ES2287048T3 - Inhbicion de la motilidad celular y la angiognesis mediante nhibidores del dominio gbr2sh2. - Google Patents

Abstract

Uso de un compuesto que inhibe la actividad de señalización celular y la actividad de motilidad celular, para la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer, donde dicho cáncer se selecciona del grupo constituido por cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de tiroides, cáncer renal, sarcoma, glioblastoma, melanoma y metástasis de cáncer, donde dicho constituido carece sustancialmente de citotoxicidad, y posee la fórmula I: en la que n es de 0 a 15 y PTI es un radical de fenilalanina que posee un anillo fenilo, un extremo amino y un extremo carboxilo, donde el anillo fenilo posee uno o más sustituyentes seleccionados del grupo constituido por formilo, carboxialquilo, dicarboxialquilo, dicarboxihaloalquilo y dicarboxihaloalquiloxi, donde la porción alquilo de los sustituyentes puede estar insustituida o sustituida con un sustituyente seleccionado del grupo constituido por halo, hidroxi, carboxilo, amino, aminoalquilo, alquilo, alcoxi y ceto; y X es un resto unido al nitrógeno de PTIy se selecciona del grupo constituido por alquilcarbonilo, oxalilo, alquilaminocarbonilo, arilaminooxalilo, arilalquilaminooxalilo, alcoxioxalilo, carboxialquilo, carbonilo, heterociclil carbonilo, heterociclilalquil carbonilo, arilalquil heterociclilalquil carbonilo, ariloxicarbonilo y arilalcoxicarbonilo, donde las porciones arilo y alquilo de los sustituyentes pueden estar insustituidos o sustituidos con un sustituyente seleccionado del grupo constituido por halo, hidroxi, carboxilo, amino, aminoalquilo, alquilo, alcoxi y ceto; y la porción heterociclilo de Y contiene al menos 4 heteroátomos seleccionados del grupo constituido por O, N y S; AA es un aminoácido, cuyo extremo amino está unido al extremo carboxilo de PTI; e Y es un arilaquilamino o arilheterociclil alquilamino; o una sal del mismo.

Description

Inhibición de la motilidad celular y la angiogénesis mediante inhibidores del dominio Grb2 SH2.

Campo de la invención

La presente invención en general se refiere a un procedimiento para inhibir la motilidad celular y la angiogénesis y tratar varias enfermedades en un mamífero, y, particularmente, a un procedimiento para inhibir la motilidad celular y la angiogénesis inducida por el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF). La presente invención también se refiere a un procedimiento para bloquear la migración celular estimulada por HGF, VEGF y bFGF, la proliferación celular y/o la formación de estructuras similares a capilares. La presente invención también se refiere a tratar cáncer y metástasis producida por cáncer.

Antecedentes de la invención

La industria farmacéutica está a la búsqueda de un tratamiento y/o profilaxis de enfermedades, trastornos o afecciones proliferativos tal como cáncer y metástasis producidas por cáncer. Estas enfermedades, trastornos o afecciones afectan a una gran parte de la población y conducen a sufrimiento y, posiblemente, muerte.

El cáncer pocas veces es una enfermedad localizada, ya que las células cancerosas se desprenden del tumor primario, se translocan a lugares distantes y crecen como colonias secundarias en las nuevas localizaciones anatómicas conduciendo así al cáncer metastásico. La motilidad de las células cancerosas está asociada con la metástasis del cáncer. El establecimiento de colonias secundarias también está asociado con el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos que suministran a la colonia recién formada sangre y nutrientes.

El desarrollo y progresión de estas enfermedades o trastornos implican alguna forma de transducción de señal intracelular. La transducción de señal es crucial para la homeostasis normal de las células y en el proceso de transmitir mensajes extracelulares, por ejemplo mensajes químicos en forma de factores de crecimiento, hormonas y neurotransmisores, a través de receptores, por ejemplo receptores de la superficie celular, hacia el interior de la célula. Las enzimas proteína tirosina quinasa desempeñan un papel principal en esta función biológica.

Las enzimas anteriores catalizan la fosforilación de residuos específicos de tirosina para formar residuos de tirosina fosforilada. Las proteínas tirosina fosforiladas están implicadas en una serie de procesos metabólicos, desde proliferación y crecimiento hasta diferenciación. Un ejemplo de esta clase de enzimas es el receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) (también conocido como el factor de dispersión (SF)), conocido como c-Met. El HGF es un factor de crecimiento pleiotrópico que, además de estimular la supervivencia y proliferación celular, posee la capacidad para disociar láminas epiteliales y estimular la motilidad celular. La disociación de las láminas celulares y la estimulación de la motilidad celular están asociadas con la formación de nuevos vasos sanguíneos, lo que se conoce como angiogénesis.

El HGF estimula la mitogénesis, motogénesis y morfogénesis en un amplio abanico de dianas celulares, incluidas las células epiteliales y endoteliales, las células hematopoyéticas, las neuronas, los melanocitos, así como los hepatocitos. Estos efectos pleiotrópicos desempeñan papeles importantes durante el desarrollo y la regeneración tisular. La señalización del HGF también está implicada en varios tipos de cáncer humano, incluido los carcinomas de colon, mama, pulmón, tiroideo y renal, varios sarcomas y glioblastoma. La capacidad del HGF para iniciar un programa de disociación celular e incremento de la motilidad celular acoplado a un incremento de la producción de proteasa estimula la invasión celular agresiva y está ligada a la metástasis tumoral.

La disociación celular y el incremento de la motilidad celular, como lo inducido por el HGF, también se asocian con la angiogénesis. La angiogénesis es un procedimiento complejo y de múltiples etapas que es esencial para la vascularización normal y la reparación de heridas. No obstante, cuando el proceso angiogénico no está estrechamente regulado, se produce una neovascularización persistente e incontrolada, que contribuye a la neovascularización tumoral y la metástasis tumoral.

EL HGF conduce la señal a través de su receptor en la superficie de la célula. Tras la unión del HGF, varios residuos de tirosina dentro del dominio intracelular c-Met se fosforilan, algunos de los cuales median la unión de las proteínas de señalización tales como Grb2. La unión de Grb2 está implicada en la tubulogénesis estimulada por HGF y se piensa que se une a c-Met con pequeñas proteínas de unión a GTP tal como Rho y Rac, que son necesarias para las reorganizaciones citoesqueléticas estimuladas por HGF y la motilidad celular. Además, el VEGF y el bFGF se encuentran entre los reguladores más potentes de la angiogénesis y comparten mediadores de señalización intracelular con una variedad de vías de señalización de angiogénesis. Folkman)., EXS. 79: 1-8 (1997).

A modo de antecedentes, se proporciona lo siguiente. Gay y col., 1. Siolog. Chem., 33, 2311-315 (1999) indica que un inhibidor de la unión al dominio Grb2 SH2 designado como "CGP78850" inhibe la asociación dominio Grb2 SH2/c-met, posee actividad en células MDCK y dispersión de colonias estimuladas por HGF/SF.

Yao y col., J. Med. Chem., 42, 25-35 (1999) trata ciertos inhibidores del dominio Grb2 SH2 que son miméticos de pTyr que no contienen fósforo. El documento WO97/08193 describe ciertos péptidos acilados para el tratamiento de enfermedades que responden a la inhibición de la interacción de una proteína que comprende un dominio SH2 y una proteína tirosina quinasa. Jiang y col., Critical Reviews in Oncology/Hematology, 29, 209-248 (1999) trata el factor de crecimiento de hepatocitos/factor de dispersión, sus implicaciones moleculares, celulares y clínicas en el cáncer.

Lo anterior indica que existe una necesidad de un procedimiento de inhibición de la motilidad celular y la angiogénesis. Además, existe una necesidad de inhibir la motilidad celular y la angiogénesis inducidas por HGF. Además, existe una necesidad de inhibir la migración celular, proliferación celular y/o formación de estructuras similares a capilares inducidas por HFG, VEGF y bFGF. Además existe una necesidad de un procedimiento para tratar o prevenir enfermedades tales como cáncer y metástasis por cáncer en mamíferos.

Estas ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la descripción detallada de las formas de realización de la invención que se expone a continuación.

Breve resumen de la invención

Muchas de las anteriores necesidades han sido satisfechas por la presente invención, que proporciona un procedimiento para inhibir la motilidad celular. La presente invención además proporciona inhibición de la angiogénesis en un animal. También en la presente invención se proporciona un procedimiento para inhibir la unión de los transductores intracelulares a las proteínas tirosina quinasa receptoras. Los procedimientos de la presente invención emplean compuestos de fórmula I, por ejemplo MIMETICS de la fosfotirosima, para inhibir la motilidad celular y la angiogénesis. La presente invención además proporciona su uso en la fabricación de un medicamento para prevenir y/o tratar el cáncer, en particular el cáncer metastásico. Una ventaja de los procedimientos y usos de la presente invención es que los compuestos de fórmula I no presentan citotoxicidad.

La presente invención proporciona compuestos de fórmula I para bloquear la invasión de la matriz celular estimulada por HGF, para bloquear la tubulogénesis ramificada estimulada por HGF, para bloquear la migración estimulada por HGF, VEGF o bFGF, para bloquear la proliferación celular estimulada por HGF, VEGF o bFGF y para bloquear la formación de estructuras capilares estimulada por HGF, VEGF o bFGF. Los péptidos miméticos de la fosfotirosina descritos en la presente memoria descriptiva bloquean la invasión de la matriz estimulada por HGF por células epiteliales cultivadas o células endoteliales vasculares. Los compuestos de fórmula I también bloquean la tubulogénesis ramificada estimulada por HGF por células cultivadas o células endoteliales vasculares, por ejemplo las que han crecido en una matriz extracelular tridimensional. Los compuestos de fórmula I también bloquean la migración estimulada HGF, VEGF o bFGF por células endoteliales vasculares, por ejemplo in vitro. Los compuestos de fórmula I también bloquean formación de estructuras similares a capilares estimulada por HGF, VEGF o bFGF por células endoteliales vasculares, por ejemplo las cultivadas sobre una matriz extracelular reconstituida (Matrigel) in vitro. Los compuestos de fórmula I bloquean la angiogénesis in vivo, también como se ha mostrado, por ejemplo mediante ensayo de membrana alantoidea de pollo.

Aunque la invención se ha descrito y desvelado más adelante, en relación con ciertas formas de realización y procedimientos, no se pretende limitar la invención a dichas formas de realización específicas. En su lugar, se pretende que cubra todas las formas de realización alternativas y todas las modificaciones si entran dentro del alcance de la invención.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 representa las fórmulas estructurales de los péptidos 1-3 que pueden encontrar utilidad en el procedimiento de acuerdo con las formas de realización de la presente invención. La fig. 1 también representa la fórmula estructuran del péptido control 4.

Las Fig. 2A y 2B representan el efecto de los péptidos 1-3 sobre la migración de Las células 32D/c-Met. En las figuras 2A y 2B, el eje x representa las concentraciones de los péptIdos en nM y las barras en blanco representan la migración de las células en ausencia de HGF/NK1 y las barras sombreadas representan la migración de las células en presencia de HGF/NK1 (1 microgramo por ml, concentración final). En la figura 2A, el eje Y representa el número de células en migración. En la figura 2B, el eje Y representa la multiplicación o el cambio en la migración celular. También en las Figuras 2A y 2B se incluyen los resultados obtenidos en el péptido 4.

La Fig. 3A representa el efecto de los péptidos 1-3 sobre la migración de las células de Okajima y la fig. 3B representa el efecto del péptido 1 sobre las células 184B5. En las Fig. 3A y 3B, el eje X representa las concentraciones de los péptidos en nM y las barras en blanco representan la migración de las células en ausencia de HGF/NK1 y las barras sombreadas representan la migración de las células en presencia de HGF/NK1 (300 nanogramos por ml, concentración final). En la figura 3A, el eje Y representa el número de células en migración. En la figura 3B, el eje Y representa la multiplicación o el cambio en la migración celular. También en las Figuras 3A y 3B se incluyen los resultados obtenidos en el péptido 4.

