарбодиимид диизопропилэтиламин
4-(Ν,Ν-диметиламино)пиридин реагент Десс-Мартина - периодинан (РегФосЦпапе)
ДМФ дмео ЭА ΕϋΟΙ Экв. ЕС ес2о ЕбОН ЕЪОАс ЕС3З1 ЕМОС диметилформамид диметилсульфоксид элементный анализ 1-этил-З-(3-диметиламинопропил)карбодиимид* НС1 эквивалент(ы) этил диэтиловый эфир этанол этилацетат триэтилсилан 9-флуоренилметоксикарбонил О
Н-СЬд-ОН О
НОАР НОВ! Н0£и ВЭЖХ ЬАЯ Ме Ме1 МеОН Ме0С(О)С1 МОМС1 МОМ мс ЫаВН4 ЫагС4Н40б ΝΜΡ ЯМР Р— РуВОР 1-гидрокси-7-азабензотриаэол 1-гидроксибензотриазол Ν-гидроксисукцинамид высокоэффективная жидкостная хроматография литийалюмогидрид метил метилиодид метанол метилхлорформиат метоксиметилхлорид метоксиметил масс-спектроскопия боргидрид натрия тартрат натрия Ν-метилпирролидинон ядерный магнитный резонанс полимерная связь бензотриазол-1илокситриспирролидинофосфонийгексафторфосфат
ΊΒϋ ОФ-ВЭЖХ 1,5,7-триазабицикло[4,4,0]дец-5-ен высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой
ТВЗС1 ТСА ТГА Т£2О трет-бутилдиме тил силилхлорид трихлоруксусная кислота трифторуксусная кислота трифлатангидрид (ангидрид трифторметансульфоновой кислоты)
ТГФ ТНР тех тетрагидрофуран тетрагидропиран тонкослойная хроматография
- 8 011547
Как использовано выше и во всем описании изобретения, следует считать, что указанные ниже термины, если не оговорено особо, имеют следующие значения.
Кислотная биостера означает группу, обладающую химическими и физическими подобиями, обусловливающими биологические характеристики, близко схожие с карбоксильной группой (см., Ыршккт, Аппиа1 Керотй ίη Меб1сша1 Сйет181ту, ВюБоЦегБш 1п Эгид Эекди 21, 283 (1986); Уил, Н^айак 8екуе, Аррйсайоп Θί Вю18О81еи8т То №\ν Эгид Эекди 33, 576-579, (1993); 2йао, Ниахие ТопдЬао, Βίοίβοδ1епс Кер1асетеп1 апб Оеуе1ортеп1 Οί Ьеаб Сотроипбз 1п Эгид Оекдп 34-38, (1995); Сгайат, Тйеосйет, Тйеогейса1 81иб1е8 Аррйеб То Эгид Пе81дп:аЬ шйю Е1ес1тошс ОМпЬиОопх 1п Вю18о81еге8 343, 105-109, (1995)). Характерные примеры кислотных биостер включают -С(О)-ИНОН, С(О)-СН2ОН, -С(О)-СН28Н, С(О)-ХН-СЫ, сульфо, фосфоно, алкилсульфонилкарбамоил, тетразолил, арилсульфонилкарбамоил, Νметоксикарбамоил, гетероарилсульфонилкарбамоил, 3-гидрокси-3-циклобутен-1,2-дион, 3,5-диоксо1,2,4-оксадиазолидинил или гидроксигетероарил, такой как 3-гидроксиизоксазолил, 3-гидрокси-1метилпиразолил и тому подобное.
Кислотная функциональная группа означает группу, несущую кислотный водород. Характерные примеры кислотных функциональных групп включают карбоксил (-С(О)ОН), -С(Ο)-NНΟН, -С(О)СН2ОН, -С(О)-СН28Н, -С(О)-№Н-С^ сульфо, фосфоно, алкилсульфонилкарбамоил, тетразолил, арилсульфонилкарбамоил, Ν-метоксикарбамоил, гетероарилсульфонилкарбамоил, 3-гидрокси-3-циклобутен1,2-дион, 3,5-диоксо-1,2,4-оксадиазолидинил или гидроксигетероарил, такой как 3-гидроксиизоксазолил, 3-гидрокси-1-метилпиразолил, имидазолил, меркапто и тому подобное, и подходящий гидрокси, такой как ароматический гидрокси, например гидроксифенил.
Кислотная защитная группа означает легко удаляемую группу, которая, как известно в данной области, защищает кислотный водород или карбоксильную группу от нежелательной реакции во время синтеза, например блокирует или защищает кислотную функциональность в то время, как осуществляются взаимодействия, затрагивающие другие функциональные участки соединения, и может быть избирательно удалена. Такие кислотные защитные группы хорошо известны специалистам в данной области и широко используются для защиты карбоксильных групп, как описано в патенте США № 3840556 и 3719667, содержание которых включено в данное описание посредством ссылок. В отношении подходящих кислотных защитных групп см., Т.^. Сгееп апб Р.С.М.\Уи15 ш Рто1есйуе Сгоирз т Отдашс Сйет181ту 1ойп \УПеу апб 8оп8, 1991. Кислотная защитная группа также включает описанную в данном описании неустойчивую к гидрированию кислотную защитную группу. Характерные примеры кислотных защитных групп включают сложные эфиры, такие как замещенные и незамещенные СВ8низшие алкиловые эфиры, например метиловый, этиловый, трет-бутиловый, метоксиметиловый, метилтиометиловый, 2,2,2трихлорэтиловый и тому подобное, тетрагидропиранил, замещенный и незамещенный фенилалкил, такой как бензил и его замещенные производные, такие как алкоксибензильная или нитробензильная группы и тому подобное, циннамил, диалкиламиноалкил, например диметиламиноэтил и тому подобное, триметилсилил, замещенные и незамещенные амиды и гидразиды, например амиды и гидразиды Ν,Νдиметиламина, 7-нитроиндола, гидразина, Ν-фенилгидразина и тому подобное, ацилоксиалкильные группы, такие как пивалоилоксиметил или пропионилоксиметил и тому подобное, ароилоксиалкил, такой как бензоилоксиэтил и тому подобное, алкоксикарбонилалкил, такой как метоксикарбонилметил, циклогексилоксикарбонилметил и тому подобное, алкоксикарбонилоксиалкил, такой как третбутилоксикарбонилоксиметил и тому подобное, алкоксикарбониламиноалкил, такой как третбутилоксикарбониламинометил и тому подобное, алкиламинокарбониламиноалкил, такой как метиламинокарбониламинометил и тому подобное, ациламиноалкил, такой как ацетиламинометил и тому подобное, гетероциклилкарбонилоксиалкил, такой как 4-метилпиперазинилкарбонилоксиметил и тому подобное, диалкиламинокарбонилалкил, такой как диметиламинокарбонилметил и тому подобное, (5-(низший алкил)-2-оксо-1,3-диоксолен-4-ил)алкил, такой как (5-трет-бутил-2-оксо-1,3-диоксолен-4-ил)метил и тому подобное, и (5-фенил-2-оксо-1,3-диоксолен-4-ил)алкил, такой как (5-фенил-2-оксо-1,3-диоксолен-4ил)метил и тому подобное.
Неустойчивая к кислоте аминозащитная группа означает указанную аминозащитную группу, которая легко удаляется при обработке кислотой, хотя остается сравнительно стабильной по отношению к другим реагентам. Предпочтительной неустойчивой к кислоте аминозащитной группой является ВОС.
Алифатический означает указанный в данном описании алкил, алкенил или алкинил.
Заместитель (заместители) алифатической группы означает заместители, присоединенные к указанной алифатической группе, включающие арил, гетероарил, гидрокси, алкокси, циклилокси, арилокси, гетероарилокси, ацил или его тиоксо-аналог, циклилкарбонил или его тиоксо-аналог, ароил или его тиоксо-аналог, гетероароил или его тиоксо-аналог, ацилокси, циклилкарбонилокси, ароилокси, гетероароилокси, галоген, нитро, циано, карбокси (кислота), -С(О)-ХНОН, -С(О)-СН2ОН, -С(О)-СН28Н, -С(О)-№НΟΝ, сульфо, фосфоно, алкилсульфонилкарбамоил, тетразолил, арилсульфонилкарбамоил, Ν-метоксикарбамоил, гетероарилсульфонилкарбамоил, 3-гидрокси-3-циклобутен-1,2-дион, 3,5-диоксо-1,2,4-оксадиазолидинил или гидроксигетероарил, такой как 3-гидроксиизоксазолил, 3-гидрокси-1-метилпиразолил, алкоксикарбонил, циклилоксикарбонил, арилоксикарбонил, гетероарилоксикарбонил, алкилсульфонил, циклилсульфонил, арилсульфонил, гетероарилсульфонил, алкилсульфинил, циклилсульфинил, арил- 9 011547 сульфинил, гетероарилсульфинил, алкилтио, циклилтио, арилтио, гетероарилтио, циклил, арилдиазо, гетероарилдиазо, тиол, метилен (Н2С=), оксо (О=), тиоксо (8=), Υ1Υ2Ν-, Υ1Υ2ΝΟ(Θ)-, Υ1Υ2ΝΟ(Θ)Θ-, Υ1Υ2ΝΟ(Θ)ΝΥ3-, Υ1Χ2ΥΝ8Θ2- или Υ38Θ2ΝΥ1-, где Я2 принимает указанные выше значения, Υ1 и Υ2 независимо означают водород, алкил, арил или гетероарил и Υ3 означает алкил, циклоалкиларил или гетероарил, или в случае, когда заместитель означает Υ1Υ2Ν-, один из Υ1 и Υ2 может означать указанные ацил, циклилкарбонил, ароил, гетероароил, алкоксикарбонил, циклилоксикарбонил, арилоксикарбонил или гетероарилоксикарбонил, а другой из Υ1 и Υ2 имеет значения, указанные выше, или в случае, когда заместитель означает Υ1Υ2ΝΟ(Θ)-, Υ1Υ2ΝΟ(Θ)Θ-, Υ1Υ2ΝΟ(Θ)ΝΥ3- или Υ1 Υ2Ν8Θ2-, Υ1 и Υ2 могут вместе с атомом Ν, через который связан каждый из Υ1 и Υ2, образовывать 4-7-членный азагетероциклил или азагетероцикленил. Кислотными/амидными заместителями алифатических групп являются карбокси (кислота), -ί.’(ϋ)-ΝΗΘΗ. -С(О)-СН2ОН, -С(О)-СН28Н, -ί.’(Θ)-ΝΗ-ί.’Ν. сульфо, фосфоно, алкилсульфонилкарбамоил, тетразолил, арилсульфонилкарбамоил, Ν-метоксикарбамоил, гетероарилсульфонилкарбамоил, 3гидрокси-3-циклобутен-1,2-дион, 3,5-диоксо-1,2,4-оксадиазолидинил или гидроксигетероарил, такой как 3-гидроксиизоксазолил, 3-гидрокси-1-метилпиразолил и Υ1Υ2ΝΠΘ-. Некислотными полярными заместителями алифатических групп являются гидрокси, оксо (Θ=), тиоксо (8=), ацил или его тиоксо-аналог, циклилкарбонил или его тиоксо-аналог, ароил или его тиоксо-аналог, гетероароил или его тиоксо-аналог, алкоксикарбонил, циклилоксикарбонил, арилоксикарбонил, гетероарилоксикарбонил, ацилокси, циклилкарбонилокси, ароилокси, гетероароилокси, алкилсульфонил, циклилсульфонил, арилсульфонил, гетероарилсульфонил, алкилсульфинил, циклилсульфини арилсульфинил, гетероарилсульфинил, тиол, Υ1Υ2Ν-, Υ^Ν^Θ)-, υΎ2Ν^Θ)Θ-, ΥΎ2Ν^Θ)ΝΥ3- или υΎ2Ν^2·. Характерные примеры алифатических групп с алифатической группой в качестве заместителя включают метоксиметокси, метоксиэтокси, этоксиэтокси, (метокси, бензилокси, фенокси или этокси)карбонил(метил или этил), бензилоксикарбонил, пиридилметилоксикарбонилметил, метоксиэтил, этоксиметил, н-бутоксиметил, циклопентилметилоксиэтил, феноксипропил, феноксиаллил, трифторметил, циклопропилметил, циклопентилметил, карбокси(метил или этил), 2-фенетенил, бензилокси, 1- или 2-нафтилметокси, 4-пиридилметилокси, бензилоксиэтил, 3-бензилоксиаллил, 4-пиридилметилоксиэтил, 4-пиридилметилоксиаллил, бензил, 2-фенетил, нафтилметил, стирил, 4-фенил-1,3-пентадиенил, фенилпропинил, 3-фенилбут-2-инил, пирид-3илацетиленил и хинолин-3-илацетиленил, 4-пиридилэтинил, 4-пиридилвинил, тиенилэтенил, пиридилэтенил, имидазолилэтенил, пиразинилэтенил, пиридилпентенил, пиридилгексенил и пиридилгептенил, тиенилметил, пиридилметил, имидазолилметил, пиразинилметил, тетрагидропиранилметил, тетрагидропиранилметилоксиметил и тому подобное.
Ацил означает Н-СО- или (алифатическую или циклил)-СО-группу, где алифатическая группа принимает указанные значения. Предпочтительные ацилы содержат низший алкил. Характерные примеры ацильных групп включают формил, ацетил, пропаноил, 2-метилпропаноил, бутаноил, пальмитоил, акрилоил, пропиноил, циклогексилкарбонил и тому подобное.
Алкеноил означает алкенил-СО- группу, где алкенил принимает указанные значения.
Алкенил означает алифатическую углеводородную группу, содержащую углерод-углеродную двойную связь, указанная группа может быть линейной или разветвленной и содержать приблизительно 2-15 атомов углерода в цепи. Предпочтительные алкенильные группы содержат 2-12 атомов углерода в цепи и, более предпочтительно, 2-4 атома углерода в цепи. Разветвленный означает, что одна или более низших алкильных групп, таких как метил, этил или пропил, присоединены к линейной алкенильной цепи. Низший алкенил означает приблизительно 2-4 углеродных атома в цепи, которая может быть линейной или разветвленной. Характерные примеры алкенильных групп включают этенил, пропенил, нбутенил, изобутенил, 3-метилбут-2-енил, н-пентенил, гептенил, октенил, циклогексилбутенил, деценил и тому подобное. Замещенный алкенил означает указанную алкенильную группу, замещенную одним или более заместителями алифатической группы (предпочтительно 1-3), которые могут быть одинаковыми или различными и принимают указанные значения. Примеры заместителей алкенильной алифатической группы включают галоген или циклоалкильные группы.
Алкенилокси означает алкенил-О- группу, где алкенильная группа является такой, как указано выше. Характерные примеры алкенилоксигрупп включают аллилокси, 3-бутенилокси и тому подобное.
Алкокси означает алкил-О- группу, где алкильная группа является такой, как указано выше. Характерные примеры алкоксигрупп включают метокси, этокси, н-пропокси, изопропокси, н-бутокси, гептокси и тому подобное.
Алкоксикарбонил означает алкилЮ-СО- группу, где алкильная группа является такой, как указано выше. Характерные примеры алкоксикарбонильных групп включают метоксикарбонил, этоксикарбонил, трет-бутилоксикарбонил и тому подобное.
Алкил означает алифатическую углеводородную группу, которая может быть линейной или разветвленной и содержит приблизительно 1-20 атомов углерода в цепи. Предпочтительные алкильные группы содержат приблизительно 1-12 атомов углерода в цепи, более предпочтительным является указанный низший алкил. Разветвленный означает, что одна или более низших алкильных групп, таких как метил, этил или пропил, присоединены к линейной алкильной цепи. Низший алкил означает приблизительно 1-4 углеродных атома в цепи, которая может быть линейной или разветвленной. Замещен
- 10 011547 ный алкил означает указанную выше алкенильную группу, замещенную одним или более заместителями алифатической группы (предпочтительно 1-3), которые могут быть одинаковыми или различными и принимают указанные значения.
Алкилсульфинил означает алкил-80- группу, где алкильная группа является такой, как указано выше. Предпочтительными группами являются те группы, в которых алкильная группа означает низший алкил.
Алкилсульфонил означает алкил-802- группу, где алкильная группа является такой, как указано выше. Предпочтительными группами являются те группы, в которых алкильная группа означает низший алкил.
Алкилсульфонилкарбамоил означает алкил-802-ПН-С (=0)- группу, где алкильная группа является такой, как указано выше. Предпочтительными алкилсульфонилкарбамоильными группами являются те группы, в которых алкильная группа означает низший алкил.
Алкилтио означает алкил-8- группу, где алкильная группа является такой, как указано выше. Характерные примеры алкилтиогрупп включают метилтио, этилтио, изопропилтио и гептилтио.
Алкинил означает алифатическую углеводородную группу, содержащую углерод-углеродную тройную связь, указанная группа может быть линейной или разветвленной и содержать приблизительно 2-15 атомов углерода в цепи. Предпочтительные алкинильные группы содержат приблизительно 2-12 атомов углерода в цепи и более предпочтительно 2-4 атома углерода в цепи. Разветвленный означает, что одна или более низших алкильных групп, таких как метил, этил или пропил, присоединены к линейной алкинильной цепи. Низший алкинил означает приблизительно 2-4 углеродных атома в цепи, которая может быть линейной или разветвленной. Алкинильная группа может быть замещена одним или более галогенами. Характерные примеры алкинильных групп включают этинил, пропинил, н-бутинил, 2бутинил, 3-метилбутинил, н-пентинил, гептинил, октинил, децинил и тому подобное. Замещенный алкинил означает указанный выше алкинил, замещенный одним или более заместителями алифатической группы (предпочтительно 1-3), которые могут быть одинаковыми или различными и принимают указанные выше значения.
Аминозащитная группа означает легко удаляемую группу, используемую, как известно в данной области, для защиты азота амино- или амидной группы от нежелательного взаимодействия в ходе синтеза и пригодную для избирательного удаления. Применение амино/амидных защитных групп для защиты групп от нежелательного взаимодействия в ходе синтеза хорошо известно в данной области, и многие такие защитные группы описаны, например, в Т.^. Сгеепе и Р.С.М. ХХиК РгсИссОус Сгоирк ίη 0гдашс 8уШ11С515. 2ηά ебйюп, ίοΐιη \УПеу & 8опк, Ыете Уогк (1991), включенном здесь посредством ссылки. Амино/амидные защитные группы также включают неустойчивую к гидрированию амино/амидную защитную группу. Характерными примерами амино/амидных защитных групп являются ацил, включая формил, ацетил, хлорацетил, трихлорацетил, о-нитрофенилацетил, о-нитрофеноксиацетил, трифторацетил, ацетоацетил, 4-хлорбутирил, изобутирил, о-нитроциннамоил, пиколиноил, ацилизотиоцианат, аминокапроил, бензоил и тому подобное, и ацилокси, включая метоксикарбонил, 9-флуоренилметоксикарбонил, 2,2,2-трифторэтоксикарбонил, 2-триметилсилилэтоксикарбонил, винилоксикарбонил, аллилоксикарбонил, трет-бутилоксикарбонил (ВОС), 1,1-диметилпропинилоксикарбонил, бензилоксикарбонил (ΟΒΖ), пнитробензилоксикарбонил, 2,4-дихлорбензилоксикарбонил и тому подобное.
Амидная защитная группа означает легко удаляемую группу, используемую, как известно в данной области, для защиты азота амидной группы от нежелательного взаимодействия в ходе синтеза и пригодную для избирательного удаления после превращения в амин. Применение амидных защитных групп для защиты групп от нежелательного взаимодействия в ходе синтеза хорошо известно, и многие такие защитные группы описаны, например, в Т.^. Сгеепе и Р.С.М. ХХиК Рго1сс11ус Сгоирк ίη 0гдашс 8уп1йе518, 2ηά ебйюп, ЛоПп \УПеу & 8опк, Ыете Уогк (1991), включенном в данное описание в качестве ссылки. Амидная защитная группа также включает неустойчивую к кислотам амидную защитную группу и неустойчивую к гидрированию амидную защитную группу. Характерные примерами амидных защитных групп являются о-нитроциннамоил, пиколиноил, аминокапроил, бензоил и тому подобное, и ацилокси, включая метоксикарбонил, 9-флуоренилметоксикарбонил, 2,2,2-трифторэтоксикарбонил, 2триметилсилилэтоксикарбонил, винилоксикарбонил, аллилоксикарбонил, трет-бутилоксикарбонил (ВОС), 1,1-диметилпропинилоксикарбонил, бензилоксикарбонил (ΟΒΖ), п-нитробензилоксикарбонил, 2,4-дихлорбензилоксикарбонил и тому подобное.
Аминокислота означает аминокислоту, выбранную из группы, включающей указанные природные и неприродные аминокислоты. Подразумевается также, что аминокислота включает аминокислоты с Ь или Ό стереохимией по α-углероду. Предпочтительными аминокислотами являются аминокислоты, имеющие α-аминогруппу. Аминокислоты могут быть нейтральными, положительно заряженными или отрицательно заряженными в зависимости от заместителей в боковой цепи. Нейтральная аминокислота означает аминокислоту, содержащую незаряженные заместители боковой цепи. Характерные примеры нейтральных аминокислот включают аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, триптофан, метионин, глицин, серии, треонин и цистеин. Положительная аминокислота означает аминокисло
- 11 011547 ту, содержащую заместители боковой цепи, положительно заряженные при физиологическом рН. Характерные примеры положительных аминокислот включают лизин, аргинин и гистидин. Отрицательная аминокислота означает аминокислоту, содержащую заместители боковой цепи, несущие отрицательный заряд при физиологическом рН. Характерные примеры отрицательных аминокислот включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Предпочтительными аминокислотами являются αаминокислоты. Характерными примерами природных аминокислот являются изолейцин, пролин, фенилаланин, триптофан, метионин, глицин, серии, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин, глутамин, лизин, аргинин, гистидин, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота. Неприродная аминокислота означает аминокислоту, для которой отсутствует кодон нуклеиновой кислоты. Характерные примеры неприродных аминокислот включают, например, Ό-изомеры указанных выше природных α-аминокислот; Л1Ь (аминомасляную кислоту), β-ЛФ (3-аминоизомасляную кислоту), Ννα (норвалин), β-Α1α, Лаб (2аминоадипиновую кислоту), β-Лаб (3-аминоадипиновую кислоту), ЛЬи (2-аминомасляную кислоту), ОаЬа (γ-аминомасляную кислоту), Аср (6-аминокапроновую кислоту), ЭЬи (2,4-диаминомасляную кислоту), α-аминопимелиновую кислоту, ТМ8Л (триметилсилил-Л1а), а11е (аллоизолейцин), Ν1ο (норлейцин), трет-Ьеи, СИ (цитрулин), Огп, Эрт (2,2'-диаминопимелиновую кислоту), Ирг (2,3-диаминопропионовую кислоту), α- или в^а1, С1а (циклогексил-Л1а), гидроксипролин, 8аг (саркозин) и тому подобное; циклические аминокислоты; №-алкилированные аминокислоты, такие как МеО1у (№-метилглицин), Е(С1у (№этилглицин) и Е1Л8П (№-этиласпарагин); и аминокислоты, в которых α-углерод несет два заместителя боковой цепи. Используемые в данном описании названия природных и неприродных аминокислот и их остатков соответствуют общепринятым названиям, рекомендуемым комитетом ИЮПАК по номенклатуре в органической химии и комитетом ИЮПАК-ИЮБ по биохимической номенклатуре, приведенным в №тепс1аи.1ге οί α -Лтшо Лс1б§ (Весоттепбабопк, 1974) Вюсйеткйу, 14(2), (1975). Это сделано с целью внесения определенности и отсутствия разночтений в отношении названий и аббревиатуры аминокислот и их остатков, используемых в данном описании и приложенных пунктах формулы изобретения.
Аминокислотная защитная группа означает группу, которая защищает кислотную или аминогруппу аминокислоты или другую реакционноспособную группу в боковой цепи аминокислоты, например гидрокси или тиол. В отношении примеров соответственно защищенных производных боковых цепей аминокислот, см., Т.^. Огееп апб Р.О.М. \Уи15 ίη Рго1есйуе С1гоир§ ίη Огдашс СйеткИу 1о1т \УПеу и 8оп§, 1991. Защитные группы для кислотной группы аминокислоты описаны, например, в разделах кислотная функциональная группа и неустойчивая к гидрированию кислотная защитная группа. Защитные группы для аминогруппы аминокислоты описаны, например, в разделах аминозащитная группа, неустойчивая к кислотам аминозащитная группа и неустойчивая к гидрированию аминозащитная группа.
Аминокислотный остаток означает отдельные аминокислотные структурные единицы, включенные в соединение по изобретению.
Аминокислотная боковая цепь означает заместитель, находящийся на углероде между амино- и карбоксигруппами в α-аминокислотах. Характерные примеры аминокислотных боковых цепей включают изопропил, метил и карбоксиметил для валина, аланина и аспарагиновой кислоты, соответственно.
Аминокислотный эквивалент означает аминокислоту, которая может быть замещена на другую аминокислоту в пептидах по изобретению без какой-либо утраты функции. Для выполнения таких замен осуществляют замещение подобных аминокислот на основе относительного подобия заместителей боковых цепей, например, в отношении размера, заряда, гидрофильности, гидропатичности и гидрофобности, как указано выше.
Ароматическая группа означает арил или гетероарил. Характерные примеры ароматических групп включают фенил, галогензамещенный фенил, азагетероарил и тому подобное.
Ароил означает арил-СО-группу, где арильная группа принимает указанные значения. Характерные примеры ароильных групп включают бензоил, 1- и 2-нафтоил и тому подобное.
Арил означает ароматическую моноциклическую или полициклическую кольцевую систему приблизительно из 6-14 атомов углерода, предпочтительно, 6-10 атомов углерода. Понятие арил охватывает указанные конденсированный арилциклоалкенил, конденсированный арилциклоалкил, конденсированный арилгетероцикленил и конденсированный арилгетероциклил, присоединенные через их арильную группу. Арил является необязательно замещенным одним или более заместителями кольцевой группы, которые могут быть одинаковыми или различными и принимают указанные значения. Характерные примеры арильных групп включают фенил или нафтил, или замещенный фенил, или замещенный нафтил. Замещенный арил означает указанную выше арильную группу, замещенную одним или более заместителями циклической группы (предпочтительно 1-3), которые могут быть одинаковыми или различными и принимают указанные выше значения.
Арилдиазо означает арилдиазогруппу, где арильная и диазогруппы принимают указанные выше значения.
Арилен означает необязательно замещенную 1,2-, 1,3-, 1,4-двухвалентную арильную группу, где арильная группа принимает указанные выше значения. Характерные примеры ариленовых групп вклю
- 12 011547 чают необязательно замещенный фенилен, нафтилен и инданилен. Заслуживающим особого внимания ариленом является необязательно замещенный фенилен. Замещенный арилен означает указанную выше ариленовую группу, замещенную одним или более заместителями циклической группы (предпочтительно 1-3), которые могут быть одинаковыми или различными и принимают указанные выше значения.
Арилокси означает арил-О-группу, где арильная группа принимает указанные выше значения. Характерные примеры арилоксигрупп включают фенокси и 2-нафтилокси.
Арилоксикарбонил означает арил-О-СО-группу, где арильная группа принимает указанные выше значения. Характерные примеры арилоксикарбонильных групп включают феноксикарбонил и нафтоксикарбонил.
Арилсульфонил означает арил-8О2-группу, где арильная группа принимает указанные выше значения.
Арилсульфонилкарбамоил означает арил-8О2-МН-С(=О)-группу, где арильная группа принимает указанные выше значения. Характерным примером арилсульфонилкарбамоильной группы является фенилсульфонилкарбамоил.
Арилсульфинил означает арил-8О-группу, где арильная группа принимает указанные выше значения.
Арилтио означает арил-8-группу, где арильная группа принимает указанные выше значения. Характерные арилтиогруппы включают фенилтио и нафтилтио.
Основной атом азота означает §р2 или §р3 гибридизированный атом азота, имеющий несвязанную пару электронов, которая может быть протонирована. Характерные примеры основного атома азота включают необязательно замещенную имино, необязательно замещенную амино и необязательно замещенную амидиногруппы.
Карбокси означает НО(О)С-группу (карбоновой кислоты).
Связующий агент означает соединение, которое реагирует с гидроксильной группой карбоксильной группы, тем самым, делая ее восприимчивой к нуклеофильной атаке. Характерные примеры связующих агентов включают О1С. ЕЭС1. ОСС и тому подобное.
Циклоалкенил означает неароматическую моно- или полициклическую кольцевую систему приблизительно из 3-10 атомов углерода, предпочтительно 5-10 атомов углерода, которая содержит по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь. Понятие циклоалкенил охватывает указанный конденсированный арилциклоалкенил и конденсированный гетероарилциклоалкенил, когда связь осуществляется через циклоалкенильную группу. Предпочтительные размеры колец для кольцевой системы составляют приблизительно 5-6 атомов в кольце; и такие предпочтительные размеры колец называют также низшими. Замещенный циклоалкенил означает указанную выше циклоалкенильную группу, замещенную одним или более заместителями кольцевой группы (предпочтительно 1-3), которые могут быть одинаковыми или различными и принимают указанные выше значения. Характерные примеры моноциклического циклоалкенила включают циклопентенил, циклогексенил, циклогептенил и тому подобное. Характерным примером полициклического циклоалкенила является норборниленил.
Циклоалкил означает неароматическую моно- или полициклическую кольцевую систему приблизительно из 3-10 атомов углерода, предпочтительно 5-10 атомов углерода. Предпочтительные размеры колец для кольцевой системы составляют приблизительно 5-6 атомов в кольце; и такие предпочтительные размеры колец называют также низшими. Понятие циклоалкил охватывает указанный выше конденсированный арилциклоалкил и конденсированный гетероарилциклоалкил, когда связь осуществляется через циклоалкенильную группу. Замещенный циклоалкил означает указанную выше циклоалкильную группу, замещенную одним или более заместителями кольцевой группы (предпочтительно 1-3), которые могут быть одинаковыми или различными и принимают указанные выше значения. Характерные примеры моноциклического циклоалкила включают циклопентил, циклогексил, циклогептил и тому подобное. Характерные примеры полициклического циклоалкила включают 1-декалин, норборнил, адамант-(1- или 2-)ил и тому подобное.
Циклоалкилен означает двухвалентную указанную выше циклоалкильную группу, имеющую приблизительно 4-8 атомов углерода. Предпочтительные размеры колец для циклоалкилена составляют приблизительно 5-6 атомов в кольце; и такие предпочтительные размеры колец называют также низшими. Точки связывания по циклоалкенильной группе включают 1,1-, 1,2-, 1,3-или 1,4- схемы связывания, где подходящая стереохимическая взаимосвязь точек связывания представляет собой либо цис-, либо транс-конфигурации. Характерные примеры циклоалкиленовых групп включают (1,1-, 1,2- или 1,3-)циклогексилен и (1,1- или 1,2-)циклопентилен. Замещенный циклоалкилен означает указанную выше циклоалкиленовую группу, замещенную одним или более заместителями кольцевой группы (предпочтительно 1-3), которые могут быть одинаковыми или различными и принимают указанные выше значения.
Циклический или циклил означает указанный циклоалкил, циклоалкенил, гетероциклил или гетероцикленил. Термин низший, используемый в сочетании с термином циклический, имеет то же значение в отношении циклоалкила, циклоалкенила, гетероциклила или гетероцикленила.
Циклилокси означает циклил-О-группу, где циклильная группа является такой, как указано выше. Характерные примеры циклоалкоксигрупп включают циклопентилокси, циклогексилокси, хинуклиди
- 13 011547 локси, пентаметиленсульфидокси, тетрагидропиранилокси, тетрагидротиофенилокси, пирролидинилокси, тетрагидрофуранилокси или 7-оксабицикло[2,2,1]гептанилокси, гидрокситетрагидропиранилокси, гидрокси-7-оксабицикло[2,2,1]гептанилокси и тому подобное.
Циклилсульфинил означает циклил-8(О)-группу, где циклильная группа является такой, как указано выше.
Циклилсульфонил означает циклил-8(О)2-группу, где циклильная группа является такой, как указано выше.
Циклилтио означает циклил-8-группу, где циклильная группа является такой, как указано выше. Диазо означает двухвалентную -Ν=Ν- группу.
Замещаемая группа означает группу, которая, когда связана с указанным Ь, становится способной к замещению под действием нуклеофильной атаки моно- или дизамещенной аминогруппы в присутствии или в отсутствии агента, облегчающего указанную атаку, например связующего агента. Характерные примеры замещаемых групп включают гидрокси, алифатическую оксигруппу, галоген, Νоксисукцинимид, ацилокси и тому подобное.
Эффективное количество означает количество соединения/композиции по данному изобретение, эффективное для получения требуемого терапевтического действия.
Конденсированный арилциклоалкенил означает конденсированные указанные выше арил и циклоалкенил. Предпочтительными конденсированными арилциклоалкенилами являются те, в которых арил означает фенил, а циклоалкенил содержит приблизительно 5-6 атомов в кольце. Конденсированный арилциклоалкенил, как неустойчивый, может быть связан через любой способный к этому атом кольцевой системы. Замещенный конденсированный арилциклоалкенил означает указанную выше конденсированную арилциклоалкенильную группу, замещенную одним или более заместителями кольцевой группы (предпочтительно 1-3), которые могут быть одинаковыми или различными и принимают указанные выше значения. Характерные примеры конденсированного арилциклоалкенила включают 1,2дигидронафтилен, инден и тому подобное.
Конденсированный арилциклоалкил означает конденсированные указанные выше арил и циклоалкил. Предпочтительными конденсированными арилциклоалкилами являются те, в которых арил означает фенил, а циклоалкил содержит приблизительно 5-6 атомов в кольце. Конденсированный арилциклоалкил, как неустойчивый, может быть связан через любой способный к этому атом кольцевой системы. Замещенный конденсированный арилциклоалкил означает указанную выше конденсированную арилциклоалкильную группу, замещенную одним или более заместителями кольцевой группы (предпочтительно 1-3), которые могут быть одинаковыми или различными и принимают указанные выше значения. Характерные примеры конденсированного арилциклоалкила включают 1,2,3,4-тетрагидронафтилен и тому подобное.
Конденсированный арилгетероцикленил означает конденсированные указанные выше арил и гетероцикленил. Предпочтительными конденсированными арилгетероцикленилами являются те, в которых арил означает фенил, а гетероцикленил содержит приблизительно 5-6 атомов в кольце. Конденсированный арилгетероцикленил, как неустойчивый, может быть связан через любой способный к этому атом кольцевой системы. Использование аза-, окса- или тиа- в качестве приставки перед гетероцикленильной частью конденсированного арилгетероцикленила означает, что, по меньшей мере, атом азота, кислорода или серы, соответственно, присутствует в качестве входящего в кольцо атома. Замещенный конденсированный арилгетероцикленил означает указанную выше конденсированную арилгетероцикленильную группу, замещенную одним или более заместителями кольцевой группы (предпочтительно 1-3), которые могут быть одинаковыми или различными и принимают указанные выше значения. Атом азота конденсированного арилгетероцикленила может быть основным атомом азота. Атом азота или серы гетероцикленильной части конденсированного арилгетероцикленила может быть также, необязательно, окислен до соответствующего Ν-оксида, 8-оксида или 8,8-диоксида. Характерные примеры конденсированного арилгетероцикленила включают ЗН-индолинил, 1Н-2-оксохинолил, 2Н-1-оксоизохинолил, 1,2дигидрохинолинил, 3,4-дигидрохинолинил, 1,2-дигидроизохинолинил, 3,4-дигидроизохинолинил и тому подобное.
Конденсированный арилгетероциклил означает конденсированные указанные выше арил и гетероциклил. Предпочтительными конденсированными арилгетероциклилами являются те, в которых арил означает фенил, а гетероциклил содержит приблизительно 5-6 атомов в кольце. Конденсированный арилгетероциклил, как неустойчивый, может быть связан через любой способный к этому атом кольцевой системы. Использование аза-, окса- или тиа- в качестве приставки перед гетероциклильной частью конденсированного арилгетероциклила означает, что, по меньшей мере, атом азота, кислорода или серы, соответственно, присутствует в качестве входящего в кольцо атома. Замещенный конденсированный арилгетероциклил означает указанную выше конденсированную арилгетероциклильную группу, замещенную одним или более заместителями кольцевой группы (предпочтительно 1-3), которые могут быть одинаковыми или различными и принимают указанные выше значения. Атом азота конденсированного арилгетероциклила может быть основным атомом азота. Атом азота или серы гетероциклильной части конденсированного арилгетероциклила может быть также, необязательно, окислен до соответст
- 14 011547 вующего Ν-оксида, 8-оксида или 8,8-диоксида.
Характерные примеры конденсированных арилгетероциклильных кольцевых систем включают индолинил, 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин, 1,2,3,4-тетрагидрохинолин, 1Н-2,3-дигидроизоиндол-2-ил, 2,3дигидробенз[1]изоиндол-2-ил, 1,2,3,4-тетрагидробенз[д]изохинолин-2-ил и тому подобное.
Конденсированный гетероарилциклоалкенил означает конденсированные указанные выше гетероарил и циклоалкенил. Предпочтительными конденсированными гетероарилциклоалкенилами являются те, в которых гетероарил означает фенил, а циклоалкенил содержит приблизительно 5-6 атомов в кольце. Конденсированный гетероарилциклоалкенил, как неустойчивый, может быть связан через любой способный к этому атом кольцевой системы. Использование аза-, окса- или тиа- в качестве приставки перед гетероарильной частью конденсированного гетероарилциклоалкенила означает, что, по меньшей мере, атом азота, кислорода или серы, соответственно, присутствует в качестве входящего в кольцо атома. Замещенный конденсированный гетероарилциклоалкенил означает конденсированную гетероарилциклоалкенильную группу, замещенную одним или более заместителями кольцевой группы (предпочтительно 1-3), которые могут быть одинаковыми или различными и принимают указанные выше значения. Атом азота конденсированного гетероарилциклоалкенила может быть основным атомом азота. Атом азота гетероарильной части конденсированного гетероарилциклоалкенила может быть также, необязательно, окислен до соответствующего Ν-оксида. Характерные примеры конденсированного гетероарилциклоалкенила включают 5,6-дигидрохинолил, 5,6-дигидроизохинолил, 5,6-дигидрохиноксалинил, 5,6дигидрохиназолинил, 4,5-дигидро-1Н-бензимидазолил, 4,5-дигидробензоксазолил и тому подобное.
Конденсированный гетероарилциклоалкил означает конденсированные указанные выше гетероарил и циклоалкил. Предпочтительными конденсированными гетероарилциклоалкилами являются те, в которых гетероарил содержит приблизительно 5-6 атомов в кольце и циклоалкил содержит приблизительно 5-6 атомов в кольце. Конденсированный гетероарилциклоалкил, как неустойчивый, может быть связан через любой способный к этому атом кольцевой системы. Использование аза-, окса- или тиа- в качестве приставки перед гетероарильной частью конденсированного гетероарилциклоалкила означает, что, по меньшей мере, атом азота, кислорода или серы, соответственно, присутствует в качестве входящего в кольцо атома. Замещенный конденсированный гетероарилциклоалкил означает указанную выше конденсированную гетероарилциклоалкильную группу, замещенную одним или более заместителями кольцевой группы (предпочтительно 1-3), которые могут быть одинаковыми или различными и принимают указанные выше значения. Атом азота конденсированного гетероарилциклоалкила может быть основным атомом азота. Атом азота гетероарильной части конденсированного гетероарилциклоалкила может быть также, необязательно, окислен до соответствующего Ν-оксида. Характерные примеры конденсированного гетероарилциклоалкила включают 5,6,7,8-тетрагидрохинолинил, 5,6,7,8-тетрагидроизохинолил, 5,6,7,8-тетрагидрохиноксалинил, 5,6,7,8-тетрагидрохиназолил, 4,5,6,7-тетрагидро-1Н-бензимидазолил, 4,5,6,7-тетрагидробензоксазолил, 1Н-4-окса-1,5-диазанафталин-2-онил, 1,3-дигидроимидизол [4,5]пиридин-2-онил и тому подобное.
Конденсированный гетероарилгетероцикленил означает конденсированные указанные выше гетероарил и гетероцикленил. Предпочтительными конденсированными гетероарилгетероцикленилами являются те, в которых гетероарил содержит приблизительно 5-6 атомов в кольце и гетероцикленил содержит приблизительно 5-6 атомов в кольце. Конденсированный гетероарилгетероцикленил, как неустойчивый, может быть связан через любой способный к этому атом кольцевой системы. Использование аза-, окса- или тиа- в качестве приставки перед гетероарильной или гетероцикленильной частью конденсированного гетероарилгетероцикленила означает, что, по меньшей мере, атом азота, кислорода или серы, соответственно, присутствует в качестве входящего в кольцо атома. Замещенный конденсированный гетероарилгетероцикленил означает указанную выше конденсированную гетероарилгетероцикленильную группу, замещенную одним или более заместителями кольцевой группы (предпочтительно 1-3), которые могут быть одинаковыми или различными и принимают указанные выше значения. Атом азота конденсированного гетероарилазагетероцикленила может быть основным атомом азота. Атом азота или серы гетероарильной части конденсированного гетероарилгетероцикленила может быть также, необязательно, окислен до соответствующего Ν-оксида. Атом азота или серы гетероарильной или гетероцикленильной части конденсированного гетероарилгетероцикленила может быть также, необязательно, окислен до соответствующего Ν-оксида, 8-оксида или 8,8-диоксида. Характерные примеры конденсированного гетероарилгетероцикленила включают 7,8-дигидро[1,7]нафтиридинил, 1,2-дигидро[2,7]нафтиридинил, 6,7-дигидро-3Н-имидазо[4,5-с]пиридил, 1,2-дигидро-1,5-нафтиридинил, 1,2-дигидро-1,6-нафтиридинил, 1,2-дигидро-1,7-нафтиридинил, 1,2-дигидро-1,8-нафтиридинил, 1,2-дигидро-2,6-нафтиридинил и тому подобное.
Конденсированный гетероарилгетероциклил означает конденсированные указанные выше гетероарил и гетероциклил. Предпочтительными конденсированными гетероарилгетероциклилами являются те, в которых гетероарил содержит приблизительно 5-6 атомов в кольце и гетероциклил содержит приблизительно 5-6 атомов в кольце. Конденсированный гетероарилгетероциклил, как неустойчивый, может быть связан через любой способный к этому атом циклической системы. Использование аза-, окса- или тиа- в качестве приставки перед гетероарильной или гетероциклильной частью конденсированного гете- 15 011547 роарилгетероциклила означает, что, по меньшей мере, атом азота, кислорода или серы, соответственно, присутствует в качестве входящего в кольцо атома. Замещенный конденсированный гетероарилгетероциклил означает указанную выше конденсированную гетероарилгетероциклильную группу, замещенную одним или более заместителями кольцевой группы (предпочтительно 1-3), которые могут быть одинаковыми или различными и принимают указанные выше значения. Атом азота конденсированного гетероарилгетероциклила может быть основным атомом азота. Атом азота гетероарильной части конденсированного гетероарилгетероциклила может быть также, необязательно, окислен до соответствующего Ν-оксида. Атом азота или серы гетероарильной или гетероциклильной части конденсированного гетероарилгетероциклила может быть также, необязательно, окислен до соответствующего Ν-оксида, 8оксида или 8,8-диоксида. Характерные примеры конденсированного гетероарилгетероциклила включают 2,3-дигидро-1Н-пиррол[3,4-Ь]хинолин-2-ил, 1,2,3,4-тетрагидробенз[Ь][1,7]нафтиридин-2-ил, 1,2,3,4тетрагидробенз[Ь][1,6]нафтиридин-2-ил, 1,2,3,4-тетрагидро-9Н-пиридо[3,4-Ь]индол-2-ил, 1,2,3,4-тетрагидро-9Н-пиридо[4,3-Ь]индол-2-ил, 2,3-дигидро-1Н-пирроло[3,4-Ь]индол-2-ил, 1Н-2,3,4,5-тетрагидроазепино[3,4-Ь]индол-2-ил, 1Н-2,3,4,5-тетрагидроазепино[4,3-Ь]индол-3-ил, 1Н-2,3,4,5-тетрагидроазепино [4,5-Ь]индол-2-ил, 5,6,7,8-тетрагидро[1,7]нафтиридил, 1,2,3,4-тетрагидро[2,7]нафтиридил, 2,3-дигидро [1,4]диоксино[2,3-Ь]пиридил, 2,3-дигидро[1,4]диоксино[2,3-Ь]пиридил, 3,4-дигидро-2Н-1-окса[4,6]диазанафталинил, 4,5,6,7-тетрагидро-3Н-имидазо[4,5-с]пиридил, 6,7-дигидро[5,8]диазанафталинил, 1,2,3,4тетрагидро [1,5]нафтиридинил, 1,2,3,4-тетрагидро [1,6]нафтиридинил, 1,2,3,4-тетрагидро [1,7]нафтиридинил, 1,2,3,4-тетрагидро[1,8]нафтиридинил, 1,2,3,4-тетрагидро[2,6]нафтиридинил и тому подобное.
Галоген означает фтор, хлор, бром или иод. Предпочтительными являются фтор, хлор или бром, и более желательны фтор или хлор.
Гетероароил означает гетербарил-СО- группу, где гетероарильная группа принимает указанные выше значения. Характерные примеры гетероароильных групп включают тиофеноил, никотиноил, пиррол-2-илкарбонил, 1- и 2-нафтоил, пиридиноил и тому подобное.
Гетероарил означает ароматическую моноциклическую или полициклическую кольцевую систему из приблизительно 5-14 атомов углерода, предпочтительно 5-10 атомов углерода, где один или более атомов углерода в кольцевой системе заменены гетероэлементом (элементами), отличными от углерода, например азотом, кислородом или серой. Предпочтительно кольцевая система включает 1-3 гетероатома. Предпочтительные размеры колец кольцевой системы соответствуют приблизительно 5-6 атомам в кольце. Термин гетероарил охватывает указанные выше конденсированный гетероарилциклоалкенил, конденсированный гетероарилциклоалкил, конденсированный гетероарилгетероцикленил и конденсированный гетероарилгетероциклил, когда связь осуществляется через гетероарильную группу. Замещенный гетероарил означает указанную выше гетероарильную группу, замещенную одним или более заместителями кольцевой группы (предпочтительно 1-3), которые могут быть одинаковыми или различными и принимают указанные выше значения. Использование аза-, окса- или тиа- в качестве приставки перед гетероарилом означает, что, по меньшей мере, атом азота, кислорода или серы, соответственно, присутствует в качестве входящего в кольцо атома. Атом азота гетероарила может быть основным атомом азота, и может быть также, необязательно, окислен до соответствующего Ν-оксида. Характерные примеры гетероарильной и замещенной гетероарильной групп включают пиразинил, тиенил, изотиазолил, оксазолил, пиразолил, фуразанил, пирролил, 1,2,4-тиадиазолил, пиридазинил, хиноксалинил, фталазинил, имидазо[1,2-а]пиридин, имидазо [2,1-Ь]тиазолил, бензофуразанил, азаиндолил, бензимидазолил, бензотиенил, тиенопиридил, тиенопиримидил, пирролопиридил, имидазопиридил, бензоазаиндолил, 1,2,4-триазинил, бензотиазолил, фуранил, имидазолил, индолил, индолизинил, изоксазолил, изохинолинил, изотиазолил, оксадиазолил, пиразинил, пиридазинил, пиразолил, пиридил, пиримидинил, пирролил, хиназолинил, хинолинил, 1,3,4-тиадиазолил, тиазолил, тиенил, триазолил и тому подобное. Предпочтительной гетероарильной группой является пиразинил.
Гетероарилазо означает гетероарилазогруппу, где гетероарил и азогруппы принимают указанные значения.
Гетероарилдиил означает двухвалентную группу, полученную из гетероарила, где гетероарил принимает указанные значения. Характерным примером гетероарилдиильной группы является необязательно замещенный пиридиндиил.
Гетероарилсульфонилкарбамоил означает гетероарил-8О2-МН-С(=О)-группу, где гетероарильная группа принимает указанные значения.
Гетероцикленил означает неароматическую моноциклическую или полициклическую систему углеводородных колец из, приблизительно 3-10 атомов углерода, предпочтительно 5-10 атомов углерода, где один или более атомов углерода в кольцевой системе заменен гетероэлементом (элементами), отличными от углерода, например азотом, кислородом или серой, и которая содержит, по меньшей мере, одну углерод-углеродную двойную связь или углерод-азотную двойную связь. Предпочтительно кольцо включает 1-3 гетероатома. Предпочтительные размеры колец кольцевой системы соответствуют приблизительно 5-6 атомам в кольце, и такие предпочтительные размеры колец называются также низшими. Термин гетероцикленил охватывает указанные выше конденсированный арилгетероцикленил и конденсированный гетероарилгетероцикленил, когда связь осуществляется через гетероцикленильную группу.
- 16 011547
Использование аза-, окса- или тиа- в качестве приставки перед гетероцикленилом означает, что, по меньшей мере, атом азота, кислорода или серы, соответственно, присутствует в качестве входящего в кольцо атома. Замещенный гетероцикленил означает указанную выше гетероцикленильную группу, замещенную одним или более заместителями кольцевой группы (предпочтительно 1-3), которые могут быть одинаковыми или различными и принимают указанные выше значения. Атом азота гетероцикленила может быть основным атомом азота. Атом азота или серы гетероцикленила может быть также, необязательно, окислен до соответствующего Ν-оксида, 8-оксида или 8,8-диоксида. Характерные примеры азагетероцикленильных групп включают 1,2,3,4-тетрагидропиридин, 1,2-дигидропиридил, 1,4дигидропиридил, 1,2,3,6-тетрагидропиридин, 1,4,5,6-тетрагидропиримидин, 2-пирролинил, 3пирролинил, 2-имидазолинил, 2-пиразолинил и тому подобное. Характерные примеры оксагетероцикленильных групп включают 3,4-дигидро-2Н-пиран, дигидрофуранил и фтордигидрофуранил. Характерным примером полициклической оксагетероцикленильной группы является 7-оксабицикло[2,2,1]гептенил. Характерные примеры моноциклических тиагетероцикленильных групп включают дигидротиофенил и дигидротиопиранил.
Гетероциклил означает неароматическую насыщенную моноциклическую или полициклическую кольцевую систему приблизительно из 3-10 атомов углерода, предпочтительно 5-10 атомов углерода, где один или более атомов углерода в кольцевой системе заменены гетероэлементом (элементами), отличными от углерода, например азотом, кислородом или серой. Предпочтительно кольцевая система включает 1-3 гетероатома. Предпочтительные размеры колец кольцевой системы соответствуют приблизительно 5-6 атомам в кольце; и такие предпочтительные размеры колец называются также низшими. Термин гетероциклил охватывает указанные выше конденсированный гетероциклил и конденсированный гетероарилгетероциклил, когда связь осуществляется через гетероциклильную группу. Использование аза-, окса- или тиа- в качестве приставки перед гетероциклилом означает, что, по меньшей мере, атом азота, кислорода или серы, соответственно, присутствует в качестве входящего в кольцо атома. Замещенный гетероциклил означает указанную выше гетероциклильную группу, замещенную одним или более заместителями кольцевой группы (предпочтительно 1-3), которые могут быть одинаковыми или различными и принимают указанные выше значения. Атом азота гетероциклила может быть основным атомом азота. Атом азота или серы гетероциклила может быть также, необязательно, окислен до соответствующего Ν-оксида, 8-оксида или 8,8-диоксида. Характерные примеры моноциклических гетероциклильных колец включают пиперидил, пирролидинил, пиперазинил, морфолинил, тиоморфолинил, тиазолидинил, 1,3-диоксоланил, 1,4-диоксанил, тетрагидрофуранил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиопиранил и тому подобное.
о . .
4—как замещенный моноциклический азагетероциклил замещен непосредственно или через связующую группу по меньшей мере одним заместителем, который означает, или включает, или замещен, указанной выше ароматической группой; например, такой как арил, гетероарил, арилокси, гетероарилокси, ароил или его тиоксо-аналог, гетероароил или его тиоксо-аналог, ароилокси, гетероароилокси, арилоксикарбонил, гетероарилоксикарбонил, арилсульфонил, гетероарилсульфонил, арилсульфинил, гетероарилсульфинил, арилтио, гетероарилтио, арилдиазо, гетероарилдиазо, Υ'Υ2Ν-. У'У2Ж.’(О)-. ΥΧΝίΧΟ)-. Υ1 Υ2Νί.’(Ο)ΝΥ3’- или Υ1Υ2Ν8Ο2-, по меньшей мере один из Υ1 и Υ2 означает, включает или замещен арильной или гетероарильной группой. Предпочтительные связующие группы включают -С(О), -ОС(О)-, низший алкил, низший алкокси, низший алкенил, -О-, -8-, -С(О)С(О)-, -8(О)-, -8(Ο)2-, -ΝΚ80-, где В80 означает водород, алкил, циклоалкил, арил, аралкил, гетероциклил или гетероарил. В особенности предпочтительными мостиковыми группами являются -С(О)- и -ОС(О)-. Замещенный полициклический азагетероциклил означает указанную выше полициклическую азагетероциклильную группу, замещенную одним или более заместителями кольцевой группы (предпочтительно 1-3), которые могут быть одинаковыми или различными и принимают указанные выше значения. Замещенный полициклический азагетероцикленил означает указанную выше полициклическую азагетероцикленильную группу, замещенную одним или более заместителями кольцевой группы (предпочтительно 1-3), которые могут быть одинаковыми или различными и принимают указанные выше значения.
Гетероциклилен означает двухвалентную указанную выше гетероциклильную группу приблизительно из 4-8 атомов углерода. Предпочтительные размеры колец гетероциклилена соответствуют приблизительно 5-6 атомам в кольце; и такие предпочтительные размеры колец называются также как низшие. Точки связывания по циклоалкиленовой группе включают 1,1-, 1,2-, 1,3- или 1,4-примеры связывания, где подходящая стереохимическая взаимосвязь точек связывания представляет собой либо цис, либо транс конфигурации. Характерные примеры гетероциклиленовых групп включают (1,1-, 1,2- или 1,3)пиперидинилен и (1,1- или 1,2-)тетрагидрофуранилен. Замещенный гетероциклилен означает указанную выше гетероциклиленовую группу, замещенную одним или более заместителями кольцевой группы (предпочтительно 1-3), которые могут быть одинаковыми или различными и принимают указанные выше значения.
Гидрат означает сольват, где молекулой (молекулами) растворителя является Н2О.
- 17 011547
Неустойчивая к гидрированию аминозащитная группа означает указанную выше аминозащитную группу, которая легко удаляется гидрированием, тогда как сравнительно устойчива к другим реагентам. Предпочтительной неустойчивой к гидрированию аминозащитной группой является СЬх.
Неустойчивая к гидрированию кислотная защитная группа означает указанную выше кислотную защитную группу, которая легко удаляется гидрированием, тогда как сравнительно устойчива к другим реагентам. Предпочтительной неустойчивой к гидрированию кислотной защитной группой является бен зил.
Гигроскопичность означает сорбцию, выражаемую в количестве поглощенной или удерживаемой воды, достаточном для влияния на физические и химические свойства вещества (Εάδ. 1. ЕлгагЬпск аиб ГС. Воу1ап, Епсус1оре61а οί РйагтасеиИса1 Тесйпо1оду, 10, 33).
Иминное производное глицинимида означает иминное основание Шиффа на основе глицина, используемое в синтезе α-аминокислот, как природных, так и неприродных. Функциональная группа иминного сложного эфира может содержать один или более асимметрических центров, которые могут усиливать стереоиндукцию во время процесса образования связи. В дополнение, такие иминные производные глицинимида могут быть нанесены на полимерные основы, что облегчает комбинаторный синтез. Иминные производные глицинимида могут быть получены конденсацией глицинового эфира с соответствующим кетоном в присутствии кислотного катализатора. Реакции способствует удаление воды. Иминные производные глицинимида хорошо известны в данной области и используются в реакции присоединения Михаэля, например, как описано в 6ш11епа, 6., е! а1, 1. Огд. Сйет. 2000, 65, 7310-7322, включенном в данное описание посредством ссылки. Конкретные примеры иминных производных глицинимида по изобретению включают соединения, выбранные из группы, описываемой формулами:
где М* означает переходный металл, предпочтительно Си, более предпочтительно Си11. Я14 означает -СО2Я16, -СЫ
или -СОИК15Я15;
Я15 означает необязательно замещенную алифатическую группу;
Я16 означает кислотную защитную группу, необязательно замещенный арил или необязательно замещенную алифатическую группу;
означает необязательно замещенный арил, необязательно замещенную алифатическую группу,
Я17
означает водород, алкил или алкилтио; или необязательно замещенный арил;
и Я18, взятые вместе с углеродом, к которому Я17 и Я18 присоединены, образуют структуры приЯ18
Я17 соединения
означает твердую фазу.
- 18 011547
Аддукт иминного производного глицинимида означает соединение, образующееся при отщеплении α-водорода относительно положения азота и карбонильной группы основания Шиффа, и используется для осуществления присоединения за счет образования связи. Конкретные примеры аддуктов иминного производного глицинимида по изобретению включают соединения, описываемые формулами, выбранными из группы
где К14, К17 и К18 принимают значения, указанные в определении иминного производного глицинимида.
Ν-оксисукцинимид означает группу следующей структуры
Ν-оксид означает группу следующей структуры
Термин пациент включает как человека, так и млекопитающих.
Пептидомиметический означает полимер, включающий аминокислотные остатки, присоединенные друг к другу через амидные связи.
Фармацевтически приемлемый сложный эфир означает сложный эфир, гидролизующийся т у1уо, и включает те эфиры, которые легко распадаются в организме до исходного соединения или его соли. Подходящие сложноэфирные группы включают, например, группы, образованные фармацевтически приемлемыми алифатическими карбоновыми кислотами, в особенности алкановыми, алкеновыми, циклоалкановыми и алкандионовыми кислотами, в которых каждая алкильная или алкенильная группа преимущественно содержит не более 6 атомов углерода. Характерные примеры сложных эфиров включают формиаты, ацетаты, пропионаты, бутираты, акрилаты, этилсукциаты и тому подобное.
Фармацевтически приемлемые пролекарства, как использовано в данном описании, означают те пролекарства соединений по изобретению, которые эффективны по разумной биологической оценке и пригодны для использования в контакте с клетками человека или других млекопитающих, не являясь излишне токсичными, вызывающими раздражение, аллергическую реакцию и тому подобное, соответствующие разумному соотношению польза/риск, и эффективные в целях предусмотренного применения, а также цвитерионные формы, где возможно, соединений по изобретению. Термин пролекарство означает соединения, которые подвергаются быстрому превращению ш у1уо, давая исходное соединение указанной выше формулы, например, за счет гидролиза в крови. Функциональные группы, которые могут быть быстро превращены путем метаболического расщепления т у1уо, образуют класс групп, реакционноспособных по отношению к карбоксильной группе соединений по изобретению.
Указанные группы включают, но не ограничиваясь ими, такие группы, как алканоил (такой как ацетил, пропаноил, бутаноил и тому подобное), незамещенный и замещенный ароил (такой как бензоил и замещенный бензоил), алкоксикарбонил (такой как этоксикарбонил), триалкилсилил (такой как триметил- и триэтилсилил), образующие сложные моноэфиры с дикарбоновыми кислотами (такими как янтарная) и тому подобное.
Из-за легкости, с какой метаболически расщепляемые группы соединений по настоящему изобретению расщепляются т у1уо, соединения, несущие такие группы, ведут себя как пролекарства. Соединения с метаболически расщепляемыми группами обладают тем преимуществом, что для них может быть характерна повышенная биодоступность, являющаяся результатом повышенной растворимости и/или скорости всасывания, обусловленных наличием в исходных соединениях метаболически расщепляемых групп. Подробный обзор представлен в Эемдп о£ Ргобгидз, Н. Випбдаагб, еб., Е1зеу1ег (1985); Ме!Нобз т Епхуто1оду; К. У1ббег е! а1., Еб., Асабетю Ргезз, 42, 309-396 (1985); А Тех!Ьоок оГ Эгид Оезщп апб Эеуе1оретеп!, Кгодздаагб-Ьагзеп апб Н. Вапбадеб, еб., СНар!ег 5; Оез1дп апб Аррйсайопз оГ Ргобгидз 113191 (1991); Абуапсеб Эгид ОеНуегу Кеу1е^з, Н. Випбдагб, 8, 1-38, (1992); I. РНагт. 8сЕ, 77, 285 (1988); СНет. РНагт. Ви11., Ν. Nакеуа е! а1, 32, 692 (1984); Рго-бгидз аз №уе1 ОеНуегу 8уз!етз, Т. ШдисЫ апб У. 8!е11а, 14 А.С.8. 8утрозшт 8епез апб Вюгеуегз1Ь1е Сатегз ш Эгид Пез1дп, Е.В. КосНе, еб., Атепсап РНагтасеи!1са1 АззоааНоп апб Регдатоп Ргезз, 1987, включенных в данное описание посредством ссылок.
Термин фармацевтически приемлемые соли относится к сравнительно нетоксичным аддитивным
- 19 011547 солям соединений по настоящему изобретению с неорганическими и органическими кислотами и основаниями. Указанные соли могут быть получены ίη йи во время окончательного выделения или очистки соединений. В частности, аддитивные соли кислот могут быть получены взаимодействием очищенного соединения в форме свободного основания с подходящей органической или неорганической кислотой и выделением полученной таким образом соли. Характерные примеры кислотно-аддитивных солей включают гидробромид, гидрохлорид, сульфат, бисульфат, фосфат, нитрат, ацетат, оксалат, валерат, олеат, пальмитат, стеарат, лаурат, борат, бензоат, лактат, фосфат, тозилат, цитрат, малеат, фумарат, сукцинат, тартрат, нафтилат, мезилат, глюкогептанат, лактобионат, сульфаматы, малонаты, салицилаты, пропионаты, метилен-бис-п-гидроксинафтоаты, гентизаты, изэтионаты, ди-п-толуоилтартраты, метансульфонаты, этансульфонаты, бензолсульфонаты, п-толуолсульфонаты, циклогексилсульфаматы, хинаты и лаурилсульфонаты, и тому подобное. См., например, 8.М. Бсгдс. с1 а1., Рйагтасеийса1 8а115. ί. Рйагт. 8с1., 66, 1-19 (1977), включенный в данное описание посредством ссылки. Аддитивные соли оснований могут также быть получены взаимодействием очищенного соединения в форме кислоты с подходящим органическим или неорганическим основанием и выделением полученной таким образом соли. Основноаддитивные соли включают соли фармацевтически приемлемых металлов и аминов. Подходящие соли металлов включают соли натрия, калия, кальция, бария, цинка, магния и алюминия. Предпочтительны соли натрия и калия. Подходящие аддитивные соли неорганических оснований получают из оснований металлов, которые включают гидрид натрия, гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид кальция, гидроксид алюминия, гидроксид лития, гидроксид магния, гидроксид цинка и тому подобное. Подходящие аддитивные соли аминных оснований получают из аминов, обладающих достаточной основностью для образования стабильной соли, указанные аддитивные соли предпочтительно включают те амины, которые часто используются в химии лекарственных препаратов по причине их низкой токсичности и приемлемости для применения в области медицины. Указанные амины включают аммиак, этилендиамин, Ν-метилглюкамин, лизин, аргинин, орнитин, холин, Ν,Ν'-дибензилэтилендиамин, хлорпрокаин, диэтаноламин, прокаин, Ν-бензилфенетиламин, диэтиламин, пиперазин, трис(гидроксиметил)аминометан, гидроксид тетраметиламмония, триэтиламин, дибензиламин, эфенамин, дегидроабиетиламин, Ν-этилпиперидин, бензиламин, тетраметиламмоний, тетраэтиламмоний, метиламин, диметиламин, триметиламин, этиламин, основные аминокислоты, например лизин и аргинин, и дициклогексиламин, и тому подобное.
Заместители кольцевой группы означают заместители, присоединенные к ароматическим или неароматическим кольцевым системам, включающие: арил, гетероарил, гидрокси, алкокси, циклилокси, арилокси, гетероарилокси, ацил или его тиоксо-аналог, циклилкарбонил или его тиоксо-аналог, ароил или его тиоксо-аналог, гетероароил или его тиоксо-аналог, ацилокси, циклилкарбонилокси, ароилокси, гетероароилокси, галоген, нитро, циано, карбокси (кислота), -С(О)-ЫНОН, -С(О)-СН2ОН, -С(О)-СН28Н, -С(О)-ЛН-СН сульфо, фосфоно, алкилсульфонилкарбамоил, тетразолил, арилсульфонилкарбамоил, Νметоксикарбамоил, гетероарилсульфонилкарбамоил, 3-гидрокси-3-циклобутен-1,2-дион, 3,5-диоксо1,2,4-оксадиазолидинил или гидроксигетероарил, такой как 3-гидроксиизоксазолил, 3-гидрокси-1метилпиразолил, алкоксикарбонил, циклилоксикарбонил, арилоксикарбонил, гетероарилоксикарбонил, алкилсульфонил, циклилсульфонил, арилсульфонил, гетероарилсульфонил, алкилсульфинил, циклилсульфинил, арилсульфинил, гетероарилсульфинил, алкилтио, циклилтио, арилтио, гетероарилтио, циклил, арилдиазо, гетероарилдиазо, тиол, Υ1Υ2Ν-, Υ1Υ2NС(О)-, Υ1Υ2NС(О)О-, Υ1Υ2NС(О)NΥ3- или Υ1Υ2N8О2-, где Υ1, Υ2 и Υ3 независимо означают водород, алкил, арил или гетероарил, или в случае, когда заместитель означает Υ1Υ2Ν-, один из Υ1 и Υ2 может означать указанные выше ацил, циклилкарбонил, ароил, гетероароил, алкоксикарбонил, циклилоксикарбонил, арилоксикарбонил или гетероарилоксикарбонил, а другой из Υ1 и Υ2 принимает значения указанные выше, или в случае, когда заместитель означает У^ЫССО)-, ΥΎ^^ΝΥ3- или Υ'ΥΛ'Ο·, Υ1 и Υ2 могут вместе с атомом Ν, через который связан каждый из Υ1 и Υ2, образовывать 4-7-членный азагетероциклил или азагетероцикленил. Когда кольцевая система является насыщенной или частично насыщенной, заместители кольцевой группы дополнительно включают метилен (Н2С=), оксо (О=) и тиоксо (8=). Кислотными/амидными заместителями циклических групп являются карбокси (кислота), -С(О)-ЫНОН, -С(О)-СН2ОН, -С(О)СН28Н, -С(О)-ЛН-СН сульфо, фосфоно, алкилсульфонилкарбамоил, тетразолил, арилсульфонилкарбамоил, Ν-метоксикарбамоил, гетероарилсульфонилкарбамоил, 3-гидрокси-3-циклобутен-1,2-дион, 3,5диоксо-1,2,4-оксадиазолидинил или гидроксигетероарил, такой как 3-гидроксиизоксазолил, 3-гидрокси1-метилпиразолил и Υ1Υ2NСО-. Некислотными полярными заместителями циклических групп являются гидрокси, оксо (О=), тиоксо (8=), ацил или его тиоксо-аналог, циклилкарбонил или его тиоксо-аналог, ароил или его тиоксо-аналог, гетероароил или его тиоксо-аналог, алкоксикарбонил, циклилоксикарбонил, арилоксикарбонил, гетероарилоксикарбонил, ацилокси, циклилкарбонилокси, ароилокси, гетероароилокси, алкилсульфонил, циклилсульфонил, арилсульфонил, гетероарилсульфонил, алкилсульфинил, циклилсульфинил, арилсульфинил, гетероарилсульфинил, тиол, Υ'Υ:Ν-, Υ1Υ2NС(О)-, Υ1Υ2NС(О)О-, ΥΎ^^ΝΥ3- или У1У2Ц8О2-.
Сольват означает физическую ассоциацию соединения по настоящему изобретению с одной или более молекулами растворителя. Физическая ассоциация включает образование водородной связи. В некоторых случаях сольват поддается выделению, например, когда одна или более молекул растворителя
- 20 011547 включены в кристаллическую решетку твердого кристаллического соединения. Понятие сольват охватывает как фазу раствора, так и поддающиеся выделению сольваты. Характерные примеры сольватов включают гидраты, этаноляты, метаноляты и тому подобное.
Соединения по изобретению, необязательно, могут быть представлены в виде солей. Указанные соли, являющиеся фармацевтически приемлемыми, представляют особый интерес, поскольку они используются при применении указанных выше соединений в медицинских целях. Соли, которые фармацевтически не приемлемы, используются в способах получения для выделения и очистки и, в некоторых случаях, для разделения стереоизомерных форм соединений по изобретению. Последнее в особенности справедливо в отношении солей аминов, полученных из оптически гистивных аминов.
Когда соединение по изобретению содержит карбоксильную группу или достаточно кислотную биостеру, могут быть получены аддитивные соли с основаниями, которые являются просто более удобной формой для применения; и на практике использование солевой формы, по существу, равносильно применению в форме свободной кислоты.
Также, когда соединение по изобретению содержит основную группу или достаточно основную биостеру, могут быть получены аддитивные соли с кислотами, которые являются просто более удобной формой для применения; и на практике использование солевой формы, по существу, равносильно применению в форме свободного основания.
Получение соединений по изобретению
Исходные вещества и промежуточные соединения для соединений по изобретению могут быть получены путем применения или адаптации известных способов, как, например, способы, описанные в стандартных примерах, или очевидными, химически эквивалентными им способами.
Соединения по изобретению могут быть получены путем применения или адаптации известных способов, под которыми понимаются способы, используемые для этого ранее или описанные в литературе, например, способами, описанными в Я.С. Ьатоск ίη Сотртейеиауе Θί^απίο ТтаизГоттаНоик, УСН риЬ118Йет8 (1989).
Соединение формулы 1, где переменные и группа принимают указанные значения, могут быть получены обработкой соединения формулы 2,
где переменные и группа принимают указанные значения, соответствующим окисляющим агентом и в подходящих условиях. Характерным окисляющим агентом является ΌΜΡ реагент. Характерные условия включают окисление в соответствующем органическом растворителе, таком как дихлорметан, при температуре, близкой к комнатной.
Соединение формулы 2, где переменные и группа
принимают указанные значения, может
принимают указанбыть получено сочетанием соединения формулы 3, где переменные и группа ные значения, и соединения формулы 4,
где переменные принимают указанные значения, с соответствующим связующим агентом и в подходящих условиях. Характерный связующий агент и условия включают использование И1С и ΗΘΆΐ в подходящем органическом растворителе, таком как ДМФ, приблизительно при 0°С, или использование РуВор и ΌΙΡΕΆ в подходящем органическом растворителе, таком как дихлорметан, при температуре,
- 21 011547 близкой к комнатной.
Соединение формулы 3, где переменные и группа принимают указанные значения, может быть получено сочетанием соединения формулы 5, где переменные принимают указанные значения, и
ответствующим связующим агентом и в подходящих условиях связывания, с последующим использованием соответствующего агента для снятия защиты в подходящих для снятия защиты условиях. Характерные связующий агент и условия включают использование О1С или ОСС и НОАГ в подходящем органическом растворителе, таком как ДМФ, при температуре приблизительно от 0°С до комнатной. Снятие защиты осуществляют, используя соответствующий агент для снятия защиты, зависящий от природы защитного агента, т. е. от того, удаляется (неустойчив) он под действием кислоты, основания или в условиях гидрирования, и других реакционноспособных групп подвергаемого снятию защиты соединения, т.е. агент для снятия защиты выбирают так, чтобы выполнить снятие защиты без воздействия на другие реакционноспособные группы, за исключением случаев, когда сопутствующая реакция является желательной. Характерным кислотным защитным агентом является С1-С8-низший алкил; в частности метил. Характерным агентом для снятия защиты является неорганическое основание, такое как гидроксид щелочного металла; в частности №1ОН. Характерные условия снятия защиты включают снятие защиты в спиртовом растворителе, таком как метанол или этанол, при температуре, близкой к комнатной.
Соединение формулы 5, где п равно 0 и остальные переменные принимают указанные значения, т.е., соединение 5а, может быть получено путем снятия защиты с соединения формулы 7 ?
Агент снятия кислотной ващиты и условия
5а где Р2 означает кислотную защитную группу, и остальные переменные принимают указанные выше значения, с помощью соответствующего агента для снятия защиты и в подходящих условиях. Снятие защиты осуществляют, используя соответствующий агент для снятия защиты, зависящий от природы защитного агента, т. е. от того, удаляется (неустойчив) он под действием кислоты, основания или в условиях гидрирования, и других реакционноспособных групп подвергаемого снятию защиты соединения, т.е. агент для снятия защиты выбирают так, чтобы выполнить снятие защиты без воздействия на другие реакционноспособные группы, за исключением случаев, когда сопутствующая реакция является желательной. Характерным кислотным защитным агентом является С1-С8-низший алкил; в частности метил. Характерным агентом для снятия защиты является неорганическое основание, такое как гидроксид щелочного металла; в частности №1ОН. Характерные условия снятия защиты включают снятие защиты в спиртовом растворителе, таком как метанол или этанол, при температуре, близкой к комнатной.
Соединение формулы 7, где переменные принимают указанные значения, может быть получено ацилированием соединения формулы 8, где переменные принимают указанные значения, соединением формулы 9
- 22 011547
где М означает заменяемую группу, а остальные переменные принимают указанные выше значения, в подходящих условиях. Характерные условия связывания подразумевают использование ΌΚ.' или ОСС и ΗΟΑΐ в подходящем органическом растворителе, таком как ДМФ или дихлорметан, приблизительно при температуре от 0°С до комнатной, или использование РуВор и ΌΣΡΕΑ в подходящем органическом растворителе, таком как ДМФ или дихлорметан, при температуре, близкой к комнатной; последние условия являются предпочтительными. Характерный Ь означает карбонил. Характерный М означает гидрокси или Ν-оксисукцинимид.
Соединение формулы 5, где η равно 1 и остальные переменные принимают указанные выше значения, т.е., соединение 5Ь, может быть получено снятием защиты с соединения формулы 10
где Р2 означает кислотную защитную группу и остальные переменные принимают указанные выше значения, с помощью подходящего агента для снятия защиты и в соответствующих условиях. Снятие защиты осуществляют, используя соответствующий агент для снятия защиты, зависящий от природы защитного агента, т. е. от того, удаляется (неустойчив) он под действием кислоты, основания или в условиях гидрирования, и других реакционноспособных групп подвергаемого снятию защиты соединения, т.е. агент для снятия защиты выбирают так, чтобы выполнить снятие защиты без воздействия на другие реакционноспособные группы, за исключением случаев, когда сопутствующая реакция является желательной. Характерным кислотным защитным агентом является С1-С8-низший алкил; в частности метил. Характерным агентом для снятия защиты является неорганическое основание, такое как гидроксид щелочного металла; в частности ΝαΟΗ. Характерные условия снятия защиты включают снятие защиты в спиртовом растворителе, таком как метанол или этанол, при температуре, близкой к комнатной.
Соединение формулы 10, где переменные принимают указанные выше значения, может быть получено ацилированием соединения формулы 11, где переменные принимают указанные выше значения, с помощью соединения формулы 9, где переменные принимают указанные выше значения,
в подходящих условиях. Характерные условия связывания подразумевают использование ΌΣΟ или ОСС и ΗΟΑΐ в подходящем органическом растворителе, таком как ДМФ или дихлорметан, приблизительно при температуре от 0° С до комнатной, или использование РуВор и ΌΣΡΕΑ в подходящем органическом растворителе, таком как ДМФ или дихлорметан, при температуре, близкой к комнатной; последние условия являются предпочтительными. Характерный Ь означает карбонил. Характерный М означает
- 23 011547 гидрокси или Ν-оксисукцинимид.
Соединение формулы 11, где переменные принимают указанные выше значения, может быть получено снятием защиты с соединения формулы 12
где Р1 означает аминозащитную группу и остальные переменные принимают указанные выше значения, с помощью подходящего агента для снятия защиты и в соответствующих условиях. Снятие защиты осуществляют, используя соответствующий агент для снятия защиты, зависящий от природы аминозащитного агента, т. е. от того, удаляется (неустойчив) он под действием кислоты, основания или в условиях гидрирования, и других реакционноспособных групп подвергаемого снятию защиты соединения, т.е. агент для снятия защиты выбирают так, чтобы выполнить снятие защиты без воздействия на другие реакционноспособные группы, за исключением случаев, когда сопутствующая реакция является желательной. Характерным аминозащитным агентом является СЬх или ВОС; более предпочтителен СЬх. Характерным агентом для снятия защиты является кислота, такая как НС1, или Н2/Рй(0Н)2; более предпочтителен Н2/Рй(0Н)2. Характерные условия снятия защиты включают снятие защиты в спиртовом растворителе, таком как метанол или этанол, или алкилалканоатном растворителе, таком как этилацетат, при температуре, близкой к комнатной.
