KR101558403B1 - Ｃ형 간염 바이러스 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-바이러스 활성을 가진 신규한 조성물, 특히 C형 간염 바이러스(HCV)에 대해 활성을 가진 상승작용성 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 HCV의 증식 및/또는 기능적 활성을 지연, 감소 또는 저해하는 방법에 관한 것이다.

Description

Ｃ형 간염 바이러스 조성물 및 방법{HEPATITIS C ANTIVIRAL COMPOSITIONS AND METHODS}
본 발명은 C형 간염 바이러스(HCV)에 대해 활성을 가진 신규 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 HCV 증식 및/또는 기능적인 활성을 지연, 감소 또는 저해하는 방법에 관한 것이다.
명세서 전반에 걸쳐 논의되어 있는 종래 기술은, 어떠한 방식으로도 이러한 종래 기술이 당해 분야에서 널리 공지되어 있거나 일반적인 보편된 지식을 형성함을 인정하는 것으로 간주되어서는 안된다.
현재, 바이러스 감염, 특히 질병률과 사망률이 높고 대규모 집단에게 영향을 미치는 바이러스 감염, 예컨대 C형 간염 바이러스(HCV)에 대한 유효하고 새로운 치료제의 개발이 매우 필요한 실정이다. 현재 이용가능한 치료제는 HCV에 감염된 환자 대다수에게 적합하지 않으며 효과가 없다.
C형 감염은 바이러스의 혈액성 질환으로, HCV라고 하는 간친화성( hepatotropic) 바이러스에 의해 유발된다. 감염은 보통 무증상의 간 염증을 유발할 수 있지만, 만성 감염은 나중에 간경변(간의 섬유증 반흔)과 간암을 유발시킬 수 있다. HCV는 6가지: A, B, C, D, E, G의 공지의 간염 바이러스들 중 한가지로서, 감염된 개체와의 혈액을 통한 혈액 접촉에 의해 전파된다. 증상은 의학적으로 처치할 수 있어, 대부분의 환자들은 장기간의 항바이러스 치료 코스를 통해 바이러스를 제거할 수 있다. 조기의 의학적 개입이 도움이 되지만, HCV 감염 환자들 대부분은 증상이 약하게 나타나 치료를 받지 않는다. 전세계적으로 1억 5천만 내지 2억명이 HCV에 감염된 것으로 추산되고 있다. 정맥내 약물의 사용, 흡입성 약물의 사용, 문신 또는 안전하지 않은 성 관계를 통해 혈액에 노출된 경험이 있는 개체가 이 질환에 걸릴 위험성이 높다. C형 간염은 미국에서 간 이식의 주된 원인이다.
C형 간염은 2가지로 구분되는 임상 단계를 보인다. 첫번째로, C형 간염은 HCV에 감염된 후 그로부터 처음 6개월간은 급성 C형 간염 단계이다. 감염된 개체들 중 60% 내지 70%에서는 급성 단계에서 증상이 나타나지 않는다. 급성 단계에서 증상을 경험하는 소수의 환자들에 있어서도 역시 증상이 일반적으로 약하고 비특이적이며, C형 간염으로 특정하게 진단받는 경우는 드물다. 급성 C형 감염의 증상은 식욕 감소, 피곤, 복통, 황달, 가려움 및 감기 증상이다.
HCV는 일반적으로 감염 후 1주일 내지 3주 이내에 혈액으로부터 검출할 수 있으며, 바이러스 항체는 일반적으로 3주 내지 12주 이내에 검출할 수 있다. HCV에 감염된 개체들 중 약 20-30%에서는, 알라닌 트랜스아미나제(ALT) 및 아스파르테이트 트랜스아미나제(AST) 정상화(normalization) 뿐만 아니라 혈장내 HCV-RNA 제거(이는 자발적인 바이러스 제거(spontaneous viral clearance)라 함)와 같은 간 기능 검사(LFT)에서 정상화에 의해 입증된 바와 같이, 급성기에 신체에서 바이러스가 제거된다. 나머지 HCV 감염 환자 70-80%는 만성 C형 간염으로 진행된다.
C형 만성 간염은 6개월 이상의 HCV의 지속적인 감염으로 정의된다. 임상적으로, 무증상이며(황달 증상 없음), 대부분 우연히 발견된다.
만성 C형 간염의 자연 경과는 사람에 따라 상당한 차이가 난다. 실제, HCV 감염 환자 모두 간 생검시 염증 증거를 가지고 있다. 그러나, 간 반흔(섬유증)의 진행율은 개체마다 다르다. 최근 데이타에 따르면, 치료받지 않은 환자들 중에서, 약 1/3은 향후 20년 이내에 간경변으로 진행되는 것으로, 보인다. 나머지 1/3은 30년 이내에 간경변으로 진행된다. 나머지 환자들에서는 매우 느리게 진행되어 살아있는 동안에 간경변으로 진행될 것 같지 않은 것으로 보인다. HCV 질병의 진행 속도에 영향을 주는 것으로 보고된 인자는 나이, 성별, 음주, HIV 병행-감염 및 지방 간 등이다.
간 질환을 특이적으로 암시하는 증상은, 실질적인 간 반흔이 생기기 전까지는 일반적으로 없다. 그러나, C형 간염은 전신 질환이며, 환자는 진행된 간 질환으로 발병되기 전까지 무증상에서부터 증상이 좀더 나타나는 병에 이르는 다양한 임상적인 징후를 경험할 수도 있다. 만성 C형 간염과 관련있는 일반적인 징후와 증상으로는, 피로, 현저한 체중 감소, 감기 증상, 근육 통증, 관절 통증, 간헐성 미열, 가려움, 수면 장애, 복통, 식욕 변화, 구역질, 설사, 소화 불량, 인지력의 변화, 우울증, 두통 및 기분 동요(mood swing)가 있다.
만성적인 C형 간염이 간경변으로 진행되면, 간기능 저하 또는 간 순환계의 압력 증가, 이른바 문맥 고혈압에 의해 일반적으로 유발되는 징후와 증상이 나타날 수 있다. 간경변에서 나타날 수 있는 징후와 증상으로는 복수, 타박상과 출혈 발생, 뼈의 통증, 정맥류, 지방 변(지방변증), 황달 및 간성 뇌병증이라고도 하는 인지 장애 증후군이 있다.
C형 간염에 감염된 대부분의 사람들은 급성기에는 증상이 없기 때문에, 이에 대한 진단이 이루어지는 경우가 드문 편이다. 급성기 증상을 겪는 개체도 의료적 조치를 받을 만큼 아프지 않다. 또한, 만성 C형 간염은 진행된 간 질환으로 발병할 때까지는 특별한 증상이 없거나 약하고, 수십년간 질병으로 발병되지 않을 수 있기 때문에, 만성 C형 감염의 진단은 난제로 남아 있다.
현행 치료 방법("치료의 표준")은 바이러스 유전자형에 따라 24 내지 48주의 기간 동안 페길화된 인터페론 α와 항바이러스 약물인 리바비린을 조합 투여하는 것이다. 또한, 이러한 조합 치료는 다양한 형태에서 그 효과가 바이러스 유전자형에 따라 결정되는데, 그 범위는 14% 내지 82%이다.
바이러스 감염증을 치료 또는 예방할 가능성을 향상시키기 위해, 그리고 진행 중인 바이러스 진화에 대처하기 위해, 바이러스 생활 주기의 다양한 측면들을 저해할 수 있는 분자를 동정하기 위한 노력이 요구되고 있다. 따라서, 항바이러스 활성을 가진 추가적인 신규 조성물과 제제가 필요하다.
본 발명의 과제는 종래 기술의 한가지 이상의 문제점을 해결 또는 개선하거나, 또는 유용한 대안책을 제공하는 것이다.
본 발명은, HCV 감염 치료에 유용한, 치환된 아실구아니딘으로 분류되는 신규한 항바이러스 화합물을 포함하는, 조성물, 바람직하게는 상승작용성 조성물(synergistic somposition)에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 하나 이상의 치환된 아실구아니딘 및 하나 이상의 공지된 항바이러스 화합물을 포함하는, 상승작용성 조성물에 관한 것이다.
이에, 본 발명은 제1 측면으로 식 I의 화합물 및 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 항바이러스 활성을 가진 1종 이상의 추가적인 제제와 조합하여 포함하는 HCV 치료용 조성물을 제공한다:
식 I:
Figure 112010013669538-pct00001
상기 식 I에서,
R1은 페닐, 치환된 페닐, 나프틸, 치환된 나프틸이거나 또는 R1은
Figure 112010013669538-pct00002
및
Figure 112010013669538-pct00003
로 이루어진 군으로부터 선택되고,
n은 1, 2, 3 또는 4이고;
Figure 112010013669538-pct00004
는
Figure 112010013669538-pct00005
또는
Figure 112010013669538-pct00006
이고;
F는 독립적으로,
Figure 112010013669538-pct00007
, 할로겐, 알킬, 할로 또는 폴리할로 알킬이고;
Q는 독립적으로 수소, 알콕시, 특히 메톡시, 알킬, 특히 메틸, 사이클로알킬, 티에닐, 퓨릴, 피라졸릴, 치환된 피라졸릴, 피리딜, 치환된 피리딜, 페닐, 치환된 페닐, 할로, 특히 클로로 또는 브로모, 헤테로사이클("het")이거나, 또는 Q는 독립적으로,
Figure 112010013669538-pct00008
Figure 112010013669538-pct00009
및
Figure 112010013669538-pct00010
로 이루어진 군으로부터 선택되며, R2는 직쇄 또는 분지쇄의 알킬,
Figure 112010013669538-pct00011
,
Figure 112010013669538-pct00012
,
Figure 112010013669538-pct00013
또는
Figure 112010013669538-pct00014
이고, R3은
Figure 112010013669538-pct00015
또는
Figure 112010013669538-pct00016
이고,
X는 수소 또는 알콕시이다.
유익하게는, 본 발명의 조성물은 상기 화합물과 1종 이상의 추가적인 항바이러스성 제제의 효능이 상기 화합물과 1종 이상의 항바이러스 제제 각각의 효과를 합한 것 보다 높은, 상승작용성 조성물이다.
본 발명은 제2 측면에서 제1 측면에 따른 조성물과 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, HCV 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 제3 측면에서 상기 HCV에 감염되었거나 HCV에 노출된 세포를 제1 측면에 따른 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, HCV의 증식 및/또는 복제를 감소, 지연 또는 저해하는 방법을 제공한다.
본 발명은 제4 측면에서 HCV에 노출된 세포를 제1 측면에 따른 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 HCV에 노출된 세포의 감염을 예방하는 방법을 제공한다.
상기 세포는 완전한 조합 조성물(즉, 조성물의 모든 성분이 동시에)에 접촉되거나 또는 조성물의 각 성분들과 순차적으로 접촉될 수 있다.
본 발명은 제5 측면에서 HCV에 노출 또는 감염된 개체에게 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 HCV에 노출 또는 감염된 개체의 치료학적 또는 예방학적 치료 방법을 제공한다.
조성물의 개별 성분들은 순차적인 방식으로 각각 투여되거나 또는 임의 순서로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 제형은, 정맥내(iv), 복막내, 피하, 두개내, 진피내, 근육내, 안구내, 경막내(intrathecal), 뇌내, 비내, 경점막으로, 또는 경구나 직장 주입(infusion)에 의해, iv 점적, 패치 또는 임플란트를 통해 투여될 수 있다. 조성물은 분말, 정제, 캡슐, 액체, 현탁제 또는 그외 유사한 투약 형태일 수 있다.
본 발명의 제6 측면은 본 발명에 따른 조성물을 치료학적 유효량으로 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 C형 간염의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 제7 측면은 본 발명에 따른 조성물을 치료학적 유효량으로 필요한 개체에게 투여하여 C형 간염의 치료 방법을 제공하며, 상기 조성물은 HCV p7 단백질을 저해한다.
