PT769947E - Compostos de indolinona para o tratamento de doenca - Google Patents

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alkyl
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Peng Cho Tang
Li Sun
Gerald Mcmahon
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Sugen Inc
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Description

86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ
DESCRICÃO “Compostos de indolinona para o tratamento de doença” 1, Introdução O presente invento refere-se a novos compostos capazes de modularem, regularem e/ou inibirem a transduçào do sinal da tirosina-quinase. O presente invento também se dirige a métodos para a regulação, modulação ou inibição de tirosina-quinases, quer da classe receptora quer da não receptora, para a prevenção e/ou tratamento de desordens relacionadas com a transdução do sinal da tirosina-quinase não regulada, incluindo desordens proliferativas celulares e metabólicas. 2. Antecedentes do invento
As tirosina-quinases proteicas (PTK) compreendem uma classe ampla e variada de proteínas que apresentam actividade enzimática. As PTK desempenham um papel importante no controlo do crescimento e da diferenciação celular (para revisão, ver Schlessinger & Ullrich, 1992, Neuron 9:383-391).
Por exemplo, a transdução do sinal mediada pela tirosina-quinase receptora é iniciada pela interacção extracelular com um factor de crescimento específico (ligando), seguida pela dimerização do receptor, estimulação transitória da actividade intrínseca da tirosina-quinase proteica e fosforilação. Deste modo, locais de ligação para moléculas de transdução do sinal intracelular são criados e induzem a formação de complexos com um espectro de moléculas sinalizadoras citoplasmáticas que facilitam a resposta celular apropriada (e.g., divisão celular, efeitos metabólicos para o microambiente extracelular). Ver, Schlessinger & Ullrich, 1992, Neuron 9:383-391.
Em relação às tirosina-quinases receptoras, também se verificou que os locais de fosforilação da tirosina actuam como locais de ligação de afinidade elevada para os domínios SH2 (homologia src) das moléculas sinalizadoras. Fantl et al., 1992, Cell 69: 413-423; Songyang et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14: 2777-2785; Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778; e Koch et al., 1991, Science 252: 668-678. Foram identificados diversos substratos proteicos intracelulares que se associam com as tirosina-quinases receptoras (RTK). Eles podem ser divididos em dois grupos principais: (1) substratos que possuem um domínio catalítico; e (2) substratos sem o referido domínio mas que servem como adaptadores e se 2 86518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ associam com moléculas cataliticamente activas. Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778. A especificidade das interacções entre os receptores ou proteínas e os domínios SH2 dos seus substratos é determinada pelos resíduos aminoácido que circundam imediatamente o resíduo tirosina fosforilado. As diferenças nas afinidades de ligação entre os domínios SH2 e as sequências de aminoácidos que circundam os resíduos fosfotirosina em receptores particulares são consistentes com as diferenças observadas nos seus perfis de fosforilação do substrato. Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778. Estas observações sugerem que a função de cada tirosina-quinase receptora é determinada não só pelo seu padrão de expressão e disponibilidade do ligando mas também pela disposição das vias de transdução do sinal para jusante que são activadas por um receptor particular. Assim, a fosforilação fornece um importante passo regulador o qual determina a selectividade das vias de sinalização recrutadas pelos receptores do factor de crescimento específicos, bem como a diferenciação dos receptores do factor.
Verificou-se que a expressão aberrante ou as mutações nas PTK conduzem quer a proliferação celular incontrolada {e.g., crescimento de tumor maligno) quer a defeitos em processos de desenvolvimento chave. Consequentemente, a comunidade biomédica despendeu recursos significativos a fim de descobrir o papel biológico específico de membros da família PTK, a sua função em processos de diferenciação, o seu envolvimento na génese tumoral e noutras doenças, os mecanismos bioquímicos subjacentes às suas vias de transdução do sinal activadas por estimulação do ligando e o desenvolvimento de novas drogas.
As tirosina-quinases podem ser do tipo receptor (possuindo domínios extracelulares, transmembrana e intracelulares) ou do tipo não receptor (sendo exclusivamente intracelulares).
Tirosina-quinases receptoras. As RTK compreendem uma numerosa família de receptores transmembrana com diferentes actividades biológicas. A função intrínseca das RTK é activada por ligação do ligando, a qual origina a fosforilação do receptor e de múltiplos substratos celulares, e subsequentemente uma diversidade de respostas celulares. Ullrich & Schlessinger, 1990, Cell 61: 203-212.
Na actualidade, foram identificadas pelo menos dezanove (19) subfamílias de RTK distintas. Verifica-se que uma subfamília de RTK, designada como a subfamília HER, é constituída por EGFR, HER2, HER3 e HER4. Os ligandos à subfamília Her de receptores
86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 3 incluem ο factor de crescimento epitelial (EGF), TGF-α, anfiregulina, HB-EGF, betacelulina e heregulina.
Uma segunda família de RTK, designada como a subfamília da insulina, é constituída por INS-R, IGF-1R e IR-R. Uma terceira família, a subfamília “PDGF” inclui os receptores α e β de PDGF, CSFIR, c-kit e FLK-II. Verifica-se que uma outra subfamília de RTK, identificada como a família FLK, é constituída pela quinase 1 de fígado fetal inserção Domínio-Receptor de quinase (KDR/FLK-1), pela quinase 4 de fígado fetal (FLK-4) e pela tirosina-quinase 1 semelhante a ftns (flt-1). Verificou-se inicialmente cada um destes receptores como sendo receptores para factores de crescimento hematopoiéticos. Duas outras subfamílias de RTK foram designadas como a família do receptor FGF (FGFR1, FGFR2, FGFR3 e FGFR4) e a subfamília Met (c-met e Ron).
Dadas as semelhanças entre as subfamílias PDGF e FLK, as duas subfamílias são muitas vezes consideradas em conjunto. As subfamílias de RTK conhecidas encontram-se identificadas em Plowman et al., 1994, DN&P 7 (6): 334-339.
Tirosina-quinases não receptoras. As tirosina-quinases não receptoras representam uma colecção de enzimas celulares os quais não possuem sequências extracelulares e transmembrana. Na actualidade, foram identificadas mais de vinte e quatro tirosina-quinases não receptoras individuais, compreendendo onze (11) subfamílias (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack e LIMK). Presentemente, a subfamília Src de tirosina-quinases não receptoras é constituída pelo maior número de PTK e inclui Scr, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr e Yrk. A subfamília Src de enzimas foi associada à oncogénese. Uma discussão mais detalhada das tirosina-quinases não receptoras é fornecida em Bolen, 1993, Oncogene 8: 2025-2031, o qual é aqui incorporado por referência.
Verificou-se que muitas das tirosina-quinases, quer uma RTK quer uma tirosina-quinase não receptora, se encontram envolvidas em vias de sinalização celular conduzindo a ensaios de sinal celular assinalando vias que conduzem a condições patogénicas, incluindo cancro, psoríase e resposta hiper imune.
Desenvolvimento de compostos para modular as PTK. Tendo em conta a importância inferida das PTK no controlo, regulação e modulação da proliferação celular e nas doenças e desordens associadas com a proliferação celular anormal, foram efectuadas muitas tentativas a fim de identificar “inibidores” da tirosina-quinase receptora e não receptora utilizando uma diversidade de abordagens, incluindo a utilização de ligandos 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 4 mutantes (Pedido U.S. N° 4966849), de receptores e anticorpos solúveis (Pedido N° WO 94/10202; Kendall & Thomas, 1994, Proc. Nat'l Acad. Sei. 90: 10705-09; Kim et al., 1993, Nature 362:841-844), ligandos de ARN (Jellinek et al., Biochemistry 33: 10450-56; Takano et al., 1993, Mol. Bio. Cell 4: 358A; Kinsella et al., 1992, Exp. Cell Res. 199: 56-62; Wright et ai, 1992, J. Cellular Phys. 152: 448-57) e inibidores da tirosina-quinase (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; Patente U.S. N° 5330992; Mariani et al, 1994, Proc. Am. Assoe. Câncer Res. 35:2268).
Mais recentemente, foram efectuadas tentativas no sentido de identificar pequenas moléculas as quais actuem como inibidores da tirosina-quinase. Por exemplo, compostos arilo bis monocíclicos, bicíclicos ou heterocíclicos (PCT WO 92/20642), derivados vinileno-azaindolo (PCT WO 94/14808) e l-ciclopropil-4-piridil-quinolonas (Patente U.S. N° 5330992) têm sido descritos, duma forma geral, como inibidores da tirosina-quinase. Compostos de estirilo (Patente U.S. N° 5217999), compostos de piridilo substituídos por estirilo (Patente U.S. N° 5302606), certos derivados de quinazolina (Pedido EP N° 0566266 Al), seleo-indolos e selenetos (PCT WO 94/03427), compostos poli-hidroxílicos tricíclicos (PCT WO 92/21660) e compostos do ácido benzilfosfónico (PCT WO 91/15495) têm sido descritos como compostos para utilização como inibidores da tirosina-quinase para utilização no tratamento do cancro. A identificação de pequenos compostos eficazes os quais inibam especificamente a transdução do sinal por modulação da actividade das tirosina-quinases receptoras e não receptoras a fim de regular e modular a proliferação celular anormal ou inapropriada é, por conseguinte, desejável e o objectivo deste invento. 3. Sumário do invento O presente invento refere-se a moléculas orgânicas capazes de modular, regular e/ou inibir a transdução do sinal da tirosina-quinase. Os referidos compostos são úteis para o tratamento de doenças relacionadas com a transdução de TKS não regulada, incluindo doenças proliferativas celulares tais como cancro, aterosclerose, artrite e re-estenose, e doenças metabólicas tal como a diabetes.
Numa concretização ilustrativa, os compostos do presente invento apresentam a fórmula: 5 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ Α
e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, em que: R,éH; R2 é O ou S; R3 é hidrogénio; R4, R5, R6, e R7 são, cada um independentemente, seleccionados a partir do grupo constituído por hidrogénio, alquilo, alcoxi, arilo, ariloxi, alcarilo, alcariloxi, halogéneo, tri-halogenometilo, S(0)R, S02NRR’, S03R, SR, N02, NRR’, OH, CN, C(0)R, 0C(0)R, NHC(0)R, (CH2)nC02R, e CONRR’; A é um anel hetero-arilo de cinco elementos seleccionado a partir do grupo constituído por tiofeno, pirrolo, pirazolo, imidazolo, 1,2,3-triazolo, 1,2,4-triazolo, oxazolo, isoxazolo, tiazolo, isotiazolo, 2-sulfonilfurano, 4-alquilfiirano, 1,2,3-oxadiazolo, 1.2.4- oxadiazolo, 1,2,5-oxadiazolo, 1,3,4-oxadiazolo, 1,2,3,4-oxatriazolo, 1,2,3,5-oxatriazolo, 1,2,3-tiadiazolo, 1,2,4-tiadiazolo, 1,2,5-tiadiazolo, 1,3,4-tiadiazolo, 1.2.3.4- tiatriazolo, 1,2,3,5-tiatriazolo, e tetrazolo, facultativamente substituído em uma ou mais posições com alquilo, alcoxi, arilo, ariloxi, alcarilo, alcariloxi, halogéneo, tri-halogenometilo, S(0)R, S02NRR\ S03R, SR, N02, NRR’, OH, CN, C(0)R, 0C(0)R, NHC(0)R, (CH2)nC02R, e CONRR’; n é 0-3; R é H, alquilo ou arilo; e R’ é H, alquilo ou arilo; em que nas definições anteriores: 6 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ alquilo refere-se a um hidrocarboneto alifático saturado de cadeia linear, ramificado ou cíclico, possuindo 1 a 12 átomos de carbono e facultativamente sendo substituído com um ou mais substituintes seleccionados a partir de hidroxi, ciano, =0, =S, N02, halogéneo, N(CH3),, amino e -SH; arilo refere-se a um grupo aromático o qual apresenta pelo menos um anel que possui um sistema de electrões pi conjugados incluindo grupos arilo carbocíclico, arilo heterocíclico e bi-arilo e sendo facultativamente substituído com um ou mais substituintes seleccionados a partir do grupo constituído por halogéneo, tri-halogenometilo, hidroxilo, SH, OH, N02, amina, tio-éter, ciano, alcoxi, alquilo, alquilo e amino; alcarilo refere-se a um alquilo que está covalentemente ligado a um grupo arilo; e alcoxi, ariloxi e alcariloxi referem-se, respectivamente, a um grupo -O-alquilo, -O-arilo e -0-alcarilo; com a condição de os compostos seguintes estarem excluídos: 3-(pirrol-2-ilmetileno)-2-indolinona; 3-(5-cloro-3,4-dimetilpirrol-2-ilmetileno)-2-indolinona; 3-(3,5-dimetil-4-etilpirrol-2-il)-2-indolinona; 3-(3,5-dimetil-4-etoxicarbonilpirrol-2-il)-2-indolinona; ácido 2-[[[l-etil-2,3-di-hidro-2-oxo-3-(lH-pirrol-2-ilmetileno)-lH-indol-5-il]oxi]-metiljbenzóico; 3-[(l-metil-5-nitro-imidazol-2-il)metileno]-2-indolinona; 3-(tien-2-ilmetileno)-2-indolinona; éster etílico do ácido 3-[(2-butil-lH-imidazol-4-il)metileno]-2,3-di-hidro-2-oxo-lH-indol-7-acético; éster etílico do ácido 3-[[2-butil-l-[(l,l-dimetiletoxi)carbonil]-lH-imidazol-4-il]-metileno]-2,3-di-hidro-2-oxo-lH-indol-7-acético; 5- benzoíl-3-[(imidazolo-2-il)metileno]-2-indolinona; 6- di-etilamino-3-[(isotiazolo-2-il)metileno]-2-indolinona; 5- cloro-3-[(tiazolo-2-il)metileno]-2-indolinona; e 6- nitro-3-[(pirrol-2-il)metileno]-2-indolinona.
Numa outra concretização ilustrativa, os compostos do presente invento apresentam a seguinte fórmula:
e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, em que:
Ri éH; R2 é 0 ou S; R3 é hidrogénio; R4, R5, R6, e R7 são, cada um independentemente, seleccionados a partir do grupo constituído por hidrogénio, alquilo, alcoxi, arilo, ariloxi, alcarilo, alcariloxi, halogéneo, tri-halogenometilo, S(0)R, S02NRR’, S03R, SR, NO:, NRR’, OH, CN, C(0)R, 0C(0)R, NHC(0)R, (CH2)nC02R, e CONRR’; A é um anel hetero-arilo de cinco elementos seleccionado a partir do grupo constituído por pirazolo, 1,2,3-triazolo, 1,2,4-triazolo, oxazolo, isoxazolo, tiazolo, isotiazolo, 2-sulfonilfurano, 4-alquilfurano, 1,2,3-oxadiazolo, 1,2,4-oxadiazolo, 1,2,5-oxadiazolo, 1.3.4- oxadiazolo, 1,2,3,4-oxatriazolo, 1,2,3,5-oxatriazolo, 1,2,3-tiadiazolo, 1,2,4-tiadiazolo, 1.2.5- tiadiazolo, 1,3,4-tiadiazolo, 1,2,3,4-tiatriazolo, 1,2,3,5-tiatriazolo, e tetrazolo, facultativamente substituído em uma ou mais posições com alquilo, alcoxi, arilo, ariloxi, alcarilo, alcariloxi, halogéneo, tri-halogenometilo, S(0)R, SO,NRR’, S03R, SR, N02, NRR’, OH, CN, C(0)R, 0C(0)R, NHC(0)R, (CH2)nC02R, e CONRR’; n é 0-3; R é H, alquilo ou arilo; e R’ é H, alquilo ou arilo; com a condição de os compostos 6-dietilamino-3-[(isotiazolo-2-il)metileno]-2-indolinona e 5-cloro-3-[(tiazolo-2-il)metileno]-2-indolinona estarem excluídos; em que, nas definições anteriores, alquilo, arilo, alcarilo, alcoxi, ariloxi e alcariloxi têm as definições tal como atribuídas acima.
86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 8 Ο presente invento é adicionalmente orientado para composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade farmaceuticamente eficaz dos compostos anteriormente descritos de fórmulas I e II e um portador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Julga-se que a referida composição modula a transdução do sinal por uma tirosina-quinase, quer por inibição da actividade catalítica, afinidade ao ATP ou capacidade para interagir com um substrato.
Mais particularmente, as composições do presente invento podem ser incluídas em métodos para o tratamento de doenças que compreendem desordens da proliferação, fíbróticas ou metabólicas, por exemplo cancro, fibrose, psoríase, aterosclerose, artrite, e outras desordens relacionadas com a vasculogénese e/ou a angiogénese anormal, tal como a retinopatia diabética. 4. Descrição detalhada do invento 4.1. Definições “Sal farmaceuticamente aceitável” refere-se àqueles sais que retêm a eficácia biológica e as propriedades das bases livres e os quais são obtidos por reacção com ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfiírico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido metano-sulfónico, ácido etano-sulfónico, ácido p-tolueno-sulfónico, ácido salicílico e similares. “Alquilo” refere-se a um hidrocarboneto alifático saturado de cadeia linear, ramificado ou cíclico. Preferencialmente, o grupo alquilo possui 1 a 12 carbonos. Mais preferencialmente, é um alquilo inferior de 1 a 7 carbonos, mais preferencialmente de 1 a 4 carbonos. Grupos alquilo típicos incluem metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, butilo terciário, pentilo, hexilo e similares. O grupo alquilo pode ser facultativamente substituído com um ou mais substituintes seleccionados a partir do grupo constituído por hidroxilo, ciano, alcoxi, =0, =S, N02, halogéneo, N(CH,),, amino, e SH. “Alcenilo” refere-se a um grupo hidrocarboneto não saturado de cadeia linear, ramificado ou cíclico contendo pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono. Preferencialmente, o grupo alcenilo possui 1 a 12 carbonos. Mais preferencialmente, é um alcenilo inferior de 1 a 7 carbonos, mais preferencialmente de 1 a 4 carbonos. O grupo alcenilo pode ser facultativamente substituído com um ou mais substituintes seleccionados a 9 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ partir do grupo.constituído por hidroxilo, ciano, alcoxi, =0, =S, NO,, halogéneo, N(CH3),, amino, e SH. “Alcinilo” refere-se a um hidrocarboneto não saturado de cadeia linear, ramificado ou cíclico contendo pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono. Preferencialmente, o grupo alcinilo possui 1 a 12 carbonos. Mais preferencialmente, é um alcinilo inferior de 1 a 7 carbonos, mais preferencialmente de 1 a 4 carbonos. O grupo alcinilo pode ser facultativamente substituído com um ou mais substituintes seleccionados a partir do grupo constituído por hidroxilo, ciano, alcoxi, =0, =S, NO,, halogéneo, N(CH3)2, amino, e SH. “Alcoxi” refere-se a um grupo “-O-alquilo”. “Arilo” refere-se a um grupo aromático o qual apresenta pelo menos um anel que possui um sistema de electões pi conjugado e inclui grupos arilo carbocíclico, arilo heterocíclico e bi-arilo. 0 grupo arilo pode ser facultativamente substituído com um ou mais substituintes seleccionados a partir do grupo constituído por halogéneo, tri-halogenometilo, hidroxilo, SH, OH, NO,, amina, tio-éter, ciano, alcoxi, alquilo, e amino. “Alcarilo” refere-se a um alquilo que se encontra covalentemente unido a um grupo arilo. Preferencialmente, o alquilo é um alquilo inferior. “Arilo carbocíclico” refere-se a um grupo arilo em que os átomos do anel são carbono. “Arilo heterocíclico” refere-se a um grupo arilo que possui de 1 a 3 hetero-átomos como átomos do anel, sendo carbono os restantes átomos do anel. Os hetero-átomos incluem oxigénio, enxofre, e azoto. Assim, grupos arilo heterocíclicos preferidos incluem furanilo, tienilo, piridilo, pirrolilo, N-alquilo inferior pirrolo, pirimidilo, pirazinilo, imidazolilo e similares. “Amida” refere-se a -C(0)-NH-R, onde R é alquilo, arilo, alquilarilo ou hidrogénio. “Tio-amida” refere-se a -C(S)-NH-R, onde R é alquilo, arilo, alquilarilo ou hidrogénio. “Amina” refere-se a um grupo -N(R’)R”, onde R’ e R” são independentemente seleccionados a partir do grupo constituído por alquilo, arilo, e alquilarilo.
86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 10 “Tio-éter” refere-se a -S-R, onde R é alquilo, arilo, ou alquilarilo “Sulfonilo” refere-se a -S(0),-R, onde R é arilo, C(CN)=C-arilo, CH,CN, alquilarilo, sulfonamida, NH-alquilo, NH-alquilarilo, ou NH-arilo. 4.2. O invento O presente invento refere-se a compostos capazes de regular e/ou modular a transdução do sinal da tirosina-quinase e mais particularmente a transdução do sinal da tirosina-quinase receptora e não receptora. A transdução do sinal mediada pela tirosina-quinase receptora é iniciada pela interacção extracelular com um factor de crescimento específico (ligando), seguida pela dimerização do receptor, estimulação transitória da actividade intrínseca da tirosina-quinase proteica e fosforilação. Deste modo, locais de ligação para moléculas de transdução do sinal intracelular são criados e induzem a formação de complexos com um espectro de moléculas sinalizadoras citoplasmáticas que facilitam a resposta celular apropriada (e.g., divisão celular, efeitos metabólicos para o microambiente extracelular). Ver, Schlessinger e Ullrich, 1992, Neuron 9:383-391.
Verificou-se que os locais de fosforilação da tirosina nos receptores para o factor de crescimento actuam como locais de ligação de afinidade elevada para os domínios SH2 (homologia src) das moléculas sinalizadoras. Fantl et al., 1992, Cell 69: 413-423; Songyang et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14: 2777-2785; Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778; e Koch et al., 1991, Science 252: 668-678. Foram identificados diversos substratos proteicos intracelulares que se associam com as tirosina-quinases receptoras. Eles podem ser divididos em dois grupos principais: (1) substratos que possuem um domínio catalítico; e (2) substratos sem o referido domínio mas que servem como adaptadores e se associam com moléculas cataliticamente activas. Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778. A especificidade das interacções entre os receptores e os domínios SH2 dos seus substratos é determinada pelos resíduos amino-ácido que circundam imediatamente o resíduo tirosina fosforilado. As diferenças nas afinidades de ligação entre os domínios SH2 e as sequências de aminoácidos que circundam os resíduos fosfotirosina em receptores particulares são consistentes com as diferenças observadas nos seus perfis de fosforilação do substrato. Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778. Estas observações sugerem que a função de cada tirosina-quinase receptora é determinada não só pelo seu padrão de expressão e disponibilidade do ligando mas também pela disposição das vias de transdução do sinal para jusante que são activadas
86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 11 por um receptor particular. Assim, a fosforilação fornece um importante passo regulador o qual determina a selectividade das vias de sinalização recrutadas por receptores do factor de crescimento específicos, bem como a diferenciação de receptores do factor. A transdução do sinal da tirosina-quinase origina, entre outras respostas, a proliferação, a diferenciação e o metabolismo celular. A proliferação celular anormal pode resultar numa ampla colecção de desordens e doenças, incluindo o desenvolvimento de neoplasia como carcinoma, sarcoma, leucemia, glioblastoma, hemangioma, psoríase, arteriosclerose, artrite e retinopatia diabética (ou outras desordens relacionadas com a angiogénese e/ou a vasculogénese incontrolada).
