JP5030587B2 - 抗ウイルスアシルグアニジン化合物および方法 - Google Patents

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Description

本発明は、ウイルス増殖、および／または機能活性を妨害、低下、または阻害する方法に関する。本発明はまた、この方法に使用するのに適した化合物および組成物に関する。
従来より、ウイルス感染、特に罹患率および死亡率が高く、しかも多くの人々に影響を及ぼすウイルス感染に対して有効な新規の治療法の開発が非常に必要とされている。現在利用可能な治療法は、感染患者において高い割合で不適切であるかまたは効果的でない。
例えば、ＡＩＤＳ症状を改善させ余命を延長させる際、ウイルス逆転写酵素とタンパク質分解酵素類を標的にした薬物によって、成果のある手段が達成された（Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓａｒｖｅｒ、１９９７；Ｍｉｔｓｕｙａ，１９９２；Ｍｏｏｒｅ，１９９７；Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｙ、１９９７）。しかし、ＨＩＶ感染に完璧に有効な単独治療法はまったくない（Ｂａｒｒｙら、１９９８；Ｄｅｅｋｓ，１９９８；Ｍｉｌｅｓ，１９９７；Ｍｉｌｅｓ、１９９８；Ｍｏｙｌｅら、１９９８；Ｒａｃｈｌｉｓ ａｎｄ Ｚａｒｏｗｎｙ，１９９８；Ｖｅｉｌら、１９９７；Ｖｏｌｂｅｒｄｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｅｋｓ，１９９８；Ｖｏｌｂｅｒｄｉｎ，１９９８）。
ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＡＵ９９／００８７２は、化合物類５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）−アミロライドおよび５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）−アミロライドのＨＩＶ感染治療における用途を記載している。
ヒト病原体として考えられている重要な別のウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）である。これは、ヒト健康に対するコストと関連経済コストの両方の観点から重要なヒト病原体である。ＨＣＶは慢性肝炎と肝硬変の原因となり、肝補充手術の主要な指標である。２００２年、米国だけで４００万以上の人々が感染しており、およそ８，０００乃至１０，０００人が慢性ＨＣＶ感染で毎年死亡しているとＣｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎは推定している。治癒法またはワクチンは全く知られていない。さらに効果的な薬剤が早急に必要となっている。
さらに周知の病原性ウイルス族は、コロナウイルスである。コロナウイルス類（Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ目、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ属）は、小胞体−ゴルジ中間体コンパートメントまたはｃｉｓ−ゴルジネットワークから派生するエンベロープを有する正鎖ＲＮＡウイルス類である（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓｔｅｇｅｎら、１９９８；Ｍａｅｄａ，Ｍａｅｄａら、１９９９；Ｃｏｒｓｅ ａｎｄ Ｍａｃｈａｍｅｒ ２０００；Ｍａｅｄａ，Ｒｅｐａｓｓら、２００１；Ｋｕｏ ａｎｄ Ｍａｓｔｅｒｓ ２００３）。
コロナウイルス類は、ヒトおよび動物に感染し、あらゆる動物に感染するコロナウイルスが存在するであろうと考えられている。２種のヒトコロナウイルス類２２９ＥおよびＯＣ４３は、普通の風邪の主要原因であると知られており、時には、高齢者、新生児または免疫妥協患者において肺炎を引き起こす（Ｐｅｉｒｉｓ、Ｌａｉら、２００３）。動物コロナウイルス類は、その宿主において呼吸器、消化管、神経系、または肝疾患類を引き起こす（Ｐｅｉｒｉｓ、Ｌａｉら、２００３）。数種の動物コロナウイルス類は、重大な獣医学的病原体である（Ｒｏｔａ，Ｏｂｅｒｓｔｅら、２００３）。
重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）は、新たに確認されたウイルスが原因である。ＳＡＲＳは、最近になってアジア、北アメリカおよびヨーロッパで報告された呼吸器疾患である（Ｐｅｉｒｉｓ、Ｌａｉら、２００３）。ＳＡＲＳの原因物質は、コロナウイルスと同定された（Ｄｒｏｓｔｅｎ，Ｇｕｎｔｈｅｒら、２００３；Ｋｓｉａｚｅｋ，Ｅｒｄｍａｎら、２００３；Ｐｅｉｒｉｓ、Ｌａｉら、２００３）。世界保健機構(ＷＨＯ)により２００２年１１月１日から２００３年７月１１日までのＳＡＲＳが原因と報告された合計症例数は、８，４３７例で、死亡８１３例であり、およそ死亡率１０％である。ＳＡＲＳは撲滅されないで風邪やインフルエンザウイルスのように季節ごとに大流行を引き起こすであろうと考えられている（Ｖｏｇｅｌ、２００３）。
ウイルス感染を治療し予防する見通しを改善するため、現在さまざまなウイルスライフサイクルの面を阻害できる分子類を明らかにする必要がある。
本発明の目的は、先行技術の欠点の少なくともひとつを克服または改善すること、または有用な代替手段を提供することである。
本明細書全文で検討した先行技術は全て、この先行技術が広く公知であるとかあるいは当該分野で常識的一般知識を形成していると認められているとけっしてみなすべきではない。
本発明者らは驚くべきことに、置換アシルグアニジン類に分類されるある化合物類が異なるウイルス科範囲のウイルス類に対して抗ウイルス活性を有していることを見出した。いかなる理論にもまたいかなる作用メカニズムにも限定されることなくしかも現在のドグマにもかかわらず、宿主細胞に発現したイオンチャンネル活性を阻害し、又はダウンレギュレーションすることによってウイルス複製を妨害できることが可能であり得る。したがって、本発明の化合物類のウイルス複製に対する負の影響は、ウイルスが複製の際に依存する膜イオンチャンネルの阻害またはダウンレギュレーションにより媒介できるようである。この膜イオンチャンネルは、ウイルス膜イオンチャンネル（宿主細胞に対して外因性）またはウイルス感染の結果誘発された宿主細胞イオンチャンネルであり得る（宿主細胞に対して内因性）。
例として、本発明の化合物類は、Ｖｐｕまたはｐ７機能を阻害でき、それによって、それぞれのＨＩＶまたはＨＣＶライフサイクルの継続を阻害できる。
ＳＡＲＳウイルスは、本発明者らが始めてイオンチャンネルとして作用すると明らかにしたＥタンパク質をコードする。他のコロナウイルス類に類似のＥタンパク質が存在するので、本発明の化合物類、組成物類および方法類は、他のコロナウイルス類による感染阻害および／または治療に用途を有しているであろう。
本発明は、置換アシルグアニジン類の分類に入る新規抗ウイルス化合物類に関する。その範囲には、ウイルス増殖および／またはＨＩＶ機能活性の妨害、低下または阻害のための化合物類５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）アミロライドおよび５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）−アミロライドの使用を含まない。
したがって、本発明は第一に、抗ウイルス活性を有するアシルグアニジンを提供することである。
本発明は第二に、式Ｉ
Figure 0005030587
 の抗ウイルス化合物を提供することであり、
ここで、Ｒ１−Ｒ４は、それぞれ独立して、芳香族基類、複素環式方向族基類、アルキル芳香族基類、アルキル複素環式方向族基類、アルケニル芳香族基類、アルケニル複素環式方向族基類、シクロアルキル芳香族基類、シクロアルキル複素環式方向族基類、アリールオキシアルキル基類、ヘテロアリールオキシアルキル基類であり、前記基類は、単環または多環であり、適宜、水素、ハイドロキシ、ニトロ、ハロ、アミノ、置換アミノ、アルキル置換アミノ、シクロアルキル置換アミノ、アリール置換アミノ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルオキシ、Ｃ３−６シクロアルキル、ハロ置換Ｃ１−６アルキル、ハロ置換Ｃ１−６アルキルオキシ、フェニル、Ｃ１−６アルケニル、Ｃ３−６シクロアルケニル、Ｃ１−６アルケンオキシ、ベンゾ、アリール、置換アリール、プロピルチオ，
Figure 0005030587
 から選択した１個以上の置換基類により置換されている。
本発明は第三に、式Ｉ
Figure 0005030587
 の抗ウイルス化合物またはその薬学的に許容できる塩類を提供し、
ここで、
Figure 0005030587
Figure 0005030587
であり、
Ｒ２，Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素、
Figure 0005030587
 であり、
かつ、
Ｘは、水素、ハイドロキシ、ニトロ、ハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルオキシ、Ｃ３−６シクロアルキル、ハロ置換Ｃ１−６アルキル、ハロ置換Ｃ１−６アルキルオキシ、フェニル、Ｃ１−６アルケニル、Ｃ３−６シクロアルケニル、Ｃ１−６アルケンオキシまたはベンゾであり、Ｒａ，Ｒｂ，Ｒｃ，Ｒｄ，Ｒｅ，Ｒｆ，Ｒｈ，Ｒｋ，ＲＬ，Ｒｍ，Ｒｎ、ＲｏおよびＲｐは、それぞれ独立して、水素、アミノ、ハロ、Ｃ１−５アルキル、Ｃ１−５アルキルオキシ、ハイドロキシ、アリール、置換アリール、置換アミノ、モノまたはジアルキル置換アミノ、シクロアルキル置換アミノ、アリール置換アミノ、
Figure 0005030587
 またはプロピルチオであり、
Ｒｇ，Ｒｉは、それぞれ独立して、水素、ハイドロキシ、ハロまたはＣ１−５アルキルであり；
Ｒｊは、水素、アミノ、ハロ、Ｃ１−５アルキル、Ｃ１−５アルキルオキシ、ハイドロキシ、アリール、置換アリール、置換アミノ、アルキル置換アミノ、シクロアルキル置換アミノ、アリール置換アミノ、プロピルチオ、
Figure 0005030587
 である。
本発明の化合物類は、好適には、下記を含む、
構造
Figure 0005030587
 を含む５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）アミロライド、
構造
Figure 0005030587
 を含む５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アミロライドハイドロクロライド、
構造
Figure 0005030587
 を含む５−（Ｎ−メチル−Ｎ−イソブチル）アミロライド、
構造
Figure 0005030587
 を含む５−（Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピル）アミロライド（ここでＥＩＰＡと称する）、
構造
Figure 0005030587
 を含むＮ−（３，５−ジアミノ−６−クロロ−ピラジン−２−カルボニル）−Ｎ’−フェニル−グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含むＮ−ベンチル−Ｎ’−（３，５−ジアミノ−６−クロロ−２−ピラジン−２−カルボニル）−グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む３−メトキシアミロライド、
構造
Figure 0005030587
 を含む３−メトキシ−５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）−アミロライド、
構造
Figure 0005030587
 を含む３−ハイドロキシ−５−ヘキサメチレンイミノ−アミロライド、
構造
Figure 0005030587
 を含むヘキサメチレンイミノ−６−フェニル−２−ピラキンカルボキサミド、
構造
Figure 0005030587
 を含むＮ−アミジノ−３，５−ジアミノ−６−フェニル−２−ピラジンカルボキサミド、
構造
Figure 0005030587
 を含む５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）アミロライド、
構造
Figure 0005030587
 を含むＮ−アミジノ−３−アミノ−５−フェニル−６−クロロ−２−ピラジンカルボキサミド、
構造
Figure 0005030587
 を含む３’４ジクロロベンザミル、
構造
Figure 0005030587
 を含む２’４ジクロロベンザミルＨＣｌ、
構造
Figure 0005030587
 を含む５−（Ｎ−メチル−Ｎ−グアニジノカルボニル−メチル）アミロライド、
構造
Figure 0005030587
 を含む５−（Ｎ，Ｎ−ジエチル）アミロライドハイドロクロライド、
構造
Figure 0005030587
 を含む５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アミロライドハイドロクロライド、
構造
Figure 0005030587
 を含む５−ｔ−ブチルアミノ−アミロライド、
構造
Figure 0005030587
 を含む６−ヨードアミロライド、
構造
Figure 0005030587
 を含むボジピ（ＢＯＤＩＰＹ）−ＦＬアミロライド、
構造
Figure 0005030587
 を含む５−（４−フルオロフェニル）アミロライド、
構造
Figure 0005030587
 を含む１−ナフトイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む２−ナフトイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含むＮ−（２−ナフトイル）−Ｎ’−フェニルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含むＮ，Ｎ’−ビス（２−ナフトイル）グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含むＮ，Ｎ’−ビス（１−ナフトイル）グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含むＮ，Ｎ’−ビス（２−ナフトイル）−Ｎ”−フェニルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む６−メトキシ−２−ナフトイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含むＮ−シンナモイル−Ｎ’，Ｎ’−ジメチルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む３−キノリノイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含むシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む４−フェニルベンゾイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含むＮ−（シンナモイル）−Ｎ’フェニルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む（３−フェニルプロパノイル）グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含むＮ，Ｎ’−ビス−（シンナモイル）−Ｎ”−フェニルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含むＮ−（３−フェニルプロパノイル）−Ｎ’−フェニルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含むＮ，Ｎ’−ビス（３フェニルプロパノイル）−Ｎ”−フェニルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含むトランス−３−フランアクリロイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含むＮ−（６−ハイドロキシ−２−ナフトイル）−Ｎ’−フェニルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む（４−フェノキシベンゾイル）グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含むＮ，Ｎ’−ビス（アミジノ）ナフタレン−２，６−ジカルボキサミド、
構造
Figure 0005030587
 を含む６−ブロモ−２−ナフトイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む１−ブロモ−２−ナフトイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む２−（２−ナフトイル）アセトイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含むＮ”−シンナモイル−Ｎ，Ｎ’−ジフェニルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む（フェニルアセチル）グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含むＮ，Ｎ’−ビス（３−フェニルプロパノイル）グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含むベンゾイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む（４−クロロフェノキシ−アセチル）グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含むＮ−ベンゾイル−Ｎ’−シンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む［（Ｅ）−３−（４−ジメチルアミノフェニル）−２−メチルアクリロイル］グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む（４−クロロシンナモイル）グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む（４−ブロモシンナモイル）グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む（４−メトキシシンナモイル）グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む（５−フェニル−ペンタ−２，４−ジエノイル）グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む（３−ブロモシンナモイル）グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む（３−メトキシシンナモイル）グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む（３−クロロシンナモイル）グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む（２−クロロシンナモイル）グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む（２−ブロモシンナモイル）グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む（２−メトキシシンナモイル）グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む（トランス−２−フェニルシクロプロパンカルボニル）グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む［３−（３−ピリジル）アクリロイル］グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む（４−ハイドロキシシンナモイル）グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む（キノリン−２−カルボニル）グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む（４−ニトロシンナモイル）グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む（３−ニトロシンナモイル）グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む（２−ニトロシンナモイル）グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む（α−メチルシンナモイル）グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含むトランス−３−（１−ナフチル）アクリロイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む４−フェニルシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む３−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む３−メチルシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む４−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む２−メチルシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む２−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む４−メチルシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む４−イソプロピルシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む３−フルオロシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む２−フルオロシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む４−フルオロシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む３，４−ジクロロシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む２，４−ジクロロシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む２，６−ジクロロシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む４−エトキシシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む３，４−（メチレンジオキシ）シンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む３−（２−ナフチル）アクリロイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む４−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む３，４，５−トリメトキシシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む２−（１−ナフチル）アセトイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む２，５−ジメチルシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む２，３−ジフルオロシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む３−フェニルシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む３−（トランス−ヘプト−１−エン−１−イル）シンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む２−エチルシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む２−クロロ−６−フルオロシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む３−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む３，４−ジフルオロシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む５−ブロモ−２−フルオロシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む３−（トリフルオロメトキシ）シンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む２−エトキシシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む２−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む３−（シクロヘキセ−１−エン−１−イル）シンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含むシンナモイルグアニジンハイドロクロライド、
構造
Figure 0005030587
 を含む２，３，５，６−テトラメチルシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む２−シクロヘキシルシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む５−ブロモ−２−メトキシシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む２，３−ジメチルシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む３−エトキシシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む３−イソプロピルシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む２−フェニルシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む２−（シクロヘキセ−１−エン−１イル）シンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む２，４，６−トリメチルシンナモイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む（５−フェニル−ペンタ−２，４−ジエノイル）グアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む５−（３’−ブロモフェニル）ペンタ−２，４−ジエノイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含む５−（２’−ブロモフェニル）ペンタ−２，４−ジエノイルグアニジン、
構造
Figure 0005030587
 を含むフランアクリロイル、
好適には、本発明の化合物類は、ウイルス増殖および／または複製を低下、妨害または阻害できる。
好適には、本発明の化合物類の抗ウイルス活性は、レンチウイルス科のウイルス類およびコロナウイルス科のウイルス類に属するようなウイルスに対する。例えば、本発明の化合物類は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、重症急性呼吸器症候群ウイルス（ＳＡＲＳ）、マウス肝炎ウイルス（ＨＭＶ）およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のようなウイルス類に対する抗ウイルス活性を示す。
本発明においては第四の態様は、第一、第二または第三のいずれかによる抗ウイルス化合物と適宜１個以上の薬学的に許容できる担体または誘導体類を含む薬剤組成物が提供し、ここで、この化合物は、ウイルス増殖および／または複製を低下、妨害または阻害できる。
好適には、本発明の化合物類の抗ウイルス活性は、レンチウイルス科のウイルス類およびコロナウイルス科のウイルス類に属するようなウイルスに対する。例えば、本発明の化合物類は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、重症急性呼吸器症候群ウイルス（ＳＡＲＳ）、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ，ヒトコロナウイルスＯＣ４３，マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）、ブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびウマアルテリウイルス（ＥＡＶ）のようなウイルス類に対して抗ウイルス活性を示す。
本発明の化合物類によって阻害できる、または本発明の化合物それらによって感染を治療できる他のコロナウイルス類を表１に示した。