Соединение формулы 12, где переменные принимают указанные выше значения, может быть получено сочетанием соединения формулы 13, где переменные принимают указанные выше значения, с соединением формулы 14, где переменные принимают указанные выше значения,
в подходящих условиях. Характерные условия связывания подразумевают использование Н0Л1/01С и ΌΙΡΕΆ в подходящем органическом растворителе, таком как ТГФ, при температуре, близкой к комнатной.
Соединение формулы 4, где переменные принимают указанные выше значения, может быть получено снятием защиты с соединения формулы 15,
Условия снятия защиты
где переменные принимают указанные выше значения, с помощью подходящего агента для снятия защиты и в соответствующих условиях. Снятие защиты осуществляют, используя соответствующий агент для снятия защиты, зависящий от природы аминозащитного агента, т.е. от того, удаляется (неустойчив) он под действием кислоты, основания или в условиях гидрирования, и других реакционноспособных групп подвергаемого снятию защиты соединения, т.е. агент для снятия защиты выбирают так,
- 24 011547 чтобы выполнить снятие защиты без воздействия на другие реакционноспособные группы, за исключением случаев, когда сопутствующая реакция является желательной. Характерным аминозащитным агентом является СЬх или ВОС; более предпочтителен СЬх. Характерным агентом для снятия защиты является кислота, такая как НС1, или Н2/Рб(ОН)2; более предпочтителен Н2/Рб(ОН)2. Характерные условия снятия защиты включают снятие защиты в спиртовом растворителе, таком как метанол или этанол, или алкилалканоатном растворителе, таком как этилацетат, при температуре, близкой к комнатной.
Соединение формулы 15, где переменные принимают указанные выше значения, может быть получено сочетанием соединения формулы 16, где переменные принимают указанные выше значения, с соединением формулы 17, где переменные принимают указанные выше значения,
в подходящих условиях. Характерным аминозащитным агентом является СЬх или ВОС; более предпочтителен СЬх. Характерные условия связывания подразумевают использование НОВТ, РуВор и ΌΙΡΕΑ в подходящем органическом растворителе, таком как дихлорметан, при температуре приблизительно от 0°С до комнатной.
Соединение формулы 16, где переменные принимают указанные выше значения, может быть получено снятием защиты с соединения формулы 18
где остальные переменные принимают указанные выше значения, с помощью подходящего агента для снятия защиты и в соответствующих условиях. Снятие защиты осуществляют, используя соответствующий агент для снятия защиты, зависящий от природы кислотного защитного агента, т. е. от того, удаляется (неустойчив) он под действием кислоты, основания или в условиях гидрирования, и других реакционноспособных групп подвергаемого снятию защиты соединения, т.е. агент для снятия защиты выбирают так, чтобы выполнить снятие защиты без воздействия на другие реакционноспособные группы, за исключением случаев, когда сопутствующая реакция является желательной. Характерным аминозащитным агентом является СЬх. Характерным кислотным защитным агентом является С1-С8-низший алкил; в частности метил. Характерным агентом для снятия защиты является неорганическое основание, такое как гидроксид щелочного металла; в частности №1ОН. Характерные условия снятия защиты включают снятие защиты в спиртовом растворителе, таком как метанол или этанол, при температуре, близкой к комнатной.
Соединение формулы 18, где В0 означает связь, и остальные параметры принимают указанные выше значения, может быть получено путем защиты соединения формулы 20, где переменные принимают указанные выше значения, с помощью соединения формулы 19
где переменные принимают указанные выше значения, в соответствующих условиях. Характерным
- 25 011547 аминозащитным агентом является СЬх или ВОС. Характерные условия связывания подразумевают использование подходящего органического растворителя, такого как дихлорметан, при температуре приблизительно от 0°С до комнатной.
Соединение формулы 20, где Я4 означает водород, и остальные переменные принимают указанные выше значения, может быть получено гидрированием соединения формулы 21
О ОН 21
Условия гидрирования
Υ’Υ где переменные принимают указанные выше значения, с помощью гидрирующего агента и в подходящих условиях. Характерным гидрирующим агентом является Н2/Р6(ОН)2. Характерные условия гидрирования включают гидрирование в спиртовом растворителе, таком как метанол или этанол, или алкилалканоатном растворителе, таком как этилацетат, при температуре, близкой к комнатной.
Соединение формулы 20, где Я4 означает необязательно замещенную алифатическую группу, и остальные переменные принимают указанные выше значения, может быть получено алкилированием соединения 20', где переменные принимают указанные выше значения, с помощью соединения 22 (алкилирующего агента), где Я4 означает необязательно замещенную алифатическую группу и О означает замещаемую группу, такую как галогениды, тозилаты или сульфонаты, в подходящих условиях.
Подходящие алкилирующие агенты включают алифатические (галогениды, тозилаты или сульфонаты). Подходящие условия алкилирования включают алкилирование в подходящем органическом растворителе, таком как спиртовой растворитель, например метанол или этанол, или простой эфирный растворитель, например, диэтиловый эфир или тетрагидрофуран, приблизительно от комнатной температуры до температуры дефлегмации.
Соединение формулы 21, где переменные принимают указанные выше значения, может быть получено алкилированием соединения формулы 22, где переменная принимает указанные выше значения, с помощью соединения формулы 23 θρ, + СКОСИВ к
О 23
Условия алкилирования θ'^γ^ορ2 О ОН 21 где заместители Я3' независимо означают указанные необязательно замещенную алифатическую группу, необязательно замещенную циклическую группу или необязательно замещенную ароматическую группу, в подходящих условиях. Характерные условия алкилирования включают алкилирование с применением сильного основания, такого как трет-бутилат калия, в спиртовом растворителе, таком как метанол или этанол, при температуре, близкой к комнатной.
Соединение формулы 24, где переменные принимают указанные выше значения, может быть получено осуществлением присоединения по Михаэлю к акцептору Михаэля формулы 29, где переменная принимает указанные выше значения, с помощью иминного производного глицинимида.
Условия присоединения по Михаэлю включают подходящие полярные растворители, гидроксиды
- 26 011547 щелочных металлов в качестве оснований и соответствующие температуры. В отношении присоединения по Михаэлю, см., Согеу, Ε.6.; №е, М.С.; Хи, Г. Те!гаИебгои Ье!!ег 1998, 39, 5347. В отношении синтеза с применением хиральных межфазных катализаторов, см., Согеу, Ε.6.; Ное, М.С.; Хи, ГД. Ат. СИет. 8ос. 1997, 119, 12414. Подходящие растворители включают ОСМ, АСN или ΝυΑ. В зависимости от условий взаимодействия. Подходящие основания включают С8ОΗ, NаОΗ, КЮН и ЬЮН. Подходящий интервал температур составляет приблизительно от -78 до 0°С, более предпочтительно приблизительно -60°С. Иминные глицинимиды, полезные по изобретению, приведены в данном описании. Предпочтительным иминным глицинимидом является трет-бутиловый эфир М-(дифенилметилен)глицина. Кроме того, условия присоединения по Михаэлю могут зависеть от наличия или отсутствия межфазного катализатора (МФК) (хирального и нехирального). Предпочтительным МФК является О-[9]-аллил-М-9антраценилметилцинхонидийбромид.
Соединение формулы 25, где переменные принимают указанные выше значения, может быть получено иминным расщеплением и циклизацией соединения формулы 24.
В отношении методик расщепления и циклизации, см., бау1баи, А.; 8сИ£ег, К.; Руие, 8. 8уи1е!! 1996, 100; Та!зикама, А.; Паи, М.; ОИЬа!аке, М.; Кама!аке, К.; Гика!а, Т.; Шаба, Ε.; Каиетазе, 8.; Какец 8. б. Θτ§. СИет. 1993, 58, 4221. Условия расщепления и циклизации включают использование полярных растворителей, кислотных реагентов и температур приблизительно в интервале от комнатной температуры до 150° С. Предпочтительные условия включают использование БЮН, А^№ и NΗ2ОΗ·ΗС1, и температуры, близкой к температуре кипения используемого растворителя.
Соединение формулы 26, где переменные принимают указанные выше значения, может быть получено защитой амида соединения формулы 25, где переменные принимают указанные выше значения, с помощью подходящей амидной защитной группы, такой как ВОС. Другие подходящие защитные группы включают СВ/, -СО2алкил. См. также, Сгееие, Т.Ш.; Р.С.М. ίη Рто!ес!1уе Сгоирз ίη ΘΓ^πηιο 8уи!Иез18, Шбеу, №\ν Υо^к, 1991. в отношении других аминозащитных групп. Условия защиты включают применение апротонных полярных растворителей, органических оснований в качестве катализаторов и температур приблизительно в интервале 0° С-100° С. Предпочтительные условия включают использование АСМ, диметиламинопиридина и температуры, близкой к комнатной.
Соединение формулы 27, где переменные принимают указанные выше значения, может быть получено восстановлением защищенного соединения формулы 26, где переменные принимают указанные выше значения.
Фактически выполняют два восстановления. Первым является восстановление амида до гемиаминаля с использованием ОШАЬН или супергидрида [Ь1ВЕ!3Н]. Вторым является восстановление гемиаминаля до амина с использованием Е!381Н и ΒΡ3·ΘΕ!2. См., Со11або, I.; Ехциегга, б.; Ма!ео, Α.Ι.; КиЬю, А., б. Θτ§. СИет. 1998, 63 1995-2001 и Вхциеега, б.; РебгедаЕ С.; Υ^и^е!аβоуеиа, В.; КиЬю, А.; Саггеио, М.С.; Ε8сπЬаηо, А.; Сагаа Киаио, б.Ь. б. Θτ§. СИет. 1995, 60, 2925, в отношении условий восстановления. Другие стандартные условия превращения пироглютаматов в пирролидины состоят в использованием ВН3 8Ме2.
Соединение формулы 28, где переменные принимают указанные выше значения, может быть получено снятием защиты с соединения формулы 27, где переменные принимают указанные выше значения.
См., С1Ьзои, Г.С.; Вегте1ег, 8.С.; Каророг!, Н., б. Θτ§ СИет. 1994, 59, 3216-3218 в отношении условий селективного удаления N-ВОС защитной группы в присутствии сложного трет-бутилового эфира.
- 27 011547
Каждому специалисту в данной области известно, что условия снятия защиты зависят от выбора защитной группы. Например, если используют СВ/, могут быть использованы условия гидрирования или основные условия. Например, если используют ВОС, то можно использовать 1н. НС1 в этилацетате. См., Сгсспс. Т.^.; Р.С.М. ίη Рго1сс11ус Сгоирк ίη Огдашс 8уп111С5к. ^11еу, Νο\ν Уогк, 1991.
Для специалиста в данной области ценно, что соединение формулы 3 может быть получено сочетанием соединения формулы 5 с соединением формулы 28 в указанных выше условиях.
Способы получения В3, В5 или В7, в виде необязательно замещенных этандиильных групп, включают способы, известные специалистам в данной области, например, способы, описанные в Тке огдашс С.’кетк1гу οί р-Ьас!ат8 ебкеб Ьу С. Оеогд, УСН РиЫккега, 1пс. (1993), например, страницы 240-241 и 303-305.
Приведенные далее схемы 1-11 иллюстрируют разнообразные способы получения необязательно замещенных полициклических азагетероциклилов. Способы, приведенные ниже в виде схем, приемлемы также для других необязательно замещенных полициклических азагетероциклилов, включающих подоб ные совместимые заместители.
Схема 1
Βμ,ΒπΗ/ ΑΙΒΝ
Схема 2
Схема 3
Нг
- 28 011547
Схема 4
Схема 5
Схема 6
Схема 7
ТРгОЛЭМАР
Схема 8
- 29 011547
Схема 11
Соединение формулы 1, включающее группу, содержащую один или более атомов азота в кольце, предпочтительно имин (=Ν-), может быть превращено в соответствующее соединение, где один или более циклических атомов азота в группе окислены до Ν-оксида, преимущественно путем взаимодействия с перкислотой, например перуксусной кислотой в уксусной кислоте или м-хлорпероксибензойной кислотой в инертном растворителе, таком как дихлорметан, при температуре приблизительно в интервале от комнатной до температуры дефлегмации, предпочтительно при повышенной температуре.
При осуществлении приведенных ниже взаимодействий может возникнуть необходимость защиты реакцинноспособных функциональных групп, например гидрокси-, амино-, имино-, тио- или карбоксигрупп во избежание их нежелательного участия в реакциях, когда требуется наличие указанных групп в конечном продукте. Могут быть использованы обычные защитные группы в соответствии со стандартными методиками, например, см., Т.У. Сгееп апб Р.С.М. \Уи18 ίη Рго1есбуе Сгоирк ίη Огдашс Сйетк1гу Ло1т У11еу апб 8опк (1991); ТЕЛУ. МсОт1е ίη РгсИесЕуе Сгоирк ίη Огдашс СйеткЦу Р1епит Ргекк, 1973.
Соединение, полученное указанными способами, может быть выделено из реакционной смеси общепринятыми способами. Например, соединение может быть выделено путем отгонки растворителя из реакционной смеси или, по необходимости, выливанием остатка после отгонки растворителя из реакционной смеси в воду с последующей экстракцией несмешивающимся с водой органическим растворителем и отгонкой растворителя из экстракта. Кроме того, продукт может быть, по желанию, дополнительно очищен различными подходящими способами, такими как перекристаллизация, переосаждение или различные хроматографические методы, в особенности, хроматографией на колонке или препаративной тонкослойной хроматографией.
Согласно еще одной отличительной особенности настоящего изобретения соединения по изобретению могут быть получены взаимным превращением соединений по изобретению.
В качестве примера взаимного превращения, соединения формулы 1, содержащие сульфоксидные мостики, могут быть получены окислением соответствующих соединений, содержащих -8- связи. Например, окисление может обычно быть выполнено путем взаимодействия с перкислотой, например, 3хлорпербензойной кислотой, предпочтительно в инертном растворителе, например, дихлорметане, преимущественно при температуре, близкой к комнатной, или иначе, под действием кислого пероксомоносульфата калия в такой среде, как водный метанол забуференный приблизительно до рН 5, в интервале температур приблизительно от 0°С до комнатной температуры. Последний способ предпочтителен для соединений, содержащих неустойчивую к кислоте группу.
В качестве другого примера взаимного превращения, соединения формулы 1, содержащие сульфоновые мостики, могут быть получены окислением соответствующих соединений, содержащих -8- или сульфоксидные мостики. Например, окисление может обычно быть выполнено путем взаимодействия с перкислотой, например 3-хлорпербензойной кислотой, предпочтительно в инертном растворителе, например дихлорметане, преимущественно при температуре, близкой к комнатной.
- 30 011547
Очевидно, что определение ароматичности в отношении арилов и гетероарилов включает высокорезонансную ненасыщенную кольцевую структуру. Альтернативно, наличие двойных связей, где это указано, представляет одну из возможных структур описываемого соединения, но подразумевается, что она включает другие резонансные состояния, такие как протонированные и заряженные состояния, только одно из которых может быть показано.
Следует отметить, что соединения по настоящему изобретению имеют асимметрические центры. Такие асимметрические центры могут независимо иметь К или 8 конфигурацию. Для специалистов в данной области очевидно, что некоторые соединения по изобретению могут также обладать геометрической изомерией. Понятно, что настоящее изобретение включает отдельные геометрические изомеры, стереоизомеры и их смеси, включая рацемические смеси, соединений по изобретению. Такие изомеры могут быть выделены из их смесей путем применения или адаптации известных способов, например, хроматографическими методами и способами перекристаллизации, либо их раздельно получают из подходящих изомеров промежуточных соединений.
Применительно к данному описанию имеется в виду, что в перечень указанных групп входят их таутомерные формы, например тиоксо/меркапто или оксо/гидроксил.
Аддитивные соли кислот получают с соединениями по изобретению, в которых присутствуют основные функциональные группы, такие как амино, алкиламино или диалкиламино. Предпочтительны фармацевтически приемлемые, т.е. нетоксичные, аддитивные соли кислот. Выбранные соли подбирают таким образом, чтобы они были оптимально совместимы с обычными фармацевтическими наполнителями и подходили для перорального или парентерального введения. Кислотно-аддитивные соли соединений по настоящему изобретению могут быть получены взаимодействием свободного основания с подходящей кислотой, на основе применения или адаптации известных способов. Например, кислотноаддитивные соли соединений по настоящему изобретению могут быть получены либо растворением свободного основания в воде или водном спиртовом растворе, или других подходящих растворителях, содержащих соответствующую кислоту, и выделением соли путем упаривания раствора, или взаимодействием свободного основания и кислоты в органическом растворителе, в этом случае соль выделяется сразу, либо может быть получена концентрированием раствора. Ряд подходящих кислот, используемых для получения таких солей, включает: хлористоводородную кислоту, бромисто-водородную кислоту, фосфорную кислоту, серную кислоту, различные органические, карбоновые и сульфоновые кислоты, такие как уксусная кислота, лимонная кислота, пропионовая кислота, янтарная кислота, бензойная кислота, винная кислота, фумаровая кислота, миндальная кислота, аскорбиновая кислота, яблочная кислота, метансульфоновая кислота, толуолсульфоновая кислота, жирные кислоты. Например, используются такие соли органических кислот, как адипат, альгинат, аскорбат, аспартат, бензолсульфонат, бензоат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, бисульфат, бутират, лактат, лаурат, лаурилсульфат, малат, гидроиодид, 2-гидроксиэтансульфонат, глицерофосфат, пикрат, пивалат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, тиоцианат, 2-нафталинсульфонат, ундеканоат, никотинат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, камфорат, камфорсульфонат и другие.
Соединения по настоящему изобретению могут быть регенерированы из солей на основе применения или адаптации известных способов. Например, соединения по изобретению могут быть восстановлены из их кислотно-аддитивных солей путем обработки их щелочью, например водным раствором бикарбоната натрия или водным раствором аммиака.
Соединения по настоящему изобретению могут быть регенерированы из основно-аддитивных солей на основе применения или адаптации известных способов. Например, соединения по изобретению могут быть восстановлены из их основно-аддитивных солей путем обработки их кислотой, например соляной кислотой.
Основно-аддитивные соли могут быть получены, когда соединение по изобретению содержит карбоксигруппу или достаточно кислотную биостеру. Основания, которые могут быть использованы для получения основно-аддитивных солей, включают преимущественно основания, образующие при взаимодействии со свободной кислотой фармацевтически приемлемые соли, то есть соли, катионы которых в фармацевтических дозах не токсичны для пациента, так что положительные ингибирующие воздействия, присущие свободным основаниям, не ослабляются побочными действиями за счет катионов. Фармацевтически приемлемые соли, включая соли щелочных и щелочно-земельных металлов, охватываются объемом настоящего изобретения и включают соли, полученные с основаниями, такими как: гидрид натрия, гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид кальция, гидроксид алюминия, гидроксид лития, гидроксид магния, гидроксид цинка, аммиак, этилендиамин, Ν-метилглюкамин, лизин, аргинин, орнитин, холин, Ν,Ν'-дибензилэтилендиамин, хлорпрокаин, диэтаноламин, прокаин, Ν-бензилфенетиламин, диэтиламин, пиперазин, трис(гидроксиметил)аминометан, гидроксид тетраметиламмония и тому подобное.
Соединения по настоящему изобретению удобно переводить в форму сольватов, либо они образуются по ходу осуществления способа по изобретению в виде сольватов (например, гидратов). Гидраты соединений по настоящему изобретению удобно получать перекристаллизацией из смеси водных/органических растворителей, используя такие органические растворители, как диоксан, тетрагидрофуран или метанол.
- 31 011547
Исходные вещества и промежуточные соединения могут быть получены на основе применения или адаптации известных способов, например способов, описанных в стандартных примерах или используя их очевидные химические эквиваленты.
Соединения по изобретению, способы или методики их получения и биологическая активность станут более очевидными при анализе приведенных ниже примеров, которые представлены исключительно для иллюстрации и не рассматриваются, как ограничивающие объем изобретения.
Образцы анализированы путем ТСХ, ЯМР, ОТ-ПЦР или ЭА.
Пример 1. Соединения А-Е.
К ЭСМ раствору (10 мл) соединения χί (310 мг, 0,39 ммоль) добавляют ТЕА (4 мл). Реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение 5 ч. По окончанию этого времени растворитель удаляют в вакууме. Полученный остаток очищают ВЭЖХ с обращенной фазой, получая 195 мг (68%) соединения А.
Следуя указанному выше способу и используя соответствующие исходные вещества, получают следующие соединения В-Е:
Пример 2. Соединения Е-М.
К ЭСМ раствору (10 мл) соединения χίί (350 мг, 0,56 ммоль) добавляют ΌΜΡ реагент (307 мг, 0,73 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение 2 ч и затем гасят добавлением 10% №ь8О3 в течение 30 мин. Реакционную смесь экстрагируют затем ЕЮАс (75 мл) и промывают насыщенным раствором соли. Органический слой сушат и концентрируют в вакууме. Полученный остаток очищают хроматографией на силикагеле (80-90% ЕЮАс/гексаны), получая 248 мг (71%) соединения Е
Следуя указанному выше способу и используя соответствующие исходные вещества, получают следующие соединения С-М:
- 32 011547
К ЭСМ раствору (4 мл) соединения χίχ (~0,22 ммоль) добавляют ЭМР реагент (146 мг, 0,34 ммоль). После перемешивания при температуре, близкой к комнатной, в течение 2 ч реакцию гасят добавлением 10% №ь8О31. Реакционную смесь разбавляют затем ЭСМ. Органический слой отделяют и промывают дважды 10% №ь8О3, и насыщенным раствором соли. Полученный органический слой сушат и концентрируют в вакууме, получая остаток, который очищают хроматографией на силикагеле (5% ЕГОН/ЕГОАс), что дает 78 мг (56%) требуемого соединения Ν.
Следуя указанному выше способу и используя соответствующие исходные вещества, получают следующие соединения О-К:
- 33 011547
Пример 4. Соединения 8-\ν.
К ЭСМ раствору (10 мл) соединения χχν (320 мг, 0,5 ммоль) добавляют ЭМР реагент (272 мг, 0,65 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение 2 ч и гасят 10% №ь8О3 в течение 20 мин. Образовавшуюся смесь затем экстрагируют ЕГОАс. Органический слой промывают насыщенным раствором соли, сушат и концентрируют в вакууме. Полученный остаток очищают хроматографией на силикагеле (80% ЕГОАс/гексаны), получая 170 мг (53%) соединения 8.
Следуя указанному выше способу и используя соответствующие исходные вещества, получают следующие соединения Τ-ν:
Пример 5. Соединения Х-АЭ.
К ЭСМ раствору (20 мл) соединения χχνί (400 мг, 0,6 ммоль) добавляют ЭМР реагент (329 мг, 0,78 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, 1,5 ч и гасят 10% №^О3 в течение 20 мин. Образовавшуюся смесь затем экстрагируют ЕГОАс. Органический слой промывают насыщенным раствором соли, сушат и концентрируют в вакууме. Полученный остаток очищают хроматографией на силикагеле (70-100% ЕГОАс/гексаны), получая 210 мг (53%) соединения X.
ρ
Следуя указанному выше способу и используя соответствующие исходные вещества, получают сле- 34 011547 дующие соединения Υ-ΆΌ:
Пример 6. Соединения ΑΕ-ΑΙ.
Соединение χχχίίί (150 мг; 0,076 ммоль) растворяют в 5 мл ΤΡΑ и перемешивают в течение двух дней. Продукт очищают ОФ-ВЭЖХ, получая 40 мг (33% выход) соединения АЕ.
Следуя указанному выше способу и используя соответствующие исходные вещества, получают следующие соединения ΑΡ-ΑΙ:
- 35 011547
Пример 7. Соединение Лк
Соединение χχχνίίί (180 мг, 0,21 ммоль) растворяют в чистом ТЕЛ (5 мл) и оставляют на 3 дня при температуре, близкой к комнатной. По прошествии указанного времени реакционную смесь концентрируют в вакууме, получая остаток, который очищают ВЭЖХ с обращенной фазой, получая 50 мг (32%) соединения Л1.
Пример 8. Соединения АК-АМ.
Соединение χχχχίίί (150 мг; 0,16 ммоль) растворяют в 4,5 мл ТЕА и перемешивают в течение трех дней. Продукт очищают ОФ-ВЭЖХ, получая 70 мг (54% выход) соединения АК.
Следуя указанному выше способу и используя соответствующие исходные вещества, получают следующие соединения АЬ-АМ:
Пример 9. Соединения ΑΝ.
Соединение Ιίί (80 мг) растворяют в 3 мл ТЕА и 3 мл ЭСМ. Смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение 5 ч. Растворитель удаляют упариванием. Полученный остаток очищают ВЭЖХ, получая 62 мг (83%) соединения АК
Пример 10. Соединения АО.
Соединение 1ш (160 мг; 0,2 ммоль) растворяют в 5 мл ЭСМ и добавляют ΌΜΡ реагент (170 мг; 0,4 ммоль). Смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение трех часов. Растворитель удаляют упариванием и остаток растворяют в смеси 50% ацетонитрил/вода и очищают ОФ-ВЭЖХ, получая 51 мг (32%) соединения АО.
- 36 011547
Пример 11. Соединения АР.
Соединение 1ίχ (162 мг; 0,22 ммоль) растворяют в 8 мл ЭСМ и добавляют ЭМР реагент (189 мг; 0,44 ммоль). Смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение 3 ч. Растворитель удаляют упариванием и продукт очищают ОФ-ВЭЖХ, получая 41 мг (25%) соединения АР.
Соединение 1х (70 мг; 0,09 ммоль) растворяют в 5 мл ТЕА и 5 мл ЭСМ. Смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение 3 ч. Растворитель удаляют в вакууме и остаток растворяют в смеси 50% ацетонитрил/вода и лиофилизуют, получая соединение Ар в виде порошка.
Пример 13. Соединения АК-В6.
Соединение 1χνί (223 мг, 0,326 ммоль) перемешивают в растворе ТЕА (5 мл) и ЭСМ (5 мл) 4 ч. ТСХ (силикагель: 2% МеОН/Е!ОАс) свидетельствует о полной конверсии в более медленно перемещающийся продукт. Растворитель удаляют при пониженном давлении и продукт лиофилизуют, получая 198 мг (97%) соединения АК.
Следуя указанному выше способу и используя соответствующие исходные вещества, получают следующие соединения А8-ВС:
- 37 011547
- 38 011547
Пример 14. Соединения ВН-В8.
Соединение Ιχχίίί (150 мг, 0,15 ммоль) поглощают ЭСМ (3 мл). К указанному раствору добавляют ТЕЛ (1,5 мл). Образовавшийся раствор перемешивают в течение ночи. По прошествии указанного времени реакционную смесь концентрируют в вакууме, получая остаток. Остаток очищают ВЭЖХ с обращенной фазой и лиофилизуют, получая 60 мг (50%) соединения ВН.
Следуя указанному выше способу и используя соответствующие исходные вещества, получают следующие соединения ΒΙ-Β8:
- 39 011547
- 40 011547
Пример 15. Соединения ΒΤ-Βυ.
Следуя методике примера 12 и используя соответствующие исходные вещества, получают следующие соединения ΒΤ-Βυ:
Пример 16. Соединение Βν.
К дихлорметановому раствору (4,2 мл) соединения Ιχχνίί (143 мг, 0,21 ммоль) добавляют ΌΜΡ реагент (165 мг, 0,39 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение 2 ч и гасят 10% №ь8О3 (водн.) в течение 20 мин. Полученную смесь экстрагируют ЕЮАс. Органический слой промывают насыщенным раствором соли, сушат над Мд§О4 и концентрируют до желтого масла. Очистка хроматографией на силикагеле (5% ЕЮН/ЕЮАс) дает 124 мг (79%) соединения Βν.
Пример 17. Соединения Βν-СА.
К дихлорметановому раствору (20 мл) соединения Ιχχχίχ (420 мг, 0,62 ммоль) добавляют ΌΜΡ реагент (342 мг, 0,81 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение 1 ч и гасят 10% №ь8О3 в течение 20 мин. Образовавшуюся смесь затем экстрагируют ЕЮАс. Органический слой промывают насыщенным раствором соли, сушат и концентрируют в вакууме. Полученный остаток очищают хроматографией на силикагеле (80% ЕЮАс/гексан), получая 208 мг (50%) соединения Βν.
Следуя указанному выше способу, но, используя соответствующие исходные вещества, получают следующие соединения ВХ-СА:
- 41 011547
Пример 18. Соединения СВ-СС.
К дихлорметановому раствору (6,5 мл) соединения 1χχχνίί (200 мг, 0,3 ммоль) добавляют ΌΜΡ реагент (227 мг, 0,54 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение 2 ч и гасят 10% Ыа28О3 (водн.) в течение 20 мин. Полученную смесь экстрагируют ЕЮЛс. Органический слой промывают насыщенным раствором соли, сушат над Мд8О4 и концентрируют до желтого масла. Очистка хроматографией на силикагеле (5% ЕЮН/ЕЮЛс) дает 138 мг (70%) соединения СВ.
Следуя указанному выше способу, но, используя соответствующие исходные вещества, получают следующее соединение СС:
Пример 19. Соединение СО.
Соединение 1χχχχνίίί (40 мг, 0,05 ммоль) поглощают ТЕЛ (3 мл). Раствор перемешивают в течение двух ночей и концентрируют. Остаток очищают ВЭЖХ с обращенной фазой, получая 25 мг (74%) соединения СО.
Следуя методике примера 17 и используя соответствующие исходные вещества, получают следующее соединение СЕ:
Пример 21. Соединения СЕ-СС.
Следуя методике примера 14 и используя соответствующие исходные вещества, получают следующие соединения СЕ-СС:
Пример 22. Соединение СН.
Следуя методике примера 16 и используя соответствующие исходные вещества, получают следующее соединение СН:
- 42 011547
Пример 23. Соединения С1-СМ.
Соединение сх1 (490 мг, 0,75 ммоль) растворяют в ЭСМ (6 мл). К указанному раствору добавляют ЭМР реагент (380 мг, 0,9 ммоль) и перемешивают 1 ч. Реакционную смесь гасят 10% раствором №28О3 и затем органическую фазу промывают насыщенным NаНСΟ3 и насыщенным раствором соли. После концентрирования органической фазы, полученный остаток очищают хроматографией, используя 70% ЕЮАс/гексан, получают соединение С1 (325 мг, 66,4%).
Следуя указанному выше способу получения приведенного выше соединения и способам, связанным с получением его промежуточного соединения, но используя соответствующие исходные вещества, получают следующие соединения С1-СМ:
Пример 24. Соединения ΟΝ.
К ЭСМ/ТГФ раствору (3 мл/3 мл) соединения схуш (335 мг, 0,46 ммоль) добавляют ЭМР реагент (300 мг, 0,69 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч и гасят 10% №128О3 (водн.) в течение 20 мин. Полученную смесь экстрагируют ЕЮАс. Органическую фазу промывают насыщенным раствором соли, сушат над Мд§О4 и концентрируют, получая желтое масло. Очистка хроматографией на силикагеле (80% ЕЮАс/гексаны) дает соединение СN (220 мг, 67%).
Пример 25. Соединения СО-СК.
К ЭСМ/ТГФ раствору (1,5 мл/1,5 мл) соединения сх1х (164 мг, 0,25 ммоль) добавляют ЭМР реагент (159 мг, 0,38 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч и гасят 10% №128О3 (водн.) в течение 20 мин. Полученную смесь экстрагируют ЕЮАс. Органическую фазу промывают насыщенным раствором соли, сушат над Мд§О4 и концентрируют до желтого масла. Очистка хроматографией на силикагеле (70% ЕЮАс/гексаны) дает соединение СО (100 мг, 61%).
- 43 011547
Следуя указанному выше способу получения приведенного выше соединения и способам, связан ным с получением его промежуточного соединения, но используя соответствующие исходные вещества, получают следующие соединения СР-СВ:
Пример 26. Соединения С8-СТ.
Соединение схх растворяют в ЭСМ (3 мл). К раствору добавляют ΌΜΡ реагент (180 мг, 0,41 ммоль) и затем перемешивают в течение 1 ч. Реакционную смесь гасят 10% №ь8О3 и затем органическую фазу промывают насыщенным NаНСΟ3 и насыщенным раствором соли. После концентрирования органической фазы остаток очищают хроматографией, используя 100% ΕΐΟΑс, и получают соединение С8 (95 мг, 43,7%).
Следуя указанному выше способу получения приведенного выше соединения и способам, связанным с получением его промежуточного соединения, но используя соответствующие исходные вещества, получают следующее соединение СТ:
Пример 27. Соединения СИ, ΕΙ, ΕΚ-ΕΜ, ЕО-ΕΖ и ΡΑ-Ρ6.
Соединение οχχνίίί (356 мг, 0,52 ммоль) растворяют в ЭСМ (5 мл). К указанному раствору добавляют ΌΜΡ реагент (270 мг, 0,63 ммоль) и перемешивают 1 ч. Реакционную смесь гасят 10% №ь8О3 и затем органическую фазу отделяют и промывают насыщенным NаНСΟ3 и насыщенным раствором соли. После концентрирования органического растворителя остаток очищают хроматографией, используя
Следуя указанному выше способу получения приведенного выше соединения и способам, связанным с получением его промежуточного соединения, но используя соответствующие исходные вещества, получают следующие соединения ΕΙ, ΕΚ-ΕΜ, ΕΟ-ΕΖ и ΡΑ-РН:
- 44 011547
- 45 011547
- 46 011547
Соединения СУ-ОС.
Соединение сххх (330 мг, 0,46 ммоль) растворяют в ЭСМ (5 мл). К указанному раствору добавляют ΌΜΡ реагент (240 мг, 0,56 ммоль) и перемешивают 1 ч. Реакционную смесь гасят 10% Ыа28О3 и органическую фазу промывают насыщенным №1НСО3 и насыщенным раствором соли.
После концентрирования органической фазы полученный остаток очищают хроматографией, используя 100% ЕЮЛс, получают соединение сххх (280 мг, 85,9%).
Следуя указанному выше способу получения приведенного выше соединения и способам, связанным с получением его промежуточного соединения, но используя соответствующие исходные вещества, получают следующие соединения СХУ-ЭС:
- 47 011547
Пример 29. Соединения ЭЭ-ЭЕ.
К ЭСМ раствору (6 мл) соединения схххуш (400 мг, 0,57 ммоль) добавляют ЭМР реагент (362 мг, 0,85 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч и гасят 10% №38О3 (водн.) в течение 20 мин. Полученную смесь экстрагируют ЕЮАс. Экстрагированную органическую фазу промывают насыщенным раствором соли, сушат над Мд8О4 и концентрируют, получая желтое масло. Очистка на силикагеле (7 0% ЕЮАс/гексаны) дает соединение ЭЭ (201 мг, 51%).
Следуя указанному выше способу получения приведенного выше соединения и способам, связанным с получением его промежуточного соединения, но используя соответствующие исходные вещества, получают следующее соединение ЭЕ:
Соединение сххххш (165 мг, 0,24 ммоль) растворяют в ЭСМ (5 мл). К раствору добавляют ЭМР реагент (125 мг, 0,29 ммоль) и перемешивают 1 ч. Реакционную смесь гасят 10% №ь8О3 и органическую фазу промывают насыщенным NаНСО3 и насыщенным раствором соли. После концентрирования органической фазы полученный остаток очищают хроматографией, используя 70% ЕЮАс/гексан, получают соединение ЭР (108 мг, 65,6%).
Пример 31. Соединения ЭС-ЭР
К раствору соединения сП (0,350 г, 0,516 ммоль) в ЭСМ (15 мл), охлажденному на ледяной бане, добавляют ЭМР реагент (0,281 г, 0,671 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч, затем гасят 10% раствором №38О3 и перемешивают в течение 20 мин. Полученную смесь экстрагируют ЭСМ (3x20 мл) и органический экстракт сушат (Мд8О4). После фильтрования с целью удаления Мд8О4, фильтрат концентрируют и очищают хроматографией на колонке (70% этилацетат/гексаны), получая конечное соединение ЭС (0,265 г, 76%) в виде белого твердого вещества.
Следуя указанному выше способу получения приведенного выше соединения и способам, связан
- 48 011547 ным с получением его промежуточного соединения, но используя соответствующие исходные вещества, получают следующие соединения ПН-01:
Пример 32. Соединения ΏΚ-ΏΝ.
ОСМ раствор соединения с1.\ (108 мг, 0,123 ммоль) обрабатывают ОМР реагентом (78 мг, 0,185 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 1 ч реакционную смесь разбавляют ЕГОАс (50 мл) и затем гасят 10% №ь8О3,. После перемешивания в течение 30 мин органическую фазу отделяют и промывают NаНСΟз и насыщенным раствором соли. Органическую фазу сушат и концентрируют в вакууме, получая остаток, который очищают хроматографией на силикагеле (80% ЕГОАс/гексан), что дает соединение ΏΚ (84 мг, 78%)
Следуя указанному выше способу получения приведенного выше соединения и способам, связан ным с получением его промежуточного соединения, но используя соответствующие исходные вещества, получают следующие соединения ОЬ-ΟΝ
Пример 33. Соединения ОО-Э8.
ЕГОН раствор (10 мл) соединения с1.\й (174 мг, 0,189 ммоль) гидрируют, используя Рб/С (30% экв., 60 мг, 10% содержание палладия) в течение 2,5 ч. Затем катализатор отфильтровывают. Полученный фильтрат концентрируют в вакууме, получая остаток, который очищают полупрепаративной хроматографией с обращенной фазой и лиофилизуют, получая соединение ОО с 70% выходом
- 49 011547
Следуя указанному выше способу получения приведенного выше соединения и способам, связанным с получением его промежуточного соединения, но используя соответствующие исходные вещества, получают следующие соединения ЭР-Э8:
Пример 34. Соединение С^.
Соединение с1хш (175 мг, 0,24 ммоль) поглощают ЭСМ (3 мл). К указанному раствору добавляют ЭМР реагент (120 мг, 0,28 ммоль) и перемешивают 1 ч. Реакционную смесь гасят 10% Να:8( )3 и промывают насыщенным ΝαΙ ΙΟ'Τ и насыщенным раствором соли. Очистка 70% ЕЮАс дает соединение СУ (134 мг, 75%).
Пример 35. Соединения СУ и ОТ-ЭХ.
К ЭСМ раствору (15 мл) с1хх11 (290 мг, 0,43 ммоль) добавляют ЭМР реагент (239 мг, 0,56 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч и гасят 10% Να:8( )3 в течение 20 мин. Образовавшуюся смесь затем экстрагируют ЕЮЛс. Органический слой промывают насыщенным раствором соли, сушат и концентрируют в вакууме. Полученный остаток очищают хроматографией на силикагеле (8-100% ЕЮАс/гексан), получая соединение СУ (151 мг, 52%).
Следуя указанному выше способу получения приведенного выше соединения и способам, связанным с получением его промежуточного соединения, но используя соответствующие исходные вещества, получают следующие соединения ЭТ-ЭХ:
- 50 011547
Пример 36. Соединения ΌΥ.
Соединение 1χχχν (1,17 ммоль) поглощают ЭСМ (5 мл). К указанному раствору добавляют ЭМР реагент (545 мг, 1,3 ммоль) и перемешивают 1 ч. Реакционную смесь гасят Р-№ь8О3 (1,5 ммоль/г полимера) и перемешивают один час. Добавляют Р-ΊΈΌ полимерный поглотитель* (2,5 ммоль/г полимера) и перемешивают 45 мин. Полученную смесь фильтруют и очищают 50% Е!ОАс, получая соединение ΌΥ (440 мг, 50,2% за две стадии).
*Ссылка относительно Р-ТВЭ полимерного поглотителя: I. Раг1о\г е! а1. Те!гайебгоп. 55, 6785-6796 (1999).
Пример 37. Соединение ΌΖ.
Исходное вещество, соединение Οχχχχί (94 мг, 0,14 ммоль), растворяют в смеси ТГФ (10 мл) и ОСМ (20 мл). Затем добавляют ОМР реагент (118 мг, 0,28 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 2 ч, реакционную смесь переносят в делительную воронку, содержащую Ότι 8оА ТГФ (120 мл). Реакционную смесь промывают 10% №ь8О3 (50 мл) и затем насыщенным раствором соли (75 мл). Затем органический слой отделяют, сушат над Мд8О4 и растворитель удаляют при пониженном давлении. После хроматографии (силикагель: элюирование смесью 50% Ότι 8о1т ТГФ/Е!ОАс и затем 4% МеОН/ТГФ), фракции анализируют МС. Соответствующие фракции лиофилизуют, получая соединение ΌΖ (38,8 мг, 41%).
Исходное соединение Οχχχχν (185 мг, 0,26 ммоль) растворяют в ТГФ (20 мл). Затем добавляют ОМР реагент (219 мг, 0,52 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 1 ч ТСХ свидетельствует о завершении превращения в кетон (5% МеОН/ТГФ). Реакционную смесь переносят в делительную воронку, содержащую Ότι 8оА ТГФ (120 мл). Реакционную смесь промывают 10% №ь8О3 (50 мл) и затем насыщенным раствором соли (75 мл). Затем органический слой отделяют, сушат над Мд8О4 и растворитель удаляют при пониженном давлении, получая остаток, который очищают хроматографией (силикагель: элюирование смесью 50% Ότι 8о1т ТГФ/Е!ОАс и затем 4% МеОН/ТГФ), и фракции контролируют по УФ и МС. Подходящие фракции лиофилизуют, получая соединение ЕА (159 мг, 88%).
Следуя указанному выше способу получения приведенного выше соединения и способам, связанным с получением его промежуточного соединения, но используя соответствующие исходные вещества, получают следующее соединение ЕВ:
Пример 39. Соединения ЕС-ЕО.
К раствору соединения ^χχχχνίίί (0,341 г, 0,503 ммоль) в ОСМ (15 мл), охлажденному на ледяной бане добавляют ОМР реагент (0,277 г, 0,654 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч, затем гасят 10% раствором №ь8О3 и перемешивают в течение 20 мин. Полученную смесь экстрагируют ОСМ (3х 20 мл) и органический экстракт сушат (Мд8О4). После фильтрования с целью удаления Мд8О4 фильтрат концентрируют и очищают хроматографией на колонке (70% Е!ОАс/гексан), получая соединение ЕС (0,183 г, 54%) в виде белого твердого вещества.
Следуя указанному выше способу получения приведенного выше соединения и способам, связанным с получением его промежуточного соединения, но используя соответствующие исходные вещества, получают следующее соединение ЕО:
- 51 011547
Соединение ссп (290 мг, 0,37 ммоль) поглощают ЭСМ (5 мл). К указанному раствору добавляют ΌΜΡ реагент (175 мг, 0,41 ммоль) и перемешивают 1 ч. Реакционную смесь гасят Р-Ка28О3 (1,5 ммоль/г полимера) и перемешивают 1 ч. Погашенный ЭМР реагент поглощают Р-ΤΒΌ (2,5 ммоль/г полимера) и перемешивают 1 ч. Полученную смесь фильтруют и промывают ЭСМ. прежде чем сконцентрировать до остаточного продукта. Полученный остаток очищают 50% ЕЮАс/Гексан, получая соединение ЕЕ (440 мг, 28%).
Следуя указанному выше способу получения приведенного выше соединения и способам, связан ным с получением его промежуточного соединения, но используя соответствующие исходные вещества, получают следующие соединения ЕЕ-ЕС:
Пример 41. Соединение ЕН.
К ЭСМ раствору (3 мл) соединения ссш (140 мг, 0,2 ммоль) добавляют ЭМР реагент (133 мг, 0,3 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч и гасят 10% Ν;·ι28Ο3 (водн.) в течение 20 мин. Полученную смесь экстрагируют Е1ОАс. Органический слой промывают насыщенным раствором соли, сушат над Мд8О4, концентрируют до желтого масла, которое очищают на силикагеле (70% ЕЮАс/гексан), и затем лиофилизуют, получая соединение ЕН (50 мг, 38%).
Пример 42. Соединение ЕЕ
Соединение Ιχχχίίί (520 мг, 1 ммоль) поглощают ЭСМ (5 мл). К указанному выше раствору добавляют РуВОР (624 мг, 1,2 ммоль) и перемешивают 5 мин. Соединение сН-νίίί (300 мг, 1,2 ммоль) в ТГФ (5 мл) добавляют по каплям к указанному раствору, с последующим добавлением Э1РЕА (0,22 мл, 1,2 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи в атмосфере азота. По прошествии указанного времени реакционную смесь разбавляют Е1ОАс, промывают насыщенным №1НСО3 и насыщенным раствором соли. Органическую фазу сушат Мд8О4, фильтруют и концентрируют, получая неочищенный промежуточный продукт сочетания сфу.
Промежуточное соединение с01.\ (~1 ммоль) поглощают ЭСМ (10 мл). К полученному раствору добавляют периодинан Десс-Мартина (466 мг, 1,1 ммоль). После перемешивания в течение 1 ч при комнатной температуре реакционную смесь гасят полимерносвязанным Ν;·ι28Ο3, (740 мг, 1,5 ммоль ЭМР/г полимера) и перемешивают 45 мин. Затем реакционную смесь очищают от примесей с помощью полимера с полимерносвязанным ΤΒΌ (440 мг, 2,5 ммоль ЭМР/г полимера). Полученную смесь перемешивают 45 мин и затем фильтруют. Очистку выполняют в 5% ЕЮН/ЕЮАс, получая соединение Е1 (245 мг, 32% за 2 стадии). Литературная ссылка по методике обработки может быть найдена в Тс1га11сйгоп 55 (1999) 67856796.
Пример 43. Соединение ЕК
- 52 011547
Промежуточное соединение οάνΐΐ (415 мг, 0,59 ммоль) поглощают ЭСМ (10 мл) и ТГФ (10 мл). Добавляют трет-ВиОН (300 мкл) с последующим добавлением периодинана Десс-Мартина (750 мг, 1,77 ммоль). Реакционную смесь перемешивают 50 мин и затем гасят Р-Ыа28О3 (1,5 ммоль ΌΜΡ/г полимера). После перемешивания в течение 20 мин при комнатной температуре реакционную смесь очищают от примесей с помощью Ρ-ΤΒΌ (2,5 ммоль ΌΜΡ/г полимера). После перемешивания в течение 1 ч полученную смесь фильтруют и концентрируют. Продукт очищают хроматографией на силикагеле (50-70% ЕЮЛс/гексан), получая соединение ΕΝ (220 мг, 53%).
В приведенной ниже табл. 1 приведены масспектральные [М], полученные для перечисленных соединений.
Таблица 1
Пример Найденная масса
А 7333
В 747.2
С 657.2
П 769.4
Е 733.4
Р 625.4
О 639.3
н 661.4
I 643.4
I 707.3
к 641.3
ь 689.3
м 639.3
N 639.4
О 731.4
Р 687.4
О 653.4
к 701.4
5 639.3
Т 747.1
и 655.4
V 653.4
V 703.4
X 661.3
Υ 647.3
2 663.3
АЛ 667.4
АВ 711.4
АС 725.4
АП 647.3
АЕ 779.4
АР 6893
АО 6714
АХ 806.4
АН 687.5
ΑΙ 735.4
ΑΙ 736.5
АМ 870.4
ΑΝ 8133
АР 724.4
АО 653.4
АВ 628.2
Αίν 642.2
АХ 6143
ΑΥ 6283
Βϋ 5703
вв 5203
ВР 5343
во 5843
ви 890.3
Βν 685.4
ВТ» 679.3
ВХ 695.3
ΒΥ 6973
ΒΖ 787.4
- 53 011547
СА 7013
СВ 6159.4
СС 733.5
СО 643.3
СЕ 653.5
СН 749.4
а «3.3
а 717.5
СК 683.4
а. 669.3
см 6753
ΟΝ 7173
СО 653.3
СР 683.3
СО 669.3
СК 6753
ст 661.8
С8 639.3
си 6793
СУ 7093
су/ 7433
сх 6953
СУ 6652
ст 6813
РА 6953
РВ 7013
ОС 6733
РР 693.3
РЕ 7574
РР 682.3
РС 6763
РН 676.2
ΟΙ 692.5
ΟΙ 6053
ок 874.4
оь 924.5
ом 924.2
ΡΝ 952.7
ОО 830
РР 8423
от 667.4
υυ 639.2
ρν 7403
ОУ/ 6843
ОХ 6783
ΡΥ 7493
ρζ 6853
ΕΑ 6493
ЕВ 700.3
ЕС 7023
ΕΟ 7303
ЕЕ 7753
ЕР 7493
ΕΟ 7223
ЕН 6652
ΕΙ 796.4
ΕΙ 7443
ΕΚ 730.5
ЕЬ 7303
ЕМ 7573
ΕΝ 7033
ΕΟ 7153
ΕΡ 6793
ΕΟ «13
ΕΚ 7153
Ε5 6683
ΕΤ 7323
Ευ 7433
ЕУ 683.3
Εΐν 750.4
ΕΧ 786.4
ΕΥ 7443
ΕΖ 780.4
ΡΒ 693.4
РС 655.3
ΕΟ «5.3
ЕЕ 774.4
ΡΡ 6813
ΕΟ 6673
- 54 011547
В табл. 2 приведены масс-спектры высокого разрешения (ВРМС) для следующих соединений: Таблица 2
Пример Молекулярная формула (М+1) Рассчитанный (Μ+1) Найденная масса (Μ+1)
Ь Ο37Η52Ν7Ο6 690.3979 690.3986
М Ο33Η50Ν7Ο6 640.3822 640.3822
Ζ €32Η48Ρ2Ν7Ο6 664.3634 664.3627
АВ С36Н48Р2Ю7О6 712.3634 712.3649
СЕ Ο34Η52Ν7Ο6 654.3979 654.3967
ΕΝ С35Н52Ы7О6Р2 704.3947 704.3945
ЕК Ο37Η63Ν6Ο85 751.4428 750.4350 (Μ)
ЕС С36Н59М6О8 703.4395 703.4382
СА С35Н50М706Р2 702.3790 702.3801
ΕΖ С40Н55№О6Е2 781.4213 781.4196
Εϋ Ο36Η52Ν7Ο6Ρ2 716.3947 716.3929
СУ 035Η52Ν7Ο6 666.3979 666.3966
ВХ Ο.37Η58Ν7Ο6 696.4448 696.4432
5 Ο33Η50Ν7Ο6 640.3823 . 640.3831
В^’ С36Н54М7О6 680.4136 680.4126
си Ο36Η54Ν7Ο6 680.4136 680.4128
ЕГ С40Н57Ы8О6 745.4401 745.4417
ЕМ С35Н54Ы7О6 668.4136 668.4139
не обозначен Ο41Η58Ν7Ο6 744.4448 744.4691
Пример полупродукта 1. Соединение ίί.
К этанольному раствору (40 мл) соединения ί (8,1 г, 24,4 ммоль) добавляют ΝαΒ^
I (924 мг, 24,4 ммоль) при -10°С. Реакционную смесь перемешивают при указанной температуре в течение 30 мин и затем гасят АсОН (3 мл). Реакционную смесь разбавляют ЕЮАс (250 мл) и промывают NаНСО3 и насыщенным раствором соли. Органический слой сушат и концентрируют в вакууме, получая остаток, который очищают хроматографией на силикагеле (50% ЕЮАс/гексан), что дает 7,85 г (97%) соединения ίί.
ОН
И
Пример полупродукта 2. Соединение ίίί.
К ТГФ раствору (70 мл) соединения ίί (4,48 г, 13,4 ммоль) добавляют при 0°С №1Н (699 мг, 60%, 17,42 ммоль). После перемешивания при указанной температуре в течение 40 мин добавляют чистый Ме1 (1,25 мл, 20,1 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи. По прошествии указанного времени реакционную смесь осторожно гасят насыщенным раствором ЫН4С1 при 0°С. Реакционную смесь экстрагируют ЕьО и ЕЮАс. Органический слой промывают водой, насыщенным раствором соли и сушат №ь8О4. Полученный таким образом органический слой концентрируют в вакууме, что дает ксантогенат, соединение ίίί.
Ксантогенат, соединение ίίί (~13,4 ммоль), растворяют в толуоле (100 мл). К указанному раствору добавляют АIΒN (216 мг, 1,34 ммоль). Образовавшийся раствор дегазируют сухим азотом и затем обрабатывают н-Βи3§ηН (5,4 мл, 20,1 ммоль). Реакционную смесь нагревают до 90°С в течение 3 ч. По прошествии указанного времени реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и концентрируют в вакууме. Полученный остаток очищают хроматографией на силикагеле (15-20% ЕЮАс/гексан), что дает 2,8 г (66% в расчете на соединение ίί) соединения ίν.
- 55 011547
Пример полупродукта 4. Соединение ν.
К этанольному раствору (21 мл) соединения ίν (1 г, 3,15 ммоль) добавляют Рб(ОН)2/С (655 мг, 20%, 0,95 ммоль) в токе азота. Полученную реакционную смесь гидрируют стандартным способом (1,5 атм). Через 5 ч источник гидрирования удаляют и реакционную смесь фильтруют. Фильтраты концентрируют в вакууме, что дает свободный амин, соединение ν.
Пример полупродукта 5. Соединение νί.
К ЭСМ раствору (10 мл) соединения νίί (629 мг, 1,95 ммоль) добавляют
при температуре, близкой к комнатной, НОА1 (265 мг, 1,95 ммоль) и затем 1М раствор ОСС в ЭСМ (1,95 мл, 1,95 ммоль). После перемешивания в течение 30 мин к НОА1-активированной кислоте добавляют ЭСМ раствор (3 мл) соединения ν (1,5 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи. По прошествии указанного времени реакционную смесь фильтруют через целит. Фильтраты разбавляют Е1ОАс (75 мл) и промывают водой и насыщенным раствором соли. Органический слой сушат и концентрируют в вакууме. Полученный остаток очищают хроматографией на силикагеле (70-80% ЕЮАс/гексан), получая 620 мг (85%) соединения νί.
Пример полупродукта 6. Соединение νίίί.
К этанольному раствору (10 мл) соединения νί (615 мг, 1,26 ммоль) добавляют 2н. водный раствор №ОН (1,26 мл, 2,52 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при температуре, близкой к комнатной, и затем подкисляют до рН 3, используя Эо^ех кислотные смолы. Твердые вещества отфильтровывают и фильтраты концентрируют в вакууме, получая остаток, который вновь растворяют в 1:1 СНзСN/Н2О. Полученный раствор лиофилизуют, что дает 495 мг (85%) соединения νίίί.
Пример полупродукта 7. Соединение ίχ.
К ЭСМ раствору (10 мл) соединения νίίί (230 мг, 0,5 ммоль) добавляют РуВор (417 мг, 0,8 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение 30 мин. К указанному раствору добавляют затем ТГФ раствор (5,25 мл) соединения х (263 мг, 0,75 ммоль)
с последующим добавлением Э1РЕА (0,174 мл, 1 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи и затем гасят водой (30 мл) в течение 30 мин. Реакционную смесь экстрагируют Е1ОАс (100 мл). Органический слой промывают насыщенным раствором соли, сушат и концентрируют в вакууме, получая остаток, который очищают хроматографией на силикагеле (5% ЕЮН/ЕЮАс), получая ~400 мг (100%) соединения ίχ.
Пример полупродукта 8. Соединение χί.
К ЭСМ раствору (10 мл) соединения ίχ (396 мг, 0,5 ммоль) добавляют ЭМР реагент (278 мг, 0,65
- 56 011547 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение 1 ч и затем гасят 10% Ν;·ι28Ο3 в течение 30 мин. Реакционную смесь экстрагируют затем ЕЮАс (75 мл) и промывают насыщенным раствором соли. Органический слой сушат и концентрируют в вакууме. Полученный остаток очищают хроматографией на силикагеле (70% ЕЮАс/гексаны), получая 320 мг (81%) соединения χί.
Пример полупродукта 9. Соединение χίί.
К ЭСМ раствору (10 мл) соединения νίίί (230 мг, 0,5 ммоль) добавляют РуВор (417 мг, 0,8 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение 30 мин. К указанному раствору добавляют ТГФ раствор (3,5 мл) соединения χίίί (140 мг, 0,75 ммоль)
с последующим добавлением ΌΙΡΕΑ (0,174 мл, 1 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи и затем гасят водой (30 мл) в течение 30 мин. Реакционную смесь экстрагируют ЕЮАс (75 мл). Органический слой промывают насыщенным раствором соли, сушат и концентрируют в вакууме, получая остаток, который очищают хроматографией на силикагеле (5% ЕЮН/ЕЮАс), получая с количественным выходом соединение χίί.
Пример полупродукта 10. Соединение ί'.
К метанольному раствору (30 мл) соединения ί (5 г, 15,1 ммоль) добавляют (ВОС)2О (3,3 г, 15,1 ммоль) и Н2/Рб (ОН)2/С (1,6 г, 10% Ρ6 содержание). Реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение 2 ч и затем фильтруют через целит дважды. Слой целита промывают ЭСМ. Объединенные фильтраты концентрируют в вакууме, получая маслянистый остаток, который очищают хроматографией на силикагеле (40% ЕЮАс/гексаны), получая 3,8 г (85%) соединения ί'.
К метанольному раствору (111 мл) соединения 1' (3,7 г, 12,5 ммоль) добавляют при 0°С ΝαΒΗ4 (0,805 г, 21 ммоль). После перемешивания при 0°С в течение 2,5 ч, реакционный растворитель медленно упаривают в вакууме, получая остаток, который разбавляют ЕЮАс. Полученный раствор затем дважды промывают водой. Водный слой экстрагируют ЕЮАс. Объединенные органические слои сушат Мд8О4, фильтруют и концентрируют в вакууме, получая остаток, который очищают хроматографией, что дает 3,76 г (99%) соединения И'.
Пример полупродукта 12. Соединение χίν.
К ОСМ раствору (180 мл) соединения ίί' (3,76 г, 12,3 ммоль) добавляют при 0°С ЭМАГ (5 г, 40,1 ммоль) и затем Τί2Ο (4 мл, 23,7 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при 0°С в течение 1 ч и при температуре, близкой к комнатной, еще 1,5 ч. Реакционную смесь промывают затем дважды 5% ЫаНСО3 и сушат Мд8О4. Полученный таким образом органический слой концентрируют в вакууме, что дает неочищенный трифлат. Полученный трифлат (2,7 г, 6 ммоль) растворяют в ОСМ (120 мл). К указанному раствору добавляют ОМАЕ (2,5 г, 20,5 ммоль). Полученную реакционную смесь кипятят с обратным хо
- 57 011547 лодильником в течение ночи. По прошествии указанного времени реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и промывают дважды 5% №НСО3. Реакционную смесь сушат Мд§О4, фильтруют и концентрируют в вакууме, получая коричневатый маслянистый остаток, который очищают (1% МсОН/ЭСМ). получая 500 мг (30%) соединения χίν.
Пример полупродукта 13. Соединение χν.
Соединение χίν (500 мг, 1,8 ммоль) растворяют в 4н. НС1 в диоксане (6,75 мл). Реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, ~4 ч. По прошествии указанного времени, растворитель удаляют в вакууме. Полученный остаток растирают дважды с диэтиловым эфиром, получая почти с количественным выходом НС1-соль соединения χν.
Пример полупродукта 14. Соединение χνί.
К ТГФ раствору (7 мл) соединения νίί (57 9 мг, 1,8 ммоль) добавляют НОЛ1 (245 мг, 1,8 ммоль) и ОСС (1,8 мл, 1М в ЭСМ). Получают суспензию. После перемешивания при температуре, близкой к комнатной, в течение 15 мин к указанной выше суспензии добавляют ТГФ раствор (6 мл) соединения χν (1,8 ммоль) и ΌΙΡΕΆ (0,63 мл, 3,6 ммоль). Затем добавляют дополнительное количество ΌΙΡΕΆ (0,8 мл). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при температуре, близкой к комнатной. По прошествии указанного времени полученные таким образом белые твердые вещества отфильтровывают. Белые твердые вещества промывают ТГФ. Объединенные фильтраты и промывные воды концентрируют в вакууме, получая неочищенный продукт, который очищают хроматографией на силикагеле (100% ЕЮЛс), что дает 665 мг (76%) соединения χνί.
Пример полупродукта 15. Соединение χνίί.
К этанольному раствору (8 мл) 7 (665 мг, 1,37 ммоль) добавляют 1н. водный ЫаОН (2,4 ммоль) при 0°С. Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при температуре, близкой к комнатной, и затем подкисляют до рН 3, используя Όο^βχ кислотные смолы. Твердые вещества фильтруют. Полученные фильтраты концентрируют в вакууме, получая бледно-желтый остаток, который вновь растворяют в 1:1 СН3СЫ/Н2О и лиофилизуют, получая 467 мг (74%) соединения χνίί.
Пример полупродукта 16. Соединение χίχ.
ЭСМ раствор (4 мл) соединения χνίί (100 мг, 0,22 ммоль) обрабатывают РуВор (207 мг, 0,4 ммоль) при температуре, близкой к комнатной, в течение 20 мин. По прошествии указанного времени полученный раствор обрабатывают ТГФ раствором (2,6 мл) соединения χνίίί (65 мг, 0,32 ммоль)
и затем ΌΙΡΕΆ (0,076 мл). После перемешивания при температуре, близкой к комнатной, в течение 7 ч реакционную смесь гасят водой. Реакционную смесь разбавляют ЭСМ (60 мл). Органический слой отделяют, промывают дважды насыщенным раствором соли и сушат Мд§О4. После фильтрования, концентрирования и хроматографии на силикагеле (5% ЕЮН/ЕЮЛс) получают 148 мг (~100%) соединения χίχ.
- 58 011547
Пример полупродукта 17. Соединение хх.
К ТГФ раствору (100 мл) Ν-СЬх-Ь-валина (14,4 г, 57,2 ммоль) добавляют НОВТ (7,72 г, 57,2 ммоль) и ΕΌΟ (10,98 г, 57,2 ммоль). После перемешивания при температуре, близкой к комнатной, в течение 20 мин, к полученному раствору добавляют ТГФ раствор (50 мл), содержащий гидрохлорид метилового эфира трет-Ь-лейцина (10,4 г, 57,2 ммоль) и ΌΙΡΕΑ (11,9 мл, 68,7 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи. После стандартной водной обработки и хроматографии на силикагеле (30% ΕΐΟΑс/гексаны) получают 14 г (64%) соединения хх.
Пример полупродукта 18. Соединение χχί.
К метанольному раствору (80 мл) хх (6,71 г, 17,7 ммоль) добавляют (в токе Ν2) Рб/С (1,88 г, 10% Рб содержание). Содержимое сосуда гидрируют (1 атм Н2) в течение ночи при температуре, близкой к комнатной. По прошествии указанного времени реакционную смесь фильтруют через слой целита и концентрируют в вакууме, что дает соответствующий неочищенный свободный амин для следующей стадии. ТГФ раствор указанного амина (~17,7 ммоль) добавляют к ТГФ (46 мл) и ДМФ (5 мл) раствору, содержащему 2-пиразинкарбоновую кислоту (2,85 г, 23 ммоль), НоЬЬб (3,12 г, 23 ммоль) и ΕΩΟΙ (4,41 г, 23 ммоль). К образовавшейся смеси добавляют затем ΌΣΓΕΑ (3,08 г, 17,7 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при температуре, близкой к комнатной, и затем гасят водой. Реакционную смесь экстрагируют ΕίΌΑο. Органический слой промывают насыщенным раствором соли и концентрируют в вакууме, что дает остаток, который очищают хроматографией на силикагеле (40-50% ΕΐΟΑс/гексан), получая 3,9 г (63%) соединения χχί.
Пример полупродукта 19. Соединение χχίί.
К метанольному раствору (40 мл) соединения χχί (4,67 г, 13,34 ммоль) добавляют 2н. №1ОН (10 мл, 20 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение 2 ч. По истечении указанного времени к реакционной смеси добавляют 2н. №ОН (3,3 мл, 6,67 ммоль). После перемешивания при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи, реакционную смесь подкисляют до рН 3, используя кислотную смолу. Реакционную смесь затем фильтруют и фильтраты концентрируют в вакууме, получая остаток, который растворяют в 1:1 СН3СН/Н2О для лиофилизации. Получают 4,15 г (93%) соединения χχίί.
он
Пример полупродукта 20. Соединение χχίίί.
ЭСМ раствор (10 мл) соединения χχίί (917 мг, 2,73 ммоль) обрабатывают НΟΑΐ (371 мг, 2,73 ммоль) и ОСС (2,73 мл, 1 М, 2,73 ммоль). После перемешивания в течение 30 мин реакционную смесь обрабатывают ТГФ раствором (10 мл) соединения ν (500 мг, 2,73 ммоль). После перемешивания при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи, отфильтровывают белые твердые вещества (мочевину). Фильтраты концентрируют в вакууме, получая остаток, который очищают хроматографией на силикагеле (60-7 0% ΕΐΟΑс/гексан), что дает 1,06 г (77%) соединения χχίίί.
Пример полупродукта 21. Соединение χχίν.
Этанольный раствор (20 мл) соединения χχίίί (1,06 г, 2,11 ммоль) обрабатывают 2н. №1ОН (2,11 мл, 4,23 ммоль). После перемешивания при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи, реакционную смесь подкисляют до рН 3 с помощью кислотной смолы. Твердые вещества отфильтровывают. Полученные фильтраты концентрируют в вакууме, что дает остаток, который лиофилизуют, получая ~1г (100%) соединения χχίν.
он
- 59 011547
Пример полупродукта 22. Соединение χχν.
ЭСМ раствор (10 мл) соединения χχίν (236,7 мг, 0,5 ммоль) обрабатывают РуВор (417 мг, 0,8 ммоль). После перемешивания при температуре, близкой к комнатной, в течение 20 мин, реакционную смесь обрабатывают ДМФ раствором (5,6 мл) соединения χίίί (139,5 мг, 0,75 ммоль) и затем О1РЕА (0,174 мл, 1 ммоль). После перемешивания при температуре, близкой к комнатной, в течение 8 ч, реакционную смесь гасят водой и экстрагируют ЕГОАс. Полученный органический слой промывают насыщенным раствором соли, сушат и концентрируют в вакууме, получая остаток, который очищают хроматографией на силикагеле (5% ЕГОН/ЕГОАс), получая ~320 мг (100%) соединения χχν.
Пример полупродукта 23. Соединение χχνί.
ЭСМ раствор (15 мл) соединения χχίν (355 мг, 0,75 ммоль) обрабатывают РуВор (622 мг, 1,2 ммоль). После перемешивания при температуре, близкой к комнатной, в течение 20 мин, реакционную смесь обрабатывают ТГФ раствором (10 мл) соединения χχνίί' (156 мг, 0,75ммоль) и затем О1РЕА (0,26 мл, 1,5 ммоль). После перемешивания при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи, реакционную смесь гасят водой и экстрагируют ЕГОАс. Полученный органический слой промывают насыщенным раствором соли, сушат и концентрируют в вакууме, получая остаток, который очищают хроматографией на силикагеле (2% ЕГОН/ЕГОАс), получая ~400 мг (80%) соединения χχνί.
Пример полупродукта 24. Метил 5-цианопентаноат.
Цианид калия (4 г, 61,44 ммоль) растворяют в 70 мл воды и 200 мл метанола. К раствору добавляют 10 г (51,2 ммоль) метил 5-бромпентаноата и смесь нагревают до температуры кипения с обратным холодильником в течение ночи. Реакционную смесь концентрируют досуха. К остатку добавляют 100 мл ЕГОАс для экстракции продукта. Органическую фазу трижды промывают водой, сушат и концентрируют, получая 5,37 г (74%) метил 5-цианопентаноата в виде масла.
Пример полупродукта 25. Метил 5-тетразол-5-илпентаноат.
Метил 5-цианопентаноат (4,8 г, 34 ммоль) растворяют в толуоле, добавляют триэтиламмонийхлорид (14 г, 102 ммоль) и азид натрия (6,63, 102 ммоль). Смесь нагревают до температуры кипения с обратным холодильником в течение ночи. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, добавляют воду для экстракции (3x100 мл) метил-5-тетразол-5-илпентаноата из органической фазы. К водной фазе добавляют концентрированную НС1 для доведения рН до 2. Продукт экстрагируют из водного раствора с помощью ЕГОАс (3x50 мл). Органические фазы объединяют, сушат и концентрируют, получая 4,25 г (68%) метил 5-тетразол-5-илпентаноата.
Пример полупродукта 26. Метил 5-|Л-(1,1-диметилбензил)тетразол-5-ил]пентаноат.
Метил 5-тетразол-5-илпентаноат (4,23 г, 23 ммоль) и трихлоруксусную кислоту (8,69 г, 53 ммоль) растворяют в 50 мл СНС13. К раствору добавляют по каплям α-метилстирол (2,72, 23 ммоль) и реакционную смесь оставляют перемешиваться при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи. Реакционную смесь разбавляют ЕГОАс до 200 мл и органический слой промывают 10% водным КОН и насыщенным раствором соли. Органический слой сушат, концентрируют. Продукт очищают флэш хроматографией на колонке, получая 6,6 г (95%) метил 5-|Л-(1,1-диметилбензил)тетразол-5-ил]пентаноата.
Пример полупродукта 27. 5-|Л-(1,1-диметилбензил)тетразол-5-ил]пентановая кислота.
Метил 5-|Л-(1,1-диметилбензил)тетразол-5-ил]пентаноат (6,6 г, 21,8 ммоль) растворяют в метаноле (100 мл) и добавляют 23 мл 1н. водного №1ОН. Смесь перемешивают в течение ночи и концентрируют для удаления метанола. Остаток растворяют в воде (100 мл) и раствор нейтрализуют добавлением эквивалентного количества 1н. водной НС1. Продукт экстрагируют ЕГОАс (3x50 мл). Органическую фазу су
- 60 011547 шат и концентрируют, получая 4,75 г (75%) 5-Щ-(1,1-диметилбензил)тетразол-5-ил]пентановой кислоты. Пример полупродукта 28. Соединение ххуш.
5-Щ-(1,1-диметилбензил)тетразол-5-ил]пентановую кислоту (4,75 г, 16,5 ммоль) растворяют в ЭСМ (100 мл), добавляют 4,8 г (24,8 ммоль) ЕОС.Ч и 6 мл Э1РЕА. К смеси добавляют Ν-гидроксилсукцинимид (3,8 г, 33 ммоль). Реакционную смесь перемешивают 3 ч при температуре, близкой к комнатной. Смесь разбавляют ЭСМ до 200 мл и раствор трижды промывают водой. Органическую фазу сушат и концентрируют, получая 4,79 г (75%) соединения ххуш.
Пример полупродукта 29. Соединение хх1х.
Дипептид Н-Уа1-Уа1-ОН (3,22 г, 14,9 ммоль) суспендируют в 50 мл Ν,Ν-диметилформамида (ДМФ) и добавляют 4,75 г (12,42 ммоль) соединения ххуш с последующим добавлением 3,4 мл (18,63 ммоль) диизопропилэтиламина (ОГРЕЛ). Смесь нагревают до 40°С и перемешивают в течение ночи. Растворитель упаривают в вакууме. Остаток растворяют в ЕГОАс и промывают 1н. НС1 и насыщенным раствором соли, получая 5,52 г (91%) соединения хх1х.
Пример полупродукта 30. Соединение ххх.
1,6 г (3,29 ммоль) соединения хх1х растворяют в 20 мл ЭСМ, добавляют 3,3 мл 1 М раствора ОСС в ТГФ. К смеси добавляют 500 мг (2,73 ммоль) соединения ν. Смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи. Смесь разбавляют ЕГОАс до 100 мл и промывают 1н. НС1, NаНСΟ3 и насыщенным раствором соли. Очищают хроматографией на колонке (50% ЕГОАс/гексан), получая 1,02 г (58%) соединения ххх.
Пример полупродукта 31. Соединение ххх1.
Соединение ххх (1,02 г, 1,57 ммоль) растворяют в 10 мл МеОН и добавляют 2 мл 1н водного №1ОН. Смесь перемешивают в течение ночи. Метанол удаляют упариванием и остаток растворяют в воде и нейтрализуют 2 мл НС1. Последующая экстракция ЕГОАс дает 1,00 г (~100%) соединения ххх1.
Пример полупродукта 32. Соединение хххи.
Соединение ххх1 (300 мг, 0,48 ммоль) и РуВор (300 мг, 0,58 ммоль) растворяют в 10 мл ЭСМ. К раствору добавляют соединение х (201 мг, 0,58 ммоль) и затем добавляют ОГРЕА (104 мкл). Смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи. Реакционную смесь разбавляют затем ЕГОАс до 100 мл и промывают дважды 1н. НС1, дважды NаНСΟ3 и трижды насыщенным раствором соли. Органическую фазу сушат и концентрируют. Остаток очищают хроматографией на колонке (100% ЕГОАс), получая 450 мг (98%) соединения хххи.
- 61 011547
Пример полупродукта 33. Соединение χχχίίί.
Соединение χχχίί 360 мг (0,38 ммоль) растворяют в 8 мл ЭСМ и добавляют 240 мг (0,57 ммоль) ЭМР реагента. Смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение трех часов. Смесь разбавляют ΕΐΘΑс до 50 мл и трижды промывают насыщенным раствором соли. Продукт очищают хроматографией на колонке (25% этанол^ЮАс), получая 300 мг (83%) соединения χχχίίί.
Пример полупродукта 34. Соединение χχχίν.
К ЭСМ раствору (10 мл) χχχν
(790 мг, 2,80 ммоль) добавляют РуВор (1,7 г, 3,36 ммоль) и НоЬЬй (450 мг, 3,36 ммоль). Образовав шийся раствор охлаждают до 0°С и обрабатывают ЭСМ раствором (3 мл) (з)-а-(4-пиридил)этиламина (410 мг, 3,36 ммоль). Затем добавляют Э1РНА (0,5 мл, 3,36 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при температуре, близкой к комнатной. По прошествии указанного времени реакционную смесь разбавляют ΕΐΘΑс. Весь объем промывают насыщенным NаΗСΘз и насыщенным раствором соли. Полученный таким образом органический слой сушат и концентрируют в вакууме. Полученный остаток очищают хроматографией на силикагеле (5% ΕΐΘΗ/ΕΐΘΑс), что дает 630 мг (58%) соединения χχχίν.
Примечание: (з)-а-(4-пиридил)этиламин получают из его соли, Ό-тартрата, путем промывки основанием (1н NаΘΗ) и последующей экстракцией ΕΐΘΑс. Степень выделения составляет 89%.
Пример полупродукта 35. Соединение χχχνί.
К метанольному раствору (15 мл) соединения χχχίν (630 мг, 1,64 ммоль) добавляют в атмосфере Ν2 Рб/С (150 мг, 10% содержание палладия). Реакционную смесь перемешивают в атмосфере Н2 в течение ночи. Реакционную смесь фильтруют через слой Се1бе® 521. Фильтраты концентрируют в вакууме, получая 420 мг (~100%) соединения χχχνί.
Пример полупродукта 36. Соединение χχχνίί.
К ЭСМ раствору (3 мл) соединения χχχί (27 0 мг, 0,43 ммоль) добавляют РуВор (270 мг, 0,52 ммоль). Затем добавляют соединение χχχνί (160 мг, 0,64 ммоль) и Э1РНА (0,09 мл, 0,52 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи. По прошествии указанного времени реакционную смесь разбавляют ΕΐΘΑс и промывают 0,1н. НС1, затем насыщенным ΝιΗСΘз и насыщенным раствором соли. Полученный органический слой сушат и концентрируют, получая соединение χχχνίί (430 мг общей массой) для следующей стадии.
Пример полупродукта 37. Соединение χχχνίίί.
- 62 011547
К ЭСМ раствору (3 мл) соединения χχχνίί (370 мг, 0,43 ммоль) добавляют ЭМР реагент (280 мг, 0,65 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение 2 ч и затем гасят 10% №ь803. После перемешивания в течение 30 мин реакционную смесь экстрагируют ЕЮАс. Органический слой промывают насыщенным NаНС03 и насыщенным раствором соли. Полученный органический слой сушат и концентрируют в вакууме, получая остаток, который очищают хроматографией на силикагеле (5% ЕЮН/ЕЮАс), что дает 180 мг (49% для 2 стадий) соединения χχχνίίί.
Пример полупродукта 38. Соединение хххх.
Соединение χχίχ (2,5 г, 5 ммоль) растворяют в 40 мл ЭСМ, к раствору добавляют 5,1 мл 1 М раствора ЭСС в ТГФ. К полученной смеси добавляют 1,08 г (3,53 ммоль) соединения χχχίχ. Смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи.
Смесь разбавляют ЕЮАс до 100 мл, промывают последовательно 1н. НС1, NаНС03 и насыщенным раствором соли и затем очищают хроматографией на колонке (80% ЕЮАс/гексан), получая 2,59 г (95%) соединения хххх.
хххх
Пример полупродукта 39. Соединение χχχχί.
Соединение хххх (2,59 г, 3,35 ммоль) растворяют в 20 мл МеОН и добавляют 4 мл 1н. водного №ЮН. Смесь перемешивают в течение ночи и затем упаривают на роторном испарителе до получения остатка. Остаток растворяют в воде и нейтрализуют 2 мл НС1. Нейтрализованный раствор затем экстрагируют ЕЮАс, получая 2,49 г (~100%) соединения χχχχί.
Пример полупродукта 40. Соединение χχχχίί.
Соединение χχχχί (847 мг, 1,16 ммоль) и 724 мг (1,39 ммоль) РуВор растворяют в 10 мл ЭСМ. К раствору добавляют соединение χίίί (260 мг, 1,39 ммоль) с последующим добавлением ЦГРЕА (209 мкл). Смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи. Реакционную смесь разбавляют затем ЕЮАс до 100 мл и промывают дважды 1н. НС1, дважды №1НС03, и трижды насыщенным раствором соли. Органическую фазу сушат и концентрируют. Остаток очищают хроматографией на колонке (5% этанол/ЕЮАс), получая 930 мг (86%) соединения χχχχίί.
Пример полупродукта 41. Соединение χχχχίίί.
- 63 011547
Соединение χχχχίί (350 мг, 0,38 ммоль) растворяют в 10 мл ЭСМ и добавляют 242 мг (0,57 ммоль) ЭМР реагента. Смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение трех часов. Смесь разбавляют ЕЮАс до 50 мл и промывают трижды насыщенным раствором соли. Продукт очищают хроматографией на колонке (100% ЕЮАс), получая 180 мг (51%) соединения χχχχίίί.
ххххШ
Пример полупродукта 42. Соединение χχχχν.
Н-Уа1-Уа1-ОН (5 г, 23 ммоль) суспендируют в 100 мл ДМФ, добавляют соединение χχχχίν
(8,3 г, 27,6 ммоль) и затем добавляют 6,2 мл (35,5 ммоль) Э1РЕА. Смесь перемешивают при 40° С в течение двух дней. Растворитель удаляют при глубоком вакууме, остаток растворяют в 100 мл ЕЮАс и промывают трижды 1н. НС1 и дважды насыщенным раствором соли. Получают 9,14 г (99%) соединения χχχχν.
Пример полупродукта 43. Соединение χχχχνί.
Соединение χχχχν (2,8 г, 7 ммоль) и 954 мг (7 ммоль) НОА1 растворяют в 100 мл ЭСМ. Добавляют 7 мл 1 М ЭСС/ЭСМ. К реакционной смеси добавляют соединение χχχίχ (2,15 г) и реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи. Смесь концентрируют досуха и остаток растворяют в ЕЮАс и очищают хроматографией на колонке (100% ЕЮАс), получая 4,57 г (95%) соединения χχχχνί.
Пример полупродукта 44. Соединение χχχχνίί.
Соединение χχχχνί (4,57 г, 6,65 ммоль) растворяют в 10 мл ТЕА и 10 мл ЭСМ. Смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение 4 ч. Растворитель удаляют в вакууме и остаток растворяют в 50:50 смеси ацетонитрил/вода и лиофилизуют, получая соединение χχχχνίί в виде порошка.
Пример полупродукта 45. Соединение χχχχνίίί.
Соединение χχχχνίί (1 г, 1,59 ммоль) и 990 мг (2,28 ммоль) РуВор растворяют в 20 мл ЭСМ и добавляют 1,6 мл 1 М метиламина в ТГФ. Смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение 4 ч. Реакционную смесь разбавляют до 100 мл ЕЮАс и промывают 1н. НС1, №1НСО3 и насыщенным раствором соли. Остаток очищают флэш хроматографией на колонке (10% ЕЮН/ЕЮАс), получая 1 г (98%) соединения χχχχνίίί.
- 64 011547
Пример полупродукта 46. Соединение χχχχίχ.
Соединение χχχχνίίί (1 г, 1,55 ммоль) растворяют в 10 мл МеОН и добавляют 2 мл 1н. №ОН. Смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи. Растворитель удаляют упариванием. Остаток растворяют в воде, нейтрализуют и экстрагируют Е1ОАс, получая 960 мг (98%) соединения χχχχίχ.
Пример полупродукта 47. Соединение 11.
Соединение χχχχίχ (315 мг, 0,5 ммоль) и 312 мг (0,6 ммоль) РуВор растворяют в 10 мл ЭСМ. Добавляют соединение 1 (56 мг, 0,6 ммоль) и 108 мкл ОГРЕЛ.
Смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи и разбавляют до 100 мл ЕЮАс и промывают 1н.НС1, NаНСОз и насыщенным раствором соли. Очищают хроматографией на колонке (15% ЕЮН/ЕЮАс), получая 400 мг (92%) соединения 11.
Пример полупродукта 48. Соединение 1ίί.
Соединение 11 (400 мг, 0,46 ммоль) растворяют реагента. Смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение 3 ч. Растворитель удаляют упариванием и продукт очищают ОФ-ВЭЖХ, получая 130 мг (32%) соединения 1ίί.
в 10 мл ЭСМ и добавляют 292 мг (0,69 ммоль) ЭМР
Пример полупродукта 49. Соединение 1ш.
Соединение χχχχίχ (210 мг, 0,33 ммоль) и 208 мг (0,4 ммоль) РуВор растворяют в 10 мл ЭСМ. К раствору добавляют соединение χίίί (154 мг, 0,83 ммоль) с последующим добавлением ОГРЕА (72 мкл, 0,4 ммоль). Смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи. Реакционную смесь разбавляют до 100 мл с помощью ЕЮАс, промывают 1н. НС1, NаНСОз и насыщенным раствором соли и затем очищают флэш хроматографией на колонке (10% ЕЮН/ЕЮАс), получая 250 мг (95%) соединения 1ϊϊΐ.