본 발명은 제8 측면에서 C형 감염 치료용 약제의 제조 또는 조제에 있어 본 발명에 따른 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 제9 측면에서 C형 간염을 치료하기 위한 약제의 제조 또는 조제에 있어 HCV p7 단백질을 저해하는 본 발명에 따른 조성물의 용도를 제공한다.
문맥상 명확한 경우를 제외하고는, 본 발명의 상세한 설명 및 청구항 전반에 걸쳐, 용어 '포함한다', '포함하는' 등은 독점적이거나 배타적인 의미에 반대되는 포괄적인 의미로 파악되며, 즉, "비제한적으로 포함하는"의 의미이다.
도 1은 BIT 225 및 BIT 100에 의한 BIT 225 및 BIT 100 복제 저해를 나타낸 그래프이다.
도 2는 BVDV에 대한 다양한 농도의 BIT 225의 농도 반응 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 3은 IFN에 대한 다양한 농도의 BIT 225의 농도 반응 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 4는 BVDV에 대한 다양한 농도의 리바비린의 농도 반응 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 5는 IFNα의 존재 또는 부재하에 31 nM BIT225 및/또는 1.25 ㎍ 리바비린의 바이러스 저해 수준을 나타낸 그래프이다.
도 6은 5 및 10 IU/m IFNα의 존재 하의 BIT225에 대한 전 범위의 농도 반응 그래프로서, 1.25 ㎍/ml 첨가시 항바이러스 효과가 증강됨을 보여준다. 삽입된 그래프는 5 및 10 IU/m IFNα의 존재 하에 리바비린의 전 범위의 농도 반응 그래프이다.
도 7은 BVDV에 대한 2'-C-메틸아데노신 및 2'-C-메틸시티딘 각각의 농도 반응 그래프이다.
도 8 및 9는 다양한 농도의 2'-C-메틸아데노신 또는 2'-C-메틸시티딘 각각의 존재 하의 BIT225의 농도 반응 변화를 나타낸 것이다.
도 10은 다양한 농도의 rIFNα-2b 존재 하의 BIT314의 전 범위의 농도 반응 그래프이다.
도 11은 5 IU/m IFNα + 1.25 ㎍/ml 리바비린 및 5 IU/m IFNα + 2.5 ㎍/ml 리바비린의 첨가에 의해 항바이러스 효과가 증강됨을 나타낸 것이다.
본 발명은 식 I 화합물 및 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 항바이러스 활성을 가진 1종 이상의 추가적인 제제를 조합하여 포함하는 HCV 치료용 조성물에 관한 것이다:
(식 I)
Figure 112010013669538-pct00017
상기 식 I에서,
R1은 페닐, 치환된 페닐, 나프틸, 치환된 나프틸이거나 또는 R1은
Figure 112010013669538-pct00018
또는
Figure 112010013669538-pct00019
로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
n은 1, 2, 3 또는 4이고,
Figure 112010013669538-pct00020
는
Figure 112010013669538-pct00021
또는
Figure 112010013669538-pct00022
이고;
F는 독립적으로,
Figure 112010013669538-pct00023
, 할로겐, 알킬, 할로 또는 폴리할로 알킬이고,
Q는 독립적으로 수소, 알콕시, 특히 메톡시, 알킬, 특히 메틸, 사이클로알킬, 티에닐, 퓨릴, 피라졸릴, 치환된 피라졸릴, 피리딜, 치환된 피리딜, 페닐, 치환된 페닐, 할로, 특히 클로로, 또는 브로모, 헤테로사이클("het")이거나, 또는 Q는 독립적으로
Figure 112010013669538-pct00024
Figure 112010013669538-pct00025
및
Figure 112010013669538-pct00026
로부터 선택되고,
R2는 직쇄 또는 분지쇄의 알킬,
Figure 112010013669538-pct00027
,
Figure 112010013669538-pct00028
,
Figure 112010013669538-pct00029
또는
Figure 112010013669538-pct00030
이고,
R3은
Figure 112010013669538-pct00031
또는
Figure 112010013669538-pct00032
이고,
X는 하이드로겐 또는 알콕시이다.
특히, 본 발명의 조성물에 사용하기 유용한 화합물은 하기 화합물 및 그것의 약학적으로 허용가능한 염 중에서 선택될 수 있다:
하기 구조를 포함하는 (3-벤조일)신나모일구아니딘
Figure 112010013669538-pct00033
하기 구조를 포함하는 2,3-메틸렌디옥시신나모일 구아니딘
Figure 112010013669538-pct00034
하기 구조를 포함하는 5-메틸-2-나프토일구아니딘
Figure 112010013669538-pct00035
하기 구조를 포함하는 3(인단-4-일)-프로페노일구아니딘
Figure 112010013669538-pct00036
하기 구조를 포함하는 5-브로모-6-메톡시-2-나프토일구아니딘
Figure 112010013669538-pct00037
하기 구조를 포함하는 5-티오펜-3-일-2-나프토일구아니딘
Figure 112010013669538-pct00038
하기 구조를 포함하는 5-(1-메틸피라졸-4-일)2-나프토일구아니딘
Figure 112010013669538-pct00039
하기 구조를 포함하는 (1-메톡시-2-나프토일)구아니딘
Figure 112010013669538-pct00040
하기 구조를 포함하는 (3-메톡시-2-나프토일)구아니딘
Figure 112010013669538-pct00041
하기 구조를 포함하는 (5-브로모-2-나프토일)구아니딘
Figure 112010013669538-pct00042
하기 구조를 포함하는 (1,4-디메톡시--2-나프토일)구아니딘
Figure 112010013669538-pct00043
하기 구조를 포함하는 (6-(3-티에닐)-2-나프토일)구아니딘
Figure 112010013669538-pct00044
하기 구조를 포함하는 (6-메틸-2-나프토일)구아니딘
Figure 112010013669538-pct00045
하기 구조를 포함하는 (5-페닐-2-나프토일)구아니딘
Figure 112010013669538-pct00046
하기 구조를 포함하는 (5-(티엔-2-일)-2-나프토일)구아니딘
Figure 112010013669538-pct00047
하기 구조를 포함하는 (5-(1-이소부틸-1H-피라졸-4-일)-2-나프토일)구아니딘
Figure 112010013669538-pct00048
하기 구조를 포함하는 (5-(3-퓨릴)-2-나프토일)구아니딘
Figure 112010013669538-pct00049
하기 구조를 포함하는 (5-사이클로프로필-2-나프토일)구아니딘
Figure 112010013669538-pct00050
하기 구조를 포함하는 (5-클로로-2-나프토일)구아니딘
Figure 112010013669538-pct00051
하기 구조를 포함하는 (6-(1-메틸피라졸-4-일)-2-나프토일)구아니디늄 아세테이트
Figure 112010013669538-pct00052
하기 구조를 포함하는 (5-(2,6-디메톡시피리딘-3-일)-2-나프토일)구아니딘
Figure 112010013669538-pct00053
하기 구조를 포함하는 (5-(2-클로로페닐)-2-나프토일)구아니딘
Figure 112010013669538-pct00054
하기 구조를 포함하는 (5-(4-(아세틸아미노)페닐)-2-나프토일)구아니딘
Figure 112010013669538-pct00055
하기 구조를 포함하는 (5-(3-(아세틸아미노)페닐)-2-나프토일)구아니딘
Figure 112010013669538-pct00056
하기 구조를 포함하는 (5-(4-((메틸설포닐)아미노)페닐)-2-나프토일)구아니딘
Figure 112010013669538-pct00057
식 I의 화합물의 구아니딜 부분의 아민 또는 이민 기는 이러한 화합물의 제공에 사용되는 임의의 통상적인 형태로 존재할 수 있다. 예로, 이는 유리 염기, 수화물, 유기염, 무기염 또는 이들의 조합으로 존재할 수 있다.
본 발명의 화합물을 항바이러스 활성에 대해 스크리닝하기 위해 개발된 방법은 PCT/AU2004/000866에 구체적으로 언급되어 있으며, 이 문헌은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
"HCV"에 대한 언급은 모든 C형 간염 바이러스 균주에 대한 언급으로서 이해되어야 하며, 상동체 및 돌연변이도 포함된다.
바이러스의 "기능적 활성"은 바이러스가 수행하거나 참여하는 한가지 이상의 기능을 나타내는 것으로서 이해되어야 한다.
"바이러스 복제"는 비리온의 조합 또는 방출을 저해하는 것과 같이, HCV의 생활 주기 중 한 단계 이상 또는 양상을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명의 방법은 HCV 생활 주기 중 임의 한 단계 이상 또는 양상을 조절하는 단계들의 케스케이드 유도를 통한, HCV 복제의 조절을 포함한다.
HCV로 감염된 "세포"는 HCV로 감염된 임의 세포, 원핵 또는 진핵 세포를 언급하는 것으로 이해되어야 한다. 이는, 예로, 불멸화된 세포주 또는 일차(primary) 세포주, 박테리아 배양물 및 인 시츄(in situ) 세포를 포함한다.
본 발명의 화합물은 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 조성물 또는 제형 형태로 투여될 수 있음을, 당업자는 이해할 것이다.
본 발명의 화합물을 포함하는 본 발명의 조성물은 하나 이상의 임의 타입의 추가적인 항바이러스 제제를 조합하여 포함할 수 있으며, 예컨대 비-뉴클레오시드 HCV RNA-의존적인 RNA 중합효소(RdRP) 저해제, 뉴클레오시드 HCV RNA-의존적인 RNA 중합효소(RdRP) 저해제, 비-뉴클레오시드 HCV RNA 프로테아제 저해제, 뉴클레오시드 HCV RNA 프로테아제 저해제, 비-뉴클레오시드 역전사 효소 저해제(NNRTI), 뉴클레오시드 역전사 효소 저해제, 바이러스 도입 저해제, 인터페론, PEG-인터페론, 리바비린 및 이들의 조합이 있다. 뉴클레오시드 및 비-뉴클레오시드 저해제는 뉴클레오시드 및 비-뉴클레오시드 분자의 유사체를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 중합효소 저해제는 HCV NS5B 및 NS5A를 표적할 수 있으며, 프로테아제 저해제는 HCV NS3 및 NS4를 표적할 수 있다.
본 발명의 조합 치료 및 조성물에 사용할 수 있는 NS5B의 뉴클레오시드 유사체 저해제에 대한 비제한적인 예로는, 뉴클레오시드 유사체 2'-C-메틸시토신의 전구체인 발로픽시타빈(valopicitabine); JTK103; R04048; 4'-아지도시토신의 뉴클레오시드 유사체인 R-1479/R-1626 및 이의 프로드럭; 및 R-7128이 있다. 본 발명의 조성물에 사용할 수 있는 비-뉴클레오시드 유사체 저해제(NNRTI)의 비제한적인 예로는 아벤조퓨란 HCV 중합효소 저해제인 HCV-796; GL60667 또는 "667"; 및 XTL-2125가 있다. 본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 HCV의 NS3/4A의 세린 프로테아제 저해제의 비제한적인 예로는 VX-950; SCH-503034; ACH-806/GS-9132; 및 BILN-2061 및 ITMN-191이 있다.
