CN113248449B - 一种含甲脒的芳基螺环类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种含甲脒的芳基螺环类化合物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物化学领域，具体涉及一种含甲脒的芳基螺环类化合物及其制备方法与应用。含有通式I‑III三种芳基螺环类化合物及其药学上可接受的盐、对映异构体、非异构体、互变异构体、溶剂化物、多晶型物或前药；本发明基于SHP099为先导化合物，制备出一类末端为胍基的全新化合物，以解决目前SHP2抑制剂结构骨架单一等问题；本发明重要意义在于提供很多修饰位点，为后期结构改造提供基础。同时本发明的实施例证实了化合物对SHP2磷酸酶具有变构抑制作用，为后续开发SHP2磷酸酶抑制剂提供骨架支持。

Description

一种含甲脒的芳基螺环类化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及一种含甲脒的芳基螺环类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
脒类化合物种类繁多，甲脒就是其中最常见的种类之一。甲脒中的氨基和亚胺基可以形成互变异构体，两者可以相互转换，其可提供有效的氢键结合位点，提高生物活性，因此甲脒经常运用于药物分子中，通过对甲脒类化合物进行骨架修饰，引入一些极性基团对抗肿瘤活性有较大的影响。含有胍基、脒基这些平面极性基团的更易于在配体和受体及酶之间通过氢键或静电作用形成特殊的相互作用。因此发现和寻找具有较好成药性的甲脒类抗肿瘤化合物分子逐渐成为工业界和学术界的一大热点研宄领域。
发明内容
本发明需要解决的技术问题之一是提供一种新型的含甲脒的芳基螺环类化合物，为后续药物开发提供可能。
解决上述技术问题的方案如下：
一 种如通式I所示的芳基螺环类化合物，或其药学上可接受的盐、或其对映异构体、非对映异构体、互变异构体、溶剂化物、多晶型物或前药。
Figure BDA0003052685280000011
R1和R2独立地为氢、卤素、氨基、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基、C1-C3的烷氧基、C1-C3的卤代烷基、未取代或R1-1取代的C1-C5环烷烃；
X为N或CR3,其中R3为氢、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基、C1-C3的烷氧基或C1-C3的卤代烷基；
L为键、C1-C2的碳链、O或S；
当Y1 Y2为双键时，Y1为N；
当Y1 Y2为单键时，Y1为C＝O；
Y2为NR5或CR6，其中R5和R6为氢、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基、C1-C3的烷氧基或C1-C3的卤代烷基；
Y3为N或CR7，其中R7为氢或氨基；
R为
Figure BDA0003052685280000021
当R为
Figure BDA0003052685280000022
取代时，K＝0或1；
A为CH2、C＝O、C＝S；
Z为NR8或CR9 R10，其中R8为
Figure BDA0003052685280000023
SO2NH2；
R9为
Figure BDA0003052685280000024
其中n＝0,1,2；
R10为氢、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基、C1-C3的烷氧基、C1-C3的卤代烷基、未取代或R10-1取代的C6-C10芳基；
R10-1为氢、卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基、C1-C3的烷氧基、C1-C3的卤代烷基、-COOH、-CONH2、SO2NH2；
R11为氢、氘、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基、C1-C3的烷氧基、C1-C3的卤代烷基、未取代或R11-1取代的C6-C10芳基；
R11-1为氢、卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基、C1-C3的烷氧基、C1-C3的卤代烷基、-COOH、-CONH2、SO2NH2；
R12为氢、氘、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基、C1-C3的烷氧基、C1-C3的卤代烷基、C3-C6的环烷基或“杂原子为N、O或S中的一种或多种，杂原子数为1-3个的1-3元C3-C6 环杂烷基；
当R为
Figure BDA0003052685280000025
取代时，
M和Q为CRmRn或NRm，其中Rm为氢、氘、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基、C1-C3 的烷氧基或C1-C3的卤代烷基，Rn为氢、氘、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基、C1-C3的烷氧基、C1-C3的卤代烷基、C3-C6的环烷基或C1-C2的烷羟基；
n＝0，1或2；
Z为
Figure BDA0003052685280000031
SO2NH2；
R11为氢、氘、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基、C1-C3的烷氧基、C1-C3的卤代烷基、未取代或R11-1取代的C6-C10芳基；
R11-1为氢、卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基、C1-C3的烷氧基、C1-C3的卤代烷基、-COOH、-CONH2、SO2NH2；
R12为氢、氘、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基、C1-C3的烷氧基、C1-C3的卤代烷基、C3-C6的环烷基或“杂原子为N、O或S中的一种或多种，杂原子数为1-3个的1-3元C3-C6 环杂烷基；
如通式II所示的芳基螺环类化合物，或其药学上可接受的盐、或其对映异构体、非对映异构体、互变异构体、溶剂化物、多晶型物或前药。
Figure BDA0003052685280000032
其中R1和R2如权利要求1所述：
R1和R2独立地为氢、卤素、氨基、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基、C1-C3的烷氧基、C1-C3的卤代烷基、未取代或R1-1取代的C1-C5环烷烃；
L为键、C1-C2的碳链、O或S；
Y2为NR5或CR6，其中R5和R6为氢、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基、C1-C3的烷氧基或C1-C3的卤代烷基；
