CN101111475B

CN101111475B - 抗病毒化合物及方法

Info

Publication number: CN101111475B
Application number: CN2004800240974A
Authority: CN
Inventors: P·W·加格; G·D·埃瓦尔特; L·E·维尔松; W·贝斯特; A·普雷姆库马尔
Original assignee: Biotron Ltd
Current assignee: Biotron Ltd
Priority date: 2003-06-26
Filing date: 2004-06-26
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2024-06-26
Also published as: CN101111475A; ZA200600650B; AU2003903251A0

Abstract

本发明涉及具有抗病毒活性的化合物和利用所述化合物治疗病毒感染的方法。

Description

抗病毒化合物及方法

发明领域

本发明涉及延缓、降低或抑制病毒的生长和/或功能活性的方法。本发明还涉及适合用于此方法的化合物和组合物。

发明背景

目前，非常需要开发针对病毒感染，尤其是针对与高发病率和死亡率相关的，以及影响很大人群的病毒感染有效的新的治疗。目前可用的治疗在很大比例的感染患者中是不足够或无效的。

例如，在改善AIDS综合征和延长生命期望方面，利用靶向病毒的逆转录酶和蛋白酶的药物，已获得成功的方法(Miller和Sarver，1997；Mitsuya，1992；Moore，1997；以及Thomas和Brady，1997)。然而，没有单独一种治疗方法对于HIV感染是完全有效的。(Barry等人，1998；Deeks，1998；Miles，1997：Miles，1998；Moyle等人，1998；Rachlis和Zarowny，1998；Veil等人，1997；Volberding和Deeks，1998；以及Volberdin，1998)。

PCT申请PCT/AU99/00872描述了化合物5-(N，N-亚己基)-氨氯吡咪和5-(N，N-二甲基)-氨氯吡咪在HIV感染治疗中的用途。

另一种被认为是重要的人类病原体的病毒是丙型肝炎病毒(HCV)。根据对于人类健康的代价和相关的经济代价，该病毒是重要的人类病原体。HCV引起慢性肝炎和肝硬变并为肝脏置换外科的主要指示。2002年，疾病控制与预防中心(Center for Disease Control and Prevention)估计仅美国就有超过4百万人受到感染，并估计每年约8000至10000人死于慢性HCV感染。没有已知的治疗或疫苗。急需更有效的药剂。

目，冠状病毒科，冠状病毒属)由正链RNA病毒包膜，所述病毒从内质网-高尔基体中间区室或顺面高尔基体网络出芽(Fischer，Stegen等人，1998；Maeda，Maeda等人，1999；Corse和Machamer 2000；Maeda，Repass等人，2001；Kuo和Masters 2003)。

冠状病毒感染人和动物，并认为可能存在感染每一种动物的冠状病毒。两种人类冠状病毒229E和OC43已知为普通感冒的主要原因并可在老年人、新生儿或无免疫应答的患者中偶尔引起肺炎(Peiris，Lai等人，2003)。动物冠状病毒可在其宿主中引起呼吸的、胃肠的、神经的或肝的疾病(Peiris，Lai等人，2003)。几种动物冠状病毒是重要的兽医病原体(Rota，Oberste等人，2003)。

严重急性呼吸综合征(SARS)由新鉴定的病毒引起。SARS是最近在亚洲、北美洲和欧洲所报道的呼吸疾病(Peiris，Lai等人，2003)。SARS的病原体经鉴定为冠状病毒(Drosten，Gunther等人，2003；Ksiazek，Erdman等人，2003；Peiris，Lai等人，2003)。世界卫生组织报道，从2002年11月1日至2003年7月11日所报道的可能的SARS病例的累积数目是8437例，813例死亡，接近10％的死亡率。人们相信SARS将不会根除，而将像感冒或流感病毒一样引起季节性流行(Vogel 2003)。

为改善治疗和预防病毒感染的前景，目前需要鉴定能够抑制病毒生活周期的不同方面的分子。

本发明的目标是克服或改善现有技术的至少一种缺陷，或提供有用的备选方案。

决不应当将贯穿说明书的任意现有技术的讨论视为承认此现有技术是广泛为人所知的或在本领域形成了普遍常识的一部分。

发明概述

发明人令人吃惊地发现，某些归入经取代的酰基胍类别的化合物具有针对来自一系列不同病毒科的病毒的抗病毒活性。无意被任意特定的理论或作用机制束缚，并不管当前的信条，看起来可能通过抑制或下调宿主细胞中表达的离子通道的活性而延缓病毒复制。因此，本发明的化合物对病毒复制的负面影响可通过抑制或下调病毒复制所依赖的膜离子通道来调节。此膜离子通道可为病毒膜离子通道(对于宿主细胞是外源性的)或由于病毒感染所诱导的宿主细胞离子通道(对于宿主细胞是内源性的)。

例如，本发明的化合物可抑制Vpu或p7功能并因而抑制各自的HIV或HCV生活周期的持续。

SARS病毒编码E蛋白质，其由本发明人首次表明用作离子通道。由于类似的E蛋白质存在于其它冠状病毒中，所以本发明的化合物、组合物和方法在抑制和/或治疗其它冠状病毒的感染中将具有效用。

本发明涉及新型抗病毒化合物，其属于经取代的酰基胍分类。在它的范围内不包括使用化合物5-(N，N-亚己基)-氨氯吡咪和5-(N，N-二甲基)-氨氯吡咪延缓、降低或抑制HIV的病毒生长和/或功能活性。

因此，本发明的第一方面提供了具有抗病毒活性的酰基胍。

根据第二方面，本发明提供了式I的抗病毒化合物。

其中R₁-R₄独立地为芳香基、杂芳香基、烷基芳香基、烷基杂芳香基、链烯基芳香基、链烯基杂芳香基、环烷基芳香基、环烷基杂芳香基、芳氧基烷基和杂芳氧基烷基，所述基团是单或多环的，且任选地由一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自氢、羟基、硝基、卤、氨基、取代氨基、烷基取代的氨基、环烷基取代的氨基、芳基取代的氨基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_3-6环烷基、卤取代的C_1-6烷基、卤取代的C_1-6烷氧基、苯基、C_1-6链烯基、C_3-6环烯基、C_1-6链烯氧基、苯并、芳基、取代芳基、PrS、

根据第三方面，本发明提供了式I的抗病毒化合物

或其药学上可接受的盐，

其中，

R₁＝

R₂、R₃和R₄独立地为氢、

且其中，

X＝氢、羟基、硝基、卤、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_3-6环烷基、卤取代的C_1-6烷基、卤取代的C_1-6烷氧基、苯基、C_1-6链烯基、C_3-6环烯基、C_1-6链烯氧基或苯并；

R_a、R_b、R_c、R_d、R_e、R_f、R_h、R_k、R_L、R_m、R_n、R_o、R_p独立地＝氢、氨基、卤、C_1-5烷基、C_1-5烷氧基、羟基、芳基、取代芳基、取代氨基、单或二烷基取代的氨基、环烷基取代的氨基、芳基取代的氨基、

或PrS；

R_g，R_i独立地＝氢、羟基、卤或C_1-5烷基；

R_j＝氢、氨基、卤、C_1-5烷基、C_1-5烷氧基、羟基、芳基、取代芳基、取代氨基、烷基取代的氨基、环烷基取代的氨基、芳基取代的氨基、PrS、

优选地，本发明的化合物包括下列：

包含结构

的5-(N，N-亚己基)-氨氯吡咪

包含结构的5-(N，N-二甲基)-氨氯吡咪盐酸盐

包含结构

的5-(N-甲基-N-异丁基)氨氯吡咪

包含结构

的5-(N-乙基-N-异丙基)氨氯吡咪(此处称作EIPA)

包含结构

的N-(3，5-二氨基-6-氯-吡嗪-2-羰基)-N’-苯基-胍

包含结构

的N-苯甲基-N’-(3，5-二氨基-6-氯-吡嗪-2-羰基)胍

包含结构

的3-甲氧基氨氯吡咪

包含结构

的3-甲氧基-5-(N，N-亚己基)-氨氯吡咪

包含结构

的3-羟基-5-亚己基亚氨基-氨氯吡咪

包含结构的亚己基亚氨基-6-苯基-2-吡嗪甲酰胺

包含结构

的N-脒基-3，5-二氨基-6-苯基-2-吡嗪甲酰胺

包含结构

的5-(N，N-亚己基)-氨氯吡咪

包含结构的N-脒基-3-氨基-5-苯基-6-氯-2-吡嗪甲酰胺

包含结构

的3’4二氯benzamil

包含结构

的2’4二氯benzamil HCl

包含结构

的5-(N-甲基-N-胍基羰基-甲基)氨氯吡咪

包含结构

的5-(N，N-二乙基)-氨氯吡咪盐酸盐

包含结构

的5-(N，N-二甲基)-氨氯吡咪盐酸盐

包含结构

的5-叔-丁基氨基-氨氯吡咪

包含结构

的6-碘代氨氯吡咪

包含结构

的Bofipy-FL氨氯吡咪

包含结构

的5-(4-氟苯基)氨氯吡咪

包含结构

的1-萘甲酰基胍

包含结构的2-萘甲酰基胍

包含结构

的N-(2-萘甲酰基)-N’-苯基胍

包含结构的N，N’-双(2-萘甲酰基)胍

包含结构

的N，N’-双(1-萘甲酰基)胍

包含结构

的N，N’-双(2-萘甲酰基)-N”-苯基胍

包含结构

的6-甲氧基-2-萘甲酰基胍

包含结构

的N-肉桂酰基-N’，N’-二甲基胍

包含结构的3-喹啉甲酰基胍

包含结构

的肉桂酰基胍

包含结构

的4-苯基苯甲酰基胍

包含结构

的N-(肉桂酰基)-N’苯基胍

包含结构

的(3-苯基丙酰基)胍

包含结构的N，N’-双-(肉桂酰基)-N”-苯基胍

包含结构

的N-(3-苯基丙酰基)-N’-苯基胍

包含结构

的N’N-双(3-苯基丙酰基)-N”-苯基胍

包含结构的反式-3-呋喃丙烯酰基胍

包含结构

的N-(6-羟基-2-萘甲酰基)-N’-苯基胍

包含结构

的(4-苯氧基苯甲酰基)胍

包含结构

的N，N’-双(脒基)萘-2，6-二甲酰胺

包含结构

的6-溴-2-萘甲酰基胍

包含结构

的1-溴-2-萘甲酰基胍

包含结构

的2-(2-萘基)乙酰基胍

包含结构

的N”-肉桂酰基-N，N’-二苯基胍

包含结构

的(苯基乙酰基)胍

包含结构

的N，N’-双(3-苯基丙酰基)胍

包含结构

的苯甲酰基胍

包含结构

的(4-氯苯氧基-乙酰基)胍

包含结构

的N-苯甲酰基-N’-肉桂酰基胍

包含结构的[(E)-3-(4-二甲基氨基苯基)-2-甲基丙烯酰基]胍

包含结构

的(4-氯肉桂酰基)胍

包含结构

的(4-溴肉桂酰基)胍

包含结构

的(4-甲氧基肉桂酰基)胍

包含结构

的(5-苯基-戊-2，4-二烯酰基)胍

包含结构

的(3-溴肉桂酰基)胍

包含结构

的(3-甲氧基肉桂酰基)胍

包含结构

的(3-氯肉桂酰基)胍

包含结构的(2-氯肉桂酰基)胍

包含结构

的(2-溴肉桂酰基)胍

包含结构

的(2-甲氧基肉桂酰基)胍

包含结构

的(反式-2-苯基环丙烷羰基)胍

包含结构

的[3-(3-吡啶基)丙烯酰基]胍

包含结构

的(4-羟基肉桂酰基)胍

包含结构

的(喹啉-2-羰基)胍

包含结构

的(4-硝基肉桂酰基)胍

包含结构

的(3-硝基肉桂酰基)胍

包含结构

的(2-硝基肉桂酰基)胍

包含结构

的(α-甲基肉桂酰基)胍

包含结构

的反式-3-(1-萘基)丙烯酰基胍

包含结构的4-苯基肉桂酰基胍

包含结构

的3-(三氟甲基)肉桂酰基胍

包含结构

的3-甲基肉桂酰基胍

包含结构

的4-(三氟甲基)肉桂酰基胍

包含结构

的2-甲基肉桂酰基胍

包含结构

的2-(三氟甲基)肉桂酰基胍

包含结构

的4-甲基肉桂酰基胍

包含结构

的4-异丙基肉桂酰基胍

包含结构

的3-氟肉桂酰基胍

包含结构

的2-氟肉桂酰基胍

包含结构

的4-氟肉桂酰基胍

包含结构

的3，4-二氯肉桂酰基胍

包含结构

的2，4-二氯肉桂酰基胍

包含结构

的2，6-二氯肉桂酰基胍

包含结构

的4-乙氧基肉桂酰基胍

包含结构

的3，4-(亚甲二氧基)肉桂酰基胍

包含结构

的3-(2-萘基)丙烯酰基胍

包含结构

的4-叔-丁基肉桂酰基胍

包含结构

的3，4，5-三甲氧基肉桂酰基胍

包含结构的2-(1-萘基)乙酰基胍

包含结构

的2，5-二甲基肉桂酰基胍

包含结构的2，3-二氟肉桂酰基胍

包含结构

的3-苯基肉桂酰基胍

包含结构

的3-(反式-庚-1-烯-1-基)肉桂酰基胍

包含结构

的2-乙基肉桂酰基胍

包含结构的2-氯-6-氟肉桂酰基胍

包含结构的3-叔-丁基肉桂酰基胍

包含结构

的3，4-二氟肉桂酰基胍

包含结构

的5-溴-2-氟肉桂酰基胍

包含结构

的3-(三氟甲氧基)肉桂酰基胍

包含结构

的2-乙氧基肉桂酰基胍

包含结构

的2-叔-丁基肉桂酰基胍

包含结构

的3-(环己-1-烯-1-基)肉桂酰基胍

包含结构

的肉桂酰基胍盐酸盐

包含结构

的2，3，5，6-四甲基肉桂酰基胍(Bit 134)

包含结构

的2-环己基肉桂酰基胍

包含结构

的5-溴-2-甲氧基肉桂酰基胍

包含结构

的2，3-二甲基肉桂酰基胍

包含结构

的3-乙氧基肉桂酰基胍

包含结构的3-异丙基肉桂酰基胍

包含结构

的2-苯基肉桂酰基胍

包含结构

的2-(环己-1-烯-1基)肉桂酰基胍

包含结构

的2，4，6-三甲基肉桂酰基胍

包含结构的(5-苯基-戊-2，4-二烯酰基)胍

包含结构

的5-(3’-溴苯基)戊-2，4-二烯酰基胍

包含结构

的5-(2’-溴苯基)戊-2，4-二烯酰基胍

包含结构

的呋喃丙烯酰基胍。

优选地，本发明的化合物能够降低、延缓或抑制病毒生长和/或复制。

优选地，本发明化合物的抗病毒活性是针对病毒，例如属于慢病毒家族和冠状病毒家族的那些病毒。例如，本发明的化合物显示出针对病毒，例如人免疫缺陷病毒(HIV)、严重急性呼吸综合征病毒(SARS)、小鼠肝炎病毒(MHV)、和丙型肝炎病毒(HCV)的活性。

根据本发明的第四方面，提供了包含根据第一、第二或第三方面的任意一项的抗病毒化合物及任选一种或多种药学可接受的载体或衍生物的药物组合物，其中所述化合物能够降低、延缓或抑制病毒生长和/或复制。

优选地，本发明化合物的抗病毒活性是针对病毒，例如那些属于慢病毒家族和冠状病毒家族的那些病毒。例如，本发明的化合物显示出针对病毒，例如人免疫缺陷病毒(HIV)、严重急性呼吸综合征病毒(SARS)、人冠状病毒229E、人冠状病毒OC43、小鼠肝炎病毒(MHV)、牛冠状病毒(BCV)、猪呼吸冠状病毒(PRCV)、丙型肝炎病毒(HCV)和马动脉炎病毒(EAV)的抗病毒活性。

可通过本发明的化合物来抑制或治疗其感染的其它冠状病毒是列于表1中的那些病毒。

本发明的组合物可进一步包含一种或多种已知的抗病毒化合物或分子。

根据第五方面，提供了用于降低、延缓或抑制病毒生长和/或复制的方法，其包含用根据第一、第二或第三方面中任意一项的化合物来接触受所述病毒感染或暴露于所述病毒的细胞。

优选地，病毒来自慢病毒家族或冠状病毒家族。更优选地，所述病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)、严重急性呼吸综合征病毒(SARS)、人冠状病毒229E、人冠状病毒OC43、小鼠肝炎病毒(MHV)、牛冠状病毒(BCV)、猪呼吸冠状病毒(PRCV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、丙型肝炎病毒(HCV)或马动脉炎病毒(EAV)。最优选地，病毒是HIV-1、HIV-2、SARS病毒、冠状病毒229E、冠状病毒OC43、PRCV、BCV、HCV或EAV。

根据第六方面，提供了用于预防暴露于病毒的细胞感染的方法，其包含用根据第一、第二或第三方面中任意一项的化合物来接触所述细胞。

优选地，病毒来自慢病毒家族或冠状病毒家族。更优选地，病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)、严重急性呼吸综合征病毒(SARS)、人冠状病毒229E、人冠状病毒OC43、小鼠肝炎病毒(MHV)、牛冠状病毒(BCV)、猪呼吸冠状病毒(PRCV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、丙型肝炎病毒(HCV)或马动脉炎病毒(EAV)。最优选地，病毒是HIV-1、HIV-2、SARS病毒、冠状病毒229E、冠状病毒OC43、PRCV、BCV、HCV或EAV。

根据本发明的第七方面，提供了用于受病毒感染或暴露于病毒的受试者的治疗性或预防性治疗的方法，其包含对需要所述治疗的受试者施用根据第一、第二或第三方面的任意一项的化合物。

优选地，病毒的感染或暴露于病毒发生于属于慢病毒家族或冠状病毒家族的病毒。更优选地，感染或暴露发生于HIV、SARS、人冠状病毒229E、人冠状病毒OC43、小鼠肝炎病毒(MHV)、牛冠状病毒(BCV)、猪呼吸冠状病毒(PRCV)、丙型肝炎病毒(HCV)、或马动脉炎病毒(EAV)。最优选地，感染或暴露发生于HIV-1、HIV-2、SARS、人冠状病毒229E、人冠状病毒OC43、丙型肝炎病毒(HCV)或马动脉炎病毒(EAV)。

病毒抑制的受试者通常是哺乳动物，例如但不限于人、灵长类、家畜动物(例如，绵羊、奶牛、马、驴、猪)、陪伴动物(例如，狗、猫)、实验室试验动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)、俘获的野生动物(例如，狐狸、鹿)。优选地，受试者是灵长类或马。最优选地，受试者是人。

根据第八方面，提供了下调受病毒感染的细胞中膜离子通道的功能活性的方法，其包含用根据第一、第二或第三方面中的任意一项的化合物接触所述细胞。

膜离子通道可为细胞内源或细胞外源的。

优选地，功能活性受到下调的膜离子通道是慢病毒和冠状病毒用于介导病毒复制的膜离子通道，并其包括，例如，HIV膜离子通道Vpu、HCV膜离子通道P7、冠状病毒E蛋白质膜离子通道、和SARS E蛋白质膜离子通道。

根据本发明的第九方面，提供了降低、延缓或抑制已感染细胞的病毒的生长和/或复制的方法，所述方法包含用根据第一、第二或第三方面中任意一项的化合物接触所述受感染的细胞，其中所述化合物下调来自所述病毒并表达于所述受感染的细胞的膜离子通道的功能活性。

优选地，感染发生于属于慢病毒家族或冠状病毒家族的病毒。更优选地，感染或暴露发生于HIV、SARS、人冠状病毒229E、人冠状病毒OC43、小鼠肝炎病毒(MHV)、牛冠状病毒(BCV)、猪呼吸冠状病毒(PRCV)、丙型肝炎病毒(HCV)、或马动脉炎病毒(EAV)。最优选地，感染或暴露发生于HIV-1、HIV-2、SARS、人冠状病毒229E、人冠状病毒OC43、丙型肝炎病毒(HCV)或马动脉炎病毒(EAV)。

优选地，功能活性受到下调的膜离子通道是慢病毒和冠状病毒用于介导病毒复制的膜离子通道，并包括，例如，HIV膜离子通道Vpu、HCV膜离子通道P7、冠状病毒E蛋白质膜离子通道。

根据第十方面，本发明提供了降低、延缓或抑制哺乳动物中已感染细胞的病毒的生长和/或复制的方法，所述方法包含对所述哺乳动物施用根据第一、第二或第三方面的任意一项的化合物，或根据第四方面的药物组合物，其中所述化合物或所述组合物下调表达于所述受感染细胞中的膜离子通道的功能活性。

优选地，功能活性受到下调的膜离子通道是慢病毒和冠状病毒用于介导病毒复制的膜离子通道，并包括，例如，HIV膜离子通道Vpu、HCV膜离子通道P7、和冠状病毒E蛋白质膜离子通道。

病毒抑制的受试者通常是哺乳动物，例如但不限于人、灵长类、家畜动物(例如绵羊、奶牛、马、驴、猪)、陪伴动物(例如狗、猫)、实验室试验动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)、俘获的野生动物(例如，狐狸、鹿)。优选地，受试者是灵长类或马。最优选地，受试者是人。

