BRPI0814737B1 - Composição para o tratamento de hcv, e, uso de uma composição - Google Patents

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Gary Dinneen Ewart
Carolyn Anne Luscombe
Michelle Miller
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Abstract

composição para o tratamento de hcv, e, uso de uma composição a presente invenção refere-se a novas composições tendo atividade antiviral e em particular ela refere-se a composições sinérgicas ativas contra o vírus de hepatite c (hcv). a invenção também se refere a métodos para retardar, reduzir ou de um outro modo inibir o crescimento de hcv el ou a atividade funcional.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a novas composições tendo atividade contra o vírus de Hepatite C (HCV). A invenção também se refere a métodos para o retardo, a redução ou de um outro modo a inibição do crescimento de HCV e/ ou a atividade funcional.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002] Qualquer discussão da arte antecedente em todo o relatório não deve, de modo algum, ser considerada como uma admissão de que tal arte anterior seja amplamente conhecida ou faça parte do conhecimento geral comum no campo.
[003] Correntemente, existe uma grande necessidade quanto ao desenvolvimento de novos tratamentos, que sejam eficazes contra infeções virais, em particular contra infeções virais que estejam associadas com alta morbidade e mortalidade, e que causam impacto sobre populações mensuráveis, por exemplo o vírus de Hepatite C (HCV). Os tratamentos que estão correntemente disponíveis são inadequados ou ineficazes em grandes proporções de pacientes infectados com o HCV.
[004] A hepatite C é uma doença virai, infecciosa, originária no sangue, que é causada por um vírus hepatotrópico denominado HCV. A infecção pode causar a inflamação do fígado, que é, com frequência, as sintomática, mas seguindo-se a hepatite crônica pode resultar em cirrose (cicatrização fibrótica do fígado) e em câncer de fígado. O HCV é um de seis vírus de hepatite conhecidos: A, B, C, D, E e G e é espalhado através do contato, sangue a sangue, com o sangue da pessoa infectada. Os sintomas podem ser controlados medicamente, e uma proporção dos pacientes pode ser livrada do vírus através de medicações anti virais de longo termo. Embora a intervenção médica precoce seja útil, as pessoas com a infecção por HCV experimentam, com frequência, sintomas brandos, e em consequência disto, não buscam tratamento. Uma população estimada de 150- 200 milhões de pessoas estão infectadas com o HCV. Aqueles com uma história de uso de droga intravenosa, uso de droga inalada, tatuagens, ou que foram expostos a sangue através de seco não seguro estão em risco aumentado de contrair esta doença. A hepatite C constitui a principal causa de transplante de fígado nos Estados Unidos.
[005] A hepatite C é apresentada como dois estágios clínicos distintos. Em primeiro lugar, a Hepatite C é apresentada como Hepatite C aguda, que se refere aos primeiros 6 meses após a infecção com HCV. Entre 60% a 70% das pessoas infectadas não desenvolvem sintomas durante a fase aguda. Na maioria dos pacientes, que experimentos sintomas na fase aguda, elas são, de um modo geral, brandos e não- específicos, e raramente conduzem um diagnóstico específico de Hepatite C. Os sintomas da infecção de hepatite C aguda incluem o apetite diminuído, fadiga, dor abdominal, icterícia, coceira, e sintomas tipo gripe.
[006] O HCV é usualmente detectável no sangue dentro de uma a três semanas após a infecção, e os anticorpos para o vírus são detectáveis, de um modo geral, dentro de 3 a 12 semanas. Aproximadamente 20-30% das pessoas infectadas com o HCV são liberadas do vírus a partir de seus corpos durante a fase aguda, tal como mostrado através de normalização em testes de função intestinal (LFTs), tais que a normalização de alanina transaminase (ALT) assim como a eliminação de HCV-RNA do plasma (que é conhecida como a eliminação virai espontânea). Os restantes 70-80% dos pacientes infectados com HCV desenvolvem a Hepatite C crônica.
[007] A Hepatite C crônica é definida como uma infecção com HCV, que persiste durante mais de seis meses. Clinicamente, ela é frequentemente assintomática (sem icterícea) e é descoberta principalmente de um modo acidental.
[008] O curso natural da Hepatite C crônica varia, de um modo considerável, de pessoa para pessoa. Virtualmente todas as pessoas infectadas com o HCV apresentam evidência de inflamação quando da biópsia do fígado. No entanto, a taxa de progressão da cicatrização do fígado (fibrose) apresenta uma variabilidade significativa entre os indivíduos. Os dados recentes sugerem que, dentre os pacientes não- tratados, a grosso modo, um terço progride para a cirrose do fígado em menos do que 20 anos. Um outro terço progride para a cirrose dentro de 30 anos. O restante dos pacientes parece progredir lentamente, de um modo tal que não é provável que eles venham a desenvolver a cirrose dentro de seus períodos de vida. Os fatores que foram relatados como influenciando a taxa de progressão da doença de HCV incluem a idade, o gênero, a co- infecção com HIV e um fígado graxo.
[009] Os sintomas especificamente sugestivos da doença estão, de um modo típico, ausentes, até que uma cicatrização substancial do fígado tenha ocorrido. No entanto, a Hepatite C é uma doença sistêmica, e os pacientes podem experimentar um amplo espectro de manifestações clínicas, em uma faixa a partir de uma ausência de sintomas a uma doença mais sintomática, antes do desenvolvimento da doença do fígado aumentada. Os sinais e sintomas generalizados, associados com a Hepatite C crônica incluem a fadiga, a perda de peso acentuada, os sintomas do tipo de gripe, dor muscular, dor nas juntas, febres de baixo grau intermitentes, coceira, distúrbios do sono, dor abdominal, alterações de apetite, náusea, diarréia, dispepsia, alterações cognitivas, depressão, dores de cabeça e alterações de humor.
[0010] Uma vez que a Hepatite C crônica progrediu para a cirrose, podem aparecer sinais e sintomas, que são, de um modo geral, ou causados seja pela função do fígado diminuída ou pela pressão aumentada na circulação do fígado, uma condição conhecida como hipertensão portal. Sinais e sintomas possíveis de cirrose do fígado incluem a ascite, uma tendência para contusões e sangramentos, dor óssea, varizes, fezes graxas (esteatorréia), icterícea, e uma síndrome de dano cognitivo, conhecida como encefalopatia hepática.
[0011] O diagnóstico de Hepatite C é raramente efetuado durante a fase aguda da doença, porque a maior parte das pessoas infectadas não experimentam sintomas durante esta fase. Aqueles que experimentam sintomas de fase aguda raramente estão suficientemente doentes para buscar cuidados médicos. O diagnóstico da Hepatite C constitui também um desafio devido à ausência ou à falta de sintomas específicos, até que uma doença do fígado avançada seja desenvolvida, o que pode não ocorrer durante até décadas da doença.
[0012] O tratamento corrente (“padrão de cuidado”) consiste em uma combinação de alfo Interferon pegilado e da droga antiviral Ribavirina durante um período de 24 ou 48 semanas, dependendo do genótipo do vírus. Além disto, a eficácia desta terapia combinada, em suas várias formas, também depende do genótipo do vírus e está em uma faixa de 14% a 82%.
[0013] De um modo a melhor o prospecto de tratamento e prevenção de infeções virais, e de um modo a tratar da evolução virai crescente, existe uma necessidade crescente de que sejam identificadas moléculas capazes de inibir os vários aspectos do ciclo de vida virai. Deste modo, existe uma necessidade quanto a novas composições adicionais e quanto a agentes com atividade antiviral.
[0014] Constitui um objeto da presente invenção superar ou melhorar pelo menos uma das desvantagens da arte anterior, ou de que seja provida uma alternativa útil.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0015] A presente invenção é dirigida a certas composições, de um modo preferido a composições sinérgicas, que compreendem novos compostos antivirais, úteis no tratamento de infecção por HCV, que recaem sob a classificação de acil guanidinas substituídas. De um modo mais particular, a presente invenção é dirigida a composições sinérgicas, que compreendem uma ou mais acil guanidinas substituídas e um ou mais compostos antivirais conhecidos.
[0016] De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção provê uma composição para o tratamento de HCV, que compreende um composto da Fórmula I:
Figure img0001
RI é fenila, fenila substituído, naftila, naftila substituído, ou RI é selecionado a partir de,
Figure img0002
F é independentemente ,
Figure img0003
halogênio, alquila, halo ou polihalo alquila; Q é independentemente hidrogênio, alcóxi, em especial metóxi, alquila, em especial metila, cicloalquila, tienila, furila, pirazolila, pirazolila substituído, piridila, piridila substituído, fenila, fenila substituído, halo, em especial cloro ou bromo, heterociclo (“het”), ou Q é independentemente selecionado a partir de
Figure img0004
ou
Figure img0005
em que R2 é alquila de cadeia reta ou ramificada,
Figure img0006
em que R3 é
Figure img0007
X é hidrogênio ou alcóxi, e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, em combinação com pelo menos um agente adicional tendo atividade antiviral.
[0017] De um modo vantajoso, as composições de acordo com a presente invenção são composições sinérgicas, em que o efeito do composto e do pelo menos um agente antiviral é maior do que a soma dos efeitos do composto e de pelo menos um agente antiviral isoladamente.
[0018] De acordo com um segundo aspecto, a presente invenção provê uma composição farmacêutica para o tratamento de HCV, que compreende uma composição de acordo com o primeiro aspecto e um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis.
[0019] De acordo com um terceiro aspecto, é provido um método para a redução, retardo ou de um outro modo para a inibição do crescimento e/ ou replicação de HCV, que compreende contatar uma célula infectada com o referido HCV ou exposta a HCV com uma composição de acordo com o primeiro aspecto.
[0020] De acordo com um quarto aspecto, é provido um método para evitar a infecção de uma célula exposta a HCV, que compreende contatar a referida célula com uma composição de acordo com o primeiro aspecto.
[0021] A célula pode ser contatada com uma composição combinada completa (isto é, simultaneamente com todos os componentes da composição) ou pode ser contatada com os componentes individuais da composição, em um modo sequencial.