Z为NR8或CR9 R10，其中R8为
Figure BDA0003052685280000033
SO2NH2；
R9为
Figure BDA0003052685280000041
其中n＝0,1,2；
R10为氢、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基、C1-C3的烷氧基、C1-C3的卤代烷基、未取代或R10-1取代的C6-C10芳基；
R10-1为氢、卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基、C1-C3的烷氧基、C1-C3的卤代烷基、-COOH、-CONH2、SO2NH2；
R11为氢、氘、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基、C1-C3的烷氧基、C1-C3的卤代烷基、未取代或R11-1取代的C6-C10芳基；
R11-1为氢、卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基、C1-C3的烷氧基、C1-C3的卤代烷基、-COOH、-CONH2、SO2NH2；
R12为氢、氘、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基、C1-C3的烷氧基、C1-C3的卤代烷基、C3-C6的环烷基或“杂原子为N、O或S中的一种或多种，杂原子数为1-3个的1-3元C3-C6 环杂烷基；
如通式III所示的芳基螺环类化合物，或其药学上可接受的盐、或其对映异构体、非对映异构体、互变异构体、溶剂化物、多晶型物或前药。
Figure BDA0003052685280000042
其中R1和R2如权利要求1所述：
R1和R2独立地为氢、卤素、氨基、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基、C1-C3的烷氧基、C1-C3的卤代烷基、未取代或R1-1取代的C1-C5环烷烃；
M和Q为CRmRn或NRm，其中Rm为氢、氘、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基、C1-C3 的烷氧基或C1-C3的卤代烷基，Rn为氢、氘、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基、C1-C3的烷氧基、C1-C3的卤代烷基、C3-C6的环烷基或C1-C2的烷羟基；
n＝0，1或2；
Z为
Figure BDA0003052685280000051
SO2NH2；
R11为氢、氘、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基、C1-C3的烷氧基、C1-C3的卤代烷基、未取代或R11-1取代的C6-C10芳基；
R11-1为氢、卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基、C1-C3的烷氧基、C1-C3的卤代烷基、-COOH、-CONH2、SO2NH2；
R12为氢、氘、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基、C1-C3的烷氧基、C1-C3的卤代烷基、C3-C6的环烷基或“杂原子为N、O或S中的一种或多种，杂原子数为1-3个的1-3元C3-C6 环杂烷基；
一种药物组合物，其特征在于含有如权利要求1-3任意一项所述的芳基螺环类化合物和药学可接受的辅料。
所的药物组合物，其特征在于药物组合物制成片剂、胶囊剂、注射液或冻干粉剂。
所述的芳基螺环类化合物、所述的药物组合物在制备治疗抗肿瘤药物、作为抗肿瘤药物的前药或作为抗肿瘤药物的中间体中应用。
有益效果
1、脒类化合物是一类含氮的有机化合物，其中最简单的脒类化合物就是甲脒，其结构简式为HC(＝NH)NH2，含有一个氨基和亚氨基，这也使得脒类化合物具有碱性，因此会和酸形成稳定的盐，同时甲脒中的氨基和亚胺基可以形成互变异构体，并且两者可以相互转换，其可提供有效的氢键结合位点，提高生物活性，因此甲脒经常运用于药物分子中。本发明提供了一系列甲脒修饰的芳基螺环类化合物，由于脒中的氨基和亚胺基可以形成互变异构体，两者可以相互转换，其可提供有效的氢键结合位点，提高生物活性，通过对甲脒类化合物进行骨架修饰，引入一些极性基团对抗肿瘤活性有较大的影响。含有胍基、脒基这些平面极性基团的更易于在配体和受体及酶之间通过氢键或静电作用形成特殊的相互作用，故作为抗肿瘤药物的前药，即使该化合物细胞毒性很低，如实施例所示，但不影响作为抗肿瘤药物的中间产物，本发明重要意义在于提供很多修饰位点，为后期结构改造提供基础。同时本发明的实施例证实了化合物对SHP2磷酸酶具有变构抑制作用，为后续开发SHP2磷酸酶抑制剂提供骨架支持。
2、本发明基于SHP099为先导化合物，制备出一类末端为胍基的全新化合物，以解决目前SHP2抑制剂结构骨架单一等问题。在NCI-H358细胞系抗增殖实验中，实施例17(IC50＝8.2uM)显示出优于SHP099(IC50＝46.2uM)的抗增殖活性，具体实施例结构如下：
Figure BDA0003052685280000061
Figure BDA0003052685280000071
具体实施方式
中间体3-氯-4-碘-2-吡啶胺(A1)的合成：
Figure BDA0003052685280000072
步骤一：2-氟-3-氯-4-碘吡啶(A1-2)的合成：
-78℃下，将正丁基锂(38mL，1.25eq.)缓慢滴加到A1-1(10.00g,76.3mmol) 的THF(75mL)溶液中。反应1h后缓慢滴加I2的THF(30mL)溶液。反应30min后监测。监测反应完全后，滴加饱和Na2SO3水溶液淬灭，浓缩除THF，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离得化合物A1-2(7.76g，收率41％)。
步骤二：3-氯-4-碘-2-吡啶胺(A1)的合成
将NH3·H2O(38mL)缓慢滴加到A1-2(7.56g,29.4mmol)的DMSO(38mL)溶液中。加毕，80℃封管反应过夜。监测反应完全后，将反应体系倒入水(200mL)中搅拌30min，抽滤干燥得化合物A1(6.79g，收率91％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.57 (d,J＝5.2Hz,1H),7.12(d,J＝5.2Hz,1H),5.05(s,2H).
中间体6-氯-3-(2,3-二氯丙基)吡嗪-2-氨基叔丁酯(B1)的合成：
Figure BDA0003052685280000073
步骤一：6-氯-3-(2,3-二氯苯基)吡嗪-2-胺(B1-2)的合成
