PL211019B1 - Związek peptydomimetyczny, kompozycje farmaceutyczne i zestawy lub opakowania farmaceutyczne zawierające ten związek oraz zastosowanie tego związku do wytwarzania leku - Google Patents

Związek peptydomimetyczny, kompozycje farmaceutyczne i zestawy lub opakowania farmaceutyczne zawierające ten związek oraz zastosowanie tego związku do wytwarzania leku

Info

Publication number
PL211019B1
PL211019B1 PL365836A PL36583601A PL211019B1 PL 211019 B1 PL211019 B1 PL 211019B1 PL 365836 A PL365836 A PL 365836A PL 36583601 A PL36583601 A PL 36583601A PL 211019 B1 PL211019 B1 PL 211019B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
interferon
compound
hepatitis
activity
hcv
Prior art date
Application number
PL365836A
Other languages
English (en)
Other versions
PL365836A1 (pl
Inventor
Robert Ewdard Babine
Shu Hui Chen
Jason Eric Lamar
Nancy June Snyder
Xicheng David Sun
Mark Joseph Tebbe
Frantz Victor
Q. May Wang
Yvonne Yee Mai Yip
Ivan Collado
Cristina Garcia-Paredes
Raymond Samuel Parker Iii
Ling Jin
Deqi Guo
John Irvin Glass
Original Assignee
Vertex Pharmaceuticals
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26923261&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL211019(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Vertex Pharmaceuticals filed Critical Vertex Pharmaceuticals
Publication of PL365836A1 publication Critical patent/PL365836A1/pl
Publication of PL211019B1 publication Critical patent/PL211019B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/02—Linear peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/212—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/215—IFN-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/52—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring condensed with a ring other than six-membered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0202—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-X-X-C(=0)-, X being an optionally substituted carbon atom or a heteroatom, e.g. beta-amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0205—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-(X)3-C(=0)-, e.g. statine or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C07K5/06052—Val-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0808—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/101—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A61K38/095—Oxytocins; Vasopressins; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest związek peptydomimetyczny, kompozycje farmaceutyczne i zestawy lub opakowania farmaceutyczne zawierające ten związek. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie związków peptydomimetycznych do wytwarzania leku do inhibitowania proteazy serynowej wirusa zapalenia wątroby typu C (NS3 HCV), do leczenia lub zapobiegania infekcji wirusem zapalenia wątroby typu C oraz do hamowania replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C w komórce.
Infekcja HCV jest trudnym, ludzkim, medycznym problemem i jest obecnie uważana za czynnik sprawczy większości przypadków zapalenia wątroby nie-A, nie-B.
Uważa się, że 3% światowej populacji jest przewlekle zainfekowana HCV [A. Alberti i in., Natural History of Hepatitis C, J. Hepatology, 31, (Suppl. 1), 17-24 (1999)]. W samych Stanach Zjednoczonych Ameryki zakres infekcji wynosi 1,8% lub 3,9 miliona ludzi [M. J. Alter, Hepatitis C Virus Infection in the United States, J. Hepatology, 31, (Suppl. 1), 88-91 (1999)]. Ze wszystkich pacjentów zainfekowanych ponad 70% doznaje przewlekłej infekcji, która jest uważana za główną przyczynę marskości wątroby i raka wątrobowokomórkowego. [D. Lavanchy, Global Surveillance and Control of Hepatitis C, J. Viral Hepatitis, 6, 35-47 (1999)].
Replikacja HCV obejmuje genomowe kodowanie polibiałka z 3010-3033 aminokwasów [Q.-L. Choo, i in., Genetic Organization and Diversity of the Hepatitis C Virus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2451-2455 (1991); N. Kato i in., Molecular Cloning of the Human Hepatitis C Virus Genome From Japanese Patients with Non-A, Non-B Hepatitis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9524-9528 (1990); A. Takamizawa i in., Structure and Organization of the Hepatitis C Virus Genome Isolated From Human Carriers, J. Virol., 65, 1105-1113 (1991)]. Sądzi się, że niestrukturalne (NS) białka HCV dostarczają zasadniczej katalitycznej maszynerii dla replikacji wirusa. Białka NS pochodzą z proteolitycznego rozcięcia polibiałka [R. Bartenschlager i in., Nonstructural Protein 3 of the Hepatitis C Virus Encodes a Serine-Type Proteinase Required for Cleavage at the NS3/4 i NS4/5 Junctions, J. Virol., 67, 3835-3844 (1993); A. Grakoui i in., Characterization of the Hepatitis C Virus-Encoded Serine Proteinase: Determination of Proteinase-Dependent Polyprotein Cleavage Sites, J. Virol., 67, 2832-2843 (1993); A. Grakoui i in., Expression and Identification of Hepatitis C Virus Polyprotein Cleavage Products, J. Virol., 67, 1385-1395 (1993); L. Tomei i in., NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis C virus polyprotein, J. Virol., 67, 4017-4026 (1993)]. W istocie, okazało się, że 181 pierwszych aminokwasów NS3 (reszty 1027-1207 wirusowego polibiałka) zawiera domenę proteazy serynowej NS3, która przetwarza wszystkie cztery miejsca w dół polibiałka HCV [C. Lin i in., Hepatitis C Virus NS3 Serine Proteinase: Trans-Cleavage Requirements and Processing Kinetics, J. Virol., 68, 8147-8157 (1994)].
Białko NS 3 (NS3) HCV zawiera aktywność proteazy serynowej, która pomaga w przetwarzaniu większości wirusowych enzymów, a więc jest uważane za zasadnicze dla wirusowej replikacji i infekcyjności. Samoistność proteazy NS3 wynikała z faktu, że mutacje w proteazie NS3 wirusa żółtej febry zmniejszają infekcyjność wirusową [T. J. Chambers i in., Evidence that the N-terminal Domain of Nonstructural Protein NS3 From Yellow Fever Virus is a Serine Protease Responsible for Site-Specific Cleavages in the Viral Polyprotein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 8898-8902 (1990)]. Ostatnio wykazano, że mutacje w aktywnym miejscu proteazy NS3 HCV mogą zupełnie zablokować infekcję HCV w modelu szympansa [C. M. Rice i in., Hepatitis C virus-encoded enzymatic activities and conserved RNA elements in the 3'-nontranslated region are essential for virus replication in vivo, J. Virol., 74 (4) 2046-51 (2000)]. Proteaza serynowa NS3 HCV jest również uważana za zasadniczą dla replikacji wirusa, ponieważ ona i jej związany kofaktor, NS4A, pomagają w przetwarzaniu wszystkich wirusowych enzymów. Takie przetwarzanie okazuje się analogiczne do prowadzonego przez proteazę aspartylową ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV). Ponadto, pokazane zastosowanie inhibitora proteazy HIV jako silnego antywirusowego środka dla ludzi wykazuje, że przerywanie etapu przetwarzania proteazy białkowej w cyklu życiowym wirusa nie daje terapeutycznie czynnych środków. Dzięki temu enzym proteaza jest atrakcyjnym celem badania leków.
Opisano kilka potencjalnych inhibitorów proteazy HCV. Publikacje PCT nr WO 00/09558, WO
00/09543, WO 99/64442, WO 99/07733, WO 99/07734, WO 99/50230, WO 98/46630, WO 98/17679 i WO 97/43310, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5990276, M. Llinas-Brunet i in., Bioorg. Med. Chem. Lett., 8, 1713-1718 (1998), W. Han i in., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, 711-713 (2000), R. Dunsdon i in., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, 1571-1579 (2000), M. Llinas-Brunet i in., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, 2267-2270 (2000), i S. LaPlante i in., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, 2271PL 211 019 B1
-2274 (2000) opisują potencjalne inhibitory proteazy NS3 HCV. Niestety, nie ma inhibitorów proteazy serynowej dostępnych obecnie jako środki przeciw HCV.
W rzeczywistości, nie ma terapii przeciw HCV poza interferonem-a, kombinacją interferonu-a/rybawiryną i ostatnio pegylowanym interferonem-α. Jednakże, szybkości przedłużonej reakcji dla terapii interferonem-a i interferonem-a/rybawiryną są dość niskie (< 50%), a skutki uboczne wykazywane przez terapie są raczej znaczne i ostre [M. A. Walker, Hepatitis C Virus: an Overview of Current Approaches and Progress, DDT, 4, 518-529 (1999); D. Moradpour i in., Current and Evolving Therapies for Hepatitis C Virus, Eur. J. Gastroenterol. Hepatol., 11, 1199-1202 (1999); H. L. A. Janssen i in., Suicide Associated with Alfa-Interferon Therapy for Chronic Viral Hepatitis, J. Hepatol., 21, 241-243 (1994); i P. F. Renault i in., Side effects of alpha interferon, Seminars in Liver Disease 9, 273-277, (1989)]. Ponadto, terapie interferonowe indukują długoterminową remisję tylko w części (-25%) przypadków [O. Weiland, Interferon Therapy in Chronic Hepatitis C Virus Infection, FEMS Microbiol. Rev., 14, 279-288 (1994)]. Wspomniane problemy z terapiami interferonem-a doprowadziły do opracowania i klinicznych badań pegylowanych derywatyzowanych związków interferonu-a, jako polepszonych leków przeciw HCV.
W świetle bieżącej sytuacji odnoszącej się do terapii przeciw HCV, oczywiste jest, że istnieje zapotrzebowanie na bardziej skuteczne i lepiej tolerowane terapie.
Ponadto, synteza kompleksowych peptydomimetycznych związków była od dawna hamowana niestereoselektywną naturą większości syntetycznych organicznych procesów. Dobrze wiadomo, że lecznicza aktywność enancjomerów peptydomimetycznych związków waha się w szerokim zakresie. Bardzo korzystne jest więc opracowanie takich stereospecyficznych procesów syntezy.
Dotychczasowe próby syntezy chiralnych bicykloprolinianowych związków pośrednich, przydatnych w syntezie niniejszych leczniczych peptydomimetycznych inhibitorów proteazy nie były niestety enacjoselektywne, lub diasteroselektywne, lub obejmowały długie ścieżki syntezy, lub były nieodpowiednie do wytwarzania dużych ilości produktu. Tak więc, istnieje również zapotrzebowanie na sposoby wytwarzania wielkich ilości bicykloprolin w sposób diastereoselektywny i enancjomerycznie wzbogacony.
Przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze:
lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól lub przedlek, lub solwat takiego związku, jego sól lub przedlek.
Przedmiotem wynalazku jest również związek o wzorze:
lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól lub przedlek, lub solwat takiego związku, jego sól lub przedlek.
Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca farmaceutycznie dopuszczalną ilość związku o wzorze BW lub CU lub ich farmaceutycznie dopuszczalnej soli lub przedleku, lub solwatu tych związków, jego soli lub przedleku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
PL 211 019 B1
Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek o wzorze BW lub CU lub ich farmaceutycznie dopuszczalnej soli lub przedleku, lub solwatu tych związków, jego soli lub przedleku, interferon wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie kompozycja farmaceutyczna dodatkowo zawiera związek wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C, inny niż interferon. Korzystnie związek o wzorze BW lub CU lub ich farmaceutycznie dopuszczalna sól lub przedlek, lub solwat tych związków, jego sól lub przedlek, interferon, i związek wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C występują w ilości wybranej z grupy obejmującej farmaceutycznie skuteczną ilość, subkliniczną farmaceutycznie skuteczną ilość i ich kombinację. Korzystnie interferon wybiera się z grupy obejmują cej interferon alfa 2B, pegylowany interferon alfa, consensus interferon, interferon alfa 2A, limfoblastoidowy interferon i interferon tau; a związek wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C wybiera się z grupy obejmującej interleukinę 2, interleukinę 6, interleukinę 12, związek ułatwiający rozwój odpowiedzi limfocytu T pomocnicznego typu 1, dwuniciowy RNA, dwuniciowy RNA kompleksowany z tobramycyną, imikwimod, rybawirynę, inhibitor dehydrogenazy 5'-monofosforanu inozyny, amantadynę i rymantadynę.
Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek o wzorze BW lub CU lub ich farmaceutycznie dopuszczalną sól lub przedlek, lub solwat tych związków, jego sól lub przedlek, związek wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C, inny niż interferon i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie związku o wzorze BW lub CU lub ich farmaceutycznie dopuszczalnej soli lub przedleku, lub solwatu tych związków, jego soli lub przedleku, do wytwarzania leku do inhibitowania proteazy wirusa zapalenia wątroby typu C.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie związku o wzorze BW lub CU lub ich farmaceutycznie dopuszczalnej soli lub przedleku, lub solwatu tych związków, jego soli lub przedleku, do wytwarzania leku do leczenia pacjentów zakażonych wirusem zapalenia wątroby typu C lub pacjentów, u których występują stany fizjologiczne związane z zakażeniem. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie związku o wzorze BW lub CU lub ich farmaceutycznie dopuszczalnej soli lub przedleku, lub solwatu tych związków, jego soli lub przedleku, w połączeniu z farmaceutycznie skuteczną ilością innego środka leczniczego przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C, do wytwarzania leku do leczenia pacjentów zakażonych wirusem zapalenia wątroby typu C lub pacjentów u których występują stany fizjologiczne związane z zakażeniem.
Korzystnie innym środkiem leczniczym przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C jest interferon lub derywatyzowany interferon.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie związku o wzorze BW lub CU lub ich farmaceutycznie dopuszczalnej soli lub przedleku, lub solwatu tych związków, jego soli lub przedleku, w połączeniu z interferonem wykazującym aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C, do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania infekcji wirusem zapalenia wątroby typu C, u pacjenta potrzebującego takiego leczenia lub zapobiegania. Korzystnie związek o wzorze BW lub CU lub ich farmaceutycznie dopuszczalna sól lub przedlek, lub solwat tych związków, jego sól lub przedlek i interferon występują w ilości wybranej z grupy obejmującej farmaceutycznie skuteczną ilość, subkliniczną farmaceutycznie skuteczną ilość i ich kombinację. Korzystnie interferon wybiera się z grupy obejmującej interferon alfa 2B, pegylowany interferon alfa, consensus interferon, interferon alfa 2A, limfoblastoidowy interferon i interferon tau.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie związku o wzorze BW lub CU lub ich farmaceutycznie dopuszczalnej soli lub przedleku, lub solwatu tych związków, jego soli lub przedleku, w połączeniu ze związkiem wykazującym aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C, innym niż interferon, do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania infekcji wirusem zapalenia wątroby typu C u pacjenta potrzebującego takiego leczenia lub zapobiegania.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie związku o wzorze BW lub CU lub ich farmaceutycznie dopuszczalnej soli lub przedleku, lub solwatu tych związków, jego soli lub przedleku, w połączeniu z interferonem wykazującym aktywność przeciw wirusowi zapalenia wą troby typu C i związkiem wykazują cym aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C, innym niż interferon, do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania infekcji wirusem zapalenia wątroby typu C, u pacjenta potrzebującego takiego leczenia lub zapobiegania. Korzystnie związek o wzorze BW lub CU lub ich farmaceutycznie dopuszczalna sól lub przedlek, lub solwat tych związków, jego sól lub przedlek, interferon i związek wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C występują
PL 211 019 B1 w ilości wybranej z grupy obejmującej farmaceutycznie skuteczną ilość, subkliniczną farmaceutycznie skuteczną ilość i ich kombinację. Korzystnie interferon wybiera się z grupy obejmującej interferon alfa 2B, pegylowany interferon alfa, consensus interferon, interferon alfa 2A, limfoblastoidowy interferon i interferon tau; a związek wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wą troby typu C wybiera się z grupy obejmującej interleukinę 2, interleukinę 6, interleukinę 12, związek ułatwiający rozwój odpowiedzi limfocytu T pomocnicznego typu 1, dwuniciowy RNA, dwuniciowy RNA kompleksowany z tobramycyną , imikwimod, rybawirynę , inhibitor dehydrogenazy 5'-monofosforanu inozyny, amantadynę i rymantadynę.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie związku o wzorze BW lub CU lub ich farmaceutycznie dopuszczalnej soli lub przedleku, lub solwatu tych związków, jego soli lub przedleku i interferonu wykazują cego aktywność przeciw wirusowi zapalenia wą troby typu C, do wytwarzania leku do hamowania replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C w komórce. Korzystnie lek dodatkowo zawiera związek wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C, inny niż interferon. Korzystnie związek o wzorze BW lub CU lub ich farmaceutycznie dopuszczalna sól lub przedlek, lub solwat tych związków, jego sól lub przedlek, interferon, i związek wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C występują w ilości wybranej z grupy obejmującej farmaceutycznie skuteczną ilość, subkliniczną farmaceutycznie skuteczną ilość i ich kombinację. Korzystnie interferon wybiera się z grupy obejmującej interferon alfa 2B, pegylowany interferon alfa, consensus interferon, interferon alfa 2A, limfoblastoidowy interferon i interferon tau; a związek wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C wybiera się z grupy obejmującej interleukinę 2, interleukinę 6, interleukinę 12, związek ułatwiający rozwój odpowiedzi limfocytu T pomocnicznego typu 1, dwuniciowy RNA, dwuniciowy RNA kompleksowany z tobramycyną, imikwimod, rybawirynę, inhibitor dehydrogenazy 5'-monofosforanu inozyny, amantadynę i rymantadynę.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie związku o wzorze BW lub CU lub ich farmaceutycznie dopuszczalnej soli lub przedleku, lub solwatu tych związków, jego soli lub przedleku, i zwią zku wykazują cego aktywność przeciw wirusowi zapalenia wą troby typu C, innego niż interferon, do wytwarzania leku do hamowania replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C w komórce.
Przedmiotem wynalazku jest również zestaw lub farmaceutyczne opakowanie, obejmujące wiele odrębnych pojemników, znamienne tym, że co najmniej jeden z pojemników zawiera inhibitor proteazy serynowej wirusa zapalenia wątroby typu C, którym jest związek o wzorze BW lub CU lub ich farmaceutycznie dopuszczalna sól lub przedlek, lub solwat tych związków, jego sól lub przedlek, a co najmniej drugi z pojemników zawiera interferon wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C.
Przedmiotem wynalazku jest również zestaw lub farmaceutyczne opakowanie, obejmujące wiele odrębnych pojemników, znamienne tym, że co najmniej jeden z pojemników zawiera inhibitor proteazy serynowej wirusa zapalenia wątroby typu C, którym jest związek o wzorze BW lub CU lub ich farmaceutycznie dopuszczalna sól lub przedlek, lub solwat tych związków, jego sól lub przedlek i co najmniej drugi z pojemników zawiera związek wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C, inny niż interferon.
Przedmiotem wynalazku jest również zestaw lub farmaceutyczne opakowanie, obejmujące wiele odrębnych pojemników, znamienne tym, że co najmniej jeden z pojemników zawiera inhibitor proteazy serynowej wirusa zapalenia wątroby typu C, którym jest związek o wzorze BW lub CU lub ich farmaceutycznie dopuszczalna sól lub przedlek, lub solwat tych związków, jego sól lub przedlek, co najmniej drugi z pojemników zawiera interferon wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C, i co najmniej kolejny z pojemników zawiera związek wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C, inny niż interferon. Korzystnie inhibitor proteazy serynowej wirusa zapalenia wątroby typu C, interferon i związek wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C występują w ilości wybranej z grupy obejmującej farmaceutycznie skuteczną ilość, subkliniczną farmaceutycznie skuteczną ilość i ich kombinację. Korzystnie interferon wybiera się z grupy obejmują cej interferon alfa 2B, pegylowany interferon alfa, consensus interferon, interferon alfa 2A, limfoblastoidowy interferon i interferon tau; a związek wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C wybiera się z grupy obejmującej interleukinę 2, interleukinę 6, interleukinę 12, związek ułatwiający rozwój odpowiedzi limfocytu T pomocnicznego typu 1, dwuniciowy RNA, dwuniciowy RNA kompleksowany z tobramycyną, imikwimod, rybawirynę, inhibitor dehydrogenazy 5'-monofosforanu inozyny, amantadynę i rymantadynę.
PL 211 019 B1
Ilość proteazy serynowej inhibitora (inhibitorów) HCV, interferonu (interferonów), lub związku (związków) przeciw HCV w dowolnym z powyższych zastosowań może być farmaceutycznie skuteczną ilością, podkliniczną ilość skuteczną przeciw HCV, lub ich kombinacjami, jeśli tylko końcowa kombinacja proteazy serynowej inhibitora (inhibitorów) HCV, interferonu (interferonów), lub związków indukujących wytwarzanie interferonu, które wykazują aktywność przeciw HCV, i/lub związku (związków) przeciw HCV, obejmuje farmaceutycznie skuteczną ilość związków skuteczną w leczeniu lub zapobieganiu infekcji HCV u pacjenta.
Powyższe i inne aspekty, cechy i korzyści z wynalazku będą lepiej zrozumiałe z następującego szczegółowego opisu w powiązaniu z załączonymi rysunkami, z których wszystkie podano tylko jako przykłady, a nie ograniczenia wynalazku, i w których:
Fig. 1 pokazuje inhibicję akumulację RNA replikonu HCV po 48 godzinach traktowanie zawierających replikon komórek ze związkiem CU i interferonem-alfa 2B, osobno lub w kombinacji.
Fig. 2 graficznie pokazuje wklęsłość izobolu wykazywaną przez związki stosowane w kombinacji, które są antagonistyczne, addycyjne i synergiczne zgodnie z sposobem obliczania synergii Greco, Parka i Rustoma ((1990) Application of a New Approach for the Quantitation of Drug Synergism to the Combination of cis-Diamminedichloroplatinum and 1-e-D-Arabinofuranosylcytosine, Cancer Research, 50, 5318-5327).
Fig. 3 pokazuje geometryczną zależność pomiędzy α i wielkością zakrzywienia w izobolu. Hipotetyczny izobol przy poziomie efektu E = 50% jest pokazany prostoliniowym izobolem, której można się spodziewać przy addycyjności. M jest punktem przecięcia linii y = x i hipotetycznego izobolu. N jest punktem przecięcia linii y = x i prostoliniowego izobolu. O oznacza początek (0,0). S daje miarę wielkości zakrzywienia w izobolu, gdy S = ON/OM. ON jest odległością od O do N i OM jest odległością od O do M. Parametr α jest związany z S równaniem α = 4(S2-S).
Fig. 4 pokazuje obliczenia izobolu z użyciem sposobu Greco i in., supra, dla kombinacji związku CU i interferonu alfa-2B (Schering-Plough) stosując 6 rozcieńczeń każdego związku w eksperymencie 1.
Fig. 5 pokazuje obliczenia izobolu z użyciem sposobu Greco i in., supra, dla kombinacji związku CU i interferonu alfa-2A stosując 6 rozcieńczeń każdego związku w eksperymencie 2.
Fig. 6 pokazuje obliczenia izobolu z użyciem sposobu Greco i in., supra, dla kombinacji związku CU i interferonu alfa-2B (Schering-Plough) stosując 8 rozcieńczeń każdego związku w eksperymencie 3.
Fig. 7 pokazuje obliczenia izobolu z użyciem sposobu Greco i in., supra, dla kombinacji związku CU i interferon alfa-2A stosując 8 rozcieńczeń każdego związku w eksperymencie 4.
Fig. 8 pokazuje obliczenia izobolu z użyciem sposobu Greco i in., supra, dla kombinacji związku CU i owczego interferonu tau stosując 8 rozcieńczeń każdego związku w eksperymencie 5.
Fig. 9 pokazuje obliczenia izobolu z użyciem sposobu Greco i in., supra, dla kombinacji związku EC i interferonu alfa-2B (Schering-Plough) stosując 8 rozcieńczeń każdego związku w eksperymencie 6.
Fig. 10 pokazuje obliczenia izobolu z użyciem sposobu Greco i in., supra, dla kombinacji związku EC i interferonu alfa-2A stosując 8 rozcieńczeń każdego związku w eksperymencie 7.
Fig. 11 pokazuje obliczenia izobolu z użyciem sposobu Greco i in., supra, dla kombinacji związku CU i interferonu beta stosując 8 rozcieńczeń każdego związku w eksperymencie 8.
Fig. 12 pokazuje obliczenia izobolu z użyciem sposobu Greco i in., supra, dla kombinacji związku EP i interferonu alfa-2B (Schering-Plough) stosując 8 rozcieńczeń każdego związku w eksperymencie 9.
Fig. 13 pokazuje obliczenia izobolu z użyciem sposobu Greco i in., supra, dla kombinacji rybawiryny i interferonu alfa-2B (Schering-Plough) stosując 8 rozcieńczeń każdego związku w eksperymencie 10.
Fig. 14 pokazuje inhibicję akumulacji RNA replikonu HCV powodowaną przez traktowanie komórek replikonu (A) samą rybawiryną lub (B) samym interferonem alfa-2B. W obu panelach pokazano zmierzoną inhibicję, jak też inhibicję poprawioną na cytotoksyczność związków.
Stosowane powyżej i w całym opisie wynalazku, następujące skróty, jeśli nie wskazano inaczej, mają następujące znaczenia:
Oznaczenie Reagent lub fragment
ACN acetonitryl
AIBN 2,2'-azobisizobutyronitryl
BOC lub BOc karbaminian t-butylu
BOP heksafluorofosforan benzotriazol-1-iloksytris(dimetyloamino)fosfoniowy
PL 211 019 B1 n-Bu3SnH
Cbz
DCC
DCM
DIC
DIPEA
DMAP
DMF
DMSO
EA
EDCI
Et2O
EtOAc
HOAt
HOBT
MeI
NaBH4
NMR
PPyBOP
RP-HPLC
THF
TLC wodorek tri-n-butylocyny karbaminian benzylu dicyklokarbodiimid dichlorometan (CH2Cl2)
1,3-diizopropylokarbodiimid diizopropyloetyloamina
4-(N,N-dimetyloamino)pirydyna odczynnik DMP odczynnik nadjodowy Dessa-Martina
dimetyloformamid dimetylosulfotlenek analiza elementarna chlorowodorek 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu eter dietylowy octan etylu
1-hydroksy-7-azabenzotriazol
1-hydroksybenzotriazol jodek metylu borowodorek sodu magnetyczny rezonans jądrowy wiązanie polimeru heksafluorofosforan benzotriazol-1-ilo-oksytris-pirolidyno-fosfoniowy wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami tetrahydrofuran chromatografia cienkowarstwowa
Powyżej i w całym opisie wynalazku, następujące terminy, jeśli nie wskazano inaczej, mają następujące znaczenia:
Bioizoster kwasu oznacza grupę, która ma chemiczne i fizyczne podobieństwo powodujące w przybliż eniu podobne biologiczne wł a ś ciwoś ci jak grupa karboksylowa (patrz Lipinski, Annual Reports in Medicinal Chemistry, Bioisosterism In Drug Design 21, 283 (1986); Yun, Hwahak Sekye, Application Of Bioisosterism To New Drug Design 33, 576-579, (1993); Zhao, Huaxue Tongbao,Bioisosteric Replacement And Development Of Lead Copmounds In Drug Design 34-38, (1995); Graham, Theochem, Theoretical Studies Applied To Drug Design: ab initio Electronic Distributions In Bioisosteres 343, 105-109, (1995)). Przykładowe bioizostery kwasu obejmują -C(O)-NHOH, -C(O)-CH2OH, -C(O)-CH2SH, -C(O)-NH-CN, sulfo, fosfono, alkilosulfonylokarbamoil, tetrazolil, arylosulfonylokarbamoil, N-metoksykarbamoil, heteroarylosulfonylokarbamoil, 3-hydroksy-3-cyklobuteno-1,2-dion, 3,5-diokso-1,2,4-oksadiazolidynyl lub hydroksyheteroaryl, taki jak 3-hydroksyizoksazolil, 3-hydroksy-1-metylopirazolil i tym podobne.
Kwasowa grupa funkcyjna oznacza ugrupowanie zawierające kwasowy atom wodoru. Przykładowe kwasowe grupy funkcyjne obejmują karboksyl (-C(O)OH), -C(O)-NHOH, -C(O)-CH2OH, -C(O)-CH2SH, -C(O)-NH-CN, sulfo, fosfono, alkilosulfonylokarbamoil, tetrazolil, arylosulfonylokarbamoil, N-metoksykarbamoil, heteroarylosulfonylokarbamoil, 3-hydroksy-3-cyklobuteno-1,2-dion, 3,5-diokso-1,2,4-oksadiazolidynyl lub hydroksyheteroaryl, taki jak 3-hydroksyizoksazolil, 3-hydroksy-1-metylopirazolil, imidazolil, merkapto, i tym podobne, i odpowiedni hydroksyl, taki jak aromatyczny hydroksyl, np., hydroksyfenyl.
Grupa zabezpieczająca grupę aminową oznacza łatwo usuwalną grupę, która jest znana w dziedzinie z zabezpieczania ugrupowania azotowego grupy aminowej lub amidowej przed niepo żą8
PL 211 019 B1 daną reakcją podczas procedur syntezy i jest selektywnie usuwalna. Zastosowanie grupy zabezpieczającej aminy/amidy jest dobrze znane w dziedzinie grup zabezpieczających przed niepożądanymi reakcjami w procedurze syntezy i znanych jest wiele takich grup zabezpieczających, np., T. W. Greene i P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, wyd. 2, John Wiley & Sons, New York (1991), dołączane niniejszym jako odnośnik literaturowy. Grupa zabezpieczająca aminę/amid również obejmuje nietrwałą wobec kwasu grupę zabezpieczającą aminę/amid i nietrwałą przy uwodornieniu grupę zabezpieczającą aminę/amid. Przykładowymi grupami zabezpieczającymi aminę/amid są acyl, w tym formyl, acetyl, chloroacetyl, trichloroacetyl, o-nitrofenyloacetyl, o-nitrofenoksyacetyl, trifluoroacetyl, acetoacetyl, 4-chlorobutyryl, izobutyryl, o-nitrocynamoil, pikolinoil, acyloizotiocyjanian, aminokaproil, benzoil i tym podobne, oraz acyloksyl, w tym metoksykarbonyl, 9-fluorenylometoksykarbonyl, 2,2,2-trifluoroetoksykarbonyl, 2-trimetylosililetoksykarbonyl, winyloksykarbonyl, alliloksykarbonyl, t-butyloksykarbonyl (BOC), 1,1-dimetylopropynyloksykarbonyl, benzyloksykarbonyl (CBZ), p-nitrobenzyloksykarbonyl, 2,4-dichlorobenzyloksykarbonyl i tym podobne.
Grupa zabezpieczająca grupę amidową oznacza łatwo usuwalną grupę, która jest znana w dziedzinie z zabezpieczania ugrupowanie azotu grupy amidowej przed niepożądaną reakcją podczas procedur syntezy i jest selektywnie usuwalna po konwersji do aminy. Zastosowanie grup zabezpieczających amid jest dobrze znane w dziedzinie grup zabezpieczających przed niepożądanymi reakcjami podczas procedury syntezy, i znanych jest wiele takich grup zabezpieczających, np., T. W. Greene i P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, wyd. 2, John Wiley & Sons, New York (1991), dołączane niniejszym jako odnośnik literaturowy. Grupa zabezpieczająca amid obejmuje również nietrwałą wobec kwasu grupę zabezpieczającą amid i nietrwałą przy uwodornieniu grupę zabezpieczającą amid. Przykładowymi grupami zabezpieczającymi amid są o-nitrocynamoil, pikolinoil, aminokaproil, benzoil i tym podobne, oraz acyloksyl, w tym metoksykarbonyl, 9-fluorenylometoksykarbonyl, 2,2,2-trifluoroetoksykarbonyl, 2-trimetylosililetoksykarbonyl, winyloksykarbonyl, alliloksykarbonyl, t-butyloksykarbonyl (BOC), 1,1-dimetylopropynyloksykarbonyl, benzyloksykarbonyl (CBZ), p-nitrobenzyloksykarbonyl, 2,4-dichlorobenzyloksykarbonyl, i tym podobne.
Środek sprzęgający oznacza związek, który reaguje z ugrupowaniem hydroksylowym ugrupowania karboksylowego powodując jego podatność na atak nukleofilowy. Przykładowe środki sprzęgające obejmują DIC, EDCI, DCC, i tym podobne.
Skuteczna ilość oznacza ilość związku/kompozycji według wynalazku skuteczną w powodowaniu żądanego efektu leczniczego.
Hydrat oznacza solwat, w którym cząsteczkami rozpuszczalnika są H2O.
Iminowa pochodna glicynimidu oznacza iminową zasadę Schiffa glicyny, która jest przydatna w syntezie a -aminokwasów, naturalnych i nienaturalnych. Grupa funkcyjna estru iminowego moż e zawierać jeden lub większą liczbę centrów asymetrii, które mogą pomóc w stereoindukcji podczas procesu tworzenia wiązania. Ponadto, takie iminowe pochodne glicynimidu można przyłączać do polimerycznych nośników dla ułatwienia kombinatorycznej syntezy. Iminowe pochodne glicynimidu można wytwarzać kondensując ester glicynowy z odpowiednim ketonem w obecności kwasowego katalizatora. Reakcję ułatwia usuwanie wody. Iminowe pochodne glicynimidu są dobrze znane w dziedzinie dzięki zastosowaniu w procedurach syntetycznych addycji Michaela, np. jak opisuje Guillena, G., i in., J. Org. Chem. 2000, 65, 7310-7322, dołączany niniejszym jako odnośnik. Konkretne przykłady iminowych pochodnych glicynimidu według wynalazku obejmują związki wybrane spośród grupy wzorów
PL 211 019 B1 którym:
* oznacza metal przejściowy, korzystnie CU, korzystniej CUII.
R15 oznacza ewentualnie podstawioną grupę alifatyczną;
R16 oznacza grupę zabezpieczającą kwas, ewentualnie podstawiony aryl, lub ewentualnie podstawioną grupę alifatyczną;
R17 oznacza ewentualnie podstawiony aryl, ewentualnie podsta-
wioną grupę alifatyczną,
R18 oznacza atom wodoru, alkil, lub alkilotio; lub ewentualnie podstawiony aryl;
18 17
R17 i R18 wraz z atomem węgla, z którym są połączone R17 i
PL 211 019 B1
R18, tworzą
oznacza fazę stałą.
„N-oksysukcynimid” oznacza ugrupowanie o następującej
strukturze
Pacjent obejmuje ludzi i inne ssaki.
Peptydomimetyczny oznacza polimer obejmujący reszty aminokwasowe związane wiązaniami amidowymi.
Farmaceutycznie dopuszczalne przedleki stosowane w wynalazku odnoszą się do tych przedleków związków według wynalazku, które są, w zakresie rozsądnej oceny medycznej, odpowiednie do stosowania w kontakcie z tkankami ludzi i niższych zwierząt bez zbędnej toksyczności, podrażnienia, reakcji alergicznej, i tym podobnych, w proporcji do rozsądnego stosunku korzyść/ryzyko, i skuteczne w zamierzanym zastosowaniu, jak też postaci obojnaczych, gdzie są możliwe, związków według wynalazku. Termin przedlek odnosi się do związków, które gwałtownie przekształcają się in vivo dając macierzysty związek o powyższym wzorze, np. przez hydrolizę we krwi. Grupy funkcyjne, które mogą się szybko przekształcać, przez rozpad metaboliczny, in vivo, tworzą klasę grup reagujących z grupą karboksylową związków według wynalazku. Obejmują one, między innymi, takie grupy, jak alkanoil (taki jak acetyl, propanoil, butanoil, i tym podobne), niepodstawiony i podstawiony aroil (taki jak benzoil i podstawiony benzoil), alkoksykarbonyl (taki jak etoksykarbonyl), trialkilosilil (taki jak trimetylo- i trietylosilil), monoestry tworzone z kwasami dikarboksylowymi (takimi jak sukcynyl), i tym podobne. Ze względu na łatwość, z jaką metaboliczne odcinane grupy związków według wynalazku odcina się in vivo, związki niosące takie grupy działają jako przedleki. Związki niosące metabolicznie odcinane grupy korzystnie mogą wykazywać polepszoną biodostępność dzięki polepszonej rozpuszczalności i/lub szybkości absorpcji nadawanej macierzystemu związkowi dzięki obecności metabolicznie odcinanej grupy. Szczegółowe omówienie podaje Design of Prodrugs, red. H. Bundgaard, Elsevier (1985); Methods in Enzymology; red. K. Widder i in., Academic Press, 42, 309-396 (1985); A Textbook of Drug Design and Developement, red. Krogsgaard-Larsen i H. Bandaged, rozdz. 5; Design and Applications of Prodrugs 113-191 (1991); Advanced Drug Delivery Reviews, H. Bundgard, 8, 1-38, (1992); J. Pharm. Sci., 77, 285 (1988); Chem. Pharm. Bull., N. Nakeya i in., 32, 692 (1984); Prodrugs as Novel Delivery Systems, T. Higuchi i V. Stella, 14 A. C. S. Symposium Series, i Bioreversible Carriers in Drug Design, red. E. B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987, które są dołączane niniejszym jako odnośniki literaturowe.