바람직하게는, 항바이러스 활성을 가진 1종 이상의 추가적인 제제는 인터페론(IFN)이다. 보다 더 바람직하게는, 인터페론은 I형 및 II형 IFN으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 더 바람직하게는, IFN은 IFNα, IFNβ 및 IFNγ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 더 바람직하게는, IFN은 IFN α-2a, IFN α-2b, IFNα-n3, IFNα con-1, IFNβ-1a, IFN-β1, IFN-γ1b, 페그인터페론(peginterferon) α-2b 및 페그인터페론 α-2a로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 예로, 항바이러스 활성을 가진 1종 이상의 추가적인 제제는, IFNα-2b 및 리바비린; IFNα-2a 및 리바비린; 페길화된 IFNα-2a 및 리바비린 또는 페길화된 IFNα-2a 및 리바비린 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
1종 이상의 항바이러스 활성의 추가적인 제제는 HCV 프로테아제 저해제, HCV 중합효소 저해제 또는 HCV 세린 프로테아제 저해제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함할 수 있다. 다른 예로, 1종 이상의 항바이러스 활성의 추가적인 제제는 단일 항체, 식물 추출물, NS5A 저해제, 면역조절제, 티아졸리드, 항-인지질 치료제, 안티센스 화합물, 이사토리빈(isatoribine), 광대력의 면역 자극제, 염증/섬유증 저해제, 복제효소 저해제, 사이클로필린 저해제, 이미노 당(sugar) 저해제, 판카스파제 저해제 또는 다클론 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함할 수 있다.
또한, 1종 이상의 항바이러스 활성의 추가적인 제제는 예컨대 2'-C-메틸 뉴클레오시드 유사체와 같은 1종 이상의 항바이러스 뉴클레오시드 유사체를 포함할 수 있다. 이들은 예컨대 2'-C-메틸아데노신 또는 2'-C-메틸시티딘으로부터 선택할 수 있다.
또한, 1종 이상의 항바이러스 활성의 추가적인 제제는 치료 백신 또는 DNA 백신으로부터 선택되는 백신을 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물을 1종 이상의 통상적인 항바이러스 화합물 또는 HCV 길항제와 조합하여 사용하는 조합 요법에 있어, 본 발명의 화합물은 상기 1종 이상의 통상적인 항바이러스 화합물 또는 길항제 전에, 이후에 또는 동시에 개체에 제공할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은, 화합물과 항바이러스 활성을 가진 1종 이상의 추가적인 제제의 효과가 화합물과 항바이러스 활성을 가진 1종 이상의 추가적인 제제를 합한 것 보다 높은, 상승작용의 조성물이다. 또한, 신규한 화합물과 기존의 항바이러스 제제의 단순, 상가(additive) 조합도 고려되는 것으로 이해될 것이다.
바이러스 저해 개체는, 인간, 영장류, 가축, 예, 양, 소, 말, 당나귀, 돼지; 애완 동물, 예, 개, 고양이; 실험 동물, 예, 마우스, 토끼, 랫, 기니아피그, 햄스터; 또는 포획한 야생 동물, 예, 여우, 사슴과 같은 포유류이지만, 이로 한정되지 않는다. 바람직하기로는, 개체는 영장류이다. 가장 바람직하기로는, 개체는 인간이다.
본 발명의 방법은 특히 HCV 감염의 치료 및 예방에 유용하다. 예컨대, HCV에 감염된 개체에서, HCV의 복제를 방지하여 급성 또는 만성 C형 간염의 개시를 예방하기 위하여, 항바이러스 활성을 작동시킬 수 있다. 다른 예로, 본 발명의 방법을 사용하여 혈청 HCV 하중(load)을 감소시키거나 HCV 감염 증상을 개선시킬 수 있다.
본 발명의 방법은 특히 감염된 세포에서 HCV 저장소 확립을 예방하기 위해 HCV 감염의 초기 단계에 사용할 수 있거나, 또는 가능성 있는 HCV 소스에 노출되기 바로 전이나 노출된 후 일정 기간 동안 적용되는 예방학적 치료로서 사용할 수 있다.
본원에서, "치료학적" 및 "예방학적"은 가장 넓은 의미로 간주된다. 용어 "치료학적"이 반드시 포유류가 완전히 회복될 때까지 치료되는 것을 암시하는 것은 아니다. 유사하게, "예방학적"이 개체가 궁극적으로 질병 상태가 되지 않는 것을 반드시 의미하는 것은 아니다. 따라서, 치료 및 예방은 특정 상태의 증상 완화, 또는 특정 상태로 발병할 위험성 방지 또는 경감을 포함한다. 용어 "예방"은 특정 상태가 발병될 심각성을 감소시키는 것으로 간주될 수 있다. 또한, 치료는 기존 상태의 중증도나 갑작스러운 공격의 빈도를 낮출 수 있다.
본 발명의 방법에서, 2종 이상의 조성물은 다른 화합물 1종 이상의 치료제와 병행-투여할 수 있다. "병행-투여"는 동일하거나 상이한 경로를 통한 동일한 제형 또는 2가지 다른 제형의 동시 투여, 또는 동일하거나 상이한 경로를 통한 순차적인 투여를 의미한다. "순차" 투여는 하나의 화합물과 다음 화합물 간의 투여 간격이 수 초, 수 분, 수 시간 또는 수 일인 시간 차를 의미한다. 조성물과 추가적인 치료제는 임의 순서로 투여할 수도 있다.
투여 경로는 정맥내(iv), 복막내, 피하, 두개내, 진피내, 근육내, 안구내, 경막내(intrathecal), 뇌내, 비내, 경점막으로, 또는 경구나 직장 주입(infusion)에 의해, iv 점적, 패치 또는 임플란트를 통해 투여되는 것일 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 정맥내 경로가 특히 바람직하다.
또한, 본 발명은 크림, 로션 및 젤과 같은 국소 적용에 적합한 형태로 확장된다.
추가적인 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에 따른 조성물을 포함하는 HCV 치료를 위한 폐 또는 코 투여용 제형을 제공한다.
투여 용이성과 투약의 균일성을 위해, 비경구 조성물을 투약 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유익하다. 투약 단위 형태는 본원에서 처리되는 포유류 대상에게 단일 투약으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하며; 각 단위는 필수 약제학적 담체와 조합하여 원하는 치료 효과를 형성하도록 계산된 피정량(predetermined quantity)의 활성 물질을 포함하고 있다. 본 발명의 신규한 투약 단위 형태는, (a) 활성 물질의 고유 특징과 달성하고자 하는 특정 치료 효과, 및 (b) 컴파운딩 분야의 선천적인 한계에 의해 정해지며, 이에 따라 직접적으로 결정된다.
투약 단위 형태 및 국소 제제의 제조 방법은 다음의 문헌으로부터 당업자가 쉽게 이용할 수 있다: Pharmaceutical Handbook . A Martindale Companion Volume Ed . Ainley Wade Nineteenth Edition The Pharmaceutical Press London , CRC Handbook of Chemistry and Physics Ed . Robert C. Weast Ph D. CRC Press Inc .; Goodman and Gilman' s; The Pharmacological basis of Therapeutics . Ninth Ed . McGraw Hill ; Remington; and The Science and Practice of Pharmacy . Nineteenth Ed . Ed . Alfonso R. Gennaro Mack Publishing Co . Easton Pennsylvania .
본 발명에 고려되는 유효량은 증상의 중증도와 수용자의 건강과 나이에 따라 변경될 것이다. 일반적으로 유효량은 체중 1 kg 당 0.01 ng 내지 약 100 mg으로 다양할 수 있다.
본 발명은, 본 발명의 화합물의 합성 프로토콜, 바이러스 저해 및 그외 항-바이러스 특성을 설명하는 비제한적이며 특이적인 예를 들어 보다 상세하게 설명될 것이다. 항바이러스 활성을 가진 화합물의 합성 및 스크리닝은 본원에 언급되거나 PCT/AU2004/000866에 보다 상세하게 언급된 여러가지 방법에 의해 달성될 수 있으며, 상기 문헌은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
그러나, 구체적인 과정, 화합물 및 방법에 대한 상세한 설명은 본 발명을 예시하기 위한 목적으로만 포함되는 것으로 이해된다. 어떠한 방식으로도 본 발명의 폭넓은 내용이 전술한 바로 한정되는 것으로 이해되어서는 안된다.
실시예
본 발명에 따른 모든 화합물의 항-바이러스 활성은 본원 또는 PCT/AU2004/000866에 구체적으로 언급된 방법을 이용하여 확인할 수 있으며, 확인되었으며, 상기 문헌은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다. 또한, 일반적이고 구체적으로 본 명세서 또는 참조 공개 문헌에 언급되어 있거나 또는 당업자에게 공지된, 본 발명의 화합물의 합성 방법은 본 발명의 모든 화합물의 제조에 사용할 수 있다. 또한, 유용한 합성 프로토콜은 PCT/AU2006/000880에 제공되어 있으며, 이 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본원에 포함된다.
보다 구체적으로는, 아실구아니딘은, (일반적으로 그것의 하이드로클로라이드 염으로부터 인 시츄 제조된) 구아니딘을 적합하게 활성화된 카르복시산의 유도체와 반응시키는 단계를 포함하는, 다양한 방법에 의해 합성할 수 있다. 그 예로 하기를 포함한다:
i) Yamamoto et al, Chem. Pharm. Bull, 1997, 45, 1282에 예시된, 산 클로라이드로부터의 합성,
ii) 미국 특허 2,734,904에 예시된, 단순한 에스테르로부터의 합성,
iii) 미국 특허 5,883,133에 예시된, 카르보닐디이미다졸에 의한 인 시츄 활성화를 통한 카르복시산으로부터의 합성.
본원에 개시된 아실구아니딘의 제조에 필요한 카르복시산 전구체는 다양한 방법에 의해 수득된다. 치환된 신남산 다수를 상업적으로 이용할 수 있다. 또한, 치환된 신남산과 이의 단순한 에스테르를 합성하기 위한 수많은 공정들이 당업계에 잘 알려져 있으며, 그 예로는 하기를 포함한다:
i) Chemical Reviews, 1944, 35, 156 및 상기 문헌의 참조문헌에 개시된, 말론산과 방향족 알데하이드 및 염기의 반응(Doebner 축합),
ii) Organic Reactions, 1942, 1, 210 및 상기 문헌의 참조문헌에 개시된, 아세트 무수 화합물과 방향족 알데하이드 및 염기의 반응(Perkin 반응),
iii) Organic Reactions, 1982, 28, 345 및 상기 문헌의 참조문헌에 개시된, 아크릴산 및 이의 단순 에스테르와 방향족 할라이드 또는 방향족 트리플레이트와의 팔라듐 촉매를 이용한 반응(Heck 반응),
iv) Organic Reactions, 1977, 25, 73 및 상기 문헌의 참조문헌에 개시된, 트리알킬 포스포노아세테이트와 방향족 알데하이드 및 염기의 반응(Homer-Emmons 반응).
다수의 단순 할로, 하이드록시 및 알콕시 치환된 나프토산은 상업적으로 이용가능하거나, 또는 당업계에 공지되어 있으며, 이들은 치환된 나프토일구아니딘의 출발 물질로 제공된다.
알킬, 사이클로알킬, 아릴 및 헤테로사이클기로 치환된 나프토산은 전이 금속 촉매를 이용한 적정 유기금속 반응제와 할로나프토산을 반응시켜 흔히 제조할 수 있다. 나프토일구아니딘에 전구체로서 사용되는 다수의 치환된 나프토산을 제조하기 위해 사용되는 이러한 방법에 대한 변형 방법은, 스즈키(suzuki) 커플링(Chemical Reviews, 1995, 95, 2457 및 상기 문헌에 포함된 참조문헌)으로서 당업계에 널리 공지된, 브로모나프토산과 적합하게 치환된 보론산(또는 보로네이트 에스테르) 간의 팔라듐-촉매화된 탄소-탄소 결합 형성 반응이다. 이 반응은 다양한 응용 가능성이 있으며, 필요한 카르복시산기를 도입 또는 드러내도록 추가적으로 작업할 수 있는 치환된 할로나프탈렌 범주에 사용될 수 있다.
