KR101153254B1 - 항바이러스 화합물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 바이러스 증식 및/또는 기능적인 활성의 지연, 감소 또는 저해 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 방법에 이용가능한 화합물 및 조성물에 관한 것이다.
현재, 바이러스 감염, 특히 높은 질병률 및 사망율과 관련있으며 많은 사람들에게 영향을 미치는 바이러스 감염에 대하여 효과적인 새로운 치료제 개발이 절실한 실정이다. 현재 이용가능한 치료제들은 상당수의 감염 환자들에서 무력하거나 또는 효과가 없다.
예를 들어, 바이러스의 역전사효소 및 단백질분해 효소를 표적으로 하는 약물들을 이용하여 AIDS 증상 개선 및 기대 수명 연장을 성공적으로 이루고 있다(Miller and Sarver, 1997 ; Mitsuya, 1992 ; Moore, 1997 ; and Thomas and Brady, 1997). 그러나, 단일 치료제 방법은 HIV 감염에 완벽하게 효과가 있는 것은 아니다(Barry et al, 1998 ; Deeks, 1998; Miles, 1997: Miles, 1998; Moyle et al, 1998 ; Rachlis and Zarowny, 1998; Veil et al, 1997 ; Volberding and Deeks, 1998; and Volberdin, 1998).
PCT 출원 PCT/AU99/00872는 화합물 5-(N,N-헥사메틸렌)-아밀로라이드 및 5- (N,N-디메틸)-아밀로라드의 HIV 감염 치료제 용도를 기술하고 있다.
중요한 인간 병원체로 간주되는 다른 바이러스로는 C형 감염바이러스(HCV)가 있다. 이는 인간의 건강적 손실 및 관련 경제학적 손실의 관점에서 중요한 인간 병원체이다. HCV는 만성 간염 및 간경변을 유발하며, 간 치환 수술의 주된 지표이다. 질병 통제 및 방제 센터에서는, 2002년 미국에서만도 4백만 이상이 감염되며 해마다 만성 간염바이러스에 의해 약 8,000 내지 10,000명이 사망하는 것으로 추산하였다. 그러나 이의 치유법 또는 백신은 공지되어 있지 않다. 보다 효과적인 약제가 절실히 요구되는 실정이다.
병원성 바이러스로 잘 알려진 다른 계열로는, 코로나바이러스가 있다. 코로나바이러스(니도비럴리스(Nidovirales) 목, 코로나비리디(Coronaviridae) 과, 코로나바이러스 속)는 소포체(endoplasmic reticulum)-골지(Golgi) 중간 구획 또는 cis-골지 네트워크로부터 출아되는 외피성 (+)가닥 RNA 바이러스이다(Fischer, Stegen et al. 1998; Maeda, Maeda et al. 1999 ; Corse and Machamer 2000 ; Maeda, Repass et al. 2001; Kuo and Masters 2003).
코로나바이러스는 인간과 동물에게 감염되며, 모든 동물마다 감염되는 코로나바이러스가 있을 것을 여겨진다. 2종의 인간 코로나바이러스인 229E 및 OC43은 감기의 주된 요인인 것으로 알려져 있으며, 노인, 신생아 또는 면역력 감소 환자들에서 가끔 폐렴을 유발시킬 수 있다(Peiris, Lai et al. 2003). 동물 코로나바이러스는 숙주에서 호흡기 질환, 위장 질환, 신경 질환 또는 간 질환을 초래할 수 있다(Penis, Lai et al. 2003). 몇 종의 동물 코로나바이러스들은 중요한 가축 병원 체이다(Rota, Oberste et al. 2003).
중증 급성 호흡기 증후군(SARS)은 새롭게 동정된 바이러스에 의해 유발된다. SARS는 최근들어 아시아, 북아메리카 및 유럽에서 보고된 호흡기 질병이다(Penis, Lai et al. 2003). SARS의 원인체는 코로나바이러스인 것으로 확인되었다(Drosten, Gunther et al. 2003 ; Ksiazek, Erdman et al. 2003 ; Peiris, Lai et al. 2003). 세계 보건기구는, 2002년 11월 1일부터 2003년 7월 11일까지 SARS 의심 경우로 보고된 총 사례가 8,437건이며, 거의 10%에 달하는 813명이 사망한 것으로 발표하였다. SARS는 근절되지 않고, 감기와 유사한 계절성 전염병을 초래할 것으로 여겨진다(Vogel 2003).
바이러스 감염의 치료 및 예방 가능성을 향상시키기 위해, 바이러스의 생활주기에서 여러가지 측면을 저해할 수 있는 분자의 동정이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 종래 기술에서 나타나는 적어도 하나 이상의 문제점을 극복 또는 개선시키는 방법, 또는 유용한 대안책을 제공하는 것이다.
본 명세서에서 논의된 종래 기술에 대한 모든 내용은 상기 종래 기술이 당해 기술분야에 널리 알려지거나, 보편적인 상식의 일부로서 인정하는 것으로 간주되지 않아야 한다.
발명의 개요
본 발명자들은 여러가지 바이러스 계열의 바이러스에 대해 항바이러스 활성을 가지는 치환된 아실구아니딘로 분류되는 특정 화합물을 놀랍게도 발견하였다. 특정 이론 또는 작용 기작과 결부시키고자 의도하지 않고 현재 정론을 고려하지 않으면서, 숙주 세포에서 발현된 이온 채널의 활성을 저해 또는 하향 조절함으로써 바이러스 복제를 지연시킬 수 있는 것으로 보인다. 따라서, 본 발명의 화합물의 바이러스 복제에 대한 악영향은, 바이러스 복제와 관련있는 막 이온 채널의 저해 또는 하향 조절에 의해 매개될 수 있다. 상기 막 이온 채널은 (숙주 세포에 외인적인) 바이러스 막 이온 채널이거나 또는 바이러스 감염의 결과로서 유도된 (숙주 세포에 내인적인) 숙주 세포 이온 채널일 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 화합물은 Vpu 또는 p7 기능을 저해할 수 있으며, 따라서 HIV 또는 HCV 각각의 생활 주기 순환을 저해할 수 있다.
SARS 바이러스는 본 발명에서 최초로 입증된, 이온 채널로 작용하는 E 단백질을 코딩한다. E 단백질과 유사한 단백질들이 다른 코로나바이러스들에 존재하므로, 본 발명의 화합물, 조성물 및 방법은, 다른 코로나바이러스에 의한 감염의 치료 및/또는 저해에 활용된다.
본 발명은 치환된 아실구아니딘으로 분류되는 신규 항바이러스 화합물에 관한 것이다. 본 발명의 범위에는 바이러스 증식 및/또는 기능적 활성을 지연, 감소 또는 저해함에 있어서, 화합물, 5-(N,N-헥사메틸렌)-아밀로라이드 및 5-(N,N-디메틸)-아밀로라드의 HIV의 용도를 포함하지 않는다.
따라서, 본 발명의 제1 측면은 항바이러스 활성이 있는 아실구아니딘을 제공하는 것이다.
본 발명의 제2 측면은 식I의 항바이러스 화합물을 제공하는 것이다:
상기에서, R1-R4는 독립적으로, 방향족기, 헤테로방향족기, 알킬방향족기, 알킬헤테로방향족기, 알케닐방향족기, 알케닐헤테로방향족기, 사이클로알킬방향족기, 사이클로알킬헤테로방향족기, 아릴옥시알킬기, 헤테로아릴옥시알킬기이며, 상기 기는 모노사이클 또는 폴리사이클이고, 수소, 하이드록시, 니트로, 할로, 아미노, 치환된 아미노, 알킬 치환된 아미노, 사이클로알킬 치환된 아미노, 아릴 치환된 아미노, C1-6 알킬, C1-6 알킬옥시, C3-6 사이클로알킬, 할로 치환된 C1-6 알킬, 할로 치환된 C1-6 알킬옥시, 페닐, C1-6 알켄일, C3-6 사이클로알켄일, C1-6 알켄옥시, 벤조, 아릴, 치환된 아릴, PrS, 또는 로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환된다.
본 발명의 제3 측면은 식I의 항바이러스 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하며,
상기에서, R1은
R2, R3 및 R4는 독립적으로 수소,
X는 수소, 하이드록시, 니트로, 할로, C1-6 알킬, C1-6 알킬옥시, C3-6 사이클로알킬, 할로 치환된 C1-6 알킬, 할로 치환된 C1-6 알킬옥시, 페닐, C1-6 알켄일, C3-6 사이클로알켄일, C1-6 알켄옥시 또는 벤조이고;
Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rf, Rh, Rk, Rl, Rm, Rn, Ro, Rp는 독립적으로, 수소, 아미노, 할로, C1-5 알킬, C1-5 알킬옥시, 하이드록시, 아릴, 치환된 아릴, 치환된 아미노, 모노알킬 치환된 아미노, 다이알킬 치환된 아미노, 사이클로알킬 치환된 아미노, 아릴 치환된 아미노, 또는 PrS이고;
Rg, Ri는 독립적으로 수소, 하이드록시, 할로 또는 C1-5 알킬이고;
Rj는 수소, 아미노, 할로, C1-5 알킬, C1-5 알킬옥시, 하이드록시, 아릴, 치환된 아릴, 치환된 아미노, 알킬 치환된 아미노, 사이클로알킬 치환된 아미노, 아릴 치환된 아미노, PrS, 또는 이다.
바람직하기로는 본 발명의 화합물은 하기를 포함한다:
하기 구조를 포함하는 5-(N,N-헥사메틸렌)아밀로라이드
하기 구조를 포함하는 5-(N,N-디메틸)아밀로라이드 하이드로클로라이드
하기 구조를 포함하는 5-(N-메틸-N-이소부틸)아밀로라이드
하기 구조를 포함하는 5-(N-에틸-N-이소프로필)아밀로라이드(이하 EIPA로 언금함)
하기 구조를 포함하는 N-(3,5-디아미노-6-클로로-피라진-2-카르보닐)-N'-페닐-구아니딘
하기 구조를 포함하는 N-벤질-N'-(3,5-디아미노-6-클로로-피르진-2-카르보닐)-구아니딘
하기 구조를 포함하는 3-메톡시 아밀로라이드
하기 구조를 포함하는 3-메톡시-5-(N,N-헥사메틸렌)-아밀로라이드
하기 구조를 포함하는 3-하이드록시-5-헥사메틸렌이미노-아밀로라이드
하기 구조를 포함하는 헥사메틸렌이미노-6-페닐-2-피라신카르복사미드
하기 구조를 포함하는 N-아미디노-3,5-디아미노-6-페닐-2-피라진카르복사미드
하기 구조를 포함하는 5-(N,N-헥사메틸렌)아밀로라이드
하기 구조를 포함하는 N-아미디노-3-아미노-5-페닐-6-클로로-2-피라진카르복사미드
하기 구조를 포함하는 3'4 디클로로벤즈아밀
하기 구조를 포함하는 2'4 디클로로벤즈아밀 HCl
하기 구조를 포함하는 5-(N-메틸-N-구아니디노카르보닐-메틸)아밀로라이드
하기 구조를 포함하는 5-(N,N-디에틸)아밀로라이드 하이드로클로라이드
하기 구조를 포함하는 5-(N,N-디메틸)아밀로라이드 하이드로클로라이드
하기 구조를 포함하는 5-tert-부틸아미노-아밀로라이드
하기 구조를 포함하는 6-요오도아밀로라이드
하기 구조를 포함하는 보디피-FL 아밀로라이드
하기 구조를 포함하는 5-(4-플루오로페닐)아밀로라이드
하기 구조를 포함하는 1-나프토일구아니딘
하기 구조를 포함하는 2-나프토일구아니딘
하기 구조를 포함하는 N-(2-나프토일)-N'-페닐구아니딘
하기 구조를 포함하는 N,N'-비스(2-나프토일)구아니딘
하기 구조를 포함하는 N,N'-비스(1-나프토일)구아니딘
하기 구조를 포함하는 N,N'-비스(2-나프토일)-N''-페닐구아니딘
하기 구조를 포함하는 6-메톡시-2-나프토일구아니딘
하기 구조를 포함하는 N-신나모일-N',N'-디메틸구아니딘
하기 구조를 포함하는 3-뷔놀리노일구아니딘
하기 구조를 포함하는 신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 4-페닐벤조일구아니딘
하기 구조를 포함하는 N-(신나모일)-N'페닐구아니딘
하기 구조를 포함하는 (3-페닐프로파노일)구아니딘
하기 구조를 포함하는 N,N'-비스-(신나모일)-N''-페닐구아니딘
하기 구조를 포함하는 N-(3-페닐프로파노일)-N'-페닐구아니딘
하기 구조를 포함하는 N,N'-비스(3페닐프로파노일)-N''-페닐구아니딘
하기 구조를 포함하는 트랜스-3-퓨란아크리오일구아니딘
하기 구조를 포함하는 N-(6-하이드록시-2-나프토일)-N'-페닐구아니딘
하기 구조를 포함하는 (4-페놀시벤조일)구아니딘
하기 구조를 포함하는 N,N'-비스(아미디노)나프탈렌-2,6-디카르복사미드
하기 구조를 포함하는 6-브로모-2-나프토일구아니딘
하기 구조를 포함하는 1-브로모-2-나프토일구아니딘
하기 구조를 포함하는 2-(2-나프틸)아세토일구아니딘
하기 구조를 포함하는 N''-신나모일-N,N'-디페닐구아니딘
하기 구조를 포함하는 (페닐아세틸)구아니딘
하기 구조를 포함하는 N,N'-비스(3-페닐프로파노일)구아니딘
하기 구조를 포함하는 벤조일구아니딘
하기 구조를 포함하는 (4-클로로페녹시-아세틸)구아니딘
하기 구조를 포함하는 N-벤조일-N'-신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 [(E)-3-(4-디메틸아미노페닐)-2-메틸아크릴오릴]구아니딘
하기 구조를 포함하는 (4-클로로신나모일)구아니딘
하기 구조를 포함하는 (4-브로모신나모일)구아니딘
하기 구조를 포함하는 (4-메톡시신나모일)구아니딘
하기 구조를 포함하는 (5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘
하기 구조를 포함하는 (3-브로모신나모일)구아니딘
하기 구조를 포함하는 (3-메톡시신나모일)구아니딘
하기 구조를 포함하는 (3-클로로신나모일)구아니딘
하기 구조를 포함하는 (2-클로로신나모일)구아니딘
하기 구조를 포함하는 (2-브로모신나모일)구아니딘
하기 구조를 포함하는 (2-메톡시신나모일)구아니딘
하기 구조를 포함하는 (트랜스-2-페닐사이클로프로판카르보닐)구아니딘
하기 구조를 포함하는 [3-(3-피리딜)아크릴로일]구아니딘
하기 구조를 포함하는 (4-하이드록시신나모일)구아니딘
하기 구조를 포함하는 (뷔놀린-2-카르보닐)구아니딘
하기 구조를 포함하는 (4-니트로신나모일)구아니딘
하기 구조를 포함하는 (3-니트로신나모일)구아니딘
하기 구조를 포함하는 (2-니트로신나모일)구아니딘
하기 구조를 포함하는 (α-메틸신나모일)구아니딘
하기 구조를 포함하는 트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘
하기 구조를 포함하는 4-페닐신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 3-메틸신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 4-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 2-메틸신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 2-(트리플루오로메틸)신나모일
하기 구조를 포함하는 4-메틸신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 4-이소프로필신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 3-플루오로신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 2-플루오로신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 4-플루오로신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 3,4-디클로로신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 2,4-디클로로신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 2,6-디클로로신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 4-에톡시신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 3,4-(메틸렌디옥시)신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 3-(2-나프틸)아크릴로일구아니딘
하기 구조를 포함하는 4-t-부틸신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 3,4,5-트리메톡시신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 2-(1-나프틸)아세토일구아니딘
하기 구조를 포함하는 2,5-디메틸신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 2,3-디플루올로신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 3-페닐신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 3-(트랜스-헵트-1-엔-1-일)신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 2-에틸신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 2-클로로-6-플루오로신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 3-t-부틸신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 3,4-디플루오로신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 5-브로모-2-플루오로신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 3-(트리플루오로메톡시)신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 2-에톡시신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 2-t-부틸신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 3-(사이클로헥스-1-엔-1일)신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 신나모일구아니딘 하이드로클로라이드
하기 구조를 포함하는 2,3,5,6-테트라메틸신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 2-사이클로헥시신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 5-브로모-2-메톡시신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 2,3-디메틸신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 3-에톡시신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 3-이소프로필신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 2-페닐신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 2-(사이클로헥스-1-엔-1일)신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 2,4,6-트리메틸신나모일구아니딘
하기 구조를 포함하는 (5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘
하기 구조를 포함하는 5-(3'-브로모페닐)펜타-2,4-디에노일구아니딘
하기 구조를 포함하는 5-(2'-브로모페닐)펜타-2,4-디에노일구아니딘
하기 구조를 포함하는 퓨란아크릴로일
바람직하기로는, 본 발명의 화합물은 바이러스의 증식 및/또는 복제를 지연, 감소 또는 저해할 수 있다.
바람직하기로는, 본 발명의 화합물의 항바이러스 활성은, 렌티바이러스 과 및 코로노바이러스 과에 속하는 바이러스에 대한 것이다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스(SARS), 마우스 간염 바이러스 및 C형 간염 바이러스(HCV)와 같은 바이러스에 대해 항바이러스 활성을 보인다.
본 발명의 제4 측면은, 제1, 제2 또는 제3 측면중 어느 하나에 따른 항바이러스 화합물 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체 또는 유사체를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것으로, 상기 화합물은 바이러스의 증식 및/또는 복제를 감소, 지연 또는 저해할 수 있다.
바람직하기로는, 본 발명의 항바이러스 활성은 렌티바이러스 과 및 코로나바이러스 과에 속하는 바이러스에 대한 것이다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스(SARS), 인간 코로나바이러스 229E, 인간 코로나바이러스 OC43, 마우스 간염 바이러스(MHV), 소 코로나바이러스(BCV), 돼지 호흡기 코로나바이러스(PRCV), C형 간염 바이러스(HCV) 및 말 동맥염 바이러스(EAV)와 같은 바이러스에 대해 항바이러스 활성을 보인다.
본 발명의 화합물에 의해 이의 감염이 저해 또는 치료되는 다른 코로나바이러스들은 표 1에 기재되어 있다.
본 발명의 조성물은 공지의 항바이러스 화합물 또는 분자를 하나 이상 더 포함할 수 있다.
본 발명의 제5 측면은, 바이러스에 감염된 세포 또는 상기 바이러스에 노출된 세포에 제1, 제2 또는 제3 측면중 어느 하나에 따른 항바이러스 화합물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 바이러스의 증식 및/또는 복제의 감소, 지연 또는 저해 방법을 제공한다.
바람직하기로는, 상기 바이러스는 렌티바이러스 과 또는 코로나바이러스 과의 바이러스이다. 더 바람직하기로는, 상기 바이러스는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스(SARS), 인간 코로나바이러스 229E, 인간 코로나바이러스 OC43, 마우스 간염 바이러스(MHV), 소 코로나바이러스(BCV), 돼지 호흡기 코로나바이러스(PRCV), C형 간염 바이러스(HCV) 또는 말 동맥염 바이러스(EAV)이다. 가장 비람직하기로는, 상기 바이러스는 HIV-1, HIV-2, SARS 바이러스, 코로나바이러스 229E, 코로나바이러스 OC43, PRCA, BCA, HCV 또는 EAV이다.
본 발명의 화합물에 의해 이의 감염이 저해 또는 치료되는 다른 코로나바이러스들은 표 1에 기재되어 있다.
본 발명의 제6 측면은, 세포에 제1, 제2 또는 제3 측면중 어느 하나에 따른 항바이러스 화합물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 바이러스에 노출된 세포의 감염의 예방 방법을 제공한다.
바람직하기로는, 상기 바이러스는 렌티바이러스 과 또는 코로나바이러스 과의 바이러스이다. 더 바람직하기로는, 상기 바이러스는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스(SARS), 인간 코로나바이러스 229E, 인간 코로나바이러스 OC43, 마우스 간염 바이러스(MHV), 소 코로나바이러스(BCV), 돼지 호흡기 코로나바이러스(PRCV), C형 간염 바이러스(HCV) 또는 말 동맥염 바이러스(EAV)이다. 가장 비람직하기로는, 상기 바이러스는 HIV-1, HIV-2, SARS 바이러스, 코로나바이러스 229E, 코로나바이러스 OC43, PRCA, BCA, HCV 또는 EAV이다.
본 발명의 화합물에 의해 이의 감염이 저해 또는 치료되는 다른 코로나바이러스들은 표 1에 기재되어 있다.
본 발명의 제7 측면은, 세포에 제1, 제2 또는 제3 측면중 어느 하나에 따른 항바이러스 화합물을 치료가 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스로 감염되었거나 또는 바이러스에 노출된 개체에 대한 치료학적 또는 예방학적 처리 방법을 제공한다.
바람직하기로는, 상기 바이러스는 렌티바이러스 과 또는 코로나바이러스 과의 바이러스이다. 더 바람직하기로는, 상기 바이러스는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스(SARS), 인간 코로나바이러스 229E, 인간 코로나바이러스 OC43, 마우스 간염 바이러스(MHV), 소 코로나바이러스(BCV), 돼지 호흡기 코로나바이러스(PRCV), C형 간염 바이러스(HCV) 또는 말 동맥염 바이러스(EAV)이다. 가장 비람직하기로는, 상기 바이러스는 HIV-1, HIV-2, SARS 바이러스, 코로나바이러스 229E, 코로나바이러스 OC43, PRCA, BCA, HCV 또는 EAV이다.
본 발명의 화합물에 의해 이의 감염이 저해 또는 치료되는 다른 코로나바이러스들은 표 1에 기재되어 있다.
바이러스 저해 대상은 일반적으로 인간, 영장류, 가축(예, 양, 소, 당나귀, 돼지), 애완동물(예, 개, 고양이), 실험용 동물(예, 마우스, 토끼, 랫, 기니아피그, 햄스터), 야생 포획 동물(예, 여우, 사슴)에 제한되진 않으나 이와 같은 포유류이다. 바람직하기로는 상기 대상은 영장류 또는 말이다. 가장 바람직하기로는, 상기 대상은 인간이다.
본 발명의 제8 측면은, 세포에 제1, 제2 또는 제3 측면중 어느 하나에 따른 항바이러스 화합물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 바이러스로 감염된 세포에서의 막 이온 채널의 기능적 활성을 하향 조절하는 방법을 제공한다.
상기 막 이온 채널은 세포 내인적이거나, 외인적이다.
바람직하기로는, 기능적 활성이 하향 조절되는 상기 막 이온 채널은, 바이러스 복제 매개시 렌티바이러스 및 코로나바이러스가 사용하는 것이며, 예컨대, HIV 막 이온 채널 Vpu, HCV 막 이온 채널 P7, 코로나바이러스 E 단백질 막 이온 채널 및 SARS E 단백질 막 이온 채널이 있다.
바람직하기로는, 상기 바이러스는 렌티바이러스 과 또는 코로나바이러스 과의 바이러스이다. 더 바람직하기로는, 상기 바이러스는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스(SARS), 인간 코로나바이러스 229E, 인간 코로나바이러스 OC43, 마우스 간염 바이러스(MHV), 소 코로나바이러스(BCV), 돼지 호흡기 코로나바이러스(PRCV), C형 간염 바이러스(HCV) 또는 말 동맥염 바이러스(EAV)이다. 가장 비람직하기로는, 상기 바이러스는 HIV-1, HIV-2, SARS 바이러스, 코로나바이러스 229E, 코로나바이러스 OC43, C형 간염 바이러스(HCV) 또는 말 동맥염 바이러스(EAV)이다.
본 발명의 제9 측면에 있어서, 감염 세포에 제1, 제2 또는 제3 측면중 어느 하나에 따른 항바이러스 화합물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 감염된 세포에서의 바이러스 증식 및/또는 복제를 감퇴, 지연 또는 저해하는 방법을 제공한다.
바람직하기로는, 상기 바이러스는 렌티바이러스 과 또는 코로나바이러스 과의 바이러스이다. 더 바람직하기로는, 상기 바이러스는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스(SARS), 인간 코로나바이러스 229E, 인간 코로나바이러스 OC43, 마우스 간염 바이러스(MHV), 소 코로나바이러스(BCV), 돼지 호흡기 코로나바이러스(PRCV), C형 간염 바이러스(HCV) 또는 말 동맥염 바이러스(EAV)이다. 가장 비람직하기로는, 상기 바이러스는 HIV-1, HIV-2, SARS 바이러스, 코로나바이러스 229E, 코로나바이러스 OC43, C형 간염 바이러스(HCV) 또는 말 동맥염 바이러스(EAV)이다.
본 발명의 화합물에 의해 감염이 저해 또는 치료될 수 있는 다른 코로나바이러스는 표 1에 개시되어 있다.
바람직하기로는, 기능적 활성이 하향 조절되는 상기 막 이온 채널은, 바이러스 복제 매개시 렌티바이러스 및 코로나바이러스가 사용하는 것이며, 예컨대, HIV 막 이온 채널 Vpu, HCV 막 이온 채널 P7, 코로나바이러스 E 단백질 막 이온 채널 및 SARS E 단백질 막 이온 채널이 있다.
본 발명의 제10 측면은, 제1, 제2 또는 제3 측면중 어느 하나에 따른 항바이러스 화합물, 또는 제4 측면에 따른 약학적 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 화합물 또는 상기 조성물은 감염된 세포에서 발현된 막 이온 채널의 기능적 활성을 하향 조절하는 것인, 포유류의 감염된 세포에서의 바이러스 증식 및/또는 복제를 감퇴, 지연 또는 저해하는 방법을 제공한다.
바람직하기로는, 상기 바이러스는 렌티바이러스 과 또는 코로나바이러스 과의 바이러스이다. 더 바람직하기로는, 상기 바이러스는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스(SARS), 인간 코로나바이러스 229E, 인간 코로나바이러스 OC43, 마우스 간염 바이러스(MHV), 소 코로나바이러스(BCV), 돼지 호흡기 코로나바이러스(PRCV), C형 간염 바이러스(HCV) 또는 말 동맥염 바이러스(EAV)이다. 가장 비람직하기로는, 상기 바이러스는 HIV-1, HIV-2, SARS 바이러스, 코로나바이러스 229E, 코로나바이러스 OC43, C형 간염 바이러스(HCV) 또는 말 동맥염 바이러스(EAV)이다.
본 발명의 화합물에 의해 감염이 저해 또는 치료될 수 있는 다른 코로나바이러스는 표 1에 개시되어 있다.
바람직하기로는, 기능적 활성이 하향 조절되는 상기 막 이온 채널은, 바이러스 복제 매개시 렌티바이러스 및 코로나바이러스가 사용하는 것이며, 예컨대, HIV 막 이온 채널 Vpu, HCV 막 이온 채널 P7, 코로나바이러스 E 단백질 막 이온 채널 및 SARS E 단백질 막 이온 채널이 있다.
바이러스 저해 대상은 일반적으로 인간, 영장류, 가축(예, 양, 소, 당나귀, 돼지), 애완동물(예, 개, 고양이), 실험용 동물(예, 마우스, 토끼, 랫, 기니아피그, 햄스터), 야생 포획 동물(예, 여우, 사슴)에 제한되진 않으나 이와 같은 포유류이다. 바람직하기로는 상기 대상은 영장류 또는 말이다. 가장 바람직하기로는, 상기 대상은 인간이다.
본 발명의 제11 측면은, 제1, 제2 또는 제3 측면중 어느 하나에 따른 항바이러스 화합물, 또는 제4 측면에 따른 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 화합물 또는 상기 조성물은 바이러스 유래의 막 이온 채널의 기능적 활성을 하향 조절하는 것인, 바이러스에 노출되거나 또는 감염된 개체에 대한 치료학적 또는 예방학적 처치 방법을 제공한다.
바람직하기로는, 상기 바이러스는 렌티바이러스 과 또는 코로나바이러스 과의 바이러스이다. 더 바람직하기로는, 상기 바이러스는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스(SARS), 인간 코로나바이러스 229E, 인간 코로나바이러스 OC43, 마우스 간염 바이러스(MHV), 소 코로나바이러스(BCV), 돼지 호흡기 코로나바이러스(PRCV), C형 간염 바이러스(HCV) 또는 말 동맥염 바이러스(EAV)이다. 가장 비람직하기로는, 상기 바이러스는 HIV-1, HIV-2, SARS 바이러스, 코로나바이러스 229E, 코로나바이러스 OC43, C형 간염 바이러스(HCV) 또는 말 동맥염 바이러스(EAV)이다.
본 발명의 화합물에 의해 감염이 저해 또는 치료될 수 있는 다른 코로나바이러스는 표 1에 개시되어 있다.
바람직하기로는, 기능적 활성이 하향 조절되는 상기 막 이온 채널은, 바이러스 복제 매개시 렌티바이러스 및 코로나바이러스가 사용하는 것이며, 예컨대, HIV 막 이온 채널 Vpu, HCV 막 이온 채널 P7, 코로나바이러스 E 단백질 막 이온 채널 및 SARS E 단백질 막 이온 채널이 있다.
바이러스 저해 대상은 일반적으로 인간, 영장류, 가축(예, 양, 소, 당나귀, 돼지), 애완동물(예, 개, 고양이), 실험용 동물(예, 마우스, 토끼, 랫, 기니아피그, 햄스터), 야생 포획 동물(예, 여우, 사슴)에 제한되진 않으나 이와 같은 포유류이다. 바람직하기로는 상기 대상은 영장류 또는 말이다. 가장 바람직하기로는, 상기 대상은 인간이다.
본 발명의 제12 측면은, 아래 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 항바이러스 화합물을 제공한다:
N-(3,5-디아미노-6-클로로-피라진-2-카르보닐)-N'-페닐-구아니딘,
N-벤질-N'-(3,5-디아미노-6-클로로-피라진-2-카르보닐)-구아니딘,
3'4 디클로로벤즈아밀,
2'4디클로로벤즈아밀,
5-(N-메틸-N-구아니디노카르보닐-메틸)아밀로라이드,
5-(N-메틸-N-이소부틸)아밀로라이드,
5-(N-에틸-N-이소프로필)아밀로라이드,
5-(N,N-디메틸)아밀로라이드 하이드로클로라이드,
5-(N,N-헥사메틸렌)아밀로라이드,
5-(N,N-디에틸)아밀로라이드 하이드로클로라이드,
6-요오도아밀로라이드,
보디피-FL 아밀로라이드,
3-하이드록시-5-헥사메틸렌이미노-아밀로라이드,
5-(4-플루오로페닐)아밀로라이드,
5-tert-부틸아미노-아밀로라이드,
N-아미디노-3-아미노-5-페닐-6-클로로-2-피라진카르복사미드,
3-메톡시-5-(N,N-헥사메틸린)-아밀로라이드,
3-메톡시-아밀로라이드
헥사메틸렌이미노-6-페닐-2-피라진카르복시미드,
N-아미디노-3,5-디아미노-6-페닐-2-피라진카르복사미드,
1-나프토일구아니딘,
2-나프토일구아니딘,
N-(2-나프토일)-N'-페닐구아니딘,
N,N'-비스(2-나프토일)구아니딘,
N,N'-비스(1-나프토일)구아니딘,
N,N'-비스(2-나프토일)-N''-페닐구아니딘,
6-메톡시-2-나프토일구아니딘,
3-퀴놀리노일구아니딘,
신나모일구아니딘,
4-페닐벤조일구아니딘,
N-(신나모일)-N'페닐구아니딘,
(3-페닐프로파노일)구아니딘,
N,N'-비스-(신나모일)-N''-페닐구아니딘,
N-(3-페닐프로파노일)-N'-페닐구아니딘,
N,N-비스(3페닐프로파노일)-N''-페닐구아니딘,
트랜스-3-퓨란아크리오일구아니딘,
N-(6-하이드록시-2-나프토일)-N'-페닐구아니딘,
(4-페녹시벤조일)구아니딘,
N,N'-비스(아미디노)나프탈렌-2,6-디카르복사미드,
N''-신나모일-N,N'-디페닐구아니딘,
(페닐아세틸)구아니딘,
N,N'-비스(3-페닐프로파노일)구아니딘,
벤조일구아니딘,
(4-클로로페녹시-아세틸)구아니딘,
N-벤조일-N'-신나모일구아니딘,
[(E)-3-(4-디메틸아미노페닐)-2-메틸아크릴로일]구아니딘,
(4-클로로신나모일)구아니딘,
(4-브로모신나모일)구아니딘,
(4-메톡시신나모일)구아니딘,
(5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘,
(3-브로모신나모일)구아니딘,
(3-메톡시신나모일)구아니딘,
(3-클로로신나모일)구아니딘,
(2-클로로신나모일)구아니딘,
(2-브로모신나모일)구아니딘,
(트랜스-2-페닐사이클로프로판카르보닐)구아니딘,
[3-(3-피리딜)아크릴로일]구아니딘,
(4-하이드록시신나모일)구아니딘,
(퀴놀린-2-카르보닐)구아니딘,
또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염들.
