ES2563477T3 - Composiciones antivirales para tratar la hepatitis C a base de 5-(1-metilpirazol-4-il)2-naftoilguanidina y 2'-C-metiladenosina o 2'-C-metilcitidina - Google Patents

Composiciones antivirales para tratar la hepatitis C a base de 5-(1-metilpirazol-4-il)2-naftoilguanidina y 2'-C-metiladenosina o 2'-C-metilcitidina Download PDF

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ES2563477T3 ES08782880.2T ES08782880T ES2563477T3 ES 2563477 T3 ES2563477 T3 ES 2563477T3 ES 08782880 T ES08782880 T ES 08782880T ES 2563477 T3 ES2563477 T3 ES 2563477T3
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virus
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Gary Dinneen Ewart
Carolyn Anne Luscombe
Michelle Miller
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Biotron Ltd
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Abstract

Una composición que contiene principios activos: (A) 5-(1-metilpirazol-4-il)2-naftoilguanidina, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, y (B) al menos otro agente con actividad antiviral elegido entre 2'-C-metiladenosina y 2'-C-metilcitidina, donde: 5-(1-metilpirazol-4-il)2-naftoilguanidina tiene la estructura.**Fórmula**

Description

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DESCRIPCION
Composiciones antivirales para tratar la hepatitis C a base de 5-(1-metilpirazol-4-il)2-naftoilguanidina y 2'-C- metiladenosina o 2'-C-metilcitidina
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a nuevas composiciones que tienen actividad contra el virus de la hepatitis C (HCV). La invencion tambien se refiere a metodos para retardar, reducir o de lo contrario inhibir la multiplicacion de HCV y/o su actividad funcional.
Antecedentes de la invencion
Cualquier discusion del estado anterior de la tecnica en toda esta memoria no se debe considerar en modo alguno como una admision de que dicho estado anterior de la tecnica es ampliamente conocido o forma parte del conocimiento general comun en el campo.
En la actualidad, existe una gran necesidad de desarrollo de nuevos tratamientos que sean eficaces contra las infecciones virales, particularmente contra las infecciones virales que se asocian con alta morbimortalidad, y que impactan en poblaciones de tamano considerable, por ejemplo el virus de la hepatitis C (HCV). Los tratamientos que estan disponibles en la actualidad son inadecuados o ineficaces en grandes proporciones de pacientes infectados con HCV.
La hepatitis C es una enfermedad viral infecciosa, transmitida por la sangre, que es causada por un virus hepatotropico denominado HCV. La infeccion puede causar inflamacion del hngado que suele ser asintomatica, pero la hepatitis cronica siguiente puede resultar en cirrosis (cicatrizacion fibrotica del tngado) y cancer de tngado. HCV es uno de los seis virus conocidos de la hepatitis: A, B, C, D, E, G y se propaga por contacto sangre a sangre con la sangre de una persona infectada. Los smtomas se pueden manejar medicamente, y una proporcion de pacientes puede ser depurada del virus mediante un largo tratamiento con medicamentos antivirales. Aunque la intervencion medica temprana es util, las personas con infeccion por HCV a menudo experimentan smtomas leves y por lo tanto no buscan tratamiento. Se estima que 150-200 millones de personas en todo el mundo estan infectadas con HCV. Las personas con antecedentes de uso de drogas intravenosas, uso de drogas inhaladas, tatuajes o que han estado expuestas a sangre a traves de relaciones sexuales sin proteccion, corren mayor riesgo de contraer esta enfermedad. La hepatitis C es la principal causa de trasplante de hngado en los Estados Unidos.
La hepatitis C se presenta como dos fases clmicas distintas. En primer lugar, la hepatitis C se presenta como hepatitis C aguda, que se refiere a los primeros 6 meses despues de la infeccion con hCv. Entre 60% y 70% de las personas infectadas no presenta smtomas durante la fase aguda. En la minona de pacientes que experimentan smtomas en la fase aguda, estos son generalmente leves e inespedficos, y rara vez conducen a un diagnostico espedfico de hepatitis C. Los smtomas de la infeccion de hepatitis C aguda incluyen disminucion del apetito, fatiga, dolor abdominal, ictericia, prurito y smtomas semejantes a los de la gripe.
El HCV generalmente es detectable en la sangre en el correr de una a tres semanas despues de la infeccion, y los anticuerpos contra el virus son generalmente detectables en el correr de 3 a 12 semanas. Aproximadamente 20-30% de las personas infectadas por HCV eliminan el virus de sus cuerpos durante la fase aguda como se muestra mediante la normalizacion en las pruebas funcionales hepaticas (LFT) como normalizacion de la alanina aminotransferasa (ALT) y la aspartato aminotransferasa (AST), asf como mediante la depuracion plasmatica del ARN de HCV (esto se conoce como depuracion viral espontanea). El 70-80% restante de los pacientes infectados con HCV avanza a hepatitis C cronica.
La hepatitis C cronica se define como la infeccion por HCV que persiste por mas de seis meses. Clmicamente, a menudo es asintomatica (sin ictericia) y en la mayona de los casos se descubre accidentalmente.
El curso natural de la hepatitis C cronica vana considerablemente de persona a persona. Practicamente todas las personas infectadas con HCV tienen evidencia de inflamacion en la biopsia de Idgado. Sin embargo, la velocidad de avance de la cicatrizacion hepatica (fibrosis) muestra una variabilidad significativa entre los individuos. Los datos recientes sugieren que entre los pacientes sin tratar, aproximadamente un tercio avanza a cirrosis hepatica en menos de 20 anos. Otro tercio avanza a cirrosis en el transcurso de 30 anos. El resto de los pacientes parece avanzar tan lentamente que es poco probable que presenten cirrosis durante su vida. Los factores que se ha divulgado que influyen en la velocidad de avance de la enfermedad de HCV incluyen edad, genero, consumo de alcohol, coinfeccion con VIH e hngado graso.
Los smtomas espedficamente sugestivos de enfermedad hepatica estan generalmente ausentes hasta que se ha producido una cicatrizacion considerable del hngado. Sin embargo, la hepatitis C es una enfermedad sistemica y los pacientes pueden experimentar un amplio espectro de manifestaciones clmicas que van desde ausencia de smtomas a una enfermedad mas sintomatica, antes de presentar enfermedad hepatica avanzada. Los signos y
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smtomas generalizados asociados a la hepatitis C cronica incluyen fatiga, marcada perdida de peso, smtomas semejantes a los de la gripe, dolor muscular, dolor en las articulaciones, fiebres intermitentes de pocos grados, prurito, trastornos del sueno, dolor abdominal, cambios en el apetito, nauseas, diarrea, dispepsia, cambios cognitivos, depresion, dolores de cabeza y cambios de humor.
Una vez que la hepatitis C cronica avanzo a cirrosis, pueden aparecer signos y smtomas que generalmente son causados por disminucion de la funcion hepatica o aumento de la presion en la circulacion hepatica, una afeccion conocida como hipertension portal. Los posibles signos y smtomas de la cirrosis incluyen ascitis, tendencia a formar hematomas y sangrar, dolor oseo, varices, heces grasas (esteatorrea), ictericia y un smdrome de deterioro cognitivo conocido como encefalopatia hepatica.
El diagnostico de la hepatitis C rara vez se hace durante la fase aguda de la enfermedad porque la mayoria de las personas infectadas no experimenta smtomas durante esta fase. Las personas que experimentan smtomas en la fase aguda rara vez estan suficientemente enfermos para buscar atencion medica. El diagnostico de la hepatitis C cronica es tambien un reto debido a la ausencia o la falta de smtomas espedficos hasta que aparece la enfermedad hepatica avanzada, que puede no ocurrir hasta decadas despues del inicio de la enfermedad.
El tratamiento actual ("estandar de atencion") es una combinacion de interferon alfa pegilado y el farmaco antiviral Ribavirina por un periodo de 24 o 48 semanas, dependiendo del genotipo del virus. Ademas, la eficacia de esta terapia de combinacion, en sus diversas formas, tambien depende del genotipo del virus y varia entre 14% y 82%.
El uso de nucleosidos para el tratamiento del virus de la hepatitis C se informa en Koch, U. y Narjes, F., "Recent Progress in the Development of Inhibitors of the Hepatitis C Virus RNA-Dependent RNA Polymerase", Current topics in Medicinal Chemistry, 2007, 7, 1302-329. La combinacion de BIT-225 con terapias anti-HCV se dan a conocer entre otras en Luscombe C.A. et al., Global Antiviral Journal, 2007, 3 (5), 69-70.
Para mejorar las perspectivas de tratamiento y la prevention de las infecciones virales y para hacer frente a la evolution viral en curso, existe una necesidad continua de identificar moleculas capaces de inhibir diversos aspectos del ciclo de vida viral. Por consiguiente, existe la necesidad de mas composiciones y agentes con actividad antiviral, nuevos.
Es un objetivo de la presente invention superar o mejorar al menos una de las desventajas del estado anterior de la tecnica o proporcionar una alternativa util.
Resumen de la invencion
La presente invencion se refiere a ciertas composiciones, composiciones preferentemente sinergicas, que contienen nuevos compuestos antivirales, utiles en el tratamiento de la infection por HCV, que estan comprendidas por la clasificacion de acilguanidinas sustituidas. Mas en particular la presente invencion se refiere a composiciones sinergicas que contienen una o mas acilguanidinas sustituidas y uno o mas compuestos antivirales conocidos.
Segun un primer aspecto, la presente invencion proporciona una composition para el tratamiento de HCV, que contiene los principios activos:
(A) 5-(1-metilpirazol-4-il)2-naftoilguanidina,
o una de sus sales farmaceuticamente aceptables, y
(B) al menos otro agente que tenga actividad antiviral elegido entre 2'-C-metiladenosina y 2-C-metilcitidina, donde:
5-(1-metilpirazol-4-il)2-naftoilguanidina tiene la estructura
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Ventajosamente, las composiciones de conformidad con la presente invencion son composiciones sinergicas en las que el efecto del compuesto y el al menos un agente antiviral adicional es mayor que la suma de los efectos del compuesto y del al menos un agente antiviral adicional, solos.
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Segun un segundo aspecto, la presente invention proporciona una composition farmaceutica para usar en tratamiento de HCV, que comprende una composicion segun el primer aspecto y uno o mas portadores o excipientes farmaceuticamente aceptables.
Segun un tercer aspecto, se proporciona una cantidad terapeuticamente eficaz de al menos un compuesto definido segun el primer aspecto y al menos un agente adicional con actividad antiviral elegido entre 2'-C-metiladenosina y 2'- C-metilcitidina para usar en el tratamiento de HCV de la invencion como una preparation combinada para el uso simultaneo, por separado o secuencial, en cualquier orden.
Los componentes individuales de la composicion se pueden administrar por separado de manera secuencial y en cualquier orden.