将化合物B1-1(5.00g,24.0mmol，1.0eq.)、2,3-二氯苯硼酸(5.04g,26.4 mmol,1.1eq.)、Pd(dppf)Cl2(350.1mg,2mol％)和K3PO4(10.18g，48.0mmol,2.0eq.) 置于200mL单口瓶中，将体系抽真空置换氮气，加入1,4-二氧六环(54mL)和水(6mL) 于120℃油浴中反应过夜，监测至原料转化完全。硅藻土过滤，滤液浓缩，加入30mL 乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠水溶液水洗3次，浓缩，柱层析纯化，得化合物B1-2(5.94 g，收率91％)。
步骤二：6-氯-3-(2,3-二氯苯基)吡嗪-2-氨基叔丁酯(B1)的合成
将化合物B1-2(5.30g,19.4mmol)和DMAP(118.0mg,0.97mmol,0.05eq.)置于200mL单口瓶中，加入二氯甲烷(50mL)，在0℃加入二碳酸二叔丁酯，加毕，移至室温反应2h，监测至原料转化完全。饱和氯化钠水溶液水洗3次(15mL×3)，有机相浓缩，柱层析纯化,得化合物B1(7.50g，收率82％)。
中间体B2的合成：
Figure BDA0003052685280000081
步骤一：6-氨基-3-甲基嘧啶-2,4(1H，3H)-二酮(B2-2)的合成
将浓H2SO4(0.1mL)缓慢滴加到4-氨基-2,6-二羟基嘧啶(5.18g,40.8mmol)的 HMDS(25mL)溶液中。130℃反应6h后，浓缩除HMDS。加入DMF(25mL)，碘甲烷(8.5mL,3.5eq.)，室温反应过夜。监测反应完全后，滴加NaHCO3(aq.)至无气泡产生，抽滤，滤饼水洗，干燥得化合物B2-2(3.60g，收率63％)。
步骤二：6-氨基-5-碘-3-甲基嘧啶-2,4(1H，3H)-二酮(B2)的合成
将化合物B2-2(1.95g,13.83mmol)溶于DMF(14mL)和AcOH(44mL)中，加入NIS(3.73g,1.2eq.)。室温反应2h，监测反应完全后，抽滤，滤饼水洗干燥，得中间体B2(3.06g,收率83％)。
中间体5-氯吡嗪-2-硫醇钠(B3)的合成：
Figure BDA0003052685280000082
步骤一：3-((5-氯吡嗪-2-基)硫代)丙酸乙酯(B3-1)的合成
将3-巯基丙酸乙酯(4.45mL,1.05eq.)缓慢滴加到2,5-二氯吡嗪(5.00g,33.6mmol) 和K2CO3(4.64g,1eq.)的DMF(42mL)溶液中。室温反应4h。监测反应完全后，乙酸乙酯稀释，饱和食盐水水洗5次，有机相浓缩，柱层析分离得化合物B3-1(7.78g,收率94％)。
步骤二：5-氯吡嗪-2-硫醇钠(B3)的合成
将乙醇钠(2.24g,1.1eq.)缓慢滴加到B3-1(7.38g,30mmol)的THF(100mL) 溶液中。室温反应2h。监测反应完全后，加正己烷(100mL)打浆抽滤，固体干燥得化合物B3(5.13g，粗品)。
中间体6-溴-3-(4-(4-丁氧基羰基)哌嗪-1-基)吡嗪-2-羧酸甲酯(B4)的合成：
Figure BDA0003052685280000091
将3,6-二溴吡嗪-2-甲酸甲酯(500.0mg,1.69mmol)、N-Boc哌嗪(346.2mg,1.1eq.)及DIPEA(1.09g，5eq)溶于乙腈(8mL)，室温搅拌过夜。监测反应完全后，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离得化合物B4(498.6mg，收率74％)。
中间体((4-苯基哌啶-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(C1)的合成：
Figure BDA0003052685280000092
步骤一：(1-苄基-4-苯基哌啶-4-基)甲胺(C1-2)的合成：
0℃下，将LiAlH4(850.0mg,20.1mmol)分批加到化合物C1-1(4.5g,14.4mmol) 的THF(80mL)溶液中。加毕室温反应过夜。监测反应完全后，将反应置于0℃下搅拌，缓慢滴加NH4Cl(aq.)淬灭，DCM萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩得化合物C1-2(3.8 g,粗品)。
步骤二：((1-苄基-4-苯基哌啶-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(C1-3)的合成：
将NaOH(30mL，2N)加入到化合物C1-2(3.8g,13.6mmol)的THF(15mL)溶液中。最后滴加Boc酸酐(3.55g,1.2eq.)。室温反应1h，监测反应完全后，DCM萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩得化合物C1-3(4.9g,粗品)。
步骤三：((4-苯基哌啶-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(C1)的合成：
将Pd/C(1g,20％wt)和水合肼(1.29g,2eq.)加入到化合物C1-3(4.9g,12.9mmol)的乙醇(70mL)溶液中。回流反应4h，监测反应完全后，抽滤除Pd/C，浓缩，加DCM 打浆抽滤得化合物C1(2.50g,合并三步收率53％)。
实施例1：4-(6-氨基-5-(2,3-二氯苯基)吡嗪-2-基)哌嗪-1-磺酰胺盐酸盐的合成
Figure BDA0003052685280000101
步骤一：
将化合物B1(0.60g,1.27mmol,1.0eq.)、哌嗪(0.44g,5.1mmol,4.0eq.)和碳酸铯(0.62g,1.9mmol,1.5eq.)置于25mL单口瓶中，加入DMSO(5mL),于室温反应6 h,TLC板监测至原料转化完全,加入乙酸乙酯(10mL)，饱和氯化钠水溶液水洗多次(3 mL×6)，合并有机相，浓缩，柱层析纯化,得化合物1-1(0.33g，收率82％)。
步骤二：
将化合物1-1(100.0mg,0.19mmol,1.0eq.)和磺酰胺(36.5mg,0.38mmol,2.0eq.)置于10mL单口瓶中,加入的1,4-二氧六环(1mL)于室温搅拌反应4h，TLC板监测至原料转化完全,浓缩，柱层析纯化,得化合物1-2(124.0mg，收率72％)。
步骤三：
将化合物1-2(90.0mg,0.15mmol,1.0eq.)溶于乙酸乙酯(1mL)中，缓慢加入 2M的盐酸乙酸乙酯溶液(1mL),在室温搅拌至原料反应完全，过滤固体得实施例1(60.2 mg，收率91％)。ESI-MS(m/z):439.0[M+H]+；1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.67(dd,J＝7.9, 1.7Hz,1H),7.56(s,1H),7.43(t,J＝7.9Hz,1H),7.35(dd,J＝7.9,1.7Hz,1H),6.87(s,2H), 3.69–3.57(m,4H),3.11–2.97(m,4H).