La Fig. 4 representa microfotografías del efecto de los péptidos 1-3 sobre la dispersión de las células MDCK. Los paneles en la parte izquierda muestra células no tratadas con HGF y los paneles de la derecha muestran las células tratadas con HGF a 30 nM (Concentración final). Los péptidos se añadieron a 10 nM (concentración final). También en la Figura 4A se incluyen los resultados obtenidos en el péptido 4.

La Fig. 5 representa el efecto de los péptidos 1, 3 y 4 sobre la longitud del cordón (en \mum) formado por las células TAC-2 pre-tratadas durante 18-24 horas con o sin las concentraciones indicadas de los péptidos 1, 3 o 4. Las concentraciones de los péptidos están indicadas en el eje X en nM. Los valores del eje Y son la longitud media del cordón por campo SEM.

La Fig. 6A representa el efecto del péptido 1 sobre la migración de las células HMEC-1 inducida por HGF. La fig. 6B representa el efecto del péptido 1 sobre la migración de las células HUVEC-1 inducida por HGF y bFGF. En ambas figuras, 6A y 6B, el eje X representa las condiciones del tratamiento. El eje Y representa el incremento de la migración de HMEC-1 expresado como la proporción de células en migración en los pocillos tratados con HGF (Fig. 6A) o en los pocillos tratados con bFGF (Fig. 6B) con respecto a los pocillos control tratados. En las Fig. 6A y 6B, las barras no sombreadas representan la migración de las células en ausencia de HGF, mientras que las barras sombreadas representan la migración de las células en presencia de HGF. Las barras sombreadas en gris de la Fig. 6B representan la migración de las células en presencia de bFGF.

La Fig. 7 representa el efecto del péptido 1 sobre la invasión de la matriz de colágeno por las células HMEC-1. Las barras no sombreadas representan la invasión de la matriz de colágeno por las células HMEC-1 en ausencia de HGF. Las barras sombreadas representan la invasión de la matriz por las células HMEC-1 en presencia de HGF. El eje X representa la concentración peptídica en nM. El eje Y representa la longitud media de los cordones o células únicas que invaden el colágeno a 20 \muM debajo de la superficie del gel.

La Fig. 8A representa el efecto del péptido 2 sobre la migración de HMVEC inducida por HGF. La Fig. 8B representa el efecto del péptido 2 sobre la migración de HMVEC inducida por bFGF. En las Fig. 8A-B, los valores indicados son el número medio de células por campo óptico. Las barras de error indican el error estándar de la media (sem.) de los valores de los pocillos por triplicado por condición experimental; cuando no hay barras de error visibles significa que el error es demasiado bajo como para mostrarse.

La fig. 9A representa el efecto del péptido 2 sobre la migración celular inducida por VEGF por células HMEC-1, la fig. 9B representa el efecto del péptido 2 sobre la migración celular inducida por VEGF por células HMVE, la fig. 9C representa el efecto del péptido 2 sobre la migración celular inducida por VEGF por células HUVE y la fig. 9D representa el efecto del péptido 1 sobre la migración celular inducida por VEGF por células HUVE.

La fig. 10 representa el efecto del péptido 2 sobre la migración de células HUVE inducida por PMA.

La fig. 11 representa el efecto del péptido 2 sobre la migración celular inducida por PDGF-BB y bFGF en fibroblastos NIH 3T3.

La fig. 12 representa el efecto del péptido 2 sobre la proliferación de células UVE y HMVE inducida por HGF, bFGF y VEGF.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento in vitro para inhibir la motilidad celular. La presente invención también proporciona para inhibir la angiogénesis en un animal.

La presente invención proporciona el uso, para la fabricación de un medicamento para inhibir la motilidad celular en un mamífero, de un compuesto de fórmula I que posee actividad inhibidora de señal celular y actividad inhibidora de motilidad celular. De un modo ventajoso, el compuesto de fórmula I carece o carece sustancialmente de citotoxicidad.

La presente invención contempla retrasar o reducir el movimiento de las células. En el movimiento de las células de un lugar a otro están implicados numerosos factores, fuerzas y/ mecanismos. El procedimiento de la presente invención no está limitado a inhibir o interferir en un factor, fuerza o mecanismo particular implicado en el movimiento celular.

El proceso del movimiento celular comienza con la extensión de la membrana celular, el desplazamiento hacia delante del citosol (el material interno de la célula) y la retracción de la parte posterior de la célula. A medida que la membrana célula se propulsa inicialmente hacia delante se forma una unión entre la membrana y el sustrato, anclando la "cabeza" de la célula. Algunos autores piensan que el citosol es desplazado hacia delante mediante la reestructuración de la red del citoesqueleto dentro de la célula, aunque el mecanismo exacto se desconoce. La etapa final implica la separación de la "cola" de la célula del sustrato.

Se cree que los factores de crecimiento activan una vía de transducción de señal en la que participan proteínas G, que estimula los cambios del citoesqueleto, incluida la polimerización de la actina. Los factores externos estimulan la motilidad celular uniéndose a un receptor de la superficie de la membrana y activando una vía de transducción de señal, por ejemplo una en la que participen proteínas G. A su vez, vía de transducción de señal estimula la reorganización del citoesqueleto. Sobre la motilidad celular influyen varios factores extracelulares. El movimiento de una célula siguiendo a las moléculas solubles a través de un gradiente de concentración se denomina quimiotaxis. El calcio intracelular puede desempeñar un papel en la capacidad de una célula para reorganizar los gradientes de concentración. Se han identificado hormonas como la insulina, citoquinas y fragmentos peptídicos específicos de la matriz extracelular que estimulan la motilidad de las células tumorales y la quimiotaxis.

Aparte de estimular la motilidad celular, los factores de crecimiento estimulan la neovascularización, que implica, en parte, el movimiento celular. La angiogénesis comienza con la degradación, mediada por enzimas proteolíticas, de la membrana basal de un vaso sanguíneo. Se cree que la degradación de la membrana basal está regulada por factores angiogénicos, tales como el factor de crecimiento de fibroblastos. Las células endoteliales migran hacia el área de degradación e invaden la matriz extracelular que la rodea. Las células endoteliales invasoras proliferan y forman una columna alargada de células. Dentro del la columna celular sólida se forma un lumen, por lo que se forma un vaso que, en última instancia, se conecta con un vaso sanguíneo existente y forma un bucle capilar (Fotsis y col., J. Nutr., 125: 790S-797S (1995)).

La presente invención proporciona la inhibición de la angiogénesis en un animal, por ejemplo un mamífero, que comprende el uso para la fabricación de un medicamento, de un compuesto de fórmula I que posee actividad inhibidora de la señal celular y actividad inhibidora de la motilidad celular, en el que el compuesto de fórmula I carece sustancialmente de citotoxicidad. Preferentemente, el compuesto de la fórmula I afecta a múltiples aspectos del proceso angiogénico para tratar de forma efectiva terapéutica o profilácticamente la angiogénesis. Por ejemplo, además de inhibir la señalización celular y la motilidad celular, el compuesto de fórmula I inhibe preferentemente la invasión de células epiteliales y/o endoteliales en la matriz extracelular.

En una forma de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para inhibir la motilidad celular y la angiogénesis inducida por el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), en particular la motilidad derivada de una respuesta biológica mediada por su receptor de la superficie celular, el producto c-Met protooncogen, una tirosina quinasa transmembranal. Tras la unión del HGF, se fosforilan varios residuos de tirosina con el dominio intracelular c-Met. Algunos de los dominios fosforilados median la unión con varias proteínas de señalización, por ejemplo la proteína Grb2, la subunidad p85 de la fosfoinositida 3-quinasa (PI3K), fosfolipasa C-gamma Shc y Gab1.

Preferentemente, el compuesto de fórmula I es un compuesto que inhibe la unión del dominio Grb2 SH2. A este respecto, es necesario para la función celular que una proteína transductora identifique de forma exacta los receptores celulares activados. Más a menudo, la especificidad de reconocimiento surge de la capacidad de la proteína transductora para reconocer una fosfotirosina rodeada por una secuencia aminoacídica específica. El motivo de reconocimiento para Grb2 es pYXN, en el que pY es fosfo-Tyr, X es cualquier aminoácido y N es Asn. Por tanto, el compuesto de fórmula I, en ciertas formas de realización reconoce y une un motivo pYXN. Las uniones a HGF, preferentemente la unión del receptor HGF c-MEt con la proteína Grb2.

El compuesto empleado en la presente invención posee la fórmula I

1

en la que n es 0 a 15, X es un grupo que modifica un grupo amino en una amida, PTI es un radical bivalente de tirosina, un radical bivalente de fosfotirosina o de un mimético de fosfotirosina; AA se refiere a un radical bivalente de un aminoácido natural o no natural; e Y es un grupo amino secundario; o una sal del mismo. PTI en la fórmula I anterior es un radical bivalente de fosfotirosina o de un mimético de fosfotirosina. En una forma de realización preferida, n en la fórmula I es 1-4. En ciertas formas de realización, n es 1-4 y PTI es un radical bivalente de tirosina, un radical bivalente de fosfotirosina o de un mimético de fosfotirosina en forma de un radical bivalente de un aminoácido seleccionado del grupo constituido por fosfonometil-fenilalalnina, fosfono-(\alpha-fluoro)metil-fenilalanina, fosfono-(\alpha\alpha,-difluoro)metil-fenilalanina, fosfono-(\alpha-hidroxi)-metil-fenilalanina, O-sulfo-tirosina, dicarboximetoxi-fenilalanina, ácido aspártico, ácido glutámico, fosfoserina y fosfotreonina, cada uno de los cuales puede estar presente en la forma (D,L)-, D- o L; (AA)_{n}- es un radical bivalente de un tripéptido en la fórmula -(AA^{1})-(AA^{2})-(AA^{3})-, donde -(AA^{1})- se selecciona del grupo constituido por -Ile-, -Ac_{5}c-, -Ac_{6}c-, -Asp-, -Gly-, -Phe-, -Ac_{7}c-, -Nbo-, -Met-, -Pro-, -\beta-Ala-, -Gln-, -Glu-, -DHph-, -HPh- y -tLe-; -(AA^{2})- se selecciona del grupo constituido por -Asn-, -\beta-Ala-, -Gly-, -Ile- y -Gln-; y -(AA^{3})- se selecciona del grupo constituido por -Val-, -\beta-Ala-, -Gly-, -Gln-, -Asp-, -Ac_{5}c-; un radical bivalente de un dipéptido de la fórmula -(AA^{1})-(AA^{2})-, donde -(AA^{1})- y -(AA^{2})- son como se ha citado anteriormente;

o un radical bivalente de un aminoácido seleccionado de los aminoácidos mencionados antes; e

Y es un amino monosustituido seleccionado del grupo constituido por alquilamino inferior, octilamino, halonaftiloxi-alquilamino inferior, naftiloxi-alquilamino inferior, fenil-alquilamino inferior, difenil-alquilamino inferior, (mono o di-halofenil)-alquilamino inferior, naftalenil-alquilamino inferior, hidroxinaftalenil-alquilamino inferior, fenantrenil-alquilamino inferior; cicloalquilamino y cicloalquil-alquilamino inferior;

o una sal de los mismos.