本発明の化合物類は、さらに、１種以上の公知の抗ウイルス化合物類または分子類を含むことができる。
第五の態様によれば、ウイルスに感染したかまたはウイルスに暴露した細胞を第一、第二または第三の態様のいずれかによる化合物に接触させることを含むウイルスの増殖および／または複製を低下、妨害または阻害するための方法が提供される。
好適には、上記ウイルスは、レンチウイルス科またはコロナウイルス科に属する。さらに好適には、前記ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、重症急性呼吸器症候群ウイルス（ＳＡＲＳ）、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ，ヒトコロナウイルスＯＣ４３，マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）、ブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはウマアルテリウイルス（ＥＡＶ）である。最も好適には、前記ウイルスは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＡＲＳウイルス、コロナウイルス２２９Ｅ、コロナウイルスＯＣ４３，ＰＲＣＶ，ＢＣＶ，ＨＣＶまたはＥＡＶである。
本発明の化合物類によって阻害できる、または本発明の化合物によって感染を治療できる他のコロナウイルス類を表１に示した。
第六の態様によれば、ウイルスに暴露した細胞を第一、第二または第三の態様におけるのいずれかの化合物に接触させることを含む上記細胞の感染を防止する方法が提供される。
好適には、このウイルスは、レンチウイルス科またはコロナウイルス科に属する。さらに好適には、このウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、重症急性呼吸器症候群ウイルス（ＳＡＲＳ）、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ，ヒトコロナウイルスＯＣ４３，マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）、ブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびウマアルテリウイルス（ＥＡＶ）である。最も好適には、前記ウイルスは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＡＲＳウイルス、コロナウイルス２２９Ｅ、コロナウイルスＯＣ４３，ＰＲＣＶ，ＢＣＶ，ＨＣＶまたはＥＡＶである。
本発明の化合物類によって阻害できる、またはそれらによって感染を治療できる他のコロナウイルス類を表１に示した。
本発明の第七の態様によれば、ウイルスに感染したかまたは暴露した対象の治療または予防処置方法で、処置を必要とする対象に対して第一、第二または第三の態様におけるいずれかの化合物を投与することを含む方法が提供される。
好適には、ウイルス感染またはウイルス暴露は、レンチウイルス科またはコロナウイルス科に属するウイルス類により発生する。さらに好適には、感染または暴露は、ＨＩＶ、ＳＡＲＳ、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ，ヒトコロナウイルスＯＣ４３，マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）、ブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはウマアルテリウイルス（ＥＡＶ）により発生する。最も好適には、感染または暴露は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＡＲＳ、コロナウイルス２２９Ｅ、コロナウイルスＯＣ４３，Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはウマアルテリウイルス（ＥＡＶ）により発生する。
本発明の化合物類によって阻害できる、または本発明の化合物によって感染を治療できる他のコロナウイルス類を表１に示した。
ウイルス阻害対象は、通常、ヒト、霊長類、家畜（例 ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、愛玩動物（例 イヌ、ネコ）、実験用動物（例 マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、狩猟野生動物（例 キツネ、シカ）のような哺乳類であるが、それらに限定されない。好適には、対象は、霊長類またはウマである。最も好適には、前記対象は、ヒトである。
第八の態様によれば、ウイルスに感染した細胞において膜イオンチャンネル機能活性をダウンレギュレーションする方法が提供され、この方法は、前記細胞を第一、第二または第三の面のいずれかに記載の化合物に接触させることを含む。
膜イオンチャンネルは、細胞に対して内因性であるかまたは外因性である。
好適には、機能活性がダウンレギュレーションされる膜イオンチャンネルは、レンチウイルス類およびコロナウイルス類がウイルス複製を媒介するために利用するものであり、例えばＨＩＶ膜イオンチャンネルＶｐｕ、ＨＣＶ膜イオンチャンネルＰ７，コロナウイルスＥタンパク質膜イオンチャンネル、およびＳＡＲＳ Ｅタンパク質膜イオンチャンネルが含まれる。
好適には、ウイルス感染またはウイルス暴露は、レンチウイルス科またはコロナウイルス科に属するウイルス類により発生する。さらに好適には、感染または暴露は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ＳＡＲＳ、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ，ヒトコロナウイルスＯＣ４３，マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）、ブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはウマアルテリウイルス（ＥＡＶ）により発生する。最も好適には、感染または暴露は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＡＲＳ、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ヒトコロナウイルスＯＣ４３，Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはウマアルテリウイルス（ＥＡＶ）により発生する。
本発明の第九の態様によれば、細胞に感染したウイルスの増殖および／または複製を低下，妨害または阻害する方法が提供され、方法は、第一、第二または第三の態様による化合物に前記感染細胞を接触させることを含み、この化合物は、ウイルスに由来し感染細胞において発現した膜イオンチャンネルの機能活性をダウンレギュレーションする。
好適には、感染は、レンチウイルス科またはコロナウイルス科に属するウイルス類により発生する。さらに好適には、感染または暴露は、ＨＩＶ、ＳＡＲＳ、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ，ヒトコロナウイルスＯＣ４３，マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）、ブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはウマアルテリウイルス（ＥＡＶ）である。最も好適には、感染または暴露は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＡＲＳ、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ヒトコロナウイルスＯＣ４３，Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはウマアルテリウイルス（ＥＡＶ）により発生する。
本発明の化合物類によって阻害できる、または本発明の化合物によって感染を治療できる他のコロナウイルス類を表１に示した。
好適には、機能活性がダウンレギュレーションされる膜イオンチャンネルは、レンチウイルス類またはコロナウイルス類がウイルス複製を媒介するために利用するものであり、例えば、ＨＩＶ膜イオンチャンネルＶｐｕ、ＨＣＶ膜イオンチャンネルＰ７およびコロナウイルスＥタンパク質膜イオンチャンネルを含む。
本発明の第十の態様によれば、哺乳類の細胞に感染したウイルスの増殖および／または複製を低下、妨害または阻害する方法が提供され、方法は、第一、第二または第三の態様のいずれかによる化合物または第四の態様による薬剤組成物を哺乳類に投与することを含み、化合物または前記組成物は、感染細胞において発現した膜イオンチャンネルの機能活性をダウンレギュレーションする。
好適には、感染は、レンチウイルス科またはコロナウイルス科に属するウイルス類により発生する。さらに好適には、感染または暴露は、ＨＩＶ、ＳＡＲＳ、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ，ヒトコロナウイルスＯＣ４３，マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）、ブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはウマアルテリウイルス（ＥＡＶ）である。最も好適には、感染または暴露は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＡＲＳ、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ヒトコロナウイルスＯＣ４３，Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはウマアルテリウイルス（ＥＡＶ）により発生する。
本発明の化合物類によって阻害できる、または本発明の化合物類によって感染を治療できる他のコロナウイルス類を表１に示した。
好適には、機能活性がダウンレギュレーションされる膜イオンチャンネルは、レンチウイルス類またはコロナウイルス類がウイルス複製を媒介するために利用するものであり、例えば、ＨＩＶ膜イオンチャンネルＶｐｕ、ＨＣＶ膜イオンチャンネルＰ７およびコロナウイルスＥタンパク質膜イオンチャンネルを含む。
ウイルス阻害対象は、通常、ヒト、霊長類、家畜（例 ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、愛玩動物（例 イヌ、ネコ）、実験用動物（例 マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、狩猟野生動物（例 キツネ、シカ）のような哺乳類であるが、それらに限定されるわけではない。好適には、前記対象は、霊長類またはウマである。最も好適には、前記対象は、ヒトである。
第十一の態様によれば、ウイルスに感染したかまたは暴露した対象を治療または予防処置する方法を提供し、方法は、対象に対して第一、第二または第三の態様のいずれかに記載の化合物または第四の態様による薬剤組成物を投与することを含み、化合物または組成物は、ウイルス由来膜イオンチャンネルの機能活性をダウンレギュレーションする。
好適には、感染は、レンチウイルス科またはコロナウイルス科に属するウイルスにより起こる。さらに好適には、感染または暴露は、ＨＩＶ、ＳＡＲＳ、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ，ヒトコロナウイルスＯＣ４３，マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）、ブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはウマアルテリウイルス（ＥＡＶ）により起こる。最も好適には、感染または暴露は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＡＲＳ、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ヒトコロナウイルスＯＣ４３，Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはウマアルテリウイルス（ＥＡＶ）により起こる。
本発明の化合物類によって阻害できる、または本発明の化合物類によって感染を治療できる他のコロナウイルス類を表１に示した。
好適には、機能活性がダウンレギュレーションされる膜イオンチャンネルは、レンチウイルス類またはコロナウイルス類がウイルス複製を媒介するために利用するものであり、例えば、ＨＩＶ膜イオンチャンネルＶｐｕ、ＨＣＶ膜イオンチャンネルＰ７およびコロナウイルスＥタンパク質膜イオンチャンネルを含む。
ウイルス阻害対象は、通常、ヒト、霊長類、家畜（例 ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、愛玩動物（例 イヌ、ネコ）、実験用動物（例 マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、狩猟野生動物（例 キツネ、シカ）のような哺乳類であるが、それらに限定されない。好適には、前記対象は、霊長類またはウマである。最も好適には、前記対象は、ヒトである。
第十二の態様によれば、本発明は、下記から構成される群から選択された抗ウイルス化合物を提供する：
Ｎ−（３，５−ジアミノ−６−クロロ−ピラジン−２−カルボニル）−Ｎ’−フェニル−グアニジン、
Ｎ−ベンチル−Ｎ’−（３，５−ジアミノ−６−クロロ−２−ピラジン−２−カルボニル）−グアニジン、
３’４ジクロロベンザミル、
２’４ジクロロベンザミル、
５−（Ｎ−メチル−Ｎ−グアニジノカルボニル−メチル）アミロライド、
５−（Ｎ−メチル−Ｎ−イソブチル）アミロライド、
５−（Ｎ−エチル−Ｎ−イソブチル）アミロライド、
５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アミロライドハイドロクロライド、
５−（Ｎ、Ｎ−ヘキサメチレン）アミロライドハイドロクロライド、
５−（Ｎ、Ｎ−ジエチル）アミロライドハイドロクロライド、
６−ヨードアミロライド、
ボジピ（Ｂｏｄｉｐｙ)−ＦＬアミロライド、
３−ハイドロキシ−５−ヘキサメチレンイミノ−アミロライド、
５−（４−フルオロフェニル）アミロライド、
５−ｔ−ブチルアミノ−アミロライド、
Ｎ−アミジノ−３−アミノ−５−フェニル−６−クロロ−２−ピラジンカルボキサミド、
３−メトキシ−５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）−アミロライド、
３−メトキシ−アミロライド、
ヘキサメチレンイミノ−６−フェニル−２−ピラジンカルボキシイミド、
Ｎ−アミジノ−３，５−ジアミノ−６−フェニル−２−ピラジンカルボキサミド、
１−ナフトイルグアニジン、
２−ナフトイルグアニジン、
Ｎ−（２−ナフトイル）−Ｎ’−フェニルグアニジン、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ナフトイル）グアニジン、
Ｎ，Ｎ’−ビス（１−ナフトイル）グアニジン、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ナフトイル）−Ｎ”−フェニルグアニジン、
６−メトキシ−２−ナフトイルグアニジン、
３−キノリノイルグアニジン、
シンナモイルグアニジン、
４−フェニルベンゾイルグアニジン、
Ｎ−（シンナモイル）−Ｎ’フェニルグアニジン、
（３−フェニルプロパノイル）グアニジン、
Ｎ，Ｎ’−ビス−（シンナモイル）−Ｎ”−フェニルグアニジン、
Ｎ−（３−フェニルプロパノイル）−Ｎ’−フェニルグアニジン、
Ｎ，Ｎ’−ビス（３フェニルプロパノイル）−Ｎ”−フェニルグアニジン、
トランス−３−フランアクリロイルグアニジン、
Ｎ−（６−ハイドロキシ−２−ナフトイル）−Ｎ’−フェニルグアニジン、
（４−フェノキシベンゾイル）グアニジン、
Ｎ，Ｎ’−ビス（アミジノ）ナフタレン−２，６−ジカルボキサミド、
Ｎ”−シンナモイル−Ｎ，Ｎ’−ジフェニルグアニジン、
（フェニルアセチル）グアニジン、
Ｎ，Ｎ’−ビス（３−フェニルプロパノイル）グアニジン、
ベンゾイルグアニジン、
（４−クロロフェノキシ−アセチル）グアニジン、
Ｎ−ベンゾイル−Ｎ’−シンナモイルグアニジン、
［（Ｅ）−３−（４−ジメチルアミノフェニル）−２−メチルアクリロイル］グアニジン、
（４−クロロシンナモイル）グアニジン、
（４−ブロモシンナモイル）グアニジン、
（４−メトキシシンナモイル）グアニジン、
（５−フェニル−ペンタ−２，４−ジエノイル）グアニジン、
（３−ブロモシンナモイル）グアニジン、
（３−メトキシシンナモイル）グアニジン、
（３−クロロシンナモイル）グアニジン、
（２−クロロシンナモイル）グアニジン、
（２−ブロモシンナモイル）グアニジン、
（２−メトキシシンナモイル）グアニジン、
（トランス−２−フェニルシクロプロパンカルボニル）グアニジン、
［３−（３−ピリジル）アクリロイル］グアニジン、
（４−ハイドロキシシンナモイル）グアニジン、
（キノリン−２−カルボニル）グアニジン、
またはその薬学的に許容できる塩類。
第十三の態様によれば、本発明は、第十二の態様による化合物、および適宜１種以上の薬学的に許容できる担体または誘導体類を含む薬剤組成物が提供される。
好適には、薬剤組成物は、さらに、１種以上の公知の抗ウイルス化合物類または分子類を含むことができる。
本文で他に明確にすることがなければ、本明細書および請求の範囲全文において、用語“含む”、“含んでいる”等は、排他的または網羅的意味に対して包括的意味であるとみなすべきであり、すなわち、“に限定されないが含む”の意味で使用される。
本発明は、置換アシルグアニジン類に分類されるある化合物類が異なるウイルス科範囲由来のウイルス類に対して抗ウイルス活性を有しているという驚くべき決定に基づいている。いかなる特定の理論にもあるいは作用メカニズムにも限定されないが、本発明の化合物類のウイルス複製に及ぼすマイナスの影響は、ウイルスが複製のために依存する膜イオンチャンネルの阻害またはダウンレギュレーションによって媒介されている。この膜イオンチャンネルは、ウイルス感染の結果誘発されたウイルス膜イオンチャンネル（宿主細胞に対して外因性）または宿主細胞イオンチャンネル（宿主細胞に対して内因性）である。
例として、本発明の化合物類は、Ｖｐｕまたはｐ７機能を阻害できそれによってそれぞれのＨＩＶまたはＨＣＶライフサイクルの継続を阻害できる。
ＳＡＲＳウイルスは、本発明者らが始めてイオンチャンネルとして作用すると明らかにしたＥタンパク質をコードする。他のコロナウイルス類に類似のＥタンパク質が存在するので、本発明の化合物類、組成物類および方法類は、他のコロナウイルス類による感染の阻害および／または治療に用途を有しているであろう。
本発明は、置換アシルグアニジン類の分類に入る新規抗ウイルス化合物類に関するが、その範囲には、ウイルス増殖および／またはＨＩＶ機能活性の妨害、低下または阻害のための化合物類５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）アミロライドおよび５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）−アミロライドの使用を含まない。
本発明の化合物類が、薬学的に許容できる担体類および賦形剤類を含む組成物または製剤の形状で投与できることが当業者には理解されるであろう。
本発明の薬剤組成物類には、さらに、１種以上の公知の抗ウイルス化合物類または分子類を含むことができる。好適には、前記公知の抗ウイルス化合物類は、ビダラビン、アシクロビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、バラシクロビル、シドホビル、ファムシクロビル、リバビリン、アマンタジン、リマンタジン、インターフェロン、オセルタミビア、パリヴィズマブ、リマンタジン、ザナミビア、ジドブジン、ジダノシン、ダルシタビン、スタブジン、ラミブジンおよびアバカビルのようなヌクレオシド−アナログ逆転写酵素阻害剤類（ＮＲＴＩ）、ネビラピン、デラビルジンおよびエファビレンツのような非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤類（ＮＮＲＴＩ）、サクイナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビルのようなプロテアーゼ阻害剤類、および他の公知の抗ウイルス化合物類および調製物類から選択される。公知の抗ウイルス化合物類または分子類は、ある場合には、本発明の抗ウイルス化合物類と相乗的に作用する。
Figure 0005030587
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本観察事項および知見によって、ある置換アシルグアニジン類等の物質類を異なるウイルス類を原因とするウイルス病を治療および予防するための抗ウイルス剤類としての使用が可能になる。本発明の方法類および組成物類は、複製のためにイオンチャンネル形成に依存するウイルス類に対して特に効果的であるが、しかし、これが唯一の、ウイルス類が依存する機構ではないこと、および本発明の化合物類および方法類は、イオンチャンネルの機能を妨害または阻害することによってそれらの作用を発揮する物質類に限定されないことがわかるであろう。
“膜イオンチャンネル”を言及した際には、膜を介してイオン類を運搬する構造を意味していると理解されたい。本発明は、受動的、浸透圧性、能動的または交換運搬のような手段によって機能できるイオンチャンネル類にも拡大される。このイオンチャンネルは、細胞内または細胞外手段によって形成できる。例えば、イオンチャンネルは、その正常作動を促進する細胞によって天然に形成されるイオンチャンネルであることができる。これとは別に、前記イオンチャンネルは、細胞外手段によって形成されることもある。細胞外手段とは、例えば、導入化学物質類、薬物類またはイオノフォアのような他の物質類によるかまたは細胞に入ったウイルスによってコードされるウイルスタンパク質類の機能活性によるイオンチャンネル類形成を含む。
本発明のある態様の対象であるイオンチャンネル類は、膜を介したイオン類の運搬を促進する。この膜はいかなる膜であってもよく、細胞外壁形質膜に限定されない。したがって、本文で使用した“膜”とは、ゴルジ体および小胞体のようなすべての細胞小器官、細胞外膜、細胞内に局在する全ての外来抗原を取り囲む膜（例 ウイルスエンベロープ）、または細胞外に局在する外来性生命体の膜を含む。膜は、典型的には液状脂質二重層で構成されているが、必ずしもそうではない場合もある。対象イオンチャンネルは、いかなる構造であることもできる。例えば、Ｖｐｕイオンチャンネルは、例えば、感染細胞のゴルジおよび小胞体膜類に会合するＨＩＶ−１によってコードされる内在性膜タンパク質であるＶｐｕによって形成される。以下、“Ｖｐｕイオンチャンネル類”に言及した際には、例えば、Ｐ７ ＨＣＶおよびインフルエンザＭ２等の全関連イオンチャンネル類を意味している。
“ＨＩＶ”、“ＳＡＲＳ”、“コロナウイルス”、または“ＨＣＶ”を言及した際には、いかなるＨＩＶ，ＳＡＲＳ，コロナウイルスまたはＨＣＶウイルス株であってもよく相同体類および変異体類を含むと理解されたい。
イオンチャンネルの“機能活性”とは、イオンチャンネルが実行するかまたは関連している機能類のいずれか１種以上を意味していると理解されたい。例えば、Ｖｐｕタンパク質がコードしたイオンチャンネルは、Ｎａ＋，Ｋ＋，Ｃｌ−およびＰＯ４ ３−の運搬を促進する他に、さらに、小胞体においてＣＤ４分子の分解に作用している。特定の理論に限定されることを望むわけではないが、Ｖｐｕタンパク質がコードしたイオンチャンネルはまた、ＨＩＶライフサイクルの媒介に作用していると考えられている。本発明は、ＨＩＶライフサイクル特にＨＩＶ複製の阻害機構を介してＨＩＶ感染を治療することに限定されない。むしろ、本発明は、本発明の化合物類がその抗ウイルス活性を発揮するあらゆる機構を包含し、ＨＩＶの生存または機能活性を阻害することを含むことができる。このことはまた、ＨＩＶ，コロナウイルス類および他のウイルス類にも適用される。
ウイルスの“機能活性”とは、ウイルスが実行する機能類、または関連する機能類のいかなる１種以上をも意味するものと理解されたい。
“ウイルス複製”を言及する際には、ビリオン類のアセンブリまたは放出を阻害すること等のウイルスライフサイクルの１種以上の段階または様相を含むと理解されたい。ウイルス複製のイオンチャンネル媒介は、直接的または間接的手段によることができる。イオンチャンネルがいかなる１種以上のライフサイクル段階においてビリオンと直接相互作用する場合、イオンチャンネル媒介は、直接的手段による。直接的または間接的にウイルスライフサイクルのいかなる１種以上の段階を調整するビリオンのそれら以外の分子とイオンチャンネル媒介が相互作用する場合、イオンチャンネル媒介は、間接的である。したがって、本発明の方法は、ウイルスライフサイクルの１種以上の様相または段階の媒介を起こすカスケード段階の導入によるウイルス複製の媒介を包含する。
イオンチャンネル機能活性を“ダウンレギュレーションする”とは、直接的機構、間接的機構のいずれによる活性の１種以上の態様を部分的または完全に阻害することを意味すると理解されたい。例えば、適切な物質は、イオンチャンネルと直接相互作用でき、ウイルスの複製を防止する、またはこれとは別に、間接的に作用し、複製を例えばイオンチャンネル以外の分子と相互作用して前記複製を防止するように作用する。さらにこれとは別に、多分子がイオンチャンネルの活性と相互作用するかまたは阻害することである。
坑ウイルス活性を有する分子のスクリーニングは、本文に記載の方法類によって行うことができる。
ウイルス感染“細胞”と言及する際には、ウイルスに感染したいかなる細胞、原核細胞または真核細胞を意味している。これには、例えば、不死化細胞類または初代細胞株類、細菌培養物およびインシトゥ細胞類が含まれる。抗ウイルス化合物類の適切なスクリーニングシステムにおいて、好適な感染細胞は、ＨＩＶまたはＨＣＶにそれぞれ感染したマクロファージ類／単球類または肝細胞類／リンパ球細胞類であろう。
いかなる理論にも作用モードにも本発明を限定するわけではないが、本発明の化合物類は、イオンチャンネル類すなわちＨＩＶのＶＰＵ、ＳＡＲＳおよびコロナウイルス類のＥタンパク質、またはＨＩＶのＰ７がブロックされるようにすることによってウイルス複製または細胞からのビリオン放出を阻害すると考えられている。本発明は、置換アシルグアニジン類である抗ウイルス化合物類を包含する。
本発明はまた、化合物類５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）アミロライドおよび５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）−アミロライドのＨＩＶ以外のウイルス複製および／または増殖を制御する際に使用することを含む。
ウイルス阻害の対象は、通常、ヒト、霊長類、家畜（例 ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、愛玩動物（例 イヌ、ネコ）、実験用動物（例 マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、狩猟野生動物（例 キツネ、シカ）のような哺乳類であるが、それらに限定するわけではない。好適には、対象は、霊長類またはウマである。最も好適には、対象は、ヒトである。
本発明の方法は、例えば、ＨＩＶ感染、ＨＣＶ感染および他のウイルス感染類のようなウイルス感染の治療および予防において有用であるが、これらに限定されるわけではない。例えば、抗ウイルス活性は、ＨＩＶ複製を予防するためにＨＩＶ感染がわかっている対象において発揮され、それによって、ＡＩＤＳ発症を防止する。これとは別に、本発明の方法を、血清ウイルス量を低下させるかまたはウイルス感染症状を緩和させるために使用することもできる。同様に、抗ウイルス処置は、例えばＨＣＶに感染したことがわかっている対象において、ＨＣＶ複製を防止するために行われ、それによってさらなる肝細胞への感染を防止し、最終的な肝組織の変性を防止することができる。
本発明の方法は、ウイルス感染の初期段階で罹患細胞中におけるウイルス残留を防止するために有用であること、またはおそらくウイルス源であろうと考えられるものに暴露する直前または直後の期間に適用すべき予防処置として特に有用であることができる。
本文で“治療的”または“予防的”と称した際には、その非常に広い内容で考慮すべきである。用語“治療的”とは、必ずしも哺乳類を完治するまで治療することを意味していない。同様に、“予防的”とは、必ずしも対象が最終的に疾患状態にならないであろうということを意味していない。したがって、治療および予防措置には、特定状態症状の改善、または特定状態発生の予防または低下を含む。用語“予防”とは、特定状態の発症の重篤度を低下させることとしてみなすべきである。治療には、既存状態の重篤度または急性発作の頻度を低下させることができる。
本発明の方法類によれば、１を超える化合物または組成物を、公知の抗ウイルス化合物類または分子類のような１種以上の他の化合物類とともに同時投与することができる。“同時投与”とは、同一製剤で同時に投与するかまたは同一または異なる経路で２種の異なる製剤として投与するかまたは同一または異なる経路で連続的に投与することを意味する。“連続”投与とは、前記２種以上の別々の化合物類の投与の間に秒、分、時間または日の時間的差があることを意味する。対象抗ウイルス化合物類とは、いかなる順序でも投与することができる。