본 발명의 제13 측면은, 제12 측면에 따른 화합물 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체 또는 유사체 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
바람직하기로는, 상기 약학적 조성물은 공지의 항바이러스 화합물 또는 분자 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
문맥이 명확하지 않는한, 본 발명의 상세한 설명 및 청구의 범위에 있어서 용어 '포함하다', '포함하는' 및 유사어는"포함하나 제한되지 않음의 의미로, 한정적인 의미 또는 전체 의미에 반하는 포괄적인 의미로 해석되어진다.
발명의 상세한 설명
본 발명자들은 여러가지 바이러스 계열의 바이러스에 대해 항바이러스 활성을 가지는 치환된 아실구아니딘로 분류되는 특정 화합물을 놀랍게도 발견하였다. 특정 이론 또는 작용 기작과 결부시키고자 의도하지 않고 현재 정론을 고려하지 않으면서, 바이러스 복제를 숙주 세포에서 발현된 이온 채널의 활성을 저해 또는 하향 조절함으로써 지연시킬 수 있는 것으로 보인다. 따라서, 본 발명의 화합물의 바이러스 복제에 대한 악영향은, 바이러스 복제와 관련있는 막 이온 채널의 저해 또는 하향 조절에 의해 매개될 수 있다. 상기 막 이온 채널은 (숙주 세포에 외인적인) 바이러스 막 이온 채널이거나 또는 바이러스 감염의 결과로서 유도된 (숙주 세포에 내인적인) 숙주 세포 이온 채널일 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 화합물은 Vpu 또는 p7 기능을 저해할 수 있으며, 따라서 HIV 또는 HCV 각각의 생활 주기 순환을 저해할 수 있다.
SARS 바이러스는 본 발명에서 최초로 입증된, 이온 채널로 작용하는 E 단백질을 코딩한다. E 단백질과 유사한 단백질들이 다른 코로나바이러스들에 존재하므로, 본 발명의 화합물, 조성물 및 방법은, 다른 코로나바이러스에 의한 감염의 치료 및/또는 저해에 활용된다.
그러나, 본 발명은 치환된 아실구아니딘으로 분류되는 항바이러스 화합물에 관한 것이나, 본 발명의 범위에는 바이러스 증식 및/또는 기능적 활성을 지연, 감소 또는 저해함에 있어서의 화합물, 5-(N,N-헥사메틸렌)-아밀로라이드 및 5-(N,N-디메틸)-아밀로라드의 HIV의 용도를 포함하지 않는다.
당업자라면 본 발명의 화합물이 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제를 포함한 조성물 형태나 또는 제형 형태로 투여될 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 약학적 조성물은 하나 이상의 공지된 항바이러스 화합물 또는 분자를 더 포함할 수도 있다. 바람직하기로는, 상기 공지된 항바이러스 성분은 비다라빈(Vidarabine), 어사이클로비르(Acyclovir), 간시클로비르(Ganciclovir), 발간시클로비르(Valganciclovir), 발라사이클로비르(Valacyclovir), 시도포비르(Cidofovir), 팜시클로비르(Famciclovir), 리바비린(Ribavirin), 아만타딘(Amantadine), 리만타딘(Rimantadine), 인터페론(Interferon), 오셀타미비르(Oseltamivir), 팔리비주맵(Palivizumab), 리만타딘(Rimantadine), 자나미비르(Zanamivir), 뉴클레오시드-유사 역전사효소 저해제(nucleoside-analog reverse transcriptase inhibitors)(NRT1), 예컨대 지도부딘(Zidovudine), 디다노신(Didanosine), 잘시타빈(Zalcitabine), 스타부딘(Stavudine), 라미부딘(Lamivudine) 및 아바카비르(Abacavir), 비뉴클레오시드 역전사효소 저해제(non- nucleoside reverse transcriptase inhibitors)(NNRTT), 예컨대 네비라핀(Nevirapine), 델라비르딘(Delavirdine) 및 에파비렌즈(Efavirenz), 단백질분해효소 저해제, 예컨대 사뷔나비르(Saquinavir), 리토나비르(Ritonavir), 인디나비르(Indinavir), 넬피나비르(Nelfnavir), 암프레나비르(Amprenavir) 및 그외 공지된 화합물 및 조제물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 공지된 항바이러스 화합물 또는 분자는 본 발명의 항바이러스 화합물과 함께 일부 경우에서는 상승적으로 작용할 수 있다.
표 1. 공지된 코로나바이러스
그룹 1 종
개 코로나바이러스
개 장염성 코로나바이러스(균주 INSAVC-1)
개 장염성 코로나바이러스(균주 K378)
고양이 코로나바이러스
고양이 장염성 코로나바이러스(균주 79-683)
고양인 전염성 복막염 코로나바이러스(FIPV)
인간 코로나바이러스 229E
돼지 유행성 설사 바이러스
돼지 유행성 설사 바이러스(균주 Brl/87)
돼지 유행성 설사 바이러스(균주 CV777)
전염성 위장염 바이러스
돼지 호흡기 코로나바이러스
돼지 전염성 위장염 바이러스(균주 FS772/70)
돼지 전염성 위장염 바이러스(Miller)
돼지 전염성 위장염 바이러스(균주 Neb72-RT)
돼지 전염성 위장염 바이러스(균주 PURDUE)
그룹 2 종
소 코로나바이러스
소 코로나바이러스(균주 F15)
소 코로나바이러스(균주 G95)
소 코로나바이러스(균주 L9)
소 코로나바이러스(균주 LSU-94LSS-051)
소 코로나바이러스(균주 LY-138)
소 코로나바이러스(균주 MEBUS)
소 코로나바이러스(균주 OK-0514-3
소 코로나바이러스(균주 Ontario)
소 코로나바이러스(균주 QUEBEC)
소 코로나바이러스(균주 VACCINE)
소 장염성 코로나바이러스(균주 98TXSF-110-ENT)
개 호흡기 코로나바이러스
닭 장엄성 코로나바이러스
인간 코로나바이러스 OC43
뮤라인 간염 바이러스
뮤라인 간염 바이러스(균주 DVIM)
뮤라인 간염 바이러스(균주 A59)
뮤라인 간염 바이러스(균주 JHM)
뮤라인 간염 바이러스(균주 S)
뮤라인 간염 바이러스 균주 1
뮤라인 간염 바이러스 균주 2
` 뮤라인 간염 바이러스 균주 3
뮤라인 간염 바이러스 균주 4
뮤라인 간염 바이러스 균주 ML-11
돼지 혈구응집성 뇌척수염 바이러스
돼지 혈구응집성 뇌척수염 바이러스(균주 67N)
돼지 혈구응집성 뇌척수염 바이러스(균주 IAF-404)
퓨피노시스(Puffinosis) 바이러스
랫 코로나바이러스
랫 코로나바이러스(균주 681)
랫 코로나바이러스(균주 (NJ)
랫 시알로드아크리오아데니티스(sialodacryoadenitis) 코로나바이러스
그룹 3 종
칠면조 코로나바이러스
칠면조 코로나바이러스(균주 Indiana)
칠면조 코로나바이러스(균주 Minnesota)
칠면조 코로나바이러스(균주 NC95)
조류 전염성 기관지염 바이러스
조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 6/82)
조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 Arkansas 99)
조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 Beaudette CK)
조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 Beaudette M42)
조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 Beaudette US)
조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 Beaudette)
조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 D1466)
조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 D274)
조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 D3896)
조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 D41)
조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 DE072)
조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 GRAY)
조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 H120)
조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 H52)
조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 KB8523)
조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 M41)
조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 PORTUGAL/322/82)
조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 SAIB20)
조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 UK/123/82)
조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 UK142/86)
조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 UK/167/84)
조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 UK/183/66)
조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 UK/68/84)
조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 V18/91)
조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 Vic S)
조류 전염성 후두기관염 바이러스
예비 그룹 4 종
SARS 코로나 바이러스
SARS 코로나 바이러스 베이징 ZY-2003
SARS 코로나 바이러스 BJ01
SARS 코로나 바이러스 BJ02
SARS 코로나 바이러스 BJ03
SARS 코로나 바이러스 BJ04
SARS 코로나 바이러스 CUHK-Su10
SARS 코로나 바이러스 CUHK-W1
SARS 코로나 바이러스 Frankfurt1
SARS 코로나 바이러스 GZ01
SARS 코로나 바이러스 HKU-39849
SARS 코로나 바이러스 홍콩 ZY-2003
SARS 코로나 바이러스 홍콩/03/2003
SARS 코로나 바이러스 HSR1
SARS 코로나 바이러스 Sin2500
SARS 코로나 바이러스 Sin2677
SARS 코로나 바이러스 Sin2679
SARS 코로나 바이러스 Sin2748
SARS 코로나 바이러스 Sin2774
SARS 코로나 바이러스 타이완
SARS 코로나 바이러스 타이완 JC-2003
SARS 코로나 바이러스 타이완 TC1
SARS 코로나 바이러스 타이완 TC2
SARS 코로나 바이러스 Tor2
SARS 코로나 바이러스 TW1
SARS 코로나 바이러스 TWC
SARS 코로나 바이러스 우르바니
SARS 코로나 바이러스 베트남
SARS 코로나 바이러스 ZJ-HZ01
SARS 코로나 바이러스 ZJ01
미분류된 코로나바이러스
소 호흡기 코로나바이러스(균주 98TXSF-110-LUN)
인간 장염 코로나바이러스 4408
장염 코로나바이러스
말 코로나바이러스
말 코로나바이러스 NC99
본 발명의 관찰과 확인은 특정 치환된 아실구아니딘과 같은 물질의 여러가지 바이러스에 의해 유발된 바이러스 질병의 치료 및 예방용 항바이러스제로서의 사용을 허용한다. 본 발명의 방법 및 조성물은 특히 바이러스 복제시 이온 채널 형성에 의존적인 바이러스에 대해 효과적인 수 있지만, 이는 바이러스 복제시 의존적인 기작에 국한되지 않으며, 본 발명의 화합물 및 방법은 이온 채널 형성을 지연 또는 저해하는 것으로 이의 작용을 나타내는 물질에 한정되지 않는 것으로 이해될 것이다.
"막 이온 채널"은 참조로, 막을 통과하여 이온을 수송하는 구조를 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 수동적 수송, 삼투압 수송, 능동 수송 또는 교환 수송과 같은 방식으로 작용할 수 있는 이온 채널을 포함한다. 이온 채널은 세포내 또는 세포외 방법에 의해 형성될 수 있다. 예를 들면, 이온 채널은 세포의 정상적인 기능성을 용이하게 하기 위해 세포에 의해 자연적으로 형성된 이온 채널일 수 있다. 또한, 이온 채널은 세포외 방법에 의해 형성될 수도 있다. 세포외 방법으로는, 예컨대 도입된 화합물, 약물 또는 이오노포어와 같은 다른 물질이나 또는 세포에 들어온 바이러스에 의해 코딩되는 바이러스 단백질의 기능적 활성에 의한, 이온 채널 형성을 포함한다.
본 발명의 특정 예의 대상인 이온 채널은, 막을 통과하는 이온 수송을 용이하게 한다. 상기 막은 모든 막일 수 있으며, 외층 세포 벽인 원형질(plasma) 막에 국한되진 않는다. 따라서, "막"은 모든 세포성 세포기관, 예컨대 골지체 및 소포체, 외측 세포 막, 세포내 위치한 임의의 외부 항원을 둘러싼 막(예, 바이러스 외피(virus envelope)), 또는 세포외에 위치하는 외부 생물의 막을 포함한다. 막은 전형적으로, 그러나 비필수적으로 유동성 지질 이중막으로 구성되어 있다. 대상이 되는 이온 채널은 임의의 구조일 수 있다. 예를 들면, Vpu 이온 채널은 감염된 세포의 골지 및 소포체 막과 조합된, HIV-1에 의해 코딩된 삽입 막인 Vpu에 의해 형성된다. "Vpu 이온 채널"은 예컨대 인플루엔자의 P7 HCV 및 M2 등의 모든 관련 이온 채널을 의미한다.
"HIV", "SARS", "코로나바이러스" 또는 "HCV"는 임의의 HIV, SARS, 코로나바이러스 또는 HCV 바이러스 균주 및 상동체 및 돌연변이를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
이온 채널의 "기능적 활성"은, 이온 채널이 수행하거나 참여하는 임의의 한가지 이상의 기능을 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, Vpu 단백질은 이온 채널을 코딩하며, Na+, K+,Cl- 및 PO4 3-의 수송을 용이하게 하고, 또한 소포체에서 CD4 분자를 분해시킨다. 특정 이론에 결부됨이 없이, 이온 채널을 코딩하는 Vpu 단백질은 또한 HIV 생활주기(life cycle)를 매개하는데 역할을 하는 것으로 생각된다. 본 발명은 HIV 생활주기, 특히 HIV 복제 저해 기작을 통한 HIV 감염 치료에 국한되지 않는다. 오히려 본 발명은 항바이러스 활성을 나타내는 본 발명의 화합물에 의한 임의의 기작을 포함하는 것으로 이해되며, HIV 생존성 또는 기능적 활성 저해를 포함할 수 있다. 또한 이는 HCV, 코로나바이러스 및 다른 바이러스에도 해당된다.
바이러스의 "기능적 활성"은 바이러스가 수행하거나 참여하는 임의의 한가지 이상의 기능을 나타내는 것으로 이해되어야 한다.
"바이러스 복제"는 비리온 조립 또는 방출 저해와 같은, 바이러스 생활 주기의 임의의 한가지 이상의 시기나 또는 일측면을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 바이러스 복제의 이온 채널 매개는 간접적인 방식으로 또는 직접적인 방식에 의한 것일 수 있다. 이온 채널이 바이러스의 생활주기의 임의의 한가지 이상의 시기에서 비리온과 직접적으로 상호작용하는 경우, 이온 채널 매개는 직접적인 방식에 의한 것이다. 만약 이온 채널이 비리온 이외 분자와 상호작용하여, 다른 분자가 바이러스 생활 주기의 임의의 한가지 이상의 측면 또는 시기를 직접적으로 또는 간접적으로 조정하는 경우, 이온 채널 매개는 간접적인 방식에 의한 것이다. 따라서, 본 발명의 방법은 바이러스 생활 주기의 한가지 이상의 측면이나 시기를 매개하는, 케스케이드 단계를 통한 바이러스 복제 매개를 포함한다.
이온 채널의 기능적 활성의 "하향 조절"은 직, 간접적인 기작에 의하여 기능적 활성의 한가지 이상의 임의 측면이 부분적으로 또는 완전히 저해되는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 적합한 물질이 바이러스의 복제를 방지하기 위해 이온 채널과 직접적으로 상호작용할 수 있으며, 또는 이와는 다르게, 예컨데 이온 채널 이외의 분자와 상호작용함으로써 바이러스의 복제를 방지하기 위해 간접적으로 작용할 수도 있다. 또 다르게는 상기 다른 분자는 이온 채널과 상호작용하여 이의 활성을 저해한다.
항바이러스 활성을 가지는 분자의 스크리닝은, 본원에 기재된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다.
바이러스에 감염된 "세포"는 바이러스로 감염되어진, 임의의 세포, 원핵 세포 또는 진핵 세포를 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 상기 세포는 예컨대, 불멸 세포 또는 일차 세포주, 세균 배양물 및 in situ 세포를 포함한다. 항바이러스 화합물에 대한 적합한 스크리닝 시스템에 있어서, 바람직한 감염된 세포는 HIV 또는 HCV에 각각 감염된 대식세포/단핵세포 또는 간세포/림프구 세포이다.
본 발명은 임의의 한가지 이론이나 작용 기작으로 한정되지 않으며, 본 발명의 화합물은 이온 채널, 즉 HIV의 VPU, SARS 및 다른 코로나바이러스의 E 단백질 및 HCV의 P7이 차단되도록 유발함으로써 바이러스 복제 또는 세포에서의 비리온 방출을 저해하는 것으로 간주된다.
또한, 본 발명은 HIV 이외의 바이러스 복제 및/또는 증식 통제에 있어서, 5-(N,N-헥사메틸렌)아밀로라이드 및 5-(N,N-디메틸)-아밀로라이드의 용도에 관한 것이다.
바이러스 저해의 대상은 일반적으로 인간, 영장류, 가금류(예, 양, 소, 말, 당나귀, 돼지), 애완동물(예, 개, 고양이), 실험 동물(예, 마우스, 토끼, 랫, 기니피그, 햄스터), 야생 포획 동물(예, 여우, 사슴)으로 한정되지 않으나, 이와 같은 에 포유류이다. 바람직하기로는 상기 대상은 인간 또는 영장류이다. 가장 바람직하기로는 상기 대상은 인간이다.
본 발명의 방법은 HIV 감염, HCV 감염 및 그외 바이러스 감염에 한정되지 않으나 이와 같은 바이러스 감염의 치료 및 예방으로 유용하다. 예컨대, 항바이러스 활성은 HIV 복제를 방지하기 위해 HIV로 감염된 것으로 확인된 개체에 효과적일 수 있으며, 따라서 AIDS 발병을 방지한다. 또한, 본 발명의 방법을 사용하여 혈청중 바이러스 부하를 감소시키거나 또는 바이러스 감염 증상을 완화시킬 수 있다. 이와 유사하게 항바이러스 치료제는 HCV 복제를 방지하기 위해 예컨대 HCV에 감염된 것으로 확인된 개체에 효과적일 수 있으며, 따라서, 간세포의 추가적인 참여 및 간 조직의 궁극적인 변성을 방지한다.
본 발명의 방법은 감염된 세포내 바이러스 보관 확립을 방지하기 위해 바이러스 감염 초기 단계에 유용하거나 또는 가능한 바이러스 원에 노출되기 전 또는 후에 즉각적으로 적용되는 예방학적 치료제로 특히 사용될 수 있다.
본원에서 "치료학적" 및 "예방학적"은 가장 넒은 의미로 간주되어야 한다. 용어 "치료학적"은 포유류가 완전히 회복될때까지 치료되는 것을 필수적으로 암시하는 것은 아니다. 이와 유사하게, "예방학적" 은 개체가 궁극적으로 질병에 걸리지 않는 것을 필수적으로 의미하는 것은 아니다. 따라서, 치료 및 예방은 특정 질병의 증상 완화 및 특정 질환의 발병 위험도 방지 또는 감소를 포함한다. 용어 "예방"은 특정 발병 질환의 심각도 감소로 간주된다. 또한 치료는 기존 질병의 심각도 또는 급성 발병 진도를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 방법에 다른, 한 가지 이상의 화합물 또는 조성물은 공지된 항바이러스 화합물 또는 분자와 같은 한가지 이상의 다른 화합물과 병용 투여될 수 있다. "병용 투여"는 동일하거나 다른 경로를 통해 동일한 제형 또는 2가지의 다른 제형으로 동시적으로 투여되거나 또는 동일하거나 다른 경로에 의해 연속적으로 투여되는 것을 의미한다. "연속적"은 2가지 이상의 개별 화합물의 투여 사이에 수초, 수분, 수시간 또는 수일의 시간 차이가 있음을 의미한다. 항바이러스 화합물은 임의 순서로 투여될 수 있다.
투여 경로는, 정맥내, 복막내, 피하, 두개내, 진피내, 균육내, 안내, 척수강내, 뇌내, 비강내, 근육을 통하여, 흡입에 의해, 경구로, 직장으로, 점적, 패치 및 임플란트에 의한 것을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 정맥내 경로가 특히 바람직하다.
주입용 조성물은 (수용성인) 멸균 수용액과 멸균 주입액의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 담체는 예컨대, 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 가능한 혼합물 및 식물성 오일을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 미생물에 대한 방지 작용은, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티르메로살 등의 여러가지 항세균제 및 항진균제에 의해 이루어질 수 있다. 여러 경우들에셔, 등장제, 예컨대 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 주입 조성물의 연장된 흡수는, 흡수 지연제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물중에 사용함으로써 유발될 수 있다.
멸균 주입액은 활성 화합물의 필요량을 적절한 용매에 전술한 다른 여러가지 성분들과 함께 혼입함으로써 제조되며, 이후 필요에 따라, 예컨대 필터 멸균 또는 다른 적당한 방식에 의한 멸균을 수행할 수 있다. 또한 분산을 고려할 수 있으며, 이는 여러가지 멸균된 활성 성분들을 기본적인 분산 매질과 전술한 다른 필수 성분을 함유하는 멸균 비히클내로 혼합함으로써 제조할 수 있다. 멸균 주입액 제조용 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법으로는 활성 성분 및 추가적인 임의의 적합한 성분의 분말을 사전에 멸균 여과한 용액으로부터 수득하는 진공 건조 및 동결 건조 기법이 있다.
활성 성분이 적절히 보호된 경우, 이는, 예컨대 무활성의 희석제나 또는 동화성 식이 담체와 함께 경구 투여될 수 있으며, 또는 경질 또는 연질 셀 젤라틴 캡슐내에 봉입되거나, 또는 정제로 압착될 수 있다. 경구 치료학적 투여시, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입될 수 있으며, 섭취가능한 정제, 구강 정제, 트로키제, 캡슐제, 엘리시르제, 현탁제, 시럽제, 웨이퍼제(wafers) 등의 형태로 사용된다. 이러한 조성물 및 조제물은 활성 화합물을 적어도 0.01 중량%, 더 바람직하기로는 0.1 중량%, 더더 바람직하기로는 1 중량%로 함유하여야 한다. 조성물 및 조제물의 비율은 물론 변경될 있으며, 단위 중량은 약 1 내지 99%, 더 바람직하기로는 약 2 내지 약 90%, 더더 바람직하기로는 약 5 내지 약 80 %일 수 있다. 상기 치료학적으로 유용한 조성물내 활성 화합물의 양은 적합한 투여량으로 수득될 것이다. 본 발명에 따른 바람직한 조성물 또는 조제물은 경구 투여 단위 형태가 활성 화합물 약 0.1 ng 내지 2000 mg을 함유하도록 제조된다.
정제, 트로키제, 환제, 캡슐제 등은, 또한 하기 나열된 성분을 함유할 수도 있다. 검, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등과 같은 붕괴제; 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제; 및 슈크로스, 락토스 또는 사카린과 같은 감미료 또는, 페퍼민트 윈터그린 오일 또는 체리 향료와 같은 향미제를 참가할 수도 있다. 투여 단위 형태가 캡슐인 경우, 상기 유형의 물질 분만 아니라 액상 담체를 포함할 수도 있다. 여러가지 다른 물질들인 코팅제로서 존재하거나 또는 존재하여 투여 단위의 물질적인 형태를 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 정제, 환제 또는 캡슐제는 셀락, 당 또는 이들 둘다로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘리시르는 활성 화합물, 감미료로서 슈크로스, 보존제로서 메틸 및 프로필파라젠, 염료 및 체리 또는 오렌지 향과 같은 향료를 포함할 수 있다. 모든 투여 단위 형태 제조에 사용되는 임위위 물질은 약학적으로 순수하며, 사용함량이 실질적으로 무독성이어야 한다. 또한 활성 화합물은 서방형 조제물 및 제형으로 병합될 수 있다.
또한, 본 발명은 크림제, 로션제 및 젤제와 같은 국소 적용에 적합한 형태를 포함한다. 상기 형태에서, 항-응고성 펩티드가 계면 침투를 허용하도록 변형될 수 있다. 당업자는 Pharmaceutical Handbook와 같은 문헌으로부터 투여 단위 형태 및 국소 조제물의 제조 공정을 쉽게 실시할 수 있다. A Martingale Companion Volume Ed. Ainley Wade Nineteenth Edition The Pharmaceutical Press, London, CRC Handbook of Chemistry and Physics Ed. Robert C. Weast Ph D. CRC Press Inc.; Goodman and Gilman's; The Pharmacological basis of Therapeutics. Ninth Ed. McGraw Hill; Remington; and The Science and Practice of Pharmacy. Nineteenth Ed. Ed. Alfonso R. Gennaro Mack Publishing Co. Easton Pennsylvania.
약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항세균제, 항진균제, 등장제, 흡수 지연제 등을 함유한다. 약학적으로 활성인 성분에 대한 상기 매질 및 제제 사용은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 기존 기질 또는 제제과 상기 활성 성분과 혼화되지 않는 경우를 제외하고는, 치료 조성물 중에 사용되는 것으로 간주한다. 보충적인 활성 성분을 상기 조성물에 혼합할 수 있다.
투여 용이성 및 투여량 균일성을 위해 투여 단위 형태는 비경구 조성물로 제형화하는 것이 특이 유익하다. 본원에서 투여 단위 형태는 처리되는 포유류 개채에 대한 일정 투여량으로 조절된 물리적으로 구별되는 단위이며, 사전에 결정된 함량의 활성 물질을 포함하는 각 단위는 필수 약학적 담체와 연합하여 목적한 치료 효과를 형성하도록 계산된다. 신규한 투여 단위 형태에 대한 내용은 (a) 활성 성분의 고유 특성 및 실행되어지는 특정 치료 효과 및 (b) 컴파운딩 분야의 본래 한계점에 의해 기재되며, 직접적으로 의존된다.
본 발명에서 고려되는 유효량은 통증의 심각성 및 수용체의 건강 및 나이에 따라 변경된다. 일반적으로, 유효량은 약 0.01 ng/kg(체중) 내지 약 100 mg/kg(체중)일 수 있다.
또한 약 0.1 ng/kg(체중) 내지 약 100 mg/kg(체중) 또는 1.0 ng/kg(체중) 내지 약 80 mg/kg(체중)의 유효량일 수 있다.
바이러스 저해의 대상은 일반적으로 인간, 영장류, 가금류(예, 양, 소, 말, 당나귀, 돼지), 애완동물(예, 개, 고양이), 실험 동물(예, 마우스, 토끼, 랫, 기니피그, 햄스터), 야생 포획 동물(예, 여우, 사슴)으로 한정되지 않으나, 이와 같은 에 포유류이다. 바람직하기로는 상기 대상은 인간 또는 영장류이다. 가장 바람직하기로는 상기 대상은 인간이다.
본 발명의 방법은 HIV 감염, HCV 감염 및 그외 바이러스 감염에 한정되지 않으나 이와 같은 바이러스 감염의 치료 및 예방으로 유용하다. 예컨대, 항바이러스 활성은 HIV 복제를 방지하기 위해 HIV로 감염된 것으로 확인된 개체에 효과적일 수 있으며, 따라서 AIDS 발병을 방지한다. 또한, 본 발명의 방법을 사용하여 혈청중 바이러스 부하를 감소시키거나 또는 바이러스 감염 증상을 완화시킬 수 있다. 이와 유사하게 항바이러스 치료제는 HCV 복제를 방지하기 위해 예컨대 HCV에 감염된 것으로 확인된 개체에 효과적일 수 있으며, 따라서, 간세포의 추가적인 참여 및 간 조직의 궁극적인 변성을 방지한다.
본 발명의 방법은 감염된 세포에서 바이러스 저장 확립을 방지하기 위해 바이러스 감염 초기 단계에 유용하거나 또는 가능한 바이러스 원에 노출되기 전 또는 후에 즉각적으로 적용되는 예방학적 치료제로 특히 사용될 수 있다.
본 발명은 바이러스 막 이온 채널 및 항바이러스 활성 스크리닝에 관한 비제한적인 특정 실시예를 참조로 상세히 기재할 것이다. 일부 실시예들에는 SARS 바이러스를 사용한다. 다른 렌티 바이러스, 코로나바이러스 및 다른 화합물이 본 발명의 내용에 효과적으로 사용될 수 있음이, 본 명세서에서 명확질 것이다. 그러나, 상세한 설명은 본 발명을 예시하기 위한 것이다. 전술한 본 발명의 광범위한 내용을 제한하는 것으로 이해되지 않아야 한다.
도 1. E. coli에서의 Vpu 발현에 사용된 플라스미드의 개략도. A. HIV 균주의 HXB2 cDNA 클론으로부터 PCR에 의해 제조된 vpu ORF에 의해 코딩되는 아미노산 서열(< 400 > 1). 상기 vpu ORF는 p2GEX의 GST 유전자 3' 말단에 클로닝하여 p2GEXVpu(B)를 제조하였다. 이후 이는 pPL451에 클로닝하여 플라스미드 pPL +Vpu (C)를 제조하였다.
도 2. E. coli에서의 Vpu 발현 및 정제를 나타낸 사진. A. SDS-PAGE후 웨스턴 블롯팅을 사용하여 E. coli 추출물에서 발현된 Vpu를 검출하였다. 레인 1-4는 p2GEXVpu에서 발현된 Vpu의 여러 정제 단계의 시료를 나타낸다: 레인 1은 글루타티 온-아가로스 친화성 크로마토그래피로 분리된 GST-Vpu 융합 단백질이고; 레인 2는 트롬빈 처리로 융합 단백질로부터 유리된 Vpu이고; 레인 3은 HPLC 음이온 교화 크로마토그래피로 정제한 Vpu이고; 레인 4는 면역친화성 컬럼을 통과시킨 Vpu이다. 레인 5 및 6은 pPL+Vpu 또는 pPL451을 각각 포함하는 세포를 42 ℃에서 유발하여 제조한 막 베시클이다. B. 은 염색한 SDS-PAGE 젤: 레인 1은 HPLC 음이온 교환 크로마토그래피로 정제한 Vpu이고; 레인 2는 면역친화성 컬럼을 통과시킨 Vpu이다.
도 3. 이중 지질층을 정제된 Vpu를 포함하는 분주물에 노출시킨 후 관찰된 이온 채널 활성을 나타낸 그래프. A 및 B에서, CIS 챔버는 500 mM NaCl을 포함하며, TRANS 챔버는 50 mM NACl을 포함하며; 양쪽 용액은 10 mM의 MES로 pH 6.0으로 완충화된다. B는 A와 유사한 데이타로부터 제작된 전류 대 전압 곡선이다.
도 4. 세균 교차 공급 분석을 나타내는 그래프. 모든 플레이트에 Met-, Pro- 영양 요구주를 사용하여 부드러운 아가의 상층에 접종하였다. 플레이트 A 및 B는 프롤린이 결핍된 최소 드롭 아웃(drop-out) 배지를 포함하며; 플레이트 S의 배지는 메티오인이 결핍된 것이다. 백그라우드에서 세포 생존성을 조절하기 위해, 프롤린 또는 메티오닌이 첨가된 P 및 M으로 표지된 디스크가 포함된다. C 및 V로 표지된 디스크에 각각 플라스미드 pPL451 또는 pPL+Vpu를 함유하는 Met+, Pro+ E. Coli 세포를 접종하였다. 플레이트는 이틀간 37 ℃(A 및 C) 또는 30 ℃(B)에서 배양하고, 플레이트 하단에 위치시킨 형광 광원으로부터 말초 조사를 이용하여 검은 배경에서 사진을 찍었다. 이미지는 노발린 비디오 젤 문서화 시스템으로 기록하였 다. 모든 플레이트에서 P 또는 M 디스크 주변 및 플레이트 A의 디스크 A 주변의 연한 할로(halos)은, 백그라운드 균주가 성장되었음을 의미한다.
도 5. 잠재적인 Vpu 채널 차단제에 대한 약물 스크리닝을 나타낸 그래프. 사진은 Vpu 발현 플라스미드인 pPLVpu 를 포함하는 XL-I-블루 E. coli 세포 접종된 플레이트상에 아데닌 결핍성 최소 한천 배지의 단편이다. 숫자 6-11은 테스트하는 여러가지 약물이 적용된 부위를 나타내며, 이는 3 ㎕씩 점적되어 아가로스을 젖셨다. 플레이트는 이후 사진 촬영전 48시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 백그라운드의 회색빛 색조는 세균이 성장하지 않은 부위이다. "10" 주변의 밝은 원형 부위는 그 위치에서 아데노신의 첨가로 인해 세균이 성장하였음을 나타낸다(양성 대조군). "9" 주변의 더욱 작은 할로는 그 위치에 5-(N,N-헥사메틸렌)-아밀로라이드를 적용하였기 때문이다.