Las composiciones y formulaciones de la presente invencion se pueden administrar de cualquier manera, incluidas, pero no exclusivamente, por vfas intravenosa (iv), intraperitoneal, subcutanea, intracraneal, intradermica, intramuscular, intraocular, intratecal, intracerebral, intranasal, transmucosa, o por infusion oral, rectal, mediante goteo iv, parche o implante. Las composiciones pueden estar en forma de polvo, comprimido, capsula, lfquido, suspension u otra forma farmaceutica similar.
A menos que el contexto claramente requiera lo contrario, en toda la description y las reivindicaciones, las palabras "comprende(n)", "que comprende(n)", “contiene(n)”, “que contiene(n)” y similares se deben interpretar en un sentido inclusivo por oposicion a un sentido exclusivo o exhaustivo; es decir, en el sentido de "incluye(n), pero no exclusivamente".
Breve descripcion de las figuras
Figura 1: muestra graficamente la inhibition de la replication de GBV-B por BIT 225 y BIT100;
Figura 2: muestra graficamente una curva de dosis versus respuesta de diversas concentraciones de BIT 225 contra BVDV;
Figura 3: muestra graficamente una curva de dosis versus respuesta de diversas concentraciones de IFN contra BVDV;
Figura 4: muestra graficamente una curva de dosis versus respuesta de diversas concentraciones de Ribavirina contra BVDV;
Figura 5: muestra graficamente los niveles de inhibicion del virus observados con BIT225 31 nM y/o 1.25 pg de Ribavirina en presencia o ausencia de IFNa, y
Figura 6: muestra curvas de todo el espectro de dosis versus respuesta para BIT225 en presencia de 5 y 10 IU/ml de IFNa y muestra el efecto antiviral potenciado por adicion de 1.25 pg/ml. El recuadro muestra las curvas de todo el espectro de dosis versus respuesta para Ribavirina en presencia de 5 y 10 IU/ml de IFNa.
Figura 7: muestra curvas de dosis versus respuesta individuales para 2'-C-metiladenosina y 2'-C-metilcitidina contra BVDV.
Figuras 8 y 9: muestran los cambios en las curvas de dosis versus respuesta para BIT225 en presencia de diversas concentraciones de 2'-C-metiladenosina o 2'-C-metilcitidina, respectivamente.
Figura 10: muestra curvas de todo el espectro de dosis versus respuesta para BIT314 en presencia de diversas concentraciones de rIFNa-2b.
Figura 11 ilustra el efecto antiviral potenciado por adicion de 5 IU/ml de IFNa + 1.25 pg/ml de Ribavirina y 5 IU/ml de IFNa + 2.5 pg/ml de Ribavirina.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se refiere a composiciones para el tratamiento de HCV que contienen 5-(1-metilpirazol-4-il)2- naftoilguanidina,
o una de sus sales farmaceuticamente aceptables, en combination con al menos un agente adicional con actividad antiviral eligiendose el al menos un agente adicional con actividad antiviral entre 2'-C-metiladenosina y 2'-C- metilcitidina, donde:
5-(1-metilpirazol-4-il)2-naftoilguanidina tiene la estructura
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Un compuesto particularmente util para utilizar en composiciones de la presente invencion es BIT-225. Otros compuestos dados a conocer en este documento son los siguientes:
(3-benzoil)cinamoilguanidina que tiene la estructura
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2,3-metilenodioxicinamoil guanidina que tiene la estructura
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5-metil-2-naftoilguanidina que tiene la estructura
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3(indan-4-il)-propenoilguanidina que tiene la estructura
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5-bromo-6-metoxi-2-naftoilguanidina que tiene la estructura
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5-tiofen-3-il-2-naftoilguanidina que tiene la estructura
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5-(1-metilpirazol-4-il)2-naftoilguanidina que tiene la estructura
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(1-metoxi-2-naftoil)guanidina que tiene la estructura
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(3-metoxi-2-naftoil)guanidina que tiene la estructura
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(5-bromo-2-naftoil)guanidina que tiene la estructura
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(1,4-dimetoxi-2-naftoil)guanidina que tiene la estructura
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(6-(3-tienil)-2-naftoil)guanidina que tiene la estructura
(6-metil-2-naftoil)guanidina que tiene la estructura
(5-fenil-2-naftoil)guanidina que tiene la estructura
(5-(tien-2-il)-2-naftoil)guanidina que tiene la estructura
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(5-(1 -isobutil-1 H-pirazol-4-il)-2-naftoil)guanidina que tiene la estructura
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(5-(3-furil)-2-naftoil)guanidina que tiene la estructura
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(5-ddopropil-2-naftoN)guamdina
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(5-cloro-2-naftoil)guanidina
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acetato de (6-(1-metilpirazol-4-il)-2-naftoil)guanidinio
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(5-(2,6-dimetoxipiridin-3-il)-2-naftoil)guanidina
(5-(2-clorofenil)-2-naftoil)guanidina
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(5-(4-(acetilamino)fenil)-2-naftoil)guanidina
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(5-(3-(acetilamino)fenil)-2-naftoil)guanidina
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(5-(4-((metilsulfonil)amino)fenil)-2-naftoil)guanidina
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y sus sales farmaceuticamente aceptables. Los grupos amina o imina de la porcion guanidilo de los compuestos de formula I pueden estar presentes en cualquier forma convencional utilizada para la provision de dichos compuestos. Por ejemplo, pueden estar presentes como la base libre, un hidrato, una sal organica o inorganica o sus combinaciones.
Los metodos desarrollados para cribar los compuestos de la presente invencion en relacion con la actividad antiviral se describen en detalle en PCT/AU2004/000866.
La referencia a "HCV" se debe entender como una referencia a cualquier cepa del virus de la hepatitis C, incluidos los homologos y mutantes.
La referencia a la "actividad funcional" de HCV se debe entender como una referencia a una o mas de las funciones que realiza HCV o en las que esta involucrado.
La referencia a la "replication viral" se debe entender que incluye una o mas etapas o aspectos del ciclo de vida de HCV, como inhibir el ensamblado o la liberation de viriones. Por lo tanto, el metodo de la presente invencion abarca la mediation de la replicacion de HCV a traves de la induction de una cascada de pasos que conducen a la mediation de uno o mas aspectos o etapas del ciclo de vida de HCV.
La referencia a una "celula" infectada con HCV se debe entender como una referencia a cualquier celula, procariota o eucariota, que ha sido infectada con HCV. Esto incluye, por ejemplo, lmeas celulares inmortales o primarias, cultivos bacterianos y celulas in situ.
Los expertos entenderan que los compuestos de la invencion se pueden administrar en forma de una composition o formulation que contiene portadores y/o excipientes farmaceuticamente aceptables.
Las composiciones descritas en este documento que contienen los compuestos de la presente invencion, pueden incluir en combination uno o mas antivirales adicionales de cualquier tipo, por ejemplo, un inhibidor no nucleosidico de la ARN polimerasa dependiente del ARN de HCV (RdRP), un inhibidor nucleosidico de la ARN polimerasa
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dependiente del ARN de HCV (RdRP), un inhibidor no nucleosfdico de la ARN proteasa de HCV, un inhibidor nucleosfdico de la ARN proteasa de HCV, inhibidores no nucleos^dicos de la transcriptasa inversa (NNRTI), un inhibidor nucleosfdico de la transcriptasa inversa, un inhibidor de la entrada viral, interferon, interferon-PEG, ribavirina y sus combinaciones. Se entendera que los inhibidores nucleosfdicos y no nucleosfdicos incluyen las moleculas de los analogos de los nucleosidos y los no analogos de los nucleosidos. Los inhibidores de la polimerasa pueden dirigirse a NS5B y NS5A de HCV; los inhibidores de la proteasa pueden dirigirse a NS3 y NS4 de HCV.
Los ejemplos no limitantes de inhibidores de NS5B analogos de los nucleosidos que se pueden utilizar en terapias de combinacion y en las composiciones dadas a conocer en este documento, incluyen valopicitabina, un profarmaco del analogo de los nucleosidos 2'-C-metilcitosina; JTK103; R04048; R-1479/R-1626, analogo de los nucleosidos 4'- azidocitosina y su profarmaco; y R-7128. Los ejemplos no limitantes de inhibidores no analogos de los nucleosidos (NNRTI) que se pueden utilizar en las composiciones de la presente invencion incluyen HCV-796, un benzofurano inhibidor de la polimerasa de HCV; GL60667 o "667"; y XTL-2125. Los ejemplos no limitantes de inhibidores de la serina proteasa de NS3/4A de HCV que se pueden usar en las composiciones de la presente invencion incluyen VX- 950; SCH-503034; ACH-806/GS-9132; y BILN-2061 e ITMN-191.
Preferentemente, el al menos un agente adicional con actividad antiviral es un interferon (IFN). Aun mas preferentemente, el interferon se elige del grupo que consiste en los IFN tipo I y tipo II. Aun mas preferentemente el IFN se elige del grupo que consiste en IFNa, IFNp e IFNy. Todavfa mas preferentemente, el IFN se elige del grupo que consiste en IFN a-2a, IFN a-2b, IFNa-n3, IFNa con-1, IFNp-1a, IFN-p1, IFN-Ylb, peginterferon a-2b y peginterferon a-2a. Alternativamente, el al menos un agente adicional con actividad antiviral puede comprender uno o mas de IFNa-2b y Ribavirina; IFNa-2a y Ribavirina; IFNa-2a pegilado y Ribavirina o IFNa-2a pegilado y Ribavirina.
El al menos un agente adicional con actividad antiviral puede comprender uno o mas compuestos elegidos entre un inhibidor de la proteasa de HCV, un inhibidor de la polimerasa de HCV o un inhibidor de la serina proteasa de HCV. Alternativamente, el al menos un agente adicional con actividad antiviral puede comprender uno o mas compuestos elegidos entre un anticuerpo monoclonal, un extracto botanico, un inhibidor de NS5A, un inmunomodulador, un tiazolido, una terapia antifosfolfpidos, un compuesto antisentido, una isatoribina, un inmunoestimulante de amplio espectro, un inhibidor de la inflamacion/fibrosis, un inhibidor de la replicasa, un inhibidor de ciclofilina, un inhibidor de un imino azucar, un inhibidor de la pancaspasa o un anticuerpo policlonal.
Ademas, el al menos un agente adicional con actividad antiviral puede comprender uno o mas analogos de los nucleosidos antivirales como por ejemplo analogos de 2'-C-metil nucleosido. Segun la invencion, esto se eligen entre 2'-C-metiladenosina o 2'-C-metilcitidina.
El al menos un agente adicional con actividad antiviral puede tambien comprender una vacuna elegida entre una vacuna terapeutica o una vacuna a base de ADN.