Este invento encontra-se, por conseguinte, orientado para compostos os quais regulam, modulam e/ou inibem a transdução do sinal da tirosina-quinase ao afectarem a actividade enzimática das RTK e/ou das tirosina-quinases não receptoras e ao interferirem com o sinal transduzido pelas referidas proteínas. Mais particularmente, o presente invento encontra-se orientado para compostos os quais regulam, modulam e/ou inibem as vias de transdução do sinal mediadas pela RTK e/ou pela tirosina-quinase não receptora como uma abordagem terapêutica para a cura de leucemia e de muitos tipos de tumores sólidos, incluindo mas não se encontrando limitados a carcinoma, sarcoma, eritroblastoma, glioblastoma, meningioma, astrocitoma, melanoma e mioblastoma. As indicações podem incluir, mas não se encontram limitadas a cancros cerebrais, cancro vesicais, cancros ováricos, cancros gástricos, cancros pancreáticos, cancros eólicos, cancros pulmonares e cancros ósseos. 4.3. Os compostos
Numa concretização, o invento proporciona compostos que apresentam a fórmula:
A
e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, em que:
86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ
Ri é Η; R, é Ο ou S; R3 é hidrogénio; R4, Rs, R6, e R7 são, cada um independentemente, seleccionados a partir do grupo constituído por hidrogénio, alquilo, alcoxi, arilo, ariloxi, alcarilo, alcariloxi, halogéneo, tri-halogenometilo, S(0)R, SO:NRR\ S03R, SR, NO:, NRR’, OH, CN, C(0)R, 0C(0)R, NHC(0)R, (CH2)nC02R, e CONRR’; A é um anel hetero-arilo de cinco elementos seleccionado a partir do grupo constituído por tiofeno, pirrolo, pirazolo, imidazolo, 1,2,3-triazolo, 1,2,4-triazolo, oxazolo, isoxazolo, tiazolo, isotiazolo, 2-sulfonilfurano, 4-alquilfurano, 1,2,3-oxadiazolo, 1.2.4- oxadiazolo, 1,2,5-oxadiazolo, 1,3,4-oxadiazolo, 1,2,3,4-oxatriazolo, 1,2,3,5-oxatriazolo, 1,2,3-tiadiazolo, 1,2,4-tiadiazolo, 1,2,5-tiadiazolo, 1,3,4-tiadiazolo, 1.2.3.4- tiatriazolo, 1,2,3,5-tiatriazolo, e tetrazolo, facultativamente substituído em uma ou mais posições com alquilo, alcoxi, arilo, ariloxi, alcarilo, alcariloxi, halogéneo, tri-halogenometilo, S(0)R, S02NRR’, S03R, SR, NO:, NRR’, OH, CN, C(0)R, 0C(0)R, NHC(0)R, (CH2)nC02R, e CONRR’; n é 0-3; R é H, alquilo ou arilo; e R’ é H, alquilo ou arilo; em que, nas definições anteriores: alquilo refere-se a um hidrocarboneto alifático saturado de cadeia linear, ramificado ou cíclico, possuindo 1 a 12 átomos de carbono e facultativamente sendo substituído com um ou mais substituintes seleccionados a partir de hidroxi, ciano, =0, =S, NO:, halogéneo, N(CH3)2, amino e -SH; arilo refere-se a um grupo aromático o qual apresenta pelo menos um anel que possui um sistema de electões pi conjugado incluindo grupos arilo carbocíclico, arilo heterocíclico e bi-arilo e sendo facultativamente substituído com um ou mais substituintes seleccionados a 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 13 ί/-~ partir do grupo constituído por halogéneo, tri-halogenometilo, hidroxilo, SH, OH, N02, amina, tio-éter, ciano, alcoxi, alquilo, alquilo e amino; alcarilo refere-se a um alquilo que está covalentemente ligado a um grupo arilo; e alcoxi, ariloxi e alcariloxi referem-se, respectivamente, a um grupo -O-alquilo, -O-arilo e -O-alcarilo; com a condição de estarem excluídos os compostos seguintes: 3-(pirrol-2-ilmetileno)-2-indolinona; 3-(5-cloro-3,4-dimetilpirrol-2-ilmetileno)-2-indolinona; 3-(3,5-dimetil-4-etilpirrol-2-il)-2-indolinona; 3-(3,5-dimetil-4-etoxicarbonilpirrol-2-il)-2-indolinona; ácido 2-[[[l-etil-2,3-di-hidro-2-oxo-3-(lH-pirrol-2-ilmetileno)-lH-indol-5-il]oxi]-metil]-benzóico; 3-[(l-metil-5-nitro-imidazol-2-il)metileno]-2-indolinona; 3-(tien-2-ilmetileno)-2-indolinona; éster etílico do ácido 3-[(2-butil-lH-imidazol-4-il)metileno]-2,3-di-hidro-2-oxo-lH-indol-7-acético; éster etílico do ácido 3-[[2-butil-l-[(l,l-dimetiletoxi)carbonil]-lH-imidazol-4-il]-metileno]-2,3-di-hidro-2-oxo-lH-indol-7-acético; 5- benzoíl-3-[(imidazolo-2-il)metileno]-2-indolinona; 6- di-etilamino-3-[(isotiazolo-2-il)metileno]-2-indolinona; 5- cloro-3-[(tiazolo-2-il)metileno]-2-indolinona; e 6- nitro-3-[(pirrol-2-il)metileno]-2-indolinona.
Numa outra concretização, o invento fornece compostos da fórmula:
86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 14 e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, em que R, é H; R, é O ou S; R3 é hidrogénio; R4, R5, R6, e R7 são, cada um independentemente, seleccionados a partir do grupo constituído por hidrogénio, alquilo, alcoxi, arilo, ariloxi, alcarilo, alcariloxi, halogéneo, tri-halogenometilo, S(0)R, SO,NRR’, S03R, SR, NO,, NRR’, OH, CN, C(0)R, 0C(0)R, NHC(0)R, (CH2)nC02R, e CONRR’; A é um anel hetero-arilo de cinco elementos seleccionado a partir do grupo constituído por pirazolo, 1,2,3-triazolo, 1,2,4-triazolo, oxazolo, isoxazolo, tiazolo, isotiazolo, 2-sulfonilfíirano, 4-alquilfurano, 1,2,3-oxadiazolo, 1,2,4-oxadiazolo, 1,2,5-oxadiazolo, 1.3.4- oxadiazolo, 1,2,3,4-oxatriazolo, 1,2,3,5-oxatriazolo, 1,2,3-tiadiazolo, 1,2,4-tiadiazolo, 1.2.5- tiadiazolo, 1,3,4-tiadiazolo, 1,2,3,4-tiatriazolo, 1,2,3,5-tiatriazolo, e tetrazolo, facultativamente substituído em uma ou mais posições com alquilo, alcoxi, arilo, ariloxi, alcarilo, alcariloxi, halogéneo, tri-halogenometilo, S(0)R, SO,NRR’, S03R, SR, NO,, NRR’, OH, CN, C(0)R, 0C(0)R, NHC(0)R, (CH,)nCO,R, e CONRR’; n é 0-3; R é H, alquilo ou arilo; e R’ é H, alquilo ou arilo; com a condição de os compostos 6-dietilamino-3-[(isotiazolo-2-il)metileno]-2-indolinona e 5-cloro-3-[(tiazolo-2-il)metileno]-2-indolinona estarem excluídos; em que, nas definições anteriores, alquilo, arilo, alcarilo, alcoxi, ariloxi e alcariloxi têm as definições tal como atribuídas acima.
As fórmulas químicas aqui referidas podem exibir o fenómeno do tautomerismo ou do isomerismo estrutural. Por exemplo, os compostos aqui descritos podem adoptar uma conformação cis ou trans na ligação dupla que conecta o substituinte 3 da indolina ao anel indolinona, ou podem ser misturas dos isómeros cis e trans. Dado que o desenho das 15 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ fórmulas nesta descrição apenas pode representar uma possível forma tautomérica ou isomérica estrutural, deverá ser compreendido que o invento abrange qualquer forma tautomérica ou isomérica estrutural, ou suas misturas, as quais possuam a capacidade de regular, inibir e/ou modular a transdução do sinal da tirosina-quinase ou a proliferação celular, e não se encontra limitado a qualquer forma tautomérica ou isomérica estrutural utilizada no desenho das fórmulas.
Para além dos compostos acima descritos e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, o invento encontra-se adicionalmente orientado, onde aplicável, para formas solvatadas bem como não solvatadas dos compostos (e.g., formas hidratadas) que possuam a capacidade de regular e/ou modular a proliferação celular.
Os compostos aqui descritos podem ser preparados por qualquer processo conhecido como sendo aplicável à preparação de compostos quimicamente relacionados. Processos adequados encontram-se ilustrados nos exemplos. Os materiais de partida necessários podem ser obtidos por processos padronizados de química orgânica. A actividade e a eficácia relativas de um composto individual como um agente para afectar a transdução do sinal mediada pela tirosina-quinase receptora podem ser determinadas utilizando técnicas disponíveis. Preferencialmente, um composto é submetido a uma série de análises a fim de determinar a capacidade do composto para modular, regular e/ou inibir a proliferação celular. Estas análises, na ordem pela qual elas são realizadas, incluem ensaios bioquímicos, ensaios de crescimento celular e experiências in vivo. 4.4, Indicações
Os compostos aqui descritos são úteis para o tratamento de desordens relacionadas com a transdução do sinal da tirosina-quinase não regulada, incluindo desordens proliferativas celulares, desordens fibróticas e desordens metabólicas.
As desordens proliferativas celulares, as quais podem ser tratadas ou adicionalmente estudadas pelo presente invento, incluem cancros, desordens proliferativas dos vasos sanguíneos e desordens proliferativas das células mesangiais.
As desordens proliferativas dos vasos sanguíneos referem-se a desordens angiogénicas e vasculogénicas que, duma forma geral, têm como consequência a proliferação anormal de vasos sanguíneos. A formação e o alastramento de vasos sanguíneos, ou 16 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ vasculogénese e angiogénese, respectivamente, desempenham papéis importantes numa diversidade de processos fisiológicos tais como o desenvolvimento embrionário, a formação do corpo lúteo, a cicatrização de feridas e a regeneração de órgãos. Também desempenham um papel fulcral no desenvolvimento do cancro. Outros exemplos de desordens da proliferação dos vasos sanguíneos incluem a artrite, onde novos vasos sanguíneos capilares invadem a articulação e destroem a cartilagem, e doenças oculares, como a retinopatia diabética, onde novos capilares na retina invadem o vítreo, sangram e provocam cegueira. Inversamente, também se encontram implicadas desordens relacionadas com a retracção, contracção ou encerramento de vasos sanguíneos, tal como a re-estenose.
As desordens fibróticas referem-se à formação anormal de matriz extracelular. Exemplos de desordens fibróticas incluem a cirrose hepática e desordens proliferativas das células mesangiais. A cirrose hepática é caracterizada pelo aumento dos constituintes da matriz extracelular originando a formação de uma cicatriz hepática. A cirrose hepática pode causar doenças como a cirrose do fígado. Uma matriz extracelular aumentada tendo como resultado uma cicatriz hepática também pode ser provocada por uma infecção virai como a hepatite. Os lipócitos parecem desempenhar um papel importante na cirrose hepática. Outras desordens fibróticas envolvidas incluem a aterosclerose (ver, abaixo).
As desordens proliferativas das células mesangiais referem-se a desordens ocasionadas pela proliferação anormal de células mesangiais. As desordens proliferativas mesangiais incluem diversas doenças renais humanas, tais como a glomerulonefrite, a nefropatia diabética, a nefrosclerose maligna, as síndromes de micro-angiopatia trombótica, a rejeição de transplantes, e as glomerulopatias. O PDFG-R foi implicado na manutenção da proliferação das células mesangiais. Floege et al., 1993, Kiclney International 43: 47S-54S.
As PTK foram associadas com as referidas desordens proliferativas. Por exemplo, alguns membros da família das RTK foram associados com o desenvolvimento de cancro. Alguns destes receptores, como o EGFR (Tuzi et al., 1991, Br. J. Câncer 63: 227-233; Torp et al., 1992, APMIS 100: 713-719), o HER2/neu (Slamon et ai, 1989, Science 244: 707-712) e o PDGF-R (Kumabe et al., 1992, Oncogene 7: 627-633), encontram-se sobre-expressos em muitos tumores e/ou persistentemente activados por alças autócrinas. Na realidade, nos cancros mais comuns e graves foram demonstradas estas sobre-expressões do receptor (Akbasak e Suner-Akbasak et al., 1992, J. Neurol. Sei. 111: 119-133; Dickson et al., 1992, Câncer Treatment Res. 61: 249-273; Korc et al., 1992, J. Clin. Invest. 90:1352-1360) e alças autócrinas (Lee e Donoghue, 1992, J. Cell. Biol. 118: 1057-1070; Korc et al., supra; Akbasak e Suner-Akbasak et al.. supra). Por exemplo, o receptor EGFR tem sido associado
86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ com ο carcinoma de células escamosas, o asírocitoma, o glioblastoma, o cancro da cabeça e do pescoço, o cancro do pulmão e o cancro da bexiga. O HER2 tem sido associado com o cancro da mama, do ovário, do estômago, do pulmão, do pâncreas e da bexiga. O PDGF-R tem sido associado com o glioblastoma e o cancro do pulmão, do ovário, da próstata e o melanoma. A RTK c-met tem sido geralmente associada com a hepatocarcinogénese e, desse modo, com o carcinoma hepato-celular. Adicionalmente, a c-met tem sido ligada à formação do tumor maligno. Mais especificamente, a RTK c-met tem sido associada, entre outros cancros, com o carcinoma colo-rectal, tiroideu, pancreático e gástrico, a leucemia e o linfoma. Adicionalmente, a sobre-expressão do gene c-met tem sido detectada em doentes com doença de Hodgkin, doença de Burkitts, e a linha de células do linfoma. O IGF-IR, para além de estar implicado no suporte nutricional e na diabetes tipo II, também foi associado a vários tipos de cancros. Por exemplo, o IGF-I tem sido implicado como um estimulador do crescimento autócrino para diversos tipos de tumor, e.g. as células de carcinoma humano da mama (Arteaga et al, 1989, J. Clin. Invest. 84: 1418-1423) e o tumor de pequenas células do pulmão (Macauley et al., 1990, Câncer Res. 50: 2511-2517). Além disso, o IGF-I, integralmente envolvido no crescimento e na diferenciação normais do sistema nervoso, parece ser um estimulador autócrino dos gliomas humanos. Sandberg-Nordqvist et al., 1993, Câncer Res. 53: 2475-2478. A importância do IGF-IR e dos seus ligandos na proliferação celular é adicionalmente sustentada pelo facto de muitos tipos de células em cultura (fibroblastos, células epiteliais, células musculares lisas, linfócitos T, células mielóides, condrócitos, osteoblastos, as células precursoras da médula óssea) serem estimuladas a crescer pelo IGF-I. Goldring e Goldring, 1991, Eukaryotic Gene Expression 1: 301-326. Numa série de publicações recentes, Baserga chega a sugerir que o IGF-I-R desempenha um papel central nos mecanismos de transformação e, como tal, poderia ser um alvo preferido para as intervenções terapêuticas num largo espectro de tumores malignos humanos. Baserga, 1995, Câncer Res. 55: 249-252; Baserga, 1994, Cell 79: 927-930; Coppola etal., 1994,Mol. Cell. Biol. 14: 4588-4595. A associação entre anomalias nas RTK e a doença não se encontra, no entanto, confinada ao cancro. Por exemplo, as RTK têm sido associadas com doenças metabólicas como a psoríase, a diabetes mellitus, a cicatrização de feridas, a inflamação e doenças neurodegenerativas. Por exemplo, o EGF-R encontra-se implicado na cicatrização de feridas da cómea e da derme. Deficiências no Insulina-R e no IGF-IR encontram-se implicadas na diabetes mellitus tipo II. Uma correlação mais completa entre RTK específicas e as suas indicações terapêuticas encontra-se exposta em Plowman et al., 1994, DN&P 7: 334-339.
86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 18 Não só as tirosina-quinases do tipo receptor, mas também muitas tirosina-quinases celulares (CTK) incluindo src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lck, blk, hck, fgr, yrk (revisto por Bolen et al., 1992, FASEB J. 6:3403-3409), encontram-se envolvidas na via de transdução do sinal proliferativo e metabólico e, desse modo, nas indicações do presente invento. Por exemplo, o src mutado (v-src) foi demonstrado como sendo uma oncoproteína (pp60vsrc) na galinha. Além disso, o seu homólogo celular, o proto-oncogene pp60csrc transmite sinais oncogénicos de muitos receptores. Por exemplo, a sobre-expressão do EGF-R ou do HER2/neu em tumores conduz à activação constitutiva do pp60C:!rc, o qual é característico para a célula maligna mas se encontra ausente na célula normal. Por outro lado, ratinhos deficientes para a expressão do c-src exibem um fenótipo osteopétrico, indicando uma participação chave do c-src na função do osteoclasto e um possível envolvimento em desordens relacionadas. De forma semelhante, o Zap 70 está implicado na sinalização da célula T.
Além disso, é um aspecto do presente invento a identificação de compostos para modulação da CTK a fim de aumentar ou mesmo actuar em sinergia com os bloqueantes da RTK visados.
Finalmente, quer as RTK quer as quinases do tipo não receptor têm sido conectadas com desordens hiper-imunes. 4.5, Formulações farmacêuticas e vias de administração
Os compostos aqui descritos podem ser administrados a um doente humano per se, ou em composições farmacêuticas onde são misturados com portadores ou excipientes adequados. As técnicas para a formulação e administração dos compostos do actual pedido podem ser encontradas em “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, edição mais recente. 4,5.1. Vias de administração
Vias de administração adequadas podem, por exemplo, incluir a administração oral, rectal, transmucosa ou intestinal; a distribuição parentérica, incluindo injecções intramusculares, subcutâneas, intramedulares, bem como injecções intratecais, intraventriculares directas, endovenosas, intraperitoneais, intranasais, ou intra-oculares. 86518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 19
Altemativamente, ο composto pode ser administrado duma forma local em vez de numa maneira sistémica, por exemplo, por meio da injecção do composto directamente num tumor sólido, muitas vezes numa formulação em depósito ou de libertação sustentada.
Além disso, a droga pode ser administrada num sistema de distribuição da droga direccionada, por exemplo, num lipossoma revestido com anticorpo específico para o tumor. Os lipossomas serão direccionados e selectivamente incorporados pelo tumor. 4.5.2. Composicão/Formulacão
As composições farmacêuticas do presente invento podem ser produzidas duma forma que é conhecida por si própria, e.g. por meio de processos de mistura, dissolução, granulação, preparação de drageias, levigação, emulsificação, encapsulação, encarceramento ou liofilização convencionais.
As composições farmacêuticas para utilização de acordo com o presente invento podem, desse modo, ser formuladas da forma convencional utilizando um ou mais portadores fisiologicamente aceitáveis compreendendo excipientes e auxiliares, os quais facilitam o processamento dos compostos activos em preparações, as quais podem ser utilizadas farmaceuticamente. A formulação correcta encontra-se dependente da via de administração escolhida.
Para injecção, os agentes do invento podem ser formulados em soluções aquosas, preferencialmente em tampões fisiologicamente compatíveis como solução de Hanks, solução de Ringer, ou tampão salino fisiológico. Para a administração transmucosa, são utilizados na formulação penetrantes apropriados à barreira a ser permeada. Os referidos penetrantes são, duma forma geral, conhecidos na arte.
Para a administração oral, os compostos podem ser prontamente formulados pela combinação dos compostos activos com portadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na arte. Os referidos portadores permitem que os compostos do invento sejam formulados sob a forma de comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, líquidos, geles, xaropes, pastas, suspensões e similares, para a ingestão oral por parte de um doente a ser tratado. As preparações farmacêuticas para utilização oral podem ser obtidas por combinação dos compostos activos com um excipiente sólido, facultativamente com trituração da mistura resultante, e processamento da mistura de grânulos, após a adição de auxiliares adequados, se desejado, a fim de obter comprimidos ou núcleos de drageia. Excipientes adequados são, em f 86 518
EP 0 769 947 / PT 20 particular, cargas como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol, ou sorbitol; preparações de celulose tais como, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma adragante, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, e/ou polivinilpirrolidona (PVP). Se desejado, podem ser adicionados agentes desintegradores, tais como polivinilpirrolidona reticulada, agar, ou ácido algínico ou um seu sal tal como alginato de sódio.
Os núcleos de drageia são fornecidos com revestimentos adequados. Para este fim, podem ser utilizadas soluções concentradas de açúcar, as quais podem facultativamente conter goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, carbopol gel, polietilenoglicol, e/ou dióxido de titânio, soluções de verniz, e misturas solventes ou solventes orgânicos adequados. Matérias corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos comprimidos ou ao revestimento das drageias para identificação ou para caracterizar diferentes combinações de doses do composto activo.
As preparações farmacêuticas as quais podem ser utilizadas oralmente incluem cápsulas de encaixe feitas de gelatina, bem como cápsulas moles seladas feitas de gelatina e de um plasticizante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de encaixe podem conter os ingredientes activos em mistura com uma carga, tal como lactose, ligantes tais como amidos, e/ou lubrificantes tais como talco ou estearato de magnésio e, facultativamente, estabilizadores. Nas cápsulas moles, os compostos activos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos gordos, parafina líquida, ou polietilenoglicóis líquidos. Além disso, podem ser adicionados estabilizadores. Todas as formulações para administração oral devem encontrar-se em dosagens adequadas para a referida administração.
Para administração bocal, as composições podem assumir a forma de comprimidos ou pastilhas, formulados da maneira convencional.
Para administração por inalação, os compostos para utilização de acordo com o presente invento são convenientemente distribuídos sob a forma de uma apresentação em pulverização de aerosol a partir de embalagens pressurizadas ou de um nebulizador, com a utilização de um propulsor adequado, e.g. diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluorometano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerosol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada pelo fornecimento de uma válvula a fim de distribuir uma quantidade doseada. Podem ser formuladas cápsulas e cartuchos de, 21 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ e.g., gelatina, para utilização num inalador ou insuflador, contendo uma mistura em pó do composto e de uma base em pó adequada tal como lactose ou amido.
Os compostos podem ser formulados para administração parentérica por injecção, e.g. por injecção em bólus ou em infusão contínua. As formulações para injecção podem ser apresentadas sob a forma de uma dosagem unitária, e.g. em ampolas ou recipientes multi-dose, com um conservante adicionado. As composições podem assumir tais formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes formulatórios tais como agentes suspensores, estabilizadores e/ou dispersivos.
As formulações farmacêuticas para administração parentérica incluem soluções aquosas dos compostos activos sob a forma solúvel em água. Adicionalmente, suspensões dos compostos activos podem ser preparadas sob a forma de suspensões oleosas apropriadas para injecção. Veículos ou solventes lipofilicos adequados incluem óleos gordos como óleo de sésamo, ou ésteres de ácidos gordos sintéticos, tais como oleato de etilo ou triglicéridos, ou lipossomas. As suspensões aquosas para injecção podem conter substâncias as quais aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol ou dextrano. Facultativamente, as suspensões também podem conter estabilizadores ou agentes adequados os quais aumentam a solubilidade dos compostos a fim de permitir a preparação de soluções altamente concentradas.
Altemativamente, o ingrediente activo pode encontrar-se sob a forma de um pó para constituição com um veículo adequado, e.g., água estéril isenta de pirogénio, antes da utilização.
Os compostos também podem ser formulados em composições rectais tais como supositórios ou enemas de retenção, e.g., contendo bases convencionais para supositório tais como manteiga de cacau ou outros glicéridos.
Para além das formulações anteriormente descritas, os compostos também podem ser formulados como uma preparação em depósito. As referidas formulações de actuação prolongada podem ser administradas por implantação (por exemplo, subcutânea ou intramuscularmente) ou por injecção intramuscular. Assim, por exemplo, os compostos podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrófobos adequados (por exemplo sob a forma de uma emulsão num óleo aceitável) ou com resinas permutadoras de iões, ou como derivados pouco solúveis, por exemplo, um sal pouco solúvel. ί i
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Um portador farmacêutico para compostos hidrófobos do invento é um sistema co-solvente compreendendo álcool benzílico, um tensioactivo não polar, um polímero orgânico miscível com a água, e uma fase aquosa. O sistema co-solvente pode ser o sistema co-solvente VPD. VPD é uma solução de 3% p/v de álcool benzílico, 8% p/v do tensioactivo não polar Polysorbate 80, e 65% p/v de polietilenoglicol 300, preparado até ao volume em etanol absoluto. O sistema co-solvente VPD (VPD:D5W) é constituído por VPD diluído a 1:1 com uma solução de dextrose a 5% em água. Este sistema co-solvente dissolve bem os compostos hidrófobos, e ele próprio produz baixa toxicidade após administração sistémica. Naturalmente, as proporções de um sistema co-solvente podem variar consideravelmente sem destruir as suas características de solubilidade e toxicidade. Além disso, a identidade dos componentes do co-solvente pode variar: por exemplo, podem ser utilizados outros tensioactivos não polares de baixa toxicidade em vez do Polysorbate 80; o tamanho da fracção de polietilenoglicol pode variar; outros polímeros biocompatíveis podem substituir o polietilenoglicol, e.g., polivinilpirrolidona; e outros açúcares ou polissacáridos podem substituir a dextrose.