实施例2：4-(6-氨基-5-(2,3-二氯苯基)吡嗪-2-基)哌嗪-1-羧酰亚胺盐酸盐的合成
Figure BDA0003052685280000111
步骤一：
将化合物1-1(150.0mg,0.29mmol,1.0eq.)和1-吡唑甲脒盐酸盐(40mg,0.27mmol,0.95eq.)溶于乙腈(1mL)中，加入DIPEA(54μL,0.32mmol,1.1eq.)，室温反应6h,TLC板监测至原料转化完全，过滤固体得化合物2-1(92.1mg，收率65％)。
步骤二：
将化合物2-1(90.0mg,0.16mmol,1.0eq.)溶于乙酸乙酯(1mL)中，缓慢加入2M 的盐酸乙酸乙酯溶液(1mL),在室温搅拌至原料反应完全，过滤固体得实施例2(30.0 mg，收率47％)。ESI-MS(m/z):402.1[M+H]+；1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.70(dd,J＝7.8,1.6 Hz,1H),7.66(s,4H),7.58(s,1H),7.45(t,J＝7.8Hz,1H),7.37(dd,J＝7.8,1.6Hz,1H), 3.71-3.48(m,8H)。
实施例3：4-(6-氨基-5-(2,3-二氯苯基)吡嗪-2-基)哌嗪-1-甲酰胺的合成
Figure BDA0003052685280000112
步骤一：
将三甲基硅基异氰酸酯(32mg,1.12eq.)缓慢滴加到化合物1-1(130mg,0.25mmol)和DIPEA(70.5mg,2.2eq.)的DMSO(1mL)溶液中。室温反应过夜。监测反应完全后，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离得化合物3-1(61.6mg，收率43％)。
步骤二：
将化合物3-1(61.6mg,0.11mmol)溶于EA(1mL)，加入EA·HCl(2mL)，室温反应过夜。监测反应完全后，加碳酸钠水溶液调碱，EA萃取，干燥浓缩得化合物3(38.1 mg,96％)。1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.63(dd,J＝7.9,1.6Hz,1H),7.51(s,1H),7.39(t,J＝7.9 Hz,1H),7.30(dd,J＝7.9,1.6Hz,1H),6.07(s,2H),5.71(s,2H),3.56–3.44(m,4H),3.44–3.35(m,4H).
实施例4：1-(1-(6-氨基-5-(2,3-二氯苯基)吡嗪-2-基)哌啶-4-基)胍盐酸盐的合成
Figure BDA0003052685280000121
步骤一：
将化合物B1(300.0mg,0.63mmol,1.0eq.)、哌啶-4-胺(76mg,0.76mmol,1.2eq.)和碳酸铯(310mg,0.95mmol,1.5eq.)置于10mL单口瓶中，加入DMSO(3mL)。室温反应6h,TLC板监测至原料转化完全,加入乙酸乙酯(10mL)，饱和氯化钠水溶液水洗多次(3mL×6)，合并有机相，浓缩，柱层析纯化,得化合物4-1(0.28g，83％)。
步骤二：
将化合物4-1(200mg,0.37mmol,1.0eq.)和1-吡唑甲脒盐酸盐(55mg,0.37mmol,1.0eq.)置于封管中，加入DMF(2mL)溶液，加入DIPEA(83μL,0.48mmol,1.3eq.)， 85℃反应6h,加入乙酸乙酯(10mL)，饱和氯化钠水溶液水洗多次(3mL×6)，合并有机相，浓缩，柱层析纯化,得化合物化合物4-2(127mg，59％)。
步骤三：
将化合物4-2(104mg,0.18mmol,1.0eq.)溶于乙酸乙酯(1mL)中，缓慢加入2M 的盐酸乙酸乙酯溶液(1mL),在室温搅拌至原料反应完全，过滤固体得化合物4(46mg，收率62％)。ESI-MS(m/z):416.1[M+H]+；1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.02(d,J＝8.3Hz,1H), 7.72(dd,J＝7.7,1.9Hz,1H),7.60(s,1H),7.46(t,J＝7.7Hz,1H),7.41(dd,J＝7.7,1.9Hz,1H),7.25(brs,3H),4.31-4.19(m,2H),3.75–3.60(m,1H),3.14-3.02(m,2H),1.99-1.85(m,2H),1.52-1.35(m,2H).
实施例5：4-(5-((2-氨基-3-氯吡啶-4-基)硫基]吡嗪-2-基)哌嗪-1-羧酰亚胺盐酸盐的合成
Figure BDA0003052685280000131
步骤一：
将中间体A1(3.00g,11.8mmol)、中间体B3(1.99g,1eq.)、Pd2(dba)3(216.3mg,2mol％)、XantPhos(273.2mg,4mol％)、DIPEA(3.04g，2eq)置于封管中,氮气保护后加入无水二氧六环(50mL)于105℃反应过夜。监测反应完全后，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离得化合物5-1(2.33g，收率72％)。
步骤二：
将化合物5-1(200.0mg,0.74mmol)、无水哌嗪(252.9mg,4eq.)、碳酸铯(359.5 mg,1.5eq.)溶于DMSO(3mL)中，室温搅拌过夜。监测反应完全后，乙酸乙酯稀释，饱和食盐水水洗5次，有机相浓缩，柱层析分离得化合物5-2(422.6mg,收率89％)。
步骤三：
将1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐(45.4mg,1eq.)、DIPEA(44.1mg,1.1eq.)加入到化合物5-2(100.0mg,0.31mmol)的乙腈(1mL)溶液中，室温反应过夜。监测反应完全后，抽滤，固体用EA打浆再次抽滤，干燥得化合物5(90.7mg,收率73％)。1H NMR(300 MHz,DMSO)δ8.50(d,J＝1.1Hz,1H),8.35(d,J＝1.1Hz,1H),7.65(d,J＝5.4Hz,1H),7.63 (brs,4H),6.37(s,2H),5.80(d,J＝5.4Hz,1H),3.82-3.79(m,4H),3.63-3.60(m,4H).
实施例6：4-(5-((2-氨基-3-氯吡啶-4-基)硫基)-3-(羟甲基)吡嗪-2-基哌嗪-1-羧酰亚胺盐酸盐的合成
Figure BDA0003052685280000141
步骤一：
将化合物A-1(2.55g,10mmol)、3-巯基丙酸乙酯(1.41g,10.5mmol,1.05eq.)、 Pd2(dba)3(192.1mg,2mol％)、XantPhos(242.1mg,4mol％)、DIPEA(2.60g，2eq)置于封管中,氮气保护后加入无水二氧六环(10mL)于100℃反应过夜。监测反应完全后，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离得化合物6-2(2.45g，收率94％)。
步骤二：
将乙醇钠(674.8mg,1.2eq.)分批加入到化合物6-2(2.15g,8.27mmol)的THF(28mL)溶液中，室温反应2h。监测反应完全后，加入石油醚(20mL)打浆，抽滤得化合物6-3(1.50g，粗品)。
步骤三：
将B4(2.50g,6.23mmol)、化合物6-3(1.25g,1.1eq.)、Pd2(dba)3(114.1mg,2mol％)、 XantPhos(144.2mg,4mol％)、DIPEA(2.41g，3eq)置于封管中,氮气保护后加入无水二氧六环(40mL)于110℃反应过夜。监测反应完全后，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离得化合物6-4(1.54g，两步收率51％)。
步骤四：
-78℃下，将DIBAL-H(5mL,5.0mmol)缓慢滴加到化合物6-4(600mg,1.25mmol) 的DCM(2mL)溶液中，反应1h后置于0℃下反应30min。监测反应完全后，将反应置于-78℃下搅拌，缓慢滴加酒石酸钠钾(aq.)淬灭，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离得化合物6-5(199.1mg,收率30％)。
步骤五：
将化合物6-5(150.0mg,0.33mmol)溶于EA(1mL)，加入EA·HCl(1mL)，室温反应过夜。监测反应完全后，加碳酸钠水溶液调碱，DCM/MeOH(5：1)萃取，干燥浓缩得化合物6-6(91.2mg,收率78％)。
步骤六：
将1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐(13.7mg,1.1eq.)、DIPEA(12.0mg,1.1eq.)加入到化合物6-6(30.0mg,0.085mmol)的DMF(1mL)溶液中，室温反应过夜。监测反应完全后，加EA打浆抽滤，固体干燥得化合物6(10mg,收率30％)。1H NMR(300MHz,DMSO) δ8.37(s,1H),7.67(d,J＝5.4Hz,1H),7.57(brs,4H),6.40(s,2H),5.92(d,J＝5.4Hz,1H),5.66 (t,J＝5.8Hz,1H),4.56(d,J＝5.8Hz,2H),3.61(s,8H).