Para una terapia de combinacion en la cual los compuestos de la presente invencion se usan conjuntamente con uno o mas compuestos antivirales convencionales o antagonistas de HCV, los compuestos se pueden administrar al sujeto antes de, a continuacion de, o simultaneamente con, el uno o mas compuestos o agentes antivirales convencionales.
Preferentemente, la composicion de la presente invencion es una composicion sinergica, en la que el efecto del compuesto y el al menos un agente adicional con actividad antiviral es mayor que la suma de los efectos del compuesto y del al menos un agente adicional con actividad antiviral, solos. Por supuesto, se entendera que tambien se contemplan las combinaciones simples, aditivas, de nuevos compuestos y antivirales existentes.
El sujeto de la inhibicion viral es un mairnfero, por ejemplo, pero no exclusivamente, un ser humano, un primate, un animal de ganado, por ejemplo, una oveja, una vaca, un caballo, un burro o un cerdo; un animal de comparua por ejemplo un perro o un gato; un animal para pruebas de laboratorio, por ejemplo un raton, un conejo, una rata, un conejillo de indias o un hamster; o un animal salvaje cautivo, por ejemplo, un zorro o un ciervo. Preferentemente, el sujeto es un primate. Muy preferentemente, el sujeto es un ser humano.
La presente invencion es particularmente util en el tratamiento y la profilaxis de la infeccion por HCV. Por ejemplo, en sujetos infectados con HCV, la actividad antiviral puede ser afectada para evitar la replicacion de HCV previniendo asf el inicio de la hepatitis C aguda o cronica. Alternativamente, el metodo de la presente invencion se puede utilizar para reducir la carga serica de HCV o para aliviar los smtomas de la infeccion por HCV.
La presente invencion puede ser particularmente util en etapas tempranas de la infeccion por HCV para evitar el establecimiento de un deposito de HCV en celulas afectadas o como tratamiento profilactico a ser aplicado inmediatamente antes de la exposicion o durante un penodo luego de la exposicion a una posible fuente de hCv.
Las referencias en este documento a "terapeutico" y "profilactico" se deben considerar en sus contextos mas amplios. El termino "terapeutico" no implica necesariamente que se trate a un mamffero hasta la recuperacion total. Analogamente, "profilactico" no significa necesariamente que el sujeto no contraera finalmente una afeccion
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patologica. Por consiguiente, terapia y profilaxis incluyen el mejoramiento de los smtomas de una afeccion particular o prevenir o de lo contrario reducir, el riesgo de sufrir una afeccion particular. El termino "profilaxis" se puede considerar como reducir la intensidad de aparicion de una afeccion particular. La terapia tambien puede reducir la gravedad de una afeccion existente o la frecuencia de ataques agudos.
De conformidad con la presente invencion, se puede coadministrar mas de una composicion con uno o mas de otros agentes terapeuticos. Mediante "coadministrar" se quiere dar a entender la administracion simultanea en la misma formulacion o en dos formulaciones diferentes a traves de la misma via o vfas diferentes, o la administracion secuencial por la misma via o vfas diferentes. Mediante administracion "secuencial" se quiere dar a entender una diferencia en el tiempo de segundos, minutos, horas o dfas entre la administracion de un compuesto y el siguiente. La composicion y los agentes terapeuticos adicionales se pueden administrar en cualquier orden.
Las vfas de administracion incluyen, pero no exclusivamente, las vfas intravenosa (iv), intraperitoneal, subcutanea, intracraneal, intradermica, intramuscular, intraocular, intratecal, intracerebral, intranasal, transmucosa, o por infusion oral, rectal, mediante goteo iv, parche o implante. Se prefieren particularmente las vfas intravenosas.
La presente invencion tambien se extiende a formas adecuadas para la aplicacion topica como cremas, lociones y geles.
En otra realizacion, la presente invencion proporciona una formulacion para la administracion pulmonar o nasal destinada al tratamiento de HCV que comprende una composicion de conformidad con el primer aspecto de la invencion.
Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en una forma farmaceutica unitaria para facilitar la administracion y la uniformidad de dosis. Formas farmaceuticas unitarias segun se usa en este documento se refiere a unidades ffsicamente diferenciadas adecuadas como unidades de dosificacion para los sujetos marnfferos que se van a tratar; donde cada unidad contiene una cantidad predeterminada de principio activo, calculada para producir el efecto terapeutico deseado, en asociacion con el portador farmaceutico necesario. La especificacion para las nuevas formas farmaceuticas unitarias de la invencion son dictadas por y dependen directamente de (a) la caractenstica unica del principio activo elegido y el efecto particular a alcanzar, y (b) las limitaciones inherentes al arte de preparar compuestos.
Los procedimientos para la preparacion de formas farmaceuticas unitarias y preparaciones topicas estan facilmente accesibles a los expertos en textos como Pharmaceutical Handbook. A Martindale Companion Volume Ed. Ainley Wade 19a edicion The Pharmaceutical Press London, CRC Handbook of Chemistry and Physics Ed. Robert C. Weast Ph D. CRC Press Inc.; Goodman y Gilman's; The Pharmacological basis of Therapeutics. 9a Ed. McGraw Hill; Remington; y The Science and Practice of Pharmacy. 19a Ed. Ed. Alfonso R. Gennaro Mack Publishing Co. Easton Pensilvania.
Las cantidades eficaces contempladas por la presente invencion variaran dependiendo de la gravedad de la afeccion y de la salud y la edad del receptor. En terminos generales, las cantidades eficaces pueden variar entre 0.01 ng/kg de peso corporal y alrededor de 100 mg/kg de peso corporal.
La presente invencion se describira ahora en mas detalle por referencia a los ejemplos espedficos pero no limitantes que describen protocolos de smtesis, inhibicion viral y otras propiedades antivirales de los compuestos de la presente invencion. La smtesis y el cribado de compuestos con actividad antiviral se pueden lograr mediante la gama de metodologfas descrita en este documento o descrita en mas detalle en PCT/AU2004/000866.
Se debe entender, sin embargo, que la descripcion detallada de los procedimientos, compuestos y metodos espedficos se incluye unicamente con el proposito de ejemplificar la presente invencion. No se debe entender en modo alguno como una restriccion de la descripcion amplia de la invencion dada a conocer previamente.
Ejemplos
La actividad antiviral de todos los compuestos de la presente invencion puede ser, y ha sido, verificada empleando los metodos descritos en este documento o descritos en detalle en PCT/AU2004/000866. Se pueden usar otros metodos para la smtesis de los compuestos de la invencion, tanto genericos como espedficos, descritos en este documento, descritos en publicaciones de referencia o en cualquier otra parte conocida por los expertos, para preparar todos los compuestos de la presente invencion. Tambien se proporcionan protocolos de smtesis utiles en PCT/AU2006/000880.
Mas espedficamente, las acilguanidinas se pueden sintetizar mediante diversos metodos que incluyen hacer reaccionar la guanidina (generalmente generada in situ a partir de su sal de clorhidrato) con un derivado adecuadamente activado de un acido carboxflico. Los ejemplos incluyen:
i) smtesis a partir de cloruros de acido, ejemplificada por Yamamoto et al., Chem. Pharm. Bull., 1997, 45, 1282
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ii) smtesis a partir de esteres simples, ejemplificada por la patente US 2,734,904.
iii) smtesis a partir de acidos carboxflicos, a traves de activacion in situ mediante carbonildiimidazol, ejemplificada por la patente US 5,883,133
Los precursores de los acidos carboxflicos necesarios para la preparacion de las acilguanidinas descritas en este documento se obtuvieron mediante una variedad de metodos diferentes. Un gran numero de acidos cinamicos sustituidos estan disponibles en el comercio. Ademas, numerosos procedimientos para la smtesis de acidos cinamicos sustituidos y sus esteres simples estan bien descritos en el area, que incluyen:
i) La reaccion del acido malonico con un aldetndo aromatico y una base (la condensacion de Doebner), descrita en Chemical Reviews, 1944, 35, 156, y las referencias contenidas alff.
ii) La reaccion del antndrido acetico con un aldetndo aromatico y una base (la reaccion de Perkin), descrita en Organic Reactions, 1942, 1, 210, y las referencias contenidas alff.
iii) La reaccion del acido acrffico y sus esteres simples con un haluro aromatico o triflato aromatico empleando catalizador de paladio (la reaccion de Heck), descrita en Organic Reactions, 1982, 28, 345, y las referencias contenidas alff.
iv) La reaccion del fosfonoacetato de trialquilo con un aldetndo aromatico y una base (la reaccion de Horner- Emmons), descrita en Organic Reactions, 1977, 25, 73, y las referencias contenidas allt
Un numero de acidos naftoicos simples, sustituidos con halo, hidroxi y alcoxi, o bien se encuentran en el comercio o son conocidos en el area y estos proporcionan los materiales de partida para las naftoilguanidinas sustituidas.
Los acidos naftoicos que estan sustituidos con grupos alquilo, cicloalquilo, arilo y heterodclico se pueden preparar a menudo haciendo reaccionar un acido halonaftoico con un reactivo organo metalico adecuado usando un catalizador de un metal de transicion. Una variante de esta metodologfa que se uso para preparar varios acidos naftoicos sustituidos utilizados como precursores para las naftoilguanidinas descritas en este documento, fue la reaccion de formacion de un enlace carbono-carbono, catalizada por paladio, entre acidos bromonaftoicos y un acido boronico sustituido adecuado (o ester boronato), que es ampliamente conocida en el area como acoplamiento de Suzuki (descrito en Chemical Reviews, 1995, 95, 2457 y las referencias de ese documento). La reaccion tiene una amplia aplicabilidad y se puede usar sobre una serie de halo naftalenos sustituidos que despues se pueden elaborar adicionalmente para introducir o enmascarar el grupo acido carboxffico necesario.
1. Metodologfa de smtesis general
1.1 Procedimiento general A -Preparacion de triflatos de arilo
A una solucion del fenol (10 mmol) en piridina (7 mL) a 0 °C se le agrego lentamente anhffdrido trifluorometanosulfonico (11 mmol, 1.1 eq). La mezcla resultante se agito a 0 °C durante otros 5 minutos antes de dejar que se calentara hasta temperatura ambiente y se agito hasta que el analisis por TLC mostro que el fenol de partida habfa sido consumido. Despues la mezcla se vertio en agua y se extrajo con acetato de etilo (x 3). Los extractos combinados se lavaron secuencialmente con agua, acido cloff'ffdrico 1 M, agua y solucion saturada de cloruro de sodio, despues se secaron (MgSO4) y se concentraron al vacm para dar el producto crudo. Los productos crudos se sometieron a cromatograffa en gel de sffice. La elucion con una mezcla de acetato de etilo/hexanos dio los triflatos de arilo deseados, generalmente como aceites incoloros.