Farmaceutycznie dopuszczalne sole odnoszą się do względnie nietoksycznych, nieorganicznych i organicznych soli addycyjnych kwasów, i soli addycyjnych zasad, związków według wynalazku. Te sole można wytwarzać in situ podczas końcowego wydzielania i oczyszczania związków. W szczególności, sole addycyjne kwasów można wytwarzać oddzielnie poddając reakcji oczyszczony związek w jego postaci wolnej zasady z odpowiednim kwasem organicznym lub nieorganicznym i wydzielając powstałą sól. Przykładowe sole addycyjne kwasów obejmują bromowodorek, chlorowodorek, siarczan, wodorosiarczan, fosforan, azotan, octan, szczawian, walerianian, oleinian, palmitynian, stearynian, laurynian, boran, benzoesan, mleczan, fosforan, tosylan, cytrynian, maleinian, fumaran, bursztynian, winian, naftylan, mesylan, glukoheptanian, laktobionian, sulfaminiany, maloniany, salicylany, propioniany, metyleno-bis-e-hydroksynaftoesany, gentisany, izetioniany, di-p-toluoilowiniany, metanosulfoniany, etanosulfoniany, benzenosulfoniany, p-toluenosulfoniany, cykloheksylosulfaminiany i chinianolaurylosulfonian, i tym podobne. Patrz, np. S. M. Berge, i in., Pharmaceutical Salts, J. Pharm. Sci.,
PL 211 019 B1
66, 1-19 (1977), który jest dołączany niniejszym jako odnośnik literaturowy. Sole addycyjne zasad można również wytwarzać w oddzielnej reakcji oczyszczonego związku w postaci kwasowej z odpowiednią organiczną lub nieorganiczną zasadą i wydzielać powstałą sól. Sole addycyjne zasad obejmują farmaceutycznie dopuszczalne sole metali i amin. Odpowiednie sole metali obejmują sole sodu, potasu, wapnia, baru, cynku, magnezu i glinu. Sole sodu i potasu są korzystne. Odpowiednie nieorganiczne sole addycyjne zasad wytwarza się z zasady metalu, która obejmuje wodorek sodu, wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, wodorotlenek wapnia, wodorotlenek glinu, wodorotlenek litu, wodorotlenek magnezu, wodorotlenek cynku i tym podobne. Odpowiednie sole addycyjne zasad aminy wytwarza się z amin, które mają dostateczną zasadowość, aby tworzyć trwałą sól, i korzystnie obejmują te aminy, które są często stosowane w chemii medycznej ze względu na ich niską toksyczność i dopuszczalność do użytku medycznego, amoniak, etylenodiamina, N-metyloglucamina, lizyna, arginina, ornityna, cholina, N,N'-dibenzyloetylenodiamina, chloroprokaina, dietanoloamina, prokaina, N-benzylofenetyloamina, dietyloamina, piperazyna, tris(hydroksymetylo)aminometan, wodorotlenek tetrametyloamoniowy, trietyloamina, dibenzyloamina, efenamina, dehydroabietyloamina, N-etylopiperydyna, benzyloamina, jon tetrametyloamoniowy, jon tetraetyloamoniowy, metyloamina, dimetyloamina, trimetyloamina, etyloamina, zasadowe aminokwasy, np., lizyna i arginina, oraz dicykloheksyloamina, i tym podobne.
Solwat obejmuje fazę roztworu i wydzielone solwaty. Przykładowe solwaty obejmują hydraty, etanolany, metanolany, i tym podobne.
Substraty i związki pośrednie związków według wynalazku można wytwarzać stosując lub adaptując znane sposoby, np. sposoby opisane w przykładach odniesienia lub ich oczywiste chemiczne równoważniki.
Związki według wynalazku można wytwarzać stosując lub adaptując znane sposoby, przez co rozumie się sposoby stosowane dotychczas lub opisane w literaturze, np. te opisane przez R. C. Larocka w Comprehensive Organie Transformations, VCH publishers (1989).
w którym:
R0 oznacza wiązanie;
1
R1 oznacza atom wodoru;
2
R2 oznacza cyklopropan;
9
R9 oznacza pirazynę;
R3 i R5 oznaczają metylen;
R7 oznacza metylen podstawiony fenylem; R4, R6 i R8 oznaczają atom wodoru;
O
a n wynosi 1 stanowią związki według wynalazku BW i CU.
Oznaczenia podane niżej mają znaczenia takie same jak we wzorze 1. Związek o wzorze 1, można wytwarzać traktując związek o wzorze 2,
PL 211 019 B1
z odpowiednim ś rodkiem utleniają cym i w odpowiednich warunkach. Konkretnym ś rodkiem utleniają cym jest reagent DMP. Konkretne warunki obejmują prowadzenie utleniania w odpowiednim organicznym rozpuszczalniku, takim jak dichlorometan w temperaturze bliskiej pokojowej.
Związek o wzorze 2 można wytwarzać sprzęgając związek o wzorze 3 i związek o wzorze 4,
z odpowiednim środkiem sprzęgającym i w odpowiednich warunkach. Konkretny środek sprzęgający i warunki obejmują stosowanie DIC i HOAt w odpowiednim organicznym rozpuszczalniku, takim jak DMF w temperaturze około 0°C lub stosowanie PyBop i DIPEA w odpowiednim organicznym rozpuszczalniku takim jak dichlorometan w temperaturze bliskiej pokojowej.
Związek o wzorze 3 można wytwarzać sprzęgając związek o wzorze 5 i związek o wzorze 6, w którym P2 oznacza grupę zabezpieczając ą kwas
PL 211 019 B1 z odpowiednim środkiem sprzęgającym i w odpowiednich warunkach sprzęgania, a następnie stosując odpowiedni środek odbezpieczający w odpowiednich warunkach odbezpieczania. Konkretny środek sprzęgający i warunki obejmują stosowanie DIC lub DCC i HOAt w odpowiednim organicznym rozpuszczalniku, takim jak DMF lub dichlorometan w temperaturze około 0°C do bliskiej pokojowej. Odbezpieczanie prowadzi się stosując odpowiedni środek odbezpieczający, który zależy od natury środka odbezpieczającego, to jest, czy jest usuwalna (labilna) w warunkach kwasowych, zasadowych, czy uwodornienia, i inne reaktywnych ugrupowań w związku poddawanym odbezpieczaniu, to jest, środek odbezpieczający wybiera się tak, aby prowadzić odbezpieczanie bez wpływania na inne reaktywne ugrupowania, jeśli nie jest potrzebna równoczesna reakcja. Konkretnym środkiem zabezpieczającym kwas jest niższy C1 do C8 alkil; korzystniej metyl. Konkretnym środkiem odbezpieczającym jest nieorganiczna zasada, taka jak wodorotlenek metalu alkalicznego; korzystniej NaOH. Konkretne warunki odbezpieczania obejmują prowadzenie odbezpieczania w alkoholowym rozpuszczalniku, takim jak metanol lub etanol w temperaturze bliskiej pokojowej.
Związek o wzorze 5b można wytwarzać przez odbezpieczanie związku o wzorze 10, w którym 2
P2 oznacza grupę zabezpieczającą kwas
z odpowiednim ś rodkiem odbezpieczają cym i w odpowiednich warunkach. Odbezpieczanie prowadzi się stosując odpowiedni środek odbezpieczający w zależności od natury środka zabezpieczającego kwas, to jest, czy jest on usuwalny (labilny) w warunkach kwasowych, zasadowych czy uwodornienia, i innych reaktywnych ugrupowań w zwią zku podlegają cym odbezpieczaniu, to jest, ś rodek odbezpieczający wybiera się tak, aby prowadzić odbezpieczanie bez wpływania na inne reaktywne ugrupowania, jeśli nie jest potrzebna równoczesna reakcja. Konkretnym środkiem zabezpieczającym kwas jest niższy C1 do C8 alkil; korzystniej metyl. Konkretnym środkiem odbezpieczającym jest nieorganiczna zasada, taka jak wodorotlenek metalu alkalicznego; korzystniej NaOH. Konkretne warunki odbezpieczania obejmują prowadzenie odbezpieczania w alkoholowym rozpuszczalniku, takim jak metanol lub etanol w temperaturze bliskiej pokojowej.
Związek o wzorze 10 można wytwarzać acylując związek o wzorze 11 ze związkiem o wzorze 9 w odpowiednich warunkach.
PL 211 019 B1
Konkretne warunki sprzęgania wykorzystują DIC lub DCC i HOAt w odpowiednim organicznym rozpuszczalniku, takim jak DMF lub dichlorometan w temperaturze około 0°C do bliskiej pokojowej, lub PyBop i DIPEA w odpowiednim organicznym rozpuszczalniku, takim jak DMF lub dichlorometan w temperaturze bliskiej pokojowej; i korzystne są te ostatnie warunki. Korzystnym M jest hydroksyl lub N-oksysukcynimid.
Związek o wzorze 11 można wytwarzać przez odbezpieczenie związku o wzorze 12, w którym P1 oznacza grupę zabezpieczającą grupę aminową.
z odpowiednim ś rodkiem odbezpieczają cym i w odpowiednich warunkach. Odbezpieczanie prowadzi się stosując odpowiedni środek odbezpieczający w zależności od natury środka zabezpieczającego aminę, to jest, czy jest on usuwalny (labilny) w warunkach kwasowych, zasadowych czy uwodornienia, i innych reaktywnych ugrupowań w zwią zku podlegają cym odbezpieczaniu, to jest, ś rodek odbezpieczający wybiera się tak, aby prowadzić odbezpieczanie bez wpływania na inne reaktywne ugrupowania, jeśli nie jest potrzebna równoczesna reakcja. Konkretnym środkiem zabezpieczającym aminę jest Cbz lub BOC; korzystniej Cbz. Konkretnym środkiem odbezpieczającym jest kwas, taki jak HCl lub H2/Pd(OH)2; korzystniej H2/Pd(OH)2. Konkretne warunki odbezpieczania obejmują prowadzenie odbezpieczania w alkoholowym rozpuszczalniku, takim jak metanol lub etanol lub rozpuszczalnik z alkanianu alkilu, takim jak octan etylu w temperaturze bliskiej pokojowej.
Związek o wzorze 12 można wytwarzać sprzęgając związek o wzorze 13 ze związkiem o wzorze 14 w odpowiednich warunkach.
Konkretne warunki sprzęgania wykorzystują HOAt/DIC i DIPEA w odpowiednim organicznym rozpuszczalniku, takim jak THF w temperaturze bliskiej pokojowej.
Związek o wzorze 4 można wytwarzać przez odbezpieczanie związku o wzorze 15
PL 211 019 B1
odpowiednim środkiem odbezpieczającym i w odpowiednich warunkach. Odbezpieczanie prowadzi się stosując odpowiedni środek odbezpieczający w zależności od natury środka zabezpieczającego aminę, to jest, czy jest on usuwalny (labilny) w warunkach kwasowych, zasadowych czy uwodornienia, i innych reaktywnych ugrupowań w zwią zku podlegają cym odbezpieczaniu, to jest, ś rodek odbezpieczający wybiera się tak, aby prowadzić odbezpieczanie bez wpływania na inne reaktywne ugrupowania, jeśli nie jest potrzebna równoczesna reakcja. Konkretnym środkiem zabezpieczającym aminę jest Cbz lub BOC; korzystniej Cbz. Konkretnym środkiem odbezpieczającym jest kwas, taki jak HCl lub H2/Pd(OH)2; korzystniej H2/Pd(OH)2. Konkretne warunki odbezpieczania obejmują prowadzenie odbezpieczania w alkoholowym rozpuszczalniku, takim jak metanol lub etanol, lub rozpuszczalnik alkanian alkilu, takim jak octan etylu w temperaturze bliskiej pokojowej.
Związek o wzorze 15 można wytwarzać sprzęgając związek o wzorze 16 ze związkiem o wzorze 17 w odpowiednich warunkach.
Konkretnym środkiem zabezpieczającym aminę jest Cbz lub BOC; korzystniej Cbz. Konkretne warunki sprzęgania wykorzystują HOBT, PyBop i DIPEA w odpowiednim organicznym rozpuszczalniku, takim jak dichlorometan w temperaturze około 0°C do temperatury bliskiej pokojowej.
Związek o wzorze 16 można wytwarzać przez odbezpieczanie związku o wzorze 18
PL 211 019 B1 odpowiednim środkiem odbezpieczającym i w odpowiednich warunkach. Odbezpieczanie prowadzi się stosując odpowiedni środek odbezpieczający w zależności od natury środka zabezpieczającego kwas, to jest, czy jest on usuwalny (labilny) w warunkach kwasowych, zasadowych czy uwodornienia, i innych reaktywnych ugrupowań w związku podlegającym odbezpieczaniu, to jest, środek odbezpieczający wybiera się tak, aby prowadzić odbezpieczanie bez wpływania na inne reaktywne ugrupowania, jeśli nie jest potrzebna równoczesna reakcja. Konkretnym środkiem zabezpieczającym aminę jest Cbz. Konkretnym środkiem zabezpieczającym kwas jest niższy C1 do C8 alkil; korzystniej metyl. Konkretnym środkiem odbezpieczającym jest nieorganiczna zasada, taka jak wodorotlenek metalu alkalicznego; korzystniej NaOH. Konkretne warunki odbezpieczania obejmują prowadzenie odbezpieczania w alkoholowym rozpuszczalniku, takim jak metanol lub etanol w temperaturze bliskiej pokojowej.
Związek o wzorze 18 można wytwarzać przez zabezpieczenie związku o wzorze 20 związkiem o wzorze 19
w odpowiednich warunkach. Konkretnym środkiem zabezpieczającym aminę jest Cbz lub BOC. Konkretne warunki sprzęgania wykorzystują odpowiedni organiczny rozpuszczalnik, taki jak dichlorometan w temperaturze oko ło 0°C do bliskiej pokojowej.
Związek o wzorze 20 można wytwarzać przez uwodornienie związku o wzorze 21
odpowiednim środkiem uwodorniającym i w odpowiednich warunkach. Konkretnym środkiem uwodorniającym jest H2/Pd(OH)2. Konkretne warunki uwodornienia obejmują prowadzenie uwodornienia w alkoholowym rozpuszczalniku, takim jak metanol lub etanol lub rozpuszczalnik alkanianu alkilu, taki jak octan etylu w temperaturze bliskiej pokojowej.
Związek o wzorze 24 można wytwarzać prowadząc addycję Michaela na akceptorze Michaela o wzorze 29 z iminową pochodną glicynimidu.
PL 211 019 B1
Addycje Michaela wymagają odpowiednich aprotonowych polarnych rozpuszczalników, zasadowych wodorotlenków metali alkalicznych, i odpowiednich temperatur. Addycje Michaela opisuje Corey, E. J.; Noe, M. C.; Xu, F. Tetrahedron Letter 1998, 39, 5347. Syntezę chiralnych katalizatorów z przenoszeniem międzyfazowym opisuje Corey, E. J.; Noe, M. C.; Xu, F. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 12414. Odpowiednie rozpuszczalniki obejmują DCM, ACN lub THF w zależności od warunków reakcji. Odpowiednie zasady obejmują CsOH, NaOH, KOH i LiOH. Odpowiednie zakresy temperatur wahają się od około -78°C do około 0°C, konkretniej około -60°C. Opisano tutaj iminowe glicynimidy przydatne w wynalazku. Korzystnym iminowym glicynimidem jest ester t-butylowy N-(difenylometyleno)glicyny. Ponadto, na warunki addycji Michaela może wpływać brak lub obecność katalizatora z przenoszeniem mię dzyfazowym (PTC) (chiralnego i niechiralnego). Korzystnym PTC jest bromek O-[9]allilo-N-9-antracenylometylocynchonidiowy.
Związek o wzorze 25 można wytwarzać przez rozcinanie iminy i cyklizowanie związku o wzorze 24.
Procedury rozcinania i cyklizacji podają Javidan, A.; Schfer, K.; Pyne, S. Synlett 1996, 100; Tatsukawa, A.; Dan, M.; Ohbatake, M.; Kawatake, K.; Fukata, T.; Wada, E.; Kanemase, S.; Kakei, S. J. Org. Chem. 1993, 58, 4221. Warunki rozcinania i cyklizacji obejmują stosowanie polarnych rozpuszczalników, reagentów kwasowych i temperatur bliskich pokojowej do około 150°C. Korzystne warunki obejmują stosowanie EtOH, AcONa i NH2OH^HCl, oraz temperatury około temperatury wrzenia użytego rozpuszczalnika.
Związek o wzorze 26 można wytwarzać przez zabezpieczanie związku amidowego o wzorze 25 odpowiednią grupą zabezpieczającą amid, taką jak BOC. Inne odpowiednie grupy zabezpieczające obejmują CBz, -CO2alkil. Również patrz Greene, T. W.; P. G. M. w Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, New York, 1991, inne grupy zabezpieczające grupy aminowe. Warunki zabezpieczania obejmują stosowanie aprotonowych polarnych rozpuszczalników, organicznych zasad jako katalizatorów, i temperatur około 0°C-100°C. Korzystne warunki obejmują stosowanie ACN, dimetyloaminopirydyny i temperatury bliskiej pokojowej.
PL 211 019 B1
Związek o wzorze 27 można wytwarzać przez redukowanie zabezpieczonego związku o wzorze 26.
W istocie wykonuje się dwie redukcje. Pierwsza redukcja jest redukcją amidu do hemiaminalu z użyciem DIBALH lub superwodorku [LiBEt3H]. Druga redukcja jest redukcją hemiaminalu do aminy z użyciem Et3SiH i BF3OEt2. Collado, I.; Ezquerra, J.; Mateo, A. I.; Rubio, A., J. Org. Chem. 1998, 63 1995-2001 i Ezqueera, J.; Pedregal, C.; Yruretagoyena, B.; Rubio, A.; Carreno, M. C., Escribano, A.; Garcia Ruano, J. L. J. Org. Chem. 1995, 60, 2925 podają warunki redukowania. Innymi zwykłymi warunkami przekształcania piroglutaminianów w pirolidyny jest stosowanie BHySMe2.
Związek o wzorze 28 można wytwarzać przez odbezpieczenie związku o wzorze 27.
Gibson, F. G.; Bermeier, S. C.; Rapoport, H., J. Org. Chem. 1994, 59, 3216-3218 podają warunki selektywnego usuwania zabezpieczającej grupy N-BOC w obecności estru t-butylowego. Specjalista w dziedzinie będzie wiedział, że warunki odbezpieczania będą zależne od wyboru grupy zabezpieczającej. Np., jeśli stosuje się CBz, można stosować uwodornienie lub warunki zasadowe. Korzystnie, jeśli stosuje się BOC, można stosować 1N HCl w octanie etylu. Patrz Greene, T. W.; P. G. M. w Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, New York, 1991.
Fachowiec w dziedzinie zauważy, że związek o wzorze 3 można wytwarzać sprzęgając związek o wzorze 5 ze związkiem o wzorze 28 w warunkach opisanych powyżej.
Związek, który wytwarza się jak opisano w wynalazku można odzyskać z mieszaniny reakcyjnej konwencjonalnymi środkami. Np., związki można odzyskać oddestylowując rozpuszczalnik z mieszaniny reakcyjnej lub, jeśli to konieczne, po oddestylowaniu rozpuszczalnika z mieszaniny reakcyjnej, wylewając pozostałość do wody, a następnie ekstrahując niemieszającym się z wodą organicznym rozpuszczalnikiem i oddestylowując rozpuszczalnik z ekstraktu. Dodatkowo, produkt można, jeśli to pożądane, oczyścić następnie różnymi dobrze znanymi technikami, takimi jak rekrystalizacja, strącanie lub różne techniki chromatograficzne, w szczególności kolumnowa chromatografia lub preparatywna cienkowarstwowa chromatografia.
Należy rozumieć, że związki według wynalazku mogą zawierać centra asymetrii. Te centra asymetrii mogą niezależnie być w konfiguracji R lub S. Będzie oczywiste dla specjalistów w dziedzinie, że pewne związki według wynalazku można również wykazywać izomerię geometryczną. Należy rozumieć, że wynalazek obejmuje indywidualne geometryczne izomery i stereoizomery i ich mieszaniny, w tym racemiczne mieszaniny, związków według wynalazku. Takie izomery można oddzielić od ich mieszaniny, stosując lub adaptując znane sposoby, np. techniki chromatograficzne i techniki rekrystalizacyjne, lub oddzielnie wytworzyć z odpowiednich izomerów ich związków pośrednich.
Dla celów wynalazku należy rozumieć, że formy tautomeryczne są obejmowane przy wymienianiu danej grupy, np., tiokso/merkapto lub okso/hydroksyl.
Sole addycyjne kwasów tworzone są ze związkami według wynalazku, w których występuje zasadowa grupa funkcyjna, taka jak grupa aminowa, alkiloaminowa, lub dialkiloaminowa. Korzystne są farmaceutycznie dopuszczalne, to jest, nietoksyczne, sole addycyjne kwasów. Wybrane sole są wybrane optymalnie dla zgodności ze zwykłymi farmaceutycznymi nośnikami i adaptowano do podawaPL 211 019 B1 nia doustnego lub pozajelitowego. Sole addycyjne kwasów związków według wynalazku można wytwarzać w reakcji wolnej zasady z odpowiednim kwasem, przez zastosowanie lub adaptację znanych sposobów. Np., sole addycyjne kwasów związków według wynalazku można wytwarzać przez rozpuszczanie wolnej zasady w wodzie lub wodnym roztworze alkoholu lub innych odpowiednich rozpuszczalnikach zawierających odpowiedni kwas i wydzielenie soli przez odparowanie roztworu, lub w reakcji wolnej zasady i kwasu w organicznym rozpuszczalniku, w którym to przypadku sól oddziela się bezpośrednio lub można ją otrzymać przez zatężenie roztworu. Pewne odpowiednie kwasy do stosowania w wytwarzaniu takich soli to kwas chlorowodorowy, kwas bromowodorowy, kwas fosforowy, kwas siarkowy, różne organiczne kwasy karboksylowe i sulfonowe, takie jak kwas octowy, kwas cytrynowy, kwas propionowy, kwas bursztynowy, kwas benzoesowy, kwas winowy, kwas fumarowy, kwas migdałowy, kwas askorbinowy, kwas jabłkowy, kwas metanosulfonowy, kwas toluenosulfonowy, kwasy tłuszczowe, adypinian, alginian, askorbinian, asparaginian, benzenosulfonian, benzoesan, cyklopentanopropionian, diglukonian, dodecylosiarczan, wodorosiarczan, maślan, mleczan, laurynian, laurylosiarczan, jabłczan, jodowodorek, 2-hydroksyetanosulfonian, glicerofosforan, pikrynian, piwalan, pamoesan, pektynian, nadsiarczan, 3-fenylopropionian, tiocyjanian, 2-naftalenosulfonian, undekanian, nikotynian, hemisiarczan, heptanian, heksanian, kamforan, kamforosulfonian i inne.
Sole addycyjne kwasów związków według wynalazku można regenerować z soli przez zastosowanie lub adaptację znanych sposobów. Np., macierzyste związki według wynalazku można regenerować z ich soli addycyjnych kwasów przez traktowanie zasadą, np., wodnym roztworem wodorowęglanu sodu lub wodnym roztworem amoniaku.
Związki według wynalazku można regenerować z ich soli addycyjnych zasad przez zastosowanie lub adaptację znanych sposobów. Np., macierzyste związki według wynalazku można regenerować z ich soli addycyjnych zasad przez traktowanie kwasem, np., kwasem chlorowodorowym.
Sole addycyjne zasad można wytwarzać, gdy związek według wynalazku zawiera grupę karboksylową, lub dostatecznie kwasowy bioizoster. Zasady, które można stosować do wytwarzania soli addycyjnych zasad, obejmują korzystnie te, które dają, przy połączeniu z wolnym kwasem, farmaceutycznie dopuszczalne sole, to jest, sole, których kationy są nietoksyczne dla pacjenta w farmaceutycznych dawkach soli, tak że korzystne hamujące działanie właściwe dla wolnej zasady nie jest zakłócone skutkami ubocznymi przypisywanymi kationom. Farmaceutycznie dopuszczalne sole, w tym sole pochodzące od metali alkalicznych i metali ziem alkalicznych, w zakresie wynalazku, obejmują sole pochodzące od następujących zasad: wodorku sodu, wodorotlenku sodu, wodorotlenku potasu, wodorotlenku wapnia, wodorotlenku glinu, wodorotlenku litu, wodorotlenku magnezu, wodorotlenku cynku, amoniaku, etylenodiaminy, N-metyloglukaminy, lizyny, argininy, ornityny, choliny, N,N'-dibenzyloetylenodiaminy, chloroprokainy, dietanoloaminy, prokainy, N-benzylofenetyloaminy, dietyloaminy, piperazyny, tris(hydroksymetylo)aminometanu, wodorotlenku tetrametyloamoniowego, i tym podobnych.
Związki według wynalazku można dogodnie wytwarzać, lub formować jako solwaty (np., hydraty). Hydraty związków według wynalazku można dogodnie wytwarzać przez rekrystalizację z mieszanina wodnego/organicznego rozpuszczalnika, stosując organiczne rozpuszczalniki, takie jak dioksan, tetrahydrofuran lub metanol.
Substraty i związki pośrednie można wytwarzać przez zastosowanie lub adaptację znanych sposobów, np. sposobów opisanych w przykładach odniesienia lub ich oczywistych chemicznych równoważników.
Związki według wynalazku, sposoby ich wytwarzania i ich biologiczna aktywność można dostrzec dokładniej po zbadaniu następujących przykładów, które są podane tylko dla zilustrowania i nie należy ich uważać za ograniczenia zakresu wynalazku.
Próbki zanalizowano metodą TLC, NMR, RP-HPLC lub EA.
P r z y k ł a d 1 - Związek BW:
Do dichlorometanowego roztworu (20 ml) związku lxxxix (420 mg, 0,62 mmol) dodaje się reagent DMP (342 mg, 0,81 mmol). Mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze bliskiej pokojowej przez 1 godzinę i zalewa 10% Na2SO3 przez 20 minut. Powstałą mieszaninę ekstrahuje się następnie EtOAc. Warstwę organiczną przemywa się solanką, osusza się i zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem. Powstałą pozostałość oczyszcza się metodą chromatografii na żelu krzemionkowym (80% EtOAc/heksany) z wytworzeniem 208 mg (50%) związku BW,
PL 211 019 B1
P r z y k ł a d 2 - Związek CU
Związek cxxviii (356 mg, 0,52 mmol) rozpuszcza się w DCM (5 ml). Reagent DMP (270 mg, 0,63 mmol) dodaje się do tego roztworu i miesza 1 godzinę. Mieszaninę reakcyjną zalewa się 10% Na2SO3, a następnie fazę organiczną oddziela się i przemywa nasyconym NaHCO3 i solanką. Po zatężeniu organicznego rozpuszczalnika, pozostałość oczyszcza się chromatograficznie 100% EtOAc otrzymując związek CU (200 mg, 56,3%). temperatura topnienia 225-235°C.
Widma masowe [M] otrzymano dla następujących związków, jak pokazano w tablicy 1 poniżej.
T a b l i c a 1
Przykład Znaleziona masa
BW 679,3
CU 679,2
Wysokorozdzielcze widma masowe (HRMS) następujących związków otrzymano jak pokazano w tablicy 2.
T a b l i c a 2
Przykład Wzór cząsteczkowy (M+1) Obliczone widmo masowe (M+1) Masa znaleziona (M+1)
BW C36H54N7O6 680,4136 680,4126
CU C36H54N7O6 680,4136 680,4128
Przykład związku pośredniego 1 - Związek ii
Do etanolowego roztworu (40 ml) związku i (8,1 g, 24,4 mmol) dodaje się NaBH4 i (924 mg, 24,4 mmol) w temperaturze
-10°C. Mieszaninę reakcyjną miesza się w tej temperaturze przez 30 minut, a następnie zalewa AcOH (3 ml). Mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się EtOAc (250 ml) i przemywa NaHCO3 i solanką. Warstwę organiczną osusza się i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując pozostałość, którą oczyszPL 211 019 B1 cza się metodą chromatografii na żelu krzemionkowym (50% EtOAc/heksany) otrzymując 7,85 g (97%) związku ii,
Przykład związku pośredniego 2 - Związek iii
Do roztworu THF (70 ml) związku ii (4,48 g, 13,4 mmol) dodaje się w temperaturze 0°C NaH (699 mg, 60%, 17,42 mmol). Po wymieszaniu w tej temperaturze przez 40 minut, dodaje się Mel bez rozpuszczalnika (1,25 ml, 20,1 mmol). Mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze bliskiej pokojowej przez noc. W tym punkcie, mieszaninę reakcyjną zalewa się ostrożnie nasyconym roztworem NH4CI w temperaturze 0°C. Mieszaninę reakcyjną ekstrahuje się Et2O i EtOAc. Warstwę organiczną przemywa się wodą, solanką i osusza Na2SO4. Otrzymaną warstwę organiczną zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując związek ksantogenianowy iii,
Przykład związku pośredniego 3 - Związek iv
Związek ksantogenianowy iii (—13,4 mmol) rozpuszcza się w toluenie (100 ml). Do tego roztworu dodaje się AIBN (216 mg, 1,34 mmol). Powstały roztwór odgazowuje się suchym azotem i następnie traktuje n-Bu3SnH (5,4 ml, 20,1 mmol). Mieszaninę reakcyjną ogrzewa się w temperaturze 90°C przez 3 godziny. W tym punkcie, mieszaninę reakcyjną ochładza się do temperatury pokojowej i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem. Powstałą pozostałość oczyszcza się chromatograficznie na żelu krzemionkowym (15-20% EtOAc/heksany) otrzymując 2,8 g (66% łącznie ze związku ii) związku iv,
Przykład związku pośredniego 4 - Związek v
Do etanolowego roztworu (21 ml) związku iv (1 g, 3,15 mmol) dodaje się Pd(OH)2/C (655 mg, 20%, 0,95 mmol) w strumieniu azotu. Powstałą mieszaninę reakcyjną poddaje się standardowemu uwodornieniu (1,5 atm). Po 5 godzinach źródło wodoru usuwa się i mieszaninę reakcyjną przesącza. Przesącze zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując wolną aminę v,
v
PL 211 019 B1
Przykład związku pośredniego 5 - Związek lxxxix Związek lxxxviii, N-Cbz-L-walinę, (2,5 g, 9,9 mmol)
rozpuszcza się w THF (30 ml). Dodaje się EDCI (2,29 g, 11,9 mmol) i HOBT (1,62 g, 11,9 mmol) i mieszaninę miesza 5 minut, dodaje się chlorowodorek estru metylowego L-t-leucyny (2,17 g, 11,9 mmol) w THF (23,9 ml), a następnie DIPEA (2,1 ml). Mieszaninę reakcyjną miesza się przez noc pod azotem. Mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się octanem etylu, przemywa 1N HCl, nasyconym wodorowęglanem sodu i solanką. Fazę organiczną osusza się nad siarczanem sodu, przesącza i zatęża. Zatężoną pozostałość oczyszcza się 25% octanem etylu/heksanem otrzymując 1,1 g (29%) związku lxxxix.
Przykład związku pośredniego 6 - Związek cv
N-Boc-L-t-leucynę (2,3 g, 10 mmol) i chlorowodorek estru metylowego L-t-leucyny (2 g, 11 mmol) łączy się w DMF (30 ml). Następnie dodaje się do roztworu HOAt (1,6 g, 11,5 mmol). Powstałą mieszaninę miesza się przez 20 minut pod N2 i następnie obniża do 0°C, i dodaje się DIC (1,8 ml, 11,5 mmol) i 2,4,6-kolidynę (1,45 ml, 11 mmol). Powstały roztwór miesza się przez noc z ogrzewaniem do temperatury pokojowej. Mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się EtOAc i fazę organiczną przemywa 1N HCl, nasyconym NaHCO3 i solanką. Po zatężeniu fazy organicznej, powstałą pozostałość oczyszcza się chromatograficznie gradientem 20%-30% EtOAc/heksany otrzymując związek cv (3,3 g, 92%).
Przykład związku pośredniego 7 - Związek cvi
Związek cv (3,3 g, 9,2 mmol) hydrolizuje się stosując dioksan (40 ml) i 0,5N NaOH (37 ml, 18,4 mmol) otrzymując związek cvi (2,9 g, 92%).
PL 211 019 B1
Przykład związku pośredniego - Związek cvii
Związek cvi (2 g, 5,8 mmol) i związek v (1 g, 5,5 mmol) rozpuszcza się w DMF (20 ml). Następnie dodaje się do roztworu HOAt (832 mg, 6,6 mmol) i DIC (1,1 ml, 6,6 mmol). Powstały roztwór miesza się przez noc pod N2. Mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się EtOAc i fazę organiczną przemywa 1N HCl, nasyconym NaHCO3 i solanką. Po zatężeniu fazy organicznej, powstałą pozostałość oczyszcza się chromatograficznie gradientem 20%-30% EtOAc/heksany otrzymując związek cvii (2,4 g, 81%).
Przykład związku pośredniego 9 - Związek cxviii
Do roztworu DCM/THF (10 ml/2 ml) związku cvii (300 mg, 0,6 mmol) dodaje się PyBOP (416 mg, 0,8 mmol). Roztwór miesza się w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Do tego roztworu dodaje się następnie związek xxxvi' (200 mg, 0,8 mmol).
a następnie DIPEA (0,22 ml, 1,2 mmol). Mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej przez noc i następnie zalewa wodą (25 ml) na 30 minut. Mieszaninę ekstrahuje się następnie EtOAc. Powstałą fazę organiczną przemywa się solanką i osusza nad MgSO4, i zatęża otrzymując żółty olej. Oczyszczanie metodą chromatografii na żelu krzemionkowym (3-5% EtOH/EtOAc) daje związek cxviii (335 mg, 76%).
Farmakologia
Związki według wynalazku są przydatne ze względu na zdolność hamowania proteazy HCV, a wię c są również przydatne do hamowania replikacji HCV.
Sposób hamowania proteazy HCV obejmuje zetknięcie hamującej ilości przeciw proteazie HCV związku według wynalazku z kompozycją zawierającą proteazę HCV.
Sposób hamowania replikacji HCV obejmuje również zetknięcie HCV ze skuteczną ilością związku według wynalazku. Sposób leczenia pacjenta cierpiącego lub podatnego na infekcję HCV, obejmuje podawanie pacjentowi farmaceutycznie skutecznej ilości związku według wynalazku. Odnośniki do leczenia infekcji HCV powinno się rozumieć jako obejmujące profilaktyczną terapię zapobiegającą lub hamującą infekcję, jak też terapię ustalonej ostrej lub przewlekłej infekcji HCV lub stanów fizjologicznych związanych z infekcją HCV dla zasadniczego wyleczenia pacjenta z infekcji, zahamowania stopnia (wielkości) infekcji lub złagodzenia stanów fizjologicznych z nią związanych. Skuteczna
PL 211 019 B1 ilość ma opisywać ilość związku według wynalazku skuteczną w zakresie rozsądnej oceny biologicznej, odpowiednią do stosowania w kontakcie z komórkami ludzi i innych ssaków bez zbędnej toksyczności, podrażnienia, reakcji alergicznej i tym podobnych, i proporcjonalną do rozsądnego stosunku korzyść/ryzyko w leczeniu infekcji HCV, a więc powodującą żądany efekt leczniczy.
Stany fizjologiczne omówione w wynalazku obejmują pewne, lecz nie wszystkie, z możliwych klinicznych sytuacji, w których uzasadniona jest terapia przeciw HCV. Specjaliści w dziedzinie dobrze znają okoliczności wymagające terapii przeciw HCV.
Konkretnym aspektem wynalazku jest związek według wynalazku do podawania w postaci kompozycji farmaceutycznej, chociaż związek może być podawany odrębnie. Kompozycja farmaceutyczna oznacza kompozycję zawierającą związek według wynalazku i co najmniej jeden składnik wybrany z grupy obejmującej farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, rozcieńczalniki, powłoki, adiuwanty, zaróbki lub nośniki, takie jak konserwanty, wypełniacze, środki dezintegrujące, środki zwilżające, środki emulgujące, środki stabilizujące emulsję, środki tworzące zawiesiny, środki izotoniczne, środki słodzące, środki smakowe, środki zapachowe, środki barwiące, środki przeciwbakteryjne, środki przeciwgrzybicze, inne środki lecznicze, środki smarujące, środki opóźniające lub sprzyjające adsorpcji, i środki przygotowujące, w zależności od natury sposobu podawania i postaci dawek. Kompozycje mogą być sporządzane w postaci tabletek, pigułek, granulek, proszków, roztworów wodnych lub zawiesin, roztworów do wstrzykiwania, eliksirów lub syropów. Przykładowe tworzące zawiesiny środki obejmują oksyetylenowane alkohole izostearylowe, polioksyetylenowane estry sorbitolu i sorbitanu, mikrokrystaliczną celulozę, metawodorotlenek glinu, bentonit, agar-agar i tragakant, lub mieszaniny tych substancji. Przykładowe przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze środki do zapobiegania działaniu mikroorganizmów obejmują parabeny, chlorobutanol, fenol, kwas sorbowy, i tym podobne. Przykładowe izotoniczne środki obejmują cukry, chlorek sodu i tym podobne. Przykładowe środki opóźniające adsorpcję dla przedłużenia absorpcji obejmują monostearynian glinu i żelatynę. Przykładowe środki sprzyjające adsorpcji dla polepszenia absorpcji obejmują dimetylosulfotlenek i pokrewne analogi. Przykładowe nośniki, rozcieńczalniki, rozpuszczalniki, zaróbki, środki solubilizujące, emulgatory i stabilizatory emulsji, obejmują wodę, chloroform, sacharozę, etanol, alkohol izopropylowy, węglan etylu, octan etylu, alkohol benzylowy, alkohol tetrahydrofurfurylowy, benzoesan benzylu, poliole, glikol propylenowy, glikol 1,3-butylenowy, glicerynę, poli(glikole etylenowe), dimetyloformamid, Tween® 60, Span® 80, alkohol cetostearylowy, alkohol mirystylowy, mono-stearynian glicerylu i laurylosiarczan sodu, estry sorbitanu z kwasem tłuszczowym, oleje roślinne (takie jak olej z nasion bawełny, olej arachidowy, olej z zarodków kukurydzy, oliwa, olej rącznikowy i sezamowy) i organiczne estry do wstrzykiwania, takie jak oleinian etylu, i tym podobne, lub odpowiednie mieszaniny tych substancji. Przykładowe zaróbki obejmują laktozę, cukier mlekowy, cytrynian sodu, węglan wapnia, fosforan diwapnia. Przykładowe środki dezintegrujące obejmują skrobię, kwasy alginowe i pewne kompleksowe krzemiany. Przykładowe środki smarujące obejmują stearynian magnezu, laurylosiarczan sodu, talk, jak też poli(glikole etylenowe) o wysokiej masie cząsteczkowej.
W kombinacji ze związkiem według wynalazku można stosować inne środki lecznicze, w tym inne środki przeciw HCV. Pewne przykładowe znane środki przeciw HCV obejmują środki immunomodulacyjne, takie jak interferony a, β lub γ; pegylowane derywatyzowane interferony a, inne środki przeciwwirusowe, takie jak rybawiryna i amantadyna; inne inhibitory proteazy zapalenia wątroby C; inhibitory innych punktów docelowych w cyklu życiowym HCV, w tym helikazy, polimerazy, metaloproteazy, wewnętrznego wejścia do rybosomu, lub szerokozakresowe związki przeciwwirusowe, takie jak VX497, inhibitor komórkowej dehydrogenazy monofosforanu inozyny, IMPDH, obejmowany opisem patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5807876; lub ich kombinacje. Lecznicze środki stosowane w kombinacji ze związkiem według wynalazku mogą być podawane oddzielnie, równocześnie lub po kolei.
Dobór substancji w kompozycji farmaceutycznej, innych niż związek według wynalazku, określa się ogólnie zgodnie z chemicznymi właściwościami związku czynnego, takimi jak rozpuszczalność, konkretny tryb podawania i zasady przestrzegane w farmaceutycznej praktyce. Np., zaróbki, takie jak laktoza, cytrynian sodu, węglan wapnia, fosforan diwapnia i środki dezintegrujące, takie jak skrobia, kwasy alginowe i pewne kompleksowe krzemiany połączone ze środkami smarującymi, takimi jak stearynian magnezu, laurylosiarczan sodu i talk, można stosować do wytwarzania tabletek.
Kompozycje farmaceutyczne można sporządzać w postaci asortymentów, takich jak tabletki, pigułki, granulki, proszki, roztwory wodne lub zawiesiny, roztwory do wstrzykiwania, eliksiry lub syropy.
PL 211 019 B1
Ciekła postać dawki oznacza, że dawka czynnego związku do podawania pacjentowi jest w postaci ciekłej, np., farmaceutycznie dopuszczalnych emulsji, roztworów, zawiesin, syropów i eliksirów. Poza związkami czynnymi, ciekłe postaci dawek mogą zawierać obojętne rozcieńczalniki zwykle stosowane w dziedzinie, takie jak rozpuszczalniki, środki solubilizujące i emulgatory.
Stałe kompozycje można również stosować jako wypełniacze w miękkich i twardych napełnianych żelatynowych kapsułkach, z użyciem takich zaróbek, jak laktoza lub cukier mlekowy, jak też poli(glikole etylenowe) o wysokiej masie cząsteczkowej, i tym podobne.
Gdy stosuje się wodne zawiesiny, mogą one zawierać środki emulgujące lub środki, które ułatwiają tworzenie zawiesin.