1. 일반적인 합성 방법
1.1 일반 공정 A - 아릴 트리플레이트의 제조
0℃에서, 피리딘(7㎖) 중의 페놀(10mmol) 용액에, 트리플루오로메탄설폰 무수화물(11mmol, 1.1eq)을 서서히 첨가하였다. 수득되는 혼합물을 0℃에서 5분간 더 혼합한 다음, 실온으로 승온되게 두고, TLC 분석으로 출발 페놀이 소모된 것으로 확인될 때까지 교반하였다. 이후, 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트(3번)로 추출하였다. 모은 추출물을 물, 1M 염산 수용액, 물 및 염수로 연속 세정하고, 건조(MgSO4)한 다음, 진공 농축하여, 조산물을 수득하였다. 조산물을 실리카겔에서 크로마토그래피를 수행하였다. 에틸 아세테이트/헥산 혼합물로 용출시켜, 원하는 아릴 트리플레이트를 무색 오일로서 수득하였다.
1.2 일반 공정 B - 트리플레이트의 Heck 반응을 통한 신나메이트 에스테르의 제조
디메틸포름아미드(30㎖) 중의 페닐 트리플레이트(10mmol), 메틸 아크릴레이트(14mmol, 1.4eq), 트리에틸아민(40mmol, 4eq) 및 디클로로비스(트리페닐포스핀)팔라듐(0.3mmol, 0.03eq) 혼합물을 90℃로 가열하였다. 반응은 GC/MS로 모니터링하였고, 반응이 완료되도록 필요에 따라 새로운 배치의 메틸 아크릴레이트(1eq), 트리에틸아민(2eq) 및 팔라듐 촉매(0.03eq)를 첨가하였다. 혼합물을 물에 붓고, 1:1의 디에틸 에테르/헥산 혼합물로 (3번) 추출하였다. 모은 추출물을 물, 염수로 차례로 세정하고, 건조(MgSO4)한 다음 실리카겔 패드로 여과하고, 여과물을 진공 농축하여, 조산물을 오일로서 수득하였다. 조산물을 실리카겔에서 크로마토그래피를 수행하였다. 에틸 아세테이트/헥산 혼합물로 용출시켜, 원하는 메틸 신나메이트를 일반적으로 무색 오일로서 수득하였다.
1.3 일반 공정 C - 브로마이드의 Heck 반응을 통한 신나메이트 에스테르의 제조
아릴 브로마이드(10mmol), 팔라듐 아세테이트(0.1mmol, 0.01eq) 및 트리-o-톨릴포스핀(0.4mmol, 0.04eq)을 반응 플라스크에 넣고, 질소를 통기시켰다. 여기에, 메틸 아크릴레이트(12.5mmol, 1.25eq), 트리에틸아민(12.5mmol, 1.25eq) 및 디메틸포름아미드(1㎖)를 첨가하고, 혼합물을 100℃로 가열하였다. 반응은 GC/MS로 모니터링하였고, 반응을 완료시키기 위해 필요에 따라 새로운 배치의 팔라듐 아세테이트(0.01eq), 트리-o-톨릴포스핀(0.04eq), 메틸 아크릴레이트(1.25eq) 및 트리에틸아민(1.25eq)을 첨가하였다. 혼합물을 물에 붓고, 1:1의 디에틸 에테르/헥산 혼합물로 (4번) 추출하였다. 모은 추출물을 물 및 염수로 순차적으로 세정하고, 건조(MgSO4)하고, 실리카겔 패드로 여과한 다음, 여과물을 진공 농축하여, 조산물을 수득하였다. 조산물을 실리카겔에서 크로마토그래피하였다. 에틸 아세테이트/헥산 혼합물로 용출시켜, 원하는 메틸 신나메이트를 일반적으로 무색 오일로서 수득하였다.
1.4 일반 공정 D - Horner - Emmons 반응을 통한 신나메이트 에스테르의 제조
0℃, 질소 하에서, 무수 테트라하이드로퓨란(10㎖) 중의 트리에틸 포스포노아세테이트(13mmol, 1.3eq) 용액을, 무수 테트라하이드로퓨란(10㎖)중의 소듐 수소화물(14.3mmol, 1.4eq) 현탁액에 5분간 적가하였다. 이후, 혼합물을 20분간 0℃에서 교반하였다. 테트라하이드로퓨란(15㎖) 중의 벤즈알데하이드(10mmol) 용액을 10분간 0℃에서 첨가하였다. 혼합물은 30분간 0℃에서 더 교반한 다음, GC/MS 또는 TLC 분석으로 벤즈알데하이드 출발 물질이 소모된 것으로 확인될 때까지 실온에서 교반하였다. 전형적으로, 반응물은 출발 물질인 알데하이드를 완전히 소모시키기 위해 실온에서 철야 교반시켰다. 혼합물을 물에 부어, 유기층을 분리시킨 다음, 수층을 에틸 아세테이트로 (3번) 추출하였다. 모은 유기 추출물을 물 및 염수로 순차적으로 세정하고, 건조(MgSO4)한 다음, 진공 농축하여, 조산물을 수득하였다. 조산물을 실리카겔에서 크로마토그래피를 수행하였다. 에틸 아세테이트/헥산 혼합물로 용출시켜, 원하는 에틸 신나메이트를 일반적으로 무색 오일로서 수득하였다.
1.5 일반 공정 E - 5- 페닐펜타 -2,4- 디에노익 에스테르의 제조
0℃, 질소 하에서, 무수 테트라하이드로퓨란(10㎖)중의 트리에틸 4-포스포노크로토네이트(26mmol, 1.3eq) 용액을, 무수 테트라하이드로퓨란(15㎖) 중의 소듐 수소화물(28mmol, 1.4eq) 현탁액(오일중 60% 현탁액)에 5분간 적가하였다. 이후, 혼합물을 20분간 0℃에서 교반하였다. 테트라하이드로퓨란(10㎖) 중의 벤즈알데하이드(20mmol) 용액을 10분간 0℃에서 첨가하였다. 혼합물은 30분간 0℃에서 더 교반한 다음, GC/MS 분석으로 알데하이드 출발 물질이 소모된 것으로 확인될 때까지 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 부어, 유기층을 분리시킨 다음, 수층을 에틸 아세테이트로 (3번) 추출하였다. 모은 유기 추출물을 물 및 염수로 순차적으로 세정하고, 건조(MgSO4)한 다음, 진공 농축하여, 조산물 에틸 에스테르를 오일로 수득하였다. 조산물을 실리카겔에서 크로마토그래피를 수행하였다. 에틸 아세테이트/헥산 혼합물로 용출시켜, 원하는 에틸 에스테르를 무색 오일로서 수득하였다.
1.6 일반 공정 F - 에스테르의 가수분해
메탄올(50㎖) 및 물(5㎖) 중의 에스테르(10mmol) 용액을, 6M 포타슘 하이드록사이드(20mmol, 2eq) 수용액으로 처리하고, 이 혼합물을 TLC 분석으로 출발 물질이 더 이상 없는 것으로 확인될 때까지 (통상 2-3시간) 환류하에 가열하였다. 이후, 혼합물을 물(50-200㎖)에 붓고, 농축 염산으로 약 pH 2로 산성화하였다. 수득된 카르복실산을 여과에 의해 수집하고, 물로 세정한 다음 높은 진공하에서 밤새 건조하였다.
1.7 일반 공정 G - 브로모나프토산의 스즈키 반응
브로모-2-나프토산(2mmol), 적정 보론산(또는 보로네이트 에스테르)(2.2mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)(0.1mmol) 및 소듐 카보네이트 고형물(6.8mmol)을 반응 플라스크에 넣고, 질소를 통기시켰다. 아세토니트릴(6㎖) 및 물(2.5㎖)을 첨가하고, 혼합물은 출발물질인 브로모-2-나프토산이 소모될때까지 왕성하게 교반하면서 환류하에 가열하였다. 이후, 반응 혼합물을 톨루엔(50㎖) 및 0.5M 소듐 하이드록사이드 용액(100㎖)으로 분별하였다. 수층은 톨루엔으로 (트리페닐포스핀을 모두 제거하기 위해, 3 x 20㎖) 세정하고, 농축 염산으로 pH1로 산성화시켰다. 나프토산 유도체를 에틸 아세테이트(4 x 20㎖)로 추출하였다. 모은 에틸 아세테이트 추출물을 물(3 x 20㎖) 및 염수(1O㎖)로 세정하고, 건조(MgSO4)한 다음, 여과 및 농축하였다. 잔류물을 1H NMR로 분석하고, (필요에 따라) 실리카겔에서 크로마토그래피를 수행하였다.
1.8 일반 공정 H - 아실구아니딘의 제조
디메틸포름아미드 한 방울이 첨가된 디클로로메탄(30㎖) 중의 카르복실산(10mmol, 1.0eq) 현탁액/용액에, 용액에 거품을 발생시키는 옥살릴 클로라이드(12mmol, 1.2eq)를 첨가하였다. 2시간동안 교반한 다음, 수득되는 용액을 증발시켜 감압하에 건조시켰다. 잔류물을 건조 테트라하이드로퓨란(30㎖)에 용해시키고, 2M 수산화나트륨 수용액(30㎖) 중의 구아니딘 하이드로클로라이드 용액(50mmol, 5.0eq) 용액에 첨가하였다. 반응물은 한시간 동안 실온에서 교반하여, 테트라하이드로퓨란 층을 분리시켰다. 수층은 클로로포름(100㎖)으로 추출하고, 이후 에틸 아세테이트(100㎖)로 추출한 다음, 모은 유기층을 감압하에 증발시켰다. 수득되는 잔류물은 클로로포름(200㎖)및 2M 수산화나트륨 수용액(100㎖)로 분별하고, 유기층을 분리하여 건조(Na2SO4)시켰다. 용액을 여과하고, 고형물이 침전되기 시작할 때까지 감압하에 증발시켰다. 이때, 헥산을 첨가하여 생기는 침전 산물을 여과로 모우고, 높은 진공하에 건조하였다.
2. 구체적인 합성 실험
실시예 1: 4- 하이드록시인단
4-아미노인단(3.0g)을 물(15㎖) 중의 농축 황산(2.4㎖) 용액에 첨가하였다. 물(15㎖)을 더 첨가하고, 혼합물을 5℃로 냉각시켰다. 혼합물을 5℃ 미만으로 유지시키면서, 수(4.5㎖) 중의 아질산나트륨(1.71g) 용액을 부분 적가하였다. 적가를 완료한 후, 혼합물은 실온으로 승온시키고, 유레아(0.29g)를 첨가하였다. 혼합물을 5분 더 교반한 후, 30분간 45℃에서 가열하였다. 이후, 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 모은 유기 추출물을 2M 수산화나트륨 수용액으로 (2 x 100㎖) 세정하고, 이 수계 추출물을 염산으로 산성화한 다음, 에틸 아세테이트로 (3 x 100㎖)로 추출하였다. 모은 유기 추출물을 염수로 세정하고, 건조(Na2SO4)한 다음 진공 농축하였다. 수득되는 조산물을 실리카겔에서 크로마토그래피하였다. 에틸 아세테이트/헥산(1:7)로 추출하여, 4-하이드록시인단을 오렌지색 오일(1.0g)로 수득하였다.
실시예 2: 4- 인다닐 트리플레이트
0℃에서, 피리딘(5㎖) 중의 4-하이드록시인단(1.2g, 8.9mmol) 용액에 트리플루오로메탄설폰 무수화물(1.6㎖,9.8mmol)을 서서히 첨가하였다. 수득되는 혼합물을 5분간 0℃에서 교반하고, 실온에서 승온시킨 후 45분간 교반하였다. 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 (3 x 25㎖) 추출하였다. 모은 추출물은 물, 1M 염산 수용액, 물 및 염수로 순차적으로 세정하고, 건조(Na2SO4)한 다음 진공 농축하여, 조산물인 트리플레이트를 오렌지색 오일(2.13g, 89%)로 수득하였다.