1.2 Procedimiento general B - Esteres de cinamato a traves de la reaccion de Heck de los triflatos
Una mezcla de triflato de fenilo (10 mmol), acrilato de metilo (14 mmol, 1.4 eq), trietilamina (40 mmol, 4 eq) y diclorobis(trifenilfosfina)paladio (0.3 mmol, 0.03 eq) en dimetilformamida (30 mL) se calento a 90 °C. La reaccion se monitoreo por GC/MS y se agregaron lotes recien preparados de acrilato de metilo (1 eq), trietilamina (2 eq) y el catalizador de paladio (0.03 eq) segun fue necesario, en un esfuerzo por forzar la reaccion a completarse. Despues la mezcla se vertio en agua y se extrajo con una mezcla de eter dietffico/hexanos 1:1 (x 3). Los extractos combinados se lavaron con agua y despues solucion saturada de cloruro de sodio, se secaron (MgSO4), se filtraron a traves de una almohadilla de gel de sffice y el filtrado se concentro al vacm para dar el producto crudo como un aceite. Los productos crudos se sometieron a cromatograffa en gel de sffice. La elucion con una mezcla de acetato de etilo/hexanos dio los metil cinamatos deseados, generalmente como aceites incoloros.
1.3 Procedimiento general C - Esteres de cinamato a traves de la reaccion de Heck de bromuros
Se agregaron bromuro de arilo (10 mmol), acetato de paladio (0.1 mmol, 0.01 eq) y tri-o-tolilfosfina (0.4 mmol, 0.04 eq) al matraz de reaccion y se purgo con nitrogeno. A esto se le agregaron despues acrilato de metilo (12.5 mmol, 1.25 eq), trietilamina (12.5 mmol, 1.25 eq) y dimetilformamida (1 mL) y la mezcla se calento a 100 °C. La reaccion se monitoreo por GC/MS y se agregaron lotes recien preparados de acetato de paladio (0.01 eq), tri-o-tolilfosfina (0.04 eq), acrilato de metilo (1.25 eq) y trietilamina (1.25 eq) segun fue necesario, en un esfuerzo para forzar la reaccion a completarse. Despues la mezcla se vertio en agua y se extrajo con una mezcla de eter diefflico/hexanos 1:1 (x 4). Los extractos combinados se lavaron con agua y despues solucion saturada de cloruro de sodio, se secaron
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(MgSO4), se filtraron a traves de una almohadilla de gel de s^lice y el filtrado se concentro al vado para dar el producto crudo. Los productos crudos se sometieron a cromatograffa en gel de sflice. La elucion con una mezcla de acetato de etilo/hexanos dio los metil cinamatos deseados, generalmente como aceites incoloros.
1.4 Procedimiento general D - Esteres de cinamato a traves de la reaccion de Horner-Emmons
Se agrego una solucion de fosfonoacetato de trietilo (13 mmol, 1.3 eq) en tetrahidrofurano anhidro (10 mL) en el transcurso de 5 minutos, a una suspension de hidruro de sodio (14.3 mmol, 1.4 eq) en tetrahidrofurano anhidro (10 mL) a 0 °C bajo flujo de nitrogeno. La mezcla se agito despues a 0 °C durante 20 minutos. Luego se agrego una solucion del benzaldehffdo (10 mmol) en tetrahidrofurano (15 mL) en el transcurso de 10 minutos, a 0 °C. La mezcla se agito a 0 °C durante otros 30 minutos antes de dejarla en agitacion a temperatura ambiente hasta que el analisis por GC/MS o TLC mostro que todo el material de partida de benzaldehffdo se hada consumido. Habitualmente, las reacciones se dejaron en agitacion a temperatura ambiente toda la noche para asegurar el consumo completo del aldehffdo de partida. La mezcla se vertio en agua, la capa organica se separo y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (x 3). Los extractos organicos combinados se lavaron despues con agua y despues con solucion saturada de cloruro de sodio, se secaron en (MgSO4) y se concentraron al vado para dar el producto crudo. Los productos crudos se sometieron a cromatograffa en gel de sflice. La elucion con una mezcla de acetato de etilo/hexanos dio los etil cinamatos deseados generalmente como aceites incoloros.
1.5 Procedimiento general E - Preparacion de esteres 5-fenilpenta-2,4-dienoicos
Se agrego una solucion de 4-fosfonocrotonato de trietilo (26 mmol, 1.3 eq) en tetrahidrofurano anhidro (10 mL) en el transcurso de 5 minutos, a una suspension de hidruro de sodio (28 mmol, 1.4 eq, suspension al 60% en aceite) en tetrahidrofurano anhidro (15 mL), a 0 °C, bajo flujo de nitrogeno. La mezcla se agito a 0 °C durante 20 minutos. Despues se agrego una solucion del benzaldehffdo (20 mmol) en tetrahidrofurano (10 mL) en el transcurso de 10 minutos, a 0 °C. La mezcla se agito a 0 °C durante otros 30 minutos antes de dejarla en agitacion a temperatura ambiente hasta que el analisis por GC/MS mostro que el aldehffdo de partida se hada consumido. La mezcla de reaccion se vertio en agua, la capa organica se separo y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (x 3). Despues los extractos organicos combinados se lavaron con agua, y despues con solucion saturada de cloruro de sodio, se secaron (MgSO4) y se concentraron al vado para dar el ester efflico crudo como un aceite. Los productos crudos se sometieron a cromatograffa en gel de sflice. La elucion con una mezcla de acetato de etilo/hexanos dio los esteres efflicos deseados, generalmente como aceites incoloros.
1.6 Procedimiento general F - Hidrolisis de esteres
Una solucion del ester (10 mmol) en metanol (50 mL) y agua (5 mL) se trato con una solucion acuosa de hidroxido de potasio 6 M (20 mmol, 2 eq) y la mezcla se calento a reflujo hasta que el analisis por TLC mostro que no hada mas material de partida presente (habitualmente 2-3 horas). Despues la mezcla se vertio en agua (50-200 mL), se acidifico con acido clorhffdrico concentrado hasta aproximadamente pH 2. El acido carboxflico resultante se recogio por filtracion, se lavo con agua y se seco toda la noche en alto vado.
1.7 Procedimiento general G - Reacciones de Suzuki acidos bromonaftoicos
Se agregaron el acido bromo-2-naftoico (2 mmol), el acido boronico adecuado (o ester boronato) (2.2 mmol), tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0) (0.1 mmol) y carbonato de sodio solido (6.8 mmol) al matraz de reaccion, que despues se purgo con nitrogeno. Se agregaron acetonitrilo (6 mL) y agua (2.5 mL) y la mezcla se calento a reflujo con agitacion vigorosa hasta que el acido bromo-2-naftoico de partida se hubo consumido. La mezcla de reaccion se particiono despues en tolueno (50 mL) y solucion de hidroxido de sodio 0.5 M (100 mL). La capa acuosa se lavo con tolueno (para eliminar toda la trifenilfosfina, 3 x 20 mL) y despues se acidifico hasta pH 1 con acido clorhffdrico concentrado. Los derivados del acido naftoico se extrajeron en acetato de etilo (4 x 20 mL). Los extractos de acetato de etilo combinados se lavaron con agua (3 x 20 mL) y solucion saturada de cloruro de sodio (10 mL), despues se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron. El residuo se analizo por 1H NMR, y se sometio a cromatograffa en gel de sflice (cuando fue necesario).
1.8 Procedimiento general H - Preparacion de acilguanidinas
A una suspension/solucion de acido carboxflico (10 mmol, 1.0 eq) en diclorometano (30 mL) que contema una gota de dimetilformamida se le agrego cloruro de oxalilo (12 mmol, 1.2 eq) que causo que la solucion esferveciera. Despues de agitar durante 2 h, la solucion resultante se evaporo hasta sequedad a presion reducida. El residuo se disolvio en tetrahidrofurano seco (30 mL) y se agrego a una solucion de clorhidrato de guanidina (50 mmol, 5.0 eq) en hidroxido de sodio acuoso 2 M (30 mL). La reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1 h y despues se separo la capa de tetrahidrofurano. La capa acuosa se extrajo con cloroformo (100 mL) seguido de acetato de etilo (100 mL) y las capas organicas combinadas se evaporaron a presion reducida. El residuo resultante se particiono entre cloroformo (200 mL) e hidroxido de sodio acuoso 2 M (100 mL) y la capa organica se separo y se seco (Na2SO4). La solucion se filtro y se evaporo a presion reducida hasta el momento en que comenzo a precipitar un
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solido. En ese momento se agregaron hexanos que causaron precipitacion del producto que se recogio por filtracion y se seco en alto vado.
2. Ejemplos experimentales espedficos de smtesis Ejemplo 1: 4-Hidroxiindano
Se agrego 4-aminoindano (3.0 g) a una solucion de acido sulfurico concentrado (2.4 mL) en agua (15 mL). Se agrego mas agua (15 mL) y la mezcla se enfrio hasta 5 °C. Una solucion de nitrito de sodio (1.71 g) en agua (4.5 mL) se agrego en porciones a la mezcla, mientras se mantema la temperatura por debajo de 5 °C. Despues que se completo la adicion, se permitio que la mezcla alcanzara la temperatura ambiente y se agrego urea (0.29 g). La mezcla se agito durante otros 5 minutos antes de ser calentada a 45 °C durante 30 minutos. Despues la mezcla se enfrio hasta temperatura ambiente y se extrajo con acetato de etilo. Los extractos organicos combinados se lavaron con hidroxido de sodio acuoso 2 M (2 x 100 mL) y esos extractos acuosos se acidificaron despues con acido clorhffdrico y se extrajeron con acetato de etilo (3 x 100 mL). Los extractos organicos combinados se lavaron despues con solucion saturada de cloruro de sodio y se secaron (Na2SO4) antes de concentrarlos al vado. El producto crudo resultante se sometio a cromatograffa en gel de sflice. La elucion con acetato de etilo/hexanos (1:7) dio 4-hidroxiindano como un aceite anaranjado (1.0 g).
Ejemplo 2: Triflato de 4-indanilo
A una solucion de 4-hidroxiindano (1.2 g, 8.9 mmol) en piridina (5 mL) a 0 °C se le agrego lentamente anhffdrido trifluorometanosulfonico (1.6 mL, 9.8 mmol). La mezcla resultante se agito a 0 °C durante 5 minutos antes de permitirle alcanzar la temperatura ambiente y despues se agito durante 45 minutos. Despues la mezcla se vertio en agua y se extrajo con acetato de etilo (3 x 25 mL). Los extractos combinados se lavaron secuencialmente con agua, acido clorhffdrico acuoso 1 M, agua y solucion saturada de cloruro de sodio, despues se secaron (Na2SO4) y se concentraron al vado para dar el triflato crudo como un aceite anaranjado (2.13 g, 89%).