投与経路には、静脈内、腹腔内、皮下、頭部内、皮内、筋肉内、眼内、くも膜下腔内、大脳内、鼻腔内、粘膜内、点滴、経口、直腸、点滴静注、パッチ剤およびインプラントによるなどが含まれるが、これらに限定されない。静注経路は特に好適である。
注入可能用途に適した組成物類は、無菌水溶液類（水溶性）および無菌注入可能溶液の即時調製のための無菌粉末類が含まれる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロイレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）、適切なその混合物類および植物油を含む溶媒または分散媒体である。微生物類の作用防止は、さまざまな抗菌および抗かび物質類によりもたらされ、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等がある。多くの場合、例えば、糖類および塩化ナトリウムのような等張剤類を含むのが好適であろう。注入可能な組成物類の吸収延長は、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収遅延剤類組成物を組成物類中で使用することによってもたらされる。
無菌の注入可能溶液類は、必要量の有効化合物類を前記に例示したさまざまな成分類を必要に応じて適切な溶媒に取り込み、例えば、ろ紙殺菌または他の適切な手段による殺菌を行うことにより調製される。分散もまた考慮に入れられ、これらは、前記のさまざまな無菌化有効性分類を、基本的分散媒体と前記に例示したものの中から必要な他成分類を無菌小胞中に取り込むことによって調製することができる。無菌注入可能溶液類の調製用無菌粉末の場合、好適な調製方法は、有効成分に追加の所望成分の粉末を先に加工無菌ろ過した溶液から得る。真空乾燥および凍結乾燥技術を含む。
有効成分類を適切に保護すると、それらは例えば、不活性希釈剤とともにまたは同化可能な摂取可能な担体とともに経口投与できるかまたは、それをハードまたはソフトシェルゼラチンカプセルに充填するか、または、それを錠剤に圧縮することもできる。経口治療投与のため、有効化合物は、賦形剤類とともに取り込ませることができ、摂取可能な錠剤、バッカル剤、トローチ、カプセル、エレキシル、懸濁剤、シロップ、ウェーファー等の形態で使用できる。このような組成物類および調製物類は、少なくとも０．０１重量％、さらに好適には０．１重量％、さらに好適には１重量％の有効化合物を含むであろう。組成物類および調製物類の百分率はもちろん変化させることができ、単位重量の約１乃至約９９％、さらに好適には約２乃至約９０％、さらに好適には約５乃至約８０％重量の間であるのが有用である。このような治療上有用な組成物中における有効化合物の量は、適切な投与量が得られるようなものである。本発明の好適な組成物類または調製物類は、経口投与単位量が有効化合物を約０．１ｎｇから２０００ｍｇ含むように調製される。
錠剤、トローチ、丸薬、カプセル等は、また、以下に列挙する成分類を含むことができる。ガム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンのような結合剤；リン酸二カルシウムのような賦形剤；コーンスターチ、馬鈴薯でんぷん、アルギン酸等のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような滑択剤；およびショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味料を添加でき、または、ペパーミント、ウインターグリーンオイルまたはチェリーフレーバーのような芳香剤を添加できる。単位投与形態がカプセルである時、それは、前記タイプの物質類の他に液体担体を含むことができる。さまざまな他の材料類もコーティングとしてまたは単位投与量の物理的形態を修飾するために存在させることができる。例えば、錠剤、丸薬、またはカプセル類は、シェラック、糖または両者でコーティングすることができる。シロップまたはエレキシルは、有効化合物、甘味料としてのショ糖、保存剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、色素、およびチェリーまたはオレンジフレーバーのような芳香剤を含むことができる。あらゆる単位投与量調製に使用したいかなる材料も薬学的に純粋でかつ使用した量で実質的に無毒でなければならない。さらに、有効成分（類）は、徐放性調製物類および製剤類に取り込ませることができる。
本発明はまた、クリーム、ローションおよびゲルのような局所投与に適した形状にも拡大できる。このような形状において、抗凝固ペプチド類を修飾して表面バリアを浸透できるようにする必要があることがある。単位投与量形状および局所用調製物を調製するための操作は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ． Ａ Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ Ｖｏｌｕｍｅ Ｅｄ． Ａｉｎｌｅｙ Ｗａｄｅ Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ Ｌｏｎｄｏｎ、
ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｅｄ． Ｒｏｂｅｒｔ Ｃ． Ｗｅａｓｔ Ｐｈ．Ｄ． ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．；Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎｓ’ｓ； Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ． Ｎｉｎｔｈ Ｅｄ．ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ； Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ；ａｎｄ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ． Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ Ｅｄ． Ｅｄ． Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． Ｅａｓｔｏｎ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａなどの参考書から当業者は容易に知ることができる。
薬学的に許容できる担体類および／または希釈剤類には、いかなる溶媒類、分散剤類、コーティング類、抗菌および抗カビ剤類、等張剤および吸収遅延剤類等も含まれ、それら全てが含まれる。薬学的に有効な物質類のためにこのような媒体類および物質類を使用することは、当該技術で周知である。従来のいかなる媒体または物質も有効成分と不適合のものを除いて、その治療化合物中での使用を考慮している。補助的有効成分類もまた、組成物類中に取り込ませることができる。
特に、投与の容易さ、および投与量を均一にするため単位投与量形態で非経口組成物を処方するのが有利である。本文では、単位投与量形態とは治療すべき哺乳類に対して一元的に投与するのに適した物理的に分離した単位で、各単位は、必要な薬学的担体とともに所望の治療効果をもたらすように計算したあらかじめ定めた量の有効成分を含むことを意味する。本発明の新規単位投与量形態の仕様は、（ａ）有効物質に特有の特徴と達成すべき特定の治療効果および（ｂ）化合物調製技術に固有の限界によって左右されかつ直接的にそれらに依存している。
本発明が検討した有効量とは、投与を受ける者の疼痛の強さと健康および年齢により変動するであろう。一般的には、有効量は、０．０１ｎｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重まで変動するであろう。
これとは別の量としては、０．１ｎｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重または１．０ｎｇ／ｋｇ体重から約８０ｍｇ／ｋｇ体重まで変動するであろう。
ウイルス阻害対象は、通常、ヒト、霊長類、家畜（例 ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、愛玩動物（例 イヌ、ネコ）、実験用動物（例 マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、狩猟野生動物（例 キツネ、シカ）のような哺乳類であるが、これらに限定されない。好適には、対象は、霊長類またはウマである。最も好適には、前記対象は、ヒトである。
本発明の方法は、例えばＨＩＶ感染、ＨＣＶ感染および他のウイルス感染のようなウイルス感染の治療および予防に有用であるが、これらに限定されない。例えば、抗ウイルス活性は、ＨＩＶ複製を防止しそれによってＡＩＤＳ発症を防ぐためＨＩＶに感染したとわかっている対象で実行できる。これとは別に、本発明の方法を用いて、血清ウイルス量を減少するため、またはウイルス感染症状を改善するために使用できる。同様に、抗ウイルス治療は、ＨＣＶ複製を防止しそれによってそれ以上肝細胞の感染と最終的な肝組織の変性を防ぐためＨＣＶに感染したとわかっている対象で実行できる。
本発明の方法は、特に、ウイルス感染の初期段階で有用であり、感染細胞中におけるウイルス貯蔵の成立を防止し、あるいはおそらくウイルス源であろうと考えられるものに暴露する直前または直後の期間に適用すべき予防処置として特に有用であり得る。
本発明をさらに詳細に具体的ではあるが限定的ではない実施例を参考に説明するが、これらの実施例は、ウイルス膜イオンチャンネルと抗ウイルス活性スクリーニング研究について述べている。いくつかの実施例では、ＳＡＲＳウイルスを使用することが含まれている。下記の説明から、他のレンチウイルスおよびコロナウイルスおよび他の化合物類も本発明の文脈で有効に使用できることが明らかであろう。しかし、前記の詳細な説明は、本発明を例示する目的のためだけに記載されていることを理解いただきたい。いかなる意味でも、前記に述べた本発明の広い範囲を限定するものとみなしてはならない。
実施例１ 本発明の化合物類の合成
本発明の化合物類を、対応する酸クロリドまたはメチルエステル類からスキーム１に示したように調製できる。これらの両方法とも、文献に詳細に述べられている。
Figure 0005030587
下記の実施例では、本発明のいくつかの化合物類について合成スキームを示す。
実施例２ 桂皮酸シンナモイルクロリドからのシンナモイルグアニジンの合成
Figure 0005030587
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１滴を含有する乾燥ベンゼン（３０ｍＬ）中のトランス−桂皮酸（１．５０ｇ、１０．１２ｍｍｏｌ）の溶液に、オキサリルクロリド（５．１４ｇ、４０．５ｍｍｏｌ）を添加し、前記溶液を泡立たせた。２時間還流後、溶液が乾燥するまで減圧下で蒸発させた。生成した固体を乾燥テトラハイドロフラン（２０ｍＬ）に溶解させ、グアニジンハイドロクロライドの２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（２５ｍＬ）溶液にゆっくりと添加した。反応物を室温で１時間攪拌させ、その後、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。抽出物をまとめて硫酸マグネシウムで乾燥させ、蒸発させて、オレンジオイルを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィで精製した。ジクロロメタン中で１０％から２０％のメタノールにより溶出すると、クリーム状固体としてシンナモイルグアニジンを得た（０．８２９ｇ、４３％）。
実施例３ Ｎ−アミジノ−３−アミノ−５−フェニル−６−クロロ−２−ピラジンカルボキサミドの合成
パート１
Figure 0005030587
テトラハイドロフラン（５ｍＬ）／水（１０ｍＬ）／トルエン（２０ｍＬ）中のメチル３−アミノ−５，６−ジクロロ−２−ピラジンカルボキシレート（０．４４４ｇ、２．０ｍｍｏｌ）の溶液に対して、フェニルボロン酸（０．５３６ｇ、４．４ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（０．６９９ｇ、６．６ｍｍｏｌ）およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）−パラジウム（０）（０．１１６ｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を真空にし、窒素を数回通気した後、６時間還流した。有機層を分離し、水層をトルエンで抽出した（３×２０ｍＬ）。有機抽出物をまとめて硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し減圧下で蒸発させ、メチル３−アミノ−６−クロロ−５−フェニル−２−ピラジンカルボキシレートを黄色固体として得た（０．４３ｇ、８２％）。
パート２
Figure 0005030587
メタノール（５ｍＬ）に溶解させたナトリウム（０．０４０ｇ、１．７４ｍｍｏｌ）の溶液に対してグアニジンハイドロクロライド（０．２５８ｇ、２．７０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を３０分間還流させ、その後、ろ過した。ろ液に対してＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）中メチル３−アミノ−６−クロロ−５−フェニル−２−ピラジンカルボキシレート（０．２６４ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を７５℃で１２時間加熱した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を１％トリエチルアミン／５％メタノール／ジクロロメタンによる溶出でシリカゲルクロマトグラフィを行った。生成した固体をクロロホルムに懸濁させ、ろ過し、高真空で乾燥させ、黄色固体としてＮ−アミジノ−３−アミノ−５−フェニル−６−クロロ−２−ピラジンカルボキサミドを得た（０．０４ｇ、１４％）。
実施例４ ヘキサメチレンイミノ−６−フェニル−２−ピラジンカルボキサミドの合成
パート１
Figure 0005030587
メチル３−アミノ−５，６−ジクロロ−２−ピラジンカルボキシレート（１．１１ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を含むテトラハイドロフラン（５０ｍＬ）溶液に対して、ヘキサメチレンイミン（１．４９ｇ、１５．０ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を１時間還流した。この反応物を冷却し、固体ヘキサメチレンイミノハイドロクロライドをろ過によって除去した。ろ液を蒸発させ、残渣をシリカゲルクロマトグラフィにかけた。ジクロロメタンにより溶出し、メチル３−アミノ−６−クロロ−５−ヘキサメチレンイミノ−２−ピラジンカルボキシレートを乳白色の固体として得た（１．２０ｇ、８５％）。
パート２
Figure 0005030587
メチル３−アミノ−６−クロロ−５−ヘキサメチレンイミノ−２−ピラジンカルボキシレート（０．３５０ｇ、１．２３ｍｍｏｌ）を含むジメチルスルホキシド（５ｍＬ）溶液に対して、フェニルボロン酸（０．１６６ｇ、１．３５ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（０．５１１ｇ、３．７０ｍｍｏｌ）および［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）−ジクロロメタン錯体（０．０４１ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を９０℃で１６時間加熱し、水（５０ｍＬ）に注ぎ、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。抽出物をまとめ、硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し蒸発させ、茶色の油状物を得、それをシリカゲルクロマトグラフィで精製した。ジクロロメタンの後に１０％酢酸エチル／ジクロロメタンにより溶出し、メチル３−アミノ−５−ヘキサメチレンイミノ−６−フェニル−２−ピラジンカルボキシレートを黄色固体として得た（０．３０９ｇ、７７％）。
パート３
Figure 0005030587
メタノール（８ｍＬ）中に溶解させたナトリウム（０．０９０ｇ、６．１７ｍｍｏｌ）の溶液に対してグアニジンハイドロクロライド（０．５９８ｇ、６．２６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を３０分間還流させ、その後、ろ過した。ろ液に対してテトラハイドロフラン（１０ｍＬ）中メチル３−アミノ−５−ヘキサメチレンイミノ−６−フェニル−２−ピラジンカルボキシレート（０．３１０ｇ、０．９５ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を７２時間還流した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をリカゲルクロマトグラフィにかけた。５％メタノール／ジクロロメタンによる溶出で、Ｎ−アミジノ−３−アミノ−５−ヘキサメチレンイミノ−６−フェニル−２−ピラジンカルボキサミドを黄色固体として得た（０．１１６ｇ、３５％）。
実施例５ ウイルス研究
さまざまなウイルスタンパク質類をコードするオープンリーディングフレーム（読み取り枠）を含む組み換えプラスミド類の構築
表２に示したさまざまなウイルスタンパク質類に対する相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）断片類を、親ウイルスゲノムクローンからのＰＣＲ増幅またはポリヌクレオチド配列の直接化学合成によって得た。例えば、Ｖｐｕをコードするオープンリーディングフレーム（図１ａ）は、下記のようにしてＨＩＶ−１ゲノムのＮｄｅＩ断片のｃＤＮＡクローンによるＰＣＲによって増幅させた（単離物ＨＸＢ２，ＭｃＦａｒｌａｎｅ Ｂｕｒｎｅｔ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）：天然のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；０．０３５Ｕ／／ＩＩ）を選びＰＣＲ反応触媒とし、酵素のプルーフリーディング活性による起こりうるＰＣＲ導入エラーを最小にした。５’センスプライマー（配列番号１）（＜４００＞２）は、ｐ２ＧＥＸのＧＳＴ遺伝子３‘末端にインフレームクローニングするためにＢａｎＨ１部位（下線部）を導入する（４１）。このプライマーはまた、スタートコドンを修復する（太字のＴは、ＨＸＢ２単離物中のスレオニンコドンであるｖｐｕ遺伝子のＱに置換する。３’アンチセンスプライマー（配列番号２）（＜４００＞３）は、ＰＣＲ産物の他端にＥｃｏＲ１部位（下線部）を導入し、クローニングを促進する。パーキンバルマーのサーモサイクラーにて壁厚０．５ｍｌの薄いエッペンドルフ管中で、９４℃で４５秒、５５℃で１分間および７２℃で１分間のサイクルを３０回行い、２６８ｂｐの断片を精製し、ＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１で消化し、同一の２種の酵素で消化し調製したｐ２ＧＥＸに連結した。生成した組み換えプラスミドを図１ｂに示した。Ｖｐｕオープンリーディングフレーム全体およびＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１連結部位を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ダイターミネータキットを用いて、サイクル配列決定によりＤＮＡ配列を確認した。他のｃＤＮＡ類は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）による当該技術で標準的な方法類を用いて合成した。コドン配列は、細菌、昆虫または哺乳類細胞中での発現に最適なように適当にした。制限エンドヌクレアーゼ酵素認識部位は、合成ｃＤＮＡ類の５’および３’末端に導入し、プラスミド発現ベクター類、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＦａｓｔＢａｃおよびｐＰＬ４５１へのクローニングを促進し、それぞれ、哺乳類、昆虫または細菌細胞中でのコードされたウイルスタンパク質類を発現させた。
分子生物学の標準的手法をクローニング実験で用いた。例えば、ｐＰＬ４５１発現プラスミド中への挿入のためＶｐｕオープンリーディングフレーム調製には、最初にｐ２ＧＥＸＶｐｕをＢａｍＨ１で消化し、５’塩基のオーバーハングをｄＮＴＰ類存在下クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）ＤＮＡポリメラーゼに入れた。このＶｐｕコード断片をその後、ＥｃｏＲ１消化により放出させ、アガロースゲルで精製し、Ｈｐａ１およびＥｃｏＲ１で消化しておいたｐＰＬ４５１に連結した。その後ウェスタンブロッティングにより、このｐＰＬＶｐｕ構築体（図１ｃ）が、ＲＰおよびＰＬプロモータ類のｃＩ８５７リプレッサー不活性化のため培養物を４２℃で導入した後、Ｖｐｕを発現したことを確認した。
Figure 0005030587
実施例６ Ｅ．Ｃｏｌｉからの組み換えＶｐｕの精製
ｐ２ＧＥＸＶｐｕを含むＥ．ｃｏｌｉ ＸＬＩ−ブルー細胞の培養物を、グルコース（６ｇ／Ｌ）およびアンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）添加ＬＢ培地中で激しく通気しながら、密度が約２５０濃度（Ｋｌｅｔｔ）単位になるまで３０℃で増殖させ、この時点で、最終濃度０．０１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに４時間増殖を継続させた。最終培養物密度は、約２８０濃度（Ｋｌｅｔｔ）単位であった。初期の実験で発現ＧＳＴ−Ｖｐｕ融合タンパク質の大半が細胞残渣および３０種の膜断片の両者に会合することが明らかになっているので、ＶａｒａｄｈａｃｈａｒｙおよびＭａｌｏｎｅｙの方法（Ｖａｒａｄｈａｃｈａｒｙ ａｎｄ Ｍａｌｏｎｅｙ、１９９０）を採用し、最初の精製段階のため浸透圧で破壊した細胞ゴースト（細胞残渣と膜断片類をまとめた）を単離した。細胞を採取し、洗浄し、秤量し、ＤＴＴ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）を含むＭＴＰＢＳ中に１０ｍｌ／ｇとなるように再懸濁させた。リゾチーム（０．３ｍｇ／ｍｌ；ニワトリ卵白；Ｓｉｇｍａ）を添加し、氷上で３０分間静かに攪拌しながらインキュベーションし、次に３７℃で５分間インキュベーションした。浸透圧に感受性とした細胞を１２，０００ｇでペレットにし、元の容量になるまで水中で、再懸濁させ、細胞を破裂させた。懸濁物を次に１×ＭＴＰＢＳ／ＤＴＴに１０×緩衝液原液を用いて調整し、遠心分離によりゴーストを単離し、ＭＴＰＢＳ／ＤＴＴに再懸濁させ、次に、順次グリセロール（２０重量／容量％まで）およびＣＨＡＰＳ（２重量／容量％まで）を添加し、最終容量を元の容量の１／４にした。この混合物を氷上で１時間攪拌し、次に４００，０００ｇで１時間遠心分離し、不溶性の物質を除去した。ＧＳＴ−Ｖｐｕ融合タンパク質をグルタチオン−アガロースレジンアフィニティクロマトグラフィ（Ｓｉｇｍａ）で界面活性剤による抽出により精製した。レジンをグリセロール（５％）、ＤＴＴ（１ｍＭ）およびＣＨＡＰＳ（０．５％）を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５（緩衝液Ａ）で完璧に洗浄し、次に、前記融合タンパク質のＶｐｕ部分を放出させ、ヒトトロンビンとの５０（ｖ／ｖ）％ビーズ懸濁物による処理（１００Ｕ／ｍｌ；３７℃で１時間）でレジン結合ＧＳＴから溶出させた。ＰＭＳＦ（０．５ｍＭ）を溶出物に添加し、トロンビン活性が全くなくなるようにした。このＶｐｕ分画をさらにＢｉｏＲａｄ ＨＰＬＣ結合ＭＡ７Ｑアニオン交換レジンで精製し、緩衝液Ａ中ＮａＣｌ直線勾配（０−２Ｍ）でさらに溶出した。
Ｖｐｕは均質―銀ステインゲルで決定―になるまで、下記のようにして免疫アフィニティカラムで精製した：Ｖｐｕを含むＨＰＬＣ分画を、ＮＡＰ２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で緩衝液Ａ中で脱塩し、次に、室温で１時間、抗体−アガロースゲルビーズと混合した。ビーズを完全に洗浄し、Ｖｐｕを塩濃度を２Ｍまで高めることによって溶出させた。タンパク質は、ＢｉｏＲａｄ色素結合アッセイを用いて定量した。
実施例７ Ｅ．Ｃｏｌｉ中Ｖｐｕの発現と精製
プラスミドｐ２ＧＥＸＶｐｕ（図１）を構築し、ＧＳＴとＶｐｕオープンリーディングフレームの間にインフレーム遺伝子融合を作製した。この系により、ＧＳＴのＣ末端に融合したＶｐｕポリペプチドのＩＰＴＧ−誘発可能な発現が可能になり、この融合タンパク質の精製がグルタチオンアガロース上でのアフィニティクロマトグラフィにより可能になった。
ＧＳＴ−Ｖｐｕタンパク質発現の最適レベルは、細胞密度約２５０−３００クレット単位になるまで培養物を３０℃で増殖させ、低レベルのＩＰＴＧ（０．０１ｍＭ）で誘発することによって、得られた。ＧＳＴ−Ｖｐｕを精製するため、細胞残渣と形質膜を含む細胞分画をまとめたものを、誘発細胞のリゾチーム処理とその後の低速遠心分離によって、調製した。約５０％のＧＳＴ−Ｖｐｕタンパク質が、この分画から両性イオン界面活性剤ＣＨＡＰＳを用いて可溶化される。グルタチオン−アガロースビーズを用いたアフィニティクロマトグラフィを用いて融合タンパク質を濃縮し、トロンビンを用いて融合パートナ間の高アフィニティトロンビン部位で融合タンパク質を切断し、Ｖｐｕを放出させた（図２Ａ）。アニオン交換カラムから溶出した分画の中で、Ｖｐｕが銀ステインゲルで可視できる主要タンパク質（図２Ｂ，レーン１）であった。最終的に、Ｖｐｕを免疫アフィニティカラムで明らかに均質になるまで精製した（図２Ｂ，レーン２）。免疫検出タンパク質に対応するこのタンパク質バンド（ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出し）のＮ末端アミノ酸配列によりそれがＶｐｕであると同定確認した。
実施例８ リン脂質小胞中でのＶｐｕ再構築
Ｖｐｕを含むプロテオリポゾームを、界面活性剤希釈法（Ｎｅｗ，１９９０）により調製した。クロロホルムに溶解した脂質類混合物（ＰＥ：ＰＣ：ＰＳ；５：３：２；総脂質１ｍｇ）を窒素ガス気流で乾燥させ、ＤＴＴ（１ｍＭ）含有リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ ｐＨ７．４）０．１ｍｌ中に再懸濁した。精製Ｖｐｕを含むアリコット２５μｌを添加し、最終濃度１．２５（重量／容量）％になるようにオクチルグルコシドを添加した。この混合物を液体窒素による凍結、融解およびバスタイプソニケータによる超音波破砕（２０−３０秒）を３回ずつ繰り返し、その後、リン酸カリウム緩衝液で２００倍容量に迅速に希釈した。プロテオリポゾームを４００，０００ｇで１時間遠心分離し採取し、約１５０μｌのリン酸緩衝液に再懸濁した。
実施例９ Ｖｐｕイオンチャンネル活性アッセイ
精製Ｖｐｕの活性を、脂質二重平面層にチャンネル活性を誘発するか、他文献に記載の標準的手法を用いて（Ｍｉｌｌｅｒ １９８６；およびＰｉｌｌｅｒら、１９９６）試験した。ＣＩＳおよびＴＲＡＮＳチェンバーの溶液を、直径約１００μｍの小円孔を含むＤｅｌｒｉｎ（商標）プラスチックウォールによって分離し、そのウォールを横断して高抵抗の電気的シールを形成するため、脂質二重膜が染色された。二重膜は、ｎ−デカン中パルミトイル−オレオイル−ホスファチジル−エタノールアミンおよびパルミトイル−オレオイルホスファチジル−コリン（８：２）混合物（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ、Ａｌａｂａｍａ）で染色された。２種のチェンバー中溶液は、ＭＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ６．０）を含み、それに対してさまざまなＮａＣｌまたはＫＣｌ濃度を添加した。Ａｘｏｐａｔｃｈ（商標）２００増幅器で電流を記録した。２種のチェンバー間の電位は、＋／−２００ｍＶ（接地ＣＩＳに対してＴＲＡＮＳ）の間に操作できた。Ｖｐｕ含有アリコットをＣＩＳチェンバーに界面活性剤溶液としてまたはタンパク質をリン脂質に取り込ませた後添加した。チェンバーを、電流が観察されるまで攪拌した。
実施例１０ 脂質二重膜でＶｐｕはイオンチャンネルを形成する
Ｖｐｕによるイオンチャンネル形成を分析するため、脂質二重平面膜への再構築を行った。精製組み換えＶｐｕのサンプル（タンパク質７乃至７０ｎｇを含む）を２層装置のＣＩＳチェンバー中の緩衝液１ｍｌに添加すると、２乃至３０分のさまざまな攪拌期間後に電流ゆらぎが検出された（図３）。チャンネル活性観察に要した時間は、チェンバーに添加したタンパク質量におよそ対応していた。対照緩衝液アリコットまたは対照脂質小胞をＣＩＳチェンバーに添加した時には、チャンネルは全く検出されなかった。それらの対照実験において、チャンネル活性が出現することもなく１時間以上チェンバーを攪拌できた。
実施例１１ Ｖｐｕチャンネルの性質
それぞれ独立した精製物５個から調製したＶｐｕサンプルにおいてチャンネル活性が４０以上のそれぞれの実験で観察された。異なる実験では、電流の大きさが広い範囲で変動し、添加したタンパク質量におよそ相関しているようであった。測定した最小および最大チャンネルは、それぞれ、１４ｐＳおよび２８０ｐＳのコンダクタンスを有していた。チャンネルは、Ｖｐｕを含む脂質小胞を調製し、二重膜に融合すると、界面活性剤溶液として精製タンパク質を添加した時よりもいつも小さかった。これは、前者の方法が高濃度の界面活性剤による処理と希釈段階を含み、そのことが大きな集合体をモノマーに小さくするのに貢献し得る。