根据第十一方面，本发明提供了用于受病毒感染或暴露于病毒的受试者的治疗性或预防性治疗的方法，其包含对所述受试者施用根据第一、第二或第三方面的任意一项的化合物，或根据第四方面的药物组合物，其中所述化合物或所述组合物下调来自所述病毒的膜离子通道的功能活性。

根据第十二方面，本发明提供了选自：

N-(3，5-二氨基-6-氯-吡嗪-2-羰基)-N’-苯基-胍、

N-苯甲基-N’-(3，5-二氨基-6-氯-吡嗪-2-羰基)-胍、

3’4二氯benzamil、

2’4二氯benzamil、

5-(N-甲基-N-胍基羰基-甲基)氨氯吡咪、

5-(N-甲基-N-异丁基)氨氯吡咪、

5-(N-乙基-N-异丙基)氨氯吡咪、

5-(N，N-二甲基)氨氯吡咪盐酸盐、

5-(N，N-亚己基)氨氯吡咪、

5-(N，N-二乙基)氨氯吡咪盐酸盐、

6-碘代氨氯吡咪、

Bodipy-FL氨氯吡咪、

3-羟基-5-亚己基亚氨基-氨氯吡咪、

5-(4-氟苯基)氨氯吡咪、

5-叔-丁基氨基-氨氯吡咪、

N-脒基-3-氨基-5-苯基-6-氯-2-吡嗪甲酰胺、

3-甲氧基-5-(N，N-亚己基)-氨氯吡咪、

3-甲氧基-氨氯吡咪、

亚己基亚氨基-6-苯基-2-吡嗪甲酰胺、

N-脒基-3，5-二氨基-6-苯基-2-吡嗪甲酰胺、

1-萘甲酰基胍、

2-萘甲酰基胍、

N-(2-萘甲酰基)-N’-苯基胍、

N，N’-双(2-萘甲酰基)胍、

N，N’-双(1-萘甲酰基)胍、

N，N’-双(2-萘甲酰基)-N”-苯基胍、

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

3-喹啉甲酰基胍、

肉桂酰基胍、

4-苯基苯甲酰基胍、

N-(肉桂酰基)-N’苯基胍、

(3-苯基丙酰基)胍、

N，N’-双-(肉桂酰基)-N”-苯基胍、

N-(3-苯基丙酰基)-N’-苯基胍、

N，N’-双(3-苯基丙酰基)-N”-苯基胍、

反式-3-呋喃丙烯酰基胍、

N-(6-羟基-2-萘甲酰基)-N’-苯基胍、

(4-苯氧基苯甲酰基)胍、

N，N’-双(脒基)萘-2，6-二甲酰胺、

N”-肉桂酰基-N，N’-二苯基胍、

(苯乙酰基)胍、

N，N’-双(3-苯基丙酰基)胍、

苯甲酰基胍、

(4-氯苯氧基-乙酰基)胍、

N-苯甲酰基-N’-肉桂酰基胍、

[(E)-3-(4-二甲基氨基苯基)-2-甲基丙烯酰基]胍、

(4-氯肉桂酰基)胍、

(4-溴肉桂酰基)胍、

(4-甲氧基肉桂酰基)胍、

(5-苯基-戊-2，4-二烯酰基)胍、

(3-溴肉桂酰基)胍、

(3-甲氧基肉桂酰基)胍、

(3-氯肉桂酰基)胍、

(2-氯肉桂酰基)胍、

(2-溴肉桂酰基)胍、

(2-甲氧基肉桂酰基)胍、

(反式-2-苯基环丙烷羰基)胍、

[3-(3-吡啶基)丙烯酰基]胍、

(4-羟基肉桂酰基)胍、

(喹啉-2-羰基)胍

的抗病毒化合物，或其药学上可接受的盐。

根据第十三方面，本发明提供了药物组合物，其包含根据第十二方面的化合物，和任选一种或多种药学可接受的载体或衍生物。

优选地，药物组合物可以还包含一种或多种已知的抗病毒化合物或分子。

除非上下文清楚地要求，否则，说明书和权利要求书全文中，单词“包含”等等将以包括的含义来理解，而不是以排他性或穷尽性含义理解；即，以“包括，但不限于”的含义理解。

附图简述

图1是用于在大肠杆菌(E.coli)中表达Vpu的质粒的图示。A.由vpu可读框(ORF)编码的氨基酸序列(<400>1)，所述可读框通过PCR从HIV-1株HXB2 cDNA克隆产生。将vpu ORF克隆进位于p2GEX中的GST基因3’端的框中以产生p2GEXVpu(B)。随后将其克隆进入pPL451以产生质粒pPL+Vpu(C)。

图2是大肠杆菌中Vpu的表达和纯化的照片显示。A.将SDS-PAGE后的蛋白质印迹法用于检测大肠杆菌提取物中所表达的Vpu。泳道1-4含有自p2GEXVpu表达的Vpu的处于不同阶段纯度的样品。泳道1，通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析分离的GST-Vpu融合蛋白质；泳道2，通过凝血酶处理而释放自融合蛋白质的Vpu；泳道3，通过HPLC阴离子交换层析纯化的Vpu；泳道4，穿过免疫亲和柱后的Vpu；泳道5和6，从42℃诱导的分别含有pPL+Vpu或pPL451的细胞制备的膜囊。B.银染的SDS-PAGE凝胶；泳道1，通过HPLC阴离子交换层析纯化的Vpu；泳道2，穿过免疫亲和柱后的Vpu。

图3是将脂双层暴露于包含纯化的Vpu的等分试样后，所观察到的离子通道活性的图示。在A和B中，CIS小室包含500mM NaCl且TRANS小室包含50mM NaCl；两种溶液都用10mM MES缓冲至pH6.0。B显示了电流对电压的曲线，其产生自类似于A中所示的数据。

图4是细菌互养试验的照片显示。对于所有平板，使用Met^-，Pro^-营养缺陷型菌株接种软琼脂覆层。平板A和B含有减去脯氨酸的极限撤除成分(drop-out)培养基；平板C中培养基减去甲硫氨酸。为控制背景菌苔中细胞的生存力，标记为P和M的盘(discs)分别含有添加的脯氨酸或甲硫氨酸。标记C和V的盘用分别含有质粒pPL451或pPL+Vpu的Met⁺，Pro⁺大肠杆菌细胞接种。在37℃(A和C)或30℃(B)下将平板孵育两天，并使用来自位于平板下的荧光灯的周围照明在黑色背景上拍照。在Novaline视频凝胶文件系统上记录图像。在所有平板上标记P或M的盘周围和平板A上标记V的盘周围的光晕显示了背景菌苔菌株的生长。

图5是对于可能的Vpu通道阻断剂的药物筛选的图示。照片显示了基本培养基(缺少腺嘌呤)琼脂糖平板的剖面，在所述平板上接种了含有Vpu表达质粒pPLVpu的XL-I-blue大肠杆菌的菌苔。数字6-11位于所测试的多种药物的应用位置，所述药物以3μl滴使用并允许渗透入琼脂糖。然后在拍照前将平板在37℃孵育48小时。背景灰色阴影相应于无细菌生长的区域。“10”周围明亮的环形区域代表由于在该位置应用腺嘌呤引起的细菌细胞生长(阳性对照)。“9”周围细菌生长的较小晕圈是由于在该位置应用5-(N，N-亚己基)-氨氯吡咪。

图6.将脂双层暴露于3-10μg E蛋白质后，在NaCl溶液中所观察到的SARS E蛋白质离子通道活性。A.关闭状态显示为实线，开放状态是从此线的衍生物(derivations)。比例尺(scale bar)是300ms和5pA。CIS小室含有在pH7.2的5mM HEPES缓冲液中的50mM NaCl，TRANS小室含有在pH7.2的5mM HEPES缓冲液中的500mM NaCl。将CIS小室接地，并将TRANS小室保持在从-100至+100mV间的不同电压下。B.单个离子通道的最大的单一开放事件(single opening events)。

图7.将脂双层暴露于3-10μg E蛋白质后，在NaCl溶液中所观察到的SARS E蛋白质离子通道活性。A.关闭状态显示为实线，开放状态是从此线的衍生物(derivations)。尺度杆(scale bar)是300ms和5pA。CIS小室含有在pH7.2的5mM HEPES缓冲液中的50mM NaCl，TRANS小室含有在pH7.2的5mM HEPES缓冲液中的500mM NaCl。将CIS小室接地，并将TRANS小室维持在从-100至+100mV间的不同电压下。B.单个离子通道的最大的单次开放事件。

图8.肉桂酰基胍(Bit036)抑制NaCl溶液中的SARS E蛋白质离子通道活性。A.在-40mV的维持电压下的代表性电流。比例尺是300mS和5pA。在添加100μM Bit036后E蛋白质离子通道活性和E蛋白质通道活性。B.在-40mV的维持电压下的所有点柱形图。添加100μM Bit036之前和之后的E蛋白质离子通道活性。C.在E蛋白质离子通道形成之前、E蛋白质离子通道活性和添加100μM Bit036之后的平均电流(pA)。

图9.KCl溶液中的脂双层中的229E E蛋白质离子通道活性。

图10：A部分显示在平面脂双层中由229E-E蛋白质离子通道产生的原始电流。上方迹线显示在加入药物前的电流活性，而下方迹线显示加入100μM肉桂酰基胍对通道活性的影响。B部分是在添加肉桂酰基胍之前和之后，流经双层的平均电流的图示(以任意单位)。

图11：在脂双层NaCl溶液中的MHV E蛋白质离子通道活性。

图12：A部分显示由平面脂双层中的MHV-E蛋白质离子通道产生的原始电流。上方迹线显示在加入药物前的电流活性，而下方迹线显示加入100μM肉桂酰基胍对通道活性的影响。B部分是在添加肉桂酰基胍之前和之后，流经双层的平均电流的图示(以任意单位)。

发明详述

本发明是部分基于令人惊奇的确定——某些归入经取代的酰基胍分类的化合物具有针对来自一系列不同病毒家族的病毒的抗病毒活性。无意被任意特定的理论或作用机制束缚，本发明的化合物对病毒复制的负面影响可能通过抑制或下调病毒复制所依赖的膜离子通道来介导。此膜离子通道可为病毒膜离子通道(对于宿主细胞是外源性的)或由于病毒感染所诱导的宿主细胞离子通道(对于宿主细胞是内源性的)。

SARS病毒编码E蛋白质，所述蛋白质由本发明人首次表明用作离子通道。由于类似的E蛋白质存在于其它冠状病毒中，所以本发明的化合物、组合物和方法在抑制和/或治疗其它冠状病毒的感染中将具有效用。

虽然本发明涉及归入经取代的酰基胍的分类的新型抗病毒化合物，但在其范围内不包括使用化合物5-(N，N-亚己基)-氨氯吡咪和5-(N，N-二甲基)-氨氯吡咪延缓、降低或抑制HIV的病毒生长和/或功能活性。

本领域的技术人员可以理解，本发明的化合物可以组合物或制剂的形式施用，所述组合物或制剂包含药学上可接受的载体和赋形剂。

本发明的药物组合物可以还包含一种或多种已知的抗病毒化合物或分子。优选地，已知的抗病毒化合物选自阿糖腺苷、无环鸟苷、更昔洛韦、瓦更昔洛韦、伐昔洛韦、西多福韦、泛昔洛韦、三氮唑核苷、金刚胺、金刚乙胺、干扰素、奥塞米韦、帕利珠单抗、金刚乙胺、扎那米韦、核苷类似物逆转录酶抑制剂(NRTI)，例如叠氮胸苷、地达诺新、扎西他滨、司他夫定、拉米夫定和阿巴卡韦，非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)，例如奈韦拉平、地拉夫定和依法韦仑，蛋白酶抑制剂，例如沙奎那韦、利托那韦、印地那韦、那非那韦、安泼那韦，及其它已知的抗病毒化合物和制剂。已知的抗病毒化合物或分子可在一些情况下与本发明的抗病毒化合物协同作用。

表1已知的冠状病毒分离物

第1组种类
	犬冠状病毒
犬肠道冠状病毒(株INSAVC-1)
	犬肠道冠状病毒(株K378)
猫冠状病毒
	猫肠道冠状病毒(株79-1863)
猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)
	人冠状病毒229E
猪流行性腹泻病毒
	猪流行性腹泻病毒(株Br1/87)
猪流行性腹泻病毒(株CV777)
	传染性肠胃炎病毒
猪呼吸冠状病毒
	猪传染性肠胃炎冠状病毒(株FS772/70)
猪传染性肠胃炎冠状病毒(株Miller)
	猪传染性肠胃炎冠状病毒(株Neb72-RT)
猪传染性肠胃炎冠状病毒(株PURDUE)
	第2组种类
牛冠状病毒
	牛冠状病毒(株F15)
牛冠状病毒(株G95)
	牛冠状病毒(株L9)
牛冠状病毒(株LSU-94LSS-051)
	牛冠状病毒(株LY-138)
牛冠状病毒(株MEBUS)
	牛冠状病毒(株OK-0514-3)
牛冠状病毒(株Ontario)
	牛冠状病毒(株QUEBEC)

牛冠状病毒(株VACCINE)
	牛肠道冠状病毒(株98TXSF-110-ENT)
犬呼吸冠状病毒
	鸡肠道冠状病毒
人冠状病毒OC43
	鼠肝炎病毒
鼠冠状病毒(株DVIM)
	鼠肝炎病毒(株A59)
鼠肝炎病毒(株JHM)
	鼠肝炎病毒(株S)
鼠肝炎病毒株1
	鼠肝炎病毒株2
鼠肝炎病毒株3
	鼠肝炎病毒株4
鼠肝炎病毒株ML-11
	猪血凝脑脊髓炎病毒
猪血凝脑脊髓炎病毒(株67N)
	猪血凝脑脊髓炎病毒(株IAF-404)
Puffinosis病毒
	大鼠冠状病毒
大鼠冠状病毒(株681)
	大鼠冠状病毒(株NJ)
大鼠sialodacryoadenitis冠状病毒
	第3组种类
火鸡冠状病毒
	火鸡冠状病毒(株Indiana)
火鸡冠状病毒(株Minnesota)
	火鸡冠状病毒(株NC95)
鸟传染性支气管炎病毒
	鸟传染性支气管炎病毒(株6/82)
鸟传染性支气管炎病毒(株Arkansas99)

鸟传染性支气管炎病毒(株Beaudette CK)
	鸟传染性支气管炎病毒(株Beaudette M42)
鸟传染性支气管炎病毒(株Beaudette US)
	鸟传染性支气管炎病毒(株Beaudette)
鸟传染性支气管炎病毒(株D1466)
	鸟传染性支气管炎病毒(株D274)
鸟传染性支气管炎病毒(株D3896)
	鸟传染性支气管炎病毒(株D41)
鸟传染性支气管炎病毒(株DE072)
	鸟传染性支气管炎病毒(株GRAY)
鸟传染性支气管炎病毒(株H120)
	鸟传染性支气管炎病毒(株H52)
鸟传染性支气管炎病毒(株KB8523)
	鸟传染性支气管炎病毒(株M41)
鸟传染性支气管炎病毒(株PORTUGAL/322/82)
	鸟传染性支气管炎病毒(株SAIB20)
鸟传染性支气管炎病毒(株UK/123/82)
	鸟传染性支气管炎病毒(株UK/142/86)
鸟传染性支气管炎病毒(株UK/167/84)
	鸟传染性支气管炎病毒(株UK/183/66)
鸟传染性支气管炎病毒(株UK/68/84)
	鸟传染性支气管炎病毒(株V18/91)
鸟传染性支气管炎病毒(株Vic S)
	鸟传染性喉气管炎病毒
初步的第4组种类
	SARS冠状病毒
SARS冠状病毒Beijing ZY-2003
	SARS冠状病毒BJ01
SARS冠状病毒BJ02
	SARS冠状病毒BJ03
SARS冠状病毒BJ04

SARS冠状病毒CUHK-Su10
	SARS冠状病毒CUHK-W1
SARS冠状病毒Frankfurt1
	SARS冠状病毒GZ01
SARS冠状病毒HKU-39849
	SARS冠状病毒Hong Kong ZY-2003
SARS冠状病毒Hong Kong/03/2003
	SARS冠状病毒HSR1
SARS冠状病毒Sin2500
	SARS冠状病毒Sin2677
SARS冠状病毒Sin2679
	SARS冠状病毒Sin2748
SARS冠状病毒Sin2774
	SARS冠状病毒Taiwan
SARS冠状病毒Taiwan JC-2003
	SARS冠状病毒Taiwan TC1
SARS冠状病毒Taiwan TC2
	SARS冠状病毒Tor2
SARS冠状病毒TW1
	SARS冠状病毒TWC
SARS冠状病毒Urbani
	SARS冠状病毒Vietnam
SARS冠状病毒ZJ-HZ01
	SARS冠状病毒ZJ01
未归类的冠状病毒
	牛呼吸冠状病毒(株98TXSF-110-LUN)
人肠道冠状病毒4408
	肠道冠状病毒
马冠状病毒
	马冠状病毒NC99

本观察和发现现在允许使用诸如某些经取代的酰基胍的活性剂作为抗病毒剂用于治疗和预防由不同病毒引起的病毒状况。本发明的方法和组合物可对依赖离子通道形成来进行复制的病毒尤其有效，然而可以理解这不是病毒复制所依赖的唯一机制，且本发明的化合物和方法不限于通过延缓或抑制离子通道的功能来发挥其作用的活性剂。

对“膜离子通道”的参考应当理解为对运输离子穿过膜的结构参考。本发明延伸至可通过例如被动、渗透、主动或交换运输来起作用的离子通道。离子通道可通过胞内或胞外方式形成。例如，离子通道可以是细胞为促进其正常机能而自然形成的离子通道。备选地，离子通道可通过胞外方式形成。胞外方式包括，例如，由于引入的化学药品、药物或其它活性剂例如离子载体，或者由于进入细胞的病毒所编码的病毒蛋白质的功能活性引起形成离子通道。

作为本发明某些实施方案的主题的离子通道方便离子跨膜运输。所述膜可为任意膜并且不限于外部的细胞壁质膜。因此，此处所用的“膜”包含围绕任意细胞器(，例如高尔基体和内质网)的膜、外部细胞膜、围绕任意位于细胞内部的外来抗原的膜(例如，病毒被膜)或者位于胞外的外来有机体的膜。膜通常但不是必需地由流动脂双层组成。主题离子通道可为任意结构。例如，Vpu离子通道由Vpu形成，所述Vpu是由HIV-1编码的整合膜蛋白质，其与例如受感染细胞的高尔基体和内质网膜相结合。下文中涉及的“Vpu离子通道”是涉及所有相关的离子通道，例如P7 HCV、流感的M2等等。

涉及“HIV”、“SARS”、“冠状病毒”或“HCV”应当理解为涉及任意HIV、SARS、冠状病毒或HCV病毒株并包括同源物或突变体。

涉及离子通道的“功能活性”应当理解为涉及离子通道完成或参与的任意一种或多种功能。例如，编码离子通道的Vpu蛋白质，除了促进Na⁺、K⁺、Cl^-和PO₄ ^3-的运输，还在内质网内CD4分子的降解中发挥作用。无意被特定理论束缚，也认为Vpu蛋白质编码的离子通道在调节HIV生活周期中发挥作用。本发明不限于通过抑制HIV生活周期尤其是HIV复制的机制来治疗HIV感染。相反，应当将本发明理解为包含任意机制，通过所述机制本发明的化合物发挥其抗病毒活性并可以包括HIV生存力或功能活性的抑制。这也适用于HCV、冠状病毒和其它病毒。

涉及病毒的“功能活性”应当理解为涉及病毒完成或参与的任意一种或多种功能。

涉及“病毒复制”应当理解为包括病毒生活周期的任意一个或多个阶段或方面，例如抑制病毒体的装配或释放。病毒复制的离子通道介导可通过直接的或间接的方式。如果离子通道与处于生活周期的任意一个或多个阶段的病毒体直接相互作用，那么所述离子通道介导是通过直接方式。如果它与除病毒体之外的分子相互作用，其中所述其它分子直接或间接调节病毒生活周期的任意一个或多个方面或阶段，那么所述离子通道介导是间接的。因此，本发明的方法包含通过级联步骤的诱导来介导病毒复制，所述步骤导致病毒生活周期的任意一个或多个方面或阶段的介导。

涉及“下调”离子通道功能活性应当理解为涉及通过直接和间接机制部分或完全地抑制所述活性的任意一个或多个方面。例如，合适的活性剂可直接与离子通道相互作用来防止病毒的复制或，备选地，可间接作用，例如通过与不同于离子通道的分子相互作用来防止所述复制。另外的备选方案是所述其它分子与离子通道相互作用并抑制离子通道的活性。

可通过此处所述的系列方法完成具有抗病毒活性的分子的筛选。

涉及病毒感染的“细胞”应当理解为涉及已由病毒感染的任意原核或真核细胞。这包括，例如，永生的或原代细胞系、细菌培养物和原位细胞。在抗病毒化合物的合适的筛选系统中，优选的受感染细胞是由HIV或HCV分别感染的巨噬细胞/单核细胞或肝细胞/淋巴样细胞。