[0022] De acordo com um quinto aspecto da invenção, é provido um método para o tratamento terapêutico ou profilático de um paciente, exposto a ou infectado com HCV, que compreende a administração ao referido paciente de uma composição de acordo com o primeiro aspecto.
[0023] Os componentes individuais da composição podem ser administrados, de um modo separado, em um modo sequencial, e em qualquer ordem.
[0024] As composições e formulações da presente invenção podem ser administradas de qualquer modo, incluindo, mas não limitadas a, por via intravenosa (iv), por via intraperitonial, por via subcutânea, por via intracranial, por via intradérmica, por via intramuscular, por via intraocular, por via intratecal, por via intracerebral, por via intranasal, por via de transmucosa, ou através de infusão por via oral, retal por via de gotejamento iv, por adesivo ou através de implante. As composições podem estar sob a forma de um pó, comprimido, cápsula, líquido, suspensão, ou de outra forma de dosagem similar.
[0025] De acordo com um sexto aspecto da invenção, é provido um método de tratamento Hepatite C, que compreende administrar uma quantidade eficaz de uma composição de acordo com a invenção a um paciente que esteja em necessidade da mesma.
[0026] De acordo com um sétimo aspecto da invenção, é provido um método para o tratamento de Hepatite C, que compreende administrar uma quantidade eficaz de uma composição de acordo com a invenção a um paciente que esteja em necessidade da mesma, em que a referida composição inibe a proteína p7 de HCV.
[0027] De acordo com um oitavo aspecto da invenção, é provido o uso de uma composição de acordo com a invenção para a preparação ou a fabricação de um medicamento para o tratamento de Hepatite C.
[0028] De acordo com um nono aspecto da invenção, é provido o uso de uma composição de acordo com a invenção na preparação ou na fabricação de um medicamento para o tratamento de Hepatite C, em que a referida composição inibe a proteína p7 de HCV.
[0029] A não ser que o contexto o requeira de um outro modo, em toda a descrição e nas reivindicações, as palavras “compreendem”, “compreendendo”, e as similares devem ser construídas em um sentido inclusivo, em oposição a um sentido exclusivo ou exaustivo; ou seja dizer, no sentido de “incluindo, mas não limitado a”.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0030] A Figura 1 mostra graficamente a inibição da replicação de GBV- B por BIT 225 e BIT 100;
[0031] A Figura 2 mostra graficamente uma curva de resposta de dose de várias concentrações de BIT 225 contra BVDV;
[0032] A Figura 3 mostra graficamente uma curva de resposta de dose de várias concentrações de IFN contra BVDV;
[0033] A Figura 4 mostra graficamente uma curva de resposta de dose de várias concentrações de Ribavirina contra BVDV;
[0034] A Figura 5 mostra graficamente os níveis de inibição de vírus observados com 31 uM BIT225 e/ ou 1,25 pg de Ribavirina na presença ou na ausência de IFN-a, e
[0035] A Figura 6 mostra a resposta de dose de faixa total para BIT225 na presença de 5 e 10 IU/ m de IFNa e mostra o efeito antiviral aumentado através da adição de 1,25 pg/ ml. A inserção mostra as curvas de resposta de dose de faixa completa para Ribavirina, na presença de 5 e 10 IU/m IFNa.
[0036] A Figura 7 mostra as curvas de resposta de dose individuais para 2'-C-metil adenosina e 2'-C-metil citidina contra BVDV.
[0037] As Figuras 8 e 9 mostram as alterações para as curvas de resposta de dose para BIT225, na presença de várias concentrações de 2'-C- metil adenosina ou 2'-C-metil citidina, respectivamente.
[0038] A Figura 10 mostra as curvas de resposta de dose de faixa completa para BIT314, na presença de e em várias concentrações de rlFNa- 2b.
[0039] A Figura 11 ilustra o efeito antiviral aumentado através da adição de 5 IU /m de IFNa + 1,25 pg/ ml de ribavirina e 5 IU/ m de IFNa + 2,5 pg/ ml de ribavirina.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0040] A presente invenção refere-se a composições para o tratamento de HCV, que compreendem um composto da Fórmula I
Figure img0008
em que, RI é fenila, fenila substituído, naftila, naftila substituído ou RI é selecionado a partir de: 
Figure img0009
F é independentemente ,
Figure img0010
halogênio, alquila, halo ou polihalo alquila; Q é independentemente hidrogênio, alcóxi em especial metóxi, alquila em especial metila, cicloalquila, tienila, furila, pirazolila, pirazolila substituído, piridila, piridila substituído, fenila, fenila substituído halo, em especial cloro ou bromo, heterociclo (“het”) ou Q é independentemente selecionado a partir de
Figure img0011
ou
Figure img0012
R2 em que R2 é alquila de cadeia reta ou ramificada, 
Figure img0013
em que R3é
Figure img0014
X é hidrogênio ou alcóxi, e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, em combinação com pelo menos um agente adicional tendo atividade antiviral.
[0041] Os compostos particularmente úteis para o uso nas composições da presente invenção podem ser selecionados a partir dos seguintes: (3- benzoil) cinamoilguanidina compreendendo a estrutura:
Figure img0015
2,3-metilenodioxicinamoil guanidina compreendendo a
Figure img0016
5-metil-2-naftoil guanidina compreendendo a estrutura
Figure img0017
3-(indan-4-il)-propenoil guanidina compreendendo a estrutura:
Figure img0018
5-bromo-6-metóxi-2-naftoil guanidina compreendendo a
Figure img0019
5-tiofen-3-il-2-naftoil guanidina compreendendo a estrutura:
Figure img0020
5-(l-metilpirazol-4-il)-2-naftoil guanidina compreendendo a
Figure img0021
(l-metóxi-2-naftoil) guanidina compreendendo a estrutura: 
Figure img0022
(3-metóxi-2-naftoil)guanidina compreendendo a estrutura:
Figure img0023
(5-bromo-2-naftoil) guanidina compreendendo a estrutura:
Figure img0024
(l,4-dimetóxi-2-naftoil) guanidina compreendendo a estrutura:
Figure img0025
(6- (3- tienil)-2-naftoil) guanidina compreendendo a estrutura:
Figure img0026
(6-metil-2-naftoil) guanidina compreendendo a estrutura:
Figure img0027
(5-fenil-2-naftoil) guanidina compreendendo a estrutura:
Figure img0028
(5- (tien-2-il)-2-naftoil) guanidina compreendendo a estrutura:
Figure img0029
(5-(1-isobutil-1H-pirazol-4-il)-2-naftoil) guanidina compreendendo a estrutura:
Figure img0030
(5-(3-furil)-2-naftoil) guanidina compreendendo a estrutura:
Figure img0031
(5-ciclopropil-2-naftoil) guanidine
Figure img0032
(5-cloro-2-naftoil) guanidine
Figure img0033
acetato de (6-(1-metilpirazol-4-il)-2-naftoil) guanidínio
Figure img0034
(5-(2,6-dimetoxipiridin-3-il)-2-naftoil) guanidina
Figure img0035
(5- (2- clorofenil)-2- naftoil) guanidina
Figure img0036
(5-(4-(acetilamino)fenil)-2-naftoil) guanidine
Figure img0037
(5- (3-(acetilamino) fenil)-2-naftoil)guanidina
Figure img0038
(5-(4-(metilsulfonil) amino) fenil)-2-naftoil) guanidina
Figure img0039
BIT-319 e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Os grupos amina ou imina da porção guanidina dos compostos da Fórmula I podem estar presentes em qualquer forma convencional, usada para a provisão de tais compostos. Por exemplo, eles podem estar presentes como uma base livre, um hidrato, um sal orgânico ou inorgânico, ou combinações dos mesmos.
[0042] Os métodos desenvolvidos para a varredura dos compostos da presente invenção quanto à atividade antiviral são descritos em detalhe no PCT/AU 2004/ 000866, incorporados a este, em sua totalidade, a título referencial.
[0043] A referência a “HCV” deve ser entendida como uma referência a qualquer cepa de vírus de hepatite C, incluindo os homólogos e os mutantes.
[0044] A referência à “atividade funcional“ de HCV deve ser entendida como uma referência a qualquer uma ou mais das funções que o HCV efetua ou está envolvido.
[0045] A referência à “replicação virai” deve ser entendida como incluindo qualquer um ou mais estágios ou aspectos do ciclo de vida de HCV, tal que a inibição do conjunto ou a liberação de virions. Deste modo, o método da presente invenção abrange a mediação da replicação de HCV através da indução de uma cascata de estágios, que conduzem à mediação de qualquer um ou mais aspectos ou estágios do ciclo de vida de HCV.
[0046] A referência a uma “célula” infectada com HCV deve ser entendida como uma referência a qualquer célula, procariótica ou eucariótica, que foi infectada com HCV. Isto inclui, por exemplo, as linhagens de célula imortais ou primárias, as culturas bacterianas e as células in situ.
[0047] Deve ser entendido por aqueles versados na arte, que os compostos da invenção podem ser administrados sob a forma de uma composição ou formulação, que compreende veículos e/ ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[0048] As composições aqui descritas, que compreendem os compostos da presente invenção, podem incluir, em combinação, um ou mais agentes antivirais adicionais de qualquer tipo, por exemplo um inibidor de RNA polimerase dependente de RCV- RNA de nucleosídeo (RDRP), um inibidor de
[0049] de RNA polimerase dependente de HCV RNA de nucleosídeo (RdRP), um inibidor de HCV RNA protease não-nucleosídeo, um inibidor de HCV RNA protease de nucleosídeo, inibidores de transcriptase reversa não- nucleosídeo (NNRTIs), um inibidor de transcriptase reversa de nucleosídeo, um inibidor de entrada viral, Interferon, PEG- Interferon, ribavirina e combinações dos mesmos. Será entendido que os inibidores de nucleosídeo e não- nucleosídeo incluem os análogos de moléculas de nucleosídeo e não- nucleosídeo. Os inibidores de polimerase podem objetivar HCV NS5B e NS5A; os inibidores de protease podem objetivar HCV NS53 e NS4.