- 65 011547
Пример полупродукта 50. Соединение 1ίν.
Соединение χχχχν (755 мг, 1,88 ммоль) и 255 мг (1,88 ммоль) НОА! растворяют в 20 мл ЭСМ. Добавляют 1,88 мл 1 М ЭСС/ЭСМ. К реакционной смеси добавляют соединение ν (2 88 мг) и реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение 2 ч. Смесь концентрируют досуха, остаток растворяют в Е!ОАс и очищают хроматографией на колонке (80% ЕЮАс/гексан), получая 800 мг (90%) соединения 1ίν.
Пример полупродукта 51. Соединение 1ν.
Соединение 1ίν (800 мг, 1,41 ммоль) растворяют в 10 мл МеОН и добавляют 2 мл ЫаОН. Смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи. Растворитель удаляют в вакууме, остаток растворяют в воде и нейтрализуют 2 мл 1н. НС1. Продукт экстрагируют Е!ОАс. Упаривание экстракционного растворителя дает 760 мг (~100%) 1ν.
Пример полупродукта 52. Соединение 1νίί.
Соединение 1ν (7 60 мг, 1,41 ммоль) и 880 мг (1,69 ммоль) РуВор растворяют в 5 мл ЭСМ. К раствору добавляют соединение 1νί
I νί (530 мг, 2,12 ммоль) и затем добавляют 0, 31 мг Э1РЕА. Смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи. Реакционную смесь разбавляют до 100 мл Е!ОАс, промывают 1н. НС1, ЫаНСОз и насыщенным раствором соли, и затем очищают флэш хроматографией на колонке (100% Е!ОАс), получая 870 мг (80%) соединения 1νίί.
Пример полупродукта 53. Соединение 1νίίί.
Соединение 1νίί (350 мг, 0,45 ммоль) растворяют в 5 мл ТЕА и 5 мл ЭСМ и смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение 3 ч. Растворитель удаляют упариванием и продукт очищают ОФ-ВЭЖХ, получая 220 мг (69%) соединения 1νίίί.
Пример полупродукта 54. Соединение 1ίχ.
Соединение 1νίίί (200 мг, 0.28 ммоль) и 218 мг (0,42 ммоль) РуВор растворяют в 5 мл ЭСМ. Добавляют метиламин (0,28 мл 2 М раствора в ТГФ). Смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи. Смесь разбавляют до 100 мл Е!ОАс, промывают 1н. НС1, ЫаНСО3 и насыщенным раствором соли и затем очищают хроматографией на колонке (15% Е1ОН/Е1ОАс), получая 168 мг (79%) 1ίχ.
- 66 011547
Пример полупродукта 55. Соединение 1χ.
Соединение 1νίίί (200 мг, 0,26 ммоль) растворяют в 4 мл ЭСМ и добавляют 165 мг (0,39 ммоль) ЭМР реагента (реагент). Смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение 3 ч. Растворитель удаляют упариванием. Остаток растворяют в смеси 50% ацетонитрил/вода, фильтруют и очищают ОФ-ВЭЖХ, получая 140 мг (70%) соединения 1х.
Пример полупродукта 56. Соединение ίί.
ЭСМ (30 мл) и раствор соединения ί (4 г, 12,1 ммоль) в Е!ОН (30 мл), в атмосфере Ν2, охлаждают до -10° С. Добавляют NаВН4 (458 мг, 12,1 ммоль) и раствор перемешивают при -10° С в течение 50 мин. Полная конверсия подтверждается появлением на ТСХ (50% Е!ОАс/гексан) более медленно движущегося пятна. Реакционную смесь осторожно гасят льдом и затем охлажденным насыщенным раствором ΝΉ4Ο (10 мл). Смесь выливают в ЭСМ (300 мл). Органический слой однократно промывают насыщенным раствором ΝΉ4Ο (60 мл) и дважды насыщенным раствором соли (60 мл). Затем органический слой отделяют, сушат над Мд8О4 и концентрируют в вакууме, получая 3,5 г соединения ίί (87%).
Пример полупродукта 57. Соединение 1χί.
В круглодонной колбе на 250 мл, снабженной Н2 баллоном, этанольный раствор (50 мл) соединения ίί (3,5 г, 10,5 ммоль) гидрируют в стандартных условиях [20% Рб(ОН)2/С (1,47 г, 2,1 ммоль)] в течение 5 ч при температуре, близкой к комнатной. Катализатор отфильтровывают через целит и промывают ЭСМ. Растворитель удаляют затем при пониженном давлении, получая 2 г (96%) соединения 1χί.
Пример полупродукта 58. Соединение 1χίί.
В инертной атмосфере раствор соединения 1χί (200 мг, 1 ммоль), соединения 1χίίί.
(233 мг, 1,1 ммоль), НОА! (1-гидрокси-7-азабензотриазола) (156 мг, 1,15 ммоль) в безводном ДМФ (6 мл) перемешивают в течение 20 мин. Затем температуру снижают до 0°С с последующим добавлением ΌΙί.' (0,18 мл, 1,15 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при температуре, близкой к комнатной. Раствор разбавляют Е!ОАс и затем промывают дважды 1н. НС1, дважды насыщенным водным NаНСОз и насыщенным раствором соли. Органический слой отделяют, сушат над Мд8О4 и растворитель удаляют при пониженном давлении. Остаток Е!ОАс/ОСМ), получая соединение 1χίί с 45% выходом.
очищают хроматографией (силикагель: 70%
Пример полупродукта 59. Соединение 1χίν.
Раствор соединения 1χίί (777 мг, 2 ммоль) в диоксане (6 мл) и 0,5 М №1ОН (6 мл) перемешивают 5 ч при температуре, близкой к комнатной. Анализ ТСХ (100% Е!ОАс) показывает полноту конверсии до вещества, дающего остающееся на старте пятно. Реакционную смесь охлаждают на ледяной бане с последующим добавлением 1н. НС1 (4 мл). Затем добавляют твердый №С1 и всю смесь дважды экстрагируют Е!ОАс (2x150 мл). Затем органические экстракты объединяют, сушат над Мд8О4 и растворитель
- 67 011547 удаляют при пониженном давлении, получая соединение Ιχίν с выходом 92%.
Пример полупродукта 60. Соединение Ιχν.
В инертной атмосфере раствор соединения х (203 мг, 0,58 ммоль), соединения Ιχίν (276 мг, 0,775 ммоль), НОА1 (1-гидрокси-7-азабензотриазола) (126 мг, 0,93 ммоль) в безводном ДМФ (6 мл) перемешивают в течение 20 мин. Затем температуру снижают до 0°С с последующим добавлением ΌΣΟ (0,14 мл, 0,93 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при температуре, близкой к комнатной. Раствор разбавляют ЕЮАс и затем промывают дважды 1н. НС1, дважды насыщенным водным №-1НСО3 и насыщенным раствором соли. Органический слой отделяют, сушат над Мд8О4 и растворитель удаляют при пониженном давлении. Остаток очищают хроматографией (силикагель: 50% ЕЮАс/ЭСМ - 80:19:1 ЕЮАС/ЭСМ/МеОН), получая соединение 1χν с выходом 62%.
Пример полупродукта 61. Соединение 1χνί.
В инертной атмосфере к раствору соединения 1χν (287 мг, 0,42 ммоль) в безводном ЭСМ (15 мл) добавляют ЭМР реагент (605 мг, 1,43 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при температуре, близкой к комнатной. (Примечание: удвоенные количество ЭМР реагента и реакционное время являются гарантией того, что обе спиртовые группы полностью окисляются до соответствующих кетогрупп). Анализ ТСХ (силикагель: 2% МеОН/ЕЮАс) свидетельствует о полном превращении в более неподвижный продукт. Реакционную смесь разбавляют ЭСМ (150 мл) и затем промывают дважды 10% водным раствором сульфита натрия (2x50 мл), дважды насыщенным водным №-1НСО3 и насыщенным раствором соли. Органический слой отделяют, сушат над Мд8О4 и растворитель удаляют при пониженном давлении. Остаток очищают хроматографией (силикагель: 50% ЕЮАс/ЭСМ - 80:19:1 ЕЮАс/ЭСМ/ МеОН), получая соединение 1χνί с выходом 77%.
Пример полупродукта 62. Соединение 1χνίί.
К ЭСМ раствору (60 мл) Ь-3-фенилмолочной кислоты (2 г, 12 ммоль) добавляют РуВОР (7,5 г, 14,4 ммоль). К указанному раствору добавляют ЭСМ раствор (20 мл), содержащий НС1-метиловый эфир Ьвалина (2,4 г, 14,4 ммоль) и Э1РЕА (2,6 мл, 14,4 ммоль). Полученную реакционную смесь перемешивают в течение ночи при температуре, близкой к комнатной. По прошествии указанного времени, реакционную смесь разбавляют ЕЮАс (30 мл), промывают №-1НСО3 (30 мл) и насыщенным раствором соли (15 мл). Органический слой сушат над Ка28О4, фильтруют и концентрируют. Очистка, осуществляемая в 50% ЕЮАс/гексан на силикагеле, дает 2,97 г (89%) соединения 1χνίί.
Пример полупродукта 63. Соединение 1χνίίί.
Соединение 1χνίί (2,97 г, 10,6 ммоль) поглощают ЭСМ (50 мл) и охлаждают на ледяной бане. К указанному раствору добавляют ТВ8С1 (2,1 г, 13,8 ммоль) с последующим добавлением имидазола (0,94 г, 13,8 ммоль). Образовавшийся раствор перемешивают в течение ночи. Реакционную смесь разбавляют затем ЕЮАс (50 мл), промывают №-1НСО3 и насыщенным раствором соли. Органический слой сушат над Ка28О4, фильтруют и концентрируют. Очистка, осуществляемая в 20% ЕЮАс/гексан на силикагеле, дает 3,79 г (90%) соединения 1χνίίί.
- 68 011547
Пример полупродукта 64. Соединение Ιχίχ.
К метанольному (50 мл) раствору соединения Ιχνίίί (3,78 г, 9,6 ммоль) добавляют 1н. водный ΝαΟΗ (14,4 мл, 14,4 ммоль). Образовавшийся раствор перемешивают в течение ночи. Растворитель частично удаляют в вакууме. РН реакционной смеси снижают затем до 3, используя водный раствор 1н. НС1. Раствор разбавляют ЕЮАс и насыщенным раствором соли. Требуемый продукт экстрагируют ЕЮАс (3x50 мл). Органические слои объединяют, сушат над №ь8О4. фильтруют и концентрируют, получая 3,5 г (96%) соединения 1χίχ.
Пример полупродукта 65. Соединение 1хх.
К ЭСМ (15 мл) раствору, содержащему соединение 1χίχ (1,1 г, 2,9 ммоль), добавляют ΗΟΆΐ (0,44 г, 3,2 ммоль) с последующим добавлением 1 М раствора ОСС (3,2 мл, 3,2 ммоль) в ЭСМ. После перемешивания при температуре, близкой к комнатной, в течение 20 мин, добавляют раствор соединения χχχίχ (970 мг, 3,2 ммоль) в ЭСМ (15 мл). Полученную реакционную смесь перемешивают в течение ночи в атмосфере Ν2. Затем реакционную смесь разбавляют ЕЮАс (30 мл), фильтруют через рыхлый слой силикагеля, промывают 0,1н. НС1, ЫаНСО3 и насыщенный раствором соли. Органический слой сушат над Ыа28О4, фильтруют и концентрируют в вакууме. Очистку осуществляют в 50% ЕЮАс/гексан на силикагеле, получая 1,5 г (77%) соединения 1хх.
Пример полупродукта 66. Соединение 1χχί.
К метанольному раствору (30 мл) соединения хх (1,5 г, 2,4 ммоль) добавляют 1н. водный ЫаОН (3,6 мл, 3,6 ммоль). Образовавшийся раствор перемешивают в течение ночи. По прошествии указанного времени растворитель частично удаляют и рН реакционной смеси доводят до 3, используя 1н. водный НС1.
Реакционную смесь затем разбавляют ЕЮАс (50 мл) и насыщенным раствором соли (20 мл). Водный слой экстрагируют ЕЮАс (3х 50 мл). Органические слои объединяют, сушат над Ыа28О4, фильтруют и концентрируют, что дает 1,3 г (92%) соединения 1χχί.
Пример полупродукта 67. Соединение 1χχίί.
К раствору ЭСМ (2 мл), содержащему соединение 1χχί (180 мг, 0,28 ммоль), добавляют РуВОР (175 мг, 0,34 ммоль) и ЭФЕА (0,06 мл, 0,34 ммоль), затем ЭСМ раствор (3 мл) соединения х (150 мг, 0,41 ммоль). Образовавшийся раствор перемешивают в течение ночи в атмосфере Ν2. Реакционную смесь затем разбавляют ЕЮАс (30 мл), промывают ЫаНСО3 и насыщенным раствором соли. Органический слой сушат над Ыа28О4, фильтруют и концентрируют. Очистку осуществляют в 100% ЕЮАс на силикагеле, получая 270 мг (98%) соединения 1χχίί.
- 69 011547
Пример полупродукта 68. Соединение Ιχχίίί.
К ЭСМ (3 мл) раствору соединения 1χχίί (27 0 мг, 0,27 ммоль) добавляют ОМБ реагент (140 мг, 0,33 ммоль). После перемешивания при температуре, близкой к комнатной, в течение 1,5 ч реакционную смесь гасят 10% Ыа28О4 (10 мл). Реакционную смесь разбавляют ЕЮЛс (30 мл) и перемешивают 10 мин. Органический слой промывают ЫаНСОз и насыщенным раствором соли. Органический слой сушат над Ыа28О4, фильтруют и концентрируют. Очистку осуществляют в 60% ЕЮЛс/гексан, получая 150 мг (56%) соединения Ιχχίίί.
Пример полупродукта 69. Соединение 1χί.
К этанольному раствору (50 мл) соединения ίί (3,5 г, 10,5 ммоль) добавляют в токе азота Ρά^^^ (1,47 г, 20% Ρά содержание, 2,1 ммоль). Реакционную смесь гидрируют при давлении 1 атм. По окончанию гидрирования катализаторы фильтруют через рыхлый слой целита и промывают дихлорметаном. Фильтраты концентрируют в вакууме, получая 2 г (96%) соединения 1χί.
Пример полупродукта 70. Соединение 1χχίν.
К ДМФ раствору (60 мл) соединения νίί (9,1 г, 28,2 ммоль) добавляют НОЛ1 (4 г, 29,4 ммоль) и 1,3дииизопропилкарбодиимид (3,7 г, 29,4 ммоль). После перемешивания при температуре, близкой к комнатной, в течение 30 мин, к указанному выше раствору добавляют ДМФ раствор (10 мл) соединения 1χί (5,1 г, 25,6 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи. По прошествии указанного времени белые твердые вещества отфильтровывают. Фильтраты концентрируют в вакууме, получая остаток, который очищают хроматографией на силикагеле, получая 9,5 г (67%) соединения 1χχίν.
Пример полупродукта 71. Соединение 1χχν.
К раствору соединения 1χχίν (1,5 г, 3 ммоль) в безводном ТГФ (25 мл) добавляют ΞΗΡι^Ν (0,78 мл, 4,5 ммоль) при температуре, близкой к комнатной. Смесь охлаждают до 0°С и добавляют по каплям МОМС1 (1,5 мл, 19,7 ммоль). Реакционную смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Затем раствор разбавляют диэтиловым эфиром и промывают водой (3 раза). Водные слои дополнительно экстрагируют диэтиловым эфиром и все органические слои сушат над Мд8О4, затем концентрируют, получая желтое масло. Требуемый изомер соединения 1χχν
выделяют хроматографией на силикагеле (ЕЮЛс/гексан 5/2) с 40% выходом при полном разделе нии диастереомеров.
Пример полупродукта 72. Соединение 1χχνί.
К раствору соединения 1χχν (502 мг, 0,9 ммоль) в Е(ОН (5 мл) добавляют по каплям 2н. водный №ОН (0,9 мл, 1,8 ммоль) при 0°С. Реакционную смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. После завершения омыления раствор подкисляют до рН 3 с помощью Όο^βχ 50\У8Х-200 кислотной смолы. Твердые вещества отфильтровывают и полученный фильтрат концентрируют в вакууме, получая маслянистый остаток, который лиофилизуют, что дает 370 мг (80 %) соединения 1χχνί.
Пример полупродукта 73. Соединение 1χχνίί.
Дихлорметановый раствор (4 мл) соединения 1χχνί (110 мг, 0,21 ммоль) обрабатывают РуВОР (200
- 70 011547 мг, 0,38 ммоль). После перемешивания при температуре, близкой к комнатной, в течение 30 мин, в реакционную смесь загружают ТГФ раствор (3,2 мл) соединения χίίί (60 мг, 0,32 ммоль) и затем Ε!ιΡγ2Ν. После перемешивания в течение ночи при температуре, близкой к комнатной, реакционную смесь гасят водой и экстрагируют ΕΐΘΑс. Полученный органический слой промывают насыщенным раствором соли и сушат над Μд8Θ4, затем концентрируют до желтого масла. Очистка хроматографией на силикагеле (5%
ΕΐΘΗ/ΕΐΘΑс) дает 143 мг (100%) соединения Ιχχνίί.
Пример полупродукта 74. Соединение Ιχχνίίί.
К ТГФ раствору (50 мл) Η-Сйд-ΘΗ (5 г, 19,4 ммоль) добавляют ΗΘВΐ (2,63 г, 19,4 ммоль) и ΕΩΕΙ (3,72 г, 19,4 ммоль). После перемешивания при температуре, близкой к комнатной, в течение 20 мин, к указанному выше раствору добавляют ТГФ (19 мл) и ДМФ (10 мл) раствор, содержащий гидрохлорид метилового эфира трет-Ь-лейцина (19,4 ммоль) и ^IΡΕΑ (6,75 мл, 38,8 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи. Стандартная водная обработка и хроматография на силикагеле (15-20% ΕΐΘΑс/гексаны) дают 2,27 г (30%) соединения Ιχχνίίί.
Пример полупродукта 75. Соединение 1χχίχ.
К ТГФ раствору (12 мл) соединения Ιχχνίίί (2,27 г, 5,91 ммоль) добавляют 4н. раствор НС1 в диоксане (7,38 мл, 29,5 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи. По прошествии указанного времени растворитель удаляют при пониженном давлении, получая соединение 1χχίχ, которое используют непосредственно в последующей реакции.
на-Η,Ν
Ιχχίχ
Пример полупродукта 76. Соединение 1ххх.
К ТГФ раствору соединения 1χχίχ (5,9 ммоль) добавляют ТГФ (20 мл) раствор, содержащий 2пиразинкарбоновую кислоту (878 мг, 7,08 ммоль), ΗΘВΐ (957 мг, 7,08 ммоль) и ΕΌΟ (1,36 г, 7,08 ммоль). К образовавшейся смеси затем добавляют ^IΡΕΑ (2,05 мл, 11,8 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при температуре, близкой к комнатной, и затем гасят водой. Реакционную смесь экстрагируют ΕΐΘΑс. Органический слой промывают насыщенным раствором соли и концентрируют в вакууме, что дает остаток, который очищают хроматографией на силикагеле (40-50% ΕΐΘΑс/гексаны), получая 1 г (36%) соединения 1χχχ.
Пример полупродукта 77. Соединение 1χχχί.
К метанольному раствору (20 мл) соединения 1χχχ (1 г, 2,56 ммоль) добавляют 2н. NаΘΗ (3,2 мл, 6,4 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи. По прошествии указанного времени, реакционную смесь подкисляют до рН 3, используя 5н. НС1. Реакционную смесь разбавляют ΕΐΘΑс (75 мл) и промывают водой и насыщенным раствором соли. Полученный таким образом органический слой сушат и концентрируют в вакууме, получая остаток, который растворяют в 1:1 СΗзСN/Η2Θ для лиофилизации. Всего получают ~1 г (100%) соединения 1χχχί.
- 71 011547
Пример полупродукта 78. Соединение Ιχχχίί.
Дихлорметановый раствор (10 мл) соединения 1χχχί (2,56 ммоль) обрабатывают Н0А1 (348 мг, 2,56 ммоль) и ЭСС (2,56 мл, 1М, 2,56 ммоль). После перемешивания в течение 30 мин реакционную смесь обрабатывают ТГФ раствором (5 мл) соединения ν (2,56 ммоль). После перемешивания при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи, белые твердые вещества (мочевину) удаляют фильтрованием. Фильтраты концентрируют в вакууме, получая остаток, который очищают хроматографией на силикагеле, что дает 1,4 г (100%) соединения 1χχχίί.
Ιχχχϋ
Пример полупродукта 79. Соединение 1χχχίίί.
Этанольный раствор (15 мл) соединения 1χχχίί (1,4 г, 2,58 ммоль) обрабатывают 2н. №0Н (2,58 мл, 5,17 ммоль). После перемешивания при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи, реакционную смесь подкисляют до рН 3 с помощью кислотной смолы. Твердые вещества отфильтровывают. Полученные фильтраты концентрируют в вакууме, получая остаток, который лиофилизуют, получая 1,32 г (~100%) соединения 1χχχίίί.
Ιχχχΐη
Пример полупродукта 80. Соединение 1χχχίν.
Дихлорметановый раствор (15 мл) соединения 1χχχίίί (360 мг, 0,7 ммоль) обрабатывают РуВОР (582 мг, 1,12 ммоль). После перемешивания при температуре, близкой к комнатной, в течение 20 мин, реакционную смесь обрабатывают ТГФ раствором (10 мл) соединения χίίί (195,6 мг, 1,05 ммоль) и затем Э1РЕА (0,25 мл, 1,40 ммоль). После перемешивания в течение ночи при температуре, близкой к комнатной, реакционную смесь гасят водой и экстрагируют ЕЮАс. Полученный органический слой промывают насыщенным раствором соли, сушат и концентрируют в вакууме, получая остаток, который очищают хроматографией на силикагеле (3% ЕЮН/ЕЮАс), что дает 420 мг (88%) соединения 1χχχίν.
Пример полупродукта 81. Соединение ίί'.
Смесь безводного дихлорметана и диэтилового эфира (20 мл:20 мл) охлаждают до -78°С в атмосфере Ν2 (г). К раствору добавляют ТЮ14 (1М в дихлорметане, 10 мл, 10 ммоль) и затем МеЫ (1,4 М в диэтиловом эфире, 7,1 мл, 10 ммоль), с последующим дополнительным перемешиванием еще в течение 30 минут при -78°С. Раствор соединения ί (2 г, 6 ммоль) в 10 мл дихлорметана по каплям добавляют к смеси при той же температуре, за 15 мин. Раствор медленно нагревают до -40°С в течение 10 мин и затем пере мешивают при 0°С в течение 2 ч. Реакционную смесь гасят, выливая в смесь вода/диэтиловый эфир (1:1), и затем дают расслоиться. Водный слой дополнительно дважды экстрагируют диэтиловым эфиром. Все органические слои промывают водой, насыщенным раствором соли и сушат над Мд804, затем концентрируют до желтого масла. Требуемое соединение ίί' выделяют хроматографией на силикагеле (ЕЮАс/гексаны 2/1) с выходом 83%.
Пример полупродукта 82. Соединение 1χί'.
- 72 011547
К соединению И' (1,7 г, 5 ммоль) добавляют 10 мас.% Рб на С (0,53 г, 0,5 ммоль) с последующим добавлением МеОН (17 мл). Газообразный водород продувают через реакционную смесь и давление газообразного водорода поддерживают во время реакции в течение ночи при 1 атм. Реакционную смесь затем фильтруют и концентрируют, получая 92 9 мг (87%) соединения 1χί' в виде бесцветного масла.
1»’
Пример полупродукта 83. Соединение 1χχχν.
К ТГФ раствору (16 мл) соединения χχίί (1 г, 3 ммоль) добавляют, при температуре, близкой к комнатной, НОА1 (0,41 г, 3 ммоль) и затем 1 М ЭСС раствор дихлорметана (3 мл, 3 ммоль). После перемешивания в течение 30 мин при температуре, близкой к комнатной, к полученной НОА!-активированной кислоте добавляют дихлорметановый раствор (6 мл) соединения 1χί'. Реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи. По прошествии указанного времени реакционную смесь фильтруют через целит. Фильтрат разбавляют ЕЮАс (120 мл), промывают водой и затем насыщенным раствором соли. Органический слой сушат и концентрируют до желтого масла, которое очищают хроматографией на силикагеле (100% ЕЮАс), получая 1 г (65%) соединения 1χχχν.
Ιχχχν
Пример полупродукта 84. Соединение 1χχχνί.
К этанольному раствору (8 мл) соединения 1χχχν (920 мг, 1,7 ммоль) добавляют 2н. водный раствор №ЮН (1,7 мл, 3,4 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при температуре, близкой к комнатной, и затем подкисляют до рН 3 с помощью ϋο\\Ό5 кислотной смолы. Твердые вещества отфильтровывают и фильтрат концентрируют, получая бесцветное масло, которое вновь растворяют в 1:1 СНзС№/Н2О и лиофилизуют, что дает 800 мг (93%) соединения 1χχχνί. ВЭЖХ дает единственный пик продукта.
Пример полупродукта 85. Соединение 1χχχνίί.
К дихлорметановому раствору (4 мл) соединения 1χχχνί (150 мг, 0,3 ммоль) добавляют РуВОР (250 мг, 0,47 ммоль). Раствор перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение 30 мин. К указанному раствору добавляют раствор соединения χίίί (84 мг, 0,45 ммоль) в ТГФ (4,5 мл) с последующим добавлением ЕбРг^ (0,1 мл, 0,6 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре, близкой к комнатной, в течение ночи и затем гасят водой (25 мл) за 30 мин. Смесь затем экстрагируют ЕЮАс. Полученный органический слой промывают насыщенным раствором соли и сушат над Мд8О4, затем концентрируют до желтого масла. Очистка хроматографией на силикагеле (5% ЕЮН/ЕЮАс) дает 200 мг (100%) соединения 1χχχνίί.
Пример полупродукта 86. Соединение 1χχχίχ.
Соединение 1χχχνίίί.
№СЬ/-Ь-валин, (2,5 г, 9,9 ммоль) поглощают ТГФ (30 мл) ЕЭС.Ч (2,29 г, 11,9 ммоль) и НОВТ (1,62 г, 11,9 ммоль) смешивают и смесь перемешивают пять минут. Добавляют гидрохлорид метилового эфира
- 73 011547
Ь-трет-лейцина (2,17 г, 11,9 ммоль) в ТГФ (23,9 мл) с последующим добавлением ОГРЕА (2,1 мл). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи в атмосфере азота. Реакционную смесь разбавляют этилацетатом, промывают 1н. НС1, насыщенным бикарбонатом натрия и насыщенным раствором соли. Органическую фазу сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют. Концентрированный остаток очищают в смеси 25% этилацетат/гексан, получая 1,1 г (29%) соединения 1ххх1х.
Пример полупродукта 87. Соединение 1хххх.
Соединение 1ххх1х гидролизуют в стандартных условиях, используя метиловый спирт (0,3 М) и 1н. №ОН (1,5 экв.), получая 1,03 г (95%) соединения 1хххх.
Пример полупродукта 88. Соединение 1хххх1.
Соединение 1хххх (385 мг, 1,06 ммоль) поглощают дихлорметаном (3 мл). Добавляют ОСС (1,4 ммоль) с последующим добавлением НОАГ (190 мг, 1,4 ммоль). Затем добавляют соединение ν (260 мг, 1,4 ммоль) в дихлорметане (3 мл). Полученную смесь перемешивают в течение ночи в атмосфере азота. Реакционную смесь разбавляют этилацетатом, фильтруют через силикагель и концентрируют.
Остаток очищают в смеси 50% этилацетат/гексан, получая 440 мг (80%) соединения 1хххх1.
Пример полупродукта 89. Соединение 1ххххи.
Соединение 1хххх1 гидролизуют в стандартных условиях, используя этиловый спирт (0,3 М) и 1н. №ОН (1,5 экв.), получая 390 мг соединения 1ххххи.
Пример полупродукта 90. Соединение 1ххххш.
Соединение 1ххххи (350 мг, 0,7 ммоль) поглощают дихлорметаном (3 мл). Добавляют РуВОР (480 мг, 0,91 ммоль) с последующим добавлением соединения хш (170 мг, 0,91 ммоль). Добавляют ОГРЕА (0,16 мл, 0,91 ммоль) и реакционную смесь перемешивают в течение ночи. Реакционную смесь концентрируют и очищают в 100% этилацетате, получая 420 мг (90%) соединения 1ххххш.
Пример полупродукта 91. Соединение 1ххххК.
Соединение 1ххххш гидрируют, используя 10% Рб/С (1% моль) в метиловом спирте в атмосфере водорода, получая 335 мг (100%) соединения 1ххххК.
Пример полупродукта 92. Соединение 1χχχχν.
Этил 1Н-тетразол-5-ацетат (5 г, 32 ммоль) поглощают хлороформом (80 мл). Добавляют трихлоруксусную кислоту (12,03 г, 73,65 ммоль) с последующим добавлением альфа-метилстирола (3,78 г, 32 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи. На следующий день раствор разбавляют этилацетатом, промывают 10% КОН и насыщенным раствором соли. Органическую фазу сушат над сульфатом магния, фильтруют и концентрируют, получая 8 г (96%) соответствующего Ν-защищенного этил тетразол-5-ацетата. Полученное вещество гидролизуют в стандартных условиях, используя этило
- 74 011547 вый спирт (0,3 М) и 1н. №1ОН (3 экв.), и получают 7 г (99%) соединения Ιχχχχν.
Пример полупродукта 93. Соединение Ιχχχχνί.
Соединение Ιχχχχν (3,62 г, 14,7 ммоль) поглощают дихлорметаном (50 мл). Добавляют ΕΩΟΙ (4,32 г, 22,1 ммоль) и ΌΓΓΕΑ (5,1 мл, 29,4 ммоль) и перемешивают в течение 5 мин. Добавляют Νгидроксисукцинимид (3,38 г, 29,4 ммоль) и перемешивают 3 ч. Реакционную смесь разбавляют дихлорметаном и промывают трижды водой. Органическую фазу сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют получая 3,66 г (73%) соединения Ιχχχχνί.
Пример полупродукта 94. Соединение Ιχχχχνίί.
Соединение Ιχχχχίν (335 мг, 0,62 ммоль) и соединение Ιχχχχνί (343 мг, 1 ммоль) поглощают дихлорметаном (6 мл). Добавляют ΩΦΕΛ (0,17 мл, 1 ммоль) и реакционную смесь перемешивают в течение ночи. Реакционную смесь разбавляют этилацетатом, промывают насыщенным бикарбонатом натрия, насыщенным раствором соли и концентрируют. Остаток очищают в смеси 5% этиловый спирт/этилацетат, получая 80 мг (16%) соединения Ιχχχχνίί.
Пример полупродукта 95. Соединение Ιχχχχνίίί.
Соединение Ιχχχχνίί (80 мг, 0,11 ммоль) поглощают дихлорметаном (3 мл). Добавляют ЭМР реагент (55 мг, 0,13 ммоль) и перемешивают один час. Реакционную смесь разбавляют этилацетатом и гасят 10% раствором сульфита натрия. Органическую фазу промывают насыщенным бикарбонатом натрия насыщенным раствором соли. Органическую фазу концентрируют и полученный остаток очищают 100% этилацетате, получая 40 мг (48%) соединения Ιχχχχνίίί.
Пример полупродукта 96. Соединение χχχίχ. Соединение ю, метиловый эфир ХСЬх-4-гидрокси-Рго,
(2,1 г, 7,9 ммоль), полученное с количественным выходом из соединения с, Н-СЬх-4-гидрокси-Рго
ОН
с ,) растворяют в ЭСМ (25мл). К раствору добавляют ί,ΌΙ (1,54 г, 9,5 ммоль) и ΩΙΓΕΑ (1,7 мл, 9,5 ммоль) перемешивают в течение 10 мин. К реакционной смеси добавляют по каплям 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин (ΤΙΟ) (1,2 мл, 9,5 ммоль) и перемешивают 5 ч. Органическую фазу промывают водой, 1н. НС1 и насыщенным раствором соли. После концентрирования органической фазы полученный остаток очищают хроматографией, используя 40% ΕΐΟΑс/гексаны, получают соединение С1, метиловый эфир Н-СЬх-4Т^карбонилокси-Рго, (2,5 г, 75%).
- 75 011547
Соединение с1 (2,5 г, 5,9 ммоль) растворяют в МеОН (75 мл). Раствор продувают № и добавляют Рб/С (10%, 300 мг). Реакционную смесь продувают Н2 и перемешивают в течение ночи. Реакционную смесь фильтруют через целит и концентрируют, получая соединение χχχίχ, метиловый эфир 4-(Т1Окарбонилокси)-Рго, (1,49 г, 83%).
Пример полупродукта 97. Соединение νίί.
Соединение си, метиловый эфир №пиразин-2-илкарбонил-Уа1-Уа1, (10,9 г, 32,4 ммоль)
растворяют в ТГФ (80 мл) и затем добавляют водный №ОН (48,6 мл, 48,6 ммоль). Полученную смесь перемешивают 48 ч и затем добавляют дополнительное количество №ОН (16,3 мл, 16,3 ммоль) и смесь нагревают до 40°С в течение трех часов. Затем рН реакционной смеси снижают до 3 и водную фазу экстрагируют ЕЮАс и затем концентрируют, получая неочищенное соединение νίί, №пиразин-2илкарбонил-Уа1-Уа1 кислоту (10,6 г, 100%).
Пример полупродукта 98. Соединение сш.
Соединение сп (4,1 г, 12,7 ммоль) растворяют в ЭСМ (20 мл). К указанному раствору добавляют НОА1 (1,73 г, 12,7 ммоль) и ОСС (12,7 ммоль) и раствор перемешивают в течение одного часа. К реакционной смеси добавляют соединение χχχίχ (3,22 г, 10,6 ммоль) в ЭСМ (10 мл). Полученную смесь перемешивают в течение ночи в атмосфере N2. Реакционную смесь фильтруют через силикагель и концентрируют. Полученный остаток очищают хроматографией на силикагеле (градиент 50%-80% смеси ЕЮАс/гексаны), получая соединение сш, метиловый эфир №пиразин-2-илкарбонил-Уа1-Уа1-4-(Т1р карбонилокси)-Рго, (5,27 г, 81,7%).
Пример полупродукта 99. Соединение αν.
Соединение сш (650 мг, 1,29 ммоль) растворяют в ТГФ (5 мл). К раствору добавляют водный №ОН (1,42 мл, 1,42 ммоль) и затем перемешивают в течение ночи. Снижают РН раствора до 3 и органическую фазу выделяют и концентрируют, получая остаток. Остаток очищают, используя ВЭЖХ с обращенной фазой в смеси ацетонитрил/вода, и получают соединение αν, №пиразин-2-илкарбонил-Уа1-Уа1-4(ТГркарбонилокси)-Рго кислоту, (600 мг, 95%).
Пример полупродукта 100. Соединение су.
N-Вοс-^-трет-лейцин (2,3 г, 10 ммоль) и гидрохлорид метилового эфира Ь-трет-лейцина (2 г, 11 ммоль) объединяют в ДМФ (30 мл). Затем к раствору добавляют НОА1 (1,6 г, 11,5 ммоль). Полученную смесь перемешивают в течение 20 мин в атмосфере № и затем температуру снижают до 0°С, затем добавляют ЭГС (1,8 мл, 11,5 ммоль) и 2,4,6-коллидин (1,45 мл, 11 ммоль). Образовавшийся раствор перемешивают в течение ночи, позволяя нагреться до комнатной температуры. Реакционную смесь разбавляют ЕЮАс и органическую фазу промывают 1н. НС1, насыщенным NаНСОз и насыщенным раствором соли. После концентрирования органической фазы полученный остаток очищают хроматографией, используя градиент 20-30% смеси Е1ОАс/гексаны, и получают соединение су (3,3 г, 92%).
- 76 011547
Пример полупродукта 101. Соединение суб
Соединение су (3,3 г, 9,2 ммоль) гидролизуют, используя диоксан (40 мл) и 0,5н №1ОН (37 мл, 18,4 ммоль), получая соединение су1 (2,9 г, 92%).
Пример полупродукта 102. Соединение суй.
Соединение су1 (2 г, 5,8 ммоль) и соединение у (1 г, 5,5 ммоль) растворяют в ДМФ (20 мл). Затем к раствору добавляют НОАГ (832 мг, 6,6 ммоль) и Э1С (1,1 мл, 6,6 ммоль). Образовавшийся раствор перемешивают в течение ночи в атмосфере Ν2. Реакционную смесь разбавляют ЕГОАс и органическую фазу промывают 1н. НС1, насыщенным NаНСΟз и насыщенным раствором соли. После концентрирования органической фазы полученный остаток очищают хроматографией, используя градиент 20-30% смеси ЕГОАс/гексаны, и получают соединение суй (2,4 г, 81%).
Пример полупродукта 103. Соединение суш.
Соединение суй (2,4 г, 4,72 ммоль) растворяют в ЭСМ (10 мл). К раствору добавляют ТЕА (10 мл). Образовавшийся раствор перемешивают в течение 4 ч. Реакционную смесь концентрируют, растворяют в ЕГОАс и затем органическую фазу промывают 1н. №1ОН и насыщенным раствором соли. Органическую фазу концентрируют, получая соединение суш (1,084 г, 56,1%).
Пример полупродукта 104. Соединение αχ.
2-Пиразинкарбоновую кислоту (181 мг, 1,46 ммоль) и соединение суш (541 мг, 1,325 ммоль) растворяют в ДМФ (15 мл). К раствору добавляют НОАГ (207 мг, 1,52 ммоль) и О1С (0,24 мл, 1,52 ммоль). Образовавшийся раствор перемешивают в течение ночи в атмосфере Ν2. Реакционную смесь разбавляют ЕГОАс и органическую фазу промывают 1н. НС1, насыщенным NаНСΟз и насыщенным раствором соли. После концентрирования органической фазы полученный остаток очищают хроматографией, используя градиент 20-30-35% смеси ЕГОАс/гексаны, и получают соединение αχ (430 мг, 63%).
Пример полупродукта 105. Соединение сх.
Соединение αχ гидролизуют, используя ЕГОН (7 мл) и 1н. №1ОН (4,7 мл, 4,7 ммоль), и получают соединение сх (700 мг, 91,6%).
Пример полупродукта 106. Соединение с.\1.
Соединение сх (690 мг, 1,42 ммоль) растворяют в ЭСМ (9 мл). Затем к раствору добавляют РуВОР (890 мг, 1,7 ммоль) с последующим добавлением соединения χίίί'
(320 мг, 1,7 ммоль). К полученной смеси добавляют О1РЕА (0,3 мл, 1,7 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи в атмосфере Ν2. Реакционную смесь разбавляют затем ЕГОАс, промывают насыщенным NаНСΟз и насыщенным раствором соли. После концентрирования органической фазы полученный остаток очищают хроматографией, используя 100% ЕГОАс, и получают соединение с.\1 (490 мг, 52,7%).
- 77 011547
Пример полупродукта 107. Соединение сх|у.
Соединение схп (1,2 г, 3,06 ммоль)
растворяют в МеОН (12 мл). После тщательного продувания Ν2 добавляют 10 мас.% Рй(ОН)2 на углероде (0,6 г) и смесь гидрируют в течение ночи, затем полученную реакционную смесь анализируют ТСХ (30% Е!ОАс/гексаны). Раствор отделяют от твердого вещества фильтрованием и концентрируют до соответствующего соединения схш со снятой защитой, в виде бесцветного масла (100%),
которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки.
2-Пиразинкарбоновую кислоту (400 мг, 3,2 ммоль, 1,1 экв.) растворяют в ЭСМ/ТТФ (4 мл/4 мл) и затем добавляют НОА! (440 мг, 3,2 ммоль) и ОСС (343 мл, 1М в ЭСМ). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20 мин соединение схш (0,96 г, 3,2 ммоль), полученное ранее, растворяют в ЭСМ (6,4 мл) и добавляют к активированной смеси. После перемешивания в течение ночи при комнатной температуре реакционную смесь фильтруют через целит и соединение схгу очищают хроматографией на колонке (30% Е!ОАс/гексаны)
получая белое твердое вещество (0,8 г, 80%).
Пример полупродукта 108. Соединение сху.
Соединение сх1у (0,8 г, 2,2 ммоль) растворяют в МеОН (10 мл) и затем добавляют 2н. ЫаОН (водн.) (3,3 мл, 6,6 ммоль). Раствор перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, затем состав реакционной смеси анализируют ТСХ (50% Е!ОАс/гексаны). Подкисляют до рН 3 с помощью 5н. НС1 и разбавляют Е!ОАс с последующей экстракцией органической фазы. Экстрагированную органическую фазу промывают насыщенным раствором соли и сушат над Мд§О4, получая концентрированием соединение сху (0,74 г, 95%).
Пример полупродукта 109. Соединение сху1.
К ЭСМ раствору (6 мл) соединения сху (0,74 г, 2,1 ммоль) при комнатной температуре добавляют НОА! (290 мг, 2,1 ммоль), с последующим добавлением 1 М раствора ОСС в ЭСМ (2,2 мл, 2,2 ммоль). После перемешивания в течение 30 мин при комнатной температуре к полученной выше НОА!активированной кислоте добавляют ТГФ раствор (10,5 мл, 0,2 М) соединения ν (2,1 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. По прошествии указанного времени реакционную смесь фильтруют через целит. Фильтрат разбавляют Е!ОАс (120 мл) и промывают водой и насыщенным раствором соли. Органическую фазу сушат и концентрируют до желтого масла, которое очищают хроматографией на силикагеле (50% Е!ОАс/гексаны), получая соединение сху1 (0,714 г, 66%).
Пример полупродукта 110. Соединение схуц.
К Е!ОН раствору соединения сху1 (0,7 г, 1,4 ммоль) добавляют 2н. водный раствор ЫаОН (2 мл, 4 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре, затем подкисляют до рН 3 с помощью 5н. НС1 и разбавляют Е!ОАс, с последующей экстракцией органической фазы. Экстрагированную органическую фазу промывают насыщенным раствором соли и сушат над Мд§О4, получая концентрированием соединение схуц (95%).
- 78 011547
οχνίί
Пример полупродукта 111. Соединение сχν^^^.
К ЭСМ/ТГФ раствору (10 мл/2 мл) соединения суН (300 мг, 0,6 ммоль) добавляют РуВОР (416 мг, 0,8 ммоль). Раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. К указанному раствору затем добавляют соединение χχχνί' (200 мг, 0,8 ммоль),
χχχνί с последующим добавлением ОГРЕЛ (0,22 мл, 1,2 ммоль).
Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи и затем гасят водой (25 мл) в течение 30 мин. Затем смесь экстрагируют Е!ОАс. Полученную органическую фазу промывают насыщенным раствором соли и сушат над Мд8О4, затем концентрируют, получая желтое масло. Очистка хроматографией на силикагеле (3-5% Е!ОН/Е!ОАс) дает соединение сχν^^^ (335 мг, 76%).
Пример полупродукта 112. Соединение сχ^χ.
К ЭСМ раствору (10 мл) соединения сχν^^ (340 мг, 0,6 ммоль) добавляют РуВОР (470 мг, 0,9 ммоль). Раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. К указанному раствору добавляют затем соединение χίίί' (170 мг, 0,9 ммоль), с последующим добавлением ЭГРЕА (0,24 мл, 1,2 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи и затем гасят водой (25 мл) в течение 30 мин. Смесь затем экстрагируют Е!ОАс. Полученную органическую фазу промывают насыщенным раствором соли и сушат над Мд8О4, затем концентрируют до желтого масла. Очистка хроматографией на силикагеле (3-5% Е!ОН/Е!ОАс) дает соединение сχ^χ (164 мг, 36%).
Пример полупродукта 113. Соединение хх.
^СГО-Ь-валин (6,28 г, 25 ммоль) растворяют в ЭСМ (30 мл). К указанному раствору добавляют НОВТ (3,38 г, 25 ммоль) и ОСС (25 мл, 1 М раствор) и перемешивают 5 мин. К полученной смеси добавляют гидрохлорид метилового эфира Ь-трет-лейцина (25 мл, 1 М раствор) и перемешивают в течение ночи в атмосфере Ν2. Реакционную смесь разбавляют Е!ОАс, промывают 1н. НС1, насыщенным NаНСОз и насыщенным раствором соли. Органическую фазу сушат над №28О4, фильтруют и концентрируют. Остаток очищают хроматографией, используя 20-30% Е!ОАс/гексаны, и получают соединение хх (2,96 г, 31%).
Пример полупродукта 114. Соединение χχί.
Соединение хх (2,95 г, 7,8 ммоль) гидрируют, используя 10% Рб/С (800 мг) в МеОН (40 мл) в атмосфере Н2, получают приведенный ниже соответствующий свободный амин (1,9 г, 100%).
2-Пиразинкарбоновую кислоту (970 мг, 7,8 ммоль) растворяют в ЭСМ (20 мл). К указанному раствору добавляют РуВОР (4,06 г, 7,8 ммоль). К раствору добавляют свободный амин (1,9 г, 7,8 ммоль) в ЭСМ (15 мл) и затем добавляют ЭГРЕА (1,36 мл, 7,8 ммоль). Полученную смесь перемешивают в течение ночи в атмосфере Ν2. Реакционную смесь разбавляют Е!ОАс и органическую фазу промывают насыщенным NаНСОз и насыщенным раствором соли. После концентрирования органической фазы остаток очищают хроматографией, используя 30-40% Е!ОАс/гексаны, и получают соединение χχί (2,07 г, 75,8%).
- 79 011547
Пример полупродукта 115. Соединение χχίί.
Соединение χχί гидролизуют, используя МеОН (20 мл) и 1н. №1ОН (3 экв.), и получают соединение χχίί (1,82 г, 93,9%).
Пример полупродукта 116. Соединение χχίίί.
Соединение χχίί (895 мг, 2,66 ммоль) растворяют в ЭСМ (10 мл). К раствору добавляют ОСС (3,2 ммоль) и затем НОАί (435 мг, 3,2 ммоль). Затем добавляют соединение ν (3,2 ммоль) в ТГФ (16 мл). Полученную смесь перемешивают в течение ночи в атмосфере Ν2. Реакционную смесь разбавляют ЕЮАс, фильтруют через силикагель и концентрируют. Полученный остаток очищают хроматографией, используя 50% ЕЮАс/гексаны, и получают соединение χχίίί (730 мг, 54,8%).
Пример полупродукта 117. Соединение χχίν.
Соединение χχίίί гидролизуют, используя ЕЮН (5 мл) и 1н. №1ОН (1,5 экв.), и получают соединение χχίν (690 мг, 100%).
Пример полупродукта 118. Соединение схх.
Соединение χχίν (245 мг, 0,52 ммоль) растворяют в ЭСМ (3 мл). К раствору добавляют РуВОР (330 мг, 0,62 ммоль) и затем добавляют соединение χίίί' (120 мг, 0,62 ммоль). К полученной смеси добавляют Э1РЕА (0,11 мл, 0,62 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи в атмосфере Ν2. Реакционную смесь разбавляют ЕЮАс и органическую фазу промывают насыщенным NаНСО3 и насыщенным раствором соли. После концентрирования органической фазы остаток очищают хроматографией, используя 5% ЕЮН/ЕЮАс, и получают соединение схх (220 мг, 60%).
Пример полупродукта 119. Соединение χίίί'.
Βοс-NVА-ОН (24,96 г, 114,9 ммоль)
растворяют в ТГФ (200 мл). К раствору порциями добавляют СЭ1 (22,35, 137,8 ммоль) и раствор перемешивают в течение 30 мин. ^О-диметилгидроксиламингидрохлорид (12,33 г, 126,4 ммоль) растворяют в ДМФ (50 мл) и затем к раствору добавляют Э1РЕА (22 мл, 126,4 ммоль). ДМФ раствор оставляют перемешиваться при комнатной температуре в течение 20 мин и затем добавляют ТГФ раствор. Полученную смесь перемешивают в течение двух выходных дней в атмосфере Ν2. Реакционную смесь концентрируют в вакууме до общего объема 100 мл. Полученную органическую фазу промывают 1н. НС1, насыщенным NаНСО3 и насыщенным раствором соли. Органическую фазу концентрируют, получая неочищенное соединение суу! (25,3 г).
СХХ|
ЬАН (107,3 ммоль) добавляют в сухую круглодонную колбу на 1 л в атмосфере Ν2 в виде 1 М раствора в ЕьО. Полученный раствор охлаждают до 0°С и затем добавляют по каплям соединение сууг (97,5 ммоль) в ЕьО (100 мл). По завершении добавления полученную смесь перемешивают в течение 30 мин. Реакционную смесь гасят при 0°С медленным добавлением ЕЮАс (50 мл), с последующим медленным добавлением 5% раствора КН8О4 (50 мл). Образовавшуюся смесь перемешивают в течение 30 мин. Органическую фазу промывают 1н. НС1, насыщенным NаНСО3 и насыщенным раствором соли. Органическую фазу концентрируют, получая неочищенное соединение сxx^^ (22,28 г).
- 80 011547
Соединение сxx^^ растворяют в МеОН (100 мл). Ка282О4 (16,82 г, 96,6 ммоль) растворяют в воде (100 мл) и затем добавляют к раствору соединения сxx^^ при 0°С. Полученную смесь хранят в холодильнике (5°С) в течение ночи. К реакционной смеси добавляют ΚϋΝ (7,53 г, 115,9 ммоль) в воде (100 мл) и перемешивают 1,5 ч при комнатной температуре. Соединение экстрагируют ЕЮАс (3х 100 мл). Органическую фазу промывают насыщенным раствором соли (3x50 мл), сушат над Мд8О4, фильтруют и концентрируют, получая неочищенное соединение сxx^^^ (15,86 г).
Соединение сxx^^^ (15,86 г) растворяют в диоксане (100 мл). К указанному раствору добавляют концентрированную НС1 (37%, 100 мл) с последующим добавлением анизола (10 мл) и нагревают до температуры кипения с обратным холодильником (110°С). Реакционную смесь перемешивают в течение 1,5 ч. Затем реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и растворитель удаляют в вакууме, получая сухую пасту. Остаток сушат в течение ночи в глубоком вакууме, получая неочищенное соединение сxx^ν.
Соединение сxx^ν (69,6 ммоль) растворяют в ДМФ (60 мл) и ТГФ (60 мл). К смеси добавляют Ν(бензилоксикарбонилокси)сукцинимид (17,33 г, 69,6 ммоль), с последующим добавлением Э1РЕА (12,1 мл, 69,6 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи в атмосфере Ν2. Смесь концентрируют до остаточного объема (50 мл) и разбавляют ЕЮАс. Органическую фазу промывают 0,1н. НС1 (2х 100 мл) и насыщенным раствором соли, получая соединение сxxν (17,5 г, 54,2% за пять стадий).
Соединение сxxν (5,66 г, 20,14 ммоль) растворяют в ЭСМ (60 мл). К указанному раствору добавляют РуВОР (12,57 г, 24,2 ммоль) и НОВТ (3,27 г, 24,2 ммоль) и перемешивают пять минут. Полученную смесь охлаждают до 0°С и затем добавляют циклопропиламин (1,67 мл, 24,2 ммоль) и Э1РЕА (4,2 мл, 24,2 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи, давая нагреться до комнатной температуры. Реакционную смесь промывают 0,1н. НС1, насыщенным КаНСО3 и насыщенным раствором соли. Органическую фазу затем концентрируют и очищают хроматографией, используя 70% ЕЮАс/гексаны, что дает соединение сxxν^ (3,18 г, 49,3%).
Соединение сxxν^ (3,18 г, 9,94 ммоль) гидрируют, используя 10% Рб/С (600 мг) в МеОН (70 мл). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи в атмосфере Н2, фильтруют через целит и концентрируют, получая неочищенное соединение χίίί' (2,1 г, 100%).
Пример полупродукта 120. Соединение сxxν^^.
К-СЬ/-Ь-циклогексилглицин (3 г, 10,3 ммоль) растворяют в ЭСМ (36 мл). К указанному раствору добавляют НОА1 (1,5 г, 11,28 ммоль) и ОСС (11,28 мл, 11,28 ммоль) и перемешивают 5 мин. К полученной смеси добавляют гидрохлорид метилового эфира Ь-трет-лейцина (103 мл, 1 М раствор, 10,3 ммоль) и перемешивают в течение ночи в атмосфере Ν2. Реакционную смесь фильтруют через целит, промывают ЕЮАс и концентрируют до остатка, который очищают хроматографией, используя 20-30%
- 81 011547
ΕΐΘΑс/гексаны, что дает соединение сxxν^^ (2,2 г, 52%).
Пример полупродукта 121. Соединение 1χχίχ'.
Соединение сххуб (2,2 г, 5,2 ммоль) гидрируют, используя 20% Рб^Н^/С (1 г) в МеОН (15 мл) в атмосфере Н2, и получают соединение 1χχίχ' (1,4 г, 98%).
0 хЪч Ιχχκ*
Пример полупродукта 122. Соединение 1χχχ.
2-Пиразинкарбоновую кислоту (360 мг, 2,9 ммоль) растворяют в ЭСМ (10 мл). К раствору добавляют РуВОР (1,81 г, 3,5 ммоль). Затем к раствору добавляют соединение 1χχίχ' (825 мг, 2,9 ммоль) в ТГФ (10 мл), с последующим добавлением Э1РНА (0,5 мл, 2,9 ммоль). Полученную смесь перемешивают в течение ночи в атмосфере Ν2. Реакционную смесь разбавляют ΕΐΘΑс и органическую фазу промывают насыщенным NаΗСΘз и насыщенным раствором соли. Остаток, полученный от концентрирования органической фазы, очищают хроматографией, используя 30% ΕΐΘΑс/гексаны, и получают соединение 1χχχ (780 мг, 69%).
Пример полупродукта 123. Соединение 1χχχί.
Соединение 1χχχ гидролизуют, используя МеОН (10 мл) и 1н. NаΘΗ (3 зкв.), и получают соединение 1χχχί (615 мг, 81,8%).
Пример полупродукта 124. Соединение 1χχχίί.
Соединение 1χχχί (610 мг, 1,6 ммоль) растворяют в ЭСМ (10 мл). Затем к раствору добавляют ОСС (1,94 мл, 1,94 ммоль), с последующим добавлением ΗΘΑΐ (270 мг, 1,94 ммоль). Затем к раствору добавляют соединение ν (1,94 ммоль) в ТГФ (19,4 мл). Полученную смесь перемешивают в течение двух ночей в атмосфере Ν2. Реакционную смесь разбавляют ΕΐΘΑс, фильтруют через силикагель и концентрируют. Полученный остаток очищают хроматографией, используя 40% ΕΐΘΑс/гексаны, и получают соединение 1χχχίί (450 мг, 83,4%).
Пример полупродукта 125. Соединение 1χχχίίί.
Соединение 1χχχί гидролизуют, используя ΕΐΘΗ (10 мл) и 1н. NаΘΗ (3 экв.), и получают соединение 1χχχίίί (650 мг, 99%).
Пример полупродукта 126. Соединение сххуй|.
Соединение 1χχχίίί (400 мг, 0,78 ммоль) растворяют в ЭСМ (5 мл). К раствору добавляют РуВОР (610 мг, 1,2 ммоль), с последующим добавлением соединения χίίί' (230 мг, 1,2 ммоль). К полученной смеси добавляют Э1РНА (0,2, мл, 1,2 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи в атмосфере Ν2. Реакционную смесь разбавляют ΕΐΘΑс и органическую фазу промывают насыщенным NаΗСΘз и насыщенным раствором соли. После концентрирования органической фазы остаток очищают хроматографией при градиенте от 100% ΕΐΘΑс до 5% смеси ΕΐΘΗ/ΕΐΘΑс, получая соединение сxxν^^^ (365 мг, 68,7%).
Пример полупродукта 127. Соединение сххх.
Соединение 1χχχίίί (365 мг, 0,7 ммоль) растворяют в ЭСМ (5 мл). К раствору добавляют РуВОР (440 мг, 0,84 ммоль), с последующим добавлением соединения сххгх
оойх (0,84 ммоль) в ТГФ (8,4 мл). К полученной смеси добавляют Э1РНА (0,1 мл, 0,84 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи в атмосфере Ν2. Реакционную смесь разбавляют ΕΐΘΑс и органическую фазу промывают насыщенным NаΗСΘз и насыщенным раствором соли. После концентрирования органической фазы, полученный остаток очищают хроматографией, используя 100% ΕΐΘΑс, и получают соединение сххх (350 мг, 70%).
- 82 011547
Пример полупродукта 128. Соединение сххх1.
Соединение схху (2,54 г, 9,05 ммоль) растворяют в ИСМ (30 мл). К раствору добавляют РуВОР (5,65 г, 10,9 ммоль) и НОВТ (1,47 г, 10,9 ммоль) и перемешивают пять минут. Реакционную смесь охлаждают до 0°С, затем добавляют (8)-(+)-3-метил-2-бутиламин (1,27 мл, 10,9 ммоль) и И1РЕЛ (1,9 мл, 10,9 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи, позволяя нагреться до комнатной температуры. Органическую фазу промывают 0,1н. НС1, насыщенным NаНСОз и насыщенным раствором соли. После концентрирования органической фазы полученный остаток очищают хроматографией, используя 30% ЕЮЛс/гексан, и получают соединение сххх1 (1,44 г, 45,5%).
Пример полупродукта 129. Соединение схх1х.
Соединение сххх1 (1,3 г, 3,7 ммоль) гидрируют, используя 10% Рб/С (500 мг) в МеОН (40 мл). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи в атмосфере Н2. Реакционную смесь фильтруют через целит и органическую фазу концентрируют, получая неочищенное соединение схх1х (800 мг, 100%).
Пример полупродукта 130. Соединение схххгу. Соединение схххп (1,6 г, 3,7 ммоль)
растворяют в МеОН (12 мл). После тщательного продувания Ν2 добавляют 10 мас.% Рб(ОН)2 на углероде (0,74 г) и смесь гидрируют в течение ночи, затем полученную реакционную смесь анализируют ТСХ (30% ЕЮЛс/гексан). Раствор отделяют от твердого вещества фильтрованием и концентрируют, получая соединение схххш
в виде бесцветного масла (100%), которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки. 2-Пиразинкарбоновую кислоту (400 мг, 3,2 ммоль, 1,1 экв.) растворяют в ИСМ/ТГФ (4мл/4 мл) и затем добавляют НОЛ! (440 мг, 3,2 ммоль) и ЭСС (3,3 мл, 1М в ИСМ). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20 мин соединение схххш (0,96 г, 3,2 ммоль), полученное выше, растворяют в ИСМ (6,4 мл) и добавляют к активированной смеси. После перемешивания в течение 2 дней при комнатной температуре реакционную смесь фильтруют через целит и концентрируют до остатка, который очищают хроматографией на колонке (50% ЕЮЛс/гексаны) и получают соединение схххгу в виде белого твердого вещества (1,06 г, 83%).
.Ν. Л \ >· 0 Ό0 οχχχίν
Пример полупродукта 131. Соединение сххху.
Соединение схххгу (1,06 г, 2,6 ммоль) растворяют в МеОН (10 мл) и затем добавляют 2н. №1ОН (водн.) (4 мл, 8 ммоль). Раствор перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, затем полно
- 83 011547 ту гидролиза контролируют ТСХ (50% ЕЮАс/гексаны). Раствор подкисляют до рН 3 с помощью 5н. НС1, разбавляют ЕЮАс и затем органическую фазу экстрагируют. Экстрагированную органическую фазу промывают насыщенным раствором соли и сушат над Мд8О4, получая концентрированием соединение сxxxν (100%).
Ν.
ОН
Пример полупродукта 132. Соединение сxxxν^.
К ЭСМ раствору (8 мл) соединения сxxxν (1,44 г, 3,7 ммоль) при комнатной температуре добавляют НОА (500 мг, 3,7 ммоль) и затем добавляют 1 М раствор ЭСС в ЭСМ (3,7 мл, 3,7 ммоль). После перемешивания в течение 30 мин при комнатной температуре к полученной НОА-активированной кислоте добавляют ТГФ раствор (18,5 мл, 0,2 М) соединения ν (3,7 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь фильтруют через целит. Фильтраты разбавляют ЕЮАс (120 мл) и промывают водой и насыщенным раствором соли. Органическую фазу сушат и концентрируют, получая желтое масло, которое очищают хроматографией на силикагеле (70% ЕЮАс/гексан) и получают соединение сxxxν^ (1 г, 71%).
βοανΙ
Пример полупродукта 133. Соединение сxxxν^^.
К ЕЮН раствору (8 мл) соединения сxxxν^ (1 г, 1,8 ммоль) добавляют 2н. водный раствор ЫаОН (2,7 мл, 5,4 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре, затем подкисляют до рН 3 с помощью 5н. НС1, разбавляют ЕЮАс и затем органическую фазу экстрагируют. Экстрагированную органическую фазу промывают насыщенным раствором соли и сушат над Мд8О4, получая концентрированием соединение сxxxν^^ (88%).
ΦΜΧνίΙ
Пример полупродукта 133. Соединение сxxxν^^^ К ЭСМ раствору (10 мл) соединения сxxxν^^ (350 мг, 0,6 ммоль) добавляют РуВОР (450 мг, 0,86 ммоль). Раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. К указанному раствору затем добавляют соединение χίίί' (160 мг, 0,86 ммоль) с последующим добавлением ЭФЕА (0,23 мл, 1,3 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи и затем гасят водой (25 мл) в течение 30 мин. Смесь экстрагируют затем ЕЮАс. Экстрагированную органическую фазу промывают насыщенным раствором соли и сушат над Мд8О4, затем концентрируют, получая желтое масло. Очистка хроматографией на силикагеле (5% ЕЮН/ЕЮАс) дает соединение сxxxν^^^ (407 мг, 88%).
схх»ЛИ
Пример полупродукта 134. Соединение сxxx^x.
5-Метилизоксазол-3-карбоновую кислоту (200 мг, 2,05 ммоль) растворяют в ЭСМ (5 мл). К раствору добавляют РуВОР (1,07 г, 2,05 ммоль). К раствору добавляют соединение 1χχίχ' (582 мг, 2,05 ммоль) в ЭСМ (5 мл) с последующим добавлением ЭФЕА (0,36 мл, 2,05 ммоль). Полученную смесь перемешивают в течение ночи в атмосфере Ν2. Реакционную смесь разбавляют ЕЮАс и органическую фазу промывают насыщенным №1НСЮ3 и насыщенным раствором соли. Органическую фазу концентрируют и полученный остаток очищают хроматографией, используя 30% ЕЮАс/гексаны, что дает соединение сxxx^x (495 мг, 61,4%).
- 84 011547
Пример полупродукта 135. Соединение схххх.
Соединение сxxx^x гидролизуют, используя МеОН (10 мл) и 1н. №ОН (3 экв.), и получают соединение схххх (430 мг, 90%).
Пример полупродукта 136. Соединение сxxxx^.
Соединение схххх (380 мг, 1 ммоль) растворяют в ЭСМ (5 мл). Затем к раствору добавляют ОСС (1,2 ммоль), с последующим добавлением НОАГ (165 мг, 1,2 ммоль). Затем добавляют соединение ν (1,2 ммоль) в ТГФ (12 мл). Полученную смесь перемешивают в течение ночи в атмосфере Ν2. Реакционную смесь разбавляют ЕГОАс, фильтруют через силикагель и концентрируют. Полученный остаток очищают хроматографией, используя 35% ЕГОАс/гексаны, и получают соединение сxxxx^ (320 мг, 58%).
Пример полупродукта 137. Соединение сxxxx^^.
Соединение сxxxx^ гидролизуют, используя ЕГОН (10 мл) и 1н. №1ОН (3 экв.), и получают соединение сxxxx^^ (730 мг, 94,3%).
сххххб
Пример полупродукта 138. Соединение сxxxx^^^.
Соединение сxxxx^^ (240 мг, 0,46 ммоль) растворяют в ЭСМ (5 мл). Затем к раствору добавляют РуВОР (295 мг, 0,56 ммоль) с последующим добавлением соединения χίίί' (110 мг, 0,56 ммоль). К полученной смеси добавляют Э1РЕА (0,1 мл, 0,56 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение двух ночей в атмосфере Ν2. Реакционную смесь разбавляют ЕГОАс и органическую фазу промывают насыщенным NаНСΟз и насыщенным раствором соли. После концентрирования органической фазы полученный остаток очищают хроматографией, используя 90% ЕГОАс/гексаны, и получают соединение сxxxx^^^ (168 мг, 53%).
Пример полупродукта 139. Соединение сxxxx^у.
К раствору №1ОН (2н, 42,1 мл, 84,2 ммоль) при 5°С добавляют Ь-аланин (5,00 г, 56,1 ммоль). После перемешивания в течение 10 мин одновременно добавляют по каплям метилхлорформиат (6,5 мл, 84,2 ммоль) и №ОН (2н., 42,1 мл, 84,2 ммоль). Раствор перемешивают на ледяной бане в течение 2 ч, затем при комнатной температуре в течение 1 ч. Смесь промывают ЕГ2О (2x50 мл), водный слой нейтрализуют до рН ~2 с помощью 5н. НС1 и экстрагируют ЕГОАс (3x50 мл). Экстрагированную органическую фазу промывают насыщенным раствором соли, сушат Мд8О4 и концентрируют, получая соединение сxxxx^у, н и '0γΝΎοΗ
О 1 οχχχχίν
- 85 011547
Ν-карбометокси-Ь-аланин, (4,54 г, 54%) в виде бесцветного масла.
Пример полупродукта 140. Соединение сxxxxν^.
Раствор соединения сxxxxν (3,57 г, 9,44 ммоль)
схххм в ТГФ при 5°С обрабатывают НОЛ1 (1,28 г, 9,44 ммоль) и затем добавляют ОСС (9,50 мл, 9,50 ммоль). После перемешивания на ледяной бане в течение 45 мин добавляют раствор соединения ν (104 мл, 10,4 ммоль) в ТГФ. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Смесь охлаждают до 5°С и гасят насыщенным NаНСО3. После фильтрования с целью удаления осажденного ОСИ смесь растворяют в ЕЮЛс (100 мл), промывают насыщенным NаНСО3, насыщенным раствором соли, затем сушат Мд8О3 и концентрируют до остатка, очищают хроматографией на колонке с силикагелем (25% ЕЮЛс/гексаны), получая соединение βχχχχνί (2,91 г, 57%) в виде смолистой пены.
сххххм)
Пример полупродукта 141. Соединение суш.
К раствору соединения βχχχχνί в МеОН (25 мл), охлажденному на ледяной бане, в токе Ν2, медленно добавляют Ρά/С. Смесь гидрируют при 1 атм в течение ночи. Катализатор удаляют фильтрованием, фильтрат объединяют с 5 мл ДМФ и сушат в вакууме, получая соединение суш.
Пример полупродукта 142. Соединение βχχχχνίί.
Раствор соединения βχχχχίν (0,298 г, 2,03 ммоль) и НОЛ1 (0,27 6 г, 2,03 ммоль) в ТГФ, охлажденный на ледяной бане, обрабатывают ОСС (2,05 мл, 2,05 ммоль). После перемешивания на ледяной бане в течение 0,5 ч добавляют раствор соединения суш в ТГФ и затем добавляют ОГГЕЛ (0,39 мл, 2,2 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, затем охлаждают на ледяной бане и гасят насыщенным NаНСО3. Выпавший в осадок ОСИ фильтруют и фильтрат растворяют в ЕЮЛс (100 мл). Органическую фазу промывают насыщенным NаНСО3, насыщенным раствором соли и затем сушат Мд§О4. После удаления органического растворителя остаток очищают хроматографией на колонке с силикагелем (60% ЕЮЛс/гексаны), получая соединение сxxxxν^^ (0,47 г, 48%) в виде смолистой пены.
СХХХХУП
Пример полупродукта 143. Соединение сxxxxν^^^.
К раствору соединения сxxxxν^^ (0,47 г, 0,847 ммоль) в ЕЮН (5 мл) при 5°С добавляют №ЮН (2н, 1,31 мл, 2,62 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч. Раствор подкисляют до рН ~2 с помощью НС1 (1н) и ЕЮН удаляют упариванием на роторном испарителе. Смесь экстрагируют ЕЮЛс (3х 30 мл), объединенный экстракт промывают насыщенным раствором соли и затем сушат Мд§О4. Растворитель удаляют и остаток сушат в вакууме, получая соединение сxxxxν^^^ (0,366 г, 82%) в виде смолистой пены.
СЮОМИЙ
Пример полупродукта 144. Соединение сП.
Раствор соединения сxxxxν^^^ (0,366 г, 0,718 ммоль) в ЭСМ охлаждают на ледяной бане и обрабатывают РуВор (0,5 99 г, 1,15 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 0,5 ч смесь охлаждают на ледяной бане и обрабатывают раствором соединения χίίί' (0,200 г, 1,08 ммоль) в ТГФ и ЭРЕЛ (0,250 мл, 1,44 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи и затем гасят раствором ΝΉ4Ο. Растворитель концентрируют и смесь растворяют в ЕЮЛс (100 мл). Органическую фазу промывают насыщенным NаНСО3, насыщенным раствором соли и затем сушат Мд§О4. После удаления органического растворителя остаток очищают хроматографией на колонке (5% ЕЮН/ЕЮЛс), получая соединение сП (0,35 г, 72%).
- 86 011547
Пример полупродукта 145. Соединение сххг
К ТГФ раствору (85 мл) N-Βοс-Nνа-ΟН (соединения 1) (8,68 г, 40 ммоль) добавляют СЭ1 (7,79 г, 48 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 30 мин полученный раствор обрабатывают ДМФ раствором (25 мл), содержащим ^0-диметилгидроксиламингидрохлорид (4,25 г, 44 ммоль) и ЦГРЕА (7,66 мл, 44 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь затем концентрируют в вакууме. Полученный остаток разбавляют ЕЮАс (300 мл). Полученный раствор последовательно промывают 0,1н. НС1 (50 мл), насыщенным NаНΟ0з (3x50 мл) и насыщенным раствором соли. Органическую фазу концентрируют в вакууме, получая остаток, который очищают хроматографией на силикагеле (40% ЕЮАс/гексаны) и получают соединение схх1 (9,38 г, 94%).
Пример полупродукта 146. Соединение сххп.
К диэтиловому (Εΐ20) раствору (50 мл) соединения схх1 (9,38 г, 31,9 ммоль), охлажденному до 0°С добавляют (медленно) ЬАН (34,7 мл, 1 М, 34,7 ммоль). Во время добавления ЬАН температуру реакционной колбы поддерживают ниже 5°С. По завершению добавления к реакционной смеси добавляют ЕЮАс (20 мл), чтобы погасить избыток ЬАН. Водный КН8СЦ (5%, 20 мл) добавляют затем каплям, чтобы поддерживать температуру ниже 5°С. Органическую фазу отделяют и затем промывают последовательно 1н. НС1 (3x30 мл), насыщенным NаНΟ0з (3x30 мл) и насыщенным раствором соли. Органическую фазу концентрируют и сушат в вакууме, получая неочищенное соединение сххп (5,18 г, 69%).
Пример полупродукта 147. Соединение с1.
К суспензии Ζη (2,75 г, 42 ммоль) в ТГФ (25 мл) добавляют при кипячении с обратным холодильником 0,2 мл ΕЮΟ(О)ΟΕ2Β^. Затем медленно добавляют ТГФ раствор (25 мл) соединения сххп (3,05 г, 15,0 ммоль) и ЕЮС^СЕ^г (4,84 мл, 37,5 ммоль). По завершении добавления обоих реагентов реакционную смесь дополнительно нагревают до температуры кипения с обратным холодильником еще 30 мин. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и разбавляют ЭСМ (200 мл). Органическую фазу промывают 1н. КН804. Органическую фазу концентрируют и сушат в вакууме, получая остаток, который очищают хроматографией на силикагеле (20% ЕЮАс/гексан), получая соединение с1 (2,78 г, 57%).
ВосНК
РР
Данная методика, по существу, та же, что описана ТНакгАопдк е1 а1., I. Мей. СНет., 29, 2080-2087 (1986).
Пример полупродукта 148. Соединение с11.
ТГФ раствор (40 мл) соединения с1 (2,78 г, 8,53 ммоль) обрабатывают 1н. №ЮН (12,8 мл, 12,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение ночи растворитель частично удаляют в вакууме. Оставшуюся реакционную смесь разбавляют водой (50 мл) и лиофилизуют, получая неочищенное соединение с11 (2,82 г, >100%) в виде натриевой соли.
сП
Данная методика, по существу, та же, что описана ТНакгАопдк е1 а1., I. Мей. СНет.. 29, 20802087(1986).
Пример полупродукта 149. Соединение с1и.
ЭСМ раствор (10 мл) неочищенного соединения с11 (516 мг, 1,61 ммоль) обрабатывают НОВТ (436 мг, 3,23 ммоль) и Э1С (0,328 мл, 2,09 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 30 мин реакционную смесь обрабатывают ЭСМ раствором (5 мл), содержащим ТЮН-соль бензилового эфира глицина (815 мг, 2,42 ммоль) и ЦГРЕА (0,422 мл, 2,42 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 12 ч реакционную смесь гасят водой и экстрагируют ЕЮАс. Органическую фазу сушат, концентрируют в вакууме и очищают хроматографией на силикагеле (40% ЕЮАс/гексаны), получая соединение сШ (495 мг, 69%). 1Н ЯМР соединения сШ (400 МГц, СЮСЬ): δ 7,297,21 (м, 5Н), 5,16 (уш.с, 2Н), 4,89 (уш.с, 1Н), 4,20-3,90 (м, 4Н), 3,80 (уш.с, 1Н), 1,75-1,42 (м, 4Н), 1,38 (с, 9Н), 0,87 (м, 3Н).
- 87 011547
Исходя из неочищенного соединения с11, соединения с1ш (83%) и с1к (50%) получают способом, идентичным описанному для соединения сШ. 1Н ЯМР соединения с1ш (400 МГц, СЭС13): δ 7,49 (уш.с, 1Н), 7,34-7,24 (м, 5Н), 5,13 (АВ кв, 1=12,2 Гц, Т=23,9 Гц, 2Н), 4,88 (уш.д, 1=8,8 Гц, 1Н), 4,53 (м, 1Н), 3,983,91 (м, 2Н), 3,82 (м, 1Н), 1,65-1,20 [м, 16Н, включая синглет при 1,37 (9Н)], 0,86 (т, 1=7,3 Гц, 3Н).
!Н ЯМР соединения с1к (400 МГц, СОС13) : δ 7,60-7,0 (м, 10Н), 5,30-5,0 (м, 2Н), 5,00-4,75 (м, 2Н), 4,15-3,70 (м, 3Н), 3,30-3,00 (м, 2Н), 1,75-1,20 [м, 13Н, включая синглет при 1,37 (9Н)], 0,86 (уш.с, 3Н).
Пример полупродукта 150. Соединение ск.
К ЭСМ (10 мл) и ТГФ (5 мл) раствору неочищенного соединения с11 (1 г, 3,13 ммоль) добавляют НОВТ (634 мг, 4,69 ммоль) и ЕЭС1 (781 мг, 4,07 ммоль), и затем (з)-а-метилбензиламин (0,604 мл, 4,69 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре и затем гасят водой. Реакционную смесь экстрагируют ЕГОАс. Органическую фазу промывают насыщенным раствором соли и сушат №28О4. Органическую фазу концентрируют в вакууме, получая остаток, который очищают хроматографией на силикагеле (20% ЕГОАс/гексаны) и получают соединение ск (459 мг, 37%). !Н ЯМР соединения ск (400 МГц, СОС13): δ 7,32-7,21 (м, 6Н), 5,0 (м, 1Н), 4,75 (м, 1Н), 3,94 (м, 2Н), 3,70 (м, 1Н), 1,65-1,15 [м, 16Н, включая дублет при 1,51 (1=6,8 Гц, 3Н), синглет при 1,39 (9Н)], 0,82 (м, 3Н).
Пример полупродукта 151. Соединение сМ.
Соединение ск (220 мг, 0,55 ммоль) растворяют в 4н. НС1 в диоксане (10 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч и затем концентрируют в вакууме, получая неочищенное соединение сМ (~100%) в виде НС1-соли.
Следуя методике, описанной для получения соединения сМ, соединения ски, скш и сйх получают с почти количественным выходом из неочищенного соединения с11.
- 88 011547
Пример полупродукта 152. Соединение с1х.
ЭСМ раствор (4 мл) НС1-соли соединения νίί (96 мг, 0,144 ммоль) обрабатывают РуВОР (120 мг, 0,23 ммоль) и Э1РЕЛ (0,1 мл, 0,576 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 30 мин раствор обрабатывают ТГФ раствором (4 мл), содержащим соединение с1у (0,288 ммоль) и Э1РЕА (0,2 мл, 1,152 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разбавляют ЕЮАс (50 мл) и органическую фазу промывают затем NаНСО3 и насыщенным раствором соли. Органическую фазу концентрируют в вакууме и остаток очищают хроматографией на силикагеле (80% ЕЮАс/гексаны), получая соединение с1х (113 мг, 89%).
Пример полупродукта 153. Соединение с1х1.
ЭСМ раствор (6 мл) соединения νίί (140 мг, 0,235 ммоль) обрабатывают РуВОР (196 мг, 0,376 ммоль) в течение 30 мин. Затем к полученному раствору добавляют ТГФ раствор (6 мл) соединения с1уи (~0,47 ммоль) и Э1РЕА (0,327 мл, 1,88 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи и гасят водой (30 мин). Реакционную смесь экстрагируют ЕЮАс (50 мл). Органическую фазу промывают NаНСО3 и насыщенным раствором соли. Объединенные водные слои вновь экстрагируют ЕЮАс (50 мл). Объединенные органические фазы сушат и концентрируют в вакууме. Полученный остаток очищают хроматографией на силикагеле (80-100 смесь ЕЮАс/гексаны) и получают соединение с1х1 (104 мг, 48%).
Пример полупродукта 154. Соединение с1хи.
К ЭСМ раствору (10 мл) соединения с1х1 (280 мг, 0,304 ммоль) добавляют ЭМР реагент (193 мг, 0,456 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч и гасят 10% №ь8О3. Органическую фазу промывают NаНСО3 и насыщенным раствором соли. Полученную органическую фазу сушат и концентрируют в вакууме, получая остаток, который очищают хроматографией на силикагеле (80-100% ЕЮАс/гексаны) и получают соединение с1хп (271 мг, 97%).
Пример полупродукта 155. Соединение с1хш.
Соединение 1χχχίίί (220 мг, 0,43 ммоль) поглощают ЭСМ (5 мл). К ЭСМ раствору добавляют РуВОР (270 мг, 0,51 ммоль) и перемешивают 5 мин. К указанному раствору добавляют по каплям соединение χχχνί' (0,51 ммоль) в ТГФ (5,1 мл). К реакционной смеси добавляют Э1РЕА (0,09 мл, 0,51 ммоль) и перемешивают в течение ночи в атмосфере Ν2. На следующий день реакционную смесь разбавляют ЕЮАс, промывают насыщенным NаНСО3, промывают насыщенным раствором соли. Очистка при градиенте смеси 70-90% ЕЮАс/гексан дает соединение с1хш (180 мг, 56%).
Пример полупродукта 156. Соединение с1хгу.
Соединение сχχν (2,09 г, 7,4 ммоль) поглощают ЭСМ (20 мл). К указанному раствору добавляют РуВОР (4,64 г, 8,9 ммоль) и НОВ! (1,2 г, 8,9 ммоль) и перемешивают 5 мин. Полученную смесь охлаждают до 0°С и затем добавляют 8(-)-а-метилбензиламин (1,15 мл, 8,9 ммоль) и Э1РЕА (1,55 мл, 8,9 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи, давая нагреться до комнатной температуры. Реакционную смесь промывают 0,1н. НС1, насыщенным NаНСО3 и насыщенным раствором соли. Очист- 89 011547 ка смесью 30% ΕΐΟΑс/гексаны дает соединение с1\1у (1,6 г, 56,3%).
Пример полупродукта 157. Соединение χχχνί'.
Соединение Οχίν (1,48 г, 3,8 ммоль) гидрируют, используя 10% Рб/С (300 мг) в МеОН (50 мл). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи в атмосфере Н2. Реакционную смесь фильтруют через целит и концентрируют, получая соединение χχχνί' (895 мг, 94,2%).
Пример полупродукта 158. Соединение с1.\уг
К ЭСМ раствору (15 мл) соединения с1.\у (2 г, 8,2 ммоль)
добавляют НΟΑΐ (1,34 г, 9,84 ммоль) и ОСС (9,84 мл, 1 М, 9,84 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20 мин к полученному выше раствору добавляют ТГФ раствор (9,84 мл), содержащий гидрохлорид метилового эфира трет-Ь-лейцина (9,84 ммоль) и ΟΙΓΕΑ (1,72 мл, 9,84 ммоль). Затем добавляют при комнатной температуре ^ΜΛР (1 г, 8,2 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Последующие стандартная водная обработка и хроматография на силикагеле (20% ΕΐΟΑс/гексаны) приводят к получению соединения с1\у| (1,75 г, 58%).
Пример полупродукта 159. Соединение Πχνίί.
К ТГФ раствору (35 мл) соединения Πχνί (1,75 г, 4,73 ммоль) добавляют 4н. раствор НС1 в диоксане (11,8 мл, 47,3 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. По прошествии указанного времени растворитель удаляют при пониженном давлении, получая неочищенное соединение Πχνίί (~100%), которое вновь растворяют в ДМФ и используют непосредственно в последующей реакции.
Пример полупродукта 160. Соединение Πχνίίί.
К ЭСМ раствору (15 мл), содержащему 2-пиразинкарбоновую кислоту (447 мг, 3,6 ммоль), РуВОР (1,87 г, 3,6 ммоль) добавляют ДМФ раствор (15 мл) соединения Πχνίί (811 мг, 3 ммоль). К образовавшейся смеси затем добавляют ΌΙΓΕΑ (0,63 мл, 3,6 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре и затем гасят водой. Реакционную смесь экстрагируют ΕίΌΑ^ Органический слой промывают насыщенным раствором соли и концентрируют в вакууме, что дает остаток, который очищают хроматографией на силикагеле (40% ΕΐΟΑс/гексаны) и получают соединение Πχνίίί (0,93 г, 82%).
Пример полупродукта 161. Соединение Πχίχ.
К МеОН раствору (10 мл) соединения Πχνίίί (0,93 г, 2,47 ммоль) добавляют 2н. №ОН (3,71 мл, 7,41 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Затем реакционную смесь подкисляют до рН 3, используя 1н. НС1. Реакционную смесь разбавляют ΕΐΟΑс (75 мл) и промывают водой и насыщенным раствором соли. Полученный таким образом органический слой сушат и концентрируют в вакууме, получая соединение Πχίχ (~100%).
- 90 011547
Пример полупродукта 162. Соединение с1хх.
ЭСМ раствор (10 мл) соединения с1х1х (2,47 ммоль) обрабатывают НОА! (436 мг, 3,21 ммоль) и ОСС (3,2 мл, 1 М, 3,2 ммоль). После перемешивания в течение 30 мин реакционную смесь обрабатывают ТГФ раствором (13,6 мл) соединения ν (499 мг, 2,72 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение ночи белые твердые вещества (мочевину) фильтруют. Фильтраты концентрируют в вакууме, получая остаток, который очищают хроматографией на силикагеле, получая соединение с1хх (0,99 г, 76%).
Пример полупродукта 163. Соединение с1хх1.
Е!ОН раствор (20 мл) соединения с1хх (0,99 г, 1,88 ммоль) обрабатывают 2н. ЫаОН (2,81 мл, 5,63 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение ночи реакционную смесь подкисляют до рН 3 с помощью 1н. НС1. Реакционную смесь экстрагируют Е!ОАс (75 мл). Органический слой сушат и концентрируют в вакууме, получая соединение с1хх1 (772 мг, 82%).
Пример полупродукта 164. Соединение с1хх1.
ЭСМ раствор (10 мл) соединения с1хх1 (290 мг, 0,58 ммоль) обрабатывают РуВОР (484 мг, 0,93 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20 мин реакционную смесь обрабатывают ТГФ раствором (7,5 мл) соединения хш' (140 мг, 0,75 ммоль), затем Э1РЕА (0,13 мл, 0,75 ммоль). После перемешивания в течение ночи при комнатной температуре реакционную смесь гасят водой и экстрагируют Е!ОАс. Полученный органический слой промывают насыщенным раствором соли, сушат и концентрируют в вакууме. Полученный остаток очищают хроматографией на силикагеле (5% Е!ОН/Е!ОАс), получая соединение с1ххп 290 мг (75%).
Пример полупродукта 165. Соединение с1хх1у.
Соединение 1хххш (600 мг, 1,17 ммоль) поглощают ЭСМ (4 мл). Добавляют РуВОР (670 мг, 1,3 ммоль), перемешивают пять минут и охлаждают до 0°С. К указанному раствору добавляют по каплям соединение с1ххш
(333 мг, 1,3 ммоль) в ТГФ (13 мл). К реакционной смеси добавляют Э1РЕА (0,23 мл, 1,3 ммоль) и дают нагреться до температуры окружающей среды, перемешивая в течение двух ночей. На следующий день реакционную смесь концентрируют и очищают, используя 2% Е!ОН/Е!ОАс, что дает неочищенное соединение с1хх1у (900 мг, свыше 100%).
οΐχχίν
Пример полупродукта 166. Соединение с1хху1.
Соединение схху (3,01 г, 10,7 ммоль) поглощают ЭСМ (30 мл) и температуру снижают до -78°С. К указанному раствору добавляют РуВОР (6,1 г, 11,7 ммоль) и НОВТ (1,58 г, 11,7 ммоль) с последующим добавлением (8)-(+)-1-циклогексилэтиламина, соединения с1хху, (1,74 мл, 11,7 ммоль) и Э1РЕА (2,1 мл, 11,7 ммоль). Полученную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. На следую- 91 011547 щий день реакционную смесь разбавляют ЕЮАс, промывают 0,1н. НС1, насыщенным NаНСОз и насыщенным раствором соли. Продукт очищают, используя 40% Е1ОАс/гексан, и получают 2 г (47,8%) соединения ^χνί.
οΙχχνΙ
Пример полупродукта 167. Соединение ο1χχΐΐΐ.
Соединение Πχχνί (2 г, 5,13 ммоль) гидрируют, используя 10% Рб/С (500 мг) в МеОН (40 мл). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи в атмосфере Н2. Реакционную смесь фильтруют через целит и концентрируют, получая соединение Οχ-χίπ (1,31 г, 99,8%).
Пример полупродукта 168. Соединение Πχχίχ.
В круглодонной колбе в инертной атмосфере соединение Οχ-χγιι [1-бензиловый эфир (8)-(-)-2-оксо1,5-имидазолиндикарбоновой кислоты]
С1ХХУП (290 мг, 1,1 ммоль) растворяют в безводном ДМФ (6 мл). Добавляют НОА! (151 мг, 1,2 ммоль) и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре 25 мин. Реакционную смесь охлаждают на ледяной бане. Затем добавляют Э1С (0,2 мл, 0,16 г, 1,2 ммоль) с последующим добавлением соединения ο1χχνΐΐΐ (1 ммоль, 435 мг) в безводном ДМФ (4 мл). Реакционную смесь оставляют медленно нагреваться до комнатной температуры и перемешивают в течение 2 дней. Затем реакционную смесь переносят в делительную воронку, содержащую 120 мл ЕЮАс, и промывают 2х 1н. НС1 (50 мл) и 1Х насыщенным раствором соли. Органический слой отделяют, сушат над Мд8О4. Растворитель упаривают при пониженном давлении и остаток очищают хроматографией на силикагеле (загружают в ЭСМ и элюируют 30%, затем 50% ЕЮАс/ИСМ, затем 2% МеОН/ЕЮАс), получая продукт ^χχίχ (434 мг, 64%).
Пример полупродукта 169. Соединение Πχχχ.
Исходное вещество ^χχίχ (434 мг, 0,64 ммоль) растворяют в диоксане (6 мл) и 0,5 М водном растворе №ЮН (4 мл, 3 экв.). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи. ТСХ в 100% ЕЮАс (используют пятно РМА) показывает в дополнение к кислотному продукту на старте продукт с более быстрой фракцией. Реакционную смесь подкисляют до рН 2 с помощью 1н. НС1 и затем экстрагируют 2х ЕЮАс. К водному раствору добавляют твердый Хао для усиления экстракции. Органические экстракты затем объединяют, сушат над Мд8О4 и упаривают при пониженном давлении. МС показывает, что ί,'ΒΖ группа удаляется путем гидролиза. Полученное соединение ^χχχ (количественный выход) используют на следующей стадии как таковое.
οΙλλλ.
Пример полупродукта 170. Соединение с1χχχ^.
В круглодонной колбе в инертной атмосфере соединение ^χχχ (279 мг, 0,54 ммоль) растворяют в безводном ДМФ (6 мл). Добавляют НОА1 (82 мг, 0,65 ммоль) и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 25 мин. Реакционную смесь охлаждают затем на ледяной бане. Затем добавляют ИГС (0,11 мл, 0,65 ммоль) с последующим добавлением соединения χίίί' (0,7 ммоль) в безвод