Altemativamente, podem ser empregues outros sistemas de distribuição para compostos farmacêuticos hidrófobos. Os lipossomas e as emulsões são exemplos bem conhecidos de veículos ou portadores de distribuição para drogas hidrófobas. Também podem ser empregues certos solventes orgânicos tal como o dimetilsulfóxido, embora habitualmente à custa de maior toxicidade. Adicionalmente, os compostos podem ser distribuídos utilizando um sistema de libertação sustentada, como matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrófobos sólidos contendo o agente terapêutico. Diversos materiais de libertação sustentada foram determinados e são bem conhecidos pelos especialistas na arte. Cápsulas de libertação sustentada podem, dependendo da sua natureza química, libertar os compostos ao longo de algumas semanas até mais de 100 dias. Dependendo da natureza química e da estabilidade biológica do reagente terapêutico, podem ser empregues estratégias adicionais para estabilização proteica.
As composições farmacêuticas também podem compreender portadores ou excipientes em fase sólida ou de gel adequados. Exemplos dos referidos portadores ou excipientes incluem, mas não se encontram limitados a carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, diversos açúcares, amidos, derivados da celulose, gelatina, e polímeros tais como polietilenoglicóis.
Muitos dos compostos do invento para modulação da PTK podem ser fornecidos como sais com contra-iões farmaceuticamente compatíveis. Sais farmaceuticamente
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23 compatíveis podem ser formados com muitos ácidos, incluindo mas não se erreontranao limitados a ácido clorídrico, sulfurico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Os sais tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos ou outros solventes protónicos do que são as formas de base livre correspondentes. 4.5.3. Dosagem eficaz
As composições farmacêuticas adequadas para utilização no presente invento incluem composições nas quais os ingredientes activos se encontram contidos numa quantidade eficaz para alcançar o objectivo pretendido. Mais especificamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade de composto efectiva para prevenir, aliviar ou melhorar sintomas de doença ou prolongar a sobrevivência do sujeito a ser tratado. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz situa-se bem dentro da capacidade dos especialistas na arte, especialmente tendo como base a descrição detalhada aqui fornecida.
Para qualquer composto utilizado nos métodos do invento, a dose terapeuticamente eficaz pode ser inicialmente estimada a partir de ensaios de cultura de células. Por exemplo, uma dose pode ser formulada em modelos animais a fim de obter uma gama de concentrações circulantes que inclua a IC50 tal como determinada em cultura de células (isto é, a concentração do composto em teste a qual atinge metade da inibição máxima da actividade da PTK). A referida informação pode ser utilizada a fim de determinar duma forma mais precisa doses úteis em humanos. A toxicidade e a eficácia terapêutica dos compostos aqui descritos pode ser determinada por processos farmacêuticos padronizados em culturas de células ou em animais experimentais, e.g., para determinação da LD50 (a dose letal para 50% da população) e da ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A proporção entre as doses dos efeitos tóxico e terapêutico é o índice terapêutico e pode ser expresso como a razão entre a LD50 e a EDS0. São preferidos os compostos que apresentam índices terapêuticos elevados. Os dados obtidos a partir destes ensaios de cultura de células e destes estudos animais podem ser utilizados na formulação de uma gama de dosagens para utilização em humanos. A dosagem dos referidos compostos situa-se preferencialmente dentro de uma gama de concentrações circulantes que inclui a ED50 com pequena ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta gama dependendo da forma de dosagem empregue e da via de administração utilizada. A formulação exacta, a via de administração e a dosagem podem
24 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ ser escolhidas pelo médico individual tendo em conta as condições do doente. (Ver, e.g., Fingi et al., 1975, em “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Cap. 1, pág. 1). A quantidade e o intervalo de dosagem podem ser ajustados individualmente a fim de proporcionar níveis plasmáticos da porção activa os quais sejam suficientes para manter os efeitos de modulação da quinase, ou a concentração eficaz mínima (MEC). A MEC variará para cada composto mas pode ser estimada a partir de dados in vitro\ e.g., a concentração necessária para obter 50-90% de inibição da quinase utilizando os ensaios aqui descritos. As dosagens necessárias para obter a MEC dependerão das características individuais e da via de administração. No entanto, ensaios de HPLC ou bio-ensaios podem ser utilizados a fim de determinar concentrações plasmáticas.
Os intervalos de dosagem podem ser determinados utilizando o valor da MEC. O composto deve ser administrado utilizando um regime o qual mantém níveis plasmáticos acima da MEC durante 10-90% do tempo, preferencialmente entre 30-90% e o mais preferencialmente entre 50-90%.
No caso de administração local ou de incorporação selectiva, a concentração local eficaz da droga pode não se encontrar relacionada com a concentração plasmática. A quantidade de composição administrada deverá, evidentemente, ser dependente do sujeito a ser tratado, do peso do sujeito, da gravidade da doença, da forma de administração e do julgamento do médico prescritor. 4.5.4. Embalagem
As composições podem, se desejado, ser apresentadas numa embalagem ou dispositivo distribuidor o qual pode conter uma ou mais formas de dosagem unitária contendo o ingrediente activo. A embalagem pode, por exemplo, incluir folha metálica ou plástica, tal com uma embalagem em “Mister”. A embalagem ou dispositivo distribuidor pode ser acompanhado por instruções para a administração. Também podem ser preparadas composições compreendendo um composto do invento formuladas num portador farmacêutico compatível, colocadas num recipiente apropriado, e rotuladas para o tratamento de uma condição indicada. Condições adequadas indicadas no rótulo podem incluir o tratamento de um tumor, inibição da angiogénese, tratamento de fibrose, diabetes e similares.
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25 5. EXEMPLO: Síntese do composto
Os compostos do presente invento podem ser sintetizados de acordo com técnicas conhecidas. Os seguintes representam métodos preferidos para a síntese dos compostos do invento reivindicado. 5.1. Síntese geral de análogos 3-substituídos da 2-indolinona
As metodologias gerais seguintes foram utilizadas a fim de sintetizar compostos 3-substituídos da 2-indolinona de acordo com o invento.
5.1.1. Método A
Uma mistura reaccional do oxindolo (2-indolinona) correcto (1 equiv.), do aldeído apropriado (1,2 equiv.), e de piperidina (0,1 equiv.) em etanol (1-2 ml/1 mmol de oxindolo) foi agitada a 90°C durante 3-5 h. Após arrefecimento, o precipitado foi filtrado, lavado com etanol frio, e seco a fim de produzir o composto alvo.
5.1.2. Método B
Preparação do aldeído correcto via reaccão de Vilsmeier A uma solução de N,N-dimetilformamida (1,2 equiv.) em 1,2-dicloroetano (2,0 ml/1,0 mmole de material de partida) foi adicionado, gota a gota, oxicloreto de fósforo (1,2 equiv.) a 0°C. O banho de gelo foi removido e a mistura reaccional foi adicionalmente agitada durante 30 min. O material de partida correcto (1,0 equiv.) foi adicionado à solução anterior, em porções, e a mistura reaccional foi agitada a 50-70°C durante 5 h-2 dias. A mistura reaccional foi vertida para solução de hidróxido de sódio IN gelada (pH = 9 após mistura) e a mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 1 h. A camada orgânica foi separada e a camada aquosa foi extractada com acetato de etilo. A camada orgânica combinada foi lavada com salmoura até pH = 7, seca sobre sulfato de sódio anidro e evaporada. O resíduo foi submetido a cromatografia numa coluna de gel de sílica eluindo com uma mistura solvente de acetato de etilo e hexano a fim de originar o composto do título. Síntese para análogos 3-substituídos da 2-indolinona
Uma mistura reaccional do oxindolo (2-indolinona) correcto (1 equiv.), do aldeído apropriado (1,2 equiv.), e de piperidina (0,1 equiv.) em etanol (1-2 ml/1 mmol de oxindolo)
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26 foi agitada a 90°C durante 3-5 h. Após arrefecimento, o precipitado foi filtrad etanol frio, e seco a fim de produzir o composto alvo. 5.2. Síntese de 3-IY4-Metiltien-2-il)metilenol-2-indolinona
Uma mistura reaccional de 133,0 mg de oxindolo, 151,2 mg do 4-metiltiofeno-2-carboxaldeído, e 3 gotas de piperidina em 3 ml de etanol foi agitada a 90°C durante 3 h. Após arrefecimento, o precipitado foi filtrado, lavado com etanol frio, e seco a fim de produzir 147,3 mg (61%) do composto do título sob a forma de um sólido amarelo. 5.3. Síntese de 3-r(3-Metilpirrol-2-il)metileno1-2-indolinona
Uma mistura reaccional de 133,0 mg de oxindolo, 130,9 mg do 3-metilpirrol-2-carboxaldeído, e 3 gotas de piperidina em 2 ml de etanol foi agitada a 90°C durante 3 h. Após arrefecimento, o precipitado foi filtrado, lavado com etanol frio, e seco a fim de produzir 150,9 mg (67%) do composto do título sob a forma de um sólido amarelo. 5.4. Síntese de 3-f(3.4-Dimetilpirrol-2-il)metileno1-2-indolinona A 3-[(3,4-Dimetilpirrol-2-il)metileno]-2-indolinona foi sintetizada tal como descrito em J. Heterocyclic Chem. 13: 1145-1147(1976). 4-Metilpirrol-3-carboxilato de etilo
Uma solução de 11,86 g (0,1 moles) de crotonato de etilo e 19,50 g (0,1 moles) de isocianeto de p-tolueno-sulfonilmetilo em 500 ml de éter/dimetilsulfóxido a 2:1 foi adicionada, gota a gota, a uma suspensão de 6,8 g de hidreto de sódio (dispersão em óleo mineral a 60%, 0,17 moles) em éter à temperatura ambiente. Após conclusão da adição, a mistura reaccional foi agitada durante 30 min e diluída com 400 ml de água. A camada aquosa foi extractada com 3 x 100 ml de éter. Os extractos de éter combinados foram passados através de uma coluna de alumina eluindo com diclorometano. O solvente orgânico foi evaporado e o resíduo resultante foi solidificado em repouso. O sólido foi lavado com hexano e seco a 40°C em estufa sob vácuo durante toda a noite a fim de produzir 12,38 g (80%) do composto do título.
Preparação de 3.4-Dimetilpirrolo A uma solução de 23 g (80 mmoles) de di-hidrobis(2-metoxi-etoxialuminato) de sódio foi adicionada, gota a gota, uma solução de 5 g (34 mmoles) de 4-metilpirrol-3-
86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 27 carboxilato de etilo em 50 ml de benzeno à temperatura ambiente sob atmosfera mistura reaccional foi agitada durante 18 h. Foi adicionada água (100 ml) à mistura reaccional. A camada orgânica foi separada, lavada com salmoura e seca sobre sulfato de sódio anidro. O solvente foi removido e o resíduo foi destilado originando 1,2 g (44%) do composto do título.
Preparação de 3.4-Dimetilpirrol-2-carboxaldeído A uma solução de 0,92 ml (12 mmoles) de Ν,Ν-dimetilformamida em 10 ml de 1,2-dicloroetano foi adicionado, gota a gota, 1,0 ml (12 mmoles) de oxicloreto de fósforo a 0°C. O banho de gelo foi removido e a mistura reaccional foi adicionalmente agitada durante 30 min. 3,4-Dimetilpirrolo (960,0 mg, 10 mmoles) foi adicionado à solução anterior, em porções, e a mistura reaccional foi agitada a 50°C durante 5 h. A mistura reaccional foi vertida para solução de hidróxido de sódio IN gelada (pH = 9 após mistura) e a mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 1 h. A camada orgânica foi separada e a camada aquosa foi extractada com acetato de etilo. A camada orgânica combinada foi lavada com salmoura até pH = 7, seca sobre sulfato de sódio anidro e evaporada. O resíduo foi submetido a cromatografia numa coluna de gel de sílica eluindo com uma mistura solvente de acetato de etilo e hexano a fim de originar 610 mg (50%) do composto do título. 3-IY3.4-DimetiIpirrol-2-iPmetilenol-2-indolinona
Uma mistura reaccional de 67,0 mg (0,5 mmoles) de oxindolo, 73,0 mg (0,6 mmoles) do 3,4-dimetilpirrol-2-carboxaldeído, e 2 gotas de piperidina em 2 ml de etanol foi agitada a 90°C durante 3 h. Após arrefecimento, o precipitado foi filtrado, lavado com etanol frio, e seco a fim de produzir 87,7 mg (37%) do composto do título sob a forma de um sólido amarelo. 5.5. Síntese de 3-r(2,4-Dimetil-3-etoxicarbonilpirrol-5-il)metileno]-2-indolinona
Uma mistura reaccional de 134,0 mg de oxindolo, 234,3 mg do 4-etoxicarbonil-3,5-dimetilpirrol-2-carboxaldeído, e 3 gotas de piperidina em 3 ml de etanol foi agitada a 90°C durante 3 h. Após arrefecimento, o precipitado foi filtrado, lavado com etanol frio, e seco a fim de produzir 244,6 mg (79%) do composto do título sob a forma de um sólido amarelo. 5.6. Síntese de 3-rf2,4-Dimetilpirrol-5-il)metileno1-2-indolinona
Uma mistura reaccional de 134,0 mg de oxindolo, 147,8 mg do 3,5-dimetilpirrol-2-carboxaldeído, e 3 gotas de piperidina em 2 ml de etanol foi agitada a 90°C durante 3 h.
86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 28
Após arrefecimento, ο precipitado foi filtrado, lavado com etanol frio, e seco produzir 136,7 mg (57%) do composto do título sob a forma de um sólido amarelo. 5.7. Síntese de 3-IY2-Metilmercaptotien-5-il)metilenol-2-indolinona
Uma mistura reaccional de 134,0 mg de oxindolo, 189,9 mg do 5-metilmercaptotiofeno-2-carboxaldeído, e 3 gotas de piperidina em 2 ml de etanol foi agitada a 90°C durante 3 h. Após arrefecimento, o precipitado foi filtrado, lavado com etanol frio, e seco a fim de produzir 246,6 mg (90%) do composto do título sob a forma de um sólido cor de laranja. 5.8. Síntese de 3-r(2-Metiltien-5-iDmetilenol-2-indolinona
Uma mistura reaccional de 134,0 mg de oxindolo, 151,42 mg do 5-metiltiofeno-2-carboxaldeído, e 3 gotas de piperidina em 2 ml de etanol foi agitada a 90°C durante 3 h. Após arrefecimento, o precipitado foi filtrado, lavado com etanol frio, e seco a fim de produzir 237,8 mg (99%) do composto do título sob a forma de um sólido amarelo. 5,9. Síntese de 3-IY3-Metiltien-2-iDmetilenol-2-indolinona
Uma mistura reaccional de 134,0 mg de oxindolo, 151,4 mg do 3-metiltiofeno-2-carboxaldeído, e 3 gotas de piperidina em 2 ml de etanol foi agitada a 90°C durante 3 h. Após arrefecimento, o precipitado foi filtrado, lavado com etanol frio, e seco a fim de produzir 157,8 mg (65%) do composto do título sob a forma de um sólido amarelo. 5.10. Síntese de· 3-[Y3-(2-carboxi-etil)-4-metilpirrol-5-il)metilenol-2-indolinona A 3-[(3-(2-carboxi-etil)-4-metilpirrol-5-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.11. Síntese de 3-[f3,4-Dibromo-5-metilpirrol-2-iDmetilenol-2-indolinona A 3-[(3,4-Dibromo-5-metilpirrol-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método B.
86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ρτ 29 £J1- Síntese de 3-[(3,4-Dimetil-2-formilpirrol-5-il)metilenol-2-indolinona A 3-[(3,4-Dimetil-2-formilpirrol-5-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.13. Síntese de 3-1 í4-(2-metoxicarboniletilV3-metilpirrol-5-il]metileno}-2-indolinona A 3-{[(4-(2-metoxicarboniletil)-3-metilpirrol-5-il]metileno}-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.14. Síntese de 3-r(3-Etoxicarbonil-2-metilfuran-5-il~)metileno1-2-indolinona A 3-[(3-Etoxicarbonil-2-metilfuran-5-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.15. Síntese de 3-r(,3-Bromotieno-2-il')metilenol-2-indolinona A 3-[(3-Bromotieno-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.16. Síntese de 3-r(2-Clorotieno-5-il)metilenol-2-indolinona A 3-[(2-Clorotieno-5-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.17. Síntese de 3-r(2.3-DimetiIfuran-5-il')metileno1-2-indolinona A 3-[(2,3-Dimetilfuran-5-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.18. Síntese de 3-rí5-Nitrotien-2-il)metileno1-2-indolinona A 3-[(5-Nitrotien-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 30 5.19. Síntese de 3-IY2-Carboxitien-5-iBmetilenol-2-indolinona A 3-[(2-Carboxitien-5-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.20. Síntese de 3-r('2-Bromotieno-5-il')metilenol-2-indolinona A 3-[(2-Bromotieno-5-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.21. Síntese de 3-fí4-Bromotieno-2-il)metilenol-2-indolinona A 3-[(4-Bromotieno-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.22. Síntese de sal de sódio da 3-r(2-Sulfonilfuran-5-iDmetileno1-2-indolinona O sal de sódio da 3-[(2-Sulfonilfuran-5-il)metileno]-2-indolinona é sintetizado de acordo com o Método A. 5.23. Síntese de 3-r(2-Metilfuran-5-il)rnetileno1-2-indolinona A 3-[(2-Metilfuran-5-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.24. Síntese de 3-r(2-Etilfuran-5-il)metilenol-2-indolinona A 3-[(2-Etilfuran-5-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.25. Síntese de 3-r(2-Etiltien-5-iBmetilenol-2-indolinona A 3-[(2-Etiltien-5-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A.
86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 31 5.26. Síntese de 3-í(4.5-Dimetil-3-etilDÍrrol-2-il)metileno1-2-indolinona A 3-[(4,5-Dimetil-3-etilpirrol-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.27. Síntese de 3-r(5-Etoxicarbonil-4-etoxicarboniletil-3-etoxicarbonilmetilpirrol-2- i0-metileno1-2-indolinona A 3-[(5-Etoxicarbonil-4-etoxicarboniletil-3-etoxicarbonilmetilpirrol-2-il)-metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.28. Síntese de 3-r(5-Carboxi-3-etil-4-metilpirrol-2-il)metileno1-2-indolinona A 3-[(5-Carboxi-3-etil-4-metilpirrol-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.29. Síntese de 3-r(3.5-Di-iodo-4-metilpirrol-2-il')metileno1-2-indolinona A 3-[(3,5-Di-iodo-4-metilpirrol-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.30. Síntese de 3-íf5-Cloro-3-metoxicarbonil-4-metoxicarbonilmetilpirrol-2-ir)- metilenol-2-indolinona
Sintetiza-se a 3-[(5-Cloro-3-metoxicarbonil-4-metoxicarbonilmetilpirrol-2-il)-metileno]-2-indolinona de acordo com o Método A. 5.31. Síntese de 3-rn-Acetil-5-etoxicarbonil-4-metilpinOl-2-ir)metileno1-2-indolinona A 3-[(3-Acetil-5-etoxicarbonil-4-metilpirrol-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.32. Síntese de 3-(ri-t3.5-Diclorofeninpirrol-2-illmetilenot-2-indolinona A 3-{[l-(3,5-DicIorofenil)pirrol-2-il]metileno}-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 32 5.33. Síntese de 3dl44-Clorofenil)pirrol-2dnmetileno')-2-indolinona A 3-[l-(4-Clorofenil)pirrol-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.34. Síntese de 3-IY4-Etoxicarbonil-3-metiQpirrol-2-ilknetileno1-2-indolinona A 3-[(4-Etoxicarbonil-3-metil)pirrol-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.35. Síntese de 3-f(l-Metilpirrol-2-ir)metileno1-2-indolinona A 3-[(l-Metilpirrol-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.36. Síntese de 3-IY5-Etoxicarbonil-3-etoxicarboniletil-4-etoxilcarbonilmetilnirrol-2- inmetilenol-2-indolinona A 3-[(5-Etoxicarbonil-3-etoxicarboniletil-4-etoxilcarbonilmetilpirrol-2-il)-metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.37. Síntese de 3-lY5-Metilimidazol-2-inmetileno1-2-indolinona A 3-[(5-Metilimidazol-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.38. Síntese de 3-IY5-Metiltiazol-2-il)metilenol-2-indolinona A 3-[(5-Metiltiazol-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.39. Síntese de 3-[Y3-Metilpirazol-5-il)metilenol-2-indolinona A 3-[(3-Metilpirazol-5-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. f f
86 518
EP 0 769 947 / PT Λ Λ 5.40. Síntese de 3-IYImidazol-4-il')metilenol-2-indolinona A 3-[(Imidazol-4-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5 41. Síntese de 3-f(4-Cloropirazol-3-il)metileno1-2-indolinona A 3-[(4-Cloropirazol-3-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.42. Síntese de 3-[Y4-Bromo-l-í4-clorobenzil)pirazol-5-il)metileno1-2-indolinona A 3-[(4-Bromo-l-(4-clorobenzil)pirazol-5-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.43. Síntese de 3-r(4-Cloro-l-metilpirazol-3-iBmetileno1-2-indolinona A 3'[(4-Cloro-l-metilpirazol-3-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.44. Síntese de 3-r(4-Etil-3.5-dimetilpirrol-2-il)metilenol-2-indolinona A 3-[(4-Etil-3,5-dimetilpirrol-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método B. 5.45. Síntese de 3-IY5-Etilpirrol-2-iBmetileno~l-2-indolinona A 3-[(5-Etilpirrol-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método B. 5.46. Síntese de S-rn^S-DimetiM-tpropen^-iripirrol^-irimetilenol-l-inrinlinnna A 3-[(3,5-Dimetil-4-(propen-2-il)pirrol-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método B.
86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 34 5.47. Síntese de 5-Cloro-3-í(pirrol-2-il)metileno1-2-indolinona A 5-Cloro-3-[(pirrol-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.48. Síntese de 5-Cloro-3-ff3-metilpirrol-2-il)metilenol-2-indolinona A 5-Cloro-3-[(3-metilpirrol-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.49. Síntese de S-Cloro-S-rG.S-dimetilpinOl^-iPmetilenol^-indolinona A 5-Cloro-3-[(3,5-dimetilpirrol-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.50. Síntese de 3-[(Pirrol-2-iDmetilenol-2-indolinona A 3-[(Pirrol-2-il)metileno]-2-indolinona encontra-se disponível a partir de Maybridge Chemical Co., Ltd. 5.51. Síntese de 5-Cloro-3-f(indol-3-inmetilenol-2-indolinona A 5-Cloro-3-[(indol-3-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.52. Síntese de 5-Cloro-3-r(tien-2-iDmetileno1-2-indolinona A 5-Cloro-3-[(tien-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.53. Síntese de 5-Cloro-3-[Y3-metiltien-2-ir)metileno1-2-indolinona A 5-Cloro-3-[(3-metiltien-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 35 j 54. Síntese de 5-Cloro-3-r(5-metiltien-2-il)metileno1-2-indolinona
A 5-Cloro-3-[(5-metiltien-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. j,55. Síntese de 5-Cloro-3-í(5-etiltien-2-ir>metilenol-2-indolmona A 5-Cloro-3-[(5-etiltien-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5 56. Síntese de 5-Cloro-3-f(5-metilmercaptotien-2-iDmetileno1-2-indolinona A 5-Cloro-3-[(5-metilmercaptotien-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.57. Síntese de 5-Cloro-3-r('imidazol-2-il')metileno1-2-indolinona A 5-Cloro-3-[(imidazol-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.58. Síntese de 5-Nitro-3-IYpirrol-2-il)metilenol-2--indolinona A 5-Nitro-3-[(pirrol-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.59. Síntese de 3-IY3-Metilpirrol-2-il)metileno1-5-nitro-2-indolinona A 3-[(3-Metilpirrol-2-il)metileno]-5-nitro-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.60. Síntese de 3-r(3.5-Dimetiloirrol-2-ilimetilenoi-5-nitro-2-indolinona A 3-[(3,5-Dimetilpirrol-2-il)metileno]-5-nitro-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A.