[0050] Exemplos não- limitativos de inibidores de análogo de nucleosídeo de NS5B, que podem ser usados nas terapias combinadas e nas composições da presente invenção incluem valopicitabina, uma prodroga de análogo de nucleosídeo 2'C-metilcitosina; JTK103; R04048; R-1479R- 1626, análogo de nucleosídeo de 4'- azidocitosina e prodrogas dos mesmos; e R- 7128. Exemplos não- limitativos de inibidores de análogo de não-nucleosídeo (NNRTI), que podem ser usados nas composições da presente invenção, incluem HCV- 796, inibidor de polimerase de abenzofurano HCV; GL 60667 ou “667”; e XTL- 2125. Exemplos não limitativos de inibidores de serina protease de NS3/ 4A de HCV, que podem ser usados nas composições da presente invenção, incluem VX-950; SCH - 503034; ACH - 806 / GS -9132; e BILN-2061 eITMN-191.
[0051] De um modo preferido, o pelo menos um agente adicional tendo atividade anti- viral é um Interferon (IFN). De um modo ainda mais preferido,a o Interferon é selecionada a partir do grupo que consiste de IFNs do tipo I e do tipo II. De um modo ainda amais preferido, o Interferon é selecionada a partir do grupo que consiste de IFNα, IFNβ e IFNy. Ainda mais preferivelmente, o IFN é selecionado a partir do grupo que consiste de IFN a- 2a, IFN α-2b, IFN a-n3, IFNα con-I, IFNβ-la, IFN-βl, IFN-y 1b, peginterferon α-2b e peginterferon a-2a. De um modo alternativo, o pelo menos um agente adicional tendo atividade antiviral pode compreender um ou mais de IFNa-2a e Ribavirina; IFNa-2a pegilado e Ribavirina ou IFNa-2a pegilado e Ribavirina.
[0052] O pelo menos um agente adicional tendo atividade anti- viral pode compreender um ou mais compostos selecionados a partir de um inibidor de HCV protease, um inibidor de HCV polimerase ou um inibidor de HCV serina protease. De um modo alternativo, o pelo menos um agente adicional tendo uma atividade antiviral pode compreender um ou mais compostos selecionados a partir de uma anticorpo monoclonal, um extrato botânico, um inibidor de NS5A, um imunomodulador, uma tiazolida, uma terapia antifosfolídeo, um composto anti- sentido, uma isatoribina, um estimulador de imina de amplo espectro, um inibidor de inflamação/ fibrose, um inibidor de replicase, um inibidor de ciclofilina, um inibidor de iminoaçúcar, um inibidor de pancaspase ou um anticorpo policlonal.
[0053] Além disso, o pelo menos um agente adicional tendo uma atividade antiviral pode compreender um ou mais análogos de nucleosídeo antivirais, tais que, por exemplo, análogos de 2'-C-metil nucleosídeo. Estes podem ser selecionados, por exemplo, a partir de 2'-C-metil adenosina ou 2'- C- metil citidina.
[0054] O pelo menos um agente adicional tendo atividade antiviral pode também compreender uma vacina selecionada a partir de uma vacina terapêutica ou uma vacina à base de DNA.
[0055] Para uma terapia combinada, na qual os compostos da presente invenção são usados em conjunção com um ou mais compostos antivirais convencionais ou agentes antagonistas de HVC, os compostos podem ser providos ao paciente antes de, subsequentemente a, ou de um modo concorrente com o um ou mais compostos ou agentes antivirais.
[0056] De um modo preferido, a composição da presente invenção é uma composição sinérgica, em que o efeito do composto e de pelo menos um agente adicional tendo atividade antiviral é maior do que a soma dos efeitos do composto e de pelo menos um agente adicional tendo apenas atividade antiviral. Naturalmente, será também entendido que combinações aditivas, simples, de novos compostos e de agentes antivirais existentes estão também contempladas.
[0057] O paciente da inibição virai é um mamífero, tal que, mas não limitado a, um humano, um primata, um animal de criação, por exemplo, uma ovelha, uma vaca, um cavalo, um macaco ou um porco; um animal de estimação, por exemplo um cachorro ou um gato; um animal para testes laboratoriais, por exemplo, um camundongo, um coelho, um rato, um porquinho da guiné ou um criceto; ou um animal selvagem cativo, por exemplo, uma raposa ou um cervo. De um modo preferido, o paciente é um primata. De um modo ainda mais preferido, o paciente é um ser humano.
[0058] O método da presente invenção é particularmente útil no tratamento e na profilaxia de uma infecção por HCV. Por exemplo, em pacientes infectados com HCV, a atividade antiviral pode ser afetada, de um modo a evitar a replicação de HCV, deste modo evitando o início da Hepatite C, aguda ou crônica. De um modo alternativo, o método da presente invenção pode ser usado para reduzir a carga de HCV no soro ou para aliviar os sintomas de infecção por HCV.
[0059] O método da presente invenção pode ser particularmente útil nos estágios precoces de infecção por HCV, de um modo a evitar o estabelecimento de um reservatório de HCV nas células afetadas ou como um tratamento profilático a ser aplicado imediatamente antes de ou durante um período após a exposição a uma possível fonte de HCV.
[0060] A referência neste caso a “terapêutico” e “profilático deve ser considerada em seus contextos mais amplos. O termo “terapêutico” não implica necessariamente em que um mamífero seja tratado até a recuperação total. De um modo similar, “profilático” não significa necessariamente que o paciente não irá eventualmente contrair uma condição de doença. Deste modo, a terapia e a profilaxia incluem a melhora dos sintomas de uma condição particular ou a prevenção ou de um outro modo a redução do risco de que seja desenvolvida uma condição particular. O termo “profilaxia” deve ser considerado como sendo capaz de reduzir o início de uma condição particular. A terapia pode também reduzir a severidade de uma condição existente ou a frequência de ataques agudos.
[0061] De acordo com os métodos da presente invenção, mais do que uma composição pode ser administrada de um modo conjunto com um ou mais outros a gentes terapêuticos. Por “co- administrada” é compreendida a administração simultânea na mesma formulação ou em duas formulações diferentes, através da mesma ou de diferentes vias, ou a administração sequencial através da mesma ou de diferentes vias. Por administração sequencial” é compreendida uma diferença de tempo de segundos, minutos, horas ou dias entre a administração de um composto e o próximo. A composição e os agentes terapêuticos adicionais podem ser administrados em qualquer ordem.
[0062] As vias de administração incluem, mas não estão limitadas a, intravenosa (iv), intraperitonial, subcutânea, intracraniana, intradémica, intramuscular, intraocular, intratecal, intracerebral, intranasal, transmucosal, ou através de infusão oral, retal, através de gotejamento intravenoso, adesivo e implante. As vias intravenosas são, de um modo particular, as preferidas.
[0063] A presente invenção também se estende a formas adequadas para a aplicação tópica, tais que cremes, loções e géis.
[0064] Em uma outra modalidade, a presente invenção provê uma formulação para a administração pulmonar ou nasal para o tratamento de HCV, que compreende uma composição de acordo com o primeiro aspecto da invenção.
[0065] É em especial vantajoso formular as composições parenterais em uma forma de unidade de dosagem para a facilidade de administração e uniformidade dosagem. A forma de dosagem unitária, como aqui usada, refere-se a unidades fisicamente distintas, adequadas para as dosagens unitárias dos pacientes mamíferos a serem tratados; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de material ativo, calculada para produzir o efeito desejado em associação com o veículo farmacêutico requerido. As especificações para as novas formas de unidade de dosagem da invenção são ditadas por e diretamente dependentes de (a) as características únicas do material ativo e, de um modo particular, do efeito terapêutico a ser alcançado e (b) das limitações inerentes na arte da composição.
[0066] Os procedimentos para a preparação das formas de unidade de dosagem e para as preparações tópicas estão prontamente disponíveis para aqueles versados na arte a partir de textos, tais que Pharmaceutical Handbook, A. Martindale Companion Volume Ed. Ainley Wade, Nineteenth Edition, The Pharmaceutical Press London, CRC Handbook of Chemistry and Physics Ed. Robert C. Weast PH. D CRC Pres, Inc.; Goodman and Gilman's; The Pharmacological basis of Therapeutics, Ninth Ed. Me Graw Hill; Remington; end the Science and Practice of Pharmacy. Nineteenth Ed. Ed. Alfonso R. Genaro Mack Publishing Co. Easton Pennsylvania.
[0067] As quantidades eficazes contempladas pela presente invenção irão variar dependendo da severidade das condições e da saúde e idade do receptor. Em termos gerais, as quantidades eficazes podem variar a partir de 0,01 mg/ kg de peso corpóreo a cerca de 100 mg/ kg de peso corpóreo.
[0068] A presente invenção será agora descrita em maiores detalhes com referência a exemplos específicos, mas não- limitativos, que descrevem os protocolos sintéticos, a inibição virai e outras propriedades antivirais dos compostos da presente invenção. A síntese e a varredura quanto a compostos que possuem atividade antiviral pode ser alcançada pela faixa de metodologias aqui descritas ou descritas em maiores detalhes no PCT/ AU 2004/ 000866, incorporado a este, em sua totalidade, a título referencial.
[0069] Deve ser entendido, no entanto, que a descrição detalhada de procedimentos específicos compostos e métodos é incluída apenas com o propósito de exemplificar a presente invenção. Ela não deve ser entendida, de modo algum, como constituindo uma restrição em relação à ampla descrição da invenção, tal como acima exposta.
EXEMPLOS
[0070] A atividade antiviral de todos os compostos da presente invenção pode ser, e tem sido, verificada com o uso dos métodos aqui descritos ou descritos de um modo detalhado no PCT/ AU 2004/ 000866, incorporado a este, em sua totalidade, a título referencial. Além disso, os métodos para a síntese dos compostos da invenção, tanto genéricos como específicos, aqui descritos, descritos em publicações referenciadas, ou de outro modo conhecidos daqueles versados na arte, podem ser usados para preparar todos os compostos da presente invenção. Protocolos sintéticos úteis são também providos no PCT/ ASU 2006/ 000880, incorporado a este, a título referencial, em sua totalidade.