- 92 011547 ном ДМФ (4 мл). Реакционную смесь оставляют медленно нагреваться до комнатной температуры и перемешивают 21 ч. Реакционную смесь затем выгружают в делительную воронку, содержащую 120 мл Е!ОАс, и промывают 2х 1н. НС1 (50 мл) и 1Х насыщенным раствором соли. Органический слой отделяют, сушат над Мд8О4. Растворитель упаривают при пониженном давлении и продукт очищают хроматографией на силикагеле (загружают в ЭСМ и элюируют 50% ЕЮАс/ОСМ, затем 3% МеОН/Е!ОАс и затем 20% Е!ОН/Е!ОАс). После удаления растворителя остаток повторно растворяют в Ότι 8о1у ТГФ и фильтруют для удаления силикагеля. Последующее удаление растворителя дает соединение Οχχχί (434 мг, 64% выход).
Пример полупродукта 171. Соединение Οχχχίίί.
В круглодонной колбе в инертной атмосфере 6-гидроксипиколиновую кислоту
соон (153 мг, 1,1 ммоль) растворяют в безводном ДМФ (6 мл). Добавляют НОА! (151 мг, 1,2 ммоль) и затем реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 25 мин. Реакционную смесь охлаждают затем на ледяной бане. Добавляют Э1С (0,2 мл, 0,16 г, 1,2 ммоль) с последующим добавлением соединения Οχχχίί
(1,0 ммоль, 435 мг) в безводном ДМФ (4 мл). Реакционную смесь оставляют медленно нагреваться до комнатной температуры и перемешивают 2 дня. Реакционную смесь затем выгружают в делительную воронку, содержащую 120 мл Е!ОАс, и промывают 2х 1н. НС1 (50 мл) и 1Х насыщенным раствором соли. Органический слой отделяют, сушат над Мд8О4. Растворитель упаривают при пониженном давлении и продукт очищают хроматографией на силикагеле (загружают в ЭСМ, элюируют 30%, затем 50% Е!ОАс/ОСМ и затем 2% МеОН/Е!ОАс), что позволяет собрать образовавшееся соединение Οχχχίίί (314 мг, 56%).
Пример полупродукта 172. Соединение Οχχχίν.
Исходное вещество Οχχχίίί (314 мг, 0,56 ммоль) растворяют в диоксане (5 мл) и 0,5 М №1ОН (3,4 мл, 3 экв.). Реакцию осуществляют в течение ночи. ТСХ в 100% Е!ОАс (с применением УФ) свидетельствует о полной конверсии до кислотного продукта на старте с медленной фракцией. Реакционную смесь подкисляют до рН 2 с помощью 1н. НС1 и затем экстрагируют 2х Е!ОАс. К водной фазе добавляют твердый №1С1 для усиления экстракции. Органические экстракты затем объединяют, сушат над Мд8О4 и затем упаривают при пониженном давлении, получая соединение Οχχχίν (0,5 ммоль, 89%), которое используют на следующей стадии как таковое.
Пример полупродукта 173. Соединение Οχχχν.
В круглодонной колбе в инертной атмосфере кислотное соединение Οχχχίν (265мг, 0,5 ммоль) растворяют в безводном ДМФ (6 мл). Добавляют НОАТ (75,6 мг, 0,6 ммоль) и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре 25 мин. Реакционную смесь охлаждают на ледяной бане. Затем добавляют Э1С (0,1 мл, 0,6 ммоль) с последующим добавлением соединения χίίί' (0,65 ммоль) в безводном ДМФ (4мл). Реакционную смесь оставляют медленно нагреваться до комнатной температуры и переме
- 93 011547 шивают в течение 21 ч. Реакционную смесь затем выгружают в делительную воронку, содержащую ЕЮАс (120 мл), и промывают 2х 1н. НС1 (50 мл) и 1х насыщенным раствором соли. Органический слой отделяют, сушат над Мд§О4. Растворитель упаривают при пониженном давлении и продукт очищают хроматографией на силикагеле (загружают в ЭСМ, элюируют 50% ЕЮАс/гексан, затем чистым ЕЮАс и затем 4% МеОН/ЕЮАс), получая продукт, соединение Φχχχν (185 мг, 52%).
Пример полупродукта 174. Соединение сxxxx^ν'.
К раствору Ό-аланина (5 г, 56,1 ммоль) в 1н. №1ОН (152 мл, 152 ммоль) при 0°С добавляют раствор МеОС(О)С1 (6,5 мл, 84,2 ммоль) в диэтиловом эфире (30 мл). Смесь перемешивают на ледяной бане в течение 3 ч и затем доводят до рН 9 с помощью 1н. №1ОН. После перемешивания при комнатной температуре в течение 1 ч смесь промывают диэтиловым эфиром (3x50 мл), подкисляют до рН ~2 с помощью 5н. НС1, экстрагируют ЕЮАс (5x50 мл). Органический экстракт промывают водой, насыщенным раствором соли и затем сушат (Мд§О4). Растворитель удаляют, получая соединение сxxx^ν, Νметоксикарбонил-Э-аланин, в виде бесцветного масла (6,48 г, 79%).
Пример полупродукта 175. Соединение Φχχχνί.
Раствор Ν-метоксикарбонил-Э-аланина (0,193 г, 1,31 ммоль) и НОАί (0,177 г, 1,31 ммоль) в ЭСМ (10 мл), охлажденный на ледяной бане, обрабатывают ОСС (1,31 мл, 1,31 ммоль). После перемешивания на ледяной бане в течение 0,5 ч добавляют раствор полученного соединения Φχχχίί (0,88 ммоль) ТГФ (8,8 мл). Смесь нагревают до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи, затем охлаждают на ледяной бане и гасят насыщенным раствором NаНСО3. Выпавшие осадки фильтруют и фильтрат поглощают ЕЮАс (100 мл). Органический слой промывают насыщенным раствором NаНСО3, насыщенным раствором соли и затем сушат (Мд§О4). После удаления растворителя остаток очищают хроматографией на колонке с силикагелем (60% ЕЮАс/гексан), получая соединение Φχχχνί в виде смолистой пены (0,321 г, 68%).
Пример полупродукта 176. Соединение Φχχχνίί.
К раствору соединения Φχχχνί (0,321 г, 0,597 ммоль) в ЕЮН (5 мл) при 5°С добавляют 2н. №ОН (1,05 мл, 2,1 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч. Раствор подкисляют до рН ~2 с помощью 1н. НС1 и ЕЮН удаляют упариванием на роторном испарителе. Смесь экстрагируют ЕЮАс (3x30 мл) и объединенный экстракт промывают насыщенным раствором соли и затем сушат (Мд§О4). Растворитель удаляют и остаток сушат в вакууме, получая соединение Φχχχνίί в виде смолистой пены (0,235 г, 77%).
οΐχχχνϋ
Пример полупродукта 177. Соединение Φχχχνίίί.
Раствор соединения Φχχχνίί (0,363 г, 0,712 ммоль) в ЭСМ (10 мл) охлаждают на ледяной бане и обрабатывают РуВОР (0,594 г, 1,14 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 0,5 ч смесь охлаждают на ледяной бане и обрабатывают раствором соединения χίίί' (1,1 ммоль) в ТГФ (11 мл) и Э1РЕА (0,249 мл, 1,42 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи и гасят раствором ТРС1. Растворитель концентрируют и смесь поглощают ЕЮАс (100 мл). Органический слой промывают насыщенным раствором NаНСО3, насыщенным раствором соли и затем сушат (Мд§О4). После удаления растворителя остаток очищают хроматографией на колонке (5% ЕЮН/ЕЮАс), получая
- 94 011547
Πχχχνίίί (0,341 г, 71%).
Пример полупродукта 178. Соединение Πχχχίχ.
Диаминопропионовую кислоту (3 г, 28,7 ммоль) поглощают 1М №ЮН (86,2 мл, 86,2 ммоль), охлаждают до 0°С и затем добавляют МеОС(О)С1 (5,54 мл, 71,75 ммоль) в ЕеО (25 мл). Полученную смесь перемешивают в течение ночи при нагревании до комнатной температуры. Снижают рН реакционной смеси до 2 и водный слой экстрагируют 3х ЕЮАс. Экстракты объединяют, сушат над №28О4, фильтруют и концентрируют, получая соединение ^χχχίχ (3,09 г, 48,9%).
Пример полупродукта 179. Соединение сс.
Соединение ^χχχίχ (340 мг, 1,55 ммоль) поглощают ЭСМ (4 мл). Добавляют ОСС (1,7 ммоль) и НОА1 (235 мг, 1,7 ммоль) с последующим добавлением соединения Πχχχίί (1,7 ммоль) в ЭСМ (3,4 мл). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи. На следующий день реакционную смесь фильтруют через рыхлый слой диоксида кремния и концентрируют. Очистку осуществляют в смеси 75% ЕЮАс/гексан, получая соединение Πχχχχ (715 мг, 72,4%).
Пример полупродукта 180. Соединение Πχχχχί.
Соединение Πχχχχ (715 мг, 1,12 ммоль) гидролизуют в стандартных условиях, используя ЕЮН (4 мл) и 1н №ЮН (3 экв.), получают соединение ^χχχχί (600 мг, 88,0%).
Пример полупродукта 181. Соединение Πχχχχίί.
Соединение ^χχχχί (550 мг, 0,9 ммоль) поглощают ЭСМ (8 мл). Добавляют РуВОР (675 мг, 1,3 ммоль) с последующим добавлением соединения χίίί' (1,3 ммоль) в ТГФ (1,3 мл). Добавляют Э1РЕА (0,23 мл, 1,3 ммоль) и образовавшийся раствор перемешивают в течение ночи. На следующий день реакционную смесь разбавляют ЕЮАс, промывают насыщенным КаНСО3 и затем насыщенным раствором соли, затем концентрируют, получая остаток. Полученный остаток очищают, используя 5% ЕЮН/ЕЮАс, и получают соединение Πχχχχίί (290 мг, 41,5%).
Пример полупродукта 182. Соединение Πχχχχίίί.
Метиловый эфир СЬх-циклогексилглицин-трет-лейцина (7,36 г, 17,6 ммоль) гидролизуют в стандартных условиях, используя МеОН (60 мл) и 1н. №1ОН (52,8 мл, 3 экв.), и получают промежуточное соединение ^χχχχίίί (92%).
- 95 011547
Пример полупродукта 183. Соединение с1хххх1У.
Соединение с1ххххш (3,82 г, 9,46 ммоль) поглощают ЭСМ (30 мл). Добавляют ОСС (11,35 ммоль) в
ЭСМ (11,35 мл), с последующим добавлением ΗΘΑΐ (1,54 г, 11,35 ммоль). Полученную смесь перемешивают 5 мин и добавляют соединение ν (9,46 ммоль) в ТГФ (40 мл). Полученную смесь перемешивают в течение ночи. На следующий день реакционную смесь разбавляют ΕΐΘΑс, промывают 1н. НС1, насыщенным NаΗСΘз и затем насыщенным раствором соли, затем концентрируют, получая остаток. Полученный остаток очищают на силикагеле при градиенте 20-30%, получая соединение с1хххх1У (3,03 г, 56,3%).
οΐβχχΐν
Пример полупродукта 183. Соединение с1хххп.
Соединение с1хххх1У (3,03 г, 5,33 ммоль) гидрируют, используя 10% Рб/С (500 мг) в МеОН (30 мл), в атмосфере Н2 в течение 4 ч, получая соединение с1хххи (2,3 г, 99%).
Пример полупродукта 184. Соединение с1хххху.
К раствору 1-амино-1-циклогексанкарбоновой кислоты (2,86 г, 20 ммоль) в МеОН (40 мл) добавляют по каплям 8ΘΠ2 (3 мл) при 0°С. Смесь медленно нагревают до комнатной температуры и затем кипятят с обратным холодильником в течение 5 ч. Затем к прозрачному раствору добавляют Ε!2Θ и отделяют осадок. Твердый продукт дополнительно сушат в вакууме, получая соединение с1хххху (95%) в виде белого порошка.
εϊχχχχν
Пример полупродукта 185. Соединение с1хххху1.
2-Пиразинкарбоновую кислоту (1 г, 8 ммоль, 1 экв.) растворяют в ЭСМ (15 мл), добавляя ΗΘΑΐ (1,1 г, 8 ммоль) и ОСС (8 мл, 1 М) в ЭСМ. После перемешивания при комнатной температуре в течение 20 мин к активированной смеси добавляют соединение с1хххху (1,3 г, 8 ммоль). Затем добавляют Э1РНА (2 мл, 12 ммоль) с последующим добавлением ОМАР (1,5 г, 12 ммоль). После перемешивания в течение 3 дней при комнатной температуре реакционную смесь фильтруют через целит, концентрируют и очищают хроматографией на колонке (50% ΕΐΘΑс/гексан), получая требуемый продукт с1хххху1 в виде желтого масла (2,1 г, 100%).
Пример полупродукта 186. Соединение с1ххххуи.
Соединение с1хххху1 (1,06 г, 2,6 ммоль) растворяют в МеОН (30 мл) с добавлением 2н. NаΘΗ (водн.) (12 мл, 24 ммоль). Раствор перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, до тех пор пока ТСХ (50% ΕΐΘΑс/гексан) не укажет на полноту гидролиза. Затем раствор подкисляют до рН 3 с помощью 5н. НС1, разбавляют ΕΐΘΑс и затем экстрагируют органический слой. Органический слой промывают затем насыщенным раствором соли и сушат над Μд8Θ4, получая концентрированием соединение с1ххххуи (84%).
сЬсхххи!
Пример полупродукта 187. Соединение с1ххххуш.
Соединение с1хххуп (1,6 г, 6,4 ммоль) растворяют в ЭСМ (18 мл) и затем последовательно добавляют ΗΘΑΐ (0,96 г, 7 ммоль) и ОСС (7 мл, 1М в ЭСМ) при комнатной температуре. После перемешивания при комнатной температуре в течение 20 мин к активированной смеси добавляют гидрохлорид метилового эфира Ь-трет-лейцина (7 мл, 1М в ТГФ). Затем добавляют Э1РНА (1,2 мл, 7 ммоль) с последующим добавлением ОМАР (1,2 г, 9,8 ммоль). После перемешивания в течение 3 дней при комнатной температуре реакционную смесь фильтруют через целит, очищают хроматографией на колонке и концен
- 96 011547 трируют, получая соединение с1ххххуш (60% ЕЮЛс/гексан) в виде белого твердого вещества (1,74 г, 72%).
Пример полупродукта 188. Соединение сю.
Соединение Πχχχχνίίί (1,74 г, 4,6 ммоль) растворяют в МеОН (22 мл) с добавлением 2н №ЮН (водн.) (7 мл, 14 ммолъ). Раствор перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, до тех пор пока ТСХ (50% Е!ОЛс/гексан) не укажет на полноту гидролиза. Раствор подкисляют до рН 3 с помощью 5н. НС1, разбавляют Е!ОЛс и затем органический слой экстрагируют. Органический слой промывают насыщенным раствором соли и сушат над Мд8О4 и затем концентрируют, получая соединение сю (100%).
Пример полупродукта 189. Соединение сс.
К ИСМ раствору (15 мл) соединения сю (1,5 г, 4,1 ммоль) при комнатной температуре добавляют НОЛ! (610 мг, 4,5 ммоль), с последующим добавлением 1 М раствора ЭСС в ИСМ (4,5 мл, 4,5 ммоль). После перемешивания в течение 30 мин при комнатной температуре добавляют ТГФ раствор (20 мл, 0,2 М) соединения ν (4 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Затем реакционную смесь фильтруют через целит. Фильтрат концентрируют до желтого масла, которое очищают хроматографией на силикагеле (50% Е!ОЛс/гексан), получая соединение сс1 (660 мг, 32%).
Пример полупродукта 190. Соединение сс!
К Е!ОН раствору (6 мл) соединения сс (600 мг, 1,13 ммоль) добавляют 2н. №ЮН (1,7 мл, 3,4 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре, затем подкисляют до рН 3 с помощью 5н. НС1. Затем смесь разбавляют Е!ОЛс с последующей экстракцией органического слоя. Затем органический слой промывают насыщенным раствором соли и сушат над Мд8О3, получая после концентрирования соединение сс1 (92%).
Пример полупродукта 191. Соединение сси.
К ИСМ раствору (8 мл) ссп (310 мг, 0,62 ммоль) добавляют РуВОР (420 мг, 0,8 ммоль). Раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. К указанному раствору затем добавляют соединение χίίί' (8 мл, 0,1 М) в ТГФ, с последующим добавлением ОГРЕЛ (0,23 мл, 1,3 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи и затем гасят водой (25 мл) в течение 30 мин. Затем смесь экстрагируют Е!ОЛс. Полученный органический слой промывают насыщенным раствором соли и сушат над Мд8О4, затем концентрируют, получая желтое масло. Очистка хроматографией на силикагеле (3% Е!ОН/Е!ОЛс) дает соединение ссп (140 мг, 33%).
Пример полупродукта 192. Соединение ссхту.
К раствору соединения ссш, трет-бутилового эфира (№дифенилметилен)глицина, (6 г, 0,0206 ммоль) и хирального РТС (1,08 г, 0,00206 ммоль) в сухом ЭСМ (48 мл), в атмосфере Ν2, при -60°С, до
- 97 011547 бавляют С§ОН-Н2О (6,9 г, 0,0412 ммоль). К реакционной смеси добавляют по каплям метиловый эфир 1карбокси-1-циклопентена (5,2 мл, 0,0412 ммоль) в 10 мл ЭСМ. Смесь перемешивают в течение 4 дней при -60°С, затем разбавляют 200 мл ЕГ2О и добавляют 15 мл насыщенного водного раствора ИН4С1. Фазы разделяют и органическую фазу промывают 15 мл воды и 15 мл насыщенного раствора соли. Водные фазы экстрагируют 100 мл ЕГ2О. Органические фазы объединяют и сушат над №ь8О4. Неочищенный продукт, полученный удалением растворителя, растворяют в 100 мл ЕГОН и затем добавляют NН2ΟН·НС1 (1,43 г, 0,0206 ммоль) и №1ОАс (1,68 г, 0,0206 ммоль). Смесь нагревают до температуры кипения с обратным холодильником в течение 48 ч. Затем растворитель удаляют и полученный неочищенный остаток непосредственно очищают флэш хроматографией, элюируя смесью 30-50% ЕГОАс/гексан, получая- соединение сск (65%) в виде белого твердого вещества. С12Н^О3 (ММ=225,29); МС: т/ζ (М++1) =226,5. Энантиомерный избыток: 18% ее, определен хиральной ВЭЖХ.
Пример полупродукта 193. Соединение сот.
К раствору соединения сск (2 г, 0,0088 ммоль) в 60 мл ЛСN добавляют каталитическое количество ОМАР (0,216 г, 0,0017 ммоль) и раствор ди-трет-бутилдикарбоната (2,49 г, 0,011 ммоль) в 30 мл АСК Смесь перемешивают в течение 14 ч при комнатной температуре, затем разбавляют 100 мл ЭСМ и промывают насыщенным NаНСΟ3 (10 мл) и насыщенным раствором соли (10 мл). Органическую фазу сушат над №ь8О4. Упаривание растворителя дает неочищенный продукт, который очищают на колонке с силикагелем, элюируя смесью 15% ЕГОАс/гексан, что дает соединение сот (86%) в виде белого твердого вещества. С11; \О. ММ=325,40 МС: т/ζ (М++1)=326,2
Пример полупродукта 194. Соединение сотг
К раствору соединения сот (1,7 г, 0,0052 ммоль) в 50 мл ТГФ (0,14 М) при -78°С добавляют ОГВАБН (7,8 мл, 0,0078 ммоль). Смесь перемешивают в течение 1 ч, затем добавляют 10 мл МеОН. Смесь разбавляют 25 мл ЕГОАс и 25 мл насыщенного водного раствора тартрата натрия и затем перемешивают при комнатной температуре один час. Фазы разделяют и водную фазу однократно экстрагируют 50 мл ЕГОАс. Органические фазы объединяют и сушат над №ь8О4. Упаривание растворителя дает неочищенный остаток, который используют без очистки. Неочищенный продукт растворяют в 25 мл ЭСМ, добавляют ЕГ381 (0,84 мл, 0,0052 ммоль) и смесь охлаждают до -78°С, затем добавляют по каплям ВЕ3ОЕГ2 (0,71 мл, 0,0061 ммоль). Спустя 30 мин добавляют ЕГ381 (0,84 мл) и ВЕ3ОЕГ2 (0,71 мл) и смесь перемешивают в течение 2 ч при -78° С. Реакционную смесь гасят насыщенным водным NаНСΟ3 (10 мл) и экстрагируют ЭСМ (2x20 мл). Органические фазы объединяют и сушат над №ь8О4. Упаривание растворителя дает неочищенный остаток, который очищают флэш хроматографией, элюируя 13% смесью ЕГОАс/гексан, и получают соединение сот1 (87%). С17Н29NΟ4 ММ=311,42 МС: т/ζ (М++1)=312,6.
Пример полупродукта 195. Соединение соти.
Соединение сот1 (0,5 г, 0,0016 ммоль) растворяют в 8 мл раствора 1н. НС1 в ЕГОАс (получен барботированием НС1 через сухой ЕГОАс с последующим разбавлением до 1н добавлением ЕГОАс). Смесь перемешивают 6 ч при комнатной температуре. Растворитель удаляют в вакууме и полученный осадок растворяют в ЕГ2О. После перемешивания смеси в течение 15 мин растворитель удаляют при пониженном давлении. Полученное белое твердое вещество промывают ЕГ2О и соединение сотп (0,27 г, 80% выход) отделяют фильтрованием. С12Н2^О2 ММ 211,15 МС: т/ζ (М+1) =212, 6.
- 98 011547
Пример полупродукта 196. Соединение ν.
К раствору соединения ^χνί (0,230 г, 0,74 ммоль) в ЭСМ (3,7 мл) добавляют ТРА (2,85 мл). Смесь перемешивают в течение ночи, затем растворитель удаляют в вакууме досуха и остаток растворяют в ЕЮН (7,5 мл). Смесь охлаждают до 0°С, добавляют по каплям 8ОС12 (0,22 мл, 2,96 ммоль) и затем кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч. ЕЮН удаляют при пониженном давлении и остаток растворяют в ЭСМ (10 мл). Образовавшийся раствор промывают дважды насыщенным водным раствором №НСЮ3 (5 мл). Фазы разделяют, органическую фазу сушат над Ыа28О4 и растворитель удаляют в вакууме, получая соединение ν (80 %) в виде масла. С1оН17МО2 ММ : 183,25, МС: т/ζ (М++1) =184,2.
Пример полупродукта 197. Соединение сб.
1-Бензилимидазол (6 г, 37,9 ммоль) поглощают ЕьО (180 мл). Образовавшийся раствор охлаждают до -60°С и обрабатывают н-ВиЫ (1,6 М, 24 мл). Реакционную смесь перемешивают 30 мин и затем через смесь барботируют СО2 в течение 15 мин. Осадок фильтруют, промывают ЕвО и затем поглощают Н2О. Полученный водный раствор подкисляют до рН 3 с помощью 5н. НС1. Требуемый продукт, сб, выделяют после лиофилизации в виде белого твердого вещества.
Пример полупродукта 198. Соединение сб1.
ЭСМ раствор (100 мл) соединения ί (9,25 г, 27,9 ммоль) обрабатывают при 0°С ЭА8Т (9,2 мл, 69,8 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение ночи реакционную смесь резко охлаждают льдом и экстрагируют ЭСМ (200 мл). Органический слой промывают насыщенным раствором соли и концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографией на силикагеле (30% ЕЮАс/гексан) и получают 8,5 г (86%) требуемого фторированного промежуточного соединения. Часть полученного промежуточного соединения (4,5 г, 14,2 ммоль) растворяют в ЕЮН (75 мл). Образовавшийся раствор гидрируют в стандартных условиях, используя Ρб(ОΗ)2/С (2,98 г, 20% Ρ6 содержание, 4,26 ммоль). После перемешивания в течение ночи при комнатной температуре реакционную смесь фильтруют через целит. Фильтраты концентрируют в вакууме, получая соединение сб1 (2,5 г, 96%).
Пример полупродукта 199. Соединение сбп.
Раствор соединения сб (8 90 мг, 4,4 ммоль) поглощают ЭСМ (15 мл). Добавляют НОВТ (595 мг, 4,4 ммоль) и ОСС (4,4 ммоль, 1 М в ЭСМ) и перемешивают в течение 20 мин. К указанной смеси добавляют ЭСМ раствор (15 мл) 1χχίχ' (990 мг, 3,5 ммоль). Полученную смесь перемешивают в течение ночи в атмосфере азота. Реакционную смесь разбавляют ЕЮАс, промывают насыщенным ЫаНСО3 и насыщенным раствором соли. Органический слой концентрируют в вакууме, получая остаток, который очищают в смеси 30% ЕЮАс/гексан, получая соединение сби (666 мг, 41%).
Пример полупродукта 200. Соединение сбш.
Соединение сбш получают из соединения сби в стандартных условиях гидролиза, используя метиловый спирт (10 мл) и 1н. ЫаОН (3 экв.). Выделяют 565 мг соединения сбш (88%).
- 99 011547
Пример полупродукта 201. Соединение сб1У.
Соединение сбш (1,24 ммоль) поглощают ЭСМ (5 мл). Добавляют ОСС (1,6 ммоль, 1 М ЭСМ) с последующим добавлением НОАТ (1,6 ммоль). Полученную смесь перемешивают 20 мин и добавляют по каплям соединение сб1 (1,6 ммоль) в ТГФ (8 мл). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи. Реакционную смесь фильтруют и промывают ЕГОАс. Объединенный органический слой промывают насыщенным NаНСΟз, насыщенным раствором соли, сушат над Мд8О4 и концентрируют. Очистку осуществляют в смеси 30% ЕГОАс/гексан, получая соединение сб1У (565 мг, 70%).
Пример полупродукта 202. Соединение сбу.
Соединение сбу (565 мг, 0,86 ммоль) получают из соединения сб1У в стандартных условиях гидролиза, используя этиловый спирт (10 мл) и 1н. №1ОН (3 экв.). Выделяют 490 мг (91%) соединения сбу.
Пример полупродукта 203. Соединение сб\з.
Соединение сбу (490 мг, 0,78 ммоль) поглощают ЭСМ (10 мл). К ЭСМ раствору добавляют РуВОР (520 мг, 1 ммоль) с последующим добавлением ТГФ раствора (10 мл) χίίί (186 мг, 1 ммоль). К реакционной смеси добавляют О1ЕЛ (0,18 мл, 1 ммоль) и перемешивают в течение ночи в атмосфере азота. На следующий день реакционную смесь разбавляют ЕГОАс, промывают насыщенным NаНСΟз и насыщенным раствором соли. Очистку осуществляют в 100% ЕГОАс, получая соединение сбу1 (478 мг, 77%).
Пример полупродукта 204. Соединение сбуц.
Соединение сбу1 (478 мг, 0,6 ммоль) гидрируют, используя Рб(ОН)2/С (20% сухая основа, 100 мг), в МеОН (40 мл). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи в атмосфере водорода. По прошествии указанного времени реакционную смесь фильтруют через целит и концентрируют, получая соединение сбуц (417 мг, 98%).
- 100 011547
Пример полупродукта 205. Соединение сбх.
Соединение схху (поставляемое Л1Ьаиу Мо1еси1аг Векеатсй 1пс., 1,5 г, 5,2 ммоль) поглощают ЭСМ (15 мл). К указанному раствору добавляют РуВОР (2,7 г, 5,2 ммоль) и НО8Т (700 мг, 5,2 ммоль). К указанному выше раствору добавляют ТГФ раствор (15 мл) (-)-альфа-(4-пиридил)этиламина (640 мг, 5,2 ммоль) с последующим добавлением ΌΙΕΆ (0,93 мл, 5,2 ммоль). [(-)-альфа-(4-пиридил)этиламин получают из соли, тартрата (-)-альфа-(4-пиридил)этиламина (Л1бг1сН). перемешиванием с 1н. ΝαΟΗ (2 экв.) в течение 1 ч и последующей экстракцией Е1ОЛс (3х), 70% извлечение]. Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь промывают насыщенным NаΗСΟ3 и насыщенным раствором соли. Продукт очищают в 5% смеси ЕЮН/ЕЮЛс, получая 2 г (99%) промежуточного соединения сбх.
Пример полупродукта 206. Соединение сбуш.
Соединение сбх (2 г, 5,2 ммоль) гидрируют, используя 10% Рб/С (500 мг) в МеОН (50 мл). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи в атмосфере водорода. Продукт фильтруют через целит и концентрируют, получая соединение сбуш (1,3 г, 98%).
с4уш
Фармакология
Как указано в данном описании, соединения по изобретению полезны благодаря их способности ингибировать протеазу НСУ, а следовательно, полезны также для ингибирования репликации НСУ.
Следовательно, изобретение касается способа ингибирования протеазы НСУ, включающего контактирование анти-НСУ-протеаза-ингибирующего количества соединения формулы 1 с композицией, содержащей протеазу НСУ.
Кроме того, изобретение касается способа ингибирования репликации НСУ, включающего контактирование НСУ с эффективным количеством соединения формулы 1.
Далее, изобретение касается способа лечения пациента, страдающего от инфекции НСУ или подвергающегося воздействию инфекции НСУ, включающего введение пациенту фармацевтически эффективного количества соединения формулы 1. Следует понимать, что ссылки на лечение инфекции НСУ включают профилактическую терапию для подавления или остановки инфекции, а также лечение установленного острого или хронического инфекционного заболевания НСУ или физиологических состояний, вызванных инфекцией НСУ, обеспечивающие, по существу, излечивание пациента от инфекции, сдерживание степени (объема) заражения или улучшение связанных с ним физиологических состояний. Подразумевается, что эффективное количество определяет количество соединения по настоящему изобретению, эффективное по разумной биологической оценке, пригодное для использования в контакте с клетками человека или других млекопитающих, не являясь излишне токсичным, не вызывая раздражения, аллергической реакции и тому подобное, и соответствующее разумному соотношению польза/риск при лечении инфекции НСУ и, таким образом, обеспечивающее требуемый терапевтический эффект.
Рассматриваемые физиологические состояния включают некоторые, но не все из возможных клинических состояний, при которых анти-НСУ лечение является оправданным. Специалистам в данной области хорошо известны обстоятельства, определяющие требуется ли анти-НСУ лечение.
Особый аспект изобретения составляет соединение по изобретению для введения в форме фармацевтической композиции, хотя соединение может быть введено и само по себе. Фармацевтическая композиция означает композицию, содержащую соединение формулы 1 и по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, включающей: фармацевтически приемлемые носители, разбавители, создающие покрывающие оболочки средства, вспомогательные средства, эксципиенты или средства доставки, такие как консерванты, наполнители, дезинтеграторы, смачивающие средства, эмульгирующие средства, средства стабилизации эмульсии, суспендирующие средства, изотонические агенты, подсластители, корригенты, отдушки, красители, антибактериальные средства, противогрибковые средства, другие терапевтические средства, смазывающие средства, замедлители или промоторы адсорбции и средств доставки, в зависимости от способа введения и дозированных форм. Композиции могут быть представлены в форме таблеток, пилюль, гранул, порошков, водных растворов или суспензий, растворов для инъекции, эликсиров или сиропов. Характерные примеры суспендирующих средств включают этоксилированные
- 101 011547 изостеариловые спирты, полиоксиэтиленсорбит и сложные сорбитановые эфиры, микрокристаллическую целлюлозу, алюминийметагидроксид, бентонит, агар-агар и трагакант, или смеси указанных веществ. Примеры антибактериальных и противогрибковых средств для предотвращения действия микроорганизмов включают парабены, хлорбутанол, фенол, сорбиновую кислоту и тому подобное. Характерные примеры изотонических средств включают сахара, хлорид натрия и тому подобное. Характерные примеры замедлителей адсорбции для пролонгирования всасывания включают моностеарат алюминия и желатин. Характерные примеры промоторов адсорбции для усиления всасывания включают диметилсульфоксид и родственные аналоги. Характерные примеры носителей, разбавителей, растворителей, средств доставки, солюбилизирующих средств, эмульгаторов и стабилизаторов эмульсии включают воду, хлороформ, сахарозу, этанол, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, тетрагидрофуриловый спирт, бензилбензоат, полиолы, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, глицерин, полиэтиленгликоли, диметилформамид, Тетееп® 60, 8рап® 80, цетостеариловый спирт, миристиловый спирт, моностеарат глицерина и натрийлаурилсульфат, сложные зфиры сорбитана и жирных кислот, растительные масла (такие как хлопковое масло, арахисовое масло, кукурузное масло, оливковое масло, касторовое масло и кунжутное масло) и пригодные для инъекции органические сложные эфиры, такие как этилолеат и тому подобное, или подходящие смеси указанных веществ. Характерные примеры эксципиентов включают лактозу, молочный сахар, цитрат натрия, карбонат кальция, дикальцийфосфат. Характерные примеры дезинтеграторов включают крахмал, альгиновые кислоты и некоторые комплексные силикаты. Характерные примеры смазывающих средств включают стеарат магния, лаурилсульфат натрия, тальк, а также полиэтиленгликоли высокой молекулярной массы.
В комбинации с соединением по настоящему изобретению можно использовать другие терапевтические средства, включая другие анти-НСУ средства. Некоторые характерные примеры известных антиНСУ средств включают иммуномодуляторные средства, такие как α-, β- или γ-интерфероны; ПЭГилированные производные соединения интерферона-α, другие противовирусные средства, такие как рибавирин и амантадин; другие ингибиторы протеазы гепатита С; ингибиторы других мишеней жизненного цикла НСУ, включающих геликазу, полимеразу, металлопротеазу, рибосомы внутреннего проникновения, или противовирусные соединения широкого спектра действия, такие как УХ-497, ингибитор клеточной инозинмонофосфатдегидрогеназы, ГМРОН, описанные в патенте Соединенных штатов № 5807876; либо их комбинации. Терапевтические средства, используемые в комбинации с соединением по настоящему изобретению, могут быть введены раздельно, одновременно или последовательно.
Выбор материала в фармацевтической композиции, отличного от соединения формулы 1, обычно обусловлен химическими свойствами активного соединения, такими как растворимость, конкретным способом введения и мерами предосторожности, соблюдаемыми в фармацевтической практике. Например, эксципиенты, такие как лактоза, цитрат натрия, карбонат кальция, дикальцийфосфат, и дезинтеграторы, такие как крахмал, альгиновые кислоты и некоторые комплексные силикаты, объединенные со смазывающими средствами, такими как стеарат магния, лаурилсульфат натрия и тальк, могут быть использованы для получения таблеток.
Фармацевтические композиции могут быть представлены ассортиментом форм, таких как таблетки, пилюли, гранулы, порошки, водные растворы или суспензии, растворы для инъекции, эликсиры и сиропы.
Жидкая дозированная форма означает дозу активного соединения, предназначенную для введения пациенту в жидкой форме, например фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. В дополнение к активным соединениям жидкие дозированные формы могут содержать инертные разбавители, обычно используемые в данной области, такие как растворители, солюбилизирующие агенты и эмульгаторы.
Твердые композиции могут также быть использованы для заполнения мягких и твердых наполняемых желатиновых капсул с применением таких эксципиентов, как лактоза или молочный сахар, а также полиэтиленгликоли высокой молекулярной массы и тому подобных.
Когда используют водные суспензии, они могут содержать эмульгирующие средства или агенты, способствующие образованию суспензий.
Масляная фаза эмульсионной фармацевтической композиции может быть составлена из известных ингредиентов известными способами. Хотя фаза может включать только вещество, способствующее эмульгированию (иначе называемое эмульгатором), предпочтительно фаза включает смесь из, по меньшей мере, одного эмульгатора с жиром или маслом, либо как с жиром, так и с маслом. Предпочтительно, гидрофильный эмульгатор включают вместе с липофильным эмульгатором, действующим как стабилизатор. Предпочтительно также включать как масло, так и жир. Вместе эмульгатор (эмульгаторы) и стабилизатор (стабилизаторы) составляют пластичный материал, который вместе с маслом и жиром составляет эмульгирующую основу мази, образующую масляную дисперсную фазу композиций в виде крема.
По желанию, водная фаза основы крема может включать, например по меньшей мере 30% мас./мас. многоатомного спирта, т. е. спирта с двумя или более гидроксилъными группами, такого как пропиленгликоль, бутан-1,3-диол, маннит, сорбит, глицерин и полиэтиленгликоль (включая ПЭГ 400) и их смеси.
- 102 011547
Композиции местного применения предпочтительно включают соединение, которое усиливает всасывание или проникновение активного ингредиента через кожу или другие пораженные участки.
Выбор подходящих масел или жиров для композиции основан на достижении требуемых косметических свойств. Так, крем должен предпочтительно быть не жирным, не оставляющим пятна и смываемым продуктом с подходящей консистенцией, не допускающей вытекания из тюбиков или других контейнеров. Могут быть использованы линейные или разветвленные моно- или двухосновные сложные алкиловые эфиры, такие как диизопропилмиристат, децилолеат, изопропилпальмитат, бутилстеарат, 2этилгексилпальмитат или смесь разветвленных сложных эфиров, известная как Сгобато1 САР. Указанные соединения могут быть использованы по отдельности или в комбинации, в зависимости от требуемых характеристик. Альтернативно, могут быть использованы липиды с высокой температурой плавления, такие как вазелиновое масло и/или вазелин, либо другие минеральные масла.
На практике, соединение/фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть введены в подходящей композиции человеку или животным путем местного или системного введения, включающего пероральное, ингаляционное, ректальное, назальное, буккальное, подъязычное, вагинальное, введение в толстую кишку, парентеральное (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное, внутрикожное, подоболочечное и эпидуральное), внутриполостное и внутрибрюшинное. Очевидно, что предпочтительный способ введения может меняться в зависимости, например, от состояния реципиента.
Фармацевтически приемлемые дозированные формы означают дозированные формы соединения по изобретению и включают, например, таблетки, драже, порошки, эликсиры, сиропы, жидкие препараты, включая суспензии, спреи, таблетки для ингаляции, лепешки, эмульсии, растворы, гранулы, капсулы и суппозитории, а также жидкие препараты для инъекций, включая липосомные препараты. Методики и рецептура могут обычно быть взяты из Веттдоп'к Рйагтасеи11са1 8с1епсе§, Маск РиЫкЫпд Со., Еайоп, РА, 1а1е81 ебкюп.
Композиции, подходящие для перорального введения могут быть представлены в виде дискретных единиц, таких как капсулы, облатки или таблетки, каждая из которых содержит заранее рассчитанное количество активного ингредиента; как порошок или гранулы; как раствор или суспензия в водной жидкости или неводной жидкости; или как жидкая эмульсия по типу масло-в-воде или жидкая эмульсия по типу вода-в-масле. Активный ингредиент может также быть представлен в виде болюса, электуария или пасты.
Таблетка может быть получена прессованием или формованием, необязательно, с одним или более вспомогательными ингредиентами. Прессованные таблетки могут быть получены прессованием в подходящей машине активного ингредиента в сыпучей форме, такой как порошок или гранулы, необязательно смешанного со связующим, смазывающим агентом, инертным разбавителем, консервантом, поверхностно-активным или диспергирующим агентом. Формованные таблетки могут быть получены формованием в подходящей машине смеси порошкообразных соединений, увлажненных инертным жидким разбавителем. Таблетки могут быть, необязательно, покрыты оболочкой или разделены бороздками и могут быть составлены так, чтобы обеспечивалось замедленное или регулируемое высвобождение активного ингредиента.
Твердые композиции для ректального введения включают суппозитории, составленные известными способами и содержащие по меньшей мере одно соединение по изобретению.
По желанию и для более эффективного распределения соединения могут быть микроинкапсулированы в системах доставки замедленного высвобождения или мишененаправленных системах доставки, либо соединены с указанными системами, такими как биосовместимые биоразлагаемые полимерные матрицы (например, поли(б,1-лактид со-гликолид)), липосомы и микросферы, подкожно или внутримышечно впрыскиваемые способом, называемым подкожное или внутримышечное депо, обеспечивающим непрерывное замедленное высвобождение соединения (соединений) в течение 2 недель или дольше. Соединения могут быть стерилизованы, например, путем фильтрования через бактериальный фильтр или путем включения стерилизующих средств в форме стерильных твердых композиций, которые могут быть растворены в стерильной воде или некоторой другой стерильной, пригодной для инъекции среде непосредственно перед применением.
Композиции, подходящие для назального введения или введения путем ингаляции означают композиции, находящиеся в форме, пригодной для введения пациенту через нос или путем ингаляции. Композиция может содержать носитель, в форме порошка, с размером частиц, например, в пределах 1-500 микрон (включая размеры частиц в пределах 20-500 мкм с приращением в 5 мкм, такие как 30 мкм, 35 мкм и т.д.). Подходящие композиции, где носитель является жидким, для введения в качестве, например, назального спрея или капель для носа, включают водные или масляные растворы активного ингредиента. Композиции, подходящие для аэрозольного введения, могут быть получены общепринятыми способами и могут доставляться с другими терапевтическими средствами. Ингаляционную терапию легко осуществлять с помощью ингаляторов с отмеряемыми дозами.
Композиции, подходящие для перорального введения означают композиции, находящиеся в форме, пригодной для введения пациенту через рот. Композиции могут быть представлены в виде дискретных единиц, таких как капсулы, лепешки или таблетки, каждая из которых содержит заранее рассчитан
- 103 011547 ное количество активного ингредиента; в виде порошка или гранул; в виде раствора или суспензии в водной жидкости или неводной жидкости; или в виде жидкой эмульсии масло-в-воде или жидкой эмульсии вода-в-масле. Активный ингредиент может также быть представлен в виде болюса, электуария или пасты.
Композиции, подходящие для парентельного введения означают композиции, находящиеся в форме, пригодной для введения пациенту, минуя пищеварительный тракт. Композиции являются стерильными и включают эмульсии, суспензии, водные и неводные растворы для инъекции, которые могут содержать суспендирующие средства и загустители, а также антиоксиданты, буферные растворы, бактериостатические факторы и растворенные вещества, делающие композицию изотонической и имеющие рН, приведенный в соответствие с кровью предполагаемого реципиента.
Композиции, подходящие для ректального или вагинального введения означают композиции, находящиеся в форме, пригодной для введения пациенту прямокишечно или через влагалище. Композиция предпочтительно находится в форме суппозиториев, которые могут быть получены смешиванием соединений по настоящему изобретению с подходящими, не вызывающими раздражение эксципиентами или носителями, такими как масло какао, полиэтиленгликоль или воск для суппозиториев, являющихся твердыми при обычной температуре, но жидкими при температуре тела, и, поэтому, плавящимися в прямой кишке или влагалище и высвобождающими активный компонент.
Композиции, подходящие для системного введения означают композиции, находящиеся в форме, пригодной для общего введения в организм пациента. Композицию предпочтительно вводят путем инъекции, включая внутримышечную, внутривенную, внутрибрюшинную и подкожную. Для инъекции соединения по изобретению составляют в жидкие растворы, предпочтительно в физиологически совместимые буферные растворы, такие как раствор Хенке или раствор Рингера. В дополнение, соединения могут быть составлены в твердой форме и повторно растворены или суспендированы непосредственно перед применением. Включаются также лиофилизованные формы. Системное введение может также быть выполнено введением трансмукозальным или трансдермальным способами, либо соединение может быть введено перорально. Для введения через слизистую оболочку или через кожу в композиции используют пенетранты, способствующие проникновению через барьер вещества. Такие пенетранты обычно известны в данной области и включают, например, соли желчной кислоты и производные фусидовой кислоты для введения через слизистую оболочку. В дополнение, для усиления проникновения могут быть использованы детергенты. Трансмукозальное введение может быть произведено, например, путем применения спреев для носа или суппозиториев. Для перорального введения соединения составляют в общепринятые для перорального введения формы, такие как капсулы, таблетки и тоники.
Композиции, подходящие для местного применения означают составы, находящиеся в форме, пригодной для местного введения пациенту. Композиция для местного применения может быть представлена в виде мази, бальзамов, порошков, спреев и ингаляций, гелей (на водной и спиртовой основе), кремов, в том виде, как они известны в данной области, либо включенных в матриксную основу для нанесения на пластырь, что позволяет регулируемое высвобождение соединения через трансдермальный барьер. При составлении мази активные ингредиенты могут быть использованы с мазевой основой, либо парафиновой, либо смешиваемой с водой. Альтернативно, активные ингредиенты могут быть составлены в крем с основой для крема по типу масло-в-воде. Композиции, подходящие для местного введения в глаз, включают глазные капли, где активный ингредиент растворен или суспендирован в подходящем носителе, в особенности, водном растворителе для активного ингредиента. Композиции, подходящие для местного введения через рот, включают лепешки, содержащие активный ингредиент в ароматизированных основах, обычно сахаре и аравийской камеди или трагаканте; пастилки, содержащие активный ингредиент в инертной основе, такой как желатин и глицерин, или сахароза и аравийская камедь; и полоскания для рта, включающие активный ингредиент в подходящем жидком носителе.
Твердая дозированная форма означает, что дозированная форма соединения по изобретению является твердой, например капсулы, таблетки, пилюли, порошки, драже или гранулы. В таких твердых дозированных формах соединение по изобретению является смешанным по меньшей мере с одним обычным инертным эксципиентом (или носителем), таким как цитрат натрия или дикальцийфосфат, или (а) наполнителями или сухими разбавителями, как, например, крахмал, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и кремниевая кислота, (Ь) связующими веществами, например, карбоксиметилцеллюлозой, альгинатами, желатином, поливинилпирролидоном, сахарозой или аравийской камедью, (с) увлажнителями, как например, глицерин, (б) дезинтегрирующими средствами, как, например, агар-агар, карбонат кальция, картофельный крахмал или тапиока, альгиновая кислота, некоторые комплексные силикаты и карбонат натрия, замедлителями растворения, как, например, парафин, (Г) ускорителями всасывания, как, например, четвертичные аммониевые соединения, (д) смачивающими средствами, как например, цетиловый спирт и глицеринмоностеарат, (11) адсорбентами, как например, каолин и бентонит, (1) смазывающими средствами, как например, тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия, (|) веществами, делающими материал непрозрачным, (к) буферными агентами и агентами, высвобождающими соединение (соединения) по изобретению на определенном участке желудочнокишечного тракта отсроченным способом.
- 104 011547
Фактические уровни дозы активного ингредиента (ингредиентов) в композициях по изобретению можно варьировать так, чтобы было получено количество активного ингредиента (ингредиентов), эффективное для получения требуемого терапевтического ответа для отдельного пациента при данной композиции и конкретном способе введения. Следовательно, выбранный для конкретного пациента уровень дозы зависит от ряда факторов, включающих требуемый терапевтический эффект, способ введения, требуемую длительность лечения, этиологию и тяжесть заболевания, состояние пациента, массу, пол, диету и возраст, тип и эффективность каждого активного ингредиента, скорость всасывания, метаболизм и экскрецию, и другие факторы.
Суммарная суточная доза соединений по данному изобретению, вводимая пациенту в виде разовых или разделенных доз, может составлять, например, приблизительно от 0,001 до 100 мг/кг массы тела ежедневно и предпочтительно 0,01-10 мг/кг/день. Например, для взрослого, дозы обычно составляют приблизительно от 0,01 до 100, предпочтительно приблизительно 0,01-10 мг/кг массы тела в день при ингаляции, приблизительно от 0,01 до 100, предпочтительно приблизительно 0,1-70, в особенности 0,510 мг/кг массы тела в день при пероральном введении и приблизительно от 0,01 до 50, предпочтительно приблизительно 0,01-10 мг/кг массы тела в день при внутривенном введении. Процент активного ингредиента в композиции может меняться, считается, что он должен составлять такую долю, чтобы можно было получить подходящую дозу. Дозированные единичные композиции могут содержать такое количество дозированных единиц, какое может быть использовано для получения суточной дозы. Обычно несколько единичных дозированных форм может быть введено почти одновременно. Дозу можно вводить так часто, как это необходимо для получения требуемого терапевтического эффекта. Некоторые пациенты могут реагировать быстро на большую или меньшую дозу, и следует выбрать значительно более слабые достаточные поддерживающие дозы. Для других пациентов может быть необходимо долговременное лечение при норме 1-4 дозы в день, согласно физиологическим потребностям каждого отдельного пациента. Само собой разумеется, что иным пациентам потребуется прописать не более одной или двух доз в день.
Композиции могут быть получены в единичной дозированной форме любым из хорошо известных в области фармации способов. Такие способы включают стадию объединения активного ингредиента с носителем, состоящим из одного или более вспомогательных ингредиентов. Обычно составы получают равномерным и однородным смешиванием активного ингредиента с жидкими носителями или тонко измельченными твердыми носителями, либо с тем и другим, а затем, при необходимости, формованием продукта.
Композиции могут быть представлены в контейнерах с единичной или многократной дозой, например, запаянных ампулах или пузырьках с резиновыми крышками, и могут храниться в сублимированном (лиофилизованном) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например воды для инъекции, непосредственно перед применением. Приготовленные для немедленной инъекции растворы или суспензии могут быть получены из стерильных порошков, гранул и таблеток указанного выше типа.
Соединения, охватываемые объемом настоящего изобретения, обладают значительной фармакологической активностью согласно испытаниям, описанным в литературе и приведенным ниже, причем результаты испытаний считаются коррелируемыми с фармакологической активностью в организмах человека и других млекопитающих.
Методика ферментного анализа ΐη νΐΐΓθ Ингибирование Ν83 сериновой протеазы НСУ
Домен Ν83 протеазы НСУ экспрессируют и очищают как описано ранее (Уег^, опубликованная РСТ заявка УО 98/17679; включенная в данное описание в качестве ссылки). Хромогенный пептидный субстрат, Е^УЛЬиС-п-нитроанилид, и фрагмент кофактора Ж4А (-КК68У1У6К1УЪ86К-) для Ν83 протеазы синтезированы на заказ Атепсап РерЕбе Сот (Са). Соединения по изобретению исследуют на их способность ингибировать активность Ν83 протеазы НСУ, используя спектрофотометрический анализ и Е^УЛЬиС-п-нитроанилид в качестве субстрата. Испытание проводят в 96-луночном планшете для микротитрования, используя 8рес!^аМаχ 250 считывающее устройство (Мо1еси1аг Оеуюез, 8иппууа1е, СА), обеспечивающее возможность измерения кинетических параметров. Расщепление ЕПУАЬиС-пнитроанилидного (500 мкМ) субстрата с помощью очищенной Ν83 протеазы НСУ (0,5 мкМ) проводят при 30°С в буферном растворе, содержащем 30 мкМ фрагмента №4А, 46 мМ Нерез, рН 8,0, 92 мМ №С1, 18% глицерина, 5 мМ ОТТ и 7,5 % ДМСО, в отсутствии или в присутствии испытуемого соединения. Реакцию контролируют по высвобождению рNЛ (п-нитроанилина) при 405 нм.
Определение кинетических параметров, включающих У^, Кт и УпДК.,,, проводят в указанных выше условиях. Значения К1 рассчитывают из графика зависимости скорости от концентрации ингибитора, при фиксированных концентрациях фермента и субстрата, путем нелинейной подгонки данных методом наименьших квадратов по уравнению Моррисона для конкурентного ингибирования сильного связывания [1. Е. Мотзоп, ВюсЫт. ВюрНтз. Ас!а., 185, 269-286 (1969)]. Для этой цели используют Рпзт программу (СгарНРаб 8ойгаге, 1пс.).
Описываемые ингибиторы сериновой протеазы НСУ могут быть использованы в комбинации с дру
- 105 011547 гими молекулами, которые непосредственно обладают анти-НСУ активностью или опосредованно проявляют анти-НСУ активность, либо для профилактического лечения пациентов при риске заражения инфекцией НСУ, либо для лечения уже заразившихся пациентов. Термин анти-НСУ активность означает способность молекулы, в случае наличия, полностью ингибировать или снижать накопление вирионов НСУ по сравнению с накоплением вирионов НСУ в отсутствии такой молекулы, и/или способность молекулы облегчать состояния или уменьшать интенсивность симтомов, связанных с инфекцией НСУ или патогенезом у пациентов. Молекулы, обладающие анти-НСУ активностью, включают такие молекулы, которые нарушают одну или более стадий развития инфекции НСУ или репликации, а также такие, которые вызывают иммуномодулирующие и антипролиферативные эффекты в клетках хозяина. Молекулы, обладающие анти-НСУ активностью, могут ингибировать НСУ-специфические репликативные события, такие как, но, не ограничиваясь ими, НСУ-направленный синтез нуклеиновой кислоты или белка. Стадии репликации НСУ, на которых могут действовать молекулы, обладающие анти-НСУ активностью, могут включать проникновение в клетку (например, прикрепление, проникновение); декапсидацию и высвобождение генома НСУ; репликацию генома НСУ (например, репликацию вирусного генома РНК или цепи вирусного генома РНК; транскрипцию вирусной информационной РНК); трансляцию белков НСУ; посттрансляцинную модификацию протеинов НСУ (например, протеолитическое расщепление; гликозилирование); внутриклеточный транспорт вирусных протеинов; сборку компонентов вириона и высвобождение вирусных частиц (например, отделение дочерней клетки). Классы молекул, обладающих противовирусной активностью, включают, но, не ограничиваясь ими, растворимые рецепторные ловушки и противорецепторные антитела; блокаторы ионных каналов, стабилизаторы капсидов и ингибиторы слитого белка; ингибиторы вирусных полимераз, обратной транскриптазы, геликазы, примазы или интегразы; антисенсорные олигонуклеотиды и рибозимы; иммуномодулирующие и иммуностимулирующие агенты, включающие цитокины, такие как интерфероны, а также белковые агонисты, стероиды и классические лекарства, такие как левамизол; ингибиторы регуляторных белков; ингибиторы протеазы; ингибиторы составного белка; и вируснейтрализующие антитела и цитотоксические лимфоциты. Термин анти-НСУ эффективное количество или фармацевтически эффективное количество означает количество соединения или комбинации указанных выше соединений, эффективное для нормализации или улучшения состояний или уменьшения интенсивности симптомов, вызванных инфекцией НСУ или сопутствующим патогенезом у пациентов, или снижения уровней вируса ш νίΙΐΌ или ш угуо. Применения ш у11го включают систему анализа репликона, описанную ниже, где такие количества эффективны для снижения аккумуляции РНК репликона НСУ и/или накопления белков, кодируемых составляющими их генами.
Соединения, обладающие анти-НСУ активностью, предусмотренные для применения в композициях и способах комбинированной терапии, описываемых в данной заявке, включают, но, не ограничиваясь ими, иммуномодуляторные молекулы, включающие иммуномодулирующие цитокины и другие известные соединения, обладающие противовирусной активностью в отношении НСУ, такие как различные противовирусные нуклеозиды и нуклеотиды.
Иммуномодулирующие молекулы, предусмотренные для применения в комбинации с описываемыми ингибиторами сериновой протеазы НСУ, включают, но, не ограничиваясь ими, интерферон-альфа 2В (1п!гоп А, 8с11еппд Р1оидЬ); ребатрон (8сйеппд Р1оидЬ, интерферон-альфа 2В + рибавирин); ПЭГилированный интерферон альфа (Кеббу, К.К. е1 а1. Е!йсасу апб 8а!е1у о! реду1а!еб (40-кб) йИегГегоп а1рЬа-2а сотрагеб \νί11ι 1п1ег!егоп а1рЬа-2а т попситйойс райеп18 \νί11ι сЬгошс ЬерайЙ8 С. Нера!о1оду 33, 433-438(2001)); согласованный интерферон (Као, ЬН., СЬеп, Р.Ь, Ьа1, М.У. & СЬеп, Ό.8. Е!йсасу о! соп8еп8И8 1п!ег!егоп ш 11е 1геа1теп1 о! сЬгошс ЬерайЙ8 С. 1. Са81гоеп!его1. Нера!о1. 15, 1418-1423 (2000)); интерферон-альфа 2А (Ко!егоп А; КосЬе); лимфобластоидный или природный интерферон; интерферон 1аи (С1ауейе, Р. е1 а1. ШЫйаи, а пе\г й11е1Тегоп 1уре I \\ЙЬ апйгейоуйа1 асйуйу. Ра!Ьо1. Вю1. (Рап8) 47, 553-559 (1999)); интерлейкин 2 (Оау18, С.Ь., №18оп, Ό.Κ. & Кеуе8, С.К. Ри1иге орйопк !ог 1Ье тападетеп! о! ЬерайЙ8 С. 8еттаг8 т Ыуег И18еа8е 19, 103-112 (1999)); интерлейкин 6 (Оау18, С.Ь., №18оп, Ό.Κ. & Кеуе8, С.К. РиШге орйоп8 !ог Не тападетеп! о! ЬерайЙ8 С. 8еттаг8 ш Ыуег И18еа8е 19, 103-112 (1999)); интерлейкин 12 (Оау18, С.Ь., №18оп, Ό.Κ. & Кеуе8, С.К. Ри1ше орйоп8 !ог 1Ье тападетеп! о! ЬерайЙ8 С. 8етшаг8 ш Ыуег И18еа8е 19, 103-112 (1999)); рибавирин и соединения, усиливающие развитие реакции типа 1 Тхелперных клеток (Оау18, С.Ь., №18оп, Ό.Κ. & Кеуе8, С.К. Ри1иге орйоп8 !ог 1Ье тападетеп! о! ЬерайЙ8 С. 8ет1паг8 т Ыуег И18еа8е 19, 103-112 (1999)). Интерфероны могут снижать интенсивность вирусных инфекций, оказывая прямые антивирусные действия и/или модифицируя иммунный ответ на инфекцию. Антивирусные действия интерферонов часто опосредованы ингибированием проникновения и декапсидации, синтеза вирусной РНК, трансляции вирусных белков и/или вирусной сборки и высвобождения. Композиции, стимулирующие синтез интерферона в клетках (ТагЫакЬоуа, Е.В., РагаЫпа, О.У., Си8еу, Т.8. & Ег81оу, Ρ.Ι. Ки881ап Еχре^^еηсе ш 8сгеешпд, Апа1у818, апб СЬшса1 АррЬсайоп о! №ге1 1п1ег!егоп 1пбисег8. 1. 1п1ег!егоп СуЮкте Ке8. 21, 65-73)) включают, но, не ограничиваясь ими, двунитевую РНК, отдельно или в сочетании с тобрамицином, и имиквимод (3М РЬагтасеийса18) (8аибег, Ь.№ Гттипогпоби1а!огу апб рЬагтасо1одю ргорегйе8 о! ппк|штоб. 1. Ат. Асаб. Ьегта1о1. 43, 86-11 (2000)).
Другие известные соединения, обладающие или способные обладать антивирусной активностью в отношении НСУ, обусловленной неиммуномодулирующими механизмами, включают, но, не ограничи
- 106 011547 ваясь ими, рибавирин (Κ.’Ν Рйагтасеийсак); ингибиторы инозин-5'-монофосфатдегидрогеназы (УХ-497, разработанные Уег1е.\ Рйагтасеийсак); амантадин и римантадин (Уоиповв1, А.М. апб РегШо, К.Р. ТНе го1ез οί атаШабте, птаШабте, ιΐΓ5θώ;οχ\Ό1ιο1κ ас1б, ЖАТОв, а1опе ог ίη сотЬтаЕоп \уНН а1рНа 1п1егГегопв, т 1Не 1геа1теп1 οί сНгошс Нера1Шв С 8еттагв т Ыуег О1веаве 19, 95-102 (1999)); ЬУ217896 (патент США 4835168) (Со1асшо, ЕМ. е1 а1 Еуа1иайоп οί Не апП-тПиепха У1гив асДуШев οί 1,3,4-1Ыаб1а7о1-2у1суапат1бе (ΕΥ217896) апб Нв вобтт ва11. АпЕткгоЫа1 Адеп1в & СНетоШегару 34, 2156-2163 (1990)) и метиловый эфир 9-гидроксиимино-6-метокси-1,4а-диметил-1,2,3,4,4а,9,10,10а-октагидрофенантрен-1 карбоновой кислоты; гидрохлорид метилового эфира 6-метокси-1,4а-диметил-9-(4-метилпиперазин-1илимино)-1,2,3,4,4а,9,10,10а-октагидрофенантрен-1-карбоновой кислоты; 1-(2-хлорфенил)-3-(2,2-дифенилэтил)мочевина (патент США 6127422).
Составы, дозировка и способы введения указанных выше молекул либо представлены в приведенных ниже ссылках, либо хорошо известны в данной области, как, например, описано Е.С. Наубеп, ш Сообтап & СПтап'в ТНе РНагтасо1одюа1 Вав1в οί ТЕегареиПсв, ΝίπΐΗ Ебйюп, Нагбтап е1 а1., Ебв., МсСга^-НШ, №\у Уогк (1996), СНар1ег 50, рр. 1191-1223 и приведенных там ссылках. Альтернативно, если соединение, обладающее НСУ-антивирусной активностью идентифицировано, фармацевтически активное количество такого соединения может быть определено на основании методик, хорошо известных специалисту в данной области. См., например, Вепе1 е1 а1., ш Сообтап & СПтап'в ТНе РНагтасо1од|са1 Вав1в οί ТНегареиЕсв, ΝίπΐΗ Ебйюп, Нагбтап е1 а1., Ебв., МсСга^-НШ, №\у Уогк (1996), СНар1ег 1, рр. 3-27 и приведенные там ссылки. Таким образом, подходящие композиции, пределы доз и схемы приема лекарственного средства для таких соединений легко могут быть определены стандартными способами.
Комбинации лекарственных средств по настоящему изобретению могут выпускаться для воздействия на клетку или клетки, или на организм в целом, либо в виде отдельных фармацевтически приемлемых композиций, вводимых одновременно или последовательно, либо композиций, содержащих более одного терапевтического средства, либо в виде набора из отдельного средства и композиций из ряда агентов. Независимо от введения такие комбинации лекарственных средств создают анти-НСУ эффективное количество компонентов.
Целый ряд других иммуномодуляторов и иммуностимуляторов, которые могут быть использованы в способе по настоящему изобретению, поступает в настоящее время в продажу и включает препараты под названием: АА-2С; адамантиламиддипептид; аденозиндеаминаза, Епхоп; адъювант, АШапсе; адъюванты, К1Ь1; адъюванты, Уаxсе1; Αб^иуаx; агеласфин-11; СПИД терапия, СЫгоп; алгалглюкан, 8Ш; алгаммулин, АпШесН; Апдт1ус; антиклеточные факторы, Уеба; АпЕсоП; антигастрин-17 иммуноген, Ар; система доставки антигена, Уас; антигенсодержащий состав, ШВС; анти-СпКН-иммуноген, АрЫоп; АпЕНегрт; АгЬ1бо1; азарол; Ваущ-8939; Вау-г-1005; ВСН-1393; Ве1аГесЕп; ВювЕт; ВЬ-001; ВЬ-009; Вгопсов1а1; СагИавЕт; СИК1-84-246; цефодизим; ингибиторы хемокина, 1СО8; СМУ белки, СПу οί Норе; ϋΝ5888; цитокинвысвобождающий агент, 8ΐ; ИНЕА8, Рагаб1дт; Э18С ТА-Н8У; Σ07Β; 101А; Ι01Ζ; натрий дитиокарб; ЕСА-10-142; ЕЬ8-1; эндотоксин, Nοуа^ί^β; ЕСЕ-20696; ЕСЕ-24089; ЕСЕ-24578; ЕЬТ-3 лиганд, Iттиηеx; ЕК-900483; ЕК-900494; ЕК-901235; ЕТ8^п; С-протеины, Сабив; глудапсин; глутаурин; гликофосфопептикал; СМ-2; СМ-53; СМИР; вакцина фактора роста, Еп1геМ; Н-В1С, ЫАВ1; Н-С1С, ЫАВ1; НАВ-439; вакцина НеНсоЬас1ег ру1оп; герпес-специфический иммунный фактор; НТУ терапия, ИпПеб Вютеб; НурегСАМ+СЕ; IттиΜаx; 1ттип ВСС; иммунная терапия, Со··!!'^^^ иммуномодулятор, Еуапв; иммуномодулятор, Nοуасе11; Нпгед-Е тгед-2; 1пботипе; инозин пранобекс; интерферон, Иопд-А (альфа2); интерферон, СепепЮсН (гамма); интерферон, №\'агЕв (альфа); интерлейкин-12, СепеЕсв 1пв; интерлейкин-15, Iттиηеx; интерлейкин-16, КевеагсН Сог; 18САК-1; Σ005Χ; Ь-644257; Исотагавтшю кислота; ЫроТНег; ЬК-409; ЬК-410; ЬР-2307; ЬТ (К1926); БАУ-50020; МАР, 81иоподЕ МИР производные, Мегск; метенкефалин, ТМ; метилфурилбутиролактоны; М1МР; миримостим; ассоциированная бактериальная вакцина, Тегп; ММ-1; монилиастат; МРЬА, К1Ь1; М8-705; мурабутид; мурабутид, Уасвуп; мурамилдипептидные производные; мурамилпептидные производные миелопид; -563; ЫАСО8-6; ΝΉ-765; К8У, РгсИенв; ИРТ-16416; КТ-002; РА-485; РЕЕА-814; белки, 8сюв; пептидогликан, РЕуз; РейЪоп, Абуаηсеб Р1ап1; РСМ производное, РНуз; заявки на регистрацию фармпрепаратов Νο. 1099; Νο. 1426; Νο. 1549; Νο. 1585; Νο. 1607; Νο. 1710; Νο. 1779; Νο. 2002; Νο. 2060; Νο. 2795; Νο. 3088; Νο. 3111; Νο. 3345; Νο. 3467; Νο. 3668; Νο. 3998; Νο. 3999; Νο. 4089; Νο. 4188; Νο. 4451; Νο. 4500; Νο. 4689; Νο. 4833; Νο. 494; Νο. 5217; Νο. 530; пидотимод; пимелаутид; пинафид; РМИ-58 9; подофиллотоксин, СопрНагт; РОЬ509; ро1у-1СЬС; ро1у-1СЬС, Уатава 8Ноуи; Ро1уА-Ро1уИ; полисахарид А; протеин А, Вег1о.\ Вюваепсе; Р834ХУО; Рвеиботопав МАЬв, Тегрп; псомаглобин; РТЬ-78419; пирексол; пириферон; ретроген; ретропеп; КС-003; риностат; рифамаксил; КМ-06; роллин; ромуртид; КИ-40555; КИ-41821; ^ЬеПа антитела, КевСо; 8-27609; 8В-73; 8ΌΖ-280-636; 8^Ζ-ΜК^-953; 8К&Е-107647; 8Ь04; 8Ь05; 8М-4333; солютеин; 8К1-62-834; 8КИ-172; 8Т-570; 8Т-789; стафаджлизат; стимулон; супрессии; Т-150К1; Т-ЬСЕЕ; табилаутид; темуртид; ТНегаб1дт-НВУ; ТНегаб1дт-НРУ; ТНегаб1дт-Н8У; ТНЕ, РНагт & Ир)оНп; ТНЕ, Уеба; тималфазин; фракции тимусного гормона; тимокартин; тимолимфотропин; тимопентин; тимопентинаналоги; тимопентин, Рер1есН; тимозин фракция 5, альфа; тимостимулин; тимотринан; ТМЭ-232; ТО-115; фактор переноса, Утадеп; туфтсин, 8е1ауο; убенимекс; И1вав1а1; ΑNСС-; СЭ-4+; Со11ад+; СОЬ8Е+; СОМ+; ЭА-А+; СА8Т-; СЕ-ТН+; СР-120-; 1Е+; 1Е-А+; 1Е-А-2+; 1Е-В+; 1Е-С+; 1Е-С-1В+; Ш-2+; Ш-12+;
- 107 011547
ВЬ-15+; 1М+; ЬНВН-; Ι.ΙΡίΌΗ ·1. ЬУМ-В+; ЬУМ-ΝΚ+; ЬУМ-Т+; ОΡI+; ΡΕΡ+; ΡН6-ΜА+; ΚΝΆ-8ΥΝ-; 8¥-С\\ - ТН-А-1+; ТН-5+; ΤΝΡ+; ϋΝ.
Характерные примеры нуклеозидных и нуклеотидных соединений, полезных по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваясь ими:
(+)-цис-5 -фтор-1 -[2-(гидроксиметил)] -[1,3 -оксатиолан-5-ил] цитозин;
(-)-2'-дезокси-3'-тиоцитидин-5'-трифосфат (3ТС); (-)-цис-5-фтор-1-[2-(гидроксиметил)]-[1,3-оксатиолан-5-ил]цитозин (РТС);
(-)-2',3'-дидеокси-3'-тиацитидин[(-)-8ППС]; 1-(2'-дезокси-2'-фтор-бета-О-арабинофуранозил)-5-иодцитозин (РЬАС) ; 1-(2'-дезокси-2'-фтор-бета-О-арабинофуранозил)-5-иодцитозинтрифосфат (РIАСΤΡ); 1-(2'-дезокси-2'-фтор-бета-В-арабинофуранозил)-5-метилурацил (РМАИ);
1- бета-Э-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид; 2',3'-дидезокси-3'-фтор-5-метилдексоцитидин (РППМеСу!); 2',3'-дидезокси-3'-хлор-5-метилдексоцитидин (С1ППМеСу!); 2',3'-дидезокси-3'-амино-5-метилдексоцитидин (АППМеСу!); 2',3'-дидезокси-3'-фтор-5-метилцитидин (РППМеСу!);
2',3'-дидезокси-3'-хлор-5-метилцитидин (С1ППМеСу!); 2',3'-дидезокси-3'-амино-5-метилцитидин (АППМеСу!); 2',3'-дидезокси-3'-фтортимидин (РППТРП);
2',3'-дидезокси-бета-Ь-5 -фторцитидин (бета-Ь-Р ППС);
2',3'-дидезокси-бета-Ь-5 -тиацитидин;
2',3'-дидезокси-бета-Ь-5 -цитидин (бета-Ь-ППС);
9-(1,3 -дигидрокси-2-пропоксиметил)гуанин;
2'-деокси-3'-тиа-5-фторцитозин;
3'-амино-5-метилдексоцитидин (АППМеСу!);
2- амино-1,9-[(2-гидроксиметил-1-(гидроксиметил)этокси]метил]-6Н-пурин-6-он(ганцикловир);
2-[2-(2-амино-9Н-пурин-9ил)этил]- 1,3-пропандилдиацетат(фамцикловир); 2-амино-1,9-дигидро-9-[(2-гидроксиэтокси)метил]-6Н-пурин-6-он (ацикловир); 9-(4-гидрокси-3 -гидроксиметилбут-1 -ил)гуанин (пенцикловир);
9-(4-гидрокси-3-гидроксиметилбут-1-ил)-6-дезоксигуаниндиацетат (фамцикловир); 3'-азидо-3'-дезокситимидин (А2Т);
3'-хлор-5-метилдексоцитидин (С1ППМеСу!);
9-(2-фосфонилметоксиэтил)-2',6'-диаминопурин-2',3'-дидезоксирибозид;
9-(2-фосфонилметоксиэтил)аденин (РМЕА);
ацикловиртрифосфат (АСУТВ);
И-карбоциклил-2'-дезоксигуанозин (СПС); дидезоксицитидин; дидезоксицитозин (ППС); дидезоксигуанин (ППС); дидезоксиинозин(ПП1); Е-5-(2-бромвинил)-2'-дезоксиуридинтрифосфат; фторарабинофуранозилиодурацил;
1- (2'-деокси-2'-фтор-1-бета-О-арабинофуранозил)-5-иодурацил (Р1АИ); ставудин; 9-бета-О-арабинофуранозил-9Н-пурин-6-аминмоногидрат (Ага-А);
9-бета-О-арабинофуранозил-9Н-пурин-6-амин-5'-монофосфатмоногидрат (Ага-АМР);
2- дезокси-3'-тиа-5-фторцитидин;
2',3'-дидезоксигуанин и 2',3'-дидезоксигуанозин.
Синтетические способы получения нуклеозидов и нуклеотидов, полезных в настоящем изобретении, хорошо известны в данной области и описаны в Ас!а ВюсЫт. Ρο1., 43, 25-36 (1996); 8\уеП. М.1с1ео81Пе8 М.1с1еоНПе5 15, 361-378 (1996); ЗупШекк 12, 1465-1479 (1995); СагЬоРуП. СРет. 27, 242-276 (1995); СРет. М.1с1ео5|Пе5 №.1с1еоРПе5 3, 421-535 (1994); Алл. РерогЦ ίη МеП. СРет., АсаПепРс ΡΐΌ55 и Ехр. Орт. 1пуе§1. Игидк 4, 95-115 (1995).
Химические реакции, описанные в приведенных выше ссылках, в целом обсуждаются в самом широком смысле их применения к синтезу соединений по данному изобретению. Иногда для некоторых из числа рассматриваемых в данном описании соединений данные реакции могут оказаться не применимы в том виде, как они описаны. Специалисты в данной области легко могут определить соединения, для которых возникает эта проблема. Во всех таких случаях либо реакции могут быть успешно осуществлены за счет обычных модификаций, известных специалисту в данной области, например, путем подходящей защиты мешающих групп, путем замены обычных реагентов на альтернативные, путем стандартного изменения реакционных условий и тому подобное, либо другие, описываемые или, наоборот, общеизвестные реакции могут быть применимы для получения соответствующих соединений по данному изобретению. Во всех препаративных способах все исходные вещества являются известными или их легко получить из известных исходных соединений.
Хотя нуклеозидные аналоги обычно используют в качестве антивирусных агентов как таковые,
- 108 011547 нуклеотиды (нуклеозидфосфаты) иногда должны быть превращены в нуклеозиды для облегчения их транспорта через клеточные мембраны. Примером химически модифицированного нуклеотида, способного к проникновению в клетки, является 3-1-3-гидрокси-2-фосфонилметоксипропилцитозин (НРМРС, СПеаб 8с1спсс5). Нуклеозидные и нуклеотидные соединения по настоящему изобретению, являющиеся кислотами, могут образовывать соли. Примеры включают соли с щелочными металлами или щелочноземельными металлами, такими как натрий, калий, кальций или магний, или с органическими основаниями или основные соли четвертичного аммония.
Иммуномодуляторы и иммуностимуляторы, используемые в способах комбинированной терапии по настоящему изобретению могут быть введены в количествах, меньших, чем обычно принято в данной области. Например, интерферон альфа обычно вводят пациентам для лечения инфекции НСУ в количестве приблизительно от 1ж 106 единиц/пациент три раза в неделю до 10x106 единиц/пациент три раза в неделю (81топ еГ а1., НераГо1оду 25: 445-448 (1997)). В способах и композициях по настоящему изобретению эта доза может быть в пределах приблизительно от 0,^106 единиц/пациент три раза в неделю до 7.5x1с)6 единиц/пациент три раза в неделю; более предпочтительно, приблизительно от 0.5x1с)6' единиц/пациент три раза в неделю до 5x106 единиц/пациент три раза в неделю; наиболее предпочтительно, приблизительно от 1x106 единиц/пациент три раза в неделю до 3x106 единиц/пациент три раза в неделю. Благодаря повышенной антивирусной эффективности в отношении вируса гепатита С иммуномодуляторов и иммуностимуляторов в присутствии ингибиторов сериновой протеазы НСУ по настоящему изобретению, могут быть использованы меньшие количества таких иммуномодуляторов/иммуностимуляторов в описываемых способах и композициях. Подобным образом, благодаря повышенной антивирусной эффективности в отношении вируса гепатита С данных ингибиторов сериновой протеазы НСУ по настоящему изобретению в присутствии иммуномодуляторов и иммуностимуляторов, могут быть использованы меньшие количества ингибиторов сериновой протеазы НСУ в описываемых способах и композициях. Такие уменьшенные количества могут быть определены стандартным контролем за титрами вируса гепатита С проходящих лечение больных. Это может быть выполнено, например, контролем за РНК НСУ в сыворотке пациентов по методикам слот-блоттинг, дот-блоттинг или ОТ-ПЦР, или путем определения поверхностных или других антигенов НСУ. Подобным образом можно проводить мониторинг пациентов во время комбинированной терапии с использованием описываемых ингибиторов сериновой протеазы НСУ и других соединений, обладающих анти-НСУ активностью, например, нуклеозидных и/или нуклеотидных антивирусных агентов, для определения наименьших эффективных доз для каждого из используемых в комбинации соединений.
В описываемых способах комбинированной терапии нуклеозидные и/или нуклеотидные антивирусные соединения или их смеси могут быть введены пациенту в количестве в пределах приблизительно от 0,1 до 500 мг/пациент/день; предпочтительно от 10 до 300 мг/пациент/день; более предпочтительно приблизительно от 25 до 200 мг/пациент/день; еще более предпочтительно приблизительно от 50 до 150 мг/пациент/день и наиболее предпочтительно в пределах приблизительно от 1 до 50 мг/пациент/день.
Соединения могут быть введены пациенту в виде разовой дозы или пропорциональных многократных разделенных доз. В последнем случае дозированные единичные композиции могут содержать такое количество разделенных доз, которое может составлять суточную дозу. Общая суточная доза может также быть увеличена по усмотрению прописывающего лекарство врача за счет кратности приема доз в день.
Схему лечения зараженного инфекцией НСУ пациента с помощью соединений и/или композиций по настоящему изобретению выбирают с учетом различных факторов, включающих возраст, массу, пол, диету и состояние пациента, тяжесть заболевания, способ введения, исходя из фармакологических соображений, таких как активность, эффективность, фармакокинетика и токсилогические профили конкретных используемых соединений и в завимости от того, какая именно система доставки лекарственного средства используется. Введение описываемых лекарственных комбинаций обычно должно продолжаться в течение периода от нескольких недель до нескольких месяцев или лет, пока титры вируса не достигнут приемлемых уровней, указывающих, что инфекция контролируется или уничтожена. За пациентами, проходящими лечение описываемыми лекарственными комбинациями, может осуществляться стандартный контроль путем определения РНК вирусного гепатита в сыворотке пациентов по методикам слотблоттинг, дот-блоттинг или ОТ-ПЦР, или путем определения антигенов вируса гепатита С, таких как поверхностные антигены в сыворотке для установления эффективности лечения. Постоянный анализ полученных указанными способами данных позволяет изменять схемы приема лекарственных средств в ходе лечения с целью введения в комбинацию оптимальных количеств каждого из компонентов, так что за счет этого может быть сокращена длительность лечения. Таким образом, схему лечения/приема лекарства можно рационально изменять по ходу курса терапии с тем, чтобы вводить наименьшие количества каждого из используемых в комбинации антивирусных соединений, которые вместе обладают достаточной эффективностью против вируса гепатита С, и так, чтобы введение таких антивирусных соединений в комбинации продолжалось так долго, как это необходимо для успешного лечения инфекции.
Настоящее изобретение касается применения описываемых ингибиторов сериновой протеазы НСУ
- 109 011547 в различных комбинациях с вышеуказанными соединениями и соединениями подобных типов, обладающих анти-НСV активностью, для лечения или предотвращения инфекций НСV у пациентов. Например, один или более ингибиторов сериновой протеазы НСV могут быть использованы в сочетании с одним или более интерферонами или производными интерферона, обладающими анти-НСУ активностью; одним или более соединениями, не относящимися к классу интерферона, обладающими анти-НСV активностью; или одним или более интерферонами или производными интерферона, обладающими антиНСV активностью и одним или более соединениями, не относящимися к классу интерферона, обладающими анти-НСV активностью. При использовании в комбинации для лечения или профилактики инфекций НСV у пациентов любой из описанных сейчас ингибиторов сериновой протеазы НСV и указанных выше соединений, обладающих анти-НСУ активностью, может присутствовать в фармацевтически или анти-НСУ эффективном количестве. В силу аддитивных или синергических эффектов при использовании в указанных выше комбинациях каждое соединение может также присутствовать в субклиническом фармацевтически эффективном или анти-НСУ эффективном количестве, т.е. количестве, которое, если используется отдельно, обеспечивает пониженную фармацевтическую эффективность, недостаточную для полного ингибирования или снижения аккумуляции вирионов НСУ и/или облегчения состояния или уменьшения интенсивности симптомов, связанных с инфекцией НСУ или патогенезом у пациентов, по сравнению со случаем использования таких ингибиторов сериновой протеазы НСУ и соединений, обладающих анти-НСУ активностью, в фармацевтически эффективных количествах. В дополнение, настоящее изобретение касается применения комбинаций ингибиторов сериновой протеазы НСУ и соединений, обладающих анти-НСУ активностью, как указано выше, для лечения или профилактики инфекций НСУ, где один или более из указанных ингибиторов или соединений присутствуют в фармацевтически эффективном количестве, а другой (другие) присутствуют в субклиническом фармацевтически эффективном количестве или анти-НСУ эффективном количестве (количествах) в силу их аддитивных или синергических эффектов. Как используется в данном описании, термин аддитивный эффект описывает комбинированный эффект двух (или более) фармацевтически активных агентов, который равен сумме эффектов каждого отдельно взятого агента. Синергический эффект означает случай, при котором комбинированный эффект двух (или более) фармацевтически активных агентов выше, чем сумма эффектов каждого отдельно взятого агента.
Пример 42. Стандартным способом лечения инфекции, вызванной вирусом гепатита С (НСУ), в настоящее время является лечение иммуномодулятором, альфа-интерфероном (Сйгошс Нераййк С: Сиггеп! Э^еа^е Мападетеп!, υ.δ. Эераг1теп1 οί НеаИй апб Нитап 8егу1се§, Ναΐίοηαΐ 1п81йи1е8 οί НеаИй, 1999). Указанный способ лечения неэффективен для большинства пациентов с НСУ, у которых либо не наблюдается ответа, либо наблюдается рецидив даже после продолжительного лечения интерфероном. Кроме того, существуют тяжелые побочные эффекты, связанные с лечением интерфероном.