도 6. 이중 지질 층을 3-10 ㎍의 E 단백질에 노출시킨 후 NaCl 용액내에서 관찰한 SARS E 단백질 이온 채널의 활성. 닫힌 상태는 굵은 선으로 나타내었고 열린 상태는 상기 직선으로부터 파생된 형태로 나타내었다. 범위는 300 ms 및 5 pA이다. CIS 챔버는 5 mM HEPES 완충액 pH 7.2중의 50 mM NaCl를 함유하며, TRANS 챔버는 5 mM HEPES 완충액 pH 7.2중의 500 mM NaCl를 함유한다. CIS 챔버는 접지하고, TRANS 챔버는 -100 내지 +100 mV로 다양한 전위하에 두었다. B는 단일 채널의 최대 1회 열림 상태이다.
도 7. 이중 지질층을 3-10 ㎍의 E 단백질에 노출시킨 후 NaCl 용액내에서 관찰한 SARS E 단백질 이온 채널의 활성. 닫힌 상태는 굵은 선으로 나타내었고 열 린 상태는 상기 직선으로부터 파생된 형태로 나타내었다. 범위는 300 ms 및 5 pA이다. CIS 챔버는 5 mM HEPES 완충액 pH 7.2중의 50 mM NaCl를 함유하며, TRANS 챔버는 5 mM HEPES 완충액 pH 7.2중의 500 mM NaCl를 함유한다. CIS 챔버는 접지하고, TRANS 챔버는 -100 내지 +100 mV로 다양한 전위하에 두었다. B는 단일 채널의 최대 1회 열림 상태이다.
도 8. 신나모일구아니딘(Bit036)은 NaCl 용액에서의 SARS E 단백질 이온 채널 활성을 저해한다. A. 홀딩 전위 -40 mV에서의 전류. 범위는 300 ms 및 5 pA이다. E 단백질 이온 채널 활성 및 100 μM Bit036 첨가후 E 단백질 이온 채널 활성. B. 홀딩 전위 -40 mV에서의 막대그래프. 100 μM Bit036 첨가 전 및 후 E 단백질 이온 채널 활성. E 단백질 채널 형성전 평균 전류(pA), E 단백질 이온 채널 활성 및 100 μM Bit036 첨가 후.
도 9. KCl 용액에서의 이중 지질층내 229E E 단백질 이온 채널의 활성
도 10. 평면 이중 지질층내 229E-E 단백질 이온 채널에 의해 형성된 원 전류(raw current)를 나타낸다. 상위 트레이스는 약물 첨가전 전류 활성이고, 하위 트레이스는 채널 활성에 대한 100 μM의 신나모일구아니딘의 첨가 효과를 나타낸다. 파트 B는 신나모일구아니딘 첨가 전 및 후에, 이중층을 가로질러 흐르는 평균 전류값을 나타낸 그래프이다(임의의).
도 11. NaCl 용액내 지질 이중층에서의 MHV E 단백질 이온 채널의 활성.
도 12. 평면 이중 지질층내 MHV E 단백질 이온 채널에 의해 형성된 원 전류를 나타낸다. 상위 트레이스는 약물 첨가전 전류 활성이고, 하위 트레이스는 채널 활성에 대한 100 μM의 신나모일구아니딘의 첨가 효과를 나타낸다. 파트 B는 신나모일구아니딘 첨가 전 및 후에, 이중층을 가로질러 흐르는 평균 전류값을 나타낸 그래프이다(임의의).
실시예 1. 본 발명의 화합물 합성
본 발명의 화합물은 도식 1에 나타낸 바와 같이 산 클로라이드 또는 메틸에스테르로부터 제조할 수 있다. 이러한 방법들 모두 문헌에 상세히 개시되어 있다.
산 클로라이드 아실구아니딘 에스테르
도식 1
하기 실시예들은 본 발명의 일부 화합물들에 대한 합성 도식을 나타낸다.
실시예 2. 신남산 신나모일 클로라이드로부터 신나모일구아니딘 합성
N,N-디메틸포름아미드 방울(drop)를 함유하는 건조 벤젠(dry benzene)(30 ml)중의 트랜스-신남산 용액(1.50 g, 10.12 mmol)에 옥살릴 클로라이드(5.14 g, 40.5 mmol)을 첨가하여, 용액에 거품이 일도록 하였다. 2시간 동안 환류시킨 후, 용액을 감압하에 증발시켜 건조물을 수득하였다. 제조되는 고형물은 건조 테트라하이드로퓨란(20 mL)에 용해학고, 2M 수성 수산화나트륨중의 구아니딘 하이드로클로라이드 용액(25 mL)을 서서히 첨가하였다. 상온에서 1시간동안 교반한 후, 에틸 아세테이트(3 x 50 mL)로 추출하였다. 조합 추출물을 황산마그네슘상에서 건조하고 증발시켜 오렌지 색상의 오일을 수득하였다. 조 산물은 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 디클로로메탄중의 10% 내지 20%의 메탄올로 용출시켜 크림형 고형물의 신나모일구아니딘(0.829 g, 43%)를 수득하였다.
실시예 3. N-아미디노-3-아미노-5-페닐-6-클로로-2-피라진카르복스아미드의 합성
파트 1
테트라하이드로퓨란(5 mL)/물(10 mL)/톨루엔(20 mL)중의 메틸 3-아미노-5,6-디클로로-2-피라진카르복실레이트(0.444g, 2.0 mmol) 용액에 페닐 보론산(0.536 g, 4.4 mmol), 탄산나트륨(0.699 g, 6.6 mmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)-팔라듐(0)(0.116 g, 0.10 mmol)을 첨가하였다. 반응을 정지(evacuate)하고, 6시간동안 환류하기 전에 수차례 질소로 퍼징하였다. 유기 층을 분리하고, 수층을 톨루엔(3 x 20 mL)으로 추출하였다. 조합한 유기 추출물은 황산마그네슘상에서 건조하고, 여과한 다음 감암하에서 증발시켜, 노란색 고형물인 메틸 3-아미노-6-클로로-5-페닐-2-피라진카르복실레이트(0.43 g, 82%)를 수득하였다.
파트 2
메탄올(5 mL) 중의 나트륨 용액(0.040 g, 1.74 mmol)에 구아니딘 하이드로클로라이드(0.258 g, 2.70 mmol)을 첨가하고, 혼합물은 30분간 환류한 다음 여과하였다. 여과물에 N,N-디메틸포름아미드(5 mL)중의 메틸 3-아미노-6-클로로-5-페닐-2-피라진카르복실레이트(0.264 g, 1.0 mmol)을 첨가하고, 12시간동안 75 ℃로 가온하였다. 용매는 감압하에 제거하고, 잔사는 실리카젤상에서 1% 트리에틸아민/5% 메탄올/디클로로메탄의 용출을 이용하여 크로마토그래피를 실시하였다. 수득되는 고형물은 클로로포른에 현탁하고 여과한 다음 고진공하에 건조시켜, 노란색 고형물의 N-아미디노-3-아미노-5-페닐-6-클로로-2-피라진카르복스아미드(0.04 g, 14%)을 수득하였다.
실시예 4. 헥사메틸렌이미노-6-페닐-2-피라진카르복스아미드의 합성
파트 1
테트라하이드로퓨란(50 mL)중의 메틸 3-아미노-5,6-디클로로-2-피라진카르복실레이트(1.11 g, 5.0 mmol) 용액에 헥사메틸렌이민(1.49 g, 15.0 mmol)을 첨가하고 1시간동안 환류하였다. 반응물을 냉각시키고, 여과하여 고형물 헥사메틸렌이민 하이드로클로라이드를 제거하였다. 여액을 증발시키고, 잔사는 실리카겔상에서 크로파모그래피하였다. 디클로로메탄으로 용출하여 오프 화이트(off white) 색상의 메틸 3-아미노-6-클로로-5-헥사메틸렌이미노-2-피라진카르복실레이트(1.20 g, 85 %)를 수득하였다.
파트 2
디메틸설폭사이드(5 mL)중의 메틸 3-아미노-6-클로로-5-헥사메틸렌이미노-2-피라진카르복실레이트(0.350g, 1.23 mmol)에 페닐 보론산(0.166 g, 1.35 mmol), 탄산칼(0.511 g, 3.70 mmol) 및 [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II)-디클로로메탄 컴플렉스(0.041 g, 0.05 mmol)를 첨가하였다. 반응물은 16시간동안 90 ℃로 가온한 후 물(50 mL)을 넣고, 에틸 아세테이트(3 x 50 mL)로 추출하였다. 조합한 추출물은 황산마그네슘상에 건조하고, 여과 및 증발한 다음 실리카겔상에 크로마토그래피를 통해 갈색 오일을 수득하였다. 디클로로메탄 및 이후 10% 에틸 아세테이트/디클로로메탄으로 용출하여, 노란색 고형물인 메틸 3-아미노-5-헥사메틸렌이미노-6-페닐-2-피라진카르복실레이트(0.309 g, 77%)를 수득하였다.
파트 3
메탄올(8 mL)에 용해된 나트륨 용액(0.090 g, 6.17 mmol)에 구아니딘 하이드로클로라이드(0.598 g, 6.26 mmol)를 첨가하여, 혼합물은 30분간 환류시킨 다음 여과하였다 여액에 테트라하이드로퓨란(10 mL)엥 용해된 메틸 3-아미노-5-헥사메틸렌이미노-6-페닐-2-피라진카르복실레이트(0.310 g, 0.95 mmol)를 가하고 72시간동안 환류시켰다. 감압하에 용매를 제거하고 잔사는 실리카겔상에 크로마토그래피를 실시하였다. 5% 메탄올/디클로로메탄으로 용출시켜, 노란색 고형물인 N-아미디노-3-아미노-5-헥사메틸렌이미노-6-페닐-2-피라진카르복스아미드(0.116 g, 35%)를 수득하였다.
실시예 5. 바이러스 실험
여러가지 바이러스 단백질을 코딩하는 ORF 함유성 재조합 플라스미드의 구축
표 1에 나열된 여러가지 바이러스 단백질의 상보성 DNA(cDNA) 절편을 모체 바이러스 게놈 클론으로부터 PCR이나 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 화학적 직접 합성 중 어느 하나의 방법으로 수득하였다. 예를 들면, Vpu(도 1a)의 ORF를 HIV 게놈의 NdeI cDNA 절편(HXB2 분리, McFarlane Bumet Centre, Melbourne, Australia)로부터 다음과 같이 PCR로 증폭하였다: 천연 Pfu DNA 중합효소 (Stratagene; 0.035 U//II)를 선택하여 PCR 반응을 촉매함으로써 효소의 프로프리딩 활성에 의해 도입된 PCR 에러를 최소화하였다. 5'센스 프라이머, AGTAGGATCCATGCAACCTATACC(< 400 > 2)는 p2GEX(41)의 GST 3'말단과 함께 내부에 클로닝하기 위해 BamHI(밑줄) 부위를 도입하였다. 또한 상기 프라이머는 개시 코돈을 교정한다(굵은체 T는 HXB2 분리물의 트레오린 코돈인 vpu 유전자의 Q를 치환함). 3' 안티센스 프라이머, TCTGGAATTLTACAGATCATCAAC(<400>3)는 클로닝 용이성을 위해 PCR 산물의 다른 말단에 EcoRI(밑줄)을 도입한다. 94℃, 45초 -> 55 ℃, 1분 -> 72℃, 1분으로 이루어진 주기 30회를 05 ml 얇은 두께의 에펜도르프 튜브로 퍼킨-엘러 열주기장치에서 실시한 다음, 268 bp를 정제하고, BamHI 및 EcoRI으로 절단하여 동일 효소로 절개한 p2GEX에 삽입하였다. 제조된 재조합 플라스미드는 도 1b에 개시되어 있다. 전체 Vpu ORF와 BamHI 및 EcoRI 삽입 부위를 Applied Biosystem 사의 염색-종말 키트를 이용하여 사이클 시퀀싱함으로써 서열분석함으로써 DNA 서열을 확인하였다. GenScript Corporation(New Jersey, USA)사의 방법을 이용하여 다른 cDNA를 합성하였다. 코돈 서열을 세균, 곤충 또는 포유류 세포에 적합하게 최적화하였다. 제한 엔도뉴클레아제 효소의 인식 부위를 합성 cDNA의 5' 및 3' 말단에 형성시켜, 포유류 세포, 곤충 세포 또는 세균 세포 각각에서 바이러스 단백질을 발현시키기 위해, 플라스미드 발현 벡터인 pcDNA3.1, pFastBac 및 pPL451로의 클로닝을 용이하게 하였다.
분자생물학의 표준 기법을 클로닝 실험에 사용하였다. 예를 들면, Vpu ORF를 pPL451 발현 플라스미드내로 삽입하기 위해, p2GXVpu를 먼저 BamHI를 절단하고, dNTP 존재하에 클레나우 DNA 중합효소로 5' 염기의 돌출부(overhang)을 채워넣었다. EcoRI으로 절단하여 Vpu 코딩 절편을 유리시킨 후 아가로스 젤로부터 정제하여, HpaI 및 EcoRI으로 절개된 pPL451에 삽입하였다. 이후, 웨스턴 블롯으로, 42 ℃에서 배양 유도 후 pPLVpu 구조체(도 1c)가 Vpu를 발현함으로써 PR 및 PL 프로모터의 cI857 억제자를 불활성화시킴을 확인하였다.
표 2 바이러스 cDNA 또는 펩티드 서열의 재료
표적 단백질 | 생물원 | 균주 또는 서열의 기탁 번호 |
Vpu | HIV-1 | 균주 HXB2 |
SARS-CoV E 단백질 | SARS 코로나바이러스 | P59637 |
HCV p7 | C형 간염 바이러스 H77 1a | NP_751922 |
MHV-E 단백질 | 뮤라인 간염 바이러스 | NP_068673 |
229E E 단백질 | 인간 코로나바이러스 229E | NP_073554 |
뎅기열 M 단백질 | 뎅기열 바이러스 타입 1 | 균주 싱가폴 S275/90 |
실시예 6.
E.coli
로부터 재조합 Vpu 정제
p2GEXVpu를 함유하는 E. coli 균주 XLI-blue 세포를 글루코스(6 g/L) 및 암피실린(50 mg/L)가 보충된 LB 배지상에 왕성하게 통기시키면서 30 ℃에서 약 250 Klett unit로 배양하였고, 이때 IPTG를 최종 농도 0.01 mM로 첨가하여 4시간 더 배양하였다. 실험 초기에 발현된 GST-Vpu 융합 단백질 대부분은 세포 파편 및 30 막 분획물과 함께 존재하였기에, Varadhachary 및 Maloney(Varadhachary and Maloney, 1990)를 적용하여 삼투압에 의해 파괴된 (세포 파편 및 막 분획물 모두를 조합하는)를 분해 초기 단계에서 분리하였다. 세포를 수거, 세척, 측량하고, DTT(1 mM) 및 MgCl2(l mM)를 함유하는 MTPBS에 10 ml/g(습윤 중량)으로 재현탁하였다. 라이소자임(0.3 mg/ml; 계란 난백; Sigma)를 첨가하여 부드럽게 교반하면서 30분간 얼음위에 둔 다음 37 ℃에 5분간 두었다. 삼투압에 감응된 세포는 12,000g로 펠렛화한 다음, 초기 부피와 동량의 물로 현탁하여 세포를 파열시켰다. 이후 현탁액은 10X 완충액 원액을 이용하여 1x MTFBS/DTT로 만들고, 순차적으로 글리세롤(20 % wt/vol) 및 CHAPS(2 % wt/vol)를 가하여, 최종 부피를 최초 부피의 1/4로 조정하였다. 상기 혼합물은 1시간동안 얼음상에서 혼합하고, 이후 1시간동안 400,000g로 원심분리하여 불용성 물질을 제거하였다. GST-Vpu 융합 단백질을 친화성 크로마토그래피인 글루타티온 아가로스 수지(Sigma)상에서 세정제로 추출함으로써 정제하였다. 수지는 글리세롤(5 %), DTT(1 mM) 및 CHAPS(0.5%)(완충액 A)를 함유한 50 mM Tris pH7.5로 완전히 세척한 다음, 인간 트롬빈(10O U/ml; 37 ℃ , l시간)과 50 %(v/v) 비드 현탁액을 처리하여 수지에 결합된 GST로부터 융합 단백질의 Vpu 부분을 유리 및 용출시켰다. 잔류성 트롬빈 활성을 모두 소거하기 위하여, 용출물에 PMSF(0.5 mM)를 가하였다. Vpu 분획은 이후 BioRad HPLC에 부착된 MA7Q 음이온 교환 수지 컬럼으로 정제하고 완충액 A상의 NaCl의 직선 농도 구배(0-2 M)로 용출시켰다.
Vpu는 하기와 같이 면역친화성 컬럼상에서, 은 염색한 젤에서 측정한 바와 같이 동질한 것으로 정제하였다: Vpu를 함유하고 있는 HPLC 분획들을 NAP 25 컬럼(Pharmacia)상에서 완충액 A로 탈염하고, 이후 상온에서 1시간동안 항체-아가로스 비드와 혼합하였다. 상기 비드는 철저하게 세척하고, Vpu는 염 농도를 2 M까지 증가시키면서 용출시켰다. 단백질은 BioRad사의 염료 결합 분석으로 정량하였다.
실시예 7.
E.coli
에서의 Vpu 발현 및 정제
GST와 Vpu ORF 간의 유전자 융합이 형성된 플라스미드 p2GEXVpu(도 1)을 구 축하였다. 이 시스템은 GST의 C 말단에 융합된 Vpu 폴리펩티드가 IPTG 유발에 의해 발현되며, 글루타티온 아가로스상에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 융합 단백질 정제를 허용한다. 세포를 30 ℃에서 세포 밀도가 약 250-300 Klett unit가 될때까지 배양하고, 저농도의 IPTG(0.01 mM)를 이용하여 유도함으로써, GST-Vpu 발현의 최적 수준을 구하였다. GST-Vpu를 정제하기 위해, 유발된 세포에 라이소자임을 처리하고, 이후 저속으로 원심분리하여, 세포 파편 및 원형질 막을 함유하고 있는 조합한 세포성 분획을 제조하였다. 양쪽성 세정제인 CHAPS를 이용하여 상기 분획으로부터 약 50%의 GST-Vpu 단백질을 용해시킬 수 있었다. 글루타티온-아가로스 비드를 이용한 친화성 크로마토그래피로, 융합단백질을 농축시키고, 트롬빈을 사용하여 융합 파트너 사이에 있는 고친화성 트롬빈 부위에서 융합 단백질을 절단하여, Vpu를 유리시켰다(도 2A). 음이온 교환 컬럼으로부터 융출시킨 분획에서, Vpu는 은으로 염색한 젤에서 확인가능한 주된 단백질이었다(도 2B, 레인 1). 마지막으로, 면역친화성 컬럼으로 괴견상 동질한 Vpu를 정제하였다(도 2B, 레인 2). 면역학적으로 검출된 단백질에 해당되는 단백질 밴드(SDS-PAGE 젤에서 추출)의 N-말단 아미노산 서열로 Vpu임을 확인하였다.
실시예 8. 인지질 비히클내에서 Vpu 재구성
Vpu를 함유하고 있는 프로테오리포좀(Proteoliposom)을, 세정제 희석법(New, 1990)으로 준비하였다. 클로로포름에 용해시킨 지질 혼합물(PE:PC:PS = 5:3:2; 총 지질 lmg)을 질소 가스 흐름하에 건조시키고, DTT(1 mM)을 함유하고 있는 인산칼륨 완충액(50 mM pH 7.4) 0.1 ml에 재현탁하였다. 분리된 Vpu를 함유하고 있는 분주 물 25 ㎕를 가하고, 이후 옥틸글루코시드를 최종 농도 1.25 % (wt/vol)으로 첨가하였다. 상기 혼합물은 액체 질소상에서 동결, 해동 및 수조형의 초음파기기에서의 초음파분해(20-30초)를 3회 실시하고, 인산칼륨 완충액 100 부피배로 재빨리 희석하였다. 1시간동안 400,000g으로 원심분리하여 프로테오리포좀을 수집하고, 인산 완충액 약 150 ㎕에 재현탁하였다.
실시예 9. Vpu 이온 채널의 활성 분석
정제한 Vpu는 공지된 표준 기법(Miller, 1986 ; and Piller et al, 1996)을 이용하여 2차 구조의 지질 이중막에서의 채널의 활성 유발력에 대해 테스트하였다. 높은 저항의 전기적 봉합을 형성하도록 가공된 이중 지질막을 통과하는 약 100 ㎛ 직경의 작은 구멍을 가지고 있는 DelrinTM 플라스틱 벽에 의해, CIS 및 TRANS 챔버내 용액을 분리하였다. 이중막은, n-데칸 내의 팔미토일-올레오일-포스파티딜-에탄올아민과 파니토일-올레올리포스파티딜-콜린(Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama) 혼합물(8:2)로 제조된 것이다. NaCl 또는 KCl의 다양한 농도에 MES 완충액(10mM, pH 6.0)를 함유한 2개의 챔버내 용액을 첨가하였다. 전류는 AxopatchTM 200 증폭기로 기록하였다. 2개의 챔버간의 전기적 전위는 +/-200 mV(바닥 CIS에 상대적인 TRANS) 사이로 조작하였다. Vpu를 함유하고 있는 분주물을 세정제 용액으로서 또는 인지질 비히클로 단백질을 혼입한 후 CIS 챔버에 첨가하였다. 챔버는 전류가 관찰될때까지 교반하였다.
실시예 10. 이중 지질막내 Vpu 이온 채널 형성
Vpu에 의한 이온 채널 형성을 분석하기 위해, 평면의 이중 지질막으로의 재구성을 수행하였다. 정제된 재조합 Vpu 시료(7 내지 70 ng의 단백질 함유)를 이중막 장치의 CIS 챔버내 완충액 1 ml에 첨가하였을 때, 2 내지 30분간 교반한 후 전류 변동이 측정되었다(도 3). 채널 활성 관찰에 소요되는 시간은 챔버에 첨가된 단백질의 양과 상관성이 있다. 대조군 완충액 분주물 또는 대조군으로 지질 비히클을 CIS 챔버에 첨가한 경우, 챔버에서 관찰되지 않았다. 이러한 대조군 실험에서, 챔버는 한시간 이상 교반하였으나 채널 활성이 나타나지 않았다.
실시예 11. Vpu 채널의 특성
5개의 독립적인 정제물로부터 준비한 Vpu 시료를 이용하여 40회의 개별적인 실험으로 채널 활성을 관찰하였다. 여러 실험들에서, 전류의 진폭은 넓은 범위로 변하고 다시 첨가된 단백질의 양과 대략적으로 관련있는 것으로 보였다. 관찰된 최소 및 최대 채널은 각각 14 pS 및 280 pS이었다. Vpu를 함유하고 있는 지질 비히클을 제조하여 이중막에 융합한 경우, 세정제 용액에서 정제한 단백질을 첨가한 경우에 비해, 채널은 일관되게 더 작았다. 이는, 전자가 고농도의 세정제 처리 및 거대 응집물을 우호적으로 모노머로 분해할 수 있는 희석 단계를 포함하는 방법이기 때문일 수 있다.
전류 진폭과 전압은 선형적인 상관관계를 가지며, 10 배의 NaCl(500 mM CIS; 50 mM TRANS)을 함유하는 용액에서의 역전위는 +30 mV이었다(도 3B). 유사한 역전위가 NaCl 대신 KCl을 포함하는 용액에서 확인되었다. 막의 양쪽면에 있는 용액중에 NaCl 또는 KCl중 어느 하나가 있는 5번의 실험들의, 평균 역전위는 31.0 +/- 1.2mV (+/-SEM)이었다. 이는 양이온 단독으로 선택적으로 투과가능한 채널에서 예상되는 것보다 더 낮다(-). Goldman- Hodgkin-Katz 공식의 이온 활성을 이용하면 약 5.5의 PNa/PCl 비율이 나오며, 이는 염소 이온이 채널에 투과될 수 있음을 의미한다. 염소 이온을 인산으로 대체함으로써 음이온 전류를 감소시키는 실험을 수행하였다. 나트륨-인산 농도구배(150 mM Na+ & 100 mM phosphate CIS; 15 mM Na+ & 10 mM phosphate TRANS, pH 6.8)를 NaCl 농도구배 대신 사용한 경우, 역 전위는 37.1 +/- 0.2(+/-SEM, n=2)이었으며, 이는 양이온/음이온 투과성 비율이 약 5임을 의미한다. (인산 용액 참여한 계산시, 일가 및 이가 음이온의 총 활성을 사용하였고, 두가지 종들은 동일하게 투과가능한 것으로 추측되었음). 전류-전압 곡선은 NaCl 용액에서 나타나지 않는 정류(rectification)를 나타내었다. Vpu 에 의해 형성된 채널은 Na+ 및 K+를 동일하게 투과시키며, 또한 인산 이온 뿐만 아니라 염소도 소량 투과가능한 것으로 결론지을 수 있다.
실시예 12. 잠재적인 이온 채널 차단 약물을 스크니링하기 위한 세균성 생물학적 분석
생물학적 분석은 E. coli에서의 Vpu 발명은 원형질에 위치한 활성의 Vpu를 형성하고 트랜스막의 나트륨 농도 구배를 흩뜨린다는 관찰을 토대로 한 것이다. 이러한 Vpu 채널 활성의 결과로, 세포내 축적이 나트륨 의존적인 보조-수송자(co-transporter)(예컨대, 프롤린 또는 아데닌)에 의해 매개되는 대사산물은, 합성될 수 있는 것보다 더 빨리 세포에서 누출되어, 세포내 대사산물의 수준은 세포의 성 장을 저해하게 된다. 따라서, Vpu를 발현하는 E. coli는 아데닌 또는 프롤린 결핍성 최소 드롭 아웃 배지에서 증식할 수 없다. 그러나, Vpu 채널을 차단하는 약물의 존재하에서는, 막에서의 다른 이온 펌프의 작용으로 인해 세포는 다시 트랜스 막의 나트륨 농도구배를 재확립할 수 있으며, 대사산물의 누출은 방지되어 증식가능하다. Vpu 가 E.coli의 원형질 막에서 나트륨 채널을 형성할 수 있음을 입증하는 실험을 하기와 같이 수행하였다.
E. coli에서 융합되지 않은 Vpu를 발현시키기 위해, Vpu ORF를 pPL451에 클로닝하여 재조합 플라스미드 pPL-Vpu(도 1b)를 제조하였다. 상기 벡터에서, 강력한 PL 및 PR 람다 프로모터를 사용하여 온도 민감성 c1857 억제자의 조절하에 Vpu을 발현시키며, 30 ℃에서 배양하는 경우 발현이 철저히 억제되고, 37 내지 42 ℃로 온도를 높여 발현을 유도할 수 있다. 한천 플레이트에서, 42 ℃가 30 ℃ 및 37 ℃에서 배양하였을때 pPL-Vpu를 함유하고 있는 세포가 증식되며, 대조군 균주는 42℃에서 매우 잘 증식된다. pPL-Vpu를 함유하고 있는 세포의 배양액이 OD600 =0.84가 될때까지 30 ℃에서 배양하고, 이후 42℃에서 2시간 배양하였다(최종 세포 밀도는 OD600=0.75임). 원형질 막 분획을 준비하고 Vpu의 C-말단에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하여, 약 l6kDa의 단일 밴드를 검출하였으며, 이는 Vpu가 발현되며 막과 조합됨을 의미한다(도 2A, 레인 5).
실시예 13. 교차 공급(cross feeding) 실험시 Vpu를 발현하는 세포에서 프롤린 누출이 확인된다.
E.coli의 프롤린 흡수는 매우 특정화되어 있으며, 세포로의 아미노산의 능동 수송시 에너지원으로서 나트륨 농도구배를 이용하는 것으로 알려져 있다(Yamato et al, 1994). 프롤린 누출 발생을 검출하기 위해, 다음 교차 공급 분석을 실시하였다: 프롤린 및 메티오닌에 영양요구성을 가지는 E.coli 균주(Met- Pro-)를 바탕(law)으로 접종하고, 메티오인을 포함하지만 프롤린이 결핍된 최소 드롭 아웃 배지를 상층 연질 아가로 적층하였다. 멸균된 다공성 필터 디스크에 pPL451 대조군 플라스미드 또는 pPL-Vpu를 함유하고 있는 Met+Pro+ 균주(XL-1 blue)를 접종하고, 상기 연질 아가 상위에 두었다. 상기 플레이트는 이틀간 37 ℃ 또는 30 ℃에서 배양하였다. Met- Pro- 균주의 할로(halo) 증식이 37 ℃에서 배양한 pPL-Vpu를 함유하고 있는 세포가 접종된 디스크 주변에 명확하게 가시화되었다(도 4A). 이러한 성장은 디스크상의 Vpu 발현 세포로부터 프롤린이 누출되었지 때문일 수 있다. 이러한 누출은 37 ℃의 대조군 균주나 또는 30 ℃에서 배양한 플레이트상의 균주 주변에서는 나타나지 않았다(도 4B).
프롤린 수송과는 반대로, E.coli의 메티오닌 투과효소는 ABC 수송체 계열(Rosen, 1987)에 속하며, 따라서, ATP에 의해 에너지를 획득하는 것으로 알려져 있다. 전술한 교차 공급 실헙과 동일하게 설정하고, 대신 Met- Pro- 균주를 프롤린은 포함하나 메티오닌인 결핍된 최소 드롭 아웃 플레이트에 도말하였다. 상기 균주는 모든 디스크 주변에서 성장되지 않았으며(도 4C), 이는 Vpu이 발현되더라도 XL-1 blue 세포에서 메티오닌이 누출되지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 14. Vpu 발현 세포는
E. Coli
증식시 배지 외부에 아데닌이 요구된다
아데닌 합성 경로에서 비특성화된 돌연변이로 인해, 37 ℃에서 Vpu를 발현하는 XL1-blue 균주의 E. coli 세포 증식이 배지내 아데닌의 존재에 의존적임을 확인하였다. 이는 전술한 프롤린 교차 공급 분석보다 Vpu 채널 활성에 대한 보다 더 간단한 생물분석법의 개발을 허용하였다: pPL-Vpu 플라스미드를 함유하고 있는 XL1-blue 세포의 바탕을 배지내 아데닌이 결핍된 한천 플레이트상에 접종하고, Vpu 채널 저해에 대해 테스트할 약물 소량을 한천상의 분리된 위치에 점적하고, 플레이트는 적정 시간(12-36시간)동안 37 ℃에서 배양하였다. 개별 약물을 적용한 부위의 주변의 할로 증식은, 약물을 약물 부재시 성장을 저해하는 Vpu 이온 채널 활성의 발현을 저해함을 나타내는 것이다(도 5).
실시예 15. 평면 이중 지질막에서의 Vpu 채널 차단 활성에 대한 화합물 분석
평면 이중 지질막으로 재구성되는 Vpu 이온 채널 활성을 차단하는 화합물의 능력에 대해 특성화하였다. 트리플루오로에탄올에 용해한 Vpu N-말단 펩티드(잔기 1-32)를 이중막 장치의 CIS 챔버에 가하고, 이중막으로 하나 이상의 Vpu 이온 채널의 통합을 의미하는 이온 전류가 관찰될때까지 용액을 교반하였다. 몇 분간 채널 활성을 기록한 후, CIS 및 TANS 챔버 용액에 교반하면서 최종 농도 100 μM로 약물을 가하였다. 이후 채널 활성은 적어도 3분 이상 동안 기록하고, 약물 첨가에 따른 이온 전류에 대한 효과를 약물 첨가 전후의 채널 활성을 비교하여 결정하였다. 각 실험에서, 약물 효과는 4가지로 분류하였다: 전류가 약 90-100%로 저해되는 경 우 "강력한 차단", 약 50-90% 저해는 "약한 차단", <50% 저해는 "일부 차단", 및 "효과없음". Vpu N-펩티드 첨가 후 + 50pA 보다 높은 경우, 무천연성 펩티드 응집물이 이중막을 붕괴한 가능성이 있기 때문에, 이 경우의 실험은 무시하였다. 실제 이러한 응집물의 비조직화된 구조는 테스트한 농도의 약물에 의해 특이적으로 차단되지 않을 수 있다.