En algunas otras formas de realización de la presente invención, n es de 1 a 4; PTI es un radical bivalente de fosfotirosina o de un mimético de fosfotirosina en forma de un radical bivalente de un aminoácido seleccionado del grupo constituido por fosfonometil-fenialalnina, fosfono-(\alpha-fluoro)metil-fenilalanina, fosfono-(\alpha\alpha,-difluoro)metil-fenilalanina, fosfono-(\alpha-hidroxi)-metil-fenilalanina, O-sulfo-tirosina, dicarboximetoxi-fenilalanina, ácido aspártico, ácido glutámico, fosfoserina y fosfotreonina, cada uno de los cuales puede estar presente en la forma (D,L)-, D- o L; (AA)_{n}-
es un es un radical bivalente de un tripéptido en la fórmula -(AA^{1})-(AA^{2})-(AA^{3})-, donde -(AA^{1})- se selecciona del grupo constituido por -Ile-, -Ac_{6}c-, -Asp-, -Gly- y -Phe-; -(AA^{2})- se selecciona del grupo constituido por -Asn-, -\beta-Ala- y -Gly-; y -(AA^{3})- se selecciona del grupo constituido por -Val-, -\beta-Ala-, -Gly-, -Gln-, -Asp-, -y -Ac_{5}c-;

un radical bivalente de un dipéptido de la fórmula -(AA^{1})-(AA^{2})-, donde -(AA^{1})- es -Ile- o -Ac_{6}c-, y -(AA^{2})- es -Asn- o -\beta-Ala-;

o un radical bivalente del aminoácido seleccionado de los aminoácidos mencionados antes; e

Y es un grupo amino monosustituido que posee un sustituyente seleccionado del grupo constituido por alquilo inferior y aril-alquilo inferior;

o una sal de los mismos. En ciertas otras formas de realización de la presente invención, n es de 1 a 4; PTI es un radical bivalente de tirosina o un radical bivalente de un mimético de fosfotirosina en forma de un radical bivalente de un aminoácido seleccionado del grupo constituido por fosfonometil-fenialalnina, fosfono-(\alpha-fluoro)metil-fenilalanina, fosfono-(\alpha\alpha,-difluoro)metil-fenilalanina, fosfono-(\alpha-hidroxi)-metil-fenilalanina, O-sulfo-tirosina, dicarboximetoxi-fenilalanina, ácido aspártico, ácido glutámico, fosfoserina y fosfotreonina, cada uno de los cuales puede estar presente en la forma (D,L)-, D- o L;

(AA)_{n}- es un es un radical bivalente de un tripéptido en la fórmula -(AA^{1})-(AA^{2})-(AA^{3})-, donde -(AA^{1})- se selecciona del grupo constituido por -Ile-, --Ac_{5}c-, -Ac_{6}c-, -Asp-, -Gly-, -Phe-, -Ac_{7}c-, -Nbo-, -Met-, -Pro-, -\beta-Ala-, -Gln-, -Glu-, -DHph-, -HPh- y -tLe-; -(AA^{2})- se selecciona del grupo constituido por -Asn-, -\beta-Ala-, -Gly-, -Ile- y -Gln-; y -(AA^{3})- se selecciona del grupo constituido por -Val-, -\beta-Ala-, -Gly-, -Gln-, -Asp-, -Ac_{5}c-; o un radical bivalente de un aminoácido seleccionado de los aminoácidos mencionados anteriormente; e

Y es un amino monosustituido seleccionado del grupo constituido por alquilamino inferior, octilamino, halonaftiloxi-alquilamino inferior, naftiloxi-alquilamino inferior, fenil-alquilamino inferior, difenil-alquilamino inferior, (mono o di-halofenil)-alquilamino inferior, naftalenil-alquilamino inferior, hidroxinaftalenil-alquilamino inferior, fenantrenil-alquilamino inferior; cicloalquilamino y cicloalquil-alquilamino inferior; o una sal de los mismos.

En la fórmula I, X es un resto unido al nitrógeno de PTI y se selecciona del grupo constituido por alquilcarbonilo C_{1}-C_{6}, oxalilo, por alquilaminooxalilo C_{1}-C_{6}, arilaminooxalilo, aril alquilaminooxalilo C_{1}-C_{6}, alcoxioxalilo C_{1}-C_{6}, carboxi alquilcarbonilo C_{1}-C_{6}, heterociclilo, carbonilo, heterociclo alquilcarbonilo C_{1}-C_{6}, aril alquilo C_{1}-C_{6}, alquilcarbonilo C_{1}-C_{6} heterocíclico, ariloxicarbonilo y aril alcoxicarbonilo C_{1}-C_{6}. En una forma de realización preferida, X es oxalilo. Ejemplos concretos de péptidos incluyen oxalilo-Pmp-Ile-Asn-NH-(3-naftalen-1-il-propilo), oxalil-Pmp-Ile-Asn-NH-(3-(2-hidroxinaftalen-1-il)-propilo), oxalil-Pmp-Ile-Asn-NH-(3-naftalen-2-il-propilo) y oxalil-Pmp-Ac_{6}c-Asn-NH-(3-naftalen-1-il-propilo), donde "Pmp" significa fosfonometilfenilalanina.

En otras formas de realización más, el compuesto posee la fórmula I, donde PTI es un radical de fenilalanina que posee un anillo fenilo, un extremo amino y un extremo carboxilo, donde el anillo fenilo posee uno o más sustituyentes seleccionados del grupo constituido por hidroxilo, carbonilo, formilo, carboxialquilo, carboxialquiloxi, dicarboxialquilo, dicarboxialquiloxi, dicarboxihaloalquilo, dicarboxihaloalquiloxi y fosfonoalquilo, fosfonohaloalquilo, donde la porción alquilo de los sustituyentes puede estar insustituida o sustituida con un sustituyente seleccionado del grupo constituido por halo, hidroxi, carboxilo, amino, aminoalquilo, alquilo, alcoxi y ceto;

X es un resto unido al nitrógeno de PTI y se selecciona del grupo constituido por alquilcarbonilo, oxalilo, alquilaminocarbonilo, arilaminooxalilo, arilalquilaminooxalilo, alcoxioxalilo, carboxialquilo, carbonilo, heterociclil carbonilo, heterociclilalquil carbonilo, arilalquil heterociclilalquil carbonilo, ariloxicarbonilo y arilalcoxicarbonilo, donde las porciones arilo y alquilo de los sustituyentes pueden estar insustituidos o sustituidos con un sustituyente seleccionado del grupo constituido por halo, hidroxi, carboxilo, amino, aminoalquilo, alquilo, alcoxi y ceto; y la porción heterociclilo de Y contiene al menos 4 heteroátomos seleccionados del grupo constituido por O, N y S;

AA es un aminoácido, cuyo extremo amino está unido al extremo carboxilo de PTI; e

Y es un arilaquilamino o arilheterociclil alquilamino;

o una sal de los mismos.

Ciertas otras formas de realización de la presente invención emplean compuestos de fórmula I en los que PTI es un radical de fenilalanina que posee un anillo fenilo, un extremo amino y un extremo carboxilo, donde el anillo fenilo posee uno o más sustituyentes seleccionados del grupo constituido por hidroxilo, carbonilo, formilo, carboxialquilo C_{1}-C_{6}, carboxialquiloxi C_{1}-C_{6}, dicarboxialquilo C_{1}-C_{6}, dicarboxialquiloxi C_{1}-C_{6}, dicarboxihaloalquilo C_{1}-C_{6}, dicarboxihaloalquiloxi C_{1}-C_{6} y fosfonoalquilo C_{1}-C_{6}, fosfonohaloalquilo C_{1}-C_{6}, donde la porción alquilo de los sustituyentes puede estar insustituida o sustituida con un sustituyente seleccionado del grupo constituido por halo, hidroxi, carboxilo, amino, aminoalquilo, alquilo C_{1}-C_{6}, alcoxi C_{1}-C_{6} y ceto;

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X es un resto unido al nitrógeno de PTI y se selecciona del grupo constituido por alquilcarbonilo C_{1}-C_{6}, oxalilo, alquilaminooxalilo C_{1}-C_{6}, arilaminooxalilo, arilalquilaminooxalilo C_{1}-C_{6}, alcoxioxalilo C_{1}-C_{6}, carboxialquilo C_{1}-C_{6} carbonilo, heterociclil carbonilo, heterociclilalquilo C_{1}-C_{6} carbonilo, arilalquiloC_{1}-C_{6} heterociclilalquilo C_{1}-C_{6} carbonilo, ariloxicarbonilo y arilalcoxicarbonilo C_{1}-C_{6}, donde las porciones arilo y alquilo de los sustituyentes pueden estar insustituidos o sustituidos con un sustituyente seleccionado del grupo constituido por halo, hidroxi, carboxilo, amino, aminoalquilo C_{1}-C_{6}, alquilo C_{1}-C_{6}, alcoxi C_{1}-C_{6} y ceto; y la porción heterociclilo de Y contiene al menos 4 heteroátomos seleccionados del grupo constituido por O, N y S;

AA es un aminoácido, cuyo extremo amino está unido al extremo carboxilo de PTI; e

Y es un arilaquilamino C_{1}-C_{6} o arilheterociclil alquilamino C_{1}-C_{6}; o una sal de los mismos.

En cualquiera de las formas de realización anteriores, los sustituyentes pueden estar presentes en cualquier posición adecuada sobre el anillo fenilo de la fenilalanina, preferentemente en la posición para con respecto al grupo metilenbencílico.

Los compuestos de la fórmula I que se pueden emplear en el procedimiento de la presente invención incluyen compuestos en los que PTI es de la fórmula II:

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2

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en la que D posee la fórmula III y IV:

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3

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en la que R_{3} y R_{4} pueden ser iguales o diferentes y se seleccionan del grupo constituido por hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, arilo, arilaquilo C_{1}-C_{6}, alcarilo C_{1}-C_{6}, y heteroarilo; y R_{5} y R_{6} pueden ser iguales o diferentes y se seleccionan del grupo constituido por hidrógeno, halo, hidroxi, amino y alcoxi C_{1}-C_{6}; y

E se selecciona del grupo constituido por hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, alquilcarbonilo C_{1}-C_{6}, carboxilo y alquilcarbonilo alquilo C_{1}-C_{6}.

Un ejemplo concreto de Y es arilalquilamino C_{1}-C_{6}. En formas de realización de los compuestos usados en el presente procedimiento de la invención, la porción arilo de Y posee la fórmula:

4

en la que Q_{1} es hidrógeno o un sustituyente seleccionado del grupo constituido por hidroxilo, halo, alquilo C_{1}-C_{6}, alcoxi C_{1}-C_{6}, amino y acialmino C_{1}-C_{6}. La porción heteroarilo en ciertas formas de realización de Y posee la fórmula:

5

en la que Q_{2} es hidrógeno o un sustituyente seleccionado del grupo constituido por hidroxilo, halo, alquilo C_{1}-C_{6}, alcoxi C_{1}-C_{6}, amino y acilamino C_{1}-C_{6} y F y G se seleccionan, de forma independiente, del grupo constituido por C, N, O y S.

Aunque cualquier X adecuado puede estar presente en el péptido, X se selecciona preferentemente del grupo constituido por acetilo, oxalilo, alquilaminooxalilo C_{1}-C_{6}, arilaminooxalilo, aril alquilaminooxalilo C_{1}-C_{6}, alcoxioxalilo C_{1}-C_{6}, carboximetilcarbonilo, tetrazolilcarbonilo, tetrazolilmetilcarbonilo, aminofenilmetoxicarbonilo, aminonaftiloxicarbonilo y metoxifenilmetil tetrazolilmetilcarbonilo, y más preferentemente X es oxalilo.

En ciertos compuestos de acuerdo con las formas de realización preferidas de la presente invención, n es 1-3.

Ejemplos concretos de compuestos de fórmula I incluyen (N-oxalil-4-malonil)-Phe-Ac_{6}c-Asn-NH-(3-naftalen-1-il-propil), péptido 2, y (N-acetil-4-malonil)-Phe-Ac_{6}c-Asn-NH-(3-naftalen-1-il-propil), péptido 3.

Los compuestos de fórmula I que poseen actividad inhibidora de la señalización celular y actividad inhibidora de la motilidad celular, como los péptidos mimético del dominio Grb2-SH2, son particularmente útiles en la inhibición de la neovascularización. Como se demuestra en el Ejemplo 2, los compuestos de fórmula I que poseen actividad inhibidora de la señalización celular y actividad inhibidora de la motilidad celular, como los péptidos mimético del dominio Grb2-SH2 que se describen en la presente memoria descriptiva, inhiben la invasión de las matrices por células endoteliales y células epiteliales y la formación de cordones celulares. Los ensayos usados en el Ejemplo 2 se asemejan al proceso angiogénico in vivo. Por ejemplo, Matrigel está constituido por proteínas reconstituidas de la membrana basal. Las células que invaden la matriz Matrigel forman cordones celulares alargados, que, en última instancia, forman interconexiones (Baatout, Anticancer Research, 17: 451-456 (1997)). La invasión de la matriz extracelular y la formación de columnas de células en la misma son importantes procesos asociados con la angiogénesis in vivo.