不将本发明限制于任意一种理论或作用模式，认为本发明的化合物通过促进离子通道即HIV的VPU、SARS和其它冠状病毒的E蛋白质或HCV的P7变成封闭的，来抑制病毒复制或病毒体从细胞的释放。本发明包含抗病毒化合物，其是经取代的酰基胍。

本发明也包括化合物5-(N，N-亚己基)-氨氯吡咪和5-(N，N-二甲基)-氨氯吡咪在控制除HIV外的病毒的复制和/或生长方面的用途。

病毒抑制的受试者一般为哺乳动物，例如但不限于人、灵长类、家畜动物(例如，绵羊、奶牛、马、驴、猪)、陪伴动物(例如，狗、猫)、实验室试验动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)、俘获的野生动物(例如，狐狸、鹿)。优选地，受试者是人或灵长类。最优选地，受试者是人。

本发明的方法在治疗和预防病毒感染例如，但不限于HIV感染、HCV感染和其它病毒感染中是有用的。例如，可以在已知的受HIV感染的受试者中实现抗病毒活性以便阻止HIV的复制从而预防AIDS的发作。备选地，本发明的方法可用于降低血清病毒负荷或减轻病毒感染症状。类似地，可以在已知的受例如HCV感染的受试者中实现抗病毒治疗以便阻止HCV的复制，从而预防进一步的肝细胞涉及和最终肝组织的变性。

本发明的方法可尤其用于病毒感染的早期以防止受感染细胞中病毒储蓄泡的形成，或者可作为预防性治疗在暴露至病毒的可能来源即刻之前或暴露一段时间后使用。

此处涉及的“治疗的”和“预防的”是在最广泛的上下文中来考虑的。术语“治疗的”不一定暗示着哺乳动物经治疗直至完全痊愈。类似地，“预防的”不一定意味着受试者将不会最终感染疾病病症。因此，治疗和预防包括特定病症的症状的改善或者防止或降低发展特定病症的危险。可将术语“预防”认为是减小特定病症发作的严重性。治疗也可降低现有病症的严重性或急性发作的频率。

根据本发明的方法，多于一种化合物或组合物可与一种或多种其它化合物例如已知的抗病毒化合物或分子共同施用。“共同施用”意指经相同或不同途径在同一制剂中或在两种不同的制剂中同时施用，或者通过同样或不同途径顺序施用。通过“顺序”施用意指在两种或更多分离的化合物之间的秒、分钟、小时或天的时间差别。主题抗病毒化合物可以以任意顺序施用。

施用的途径包括但不限于静脉内、腹膜内、皮下、颅内、皮内、肌内、眼内、鞘内、脑内、鼻内、透粘膜、通过注入、经口、直肠、经静脉内滴注、贴剂和植入。静脉内途径是特别优选的。

适于注射使用的组合物包括无菌水溶液(水溶的)和用于临时制备无菌可注射溶液的无菌粉剂。载体可为溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇，等等)、其合适的混合物和植物油。对微生物作用的防止可通过多种抗细菌和抗真菌剂来产生，所述抗细菌和抗真菌剂为例如对羟苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等等。在许多情况下，它优选地包括等渗剂，例如，糖或氯化钠。通过在组合物中使用延缓吸收的试剂例如一硬脂酸铝和明胶，可引起注射组合物的延长吸收。

无菌注射溶液剂是通过将所需量的活性化合物与(如果需要)上面列举的多种其它成分在合适溶剂中混合，然后，例如过滤除菌或通过其它合适的方式灭菌来制备的。分散体(dispersion)也是预期的，这些可通过将多种无菌活性成分掺入无菌赋形物(vehicle)来制备，所述赋形物包含基本分散介质和来自那些上面列举的所需的其它成分。至于用于制备无菌注射溶液剂的无菌粉剂，优选的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分加上来自先前无菌过滤的溶液的任意另外所希望的成分。

当活性成分经适当保护时，它们可经口施用，例如，利用惰性稀释剂或利用可同化的可食用载体，或者可将它封入硬或软壳明胶胶囊，或者将它压制成片剂。对于经口治疗性施用，可将活性化合物与赋形剂混合并以可吸收的片剂、口含片剂、糖锭、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等等的形式使用。此类组合物和制剂应含有至少按重量计0.01％，更优选按重量计0.1％，甚至更优选按重量计1％的活性化合物。组合物和制剂的百分率当然可以改变，并且可以便利地在单位重量的约1至约99％，更优选地约2至约90％，甚至更优选地约5至约80％。此类药学上可用的组合物中活性化合物的量为使得将获得合适的剂量。制备根据本发明的优选的组合物或制剂从而经口剂量单位形式含有约0.1ng到2000mg的活性化合物。

片剂、糖锭、丸剂、胶囊剂等等也可含有此后所列的组分：粘合剂，例如树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等等；润滑剂，例如硬脂酸镁；并且可加入甜味剂，例如蔗糖、乳糖或糖精或者调味剂，例如薄荷、冬青油、或樱桃香料。当剂量单位形式是胶囊剂时，它除上面类型的材料外，还可包含液态载体。多种其它材料可作为包衣存在或修饰剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂、或胶囊剂可用虫胶、糖或二者来包衣。糖浆剂或酏剂可含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、用作防腐剂的甲基和丙基对羟基苯甲酸酯、染料和香料，例如樱桃或桔子香料。用于制备任意剂量单位形式的材料应当是药学纯的且基本上在所使用的量中是无毒的。另外，可将活性化合物掺入持续释放制剂和剂型。

本发明还延伸至适于局部应用的形式，例如霜剂、洗剂和凝胶剂。在此类形式中，需要将抗凝肽进行修饰以允许穿透表面障碍。用于剂量单位形式和局部制剂的方法对于本领域的技术人员是容易从下列文件获得的，例如Pharmaceutical Handbook.A Martingale Companion Volume Ed.Ainley Wade 第十九版 The Pharmaceutical Press，London，

CRC Handbook of Chemistry and Physics Ed.Robert C.Weast Ph D.CRC Press Inc.；Goodman and Gilman ′s；The Pharmacological basis ofTherapeutics.第九版。McGraw Hill；Remington；以及The Science andPractice of Pharmacy.第十九版，Ed.Alfonso R.Gennaro Mack PublishingCo.Easton Pennsylvania.

药学上可接受的载体和/或稀释剂包括任意和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。此类介质和试剂用作药学活性物质的用途在本领域中是众所周知的。除非常规介质或试剂与活性成分是不相容的，否则它在治疗性组合物中的用途是预期的。辅助的活性成分也可掺入组合物中。

以剂量单位形式配制肠胃外组合物对于施用和剂量的均匀性是尤其有利的。此处所用的剂量单位形式指物理上离散单位，其适合作为用于所处理的哺乳动物受试者的单一剂量；每个单位含有经计算用以与所需药物载体相结合来生产预期治疗效应的预定量的活性物质。对本发明新剂量单位形式的详细说明受控于并直接依赖于(a)活性物质的独特特性和所要获得的特定治疗效果以及(b)配料(compounding)领域中所固有的限制。

本发明所预期的有效量依赖于痛苦的严重性和受者的健康以及年龄而不同。在一般条件下，有效量可从0.01ng/kg体重至约100mg/kg体重变动。

备选量包括约0.1ng/kg体重至约100mg/kg体重或者从1.0ng/kg体重至约80mg/kg体重。

病毒抑制的受试者通常为哺乳动物，例如但不限于人、灵长类、家畜动物(例如，绵羊、奶牛、马、驴、猪)、陪伴动物(例如，狗、猫)、实验室试验动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)、俘获的野生动物(例如，狐狸、鹿)。优选地，受试者是人或灵长类。最优选地，受试者是人。

本发明的方法在治疗和预防病毒感染例如，但不限于HIV感染、HCV感染和其它病毒感染中是有用的。例如，可以在已知的受HIV感染的受试者中实现抗病毒活性以便防止HIV的复制从而预防AIDS的发作。备选地，本发明的方法可用于降低血清病毒负荷或减轻病毒感染症状。类似地，可以在已知的受例如HCV感染的受试者中实现抗病毒治疗以便阻止HCV的复制，从而预防进一步的肝细胞涉及和最终肝组织的变性。

本发明现在将参考特定但非限制性实施例来更加详细地描述，所述实施例描述了病毒膜离子通道的研究和抗病毒活性的筛选。一些实施例包括SARS病毒的应用。从此处的描述可以清楚其它慢病毒和冠状病毒以及其它化合物可有效用于本发明的上下文中。然而，可以理解为了例证本发明，单独包括详细描述。决不应该将详细描述理解为对上面给出的本发明的宽泛描述的限制。

实施例1.本发明化合物的合成

如图解1中所示的，本发明的化合物可从相应的酰基氯或甲酯来制备。

两种方法在文献中均有详细描述。

下列实施例显示了本发明的一些化合物的合成图解。

实施例2.从肉桂酸、肉桂酰氯合成肉桂酰基胍

在含有一滴N，N-二甲基甲酰胺的无水苯(30mL)中的反式-肉桂酸(1.50g，10.12mmol)溶液中加入草酰氯(5.14g，40.5mmol)，引起溶液泡腾。回流2小时后，在减压下将溶液蒸发至干燥。将所得固体溶解于无水四氢呋喃(20mL)中并缓慢加入至2M氢氧化钠水溶液(25mL)中的盐酸胍溶液中。在室温下搅拌反应物1小时，然后用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。合并的萃取物通过硫酸镁来干燥并蒸发以产生橙色油。粗制品通过柱层析来纯化。用二氯甲烷中10％至20％甲醇洗脱得到肉桂酰基胍，其为膏状固体(0.829g，43％)。

实施例3.

N-脒基-3-氨基-5-苯基-6-氯-2-吡嗪甲酰胺的合成

第1部分

向四氢呋喃(5mL)/水(10mL)/甲苯(20mL)中的3-氨基-5，6-二氯-2-吡嗪甲酸甲酯(0.444g，2.0mmol)溶液中，加入苯基硼酸(0.536g，4.4mmol)、碳酸钠(0.699g，6.6mmol)和四(三苯基膦)-钯(0)(0.116g，0.10mmol)。在进行6小时回流前，将反应物抽气并用氮气清洗几次。分离有机层并用甲苯(3×20mL)萃取含水层。将合并的有机萃取物用硫酸镁干燥，过滤并在减压下蒸发产生3-氨基-6-氯-5-苯基-2-吡嗪甲酸甲酯，其为黄色固体(0.43g，82％)。

第2部分

在溶解于甲醇(5mL)的钠(0.040g，1.74mmol)溶液中加入盐酸胍(0.258g，2.70mmol)，并将混合物回流30分钟后过滤。向滤液中加入溶于N，N-二甲基甲酰胺(5mL)中的3-氨基-6-氯-5-苯基-2-吡嗪甲酸甲酯(0.264g，1.0mmol)，并将溶液在75℃加热12小时。在减压下除去溶剂并将残留物在硅胶上层析，用1％三乙胺/5％甲醇/二氯甲烷洗脱。将所获得的固体悬浮于氯仿中，过滤并在高真空下干燥至产生N-脒基-3-氨基-5-苯基-6-氯-2-吡嗪甲酰胺，其为黄色固体(0.04g，14％)。

实施例4.

亚己基亚氨基-6-苯基-2-吡嗪甲酰胺的合成

第1部分

在四氢呋喃(50mL)中的3-氨基-5，6-二氯-2-吡嗪甲酸甲酯(1.11g，5.0mmol)中加入六亚甲基亚胺(1.49g，15.0mmol)并将反应物回流1小时。将反应物冷却并经过滤除去固体六亚甲基亚胺盐酸盐。将滤液蒸发并将残留物在硅胶上层析。用二氯甲烷洗脱产生3-氨基-6-氯-5-亚己基亚氨基-2-吡嗪甲酸甲酯，其为米色固体(1.20g，85％)。

第2部分

在二甲亚砜(5mL)中的3-氨基-6-氯-5-亚己基亚氨基-2-吡嗪甲酸甲酯(0.350g，1.23mmol)溶液中加入苯基硼酸(0.166g，1.35mmol)、碳酸钾(0.511g，3.70mmol)和[1，1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(II)-二氯甲烷络合物(0.041g，0.05mmol)。将反应物在90℃下加热16小时后倒入水(50mL)并用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。合并的萃取物用硫酸镁干燥，过滤并蒸发以产生棕色油，其通过在硅胶上层析来纯化。用二氯甲烷随后用10％乙酸乙酯/二氯甲烷洗脱产生3-氨基-5-亚己基亚氨基-6-苯基-2-吡嗪甲酸甲酯，其为黄色固体(0.309g，77％)。

第3部分

在溶于甲醇(8mL)的钠(0.090g，6.17mmol)溶液中加入盐酸胍(0.598g，6.26mmol)，并在过滤后将混合物回流30分钟。向滤液中加入四氢呋喃(10mL)中的3-氨基-5-亚己基亚氨基-6-苯基-2-吡嗪甲酸甲酯(0.310g，0.95mmol)，并将溶液回流72小时。在减压下除去溶剂并将残留物在硅胶上层析。用5％甲醇/二氯甲烷洗脱产生N-脒基-3-氨基-5-亚己基亚氨基-6-苯基-2-吡嗪甲酰胺，其为黄色固体(0.116g，35％)。

实施例5.病毒研究

含有编码多种病毒蛋白质的可读框的重组质粒的构建

通过从母本病毒基因组克隆中PCR扩增，或直接化学合成多核苷酸序列来获得表2中所列的多种病毒蛋白质的互补DNA(cDNA)。例如，编码Vpu(图1a)的可读框是通过PCR从HIV-1基因组(分离物HXB2，McFarlane Burnet Centre，墨尔本，澳大利亚)的NdeI片段的cDNA克隆扩增而来的，如下：选择天然Pfu DNA聚合酶(Stratagene；0.035U//I1)来催化PCR反应以借助酶的校正活性而将可能的PCR引入的错误最小化。5’有义引物

AGTAGGATCCATGCAACCTATACC(<400>2)引入BamHI位点(下划线的)用以与p2GEX(41)中GST基因的3’端克隆在框内。该引物还修复起始密码子(粗体T代替vpu基因的Q，其在HXB2分离物中为苏氨酸密码子)。3’反义引物TCTGGAATTLTACAGATCATCAAC(<400>3)引入EcoR1位点(下划线)至PCR产物的另一端来帮助克隆。在Perkin-Elmer循环变温器内在0.5ml薄壁eppendorf管中94℃45秒，55℃1分钟和72℃1分钟的30个循环之后，将268bp片段纯化，用BamHI和EcoRI消化并连接到经同样两种酶消化制备的p2GEX上。所获得的重组质粒图解于图1b中。利用Applied Biosystems dye-terminator试剂盒，通过循环测序对整个Vpu可读框和BamHI和EcoRI连接位点测序，以验证DNA序列。利用GenScript Corporation(新泽西州，美国)的现有技术方法合成其它cDNAs。适宜时，将密码子序列优化用于细菌、昆虫或哺乳动物细胞中的表达。在合成的cDNAs的5’和3’端掺入限制性内切酶识别位点以促进克隆进入质粒表达载体pcDNA3.1、pFastBac和pPL451，用于分别在哺乳动物、昆虫或细菌细胞中表达所编码的病毒蛋白质。

克隆实验中应用分子生物学的标准技术。例如，为制备用于插入pPL451表达质粒的Vpu可读框，首先用BamHI消化p2GEXVpu，并且在dNTPs存在下用Klenow DNA聚合酶填充5’碱基突出端。然后通过EcoRI消化将Vpu编码片段释放，从琼脂糖凝胶中纯化所述片段并将其连接至已用Hpal和EcoRI消化过的pPL451中。随后蛋白质印迹证实在42℃诱导培养物来失活PR的cI857阻抑物和PL启动子之后，pPLVpu构建体(图1c)表达了Vpu。

表2病毒cDNA或肽序列的来源

靶蛋白质	来源生物	株或序列检索号
			Vpu	HIV-1	株HXB2
SARS-CoV E蛋白质	SARS冠状病毒	P59637
			HCVp7	丙型肝炎病毒H77 1a	NP_751922
MHV-E蛋白质	鼠肝炎病毒	NP_068673
			229E E蛋白质	人冠状病毒229E	NP_073554
登革M蛋白质	1型登革病毒	株Singapore S275/90

实施例6.来自大肠杆菌的重组Vpu的纯化

将含有p2GEXVpu的大肠杆菌菌株XLI-blue细胞在30℃剧烈通气下培养于添加了葡萄糖(6g/L)和氨苄青霉素(50mg/L)的LB培养基中，直至约250克莱特单位的密度，此时加入IPTG至0.01mM的终浓度并继续培养4小时。最终的培养物密度为约280克莱特单位。由于早期实验表明大多数表达的GST-Vpu融合蛋白质结合于细胞碎片和30种膜级分，所以采用Varadhachary和Maloney(Varadhachary和Maloney，1990)的方法来分离渗透破裂的细胞空胞(ghosts)(结合细胞碎片和膜片段)用于最初的纯化步骤。收获细胞，将其洗涤，称重并重悬于含有DTT(1mM)和MgCl₂(10mM)的MTPBS中至10ml/g的湿重。加入溶菌酶(0.3mg/ml；鸡蛋白；Sigma)并在温和搅拌下在冰上孵育30分钟，然后在37℃孵育5分钟。将渗透敏感的细胞以12000g沉淀并重悬于水中至原始体积来裂解细胞。然后利用10×缓冲液原液将悬浮液制成1×MTPBS/DTT，并通过离心来分离空胞并悬浮于MTPBS/DTT，然后向其中顺序加入甘油(至20％wt/vol)和CHAPS(至2％wt/vol)以产生四分之一原始体积的终体积。将此混合物在冰上搅拌1小时，然后以400,000g离心1小时除去不溶物质。通过亲和层析在谷胱甘肽琼脂糖树脂(Sigma)上从去污剂提取物纯化GST-Vpu融合蛋白质。用含有甘油(5％)、DTT(1mM)和CHAPS(0.5％)(缓冲液A)的50mM Tris pH7.5彻底洗涤树脂，然后融合蛋白质的Vpu部分得以释放，并通过带有人凝血酶的珠子(100U/ml；37℃1小时)的50％(v/v)悬浮液处理从树脂结合的GST上洗脱下来。将PMSF(0.5mM)加入到洗脱液中以消除残留的凝血酶活性。在连接倒BioRad HPLC的MA7Q阴离子交换树脂柱上进一步纯化此Vpu级分，并用缓冲液A中的线性NaCl梯度(0-2M)进行洗脱。

如下将Vpu在免疫亲和柱上纯化至均一(如银染凝胶所确定的)：将含有Vpu的HPLC级分在NAP25柱(Pharmacia)上脱盐至缓冲液A中，然后在室温下与抗体琼脂糖珠子混合1小时。彻底洗涤珠子并通过增加盐浓度至2M将Vpu洗脱下来。利用BioRad染料结合测定法将蛋白质定量。

实施例7.大肠杆菌中Vpu的表达与纯化

构建质粒p2GEXVpu(图1)来产生GST和Vpu可读框间的框内基因融合。该系统使得融合至GST C-末端的Vpu多肽的IPTG诱导的表达，并允许通过亲和层析在谷胱甘肽琼脂糖上纯化融合蛋白质。GST-Vpu表达的最佳水平通过在30℃培养培养物至约250-300克莱特单位的细胞密度并用低水平的IPTG(0.01mM)诱导来获得。为纯化GST-Vpu，通过诱导细胞的溶菌酶处理然后低速离心来制备含有细胞碎片和质膜的组合细胞级分。利用两性离子去污剂可将约50％的GST-Vpu蛋白质从该级分中溶解出来。使用谷胱甘肽琼脂糖珠的亲和层析用于富集融合蛋白质，并将凝血酶用于在融合配偶体(partner)间的高亲和力凝血酶位点处切割融合蛋白质，释放Vpu(图2A)。在洗脱自阴离子交换柱的级分中，Vpu是在银染凝胶上可见的主要蛋白质(图2B，泳道1)。最后，在免疫亲和柱上纯化Vpu至表观均一(图2B，泳道2)。与免疫检测的蛋白质相应的蛋白质条带的N末端氨基酸序列(切除自SDS-PAGE凝胶)证实其身份为Vpu。

实施例8.Vpu在磷脂小泡中的重建

通过去污剂稀释方法(New，1990)来制备含有Vpu的脂蛋白体。溶解于氯仿的脂质混合物(PE∶PC∶PS；5∶3∶2；1mg总脂质)在氮气流下干燥并重悬于含有DTT(1mM)的0.1ml磷酸钾缓冲液(50mM，pH 7.4)中。加入含有纯化的Vpu的25μl等分试样，然后加入辛基葡糖苷至终浓度1.25％(wt/vol)。将此混合物在液氮中进行冷冻、解冻和在浴型超声波仪中的超声处理(20-30秒)的三轮循环，然后快速稀释至200体积的磷酸钾缓冲液中。通过在400,000g离心1小时收集脂蛋白体并重悬于约150μl的磷酸缓冲液中。