실시예 3: 메틸 3-(인단-4-일) 아크릴레이트
디메틸포름아미드(15㎖) 중의 조산물 4-인다닐 트리플레이트(2.13g, 8.0mmol), 메틸 아크릴레이트(1.01㎖, 11.2mmol), 트리에틸아민(4.4㎖, 32mmol, 4eq) 및 디클로로비스(트리페닐포스핀)팔라듐(170mg, 0.24mmol) 혼합물을 71시간동안 85℃에서 가열하였다. 소량의 분획을 취하여 상당량의 출발 물질이 여전히 존재하는지를 확인하는 GC/MS 분석에 사용하였다. 추가적으로 메틸 아크릴레이트(0.7㎖), 트리에틸아민(2㎖) 및 팔라듐 촉매(170mg)를 첨가하고, 혼합물을 24시간 더 가열하였다. 이후, 혼합물을 물에 부어, 에틸 아세테이트로 추출한 다음, 유기 추출물은 물과 염수로 순차적으로 세정하고, 건조(Na2SO4) 및 진공 농축하여, 조산물을 오일(2.4g)로 수득하였다. 조산물을 실리카겔에서 크로마토그래피하였다. 에틸 아세테이트/헥산(1:19)으로 용출시켜, 출발물질인 트리플레이트(812mg, 38%)를 무색 오일로서 수득하였고, 이후 원하는 메틸 3-(인단-4-일)아크릴레이트를 갈색 오일(880mg, 54%)로 수득하였다.
실시예 4: 메틸 3- 벤조일신나메이트
3-브로모벤조페논(5.Og, 19mmol), 팔라듐 아세테이트(215mg, 0.958mmol) 및 트리-o-톨릴포스핀(290mg, 0.953mmol) 혼합물에, 트리에틸아민(3.3㎖, 45mmol), 톨루엔(4㎖) 및 메틸 아크릴레이트(2.2㎖, 27mmol)를 첨가하였다. TLC 분석에서 반응이 여전히 미완성인 것으로 나타난 시기인 18시간동안 혼합물을 100℃로 가열하였다. 추가적으로 팔라듐 아세테이트(215mg, 0.958mmol), 트리-o-톨릴포스핀(290mg, 0.953mmol), 트리에틸아민(3.3㎖, 45mmol) 및 메틸 아크릴레이트(2.2㎖, 27mmol)을 첨가하여, 혼합물을 18시간 더 110℃에서 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 혼합물을 물에 부어 에틸 아세테이트로 (3 x 100㎖) 추출하였다. 모은 유기 추출물은 물과 염수로 연속 세정하고, 건조(MgSO4)한 다음 갈색 오일(5.3g)로 농축하였다. 오일을 실리카겔에서 크로마토그래피하였다. 에틸 아세테이트/헥산(1:9)로 용출시켜, 메틸 3-벤조일신나메이트(4.6g, 91%)를 노란색 고형물로 수득하였다.
실시예 5: 3- 벤조일신남산
5M 포타슘 수산화물 수용액(1O㎖, 50mmol)을 메탄올(20㎖) 중의 메틸 3-벤조일신나메이트(2.5g, 9.4mmol) 용액에 첨가하고, 혼합물을 18시간동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 농축시키고, 1M 염산 수용액으로 pH1로 산성화하였다. 수득되는 침전물을 여과로 수집하고, 진공하에 건조하여, 3-벤조일신남산(2.2g, 93%)을 노란색 고형물로 수득하였다.
실시예 6: 5-(1- 메틸 -1H- 피라졸 -4-일)-2- 나프토산
250㎖의 둥근 바닥 플라스크에 있는 5-브로모-2-나프토산(2.12g, 8.44mmol), 1-메틸-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-1H-피라졸(1.84g, 8.86mmol), 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)(502mg, 0.435mmol) 혼합물을 탈기하고, 질소를 (3회) 통기시켰다. 아세토니트릴(40㎖) 및 2M 소듐카보네이트 수용액(10㎖)을 시린지를 통해 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 질소하에서 22시간동안 환류하에 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 1M 염산 수용액(30㎖)을 첨가한 다음, 에틸 아세테이트로 (3 x 50㎖) 추출하였다. 모은 유기층은 건조(MgSO4), 여과 및 진공 농축하여, 조산물(공기 중 건조 후 2.98g)을 수득하였다. 이 조산물을 뜨거운 에탄올(150㎖)에 용해시켜, 뜨거운 상태로 여과하여 노란색의 불순물(120mg)을 제거하였다. 여과물을 진공 농축하고, 잔류물을 디클로로메탄(30㎖)로부터 재결정화하여 5-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)-1-나프토산을 백색 고형물(724mg, 34%)로 수득하였다. 이차 산물, 5-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)-2-나프토산(527mg, 25%)을 디클로로메탄(20㎖)로부터 재결정화함으로써 농축된 모 액체로부터 수득하였다.
실시예 7: 5-(1- 메틸 -1-1H- 피라졸 -4-일)-1- 나프토일구아니딘
질소하에, 옥살릴 클로라이드(1.1㎖, 13mmol)을, 디메틸포름아미드(2 방울)이 첨가된 무수 디클로로메탄(200㎖(용해시키는 반응 동안에 부분 적가됨)) 중의 5-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)-2-나프토산(1.19g, 4.71mmol) 용액에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 4.25시간동안 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 40℃에서 한시간 가열하고, 감압하에 농축시켰다. 수득되는 조산물인 산 클로라이드를 무수 테트라하이드로퓨란(50㎖)에 현탁하고, 이 혼합물을 2M 수산화나트륨(15㎖, 30mmol) 중의 구아니딘 하이드로클로라이드(2.09g, 21.9mmol) 용액에 점적한 다음, 반응 혼합물을 30분간 교반시켰다. 유기상을 분리하고, 수상을 클로로포름(3 x 30㎖)으로, 다음으로 에틸 아세테이트(3 x 30㎖)로 추출하였다. 모은 유기 추출물을 1M 수산화나트륨 수용액(60㎖) 및 물(40㎖)로 연속 세정하고, 건조(Na2SO4) 및 진공 농축하여, 유리같은 고형물(고진공하에서 건조 후 1.45g)을 수득하였다. 이 고형물을 디클로로메탄에 녹이고, 서서히 증발시켜, 5-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)-2-나프토일구아니딘을 노란색 고형물(1.15g, 83%)로 수득하였다.
실시예 8: 에틸 2,3- 메틸렌디옥시신나메이트
0℃, 질소 하에서, 트리에틸 포스포노아세테이트(4.05㎖, 20.2mmol)를, 무수 테트라하이드로퓨란(20㎖) 중에 교반한 소듐 수소화물(0.80g, 20mmol) 현탁액에 점적하였다. 혼합물을 20분간 0℃에서 교반하였다. 테트라하이드로퓨란(10㎖) 중의 2,3-메틸렌디옥시벤즈알데하이드(2.50g, 16.7mmol) 용액을 0℃에서 점적하였다. 혼합물을 실온에서 승온시키는 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물(250㎖)에 부어, 에틸 아세테이트로 (3 x 250㎖) 추출하였다. 모은 유기 추출물을 염수로 세정하고, 건조(MgSO4) 및 진공 농축하였다. 조산물을 실리카겔에서 크로마토그래피하였다. 에틸 아세테이트/헥산(1:10)으로 용출시켜, 에틸 2,3-메틸렌디옥시신나메이트를 무색 고형물(3.50g, 92%)로 수득하였다.
실시예 9: 2,3- 메틸렌디옥시신남산
메탄올(25㎖) 및 물(5㎖) 중의 에틸 2,3-메틸렌디옥시신나메이트(3.40g) 용액을 물(25㎖) 중의 포타슘 수산화물(4.3g) 용액으로 처리하였다. 혼합물을 실온에서 철야 교반하고, 진공 농축하여 부피를 반으로 줄였다. 농축물은 농축 HCl로 산성화하고, 여과로 수집하고, 진공하에 철야 건조하여, 2,3-메틸렌디옥시신남산을 무색 고형물(2.81g, 95%)로 수득하였다.
실시예 10: 2,3- 메틸렌디옥시신나모일구아니딘
옥살릴 클로라이드(0.68㎖, 7.8mmol)를, 디메틸포름아미드 한 방울이 첨가된 디클로로메탄(5㎖) 중의 2,3-메틸렌디옥시신남산(500mg, 2.6mmol) 현탁액에 첨가하였다. 혼합물을 2.5시간동안 교반하고, 수득되는 용액을 증발시켜 감압하에 건조하였다. 잔류물을 건조 테트라하이드로퓨란(5㎖)에 용해시키고, 2M 수산화나트륨 수용액(8㎖) 중의 구아니딘 하이드로클로라이드(1.24g, 13mmol) 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 한시간 교반하고, 클로로포름을 첨가하였다. 생성된 조산물 침전물(100mg)을 여과로 수집하였다. 여과물을 클로로포름(3 x 30㎖) 및 에틸 아세테이트(20㎖)로 추출하였다. 모은 유기 추출물을 2M 수산화나트륨 수용액(20㎖), 물(20㎖)로 세정하고, 건조(Na2SO4) 및 감압 농축하여, 추가로 다량의 조산물(400mg)을 수득하였다. 조산물의 2가지 수확물을 모아 클로로포름(10㎖)에 현탁하고 20분간 왕성하게 교반하였다. 수득되는 2,3-메틸렌디옥시신나모일구아니딘(420mg)을 여과 및 진공 건조에 의해 수득하였다.
실시예 11: 박테리아 바이오분석 방법을 이용한 화합물의 항바이러스 활성
여러가지 바이러스 표적에 대한 화합물의 항바이러스 활성을 테스트하기 위해 본 실시예에 사용되는 박테리아 바이오분석 방법은, PCT/AU2004/000866에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다. 본 분석을 하기 GBV-B 및 BVDV 분석과 함께 사용하여, 모든 활성 화합물들이 일부는 한가지 또는 다른 분석에서 활성이고, 일부 화합물들이 2가지 분석에서 활성일 수 있음을, 확인한다.
간략하게는, 잠재적인 항-HCV 화합물을 스크리닝하기 위한 박테리아 바이오분석은 HCV p7 이온 채널 단백질을 기초로 한다. p7은 HCV에 의해 코딩되는 작은 막 단백질로서, 바이러스의 증식 및/또는 복제를 뒷받침하는 기능적 활성을 가진다.
p7을 코딩하는 합성 cDNA 단편이며 E. coli에서의 p7의 발현용으로 코돈이 최적화된 cDp7.coli를, PCT/2004/000866에 상세히 기술된 바와 같이, 발현 벡터 pPL451에 클로닝하여, p7의 발현이 온도에 의해 유도되는 pPLp7을 제조하였다. 37℃에서 p7을 발현하는 E.coli 세포의 증식의 저해는, 박테리아 세포에 의해 유지되는 정상적인 Na+ 농도 구배를 없애는 p7 이온 채널 기능의 인디케이터로서 관찰하였다. 특정 화합물을 적용한 부위의 주변의 할로(halo) 형성은, 화합물 부재시 증식을 방지하는 p7 이온 채널 활성의 발현을 화합물이 저해함을 의미한다.
일정 시간 동안 수득하고 평균화한 박테리아 바이오분석 테스트의 누적 결과는 하기 표 1에 개괄되어 있다.