Olejowa faza emulsyjnej kompozycji farmaceutycznej może być złożona ze znanych składników w znany sposób. Podczas gdy faza może obejmować po prostu emulgator (inaczej znany jako emulgent), korzystnie obejmuje mieszaninę co najmniej jednego emulgatora z tłuszczem lub olejem, lub z tłuszczem i olejem. Korzystnie zawiera hydrofilowy emulgator wraz z lipofilowym emulgatorem, który działa jako stabilizator. Korzystnie również zawiera olej i tłuszcz. Łącznie, emulgator (emulgatory) ze stabilizatorem (stabilizatorami) lub bez nich tworzą emulgujący wosk, a z olejem i tłuszczem stanowią podstawę emulgującą maści, tworzącą olejową zdyspergowaną fazę preparatu kremu.
Jeśli to pożądane, faza wodna podstawy kremu może obejmować, np., co najmniej 30% wagowych wielowodorotlenowego alkoholu, to jest alkoholu mającego dwie lub większą liczbę grup hydroksylowych, takiego jak glikol propylenowy, butano-1,3-diol, mannitol, sorbitol, gliceryna i poli(glikol etylenowy) (w tym PEG 400) i ich mieszaniny. Miejscowe preparaty mogą korzystnie obejmować związek, który polepsza absorpcję lub penetrację składnika czynnego przez skórę lub inne dotknięte obszary.
Dobór odpowiednich olejów lub tłuszczów do preparatu opiera się na osiąganiu żądanych kosmetycznych właściwości. Tak więc krem powinien korzystnie być nietłustym, nie-brudzącym i zmywalnym produktem z odpowiednią konsystencją dla uniknięcia wyciekania z tubek lub innych pojemników. Można stosować proste lub z rozgałęzionymi łańcuchami, mono- lub dwuzasadowe estry alkilowe, takie jak mirystynian di-izopropylu, oleinian decylu, palmitynian izopropylu, stearynian butylu, palmitynian 2-etyloheksylu lub mieszankę estrów o rozgałęzionych łańcuchach znaną jako Crodamol CAP. Można je stosować same lub w kombinacji w zależności od żądanych właściwości. Alternatywnie można stosować wysokotopliwe lipidy, takie jak biała miękka parafina i/lub ciekła parafina, lub inne oleje mineralne.
W praktyce, związek/kompozycję farmaceutyczną według wynalazku można podawać w odpowiednim preparacie ludziom i zwierzętom sposobem miejscowego lub układowego podawania, w tym doustnego, inhalacyjnego, doodbytniczego, donosowego, policzkowego, podjęzykowego, dopochwowego, dookrężniczego, pozajelitowego (w tym podskórnego, domięśniowego, dożylnego, doskórnego, dooponowego i nadtwardówkowego), podpotylicznego i dootrzewnowego. Należy rozumieć, że korzystna droga może być różna w zależności od np. stanu przyjmującego.
Farmaceutycznie dopuszczalne postaci dawek odnoszą się do postaci dawek związku według wynalazku, i obejmują, np., tabletki, drażetki, proszki, eliksiry, syropy, ciekłe preparaty, w tym zawiesiny, płyny do rozpylania, tabletki inhalacyjne, pastylki do ssania, emulsje, roztwory, granulki, kapsułki i czopki, jak też ciekłe preparaty do iniekcji, w tym preparaty liposomowe. Techniki i preparaty ogólnie można znaleźć w Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, ostatnie wydanie.
Preparaty odpowiednie do doustnego podawania można przygotowywać jako odrębne jednostki, takie jak kapsułki, opłatki lub tabletki, każda zawierająca określoną ilość składnika czynnego; jako proszku lub granulek; jak roztwór lub zawiesina w wodnej cieczy lub niewodnej cieczy; lub jako ciekła emulsja typu olej-w-wodzie lub woda-w-oleju. Składnik czynny można również przygotowywać jako dużą pigułkę, powidełko lub pastę.
Tabletkę można wytworzyć przez prasowanie lub formowanie, ewentualnie z jednym lub większą liczbą pomocniczych składników. Prasowane tabletki można wytwarzać przez prasowanie w odpowiednim urządzeniu składnika czynnego w sypkiej postaci, takiej jak proszek lub granulki, ewentualnie zmieszane ze środkiem wiążącym, środkiem smarującym, obojętnym rozcieńczalnikiem, konserwantem, środkiem powierzchniowo czynnym lub dyspergującym. Formowane tabletki można wytwarzać przez formowanie w odpowiednim urządzeniu mieszaniny sproszkowanych związków zwilżonych obojętnym ciekłym rozcieńczalnikiem. Tabletki można ewentualnie powlekać lub nacinać i można je komponować tak, aby uzyskać powolne lub kontrolowane uwalnianie składnika czynnego.
PL 211 019 B1
Stałe kompozycje do doodbytniczego podawania obejmują czopki skomponowane zgodnie ze znanymi sposobami, zawierające co najmniej jeden związek według wynalazku.
Jeśli to pożądane, i dla skuteczniejszej dystrybucji, związki można mikrokapsułkować, lub przyłączać, do systemów powolnego uwalniania lub docelowego dostarczania, takich jak biokompatybilne, biodegradujące matryce polimerowe (np., koglikolid poli(d,1-laktydu)), liposomy i mikrokulki, i wstrzykiwać podskórnie lub śródmięśniowo techniką nazywaną podskórnym lub domięśniowym depotem, osiągając ciągłe powolne uwalnianie związku (związków) przez okres 2 tygodnie lub dłuższy. Związki można sterylizować, np., metodą filtracji przez zatrzymujący bakterie filtr, lub włączając środki sterylizujące w postaci sterylnych stałych kompozycji, które można rozpuszczać w sterylnej wodzie, lub pewnym innym sterylnym ośrodku do wstrzykiwania natychmiast przed użyciem.
Preparaty odpowiednie do donosowego lub inhalacyjnego podawania oznaczają preparaty, które mają postać odpowiednią do podawania donosowo lub przez inhalację pacjentowi. Preparat może zawierać nośnik, w postaci proszku, o rozmiarach cząstek np. w zakresie 1 do 500 μm (w tym rozmiarach cząstek w zakresie pomiędzy 20 i 500 μm w odstępach co 5 μm, takich jak 30 μm, 35 μm, itp.) Odpowiednie preparaty, w których nośnikiem jest ciecz, do podawania jako np. płyn rozpylany do nosa lub krople do nosa, obejmują wodne lub olejowe roztwory składnika czynnego. Preparaty odpowiednie do aerozolowego podawania można wytwarzać zgodnie z konwencjonalnymi sposobami i można go dostarczać z innymi leczniczymi środkami. Inhalacyjną terapię łatwo realizuje się inhalatorami odmierzającymi dawkę.
Preparaty odpowiednie do doustnego podawania oznacza preparaty, które mają postać odpowiednią do podawania doustnego pacjentowi. Preparaty można podawać jako odrębne jednostki, takie jak kapsułki, opłatki lub tabletki, każda zawierająca określoną ilość składnika czynnego; jako proszek lub granulki; jako roztwór lub zawiesinę w wodnej cieczy lub niewodnej cieczy; lub jako ciekłą emulsję olej-w-wodzie lub woda-w-oleju. Składnik czynny można również podawać jako dużą pigułkę, powidełko lub pastę.
Preparaty odpowiednie do pozajelitowego podawania oznaczają preparaty, które mają postać odpowiednią do podawania pozajelitowego pacjentowi. Preparaty są sterylne i obejmują emulsje, zawiesiny, wodne i niewodne roztwory do iniekcji, które mogą zawierać środki tworzące zawiesiny i środki zagęszczające oraz przeciwutleniacze, bufory, środki bakteriostatyczne i substancje nadające preparatowi izotoniczność, i mają dogodnie ustawione pH, zgodnie z krwią przeszłego pacjenta.
Preparaty odpowiednie do dodobytniczego lub dopochwowego podawania oznaczają preparaty, które mają postać odpowiednią do podawania doodbytniczo lub dopochwowo pacjentowi. Preparat ma korzystnie postać czopków, które można wytwarzać mieszając związki według wynalazku z odpowiednimi niedrażniącymi zaróbkami lub nośnikami, takimi jak masło kakaowe, poli(glikol etylenowy) lub wosk na czopki, które są stałe w zwykłych temperaturach, lecz ciekłe w temperaturze ciała, a więc topią się w odbycie lub jamie pochwy i uwalniania składnik czynny.
Preparaty odpowiednie do układowego podawania oznacza preparaty, które mają postać odpowiednią do podawania układowego pacjentowi. Preparat korzystnie podaje się przez iniekcję, w tym domięśniową, dożylną, dootrzewnową i podskórną. Do iniekcji związki według wynalazku komponuje się w ciekłe roztwory, korzystnie w fizjologicznie zgodnych buforach, takich jak roztwór Hanka lub Ringera. Ponadto, związki można komponować w postać stałą i rozpuszczać lub zawieszać tuż przed użyciem. Stosuje się też formy liofilizowane. Układowe podawanie może być również przezśluzówkowe lub przezskórne, lub związki mogą być podawane doustnie. Dla przezśluzówkowego lub przezskórnego podawania, stosuje się w preparacie środki penetrujące właściwe dla przekraczanej bariery. Takie środki penetrujące są ogólnie znane w dziedzinie, i obejmują, np., sole kwasów żółciowych i pochodne kwasu fusydowego do przezśluzówkowego podawania. Ponadto można stosować detergenty dla ułatwienia przepuszczania. Podawanie przezśluzówkowe może zachodzić np. przez stosowanie płynów rozpylanych do nosa lub czopków. Do doustnego podawania, związki komponuje się w konwencjonalne doustne postaci do podawania, takie jak kapsułki, tabletki i środki tonizujące.
Preparaty odpowiednie do miejscowego podawania oznaczają preparaty, które mają postać odpowiednią do podawania miejscowego pacjentowi. Preparat można sporządzić jako miejscową maść, balsamy, proszki, płyny do rozpylania i inhalacji, żele (wodne lub alkoholowe), kremy, jak ogólnie znane, lub włączyć w podstawę matrycy do stosowania w plastrach, które pozwolą na kontrolowane uwalnianie związku przez barierę skóry. Przy komponowaniu w maść, składniki czynne można stosować z podstawą maści parafinową lub mieszalną z wodą. Alternatywnie, składniki czynne można komponować w krem z podstawą typu olej-w-wodzie. Preparaty odpowiednie do miejscowego podaPL 211 019 B1 wania do oczu obejmują krople do oczu, w których składnik czynny rozpuszcza się lub zawiesza w odpowiednim nośniku, zwłaszcza wodnym rozpuszczalniku składnika czynnego. Preparaty odpowiednie do miejscowego podawania do ust obejmują pastylki do ssania zawierające składnik czynny w podstawie smakowej, zwykle sacharozie i gumie arabskiej lub tragakantowej; pastylki zawierające składnik czynny w obojętnej podstawie, takiej jak żelatyna i gliceryna, lub sacharoza i guma arabska; oraz płukanki do ust zawierające składnik czynny w odpowiednim ciekłym nośniku.
Stała postać dawki oznacza, że postać dawki związku według wynalazku jest stała, np., kapsułka, tabletki, pigułki, proszki, drażetki lub granulki. W takich stałych postaciach dawek, związek według wynalazku miesza się z co najmniej jedną obojętną stałą zaróbką (lub nośnikiem) takim jak cytrynian sodu lub fosforan diwapnia lub (a) wypełniaczami lub zaróbkami, jak np., skrobie, laktoza, sacharoza, glukoza, mannitol i kwas krzemowy, (b) środkami wiążącymi, jak np., karboksymetyloceluloza, alginiany, żelatyna, poliwinylopirolidon, sacharoza i guma arabska, (c) środkami utrzymującymi wilgoć, jak np., gliceryna, (d) środkami dezintegrującymi, jak np., agar-agar, węglan wapnia, skrobia ziemniaczana lub tapiokowa, kwas alginowy, pewne kompleksowe krzemiany i węglan sodu, (e) opóźniaczami roztwarzania, jak np., parafina, (f) przyśpieszaczami absorpcji, jak np., czwartorzędowe związki amoniowe, (g) środkami zwilżającymi, jak np., alkohol cetylowy i monostearynian gliceryny, (h) adsorbentami, jak np., kaolin i bentonit, (i) środkami smarującymi, jak np., talk, stearynian wapnia, stearynian magnezu, stałe poli(glikole etylenowe), laurylosiarczan sodu, (j) środkami zmętniającymi, (k) środkami buforującymi, i środkami, które uwalniają związek (związki) według wynalazku w pewnej części przewodu jelitowego w sposób opóźniony.
Rzeczywiste poziomy dawkowania składnika (składników) czynnych w kompozycjach według wynalazku można zmieniać tak, aby uzyskać ilość składnika (składników) czynnych skutecznie dających pożądaną reakcję leczniczą dla konkretnej kompozycji i sposobu podawania pacjentowi. Wybrany poziom dawkowania dla dowolnego konkretnego pacjenta zależy więc od wielu czynników, w tym żądanego leczniczego efektu, drogi podawania, pożądanego czasu trwania terapii, etiologii i ostrości choroby, stanu pacjenta, masy, płci, diety i wieku, typu i siły każdego składnika czynnego, szybkości absorpcji, metabolizmu i/lub wydalania i innych czynników.
Łączna dzienna dawka związków według wynalazku podawana pacjentowi w pojedynczej lub w podzielonych dawkach może stanowić ilości, np., od około 0,001 do około 100 mg/kg masy ciała dziennie i korzystnie 0,01 do 10 mg/kg dziennie. Np., u dorosłych, dawki wynoszą ogólnie od około 0,01 do około 100, korzystnie około 0,01 do około 10 mg/kg masy ciała dziennie przez inhalację, od około 0,01 do około 100, korzystnie 0,1 do 70, zwłaszcza 0,5 do 10 mg/kg masy ciała dziennie przez doustne podawanie, i od około 0,01 do około 50, korzystnie 0,01 do 10 mg/kg masy ciała dziennie przez dożylne podawanie. Procent składnika czynnego w kompozycji może się wahać, chociaż powinien stanowić część taką, że otrzyma się odpowiednią dawkę. Kompozycje dawki jednostkowej mogą zawierać takie ilości takich jej podwielokrotności, jakie można stosować dla pobrania dziennej dawki. Oczywiście, kilka jednostkowych postaci dawek można podawać w przybliżeniu w tym samym czasie. Dawkę można podawać tak często, jak to konieczne, dla uzyskania żądanego działania leczniczego. Pewni pacjenci mogą reagować gwałtownie na wyższą lub niższą dawkę i mogą jako odpowiednie przyjmować znacznie słabsze dawki podtrzymujące. Dla innych pacjentów może być konieczna długoterminowa terapia przy ilości od 1 do 4 dawek dziennie, zgodnie z fizjologicznymi wymaganiami każdego pacjenta. Dla niektórych pacjentów będzie konieczne przepisanie nie więcej niż jednej lub dwu dawek dziennie.
Preparaty można wytwarzać w postaci dawki jednostkowej dowolnym ze sposobów dobrze znanych w dziedzinie farmacji. Takie sposoby obejmują etap połączenia składnika czynnego z nośnikiem złożonym z jednego lub większej liczby pomocniczych składników. W ogólności preparaty wytwarza się przez równomierne i dokładne połączenie składnika czynnego z ciekłymi nośnikami lub dobrze rozdrobnionymi stałymi nośnikami, lub jednymi i drugimi, a następnie, jeśli to konieczne, ukształtowanie produktu.
Preparaty można przygotowywać w jednodawkowych lub wielodawkowych pojemnikach, np. zatopionych ampułkach i fiolkach z elastomerycznymi korkami, i można je przechowywać w osuszanym przez wymrożenie (liofilizowanym) stanie wymagającym tylko dodania sterylnego ciekłego nośnika, np. wody do iniekcji, natychmiast przed użyciem. Przygotowywane przed użyciem roztwory i zawiesiny do iniekcji można wytwarzać ze sterylnych proszków, granulek i tabletek rodzaju poprzednio opisanych.
PL 211 019 B1
Związki według wynalazku wykazują znaczące aktywności farmakologiczne zgodnie z testami opisanymi w literaturze i poniżej, których wyniki wydają się korelować z farmakologiczną aktywnością u ludzi i innych ssaków.
PROCEDURA TESTU ENZYMATYCZNEGO IN VITRO
Inhibicja proteazy serynowej NS3 HCV
Domenę proteazy NS3 HCV poddano ekspresji i oczyszczono jak opisano poprzednio (Vertex, publikacja PCT WO 98/17679; dołączana niniejszym jako odnośnik literaturowy). Chromogenny substrat peptydu, EDVVAbuC-p-nitroanilid, i fragment kofactora NS4A (-KKGSVVIVGRIVLSGK-) dla proteazy NS3 zsyntetyzowano w firmie American Peptide Com (Ca). Związki według wynalazku testowano na ich zdolność do hamowania aktywności proteazy NS3 HCV stosując test spektrofotometryczny z EDVVAbuC-p-nitroanilidem jako substratem. Test wykonano na 96-dołkowej płytce do mikromiareczkowania stosując czytnik SpectraMax 250 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) z możliwościami kinetycznymi. Rozcinanie substratu, EDWAbuC-p-nitroanilidu (500 μM) przez oczyszczoną proteazę NS3 HCV (0,5 μM) przeprowadzono w temperaturze 30°C w buforze zawierającym 30 μM fragmentu NS4A, 46 mM Hepes, pH 8, 0,92 mM NaCl, 18% gliceryny, 5 mM DTT, i 7,5% DMSO w nieobecności lub obecności testowanego związku. Reakcję monitorowano uwalnianie pNA (p-nitroaniliny) przy 405 nm.
Określanie kinetycznych parametrów, w tym Vmax, Km i Vmax/Km przeprowadza się w warunkach jak opisano wyżej. Wartości Ki obliczono z wykresów szybkości względem [stężenia inhibitora], przy ustalonych stężeniach enzymu i substratu, przez dopasowanie nieliniowe danych metodą najmniejszych kwadratów do równania Morrisona dla hamowania współzawodniczącego silnego wiązania [J. F. Morrison, Biochim. Biophys. Acta., 185, 269-286 (1969)]. Do tej procedury stosuje się program Prism (GraphPad Software, Inc.).
Inhibitory proteazy serynowej HCV ujawnione w wynalazku można stosować w kombinacji z innymi cząsteczkami, które bezpośrednio wykazują lub pośrednio wywołują aktywność przeciw HCV albo zapobiegawczo u pacjentów zagrożonych infekcją HCV, lub do leczenia pacjentów już zainfekowanych. Termin aktywność przeciw HCV odnosi się do zdolności cząsteczki, jeśli występuje, do całkowitego hamowania lub zmniejszania akumulacji wirionów HCV w porównaniu z akumulacją wirionów HCV w nieobecności takiej cząsteczki, i/lub zdolności cząsteczki do cofania lub łagodzenia stanów lub objawów związanych z infekcją HCV lub patogenezą u pacjentów. Cząsteczki wykazujące aktywność przeciw HCV obejmują te, które zrywają jeden lub większą liczbę etapów infekcji lub replikacji HCV, jak też te, które wywołują działania immunomodulacyjne i przeciwrozrostowe w komórkach gospodarza. Cząsteczki wykazujące aktywność przeciw HCV mogą hamować specyficzne dla HCV działania replikacyjne, takie jak, między innymi, syntezę kwasu nukleinowego lub białka skierowaną na HCV. Etapy replikacji HCV, w których mogą działać cząsteczki wykazujące aktywność przeciw HCV, obejmują wchodzenie do cząsteczki (np., wiązanie; penetrację); wchłanianie i uwalnianie genomu HCV; replikację genomu HCV (np., replikację jednej z nici genomu wirusowego RNA; transkrypcję wirusowego informacyjnego RNA); translację białek HCV; potranslacyjną modyfikację białek HCV (np., rozcinanie proteolityczne; glikozylację); transport wewnątrzkomórkowy białek wirusowych; zestawianie składników wirionu; oraz uwalnianie cząstek wirusa (np., pączkowanie). Klasy cząsteczek wykazujących przeciwwirusową aktywność obejmują między innymi rozpuszczalne receptorowe przynęty i antyreceptorowe przeciwciała; blokery kanału jonowego, stabilizatory kapsydu, oraz inhibitory białka fuzyjnego; inhibitory wirusowych polimeraz, odwrotnej transkryptazy, helikazy, prymazy, lub integrazy; oligonukleotydy antysensowne i rybozymy; środki immunomodulacyjne i immunostymulacyjne, w tym cytokiny, takie jak interferony, jak też agoniści peptydów, sterydy, oraz klasyczne leki, takie jak lewamisol; inhibitory białek regulacyjnych; inhibitory proteazy; inhibitory białek zestawiających; oraz przeciwwirusowe przeciwciała i cytotoksyczne limfocyty. Termin ilość skuteczna przeciw HCV lub farmaceutycznie skuteczna ilość odnosi się do ilości związku, lub kombinacji związków ujawnionych w wynalazku, skutecznej w osłabianiu lub łagodzeniu stanów lub objawów związanych z infekcją HCV lub pokrewnymi patogenezami u pacjentów, lub w zmniejszaniu poziomu wirusów in vitro lub in vivo. Zastosowania in vitro obejmują system testu replikonu, opisany poniżej, gdzie takie ilości są skuteczne w zmniejszaniu akumulacji RNA replikonu HCV i/lub akumulacji białek kodowanych przez geny zawarte w nich.
Związki wykazujące aktywność przeciw HCV brane pod uwagę do stosowania w kompozycjach i sposobach terapii kombinowanej ujawnionych w wynalazku obejmują między innymi cząsteczki immunomodulujące, w tym immunostymulacyjne cytokiny, i inne związki znane z aktywności przeciw wirusowi HCV, takie jak różne przeciwwirusowe nukleozydy i nukleotydy.
PL 211 019 B1
Immunomodulujące cząsteczki brane pod uwagę do stosowania w kombinacji z inhibitorami proteazy serynowej HCV ujawnione w wynalazku obejmują między innymi interferon-alfa 2B (Intron A, Sobering Plough); Rebatron (Schering Plough, Interferon-alfa 2B + rybawiryna); pegylowany interferon alfa (Reddy, K. R. i in. Efficacy and safety of pegylated (40-kd) interferon alfa-2a compared with interferon alfa-2a in noncirrhotic patients with chronic hepatitis C. Hepatology 33, 433-438 (2001)); consensus interferon (Kao, J. H. , Chen, P. J., Lai, M. Y. & Chen, D. S. Efficacy of consensus interferon in the treatment of chronic hepatitis C. J. Gastroenterol. Hepatol. 15, 1418-1423 (2000)); interferon-alfa 2A (Roferon A; Roche); limfoblastoidalny lub naturalny interferon; interferon tau (Clayette, P. i in. IFN-tau, a new interferon type I with antiretroviral activity, Pathol. Biol. (Paris) 47, 553-559 (1999)); interleukinę 2 (Davis, G. L., Nelson, D. R. & Reyes, G. R. Future options for the management of hepatitis C. Seminars in Liver Disease 19, 103-112 (1999)); Interleukinę 6 (Davis, G. L., Nelson, D. R. & Reyes, G. R. Future options for the management of hepatitis C. Seminars in Liver Disease 19, 103-112 (1999)); Interleukinę 12 (Davis, G. L., Nelson, D. R. & Reyes, G. R. Future options for the management of hepatitis C. Seminars in Liver Disease 19, 103-112 (1999)); rybawirynę; i związki ułatwiające rozwój reakcji komórkowej limfocytu T wspomagającego typu 1 (Davis, G. L., Nelson, D. R. Sc Reyes, G. R. Future options for the management of hepatitis C. Seminars in Liver Disease 19, 103-112 (1999)). Interferony mogą łagodzić wirusowe infekcje wywierając bezpośrednie przeciwwirusowe działanie i/lub modyfikując odpowiedź immunologiczną na infekcję. Przeciwwirusowe działanie interferonów jest często mediowane inhibicją penetracji lub wnikania wirusa, syntezą wirusowego RNA, translacją wirusowych białek, i/lub składania i uwalniania wirusa.
Związki stymulujące syntezę interferonu w komórkach (Tazulakhova, E. B., Parshina, O. V., Gusev, T. S. & Ershov, F. I. Russian Experience in Screening, Analysis, and Clinical Application of Novel Interferon Inducers. J. Interferon Cytokine Res. 21, 65-73)) obejmują między innymi dwuniciowy RNA, sam lub w kombinacji z tobramycyną, oraz Imiquimod (3M Pharmaceuticals) (Sauder, D. N. Immunomodulatory and pharmacologic properties of imiquimod, J. Am. Acad. Dermatol. 43, S6-11 (2000)).
Inne związki znane z wykazywania, lub ewentualnego wykazywania, aktywności przeciw wirusowi HCV dzięki nieimmunomodulacyjnym mechanizmom obejmują między innymi rybawirynę (ICN Pharmaceuticals); inhibitory dehydrogenazy 5'-monofosforanu inozyny (VX-497, w opracowaniu w Vertex Pharmaceuticals); amantadynę i rymantadynę (Younossi, A. M. i Perillo, R. P. The roles of amantadine, rimantadine, ursodeoksycholic acid, NSAIDs, alone lub in combination with alpha interferons, in the treatment of chronic hepatitis C. Seminars in Liver Disease 19, 95-102 (1999)); LY217896 (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4835168) (Colacino, J. M. i in. Evaluation of the anti-influenza virus activities of 1,3,4-thiadiazol-2-ylcyanamide (LY217896) i its sodium salt. Antimicrobial Agents & Chemotherapy 34, 2156-2163 (1990)); i 9-Hydroxyimino-6-methoxy-1,4a-dimethyl-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-phenanthrene-1-carboxylic acid methyl ester; 6-Methoxy-1,4a-dimethyl-9-(4-methyl-piperazin-1-ylimino)-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-phenanthrene-1-carboxylic acid methyl ester hydrochloride; 1-(2-Chloro-phenyl)-3-(2,2-diphenylethyl)urea (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 6127422).
Preparaty, dawki i drogi podawania powyższych cząsteczek są podane w odnośnikach cytowanych poniżej, lub oznaczają dobrze znane w dziedzinie, jak podaje, np., F. G. Hayden, w Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, wyd. 9, red. Hardman i in., McGraw-Hill, New York (1996), rozdz. 50, str. 1191-1223, i cytowane tam odnośniki. Alternatywnie, po zidentyfikowaniu związku wykazującego aktywność przeciw wirusowi HCV, farmaceutycznie skuteczną ilość tego związku można określić stosując techniki dobrze znane specjaliście. Można wymienić, np., Beneta i in., w Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, wyd. 9, red. Hardman i in., McGraw-Hill, New York (1996), rozdz. 1, str. 3-27, i cytowane tam odnośniki. Tak więc odpowiednie preparaty, zakresy dawek i reżimy dawkowania takiego związku można łatwo określić rutynowymi sposobami.
Kombinacje leków według wynalazku można dostarczać do komórki lub komórek, lub ludzkiemu pacjentowi, w odrębnych farmaceutycznie dopuszczalnych preparatach podawanych równocześnie lub po kolei, zawierających więcej niż jeden środek leczniczy, lub jako zestaw pojedynczych środków i preparaty wielu środków. Jakkolwiek podawane, takie kombinacje leków stanowią ilość składników skuteczną przeciw HCV.
Wiele innych immunomodulatorów i immunostymulantów, które można stosować jest obecnie dostępnych i obejmują one: AA-2G; dipeptyd adamantyloamidowy; deaminazę adenozyny, Enzon; adiuwant, Alliance; adiuwanty, Ribi; adiuwanty, Vaxcel; Adjuvax; agelasfinę-11; lek na AIDS, Chiron;
PL 211 019 B1 glukan algalu, SRI; algammulinę, Anutech; Anginlyc; czynniki przeciwkomórkowe, Yeda; Anticort; immunogen antygastryny-17, Ap; system dostarczania antygenu, Vac; preparat antygenu, IDBC; immunogen antiGnRH, Aphton; Antiherpin; Arbidol; azarol; Bay-q-8939; Bay-r-1005; BCH-1393; Betafectin; Biostim; BL-001; BL-009; Broncostat; Cantastim; CDRI-84-246; cefodizym; inhibitory chemokin, ICOS; peptydy CMV, City of Hope; CN-5888; środek uwalniający cytokiny, St; DHEAS, Paradigm; DISC TA-HSV; J07B; l01A; l01Z; ditiokarb sodowy; ECA-10-142; ELS-1; endotoksynę, Novartis; FCE-20696; CE-24089; FCE-24578; ligand FLT-3, Immunex; FR-900483; FR-900494; FR-901235; FTS-Zn; białka G, Cadus; gludapcynę; glutaurynę; glikofosfopeptykal; GM-2; GM-53; GMDP; szczepionkę czynnika wzrostu, EntreM; H-BIG, NABI; H-CIG, NABI; HAB-439; szczepionkę Helicobacter pylori; herpes-specific immune factor; HIV therapy. United Biomed; HyperGAM+CF; Immumax; Immun BCG; terapia odpornościowa, Connective; immunomodulator, Evans; immunomodulatory, Novacell; imreg-1; imreg-2; Indomune; pranobeks inozyny; interferon, Dong-A (alfa2); interferon, Genentech (gamma); interferon, Novartis (alfa); interleukina-12, Genetics Ins; interleukina-15, Immunex; interleukina-16. Research Cor; lSCAR-1; J005X; L-644257; kwas likomarazminowy; LipoTher; LK-409; LK-410; LP-2307; LT (R1926); LW-50020; MAF, Shionogi; pochodne MDP, Merck; metenkefalina, TNI; metylofurylobutyrolaktony; MIMP; mirimostim; mieszana bakteryjna szczepionka. Tem; MM-1; moniliastat; MPLA, Ribi; MS-705; murabutyd; murabutyd, Vacsyn; pochodna dipeptydu muramylu; pochodne peptydu muramylu, myelopid; - 563; NACOS-6; NH-765; NISV, Proteus; NPT-16416; NT-002; PA-485; PFA-814; peptydy, Scios; peptydoglikan, Pliva; Perthon, Advanced Plant; pochodna PGM, Pliva; Pharmaprojects nr 1099; nr 1426; nr 1549; nr 1585; nr 1607; nr 1710; nr 1779; nr 2002; nr 2060; nr 2795; nr 3088; nr 3111; nr 3345; nr 3467; nr 3668; nr 3998; nr 3999; nr 4089; nr 4188; nr 4451; nr 4500; nr 4689; nr 4833; nr 494; nr 5217; nr 530; pidotimod; pimelautyd; pinafid PMD-589; podofilotoksyna, Conpharm; POL-509; poly-ICLC; poly-ICLC, Yamasa Shoyu; PolyA-PolyU; Polysaccharide A; białko A, Berlox Bioscience; PS34WO; MAbs Pseudomonas, Teljin; Psomaglobin; PTL-78419; Pyrexol; piryferon; Retrogen; Retropep; RG-003 ; Rhinostat; rifamaksil; RM-06; Rollin; romurtyd; RU-40555; RU-41821; przeciwciała Rubella, ResCo; S-27609; SB-73; SDZ-280-636; SDZ-MRL-953; SK & F-107647; SL04; SL05; SM-4333; Solutein; SRI-62-834; SRL-172; ST-570; ST-789; lizat stafaga; Stimulon; supresyna; T-150R1; T-LCEF; tabilautyd; temurtyd; Theradigm-HBV; Theradigm-HPV; Theradigm-HSV; THF, Pharm & Upjohn; THF, Yeda; tymalfasyna; frakcje hormonu grasicy; tymokartyna; tymolimfotropina; tymopentyna; analogi tymopentyny; tymopentyna, Peptech; frakcja 5 tymozyny, Alpha; tymostymulina; tymotrinan; TMD-232; TO-115; czynnik przenoszący, Viragen; tuftsin, Selavo; ubenimeks; Ulsastat; ANGG-; CD-4+; Collag+; COLSF+; COM+; DA-A+; GAST-; GF-TH+; GP-120-; IF+; IF-A+; IF-A-2+; IF-B+; IF-G+; IF-G-1B+; IL-2+; IL-12+; IL-15+; IM+; LHRH-; LIPCOR+L LYM-B+; LYM-NK+; LYM-T+; OPI+; PEP+; PHG-MA+; RNA-SYN-; SY-CW-; TH-A-1+; TH-5+; TNF+; UN.
Reprezentatywne nukleozydowe i nukleotydowe związki przydatne w wynalazku obejmują, między innymi:
(+)-cis-5-fluoro-1-[2-(hydroksy-metylo)-[1,3-oksatiolan-5-ylo]cytozynę; (-)-2'-dezoksy-3'-tiocytydyno-5'-trifosforan (3TC);
(-)-cis-5-fluoro-1-[2-(hydroksy-metylo)-[1,3-oksatiolan-5-ylo]cytozynę (FTC);
(-)2',3'-[(-)-SddC];
1-(2'-deoksy-2'-fluoro-beta-D-arabinofuranozylo)-5-jodocytozynę (FIAC); trifosforan 1-(2'-dezoksy-2'-fluoro-beta-D-arabinofuranozylo)-5-jodocytozyny; 1-(2'-dezoksy-2'-fluoro-beta-D-arabinofuranozylo)-5-metylouracyl (FMAU); 1-beta-D-rybofuranozylo-1,2,4-triazolo-3-karboksamid;
2',3'-didezoksy-3'-fluoro-5-metylo-deksocytydynę (FddMeCyt); 2',3'-didezoksy-3'-chloro-5-metylo-deksocytydynę (ClddMeCyt); 2',3'-didezoksy-3'-amino-5-metylo-deksocytydynę (AddMeCyt); 2',3'-didezoksy-3'-fluoro-5-metylo-cytydynę (FddMeCyt); 2',3'-didezoksy-3'-chloro-5-metylo-cytydynę (ClddMeCyt); 2',3'-didezoksy-3'-amino-5-metylo-cytydynę (AddMeCyt);
2',3'-didezoksy-3'-fluorotymidynę (FddThd);
2',3'-didezoksy-beta-L-5-fluorocytydynę (beta-L-FddC);
2',3'-didezoksy-beta-L-5-tiacytydynę;
2',3'-didezoksy-beta-L-5-cytydynę (beta-L-ddC);
9-(1,3-dihydroksy-2-propoksymetylo)guaninę;
2'-dezoksy-3'-tia-5-fluorocytozynę;
PL 211 019 B1
3'-amino-5-metylo-deksocytydynę (AddMeCyt);
2-amino-1,9-[(2-hydroksymetylo-1-(hydroksymetylo)etoksy]metylo]-6H-puryn-6-on (gancyklowir); dioctan 2-[2-(2-amino-9H-puryn-9-ylo)etylo]-1,3-propandilu (famcyklowir); 2-amino-1,9-dihydro-9-[(2-hydroksy-etoksy)metylo]-6H-puryn-6 on (acyklowir); 9-(4-hydroksy-3-hydroksymetylo-but-1-ylo)guanina (pencyklowir); dioctan 9-(4-hydroksy-3-hydroksymetylo-but-1-ylo)-6-dezoksy-guanina (famcyklowir); 3'-azydo-3'-dezoksytymidynę (AZT);
3'-chloro-5-metylo-deksocytydynę (ClddMeCyt);
9-(2-fosfonylometoksyetylo)-2',6'-diaminopuryno-2',3'-didezoksyrybozyd;
9-(2-fosfonylometoksyetylo)adeninę (PMEA); trifosforan acyklowiru;
D-karbocyklo-2'-dezoksyguanozynę (CdG); didezoksy-cytydynę; didezoksy-cytozynę (ddC); didezoksy-guaninę (ddG); didezoksy-inozynę (ddl);
trifosforan E-5-(2-bromowinylo)-2'-dezoksyurydyny; fluoro-arabinofuranozylo-jodouracyl;
1- (2'-dezoksy-2'-fluoro-1-beta-D-arabinofuranozylo)-5-jodouracyl (FIAU); stawudynę;
monohydrat 9-beta-D-arabinofuranozylo-9H-puryno-6-aminy (Ara-A);
monohydrat 9-beta-D-arabinofuranozylo-9H-puryno-6-amino-5'-monofosforanu (Ara-AMP);
2- dezoksy-3'-tia-5-fluorocytydynę;
2',3'-didezoksy-guaninę; i
2',3'-didezoksy-guanozynę.
Syntetyczne metody wytwarzania nukleozydów i nukleotydów przydatne w wynalazku są dobrze znane w dziedzinie, jak ujawniono w Acta Biochim. Pol., 43, 25-36 (1996); Swed. Nucleosides Nucleotides 15, 361-378 (1996); Synthesis 12, 1465-1479 (1995); Carbohyd. Chem. 27, 242-276 (1995); Chem. Nucleosides Nucleotides 3, 421-535 (1994); Ann. Reports in Med. Chem., Academic Press; i Exp. Opin. Invest. Drugs 4, 95-115 (1995).
Reakcje chemiczne opisane w odnośnikach cytowanych powyżej są ogólnie ujawnione w kategoriach ich najszerszego zastosowania do wytwarzania związków według wynalazku. Sporadycznie, reakcje mogą nie być przydatne, jak opisano przy każdym związku obejmowanym zakresem związków ujawnionych w wynalazku. Związki, dla których to zachodzi, będą łatwo odróżniane przez specjalistów w dziedzinie. We wszystkich takich przypadkach, reakcje można pomyślnie przeprowadzić dokonując konwencjonalnych modyfikacji znanych specjalistom w dziedzinie, np., przez odpowiednie zabezpieczenie przeszkadzających grup, przez zmienianie alternatywnych konwencjonalnych reagentów, przez zwykłe modyfikacje warunków reakcji, i tym podobnych, lub inne reakcje ujawnione w wynalazku lub konwencjonalne będą przydatne do wytwarzania odpowiednich związków według wynalazku. We wszystkich sposobach preparatywnych, wszystkie substraty są znane lub łatwo wytwarzane ze znanych substratów.
Chociaż analogi nukleozydów są zwykle stosowane jako środki przeciwwirusowe jako takie, nukleotydy (fosforany nukleozydów) musi się czasami przekształcać w nukleozydy dla ułatwienia ich transportu przez błony komórkowe. Przykładem chemicznie zmodyfikowanego nukleotydu zdolnego do wejścia do komórki jest S-1-3-hydroksy-2-fosfonylometoksypropylocytozyna (HPMPC, Gilead Sciences). Nukleozydowe i nukleotydowe związki według wynalazku, które są kwasami, mogą tworzyć sole. Przykłady obejmują sole z metalami alkalicznymi lub metalami ziem alkalicznych, takimi jak sód, potas, wapń lub magnez, lub z organicznymi zasadami lub zasadowymi czwartorzędowymi solami amoniowymi.
Immunomodulatory i immunostymulanty przydatne w sposobach terapii kombinowanej można podawać w ilościach niższych niż ilości konwencjonalne w dziedzinie. Np., interferon alfa jest typowo podawany ludziom w leczeniu infekcji HCV w ilości od około 1x106 jednostek/osobę trzy razy na tydzień do około 10x106 jednostek/osobę trzy razy na tydzień (Simon i in., Hepatology 25: 445-448 (1997)). W sposobach i kompozycjach taka dawka może mieścić się w zakresie od około 0,1x106 jednostek/osobę trzy razy na tydzień do około 7,5x106 jednostek/osobę trzy razy na tydzień; korzystniej od około 0,5x106 jednostek/osobę trzy razy na tydzień do około 5x106 jednostek/osobę trzy razy na
PL 211 019 B1 tydzień; najkorzystniej od około 1x106 jednostek/osobę trzy razy na tydzień do około 3x106 jednostek/osobę trzy razy na tydzień. Dzięki polepszonej skuteczności przeciwwirusowej wobec wirusa zapalenia wątroby C immunomodulatorów i immunostymulantów w obecności inhibitorów proteazy serynowej HCV według wynalazku, można stosować zmniejszone ilości tych immunomodulatorów/immunostymulantów w sposobach i kompozycjach ujawnionych w wynalazku. Podobnie, dzięki polepszonej skuteczności przeciwwirusowej wobec wirusa zapalenia wątroby C niniejszych inhibitorów proteazy serynowej HCV w obecności immunomodulatorów i immunostymulantów, można stosować zmniejszone ilości tych inhibitorów proteazy serynowej HCV w sposobach i kompozycjach ujawnionych w wynalazku. Takie zmniejszone ilości można określić przez rutynowe monitorowanie mian wirusa zapalenia wątroby C u zainfekowanych pacjentów podlegających terapii. Można je prowadzić przez, np., monitorowanie RNA HCV w surowicy pacjentów metodą slot-blot, dot-blot, lub RT-PCR, lub przez pomiar powierzchniowych lub innych antygenów HCV. Pacjentów można podobnie monitorować podczas terapii kombinowanej stosując inhibitory proteazy serynowej HCV ujawnione w wynalazku i inne zwi ą zki wykazują ce aktywność przeciw HCV, np. nukleozydowe i/lub nukleotydowe ś rodki przeciwwirusowe, dla określenia najniższych skutecznych dawek każdego przy stosowaniu w kombinacji.
W sposobach terapii kombinowanej ujawnionych w wynalazku, nukleozydowe lub nukleotydowe związki przeciwwirusowe, lub ich mieszaniny, mogą być podawane ludziom w ilości w zakresie od około 0,1 mg/osobę dziennie do około 500 mg/osobę dziennie; korzystnie od około 10 mg/osobę dziennie do około 300 mg/osobę dziennie; korzystniej od około 25 mg/osobę dziennie do około 200 mg/osobę dziennie; jeszcze korzystniej od około 50 mg/osobę dziennie do około 150 mg/osobę dziennie; i najkorzystniej w zakresie od około 1 mg/osobę dziennie do około 50 mg/osobę dziennie.
Dawki związków można podawać pacjentowi jako pojedynczą dawkę lub w proporcjonalnie podzielonych wielu mniejszych dawkach. W tym ostatnim przypadku kompozycje dawki jednostkowej mogą zawierać takie ilości podwielokrotności dawki, aby tworzyły dzienną dawkę. Wiele mniejszych dawek dziennie może również zwiększać łączną dzienną dawkę, jeśli tak zdecyduje osoba przepisująca lek.