86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 36 5.61. Síntese de 3-r(Indol-3-iOmetileno1-5-nitro-2-indolinona A 3-[(Indol-3-il)metileno]-5-nitro-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.62. Síntese de 5-Nfitro-3-[Ytien-2-iDmetiIeno1-2-indolinona A 5-Nitro-3-[(tien-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.63. Síntese de 3-r(3-Metiltien-2-iDmetileno1-5-nitro-2-indolinona A 3-[(3-Metiltien-2-il)metileno]-5-nitro-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.64. Síntese de 3-IY5-Metiltien-2-il)metileno1-5-nitro-2-indolinona A 3-[(5-Metiltien-2-il)metileno]-5-nitro-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.65. Síntese de 3-[(5-Etiltien-2-iDmetileno]-5-nitro-2-indolinona A 3-[(5-Etiltien-2-il)metileno]-5-nitro-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.66. Síntese de 3-rf5-Metilmercaptotien-2-il')metileno1-5-nitro-2-indolinona A 3-[(5-Metilmercaptotien-2-il)metileno]-5-nitro-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.67. Síntese de 3-r(lmidazol-2dDmetileno1-5-nitro-2-indolinona A 3-[(Imidazol-2-il)metileno]-5-nitro-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 86 518
ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 37 5.68. Síntese de 3-r(Oxazol-2-inmetileno1-2-indolinona A 3~[(Oxazol-2'il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.69. Síntese de 3-IYC)xazol-4-i0metileno1-2-indolinona A 3-[(Oxazol-4-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.70. Síntese de 3-IYOxazol-5-il~)metilenol-2-indolinona A 3-[(Oxazol-5-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.71. Síntese de S-rrriazoKZ-iDmetilenol^-indolinona A 3-[(Tiazol-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.72. Síntese de 3-|YTiazol-4-ir)metileno1-2-indolinona A 3-[(Tiazol-4-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.73. Síntese de 3-r(Tiazol-5-iDmetileno1-2-indolinona A 3-[(Tiazol-5-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.74. Síntese de 3-F(Imidazol-2-il)metileno1-2-indolinona A 3-[(Imidazol-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.75. Síntese de 34íPirazol-3-iDmetileno1-2-indolinona A 3-[(Pirazol-3-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.76. Síntese de 3-lYPirazol-4-iDmetileno1-2-indolinona A 3-[(Pirazol-4-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 38 5.77. Síntese de 3-f(Isoxazol-3-iOmetilenol-2-indolinona
A 3-[(Isoxazol-3-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.78. Síntese de 3-r(Isoxazol-4-i0metileno1-2-indolinona A 3-[(Isoxazol-4-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.79. Síntese de 3-r(Isoxazol-5-il)metileno1-2-indolinona A 3-[(Isoxazol-5-il)metileno]-2'indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.80. Síntese de 34(Isotiazol-3-iDmetileno~|-2-indolinona A 3-[(Isotiazol-3-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.81. Síntese de 3-r(Isotiazol-4-il)metileno1-2-indolinona A 3-[(Isotiazol-4-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.82. Síntese de 3-IYIsotiazol-5-iDmetileno1-2-indolinona A 3-[(Isotiazol-5-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.83. Síntese de 3-rn.23-TriazoÍ-4-i0metileno1-2-indolinona A 3-[(l,2,3-Triazol-4-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.84. Síntese de 3-IY1.3.4-Tiadiazol-2-i0metilenol-2-indolinona A 3-[(l,3,4-Tiadiazol-2-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A.
86518
ΕΡ Ο 769 947/PT 39 5.85. Síntese de 3-r(5-Fenil-1.2.4-oxadiazol-3-il)metilenoI-2-indolinona A 3-[(5-Fenil-l,2,4-oxadiazol-3-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.86. Síntese de 3-IY3-Fenil-1.2.4-oxadiazol-5-il)metilenol-2-indolinona A 3-[(3-Fenil-l,2,4-oxadiazol-5-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A. 5.87. Síntese de 3-r(3-Fenil-l,2.5-oxadiazol-4-il)metilenol-2-indolinona A 3-[(3-Fenil-l,2,5-oxadiazol-4-il)metileno]-2-indolinona é sintetizada de acordo com o Método A.
6. EXEMPLOS: Ensaios in vitro para RTK
Os ensaios in vitro seguintes podem ser utilizados a fim de determinar o nível de actividade e efeito dos diferentes compostos do presente invento sobre uma ou mais das RTK. Ensaios semelhantes podem ser desenhados ao longo das mesmas linhas para qualquer tirosina-quinase utilizando técnicas bem conhecidas na arte. 6.1. Ensaio imuno-sorvente ligado a enzima (ELISA)
Os ensaios imuno-sorventes ligados a enzima (ELISA) podem ser utilizados a fim de detectar e medir a presença de actividade de tirosina-quinase. O ELISA pode ser executado de acordo com protocolos conhecidos os quais se encontram descritos, por exemplo, em Voller et al., 1980, “Enzyme-Linked Immunosorbent Assay”, em: Manual of Clinicai Immunology, 2a edição, editado por Rose e Friedman, págs. 359-371, Am. Society of Microbiology, Washington, D.C. O protocolo descrito pode ser adaptado para a determinação da actividade relativamente a uma RTK específica. Por exemplo, são fornecidos abaixo os protocolos preferidos para a condução das experiências com o ELISA para RTK específicas. A adaptação destes protocolos para a determinação da actividade de um composto para outros membros da família de RTK, bem como para tirosina-quinases não receptoras, encontra-se dentro da capacidade dos peritos na arte. 40 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 6.1.1. ELISA para FLK-1
Foi conduzido um ensaio ELISA a fim de medir a actividade de quinase do receptor FLK-1 e, mais especificamente, a inibição ou a activação da actividade da tirosina-quinase proteica sobre o receptor FLK-1. Especifícamente, o ensaio seguinte foi conduzido a fim de medir a actividade de quinase do receptor FLK-1 em células FLK-1/NIH3T3.
Materiais e Métodos
Materiais
Foram utilizados os seguintes reagentes e fornecimentos: a. placas para ELISA com 96 alvéolos Corning (catálogo Corning n°. 25805- b. IgG de cabra anti-coelho Cappel (catálogo n°. 55641); c. PBS (catálogo Gibco n°. 450-1300EB); d. tampão TBSW (50 mM de Tris (pH 7,2), 150 mM de NaCl e 0,1% de Tween- 20); e. caldo de etanolamina (etanolamina a 10% (pH 7,0), armazenada a 4°C); f. tampão HNTG (20 mM de tampão HEPES (pH 7,5), 150 mM de NaCl, 0,2% de Triton X-100, e 10% de glicerol); g. EDTA (0,5 M (pH 7,0) como um concentrado a 100X); h. ortovanadato de sódio (0,5 M como um concentrado a 100X); i. pirofosfato de sódio (0,2 M como um concentrado a 100X); j. placas de polipropileno com 96 alvéolos de fundo em V NUNC (catálogo Applied Scientific n°. AS-72092); k. Células NIH3T3 C7#3 (células que expressam FLK-1); l. DMEM com lx glucose elevada L-glutamina (catálogo n°. 11965-050); m. FBS, Gibco (catálogo n°. 16000-028); n. L-glutamina, Gibco (catálogo n°. 25030-016); o. VEGF, PeproTech, Inc. (catálogo n°. 100-20) (mantido como 1 pg/100 μΐ de caldo em Milli-Q dH20 e armazenado a -20°C); p. anti-soro anti-FLK-1 purificado por afinidade, Enzymology Lab, Sugen, Inc.; q. anticorpo monoclonal UB40 específico para fosfotirosina, Enzymology Lab, Sugen, Inc. (ver, Fendly et al., 1990, Câncer Research 50: 1550-1558); r. IgG de cabra anti-ratinho grau EIA - POD (catálogo BioRad n°. 172-1011); s. solução de ácido 2,2-azino-bis(3-etilbenz-tiazolino-6-sulfónico) (ABTS) (100 mM de ácido cítrico (anidro), 250 mM de Na:HP04 (pH 4,0), 0,5 mg/ml de 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 41 ABTS (catálogo Sigma η°. Α-1888)), devendo a solução ser armazenada no escuro a 4°C até estar pronta para utilização; t. Η,Ο, (solução a 30%) (catálogo Fisher n°. H325); u. ABTS/H202 (15 ml de solução ABTS, 2 μΐ de H202) preparado 5 minutos antes da utilização e deixado à temperatura ambiente; v. caldo de HC1 a 0,2 M em H20; w. dimetilsulfóxido (100%) (catálogo Sigma n°. D-8418); e y. Tripsina-EDTA (catálogo Gibco BRL n°. 25200-049).
Protocolo
Foi utilizado o seguinte protocolo para condução do ensaio: 1. Revestir placas para ELISA com 96 alvéolos Corning com 1,0 pg por alvéolo de anticorpo IgG anti-coelho Cappel em 0,1 M de Na2C03, pH 9,6. Levar o volume final até 150 μΐ por alvéolo. Revestir as placas durante toda a noite a 4°C. As placas podem ser mantidas até duas semanas quando armazenadas a 4°C. 2. Cultivar células em meio de crescimento (DMEM, suplementado com 2,0 mM de L-glutamina, 10% de FBS) em caixas para cultura adequadas até à confluência a 37°C, 5% de C02. 3. Recolher as células por tripsinização e semear em placas para células Corning 25850 de polistireno com 96 alvéolos de fundo redondo, 25000 células/alvéolo em 200 μΐ de meio de crescimento. 4. Cultivar as células pelo menos durante um dia a 37°C, 5% de C02. 5. Lavar as células com D-PBS IX. 6. Adicionar 200 μΐ/alvéolo de meio de jejum (DMEM, 2,0 mM de L-glutamina, 0,1% de FBS). Incubar durante toda a noite a 37°C, 5% de C02. 7. Diluir Compostos/Extractos a 1:20 em placas de polipropileno com 96 alvéolos utilizando meio de inanição. Diluir dimetilsulfóxido a 1:20 para utilização em alvéolos de controlo. 8. Remover o meio de inanição a partir das placas de cultura com 96 alvéolos e adicionar 162 μΐ de meio de inanição fresco a cada alvéolo. 9. Adicionar 18 μΐ da diluição a 1:20 de Composto diluído/Extracto (do passo 7) a cada alvéolo mais a diluição a 1:20 de dimetilsulfóxido aos alvéolos de controlo (+/-VEGF), para uma diluição final de 1:200 após estimulação celular. Dimetilsulfóxido final é de 0,5%. Incubar a placa a 37°C, 5% de C02, durante duas horas.
10. Remover o anticorpo não ligado a partir das placas para ELISA por inversão da placa a fim de remover o líquido. Lavar 3 vezes com TBSW + 0,5% de etanolamina, pH
86518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 42 7.0. Bater levemente com a placa sobre uma toalha de papel a fim de remover o líquido em excesso e as bolhas. 11. Bloquear as placas com TBSW + 0,5% de etanolamina, pH 7,0, 150 μΐ por alvéolo. Incubar a placa durante trinta minutos enquanto é submetida a agitação num agitador para placas de micro titulação. 12. Lavar a placa 3 vezes tal como descrito no passo 10. 13. Adicionar 0,5 iig/alvéolo de anti-soro policlonal de coelho anti-FLU-1 purificado por afinidade. Levar o volume final até 150 Lig/alvéolo com TBSW + 0,5% de etanolamina, pH 7,0. Incubar a placa durante trinta minutos sob agitação. 14. Adicionar 180 μΐ de meio de inaniçào às células e estimular as células com 20 μΐ/alvéolo de orto vanadato de sódio a 10,0mM e 500 ng/ml de VEGF (originando uma concentração fmal de orto vanadato de sódio de 1,0 mM e de 50 ng/ml de VEGF por alvéolo) durante oito minutos a 37°C, 5% de C02. Os alvéolos de controlo negativo recebem apenas meio de inaniçào. 15. Após oito minutos, o meio deve ser removido a partir das células e lavado uma vez com 200 μΐ/alvéolo de PBS. 16. Lisar as células em 150 μΐ/alvéolo de HNTG sob agitação à temperatura ambiente durante cinco minutos. A formulação de HNTG inclui orto vanadato de sódio, piro fosfato de sódio e EDTA. 17. Lavar a placa para ELISA três vezes tal como descrito no passo 10. 18. Transferir os lisados celulares a partir da placa para células para a placa para ELISA e incubar sob agitação durante duas horas. Para transferir o lisado celular pipetar para cima e para baixo ao mesmo tempo que se raspam os alvéolos. 19. Lavar a placa três vezes tal como descrito no passo 10. 20. Incubar a placa para ELISA com 0,2 pg/alvéolo de UB40 em TBSW + 0,5% de etanolamina. Levar o volume final até 150 μΐ/alvéolo. Incubar sob agitação durante 30 minutos. 21. Lavar a placa três vezes tal como descrito no passo 10.
22. Incubar a placa para ELISA com IgG de cabra anti-ratinho grau EIA diluído a 1:10000 conjugada com peroxidase de rábano picante em TBSW + 0,5% de etanolamina, pH 7.0. Levar o volume final até 150 μΐ/alvéolo. Incubar sob agitação durante trinta minutos. 23. Lavar a placa tal como descrito no passo 10. 24. Adicionar 100 μΐ de solução ABTS/TLCL ao alvéolo. Incubar durante trinta minutos sob agitação. 25. Adicionar 100 μΐ de HC1 a 0,2 M para HC1 final a 0,1 Ma fim de parar a reacção de desenvolvimento da cor. Agitar l minuto à temperatura ambiente. Remover as
43 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ bolhas com uma corrente lenta de ar e ler a placa para ELISA num leitor de placa para ELISA a 410 nm. 6.1.2. ELISA para HER-2
Ensaio 1: Ensaio para o Receptor Quimérico EGF Receptor-HER2 em Células
Inteiras A actividade da quinase HER2 em células EGFR-NIH3T3 inteiras foi medida tal como descrito abaixo:
Materiais e Reagentes
Foram utilizados os seguintes materiais e reagentes a fim de conduzir o ensaio: supra). a. EGF: concentração do caldo Japão. = 16,5 ILM; EGF 201, TOYOBO, CO., Ltd. b. 05-101 (UBI) (um anticorpo monoclonal que reconhece um domínio extracelular do EGFR). c. Anticorpo anti-fosfotirosina (anti-Ptyr) (policlonal) (Ver, Fendly et ai, d. Anticorpo de detecção: conjugado de IgG de cabra anti-coelho com peroxidase de rábano picante, TAGO, Inc., Burlingame, CA. e. Tampão TB ST: Tris-HCl, pH 7,2 50 mM NaCl 150 mM Triton X-100 0,1% f. HNTG concentrado 5X: HEPES 0,1 M NaCl 0,75 M Glicerol 50% Triton X-100 1,0% g· caldo de ABTS: ácido cítrico 100 mM Na2HP04 250 mM HC1, conc. 0,5 pM ABTS* 0,5 mg/ml * (2,2’-azinobis(ácido 3-etilbenzotiazolino-sulfónico)). Manter a solução às escuras a 4°C até à utilização. 44 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ h. Reagentes concentrados de: EDTA Na3V04 Na4(P,07) 100 mM, pH 7,0 0,5 M 0,2 M.
Processo
Foi utilizado o seguinte protocolo:
A. Pré-revestimento da placa para ELISA 1. Revestir placas para ELISA (Corning, 96 alvéolos, Cat. # 25805-96) com anticorpo 05-101 a 0,5 g por alvéolo em PBS, volume final de 100 μΐ/ alvéolo, e armazenar durante toda a noite a 4°C. As placas revestidas mantêm-se boas durante até 10 dias quando armazenadas a 4°C. 2. No dia da utilização, remover o tampão de revestimento e substituir com tampão de bloqueio (Leite em pó instantâneo não gordo vermelho a 5% em PBS). Incubar a placa, sob agitação, à temperatura ambiente (cerca de 23°C a 25°C) durante 30 minutos. Imediatamente antes da utilização, remover o tampão de bloqueio e lavar a placa 4 vezes com tampão TBST. B. Sementeira de Células 1. Pode ser utilizada neste ensaio uma linha de células ΜΗ3Τ3 que sobre-expresse um receptor quimérico contendo o domínio extracelular EGFR e o domínio extracelular da quinase HER2. 2. Escolher para a experiência caixas que apresentem 80-90% de confluência. Tripsinizar as células e parar a reacção pela adição de 10% de soro de bovino fetal. Suspender as células em meio DMEM (10% de meio CS DMEM) e centrifugar uma vez a 1500 rpm, à temperatura ambiente durante 5 minutos. 3. Ressuspender as células em meio de sementeira (DMEM, 0,5% de soro de bovino), e contar as células utilizando azul de tripano. Viabilidade acima de 90% é aceitável. Semear as células em meio DMEM (0,5% de soro de bovino) a uma densidade de 10000 células por alvéolo, 100 μΐ por alvéolo, numa placa de microtitulação de 96 alvéolos. Incubar as células semeadas em 5% de C02 a 37°C durante cerca de 40 horas. C. Processos do Ensaio 1. Verificar as células semeadas quanto a contaminação utilizando um microscópio invertido. Diluir o concentrado da droga (10 mg/ml em DMSO) a 1:10 em meio DMEM, de seguida transferir 5 μΐ para um alvéolo com TBST para uma diluição final da droga de 1:200 e uma concentração final de DMSO de 1%. Os alvéolos de controlo recebem apenas DMSO. Incubar em 5% de C02 a 37°C durante duas horas. 2. Preparar o ligando EGF: diluir EGF concentrado em DMEM de modo que, após transferência de 10 μΐ de EGF diluído (diluição a 1:12), seja atingida a concentração final de 100 nM. 3. Preparar HNTG* fresco suficiente para 100 μΐ por alvéolo; e colocar em gelo. HNTG* (10 ml): HNTG concentrado 2,0 ml H20 mili Q 7,3 ml EDTA, 100 mM, pH 7,0 0,5 ml Na3V04, 0,5 M 0,1 ml Na4(P,07), 0,2 M 0,1 ml. 4. Após 120 minutos de incubação com a droga, adicionar às células ligando SGF preparado, 10 μΐ por alvéolo, até uma concentração final de 100 nM. Os alvéolos de controlo recebem apenas DMEM. Incubar, sob agitação, à temperatura ambiente, durante 5 minutos. 5. Remover a droga, EGF, e DMEM. Lavar as células, duas vezes, com PBS. Transferir HTNG* para as células, 100 μΐ por alvéolo. Colocar em gelo durante 5 minutos. Entretanto, remover o tampão de bloqueio a partir de outra placa para ELISA e lavar com TBST tal como descrito acima. 6. Com uma ponta de pipeta seguramente ajustada a um micropipetador, raspar células a partir da placa e homogeneizar o material celular por repetidamente aspirar e repartir o tampão de lise HNTG*. Transferir o lisado para uma placa para ELISA revestida, bloqueada e lavada. Incubar sob agitação à temperatura ambiente durante uma hora. 7. Remover o lisado e lavar 4 vezes com TBST. Transferir anticorpo anti-Ptyr recentemente diluído para a placa para ELISA a 100 μΐ por alvéolo. Incubar sob agitação à temperatura ambiente durante 30 minutos na presença do anti-soro anti-Ptyr (diluição a 1:3000 em TBST). 8. Remover o anticorpo anti-Ptyr e lavar 4 vezes com TBST. Transferir o anticorpo IgG anti-coelho TAGO recentemente diluído para a placa para ELISA a 100 μΐ por alvéolo. Incubar sob agitação à temperatura ambiente durante 30 minutos (anticorpo IgG anti-coelho: diluição a 1:3000 em TBST).
86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 46 9. Remover ο anticorpo de detecção TAGO e lavar 4 vezes com TBST. Transferir solução ABTS/H202 recentemente preparada para a placa para ELISA, 100 μΐ por alvéolo. Incubar sob agitação à temperatura ambiente durante 20 minutos, (solução ABTS/H202: 1,0 μΐ de H,02 a 30% em 10 ml de concentrado de ABTS). 10. Parar a reacçào pela adição de 50 μΐ de H2S04 5N (facultativo), e determinar a O.D. a 410 nm. 11. O sinal de fosfotirosina máximo é determinado pela subtracção do valor dos controlos negativos ao dos controlos positivos. A percentagem de inibição do teor em fosfotirosina para os alvéolos contendo extracto é de seguida calculada, após subtracção dos controlos negativos.
Ensaio 2: ELISA para HER-2-BT474
Pode ser conduzido um segundo ensaio a fim de medir a actividade da HER2 em células inteiras. O referido ensaio pode ser conduzido como se segue:
Materiais e Reagentes
Foram utilizados os seguintes materiais e reagentes: a. BT-474 (ATCC HBT20), uma linha de células de tumor da mama humano a qual expressa níveis elevados de quinase HER2. b. Meio de crescimento compreendendo RPMI + 10% de FBS + GMS-G (suplemento Gibco) + glutamina para utilização em BT-474 cultivadas num incubador com 5% de CO, a 37°C. c. Anticorpo anti-HER2 monoclonal. d. D-PBS: KH2HP04 0,20 g/1 10 (GIBCO, 310-4190AJ) K2HP04 2,16 g/1 KC1 0,20 g/1
NaCl 8,00 g/1 (pH 7,2). e. Tampão de bloqueio: TBST mais Leite a 5% (leite em pó instantâneo não gordo vermelho). f. Tampão TBST:
Tris-HCl 50 mM
NaCl 150 mM (pH 7,2, HC1 10N)
TritonX-100 0,1%, em que a solução concentrada de TES (10X) é preparada, e o Triton X-100 é adicionado ao tampão durante a diluição. 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ g· ι
h. i. j· k. m. n. 47 tampão HNTG (5X): HEPES 0,1 M NaCl 750 mM (pH 7,2, HC1 IN) Glicerol 50% Triton X-100 1,0%; a solução concentrada (5X) é preparada e mantida a 4°C. EDTA-HC1: 0,5 M, pH 7,0 (HC1 10N) como concentrado 500X. Na3V04: 0,5 M como concentrado 100X é mantido a -80°C como alíquotas. Na4(P207): 0,2 M como concentrado 100X. Anti-soro anti-fosfotirosina policlonal. Conjugado de IgG de cabra anti-coelho, peroxidase de rábano picante (POD) (anticorpo de detecção), TAGO (cat. n°. 4520; lote n°. 1802): TAGO, Inc., Burlingame, CA. solução ABTS: ácido cítrico 100 mM Na2HP04 250 mM (pH 4,0, HC1 IN) ABTS 0,5 mg/ml, em que ABTS é 2,2’-azinobis(ácido 3-etilbenzotiazolino-sulfónico). Para este ensaio, a solução ABTS deve ser mantida às escuras a 4°C. A solução deve ser rejeitada quando se toma verde. Peróxido de hidrogénio: a solução a 30% é mantida no escuro a 4°C.
Processo
Todos os passos seguintes são executados à temperatura ambiente e assepticamente, excepto se de outro modo declarado. Todas as lavagens da placa para ELISA são efectuadas por enxaguamento com água destilada três vezes e uma vez com TBST. A. Sementeira de Células 1. Cultivar células BT474 em caixas para cultura de tecidos (Corning 25020-100) até 80-90% de confluência e recolher utilizando Tripsina-EDTA (0,25%, GIBCO). 2. Ressuspender as células em meio fresco e transferir para placas de cultura de tecidos de 96 alvéolos (Corning 25806-96) a cerca de 25000-50000 células/ alvéolo (100 μΐ/ alvéolo). Incubar as células em 5% de CO, a 37°C durante toda a noite. 48 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ
Β. Revestimento e bloqueio da placa para ELISA 1. Revestir a placa para ELISA (Corning 25805-96) com anticorpo anti-HER2 a 0,5 pg/ alvéolo em 150 μΐ de PBS durante toda a noite a 4°C, e selar com parafina. As placas revestidas com anticorpo podem ser utilizadas durante até 2 semanas, quando armazenadas a 4°C. 2. No dia da utilização, remover a solução de revestimento, substituir com 200 μΐ de tampão de bloqueio, colocar a placa sob agitação, e de seguida remover o tampão de bloqueio e lavar a placa imediatamente antes da adição do lisado. C. Processos do Ensaio 1. As drogas TBST sob condição isenta de soro. Antes da adição das drogas, o meio antigo é substituído com RPMI isento de soro (90 μΐ/ alvéolo). 2. Diluir o caldo da droga (em DMSO a 100%) a 1:10 com RPMI, e transferir 10 μ 1/alvéolo desta solução para as células a fim de obter uma concentração final da droga em DMSO de 1%. Incubar as células em 5% de C02 a 37°C. 3. Preparar tampão de lise celular fresco (HNTG*) HNTG 5x 2 ml EDTA 0,2 ml Na3V04 0,1 ml Na4P20- 0,1 ml h2o 7,3 ml. 4. Após pré-incubação da droga durante duas horas, remover toda a solução a partir da placa, transferir HTNG* (100 μΐ/alvéolo) para as células, e colocar sob agitação durante 10 minutos. 5. Utilizar uma pipeta de 12 canais para raspar as células a partir da placa, e homogenizar o lisado por repetida aspiração e repartição. Transferir todo o lisado para a placa para ELISA e colocar sob agitação durante 1 hora. 6. Remover o lisado, lavar a placa, adicionar anti-Ptyr (1:3000 com TBST) a 100 μΐ/ alvéolo, e colocar sob agitação durante 30 minutos. 7. Remover o anti-Ptyr, lavar a placa, adicionar 100 μΐ/ alvéolo de anticorpo IgG de cabra anti-coelho conjugado (1:5000 com TBST), e colocar sob agitação durante 30 minutos. 8. Remover o anticorpo igG anti-coelho, lavar a placa, e adicionar 100 μΐ/ alvéolo de ABTS/H202 fresco (1,2 μΐ de H,0; para 10 ml de ABTS) à placa a fim de iniciar o desenvolvimento da cor, o qual geralmente demora 20 minutos.