Ввиду настоятельной потребности в новых, более эффективных антивирусных лекарственных средствах для лечения инфицированных НСУ пациентов авторы данного изобретения разработали серию соединений, которые ингибируют сериновую протеазу НСУ (комплекс белков Ν83 и Ν84Λ вируса НСУ). Указанные соединения можно использовать отдельно или совместно друг с другом и в комбинации с соединениями других классов для лечения или профилактики НСУ-инфекции. В данном примере описано тестирование трех представителей ингибиторов сериновой протеазы НСУ, т.е. соединения Си, соединения ЕР и соединения ЕС по отдельности и в комбинации с отдельными представителями группы интерферонов (интерфероном альфа-2 (8сйегшд-Р1оидй), интерфероном альфа-2А (РЕЬ Б|отеб1са1 ЬаЬогаЮпеь Νονν Β^иη8ν^ск, Ν1), интерфероном бета (Векеагсй П1адпо8!1с8 1пс, Иапбега, ΝΙ) интерфероном овцы !аи (Векеагсй О|адпо5Рс5 1пс, Иапбега, ΝΙ)) на основе анализа субгеномного РНК-репликона НСУ (анализ репликонов) для определения того, согласованно ли действуют два соединения, снижая накопление РНК НСУ. При анализе репликонов измеряют количество субгеномной РНК НСУ (РНК репликона), остающееся в клетках, несущих репликон (Ьойтапп е! а1. 8аепсе 285:110-113 (1999)), после двух дней обработки лекарственным средством по сравнению с количеством РНК репликона в необработанных клетках. В данном анализе эффективность соединений в качестве антивирусных лекарственных средств против НСУ прямо пропорциональна уровню ингибирования накопления РНК репликона.
Два лекарственных средства тестируют в комбинациях в системе анализа репликонов ш νίΙΐΌ с целью определения того, проявляют ли они при совместном использовании аддитивную или синергическую активность, направленную против НСУ. Анализ репликонов используют в качестве модели, заменяющей инфекцию НСУ ш νίΙΐΌ, для оценки комбинированных воздействий иммуномодулятора, например, интерферона-альфа 2В ((интрон А); 8сйегтд Р1оидй), и ингибитора сериновой протеазы НСУ, например, соединения Си. Как показано ниже, результаты свидетельствуют, что имеет место четкое синергическое действие указанных двух типов лекарственных средств, направленное против НСУ, которое измеряли с использованием формального математического анализа синергизма, исследуя их способность снижать уровни РНК НСУ в анализе репликонов.
Анализ репликонов
Анализ репликонов с использованием линии клеток, содержащих самореплицирующуюся субгеномную РНК НСУ (репликон), описан Ьойтапп е! а1. 8аепсе 285:110-113 (1999). Инвентарный номер в
- 110 011547
СепЬапк последовательности репликона, используемого в описанных в данной заявке экспериментах, указан в приведенном источнике информации как А1242654. В данной статье описаны способы транскрипции ίη νίίτο РНК из кДНК репликона, трансфекции в клетки НиН7 РНК репликона путем электропорации и селекции клеток, содержащих РНК репликона, с использованием антибиотика С418. Клетки НиН7 являются линией клеток гепатомы, полученной Όγ. ГОШат Макоп в Еох СНаке Сапсег Кекеагсй Сеп1ег (РН11айе1рН1а). Указанные клетки общедоступны из Еох СНаке и всесторонне описаны в научной литературе (№1каЬауак1и е1 а1. Сапсег Кек. 42:3858-3863 (1982)). В описанных в данной заявке экспериментах всю матричную ДНК удаляют из транскрибированного ш уйго препарата РНК репликона перед электропорацией указанной РНК в клетки НиН7 путем многократной обработки ДНКазой (три последовательных обработки).
Анализ репликонов выполняют, как подробно описано ниже. Коротко, клетки, несущие репликон, помещают в 96-луночные планшеты при плотности 10000 клеток на лунку и инкубируют при 37°С. Клетки инкубируют в ЭМЕМ (минимальной основной среде Дульбекко), с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка, глутамина, заменимых аминокислот и антибиотика 0418 (0,25 мг/мл). После инкубации в течение ночи среду заменят ЦМЕМ, содержащей 2% фетальную сыворотку теленка и различные концентрации ингибитора сериновой протеазы, такого как соединение СИ, и/или интерферона, такого как интерферон-альфа 2В (интрон А, 8сНеппд Р1оидН). Каждое соединение тестируют при шести-восьми различных концентрациях. В качестве предельного значения концентраций выбирают высокие концентрации соединений, приводящие почти к полному ингибированию накопления РНК репликона РНК после двух дней обработки. Исходя из этих начальных концентраций, проводят серийные разведения так, чтобы пределы концентраций, исследуемых при анализе репликона включали концентрации, при которых соединения являются высокоэффективными, а также концентрации, при которых эффект незначителен. Каждую концентрацию ингибитора сериновой протеазы НСУ исследуют в отсутствии интерферона, а также с добавлением шести-восьми различных доз интерферона. Подобным образом интерферон исследуют в отсутствии каких-либо добавок ингибитора сериновой протеазы НСУ. После 48-часовой инкубации с соединениями среду удаляют из планшетов и суммарную клеточную РНК экстрагируют из клеток, используя набор К№аку-96, выпускаемый О1;щеп 1пс. (Уа1епс1а, СА). Затем полученную РНК анализируют посредством количественной ОТ-ПЦР или ТацМап® (АррЕей Β^οкукΐетк, Еок1ег С11у СА). Мишенью Тас.|Мап® ОТ-ПЦР является ген устойчивости к неомицину в РНК репликона. Планшеты готовят так, чтобы получить 5 повторов каждого образца обработки лекарственным средством и 16 повторов необработанных образцов. Это обеспечивает высокую статистическую доверительность количественных данных ОТ-ПЦР.
Анализ результатов исследования репликона дает две величины, полезных для оценки эффективности потенциальных антивирусных агентов против НСУ. При каждой исследуемой концентрации соединения определяют уровень ингибирования накопления РНК репликона, вызванный соединением за два дня обработки, относительно количества РНК репликона в необработанных клетках. Результаты представляют как процент ингибирования. После получения серии результатов, определенных при обработке клеток в интервале концентраций, определяют значения 1С50, т.е., концентрацию соединения, при которой соединение снижает накопление РНК репликона на 50%. Путем повторных исследований ингибиторов сериновых протеаз НСУ в анализе репликонов установлено, что 1С50 имеет коэффициент вариации в процентах (%СУ или 100% х стандартное отклонение в 1С50/среднее 1С50) приблизительно 20%. 1С50 является значением, используемым для ранжирования отдельных соединений, исследуемых в данном анализе, на основании их эффективности в качестве антивирусных средств против НСУ. Простые определения 1С50 являются неадекватными для оценки полезности соединений, используемых в комбинации. Наиболее эффективный анализ совокупных данных, полученных с использованием всех комбинаций различных интерферонов и ингибиторов сериновой протеазы, требует оценки ингибирования в процентах, как показано в табл. 7, с использованием описанных ниже математических способов, предназначенных для определения того, является ли характер комбинированных обработок агонистическим, аддитивным или синергическим.
Подробности проведения анализа репликонов следующие.
Методика количественного анализа РНК репликона НСУ при анализе репликона НСУ с использованием ОТ-ПЦР ТацМап®
Анализ репликонов используют для оценки способности потенциальных антивирусных соединений, направленных против НСУ, ингибировать накопление молекул субгеномной РНК репликона НСУ в клетках линии НиН7 (ЬоНтапп е1 а1. Керйсайоп ок 8иЬдепотю Нера1111к С Уиик ^Ак ш а НераЮта Се11 Ьше. 8с1епсе 285, 110-113 (1999)). Указанный анализ включает три технологических этапа: (1) поддержание клеток, несущих репликон, подготовка планшетов для анализа и внесение соединений; (2) экстракцию суммарной клеточной РНК из клеток, несущих репликон, и (3) ОТ-ПЦР в режиме реального времени (Тас.|Мап®) для измерения количества РНК репликона в каждом образце. Для выполнения анализа репликонов требуется, по меньшей мере, 4 дня; однако процесс можно прерывать и образцы между стадиями хранить замороженными. Каждый этап анализа описан ниже.
- 111 011547
1. Поддержание клеток, несущих репликон, подготовка планшетов для анализа и внесение соединений.
1.1. Поддержание линии клеток, несущей репликон.
Линию клеток, используемую в анализе репликонов, получают, как описано ЬоЬтаии е! а1. (ЯерИсабоп о! 8иЬдепотк Нераббк С Уник РНЛк ίη а Нера!ота Се11 Ыпе. 8с1епсе 285, 110-113 (1999)). После инкубирования флаконов для культивирования клеток размером 150 см2 (Сок!аг), содержащих клетки, несущие репликон, при 37°С и 5% СО2 и образования слитого монослоя, клетки разводяют 1:10, об./об., в новых флаконах для культивирования клеток размером 150 см2. Средой является ЭМЕМ. содержащая 10% фетальной сыворотки теленка (ЕВ8), 1Х заменимых аминокислот (НЕЛЛ), 1Х глутамина (С1и) и 0,25 мг/мл С418. Проводят три серийных посева, каждый раз давая возможность клеткам образовать монослой, с последующим разведением клеток в новых флаконах для культивирования клеток размеров 150 см2. Затем полученные клетки, называемые «исходными клетками» делят на аликвотные пробы и хранят для последующего использования в анализе репликонов. Анализ, основанный на Тас.|Мап® , выполняют для определения числа геномов репликона НСУ на клетку, который обнаруживает наличие ~150 копий репликона на клетку. Результат основан на отношении количества копий РНК репликона к двукратному количеству копий гена ароВ человека (число гаплоидных геномов).
1.1.1. Исходные клетки хранят в жидком Ν2. Что касается клеток, используемых в анализе репликонов, после 20 последовательных пассажей клетки отбрасывают и оживляют новую партию после хранения в жидком Ν2.
1.2. Посев клеток в 96-луночные планшеты для анализа репликонов.
1.2.1. Для подготовки 96-луночных планшетов флаконы размером 75 см2 на 75% занятые монослоем из содержащих репликон клеток, обрабатывают трипсином и клетки ресуспендируют в 10 мл среды А. Трипсинизацию проводят, удаляя среду, добавляя 1 мл смеси трипсин-ЕОТЛ 0,25%, мас./об. и затем удаляя трипсин-ЕОТЛ. Спустя 5-10 мин клетки снимаются со стенок флакона и их ресуспендируют в среде.
1.2.2. Клетки подсчитывают, используя гемоцитометр, и концентрацию клеток доводят до 105 клеток/мл.
1.2.3. Каждую лунку засевают 100 мкл суспензии клеток, используя многоканальную пипетку 1трас!2 (МаРгх), никогда не засевая более четырех 96-луночных планшетов одной клеточной суспензией.
1.2.4. 96-луночные планшеты инкубируют при 37°С в течение ночи.
1.3. Разведения соединений и внесение в планшеты с клетками, содержащими репликон.
1.3.1. Соединения-ингибиторы сериновой протеазы НСУ растворяют в диметилсульфоксиде (ДМСО) до конечной концентрации 20 мМ. Интерфероны суспендируют в забуференном фосфатом солевом растворе, содержащем 0,1% мас./об. бычьего сывороточного альбумина.
1.3.2. 20 мМ раствор соединения разбавляют до 1 мМ с помощью ДМСО.
1.3.3. 50 мкл соединения, растворенного в ДМСО, добавляют к 10 мл среды В (концентрация соединения равна 5 мМ и концентрация ДМСО равна теперь 0,5%), или 20 мкл из 1 мМ раствора соединения и 30 мкл ДМСО добавляют к 10 мл среды В (концентрация соединения составляет 2 мкМ).
1.3.4. Разбавление соединения до конечной концентрации завершают, смешивая раствор соединение/среда В со средой С (содержащей 0,5% ДМСО). Серийные (одно-пять) разведения соединения выполняют с помощью среды С в полипропиленовом 96-луночном блоке объемом 2 мл, получая требуемые конечные концентрации соединения.
1.3.5. Планшет с клетками вынимают из инкубатора с температурой 37°С и метят в верхнем правом углу крышки и на правой стороне основания. Среду сливают из 96-луночных планшетов.
1.3.6. 100 мкл растворов соединение/среда из каждой лунки 96-луночного блока для разбавлений добавляют к 96-луночному планшету для клеток, используя пипетку 1трас!2.
1.3.7. 100 мкл среды С добавляют во все необработанные лунки согласно табл. 3 для тестирования соединений в 1, 3 или 6 различных концентрациях. «ϋηίχ» означает холостую обработку клеток (добавляют ДМСО в тех же концентрациях, как и в обработанные клетки); «Соп.» означает концентрацию соединения.
- 112 011547
Таблица 3 соединения, 6 концентраций, повторов
1 Соединение 1
2 3 4 5 6
А ипРх ипсх ипСх ипЬх ипРх
I) соп.1 соп.1 соп. 1 соп.1 соп. 1
С соп, 2 соп.2 соп.. 2 соп.2 соп.2
Д соп. 3 соп.З соп. 3 соп.З соп.З
Е соп.4 соп.4 соп.4 соп.4 соп.4
Г сои. 5 соп. 5 соп. 5 соп.З соп.З
С сот. б сои. б соп. б соп. 6 соп. 6
и игЛх ипЪх ппДх ипсх ипЬх
4 соединения. 3 концентрации г
5 повторов
Соединение 1
1 2 3 4 5 6
А Ш11х ипЪх олСх ипСх ипСх
д соп.1 соп. 1 соп.1 соп.1 соп.1
с соп.2 соп.2 соп.2 соп.2 соп.2
д соп.З соп. 3 соп. 3 соп.З соп.З
Е соп.1 соп. 1 соп.1 соп.1 соп.1
Г соп.2 соп.2 соп.2 соп.2 соп.2
е соп.З соп.З соп.З соп.З соп.З
н ппрх илСх ипДх ΌΠίΧ ипсх
Соединение 3
Соединение 2
7 8 9 10 11 12
ιιηΐχ ипЬх ипсх ипРх ипРх
соп. 1 соп.1 соп.1 соп.1 соп.1
соп.2 соп.2 соп.2 соп.2 соп.2
соп.З соп.З соп.З соп.З соп.З
соп.4 соп.4 соп.4 соп. 4 соп.4
соп. 5 соп, 5 соп. 5 соп.З соп.З
соп. 6 соп. б соп-б соп. 6 соп. б
ипСх ипРх ипСх ηηΐχ ипСх
соединение 2
7 8 9 10 11 12
ипСх ипСх ипЪх ипСх ипЪх
соп.1 соп.1 соп.1 соп.1 СОП. 1
соп.2 соп.2 соп.2 соп.2 соп.2
соп.З соп. 3 соп. 3 соп.З соп. 3
соп.1 соп. 1 соп.1 соп.1 соп.1
соп.2 соп.2 соп.2 соп.2 СОп.2
соп.З соп.З соп.З соп.З соп.З
ипДх игЛх ηηίχ ηηΊζχ ιιηίχ
Соединение 4
16 соединений, 1 концентрация, 4 повтора
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
А ипЬх сра 1 сра 2 сра з сра 4 сра 5 сра 6 сра 7 сра в ипСх
Д ипСх ерб 1 сра 2 сра з сра 4 сра з сра б сра 7 сра а ипрх
С ипСх сра 1 ерб 2 сра з сра 4 сра з сра б сра 7 сра в ипСх
д υηΐχ ерб 1 сра 2 сра з срсЗ 4 сра 5 сра б сра 7 сра в ипЬх
Е ипЬх сра 9 ерб 10 сра 11 сра 12 сра 13 сра 14 ерб 15 сра 1б ипбх
Г ппДх сра э сра ю сра 11 сра 12 сра 13 ерб 14 сра 15 сра 16 ипРх
& ипДх сра 9 сра ю сра 11 ерб 12 сра 13 сра 14 сра 15 сра 16 иг±х
И ипЪх сра э сра ίο сра 11 сра 12 сра 13 срЦ 14 сра 15 ерб 16 ипЪх
12 соединений , 1 концентрация, 5 повтора
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
А ипЬх ипСх ипСх чпСх ипСх 1Н1СХ ипСх ипЬх ипПх ипСх
Д ерб 1 сра 1 сра 1 сра ί сра 1 сра 7 сра 7 ерб 7 ерб 7 сра 7
0 сра 2 сра 2 сра 2 с₽а 2 сра 2 сра в сра 8 сра в ерб В сра е
Д ерб 3 сра з сра з сра з сра з сра э сра э сра 9 ерб 9 сра 9
Е Срб 4 сра 4 сра 4 сра 4 сра 4 сра ю сра ю сра ίο сра ю сра ίο
Е сра 5 сра 5 сра з сра 5 сра 5 сра 11 сра 11 сра 11 ерб 11 Срб 11
е сра б сра б сра 6 ср<1 € сра 6 сра 12 сра 12 сра 12 сра 12 ерб 12
И ипкх ипсх ипсх ип^эс ипьх ипгх ιΐηΐχ ипех иппх ипСх
1.4. Планшеты инкубируют в течение 48 ч при 37°С и затем подвергают экстракции РНК.
- 113 011547
Таблица 4. Сводные данные по оборудованию и вспомогательным материалам, используемым для культивирования клеток и подготовки соединений
8-канальная пипетка 1шрасР2, 1250 мкл Кат. № 2004 Мартах
Полипропиленовая форма с глубокими лунками, объемом 2 мл, 96луночная, стерильная Кат. № 4222 Мартах
Емкости для реагентов объемом 25 мл, стерильные Кат. № 8096 Мартах
Длинные наконечники для пипеток Х-Рга, 1250 мкл Кат. № 8255 Мартах
96-луночный планшет Кат. № 3595 СозРаг
Гемацитометр №еиЬаиег усовершенствованный с яркими линиями глубиной ОД мм КеасАегР
ΏΜΕΜ Кат. № 51444-79Р ОКН
ь-глутамин (С1и) Кат. № 12403-010 С1ВСО-ВВЬ
Заменимые аминокислоты (ΝΕΑΑ) Кат. № 11140-050 61ВС0-ВКЬ
Фетальная сыворотка теленка (ГВЗ) Кат. № 16250-078 С1ВСО-ВВД
6418 Кат. № 55-0273 1пч1Ргодеп
ДМСО Кат. № ϋ-2650 Задта
Среда А ШЕМ, 10% ЕВЗ, IX ΝΕΑΑ, IX 61и, 0,25 мг/мл 6418
Среда В 6МЕМ, 2% ЕВЗ, IX ΝΕΑΑ, IX С1и
Среда С ΌΜΕΜ, 2% ГВЗ, IX ΝΕΑΑ, IX С1и, 0,5% ДМСО
Трипсин-ΕϋΤΑ 0,25% С1ВСО-ВКЕ
2. Экстракция суммарной клеточной РНК из клеток, несущих репликон.
2.1 Введение.
Целью методики является экстракция РНК из образцов культур тканей 1и уДго, таким образом, чтобы количественно извлечь вирусную или клеточную РНК, очищенную в достаточной степени для количественного анализа посредством ОТ-ПЦР НСУ.
Для того чтобы выявить разброс в эффективности экстракции РНК к каждому образцу клеток перед экстракцией РНК добавляли стандартное количество вируса вирусной диареи крупного рогатого скота (ВУЭУ), РНК-вируса, обладающего некоторым сходством с НСУ. Таким образом, уровень РНК ВУЭУ, выявленный в конечной реакции многократной ОТ-ПЦР должен быть сходным во всех лунках в пределах вариабельности, связанной с анализом репликонов. Указанный внутренний контроль эффективности экстракции РНК обсуждается далее в приведенном ниже разделе Тас.|Маг1®.
Используемым способом экстракции РНК является способ К^азу^ производства О1адеи 1ис. (Уа1еис1а, СА). В указанном способе используют 96 миниколонок на основе диоксида кремния, которые располагают в порядке, совместимом с операциями, проводимыми на культурах ткани в 96 лунках. Способ экстракции РНК представляет собой модификацию способа Бума, при котором все клеточные белки и нуклеиновую кислоту, включая нуклеазы, сначала денатурируют сильной хаотропной солью (гуанидинтиоцианат). В такой среде нуклеиновые кислоты обладают высоким сродством к диоксиду кремния, материалу на дисках миниколонок; однако белки и другие загрязнители не связываются с диоксидом кремния и проходят через колонки. После промывки колонок растворами хаотропного агента/этанола образцы подсушивают и затем высвобождают нуклеиновую кислоту с колонки небольшим объемом воды.
Чтобы уменьшить вариабельность извлечения РНК НСУ, соблюдают осторожность при промывке колонок и выборе условий подсушивания. Присутствие небольшого количества этанола на колонке будет загрязнять конечную РНК и мешать в системе регистрации ОТ-ПЦР. Требуется осторожность на всех стадиях данной процедуры, поскольку исходные образцы могут быть биологически опасными, хаотропная соль может быть очень едкой и как в случае тиоцианата может образовывать ядовитый цианидный газ при возможности контактирования с кислой средой.
- 114 011547
Таблица 5. Сводные данные по оборудованию и вспомогательным материалам, используемым в методике экстракции РНК НСУ
Набор Нпеазу 96 (24) Кат. Ν· 74183 Охадеп
Коллектор 01Ачас 96 Кат. № 19504 Охадеп
Центрифуга 4-15С для планшетов 2x96, 6000 х д Кат. № 81010 Сгадеп
Тарельчатый ротор для планшетов 2x96 Кат. № 81031 <2хадеп
Этиловый спирт Ргоо£ 200
8-канальная пипетка 1трасб2, 250 мкл Кат. № 2002 Мабг1х
8-канальная пипетка 1трасб2, 1250 мкл Кат. № 2004 МабПх
Полипропиленовый блок с глубокими лунками объемом 2 мл, 96-луночннй, стерильный Кат. » 4222 Мабгхх
Емкости для реагентов объемом 25 мл, стерильные Кат. № 8096 Мабг1х
Длинные наконечники для пипеток Х-бга, 1250 мкл Кат. № 8255 Мабгхх
Наконечники для пипеток, 200 мкл Кат. № 7275 Мабгхх
Среда МЕМ без сыворотки Кат. № 11095-80 ОГВСОВКЬ
2.2. Методика.
2.2.1. Лизис клеток.
2.2.1.1. Готовят лизирующий буфер: для одного 96-луночного планшета добавляют 150 мкл βмеркаптоэтанола (β-МЕ) и 1 мкл культуры ВУЭУ (культуру перед добавлением встряхивают) к 15 мл буфера КЕТ (компонент набора КЫеазу, ф1адеп). Указанную культуру получают инфицированием клеток МЭВК (клетки почки быка, #ССБ-22, доступные из Американской коллекции типов культур Мапаззаз УА) вирусом ВУЭУ и сбором культуры при достижении пика цитопатического действия (ЦПД). Полученная культура имеет инфекционный титр примерно равный 1х107 БОЭ/мл. Это дает пороговый цикл ВАЛУ (С!) примерно 22 в анализе ТацМап® . Культуру ВУЭУ хранят в морозилке при -80°С.
2.2.1.2. Клетки промывают 150 мкл среды МЕМ без сыворотки (программа 4 для 8-канальной электронной пипетки Р1250: Наполнение 1250, распределение 150x8). В каждую лунку добавляют 150 мкл лизирующего буфера (программа та же).
2.2.1.3. РНК экстрагируют сразу же или клетки замораживают при -80°С.
2.2.2. Подготовка реагентов и материалов для экстракции РНК.
2.2.2.1.Отмечают № партии КРЕ и набора КЫеазу 96.
2.2.2.2. КРЕ: 720 мл 100% этанола добавляют к одному флакону КРЕ (ф1адеп) и тщательно перемешивают; флаконы с КРЕ всегда хорошо встряхивают перед использованием.
2.2.2.3. 70% этанол: 150 мл воды, обработанной диэтилпирокарбонатом (ПЕРС), добавляют к 350 мл 100% этанола и тщательно перемешивают.
2.2.3. Получение РНК с помощью набора КЫеазу 96.
2.2.3.1. Замороженные образцы размораживают при комнатной температуре в течение 40 мин. Одновременно для каждого планшета размораживают одну колонку для контролей экстракции (контроли экстракции: контроли экстракции КЫеазу представляют собой набор из 8 пробирок, соединенных друг с другом. Внутри каждой пробирки находится 170 мкл лизата клеток с определенным соотношением позитивных и негативных по отношению к НСУ клеток. Сверху вниз соответственно располагаются по два контроля с низким, средним, высоким и нулевым количеством (см. раздел протокола 2.3 ниже).
2.2.3.2. Образцы перемешивают пипетированием 100 мкл вверх и вниз пять раз. Образец целиком переносят в колонки 1-10 формы с квадратными лунками объемом 2 мл Ма!пх (программа 1 на Р250: перемешивание 100x5, наполнение 170, очистка).
2.2.3.3. 150 мкл стандарта репликона переносят в колонку 11 (в колонке 12 нет образцов).
2.2.3.4. К каждому образцу добавляют 150 мкл 70% этанола (Е!ОН) (программа 4 на Р1250: наполнение 1250, распределение 150).
2.2.3.5. Планшет КЫеазу 96, помеченный соответствующим номером планшета, помещают в вакуумный коллектор. Перемешивают и переносят смесь лизат/Е!ОН на планшет КЫеазу 96 (программа 1 на Р1250: перемешивание 200, 5 раз, наполнение 330 и очистка). Любые неиспользуемые лунки заклеивают прозрачной лентой (поставляется ф1адеп), обычно колонку 12.
2.2.3.6. Применяют вакуум (примерно 800 мбар) для нанесения образца на миниколонки.
2.2.3.7. Планшет К№азу-96 промывают 1000 мкл буфера К\У1 (ф1адеп)/лунку (программа 2 на
- 115 011547
Р1250: наполнение 1000, распределение 1000).
2.2.3.8. Применяют вакуум для того, чтобы буфер К\У1 пошел сквозь фильтр до прекращения прохождения потока.
2.2.3.9. Планшет КЫеа8у-96 промывают 1000 мкл буфера КРЕ/лунка (программа 2 на Р1250).
2.2.3.10. Применяют вакуум для того, чтобы буфер КРЕ прошел через фильтр.
2.2.3.11. Повторяют стадию 2.2.3.9.
2.2.3.12. Применяют вакуум для того, чтобы буфер КРЕ прошел через фильтр, выдерживая под вакуумом в течение 3 мин.
2.2.3.13. Сушат планшет КЫеазу 96: планшет КЫеа8у-96 помещают в многоместный держатель для микропробирок (поставляемый Д1адеп), покрывают пленкой АиРоге, которая прилагается, и полученный блок центрифугируют в течение 10 мин при 6000хд (центрифуга Д1адеп 81дта; 4-15°С).
2.2.3.15. Элюируют РНК из 96-луночного планшета К№азу: планшет КЫеа8у-96 переносят на верх нового многоместного держателя для микропробирок. В середину каждой лунки добавляют 70 мкл воды, не содержащей РНКазы (программа 3 на Р1250: наполнение 850, распределение 70).
2.2.3.16. Инкубируют 1 мин при комнатной температуре и затем планшет покрывают свежей пленкой АиРоге.
2.2.3.17. Блок центрифугируют в течение 4 мин при 6000хд в центрифуге 81дта 4-15С. Элюированный объем составляет от 28 мкл до 50 мкл.
2.2.3.18. Планшет КЫеа8у-96 выбрасывают, а многоместный держатель пробирок закрывают крышками, прилагаемыми Д1адеп (по 8 на полоске).
2.2.3.19. Элюированную РНК хранят при -80° С или сразу же подвергают анализу ТацМап® .
2.3 Подготовка контролем: экстракции.
День 1.
2.3.1.1. Высевают 2,5х107 клеток, продуцирующих репликон, во флаконы для культуры тканей размером 150 см2 (Т-150).
2.3.1.2. Высевают 2,0х106 клеток Ний7 во флаконы для культуры тканей размером 75 см2 (Т-75).
2.3.1.3. Инкубируют в течение ночи при 37°С.
День 2.
2.3.1.4. Лизируют клетки лизирующим буфером.
2.3.1.5. Удаляют надосадок с клеток Ний7 и клеток, продуцирующих репликон, и монослой промывают 10 мл бессывороточной среды (МЕМ).
2.3.1.6. К клеткам Ний7 добавляют 30 мл лизирующего буфера (1 мкл культуры ВУЭУ/15 мл лизирующего буфера), перемешивают многократным пипетированием и лизат клеток помещают в центрифужные пробирки для культуры ткани с коническим дном объемом 50 мл.
2.3.1.7. 10,5 мл лизирующего буфера добавляют к клеткам, продуцирующим репликон, перемешивают многократным пипетированием и лизат клеток помещают в центрифужные пробирки для культуры ткани с коническим дном объемом 15 мл.
2.3.2. Стандарт высокой экстракции: разносят аликвоты клеточного лизата продуцирующих репликон клеток объемом 170 мкл в 5 и 6 ряды двух держателей пробирок объемом 0,75 мл МаГпх.
2.3.3. Стандарт средней экстракции: 1,0 мл клеточного лизата продуцирующих репликон клеток добавляют к 9 мл лизата Ни117 и тщательно перемешивают. Разносят аликвоты указанной смести объемом 170 мкл в 3 и 4 ряды двух держателей для пробирок объемом 0,75 мл МаГпх.
2.3.4. Стандарт низкой экстракции: 50 мкл клеточного лизата продуцирующих репликон клеток добавляют к 10 мл лизата Ни117 и тщательно перемешивают. Разносят аликвоты указанной смести объемом 170 мкл в 1 и 2 ряды двух держателей для пробирок объемом 0,75 мл МаГпх.
2.3.5. Контроль нулевой экстракции: разносят аликвоты лизата клеток Ни117 объемом 170 мкл в 7 и 8 ряды двух держателей пробирок объемом 0,75 мл МаГпх.
2.3.6. Контроли хранят при -80°С.
3. ОТ-ПЦР ТацМап® и анализ данных.
3.1. Введение: количественную ОТ-ПЦР в режиме реального времени используют для измерения количества РНК репликона НСУ в каждом образце. Указанную методику также называют основанным на ПЦР 5'-нуклеазным анализом и ТацМап®. Прибор для анализа представляет собой систему регистрации последовательностей АррНеб ВюзузГетз 7700 РгБт (АррНеб ВюзузГетз, ЕозГег С11у, СА). Указанный прибор по существу является флуоресцентным спектрографом с временным мультиплексированием, связанным с термоциклером. Он контролирует накопление ПЦР-ампликона в каждой лунке 96-луночного планшета с образцами в ходе процесса ПЦР.
3.2. Применение внутреннего контроля ВУЭУ: Как указано в предыдущем разделе в каждый образец включают внутренний позитивный контроль. Контроль служит в качестве меры эффективности экстракции РНК и показывает, содержит ли образец загрязнения, которые ингибируют ПЦР ТацМап® . ВУЭУ смешивают с хаотропным буфером для лизиса клеток перед внесение лизирующего буфера в клетки. Хотя позитивный контроль имеется в каждом образце, анализ внутреннего позитивного контроля
- 116 011547
ВУЭУ проводят только в том случае, когда результаты анализа РНК репликона НСУ выпадают из ожидаемых пределов, что свидетельствует о том, что может существовать проблема, связанная с образцами. Система 7700 способна одновременно осуществлять мониторинг накопления двух разных ПЦРампликонов в одной и той же пробирке при использовании регистрирующих зондов, меченых двумя разными флуоресцентными репортерными красителями («мультиплексирование»). Конкретные критерии, которые являются основанием для Тас.|Мап®-анализа внутреннего позитивного ВУЭУ-контроля планшета с образцами, описаны в разделе, посвященном анализу результатов (3.6).
3.3. Зонд и праймеры для Тас.|Мап® РНК репликона НСУ Вследствие ожидаемой генетической стабильности и отсутствия общей вторичной структуры РНК в гене устойчивости к неомицину (пео), кодируемом репликоном, используют праймеры и зонд, которые связываются с данной областью. Указанный фрагмент РНК репликона простирается в пределах оснований 342-1193 репликона из 8001 пар оснований ®ЕС) ΙΌ N0: 1):
301 дВдсЕЪдсда дбдссссддд аддъсБсдЬа дассдСдсас сабдадсасд ааЪссЬааас 361 сЬсааадааа аассааасдЬ аасассаасд ддсдсдссаЪ даЪЪдаасаа даьддаеъдс 421 асдсаддЪЬс гссддссдсЪ ЪддДОддада ддсСаЪЬсдд сЪа^дасЪдд доасаасада 481 сааесддсед ссседаедсс дссдСдсСсс ддсЪдееадс дсаддддсдс ссддбсеб^с 541 ььдисаадас сдадсЪдЪсс ддЪдсссЬда аЪдаасьдса ддасдаддса дсдсддсЬаЪ 601 сдЬддсЪддс сасдасдддс дЪЪсекХдсд саде£дедс& сдасдЕХдБс аскдаадсдд 661 даадддасЕд дс1дсЪаЬЕд ддсдаадьдс сддддсадда ЕсвссСдСса Ессеаассхд 721 ссссЕдссда дааадЪаЪсс аЬсабддсСд аедсааЪдсд дсддсьдсаъ асдсЕЕдаЕс 781 сддсЕассгд сссаЬЬсдас сассаадсда аасаЪсдсаЬ сдадсдадса сдЬасЪсдда 841 ъддаадссдд есЪсдЪсдаЪ саддаЕдаЕс сддасдаада дсабсадддд сЕсдсдссад 901 есдаасЪдЪС сдссаддеьс ааддедсдса Ъдсесдасдд сдаддаЬсЪс дксдЬдассс 961 агддсдаЬдс сСдсЕЕдссд ааСаСсаьдд ЕддааааЕдд СС6СПТТСТ ООВОССЖЮ6 фямо* драйсяр
1021 аСТОТООССЗ ОСТОООТОТС СсддассдсЕ ассаддасаЬ адсдЕЕддсЕ асссдЕдаЕа ТадМвп*
1081 съдссдаада дсЯТОбСООС шжгаоосЪд ассдсЕЕссЕ сдЕдсЕЕЕас ддЕассдссд
1141 сЕсссдаЕЕс доадсдсаъс дссбЕсЕаЕс дссЕЕсЕЕда сдадЕЕсЬЕс ЕдадЕЕЕааа
3.4. Методики
3.4.1. Способ получения 1Х исходных смесей для ОТ-ПЦР ΝΕ0 и ВУЭУ.
Таблица 6. Сводные данные по оборудованию и вспомогательным материалам, используемым в методике экстракции РНК НСУ
Оборудование и вспомогательные материалы Порядковый Но. Поставщик
Пипетка 0,5-10 мкл Серия 22 47 005-1 2000 Еррепйог£
Пипетка 2-20 мкл Серия 22 47 015-9 2000 Ерреп<5ог£
Пипетка 10-100 мкл Серия 22 47 020-5 2000 ЕррепйогГ
Пипетка 50-200 мкл Серия 22 47 025-6 2000 ЕррепйогГ
Пипетка 100-1000 мкл Серия 22 47 030-2 2000 Еррепдог?
Наконечники 1250 мкл МаЕггх Кат. да 8255 МаЕгЗх
Наконечники 200 мкл МаЕггх Кат. да 7275 МаЕггх
Наконечники 10 мкл АКТ Кат. да 2140 Мо1еси1аг ВгоргойисЕз
Наконечники 20 мкл АКТ Кат. » 2149Р Мо1еси1аг ВхоргойисЕз
Наконечники 100 мкл АКТ Кат. № 2065Е Мо1еси1аг В1оргойисЕз
Наконечники 200 мкл АНТ Кат. да 2069 Мо1есц1аг ВгоргобисЕз
Наконечники 1000 мкл АКТ Кат. да 2079Е Мо1еси1аг ВгсргобисЕз
Электронная пипетка, Пирас 52 Кат. да 2001 МаЕгЕх
Микроцентрифужные пробирки, не содержащие РНКазы, 1,5 мл Кат. ® 12450 АшЫоп
Полипропиленовые пробирки, 14 мл Кат. № 352059 Га1соп
Емкость для реагентов, 25 мл Кат. да 8096 МаЕгхх
96~луночный планшет для реакций Кат. № N801-0560 Αρρίίβά ВЕозузЕешз
Оптические полоски с крышками Кат. » N80 1-0935 Αρρίίθά ВгозузЕетз
Одноразовые стерильные покрытия Кат. № 9515-Е ВахЬег
Реагенты Порядковый Νο. Поставщик
Кислота 0,1н НС1 Е1з11ег
КЫАзеЕар Кат. да 9780 АтЫоп
Р.МАзе аыау Кат. да 7005 Мо1еси1аг ВгоргойисЕз
10-рак, набор основных реагентов для ОТ-ПЦР ΕΖ, Кат. да 40302Θ Αρρίίβά ВгозузЕешз
- 117 011547
5х реакционный буфер, 25 мМ ацетат магния, дезоксиНТФы.
Зонд Ч1С ΝΕΟ, 2 мкМ (=10х), 550 мкл на аликвоту Кат. № «50003, изготовлен на заказ, 5'-чю-сте тес ссс ест ЕСЕ ТОТ СЕ-ТАМКА -3' (БЕ <2 ЕО N0: 2) Αρρίίβά В1о5у5беш5
Зонд VIс ВЧЮЧ, 2 мкМ (=10х), 550 мкл на аликвоту (Чегбех) Кат. № 450003, изготовлен на заказ, 5'-Ч1С-ССС ТС6 ТСС АСЕ ТСС САТ СТС ЕА-ТАМКА-3' (БЕС ΙΌ ΝΟ: 3) Арр1ίей Вхоаузбетз
Прямой праймер ΝΕΟ, 3 мкМ (=10х) смесь прямой/обратный праймер, 550 мкл на аликвоту Кат. №4304972, изготовлен на заказ, 5'-ССС СТТ ТТС ТСС АТТ САТ СС-3' (5Е0 Ιϋ ΝΟ: 4) Αρρίϊβά ΒίοεγΕΐεπίδ
Обратный праймер ΝΕΟ, 3 ыкМ (=10х) смесь прямой/обратный праймер, 550 мкл на аликвоту Кат. №4304972, изготовлен на заказ, 5'-ССС АТТ ССС СЙС САА- 3' (3Ες ЮЖ: 5) Αρρίίθά В1овузТеша
Прямой праймер ВЧБЧ, 3 мкМ (=10х) смесь прямой/обратный праймер, 550 мкл на аликвоту изготовлен на заказ, 5'-САЕ ЕСТ АСТ СЕТ САЕ ТЕС ТТС С-3' (БЕС ΙΡ N0: 6), масштаб 1,0 мкМ/очистка в геле ОИдов е£с
Обратный праймер ВЧОЧ, 3 мКМ (=10х) смесь прямой/обратный праймер, 550 мкл на аликвоту изготовлен на заказ, 5'-СЕС СТС ТЕС АЙС АСС СТА ТС-3' (БЕС ΙΌ N0: 7), масштаб 1,0 мкм/очистка в геле О11дов е!с
Стандарты РНК ΝΕΟ РНК, транскрибированная ίπ νίί:го с плазмидой, содержащей часть гена пео РНК репликона ИСТ с использованием РНК-полимеразы Е7. Транскрибированную ίη νίίπο РНК количественно оценивают на основе известной молекулярной массы транскриптов и УФ-оптической плотности раствора очищенного транскрипта. Полученную РНК разбавляют, делят на аликвоты и хранят при -0О°С. Отдельные аликвоты размораживают для каждого анализа ТадМап®.
Подлежащие тестированию образцы РНК, выделенные из клеток, несущих репликон НСЧ (раздел 2 данного протокола), 10 мкл/96луночный планшет
Вода, не содержащая нуклеаз (не обработанная И5РС) Кат. № 9930 АтЫоп
3.4.2. Подготовка реагентов для исходной смеси.
3.4.2.1. Очищают лабораторный стол в две стадии, указанные ниже, и протирают пипетки КИАке а^ау.
ВИАке 2ар (АтЬюп, Аикбп, ТХ).
ВИАке А^ау (Мо1еси1аг Вюргобиск, 8ап Э1едо, СА).
3.4.2.2. Открывают основные реагенты для ОТ-ПЦР Е2 (Аррйеб Вюкук(етк) и помещают 5 х буфер на лед, замороженные реагенты размораживают при комнатной температуре примерно в течение 15 мин и затем помещают их на лед. Один набор реагентов для ОТ-ПЦР ΞΖ можно использовать для анализа экстракций РНК в двух 96-луночных планшетах.
3.4.2.3. Вынимают одну пробирку с 2 мкМ зондом У1С (ИЕО или ВУЭУ, 550 мкл на пробирку) из -20°С и помещают на лед.
3.4.2.4. Вынимают одну пробирку с 3 мкМ смесью прямого/обратного праймера (ИЕО или ВУЭУ, 550 мкл на пробирку) из -20°С и помещают на лед.
3.4.2.5. Вынимают одну пробирку (30 мкл) стандартов РНК-транскриптов (108 копий/10 мкл) из -80°С и помещают на лед.
3.4.2.6. Берут одну пробирку с водой АтЬюп комнатной температуры.
3.4.3. Компоновка исходной смеси для реакции в одном 96-луночном планшете.
3.4.3.1. Используют пипетку на 1 мл, чтобы перенести 5хбуфер (Аррйеб Вюкук(етк) в пробирку объемом 14 мл; общий добавленный объем составляет 1100 мкл.
- 118 011547
3.4.3.2. Используют пипетку на 1 мл, чтобы добавить 25 мМ Μη(ΟΑс)2 (Αρρ1ίβ6 Вю5у51сш5) в пробирку объемом 14 мл; общий добавленный объем составляет 660 мкл.
3.4.3.3. Используют пипетку на 200 мкл, чтобы добавить 165 мкл 10 мМ 6ΑΤΓ в пробирку объемом 14 мл. То же самое делают с 10 мМ бСТР, 20 мМ бИТР и 10 мМ бСТР.
3.4.3.4. Используют пипетку на 1 мл, чтобы добавить 550 мкл 10x3 мкМ смеси прямой/обратный праймер.
3.4.3.5. Используют пипетку на 1 мл, чтобы добавить 550 мкл 10x2 мкМ зонда.
3.4.3.6. Используют пипетку на 1 мл, чтобы добавить 220 мкл ДНК-полимеразы гТИт (Αρρ1ίβ6 Βίο5У51СШ5).
3.4.3.7. Используют пипетку на 100 мкл, чтобы добавить 55 мкл ΑιηρΕηδο υΝΟ (Αρρ1ίβ6 Вю5У51ет§).
3.4.3.8. Используют пипетку на 1 мл, чтобы добавить 605 мкл Н2О ΑιτιΝοη в пробирку объемом 14 мл; конечный объем составляет всего 4400 мкл.
3.4.3.9. Переносят 4400 мкл исходной смеси в емкость для реагентов объемом 25 мл.
3.4.3.10. Распределяют по 40 мкл на лунку во все 96 лунок, используя 8-канальную пипетку.
3.4.3.11. Переносят 10 мкл экстрагированных неизвестных образцов в лунки планшета для реакций, используя 8-канальную пипетку, колонку за колонкой, с 1 колонки по 11 колонку. После переноса каждую колонку закрывают крышками.
3.4.3.12. Добавляют 270 мкл Н2О ΑιτιΝοη к 30 мкл транскрипта РНК 108 копий/10 мкл для использования в случае стандартной кривой и перемешивают. Теперь имеется 107 копий стандартной РНК для количественного анализа репликона НСУ/10 мкл.
3.4.4. Установка ΑΒΙ 7700 для каждого прогона.
3.4.4.1. Перед каждым прогоном перезагружают компьютер для ΑΒΙ 77 00 и заново компонуют рабочий стол.
3.4.4.2. Закрывают и удаляют любые лишние программы в накопителе на жестком диске; переполнения данных удаляют в корзину.
3.4.4.3. Открывают программу детектора последовательностей ν1.7 (компьютерная программа 8Ό8).
3.4.4.5. Открывают папку «Ход анализа репликонов».
3.4.4.6. Открывают матричный диск «Анализ репликонов». Условия термоциклера, запрограммированные на матрице, представляют собой следующее:
Стадия 1: 50°С в течение 2 мин.
Стадия 2: 60°С в течение 30 мин.
Стадия 3: 95°С в течение 5 мин.
Стадия 4: 95°С в течение 15 с.
Стадия 5: 60°С в течение 60 с.
Количество циклических повторов стадий 4-5: 40.
Матричное устройство: диагностика: дополнительные опции:
Выбранное представление: показ пъе.
Выбранное представление: показ наилучшей подгонки.
Выбранное прочее: эталонный краситель ВОХ.
3.4.4.7. Файл «сохраняют» (но не «сохраняют как») в папке «Ход анализа репликонов».
3.4.4.8. Раскрывают установку: нажимают ΒυΝ.
3.5. Подготовка данных ΑΒΙ7700 после выполнения анализа с использованием компьютерной программы 8Ό8.
3.5.1. Анализируемые планшеты вынимают из ΑΒΙ7700 и выбрасывают, даже не открывая. Это значительно уменьшает лабораторные проблемы, связанные с перекрестным загрязнением ПЦР.
3.5.2. Данные анализируют с использованием компьютерной программы системы регистрации последовательностей У1.7.
3.5.3. Пороговые уровни сначала устанавливают, используя установки по умолчанию.
3.5.4. Критерии выбраковки данных: данные отдельных точек или серии целых планшетов могут быть забракованы. Данные можно отбраковать в том случае, если имеется значительное отклонение от протокола, недостаток реагента или случайная ошибка, связанная с реагентом, или сбой в работе ΑΒΙ7700. Для выбраковки каких-либо точек данных из очевидно нормального прохождения анализа, должен выполняться один или несколько из указанных критериев.
3.5.4.1. Расчеты порогового цикла. Обычно используют значения по умолчанию для компьютерной программы 8Ό8. Если 0'1 наиболее концентрированного образца меньше 15, то при необходимости изменяют конечный предел порогового значения до более низкого значения, так чтобы С'1 образца с самой высокой концентрацией было выше, чем конечный предел. После выполнения такого изменения корректируют расчеты.
3.5.3.2. Решают вопрос о выбраковке всего неправильного прогона ТадМап®, о котором свидетель
- 119 011547 ствует отклонение от средних значений для наклона и отрезка, отсекаемого на оси у графиком, получаемым при анализе стандартов РНК пео. Допустимыми пределами таких значений являются: значения наклона должны быть в пределах от 3,0 до 3,6; количество циклов, соответствующее отрезку, отсекаемому на оси у, должно составлять от 36 до 41 цикла.
3.5.4.3. Отклоняющиеся от нормы отдельные лунки ТадМап®, о чем свидетельствует экстремальное значение Кп/АКп, можно исключить перед анализом данных с тем, чтобы они не влияли на расчеты компьютерной программы 8Ό8.
3.5.4.4. Проверяют и регистрируют значения С! нематричных контролей и подтверждают, что они >7,0 С! (>100Х), выше, чем С! для любого обработанного соединением образца.
3.5.5. Значения С! стандартов РНК НСУ сравнивают с полученными ранее результатами.
3.5.6. Кривую для стандарта РНК НСУ сравнивают с полученными ранее результатами.
3.5.7. Если в отдельных лунках имеет место явная отклоняющаяся от нормы амплификация, то данные лунки идентифицируют и помечают.
3.5.8. Файл «результаты» экспортируют и переносят из компьютера 7700 в другой компьютер для анализа с использованием Мюгозой Еχсе1.
3.5.9. Сообщают о любых из следующих изменений в приготовлениях реагентов или разведении.
Синтез нового зонда или праймера от поставщика.
Новое разведение зонда или праймера и аликвоты.
Новый препарат стандартов РНК-транскриптов.
Новое разведение стандартов РНК-транскриптов и аликвоты.
Новый вирусный препарат ВУЭУ.
Новый препарат стандартов колонки 11.
3.6. Анализ данных ТадМап®.
3.6.1. Копируют и вставляют номер С! НСУ ТадМап® и количество копий из файла результатов Тас.|Мап® в соответствующие ячейки Мюгозой Еχсе1 тасго для анализа данных исследования репликонов, и запускают макрокоманду.
3.6.2. Копируют таблицу результатов ТадМап® из макролиста на другой лист, вводят серийный номер соединения и номер партии.
3.6.3. На основе указанного листа еχсе1 будет рассчитано среднее значение, стандартное отклонение и процент СУ ингибирующей активности соединения, а также число копий НСУ, номер С! НСУ С! и номер С! ВУЭУ (если имеется) для всех точек разведения в 5 повторах и контроля, не содержащего соединения.
3.6.4. Критерии выбраковки данных и выполнения контрольного ТадМап® ВУЭУ. Проверяют все расчеты. Данные отдельных точек или серии целых планшетов могут быть забракованы. Данные можно отбраковать в том случае, если имеется значительное отклонение от протокола, недостаток реагента или случайная ошибка, связанная с реагентом, или сбой в работе АВ17700. Для выбраковки каких-либо точек данных из очевидно нормального прогона должен выполняться один или несколько из указанных критериев. Стандартное отклонение ингибирования в процентах должно составлять менее 30% для активных соединений. % СУ количества копий НСУ должен составлять менее 30%. Стандартное отклонение С! НСУ всех образцов должно быть меньше 0,5; в большинстве образцов обычно оно составляет примерно от 0,1 до 0,3. Если стандартное отклонение С! НСУ составляет более 0,5, то возвращаются к таблице необработанных данных и поверяют номера С! 5 повторов. Если номер С! для какой-либо одной лунки отличается на 2 С! от среднего номера С! 5 повторов, то указанную лунку следует исключить из анализа. Если более 3 лунок (не в одной и той же колонке) имеют необычные номера С!, то необходимо провести анализ внутреннего контроля ТадМап® ВУЭУ. Если результаты, полученные для ВУЭУ неравномерны, то соединение необходимо тестировать заново.
3.6.5. Расчет 1С50: копируют и вставляют данные среднего значения ингибирования и стандартного отклонения в сигмоидальную кривую доза-ответ с помощью устройства, рассчитывающего различные наклоны кривой, которое использует способы нелинейной регрессии. Используя указанное устройство, рассчитывают 1С50, используя каждый из двух способов: фиксирование только верхнего предела на уровне 100% ингибирования, или фиксирование верхнего предела на уровне 100% ингибирования и нижнего предела на уровне 0% ингибирования. Затем отмечают способ, который дает самую точную подгонку, для каждого соединения. Наиболее достоверное значение 1С50 получают из расчета с наименьшей стандартной ошибкой. Если 1С50, рассчитанные на основе указанных двух вариантов подгонки кривых, демонстрирует различие, превышающее однократное, или если 8Ό 1С50 больше чем 1С50, соединение следует тестировать заново с корректировкой концентраций.
Расчет влияния ингибиторов сериновой протеазы НСУ в комбинации с интерферонами
Влияние ингибитора сериновой протеазы НСУ (Н8Р1) и интерферона в комбинации можно оценить в анализе репликонов, получая кривую «доза-ответ» для Н8Р1 в присутствии различных уровней интерферона, или определяя кривую «доза-ответ» для интерферона в присутствии различных уровней Н8Р1. Цель заключается в том, чтобы оценить, будет ли иметь место большее или меньшее ингибирование на
- 120 011547 копления вирусной РНК, чем ожидалось бы, если бы два лекарственных средства оказывали аддитивное действие на РНК. Более конкретно, используют определение аддитивности по Ьо^е ((1928) О1е СиапШаГюп РгоЫете бег Рйагтако1одю, ЕгдеЬп. РЕукюк 27, 47-187). Аддитивность определяют следующим образом. Пусть Όε,πφ означает концентрацию интерферона, результатом которой является эффект Е, и пусть 1)8. означает концентрацию ингибитора протеазы, результатом которой является эффект Е.
Тогда отсутствие взаимодействия или аддитивность Ьо^е выражается следующим соотношением, где комбинация концентрации Όι ΙΝΕ и Ό2 Н8Р1 дает эффект Е.
Степень синергизма или антагонизма выражают кривыми изоэффекта или изоболами. Комбинация (Ό1,Ό2) представляет собой точку на графике, где на осях представлены концентрации интерферона и Н8Р1 (фиг. 2). Все такие комбинации, который дают уровень эффекта Е, образуют изоболу эффекта Е. Обязателен случай, когда (Όε,ινρ,0) и (0, ЭЕ,Н8Р1) являются точками изоболы. Изоболы представляют собой прямые линии, связывающие точки (Όε,ινρ,0) и (0, ОЕ,Н8Р1), когда удовлетворяется соотношение аддитивности (1).
Изоболы, вогнутые вверх, свидетельствуют о синергизме, а изоболы, вогнутые вниз, свидетельствуют об антагонизме. Следуя руководствам ВегепЬаит, М. С. ((1985) Тйе еxресГеб ейесГ о£ а сотЬтаГюп о£ адепГк: Гйе депега1 ко1иГюп. Е Тйеог. Вю1., 114, 413-431) и Сгесо, Рагк апб ВикГот ((1990) Аррйсайоп о£ а Νον Арргоасй £ог Изе СиапШаПоп о£ Эгид 8упегд18т Го Гйе СотЬтаГюп о£ с18-О1атттебюЫогор1аГтит апб 1-В-О-АгаЬто£игапо8у1суГо8те, Сапсег Векеагсй, 50, 5318-5327), добавляют член к (1), чтобы рассчитать синергизм или антагонизм. Уравнение задает поверхность ответов, которую можно подогнать для контрольных процентных значений при всех комбинациях обработки. Точки контура из указанной подогнанной поверхности ответов представляют изоболы.
Модель поверхности ответов предполагает сигмоидальную зависимость «доза-ответ» для каждого соединения, определяемую (2).
Концентрации, которые дают конкретный уровень активности Е по отдельности, выражаются уравнениями (3).
Чтобы удовлетворять модели Сгесо еГ а1. (1990), комбинированное действие лекарственных средств должно удовлетворять уравнению (4) для каждой комбинации лекарственных средств, которая дает уровень ответа Е.
Параметр α является мерой количества взаимодействия. Нулевое значение альфа означает отсутствие взаимодействия или аддитивность, так как уравнение сводится к (1) при α = 0. Если даны 1С50, наклоны Хилла (т), максимальное значение (ЕтЕК) и минимальное значение (В), данное уравнение можно решить, получив эффект, являющийся результатом любой комбинации обработок [ΙΝΕ] и [Н8Р1]. Следовательно, данное уравнение задает поверхность ответов. Если имеется эксперимент, где [ΙΝΕ] и [Н8Р1] варьируют, то параметры можно выбрать с использованием нелинейной регрессии на основе метода взвешенных наименьших квадратов. Параметр а может быть связан с показателем синергизма 8 (НеМеГГ, Р. 8. (1969) МеакигетепГ о£ роГепаек о£ бгид т^xГи^е8. ВютеГпск, 25, 477-487), который определяют непосредственно на основе изобол при 50% эффекте. 8 представляет собой отношение расстояния от начала координат до изоболы, определяющей аддитивность, к расстоянию от начала координат до изоболы подгоняемых данных, вдоль прямой, проходящей под углом в 45° относительно осей. (8=ОЩОМ, см. фигуру 3). Зависимость представляет собой α =4(82-8).
Способ, обсуждаемый в Сгесо еГ а1. (1990), выше, для подгонки поверхности ответов и определения параметра синергизма а и уровня его значимости дает оценку степени синергизма в серии экспериментов, в которых тестируют Н8Р1 в комбинации с несколькими различными интерферонами. Однако существует необходимость взвесить результаты наблюдений с более низкими оценками в большей степени, чем с более высокими оценками. Оценки прямо связаны с процентом в контроле, который представляет
- 121 011547 эффект Е. Используя способы, описанные в Сагго11, К! апб Кирей, Ό. ((1988) (ТгапкГогтаПоп апб Уе1дк!ίη§ ίη Кедгеккюп, СЬартап апб На11, Νο\υ Уогк), можно увидеть, что вариабельность от лунки к лунке увеличивается с увеличением квадрата среднего значения процента в контроле. Поэтому результатам наблюдений по одному приписывают веса по возведенному в квадрат подогнанному значению процента в контроле (Е). Дисперсия и взвешивание, используемые для анализа указанных экспериментов, не противоречат зависимостям изменчивости, наблюдаемым исследователями, изучающими способы анализа исследований радиолигандов (Ешпеу, Ό. 1., (1976), КабюНдапб Лккау, ВютеРтск, 32, 721-740, и Оиб1еу, К. Л. Еб^агбк, Р., Екшк, К.Р., МсК1п71е, I. С. М., КааЬ, С.М., КобЬагб, Ό. апб Кобдегк, К.Р.С. (1985), СшбеНпек Гог Гттипоаккау Эа1а Ргосеккшд, СНшса1 Скетк!гу, 31/8, 1264-1271).
Результаты
В исходном эксперименте ингибитор сериновой протеазы НСУ, соединение СИ, тестируют в пределах концентраций от 3 до 0,0123 мкМ, т.е. в 244-кратном диапазоне. Концентрации интерферона-альфа 2В варьируют от 30 единиц в образце до 0,0096 единиц в образце, т.е. в 3125-кратном диапазоне. Как показано в таблице 7, при использовании в качестве единственного лекарственного средства для обработки соединение СИ проявляет 1С50, равное 0,48 мкМ, а интерферон - 1С50, равное 2,19 ед. В пределах погрешности анализа репликонов, которое составляет примерно 20%, добавление интерферона-альфа 2В приводит к увеличению ингибирования накопления РНК репликона дозозависимым образом. Например, обработка клеток 0,333 мкМ соединения Си приводит к 28% ингибированию накопления РНК репликона. Обработка клеток комбинацией 0,333 мкМ соединения СИ, что составляет 71% дозы 1С50 (0,469 мкМ), и 0,24 ед. интерферона-альфа 2В, что составляет 11% 1С50 интерферона-альфа 2В (2,05 мкМ) приводит к 49% ингибированию накопления РНК репликона. Таким образом, 71% дозы 1С50 одного соединения в комбинации с 11% другого приводит к 49% ингибированию накопления РНК репликона. Используя интуитивный подход к определению того, является ли комбинированная обработка синергической или аддитивной, или антагонистической, можно предположить, что если бы эффект комбинированной обработки был только аддитивным, то следовало бы ожидать, что объединяемые фракции двух доз 1С50, необходимые для получения 49% ингибирования накопления РНК репликона, составляли бы 98%. Экспериментальные результаты авторов изобретения показывают, что уровень ингибирования накопления РНК репликона достигается с использованием 71% плюс 11%, т.е. 82% дозы 1С50, а не 98%, как рассчитано для случая аддитивных эффектов комбинированной обработки. Таким образом, при указанных концентрациях соединений эффект, по-видимому, является синергическим, так как используют меньшие дробные дозы 1С50 каждого соединения для получения 49% ингибирования РНК репликона НСУ, чем требовалось бы в случае использования любого из соединений по отдельности, когда было бы необходимо 98% доз 1С50. Результаты комбинированной обработки показаны в табл. 8 и графически на фиг. 1.
Таблица 7. Ингибирование накопления РНК репликона после 48-часовой обработки соединением Си и интерфероном-альфа 2В отдельно или в комбинации Интерферон-альфа 2В (единицы)
Соединение си зо и 6 и 1,2 и 0,24 и 0,048 и 0,0096 и о и
(конц.)
3 мкМ 99% 99% 99% 99% 98% 98% 98%
1 мкМ 99% 98% 96% 95% 92% 93% 88%
С,333 МКМ 94% 87% 66% 49% 33% 27% 28%
0,1111 мкМ 93% 79% 46% 29% 12% 15% 11%
0,0370 мкН 92% 78% 44% 21% 2% 7% 8%
0,0123 мкМ 92% 78% 44% 20% 19% 19% 5%
0 мкМ 89% 73% 38% 16% 8% 12% 0%
Представленные исходные результаты, полученные, как указано ранее, с использованием анализа репликона ίη νίΙΐΌ и простого анализа аддитивности данных, полученных в данном анализе, показывают, что комбинированная обработка клеток, несущих репликон, ингибитором сериновой протеазы НСУ и интерфероном дает, по меньшей мере, аддитивный антивирусный эффект и, по-видимому, синергический антивирусный эффект.
Приведенные выше данные повторно анализировали, используя формальные математические способы, описанные выше для того, чтобы определить, является ли взаимоотношение между ингибитором СИ сериновой протеазы НСУ и интерфероном-альфа-2В синергическим, аддитивным или антагонистическим. Повторный анализ данных показан в числовом выражении в табл. 8 и графически на фиг. 4.
В табл. 8 суммированы дополнительные результаты, полученные в анализе репликонов после обработки клеток, содержащих репликон, в течение 48 ч различными ингибиторами сериновой протеазы НСУ согласно данному изобретению и несколькими разными интерферонами, отдельно или в комбинации. Авторы обращают внимание, что стандартное отклонение значений, измеренных для ингибирования РНК репликона НСУ в анализе репликона, составляет ~20%. Соединения тестируют в широком диапазоне концентраций и при более низких концентрациях соединения, которые не вызывают существенного ингибирования концентрации РНК репликона НСУ. Поскольку стандартное отклонение в анализе составляет ~20%, в некоторых точках данные будут давать отрицательные числа. Отрицательные числа
- 122 011547 ингибирования свидетельствуют о том, что в конкретном эксперименте в образцах, обработанных соединением, в среднем больше молекул РНК репликона НСУ, чем в ложно обработанных образцах.
Таблица 8. Ингибирование накопления РНК репликона после 48-часовой обработки ингибиторами сериновой протеазы НСУ и различными интерферонами отдельно или в комбинации Эксперимент 1
ΙΓΝ альфа-2В (единицы)
30.00 6.00 1.20 0-24 0.048 0.00% ОЛОО
0.000 89% 73% 38% 16% 8% 12% 0%
Соединение 0.012 92% 78% 44% 20% 19% 19% 5%
си (мкМ) 0.037 92% 78% 44% 21% 2% 7% 8%
0.111 93% 79% 40% 29% 12% 15% 11%
0.333 94% 87% 80% 49% 33% 27% 28%
1.000 99% 98% 96% 95% 92% 93% 88%
3.000 99% 99% 99% 99% 98% 98% 98%
Эксперимент 2
ΙΕΝ альфа-2А (единицы)
6 12 024 0.048 0.0096 О
0 0.0123 86% 87% 61% 66% 27% 17% 4% -23% -7% 8% 5% 8% 0% 10%
Соединение СП 037 85% 62% 13% -2% 0% -1% 1%
(мкМ) 0.1111 87% 68% 37% 20% -6% 12% 10%
0333 92% 77% 58% 41% 26% 25% 44%
1 98% 96% 90% 86% 84% 83% 85%
3 99% 99% 98% 98% 98% 98% 98%
Эксперимент 3
Соединение си (мкМ)
1.5 0.75 0375 0.1875 0.0938 0.0469 0.0234 О
0 98% 93% 62% 23% 12% -2% -4% -2% 0
0.049 98% 95% 70% 39% 12% 2% 6% 9% 3%
Интерферон 0.123 98% 95% 70% 43% 15% 7% 14% 2% 7% 5% 19% 2% -3%
альфа-2В 0307 98% 95% 73% 46% 16%
(единицы) 0.768 98% 95% 82% 56% 43% 34% 28% 32% 28%
1.920 98% 98% 87% 71% 51% 54% 49% 52% 45%
43 99% 98% 92% 82% 74% 71% 69% 71% 59%
12.0 99% 98% 96% 89% 87% 85% 85% 85% 80%
30.0 99% 99% 98% 95% 93% 92% 92% 93% 89%
Эксперимент 4
Соединение си (мкМ)
13 0.75 0375 0.1875 0.0938 0.0469 0.0234 О
0 98% 94% 74% 38% 17% 3% -1% 6% 0%
0.049 98% 93% 60% 22% 29% 21% -9% -6% 6%
0.123 98% 93% 67% 29% 21% 12% 3% 2% -8%
Интерферон 0-307 98% 93% 66% 29% 22% 4% -3% -4% 10%
альфа-2А 07ω (единицы) 1320 98% 95% 67% 46% 24% 21% 20% 9% 15%
98% 96% 73% 48% 43% 44% 27% 33% 29%
4.8 98% 97% 82% 61% 61% 59% 52% 55% 43%
12.0 99% 98% 91% 75% 76% 72% 71% 74% 73%
30.0 99% 98% 96% 89% 86% 85% 84% 84% 83%
- 123 011547
Эксперимент 5
Со«дии«яив СО (мкМ)
3 1Л 0.75 0375 0.1875 0.0938 0.0469 0.0234 8
ол 98% 95« 65« 24« -1« -14« -14« -и» 0
0.9375 97« 95« 72« 41« 17« 11» 12% 6« 17«
Овечий ЦП5 97« 95« 71« 40« 31« 18« 18« 11« 4«
интерферон 175 90« 96« 75« 44« 38« 25« 34« 18« 17«
Паи (единицы) 7Л 98% 96% 82« 61« 42« 37« 25« 26« 36»
15 98% 97% 84« 64« 59* 61« 56% 51« 53«
30 98« 98« 90« 79« 72« 68« 65« 68« 68«
«0 98« 98« 93« 87« 80« 80« 74« 77« 82»
ио 98« 98« 95« 92« 86« 87% 86« 86« 87«
Эксперимент 6
Соединение ЕС (мйС
1Л 0.75 0375 0.1875 0.0938 0Л46» 0.8234 0
0 96» 93« 81« 56» 29» 23« 19« 1» 0
00492 деле тете 92« 80« 60» 31« 15« 19» 29« 6%
0.1229 96* 94« 78« 58« 32» 13« 20« 20« 4«
Интерферон альфа-2В 03072 97« 95« 82« 60« 38» 32« 34« 42» 23*
(единицы) 0.7« 97» 95» 87» 66« 43» 41« 46« 43« 25»
1Λ 98« 97« 90« 73» 62% 51« 54« 58« 47»
43 98« 97» 94« 87« 76% 73» 78« 76* 69»
123 98* 98* 96» 92» 86* 86« 86» 85« 84»
303 98* 98« 96% 96» 93» 92% 92« 95« 91»
Эксперимент 7
Соединение ЕС (мхМ)
ЗЛ 13 0.75 0375 «1875 0.0938 ОЛИ® 602344 0
0 7070 92« 81« 47» 28« 17» -1« -8» 0
0.0492 96» 93» 78» 58» 21» 8« -12» 10« -17«
0.1229 95« 93« 79« 64» 14« 5« 14« 7« -22»
Интерферон 83072 95« 91« 80» 64» 22« 15» 5« 2» -5«
Ь*а'2А 0.768 (единицы) 132 96« 95% 81« 64« 34« 21« 19« 20» 4«
96« 95« 88« 78« 44* 41« 19» 33« 21»
43 97« 95» 91« 85« 60« 58% 60» 53* 49«
123 97« 97« 95« 91» 77« 72« 76» 70« 71»
ЗОЛ 98« 98» 97» 94« 91» 86« 85« 85» 84«
Эксперимент 8
Соединение Си (мкМ)
3.0 1.5 0.75 0375 0.1875 0.0938 0.0469 0.02344 0
0 &2344 97« 98» 95% 97« 77« 83« 34« 49« 16% 31« 6% 19% -7« -21« 0« -7« 0 1«
Интерферон 04688 98« 96% 84« 56« 39« 27« 10« -3« 21«
бета (единицы) 0.9375 98« 97% 91» 73« 54« 42« 31« 15» 30«
1.875 98« 98» 95« 80% 65% 58« 65% 60« 60%
3.75 98« 98« 97« 92« 86% 61% 77« 73« 79«
73 99« 98» 98« 96% 93* 93% 93« 90« 92«
15.0 99« 99% 99« 97« 97« 96% 97« 95« 96«
ЗОЛ 99« 99% 99« 99% 98% 99% 98« 98% 97%
Эксперимент 9
- 124 011547
Соединение ЕР (мкМ)
4 2 1 ВЛ 0.25 «125 0Л625 0
0 94« 96% 96% 92% 64% 36« 23% 8% 0
0.В492 95% 96% 96% $1% «7% 25% 28% 8% 3«
0.122» 95% 97% 96% 91% 65% 44% 4% 11% 4%
Интерферон 03072 95% 97% 96% 91% 71% 46% 20« 8% 20%
альфа-2В 0,7(80 (единицы) 02 96% 97% 97% 93% 75% 49% 36« 24% 24%
96% 97% 97% 94% 82% 67% 49« 52« 54%
4Λ 96% 98% 97% 96% 90% 79% 75% 75% 70%
12 97« 98% 98% 97% 94% 89% 89« 87% 83%
30 97% 98% 98% 98% 96% 94% $4« 95% 92«
Эксперимент 10
Рибалирин (мкМ)
Ж N 32 1X8 512 1048 ИЯЯ №3277 0
0 85% 62% 43% 3« -8% -17% -22% -6% 0
0.6492 87% 66% 48« 44« 11% -4% -10% 11% -7%
0.122» 84% 64% 53% 40% 26% -12% •5% 11% -9%
Интерферон О3072 86% 70% 62% 44« 28% 1« 6% 14% 7%
альфа-2В ____ , 0.7680 (единицы) 02 90« 80% 72% 65« 38% 30% 28% 44% 2»%
93« 85% 77% 76« 61« 57% 58% 50% 46%
4Л 96% 92% 87% 83« 82% 74% 71% 77% 72%
12 97% 95% 93% 91% 90« 89% 90% 89% 85%
30 98» 97% 96« 95% 94« 94% 93% 95% 94%
Как показано на фиг. 4-13, на которых графически изображены данные табл. 8, нанесенные с использованием описанного выше математического способа измерения синергизма, изоболические кривые для всех комбинаций ингибиторов сериновой протеазы НСУ и тестированных интерферонов вогнуты вверх, что свидетельствует о том, что антивирусное действие обработок в анализе репликонов является синергическим. Полученные результаты сведены в табл. 9, в которой показаны относительные уровни синергизма для комбинированной обработки и значения 1С50 для антивирусных соединений, используемых отдельно. Ключевыми элементами в табл. 9 являются значения α и значения р для определений. Элемент α является мерой максимального изгиба изоболической кривой для каждой комбинированной обработки. Значение α, равное нулю, свидетельствует об аддитивности, отрицательное значение свидетельствует об антагонизме и в случае комбинированной обработки ингибиторами сериновой протеазы НСУ и интерферонами, указанной выше, значение большее единицы свидетельствует о синергизме. Чем больше параметр α, тем больше синергизм. Как показано в табл. 9 для комбинаций ингибиторов сериновой протеазы НСУ и интерферонов, даже при игнорировании уровней значимости в каждом эксперименте, 1-критерий на основании 9 экспериментов при среднем значении альфа равном 0 (нет взаимодействия) имеет значение р, равное 0,00014, свидетельствуя о том, что результаты высоко достоверны.
Расчет синергизма методом Сгесо Кик1от ( (1990) АррНсаНоп ок а №\ν АрргоасН ког (Не ОнапШаНоп ок Эгид 8упегд1кт (о (Не СотЬтаИоп ок с1к-О1атттей1сЫогор1а1тит апй 1-в-О-АгаЬтокигапоку1су1окте, Сапсег КекеагсН, 50, 5318-5327), используемый в данном анализе, является идеальным средством оценки характера экспериментальных данных, которые могут быть получены с использованием анализа репликонов НСУ. Существуют другие способы, которые применяют для исследования антивирусных соединений, такие как способ РгНсНагй апй 8Ыртап (РпсНагй, М.К, апй 8Ыртап, С.1г., (1990) А (Нгеей1тепкюпа1 тойе1 (о апа1ухе йгид-йгид т(егас(юпк (ΐΌλ^ιν), Ап1Мга1 Кек. 14:181-206). Применение способа расчета синергизма этих авторов к данным, показанным в табл. 8, также свидетельствует о том, что комбинированная обработка клеток, несущих репликон, ингибитором сериновой протеазы НСУ и интерфероном приведет к синергическому ингибированию накопления РНК репликона НСУ (данные не показаны).
- 125 011547 <Х (ЕЕ)1
1СМ
Η5ΡΙ (мКМ)
Рзначение о>0
Таблица 9. Относительные уровни синергизма для комбинированной обработки и значения 1С50 для антивирусных соединений, используемых отдельно
Ингибитор Интерферон ΙΟί(1 ΙΝΓ сериновой (единицы) протеазы НСУ (Η3ΡΙ)
Эксперимент 1 Соединение Си ΙΓΝ 2, 05 0, 469 0, 477(0, 0Э) <0, 0001
Эксперимент 2 Соединение си ΙΕΤ1 альфа-2А 3,72 0,446 0,770(0,12) <0,0001
Эксперимент 3 Соединение Си ГЕН альфа-2В 2, 36 0,587 0,730(0,08) <0,0001
Эксперимент 4 Соединение си ΙΓΝ альфа-2А 5, 67 0, 633 0,438 (0,08} <0,0001
Эксперимент 5 Соединение си ΙΓΝ Ъаи 13,22 0, 605 0, 328(0,07) <0,0001
Эксперимент 6 Соединение ЕС ΙΕΉ альфа-2В 2,53 0,384 0,516(0,10} <0,0001
Эксперимент 7 Соединение ЕС ΙΕΉ альфа~2А 5,50 0, 312 1,24(0,20) <0,0001
эксперимент 8 соединение си ΙΓΝ ЬеГа 1,82 0, 466 0,551(0,09] <0,0001
Эксперимент 9 Соединение ЕР 1ЕН альфа-2В 30,6 0,426 0,490(0,12) <0,0001
0,0004 |
Рибавирин №1 альфа-2В
1,22
145 -0,24(0,067) ] Эксперимент 10 (8Е) - стандартная ошибка.
Другое измерение для оценки синергической природы анти-НСУ-лекарственной обработки с использованием ингибиторов сериновой протеазы НСУ и интерферонов состоит в использовании таких же способов, которые описаны выше, для оценки в анализе репликонов современной стандартной комбинированной терапии НСУ, т.е. интерферона альфа-2В в комбинации с рибавирином. На последней строке в табл. 9 показано, что параметр α для смеси интерферона альфа-2В и рибавирина является отрицательным числом, что свидетельствует о том, что существует небольшой антагонизм между двумя указанными лекарственными средствами. Это дополнительно подчеркивает значение описанных в данной заявке комбинированных обработок, в которых используются ингибитор сериновой протеазы НСУ в комбинации с интерферонами, так как указанные обработки бесспорно обеспечивают синергизм, тогда как стандартная комбинированная терапия, используемая в случае НСУ (интерферон альфа-2В в комбинации с рибавирином) не имеет синергического характера в анализе репликонов.
Приведенное выше сравнение комбинированных обработок с использованием описанных в данной заявке ингибиторов сериновой протеазы НСУ плюс интерфероны с рибавирином плюс интерферон в анализе репликонов явно свидетельствует о том, что первая обработка имеет синергический характер, а последняя - не имеет.
Результаты экспериментов, полученные с использованием анализа репликонов, свидетельствуют о том, что гораздо меньшие дозы интерферона были бы эффективными в том случае, если интерферон использовать в комбинации с ингибитором сериновой протеазы НСУ, чем необходимо при использовании интерферона альфа-2В в комбинации с рибавирином. Анализ репликонов является полезной модельной системой для тестирования потенциальных анти-НСУ-соединений и в настоящее время широко признан как эффективное средство прогнозирования анти-НСУ-активности. Например, смотри Β1ί§Η( е! а1. (2000) ЕШс1еп! 1шба!юп о£ НСУ ЕХА Еербсабоп ш Се11 Си1!иге. 8аепсе 8; 290: 1972-1974, и СНипд е! а1. (2001) НераШь С νίπ.15 герйсабоп Ф биес!1у шЫЬбеб Ьу ΙΒΝ-α ш а Ги11-1епд(Н Ыпагу е.\рге55юп 5у5(ет. Ргос. №11. Асаб. 8ск и.8.А. 98(17): 9847-52. Отдельно рибавирин обладает минимальной эффективностью в снижении накопления РНК репликона НСУ в анализе репликонов (табл. 8, эксперимент 10, и последняя строка табл. 9). Полученный результат видимо противоречит исследованиям ш νίνΌ, в которых сам по себе рибавирин в случае применения не имеет значимого терапевтического значения для лечения НСУ. Напротив, в анализе репликонов при корректировке на цитотоксичность, как обсуждается далее, рибавирин имеет 1С50, равную 145 мкМ. Полученный результат можно объяснить, приняв во внимание, что при анализе репликонов выполняют оценку высоких концентраций рибавирина, которые не возможны при терапии человека вследствие цитотоксичности ш νί\Ό (СНи!ари!б А. (2000) Абсегке еГГесЬ апб о(Нег 5аГе(у а§рес!8 оГ(Не НераШь С ап!МгаК 1оитпа1 оГСайгоеп!его1оду апб Нера!о1оду. 15 8ирр1.: Е156-63).
Данная оценка настоятельно требует определения цитотоксичности рибавирина. Такая цитотоксичность имеет место у пациентов и в анализах на клетках (81аГГтап М. Ь., УегЬеке 8. В., К1тЬа11 Р. М. (2000) А1рНа т!ег£егоп сотЬтеб νίΐΗ пЬастп ро!еп!1а!е§ ргоКГегаНсе кирргекыоп Ьи! по! су!окше ргобисбоп т тбодешсаНу 5бти1а(еб Нитап 1утрНосу(е5. Ап!Мга1 ЕекеагсН. 48(2): 91-9). В описанных в данной заявке экспериментах наблюдали и двумя способами измеряли цитотоксичность рибавирина в анализе репликонов. И в метаболическом ХТТ-анализе для определения жизнеспособности несущих репликон клеток (ЕоеНт Ν.ν., Еобдегк С. Н., На(Пе1б 8. М., С1а§еЬгоок А. Ь. (1991) Ап ппргосеб со1опте!пс аккау Гог се11 ргоПГегаПоп апб νίηόί1ίΙν и1111хлпд (Не 1е1гахо1шт ка1! ΧΤΤ. 1оита1 о£ 1ттипо1. Ме(Ноб5. 142(2): 25765) и в количественном ОТ-ПЦР анализе Τа^Μаη® , в котором измеряют уровни мРНК глицеральдегид3-фосфатдегидрогеназы (САРЭН) в обработанных по сравнению с необработанными клетками в анализе репликонов (Пипк Ν., 8хате1 М., Υοиηд А.Е., V^!!ет К.Р., Βе^детаηη 1. (2000) Сотрагабсе с.|иапНПса(юп о£ 1Ь-1Ье!а, 1Ь-10, 1Ь-10г, ΤNΕа1рНа апб ЕЬ-7 тКЫА 1еνе18 ш иУ-игаб1а!еб Нитап ккт ш νί\Ό. 1пГ1атта!1оп ЕекеагсН. 49(6): 290-6) наблюдается значительная индуцированная рибавирином цитотоксичность, но ее корректируют следующим образом. Предполагается, что уровень мРНК САРЭН, которая конститу
- 126 011547 тивно экспрессируется геном «хаускипинга», одинаков во всех жизнеспособных клетках. На основе измерений уровней мРНК САРЭН в клетках, обработанных ингибитором транскрипции активномицином Ό, известно, что время полужизни мРНК САРОН составляет только несколько часов (данные не показаны). Таким образом, допускается, как это делается другими авторами при использовании методики ТацМап® для определения уровней конкретных мРНК в клетках человека, что уровни мРНК САРЭН пропорциональны количеству жизнеспособных клеток (УСЫ) в любом данном образце, при этом зависимость имеет вид VСN = 2 (40-СГМРНК САРВН). Вычисляют VСN для каждой лунки образцов в анализе репликонов и затем делят число копий РНК репликона НСУ для конкретной лунки на VСN для данной лунки. После расчета указанное отношение используют вместо числа копий НСУ, чтобы рассчитать ингибирование («Среднее ингибирование с использованием отношения»; фиг. 14.А). Без внесения поправки в результаты анализа репликонов на указанную цитотоксичность, такая цитотоксичность регистрируется как ложно позитивное ингибирование накопления РНК репликона НСУ. В анализе репликонов предполагается, что измеренное ингибирование накопления РНК репликона НСУ представляет собой сумму действительного ингибирования накопления РНК репликона НСУ и кажущегося ингибирования накопления РНК репликона НСУ вследствие цитотоксичности. Кроме того, на основании близкой корреляции измерений цитотоксичности с помощью ХТТ и с помощью измерения мРНК САРОН в ТацМаи® предполагается, что ингибирование накопления мРНК САРОН, вызванное тестируемыми соединениями при анализе репликонов является надежной мерой кажущегося ингибирования накопления РНК-репликона НСУ вследствие цитотоксичности. Таким образом, истинную анти-НСУ-активность соединения в анализе репликонов, скорректированную на общую цитотоксичность, можно оценить путем деления количества молекул РНК-репликона НСУ, измеренного в каждом образце, на УСЫ, таким образом, нормализуя количество жизнеспособных клеток в каждом образце. На фиг. 14А показана оценка с использованием данного способа истинной анти-НСУ-активности рибавирина в анализе репликонов («среднее ингибирование с использованием отношения»). Оценка ГС50 для рибавирина лучше всего рассчитывается с использованием указанного способа. На фиг. 14А «среднее исходное ингибирование» показывает нескорректированную ГС50 для рибавирина, которая составляет примерно 80 мкМ, тогда как скорректированное значение ГС50, рассчитанное на основе кривой «среднее ингибирование с использованием отношения», составляет примерно 145 мкМ. Следует отметить, что различие между скорректированным и измеренным ингибированием накопления РНК-репликона НСУ в результате обработки интерфероном альфа-2В (фиг. 14В) незначительно, учитывая ~20% %СУ в анализе репликонов. Подобно интерферону альфа-2В ингибиторы сериновой протеазы НСУ, тестированные в данном примере, не проявляли значительной цитотоксичности при используемых концентрациях. Это определяли с использованием ХТТ-анализов, в которых значения ТС50 для разных соединений составляют: Си = 64,7 мкМ, ЕР > 10 мкМ и ЕС > 50 мкМ. Указанные значения ТС50 в 20-140 раз выше, чем значения ГС50, показанные в табл. 9. Таким образом, цитотоксичность указанных соединений не оказывает существенного влияния на накопление РНК НСУ в анализе репликонов в пределах точности анализа, так как указанная цитотоксичность имеет место только при концентрациях ингибитора сериновой протеазы НСУ значительно превышающих концентрации, тестированные при анализе репликонов.
Выводы, касающиеся эффективности ингибиторов сериновой протеазы НСУ и интерферонов отдельно и в комбинации
Анти-НСУ-активности описанных в данной заявке ингибиторов сериновой протеазы НСУ и различных интерферонов, используемых отдельно в анализе репликонов НСУ, показаны в столбцах и строках для отдельных экспериментов, составляющих табл. 8, в которых применяли только одно антивирусное средство. В табл. 9 перечислены значения ГС50, измеренные для каждого антивирусного соединения в том случае, когда их тестировали по отдельности. Приведенные выше результаты, полученные с применением анализа репликонов ш νίίΓΟ, также показали, что комбинированная обработка клеток, несущих репликон, ингибиторами сериновой протеазы НСУ согласно данному изобретению и различными интерферонами дает синергические антивирусные эффекты. Ожидается, что полученные эффекты в полной мере будут перенесены на эффективности т νίνο.
Комбинированная терапия с применением ингибиторов сериновой протеазы НСУ согласно данному изобретению имеет несколько основных преимуществ по сравнению с терапией отдельным лекарственным средством. Во-первых, при осуществлении лечения возможными более низкими дозами отдельных лекарственных средств, чем было бы возможно при отдельном использовании, можно ожидать снижения токсичности и побочных эффектов, связанных с лечением. Это особенно важно в случае терапии интерферонами, при которой побочные эффекты являются тяжелыми и, как было показано, пропорциональными дозе, вводимой пациентам. Приведенные выше результаты свидетельствуют о том, что дозу ингибитора сериновой протеазы НСУ, такого как СИ, на уровне ГС95 можно комбинировать с дозой интерферона альфа, например, на уровне ГС50, и в результате терапия будет намного более эффективной, чем можно достичь с одним ингибитором сериновой протеазы НСУ, без нежелательных побочных эффектов, вызванных высокими дозами интерферона альфа. Второе основное преимущество комбинированной терапии состоит в том, что поскольку два лекарственных средства действуют независимо, то меньше веро
- 127 011547 ятность развития мутантных штаммов НСУ, которые устойчивы к лечению. Развитие резистентности является основной заботой в случае РНК-вирусов, подобных НСУ. Вследствие высокой скорости их мутации такие вирусы могут быстро адаптироваться к окружающим стрессовым условиям. Третьим преимуществом комбинированной терапии может быть сниженная стоимость вследствие потребности в меньших количествах терапевтических средств, требуемых для эффективного лечения.
Дополнительные иммуностимуляторы, которые можно применять в способах, описанных в данной заявке, включают, например, альфа-интерферон 2А, интерферон-консенсус, интерферон !аи, интерферон + рибавирин (ребатрон), пэгилированный интерферон и промоторы экспрессии гена интерферона. Ожидается, что анти-НСУ-активность указанных соединений будет повышена при использовании в комбинации с ингибиторами сериновой протеазы НСУ, такими как ингибиторы, описанные в данной заявке. Так как известно, что интерфероны активны ίη νίνο и в анализе репликонов, ожидается, что данные ингибиторы сериновой протеазы НСУ будут также активными ίη νίνο, и что более важно, будут обладать способностью вызывать синергическую активность при использовании в комбинации с интерферонами, стимуляторами иммунной системы или другими соединениями, обладающими антивирусной активностью, направленной против НСУ, которые действуют по механизму, отличному от ингибирования сериновой протеазы НСУ.
В наилучшем способе терапии НСУ в настоящее время используют интерферон альфа и нуклеозидный аналог рибавирин. Указанная обработка эффективна только в небольшой степени и дает существенные побочные эффекты, которые снижают адаптационную способность пациента (СЬюшс ^ραίίΐίδ С: СиттеШ ЭЦеа^е МаиадетеШ, υ.8. ^еρа^ιтеηΐ ο Г НеаИЪ анб Нитаи 8еМсе§, Ναΐίοηαΐ БъШШех ο Г НеаИЪ, 1999). Кроме того, у пациентов с трансплантациями не ясно как работает комбинация рибавирининтерферон, и в действительности может работать хуже, чем один интерферон (СЬюшс Неρаί^ί^8 С: СиггеШ ЭЕеахе Маги-щетет υ.8. ^еρаΠтеиΐ οΓНеаИЪ авб Нитаи 8еМсе§, №11юг1а1 БъШШех οΓНеаИЪ, 1999).
Представленные выше результаты свидетельствуют о синергическом комбинированном действии в том случае, когда интерфероны используют с новым классом антивирусных средств против НСУ, ингибиторами сериновой протеазы согласно данному изобретению. Авторы вполне обоснованно ожидают, что описанные в данной заявке результаты ίη νίίτο приведут к более эффективному лечению пациентов с НСУ, чем возможно в настоящее время только с использованием одного интерферона. Субтерапевтические дозы интерферона смогут мобилизовать иммунную систему пациента для лучшей борьбы с вирусом, а ингибитор сериновой протеазы может атаковать непосредственно вирус, что обеспечит атаку на вирус по двум направлениям посредством разных механизмов действия. Таким образом, лечение НСУинфекции можно осуществлять при более низкой стоимости для пациента как с точки зрения пониженных побочных эффектов, так и более низкой оплаты необходимых фармацевтических средств, так как для эффективной антивирусной терапии, направленной против НСУ, обоих лекарственных средств потребуется меньше.
Данное изобретение может быть реализовано в других конкретных формах, не отходя от сути или его важных отличительных признаков.