본 발명의 화합물에 대한 박테리아 바이오분석의 평균값
화합물 명칭 BIT # 박테리아 분석의 평균값
HCV p7
(3-벤조일)신나모일구아니딘 216 1.3
2,3-메틸렌디옥시신나모일 구아니딘 217 1.0
5-메틸-2-나프토일구아니딘 218 1.7
3(인단-4-일)-프로페노일구아니딘 222 2.0
5-브로모-6-메톡시-2-나프토일구아니딘 223 0.5
5-티오펜-3-일-2-나프토일구아니딘 224 1.10
5-(1-메틸피라졸-4-일)2-나프토일구아니딘 225 1.20
3,4-디클로로신나모일 구아니딘 300 1.12
(1-메톡시-2-나프토일)구아니딘 301 0.25
(3-메톡시-2-나프토일)구아니딘 302 0.76
(5-브로모-2-나프토일)구아니딘 303 0.62
(1,4-디메톡시--2-나프토일)구아니딘 304 0.60
(6-(3-티에닐)-2-나프토일)구아니딘 305 0.08
(6-메틸-2-나프토일)구아니딘 306 0.07
(5-페닐-2-나프토일)구아니딘 307 0.46
(5-(티엔-2-일)-2-나프토일)구아니딘 308 0.55
(5-(1-이소부틸-1H-피라졸-4-일)-2-나프토일)구아니딘 310 0.36
(5-(3-퓨릴)-2-나프토일)구아니딘 311 0.81
(5-사이클로프로필-2-나프토일)구아니딘 312 1.00
(5-클로로-2-나프토일)구아니딘 313 1.30
(6-(1-메틸피라졸-4-일)-2-나프토일)구아니디늄 acetate 314 4.03
(5-(2,6-디메톡시피리딘-3-일)-2-나프토일)구아니딘 315 0.20
(5-(2-클로로페닐)-2-나프토일)구아니딘 316 0.37
(5-(4-(아세틸아미노)페닐)-2-나프토일)구아니딘 317 0.06
(5-(3-(아세틸아미노)페닐)-2-나프토일)구아니딘 318 0.73
(5-(4-((메틸설포닐)amino)페닐)-2-나프토일)구아니딘 319 0.10
분석의 양성 대조군
(3-브로모신나모일)구아니딘 BIT067 2.00
5-브로모-2-플루오로신나모일구아니딘 BIT124 2.70
양성 대조군을 본 분석에 사용하여, 화합물의 상대적인 활성을 비교하기 보다는 분석이 작동한다는 것을 확인하였다. 상기 결과에서 0은 화합물이 잠재적인 항바이러스 활성을 가짐을 의미한다.
실시예 12 - C형 간염 바이러스에 대한 p7 저해제 테스트
신규한 잠재적인 HCV 약물의 항바이러스 효능 테스트는 HCV에 대한 일반적으로 이용가능한 세포 배양 모델 시스템이 없어 어렵다. 제안된 p7 저해제는 써로게이트(surrogate) 플라비바이러스 시스템, 특히 GBV-B 및 BVDV (Bovine Viral Diarrhoea Virus) 시스템을 이용하여 테스트하였다.
GBV-B는 HCV에 가장 근접한 플라비바이러스로서, 폴리펩타이드 서열 전체에 대한 뉴클레오티드 서열 동일성은 27-33%이고 아미노산 유사성은 28%를 공유하고 있다. 이 바이러스는 작은 신세계 영장류에 감염하고 일차 마모셋 간세포(PMH) 배양물에서 효과적으로 시험관내 복제하기 때문에, HCV에 대한 탁월한 시스템이다. HCV p7의 GBV-B 상동체는 p13이다. p13의 2종의 C-말단 트랜스막 나선에 해당되는 합성 펩타이드(p7과 가장 높은 상동성을 공유함)는 p7 채널과 같이 아만타딘에 의해 차단되는 양이온 선택적인 이온 채널을 형성한다(Premkumar et al., 2006). 반면에, HMA는 p7와를 다르게, p13 채널을 저해하지 않는다. 이러한 결과는, 2종의 상동성 채널들이 비슷하지만 동일하진 않은 구조적 특징을 공유하고 있음을 나타낸다.
선택된 BIT 화합물 - HCV p7의 저해제에 대한 박테리아 분석 스크리닝에 의해 동정됨 -을 일차 마모셋 간세포에서의 GBV-B 복제를 저해하는 능력을 테스트하였다(도 1 참조). 간세포를 10x TCID50의 GBV-B 양성 마모셋 혈청과 함께 도말한 후 3일째에 접종하였다. HCV를 2시간 흡수시킨 다음, 세포를 3번 헹구고, 2일간 호르몬과 성장 인자가 첨가된 신선한 무혈청 배지(SFM)에서 배양하였다. 배양 상층물에 방출된 바이러스는, 실시간 RT-PCR로 측정되는 바이러스 RNA 카피 수로서 측정하였다. 화합물 - DMSO에 용해된 - 을 바이러스 접종하기 30분 전에("처리전") 또는 접종 및 세정 단계 후("처리후")에 즉시 배지에 첨가하였다. 무처리, 음성(DMSO 단독) 및 양성(10㎍/ml Poly I:C) 대조군을 실험에 포함시켰다. 간세포에 대한 화합물의 세포 독성을 표준적인 MTT 분석으로 테스트하였다.
가장 놀라운 결과는 20μM BIT225로 미리 처리한 세포에서 나타났는데, 바이러스는 배양 상층물에서 검출되지 않았다. 20μM BIT225는 바이러스 복제를 >1.0 log으로 감소시켰으며, poly I:C 양성 대조군 보다 더욱 강하게 바이러스를 저해하였다. BIT225와 BIT100 두가지의 효능은 화합물을 접종 후 첨가하였을 때 어느 정도 감소되었는데, 이는 화합물이 바이러스 생활 주기의 매우 초기 단계에 작용할 수 있음을 시사한다. 도 1에서, 화합물들은 모두 20μM에서는 간세포에 세포독성을 나타내지 않았다.
BVDV는 플라비비리대의 페스티바이러스 속에 속하며, 게놈 구조, 유전자 산물 및 복제 사이클 등의 많은 유사성으로 인해 잠재적인 HCV 항바이러스 제제를 동정하기 위한 써로게이트 모델 시스템으로서 널리 사용되고 있다. 또한, 일차 간세포에서만 배양할 수 있는 GBV-B와는 다르게, BVDV는 조직 배양에서 쉽게 증식하며, 통상적으로 사용되는 균주는 세포변성 균주이므로, 항바이러스 약물을 쉽게 테스트할 수 있다. BVDV의 HCV p7 상동체는 이온 채널을 형성하고, 감염성 바이러스 입자 제조에 필수적인 것으로 확인되었다(Harada et al., 2000 and Griffin et al., 2005).
선택한 BIT 화합물의 BVDV에 대한 항바이러스 평가는 SRI(Southern Research Institute, Fredrick MD USA)에서 외주사에서 수행하였다. 화합물의 항바이러스 효과를 Madin-Darby 소 신장 세포에서 BVDV 감염의 세포변성 효과를 감소시키는 능력에 의해 평가하는, 간단한 세포보호 포멧을 사용한다(Buckwold et al ., 2003).
바이러스-유도성 세포변성 효과(CPE)-저해 분석 방법을 사용하여, 소 바이러스 설사 바이러스(BVDV) 균주 NADL에 대한 항바이러스 활성에 대해 화합물을 T-75 플라스크에서 계대 배양한 Madin-Darby 소 신장(MDBK) 세포에서 평가하였다(1, 2). 챌린지 바이러스에 대해 3세트로 각 화합물의 1/2-log 농도 6가지를 테스트하는 항바이러스 분석을 설계하였다. 배지만 포함하는 세포 대조군(CC), 배지 및 바이러스를 포함하는 바이러스-감염된 세포 대조군(VC), 배지 및 각 약물 농도를 포함하는 약물 새포독성 대조군, 배양 배지 단독이 포함된 시약 대조군(세포 없음), 및 약물과 배지를 포함하는 약물 비색 대조군(세포 없음)을 테스트 샘플과 함께 사용한다. 인간 인터페론-α 2b를 양성 대조군으로 사용하였다. 분석 전날, 세포를 트립신 처리하고, 펠릿화한 다음, 계수하여, 평평한 바닥의 96웰 조직 배양 플레이트에 웰 당 100 ㎕ 부피의 조직 배양 배지에 1x104/웰로 재현탁하였다. 세포를 접종한 다음날, 웰을 헹구고, 배지에 1/2 시리즈로 희석된 다양한 농도의 테스트 화합물이 포함된 완전 배지(2% 혈청)으로 배지를 교체하였다. 각각의 실험 바로 전에 역가 측정하기 전의 바이러스 분액(pre-titered aliquot)을 냉동기(-80℃)에서 취하였다. 바이러스는, 각 웰에 첨가한 바이러스의 양이 감염 후 6-7일에 세포를 완전히 사멸시키도록 조직 배양 배지에 희석하였다. 플레이트는, 무처리 바이러스 대조군 배양물에서 최대 CPE가 관찰될 때까지(~7일) 5% CO2의 습윤 대기하 37℃에서 인큐베이션하였다. 화합물에 의한 CPE 저해는, 세포 타이터 96(Promega)을 이용하여 측정하였다. 살아있는 세포의 수를 측정하기 위한 비색 방법을 사용하였다. 컴퓨터 프로그램을 활용하여, 바이러스-감염된 웰의 CPR 감소%와 무감염 약물 대조군 웰의 세포 생존력%를 계산하였다. CPE를 50% (IC50)까지 감소시키는 최대 저해 약물 농도와 살아있는 세포를 50% (TC50)까지 감소시키는 최소 독성 약물 농도를, 회귀 분석 프로그램을 이용하여 계산하고, 세미 로그 곡선을 구하였다. 각 활성 화합물의 치료(선택성) 인덱스(TI50)는, TC50를 IC50으로 나누어 구하였다.
약물 세포독성은 무감염 세포에서 별도로 측정하였다. 17개의 BIT 화합물을 1차 실험에서 테스트하였는데, 이때 화합물은 감염시키기 바로 전에 세포에 첨가하였고, 실험 기간 동안에 유지시켰다. 이들 화합물들 중 2종, BIT225와 BIT314는 IC50 값이 μM 이하의 수준이었다(하기 표 2 참조).
MDBK 세포에서의 항바이러스 효과 vs . BVDV
화합물 IC 50 TC 50 AI
BIT-225 0.53 μM 11.6 μM 21.7
BIT-300 N/A 3.69 μM N/A
BIT-124 N/A 5.21 μM N/A
BIT-33 3.64 μM 25.2 μM 6.91
BIT-143 4.66 μM 17.0 μM 3.65
BIT-93 16.7 μM >30.0 μM >1.80
BIT-123 N/A 9.92 μM N/A
BIT-137 N/A 16.5 μM N/A
BIT-110 N/A 16.8 μM N/A
BIT-314 0.21 μM 11.6 μM 54.2
BIT-223 4.38 μM >30.0 μM >6.85
IFN-α 20.6 IU/mL >500 IU/mL >24.3
N/A = 검출되지 않음
이후의 반복적인 BIT225 분석에서, IC50 수치는 0.33μM으로 되돌아갔다. 본 발명의 다른 화합물도 테스트하였고, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
BIT# BVDV IC 50 uM
BIT314 0.39
BIT313 9.64
BIT225 1.27
BIT312 8.63
BIT311 2.96
BIT302 7.21
BIT318 >20
BIT306 14.5
BIT303 13.6
BIT304 >20
BIT317 6.02
BIT308 8.73
BIT307 1.99
BIT316 >20
BIT310 >20
BIT301 >20
BIT315 >20
BIT319 >20
BIT305 >20
BIT309 >20
실시예 13 - BIT225 와 IFN 또는 리바비린의 조합을 이용한 HCV 의 저해
BIT225/IFN 조합 및 BIT225/리바비린 조합을 바이러스에 대해 테스트하였다. 도 2, 3 및 4는 각각의 약물이 다음과 같은 EC50 수치를 보였음을 나타낸다: BIT225, 314nM; rIFNα-2b, 21.7 IU/ml; 그러나, 리바비린 그 자체는 최대 20㎍/ml의 범위까지에서도 거의 항바이러스 활성이 검출되지 않았다.