Reżim leczenia pacjenta cierpiącego na infekcję HCV związkami i/lub kompozycjami według wynalazku dobiera się odpowiednio do wielu czynników, w tym wieku, masy, płci, diety i medycznego stanu pacjenta, ostrości infekcji, drogi podawania, farmakologicznych względów, takich jak aktywność, skuteczność, profile farmakokinetyczne i toksykologiczne konkretnych stosowanych związków, oraz wykorzystanie systemu podawania leku. Podawanie kombinacji leków ujawnionych w wynalazku powinno ogólnie kontynuować się przez okres kilku tygodni do kilku miesięcy lub lat, dopóki miana wirusów nie osiągną dopuszczalnych poziomów, wskazując, że infekcja została zwalczona lub usunięta. Pacjenci podlegający terapii kombinacjami leków ujawnionymi w wynalazku mogą być rutynowo monitorowani przez mierzenie poziomu wirusowego RNA zapalenia wątroby w surowicy pacjentów metodą slot-blot, dot-blot, lub technikami RT-PCR, lub mierząc ilość wirusowych antygenów zapalenia wątroby C, takich jak powierzchniowe antygeny, w surowicy, dla określenia skuteczności terapii. Ciągła analiza danych otrzymanych tymi sposobami pozwala na modyfikację reżimu terapii podczas terapii, tak że będzie się podawało optymalne ilości każdego składnika w kombinacji, i tak że będzie można też określić czas trwania terapii. Tak więc, reżim terapii/schemat dawkowania można racjonalnie zmodyfikować w czasie trwania terapii, tak że podaje się najniższe ilości każdego ze związków przeciwwirusowych użytych w kombinacji, które razem wykazują zadowalającą skuteczność przeciw wirusowi zapalenia wątroby C, i tak że podawanie takich związków przeciwwirusowych w kombinacji kontynuuje się tylko tak długo, jak to jest konieczne do pomyślnego wyleczenia infekcji.
Wynalazek obejmuje stosowanie inhibitorów proteazy serynowej HCV ujawnionych w wynalazku w różnych kombinacjach z powyższymi i podobnymi typami związków wykazujących aktywność przeciw HCV do leczenia lub zapobiegania infekcji HCV u pacjentów. Np., jeden lub więcej inhibitorów proteazy serynowej HCV można stosować w kombinacji z: jednym lub większą liczbą interferonów lub pochodnych interferonu wykazujących aktywność przeciw HCV; jednym lub większą liczbą nieinterferonowych związków wykazujących aktywność przeciw HCV; lub jednym lub większą liczbą interferonów lub pochodnych interferonu wykazujących aktywność przeciw HCV i jednym lub większą liczbą nieinterferonowych związków wykazującym aktywność przeciw HCV. Przy stosowaniu w kombinacji do leczenia lub zapobiegania infekcji HCV u człowieka, dowolny z dotychczas ujawnionych inhibitorów proteazy serynowej HCV i powyższych związków wykazujących aktywność przeciw HCV może być obecny w ilości skutecznej farmaceutycznie lub przeciw HCV. Dzięki ich addytywnym lub synergicznym efektom, przy użyciu w kombinacjach opisanych powyżej, każda może również być obecna w podklinicznej farmaceutycznie skutecznej lub iloś ci skutecznej przeciw HCV, to jest iloś ci, która, jeś li
PL 211 019 B1 użyje się jej samej, ma zmniejszoną farmaceutyczną skuteczność w całkowitym hamowaniu lub redukowaniu akumulacji wirionów HCV i/lub osłabiania albo łagodzenia stanów lub objawów związanych z infekcją HCV lub patogenezą u pacjentów w porównaniu z takimi inhibitorami proteazy serynowej HCV i związkami wykazującymi aktywność przeciw HCV przy stosowaniu w farmaceutycznie skutecznych ilościach. Ponadto, wynalazek obejmuje zastosowanie kombinacji inhibitorów proteazy serynowej HCV i związków wykazujących aktywność przeciw HCV, jak opisano wyżej, do wytwarzania leków do leczenia lub zapobiegania infekcji HCV, gdzie jeden lub większa liczba tych inhibitorów lub związków występuje w farmaceutycznie skutecznej ilości, i inny (inne) są obecne w ilości podklinicznej skutecznej farmaceutycznie lub ilości skutecznej przeciw HCV dzięki ich addytywnym lub synergicznym efektom. W niniejszym opisie, termin efekt addytywny opisuje połączony efekt dwu (lub większej liczby) farmaceutycznie czynnych środków, który jest równy sumie efektów każdego środka podawanego samodzielnie. Efekt synergiczny występuje, gdy połączony efekt dwu (lub większej liczby) farmaceutycznie czynnych środków jest większy niż suma efektów każdego środka podawanego samodzielnie.
P r z y k ł a d 3
W przykładzie tym wykorzystano zwią zek wedł ug wynalazku CU oraz dwa dodatkowe zwią zki oznaczone jako EP i EC.
Obecną standardową terapią infekcji wirusem zapalenia wątroby C (HCV) jest terapia immunomodulatorowym alfa-interferonem (Chronic Hepatitis C: Current Disease Management, U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health, 1999). Ta terapia jest nieskuteczna u wię kszoś ci pacjentów z HCV, którzy nie wykazują reakcji lub mają nawrót nawet po dł u ż szej terapii interferonowej. Dodatkowo, istnieje kilka skutków ubocznych związanych z terapią interferonem.
Ze względu na pilną potrzebę nowych, skuteczniejszych leków przeciwwirusowych do leczenia zainfekowanych HCV pacjentów, wynalazcy niniejszego opracowali serię związków, które hamują proteazę serynową HCV (kompleks białek wirusowych NS3 i NS4A HCV). Te związki można stosować pojedynczo, ze sobą łącznie, i w kombinacji z innymi klasami związków do leczenia lub zapobiegania infekcji HCV. Ten przykład opisuje testowanie trzech reprezentatywnych inhibitorów proteazy serynowej HCV, to jest, związku CU, związku EP i związku EC, samych i w kombinacji z indywidualnymi elementami zestawu interferonów (interferon alfa-2B (Schering Plough), interferon alfa-2A (PBL Biomedical Laboratories, New Brunswick, NJ), interferon beta (Research Diagnostics Inc, Flanders, NJ), i owczy interferon tau (Research Diagnostics Inc, Flanders, NJ)) w teś cie replikonu subgenomowego RNA HCV (Test replikonu) dla określenia, czy dwa związki działają wspólnie zmniejszając akumulację RNA HCV. Test replikonu mierzy ilość subgenomowego RNA HCV (replikonu RNA) pozostałego w komórkach replikonowych (Lohmann i in. Science 285: 110-113 (1999)) po dwu dniach terapii lekowej, względem ilości replikonu RNA w nietraktowanych komórkach. W tym teście, siła związków jako leków przeciw wirusowi HCV jest bezpośrednio proporcjonalna do poziomu inhibicji akumulacji replikonu RNA.
Dwa leki testuje się w kombinacjach w teście in vitro systemu replikonu dla określenia, czy przy użyciu łącznym wykazują addytywną lub synergiczną aktywność przeciw HCV. Test replikonu stosuje się jako zastępczy model infekcji HCV in vitro dla ocenienia połączonych efektów immunomodulatora, np. interferonu-alfa 2B ((Intron A); Schering Plough), i inhibitora serynowej proteazy HCV, np. związku CU. Jak pokazano poniżej, wyniki wykazują, że istnieje wyraźny synergiczny efekt skierowany przeciw HCV tych dwu typów leków w pomiarze formalnych matematycznych ocen synergii dla zanalizowania ich zdolności do zmniejszania poziomów RNA HCV w teście replikonu.
Test replikonu
Test replikonu wykorzystujący linię komórek zawierającą samoreplikujący subgenomowy RNA HCV (replikon) opisuje Lohmann i in. Science 285: 110-113 (1999). Numer dostępu Genbank dla sekwencji replikonu użytego w eksperymentach opisanych w wynalazku wymieniono w tym odnośniku jako AJ242654. Artykuł ujawnia sposoby transkrypcji in vitro RNA z replikonowego cDNA, transfekcję replikonu RNA do komórek Huh7 przez elektroporację, oraz dobór komórek zawierających replikon RNA z użyciem antybiotyku G418. Komórki Huh7 są linią komórek wątrobiaka otrzymaną od Dr. Williama Masona z Fox Chase Cancer Research Center (Philadelphia). Te komórki są ogólnie dostępne z Fox Chase, i opisano je szeroko w naukowej literaturze (Nakabayashi i in. Cancer Res. 42: 3858-3863 (1982)). W eksperymentach opisanych w wynalazku, całość DNA wzorca usuwa się z transkrybowanego in vitro preparatu replikonu RNA przed elektroporacją tego RNA do komórek Huh7 przez wielokrotne traktowanie DNazą (trzy kolejne zabiegi).
PL 211 019 B1
Test replikonu przeprowadza się jak opisano szczegółowo poniżej. W skrócie, komórki replikonu umieszcza się w 96-dołkowych szalkach przy gęstości 10000 komórek na dołek i inkubuje w temperaturze 37°C. Komórki inkubuje się w DMEM (Dulbecco's Minimal Essential Media) uzupełnionym 10% płodowej surowicy wołowej, glutaminą, nieegzogennych aminokwasów, i antybiotycznych G418 (0,25 mg/ /ml). Po inkubacji przez noc, pożywkę zastępuje się DMEM zawierającą 2% płodowej surowicy wołowej i różnymi stężeniami inhibitora proteazy serynowej, takiego jak Związek CU, i/lub interferonu takiego jak interferon-alfa 2B (Intron A, Schering Plough). Każdy związek testuje się w sześciu do ośmiu różnych stężeń. Dla jednego skraju zakresu stężeń, wybiera się wysokie stężenia związków powodujące niemal całkowitą inhibicję akumulacji RNA replikonu po dwu dniach terapii. Z tych początkowych stężeń wykonuje się seryjne rozcieńczenia tak, że zakresy stężeń testowanych w teście replikonu obejmują stężenia, przy których związki są wysoce skuteczne, jak też stężenia, przy których nie występuje znaczący efekt. Każde stężenie inhibitora proteazy serynowej HCV testuje się bez dodatku interferonu, jak też z dodatkiem sześciu do ośmiu różnych dawek interferonu. Podobnie, interferon testuje się bez dodatku inhibitora proteazy serynowej HCV. Po 48 godzinach inkubacji ze związkami, pożywkę usuwa się z płytek i całość komórkowego RNA ekstrahuje się z komórek stosując zestaw RNeasy-96 z Qiagen Inc. (Valencia, CA). Ten RNA następnie analizuje się ilościową RT-PCR, lub TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City CA). Celem TaqMan® RT-PCR jest gen oporności na neomycynę w replikonie RNA. Płytki konfiguruje się tak, że występuje 5 powtórzeń każdej próbki terapii lekiem, i 16 powtórzeń nietraktowanych próbek. Pozwala to na większą statystyczną ufność w danych ilościowej RT-PCR.
Analiza danych z testu replikonu daje dwie wartości, które są przydatne w ocenie siły potencjalnych środków przeciw wirusowi HCV. Przy każdym testowanym stężeniu związku, określa się poziomy inhibicji akumulacji RNA replikonu powodowanej przez związek podczas dwu dni traktowania względem ilości replikonu RNA w nietraktowanych komórkach. Podaje się je jako procent inhibicji. Gdy otrzyma się serie punktów danych generowanych przez traktowanie komórek w zakresie stężeń, uzyskuje się wartości IC50, to jest, stężenia związku, przy których akumulacja RNA replikonu HCV jest zmniejszana o 50% przez związek. Dzięki powtarzanym testom inhibitorów proteazy serynowej HCV w teście replikonu, określa się, że IC50 ma procentowy współczynnik zmienności (%CV lub 100% x standardowe odchylenie IC50/średnie IC50) około 20%. IC50 jest wartością stosowaną do oceniania indywidualnych związków testowanych w tym teście w oparciu o ich siłę jako środków przeciw wirusowi HCV. Proste określenia IC50 są nieodpowiednie do oceny przydatności związków użytych w kombinacji. Najskuteczniejsza analiza zestawu danych wytwarzanych z użyciem wszystkich kombinacji różnych interferonów i inhibitorów proteazy serynowej wymaga określenia procentowej inhibicji, jak pokazano w tablicy 7, z użyciem matematycznych sposobów opisanych poniżej przeznaczonych do określania, czy kombinacja terapii jest agonistyczna, addytywna, czy synergiczna.
Szczegóły testu replikonu są następujące:
®
Procedura ilościowej analizy RNA replikonu HCV w teście replikonu HCV z użyciem TaqMan® RT-PCR
Test replikonu stosuje się do pomiaru zdolności potencjalnych związków przeciw wirusowi HCV do hamowania akumulacji cząsteczki subgenomowego RNA replikonu HCV w linii komórek Huh7 (Lohmann i in. Replication of Subgenomic Hepatitis C Virus RNAs in a Hepatoma Cell Line, Science 285, 110-113 (1999)). Ten test obejmuje trzy operacyjne składniki: (1) utrzymanie komórek replikonowych, ustawienie płytek testowych i zastosowanie związku; (2) ekstrakcję całego komórkowego RNA z komórek replikonowych; i (3) RT-PCR (TaqMan®) w czasie rzeczywistym dla zmierzenia osadzania RNA replikonu w każdej próbce. Test replikonu do wykonania wymaga co najmniej 4 dni; jednakże, proces może być przerwany i próbki zamrożone pomiędzy etapami. Każdy składnik testu opisano poniżej.
1. Utrzymanie komórek replikonowych, ustawienie płytek testowych i zastosowanie związku
1.1 Utrzymanie komórek replikonowych
Linię komórek użytych w teście replikonu wytwarza się jak opisuje Lohmann i in. (Replication of Subgenomic Hepatitis C Virus RNAs in a Hepatoma Cell Line, Science 285, 110-113 (1999)). Po inkubacji w kolbach do kultur komórkowych 150 cm3 (Costar) zawierających komórki replikonowe w temperaturze 37°C i 5% CO2 i zlaniu się, komórki rozcieńcza się 1:10 objętościowo do nowych kolb do kultur komórkowych 150 cm3. Pożywką jest DMEM zawierająca 10% płodowej surowicy wołowej (FBS), IX nieegzogenne aminokwasy (NEAA), 1X glutaminę (Glu), i 0,25 mg/ml G418. Przeprowadza się trzy kolejne pasaże, za każdym razem pozwalając na zlanie się komórek, a następnie rozcieńcza
PL 211 019 B1 komórki w nowych kolb do kultur komórkowych 150 cm3. Te komórki, określane jako oryginalne komórki dzieli się następnie na próbki i przechowuje do przyszłego użycia w teście replikonu. Przeprowadza się analizę opartą na TaqMan® dla określenia liczby replikonów genomu HCV na komórkę, która ujawnia obecność ~150 kopii replikonu na komórkę. Jest ona oparta na stosunku kopii RNA replikonu do dwukrotności kopii ludzkiego genu apoB (liczba haploidalnych genomów).
1.1.1 Oryginalne komórki przechowuje się w ciekłym N2. Dla komórki użytych w teście replikonu, po 20 kolejnych pasażach, komórki odrzuca się, i świeżą porcję odzyskuje się z magazynu z ciekłego N2.
1.2 Komórki w 96-dołkowych szalkach do testu replikonu
1.2.1. Dla przygotowania 96-dołkowych płytek, w 75% zlane zawierające replikon komórki w kolbie 75 cm3 traktuje się trypsyną i zawiesza w 10 ml pożywki A. Trypsynowanie przeprowadza się usuwając pożywkę, dodając 1 ml trypsyny-EDTA 0,25% wagowych, a następnie usuwając trypsynę -EDTA. Po 5-10 minutach komórki usuwa się z kolby i zawiesza w pożywce.
1.2.2. Komórki zlicza się stosując hemacytometr, i stężenie komórek ustawia się na 105 komórek/ml.
1.2.3. Każdy dołek posiewa się 100 μl zawiesiny komórek stosując wielokanałową pipetę Impact2 (Matrix), nie umieszczając na więcej niż czterech 96-dołkowych płytkach pojedynczej zawiesiny komórek.
1.2.4. 96-dołkowe płytki inkubuje się w temperaturze 37°C przez noc.
1.3. Rozcieńczenie związku i nałożenie na szalki z replikonowymi komórkami
1.3.1. Inhibitory proteazy serynowej HCV rozpuszcza się w dimetylosulfotlenku (DMSO) do końcowego stężenia 20 mM. Interferony umieszcza się w zawiesinie w roztworze solanki buforowanej fosforanem zawierającej 0,1% wagowych albuminy surowicy wołowej.
1.3.2. Roztwór 20 mM związku rozcieńcza się do 1 mM DMSO.
1.3.3. 50 μl związku rozpuszczonego w DMSO dodaje się do 10 ml pożywki B (stężenie związku wynosi 5 mM, a stężenie DMSO wynosi teraz 0,5%), lub 20 μl 1 mM związku i 30 μl DMSO dodaje się do 10 ml pożywki B (stężenie związku wynosi 2 μM).
1.3.4. Rozcieńczenie związku do końcowego stężenia wykonuje się mieszając roztwór związku/pożywki B z pożywką C (zawiera 0,5% DMSO). Wykonuje się kolejne jedno do pięciu rozcieńczeń związku pożywką C w 2 μl 96-dołkowym bloku z polipropylenu otrzymując żądane końcowe stężenia związku.
1.3.5. Płytkę z komórkami usuwa się z inkubatora 37°C i znakuje w prawym górnym rogu pokrywki i prawej stronie podstawy. Pożywkę wylewa się z 96-dołkowych płytek.
1.3.6. 100 μl roztworów związek/pożywka z każdego dołka 96-dołkowego bloku z rozcieńczeniami dodaje się na 96-dołkową płytkę z komórkami stosując pipetę Impact2.
1.3.7. 100 μl pożywki C dodaje się do wszystkich nietraktowanych dołków zgodnie z tablicą 3 dla testowania związków przy 1, 3 lub 6 różnych stężeń. Nie odnosi się do fikcyjnie potraktowanych komórek (DMSO dodaje w tym samym stężeniu jak potraktowane komórek); St. odnosi się do stężenia związku.
T a b l i c a 3 związki, 6 stężenia, 5 powtórzeń
1 Związek 1 6 Związek 2 7 8 9 10 11 12
2 3 4 5
A nie nie nie nie nie nie nie nie nie nie
B st.1 st.1 st.1 st.1 st.1 st.1 st.1 st.1 st.1 st.1
C st.2 st.2 st.2 st.2 st.2 st.2 st.2 st.2 st.2 st.2
D st.3 st.3 st.3 st.3 st.3 st.3 st.3 st.3 st.3 st.3
E st.4 st.4 st.4 st.4 st.4 st.4 st.4 st.4 st.4 st.4
F st.5 st.5 st.5 st.5 st.5 st.5 st.5 st.5 st.5 st.5
G st.6 st.6 st.6 st.6 st.6 st.6 st.6 st.6 st.6 st.6
H nie nie nie nie nie nie nie nie nie nie
PL 211 019 B1
4 związki, 3 stężenia, 5 powtórzeń 10 11 12
Związek 1 4 5 Związek 2 9
1 2 3 6 7 8
A nie nie nie nie nie nie nie nie nie nie
B st.1 st.1 st.1 st.1 st.1 st.1 st.1 st.1 st.1 st.1
C st.2 st.2 st.2 st.2 st.2 st.2 st.2 st.2 st.2 st.2
D st.3 st.3 st.3 st.3 st.3 st.3 st.3 st.3 st.3 st.3
E st.1 st.1 st.1 st.1 st.1 st.1 st.1 st.1 st.1 st.1
F st.2 st.2 st.2 st.2 st.2 st.2 st.2 st.2 st.2 st.2
G st.3 st.3 st.3 st.3 st.3 st.3 st.3 st.3 st.3 st.3
H nie nie nie nie nie nie nie nie nie nie
Związek 3 16 związków, 1 stężenie, 4 powtórzenia Związek 4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A nie zw1 zw2 zw3 zw4 zw5 zw6 zw7 zw8 nie
B nie zw1 zw2 zw3 zw4 zw5 zw6 zw7 zw8 nie
C nie zw1 zw2 zw3 zw4 zw5 zw6 zw7 zw8 nie
D nie zw1 zw2 zw3 zw4 zw5 zw6 zw7 zw8 nie
E nie zw9 zw10 zw11 zw12 zw13 zw14 zw15 zw16 nie
F nie zw9 zw10 zw11 zw12 zw13 zw14 zw15 zw16 nie
G nie zw9 zw10 zw11 zw12 zw13 zw14 zw15 zw16 nie
H nie zw9 zw10 zw11 zw12 zw13 zw14 zw15 zw16 nie
12 związków, 1 stężenie, 5 powtórzeń
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A nie nie nie nie nie nie nie nie nie nie
B zw1 zw1 zw1 zw1 zw1 zw7 zw7 zw7 zw7 zw7
C zw2 zw2 zw2 zw2 zw2 zw8 zw8 zw8 zw8 zw8
D zw3 zw3 zw3 zw3 zw3 zw9 zw9 zw9 zw9 zw9
E zw4 zw4 zw4 zw4 zw4 zw10 zw10 zw10 zw10 zw10
F zw5 zw5 zw5 zw5 zw5 zw11 zw11 zw11 zw11 zw11
G zw6 zw6 zw6 zw6 zw6 zw12 zw12 zw12 zw12 zw12
H nie nie nie nie nie nie nie nie nie nie
1.4. Płytki inkubuje się przez 48 godzin w temperaturze 37°C, i następnie poddaje ekstrakcji RNA.
T a b l i c a 4
Podsumowanie sprzętu i materiałów użytych do ustawiania kultury komórek i związku
8-kanałowa pipeta Impact2, 1250 pl nr kat 2004 Matrix
1 2 3
2 ml polipropylenowy blok z głębokimi dołkami, 96-dołków, sterylny nr kat. 4222 Matrix
25 ml zbiorniczki na reagent, sterylne nr kat. 8096 Matrix
1250 pl bardzo długie końcówki do pipet nr kat. 8255 Matrix
PL 211 019 B1 cd. tablicy 4
1 2 3
96-dołkowa płytka nr kat. 3595 Costar
Hemacytometr Bright line improved Neubauer 0,1 mm deep Reichert
DMEM nr kat. 51444-79P JRH
L-glutamina (Glu) nr kat. 12403-010 GIBCO-BRL
Nieegzogenne aminokwasy (NEAA) nr kat. 11140-050 GIBCO-BRL
Płodowa surowica wołowa (FBS) nr kat. 16250-078 GIBCO-BRL
G418 nr kat. 55-0273 Invitrogen
DMSO nr kat. D-2650 Sigma
Pożywka A DMEM, 10% FBS, 1X NEAA, 1X Glu, 0,25 mg/ml G418
Pożywka B DMEM, 2% FBS, 1X NEAA, 1X Glu
Pożywka C DMEM, 2% FBS, 1X NEAA, 1X Glu, 0,5% DMSO
Trypsyna-EDTA 0,25% GIBCO-BRL
2. Ekstrakcja łącznego komórkowego RNA z komórek replikonowych
2.1 Wstęp
Celem procedury jest ekstrakcja RNA z próbek kultury tkankowej in vitro, tak że wirusowe lub komórkowe RNA jest ilościowo odzyskiwane i dość czyste, aby być analizowane w teście ilościowym
HCV RT-PCR.
Dla umożliwienia detekcji zmienności w wydajności ekstrakcji RNA, standardowe ilości wołowego wirusa biegunki (BVDV), wirusa RNA z pewnym podobieństwem do HCV, dodaje się do każdej próbki komórek przed ekstrakcją RNA. Tak więc, poziom RNA BVDV wykrytego w końcowej wielokrotnej reakcji RT-PCR powinien być spójny dla wszystkich dołków w granicach zmienności związanych z testem replikonu, taka wewnętrzna kontrola skuteczności ekstrakcji RNA jest omówiona w sekcji TaqMan® poniżej.
Ekstrakcję RNA prowadzono sposobem RNeasy-96 firmy Qiagen Inc. (Valencia, CA). Ten sposób wykorzystuje 96 opartych na krzemionce mini-kolumn umieszczonych w układzie kompatybilnym z 96 dołkami kultury tkankowej. Technika ekstrakcji RNA jest modyfikacją metody Booma, w której wszystkie komórkowe białka i kwasy nukleinowe, w tym nukleazy, najpierw denaturuje się silną chaotropową solą (tiocyjanian guanidyniowy). W tym środowisku, kwasy nukleinowe mają silne powinowactwo do krzemionki, materiału na półkach mini-kolumny; a białka i inne zanieczyszczenia nie wiążą się z krzemionką i przechodzą przez kolumny. Po przemyciu kolumn roztworem chaotropowym/etanolowym, próbki częściowo osusza się i kwas nukleinowy uwalnia z kolumny w małej objętości wody.
Dla zmniejszenia zmienności w odzyskiwaniu RNA HCV, należy zadbać o warunki przemywania kolumn i częściowego suszenia. Obecność małej ilości etanolu na kolumnie spowoduje zanieczyszczenie końcowego RNA i przeszkodzi działaniu układu detekcji RT-PCR. Konieczne jest zachowanie ostrożności we wszystkich fazach tej procedury, ponieważ początkowe próbki mogą być biologicznie niebezpieczne, chaotropowa sól jest wysoce żrąca, i jako tiocyjanian, może wytwarzać trujący cyjanowodór w ewentualnym kontakcie z kwasowym środowiskiem.
T a b l i c a 5
Podsumowanie sprzętu i materiałów potrzebnych do procedur ekstrakcji RNA HCV
Zestaw RNeasy 96 (24) nr kat. 74183 Qiagen
1 2 3
Rozgałęziacz QIAvac 96 nr kat. 19504 Qiagen
Wirówka 4-15C, na płytek 2x96, 6000 x g nr kat. 81010 Qiagen
Płytka wirnika dla płytek 2x96 nr kat. 81031 Qiagen
PL 211 019 B1 cd. tablicy 5
1 2 3
Alkohol etylowy 200 stopni
8-kanałowa pipeta Impact2, 250 pl nr kat. 2002 Matrix
8-kanałowa pipeta Impact2, 1250 pl nr kat. 2004 Matrix
2 ml polipropylenowy blok z głębokimi dołkami, 96-dołków, sterylny nr kat. 4222 Matrix
25 ml zbiorniczki na reagent, sterylne nr kat. 8096 Matrix
1250 pl bardzo długie końcówki do pipet nr kat. 8255 Matrix
200 pl końcówki do pipet nr kat. 7275 Matrix
Pożywka MEM bez surowicy nr kat. 11095-80 GIBCO BRL
2.2 Procedura:
2.2.1 Liza komórek
2.2.1.1. Przygotowanie buforu lizy: Na jedną 96-dołkową płytkę, dodać 150 μl β-merkaptoetanolu (β-ME) i 1 μl roztworu podstawowego BVDV (wytrząsnąć przed dodaniem) do 15 ml buforu RLT (składnik zestawu RNeasy, Qiagen). Roztwór podstawowy wytwarza się zakażając komórki MDBK (wołowe komórki nerki, #CCL-22, dostępne z American Type Culture Collection, Manassas VA) BVDV i zbierając kulturę na szczycie efektu cytopatycznego (CPE). Roztwór podstawowy ma miano infekcji w przybliżeniu 1x107 pfu/ml. Daje to cykl progowy BVDV (Ct) około 22 w teście TaqMan. Roztwór podstawowy BVDV przechowuje się w zamrażarce -80°C.
2.2.1.2. Komórki przemywa się 150 μl wolnej od surowicy pożywki MEM (program 4 na 8-kanałowej elektronicznej pipecie P1250: Fill 1250, Disp 150 x 8). 150 μl buforu lizy dodaje się do każdego dołka (ten sam program).
2.2.1.3. RNA ekstrahuje się natychmiast, lub komórki zamraża w temperaturze -80°C.
2.2.2. Wytwarzanie reagentów i materiałów do ekstrakcji RNA.
2.2.2.1. Zapisać nr partii RPE i zestawu RNeasy 96.
2.2.2.2. RPE: 720 ml 100% etanolu dodaje się do jednej butli RPE (Qiagen) i dobrze miesza; butle RPE zawsze dobrze wytrząsa się przed użyciem.
2.2.2.3. 70% etanol: 150 ml dietylopirowęglanowej wody (DEPC) dodaje się do 350 ml 100% etanolu i dobrze miesza.
2.2.3. Wytwarzanie RNA zestawem RNeasy 96
2.2.3.1. Zamrożone próbki rozmraża się w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Jednocześnie jedną kolumnę kontroli ekstrakcji rozmraża się na każdą płytkę (kontrola ekstrakcji: kontrola ekstrakcji RNeasy to zestaw 8 probówek połączonych ze sobą. Wewnątrz każdej probówki jest 170 μl lizatu komórek z pewnym stosunkiem dodatnich i ujemnych względem HCV komórek. Od góry do dołu znajdują się dwie kontrole z liczbą niską, wysoką i zerową, odpowiednio. (Patrz sekcja 2.3 protokołu poniżej).
2.2.3.2. Próbki miesza się przez pipetowanie 100 μl w górę i w dół 5 razy. Całą próbkę przenosi się na kolumny 1-10 bloku z 2 ml kwadratowymi dołkami Matrix (program 1 na P250: Mix 100 x 5, Fill 170, Purge).
2.2.3.3. 150 pl wzorca replikonu przenosi się do kolumny 1 l (bez próbki w kolumnie 12).
2.2.3.4. 150 pl 70% etanolu (EtOH) dodaje się do każdej próbki (program 4 na P1250: Fill 1250, Disp 150).
2.2.3.5. Płytkę RNeasy 96 znakowaną odpowiednim numerem płytki umieszcza się w próżniowej rurze rozgałęźnej. Zmieszać i przenieść lizat/EtOH na płytkę RNeasy 96 (program 1 na P1250: Mix 200, Times 5, Fill 330, i Purge). Wszelkie nieużywane dołki zamyka się przezroczystą taśmą (z Qiagen), zwykle kolumnę 12.
2.2.3.6. Zmniejszone ciśnienie (w przybliżeniu 800 mbar) stosuje się dla wprowadzenia próbki na mini-kolumny.
2.2.3.7. Płytkę RNeasy-96 przemywa się 1000 μl buforu RW1 (Qiagen)/dołek (program 2 na P1250: Fill 1000, Disp 1000).
2.2.3.8. Zmniejszone ciśnienie przykłada się do filtru przez bufor RW1, i przepływ opróżnia się.
2.2.3.9. Płytkę RNeasy-96 przemywa się 1000 μl buforu RPE/dołek (program 2 na P1250).
PL 211 019 B1
2.2.3.10. Zmniejszone ciśnienie przykłada się do filtru przez bufor RPE.
2.2.3.11. Powtórzyć etap 2.2.3.9
2.2.3.12. Zmniejszone ciśnienie przykłada się do filtru przez bufor RPE, przez czas 3 minut.
2.2.3.13. Osuszyć płytkę RNeasy 96: płytkę RNeasy-96 umieszcza się na stojaku do mikroprobówek zbierających (z Qiagen), przykrywa dostarczoną taśmą AirPore, i jednostkę odwirowuje się przez 10 minut przy 6000 x g (wirówka Qiagen Sigma; 4-15°C).
2.2.3.15. Eluować RNA z 96-dołkowej płytki RNeasy: płytkę RNeasy-96 przenosi się na wierzch nowego stojaka do mikroprobówek zbierających. 70 μl wolnej od RNase wody dodaje się do wnętrza każdego dołka (program 3 na P1250: Fill 850, Disp 70).
2.2.3.16. Inkubować 1 min w temperaturze pokojowej, a następnie umieścić nową taśmę AirPore na płytce.
2.2.3.17. Jednostkę odwirowuje się następnie przez 4 minuty przy 6000 x g w wirówce Sigma 4-15C. Eluowana objętość ma pomiędzy 28 μl i 50 gl.
2.2.3.18. Płytkę RNeasy-96 odrzuca się, i stojak do mikroprobówek zbierających uszczelnia się przykrywkami Qiagen (8 na pasek).
2.2.3.19. Eluowany RNA przechowuje się w temperaturze -80°C lub natychmiast analizuje w teście TaqMan®.
2.3 Wytwarzanie kontroli ekstrakcji
Dzień 1
2.3.1.1. Umieścić na płytkach 2,5x107 wytwarzających replikon komórek w kolbie do kultur tkankowych 150 cm3 (T-150).
2.3.1.2. Umieścić na płytkach 2,0x106 komórek Huh7 w kolbie do kultur tkankowych 75 cm3 (T-75).
2.3.1.3. Inkubować przez noc w temperaturze 37°C.
Dzień 2
2.3.1.4. Lizować komórki buforem lizy.
2.3.1.5. Usunąć supernatant z Huh7 i wytwarzających replikon komórek, i przemyć monowarstwę 10 ml wolnej od surowicy pożywki (MEM).
2.3.1.6. Dodać 30 ml buforu lizy (z 1 gl roztworu podstawowego BVDV/15 ml buforu lizy) do komórek Huh7, zmieszać przez pipetowanie, i umieścić lizat komórek w 50 ml w probówce wirówkowej ze stożkowym dnem do kultur tkankowych.
2.3.1.7. Dodać 10,5 ml buforu lizy do komórek wytwarzających replikon, zmieszać przez pipetowanie, i umieścić lizat komórek w 15 ml probówce wirówkowej ze stożkowym dnem do kultur tkankowych.
2.3.2. Dla wzorca WYSOKIEJ ekstrakcji: Odmierzyć 170 gl lizatu komórek wytwarzających replikon do rzędów 5 i 6 dwu stojaków na probówki 0,75 ml Matrix.
2.3.3. Dla wzorca ŚREDNIEJ ekstrakcji: Dodać 1,0 ml lizatu komórek wytwarzających replikon do 9 ml lizatu Huh7, i dobrze zmieszać. Odmierzyć 170 gl tej mieszaniny do rzędów 3 i 4 dwu stojaków na probówki 0,7 5 ml Matrix.
2.3.4. Dla wzorca NISKIEJ ekstrakcji: Dodać 50 gl lizatu komórek wytwarzających replikon do 10 ml lizatu Huh7, i dobrze zmieszać. Odmierzyć 170 gl tej mieszaniny do rzędów 1 i 2 dwu stojaków na probówki 0,7 5 ml Matrix.
2.3.5. Wzorzec ZEROWEJ ekstrakcji: Odmierzyć 170 gl lizatu komórek Huh7 do rzędów 7 i 8 dwu stojaków na probówki 0,75 ml Matrix.
2.3.6. Przechowywać wzorce w temperaturze -80°C
3. TaqMan® RT-PCR i analiza danych
3.1 Wstęp: Stosuje się ilościową RT-PCR w czasie rzeczywistym dla zmierzenia ilości RNA replikonu HCV w każdej próbce. Tę technikę określa się również jako oparty na PCR test 5'-nukleazy, oraz Taq-Man®. Urządzeniem analitycznym jest Applied Biosystems 7700 Prism Sequence Detector System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Ten instrument jest zasadniczo czasowo multipleksowanym spektrografem z laserowo indukowaną fluorescencją sprzężonym z cyklizerem termicznym. Monitoruje akumulację amplikonu PCR w każdym dołku 96-dołkowej szalki z próbkami w czasie procesu PCR.
3.2. Zastosowanie wewnętrznej kontroli BVDV: Jak wspomniano w poprzedniej sekcji, każda próbka zawiera wewnętrzną dodatnią kontrolę. Służy ona jako miara skuteczności ekstrakcji RNA i pokazuje, czy próbka zawiera zanieczyszczenia hamujące TaqMan® PCR. BVDV miesza się z chaotropowym buforem lizy komórek przez zastosowaniem buforu lizy do komórek. Chociaż dodatnia kontrola znajduje się w każdej próbce, test wewnętrznej dodatniej kontroli BVDV prowadzi się tylko,
PL 211 019 B1 gdy dane testu RNA replikonu HCV nie mieszczą się w spodziewanych granicach, sugerując trudności z próbką. 7700 może równocześnie monitorować akumulację dwu różnych amplikonów PCR w tej samej probówce stosując sondy detekcyjne znakowane dwoma różnymi reporterowymi barwnikami fluorescencyjnymi (multipleksowanie). Specyficzne kryteria zmuszające do analizy TaqMan® wewnętrznej dodatniej kontroli BVDV próbki z płytki opisano w sekcji analizy danych (3.6).
3.3 Sonda i startery TaqMan® RNA replikonu HCV. Ze względu na spodziewaną genetyczną stabilność i ogólny brak drugorzędowej struktury RNA w genie oporności na neomycynę (neo) zakodowanym w replikonie, stosuje się startery i sondę wiążącą się z tym regionem. Ten segment replikonu RNA rozciąga się od zasad 342-1193 mającego 8001 par zasad replikonu (SEKW NR ID: 1):
301 gtgcttgcga gtgccccggg aggtctcgta gaccgtgcac catgagcacg aatcctaaac
361 ctcaaagaaa aaccaaacgt aacaccaacg ggcgcgccat gattgaacaa gatggattgc
421 acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga
481 caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt
541 ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat
601 cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg
661 gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggeagga tctcctgtca tctcaccttg
721 ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc
781 cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga
841 tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag
901 ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc
961 atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg CCGCTTTTCT GGATTCATCG
1021 aCTGTGGCCG GCTGGGTGTG Gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata sonda TaąMan®
1081 ttgctgaaga gcTTGGCGGC GAATGGGctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg starter w tył
1141 ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagtttaaa
3.4. Procedury
3.4.1. Sposób wytwarzania 1x głównej mieszaniny dla NEO i BVDV RT-PCR
T a b l i c a 6
Podsumowanie sprzętu i materiałów potrzebnych do wytwarzania głównej mieszaniny 10-płytkowej RT-PCR
Sprzęt i materiały Nr do zamówienia Dostawca
1 2 3
Pipeta 0,5-10 μl 22 47 005-1 2000 Series Eppendorf
Pipeta 2-20 μl 22 47 015-9 2000 Series Eppendorf
PL 211 019 B1 cd. tablicy 6
1 2 3
Pipeta 10-100 gl 22 47 020-5 2000 Series Eppendorf
Pipeta 50-200 gl 22 47 025-6 2000 Series Eppendorf
Pipeta 100-1000 gl 22 47 030-2 2000 Series Eppendorf
1250 gl końcówki Matrix nr kat. 8255 Matrix
200 gl końcówki Matrix nr kat. 7275 Matrix
10 gl końcówki ART nr kat. 2140 Molecular Bioproducts
20 gl końcówki ART nr kat. 2149P Molecular Bioproducts
100 gl końcówki ART nr kat. 2065E Molecular Bioproducts
200 gl końcówki ART nr kat. 2069 Molecular Bioproducts
1000 gl koncówki ART nr kat. 2079E Molecular Bioproducts
Elektroniczna pipeta, Impact2 nr kat. 2001 Matrix
1,5 ml bez RNazy probówki mikrowirówkowe nr kat. 12450 Ambion
14 ml probówki polipropylenowe nr kat. 352059 Falcon
25 ml pojemnik na reagent nr kat. 8096 Matrix
96-dołkowa płytka reakcyjna nr kat. N801-0560 Applied Biosystems
Paski pokrywek optycznych nr kat. N801-0935 Applied Biosystems
Jednorazowe sterylne okrycia nr kat. 9515-E Baxter
Reagenty Nr do zamówienia Dostawca
Kwas 0,1N HCl Fisher
RNAseZap nr kat. 9780 Ambion
RNAse away nr kat. 7005 Molecular Bioproducts
10-pak, EZ RT-PCR core reagents kit, 5x reaction buffer, 25 mM Manganese Acetate, deoksy NTPs nr kat. 403028 Applied Biosystems
Sonda VIC NEO, 2 gM (=10x), 550 gl na porcję nr kat. 450003, na zamówienie, 5'-VIC-CTG TGG CCG GCT GGG TGT GG-TAMRA-3' (SEKW NR ID:2) Applied Biosystems
Sonda VIC BVDV, 2 gM (=10x), 550 gl na porcję (Vertex) nr kat. 450003, na zamówienie, 5'-VIC-CCC TCG TCC ACG TGG CAT CTC GA-TAMRA-3' (SEKW NR ID: 3) Applied Biosystems
Starter w przód NEO, 3 gM (=10x) mieszanka starterów w przód/w tył, 550 gl na porcję nr kat. 4304972, na zamówienie, 5'-CCG CTT TTC TGG ATT CAT CG-3' (SEKW NR ID: 4) Applied Biosystems
Starter w tył NEO, 3 gM (=10x) mieszanka starterów w przód/w tył, 550 gl na porcję nr kat. 4304972, na zamówienie, 5'-CCC ATT CGC CGC CAA-3' (SEKW NR ID: 5) Applied Biosystems
Starter w przód BVDV, 3 gM (=10x) mieszanka starterów w przód/w tył, 550 gl na porcję na zamówienie, 5'-CAG GGT AGT CGT CAG TGG TTC G-3' (SEKW NR ID: 6), skala 1,0 gM w/oczyszczanie żelowe Oligos etc
PL 211 019 B1 cd. tablicy 6
1 2 3
Starter w tył BVDV, 3 gM (=10x) mieszanka starterów w przód/w tył, 550 gl na porcję na zamówienie, 5'-GGC CTC TGC AGC ACC CTA TC-3' (SEKW NR ID: 7) skala 1,0 gM w/oczyszczanie żelowe Oligos etc
Wzorce RNA NEO In vitro transkrybowany RNA z plazmidu zawierającego część genu neo RNA replikonu HCV z użyciem polimerazy RNA T7. Ilość in vitro transkrybowanego RNA ocenia się w oparciu o znaną masę cząsteczkową transkryptów i absorbancję UV oczyszczonego roztworu transkryptu. Ten RNA rozcieńcza się, dzieli na porcje i przechowuje w temperaturze -80°C. Pojedyncze porcje rozmraża się do każdego testu TaqMan®
Testowane próbki RNA wydzielane z komórek replikonowych HCV (sekcja 2 protokołu), 10 gl/96-dołkową płytkę
Wolna od nukleazy woda (nie traktowana DEPC) nr kat. 9930 Ambion
3.4.2. Przygotowanie reagentów dla głównej mieszanki
3.4.2.1. Oczyścić ławę zgodnie z dwoma etapami poniżej, i przepłukać pipety RNAse away.
RNAse Zap (Ambion, Austin, TX)
RNAse Away (Molecular Bioproducts, San Diego, CA)
3.4.2.2. Otworzyć podstawowe reagenty EZ RT-PCR (Applied Biosystems) i umieścić 5x bufor na lodzie, rozmrozić zamarznięte reagenty w temperaturze pokojowej przez około 15 minut, a następnie umieścić na lodzie. Jeden zestaw reagentów EZ RT-PCR można stosować do analizy dwu 96-dołkowych ekstrakcji RNA.
3.4.2.3. Wziąć jedną probówkę 2 μM sondy VIC (NEO lub BVDV, 550 μl na probówkę) z -20°C i umieścić na lodzie.
3.4.2.4. Wziąć jedną probówkę 3 μM mieszanki starterów w przód/w tył (NEO lub BVDV, 550 μl na probówkę) z -20°C i umieścić na lodzie.
3.4.2.5. Wziąć jedną probówkę (30 μθ wzorców transkryptu RNA (108 kopii/10 μθ z -80°C i umieścić na lodzie.
3.4.2.6. Wziąć jedną probówkę wody Ambion o pokojowej temperaturze.
3.4.3. Zestawić główną mieszaninę dla jednej reakcji 96-dołkowej płytki.
3.4.3.1. Użyć 1 ml pipety do przeniesienia 5x buforu (Applied Biosystems) do 14 ml probówki; łączna dodana objętość wynosi 1100 gl.
3.4.3.2. Użyć 1 ml pipety dla dodania 25 mM Mn(OAc)2 (Applied Biosystems) do 14 ml probówki; łączna dodana objętość wynosi 660 gl.
3.4.3.3. Użyć 200 gl pipety dla dodania 165 gl 10 mM dATP aby 14 ml probówki. Wykonać to samo dla 10 mM dCTP, 20 mM dUTP i 10 mM dGTP.
3.4.3.4. Użyć 1 ml pipety dla dodania 550 gl 10x 3 gM mieszanki starterów w przód/w tył.
3.4.3.5. Użyć 1 ml pipety dla dodania 550 gl sondy 10x 2 gM.
3.4.3.6. Użyć 1 ml pipety dla dodania 220 gl rTth polimerazy DNA (Applied Biosystems).
3.4.3.7. Użyć 100 gl pipety dla dodania 55 gl AmpErase UNG (Applied Biosystems).