Ejemplo 3: 3-(Indan-4-il)acrilato de metilo
Una mezcla de triflato de 4-indanilo crudo (2.13 g, 8.0 mmol), acrilato de metilo (1.01 mL, 11.2 mmol), trietilamina (4.4 mL, 32 mmol, 4 eq) y diclorobis(trifenilfosfina)paladio (170 mg 0.24 mmol) en dimetilformamida (15 mL) se calento a 85 °C durante 71 horas. Se extrajo una pequena affcuota y se proceso por analisis de GC/MS que revelo que una cantidad significativa de material de partida estaba todavfa presente. Se agregaron mas acrilato de metilo (0.7 mL), trietilamina (2 mL) y catalizador de paladio (170 mg) y la mezcla se calento durante otras 24 horas. Despues la mezcla se vertio en agua, se extrajo con acetato de etilo, y los extractos organicos se lavaron con agua y despues solucion saturada de cloruro de sodio, se secaron (Na2SO4), y se concentraron al vado para dar el producto crudo como un aceite (2.4 g). El producto crudo se sometio a cromatograffa en gel de sflice. La elucion con acetato de etilo/hexanos (1:19) dio el triflato de partida (812 mg, 38%) como un aceite incoloro, seguido del 3-(indan- 4-il)acrilato de metilo deseado, como un aceite marron (880 mg, 54%).
Ejemplo 4: 3-Benzoilcinamato de metilo
A una mezcla de 3-bromobenzofenona (5.0 g, 19 mmol), acetato de paladio (215 mg, 0.958 mmol) y tri-o-tolilfosfina (290 mg, 0.953 mmol) se le agrego trietilamina (3.3 mL, 45 mmol), tolueno (4 mL) y acrilato de metilo (2.2 mL, 27 mmol). La mezcla se calento a 100 °C durante 18 horas momento en el cual el analisis de TLC mostro que la reaccion era todavfa incompleta. Se agregaron porciones adicionales de acetato de paladio (215 mg, 0.958 mmol), tri-o-tolilfosfina (290 mg, 0.953 mmol), trietilamina (3.3 mL, 45 mmol) y acrilato de metilo (2.2 mL, 27 mmol), y la mezcla se calento a 110 ° durante otras 18 horas. Despues de enfriar hasta temperatura ambiente la mezcla se vertio en agua y se extrajo con acetato de etilo (3 x 100 mL). Los extractos organicos combinados se lavaron secuencialmente con agua y solucion saturada de cloruro de sodio, despues se secaron (MgSO4) y se concentraron hasta obtener un aceite marron (5.3 g). El aceite se sometio a cromatograffa en gel de sflice. La elucion con acetato de etilo/hexanos (1:9) produjo 3-benzoilcinamato de metilo (4.6 g, 91%) como un solido amarillo.
Ejemplo 5: Acido 3-benzoilcinamico
Se agrego hidroxido de potasio acuoso 5 M (10 mL, 50 mmol) a una solucion de 3-benzoilcinamato de metilo (2.5 g, 9.4 mmol) en metanol (20 mL) y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla se concentro y se acidifico hasta pH 1 usando acido clorhffdrico acuoso 1 M. El precipitado resultante se recogio por filtracion y se seco al vado para dar acido 3-benzoilcinamico (2.2 g, 93%) como un solido amarillo.
Ejemplo 6: Acido 5-(1-metil-1H-pirazol-4-il)-2-naftoico
Una mezcla de acido 5-bromo-2-naftoico (2.12 g, 8.44 mmol), 1-metil-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)- 1H-pirazol (1.84 g, 8.86 mmol) y tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0) (502 mg, 0.435 mmol) en un balon de 250 mL se evacuo y se purgo con nitrogeno (en tres ciclos). Se agregaron a la mezcla acetonitrilo (40 mL) y carbonato de sodio
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acuoso 2 M (10 mL) mediante una jeringa, y la mezcla se calento a reflujo bajo flujo de nitrogeno durante 22 horas. La mezcla de reaccion se dejo enfriar antes de la adicion de acido clorlmdrico acuoso 1 M (30 mL) y luego se extrajo con acetato de etilo (3 x 50 mL). Las capas organicas combinadas se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron al vado para proporcionar un producto crudo (2.98 g despues de secar al aire). Este material crudo se disolvio en etanol caliente (150 mL) y se filtro mientras estaba caliente para eliminar una impureza amarilla (120 mg). El filtrado se concentro al vado y el residuo se recristalizo de diclorometano (30 mL) para proporcionar acido 5-(1- metil-1H-pirazol-4-il)-2-naftoico como un solido blanco (724 mg, 34%). Se obtuvo una segunda cosecha de acido 5- (1-metil-1H-pirazol-4-il)-2-naftoico (527 mg, 25%) a partir de los licores madre concentrados por recristalizacion de diclorometano (20 mL).
Ejemplo 7: 5-(1-Metil-1H-pirazol-4-il)-2-naftoilguanidina
Se agrego cloruro de oxalilo (1.1 mL, 13 mmol) a una solucion de acido 5-(1-metil-1H-pirazol-4-il)-2-naftoico (1.19 g, 4.71 mmol) en diclorometano anhidro (200 mL (que se agrego en porciones durante la reaccion para efectuar la disolucion)) que contema dimetilformamida (2 gotas) bajo flujo de nitrogeno y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 4.25 horas. La mezcla de reaccion se calento despues durante 1 hora a 40 °C, antes de ser concentrada a presion reducida. El cloruro de acido crudo resultante se suspendio en tetrahidrofurano anhidro (50 mL) y esta mezcla se agrego gota a gota a una solucion de clorhidrato de guanidina (2.09 g, 21.9 mmol) en hidroxido de sodio acuoso 2 M (15 mL, 30 mmol) y la mezcla de reaccion se agito despues durante 30 minutos. Se separo la fase organica, y la fase acuosa se extrajo con cloroformo (3 x 30 mL) seguido de acetato de etilo (3 x 30 mL). Los extractos organicos combinados se lavaron secuencialmente con hidroxido de sodio acuoso 1 M (60 mL) y agua (40 mL), despues se secaron (Na2SO4) y se concentraron al vado para dar un solido vftreo (1.45 g despues se secar en alto vado). Este solido se disolvio en diclorometano que despues se dejo evaporar lentamente para dar 5-(1-metil- 1H-pirazol-4-il)-2-naftoilguanidina como un solido amarillo (1.15 g, 83%).
Ejemplo 8: 2,3-Metilenodioxicinamato de etilo
Se agrego gota a gota fosfonoacetato de trietilo (4.05 mL, 20.2 mmol) a una suspension en agitacion de hidruro de sodio (0.80 g, 20 mmol) en tetrahidrofurano anhidro (20 mL) a 0 °C bajo flujo de nitrogeno. La mezcla se agito a 0°C durante 20 minutos. Se agrego gota a gota una solucion de 2,3-metilenodioxibenzaldelmdo (2.50 g, 16.7 mmol) en tetrahidrofurano (10 mL) a 0 °C. La mezcla se agito durante 2 horas tiempo durante el cual se permitio que alcanzara la temperatura ambiente. La mezcla se vertio en agua (250 mL) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 250 mL). Despues los extractos organicos combinados se lavaron con solucion saturada de cloruro de sodio, se secaron en (MgSO4) y se concentraron al vado. El producto crudo se sometio a cromatograffa en gel de sflice. La elucion con acetato de etilo/hexanos (1:10) dio 2,3-metilenodioxicinamato de etilo como un solido incoloro (3.50 g, 92%).
Ejemplo 9: Acido 2,3-metilenodioxicinamico
Una solucion de 2,3-metilenodioxicinamato de etilo (3.40 g) en metanol (25 mL) y agua (5 mL) se trato con una solucion de hidroxido de potasio (4.3 g) en agua (25 mL). La mezcla se agito toda la noche a temperatura ambiente antes de ser concentrada al vado hasta la mitad de su volumen original. Despues el concentrado se acidifico con HCl concentrado para dar acido 2,3-metilenodioxicinamico como un solido incoloro (2.81 g, 95%) que se recogio por filtracion y se seco toda la noche al vado.
Ejemplo 10: 2,3-Metilenodioxicinamoilguanidina
Se agrego cloruro de oxalilo (0.68 mL, 7.8 mmol) a una suspension de acido 2,3-metilenodioxicinamico (500 mg, 2.6 mmol) en diclorometano (5 mL) que contema una gota de dimetilformamida. La mezcla se agito durante 2.5 horas y la solucion resultante se evaporo hasta sequedad a presion reducida. El residuo se disolvio en tetrahidrofurano seco (5 mL) y se agrego a una solucion de clorhidrato de guanidina (1.24 g, 13 mmol) en hidroxido de sodio acuoso 2 M (8 mL). La reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1 hora y despues se le agrego cloroformo. El precipitado resultante del producto crudo (100 mg) se recogio por filtracion. El filtrado se extrajo con cloroformo (3 x 30 mL) y acetato de etilo (20 mL). Los extractos organicos combinados se lavaron con hidroxido de sodio acuoso 2M (20 mL) y agua (20 mL), se secaron (Na2SO4) y se concentraron a presion reducida para dar otra cantidad de producto crudo (400 mg). Las dos cosechas de producto crudo se combinaron, se suspendieron en cloroformo (10 mL) y se agitaron vigorosamente durante 20 minutos. La 2,3-metilenodioxicinamoilguanidina resultante (420 mg) se recogio por filtracion y se seco al vado.
Ejemplo 11: Actividad antiviral de compuestos utilizando el metodo de bioensayo bacteriano
El metodo de bioensayo bacteriano utilizado en el presente ejemplo para determinar la actividad antiviral de los compuestos contra diferentes objetivos virales se describio en detalle en PCT/2004/000866. Este ensayo se utiliza conjuntamente con los ensayos de GBV-B y BVDV que se describen a continuacion, para asegurar que se identifican todos los principios activos, algunos de los cuales son activos en uno o el otro de los ensayos, mientras que algunos compuestos pueden ser activos en ambos ensayos.
En resumen, el bioensayo bacteriano para activar potenciales compuestos anti-HCV se basa en la protema canal ionico p7 de HCV. p7 es una protema de membrana, pequena, codificada por HCV, que tiene una actividad funcional que sustenta la multiplicacion y/o la replicacion virales.
5 El fragmento de ADNc sintetico que codifica a p7, cDp7.coli, en el cual se optimizaron los codones para la expresion de la protema p7 en E. coli, se clono en el plasmido de expresion pPL451, creando el vector pPLp7, en el cual la expresion de p7 es inducible por la temperatura, como se describe en detalle en PCT/2004/000866. La inhibicion de la multiplicacion de las celulas de E. coli que expresan p7 a 37 °C se observo como un indicador de la funcion de p7 de canal ionico que disipa el gradiente de Na+ normal mantenido por las celulas bacterianas. Halos de crecimiento 10 alrededor del sitio de aplicacion de un compuesto particular indican que el compuesto tiene expresion inhibida de la actividad de canal ionico de p7 que previene el crecimiento en ausencia del compuesto.