電流の大きさと電圧の関係は直線的で、１０倍勾配のＮａＣｌ（５００ｍＭ ＣＩＳ；５０ｍＭ ＴＲＡＮＳ）を含む溶液での逆電位は、＋３０ｍＶであった（図３Ｂ）。溶液がＮａＣｌの代わりにＫＣｌを含む時に同様の逆電位が得られた。膜のいずれかの側における溶液中ＮａＣｌまたはＫＣｌによる実験５回で、平均逆電位は３１．０＋／−１．２ｍＶ（＋／−ＳＥＭ）であった。これは、カチオンのみを選択的に透過できるチャンネルについて予測したよりもより低い。Ｇｏｌｄｍａｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ−Ｋａｔｚ式におけるイオン活性を用いて、約５．５のＰＮａ／ＰＣｌ比を得て、このことは、チャンネル類がまた塩素イオン類も透過できることを示唆している。塩素イオンをホスフェートで置換してアニオン電流を低下させてみた。Ｎａ−ホスフェート勾配（１５０ｍＭ Ｎａ＋＆１００ｍＭ ホスフェートＣＩＳ；１５ｍＭ Ｎａ＋＆１０ｍＭ ホスフェートＴＲＡＮＳ、ｐＨ６．８）をＮａＣｌ勾配の代わりに用いた時、逆電位は、３７．１＋／−０．２（＋／−ＳＥＭ，ｎ＝２）であり、同様に約５のカチオン／アニオン透過率を示唆した。（ホスフェート溶液を伴う計算について、モノおよび２価アニオン類の合計活性を用い、また、２種が同等の透過性であると仮定した）。電流−電圧曲線は、ＮａＣｌ溶液で見られなかった整流を示した。Ｖｐｕによって形成されたチャンネル類がＮａ＋およびＫ＋に対して同等の透過性であり、程度がより低いが塩素ならびにホスフェートイオン類に対しても透過性であると結論できる。
実施例１２ 潜在的イオンチャンネルブロック薬物類のスクリーニング用細菌バイオアッセイ
このバイオアッセイは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＶｐｕの発現の結果経膜ナトリウム勾配を分散させる細胞膜局在活性Ｖｐｕチャンネルが生成するという観察に基づいている。このＶｐｕチャンネル活性の結果、細胞内集積がナトリウム依存性コトランスポータ（例 プロリンまたはアデニン）により媒介されている代謝物類が合成された場合よりもより速く細胞から出てきて、その結果、代謝物類の細胞内レベルが細胞増殖に対して制限することになる。それによって、Ｖｐｕ発現Ｅ．ｃｏｌｉ細胞はアデニンまたはプロリンを欠損している最小ドロップアウト媒地で増殖できなくなる。しかし、Ｖｐｕチャンネルをブロックする薬物が存在すると、細胞は再度その経膜ナトリウム勾配を−膜中の他のイオンポンプの作用により−再確立し、代謝物の漏出が防止され、増殖は可能となる。
ＶｐｕがナトリウムチャンネルをＥ．ｃｏｌｉ形質膜中で形成できることを実証するための実験を下記のようにして行った。
Ｅ．ｃｏｌｉ中で未融合Ｖｐｕを発現させるため、ｖｐｕオープンリーディングフレームをプラスミドｐＰＬ４５１にクローニングし、組み換えプラスミドｐＰＬ−Ｖｐｕを作った（図１ｂ）。このベクター中で、強力なＰＬおよびＰＲラムダプロモータ類を用いて温度感受性ｃ１８５７リプレッサーの制御下Ｖｐｕ発現を進め、３０℃で増殖させると、発現が強く抑制され、温度を３７℃と４２℃の間に上げることによって誘発できるようにする。寒天プレート上で、ｐＰＬ−Ｖｐｕを含む細胞が３０℃および３７℃でインキュベーションすると増殖したが、４２℃では増殖せず、一方対照株類は４２℃で非常によく増殖した。ｐＰＬ−Ｖｐｕを含む細胞の液体培養物をＯＤ６００＝０．８４となるように３０℃で増殖させ、その後、４２℃で２時間増殖させた（最終細胞密度はＯＤ６００＝０．７５であった）。形質膜分画を調製し、ＶｐｕのＣ末端に特異的に結合する抗体を用いてウェスタンブロッティングし、約１６ｋＤａの単一バンドを検出したが、このことは、Ｖｐｕが発現し膜類に結合していることを示唆している（図２Ａ、レーン５）。
実施例１３ クロスフィーディング実験はプロリンがＶｐｕ発現細胞から漏出することを示す
Ｅ．ｃｏｌｉによるプロリン取り込みについては十分に特性解析されており、記細胞中へのこのアミノ酸の能動輸送がエネルギー源としてナトリウム勾配を利用することがわかっている（Ｙａｍａｔｏら、１９９４）。プロリン漏出が起こるかどうかを検出するため、下記のクロスフィーディングアッセイを用いた：プロリンおよびメチオニンを栄養素として要求するＥ．ｃｏｌｉ株菌叢（Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−）を接種し、プロリンを欠いているがメチオニンを含む最小ドロップアウト培地プレートにソフト寒天オーバーレイとして注いだ。無菌の多孔性フィルターディスクに、ｐＰＬ４５１対照プラスミドまたはｐＰＬ−Ｖｐｕを含むＭｅｔ＋Ｐｒｏ＋株（ＸＬ−１ブルー）を接種し、ソフト寒天上に置いた。プレートを次に、３７℃または３０℃で２日間インキュベーションした。その後、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−株のハロ状増殖が明らかに認められ、ｐＰＬ−Ｖｐｕを含む細胞を接種したディスクを３７℃でインキュベーションした（図４Ａ）。この増殖は、ディスク上のＶｐｕ発現細胞からのプロリン漏出のみによる。３７℃であるいはその近辺で対照株からあるいは３０℃で増殖させたプレート上のいずれの株からもこのような漏出は全く認められなかった（図４Ｂ）。
プロリン運搬と対照的に、Ｅ．ｃｏｌｉメチオニンパーミアーゼがＡＢＣトランスポートファミリに属することが公知であり（Ｒｏｓｅｎ，１９８７）、従って、ＡＴＰによってエネルギーを得ている。前記と同様のクロスフィーディング実験を同様に行ったが、ただし、メチオニンを欠いているがプロリンを含有する最小ドロップアウトプレート上に前記のＭｅｔ−Ｐｒｏ−株を塗布した。この株の増殖はどのディスクでも全く見られず（図４Ｃ）、メチオニンがＶｐｕが発現している時でもＸＬ−１ブルーから漏出していないことを示唆している。
実施例１４ Ｖｐｕ発現Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、増殖用外部培地中にアデニンを必要とする。
アデニン合成経路中における未解析の変異によりＶｐｕ発現ＸＬ−１ブルーＥ．ｃｏｌｉ細胞の３７℃における増殖は、前記培地中にアデニンが存在するかどうかに依存していた。これにより、前記のプロリンクロスフィーディングアッセイよりもＶｐｕイオンチャンネル活性についてはるかに簡便なバイオアッセイを開発できた：ｐＰＬ−Ｖｐｕプラスミドを含むＸＬ−１ブルー菌叢を、培地中にアデニンを欠いているアガロースプレート上に接種し、Ｖｐｕチャンネル阻害を試験する薬物の少量のアリコットをアガロースに距離を離してスポットし、前記プレートを適当な時間３７℃でインキュベーションする（１２−３６時間）。特定薬物適用部位周辺における増殖ハロは、この薬物が、薬物不在下で増殖を防止するＶｐｕイオンチャンネル活性発現を阻害したことを示唆している（図５）。
実施例１５ Ｖｐｕチャンネルブロック活性についての脂質二重平面膜化合物類の分析
脂質二重平面膜に再構成したＶｐｕイオンチャンネル活性をブロックする化合物の能力を特性解析した。トリフルオロエタノールに溶解させたＶｐｕ Ｎ末端ペプチド（残基１−３２）を二重層装置のＣＩＳチェンバーに添加し、溶液をイオン電流が観察されるまで攪拌したが、このことは、１種以上のＶｐｕイオンチャンネルの二重膜への取り込みを示唆していた。数分間チャンネル活性を記録した後、薬物をＣＩＳおよびＴＲＡＮＳチェンバー中溶液に攪拌しながら最終濃度１００μＭになるまで添加した。チャンネル活性を次に少なくとも３分間記録し、イオン電流に及ぼす薬物添加効果を、薬物添加前後のチャンネル活性を比較することによって決定した。各実験について、薬物効果を４種のカテゴリーに分類した：電流が約９０−１００％阻害されると“強度ブロック”；約５０−９０％阻害で“弱ブロック”；＜約５０％阻害で“部分ブロック”；および“効果なし”。
Ｖｐｕ Ｎペプチド添加後に±５０ｐＡを超える電流が発生した場合、実験を無視した、その理由は、このような場合、非天然ペプチド集合体が二重膜破壊に寄与している可能性があるからである。このような集合体類は、その無秩序な構造のゆえに試験濃度の薬物類によって特異的にブロックできないのであろう。
表３は、二重層実験の結果を要約して示す。これらの実験の新しい結果は、フェナミルで観察されたＶｐｕチャンネル類の強度ブロックであった。フェナミルは、アミロライドのグアニジン基にフェニル基誘導体を有する。アミロライド自体は、Ｖｐｕのブロッカーではないが、一方、ピラジン環の５位にヘキサメチレン基を添加すると２５μＭもの低い濃度でチャンネルをブロックする構造（ＨＭＡ）を作り出した。しかし、フェナミルによるこれらの新しい結果は、分子の反対の末端における大きな疎水性誘導体はまた、アミロライドを有効なＶｐｕチャンネルブロッカーに変えることができることを示している。非常に類似した構造を有するベンザミルがＶｐｕチャンネルブロックの有効性がはるかに低いことは、興味深い。
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実施例１６ Ｖｐｕタンパク質の細菌バイオアッセイを用いた化合物スクリーニング
−実施例１４で記載したように−特定薬物適用部位周辺での増殖輪（ｈａｌｏｓ）は、０および６の間の点数を示し、細菌細胞増殖のゾーン大きさと密度を反映した。３を超える点数は、Ｖｐｕタンパク質の強度阻害を示し；１．５と３の間の点数は、中等度の阻害を示し、０．０１と１．５の間の点数は、かなりの阻害を示す。
表４は、細菌バイオアッセイにおけるＶｐｕタンパク質阻害点数を示す。
Figure 0005030587
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実施例１７ ヒト単球およびマクロファージにおけるＨＩＶ複製に及ぼす化合物効果
ヒト単球を末梢血から単離し、２４時間または７日間培養し、単球誘導マクロファージ（ＭＤＭ）へ分化させた。これらの細胞を次にＨＩＶ単離物の無細胞調製物に暴露させ、培地の完全吸引前に２時間吸収させ、ウイルス非含有培地で１回洗浄し、新鮮培地に再度懸濁させた。細胞をさまざまな濃度の化合物に感染２４時間前または後に暴露させた。感染後さまざまな時点でその後のＨＩＶ複製を、薬物暴露細胞と薬物に暴露しなかった細胞（対照）中で比較した。ウイルス複製の進行と程度は、ＨＩＶ ＤＮＡ ＰＣＲ法（Ｆｅａｒら、１９９８）またはＥＬＩＳＡ法を用いて分析し、培養上清におけるｐ２４を定量した（Ｋｅｌｌｙら、１９９８）。
表５は、この分析と試験抗ウイルス化合物類を用いて得られた結果の例を示している。
Figure 0005030587
実施例１８ ＳＡＲＳコロナウイルス
ＳＡＲＳ Ｅタンパク質は、イオンチャンネルを形成する
ペプチド合成
全長ＳＡＲＳ−ＣｏＶ（単離物Ｔｏｒ２およびＵｒｂａｎｉ）Ｅタンパク質に対応するペプチド（配列番号３）および全長Ｅタンパク質の最初のアミノ酸４０個を含み経膜ドメイン（配列番号４）に対応する第２のペプチドを、ＦＭＯＣ化学と固相ペプチド合成を用いてマニュアルで合成した。この合成は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ，ＵＳＡ）のＳｙｍｐｈｏｎｙ（登録商標）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒを用いてＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｊｏｈｎ Ｃｕｒｔｉｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＮＵ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で製造業者の指示に従い行った。
実施例１９ ペプチド精製
合成ペプチドのマススペクトル分析により、前記調製物が全長生成物で予測されるよりも低いｍ／ｚ比を有する物質を有意量含んでいることが明らかになった。これらの大半は、おそらく、ペプチド合成プロセス中で生成した切断されて短くなったペプチド類であろう。全長Ｅタンパク質を高含量とするため、下記の操作を用いたが、それは、小分子類と全長ペプチドの溶解度が異なることを利用している。粗調整物を１２ｍｇ／ｍｌで７０％ＣＨ３ＣＮ、０．１％ＴＦＡ中に懸濁させ、１０分間ボルテックスした。この懸濁物を１０，０００ｇで１０分間２０℃で遠心分離した。上清を捨て、不溶性分画を７０％ＣＨ３ＣＮ，０．１％ＴＦＡで前記のようにさらに２回抽出した。Ｅタンパク質を含む不溶性物質をＳｐｅｅｄｖａｃを用いて乾燥させ、最終産物の重量を用いて収率を計算した。精製ペプチドをＢｒｕｋｅｒ Ｏｍｎｉｆｌｅｘ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリによって２．５ｍｇ／ｍｌＨＡＢＡマトリックスとメタノール１：１比中で分析し、スペクトルをポジティブ直線モードで得た。ｍ／ｚ比８，３６０．１の明確なピークが、全長Ｅタンパク質の計算分子量について予測したとおりに観察され、Ｎ末端Ｅタンパク質については、４４２２．３であった。
実施例２０ 脂質二重平面膜
ＳＡＲＳウイルスＥタンパク質を２，２，２−トリフルオロエタノールに１ｍｇ／ｍｌで再懸濁させた。ＳＡＲＳウイルスＥタンパク質のイオンチャンネル形成能力を、Ｗａｒｎｅｒ（Ｗａｒｎｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、１１２５Ｄｉｘｗｅｌｌ Ａｖｅｎｕｅ，Ｈａｍｄｅｎ，ＣＴ０６５１４）二重層リングで下記のように試験した：１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルセリン、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン３：１：１のＣＨＣｌ３中脂質混合物をＮ２ガスで乾燥させ、ｎ−デカン中に５０ｍｇ／ｍｌとなるように再懸濁した。二重膜を直径約１００μｍの円形孔を介して、水溶液をＣＩＳおよびＴＲＡＮＳチェンバーに分離しているＤｅｌｒｉｎ（商標）カップ中で染色した。ＣＩＳチェンバーは、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．２中に５００ｍＭ ＮａＣｌまたはＫＣｌ溶液を含み、ＴＲＡＮＳチェンバーは、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．２中に５０ｍＭ ＮａＣｌまたはＫＣｌ溶液を含んでいた。２％アガロースブリッジを塩素中で塗布した銀電極を、ＣＩＳおよびＴＲＡＮＳチェンバー溶液中に入れる。ＳＡＲＳ Ｅタンパク質全長またはＮ末端ペプチド類（３−１０μｇ）をＣＩＳチェンバーに添加し、これをチャンネル活性が検出されるまで攪拌した。ＣＩＳチェンバーにアースを付け、ＴＲＡＮＳチェンバーを＋１００から−１００ｍＶの範囲のさまざまな保持電位に保持した。ＷａｒｎｅｒモデルＢＤ−５２５Ｄ増幅器を用いて電流を記録し、１ｋＨｚでろ過し、５ｋＨｚでサンプル採取し、所内で開発したソフトウェアを用いてＰＣハードディスクにデジタル記録した。
ＳＡＲＳ Ｅタンパク質イオンチャンネル活性を阻害する能力を試験する薬物類は、５０％ＤＭＳＯ：５０％メタノール溶液中で５０ｍＭに作製した。Ｅタンパク質イオンチャンネル活性阻害化合物類の能力を試験する実験のため、１００μＭから４００μＭの化合物をＣＩＳチェンバーに３０秒間攪拌しながら添加した。二重膜電流をチャンネル活性前、チャンネル活性中および薬物添加後に記録した。
試験化合物類の中にシンナモイルグアニジン（Ｂｉｔ０３６）があり、それは、前の実験で抗ウイルス性であり他のウイルス類由来のイオンチャンネルタンパク質類を阻害することが示された。
実施例２０．１ ポリアクリルアミドゲル電気泳動
精製Ｅタンパク質を、６Ｍ尿素、１０％グリセロール、５％ＳＤＳ、５００ｍＭ ＤＴＴ，０．００２％ブロモフェノールブルー、６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸（ｐＨ８．３）中に１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解させた。ペプチド溶液を１００℃で２０分間加熱してから、サンプル３０μＬをスタッキングゲル４−２０％（Ｇｒａｄｉｐｏｒｅ）上に流した。ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）前染色標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を分子量マーカーとして用いた。
実施例２０．２ 結果
ＳＡＲＳ Ｅタンパク質がイオンチャンネルを形成するかどうか試験するため、精製した合成ペプチドを脂質二重膜に再構成した（２１）。主に、ＳＡＲＳ全長Ｅタンパク質３μｇを攪拌しながらＣＩＳチェンバーに添加した。このＣＩＳチェンバーは、５００ｍＭのＮａＣｌを含み、ＴＲＡＮＳチェンバーは、５０ｍＭのＮａＣｌを含んでいた。実験６０回で、ＳＡＲＳ Ｅタンパク質イオンチャンネル活性によるイオン電流が、約５−１５分間攪拌後に観察された。活性は二重膜を介して約−１００ｍＶの保持電位によりさらに迅速にかつ再現性よく検出された。これらの実験のうち１実験で−１００ｍＶ（Ａ）および−６０ｍＶ（Ｂ）で記録した電流を図６に示した。その実験では、逆電位は、約＋４８ｍＶであり、チャンネルコンダクタンスは、それぞれ５２ｐＳおよび２６ｐＳと計算された。このことは、電流−電圧（ＩＶ）関係が直線的でないことを示唆している。全くタンパク質をＣＩＳチェンバーに添加しなかった他の１０回の実験において、１時間以前記録した後でもイオンチャンネル活性は全く検出されなかった。
図７ａは、ＮａＣｌ溶液中である範囲の電位にわたって記録した典型的電流トレースを示している。その実験において、電流の向きは、＋４８ｍＶにおいて逆転した（図７ｂ）。ＩＶ曲線は、低電圧で二重膜にわたる平均電流は小さいが、高電位では、二重膜を横切って平均電流の増加があり、その結果、非直線的ＩＶ関係が生じた。独立した７回の実験では、平均逆電位は、＋４８．３±２．３ｍＶ（平均±１ＳＥＭ）で、前記チャンネル類がＣｌ−イオンよりもＮａ＋イオンの透過性が約３７倍高いことを示唆している。この逆電位は、Ｎａ＋平衡電位（＋５３ｍＶ）に近く、したがって、前記チャンネルがＮａ＋イオン選択性である。これら７回の実験について、チャンネルコンダクタンスは９５−１６４ｐＳの間で変動し；平均コンダクタンスは１３０±１３ｐＳであった。
ＳＡＲＳ Ｅタンパク質イオンチャンネルは、Ｎａ＋イオンよりもＫ＋イオンに対して選択性がわずかに低い。図８ｂは、ある範囲の電位においてＫＣｌ溶液中における電流を記録したものを示している。この実験において、電流は＋３１ｍＶにおいて逆転した。７回の類似実験において、Ｅタンパク質イオンチャンネル平均逆電位は＋３４．５±２．５ｍＶであった。したがって、ＳＡＲＳ Ｅタンパク質イオンチャンネルは、Ｃｌ−イオンよりもＫ＋イオンに対して約７．２倍透過性が高い。７回の実験において、チャンネルコンダクタンスは、２４−１６６ｐＳの間で変動し、平均コンダクタンスは、８３．４±２６ｐＳであった。
類似結果が、ＳＡＲＳ Ｅタンパク質の最初の４０個のアミノ酸類“Ｎ末端ペプチド”に対応する第２の合成ペプチドで得られた。４回の実験におけるＮａＣｌ溶液中平均逆電位は、＋４６．３±２．５ｍＶであり、Ｎ末端ペプチドにより形成されたイオンチャンネルがＣｌ−イオンよりもＮａ＋イオンに対して約２５倍透過性であることを示している。ＳＡＲＳ Ｅ タンパク質Ｎ末端ペプチドは、全長ＳＡＲＳ Ｅタンパク質の性質と同様の性質を有するイオンチャンネルの形成に十分であった。したがって、ＳＡＲＳ Ｅタンパク質の選択性フィルターは、このＮ末端最初のアミノ酸４０個内部に含まれているようである。
ＳＡＲＳ Ｅタンパク質Ｎ末端ペプチドはまた、ＫＣｌ溶液中でイオンチャンネルを形成し、全長Ｅタンパク質に比べて同様にＫ＋イオンに対して選択的であった。５回の独立した実験において、平均チャンネル逆電位は＋３９．５±３．６ｍＶであり、従って、前記チャンネルは、Ｃｌ−イオンよりもＫ＋イオンに対して約１１倍透過性である。精製した全長Ｅタンパク質ペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥは、全長Ｅタンパク質に対応するバンドを示した（データ示さず）。約２０ｋＤａまでのさまざまな大きさの大きなバンドが検出され、ＳＡＲＳ Ｅタンパク質がホモオリゴマーを形成できることを示唆していた。
実施例２１ ＳＡＲＳ Ｅタンパク質イオンチャンネルがシンナモイルグアニジンおよび他の化合物類によってブロックされる
ＮａＣｌ溶液中でのＥタンパク質イオンチャンネル活性は、ＣＩＳチェンバーにシンナモイルグアニジン１００乃至２００μＭを添加することにより有意に低下した（ｐ＞＝０．０１、ｎ＝６回の実験）。二重膜にわたる平均電流は、シンナモイルグアニジン１００μＭにより基準値まで低下した。Ｅタンパク質イオンチャンネルが高コンダクタンスを有する実験において、シンナモイルグアニジン１００乃至２００μＭが二重膜にわたる平均電流を約４分の１だけ低下させた。同様に、他の４回の実験では、シンナモイルグアニジン１００乃至２００μＭがＫＣｌ溶液中全長Ｅタンパク質によって形成されたチャンネルをブロックした。さらに２回の実験において、ＳＡＲＳ Ｅタンパク質Ｎ末端ペプチドは、１００乃至２００μＭのシンナモイルグアニジンによりブロックされ、このことは、シンナモイルグアニジン薬物結合部位がＥタンパク質Ｎ末端ペプチドの最初のアミノ酸４０個の中にあることを示している。ＳＡＲＳ Ｅタンパク質に対する効果を二重膜で調べた他の化合物類を下記の表６に示した。
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実施例２１．１ 結果と考察
我々は、ＳＡＲＳ Ｅタンパク質が脂質二重層膜中でイオンチャンネルを形成できることを示してきた。このイオン電流は正電位で逆転し、このことは、Ｅタンパク質イオンチャンネルが１価のアニオンよりも１価のカチオンに対して選択性であることを示している。Ｅタンパク質イオンチャンネルは、Ｃｌ−イオンよりもＮａ＋イオンに対して約３７倍選択的であり、Ｃｌ−イオンよりもＫ＋イオンに対して約７．２倍選択的であった。６０回を超える実験において、Ｅタンパク質イオンチャンネルのＮａ＋コンダクタンスは２６ｐＳの低さから１６４ｐＳの高さまで変動した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｅタンパク質がホモオリゴマーを形成することを示し、我々は、大きなコンダクタンスは、大きなイオンチャンネルまたは多くのイオンチャンネルが同調して開となることによるＥタンパク質ペプチドの集合によるのであろうと推量した。７回の実験でシングルチャンネル電流が観察され、これらからチャンネルコンダクタンスが電圧依存性であると計算された。
Ｎ末端の最初のアミノ酸４０個はＳＡＲＳウイルスＥタンパク質の疎水性ドメインを含み、二次元脂質二重層のイオンチャンネル形成に十分である。Ｎ末端Ｅタンパク質イオンチャンネルは、全長Ｅタンパク質イオンチャンネルと同一の選択性とコンダクタンスを有している。
全ての公知のコロナウイルスは疎水性Ｎ末端経膜ドメインを有するＥタンパク質をコードし、したがって、全てのコロナウイルス類Ｅタンパク質類は、脂質二重平面膜上でイオンチャンネルを形成できた。このことは、Ｅタンパク質が抗ウイルス薬の適切な標的であり、おそらく感染宿主細胞からのコロナウイルス伝播を停止させることを示唆している。Ｅタンパク質イオンチャンネルをブロックする薬物類はＳＡＲＳおよび通常の風邪を含む数種の重大なヒトおよび獣医学的コロナウイルス疾患の治療に有効な抗ウイルス療法となるであろう。
ＮａＣｌおよびＫＣｌ溶液中における二次元脂質二重層上でのＳＡＲＳウイルス全長Ｅタンパク質イオンチャンネル活性およびＮ末端ドメインＥタンパク質イオンチャンネル活性は、１００μＭ乃至２００μＭのシンナモイルグアニジンをＣＩＳチェンバーに添加することにより阻害された。シンナモイルグアニジンによるＥタンパク質イオンチャンネル活性の阻害または部分阻害は、ＮａＣｌ溶液中で７回の独立した実験でかつＫＣｌ溶液中で４回の独立した実験で観察された。
実施例２２ 潜在的ＳＡＲＳ−ＣｏＶ Ｅタンパク質イオンチャンネルブロック薬物類スクリーニング用細菌バイオアッセイ
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ Ｅタンパク質イオンチャンネルは細菌細胞増殖を阻害する
細菌細胞におけるＳＡＲＳ−ＣｏＶ Ｅタンパク質機能バイオアッセイを開発した。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ Ｅタンパク質をコードする合成ｃＤＮＡ断片を発現プラスミドｐＰＬ４５１にクローニングし、Ｅタンパク質発現が温度誘発性であるベクターを実施例４に記載のように作製した。Ｅタンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞増殖の３７℃における阻害を、前記細菌細胞が維持している正常なＮａ＋勾配を消失させるｐ７イオンチャンネル機能のインジケータとして観察した。
実施例２３ ＳＡＲＳコロナウイルスＥタンパク質細菌バイオアッセイを用いた化合物スクリーニング
特定薬物適用部位周辺における増殖輪は、−実施例１４で述べたように−実施例１５に記載のように点数化した。
表７は、細菌バイオアッセイにおけるＳＡＲＳ−ＣｏＶ Ｅタンパク質阻害点数を示している。
Figure 0005030587
Figure 0005030587
実施例２４ ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ ＣｏＶ）複製に対する化合物試験のためのＳＡＲＳ抗ウイルス分析
精製を３回行ったウイルスプラークを用いてＶｅｒｏ細胞中でＳＡＲＳ−ＣｏＶ（Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ株）に対して化合物を試験した。ストックウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞をＭＯＩ＝１×ＴＣＩＤ５０／細胞１００個で感染させることによって作製した。
実施例２４．１ ウイルスマイクロタイター分析を用いた抗ウイルス活性スクリーニング
２５ｃｍ２のフラスコ中で増殖させたＶｅｒｏ細胞の単層を１：５０の倍数で感染させ、１０μＭおよび２μＭの２種の濃度の化合物類で感染直後に処理した。対照感染単層は、未処理のままとした。培地サンプルを感染４８時間後に採取した。各サンプルからのアリコット２個（滴定物１および２）を順次対数希釈し、対数希釈−４乃至７の１２個の重複物をマイクロタイタープレート中の細胞に添加した。４日後、マイクロタイタープレート中のウェルの細胞障害効果（ＣＰＥ）を点数化し、力価を４種の希釈物におけるＣＰＥプラスウェルの数に基づき計算した。対照力価は、４．８および５．９ＴＣＩＤ５０×１０６（平均５．３５×１０６）であった。
実施例２５ ＳＡＲＳ ＣｏＶ抗ウイルス分析における化合物類の効果：
３種の選択した化合物類のＳＡＲＳ−ＣｏＶに対する活性を実施例２１に記載の方法により試験した。トランス−３−（１−ナフチル）アクリロイルグアニジンおよびシンナモイルグアニジンについて、約８０％のウイルス力価低下を濃度１０μＭで観察し、さらに、約５０％の低下が２μＭのトランス−３−（１−ナフチル）アクリロイルグアニジンで保持されるのがわかった。
表８は、対照（化合物類不在下４８時間増殖させたＳＡＲＳ ＣｏＶ）に対する％として示したウイルス力価を示している。
Figure 0005030587
実施例２６ ヒト２２９Ｅコロナウイルス
２２９Ｅ−Ｅタンパク質対応ペプチドの合成と精製
全長２２９Ｅ−Ｅタンパク質に対応するペプチド（配列：配列番号５；寄託番号ＮＰ＿０７３５５４）を、ＦＭＯＣ化学と固相ペプチド合成を用いてマニュアルで合成した。この合成は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＳ，ＵＳＡ）のＳｙｍｐｈｏｎｙ（登録商標）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒを用いてＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｊｏｈｎ Ｃｕｒｔｉｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＮＵ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で製造業者の指示に従い行い、Ｃ−末端アミド類を得て、Ｎ−メチルピロリドン中でＨＢＴＵおよびハイドロキシベンゾトリアゾールとカップリングさせた。各合成サイクルは、ダブルカップリングおよび４倍過剰のアミノ酸類を用いた。暫定的α−Ｎ Ｆｍｏｃ−保護基は、ＤＭＦ中２０％ピペリジンを用いて除去した。
粗合成ペプチドは、製造業者の指示に従いＰｒｏｔｅｏＰｌｕｓ（商標）キット（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ ｉｎｃ．ＣＡ）を用いて精製した。簡単に述べると、ペプチド類を適用緩衝液（６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、６Ｍ尿素，５％ＳＤＳ，１０％グリセロール、０．２％ブロモフェノールブルー、±１００ｍＭ β−メルカプトエタノール）で希釈し、トリス−グリシン電気泳動緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，２５０ｍＭ グリシン、０．１％ＳＤＳ）中４−２０％の勾配ポリアクリルアミドゲル（Ｇｒａｄｉｐｏｒｅ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で流した。ペプチドをゲルコードブルー（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＮＳＷ）で染色し、全長ペプチドに対応するバンドをゲルから切り出した。