实施例8：1-((1-(6-氨基-5-(2,3-二氯苯基)吡嗪-2-基)-4-苯基哌啶-4-基)甲基)胍的合成
Figure BDA0003052685280000151
步骤一：
将化合物B-1(300.0mg,0.63mmol)、中间体C1(220.9mg,1.2eq.)、碳酸铯(413.5mg,1.5eq.)溶于DMSO(2mL)中，室温搅拌过夜。监测反应完全后，乙酸乙酯稀释，饱和食盐水水洗5次，有机相浓缩，柱层析分离得化合物8-1(422.6mg,收率92％)。
步骤二：
将化合物8-1(377.0mg,0.52mmol)溶于EA(2mL)，加入EA·HCl(5mL)，室温反应过夜。监测反应完全后，加碳酸钠水溶液调碱，DCM萃取，干燥浓缩得化合物 8-2(215.5mg,收率97％)。
步骤三：
将1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐(34.2mg,1eq.)、DIPEA(30.1mg,1eq.)加入到化合物 8-2(100.0mg,0.23mmol)的乙腈(1mL)溶液中，室温反应过夜。监测反应完全后，抽滤得白色固体，固体加EA打浆抽滤、干燥得化合物8(88.6mg,收率81％)。1H NMR (300MHz,DMSO)δ7.62(dd,J＝8.0,1.6Hz,1H),7.54-7.46(m,3H),7.45-7.35(m,3H), 7.33–7.25(m,2H),7.25(s,2H),6.88(s,2H),5.65(s,2H),3.93(d,J＝13.5Hz,2H),3.41-3.29 (m,2H),3.07(t,J＝10.2Hz,2H),2.24(d,J＝13.5Hz,2H),1.84(t,J＝10.2Hz,2H).
实施例9：4-(4-氨基-5-((2,3-二氯苯基)硫基)-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-2- 基)哌嗪-1-羧酰亚胺的合成
Figure BDA0003052685280000161
步骤一：
将中间体B2(1.00g,3.75mmol)、N-Boc哌嗪(731.5mg,1.05eq.)、BOP(3.31 g,2eq.)溶于DMF(10mL)中，缓慢加入DBU(4mL,7eq.)，加毕室温反应过夜。监测反应完全后，乙酸乙酯稀释，饱和食盐水水洗5次，有机相浓缩，柱层析分离得化合物9-1(592.1mg,收率36％)。
步骤二：
将化合物9-1(390.0mg,0.89mmol)、2,3-二氯苯硫酚(241.2mg,1.5eq.)、 CuI(3.4mg,2mol％)、TMEDA(4.1mg,4mol％)、DIPEA(566.8mg，3eq)置于封管中, 氮气保护后加入无水二氧六环(50mL)于100℃反应3h。监测反应完全后，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离得化合物9-2(197.2mg，收率45％)。
步骤三：
将化合物9-2(163.7mg,0.34mmol)溶于EA(1mL)，加入EA·HCl(2mL)，室温反应过夜。监测反应完全后，加碳酸钠水溶液调碱，EA萃取，干燥浓缩得化合物9-3 (119.7mg,收率92％)。
步骤四：
将1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐(41.8mg,1eq.)、DIPEA(36.7mg,1eq.)加入到化合物 9-3(110.0mg,0.29mmol)的乙腈(1mL)溶液中，室温反应过夜。监测反应完全后，抽滤得白色固体，固体加EA打浆抽滤、干燥得化合物9(99.6mg,收率82％)。1H NMR (300MHz,DMSO)δ7.54(brs,4H),7.35(dd,J＝7.9,1.4Hz,1H),7.20(t,J＝7.9Hz,1H),6.76 (s,2H),6.71(dd,J＝7.9,1.4Hz,1H),3.58(m,4H),3.35(m,4H),3.30(s,3H).
实施例10：1-((1-(6-氨基-5-(2,3-二氯苯基)吡嗪-2-基)-4-甲基哌啶-4-基)甲基)胍盐酸盐的合成
Figure BDA0003052685280000171
步骤一：
将化合物B1(200mg,0.42mmol,1.0eq.)、4-甲基哌啶-4-基甲胺(81mg,0.63mmol,1.5eq.)和碳酸铯(207mg,0.63mmol,1.5eq.)置于10mL单口瓶中，加入DMSO(2mL)，于室温反应6h,TLC板监测至原料转化完全,加入乙酸乙酯(10mL)，饱和氯化钠水溶液水洗多次(3mL×6)，合并有机相，浓缩，柱层析纯化,得化合物10-1(119mg，50％)。
步骤二：
将化合物10-1(110mg,0.19mmol,1.0eq.)和1-吡唑甲脒盐酸盐(29mg,0.19 mmol,1.0eq.)溶于DMF(2mL)中，加入DIPEA(35μL,0.19mmol,1.0eq.)，室温反应6h,TLC板监测至原料转化完全，加入乙酸乙酯(10mL)，饱和氯化钠水溶液水洗多次(3mL×6)，合并有机相，浓缩，柱层析纯化,得化合物10-2(58mg，50％)。
步骤三：
将化合物10-2(58mg,0.095mmol)溶于乙酸乙酯(1mL)中，缓慢加入2M的盐酸乙酸乙酯溶液(1mL),在室温搅拌至原料反应完全，加入饱和碳酸钠水溶液调pH至8，乙酸乙酯萃取(3mL×3)，合并有机相，浓缩，得化合物过滤得固体化合物10(40mg，收率95％)。ESI-MS(m/z):408.1[M+H]+；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.74(m,1H),7.62 (dd,J＝7.9,1.6Hz,1H),7.50(s,1H),7.39(t,J＝7.8Hz,1H),7.30(dd,J＝7.7,1.7Hz,1H), 7.05(brs,2H),5.63(s,2H),3.93–3.76(m,2H),3.31-3.21(m,2H),3.08(d,J＝5.9Hz,2H), 1.52-1.32(m,4H),1.02(s,3H).