[0071] De um modo mais específico, as acil guanidinas podem ser sintetizadas através de uma variedade de métodos, que incluem a reação de guanidina (em geral gerada in situa partir de seu sal de hidrocloreto) com um derivado adequadamente ativado de um ácido carboxílico. Os exemplos incluem:i) a síntese a partir de cloretos ácidos, exemplificados por Yamamoto et al., Chem. Pharm. Buli., 1997, 45, 1282. ii) síntese a partir de ésteres simples, exemplificados pela patente US 2.734. 904. iii) síntese a partir de ácidos carboxílicos, através da ativação in situpor carbonil diimidazol, exemplificados pela patente US 5.883.133.
[0072] Os precursores de ácido carboxílico, requeridos para a preparação das acil guanidinas descritas neste, foram obtidos através de uma variedade de métodos diversos. Um grande número de ácidos cinâmicos substituídos estão comercialmente disponíveis. Em adição, numerosos procedimentos para a síntese de ácidos cinâmicos substituídos e de seus ésteres simples são bem descritos na arte, incluindo: i) A reação do ácido malônico com um aldeído aromático e uma base (A Condensação de Doebner), descrita em Chemical Reviews, 1944, 35, 156, e as referências contidas nesta. ii) A reação do anidrido acético com um aldeído aromático e uma base (a Reação de Perkin), descrita em Organic Reactions, 1942, 1, 210, e as referências contidas nesta. iii) A reação de ácido acrílico e de ésteres simples do mesmo com um halogeneto aromático ou triflato aromático usando um catalisador de paládio (a Reação de Heck), descrita em Organic Reactions, 1982, 28, 345, e as referências contidas nesta. iv) A reação de um trialquil fosfonoacetato com um aldeído aromático e uma base (a Reação de Horner -Emmons), descrita em Organic Reactions, 1977, 25, 73, e as referências contidas nesta.
[0073] Um número de ácidos halo, hidróxi, e alcóxi substituídos naftóicos ou estão comercialmente disponíveis ou são conhecidos na arte e estes são providos pelos materiais de partida para as naftoil guanidinas substituídas.
[0074] Os ácidos naftóicos, que são substituídos por grupos alquila, cicloalquila, arila e heterociclo podem ser frequentemente preparados através da reação de um ácido halonaftóico com um reagente organometálico adequado, usando um catalisador de metal de transição. Uma tal variante desta metodologia, que foi usada para preparar um número dos ácidos naftóicos usados como precursores para as naftoil guanidinas aqui descritas, foi a reação de formação da ligação carbono- carbono catalisada por paládio entre os ácidos cromonaftóicos e um ácido borônico adequadamente substituído (ou éster de boronato), que é amplamente conhecida na arte como o acoplamento de Suzuki (descrito em Chemical Reviews, 1995, 95, 2457 e referências nesta). A reação possui uma ampla aplicabilidade e pode ser usada em uma faixa de halonaftalenos substituídos, que podem ser adicionalmente elaborados para introduzir ou para remover a máscara do grupo ácido carboxílico requerido.
1. Metodologia Sintética Geral 1.1. Procedimento Geral A - Preparação de Triflatos de Arila
[0075] A uma solução de fenol (10 mmol) em piridina (7 ml) a 0°C foi lentamente adicionado o anidrido trifluorometano sulfônico (11 mmol, 1,1 eq.). A mistura resultante foi agitada a 0°C durante 5 minutos adicionais, antes que fosse permitido com que fosse aquecida à temperatura ambiente e agitada até que uma análise de TLC demonstrasse que o fenol de partida havia sido consumido. A mistura foi então despejada em água e extraída com acetato de etila (x 3). Os extratos combinados foram lavados de um modo sequencial com água, ácido clorídrico aquoso 1 M, água e salmoura, e então secados (MgSÜ4) e concentrados in vacuo,de um modo a fornecer o produto bruto. Os produtos brutos foram cromatografados em sílica gel. A eluição com uma mistura de acetato de etila/ hexanos forneceu os triflatos de arila desejados, de um modo geral como óleos incolores.
1.2. Procedimento Geral B- Ésteres de Cinamato através de Reação de Heck de Triflatos
[0076] Uma mistura do triflato de fenila (10 mmol), acrilato de metila (14 mmol, 1, 4 eq.), trietilamina (40 mmol, 4 eq.), e diclorobis (trifenil fosfina) paládio (0,3 mmol, 0,03 eq.) em dimetil formamida (30 ml) foi aquecida a 90°C. A reação foi monitorada através de CG/ MS e as bateladas frescas de acrilato de etila (1 eq.), trietil amina (2 eq.) e o catalisador de paládio (0,03 eq.) foram adicionadas conforme requerido, em um esforço para forçar com que a reação fosse completada. A mistura foi então despejada em água e extraída com uma mistura a 1:1 de éter dietílico/ hexanos (x 3). Os extratos combinados foram lavados com água, e então com salmoura, secados (MgSÜ4), filtrados através de um tampão de sílica gel, e o filtrado foi concentrado in vacuo,de um modo a fornecer o produto bruto sob a forma de um óleo. Os produtos brutos foram cromatografados em sílica gel. A eluição com uma mistura de acetato de etila/ hexanos forneceu os cinamatos de metila desejados, de um modo geral como óleos incolores.
1.3. Procedimento Geral C- Ésteres de Cinamato Através de Reação de Heck de Brometos
[0077] O brometo de arila (10 mmol), acetato de paládio (0,1 mmol, 0,01 eq. e tri-o- toililfosfina (0, 4 mmmol, 0,04 eq. foi adicionado ao frasco de reação e purgado com nitrogênio. A este, foram então adicionados acrilato de metila (12, 5 mmol, 1,25 eq.), trietilamina (12, 5 mmol, 1, 25 eq.) e dimetil formamida (1 ml) foram então adicionados e a mistura foi aquecida a 100°C. A reação foi monitorada através de CG/ MS e bateladas frescas de acetato de paládio (0,01 eq.), tri-o-tolil fosfina (0,04 eq.), acrilato de metila (1,25 eq.) e trietilamina (1, 25 eq.) foram adicionados conforme requerido, em um esforço para que a reação fosse forçada a ser completada. A mistura foi despejada em água e extraída com uma mistura a 1:1 de éter dietílico/ hexanos (x 4). Os extratos combinados foram lavados com água, e então salmoura, secados (MgSÜ4), filtrados através de um tampão de sílica gel e o filtrado foi concentrado in vacuo,de um modo a fornecer o produto bruto. Os produtos brutos foram então cromatografados com sílica gel. A eluição com uma mistura de acetato de etila/ hexanos forneceu os cinamatos de metila desejados, de um modo geral como óleos incolores.
1.4. Procedimento Geral D-Ésteres de Cinamato Através de Reação de Horner -Emmons
[0078] Uma solução de fosfonoacetato de trietila (13 mmol, 1,3 eq.) em tetraidrofurano anidro (10 ml) foi adicionada, durante 5 minutos, a uma suspensão de hidreto de sódio (14,3 mmol, 1,4 eq.) em tetraidrofurano anidro (10 ml), a 0°C, sob nitrogênio. A mistura foi então agitada a 0°C, durante 20 minutos. Uma solução de benzaldeído (10 mmol) em tetraidrofurano (15 ml) foi então adicionada durante um período de 10 minutos, a 0°C. A mistura foi agitada a 0°C durante um período adicional de 30 minutos, antes que fosse deixada em agitação, em temperatura ambiente, até que a análise de CG/MS ou a análise de TLC demonstrasse que o material de partida benzaldeído havia sido consumido. De um modo típico, as reações foram deixadas em agitação, em temperatura ambiente durante a noite, de um modo a assegurar o consumo completo do aldeído de partida. A mistura foi despejada em água, a camada orgânica foi separada e a camada aquosa foi extraída com acetato de etila (x 3). Os extratos orgânicos combinados foram então lavados com água, então com salmoura, secados (MgSO4) e concentrados in vacuo,de um modo a fornecer o produto bruto. Os produtos brutos foram então comatografados com sílica gel. A eluição com uma mistura de acetato de etila/ hexanos forneceu os cinamatos de etila desejados, de um modo geral como óleos incolores.
1.5. Procedimento Geral E- Preparação de Ésteres 5- Fenilpenta-2,4-Dienóicos
[0079] Uma solução de 4-fosfonocrotonato de trietila (26 mmol, 1, 3 eq.) em tetraidrofurano anidro (10 ml) foi adicionada, durante 5 minutos, a uma suspensão de hidreto de sódio (28 mmol, 1,4 eq. 60% de suspensão em óleo) em tetraidrofurano anidro (15 ml) a 0°C, sob nitrogênio. A mistura foi então agitada a 0°C durante 20 minutos. Uma solução de benzaldeído (20 mmol) em tetraidrofurano (10 ml) foi então adicionada durante 10 minutos, a 0°C. A mistura foi agitada a 0°C durante um período adicional de 30 minutos e foi então deixada em agitação, em temperatura ambiente, até que a análise de CG/ MS demonstrasse que o aldeído de partida havia sido consumido. A mistura da reação foi despejada em água, a camada orgânica foi separada e a camada aquosa foi extraída com acetato de etila (x 3). Os extratos orgânicos combinados foram então lavados com água, então com salmoura, secados (MgSÜ4) e concentrados in vacuode um modo a fornecer o éter de etila bruto como um óleo. Os produtos brutos foram cromatografados em sílica gel. A eluição com uma mistura de acetato de etila/ hexanos forneceu os ésteres de etila desejados como óleos incolores.
1.6. Procedimento Geral F- Hidrólise de Ésteres
[0080] Uma solução do éster (10 mmol) em metanol (50 ml) e água (5 ml) foi tratada com uma solução aquosa de hidróxido de potássio 6 M (20 mmol, 2 eq.) e a mistura foi aquecida, sob refluxo, até que a análise de TLC demonstrasse que não havia mais material de partida presente (usualmente 2-3 horas). A mistura foi despejada em água (0- 200 ml) e acidificada com ácido clorídrico concentrado, aproximadamente em um p'H de 2. O ácido carboxílico resultante foi coletado através de filtração, lavado com água e secado durante a noite sob alto vácuo.