ゲルスライスをＰｒｏｔｅｏＰＬＵＳ（商標）管に移し、トリス−グリシン電気泳動緩衝液を満たした。管はトリス−グリシン電気泳動緩衝液中に浸漬させ、約１時間１００ボルトにした。電流の極性は１分間逆転し、回収されるタンパク質量を増加させた。ペプチド類を採取し１３，０００ｇで１分間遠心分離した。精製ペプチド類をＳｐｅｅｄｖａｃで乾燥させ、最終産物の重量を用いて収率を計算した。
実施例２７ ２２９Ｅ−Ｅタンパク質は脂質二重平面膜においてイオンチャンネルを形成する
脂質二重膜研究は、他文献に記載されているように実行した（Ｓｕｎｓｔｒｏｍ，１９９６；Ｍｉｌｌｅｒ，１９８６）。パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン、パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルセリン、パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルコリン（５：３：２）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａｂａｍａ）脂質混合物を用いた。この脂質混合物を１ｍｌデルリンカップの壁中１５０−２００μｍの孔上に塗布した。孔は、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓの２種のチェンバーを分離し、両者ともに異なる濃度の塩溶液を含んでいた。ｃｉｓチェンバーは、地面に接続し、ｔｒａｎｓチェンバーは、Ａｘｏｐａｔｃｈ２００増幅器の入力部に接続した。通常、ｃｉｓチェンバーは５００ｍＭ ＮａＣｌまたは５００ｍＭ ＫＣｌ溶液を含み、ｔｒａｎｓチェンバーは、５０ｍＭ ＮａＣｌまたは５０ｍＭ ＫＣｌ溶液を含んでいた。二重膜の形成は、電流ランプで発生した電流パルスの高さにより、電気的にモニターした。電位は、ｃｉｓに対してｔｒａｎｓチェンバー中で測定した。合成ペプチドは、ｃｉｓチェンバーに添加し、チャンネル活性が観察されるまで攪拌した。電流を１０００Ｈｚでフィルタリングし、５０００Ｈｚでデジタル化し、磁気ディスクに保存した。
２２９Ｅ Ｅ合成ペプチドを、２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）中に０．０５ｍｇ／ｍｌ乃至１ｍｇ／ｍｌで溶解させた。この１０μｌを２層装置のｃｉｓチェンバーに添加し（１ｍｌ水性容量）、それを磁気“フリー”で攪拌した。二重膜中チャンネル活性を示唆するイオン電流は、典型的には、１５−３０分以内に検出された。チャンネルを検出した後、２層にわたる保持電位は−１００ｍＶと＋１００ｍＶの間で変動し、電流の大きさと極性を特徴付けさらに逆電位の決定が可能になった。
ｃｉｓチェンバーが５００ｍＭ ＮａＣｌ溶液を含みｔｒａｎｓチェンバーが５０ｍＭ ＮａＣｌ溶液を含む１５回の実験で、チャンネル活性の平均逆電位は、２２±７（ＳＥＭ）ｍＶと計算された。ｃｉｓチェンバーが５００ｍＭ ＫＣｌ溶液を含みｔｒａｎｓチェンバーが５０ｍＭ ＫＣｌ溶液を含む１３回の実験で、チャンネル活性の平均逆電位は、３８±４（ＳＥＭ）ｍＶと計算された。これらの結果は、２２９Ｅ Ｅタンパク質がカチオン選択的イオンチャンネルを形成し、Ｎａ＋イオン類に対してよりもＫ＋イオン類に対してわずかに選択性が高いことを示唆している。
図９は、非対称ＫＣｌ溶液（５００／５０ｍＭ）中さまざまな保持電位（ｔｒａｎｓに対してのｃｉｓ）における２２９Ｅ Ｅイオンチャンネルの粗電流データ例を示している。グラフは、平均二重膜電流（ｐＡ；ｙ軸）対保持電位（ｍＶ；ｘ軸）の代表的プロットである。
実施例２８ 化学化合物類が２２９Ｅ Ｅタンパク質合成ペプチドのイオンチャンネル活性を阻害する。
２２９Ｅ Ｅタンパク質が形成したイオンチャンネルをブロックするかまたは阻害する能力を化合物について試験するため、前記化合物類を含む溶液の少量のアリコットを、平面脂質類を入れた水溶液に添加したが、この溶液中では、ペプチドチャンネル活性が再構成されておりイオン電流に及ぼす化合物添加の効果を記録し測定した。
化合物原液溶液は、典型的には、ＤＭＳＯ中で５００ｍＭで調製した。この溶液をさらに５０ｍＭまたはさらに低濃度に５０％ＤＭＳＯ／５０％メタノールで希釈し、適当に希釈した化合物の２μｌを、ｃｉｓおよび／またはｔｒａｎｓチェンバーに添加し、所望の最終濃度を得た。
図１０に示した実施例でｃｉｓチェンバーにシンナモイルグアニジン１００μＭを添加すると、２２９Ｅ Ｅイオンチャンネルを介した電流を大幅に低下させた。
実施例２９ 潜在的２２９Ｅ−ＣｏＶ Ｅタンパク質イオンチャンネル−ブロック薬物類のスクリーニング用細菌バイオアッセイ。
２２９Ｅ−ＣｏＶ Ｅ−タンパク質イオンチャンネルは、細菌細胞増殖を阻害する
細菌細胞中における２２９Ｅ−ＣｏＶ Ｅタンパク質機能のバイオアッセイを、開発した。２２９Ｅ−ＣｏＶ Ｅタンパク質をコードする合成ｃＤＮＡ断片を、発現プラスミドｐＰＬ４５１にクローニングし、Ｅタンパク質発現が温度誘発性であるベクターを実施例４に記載のように作製した。Ｅタンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞増殖の３７℃における阻害を、前記細菌細胞が維持している正常なＮａ＋勾配を消失させるｐ７イオンチャンネル機能のインジケータとして観察した。
実施例３０ ２２９Ｅ−ＣｏＶ Ｅ タンパク質細菌バイオアッセイを用いた化合物スクリーニング
特定薬物適用部位周辺における増殖ハロは、−実施例１４で述べたように−実施例１５に記載のように点数化した。
表９は、細菌バイオアッセイにおける２２９Ｅ−ＣｏＶ Ｅタンパク質阻害の点数を示した。
Figure 0005030587
Figure 0005030587
実施例３１ ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（２２９Ｅ）の複製に対する化合物試験のための抗ウイルス分析
ヒトコロナウイルス２２９Ｅ複製（ＡＴＣＣ ＶＲ−７４０）に対する化合物の抗ウイルス活性を調べるため、２２９Ｅ感染ＭＲＣ−５細胞（ヒト肺繊維芽細胞；ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７１）の単層中に形成されたプラーク数の減少を測定する分析法を開発した；最初に、ＭＲＣ−５細胞中でウイルス作動原液を増幅により調製した。次にこれを用いて、６ウェル組織培養プレート中に増殖させコンフルエントになった単層ＭＲＣ−５細胞を、ウイルスにＭＯＩ約０．０１ｐｆｕ／細胞で１時間３５℃で５％ＣＯ２中で暴露させ感染させた。この感染性接種物を除去し、代わりにさまざまな試験濃度の化合物類または化合物類のために使用した適当なレベルの溶媒（対照）を含む新鮮培地（１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ）と交換した。プレートをその後、３５℃で（５％ＣＯ２中）感染後３−５日間インキュベーションし、その後、培養上清を除去し、細胞を２０％エタノール中０．１％クリスタルバイオレット溶液で１０分間染色した。プラークを全てのウェル中で計数し、溶媒対照に対するプラーク数減少百分率を計算した。測定は、４重ウェルに対して二重で行った。
Figure 0005030587
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実施例３２ ヒトＯＣ４３コロナウイルス
ヒトコロナウイルスＯＣ４３複製に対する化合物試験のためのＯＣ４３抗ウイルスア分析
ヒトコロナウイルスＯＣ４３複製（ＡＴＣＣ ＶＲ−７５９）に対する化合物の抗ウイルス活性を調べるため、ＥＬＩＳＡ分析を開発し、ＯＣ４３感染ＭＲＣ−５細胞（ヒト肺繊維芽細胞；ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７１）の単層から培養上清中へのウイルスＮ−タンパク質の放出を測定した；最初に、ウイルス作動原液をＭＲＣ−５細胞中で増幅し調製した。次にこれを用いて、６ウェル組織培養プレート中に増殖させコンフルエントになった単層ＭＲＣ−５細胞を、前記ウイルスにＭＯＩ約０．０１ｐｆｕ／細胞で１時間３５℃で５％ＣＯ２中で暴露させ感染させた。この感染性接種物を除去し、代わりにさまざまな試験濃度の化合物類または前記化合物類のために使用した適当なレベルの溶媒（対照）を含む新鮮培地（１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ）と交換した。プレートをその後、３５℃で（５％ＣＯ２中）感染後５日間インキュベーションし、その後、培養上清を採取し、細胞残渣を５０００×ｇで１０分間遠心分離し除去した。Ｎ−抗原検出のため、透明にした培養上清サンプル１００μｌを９６ウェルＭａｘｉ−Ｓｏｒｂプレートの二重ウェルに添加した；ウェル１個当たりＲＩＰＡ緩衝液１００μｌを混合しながら添加し、プレートにふたをし４℃で一晩インキュベーションし、プラスチックウェルに対するタンパク質結合を可能にした。次の日、コーティング溶液を捨て、ウェルを完全にＰＢＳＴで洗浄し、非占拠タンパク質結合部位のブロックは、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ中で１．５時間インキュベーションすることによって実施した。ＯＣ４３ Ｎタンパク質を認識する抗体は、ＰＢＳ中１／８００希釈で用い（３７℃で１時間）、および第２抗体（ヤギ抗マウスアルカリホスファターゼ）を発色反応に用いた。ウェルの光学密度を４０５ｎｍで読み取り、化合物類の効果は、溶媒対照からのシグナルレベルに対して化合物存在下のシグナルレベルを比較することによって決定した。
実施例３３ ＯＣ４３抗ウイルス分析における化合物効果
実施例２２に記載の方法に従って、化合物類のＯＣ４３複製に対する活性をスクリーニングした。結果を表１１に示した。
Figure 0005030587
実施例３４ マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）
ＭＨＶ−Ａ５９Ｅタンパク質対応ペプチドの合成と精製
全長ＭＨＶ−Ａ５９Ｅタンパク質に対応するペプチド（配列：配列番号６；寄託番号ＮＰ＿０６８６７３）を、ＦＭＯＣ化学と固相ペプチド合成を用いてマニュアルで合成した。この合成は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＳ，ＵＳＡ）のＳｙｍｐｈｏｎｙ（登録商標）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒを用いてＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｊｏｈｎ Ｃｕｒｔｉｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＮＵ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で製造業者の指示に従い行い、Ｃ−末端アミド類を得て、Ｎ−メチルピロリドン中でＨＢＴＵおよびハイドロキシベンゾトリアゾールとカップリングさせた。各合成サイクルは、ダブルカップリングおよび４倍過剰のアミノ酸類を用いた。暫定的α−Ｎ Ｆｍｏｃ−保護基は、ＤＭＦ中２０％ピペリジンを用いて除去した。
粗合成ペプチドは、製造業者の指示に従いＰｒｏｔｅｏＰｌｕｓ（商標）キット（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ ｉｎｃ．ＣＡ）を用いて精製した。簡単に述べると、前記ペプチド類を適用緩衝液（６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、６Ｍ尿素，５％ＳＤＳ，１０％グリセロール、０．２％ブロモフェノールブルー、±１００ｍＭ β−メルカプトエタノール）で希釈し、トリス−グリシン電気泳動緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，２５０ｍＭ グリシン、０．１％ＳＤＳ）中４−２０％の勾配ポリアクリルアミドゲル（Ｇｒａｄｉｐｏｒｅ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で流した。前記ペプチドをゲルコードブルー（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＮＳＷ）で染色し、全長ペプチドに対応するバンドをゲルから切り出した。
ゲルスライスをＰｒｏｔｅｏＰＬＵＳ（商標）管に移し、トリス−グリシン電気泳動緩衝液を満たした。管はトリス−グリシン電気泳動緩衝液中に浸漬させ、約１時間１００ボルトにした。電流の極性は１分間逆転し、回収されるタンパク質量を増加させた。前記ペプチド類を採取し１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。精製ペプチド類をＳｐｅｅｄｖａｃで乾燥させ、最終産物の重量を用いて収率を計算した。
実施例３５ ＭＨＶ−Ｅタンパク質は脂質二重平面膜においてイオンチャンネルを形成する
脂質二重層研究は、他文献に記載されているように実行した（Ｓｕｎｓｔｒｏｍ，１９９６；Ｍｉｌｌｅｒ，１９８６）。パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン、パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルセリン、パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルコリン（５：３：２）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａｂａｍａ）脂質混合物を用いた。この脂質混合物を１ｍｌデルリンカップの壁中１５０−２００μｍの孔上に塗布した。孔は、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓの２種のチェンバーを分離し、両者ともに異なる濃度の塩溶液を含んでいた。ｃｉｓチェンバーは、地面に接続し、ｔｒａｎｓチェンバーは、Ａｘｏｐａｔｃｈ２００増幅器の入力部に接続した。通常、ｃｉｓチェンバーは５００ｍＭ ＮａＣｌまたは５００ｍＭ ＫＣｌ溶液を含み、ｔｒａｎｓチェンバーは、５０ｍＭ ＮａＣｌまたは５０ｍＭ ＫＣｌ溶液を含んでいた。二重膜形成は、電流ランプで発生した電流パルスの高さにより、電気的にモニターした。電位は、ｃｉｓに対してｔｒａｎｓチェンバー中で測定した。合成ペプチドは、ｃｉｓチェンバーに添加し、チャンネル活性が観察されるまで攪拌した。電流を１０００Ｈｚでフィルタリングし、５０００Ｈｚでデジタル化し、磁気ディスクに保存した。
ＭＨＶ Ｅ合成ペプチドを、２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）中に０．０５ｍｇ／ｍｌ乃至１ｍｇ／ｍｌで溶解させた。この１０μｌを２層装置のｃｉｓチェンバーに添加し（１ｍｌ水性容量）、それを磁気“フリー”で攪拌した。二重膜中チャンネル活性を示唆するイオン電流は、典型的には、１５−３０分以内に検出された。チャンネルを検出した後、二重膜にわたる保持電位は−１００ｍＶと＋１００ｍＶの間で変動し、電流の大きさと極性を特徴付けさらに逆電位の決定が可能になった。
ｃｉｓチェンバーが５００ｍＭ ＮａＣｌ溶液を含みｔｒａｎｓチェンバーが５０ｍＭ ＮａＣｌ溶液を含む１４回の実験で、チャンネル活性の平均逆電位は、４９±１（ＳＥＭ）ｍＶと計算された。ｃｉｓチェンバーが５００ｍＭ ＫＣｌ溶液を含みｔｒａｎｓチェンバーが５０ｍＭ ＫＣｌ溶液を含む１１回の実験で、チャンネル活性の平均逆電位は、１３±６（ＳＥＭ）ｍＶと計算された。これらの結果は、ＭＨＶ Ｅタンパク質がカチオン選択的イオンチャンネルを形成し、Ｋ＋イオン類に対してよりもＮａ＋イオン類に対してわずかに選択性が高いことを示唆している。
図１１は、非対称ＫＣｌ溶液（５００／５０ｍＭ）中さまざまな保持電位（ｔｒａｎｓに対してのｃｉｓ）におけるＭＨＶ Ｅイオンチャンネルの粗電流データ例を示している。グラフは、平均二重層電流（ｐＡ；ｙ軸）対保持電位（ｍＶ；ｘ軸）の代表的プロットである。
実施例３６ 化学化合物類がＭＨＶ Ｅタンパク質合成ペプチドのイオンチャンネル活性を阻害する
ＭＨＶ Ｅタンパク質が形成したイオンチャンネルをブロックする能力または阻害する能力について化合物を試験するため、化合物類を含む溶液の少量のアリコットを、脂質平面膜類を入れた水溶液に添加した。この溶液中におて、ペプチドチャンネル活性が再構成されて、イオン電流に及ぼす化合物添加の効果を記録し測定した。
化合物原液溶液は、主には、ＤＭＳＯ中で５００ｍＭに調製した。この溶液をさらに５０ｍＭまたはさらに低濃度に５０％ＤＭＳＯ／５０％メタノールで希釈し、適当に希釈した化合物の２μｌを、ｃｉｓおよび／またはｔｒａｎｓチェンバーに添加し、所望の最終濃度を得た。
下記の図１２に示した実施例において、ｃｉｓチェンバーに１００μＭシンナモイルグアニジンを添加するとＭＨＶ Ｅイオンチャンネルを介した電流が非常に低下した。
実施例３７ 潜在的ＭＨＶ Ｅタンパク質イオンチャンネル−ブロック薬物類のスクリーニング用細菌バイオアッセイ
ＭＨＶ Ｅ−タンパク質イオンチャンネルは、細菌細胞増殖を阻害する
細菌細胞中におけるＭＨＶ Ｅタンパク質機能のバイオアッセイを、開発した。ＭＨＶＥタンパク質をコードする合成ｃＤＮＡ断片を、発現プラスミドｐＰＬ４５１にクローニングし、Ｅタンパク質発現が温度誘発性であるベクターを実施例４に記載のように作製した。Ｅタンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞増殖の３７℃における阻害を、前記細菌細胞が維持している正常なＮａ＋勾配を消失させるｐ７イオンチャンネル機能の指標として観察した。
実施例３８
ＭＨＶ Ｅタンパク質細菌バイオアッセイを用いた化合物スクリーニング
特定薬物適用部位周辺における増殖輪は、−実施例１４で述べたように−実施例１５に記載のように点数化した。
表１２は、細菌バイオアッセイにおけるＭＨＶ Ｅタンパク質阻害の点数を示した。
Figure 0005030587
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実施例３９ マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）の複製に対する化合物試験のためのＭＨＶ抗ウイルス分析
ＭＨＶ複製（ＭＨＶ−Ａ５９株；ＡＴＣＣ ＶＲ−７６４）に対する化合物の抗ウイルス活性を調べるため、ＭＨＶ感染Ｌ９２９細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−ａ）の単層中に形成されたプラーク数の減少を測定する分析を開発した；最初に、ＮＣＴＣクローン１４６９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−９．１）細胞中で増幅させ、ウイルス作動原液を調製した。次にこれを用いて、６ウェル組織培養プレート中に増殖させコンフルエントになった単層Ｌ９２９細胞を、ウイルスに約０．０１ｐｆｕ／細胞または１ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで３７℃で３０分間、５％ＣＯ２中で暴露させ感染させた。この感染性接種物を除去し、代わりにさまざまな試験濃度の化合物類または前記化合物類のために使用した適当なレベルの溶媒（対照）を含む新鮮培地（１０％ウマ血清添加ＤＭＥＭ）と交換した。プレートをその後３７℃で（５％ＣＯ２中）感染後１６−２４時間インキュベーションし、その後、培養上清を除去し、細胞を２０％エタノール中０．１％クリスタルバイオレット溶液で１０分間染色した。プラークを全てのウェル中で計数し、溶媒対照に対するプラーク数減少百分率を計算した。測定は、二重から四重ウェルで行った。
実施例４０ ＭＨＶ抗ウイルス分析における化合物の効果
表１３は、この研究から得られた結果を示している。
Figure 0005030587
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Figure 0005030587
実施例４１ ブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ）
ブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ）複製に対する化合物試験のための抗ウイルス分析法
ブタ呼吸器コロナウイルス複製（ＡＴＣＣ ＶＲ−２３８４）に対する化合物の抗ウイルス活性を調べるため、ＰＲＣＶ感染ＳＴ細胞（ブタ胎児精巣細胞株、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７４６）の単層中に形成されたプラーク数の減少を測定する分析法を開発した；６ウェル組織培養プレート中に増殖させコンフルエントになったＳＴ細胞を、４継代ブタ呼吸器ウイルス（ＰＲＣＶ）ＡＲ３１０株のＰＢＳ中３種の希釈物１０−１、５０−１および１０−２を感染させ、ある範囲のプラーク数が計数できるようにした。希釈ウイルス１００μｌを培地１ｍｌ容量でウェル１個当たり添加した。プレートを室温でロッキングプラットフォームを用いて１時間インキュベーションし、ウイルスを細胞に吸着させた。ウイルス上清を除去し、１×ＭＥＭ，５％ＦＣＳ中１％Ｓｅａｐｌａｑｕｅ アガロースを含むオーバーレイ２ｍｌ／ウェルを各ウェルに添加した。試験する化合物類は、各濃度の化合物についてオーバーレイに対して同一容量の化合物／溶媒が添加されるように凍結原液から化合物をある濃度に希釈することによって、オーバーレイ混合物に添加した。化合物／溶媒の容量は、オーバーレイ容量の０．０７％を絶対に超えないようにした。化合物溶解に使用した溶媒は、等比で混合したＤＭＳＯおよびメタノールであった。化合物の抗プラーク形成活性を４種の濃度、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭおよび２０μＭで試験した。各濃度で二重測定または四重測定を行った。対照は、同一容量の溶媒をオーバーレイに添加して行った。前記オーバーレイは、室温に２０分間置いた。次にプレートを３７℃で２日間インキュベーションした。次に単層を固定し、室温で一晩、０．５％メチレンブルー、４％ホルムアルデヒド１ｍｌ／ウェルを添加することによって染色した。オーバーレイアガロースおよび汚れを次に洗浄除去し、染色され固定された単層を見えるようにした。
実施例４２ ＰＲＣＶ抗ウイルス分析における化合物類の効果
実施例２９に記載の方法に従ってＰＲＣＶ複製に対する化合物活性をスクリーニングした。表１４は、いくつかの試験化合物類のＥＣ５０値を示している。
Figure 0005030587
実施例４３ ウシコロナウイルス
ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）複製に対する化合物試験のための抗ウイルス分析法
ウシコロナウイルス複製（ＡＴＣＣ ＶＲ−８７４）に対する化合物の抗ウイルス活性を調べるため、ＢＣＶ感染ＭＤＢＫ細胞（ウシ腎細胞株、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２）の単層中に形成されたプラーク数の減少を測定する分析法を開発した：６ウェル組織培養プレート中に増殖させコンフルエントになったＭＤＢＫ細胞を、２継代ＢＣＶ株のＰＢＳ中希釈系列１０−３、５−５および１０−４を感染させ、ある範囲のプラーク数が計数できるようにした。希釈ウイルス１００μｌを培地１ｍｌ容量でウェル１個当たり添加した。プレートを１時間インキュベーションし、ウイルスを細胞に吸着させた。ウイルス上清を除去し、１×ＭＥＭ，５％ＦＣＳ中１％Ｓｅａｐｌａｑｕｅ アガロースを含むオーバーレイ２ｍｌ／ウェルを各ウェルに添加した。試験する化合物類は、各濃度の化合物について前記オーバーレイ物に対して同一容量の化合物／溶媒が添加されるように０．５Ｍ 凍結原液から化合物をある濃度に希釈することによって、オーバーレイ混合物に添加した。化合物／溶媒の容量は、オーバーレイ容量の０．０７％を絶対に超えないようにした。化合物溶解に使用した溶媒は、等比で混合したＤＭＳＯおよびメタノールであった。化合物の抗プラーク形成活性を４種の濃度、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭおよび２０μＭで試験した。各濃度で四重測定を行った。対照は、同一容量の溶媒をオーバーレイに添加して行った。オーバーレイは、室温に２０分間置いた。次にプレートを３７℃で７日間インキュベーションした。次に単層を固定し、０．５％メチレンブルー、４％ホルムアルデヒド１ｍｌ／ウェルを添加することによって染色した。
実施例４４ ＢＣＶ抗ウイルス分析における化合物類の効果
実施例３１に記載の方法に従ってＢＣＶ複製に対する化合物活性をスクリーニングした。表１５は、いくつかの試験化合物類のＥＣ５０値を示している。
Figure 0005030587
実施例４５ Ｃ型肝炎ウイルス
Ｃ型肝炎ウイルスＰ７タンパク質のイオンチャンネル活性
人工的脂質二重層における合成Ｐ７ペプチドのチャンネル活性試験
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）によってコードされるタンパク質Ｐを模倣するペプチドを合成し、それは、配列番号７を有していた。
脂質二重膜研究を、他文献に記載されているように実行した（Ｍｉｌｌｅｒ，１９８６）。パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン、パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルセリンおよびパルミトイル−オレオイル−ホスファチジルコリン（５：３：２）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａｂａｍａ）脂質混合物を用いた。この脂質混合物を１ｍｌデルリンカップの壁中１５０−２００μｍの孔上に塗布した。孔は、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓの２種のチェンバーを分離し、両者ともに異なる濃度の塩溶液を含んでいた。ｃｉｓチェンバーは、地面に接続し、ｔｒａｎｓチェンバーは、Ａｘｏｐａｔｃｈ２００増幅器の入力部に接続した。通常、ｃｉｓチェンバーは５００ｍＭ ＫＣｌを含み、ｔｒａｎｓチェンバーは、５０ｍＭ ＫＣｌを含んでいた。二重膜形成は、電流ランプで発生した電流パルスの高さにより、電気的にモニターした。電位は、ｃｉｓに対してｔｒａｎｓチェンバー中で測定した。このタンパク質をｃｉｓチェンバーに添加し、チャンネル活性が観察されるまで攪拌した。電流を１０００Ｈｚでフィルタリングし、２０００Ｈｚでデジタル化し、磁気ディスクに保存した。このＰ７ペプチドを２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）中に１０ｍｇ／ｍｌで溶解した。この１０μｌを２層装置のｃｉｓチェンバーに添加し、攪拌した。チャンネル活性は、１５−２０分以内に検出された。
Ｐ７ペプチドをこのｃｉｓチェンバーに添加し攪拌すると、チャンネル活性が記録された。ｔｒａｎｓチェンバー中の電位は−８０ｍＶで電流は下向きであった。電流は、これらの溶液中でカリウム平衡電位に近接した＋５０ｍＶで逆転し、このことは、前記チャンネルがカチオン選択的であることを示唆していた。オープンチャンネルピークの大きさは１．７ｐＡであり、約１４ｐＳのチャンネルコンダクタンスに対応していた。ほとんどの実験において、“シングルチャンネル”ははるかに大きなサイズを有しており、おそらくＰ７ペプチドの集合によるのであろう。この実験で電流は約＋４０ｍＶで逆転した。いくつかの実験においてｃｉｓチェンバー中の溶液は１５０ｍＭ ＫＣｌでありｔｒａｎｓチェンバー中では１５ｍＭ ＫＣｌであった。このＰ７ペプチドはまた、逆転する電流を生じた。
類似の結果が、両方のチェンバーがＮａＣｌを含む時得られた。ｃｉｓチェンバーが５００ｍＭ ＮａＣｌを含みｔｒａｎｓチェンバーが５０ｍＭ ＮａＣｌを含む時に電流を記録した。また、電流が＋４０ｍＶと＋６０ｍＶで逆転し、Ｎａ＋平衡電位に近接しており、前記チャンネルがＫ＋よりもＮａ＋に対してはるかに透過性であることを示唆していた。
Ｐ７ペプチドによって形成されたチャンネル類は、５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）アミロライド（ＨＭＡ）によってブロックされた。
Ｐ７ペプチド添加によりチャンネル活性が生じた。５０μＭ ＨＭＡをｃｉｓチェンバーに２μｌだけ添加し次に攪拌すると、チャンネル活性が消失することになった。１００μＭ ＨＭＡにより、Ｐ７ペプチドにより生じたチャンネル活性のブロックが、４回の実験で記録された。２回の実験では、ナトリウムチャンネル（５００／５０）が５００μＭ ＨＭＡによってブロックされた。
１０ｍＭ ＣａＣｌ２をｃｉｓチェンバー（Ｋ溶液類）に添加すると、Ｐ７ペプチドによって生じた電流の逆転電位がよりマイナス電位に移行し、Ｐｋ／ＰＣｌ比の低下を示唆していた。
ｃｉｓチェンバーが５００ｍＭ ＣａＣｌ２を含みｔｒａｎｓチェンバーが５０ｍＭ
ＣａＣｌ２を含む時、プラスとマイナスの両方の電流が＋２０ｍＶ位の電位で観察され、逆転電位を求めることはできなかった。
実施例４６ ＨＣＶ ｐ７タンパク質の組み換え発現