표 3은 이중막 실험 결과를 나타낸다. 이들 실험의 새로운 결과는 펜아밀을 이용하여 관찰한 Vpu 채널의 강력한 차단이다. 펜아밀은 아밀로라이드의 구아니딘기에 페닐기 유도체를 가진다. 아밀로라이드는 그 자체로 Vpu를 차단하지 않지만, 피라진 고리 5-위치에 헥사메틸렌 기의 추가로 25 μM의 낮은 낮도에서 채널을 차단하는 구조(HMA)를 형성하였다. 그러나, 펜아밀을 이용한 새로운 결과는, 분자의 반대 말단에 벌키 소수성 유사체가 아밀로라이드를 유효한 Vpu 채널 차단제로 변화시킬 수 있음을 보이고 있다. 흥미로운 점은 매우 유사한 구조를 가지는 벤즈아밀은 Vpu 채널 차단에 거의 효과가 없었다.
표 3: 이중막에서 Vpu 이온 채널을 저해하는 화합물의 개요
화합물 시험 번호 결과
펜아밀 3 3x 강력한 차단
MIA 2 1x 강력한 차단; 1x 약함
벤즈아밀 10 3x 일부 차단; 7x 효과 없음
EIPA 3 3x 약한 차단
HMA 1 1x 강력한 차단
(5-페닐-펜타-2,4-
디에노일)구아니딘 6 6x 강력한 차단
6-메톡시-2-나프토일구아니딘 5 5x 강력한 차단
(2-클로로신나모일)구아니딘 6 4x 강력; 2x 일부 차단
3-(트리플루오로메틸) 4x 강력한 차단;
신나모일구아니딘 5 1x 효과 없음
N-{5-[3-(5-구아니디노-
펜틸옥시메틸)-벤질옥시]- 3x 강력한 차단;
펜틸}-구아니딘 4 1x 효과 없음
4-페닐벤조일구아니딘 3 3x 강력한 차단
3-메틸신나모일구아니딘 4 2x 강력한 차단; 2x 부분
(3-클로로신나모일)구아니딘 4 2x 강력한 차단; 2x 부분
N-(3-페닐프로페노일)-N'-
페닐구아니딘 1 1x 강력한 차단
(3-브로모신나모일)구아니딘 3 3x 일부-강력한 차단
5-tert-부틸아미노-
아밀로라이드 3 3x 일부 차단
N-아미디노-3-아미노-5-페닐-
6-클로로-2-피라진카복사미드 3 3x 일부 차단
3-메톡시-HMA 3 3x 일부 차단
5-(N-메틸-N-이소부틸)
아밀로라이드 1 1x 일부 차단
5-(N-에틸-N-이소프로필)
아밀로라이드 1 1x 일부 차단
2-나프토일구아니딘 7 7x 약한 차단
N-N'-비스(3페닐프로파노일)-N"-
페닐구아니딘 7 7x 약한 차단
신나모일구아니딘 3 3x 약한 차단
(5-페닐-펜타-2,4-디에노일)
구아니딘 6 6x 강력한 차단
실시예 16: 세균성 생물분석을 이용한 Vpu 단백질에 대한 화합물 스크리닝
실시예 14에 개시된 바와 같이, 특정 약물의 적용 부위 주변에 할로 증식을, 세균성 세포 증식 부위의 크기 및 밀도를 반영하여 0 내지 6으로 수치를 매겼다. 3 보다 큰 수치는 Vpu 단백질의 강력한 저해를 나타내고; 1.5-3은 중간정도의 저해이며; 및 0.01-1.5는 저해 안함을 나타낸다.
표 4는 세균을 이용한 생물학적 분석에서 Vpu 단백질의 저해 수치를 나타낸다.
표 4
화합물 Vpu 저해(수치/실험 횟수)
(3-클로로신나모일)구아니딘 4.38/4
(3-브로모신나모일)구아니딘 4.3/24
(2-클로로신나모일)구아니딘 4.0/4
(2-브로모신나모일)구아니딘 3.7/2
3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘 3.7/2
5-브로모-2-플루오로신나모일구아니딘 3.5/2
3-메틸신나모일구아니딘 3.4/2
2-메틸신나모일구아니딘 3.1/2
2,3-디메틸신나모일구아니딘 3.1/2
신나모일구아니딘 2.96/12
6-메톡시-2-나프토일구아니딘 2.9/4
트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘 2.9/3
3,4-디클로로신나모일구아니딘 2.9/3
2,6-디클로로신나모일구아니딘 2.88/2
4-페닐벤조일구아니딘 2.75/5
2-에틸신나모일구아니딘 2.75/2
(4-클로로신나모일)구아니딘 2.7/5
2-나프토일구아니딘 2.7/11
2,5-디메틸신나모일구아니딘 2.69/2
3-이소프로필신나모일구아니딘 히드로클로라이드 2.6/2
(5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘 2.56/2
3-페닐신나모일구아니딘 2.54/3
(4-브로모신나모일)구아니딘 2.5/4
5-(3'-브로모페닐)펜타-2,4-디에노일구아니딘 2.5/2
3-(사이클로헥스-1-엔-1-일)-신나모일구아니딘 2.5/2
3-(트리플루오로메톡시)신나모일구아니딘 2.44/2
2-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘 2.4/2
N,N'-비스(3페닐프로파노일)-N"-페닐구아니딘 2.25/3
2-에톡시신나모일구아니딘 2.25/2
N-(3-페닐프로파노일)-N'-페닐구아니딘 2.21/3
4-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘 2.2/2
(4-메톡시신나모일)구아니딘 2.13/3
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2-t-부틸신나모일구아니딘 2.13/2
4-메틸신나모일구아니딘 2.1/2
2-플루오로신나모일구아니딘 2.1/2
2-페닐신나모일구아니딘 2.1/2
N-(6-히드록시-2-나프토일)-N'-페닐구아니딘 2.06/2
3-t-부틸신나모일구아니딘 2.06/2
3,4-디플루오로신나모일구아니딘 2.06/2
5-(N,N-헥사메틸렌)아밀로라이드 1.9/31
3-플루오로신나모일구아니딘 1.9/2
5-브로모-2-메톡시신나모일구아니딘 1.9/2
3-에톡시신나모일구아니딘 1.9/2
3,4-(메틸렌디옥시)신나모일구아니딘 1.88/2
(2-메톡시신나모일)구아니딘 1.7/4
2'4디클로로벤즈아밀 HCl 1.7/2
2,3,5,6,-테트라메틸신나모일구아니딘 1.6/2
3-(2-나프틸)아크릴로일구아니딘 1.56/2
2-(1-나프틸)아세토일구아니딘 1.56/2
2,3-디플루오로신나모일구아니딘 1.56/2
(3-메톡시신나모일)구아니딘 1.52/6
4-이소프로필신나모일구아니딘 1.4/2
2,4,6-트리메틸신나모일구아니딘 1.4/2
N-(신나모일)-N'페닐구아니딘 1.25/3
2-(사이클로헥스-1-엔-1-일)신나모일구아니딘 12./2
2-(2-나프틸)아세토일구아니딘 1.19/2
(4-히드록시신나모일)구아니딘 1.1/2
4-페닐신나모일구아니딘 1.1/2
4-플루오로신나모일구아니딘 1.1/2
N,N'-비스-(신나모일)-N"-페닐구아니딘 0.94/2
(2-퓨란아크릴로일)구아니딘 0.94/2
펜아밀 메탄설포네이트 염 0.9/5
벤즈아밀 히드록클로라이드 0.9/3
(3-니트로신나모일)구아니딘 0.9/1
벤조일구아니딘 0.88/2
(4-페녹시벤조일)구아니딘 0.81/2
3-(트랜스-헵트-1-엔-1-일)신나모일구아니딘 0.81/2
5-(N-메틸-N-이소부틸)아밀로라이드 0.8/2
2-시클로헥실신나모일구아니딘 0.8/2
4-에톡시신나모일구아니딘 0.69/2
2,4-디클로로신나모일구아니딘 0.63/2
5-(N-에틸-N-이소프로필)아밀로라이드 0.6/3
N-아미디노-3-아미노-5-헥사메틸렌이미노-6-
페닐-2-피라진카복사미드 0.6/2
(a-메틸신나모일)구아니딘 0.6/2
신나모일구아니딘 히드로클로라이드 0.6/2
[(4-클로로페녹시-아세틸]구아니딘 0.56/2
N-아미디노-3-아미노-5-페닐-6-
클로로-2-피라진카복사미드 0.5/11
5-(4-플루오로펜틸)아밀로라이드 0.4/6
----------------------------------------------------
(트랜스-2-페닐시클로프로판카보닐)구아니딘 0.4/2
(2-니트로신나모일)구아니딘 0.4/2
트랜스-3-퓨란아크리오일구아니딘 0.38/2
1-나프토일구아니딘 0.3/2
5-tert-부틸아미노-아밀로라이드 0.2/7
3-메톡시-HMA 0.2/4
(3-페닐프로파노일)구아니딘 0.2/4
4-t-부틸신나모일구아니딘 0.19/2
5-(N,N-디메틸)아밀로라이드 히드로클로라이드 0.1/2
N,N'-비스(3-페닐프로파노일)구아니딘 0.1/2
N-벤조일-N'-신나모일구아니딘 0.06/2
1-브로모-2-나프토일구아니딘 0.06/2
실시예 17. 인간 단핵구 및 대식세포에서의 HIV 복제에 대한 화합물의 효과
인간 단핵구를 말초 혈액에서 분리하여 24시간 동안 7일간 배양하여 단핵구 유래 대식세포(MDM)으로 분화되도록 하였다. 상기 세포는 이후 세포가 무첨가된 HIV 조제물에 노출시킨 후 배지를 완전히 제거하기 전에 2시간동안 흡착하도록 두었으며, 바이러스 무첨가 배지로 1회 세척한 다음 신선한 배지에 재현탁하였다. 상기 세포를 감염 전 또는 후 24 시간 여러가지 농도의 화합물에 노출시켰다. 염 후 여러 시간대별로, 약물에 노출시킨 세포와 약물에 노출시키지 않은 세포(대조군)서의 HIV 복제를 비교하였다. 바이러스 복제 진행 및 정도는 HIV DNA PCR 방법(Fear et al, 1998)이나 ELISA 방법으로 분석하여, 배양 상층액내의 p24를 정량하였다(Kelly et al, 1998)
표 5는 상기 분석 및 항바이러스 테스트 화합물을 이용한 실험 결과이다.
표 5
화합물 | 약물농도μM | 양성 대조군 % |
양성대조군 없음 | 100% | |
4-페닐벤조일구아니딘 | 10 | 26 |
5 | 4 | |
2.5 | 9 | |
1. | 216 | |
0625 | 10 | |
양성대조군 없음 | 100% | |
(3-브로모신나모일)구아니딘 | 10 | 3 |
5 | 1 | |
2.5 | 9 | |
1.25 | 59 | |
0.625 | 116 | |
양성대조군 없음 | 100% | |
3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘 | 10 | 11 |
5 | 8 | |
2.5 | 25 | |
1.25 | 27 | |
0.625 | 38 | |
양성대조군 없음 | 100% | |
5-(N,N-헥사메틸렌)아밀로라이드 | 10 | 6 |
5 | 21 | |
2.5 | 50 | |
1.25 | 19 | |
0.625 | 30 |
실시예 18. SARS 코로나바이러스.
SARE E 단백질은 이온 체널을 형성한다.
펩티드 합성
전장 SARS-CoV(Tor2 및 Urbani) E 단백질에 해당되는 펩티드(MYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCCNIVNSVLVKPTIVYVYSRVKNLNSSEGVPDLLV)와, 트랜스막 도메인에 해당되는 전장 E 단백질의 처음 40개의 아미노산을 포함하는 제2 펩티드(MYSFVSEEIGILIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLC)를 FMOC 화학 합성 및 고상 펩티드 합성으로 기계적으로 합성하였다. 합성은 Protein Technologies Inc. (Tucson, AZ, USA)사의 SymphonyR Peptide Synthesiser를 이용하여 제조사의 안내서에 따라, Biomolecular Resource Facility (John Curtin School of Medical Research, ANU, Australia)에서 합성하였다.
실시예 19. 펩티드 정제
합성 펩티드의 질량 분광 분석으로, 조제물이 전장 산물에서 예측되는 바에 비해 m/z 비율이 더욱 낮은 물질을 상당량 포함하는 것으로 확인되었다. 이들 대부분은 펩티드 합성과정중에 생성된 일부가 잘려진 펩티드(truncated peptides)인 것으로 추측된다. 전장 E 단백질을 농축하기 위해, 작은 분자와 전장 펩티드의 차별적인 가용성을 이용한 하기 과정을 실시하였다. 조 산물을 70% CH3CN, 0.1% TFA 12 mg/ml에 현탁하여 10분간 혼합하였다. 이 현탁액을 10,000g에서 110분간 20 ℃로 원심분리하였다. 상층액은 버리고, 불용성 분획을 상기와 같이 2회 더 CH3CN, 0.1% TFA로 추출하였다. E 단백질을 함유하고 있는 불용성 물질은 Speedvac으로 건조시킨 다음, 최종 산물의 무게로 수율을 계산하였다. 정제된 펩티드는 메탄올내 2.5 mg/ml의 HABA 기질에 1:1 비율로 Bruker Omniflex MALDI-TOF 질량분광기로 분석하고, 양성의 선형 모드의 스펙트럼을 수득하였다. m/z 비율 8,360 위치의 분명한 피크는 계산된 분자량의 전장 E 단백질인 것으로 보이며, 4422.3은 E 단백질의 N 말단이었다.
실시예 20. 평면 이중 지질막
SARS 바이러스의 E 단백질을 2,2,2-트리플루오로에탄올에 1 mg/ml로 재현탁하였다. SARS 바이러스 E 단백질의 이온 채널 형성력을 하기와 같이 Wamer (Warmer instruments, Inc. 1125 Dixwell Avenue, Hamden, CT 06514) 이중막 장치상에서 테스트하였다: CHCl3에 용해한 1-팔미토일-2-올레올릴 포스파티딜 에탄올아민: 1-팔미토일-2-올레올릴 포스파티딜 세린: 1-팔미토일-2-올레올릴 포스파티딜 콜린의 3:1:1의 지질 혼합물을 질소 가스하에서 건조시킨 다음 n-데칸에 50 mg/ml로 재현탁하였다. 이중막은 CIS 및 TRANS 챔버로 수용액을 분리하는 DelrinTM cup에서 약 100 ㎛ 직경의 둥근 구멍을 가로질러 페인팅되었다. CIS 챔버는 5 mM HEPES 완충액 pH 7.2에 용해된 500 mM NaCl 또는 KCl을 포함하고 있으며, TRANS 챔버는 5 mM HEPES 완충액 pH 7.2에 용해된 50 mM NaCl 또는 KCl을 포함하고 있다. 2% 아가로스 브릿이 있는 염소로 코팅된 은 전극을 CIS 및 TRANS 챔버 용액내에 두었다. SARS E 단백질의 전장 또는 N-말단 펩티드(3-10 ㎍)을 CIS 챔버에 가하고 채널 활성이 검출될때까지 교반하였다. CIS 챔버를 접지하고 TRANS 챔버에는 +100 내지 -100 mV 사이의 여러가지 홀딩 전위를 형성시켰다. 전류는 Warner model BD-525D 증폭시로 기록하고, l kHz에서 필터링, 5 kHz에서 샘플링하여 회사에서 개발 한 소프트웨어를 사용하여 PC의 하드 디스크에 디지털방식으로 기록하였다.
SARS E 단백질 이온 채널 활성에 대한 저해력을 실험하는 약물을 50% DMSO: 50% 메탄올 용액에 50 mM로 현탁하였다. E 단백질 이온 채널 활성의 저해력 테스트 실험으로, 화합물 100 μM 내지 400 μM을 CIS 챔버에 30초간 교반하면서 첨가하였다. 이중막의 전류는 채널 활동 이전에 채널 작용 중에 또는 약물 첨가 후에 기록하였다.
테스트 화합물들 중에 신나모일구아니딘(Bit036)은 항바이러스 활성을 가지며, 다른 바이러스 유래 이온 채널 단백질을 저해하는 것으로 확인되었다.
실시예 20.1 폴리아크릴아미드 젤 전기영동
정제된 E 단백질을 6 M 유레아, 10% 글리세롤, 5% SDS, 50 mM DTT, 0.002% 브로모페놀 블루, 62.5 mM Tris HCl(pH 8.3)에 1 mg/ml, 5 mg/ml 및 10 mg/ml로 용해하였다. 용액내 펩티드는 20분간 100 ℃로 가온하고, 샘플 30 ㎕을 4-20% 스테킹 젤(stacking gel)(Gradipore)에 전개하였다. Blue®pre으로 염색된 표준물질(Invitrogen)을 분자량 마커로 사용하였다.
실시예 20.2 결과
SARS E 단백질이 이온 채널을 형성하는지를 실험하기 위해, 정제한 합성 펩티드를 평면 이중 지질막(21)으로 재구성하였다. 일반적으로 SARS 전장 E 단백질 3 ㎍을 CIS 챔버에 교반하면서 가하였다. CIS 챔버는 500 mM NaCl을 포함하며, TRANS 챔버는 50 mM NaCl을 포함한다. 60회 실험으로, SARS E 단백질의 이온 채널 활성으로 인한 이온 전류가 약 5-15분 교반한 후 관찰되었다. 활성을 신속하고 신뢰성 있게 이중막의 약 -100 mV의 홀딩 전위에서 검출하였다. 상기 실험들중 한 실험에서, -100 mV(A) 및 -60mV(B)에서 기록한 전류 값은 도 6에 나타나 있다. 상기 실험에서, 역전위는 약 +48 mV이었고, 채널 전도성는 각각 52pS 및 26pS인 것으로 계산되었다. 이러한 결과는 전류-전압(IV) 상관성이 선형이 아님을 의미한다. 다른 10회의 실험들에서, CIS 챔버에 단백질을 첨가하지 않은 경우, 1시간 이상으로 기록하였으나 이온 채널 활성은 검출되지 않았다.
도 7a는 NaCl 용액에서 여러 전위에 따라 기록한 전형적인 전류 트레이스(current trace)를 나타낸다. 상기 실험에서 전류의 흐르는 방향이 +48 mV(도 7b)에서 역위되었다. IV 곡선은, 최저 전압에서 이중막의 평균 전류 흐름이 적으며 보다 높은 전위에서 이중막의 평균 전류가 증가됨을 보이며, 즉, IV의 비-선형 상관관계를 나타낸다. 독립적인 7가지 실험들에서, 평균적인 역 전위는 +48.3 + 2.3 mV(평균 + 1SEM)이었고, 이는 채널이 Cl- 보다는 Na+에 대해 약 37배 높은 투과성을 가짐을 의미한다. 역 전위는 Na+ 평형 전위(+53 mV)에 가까웠으며, 따라서, 상기 채널은 Na+ 이온에 선택적이다. 이러한 7가지 실험들에서, 채널 전도성은 95-164 pS로 다양하며, 평균 전도성은 130 + 13 pS이었다.
SARS E 단백질 이온 채널은 Na+ 이온에 비해 K+ 이온에 매우 조금 선택적이다. 도 8b는 여러 전위에서 KCl 용액내 전류 기록을 나타내고 있다. 이 실험에 서, 전류는 +31 mV에서 역위하였다. 7회의 유사 실험들에서, E 단백질 이온 채널의 평균 역 전위는 +34.5 + 2.5 mV였다. 따라서, SARS E 단백질 이온 채널은 Cl-에 비해 K+ 이온을 약 7.2배로 더 투과시킨다. 7회의 실험들에서, 채널 전도성은 24-166 pS이고, 평균 전도성은 83.4 + 26 pS이었다.
SARS E 단백질의 첫 40개의 N 말단 아미노산 "N-말단 펩티드"에 해당되는 제2 합성 펩티드를 이용한 실험에서 유사한 결과를 수득하였다(21). 4회 실험에서 NaCl 용액에서의 평균 역전위는 +46.3 + 2.5 mV이었으며, 이는 N-말단 펩티드에 의해 형성된 이온 채널이 Cl-에 비해 Na+에 약 25배 더 투과적임을 의미한다. SARS E 단백질의 N-말단 펩티드는 전장 SARS E 단백질에의한 채널과 유사한 특징을 가지는 이온 채널을 형성하는데 충분하였다. 따라서, SARS E 단백질에 대한 선택성 필터는 N-말단의 처음 40개의 아미노산내에 존재함이 틀림없다.
SARS E 단백질의 N-말단 펩티드는 또는 전장 E 단백질과 비고하였을때 K+ 이온에 대해 유사한 선택성을 가지는 이온 채널을 KCl 용액내에서 형성하였다. 5회의 독립적인 실험들에서, 평균 채널 역 전위는 +39.5 + 3.6 mV이었으며, 따라서, 채널은 Cl- 이온에 비해 K+ 이온에 약 11배 더 투과적이다. 정제한 전장 E 단백질 펩티드의 SDS-PAGE에서, 전장 E 단백질(데이타 미첨부)에 해당되는 빈드가 확인되었다. 약 20 kDa 이상의 다양한 더 큰 밴드들이 검출되었으며, 이는 SARS E 단백질이 호모올리고머를 형성할 수 있음을 시사한다.
실시예 21. SARS E 단백질 이온 채널은 신나모일구아니딘 및 다른 화합물에 의해 차단된다.
NaCl에서의 E 단백질 이온 채널의 활성은, CIS 챔버에 신나모일구아니딘을 100 내지 200 μM첨가시 현저하게 감소하였다(p> 0.01, n=6 실험). 이중막의 평균 전류는 100 μM의 신나모일구아니딘에 의해 베이스라인으로 감소되었다. E 단백질 이온 채널이 보다 높은 전도성을 가지는 실험에서, 100 내지 200 μM의 신나모일구아니딘은 이중막의 평균 전류를 약 4배 감소시켰다. 또한, 다른 4회 실험들에서, 신나모일구아니딘 100 -200 μM은 KCl 용액내에서 전장 E 단백질에 의해 형성된 채널을 차단하였다. 2회의 추가 실험들에서, SARS E 단백질의 N-말단 펩티드를 100 내지 200 μM의 신나모읽구아니딘이 차단하였으며, 이는 신나모일구아니딘 약물 결합 부위가 E 단백질의 N-말단 도메인의 첫 40개의 아미노산내에 위치하고 있음을 나타내는 것이다. 이중막에서 테스트한 다름 화합물의 SARS E 단백질에 대한 효과는 하기 표 6에 나타낸다.
표 6
화합물 | 100μM에서 평균 전류 감소 % |
5-(N,N-헥사메틸렌)아밀로라이드 | 91±7 |
6-메톡시-2-나프토일구아니딘 | 92±16 |
2'4디클로로벤즈아밀 HCl | 78±0 |
N,N'-비스(3페닐프로파노일)-N"-페닐구아니딘 | 88±6 |
(3-브로모신나모일)구아니딘 | 87±11 |
(2-브로모신나모일)구아니딘 | 88±6 |
트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘 | 66±2 |
실시예 21.1 결과 및 고찰
SARS E 단백질이 이중 지질막에서 이온 채널을 형성할 수 있음을 확인하였 다. 이온 전류는 + 전위에서 역위되었으며, 이는 E 단백질 이온 채널이 일가 음이온보다는 일가 양이온에 선택적임을 입증하는 것이다. E 단백질 이온 채널은 염소 이온에 비해 나트륨 이온에 약 37배 더 선택적이었고, 칼륨 이온에 대해 염소 이온에 비해 약 7.2배 더 선택적이었다. 60회 이상의 실험들에서, E 단백질 이온 채널의 나트륨 이온 전도성은 낮게는 26 pS에서 높게는 164 pS로 다양하였다. E 단백질은 SDS-PAGE 에서 호모올리고머를 형성하는 것으로 확인되었고, 보다 높은 전도성은 아마도 다수의 이온 채널의 동시적인 열림이나, 또는 보다 큰 이온 채널을 유발하는 E 단백질 펩티드의 응집이 원인인 것으로 요약된다. 채널 하나의 전류를 7번의 실험으로 측정하였고, 이들의 채널 전도성은 전압 의존적인 것으로 계산되었다.
SARS 바이러스 E 단백질의 소수성 도메일을 포함하는 N-말단의 첫 40개 아미노산은 2차 이중 지질막상에 이온 채널 형성에 충분하였다. E 단백질의 N 말단에 의한 이온 채널은 전장 E 단백질에 의한 이온 채널과 동일한 선택성 및 전도성을 가진다.
평면 이중 지질막상에서의 NaCl 및 KCl내 SARS 바이러스의 전장 E 단백질 이온 채널의 활성 및 N-말단 도메일의 이온 채널 활성은, 신나모일구아니딘을 CIS 챔버에 100 내지 200 μM로 첨가하는 경우 저해되었다. 신나모일구아니딘에 의한 E 단백질 이온 채널의 활성의 저해 또는 일부 저해가 NaCl에서 실시한 7번의 독립적인 실험과, KCl 용액에서 실시한 4번의 독립적인 실험들에서 관찰되었다.
공지된 모든 코로나바이러스는 N-말단의 트랜스막 도메인이 있는 E 단백질을 코딩하며, 따라서, 모든 코로나바이러스의 E 단백질은 평면 이중 지질막에 이온 채널을 형성할 수 있다. 이러한 사실은, E 단백질이 항바이러스 약물에 적합한 표적물일 수 있으며, 감염된 숙주 세포로부터 코로나바이러스 전파를 잠재적으로 중지시킬 수 있음을 의미한다. E 단백질의 이온 채널을 차단하는 약물은, SARS 및 감기를 포함하여 여러가지 중요한 인간 및 동물의 코로나바이러스 질환의 효과적인 치료제일 수 있다.
실시예 22. 가능성 있는 SARS-CoV E 단백질 이온 채널-차단 약물을 스크리닝하기 위한 세균을 이용한 생물학적 분석
SARS-CoV E 단백질 이온 채널은 세균 세포 증식을 저해한다.
세균 세포에서, SARS-CoV E 단백질 기능에 대한 생물학적 분석법을 개발하였다. SARS-CoV e 단백질을 코딩하는 cDNA 합성 단편을 발현 플라스미드인 pPL451에 클로닝하여, 실시예 4에 도시한 바와 같이 E 단백질이 온도 유발에 의해 발현되는 벡터를 제조하였다. 37 ℃에서 E 단백질을 발현하는 E. coli의 증식 저해로 p7 이온 채널 기능의 지표로서 세균 세포에 의해 유지되는 정상적인 나트륨 이온 농도 구배를 흩뜨리는 것으로 관찰되었다.
실시예 23. 세균을 이용한 생물학적 분석을 이용한 SARS 코로나바이러스 E 단백질에 대한 화합물 스크리닝
실시예 14에 기재한 바와 같이, 특정 약물을 적용한 부위의 주변의 할로 증식을 실시예 15와 같이 수치화하였다.
표 7은 세균을 이용한 생물학적 분석에서 SARS-CoV E 단백질의 저해 수치를 나타낸다.
표 7
화합물 SARS E 단백질 저해
(수치/실험 횟수)
2,3-디플루오로신나모일구아니딘 4.50/1
3,4-디클로로신나모일구아니딘 4.15/2
4-t-부틸신나모일구아니딘 4.00/1
3-(2-나프틸)아크릴로일구아니딘 3.88/1
(3-클로로신나모일)구아니딘 3.87/1
3-(시클로헥스-1-엔-1-일)신나모일구아니딘 3.75/1
2, 5-디메틸신나모일구아니딘 3.63/1
트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘 3.38/2
4-이소프로필신나모일구아니딘 3.16/2
(3-브로모신나모일)구아니딘 3.15/27
6-메톡시-2-나프토일구아니딘 3.13/3
5-(N-메틸-N-이소부틸)아밀로라이드 3.13/2
3-페닐신나모일구아니딘 3.13/1
(2-클로로신나모일)구아니딘 3.1/3
2'4 디클로로벤즈아밀 HCl 3.00/2
4-페닐신나모일구아니딘 2.75/1
4-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘 2.75/1
3-(트리플루오로메톡시)신나모일구아니딘 2.71/1
3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘 2.67/1
2-에톡시신나모일구아니딘 2.57/1
신나모일구아니딘 히드로클로라이드 2.50/1
4-에톡시신나모일구아니딘 2.48/2
(2-브로모신나모일)구아니딘 2.47/3
2,6-디클로르신나모일구아니딘 2.25/1
3,4,5-트리메톡시신나모일구아니딘 2.25/1
5-tert-부틸아미노-아밀로라이드 2.01/2
3-t-부틸신나모일구아니딘 2.00/1
5-브로모-2-플루오로신나모일구아니딘 2.00/1
(4-클로로신나모일)구아니딘 1.94/2
2-t-부틸신나모일구아니딘 1.86/1
2-시클로헥실신나모일구아니딘 1.83/1
6-요오드아밀로라이드 1.75/2
3-(트랜스-헵트-1-엔-1-일)신나모일구아니딘 1.71/1
(4-브로모신나모일)구아니딘 1.69/2
(4-히드록시신나모일)구아니딘 1.63/2
N-(3-페닐프로파노일)-N'-페닐구아니딘 1.57/2
(3-니트로신나모일)구아니딘 1.51/2
3-플루오로신나모일구아니딘 1.50/1
2-(1-나프틸)아세토일구아니딘 1.50/1
2-에틸신나모일구아니딘 1.50/1
5-(N,N-디메틸)아밀로라이드 히드로클로라이드 1.38/2
2-나프토일구아니딘 1.38/2
5-(4-플루오로페닐)아밀로라이드 1.38/1
2-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘 1.38/1
N-(6-히드록시-2-나프토일)-N'-페닐구아니딘 1.35/3
(트랜스-2-페닐시클로프로판카보닐)구아니딘 1.34/3
N,N'-비스(3페닐프로파노일)-N"-페닐구아니딘 1.33/3
1-나프토일구아니딘 1.32/3
벤즈아밀 히드로클로라이드 1.32/2
3-메톡시-HMA 1.25/1
4-메틸신나모일구아니딘 1.25/1
4-플루오로신나모일구아니딘 1.25/1
3,4-(메틸렌디옥시)신나모일구아니딘 1.25/1
5-(N,N-헥사메틸렌)아밀로라이드 1.2/3
N-(신나모일)-N'페닐구아니딘 1.19/2
5-(N-에틸-N-이소프로필)아밀로라이드 1.07/2
3-메틸신나모일구아니딘 1.00/1
2-메틸신나모일구아니딘 1.00/1
2,3,5,6,-테트라메틸신나모일구아니딘 1.00/1
트랜스-3-퓨란아크리오일구아니딘 0.88/2
(4-메톡시신나모일)구아니딘 0.88/2
(2-퓨란아크릴로일)구아니딘 0.82/2
(3-페닐프로파노일)구아니딘 0.73/5
2-(2-나프틸)아세토일구아니딘 0.71/1
신나모일구아니딘 0.69/3
(2-메톡시신나모일)구아니딘 0.69/2
[3-(3-피리딜)아크릴로일]구아니딘 0.67/3
4-페닐벤조일구아니딘 0.63/2
2,4-디클로로신나모일구아니딘 0.63/2
(3-메톡시신나모일)구아니딘 0.63/2
2-플루오로신나모일구아니딘 0.63/1
(4-페녹시벤조일)구아니딘 0.57/2
(a-메틸신나모일)구아니딘 0.50/1
5-(3'-브로모페닐)펜타-2,4-디에노일구아니딘 0.5/1
(5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘 0.44/2
(퀴놀린-2-카보닐)구아니딘 0.41/1
(페닐아세틸)구아니딘 0.32/3
N,N'-비스(아미디노)나프탈렌-2,6-디카복사미드 0.25/2
6-브로모-2-나프토일구아니딘 0.25/1
1-브로모-2-나프토일구아니딘 0.25/1
2-클로로-6-플루오로신나모일구아니딘 0.25/1
[4-클로로페녹시-아세틸]구아니딘 0.19/2
펜아밀 메탄설포네이트 염 0.13/2
N-벤조일-N'-신나모일구아니딘 0.13/2
N-(2-나프토일)-N'-페닐구아니딘 0.07/2
실시예 24. SARS 코로나바이러스(SARS-CoV) 복제에 대한 테스트 화합물의 SARS 항바이러스 분석
Vero 세포에서 3회 정제한 바이러스 플라그를 이용하여 SARS-CoV(Hong Kong strain)에 대해 화합물을 테스트하였다. 스톡 바이러스는 Vero 세포에 MOI = 1 x TCID50/100 세포로 감염시켜 제조하였다.