De acuerdo con ciertas formas de realización, la presente invención se contempla para usar en la prevención o el tratamiento de cáncer seleccionado de cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de tiroides y cáncer renal, sarcoma, glioblastoma, melanoma y cáncer o metástasis tumoral. De acuerdo con algunas formas de realización, la presente invención se puede llevar a cano in vitro o in vivo.

Los compuestos de la presente invención se pueden preparar mediante procedimientos conocidos para los expertos en la técnica. Por tanto, los compuestos se pueden sintetizar mediante técnicas sintéticas en fase de solución o fase sólida. Véase, por ejemplo, Yao y col., J. Med. Chem., 42, 25-35 (1999); Ye y col., J. Med. Chem., 38, 4270-4275 (1995); Burke, Jr. y col., Biochemistry, 33, 6490-6494 (1994); Smyth y col., Tetr. Lett., 35, 551-554 (1994); Burke, Jr. y col., J. Org. Chem., 58, 1336-1340 (1993) y Burke, Jr. y col., Tetr. Lett., 34, 4125-4128 (1993).

Por ejemplo, los péptidos que poseen un grupo fosfonometilo en el anillo fenilo de la fenilalanina, como el péptido 1, se pueden preparar mediante los procedimientos descritos en la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 09/236.160, presentada el 22 de enero de 1999, particularmente en los Esquemas 1-4 y la sección Experimental. La descripción de esta solicitud se incorpora en su totalidad en la presente memoria descriptiva por referencia. Por tanto, por ejemplo, el péptido 1 se puede preparar mediante la reacción de cloruro de t-butil oxalilo con un tripéptido de naftilpropilamido que contiene un residuo terminal de fenilalanina cuyo nitrógeno amino está protegido por un grupo protector tal como F-moc.

El tripéptido de naftilpropilamido se puede preparar mediante la reacción de éster de naftilpropilamina con N-Boc-L-Asn-N-hidroxisuccinimida. El monopéptido de naftilpropilamido resultante se puede hacer reaccionar además con un ácido aminociclohexano carboxílico N protegido para obtener un dipéptido de naftilpropilamido. A continuación el dipéptido se puede reaccionar con un fosfonometil fenilalanina para obtener el tripéptido de naftilpropilamido. La naftilpropilamina se puede preparar a partir de naftaldehído.

Como otro ejemplo, los péptidos que poseen un grupo malonilo en el anillo fenilo de la fenilalanina, como el péptido 2, se pueden preparar mediante los procedimientos descritos en la solicitud provisional nº de serie 60/126.047, presentada el 23 de marzo de 1999, particularmente en las Figuras 1, 4-5 y 7, y los Ejemplos 1-2. La descripción de esta solicitud se incorpora en su totalidad en la presente memoria descriptiva por referencia. Por tanto, por ejemplo, el péptido 2 se puede preparar del siguiente modo. Se puede preparar un dipéptido de naftilpropilamido como se ha indicado anteriormente. A continuación, el dipéptido se puede reaccionar con una fenilalanina t-butoximalonilada cuyo grupo \alpha-amino ha sido N protegido. El tripéptido di-t-butoximalonilado resultante puede reaccionar con cloruro de t-butoxi oxalilo. Los grupos t-butoxi pueden después escindirse del tripéptido resultante para obtener el péptido 2.

La fenilalanina t-butoxi-malonilada cuyo grupo \alpha-amino ha sido N protegido se puede preparar a partir de p-yodotolueno mediante reacción con di-t-butil-malonato. El derivado de tolueno malonilado resultante puede halogenarse, por ejemplo brominarse, en el grupo metilo para proporcionar un derivado de malonato de \alpha-halotolueno. El último derivado puede hacerse reaccionar con una bencil-6-oxo-2,3-difenil-4-morfolina y el derivado morfolino resultante se puede reducir con paladio e hidrógeno para proporcionar una fenilalanina malonilada. El grupo \alpha-amino de esta fenilalanina se puede N-proteger mediante grupos N-protectores tales como F-moc.

En la práctica de la presente invención, los compuestos de fórmula I se pueden administrar como una composición farmacéutica que comprende un transportador farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz (por ejemplo, terapéutica o profilácticamente eficaz) de al menos uno e los péptidos. Los transportadores farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, farmacológicamente aceptables) descritos en la presente memoria descriptiva, por ejemplo vehículos, adyuvantes, excipientes o diluyentes, son bien conocidos para los expertos en la técnica y están fácilmente disponibles para el público. Se prefiere que el transportador farmacéuticamente aceptable sea uno que sea químicamente inerte para los compuestos activos y uno que no tenga efectos secundarios perjudiciales o toxicidad en las condiciones de uso.

La elección del transportador vendrá determinada, en parte, por el agente activo particular, así como por el procedimiento concreto usado para administrar la composición. En consecuencia, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de la composición farmacéutica de la presente invención. Las formulaciones siguientes para administración oral, en aerosol, parenteral, subcutánea, intravenosa, intraarterial, intramuscular, interperitoneal, intratecal, rectal y vaginal son meramente ejemplos y no son de ningún modo limitantes.

Las formulaciones adecuadas para la administración oral pueden comprender (a) soluciones líquidas, tales como una cantidad eficaz del compuesto disuelto en diluyentes, como agua, solución salina o zumo de naranja; (b) cápsulas, sellos, comprimidos, pastillas y trociscos, donde cada uno contiene una cantidad predeterminada del ingrediente activo, como sólidos o gránulos; (c) polvos; (d) suspensiones en un líquido adecuado; y (e) emulsiones adecuadas. Las formulaciones líquidas pueden incluir diluyentes, tales como agua y alcoholes, por ejemplo etanol, alcohol bencílico y los alcoholes de polietileno, con i sin la adición de un tensioactivo, un agente de suspensión o un agente emulsionante farmacéuticamente aceptable. Las formas de las cápsulas pueden ser del tipo habitual de gelatina de cubierta dura o blanda que contienen, por ejemplo, tensioactivos, lubricantes y cargas inertes, tales como lactosa, sacarosa, fosfato cálcico y almidón de maíz. Las formas de los comprimidos pueden incluir uno o más de lactosa, sacarosa, manitol, almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico, celulosa microcristalina, goma arábiga, gelatina, goma guar, dióxido de silito coloidal, croscarmelosa sódica, talco, estearato de magnesio, estearato de calcio, estearato de cinc, ácido esteárico y otros excipientes, colorantes, diluyentes, agentes tampón, agentes disgregantes, agentes humectantes, conservantes, agentes aromatizantes y transportadores farmacológicamente compatibles. Las formas de las pastillas pueden comprender el ingrediente activo en un sabor, normalmente sacarosa y goma arábiga o de tragacanto, así como pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arábiga, emulsiones, geles y similares que contienen, además del ingrediente activo, dichos transportadores tal como se conocen en la técnica.

Los compuestos de fórmula I solos o en combinación con otros componentes adecuados, se pueden preparar en formulaciones de aerosol para administrar a través de inhalación. Estas formulaciones en aerosol se pueden introducir en propelentes presurizados aceptables, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares. También se pueden formular en formulaciones farmacéuticas para preparaciones no presurizadas, tales como en un nebulizador o un atomizador.

Entre las formulaciones adecuadas para administración parenteral se incluyen soluciones inyectables estériles isotónicas acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que convierten la solución en isotónica con la sangre del receptor al que está destinada, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes. El compuesto se puede administrar en un diluyente fisiológicamente aceptable en un transportador farmacéutico, tal como un líquido o una mezcla de líquidos estéril, incluidos agua, solución salina, dextrosa acuosa y soluciones de azúcar relacionadas, un alcohol, tal como etanol, isopropanol o alcohol hexadecílico, glicoles, tales como propilenglicol o polietilenglicol, cetales de glicerol, tales como 2,2,-dimetil-1,3-dioxolano-4-metanol, éteres, tales como poli(etilenglicol) 400, un aceite, un ácido graso, un éster o glicérido de ácido graso, o un glicérido de ácido graso acetilado con o sin la adición de un tensioactivo farmacéuticamente aceptable, tal como un jabón o un detergente, agente de suspensión, como pectina, carbómeros, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa, o agentes emulsionantes y otros adyuvantes farmacéuticos.

Los aceites que se pueden usar en formulaciones farmacéuticas incluyen petróleo, aceites animales, vegetales o sintéticos. Entre los ejemplos específicos de los aceites se incluyen aceites de cacahuete, de soja, de sésamo, de semilla de algodón, de maíz, de oliva, vaselina y minerales. Ácidos grasos adecuados para usar en formulaciones parenterales incluyen ácido oleico, ácido esteárico y ácido isoesteárico. El oleato de etilo y el miristato de isopropilo son ejemplos de ésteres de ácidos grasos adecuados. Jabones adecuados para usar en formulaciones parenterales incluyen sales de metales alcalinos grasos, amoniaco y de trietanolamina, y entre los detergentes adecuados se incluyen (a) detergentes catiónicos tales como, por ejemplo, haluros de dimetildialquil amonio y haluros de alquilpiridinio, (b) detergentes aniónicos tales como, por ejemplo, sulfonatos de alquilo, arilo y olefina, sulfatos de alquilo, olefina, éter u monoglicéridos, y sulfosuccinatos, (c) detergentes no iónicos tales como, por ejemplo, óxidos de aminas grasas, alcanolamidas de ácidos grasos y copolímeros de polioxietilenpolipropileno, (d) detergentes anfotéricos tales como, por ejem-
plo, alquil-\beta-aminopropionatos y sales 2-alquil-imidazolina de amonio cuaternario, y (e) mezclas de los mismos.

Las formulaciones parenterales contendrán, normalmente, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 25% en peso del ingrediente activo en solución. En tales formulaciones se puede usar conservantes y tampones adecuados. Con el fin de minimizar o eliminar la irritación en el punto de la inyección, tales composiciones pueden contener uno o más tensioactivos no iónicos. La cantidad de tensioactivo en tales formulaciones varía típicamente de aproximadamente 5 a aproximadamente 15% en peso. Entre los tensioactivos adecuados se incluyen ésteres de ácidos grasos de polietileno sorbitano, como monooleato de sorbitano, y los aductos de alto peso molecular del óxido de etileno con una base hidrófoba, formados mediante la condensación de óxido de propileno con propilenglicol. Las formulaciones parenterales se pueden presentar en envases sellados monodosis o multidosis, tales como ampollas y viales, y se pueden almacenar en condiciones de liofilización que sólo requieren la adición del transportador líquido estéril, por ejemplo agua para inyectables, inmediatamente antes de usar. Se pueden preparar soluciones y suspensiones extemporáneas para inyectables a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos del tipo descrito anteriormente.

Los compuestos de fórmula I o derivados de los mismos también pueden prepararse en formulaciones inyectables. Los requisitos para los transportadores farmacéuticos eficaces para composiciones inyectables son bien conocidos para los expertos habituales en la técnica. Véase, por ejemplo. Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, PA., Banker and Chalmers, eds., páginas 238-250 (1982) y ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4ª ed., páginas 622-630 (1986).

Además, los compuestos de la presente invención se pueden preparar en supositorios mezclando con una diversidad de bases, tales como bases emulsionantes o bases hidrosolubles. Las formulaciones adecuadas para administración vaginal pueden presentarse en forma de pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o fórmulas en spray que contienen, además del ingrediente activo, tales como transportadores tal y como se conocen en la técnica que son adecuados.