それぞれがＨＣＶ−１ａ ｐ７タンパク質のアミノ酸配列に対応する２個のｃＤＮＡ断片類を、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔにより商業的に合成した。この２個のｃＤＮＡ類はヌクレオチド配列が異なっており、ひとつのｃＤＮＡ（“ｃＤｐ７．ｃｏｌｉ”）では、Ｅ．ｃｏｌｉでのｐ７タンパク質発現のためにコドンが最適化され、一方、他のｃＤＮＡ（“ｃＤｐ．７ｍａｍ”）では、哺乳類細胞株中での発現のためコドン類が偏っていた。ｃＤｐ７．ｃｏｌｉは、Ｅ．ｃｏｌｉ中での発現のためＢａｍＨ１／ＥｃｏＲ１断片としてプラスミドｐＰＬ４５１にクローニングした。ｃＤＰ７．ｍａｍは、哺乳類細胞株でのｐ７発現のためベクター類（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１ワクチンウイルス、ｐｆａｓｔＢａｃ−１）にクローニングした。
実施例４７ Ｇａｇ ＶＬＰ発芽の増強におけるｐ７の役割
培養ＨｅＬａ細胞からのウイルス様粒子（ＶＬＰ）の発芽は、細胞中でのレトロウイルスＧａｇタンパク質類の発現とＭ２，Ｖｐｕおよび６Ｋのような小型のウイルスイオンチャンネルの同時発現により生じ、Ｇａｇタンパク質は発芽を増強する。前記ウイルスイオンチャンネルが異種ウイルス粒子の発芽を増強できるのは興味深い。したがって、ｐ７による発芽増強を評価するため、それをＨｅＬａ細胞中でＨＩＶ−１Ｇａｇタンパク質と同時発現させ、培地へのＶＬＰ放出をＧａｇ ＥＬＩＳＡにより測定した。これを達成するため、プラスミド類ｐｃＤＮＡｐ７（ｐｃＤＮＡ３．１は、実施例２０に述べたｐｃＤｐ７．ｍａｍ、ｐ７は、Ｔ７プロモータ制御下に発現された）、ｐｃＤＮＡＧａｇ（ＨＩＶ−１ Ｇａｇタンパク質は、Ｔ７プロモータ制御下に発現した）を、ワクチニアウイルス株ｖＴＦ７．３（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する）に感染したＨｅＬａ細胞中に同時移入し、培養上清を１６時間インキュベーション後ＥＬＩＳＡ分析のために採取した。
実施例４８ 化合物のｐ７イオンチャンネル機能活性阻害能力の分析
実施例３３−３５に記載のｐ７イオンチャンネル機能活性検出のための２つの方法を用いて、化合物のｐ７チャンネル阻害能力を分析した。実施例３３の場合、化合物のｐ７チャンネル活性阻害能力を脂質二重平面膜で試験した。実施例３５の場合、ｐ７およびＨＩＶ−１ Ｇａｇの両方を発現する細胞から放出されたＶＬＰｓの数を減少させる化合物の能力を試験した。
実施例４９ 潜在的ＨＣＶ ｐ７イオンチャンネルブロック薬物類のスクリーニング用細菌バイオアッセイ
ＨＣＶ ｐ７イオンチャンネルは細菌細胞増殖を阻害する
細菌細胞中におけるｐ７機能のバイオアッセイを開発した。ｐ７をコードする合成ｃＤＮＡ断片ｃＤｐ７．ｃｏｌｉを、発現プラスミドｐＰＬ４５１中にクローニングし、ベクターｐＰＬｐ７を作製し、ここでｐ７発現が実施例４に記載したように温度誘発可能である。３７℃においてｐ７を発現するＥ．ｃｏｌｉの増殖阻害を、細菌細胞が維持している正常Ｎａ＋勾配を消失させるｐ７イオンチャンネル機能の指標として観察された。
実施例５０
ＨＣＶ ｐ７タンパク質の細菌バイオアッセイを用いた化合物スクリーニング
−実施例１４で記載したように−特定薬物適用部位周辺での増殖輪を、実施例１５に記載のように点数として示した。
表１６は、細菌バイオアッセイにおけるＨＣＶ ｐ７タンパク質の阻害点数を示した。
Figure 0005030587
Figure 0005030587
実施例５１ ウマアルテライティスウイルス（ＥＡＶ）
ウマアルテライティスウイルス（ＥＡＶ）複製に対する化合物試験のための抗ウイルス分析法
ＥＡＶ複製（Ｂｕｃｙｒｕｓ株；ＡＴＣＣ ＶＲ−７９６）に対する化合物の抗ウイルス活性を調べるため、ＥＡＶ感染ＢＨＫ−２１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０）の単層中に形成されたプラーク数の減少を測定する分析法を開発した：ウイルス原液をＲＫ−１３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３７）中で増幅させ、つぎにこれを用いて６ウェル組織培養プレート中に増殖させコンフルエントになったＢＨＫ−２１細胞の単層を、３７℃で５％ＣＯ２中で１時間、ウイルスに５×１０−３ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで暴露させることによって、感染させた。この感染性接種物を除去し、細胞を１０％ ＦＣＳおよび試験化合物類１０、５または１μＭを含むかあるいは化合物類のための適当なレベルの溶媒（対照）を含むＭＥＭ中１％シープラークオーバーレイ（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ）に重層した。その後、プレートを感染後３日間３７℃（５％ＣＯ２中）でインキュベーションし、その後、培養上清を除去し、細胞を２０％エタノール中０．１％クリスタルバイオレット溶液で１０分間染色した。プラークを全てのウェル中で計数し、溶媒対照に対するプラーク数減少百分率を計算した。測定は、二重から四重ウェルで行った。
実施例５２ ＥＡＶ抗ウイルス分析における化合物類の効果
実施例３５に記載の方法に従ってＥＡＶ複製に対する化合物活性をスクリーニングした。ＩＣ５０値として示した結果を表１７に示した。
Figure 0005030587
実施例５３ デングフラビウイルス
デングウイルスＭタンパク質のペプチド合成
デングウイルス１型Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ Ｓ２７５／９０株（Ｆｕら１９９２）のＭタンパク質のＣ末端アミノ酸類４０個（配列番号８）を、Ｆｍｏｃ法を用いて合成した。合成は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ，ＵＳＡ）のＳｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒを用いてＣ末端アミド類を得て、Ｎ−メチルピロリドン中でＨＢＴＵおよびハイドロキシベンゾトリアゾールとカップリングさせた。各合成サイクルは、ダブルカップリングおよび４倍過剰のアミノ酸類を用いた。暫定的α−Ｎ Ｆｍｏｃ−保護基は、ＤＭＦ中２０％ピペリジンを用いて除去した。
実施例５４ 脂質二重膜へのデングウイルスＭタンパク質の取り込み
脂質二重膜研究は、他文献に記載されているように実行した（Ｓｕｎｓｔｒｏｍ，１９９６；Ｍｉｌｌｅｒ，１９８６）。パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン、パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルセリンおよびパルミトイル−オレオイル−ホスファチジルコリン（５：３：２）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａｂａｍａ）脂質混合物を用いた。この脂質混合物を１ｍｌデルリンカップの壁中１５０−２００μｍの孔上に塗布した。孔は、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓの２種のチェンバーを分離し、両者ともに異なる濃度の塩溶液を含んでいた。ｃｉｓチェンバーは接地し、ｔｒａｎｓチェンバーは、Ａｘｏｐａｔｃｈ２００増幅器の入力部に接続した。通常、ｃｉｓチェンバーは５００ｍＭ ＫＣｌ溶液を含み、ｔｒａｎｓチェンバーは、５０ｍＭ ＫＣｌ溶液を含んでいた。二重膜形成は、電流ランプで発生した電流パルスの高さにより、電気的にモニターした。電位は、ｃｉｓに対してｔｒａｎｓチェンバー中で測定した。前記タンパク質をｃｉｓチェンバーに添加し、チャンネル活性が観察されるまで攪拌した。電流を１０００Ｈｚでフィルタリングし、５０００Ｈｚでデジタル化し、磁気ディスクに保存した。
このデングウイルスＭタンパク質を２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）中に０．０５ｍｇ／ｍｌ乃至１ｍｇ／ｍｌで溶解した。この１０μｌを２層装置のｃｉｓチェンバーに添加し、攪拌した。チャンネル活性は、１５−３０分以内に検出された。
実施例５５ デングウイルスＭタンパク質Ｃ末端ペプチドのイオンチャンネル活性阻害ヘキサメチレンアミロライド（ＨＭＡ）
５０ｍＭ ＨＭＡ溶液を最初に、ＤＭＳＯ中で５００ｍＭ溶液を作製することによって調製した。この溶液をさらに０．１Ｍ ＨＣｌを用いて５０ｍＭ ＨＭＡに希釈した。５０ｍＭ ＨＭＡの２μｌを、チャンネル活性が観察された後ｃｉｓチェンバーに添加した。ｃｉｓチェンバーは、最終ＨＭＡ濃度１００μＭにする溶液１ｍｌを含んでいた。
実施例５６ 細胞増殖に対するデングフラビウイルス効果に対する化合物試験用抗ウイルス分析
アカゲザル腎細胞であるＬＬＣ−ＭＫ２の増殖に及ぼすデングウイルス感染の効果を測定する細胞増殖分析を用いて、デング１Ｈａｗａｉｉ株に対する化合物類活性を１０，５，２．５、１．２５および０．６２５μＭで試験した。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞に既定量のウイルスを感染させ、感染培養物中における細胞増殖が非感染細胞に比べて有意に低下するように力価を定めた。次に、感染細胞を９６ウェルプレート中でウェル１個当たり１．５×１０３細胞で播種した。負のコントロール（ウイルスなし、実験化合物なし）、正のコントロール（ウイルス、実験化合物なし）および細胞毒性コントロール（実験化合物、ウイルスなし）を各薬物分析とともに実験した。培養物を７日間増殖させ、次に、培養物の代謝を測定する蛍光色素（ｒｅｄ／ｏｘ）を各培養物に添加し、各培養物の蛍光値を測定した。実験化合物もウイルスもない負のコントロールを１００％にした。正のコントロール類と化合物を有する培養物類を、負のコントロールに対する百分率としてそれらの平均蛍光を計算することによって点数化した。少なくとも６個の重複ウェルを、各実験条件について測定した。
実施例５７
デング抗ウイルス分析の効果：
Figure 0005030587
実施例５８
細菌分析と抗ウイルス分析の正の相関
実施例５８．１ Ｖｐｕ細菌分析と抗ＨＩＶ−１データの正の相関
相関研究を行い、Ｖｐｕ細菌分析で試験した化合物に付けた活性点数とこれらの化合物類の抗ウイルス分析におけるＨＩＶ−１阻害能力の相関を測定した。
実施例５８．２ 方法論
さまざまな置換アシル−グアニジン類を示す１２種の化合物類のｐ２４抗原データを、Ｖｐｕ細菌分析でそれらの化合物類について得られた活性点数と比較した。各分析のデータを最初に、有効性について順位を付けた。Ｖｐｕ細菌分析の順位は、全活性点数から決定し、最高点数は、最大有効性を示唆していた。抗ＨＩＶ−１分析の順位は、試験した薬物濃度全てにおける培養上清中測定ｐ２４抗原の全体的平均値に基づいて決定したが、最低点数が、最大有効性を示唆していた。次に作成した２種の順位を、スピアマン順位相関係数を作成することによって統計的に比較した。
実施例５８．３ 結果と結論
スピアマン順位相関係数は０．７８５であり、限界値の統計表（ｎ＝１２用）と比較することにより、前記２種の順位が統計的に正の相関であることを示唆している（Ｐ＜０．０１）（表１９ａ）。
さらに、抗ウイルスデータが少なくとも一桁の大きさのｐ２４の減少を示唆したかどうかについて、ｙｅｓ／ｎｏの形でのスコアとＶｐｕ細菌分析順位について差異の比較を行うと、細菌分析による上から６個の化合物類と“ｙｅｓ”群化合物とが一致した（表１９ｂ）。
これらの結果は、本発明により行った細菌分析と抗ウイルス分析の間に正の相関があることを示唆している。したがって、細菌分析は、抗ウイルス活性を示す化合物類をスクリーニングする際に有用な手段であり得る。
Figure 0005030587
実施例５８．４ ＭＨＶプラーク形成阻害百分率とＭＨＶ−Ｅ細菌バイオアッセイスコアの相関
マウス肝炎ウイルスＥタンパク質細菌バイオアッセイで試験した化合物類に付けた活性点数とマウス肝炎ウイルスプラーク分析でこれらの化合物類が示した阻害百分率の間に正の相関が観察された。
実施例５８．５ 方法：
スクリーニングした化合物類９６種についてのＭＨＶプラーク低下活性データを、百分率のプラーク低下を最大から最小に並べかえ、順位を、化合物類リストに付した。１０μＭおよび１μＭ両方の濃度の化合物類に暴露させることによって生じたデータについて行い、２種の順位リストができた。同様に、同一の９６種の化合物類についてＭＨＶＥ細菌バイオアッセイスコアについても順位リストを作成した。１種以上の化合物類が同一点数を有した場合には、その群の順位値を平均した。
スピアマンの統計試験［“Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｗｉｔｈ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、（第２版）：Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ，Ｗ．，Ｓｃｈｅａｆｆｅｒ，ＲＬ．，＆ Ｗａｃｋｅｒｌｙ、ＤＤ．，Ｄｕｘｂｕｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ−１９８１に記載のような］を用いて、順位を比較した。簡単に述べると、これには、各化合物の順位値間の差の平方の総計を計算し、次に、式Ｒｓ＝１−（６．ＳＳ／ｎ（ｎ２−１））（ここで、ｎは、順位付けした化合物類の数である（この場合９６）によりスピアマンの順位相関係数（Ｒｓ）を求めることになる。Ｒｓを次に、限界値の表と比較し、統計的有意性を決定する（Ｐ値）。
実施例５８．６ 結果の要約
この表では、順位同士の指示されたペア規模の比較の結果として生じたＲｓおよびＰ値を要約している。
Figure 0005030587
実施例５８．７ 結論：
細菌バイオアッセイおよび抗ウイルス分析で分析した９６種の化合物類の順位比較は、試験化合物類のＭＨＶＥ細菌分析順位が、ＭＨＶプラーク減少分析で生じた順位と有意な正の相関を示すことを明らかにしている。分析間の有意な相関は、いずれの分析でも有用であるかも知れない化合物類を同定するために用いることができることを強く示唆している。細菌分析はそれによって、抗ウイルス活性を示す化合物類のスクリーニングに有用な手段となり得る。
実施例５８．８ ２２９Ｅプラーク形成阻害百分率と２２９Ｅ−Ｅ細菌バイオアッセイ点数の相関
ヒトコロナウイルス２２９Ｅ−Ｅタンパク質細菌バイオアッセイで試験した化合物類に付けた活性点数とヒトコロナウイルス２２９Ｅプラーク分析におけるこれらの化合物類が示した阻害百分率の間に正の相関が見られた。
実施例５８．９ 方法：
２．５μＭ化合物濃度に対してスクリーニングした９７種の化合物類についての２２９Ｅプラーク低下活性データを、最大から最小百分率のプラーク低下から区分けし、順位を、化合物類リストに付した。同様に、同一の９７種の化合物類について２２９Ｅ Ｅ細菌バイオアッセイについても順位リストを作成した。１種以上の化合物類が同一点数を有した場合には、その群の順位値を平均した。
スピアマンの統計試験［“Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｗｉｔｈ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、（第２版）：Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ，Ｗ．，Ｓｃｈｅａｆｆｅｒ，ＲＬ．，＆ Ｗａｃｋｅｒｌｙ、ＤＤ．，Ｄｕｘｂｕｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ−１９８１に記載のような］を用いて、順位を比較した。簡単に述べると、これには、各化合物の順位値間の差の平方の総計を計算し、次に、式Ｒｓ＝１−（６．ＳＳ／ｎ（ｎ２−１））（ここで、ｎは、順位付けした化合物類の数である（この場合９７）によりスピアマンの順位相関係数（Ｒｓ）を求めることになる。Ｒｓを次に、限界値の表と比較し、統計的有意性を決定する（Ｐ値）。
実施例５８．９．１ 結果の要約と結論
この表では、順位同じ間の指示されたペア規模の比較の結果として生じたＲｓおよびＰ値を要約している。
Figure 0005030587
前記結果は、試験化合物類の２２９Ｅ細菌分析順位が、２２９Ｅプラーク低下分析により生じた順位と有意な正の相関を示すことを示唆している。実施例４９．１と４９．４に示したそれとともにこの結果は、いずれの分析も有用であるかも知れない化合物類の同定に利用できる強い証拠を示している。それによって、細菌分析は、抗ウイルス活性を示す化合物類スクリーニングに有用な手段となり得る。
当業者は、本文に記載の発明は具体的に述べたことに加えて変更および修飾できることを理解するであろう。本発明はそのような変更および修飾を含む。本発明はまた、本明細書で言及した段階、特徴、組成物類および化合物類を全て含み、さらに、前記段階または特徴のいかなる２種以上の組み合わせも全て含むことがわかるであろう。
Ｂｉｂｌｉｏｇｒａｐｈｙ
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Ｍｉｌｅｓ，Ｓ．Ａ．，Ｊ Ａｃｑｕｉｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃ Ｓｙｎｄｒ ＨｕｍＲｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．，１６ Ｓｕｐｐｌ １：ＳＩ（１９９８）
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Ｅ．ｃｏｌｉ中におけるＶｐｕ発現に使用したプラスミド類の略図である。Ａ．アミノ酸配列（＜４００＞１））は、ＨＩＶ−１ＨＸＢ２ ｃＤＮＡクローンからＰＣＲによって調製したｖｐｕオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされている。ｖｐｕＯＲＦを、インフレームでｐ２ＧＥＸ中ＧＳＴ遺伝子の３’末端にクローニングし、ｐ２ＧＥＸＶｐｕ（Ｂ）を得た。その後、ｐＰＬ４５１中にクローニングし、プラスミドｐＰＬ＋Ｖｐｕ（Ｃ）を得た。 Ｅ．ｃｏｌｉ中におけるＶｐｕの発現と精製を写真で示した。Ａ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のウェスタンブロッティングを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物中における発現Ｖｐｕを検出した。１−４レーンは、ｐ２ＧＥＸＶｐｕから発現したさまざまな精製段階のＶｐｕ試料を示している；１レーンは、グルタチオン−アガロースアフィニティクロマトグラフィにより単離したＧＳＴ−Ｖｐｕ融合タンパク質を示している；２レーンは、トロンビン処理により前記融合タンパク質から放出されたＶｐｕを示している；３レーンは、ＨＰＬＣアニオン交換クロマトグラフィにより精製したＶｐｕを示している；４レーンは、イムノアフィニティカラムを介した経路後のＶｐｕを示している；５および６レーンは、それぞれｐＰＬ＋ＶｐｕまたはｐＰＬ４５１を含む４２Ｃ’誘発細胞から調製した膜小胞を示している。Ｂ．銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：１レーンは、ＨＰＬＣアニオン交換クロマトグラフィで精製したＶｐｕを示している；２レーンは、イムノアフィニティカラムを介した経路後のＶｐｕを示している。 精製Ｖｐｕを含むアリコット類に脂質二重膜を暴露した後に観察したイオンチャンネル活性をグラフで示した。ＡおよびＢにおいて、ＣＩＳチェンバーは、５００ｍＭ ＮａＣｌを含み、ＴＲＡＮＳチェンバーは、５０ｍＭ ＮａＣｌを含んでいた；両溶液ともに、１０ｍＭ ＭＥＳでｐＨ６．０に緩衝化されていた。Ｂは、Ａに示したものと類似のデータから得た電流対電圧曲線を示している。 細菌クロスフィーディング分析を写真で示した。全プレートについて、Ｍｅｔ−，Ｐｒｏ−栄養素要求株を用いて軟寒天オーバーレイに接種した。ＡおよびＢプレートは、プロリンを除く最小のドロップアウト培地を含んでいた；Ｃプレートは、メチオニンマイナスであった。バックグランド菌叢中細胞生存性を制御するため、ＰおよびＭと表示したディスクは、添加プロリンまたはメチオニンをそれぞれ含んでいた。ＣおよびＶと表示したディスクには、ｐＰＬ４５１またはｐＰＬ＋Ｖｐｕをそれぞれ含むＭｅｔ＋，Ｐｒｏ＋ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を接種した。プレートを３７℃（ＡおよびＣ）または３０℃（Ｂ）で２日間インキュベーションし，プレート下においた蛍光灯による周辺照明により黒のバックグランドよりも高いところで写真撮影した。イメージをＮｏｖａｌｉｎｅビデオゲル記録システムで記録した。全てのプレート上のＰまたはＭと表示したディスク周囲およびプレートＡ上のＶ表示ディスク周囲の明るいハロは、バックグランド菌叢株の増殖を示している。 潜在的Ｖｐｕチャンネルブロッカー類用薬物類スクリーニングをグラフで示した。写真は、Ｖｐｕ発現プラスミドｐＰＬＶｐｕを含むＸＬ−１−ブルーＥ．ｃｏｌｉ菌叢を接種した最小培地欠乏アデニン−アガロースプレートセクションを示している。Ｎｏ．６−１１は、さまざまな試験薬物を適用した部位に位置しているが、これらの薬物は、３μｌの液滴として適用し、アガロース中に浸漬させた。その後、前記プレートを４８時間３７℃でインキュベーションした後、写真を撮った。バックグランドの灰色の影は、細菌増殖が全くない領域に対応している。“１０”周囲の明るい円状領域は、その位置にアデニンを適用した結果（正のコントロール）としての細菌細胞増殖を示している。“９”周囲の細菌増殖ハロはより小さく、この位置に５−（Ｎ，Ｎ−ヘキサメチレン）−アミロライドを適用したことによる。 脂質二重膜をＥタンパク質３−１０μｇに暴露した後のＮａＣｌ溶液中で観察したＳＡＲＳ Ｅタンパク質イオンチャンネル活性を示した。Ａ．閉じた状態は実線で示し、開口部は、前記実線から派生している。尺度は、３００ｍｓおよび５ｐＡである。ＣＩＳチェンバーは、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．２中に５０ｍＭ ＮａＣｌを含んでいた。ＴＲＡＮＳチェンバーは、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．２中に５００ｍＭ ＮａＣｌを含んでいた。ＣＩＳチェンバーにはアースを付け、ＴＲＡＮＳチェンバーは、−１００と＋１００ｍＶの間のさまざまな電位に保持した。Ｂ．シングルチャンネルが単独で最大開いた時を示している。 脂質二重膜をＥタンパク質３−１０μｇに暴露した後のＮａＣｌ溶液中で観察したＳＡＲＳ Ｅタンパク質イオンチャンネル活性を示した。Ａ．閉じた状態は実線で示し、開口部は、前記実線から派生している。尺度は、３００ｍｓおよび５ｐＡである。ＣＩＳチェンバーは、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．２中に５０ｍＭ ＮａＣｌを含んでいた。ＴＲＡＮＳチェンバーは、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．２中に５００ｍＭ ＮａＣｌを含んでいた。ＣＩＳチェンバーにはアースを付け、ＴＲＡＮＳチェンバーは、−１００と＋１００ｍＶの間のさまざまな電位に保持した。Ｂ．シングルチャンネルが単独で最大開いた時を示している。 シンナモイルグアニジン（Ｂｉｔ０３６）は、ＮａＣｌ溶液中でＳＡＲＳ Ｅタンパク質イオンチャンネル活性を阻害する。Ａ．−４０ｍＶの保持電位における代表的電流。尺度は、３００ｍｓおよび５ｐＡである。Ｅタンパク質イオンチャンネル活性および１００μＭ Ｂｉｔ０３６添加後のＥタンパク質チャンネル活性を示している。Ｂ．−４０ｍＶ保持電位における全ポイントヒストグラム。Ｅタンパク質イオンチャンネル活性および１００μＭ Ｂｉｔ０３６添加後のＥタンパク質チャンネル活性。Ｃ．Ｅタンパク質イオンチャンネル形成前の平均電流（ｐＡ）、１００μＭ Ｂｉｔ０３６添加後のＥタンパク質チャンネル活性を示している。 ＫＣｌ溶液中脂質２重層における２２９Ｅ Ｅタンパク質イオンチャンネル活性。 Ａパートは、脂質二重膜中の２２９Ｅ−Ｅタンパク質イオンチャンネルによって発生した粗電流を示している。上部トレースは、薬物添加前の電流活性を示し、下部トレースは、チャンネル活性に及ぼす１００μＭ シンナモイルグアニジン添加の影響を示している。Ｂパートは、シンナモイルグアニジン添加前後における前記二重膜を介して流れる平均電流をグラフで示している（任意な単位）。 ＮａＣｌ溶液中脂質二重膜におけるＭＨＶ Ｅタンパク質イオンチャンネル活性 Ａパートは、脂質二重平面膜ＭＨＶ−Ｅタンパク質イオンチャンネルによって発生した粗電流を示している。上部トレースは、薬物添加前の電流活性を示し、下部トレースは、チャンネル活性に及ぼす１００μＭ シンナモイルグアニジン添加の影響を示している。Ｂパートは、シンナモイルグアニジン添加前後における前記二重膜を介して流れる平均電流をグラフで示している（任意な単位）。

Claims (73)

  1. 式Ｉの抗ウイルス化合物
    Figure 0005030587
    またはその薬学的に許容できる塩
    （ここで、
    Figure 0005030587
    であり、
    Ｒ２，Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、
    Figure 0005030587
    であり、
    かつ
    Ｘは、水素、ハイドロキシ、ニトロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−６シクロアルキル、フルオロ置換Ｃ１−６アルキル、フェニル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６シクロアルケニル、Ｃ２−６アルケンオキシ、またはベンゾであり；
    Ｒｄ，Ｒｅ，Ｒｆ，Ｒｈ，ＲＬ，Ｒｍ，Ｒｎ、Ｒｏ、およびＲｐは、それぞれ独立して、水素、アミノ、Ｃ１−５アルキル、ハイドロキシ、アリール、ジメチル置換アミノ、
    Figure 0005030587
    またはプロピルチオであり；
    Ｒｋは、アミノ、Ｃ１−５アルキル、ハイドロキシ、アリール、ジメチル置換アミノ、
    Figure 0005030587
    またはプロピルチオであり；
    Ｒｇ，Ｒｉは、それぞれ独立して、水素、ハイドロキシ、またはＣ１−５アルキルであり、
    Ｒｊは、水素、アミノ、Ｃ１−５アルキル、ハイドロキシ、アリール、ジメチル置換アミノ、プロピルチオ、
    Figure 0005030587
    であり、
    ここで、
    Ｒ１がＣ６Ｈ５ＣＨ＝ＣＨでＲ２が水素でかつＲ３がフェニルである場合、Ｒ４はフェニル以外であり；
    Ｒ１がフェニルで、Ｒ２が水素でＲ３がベンゾイルである場合、Ｒ４はベンゾイル以外であり；
    Ｒ１がフェニルで、Ｒ２が置換ベンジルでＲ３が水素でＲ４が水素である場合、Ｒｎ，Ｒｏ、およびＲｐは全てが水素であることはなく；
    Ｒ１がフェニルで、Ｒ３が水素でかつＲ４が水素である場合、Ｒ２はベンジルまたはフェニル以外であり；
    Ｒ１がフェニルで、Ｒ２が水素である場合、Ｒ４がベンゾイルのときは、同時にＲ３はフェニル以外であり；および
    Ｒ１がフェニルで、Ｒ２が水素である場合、Ｒ３およびＲ４は、両者ともにベンジルであることはない）。
  2. 式Ｉの抗ウイルス化合物
    Figure 0005030587
    またはその薬学的に許容できる塩
    （ここで、
    Figure 0005030587
    であり、
    Ｒ２，Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、
    Figure 0005030587
    であり、
    かつ
    Ｘは、水素、ハイドロキシ、ニトロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−６シクロアルキル、フルオロ置換Ｃ１−６アルキル、フェニル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６シクロアルケニル、Ｃ２−６アルケンオキシ、またはベンゾであり；
    Ｒｄ，Ｒｅ，Ｒｆ，Ｒｈ，Ｒｋ，ＲＬ，Ｒｍ，Ｒｎ、Ｒｏ、およびＲｐは、それぞれ独立して、水素、アミノ、Ｃ１−５アルキル、ハイドロキシ、アリール、ジメチル置換アミノ、
    Figure 0005030587
    またはプロピルチオであり；
    Ｒｇ、Ｒｉは、それぞれ独立して、水素、ハイドロキシまたはＣ１−５アルキルであり；
    Ｒｊは、アミノ、Ｃ１−５アルキル、ハイドロキシ、アリール、ジメチル置換アミノ、プロピルチオ、
    Figure 0005030587
    であり、
    ここで、
    Ｒ１がＣ６Ｈ５ＣＨ＝ＣＨでＲ２が水素でかつＲ３がフェニルである場合、Ｒ４はフェニル以外であり；
    Ｒ１がフェニルで、Ｒ２が水素でＲ３がベンゾイルである場合、Ｒ４はベンゾイル以外であり；
    Ｒ１がフェニルで、Ｒ２が置換ベンジルでＲ３が水素でＲ４が水素である場合、Ｒｎ，Ｒｏ、およびＲｐは全てが水素であることはなく；
    Ｒ１がフェニルで、Ｒ３が水素でかつＲ４が水素である場合、Ｒ２はベンジルまたはフェニル以外であり；
    Ｒ１がフェニルで、Ｒ２が水素である場合、Ｒ４がベンゾイルのときは、同時にＲ３はフェニル以外であり；および
    Ｒ１がフェニルで、Ｒ２が水素である場合、Ｒ３およびＲ４は、両者ともにベンジルであることはない）。
  3. 請求項１または２に記載の抗ウイルス化合物および任意の１種以上の薬学的に許容できる担体を含む薬剤組成物。
  4. １種以上の公知の抗ウイルス化合物をさらに含む請求項３に記載の薬剤組成物。
  5. ウイルスに感染した細胞、または前記ウイルスに暴露した細胞中の前記ウイルスの増殖および／または複製を減少、妨害、阻害するための薬剤の製造における請求項１または２に記載の化合物の使用。
  6. ウイルスに暴露した細胞の感染を防止するための薬剤の製造における請求項１または２に記載の化合物の使用。