实施例9.测定Vpu离子通道活性

利用如别处所述的标准技术(Miller，1986；和Piller等人，1996)测定纯化的Vpu其在平面脂双层中诱导通道活性的能力。CIS和TRANS小室中的溶液通过含有约100μl直径的小圆孔的Delrin^TM塑料壁来分离，经过所述小圆孔涂上脂双层得以便形成高电阻的电封条(seal)。双分子层从正-癸烷中的棕榈酰-油酰基-磷脂酰-乙醇胺和棕榈酰-油酰基磷脂酰-胆碱的混合物(8∶2)(Avanti Polar Lipids，Alabaster，Alabama)涂布双层。两小室中的溶液含有MES缓冲液(10mM，pH6.0)，向其中加入了多种NaCl或KCl浓缩液。用Axopatch^TM 200放大器记录电流。可将两小室间的电压控制在+/-200mV之间(TRANS相对于接地的CIS)。将含有Vpu的等分试样作为去污剂溶液或在蛋白质掺入磷脂小泡后加入到CIS小室。搅拌小室直至观察到电流。

实施例10.Vpu在脂双层中形成离子通道

为测定经Vpu的离子通道形成，进行了平面脂双层的重建。当将纯化的重组Vpu的样品(含有7到70ng的蛋白质)加入至双层装置的CIS小室中的1ml缓冲液中时，在2至3分钟不等的搅拌时间后检测到电流波动(图3)。用于观察通道活性的时间约与加入小室的蛋白质的量相关。当对照缓冲液等分试样或对照脂质小泡加入到CIS小室时，未检测到通道。在那些对照实验中可将小室搅拌1小时以上而无通道活性的出现。

实施例11.Vpu通道的性质

利用从5个独立的纯化中制备的Vpu，在超过40个独立实验中观察到通道活性。在不同实验中，电流的幅度在大范围变动，并且，再次似乎大概与所加入的蛋白质量相关。所测定的最小和最大的通道分别具有14pS和280pS的电导。当制备含有Vpu的脂质小泡并融合到双分子层时而不是当加入去污剂溶液中的纯化蛋白质时，通道始终较小。这可能是因为前一方法包括用高浓度的去污剂处理和稀释步骤，其可能帮助大聚集体分解成单体。

电流幅度与电压之间的关系是线性的，并且在含有10倍梯度的NaCl(500mM CIS；50mM TRANS)溶液中的逆转电位是+3OmV(图3B)。当溶液含有KCl代替NaCl时，获得了类似的逆转电位。在使用溶液中NaCl或KCl的5个实验中，在膜的每边上，平均逆转电位是31.0+/-1.2mV(+/-SEM)。这比仅对阳离子选择性渗透的通道所预期的更负。利用Goldman-Hodgkin-Katz方程中的离子活性得到约5.5的P_Na/P_Cl比率，表明通道对氯离子也是可渗透的。尝试通过用磷酸根取代氯离子来降低阴离子电流。当使用Na-磷酸根梯度(150mM Na⁺&100mM磷酸根CIS；15mMNa⁺&10mM磷酸根TRANS，pH6.8)代替NaCl梯度时，逆转电位是37.1+/-0.2(+/-SEM，n＝2)，再一次显示约5的阳离子/阴离子透性。(对于涉及磷酸盐溶液的计算，使用一价和二价阴离子的总活性，并假定两种阴离子是相等通透的)。电流-电压曲线现在呈现出在NaCl溶液中未看到的校正。可以得出结论：由Vpu形成的通道对于Na⁺和K⁺是相等通透的，并且对氯离子以及磷酸根离子也是可通透的(尽管程度较小)。

实施例12.用于筛选潜在离子通道阻断药物的细菌生物测定

该生物测定是基于下述观察，即Vpu在大肠杆菌中的表达导致了定位于质膜上的活性Vpu通道，其消除了跨膜钠梯度。由于此Vpu通道活性，代谢物(它们在细胞内部的积累通过钠依赖性的协同转运蛋白(例如脯氨酸或腺嘌呤)介导)渗出细胞比它们合成的速度更快，因而代谢物的胞内水平变得限制细胞的生长。因此，表达Vpu的大肠杆菌细胞不能生长于缺少腺嘌呤或脯氨酸的极限撤除培养基中。然而，在阻断Vpu通道的药物存在下，细胞再一次能够重新建立其跨膜钠梯度——由于膜中其它离子泵的作用——代谢物渗漏受到阻止，使得可以生长。如下进行实验证实Vpu可在大肠杆菌的质膜中形成钠通道。

为在大肠杆菌中表达非融合的Vpu，将vpu可读框克隆进质粒pPL451中以产生重组质粒pPL-Vpu(图1b)。在此载体中，将强P_L和P_Rλ启动子用于驱动在温度敏感的c1857阻抑物控制下的Vpu表达，这样当培养于30℃时表达受到紧密抑制并可通过提高温度至37℃到42℃来诱导。在琼脂板上，含有pPL-Vpu的细胞在30℃和37℃但不是42℃下时生长，而对照菌株在42℃下生长良好。将含有pPL-Vpu的细胞的液体培养物在30℃培养至OD₆₀₀＝0.84，然后移至4℃培养2小时(最终细胞密度是OD₆₀₀＝0.75)。制备质膜级分并且利用特异结合Vpu C-末端的抗体进行的蛋白质印迹法检测到在约16kDa的单一条带，表明Vpu得以表达并与膜结合(图2A，泳道5)。

实施例13.互养实验表明脯氨酸渗出表达Vpu的细胞

大肠杆菌对脯氨酸的摄取得到详细表征，且已知氨基酸向细胞的主动运输是利用钠梯度作为能源(Yamoto等人，1994)。为检测是否发生脯氨酸渗漏，用到下列互养试验：接种脯氨酸和甲硫氨酸的营养缺陷型(Met^-Pro^-)大肠杆菌菌株的菌苔，并在缺少脯氨酸但含有甲硫氨酸的极限撤除培养基平板上倾注作为软琼脂覆层。用含有pPL451对照质粒或pPL-Vpu的Met⁺Pro⁺菌株(XL-1 blue)接种无菌多孔滤器盘，并将其置于软琼脂上。然后在37℃或30℃下孵育平板2天。该时间后，Met^-Pro^-菌株的晕圈生长在用含有pPL-Vpu的细胞37℃下接种的盘周围是清晰可见的(图4A)。此生长只能是由于脯氨酸从盘上的Vpu表达细胞中渗漏。从37℃下的对照菌株或平板上培养于30℃的任一菌株均无此类渗漏可见(图4B)。

与脯氨酸运输对比，已知大肠杆菌甲硫氨酸通透酶属于ABC转运蛋白家族(Rosen，1987)并因此由ATP供能。进行与上面所述的那些相同的互养实验，只是将Met^-Pro^-菌株涂布于缺少甲硫氨酸但含有脯氨酸的极限撤除平板。在任意盘周围均未有该菌株的明显生长(图4C)，表明即使当Vpu表达时，甲硫氨酸也未渗出XL-1 blue细胞。

实施例14.表达Vpu的大肠杆菌细胞需要外部培养基中的腺嘌呤用于生长

可观察到，由于腺嘌呤合成途径中未表征的突变，表达Vpu的XL1-blue菌株的大肠杆菌细胞在37℃的生长依赖于培养基中腺嘌呤的存在。这允许研发比上述脯氨酸互养试验甚至更简单的用于Vpu离子通道活性的生物测定：将含有pPL-Vpu质粒的XL1-blue细胞的菌苔接种于培养基中缺少腺嘌呤的琼脂糖平板上，将待测试Vpu通道抑制的药物的小等分试样点在琼脂糖上离散位置中，并在37℃孵育平板合适的时间(12-36小时)。特定药物应用位点周围的生长晕圈表明药物已经抑制了Vpu离子通道活性的表达，所述活性在药物不存在时阻止生长(图5)。

实施例15.用于Vpu通道阻断活性的平面脂双层中化合物的测定

化合物的特征是它们能够阻断Vpu离子通道活性重建成平面脂双层。将溶解于三氟乙醇中的Vpu N-末端肽(残基1-32)加入双层装置的CIS小室，并搅拌溶液直至观察到离子电流，表明一个或多个Vpu离子通道掺入双层。记录通道活性几分钟后，搅拌下将药物加入到CIS和TRANS小室中的溶液至100μM的终浓度。然后记录通道活性至少额外的3分钟并通过比较药物加入之前和之后的通道活性来确定药物加入对离子电流的影响。对每个实验，将药物影响分类成四种类型：“强阻断”，如果电流受到约90-100％的抑制；“弱阻断”，约50-90％抑制；“部分阻断”，＜50％；和“无影响”。如果在加入Vpu N-肽后产生大于±50pA的电流，忽略实验，因为在此类情况下，可能非天然肽聚集体促进双分子层分解。此类聚集体由于其紊乱结构，可能不会由所测试浓度下药物特异阻断。

表3总结了双分子层实验的结果。这些实验的新结果是利用Phenamil所观察到的Vpu通道的强阻断。Phenamil在氨氯吡咪的胍基上具有苯基衍生物。氨氯吡咪本身不是Vpu的阻断剂，而在吡嗪环的5-位上加入亚己基产生了结构(HMA)，其在低至25μM的浓度阻断通道。然而，利用Phenamil的这些新结果现在表明，分子相反端的大的疏水衍生物也可将氨氯吡咪变为有效的Vpu通道阻断剂。有趣地，具有非常类似结构的benzamil在阻断Vpu通道上更低效的。

表3：抑制双层中Vpu离子通道的化合物总结

实施例16.利用细菌生物测定对Vpu蛋白质的化合物筛选

应用特定药物的位点周围生长的晕圈——如实施例14中所述的——被给予0到6的分数，其反映细菌细胞生长区域的大小和密度。大于3的分数代表Vpu蛋白质的强抑制；1.5到3的分数代表中等抑制；而在0.01和1.5之间的分数代表一般的抑制。

表4列出了细菌生物测定中Vpu蛋白质抑制的分数

实施例17.化合物对人单核细胞和巨噬细胞中HIV复制的影响

从外周血分离人单核细胞并培养24小时(一日龄单核细胞)或7天以允许分化成单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)。然后将这些细胞暴露于HIV分离物的无细胞制剂中，并在对培养基完全抽气之前允许其吸收2小时，用无病毒培养基洗涤一次并重悬于新鲜培养基中。在感染前24小时或感染后将细胞暴露于不同浓度的化合物中。在感染后的不同时间，对比暴露于药物的细胞和未暴露于药物的细胞(对照)中随后的HIV复制。利用HIVDNA PCR方法(Fear等人，1998)或ELISA方法测定病毒复制的进程和程度来定量在培养上清液中的p24(Kelly等人，1998)。

表5提供了利用该测定法和受试抗病毒化合物所获得的结果的实例。

表5

实施例18.SARS冠状病毒

SARS E蛋白质形成离子通道

肽合成

利用FMOC化学和固相肽合成，人工合成了相应于全长SARS-CoV(分离物Tor2和Urbani)E蛋白质的肽(MYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCCNIVNVSVLVKPTVYVYSRVKNLNSSEGVPDLLV)和包含全长E蛋白质的前40个氨基酸的第二个肽，其相应于跨膜结构域(MYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLC)。该合成是在生物分子资源实验室(Biomolecular Resource Facility)(John CurtinSchool of Medical Research，ANU，澳大利亚)利用来自ProteinTechnologies Inc.(Tucson，AZ，美国)的Symphony^R肽合成仪，根据厂商说明书来完成的。

实施例19.肽纯化

合成肽的质谱分析表明，制剂含有显著量的m/z比率比预期的全长产物的低的物质。这些中的大多数大概是在肽合成过程中产生的截短的肽。为富集全长E蛋白质，用到下列方法，其依赖于较小分子和全长肽的差别溶解度。将粗制备物以12mg/ml悬浮于70％CH₃CN、0.1％TFA中并涡旋10分钟。在20℃下将此悬浮液以10,000g离心10分钟。弃去上清液并将不溶级分用70％CH₃CN、0.1％TFA如上萃取两次。利用Speedvac将含有E蛋白质的不溶物质干燥，并将终产物的重量用于计算产率。纯化的肽通过Bruker Omniflex MALDI-TOF质谱法以2.5mg/ml HABA matrix在甲醇中以1∶1的比率来分析，并以正线性模式获得光谱。在8,360.1的m/z比率处看到了如对全长E蛋白质的理论分子量预期的清晰峰，以及4422.3处的N-末端E蛋白质。

实施例20.平面脂双层

将SARS病毒E蛋白质以1mg/ml悬浮于2，2，2-三氟乙醇中。在Warner(Warner instruments，Inc.1125 Dixwell Avenue，Hamden，CT06514)双层设备上如下测试SARS病毒E蛋白质形成离子通道的能力：将CHCl₃中3∶1∶1的1-棕榈酰-2-油酰基磷脂酰乙醇胺∶1-棕榈酰-2-油酰基磷脂酰丝氨酸∶1-棕榈酰-2-油酰基磷脂酰胆碱的脂质混合物在N₂下干燥并重悬于正-癸烷中至50mg/ml。将双层经Delrin^TM杯中的约100μm直径的圆孔涂布，所述Delrin^TM杯将CIS和TRANS小室中的水溶液分隔。CIS小室含有5mM HEPES缓冲液pH7.2中的500mM NaCl或KCl溶液，TRANS小室含有5mM HEPES缓冲液pH7.2中的50mM NaCl或KCl溶液。用2％琼脂糖桥以氯化物涂布银电极，将其置于CIS和TRANS小室溶液中。将SARS E蛋白质全长或N-末端肽(3-10μg)加入CIS小室，搅拌直至检测到通道活性。将CIS小室接地并将TRANS小室保持在+100至-100mV间范围变动的不同维持电压下。利用Warner model BD-525D放大器记录电流，在1kHz处滤波，在5kHz处取样并利用内部开发的软件以数字记录于PC的硬盘上。

将所要测试其抑制SARS E蛋白质离子通道活性能力的药物用50％DMSO：50％甲醇溶液制成50mM。对于测试化合物抑制E蛋白质离子通道活性能力的实验，将100μM至400μM的化合物加入到CIS小室中，同时搅拌30秒。在通道活性前、通道活性中和加入药物后记录双层电流。

在所测试的化合物中有肉桂酰基胍(Bit036)，其是在较早的实验中表明为抗病毒并抑制来自其它病毒的离子通道蛋白质的化合物。

实施例20.1.聚丙烯酰胺凝胶电泳

将纯化的E蛋白质溶解于6M尿素、10％甘油、5％SDS、500mM DTT、0.002％溴酚蓝、62.5mM Tris HCl(pH8.3)的混合液中至1mg/ml、5mg/ml和10mg/ml。在将30μl样品置于4-20％的积层凝胶(Gradipore)上运行之前，将溶液中的肽在100℃加热20分钟。将

预染标准(Invitrogen)用于分子量标准参照物。

实施例20.2结果

为测试SARS E蛋白质是否形成离子通道，将纯化的合成肽重构成平面脂双层(21)。一般，搅拌下将3μg的SARS全长E蛋白质加入到CIS小室中。此CIS小室含有500mM NaCl且TRANS小室含有50mM NaCl。在60个实验中，在5-10分钟的搅拌后，观察到了由于SARS E蛋白质离子通道活性导致的离子电流。利用约-100mV的跨双层的维持电压更加快速和可靠地检测到活性。在这些实验之一中于-100mV(A)和于-60mV(B)时所记录的电流在图6中显示。在该实验中逆转电位约是+48mV且通道电导经计算分别为52pS和26pS。这表明电流-电压(IV)关系不是线性的。在10个其它实验中，未将蛋白质未加入到CIS小室，甚至在记录超过1小时后也未检测到离子通道活性。

图7a显示了在NaCl溶液中的一系列电压下所记录的典型的电流迹线。在该实验中电流的方向在+48mV处逆转(图7b)。IV曲线显示，在更低的电压下跨双层的平均电流小，但在较高电压下跨双层的平均电流有所升高，导致非线性IV关系。在7个独立的实验中，平均逆转电位是+48.3±2.3mV(平均值±1SEM)，表明通道对Na⁺离子的通透性为Cl^-离子的约37倍。逆转电位接近Na⁺平衡电位(+53mV)，因此通道对于Na⁺离子是选择性的。对于这7个实验，通道电导在95-164pS之间变化；平均电导是130±13pS。

SARS E蛋白质离子通道对于K⁺离子的选择性比Na⁺离子的稍低。图8b显示了KCl溶液中在一系列电压下的电流记录。在此实验中电流在+31mV逆转。在7个类似实验中，E蛋白质离子通道平均逆转电位是+34.5±2.5mV。因此SARS E蛋白质离子通道对K⁺离子的通透性为对Cl^-离子的约7.2倍。在7个实验中通道电导在24-166pS之间变化；平均电导是83.4±26pS。

利用第二种合成肽获得了类似结果，所述合成肽相应于SARS E蛋白质“N-末端肽”的前40个N-末端氨基酸(21)。四个实验中的NaCl溶液中的平均逆转电位是+46.3±2.5mV，表明N-末端肽所形成的离子通道对Na⁺离子的通透性是对Cl^-离子的通透性的约25倍。SARS E蛋白质N-末端肽足够形成具有全长SARS E蛋白质形成的离子通道的形成的离子通道。因此，对SARS E蛋白质的选择性滤器最有可能包含在N-末端的前四十个氨基酸内。SARS E蛋白质N-末端肽也在KCl溶液中形成离子通道，其与全长E蛋白质相比对K⁺离子具有类似选择性。在5个独立的实验中平均通道逆转电位是+39.5±3.6mV，因而通道对K⁺离子的通透性是对Cl^-离子的约11倍。纯化的全长E蛋白质肽的SDS-PAGE显示相应于全长E蛋白质的条带(数据未显示)。检测到高达20kd的不同大小的较大条带，暗示SARS E蛋白质可能形成同型寡聚体。

实施例21.SARS E蛋白质离子通道受到肉桂酰基胍和其它化合物阻断

通过向CIS小室中加入100至200μM肉桂酰基胍，NaCl溶液中的E蛋白质离子通道活性显著降低(p≥0.01，n＝6个实验)。通过100μM肉桂酰基胍将跨双层的平均电流降低至基线。实验中当E蛋白质离子通道具有较高的电导时，100至200μM肉桂酰基胍将跨双层的平均电流降低到约1/4；类似地，在四个其它实验中，100至200μM肉桂酰基胍阻断由全长E蛋白质在KCl溶液中形成的通道。在两个另外的实验中，SARS E蛋白质N-末端肽受到100至200μM肉桂酰基胍阻断，证明肉桂酰基胍药物结合位点定位于E蛋白质N-末端结构域的前四十个氨基酸内部。关于它们对SARSE蛋白质的影响，其它在双层中测试的化合物显示于下面的表6中。

表6

化合物	由100μM导致的平均电流的％降低
		5-(N，N-亚己基)氨氯吡咪	91±7
6-甲氧基-2-萘甲酰基胍	92±16
		2’4二氯benzamil HCl	78±0
N，N’-双(3苯基丙酰基)-N”-苯基胍	88±6
		(3-溴肉桂酰基)胍	87±11
(2-溴肉桂酰基)胍	88±6
		反式-3-(1-萘基)丙烯酰基胍	66±2

实施例21.1结果和讨论

我们已经表明，SARS E蛋白质可在脂双层膜中形成离子通道。离子电流在正电压下逆转，其证明E蛋白质离子通道对于单价阳离子比对于单价阴离子更具选择性。E蛋白质离子通道对Na⁺离子的选择性是对Cl^-离子的选择性的约37倍，而对K⁺离子的选择性是对Cl^-离子选择性的约7.2倍。在超过60个实验中，E蛋白质离子通道的Na⁺电导从低至26pS至高达164pS变化。SDS-PAGE表明E蛋白质形成同型寡聚体，并且我们推测较大的电导可能是由于E蛋白质肽的聚集导致较大的离子通道或同时打开许多离子通道。在几个实验中观察到单通道电流，且从这些通道中计算出电导是电压依赖的。

含有SARS病毒E蛋白质的疏水结构域的N-末端前40个氨基酸对于平面脂双层上离子通道的形成是足够的。N-末端E蛋白质离子通道具有与全长E蛋白质离子通道相同的选择性和电导。

通过向CIS小室中加入100μM至200μM的肉桂酰基胍，抑制了NaCl和KCl溶液中平面脂双层上SARS病毒全长E蛋白质离子通道活性和N-末端结构域E蛋白质离子通道活性。已在7个独立实验中在NaCl溶液中和4个独立实验中在KCl溶液中观察到肉桂酰基胍对E蛋白质离子通道活性的抑制或部分抑制。

所有已知的冠状病毒都编码具有疏水N-末端跨膜结构域的E蛋白质，因此所有冠状病毒E蛋白质可在平面脂双层上形成离子通道。这表明E蛋白质可为抗病毒药物的合适靶标并可能终止冠状病毒从受感染的宿主细胞的扩散。阻断E蛋白质离子通道的药物可为有效的抗病毒治疗，用于治疗几种重要的人和兽医冠状病毒疾病，包括SARS和普通感冒。

实施例22.用于筛选可能的SARS-CoV E蛋白质离子通道阻断药物的细菌生物测定

SARS-CoV E蛋白质离子通道抑制细菌细胞生长

开发了细菌细胞中SARS-CoV E蛋白质功能的生物测定。将编码SARS-CoV E蛋白质的合成cDNA片段克隆进表达质粒pPL451，产生载体，其中E蛋白质表达是温度诱导性的，如实施例4中所述。观察到表达E蛋白质的大肠杆菌细胞在37℃下的生长抑制，其作为p7离子通道功能的指示剂，所述功能消除细菌细胞维持的正常Na⁺梯度。