86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 49 9. Medir a OD a 410 nm, Dynatec MR5000.
6.1.3. ELISA para PDGF-R
Todos os meios de cultura para células, glutamina, e soro de bovino fetal, foram adquiridos a Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) excepto se de outro modo especificado. Todas as células foram cultivadas em atmosfera húmida de 90-95% de ar e 5-10% de C02 a 37°C. Todas as linhas de células foram de forma rotineira subcultivadas duas vezes por semana e apresentaram-se negativas para micoplasma tal como determinado pelo método Mycotect (Gibco).
Para ensaios ELISA, as células (UI242, obtidas a partir de Joseph Schlessinger, NYU) foram cultivadas até 80-90% de confluência em meio de crescimento (MEM com 10% de FBS, NEAA, 1 mM de NaPyr e 2 mM de GLN) e semeadas em placas para cultura de tecidos de 96 alvéolos em 0,5% de soro a 25000 até 30000 células por alvéolo. Após incubação durante toda a noite em meio contendo 0,5% de soro, as células foram mudadas para meio isento de soro e tratadas com o composto em teste durante 2 horas num incubador a 5% de C02, 37°C. As células foram de seguida estimuladas com o ligando durante 5-10 minutos seguido por lise com HNTG (20 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 10% de glicerol, 5 mM de EDTA, 5 mM de Na3V04, 0,2% de Triton X-100, e 2 mM de NaPyr). Os lisados celulares (0,5 mg/ alvéolo em PBS) foram transferidos para placas para ELISA previamente revestidas com anticorpo específico para o receptor e as quais tinham sido bloqueadas com 5% de leite em TBST (50 mM de Tris-HCl, pH 7,2, 150 mM de NaCl e 0,1% de Triton X-100) à temperatura ambiente durante 30 minutos. Os lisados foram incubados com agitação durante 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com TBST quatro vezes e de seguida incubadas com anticorpo anti-fosfotirosina policlonal à temperatura ambiente durante 30 minutos. O anticorpo anti-fosfotirosina em excesso foi removido por enxaguamento da placa com TBST quatro vezes. Anticorpo IgG de cabra anti-coelho foi adicionado à placa para ELISA durante 30 minutos à temperatura ambiente seguido por enxaguamento com TBST mais quatro vezes. ABTS (100 mM de ácido cítrico, 250 mM de NaTíPC^ e 0,5 mg/ml de 2,2’-azinobis(ácido 3-etilbenztiazolino-6-sulfónico)) mais H20, (1,2 ml de H202 a 30% até 10 ml de ABTS) foi adicionado às placas para ELISA a fim de iniciar o desenvolvimento da cor. Foi registada a absorvância a 410 nm com um comprimento de onda de referência de 630 nm durante 15 a 30 minutos após a adição de ABTS. f 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 50
6.1.4. ELISA para IGF-I Ο protocolo seguinte pode ser utilizado para medir o nível de fosfotirosina no receptor IGF-I, o qual indica a actividade da tirosina-quinase do receptor IGF-I.
Materiais e Reagentes
Foram utilizados os seguintes materiais e reagentes: a. A linha de células utilizada neste ensaio é 3T3/IGF-1R, uma linha de células a qual sobre-expressa o receptor IGF-I. b. NIH3T3/IGF-1R é cultivada num incubador com 5% de C02 a 37°C. O meio de crescimento é DMEM + 10% de FBS (inactivado pelo calor) + 2 mM de L-glutamina. c. É utilizado anticorpo anti-IGF-lR denominado 17-69. Os anticorpos são purificados por Enzymology Lab, SUGEN, Inc. d. D-PBS: KH:HP04 0,20 g/1 K2HP04 2,16 g/1 KC1 0,20 g/1
NaCl 8,00 g/1 (pH 7,2). e. Tampão de bloqueio: TBST mais Leite a 5% (leite em pó instantâneo não gordo vermelho). f. Tampão TBST:
Tris-HCl 50 mM
NaCl 150 mM (pH 7,2 / HC110N)
Triton X-100 0,1%; a solução concentrada de TBS (10X) é preparada, e o Triton X-100 é adicionado ao tampão durante a diluição. g. Tampão HNTG:
HEPES 20 mM
NaCl 150 mM (pH 7,2 / HC1 IN)
Glicerol 10%
Triton X-100 0,2%; a solução concentrada (5X) é preparada e mantida a 4°C. h. EDTA/HCl: 0,5 M, pH 7,0 (NaOH) como concentrado 100X. i. Na3V04: 0,5 M como concentrado 100X e as alíquotas são mantidas a -80°C. j. Na4P207: 0,2 M como concentrado 100X. k. Factor de crescimento 1 semelhante a Insulina, de Promega (Cat. # G5111).
86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 51 l. Anti-soro anti-fosfotirosina policlonal: soro de coelho produzido por Enzymology Lab., SUGEN Inc. m. Conjugado de IgG de cabra anti-coelho, POD (anticorpo de detecção), TAGO (cat. n°. 4520; lote n°. 1802): TAGO, Inc., Burlingame, CA. n. solução ABTS (2,2’-azinobis(ácido 3-etilbenztiazolino sulfónico):
ácido cítrico 100 mM
Na2HP04 250 mM (pH 4,0 / HC1 IN) ABTS 0,5 mg/ml; a solução ABTS deve ser mantida às escuras a 4°C. A solução deve ser rejeitada quando se toma verde. o. Peróxido de hidrogénio: a solução a 30% é mantida às escuras a 4°C.
Processo
Todos os passos seguintes são executados à temperatura ambiente excepto se especificamente indicado. Todas as lavagens da placa para ELISA são efectuadas por enxaguamento com água canalizada três vezes, seguido por um enxaguamento com TBST. Bater levemente com a placa sobre toalhas de papel para secar. A. Sementeira de Células 1. As células, cultivadas em caixas para cultura de tecidos (Corning 25020-100) até 80-90% de confluência, são recolhidas com Tripsina-EDTA (0,25%, 0. 5 ml/D-100, GIBCO). 2. Ressuspender as células em DMEM + 10% de FBS + 2 mM de L-glutamina fresco, e transferir para placas de cultura de tecidos de 96 alvéolos (Corning 25806-96) a 20000 células/ alvéolo (100 μΐ/ alvéolo). Incubar durante 1 dia e de seguida substituir o meio para meio isento de soro (90/μ1) e incubar em 5% de C02 a 37°C durante toda a noite.
B. Revestimento e bloqueio da placa para ELISA 1. Revestir a placa para ELISA (Corning 25805-96) com anticorpo anti-IGF-lR a 0,5 pg/ alvéolo em 100 μΐ de PBS pelo menos durante 2 horas. 2. Remover a solução de revestimento, e substituir com 100 μΐ de tampão de bloqueio, e colocar sob agitação durante 30 minutos. Remover o tampão de bloqueio e lavar a placa imediatamente antes da adição do lisado. C. Processos do Ensaio 1.
As drogas são testadas sob condição isenta de soro. 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 52
2. Diluir ο caldo da droga (em DMSO a 100%) a 1:10 com DMEM numa placa de polipropileno de 96 alvéolos, e transferir 10 μΐ/ alvéolo desta solução para as células a fim de obter uma diluição final da droga de 1:100, e uma concentração final de DMSO de 1,0%. Incubar as células em 5% de C02 a 37°C durante 2 horas.
Preparar tampão de lise celular fresco (HNTG*) HNTG 2 ml EDTA 0,1 ml Na3V04 0,1 ml Na4(P207) 0,1 ml h2o 7,3 ml. Após incubação da droga durante duas horas, transferir 10 μΐ/ alvéolo de ligando IGF-1 a 200 nM em PBS para as células (concentração final = 20 nM), e incubar em 5% de CO: a 37°C durante 10 minutos. 5. Remover o meio e adicionar 100 μΐ/ alvéolo de HNTG* e colocar sob agitação durante 10 minutos. Observar as células ao microscópio a fim de verificar se se encontram adequadamente lisadas. 6. Utilizar uma pipeta de 12 canais para raspar as células a partir da placa, e homogenizar o Usado por repetida aspiração e repartição. Transferir todo o lisado para a placa para ELISA revestida com anticorpo, e colocar sob agitação durante 1 hora. 7. Remover o lisado, lavar a placa, transferir 100 μΐ/ alvéolo de anti-Ptyr (1:3000 com TBST), e colocar sob agitação durante 30 minutos. 8. Remover o anti-Ptyr, lavar a placa, transferir 100 μΐ/alvéolo de TAGO (1:3000 com TBST), e colocar sob agitação durante 30 minutos. 9. Remover o anticorpo de detecção, lavar a placa, e transferir 100 μΐ/ alvéolo de ABTS/H20; fresco (1,2 μΐ de H202 para 10 ml de ABTS) para a placa a fim de iniciar o desenvolvimento da cor. 9. Medir a OD em Dynatec MR5000, o qual é conectado a Ingres.
6.1.5. ELISA para receptor EGF A actividade da quinase do receptor EGF (ensaio EGFR-NIH3T3) em células inteiras foi medida tal como descrito abaixo:
Materiais e Reagentes
Foram utilizados os seguintes materiais e reagentes a fim de conduzir o ensaio: 53 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ a. Ligando EGF: concentração do caldo = 16,5 μΜ; EGF 201, TOYOBO, CO., Ltd. Japão. b. 05-101 (UBI) (um anticorpo monoclonal que reconhece um domínio extracelular do EGFR). c. Anticorpo anti-fosfotirosina (anti-Ptyr) (policlonal). d. Anticorpo de detecção: conjugado de peroxidase de rábano picante, TAGO, Inc. e. Tampão TBST: Tris-HCl, pH 7 50 mM NaCl 150 mM Triton X-100 0,1% f. HNTG concentrado 5X: HEPES 0,1 M NaCl 0,75 M Glicerol 50% Triton X-100 1,0% g. caldo de ABTS: ácido cítrico 100 mM Na,HP04 250 mM HC1, conc. 4,0 pH ABTS* 0,5 mg/ml; manter a solução às escuras a 4°C até à utilização. Reagentes concentrados de: EDTA 100 mM, pH 7,0
Na3V04 0,5 M
Na4(P207) 0,2 M.
Processo
Foi utilizado o seguinte protocolo:
A. Pré-revestimento da placa para ELISA 1. Revestir placas para ELISA (Corning, 96 alvéolos, Cat. # 25805-96) com anticorpo 05-101 a 0,5 pg por alvéolo em PBS, volume final de 150 μΐ/ alvéolo, e armazenar durante toda a noite a 4°C. As placas revestidas mantêm-se boas durante até 10 dias quando armazenadas a 4°C. 2. No dia da utilização, remover o tampão de revestimento e substituir com tampão de bloqueio (Leite em pó instantâneo não gordo vermelho a 5% em 54 t 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ PBS). Incubar a placa, sob agitação, à temperatura ambiente (cerca de 23°C 3"25°0) durante 30 minutos. Imediatamente antes da utilização, remover o tampão de bloqueio e lavar a placa 4 vezes com tampão TBST. B. Sementeira de Células 1. Pode ser utilizada neste ensaio a linha de células NIH 3T3/C7 (Honegger et al., Cell 51: 199-209, 1987). 2. Escolher para a experiência caixas que apresentem 80-90% de confluência. Tripsinizar as células e parar a reacção pela adição de 10% de meio CS DMEM. Suspender as células em meio DMEM (10% de meio CS DMEM) e centrifugar uma vez a 1000 rpm, e uma vez à temperatura ambiente durante 5 minutos. 3. Ressuspender as células em meio de sementeira (DMEM, 0,5% de soro de bovino), e contar as células utilizando azul de tripano. Viabilidade acima de 90% é aceitável. Semear as células em meio DMEM (0,5% de soro de bovino) a uma densidade de 10000 células por alvéolo, 100 μΐ por alvéolo, numa placa de microtitulação de 96 alvéolos. Incubar as células semeadas em 5% de C02 a 37°C durante cerca de 40 horas. C. Processos do Ensaio 1. Verificar as células semeadas quanto a contaminação utilizando um microscópio invertido. Diluir o concentrado da droga (10 mg/ml em DMSO) a 1:10 em meio DMEM, de seguida transferir 5 μΐ para um alvéolo teste para uma diluição final da droga de 1:200 e uma concentração final de DMSO de 1%. Os alvéolos de controlo recebem apenas DMSO. Incubar em 5% de C02 a 37°C durante uma hora. 2. Preparar o ligando EGF: diluir EGF concentrado em DMEM de modo que, após transferência de 10 μΐ de EGF diluído (diluição a 1:12), seja atingida a concentração final de 25 nM. 3. Preparar 10 ml HNTG* fresco suficiente para 100 μΐ por alvéolo, em que o HNTG* compreende: HNTG concentrado (2,0 ml), H20 mili Q (7,3 ml), EDTA, 100 mM, pH 7,0 (0,5 ml), Na3V04 0,5 M (0,1 ml) e Na4(P207), 0,2 M (0,1 ml). 4. Colocar em gelo. 5. Após duas horas de incubação com a droga, adicionar às células ligando EGF preparado, 10 μΐ por alvéolo, a fim de obter uma concentração final de 25 nM. Os alvéolos de controlo recebem apenas DMEM. Incubar, sob agitação, à temperatura ambiente, durante 5 minutos. 55 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 6. Remover a droga, EGF, e DMEM. Lavar as células, duas vezes, com PBS. Transferir HTNG* para as células,.100 μΐ por alvéolo. Colocar em gelo durante 5 minutos. Entretanto, remover o tampão de bloqueio a partir de outra placa para ELISA e lavar com TBST tal como descrito acima. 7. Com uma ponta de pipeta seguramente ajustada a um micropipetador, raspar células a partir da placa e homogenizar o material celular por repetidamente aspirar e repartir o tampão de lise HNTG*. Transferir o lisado para uma placa para ELISA revestida, bloqueada e lavada. Incubar sob agitação à temperatura ambiente durante uma hora. 8. Remover o lisado e lavar 4 vezes com TBST. Transferir anticorpo anti-Ptyr recentemente diluído para a placa para ELISA a 100 μΐ por alvéolo. Incubar sob agitação à temperatura ambiente durante 30 minutos na presença do anti-soro anti-Ptyr (diluição a 1:3000 em TBST). 9. Remover o anticorpo anti-Ptyr e lavar 4 vezes com TBST. Transferir o anticorpo IgG anti-coelho TAGO 30 recentemente diluído para a placa para ELISA a 100 μΐ por alvéolo. Incubar sob agitação à temperatura ambiente durante 30 minutos (anticorpo IgG anti-coelho: diluição a 1:3000 em TBST). 10. Remover o anticorpo de detecçào e lavar 4 vezes com TBST. Transferir solução ABTS/H;02 recentemente preparada para a placa para ELISA, 100 μΐ por alvéolo. Incubar à temperatura ambiente durante 20 minutos. Solução ABTS/H202: 1,2 μΐ de H20: a 30% em 10 ml de concentrado de ABTS. 11. Parar a reacção pela adição de 50 μΐ de H2S04 5N (facultativo), e determinar a O.D. a 410 nm. 12. O sinal de fosfotirosina máximo é determinado pela subtracção do valor dos controlos negativos ao dos controlos positivos. A percentagem de inibição do teor em fosfotirosina para os alvéolos contendo extracto é de seguida calculada, após subtracção dos controlos negativos. 6.1.6. ELISA para receptor de insulina celular O protocolo seguinte foi utilizado para determinar se os compostos do presente invento possuíam actividade da tirosina-quinase do receptor de insulina.
Materiais e Reagentes
Foram utilizados os seguintes materiais e reagentes para medir os níveis de fosfotirosina no receptor de insulina (indicando a actividade da tirosina-quinase do receptor de insulina): 56 r t 86 518
EP 0 769 947 / PT 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. A linha de células preferida foi uma linha de células NIH 3T3 (ATCC n°. 1658), a qual sobre-expressa o receptor de Insulina (células H25).
As células H25 foram cultivadas num incubador com 5% de C02 a 37°C. O meio de crescimento é DMEM + 10% de FBS (inactivado pelo calor) + 2 mM de L-glutamina.
Para revestimento da placa para ELISA é utilizado o anticorpo anti-ER monoclonal denominado BBE. Os referidos anticorpos foram purificados por Enzymology Lab, SUGEN, Inc. D-PBS, compreendendo: KH2HP04 0,20 g/1 (GIBCO, 310-4190AJ) K2HP04 2,16 g/1 KC1 0,20 g/1
NaCl 8,00 g/1 (pH 7,2).
Tampão de bloqueio: TBST mais Leite a 5% (leite em pó instantâneo não gordo vermelho).
Tampão TBST, compreendendo:
Tris-HCl 50 mM
NaCl 150 mM, pH 7,2 (HC1 IN)
Triton X-100 0,1%.
Nota: a solução concentrada de TBS (10X) é preparada, e o Triton X-100 é adicionado ao tampão durante a diluição.
Tampão HNTG, compreendendo:
HEPES 20 mM
NaCl 150 mM, pH 7,2 (HC1 IN)
Glicerol 10%
Triton X-100 0,2%;
Nota: a solução concentrada (5X) é preparada e mantida a 4°C. EDTA.HC1: 0,5 M, pH 7,0 (NaOH) como concentrado 100X.
Na3V04: 0,5 M como concentrado 100X e as alíquotas são mantidas a -80°C. Na4P207: 0,2 M como concentrado 100X.
Insulina de GIBCO BRL (Cat. # 18125039).
Anti-soro anti-fosfotirosina policlonal: soro de coelho produzido por Enzymology Lab., SUGEN Inc.
Anticorpo de detecção, preferencialmente conjugado de IgG de cabra anti-coelho, POD, TAGO (cat. n°. 4520; lote n°. 1802): TAGO, Inc., Burlingame, CA. solução ABTS, compreendendo: 14. r
86 518
EP 0 769 947 / PT
ácido cítrico Na2HP04 ABTS em que ABTS é 2,2’-azinobis(ácido 3-etilbenztiazolino sulfónico), devendo ser armazenado às escuras a 4°C e rejeitado quando se toma verde. 15. Peróxido de hidrogénio: a solução a 30% é mantida no escuro a 40°C.
Processo
Todos os passos seguintes são executados à temperatura ambiente excepto se especificamente indicado. Todas as lavagens da placa para ELISA são efectuadas por enxaguamento com água canalizada três vezes, seguido por um enxaguamento com TBST. Todas as placas foram secas batendo levemente com toalhas de papel antes da utilização. A. Sementeira de Células 1. As células foram cultivadas em caixas para cultura de tecidos (10 cm, Corning 25020-100) até 80-90% de confluência, e recolhidas com Tripsina-EDTA (0,25%, 0,5 ml/D-100, GIBCO). 2. Ressuspender as células em DMEM + 10% de FBS + 2 mM de L-glutamina fresco, e transferir para placas de cultura de tecidos de 96 alvéolos (Corning 25806-96) a 20000 células/alvéolo (100 μΐ/alvéolo). As células são de seguida incubadas durante 1 dia. Após a referida incubação, meio com soro a 0,01% (90/μ1) substitui o meio antigo e as células são incubadas em 5% de C02 a 37°C durante toda a noite.
B. Revestimento e bloqueio da placa para ELISA 1. Revestir a placa para ELISA (Corning 25805-96) com anticorpo anti-IR a 0,5 pg/ alvéolo em 100 μΐ de PBS pelo menos durante 2 horas. 2. Remover a solução de revestimento, e substituir com 100 μΐ de tampão de bloqueio, e colocar sob agitação durante 30 minutos. Remover o tampão de bloqueio e lavar a placa imediatamente antes da adição do lisado. C. Processos do Ensaio 1. As drogas são testadas sob condição isenta de soro. 2. Diluir o caldo da droga (em DMSO a 100%) a 1:10 com DMEM numa placa de polipropileno de 96 alvéolos, e transferir 10 μΐ/ alvéolo desta solução para as células a fim de obter uma diluição final da droga de 1:100, e uma
86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 58 concentração final de DMSO de 1,0%. Incubar as células em 5% de C02 a 37°C durante 2 horas.
Preparar tampão de lise de células fresco (HNTG*) HNTG (5X) 2 ml EDTA 0,1 ml Na3V04 0,1 ml Na4P207 0,1 ml H20 7,3 ml HNTG* 10 ml. Após incubação da droga durante duas horas, transferir 10 μΐ/ alvéolo de insulina 1 μΜ em PBS para as células (concentração final =100 nM), e incubar em 5% de C02 a 37°C durante 10 minutos. 5. Remover o meio e adicionar 100 μΐ/ alvéolo de HNTG* e colocar sob agitação durante 10 minutos. Observar as células ao microscópio a fim de verificar se se encontram adequadamente lisadas. 6. Utilizar uma pipeta de 12 canais para raspar as células a partir da placa, e homogenizar o lisado por repetida aspiração e repartição. Transferir todo o lisado para a placa para ELISA revestida com anticorpo, e colocar sob agitação durante 1 hora. 7. Remover o lisado, lavar a placa, transferir 100 μΐ/ alvéolo de anti-Ptyr (1:3000 com TBST), e colocar sob agitação durante 30 minutos. 8. Remover o anti-Ptyr, lavar a placa, transferir 100 μΐ/alvéolo de TAGO (1:3000 com TBST), e colocar sob agitação durante 30 minutos. 9. Remover o anticorpo de detecção, lavar a placa, e transferir 100 μΐ/ alvéolo de ABTS/H202 fresco (1,2 μΐ de Η,Ο, para 10 ml de ABTS) para a placa a fim de iniciar o desenvolvimento da cor. 10. Medir a OD em Dynatec MR5000, o qual é conectado a Ingres. Todos os passos seguintes devem seguir as instruções de Ingres.