3.4.3.8. Użyć 1 ml pipety dla dodania 605 gl Ambion H2O do 14 ml probówki; końcowa objętość wynosi łącznie 4400 gl.
3.4.3.9. Przenieść 4400 gl głównej mieszanki do 25 ml pojemnika na reagent.
3.4.3.10. Rozdzielić 40 gl na dołek do wszystkich 96 dołków stosując 8-kanałową pipetę.
3.4.3.11. Przenieść 10 gl ekstrahowanej nieznanej próbki do dołków płytki reakcyjnej stosując 8 kanałową pipetę, kolumnami, od kolumny 1 do kolumny 11. Zatkać każdą kolumnę po przeniesieniu.
3.4.3.12. Dodać 270 gl Ambion H2O do 30 gl 108 kopii/10 gl transkryptu RNA do stosowania w standardowej krzywej i zmieszać. Występuje teraz 107 kopii ilościowego wzorca RNA replikonu HCV/10 gl.
3.4.4. Ustawienie ABI 7700 dla każdego przebiegu
3.4.4.1 Przed każdym przebiegiem, zrestartować komputer dla ABI 7700 i odbudować pulpit.
PL 211 019 B1
3.4.4.2 Zamknąć i usunąć wszystkie niepotrzebne programy z twardego dysku; usunąć dane do kosza.
3.4.4.3 Otworzyć program Sequence Detector v1.7 (oprogramowanie SDS).
3.4.4.5 Otworzyć folder Replicon Assay Runs.
3.4.4.6 Otworzyć płytę wzorca Replicon Assay. Warunki termalnego cyklizatora zaprogramowane we wzorcu są następujące:
Etap 1 : 50°C przez 2 min.
Etap 2 : 60°C przez 30 min.
Etap 3 : 95°C przez 5 min.
Etap 4 : 95°C przez 15 s.
Etap 5 : 60°C przez 60 s.
Liczba powtórzeń etapów 4-5: 40.
Template instrument: diagnosis: advanced options:
Select views: display mse.
Select views: display best fit.
Select miscellaneous: reference dye ROX.
3.4.4.7 Save (nie save as) plik w folderze Replicon Assay Runs.
3.4.4.8 Pokazać setup: nacisnąć RUN
3.5 Przygotowanie danych ABI7700 po przebiegu z użyciem oprogramowania SDS.
3.5.1. Testowe płytki usuwa się z ABI7700 i odrzuca bez otwierania. To znacznie zmniejsza problemy laboratorium z zakażeniami krzyżowymi PCR.
3.5.2. Dane analizuje się stosując oprogramowania Sequence Detector System V1.7.
3.5.3. Poziomy progowe są początkowo ustawiane na wartości domyślne.
3.5.4. Kryteria odrzucania danych: Można odrzucać punkty danych lub serie całych płytek. Jeśli wystąpiło znaczące odchylenie od protokołu, niezadziałanie reagentu lub wypadek, lub awaria działania ABI 7700, dane można odrzucić. Dla odrzucenia dowolnego punktu danych z pozornie poprawnego przebiegu, musi się spełnić jedno lub więcej tych kryteriów.
3.5.4.1. Obliczenia cyklu progowego. Normalnie wykorzystać domyślne wartości oprogramowania SDS. Jeśli Ct najbardziej stężonej próbki jest mniejsze niż 15, zmienić wartość progową granicy zatrzymania stosownie do potrzeb do niższej wartości, tak że Ct próbki o najwyższym stężeniu jest większe niż wartość zatrzymania. Odświeżyć obliczenia po dokonaniu tej zmiany.
3.5.3.2. Rozważyć odrzucenie całego nienormalnego przebiegu TaqMan® wskazywanego przez odchylenie od średnich wartości dla nachylenia i przecięcia z osią y linii generowanej przez analizę wzorców RNA neo Dopuszczalne zakresy dla tych wartości wynoszą:
wartości nachylenia powinny być pomiędzy 3,0 i 3,6 przecięcie z y powinno być pomiędzy 36 i 41 cyklem.
3.5.4.3. Błędne indywidualne dołki TaqMan®, jak wskazuje skrajna wartość Nr/.\Nr, można skasować przed analizą danych, tak że nie wpłyną na obliczenia oprogramowania SDS.
3.5.4.4. Zbadać i zapisać bezwzorcowe kontrolne wartości Ct i potwierdzić, że są >7,0 Ct (>100X) wyższe niż Ct dla próbki potraktowanej dowolnym związkiem.
3.5.5. Wartości Ct wzorców RNA HCV porównuje się z poprzednimi wynikami.
3.5.6. Krzywą standardową RNA HCV porównuje się z poprzednimi wynikami.
3.5.7. Jeśli nienormalne wzmocnienie jest oczywiste w indywidualnych dołkach, te dołki identyfikuje się i zapisuje.
3.5.8. Plik results jest eksportowany i przenoszony z komputera 7700 do innego komputera do analizy z użyciem programu Microsoft Excel.
3.5.9. Podawane są wszystkie następujące zmiany w wytwarzaniu lub rozcieńczaniu reagentów.
Nowa synteza sondy lub startera od dostawcy.
Nowe rozcieńczenie i porcjowanie sondy lub startera.
Nowe wzorce preparatu transkryptu RNA.
Nowe wzorce rozcieńczenia i próbkowania transkryptu RNA.
Nowe wytwarzanie wirusowych BVDV.
Nowe wytwarzanie wzorców kolumny 11.
®
3.6 Analiza danych TaqMan®.
PL 211 019 B1
3.6.1. Skopiować i wkleić numer Ct HCV TaqMan® i skopiować numer z pliku wyników TaqMan® do odpowiednich komórek makroprogramu analizy danych testu replikonu Microsoft Excel, i uruchomić makro.
3.6.2. Skopiować tablicę wyników TaqMan® z arkusza makro do innego arkusza, wprowadzić nr kolejny związku i numer partii.
3.6.3 Z arkusza Excel, oblicza się średnią, standardowe odchylenie i procentowe CV aktywności inhibicji związku, jak nr kopii HCV, liczbę Ct HCV, i liczbę Ct BVDV (jeśli dostępna), dla wszystkich punktów rozcieńczenia w 5 powtórzeniach i kontroli bez związku.
3.6.4. Kryteria odrzucania danych i implementacji BVDV Control TaqMan®. Sprawdzić wszystkie obliczenia. Można odrzucać punkty danych lub serie całych płytek. Jeśli wystąpiło znaczące odchylenie od protokołu, niezadziałanie reagentu lub wypadek, lub awaria działania ABI 7700, dane można odrzucić. Dla odrzucenia dowolnego punktu danych z pozornie poprawnego przebiegu, musi się spełnić jedno lub więcej tych kryteriów. Standardowe odchylenie procentowej inhibicji powinno być mniejsze niż 30% w czynnych związkach. %CV liczby kopii HCV powinna być mniejsza niż 30%. Standardowe odchylenie Ct HCV wszystkich próbek powinno być mniejsze niż 0,5; zwykle około 0,1 do 0,3 w większości próbek. Jeśli standardowe odchylenie Ct HCV jest większe niż 0,5, wrócić do surowej tablicy danych, i sprawdzić liczby Ct 5 powtórzeń. Jeśli liczba Ct dla dowolnego dołka jest o 2 Ct różna od średniej liczby Ct z 5 powtórzeń, ten dołek powinien być pominięty w analizie. Jeśli więcej niż 3 doł ki (nie w tej samej kolumnie) ma niezwykł e liczby Ct, powinno się przeprowadzić wewnę trzny test kontrolny BVDV TaqMan®. Jeśli dane BVDV wykazują nieregularność, związek powinien być testowany ponownie.
3.6.5. Obliczenia IC50: Skopiować i wkleić dane średniej inhibicji i standardowego odchylenia do kalkulatora esowatej reakcji na dawkę ze zmiennym nachyleniem, wykorzystującego metody nieliniowej regresji. Stosując to narzędzie, obliczyć IC50 stosując oba sposoby: ustalić tylko górną wartość przy 100% inhibicji, lub ustalić górną wartość przy 100% inhibicji i dolną wartość przy 0% inhibicji. Sposób dający najlepsze dopasowanie podaje się następnie dla każdego związku. Najpewniejsze IC50 pochodzi z obliczenia mającego najniższy błąd standardowy. Jeśli IC50 obliczone z tych dwu opcji dopasowania krzywych wykazują więcej niż jednokrotną różnicę, lub jeśli standardowe odchylenie IC50 jest większe niż IC50, związek powinien być testowany ponownie przy poprawionych stężeniach.
Obliczanie efektów inhibitorów proteazy serynowej HCV w kombinacji z interferonami
Wpływ inhibitora proteazy serynowej HCV (HSPI) i interferonu w kombinacji można ocenić w teście replikonu tworząc krzywą reakcji na dawkę dla HSPI w obecności różnych poziomów interferonu, lub przez określenie krzywej reakcji na dawkę dla interferonu w obecności różnych poziomów HSPI. Celem jest ocenienie, czy występuje większa czy mniejsza inhibicja akumulacji wirusowego RNA niż spodziewana, gdy dwa leki mają addytywny wpływ na RNA. Dokładniej, stosuje się definicję addytywności Lowe'a ((1928) Die Quantitation Probleme der Pharmakologie, Ergebn. Physiol., 27, 47-187). Definicja jest następująca. Niech DE,INF będzie stężeniem interferonu dającym efekt E, i niech DE,HSPI będzie stężeniem inhibitora proteazy, dającym efekt E.
1=
Di DE,INF
D2 DE,INF (1)
Brak interakcji lub addytywność Lowe'a jest definiowana następującą zależnością, gdzie kombinacja stężenia D1 INF i D2 HSPI daje efekt E.
Stopień synergii lub antagonizmu wyraża się w kategoriach krzywych takiego samego efektu lub izoboli. Kombinacja (D1, D2) jest punktem na wykresie, gdzie na osiach są stężenia interferonu i HSPI (fig. 2). Wszystkie takie kombinacje dają ce poziom efektu E tworzą izobol efektu E. Koniecznie jest tak, że (DE,INF, 0) i (0, DE,HSPI) są punktami na izobolu. Izobole są prostymi liniami, łączącymi punkty (DE,INF, 0) i (0, DE,HSPI), gdy spełniona jest zależność addytywności (1).
Wypukłe izobole wskazują na synergię, i wklęsłe izobole wskazują na antagonizm. Zgodnie ze wskazówkami Berenbauma, M. C. ((1985) The expected effect of a combination of agents: the general solution. J. Theor. Biol., 114, 413-431), i Greco, Park i Rustom ((1990) Application of a New Approach for the Quantitation of Drug Synergism to the Combination of cis-Diamminedichloroplatinum and 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine, Cancer Research, 50, 5318-5327), dodano wyraz do (1) dla uwzględnienia synergii lub antagonizmu. Równanie definiuje powierzchnię reakcji, którą można dopasować do
PL 211 019 B1 procentowych wartości kontrolnych przy wszystkich kombinacjach terapii. Konturowymi wykresami tych dopasowanych powierzchni reakcji są izobole.
Model powierzchni reakcji zakłada esowatą reakcję na dawkę dla każdego związku zdefiniowaną przez (2).
E=
1+ \lek ] IC 50 +B (2)
Stężenia dające konkretny poziom aktywności E są dane wzorem (3)
Dla spełnienia modelu Greco i in. (1990), połączone działanie leków musi spełniać równanie (4) dla każdej kombinacji leków dających poziom reakcji E.
Parametr α mierzy wielkość interakcji. Zerowa wartość α oznacza brak interakcji lub addytywność, ponieważ równanie redukuje się do (1) gdy α = 0. Mając IC50, nachylenia Hilla (m), maksymalną wartość (Emax), i minimalną wartość (B), to równanie można rozwiązać otrzymując efekt powstający z dowolnej kombinacji terapii [INF] i [HSPI]. Tak wię c to równanie definiuje powierzchnię reakcji. W eksperymencie, w którym [INF] i [HSPI] zmieniają się , parametry moż na dobierać stosują c nieliniową ważoną regresję najmniejszych kwadratów. Parametr α może być pokrewny mierze synergii S (Hewlett, P. S. (1969) Measurement of potencies of drug mixtures. Biometrics, 25, 477-487), którą bierze się bezpośrednio z izoboli przy 50% efekcie. S oznacza stosunek odległości od początku do izobolu definiującego addytywność, do odległości od początku do izobolu dopasowanych danych, wzdłuż linii nachylonej 45 stopni od osi. (S=ON/OM, patrz fig. 3). Zależnością jest α = 4(S2-S).
Sposób omówiony przez Greco i in. (1990), powyżej, dopasowywania powierzchni reakcji i okreś lania parametru synergii α z jego poziomem istotnoś ci kontynuuje się oceną stopnia synergii w serii eksperymentów testują cych HSPI w kombinacji z kilkoma róż nymi interferonami. Jednakż e istnieje zapotrzebowanie na przydanie większej wagi obserwacjom z niższymi zliczeniami bardziej niż tym z wyższymi zliczeniami. Zliczenia odnoszą się bezpośrednio do procentu kontrolowania, który jest efektem E. Stosując sposoby opisane u Carrolla, R. J. i Ruperta, D. ((1988) (Transformation and Weighting in Regression, Chapman i Hall, New York), można stwierdzić zwiększanie zmienności między dołkami z kwadratem średniej procentowej wartości kontrolnej. Tak więc obserwacje otrzymują wagę o jeden większą od dopasowanej procentowej wartości kontrolnej (E) w kwadracie. Wariancja i wagi użyte w analizie tych eksperymentów jest spójna z zależnościami zmienności obserwowanymi przez badaczy badających sposoby analizy testów radioligandów (Finney, D. J., (1976), Radioligand Assay,
PL 211 019 B1
Biometrics, 32, 721-740, i Dudley, R. A. Edwards, P., Ekins, R. P., McKinzie, 1. G. M., Raab, G. M., Rodbard, D. i Rodgers, R. P. C. (1985), Guidelines for Immunoassay Data Processing, Clinical Chemistry, 31/8, 1264-1271).
Wyniki
W początkowym eksperymencie, inhibitor proteazy serynowej HCV, związek CU, testuje się w zakresie stężeń od 3 pM do 0,0123 pM, to jest, 244-krotnym. Stężenia interferonu-alfa 2B wahają się od 30 jednostek na próbkę do 0,0096 jednostek na próbkę, to jest, 3125-krotnie. Jak pokazano w tablicy 7, przy stosowaniu jako pojedyncza terapia lekowa, związek CU wykazuje IC50 0,48 pM, a IC50 interferon wynosi 2,19 U. W granicach precyzji testu replikonu, która wynosi w przybliżeniu 20%, dodanie interferonu-alfa 2B daje wzrost inhibicji akumulacji RNA replikonu w sposób zależny od dawki. Np., terapia komórek 0,333 pM związku CU daje 28% inhibicję akumulacji RNA replikonu. Terapia komórek kombinacją 0,333 pM związku CU, co stanowi 71% dawki IC50 (0,469 pM) i 0,24 U interferonu-alfa 2B, co stanowi 11% IC50 interferon-alfa 2B (2,05 pM) daje 49% inhibicji akumulacji RNA replikonu. Tak więc, 71% jednego IC50 dawki w kombinacji z 11% innej daje 49% inhibicji akumulacji RNA replikonu. Stosując intuicyjne podejście do określania, czy kombinowana terapia jest synergiczna, czy addytywna lub antagonistyczna, można przewidywać, że jeśli efekt kombinowanej terapii jest tylko addytywny, można się spodziewać, że kombinowane ułamki dwu IC50 dawek potrzebne do uzyskania 49% inhibicji akumulacji RNA replikonu wynoszą 98%. Nasze wyniki doświadczalne wykazują, że poziom inhibicji akumulacji RNA replikonu osiąga się stosując 71% plus 11%, to jest 82% IC50 dawki, a nie 98%, jak przewidują addytywne efekty kombinowanej terapii. Tak więc przy tych stężeniach związków, efekt wydaje się być synergiczny, ponieważ stosuje się mniejsze ułamki IC50 dawki każdego związku otrzymując 49% inhibicji RNA replikonu HCV niż byłoby konieczne dla samych związków, gdzie konieczne byłoby 98% IC50 dawek. Wyniki tej kombinowanej terapii są pokazane w tablicy 8 i graficznie na fig. 1.
T a b l i c a 7
Inhibicja akumulacji RNA replikonu po 48 godzinach traktowania związkiem CU i interferonem-alfa 2B, osobno lub w kombinacji
Interferon-alfa 2B (jednostki)
Związek CU (stęż.) 30 U 6 U 1,2 U 0,24 U 0,048 U 0,0096 U 0 U
3 pM 99% 99% 99% 99% 98% 98% 98%
1 pM 99% 98% 96% 95% 92% 93% 88%
0,333 pM 94% 87% 66% 49% 33% 27% 28%
0,1111 pM 93% 79% 46% 29% 12% 15% 11%
0,0370 pM 92% 78% 44% 21% 2% 7% 8%
0,0123 pM 92% 78% 44% 20% 19% 19% 5%
0 pM 89% 73% 38% 16% 8% 12% 0%
Te początkowe wyniki, uzyskane jako wspomniano wcześniej stosując test repiikonu in vitro i prostą analizę addytywności danych generowanych w teście wykazują, że kombinowana terapia komórek replikonowych inhibitorem proteazy serynowej HCV i interferonem daje co najmniej addytywny efekt przeciwwirusowy, i prawdopodobnie synergiczny efekt przeciwwirusowy.
Powyższe dane zanalizowano ponownie stosując formalne matematyczne narzędzia opisane powyżej dla określenia, czy zależność pomiędzy inhibitorem proteazy serynowej HCV CU i interferonem alfa-2B jest synergiczna, addytywna lub antagonistyczna. Zanalizowane ponownie dane pokazano numerycznie w tablicy 8 i graficznie na fig. 4.
Tablica 8 podsumowuje kolejne wyniki uzyskane w teście repiikonu po terapii zawierających replikon komórki przez 48 godzin z różnymi inhibitorami proteazy serynowej HCV według wynalazku i kilkoma różnymi interferonami, osobno lub w kombinacji. Wskazujemy, że standardowe odchylenie wartości zmierzonych dla inhibicji RNA repiikonu HCV w teście repiikonu wynosi ~20%. Związki testuje się w szerokim zakresie stężeń i przy niższych stężeniach związku nie powodujących znaczącej inhibicji stężenia RNA repiikonu HCV. Ze względu na ~20% standardowe odchylenie w teście, pewne punkty danych będą generowały ujemne liczby. Ujemne wartości inhibicji wskazują, że w konkretnym
PL 211 019 B1 eksperymencie występuje średnio więcej cząsteczek RNA repiikonu HCV w próbkach potraktowanych związkiem niż w fikcyjnie potraktowanych próbkach.
T a b l i c a 8
Inhibicja akumulacji RNA repiikonu po 48 godzinach terapii inhibitorów proteazy serynowej HCV i różnych interferonów, osobno lub w kombinacji
Eksperyment 1
IFN alfa-2B (jednostki)
Związek CU (pM) 30,00 6,00 1,20 0,24 0,048 0,0096 0,000
0,000 89% 73% 38% 16% 8% 12% 0%
0,012 92% 78% 44% 20% 19% 19% 5%
0,037 92% 78% 44% 21% 2% 7% 8%
0,111 93% 79% 46% 29% 12% 15% 11%
0,333 94% 87% 66% 49% 33% 27% 28%
1,000 99% 98% 96% 95% 92% 93% 88%
3,000 99% 99% 99% 99% 98% 98% 98%
Eksperyment 2
IFN alfa-2A (jednostki)
Związek CU (pM) 30 6 1,2 0,24 0,048 0,0096 0
0 86% 61% 27% 4% -7% 5% 0%
0,0123 87% 6% 17% -23% 8% 8% 10%
0,37 85% 62% 13% -2% 0% -1% 1%
0,1111 87% 68% 37% 20% -6% 12% 10%
0,333 92% 77% 58% 41% 26% 25% 44%
1 98% 96% 90% 86% 84% 83% 85%
3 99% 99% 98% 98% 98% 98% 98%
Eksperyment 3
Związek CU (pM)
Interferon alfa-2B (jednostki) 3 1,5 0,75 0,375 0,1875 0,0938 0,0469 0,0234 0
0 98% 93% 62% 23% 12% -2% -4% -2% 0
0,049 98% 95% 70% 39% 12% 2% 6% 9% 3%
0,123 98% 95% 70% 43% 15% 7% 2% 5% 2%
0,307 98% 95% 73% 46% 16% 14% 7% 19% -3%
0,768 98% 95% 82% 56% 43% 34% 28% 32% 28%
1,920 98% 98% 87% 71% 51% 54% 49% 52% 45%
4,8 99% 98% 92% 82% 74% 71% 69% 71% 59%
12,0 99% 98% 96% 89% 87% 85% 85% 85% 80%
30,0 99% 99% 98% 95% 93% 92% 92% 93% 89%
PL 211 019 B1
Eksperyment 4
Związek CU ^M)
Interferon alfa-2A (jednostki) 3 1,5 0,75 0,375 0,1875 0,0938 0,0469 0,0234 0
0 98% 94% 74% 38% 17% 3% -1% 6% 0%
0,049 98% 93% 60% 22% 29% 21% -9% -6% 6%
0,123 98% 93% 67% 29% 21% 12% 3% 2% -8%
0,307 98% 93% 66% 29% 22% 4% -3% -4% 10%
0,768 98% 95% 67% 46% 24% 21% 20% 9% 15%
1,920 98% 96% 73% 48% 43% 44% 27% 33% 29%
4,8 98% 97% 82% 61% 61% 59% 52% 55% 43%
12,0 99% 98% 91% 75% 76% 72% 71% 74% 73%
30,0 99% 98% 96% 89% 86% 85% 84% 84% 83%
Eksperyment 5
Związek CU ^M)
Owczy interferon tau (jednostki) 3 1,5 0,75 0,375 0,1875 0,0938 0,0469 0,0234 0
0,0 98% 95% 65% 24% -1% -14% -14% -12% 0
0,9375 97% 95% 72% 41% 17% 11% 12% 6% 17%
1,875 97% 95% 71% 40% 31% 18% 18% 11% 4%
3,75 98% 96% 75% 44% 38% 25% 34% 18% 17%
7,5 98% 96% 82% 61% 42% 37% 25% 26% 36%
15 98% 97% 84% 64% 59% 61% 56% 51% 53%
30 98% 98% 90% 79% 72% 68% 65% 68% 68%
60 98% 98% 93% 87% 80% 80% 74% 77% 82%
120 98% 98% 95% 92% 86% 87% 86% 86% 87%
Eksperyment 6
Związek EC ^M)
Interferon alfa 2B (jednostki) 3 1,5 0,75 0,375 0,1875 0,0938 0,0469 0,0234 0
0 96% 93% 81% 56% 29% 23% 19% 1% 0
0,0492 96% 92% 80% 60% 31% 15% 19% 29% 6%
0,1229 96% 94% 78% 58% 32% 13% 20% 20% 4%
0,3072 97% 95% 82% 60% 38% 32% 34% 42% 23%
0,768 97% 95% 87% 66% 43% 41% 46% 43% 25%
1,92 98% 97% 90% 73% 62% 51% 54% 58% 47%
4,8 98% 97% 94% 87% 76% 73% 78% 76% 69%
12,0 98% 98% 96% 92% 86% 86% 86% 85% 84%
30,0 98% 98% 96% 96% 93% 92% 92% 95% 91%
PL 211 019 B1
Eksperyment 7
Związek EC (pM)
Interferon alfa-2A (jednostek) 3,0 1,5 0,75 0,375 0,1875 0,0938 0,0469 0,02344 0
0 96% 92% 81% 47% 28% 17% -1% -8% 0
0,0492 96% 93% 78% 58% 21% 8% -12% 10% -17%
0,1229 95% 93% 79% 64% 14% 5% 14% 7% 22%
0,3072 95% 91% 80% 64% 22% 15% 5% 2% -5%
0,768 96% 95% 81% 64% 34% 21% 19% 20% 4%
1,92 96% 95% 88% 78% 44% 41% 19% 33% 21%
4,8 97% 95% 91% 85% 60% 58% 60% 53% 49%
12,0 97% 97% 95% 91% 77% 72% 76% 70% 71%
30,0 98% 98% 97% 94% 91% 86% 85% 85% 84%
Eksperyment 8
Związek CU (pM)
Interferon beta (jednostki) 3,0 1,5 0,75 0,375 0,1875 0,0938 0,0469 0,02344 0
0 97% 95% 77% 34% 16% 6% -7% 0% 0
0,2344 98% 97% 83% 49% 31% 19% -21% -7% 1%
0,4688 98% 96% 84% 56% 39% 27% 10% -3% 21%
0,9375 98% 97% 91% 73% 54% 42% 31% 15% 30%
1,875 98% 98% 95% 80% 65% 58% 65% 60% 60%
3,75 98% 98% 97% 92% 86% 81% 77% 73% 79%
7,5 99% 98% 98% 96% 93% 93% 93% 90% 92%
15,0 99% 99% 99% 97% 97% 96% 97% 95% 96%
30,0 99% 99% 99% 99% 98% 99% 98% 98% 97%
Eksperyment 9
Związek EP (pM)
Interferon alfa-2B (jednostki) 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0,0625 0
0 94% 96% 96% 92% 64% 36% 23% 8% 0
0,0492 95% 96% 96% 91% 67% 25% 28% 8% 3%
0,1229 95% 97% 96% 91% 65% 44% 4% 11% 4%
0,3072 95% 97% 96% 91% 71% 46% 20% 8% 20%
0,7680 96% 97% 97% 93% 75% 49% 36% 24% 24%
1,92 96% 97% 97% 94% 82% 67% 49% 52% 54%
4,8 96% 98% 97% 96% 90% 79% 75% 75% 70%
12 97% 98% 98% 97% 94% 89% 89% 87% 83%
30 97% 98% 98% 98% 96% 94% 94% 95% 92%
PL 211 019 B1
Eksperyment 10
Rybawiryna (gM)
Interferon alfa-2B (jednostek) 200 80 32 12,8 5,12 2,048 0,8192 0,3277 0
0 85% 62% 43% 3% -8% -17% -22% -6% 0
0,0492 87% 66% 48% 44% 11% -4% -10% 11% -7%
0,1229 84% 64% 53% 40% 26% -12% -5% 11% -9%
0,3072 86% 70% 62% 44% 28% 1% 6% 14% 7%
0,7680 90% 80% 72% 65% 38% 30% 28% 44% 29%
1,92 93% 85% 77% 76% 61% 57% 58% 50% 46%
4,8 96% 92% 87% 83% 82% 74% 71% 77% 72%
12 97% 95% 93% 91% 90% 89% 90% 89% 85%
30 98% 97% 96% 95% 94% 94% 93% 95% 94%
Jak pokazano na fig. 4-13, która graficznie obrazuje dane w tablicy 8 wykreślone z użyciem powyżej opisanego sposobu matematycznego mierzenia synergii, krzywe izobolowe dla wszystkich testowanych kombinacji inhibitorów proteazy serynowej HCV i interferonów są wypukłe, wskazując, że antywirusowe działanie terapii w teście replikonu jest synergiczne. Te wyniki są stablicowane w tablicy 9, która pokazuje względne poziomy synergii dla kombinowanej terapii i wartości IC50 dla związków przeciwwirusowych użytych osobno. Kluczowe elementy w tablicy 9 są wartościami α, i wartościami p dla oznaczeń. Termin α jest miarą maksymalnej przegięcia izobolu dla każdej kombinowanej terapii. Wartość zerowa wskazuje na addytywność, ujemna wartość wskazuje na antagonizm, i, jak w przypadku terapii kombinowanych inhibitorami proteazy serynowej HCV i interferonami pokazanymi powyżej, wartość większa niż jeden wskazuje na synergię. Im większy parametr α, większa synergia. Jak pokazano w tablicy 9 dla kombinacji inhibitorów proteazy serynowej HCV i interferonów, nawet ignorując poziomy istotności w każdym eksperymencie, test t oparty na 9 eksperymentach dla średniej wartości α równej 0 (bez interakcji) ma wartość p 0,00014, co wskazuje, że wyniki są wysoce istotne.
Obliczenie synergii oparte na metodzie Greco Rustom ((1990) Application of a New Approach for the Quantitation of Drug Synergism to the Combination of cis-Diamminedichloroplatinum and 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine, Cancer Research, 50, 5318-5327) użyte w tej analizie jest idealnym narzędziem oceny rodzaju danych doświadczalnych, które można generować stosując test replikonu HCV. Istnieją inne sposoby, które są stosowane w badaniach związków przeciwwirusowych, takie jak Pritchard i Shipman (Prichard, M. N., i Shipman, C. Jr., (1990) A three-dimensional model to analyze drug-drug interactions (review), Antiviral Res. 14: 181-206). Zastosowanie tego sposobu obliczania synergii do danych pokazanych w tablicy 8 wskazuje również, że kombinowana terapia komórek replikonowych inhibitorem proteazy serynowej HCV i interferonem spowoduje synergiczną inhibicję akumulacji RNA replikonu HCV (dane nie pokazane).
T a b l i c a 9
Względne poziomy synergii dla kombinowanej terapii i wartości IC50 dla związków przeciwwirusowych użytych osobno
Inhibitor proteazy se- rynowej HCV (HSPI) Interferon IC50 INF (jedno- stek) IC50 HSPI (gM) α (SED)1 wartość P(a>0)
Eksperyment 1 Związek CU IFN alfa-2B 2,05 0,469 0,477 (0,09) <0,0001
Eksperyment 2 Związek CU IFN alfa-2A 3,72 0,446 0,770 (0,12) <0,0001
Eksperyment 3 Związek CU IFN alfa-2B 2,36 0,587 0,730 (0,08) <0,0001
PL 211 019 B1 cd. tabeli 9
Eksperyment 4 Związek CU IFN alfa-2A 5,67 0,633 0,438 (0,08) <0,0001
Eksperyment 5 Związek CU IFN tau 13,22 0,605 0,328 (0,07) <0,0001
Eksperyment 6 Związek EC IFN alfa-2B 2,53 0,384 0,516 (0,10) <0,0001
Eksperyment 7 Związek EC IFN alfa-2A 5,50 0,312 1,24 (0,20) <0,0001
Eksperyment 8 Związek CU IFN beta 1,82 0,466 0,551 (0,09) <0,0001
Eksperyment 9 Związek EP IFN alfa-2B 3,06 0,426 0,490 (0,12) <0,0001
Eksperyment 10 rybawiryna IFN alfa-2B 1,22 145 -0,24 (0,067) 0,0004
1(SE) błąd standardowy
Inną miarą przy ocenie synergicznej natury terapii lekowej przeciw HCV z użyciem niniejszych inhibitorów proteazy serynowej HCV i interferonów jest użycie tych samych sposobów opisanych powyżej dla ocenienia obecnej standardowej terapii kombinowanej dla HCV, to jest, interferonu alfa-2B w kombinacji z rybawiryną w teście replikonu. Ostatni wiersz tablicy 9 pokazuje, że parametr α dla mieszaniny interferonu alfa-2B i rybawiryny jest liczbą ujemną, co wskazuje, że istnieje niewielki antagonizm pomiędzy tymi dwoma lekami. Podkreśla to dodatkowo znaczenie terapii kombinowanych ujawnionych w wynalazku korzystających z niniejszych inhibitorów proteazy serynowej HCV w kombinacji z interferonami, w tym, że te terapie wyraźnie dają synergię, podczas gdy standardowa terapia kombinowana w zastosowaniu wobec HCV (interferon alfa-2B w kombinacji z rybawiryną) nie jest synergiczna w teście replikonu.
Powyższe porównanie kombinowanych terapii wykorzystujących niniejsze inhibitory proteazy serynowej HCV plus interferony wobec rybawiryny plus interferon w teście replikonu wyraźnie wskazuje, że te pierwsze są synergiczne, podczas gdy ta druga nie jest taka. Doświadczalne wyniki otrzymane w teście replikonu wskazują, że znacznie niższa dawka interferonu będzie skuteczna, jeśli interferon stosuje się w kombinacji z inhibitorem proteazy serynowej HCV, niż konieczna, gdy interferon alfa-2B stosuje się w kombinacji z rybawiryną. Test replikonu jest przydatnym systemem modelowym do testowania potencjalnych związków przeciw HCV, i jest obecnie szeroko wykorzystywany jako skuteczny środek do przewidywania aktywności związku przeciw HCV. Poleca się, np., Blight i in. (2000) Efficient Initiation of HCV RNA Replication in Cell Culture. Science 8; 290: 1972-1974, i Chung i in. (2001) Hepatitis C Virus replication is directly inhibited by IFN-α in a full-length binary expression system. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 98 (17): 9847-52. Sama rybawiryna jest słabo skuteczna w zmniejszaniu akumulacji RNA replikonu HCV w teście replikonu (Tablica 8, Eksperyment 10 i ostatni wiersz tablicy 9). Ten wynik stoi w wyraźnej sprzeczności z badaniami in vivo, stosowana oddzielnie, rybawiryna nie ma znaczącej leczniczej wartości do leczenia HCV. W przeciwieństwie do tego w teście replikonu korygowanie cytotoksyczności, jak powiedziano poniżej, rybawiryna ma IC50 145 μΜ. Ten wynik można wyjaśnić zauważając, że test replikonu pozwala na określenie wysokich stężeń rybawiryny, które nie byłyby możliwe w terapii ludzi wskutek cytotoksyczności in vivo (Chutaputti A. (2000) Adverse effects and other safety aspects of the hepatitis C antivirals. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 15 Suppl: E156-63).
Takie określenie koniecznie wymaga oceny cytotoksyczności rybawiryny. Toksyczność pojawia się u pacjentów i w testach komórkowych (Shiffman M. L., Verbeke S. B., Kimball P. M. (2000) Alpha interferon combined with ribavirin potentiates proliferative suppression but not cytokine production in mitogenically stimulated human lymphocytes. Antiviral Research. 48 (2): 91-9). W eksperymentach ujawnionych w wynalazku, cytotoksyczność rybawiryny w teście replikonu jest zauważana i mierzona na dwa sposoby. W teście metabolicznym XTT dla określenia żywotności komórki replikonowej (Roehm N. W., Rodgers G. H., Hatfield S. M., Glasebrook A. L. (1991) An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. Journal of Immunol. Methods. 142 (2): 257-65) i w ilościowym teście RT-PCR TaqMan®, który mierzy poziomy mRNA dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanu (GAPDH) w potraktowanych względem nietraktowanych komórek w teście
PL 211 019 B1 replikonu (Brink N., Szamel M., Young A. R., Wittern K. P., Bergemann J. (2000) Comparative quantification of IL-1beta, lL-10, IL-10r, TNFalpha and IL-7 mRNA levels in UV-irradiated human skin in vivo. Inflamation Research. 49 (6): 290-6), zauważa się znaczącą indukowaną rybawiryną cytotoksyczność, lecz koryguje się ją jak następuje. Zakłada się, że poziom mRNA GAPDH, który jest konstytutywnie ulegającym ekspresji genem, jest taki sam we wszystkich żywych komórkach. Wiadomo z pomiarów poziomów mRNA GAPDH w komórkach potraktowanych inhibitorem transkrypcji aktynomycyną D, że czas półtrwania mRNA GAPDH wynosi tylko kilka godzin (dane nie pokazane). Tak więc postuluje się, jak czynią inni stosujący technologię TaqMan® dla określenia poziomów konkretnych mRNA w ludzkich komórkach, że poziomy mRNA GAPDH są proporcjonalne do liczby żywotnych komórek (VCN) w dowolnej danej próbce, z zależnością VCN= 2Λ (40-CtGApDH mRNA). VCN oblicza się dla każdego dołka próbki testu replikonu, i następnie dzieli się liczbę kopii RNA replikonu HCV dla konkretnego dołka przez VCN dla tego dołka. Po obliczeniu, ten stosunek stosuje się zamiast liczby kopii HCV do obliczania inhibicji (średnia inhibicja z użyciem stosunku; fig. 14.A). Bez korygowania danych testu replikonu dla tej cytotoksyczności, taką cytotoksyczność odczytuje się jako fałszywą dodatnią inhibicję akumulacji RNA replikonu HCV. W teście replikonu zakłada się, że zmierzona inhibicja akumulacji RNA replikonu HCV jest sumą rzeczywistej inhibicji akumulacji RNA replikonu HCV i pozornej inhibicji akumulacji RNA replikonu HCV wskutek cytoksyczności. Ponadto zakłada się, że ze względu na bliską korelację miar cytotoksyczności XTT i TaqMan® mRNA GAPDH, inhibicja akumulacji mRNA GAPDH powodowana przez związki testowane w teście replikonu jest pewną miarą pozornej inhibicji akumulacji RNA replikonu HCV wskutek cytoksyczności. Tak więc, rzeczywista aktywność przeciw HCV związku w teście replikonu skorygowana na ogólną cytotoksyczność może być oceniona przez podzielenie liczby cząsteczek RNA replikonu HCV mierzonej w każdej próbce przez VCN, normalizując liczbę żywych komórek w każdej próbce. Stosując ten sposób, fig. 14.A pokazuje oszacowanie prawdziwej aktywności rybawiryny wobec HCV w teście replikonu (średnia inhibicja z użyciem stosunku). Oszacowanie IC50 dla rybawiryny jest najlepiej obliczać stosując ten sposób. Na fig. 14.A, średnia inhibicja oryginalna pokazuje nieskorygowane IC50 dla rybawiryny, które wynosi w przybliżeniu 80 gM, podczas gdy skorygowana wartość IC50 obliczona z krzywej średnia inhibicja z użyciem stosunku wynosi w przybliżeniu 145 gM. Należy zauważyć, że różnica pomiędzy skorygowaną i zmierzoną inhibicją akumulacji RNA replikonu HCV w wyniku terapii interferonem alfa-2B (fig. 14.B) jest nieznacząca w świetle ~20% %CV testu replikonu. Jak interferon alfa-2B, inhibitory proteazy serynowej HCV testowane w niniejszym przykładzie nie wykazują znaczącej cytotoksyczności przy stosowanych stężeniach. Określa się ją stosując testy XTT, w których wartości IC50 dla różnych związków wynoszą: CU=64,7 gM, EP >10 gM, i EC >50 gM. Te wartości IC50 są 20-140 razy większe niż wartości IC50 pokazane w tablicy 9. Tak więc cytotoksyczność tych związków nie ma znaczącego wpływu na akumulację RNA HCV w teście replikonu w granicach precyzji testu, ponieważ taka cytotoksyczność zachodzi tylko przy stężeniach inhibitora proteazy serynowej HCV znacząco wyższych niż testowane w teście replikonu.
Wnioski dotyczące skuteczności inhibitorów proteazy serynowej HCV i interferonów, osobno i w kombinacji
Aktywności przeciw HCV niniejszych inhibitorów proteazy serynowej HCV i różnych interferonów przy stosowaniu oddzielnie w teście replikonu HCV są pokazane w kolumnach i wierszach indywidualnych eksperymentów składających się na tablicę 8, które wykorzystują tylko jeden środek antywirusowy. Tablica 9 wymienia wartości IC50 mierzone dla każdego przeciwwirusowego związku przy testowaniu oddzielnie. Powyższe wyniki, uzyskane przez użycie testu replikonu, również wykazują, że kombinowana terapia komórek replikonowych inhibitorami proteazy serynowej HCV według wynalazku i różnymi interferonami daje synergiczne efekty przeciwwirusowe. Można się w pełni spodziewać, że te efekty przełożą się na skuteczność in vivo.
Terapia kombinowana wykorzystująca inhibitory proteazy serynowej HCV według wynalazku daje kilka ważnych korzyści względem terapii pojedynczym lekiem. Po pierwsze, umożliwiając terapię możliwie niskimi dawkami indywidualnych leków, niż byłoby możliwe przy stosowaniu oddzielnie, można się spodziewać zmniejszenia toksyczności i skutków ubocznych związanych z terapią. Jest to zwłaszcza ważne w przypadku terapii interferonowej, gdzie skutki uboczne są ostre, i okazały się proporcjonalne do dawki podawanej pacjentom. Powyższe dane wskazują, że dawka inhibitora proteazy serynowej HCV, takiego jak CU przy poziomie IC95 powinna być skombinowana z dawką interferonu alfa, np. przy poziomie IC50, i wynik będzie znacznie skuteczniejszą terapią, niż można osiągnąć z samym inhibitorem proteazy serynowej HCV bez szkodliwych skutków ubocznych spowodowanych
PL 211 019 B1 wysokimi dawkami interferonu alfa. Druga główna korzyść z terapii kombinowanej jest taka, że ponieważ oba leki działają niezależnie, istnieje mniejsza możliwość rozwoju zmutowanych szczepów HCV opornych na terapię. Rozwój oporności jest głównym problemem przy wirusach RNA, jak HCV. Ze względu na ich wysoką częstość mutacji, takie wirusy mogą się gwałtownie adaptować do stresów środowiskowych. Trzecią korzyścią z terapii kombinowanej może być zmniejszony koszt, dzięki zapotrzebowaniu na mniejsze ilości leczniczych środków koniecznych do skutecznej terapii.
Dodatkowe immunomodulatory, które można stosować w sposobach ujawnionych w wynalazku obejmują, np., interferon alfa 2A, consensus interferon, interferon tau, interferon + rybawiryna (Rebatron), pegylowany interferon, oraz promotory ekspresji genu interferonu. Można w pełni przewidywać, że aktywność przeciw HCV tych związków będzie polepszona przy stosowaniu w kombinacji z inhibitorami proteazy serynowej HCV, takimi jak te ujawnione w wynalazku. Ponieważ interferony są znane z aktywności in vivo i w teście replikonu, można się spodziewać, że niniejsze inhibitory proteazy serynowej HCV będą również czynne in vivo, i co ważniejsze, zdolne do wywoływania synergicznej aktywności przy stosowaniu w kombinacji z interferonami, stymulatorami układu odpornościowego, lub innymi związkami wykazującymi aktywność przeciw wirusowi HCV działającymi poprzez mechanizm inny niż inhibicja proteazy serynowej HCV.
Najlepsza obecnie terapia na HCV wykorzystuje interferon alfa i nukleozydowy analog rybawirynę. Ta terapia jest tylko marginalnie skuteczna, i powoduje znaczące skutki uboczne zmniejszające podatność pacjenta (Chronic Hepatitis C: Current Disease Management, U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health, 1999). Dodatkowo, u pacjentów z przeszczepami, nie jest jasne działanie kombinacji rybawiryna-interferon, i może ono istotnie być gorsze niż samego interferonu (Chronic Hepatitis C: Current Disease Management, U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health, 1999).
Wyniki przedstawione powyżej pokazują synergiczny efekt kombinacji, gdy interferony stosuje się z nową klasą środków przeciw wirusowi HCV, inhibitorów proteazy serynowej według wynalazku. W pełni można się spodziewać, że wyniki in vitro ujawnione w wynalazku doprowadzą do bardziej skutecznej terapii pacjentów z HCV niż jest to obecnie możliwe dla samego interferonu. Mniejsze od leczniczych dawki interferonu mogą mobilizować układ odpornościowy pacjenta do lepszego zwalczania wirusa, i inhibitor proteazy serynowej może atakować wirus bezpośrednio, poddając wirusa dwukierunkowemu atakowi poprzez różne mechanizmy działania. Terapię infekcji HCV można więc osiągnąć przy zmniejszonym koszcie dla pacjenta w kategoriach zmniejszonych skutków ubocznych i niższych opłat za konieczne farmaceutyczne środki, ponieważ mniejsze ilości obu leków będą potrzebne dla uzyskania skutecznej terapii przeciw wirusowi HCV.
Wynalazek można zrealizować w innych specyficznych formach bez odchodzenia od jego ducha lub zasadniczych jego atrybutów.