실시예 24.1 바이러스 마이크로타이터 분석을 이용한 항바이러스 활성 스크리닝
25 cm2 플라스트에서 증식시킨 Vero 세포 단일층에 1:50의 다중도로 감염시키고, 감염후 바로 10 μM 및 2 μM의 두가지 농도로 화합물을 처리하였다. 대조군은 감염시킨 단일층을 처리하지 않고 그냥 두었다. 배양 배지 샘플은 감염 후 48시간째에 취하였다. 각 샘플에서 2가지 분주물(적정(titration) 1 및 2)을 연속적으로 log로 희석하였고, -4 내지 -7의 log로 희석한 12개의 동일 샘플(replicate)을 마이크로타이터 플레이턴내의 세포에 첨가하였다. 4일 후, 마이크로타이터 플레이트 웰의 세포 변성 효과(CPE)를 수치로 매기고, 적정치는 4개의 희석물에서 CPE 양성 웰의 수를 토대로 계산하였다. 대조군의 역가(titre)는 4.8 및 5.9 TCID50 x 106 (평균 5.35 x 106)이었다.
실시예 25: SARS CoV 항바이러스 분석에서의 화합물 효과
실시예 21의 방법에 따라, 3개의 선별 화합물의 SARS-CoV에 대한 활성을 실험하였다. 트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘과 신나모일구아니딘은 10 μM 농도에서 바이러스 역가를 약 80% 감소시켰으며, 트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘은 2 μM농도에서 약 50% 감소시켰다.
표 8은 대조군에 대한 %로 바이러스 역가 결과를 나타낸다(SARS CoV는 화합물 부재시 48시간 증식하였다.)
표 8
화합물 | 평균TCID50 (x106) | 역가(대조군%) | |
명칭 | 농도(μM) | ||
신나모일구아니딘 | 10 | 1.3 | 24 |
2 | 4.4 | 82 | |
트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘 | 10 | 115 | 22 |
2 | 2.45 | 46 | |
6-메톡시-2-나프토일구아니딘 | 10 | 5.95 | 111 |
2 | 6.35 | 118 | |
대조군 | 0 | 5.35 | 100 |
실시예 26. 인간 229E 코로나바이러스
229E-E 단백질에 해당되는 펩티드의 합성 및 정제
전장 229E-E 단백질(서열: MELKLVDDHALVVNVLLWCVVLIVILLVCITHKLIKLCFTCHMFCNRTVYGPIKNVYHIYQSYMHIDPFPKRVIDF; 기탁 번호 NP_073554)에 해당되는 펩티드를 FMOC 화학 합성 및 고상 펩티드 합성으로 기계적으로 합성하였다. 합성은 Protein Technologies Inc. (Woburn, MS, USA)사의 SymphonyR Peptide Synthesiser를 이용하여 제조사의 안내서에 따라, Biomolecular Resource Facility (John Curtin School of Medical Research, ANU, Australia)에서 합성하여, C- 말단을 아미드로 제조하고, 커플링은 N-메틸피롤리돈에 용해된 하이드록시벤조트리아졸과 HBTU를 이용하여 실시하였다. 각 합성 주기에서 이중 커플링 및 4배 많은 아미노산을 사용하였다. 임시적인 알파-N Fmoc- 보호기는 DMF에 용해한 20% 피페리딘으로 제거하였다.
합성 조 펩티드는 제조사의 안내서에 따라 ProteoPlusTM 키트(Qbiogene inc. CA)로 정제하였다. 간단하게 설명하며, 상기 펩티드는 로딩 완충액(loading buffer)(60mM Tris-HCl pH 8.3, 6M 유레아, 5% SDS, 10% 글리세롤, 0.2% 브로모페놀 블루, + 100 mM 베타-머캅토에탄올)로 희석하여 4-20% 농도 구배의 폴리아크릴아미드 젤(Gradipore, NSW, Australia)에서 트리스-글리신 전기영동 완충액(25 mM Tris, 250 mM 글리신, 0.1% SDS)으로 전기영동을 수행하였다. 코드 블루(Promega, NSW)로 펩티드를 염색하고, 전장 펩티드에 해당되는 밴드를 웰에서 적출하였다.
젤 조각을 ProteoPLUSTM 시험관으로 옮기고, 여기에 트리스-글리신 전기영동 완충액을 넣었다. 상기 시험관을 트리스-글리신 전기영동 완충액에 넣고 약 1시간 동안 100 볼트를 가하였다 1분간 전류 극성을 반대로하여, 단백질 회수량을 증가시켰다. 펩티드를 회수하여 13,000rpm으로 1시간 원심분리하였다. 정제한 펩티드는 Speedvac에서 건조한 후 최종 무게를 수율로 계산하였다.
실시예 27. 229E-E 단백질은 평면 이중 지질막에 이온 채널을 형성한다.
공지된 바에 따라 이중 지질막 실험을 수행하였다(Sunstrom, 1996; Miller, 1986). 팔미토일-2-올레올릴 포스파티딜 에탄올아민: 팔미토일-2-올레올릴 포스파티딜 세린: 팔미토일-2-올레올릴 포스파티딜 콜린 지질 (5 : 3 : 2) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama)을 사용하였다. 지질 혼합물을 1 ml 델린 컵 벽의 150-200 ㎛의 구멍에 페인팅하였다. 구멍은 염 용액을 다른 농도로 포함하고 있는 cis 및 trans의 2가지 챔버로 분리한다. 상기 cis 챔버는 바닥과 연결되어 있고, trans 챔버는 Axopatch 200 증폭기 입력부와 연결되어 있다. cis 챔버는 정상적으로 500 mM NaCI 또는 500mM KCl를 함유하고 있으며, trans는 50 mM NaCI 또는 50mM KCI을 함유하고 있다. 이중막 형성은 전류 램프에 의해 형성되는 전류 펄스 증폭에 의해 전기적으로 모니터하였다. cis에 대한 전위를 trans 챔버에서 측정하였다. 합성 펩티드를 cis 챔버에 가하고 채널 활성이 나타날때까지 교반하였다. 전류는 1000 Hz에서 필터링되었고, 5000 Hz에서 디지털화되었으며, 자기 디스크에 저장하였다.
229E E 합성 펩티드를 0.05 mg/ml 내지 1 mg/ml으로 2,2,2-트리플루오르에탄올(TFE)에 용해하였다. 이의 10 ㎕을 이중막 장치의 cis 챔버(1 ml 수 부피)에 가하고, 자기 "flea"으로 교반하였다. 이중막에서의 채널 활성을 표시하는 이온 전 류는 전형적으로 15-20분 이내에 검출되었다. 전류 검출 이후, 이중막의 홀딩 전위는 -100 mV 내지 +100 mV으로 다양하였으며, 전류 흐름의 크기, 극성을 파악하고 역전위를 결정할 수 있었다.
500 mM NaCl 용액을 포함하고 있는 cis 챔버 및 50 mM NaCl 용액을 포함하는 trans 챔버를 이용한 15번의 실험에서, 채널 활성의 평균적인 역전위가 22 + 7 (SEM) mV로 계산되었다. 500mM KCl 용액을 포함하고 있는 cis 챔버 및 50 mM KCl 용액을 포함하는 trans 챔버를 이용한 13번의 실험에서, 채널 활성의 평균적인 역전위가 38 + 4(SEM) mV로 계산되었다. 이러한 결과는, 229E E 단백질이 나트륨 이온에 비해 칼륨 이온에 조금 더 선택적인 양이온 선택적 이온 채널을 형성한다는 것을 의미한다.
도 9는 비대칭성 KCl 용액(500/50 mM)내 여러 홀딩 전위(trans에 상태적인 cis)에서 229E E 이온 채널에 대한 가공하지 않은 전류 데이타를 나타낸 것이다. 상기 그래프는 평균 이중막 전류(pA; y-축) 대 홀딩 전류(mV ; x-축)의 전형적인 axis) 도이다.
실시예 28. 화합물은 229E E 단백질의 합성 펩티드의 이온 채널 활성을 저해한다.
테스트 화합물의 229E E 단백질에 의해 형성된 이온 채널을 차단하거나 또는 저해하는 능력을 확인하기 위해, 화합물을 함유하고 있는 용액의 소량을 펩티드 채널 활성이 재구성된 평면 지질이 있는 수용액에 가하고, 화합물 첨가시의 이온 전류 효과를 측정 및 기록하였다. 화합물의 원액을 DMSO에 500 mM로 용해시킨 형태로 일반적으로 제조하였다. 이 용액을 50% DMSO/50% 메탄올에 50 mM 또는 더 낮은 농도로 추가적으로 희석하고, 적절하게 희석된 화합물 2 ㎕를 목적한 최종 농도로 cis 또는/및 trans 챔버에 넣었다.
도 10에서, 100 μM 신나모일구아니딘을 cis 챔버에 첨가하면 229E E 이온 채널을 통한 전류 흐름이 매우 감소하였다.
실시예 29. 229E-CoV E 단백질 이온 채널 차단 약물을 스클리닝하기 위한, 세균을 이용한 생물학적 분석
229E-CoV E-단백질 이온 채널은 세균의 세포 증식을 저해한다.
세균에서 229E-CoV E-단백질 기능 분석법을 개발하였다. 229E-CoV E단백질을 코딩하는 cDNA 합성 단편을 발현 플라스미드인 pPL451에 클로닝하여, 실시예 4에 도시한 바와 같이 E 단백질이 온도 유발에 의해 발현되는 벡터를 제조하였다. 37 ℃에서 E 단백질을 발현하는 E. coli의 증식 저해로 p7 이온 채널 기능의 지표로서 세균 세포에 의해 유지되는 정상적인 나트륨 이온 농도 구배를 흩뜨리는 것으로 관찰되었다.
실시예 30. 세균을 이용한 생물학적 분석으로 229E-CoV E 단백질에 대한 화합물 스크리닝
실시예 14에 기재한 바와 같이, 특정 약물을 적용한 부위의 주변의 할로 증식을 실시예 15와 같이 수치화하였다.
표 9는 세균을 이용한 생물학적 분석에서 229E-CoV E 단백질의 저해 수치를 나타낸다.
표 9
화합물 229E E단백질 저해(수치)
4-이소프로필신나모일구아니딘 4.9
3,4-디클로로신나모일구아니딘 4.4
3-(트리플루오로메톡시)신나모일구아니딘 4.1
4-t-부틸신나모일구아니딘 4.0
3-이소프로필신나모일구아니딘 히드로클로라이드 4.0
3-t-부틸신나모일구아니딘 3.9
2-t-부틸신나모일구아니딘 3.9
트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘 3.7
5-브로모-2-메톡시신나모일구아니딘 3.6
2,3-디플루오로신나모일구아니딘 3.3
--------------------------------------------------------
3-(2-나프틸)아크릴로일구아니딘 3.0
2-페닐신나모일구아니딘 3.0
3-페닐신나모일구아니딘 2.9
3-(시클로헥스-1-엔-1-일)신나모일구아니딘 2.4
4-페닐벤조일구아니딘 2.3
3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘 2.3
(4-페녹시벤조일)구아니딘 2.3
4-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘 2.3
2-(시클로헥스-1-엔-1-일)신나모일구아니딘 2.3
(4-브로모신나모일)구아니딘 2.0
5-(N,N-헥사메틸렌)아밀로라이드 1.9
1-나프토일구아니딘 1.9
5-(4-플루오로페닐)아밀로라이드 1.8
(5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘 1.8
(3-브로모신나모일)구아니딘 1.7
2,5-디메틸신나모일구아니딘 1.6
2-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘 1.5
6-메톡시-2-나프토일나프토일 1.4
(4-클로로신나모일)구아니딘 1.4
(3-메톡시신나모일)구아니딘 1.4
5-브로모-2-플루오로신나모일구아니딘 1.4
5-(N,N-디메틸)아밀로라이드 히드로클로라이드 1.3
신나모일구아니딘 1.3
(2-메톡시신나모일)구아니딘 1.1
(a-메틸신나모일)구아니딘 1.0
4-페닐신나모일구아니딘 1.0
2,6-디클로로신나모일구아니딘 1.0
(2-브로모신나모일)구아니딘 0.9
2,4,6-트리메틸신나모일구아니딘 0.9
(트랜스-2-페닐시클로프로판카보닐)구아니딘 0.8
(3-클로로신나모일)구아니딘 0.8
2-(1-나프틸)아세토일구아니딘 0.8
2-에틸신나모일구아니딘 0.8
2-시클로헥실신나모일구아니딘 0.8
(4-히드록시신나모일)구아니딘 0.6
2-에톡시신나모일구아니딘 0.6
3-메틸신나모일구아니딘 0.5
2-메틸신나모일구아니딘 0.5
3-플루오로신나모일구아니딘 0.5
신나모일구아니딘 히드로클로라이드 0.5
2,3-디메틸신나모일구아니딘 0.5
2-플루오로신나모일구아니딘 0.4
4-플루오로신나모일구아니딘 0.4
3,4-디플루오로신나모일구아니딘 0.4
5-tert-부틸아미노-아밀로라이드 0.3
2-나프토일구아니딘 0.3
--------------------------------------------------------
N,N'-비스(아미디노)나프탈렌-2,6-디카복사미드 0.3
N,N'-비스(3-페닐프로파노일)구아니딘 0.3
4-메틸신나모일구아니딘 0.3
5-(3'-브로모페닐)펜타-2,4-디에노일구아니딘 0.3
2,3,5,6,-테트라메틸신나모일구아니딘 0.3
3-에톡시신나모일구아니딘 0.3
N,N'-비스(3페닐프로파노일)-N"-페닐구아니딘 0.1
(4-메톡시신나모일)구아니딘 0.1
(2-클로로신나모일)구아니딘 0.1
(3-니트로신나모일)구아니딘 0.1
4-에톡시신나모일구아니딘 0.1
3,4,5-트리메톡시신나모일구아니딘 0.1
2-(2-나프틸)아세토일구아니딘 0.1
N-(3-페닐프로파노일)-N'-페닐구아니딘 0.1
실시예 31. 인간 코로나바이러스 229E(229E)) 복제에 대한 테스트 화합물의 항바이러스 분석
인간 코로나바이러스 229E(ATCC VR-740)의 복제에 있어서, 항바이러스 활성을 가지는 화합물을 결정하기 위해, 229E가 감염된 MRC-5(인간 폐 섬유종; ATCC CCL-171) 세포의 단일층에 형성된 플라그 수 감소를 측정하는 분석을 개발하였다: 먼저, 바이러스가 작동하는 스톡을 MRC-5 세포에서 증폭에 의해 제조하였다. 이후 이를 사용하여, 6웰 조직 배양판에 컨플루언트 단일층으로 배양한 MRC-5 세포에 약 0.01 pfu/세포의 MOI로 1시간동안 5% 이산화탄소하 35 ℃에서 감염시켰다. 감염성 접종원을 옮기고, 다양한 농도의 화합물 또는 화합물에 사용되는 적정 수준의 용매(대조군)을 포함하는 신선한 배지(10% FCS(fetal calf serum)가 보충된 DMEM)로 교환하였다. 감염후 3-5일동안 35 ℃(5% C02)에서 배양하고, 배양 상층액은 제거하고 세포는 20% 에탄올에 용해한 0.1% 크리스탈 바이올렛 용액으로 10분간 염색하였다. 모든 웰의 플라그 수를 측정하고, 용매 대조군에 대한 플라그 수 감소율을 계산하였다. 측정은 4 세트의 웰에서 2회 실시하였다.
표 10
플라그 감소(% 대조군/실험 수)
화합물 5μM 2.5μM 1μM
2-t-부틸신나모일구아니딘 100/1 100/3 050/3
4-이소프로필신나모일구아니딘 100/1 100/2 057/2
3,4-디클로로신나모일구아니딘 100/3 099/4 086/3
3-(트리플루오로메톡시)신나모일구아니딘 100/2 098/4 077/3
2,6-디클로로신나모일구아니딘 100/1 097/3 066/2
2-(시클로헥스-1-엔-1-일)신나모일구아니딘 100/1 097/3 021/1
2-시클로헥실신나모일구아니딘 070/1 097/2 089/2
5-브로모-2-메톡시신나모일구아니딘 100/2 096/4 088/3
2-페닐신나모일구아니딘 100/1 096/3 100/1
5-(2'-브로모페닐)펜타-2,4-
디에노일구아니딘 100/2 095/3 079/2
4-t-부틸신나모일구아니딘 100/1 095/3 084/3
3-페닐신나모일구아니딘 094/3 077/2
(3-브로모신나모일)구아니딘 100/2 093/3 072/2
(4-브로모신나모일)구아니딘 094/1 091/3 073/2
5-(N,N-헥사메틸렌)아밀로라이드, 089/ 091/2 033/1
트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘 100/1 091/2 064/2
3-(2-나프틸)아크릴로일구아니딘 100/1 091/2 062/2
2,4-디클로로신나모일구아니딘 100/2 090/4 064/3
(2-니트로신나모일)구아니딘 085/2 090/2 046/2
3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘 097/2 089/4 064/3
5-브로모-2-플루오로신나모일구아니딘 100/1 088/3 063/2
4-메틸신나모일구아니딘 091/2 087/4 063/2
(3-클로로신나모일)구아니딘 100/1 086/3 009/1
(4-메톡시신나모일)구아니딘 100/1 085/4 057/3
(4-클로로신나모일)구아니딘 100/2 084/2 051/2
3-플루오로신나모일구아니딘 095/1 083/3 051/2
3-(시클로헥스-1-엔-1-일)신나모일구아니딘 100/1 082/3 063/2
(a-메틸신나모일)구아니딘 023/1 082/1 036/2
2,3,5,6,-테트라메틸신나모일구아니딘 098/2 079/4 064/3
2-플루오로신나모일구아니딘 090/1 079/3 045/2
4-(트리플루오로메틸)신나아밀구아니딘 100/1 079/1 052/1
(3-니트로신나모일)구아니딘 100/1 079/1 045/1
2,5-디메틸신나모일구아니딘 092/2 078/1 078/1
3-t-부틸신나모일구아니딘 100/1 077/4 030/3
(3-메톡시신나모일)구아니딘 089/1 075/2 030/1
3-메틸신나모일구아니딘 095/1 074/3 044/4
----------------------------------------------------------------------
3-이소프로필신나모일구아니딘
히드로클로라이드 089/1 074/3 014/1
(2-브로모신나모일)구아니딘 095/2 072/2 043/2
3-에톡시신나모일구아니딘 100/1 072/3 057/1
(5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘 100/1 072/2 069/1
(2-클로로신나모일)구아니딘 095/2 072/2 040/2
4-에톡시신나모일구아니딘 073/1 069/2 057/1
4-플루오로신나모일구아니딘 100/1 067/3 034/2
3,4-디플루오로신나모일구아니딘 085/1 065/3 042/2
N-(3-페닐프로파노일)-N'-페닐구아니딘 051/1 064/1 000/1
2,4,6-트리메틸신나모일구아니딘 075/2 063/3 062/2
2-메틸신나모일구아니딘 074/2 063/3 053/3
(트랜스-2-페닐시클로프로판카보닐)구아니딘 063/2 022/1
[(E)-3-(4-디메틸아미노페닐)-2-
메틸아크릴로일]구아니딘 059/1
N-벤조일-N'-신나모일구아니딘 056/1
4-페닐벤조일구아니딘 076/1 055/2 071/1
트랜스-3-퓨란아크리오일구아니딘 055/2 018/1
(4-페녹시벤조일)구아니딘 069/1 054/3 040/2
(2-메톡시신나모일)구아니딘 051/1 053/2 024/1
N-아미디노-3-아미노-5-페닐-6-
클로로-2-피라진카복사미드 074/2 052/2 038/1
N-(신나아모일)-N'페닐구아니딘 084/1 048/2 035/1
신나모일구아니딘 095/2 047/2 059/1
3,4-(메틸렌디옥시)신나모일구아니딘 084/1 046/1 019/1
N,N'-비스(아미디노)나프탈렌-2,6-디카복사미드 045/1
2,3-디메틸신나모일구아니딘 073/1 044/2 024/1
5-(3'-브로모페닐)펜타-2,4-
디에노일구아니딘 044/1
N,N'-비스(3-페닐프로파노일)구아니딘 041/1
3-메톡시-아밀로라이드 029/2 039/3 022/2
2,3-디플루오로신나모일구아니딘 036/1
1-나프토일구아니딘 036/1
(3-페닐프로파노일)구아니딘 036/1
6-메톡시-2-나프토일구아니딘 49/3 030/4
5-(N,N-디메틸)아밀로라이드
히드로클로라이드 027/1
2-에톡시신나모일구아니딘 027/1
2-나프토일구아니딘 027/1
3,4,5-트리메톡시신나모일구아니딘 027/1
3-메톡시-HMA 027/1
벤조일구아니딘 026/1
---------------------------------------------------------------------
2-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘 022/1
N-아미디노-3,5-디아미노-6-
피닐-2-피라진카복사미드 022/1
신나모일구아니딘 히드로클로라이드 020/1
(퀴놀린-2-카보닐)구아니딘 015/3 019/3 006/2
(4-히드록시신나모일)구아니딘 019/1
5-(4-플루오로페닐)아밀로라이드 018/1
2-(1-나프틸)아세토일구아니딘 018/1
(2-퓨란아크릴로일)구아니딘 018/1
[3-(3-퓨리딜)아크릴로일]구아니딘 018/1
N-신나모일-N',N'-디메틸구아니딘 015/1
N-(2-나프토일)-N'-페닐구아니딘 011/1
2-(2-나프틸)아세토일구아니딘 009/1
N,N'-비스(3페닐프로파노일)-
N"- 페닐구아니딘 009/1
(페닐아세틸)구아니딘 009/1
실시예 32. 인간 OC43 코로나바이러스
인간 코로나바이러스 OC43 복제에 대한 테스트 화합물의 OC43 항바이러스 분석
인간 코로나바이러스 OC43(ATCC VR-759)의 복제에 있어서, 항바이러스 활성을 가지는 화합물을 결정하기 위해, OC43이 감염된 MRC-5(인간 폐 섬유종; ATCC CCL-171) 세포의 단일층으로부터 배양 상층액으로의 바이러스 N-단백질 분비를 측정하는 ELISA 분석을 개발하였다: 먼저, 바이러스가 작동하는 스톡을 MRC-5 세포에서 증폭에 의해 제조하였다. 이후 이를 사용하여, 6웰 조직 배양판에 컨플루언트 단일층으로 배양한 MRC-5 세포에 약 0.01 pfu/세포의 MOI로 1시간동안 5% 이산화탄소하 35 ℃에서 감염시켰다. 감염성 접종원을 옮기고, 다양한 농도의 화합물 또는 화합물에 사용되는 적정 수준의 용매(대조군)을 포함하는 신선한 배지(10% FCS(fetal calf serum)가 보충된 DMEM)로 교환하였다. 감염후 3-5일동안 35 ℃(5% C02)에서 배양하고, 5000 xg로 10분간 원심분리하여 배양 상층액을 회수하고 세포 파편은 제거하였다. N-항원 검출시, 맑은 배양 상층액을 96웰 Maxi-Sorb 플레이트의 웰에 2세트로 첨가하고, ZPA 완충액 100 ㎕을 웰마다 첨가하여 혼합하고, 플레이트를 덮어 4 ℃에 하룻밤 배양하여 단백질이 플라스틱 웰에 결합할 수 있도록 하였다. 다음날, 코팅액을 버리고, 웰은 PBST로 철저하게 세척한 다음, 1.5시간동안 PBS에 용해된 1% BSA에서 1시간 배양하여 비결합된 단백질 부위를 블롯킹하였다. OC43 N-단백질을 인지하는 항체를 PBS내 1/800 희석액으로 (37 ℃에서 1시간)사용하였고, 이차 항원(염소-항-마우스 알칼라니포스파타제)를 사용하여 색 반응을 발생시켰다. 웰의 광학 밀도를 405 nm에서 측정하고, 용매 대조군의 측정 수치에 대한 화합물 존재시 측정 수치를 비교하여, 화합물의 효과를 결정하였다.
실시예 33: OC43 항바이러스 분석에서의 화합물 효과
실시예 22의 방법에 따라, 화합물의 항-OC43 복제 활성을 스크리닝하였다. 결과는 표 11에 기재되어 있다.
표 11
화합물 | 2.5μM에서 바이러스 저해 |
3-메틸신나모일구아니딘 트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘 (3-브로모신나모일)구아니딘 (2-클로로신나모일)구아니딘 3,4-디클로로신나모일구아니딘 3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘 (트랜스-2-페닐시클로프로판카보닐)구아니딘 4-이소프로필신나모일구아니딘 신나모일구아니딘 6-메톡시-2-나프토일구아니딘 2,4-디클로로신나모일구아니딘 (4-클로로신나모일)구아니딘 5-(N,N-헥사메틸렌)아밀로라이드 (4-브로모신나모일)구아니딘 2,6-디클로로신나모일구아니딘 5-브로모-2-메톡시신나모일구아니딘 (5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘 3-(트리플루오로메톡시)신나모일구아니딘 2-t-부틸신나모일구아니딘 |
100 100 100 96 90 84 71 68 57 47 36 36 30 29 27 24 9 4 4 |
실시예 34. 마우스 간염 바이러스(MHV)
MHV-A59 E 단백질에 해당되는 펩티드의 합성 및 정제
전장 MHV-A59 E 단백질(서열: MFNLFLTDTVWYVGQIIFIFAVCLMVTIIVVAFLASIKLCIQLCGLCNTL VLSPSIYLYDRSKQLYKYYNEEMRLPLLEVDDI; 기탁 번호 NP_068673)에 해당되는 펩티드를 FMOC 화학 합성 및 고상 펩티드 합성으로 기계적으로 합성하였다. 합성은 Protein Technologies Inc. (Woburn, MS, USA)사의 SymphonyR Peptide Synthesiser를 이용하여 제조사의 안내서에 따라, Biomolecular Resource Facility (John Curtin School of Medical Research, ANU, Australia)에서 합성하여, C- 말단을 아미드로 제조하고, 커플링은 N-메틸피롤리돈에 용해된 하이드록시벤조트리아졸과 HBTU를 이용하여 실시하였다. 각 합성 주기에서 이중 커플링 및 4배 많은 아미노산을 사용하였다. 임시적인 알파-N Fmoc- 보호기는 DMF에 용해한 20% 피페리딘으로 제거하였다.
합성 조 펩티드는 제조사의 안내서에 따라 ProteoPlusTM 키트(Qbiogene inc. CA)로 정제하였다. 간단하게 설명하며, 상기 펩티드는 로딩 완충액(loading buffer)(60mM Tris-HCl pH 8.3, 6M 유레아, 5% SDS, 10% 글리세롤, 0.2% 브로모페놀 블루, + 100 mM 베타-머캅토에탄올)로 희석하여 4-20% 농도 구배의 폴리아크릴아미드 젤(Gradipore, NSW, Australia)에서 트리스-글리신 전기영동 완충액(25 mM Tris, 250 mM 글리신, 0.1% SDS)으로 전기영동을 수행하였다. 코드 블루(Promega, NSW)로 펩티드를 염색하고, 전장 펩티드에 해당되는 밴드를 젤에서 적출하였다.
젤 조각을 ProteoPLUSTM 시험관으로 옮기고, 여기에 트리스-글리신 전기영동 완충액을 넣었다. 상기 시험관을 트리스-글리신 전기영동 완충액에 넣고 약 1시간 동안 100 볼트를 가하였다. 1분간 전류 극성을 반대로하여, 단백질 회수량을 증가시켰다. 펩티드를 회수하여 13,000rpm으로 1시간 원심분리하였다. 정제한 펩티드는 Speedvac에서 건조한 후 최종 무게를 수율로 계산하였다.
실시예 35: MHV-E 단백질은 평면 이중 지질막에 이온 채널을 형성한다.
공지된 바에 따라 이중 지질막 실험을 수행하였다(Sunstrom, 1996; Miller, 1986). 팔미토일-2-올레올릴 포스파티딜 에탄올아민: 팔미토일-2-올레올릴 포스파티딜 세린: 팔미토일-2-올레올릴 포스파티딜 콜린 지질 (5 : 3 : 2) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama)을 사용하였다. 지질 혼합물을 1 ml 델린 컵 벽의 150-200 ㎛의 구멍에 페인팅하였다. 구멍은 염 용액을 다른 농도로 포함하고 있는 cis 및 trans의 2가지 챔버로 분리한다. 상기 cis 챔버는 바닥과 연결되어 있고, trans 챔버는 Axopatch 200 증폭기 입력부와 연결되어 있다. cis 챔버는 정상적으로 500 mM NaCI 또는 500mM KCl를 함유하고 있으며, trans는 50 mM NaCI 또는 50mM KCI을 함유하고 있다. 이중막 형성은 전류 램프에 의해 형성되는 전류 펄스 증폭에 의해 전기적으로 모니터하였다. cis에 대한 전위를 trans 챔버에서 측정하였다. 합성 펩티드를 cis 챔버에 가하고 채널 활성이 나타날때까지 교반하였다. 전류는 1000 Hz에서 필터링되었고, 5000 Hz에서 디지털화되었으며, 자기 디스크에 저장하였다.
MHV E 합성 펩티드를 0.05 mg/ml 내지 1 mg/ml으로 2,2,2-트리플루오르에탄올(TFE)에 용해하였다. 이의 10 ㎕을 이중막 장치의 cis 챔버(1 ml 수 부피)에 가하고, 자기 "flea"으로 교반하였다. 이중막에서의 채널 활성을 표시하는 이온 전류는 전형적으로 15-20분 이내에 검출되었다. 전류 검출 이후, 이중막의 홀딩 전위는 -100 mV 내지 +100 mV으로 다양하였으며, 전류 흐름의 크기, 극성을 파악하고 역전위를 결정할 수 있었다.
500 mM NaCl 용액을 포함하고 있는 cis 챔버 및 50 mM NaCl 용액을 포함하는 trans 챔버를 이용한 14번의 실험에서, 채널 활성의 평균적인 역전위가 49 + 1 (SEM) mV로 계산되었다. 500 mM KCl 용액을 포함하고 있는 cis 챔버 및 50 mM KCl 용액을 포함하는 trans 챔버를 이용한 11번의 실험에서, 채널 활성의 평균적인 역전위가 13 + 6(SEM) mV로 계산되었다. 이러한 결과는, MHV E 단백질이 나트륨 이 온에 비해 칼륨 이온에 조금 더 선택적인 양이온 선택적 이온 채널을 형성한다는 것을 의미한다.
도 11은 비대칭성 NaCl 용액(500/50 mM)내 여러 홀딩 전위(trans에 상태적인 cis)에서 MHV E 이온 채널에 대한 가공하지 않은 전류 데이타를 나타낸 것이다. 상기 그래프는 평균 이중막 전류(pA; y-축) 대 홀딩 전류(mV ; x-축)의 전형적인 axis) 도이다.
실시예 36. 화합물은 MHV E 단백질 합성 펩티드의 이온 채널 활성을 저해한다.
테스트 화합물의 MHV E 단백질에 의해 형성된 이온 채널을 차단하거나 또는 저해하는 능력을 확인하기 위해, 화합물을 함유하고 있는 용액의 소량을 펩티드 채널 활성이 재구성된 평면 지질이 있는 수용액에 가하고, 화합물 첨가시의 이온 전류 효과를 측정 및 기록하였다. 화합물의 원액을 DMSO에 500 mM로 용해시킨 형태로 일반적으로 제조하였다. 이 용액을 50% DMSO/50% 메탄올에 50 mM 또는 더 낮은 농도로 추가적으로 희석하고, 적절하게 희석된 화합물 2 ㎕를 목적한 최종 농도로 cis 또는/및 trans 챔버에 넣었다.
도 12에서, 100 μM 신나모일구아니딘을 cis 챔버에 첨가하면 MHV E 이온 채널을 통한 전류 흐름이 매우 감소하였다.
실시예 37. MHV E 단백질 이온 채널 차단 약물을 스클리닝하기 위한, 세균을 이용한 생물학적 분석
MHV E-단백질 이온 채널은 세균의 세포 증식을 저해한다.