6.1.7. Resultados experimentais a partir de ensaios ELISA
Os resultados experimentais de diversos compostos de acordo com o presente invento utilizando os protocolos descritos acima encontram-se expostos na Tabela 1: ί
86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 59
TABELA 1 - Resultados do Ensaio ELISA COMPOSTO (Exemplo) PDGFR IC50 (μΜ) FLK-1 IC50 (μΜ) EGFR IC50 (μΜ) HER2-Quinase . IC50 (μΜ) IGF-1R IC50 (μΜ) 4313 14,5 18,8 11 16,9 8,0 1B 12 0.39 2 2,9 89,8 10 0,4 11 1,8 3 17 0.24 12 23,8 4 0,17 13 53,7 U 5 0,07 6 10,8 0,11 15 15,4 7 2,3 17 4,6 8 2,4 20 51,4 9 4,5 70,6 22 8,6 23 73,4 24 41,2 25 3,4 44 26 65,5 0,14 28 36,2 34 0,18 35 20,3 37 55,9 2,7 39 8,7 40 14,2 1,5 41 7,4 44 0,15 6.2. Ensaios de crescimento celular
Os ensaios seguintes podem ser conduzidos a fim de medir o efeito dos compostos reivindicados sobre o crescimento celular como um resultado da interacção do composto com uma ou mais RTK. Excepto se de outro modo especificado, os ensaios seguintes podem 60
I 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ ser aplicados duma forma geral a fim de medir a actividade de um composto contra qualquer RTK particular. Na medida em que um ensaio, exposto abaixo, se refere a uma RTK específica, um especialista na arte será capaz de adaptar o protocolo descrito para utilização a fim de medir a actividade de uma segunda RTK. 6.2.1. Ensaio de ágar mole O ensaio do ágar mole pode ser utilizado para medir os efeitos de substâncias sobre o crescimento celular. Excepto se de outro modo estipulado, os ensaios do ágar mole podem ser levados a cabo como se segue:
Materiais e Reagentes
Foram utilizados os seguintes materiais e reagentes: a. Um banho-maria fixado a 39°C e um outro banho-maria a 37°C. b. 2X Meio de ensaio é constituído por Meio de Eagle Modificado de Dulbecco 2X (DMEM) (Gibco Cat. #CA400-4AN03) suplementado pelo seguinte: 20% de soro de bovino fetal (FBS), 2 mM de piruvato de sódio, 4 mM de glutamina amina; e 20 mM de HEPES aminoácidos não essenciais (1:50 a partir de concentrado 100X). c. IX Meio de ensaio é composto por DMEM suplementado com 10% de FBS, 1 mM de piruvato de sódio, 2 mM de glutamina, 10 mM de HEPES, amino-ácido não essencial (1:100 a partir de concentrado 100X). d. Agarose Seaplaque a 1,6% em frasco para autoclave. e. Placas Corning de 35 mm estéreis (FMC Bioproducts Cat. #50102). f. Pipetas de 5 ml em vidro estéreis (embaladas separadamente). g. Tubos para centrífuga cónicos de 15 ml e de 50 ml estéreis. h. Pipetas e pontas estéreis. i. Tubos para microcentrífuga estéreis. j. Células em balões T75: SKOV-3 (ATCC HTB77). k. Solução de tripsina a 0,25% (Gibco # 25200-015).
Processo O processo seguinte foi utilizado a fim de executar o ensaio do ágar mole: A.
Processo oara preparar a camada basal 1. Ter todos os meios aquecidos no banho-maria a 37°C.
ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 61 2. Para preparar IX de meio de ensaio +0,8% de ágar: fazer uma diluição a 1:2 (vohvol) de ágar fundido (arrefecido até 39°C), com 2X meio de ensaio. 3. Manter todos os meios com ágar aquecidos no banho-maria a 39°C quando não estão a ser utilizados. 4. Repartir 1 ml de IX meio de ensaio +0,8% de ágar por caixas e rodopiar suavemente a placa a fim de formar uma camada basal uniforme. As bolhas devem ser evitadas. 5. Refrigerar as camadas basais a fim de solidificarem (cerca de 20 minutos). As camadas basal podem ser armazenadas durante toda a noite num refrigerador. B. Processo para recolha de células 1. Retirar um balão por linha de células a partir do incubador; remover o meio por aspiração; lavar uma vez com PBS e remover por aspiração; adicionar 3 ml de solução de tripsina. 2. Depois de todas as células se dissociarem a partir do balão, adicionar 3 ml de IX meio de ensaio a fim de inibir a actividade da tripsina. Pipetar as células para cima e para baixo, de seguida transferir a suspensão para um tubo de 15 ml. 3. Determinar a concentração de células utilizando um contador Coulter, e a viabilidade por exclusão com azul tripano. 4. Retirar o volume apropriado necessário para semear 3300 células viáveis por placa e dilui-lo até 1,5 ml com IX meio de ensaio. C. Processo para preparar a camada superior de agarose a 0,4% 1. Adicionar compostos TB ST a duas vezes a concentração final desejada do ensaio; + 1,5 ml de suspensão de células em IX meio de ensaio 10% de FBS; + 1,5 ml de IX meio de ensaio + 0,8% de agarose*: Total = 3,0 ml de IX meio 10% FBS + 0,4% de agarose com 3 300 células viáveis/ml, com e sem compostos TBST. * (Preparada por diluição a 1:2 de 2X meio com 1,6% de ágar 30 para o processo para a camada basal acima.) 2. Revestir 1 ml da mistura de ensaio sobre a camada basal de 1 ml. Os duplicados são revestidos a partir do volume de 3 ml. 3. Incubar as caixas durante 2-3 semanas num incubador com 10% de C02, 100% humidificado. 4. As colónias que apresentam 60 microns ou maiores são classificadas positivas.
86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 62 6.2.2. Ensaios de crescimento em Sulforodamina B (SRB1
Os ensaios SRB podem ser utilizados para medir os efeitos de substâncias sobre o crescimento celular. Os ensaios são levados a cabo como se segue:
Ensaio 1: Ensaio SRB de Crescimento de Células 3T3/E/H+TGF-a(T)
Materiais: placas de 96 alvéolos de fundo plano estéreis, placas de 96 alvéolos de fundo redondo estéreis, reservatório de 25 ml ou de 100 ml estéril, pipetas, pipetador multi-canais, pontas de pipeta estéreis, tubos de 15 ml e de 50 ml estéreis.
Reagentes: 0,4% de SBR em ácido acético a 1%, 10 mM de base Tris, TC A a 10%, ácido acético a 1%, DMSO estéril(Sigma), composto em DMSO (100 mM ou menos de solução concentrada),
Tripsina-EDTA a 25% em Solução para dissociação de células (Sigma).
Linha de células e meio de crescimento: 3T3/E/H+TGF-a(T) (células ΝΊΗ 3T3 clone 7 que expressam a quimera EGF-R/HER2 e TGF-a, células de alça autócrina derivadas de tumor), 2% de soro de vitelo/DMEM + 2 mM de glutamina.
Protocolo:
Dia 0: Revestimento com células:
Esta parte do processo é levada a cabo numa chaminé de fluxo laminar. 1. Tripsinizar as células como habitualmente. Transferir 100 μΐ de suspensão de células para 10 ml de isótono. Contar as células com o contador Coulter. 63 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 2. Diluir as células em meio de crescimento até 60000 células/ml. Transferir 100 μΐ de células para cada alvéolo numa placa de 96 alvéolos de fundo plano a fim de originar 6000 células/ alvéolo. 3. Utilizar metade da placa (4 filas) para cada composto e alvéolos quadriplicados para cada concentração do composto, uma série de 4 alvéolos para controlo do meio e 4 alvéolos para controlo de DMSO. 4. Agitar suavemente as placas a fim de permitir a fixação uniforme das células. 5. Incubar as placas a 37°C num incubador com 10% de C02.
Dia 1: Adição do composto:
Esta parte do processo é levada a cabo numa chaminé de fluxo laminar. 1. Numa placa de 96 alvéolos de fundo redondo, adicionar 125 μΐ de meio de crescimento às colunas 3 a 11. Esta placa é utilizada para titular o composto, 4 filas por composto. 2. Num tubo de 15 ml estéril, preparar uma solução 2X da concentração mais elevada do composto pela adição de 8 μΐ do composto a um total de 2 ml de meio de crescimento para uma diluição de 1:250. A esta diluição, a concentração de DMSO é de 0,4% para uma solução 2X ou de 0,2% para uma solução IX sobre as células. A concentração de partida do composto é geralmente de 100 μΜ, mas esta concentração pode variar dependendo da solubilidade do composto. 3. Transferir a solução 2X de partida do composto para alvéolos quadriplicados na coluna 12 da placa de 96 alvéolos de fundo redondo. Fazer diluições seriadas a 1:2 através da placa da direita para a esquerda por transferência de 125 μΐ da coluna 12 para a coluna 11, da coluna 11 para a 10 e assim por diante. Transferir 100 μΐ de diluições do composto para 100 μΐ de meio para células em alvéolos correspondentes da placa de 96 alvéolos de fundo plano. O volume total por alvéolo deve ser de 200 μΐ. 4. Para controlo do veículo, preparar uma solução 2X de DMSO a 0,4% de DMSO em meio de crescimento. Transferir 100 μΐ da solução de DMSO para os alvéolos de células apropriados. A concentração final de DMSO é de 0,2%. 5. Para os alvéolos de controlo do meio, adicionar 100 μΐ/ alvéolo de meio de crescimento aos alvéolos de células apropriados. 6. Tomar a colocar a placa no incubador e incubar durante 4 dias.
Dia 5: Desenvolvimento do Ensaio:
Esta parte do processo é levada a cabo sobre a bancada.
86518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 64 1. Remover por aspiração ou decantar o meio. Adicionar 200 μΐ de TCA a 10% frio a cada alvéolo a fim de fixar as células. Incubar a placa durante, pelo menos, 60 min. a 4°C. 2. Rejeitar o TCA e enxaguar os alvéolos 5 vezes com água. Secar as placas de cabeça para baixo sobre toalhas de papel. 3. Corar as células com 100 μΐ/ alvéolo de SRB a 0,4% durante 10 min. 4. Decantar o SRB e enxaguar os alvéolos 5 vezes com ácido acético a 1%. Secar completamente as placas de cabeça para baixo sobre toalhas de papel. 5. Solubilizar o corante com 100 μΐ/ alvéolo de 10 mM de base Tris durante 5-10 min. num agitador. 6. Ler as placas num leitor de placa para ELISA Dynatech a 570 nm com referência a 630 nm.
Ensaio 2: Ensaio SRB de Crescimento de Células 3T3/EGF-R+TGF-afD
Materiais e Reagentes:
Os mesmos que para o Ensaio 1.
Linha de células e meio de crescimento: 3T3/EGF-R+TGF-a(T) (células NIH 3T3 clone 7 que expressam EGF-R e TGF-a, células de alça autócrina derivadas de tumor), 2% de soro de vitelo/DMEM + 2 mM de glutamina.
Protocolo:
Dia 0: Revestimento com células:
Esta parte do processo é levada a cabo numa chaminé de fluxo laminar. 1. Tripsinizar as células como habitualmente. Transferir 100 μΐ de suspensão de células para 10 ml de isótono. Contar as células com o contador Coulter. 2. Diluir as células em meio de crescimento até 60000 células/ml. Transferir 100 μΐ de células para cada alvéolo numa placa de 96 alvéolos de fundo plano a fim de originar 6000 células/ alvéolo. 3. Utilizar metade da placa (4 filas) para cada composto e alvéolos quadriplicados para cada concentração do composto, uma série de 4 alvéolos para controlo do meio e 4 alvéolos para controlo de DMSO. 4. Agitar suavemente as placas a fim de permitir a fixação uniforme das células. 5. Incubar as placas a 37°C num incubador com 10% de C02. 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 65
Dia 1: Adição do composto: O mesmo que para o Ensaio 1.
Dia 5: Desenvolvimento do Ensaio: O mesmo que para o Ensaio 1.
Ensaio 3: Ensaio SRB de Crescimento de Células 3T3/PDGF-BR/PDGF-BB(T)
Linha de células e meio de crescimento: 3T3/PDGF-PR/PDGF-BB(T) (células NIH 3T3 clone 7 que expressam o receptor PDGF-β e PDGF-BB, de tumores ressecados a ratinhos atímicos), 2% de soro de vitelo/DMEM + 2 mM de glutamina.
Protocolo:
Dia 0: Revestimento com células:
Esta parte do processo é levada a cabo numa chaminé de fluxo laminar. 1. Tripsinizar as células como habitualmente. Transferir 200 μΐ de suspensão de células para 10 ml de isótono. Contar as células com o contador Coulter. 2. Diluir as células em meio de crescimento até 60000 células/ml. Transferir 100 μΐ de células para cada alvéolo numa placa de 96 alvéolos de fundo plano a fim de originar 6000 células/ alvéolo. 3. Conceder metade da placa (4 filas) para cada composto e alvéolos quadriplicados para cada concentração do composto, uma série de 4 alvéolos para controlo do meio e 4 alvéolos para controlo de DMSO. 4. Agitar suavemente as placas a fim de permitir a fixação uniforme das células à placa. 5. Incubar as placas a 37°C num incubador com 10% de C02.
Dia 1: Adição do composto: O mesmo que para o Ensaio 1.
Dia 5: Desenvolvimento do Ensaio: O mesmo que para o Ensaio 1.
86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 66
Ensaio 4: Ensaio SRB de Crescimento de Células de Músculo Liso (SMQ Humanas
Materiais e Reagentes:
Os mesmos que para o Ensaio 1.
Linha de células e meio de crescimento: Células de músculo liso aórtico humanas (Clonetics)
Conjunto de projéctil de Clonetics: Meio basal para músculo liso (SmBM) o qual é modificado com MCDB 131 contendo soro de bovino fetal (5%), hFGF (2 ng/ml), hEGF (0,1 ng/ml), insulina (5,0 pg/ml), gentamicina (50 pg/ml) e anfotericina B (50 ng/ml). 2% de soro de vitelo/DMEM + 2 mM de glutamina.
Protocolo:
Dia 0: Revestimento com células:
Esta parte do processo é levada a cabo numa chaminé de fluxo laminar. 1. Tripsinizar as células como habitualmente. Transferir 200 μΐ de suspensão de células para 10 ml de isótono. Contar as células com o contador Coulter. 2. Diluir as células em meio de crescimento até 20000 células/ml. Transferir 100 μΐ de células para cada alvéolo numa placa de 96 alvéolos de fundo plano a fim de originar 2000 células/ alvéolo. 3. Conceder metade da placa (4 filas) para cada composto e alvéolos quadriplicados para cada concentração do composto, uma série de 4 alvéolos para controlo do meio e 4 alvéolos para controlo de DMSO. 4. Agitar suavemente as placas a fim de permitir a fixação uniforme das células à placa. 5. Incubar as placas a 37°C num incubador com 10% de C02.
Dia 1: Adição do composto: O mesmo que para o Ensaio 1.
Dia 5: Desenvolvimento do ensaio: O mesmo que para o Ensaio 1. r
86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 67 6.2.3. Ensaios de crescimento de células 3T3
Ensaio 1: Ensaio de Incorporação de BrdU induzida por PDGF Materiais e Reagentes: (1) PDGF: PDGF B/B humano; 1276-956, Boehringer Mannheim, Alemanha. (2) Reagente de marcação BrdU: 10 mM, em PBS (pH 7,4), Cat. n°. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (3) FixDenat: solução para fixação (pronta a utilizar), Cat. n°. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (4) Anti-BrdU-POD: anticorpo monoclonal de ratinho conjugado com peroxidase, Cat. n°. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (5) Solução do substracto TMB: tetrametilbenzidina (TMB), pronta a utilizar, Cat. n°. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (6) Solução para lavagem PBS: PBS IX, pH 7,4, preparada em casa. (7) Albumina, bovina (BSA): pó da fracção V; A-8551, Sigma Chemical Co., EUA.
Protocolo: (1) Linha de células 3T3 obtidas por engenharia: 3T3/EGFRc7. (2) As células são semeadas a 8000 células/alvéolo em DMEM, 10% de CS, 2 mM de Gin numa placa de 96 alvéolos. As células são incubadas durante toda a noite a 37°C em 5% de C02. (3) Após 24 horas, as células são lavadas com PBS, e de seguida são submetidas a carência de soro em meio isento de soro (0% de CS DMEM com 0,1% de BSA) durante 24 horas. (4) No dia 3, ligando (PDGF = 3,8 nM, preparado em DMEM com 0,1% de BSA) e os compostos em teste são adicionados simultaneamente às células. Os alvéolos de controlo negativo recebem apenas DMEM isento de soro com 0,1% de BSA; as células de controlo positivo recebem o ligando (PDGF) mas nenhum composto em teste. Os compostos em teste são preparados em DMEM isento de soro com ligando numa placa de 96 alvéolos, e são diluídos de forma seriada para 7 concentrações de teste. (5) Após 20 horas de activação pelo ligando, é adicionado reagente de marcação BrdU diluído (1:100 em DMEM; 0,1% de BSA) e as células são incubadas com BrdU (concentração final = 10 μΜ) durante 1,5 horas. 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ
68 (6) Após incubação com ο reagente de marcação, o meio é removido por decantação e por batidas suaves da placa invertida sobre uma toalha de papel. A solução de FixDenat é adicionada (50 μΐ/ alvéolo) e as placas são incubadas à temperatura ambiente durante 45 minutos num agitador de placas. (7) A solução de FixDenat é cuidadosamente removida por decantação e por batidas suaves da placa invertida sobre uma toalha de papel. É adicionado leite (leite desidratado a 5% em PBS, 200 μΐ/ alvéolo) como uma solução de bloqueio e a placa é incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente num agitador de placas. (8) A solução de bloqueio é removida por decantação e os alvéolos são lavados uma vez com PBS. Solução de anti-BrdU-POD (diluição a 1:100 em PBS, 1% de BSA) é adicionada (100 μΐ/alvéolo) e a placa é incubada durante 90 minutos à temperatura ambiente num agitador de placas. (9) O conjugado de anticorpo é cuidadosamente removido por decantação e enxaguamento dos alvéolos 5 vezes com PBS, e a placa é seca por inversão e batidas suaves sobre uma toalha de papel. (10) A solução do substracto TMB é adicionada (100 μΐ/alvéolo) e incubada durante 20 minutos à temperatura ambiente num agitador de placas até o desenvolvimento da cor ser suficiente para detecção fotométrica. (11) As absorvâncias das amostras são medidas a 410 nm (no modo de “comprimento de onda duplo” com um filtro lendo a 490 nm, como um comprimento de onda de referência) num leitor de placa para ELISA Dynatech.
Ensaio 2: Ensaio de Incorporação de BrdU induzida por EGF
Materiais e Reagentes: (1) EGF: EGF de ratinho, 201; Toyobo, Co., Ltd. Japão. (2) Reagente de marcação BrdU: 10 mM, em PBS (pH 7,4), Cat. n°. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (3) FixDenat: solução para fixação (pronta a utilizar), Cat. n°. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (4) Anti-BrdU-POD: anticorpo monoclonal de ratinho conjugado com peroxidase, Cat. n°. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (5) Solução do substracto TMB: tetrametilbenzidina (TMB), pronta a utilizar, Cat. n°. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (6) Solução para lavagem PBS: PBS IX, pH 7,4, preparada em casa. (7) Albumina, bovina (BSA): pó da fracção V; A-8551, Sigma Chemical Co., EUA. 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 69
Protocolo: (1) Linha de células 3T3 obtidas por engenharia: 3T3/EGFRc7. (2) As células são semeadas a 8000 células/ alvéolo em 10% de CS, 2 mM de Gin em DMEM, numa placa de 96 alvéolos. As células são incubadas durante toda a noite a 37°C em 5% de C02. (3) Após 24 horas, as células são lavadas com PBS, e de seguida são submetidas a carência de soro em meio isento de soro (0% de CS DMEM com 0,1% de BSA) durante 24 horas. (4) No dia 3, ligando (EGF = 2 nM, preparado em DMEM com 0,1% de BSA) e os compostos em teste são adicionados simultaneamente às células. Os alvéolos de controlo negativo recebem apenas DMEM isento de soro com 0,1% de BSA; as células de controlo positivo recebem o ligando (EGF) mas nenhum composto em teste. Os compostos em teste são preparados em DMEM isento de soro com ligando numa placa de 96 alvéolos, e são diluídos de forma seriada para 7 concentrações de teste. (5) Após 20 horas de activação pelo ligando, é adicionado reagente de marcação BrdU diluído (1:100 em DMEM; 0,1% de BSA) e as células são incubadas com BrdU (concentração final = 10 μΜ) durante 1,5 horas. (6) Após incubação com o reagente de marcação, o meio é removido por decantação e por batidas suaves da placa invertida sobre uma toalha de papel. A solução de FixDenat é adicionada (50 μΐ/ alvéolo) e as placas são incubadas à temperatura ambiente durante 45 minutos num agitador de placas. (7) A solução de FixDenat é cuidadosamente removida por decantação e por batidas suaves da placa invertida sobre uma toalha de papel. É adicionado leite (leite desidratado a 5% em PBS, 200 μΐ/ alvéolo) como uma solução de bloqueio e a placa é incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente num agitador de placas. (8) A solução de bloqueio é removida por decantação e os alvéolos são lavados uma vez com PBS. Solução de anti-BrdU-POD (diluição a 1:100 em PBS, 1% de BSA) é adicionada (100 μΐ/ alvéolo) e a placa é incubada durante 90 minutos à temperatura ambiente num agitador de placas. (9) O conjugado de anticorpo é cuidadosamente removido por decantação e enxaguamento dos alvéolos 5 vezes com PBS, e a placa é seca por inversão e batidas suaves sobre uma toalha de papel. (10) A solução do substracto TMB é adicionada (100 μΐ/alvéolo) e incubada durante 20 minutos à temperatura ambiente num agitador de placas até o desenvolvimento da cor ser suficiente para detecçào fotométrica. 86 518 #7 -«g—
EP 0 769 947 / PT 7"Z 70 (11) As absorvâncias das amostras são medidas a 410 nm (no modo de “comprimento de onda duplo” com um filtro lendo a 490 nm, como um comprimento de onda de referência) num leitor de placa para ELISA Dynatech.
Ensaio 3: Incorporação de BrdU induzida por EGF e orientada por HER2
Materiais e Reagentes: (1) EGF: EGF de ratinho, 201; Toyobo, Co., Ltd. Japão. (2) Reagente de marcação BrdU: 10 mM, em PBS (pH 7,4), Cat. n°. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (3) FixDenat: solução para fixação (pronta a utilizar), Cat. n°. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (4) Anti-BrdU-POD: anticorpo monoclonal de ratinho conjugado com peroxidase, Cat. n°. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (5) Solução do substracto TMB: tetrametilbenzidina (TMB), pronta a utilizar, Cat. n°. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (6) Solução para lavagem PBS: PBS IX, pEl 7,4, preparada em casa. (7) Albumina, bovina (BSA): pó da fracção V; A-8551, Sigma Chemical Co., EUA.
Protocolo: (1) Linha de células 3T3 obtidas por engenharia: 3T3/EGFr/Her2/EGFr (EGFr com um domínio da quinase Her2). (2) As células são semeadas a 8000 células/ alvéolo em DMEM, 10% de CS, 2 mM de Gin, numa placa de 96 alvéolos. As células são incubadas durante toda a noite a 37°C em 5% de C02. (3) Após 24 horas, as células são lavadas com PBS, e de seguida são submetidas a carência de soro em meio isento de soro (0% de CS DMEM com 0,1% de BSA) durante 24 horas. (4) No dia 3, ligando (EGF = 2 nM, preparado em DMEM com 0,1% de BSA) e os compostos em teste são adicionados simultaneamente às células. Os alvéolos de controlo negativo recebem apenas DMEM isento de soro com 0,1% de BSA; as células de controlo positivo recebem o ligando (EGF) mas nenhum composto em teste. Os compostos em teste são preparados em DMEM isento de soro com ligando numa placa de 96 alvéolos, e são diluídos de forma seriada para 7 concentrações de teste. 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 71
(5) Após 20 horas de activação pelo ligando, é adicionado reagente de marcação BrdU diluído (1:100 em DMEM; 0,1% de BSA) e as células são incubadas com BrdU (concentração final =10 μΜ) durante 1,5 horas. (6) Após incubação com o reagente de marcação, o meio é removido por decantação e por batidas suaves da placa invertida sobre uma toalha de papel. A solução de FixDenat é adicionada (50 μΐ/ alvéolo) e as placas são incubadas à temperatura ambiente durante 45 minutos num agitador de placas. (7) A solução de FixDenat é cuidadosamente removida por decantação e por batidas suaves da placa invertida sobre uma toalha de papel. É adicionado leite (leite desidratado a 5% em PBS, 200 μΐ/ alvéolo) como uma solução de bloqueio e a placa é incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente num agitador de placas. (8) A solução de bloqueio é removida por decantação e os alvéolos são lavados uma vez com PBS. Solução de anti-BrdU-POD (diluição a 1:100 em PBS, 1% de BSA) é adicionada (100 μΐ/ alvéolo) e a placa é incubada durante 90 minutos à temperatura ambiente num agitador de placas. (9) O conjugado de anticorpo é cuidadosamente removido por decantação e enxaguamento dos alvéolos 5 vezes com PBS, e a placa é seca por inversão e batidas suaves sobre uma toalha de papel. (10) A solução do substracto TMB é adicionada (100 μΐ/ alvéolo) e incubada durante 20 minutos à temperatura ambiente num agitador de placas até o desenvolvimento da cor ser suficiente para detecção fotométrica. (11) As absorvâncias das amostras são medidas a 410 nm (no modo de “comprimento de onda duplo” com um filtro lendo a 490 nm, como um comprimento de onda de referência) num leitor de placa para ELISA Dynatech.