Claims (34)

1. Соединение формулы
ВИ, или его фармацевтически приемлемая соль, или пролекарство, или сольват указанного соединения, его соли или пролекарства.
2. Соединение формулы или его фармацевтически приемлемая соль, или пролекарство, или сольват указанного соединения, его соли или пролекарства.
3. Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемое количество соединения по любому из пп.1 или 2 и фармацевтически приемлемый носитель.
4. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из пп.1 или 2, интерферон, обладающий противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, и фармацевтически прием
- 128 011547 лемый носитель.
5. Фармацевтическая композиция по п.4, дополнительно содержащая соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, где указанное соединение отлично от интерферона.
6. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из пп.1 или 2, соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, и фармацевтически приемлемый носитель, где указанное соединение отлично от интерферона.
7. Фармацевтическая композиция по п.5, где указанное соединение по любому из пп.1 или 2, указанный интерферон и указанное соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, каждый присутствует в количестве, выбранном из группы, включающей фармацевтически эффективное количество, субклиническое фармацевтически эффективное количество и их комбинацию.
8. Фармацевтическая композиция по п.7, где указанный интерферон выбирают из группы, включающей интерферон-альфа 2В, пэгилированный интерферон-альфа, согласованный интерферон, интерферон-альфа 2А, лимфобластоидный интерферон и интерферон !аи; и указанное соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, выбирают из группы, включающей интерлейкин 2, интерлейкин 6, интерлейкин 12, соединения, усиливающие развитие реакции типа 1 Тхелперных клеток, двунитевую РНК, двунитевую РНК, комплексно связанную с тобрамицином, имиквимод, рибавирин, ингибитор инозин-5'-монофосфатдегидрогеназы, амантадин и римантадин.
9. Применение соединения по п.1 или 2 для получения лекарственного средства для ингибирования протеазы НСУ.
10. Применение соединения по п.1 или 2 для получения лекарственного средства для лечения пациента, страдающего от инфекции, вызванной НСУ, или связанных с инфекцией физиологических состояний.
11. Применение соединения по п.1 или 2 в комбинации с фармацевтически эффективным количеством другого анти-НСУ терапевтического средства для получения лекарственного средства для лечения пациента, страдающего от инфекции, вызванной НСУ, или связанных с инфекцией физиологических состояний.
12. Применение по п.11, где анти-НСУ терапевтическим средством является интерферон или производное интерферона.
13. Применение соединения по п.1 или 2 в комбинации с интерфероном, обладающим противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, для получения лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызванной вирусом гепатита С, у нуждающегося в таком лечении пациента.
14. Применение соединения по п.1 или 2 в комбинации с соединением, обладающим противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, для получения лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызванной вирусом гепатита С, у нуждающегося в таком лечении пациента, где указанное соединение отлично от интерферона.
15. Применение по п.13, где указанное соединение по п.1 или 2 и указанный интерферон, каждый, присутствует в количестве, выбранном из группы, включающей фармацевтически эффективное количество, субклиническое фармацевтически эффективное количество и их комбинацию.
16. Применение по п.15, где указанный интерферон выбирают из группы, включающей интерферон-альфа 2В, пэгилированный интерферон-альфа, согласованный интерферон, интерферон-альфа 2А, лимфобластоидный интерферон и интерферон !аи.
17. Применение соединения по п.1 или 2 в комбинации с интерфероном, обладающим противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, и соединением, обладающим противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, для получения лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызванной вирусом гепатита С, у нуждающегося в таком лечении пациента, где указанное соединение отлично от интерферона.
18. Применение по п.17, где указанное соединение по п.1 или 2, указанный интерферон и указанное соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, каждый присутствует в количестве, выбранном из группы, включающей фармацевтически эффективное количество, субклиническое фармацевтически эффективное количество и их комбинацию.
19. Применение по п.18, где указанный интерферон выбирают из группы, включающей интерферон-альфа 2В, пэгилированный интерферон-альфа, согласованный интерферон, интерферон-альфа 2А, лимфобластоидный интерферон и интерферон !аи; и указанное соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, выбирают из группы, включающей интерлейкин 2, интерлейкин 6, интерлейкин 12, соединение, усиливающее развитие реакции типа 1 Т-хелперных клеток, двунитевую РНК, двунитевую РНК, комплексно связанную с тобрамицином, имиквимод, рибавирин, ингибитор инозин-5'-монофосфатдегидрогеназы, амантадин и римантадин.
20. Применение соединения по п.1 или 2 и интерферона, обладающего противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С для получения лекарственного средства для ингибирования репли
- 129 011547 кации вируса гепатита С в клетке.
21. Применение по п.20, где лекарственное средство дополнительно содержит соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, где указанное соединение отлично от интерферона.
22. Применение соединения по п.1 или 2 и соединения, обладающего противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, где указанное соединение отлично от интерферона, для получения лекарственного средства для ингибирования репликации вируса гепатита С в клетке.
23. Применение по п.21, где указанное соединение по п.1 или 2, указанный интерферон и указанное соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, каждый присутствует в количестве, выбранном из группы, включающей фармацевтически эффективное количество, субклиническое фармацевтически эффективное количество и их комбинацию.
24. Применение по п.23, где указанный интерферон выбирают из группы, включающей интерферон-альфа 2В, пэгилированный интерферон-альфа, согласованный интерферон, интерферон-альфа 2А, лимфобластоидный интерферон и интерферон !аи; и указанное соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, выбирают из группы, включающей интерлейкин 2, интерлейкин 6, интерлейкин 12, соединение, усиливающее развитие реакции типа 1 Т-хелперных клеток, двунитевую РНК, двунитевую РНК, комплексно связанную с тобрамицином, имиквимод, рибавирин, ингибитор инозин-5'-монофосфатдегидрогеназы, амантадин и римантадин.
25. Способ ингибирования репликации вируса гепатита С в клетке ίη νιΙΐΌ, включающий контактирование указанной клетки с соединением по п.1 или 2 и интерфероном, обладающим противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С.
26. Способ по п.25, дополнительно включающий контактирование указанной клетки с соединением, обладающим противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, где указанное соединение отлично от интерферона.
27. Способ ингибирования репликации вируса гепатита С в клетке ίη уйго, включающий контактирование указанной клетки с соединением по п.1 или 2 и соединением, обладающим противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, где указанное соединение отлично от интерферона.
28. Способ по п.26, где указанное соединение по п.1 или 2, указанный интерферон и указанное соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, каждый присутствует в количестве, выбранном из группы, включающей фармацевтически эффективное количество, субклиническое эффективное количество и их комбинацию.
29. Способ по п.28, где указанный интерферон выбирают из группы, включающей интерферональфа 2В, пэгилированный интерферон-альфа, согласованный интерферон, интерферон-альфа 2 А, лимфобластоидный интерферон и интерферон !аи; и указанное соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, выбирают из группы, включающей интерлейкин 2, интерлейкин 6, интерлейкин 12, соединение, усиливающее развитие реакции типа 1 Т-хелперных клеток, двунитевую РНК, двунитевую РНК, комплексно связанную с тобрамицином, имиквимод, рибавирин, ингибитор инозин-5'-монофосфатдегидрогеназы, амантадин и римантадин.
30. Набор, включающий ряд отдельных контейнеров, где по меньшей мере один из указанных контейнеров содержит ингибитор сериновой протеазы вируса гепатита С по п.1 или 2 и по меньшей мере еще один из указанных контейнеров содержит интерферон, обладающий противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С.
31. Набор, включающий ряд отдельных контейнеров, где по меньшей мере один из указанных контейнеров содержит ингибитор сериновой протеазы вируса гепатита С по п.1 или 2 и по меньшей мере еще один из указанных контейнеров содержит соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, где указанное соединение отлично от интерферона.
32. Набор, включающий ряд отдельных контейнеров, где по меньшей мере один из указанных контейнеров содержит ингибитор сериновой протеазы вируса гепатита С по п.1 или 2, по меньшей мере еще один из указанных контейнеров содержит интерферон, обладающий противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, и по меньшей мере еще один из указанных контейнеров содержит соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, где указанное соединение отлично от интерферона.
33. Набор по п.32, где указанный ингибитор сериновой протеазы вируса гепатита С, указанный интерферон и указанное соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, каждый присутствует в количестве, выбранном из группы, включающей фармацевтически эффективное количество, субклиническое фармацевтически эффективное количество и их комбинацию.
34. Набор по п.33, где указанный интерферон выбирают из группы, включающей интерферон-альфа 2В, пэгилированный интерферон-альфа, согласованный интерферон, интерферон-альфа 2 А, лимфобластоидный интерферон и интерферон !аи; и указанное соединение, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С, выбирают из группы, включающей интерлейкин 2, интерлейкин 6, интерлейкин 12, соединение, усиливающее развитие реакции типа 1 Т-хелперных клеток, двунитевую РНК, двунитевую РНК, комплексно связанную с тобрамицином, имиквимод, рибавирин, ингибитор ино-
EA200300318A 2000-08-31 2001-08-31 Пептидомиметические ингибиторы протеазы EA011547B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22939800P 2000-08-31 2000-08-31
US27764101P 2001-03-21 2001-03-21
PCT/US2001/026008 WO2002018369A2 (en) 2000-08-31 2001-08-31 Peptidomimetic protease inhibitors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200300318A1 EA200300318A1 (ru) 2004-02-26
EA011547B1 true EA011547B1 (ru) 2009-04-28