实施例11：1-(1-(6-氨基-5-(2,3-二氯苯基)吡嗪-2-基)吡咯烷-3-基)胍盐酸盐的合成
Figure BDA0003052685280000181
步骤一：
将化合物B1(300mg,0.63mmol,1.0eq.)、吡咯烷-3-基氨基甲酸叔丁酯(118mg,0.63mmol,1.0eq.)和碳酸铯(310mg,0.95mmol,1.5eq.)置于10mL单口瓶中，加入 DMSO(2mL),于90℃反应2h,TLC板监测至原料转化完全,加入乙酸乙酯(10mL)，饱和氯化钠水溶液水洗多次(3mL×6)，合并有机相，浓缩，柱层析纯化,得化合物11-1 (289mg，74％)。
步骤二：
将化合物11-1(250mg,0.41mmol,1.0eq.)溶于乙酸乙酯(2mL)中，缓慢加入 2M的盐酸乙酸乙酯溶液(2mL),在室温搅拌至原料反应完全，加入饱和碳酸钠水溶液调pH至8，乙酸乙酯萃取(3mL×3)，合并有机相，浓缩，得化合物11-2(130mg，收率98％)。
步骤三：
将化合物11-2(80mg,0.25mmol,1.0eq.)和1-吡唑甲脒盐酸盐(37mg,0.25mmol,1.0eq.)置于封管中，加入2mL乙腈，加入DIPEA(43μL,0.25mmol,1.0eq.)回流反应6h，过滤固体，用少量乙酸乙酯洗涤，得化合物11(74mg,81％).ESI-MS(m/z): 366.1[M+H]+；1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.14(d,J＝7.3Hz,1H),7.63(dd,J＝7.8,1.4Hz, 1H),7.40(t,J＝7.8Hz,1H),7.30(dd,J＝7.8,1.4Hz,1H),7.21(s,1H),5.67(s,2H),4.31-4.18 (m,1H),3.72-3.63(m,1H),3.57-3.43(m,2H),3.43-3.37(s,1H),2.34-2.19(m,1H), 2.03-1.89(m,1H).
实施例12：1-(4-(6-氨基-5-(2,3-二氯苯基)吡嗪-2-基)苄基)胍的合成
Figure BDA0003052685280000191
步骤一：
将化合物B1(258mg,0.55mmol,1.0eq.)、叔丁基(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼硼烷-2-基)苄基)氨基甲酸酯(200mg,0.6mmol,1.1eq.)、Pd(dppf)Cl2(20mg,5 mol％)和碳酸钠(116mg,1.09mmol,2.0eq.)置于封管中，加入1,4-二氧六环(2mL) 溶液,将体系置换氮气，于85℃反应9h,TLC板监测至原料转化完全,柱层析纯化,得化合物12-1(232mg，65％)。
步骤二：
将化合物12-1(180mg,0.28mmol,1.0eq.)溶于乙酸乙酯(2mL)中，缓慢加入 2M的盐酸乙酸乙酯溶液(2mL),在室温搅拌至原料反应完全，加入饱和碳酸钠水溶液调pH至8，乙酸乙酯萃取(3mL×3)，合并有机相，浓缩，得化合物12-2(90mg，收率94％)。
步骤三：
将化合物12-2(120mg,0.35mmol,1.0eq.)和1-吡唑甲脒盐酸盐(51mg,0.35mmol,1.0eq.)溶于乙腈(2mL)，加入DIPEA(60μL,0.35mmol,1.0eq.)，回流反应6h,过滤，少量乙酸乙酯洗涤固体，干燥得化合物12(113mg，84％)。ESI-MS(m/z):387.1[M+H]+；1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.75(s,1H),8.42(s,1H),8.08(d,J＝8.3Hz,2H),7.72(dd,J＝ 7.8,1.8Hz,1H),7.66(brs,4H),7.51–7.39(m,4H),6.26(s,2H),4.47(s,2H).
实施例13：4-(6-氨基-5-(2,3-二氯苯基)吡嗪-2-基)-3-氧哌嗪-1-羧酰亚胺的合成
Figure BDA0003052685280000201
步骤一：
将化合物B1(400mg,0.85mmol,1.0eq.)、3-氧杂哌嗪-1-羧酸叔丁酯(169mg,0.85mmol,1.0eq.)、Pd2(dba)3(16mg,2mol％)、XantPhos(19mg,4mol％)和碳酸铯(551mg,1.69mmol,2.0eq.)置于封管中，加入1,4-二氧六环(4mL)溶液,将体系充真空置换氮气，于110℃反应8h,TLC板监测至原料转化完全,柱层析纯化,得化合物13-1(242mg， 46％)。
步骤二：
将化合物13-1(230mg,0.36mmol,1.0eq.)溶于乙酸乙酯(2mL)中，缓慢加入2M 的盐酸乙酸乙酯溶液(2mL),在室温搅拌至原料反应完全，加入饱和碳酸钠水溶液调 pH至8，乙酸乙酯萃取(3mL×3)，合并有机相，浓缩，得化合物13-2(84mg，收率 70％)。
步骤三：
将化合物13-2(80mg,0.24mmol,1.0eq.)和1-吡唑甲脒盐酸盐(35mg,0.24 mmol,1.0eq.)溶于乙腈(2mL)，加入DIPEA(42μL,0.24mmol,1.0eq.)，回流反应 6h,TLC板监测至原料转化完全,过滤得固体，用少量乙酸乙酯洗涤，得化合物13(89 mg，97％)。ESI-MS(m/z):380.1[M+H]+；1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.48(s,1H),7.73(dd,J ＝7.8,1.5Hz,1H),7.63(s,4H),7.47(t,J＝7.8Hz,1H),7.37(dd,J＝7.8,1.5Hz,1H),6.33(s, 2H),4.28(s,2H),4.19–4.09(m,2H),3.80–3.70(m,2H).