Ensaio 4: Ensaio de Incorporação de BrdU induzida por IGF-1
Materiais e Reagentes: (1) Ligando IGF1: humano, recombinante; G511, Promega Corp., EUA. (2) Reagente de marcação BrdU: 10 mM, em PBS (pH 7,4), Cat. n°. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (3) FixDenat: solução para fixação (pronta a utilizar), Cat. n°. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (4) Anti-BrdU-POD: anticorpo monoclonal de ratinho conjugado com peroxidase, Cat. n°. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (5) Solução do substracto TMB: tetrametilbenzidina (TMB), pronta a utilizar, Cat. n°. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemanha.
86518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 72 (6) Solução para lavagem PBS: PBS IX, pH 7,4, preparada em casa. (7) Albumina, bovina (BSA): pó da fracção V; A-8551, Sigma Chemical Co., EUA.
Protocolo: (1) Linha de células 3T3 obtidas por engenharia: 3T3/IGF1 r. (2) As células são semeadas a 8000 células/alvéolo em DMEM, 10% de CS, 2 mM de Gin, numa placa de 96 alvéolos. As células são incubadas durante toda a noite a 37°C em 5% de CO,. (3) Após 24 horas, as células são lavadas com PBS, e de seguida são submetidas a carência de soro em meio isento de soro (0% de CS DMEM com 0,1% de BSA) durante 24 horas. (4) No dia 3, ligando (IGF1 =3,3 nM, preparado em DMEM com 0,1% de BSA) e os compostos em teste são adicionados simultaneamente às células. Os alvéolos de controlo negativo recebem apenas DMEM isento de soro com 0,1% de BSA; as células de controlo positivo recebem o ligando (IGF1) mas nenhum composto em teste. Os compostos em teste são preparados em DMEM isento de soro com ligando numa placa de 96 alvéolos, e são diluídos de forma seriada para 7 concentrações de teste. (5) Após 16 horas de activação pelo ligando, é adicionado reagente de marcação BrdU diluído (1:100 em DMEM; 0,1% de BSA) e as células são incubadas com BrdU (concentração final = 10 μΜ) durante 1,5 horas. (6) Após incubação com o reagente de marcação, o meio é removido por decantação e por batidas suaves da placa invertida sobre uma toalha de papel. A solução de FixDenat é adicionada (50 μΐ/ alvéolo) e as placas são incubadas à temperatura ambiente durante 45 minutos num agitador de placas. (7) A solução de FixDenat é cuidadosamente removida por decantação e por batidas suaves da placa invertida sobre uma toalha de papel. E adicionado leite (leite desidratado a 5% em PBS, 200 μΐ/ alvéolo) como uma solução de bloqueio e a placa é incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente num agitador de placas. (8) A solução de bloqueio é removida por decantação e os alvéolos são lavados uma vez com PBS. Solução de anti-BrdU-POD (diluição a 1:100 em PBS, 1% de BSA) é adicionada (100 μΐ/alvéolo) e a placa é incubada durante 90 minutos à temperatura ambiente num agitador de placas. (9) O conjugado de anticorpo é cuidadosamente removido por decantação e enxaguamento dos alvéolos 5 vezes com PBS, e a placa é seca por inversão e batidas suaves sobre uma toalha de papel. 73 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ (10) A solução do substracto ΤΜΒ é adicionada (100 μΐ/alvéolo) e incubada durante 20 minutos à temperatura ambiente num agitador de placas até o desenvolvimento da cor ser suficiente para detecçào fotométrica. (11) As absorvâncias das amostras são medidas a 410 nm (no modo de “comprimento de onda duplo” com um filtro lendo a 490 nm, como um comprimento de onda de referência) num leitor de placa para ELISA Dynatech.
Ensaio 5: Ensaio de Incorporação de BrdU induzida pela Insulina
Materiais e Reagentes: (1) Insulina: cristalina, bovina, zinco; 13007, Gibco BRL, EUA. (2) Reagente de marcação BrdU: 10 mM, em PBS (pH 7,4), Cat. η". 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (3) FixDenat: solução para fixação (pronta a utilizar), Cat. n°. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (4) Anti-BrdU-POD: anticorpo monoclonal de ratinho conjugado com peroxidase, Cat. n°. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (5) Solução do substracto TMB: tetrametilbenzidina (TMB), pronta a utilizar, Cat. n°. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (6) Solução para lavagem PBS: PBS IX, pH 7,4, preparada em casa. (7) Albumina, bovina (BSA): pó da fracção V; A-8551, Sigma Chemical Co., EUA.
Protocolo: (1) Linha de células 3T3 obtidas por engenharia: H25. (2) As células são semeadas a 8000 células/ alvéolo em DMEM, 10% de CS, 2 mM de Gin, numa placa de 96 alvéolos. As células são incubadas durante toda a noite a 37°C em 5% de C02. (3) Após 24 horas, as células são lavadas com PBS, e de seguida são submetidas a carência de soro em meio isento de soro (0% de CS DMEM com 0,1% de BSA) durante 24 horas. (4) No dia 3, ligando (Insulina = 10 nM, preparada em DMEM com 0,1% de BSA) e os compostos em teste são adicionados simultaneamente às células. Os alvéolos de controlo negativo recebem apenas DMEM isento de soro com 0,1% de BSA; as células de controlo positivo recebem o ligando (Insulina) mas nenhum composto em teste. Os compostos em teste são preparados em DMEM isento de soro
86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ com ligando numa placa de 96 alvéolos, e são diluídos de forma seriada para 7 concentrações de teste. (5) Após 16 horas de activação pelo ligando, é adicionado reagente de marcação BrdU diluído (1:100 em DMEM; 0,1% de BSA) e as células são incubadas com BrdU (concentração final = 10 μΜ) durante 1,5 horas. (6) Após incubação com o reagente de marcação, o meio é removido por decantação e por batidas suaves da placa invertida sobre uma toalha de papel. A solução de FixDenat é adicionada (50 μΐ/alvéolo) e as placas são incubadas à temperatura ambiente durante 45 minutos num agitador de placas. (7) A solução de FixDenat é cuidadosamente removida por decantação e por batidas suaves da placa invertida sobre uma toalha de papel. É adicionado leite (leite desidratado a 5% em PBS, 200 μΐ/ alvéolo) como uma solução de bloqueio e a placa é incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente num agitador de placas. (8) A solução de bloqueio é removida por decantação e os alvéolos são lavados uma vez com PBS. Solução de anti-BrdU-POD (diluição a 1:100 em PBS, 1% de BSA) é adicionada (100 μΐ/alvéolo) e a placa é incubada durante 90 minutos à temperatura ambiente num agitador de placas. (9) O conjugado de anticorpo é cuidadosamente removido por decantação e enxaguamento dos alvéolos 5 vezes com PBS, e a placa é seca por inversão e batidas suaves sobre uma toalha de papel. (10) A solução do substracto TMB é adicionada (100 μΐ/alvéolo) e incubada durante 20 minutos à temperatura ambiente num agitador de placas até o desenvolvimento da cor ser suficiente para detecção fotométrica. (11) As absorvâncias das amostras são medidas a 410 nm (no modo de “comprimento de onda duplo” com um filtro lendo a 490 nm, como um comprimento de onda de referência) num leitor de placa para ELISA Dynatech.
6.2.4, Ensaio HUV-EC-C O protocolo seguinte também pode ser utilizado para medir a actividade de um composto:
Dia 0:: 1. Lavar e tripsinizar células HUV-EC-C (células endoteliais da veia umbilical humanas; American Type Culture Collection, catálogo n°. 1730 CRL). Lavar com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS; obtida a partir de Gibco BRL, catálogo n°. 14190-029) 2 vezes a cerca de 1 ml/10 cm2 do balão de cultura de 75 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ tecidos. Tripsinizar com 0,05% de Tripsina-EDTA em solução para dissociação de células não enzimática (Sigma Chemical Company, catálogo n°. C-1544). A tripsina a 0,05% foi preparada por diluição de tripsina a 0,25%/l mM de EDTA (Gibco, catálogo n°. 25200-049) na solução para dissociação de células. Tripsinizar com aproximadamente 1 ml/ 25-30 cnr do balão de cultura de tecidos durante cerca de 5 minutos a 37°C. Depois das células se terem destacado do balão, adicionar um volume igual de meio de ensaio e transferir para um tubo de centrífuga de 50 ml estéril (Fisher Scientifíc, catálogo n°. 05-539-6). 2. Lavar as células com cerca de 35 ml de meio de ensaio no tubo de centrífuga de 50 ml estéril por adição do meio de ensaio, centrifugação durante 10 minutos a aproximadamente 200 x g, aspiração do sobrenadante, e ressuspensão com 35 ml de D-PBS. Repetir a lavagem mais duas vezes com D-PBS, ressuspender as células em cerca de 1 ml de meio de ensaio/15 cm2 do balão de cultura de tecidos. O meio de ensaio é constituído por meio F12K (Gibco BRL, catálogo n°. 21127-014) + 0,5% de soro de bovino fetal inactivado pelo calor. Contar as células com um contador Coulter® (Coulter Electronics, Inc.) e adicionar meio de ensaio às células a fim de obter uma concentração de 0,8-1,0 x 103 células/ml. 3. Adicionar células a placas de 96 alvéolos de fundo plano a 100 μΐ/alvéolo ou 0. 8-1,0 x 104 células/alvéolo; incubar ~24 h a 37°C, 5% de C02.
Dial: 1. Preparar titulações da droga duplas em placas de 96 alvéolos distintas, geralmente de 50 μΜ para baixo até 0 μΜ. Utilizar o mesmo meio de ensaio tal como mencionado no dia 0, passo 2, acima. As titulações são preparadas pela adição de 90 pg/ alvéolo da droga a 200 μΜ (4X a concentração final do alvéolo) até ao alvéolo da ponta de uma coluna particular da placa. Dado que a concentração da droga em caldo é geralmente de 20 mM em DMSO, a concentração da droga de 200 μΜ contém 2% de DMSO.
Consequentemente, diluente preparado até 2% de DMSO em meio de ensaio (F12K -ΙΟ,5% de soro de bovino fetal) é utilizado como diluente para as titulações da droga a fim de diluir a droga mas manter a concentração em DMSO constante. Adicionar este diluente aos restantes alvéolos na coluna a 60 μΐ/ alvéolo. Tomar 60 μΐ a partir dos 120 μΐ da diluição da droga a 200 μΜ no alvéolo da ponta da coluna e misturar com os 60 μΐ no segundo alvéolo da coluna. Tomar 60 μΐ a partir deste alvéolo e misturar com os 60 μΐ no terceiro alvéolo da coluna, e assim por diante até estarem concluídas as titulações duplas. Quando é misturado o alvéolo adjacente ao último, tomar 60 μΐ a partir dos 120 μΐ neste alvéolo e rejeitá-los. Deixar o último alvéolo com 60 μΐ de 76 ι 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ DMSO/diluente do meio como um controlo não contendo droga. Preparar 9 colunas de droga titulada, suficientes para alvéolos triplicados cada para 1) VEGF (obtido a partir de Pepro Tech Inc., catálogo n°. 100-200), 2) factor de crescimento de células endoteliais (ECGF) (também conhecido como factor de crescimento de fibroblastos acídico, ou aFGF) (obtido a partir de Boehringer Mannheim Biochemica, catálogo n°. 1 439 600), e controlo de meio de ensaio. O ECGF é fornecido como uma preparação com heparina sódica. 2. Transferir 50 μΐ/ alvéolo das diluições da droga para placas de ensaio de 96 alvéolos contendo 0,8-1,0 x 104 células/100 μΐ/ alvéolo das células HUV-EC-C do dia 0, e incubar ~2 h a 37°C, em 5% de C02. 3. Em triplicado, adicionar 50 μΐ/ alvéolo de 80 pg/ml de VEGF, 20 ng/ml de ECGF, ou controlo do meio a cada condição da droga. Tal como com as drogas, as concentrações do factor de crescimento são 4X a concentração final desejada. Utilizar o meio de ensaio do dia 0, passo 2, para preparar as concentrações dos factores de crescimento. Incubar aproximadamente 24 h a 37°C, em 5% de C02. Cada alvéolo possuirá 50 μΐ de diluição da droga, 50 μΐ de factor de crescimento ou meio, e 100 μΐ de células, = 200 μΐ/ alvéolo no total. Assim, as concentrações 4X das drogas e dos factores de crescimento tomam-se IX uma vez que tudo tenha sido adicionado aos alvéolos.
Dia 2: 1. Adicionar 3H-timidina (Amersham, catálogo n°. TRK-686) a 1 pCi/ alvéolo (10 μΐ/alvéolo de solução a 100 pCi/ml preparada em meio RPMI + 10% de soro de bovino fetal inactivado pelo calor) e incubar ~24 h a 37° C em 5% de C02.
Nota: a 3H-timidina é preparada em meio RPMI dado que todas as outras aplicações para as quais utilizámos a 3H-timidina envolviam experiências realizadas com RPMI. A diferença de meio neste passo é provavelmente não significativa. O RPMI foi obtido a partir de Gibco BRL, catálogo n°. 11875-051.
Dia 3: 1. Congelar as placas durante toda a noite a -20°C.
Dia 4: 1. Descongelar as placas e recolher com um equipamento para colheita para placa de 96 alvéolos (equipamento para colheita Tomcat 96®) sobre matrizes de filtro (Wallac, catálogo n°. 1205-401); ler as contagens num contador de cintilações líquido Wallac Betaplate ™. 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 77
6.2.5. Ensaio celular PDGF-R Ο ensaio para quinase celular PDGF foi levado a cabo como se segue:
As células são lisadas em 0,2 M de HEPES, 0,15 M de NaCl, 10% v/v de glicerol, 0,04% de Triton X-100, 5 mM de EDTA, 5 mM de vanadato de sódio e 2 mM de pirofosfato Na+; os lisados das células são de seguida adicionados a uma placa para ELISA revestida com um anticorpo anti-receptor PDGF (Genzyme); as placas para ELISA são revestidas a 0,5 pg de anticorpo/ alvéolo em 150 μΐ de PBS durante 18 horas a 4°C antes da adição do lisado; o lisado é incubado nas placas revestidas durante 1 hora e, em seguida, lavado quatro vezes em TBST (35 mM de Tris-HCl, pH 7,0, 0,15 M de NaCl, 0,1% de Triton X-100); é adicionado anticorpo anti-fosfotirosina (100 μΐ em PBS) e a mistura é incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente; os alvéolos são de seguida lavados quatro vezes em TBST, um anticorpo secundário conjugado com POD (TAGO) é adicionado a cada alvéolo, e os alvéolos tratados são incubados durante 30 minutos à temperatura ambiente; os alvéolos são de seguida lavados quatro vezes em TBST, solução ABTS/H:0, é adicionada a cada alvéolo e os alvéolos são incubados durante dois minutos; em seguida é medida a absorvância a 410 nm, 6.2.6. Resultados experimentais dos ensaios de crescimento de células
Os resultados obtidos para os diversos compostos a partir dos ensaios acima descritos encontram-se expostos nas Tabelas que se seguem: (segue Tabela 2) 78 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ TABELA 2
Mitogénese em Células Endoteliais
Incorporação de [3H]Timidina COMPOSTO ENSAIO HUV-EC (Exemplo) VEGF (μΜ) a-FGF (μΜ) 1B 0,2 6,0 4796 30,7 35,8 5201 2,5 2,3 5217 9,6 10,5 2 2,2 10 <0,8 2,0 3 <0,8 31,1 12 0,9 0,6 4 <0,8 13 39,8 35,5 5 <0,8 22,7 5409 26,0 6 <0,8 15 13,6 40 7 0,7 17 11,4 8 2,5 9 5,7 5429 27,6 25 1,2 30,0 27 3,8 3,4 28 20 20 32 <0,07 <0,07 33 0,5 0,8 34 0,14 7,9 35 3,8 12,9 37 0,54 8,7 39 2,0 5,0 40 1,2 14,1 44 0,05 37,8
86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 79
Mitogénese em Células 3T3/EGFR Incorporação de BrdU COMPOSTO (Exemplo) PDGFR Ligando PDGF IC50 (μΜ) FGFR Ligando FGF IC50 (μΜ) EGFR Ligando EGF IC50 (μΜ) 4313 6 5,5 5,5 1B 2,5 5402 50 40 4 5,2 13 7,5 70 100 6 2,8 70 25 30 16 5463 23 35 70 60 95 5465 40 25 50 37 8 5469 4 15 28 40 4 50 54 44 6,5 9 48 TABELA 3 TABELA 4
Resultados do Ensaio de Crescimento Celular em várias Linhas de Células
Leitura SRB COMPOSTO (Exemplo) 3T3/E/H+TGF-a(T) IC50 (μΜ) 3T3/EGFR+TGF-a(T) IC50 (μΜ) 3T3/PDGFR+PDGF(T) IC50 (μΜ) SMC IC50 (μΜ) 4313 32 10,7 8,8 1B 78 10 3T3/E/H + TGF-a(T): células NIH 3T3 que expressam a quimera EGFR/HER2 e TGF-a, derivadas de tumor. 3T3/EGFR + TGF-a(T): células NIH 3T3 que expressam EGFR e TGF-α, derivadas de tumor. 3T3/PDGFR + PDGF(T): células NIH 3T3 que expressam PDGF-PR e PDGF-ββ, derivadas de tumor. SMC: células de músculo liso humanas de Clonetics. 86 518
ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 80 6.3. Medição da toxicidade celular
Os compostos terapêuticos devem ser mais potentes na inibição da actividade da tirosina-quinase receptora do que na manifestação de um efeito citotóxico. Uma medida da eficácia e da toxicidade celular de um composto pode ser obtida pela determinação do índice terapêutico: IC50/LD50. A IC50, a dose necessária para alcançar 50% de inibição, pode ser medida utilizando técnicas padronizadas tal como aquelas aqui descritas. A LD50, a dosagem que resulta em 50% de toxicidade, também pode ser medida por técnicas padronizadas (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods 65: 55-63), pela medição da quantidade de LDH libertada (Korzeniewski e Callewaert, 1983, J. Immunol. Methods 64: 313; Decker e Lohmann-Matthes, 1988, J. Immunol. Methods 115: 61), ou por medição da dose letal em modelos animais. São preferidos os compostos com um índice terapêutico grande. O índice terapêutico deve ser superior a 2, preferencialmente de pelo menos 10, mais preferencialmente de pelo menos 50. 6.3. Modelos animais in vivo 6.3.1. Modelos animais de xeno-enxerto A capacidade de tumores humanos para crescerem como xeno-enxertos em ratinhos atímicos (e.g., Balb/c, nu/nu) fornece um modelo in vivo útil para o estudo da resposta biológica a terapias para tumores humanos. Desde o primeiro xenotransplante bem sucedido de tumores humanos para ratinhos atímicos (Rygaard e Povlsen, 1969, Acta Pathol. Microbial. Scand. 77: 758-760), muitas diferentes linhas de células de tumores humanos (e.g. mamário, pulmonar, genito-urinário, gastro-intestinal, da cabeça e pescoço, glioblastoma, ósseo, e melanomas malignos) têm sido transplantadas e deixadas crescer com sucesso em ratinhos nus. Linhas de células de tumor mamário humano, incluindo MCF-7, ZR75-1, e MDA-MB-231, têm sido instaladas como xeno-enxertos subcutâneos em ratinhos nus (Warri et al., 1991, Int. J. Câncer 49: 616-623; Ozzello e Sordat, 1980, Ear. J. Câncer 16: 553-559; Osbome et al., 1985, Câncer Res. 45: 584-590; Seibert et al., 1983, Câncer Res. 43: 2223-2239).
Ensaio 1: Modelo Animal de Xeno-enxerto HER2 A fim de estudar o efeito de drogas anti-tumorais candidatas sobre tumores que expressam HER2, as células tumorais devem ser capazes de crescer na ausência de estrogénio suplementar. Muitas linhas de células mamárias são dependentes dos estrogénios
t 86 518 EP 0 769 947 / PT 81
para o crescimento in vivo em ratinhos nus (Osbome et al., acima), no entanto, os estrogénios exógenos suprimem a expressão de HER2 em ratinhos nus (Warri et al., acima, Dati et al., 1990, Oncogene 5: 1001-1006). Por exemplo, na presença de estrogénios, as células MCF-7, ZR-75-1, e T47D crescem bem in vivo. mas expressam níveis muito baixos de HER2 (Warri et al., acima, Dati et ai, acima).
Pode ser utilizado o seguinte tipo de protocolo para xeno-enxerto: (1) implante de células tumorais (subcutaneamente) no flanco posterior de fêmeas com cinco a seis semanas de idade de ratinhos atímicos Balb/c nu/nu; (2) administração do composto anti-tumoral; (3) medição do crescimento tumoral pela medição do volume tumoral.
Os tumores também podem ser analisados quanto à presença de um receptor, tal como HER2, EGF ou PDGF, por análises de Western e imuno-histoquímicas. Utilizando técnicas conhecidas na arte, um especialista na arte pode variar os processos anteriores, por exemplo através da utilização de diferentes regimes de tratamento.
Ensaio 2: Modelo de Xeno-enxerto / FLK-1
Foi examinada a capacidade dos compostos do presente invento para inibirem linhas de células tumorais ováricas, de melanoma, prostáticas, pulmonares e mamárias determinadas como xeno-enxertos SC. Estes estudos foram conduzidos utilizando doses variando de 1 a 75 mg/kg/dia.
Materiais e Métodos
As células tumorais foram implantadas subcutaneamente nas estirpes de ratinhos indicadas. O tratamento foi iniciado no dia 1 pós implantação excepto se de outro modo indicado (e.g., o tratamento do ratinho SCID relacionado com a linha de células de melanoma A375 iniciou-se no Dia 9). Cada grupo de teste era constituído por oito (8) a dezasseis (16) ratinhos.
Especificamente:
Animais
Ratinhos atímicos fêmea (BALB/c, nu/nu), ratinhos BALB/c, ratazanas Wistar e ratazanas Fisher 344 foram obtidas a partir de Simonsen Laboratories (Gilroy, CA). Ratinhos
86518
EP 0 769 947 / PT 82 AJl fêmeas foram obtidos a partir de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). foram obtidas a partir de B&K Universal, Inc. (Fremont, CA). Ratazanas R/Nu atímicas, ratinhos DBA/2N, e ratinhos BALB/c foram obtidos a partir de Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN). Ratinhos C57BL/6 fêmeas foram obtidos a partir de Taconic (Germantown, NY). Todos os animais foram mantidos sob condições de espaço limpo em gaiolas com isolador Micro com cama Alpha-dri. Receberam comida esterilizada para roedores e água ad libitum.
Todos os processos foram conduzidos de acordo com o NIH Guide for the Core and Use of Laboratory Animais (Guia NIH para o cuidado e utilização de animais de laboratório).
Modelo de xeno-enxerto subcutâneo
As linhas de células foram cultivadas em meio apropriado tal como descrito (ver Secção 6). As células foram recolhidas na ou próximo da confluência com 0,05% de tripsina-EDTA e divididas em pelotas a 450 x g durante 10 minutos. As pelotas foram ressuspensas em PBS ou meio (sem FBS) estéril até uma concentração adequada indicada nas legendas da Figura e as células foram implantadas no flanco traseiro dos ratinhos. O crescimento tumoral foi medido ao longo de 3 a 6 semanas utilizando calibradores embutidos e os volumes tumorais foram calculados como o produto de comprimento x largura x altura, excepto se de outro modo indicado. Os valores P foram calculados utilizando o teste t de Student. O composto em 50-100 μΐ de excipiente (dimetilsulfóxido, PBTE, PBTE6C:D5W, ou PBTE:D5W) foi distribuído por injecção IP nas concentrações indicadas nas legendas da Figura.
Modelo de xeno-enxerto intracerebral
Para o modelo IC em ratinho, foram recolhidas células de glioma C6 de ratazana e suspensas em PBS estéril a uma concentração de 2,5 x 107 células/ml e colocadas em gelo. As células foram implantadas em ratinhos BALB/c, nu/nu da seguinte maneira: os escalpes frontoparietais dos ratinhos foram rapados com tosquiadores para animais, se necessário, antes de serem esfregados com etanol a 70%. Os animais foram anestesiados com isofluorano e a agulha foi inserida através do crânio no hemisfério esquerdo do cérebro. As células foram repartidas a partir de seringas Hamilton Gastight utilizando agulhas de 1,27 cm e 30 ga adaptadas a mangas que apenas permitiam uma penetração de 3 mm. Um dispensador de repetição foi utilizado a fim de distribuir de forma exacta 4 μΐ de suspensão
86 518
EP 0 769 947 / PT 83 de células. Os animais foram monitorizados diariamente quanto ao bem-estar e foram sacrificados quando apresentaram uma perda de peso de cerca de 40% e/ou mostraram sintomas neurológicos.