Las dosis y regímenes de administración adecuados se pueden determinar mediante técnicas convencionales de búsqueda de intervalos conocidas para los expertos habituales en la técnica. En general, el tratamiento se inicia con dosis más pequeñas, que son inferiores a la dosis óptima del compuesto. Después, la dosis se aumenta en pequeños incrementos hasta que se alcanza el efecto óptimo en las circunstancias. Por comodidad, la dosis diaria total se puede dividir y administrar en porciones durante el día, si se desea. A dosis adecuadas y con la administración adecuada de ciertos compuestos, la presente invención proporciona una amplia gama de respuestas. Normalmente, el intervalo de dosis de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal del animal que se está tratando/al día. Las dosis preferidas varían de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal/día, y dosis todavía más preferidas varían de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal/día.

Los efectos de los procedimientos de la presente invención se pueden determinar mediante cualquier procedimiento adecuado, tales como los procedimientos conocidos para los expertos en la técnica. Por ejemplo, la presente invención proporciona un procedimiento para inhibir, totalmente o en parte, la angiogénesis. El experto habitual en la técnica posee la capacidad para detectar la inhibición de la angiogénesis usando una diversidad de procedimientos, tales como, por ejemplo, angiografía con fluoresceína, microscopia electrónica de barrido y generación de cilindros vasculares. Además, existen varios modelos animales de angiogénesis, incluido, entre otros, el modelo de oreja de ratón de neovascularización, modelos de neovascularización ocular en conejos y el modelo de isquemia en las patas traseras de ratas de neovascularización. En el tratamiento del cáncer, el cambio en el tamaño del tumor se puede medir, por ejemplo, mediante técnicas de imagen, a intervalos adecuados durante el periodo de tratamiento así como después de que el tratamiento se suspenda. Como alternativa, se pueden extraer muestras de fluidos corporales, por ejemplo muestras de sangre, a intervalos predeterminados para determinar la concentración de las células cancerosas en las mismas. Se puede llevar a cabo una biopsia para determinar las características de las células tumorales. Los compuestos de la presente invención se contemplan para usar en la prevención de enfermedades. Por tanto, se contempla la prevención de todo o parte de una enfermedad, por ejemplo metástasis de cáncer.

Los compuestos de la presente invención tienen la ventaja de que son estables a o en presencia de las enzimas que se encuentra durante el uso in vivo. Los compuestos de fórmula I pueden encontrar utilidad en aplicaciones in vitro e in vivo. Por ejemplo pueden encontrar utilidad como sondas moleculares, así como en ensayos para identificar, aislar y/o cuantificar los receptores o sitios de unión en una célula o tejido. Los compuestos de fórmula I también pueden encontrar utilidad in vivo para estudiar la eficacia en el tratamiento de varias enfermedades o afecciones en las que están implicados los dominios SH2.

La presente invención además proporciona un procedimiento para inhibir la unión entre un transductor intracelular y una proteína tirosina quinasa receptor que influye sobre la motilidad celular, que comprende poner en contacto in vitro el receptor con un compuesto de la presente invención, o un éster o un derivado éter del mismo. Un ejemplo de un transductor intracelular es uno que incluya uno o más dominios SH2, preferentemente el transductor Grb2. Un ejemplo de una proteína tirosina quinasa receptor es el receptor de HGF, en particular el receptor HGF/c-Met.

Los compuestos de la presente invención interaccionan con transductores de señal intracelular, de modo que interfieren en las vías que conducen a la proliferación y el movimiento celular. Estos efectos biológicos pueden utilizarse para inhibir el crecimiento de células neoplásicas, inhibir la angiogénesis y prevenir la diseminación metastásica. La presente invención proporciona el uso, para la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar una enfermedad, afección o estado en un mamífero medida por la unión de un transductor intracelular a una proteína tirosina quinasa receptor de un compuesto de la presente invención.

Los compuestos de la presente invención se usan para prevenir y/o tratar el cáncer. Los cáncer que pueden prevenirse o tratarse se seleccionan de cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de tiroides y cáncer renal, sarcoma, melanoma, glioblastoma y metástasis tumoral.

La presente invención proporciona además un procedimiento para inhibir la unión de un transductor intracelular a una proteína tirosina quinasa receptor que comprende poner en contacto in vitro (a) una muestra que contenga la proteína tirosina quinasa receptor, (b) el transductor intracelular y (c) el compuesto de la presente invención, en las condiciones en las que, en ausenta del compuesto, la proteína tirosina quinasa receptor se une al transductor intracelular; en las que el contacto tiene como resultado la inhibición de la unión del transductor intracelular a la proteína tirosina quinasa receptor.

La presente invención proporciona además un procedimiento para detectar la inhibición de la unión del transductor intracelular a la proteína tirosina quinasa receptor, que comprende (a) poner en contacto una muestra in vitro que contenga la proteína tirosina quinasa receptor con el transductor intracelular y, por separado, en presencia y ausencia del compuesto de la presente invención o de un derivado del mismo, en las condiciones que permitan la unión de la proteína tirosina quinasa receptor al transductor intracelular en ausencia del compuesto de fórmula I (b) detectar si se ha producido la unión entre la proteína tirosina quinasa receptor y el transductor intracelular; y (c) comparar los niveles de unión relativos de la proteína tirosina quinasa receptor y el transductor intracelular en presencia y ausencia del compuesto de fórmula I; donde la detección de una menor unión en presencia del compuesto de fórmula I indica inhibición de la unión.

La presente invención proporciona además un procedimiento para determinar la presencia de una proteína Grb2 en un material, que comprende (a) exponer una muestra del material a un compuesto de unión a Grb2 y obtener un primer resultado de unión; (b) exponer otra muestra del material a un péptido de la presente invención, o un derivado del mismo, y obtener un segundo resultado de unión; y (c) comparar el primero y segundo resultados de unión para determinar si la proteína Grb2 está presente en el material.

Los compuestos de la presente invención inhiben la motilidad celular. Los compuestos previene la dispersión de las células.

Los efectos citotóxicos de los agentes que alteran el citoesqueleto, como colchicina, taxol, citocalasinas y faloidina están bien caracterizados y son fundamentalmente diferentes de los efectos anti-motilidad ejercidos por los compuestos empleados en la presente invención. Estos compuestos pueden ser altamente eficaces para el tratamiento seguro de enfermedades humanas tales como cáncer metastásico, por ejemplo cuando el papel del HGF desempeña un papel en la estimulación de la invasión de células en el tejido que rodea a los tumores y la migración de las metástasis a sitios distantes.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes ilustran más la presente invención pero, por supuesto, no deben interpretarse de ningún modo como limitantes de la misma.

Ejemplo 1

Este ejemplo ilustra la inhibición de la motilidad celular de acuerdo con un procedimiento de la presente invención.

Materiales

El HGF/NK1 se produjo en un sistema de expresión bacteriano, se purificó y volvió a plegar como se describe en Stahl y col., Biochem. J., 326: 763-772 (1997). Los péptidos 1-4 se sintetizaron y purificaron como se describe en Yao y col., ant. Las propiedades de unión de Grb2 de estos compuestos in vitro se han descrito anteriormente (Yao y col., ant.). Entre estos péptidos, el 4 posee la menor afinidad por Grb2 al menos 100 veces, En consecuencia, este péptido se usó como control negativo en los experimentos biológicos que se tratan en la presente memoria descriptiva.

Ensayo de dispersión de células MDCK

El movimiento de células MDCK, observado como la distribución o dispersión de células únicas desde las colonias estrechamente agrupadas, se analizó como se describe en Stoker y col. J. Cell. Sci., 77, 209-223 (1985). Brevemente, las células MDCK se sembraron a la densidad final de 2x10^{4} células/pocillo en placas de 24 pocillos en medio DMEM que contiene varias concentraciones de inhibidores. Cuatro horas después se añadió HGF (30 ng/ml) y las células se incubaron durante 16 horas adicionales a 37ºC. La dispersión de células fijas y marcadas se observó mediante microscopia óptica.

Ensayo de migración celular

La migración por células 185B5 y de Okajima se midió usando inserciones control de Biocoat Cell Environments (8 micrómetros de tamaño de poro; Becton Dickinson). La cámara inferior contenía RPMI + 0,1% de FBS, a la que se añadieron factores de crecimiento o inhibidores. Las células se tripsinizaron, lavaron en RPMI + 0,1% de FBS, se añadieron a la cámara superior a una densidad final de 2x10^{5} células/ml y se incubaron durante 16 h a 37ºC. Las células se fijaron y marcaron usando Diff-Quik (Dade Diagnostics de P.R. Inc.) u se contó el número de células que había atravesado la membrana usando microscopia de campo brillante de potencia baja. La diferencia en este número entre las células sin tratar y tratadas se indica en el eje y como "Incremento" en la migración. La migración de células 32D/c-Met se analizó usando una cámara Boyden modificada con filtros Nucleopore de un tamaño de poro de 5 micrómetros (Corning) como se describe en Uren y col., Biochem. Biophys. Res. Comm., 204, 628-634 (1994). A la cámara inferior se añadieron factores o inhibidores del crecimiento y las células 32D/c-Met lavadas con medio sin suero se aplicaron a la cámara superior a una densidad final de 2x10^{6} células(ml y se incubaron durante 8 h a 37ºC. Las células en la cámara inferior se contaron con un contador celular automático (Coulter, Inc.) y se cuantificó la migración.

Líneas celulares cultivadas y Transfecciones de ADNc

La línea de células epiteliales mamarias humanas 184B5 se mantuvo en medio 1640 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Gibco) + 10% se suero bovino fetal (FBS) y 5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (Becton Dickinson). La línea celular murina dependiente de IL-3 32D se cultivó en medio RPMI 1640 + 10% de FBS y 5% de medio condicionado WEHI-3B como fuente de IL-3. Las células 32D/c-Met se generaron mediante co-transfección de células 32D con ADNc humano pMOG de c-Met y el ADNc de pCEV27 que codifica resistencia a neomicina mediante electroporación tal y como se describe en Pierce y col., Science, 239, 628-631 (1988). Las células se seleccionaron en G418 y la expresión de c-Met en líneas celulares estables se detectó mediante inmunotransferencia.

El efecto de los péptidos sobre la migración de células 32D/c-Met se muestra en las Fig. 2A y 2B. Los resultados son representativos de tres o más experimentos. HGF/NK1 estimularon la migración celular en este sistema caso 20 veces más que las células control sin tratar. Los péptidos 1-3, cada uno, redujeron la migración celular estimulada por HGF/NK1 de un modo dependiente de la dosis. Los valores de CI50 calculados a partir de estas pruebas fueron de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 nM.

El efecto de los péptidos sobre la migración de células Okijama humanas y células epiteliales mamarias 184B5 se muestra en las Fig. 3A y 3B. Los resultados son representativos de tres o más experimentos. En ambos paneles, los valores representan el número de células en migración por unidad de área en la superficie inferior de la barrera membranosa. Los valores medios de 10 áreas unitarias seleccionadas al azar se calculan de cada uno de los tres pocillos tratados de forma idéntica. La línea Okajima es una línea celular altamente transformada derivada de un carcinoma gástrico humano en el que el receptor de HGF, c-Met, se sobreexpresa de forma espectacular (Aproximadamente 100 veces más) en relación con las células diana HGF epiteliales normales, tal como 184B5. Como se muestra en la Fig. 3A, cada uno de los péptidos redujo la migración de las células de Okajima estimuladas por HGF/NK1 de forma dependiente de la dosis. Los valores de CI50 calculados a partir de estos experimentos estaban dentro del intervalo de 10 a 30 nM. Los mismos compuestos eran igualmente eficaces en el bloqueo de la migración estimulada por HGF/NK1 de las células 18485 (Fig. 3B).

El HGF ejerce un único y potente efecto sobre la morfología, dispersión y movimiento de las células epiteliales renales caninas Madin-Darby (MDCK) conocido como "dispersión" (Stoker y col., ant.). En la fig. 4 se analizó el movimiento de las células MDCK, observado como la distribución o dispersión de células solas a partir de colonias estrechamente agrupadas. Las microfotografías muestras áreas representativas de una de muestras triplicadas para cada condición. Los resultados indicados son representativos de tres experimentos. Como se muestra en la fig. 4, la dispersión de las células MDCK estimulada por HGF fue bloqueada por los péptidos a 10 nM cada uno. Los péptidos redujeron en número de células solas, es decir aquéllas con el mayor nivel de motilidad. Estos datos muestran que los péptidos bloqueaban de un modo potente la migración estimulada por HGF de los tipos de células tanto epiteliales como hematopoyéticas, derivadas de tejido normal y tumoral.