Family

ID=26923261

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200701869A EA017556B1 (ru) 2000-08-31 2001-08-31 Пептидомиметические ингибиторы протеазы
EA200300318A EA011547B1 (ru) 2000-08-31 2001-08-31 Пептидомиметические ингибиторы протеазы

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200701869A EA017556B1 (ru) 2000-08-31 2001-08-31 Пептидомиметические ингибиторы протеазы

Country Status (37)

Country Link
US (5) US7820671B2 (ru)
EP (9) EP2368877B1 (ru)
JP (4) JP4689938B2 (ru)
KR (10) KR20080104384A (ru)
CN (7) CN101696232A (ru)
AR (1) AR030591A1 (ru)
AT (2) ATE483686T1 (ru)
AU (2) AU2001288318B2 (ru)
BR (1) BR0113666A (ru)
CA (2) CA2419607C (ru)
CL (1) CL2010000330A1 (ru)
CY (2) CY1109216T1 (ru)
CZ (1) CZ2003595A3 (ru)
DE (4) DE60143233D1 (ru)
DK (2) DK1320540T5 (ru)
DZ (1) DZ3438A1 (ru)
EA (2) EA017556B1 (ru)
EC (2) ECSP034493A (ru)
ES (4) ES2325481T3 (ru)
HK (3) HK1163061A1 (ru)
HR (1) HRP20030139B8 (ru)
HU (1) HUP0300855A3 (ru)
IL (6) IL154671A0 (ru)
LU (1) LU91960I2 (ru)
MX (1) MXPA03001780A (ru)
NO (4) NO329929B1 (ru)
NZ (2) NZ541302A (ru)
PE (1) PE20020474A1 (ru)
PL (1) PL211019B1 (ru)
PT (1) PT1320540E (ru)
SI (1) SI1320540T1 (ru)
SK (1) SK2492003A3 (ru)
SV (1) SV2003000617A (ru)
TW (6) TWI359145B (ru)
UA (2) UA81600C2 (ru)
WO (1) WO2002018369A2 (ru)
ZA (1) ZA200301641B (ru)