1.7. Procedimento Geral G- Reações de Suzuki de Ácidos Bromonaftóicos
[0081] O ácido bromo-2-naftóico (2 mmol), o ácido borônico apropriado (ou éster de boronato) (2,2 mmol), tetraquis (triflenilfosfina) paládio (0) (0,1 mmol) e carbonato de sódio sólido (6,8 mmol) foram adicionados ao frasco da reação, que foi então purgado com nitrogênio. Acetonitrila (6 ml) e água (2,5 ml) foram adicionadas e a mistura foi aquecida, sob refluxo, sob agitação vigorosa, até que o ácido bromo-2- naftóico de partida tiv esse sido consumido. A mistura da reação foi então dividida entre tolueno (50 ml) e uma solução de hidróxido de sódio 0,5 M (100 ml). A camada aquosa foi lavada com tolueno, de um modo a remover qualquer trifenil fosfina, 3 x 20 ml) e então acidificada para o pH 1 com ácido clorídrico concentrado. Os derivados de ácido naftóico foram extraídos em acetato de etila (4 x 20 ml). Os extratos de acetato de etila combinados foram lavados com água (3 x 20 ml) e salmoura (10 ml), e então secados (MgSOd), filtrados e concentrados. O resíduo foi analisado através de RMN XH, e cromatografado em sílica gel (se requerido).
1.8. Procedimento Geral H- Preparação de Acil guanidinas
[0082] A uma suspensão/ solução de ácido carboxílico (10 mmol, 1,0 eq.) em diclorometano (30 ml) contendo uma gota de dimetil formamida foi adicionado cloreto de oxalila (12 mmol, 1,2 eq.), o que causou com que a solução efervescesse. Após a agitação durante 2 horas, a solução resultante foi evaporada até a secura, sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em tetraidrofuranos seco (30 ml) e adicionado a uma solução de hidrocloreto de guanidina (50 mmol, 5,0 eq. em hidróxido de sódio aquoso 2 M (30 ml). A reação foi agitada em temperatura ambiente durante 1 hora e então a camada de tetraidrofurano foi separada. A camada aquosa foi extraída com clorofórmio (100 ml), seguido por acetato de etila (100 ml) e as camadas orgânicas combinadas foram evaporadas sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi dividido entre clorofórmio (200 ml) e hidróxido de sódio aquoso 2 M (100 ml) e a camada orgânica foi separada e secada (Na2SÜ4). A solução foi filtrada e evaporada sob pressão reduzida, até o ponto em que um sólido começou a ser precipitado. Neste ponto, os hexanos foram adicionados, causando a precipitação do produto, que foi coletado através de filtração e secado sob alto vácuo.
2. Exemplos Experimentais Específicos de Sínteses Exemplo 1: 4-Hidroxiindano
[0083] 4-Aminoindano (3,0 g) foi adicionado a uma solução de ácido sulfúrico concentrado (2,4 ml) em água (15 ml). Mais água (15 ml) foi adicionada e a mistura foi resfriada a 5°C. Uma solução de nitrito de sódio (1,71 g) em água (4,5 ml) é adicionada, em porções, à mistura, enquanto a temperatura é mantida abaixo de 5°C. Após a adição ter sido completada, a mistura foi deixada aquecer à temperatura ambiente e uréia (0, 29 g) foi adicionada. A mistura foi agitada durante um período adicional de 5 minutos, antes que fosse aquecida a 45°C durante 30 minutos. A mistura foi então resfriada à temperatura ambiente, e extraída com acetato de etila. Os extratos orgânicos combinados foram lavados com hidróxido de sódio aquoso 2 M (2 x 100 ml) e estes extratos aquosos foram então acidificados com ácido clorídrico e extraídos com acetato de etila (3 x 10o ml). Os extratos orgânicos combinados foram então lavados com salmoura e secados (Na2SÜ4) antes de serem concentrados in vacuo.O produto bruto resultante foi cromatografado em sílica gel. A eluição com acetato de etila/ hexanos (1:7) forneceu 4- hidroxiindano como um óleo laranja (1,0 g).
Exemplo 2: Triflato de 4-indanila
[0084] A uma solução de 4-hidroxiindano (1,2 g, 8,9 mmol) em piridina (5 ml) a 0°C foi lentamente adicionado o anidrido trifluorometano sulfônico (1,6 ml, 9,8 mmol). A mistura resultante foi agitada a 0°C durante 5 minutos, antes de ser deixada aquecer à temperatura ambiente, e então agitada durante 45 minutos. A mistura foi então despejada em água e extraída com acetato de etila (3 x 25 ml). Os extratos combinados foram lavados de um modo sequencial com água, ácido clorídrico aquoso 1 M, água e salmoura, e então secados (Na2SÜ4) e então concentrados in vacuo,de um modo a fornecer o triflato bruto como um óleo laranja (2,13 g, 89%).
Exemplo 3:3- (indan-4-il) acrilato de metila
[0085] Uma mistura de triflato de 4- indanila (2,13 g, 8,0 mmol), acrilato de metila (1,01 ml, 11,2 mmol), trietil amina (4,4 ml, 32 mmol, 4 eq.) e diclorobis (trifenilfosfina) paládio (170 mg, 0,24 mmol) em dimetil formamida (15 ml) foi aquecida a 85°C durante 71 horas. Uma pequena alíquota foi removida e processada quanto à análise de CG/ MS, que revelou que uma quantidade significativa de material de partida estava ainda presente. Acrilato de metila adicional (0,7 ml), trietil amina (2 ml) e o catalisador de paládio (170 mg) foram então adicionados e a mistura foi aquecida durante um período adicional de 24 horas. A mistura foi então despejada em água, extraída com acetato de etila, e os extratos orgânicos foram lavados com água, então com salmoura, secados (Na2SÜ4), e concentrados in vacuo,de um modo a fornecer o produto bruto como um óleo (2,4 g). O produto bruto foi cromatografado em sílica gel. A eluição com acetato de etila/ hexanos (1:19) forneceu o triflato de partida (812 mg, 38%) como um óleo incolor, seguido pelo 3- (indan-4-il) acrilato de metila desejado como um óleo castanho (880 mg, 54%).
Exemplo 4: 3-Benzoil cinamato de metila
[0086] A uma mistura de 3-bromobenzofenona (5, 0 g, 19 mmol), acetato de paládio (215 mg, 0,958 mmol) e tri-o-tolil fosfina (290 mg, 0,953 mmol) foi adicionada trietil amina (3,3 ml, 45 mmol), tolueno (4 ml), e acrilato de metila (2,2 ml, 27 mmol). A mistura foi aquecida a 100°C durante 18 horas, cuja análise de tempo -TLC demonstrou que a reação ainda estava incompleta. Porções adicionais de acetato de paládio (215 mg, 0,958 mmol), tri- o- tolilfosfina (290 mg, 0,953 mmol), trietil amina (3,3 ml, 45 mmol) e acrilato de metila (2,2 ml, 27 mmol) foram adicionados e a mistura foi aquecida a 110° durante um período adicional de 18 horas. Após o resfriamento à temperatura ambiente, a mistura foi despejada em água e extra'dia com acetato de etila (3 x 100 ml). Os extratos orgânicos combinados foram lavados, de um modo sequencial, com água e salmoura, e então secados (MgSÜ4) e concentrados a um óleo castanho (5,3 g). O óleo foi cromatografado em sílica gel. A eluição com acetato de etila/ hexanos (1:9) forneceu 3-benzoil cinamato de metila (4, 6 g, 91 %) como um sólido amarelo.
Exemplo 5: Acido 3- benzoil cinâmico
[0087] Hidróxido de potássio 5 M aquoso (10 ml, 50 mmol) foi adicionado a uma solução de 3-benzoil cinamato de metila (2,5 g, 9,4 mmol) em metanol (20 ml) e a mistura foi agitada, em temperatura ambiente, durante 18 horas. A mistura foi concentrada e acidificada para o pH 1, usando ácido clorídrico aquoso 1 M. O precipitado resultante foi coletado através de filtração e secado sob vácuo, de um modo a fornecer o ácido 3- benzoil cinâmico (2,2 g, 93%) como um sólido amarelo.
Exemplo 6: Ácido 5- (1- Metil-1H- pirazol -4-il)-2-naftóico
[0088] Uma mistura do ácido 5-bromo-2-naftóico (2,12 g, 8,44 mmol), l-metil-4- (4,4,5,5- tetrametil-1,3,2- dioxaborolan-2-il)-lH- pirazol (1,84 g, 8,86 mmol) e tetraquis (trifenilfosfina) paládio (0) (502 mg, 0, 435 mmol) em um frasco de fundo redondo de 250 ml foi evacuado e purgado com nitrogênio (em três ciclos). Acetonitrila (40 ml) e carbonato de sódio aquoso 2 M (10 ml) foram adicionados à mistura por meio de uma seringa, e a mistura foi aquecida, sob refluxo, sob nitrogênio, durante 22 horas. A mistura da reação foi deixada resfriar antes da adição do ácido clorídrico aquoso 1 M (30 ml) e foi então extraída com acetato de etila (3 x 50 ml). As camadas orgânicas combinadas foram secadas (MgSCh), filtradas e concentradas in vacuo,de um modo a prover um produto bruto (2,98 g após a secagem em ar). Este material bruto foi dissolvido em etanol quente (150 ml) e filtrado, enquanto ainda quente, de um modo a remover uma impureza amarela (120 mg). O filtrado foi concentrado in vacuoe o resíduo foi recristalizado a partir de diclorometano (30 ml), de um modo a prover o ácido 5- (1-metil-lH- pirazol-4-il) -2-naftóico como um sólido branco (724 mg, 34%). Uma segunda coleta do ácido 5-(l-metil-lH- pirazol-4-il) -2- naftóico (527 mg, 25%) foi obtida a partir dos licores mãe concentrados, através de recristalização a partir de diclorometano (20 ml).