El nivel de migración celular observada en ausencia de estimulación de HGF no se vio significativamente afectada por los miméticos activos. Estos datos sugieren que estos péptidos actúan a nivel de la regulación de la motilidad celular por el HGF, no a nivel del propio aparato de motilidad. Las células en todos los ensayos permanecieron viables y completamente capaces de sufrir división celular tras el tratamiento extendido (de hasta 48 horas) con estos péptidos, lo que confirma que carecen de efectos citotóxicos.

Mientras que los péptidos activos no parecieron bloquear la diseminación estimulada por HGF de las células MDCK, uno de los primeros acontecimientos en el proceso de dispersión celular (Ridley y col., Mol. Cell. Biol, 15, 1110-1122 (1995)), parecían reducir de forma espectacular el número de células solas, es decir aquéllas con el mayor nivel de motilidad. Juntos, estos datos muestran que los miméticos de 1-3 bloquean de un modo potente la migración estimulada por HGF de los tipos celulares epiteliales y hematopoyéticos, derivadas de tejido tanto normal como tumoral.

Ejemplo 2

Este ejemplo ilustra la inhibición de la invasión de la matriz y la tubulogénesis por las células epiteliales y endoteliales, procesos que están asociados con la angiogénesis.

Materiales

En un sistema de expresión bacteriano se produjo la isoforma truncada de HGF, HGF/NK1, se purificó y se volvió a plegar como se ha descrito previamente en el Ejemplo1. Los péptidos 1-4 se sintetizaron y purificaron como se ha descrito en el Ejemplo 1 y Yao y col., ant. El factor de crecimiento de fibroblastos básico recombinante humano (bFGF) y el factor de crecimiento endotelial vascular recombinante humano (VEGF) eran de R&D Systems (Minneapolis, MN).

Líneas celulares cultivadas

TAC-2 (Soriano y col., J. Cell Science, 108: 413-430 (1995)), una línea de células epiteliales de glándulas mamarias normales, se cultivó en DMEM rico en glucosa (Gibco BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Biofluids, Rockville, MD). Las células epiteliales renales caninas Madin-Darby (MDCK) se mantuvieron en DMEM + 10% de FBS. Las células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HMEC-1) (Adeset y col., J. Invest. Dermatol., 99: 683-690 (1992)) se cultivaron en RPMI 1640 (Biofluids) que contiene 10% de FBS y glutamina 2 mM. Las células endoteliales microvasculares humanas (HMVE) de dermis neonatal se adquirieron de Cascade Biologicals y se cultivaron en medio 131, que contienen MVGS (suplemento del medio) y 1% de glutamina, como indica el fabricante. Las células endoteliales de la vena umbilical humanas (HUVE) se aislaron de cordones liberados recientes como se ha indicado anteriormente (Jaffee y col., J. Clin. Invest., 52: 2745-2756 (1973)) y se cultivaron en placas Nunclon (Nunc, Dem-nark) en RPMI 1640 suplementado con 20% de suero bovino fetal (Hyclone Laboratorios, Logan, UTA), 50 \mug/ml de gentamicina, 2,5 \mug/ml de anfotericina B (fungizona) (Life Technologies), 5 U/ml de heparina sódica (Fisher Scientific, Pittsburg, PA) y 200 \mug/ml de suplemento de crecimiento de células endoteliales (ECGS) (Collaborative Research, Bedford, Mass.) y se usaron entre los pasos 3 y 6.

Ensayo de invasión de la matriz extracelular

La invasión por las células MDCK de los geles de colágeno tridimensionales se analizó como se ha descrito anteriormente. Brevemente, el colágeno de tipo I (1,5 mg/ml; Cohesión Technologies) se mezcló con 10x MEM y bicarbonato sódico (11,76 mg/ml) en un proporción de 8:1:1 (vol:vol:vol) en hielo y alícuotas de 0,4 ml se dispensaron en pocillos de cultivo tisular de 16 mm (Nunc) y se dejaron melificar a 37ºC durante 20 minutos. Las células se sembraron en geles (1x10^{4} células/pocillo) en 0,4 ml de medio de crecimiento que contiene HGF y/o los péptidos 1 ó 4, tal como se ha indicado. Tras 5 días, las células se fijaron in situ en glutaraldehído al 2,5% en tampón cacodilato sódico 0,1M (pH 7,4) y las células que habían invadido el gel por debajo de la monocapa de la superficie en diez campos seleccionados al azar (1x1,4 mm) se contaron al microscopio usando un objetivo de contraste de fases a 20 aumentos. La profundidad de la invasión celular en el gel de colágeno se cuantificó en los mismos diez campos por grupo de tratamiento usando un micrómetro de ajuste fino calibrado. Los valores se compararon usando la prueba no pareada de la t de Student, tomando como valor significativo una P<0,001. Los resultados en la Tabla 1 se muestran como el número medio de células invasoras/campo o profundidad media de la invasión/célula en micrómetros + error estándar de la media.

TABLA 1 Invasión de matrices de colágeno por células MDKC

6

La células MDCK se dejaron sin tratar (control), se trataron con HGF (10 ng/ml) o con HGF+ péptido 2 ó 4 (100 nM) y se cuantificó la invasión en matrices de colágeno con el microscopio tal como se ha descrito anteriormente. Los valores son la media de al menos 10 campos seleccionados al azar \pm el error estándar de la media.

Ensayo de formación del tubo epitelial

Células TAC-2 se suspendieron en geles tridimensionales de colágeno a 1x10^{4} células/ml en colágeno y se incubaron en medio completo que contenía HGF y/o inhibidores de Grb2. Después de 3 días, los cultivos se fijaron con glutaraldehído al 2,5% en tampón cacodilato 0,1M y al menos 3 campos seleccionados al azar por condición experimental en cada uno de 3 experimentos distintos se registraron digitalmente con microscopia de campo brillante. La longitud total de los cordones de cada colonia individual presente en cada campo óptico se midió con IPLab. La longitud del cordón se consideró "0" en: a) colonias con una forma esferoide y b) estructuras ligeramente elongadas en las que la relación entre la longitud y el diámetro era inferior a 2. Los valores medios para cada condición experimental se compararon con los controles usando la prueba no pareada de la t de Student. Los resultados en la figura 5 se muestran como el número medio de células invasoras/campo o profundidad describen como la longitud total media del cordón (en \mum) por campo.

Ensayos de migración celular

El ensayo de migración de células HUVE y HMEC-1 en cámaras de Borden modificadas se adaptó a partir de los procedimientos descritos previamente (Murohara y col., Thromb. Vasc. Biol., 19: 1156-61 (1999), Malinda y col., FASEB J., 13: 53-62 (1999)). En resumen, inserciones control de Biocoat Cell Environment (tamaño de poro de 8 micrómetros; Bencton Dickinson) se recubrieron con 0,1% de gelatina (Sigma) durante al menos 1 hora a 37ºC y se secaron al aire. Las cámaras inferiores contenían 0,7 ml de RPMI + 0,1% de BSA, al que se añadieron 20 ng/ml de HGF y/o inhibidores de Grb2 a 300 nM. Las células se trataron previamente con las concentraciones indicadas de inhibidores de Grb2 durante 18-24 horas, se sometieron a tripsinización, se lavaron dos veces en RPMI 0,1% de BSA, se añadieron a las cámaras superiores (5x10^{4} células/pocillo) con o sin inhibidores en un volumen final de 0,5 ml y se incubaron durante 4 h a 37ºC. Las células sobre la superficie superior de cada filtro se eliminaron con un hisopo de algodón, mientras que las células que habían pasado a la superficie inferior del filtro se fijaron y marcaron con Diff-Quik (Dade Diagnostics) y se contaron usando un objetivo 10x. Los valores medios de 4 campos seleccionados al azar (1 x 1,4 mm) se calcularon para cada pocillo por triplicado por condición experimental. En la fig. 6 se muestra la relación entre las células en migración tratadas con factor de crecimiento y las control designadas en el eje y como "Migración (incremento" o como el número medio de células por campo óptico en las Fig. 8-11.

Las células HUVE o HMVE se sembraron por triplicado en placas de 48 pocillos recubiertos con colágeno de tipo I (Biocoat) (3000 células/pocillo) en 500 \mul de medio completo EGM-Bullet Kit (BioWhittaker, Walkersville, MD), se dejaron fijar durante 4 horas y se incubaron durante la noche con o sin las concentraciones indicadas de péptido 2. Los cultivos se lavaron dos veces en medio sin suero y se incubaron con medio EBM (BioWhittaker) suplementado con 50 \mug/ml de heparina, 50 \mug/ml de ácido ascórbico y 10% de FCS. Después de 4 días (HUVE) o de 5 días (HMVE), las células se recolectaron con tripsina/EDTA y se contaron con un hemocitómetro. El número medio de células por ml se calculó a partir de 3 medidas independientes para cada pocillo por triplicado por condición experimental y se comparó con los controles usando la prueba no pareada de la t de Student. Los resultados que se exponen en la Fig. 12 se describen como la relación entre las células en proliferación tratadas con factor de crecimiento y las control designadas en el eje y como "Proliferación (incremento)".

Ensayo de tubulogénesis de células endoteliales en colágeno

El ensayo de tubulogénesis de células HMEC-1 sobre geles de colágeno se adaptó de un procedimiento previamente descrito (Montesano y col., Cell, 42, 469-77 (1985), Pepper y col., Exp. Cell Res., 204: 356-63 (1993)). Las células se sembraron en geles de colágeno vertidos en pocillos de 16 mm (2,5 x 10^{4} células/pocillo) y se cultivaron hasta alcanzar la confluencia en medio de crecimiento reducido (5% FCS y 150 \mug/ml de ECGS). En la confluencia, las células se trataron previamente con o sin inhibidores de Grb2 durante 24 horas, tiempo tras el cual el medio fue sustituido por medio recién preparado suplementado con o sin la concentración indicada de inhibidores y/o 20 ng/ml de HGF. El medio y los compuestos se cambiaron todos los días. Tras 24 horas, los cultivos se fijaron in situ y 5 campos ópticos seleccionados al azar por condición experimental en cada uno de los tres experimentos distintos se registraron digitalmente con microscopia de contraste de fases usando un objetivo de contraste de fases de 20 aumentos, ajustando a 20 \mum debajo de la superficie del gel. La invasión se cuantificó usando el software IPLab (Scanalytics, Fairfax, VA) midiendo la longitud total de todas las estructuras celulares que habían penetrado debajo de la monocapa superficial bien en forma de células aparentemente solas o en forma de cordones celulares. Los valores se compararon usando la prueba no pareada de la t de Student y se tomó un valor significativo a una P< 0,001. Los resultados que se exponen en la Fig. 7 son la longitud total media (en \mum) por campo.

Ensayo de tubulogénesis de células HUVE en Matrigel

El ensayo de formación de tubo de células HUVE se realizó como se ha descrito previamente (Grant y col., J. Cell. Physiol., 153, 614-625 (1992)). Brevemente, placas de 96 pocillos se recubrieron con 90 \mul de Matrigel (10 mg/ml) (Collaborative Research) (Baatout, ant.) y se incubaron a 37ºC durante 30 minutos para estimular la gelificación. Se resuspendieron 10.000 HUVE en medio de crecimiento reducido (Concentración en suero 10% y 5 U/ml de heparina) u se añadieron a cada pocillo con los reactivos indicados en un volumen final de 100 \mul. Tras 18 horas, las placas se fijaron con Diff-Quick y al menos 4 campos seleccionados al azar por condición experimental se registraron digitalmente con iluminación de campo óptico usando un objetivo de 10 aumentos. La longitud media adictiva de los cordones presentes en cada campo óptico se midió usando IPLab y se comparó con los controles usando la prueba no pareada de la t de Student.