实施例14：1-(2-((6-氨基-5-(2,3-二氯苯基)吡嗪-2-基)甲基)氨基)乙基) -1-甲基胍的合成
Figure BDA0003052685280000211
步骤一：
将化合物B1(300mg,0.63mmol,1.0eq.)、N，N-二甲基乙烷-1,2-二胺(224mg,2.5mmol,4.0eq.)和碳酸铯(413mg,1.27mmol，2.0eq.)置于25mL反应瓶中，加入 3mL二甲基亚砜溶液,于室温反应6h,TLC板监测至原料转化完全,柱层析纯化,得化合物 14-1(240mg，73％)。
步骤二：
将化合物14-1(120mg,0.23mmol，1.0eq.)和1-吡唑甲脒盐酸盐(34mg,0.23mmol,1.0eq.)置于封管中，加入乙腈(2mL)，加入DIPEA(40μL,0.23mmol,1.0eq.)回流反应6h,柱层析纯化，得化合物14-2(110mg，85％)。
步骤三：
将化合物14-2(100mg,0.17mmol)溶于2mL乙酸乙酯中，缓慢加入2M的盐酸乙酸乙酯溶液(2mL),在室温搅拌至原料反应完全，加入饱和碳酸钠水溶液调pH至8，乙酸乙酯萃取(3mL×3)，合并有机相，浓缩，得化合物14(15mg，收率24％)。
ESI-MS(m/z):368.1[M+H]+；1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.47(s,4H),7.63(dd,J＝7.9,1.7Hz, 1H),7.39(t,J＝7.9,1H),7.33(s,1H),7.31(dd,J＝7.9,1.7Hz,1H),5.63(s,2H),3.67-3.58(m, 2H),3.52-3.42(m,2H),3.03(s,3H),2.93(s,3H).
实施例15：3-(2,3-二氯苯基)-6-(4-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)哌嗪-1-基)吡嗪-2-胺的合成
Figure BDA0003052685280000221
步骤一：
将化合物2(190mg,0.52mmol,1.0eq.)溶于2mL THF和0.2mL H2O中，加入溴丙酮(70mg,0.52mmol,1.0eq.)和碳酸钾(143mg,1.04mmol,2.0eq.),在70℃搅拌至原料反应完全，柱层析纯化,得化合物15(62mg，收率30％)。ESI-MS(m/z):404.1[M+H]+；1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.57(s,1H),7.49(dd,J＝6.5,3.1Hz,1H),7.29(m,2H), 6.41(s,1H),4.40(s,2H),3.72-3.67(m,4H),3.66–3.57(m,4H),2.20(s,3H).
实施例16：4-(6-氨基-5-(2,3-二氯苯基)吡嗪-2-基)哌嗪-1-碳硫酰胺的合成
Figure BDA0003052685280000222
步骤一：将化合物1-1(300mg,0.57mmol,1.0eq.)和DIPEA(0.1mL,1.0eq.)溶于5mL丙酮中，在0℃缓慢加入邻乙基碳异硫氰酸酯(75mg,0.57mmol,1.0eq.)，在室温搅拌至原料反应完全。柱层析纯化,得化合物16-1(218mg,60％)
步骤二：将化合物16-1(100mg,0.15mmol,1.0eq.)溶于1mL浓硫酸，在80℃搅拌至原料反应完全，柱层析纯化,得化合物16(37mg,收率65％)。
ESI-MS(m/z):383.1[M+H]+；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.63(dd,J＝8.0,1.6Hz,1H),7.53(s,2H),7.49(s,1H),7.40(t,J＝7.8Hz,1H),7.30(dd,J＝7.6,1.7Hz,1H),5.74(s, 2H),3.93-3.82(m,4H),3.61-3.52(m,4H).
实施例17：4-(6-氨基-5-(2,3-二氯苯基)吡嗪-2-基)-N-苯基哌嗪-1-羧酰亚胺的合成
Figure BDA0003052685280000231
步骤一：
将化合物1-1(500mg,0.96mmol)溶于2mL乙酸乙酯中，缓慢加入2M的盐酸乙酸乙酯溶液(2mL),在室温搅拌至原料反应完全，加入饱和碳酸钠水溶液调pH至8，乙酸乙酯萃取(3mL×3)，合并有机相，浓缩，得化合物17-1(270mg，87％)。
步骤二：
将化合物17-1(200mg,0.62mmol,1.2eq.)溶于2mL THF中，加入N-苯基-1H-咪唑-1-羧酰亚胺(96mg,0.51mmol,1.0eq.)，在70℃搅拌至原料反应完全，柱层析纯化, 得化合物17(93mg,收率41％)。ESI-MS(m/z):442.1[M+H]+；1H NMR(300MHz, Chloroform-d)δ7.61(s,1H),7.51(dd,J＝7.1,2.5Hz,1H),7.37–7.27(m,4H),7.08–6.99(m, 1H),6.99–6.91(m,2H),4.29(s,2H),3.72-3.66(m,4H),3.60-3.54(m,4H).