세균에서 MHV E-단백질 기능 분석법을 개발하였다. MHV E단백질을 코딩하는 cDNA 합성 단편을 발현 플라스미드인 pPL451에 클로닝하여, 실시예 4에 도시한 바와 같이 E 단백질이 온도 유발에 의해 발현되는 벡터를 제조하였다. 37 ℃에서 E 단백질을 발현하는 E. coli의 증식 저해로 p7 이온 채널 기능의 지표로서 세균 세포에 의해 유지되는 정상적인 나트륨 이온 농도 구배를 흩뜨리는 것으로 관찰되었다.
실시예 38. 세균을 이용한 생물학적 분석으로 MHV E 단백질에 대한 화합물 스크리닝
실시예 14에 기재한 바와 같이, 특정 약물을 적용한 부위의 주변의 할로 증식을 실시예 15와 같이 수치화하였다.
표 12는 세균을 이용한 생물학적 분석에서 MHV E 단백질의 저해 수치를 나타낸다.
표 12
화합물 MHV E 단백질 저해(수치)
4-이소프로필신나모일구아니딘 4.5
3-이소프로필신나모일구아니딘 히드로클로라이드 4.2
4-t-부틸신나모일구아니딘 4.1
3-(트리플루오로메톡시)신나모일구아니딘 4.1
3-t-부틸신나모일구아니딘 4.0
3,4-디클로로신나모일구아니딘 3.8
2,3-디플루오로신나모일구아니딘 3.8
2-t-부틸신나모일구아니딘 3.8
3-페닐신나모일구아니딘 3.7
2-페닐신나모일구아니딘 3.4
5-브로모-2-메톡시신나모일구아니딘 3.3
2-(시클로헥스-1-엔-1-일)신나모일구아니딘 3.3
3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘 2.9
3-(시클로헥스-1-엔-1일)신나모일구아니딘 2.9
트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘 2.8
4-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘 2.8
3-(2-나프틸)아크릴로일구아니딘 2.8
2-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘 2.7
(4-페녹시벤조일)구아니딘 2.4
(3-브로모신나모일)구아니딘 2.4
2,5-디메틸신나모일구아니딘 2.3
5-브로모-2-플루오로신나모일구아니딘 2.1
6-메톡시-2-나프토일구아니딘 1.8
4-페닐벤조일구아니딘 1.8
(4-브로모신나모일)구아니딘 1.8
1-나프토일구아니딘 1.7
(5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘 1.4
(2-브로모신나모일)구아니딘 1.4
(4-클로로신나모일)구아니딘 1.3
2-메틸신나모일구아니딘 1.2
2,6-디클로로신나모일구아니딘 1.2
2,4,6-트리메틸신나모일구아니딘 1.2
5-(N,N-헥사메틸렌)아밀로라이드 1.1
신나모일구아니딘 1.1
신나모일구아니딘 히드로클로라이드 1.1
(a-메틸신나모일)구아니딘 1.0
2,3-디메틸신나모일구아니딘 1.0
2-시클로헥실신나모일구아니딘 0.9
N-(3-페닐프로파노일)-N'-페닐구아니딘 0.8
N,N'-비스(3페닐프로파노일)-N"-페닐구아니딘 0.8
(3-메톡시신나모일)구아니딘 0.8
(2-메톡시신나모일)구아니딘 0.8
3-플루오로신나모일구아니딘 0.8
2-플루오로신나모일구아니딘 0.8
2,4-디클로로신나모일구아니딘 0.8
2-에틸신나모일구아니딘 0.8
(2-클로로신나모일)구아니딘 0.7
(4-히드록신나모일)구아니딘 0.7
2-에틸신나모일구아니딘 0.7
2-나프토일구아니딘 0.6
(트랜스-2-페닐시클로프로판카보닐)구아니딘 0.6
5-(N,N-디메틸)아밀로라이드 히드로클로라이드 0.5
5-(4-플루오로페닐)아밀로라이드 0.5
3-메틸신나모일구아니딘 0.5
(3-클로로신나모일)구아니딘 0.4
4-메틸신나모일구아니딘 0.4
4-에톡시신나모일구아니딘 0.4
2-(1-나프틸)아세토일구아니딘 0.4
3,4-디플루오로신나모일구아니딘 0.4
2-(2-나프틸)아세토일구아니딘 0.4
2,3,5,6,-테트라메틸신나모일구아니딘 0.4
(4-메톡시신나모일)구아니딘 0.3
3,4-(메틸렌디옥시)신나모일구아니딘 0.3
-------------------------------------------------------
3-에톡시신나모일구아니딘 0.3
4-플루오로신나모일구아니딘 0.2
1-브로모-2-나프토일구아니딘 0.2
5-tert-부틸아미노-아밀로라이드 0.1
(3-니트로신나모일)구아니딘 0.1
3,4,5-트리메톡시신나모일구아니딘 0.1
5-(3'-브로모페닐)펜타-2,4-디에노일구아니딘 0.1
실시예 39. 마우스 간염 바이러스(MHV) 복제에 대한 테스트 화합물의 MHV 항바이러스 분석
MHV(MHV-A59: ATCC VR-764)의 복제에 있어서, 항바이러스 활성을 가지는 화합물을 결정하기 위해, MHV가 감염된 L-929(ATCC CCL-a) 세포의 단일층에 형성된 플라그 수 감소를 측정하는 분석을 개발하였다: 먼저, 바이러스가 작동하는 스톡을 NCTC 클론 1469 세포(ATCC CCL-9.1) 세포에서 증폭에 의해 제조하였다. 이후 이를 사용하여, 6웰 조직 배양판에 컨플루언트 단일층으로 배양한 L929 세포에 약 0.01 pfu/세포의 MOI로 1시간동안 5% 이산화탄소하 37 ℃에서 감염시켰다. 감염성 접종원을 옮기고, 다양한 농도의 화합물 또는 화합물에 사용되는 적정 수준의 용매(대조군)을 포함하는 신선한 배지(10% 말 혈청이 보충된 DMEM)로 교환하였다. 감염후 16-24시간동안 37 ℃(5% C02)에서 배양하고, 배양 상층액은 제거하고 세포는 20% 에탄올에 용해한 0.1% 크리스탈 바이올렛 용액으로 10분간 염색하였다. 모든 웰의 플라그 수를 측정하고, 용매 대조군에 대한 플라그 수 감소율을 계산하였다. 측정은 4 세트의 웰에서 2회 실시하였다.
실시예 40. MHV 항바이러스 분석에서의 화합물의 효과
표 13은 본 실험의 결과이다.
화합물 플라크 감소% /실험 수
20μM 10μM 1μM
5-(3'-브로모페닐)펜타-2,4-디에노이구아니딘 N/D 99/2 66/1
5-브로모-2-메톡시신나모일구아니딘 N/D 100/1 66/1
3-페닐신나모일구아니딘 독성 86/2 64/3
2,3-디플루오로신나모일구아니딘 독성 92/3 64/2
3-에톡시신나모일구아니딘 100/1 89/2 58/1
5-(2'-브로모페닐)펜타-2,4-디에노일구아니딘 독성 100/1 57/1
신나모일구아니딘 히드로클로라이드 85/1 72/2 56/1
(2-클로로신나모일)구아니딘 95/2 88/3 53/3
신나모일구아니딘 97/8 88/8 52/7
(4-브로모신나모일)구아니딘 독성/2 98/3 52/3
(2-브로모신나모일)구아니딘 91/2 89/3 52/3
(4-메톡시신나모일)구아니딘 98/4 96/4 51/3
(a-메틸신나모일)구아니딘 81/2 75/3 51/2
3,4-디클로로신나모일구아니딘 91/2 96/1 50/2
2-(시클로헥스-1-엔-1-일)신나모일구아니딘 N/D 97/1 50/1
3,4-디플루오로신나모일구아니딘 독성 97/1 50/1
3-t-부틸신나모일구아니딘 독성 94/3 49/2
2-에톡시신나모일구아니딘 93/2 85/3 48/2
트랜스-3-퓨란아크리오일구아니딘 70/1 65/1 48/1
N-아미디노-3-아미노-5-헥사메틸렌이미노-6-
페닐-2-피라진카복사미드 84/1 52/2 48/1
(2-니트로신나모일)구아니딘 97/1 77/2 47/1
4-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘 97/3 95/3 46/3
3,4-(메틸렌디옥시)신나모일구아니딘 93/3 82/3 45/3
5-(N-메틸-N-이소부틸)아밀로라이드 92/1 85/1 44/2
(4-클로로신나모일)구아니딘 97/2 88/2 43/3
2,4-디클로로신나모일구아니딘 76/1 73/1 43/1
N-(3-페닐프로파노일)-N'-페닐구아니딘 80/1 65/1 43/1
(3-니트로신나모일)구아니딘 95/2 77/3 42/3
2-페닐신나모일구아니딘 N/D 100/1 42/1
4-이소프로필신나모일구아니딘 95/3 93/3 41/3
3-(트리플루오로메톡시)신나모일구아니딘 100/1 90/3 41/2
3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘 98/1 83/1 40/1
(4-니트로신나모일)구아니딘 97/1 75/3 40/3
3-(2-나프틸)아크릴로일구아니딘 93/1 93/1 40/1
4-에톡시신나모일구아니딘 96/1 92/1 40/1
2,6-디클로로신나모일구아니딘 91/1 70/1 40/1
2,5-디메틸신나모일구아니딘 95/3 91/3 39/3
(3-브로모신나모일)구아니딘 95/2 90/3 39/3
(3-클로로신나모일)구아니딘 94/1 86/2 39/2
3-메틸신나모일구아니딘 90/1 88/1 39/1
(3-메톡시신나모일)구아니딘 92/2 87/2 37/3
2-t-부틸신나모일구아니딘 N/D 98/2 37/1
[(E)-3-(4-디메틸아미노페닐)-2-
메틸아크릴로일]구아니딘 56/1 45/1 37/1
N,N'-비스(1-나프토일)구아니딘 58/1 52/2 35/1
3-메톡시-HMA 15/1 31/1 35/1
5-tert-부틸아미노-아밀로라이드 89/4 84/4 34/4
트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘 95/2 86/3 34/3
6-메톡시-2-나프토일구아니딘 88/3 56/3 34/3
2-나프토일구아니딘 67/2 36/2 34/2
2-에틸신나모일구아니딘 96/1 81/2 34/1
2,3-디메틸신나모일구아니딘 95/1 79/2 34/1
N"-신나모일-N,N'-디페닐구아니딘 97/1 72/2 34/1
3-이소프로필신나모일구아니딘 히드로클로라이드 N/D 99/2 32/1
(4-페녹시벤조일)구아니딘 73/1 65/1 32/1
(트랜스-2-페닐시클로프로판카보닐)구아니딘 77/2 64/2 31/2
3-플루오로신나모일구아니딘 100/1 93/2 31/1
5-브로모-2-플루오로신나모일구아니딘 독성 81/2 31/1
N,N'-비스-(신나모일)-N"-페닐구아니딘 16/1 38/2 31/1
3-퀴놀린노일구아니딘 27/1 36/2 30/1
2,4,6-트리메틸신나모일구아니딘 91/2 61/3 27/2
1-브로모-2-나프토일구아니딘 31/1 27/2 27/1
N-아미디노-3,5-디아미노-6-페닐-
2-피라진카복사미드 53/1 39/2 25/1
N-신나모일-N',N'-디메틸구아니딘 92/2 65/3 24/2
(2-메톡시신나모일)구아니딘 90/2 85/2 23/2
2-(2-나프틸)아세토일구아니딘 52/1 20/2 23/1
4-페닐신나모일구아니딘 53/1 36/1 21/3
[3-(3-피리딜)아크릴로일]구아니딘 81/2 73/2 21/2
3,4,5-트리메톡시신나모일구아니딘 84/1 84/1 21/1
4-메틸신나모일구아니딘 93/1 89/1 20/1
4-플루오로신나모일구아니딘 86/1 83/1 20/1
2-메틸신나모일구아니딘 91/1 82/1 20/1
6-브로모-2-나프토일구아니딘 65/1 37/2 19/1
5-(N,N-디메틸)아밀로라이드 히드록클로라이드 42/4 7/4 17/4
(5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘 27/1 24/1 17/1
2-시클로헥실신나모일구아니딘 100/1 74/2 16/1
5-(4-플루오로페닐)아밀로라이드 4/1 25/1 16/1
벤조일구아니딘 22/1 39/2 14/1
N-벤조일-N'-신나모일구아니딘 0/1 0/1 14/1
5-(N,N-헥사메틸렌)아밀로라이드 84/2 89/1 13/2
N-(신나모일)-N'페니구아니딘 83/1 88/1 13/1
(4-히드록시신나모일)구아니딘 19/1 15/1 13/1
2-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘 19/1 15/1 13/1
(퀴놀린-2-카보닐)구아니딘 86/1 84/1 12/1
2-(1-나프틸)아세토일구아니딘 -19/1 02/1 11/1
2-클로로-6-플루오로신나모일구아니딘 100/1 84/2 9/1
N-아미디노-3-아미노-5-페닐-6-클로로-2-
피라진카복사미드 20/1 20/2 9/1
4-페닐벤조일구아니딘 32/1 24/1 5/1
N,N'-비스(2-나프토일)구아니딘 5/1 3/2 3/1
(페닐아세틸)구아니딘 35/1 22/1 3/1
1-나프토일구아니딘 71/3 62/3 2/3
N,N'-비스(3페닐프로파노일)-N"-페닐구아니딘 67/3 40/4 1/3
3-히드록시-5-헥사메틸렌이미노-아밀로라이드 16/1 22/2 1/1
2'4 디클로로벤즈아밀 HCl 12/2 0/3 0/3
2,3,5,6,-테트라메틸신나모일구아니딘 N/D 68/2 0/1
벤즈아밀 히드로클로라이드 0/1 26/1 0/1
6-요오드아밀로라이드 28/1 21/1 0/1
N,N'-비스(아미디노)나프탈렌-2,6-디카복사미드 19/1 16/1 0/1
[(4-클로로페녹시-아세틸]구아니딘 19/1 16/1 0/1
(3-페닐프로파노일)구아니딘 51/1 03/1 0/1
2-플루오로신나모일구아니딘 76/1 73/1
6-브로모-2-나프토일구아니딘 43/1
(2-퓨란아크릴로일)구아니딘 67/2 63/2 -3/2
N-(6-히드록시-2-나프토일)-N'-페닐구아니딘 43/1 39/1 -5/1
아밀로라이드.HCl 21/1 18/1 -5/1
3-(트랜스-헵트-1-엔-1-일)신나모일구아니딘 T/1 23(T)/1 -6/1
3-메톡시-아밀로라이드 60/2 47/3 -7/2
N,N'-비스(3-페닐프로파노일)구아니딘 41/3 30/4 -8/3
3-(시클로헥스-1-엔-1-일)신나모일구아니딘 T/1 2/2 -19/1
실시예 41. 돼지 호흡기 코로나바이러스(PRCV)
돼지 호흡기 코로나바이러스(PRCA)의 복제에 대한 테스트 화합물의 항바이러스 분석
돼지 호흡기 코로나바이러스 복제(ATCC VR-2384)에 대한 화합물의 항바이러 스 활성을 결정하기 위해, PRCV 감염된 ST 세포(돼지 태아 고환 세포주, ATCC CRL-1746)의 단일층에 형성된 플라그 수적 감소를 측정하는 분석법을 개발하였다: 6웰 플레이트에 컨플루언트 ST 세포에 돼지 호흡기 바이러스(PRCV) 균주 AR310의 4차 계대 배양물을 PBS내에 10-1, 50-1 및 10-2의 3가지 희석액으로 감염시켜, 계수하기 위한 플라그 수 범위를 제공하였다. 희석한 바이러스 100 ㎕을 각 웰에 배지 1 ml 내에 첨가하였다. 플레이트는 상온에서 흔들리는 판위에서 1시간 배양하여, 바이러스가 세포에 흡착되도록 하였다. 바이러스 상층액을 옮기고, 1X MEM 중의 1% 시플라그(Seaplaque) 아가로스을 함유하고 있는 웰에 2 ml씩 적층하고, 5% FCS를 각 웰에 첨가하였다. 테스트 화합물을 동일 부피의 화합물/용매가 화합물 각각의 농도로 상층에 첨가될 수 있는 농도로, 동결 스톡의 화합물을 희석함으로써 상층 혼합물에 첨가하였다. 화합물/용매의 부피는 상층 부피의 0.07%를 초과하지 않는다. 화합물 용해에 사용되는 용매는 동일 비율의 DMSO 및 메탄올 혼합물이다. 화합물은 0.l μM, l μM, lO μM 및 20 μM의 4가지 농도로 항플라그 형성력에 대해 실험하였다. 각 농도로 2배수 또는 4배수 실험을 실시하였다.동일 부피의 용매를 상층에 첨가한 경우를, 대조군으로 하였다. 상층은 20분간 상온에서 배치되도록 두었다. 이후 플레이트를 2일간 37 ℃에서 배양하였다. 이후 단일층을 고정하고, 0.5% 메틸렌 블루, 4% 포름알데하이드를 웰당 1 ml씩 첨가하여 상온에서 하룻밤동안 염색하였다. 상층 아가로스 몇 염료는 세척하여 염색 및 고정된 단일층을 가시화하였다.
실시예 42. PRCA 항바이러스 분석에 대한 화합물의 효과
실시예 29의 방법에 따라, 화합물의 항-PRCV 복제 활성을 스크리닝하였다. 표 14는 테스트한 화합물들중 일수의 EC50 수치를 나타낸다.
표 14
화합물 | EC50(μM) |
5-(N,N-헥사메틸렌)아밀로라이드 | 0.06 |
6-메톡시-2-나프토일구아니딘 | 0.04 |
신나모일구아니딘 | 0.08 |
N-(3-페닐프로파노일)-N'페닐구아니딘 | 19 |
3-메틸신나모일구아니딘 | 1.43 |
(3-브로모신나모일)구아니딘 | 11.2 |
(트랜스-2-페닐시클로프로판카보닐)구아니딘 | 17.2 |
트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘 | 19.1 |
2-(2-나프틸)아세토일구아니딘 | 119.6 |
실시예 43. 소 코로나바이러스(BCV)
소 코로나바이러스(BCA)의 복제에 대한 테스트 화합물의 항바이러스 분석
소 코로나바이러스 복제(ATCC VR-874)에 대한 화합물의 항바이러스 활성을 결정하기 위해, BCV 감염된 MDBK 세포(소 신장 세포주, ATCC CRL-22)의 단일층에 형성된 플라그 수적 감소를 측정하는 분석법을 개발하였다: 6웰 플레이트에 컨플루언트 MDBK 세포에 소 바이러스(BCV)의 2차 계대 배양물을 PBS내에 10-3, 5-5 및 10-4의 연속 희석액으로 감염시켜, 계수하기 위한 플라그 수 범위를 제공하였다. 희석한 바이러스 100 ㎕을 각 웰에 배지 1 ml 내에 첨가하였다. 플레이트는 상온에서 흔들리는 판위에서 1시간 배양하여, 바이러스가 세포에 흡착되도록 하였다. 바이러스 상층액을 옮기고, 1X MEM 중의 1% 시플라그(Seaplaque) 아가로스을 함유하고 있는 웰에 2 ml씩 적층하고, 5% FCS를 각 웰에 첨가하였다. 테스트 화합물을 동일 부피의 화합물/용매가 화합물 각각의 농도로 상층에 첨가될 수 있는 농도로, 0.5M 동결 스톡의 화합물을 희석함으로써 상층 혼합물에 첨가하였다. 화합물/용매의 부피는 상층 부피의 0.07%를 초과하지 않는다. 화합물 용해에 사용되는 용매는 동일 비율의 DMSO 및 메탄올 혼합물이다. 화합물은 0.l μM, l μM, lO μM 및 20 μM의 4가지 농도로 항플라그 형성력에 대해 실험하였다. 각 농도로 4배수 실험을 실시하였다. 동일 부피의 용매를 상층에 첨가한 경우를, 대조군으로 하였다. 상층은 20분간 상온에서 배치되도록 두었다. 이후 플레이트를 7일간 37 ℃에서 배양하였다. 이후 단일층을 고정하고, 0.5% 메틸렌 블루, 4% 포름알데하이드를 웰당 1 ml씩 첨가하여 염색하였다.
실시예 44. BCA 항바이러스 분석에 대한 화합물의 효과
실시예 31의 방법에 따라, 화합물의 항-BCV 복제 활성을 스크리닝하였다. 표 15는 테스트한 화합물들중 일수의 EC50 수치를 나타낸다.
표 15
화합물 | EC50(μM) |
(3-브로모신나모일)구아니딘 | 3 |
3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘 | 3 |
6-메톡시-2-나프토일구아니딘 | 9 |
5-(N,N-헥사메틸렌)아밀로라이드 | 9 |
트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘 | 13 |
신나모일구아니딘 | 42 |
(5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘 | 95 |
2-(2-나프틸)아세토일구아니딘 | 99 |
(트랜스-2-페닐시클로프로판카보닐)구아니딘 | 109 |
N-(3-페닐프로파노일)-N'-페닐구아니딘 | 156 |
4-페닐벤조일구아니딘 | 190 |
실시예 45. C형 간염 바이러스
C형 간염 바이러스 P7 단백질의 이온 채널 활성
인공 이중 지질막에서 P7 합성 펩티드의 채널 활성 테스트
C형 감염 바이러스(HCV)의 단백질 P7을 모방하는 펩티드를 하기 아미노산 서열을 가지도록 합성하였다:
ALENLVILNAASLAGTHGLVSFLVFFCFAWYLKGRWVPGAVYAFYGMWPLLLLLLALPQRAYA
공지된 바에 따라 이중 지질막 실험을 수행하였다(Sunstrom, 1996; Miller, 1986). 팔미토일-2-올레올릴 포스파티딜 에탄올아민: 팔미토일-2-올레올릴 포스파티딜 세린: 팔미토일-2-올레올릴 포스파티딜 콜린 지질 (5 : 3 : 2) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama)을 사용하였다. 지질 혼합물을 1 ml 델린 컵 벽의 150-200 ㎛의 구멍에 페인팅하였다. 구멍은 염 용액을 다른 농도로 포함하고 있는 cis 및 trans의 2가지 챔버로 분리한다. 상기 cis 챔버는 바닥과 연결되어 있고, trans 챔버는 Axopatch 200 증폭기 입력부와 연결되어 있다. cis 챔버는 정상적으로 500 mM KCI을 함유하고 있으며, trans는 50 mM KCI을 함유하고 있다. 이중막 형성은 전류 램프에 의해 형성되는 전류 펄스 증폭에 의해 전기적으로 모니터하였다. cis에 대한 전위를 trans 챔버에서 측정하였다. 합성 펩티드를 cis 챔버에 가하고 채널 활성이 나타날때까지 교반하였다. 전류는 1000 Hz에서 필터링되었고, 2000 Hz에서 디지털화되었으며, 자기 디스크에 저장하였다. P7 펩티드를 10 mg/ml로 2,2,2-트리플루오르에탄올(TFE)에 용해하였다. 이의 10 ㎕을 교반한 이중막 장치의 cis 챔버에 가하였다. 채널 활성은 15-20분 이내에 검출되었다.
P7 펩티드를 cis 챔버에 가하여 교반한 경우, 채널 활성이 표시되었다. trans 챔버내 전위는 -80 mV이었고, 전류는 감소되었다. 전류는 이들 용액에서 칼륨 평형 전취에 가까운 +50 mV에서 역위되었으며, 이는 상기 채널이 양이온 선택적임을 의미한다. 열린 채널의 피크 진폭은 1.7 pA이며 이는 약 14 pS의 채넌 전도성이다. 대부분의 실험들에서, "단일 채널"은 P7 단백질의 응집으로 인해 추측컨대 크기가 매우 크다. 전류는 약 +40 mV에서 역위된다. 일부 실험들에서는, cis 챔버내 용액은 150 mM KCl이고 trans 챔버는 15 mM KCl이었다. P7 펩티드는 다시 역위된 전류를 발생시킨다.
양쪽 챔버가 NaCl를 함유하는 경우에서 동일한 결과가 나온다. cis 챔버가 500 mM NaCl을 포함하고 trans 챔버가 50 mM NaCl을 포함하는 경우에서 전류가 나타났다. 다시 전류는 Na+ 평형 전위에 가까운 +40 내지 +60 mV에서 역위되었으며, 이러한 사실은 상기 채널이 K+보다는 Na+이 매우 더 투과적임을 의미한다.
P7 펩티드로 형성된 채널은 5-(N,N-헥사메틸렌)아밀로라이드(HMA)에 의해 차단된다.
P7 단백질 첨가는 채널 활성을 발생시킨다. cis 챔버에 50 μM HMA 2 ㎕를 가하여 교반하면 채널 활성이 소실된다. 100 μM HMA를 이용한, P7 펩티드 채널 활성 차단이 4번의 실험에서 확인되었다. 2번의 실험에서, 나트륨 채널(500/50)이 500 μM HMA에 의해 차단되었다.
cis 챔버(K 용액)에 10 mM CaCl2을 가하면, P7 펩티드에 의해 형성된 전류의 역전위가 보다 (-) 전위로 이동하여 PK/PCl 비율이 감소된다.
cis 챔버에 500 mM CaCl2이, trans 챔버에 50 mM CaCl2이 함유된 경우, (=) 및 (-) 전류가 약 +20 mV 주변 전위에서 확인되며, 역 전위는 검출되지 않았다.
실시예 46. HCV p7 단백질의 재조합 발현
HCV-1ap7 단백질의 아미노산 서열에 해당되는 동일한 폴리펩티드를 각각 코딩하는 2개의 cDNA 단편을 GeneScript에서 산업적으로 합성하였다. 상기 2개의 cDNA는 핵산 서열이 상이하며, 하나의 cDNA("cDp7.coil")는 E.coli에서 p7 단백질을 발현하기 위해 최적화된 코돈이고, 다른 cDNA("cD7.mam")은 포유류 세포주에서 발현시키기 위한 코돈이다. cDp7. coli는 E.coli에서 발현시키기 위해, BamHI/EcoRI 단편으로, 플라스미드 pPL451에 클로닝하였다. cDp7.mam는 포유류 세포주에서 p7을 발현시키기 위해 벡터(예, pcDNA3.1 백시니아 바이러스, pfastBac-1)에 클로닝하였다.
실시예 47. Gag VLP 출아(budding) 강화에 있어서의 p7 기능
배양한 HeLa 세포로부터 바이러스계 입자(VLP)의 출아는 세포에서의 레트로바이러스의 Gag 단백질의 발현으로부터 초래되며, 작은 바이러스 이온 채널, 예컨대 M2, Vpu 및 6K과 Gap 단백질의 공동-발현은 출아를 강화한다. 흥미로운 사실은, 바이러스 이온 채널이 이종적인 바이러스 입자의 출아를 강화할 수 있다는 것이다. 따라서, p7에 의한 출아 강화를 분석하기 위해, HeLA 세포에서 HIV-1 Gag 단백질과 함께 발현시키고, VLP의 배양액으로의 분비를 Gag ELISA로 측정하였다. 이를 위해, 플라스미드 pcDNAp7(pc DNA3. 1= pcDp7.mam 실시예 20, T7 프로모터의 통제하에 p7 발혐됨) 및 pcDNAGag(HIV-1 Gag 단백질은 T7 프로모터의 통제하에 발현됨)를 백시니아 바이러스 균주 vTF7.3(T7 RNA 중합효소를 발현)으로 감염된 HeLa 세포에 형질감염시키고, 배양 상층액을 모아 16시간 배양후 ELISA 분석을 실시하였다.
실시예 48. 화합물의 p7 이온 채널의 기능적 활성 저해력 분석
실시예 33-35에 개시된 p7 이온 채널의 기능적 활성을 검출하는 두가지 방법을 사용하여, 화합물의 p7 채널 저해력을 분석하였다. 실시예 33에서, 화합물은 평면 이중 지질막에서의 p7 채널 활성 저핼력에 대해 실험하였다. 실시예 35에서는, p7 및 HIV-1 Gag를 발현하는 세포로부터 분리된 VLP 수의 감소 능력을 화합물에서 테스트하였다.
실시예 49. 잠재적인 HCV p7 단백질 이온 채널 차단 약물을 스크리닝하기 위한 세균을 이용한 생물학적 분석법
실시예 14에 기재한 바와 같이, 특정 약물을 적용한 부위의 주변의 할로 증식을 실시예 15와 같이 수치화하였다.
표 16은 세균을 이용한 생물학적 분석에서 HCV p7 단백질의 저해 수치를 나타낸다.
표 16
화합물 HCV p7 단백질 저해
(수치/실험 수)
2,3-디메틸신나모일구아니딘 3.88/2
2,4,6-트리메틸신나모일구아니딘 3.75/1
5-브로모-2-플루오로신나모일구아니딘 3.73/6
(4-브로모신나모일)구아니딘 3.47/4
2,5-디메틸신나모일구아니딘 3.43/4
3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘 3.34/3
4-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘 3.33/5
6-메톡시-2-나프토일구아니딘 3.33/3
(2-클로로신나모일)구아니딘 3.31/6
(4-클로로신나모일)구아니딘 3.16/4
(2-브로모신나모일)구아니딘 3.00/3
2,6-디클로로신나모일구아니딘 3.00/3
(3-브로모신나모일)구아니딘 2.92/3
(3-클로로신나모일)구아니딘 2.75/3
2-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘 2.63/3
(4-페녹시벤조일)구아니딘 2.63/1
3,4-디클로로신나모일구아니딘 2.59/3
4-이소프로필신나모일구아니딘 2.51/2
트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘 2.44/2
4-t-부틸신나모일구아니딘 2.42/2
2-t-부틸신나모일구아니딘 2.36/2
2-에틸신나모일구아니딘 2.36/2
4-메틸신나모일구아니딘 2.32/2
5-브로모-2-메톡시신나모일구아니딘 2.32/2
3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘 2.26/2
2-시클로헥실신나모일구아니딘 2.26/2
1-나프토일구아니딘 2.25/1
3-t-부틸신나모일구아니딘 2.23/2
4-페닐벤조일구아니딘 2.19/2
(5-페닐-펜타-2,4-디에놀)구아니딘 2.13/1
N-(신나모일)-N'-페닐구아니딘 2.13/1
3-이소프로필신나모일구아니딘 히드로클로라이드 2.00/1
벤즈아밀 히드로클로라이드 2.0/1
N-(3-페닐프로파노일)-N'-페닐구아니딘 2.0/1
N,N'-비스(3페닐프로파노일)-N"-페닐구아니딘 2.0/1
3-(2-나프틸)아크릴로일구아니딘 1.93/2
5-(N-메틸-N-이소부틸)아밀로라이드 1.88/1
2"4 디클로로벤즈아밀 HCl 1.88/1
5-tert- 부틸아미노-아밀로라이드 1.88/1
5-(N-에틸-N-이소프로필)아밀로라이드 1.88/1
(4-메톡시신나모일)구아니딘 1.88/1
4-플루오로신나모일구아니딘 1.86/1
(3-니트로신나모일)구아니딘 1.71/1
4-에톡시신나모일구아니딘 1.63/1
(4-히드록시신나모일)구아니딘 1.63/1
(트랜스-2-페닐시클로프로판카보닐)구아니딘 1.63/1
3-에톡시신나모일구아니딘 1.63/1
2,3,5,6,-테트라메틸신나모일구아니딘 1.51/2
4-페닐신나모일구아니딘 1.5/1
트랜스-3-퓨란아크리오일구아니딘 1.38/1
N-(6-히드록시-2-나프토일)-N'-페닐구아니딘 1.38/1
(2-퓨란아크릴로일)구아니딘 1.38/1
3-(시클로헥스-1-엔-1-일)신나모일구아니딘 1.32/2
신나모일구아니딘 히드록클로라이드 1.32/2
5-(N,N-헥사메틸렌)아밀로라이드 1.28/4
2,3-디플루오로신나모일구아니딘 1.24/1
2-(1-나프틸)아세토일구아니딘 1.14/1
(a-메틸신나모일)구아니딘 1.14/1
(2-니트로신나모일)구아니딘 1.14/1
6-요오드아밀로라이드 1.13/1
3,4-(메틸렌디옥시)신나모일구아니딘 1.13/1
2-에톡시신나모일구아니딘 1.00/1
신나모일구아니딘 1.00/1
2-페닐신나모일구아니딘 1.00/1
2-(시클로헥스-1-엔-1-일)신나모일구아니딘 1.00/1
2-나프토일구아니딘 1.0/3
3-페닐신나모일구아니딘 1.0/1
5-(N,N-디메틸)아밀로라이드 히드록클로라이드 1.0/1
5-(4-플루오로페닐)아밀로라이드 1.0/1
(3-메톡시신나모일)구아니딘 1.0/1
2-플루오로신나모일구아니딘 1.0/1
5-(3'-브로모페닐)펜타-2,4-디에노일구아니딘 1.0/1
[(4-클로로페녹시-아세틸]구아니딘 1.0/1
(3-페닐프로파노일)구아니딘 1.0/1
2-클로로-6-플루오로신나모일구아니딘 0.88/1
3-플루오로신나모일구아니딘 0.86/1
2-메틸신나모일구아니딘 0.75/1
(2-메톡시신나모일)구아니딘 0.75/1
1-브로모-2-나프토일구아니딘 0.75/1
3,4,5-트리메톡시신나모일구아니딘 0.71/1
3-메틸신나모일구아니딘 0.63/1
3-(트랜스-헵트-1-엔-1-일)신나모일구아니딘 0.50/1
아밀로이드. HCl 0.5/2
펜아밀 메탄네설포네이트 염 0.5/1
2,4-디클로로신나모일구아니딘 0.38/1
(4-니트로신나모일)구아니딘 0.25/1
3,4-디플루오로신나모일구아니딘 0.13/1
[(E)-3-(4-디메틸아미노페닐)-2-
메틸아크릴로일]구아니딘 0.03/4
실시예 51. 말 동맥염 바이러스(EAV)
말 동맥염 바이러스(EAV)의 복제에 대한 테스트 화합물의 항바이러스 분석
말 동맥염 바이러스 복제(ATCC VR-796)에 대한 화합물의 항바이러스 활성을 결정하기 위해, EVA 감염된 BHK-21 세포(ATCC CRL-10)의 단일층에 형성된 플라그 수적 감소를 측정하는 분석법을 개발하였다: 바이러스 스톡을 RK-13 세포(ATCC CCL-37)에서 증폭시키고, 6웰 플레이트에서 배양한 컨플루언트 BHK-21 세포의 단일층에, 상기 바이러스를 MOI 5 x 10-3 pfu/세포로 37 ℃, 5% 이산화탄소 조건에서 1시간동안 노출시켜 감염시켰다. 감염성 접종원을 옮기고, (10% FCS(fetal calf serum)를 함유하는 MEM 및 10, 5 또는 1 μM 농도의 화합물 또는 화합물에 사용되 는 적정 수준의 용매(대조군)엣, 1% 시플라그 상층(Cambrex Bio Science)로 세포를 적층하였다. 감염후 3일동안 37 ℃(5% C02)에서 배양하고, 배양 상층액은 제거하고, 세포는 20% 에탄올에 용해한 0.1% 크리스탈 바이올렛 용액으로 10분간 염색하였다. 모든 웰의 플라그 수를 측정하고, 용매 대조군에 대한 플라그 수 감소율을 계산하였다. 측정은 4 세트의 웰에서 2회 실시하였다.