实施例23.利用细菌生物测定时SARS冠状病毒E蛋白质的化合物筛选

对特定药物的应用位点周围的生长晕圈——如实施例14中所述——如实施例15所述的进行打分。

表7列出了在细菌生物测定中SARS-CoV E蛋白质的抑制分数。

表7

实施例24.用于测试针对SARS冠状病毒(SARS-CoV)复制的化合物的 SARS抗病毒试验

利用在Vero细胞中纯化过三次的病毒噬斑测试了针对SARS-CoV(香港株)的化合物。通过以MOI＝1×TCID₅₀/100个细胞感染Vero细胞来产生原种病毒。

实施例24.1利用病毒微量滴定试验筛选抗病毒活性

以1∶50的感染复数感染培养于25cm²瓶中的Vero细胞的单层，并在感染后立即用两种浓度10μM和2μM的化合物处理。对照感染的单层保持不处理。感染后48小时取培养基样品。将来自每种样品的两个等分试样(滴定1和2)连续对数稀释并将对数稀释-4至-7的12份重复样品加入微量滴定板中的细胞。四天后，为致细胞病变效应(CPE)对微量滴定板中的孔进行打分，并基于4个稀释物中的CPE阳性孔数目来计算滴定值。对照滴度是4.8和5.9 TCID₅₀×10⁶(平均5.35×10⁶)。

实施例25：化合物在SARS CoV抗病毒测定中的影响

根据实施例21中所述方法对三种选定化合物测试针对SARS-CoV的活性。对于反式-3-(1-萘基)丙烯酰基胍和肉桂酰基胍，在10μM的浓度观察到病毒滴度约80％的减小，并看到在2μM反式-3-(1-萘基)丙烯酰基胍下存在50％的降低。

表8以对照的％形式(在化合物不存在下培养SARS CoV 48小时)提供了病毒滴定数据。

表8

实施例26.人229E冠状病毒

相应于229E-E蛋白质的肽的合成和纯化

利用FMOC化学和固相肽合成，人工合成了相应于全长229E-E蛋白质的肽(序列：MFLKLVDDHALVVNVLLWCVVLIVILLVCITIIKLIKLCFTCHMFCNRTVYGPIKNVYHIYQSYMHIDPFPKRVIDF；检索号NP_073554)。该合成是在生物分子资源实验室(John Curtin School of Medical Research，ANU，澳大利亚)利用来自Protein Technologies Inc.(Woburn，MS，美国)的Symphony^R肽合成仪，根据厂商说明书来给予C-末端酰胺进行的，利用HBTU和N-甲基吡咯烷酮中的羟基苯并三唑进行偶联。每个合成循环使用双偶联和4倍过量的氨基酸。利用DMF中的20％哌啶除去暂时的α-NFmoc-保护基。利用ProteoPlus^TM试剂盒(Qbiogene inc.加拿大)根据厂商说明书来纯化粗合成肽。简要地，在上样缓冲液(60mM Tris-HCl pH8.3，6M尿素，5％SDS，10％甘油，0.2％溴酚蓝，±100mM β-巯基乙醇)中稀释肽并在4-20％的梯度聚丙烯酰胺凝胶(Gradipore，NSW，澳大利亚)上tris-甘氨酸电泳缓冲液(25mM Tris，250mM甘氨酸，0.1％SDS)中运行。用凝胶codeblue(Promega，NSW)染肽并将相应于全长肽的条带从凝胶中切出。

转移凝胶切片至ProteoPLUS^TM管中并用tris-甘氨酸电泳缓冲液充满。将管子浸于tris-甘氨酸电泳缓冲液中并置于100伏约1小时。将电流极性逆转1分钟以增加所回收的蛋白质的量。收获肽并以13,000转/分钟离心1分钟。将所纯化的肽在Speedvac中干燥并将终产物的重量用于计算产率。

实施例27.229E-E蛋白质在平面脂双层中形成离子通道

如别处所述的(Sunstrom，1996；Miller，1986)进行脂双层研究。使用了棕榈酰-油酰基-磷脂酰乙醇胺、棕榈酰-油酰基-磷脂酰丝氨酸、棕榈酰-油酰基-磷脂酰胆碱的脂质混合物(5∶3∶2)(Avanti Polar Lipids，Alabaster，亚拉巴马州)。将脂质混合物涂布在1ml迭尔林(delrin)杯壁中的150-200μm的孔上。孔分隔两小室：顺式和反式，两个小室都含有不同浓度的盐溶液。将顺式小室接地并将反式小室连接Axopatch 200放大器的输入。通常顺式小室含有500mM NaCl或500mM KCl且反式含有50mM NaCl或50mMKCl。通过由电流变速产生的电流脉冲幅度来通过电学监测双层形成。测定反式小室中相对于顺式的电压。将合成肽加入顺式小室并搅拌直至看到通道活性。在1000Hz过滤电流，在5000Hz将其数字化并储存于磁盘中。

将229E合成肽溶解于0.05mg/ml至1mg/ml的2，2，2-三氟乙醇(TFE)中。将10μl的此溶液加入双层装置的顺式小室(1ml含水体积)，通过磁性“跳蚤”进行搅拌。离子电流(表明双层中通道活性)一般在15-30分钟内检测到。在检测到通道后，跨双层的维持电压在-100mV和+100mV之间变化以表征电流的大小和极性，并使得可以确定逆转电位。

在其中顺式小室含有500mM NaCl溶液且反式小室含有50mM NaCl溶液的15个实验中，通道活性的平均逆转电位计算为22±7(SEM)mV。在其中顺式小室含有500mM KCl溶液且反式小室含有50mM KCl溶液的13个实验中，通道活性的平均逆转电位计算为38±4(SEM)mV。这些结果表明229E E蛋白质形成阳离子选择性离子通道，其对K⁺比对Na⁺离子稍微更具选择性。

图9显示了在非对称的KCl溶液(500/50mM)中的多种维持电压(顺式相对于反式)下229E E离子通道的原始电流数据的实例。该图是平均双层电流(pA；y-轴)相对于维持电压(mV；x-轴)的代表图。

实施例28.化合物抑制229E E蛋白质合成肽的离子通道活性

为测试化合物阻断或抑制由229E E蛋白质形成离子通道，将含有化合物的溶液的小等分试样加入到水溶液浴平面脂质中，其中已重建了肽通道活性并记录和测定了化合物添加对离子电流的影响。

一般用DMSO制备500mM化合物贮存液。此溶液进一步用50％DMSO/50％甲醇稀释至50mM，或者更低浓度，并将2μl适当稀释的化合物加入顺式和/或反式小室以获得所希望的终浓度。

在图10中所显示的实例中，向顺式小室中加入100μM肉桂酰基胍大大降低了通过229E E离子通道的电流。

实施例29.用于筛选可能的229E-CoV E蛋白质离子通道阻断药物的细菌生物测定

229E-CoV E蛋白质离子通道抑制细菌细胞生长

开发了细菌细胞中229E-CoV E蛋白质功能的生物测定。将编码229E-CoV E蛋白质的合成cDNA片段克隆进表达质粒pPL451，产生如实施例4中所述的载体，其中E蛋白质表达是温度诱导性的。观察到表达E蛋白质的大肠杆菌细胞在37℃下的生长抑制，其作为p7离子通道功能的指示剂，所述功能消除细菌细胞维持的正常Na⁺梯度。

实施例30.利用细菌生物测定对229E-CoV E-蛋白质的化合物筛选

表9列出了在细菌生物测定中229E-CoV E-蛋白质的抑制分数。

表9

实施例31：用于测试化合物针对人冠状病毒229E(229E)的复制的抗病毒试验

为确定化合物针对人冠状病毒229E(ATCC VR-740)复制的抗病毒活性，开发了测定229E感染的MRC-5(人肺成纤维细胞；ATCC CCL-171)细胞单层中形成的噬斑数目降低的试验：首先，通过在MRC-5细胞中扩增来制备病毒工作原种。然后通过在35℃下5％CO₂中以约0.01pfu/细胞的MOI暴露于病毒，将此病毒工作原种用于感染培养于6孔组织培养板中MRC-5细胞的汇合单层。移去感染性接种物，并用含有多种测试浓度的化合物的新鲜培养基(补充了10％胎牛血清的DMEM)或用于化合物的适当水平的溶剂(对照)替换。然后将平板在感染后在35℃孵育(在5％CO₂中)3-5天，在这段时间后取出培养上清液并用20％乙醇中的0.1％结晶紫溶液将细胞染色10分钟。计数所有孔中的噬斑并计算与溶剂对照相比噬斑数目减少的百分比。在一式两份或一式四份孔中进行测定。

表10

实施例32.人OC43冠状病毒

用于测试化合物针对人冠状病毒OC43的复制的OC43抗病毒试验

为测定化合物针对人冠状病毒OC43(ATCC VR-759)复制的抗病毒活性，开发了测定病毒N-蛋白质从OC43感染的MRC-5细胞(人肺成纤维细胞；ATCC CCL-171)的单层向培养上清液中释放的ELISA试验：首先，通过在MRC-5细胞中扩增来制备病毒工作原种。然后通过在35℃下5％CO₂中以约0.01pfu/细胞的MOI暴露于病毒，将此病毒工作原种用于感染培养于6孔组织培养板中MRC-5细胞的汇合单层。移去感染性接种物，并用含有多种测试浓度的化合物的新鲜培养基(补充了10％胎牛血清的DMEM)或用于化合物的适当水平的溶剂(对照)替换。然后将平板在感染后在35℃孵育(在5％CO₂中)5天，在这段时间后收获培养上清液并通过在5000×g离心10分钟除去细胞碎片。对于N-抗原检测，将澄清的培养上清液的100μl样品加入96孔Maxi-Sorb板的双份孔中；将100μl RIPA缓冲液加入每孔混匀并覆盖平板并在4℃孵育过夜以促进蛋白质结合至塑料孔上。第二天，弃去包被溶液，用PBST彻底洗涤孔，并通过在PBS中的1％BSA中孵育1.5小时来封闭未占用的蛋白质结合位点。识别OC43 N蛋白质的抗体以PBS中的1/800稀释液(37℃下1小时)来使用，并将二级抗体(山羊抗小鼠碱性磷酸酶)用于显色反应。在405nm下读取孔的光密度，并通过比较化合物存在下的信号水平与来自溶剂对照的信号水平来确定化合物的效果。

实施例33：化合物在OC43抗病毒试验中的效果

根据实施例22中所述的方法对化合物筛选抗OC43复制的活性。结果显示于表11中。

表11

实施例34.鼠肝炎病毒(MHV)

相应于MHV-A59 E蛋白质的肽的合成与纯化

利用FMOC化学和固相肽合成，人工合成了相应于全长MHV-A59 E蛋白质的肽(序列：MFNLFLTDTVWYVGQIIFIFAVCLMVTIIVVAFLASIKLCIQLCGLCNTLVLSPSIYLYDRSKQLYKYYNEEMRLPLLEVDDI；检索号NP 068673)。该合成是在生物分子资源实验室(John Curtin School ofMedical Research，ANU，澳大利亚)利用来自Protein Technologies Inc.(Woburn，MS，美国)的Symphony^R肽合成仪，根据厂商说明书给予C-末端酰胺进行的，利用HBTU和N-甲基吡咯烷酮中的羟基苯并三唑进行偶联。每个合成循环使用双偶联和4倍过量的氨基酸。利用DMF中的20％哌啶除去暂时的α-N Fmoc-保护基。利用ProteoPlus^TM试剂盒(Qbiogene inc.加拿大)根据厂商说明书来纯化粗合成肽。简要地，在上样缓冲液(60mMTris-HCl pH8.3，6M尿素，5％SDS，10％甘油，0.2％溴酚蓝，±100mM β-巯基乙醇)中稀释肽并在4-20％的梯度聚丙烯酰胺凝胶(Gradipore，NSW，澳大利亚)上tris-甘氨酸电泳缓冲液(25mM Tris，250mM甘氨酸，0.1％SDS)中运行。用凝胶code blue(Promega，NSW)染肽并将相应于全长肽的条带从凝胶中切出。

转移凝胶切片至ProteoPLUS^TM管中并用tris-甘氨酸电泳缓冲液充满。将管子浸于tris-甘氨酸电泳缓冲液中并置于100伏约1小时。将电流逆转1分钟以增加所回收的蛋白质的量。收获肽并以13,000转/分钟离心1分钟。将所纯化的肽在Speedvac中干燥并将终产物的重量用于计算产率。

实施例35.MHV-E蛋白质在平面脂双层中形成离子通道

将MHV E合成肽溶解于0.05mg/ml至1mg/ml的2，2，2-三氟乙醇(TFE)中。将10μl的此溶液加入双层装置的顺式小室(1ml含水体积)，通过磁性“跳蚤”进行搅拌。离子电流(表明双层中通道活性)一般在15-30分钟内检测到。在检测到通道后，跨双层的维持电压在-100mV和+100mV之间变化以表征电流的大小和极性，并使得可以确定逆转电位。

在其中顺式小室含有500mM NaCl溶液且反式小室含有50mM NaCl溶液的14个实验中，通道活性的平均逆转电位计算为49±1(SEM)mV。在其中顺式小室含有500mM KCl溶液且反式小室含有50mM KCl溶液的11个实验中，通道活性的平均逆转电位计算为13±6(SEM)mV。这些结果表明MHV E蛋白质形成阳离子选择性离子通道，其对Na⁺比对K⁺离子更具选择性。

图11显示了在非对称的NaCl溶液(500/50mM)中的多种维持电压(顺式相对于反式)下MHV E离子通道的原始电流数据的实例。该图是平均双层电流(pA；y-轴)相对于维持电压(mV；x-轴)的代表性图。

实施例36.化合物抑制MHV E蛋白质合成肽的离子通道活性

为测试化合物阻断或抑制由MHV E蛋白质形成的离子通道，将含有化合物的溶液的小等分试样加入到水溶液浴平面脂质中，其中已重建了肽通道活性并记录和测定了化合物添加对离子电流的影响。

在下面图12中所显示的实施例中，向顺式小室中加入100μM肉桂酰基胍大大降低了通过MHV E离子通道的电流。

实施例37.用于筛选可能的MHV E-蛋白质离子通道阻断药物的细菌生物测定

MHV E-蛋白质离子通道抑制细菌细胞生长

开发了细菌细胞中MHV E蛋白质功能的生物测定。将编码MHV E蛋白质的合成cDNA片段克隆进表达质粒pPL451，产生如实施例4中所述的载体，其中E蛋白质表达是温度诱导性的。观察到表达E蛋白质的大肠杆菌细胞在37℃下的生长抑制，其作为p7离子通道功能的指示剂，所述功能消除细菌细胞维持的正常Na⁺梯度。

实施例38.利用细菌生物测定对MHV E蛋白质的化合物筛选

对特定药物的应用位点周围的生长晕圈——如实施例14中所述——如实施例15中所述的进行打分。

表12列出了在细菌生物测定中MHV E蛋白质的抑制分数。

表12

实施例39：用于测试化合物针对小鼠肝炎病毒(MHV)复制的MHV抗病毒试验

为确定化合物针对MHV(株MHV-A59：ATCC VR-764)复制的抗病毒活性，开发了测定MHV感染的L929细胞(ATCC CCL-a)单层中形成的噬斑数目降低的试验：首先，通过在NCTC克隆1469细胞(ATCC CCL-9.1)中扩增来制备病毒工作原种。然后通过在37℃下5％CO₂中以约0.01pfu/细胞的MOI暴露于病毒，将此病毒工作原种用于感染培养于6孔组织培养板中L929细胞的汇合单层。移去感染性接种物，并用含有多种测试浓度的化合物的新鲜培养基(补充了10％马血清的DMEM)或用于化合物的适当水平的溶剂(对照)替换。然后将平板在感染后在37℃孵育(在5％CO2中)16-24小时，在这段时间后取出培养上清液并用20％乙醇中的0.1％结晶紫溶液将细胞染色10分钟。计数所有孔中的噬斑并计算与溶剂对照相比噬斑数目减少的百分比。在一式两份到一式四份孔中进行测定。

实施例40.化合物在MHV抗病毒试验中的效果

表13提供了从该研究所获得的结果。

表13

实施例41.猪呼吸冠状病毒(PRCV)

用于测试化合物针对猪呼吸冠状病毒(PRCV)的复制的抗病毒试验

为确定化合物针对猪呼吸冠状病毒(ATCC VR-2348)复制的抗病毒活性，开发了测定PRCV感染的ST细胞(猪胎儿睾丸细胞系，ATCCCRL-1746)单层中形成的噬斑数目降低的试验：用第四代的猪呼吸病毒(PRCV)株AR310以PBS中的三种稀释度10^-1、50^-1和10^-2来感染6孔板中汇合的ST细胞，以提供一系列噬斑数目来计数。将100μl稀释的病毒加入每孔中1ml体积的培养基中。在室温下将板在摇动平台上孵育1小时以允许病毒吸附细胞。除去病毒上清液并将含有1×MEM，5％FCS中的1％Seaplaque琼脂糖的2ml/孔的覆盖层(overlay)加入到每孔中。通过将冰冻母液的化合物稀释至一种浓度来将所要测试的化合物加入到覆盖层混合物，从而对于每种浓度的化合物，将相同体积的化合物/溶剂加入到覆盖层。化合物/溶剂的体积切勿超过覆盖层体积的0.07％。用来溶解化合物的溶剂是以等比例混合的DMSO和甲醇。在四种浓度0.1μM、1μM、10μM和20μM下测试化合物的抗噬斑形成活性。在每种浓度下进行一式两份或一式四份。进行对照，其中将相同体积的溶剂加入覆盖层。允许将覆盖层置于室温下20分钟。然后将板在37℃下孵育2天。然后将单细胞层固定并在室温下通过加入1ml/孔的0.5％的亚甲蓝、4％甲醛来染色过夜。然后将覆盖层琼脂糖和染料冲洗掉以显现染色的和固定的单层。

实施例42：化合物在PRCV抗病毒试验中的效果

根据实施例29中所述的方法筛选化合物抗PRCV复制的活性。表14提供了一些所测试化合物的EC50。

表14

化合物	EC50(μM)
		5-(N，N-亚己基)氨氯吡咪	0.06
6-甲氧基-2-萘甲酰基胍	0.04
		肉桂酰基胍	0.08
N-(3-苯基丙酰基)-N’-苯基胍	19
		3-甲基肉桂酰基胍	1.43
(3-溴肉桂酰基)胍	11.2
		(反式-2-苯基环己烷羰基)胍	17.2
反式-3-(1-萘基)丙烯酰基胍	19.1
		2-(2-萘基)乙酰基胍	119.6

实施例43.牛冠状病毒

用于测试化合物针对牛冠状病毒(BCV)复制的抗病毒试验

为确定化合物针对牛冠状病毒(ATCC VR-874)复制的抗病毒活性，开发了测定BCV感染的MDBK细胞(牛肾脏细胞系，ATCC CCL-22)单层中形成的噬斑数目降低的试验：用第二代的BCV以PBS中稀释至10^-3、5^-5和10^-4的系列稀释的病毒来感染6孔板中汇合的MDBK细胞，以提供一系列噬斑数目来计数。将100μl稀释的病毒加入每孔中1ml体积的培养基中。将板孵育1小时以使得病毒吸附细胞。除去病毒上清液并将含有1×MEM，5％FCS中的1％Seaplaque琼脂糖2ml/孔的覆盖层加入到每孔中。通过将来自0.5M冰冻母液的化合物稀释至一定浓度来将所要测试的化合物加入到覆盖层混合物，从而相同体积的化合物/溶剂加入到每种浓度的化合物的覆盖层。化合物/溶剂的体积切勿超过覆盖层体积的0.07％。用来溶解化合物的溶剂是以等比例混合的DMSO和甲醇。在四种浓度0.1μM、1μM、10μM和20μM下测试化合物的抗噬斑形成活性。在每种浓度下进行一式四份。进行对照，其中将相同体积的溶剂加入到覆盖层。允许将覆盖层置于室温下20分钟。然后将板在37℃下孵育7天。然后将单细胞层固定并通过加入1ml/孔的0.5％的亚甲蓝、4％甲醛来染色。

实施例44：化合物在BCV抗病毒试验中的效果

根据实施例31中所述的方法筛选化合物抗BCV复制的活性。表15提供了一些所测试化合物的EC50。

表15

化合物	EC50μM
		(3-溴肉桂酰基)胍	3
3-(三氟甲基)肉桂酰基胍	3
		6-甲氧基-2-萘甲酰基胍	9
5-(N，N-亚己基)氨氯吡咪	9
		反式-3-(1-萘基)丙烯酰基胍	13
肉桂酰基胍	42
		(5-苯基-戊-2，4-二烯酰基)胍	95
2-(2-萘基)乙酰基胍	99
		(反式-2-苯基环丙烷羰基)胍	109
N-(3-苯基丙酰基)-N’-苯基胍	156
		4-苯基苯甲酰基胍	190