Los resultados acumulados de las pruebas de bioensayo bacteriano obtenidas durante un penodo de tiempo y promediados, se resumen en la tabla 1 a continuacion.
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Tabla 1: Media de las puntuaciones del ensayo bioensayo bacteriano para los compuestos de la invencion
Nombre del compuesto
N° BIT Puntuacion promedio del ensayo bacteriano p7 de HCV
(3-benzoil)cinamoilguanidina
216 1.3
2,3-metilenodioxicinamoil guanidina
217 1.0
5-metil-2-naftoilguanidina
218 1.7
3(indan-4-il)-propenoilguanidina
222 2.0
5-bromo-6-metoxi-2-naftoilguanidina
223 0.5
5-tiofen-3-il-2-naftoilguanidina
224 1.10
5-(1-metilpirazol-4-il)2-naftoilguanidina
225 1.20
3,4-diclorocinamoil guanidina
300 1.12
(1-metoxi-2-naftoil)guanidina
301 0.25
(3-metoxi-2-naftoil)guanidina
302 0.76
(5-bromo-2-naftoil)guanidina
303 0.62
(1,4-dimetoxi-2-naftoil)guanidina
304 0.60
(6-(3-tienil)-2-naftoil)guanidina
305 0.08
(6-metil-2-naftoil)guanidina
306 0.07
(5-fenil-2-naftoil)guanidina
307 0.46
(5-(tien-2-il)-2-naftoil)guanidina
308 0.55
(5-(1-isobutil-1H-pirazol-4-il)-2-naftoil)guanidina
310 0.36
(5-(3-furil)-2-naftoil)guanidina
311 0.81
(5-ciclopropil-2-naftoil)guanidina
312 1.00
(5-cloro-2-naftoil)guanidina
313 1.30
acetato de (6-(1-metilpirazol-4-il)-2-naftoil)guanidinio
314 4.03
(5-(2,6-dimetoxipiridin-3-il)-2-naftoil)guanidina
315 0.20
(5-(2-clorofenil)-2-naftoil)guanidina
316 0.37
(5-(4-(acetilamino)fenil)-2-naftoil)guanidina
317 0.06
(5-(3-(acetilamino)fenil)-2-naftoil)guanidina
318 0.73
(5-(4-((metilsulfonil)amino)fenil)-2-naftoil)guanidina
319 0.10
CONTROL POSITIVO DEL ENSAYO
(3-bromocinamoil)guanidina
BIT06 7 2.00
5-bromo-2-fluorocinamoilguanidina
BIT12 4 2.70
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Los controles positivos se usaron en este ensayo para asegurar que el ensayo estaba funcionando en vez de para la comparacion de actividades relativas de los compuestos. Un resultado por encima de cero indica que el compuesto tiene potencial actividad antiviral.
Ejemplo 12 -Prueba de inhibidores de p7 contra el virus de la hepatitis C.
La prueba de la eficacia antiviral de nuevos potenciales farmacos para HCV se hace diffcil por la falta de un sistema modelo generalmente accesible de cultivo celular para HCV. Se probaron los inhibidores de p7 propuestos utilizando sistemas sustitutos de flavivirus, en particular sistemas de GBV-B y BVDV (Virus de la Diarrea Viral Bovina).
GBV-B es el flavivirus mas estrechamente relacionado al HCV, comparte 27-33% de identidad de secuencia de nucleotidos y 28% de similitud de aminoacidos en la secuencia polipeptfdica completa. Este virus representa un sistema sustituto excelente para HCV porque infecta primates pequenos del Nuevo Mundo y se replica eficazmente in vitro en cultivos de hepatocitos primarios de mono titf (PMH). El homologo de GBV-B de p7 de HCV se denomina p13. En este documento se muestra que un peptido sintetico correspondiente a las dos helices transmembrana C- terminales de p13 (que comparten la mayor homologfa con p7) forma un canal ionico selectivo para cationes que, como el canal p7, es bloqueado por amantadina (Premkumar et al., 2006). Por otra parte, a diferencia de p7, HMA no inhibe los canales p13. Estas observaciones confirman que los dos canales homologos comparten caractensticas estructurales similares, pero no identicas.
Se probo la capacidad de loscompuestos BIT elegidos, identificados por cribado con el ensayo bacteriano de inhibidores de p7 de HCV, para inhibir la replicacion de GBV-B en hepatocitos primarios de mono titf (vease la figura 1). Los hepatocitos se inocularon 3 dfas despues de haberlos distribuido en placas con 10 x TCID50 de suero de mono titf positivo para GBV-B. El HCV se adsorbio durante dos horas, y despues las celulas se lavaron tres veces y se cultivaron durante dos dfas en medio exento de suero (SFM) recien preparado, complementado con hormonas y factores de crecimiento. El virus liberado al sobrenadante del cultivo se midio como el numero de copias del ARN viral, determinado mediante RT-PCR en tiempo real. Se agregaron los compuestos, disueltos en DMSO, al medio o bien 30 min antes de la inoculacion del virus ("pretratamiento"), o inmediatamente despues de los pasos de inoculacion y lavado ("post tratamiento"). Se incluyeron en los experimentos controles sin tratamiento, negativo (solo DMSO) y positivo (10 pg/ml de Poli I:C). La citotoxicidad de los compuestos hacia los hepatocitos se evaluo mediante un ensayo MTT estandar.
El resultado mas llamativo fue en las celulas tratadas previamente con BIT225 20 pM, en las cuales no se detecto virus en el sobrenadante del cultivo. BIT100 20 pM redujo la replicacion del virus en mas de 1.0 log e inhibio el virus con mas fuerza que el control positivo de poli I:C. La eficacia tanto de BIT225 como de BIT100 se redujo algo cuando los compuestos se agregaron post inoculacion, lo que sugiere que los compuestos pueden actuar en una etapa muy temprana del ciclo de vida del virus. Ninguno de los compuestos de la figura 1 mostro citotoxicidad para los hepatocitos a 20 pM
BVDV pertenece al genero Pestivirus de Flaviviridae y es ampliamente utilizado como un sistema modelo sustituto para la identificacion de potenciales antivirales contra HCV debido a las muchas similitudes de su estructura genomica, productos genicos y ciclos de replicacion. Ademas, a diferencia de GBV-B, que solo puede ser cultivado en hepatocitos primarios, BVDv se multiplica facilmente en cultivo tisular y las cepas comunmente utilizadas son citopaticas, lo que facilita la prueba de farmacos antivirales. El homologo de p7 de HCV de BVDV ha demostrado formar un canal ionico y ser esencial para la generacion de partfculas virales infecciosas (Harada et al., 2000 y Griffin et al., 2005).
La evaluacion antiviral de los compuestos BIT elegidos contra BVDV se subcontrato a Southern Research Institute (SRI), Fredrick MD Estados Unidos. Se utiliza un formato de citoproteccion simple en el cual se evalua la eficacia antiviral de los compuestos mediante su capacidad para reducir el efecto citopatico de la infeccion por BVDV en celulas de rinon bovino Madin-Darby (Buckwold et al., 2003)
Se empleo un procedimiento de ensayo de inhibicion de efectos citopatogenos (ECP) inducidos por virus para evaluar la actividad antiviral de compuestos contra el virus de la diarrea viral bovina (BVDV) cepa NADL, en celulas de rinon bovino Madin-Darby (MDBK) con pasajes en matraces T-75 (1, 2). Se disenaron ensayos antivirales para probar seis concentraciones semi-log de cada compuesto por triplicado contra el virus de provocacion. Se corrieron simultaneamente con las muestras de prueba, controles de celulas (CC) que conteman solo medio, controles de celulas infectadas por virus (VC) que conteman medio y virus, controles de citotoxicidad del farmaco que conteman medio y cada concentracion del farmaco, controles de reactivo que conteman solo medio de cultivo (sin celulas), y controles colorimetricos del farmaco que conteman farmaco y medio (sin celulas). Se uso interferon-a 2b humano como compuesto de control positivo. El dfa anterior al ensayo, las celulas se tripsinizaron, se sedimentaron, se contaron y se resuspendieron a una concentracion de 1 x 104/pocillo en medio de cultivo tisular en placas de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocillos en un volumen de 100 pl por pocillo. Un dfa despues de la distribucion de celulas en placa, las celulas se lavaron y el medio se reemplazo con medio completo (2% de suero) que contema diversas concentraciones del compuesto de prueba diluido en medio en series semi logantmicas. Justo antes de cada experimento se retiro del freezer (-80 °C) una alfcuota del virus pretitulada. El virus se diluyo en medio de
cultivo tisular de modo que la cantidad de virus agregada a cada pocillo produjera una muerte celular completa a los 6-7 dfas post infeccion. Las placas se incubaron a 37 °C en una atmosfera humidificada que contema 5% de CO2 hasta que se observo un ECP maximo en los cultivos de control del virus sin tratar (~dfa 7). La inhibicion de ECP por el compuesto se determino usando el Cell Titer 96 (Promega). Se utilizo un metodo colorimetrico para determinar el 5 numero de celulas viables. Se uso un programa informatico para calcular el porcentaje de reduccion de ECP de los pocillos infectados por virus y el porcentaje de viabilidad celular de los pocillos de control de farmaco sin infectar. Se calcularon la concentracion inhibitoria minima del farmaco que reduce ECP en 50% (CI50) y la concentracion toxica minima del farmaco que causa la reduccion de celulas viables en 50% (CT50) usando un programa de analisis de regresion con ajuste semi log de la curva. Se determino un mdice terapeutico (selectividad) (IT50) para cada principio 10 activo dividiendo la CT50 entre la CI50.
Se midio la citotoxicidad del farmaco por separado en celulas sin infectar. Once compuestos BIT se probaron en el primer experimento en el cual se agregaron los compuestos a las celulas justo antes de la infeccion y se mantuvieron durante todo el experimento. Dos de ellos, BIT225 y BIT314 devolvieron valores de CI50 sub- 15 micromolares (vease la tabla 2 a continuacion).
Tabla 2 - Eficacia antiviral vs. BVDV en celulas MDBK
Compuesto
0 01 -P. CT59 lA
BIT-225
0.53 pM 11.6 pM 21.7
BIT-300
N/A 3.69 pM N/A
BIT-124
N/A 5.21 pM N/A
BIT-33
3.64 pM 25.2 pM 6.91
BIT-143
4.66 pM 17.0 pM 3.65
BIT-93
16.7 pM >30.0 pM >1.80
BIT-123
N/A 9.92 pM N/A
BIT-137
N/A 16.5 pM N/A
BIT-110
N/A 16.8 pM N/A
BIT-314
0.21 pM 11.6 pM 54.2
BIT-223
4.38 pM >30.0 pM >6.85
IFN-a
20.6 IU/mL >500IU/mL >24.3
N/A = no se alcanzo
Un ensayo de repeticion subsiguiente con BIT225 devolvio un valor de CI50 similar de 0.33 pM. Tambien se probaron 20 otros compuestos de la invencion, como se muestra en la tabla 2a a continuacion.