실시예 52. EAV 항바이러스 분석에 있어서 화합물의 효과
실시예 35의 방법에 따라, 화합물의 항-EAV 복제 활성을 스크리닝하였다. IC50으로 나타낸 결과는 표 17에 기재되어 있다.
표 17
화합물 | IC50 |
5-(N,N-헥사메틸렌)아밀로라이드 | 7.5 μM |
(3-브로모신나모일)구아니딘 | 10 μM |
트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘 | 7.5 μM |
2-t-부틸신나모일구아니딘 | 1 μM |
2-(시클로헥스-1-엔-1-일)신나모일구아니딘 | 10 μM |
실시예 53. 뎅기열 플라비바이러스(Dengue Flavivirus)
뎅기열 바이러스 M 단백질의 펩티드 합성
뎅기열 바이러스 1형 균주인 Singapore S275/90(Fu et al1992)의 M 단백질의 C-말단의 40개 아미노산들(ALRHPGFTVIALFLAHAIGTSTQKGHFILLMLVTPSMA)을 FMOC 화학 합성으로 합성하였다. 합성은 Protein Technologies Inc. (Tucson, Arizona)사의 SymphonyR Peptide Synthesiser상에서 이루어졌으며, C- 말단을 아미드로 제조하고, 커플링은 N-메틸피롤리돈에 용해된 하이드록시벤조트리아졸과 HBTU를 이용하여 실시하였다. 각 합성 주기에서 이중 커플링 및 4배 많은 아미노산을 사용하였다. 임 시적인 알파-N Fmoc- 보호기는 DMF에 용해한 20% 피페리딘으로 제거하였다.
실시예 54. 뎅기열 M 바이러스 단백질의 이중 지질막으로의 병합
공지된 바에 따라 이중 지질막 실험을 수행하였다(Sunstrom, 1996; Miller, 1986). 팔미토일-2-올레올릴 포스파티딜 에탄올아민: 팔미토일-2-올레올릴 포스파티딜 세린: 팔미토일-2-올레올릴 포스파티딜 콜린 지질 (5 : 3 : 2) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama)을 사용하였다. 지질 혼합물을 1 ml 델린 컵 벽의 150-200 ㎛의 구멍에 페인팅하였다. 구멍은 염 용액을 다른 농도로 포함하고 있는 cis 및 trans의 2가지 챔버로 분리한다. 상기 cis 챔버는 바닥과 연결되어 있고, trans 챔버는 Axopatch 200 증폭기 입력부와 연결되어 있다. cis 챔버는 정상적으로 500 mM KCl를 함유하고 있으며, trans는 50 mM KCI을 함유하고 있다. 이중막 형성은 전류 램프에 의해 형성되는 전류 펄스 증폭에 의해 전기적으로 모니터하였다. cis에 대한 전위를 trans 챔버에서 측정하였다. 합성 펩티드를 cis 챔버에 가하고 채널 활성이 나타날때까지 교반하였다. 전류는 1000 Hz에서 필터링되었고, 5000 Hz에서 디지털화되었으며, 자기 디스크에 저장하였다.
뎅기열 바이러스 M 단백질의 C-말단 펩티드(DMVC)를 0.05 mg/ml 내지 1 mg/ml으로 2,2,2-트리플루오르에탄올(TFE)에 용해하였다. 이의 10 ㎕을 이중막 장치의 cis 챔버(1 ml 수 부피)에 가하고, 교반하였다. 채널 활성은 15-20분 이내에 검출되었다.
실시예 55. 뎅기열 바이러스 M 단백질의 C-말단 펩티드의 이온 채널 활성 저해하기 위한 헥사메틸렌 아밀로라이드(HMA)
먼저 DMSO중의 500 mM 용액 제조에 의해 50 mM HMA 용액을 제조하였다. 상기 용액은 0.1 M HCl을 이용하여 50 mM HMA로 희석하였다. 채널 활성을 확인한 후 50 mM HMA의 2 ㎕을 cis 챔버에 첨가하였다. 상기 cis 챔버는 HMA의 최종농도가 100 μM인 용액 1 ml을 함유하고 있다.
실시예 56. 화합물의 세포증식(cytoproliferation)에 대한 뎅기열 플라비바이러스 효과에 대한 항바이러스 분석
레서스 마카퀴(rhesus macaque) 원숭이의 신장 세포인 LLC-MK2의 증식에 대한 뎅기열 바이러스 감염 효과를 측정하는 세포증식 분석을 이용하여, 뎅기열 1 균주 Hawaii에 대한 저해 활성을, 화합물 10, 5, 2. 5, 1.25 및 0.625 μM 농도에서 실험하였다. 감염된 배양물에서의 세포 증식이 비감염된 대조군에 비해 현저히 감소되게 적정된, 미리 결정된 함량의 바이러스로 LLC-MK2 세포를 감염시켰다. 감염 세포를 96웰 플레이트에 1.5 x 103 세포로 배양하였다. 음성 대조군(바이러스 무첨가, 테스트 화합물 무첨가), 양성 대조군(바이러스 유, 테스트 화합물 무) 및 세포독성 대조군(테스트 화합물 유, 바이러스 무)을 각 약물 분석에 함께 실시하였다. 7일간 배양하고, 배양물의 대사를 측정하는(환원/산화) 형광 염료인 알라마르 블루를 각 배양물에 가하여 형광 수치를 측정하였다. 테스트 화합물 및 바이러스가 없는 음성 대조군을 100%로 고정하였다. 양성 대조군 및 화합물을 첨가한 배양물은, 이들의 평균 형광성을 음성 대조군에 대한 %로 게산하여, 수치화하였다. 각 조건마다 적어도 6개 이상의 리플리케이트 웰을 측정하였다.
실시예 57. 화합물의 뎅기열 항바이러스 분석에 대한 효과
표 18
약물 | 약물 농도, μM | 음성 대조군에 대한 항바이러스 % |
신나모일구아니딘 | ||
음성 대조군 | 0 | 적용 안함 |
양성 대조군 | 0 | 76.5% |
10 | 17.1% | |
5 | 38.6% | |
2.5 | 58.3% | |
1.25 | 72.6% | |
0.625 | 76.6% | |
(2-클로로신나모일)구아니딘 | ||
음성 대조군 | 0 | 적용 안함 |
양성 대조군 | 0 | 80.3% |
10 | 8.4% | |
5 | 7.7% | |
2.5 | 22.7% | |
1.25 | 52.5% | |
0.625 | 64.3% | |
트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘 | ||
음성 대조군 | 0 | 적용 안함 |
양성 대조군 | 0 | 80.4% |
10 | 6.8% | |
5 | 12.45 | |
2.5 | 38.7% | |
1.25 | 73.7% | |
0.625 | 77.7% |
실시예 58. 세균 분석 및 항바이러스 분석간의 파지티브 상관성
실시예 58.1 Vpu 세균 분석 및 항-HIV-1 실험결과간의 파지티브 상관성
상관성 실험은 Vpu 세균 분석으로 확정된 테스트 화합물의 활성치와 이들 화합물의 항바이러스 분석에서 HIV-1 저해력 간의 상관성을 측정하기 위해 수행하였다.
실시예 58.2 방법
여러가지 치환된 아실구아니딘을 대표하는 12개의 화합물에 대한 p24-항원 결과를 Vpu 세균 분석에서 수득한 활성치와 비교하였다. 각 분석 결과치는 유효 순위로 등급을 매겼다. Vpu 세균 분석의 순위는 활성치로부터 결정하였고, 최대 값은 가장 효과적임을 나타낸다. 항-HIV-1 분석의 순위는 실험 약물의 모든 농도에서, 배양 상층물에서 측정된 p24 항원의 전체 평균값을 기준으로 결정하였고, 최소값은 가장 효과적임을 나탄낸다. 두개의 순위는, 스피어만의 순위 상관계수를 구하여 통계학적으로 비교하였다.
실시예 58.3 결과 및 고찰
통계 표의 임계값(critical value)(n=12) 비교에 의한, 스피어만의 상관계수는 0785이었으며, 이는, 두가지 순위는 유의적으로 파지티브 상관성이 있음을 의미한다(P<0.01)(표 19a).
또한, 항바이러스 결과치가 적어도 1차 이상의 p24 감소를 나타내는 것인지에 대한, O/X 값을 이용한 Vpu 세균 분석 등급 순위의 여러 분석으로, 세균 분석에 의해 상위 6개의 화합물을 이용하여 "O"인 화합물 그룹을 정렬하였다(펴 19b).
이러한 결과는 세균 분석과 항바이러스 분석간에 파지티브 상관성이 있음을 나타내는 것이다. 따라서 세균 분석은 항바이러스 활성을 나타내는 화합물 스크리닝에 유용한 방법일 수 있다.
표 19a. Vpu 세균 분석 및 항-HIV 분석에서 12개의 치환된 아실구아니딘의 효과에 대한 비교 순위
화합물 | 세균분석 순위 | p24 순위 | di^2 |
(3-브로모신나모일)구아니딘 | 1 | 1 | 0 |
3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘 | 2 | 2 | 0 |
3-메틸신나모일구아니딘 | 3 | 3 | 0 |
신나모일구아니딘 | 4 | 4 | 0 |
트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘 | 5.5 | 7 | 2.25 |
6-메톡시-2-나프토일구아니딘 | 5.5 | 5 | 0.25 |
4-페닐벤조일구아니딘 | 7 | 11 | 16 |
(5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘 | 8 | 9 | 1 |
N-(3-페닐프로파노일)-N'-페닐구아니딘 | 9 | 12 | 9 |
헥사메틸렌 아밀로라이드 | 10 | 6 | 16 |
2-(2-나프틸)아세토일구아니딘 | 11 | 10 | 1 |
(트랜스-2-페닐시클로프로판카보닐)구아니딘 | 12 | 8 | 16 |
합계 di^2 | 61.5 | ||
스피어만 상관계수 | 0.785 | ||
P값 | >0.01 |
표 19b
화합물, p24 순위로 도열 | Vpu 세균 값 | 세균분석 순위 | p24 분석시 적어도 1x log 감소가 보이는지? |
(3-브로모신나모일)구아니딘 | 4.3 | 1 | O |
3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘 | 3.7 | 2 | O |
3-메틸신나모일구아니딘 | 3.4 | 3 | O |
신나모이구아니딘 | 3.0 | 4 | O |
트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘 | 2.9 | 5.5 | O |
6-메톡시-2-나프토일구아니딘 | 2.9 | 5.5 | O |
4-페닐벤조일구아니딘 | 2.8 | 7 | X |
(5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘 | 2.6 | 8 | X |
N-(3-페닐프로파노일)-N'-페닐구아니딘 | 2.2 | 9 | X |
헥사메틸렌 아밀로라이드 | 1.9 | 10 | X |
2-(2-나프틸)아세토일구아니딘 | 1.2 | 11 | X |
(트랜스-2-페닐시클로프로판카보닐)구아니딘 | 0.4 | 12 | X |
실시예 58.4. MHV 플라그 형성 저해율 및 MHV-E 세균을 이용한 생물학적 분석 수치 사이의 상관성
마우스 간염 바이러스의 E 단백질의 세균을 이용한 생물학적 분석에서 확인된 화합물의 활성치와 마우스 간염 바이러스 플라그 분석에서 상기 화합물에 의해 나타난 저해율% 사이에 파지티브 상관성이 확인되었다.
실시예 58.5. 방법
최대에서 최소 플라그 감소%로 스크리닝한 96개의 화합물에 대한 MHV 플라그 감소 활성을 분류하였고, 순위를 화합물 리스트에 표시하였다. 화합물 10 μM 및 1 μM 농도에 노출하였을때 얻어진 결과로 수행하였고, 2가지 순위 리스트를 만들었다. 이와 유사하게, 동일한 96개의 화합물의 MHVE 세균성 생물학적 수치에 대한 순위 리스트를 만들었다. 1종 이상의 화합물이 동일한 수치를 가지는 경우, 순위는 그룹의 평균으로 나타내었다.
스피어만의 통계학적 테스트["Mathematical Statistics with Applications' (2nd edn) : Mendenhall, W., Scheaffer, RL., & Wackerly, DD. Duxbury Press, Boston Massachusetts-1981]를 사용하여, 순위를 비교하였다. 즉, 각 화합물에 대한 순위 사이의 차이점의 자승합(Sum of square)(SS)을 계산하고, 스피어만의 순위 상관계수(Rs)를 식: Rs = 1-(6.SS/n(n2-1))로 구하였으며, 상기 n은 순위를 매긴 화합물의 갯수이다(이경우는 96). Rs는 통계학적 유의성(P값)을 결정하기 위해 임계값(critical value)과 비교하였다.
실시예 58.6 결과 요약
표는 순위들 사이의 비교 결과인 Rs 및 R 값을 나타낸다.
표 20
비교 | Rs | P | + 상관성 | |
10 μM에서 플라그 | 1 μM에서 플라그 | 0.689 | >99.5 | O |
세균 | 10μM에서 플라그 | 0.444 | >99 | O |
1μM에서 플라그 | 0.406 | >98.5 | O | |
무작위 수서 | -0.382 | n/s | X |
실시예 58.7. 결론:
세균을 이용한 생물학적 분석 및 항바이러스 분석으로 분석된. 96개의 화합물의 순위 비교는, 테스트 화합물에 대한 MHVE 세균 분석 순위가 MHV 플라그 감소 분석으로 구한 순위와 유의적으로 파지티브 상관성이 있음을 나타낸다. 상기 분석들간의 유의적인 상관성은 유용할 수 있는 화합물 동정에 상기 2가지 분석을 활용할 수 있음을 나타낸다. 세균 분석은 따라서, 항바이러스 활성을 나타내는 화합물 스크리닝에 유용한 방법일 수 있다.
실시예 58.8. 229E 플라그 형성의 저해% 및 229E-E 세균성 생물학적 분석 수치간의 상관성
인간 코로나바이러스 229E E 단백질의 세균을 이용한 생물학적 분석에서 확인된 화합물의 활성치와 인간 코로나바이러스 229E 플라그 분석에서 상기 화합물에 의해 나타난 저해율% 사이에 파지티브 상관성이 확인되었다.
실시예 58.9. 방법
스크리닝한 2.5 μM 농도에서 스크리닝한 97개의 화합물에 대한 229E 플라그 감소 활성은 최대에서 최소 플라그 감소%로 분류하였고, 순위를 화합물 리스트에 표시하였다. 이와 유사하게, 동일한 97개의 화합물의 229E E 세균성 생물학적 수치에 대한 순위 리스트를 만들었다. 1종 이상의 화합물이 동일한 수치를 가지는 경우, 순위는 그룹의 평균으로 나타내었다.
스피어만의 통계학적 테스트["Mathematical Statistics with Applications' (2nd edn) : Mendenhall, W., Scheaffer, RL., & Wackerly, DD. Duxbury Press, Boston Massachusetts-1981]를 사용하여, 순위를 비교하였다. 즉, 각 화합물에 대한 순위 사이의 차이점의 자승합(Sum of square)(SS)을 계산하고, 스피어만의 순위 상관계수(Rs)를 식: Rs = 1-(6.SS/n(n2-1))로 구하였으며, 상기 n은 순위를 매긴 화합물의 갯수이다(이경우는 97). Rs는 통계학적 유의성(P값)을 결정하기 위해 임계값과 비교하였다.
실시예 58.9.1. 결과 요약
표는 순위들 사이의 비교 결과인 Rs 및 R 값을 나타낸다.
표 21
비교 | Rs | P | + 상관셩 | |
2.5μM에서 플라그 | 세균 | 0.584 | >99.5 | O |
무작위 | -0.382 | n/s | X |
상기 결과는, 테스트 화합물의 229E 세균 분석 순위는 229E 플라그 감소 분석으로 구한 순위와 유의적으로 파지티브 상관성이 있음을 나타낸다. 실시예 49.1 및 49.4의 결과와 종합하면, 2가지 분석이 유용할 수 있는 화합물 동정에 활용될 수 있다는 강력한 증거를 제공한다. 세균 분석은 따라서 항바이러스 활성을 나타내는 화합물 스크리닝에 유용한 방법일 수 있다.
당업자는 명세서에 개시된 본 발명이 구체적으로 개시된 내용 이외로 변형 및 수정가능함을 이식할 것이다. 본 발명은 모든 변형 및 수정을 포함하는 것으로 이해된다. 또한 본 발명은 개별적으로 또는 종합적으로 본 명세서에 언급되거나 또는 개시된 단계, 구성, 조성물 및 화합물 모두와, 임의의 두가지 이상의 상기 단계 또는 구성의 임의 및 모든 조합을 포함하다.
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Claims (168)
- 식 I의 항바이러스 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:상기에서, R1은R2, R3 및 R4는 독립적으로 수소,X는 수소, 하이드록시, 니트로, 할로, C1-6 알킬, C1-6 알킬옥시, C3-6 사이클로알킬, 할로 치환된 C1-6 알킬, 할로 치환된 C1-6 알킬옥시, 페닐, C3-6 사이클로알켄일, 또는 C1-6 알켄옥시 이고;Rd, Re, Rf, Rh, Rk, RL, Rm 는 독립적으로, 수소,할로, C1-5 알킬, C1-5 알킬옥시, 하이드록시, 모노알킬 치환된 아미노, 다이알킬 치환된 아미노, 또는 이고;Rg, Ri는 독립적으로 수소, 또는 C1-5 알킬이고;R1이 C6H5CH=CH이고 R2가 수소이고 R3이 페닐이면, R4는 페닐일 수 없으며;R1이 페닐이고 R2가 수소이고 R3이 벤조일이면, R4는 벤조일일 수 없으며;R1이 페닐이고 R2가 벤질이고 R3이 수소이고 R4가 수소이면, Rn, Ro 및 Rp 모두는 수소일 수 없으며;R1이 페닐이고 R3이 수소이고 R4가 수소이면, R2는 벤질 또는 페닐일 수 없으며;R1이 페닐이고 R2가 수소이면, R3은 벤조일로서 R4와 함께 페닐일 수 없으며;R1이 페닐이고 R2가 수소이면, R3 및 R4는 모두 벤질일 수 없으며,
- 아래 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항바이러스 화합물:2-나프토일구아니딘,N-(2-나프토일)-N'-페닐구아니딘,N,N'-비스(2-나프토일)구아니딘,3-퀴놀리노일구아니딘,신나모일구아니딘,N-(신나모일)-N'페닐구아니딘,N,N'-비스-(신나모일)-N''-페닐구아니딘,N-(3-페닐프로파노일)-N'-페닐구아니딘,N,N-비스(3페닐프로파노일)-N''-페닐구아니딘,트랜스-3-퓨란아크리오일구아니딘,N-(6-하이드록시-2-나프토일)-N'-페닐구아니딘,N,N'-비스(아미디노)나프탈렌-2,6-디카르복사미드,(페닐아세틸)구아니딘,N,N'-비스(3-페닐프로파노일)구아니딘,벤조일구아니딘,(4-클로로페녹시-아세틸)구아니딘,N-벤조일-N'-신나모일구아니딘,[(E)-3-(4-디메틸아미노페닐)-2-메틸아크릴로일]구아니딘,(4-클로로신나모일)구아니딘,(4-브로모신나모일)구아니딘,(4-메톡시신나모일)구아니딘,(5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘,(3-브로모신나모일)구아니딘,(3-메톡시신나모일)구아니딘,(3-클로로신나모일)구아니딘,(2-클로로신나모일)구아니딘,(2-브로모신나모일)구아니딘,(2-메톡시신나모일)구아니딘,[3-(3-피리딜)아크릴로일]구아니딘,(4-하이드록시신나모일)구아니딘, 및(퀴놀린-2-카르보닐)구아니딘.
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- 제1항 또는 제2항에 따른 화합물을 포함하는,바이러스에 감염되었거나 노출된 세포에서 바이러스의 성장, 복제, 또는 성장 및 복제의 감소, 지연 또는 억제용;바이러스에 노출된 세포의 감염 예방용; 또는바이러스로 감염된 세포에서 막 이온 채널의 기능적 활성 하향 조절용,약학적 조성물.
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- 제5항에 있어서, 상기 바이러스는 렌티바이러스인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 렌티바이러스는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:(3-클로로신나모일)구아니딘,(3-브로모신나모일)구아니딘,(2-클로로신나모일)구아니딘,(2-브로모신나모일)구아니딘,3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,5-브로모-2-플루오로신나모일구아니딘,3-메틸신나모일구아니딘,2-메틸신나모일구아니딘,신나모일구아니딘,트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘,3,4-디클로로신나모일구아니딘,2-에틸신나모일구아니딘,(4-클로로신나모일)구아니딘,2-나프토일구아니딘,2,5-디메틸신나모일구아니딘,3-이소프로필신나모일구아니딘 하이드로클로라이드,(5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘,3-페닐신나모일구아니딘,(4-브로모신나모일)구아니딘,3-(사이클로헥스-1-엔-1-일)신나모일구아니딘,3-(트리플루오로메톡시)신나모일구아니딘,2-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,N,N'-비스(3페닐프로파노일)-N''-페닐구아니딘,2-에톡시신나모일구아니딘,N-(3-페닐프로파노일)-N''-페닐구아니딘,4-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,(4-메톡시신나모일)구아니딘,2-t-부틸신나모일구아니딘,4-메틸신나모일구아니딘,2-플루오로신나모일구아니딘,2-페닐신나모일구아니딘,N-(6-하이드록시-2-나프토일)-N'-페닐구아니딘,3-t-부틸신나모일구아니딘,3,4-디플루오로신나모일구아니딘,3-플루오로신나모일구아니딘,5-브로모-2-메톡시신나모일구아니딘,3-에톡시신나모일구아니딘,3,4-(메틸렌디옥시)신나모일구아니딘,(2-메톡시신나모일)구아니딘,2-(1-나프틸)아세토일구아니딘,(3-메톡시신나모일)구아니딘,4-이소프로필신나모일구아니딘,N-(신나모일)-N'페닐구아니딘,2-(사이클로헥스-1-엔-1일)신나모일구아니딘,2-(2-나프틸)아세토일구아니딘,(4-하이드록시신나모일)구아니딘,4-페닐신나모일구아니딘,4-플루오로신나모일구아니딘,N,N'-비스-(신나모일)-N''-페닐구아니딘,(3-니트로신나모일)구아니딘,벤조일구아니딘,2-사이클로헥사신나모일구아니딘,4-에톡시신나모일구아니딘,2,4-디클로로신나모일구아니딘,(a-메틸신나모일)구아니딘,신나모일구아니딘 하이드로클로라이드,(4-클로로페녹시-아세틸)구아니딘,(2-나트로신나모일)구아니딘,트랜스-3-퓨란아크리오일구아니딘,4-t-부틸신나모일구아니딘,N,N'-비스(3-페닐프로파노일)구아니딘,N-벤조일-N'-신나모일구아니딘, 및1-브로모-2-나프토일구아니딘.
- 제10항에 있어서, 상기 화합물은 (3-브로모신나모일)구아니딘, 3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘, 및 (5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 HIV는 HIV-1인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 바이러스는 코로나바이러스인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 코로나바이러스는 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스(SARS)인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제14항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:3,4-디클로로신나모일구아니딘,4-t-부틸신나모일구아니딘,(3-클로로신나모일)구아니딘,3-(사이클로헥스-1-엔-1-일)신나모일구아니딘,2,5-디메틸신나모일구아니딘,트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘,4-이소프로필신나모일구아니딘,(3-브로모신나모일)구아니딘,3-페닐신나모일구아니딘,(2-클로로신나모일)구아니딘,4-페닐신나모일구아니딘,4-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,3-(트리플루오로메톡시)신나모일구아니딘,3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,2-에톡시신나모일구아니딘,신나모일구아니딘 하이드로클로라이드,4-에톡시신나모일구아니딘,(2-브로모신나모일)구아니딘,3-t-부틸신나모일구아니딘,5-브로모-2-플루오로신나모일구아니딘,(4-클로로신나모일)구아니딘,2-t-부틸신나모일구아니딘,2-사이클로헥실신나모일구아니딘,(4-브로모신나모일)구아니딘,(4-하이드록시신나모일)구아니딘,N-(3-페닐프로판오일)-N'-페닐구아니딘,(3-니트로신나모일)구아니딘,3-플루오로신나모일구아니딘,2-(1-나프틸)아세토일구아니딘,2-에틸신나모일구아니딘,2-나프토일구아니딘,2-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,N-(6-하이드록시-2-나프토일)-N'-페닐구아니딘,N,N'-비스(3페닐프로판오일)-N"-페닐구아니딘,4-메틸신나모일구아니딘,4-플루오로신나모일구아니딘,3,4-(메틸렌디옥시)신나모일구아니딘,N-(신나모일)-N'페닐구아니딘, 5-(N-에틸-N-이소프로필)아밀로라이드,3-메틸신나모일구아니딘,2-메틸신나모일구아니딘,트랜스-3-퓨란아크릴로일구아니딘(4-메톡시신나모일)구아니딘,2-(2-나프틸)아세토일구아니딘,신나모일구아니딘,(2-메톡시신나모일)구아니딘,[3-(3-피리딜)아크릴로일]구아니딘,2,4-디클로로신나모일구아니딘,(3-메톡시신나모일)구아니딘,2-플루오로신나모일구아니딘,(a-메틸신나모일)구아니딘,(5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘,(퀴놀린-2-카르보닐)구아니딘,(페닐아세틸)구아니딘,N,N'-비스(아미디노)나프탈렌-2,6-디카르복스아미드,6-브로모-2-나프토일구아니딘,1-브로모-2-나프토일구아니딘,(4-클로로페녹시-아세틸)구아니딘,N-벤조일-N'-신나모일구아니딘 및N-(2-나프토일)-N'-페닐구아니딘.
- 제14항에 있어서, 상기 화합물은 신나모일구아니딘, 및 트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 코로나바이러스는 인간 코로나바이러스 229E인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제17항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:4-이소프로필신나모일구아니딘,3,4-디클로로신나모일구아니딘,3-(트리플루오로메톡시)신나모일구아니딘,4-t-부틸신나모일구아니딘,3-이소프로필신나모일구아니딘 하이드로클로라이드,3-t-부틸신나모일구아니딘,2-t-부틸신나모일구아니딘,트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘,5-브로모-2-메톡시신나모일구아니딘,2-페닐신나모일구아니딘,3-페닐신나모일구아니딘,3-(사이클로헥스-1-엔-1-일)신나모일구아니딘,3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,4-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,2-(사이클로헥스-1-엔-1-일)신나모일구아니딘,(4-브로모신나모일)구아니딘,(5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘,(3-브로모신나모일)구아니딘,2,5-디메틸신나모일구아니딘,2-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,(4-클로로신나모일)구아니딘,(3-메톡시신나모일)구아니딘,5-브로모-2-플루오로신나모일구아니딘,신나모일구아니딘,(2-메톡시신나모일)구아니딘,(a-메틸신나모일)구아니딘,4-페닐신나모일구아니딘,(2-브로모신나모일)구아니딘,(3-클로로신나모일)구아니딘,2-(1-나프틸)아세토일구아니딘,2-에틸신나모일구아니딘,2-사이클로헥실신나모일구아니딘,(4-하이드록시신나모일)구아니딘,2-에톡시신나모일구아니딘,3-메틸신나모일구아니딘,2-메틸신나모일구아니딘,3-플루오로신나모일구아니딘,신나모일구아니딘 하이드로클로라이드,2-플루오로신나모일구아니딘,4-플루오로신나모일구아니딘,3,4-디플루오로신나모일구아니딘,2-나프토일구아니딘,N,N'-비스(아미디노)나프탈렌-2,6-디카르복스아미드,N,N'-비스(3-페닐프로판오일)구아니딘,4-메틸신나모일구아니딘,3-에톡시신나모일구아니딘,N,N'-비스(3페닐프로판오일)-N"-페닐구아니딘,(4-메톡시신나모일)구아니딘,(2-클로로신나모일)구아니딘,(3-니트로신나모일)구아니딘,4-에톡시신나모일구아니딘,2-(2-나프틸)아세토일구아니딘, 및N-(3-페닐프로판오일)-N'-페닐구아니딘,5-(2'-브로모페닐)펜타-2,4-디에노일구아니딘,(4-브로모신나모일)구아니딘,(2-니트로신나모일)구아니딘,(3-클로로신나모일)구아니딘,4-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,[(E)-3-(4-디메틸아미노페닐)-2-메틸아크릴로일]구아니딘,N-벤조일-N'-신나모일구아니딘,트랜스-3-퓨란아크리오일구아니딘,N-(신나모일)-N'페닐구아니딘,신나모일구아니딘,벤조일구아니딘,(퀴놀린-2-카르보닐)구아니딘,[3-(3-피리딜)아크릴로일]구아니딘,N-(2-나프토일)-N'-페닐구아니딘 및(페닐아세틸)구아니딘.