약물의 조합 효과를 단독 테스트하였을 때 각각의 화합물의 활성에 대해 계산하였다. 예상되는 상가적인(additive) 항바이러스 보호는 각각의 조합 농도에서 실험에 의해 측정한 항바이러스 활성에서 제거하여, +값(상승작용), -값(길항작용) 또는 0(상가작용)으로 나타내었다. 상승 작용의 수준(농도 x 농도 x %, 예컨대 μM2%, nM2%, nMμM% 등의 단위)을 95% 신뢰 구간에서 계산하였다. 이러한 연구에서, 상승 작용은 상승 수준이 50 보다 높은 약물의 조합으로 정하였다. 경도의 상승적인 활성과 높은 상승적인 활성은 상승 수준이 각각 50-100 및 >100인 것으로 기능적으로 정의하였다. 상가적인 약물 상호작용은 상승 수준이 -50 내지 50 범위이고, 상승 수준 -50 내지 -100은 약한 길항 효과이고, < -100은 높은 길항 효과로 간주된다.
표 4는 조합 연구의 결과를 개괄한 것으로, BIT225 및 IFN의 평균 상승 수준은 87 IU/mlμM%으로, 이 수치는 "높은 상승 작용" 컷-오프에 가깝고 3번의 실험 중에서 1번의 실험에서 높은 상승 작용을 보이는 것으로 확인되었지만, 이는 경도의 상승 작용을 보임을 나타낸다. 흥미롭게도, BIT225/리바비린 조합은 경도의 길항 작용을 보였다. 이러한 실험에서, 리바비린 자체는 항바이러스 활성이 없었지만, 실험의 결과는 리바비린이 BIT225의 강한 항바이러스 활성을 길항하였다는 것을 의미한다.
여러가지 항바이러스 화합물의 조합들 간의 상승 작용 정도를 "등급화"하는 시도가 있었지만, 용어 "상승 작용"은 또한 통상적으로 절대적인 의미로 사용되어, 임의의 상승 작용 수준이 본 발명의 조합에 대해 상대적이고 유의한 것으로 간주되는 것으로 이해될 것이다.
BVDV 조합 분석
화합물 조합 계획
BIT225 & rIFNα-2b BIT225 2-배 희석물 8종; 고농도 테스트, 4μM
BIT225 & 리바비린 BIT225 2-배 희석물 8종; 고농도 테스트, 4μM
리바비린 2-배 희석물 5종; 고농도 테스트, 20㎍/mL
분석 항바이러스 효과 세포독성
상승/길항 해석 상승/길항 해석
BIT225 & rIFN
α-2b; 1st		 72/ -2 IU/mLμM% 경도의 상승작용 3 / -2 IU/mLμM% 상가작용
BIT225 & rIFN
α-2b; 2nd		 106 / 0 IU/mLμM% 높은 상승작용 0 / -10 IU/mLμM% 상가작용
BIT225 & rIFN
α-2b; 3rd		 84 / 0 IU/mLμM% 경도의 상승작용 0 / -9 IU/mLμM% 상가작용
BIT225 & rIFN
α-2b; avg		 87 / -1 IU/mL μM% 경도의 상승작용 1 / -7 IU/mLμM% 상가작용
BIT225 &
리바비린; 1st		 4 / -62 ㎍/mLμM% 경도의 길항효과 4 / -7 ㎍/mLμM% 상가작용
BIT225 &
리바비린; 2nd		 0 / -89 경도의 길항효과 0 / -6 ㎍/mLμM% 상가작용
BIT225 &
리바비린; 3rd		 0 / -65 경도의 길항효과 3 / 0 ㎍/mLμM% 상가작용
BIT225 &
리바비린; avg		 1 / -72 ㎍/mL μM% 경도의 길항효과 2 / -4 ㎍/mLμM% 상가작용
실시예 14 - BIT225 , IFN 및 리바비린의 조합을 이용한 HCV 의 저해
상기 조합 연구 결과를 통해, BIT22와 IFNα의 항바이러스 활성 간의 상승 작용이 확인되었다. 또한, 리바비린은 그 자체는 BVDV에 대한 활성이 거의 없지만(도 4), 화합물은 IFNα의 항바이러스 활성을 증강시킨다는 것은 문헌에 잘 알려져 있다. 흥미롭게도, 리바비린과 BIT225 사이의 경도의 길항 효과가 보고되었지만(표 4 참조), 이는 테스트한 2가지 약물의 농도가 더 높을 때 우세하게 나타났다.
BIT225, IFNα 및 리바비린의 조합 효과를 테스트하였다. IFNα를 2가지 고정한 서브 EC50 농도 (5 및 10 IU/ml)로 선택하여, 다양한 농도의 BIT225 및 리바비린에 대해 테스트하였다: 고-테스트 농도 4μM에서 BIT225 2배 희석물 8종 및 고-테스트 농도 20㎍/ml에서 BIT225 2배 희석물 5종. 표 5에 나타낸 결과는, 테스트한 고정한 2가지 농도에서 IFNαBIT225와 리바비린 간에 높은 상승적인 항바이러스 활성을 나타낸다.
화합물 조합 게획
고정 농도의 rIFNα-2b(5 IU/mL)를 다양한 함량의 BIT-225 & 리바비린과 조합 rIFNα-2b 고정 농도(5 IU/mL);
리바비린 2배 희석물 5종; 테스트 고농도 20㎍/mL;
BIT225 2배 희석물 8종; 테스트 고농도 4μM
고정 농도의 rIFNα-2b(10 IU/mL)를 다양한 함량의 BIT-225 & 리바비린과 조합 rIFNα-2b 고정 농도(10 IU/mL);
리바비린 2배 희석물 5종; 테스트 고농도 20㎍/mL;
BIT225 2배 희석물 8종; 테스트 고농도 4μM
항바이러스 효과 세포독성
분석 상승/길항 해석 상승/길항 해석
고정 농도의 rIFNα-2b(5 IU/mL)를 다양한 함량의 BIT-225 & 리바비린과 조합 138 / 0 ㎍/mLμM% 높은 상승작용 0 / -59 ㎍/mLμM% 경도의 길항작용
고정 농도의 rIFNα-2b(10 IU/mL)를 다양한 함량의 BIT-225 & 리바비린과 조합 127 / 0 ㎍/mLμM% 높은 상승작용 0 / -67 ㎍/mLμM% 경도의 길항작용
데이타의 추가적인 분석을 통해, 5 IU/ml IFNα + 테스트한 최저 농도의 BIT225(31nM), + 테스트한 최저 농도의 리바비린(1.25 ㎍/ml)의 조합의 바이러스 CPE 저해율이 70%인 것을 나타났다. 10 IU IFNα의 존재 하의 동일한 저농도의 BIT225 및 리바비린의 바이러스 저해율은 90%이었다. 비교를 위해, 먼저 실시한 연구에서 5 IU/ml IFNα 단독시에는 저해율 ~8%이었고, 31 nM BIT225 단독의 저해율은 ~5%이고, 1.25㎍/ml 리바비린 단독의 저해율은 항바이러스 활성이 없었다. 3가지 성분의 조합은 BVDV에 대해 매우 명백하게 효과적이었다.
도 5는 IFNα의 존재 또는 부재하의, 31nM BIT225 및/또는 1.25㎍ 리바비린에서 관찰되는 바이러스 저해율을 나타낸 것이다.
도 6은 5 및 10 IU/m IFNα의 존재 하의 BIT225의 전범위에서의 농도 반응 그래프로서, 1.25 ㎍/ml 첨가시 증강된 항바이러스 효과를 보였다. 삽입된 그래프는, 5 및 10 IU/m IFNα의 존재 하의 리바비린의 전범위에서의 농도 반응 그래프이다.
5 또는 10 IU/ml IFNα의 존재 하의 BIT225의 EC50 값은 프리즘 소프트웨어를 이용하여 Hill 기울기로 수행한 표준 시그모이드 곡선 피팅에 의해, 각각 92(95% CI: 22 - 385) nM 및 71(95% CI: 41 - 1240) nM으로 측정되었다. 가변성의 Hill 기울기를 허용하는 유사한 곡선 피팅에서 등가의 EC50 수치는 149 및 125 nM로 측정되었는데, 이는 이전 실험에서 측정된 수치와 충분히 일치되었다.
리바비린을 처가한 실험의 데이타에서는 EC50 수치를 구할 수 없었는데, 그 이유는 테스트한 모든 약물 조합의 바이러스 CPE 저해율이 >70%였기 때문이다.
요약
화합물 BIT225를 이용한 조합 연구에서 하기와 같은 결과가 확인되었다:
- BIT225 단독으로도 우수한 항바이러스 활성을 보이며, EC50 수치는 314nM임 (95% CI: 295-333).
- BIT225는 IFNα와 조합시 상승 작용을 나타내며; 5 IU/ml IFNα존재 시의 BIT225의 EC50 수치는 ~92nM로 낮음 (95% CI: 22 - 385).
- BIT225, IFNα 및 리바비린의 3가지 성분의 조합은 강한 상승 작용을 보이며, 31nM BIT225, 5 IU/m IFNα 및 1.25㎍/ml 리바비린의 낮은 수준에서의 바이러스 CPE 저해율은 70%임.
- 바이러스의 완전 저해는 3가지 성분을 다양한 조합으로 사용하여 달성할 수 있으며, 예로, 5 IU/ml IFNα + 500nM BIT225 + 2.5㎍/ml 리바비린, 또는 10 IU/ml IFNα + 31nM BIT225 + 2.5㎍/ml 리바비린임.
실시예 15 - BIT 225와 뉴클레오시드 유사체 2'-C- 메틸아데노신 또는 2'-C- 메틸시티딘 조합을 이용한 HCV 의 저해
본 발명의 뉴클레오시드 유사체는 Hecker SJ et al (2007) J. Med Chem. 50(16), 3891-6 (2'-C-메틸아데노신의 경우 및 Antiviral Research (2007) 73(3), 161-8 (2'-C-메틸시티딘의 경우)에 기술된 프로토콜을 이용하여 합성할 수 있다. 뉴클레오시드 유사체는 NANJING BAIFULI TECHNOLOGY CO., LTD.(NAN JING BAI FU LI KE JI YOU XIAN ZE REN GONG SI), RM 701 , BLDG 15, High-Tech Zone, Nanjing, 210061, P.R.CHINA와 같은 상업적인 제공사로부터 구입할 수 있다.
BVDV 조합 분석
화합물 조합 계획
BIT225 & 2'-C-메틸아데노신 BIT225 2배 희석물 8종; 테스트 고농도 4μM
2'-C-메틸아데노신 2배 희석물 5종; 테스트 고농도 10μM
BIT225 & 2'-C-메틸시티딘 BIT225 2배 희석물 8종; 테스트 고농도 4μM
2'-C-메틸시티딘 2배 희석물 5종; 테스트 고농도 10μM
BIT314 & rIFNα-2b BIT314 2배 희석물 8종; 테스트 고농도 4μM
rIFNα 2배 희석물 5종; 테스트 고농도 80IU/mL
고정 농도의 rIFNα-2b(5 IU/mL)를 다양한 함량의 BIT-314 & 리바비린과 조합 rIFNα-2b 고정 농도(5 IU/mL);
BIT314 2배 희석물 8종; 테스트 고농도 4μM;
리바비린 2배 희석물 5종; 테스트 고농도 20㎍/mL;
항바이러스 효과 세포독성
분석 상승/길항 해석 상승/길항 해석
BIT225 & 2'-C-메틸아데노신 106.62/-3.41 μM2% 높은 상승작용 1.91/ -53.29 μM2% 경도의 길항작용
BIT225 & 2'-C-메틸시티딘 71.23/0 μM2% 경도의 상승작용 0/-18.31μM2% 상가작용
BIT314 & rIFNα-2b 311.42 /-2.11 μMIU/mL% 높은 상승작용 0/-1.84μMIU/mL% 상가작용
고정 농도의 rIFNα-2b(5 IU/mL)를 다양한 함량의 BIT-314 & 리바비린과 조합 361.68/-12.19 μM㎍/mL% 높은 상승작용 22.65/-0.34 μMug/mL% 상가작용
상기 표 6은 화합물 BIT225와 뉴클레오시드 유사체, 및 화합물 BIT314와 IFN 및/또는 리바비린의 조합 연구의 결과를 나타낸다.