实施例45.丙型肝炎病毒

丙型肝炎病毒p7蛋白质的离子通道活性

测试合成的p7肽在人工脂双层中的通道活性

合成了模仿由丙型肝炎病毒(HCV)编码的蛋白质p7的肽，其具有下列氨基酸序列：

ALENLVILNAASLAGTHGLVSFLVFFCFAWYLKGRWVPGAVYAFYGMWPLLLLLLALPQRAYA

如别处所述的进行脂双层研究(Miller，1986)。使用了棕榈酰基-油酰基-磷脂酰乙醇胺、棕榈酰基-油酰基-磷脂酰丝氨酸、棕榈酰基-油酰基-磷脂酰胆碱的脂质混合物(5∶3∶2)(Avanti Polar Lipids，Alabaster，亚拉巴马州)。将脂质混合物涂在1ml迭尔林杯壁中的150-200μm的孔上。该孔分隔两小室：顺式和反式，两个小室都含有不同浓度的盐溶液。将顺式小室接地并将反式小室连接Axopatch 200放大器的输入。通常顺式小室含有500mM KCl且反式含有50mM KCl。通过由电流变速产生的电流脉冲幅度来电学地监测双层形成。测定反式小室中相对于顺式的电压。将蛋白质加入顺式小室并搅拌直至看到通道活性。在1000Hz过滤电流，在2000Hz将其数字化并储存于磁盘中。将p7肽以10mg/ml溶解于2，2，2-三氟乙醇(TFE)中。将10μl的此溶液加入经搅拌的双层的顺式小室中。在15-20分钟内看到通道活性。

当将p7肽加入到顺式小室并搅拌时，记录通道活性。反式小室中的电压是-80mV且电流是向下的。电流在接近这些溶液中的钾平衡电位的+50mV处逆转，表明通道是阳离子选择性的。开放通道峰的幅度是1.7pA，对应于约14pS的通道电导。在大多数实验中，“单通道”具有更大的尺寸，大概是由于P7肽的聚集。在此实验中电流在约+40mV处逆转。在一些实验中顺式小室中的溶液是150mM KCl，而反式小室中是15mM KCl。P7肽再一次产生了逆转的电流。

当两小室都含有NaCl时获得了类似的结果。当顺式小室含有500mMNaCl且反式小室含有50mM NaCl时，在实验中记录电流。电流再一次在+40和+60mV之间逆转，接近Na⁺平衡电位，表明通道对Na⁺比对K⁺是更具通透性。

由P7所形成的通道受到5-(N，N-亚己基)氨氯吡咪(HMA)的阻断。

P7肽的加入产生了通道活性。向顺式小室中加入2μl的50μM HMA，然后搅拌，导致通道活性的消失。在4个实验中记录了由P7肽和100μMHMA产生的通道活性的阻断。在2个实验中，钠通道(500/50)受500μMHMA阻断。

当向顺式小室中(K溶液)加入10mM CaCl₂时，由P7肽产生的电流的逆转电压变为更负的电压，表明P_K/P_Cl比率降低。

当顺式小室含有500mM CaCl₂且反式小室含有50mM CaCl₂时，在约+20mV电压处看到了正的和负的电流，并且不可能确定逆转电位。

实施例46.HCV p7蛋白质的重组表达

通过GeneScript商业上合成了两种cDNA片段，每种编码对应于HCV-1a p7的氨基酸序列的相同的多肽。两cDNAs在核苷酸序列上不同，从而在一种cDNAs(“cDp7.coli”)中密码子经优化在大肠杆菌中表达p7蛋白质，而在另一种cDNAs(“cDp7.mam”)中密码子偏向于在哺乳动物细胞系中的表达。将cDp7.coli以BamHI/EcoRI片段的形式克隆进质粒pPL451用于大肠杆菌中的表达。将cDp7.mam克隆进载体(例如，pcDNA3.1、痘苗病毒、pfastBac-1)用于p7在哺乳动物细胞系中的表达。

实施例47.p7在Gag VLP出芽的增强中的作用

病毒样颗粒(VLP)从培养的Hela细胞中的出芽是由细胞中逆转录病毒Gag蛋白质的表达引起的，小的病毒离子通道例如M2、Vpu和6K与Gag蛋白质的共表达增强出芽。有趣地，病毒离子通道可增强异源病毒颗粒的出芽。因此，为评价p7造成的出芽增强，将它与HIV-1 Gag蛋白质在Hela细胞中共表达，并通过Gag ELISA测定VLP向培养基的释放。为实现此目的，将质粒pcDNAp7(如实施例20中所述的pcDNA3.1＝pcDp7.mam，p7在T7启动子的控制下表达)和pcDNAGag(在T7启动子的控制下表达的HIV-1 Gag蛋白质)共转染进用痘苗病毒株vTF7.3(表达T7 RNA聚合酶)感染的Hela细胞中，并在16小时孵育后收集培养上清液用于ELISA试验。

实施例48.化合物抑制p7离子通道功能活性的能力的试验

使用如实施例33-35中所述的检测p7离子通道功能活性的两种方法来测定化合物抑制p7通道的能力。在实施例33的情况中，测试化合物抑制平面脂双层中p7通道活性的能力。在实施例35的情况中，测试化合物减少从表达p7和HIV-1 Gag的细胞释放VLPs的数目的能力。

实施例49.用于筛选可能的HCV p7蛋白质离子通道阻断药物的细菌生物测定

HCV p7离子通道抑制细菌细胞生长

开发了细菌细胞中p7功能的生物测定。将编码p7的合成cDNA片段cDp7.coli克隆进表达质粒pPL451，产生载体pPLp7，其中p7表达是温度诱导性的，如实施例4中所述。观察到表达p7的大肠杆菌细胞在37℃下的生长抑制，其作为p7离子通道功能的指示剂，所述功能消除细菌细胞维持的正常Na⁺梯度。

实施例50.利用细菌生物测定对HCV p7蛋白质的化合物筛选

对特定药物的应用位点周围的生长晕圈——如实施例14中所述的——如实施例15所述的进行打分。

表16列出了在细菌生物测定中HCV p7蛋白质的抑制分数。

表16

实施例51.马动脉炎病毒(EAV)

用于测试化合物针对马动脉炎病毒(EAV)的复制的抗病毒试验

为确定化合物针对EAV(株Bucyrus；ATCC VR-796)复制的抗病毒活性，开发了测定EAV感染的BHK-21细胞(ATCC CCL-10)的单层中形成的噬斑数目降低的试验：在RK-13细胞(ATCC CCL-37)中扩增病毒原种，然后通过以大约5×10^-3pfu/细胞的MOI在37℃5％CO₂中暴露于病毒1小时，将此用于感染培养于6孔组织培养板中的BHK-21细胞的汇合的单层。移去受感染的接种物，并用MEM中的1％sea plaque覆盖层(Cambrex BioScience)将细胞覆盖，所述MEM含有10％FCS和10、5或1μM所要测试的化合物或者用于化合物的适当水平的溶剂(对照)。然后将平板在感染后在37℃(在5％CO₂中)孵育3天，在这段时间后移去培养上清液并用20％乙醇中的0.1％结晶紫溶液将细胞染色10分钟。计数所有孔中的噬斑并计算噬斑数目相对于溶剂对照的百分比减少。在一式两份或一式四份孔中进行测定。

实施例52.化合物在EAV抗病毒试验中的效果

根据实施例35中所述的方法筛选化合物抗EAV复制的活性。以IC50值表示的结果显示于表17中。

表17

化合物	IC50
		5-(N，N-亚己基)氨氯吡咪	7.5μM
(3-溴肉桂酰基)胍	10μM
		反式-3-(1-萘基)丙烯酰基胍	7.5μM
2-叔-丁基肉桂酰基胍	1μM

2-(环己-1-烯-1-基)肉桂酰基胍

10μM

实施例53 登革黄病毒(flavivirus)

登革病毒M蛋白质的肽合成

利用Fmoc方法合成了登革病毒I型株Singapore S275/90(Fu等人，1992)的M蛋白质的C-末端40个氨基酸(ALRHPGFTVIALFLAHAIGTSITQKGIIFILLMLVTPSMA)。该合成是在来自Protein Technologies Inc.(Tucson，亚利桑那州)的Symphony肽合成仪上完成的，用来给予C-末端酰胺，利用HBTU和N-甲基吡咯烷酮中的羟基苯并三唑进行偶联。每个合成循环使用双偶联和4倍过量的氨基酸。利用DMF中的20％哌啶除去暂时的α-N Fmoc-保护基。

实施例54.将登革M病毒蛋白质掺入脂双层

如别处所述的(Sunstrom，1996；Miller，1986)进行脂双层研究。使用了棕榈酰-油酰基-磷脂酰乙醇胺、棕榈酰-油酰基-磷脂酰丝氨酸、棕榈酰-油酰基-磷脂酰胆碱的脂质混合物(5∶3∶2)(Avanti Polar Lipids，Alabaster，亚拉巴马州)。将脂质混合物涂在1ml迭尔林杯壁中的150-200μm的孔上。该孔分隔两小室：顺式和反式，两个小室都含有不同浓度的盐溶液。将顺式小室接地并将反式小室连接Axopatch 200放大器的输入。通常顺式小室含有500mM KCl且反式含有50mM KCl。通过由电流变速产生的电流脉冲幅度来电学地监测双层形成。测定反式小室中相对于顺式的电压。将蛋白质加入顺式小室并搅拌直至看到通道活性。将蛋白质加入顺式小室并搅拌直至看到通道活性。在1000Hz过滤电流，在5000Hz将其数字化并储存于磁盘中。

将登革病毒M蛋白质C-末端肽(DMVC)以0.05mg/ml至1mg/ml溶解于2，2，2-三氟乙醇(TFE)中。将10μl的此溶液加入经搅拌的双层的顺式小室。在15-30分钟内看到通道活性。

实施例55：亚己基氨氯吡咪(HMA)抑制登革病毒M蛋白质C-末端肽的离子通道活性

通过首先制成DMSO中的500mM溶液来制备50mM HMA溶液。利用0.1M HCl将该溶液进一步稀释至50mM HMA。在看到通道活性后向顺式小室中加入2μl的50mM HMA。顺式小室中含有1ml的溶液，使得HMA的终浓度为100μM。

实施例56.用于测试化合物针对登革黄病毒抵抗细胞增殖的影响的抗病毒试验

利用细胞增殖试验来测试化合物在10、5、2.5、1.25和0.625μM下抗登革1株Hawaii的活性，所述细胞增殖试验测定登革病毒感染对LLC-MK2(猕猴肾脏细胞)增殖的影响。用预定量的病毒感染LLC-MK2细胞，滴定，使得受感染的培养物中的细胞增殖与未受感染的对照相比将显著减少。然后将受感染的细胞以1.5×10³个细胞每孔接种于96孔板中。将阴性对照(无病毒，无实验化合物)、阳性对照(病毒，无实验化合物)和细胞毒性对照(实验化合物，无病毒)与每个药物试验一起进行。允许培养物生长7天，然后将Alamar Blue——一种测定培养物代谢(red/ox)的荧光染料加入每种培养物并测定每种培养物的荧光值。将无实验化合物或病毒的阴性对照固定于100％。通过将它们的平均荧光计算为阴性对照的百分比来对阳性对照和含有化合物的培养物打分。对于每种实验条件测定至少6个重复的孔。

实施例57.化合物在登革抗病毒试验中的效果

表18

N.A.-不适用

实施例58：细菌试验和抗病毒试验之间的正相关性

实施例58.1 Vpu细菌试验和抗-HIV-1数据之间的正相关

进行了相关性研究来测定赋予Vpu细菌试验中化合物的活性分数与抗病毒试验中这些化合物抑制HIV-1的能力之间的相关性。

实施例58.2方法学

将代表多种经取代酰基胍的12种化合物的p24-抗原数据与在Vpu细菌试验中那些化合物所获得的活性分数相比较。最初将来自每个试验的数据对于有效性进行等级排序。Vpu细菌试验的等级次序从所有活性分数来确定，最高分数表明最高有效性。基于在测试的所有药物浓度下培养上清液中所测定的p24抗原的总平均值来确定抗HIV-1试验的等级次序，最低分表明最高有效性。然后通过产生斯皮尔曼等级(SpearmaN’s Rank)相关系数，将所产生的两个等级次序在统计学上进行比较。

实施例58.3.结果和结论

斯皮尔曼等级相关系数是0.785，其通过与临界值(对于n＝12)的统计表相比较，表明两个等级次序是显著正相关的(P＜0.01)(表19a)。

另外，Vpu细菌试验等级次序与是/不是分数的不同比较将“是”组的化合物与通过细菌试验的前6个化合物排列在一起，所述是/不是分数针对是否该抗病毒数据表明p24减少至少一数量级(表19b)。

这些结果表明，在根据本发明所进行的细菌试验和抗病毒试验之间存在正相关。细菌试验可能因此成为在筛选显示抗病毒活性的化合物中的有用工具。

表19a.12种经取代的酰基胍在Vpu细菌试验和抗HIV试验中的功效的等级次序比较。

表19b.

通过p24等级次序排序的化合物	Vpu细菌分数	细菌试验等级次序	在p24试验中看到至少1×log减少？
				(3-溴肉桂酰基)胍	4.3	1	是
3-(三氟甲基)肉桂酰基胍	3.7	2	是
				3-甲基肉桂酰基胍	3.4	3	是
肉桂酰基胍	3.0	4	是
				反式-3-(1-萘基)丙烯酰基胍	2.9	5.5	是
6-甲氧基-2-萘甲酰基胍	2.9	5.5	是
				4-苯基苯甲酰基胍	2.8	7	不是
(5-苯基-戊-2，4-二烯酰基)胍	2.6	8	不是
				N-(3-苯基丙酰基)-N’-苯基胍	2.2	9	不是
亚己基氨氯吡咪	1.9	10	不是
				2-(2-萘基)乙酰基胍	1.2	11	不是
(反式-2-苯基环丙烷羰基)胍	0.4	12	不是

实施例58.4.MHV噬斑形成的百分比抑制与MHV-E细菌生物测定分数之间的相关性

在小鼠肝炎病毒E-蛋白质细菌生物测定中测试时赋予化合物的活性分数与这些化合物在小鼠肝炎病毒噬斑试验中所显示的百分比抑制之间看到了正相关性。

实施例58.5.方法：

将所筛选的96种化合物的MHV噬斑减少活性数据从最高至最低百分比噬斑减少排序，并将等级次序分配给化合物的列表。针对由暴露至10μM和1μM浓度的化合物所产生的数据来进行这项工作，产生了两个等级次序列表。类似地，对于相同的96种化合物的MHVE细菌生物测定分数产生等级次序列表。在一种或多种化合物具有相同分数时，将对于那一组的等级值平均。

将斯皮尔曼的统计检验[如“Mathematical Statistics withApplications”(第二版)：Mendenhall，W.，Scheaffer，RL.，& Wackerly，DD.Duxbury Press，Boston Massachusetts-1981中所述的]用于比较等级次序。简要地，这包括计算每种化合物的等级值间差异的平方和(SS)，然后根据公式Rs＝1-(6.SS/n(n²-1))产生斯皮尔曼等级相关系数(Rs)，此处n是所排列的化合物的数目(在此情况中是96)。然后将Rs与临界值表相比较来确定统计学显著性(P值)。

实施例58.6.结果总结：

此表概述了所示的等级次序间的成对比较所产生的Rs和P值。

表20

实施例58.7.结论：

在细菌生物测定中所测定的96种化合物的等级次序比较和抗病毒试验表明，所测试化合物的MHVE细菌试验等级次序与由MHV噬斑减少试验所产生的等级次序是显著正相关的。试验中的显著相关性高度预示着任一试验可用于鉴定那些可能有用的化合物。细菌试验可以因而成为在筛选呈现抗病毒活性的化合物中的有用工具。

实施例58.8.229E噬斑形成的百分比抑制与229E-E细菌生物测定分数之间的相关性

在人冠状病毒229E E-蛋白质细菌生物测定中测试时赋予化合物的活性分数与这些化合物在人冠状病毒229E噬斑试验中所显示的百分比抑制之间看到了正相关性。

实施例58.9.方法：

将针对2.5μM化合物浓度所筛选的97种化合物的229E噬斑减少活性数据从最高至最低百分比噬斑减少进行排序，并将等级次序赋予化合物的列表。类似地，对于相同的97种化合物，对229E E细菌生物测定分数产生了等级次序列表。在一种或多种化合物具有相同分数时，将对于那一组的等级值平均。

将斯皮尔曼的统计检验[如“Mathematical Statistics withApplications”(第二版)：Mendenhall，W.，Scheaffer，RL.，& Wackerly，DD.Duxbury Press，Boston Massachusetts-1981中所述的]用于比较等级次序。简要地，这包括计算每种化合物的等级值间差异的平方和(SS)，然后根据公式Rs＝1-(6.SS/n(n²-1))产生斯皮尔曼等级相关系数(Rs)，此处n是所排列的化合物的数目(在此情况中是97)。然后将Rs与临界值的表相比较来确定统计学显著性(P值)。

实施例58.9.1.结果和结论的总结：

此表概述了所示的等级次序间的成对比较所产生的Rs和P值。

表21

上面的结果表明对于所测试化合物，229E细菌试验等级次序与由229E噬斑减少试验所产生的等级次序是显著正相关的。此结果结合实施例49.1和49.4中所显示的结果，提供了强有力的证据证明任一试验均可用于鉴定可能有用的化合物。细菌试验可以因而成为在筛选呈现抗病毒活性的化合物中的有用工具。

本领域的技术人员将理解，此处所描述的本发明可以受到变通方案和修改，所述变通方案和修改不同于本文具体描述的那些。将理解本发明包括所有此类变通方案和修改。本发明还单独或一起包括在此说明书中所涉及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任意两个或更多所述步骤或特征的任意和所有组合。

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Claims

1.式I的抗病毒化合物

或其药学上可接受的盐，

其中，

R₂、R₃和R₄独立地为氢、

且其中

R_k＝氢、卤、C_1-5烷基、C_1-5烷氧基、羟基、或

R_j＝氢、卤、C_1-5烷基、C_1-5烷氧基、羟基、或

2.药物组合物，其包含根据权利要求1的抗病毒化合物，和任选地一种或多种药学上可接受的载体。

3.根据权利要求2的药物组合物，其还包含一种或多种已知的抗病毒分子。

4.根据权利要求1的化合物用于生产降低、延缓或抑制在受病毒感染或暴露于所述病毒的细胞中所述病毒的生长和/或复制的药物的用途。

5.根据权利要求4的用途，其中所述病毒是慢病毒。

6.根据权利要求5的用途，其中所述慢病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。

7.根据权利要求6的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

2-萘甲酰基胍、

N-(6-羟基-2-萘甲酰基)-N’-苯基胍、和

1-溴-2-萘甲酰基胍。

8.根据权利要求6的用途，其中所述HIV是HIV-1。

9.根据权利要求4的用途，其中所述病毒是冠状病毒。

10.根据权利要求9的用途，其中所述冠状病毒是严重急性呼吸综合征病毒(SARS)。

11.根据权利要求10的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

2-萘甲酰基胍、

N-(6-羟基-2-萘甲酰基)-N’-苯基胍、

N，N’-双(脒基)萘-2，6-二甲酰胺、

6-溴-2-萘甲酰基胍、

1-溴-2-萘甲酰基胍、和

N-(2-萘甲酰基)-N’-苯基胍。

12.根据权利要求10的用途，其中所述化合物是6-甲氧基-2-萘甲酰基胍。

13.根据权利要求9的用途，其中所述冠状病毒是人冠状病毒229E。

14.根据权利要求13的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

2-萘甲酰基胍、

N，N’-双(脒基)萘-2，6-二甲酰胺、和

N-(2-萘甲酰基)-N’-苯基胍。

15.根据权利要求13的用途，其中所述化合物选自：

N，N’-双(脒基)萘-2，6-二甲酰胺、

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、和

2-萘甲酰基胍。

16.根据权利要求9的用途，其中所述冠状病毒是人冠状病毒OC43。

17.根据权利要求16的用途，其中所述化合物是

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍。

18.根据权利要求9的用途，其中所述冠状病毒是猪呼吸冠状病毒(PRCV)。

19.根据权利要求18的用途，其中所述化合物是

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍。

20.根据权利要求9的用途，其中所述冠状病毒是牛冠状病毒(BCV)。

21.根据权利要求20的用途，其中所述化合物是：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍。

22.根据权利要求9的用途，其中所述冠状病毒是选自犬肠道冠状病毒株INSAVC-1、犬肠道冠状病毒株K378、猫肠道冠状病毒株79-1863、猫传染性腹膜炎病毒FIPV、马冠状病毒NC99、猪呼吸冠状病毒、猪传染性肠胃炎冠状病毒株FS772/70、猪传染性肠胃炎冠状病毒株Miller、猪传染性肠胃炎冠状病毒株Neb72-RT、猪传染性肠胃炎冠状病毒株PURDUE、牛冠状病毒株F15、牛冠状病毒株G95、牛冠状病毒株L9、牛冠状病毒株LSU-94LSS-051、牛冠状病毒株LY-138、牛冠状病毒株MEBUS、牛冠状病毒株OK-0514-3、牛冠状病毒株Ontario、牛冠状病毒株QUEBEC、牛冠状病毒株VACCINE、牛肠道冠状病毒株98TXSF-110-ENT、犬呼吸冠状病毒、鸡肠道冠状病毒、鼠冠状病毒株DVIM、鼠肝炎病毒株A59、鼠肝炎病毒株JHM、鼠肝炎病毒株S、鼠肝炎病毒株1、鼠肝炎病毒株2、鼠肝炎病毒株3、鼠肝炎病毒株4、鼠肝炎病毒株ML-11、猪血凝脑脊髓炎病毒株67N、猪血凝脑脊髓炎病毒株IAF-404、Puffinosis病毒、大鼠冠状病毒株681、大鼠冠状病毒株NJ、大鼠sialodacryoadenitis冠状病毒、火鸡冠状病毒株Indiana、火鸡冠状病毒株Minnesota、火鸡冠状病毒株NC95、鸟传染性支气管炎病毒株6/82、鸟传染性支气管炎病毒株Arkansas99、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette CK、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette M42、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette US、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette、鸟传染性支气管炎病毒株D1466、鸟传染性支气管炎病毒株D274、鸟传染性支气管炎病毒株D3896、鸟传染性支气管炎病毒株D41、鸟传染性支气管炎病毒株DE072、鸟传染性支气管炎病毒株GRAY、鸟传染性支气管炎病毒株H120、鸟传染性支气管炎病毒株H52、鸟传染性支气管炎病毒株KB8523、鸟传染性支气管炎病毒株M41、鸟传染性支气管炎病毒株PORTUGAL/322/82、鸟传染性支气管炎病毒株SAIB20、鸟传染性支气管炎病毒株UK/123/82、鸟传染性支气管炎病毒株UK/142/86、鸟传染性支气管炎病毒株UK/167/84、鸟传染性支气管炎病毒株UK/183/66、鸟传染性支气管炎病毒株UK/68/84、鸟传染性支气管炎病毒株V18/91、鸟传染性支气管炎病毒株Vic S、鸟传染性喉气管炎病毒、SARS冠状病毒Beijing ZY-2003、SARS冠状病毒BJ01、SARS冠状病毒BJ02、SARS冠状病毒BJ03、SARS冠状病毒BJ04、SARS冠状病毒CUHK-Su10、SARS冠状病毒CUHK-W1、SARS冠状病毒Frankfurt1、SARS冠状病毒GZ01、SARS冠状病毒HKU-39849、SARS冠状病毒HongKong ZY-2003、SARS冠状病毒Hong Kong/03/2003、SARS冠状病毒HSR1、SARS冠状病毒Sin2500、SARS冠状病毒Sin2677、SARS冠状病毒Sin2679、SARS冠状病毒Sin2748、SARS冠状病毒Sin2774、SARS冠状病毒Taiwan、SARS冠状病毒Taiwan JC-2003、SARS冠状病毒TaiwanTC1、SARS冠状病毒Taiwan TC2、SARS冠状病毒Tor2、SARS冠状病毒TW1、SARS冠状病毒TWC、SARS冠状病毒Urbani、SARS冠状病毒Vietnam、SARS冠状病毒ZJ-HZ01、SARS冠状病毒ZJ01、牛呼吸冠状病毒株98TXSF-110-LUN、人肠道冠状病毒4408、猪流行性腹泻病毒株Br1/87、和猪流行性腹泻病毒株CV777的已知冠状病毒分离物的任意一种。