Para o modelo IC em ratazana, ratazanas (Wistar, Sprague Dawley, Fisher 344, ou R/Nu atímicas; aproximadamente com 200-400 g (algumas com 3-400 g)) foram anestesiadas por uma injecçào IP de 100 mg/kg de Ketaset (cloridrato de cetamina; Aveco, Fort Dodge, Iowa) e 5 mg/kg de Rompun (xilazina, solução a 2%; Bayer, Alemanha). Após o início da anestesia, o escalpe foi rapado e o animal foi orientado num aparelho de estereotaxia (Stoelting, Wood Dale, IL). A pele no local da incisão foi limpa 3 vezes com lavagens alternadas com etanol a 70% e com Povidone-Iodo a 10%. Foi efectuada uma incisão mediana com 1,0-1,5 cm no escalpe utilizando uma lâmina cirúrgica estéril. A pele foi ligeiramente destacada e afastada para os lados a fim de expor as suturas na superfície do crânio. Uma broca dentária (Stoelting, Wood Dale, IL) foi utilizada para efectuar um pequeno orifício de trepanação (1-2 mm de diâmetro) no crânio, aproximadamente 1 mm anterior e 2 mm lateral em relação ao bregma. A suspensão de células foi aspirada para uma seringa Hamilton de 50 μΐ adaptada a uma agulha de bisel padrão de 23 a 25 g. A seringa foi orientada no orifício de trepanação até ao nível da aracnoideia e baixada até a ponta da agulha se encontrar a 3 mm de profundidade dentro da estrutura do cérebro, onde a suspensão das células foi lentamente injectada. Depois das células terem sido injectadas, a agulha foi deixada no orifício de trepanação durante 1-2 minutos a fim de permitir a distribuição completa das células. O crânio foi limpo e a pele foi encerrada com 2 a 3 suturas. Os animais foram observados quanto à recuperação a partir da cirurgia e da anestesia. Ao longo da experiência, os animais foram observados pelo menos duas vezes em cada dia quanto ao desenvolvimento de sintomas relacionados com a progressão de tumor intracerebral. Os animais que apresentavam sintomas avançados (inclinação, perda de equilíbrio, desidratação, perda de apetite, perda de coordenação, cessação de actividades de limpeza, e/ou perda de peso significativa) foram sacrificados humanitariamente, e os órgãos e tecidos com interesse foram ressecados.
Modelo intraperitoneal
Linhas de células foram cultivadas no meio apropriado. As células foram recolhidas e lavadas em PBS ou meio sem FBS estéril, ressuspensas até uma concentração adequada, e injectadas na cavidade IP de ratinhos da estirpe apropriada. Os ratinhos foram observados diariamente quanto à ocorrência de formação de ascite. Os animais individuais foram 84 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ
sacrificados quando apresentaram um aumento de peso de 40%, ou quando o fardo IP começou a causar stress e dor excessivas ao animal. 6.3.2. Modelo de pelota de VEGF in vivo
No exemplo seguinte, foi utilizado o modelo de pelota a fim de testar a actividade de um composto contra o receptor FLK-1 e contra desordens associadas com a formação de vasos sanguíneos. Neste modelo, o VEGF é armazenado numa pelota de libertação no tempo e implantada subcutaneamente no abdómen de ratinhos nus a fim de induzir uma resposta de “enrubescimento” e subsequente entumescimento em redor da pelota. Os inibidores de FLK-1 potenciais podem ser de seguida implantados em metilcelulose próximo da pelota de VEGF a fim de determinar se o referido inibidor pode ser utilizado para inibir a resposta de “enrubescimento” e subsequente entumescimento.
Materiais e Métodos
Foram utilizados os seguintes materiais: (1) VEGF - produto liofilizado recombinante humano encontra-se comercialmente disponível e pode ser obtido a partir de Peprotech, Inc., Princeton Business Park, G2; caixa postal P.O. 275, Rocky Hill, NJ 08553. (2) VEGF embalado em pelotas de 21 dias de libertação foi obtido a partir de Innovative Research of America (Innovative Research of America, 3361 Executive Parkway, caixa postal P.O. 2746, Toledo, Ohio 43606), utilizando matrizes de sistema de distribuição orientada patenteadas. As pelotas foram embaladas a 0,20, 0,21, ou 2,1 pg de VEGF/pelota. Estas doses aproximaram-se de 10 e 100 ng/dia de libertação de VEGF. (3) Metilcelulose (4) Agua (estéril) (5) Metanol (6) Drogas/inibidores apropriados (7) Placas de cultura de 10 cm (8) Parafilme O protocolo seguinte foi então seguido a fim de conduzir o modelo de pelota de VEGF: (1) VEGF, comercializado por Peprotech, foi enviado para Innovative Research of America para preparação de pelotas usuais. (2) Foi preparada metilcelulose a 1,5% (p/v) em água estéril. 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 85 (3) Solubilizaram-se as drogas em metanol (gama de concentação habitual = 10 a 20 mg/ml). (4) Colocou-se parafílme estéril em placas de 10 cm estéreis. (5) Adicionou-se 150 μΐ de droga em metanol a 1,35 ml de metilcelulose a 1,5% misturou-se/centrifugou-se cuidadosamente. (6) Colocaram-se alíquotas de 25 μΐ de homogenizado sobre o parafílme e secaram-se sobre a forma de discos. (7) Ratinhos (Balb/c atímicos nu/nu, fêmeas, com 6-10 semanas) foram anestesiados por meio de inalação de isofluorano. (8) As pelotas de VEGF e os discos de metilcelulose foram implantados subcutaneamente no abdómen. (9) Os ratinhos foram pontuados às 24 horas e às 48 horas quanto às respostas de enrubescimento e entumescimento. O desenho experimental específico utilizado neste exemplo foi: N = 4 animais/grupo.
Controlos: pelota de VEGF + placebo da droga placebo de VEGF + pelota da droga.
Resultados experimentais
Espera-se que os compostos do presente invento demonstrem actividade de acordo com este ensaio. 6.3.3. Modelo de almofada de gordura mamária
Dado o papel estabelecido desempenhado por muitas das RTK, e.g., o receptor HER2, no cancro da mama, o modelo de almofada de gordura mamária é particularmente útil para medição da eficácia de compostos os quais inibem as referidas RTK. Por implantação de células tumorais directamente na localização com interesse, os modelos in situ reflectem com maior precisão a biologia do desenvolvimento do tumor do que os modelos subcutâneos. Linhas de células mamárias humanas, incluindo MCF-7, foram cultivadas na almofada de gordura mamária de ratinhos atímicos. Saphie e Grantham, 1981, Natl. Câncer Instit. 67: 51-56; Gottardis et al., 1988, J. Steroid Biochem. 30: 311-314. Mais especificamente, o processo seguinte pode ser utilizado para medir o efeito inibitório de um composto sobre o receptor HER2:
86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 86 (1) implante, a diversas concentrações, de células MDA-MB-231 e MCF-7 transfectadas com HER-2 para as almofadas de gordura mamária axilares de ratinhos fêmea atímicos; (2) administração do composto; e (3) medição do crescimento tumoral em diversos pontos no tempo.
Os tumores também podem ser analisados quanto à presença de um receptor tal como HER2, por análises de Western e imuno-histoquímicas. Utilizando técnicas conhecidas na arte, um especialista na arte pode variar os processos anteriores, por exemplo através da utilização de diferentes regimes de tratamento. 6.3.4. Modelo de invasão tumoral O seguinte modelo de invasão tumoral foi desenvolvido e pode ser utilizado para a avaliação do valor terapêutico e da eficácia dos compostos identificados como inibindo selectivamente o receptor KDR/FLK-1. 6.3.4.1. Processo
Ratinhos nus de 8 semanas de idade (fêmeas) (Simonsen Inc.) foram utilizados como animais experimentais. O implante de células tumorais foi executado numa chaminé de fluxo laminar. Para anestesia foi administrado intraperitonealmente uma mistura de xilazina/cetamina (100 mg/kg de cetamina e 5 mg/kg). E efectuada uma incisão da linha média a fim de expor a cavidade abdominal (aproximadamente 1,5 cm de comprimento) para injectar 107 células tumorais num volume de meio de 100 μΐ. As células foram injectadas quer no lobo duodenal do pâncreas quer sob a serosa do cólon. O peritoneu e os músculos são encerrados com uma sutura de seda 6-0 e a pele é encerrada pela utilização de clipes. Os animais foram observados diariamente. 6.3.4.2. Análise
Após 2-6 semanas, dependendo das observações macroscópicas dos animais, os ratinhos foram sacrificados, e as metásteses tumorais locais de diversos órgãos (pulmão, fígado, cérebro, estômago, baço, coração, músculo) foram excisadas e analisadas (medição do tamanho tumoral, grau de invasão, imuno-química, e hibridação in situ). 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 6.3.5. Resultados
Os resultados obtidos para os diversos compostos a partir dos ensaios in vivo descritos anteriormente encontram-se expostos na Tabela 5, abaixo: TABELA 5
Dados in vivo COMPOSTO EpH4-VEGF (Exemplo) % de inibição @ mg/kg 46% @ 50 4942 47% @ 25 50% @ 25 6 - 50% @ 37,5/37,5 45% @ 50 8 - 65% @ 50 47?/0 @ 50 9 - 65% @ 50 T. , 30. JUL. 2001
Lisboa,
Por SUGEN, INC. O AGENTE OFICIAL -
Eng.° ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA Ag. OJ. Pr. Ind. Rua das Flores, 74-4.° 1200*195 LISBOA

Claims (16)

  1. e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, em que: R, éH; R2 é 0 ou S; R3 é hidrogénio; R4, R5, R6, e R7 são, cada um independentemente, seleccionados a partir do grupo constituído por hidrogénio, alquilo, alcoxi, arilo, ariloxi, alcarilo, alcariloxi, halogéneo, tri-halogenometilo, S(0)R, SO:NRR’, S03R, SR, NO:, NRR’, OH, CN, C(0)R, 0C(0)R, NHC(0)R, (CH2)nC02R, e CONRR’; A é um anel hetero-arilo de cinco elementos seleccionado a partir do grupo constituído por tiofeno, pirrolo, pirazolo, imidazolo, 1,2,3-triazolo, 1,2,4-triazolo, oxazolo, isoxazolo, tiazolo, isotiazolo, 2-sulfonilfurano, 4-alquilfurano, 1,2,3-oxadiazolo, 1.2.4- oxadiazolo, 1,2,5-oxadiazolo, 1,3,4-oxadiazolo, 1,2,3,4-oxatriazolo, 1,2,3,5-oxatriazolo, 1,2,3-tiadiazolo, 1,2,4-tiadiazolo, 1,2,5-tiadiazolo, 1,3,4-tiadiazolo, 1.2.3.4- tiatriazolo, 1,2,3,5-tiatriazolo, e tetrazolo, facultativamente substituído em uma ou mais posições com alquilo, alcoxi, arilo, ariloxi, alcarilo, alcariloxi, halogéneo, tri-halogenometilo, S(0)R, SO-.NRR’, S03R, SR, N02, NRR’, OH, CN, C(0)R, 0C(0)R, NHC(0)R, (CH2)nC02R, e CONRR’; n é 0-3; R é H, alquilo ou arilo; e 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 2/8 R’ é Η, alquilo ou arilo; em que, nas definições anteriores: alquilo refere-se a um hidrocarboneto alifático saturado de cadeia linear, ramificado ou cíclico, possuindo 1 a 12 átomos de carbono e facultativamente sendo substituído com um ou mais substituintes seleccionados a partir de hidroxi, ciano, =0, =S, NO,, halogéneo, N(CH3),, amino e -SH; arilo refere-se a um grupo aromático o qual apresenta pelo menos um anel que possui um sistema de electões pi conjugado incluindo grupos arilo carbocíclico, arilo heterocíclico e bi-arilo e sendo facultativamente substituído com um ou mais substituintes seleccionados a partir do grupo constituído por halogéneo, tri-halogenometilo, hidroxilo, SH, OH, NO,, amina, tio-éter, ciano, alcoxi, alquilo, e amino; alcarilo refere-se a um alquilo que está covalentemente ligado a um grupo arilo; e alcoxi, ariloxi e alcariloxi referem-se, respectivamente, a um grupo -O-alquilo, -O-arilo e -O-alcarilo; com a condição de os compostos seguintes estarem excluídos: 3-(pirrol-2-ilmetileno)-2-indolinona; 3-(5-cloro-3,4-dimetilpirrol-2-ilmetileno)-2-indolinona; 3-(3,5-dimetil-4-etilpirrol-2-il)-2-indolinona; 3-(3,5-dimetil-4-etoxicarbonilpinOl-2-il)-2-indolinona; ácido 2-[[[l-etil-2,3-di-hidro-2-oxo-3-(lH-pirrol-2-ilmetileno)-lH-indol-5-il]oxi]-metiljbenzóico; 3-[(l-metil-5-nitro-imidazol-2-il)metileno]-2-indolinona; 3-(tien-2-ilmetileno)-2-indolinona; éster etílico do ácido 3-[(2-butil-lH-imidazol-4-il)metileno]-2,3-di-hidro-2-oxo-lH-indol-7-acético; éster etílico do ácido 3-[[2-butil-l-[(l,l-dimetiletoxi)carbonil]-lH-imidazol-4-il]-metileno]-2,3-di-hidro-2-oxo-lH-indol-7-acético; 5- benzoíl-3-[(imidazolo-2-il)metileno]-2-indolinona; 6- di-etilamino-3-[(isotiazolo-2-il)metileno]-2-indolinona; 86 518 ΕΡ Ο 769 947/PT
    3/8 5- cloro-3-[(tiazolo-2-il)metileno]-2-indolinona; e 6- nitro-3-[(pirrol-2-il)metileno]-2-indolinona.
  2. 2. Composto da fórmula: A ,ÇR3
    e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, em que: R, éH; R2 é O ou S; R3 é hidrogénio; R4, R5, R6, e R7 são, cada um independentemente, seleccionados a partir do grupo constituído por hidrogénio, alquilo, alcoxi, arilo, ariloxi, alcarilo, alcariloxi, halogéneo, tri-halogenometilo, S(0)R, S02NRR’, S03R, SR, NO:, NRR’, OH, CN, C(0)R, 0C(0)R, NHC(0)R, (CH2)nCO,R, e CONRR’; A é um anel hetero-arilo de cinco elementos seleccionado a partir do grupo constituído porpirazolo, 1,2,3-triazolo, 1,2,4-triazolo, oxazolo, isoxazolo, tiazolo, isotiazolo, 2-sulfonilfurano, 4-alquilfurano, 1,2,3-oxadiazolo, 1,2,4-oxadiazolo, 1,2,5-oxadiazolo, 1.3.4- oxadiazolo, 1,2,3,4-oxatriazolo, 1,2,3,5-oxatriazolo, 1,2,3-tiadiazolo, 1,2,4-tiadiazolo, 1.2.5- tiadiazolo, 1,3,4-tiadiazolo, 1,2,3,4-tiatriazolo, 1,2,3,5-tiatriazolo, e tetrazolo, facultativamente substituído em uma ou mais posições com alquilo, alcoxi, arilo, ariloxi, alcarilo, alcariloxi, halogéneo, tri-halogenometilo, S(0)R, S02NRR’, S03R, SR, N02, NRR’, OH, CN, C(0)R, 0C(0)R, NHC(0)R, (CH2)nC02R, e CONRR’; n é 0-3; R é H, alquilo ou arilo; e 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 4/8 R’ é Η, alquilo ou arilo; em que, nas definições anteriores, alquilo, arilo, alcarilo, alcoxi, ariloxi e alcariloxi têm as definições tal como atribuídas na reivindicação 1; com a condição de os compostos seguintes estarem excluídos: 6-dietilamino-3-[(isotiazolo-2-il)metileno]-2-indolinona; e 5-cloro-3-[(tiazolo-2-il)metileno]-2-indolinona.
  3. 3. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2 seleccionado a partir do grupo constituído por 3-[(3-metilpirrol-2-il)metileno]-2-indolinona; 3-[(3,4-dimetilpirrol-2-il)-metileno]-2-indolinona; 3-[(2-metiltien-5-il)metileno]-2-indolinona; 3-[(3-metiltien-2-il)-metileno]-2-indolinona; 3-{[4-(2-metoxicarboniletil)-3-metilpirrol-5-il]metileno}-2- indolinona; 3-[(4,5-dimetil-3-etilpirrol-2-il)metileno]-2-indolinona; 3-[(5-metilimidazol-2-il)metileno]-2-indolinona; 5-cloro-3-[(5-metiltien-2-il)metileno]-2-indolinona; 3-[(3,5-dimetil-pirrol-2-il)metileno]-5-nitro-2-indolinona; 3-[(3-(2-carboxietil)-4-metilpirrol-5-il)metileno]-2-indolinona; 5-cloro-3-[(3,5-dimetilpirrol-2-il)metileno]-2-indolinona; 3-[(2,4-dimetilpirrol-5-il)metileno]-2-indolinona, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
  4. 4. Composto de acordo com a reivindicação 3, em que o referido composto é 3-[(2,4-dimetilpirrol-5-il)metileno]-2-indolinona, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
  5. 5. Composição farmacêutica que compreende um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, e um portador ou excipiente farmacuticamente aceitável.
  6. 6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, em que a referida composição farmacêutica é adequada para administração parentérica ou subcutânea ou se encontra numa formulação em depósito.
  7. 7. Utilização de um composto para a produção de uma composição farmacêutica para o tratamento de doenças relacionadas com a transdução do sinal da tirosina-quinase não regulada, possuindo o referido composto a fórmula:
    R, é H ou alquilo; R, é O ou S; R3 é hidrogénio; R4, R5, R6, e R7 são, cada um independentemente, seleccionados a partir do grupo constituído por hidrogénio, alquilo, alcoxi, arilo, ariloxi, alcarilo, alcariloxi, halogéneo, tri-halogenometilo, S(0)R, S02NRR’, S03R, SR, N02, NRR’, OH, CN, C(0)R, 0C(O)R, NHC(0)R, (CH2)nCO,R, e CONRR’; A é um anel hetero-arilo de cinco elementos seleccionado a partir do grupo constituído por tiofeno, pirrolo, pirazolo, imidazolo, 1,2,3-triazolo, 1,2,4-triazolo, oxazolo, isoxazolo, tiazolo, isotiazolo, 2-sulfonilfurano, 4-alquilfurano, 1,2,3-oxadiazolo, 1.2.4- oxadiazolo, 1,2,5-oxadiazolo, 1,3,4-oxadiazolo, 1,2,3,4-oxatriazolo, 1,2,3,5-oxatriazolo, 1,2,3-tiadiazolo, 1,2,4-tiadiazolo, 1,2,5-tiadiazolo, 1,3,4-tiadiazolo, 1.2.3.4- tiatriazolo, 1,2,3,5-tiatriazolo, e tetrazolo, facultativamente substituído em uma ou mais posições com alquilo, alcoxi, arilo, ariloxi, alcarilo, alcariloxi, halogéneo, tri-halogenometilo, S(0)R, S02NRR\ S03R, SR, N02, NRR’, OH, CN, C(0)R, 0C(0)R, NHC(0)R, (CH2)nC02R, e CONRR’; n é 0-3; R é H, alquilo ou arilo; e R’ é H, alquilo ou arilo; em que, nas definições anteriores, alquilo, arilo, alcarilo, alcoxi, ariloxi e alcariloxi têm as definições tal como atribuídas na reivindicação 1. 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 6/8
  8. 8. Utilização de um composto para a produção de uma composição farmacêutica para regulação, modulação ou inibição da transdução do sinal da tirosina-quinase, possuindo o referido composto a fórmula: A
    / R I PR3 e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, em que: R, é H ou alquilo; R2 é O ou S; R3 é hidrogénio; R4, R5, R6, e R7 são, cada um independentemente, seleccionados a partir do grupo constituído por hidrogénio, alquilo, alcoxi, arilo, ariloxi, alcarilo, alcariloxi, halogéneo, tri-halogenometilo, S(0)R, S02NRR’, S03R, SR, N02, NRR’, OH, CN, C(0)R, 0C(0)R, NHC(0)R, (CH2)nC02R, e CONRR’; A é um anel hetero-arilo de cinco elementos seleccionado a partir do grupo constituído por tiofeno, pirrolo, pirazolo, imidazolo, 1,2,3-triazolo, 1,2,4-triazolo, oxazolo, isoxazolo, tiazolo, isotiazolo, 2-sulfonilfiirano, 4-alquilfurano, 1,2,3-oxadiazolo, 1.2.4- oxadiazolo, 1,2,5-oxadiazolo, 1,3,4-oxadiazolo, 1,2,3,4-oxatriazolo, 1,2,3,5-oxatriazolo, 1,2,3-tiadiazolo, 1,2,4-tiadiazolo, 1,2,5-tiadiazolo, 1,3,4-tiadiazolo, 1.2.3.4- tiatriazolo, 1,2,3,5-tiatriazolo, e tetrazolo, facultativamente substituído em uma ou mais posições com alquilo, alcoxi, arilo, ariloxi, alcarilo, alcariloxi, halogéneo, tri-halogenometilo, S(0)R, S02NRR\ S03R, SR, N02, NRR’, OH, CN, C(0)R, 0C(0)R, NHC(0)R, (CH2)nC02R, e CONRR’; n é 0-3;
    86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ R é Η, alquilo ou arilo; e R’ é H, alquilo ou arilo; em que, nas definições anteriores, alquilo, arilo, alcarilo. alcoxi, ariloxi e alcariloxi têm as definições tal como atribuídas na reivindicação 1.
  9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 7 ou 8, em que a referida doença é seleccionada a partir do grupo constituído por cancro, desordens proliferativas dos vasos sanguíneos, desordens fibróticas, desordens proliferativas das células mesangiais e doenças metabólicas.
  10. 10. Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que a desordem proliferativa dos vasos sanguíneos é seleccionada a partir do grupo constituído por artrite e re-estenose.
  11. 11. Utilização de acordo com a reivindicação 9. em que a desordem fibrótica é seleccionada a partir do grupo constituído por cirrose hepática e aterosclerose.
  12. 12. Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que a desordem proliferativa das células mesangiais é seleccionada a partir do grupo constituído por glomeruloneffite, nefropatia diabética, neffosclerose maligna, síndromes de micro-angiopatia trombótica, rejeição de transplantes e glomerulopatias.
  13. 13. Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que a doença metabólica é seleccionada a partir do grupo constituído por psoríase, diabetes mellitus, cicatrização de feridas, inflamação e doenças neurodegenerativas.
  14. 14. Utilização de acordo com a reivindicação 7 ou 8, em que o composto é seleccionado a partir do grupo constituído por 3-[(3-metilpirrol-2-il)metileno]-2-indolinona; 3-[(3,4-dimetilpirrol-2-il)metileno]-2-indolinona; 3-[(2-metiltien-5-il)metileno]-2- indolinona; 3-[(3-metiltien-2-il)metileno]-2-indolinona; 3-{ [4-(2-metoxicarboniletil)-3-metilpirrol-5-il]-metileno}-2-indolinona; 3-[(4,5-dimetil-3-etilpirrol-2-il)metileno]-2- indolinona; 3-[(5-metil-imidazol-2-il)metileno]-2-indolinona; 5-cloro-3-[(5-metiltien-2-il)metileno]-2-indolinona; 3-[(3,5-dimetilpirrol-2-il)metileno]-5-nitro-2-indolinona; 3-[(3-(2-carboxietil)-4-metilpirrol-5-il)metileno]-2-indolinona; 5-cloro-3-[(3,5-dimetilpirrol-2-il)metileno]-2-indolinona; 3-[(2,4-dimetilpirrol-5-il)metileno]-2-indolinona, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. 86 518 ΕΡ Ο 769 947 / ΡΤ 8/8
  15. 15. Utilização de acordo com a reivindicação 14, em que o composto é 3-[(2,4-dimetilpirrol-5-il)metileno]-2-indolinona, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. Lisboa,
  16. 30. .IUL 2001 Por SUGEN, INC. - O AGENTE OFICIAL - Eng.° ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind· Roa das Flores, 74-4.° 1200-195 LISBOA
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