N° BIT
BVDVCIso hM
BIT314
0.39
BIT313
964
B1T225
1.27
BIT312
8.63
S1T311
2.96
BIT302
7.21
BIT310
- ■ . >2&. ' ■
BJT306
14.5
BIT303
13.6
BIT 304
?‘.r.
BIT317
6.02
B1T308
B.73
B1T307 BIT316 BIT310 BIT301 BIT315 BIT319 BJT305 BIT309
1.99 mmmm wif-i
Tabla 2a
5
10
15
20
25
30
Ejemplo 13 - Inhibicion de HCV usando una combinacion de BIT225 con IFN o Ribavirina. (Ejemplo de referencia)
Se probaron combinaciones de BIT225/IFN y BIT225/Ribavirina contra el virus. Las figuras 2, 3 y 4 muestran que cada farmaco individualmente produjo los valores de CE50 siguientes: BIT225, 314nM; rIFNa-2b, 21.7 lU/ml; pero para Ribavirina por sf misma, solo se detecto muy poca actividad antiviral del orden de hasta 20*g/ml.
Se calcularon los efectos de las combinaciones de farmacos sobre la actividad de cada compuesto cuando se probo solo. La proteccion antiviral aditiva esperada, se sustrajo de la actividad antiviral determinada experimentalmente a cada concentracion de la combinacion, resultando en un valor positivo (sinergia), un valor negativo (antagonismo) o cero (aditividad). El volumen de sinergia (en unidades de veces concentracion porcentaje veces concentracion, por ejemplo, |jM2%, nM2%, nM|jM%, y similares) se calculo en el intervalo de confianza de 95%. Para estos estudios, la sinergia se definio como las combinaciones de farmacos que producen volumenes de sinergia superiores a 50. La actividad ligeramente sinergica y la actividad altamente sinergica se definieron operativamente como las que producen volumenes de sinergia de 50-100 y >100, respectivamente. Las interacciones de farmacos aditivas tienen volumenes de sinergia en el intervalo de -50 a 50, mientras que volumenes de sinergia entre -50 y -100 se consideran ligeramente antagonistas y los < -100 altamente antagonistas.
La tabla 3 resume los resultados de los estudios de combinacion: BIT225 e IFN tuvieron un volumen de sinergia promedio de 87 IU/mljM% lo que indica ligera sinergia, aunque se observa que el valor es proximo al corte de "altamente sinergico" y en uno de los tres experimentos se encontro que la interaccion era altamente sinergica. Curiosamente, la combinacion de BIT225/Ribavirina fue ligeramente antagonista. En estos experimentos, en los que la Ribavirina por sf misma no tuvo actividad antiviral, el resultado indica que la Ribavirina estaba antagonizando la fuerte actividad antiviral de BIT225.
Aunque en este documento hubo un intento de "graduar" el grado de sinergia entre combinaciones diferentes de compuestos antivirales, se debe entender que el termino "sinergia" tambien se usa comunmente en su sentido absoluto y por consiguiente cualquier nivel de sinergia se considera pertinente y significativo con respecto a las combinaciones de la presente invencion.
Tabla 3 - Ensayo de combinacion de BVDV
Compuestos
Esquema de combinacion
BIT225 & rlFNa-2b
8 diluciones a la mitad de BIT225; concentracion de prueba alta a 4 jM
BIT225 & Ribavirina
8 diluciones a la mitad de BIT225; concentracion de prueba alta a 4 jM
5 diluciones a la mitad de Ribavirina; concentracion de prueba alta a 20 jg/mL
Eficacia antiviral Citotoxicidad
Ensayo
Sinergia/Antagonismo Interpretacion Sinergia/Antagonismo volumen (IU/mLnM%) Interpretacion
BIT225 & rlFNa-2b; 1a
72 / -2 IU/mLjM% Ligeramente sinergica 3 / -2 IU/mLjM% Aditiva
BIT225 & rlFNa-2b; 2a
106 / 0 IU/mLjM% Altamente sinergica 0 / -10 IU/mLjM% Aditiva
BIT225 & rlFNa-2b; 3a
84 / 0 IU/mLjM% Ligeramente sinergica 0 / -9 IU/mLjM% Aditiva
BIT225 & rlFNa-2b; prom.
87 / -1 IU/mLjM% Ligeramente sinergica 1 / -7 IU/mLjM% Aditiva
BIT225 & Ribavirina; 1a
4 / -62 jg/mLjM% Ligeramente antagonista 4 /-7 jg/mLjM% Aditiva
BIT225 & Ribavirina; 2a
0 / -89 Ligeramente antagonista 0 / -6 jg/mL)jM% Aditiva
BIT225 &
0 / -65 Ligeramente 3/0 jg/mLjM% Aditiva
Compuestos
Esquema de combinacion
Ribavirina; 3a
antagonista
BIT225 & Ribavirina; prom.
1 / -72 pg/mLpM% Ligeramente antagonista 2 / -4 pg/mLpM% Aditiva
Ejemplo 14 - Inhibicion de HCV usando una combinacion de BIT225, IFN y Ribavirina (Ejemplo de referencia)
Los resultados de los estudios de combinacion anteriores revelaron sinergia entre las actividades antivirales de 5 BIT225 e IFNa. Es bien sabido tambien a partir de la bibliograffa que aunque la Ribavirina tiene muy poca actividad contra BVDV por sf misma (vease la figura 4), el compuesto potencia la actividad antiviral del IFNa. Curiosamente, aunque se ha informado de un ligero antagonismo entre la Ribavirina y BIT225 (vease la tabla 3), esto se observo predominantemente a las mayores concentraciones probadas de ambos farmacos.
10
15
Se probo el efecto de una combinacion de BIT225, IFNa y Ribavirina. Se eligieron y se probaron dos concentraciones fijas, sub CE50 de IFNa (5 y 10 IU/ml) contra concentraciones variables de BIT225 y Ribavirina: Se probaron 8 diluciones a la mitad de BIT225 a partir de la concentracion de prueba alta de 4 pM y 5 diluciones a la mitad de Ribavirina a partir de la concentracion de prueba alta de 20 pg/ml. Los resultados, presentados en la tabla 4, muestran actividades antivirales altamente sinergicas entre BIT225 y Ribavirina a las 2 concentraciones fijas de IFNa probadas.
Tabla 4
Compuestos
Esquema de combinacion
Concentracion fija de rlFNa-2b
Con fija concentracion fija de rlFNa-2b (5 IU/mL);
5 diluciones a la mitad de Ribavirina; concentracion de prueba alta a 20 pg/mL;
(5 IU/mL) combinada con cantidades variables de BIT-225 & Ribavirina
8 diluciones a la mitad de BIT225; concentracion de prueba alta a 4 pM
Concentracion fija de rlFNa-2b
Con fija concentracion fija de rlFNa-2b (10 IU/mL);
5 diluciones a la mitad de Ribavirina; concentracion de prueba alta a 20 pg/mL;
(10 IU/mL) combinada con cantidades variables de BIT-225 & Ribavirina
8 diluciones a la mitad de BIT225; concentracion de prueba alta a 4 pM
Eficacia antiviral Citotoxicidad
Ensayo
Volumen de Sinergia/Antagonismo Interpretacion Volumen de Sinergia/Antagonismo Interpretacion
Concentracion fija de rlFNa-2b (5 IU/mL) combinada con cantidades variables de BIT-225 & Ribavirina
138 / 0 pg/mLpM% Altamente sinergica 0 / -59 pg/mLpM% Ligeramente antagonista
Concentracion fija de rlFNa-2b (10 IU/mL) combinada con cantidades variables de BIT-225 & Ribavirina
127 / 0 pg/mLpM% Altamente sinergica 0 / -67 pg/mLpM% Ligeramente antagonista
5
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30
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40
45
El analisis posterior de los datos revelo 70% de inhibicion de ECP viral para la combinacion de 5 lU/ml de IFNa mas la menor concentracion probada de BIT225 (31 nM), mas la menor concentracion probada de Ribavirina (1.25 |jg/ml). Las mismas bajas concentraciones de BIT225 y Ribavirina en presencia de 10 lU de IFNa produjeron 90% de inhibicion del virus. A efectos de comparar, de los estudios anteriores 5 lU/ml de IFNa solo da ~8% de inhibicion; BIT225 31 nM solo da ~5% de inhibicion; y 1.25 jg/ml de Ribavirina sola no muestra actividad antiviral. Claramente la triple combinacion es altamente eficaz contra BVDV.
La figura 5 muestra los niveles de inhibicion del virus observados con BIT225 31 nM y/o 1.25 jg de Ribavirina en presencia o ausencia de IFNa.
La figura 6 muestra curvas de todo el espectro de dosis versus respuesta para BIT225 en presencia de 5 y 10 IU/ml de IFNa y muestra el efecto antiviral potenciado por adicion de 1.25 jg/ml. El recuadro muestra las curvas de todo el espectro de dosis versus respuesta para Ribavirina en presencia de 5 y 10 IU/ml de IFNa.
Los valores de CE50 para BIT225 en presencia de 5 o 10 IU/ml de IFNa se determinaron como 92 (95% CI: 22 - 385) nM y 71 (95% CI: 41-1240) nM, respectivamente, mediante ajuste sigmoidal estandar de la curva con el software Prism con la pendiente Hill constrenida. Un ajuste similar de la curva permitiendo una pendiente de Hill variable produce valores de CE50 equivalentes o 149 y 125 nM, de conformidad con los valores determinados en el experimento previo.
No fue posible determinar los valores de CE50 para los datos de los experimentos en los cuales se agrego Ribavirina porque todas las combinaciones de farmacos probadas produjeron >70% de inhibicion de ECP viral.
Resumen
Los estudios de combinacion con el compuesto BIT225 muestran que:
• BIT225 solo tiene buena actividad antiviral con un valor de CE50 de 314 nM (95% CI: 295-333).
• BIT225 muestra sinergia en combinacion con IFNa; el valor de CE50 de BIT225 en presencia de 5 IU/ml de IFNa se redujo a ~92 nM (95% CI: 22 - 385).
• La triple combinacion de BIT225, IFNa y Ribavirina es fuertemente sinergica, produciendo 70% de inhibicion de ECP del virus con tan poco como BIT225 31nM, 5 IU/ml de IFNa y 1.25 jg/ml de Ribavirina.
• La inhibicion completa del virus se puede lograr con diversas combinaciones de los tres compuestos: por ejemplo; 5 IU/ml de IFNa + BIT225 500 nM + 2.5 jg/ml de Ribavirina, o; 10 IU/ml de IFNa + BIT225 31 nM + 2.5 jg/ml de Ribavirina.