본원에서 언급된 바와 같이, BIT225/2'-C-메틸아데노신 및 BIT225/2'-C-메틸시티딘의 조합을 바이러스에 대해 테스트하였다. 도 7은 각각의 뉴클레오시드 유사체가 각각 활성이며, EC50 수치는 다음과 같다: 2'-C-메틸아데노신 EC50 = 2.16 μM (95% CI: 1.54 - 3.03 μM); 2'-C-메틸시티딘 EC50 = 2.75 μM (95% CI: 0.86 - 8.7 μM).
앞서와 같이, 약물 조합물의 효과를 각 화합물을 단독으로 테스트하였을 때의 활성으로 계산하였다. 예상되는 상가적인 항바이러스 예방은 양성 수치(상승), 음성 수치(길항) 또는 0(상가)으로 나타나는, 각각의 조합 농도에서의 실험으로 측정한 항바이러스 활성으로부터 추출하였다. 상승 수준(농도 x 농도 x %, 예컨대 μM2%, nM2%, nMμM% 등의 단위)을 95% 신뢰 구간에서 계산하였다. 이러한 연구에서, 상승작용은 상승 수준이 50 보다 높은 약물의 조합으로 정하였다. 약간의 상승적인 활성과 높은 상승적인 활성은 상승 수준이 각각 50-100 및 >100인 것으로 기능적으로 정의하였다. 상가적인 약물 상호작용은 상승 수준이 -50 내지 50 범위이고, 상승 수준 -50 내지 -100은 약한 길항 효과이고, < -100은 높은 길항 효과로 간주된다.
표 6은 조합 연구의 결과를 종합한다: BIT225 및 2'-C-메틸아데노신은 106 μM2%의 상승 작용 수준으로 나타내었으며 이는 "높은" 상승 작용을 의미하며, BIT225 및 2'-C-메틸시티딘의 평균 상승 작용 수준은 71 μM2%로 나타났으며, 이는 "경도의" 상승 작용을 보임을 의미한다.
도 8과 9는 다양한 농도의 2'-C-메틸아데노신 또는 2'-C-메틸시티딘의 각각의 존재 하의 BIT225의 농도 반응 곡선 변화를 나타낸다.
실시예 16 - BIT314 와 IFN 의 조합을 이용한 HCV 의 저해
BIT314/IFN 조합을 바이러스에 대해 테스트하였다. BVDV에 대해 개별적으로 테스트한 BIT314를 이용한 2번의 이전 실험에서, EC50 수치는 210nM 및 390nM (평균 = 300nM)이었다. 이와 유사하게, 그 전에 rIFNα-2b를 테스트하여 그 EC50 수치가 21.7 IU/ml임을 확인하였다. 도 10은 3번째 실험에서 측정되는 BIT314의 농도 반응 곡선으로, 이는 이러한 조합 연구의 일부분이었다. 실험에서, BIT314의 EC50 수치는 540 nM이었다.
이전과 같이, 약물 조합의 효과를 실시예 15에서와 같이 각각의 화합물을 단독으로 테스트한 활성에서 계산하였다. 표 6는 조합 연구의 결과를 종합한 것으로, BIT314 및 IFN의 평균 상승 작용 수준은 311 μMIU/ml%이며, 이는 "높은" 상승 작용을 보임을 의미한다.
실시예 17 - BIT314 , IFN 및 리바비린의 3성분 조합을 이용한 HCV 의 저해
상기 조합 연구의 결과를 통해, BIT314 및 IFNα의 항바이러스 활성 사이에 강력한 상승 작용이 확인되었다. 또한, 리바비린은 그 자체가 BVDV에 대해 거의 활성이 없었지만(도 4 참조), 화합물은 IFNα의 항바이러스 활성을 증강시킨다는 것은 문헌을 통해 잘 알려져 있다.
BIT314, IFNα 및 리바비린의 조합 효과를 테스트하였다. 한가지의 고정된- sub EC50 - IFNα 농도(5 IU/ml)를 선정하여, 다양한 농도의 BIT314 및 리바비린에 대해 테스트하였다: 고-테스트 농도 4μM에서 BIT314 2배 희석물 8종 및 고-테스트 농도 20㎍/ml에서 리바비린 2배 희석물 5종. 표 5에 나타낸 결과는, 테스트한 고정한 2가지 농도에서 IFNαBIT225와 리바비린 간의 높은 상승적인 항바이러스 활성을 나타낸다. 그 결과는 표 X에 종합되어 있으며, IFNα의 존재 하의 BIT314 및 리바비린 사이의 높은 상승적인 항바이러스 활성이 나타났으며, 상승/길항 수준은 361 μM㎍/ml%였다.
도 10은 임의의 다양한 농도의 rIFNα-2b 존재 하의 BIT314의 전범위 농도 반응 곡선이고, 도 11은 5 IU/m IFNα + 1.25 ㎍/ml 리바비린 및 5 IU/m IFNα + 2.5 ㎍/ml 리바비린의 첨가에 의한 증강된 항바이러스 활성을 나타낸 것이다. 본 실험에서, BIT314 단독의 EC50 수치는, 프리즘 소프트웨어로 수행한 표준 시그모이드 커브 피팅을 수행하여 결정한 결과, 540 nM (95% CI: 389 - 739 nM)이었고, 5 IU/ml IFNα + 1.25 ㎍/ml 리바비린은 183 nM (95% CI: 148 - 226 nM)이었다.
요약
화합물 BIT314를 이용한 조합 연구에서 하기와 같은 결과가 확인되었다:
- BIT314 단독으로도 우수한 항바이러스 활성을 보이며, EC50 수치는 380nM임 (SEM 95.4, n=3).
- BIT314는 IFNα와 조합시 상승 작용을 보이며; 40 IU/ml IFNα존재 시의 BIT314의 EC50 수치는 약 60nM로 낮아짐.
- BIT314, IFNα 및 리바비린의 3가지 성분의 조합은 강한 상승 작용을 보이며, 62nM BIT314, 5 IU/m IFNα 및 2.5㎍/ml 리바비린의 낮은 수준에서의 바이러스 CPE 저해율은 70%이임.
- 바이러스의 완전 저해는 3가지 성분을 다양한 조합으로 사용하여 달성할 수 있으며, 예로, 5 IU/ml IFNα + 250nM BIT314 + 2.5㎍/ml 리바비린, 또는 5 IU/ml IFNα + 500nM BIT314 + 1.25㎍/ml 리바비린.
본 발명은 구체적인 예를 들어 설명되지만, 본 발명의 원칙 및 사상을 유지하는 변형 및 수정 또한 포함되는 것으로 이해될 것이다.
참조문헌
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Claims (27)

  1. 5-(1-메틸피라졸-4-일)2-나프토일구아니딘 및 IFNα-2b;
    5-(1-메틸피라졸-4-일)2-나프토일구아니딘, IFNα-2b 및 리바비린;
    (6-(1-메틸피라졸-4-일)-2-나프토일)구아니딘 및 IFNα-2b;
    (6-(1-메틸피라졸-4-일)-2-나프토일)구아니딘, IFNα-2b 및 리바비린;
    5-(1-메틸피라졸-4-일)2-나프토일구아니딘 및 2'-C-메틸아데노신; 또는
    5-(1-메틸피라졸-4-일)2-나프토일구아니딘 및 2'-C-메틸시티딘
    을 포함하는, HCV에 노출되었거나 감염된 개체를 치료 또는 예방하기 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물의 개별 성분들은 동시에 투여되는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물의 개별 성분들은 순차적인 방식 또는 임의 순서로 개별 투여되는 조성물.
  4. 5-(1-메틸피라졸-4-일)2-나프토일구아니딘 및 IFNα-2b;
    5-(1-메틸피라졸-4-일)2-나프토일구아니딘, IFNα-2b 및 리바비린;
    (6-(1-메틸피라졸-4-일)-2-나프토일)구아니딘 및 IFNα-2b;
    (6-(1-메틸피라졸-4-일)-2-나프토일)구아니딘, IFNα-2b 및 리바비린;
    5-(1-메틸피라졸-4-일)2-나프토일구아니딘 및 2'-C-메틸아데노신; 또는
    5-(1-메틸피라졸-4-일)2-나프토일구아니딘 및 2'-C-메틸시티딘
    을 포함하는, HCV의 증식 또는 복제를 감소, 지연 또는 저해하기 위한 조성물.
  5. 5-(1-메틸피라졸-4-일)2-나프토일구아니딘 및 IFNα-2b;
    5-(1-메틸피라졸-4-일)2-나프토일구아니딘, IFNα-2b 및 리바비린;
    (6-(1-메틸피라졸-4-일)-2-나프토일)구아니딘 및 IFNα-2b;
    (6-(1-메틸피라졸-4-일)-2-나프토일)구아니딘, IFNα-2b 및 리바비린;
    5-(1-메틸피라졸-4-일)2-나프토일구아니딘 및 2'-C-메틸아데노신; 또는
    5-(1-메틸피라졸-4-일)2-나프토일구아니딘 및 2'-C-메틸시티딘
    을 포함하는, HCV에 노출된 세포의 감염을 예방하기 위한 조성물.
  6. 5-(1-메틸피라졸-4-일)2-나프토일구아니딘 및 IFNα-2b;
    5-(1-메틸피라졸-4-일)2-나프토일구아니딘, IFNα-2b 및 리바비린;
    (6-(1-메틸피라졸-4-일)-2-나프토일)구아니딘 및 IFNα-2b;
    (6-(1-메틸피라졸-4-일)-2-나프토일)구아니딘, IFNα-2b 및 리바비린;
    5-(1-메틸피라졸-4-일)2-나프토일구아니딘 및 2'-C-메틸아데노신; 또는
    5-(1-메틸피라졸-4-일)2-나프토일구아니딘 및 2'-C-메틸시티딘
    을 포함하는, C형 간염을 치료하기 위한 조성물.
  7. 5-(1-메틸피라졸-4-일)2-나프토일구아니딘 및 IFNα-2b;
    5-(1-메틸피라졸-4-일)2-나프토일구아니딘, IFNα-2b 및 리바비린;
    (6-(1-메틸피라졸-4-일)-2-나프토일)구아니딘 및 IFNα-2b;
    (6-(1-메틸피라졸-4-일)-2-나프토일)구아니딘, IFNα-2b 및 리바비린;
    5-(1-메틸피라졸-4-일)2-나프토일구아니딘 및 2'-C-메틸아데노신; 또는
    5-(1-메틸피라졸-4-일)2-나프토일구아니딘 및 2'-C-메틸시티딘
    을 포함하는, HCV p7 단백질을 저해하여 C형 간염을 치료하기 위한 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 정맥내(iv), 복막내, 피하, 두개내, 진피내, 근육내, 안구내, 경막내(intrathecal), 뇌내, 비내, 경점막으로, 또는 경구나 직장 주입(infusion)에 의해, iv 점적, 패치 또는 임플란트를 통해 투여되는 조성물.
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