La capacidad de las células MDCK para invadir las matrices de colágeno tridimensionales, un requisito previo para la morfogénesis de ramificación estimulada por HGF se evaluó en presencia de los péptidos 3 y 4 (Tabla 1). Tras 5 días de cultivo en ausencia de HGF, las células MDCK permanecen en forma de monocapa sobre la superficie del gel de colágeno, aunque el HGF estimula una elevada proporción de estas células para invadir el gel (profundidad media de la invasión 35 mm; Tabla 1). El péptido 3 (100 nM) redujo el número de células invasoras, así como la profundidad media de invasión por célula, en al menos un 50%, mientras que el péptido 4 no tuvo efectos significativos (Tabla 1). La viabilidad de las células MDCK durante el periodo de cultivo de 5 días no varió en ausencia o presencia de los antagonistas del dominio Grb2 SH2. Junto con los resultados del Ejemplo 1, estos datos demuestran que los antagonistas del dominio Grb2 SH2 inhiben dos efectos biológicos principales del HGF, a saber, la inducción de la migración celular y la invasión de la matriz extracelular.

Se evaluó la capacidad de los antagonistas del dominio Grb2 SH2 para anular las actividades morfogenéticas del HGF. En un primer grupo de experimentos, los inventores usaron un modelo in vitro de la morfogénesis ductal en el que con HGF se indujo la formación por células epiteliales derivadas de glándula mamaria (TAC-2) cultivadas en un gel tridimensional de colágeno de estructuras tubulares ramificadas. Cuando se cultivaron en geles de colágeno en condiciones control, las células TAC-2 formaron pequeños agregados celulares irregulares. En presencia de 20 ng/ml de HGF recombinante humano produjeron, después de 3 días, largos tubos ramificados. En marcado contraste, la adición conjunta del péptido 1 y HGF a los cultivos anulaba la elongación y ramificación de estructuras tubulares. Un análisis cuantitativo de la formación de tubos demostró que los péptidos 1, 2 y 3 anulaban significativamente (p< 0,0001) la elongación inducida por HGF de tubos epiteliales, de un modo dependiente de la dosis, un efecto inhibidor submáximo ya observado con 30 nM del inhibidor y un efecto máximo con 3 mM, mientras que el péptido 4 de baja afinidad de unión presentaba un efecto detectable a estas concentraciones (Fig. 5 y datos no mostrados).

Se evaluó el efecto del péptido 1 sobre la respuesta quimiocinética de células microvasculares humanas inmortalizadas (HMEC-1) y células endoteliales primarias de la vena umbilical humanas a factores angiogénicos. Se observó que este compuesto (300 nM) no alteraba de forma significativa los niveles basales de la motilidad de las células endoteliales (Fig. 6A-B, barras no sombreadas). No obstante, prácticamente revirtió a los niveles basales el incremento de 5,5 y 3,5 veces la motilidad celular inducida por 20 ng/ml de HGF sobre las células HMEC-1 y HUVEC, respectivamente. Es interesante el hecho de que esta actividad inhibidora no parece limitada a la estimulación por el HGF, como queda demostrado por el bloqueo completo de la migración de células HUVEC inducida por bFGF producido por el péptido 1 a 300 nM (Fig. 6A-B, barras sombreadas). Estos resultados sugieren que los inhibidores de Grb2 pueden prevenir la motilidad de las células endoteliales en respuesta a estímulos angiogénicos transmitidos por diferentes tirosinas quinasas receptoras.

Para evaluar si el bloqueo de la motilidad de las células endoteliales por los inhibidores de Grb2 podría correlacionar con una pérdida de la respuesta morfogenética a un factor angiogénico se usaron dos modelos alternativos de angiogénesis endotelial in vitro. En el primer modelo, las células endoteliales microvasculares se sembraron sobre la superficie de un gel de colágeno de tipo 1. Los cultivos sólo se trataron después de que habían alcanzado la confluencia (aproximadamente 1 semana después). Después de otra incubación de 5 días, las células HMEC-1 cultivadas en condiciones control habían invadido claramente la matriz de colágeno subyacente como células solitarias. La adición de 20 ng/ml de HGF a los cultivos indujo un incremento por seis de la invasión del colágeno por células solitarias o por cortos cordones de células desprovistos de lumen. La adición conjunta de péptido 1 (30-300 nM) y de HGF a los cultivos suprimió la invasión de colágeno inducida por HGF, una disminución significativa (p< 0,001) de la longitud total de los cordones presentes 20 \mum debajo de la superficie del gel que ya se está observando a una concentración de 30 \muM (Fig. 7). Por tanto, aunque el HGF no indujo la formación por las células HMEC-1 de estructuras de tipo capilar con lumen, su efecto estimulador sobre la invasión de la matriz, un proceso requerido durante la angiogénesis, se bloqueó en presencia del péptido 1, un antagonista de Grb2.

En el segundo modelo in vitro de angiogénesis, se sembraron células HUVEC sobre una capa de gel Matrigel e inmediatamente se trataron con HGF, HGF/NK1 o HGF/NK1 con péptido 1. En condiciones control, las células migraron a la superficie del gel, establecieron contacto entre sí y, tras 12-18 horas, formaron crestas o cordones de forma irregular, un proceso residual de las primeras etapas de la angiogénesis. La adición a los cultivos de 20-50 ng/ml de HGF (no se muestra) o de 300 ng/ml de HGF/NK1 tuvo como resultado la formación de una red continua y amplia de gruesos cordones. En contraste, la adición continua de HGF/NK1 y de péptido 1 (1 \muM) redujo de forma marcada la extensión de la formación del cordón. Un análisis cuantitativo de la longitud media de los cordones por campo óptico demostró un incremento significativo (p<00,001) del 300% inducido por HGF/NK1 (3217,0 \pm 166,5 \mum en cultivos tratados con HGF/NK1 frente a 1189,5 \pm 166 \mum en los controles) y una disminución significativa (p= 0,001) del 30% cuando se comparó la adición conjunta de péptido 1 y de HGF/NK1 con la adición de HGF/NK1 solo (3217,9 \pm 166,5 \mum en HGF/NK1 solo frente a 2502 \pm 108 \mum en HGF/NK1 + péptido 1). Similares resultados, aunque en menor grado, se observaron cuando el HGF o HGF/NK1 se sustituyó por 50 ng/ml de bFGF (datos no mostrados).

En conjunto, estos resultados demuestran que un péptido que posee actividad inhibidora de la señal celular y actividad inhibidora de la motilidad celular, es decir antagonistas del dominio Grb2 SH2, inhiben la formación de estructuras de tipo tubular ramificadas epiteliales y alteran los cordones endoteliales de tipo capilar inducidos por la isoforma de HGF HGF/NK1.

Para caracterizar más el efecto antiangiogénico de los antagonistas de Grb2, se evaluó el efecto sobre la migración de células microvasculares neonatales humanas (HMVE) en presencia o ausencia de concentraciones crecientes de HGF (0-50 ng/ml) o de bFGF (0,2-50 ng/ml) y el péptido 2 (300 nM). Se observó que el péptido 2 anulaba (p< 0,001) la migración celular inducida por HGF (Fig. 8A) e inhibía significativamente la actividad estimuladora bifásica del bFGF. Es importante el hecho de que el efecto de la concentración óptima de bFGF (5 ng/ml) se anuló en un 72%. (Fig. 8B). Se evaluó el efecto del péptido sobre la actividad de la molécula angiogénica más potente conocida hasta la fecha, a saber, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Cuando se incubaron en cámaras modificadas de Boyden en presencia de VEGF, las células HMEC-1, HMVE y HUVE sufrieron diferentes, aunque significativos, grados de migración (Fig. 9). No obstante, la adición del péptido 2 revirtió de forma significativa (p< 0,001) el efecto del VEGF en todas las líneas celulares, aunque el grado de inhibición de la actividad de VEGF difirió entre las líneas de células endoteliales. Se Observaron resultados similares con el antagonista 1 (fig. 9 y datos no mostrados). Estos resultados muestran que los inhibidores de Grb2 previenen la motilidad de las células endoteliales en respuesta a estímulos angiogénicos transmitidos a través de distintas vías angiogénicas y que esta actividad antagonista no está restringida a un solo tipo de célula endotelial.

Para determinar si el efecto de las moléculas endógenas proangiogénicas está restringida a la inhibición de factores angiogénicos endógenos o podría también revertir las moléculas proangiogénicas exógenas, se evaluó el efecto del péptido 2 sobre las propiedades migratorias de las células HUVE en presenta de acetato miristato de forbol (PMA), un potente estimulador tumoral. In vitro, tras la exposición a PMA, las células endoteliales tanto microvasculares como macrovasculares llevan a cabo un programa morfogenético vascular mediante la invasión de la matriz extracelular que las rodea y formando, posteriormente, una extensa red de estructuras tubulares de tipo capilar (Montesano y col., Cell, 42: 469-77 (1985) y referencias mencionadas en el mismo). La adición de PMA (40 ng/ml) a los cultivos de células HUVE en cámaras modificadas de Borden tuvo como resultado un incremento del 300% de la migración celular. Esta actividad proangiogénica, que no puede simularse con la concentración máxima (5 ng/ml) de bFGF, revirtió de forma espectacular a los niveles basales en presencia del péptido 2 a 300 nM (Fig. 10).

Se evaluó el efecto de los antagonistas de Grb2 sobre la inhibición de otras propiedades biológicas de las células endoteliales relevantes para el proceso de la angiogénesis. Para entender la actividad del péptido 2 durante la proliferación de células endoteliales inducidas por el factor de crecimiento, las células HUVE y HMVE se cultivaron en pocillos recubiertos con colágeno de tipo I en medio de cultivo endotelial (EBM) suplementado parcialmente, como se describe en Materiales y Métodos. en estas estrictas condiciones, el HGF (25 ng/ml), el VEGF (10 mg/ml) y el bFGF (5 ng/ml) indujeron un incremento significativo (p< 0,0001) en la proliferación celular, como pone de manifiesto la multiplicación por 2,3, 2 y 4, respectivamente, del número medio de células HUVE macrovasculares por ml. En células HMVE se observaron incrementos similares y significativos (p< 0,001) en el número de células (Fig. 12, barras no sombreadas). La adición del péptido 2 inhibidor de Grb2 (30 nM, 300 nM) tuvo como resultado una inhibición significativa, aunque marcadamente diferente, de la proliferación de células HUVE y HMVE. Aunque el péptido 2 inhibió la proliferación de células HUVE dependiente de suero (p< 0,001) y dependiente de bFGF (p< 0,0001) a concentraciones de 30 nM), no inhibió de forma significativa (p= 0,05) la proliferación inducida por VEGF-HGF a esta concentración (Fig. 12, barras grises). Sólo concentraciones mayores del compuesto (300 nM) pudieron inducir una reducción significativa (p< 0,0001) en el recuento celular (Fig. 12, barras negras). No obstante, el comportamiento de las células HMVE microvasculares fue espectacularmente diferente. Aunque básicamente resistentes (P= 0,02-0,05) a 30 nM del inhibidor tanto en presencia como en ausencia de factores de crecimiento, sólo se observó una inhibición altamente significativa (p<0,001) del crecimiento celular con una concentración de 300 nM del compuesto (Fig. 12, barras negras). Estos resultados demuestran que los inhibidores de Grb2 provocan diferentes efectos antagonistas sobre las vías de angiogénesis en función del tipo de célula endotelial y del factor de crecimiento.