Claims (31)

1. Związek peptydomimetyczny o wzorze:
lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól lub przedlek, lub solwat takiego związku, jego sól lub przedlek.
2. Związek peptydomimetyczny według zastrz. 1, o wzorze:
PL 211 019 B1
3. Związek peptydomimetyczny o wzorze:
lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól lub przedlek, lub solwat takiego związku, jego sól lub przedlek.
4. Związek peptydomimetyczny według zastrz. 3, o wzorze:
5. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera farmaceutycznie dopuszczalną ilość związku określonego w zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
6. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera związek określony w zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, interferon wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
7. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 6, znamienna tym, że dodatkowo zawiera związek wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C, inny niż interferon.
8. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 7, znamienna tym, że związek określony w zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, interferon i związek wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C występują w ilości wybranej z grupy obejmującej farmaceutycznie skuteczną ilość, subkliniczną farmaceutycznie skuteczną ilość i ich kombinację.
9. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 8, znamienna tym, że interferon wybiera się z grupy obejmującej interferon alfa 2B, pegylowany interferon alfa, consensus interferon, interferon alfa 2A, limfoblastoidowy interferon i interferon tau; a związek wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C wybiera się z grupy obejmującej interleukinę 2, interleukinę 6, interleukinę 12, związek ułatwiający rozwój odpowiedzi limfocytu T pomocnicznego typu 1, dwuniciowy RNA, dwuniciowy RNA kompleksowany z tobramycyną, imikwimod, rybawirynę, inhibitor dehydrogenazy 5'-monofosforanu inozyny, amantadynę i rymantadynę.
PL 211 019 B1
10. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera związek określony w zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, związek wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C, inny niż interferon i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
11. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4 do wytwarzania leku do inhibitowania proteazy wirusa zapalenia wątroby typu C.
12. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4 do wytwarzania leku do leczenia pacjentów zakażonych wirusem zapalenia wątroby typu C lub pacjentów, u których występują stany fizjologiczne związane z zakażeniem.
13. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4 w połączeniu z farmaceutycznie skuteczną ilością innego środka leczniczego przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C, do wytwarzania leku do leczenia pacjentów zakażonych wirusem zapalenia wątroby typu C lub pacjentów u których występują stany fizjologiczne związane z zakażeniem.
14. Zastosowanie według zastrz. 13, w którym innym środkiem leczniczym przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C jest interferon lub derywatyzowany interferon.
15. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4 w połączeniu z interferonem wykazującym aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C, do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania infekcji wirusem zapalenia wątroby typu C, u pacjenta potrzebującego takiego leczenia lub zapobiegania.
16. Zastosowanie według zastrz. 15, w którym związek określony w zastrz. 1, albo 3, i interferon występują w ilości wybranej z grupy obejmującej farmaceutycznie skuteczną ilość, subkliniczną farmaceutycznie skuteczną ilość i ich kombinację.
17. Zastosowanie według zastrz. 16, w którym interferon wybiera się z grupy obejmującej interferon alfa 2B, pegylowany interferon alfa, consensus interferon, interferon alfa 2A, limfoblastoidowy interferon i interferon tau.
18. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, w połączeniu ze związkiem wykazującym aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C, innym niż interferon, do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania infekcji wirusem zapalenia wątroby typu C u pacjenta potrzebującego takiego leczenia lub zapobiegania.
19. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, w połączeniu z interferonem wykazującym aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C i związkiem wykazującym aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C, innym niż interferon, do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania infekcji wirusem zapalenia wątroby typu C, u pacjenta potrzebującego takiego leczenia lub zapobiegania.
20. Zastosowanie według zastrz. 19, w którym związek określony w zastrz. 1, albo 3, interferon i zwią zek wykazują cy aktywność przeciw wirusowi zapalenia wą troby typu C wystę pują w iloś ci wybranej z grupy obejmującej farmaceutycznie skuteczną ilość, subkliniczną farmaceutycznie skuteczną ilość i ich kombinację.
21. Zastosowanie według zastrz. 20, w którym interferon wybiera się z grupy obejmującej interferon alfa 2B, pegylowany interferon alfa, consensus interferon, interferon alfa 2A, limfoblastoidowy interferon i interferon tau; a związek wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C wybiera się z grupy obejmującej interleukinę 2, interleukinę 6, interleukinę 12, związek ułatwiający rozwój odpowiedzi limfocytu T pomocnicznego typu 1, dwuniciowy RNA, dwuniciowy RNA kompleksowany z tobramycyną, imikwimod, rybawirynę, inhibitor dehydrogenazy 5'-monofosforanu inozyny, amantadynę i rymantadynę.
22. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, i interferonu wykazującego aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C, do wytwarzania leku do hamowania replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C w komórce.
23. Zastosowanie według zastrz. 22, w którym lek dodatkowo zawiera związek wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C, inny niż interferon.
24. Zastosowanie według zastrz. 23, w którym związek, określony w zastrz. 1, albo 3, interferon, i związek wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C występują w ilości wybranej z grupy obejmującej farmaceutycznie skuteczną ilość, subkliniczną farmaceutycznie skuteczną ilość i ich kombinację.
25. Zastosowanie według zastrz. 24, w którym interferon wybiera się z grupy obejmującej interferon alfa 2B, pegylowany interferon alfa, consensus interferon, interferon alfa 2A, limfoblastoidowy interferon i interferon tau; a związek wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C
PL 211 019 B1 wybiera się z grupy obejmującej interleukinę 2, interleukinę 6, interleukinę 12, związek ułatwiający rozwój odpowiedzi limfocytu T pomocnicznego typu 1, dwuniciowy RNA, dwuniciowy RNA kompleksowany z tobramycyną, imikwimod, rybawirynę, inhibitor dehydrogenazy 5'-monofosforanu inozyny, amantadynę i rymantadynę.
26. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, i związku wykazującego aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C, innego niż interferon, do wytwarzania leku do hamowania replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C w komórce.
27. Zestaw lub farmaceutyczne opakowanie obejmujące wiele odrębnych pojemników, znamienne tym, że co najmniej jeden z pojemników zawiera inhibitor proteazy serynowej wirusa zapalenia wątroby typu C, określony w zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, a co najmniej drugi z pojemników zawiera interferon wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C.
28. Zestaw lub farmaceutyczne opakowanie obejmujące wiele odrębnych pojemników, znamienne tym, że co najmniej jeden z pojemników zawiera inhibitor proteazy serynowej wirusa zapalenia wątroby typu C, określony w zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, i co najmniej drugi z pojemników zawiera związek wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C, inny niż interferon.
29. Zestaw lub farmaceutyczne opakowanie obejmujące wiele odrębnych pojemników, znamienny tym, że co najmniej jeden z pojemników zawiera inhibitor proteazy serynowej wirusa zapalenia wątroby typu C, określony w zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, co najmniej drugi z pojemników zawiera interferon wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C, i co najmniej kolejny z pojemników zawiera związek wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C, inny niż interferon.
30. Zestaw lub farmaceutyczne opakowanie według zastrz. 29, znamienny tym, że inhibitor proteazy serynowej wirusa zapalenia wątroby typu C, interferon i związek wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C występują w ilości wybranej z grupy obejmującej farmaceutycznie skuteczną ilość, subkliniczną farmaceutycznie skuteczną ilość i ich kombinację.
31. Zestaw lub farmaceutyczne opakowanie według zastrz. 29, znamienny tym, że interferon wybiera się z grupy obejmującej interferon alfa 2B, pegylowany interferon alfa, consensus interferon, interferon alfa 2A, limfoblastoidowy interferon i interferon tau; a związek wykazujący aktywność przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C wybiera się z grupy obejmującej interleukinę 2, interleukinę 6, interleukinę 12, związek ułatwiający rozwój odpowiedzi limfocytu T pomocnicznego typu 1, dwuniciowy RNA, dwuniciowy RNA kompleksowany z tobramycyną, imikwimod, rybawirynę, inhibitor dehydrogenazy 5'-monofosforanu inozyny, amantadynę i rymantadynę.
PL365836A 2000-08-31 2001-08-31 Związek peptydomimetyczny, kompozycje farmaceutyczne i zestawy lub opakowania farmaceutyczne zawierające ten związek oraz zastosowanie tego związku do wytwarzania leku PL211019B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22939800P 2000-08-31 2000-08-31
US27764101P 2001-03-21 2001-03-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL365836A1 PL365836A1 (pl) 2005-01-10
PL211019B1 true PL211019B1 (pl) 2012-03-30