- 제17항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:2-t-부틸신나모일구아니딘,4-이소프로필신나모일구아니딘,3,4-디클로로신나모일구아니딘,3-(트리플루오로메톡시)신나모일구아니딘,2-(사이클로헥스-1-엔-1일)신나모일구아니딘,2-사이클로헥실신나모일구아니딘,5-브로모-2-메톡시신나모일구아니딘,2-페닐신나모일구아니딘,4-t-부틸신나모일구아니딘,3-페닐신나모일구아니딘,(3-브로모신나모일)구아니딘,트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘,2,4-디클로로신나모일구아니딘,3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,5-브로모-2-플루오로신나모일구아니딘,4-메틸신나모일구아니딘,(4-클로로신나모일)구아니딘,3-플루오로신나모일구아니딘,3-(사이클로헥스-1-엔-1일)신나모일구아니딘,(a-메틸신나모일)구아니딘,2-플루오로신나모일구아니딘,(3-니트로신나모일)구아니딘,2,5-디메틸신나모일구아니딘,3-t-부틸신나모일구아니딘,(3-메톡시신나모일)구아니딘,3-메틸신나모일구아니딘,3-이소프로필신나모일구아니딘 하이드로클로라이드,(2-브로모신나모일)구아니딘,3-에톡시신나모일구아니딘,(5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘,(2-클로로신나모일)구아니딘,4-에톡시신나모일구아니딘,4-플루오로신나모일구아니딘,3,4-디플루오로신나모일구아니딘,N-(3-페닐프로판오일)-N'-페닐구아니딘,2-메틸신나모일구아니딘,(2-메톡시신나모일)구아니딘,신나모일구아니딘,3,4-(메틸렌디옥시)신나모일구아니딘,N,N'-비스(아미디노)나프탈렌-2,6-디카르복스아미드,N,N'-비스(3-페닐프로판오일)구아니딘,2-에톡시신나모일구아니딘,2-나프토일구아니딘,2-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,신나모일구아니딘 하이드로클로라이드,(4-하이드록시신나모일)구아니딘,2-(1-나프틸)아세토일구아니딘,2-(2-나프틸)아세토일구아니딘 및N,N'-비스(3페닐프로판오일)-N''-페닐구아니딘.
- 제13항에 있어서, 상기 코로나바이러스는 인간 코로나바이러스 OC43인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제20항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:3-메틸신나모일구아니딘,트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘,(3-브로모신나모일)구아니딘,(2-클로로신나모일)구아니딘,3,4-디클로로신나모일구아니딘,3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,4-이소프로필신나모일구아니딘,신나모일구아니딘,2,4-디클로로신나모일구아니딘,(4-클로로신나모일)구아니딘,(4-브로모신나모일)구아니딘,5-브로모-2-메톡시신나모일구아니딘,(5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘,3-(트리플루오로메톡시)신나모일구아니딘 및2-t-부틸신나모일구아니딘.
- 제13항에 있어서, 상기 코로나바이러스는 돼지 호흡기 코로나바이러스(PRCV)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제22항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:신나모일구아니딘,N-(3-페닐프로판오일)-N'-페닐구아니딘,3-메틸신나모일구아니딘,(3-브로모신나모일)구아니딘,트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘 및2-(2-나프틸)아세토일구아니딘.
- 제13항에 있어서, 상기 코로나바이러스는 소 코로나바이러스(BCV)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제24항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:(3-브로모신나모일)구아니딘,3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘,신나모일구아니딘,(5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘,2-(2-나프틸)아세토일구아니딘,및N-(3-페닐프로판오일)-N'-페닐구아니딘.
- 제13항에 있어서, 상기 코로나바이러스는 이하에 나열된 공지의 코로나바이러스 분리물 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:개 장염성 코로나바이러스(균주 INSAVC-1)개 장염성 코로나바이러스(균주 K378)고양이 장염성 코로나바이러스(균주 79-683)고양인 전염성 복막염 코로나바이러스(FIPV)말 코로나바이러스 NC99돼지 호흡기 코로나바이러스돼지 전염성 위장염 바이러스(균주 FS772/70)돼지 전염성 위장염 바이러스(균주 Miller)돼지 전염성 위장염 바이러스(균주 Neb72-RT)돼지 전염성 위장염 바이러스(균주 PURDUE)소 코로나바이러스(균주 F15)소 코로나바이러스(균주 G95)소 코로나바이러스(균주 L9)소 코로나바이러스(균주 LSU-94LSS-051)소 코로나바이러스(균주 LY-138)소 코로나바이러스(균주 MEBUS)소 코로나바이러스(균주 OK-0514-3)소 코로나바이러스(균주 Ontario)소 코로나바이러스(균주 QUEBEC)소 코로나바이러스(균주 VACCINE)소 장염성 코로나바이러스(균주 98TXSF-110-ENT)개 호흡기 코로나바이러스닭 장염성 코로나바이러스뮤라인 간염 바이러스(균주 DVIM)뮤라인 간염 바이러스(균주 A59)뮤라인 간염 바이러스(균주 JHM)뮤라인 간염 바이러스(균주 S)뮤라인 간염 바이러스 균주 1뮤라인 간염 바이러스 균주 2` 뮤라인 간염 바이러스 균주 3뮤라인 간염 바이러스 균주 4뮤라인 간염 바이러스 균주 ML-11돼지 혈구응집성 뇌척수염 바이러스(균주 67N)돼지 혈구응집성 뇌척수염 바이러스(균주 IAF-404)퓨피노시스(Puffinosis) 바이러스랫 코로나바이러스(균주 681)랫 코로나바이러스(균주 (NJ)랫 시알로드아크리오아데니티스(sialodacryoadenitis) 코로나바이러스칠면조 코로나바이러스(균주 Indiana)칠면조 코로나바이러스(균주 Minnesota)칠면조 코로나바이러스(균주 NC95)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 6/82)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 Arkansas 99)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 Beaudette CK)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 Beaudette M42)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 Beaudette US)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 Beaudette)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 D1466)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 D274)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 D3896)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 D41)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 DE072)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 GRAY)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 H120)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 H52)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 KB8523)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 M41)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 PORTUGAL/322/82)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 SAIB20)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 UK/123/82)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 UK142/86)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 UK/167/84)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 UK/183/66)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 UK/68/84)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 V18/91)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 Vic S)조류 전염성 후두기관염 바이러스SARS 코로나 바이러스 베이징 ZY-2003SARS 코로나 바이러스 BJ01SARS 코로나 바이러스 BJ02SARS 코로나 바이러스 BJ03SARS 코로나 바이러스 BJ04SARS 코로나 바이러스 CUHK-Su10SARS 코로나 바이러스 CUHK-W1SARS 코로나 바이러스 Frankfurt1SARS 코로나 바이러스 GZ01SARS 코로나 바이러스 HKU-39849SARS 코로나 바이러스 홍콩 ZY-2003SARS 코로나 바이러스 홍콩/03/2003SARS 코로나 바이러스 HSR1SARS 코로나 바이러스 Sin2500SARS 코로나 바이러스 Sin2677SARS 코로나 바이러스 Sin2679SARS 코로나 바이러스 Sin2748SARS 코로나 바이러스 Sin2774SARS 코로나 바이러스 타이완SARS 코로나 바이러스 타이완 JC-2003SARS 코로나 바이러스 타이완 TC1SARS 코로나 바이러스 타이완 TC2SARS 코로나 바이러스 Tor2SARS 코로나 바이러스 TW1SARS 코로나 바이러스 TWCSARS 코로나 바이러스 우르바니SARS 코로나 바이러스 베트남SARS 코로나 바이러스 ZJ-HZ01SARS 코로나 바이러스 ZJ01소 호흡기 코로나바이러스(균주 98TXSF-110-LUN)인간 장염 코로나바이러스 4408돼지 유행성 설사 바이러스(균주 Brl/87) 및돼지 유행성 설사 바이러스(균주 CV777).
- 제26항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:4-이소프로필신나모일구아니딘,3,4-디클로로신나모일구아니딘,3-(트리플루오로메톡시)신나모일구아니딘,4-t-부틸신나모일구아니딘, 및3-이소프로필신나모일구아니딘 하이드로클로라이드
- 제5항에 있어서, 상기 바이러스는 C형 간염 바이러스인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제28항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:5-브로모-2-플루오로신나모일구아니딘,(4-브로모신나모일)구아니딘,2,5-디메틸신나모일구아니딘,3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,4-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,(2-클로로신나모일)구아니딘,(4-클로로신나모일)구아니딘,(2-브로모신나모일)구아니딘,(3-브로모신나모일)구아니딘,(3-클로로신나모일)구아니딘,2-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,3,4-디클로로신나모일구아니딘,4-이소프로필신나모일구아니딘,트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘,4-t-부틸신나모일구아니딘,2-t-부틸신나모일구아니딘,2-에틸신나모일구아니딘,4-메틸신나모일구아니딘,5-브로모-2-메톡시신나모일구아니딘,3-(트리플루오로메톡시)신나모일구아니딘,2-사이클로헥실신나모일구아니딘,3-t-부틸신나모일구아니딘,(5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘,N-(신나모일)-N'페닐구아니딘,3-이소프로필신나모일구아니딘 하이드로클로라이드,N-(3-페닐프로판오일)-N'-페닐구아니딘,N,N'-비스(3페닐프로판오일)-N''-페닐구아니딘,(4-메톡시시나모일)구아니딘,4-플루오로신나모일구아니딘,(3-니트로신나모일)구아니딘,4-에톡시신나모일구아니딘,(4-하이드록시신나모일)구아니딘,3-에톡시신나모일구아니딘,4-페닐신나모일구아니딘,트랜스-3-퓨란아크릴로일구아니딘,N-(6-하이드록시-2-나프토일l)-N'-페닐구아니딘,3-(사이클로헥스-1-엔-1-일)신나모일구아니딘,신나모일구아니딘 하이드로클로라이드,2-(1-나프틸)아세토일구아니딘,(a-메틸신나모일)구아니딘,(2-니트로신나모일)구아니딘,3,4-(메틸렌디옥시)신나모일구아니딘,2-에톡시신나모일구아니딘,신나모일구아니딘,2-페닐신나모일구아니딘,2-(사이클로헥스-1-엔-1일)신나모일구아니딘,2-나프토일구아니딘,3-페닐신나모일구아니딘,(3-메톡시신나모일)구아니딘,2-플루오로신나모일구아니딘,(4-클로로페녹시-아세틸)구아니딘,3-플루오로신나모일구아니딘,2-메틸신나모일구아니딘,(2-메톡시신나모일)구아니딘,1-브로모-2-나프토일구아니딘,3-메틸신나모일구아니딘,2,4-디클로로신나모일구아니딘,3,4-디플루오로신나모일구아니딘 및[(E)-3-(4-디메틸아미노페닐)-2-메틸아크릴로일]구아니딘.
- 제5항에 있어서, 상기 바이러스는 말 동맥염 바이러스(EAV)인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제30항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:(3-브로모신나모일)구아니딘,트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘,2-t-부틸신나모일구아니딘 및2-(사이클로헥스-1-엔-1일)신나모일구아니딘.
- 제5항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 따른 화합물을 포함하는,바이러스로 감염되거나 또는 바이러스에 노출된 포유류의 치료학적 또는 예방학적 처치용; 또는포유류의 바이러스에 감염된 세포에서 바이러스의 성장, 복제, 또는 성장 및 복제의 감소, 지연 또는 억제용,약학적 조성물.
- 제5항에 있어서, 공지의 항바이러스 화합물 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제33항에 있어서, 상기 바이러스는 렌티바이러스인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제35항에 있어서, 상기 렌티바이러스는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제36항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:(3-클로로신나모일)구아니딘,(3-브로모신나모일)구아니딘,(2-클로로신나모일)구아니딘,(2-브로모신나모일)구아니딘,3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,5-브로모-2-플루오로신나모일구아니딘,3-메틸신나모일구아니딘,2-메틸신나모일구아니딘,신나모일구아니딘,트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘,3,4-디클로로신나모일구아니딘,2-에틸신나모일구아니딘,(4-클로로신나모일)구아니딘,2-나프토일구아니딘,2,5-디메틸신나모일구아니딘,3-이소프로필신나모일구아니딘 하이드로클로라이드,(5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘,3-페닐신나모일구아니딘,(4-브로모신나모일)구아니딘,3-(사이클로헥스-1-엔-1-일)신나모일구아니딘,3-(트리플루오로메톡시)신나모일구아니딘,2-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,N,N'-비스(3페닐프로판오일)-N''-페닐구아니딘,2-에톡시신나모일구아니딘,N-(3-페닐프로판오일)-N'-페닐구아니딘,4-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,4-(메톡시신나모일)구아니딘,2-t-부틸신나모일구아니딘,4-메틸신나모일구아니딘,2-플루오로신나모일구아니딘,2-페닐신나모일구아니딘,N-(6-하이드록시-2-나프토일l)-N'-페닐구아니딘,3-t-부틸신나모일구아니딘,3,4-디플루오로신나모일구아니딘,3-플루오로신나모일구아니딘,5-브로모-2-메톡시신나모일구아니딘,3-에톡시신나모일구아니딘,3,4-(메틸렌디옥시)신나모일구아니딘,(2-메톡시신나모일)구아니딘,2-(1-나프틸)아세토일구아니딘,(3-메톡시신나모일)구아니딘,4-이소프로필신나모일구아니딘,N-(신나모일)-N'페닐구아니딘,2-(사이클로헥스-1-엔-1일)신나모일구아니딘,2-(2-나프틸)아세토일구아니딘,(4-하이드록시신나모일)구아니딘,4-페닐신나모일구아니딘,4-플루오로신나모일구아니딘,N,N'-bis-(신나모일)-N''-페닐구아니딘,(3-니트로신나모일)구아니딘,벤조일구아니딘,2-사이클로헥실신나모일구아니딘,4-에톡시신나모일구아니딘,2,4-디클로로신나모일구아니딘,(a-메틸신나모일)구아니딘,신나모일구아니딘 하이드로클로라이드,(4-클로로페녹시-아세틸]구아니딘,(2-니트로신나모일)구아니딘,트랜스-3-퓨란아크릴로일구아니딘,4-t-부틸신나모일구아니딘,N,N'-비스(3-페닐프로판오일)구아니딘,N-벤조일-N'-신나모일구아니딘 및1-브로모-2-나프토일구아니딘.
- 제36항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:(3-브로모신나모일)구아니딘, 3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘, 및 (5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘.
- 제36항에 있어서, 상기 HIV는 HIV-1인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제33항에 있어서, 상기 바이러스는 코로나바이러스인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제40항에 있어서, 상기 코로나바이러스는 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스(SARS)인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제41항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:3,4-디클로로신나모일구아니딘,4-t-부틸신나모일구아니딘,(3-클로로신나모일)구아니딘,3-(사이클로헥스-1-엔-1-일)신나모일구아니딘,2,5-디메틸신나모일구아니딘,트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘,4-이소프로필신나모일구아니딘,(3-브로모신나모일)구아니딘,3-페닐신나모일구아니딘,(2-클로로신나모일)구아니딘,4-페닐신나모일구아니딘,4-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,3-(트리플루오로메톡시)신나모일구아니딘,3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,2-에톡시신나모일구아니딘,신나모일구아니딘 하이드로클로라이드,4-에톡시신나모일구아니딘,(2-브로모신나모일)구아니딘,3-t-부틸신나모일구아니딘,5-브로모-2-플루오로신나모일구아니딘,(4-클로로신나모일)구아니딘,2-t-부틸신나모일구아니딘,2-사이클로헥실신나모일구아니딘,(4-브로모신나모일)구아니딘,(4-하이드록시신나모일)구아니딘,N-(3-페닐프로판오일)-N'-페닐구아니딘,(3-니트로신나모일)구아니딘,3-플루오로신나모일구아니딘,2-(1-나프틸)아세토일구아니딘,2-에틸신나모일구아니딘,2-나프토일구아니딘,2-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,N-(6-하이드록시-2-나프토일)-N'-페닐구아니딘,N,N'-비스(3페닐프로판오일)-N"-페닐구아니딘,4-메틸신나모일구아니딘,4-플루오로신나모일구아니딘,3,4-(메틸렌디옥시)신나모일구아니딘,N-(신나모일)-N'페닐구아니딘,3-메틸신나모일구아니딘,2-메틸신나모일구아니딘,트랜스-3-퓨란아크릴로일구아니딘,(4-메톨시신나모일)구아니단,2-(2-나프틸)아세토일구아니딘,신나모일구아니딘,(2-메톡시신나모일)구아니딘,[3-(3-피리딜)아크릴로일]구아니딘,2,4-디클로로신나모일구아니딘,(3-메톡시신나모일)구아니딘,2-플루오로신나모일구아니딘,(a-메틸신나모일)구아니딘,(5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘,(퀴놀린-2-카르보닐)구아니딘,(페닐아세틸)구아니딘,N,N'-비스(아미디노)나프탈렌-2,6-디카르복스아미드,6-브로모-2-나프토일구아니딘,1-브로모-2-나프토일구아니딘,(4-클로로페녹시-아세틸)구아니딘,N-벤조일-N'-신나모일구아니딘 및N-(2-나프토일)-N'-페닐구아니딘.
- 제41항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:신나모일구아니딘, 및 트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘.
- 제40항에 있어서, 상기 코로나바이러스는 인간 코로나바이러스 229E인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제44항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:4-이소프로필신나모일구아니딘,3,4-디클로로신나모일구아니딘,3-(트리플루오로메톡시)신나모일구아니딘,4-t-부틸신나모일구아니딘,3-이소프로필신나모일구아니딘 하이드로클로라이드,3-t-부틸신나모일구아니딘,2-t-부틸신나모일구아니딘,트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘,5-브로모-2-메톡시신나모일구아니딘,2-페닐신나모일구아니딘,3-페닐신나모일구아니딘,3-(사이클로헥스-1-엔-1-일)신나모일구아니딘,3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,4-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,2-(사이클로헥스-1-엔-1-일)신나모일구아니딘,(4-브로모신나모일)구아니딘,(5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘,(3-브로모신나모일)구아니딘,2,5-디메틸신나모일구아니딘,2-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,(4-클로로신나모일)구아니딘,(3-메톡시신나모일)구아니딘,5-브로모-2-플루오로신나모일구아니딘,신나모일구아니딘,(2-메톡시신나모일)구아니딘,(a-메틸신나모일)구아니딘,4-페닐신나모일구아니딘,(2-브로모신나모일)구아니딘,(3-클로로신나모일)구아니딘,2-(1-나프틸)아세토일구아니딘,2-에틸신나모일구아니딘,2-사이클로헥실신나모일구아니딘,(4-하이드록시신나모일)구아니딘,2-에톡시신나모일구아니딘,3-메틸신나모일구아니딘,2-메틸신나모일구아니딘,3-플루오로신나모일구아니딘,신나모일구아니딘 하이드로클로라이드,2-플루오로신나모일구아니딘,4-플루오로신나모일구아니딘,3,4-디플루오로신나모일구아니딘,2-나프토일구아니딘,N,N'-비스(아미디노)나프탈렌-2,6-디카르복스아미드,N,N'-비스(3-페닐프로판오일)구아니딘,4-메틸신나모일구아니딘,3-에톡시신나모일구아니딘,N,N'-비스(3페닐프로판오일)-N"-페닐구아니딘,(4-메톡시신나모일)구아니딘,(2-클로로신나모일)구아니딘,(3-니트로신나모일)구아니딘,4-에톡시신나모일구아니딘,2-(2-나프틸)아세토일구아니딘,N-(3-페닐프로판오일)-N'-페닐구아니딘,5-(2'-브로모페닐)펜타-2,4-디에노일구아니딘,(4-브로모신나모일)구아니딘,(2-니트로신나모일)구아니딘,(3-클로로신나모일)구아니딘,4-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,[(E)-3-(4-디메틸아미노페닐)-2-메틸아크릴로일]구아니딘,N-벤조일-N'-신나모일구아니딘,트랜스-3-퓨란아크릴로일구아니딘,N-(신나모일)-N'페닐구아니딘,신나모일구아니딘,벤조일구아니딘,(퀴놀린-2-카르보닐)구아니딘,[3-(3-피리딜)아크릴로일]구아니딘,N-(2-나프토일l)-N'-페닐구아니딘 및(페닐아세틸)구아니딘.
- 제44항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:2-t-부틸신나모일구아니딘,4-이소프로필신나모일구아니딘,3,4-디클로로신나모일구아니딘,3-(트리플루오로메톡시)신나모일구아니딘,2-(사이클로헥스-1-엔-1일)신나모일구아니딘,2-사이클로헥실신나모일구아니딘,5-브로모-2-메톡시신나모일구아니딘,2-페닐신나모일구아니딘,4-t-부틸신나모일구아니딘,3-페닐신나모일구아니딘,(3-브로모신나모일)구아니딘,트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘,2,4-디클로로신나모일구아니딘,3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,5-브로모-2-플루오로신나모일구아니딘,4-메틸신나모일구아니딘,(4-클로로신나모일)구아니딘,3-플루오로신나모일구아니딘,3-(사이클로헥스-1-엔-1-일)신나모일구아니딘,(a-메틸신나모일)구아니딘,2-플루오로신나모일구아니딘,(3-니트로신나모일)구아니딘,2,5-디메틸신나모일구아니딘,3-t-부틸신나모일구아니딘,(3-메톡시신나모일)구아니딘,3-메틸신나모일구아니딘,3-이소프로필신나모일구아니딘 하이드로클로라이드,(2-브로모신나모일)구아니딘,3-에톡시신나모일구아니딘,(5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘,(2-클로로신나모일)구아니딘,4-에톡시신나모일구아니딘,4-플루오로신나모일구아니딘,3,4-디플루오로신나모일구아니딘,N-(3-페닐프로판오일)-N'-페닐구아니딘,2-메틸신나모일구아니딘,(2-메톡시신나모일)구아니딘,신나모일구아니딘,3,4-(메틸렌디옥시)신나모일구아니딘,N,N'-비스(아미디노)나프탈렌-2,6-디카르복스아미드,N,N'-비스(3-페닐프로판오일)구아니딘,2-에톡시신나모일구아니딘,2-나프토일구아니딘,2-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,신나모일구아니딘 하이드로클로라이드,(4-하이드록시신나모일)구아니딘,2-(1-나프틸)아세토일구아니딘,2-(2-나프틸)아세토일구아니딘 및N,N'-비스(3페닐프로판오일)-N''-페닐구아니딘.
- 제40항에 있어서, 상기 코로나바이러스는 인간 코로나바이러스 OC43인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제47항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:3-메틸신나모일구아니딘,트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘,(3-브로모신나모일)구아니딘,(2-클로로신나모일)구아니딘,3,4-디클로로신나모일구아니딘,3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,4-이소프로필신나모일구아니딘,신나모일구아니딘,2,4-디클로로신나모일구아니딘,(4-클로로신나모일)구아니딘,(4-브로모신나모일)구아니딘,5-브로모-2-메톡시신나모일구아니딘,(5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘,3-(트리플루오로메톡시)신나모일구아니딘 및2-t-부틸신나모일구아니딘.
- 제40항에 있어서, 상기 코로나바이러스는 돼지 호흡기 코로나바이러스(PRCV)인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제49항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:신나모일구아니딘,N-(3-페닐프로판오일)-N'-페닐구아니딘,3-메틸신나모일구아니딘,(3-브로모신나모일)구아니딘,트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘 및2-(2-나프틸)아세토일구아니딘.
- 제40항에 있어서, 상기 코로나바이러스는 소 코로나바이러스(BCV)인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제51항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:(3-브로모신나모일)구아니딘,3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘,신나모일구아니딘,(5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘,2-(2-나프틸)아세토일구아니딘,및N-(3-페닐프로판오일)-N'-페닐구아니딘.
- 제40항에 있어서, 상기 코로나바이러스는 이하에 나열된 공지의 코로나바이러스 분리물 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:개 장염성 코로나바이러스(균주 INSAVC-1)개 장염성 코로나바이러스(균주 K378)고양이 장염성 코로나바이러스(균주 79-683)고양인 전염성 복막염 코로나바이러스(FIPV)말 코로나바이러스 NC99돼지 호흡기 코로나바이러스돼지 전염성 위장염 바이러스(균주 FS772/70)돼지 전염성 위장염 바이러스(균주 Miller)돼지 전염성 위장염 바이러스(균주 Neb72-RT)돼지 전염성 위장염 바이러스(균주 PURDUE)소 코로나바이러스(균주 F15)소 코로나바이러스(균주 G95)소 코로나바이러스(균주 L9)소 코로나바이러스(균주 LSU-94LSS-051)소 코로나바이러스(균주 LY-138)소 코로나바이러스(균주 MEBUS)소 코로나바이러스(균주 OK-0514-3)소 코로나바이러스(균주 Ontario)소 코로나바이러스(균주 QUEBEC)소 코로나바이러스(균주 VACCINE)소 장염성 코로나바이러스(균주 98TXSF-110-ENT)개 호흡기 코로나바이러스닭 장염성 코로나바이러스뮤라인 간염 바이러스(균주 DVIM)뮤라인 간염 바이러스(균주 A59)뮤라인 간염 바이러스(균주 JHM)뮤라인 간염 바이러스(균주 S)뮤라인 간염 바이러스 균주 1뮤라인 간염 바이러스 균주 2` 뮤라인 간염 바이러스 균주 3뮤라인 간염 바이러스 균주 4뮤라인 간염 바이러스 균주 ML-11돼지 혈구응집성 뇌척수염 바이러스(균주 67N)돼지 혈구응집성 뇌척수염 바이러스(균주 IAF-404)퓨피노시스(Puffinosis) 바이러스랫 코로나바이러스(균주 681)랫 코로나바이러스(균주 (NJ)랫 시알로드아크리오아데니티스(sialodacryoadenitis) 코로나바이러스칠면조 코로나바이러스(균주 Indiana)칠면조 코로나바이러스(균주 Minnesota)칠면조 코로나바이러스(균주 NC95)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 6/82)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 Arkansas 99)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 Beaudette CK)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 Beaudette M42)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 Beaudette US)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 Beaudette)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 D1466)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 D274)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 D3896)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 D41)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 DE072)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 GRAY)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 H120)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 H52)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 KB8523)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 M41)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 PORTUGAL/322/82)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 SAIB20)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 UK/123/82)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 UK142/86)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 UK/167/84)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 UK/183/66)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 UK/68/84)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 V18/91)조류 전염성 기관지염 바이러스(균주 Vic S)조류 전염성 후두기관염 바이러스SARS 코로나 바이러스 베이징 ZY-2003SARS 코로나 바이러스 BJ01SARS 코로나 바이러스 BJ02SARS 코로나 바이러스 BJ03SARS 코로나 바이러스 BJ04SARS 코로나 바이러스 CUHK-Su10SARS 코로나 바이러스 CUHK-W1SARS 코로나 바이러스 Frankfurt1SARS 코로나 바이러스 GZ01SARS 코로나 바이러스 HKU-39849SARS 코로나 바이러스 홍콩 ZY-2003SARS 코로나 바이러스 홍콩/03/2003SARS 코로나 바이러스 HSR1SARS 코로나 바이러스 Sin2500SARS 코로나 바이러스 Sin2677SARS 코로나 바이러스 Sin2679SARS 코로나 바이러스 Sin2748SARS 코로나 바이러스 Sin2774SARS 코로나 바이러스 타이완SARS 코로나 바이러스 타이완 JC-2003SARS 코로나 바이러스 타이완 TC1SARS 코로나 바이러스 타이완 TC2SARS 코로나 바이러스 Tor2SARS 코로나 바이러스 TW1SARS 코로나 바이러스 TWCSARS 코로나 바이러스 우르바니SARS 코로나 바이러스 베트남SARS 코로나 바이러스 ZJ-HZ01SARS 코로나 바이러스 ZJ01소 호흡기 코로나바이러스(균주 98TXSF-110-LUN)인간 장염 코로나바이러스 4408돼지 유행성 설사 바이러스(균주 Brl/87) 및돼지 유행성 설사 바이러스(균주 CV777).
- 제53항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:4-이소프로필신나모일구아니딘,3,4-디클로로신나모일구아니딘,3-(트리플루오로메톡시)신나모일구아니딘,4-t-부틸신나모일구아니딘, 및3-이소프로필신나모일구아니딘 하이드로클로라이드,
- 제33항에 있어서, 상기 바이러스는 C형 간염 바이러스인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제55항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:5-브로모-2-플루오로신나모일구아니딘,(4-브로모신나모일)구아니딘,2,5-디메틸신나모일구아니딘,3-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,4-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,(2-클로로신나모일)구아니딘,(4-클로로신나모일)구아니딘,(2-브로모신나모일)구아니딘,(3-브로모신나모일)구아니딘,(3-클로로신나모일)구아니딘,2-(트리플루오로메틸)신나모일구아니딘,3,4-디클로로신나모일구아니딘,4-이소프로필신나모일구아니딘,트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘,4-t-부틸신나모일구아니딘,2-t-부틸신나모일구아니딘,2-에틸신나모일구아니딘,4-메틸신나모일구아니딘,5-브로모-2-메톡시신나모일구아니딘,3-(트리플루오로메톡시)신나모일구아니딘,2-사이클로헥실신나모일구아니딘,3-t-부틸신나모일구아니딘,(5-페닐-펜타-2,4-디에노일)구아니딘,N-(신나모일)-N'페닐구아니딘,3-이소프로필신나모일구아니딘 하이드로클로라이드,N-(3-페닐프로판오일)-N'-페닐구아니딘,N,N'-비스(3페닐프로판오일)-N''-페닐구아니딘,(4-메톡시신나모일)구아니딘,4-플루오로신나모일구아니딘,(3-니트로신나모일)구아니딘,4-에톡시신나모일구아니딘,(4-하이드록시신나모일)구아니딘,3-에톡시신나모일구아니딘,4-페닐신나모일구아니딘,트랜스-3-퓨란아크릴로일구아니딘,N-(6-하이드록시-2-나프토일l)-N'-페닐구아니딘,3-(사이클로헥스-1-엔-1-일)신나모일구아니딘,신나모일구아니딘 하이드로클로라이드,2-(1-나프틸)아세토일구아니딘,(a-메틸신나모일)구아니딘,(2-니트로신나모일)구아니딘,3,4-(메틸렌디옥시)신나모일구아니딘,2-에톡시신나모일구아니딘,신나모일구아니딘,2-페닐신나모일구아니딘,2-(사이클로헥스-1-엔-1일)신나모일구아니딘,2-나프토일구아니딘,3-페닐신나모일구아니딘,(3-메톡시신나모일)구아니딘,2-플루오로신나모일구아니딘,(4-클로로페녹시-아세틸)구아니딘,3-플루오로신나모일구아니딘,2-메틸신나모일구아니딘,(2-메톡시신나모일)구아니딘,1-브로모-2-나프토일구아니딘,3-메틸신나모일구아니딘,2,4-디클로로신나모일구아니딘,3,4-디플루오로신나모일구아니딘 및[(E)-3-(4-디메틸아미노페닐)-2-메틸아크릴로일]구아니딘.
- 제33항에 있어서, 상기 바이러스는 말 동맥염 바이러스인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제57항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:(3-브로모신나모일)구아니딘,트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘,2-t-부틸신나모일구아니딘 및2-(사이클로헥스-1-엔-1일)신나모일구아니딘.
- 제33항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 화합물은 바이러스로부터 유래되며 바이러스에 감염된 세포에서 발현되는 막 이온 채널의 기능적 활성을 하향 조절하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제60항에 있어서, 상기 막 이온 채널은 HIV Vpu 막 이온 채널, 코로나바이러스 E 단백질 또는 C형 간염바이러스 P7 막 이온 채널 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제33항에 있어서, 상기 화합물은 감염된 세포에서 발현되는 막 이온 채널의 기능적 활성을 하향 조절하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제62항에 있어서, 상기 막 이온 채널은 HIV Vpu 막 이온 채널, 코로나바이러스 E 단백질 또는 C형 간염바이러스 P7 막 이온 채널 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제33항에 있어서, 상기 포유류는 영장류인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제64항에 있어서, 상기 영장류는 인간인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 바이러스는 뎅기열(dengue) 바이러스이며, 상기 화합물은 신나모일구아니딘, (2-클로로신나모일)구아니딘 또는 트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제33항에 있어서, 상기 바이러스는 뎅기열(dengue) 바이러스이며, 상기 화합물은 신나모일구아니딘, (2-클로로신나모일)구아니딘 또는 트랜스-3-(1-나프틸)아크릴로일구아니딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제33항에 있어서, 공지의 항바이러스 화합물 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제33항에 있어서, 상기 화합물은 바이러스로부터 유래되며 바이러스에 감염된 세포에서 발현되는 막 이온 채널의 기능적 활성을 하향 조절하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
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