Exemplo 7: 5-(l-Metil-lH- pirazol-4-il)-2- naftoil guanidina
[0089] Cloreto de oxalila (1,1 ml, 13 mmol) foi adicionado a uma solução do ácido 5 (1- metil-lH- pirazol -4-il)-2-naftóico (1,19 g, 4,71 mmol) em diclorometano anidro (200 ml) que foi adicionado em porções durante a reação para efetuar a dissolução) contendo dimetil formamida (2 gotas), sob nitrogênio, e a mistura foi aquecida, durante 1 hora, a 40°C, antes de ser concentrada sob pressão reduzida. O cloreto ácido bruto resultante foi então suspenso em tetraidrofurano anidro (50 ml ) e esta mistura foi então adicionada, em gotas, a uma solução de hidrocloreto de guanidina (2,09 g, 21,9 mmol) em hidróxido de sódio aquoso 2 M (15 ml, 30 mmol) e a mistura da reação foi então agitada durante 30 minutos. A fase orgânica foi separada, e a fase aquosa foi extraída com clorofórmio (3 x 30 ml), seguido por acetato de etila (3 x 30 ml). Os extratos orgânicos combinados foram lavados de um modo sequencial com hidróxido de sódio aquoso 1 M (60 ml) e água (40 ml), e então secados (Na2SÜ4) e concentrados in vacuo, de um modo a fornecer um sólido vítreo (1, 45 g, após a secagem sob alto vácuo). Este sólido foi dissolvido em diclorometano, que foi então deixado evaporar lentamente, de um modo a fornecer 5- (1- metil-1 H- pirazol-4-il)-2- naftoil guanidina como um sólido amarelo (1,15 g, 83%).
Exemplo 8: 2,3-Metilenodióxi cinamato de etila
[0090] Fosfono acetato de trietila (4, 05 ml, 20,2 mmol) foi adicionado, em gotas, a uma suspensão agitada de hidreto de sódio (0,80 g, 20 mmol) em tetraidrofurano anidro (20 ml), a 0°C, sob nitrogênio. A mistura foi agitada a 0°C, durante 20 minutos. Uma solução de 2,3-metilenodióxi benzaldeído (2, 50 g, 16,7 mmol) em tetraidrofurano (20 ml), foi adicionada em gotas a 0°C. A mistura foi agitada durante 2 horas, durante cujo período de tempo ela foi deixada aquecer à temperatura ambiente. A mistura foi despejada em água (250 ml) e extraída com acetato de etila (3 x 250 ml). Os extratos orgânicos combinados foram então lavados com salmoura, secados (MgSO4) e concentrados in vacuo.O produto bruto foi cromatografado em sílica gel. A eluição com acetato de etila/ hexanos (1: 10) forneceu o 2,3- metilenodióxi cinamato de etila como um sólido incolor (3,50 g, 92%).
Exemplo 9: Ácido 2,3-metilenodióxi cinâmico
[0091] Uma solução de 2,3-metilenodióxi cinamato de etila (3,40 g) em metanol (25 ml) e água (5 ml) foi tratada com uma solução de hidróxido de potássio (4,3 g) em água (25 ml). A mistura foi agitada durante a noite em temperatura ambiente, antes de ser concentrada in vacuoà metade de seu volume original. O concentrado foi então acidificado com HCI concentrado, de um modo a fornecer o ácido 2,3-metilenodióxi cinâmico como um sólido incolor (2,81 g, 95%), que foi coletado através de filtração e secado durante a noite sob um vácuo.
Exemplo 10: 2,3-Metilenodióxi cinamoil guanidina
[0092] Cloreto de oxalila (0,68 ml, 7,8 mmol) foi adicionado a uma suspensão do ácido 2,3-metilenodióxi cinâmico (500 mg, 2,6 mmol) em diclorometano (5 ml) contendo uma gota de dimetil formamida. A mistura foi agitada durante 2, 5 horas e a solução resultante foi evaporada até a secura, sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em tetraidrofurano seco (5 ml) e adicionado a uma solução de hidrocloreto de guanidina (1,24 g, 13 mmol) em hidróxido de sódio aquoso 2 M (8 ml). A reação foi agitada, em temperatura ambiente, durante 1 hora, e clorofórmio foi então adicionado. O precipitado resultante do produto bruto (100 mg) foi coletado através de filtração. O filtrado foi extraído com clorofórmio (3 x 30 ml) e acetato de etila (20 ml). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com hidróxido de sódio aquoso 2 M (20 ml), água (20 ml), secados (Na2SÜ4) e concentrados sob pressão reduzida, de um modo a fornecer uma quantidade adicional de produto bruto (400 mg). As duas gotas de produto bruto foram então combinadas, suspensas em clorofórmio (10 ml) e agitadas vigorosamente durante 20 minutos. A 2,3-metilenodióxi cinamoil guanidina resultante (420 mg) foi coletada através de filtração e secada sob vácuo.
Exemplo 11: Atividade antiviral de compostos usando o método de bioensaio bacteriano.
[0093] O método de imunoensaio bacteriano, usado no presente exemplo para testar a atividade antiviral dos compostos contra diferentes alvos virais foi descrita em detalhe no PCT / 2004/000866, incorporado a este, em sua totalidade, a título referencial. Este ensaio é usado em com junção com os ensaios GBV-B e BVDV descritos abaixo, de um modo a assegurar que todos os compostos ativos sejam identificados, alguns dos quais são ativos em um ou outro dos ensaios, enquanto que alguns compostos podem ser ativos em ambos os ensaios.
[0094] Em resumo, o bioensaio bacteriano para os compostos anti- HCV com potencial de varredura é baseado na proteína do canal de íon p7 de HCV. p7 é uma proteína de membrana pequena, codificada pelo HCV, que possui uma atividade funcional que suporta o crescimento virai e/ ou a replicação.
[0095] O fragmento de cDNA sintético que codifica p7 cDpt. coli, no qual os códons são otimizados para a expressão da proteína p7 em E. Coli, foi clonado no plasmídeo de expressão pPL451, criando o vetor pPLp7, no qual a expressão é induzível por temperatura, tal como descrito, de um modo detalhado, no PCT/ 2004/ 000866. A inibição do crescimento das células de E. Coli, que expressam p7 a 37°C foi observado como um indicador da função do canal do íon p7, dissipando o gradiente Na+ normal mantido pelas células bacterianas. Halos de crescimento em torno de um sítio de aplicação de composto particular indicam que o composto inibiu a expressão da atividade do canal de íon p7, que previne o crescimento na ausência do composto.
[0096] Os resultados cumulativos dois testes de bioensaio bacterianos, obtidos ao longo de um período de tempo e efetuada a média, são sumariados na Tabela I abaixo. Tabela 1: Classificações de Bioensaio Bacteriano Médio Para os compostos da Invenção
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[0097] Os controles positivos foram usados neste ensaio, de um modo a assegurar que o ensaio estava operando mais a título comparativo de atividades relativas dos compostos. Um resultado acima de zero indica que o composto possui atividade antiviral potencial.
Exemplo 12- Testes Inibidores de p7 contra o Vírus da Hepatite C
[0098] Os testes de eficácia antiviral de novas drogas potenciais são dificultados pela falta de um sistema modelo de cultura celular geralmente acessível para HCV. Os inibidores de p7 propostos foram testados usando sistemas de flavivírus substitutos, em particular os sistemas GBV-B e BVDV (Vírus de Diarréia Viral Bovina).
[0099] GBV-B é o flavivírus mais proximamente relacionado a HCV, compartilhando de 27-33% da identidade da sequência de nucleotídeo e 28% de similaridade de aminoácido em relação à sequência de polipeptídeo completa. Este vírus representa um sistema substituto excelente para HCV, porque ele infecta os pequenos primatos do Novo Mundo e é replicado eficientemente in vitro em culturas hepatocíticas de saguis primárias (OMH). O homólogo GBV- B de HCV p7 é denominado pl3. É aqui mostrado que um peptídeo sintético, que corresponda às duas hélices de transmembrana C- terminais de pl3 (que compartilham a maior homologia para p7) forma um canal de ion seletivo para cálcio que, tal como o canal p7, é bloqueado por adamantina (Premkumar et al., 2006). Por um outro lado, diferentemente de p7, HMA não inibe os canais pl3. Estas observações confirmam que os dois canais homólogos compartilham características estruturais similares, mas não idênticas.
[00100] Os compostos BIT selecionados- identificados através de varredura de ensaio bacteriano para inibidores de HCV p7 - foram testados quanto à capacidade para inibir a replicação de GBV- B em hepatócitos de saguis primários (vide Figura 1). Os hepatócitos foram inoculados 3 dias após a aplicação em placa com 10 x TCID50 de soro de sagui positivo para GBV-B. O HCV foi adsorvido durante duas horas, e então as células foram lavadas três vezes e cultivadas durante dois dias em um meio isento de soro fresco (SFM) suplementado com hormônios e fatores de crescimento. O vírus liberado ao sobrenadante da cultura foi medido como o número de cópia de RN A virai, conforme determinado através de RT-PCR em tempo real. Os compostos - dissolvidos em DMSO- foram adicionados ao meio ou 30 minutos antes da inoculação (“pré-tratamento”), ou imediatamente após a inoculação e os estágios de lavagem (pós- tratamento”). Sem tratamento, os controles negativos (apenas DMSO) e positivo (10 pg/ ml Poli I: C) foram incluídos nos experimentos. A citotoxicidade dos compostos em relação aos hepatócitos foi testada por meio de um ensaio MIT padrão.
[00101] O resultado mais surpreendente foi nas células previamente tratadas com 20 pM de BIT225, nas quais não foi detectado vírus no sobrenadante da cultura. 20 pM de BIT100 reduziram a replicação do vírus em mais do que 1,0 log e inibiram o vírus mais fortemente do que o controle poly I; C positivo. A eficácia de ambos BIT225 e BIT 100 foi um pouco reduzida quando os compostos foram adicionados pós- inoculação, sugerindo que os compostos podem agir em um estágio muito precoce do ciclo vital do vírus. Nenhum dos compostos na Figura I apresentou citotoxicidade para os hepatócitos em 20 pM.
[00102] BVDV pertence ao gênero Pestivirus de Flaviridae e é amplamente usado como um sistema modelo substituto para a identificação de agentes antivirais de HCV potenciais, devido a muitas similaridades de sua estrutura de genoma, produtos de gene e ciclos de replicação. Em adição, diferentemente de GBV-B, que apenas pode ser cultivado em hepatócitos primários, BVDV é prontamente desenvolvido em cultura de tecido e as cepas comumente usadas são citopáticas, tornando mais fáceis os testes de drogas antivirais. O homólogo HCV p7 de BVDV foi demonstrado como formando um canal de íon e como sendo essencial para a geração de partículas de vírus infecciosas (Harada et al., 2000 e Griffin et al., 2005).