  7. ウイルス感染細胞における膜イオンチャンネル機能活性をダウンレギュレーションするための薬剤の製造における請求項１または２に記載の化合物の使用。
  8. 前記ウイルスが、レンチウイルスである請求項５乃至７に記載の使用。
  9. 前記レンチウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である請求項８に記載の使用。
  10. 前記化合物が、下記：
    ３−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    ３−メチルシンナモイルグアニジン、
    ２−メチルシンナモイルグアニジン、
    シンナモイルグアニジン、
    トランス−３−（１−ナフチル）アクリロイルグアニジン、
    ２−エチルシンナモイルグアニジン、
    ２，５−ジメチルシンナモイルグアニジン、
    ３−イソプロピルシンナモイルグアニジンハイドロクロライド、
    （５−フェニル−ペンタ−２，４−ジエノイル）グアニジン、
    ３−フェニルシンナモイルグアニジン、
    ３−（シクロヘキセ−１−エン−１−イル）シンナモイルグアニジン、
    ２−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    ４−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    ２−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    ４−メチルシンナモイルグアニジン、
    ２−フェニルシンナモイルグアニジン、
    Ｎ−（６−ハイドロキシ−２−ナフトイル）−Ｎ’−フェニルグアニジン、
    ３−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    ３，４−（メチレンジオキシ）シンナモイルグアニジン、
    ２−（１−ナフチル）アセトイルグアニジン、
    ４−イソプロピルシンナモイルグアニジン、
    Ｎ−（シンナモイル）−Ｎ’−フェニルグアニジン、
    ２−（シクロヘキセ−１−エン−１−イル）シンナモイルグアニジン、
    ２−（２−ナフチル）アセトイルグアニジン、
    （４−ハイドロキシシンナモイル）グアニジン、
    ４−フェニルシンナモイルグアニジン、
    Ｎ，Ｎ’−ビス−（シンナモイル）−Ｎ”−フェニルグアニジン、
    （３−ニトロシンナモイル）グアニジン、
    ベンゾイルグアニジン、
    ２−シクロヘキシルシンナモイルグアニジン、
    （α−メチルシンナモイル）グアニジン、
    シンナモイルグアニジンハイドロクロライド、
    （２−ニトロシンナモイル）グアニジン、
    ４−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、および
    Ｎ−ベンゾイル−Ｎ’−シンナモイルグアニジン
    から構成される群から選択される請求項９に記載の使用。
  11. 前記化合物が、３−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、および（５−フェニル−ペンタ−２，４−ジエノイル）グアニジンから構成される群から選択される請求項１０に記載の使用。
  12. 前記ＨＩＶが、ＨＩＶ−１である請求項９乃至請求項１１のいずれか１項に記載の使用。
  13. 前記ウイルスが、コロナウイルスである請求項５乃至請求項７のいずれか１項に記載の使用。
  14. 前記コロナウイルスが、重症急性呼吸器症候群ウイルス（ＳＡＲＳ）である請求項１３に記載の使用。
  15. 前記化合物が、下記：
    ４−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    ３−（シクロヘキセ−１−エン−１−イル）シンナモイルグアニジン、
    ２，５−ジメチルシンナモイルグアニジン、
    トランス−３−（１−ナフチル）アクリロイルグアニジン、
    ４−イソプロピルシンナモイルグアニジン、
    ３−フェニルシンナモイルグアニジン、
    ４−フェニルシンナモイルグアニジン、
    ４−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    ３−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    シンナモイルグアニジンハイドロクロライド、
    ３−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    ２−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    ２−シクロヘキシルシンナモイルグアニジン、
    （４−ハイドロキシシンナモイル）グアニジン、
    （３−ニトロシンナモイル）グアニジン、
    ２−（１−ナフチル）アセトイルグアニジン、
    ２−エチルシンナモイルグアニジン、
    ２−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    Ｎ−（６−ハイドロキシ−２−ナフトイル）−Ｎ’−フェニルグアニジン、
    ４−メチルシンナモイルグアニジン、
    ３，４−（メチレンジオキシ）シンナモイルグアニジン、
    Ｎ−（シンナモイル）−Ｎ’−フェニルグアニジン、
    ３−メチルシンナモイルグアニジン、
    ２−メチルシンナモイルグアニジン、
    ２−（２−ナフチル）アセトイルグアニジン、
    シンナモイルグアニジン、
    ［３−（３−ピリジル）アクリロイル］グアニジン、
    （α−メチルシンナモイル）グアニジン、
    （５−フェニル−ペンタ−２，４−ジエノイル）グアニジン、
    （キノリン−２−カルボニル）グアニジン、
    （フェニルアセチル）グアニジン、
    Ｎ，Ｎ’−ビス（アミジノ）ナフタレン−２，６−ジカルボキサミド、および
    Ｎ−ベンゾイル−Ｎ’−シンナモイルグアニジン、
    から構成される群から選択される請求項１４に記載の使用。
  16. 前記化合物が、シンナモイルグアニジン、およびトランス−３−（１−ナフチル）アクリロイルグアニジンから構成される群から選択される請求項１４に記載の使用。
  17. 前記コロナウイルスが、ヒトコロナウイルス ２２９Ｅである請求項１３に記載の使用。
  18. 前記化合物が、下記：
    ４−イソプロピルシンナモイルグアニジン、
    ４−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    ３−イソプロピルシンナモイルグアニジンハイドロクロライド、
    ３−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    ２−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    トランス−３−（１−ナフチル）アクリロイルグアニジン、
    ２−フェニルシンナモイルグアニジン、
    ３−フェニルシンナモイルグアニジン、
    ３−（シクロヘキセ−１−エン−１−イル）シンナモイルグアニジン、
    ３−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    ４−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    ２−（シクロヘキセ−１−エン−１−イル）シンナモイルグアニジン、
    （５−フェニル−ペンタ−２，４−ジエノイル）グアニジン、
    ２，５−ジメチルシンナモイルグアニジン、
    ２−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    シンナモイルグアニジン、
    （α−メチルシンナモイル）グアニジン、
    ２−（１−ナフチル）アセトイルグアニジン、
    ２−エチルシンナモイルグアニジン、
    ２−シクロヘキシルシンナモイルグアニジン、
    （４−ハイドロキシシンナモイル）グアニジン、
    ３−メチルシンナモイルグアニジン、
    ２−メチルシンナモイルグアニジン、
    シンナモイルグアニジンハイドロクロライド、
    Ｎ，Ｎ’−ビス（アミジノ）ナフタレン−２，６−ジカルボキサミド、
    ４−メチルシンナモイルグアニジン、
    （３−ニトロシンナモイル）グアニジン、
    ２−（２−ナフチル）アセトイルグアニジン、
    （２−ニトロシンナモイル）グアニジン、
    ［（Ｅ）−３−（４−ジメチルアミノフェニル）−２−メチルアクリロイル］グアニジン、
    Ｎ−ベンゾイル−Ｎ’−シンナモイルグアニジン、
    Ｎ−（シンナモイル）−Ｎ’−フェニルグアニジン、
    ベンゾイルグアニジン、
    （キノリン−２−カルボニル）グアニジン、
    ［３−（３−ピリジル）アクリロイル］グアニジン、および
    （フェニルアセチル）グアニジン
    から構成される群から選択される請求項１７に記載の使用。
  19. 前記化合物が、下記：
    ２−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    ４−イソプロピルシンナモイルグアニジン、
    ２−（シクロヘキセ−１−エン−１−イル）シンナモイルグアニジン、
    ２−シクロヘキシルシンナモイルグアニジン、
    ２−フェニルシンナモイルグアニジン、
    ４−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    ３−フェニルシンナモイルグアニジン、
    トランス−３−（１−ナフチル）アクリロイルグアニジン、
    ３−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    ４−メチルシンナモイルグアニジン、
    ３−（シクロヘキセ−１−エン−１−イル）シンナモイルグアニジン、
    （α−メチルシンナモイル）グアニジン、
    （３−ニトロシンナモイル）グアニジン、
    ２，５−ジメチルシンナモイルグアニジン、
    ３−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    ３−メチルシンナモイルグアニジン、
    ３−イソプロピルシンナモイルグアニジンハイドロクロライド、
    （５−フェニル−ペンタ−２，４−ジエノイル）グアニジン、
    ２−メチルシンナモイルグアニジン、
    シンナモイルグアニジン、
    ３，４−（メチレンジオキシ）シンナモイルグアニジン、
    Ｎ，Ｎ’−ビス（アミジノ）ナフタレン−２，６−ジカルボキサミド、
    ２−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    シンナモイルグアニジンハイドロクロライド、
    （４−ハイドロキシシンナモイル）グアニジン、
    ２−（１−ナフチル）アセトイルグアニジン、および
    ２−（２−ナフチル）アセトイルグアニジン、
    から構成される群から選択される請求項１７に記載の使用。
  20. 前記コロナウイルスが、ヒトコロナウイルス ＯＣ４３である請求項１３に記載の使用。
  21. 前記化合物が、下記：
    ３−メチルシンナモイルグアニジン、
    トランス−３−（１−ナフチル）アクリロイルグアニジン、
    ３−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    ４−イソプロピルシンナモイルグアニジン、
    シンナモイルグアニジン、
    （５−フェニル−ペンタ−２，４−ジエノイル）グアニジン、および
    ２−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン
    から構成される群から選択される請求項２０に記載の使用。
  22. 前記コロナウイルスが、ブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ）である請求項１３に記載の使用。
  23. 前記化合物が、下記：
    シンナモイルグアニジン、
    ３−メチルシンナモイルグアニジン、
    トランス−３−（１−ナフチル）アクリロイルグアニジン、および
    ２−（２−ナフチル）アセトイルグアニジン
    から構成される群から選択した請求項２２に記載の使用。
  24. 前記コロナウイルスが、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）である請求項１３に記載の使用。
  25. 前記化合物が、下記：
    ３−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    トランス−３−（１−ナフチル）アクリロイルグアニジン、
    シンナモイルグアニジン、
    （５−フェニル−ペンタ−２，４−ジエノイル）グアニジン、および
    ２−（２−ナフチル）アセトイルグアニジン、
    から構成される群から選択される請求項２４に記載の使用。
  26. 前記コロナウイルスが、
    イヌ腸コロナウイルス（ＩＮＳＡＶＣ−１株）および
    イヌ腸コロナウイルス（Ｋ３７８株）を含む
    イヌコロナウイルス、
    ネコ腸コロナウイルス（７９−１６８３株）および
    ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）を含む
    ネココロナウイルス、
    ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、
    ブタ流行性下痢ウイルス（Ｂｒｌ／８７株）および
    ブタ流行性下痢ウイルス（ＣＶ７７７株）を含む
    ブタ流行性下痢ウイルス、並びに、
    ブタ呼吸器コロナウイルス、
    ブタ伝染性胃腸炎コロナウイルス（ＦＳ７７２／７０株）、
    ブタ伝染性胃腸炎コロナウイルス（Ｍｉｌｌｅｒ株）、
    ブタ伝染性胃腸炎コロナウイルス（Ｎｅｂ７２−ＲＴ株）、および
    ブタ伝染性胃腸炎コロナウイルス（ＰＵＲＤＵＥ株）を含む
    伝染性胃腸炎ウイルスから構成される１群の種と、
    ウシコロナウイルス（Ｆ１５株）、
    ウシコロナウイルス（Ｇ９５株）、
    ウシコロナウイルス（Ｌ９株）、
    ウシコロナウイルス（ＬＳＵ−９−９４ＬＳＳ−０５１株）、
    ウシコロナウイルス（ＬＹ−１３８株）、
    ウシコロナウイルス（ＭＥＢＵＳ株）、
    ウシコロナウイルス（ＯＫ−０５１４−３株）、
    ウシコロナウイルス（Ｏｎｔａｒｉｏ株）、
    ウシコロナウイルス（Ｑｕｅｂｅｃ株）、
    ウシコロナウイルス（ＶＡＣＣＩＮＥ株）、および
    ウシコロナウイルス（９８ＴＸＳＦ−１１０−ＥＮＴ株）を含む
    ウシコロナウイルス、
    イヌ呼吸器コロナウイルス、
    ニワトリ腸コロナウイルス、
    ヒトコロナウイルスＯＣ４３、
    マウスコロナウイルス（ＤＶＩＭ株）、
    マウス肝炎ウイルス（Ａ５９株）、
    マウス肝炎ウイルス（ＪＨＭ株）、
    マウス肝炎ウイルス（Ｓ株）、
    マウス肝炎ウイルス１株、
    マウス肝炎ウイルス２株、
    マウス肝炎ウイルス３株、
    マウス肝炎ウイルス４株、および
    マウス肝炎ウイルスＭＬ−１１株を含む
    マウス肝炎ウイルス、
    ブタ赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（６７Ｎ株）、および
    ブタ赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（ＩＡＦ−４０４株）を含む
    ブタ赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、
    パフィノーシスウイルス、
    ラットコロナウイルス（６８１株）、
    ラットコロナウイルス（ＮＪ株）および
    ラットシアロドアクリオアデナイティスコロナウイルスを含む
    ラットコロナウイルスから構成される２群の種と、
    シチメンチョウコロナウイルス（Ｉｎｄｉａｎａ株）、
    シチメンチョウコロナウイルス（Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ株）および
    シチメンチョウコロナウイルス（ＮＣ９５株）を含む
    シチメンチョウコロナウイルス、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（６／８２株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ａｒｋａｎｓａｓ９９株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ ＣＫ株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ Ｍ４２株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ ＵＳ株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｄ１４６６株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｄ２７４株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｄ３８９６株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｄ４１株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（ＤＥ０７２株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（ＧＲＡＹ株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｈ１２０株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｈ５２株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（ＫＢ８５２３株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｍ４１株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（ＰＯＲＴＵＧＡＬ／３２２／８２株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（ＳＡＩＢ２０株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（ＵＫ／１２３／８２株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（ＵＫ／１４２／８６株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（ＵＫ／１６７／８４株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（ＵＫ１／１８３／６６株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（ＵＫ／６８／８４株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｖ１８／１９株）および
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｖｉｓ Ｓ株）を含む
    トリ感染性気管支炎ウイルス、並びに
    トリ感染性咽頭気管炎ウイルスから構成される３群の種と、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＢｅｉｊｉｎｇ ＺＹ−２００３株、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ０１、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ０２、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ０３、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ０４、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＣＵＨＫ−Ｓｕ１０、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＣＵＨＫ−Ｗ１、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＦｒａｎｋｆｕｒｔ １、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＧＺ０１、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ−３９８４９、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＨｏｎｇ Ｋｏｎｇ ＺＹ−２００３、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＨｏｎｇ Ｋｏｎｇ／０３／２００３、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＨＳＲ１、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ２５００、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ２６７７、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ２６７９、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ２７４８、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ２７７４、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＴａｉｗａｎ、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＴａｉｗａｎ ＪＣ−２００３、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＴａｉｗａｎ ＴＣ１、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＴａｉｗａｎ ＴＣ２、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＴｏｒ２、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ１、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷＣ、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＵｒｂａｎｉ、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＶｉｅｔｎａｍ、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＺＪ−ＨＺ０１および
    ＳＡＲＳコロナウイルスＺＪ０１を含む
    ＳＡＲＳコロナウイルス、
    ウシ呼吸器コロナウイルス（９８ＴＸＳＦ−１１０−ＬＵＮ株）を含む、
    未分類コロナウイルス、
    ヒト腸コロナウイルス４４０８、
    腸コロナウイルス、
    ウマコロナウイルス、並びに
    ウマコロナウイルスＮＣ９９から構成される暫定４群の種とからなる公知のコロナウイルス単離物のいずれかひとつである請求項１３に記載の使用。
  27. 前記化合物が、下記：
    ４−イソプロピルシンナモイルグアニジン、
    ４−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、および
    ３−イソプロピルシンナモイルグアニジンハイドロクロライド
    から構成される群から選択される請求項２６に記載の使用。
  28. 前記ウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルスである請求項５乃至請求項７のいずれか１項に記載の使用。
  29. 前記化合物が、下記：
    ２，５−ジメチルシンナモイルグアニジン、
    ３−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    ４−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    ２−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    ４−イソプロピルシンナモイルグアニジン、
    トランス−３−（１−ナフチル）アクリロイルグアニジン、
    ４−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    ２−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    ２−エチルシンナモイルグアニジン、
    ４−メチルシンナモイルグアニジン、
    ２−シクロヘキシルシンナモイルグアニジン、
    ３−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    （５−フェニル−ペンタ−２，４−ジエノイル）グアニジン、
    Ｎ−（シンナモイル）−Ｎ’−フェニルグアニジン、
    ３−イソプロピルシンナモイルグアニジンハイドロクロライド、
    （３−ニトロシンナモイル）グアニジン、
    （４−ハイドロキシシンナモイル）グアニジン、
    ４−フェニルシンナモイルグアニジン、
    Ｎ−（６−ハイドロキシ−２−ナフトイル）−Ｎ’−フェニルグアニジン、
    ３−（シクロヘキセ−１−エン−１−イル）シンナモイルグアニジン、
    シンナモイルグアニジンハイドロクロライド、
    ２−（１−ナフチル）アセトイルグアニジン、
    （α−メチルシンナモイル）グアニジン、
    （２−ニトロシンナモイル）グアニジン、
    ３，４−（メチレンジオキシ）シンナモイルグアニジン、
    シンナモイルグアニジン、
    ２−フェニルシンナモイルグアニジン、
    ２−（シクロヘキセ−１−エン−１−イル）シンナモイルグアニジン、
    ３−フェニルシンナモイルグアニジン、
    ２−メチルシンナモイルグアニジン、
    ３−メチルシンナモイルグアニジン、
    （４−ニトロシンナモイル）グアニジン、および
    ［（Ｅ）−３−（４−ジメチルアミノフェニル）−２−メチルアクリロイル］グアニジン
    から構成される群から選択される請求項２８に記載の使用。
  30. 前記ウイルスが、ウマアルテライティス（動脈炎）ウイルスである請求項５乃至７のいずれか１項に記載の使用。
  31. 前記化合物が、下記：
    トランス−３−（１−ナフチル）アクリロイルグアニジン、
    ２−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、および
    ２−（シクロヘキセ−１−エン−１−イル）シンナモイルグアニジン
    から構成される群から選択される請求項３０に記載の使用。
  32. ウイルスに感染した哺乳類、または前記ウイルスに暴露した哺乳類に対する前記哺乳類の治療または予防処置のための薬剤を製造するための請求項１または２に記載の化合物の使用。
  33. 哺乳類の細胞に感染したウイルスの増殖および／もしくは複製を減少、妨害または阻害するための薬剤を製造するための請求項１または２に記載の化合物の使用。
  34. 前記ウイルスが、レンチウイルスである請求項３２または請求項３３に記載の使用。
  35. 前記レンチウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である請求項３４記載の使用。
  36. 前記化合物が、下記：
    ３−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    ３−メチルシンナモイルグアニジン、
    ２−メチルシンナモイルグアニジン、
    シンナモイルグアニジン、
    トランス−３−（１−ナフチル）アクリロイルグアニジン、
    ２−エチルシンナモイルグアニジン、
    ２，５−ジメチルシンナモイルグアニジン、
    ３−イソプロピルシンナモイルグアニジンハイドロクロライド、
    （５−フェニル−ペンタ−２，４−ジエノイル）グアニジン、
    ３−フェニルシンナモイルグアニジン、
    ３−（シクロヘキセ−１−エン−１−イル）シンナモイルグアニジン、
    ２−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    ４−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    ２−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    ４−メチルシンナモイルグアニジン、