El PDGF está implicado en diferentes procesos biológicos, tales como la remodelación vascular, la cicatrización de heridas y cáncer (para revisiones, véase Bornfeldt y col., Ann N y Acad Sci., 766: 416-30, 1995; Gendron, Surv. Ophthalmol., 44: 194-5, 1999). La adición de 50 ng/ml de PDGF-BB a fibroblastos NIH 3T3 incubados en una cámara modificada de Borden tiene como resultado un espectacular incremento por 20 de la migración celular. Cuando se añade simultáneamente a los cultivos, el péptido 2 antagonista de Grb2 inhibe la migración de las células NIH 3T3 de forma significativa (p< 0,001) y dependiente de la dosis, una reducción del 60% en el número medio de células por campo observándose ya a concentraciones tan bajas como de 30 nM y superiores (Fig. 11). Esta observación abre un potencial efecto terapéutico de los compuestos inhibidores de Grb2 en el tratamiento de enfermedades tales como cáncer, trastornos de la cicatrización de heridas, complicaciones vasculares de la diabetes mellitus, nefropatías vasculares y enfermedades con aparición de fibrosis.

Claims (19)

1. Uso de un compuesto que inhibe la actividad de señalización celular y la actividad de motilidad celular, para la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer, donde dicho cáncer se selecciona del grupo constituido por cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de tiroides, cáncer renal, sarcoma, glioblastoma, melanoma y metástasis de cáncer,

donde dicho constituido carece sustancialmente de citotoxicidad, y

posee la fórmula I:

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

en la que

n es de 0 a 15 y

PTI es un radical de fenilalanina que posee un anillo fenilo, un extremo amino y un extremo carboxilo, donde el anillo fenilo posee uno o más sustituyentes seleccionados del grupo constituido por formilo, carboxialquilo, dicarboxialquilo, dicarboxihaloalquilo y dicarboxihaloalquiloxi, donde la porción alquilo de los sustituyentes puede estar insustituida o sustituida con un sustituyente seleccionado del grupo constituido por halo, hidroxi, carboxilo, amino, aminoalquilo, alquilo, alcoxi y ceto; y

X es un resto unido al nitrógeno de PTI y se selecciona del grupo constituido por alquilcarbonilo, oxalilo, alquilaminocarbonilo, arilaminooxalilo, arilalquilaminooxalilo, alcoxioxalilo, carboxialquilo, carbonilo, heterociclil carbonilo, heterociclilalquil carbonilo, arilalquil heterociclilalquil carbonilo, ariloxicarbonilo y arilalcoxicarbonilo, donde las porciones arilo y alquilo de los sustituyentes pueden estar insustituidos o sustituidos con un sustituyente seleccionado del grupo constituido por halo, hidroxi, carboxilo, amino, aminoalquilo, alquilo, alcoxi y ceto; y la porción heterociclilo de Y contiene al menos 4 heteroátomos seleccionados del grupo constituido por O, N y S;

AA es un aminoácido, cuyo extremo amino está unido al extremo carboxilo de PTI; e

Y es un arilaquilamino o arilheterociclil alquilamino;

o una sal del mismo.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que PTI es un radical de fenilalanina que posee un anillo fenilo, un extremo amino y un extremo carboxilo, donde el anillo fenilo posee uno o más sustituyentes seleccionados del grupo constituido por formilo, carboxialquilo, dicarboxialquilo C_{1}-C_{6}, dicarboxihaloalquilo C_{1}-C_{6} y dicarboxihaloalquiloxi C_{1}-C_{6}, donde la porción alquilo de los sustituyentes puede estar insustituida o sustituida con un sustituyente seleccionado del grupo constituido por halo, hidroxi, carboxilo, amino, aminoalquilo, alquilo C_{1}-C_{6}, alcoxi C_{1}-C_{6} y ceto;

X es un resto unido al nitrógeno de PTI y se selecciona del grupo constituido por alquilcarbonilo C_{1}-C_{6}, oxalilo, alquilaminooxalilo C_{1}-C_{6}, arilaminooxalilo, arilalquilaminooxalilo C_{1}-C_{6}, alcoxioxalilo C_{1}-C_{6}, carboxialquilo C_{1}-C_{6} carbonilo, heterociclil carbonilo, heterociclilalquilo C_{1}-C_{6} carbonilo, arilalquiloC_{1}-C_{6} heterociclilalquilo C_{1}-C_{6} carbonilo, ariloxicarbonilo y arilalcoxicarbonilo C_{1}-C_{6}, donde las porciones arilo y alquilo de los sustituyentes pueden estar insustituidas o sustituidas por un sustituyente seleccionado del grupo constituido por halo, hidroxi, carboxilo, amino, aminoalquilo C_{1}-C_{6}, alquilo C_{1}-C_{6}, alcoxi C_{1}-C_{6} y ceto; y la porción heterociclilo de Y contiene al menos 4 heteroátomos seleccionados del grupo constituido por O, N y S;

AA es un aminoácido, cuyo extremo amino está unido al extremo carboxilo de PTI; e

Y es un arilaquilamino C_{1}-C_{6} o arilheterociclil alquilamino C_{1}-C_{6};

o una sal del mismo.

\newpage

3. El uso de la reivindicación 2, en el que PTI es de la fórmula II:

8

en la que D tiene la fórmula III o IV:

9

en la que

R_{3} y R_{4} pueden ser iguales o diferentes y se seleccionan del grupo constituido por hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, arilo, arilaquilo C_{1}-C_{6}, alcarilo C_{1}-C_{6}, y heteroarilo; y R_{5} y R_{6} pueden ser iguales o diferentes y se seleccionan del grupo constituido por hidrógeno, halo, hidroxi, amino y alcoxi C_{1}-C_{6}; y

E se selecciona del grupo constituido por hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, alquilcarbonilo C_{1}-C_{6}, carboxilo y alquilcarbonilo alquilo C_{1}-C_{6}.

4. El uso de la reivindicación 2 ó 3, en el que Y es aril alquilamino C_{1}-C_{6}.

5. El uso de la reivindicación 4, en el que la porción arilo de Y tiene la fórmula:

10

en la que Q_{1} es hidrógeno o un sustituyente seleccionado del grupo constituido por hidroxilo, halo, alquilo C_{1}-C_{6}, alcoxi C_{1}-C_{6}, amino y acialmino C_{1}-C_{6}.

6. El uso de la reivindicación 5, en el que la porción heterociclilo de Y tiene la fórmula:

11

en la que Q_{2} es s hidrógeno o un sustituyente seleccionado del grupo constituido por hidroxilo, halo, alquilo C_{1}-C_{6}, alcoxi C_{1}-C_{6}, amino y acialmino C_{1}-C_{6}, y F y G se seleccionan, de forma independiente, del grupo constituido por C, N, O y S.

7. El uso de las reivindicaciones 1-6, en el que X se selecciona del grupo constituido por acetilo, oxalilo, alquilaminooxalilo C_{1}-C_{6}, arilaminooxalilo, aril alquilaminooxalilo C_{1}-C_{6}, alcoxioxalilo C_{1}-C_{6}, carboximetilcarbonilo, tetrazolilcarbonilo, tetrazolilmetilcarbonilo, aminofenilmetoxicarbonilo, aminonaftiloxicarbonilo y metoxifenilmetil tetrazolilmetilcarbonilo.

8. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que n es 1-15.

9. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que n es 1-4.

10. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que n es 1-3.

11. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que dicho compuesto es (N-oxalil-4-malonil)-Phe-Ac_{6}c-Asn-NH-(3-naftalen-1-il-propil) o (N-acetil-4-malonil)-Phe-Ac_{6}c-Asn-NH-(3-naftalen-1-il-propil).

12. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que la motilidad celular contribuye a la invasión y metástasis.

13. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que la angiogénesis contribuye a la progresión de la enfermedad y la muerte.

14. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que el compuesto bloquea la invasión de la matriz celular estimulada por HGF o la tubulogénesis ramificada.

15. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el péptido bloquea la migración celular, la proliferación celular o la formación de estructuras capilares estimuladas por HGF, VEGF o bFGF.

16. Un procedimiento para inhibir la unión de un transductor intracelular a una proteína tirosina quinasa receptora que influye sobre la motilidad celular, que comprende poner en contacto in vitro (a) una muestra que contenga la proteína tirosina quinasa receptora, (b) el transductor intracelular y (c) el compuesto de la fórmula I

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en la que

n es de 0 a 15,

PTI es un radical de fenilalanina que posee un anillo fenilo, un extremo amino y un extremo carboxilo, donde el anillo fenilo posee uno o más sustituyentes seleccionados del grupo constituido por hidroxilo, formilo, carboxialquilo, dicarboxialquilo, dicarboxihaloalquilo y dicarboxihaloalquiloxi, donde la porción alquilo de los sustituyentes puede estar insustituida o sustituida con un sustituyente seleccionado del grupo constituido por halo, hidroxi, carboxilo, amino, aminoalquilo, alquilo, alcoxi y ceto; y

X es un resto unido al nitrógeno de PTI y se selecciona del grupo constituido por alquilcarbonilo, oxalilo, alquilaminooxalilo, arilaminooxalilo, arilalquilaminooxalilo, alcoxioxalilo, carboxialquilo carbonilo, heterociclil carbonilo, heterociclilalquil carbonilo, arilalquil heterociclilalquil carbonilo, ariloxicarbonilo y arilalcoxicarbonilo, donde las porciones arilo y alquilo de los sustituyentes pueden estar insustituidas o sustituidas con un sustituyente seleccionado del grupo constituido por halo, hidroxi, carboxilo, amino, aminoalquilo, alquilo, alcoxi y ceto; y la porción heterociclilo de Y contiene al menos 4 heteroátomos seleccionados del grupo constituido por O, N y S;

AA es un aminoácido, cuyo extremo amino está unido al extremo carboxilo de PTI; e

Y es un arilaquilamino o arilheterociclil alquilamino;

o una sal del mismo, en condiciones en las que, en ausencia del compuesto, la proteína tirosina quinasa receptora se une al transductor intracelular; en el que el contacto tiene como resultado la inhibición de la unión del transductor intracelular a la proteína tirosina quinasa

17. Un procedimiento para detectar la inhibición de la unión del transductor intracelular a la proteína tirosina quinasa receptor que influye sobre la motilidad celular, que comprende (a) poner en contacto una muestra in vitro que contenga la proteína tirosina quinasa receptor con el transductor intracelular y, por separado, en presencia y ausencia del compuesto de la fórmula I

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en la que

n es de 0 a 15,

PTI es un radical de fenilalanina que posee un anillo fenilo, un extremo amino y un extremo carboxilo, donde el anillo fenilo posee uno o más sustituyentes seleccionados del grupo constituido por hidroxilo, formilo, carboxialquilo, dicarboxialquilo, dicarboxihaloalquilo y dicarboxihaloalquiloxi, donde la porción alquilo de los sustituyentes puede estar insustituida o sustituida por un sustituyente seleccionado del grupo constituido por halo, hidroxi, carboxilo, amino y X es un resto unido al nitrógeno de PTI y se selecciona del grupo constituido por alquilcarbonilo, oxalilo, alquilaminooxalilo, arilaminooxalilo, arilalquilaminooxalilo, alcoxioxalilo, carboxialquil carbonilo, heterociclil carbonilo, heterociclilalquil carbonilo, arilalquil heterociclilalquil carbonilo, ariloxicarbonilo y arilalcoxicarbonilo, donde las porciones arilo y alquilo de los sustituyentes pueden estar insustituidas o sustituidas por un sustituyente seleccionado del grupo constituido por halo, hidroxi, carboxilo, amino, aminoalquilo, alquilo, alcoxi y ceto; y la porción heterociclilo de Y contiene al menos 4 heteroátomos seleccionados del grupo constituido por O, N y S;

AA es un aminoácido, cuyo extremo amino está unido al extremo carboxilo de PTI; e

Y es un arilaquilamino o arilheterociclil alquilamino; o una sal del mismo, en condiciones que permitan la unión de la proteína tirosina quinasa receptora y el transductor intracelular en ausencia del compuesto; (b) determinar que se ha producido la unión entre la proteína tirosina quinasa receptora y el transductor intracelular; y (c) comparar los niveles de unión relativos de la proteína tirosina quinasa receptora y el transductor intracelular en presencia y ausencia del compuesto de fórmula I.

18. El procedimiento de la reivindicación 14 ó 15, en el que n es de 1 a 15.

19. El procedimiento de la reivindicación 14 ó 15, en el que n es de 1 a 4.