[00103] A avaliação antiviral de compostos BIT selecionados contra BVDV teve origem no Southern Research Institute (SRI), Frederick MD USA. Um formato de citoproteção simples é usado, no qual a eficácia antiviral dos compostos é determinada pela sua capacidade para reduzir o efeito citopático de infecção de BVDV em células renais de bovino Madin- Darby (Buckwold e t al., 2003).
[00104] Um procedimento de ensaio de (CPE)- inibição de efeitos citopatogênicos induzidos por vírus foi empregado de um modo a avaliar os compostos quanto à atividade antiviral quanto à cepa de vírus de diarréia viral bovina (BVDV) NADL, em células renais de Madin- Darby (MDBK), em frascos T-75 (1,2). Os ensaios antivirais foram designados parta testar seis concentrações de semi-log de cada composto, em triplicata, contra o vírus provocador. Os controles celulares (CC) contendo apenas o meio, os controles celulares infectados com vírus (VC) contendo o meio e o vírus, os controles de citotoxicidade de droga e cada concentração de droga, os controles de reagente contendo apenas o meio de cultura (sem células), e os controles colorimétircos de droga contendo a droga e o meio (sem células) são processados de um modo simultâneo com as amostras de teste. Interferon - 2 b humana foi usada como um composto de controle positivo. No dia que precedeu ao ensaio, as células foram tripnizadas, transformadas em pelotas, contadas, e novamente suspensas em 1 x 104/ reservatório em um meio de cultura de tecido em placas de cultura de tecido de fundo plano de 96 reservatórios, em um volume de 100 jul por reservatório. Um dia após a aplicação em placa das células, os reservatórios foram lavados e o meio foi substituído por meio completo (2% de soro) contendo várias concentrações do composto de teste diluído em um meio em uma série semi-log. Uma alíquota de vírus previamente titulada foi removida a partir do congelador (- 80°C), justo antes do experimento. O vírus foi diluído na cultura de tecido, de um modo tal que a quantidade de vírus adicionada a cada reservatório fornecesse e exterminação celular completa em de 6-7 dias pós- infecção. As placas foram incubadas a 37° em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2, até que o CPE máximo seja observado em culturas de controle de vírus não tratadas (~dia 7). A inibição de CPE pelo composto foi determinada usando o Cell Titer 96 (Promega). Um método colorimétrico para a determinação do número de células viáveis foi usado. Um programa de computador foi utilizado, de um modo a calcular o percentual de redução de CPE nas células infectadas com o vírus e o percentual de viabilidade celular de células de controle de droga não infectadas. A concentração de droga inibitória mínima, que reduz o CPE em 50% (IC 50) e a concentração de droga tóxica mínima, que causa a redução das células viáveis em 50 % (TC50) foram calculadas usando um programa de análise de regressão com ajuste de curva de semi- log. Um índice terapêutico (seletividade) (TI50) para cada composto ativo foi determinado pela divisão de TC50 pelo ICso-
[00105] A citotoxicidade da droga foi medida separadamente em célula não infectadas. Onze compostos BIT foram testados no primeiro experimento, no qual os compostos foram adicionados às células, justo antes da infecção, e foram mantidos durante todo o experimento, dois deles, BIT 225 e BIT 314 retornaram valores de IC50 sub- micromolares (vide Tabela 2 abaixo).
Figure img0042
N/A = não alcançado
Tabela 2-Eficácia Antiviral contra BVDV em Células de MDBK
[00106] Um ensaio de repetição subsequente com BIT 225 retornou um valor de IC50 similar de 0, 33 pM. Compostos adicionais da invenção foram também testados, tal como mostrado na Tabela 2a abaixo. Tabela 2a
Figure img0043
Exemplo 13- Inibição de HCV usando uma combinação de BIT 225 com IFN ou Ribavirina.
[00107] Foram testadas combinações de BIT 225/IFN e de BIT 225/ Ribavirina contra o vírus. As Figuras 2, 3 e 4 mostram que cada droga individualmente forneceu os seguintes valores de ECso: BIT225, 314 nM; rIFNa- 2b, 21, 7 IU/ ml; mas para Ribavirina em si mesma, apenas muito pouca atividade antiviral foi detectada na faixa de até 20 pg/ ml.
[00108] Os efeitos das combinações de droga foram calculados com base na atividade de cada composto, quando testado isoladamente. A proteção antiviral aditiva esperada foi subtraída a partir da atividade antiviral experimentalmente determinada em cada concentração de combinação, resultando em um valor positivo (sinergia), um valor negativo (antagonismo), ou zero (aditividade). O volume de sinergia (em unidades de percentual de tempos de concentração, por exemplo pM2%, nM2%, nMpM%, e os similares) foram calculados em um intervalo de segurança de 95%. Para estes estudos, a sinergia foi definida como as combinações de droga, que fornecem volumes de sinergia maiores do que 50. A atividade ligeiramente sinérgica e a atividade altamente sinérgica foram operacionalmente definidas como fornecendo volumes de sinergia de 50- 100 e > 100, respectivamente. As interações de droga aditivas possuem volumes de sinergia na faixa de -50 a 50, embora os volumes de sinergia entre -50 e -100 sejam considerados ligeiramente antagonísticos e aqueles < - 100 sendo considerados altamente antagonísticos.
[00109] A Tabela 3 sumaria os resultados dos estudos de combinação: BIT 225 e IFN apresentaram um volume de sinergia médio de 87 IU/mliuM% indicando uma leve sinergia, embora deva ser notado que o valor está próximo ao corte “altamente sinérgico”, e em um dos três experimentos a interação foi verificada como sendo altamente sinérgica. De um modo interessante, a combinação de BIT 225/ Ribavirina foi altamente antagonística. Nestes experimentos, em que a Ribavirina em si mesma não possuía atividade antiviral, o resultado indica que a Ribavirina estava antagonizando a forte atividade antiviral de BIT 225.
[00110] Embora tenha havido uma tentativa neste caso para “graduar” o grau de sinergia entre diferentes combinações de compostos antivirais, deverá ser entendido que o termo “sinergia” é também comumente usado em se sentido absoluto e, portanto, qualquer nível de sinergia é considerado relevante e significativo com respeito às combinações da presente invenção.
Figure img0044
Tabela 3- Ensaio de Combinação de BVDV
Exemplo 14- Inibição de HCV usando uma combinação de BIT225, IFN e Ribavirina
[00111] Os resultados dos estudos de combinação acima revelaram o sinergismo entre as atividades antivirais de BIT225 e de IFNa. E bem conhecido a partir da literatura que embora a Ribavirina possua muito pouca atividade contra BVDV em si própria (vide Figura 4), o composto aumenta a atividade antiviral de IFNα. De um modo interessante, embora um ligeiro antagonismo tenha sido relatado entre Ribavirina e BIT 225 vide Tabela 3), este foi observado, de um modo predominante, nas concentrações mais elevadas de ambas as drogas testadas.
[00112] O efeito da combinação de BIT225, IFNα e Ribavirina foi testado, Duas concentrações fixas, abaixo de ECso de IFNα (5 e 10 IU/ ml) foram selecionadas e testadas contra as concentrações variáveis de BIT225 e Ribavirina: 8 diluições de duas vezes de BIT225 a partir de uma concentração de teste elevada de duas vezes de Ribavirina a partir de uma concentração de tete elevada de 20 pg/ ml foram testadas. Os resultados, apresentados na Tabela 4, mostram as atividades antivirais altamente sinérgicas entre BIT225 e Ribavirina, em ambas as concentrações fixas de IFNα testadas.
Figure img0045
Tabela 4
[00113] A análise adicional dos dados revela a inibição de 70% do CPE virai para a combinação de 5 IU/ ml de IFNα, acrescida da concentração mais baixa de BIT225 testada (31 nM), além da concentração mais baixa de Ribavirina testada (1,25 pg/ ml). A mesma baixa concentração de BIT225 e Ribavirina, na presença de 10 IU de IFNa, forneceu 90% de inibição do vírus. Para a comparação, a partir dos estudos precedentes, 5 IU de IFNa forneceu ~8% de inibição; 31 nM de BIT 225 isoladamente forneceu ~ 5% de inibição; e 1,25 pg/ ml de Ribavirina apresenta, isoladamente, nenhuma atividade virai. De um modo claro, a combinação tripla é altamente eficaz contra BVDV.
[00114] A Figura 5 mostra os níveis de inibição do vírus, observados com 31 nM de BIT225 e/ ou 1, 25 pg de Ribavirina, na presença ou na ausência de IFNa.
[00115] A figura 6 apresenta as curvas de reposta de dose de faixa total para BIT225, na presença de 5 e 10 IU/ m de IFNa e mostra o efeito antiviral aumentado pela adição de 1,25 pg / ml. A inserção mostra as curvas de resposta de dose de faixa total para Ribavirina, na presença de 5 e de 10 IU/ m IFNa.
[00116] Os valores de EC50 para BIT225, na presença de 5 ou 10 IU/ ml de IFNa, foram determinados como 92 (95% de Cl: 22- 385) nM e 71 (95% de Cl: 41- 1240) nM, respectivamente, através de ajuste de curva sigmoidal padrão, efetuado com um software Prism com graduação de Hill restrita. Um ajuste de curva similar, proporcionando rendimentos de graduação de Hill variáveis, com valores de EC50 equivalentes de 149 e de 125 nm, em uma boa concordância com os valores determinados no experimento prévio.
[00117] Não foi possível determinar os valores de EC50 para os dados a partir dos experimentos, nos quais Ribavirina foi adicionada, porque todas as combinações de droga testadas forneceram > 70% de inibição de CPE virai.