23.根据权利要求4的用途，其中所述病毒是丙型肝炎病毒。

24.根据权利要求23的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

N-(6-羟基-2-萘甲酰基)-N’-苯基胍、

2-萘甲酰基胍、和

1-溴-2-萘甲酰基胍。

25.根据权利要求4的用途，其中所述病毒是马动脉炎病毒。

26.根据权利要求4至25任意一项的用途，其中以根据权利要求2或权利要求3的药物组合物提供所述化合物。

27.根据权利要求1的化合物用于生产防止暴露于病毒的细胞感染的药物的用途。

28.根据权利要求27的用途，其中所述病毒是慢病毒。

29.根据权利要求28的用途，其中所述慢病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。

30.根据权利要求29的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

2-萘甲酰基胍、

N-(6-羟基-2-萘甲酰基)-N’-苯基胍、和

1-溴-2-萘甲酰基胍。

31.根据权利要求29的用途，其中所述HIV是HIV-1。

32.根据权利要求27的用途，其中所述病毒是冠状病毒。

33.根据权利要求32的用途，其中所述冠状病毒是严重急性呼吸综合征病毒(SARS)。

34.根据权利要求33的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

2-萘甲酰基胍、

N-(6-羟基-2-萘甲酰基)-N’-苯基胍、

N，N’-双(脒基)萘-2，6-二甲酰胺、

6-溴-2-萘甲酰基胍、

1-溴-2-萘甲酰基胍、和

N-(2-萘甲酰基)-N’-苯基胍。

35.根据权利要求33的用途，其中所述化合物是6-甲氧基-2-萘甲酰基胍。

36.根据权利要求32的用途，其中所述冠状病毒是人冠状病毒229E。

37.根据权利要求36的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

2-萘甲酰基胍、

N，N’-双(脒基)萘-2，6-二甲酰胺、和

N-(2-萘甲酰基)-N’-苯基胍。

38.根据权利要求36的用途，其中所述化合物选自：

N，N’-双(脒基)萘-2，6-二甲酰胺、

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、和

2-萘甲酰基胍。

39.根据权利要求32的用途，其中所述冠状病毒是人冠状病毒OC43。

40.根据权利要求39的用途，其中所述化合物是

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍。

41.根据权利要求32的用途，其中所述冠状病毒是猪呼吸冠状病毒(PRCV)。

42.根据权利要求41的用途，其中所述化合物是

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍。

43.根据权利要求32的用途，其中所述冠状病毒是牛冠状病毒(BCV)。

44.根据权利要求43的用途，其中所述化合物是

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍。

45.根据权利要求32的用途，其中所述冠状病毒是选自犬肠道冠状病毒株INSAVC-1、犬肠道冠状病毒株K378、猫肠道冠状病毒株79-1863、猫传染性腹膜炎病毒FIPV、马冠状病毒NC99、猪呼吸冠状病毒、猪传染性肠胃炎冠状病毒株FS772/70、猪传染性肠胃炎冠状病毒株Miller、猪传染性肠胃炎冠状病毒株Neb72-RT、猪传染性肠胃炎冠状病毒株PURDUE、牛冠状病毒株F15、牛冠状病毒株G95、牛冠状病毒株L9、牛冠状病毒株LSU-94LSS-051、牛冠状病毒株LY-138、牛冠状病毒株MEBUS、牛冠状病毒株OK-0514-3、牛冠状病毒株Ontario、牛冠状病毒株QUEBEC、牛冠状病毒株VACCINE、牛肠道冠状病毒株98TXSF-110-ENT、犬呼吸冠状病毒、鸡肠道冠状病毒、鼠冠状病毒株DVIM、鼠肝炎病毒株A59、鼠肝炎病毒株JHM、鼠肝炎病毒株S、鼠肝炎病毒株1、鼠肝炎病毒株2、鼠肝炎病毒株3、鼠肝炎病毒株4、鼠肝炎病毒株ML-11、猪血凝脑脊髓炎病毒株67N、猪血凝脑脊髓炎病毒株IAF-404、Puffinosis病毒、大鼠冠状病毒株681、大鼠冠状病毒株NJ、大鼠sialodacryoadenitis冠状病毒、火鸡冠状病毒株Indiana、火鸡冠状病毒株Minnesota、火鸡冠状病毒株NC95、鸟传染性支气管炎病毒株6/82、鸟传染性支气管炎病毒株Arkansas99、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette CK、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette M42、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette US、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette、鸟传染性支气管炎病毒株D1466、鸟传染性支气管炎病毒株D274、鸟传染性支气管炎病毒株D3896、鸟传染性支气管炎病毒株D41、鸟传染性支气管炎病毒株DE072、鸟传染性支气管炎病毒株GRAY、鸟传染性支气管炎病毒株H120、鸟传染性支气管炎病毒株H52、鸟传染性支气管炎病毒株KB8523、鸟传染性支气管炎病毒株M41、鸟传染性支气管炎病毒株PORTUGAL/322/82、鸟传染性支气管炎病毒株SAIB20、鸟传染性支气管炎病毒株UK/123/82、鸟传染性支气管炎病毒株UK/142/86、鸟传染性支气管炎病毒株UK/167/84、鸟传染性支气管炎病毒株UK/183/66、鸟传染性支气管炎病毒株UK/68/84、鸟传染性支气管炎病毒株V18/91、鸟传染性支气管炎病毒株Vic S、鸟传染性喉气管炎病毒、SARS冠状病毒Beijing ZY-2003、SARS冠状病毒BJ01、SARS冠状病毒 BJ02、SARS冠状病毒BJ03、SARS冠状病毒BJ04、SARS冠状病毒CUHK-Su10、SARS冠状病毒CUHK-W1、SARS冠状病毒Frankfurt1、SARS冠状病毒GZ01、SARS冠状病毒HKU-39849、SARS冠状病毒HongKong ZY-2003、SARS冠状病毒Hong Kong/03/2003、SARS冠状病毒HSR1、SARS冠状病毒Sin2500、SARS冠状病毒Sin2677、SARS冠状病毒Sin2679、SARS冠状病毒Sin2748、SARS冠状病毒Sin2774、SARS冠状病毒Taiwan、SARS冠状病毒Taiwan JC-2003、SARS冠状病毒TaiwanTC1、SARS冠状病毒Taiwan TC2、SARS冠状病毒Tor2、SARS冠状病毒TW1、SARS冠状病毒TWC、SARS冠状病毒Urbani、SARS冠状病毒Vietnam、SARS冠状病毒ZJ-HZ01、SARS冠状病毒ZJ01、牛呼吸冠状病毒株98TXSF-110-LUN、人肠道冠状病毒4408、猪流行性腹泻病毒株Br1/87、和猪流行性腹泻病毒株CV777的已知冠状病毒分离物的任意一种。

46.根据权利要求27的用途，其中所述病毒是丙型肝炎病毒。

47.根据权利要求46的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

N-(6-羟基-2-萘甲酰基)-N’-苯基胍、

2-萘甲酰基胍、和

1-溴-2-萘甲酰基胍。

48.根据权利要求27的用途，其中所述病毒是马动脉炎病毒。

49.根据权利要求27至48任意一项的用途，其中以根据权利要求2或权利要求3的药物组合物提供所述化合物。

50.根据权利要求1的化合物用于生产治疗感染或暴露于病毒的受试者的药物的用途。

51.根据权利要求50的用途，其中所述病毒是慢病毒。

52.根据权利要求51的用途，其中所述慢病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。

53.根据权利要求52的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

2-萘甲酰基胍、

N-(6-羟基-2-萘甲酰基)-N’-苯基胍、和

1-溴-2-萘甲酰基胍。

54.根据权利要求52的用途，其中所述HIV是HIV-1。

55.根据权利要求50的用途，其中所述病毒是冠状病毒。

56.根据权利要求55的用途，其中所述冠状病毒是严重急性呼吸综合征病毒(SARS)。

57.根据权利要求56的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

2-萘甲酰基胍、

N-(6-羟基-2-萘甲酰基)-N’-苯基胍、

N，N’-双(脒基)萘-2，6-二甲酰胺、

6-溴-2-萘甲酰基胍、

1-溴-2-萘甲酰基胍、和

N-(2-萘甲酰基)-N’-苯基胍。

58.根据权利要求56的用途，其中所述化合物是6-甲氧基-2-萘甲酰基胍。

59.根据权利要求55的用途，其中所述冠状病毒是人冠状病毒229E。

60.根据权利要求59的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

2-萘甲酰基胍、

N，N’-双(脒基)萘-2，6-二甲酰胺、和

N-(2-萘甲酰基)-N’-苯基胍。

61.根据权利要求59的用途，其中所述化合物选自：

N，N’-双(脒基)萘-2，6-二甲酰胺、

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、和

2-萘甲酰基胍。

62.根据权利要求55的用途，其中所述冠状病毒是人冠状病毒 OC43。

63.根据权利要求62的用途，其中所述化合物是

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍。

64.根据权利要求55的用途，其中所述冠状病毒是猪呼吸冠状病毒(PRCV)。

65.根据权利要求64的用途，其中所述化合物是

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍。

66.根据权利要求55的用途，其中所述冠状病毒是牛冠状病毒(BCV)。

67.根据权利要求66的用途，其中所述化合物是

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍。

68.根据权利要求55的用途，其中所述冠状病毒是选自犬肠道冠状病毒株INSAVC-1、犬肠道冠状病毒株K378、猫肠道冠状病毒株79-1863、猫传染性腹膜炎病毒FIPV、马冠状病毒NC99、猪呼吸冠状病毒、猪传染性肠胃炎冠状病毒株FS772/70、猪传染性肠胃炎冠状病毒株Miller、猪传染性肠胃炎冠状病毒株Neb72-RT、猪传染性肠胃炎冠状病毒株PURDUE、牛冠状病毒株F15、牛冠状病毒株G95、牛冠状病毒株L9、牛冠状病毒株LSU-94LSS-051、牛冠状病毒株LY-138、牛冠状病毒株MEBUS、牛冠状病毒株OK-0514-3、牛冠状病毒株Ontario、牛冠状病毒株QUEBEC、牛冠状病毒株VACCINE、牛肠道冠状病毒株98TXSF-110-ENT、犬呼吸冠状病毒、鸡肠道冠状病毒、鼠冠状病毒株DVIM、鼠肝炎病毒株A59、鼠肝炎病毒株JHM、鼠肝炎病毒株S、鼠肝炎病毒株1、鼠肝炎病毒株2、鼠肝炎病毒株3、鼠肝炎病毒株4、鼠肝炎病毒株ML-11、猪血凝脑脊髓炎病毒株67N、猪血凝脑脊髓炎病毒株IAF-404、Puffinosis病毒、大鼠冠状病毒株681、大鼠冠状病毒株NJ、大鼠sialodacryoadenitis冠状病毒、火鸡冠状病毒株Indiana、火鸡冠状病毒株Minnesota、火鸡冠状病毒株NC95、鸟传染性支气管炎病毒株6/82、鸟传染性支气管炎病毒株Arkansas99、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette CK、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette M42、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette US、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette、鸟传染性支气管炎病毒株D1466、鸟传染性支气管炎病毒株D274、鸟传染性支气管炎病毒株D3896、鸟传染性支气管炎病毒株D41、鸟传染性支气管炎病毒株DE072、鸟传染性支气管炎病毒株GRAY、鸟传染性支气管炎病毒株H120、鸟传染性支气管炎病毒株H52、鸟传染性支气管炎病毒株KB8523、鸟传染性支气管炎病毒株M41、鸟传染性支气管炎病毒株PORTUGAL/322/82、鸟传染性支气管炎病毒株SAIB20、鸟传染性支气管炎病毒株UK/123/82、鸟传染性支气管炎病毒株UK/142/86、鸟传染性支气管炎病毒株UK/167/84、鸟传染性支气管炎病毒株UK/183/66、鸟传染性支气管炎病毒株UK/68/84、鸟传染性支气管炎病毒株V18/91、鸟传染性支气管炎病毒株Vic S、鸟传染性喉气管炎病毒、SARS冠状病毒Beijing ZY-2003、SARS冠状病毒BJ01、SARS冠状病毒BJ02、SARS冠状病毒BJ03、SARS冠状病毒BJ04、SARS冠状病毒CUHK-Su10、SARS冠状病毒CUHK-W1、SARS冠状病毒Frankfurt1、SARS冠状病毒GZ01、SARS冠状病毒HKU-39849、SARS冠状病毒HongKong ZY-2003、SARS冠状病毒Hong Kong/03/2003、SARS冠状病毒HSR1、SARS冠状病毒Sin2500、SARS冠状病毒Sin2677、SARS冠状病毒Sin2679、SARS冠状病毒Sin2748、SARS冠状病毒Sin2774、SARS冠状病毒Taiwan、SARS冠状病毒Taiwan JC-2003、SARS冠状病毒TaiwanTC1、SARS冠状病毒Taiwan TC2、SARS冠状病毒Tor2、SARS冠状病毒TW1、SARS冠状病毒TWC、SARS冠状病毒Urbani、SARS冠状病毒Vietnam、SARS冠状病毒ZJ-HZ01、SARS冠状病毒ZJ01、牛呼吸冠状病毒株98TXSF-110-LUN、人肠道冠状病毒4408、猪流行性腹泻病毒株Br1/87、和猪流行性腹泻病毒株CV777的已知冠状病毒分离物的任意一种。

69.根据权利要求50的用途，其中所述病毒是丙型肝炎病毒。

70.根据权利要求69的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

N-(6-羟基-2-萘甲酰基)-N’-苯基胍、

2-萘甲酰基胍、和

1-溴-2-萘甲酰基胍。

71.根据权利要求50的用途，其中所述病毒是马动脉炎病毒。

72.根据权利要求50至71任意一项的用途，其中以根据权利要求2或权利要求3的药物组合物提供所述化合物。

73.根据权利要求1的化合物用于生产下调受病毒感染的细胞中膜离子通道功能活性的药物的用途。

74.根据权利要求73的用途，其中所述病毒是慢病毒。

75.根据权利要求74的用途，其中所述慢病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。

76.根据权利要求75的用途，其中所述膜离子通道是HIV Vpu膜离子通道。

77.根据权利要求76的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

2-萘甲酰基胍、

N-(6-羟基-2-萘甲酰基)-N’-苯基胍、和

1-溴-2-萘甲酰基胍。

78.根据权利要求75的用途，其中所述HIV是HIV-1。

79.根据权利要求73的用途，其中所述病毒是冠状病毒。

80.根据权利要求79的用途，其中所述膜离子通道是冠状病毒E蛋白质。

81.根据权利要求80的用途，其中所述冠状病毒是严重急性呼吸综合征病毒(SARS)。

82.根据权利要求81的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

2-萘甲酰基胍、

N-(6-羟基-2-萘甲酰基)-N’-苯基胍、

N，N’-双(脒基)萘-2，6-二甲酰胺、

6-溴-2-萘甲酰基胍、

1-溴-2-萘甲酰基胍、和

N-(2-萘甲酰基)-N’-苯基胍。

83.根据权利要求80的用途，其中所述冠状病毒是人冠状病毒229E。

84.根据权利要求83的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

2-萘甲酰基胍、和

N，N’-双(脒基)萘-2，6-二甲酰胺。

85.根据权利要求80的用途，其中所述冠状病毒是选自犬肠道冠状病毒株INSAVC-1、犬肠道冠状病毒株K378、猫肠道冠状病毒株79-1863、猫传染性腹膜炎病毒FIPV、马冠状病毒NC99、猪呼吸冠状病毒、猪传染性肠胃炎冠状病毒株FS772/70、猪传染性肠胃炎冠状病毒株Miller、猪传染性肠胃炎冠状病毒株Neb72-RT、猪传染性肠胃炎冠状病毒株PURDUE、牛冠状病毒株F15、牛冠状病毒株G95、牛冠状病毒株L9、牛冠状病毒株LSU-94LSS-051、牛冠状病毒株LY-138、牛冠状病毒株MEBUS、牛冠状病毒株OK-0514-3、牛冠状病毒株Ontario、牛冠状病毒株QUEBEC、牛冠状病毒株VACCINE、牛肠道冠状病毒株98TXSF-110-ENT、犬呼吸冠状病毒、鸡肠道冠状病毒、鼠冠状病毒株DVIM、鼠肝炎病毒株A59、鼠肝炎病毒株JHM、鼠肝炎病毒株S、鼠肝炎病毒株1、鼠肝炎病毒株2、鼠肝炎病毒株3、鼠肝炎病毒株4、鼠肝炎病毒株ML-11、猪血凝脑脊髓炎病毒株67N、猪血凝脑脊髓炎病毒株IAF-404、Puffinosis病毒、大鼠冠状病毒株681、大鼠冠状病毒株NJ、大鼠sialodacryoadenitis冠状病毒、火鸡冠状病毒株Indiana、火鸡冠状病毒株Minnesota、火鸡冠状病毒株NC95、鸟传染性支气管炎病毒株6/82、鸟传染性支气管炎病毒株Arkansas99、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette CK、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette M42、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette US、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette、鸟传染性支气管炎病毒株D1466、鸟传染性支气管炎病毒株D274、鸟传染性支气管炎病毒株D3896、鸟传染性支气管炎病毒株D41、鸟传染性支气管炎病毒株DE072、鸟传染性支气管炎病毒株GRAY、鸟传染性支气管炎病毒株H120、鸟传染性支气管炎病毒株H52、鸟传染性支气管炎病毒株KB8523、鸟传染性支气管炎病毒株M41、鸟传染性支气管炎病毒株PORTUGAL/322/82、鸟传染性支气管炎病毒株SAIB20、鸟传染性支气管炎病毒株UK/123/82、鸟传染性支气管炎病毒株UK/142/86、鸟传染性支气管炎病毒株UK/167/84、鸟传染性支气管炎病毒株UK/183/66、鸟传染性支气管炎病毒株UK/68/84、鸟传染性支气管炎病毒株V18/91、鸟传染性支气管炎病毒株Vic S、鸟传染性喉气管炎病毒、SARS冠状病毒Beijing ZY-2003、SARS冠状病毒BJ01、SARS冠状病毒BJ02、SARS冠状病毒BJ03、SARS冠状病毒BJ04、SARS冠状病毒CUHK-Su10、SARS冠状病毒CUHK-W1、SARS冠状病毒Frankfurt1、SARS冠状病毒GZ01、SARS冠状病毒HKU-39849、SARS冠状病毒HongKong ZY-2003、SARS冠状病毒Hong Kong/03/2003、SARS冠状病毒HSR1、SARS冠状病毒Sin2500、SARS冠状病毒Sin2677、SARS冠状病毒Sin2679、SARS冠状病毒Sin2748、SARS冠状病毒Sin2774、SARS冠状病毒Taiwan、SARS冠状病毒Taiwan JC-2003、SARS冠状病毒TaiwanTC1、SARS冠状病毒Taiwan TC2、SARS冠状病毒Tor2、SARS冠状病毒TW1、SARS冠状病毒TWC、SARS冠状病毒Urbani、SARS冠状病毒Vietnam、SARS冠状病毒ZJ-HZ01、SARS冠状病毒ZJ01、牛呼吸冠状病毒株98TXSF-110-LUN、人肠道冠状病毒4408、猪流行性腹泻病毒株Br1/87、和猪流行性腹泻病毒株CV777的已知冠状病毒分离物的任意一种。