    ２−フェニルシンナモイルグアニジン、
    Ｎ−（６−ハイドロキシ−２−ナフトイル）−Ｎ’−フェニルグアニジン、
    ３−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    ３，４−（メチレンジオキシ）シンナモイルグアニジン、
    ２−（１−ナフチル）アセトイルグアニジン、
    ４−イソプロピルシンナモイルグアニジン、
    Ｎ−（シンナモイル）−Ｎ’−フェニルグアニジン、
    ２−（シクロヘキセ−１−エン−１−イル）シンナモイルグアニジン、
    ２−（２−ナフチル）アセトイルグアニジン、
    （４−ハイドロキシシンナモイル）グアニジン、
    ４−フェニルシンナモイルグアニジン、
    Ｎ，Ｎ’−ビス−（シンナモイル）−Ｎ”−フェニルグアニジン、
    （３−ニトロシンナモイル）グアニジン、
    ベンゾイルグアニジン、
    ２−シクロヘキシルシンナモイルグアニジン、
    （α−メチルシンナモイル）グアニジン、
    シンナモイルグアニジンハイドロクロライド、
    （２−ニトロシンナモイル）グアニジン、
    ４−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、および
    Ｎ−ベンゾイル−Ｎ’−シンナモイルグアニジン
    から構成される群から選択される請求項３５に記載の使用。
  37. 前記化合物が、３−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、および（５−フェニル−ペンタ−２，４−ジエノイル）グアニジンから構成される群から選択される請求項３５に記載の使用。
  38. 前記ＨＩＶが、ＨＩＶ−１である請求項３５乃至請求項３７のいずれか１項に記載の使用。
  39. 前記ウイルスが、コロナウイルスである請求項３２、または請求項３３に記載の使用。
  40. 前記コロナウイルスが、重症急性呼吸器症候群ウイルス（ＳＡＲＳ）である請求項３９に記載の使用。
  41. 前記化合物が、下記：
    ４−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    ３−（シクロヘキセ−１−エン−１−イル）シンナモイルグアニジン、
    ２，５−ジメチルシンナモイルグアニジン、
    トランス−３−（１−ナフチル）アクリロイルグアニジン、
    ４−イソプロピルシンナモイルグアニジン、
    ３−フェニルシンナモイルグアニジン、
    ４−フェニルシンナモイルグアニジン、
    ４−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    ３−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    シンナモイルグアニジンハイドロクロライド、
    ３−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    ２−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    ２−シクロヘキシルシンナモイルグアニジン、
    （４−ハイドロキシシンナモイル）グアニジン、
    （３−ニトロシンナモイル）グアニジン、
    ２−（１−ナフチル）アセトイルグアニジン、
    ２−エチルシンナモイルグアニジン、
    ２−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    Ｎ−（６−ハイドロキシ−２−ナフトイル）−Ｎ’−フェニルグアニジン、
    ４−メチルシンナモイルグアニジン、
    ３，４−（メチレンジオキシ）シンナモイルグアニジン、
    Ｎ−（シンナモイル）−Ｎ’−フェニルグアニジン、
    ３−メチルシンナモイルグアニジン、
    ２−メチルシンナモイルグアニジン、
    ２−（２−ナフチル）アセトイルグアニジン、
    シンナモイルグアニジン、
    ［３−（３−ピリジル）アクリロイル］グアニジン、
    （α−メチルシンナモイル）グアニジン、
    （５−フェニル−ペンタ−２，４−ジエノイル）グアニジン、
    （キノリン−２−カルボニル）グアニジン、
    （フェニルアセチル）グアニジン、
    Ｎ，Ｎ’−ビス（アミジノ）ナフタレン−２，６−ジカルボキサミド、および
    Ｎ−ベンゾイル−Ｎ’−シンナモイルグアニジン、
    から構成される群から選択される請求項４０に記載の使用。
  42. 前記化合物が、シンナモイルグアニジン、およびトランス−３−（１−ナフチル）アクリロイルグアニジンから構成される群から選択される請求項４０に記載の使用。
  43. 前記コロナウイルスが、ヒトコロナウイルス ２２９Ｅである請求項３９に記載の使用。
  44. 前記化合物が、下記：
    ４−イソプロピルシンナモイルグアニジン、
    ４−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    ３−イソプロピルシンナモイルグアニジンハイドロクロライド、
    ３−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    ２−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    トランス−３−（１−ナフチル）アクリロイルグアニジン、
    ２−フェニルシンナモイルグアニジン、
    ３−フェニルシンナモイルグアニジン、
    ３−（シクロヘキセ−１−エン−１−イル）シンナモイルグアニジン、
    ３−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    ４−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    ２−（シクロヘキセ−１−エン−１−イル）シンナモイルグアニジン、
    （５−フェニル−ペンタ−２，４−ジエノイル）グアニジン、
    ２，５−ジメチルシンナモイルグアニジン、
    ２−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    シンナモイルグアニジン、
    （α−メチルシンナモイル）グアニジン、
    ４−フェニルシンナモイルグアニジン、
    ２−（１−ナフチル）アセトイルグアニジン、
    ２−エチルシンナモイルグアニジン、
    ２−シクロヘキシルシンナモイルグアニジン、
    （４−ハイドロキシシンナモイル）グアニジン、
    ３−メチルシンナモイルグアニジン、
    ２−メチルシンナモイルグアニジン、
    シンナモイルグアニジンハイドロクロライド、
    Ｎ，Ｎ’−ビス（アミジノ）ナフタレン−２，６−ジカルボキサミド、
    ４−メチルシンナモイルグアニジン、
    （３−ニトロシンナモイル）グアニジン、
    ２−（２−ナフチル）アセトイルグアニジン、
    （２−ニトロシンナモイル）グアニジン、
    ［（Ｅ）−３−（４−ジメチルアミノフェニル）−２−メチルアクリロイル］グアニジン、
    Ｎ−ベンゾイル−Ｎ’−シンナモイルグアニジン、
    Ｎ−（シンナモイル）−Ｎ’−フェニルグアニジン、
    ベンゾイルグアニジン、
    （キノリン−２−カルボニル）グアニジン、
    ［３−（３−ピリジル）アクリロイル］グアニジン、および
    （フェニルアセチル）グアニジン
    から構成される群から選択される請求項４３に記載の使用。
  45. 前記化合物が、下記：
    ２−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    ４−イソプロピルシンナモイルグアニジン、
    ２−（シクロヘキセ−１−エン−１−イル）シンナモイルグアニジン、
    ２−シクロヘキシルシンナモイルグアニジン、
    ２−フェニルシンナモイルグアニジン、
    ４−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    ３−フェニルシンナモイルグアニジン、
    トランス−３−（１−ナフチル）アクリロイルグアニジン、
    ３−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    ４−メチルシンナモイルグアニジン、
    ３−（シクロヘキセ−１−エン−１−イル）シンナモイルグアニジン、
    （α−メチルシンナモイル）グアニジン、
    （３−ニトロシンナモイル）グアニジン、
    ２，５−ジメチルシンナモイルグアニジン、
    ３−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    ３−メチルシンナモイルグアニジン、
    ３−イソプロピルシンナモイルグアニジンハイドロクロライド、
    （５−フェニル−ペンタ−２，４−ジエノイル）グアニジン、
    ２−メチルシンナモイルグアニジン、
    シンナモイルグアニジン、
    ３，４−（メチレンジオキシ）シンナモイルグアニジン、
    Ｎ，Ｎ’−ビス（アミジノ）ナフタレン−２，６−ジカルボキサミド、
    ２−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    シンナモイルグアニジンハイドロクロライド、
    （４−ハイドロキシシンナモイル）グアニジン、
    ２−（１−ナフチル）アセトイルグアニジン、および
    ２−（２−ナフチル）アセトイルグアニジン、
    から構成される群から選択される請求項４３に記載の使用。
  46. 前記コロナウイルスが、ヒトコロナウイルス ＯＣ４３である請求項３９に記載の使用。
  47. 前記化合物が、下記：
    ３−メチルシンナモイルグアニジン、
    トランス−３−（１−ナフチル）アクリロイルグアニジン、
    ３−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    ４−イソプロピルシンナモイルグアニジン、
    シンナモイルグアニジン、
    （５−フェニル−ペンタ−２，４−ジエノイル）グアニジン、および
    ２−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン
    から構成される群から選択される請求項４６に記載の使用。
  48. 前記コロナウイルスが、ブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ）である請求項３９に記載の使用。
  49. 前記化合物が、下記：
    シンナモイルグアニジン、
    ３−メチルシンナモイルグアニジン、
    トランス−３−（１−ナフチル）アクリロイルグアニジン、および
    ２−（２−ナフチル）アセトイルグアニジン
    から構成される群から選択される請求項４８に記載の使用。
  50. 前記コロナウイルスが、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）である請求項３９に記載の使用。
  51. 前記化合物が、下記：
    ３−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    トランス−３−（１−ナフチル）アクリロイルグアニジン、
    シンナモイルグアニジン、
    （５−フェニル−ペンタ−２，４−ジエノイル）グアニジン、および
    ２−（２−ナフチル）アセトイルグアニジン、
    から構成される群から選択される請求項５０に記載の使用。
  52. 前記コロナウイルスが、
    イヌ腸コロナウイルス（ＩＮＳＡＶＣ−１株）および
    イヌ腸コロナウイルス（Ｋ３７８株）を含む
    イヌコロナウイルス、
    ネコ腸コロナウイルス（７９−１６８３株）および
    ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）を含む
    ネココロナウイルス、
    ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、
    ブタ流行性下痢ウイルス（Ｂｒｌ／８７株）および
    ブタ流行性下痢ウイルス（ＣＶ７７７株）を含む
    ブタ流行性下痢ウイルス、並びに、
    ブタ呼吸器コロナウイルス、
    ブタ伝染性胃腸炎コロナウイルス（ＦＳ７７２／７０株）、
    ブタ伝染性胃腸炎コロナウイルス（Ｍｉｌｌｅｒ株）、
    ブタ伝染性胃腸炎コロナウイルス（Ｎｅｂ７２−ＲＴ株）、および
    ブタ伝染性胃腸炎コロナウイルス（ＰＵＲＤＵＥ株）を含む
    伝染性胃腸炎ウイルスから構成される１群の種と、
    ウシコロナウイルス（Ｆ１５株）、
    ウシコロナウイルス（Ｇ９５株）、
    ウシコロナウイルス（Ｌ９株）、
    ウシコロナウイルス（ＬＳＵ−９−９４ＬＳＳ−０５１株）、
    ウシコロナウイルス（ＬＹ−１３８株）、
    ウシコロナウイルス（ＭＥＢＵＳ株）、
    ウシコロナウイルス（ＯＫ−０５１４−３株）、
    ウシコロナウイルス（Ｏｎｔａｒｉｏ株）、
    ウシコロナウイルス（Ｑｕｅｂｅｃ株）、
    ウシコロナウイルス（ＶＡＣＣＩＮＥ株）、および
    ウシコロナウイルス（９８ＴＸＳＦ−１１０−ＥＮＴ株）を含む
    ウシコロナウイルス、
    イヌ呼吸器コロナウイルス、
    ニワトリ腸コロナウイルス、
    ヒトコロナウイルスＯＣ４３、
    マウスコロナウイルス（ＤＶＩＭ株）、
    マウス肝炎ウイルス（Ａ５９株）、
    マウス肝炎ウイルス（ＪＨＭ株）、
    マウス肝炎ウイルス（Ｓ株）、
    マウス肝炎ウイルス１株、
    マウス肝炎ウイルス２株、
    マウス肝炎ウイルス３株、
    マウス肝炎ウイルス４株、および
    マウス肝炎ウイルスＭＬ−１１株を含む
    マウス肝炎ウイルス、
    ブタ赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（６７Ｎ株）、および
    ブタ赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（ＩＡＦ−４０４株）を含む
    ブタ赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、
    パフィノーシスウイルス、
    ラットコロナウイルス（６８１株）、
    ラットコロナウイルス（ＮＪ株）および
    ラットシアロドアクリオアデナイティスコロナウイルスを含む
    ラットコロナウイルスから構成される２群の種と、
    シチメンチョウコロナウイルス（Ｉｎｄｉａｎａ株）、
    シチメンチョウコロナウイルス（Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ株）および
    シチメンチョウコロナウイルス（ＮＣ９５株）を含む
    シチメンチョウコロナウイルス、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（６／８２株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ａｒｋａｎｓａｓ９９株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ ＣＫ株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ Ｍ４２株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ ＵＳ株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｄ１４６６株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｄ２７４株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｄ３８９６株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｄ４１株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（ＤＥ０７２株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（ＧＲＡＹ株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｈ１２０株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｈ５２株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（ＫＢ８５２３株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｍ４１株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（ＰＯＲＴＵＧＡＬ／３２２／８２株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（ＳＡＩＢ２０株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（ＵＫ／１２３／８２株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（ＵＫ／１４２／８６株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（ＵＫ／１６７／８４株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（ＵＫ１／１８３／６６株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（ＵＫ／６８／８４株）、
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｖ１８／１９株）および
    トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｖｉｓ Ｓ株）を含む
    トリ感染性気管支炎ウイルス、並びに
    トリ感染性咽頭気管炎ウイルスから構成される３群の種と、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＢｅｉｊｉｎｇ ＺＹ−２００３株、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ０１、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ０２、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ０３、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ０４、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＣＵＨＫ−Ｓｕ１０、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＣＵＨＫ−Ｗ１、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＦｒａｎｋｆｕｒｔ １、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＧＺ０１、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ−３９８４９、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＨｏｎｇ Ｋｏｎｇ ＺＹ−２００３、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＨｏｎｇ Ｋｏｎｇ／０３／２００３、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＨＳＲ１、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ２５００、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ２６７７、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ２６７９、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ２７４８、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ２７７４、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＴａｉｗａｎ、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＴａｉｗａｎ ＪＣ−２００３、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＴａｉｗａｎ ＴＣ１、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＴａｉｗａｎ ＴＣ２、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＴｏｒ２、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ１、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷＣ、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＵｒｂａｎｉ、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＶｉｅｔｎａｍ、
    ＳＡＲＳコロナウイルスＺＪ−ＨＺ０１および
    ＳＡＲＳコロナウイルスＺＪ０１を含む
    ＳＡＲＳコロナウイルス、
    ウシ呼吸器コロナウイルス（９８ＴＸＳＦ−１１０−ＬＵＮ株）を含む、
    未分類コロナウイルス、
    ヒト腸コロナウイルス４４０８、
    腸コロナウイルス、
    ウマコロナウイルス、並びに
    ウマコロナウイルスＮＣ９９から構成される暫定４群の種とからなる公知のコロナウイルス単離物のいずれかひとつである請求項３９に記載の使用。
  53. 前記化合物が、下記：
    ４−イソプロピルシンナモイルグアニジン、
    ４−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、および
    ３−イソプロピルシンナモイルグアニジンハイドロクロライド
    から構成される群から選択される請求項５２に記載の使用。
  54. 前記ウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルスである請求項３２または請求項３３に記載の使用。
  55. 前記化合物が、下記：
    ２，５−ジメチルシンナモイルグアニジン、
    ３−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    ４−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    ２−（トリフルオロメチル）シンナモイルグアニジン、
    ４−イソプロピルシンナモイルグアニジン、
    トランス−３−（１−ナフチル）アクリロイルグアニジン、
    ４−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    ２−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    ２−エチルシンナモイルグアニジン、
    ４−メチルシンナモイルグアニジン、
    ２−シクロヘキシルシンナモイルグアニジン、
    ３−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジン、
    （５−フェニル−ペンタ−２，４−ジエノイル）グアニジン、
    Ｎ−（シンナモイル）−Ｎ’−フェニルグアニジン、
    ３−イソプロピルシンナモイルグアニジンハイドロクロライド、
    （３−ニトロシンナモイル）グアニジン、
    （４−ハイドロキシシンナモイル）グアニジン、
    ４−フェニルシンナモイルグアニジン、
    Ｎ−（６−ハイドロキシ−２−ナフトイル）−Ｎ’−フェニルグアニジン、
    ３−（シクロヘキセ−１−エン−１−イル）シンナモイルグアニジン、
    シンナモイルグアニジンハイドロクロライド、
    ２−（１−ナフチル）アセトイルグアニジン、
    （α−メチルシンナモイル）グアニジン、
    （２−ニトロシンナモイル）グアニジン、
    ３，４−（メチレンジオキシ）シンナモイルグアニジン、
    シンナモイルグアニジン、
    ２−フェニルシンナモイルグアニジン、
    ２−（シクロヘキセ−１−エン−１−イル）シンナモイルグアニジン、
    ３−フェニルシンナモイルグアニジン、
    ２−メチルシンナモイルグアニジン、
    ３−メチルシンナモイルグアニジン、
    （４−ニトロシンナモイル）グアニジン、および
    ［（Ｅ）−３−（４−ジメチルアミノフェニル）−２−メチルアクリロイル］グアニジン
    から構成される群から選択される請求項５４に記載の使用。
  56. 前記ウイルスが、ウマアルテライティス（動脈炎）ウイルスである請求項３２または請求項３３に記載の使用。
  57. 前記化合物が、下記：
    トランス−３−（１−ナフチル）アクリロイルグアニジン、
    ２−ｔ−ブチルシンナモイルグアニジンおよび
    ２−（シクロヘキセ−１−エン−１−イル）シンナモイルグアニジン
    から構成される群から選択される請求項５６に記載の使用。
  58. 前記化合物が、請求項２または請求項３に記載の薬剤組成物として提供される請求項３２乃至５７のいずれか１項に記載の使用。
  59. 前記化合物は、前記ウイルス由来及び前記感染細胞において発現した膜イオンチャンネルの機能活性をダウンレギュレーションする請求項５乃至３１のいずれか１項に記載の使用。
  60. 前記膜イオンチャンネルがＨＩＶのＶｐｕ膜イオンチャンネルである請求項５９に記載の使用。
  61. 前記膜イオンチャンネルが、コロナウイルスのＥたんぱく質である請求項５９に記載の使用。
  62. 前記膜イオンチャンネルが、Ｃ型肝炎ウイルスのｐ７膜イオンチャンネルである請求項５９に記載の使用。
  63. 前記化合物は、前記感染細胞において発現した膜イオンチャンネルの機能活性をダウンレギュレーションする請求項３２乃至請求項５８のいずれか１項に記載の使用。
  64. 前記膜イオンチャンネルが、ＨＩＶのＶｐｕ膜イオンチャンネルである請求項６３に記載の使用。
  65. 前記膜イオンチャンネルが、コロナウイルスのＥたんぱく質である請求項６３に記載の使用。
  66. 前記膜イオンチャンネルが、Ｃ型肝炎ウイルスのｐ７膜イオンチャンネルである請求項６３に記載の使用。
  67. 前記哺乳類が、霊長類である請求項３２乃至５８、または請求項６３乃至請求項６６のいずれか１項に記載の使用。
  68. 前記霊長類が、ヒトである請求項６７に記載の使用。
  69. Ｎ，Ｎ’−ビス（１−ナフトイル）グアニジン、
    シンナモイルグアニジン、
    Ｎ−（シンナモイル）−Ｎ’−フェニルグアニジン、
    Ｎ，Ｎ’−ビス−（シンナモイル）−Ｎ”−フェニルグアニジン、
    Ｎ−（６−ハイドロキシ−２−ナフトイル）−Ｎ’−フェニルグアニジン、
    Ｎ，Ｎ’−ビス（アミジノ）ナフタレン−２，６−ジカルボキサミド、
    Ｎ”−シンナモイル−Ｎ，Ｎ’−ジフェニルグアニジン、
    （フェニルアセチル）グアニジン、
    ベンゾイルグアニジン、
    Ｎ−ベンゾイル−Ｎ’−シンナモイルグアニジン、
    ［（Ｅ）−３−（４−ジメチルアミノフェニル）−２−メチルアクリロイル］グアニジン、
    （５−フェニル−ペンタ−２，４−ジエノイル）グアニジン、
    ［３−（３−ピリジル）アクリロイル］グアニジン、
    （４−ハイドロキシシンナモイル）グアニジン、および
    （キノリン−２−カルボニル）グアニジン
    から構成される群から選択された抗ウイルス化合物またはその薬学的に許容できる塩。
  70. 請求項６９に記載の化合物と、任意に１種以上の薬学的に許容できる担体とを含む薬剤組成物。
  71. １種以上の公知の抗ウイルス化合物をさらに含む請求項７０に記載の薬剤組成物。
  72. 前記化合物が、請求項６９記載の抗ウイルス化合物から選択される請求項５乃至６８のいずれか１項に記載の使用。
  73. 前記ウイルスが、デングウイルスで、かつ、前記化合物が、シンナモイルグアニジン、（２−クロロシンナモイル）グアニジンまたはトランス−３−（１−ナフチル）アクリロイルグアニジンから構成される群から選択される請求項５乃至６８のいずれか１項に記載の使用。
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