Sumário:
[00118] Os estudos de combinação com 0 composto BIT225 mostram que: • BIT225 isoladamente possui uma boa atividade antiviral com um valor de EC50 de 314 nM (95% Cl: 295-333). • BIT225 apresenta sinergismo em combinação com IFNa; o valor de EC50 de BIT225, na presença de 5 IU/ ml de IFNa é reduzido para ~92 nM (95% Cl: 22-385). • A combinação tripla de BIT225, IFN e Ribavirina é fortemente sinérgica, fornecendo 70% de inibição do vírus CPE, com tão pouco quanto 31 nm de BIT225, 5 IU/ m de IFNa e 1,25 lg/ml de Ribavirina. • A inibição do vírus completa pode ser alcançada com várias combinações dos três compostos: Por exemplo: 5 IU/ ml de IFNa + 500 nM de BIT225 + 2,. 5 pg/ ml de Ribavirina, ou 10 IU/ ml de IFNa + 31 nM de BIT225 + 2, 5 jug/ ml de Ribavirina. Exemplo 15 - Inibição de HCV usando uma combinação de BIT225 com os Análogos de Nucleotídeo 2'-C-metiladenosina ou 2'-C- metilcitidina.
[00119] Os análogos de nucleosídeo da presente invenção podem ser sintetizados usando os protocolos descritos em Hecker SJ et al. (2007), 73 (3), 161 -8 (para 2'C-metilcitidina). Os análogos de nucleosídeo podem ser também obtidos a partir de fontes comerciais, tais que NANJING BAIFULI TECHNOLOGU CO., LTD. (NAN JING BAI FU LI KE JI YOU XIAN ZE REN GONG SI), RM 701, BLDG 15, High-Tech Zone, Nanjing, 210061, P. R. CHINA. Tabela 5- Ensaio de Combinação de BVDV
Figure img0046
[00120] A Tabela 5 acima sumaria os resultados de estudos de combinação com o composto BIT225 e análogos de nucleosídeo, e combinações do composto BIT314 com IFN e/ ou Ribavirina.
[00121] Como aqui mostrado, as combinações de BIT225Z 2'-c-metil adenosina e de BIT225/ 2'- C-metil citidina foram testadas contra o vírus. A Figura 7 mostra que cada análogo de nucleosídeo era individualmente ativo com os seguintes valores de ECso: 2'C- metil adenosina EC 50 = 2, 16 ÁM (95% de Cl: 1,54 a 3,03 pM); 2'-C-metil citidina EC50=2, 75 pM (95% de Cl: 0,86 a 8, 7 pM).
[00122] Como anteriormente, os efeitos de combinações de droga foram calculados com base na atividade de cada composto, quando testado isoladamente. A proteção antiviral aditiva esperada foi subtraída a partir da atividade antiviral determinada experimentalmente, em cada concentração de combinação, resultando em um valor positivo (sinergia), um valor negativo (antagonismo), ou zero (aditividade). O volume de sinergia (em unidades de percentual de tempos de concentração), por exemplo, pM2%, nM2%, nMpM%, e os similares ) foi calculada com um intervalo de segurança de 95%. Para estes estudos, a sinergia foi definida como a combinação de droga,que fornece um volume de sinergia maior do que 50. A atividade ligeiramente sinérgica e a atividade altamente sinérgica foram operacionalmente definidas como fornecendo volumes de sinergia de 50-100 e > 100, respectivamente. As interações de droga aditivas possuem volumes de sinergia em uma faixa de - 50 a 50, embora volumes de sinergia entre - 50 e - 100 sejam considerados ligeiramente antagonísticos e aqueles < - 100 sendo considerados altamente antagonísticos.
[00123] A Tabela 5 sumaria os resultados dos estudos de combinação: BIT225 e 2'- C-metil adenosina tinham um volume de sinergia médio de 106 pM2 %, indicando uma “alta” sinergia. BIT225 e 2'-C- metil citidina possuíam um volume de sinergia médio de 71 pM2 %, indicando uma “ligeira” sinergia.
[00124] As Figuras 8 e 9 apresentam as alterações para as curvas de resposta de dose para BIT225, na presença de várias concentrações de 2'-C- metil adenosina ou 2'- C -metil citidina, respectivamente.
Exemplo 16-Inibição de HCV usando uma combinação de BIT314com IFN
[00125] As combinações de BIT314 / IFN foram testadas contra o vírus. Dois experimentos prévios com BIT314, testados individualmente contra BVDV, forneceram valores de ECso de 210 e de 390 nM (média = 300 nM). De um modo similar, determinamos previamente um valor de ECso de 21,7 IU/ ml para rIFNa-2b. A Figura 10 inclui a curva de resposta de dose para BIT314, conforme determinado em um terceiro experimento, que constitui parte destes estudos de combinação. Naquele experimento, o ECso para BIT314 foi de 540 nM.
[00126] Como previamente, os efeitos das combinações de droga foram calculados com base na atividade de cada composto, quando testado isoladamente, tal como descrito no Exemplo 15. A Tabela 5 sumaria os resultados dos estudos de combinação: BIT314 e IFN apresentaram um volume de sinergia médio de 311 pMIU/ ml%, indicando uma “alta”sinergia.
Exemplo 17- Inibição de HCV usando combinações triplas de BIT314, IFN e Ribavirina
[00127] Os resultados dos estudos de combinação acima revelaram um forte sinergismo entre as atividades antivirais de BIT314 e de IFNa. É também conhecido a partir da literatura que embora Ribavirina possua muito pouca atividade contra BVDV em si mesmo (vide Figura 4), o composto aumenta a atividade antiviral de IFNa.
[00128] O efeito de uma combinação de BIT314, IFNa e Ribavirina foi testado. Uma única concentração fixa - abaixo de EC50 - de IFNa (5 IU/ ml) foi selecionada e testada contra concentrações variáveis de BIT314 e Ribavirina: 8 diluições de duas vezes de BIT314 a partir de uma concentração de teste elevada de 4 pM e 5 diluições de duas vezes de Ribavirina a partir de uma concentração de teste elevada de 20 pg/ ml foram testadas. Os resultados, sumariados na Tabela X, mostram atividades antivirais altamente sinérgicas entre BIT314 e Ribavirina, na presença de IFNa: volume de sinergia/ antagonismo de 361 pMpg / ml %.
[00129] A Figura 10 mostra as curvas de resposta de dose de faixa total para BIT314, na presença de várias concentrações de rIFNa-2b e a Figura 11 ilustra o efeito antiviral aumentada pela adição de 5 IU/ m de IFNa + 1, 25 pg/ ml de Ribavirina e 5 IU de IFNa + 2,5 pg/ ml de Ribavirina. O valor de EC50 para BIT314 isoladamente, neste experimento, foi de 540 nM (95% de Cl: 389 a 739 nM) e, na presença de 5IU/ ml de IFNa, acrescido de 1,25 pg/ ml de Ribavirina foi de 183 nM (95% de Cl: 148 a 226 nM), conforme determinado através de ajuste de curva sigmoidal padrão, executado com um software Prism.
Sumário:
[00130] Os estudos de combinação com o composto BIT314 mostram que: • BIT314 isoladamente possui uma boa atividade antiviral com um valor de EC50 médio de 380 nM (SEM 95, 4, n = 3). • BIT314 mostra o sinergismo em combinação com IFNα; o valor de EC50 de BIT314, na presença de 40 IU/ ml de IFNα é reduzido a aproximadamente 60 nM. • A combinação tripla de BIT314, IFNα e Ribavirina é altamente sinérgica, fornecendo 70% de inibição do vírus CPE com tão pouco quanto 62 nM de BIT314, 5 IU/ m de IFNα, e 2,5 pg/ml de Ribavirina. • A inibição do vírus completa pode ser alcançada com várias combinações dos três compostos: Por exemplo: 5 IU/ml de IFNα + 250 nM de BIT314 + 2,5 pg/ ml de Ribavirina ou 5 IU/ ml de IFNα + 500 nM de BIT314 + 1, 25 pg/ ml de Ribavirina.
[00131] Embora a invenção tenha sido descrita com referência a modalidades específicas, deverá ser entendido que variações e modificações mantendo os princípios e o espírito da invenção descrito são também abrangidas. Referências: VanCott TC, Mascola JR, Loomis -Price LD, Sinangil F, Zitomersky N, Mac Neil J, Robb ML, Birx DL, Barnett S (1999), J. Virol. 73 (6); 4640-50. Pauwels R, Balzarini J, Baba M, Snoeck R, Schols D, Herdewjin P, Desmyter J e De Clercq E (1988), J. Virol. Methods, 20: 309- 321. D'Cruz OJ, Shih M. J., Yiv SH, Chen C-L, Uckm FM (1999) Mol. Hum. Reprod. 5 (5): 421 -432. Joo, Hong-Gu (2003 ) J. Veter. Sei. 4 (3): 229- 234. Ewart, G. D., T. Stherland, P. W. Gage, e G, B. Cox, The Vpu protein of human immunodeficiency virus type I forms cation- selective ion channel. J. Virol., 1996. 70 (10): pags. 7108 - 15. Ewart, G. D., K. Mills, G. B. Cox, e P.W. 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Claims (5)

1. Composição para o tratamento de HCV, caracterizadapelo fato de compreender os agentes ativos: (A) 5-(l-metilpirazol-4-il)2-naftoilguanidina, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e (B) pelo menos um agente adicional tendo atividade antiviral selecionada de 2’-C-metiladenosina e 2’-C-metilcitidina, em que: 5-(l-metilpirazol-4-il)-2-naftoilguanidina possui a estrutura
Figure img0047
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o grupo amina ou imina da porção guanidina de 5-(l- metilpirazol-4-il)2-naftoilguanidina está presente como uma base livre, um hidrato, um sal orgânico ou inorgânico, ou uma combinação dos mesmos.
3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadapelo fato de que compreende: 5-(l-metilpirazol-4-il)2-naftoilguanidina e 2’-C- metiladenosina; ou 5-(l-metilpirazol-4-il)2-naftoilguanidina e 2’-C-metilcitidina.
4. Uso de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadopelo fato de ser na preparação ou manufatura de um medicamento para o tratamento de Hepatite C.
5. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a referida composição é administrada por via intravenosa (iv), intraperitonial, subcutânea, intracraniana, intradérmica, intramuscular, intraocular, intratecal, intracerebral, intranasal, transmucosa, ou através de infusão oral, retal, ou através de gotejamento intravenoso, adesivo ou implante
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