Ejemplo 15 - Inhibicion de HCV usando una combinacion de BIT225 con analogos de los nucleosidos 2'-C- metiladenosina o 2'-C-metilcitidina.
Los analogos de los nucleosidos de la presente invencion se pueden sintetizar usando los protocolos descritos en Hecker SJ et al (2007) J. Med Chem. 50(16), 3891-6 (para 2'-C-metiladenosina) y Antiviral Research (2007) 73(3), 161-8 (para 2'-C-metilcitidina). Los analogos de los nucleosidos tambien se pueden obtener de fuentes comerciales como NANJING BAIFULI TECHNOLOGY CO., LTD.(NAN JING BAI FU LI KE JI YOU XIAN ZE REN GONG SI), RM 701 , BLDG 15, High-Tech Zone, Nanjing, 210061, P.P.CHINA
Tabla 5 - Ensayo de combinacion de BVDV
Compuestos
Esquema de combinacion
BIT225 & 2'-C-metiladenosina
8 diluciones a la mitad de BIT225; concentracion de prueba alta a 4 jM
5 diluciones a la mitad de 2'-C-metiladenosina; concentracion de prueba alta a 10 jM
BIT225 & 2'-C-metilcitidina
8 diluciones a la mitad de BIT225; concentracion de prueba alta a 4 jM
5 diluciones a la mitad de 2'-C-metilcitidina; concentracion de prueba alta a 10 jM
BIT314 & rlFNa-2b
8 diluciones a la mitad de BIT314; concentracion de prueba alta a 4 jM
5 diluciones a la mitad de rlFNa-2b; concentracion de prueba alta a 80 IU/mL
Concentracion fija de rlFNa-2b (5 IU/mL)
Con fija concentracion fija de rlFNa-2b (5 IU/mL);
5
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Compuestos
Esquema de combinacion
combinada con cantidades variables de BIT- 314 & Ribavirina
8 diluciones a la mitad de BIT-314; concentracion de prueba alta a 4 jM;
5 diluciones a la mitad de Ribavirina; concentracion de prueba alta a 20 jg/mL
Eficacia antiviral
Citotoxicidad
Ensayo
Volumen de Sinergia/Antagonismo Interpretacion Volumen de Sinergia/Antagonismo Interpretacion
BIT225 & 2'-C- metiladenosina
106.62 / -3.41 jM2% Altamente sinergica 1.91 / -53.29 jM2% Ligeramente antagonista
BIT225 & 2'-C- metilcitidina
71.23 / 0 jM2% Ligeramente sinergica 0 / -18.31jM2% Aditiva
BIT314 & rlFNa-2b
311.42 / -2.11 jMIU/mL% Altamente sinergica 0 / -1.84 jMIU/mL% Aditiva
Concentracion fija de rlFNa-2b (5 IU/mL) combinada con cantidades variables de BIT- 314 & Ribavirina
361.68 / -12.19 jMjg/mL% Altamente sinergica 22.65 / -0.34 jMjg/mL% Aditiva
La tabla 5 anterior resume los resultados de los estudios de combinacion con el compuesto BIT225 y los analogos de los nucleosidos, y las combinaciones del compuesto BIT314 con IFN y/o Ribavirina.
Como se muestra en este documento, se probaron las combinaciones de BIT225/2'-C-metiladenosina y BIT225/2'-C- metilcitidina contra el virus. La figura 7 muestra que cada analogo de los nucleosidos fue activo individualmente con los valores de CE50 siguientes: 2-C-metiladenosina CE50 = 2.16 jM (95% CI: 1.54 a 3.03 jM); 2'-C-metilcitidina CE50 = 2.75 jM (95% CI: 0.86 a 8.7 jM).
Al igual que antes, se calcularon los efectos de las combinaciones de farmacos sobre la actividad de cada compuesto cuando se probaron solos. La proteccion antiviral aditiva esperada, se sustrajo de la actividad antiviral determinada experimentalmente a cada concentracion de combinacion que resulto en un valor positivo (sinergia), un valor negativo (antagonismo) o cero (aditividad). El volumen de sinergia (en unidades de veces concentracion porcentaje veces concentracion, por ejemplo, jM2%, nM2%, nMjM%, y similares) se calculo en el intervalo de confianza de 95%. Para estos estudios, la sinergia se definio como las combinaciones de farmacos que producen volumenes de sinergia superiores a 50. La actividad ligeramente sinergica y la actividad altamente sinergica se definieron operativamente como las que producen volumenes de sinergia de 50-100 y >100, respectivamente. Las interacciones de farmacos aditivas tienen volumenes de sinergia en el intervalo de -50 a 50, mientras que volumenes de sinergia entre -50 y -100 se consideran ligeramente antagonistas y los < -100 son altamente antagonistas.
La tabla 5 resume los resultados de los estudios de combinacion: BIT225 y 2'-C-metiladenosina tuvieron un volumen
2
de sinergia promedio de 106 jM % lo que indica "alta" sinergia. BIT225 y 2'-C-metilcitidina tuvieron un volumen de sinergia promedio de 71 jM2% lo que indica "ligera" sinergia.
Las figuras 8 y 9 muestran los cambios en las curvas de dosis versus respuesta para BIT225 en presencia de diversas concentraciones de 2'-C-metiladenosina o 2'-C-metilcitidina, respectivamente.
Ejemplo 16 - Inhibicion de HCV usando una combinacion de BIT314 con IFN. (Ejemplo de referencia)
Se probaron combinaciones de BIT314/IFN contra el virus. Dos experimentos previos con BIT314 probado individualmente contra BVDV produjeron valores de CE50 de, 210 nM y 390 nM (promedio = 300 nM). Analogamente, hemos determinado previamente un valor de CE50 de 21.7 IU/ml para rIFNa-2b. La figura 10 incluye la curva de dosis versus respuesta para BIT314, determinada en un tercer experimento, que fue parte de esos estudios de combinacion. En ese experimento la CE50 para BIT314 fue de 540 nM.
Al igual que antes, se calcularon los efectos de las combinaciones de farmacos sobre la actividad de cada compuesto cuando se probaron solos como se describe en el ejemplo 15. La tabla 5 resume los resultados de los
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
estudios de combinacion: BIT314 e IFN tuvieron un volumen de sinergia promedio de 311 |jMIU/ml% lo que indica "alta" sinergia.
Ejemplo 17 - Inhibicion de HCV usando triples combinaciones de BIT314, IFN y Ribavirina (Ejemplo de referencia) Los resultados de los estudios de combinacion anteriores revelaron sinergia entre las actividades antivirales de BIT314 e IFNa. Es bien sabido tambien a partir de la bibliograffa que aunque la Ribavirina tiene muy poca actividad contra BVDV por sf misma (vease la figura 4), el compuesto potencia la actividad antiviral del IFNa.
Se probo el efecto de una combinacion de BIT314, IFNa y Ribavirina. Se eligio y se probo una unica concentracion fija, sub CE50, de IFNa (5 IU/ml) contra concentraciones variables de BIT314 y Ribavirina: se probaron 8 diluciones a la mitad de BIT314 a partir de una concentracion de prueba alta de 4 jM y 5 diluciones a la mitad de Ribavirina a partir de una concentracion de prueba alta de 20 jg/ml. Los resultados, resumidos en la tabla X, muestran actividades antivirales altamente sinergicas entre BIT314 y Ribavirina en presencia de IFNa: volumen de sinergia/antagonismo de 361 jMjg/ml%. 4
La figura 10 muestra curvas de todo el espectro de dosis versus respuesta para BIT314 en presencia de diversas concentraciones de rIFNa-2b y la figura 11 ilustra el efecto antiviral potenciado por adicion de 5 IU/ml de IFNa + 1.25 jg/ml de Ribavirina y 5 IU/ml de IFNa + 2.5 jg/ml de Ribavirina. El valor de CE50 para BIT314 solo, en este experimento, fue de 540 nM (95% CI: 389 a 739 nM) y; en presencia de 5 IU/ml de IFNa mas 1.25 jg/ml de Ribavirina fue de 183 nM (95% CI: 148 a 226 nM), segun se determino por ajuste sigmoidal estandar de la curva realizado con el software Prism.
Resumen
Los estudios de combinacion con el compuesto BIT314 muestran que:
• BIT314 solo tiene una buena actividad antiviral con un valor de CE50 promedio de 380 nM (SEM 95.4, n = 3)).
• BIT314 muestra sinergia en combinacion con IFNa; el valor de CE50 de BIT314 en presencia de 40 IU/ml de IFNa se reduce a aproximadamente 60 nM.
• La triple combinacion de BIT314, IFNa y Ribavirina es fuertemente sinergica, produciendo 70% de inhibicion de ECP del virus con tan poco como BIT314 62 nM, 5 IU/ml de IFNa y 2.5 jg/ml de Ribavirina.
• La inhibicion completa del virus se puede lograr con diversas combinaciones de los tres compuestos. Por ejemplo; 5 IU/ml de IFNa + BIT314 250 nM + 2.5 jg/ml de Ribavirina, o; 5 IU/ml de IFNa + BIT314 500 nM + 1.25 jg/ml de Ribavirina.
Referencias
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Claims (5)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    REIVINDICACIONES
    1. Una composicion que contiene principios activos:
    (A) 5-(1-metilpirazol-4-il)2-naftoilguanidina, o una de sus sales farmaceuticamente aceptables, y
    (B) al menos otro agente con actividad antiviral elegido entre 2'-C-metiladenosina y 2'-C-metilcitidina, donde:
    5-(1-metilpirazol-4-il)2-naftoilguanidina tiene la estructura
    imagen1
  2. 2. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el grupo amina o imina de la porcion guanidilo de 5- (1-metilpirazol-4-il)2-naftoilguanidina esta presente como la base libre, un hidrato, una sal organica o inorganica o una de sus combinaciones.
  3. 3. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 donde la composicion contiene: 5-(1-metilpirazol-4-il)2-naftoilguanidina y 2'-C-metiladenosina; o 5-(1-metilpirazol-4-il)2-naftoilguanidina y 2'-C-metilcitidina
  4. 4. Una composicion farmaceutica para usar en el tratamiento de HCV, que comprende una composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 junto con uno o mas portadores o excipientes farmaceuticamente aceptables.
  5. 5. Una cantidad terapeuticamente eficaz de 5-(1-metilpirazol-4-il)2-naftoilguanidina, o una de farmaceuticamente aceptables, y al menos un agente adicional con actividad antiviral elegido metiladenosina y 2'-C-metilcitidina, para usar en el tratamiento de la infeccion por HCV como una combinada para el uso simultaneo, por separado o secuencial, en cualquier orden, donde: 5-(1-metilpirazol-4-il)2-naftoilguanidina tiene la estructura
    imagen2
    sus sales entre 2'-C- preparation
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