86.根据权利要求73的用途，其中所述病毒是丙型肝炎病毒。

87.根据权利要求86的用途，其中所述膜离子通道是丙型肝炎病毒p7膜离子通道。

88.根据权利要求87的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

N-(6-羟基-2-萘甲酰基)-N’-苯基胍、

2-萘甲酰基胍、和

1-溴-2-萘甲酰基胍。

89.根据权利要求73至88任意一项的用途，其中以根据权利要求2或权利要求3的药物组合物提供所述化合物。

90.根据权利要求1的化合物用于生产降低、延缓或抑制感染细胞的病毒的生长和/或复制的药物的用途，其中所述化合物下调来源于所述病毒和表达于所述受感染的细胞中的膜离子通道的功能活性。

91.根据权利要求90的用途，其中所述病毒是慢病毒。

92.根据权利要求91的用途，其中所述慢病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。

93.根据权利要求92的用途，其中所述膜离子通道是HIV Vpu膜离子通道。

94.根据权利要求93的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

2-萘甲酰基胍、

N-(6-羟基-2-萘甲酰基)-N’-苯基胍、和

1-溴-2-萘甲酰基胍。

95.根据权利要求92的用途，其中所述HIV是HIV-1。

96.根据权利要求90的用途，其中所述病毒是冠状病毒。

97.根据权利要求96的用途，其中所述膜离子通道是冠状病毒E蛋白质。

98.根据权利要求97的用途，其中所述冠状病毒是严重急性呼吸综合征病毒(SARS)。

99.根据权利要求98的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

2-萘甲酰基胍、

N-(6-羟基-2-萘甲酰基)-N’-苯基胍、

N，N’-双(脒基)萘-2，6-二甲酰胺、

6-溴-2-萘甲酰基胍、

1-溴-2-萘甲酰基胍、和

N-(2-萘甲酰基)-N’-苯基胍。

100.根据权利要求97的用途，其中所述冠状病毒是人冠状病毒229E。

101.根据权利要求100的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

2-萘甲酰基胍、和

N，N’-双(脒基)萘-2，6-二甲酰胺。

102.根据权利要求97的用途，其中所述冠状病毒是选自犬肠道冠状病毒株INSAVC-1、犬肠道冠状病毒株K378、猫肠道冠状病毒株79-1863、猫传染性腹膜炎病毒FIPV、马冠状病毒NC99、猪呼吸冠状病毒、猪传染性肠胃炎冠状病毒株FS772/70、猪传染性肠胃炎冠状病毒株Miller、猪传染性肠胃炎冠状病毒株Neb72-RT、猪传染性肠胃炎冠状病毒株PURDUE、牛冠状病毒株F15、牛冠状病毒株G95、牛冠状病毒株L9、牛冠状病毒株LSU-94LSS-051、牛冠状病毒株LY-138、牛冠状病毒株MEBUS、牛冠状病毒株OK-0514-3、牛冠状病毒株Ontario、牛冠状病毒株QUEBEC、牛冠状病毒株VACCINE、牛肠道冠状病毒株98TXSF-110-ENT、犬呼吸冠状病毒、鸡肠道冠状病毒、鼠冠状病毒株DVIM、鼠肝炎病毒株A59、鼠肝炎病毒株JHM、鼠肝炎病毒株S、鼠肝炎病毒株1、鼠肝炎病毒株2、鼠肝炎病毒株3、鼠肝炎病毒株4、鼠肝炎病毒株ML-11、猪血凝脑脊髓炎病毒株67N、猪血凝脑脊髓炎病毒株IAF-404、Puffinosis病毒、大鼠冠状病毒株681、大鼠冠状病毒株NJ、大鼠sialodacryoadenitis冠状病毒、火鸡冠状病毒株Indiana、火鸡冠状病毒株Minnesota、火鸡冠状病毒株NC95、鸟传染性支气管炎病毒株6/82、鸟传染性支气管炎病毒株Arkansas99、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette CK、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette M42、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette US、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette、鸟传染性支气管炎病毒株D1466、鸟传染性支气管炎病毒株D274、鸟传染性支气管炎病毒株D3896、鸟传染性支气管炎病毒株D41、鸟传染性支气管炎病毒株DE072、鸟传染性支气管炎病毒株GRAY、鸟传染性支气管炎病毒株H120、鸟传染性支气管炎病毒株H52、鸟传染性支气管炎病毒株KB8523、鸟传染性支气管炎病毒株M41、鸟传染性支气管炎病毒株PORTUGAL/322/82、鸟传染性支气管炎病毒株SAIB20、鸟传染性支气管炎病毒株UK/123/82、鸟传染性支气管炎病毒株UK/142/86、鸟传染性支气管炎病毒株UK/167/84、鸟传染性支气管炎病毒株UK/183/66、鸟传染性支气管炎病毒株UK/68/84、鸟传染性支气管炎病毒株V18/91、鸟传染性支气管炎病毒株Vic S、鸟传染性喉气管炎病毒、SARS冠状病毒Beijing ZY-2003、SARS冠状病毒BJ01、SARS冠状病毒BJ02、SARS冠状病毒BJ03、SARS冠状病毒BJ04、SARS冠状病毒CUHK-Su10、SARS冠状病毒CUHK-W1、SARS冠状病毒Frankfurt1、SARS冠状病毒GZ01、SARS冠状病毒HKU-39849、SARS冠状病毒HongKong ZY-2003、SARS冠状病毒Hong Kong/03/2003、SARS冠状病毒HSR1、SARS冠状病毒Sin2500、SARS冠状病毒Sin2677、SARS冠状病毒Sin2679、SARS冠状病毒Sin2748、SARS冠状病毒Sin2774、SARS冠状病毒Taiwan、SARS冠状病毒Taiwan JC-2003、SARS冠状病毒TaiwanTC1、SARS冠状病毒Taiwan TC2、SARS冠状病毒Tor2、SARS冠状病毒TW1、SARS冠状病毒TWC、SARS冠状病毒Urbani、SARS冠状病毒Vietnam、SARS冠状病毒ZJ-HZ01、SARS冠状病毒ZJ01、牛呼吸冠状病毒株98TXSF-110-LUN、人肠道冠状病毒4408、猪流行性腹泻病毒株Br1/87、和猪流行性腹泻病毒株CV777的已知冠状病毒分离物的任意一种。

103.根据权利要求90的用途，其中所述病毒是丙型肝炎病毒。

104.根据权利要求103的用途，其中所述膜离子通道是丙型肝炎病毒p7膜离子通道。

105.根据权利要求104的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

N-(6-羟基-2-萘甲酰基)-N’-苯基胍、

2-萘甲酰基胍、和

1-溴-2-萘甲酰基胍。

106.根据权利要求90至105任意一项的用途，其中以根据权利要求2或权利要求3的药物组合物提供所述化合物。

107.根据权利要求1的化合物用于生产降低、延缓或抑制在哺乳动物中已感染细胞的病毒的生长和/或复制的药物的用途，其中所述化合物下调表达于所述受感染细胞中的膜离子通道的功能活性。

108.根据权利要求107的用途，其中所述病毒是慢病毒。

109.根据权利要求108的用途，其中所述慢病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。

110.根据权利要求109的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

2-萘甲酰基胍、

N-(6-羟基-2-萘甲酰基)-N’-苯基胍、和

1-溴-2-萘甲酰基胍。

111.根据权利要求107至110任意一项的用途，其中所述膜离子通道是HIV Vpu膜离子通道。

112.根据权利要求109的用途，其中所述HIV是HIV-1。

113.根据权利要求107的用途，其中所述病毒是冠状病毒。

114.根据权利要求113的用途，其中所述冠状病毒是严重急性呼吸综合征病毒(SARS)。

115.根据权利要求114的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

2-萘甲酰基胍、

N-(6-羟基-2-萘甲酰基)-N’-苯基胍、

N，N’-双(脒基)萘-2，6-二甲酰胺、

6-溴-2-萘甲酰基胍、

1-溴-2-萘甲酰基胍、和

N-(2-萘甲酰基)-N’-苯基胍。

116.根据权利要求113到115任意一项的用途，其中所述膜离子通道是冠状病毒E蛋白质。

117.根据权利要求113的用途，其中所述冠状病毒是人冠状病毒229E。

118.根据权利要求117的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

2-萘甲酰基胍、和

N，N’-双(脒基)萘-2，6-二甲酰胺。

119.根据权利要求117或118任意一项的用途，其中所述膜离子通道是冠状病毒E蛋白质。

120.根据权利要求113的用途，其中所述冠状病毒是选自犬肠道冠状病毒株INSAVC-1、犬肠道冠状病毒株K378、猫肠道冠状病毒株79-1863、猫传染性腹膜炎病毒FIPV、马冠状病毒NC99、猪呼吸冠状病毒、猪传染性肠胃炎冠状病毒株FS772/70、猪传染性肠胃炎冠状病毒株Miller、猪传染性肠胃炎冠状病毒株Neb72-RT、猪传染性肠胃炎冠状病毒株PURDUE、牛冠状病毒株F15、牛冠状病毒株G95、牛冠状病毒株L9、牛冠状病毒株LSU-94LSS-051、牛冠状病毒株LY-138、牛冠状病毒株MEBUS、牛冠状病毒株OK-0514-3、牛冠状病毒株Ontario、牛冠状病毒株QUEBEC、牛冠状病毒株VACCINE、牛肠道冠状病毒株98TXSF-110-ENT、犬呼吸冠状病毒、鸡肠道冠状病毒、鼠冠状病毒株DVIM、鼠肝炎病毒株A59、鼠肝炎病毒株JHM、鼠肝炎病毒株S、鼠肝炎病毒株1、鼠肝炎病毒株2、鼠肝炎病毒株3、鼠肝炎病毒株4、鼠肝炎病毒株ML-11、猪血凝脑脊髓炎病毒株67N、猪血凝脑脊髓炎病毒株IAF-404、Puffinosis病毒、大鼠冠状病毒株681、大鼠冠状病毒株NJ、大鼠sialodacryoadenitis冠状病毒、火鸡冠状病毒株Indiana、火鸡冠状病毒株Minnesota、火鸡冠状病毒株NC95、鸟传染性支气管炎病毒株6/82、鸟传染性支气管炎病毒株Arkansas99、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette CK、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette M42、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette US、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette、鸟传染性支气管炎病毒株D1466、鸟传染性支气管炎病毒株D274、鸟传染性支气管炎病毒株D3896、鸟传染性支气管炎病毒株D41、鸟传染性支气管炎病毒株DE072、鸟传染性支气管炎病毒株GRAY、鸟传染性支气管炎病毒株H120、鸟传染性支气管炎病毒株H52、鸟传染性支气管炎病毒株KB8523、鸟传染性支气管炎病毒株M41、鸟传染性支气管炎病毒株PORTUGAL/322/82、鸟传染性支气管炎病毒株SAIB20、鸟传染性支气管炎病毒株UK/123/82、鸟传染性支气管炎病毒株UK/142/86、鸟传染性支气管炎病毒株UK/167/84、鸟传染性支气管炎病毒株UK/183/66、鸟传染性支气管炎病毒株UK/68/84、鸟传染性支气管炎病毒株V18/91、鸟传染性支气管炎病毒株Vic S、鸟传染性喉气管炎病毒、SARS冠状病毒Beijing ZY-2003、SARS冠状病毒BJ01、SARS冠状病毒BJ02、SARS冠状病毒BJ03、SARS冠状病毒BJ04、SARS冠状病毒CUHK-Su10、SARS冠状病毒CUHK-W1、SARS冠状病毒Frankfurt1、SARS冠状病毒GZ01、SARS冠状病毒HKU-39849、SARS冠状病毒HongKong ZY-2003、SARS冠状病毒Hong Kong/03/2003、SARS冠状病毒HSR1、SARS冠状病毒Sin2500、SARS冠状病毒Sin2677、SARS冠状病毒Sin2679、SARS冠状病毒Sin2748、SARS冠状病毒Sin2774、SARS冠状病毒Taiwan、SARS冠状病毒Taiwan JC-2003、SARS冠状病毒TaiwanTC1、SARS冠状病毒Taiwan TC2、SARS冠状病毒Tor2、SARS冠状病毒TW1、SARS冠状病毒TWC、SARS冠状病毒Urbani、SARS冠状病毒Vietnam、SARS冠状病毒ZJ-HZ01、SARS冠状病毒ZJ01、牛呼吸冠状病毒株98TXSF-110-LUN、人肠道冠状病毒4408、猪流行性腹泻病毒株Br1/87、和猪流行性腹泻病毒株CV777的已知冠状病毒分离物的任意一种。

121.根据权利要求120的用途，其中所述膜离子通道是冠状病毒E蛋白质。

122.根据权利要求107的用途，其中所述病毒是丙型肝炎病毒。

123.根据权利要求122的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

N-(6-羟基-2-萘甲酰基)-N’-苯基胍、

2-萘甲酰基胍、和

1-溴-2-萘甲酰基胍。

124.根据权利要求123的用途，其中所述膜离子通道是丙型肝炎病毒p7膜离子通道。

125.根据权利要求107的用途，其中所述哺乳动物是灵长类动物。

126.根据权利要求122的用途，其中所述哺乳动物是灵长类动物。

127.根据权利要求125或权利要求126的用途，其中所述灵长类动物是人。

128.根据权利要求107至110任意一项的用途，其中以根据权利要求2或权利要求3的药物组合物提供所述化合物。

129.根据权利要求1的化合物用于生产治疗感染或暴露于病毒的受试者的药物的用途，其中所述化合物下调来源于所述病毒的膜离子通道的功能活性。

130.根据权利要求129的用途，其中所述病毒是慢病毒。

131.根据权利要求130的用途，其中所述慢病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。

132.根据权利要求131的用途，其中所述膜离子通道是HIV Vpu膜离子通道。

133.根据权利要求132的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

2-萘甲酰基胍、

N-(6-羟基-2-萘甲酰基)-N’-苯基胍、和

1-溴-2-萘甲酰基胍。

134.根据权利要求131至133任意一项的用途，其中所述HIV是HIV-1。

135.根据权利要求129的用途，其中所述病毒是冠状病毒。

136.根据权利要求135的用途，其中所述膜离子通道是冠状病毒E蛋白质。

137.根据权利要求136的用途，其中所述冠状病毒是严重急性呼吸综合征病毒(SARS)。

138.根据权利要求137的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

2-萘甲酰基胍、

N-(6-羟基-2-萘甲酰基)-N’-苯基胍、

N，N’-双(脒基)萘-2，6-二甲酰胺、

6-溴-2-萘甲酰基胍、

1-溴-2-萘甲酰基胍、和

N-(2-萘甲酰基)-N’-苯基胍。

139.根据权利要求136的用途，其中所述冠状病毒是人冠状病毒229E。

140.根据权利要求139的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

2-萘甲酰基胍、和

N，N’-双(脒基)萘-2，6-二甲酰胺。

141.根据权利要求136的用途，其中所述冠状病毒是选自犬肠道冠状病毒株INSAVC-1、犬肠道冠状病毒株K378、猫肠道冠状病毒株79-1863、猫传染性腹膜炎病毒FIPV、马冠状病毒NC99、猪呼吸冠状病毒、猪传染性肠胃炎冠状病毒株FS772/70、猪传染性肠胃炎冠状病毒株Miller、猪传染性肠胃炎冠状病毒株Neb72-RT、猪传染性肠胃炎冠状病毒株PURDUE、牛冠状病毒株F15、牛冠状病毒株G95、牛冠状病毒株L9、牛冠状病毒株LSU-94LSS-051、牛冠状病毒株LY-138、牛冠状病毒株MEBUS、牛冠状病毒株OK-0514-3、牛冠状病毒株Ontario、牛冠状病毒株QUEBEC、牛冠状病毒株VACCINE、牛肠道冠状病毒株98TXSF-110-ENT、犬呼吸冠状病毒、鸡肠道冠状病毒、鼠冠状病毒株DVIM、鼠肝炎病毒株A59、鼠肝炎病毒株JHM、鼠肝炎病毒株S、鼠肝炎病毒株1、鼠肝炎病毒株2、鼠肝炎病毒株3、鼠肝炎病毒株4、鼠肝炎病毒株ML-11、猪血凝脑脊髓炎病毒株67N、猪血凝脑脊髓炎病毒株IAF-404、Puffinosis病毒、大鼠冠状病毒株681、大鼠冠状病毒株NJ、大鼠sialodacryoadenitis冠状病毒、火鸡冠状病毒株Indiana、火鸡冠状病毒株Minnesota、火鸡冠状病毒株NC95、鸟传染性支气管炎病毒株6/82、鸟传染性支气管炎病毒株Arkansas99、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette CK、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette M42、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette US、鸟传染性支气管炎病毒株Beaudette、鸟传染性支气管炎病毒株D1466、鸟传染性支气管炎病毒株D274、鸟传染性支气管炎病毒株D3896、鸟传染性支气管炎病毒株D41、鸟传染性支气管炎病毒株DE072、鸟传染性支气管炎病毒株GRAY、鸟传染性支气管炎病毒株H120、鸟传染性支气管炎病毒株H52、鸟传染性支气管炎病毒株KB8523、鸟传染性支气管炎病毒株M41、鸟传染性支气管炎病毒株PORTUGAL/322/82、鸟传染性支气管炎病毒株SAIB20、鸟传染性支气管炎病毒株UK/123/82、鸟传染性支气管炎病毒株UK/142/86、鸟传染性支气管炎病毒株UK/167/84、鸟传染性支气管炎病毒株UK/183/66、鸟传染性支气管炎病毒株UK/68/84、鸟传染性支气管炎病毒株V18/91、鸟传染性支气管炎病毒株Vic S、鸟传染性喉气管炎病毒、SARS冠状病毒Beijing ZY-2003、SARS冠状病毒BJ01、SARS冠状病毒BJ02、SARS冠状病毒BJ03、SARS冠状病毒BJ04、SARS冠状病毒CUHK-Su10、SARS冠状病毒CUHK-W1、SARS冠状病毒Frankfurt1、SARS冠状病毒GZ01、SARS冠状病毒HKU-39849、SARS冠状病毒HongKong ZY-2003、SARS冠状病毒Hong Kong/03/2003、SARS冠状病毒HSR1、SARS冠状病毒Sin2500、SARS冠状病毒Sin2677、SARS冠状病毒Sin2679、SARS冠状病毒Sin2748、SARS冠状病毒Sin2774、SARS冠状病毒Taiwan、SARS冠状病毒Taiwan JC-2003、SARS冠状病毒TaiwanTC1、SARS冠状病毒Taiwan TC2、SARS冠状病毒Tor2、SARS冠状病毒TW1、SARS冠状病毒TWC、SARS冠状病毒Urbani、SARS冠状病毒Vietnam、SARS冠状病毒ZJ-HZ01、SARS冠状病毒ZJ01、牛呼吸冠状病毒株98TXSF-110-LUN、人肠道冠状病毒4408、猪流行性腹泻病毒株 Br1/87、和猪流行性腹泻病毒株CV777的已知冠状病毒分离物的任意一种。

142.根据权利要求129的用途，其中所述病毒是丙型肝炎病毒。

143.根据权利要求142的用途，其中所述膜离子通道是丙型肝炎病毒p7膜离子通道。

144.根据权利要求143的用途，其中所述化合物选自：

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

N-(6-羟基-2-萘甲酰基)-N’-苯基胍、

2-萘甲酰基胍、和

1-溴-2-萘甲酰基胍。

145.根据权利要求129的用途，其中所述哺乳动物是灵长类动物。

146.根据权利要求142的用途，其中所述哺乳动物是灵长类动物。

147.根据权利要求145或权利要求146的用途，其中所述灵长类动物是人。

148.抗病毒化合物，其选自：

2-萘甲酰基胍、

N-(2-萘甲酰基)-N’-苯基胍、

N，N’-双(2-萘甲酰基)胍、

N，N’-双(1-萘甲酰基)胍、

6-甲氧基-2-萘甲酰基胍、

N-(6-羟基-2-萘甲酰基)-N’-苯基胍、

N，N’-双(脒基)萘-2，6-二甲酰胺，

或其药学上可接受的盐。

149.药物组合物，其包含根据权利要求148的化合物，及任选地一种或多种药学上可接受的载体。

150.根据权利要求149的药物组合物，其还包含一种或多种已知的抗病毒化合物。

151.根据权利要求4、27、50、73、90、107和129任意一项的用途，其中所述化合物选自根据权利要求148的抗病毒化合物。