Family

ID=26923261

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL365836A PL211019B1 (pl) 2000-08-31 2001-08-31 Związek peptydomimetyczny, kompozycje farmaceutyczne i zestawy lub opakowania farmaceutyczne zawierające ten związek oraz zastosowanie tego związku do wytwarzania leku

Country Status (37)

Country Link
US (5) US7820671B2 (pl)
EP (9) EP2368877B1 (pl)
JP (4) JP4689938B2 (pl)
KR (10) KR20080104384A (pl)
CN (7) CN101696232A (pl)
AR (1) AR030591A1 (pl)
AT (2) ATE483686T1 (pl)
AU (2) AU2001288318B2 (pl)
BR (1) BR0113666A (pl)
CA (2) CA2419607C (pl)
CL (1) CL2010000330A1 (pl)
CY (2) CY1109216T1 (pl)
CZ (1) CZ2003595A3 (pl)
DE (4) DE60143233D1 (pl)
DK (2) DK1320540T5 (pl)
DZ (1) DZ3438A1 (pl)
EA (2) EA017556B1 (pl)
EC (2) ECSP034493A (pl)
ES (4) ES2325481T3 (pl)
HK (3) HK1163061A1 (pl)
HR (1) HRP20030139B8 (pl)
HU (1) HUP0300855A3 (pl)
IL (6) IL154671A0 (pl)
LU (1) LU91960I2 (pl)
MX (1) MXPA03001780A (pl)
NO (4) NO329929B1 (pl)
NZ (2) NZ541302A (pl)
PE (1) PE20020474A1 (pl)
PL (1) PL211019B1 (pl)
PT (1) PT1320540E (pl)
SI (1) SI1320540T1 (pl)
SK (1) SK2492003A3 (pl)
SV (1) SV2003000617A (pl)
TW (6) TWI359145B (pl)
UA (2) UA81600C2 (pl)
WO (1) WO2002018369A2 (pl)
ZA (1) ZA200301641B (pl)

Families Citing this family (237)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA001915B1 (ru) * 1996-10-18 2001-10-22 Вертекс Фармасьютикалз Инкорпорейтед Ингибиторы серин-протеаз, в частности ns3 протеазы вируса гепатита c (hvc)
US6608027B1 (en) 1999-04-06 2003-08-19 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd Macrocyclic peptides active against the hepatitis C virus
ES2240446T3 (es) * 2000-04-03 2005-10-16 Vertex Pharma Inhibidores de serina proteasas, particularmente la proteasa ns3 del virus de la hepatitis c.
MY164523A (en) 2000-05-23 2017-12-29 Univ Degli Studi Cagliari Methods and compositions for treating hepatitis c virus
CN1315862C (zh) 2000-05-26 2007-05-16 艾登尼科斯（开曼）有限公司 处理黄病毒和瘟病毒的方法和组合物
HUP0303358A3 (en) 2000-07-21 2005-10-28 Schering Corp Novel peptides as ns3-serine protease inhibitors of hepatitis c virus and pharmaceutical compositions containing them
KR100939155B1 (ko) 2000-07-21 2010-01-28 쉐링 코포레이션 Ｃ형 간염 바이러스의 ｎｓ3-세린 프로테아제 억제제로서의신규한 펩티드
US7244721B2 (en) 2000-07-21 2007-07-17 Schering Corporation Peptides as NS3-serine protease inhibitors of hepatitis C virus
SV2003000617A (es) * 2000-08-31 2003-01-13 Lilly Co Eli Inhibidores de la proteasa peptidomimetica ref. x-14912m
GB2368339B (en) 2000-10-26 2002-09-18 Yissum Res Dev Co Complex incorporating a plurality of antioxidants
CA2462163A1 (en) * 2001-10-24 2003-05-01 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of serine protease, particularly hepatitis c virus ns3-ns4a protease, incorporating a fused ring system
US7119072B2 (en) 2002-01-30 2006-10-10 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Macrocyclic peptides active against the hepatitis C virus
US7091184B2 (en) 2002-02-01 2006-08-15 Boehringer Ingelheim International Gmbh Hepatitis C inhibitor tri-peptides
US6642204B2 (en) 2002-02-01 2003-11-04 Boehringer Ingelheim International Gmbh Hepatitis C inhibitor tri-peptides
AU2003223602B8 (en) * 2002-04-11 2010-05-27 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of serine proteases, particularly hepatitis C virus NS3-NS4 protease
ES2361011T3 (es) * 2002-05-20 2011-06-13 Bristol-Myers Squibb Company Inhibidores del virus de la hepatitis c.
TW200500374A (en) 2002-06-28 2005-01-01 Idenlx Cayman Ltd 2' and 3' -nucleoside produrgs for treating flavivridae infections
US7608600B2 (en) 2002-06-28 2009-10-27 Idenix Pharmaceuticals, Inc. Modified 2′ and 3′-nucleoside prodrugs for treating Flaviviridae infections
WO2004026896A2 (en) * 2002-09-23 2004-04-01 Medivir Ab Hcv ns-3 serine protease inhibitors
US20050075279A1 (en) 2002-10-25 2005-04-07 Boehringer Ingelheim International Gmbh Macrocyclic peptides active against the hepatitis C virus
DE60331367D1 (de) 2002-12-30 2010-04-01 Angiotech Int Ag Wirkstofffreisetzung von schnell gelierender polymerzusammensetzung
AU2011203054B2 (en) * 2003-04-11 2012-04-26 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Inhibitors of Serine Proteases, Particularly HCV NS3-NS4A Protease
CN100453553C (zh) * 2003-04-11 2009-01-21 沃泰克斯药物股份有限公司 丝氨酸蛋白酶、特别是hcv ns3-ns4a蛋白酶的抑制剂
TW200510391A (en) * 2003-04-11 2005-03-16 Vertex Pharma Inhibitors of serine proteases, particularly HCV NS3-NS4A protease
DE602004010137T2 (de) 2003-05-21 2008-09-11 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Verbindungen als hepatitis c inhibitoren
SI2604620T1 (sl) 2003-05-30 2016-10-28 Gilead Pharmasset LLC c/o Gilead Sciences, Inc. Modificirani fluorirani nukleozidni analogi
CN102020700A (zh) 2003-07-18 2011-04-20 沃泰克斯药物股份有限公司 丝氨酸蛋白酶抑制剂、特别是hcv ns3-ns4a蛋白酶抑制剂
TW201127828A (en) 2003-09-05 2011-08-16 Vertex Pharma Inhibitors of serine proteases, particularly HCV NS3-NS4A protease
US20050120398A1 (en) * 2003-09-12 2005-06-02 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Animal model for HCV infection
WO2005028502A1 (en) 2003-09-18 2005-03-31 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Inhibitors of serine proteases, particularly hcv ns3-ns4a protease
CN1906208B (zh) * 2003-10-10 2011-03-30 沃泰克斯药物股份有限公司 丝氨酸蛋白酶、特别是hcv ns3-ns4a蛋白酶的抑制剂
RU2006115558A (ru) 2003-10-10 2007-11-20 Вертекс Фармасьютикалз Инкорпорейтед (Us) Ингибиторы сериновых протеаз, особенно hcv ns3-ns4a протеазы
EP1944042A1 (en) 2003-10-27 2008-07-16 Vertex Pharmceuticals Incorporated Combinations for HCV treatment
JP4890254B2 (ja) 2003-10-27 2012-03-07 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｈｃｖｎｓ３−ｎｓ４ａプロテアーゼ耐性突然変異体
DE602004018363D1 (de) * 2003-10-27 2009-01-22 Vertex Pharma Kombinationen für die hcv-behandlung
WO2005043118A2 (en) 2003-10-27 2005-05-12 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Drug discovery method
US7485625B2 (en) * 2003-12-11 2009-02-03 Schering Corporation Inhibitors of hepatitis C virus NS3/NS4a serine protease
ES2358333T3 (es) 2004-01-21 2011-05-09 Boehringer Ingelheim International Gmbh Péptidos macrocíclicos con acción contra el virus de la hepatitis c.
CA2554999A1 (en) * 2004-02-04 2005-08-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of serine proteases, particularly hcv ns3-ns4a protease
JP4745327B2 (ja) 2004-02-27 2011-08-10 シェーリング コーポレイション Ｃ型肝炎ウイルスｎｓ３プロテアーゼのインヒビター
TW200529822A (en) * 2004-02-27 2005-09-16 Schering Corp Novel ketoamides with cyclic p4's as inhibitors of ns3 serine protease of hepatitis c virus
ES2328589T3 (es) 2004-02-27 2009-11-16 Schering Corporation Compuestos de la prolina 3,4(ciclopentil) fusionados como inhibidores de la proteasa serina ns3 del virus de la hepatitis c.
KR101316137B1 (ko) * 2004-02-27 2013-10-10 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 Ｃ형 간염 바이러스 ｎｓ3 세린 프로테아제의 억제제로서의황 화합물
WO2005123076A2 (en) * 2004-06-08 2005-12-29 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions
CA2573346C (en) 2004-07-20 2011-09-20 Boehringer Ingelheim International Gmbh Hepatitis c inhibitor peptide analogs
UY29016A1 (es) 2004-07-20 2006-02-24 Boehringer Ingelheim Int Analogos de dipeptidos inhibidores de la hepatitis c
KR20070061570A (ko) * 2004-10-01 2007-06-13 버텍스 파마슈티칼스 인코포레이티드 Ｈｃｖ ｎｓ3-ｎｓ4ａ 프로테아제 저해
TW201424733A (zh) * 2004-10-29 2014-07-01 Vertex Pharma 劑量型式
CA2602175C (en) 2005-03-21 2012-11-27 Applera Corporation Alpha ketoamide compounds as cysteine protease inhibitors
US20070015803A1 (en) * 2005-04-12 2007-01-18 Romark Laboratories L.C. Methods for treating diseases through interruption of protein maturation, compounds that inhibit the function of molecular chaperones such as protein disulfide isomerases or interfere with glycosylation, pharmaceutical compositions comprising them, and screening methods for identifying therapeutic agents
KR20080016597A (ko) 2005-05-13 2008-02-21 바이로켐 파마 인코포레이티드 플라비바이러스 감염의 예방 또는 치료용 화합물 및 그의예방 또는 치료 방법
US20060276404A1 (en) * 2005-06-02 2006-12-07 Anima Ghosal Medicaments and methods combining a HCV protease inhibitor and an AKR competitor
BRPI0610737A2 (pt) 2005-06-02 2010-07-20 Schering Corp formulações farmacêuticas e métodos de tratamento usando as mesmas
NZ563361A (en) 2005-06-02 2011-02-25 Schering Corp HCV protease inhibitors in combination with food
WO2006130553A2 (en) * 2005-06-02 2006-12-07 Schering Corporation Hcv protease inhibitors
US7608592B2 (en) 2005-06-30 2009-10-27 Virobay, Inc. HCV inhibitors
AU2006274861B2 (en) 2005-07-29 2012-11-08 Medivir Ab Macrocyclic inhibitors of hepatitis C virus
PE20070210A1 (es) 2005-07-29 2007-04-16 Tibotec Pharm Ltd Compuestos macrociclicos como inhibidores del virus de hepatitis c
EP1919899B1 (en) 2005-07-29 2011-01-19 Tibotec Pharmaceuticals Macrocyclic inhibitors of hepatitis c virus
RU2437886C2 (ru) 2005-07-29 2011-12-27 Тиботек Фармасьютикалз Лтд. Макроциклические ингибиторы вируса гепатита с
PE20070211A1 (es) 2005-07-29 2007-05-12 Medivir Ab Compuestos macrociclicos como inhibidores del virus de hepatitis c
EP1913015B1 (en) 2005-07-29 2013-12-11 Janssen R&D Ireland Macrocyclic inhibitors of hepatitis c virus
JO2768B1 (en) 2005-07-29 2014-03-15 تيبوتيك فارماسيوتيكالز ليمتد Large cyclic inhibitors of hepatitis C virus
CN101282978B (zh) 2005-07-29 2012-07-11 泰博特克药品有限公司 丙型肝炎病毒的大环抑制剂
EP2402331A1 (en) 2005-08-02 2012-01-04 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of serine proteases
US8399615B2 (en) 2005-08-19 2013-03-19 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Processes and intermediates
PT1934179E (pt) * 2005-08-19 2010-07-12 Vertex Pharma PROCESSOS E INTERMEDIáRIOS
US7964624B1 (en) 2005-08-26 2011-06-21 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of serine proteases
AR055395A1 (es) 2005-08-26 2007-08-22 Vertex Pharma Compuestos inhibidores de la actividad de la serina proteasa ns3-ns4a del virus de la hepatitis c
NZ568324A (en) 2005-11-11 2012-01-12 Vertex Pharma Hepatitis C virus variants
US7705138B2 (en) 2005-11-11 2010-04-27 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Hepatitis C virus variants
JP3975226B2 (ja) * 2006-01-11 2007-09-12 生化学工業株式会社 シクロアルキルカルボニルアミノ酸誘導体及びその製造方法
CA2636765C (en) * 2006-01-11 2014-03-18 Seikagaku Corporation Cycloalkylcarbonylamino acid ester derivative and process for producing the same
JP4047365B2 (ja) * 2006-01-11 2008-02-13 生化学工業株式会社 シクロアルカンカルボキサミド誘導体及びその製造方法
WO2007083620A1 (ja) * 2006-01-20 2007-07-26 Kaneka Corporation β－アミノ－α－ヒドロキシ酸アミド誘導体の製造法
EP1991229A2 (en) 2006-02-27 2008-11-19 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Co-crystals and pharmaceutical compositions comprising the same
JP5646814B2 (ja) 2006-03-06 2014-12-24 アッヴィ・インコーポレイテッド Ｈｃｖを治療するためのリトナビルの組成物及び使用方法
NZ571280A (en) * 2006-03-16 2011-10-28 Vertex Pharma Deuterated hepatitis C protease inhibitors
JP5313124B2 (ja) * 2006-03-16 2013-10-09 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 立体的化合物を製造するための方法および中間体
AU2007226984B2 (en) 2006-03-20 2013-02-21 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Pharmaceutical compositions
EP1998759A2 (en) * 2006-03-23 2008-12-10 Schering Corporation Combinations of hcv protease inhibitor(s) and cyp3a4 inhibitor(s), and methods of treatment related thereto
WO2007120595A2 (en) * 2006-04-11 2007-10-25 Novartis Ag Amines for the treatment of hcv
MX2008013119A (es) 2006-04-11 2008-10-21 Novartis Ag Inhibidores de hcv/vih y sus usos.
AU2007253819B2 (en) 2006-05-23 2011-02-17 Irm Llc Compounds and compositions as channel activating protease inhibitors
DE102006059317A1 (de) 2006-07-04 2008-01-10 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von β-Amino-α-hydroxy-carbonsäureamiden
EP1886685A1 (en) 2006-08-11 2008-02-13 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods, uses and compositions for modulating replication of hcv through the farnesoid x receptor (fxr) activation or inhibition
US20120220520A1 (en) * 2006-10-17 2012-08-30 Van T Klooster Gerben Albert Eleutherius Bioavailable combinations for hcv treatment
PL2104674T3 (pl) 2006-11-15 2013-12-31 Vertex Pharmaceuticals Canada Incorporated Analogi tiofenu do leczenia lub zapobiegania zakażeniom flawiwirusowym
WO2008059046A1 (en) 2006-11-17 2008-05-22 Tibotec Pharmaceuticals Ltd. Macrocyclic inhibitors of hepatitis c virus
JP2010512317A (ja) * 2006-12-07 2010-04-22 シェーリング コーポレイション ｐＨ感受性マトリクス処方物
WO2008074035A1 (en) * 2006-12-27 2008-06-19 Abbott Laboratories Hcv protease inhibitors and uses thereof
WO2008095058A1 (en) * 2007-02-01 2008-08-07 Taigen Biotechnology Co. Ltd. Hcv protease inhibitors
CN101641349A (zh) 2007-02-08 2010-02-03 泰博特克药品有限公司 嘧啶取代的大环抑制剂
EA016327B1 (ru) 2007-02-09 2012-04-30 Айрм Ллк Соединения и композиции в качестве ингибиторов протеазы, активирующей каналы
NZ579295A (en) 2007-02-27 2012-03-30 Vertex Pharma Inhibitors of serine proteases
AU2008219607B2 (en) * 2007-02-27 2013-09-12 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Co-crystals and pharmaceutical compositions comprising the same
US20080255038A1 (en) * 2007-04-11 2008-10-16 Samuel Earl Hopkins Pharmaceutical compositions
CA2686051A1 (en) 2007-05-04 2008-11-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Combination therapy for the treatment of hcv infection
NZ583652A (en) * 2007-08-03 2012-06-29 Biotron Ltd Hepatitis c antiviral compositions and methods
ATE530546T1 (de) * 2007-08-30 2011-11-15 Vertex Pharma Kokristalle und pharmazeutische zusammensetzungen damit
AU2008301981A1 (en) 2007-09-14 2009-03-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Method of treating hepatitis C patients
US20090082366A1 (en) * 2007-09-26 2009-03-26 Protia, Llc Deuterium-enriched telaprevir
WO2009047264A1 (en) 2007-10-10 2009-04-16 Novartis Ag Spiropyrrolidines and their use against hcv and hiv infection
US8106059B2 (en) 2007-10-24 2012-01-31 Virobay, Inc. Substituted pyrazines that inhibit protease cathepsin S and HCV replication
WO2009055335A2 (en) * 2007-10-25 2009-04-30 Taigen Biotechnology Co., Ltd. Hcv protease inhibitors
BRPI0821836A2 (pt) 2007-12-24 2015-06-16 Tibotec Pharm Ltd Indóis macrocíclicos como inibidores do vírus da hepatite c
DE102008009761A1 (de) 2008-02-19 2009-08-27 Bayer Materialscience Ag Verfahren zur Herstellung von Isocyanaten
EP2101173A1 (en) 2008-03-14 2009-09-16 Vivalis In vitro method to determine whether a drug candidate active against a target protein is active against a variant of said protein
CN101580535B (zh) * 2008-05-16 2012-10-03 太景生物科技股份有限公司 丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂
KR20110048509A (ko) 2008-06-24 2011-05-11 코덱시스, 인코포레이티드 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 융합 이환식 프롤린 화합물의 제조를 위한 생체촉매 공정
US8569337B2 (en) 2008-07-23 2013-10-29 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Tri-cyclic pyrazolopyridine kinase inhibitors
WO2010014744A1 (en) * 2008-07-29 2010-02-04 The Scripps Research Institute Inhibitors of hepatitis c virus infection
US8188137B2 (en) 2008-08-15 2012-05-29 Avila Therapeutics, Inc. HCV protease inhibitors and uses thereof
US8865756B2 (en) 2008-12-03 2014-10-21 Presidio Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of HCV NS5A
WO2010065674A1 (en) 2008-12-03 2010-06-10 Presidio Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of hcv ns5a
GB0900914D0 (en) 2009-01-20 2009-03-04 Angeletti P Ist Richerche Bio Antiviral agents
WO2010093843A2 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Hcv combination therapies
MX2011010132A (es) 2009-03-27 2011-10-14 Presidio Pharmaceuticals Inc Inhibidores de anillo fusionado de hepatitis c.
US8512690B2 (en) 2009-04-10 2013-08-20 Novartis Ag Derivatised proline containing peptide compounds as protease inhibitors
US20110182850A1 (en) 2009-04-10 2011-07-28 Trixi Brandl Organic compounds and their uses
US20100324059A1 (en) 2009-06-23 2010-12-23 Gilead Sciences, Inc. Pharmaceutical compositions useful for treating hcv
HUE030402T2 (en) 2009-09-15 2017-05-29 Taigen Biotechnology Co Ltd HCV protease inhibitors
TWI404269B (zh) * 2009-09-18 2013-08-01 Advanced Connectek Inc High speed plug connector
UA108211C2 (uk) 2009-11-04 2015-04-10 Янссен Рід Айрленд Бензімідазолімідазольні похідні
EP2504329A1 (en) 2009-11-25 2012-10-03 Vertex Pharmaceuticals Incorporated 5-alkynyl-thiophene-2-carboxylic acid derivatives and their use for the treatment or prevention of flavivirus infections
MX2012006877A (es) * 2009-12-18 2012-08-31 Idenix Pharmaceuticals Inc Inhibidores de virus de hepatitis c de arileno o heteroarileno 5, 5 - fusionado.
MX2012007420A (es) 2009-12-24 2012-07-23 Vertex Pharma Analogos para el tratamiento o prevencion de infecciones de flavivirus.
US20110178107A1 (en) * 2010-01-20 2011-07-21 Taigen Biotechnology Co., Ltd. Hcv protease inhibitors
US8653025B2 (en) 2010-01-27 2014-02-18 AB Pharma Ltd. Polyheterocyclic compounds highly potent as HCV inhibitors
JP2013518124A (ja) 2010-01-29 2013-05-20 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｃ型肝炎ウイルス感染の処置のための治療法
WO2011112516A1 (en) 2010-03-08 2011-09-15 Ico Therapeutics Inc. Treating and preventing hepatitis c virus infection using c-raf kinase antisense oligonucleotides
JP2013522377A (ja) 2010-03-24 2013-06-13 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド フラビウイルス感染を処置または予防するためのアナログ
MX2012010918A (es) 2010-03-24 2013-01-18 Vertex Pharma Analogos para el tratamiento o prevencion de infecciones por flavivirus.
EP2550262A1 (en) 2010-03-24 2013-01-30 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Analogues for the treatment or prevention of flavivirus infections
EP2550268A1 (en) 2010-03-24 2013-01-30 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Analogues for the treatment or prevention of flavivirus infections
US8680071B2 (en) 2010-04-01 2014-03-25 Idenix Pharmaceuticals, Inc. Compounds and pharmaceutical compositions for the treatment of viral infections
CA2800509A1 (en) 2010-05-24 2011-12-01 Presidio Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of hcv ns5a
KR20130082137A (ko) 2010-06-03 2013-07-18 버텍스 파마슈티칼스 인코포레이티드 방법 및 중간체
WO2011156545A1 (en) 2010-06-09 2011-12-15 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Viral dynamic model for hcv combination therapy
WO2011159826A2 (en) 2010-06-15 2011-12-22 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Hcv ns5b protease mutants
WO2012006070A1 (en) 2010-06-28 2012-01-12 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compounds and methods for the treatment or prevention of flavivirus infections
MX2012014918A (es) 2010-06-28 2013-04-08 Vertex Pharma Compuestos y metodos para tratamiento o prevencion de infecciones por flavivirus.
JP2013531011A (ja) 2010-06-28 2013-08-01 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド フラビウイルス感染の処置または予防のための化合物および方法
EP2593105A1 (en) 2010-07-14 2013-05-22 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Palatable pharmaceutical composition comprising vx-950
WO2012020036A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Hepatitis c virus inhibitors
MX2013001869A (es) 2010-08-17 2013-06-28 Vertex Pharma Compuestos y metodos para el tratamiento o prevencion de infecciones virales por flaviviridae.
CN103209987B (zh) 2010-09-22 2017-06-06 艾丽奥斯生物制药有限公司 取代的核苷酸类似物
AU2011311880B2 (en) 2010-10-08 2014-07-24 Novartis Ag Vitamin E formulations of sulfamide NS3 inhibitors
CA2815416A1 (en) 2010-10-21 2012-04-26 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Biomarkers for hcv infected patients
NZ609564A (en) 2010-10-26 2015-06-26 Presidio Pharmaceuticals Inc Inhibitors of hepatitis c virus
WO2012109646A1 (en) 2011-02-11 2012-08-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Treatment of hcv in hiv infection patients
WO2012107589A1 (en) 2011-02-11 2012-08-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment and prevention of hcv infections
WO2012123298A1 (en) 2011-03-11 2012-09-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Antiviral compounds
JP2014514295A (ja) 2011-03-31 2014-06-19 アイディニックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ウイルス感染の治療のための化合物および薬学的組成物
WO2012151319A1 (en) 2011-05-02 2012-11-08 Virobay, Inc. Cathepsin inhibitors for the treatment of bone cancer and bone cancer pain
EP2707347A1 (en) 2011-05-13 2014-03-19 Vertex Pharmaceuticals Inc. Processes and intermediates
CA2857705A1 (en) 2011-06-16 2012-12-20 AB Pharma Ltd. Macrocyclic heterocyclic compounds for inhibiting hepatitis c virus and preparation and use thereof
CN103732242A (zh) 2011-06-23 2014-04-16 迪格纳生物技术公司 用与IFN-α2b组合的IFN-α5在患者群体中治疗慢性丙型肝炎
US20120328565A1 (en) 2011-06-24 2012-12-27 Brinkman John A Antiviral compounds
AR087345A1 (es) 2011-07-26 2014-03-19 Vertex Pharma Metodos para la preparacion de compuestos de tiofeno
WO2013016499A1 (en) 2011-07-26 2013-01-31 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Methods for preparation of thiophene compounds
JP2014526474A (ja) 2011-09-12 2014-10-06 アイディニックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ウイルス感染の治療のための化合物および薬学的組成物
CA2850003C (en) 2011-09-27 2020-01-07 Kansas State University Research Foundation Broad-spectrum antivirals against 3c or 3c-like proteases of picornavirus-like supercluster: picornaviruses, caliciviruses and coronaviruses
JP5808496B2 (ja) 2011-10-10 2015-11-10 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 抗ウイルス化合物
HUE034857T2 (en) 2011-10-14 2018-03-28 Bristol Myers Squibb Co Substituted tetrahydroisoquinoline compounds are inhibitors of factor XIA
ES2579832T3 (es) 2011-10-14 2016-08-17 Bristol-Myers Squibb Company Compuestos de tetrahidroisoquinolina sustituida como inhibidores del factor XIa
ES2699226T3 (es) 2011-10-14 2019-02-08 Bristol Myers Squibb Co Compuestos de tetrahidroisoquinolina sustituidos como inhibidores del factor XIa
DE202012013117U1 (de) 2011-10-21 2015-01-16 Abbvie Inc. Kombinationsbehandlung (z.B. mit ABT-072 oder ABT-333 von DAAs zur Verwendung in der Behandlung von HCV)
DE112012003510T5 (de) 2011-10-21 2015-03-19 Abbvie Inc. Verfahren zur Behandlung von HCV umfassend mindestens zwei direkt wirkende antivirale Wirkstoffe, Ribavirin aber nicht Interferon
US8466159B2 (en) 2011-10-21 2013-06-18 Abbvie Inc. Methods for treating HCV
US8492386B2 (en) * 2011-10-21 2013-07-23 Abbvie Inc. Methods for treating HCV
KR20140104030A (ko) 2011-12-16 2014-08-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 Hcv ns5a의 억제제
MX350809B (es) 2011-12-20 2017-09-20 Riboscience Llc Derivados nucleósidos con sustitución 2',4'-difluoro-2'-metilo como inhibidores de la replicación del arn del vhc.
MX350810B (es) 2011-12-20 2017-09-20 Riboscience Llc Derivados de los nucleosidos sustituidos en 4 '-azido, 3 '-fluoro como inhibidores de la replicacion del rna del vhc.
CN104203940B (zh) 2011-12-28 2017-01-18 爱尔兰詹森科学公司 作为hcv抑制剂的杂双环衍生物
WO2013116339A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Vertex Pharmaceuticals Incorporated High potency formulations of vx-950
ITMI20120192A1 (it) 2012-02-13 2013-08-14 Dipharma Francis Srl Procedimento per la preparazione di un inibitore delle proteasi virali e suoi intermedi
CA2864669A1 (en) * 2012-02-16 2013-08-22 Rqx Pharmaceuticals, Inc. Linear peptide antibiotics
CN104185624B (zh) 2012-02-24 2016-10-12 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗病毒化合物
ITMI20120359A1 (it) 2012-03-07 2013-09-08 Dipharma Francis Srl Procedimento per la preparazione di intermedi utili nella preparazione di un inibitore delle proteasi virali
WO2013136265A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Dipharma Francis S.R.L. Synthesis of an intermediate of an antiviral compound
ITMI20120391A1 (it) * 2012-03-13 2013-09-14 Dipharma Francis Srl Procedimento per la sintesi di un intermedio ciclopropilammidico utile nella preparazione di un inibitore delle proteasi virali
CN104321333A (zh) 2012-03-21 2015-01-28 沃泰克斯药物股份有限公司 硫代氨基磷酸酯核苷酸前药的固体形式
NZ630805A (en) 2012-03-22 2016-01-29 Alios Biopharma Inc Pharmaceutical combinations comprising a thionucleotide analog
EP2844249A4 (en) 2012-05-02 2016-03-09 Univ Kansas State MACROCYCLIC AND PEPTIDOMIMETIC COMPOUNDS AS VIRUZIDES AGAINST 3C OR 3C LIKE PROTEASES OF PICORNIVERS, CALICIVIRES AND CORONA VIRUSES
ITMI20120800A1 (it) * 2012-05-10 2013-11-11 Dipharma Francis Srl Procedimento per la preparazione di un intermedio utile nella preparazione di un inibitore delle proteasi virali
CN103450066B (zh) * 2012-05-30 2017-03-15 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 特拉匹韦中间体的制备方法
AR091192A1 (es) 2012-05-30 2015-01-21 Chemo Iberica Sa Procedimiento multicomponente para la preparacion de compuestos biciclicos
US20140010783A1 (en) 2012-07-06 2014-01-09 Hoffmann-La Roche Inc. Antiviral compounds
WO2014015217A1 (en) 2012-07-19 2014-01-23 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Biomarkers for hcv infected patients
WO2014033667A1 (en) 2012-08-30 2014-03-06 Ranbaxy Laboratories Limited Process for the preparation of telaprevir
WO2014045263A2 (en) * 2012-09-24 2014-03-27 Dr. Reddy's Laboratories Limited Process for preparation of intermediates of telaprevir
EP2906552B1 (en) 2012-10-12 2017-11-22 Bristol-Myers Squibb Company Guanidine substituted tetrahydroisoquinoline compounds as factor xia inhibitors
EP2906541B1 (en) 2012-10-12 2017-11-22 Bristol-Myers Squibb Company Guanidine and amine substituted tetrahydroisoquinoline compounds as factor xia inhibitors
TR201807316T4 (tr) 2012-10-12 2018-06-21 Squibb Bristol Myers Co Bir faktör XIa inhibitörünün kristalli formları.
EP2912047B1 (en) 2012-10-29 2016-08-24 Cipla Limited Antiviral phosphonate analogues and process for preparation thereof
ITMI20122036A1 (it) 2012-11-29 2014-05-30 Dipharma Francis Srl Sintesi di un intermedio di un composto antivirale
WO2014096374A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Sandoz Ag Process for the synthesis of pyrrolidines and pyrroles
BR112015017414A2 (pt) 2013-01-23 2017-07-11 Hoffmann La Roche derivados de triazol antivirais
CN103113288B (zh) * 2013-02-04 2015-05-20 苏州永健生物医药有限公司 一种八氢环戊烯并[c]吡咯羧酸衍生物的合成方法
US20150065439A1 (en) 2013-02-28 2015-03-05 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Pharmaceutical compositions
KR20150114566A (ko) 2013-03-05 2015-10-12 에프. 호프만-라 로슈 아게 항바이러스 화합물
ES2712699T3 (es) 2013-03-25 2019-05-14 Bristol Myers Squibb Co Tetrahidroisoquinolinas que contienen azoles sustituidos como inhibidores del factor XIa
ITMI20130706A1 (it) 2013-04-30 2014-10-31 Dipharma Francis Srl Procedimento per la preparazione di un inibitore delle proteasi virali e suoi intermedi
US20180200280A1 (en) 2013-05-16 2018-07-19 Riboscience Llc 4'-Fluoro-2'-Methyl Substituted Nucleoside Derivatives as Inhibitors of HCV RNA Replication
NZ714927A (en) 2013-05-16 2020-09-25 Riboscience Llc 4’-fluoro-2’-methyl substituted nucleoside derivatives
WO2014193663A1 (en) 2013-05-16 2014-12-04 Riboscience Llc 4'-azido, 3'-deoxy-3'-fluoro substituted nucleoside derivatives
CN104163851B (zh) * 2013-05-20 2019-03-05 湘北威尔曼制药股份有限公司 氟代的α-羰基类HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂
CN103288671B (zh) * 2013-06-20 2014-10-29 上海步越化工科技有限公司 一种(3s)-3-氨基-n-环丙基-2-羟基己酰胺盐酸盐的合成方法
WO2014203224A1 (en) 2013-06-21 2014-12-24 Ranbaxy Laboratories Limited Process for the preparation of telaprevir and its intermediates
WO2014203208A1 (en) 2013-06-21 2014-12-24 Ranbaxy Laboratories Limited Process for the preparation of telaprevir and intermediates thereof
CN104292146B (zh) * 2013-06-24 2017-04-26 上海医药工业研究院 特拉匹韦中间体及其制备方法
CN104558106B (zh) * 2013-10-19 2019-12-10 广东东阳光药业有限公司 一种治疗丙肝药物的制备方法
CN104610272B (zh) * 2013-11-05 2017-03-29 上海唐润医药科技有限公司 环状黄酮或异黄酮类化合物及其用途
EP2899207A1 (en) 2014-01-28 2015-07-29 Amikana.Biologics New method for testing HCV protease inhibition
NO2760821T3 (pl) 2014-01-31 2018-03-10
MY190429A (en) 2014-01-31 2022-04-21 Bristol Myers Squibb Co Macrocycles with hetrocyclic p2' groups as factor xia inhibitors
CN104926712B (zh) * 2014-03-20 2018-03-23 上海医药工业研究院 合成特拉匹韦的中间体及其制备方法
CN104926831A (zh) * 2014-03-20 2015-09-23 上海医药工业研究院 合成特拉匹韦的中间体及其制备方法
AU2014400642B2 (en) 2014-07-07 2018-01-04 Halliburton Energy Services, Inc. Downhole tools comprising aqueous-degradable sealing elements
JP6526796B2 (ja) 2014-09-04 2019-06-05 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｆｘｉａ阻害剤であるジアミドマクロ環
US9453018B2 (en) 2014-10-01 2016-09-27 Bristol-Myers Squibb Company Pyrimidinones as factor XIa inhibitors
CN108699105A (zh) 2016-03-04 2018-10-23 豪夫迈·罗氏有限公司 作为htra1抑制剂的新型二氟酮酰胺衍生物
JP2019513698A (ja) 2016-03-04 2019-05-30 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｈｔｒａ１阻害剤としての新規なトリフルオロメチルプロパンアミド誘導体
CN109689063A (zh) 2016-04-28 2019-04-26 埃默里大学 含有炔烃的核苷酸和核苷治疗组合物及其相关用途
EP3472149B1 (en) 2016-06-21 2023-08-30 Orion Ophthalmology LLC Heterocyclic prolinamide derivatives
WO2017222914A1 (en) 2016-06-21 2017-12-28 Inception 4, Inc. Carbocyclic prolinamide derivatives
JP7076438B2 (ja) 2016-06-21 2022-05-27 オリオン・オフサルモロジー・エルエルシー 脂肪族プロリンアミド誘導体
CN109661389A (zh) * 2016-08-23 2019-04-19 豪夫迈·罗氏有限公司 作为htra1抑制剂的新型二氟酮酰胺衍生物
EP3684374A4 (en) 2017-09-21 2021-06-16 Riboscience LLC 4'-FLUORO-2'-METHYL SUBSTITUTE NUCLEOSIDE DERIVATIVES USED AS HCV RNA REPLICATION INHIBITORS
CN109337537B (zh) * 2018-09-26 2022-10-25 河北晨阳工贸集团有限公司 一种起重机专用单组分水性面漆及其制备方法
CN110668538B (zh) * 2019-09-20 2021-10-22 济南大学 一种聚合氯化钛的制备方法
CN114057702B (zh) * 2020-07-31 2022-09-30 四川大学 一种新型冠状病毒主蛋白酶的抑制剂及其制备方法和用途
CN115960088A (zh) * 2020-07-31 2023-04-14 四川大学 一种新型冠状病毒主蛋白酶的抑制剂及其制备方法和用途
WO2023149981A1 (en) * 2022-02-07 2023-08-10 Purdue Research Foundation Compounds for the treatment of sars
CN114703003B (zh) * 2022-04-14 2023-04-28 上海绿晟环保科技有限公司 一种负载碳量子点的纳米材料润滑添加剂及其制备方法
CN115417790A (zh) * 2022-10-09 2022-12-02 山东大学 一类新型偶氮类发泡剂及合成方法