Families Citing this family (237)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA001915B1 (ru) * 1996-10-18 2001-10-22 Вертекс Фармасьютикалз Инкорпорейтед Ингибиторы серин-протеаз, в частности ns3 протеазы вируса гепатита c (hvc)
US6608027B1 (en) 1999-04-06 2003-08-19 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd Macrocyclic peptides active against the hepatitis C virus
ES2240446T3 (es) * 2000-04-03 2005-10-16 Vertex Pharma Inhibidores de serina proteasas, particularmente la proteasa ns3 del virus de la hepatitis c.
MY164523A (en) 2000-05-23 2017-12-29 Univ Degli Studi Cagliari Methods and compositions for treating hepatitis c virus
CN1315862C (zh) 2000-05-26 2007-05-16 艾登尼科斯（开曼）有限公司 处理黄病毒和瘟病毒的方法和组合物
HUP0303358A3 (en) 2000-07-21 2005-10-28 Schering Corp Novel peptides as ns3-serine protease inhibitors of hepatitis c virus and pharmaceutical compositions containing them
KR100939155B1 (ko) 2000-07-21 2010-01-28 쉐링 코포레이션 Ｃ형 간염 바이러스의 ｎｓ3-세린 프로테아제 억제제로서의신규한 펩티드
US7244721B2 (en) 2000-07-21 2007-07-17 Schering Corporation Peptides as NS3-serine protease inhibitors of hepatitis C virus
SV2003000617A (es) * 2000-08-31 2003-01-13 Lilly Co Eli Inhibidores de la proteasa peptidomimetica ref. x-14912m
GB2368339B (en) 2000-10-26 2002-09-18 Yissum Res Dev Co Complex incorporating a plurality of antioxidants
CA2462163A1 (en) * 2001-10-24 2003-05-01 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of serine protease, particularly hepatitis c virus ns3-ns4a protease, incorporating a fused ring system
US7119072B2 (en) 2002-01-30 2006-10-10 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Macrocyclic peptides active against the hepatitis C virus
US7091184B2 (en) 2002-02-01 2006-08-15 Boehringer Ingelheim International Gmbh Hepatitis C inhibitor tri-peptides
US6642204B2 (en) 2002-02-01 2003-11-04 Boehringer Ingelheim International Gmbh Hepatitis C inhibitor tri-peptides
AU2003223602B8 (en) * 2002-04-11 2010-05-27 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of serine proteases, particularly hepatitis C virus NS3-NS4 protease
ES2361011T3 (es) * 2002-05-20 2011-06-13 Bristol-Myers Squibb Company Inhibidores del virus de la hepatitis c.
TW200500374A (en) 2002-06-28 2005-01-01 Idenlx Cayman Ltd 2' and 3' -nucleoside produrgs for treating flavivridae infections
US7608600B2 (en) 2002-06-28 2009-10-27 Idenix Pharmaceuticals, Inc. Modified 2′ and 3′-nucleoside prodrugs for treating Flaviviridae infections
WO2004026896A2 (en) * 2002-09-23 2004-04-01 Medivir Ab Hcv ns-3 serine protease inhibitors
US20050075279A1 (en) 2002-10-25 2005-04-07 Boehringer Ingelheim International Gmbh Macrocyclic peptides active against the hepatitis C virus
DE60331367D1 (de) 2002-12-30 2010-04-01 Angiotech Int Ag Wirkstofffreisetzung von schnell gelierender polymerzusammensetzung
AU2011203054B2 (en) * 2003-04-11 2012-04-26 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Inhibitors of Serine Proteases, Particularly HCV NS3-NS4A Protease
CN100453553C (zh) * 2003-04-11 2009-01-21 沃泰克斯药物股份有限公司 丝氨酸蛋白酶、特别是hcv ns3-ns4a蛋白酶的抑制剂
TW200510391A (en) * 2003-04-11 2005-03-16 Vertex Pharma Inhibitors of serine proteases, particularly HCV NS3-NS4A protease
DE602004010137T2 (de) 2003-05-21 2008-09-11 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Verbindungen als hepatitis c inhibitoren
SI2604620T1 (sl) 2003-05-30 2016-10-28 Gilead Pharmasset LLC c/o Gilead Sciences, Inc. Modificirani fluorirani nukleozidni analogi
CN102020700A (zh) 2003-07-18 2011-04-20 沃泰克斯药物股份有限公司 丝氨酸蛋白酶抑制剂、特别是hcv ns3-ns4a蛋白酶抑制剂
TW201127828A (en) 2003-09-05 2011-08-16 Vertex Pharma Inhibitors of serine proteases, particularly HCV NS3-NS4A protease
US20050120398A1 (en) * 2003-09-12 2005-06-02 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Animal model for HCV infection
WO2005028502A1 (en) 2003-09-18 2005-03-31 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Inhibitors of serine proteases, particularly hcv ns3-ns4a protease
CN1906208B (zh) * 2003-10-10 2011-03-30 沃泰克斯药物股份有限公司 丝氨酸蛋白酶、特别是hcv ns3-ns4a蛋白酶的抑制剂
RU2006115558A (ru) 2003-10-10 2007-11-20 Вертекс Фармасьютикалз Инкорпорейтед (Us) Ингибиторы сериновых протеаз, особенно hcv ns3-ns4a протеазы
EP1944042A1 (en) 2003-10-27 2008-07-16 Vertex Pharmceuticals Incorporated Combinations for HCV treatment
JP4890254B2 (ja) 2003-10-27 2012-03-07 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｈｃｖｎｓ３−ｎｓ４ａプロテアーゼ耐性突然変異体
DE602004018363D1 (de) * 2003-10-27 2009-01-22 Vertex Pharma Kombinationen für die hcv-behandlung
WO2005043118A2 (en) 2003-10-27 2005-05-12 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Drug discovery method
US7485625B2 (en) * 2003-12-11 2009-02-03 Schering Corporation Inhibitors of hepatitis C virus NS3/NS4a serine protease
ES2358333T3 (es) 2004-01-21 2011-05-09 Boehringer Ingelheim International Gmbh Péptidos macrocíclicos con acción contra el virus de la hepatitis c.
CA2554999A1 (en) * 2004-02-04 2005-08-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of serine proteases, particularly hcv ns3-ns4a protease
JP4745327B2 (ja) 2004-02-27 2011-08-10 シェーリング コーポレイション Ｃ型肝炎ウイルスｎｓ３プロテアーゼのインヒビター
TW200529822A (en) * 2004-02-27 2005-09-16 Schering Corp Novel ketoamides with cyclic p4's as inhibitors of ns3 serine protease of hepatitis c virus
ES2328589T3 (es) 2004-02-27 2009-11-16 Schering Corporation Compuestos de la prolina 3,4(ciclopentil) fusionados como inhibidores de la proteasa serina ns3 del virus de la hepatitis c.
KR101316137B1 (ko) * 2004-02-27 2013-10-10 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 Ｃ형 간염 바이러스 ｎｓ3 세린 프로테아제의 억제제로서의황 화합물
WO2005123076A2 (en) * 2004-06-08 2005-12-29 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions
CA2573346C (en) 2004-07-20 2011-09-20 Boehringer Ingelheim International Gmbh Hepatitis c inhibitor peptide analogs
UY29016A1 (es) 2004-07-20 2006-02-24 Boehringer Ingelheim Int Analogos de dipeptidos inhibidores de la hepatitis c
KR20070061570A (ko) * 2004-10-01 2007-06-13 버텍스 파마슈티칼스 인코포레이티드 Ｈｃｖ ｎｓ3-ｎｓ4ａ 프로테아제 저해
TW201424733A (zh) * 2004-10-29 2014-07-01 Vertex Pharma 劑量型式
CA2602175C (en) 2005-03-21 2012-11-27 Applera Corporation Alpha ketoamide compounds as cysteine protease inhibitors
US20070015803A1 (en) * 2005-04-12 2007-01-18 Romark Laboratories L.C. Methods for treating diseases through interruption of protein maturation, compounds that inhibit the function of molecular chaperones such as protein disulfide isomerases or interfere with glycosylation, pharmaceutical compositions comprising them, and screening methods for identifying therapeutic agents
KR20080016597A (ko) 2005-05-13 2008-02-21 바이로켐 파마 인코포레이티드 플라비바이러스 감염의 예방 또는 치료용 화합물 및 그의예방 또는 치료 방법
US20060276404A1 (en) * 2005-06-02 2006-12-07 Anima Ghosal Medicaments and methods combining a HCV protease inhibitor and an AKR competitor
BRPI0610737A2 (pt) 2005-06-02 2010-07-20 Schering Corp formulações farmacêuticas e métodos de tratamento usando as mesmas
NZ563361A (en) 2005-06-02 2011-02-25 Schering Corp HCV protease inhibitors in combination with food
WO2006130553A2 (en) * 2005-06-02 2006-12-07 Schering Corporation Hcv protease inhibitors
US7608592B2 (en) 2005-06-30 2009-10-27 Virobay, Inc. HCV inhibitors
AU2006274861B2 (en) 2005-07-29 2012-11-08 Medivir Ab Macrocyclic inhibitors of hepatitis C virus
PE20070210A1 (es) 2005-07-29 2007-04-16 Tibotec Pharm Ltd Compuestos macrociclicos como inhibidores del virus de hepatitis c
EP1919899B1 (en) 2005-07-29 2011-01-19 Tibotec Pharmaceuticals Macrocyclic inhibitors of hepatitis c virus
RU2437886C2 (ru) 2005-07-29 2011-12-27 Тиботек Фармасьютикалз Лтд. Макроциклические ингибиторы вируса гепатита с
PE20070211A1 (es) 2005-07-29 2007-05-12 Medivir Ab Compuestos macrociclicos como inhibidores del virus de hepatitis c
EP1913015B1 (en) 2005-07-29 2013-12-11 Janssen R&D Ireland Macrocyclic inhibitors of hepatitis c virus
JO2768B1 (en) 2005-07-29 2014-03-15 تيبوتيك فارماسيوتيكالز ليمتد Large cyclic inhibitors of hepatitis C virus
CN101282978B (zh) 2005-07-29 2012-07-11 泰博特克药品有限公司 丙型肝炎病毒的大环抑制剂
EP2402331A1 (en) 2005-08-02 2012-01-04 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of serine proteases
US8399615B2 (en) 2005-08-19 2013-03-19 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Processes and intermediates
PT1934179E (pt) * 2005-08-19 2010-07-12 Vertex Pharma PROCESSOS E INTERMEDIáRIOS
US7964624B1 (en) 2005-08-26 2011-06-21 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of serine proteases
AR055395A1 (es) 2005-08-26 2007-08-22 Vertex Pharma Compuestos inhibidores de la actividad de la serina proteasa ns3-ns4a del virus de la hepatitis c
NZ568324A (en) 2005-11-11 2012-01-12 Vertex Pharma Hepatitis C virus variants
US7705138B2 (en) 2005-11-11 2010-04-27 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Hepatitis C virus variants
JP3975226B2 (ja) * 2006-01-11 2007-09-12 生化学工業株式会社 シクロアルキルカルボニルアミノ酸誘導体及びその製造方法
CA2636765C (en) * 2006-01-11 2014-03-18 Seikagaku Corporation Cycloalkylcarbonylamino acid ester derivative and process for producing the same
JP4047365B2 (ja) * 2006-01-11 2008-02-13 生化学工業株式会社 シクロアルカンカルボキサミド誘導体及びその製造方法
WO2007083620A1 (ja) * 2006-01-20 2007-07-26 Kaneka Corporation β－アミノ－α－ヒドロキシ酸アミド誘導体の製造法
EP1991229A2 (en) 2006-02-27 2008-11-19 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Co-crystals and pharmaceutical compositions comprising the same
JP5646814B2 (ja) 2006-03-06 2014-12-24 アッヴィ・インコーポレイテッド Ｈｃｖを治療するためのリトナビルの組成物及び使用方法
NZ571280A (en) * 2006-03-16 2011-10-28 Vertex Pharma Deuterated hepatitis C protease inhibitors
JP5313124B2 (ja) * 2006-03-16 2013-10-09 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 立体的化合物を製造するための方法および中間体
AU2007226984B2 (en) 2006-03-20 2013-02-21 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Pharmaceutical compositions
EP1998759A2 (en) * 2006-03-23 2008-12-10 Schering Corporation Combinations of hcv protease inhibitor(s) and cyp3a4 inhibitor(s), and methods of treatment related thereto
WO2007120595A2 (en) * 2006-04-11 2007-10-25 Novartis Ag Amines for the treatment of hcv
MX2008013119A (es) 2006-04-11 2008-10-21 Novartis Ag Inhibidores de hcv/vih y sus usos.
AU2007253819B2 (en) 2006-05-23 2011-02-17 Irm Llc Compounds and compositions as channel activating protease inhibitors
DE102006059317A1 (de) 2006-07-04 2008-01-10 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von β-Amino-α-hydroxy-carbonsäureamiden
EP1886685A1 (en) 2006-08-11 2008-02-13 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods, uses and compositions for modulating replication of hcv through the farnesoid x receptor (fxr) activation or inhibition
US20120220520A1 (en) * 2006-10-17 2012-08-30 Van T Klooster Gerben Albert Eleutherius Bioavailable combinations for hcv treatment
PL2104674T3 (pl) 2006-11-15 2013-12-31 Vertex Pharmaceuticals Canada Incorporated Analogi tiofenu do leczenia lub zapobiegania zakażeniom flawiwirusowym
WO2008059046A1 (en) 2006-11-17 2008-05-22 Tibotec Pharmaceuticals Ltd. Macrocyclic inhibitors of hepatitis c virus
JP2010512317A (ja) * 2006-12-07 2010-04-22 シェーリング コーポレイション ｐＨ感受性マトリクス処方物
WO2008074035A1 (en) * 2006-12-27 2008-06-19 Abbott Laboratories Hcv protease inhibitors and uses thereof
WO2008095058A1 (en) * 2007-02-01 2008-08-07 Taigen Biotechnology Co. Ltd. Hcv protease inhibitors
CN101641349A (zh) 2007-02-08 2010-02-03 泰博特克药品有限公司 嘧啶取代的大环抑制剂
EA016327B1 (ru) 2007-02-09 2012-04-30 Айрм Ллк Соединения и композиции в качестве ингибиторов протеазы, активирующей каналы
NZ579295A (en) 2007-02-27 2012-03-30 Vertex Pharma Inhibitors of serine proteases
AU2008219607B2 (en) * 2007-02-27 2013-09-12 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Co-crystals and pharmaceutical compositions comprising the same
US20080255038A1 (en) * 2007-04-11 2008-10-16 Samuel Earl Hopkins Pharmaceutical compositions
CA2686051A1 (en) 2007-05-04 2008-11-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Combination therapy for the treatment of hcv infection
NZ583652A (en) * 2007-08-03 2012-06-29 Biotron Ltd Hepatitis c antiviral compositions and methods
ATE530546T1 (de) * 2007-08-30 2011-11-15 Vertex Pharma Kokristalle und pharmazeutische zusammensetzungen damit
AU2008301981A1 (en) 2007-09-14 2009-03-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Method of treating hepatitis C patients
US20090082366A1 (en) * 2007-09-26 2009-03-26 Protia, Llc Deuterium-enriched telaprevir
WO2009047264A1 (en) 2007-10-10 2009-04-16 Novartis Ag Spiropyrrolidines and their use against hcv and hiv infection
US8106059B2 (en) 2007-10-24 2012-01-31 Virobay, Inc. Substituted pyrazines that inhibit protease cathepsin S and HCV replication
WO2009055335A2 (en) * 2007-10-25 2009-04-30 Taigen Biotechnology Co., Ltd. Hcv protease inhibitors
BRPI0821836A2 (pt) 2007-12-24 2015-06-16 Tibotec Pharm Ltd Indóis macrocíclicos como inibidores do vírus da hepatite c
DE102008009761A1 (de) 2008-02-19 2009-08-27 Bayer Materialscience Ag Verfahren zur Herstellung von Isocyanaten
EP2101173A1 (en) 2008-03-14 2009-09-16 Vivalis In vitro method to determine whether a drug candidate active against a target protein is active against a variant of said protein
CN101580535B (zh) * 2008-05-16 2012-10-03 太景生物科技股份有限公司 丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂
KR20110048509A (ko) 2008-06-24 2011-05-11 코덱시스, 인코포레이티드 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 융합 이환식 프롤린 화합물의 제조를 위한 생체촉매 공정
US8569337B2 (en) 2008-07-23 2013-10-29 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Tri-cyclic pyrazolopyridine kinase inhibitors
WO2010014744A1 (en) * 2008-07-29 2010-02-04 The Scripps Research Institute Inhibitors of hepatitis c virus infection
US8188137B2 (en) 2008-08-15 2012-05-29 Avila Therapeutics, Inc. HCV protease inhibitors and uses thereof
US8865756B2 (en) 2008-12-03 2014-10-21 Presidio Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of HCV NS5A
WO2010065674A1 (en) 2008-12-03 2010-06-10 Presidio Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of hcv ns5a
GB0900914D0 (en) 2009-01-20 2009-03-04 Angeletti P Ist Richerche Bio Antiviral agents
WO2010093843A2 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Hcv combination therapies
MX2011010132A (es) 2009-03-27 2011-10-14 Presidio Pharmaceuticals Inc Inhibidores de anillo fusionado de hepatitis c.
US8512690B2 (en) 2009-04-10 2013-08-20 Novartis Ag Derivatised proline containing peptide compounds as protease inhibitors
US20110182850A1 (en) 2009-04-10 2011-07-28 Trixi Brandl Organic compounds and their uses
US20100324059A1 (en) 2009-06-23 2010-12-23 Gilead Sciences, Inc. Pharmaceutical compositions useful for treating hcv
HUE030402T2 (en) 2009-09-15 2017-05-29 Taigen Biotechnology Co Ltd HCV protease inhibitors
TWI404269B (zh) * 2009-09-18 2013-08-01 Advanced Connectek Inc High speed plug connector
UA108211C2 (ru) 2009-11-04 2015-04-10 Янссен Рід Айрленд Бензимидазолимидазольные производные
EP2504329A1 (en) 2009-11-25 2012-10-03 Vertex Pharmaceuticals Incorporated 5-alkynyl-thiophene-2-carboxylic acid derivatives and their use for the treatment or prevention of flavivirus infections
MX2012006877A (es) * 2009-12-18 2012-08-31 Idenix Pharmaceuticals Inc Inhibidores de virus de hepatitis c de arileno o heteroarileno 5, 5 - fusionado.
MX2012007420A (es) 2009-12-24 2012-07-23 Vertex Pharma Analogos para el tratamiento o prevencion de infecciones de flavivirus.
US20110178107A1 (en) * 2010-01-20 2011-07-21 Taigen Biotechnology Co., Ltd. Hcv protease inhibitors
US8653025B2 (en) 2010-01-27 2014-02-18 AB Pharma Ltd. Polyheterocyclic compounds highly potent as HCV inhibitors
JP2013518124A (ja) 2010-01-29 2013-05-20 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｃ型肝炎ウイルス感染の処置のための治療法
WO2011112516A1 (en) 2010-03-08 2011-09-15 Ico Therapeutics Inc. Treating and preventing hepatitis c virus infection using c-raf kinase antisense oligonucleotides
JP2013522377A (ja) 2010-03-24 2013-06-13 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド フラビウイルス感染を処置または予防するためのアナログ
MX2012010918A (es) 2010-03-24 2013-01-18 Vertex Pharma Analogos para el tratamiento o prevencion de infecciones por flavivirus.
EP2550262A1 (en) 2010-03-24 2013-01-30 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Analogues for the treatment or prevention of flavivirus infections
EP2550268A1 (en) 2010-03-24 2013-01-30 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Analogues for the treatment or prevention of flavivirus infections
US8680071B2 (en) 2010-04-01 2014-03-25 Idenix Pharmaceuticals, Inc. Compounds and pharmaceutical compositions for the treatment of viral infections
CA2800509A1 (en) 2010-05-24 2011-12-01 Presidio Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of hcv ns5a
KR20130082137A (ko) 2010-06-03 2013-07-18 버텍스 파마슈티칼스 인코포레이티드 방법 및 중간체
WO2011156545A1 (en) 2010-06-09 2011-12-15 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Viral dynamic model for hcv combination therapy
WO2011159826A2 (en) 2010-06-15 2011-12-22 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Hcv ns5b protease mutants
WO2012006070A1 (en) 2010-06-28 2012-01-12 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compounds and methods for the treatment or prevention of flavivirus infections
MX2012014918A (es) 2010-06-28 2013-04-08 Vertex Pharma Compuestos y metodos para tratamiento o prevencion de infecciones por flavivirus.
JP2013531011A (ja) 2010-06-28 2013-08-01 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド フラビウイルス感染の処置または予防のための化合物および方法
EP2593105A1 (en) 2010-07-14 2013-05-22 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Palatable pharmaceutical composition comprising vx-950
WO2012020036A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Hepatitis c virus inhibitors
MX2013001869A (es) 2010-08-17 2013-06-28 Vertex Pharma Compuestos y metodos para el tratamiento o prevencion de infecciones virales por flaviviridae.
CN103209987B (zh) 2010-09-22 2017-06-06 艾丽奥斯生物制药有限公司 取代的核苷酸类似物
AU2011311880B2 (en) 2010-10-08 2014-07-24 Novartis Ag Vitamin E formulations of sulfamide NS3 inhibitors
CA2815416A1 (en) 2010-10-21 2012-04-26 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Biomarkers for hcv infected patients
NZ609564A (en) 2010-10-26 2015-06-26 Presidio Pharmaceuticals Inc Inhibitors of hepatitis c virus
WO2012109646A1 (en) 2011-02-11 2012-08-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Treatment of hcv in hiv infection patients
WO2012107589A1 (en) 2011-02-11 2012-08-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment and prevention of hcv infections
WO2012123298A1 (en) 2011-03-11 2012-09-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Antiviral compounds
JP2014514295A (ja) 2011-03-31 2014-06-19 アイディニックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ウイルス感染の治療のための化合物および薬学的組成物
WO2012151319A1 (en) 2011-05-02 2012-11-08 Virobay, Inc. Cathepsin inhibitors for the treatment of bone cancer and bone cancer pain
EP2707347A1 (en) 2011-05-13 2014-03-19 Vertex Pharmaceuticals Inc. Processes and intermediates
CA2857705A1 (en) 2011-06-16 2012-12-20 AB Pharma Ltd. Macrocyclic heterocyclic compounds for inhibiting hepatitis c virus and preparation and use thereof
CN103732242A (zh) 2011-06-23 2014-04-16 迪格纳生物技术公司 用与IFN-α2b组合的IFN-α5在患者群体中治疗慢性丙型肝炎
US20120328565A1 (en) 2011-06-24 2012-12-27 Brinkman John A Antiviral compounds
AR087345A1 (es) 2011-07-26 2014-03-19 Vertex Pharma Metodos para la preparacion de compuestos de tiofeno
WO2013016499A1 (en) 2011-07-26 2013-01-31 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Methods for preparation of thiophene compounds
JP2014526474A (ja) 2011-09-12 2014-10-06 アイディニックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ウイルス感染の治療のための化合物および薬学的組成物
CA2850003C (en) 2011-09-27 2020-01-07 Kansas State University Research Foundation Broad-spectrum antivirals against 3c or 3c-like proteases of picornavirus-like supercluster: picornaviruses, caliciviruses and coronaviruses
JP5808496B2 (ja) 2011-10-10 2015-11-10 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 抗ウイルス化合物
HUE034857T2 (en) 2011-10-14 2018-03-28 Bristol Myers Squibb Co Substituted tetrahydroisoquinoline compounds are inhibitors of factor XIA
ES2579832T3 (es) 2011-10-14 2016-08-17 Bristol-Myers Squibb Company Compuestos de tetrahidroisoquinolina sustituida como inhibidores del factor XIa
ES2699226T3 (es) 2011-10-14 2019-02-08 Bristol Myers Squibb Co Compuestos de tetrahidroisoquinolina sustituidos como inhibidores del factor XIa
DE202012013117U1 (de) 2011-10-21 2015-01-16 Abbvie Inc. Kombinationsbehandlung (z.B. mit ABT-072 oder ABT-333 von DAAs zur Verwendung in der Behandlung von HCV)
DE112012003510T5 (de) 2011-10-21 2015-03-19 Abbvie Inc. Verfahren zur Behandlung von HCV umfassend mindestens zwei direkt wirkende antivirale Wirkstoffe, Ribavirin aber nicht Interferon
US8466159B2 (en) 2011-10-21 2013-06-18 Abbvie Inc. Methods for treating HCV
US8492386B2 (en) * 2011-10-21 2013-07-23 Abbvie Inc. Methods for treating HCV
KR20140104030A (ko) 2011-12-16 2014-08-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 Hcv ns5a의 억제제
MX350809B (es) 2011-12-20 2017-09-20 Riboscience Llc Derivados nucleósidos con sustitución 2',4'-difluoro-2'-metilo como inhibidores de la replicación del arn del vhc.
MX350810B (es) 2011-12-20 2017-09-20 Riboscience Llc Derivados de los nucleosidos sustituidos en 4 '-azido, 3 '-fluoro como inhibidores de la replicacion del rna del vhc.
CN104203940B (zh) 2011-12-28 2017-01-18 爱尔兰詹森科学公司 作为hcv抑制剂的杂双环衍生物
WO2013116339A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Vertex Pharmaceuticals Incorporated High potency formulations of vx-950
ITMI20120192A1 (it) 2012-02-13 2013-08-14 Dipharma Francis Srl Procedimento per la preparazione di un inibitore delle proteasi virali e suoi intermedi
CA2864669A1 (en) * 2012-02-16 2013-08-22 Rqx Pharmaceuticals, Inc. Linear peptide antibiotics
CN104185624B (zh) 2012-02-24 2016-10-12 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗病毒化合物
ITMI20120359A1 (it) 2012-03-07 2013-09-08 Dipharma Francis Srl Procedimento per la preparazione di intermedi utili nella preparazione di un inibitore delle proteasi virali
WO2013136265A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Dipharma Francis S.R.L. Synthesis of an intermediate of an antiviral compound
ITMI20120391A1 (it) * 2012-03-13 2013-09-14 Dipharma Francis Srl Procedimento per la sintesi di un intermedio ciclopropilammidico utile nella preparazione di un inibitore delle proteasi virali
CN104321333A (zh) 2012-03-21 2015-01-28 沃泰克斯药物股份有限公司 硫代氨基磷酸酯核苷酸前药的固体形式
NZ630805A (en) 2012-03-22 2016-01-29 Alios Biopharma Inc Pharmaceutical combinations comprising a thionucleotide analog
EP2844249A4 (en) 2012-05-02 2016-03-09 Univ Kansas State MACROCYCLIC AND PEPTIDOMIMETIC COMPOUNDS AS VIRUZIDES AGAINST 3C OR 3C LIKE PROTEASES OF PICORNIVERS, CALICIVIRES AND CORONA VIRUSES
ITMI20120800A1 (it) * 2012-05-10 2013-11-11 Dipharma Francis Srl Procedimento per la preparazione di un intermedio utile nella preparazione di un inibitore delle proteasi virali
CN103450066B (zh) * 2012-05-30 2017-03-15 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 特拉匹韦中间体的制备方法
AR091192A1 (es) 2012-05-30 2015-01-21 Chemo Iberica Sa Procedimiento multicomponente para la preparacion de compuestos biciclicos
US20140010783A1 (en) 2012-07-06 2014-01-09 Hoffmann-La Roche Inc. Antiviral compounds
WO2014015217A1 (en) 2012-07-19 2014-01-23 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Biomarkers for hcv infected patients
WO2014033667A1 (en) 2012-08-30 2014-03-06 Ranbaxy Laboratories Limited Process for the preparation of telaprevir
WO2014045263A2 (en) * 2012-09-24 2014-03-27 Dr. Reddy's Laboratories Limited Process for preparation of intermediates of telaprevir
EP2906552B1 (en) 2012-10-12 2017-11-22 Bristol-Myers Squibb Company Guanidine substituted tetrahydroisoquinoline compounds as factor xia inhibitors
EP2906541B1 (en) 2012-10-12 2017-11-22 Bristol-Myers Squibb Company Guanidine and amine substituted tetrahydroisoquinoline compounds as factor xia inhibitors
TR201807316T4 (tr) 2012-10-12 2018-06-21 Squibb Bristol Myers Co Bir faktör XIa inhibitörünün kristalli formları.
EP2912047B1 (en) 2012-10-29 2016-08-24 Cipla Limited Antiviral phosphonate analogues and process for preparation thereof
ITMI20122036A1 (it) 2012-11-29 2014-05-30 Dipharma Francis Srl Sintesi di un intermedio di un composto antivirale
WO2014096374A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Sandoz Ag Process for the synthesis of pyrrolidines and pyrroles
BR112015017414A2 (pt) 2013-01-23 2017-07-11 Hoffmann La Roche derivados de triazol antivirais
CN103113288B (zh) * 2013-02-04 2015-05-20 苏州永健生物医药有限公司 一种八氢环戊烯并[c]吡咯羧酸衍生物的合成方法
US20150065439A1 (en) 2013-02-28 2015-03-05 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Pharmaceutical compositions
KR20150114566A (ko) 2013-03-05 2015-10-12 에프. 호프만-라 로슈 아게 항바이러스 화합물
ES2712699T3 (es) 2013-03-25 2019-05-14 Bristol Myers Squibb Co Tetrahidroisoquinolinas que contienen azoles sustituidos como inhibidores del factor XIa
ITMI20130706A1 (it) 2013-04-30 2014-10-31 Dipharma Francis Srl Procedimento per la preparazione di un inibitore delle proteasi virali e suoi intermedi
US20180200280A1 (en) 2013-05-16 2018-07-19 Riboscience Llc 4'-Fluoro-2'-Methyl Substituted Nucleoside Derivatives as Inhibitors of HCV RNA Replication
NZ714927A (en) 2013-05-16 2020-09-25 Riboscience Llc 4’-fluoro-2’-methyl substituted nucleoside derivatives
WO2014193663A1 (en) 2013-05-16 2014-12-04 Riboscience Llc 4'-azido, 3'-deoxy-3'-fluoro substituted nucleoside derivatives
CN104163851B (zh) * 2013-05-20 2019-03-05 湘北威尔曼制药股份有限公司 氟代的α-羰基类HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂
CN103288671B (zh) * 2013-06-20 2014-10-29 上海步越化工科技有限公司 一种(3s)-3-氨基-n-环丙基-2-羟基己酰胺盐酸盐的合成方法
WO2014203224A1 (en) 2013-06-21 2014-12-24 Ranbaxy Laboratories Limited Process for the preparation of telaprevir and its intermediates
WO2014203208A1 (en) 2013-06-21 2014-12-24 Ranbaxy Laboratories Limited Process for the preparation of telaprevir and intermediates thereof
CN104292146B (zh) * 2013-06-24 2017-04-26 上海医药工业研究院 特拉匹韦中间体及其制备方法
CN104558106B (zh) * 2013-10-19 2019-12-10 广东东阳光药业有限公司 一种治疗丙肝药物的制备方法
CN104610272B (zh) * 2013-11-05 2017-03-29 上海唐润医药科技有限公司 环状黄酮或异黄酮类化合物及其用途
EP2899207A1 (en) 2014-01-28 2015-07-29 Amikana.Biologics New method for testing HCV protease inhibition
NO2760821T3 (ru) 2014-01-31 2018-03-10
MY190429A (en) 2014-01-31 2022-04-21 Bristol Myers Squibb Co Macrocycles with hetrocyclic p2' groups as factor xia inhibitors
CN104926712B (zh) * 2014-03-20 2018-03-23 上海医药工业研究院 合成特拉匹韦的中间体及其制备方法
CN104926831A (zh) * 2014-03-20 2015-09-23 上海医药工业研究院 合成特拉匹韦的中间体及其制备方法
AU2014400642B2 (en) 2014-07-07 2018-01-04 Halliburton Energy Services, Inc. Downhole tools comprising aqueous-degradable sealing elements
JP6526796B2 (ja) 2014-09-04 2019-06-05 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｆｘｉａ阻害剤であるジアミドマクロ環
US9453018B2 (en) 2014-10-01 2016-09-27 Bristol-Myers Squibb Company Pyrimidinones as factor XIa inhibitors
CN108699105A (zh) 2016-03-04 2018-10-23 豪夫迈·罗氏有限公司 作为htra1抑制剂的新型二氟酮酰胺衍生物
JP2019513698A (ja) 2016-03-04 2019-05-30 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｈｔｒａ１阻害剤としての新規なトリフルオロメチルプロパンアミド誘導体
CN109689063A (zh) 2016-04-28 2019-04-26 埃默里大学 含有炔烃的核苷酸和核苷治疗组合物及其相关用途
EP3472149B1 (en) 2016-06-21 2023-08-30 Orion Ophthalmology LLC Heterocyclic prolinamide derivatives
WO2017222914A1 (en) 2016-06-21 2017-12-28 Inception 4, Inc. Carbocyclic prolinamide derivatives
JP7076438B2 (ja) 2016-06-21 2022-05-27 オリオン・オフサルモロジー・エルエルシー 脂肪族プロリンアミド誘導体
CN109661389A (zh) * 2016-08-23 2019-04-19 豪夫迈·罗氏有限公司 作为htra1抑制剂的新型二氟酮酰胺衍生物
EP3684374A4 (en) 2017-09-21 2021-06-16 Riboscience LLC 4'-FLUORO-2'-METHYL SUBSTITUTE NUCLEOSIDE DERIVATIVES USED AS HCV RNA REPLICATION INHIBITORS
CN109337537B (zh) * 2018-09-26 2022-10-25 河北晨阳工贸集团有限公司 一种起重机专用单组分水性面漆及其制备方法
CN110668538B (zh) * 2019-09-20 2021-10-22 济南大学 一种聚合氯化钛的制备方法
CN114057702B (zh) * 2020-07-31 2022-09-30 四川大学 一种新型冠状病毒主蛋白酶的抑制剂及其制备方法和用途
CN115960088A (zh) * 2020-07-31 2023-04-14 四川大学 一种新型冠状病毒主蛋白酶的抑制剂及其制备方法和用途
WO2023149981A1 (en) * 2022-02-07 2023-08-10 Purdue Research Foundation Compounds for the treatment of sars
CN114703003B (zh) * 2022-04-14 2023-04-28 上海绿晟环保科技有限公司 一种负载碳量子点的纳米材料润滑添加剂及其制备方法
CN115417790A (zh) * 2022-10-09 2022-12-02 山东大学 一类新型偶氮类发泡剂及合成方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4880780A (en) * 1985-06-07 1989-11-14 Ici Americas Inc. Selected difluoro derivatives
US5371072A (en) * 1992-10-16 1994-12-06 Corvas International, Inc. Asp-Pro-Arg α-keto-amide enzyme inhibitors
JPH09124691A (ja) * 1995-08-25 1997-05-13 Green Cross Corp:The ペプチド化合物およびそれを含有する医薬組成物
US5656600A (en) * 1993-03-25 1997-08-12 Corvas International, Inc. α-ketoamide derivatives as inhibitors of thrombosis
WO1998017679A1 (en) * 1996-10-18 1998-04-30 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of serine proteases, particularly hepatitis c virus ns3 protease
WO1999007734A2 (en) * 1997-08-11 1999-02-18 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Hepatitis c inhibitor peptide analogues
WO1999007733A2 (en) * 1997-08-11 1999-02-18 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Hepatitis c inhibitor peptides
WO2000009558A1 (en) * 1998-08-10 2000-02-24 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Hepatitis c inhibitor peptides
WO2000009543A2 (en) * 1998-08-10 2000-02-24 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Hepatitis c inhibitor tri-peptides

Family Cites Families (154)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3719667A (en) 1970-08-24 1973-03-06 Lilly Co Eli Epimerization of 6-acylamido and 6-imido penicillin sulfoxide esters
US3840556A (en) 1971-05-28 1974-10-08 Lilly Co Eli Penicillin conversion by halogen electrophiles and anti-bacterials derived thereby
DE3226768A1 (de) 1981-11-05 1983-05-26 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Derivate der cis, endo-2-azabicyclo-(3.3.0)-octan-3-carbonsaeure, verfahren zu ihrer herstellung, diese enthaltende mittel und deren verwendung
DE3211676A1 (de) 1982-03-30 1983-10-06 Hoechst Ag Neue derivate von cycloalka (c) pyrrol-carbonsaeuren, verfahren zu ihrer herstellung, diese enthaltende mittel und deren verwendung sowie neue cycloalka (c) pyrrol-carbonsaeuren als zwischenstufen und verfahren zu deren herstellung
US4499082A (en) 1983-12-05 1985-02-12 E. I. Du Pont De Nemours And Company α-Aminoboronic acid peptides
FR2570695A1 (fr) * 1984-09-27 1986-03-28 Synthelabo Diphenylazomethines a chaine ramifiee ou cyclique, leur preparation et leur application en therapeutique
FR2575753B1 (fr) 1985-01-07 1987-02-20 Adir Nouveaux derives peptidiques a structure polycyclique azotee, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
US5496927A (en) 1985-02-04 1996-03-05 Merrell Pharmaceuticals Inc. Peptidase inhibitors
US4835168A (en) 1985-12-16 1989-05-30 Eli Lilly And Company Thiadiazole antiviral agents
US5231084A (en) 1986-03-27 1993-07-27 Hoechst Aktiengesellschaft Compounds having a cognition adjuvant action, agents containing them, and the use thereof for the treatment and prophylaxis of cognitive dysfuncitons
US5736520A (en) 1988-10-07 1998-04-07 Merrell Pharmaceuticals Inc. Peptidase inhibitors
NZ235155A (en) 1989-09-11 1993-04-28 Merrell Dow Pharma Peptidase substrates in which the carboxy terminal group has been replaced by a tricarbonyl radical
ES2150933T3 (es) 1992-12-22 2000-12-16 Lilly Co Eli Inhibidores de la proteasa vih utiles para el tratamiento del sida.
JP2637847B2 (ja) 1992-12-29 1997-08-06 アボツト・ラボラトリーズ レトロウィルス蛋白分解酵素を阻害する化合物
US5384410A (en) 1993-03-24 1995-01-24 The Du Pont Merck Pharmaceutical Company Removal of boronic acid protecting groups by transesterification
US5672582A (en) 1993-04-30 1997-09-30 Merck & Co., Inc. Thrombin inhibitors
IL110752A (en) 1993-09-13 2000-07-26 Abbott Lab Liquid semi-solid or solid pharmaceutical composition for an HIV protease inhibitor
US5559158A (en) 1993-10-01 1996-09-24 Abbott Laboratories Pharmaceutical composition
US5468858A (en) 1993-10-28 1995-11-21 The Board Of Regents Of Oklahoma State University Physical Sciences N-alkyl and n-acyl derivatives of 3,7-diazabicyclo-[3.3.1]nonanes and selected salts thereof as multi-class antiarrhythmic agents
IL111991A (en) 1994-01-28 2000-07-26 Abbott Lab Liquid pharmaceutical composition of HIV protease inhibitors in organic solvent
RU95104898A (ru) 1994-03-31 1996-12-27 Бристоль-Мейерз Сквибб Компани (US) Имидазолсодержащие ингибиторы фарнезид-протеинтрансферазы, способ лечения связанных с ней заболеваний
US6420522B1 (en) 1995-06-05 2002-07-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme
US5847135A (en) 1994-06-17 1998-12-08 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme
US5716929A (en) 1994-06-17 1998-02-10 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme
US5756466A (en) 1994-06-17 1998-05-26 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme
US5861267A (en) 1995-05-01 1999-01-19 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Methods, nucleotide sequences and host cells for assaying exogenous and endogenous protease activity
US6037157A (en) 1995-06-29 2000-03-14 Abbott Laboratories Method for improving pharmacokinetics
JP2000500760A (ja) 1995-11-23 2000-01-25 メルク シヤープ エンド ドーム リミテツド スピロピペリジン誘導体およびタキキニン拮抗薬としてのその使用
US5807876A (en) 1996-04-23 1998-09-15 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of IMPDH enzyme
US6054472A (en) 1996-04-23 2000-04-25 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Inhibitors of IMPDH enzyme
ZA972195B (en) 1996-03-15 1998-09-14 Du Pont Merck Pharma Spirocycle integrin inhibitors
TR199802136T2 (xx) 1996-04-23 2001-06-21 Vertex Pharmaceuticals Incorporated �MPDH enzimi inhibit�rleri olarak �re t�revleri.
US6127422A (en) 1996-05-06 2000-10-03 Eli Lilly And Company Anti-viral method
US5990276A (en) 1996-05-10 1999-11-23 Schering Corporation Synthetic inhibitors of hepatitis C virus NS3 protease
WO1997043310A1 (en) 1996-05-10 1997-11-20 Schering Corporation Synthetic inhibitors of hepatitis c virus ns3 protease
CN1218479A (zh) 1996-05-17 1999-06-02 咨询卡有限公司 可固化的表面涂层组合物及其使用方法
EP0913389A4 (en) * 1996-06-28 2000-02-02 Nippon Chemiphar Co CYCLOPROPYLGLYCINE DERIVATIVES AND AGONISTS OF THE L-GLUTAMATE RECEPTOR TYPE OF METABOLITE REGULATION
US6245919B1 (en) * 1996-06-28 2001-06-12 Haruhiko Shinozaki Cyclopropylglycine derivatives and agonists for metabotronic L-glutamate receptors
US6153579A (en) 1996-09-12 2000-11-28 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Crystallizable compositions comprising a hepatitis C virus NS3 protease domain/NS4A complex
EP0929554B1 (en) 1996-09-25 2006-03-15 MERCK SHARP &amp; DOHME LTD. Spiro-azacyclic derivatives, their preparation and their use as tachykinin antagonists
JP2001502316A (ja) 1996-10-08 2001-02-20 コロラド ステート ユニバーシティ リサーチ ファンデーション 触媒不斉エポキシ化
GB9623908D0 (en) 1996-11-18 1997-01-08 Hoffmann La Roche Amino acid derivatives
DE19648011A1 (de) 1996-11-20 1998-05-28 Bayer Ag Cyclische Imine
AU6701598A (en) 1997-03-14 1998-09-29 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of impdh enzyme
GB9707659D0 (en) 1997-04-16 1997-06-04 Peptide Therapeutics Ltd Hepatitis C NS3 Protease inhibitors
GB9708484D0 (en) 1997-04-25 1997-06-18 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
GB9711114D0 (en) 1997-05-29 1997-07-23 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
US6767991B1 (en) 1997-08-11 2004-07-27 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Hepatitis C inhibitor peptides
US6183121B1 (en) 1997-08-14 2001-02-06 Vertex Pharmaceuticals Inc. Hepatitis C virus helicase crystals and coordinates that define helicase binding pockets
US20040058982A1 (en) 1999-02-17 2004-03-25 Bioavailability System, Llc Pharmaceutical compositions
US20020017295A1 (en) 2000-07-07 2002-02-14 Weers Jeffry G. Phospholipid-based powders for inhalation
US6211338B1 (en) 1997-11-28 2001-04-03 Schering Corporation Single-chain recombinant complexes of hepatitis C virus NS3 protease and NS4A cofactor peptide
JP4690545B2 (ja) 1998-03-31 2011-06-01 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド セリンプロテアーゼ、特にｃ型肝炎ウイルスｎｓ３プロテアーゼの阻害因子
US6518305B1 (en) * 1998-04-23 2003-02-11 Abbott Laboratories Five-membered carbocyclic and heterocyclic inhibitors of neuraminidases
US6251583B1 (en) 1998-04-27 2001-06-26 Schering Corporation Peptide substrates for HCV NS3 protease assays
GB9812523D0 (en) 1998-06-10 1998-08-05 Angeletti P Ist Richerche Bio Peptide inhibitors of hepatitis c virus ns3 protease
DE19836514A1 (de) 1998-08-12 2000-02-17 Univ Stuttgart Modifikation von Engineeringpolymeren mit N-basischen Gruppe und mit Ionenaustauschergruppen in der Seitenkette
US6117639A (en) 1998-08-31 2000-09-12 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Fusion proteins, DNA molecules, vectors, and host cells useful for measuring protease activity
US6025516A (en) 1998-10-14 2000-02-15 Chiragene, Inc. Resolution of 2-hydroxy-3-amino-3-phenylpropionamide and its conversion to C-13 sidechain of taxanes
EP1027885B1 (en) 1999-02-09 2008-07-09 Pfizer Products Inc. Basic drug compositions with enhanced bioavailability
US20020042046A1 (en) 1999-02-25 2002-04-11 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Crystallizable compositions comprising a hepatitis C virus NS3 protease domain/NS4A complex
EE200100492A (et) 1999-03-19 2002-12-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Ensüümi IMPDH inhibiitorid
US6608027B1 (en) 1999-04-06 2003-08-19 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd Macrocyclic peptides active against the hepatitis C virus
US7122627B2 (en) 1999-07-26 2006-10-17 Bristol-Myers Squibb Company Lactam inhibitors of Hepatitis C virus NS3 protease
US20020183249A1 (en) 1999-08-31 2002-12-05 Taylor Neil R. Method of identifying inhibitors of CDC25
AU2055301A (en) 1999-12-03 2001-06-12 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Alpha-ketoamide inhibitors of hepatitis c virus ns3 protease
US6365380B2 (en) * 2000-02-23 2002-04-02 Pcbu Services, Inc. Method for stereoselectively inverting a chiral center of a chemical compound using an enzyme and a metal catalyst
US6699855B2 (en) 2000-02-29 2004-03-02 Bristol-Myers Squibb Company Inhibitors of hepatitis C virus NS3 protease
ES2240446T3 (es) 2000-04-03 2005-10-16 Vertex Pharma Inhibidores de serina proteasas, particularmente la proteasa ns3 del virus de la hepatitis c.
WO2001077113A2 (en) 2000-04-05 2001-10-18 Schering Corporation Macrocyclic ns3-serine protease inhibitors of hepatitis c virus comprising n-cyclic p2 moieties
CN1935833A (zh) 2000-04-19 2007-03-28 先灵公司 含有烷基和芳基丙氨酸p2部分的丙型肝炎病毒的大环ns3－丝氨酸蛋白酶抑制剂
AU2001267886A1 (en) 2000-06-30 2002-01-14 Seikagaku Corporation Epoxycarboxylic acid amides, azides and amino alcohols and processes for preparation of alpha-keto amides by using them
AR034127A1 (es) 2000-07-21 2004-02-04 Schering Corp Imidazolidinonas como inhibidores de ns3-serina proteasa del virus de hepatitis c, composicion farmaceutica, un metodo para su preparacion, y el uso de las mismas para la manufactura de un medicamento
US7244721B2 (en) 2000-07-21 2007-07-17 Schering Corporation Peptides as NS3-serine protease inhibitors of hepatitis C virus
KR100939155B1 (ko) 2000-07-21 2010-01-28 쉐링 코포레이션 Ｃ형 간염 바이러스의 ｎｓ3-세린 프로테아제 억제제로서의신규한 펩티드
HUP0303358A3 (en) 2000-07-21 2005-10-28 Schering Corp Novel peptides as ns3-serine protease inhibitors of hepatitis c virus and pharmaceutical compositions containing them
AR029851A1 (es) 2000-07-21 2003-07-16 Dendreon Corp Nuevos peptidos como inhibidores de ns3-serina proteasa del virus de hepatitis c
JP2004504407A (ja) 2000-07-21 2004-02-12 コルバス・インターナショナル・インコーポレイテッド Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３−セリンプロテアーゼ阻害剤としての新規ペプチド
US6777400B2 (en) 2000-08-05 2004-08-17 Smithkline Beecham Corporation Anti-inflammatory androstane derivative compositions
SV2003000617A (es) * 2000-08-31 2003-01-13 Lilly Co Eli Inhibidores de la proteasa peptidomimetica ref. x-14912m
US6939692B2 (en) 2000-09-12 2005-09-06 Degussa Ag Nucleotide sequences coding for the pknB gene
US6846806B2 (en) 2000-10-23 2005-01-25 Bristol-Myers Squibb Company Peptide inhibitors of Hepatitis C virus NS3 protein
HUP0500456A3 (en) 2000-11-20 2012-05-02 Bristol Myers Squibb Co Hepatitis c tripeptide inhibitors, pharmaceutical compositions comprising thereof and their use
EP1343807B1 (en) 2000-12-12 2009-04-29 Schering Corporation Diaryl peptides as ns3-serine protease inhibitors of hepatits c virus
US6727366B2 (en) 2000-12-13 2004-04-27 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Imidazolidinones and their related derivatives as hepatitis C virus NS3 protease inhibitors
US6653295B2 (en) 2000-12-13 2003-11-25 Bristol-Myers Squibb Company Inhibitors of hepatitis C virus NS3 protease
SK286630B6 (sk) 2001-01-22 2009-02-05 Merck & Co., Inc. Nukleozidové deriváty, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie
GB0102342D0 (en) 2001-01-30 2001-03-14 Smithkline Beecham Plc Pharmaceutical formulation
US20020187488A1 (en) 2001-01-30 2002-12-12 Chao Lin Quantitative assay for nucleic acids
ES2328466T3 (es) 2001-03-27 2009-11-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Composiciones y metodos utiles para la infeccion por hcv.
GB0107924D0 (en) 2001-03-29 2001-05-23 Angeletti P Ist Richerche Bio Inhibitor of hepatitis C virus NS3 protease
CA2450545A1 (en) 2001-07-03 2003-01-16 Altana Pharma Ag Process for the production of 3-phenylisoserine
WO2003006490A1 (en) 2001-07-11 2003-01-23 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Bridged bicyclic serine protease inhibitors
US7029561B2 (en) 2001-07-25 2006-04-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Commerce Fluidic temperature gradient focusing
JP2003055389A (ja) 2001-08-09 2003-02-26 Univ Tokyo 錯体及びそれを用いたエポキシドの製法
US6824769B2 (en) 2001-08-28 2004-11-30 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Optimal compositions and methods thereof for treating HCV infections
CA2462163A1 (en) 2001-10-24 2003-05-01 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of serine protease, particularly hepatitis c virus ns3-ns4a protease, incorporating a fused ring system
HUP0501067A2 (en) 2001-11-14 2006-02-28 Teva Pharma Amorphous and crystalline forms of losartan potassium and process for their preparation
CA2369711A1 (en) 2002-01-30 2003-07-30 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Macrocyclic peptides active against the hepatitis c virus
CA2369970A1 (en) 2002-02-01 2003-08-01 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Hepatitis c inhibitor tri-peptides
US6642204B2 (en) 2002-02-01 2003-11-04 Boehringer Ingelheim International Gmbh Hepatitis C inhibitor tri-peptides
US7091184B2 (en) 2002-02-01 2006-08-15 Boehringer Ingelheim International Gmbh Hepatitis C inhibitor tri-peptides
AR038375A1 (es) 2002-02-01 2005-01-12 Pfizer Prod Inc Composiciones farmaceuticas de inhibidores de la proteina de transferencia de esteres de colesterilo
AU2003223602B8 (en) 2002-04-11 2010-05-27 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of serine proteases, particularly hepatitis C virus NS3-NS4 protease
MXPA05001298A (es) 2002-08-01 2005-11-04 Pharmasset Inc Compuestos con el sistema biciclo[4.2.1] nonano para el tratamiento de infecciones por flaviviridae.
US20050075279A1 (en) 2002-10-25 2005-04-07 Boehringer Ingelheim International Gmbh Macrocyclic peptides active against the hepatitis C virus
CA2413705A1 (en) 2002-12-06 2004-06-06 Raul Altman Use of meloxicam in combination with an antiplatelet agent for treatment of acute coronary syndrome and related conditions
US7601709B2 (en) 2003-02-07 2009-10-13 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Macrocyclic hepatitis C serine protease inhibitors
US7098231B2 (en) 2003-01-22 2006-08-29 Boehringer Ingelheim International Gmbh Viral polymerase inhibitors
US7223785B2 (en) 2003-01-22 2007-05-29 Boehringer Ingelheim International Gmbh Viral polymerase inhibitors
US20040180815A1 (en) 2003-03-07 2004-09-16 Suanne Nakajima Pyridazinonyl macrocyclic hepatitis C serine protease inhibitors
JP2006517960A (ja) 2003-02-18 2006-08-03 ファイザー インコーポレイテッド Ｃ型肝炎ウイルスの阻害剤、それを使用する組成物および治療法
EP1601685A1 (en) 2003-03-05 2005-12-07 Boehringer Ingelheim International GmbH Hepatitis c inhibiting compounds
DE602004029866D1 (de) 2003-03-05 2010-12-16 Boehringer Ingelheim Pharma Peptidanaloga mit inhibitorischer wirkung auf hepatitis c
TW200510391A (en) 2003-04-11 2005-03-16 Vertex Pharma Inhibitors of serine proteases, particularly HCV NS3-NS4A protease
CN100453553C (zh) 2003-04-11 2009-01-21 沃泰克斯药物股份有限公司 丝氨酸蛋白酶、特别是hcv ns3-ns4a蛋白酶的抑制剂
DE602004010137T2 (de) 2003-05-21 2008-09-11 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Verbindungen als hepatitis c inhibitoren
CN102020700A (zh) 2003-07-18 2011-04-20 沃泰克斯药物股份有限公司 丝氨酸蛋白酶抑制剂、特别是hcv ns3-ns4a蛋白酶抑制剂
WO2005018330A1 (en) 2003-08-18 2005-03-03 Pharmasset, Inc. Dosing regimen for flaviviridae therapy
TW201127828A (en) 2003-09-05 2011-08-16 Vertex Pharma Inhibitors of serine proteases, particularly HCV NS3-NS4A protease
US20050120398A1 (en) 2003-09-12 2005-06-02 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Animal model for HCV infection
WO2005028502A1 (en) 2003-09-18 2005-03-31 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Inhibitors of serine proteases, particularly hcv ns3-ns4a protease
US6933760B2 (en) 2003-09-19 2005-08-23 Intel Corporation Reference voltage generator for hysteresis circuit
PE20050431A1 (es) 2003-09-22 2005-07-19 Boehringer Ingelheim Int Peptidos macrociclicos activos contra el virus de la hepatitis c
RU2006115558A (ru) 2003-10-10 2007-11-20 Вертекс Фармасьютикалз Инкорпорейтед (Us) Ингибиторы сериновых протеаз, особенно hcv ns3-ns4a протеазы
AR045870A1 (es) 2003-10-11 2005-11-16 Vertex Pharma Terapia de combinacion para la infeccion de virus de hepatitis c
WO2005043118A2 (en) 2003-10-27 2005-05-12 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Drug discovery method
DE602004018363D1 (de) 2003-10-27 2009-01-22 Vertex Pharma Kombinationen für die hcv-behandlung
JP4890254B2 (ja) 2003-10-27 2012-03-07 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｈｃｖｎｓ３−ｎｓ４ａプロテアーゼ耐性突然変異体
CN1894211A (zh) 2003-10-28 2007-01-10 沃泰克斯药物股份有限公司 借助费歇尔－芬克型合成和随后的酰化制备4,5－二烷基－3－酰基－吡咯－2－羧酸衍生物
US20050119318A1 (en) 2003-10-31 2005-06-02 Hudyma Thomas W. Inhibitors of HCV replication
US7132504B2 (en) 2003-11-12 2006-11-07 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
CA2547787A1 (en) 2003-12-01 2005-06-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions comprising fetal liver cells and methods useful for hcv infection
ES2358333T3 (es) 2004-01-21 2011-05-09 Boehringer Ingelheim International Gmbh Péptidos macrocíclicos con acción contra el virus de la hepatitis c.
CA2554999A1 (en) 2004-02-04 2005-08-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of serine proteases, particularly hcv ns3-ns4a protease
UA86962C2 (en) 2004-02-20 2009-06-10 Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх Viral polymerase inhibitors
US20050187192A1 (en) 2004-02-20 2005-08-25 Kucera Pharmaceutical Company Phospholipids for the treatment of infection by togaviruses, herpes viruses and coronaviruses
ES2328589T3 (es) 2004-02-27 2009-11-16 Schering Corporation Compuestos de la prolina 3,4(ciclopentil) fusionados como inhibidores de la proteasa serina ns3 del virus de la hepatitis c.
CA2843066C (en) 2004-03-12 2016-06-07 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Processes and intermediates for the preparation of aspartic acetal caspase inhibitors
WO2005107745A1 (en) 2004-05-06 2005-11-17 Schering Corporation An inhibitor of hepatitis c
WO2005123076A2 (en) 2004-06-08 2005-12-29 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions
US7550559B2 (en) 2004-08-27 2009-06-23 Schering Corporation Acylsulfonamide compounds as inhibitors of hepatitis C virus NS3 serine protease
US7863274B2 (en) 2005-07-29 2011-01-04 Concert Pharmaceuticals Inc. Deuterium enriched analogues of tadalafil as PDE5 inhibitors
EP2402331A1 (en) 2005-08-02 2012-01-04 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of serine proteases
PT1934179E (pt) 2005-08-19 2010-07-12 Vertex Pharma PROCESSOS E INTERMEDIáRIOS
AR055395A1 (es) 2005-08-26 2007-08-22 Vertex Pharma Compuestos inhibidores de la actividad de la serina proteasa ns3-ns4a del virus de la hepatitis c
US7705138B2 (en) 2005-11-11 2010-04-27 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Hepatitis C virus variants
EP1991229A2 (en) 2006-02-27 2008-11-19 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Co-crystals and pharmaceutical compositions comprising the same
JP5313124B2 (ja) 2006-03-16 2013-10-09 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 立体的化合物を製造するための方法および中間体
NZ571280A (en) 2006-03-16 2011-10-28 Vertex Pharma Deuterated hepatitis C protease inhibitors
AU2007226984B2 (en) 2006-03-20 2013-02-21 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Pharmaceutical compositions
AU2007226983A1 (en) 2006-03-20 2007-09-27 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Pharmaceutical compositions
CA2653625A1 (en) 2006-05-31 2007-12-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Controlled release formulations
NZ579295A (en) 2007-02-27 2012-03-30 Vertex Pharma Inhibitors of serine proteases

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4880780A (en) * 1985-06-07 1989-11-14 Ici Americas Inc. Selected difluoro derivatives
US5371072A (en) * 1992-10-16 1994-12-06 Corvas International, Inc. Asp-Pro-Arg α-keto-amide enzyme inhibitors
US5656600A (en) * 1993-03-25 1997-08-12 Corvas International, Inc. α-ketoamide derivatives as inhibitors of thrombosis
JPH09124691A (ja) * 1995-08-25 1997-05-13 Green Cross Corp:The ペプチド化合物およびそれを含有する医薬組成物
WO1998017679A1 (en) * 1996-10-18 1998-04-30 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of serine proteases, particularly hepatitis c virus ns3 protease
WO1999007734A2 (en) * 1997-08-11 1999-02-18 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Hepatitis c inhibitor peptide analogues
WO1999007733A2 (en) * 1997-08-11 1999-02-18 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Hepatitis c inhibitor peptides
WO2000009558A1 (en) * 1998-08-10 2000-02-24 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Hepatitis c inhibitor peptides
WO2000009543A2 (en) * 1998-08-10 2000-02-24 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Hepatitis c inhibitor tri-peptides

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BERGMEIER S.C. ET AL.: "Synthesis of Bicyclic Proline Analogs Using a Formal '3 + 2! Intramolecular Aziridine-Allylsilane Cycloaddition Reaction" TETRAHEDRON, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM, NL, vol. 55, no. 26, 25 June 1999 (1999-06-25), pages 8025-8038, XP004168571 ISSN: 0040-4020 examples 2,41 *
BLANKLEY C.J. ET AL.: "Synthesis and Structure-Activity Relationships of Potent New Angiotensin Converting Enzyme Inhibitors Containing saturated Bicyclic Ami no Acids" JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 30, 1987, pages 992-998, XP001061648 examples 16-18; tables I, II *
COLLADO I. ET AL.: "Stereocontrolled Synthesis of 4-Substituted (+/-) Kainic Adds" JOURNAL OF ROGANIC CHEMISTRY, vol. 63, 1998, pages 1995-2001, XP002190871 examples 5-7,9-12 *
ESCH P.M. ET AL.: "Reductive Cyclization of Carbon-Centered Glycine Radicals; A Novel Synthetic Route to Cyclic alpha-Ami no Acids" TETRAHEDRON, vol. 48, no. 22, 1992, pages 4659-4676, XP001061646 examples 31A,,31B; table 1 *
PATENT ABSTRACTS OF JAPAN vol. 1997, no. 09, 30 September 1997 (1997-09-30) & JP 09 124691 A (GREEN CROSS CORP:THE), 13 May 1997 (1997-05-13) abstract *
UDDING J.H. ET AL.: "Transition Metal-Catalyzed Chlorine Transfer Cyclizations of Carbon-Centered Glycine Radicals; A Novel Synthetic Route to Cyclic alpha-Amino Acids" TETRAHEDRON, 1994, pages 1907-1918, XP001061645 examples 13A, 13B, 14A, 14B; table 1 *
YASUDA M. ET AL.: "Synthesis of Conformationally Defined Glutamic Acid Analogues from Readily Available Diels-Alder Adducts" CHEMICAL AND PHARMACEUTICAL BULLETIN, 1995, pages 1318-1324, XP001061647 example 2 *

Also Published As

Publication number Publication date
CY2012007I2 (el) 2014-07-02
EP1320540B9 (en) 2012-03-21
ES2450815T3 (es) 2014-03-25
EP2368878A1 (en) 2011-09-28
WO2002018369A2 (en) 2002-03-07
US20100137583A1 (en) 2010-06-03
PL365836A1 (en) 2005-01-10
DK1320540T5 (da) 2012-05-29
EP1849797A2 (en) 2007-10-31
CN101693672A (zh) 2010-04-14
PE20020474A1 (es) 2002-06-18
CA2697205C (en) 2014-07-29
EA017556B1 (ru) 2013-01-30
NZ569670A (en) 2010-03-26
BR0113666A (pt) 2005-09-27
TW201022244A (en) 2010-06-16
TW201022243A (en) 2010-06-16
KR20080007515A (ko) 2008-01-21
US8529882B2 (en) 2013-09-10
CN101633636B (zh) 2013-03-13
US20140294763A1 (en) 2014-10-02
ATE431358T1 (de) 2009-05-15
UA81600C2 (en) 2008-01-25
US7820671B2 (en) 2010-10-26
KR20030041981A (ko) 2003-05-27
KR20100043293A (ko) 2010-04-28
CN100522991C (zh) 2009-08-05
HK1114090A1 (en) 2008-10-24
EP1320540A2 (en) 2003-06-25
EA200300318A1 (ru) 2004-02-26
TWI319763B (en) 2010-01-21
IL215892A0 (en) 2011-12-29
KR20090120013A (ko) 2009-11-23
TW201022242A (en) 2010-06-16
NO20030928D0 (no) 2003-02-27
IL215890A0 (en) 2011-12-29
KR20080104384A (ko) 2008-12-02
UA99895C2 (ru) 2012-10-25
TW201022241A (en) 2010-06-16
US20120282219A1 (en) 2012-11-08
DE20122915U1 (de) 2010-04-08
CN101693672B (zh) 2014-11-12
ECSP034493A (es) 2003-04-25
CY1109216T1 (el) 2014-07-02
HUP0300855A3 (en) 2012-01-30
WO2002018369A8 (en) 2003-11-06
KR20080104382A (ko) 2008-12-02
JP4689938B2 (ja) 2011-06-01
JP2004517047A (ja) 2004-06-10
JP2012197289A (ja) 2012-10-18
IL215891A (en) 2015-04-30
ES2325481T9 (es) 2012-07-10
MXPA03001780A (es) 2003-06-04
CN101696232A (zh) 2010-04-21
IL185644A0 (en) 2008-01-06
ATE483686T1 (de) 2010-10-15
CN103232381A (zh) 2013-08-07
AR030591A1 (es) 2003-08-27
EP1849797A3 (en) 2008-01-23
CN1869061B (zh) 2013-04-24
CA2697205A1 (en) 2002-03-07
HK1057758A1 (en) 2004-04-16
TWI378927B (en) 2012-12-11
EP1876173A1 (en) 2008-01-09
EP1878720B1 (en) 2010-10-06
NO329929B1 (no) 2011-01-24
NO2012006I2 (no) 2012-04-03
EP1958956B1 (en) 2013-12-11
KR20080104383A (ko) 2008-12-02
EA200701869A1 (ru) 2008-02-28
ES2352804T3 (es) 2011-02-23
KR100945975B1 (ko) 2010-03-09
US20050197299A1 (en) 2005-09-08
CA2419607C (en) 2012-03-13
HRP20030139A2 (en) 2005-04-30
TWI359144B (en) 2012-03-01
NO20100093L (no) 2003-04-16
ZA200301641B (en) 2004-06-21
HRP20030139B1 (hr) 2015-08-28
AU2001288318C1 (en) 2002-03-13
HUP0300855A2 (hu) 2003-10-28
ECSP077217A (es) 2007-04-26
SK2492003A3 (en) 2004-11-03
CN1869061A (zh) 2006-11-29
TWI339661B (en) 2011-04-01
KR100876472B1 (ko) 2008-12-31
KR20080096718A (ko) 2008-10-31
CN101633636A (zh) 2010-01-27
IL215892A (en) 2015-03-31
TW200918523A (en) 2009-05-01
EP1958956A3 (en) 2008-09-24
HK1163061A1 (en) 2012-09-07
DE60138717D1 (de) 2009-06-25
EP2368877A1 (en) 2011-09-28
IL215891A0 (en) 2011-12-29
CN1451014A (zh) 2003-10-22
AU8831801A (en) 2002-03-13
NO330807B1 (no) 2011-07-18
DZ3438A1 (fr) 2002-03-07
PL211019B1 (pl) 2012-03-30
EP2368877B1 (en) 2014-05-07
PT1320540E (pt) 2009-07-14
ES2325481T3 (es) 2009-09-07
EP1878720A1 (en) 2008-01-16
CY2012007I1 (el) 2014-07-02
EP2371839A1 (en) 2011-10-05
NZ541302A (en) 2007-04-27
KR20110088600A (ko) 2011-08-03
NO20100999L (no) 2003-04-16
EP2368901A1 (en) 2011-09-28
SV2003000617A (es) 2003-01-13
KR20100042296A (ko) 2010-04-23
DE122012000015I1 (de) 2012-05-24
EP1320540B1 (en) 2009-05-13
LU91960I2 (fr) 2012-05-21
KR100968295B1 (ko) 2010-07-07
ES2489115T3 (es) 2014-09-01
SI1320540T1 (sl) 2009-10-31
AU2001288318B2 (en) 2007-09-06
NO20030928L (no) 2003-04-16
DK1878720T3 (da) 2011-01-24
WO2002018369A3 (en) 2002-08-15
CN102504014A (zh) 2012-06-20
EP1958956A2 (en) 2008-08-20
IL154671A (en) 2011-11-30
CL2010000330A1 (es) 2010-09-21
TWI359145B (en) 2012-03-01
DE60143233D1 (de) 2010-11-18
NO2012006I1 (no) 2012-04-30
JP2011079835A (ja) 2011-04-21
CA2419607A1 (en) 2002-03-07
JP2007284444A (ja) 2007-11-01
US20120064034A1 (en) 2012-03-15
CZ2003595A3 (cs) 2003-06-18
IL154671A0 (en) 2003-09-17
HRP20030139B8 (hr) 2015-11-06
DK1320540T3 (da) 2009-07-27
US8252923B2 (en) 2012-08-28
JP5269035B2 (ja) 2013-08-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA011547B1 (ru) Пептидомиметические ингибиторы протеазы
AU2012201015B2 (en) Peptidomimetic protease inhibitors
AU2007240156A1 (en) Peptidomimetic protease inhibitors

Legal Events

Date Code Title Description
ND4A Extension of term of a eurasian patent
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): KG TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ MD RU

TK4A Corrections in published eurasian patents