以下结合测试例进一步描述解释本发明，但这些实施例并非意味着限制本发明的范围。
实施例18体外SHP2酶水平活性测试
对上述实施例中化合物的SHP2酶水平活性进行测试，具体操作如下：
1 化合物配制
化合物溶解在100％DMSO中，配制成30mM储存液，于-20度冰箱避光保存。
2 SHP2反应过程
(1)配制1×ReactionBuffer。
(2)化合物浓度梯度的配制：受试化合物测试起始浓度为30μM，3倍稀释，10个浓度，单孔测试。在384source板中稀释成100倍终浓度的100％DMSO溶液，用Precision 3倍稀释化合物，10个浓度。使用分液器Echo 550向目的板384板中转移250nL 100倍终浓度的化合物。正对照加入250nL DMSO，负对照加入250nL 1mM SHP099。
(3)用1×ReactionBuffer配制5倍终浓度的激活肽溶液，分别加入5μL到反应板中， 1000rpm离心1min。
(4)用1×ReactionBuffer配制2.5倍终浓度的酶溶液，分别加入10μL到反应板中，1000rpm离心1min，室温孵育60分钟。
(5)用1×ReactionBuffer配制2.5倍终浓度的底物溶液，分别加入10μL到反应板中， 1000rpm离心1min，室温孵育20分钟。
(6)用EnSight读取Ex355/Em460荧光数值
3 数据分析
计算公式
Figure BDA0003052685280000241
其中：RFU：样品的荧光值；Mean(NC)：含10μM SHP099的对照孔荧光值均值；
Mean(PC)：阳性对照孔荧光值均值。
拟合量效曲线
以浓度的log值作为X轴，百分比抑制率为Y轴，采用分析软件GraphPad Prism 5的log(inhibitor)vs.response-Variable slope拟合量效曲线，从而得出各个化合物对酶活性的IC50值。
计算公式是Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))
4、实验结果
具体结果如表所示：
化合物编号 SHP2 IC<sub>50</sub>(nM)
1 C
2 B
3 C
4 A
5 B
6 A
8 A
9 A
10 B
11 A
12 C
13 C
14 C
15 C
16 C
17 A
SHP099 107
A＜500nM，500nM≤B≤1000nM，C＞1000nM。
实验结论：以上数据显示，本发明实施例化合物对SHP2磷酸酶具有变构抑制作用。
实施例19化合物体外抗增殖活性
1、实验步骤
(1)PBS溶液进行高压灭菌，置于冰箱4℃保存。
(2)称量胰蛋白酶和胰酶消化液，加入超纯水充分溶解，用微孔过滤器过滤得液体，置于冰箱-20℃保存。
(3)分别称取培养基粉和NaHCO3，加入超纯水充分溶解，加入10％双抗，用微孔滤膜过滤得培养液，置于冰箱4℃保存，待使用前加入10％胎牛血清。
(4)将NCI-H358细胞从液氮罐中取出，立刻置于37摄氏度恒温水浴锅中，摇晃使其融化，再将细胞倒入培养瓶中，加入培养液(含10％胎牛血清)稀释。将稀释后的培养基转入离心管中，1000r/min离心5分钟，舍弃上清液，再加入新鲜的培养基吹打混匀，移入培养瓶中培置于5％CO2、37℃培养箱中培养。待细胞贴壁快铺满瓶底时开始进行传代，加入少量新鲜的培养基(含10％胎牛血清)终止消化，倒掉培养瓶中的液体，PBS洗两遍，加入新鲜培养基吹打混匀，均分到两个培养瓶中继续培养。
(5)取对数期细胞，倒掉旧培养基，加入胰蛋白酶溶液消化3分钟，加入含10％胎牛血清的新鲜培养基终止消化，将溶液转移至离心管，1000r/min离心5分钟，舍弃上清液。加入培养基将其配制成细胞悬浊液，进行细胞计数。计数完成后，按照每孔5000-10000个细胞浓度将细胞植于96孔板中。将铺好细胞的96孔板置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养24h。用培养基将药物梯度稀释为90μmol/L,30μmol/L,10μmol/L,3.3μmol/L, 1.1μmol/L,0.37μmol/L随后将它们加入到96孔板中，每孔100μL，每个浓度设置三个复孔。对照组加入相应浓度的含溶媒的培养基，调零孔加入相同体积的空白培养基，置于 5％CO2、37℃培养箱孵育3天，每两天更换一次培养基。每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，混合均匀后，于5％CO2、37℃培养箱避光培养4h。将96孔板中的液体移除，每孔加入150 μL DMSO，置于微型振荡器上震荡，使底部的结晶完全溶解。随后将96孔板放入酶标仪中检测，于490nm处测定吸光度。
2、数据处理
绘制曲线并计算药物对细胞的抑制率及IC50。
抑制率＝[(对照组平均OD值-实验组平均OD值)/(对照组平均OD值-空白对照组平均OD值)]×100％。
3、实验结果
化合物对非小细胞肺癌细胞株NCI-H358细胞的抑制活性如下：
化合物编号 抑制率(10μM) 抑制率(50μM) IC<sub>50</sub>(μM)
2 -3％ 10％ NT
6 13％ 40％ NT
8 -20％ 32％ NT
9 -15％ 6.8％ NT
11 -10％ 6.8％ NT
17 56％ 65％ 8.2
SHP099 -3％ 41％ 46.2
实验结论：以上数据显示，本发明实施例化合物对NCI-H358细胞的增殖具有良好的抑制作用。相比较SHP099而言，本发明实施例17具备新颖的结构和更优越的活性。

Claims (5)

1.一种通式I所示的芳基螺环类化合物及其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003794590880000011
R1和R2独立地为卤素、氨基；
X为N或CH；
L为键、O或S；
当
Figure FDA0003794590880000017
为双键时，Y1为N，Y2为CH；
当
Figure FDA0003794590880000018
为单键时，Y1为C＝O,Y2为NR5，其中R5为H、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基或C1-C3的烷氧基；
Y3为CR7，其中R7为氢或氨基；
R为
Figure FDA0003794590880000012
当R为
Figure FDA0003794590880000013
取代时，K＝0或1；
A为CH2、C＝O或C＝S；
Z为NR8或CR9R10，其中R8为
Figure FDA0003794590880000014
SO2NH2；
R9为
Figure FDA0003794590880000015
R10为氢、C1-C3的烷基或C1-C3的氘代烷基；
R11为氢、氘、C1-C3的烷基、C1-C3的氘代烷基或未取代的苯基；
当R为
Figure FDA0003794590880000016
取代时，
M和Q为NRm，其中Rm为氢、氘、C1-C3的烷基或C1-C3的氘代烷基；
n＝0，1或2。
2.芳基螺环类化合物及其药学上可接受的盐为如下结构式中任意一个：
Figure FDA0003794590880000021
Figure FDA0003794590880000031
3.一种药物组合物，其特征在于含有如权利要求1或2所述的芳基螺环类化合物及其药学上可接受的盐和药学上可接受的辅料。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于药物组合物制成片剂、胶囊剂、注射液或冻干粉剂。
5.如权利要求1或2所述的芳基螺环类化合物及其药学上可接受的盐、权利要求3或4所述的药物组合物在制备用于治疗SHP2介导的相关疾病药物中的应用。
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