Family Cites Families (163)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3719667A (en) 1970-08-24 1973-03-06 Lilly Co Eli Epimerization of 6-acylamido and 6-imido penicillin sulfoxide esters
US3840556A (en) 1971-05-28 1974-10-08 Lilly Co Eli Penicillin conversion by halogen electrophiles and anti-bacterials derived thereby
DE3226768A1 (de) 1981-11-05 1983-05-26 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Derivate der cis, endo-2-azabicyclo-(3.3.0)-octan-3-carbonsaeure, verfahren zu ihrer herstellung, diese enthaltende mittel und deren verwendung
DE3211676A1 (de) 1982-03-30 1983-10-06 Hoechst Ag Neue derivate von cycloalka (c) pyrrol-carbonsaeuren, verfahren zu ihrer herstellung, diese enthaltende mittel und deren verwendung sowie neue cycloalka (c) pyrrol-carbonsaeuren als zwischenstufen und verfahren zu deren herstellung
US4499082A (en) 1983-12-05 1985-02-12 E. I. Du Pont De Nemours And Company α-Aminoboronic acid peptides
FR2570695A1 (fr) * 1984-09-27 1986-03-28 Synthelabo Diphenylazomethines a chaine ramifiee ou cyclique, leur preparation et leur application en therapeutique
FR2575753B1 (fr) 1985-01-07 1987-02-20 Adir Nouveaux derives peptidiques a structure polycyclique azotee, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
US5496927A (en) 1985-02-04 1996-03-05 Merrell Pharmaceuticals Inc. Peptidase inhibitors
EP0204571B1 (en) * 1985-06-07 1992-01-22 Ici Americas Inc. Selected difluoro derivatives
US4835168A (en) 1985-12-16 1989-05-30 Eli Lilly And Company Thiadiazole antiviral agents
US5231084A (en) 1986-03-27 1993-07-27 Hoechst Aktiengesellschaft Compounds having a cognition adjuvant action, agents containing them, and the use thereof for the treatment and prophylaxis of cognitive dysfuncitons
US5736520A (en) 1988-10-07 1998-04-07 Merrell Pharmaceuticals Inc. Peptidase inhibitors
NZ235155A (en) 1989-09-11 1993-04-28 Merrell Dow Pharma Peptidase substrates in which the carboxy terminal group has been replaced by a tricarbonyl radical
US5371072A (en) * 1992-10-16 1994-12-06 Corvas International, Inc. Asp-Pro-Arg α-keto-amide enzyme inhibitors
ES2150933T3 (es) 1992-12-22 2000-12-16 Lilly Co Eli Inhibidores de la proteasa vih utiles para el tratamiento del sida.
JP2637847B2 (ja) 1992-12-29 1997-08-06 アボツト・ラボラトリーズ レトロウィルス蛋白分解酵素を阻害する化合物
US5384410A (en) 1993-03-24 1995-01-24 The Du Pont Merck Pharmaceutical Company Removal of boronic acid protecting groups by transesterification
US5656600A (en) 1993-03-25 1997-08-12 Corvas International, Inc. α-ketoamide derivatives as inhibitors of thrombosis
US5672582A (en) 1993-04-30 1997-09-30 Merck & Co., Inc. Thrombin inhibitors
IL110752A (en) 1993-09-13 2000-07-26 Abbott Lab Liquid semi-solid or solid pharmaceutical composition for an HIV protease inhibitor
US5559158A (en) 1993-10-01 1996-09-24 Abbott Laboratories Pharmaceutical composition
US5468858A (en) 1993-10-28 1995-11-21 The Board Of Regents Of Oklahoma State University Physical Sciences N-alkyl and n-acyl derivatives of 3,7-diazabicyclo-[3.3.1]nonanes and selected salts thereof as multi-class antiarrhythmic agents
IL111991A (en) 1994-01-28 2000-07-26 Abbott Lab Liquid pharmaceutical composition of HIV protease inhibitors in organic solvent
RU95104898A (ru) 1994-03-31 1996-12-27 Бристоль-Мейерз Сквибб Компани (US) Имидазолсодержащие ингибиторы фарнезид-протеинтрансферазы, способ лечения связанных с ней заболеваний
US6420522B1 (en) 1995-06-05 2002-07-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme
US5847135A (en) 1994-06-17 1998-12-08 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme
US5716929A (en) 1994-06-17 1998-02-10 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme
US5756466A (en) 1994-06-17 1998-05-26 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme
US5861267A (en) 1995-05-01 1999-01-19 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Methods, nucleotide sequences and host cells for assaying exogenous and endogenous protease activity
US6037157A (en) 1995-06-29 2000-03-14 Abbott Laboratories Method for improving pharmacokinetics
JPH09124691A (ja) * 1995-08-25 1997-05-13 Green Cross Corp:The ペプチド化合物およびそれを含有する医薬組成物
JP2000500760A (ja) 1995-11-23 2000-01-25 メルク シヤープ エンド ドーム リミテツド スピロピペリジン誘導体およびタキキニン拮抗薬としてのその使用
US5807876A (en) 1996-04-23 1998-09-15 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of IMPDH enzyme
US6054472A (en) 1996-04-23 2000-04-25 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Inhibitors of IMPDH enzyme
ZA972195B (en) 1996-03-15 1998-09-14 Du Pont Merck Pharma Spirocycle integrin inhibitors
TR199802136T2 (xx) 1996-04-23 2001-06-21 Vertex Pharmaceuticals Incorporated �MPDH enzimi inhibit�rleri olarak �re t�revleri.
US6127422A (en) 1996-05-06 2000-10-03 Eli Lilly And Company Anti-viral method
US5990276A (en) 1996-05-10 1999-11-23 Schering Corporation Synthetic inhibitors of hepatitis C virus NS3 protease
WO1997043310A1 (en) 1996-05-10 1997-11-20 Schering Corporation Synthetic inhibitors of hepatitis c virus ns3 protease
CN1218479A (zh) 1996-05-17 1999-06-02 咨询卡有限公司 可固化的表面涂层组合物及其使用方法
EP0913389A4 (en) * 1996-06-28 2000-02-02 Nippon Chemiphar Co CYCLOPROPYLGLYCINE DERIVATIVES AND AGONISTS OF THE L-GLUTAMATE RECEPTOR TYPE OF METABOLITE REGULATION
US6245919B1 (en) * 1996-06-28 2001-06-12 Haruhiko Shinozaki Cyclopropylglycine derivatives and agonists for metabotronic L-glutamate receptors
US6153579A (en) 1996-09-12 2000-11-28 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Crystallizable compositions comprising a hepatitis C virus NS3 protease domain/NS4A complex
EP0929554B1 (en) 1996-09-25 2006-03-15 MERCK SHARP &amp; DOHME LTD. Spiro-azacyclic derivatives, their preparation and their use as tachykinin antagonists
JP2001502316A (ja) 1996-10-08 2001-02-20 コロラド ステート ユニバーシティ リサーチ ファンデーション 触媒不斉エポキシ化
EA001915B1 (ru) * 1996-10-18 2001-10-22 Вертекс Фармасьютикалз Инкорпорейтед Ингибиторы серин-протеаз, в частности ns3 протеазы вируса гепатита c (hvc)
GB9623908D0 (en) 1996-11-18 1997-01-08 Hoffmann La Roche Amino acid derivatives
DE19648011A1 (de) 1996-11-20 1998-05-28 Bayer Ag Cyclische Imine
AU6701598A (en) 1997-03-14 1998-09-29 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of impdh enzyme
GB9707659D0 (en) 1997-04-16 1997-06-04 Peptide Therapeutics Ltd Hepatitis C NS3 Protease inhibitors
GB9708484D0 (en) 1997-04-25 1997-06-18 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
GB9711114D0 (en) 1997-05-29 1997-07-23 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
US6767991B1 (en) 1997-08-11 2004-07-27 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Hepatitis C inhibitor peptides
EP1012180B1 (en) 1997-08-11 2004-12-01 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Hepatitis c inhibitor peptide analogues
ES2241157T3 (es) * 1997-08-11 2005-10-16 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Peptidos inhibidores de la hepatitis c.
US6183121B1 (en) 1997-08-14 2001-02-06 Vertex Pharmaceuticals Inc. Hepatitis C virus helicase crystals and coordinates that define helicase binding pockets
US20040058982A1 (en) 1999-02-17 2004-03-25 Bioavailability System, Llc Pharmaceutical compositions
US20020017295A1 (en) 2000-07-07 2002-02-14 Weers Jeffry G. Phospholipid-based powders for inhalation
US6211338B1 (en) 1997-11-28 2001-04-03 Schering Corporation Single-chain recombinant complexes of hepatitis C virus NS3 protease and NS4A cofactor peptide
JP4690545B2 (ja) 1998-03-31 2011-06-01 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド セリンプロテアーゼ、特にｃ型肝炎ウイルスｎｓ３プロテアーゼの阻害因子
US6518305B1 (en) * 1998-04-23 2003-02-11 Abbott Laboratories Five-membered carbocyclic and heterocyclic inhibitors of neuraminidases
US6251583B1 (en) 1998-04-27 2001-06-26 Schering Corporation Peptide substrates for HCV NS3 protease assays
GB9812523D0 (en) 1998-06-10 1998-08-05 Angeletti P Ist Richerche Bio Peptide inhibitors of hepatitis c virus ns3 protease
AR022061A1 (es) * 1998-08-10 2002-09-04 Boehringer Ingelheim Ca Ltd Peptidos inhibidores de la hepatitis c, una composicion farmaceutica que los contiene, el uso de los mismos para preparar una composicion farmaceutica, el uso de un producto intermedio para la preparacion de estos peptidos y un procedimiento para la preparacion de un peptido analogo de los mismos.
US6323180B1 (en) 1998-08-10 2001-11-27 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd Hepatitis C inhibitor tri-peptides
DE19836514A1 (de) 1998-08-12 2000-02-17 Univ Stuttgart Modifikation von Engineeringpolymeren mit N-basischen Gruppe und mit Ionenaustauschergruppen in der Seitenkette
US6117639A (en) 1998-08-31 2000-09-12 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Fusion proteins, DNA molecules, vectors, and host cells useful for measuring protease activity
US6025516A (en) 1998-10-14 2000-02-15 Chiragene, Inc. Resolution of 2-hydroxy-3-amino-3-phenylpropionamide and its conversion to C-13 sidechain of taxanes
EP1027885B1 (en) 1999-02-09 2008-07-09 Pfizer Products Inc. Basic drug compositions with enhanced bioavailability
US20020042046A1 (en) 1999-02-25 2002-04-11 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Crystallizable compositions comprising a hepatitis C virus NS3 protease domain/NS4A complex
EE200100492A (et) 1999-03-19 2002-12-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Ensüümi IMPDH inhibiitorid
US6608027B1 (en) 1999-04-06 2003-08-19 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd Macrocyclic peptides active against the hepatitis C virus
US7122627B2 (en) 1999-07-26 2006-10-17 Bristol-Myers Squibb Company Lactam inhibitors of Hepatitis C virus NS3 protease
US20020183249A1 (en) 1999-08-31 2002-12-05 Taylor Neil R. Method of identifying inhibitors of CDC25
AU2055301A (en) 1999-12-03 2001-06-12 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Alpha-ketoamide inhibitors of hepatitis c virus ns3 protease
US6365380B2 (en) * 2000-02-23 2002-04-02 Pcbu Services, Inc. Method for stereoselectively inverting a chiral center of a chemical compound using an enzyme and a metal catalyst
US6699855B2 (en) 2000-02-29 2004-03-02 Bristol-Myers Squibb Company Inhibitors of hepatitis C virus NS3 protease
ES2240446T3 (es) 2000-04-03 2005-10-16 Vertex Pharma Inhibidores de serina proteasas, particularmente la proteasa ns3 del virus de la hepatitis c.
WO2001077113A2 (en) 2000-04-05 2001-10-18 Schering Corporation Macrocyclic ns3-serine protease inhibitors of hepatitis c virus comprising n-cyclic p2 moieties
CN1935833A (zh) 2000-04-19 2007-03-28 先灵公司 含有烷基和芳基丙氨酸p2部分的丙型肝炎病毒的大环ns3－丝氨酸蛋白酶抑制剂
AU2001267886A1 (en) 2000-06-30 2002-01-14 Seikagaku Corporation Epoxycarboxylic acid amides, azides and amino alcohols and processes for preparation of alpha-keto amides by using them
AR034127A1 (es) 2000-07-21 2004-02-04 Schering Corp Imidazolidinonas como inhibidores de ns3-serina proteasa del virus de hepatitis c, composicion farmaceutica, un metodo para su preparacion, y el uso de las mismas para la manufactura de un medicamento
US7244721B2 (en) 2000-07-21 2007-07-17 Schering Corporation Peptides as NS3-serine protease inhibitors of hepatitis C virus
KR100939155B1 (ko) 2000-07-21 2010-01-28 쉐링 코포레이션 Ｃ형 간염 바이러스의 ｎｓ3-세린 프로테아제 억제제로서의신규한 펩티드
HUP0303358A3 (en) 2000-07-21 2005-10-28 Schering Corp Novel peptides as ns3-serine protease inhibitors of hepatitis c virus and pharmaceutical compositions containing them
AR029851A1 (es) 2000-07-21 2003-07-16 Dendreon Corp Nuevos peptidos como inhibidores de ns3-serina proteasa del virus de hepatitis c
JP2004504407A (ja) 2000-07-21 2004-02-12 コルバス・インターナショナル・インコーポレイテッド Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３−セリンプロテアーゼ阻害剤としての新規ペプチド
US6777400B2 (en) 2000-08-05 2004-08-17 Smithkline Beecham Corporation Anti-inflammatory androstane derivative compositions
SV2003000617A (es) * 2000-08-31 2003-01-13 Lilly Co Eli Inhibidores de la proteasa peptidomimetica ref. x-14912m
US6939692B2 (en) 2000-09-12 2005-09-06 Degussa Ag Nucleotide sequences coding for the pknB gene
US6846806B2 (en) 2000-10-23 2005-01-25 Bristol-Myers Squibb Company Peptide inhibitors of Hepatitis C virus NS3 protein
HUP0500456A3 (en) 2000-11-20 2012-05-02 Bristol Myers Squibb Co Hepatitis c tripeptide inhibitors, pharmaceutical compositions comprising thereof and their use
EP1343807B1 (en) 2000-12-12 2009-04-29 Schering Corporation Diaryl peptides as ns3-serine protease inhibitors of hepatits c virus
US6727366B2 (en) 2000-12-13 2004-04-27 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Imidazolidinones and their related derivatives as hepatitis C virus NS3 protease inhibitors
US6653295B2 (en) 2000-12-13 2003-11-25 Bristol-Myers Squibb Company Inhibitors of hepatitis C virus NS3 protease
SK286630B6 (sk) 2001-01-22 2009-02-05 Merck & Co., Inc. Nukleozidové deriváty, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie
GB0102342D0 (en) 2001-01-30 2001-03-14 Smithkline Beecham Plc Pharmaceutical formulation
US20020187488A1 (en) 2001-01-30 2002-12-12 Chao Lin Quantitative assay for nucleic acids
ES2328466T3 (es) 2001-03-27 2009-11-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Composiciones y metodos utiles para la infeccion por hcv.
GB0107924D0 (en) 2001-03-29 2001-05-23 Angeletti P Ist Richerche Bio Inhibitor of hepatitis C virus NS3 protease
CA2450545A1 (en) 2001-07-03 2003-01-16 Altana Pharma Ag Process for the production of 3-phenylisoserine
WO2003006490A1 (en) 2001-07-11 2003-01-23 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Bridged bicyclic serine protease inhibitors
US7029561B2 (en) 2001-07-25 2006-04-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Commerce Fluidic temperature gradient focusing
JP2003055389A (ja) 2001-08-09 2003-02-26 Univ Tokyo 錯体及びそれを用いたエポキシドの製法
US6824769B2 (en) 2001-08-28 2004-11-30 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Optimal compositions and methods thereof for treating HCV infections
CA2462163A1 (en) 2001-10-24 2003-05-01 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of serine protease, particularly hepatitis c virus ns3-ns4a protease, incorporating a fused ring system
HUP0501067A2 (en) 2001-11-14 2006-02-28 Teva Pharma Amorphous and crystalline forms of losartan potassium and process for their preparation
CA2369711A1 (en) 2002-01-30 2003-07-30 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Macrocyclic peptides active against the hepatitis c virus
CA2369970A1 (en) 2002-02-01 2003-08-01 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Hepatitis c inhibitor tri-peptides
US6642204B2 (en) 2002-02-01 2003-11-04 Boehringer Ingelheim International Gmbh Hepatitis C inhibitor tri-peptides
US7091184B2 (en) 2002-02-01 2006-08-15 Boehringer Ingelheim International Gmbh Hepatitis C inhibitor tri-peptides
AR038375A1 (es) 2002-02-01 2005-01-12 Pfizer Prod Inc Composiciones farmaceuticas de inhibidores de la proteina de transferencia de esteres de colesterilo
AU2003223602B8 (en) 2002-04-11 2010-05-27 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of serine proteases, particularly hepatitis C virus NS3-NS4 protease
MXPA05001298A (es) 2002-08-01 2005-11-04 Pharmasset Inc Compuestos con el sistema biciclo[4.2.1] nonano para el tratamiento de infecciones por flaviviridae.
US20050075279A1 (en) 2002-10-25 2005-04-07 Boehringer Ingelheim International Gmbh Macrocyclic peptides active against the hepatitis C virus
CA2413705A1 (en) 2002-12-06 2004-06-06 Raul Altman Use of meloxicam in combination with an antiplatelet agent for treatment of acute coronary syndrome and related conditions
US7601709B2 (en) 2003-02-07 2009-10-13 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Macrocyclic hepatitis C serine protease inhibitors
US7098231B2 (en) 2003-01-22 2006-08-29 Boehringer Ingelheim International Gmbh Viral polymerase inhibitors
US7223785B2 (en) 2003-01-22 2007-05-29 Boehringer Ingelheim International Gmbh Viral polymerase inhibitors
US20040180815A1 (en) 2003-03-07 2004-09-16 Suanne Nakajima Pyridazinonyl macrocyclic hepatitis C serine protease inhibitors
JP2006517960A (ja) 2003-02-18 2006-08-03 ファイザー インコーポレイテッド Ｃ型肝炎ウイルスの阻害剤、それを使用する組成物および治療法
EP1601685A1 (en) 2003-03-05 2005-12-07 Boehringer Ingelheim International GmbH Hepatitis c inhibiting compounds
DE602004029866D1 (de) 2003-03-05 2010-12-16 Boehringer Ingelheim Pharma Peptidanaloga mit inhibitorischer wirkung auf hepatitis c
TW200510391A (en) 2003-04-11 2005-03-16 Vertex Pharma Inhibitors of serine proteases, particularly HCV NS3-NS4A protease
CN100453553C (zh) 2003-04-11 2009-01-21 沃泰克斯药物股份有限公司 丝氨酸蛋白酶、特别是hcv ns3-ns4a蛋白酶的抑制剂
DE602004010137T2 (de) 2003-05-21 2008-09-11 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Verbindungen als hepatitis c inhibitoren
CN102020700A (zh) 2003-07-18 2011-04-20 沃泰克斯药物股份有限公司 丝氨酸蛋白酶抑制剂、特别是hcv ns3-ns4a蛋白酶抑制剂
WO2005018330A1 (en) 2003-08-18 2005-03-03 Pharmasset, Inc. Dosing regimen for flaviviridae therapy
TW201127828A (en) 2003-09-05 2011-08-16 Vertex Pharma Inhibitors of serine proteases, particularly HCV NS3-NS4A protease
US20050120398A1 (en) 2003-09-12 2005-06-02 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Animal model for HCV infection
WO2005028502A1 (en) 2003-09-18 2005-03-31 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Inhibitors of serine proteases, particularly hcv ns3-ns4a protease
US6933760B2 (en) 2003-09-19 2005-08-23 Intel Corporation Reference voltage generator for hysteresis circuit
PE20050431A1 (es) 2003-09-22 2005-07-19 Boehringer Ingelheim Int Peptidos macrociclicos activos contra el virus de la hepatitis c
RU2006115558A (ru) 2003-10-10 2007-11-20 Вертекс Фармасьютикалз Инкорпорейтед (Us) Ингибиторы сериновых протеаз, особенно hcv ns3-ns4a протеазы
AR045870A1 (es) 2003-10-11 2005-11-16 Vertex Pharma Terapia de combinacion para la infeccion de virus de hepatitis c
WO2005043118A2 (en) 2003-10-27 2005-05-12 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Drug discovery method
DE602004018363D1 (de) 2003-10-27 2009-01-22 Vertex Pharma Kombinationen für die hcv-behandlung
JP4890254B2 (ja) 2003-10-27 2012-03-07 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｈｃｖｎｓ３−ｎｓ４ａプロテアーゼ耐性突然変異体
CN1894211A (zh) 2003-10-28 2007-01-10 沃泰克斯药物股份有限公司 借助费歇尔－芬克型合成和随后的酰化制备4,5－二烷基－3－酰基－吡咯－2－羧酸衍生物
US20050119318A1 (en) 2003-10-31 2005-06-02 Hudyma Thomas W. Inhibitors of HCV replication
US7132504B2 (en) 2003-11-12 2006-11-07 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
CA2547787A1 (en) 2003-12-01 2005-06-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions comprising fetal liver cells and methods useful for hcv infection
ES2358333T3 (es) 2004-01-21 2011-05-09 Boehringer Ingelheim International Gmbh Péptidos macrocíclicos con acción contra el virus de la hepatitis c.
CA2554999A1 (en) 2004-02-04 2005-08-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of serine proteases, particularly hcv ns3-ns4a protease
UA86962C2 (en) 2004-02-20 2009-06-10 Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх Viral polymerase inhibitors
US20050187192A1 (en) 2004-02-20 2005-08-25 Kucera Pharmaceutical Company Phospholipids for the treatment of infection by togaviruses, herpes viruses and coronaviruses
ES2328589T3 (es) 2004-02-27 2009-11-16 Schering Corporation Compuestos de la prolina 3,4(ciclopentil) fusionados como inhibidores de la proteasa serina ns3 del virus de la hepatitis c.
CA2843066C (en) 2004-03-12 2016-06-07 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Processes and intermediates for the preparation of aspartic acetal caspase inhibitors
WO2005107745A1 (en) 2004-05-06 2005-11-17 Schering Corporation An inhibitor of hepatitis c
WO2005123076A2 (en) 2004-06-08 2005-12-29 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions
US7550559B2 (en) 2004-08-27 2009-06-23 Schering Corporation Acylsulfonamide compounds as inhibitors of hepatitis C virus NS3 serine protease
US7863274B2 (en) 2005-07-29 2011-01-04 Concert Pharmaceuticals Inc. Deuterium enriched analogues of tadalafil as PDE5 inhibitors
EP2402331A1 (en) 2005-08-02 2012-01-04 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of serine proteases
PT1934179E (pt) 2005-08-19 2010-07-12 Vertex Pharma PROCESSOS E INTERMEDIáRIOS
AR055395A1 (es) 2005-08-26 2007-08-22 Vertex Pharma Compuestos inhibidores de la actividad de la serina proteasa ns3-ns4a del virus de la hepatitis c
US7705138B2 (en) 2005-11-11 2010-04-27 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Hepatitis C virus variants
EP1991229A2 (en) 2006-02-27 2008-11-19 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Co-crystals and pharmaceutical compositions comprising the same
JP5313124B2 (ja) 2006-03-16 2013-10-09 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 立体的化合物を製造するための方法および中間体
NZ571280A (en) 2006-03-16 2011-10-28 Vertex Pharma Deuterated hepatitis C protease inhibitors
AU2007226984B2 (en) 2006-03-20 2013-02-21 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Pharmaceutical compositions
AU2007226983A1 (en) 2006-03-20 2007-09-27 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Pharmaceutical compositions
CA2653625A1 (en) 2006-05-31 2007-12-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Controlled release formulations
NZ579295A (en) 2007-02-27 2012-03-30 Vertex Pharma Inhibitors of serine proteases

Also Published As

Publication number Publication date
CY2012007I2 (el) 2014-07-02
EP1320540B9 (en) 2012-03-21
ES2450815T3 (es) 2014-03-25
EP2368878A1 (en) 2011-09-28
WO2002018369A2 (en) 2002-03-07
US20100137583A1 (en) 2010-06-03
PL365836A1 (pl) 2005-01-10
DK1320540T5 (da) 2012-05-29
EP1849797A2 (en) 2007-10-31
CN101693672A (zh) 2010-04-14
PE20020474A1 (es) 2002-06-18
CA2697205C (en) 2014-07-29
EA017556B1 (ru) 2013-01-30
NZ569670A (en) 2010-03-26
BR0113666A (pt) 2005-09-27
TW201022244A (en) 2010-06-16
TW201022243A (en) 2010-06-16
KR20080007515A (ko) 2008-01-21
US8529882B2 (en) 2013-09-10
CN101633636B (zh) 2013-03-13
US20140294763A1 (en) 2014-10-02
ATE431358T1 (de) 2009-05-15
UA81600C2 (en) 2008-01-25
US7820671B2 (en) 2010-10-26
KR20030041981A (ko) 2003-05-27
KR20100043293A (ko) 2010-04-28
CN100522991C (zh) 2009-08-05
HK1114090A1 (en) 2008-10-24
EP1320540A2 (en) 2003-06-25
EA200300318A1 (ru) 2004-02-26
TWI319763B (en) 2010-01-21
IL215892A0 (en) 2011-12-29
KR20090120013A (ko) 2009-11-23
TW201022242A (en) 2010-06-16
NO20030928D0 (no) 2003-02-27
IL215890A0 (en) 2011-12-29
KR20080104384A (ko) 2008-12-02
UA99895C2 (uk) 2012-10-25
TW201022241A (en) 2010-06-16
US20120282219A1 (en) 2012-11-08
DE20122915U1 (de) 2010-04-08
CN101693672B (zh) 2014-11-12
ECSP034493A (es) 2003-04-25
CY1109216T1 (el) 2014-07-02
HUP0300855A3 (en) 2012-01-30
WO2002018369A8 (en) 2003-11-06
KR20080104382A (ko) 2008-12-02
JP4689938B2 (ja) 2011-06-01
EA011547B1 (ru) 2009-04-28
JP2004517047A (ja) 2004-06-10
JP2012197289A (ja) 2012-10-18
IL215891A (en) 2015-04-30
ES2325481T9 (es) 2012-07-10
MXPA03001780A (es) 2003-06-04
CN101696232A (zh) 2010-04-21
IL185644A0 (en) 2008-01-06
ATE483686T1 (de) 2010-10-15
CN103232381A (zh) 2013-08-07
AR030591A1 (es) 2003-08-27
EP1849797A3 (en) 2008-01-23
CN1869061B (zh) 2013-04-24
CA2697205A1 (en) 2002-03-07
HK1057758A1 (en) 2004-04-16
TWI378927B (en) 2012-12-11
EP1876173A1 (en) 2008-01-09
EP1878720B1 (en) 2010-10-06
NO329929B1 (no) 2011-01-24
NO2012006I2 (no) 2012-04-03
EP1958956B1 (en) 2013-12-11
KR20080104383A (ko) 2008-12-02
EA200701869A1 (ru) 2008-02-28
ES2352804T3 (es) 2011-02-23
KR100945975B1 (ko) 2010-03-09
US20050197299A1 (en) 2005-09-08
CA2419607C (en) 2012-03-13
HRP20030139A2 (en) 2005-04-30
TWI359144B (en) 2012-03-01
NO20100093L (no) 2003-04-16
ZA200301641B (en) 2004-06-21
HRP20030139B1 (hr) 2015-08-28
AU2001288318C1 (en) 2002-03-13
HUP0300855A2 (hu) 2003-10-28
ECSP077217A (es) 2007-04-26
SK2492003A3 (en) 2004-11-03
CN1869061A (zh) 2006-11-29
TWI339661B (en) 2011-04-01
KR100876472B1 (ko) 2008-12-31
KR20080096718A (ko) 2008-10-31
CN101633636A (zh) 2010-01-27
IL215892A (en) 2015-03-31
TW200918523A (en) 2009-05-01
EP1958956A3 (en) 2008-09-24
HK1163061A1 (en) 2012-09-07
DE60138717D1 (de) 2009-06-25
EP2368877A1 (en) 2011-09-28
IL215891A0 (en) 2011-12-29
CN1451014A (zh) 2003-10-22
AU8831801A (en) 2002-03-13
NO330807B1 (no) 2011-07-18
DZ3438A1 (fr) 2002-03-07
EP2368877B1 (en) 2014-05-07
PT1320540E (pt) 2009-07-14
ES2325481T3 (es) 2009-09-07
EP1878720A1 (en) 2008-01-16
CY2012007I1 (el) 2014-07-02
EP2371839A1 (en) 2011-10-05
NZ541302A (en) 2007-04-27
KR20110088600A (ko) 2011-08-03
NO20100999L (no) 2003-04-16
EP2368901A1 (en) 2011-09-28
SV2003000617A (es) 2003-01-13
KR20100042296A (ko) 2010-04-23
DE122012000015I1 (de) 2012-05-24
EP1320540B1 (en) 2009-05-13
LU91960I2 (fr) 2012-05-21
KR100968295B1 (ko) 2010-07-07
ES2489115T3 (es) 2014-09-01
SI1320540T1 (sl) 2009-10-31
AU2001288318B2 (en) 2007-09-06
NO20030928L (no) 2003-04-16
DK1878720T3 (da) 2011-01-24
WO2002018369A3 (en) 2002-08-15
CN102504014A (zh) 2012-06-20
EP1958956A2 (en) 2008-08-20
IL154671A (en) 2011-11-30
CL2010000330A1 (es) 2010-09-21
TWI359145B (en) 2012-03-01
DE60143233D1 (de) 2010-11-18
NO2012006I1 (no) 2012-04-30
JP2011079835A (ja) 2011-04-21
CA2419607A1 (en) 2002-03-07
JP2007284444A (ja) 2007-11-01
US20120064034A1 (en) 2012-03-15
CZ2003595A3 (cs) 2003-06-18
IL154671A0 (en) 2003-09-17
HRP20030139B8 (hr) 2015-11-06
DK1320540T3 (da) 2009-07-27
US8252923B2 (en) 2012-08-28
JP5269035B2 (ja) 2013-08-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL211019B1 (pl) Związek peptydomimetyczny, kompozycje farmaceutyczne i zestawy lub opakowania farmaceutyczne zawierające ten związek oraz zastosowanie tego związku do wytwarzania leku
AU2001288318A1 (en) Peptidomimetic protease inhibitors
AU2012201015B2 (en) Peptidomimetic protease inhibitors
AU2007240156B2 (en) Peptidomimetic protease inhibitors

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification