ES2327982T3 - Inhibidores de la invasion para su utilizacion en la cicatrizacion de heridas y cancer. - Google Patents
Inhibidores de la invasion para su utilizacion en la cicatrizacion de heridas y cancer. Download PDFInfo
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Abstract
SE DESCRIBEN COMPUESTOS QUE PROMUEVEN LA CICATRIZACION DE HERIDAS Y LA INHIBICION DEL CANCER. ESPECIFICAMENTE SE PRESENTAN AGENTES TERAPEUTICOS QUE A) PROMUEVEN LA CICATRIZACION DE HERIDAS, O B) EXHIBEN PROPIEDADES ANTIMETASTATICAS Y ANTICRECIMIENTO. ADEMAS, SE SUMINISTRAN ENSAYOS DE SELECCION PARA IDENTIFICAR AGENTES TERAPEUTICOS ADICIONALES. LA FIGURA MUESTRA ESQUEMATICAMENTE EL MODO DE REALIZACION DEL SUBSTRATO UTILIZADO DE ACUERDO CON LA INVENCION PARA LA VERIFICACION DE CELULAS TUMORALES.
Description
Inhibidores de la invasión para su utilización
en la cicatrización de heridas y cáncer.
La presente invención se refiere a péptidos
inhibidores de la invasión para su utilización en el tratamiento del
cáncer.
El término "quimioterapia" significa
simplemente el tratamiento de enfermedades con sustancias químicas.
El padre de la quimioterapia, Paul Ehrlrich, imaginaba el agente
quimioterapéutico perfecto como una "bala mágica"; dicho
componente mataría a los organismos invasores sin dañar al huésped.
Esta especificidad esperada se busca en todos las clases de agentes
quimioterapéuticos, incluyendo los agentes anticáncer.
Sin embargo, la especificidad ha sido el mayor
problema con los agentes anticáncer. En el caso de agentes
anticáncer, el fármaco debe distinguir entre células huésped que son
cancerosas y células huésped que no son cancerosas. La vasta
mayoría de los fármacos anticáncer no discrimina en este nivel.
Generalmente, los agentes anticáncer tienen efectos hematológicos
negativos (por ejemplo, cese de mitosis y desintegración de
elementos formados en tejidos de la médula y linfoides), y acción
inmunosupresora (por ejemplo, disminución del conteo de células),
así como también un fuerte impacto en los tejidos epiteliales (por
ejemplo, en la mucosa intestinal), los tejidos reproductivos (por
ejemplo, deterioro de la espermatogénesis) y el sistema nervioso. P.
Calabresi y B. A. Chabner, en: Goodman y Gilman, The
Pharmacological Basis of Therapeutics (Pergamon Press, 8ª edición)
(pp. 1209-1216).
El éxito de los agentes quimioterapéuticos como
agentes anticáncer ha sido obstaculizado por el fenómeno de
múltiple resistencia a los fármacos, resistencia a una amplia gama
de componentes anticáncer citotóxicos no relacionados
estructuralmente. J.H. Gerlach et al., Cancer Surveys,
5:25-46 (1986). La causa subyacente de la
progresiva resistencia a los fármacos puede deberse a una pequeña
población de células resistentes a los fármacos dentro del tumor
(por ejemplo, células mutantes) en el momento del diagnóstico. J. H.
Goldie y Andrew J. Coldman. Cancer Research,
44:3643-3653 (1984). Tratar dicho tumor con una
única fármaco resulta primero en remisión, cuando el tamaño del
tumor se reduce como resultado de la destrucción de las células
sensibles a los fármacos predominantes. Sin las células sensibles a
los fármacos, las células resistentes a los fármacos que permanecen
continúan multiplicándose y finalmente dominan la población de
células del tumor.
El documento WO 92/09200 revela polipéptidos
para promover la unión de células. Los polipéptidos derivan de la
fibronectina humana y pueden enlazarse con la integrina
GPIIb-IIIa en plaquetas humanas.
Akiyama S.K., Hum. Cell 1996, Vol. 9,
181-186 analiza las diversas integrinas que
participan en la adhesión celular. Se revela que los motivos
peptídicos PHSRN y RGD actúan sinergísticamente en el enlace de la
integrina \alpha_{5}\beta_{1} con la fibronectina.
Finalmente, el tratamiento del cáncer ha sido
obstaculizado por el hecho de que hay una heterogeneidad
considerable incluso dentro de una clase de cáncer. Algunos
cánceres, por ejemplo, tienen la capacidad de invadir tejidos y
manifestar un curso agresivo de crecimiento caracterizado por
metástasis. Estos tumores generalmente se asocian con consecuencias
negativas para el paciente. Sin embargo, sin un mecanismo para
identificar dichos tumores y distinguirlos del cáncer no invasivo,
el médico no puede encontrar la forma de cambiar y/u optimizar la
terapia.
Lo que se necesita es un abordaje anticáncer
específico que sea seguro para una amplia variedad de clases de
tumores y particularmente apropiado para tumores invasivos. Es
importante que el tratamiento sea efectivo con toxicidad mínima para
el huésped.
La presente invención se define en las
reivindicaciones y se refiere a péptidos inhibidores de la invasión
para su utilización en el tratamiento del cáncer.
En una realización, la presente invención
proporciona péptidos inhibidores de la invasión para tratar el
cáncer.
Finalmente, la presente invención contempla
péptidos inhibidores de la invasión para tratar tumores invasivos.
Específicamente, se contemplan una variedad de agentes
quimioterapéuticos antiinvasivos para antagonizar la actividad
promotora de la invasión del péptido PHSRN. En la realización
preferida, el inhibidor de la invasión o "agente antiinvasivo"
es un péptido con la secuencia de aminoácidos PHSCN (seq. ID No. 2).
En otra realización, el agente antiinvasivo es un péptido inhibidor
de la invasión que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende
PHSXN, en donde X es un aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en homocisteína y el isómero D de
cisteína.
cisteína.
\newpage
La presente invención también contempla un
agente antiinvasivo (por ejemplo, un péptido inhibidor de la
invasión) que comprende una secuencia de aminoácidos
X_{1}HSX_{2}N, en la que X_{1} es prolina y X_{2} es un
aminoácido seleccionado del grupo que consiste en el isómero L de
cisteína, el isómero D de cisteína y homocisteína. En la realización
preferida, el péptido es PHSCN, en donde la cisteína es el isómero L
o el isómero D.
También se contempla que los agentes
antiinvasivos mencionados anteriormente comprendan la secuencia de
aminoácidos mencionada y aminoácidos adicionales que se agregan al
extremo amino terminal, al extremo carboxilo terminal o a los
extremos amino y carboxilo terminales. En una realización, el agente
antiinvasivo tiene hasta quinientos aminoácidos de largo, y más
preferentemente entre cuatrocientos y quinientos aminoácidos, y aun
más preferentemente entre seiscientos y cien aminoácidos. También
se contempla que, en algunas realizaciones, los agentes
antiinvasivos mencionados anteriormente comprendan un péptido con
el extremo amino terminal bloqueado por métodos estándar para
prevenir la digestión por exopeptidasas, por ejemplo por
acetilación; y el extremo carboxilo terminal bloqueado por métodos
estándar para prevenir la digestión por exopéptidasas, por ejemplo
por amidación. Además, se contempla que, en algunas realizaciones,
los agentes antiinvasivos mencionados anteriormente comprendan un
péptido que tenga uno o más aminoácidos L reemplazados por sus
isómeros D para prevenir la digestión por endoproteinasas.
A este respecto, la presente invención
proporciona péptidos inhibidores de la invasión para su utilización
en el tratamiento del cáncer que comprenden: una composición de
materia que comprende un péptido de la reivindicación 1 que inhibe
la actividad promotora de la invasión tumoral de la secuencia de
PHSRN de fibronectina de plasma. La presente invención contempla
además la utilización de los antagonistas de la reivindicación 1
antes y/o después de la extracción quirúrgica del tumor primario.
En una realización, el método comprende al antagonista de PHSRN de
la reivindicación 1 como terapia adjunta con agentes
quimioterapéuticos adicionales.
Aunque sin limitarse a ningún mecanismo, se cree
que estos agentes quiomioterapéuticos antiinvasivos antagonizan la
actividad promotora de la invasión de la secuencia de PHSRN (por
ejemplo, de fibronectina) bloqueando el enlace de esta secuencia
con su receptor en las células tumorales. También sin limitarse a
ningún mecanismo, se cree que la secuencia de PHSRN puede promover
la invasión actuando para desplazar un catión divalente (Mg+.2,
Ca+2 o Mn+) en el receptor \alpha_{5}\beta_{1} en células
tumorales metastásicas y los agentes antiinvasivos
quimioterapéuticos mencionados anteriormente pueden actuar para
inhibir esta invasión mediante la quelación de uno o más de estos
cationes divalentes.
La Figura 1 muestra esquemáticamente la
realización del sustrato utilizado de acuerdo con la presente
invención para evaluar células tumorales. Se muestra la relación
espacial del ectodermo del embrión Stronglyocentrotus
purpuratus con su matriz extracelular y con estructuras
blastocelares (s, espículos; h, capa hialina; e, ectodermo; b,
membrana basal subectodermal; bl, blastocelo; g, estómago del
intestino primitivo; c, sacos celómicos). El esófago y el intestino
no aparecen en el lado del embrión que se muestra.
La Figura 5A es un gráfico que muestra los
resultados de la inhibición de la invasión de células de cáncer de
mama humano inducida por suero del sustrato de la
SU-ECM con diversas concentraciones de los péptidos
PHSCN.
La Figura 5B es un gráfico que muestra los
resultados de la inhibición de la invasión de células de cáncer de
mama humano y células humanas epiteliales mamarias normales inducida
por PHSRN del sustrato de la SU-ECM con diversas
concentraciones del péptido PHSCN.
La Figura 6A es un gráfico que muestra los
resultados de la inhibición de la invasión de células de cáncer de
próstata humano inducida por suero del sustrato de la
SU-ECM con diversas concentraciones del péptido
PHSCN.
La Figura 6B es un gráfico que muestra los
resultados de la inhibición de la invasión de células de cáncer de
próstata humano y células normales epiteliales de próstata inducida
por PHSRN del sustrato de la SU-ECM con diversas
concentraciones del péptido PHSCN.
La Figura 7A es un gráfico que muestra los
resultados de la prueba de la invasión de células de cáncer de
próstata de rata inducida por suero del sustrato de la
SU-ECM con y sin péptido PHSCN.
La Figura 7B es un gráfico que muestra los
resultados de la inhibición de la invasión de células de cáncer de
próstata de rata inducida por PHSRN del sustrato de la
SU-ECM con diversas concentraciones del péptido
PHSCN.
La Figura 8 es un gráfico que muestra los
resultados de la inhibición de la invasión de células de cáncer de
próstata de rata inducida por suero del sustrato de la
SU-ECM con diversas concentraciones del péptido
PHS(homo)CN.
La Figura 9A es un gráfico que muestra los
resultados de la prueba del crecimiento del tumor en ratas a las que
se les inyectan células de cáncer de próstata, recibiendo la mitad
de las ratas tratamiento con el péptido PHSCN iniciado junto con la
inyección inicial.
La Figura 9B es un gráfico que muestra los
resultados de la determinación de la cantidad promedio de metástasis
de pulmón en los dos grupos de ratas que se describen en la Figura
9A.
La Figura 10A es un gráfico que muestra los
resultados de la prueba del crecimiento del tumor en ratas a las que
se les inyectan células de cáncer de próstata, recibiendo la mitad
de las ratas tratamiento con el péptido PHSCN iniciado 24 horas
después de la inyección inicial de células cancerosas.
La Figura 10B es un gráfico que muestra los
resultados de la determinación de la cantidad promedio de metástasis
de pulmón en los dos grupos de ratas que se describen en la Figura
10A.
La Figura 10C es un gráfico que muestra los
resultados de la determinación de la masa promedio de tejidos
metástasicos intraperitoneales en los dos grupos de ratas que se
describen en la Figura 10A.
La Figura 11 es un gráfico que muestra los
resultados de la inhibición de la invasión de células humanas de
cáncer inducida por suero con diversas concentraciones del péptido
PHSCN, así como también el péptido PHSCN químicamente modificado con
grupos protectores y péptido PHSCN, en donde un aminoácido L ha sido
reemplazado por el isómero D.
La Figura 12 es un gráfico que muestra los
resultados de la inhibición de la invasión de células humanas
cancerosas inducida por suero con diversas concentraciones de
componentes no peptídicos en comparación con el péptido PHSCN, así
como también péptido PHSCN químicamente modificado con grupos
protectores y péptido PHSCN, en donde un aminoácido L fue
reemplazado por el isómero D.
La Figura 13 es un esquema que muestra
relaciones estructurales entre el PHSCN y los componentes no
peptídicos de la Figura 12.
El término "fármaco", como se utiliza en la
presente, hace referencia a cualquier sustancia medicinal utilizada
en humanos u otros animales. Esta definición incluye análogos
compuestos, productos farmacéuticos naturales, sintéticos y
recombinantes, hormonas, antimicrobiales, neurotransmisores,
etc.
La frase "agente inductor" hace referencia
a cualquier compuesto o molécula que es capaz de causar (directa o
indirectamente) la invasión de células en un sustrato. De este modo,
los agentes inductores de la invasión se definen funcionalmente.
Esta función puede ser fácilmente evaluada utilizando los sustratos
y ensayos de la invasión de la presente invención (que se describen
más adelante). "Agentes inductores" incluyen, a modo no
taxativo, péptidos que contienen PHSRN y péptidos relacionados (ver
más adelante).
El término "receptores" hace referencia a
estructuras expresadas por células y que reorganizan moléculas de
enlace (por ejemplo ligandos).
El término "antagonista" hace referencia a
moléculas o compuestos que inhiben la acción de un compuesto
"nativo" o "natural" (como la fibronectina). Los
antagonistas pueden o no ser homólogos a estos compuestos naturales
en cuanto a la conformación, carga y otras características. De este
modo, los antagonistas pueden ser reconocidos por los mismos
receptores que son reconocidos por el compuesto natural o por otros
distintos. "Antagonistas" incluyen, a modo no taxativo,
péptidos que contienen PHSCN y péptidos relacionados (ver más
adelante).
La frase "célula huésped" o "célula"
hace referencia a cualquier célula que se utiliza en cualquiera de
los ensayos de detección sistemática de la presente invención.
"Célula huésped" o "célula" también hacen referencia a
cualquier célula que naturalmente exprese receptores de interés
particulares o esté genéticamente alterada de forma tal que
produzca estos receptores normales o mutados. Las células pueden ser
transfectadas con ácido nucleico que codifica un gen de interés (es
decir, un gen que codifica una proteína particular, incluyendo, a
modo no taxativo, proteínas que son terapéuticas). Los péptidos de
la presente invención son útiles para facilitar y mejorar el proceso
de introducción de ácido nucleico en células.
La frase "agente quimioterapéutico" hace
referencia a moléculas o compuestos que inhiben el crecimiento o
metástasis de tumores. "Agentes quimioterapéuticos" incluyen, a
modo no taxativo, péptidos que contienen PHSCN y péptidos
relacionados (ver más adelante).
La presente invención también contempla
homocisteína que se identifica como "hC".
El término "herida" hace referencia, en
líneas generales, a lesiones en la piel o tejido subcutáneo
producidas de diferentes formas (por ejemplo, úlceras de presión a
partir de un prolongado reposo en cama y heridas inducidas por
traumatismos) y con diversas características. Las heridas pueden
clasificarse en uno de cuatro grados dependiendo de la profundidad
de la herida: i) Grado I: heridas limitadas al epitelio; ii) Grado
II: heridas que se extienden dentro de la dermis; iii) Grado III:
heridas que se extienden dentro del tejido subcutáneo; y iv) Grado
IV (o heridas de espesor total): heridas en donde los huesos están
expuestos (por ejemplo, un punto de presión de huesos como el
trocánter mayor o el sacro). El término "herida de espesor
parcial" hace referencia a heridas que abarcan los Grados de I a
III; los ejemplos de heridas de espesor parcial incluyen heridas
leves, úlceras de presión, úlceras de insuficiencia venosa y úlceras
diabéticas. El término "herida profunda" incluye las heridas
de los Grados III y IV. La presente invención contempla el
tratamiento de toda clase de heridas, incluyendo las heridas
profundas y las heridas crónicas.
La frase "herida crónica" hace referencia a
una herida que no se ha curado en 30 días.
La frase "posicionar el soporte sólido en o
sobre la herida" pretende significar poner en contacto alguna
parte de la herida con el soporte sólido.
Las frases "promover la cicatrización de la
herida", "mejorar la cicatrización de la herida" y similares
hacen referencia a la inducción de la formación de tejido de
granulación de contracción de heridas y/o a la inducción de
epitelialización (es decir, la generación de nuevas células en el
epitelio). La cicatrización de heridas se mide convenientemente
reduciendo el área de la herida.
La frase "contenidos fluidos de la herida"
hace referencia a líquido asociado con una herida así como también a
células, factores celulares, iones, material macromolecular y
proteico, suspendidos en el lugar de la herida.
El término "sujeto" hace referencia a
humanos y animales.
Los términos "receptáculo",
"compartimiento" y similares hacen referencia, en líneas
generales, a cualquier recipiente capaz de encerrar un soporte
sólido en un lugar definido.
La frase "soporte sólido" hace referencia,
en líneas generales, a cualquier soporte, incluyendo, a modo no
taxativo, partículas microportadoras, geles,
Band-Aids^{TM} y apósitos.
El término "apósito" hace referencia, en
líneas generales, a cualquier material aplicado a una herida para
su protección, absorción, drenaje, etc. De este modo, los materiales
adsorbentes y absorbentes están específicamente contemplados como
un soporte sólido. Numerosas clases de apósitos están disponibles
comercialmente, incluyendo películas (por ejemplo, películas de
poliuretano), hidrocoloides (partículas coloidales hidrofílicas
enlazadas con espuma de poliuretano), hidrogeles (polímeros
entrecruzados que contienen aproximadamente un 60% de agua),
espumas (hidrofílicas o hidrofóbicas), alginatos de calcio
(compuestos no tejidos de fibras a partir de alginato de calcio) y
celofán (celulosa con un plastificante) [Kannon y Garret, Dermatol.
Surg. 21:583-590 (1995); Davies, Burns 10:91
(1983)]. La presente invención contempla específicamente el uso de
apósitos impregnados con los compuestos de la presente invención
que mejoran y promueven la cicatrización de heridas.
El término "biocompatible" significa que
hay un efecto mínimo (es decir, no se observa una diferencia
significativa en comparación con un control) en los alrededores, si
lo hay. Por ejemplo, en algunas realizaciones de la presente
invención, el apósito comprende una membrana biocompatible.
La frase "péptido derivado de fibronectina"
significa un péptido que es más pequeño que la proteína de
fibronectina intacta pero que tiene una secuencia idéntica (o al
menos un 90% idéntica) a una porción de la secuencia de
fibronectina natural. Por ejemplo, el péptido PHSRN tiene una
secuencia que existe en una porción de la fibronectina natural; el
péptido PHSCN, si bien no existe como una porción de la secuencia
natural, es por su definición un péptido derivado de fibronectina.
Generalmente, el péptido será de entre cuatrocientos y cien
aminoácidos (a pesar de que son posibles fragmentos más grandes de
fibronectina, incluyendo, a modo no taxativo, fragmentos en donde
secuencias de aminoácidos de no fibronectina adicionales han sido
agregados al péptido). Un péptido derivado de fibronectina
preferido es aquel que carece de motivo RGD de fibronectina. Incluso
en otra realización, dicho péptido carece de motivo que enlaza al
receptor \alpha_{5}\beta_{1}.
La frase "derivado peptídico" hace
referencia a un compuesto que tiene un grupo imino (-NH-) y más
particularmente a un enlace peptídico. Los péptidos pueden
considerarse amidas sustituidas. Al igual que el grupo amida, el
enlace peptídico muestra un alto grado de estabilización de
resonancia. El enlace único C-N en el enlace
peptídico generalmente tiene aproximadamentel 40 por ciento de
carácter de enlace doble y el enlace doble C=O aproximadamentel 40
por ciento de carácter de enlace único. Los derivados peptídicos
incluyen (a modo no taxativo) "análogos peptídicos" que están
definidos aquí como compuestos que se pueden incorporar en cadenas
polipeptídicas, en lugar de los correspondientes aminoácidos
naturales, por las enzimas naturales (es decir, incorporadas por
aminoacil-ARNt sintetasas). Ejemplos de dichos
análogos incluyen p-fluorofenilalanina (un análogo
de fenilalanina) y etionina y norleucina (análogos de
metionina).
"Grupos protectores" son aquellos grupos
que evitan reacciones no deseadas (como proteólisis) que implican
grupos funcionales desprotegidos. En una realización, la presente
invención contempla que el grupo protector es un acilo o una amida.
En una realización, el acilo es acetato. En otra realización, el
grupo protector es un grupo bencilo. En otra realización, el grupo
protector es un grupo benzoilo. La presente invención también
contempla combinaciones de dichos grupos protectores.
El término
"Band-Aid^{TM}" indica una tira adhesiva
relativamente pequeña que comprende una almohadilla absorbente (por
ejemplo, una almohadilla de gasa) para cubrir heridas menores.
La presente invención se define en las
reivindicaciones y proporciona péptidos inhibidores de la invasión
para su utilización en el tratamiento del cáncer.
Como preludio de metástasis, se cree que las
células cancerosas alteran proteolíticamente las membranas basales
subyacentes a los revestimientos epiteliales o endoteliales de los
vasos sanguíneos y linfáticos, invaden a través de los defectos
creados por proteólisis y entran a los sistemas circulatorio y
linfático para colonizar sitios distantes. Durante este proceso, la
secreción de enzimas proteolíticas se asocia con una motilidad
celular mayor y adhesión alterada. Tras colonizar sitios distantes,
las celulosas tumorales metastásicas proliferan para establecer
nódulos metastásicos.
Como se indicó anteriormente, los agentes
quimioterapéuticos actualmente se emplean para reducir el
crecimiento no restringido de células cancerosas, ya sea antes de
la extracción quirúrgica del tumor (terapia neoadyuvante) o después
de la cirugía (terapia adyuvante). Sin embargo, ninguno de estos
métodos ha resultado ser curativo una vez que se ha producido la
metástasis. Dado que el comportamiento invasivo no restringido es
también una señal de células tumorales metastásicas, se necesitan
métodos para inhibir directamente la invasión de células tumorales y
la metástasis.
Para descubrir cómo inhibir el comportamiento
invasivo de células tumorales para intervenir en la cascada
metastásica es necesario, en primer lugar, desarrollar ensayos con
los cuales evaluar la invasión de células tumorales in
vitro. Se contemplan dos sistemas de ensayos para utilizar en el
método de la presente invención para evaluar la invasión de células
tumorales.
En un sistema de ensayos, la presente invención
contempla el uso de sustratos de fibronectina reducida. Estos son
sustratos que originalmente contienen fibronectina y que son
tratados de acuerdo con los métodos de la presente invención (ver
más adelante) para eliminar fibronectina. No se pretende que la
presente invención esté limitada por la naturaleza del sustrato
original; dichos sustratos que contienen fibronectina, apropiados
para tratamiento y depleción, incluyen: i) sustratos complejos que
contienen una variedad de proteínas extracelulares y ii) sustratos
menos complejos que contienen fibronectina y una o dos proteínas más
(por ejemplo, colágeno, laminina, etc.).
No se pretende tampoco que la presente invención
esté limitada por la cantidad exacta de fibronectina que permanece
luego de que el sustrato ha sido tratado. En otras palabras, si bien
los métodos de la presente invención eliminan fibronectina, y en
algunas realizaciones reducen considerablemente toda la
fibronectina, es dentro del significado del término sustrato de
"fibronectina reducida" que permanece una pequeña cantidad en
el sustrato.
En una realización, la presente invención
contempla la utilización de una matriz extracelular disponible
comercialmente. Por ejemplo, la presente invención contempla el
tratamiento de matrices de membranas basales como ECM GEL, una
matriz de sarcoma de ratón (disponible comercialmente en Sigma, St.
Louis, Mo). Sin embargo, no se pretende que la presente invención
esté limitada por el sustrato particular que contiene fibronectina.
Por ejemplo, se contemplan otros sustratos disponibles
comercialmente, como el sustrato Matrigel comúnmente utilizado
(disponible en Becton Dickinson Labware, Nº de Catálogo 40234);
Matrigel puede ser tratado apropiadamente de acuerdo con los
métodos de la presente invención para transformarlo en un sustrato
de "fibronectina reducida" (ver más adelante). El Matrigel no
tratado (y sustratos similares) ha sido utilizado para demostrar la
importancia de las proteasas y los factores de motilidad en la
invasión y metástasis de muchos tumores. Sin embargo, estos
sustratos de la invasión no están disponibles como sustratos libres
de suero. De este modo, la regulación del comportamiento invasivo
de las células tumorales por parte de componentes de suero, como la
fibronectina de plasma, es un factor que complica con el Matrigel no
tratado.
Por lo tanto, la presente invención contempla un
sustrato libre de fibronectina. En esta realización el Matrigel es
tratado de forma tal que queda considerablemente libre de
fibronectina. La preparación de Matrigel libre de fibronectina
implica "seleccionar" el sustrato Matrigel en gelatina y
"seleccionar" el sustrato en un anticuerpo antifibronectina
(anti-IgG de fibronectina humana comercialmente
disponible, como por ejemplo anticuerpos de Promega Corporation,
Madison, Wisconsin).
En otra realización, la presente invención
contempla los sustratos que están naturalmente libres de
fibronectina; dicha fuente proporciona, por ejemplo, membranas
basales permeables para seleccionar clases de células normalmente
invasivas, estando dichas membranas naturalmente libres de suero. En
una realización, la presente invención contempla los erizos de mar
como una fuente de dichas membranas. A este respecto, el ectodermo
de embriones de erizos de mar tiene el espesor de una célula y
secreta una membrana basal subyacente (ver Figura 1) muy similar a
la de los mamíferos. Estos embriones no contienen sistema
circulatorio ni linfático y, por lo tanto, sus membranas basales
están libres de suero. En embriones, la membrana basal
sub-ectodérmica funciona simultáneamente como un
sustrato de migración para varias clases de células
mesenquimalesespecíficas, mientras que funciona como un sustrato de
la invasión para otras. Las membranas basales de embriones de erizos
marinos (SU-ECM) pueden prepararse por medio de un
tratamiento con detergente suave, como se describe en D. Livant
et al., Cancer Research 55:5085 (1995) y en la sección
experimental que se describe más adelante.
Independientemente de cuál de las dos clases de
sustratos se emplea, los sustratos de la invasión de la presente
invención son fáciles de preparar y dan resultados rápidos y muy
consistentes con una variedad de células que incluyen: a) líneas
celulares a partir de: i) tumores primarios y metastásicos, y ii)
tejidos epiteliales normales; así como también b) células de
muestras de tejido primario de ambos tumores, sus tejidos normales
circundantes, y melanocitos neonatales, fibroblastos y
queratinocitos de tejido circuncidado.
En este ensayo de detección sistemática de
fármacos se agregan inhibidores de fármacos candidatos al cultivo
del tejido (esto puede hacerse individualmente o en mezclas). Cuando
se encuentra que la célula tumoral inducible está inhibida de
invadir el sustrato, se indica un inhibidor de fármaco (ver la
sección de Ejemplos que se describe más adelante utilizando el
péptido PHSCN).
Si bien no es necesaria una comprensión de los
mecanismos que implica el cáncer metastásico para poner en práctica
exitosamente la presente invención, se cree que la invasión de
células tumorales de membranas basales ocurre en varios puntos de
la cascada metastásica: (1) cuando células tumorales epiteliales
(como por ejemplo las células de los cánceres de mama y de
próstata) salen del epitelio e ingresan en el estroma; (2) cuando
células tumorales ingresan en el sistema circulatorio o linfático, y
(3) cuando células tumorales salen del sistema circulatorio o
linfático para invadir sitios distantes. De este modo, se contempla
la intervención en la inducción de la invasividad de células
tumorales utilizando un antagonista de PHSRN, como por ejemplo el
péptido PHSCN, para bloquear receptores de células tumorales para
esta secuencia, como un método para reducir el índice de
metástasis.
Una ventaja de esta estrategia es que los
leucocitos son las únicas células normales que se conocen que
invaden tejidos de forma rutinaria para llevar a cabo sus funciones
y relativamente pocos leucocitos son invasivos en determinado
momento. De este modo, se requieren dosis relativamente pequeñas de
un antagonista antiinvasión que bloquee el enlace de PHSRN con su
receptor. Además, aparte de cierta inmunodepresión, debería haber
relativamente pocos efectos secundarios asociados con un
tratamiento antimetastásico utilizando compuestos diseñados para
bloquear la inducción de la invasión. La falta de efectos
secundarios debilitadores que se esperan de una terapia
antiinvasiva significa que utilizarla en combinación con agentes
antiproliferativos no sería complicado y que podría utilizarse
antes de la cirugía o incluso profilácticamente para bloquear la
invasión de células tumorales y la metástasis.
Se sabe que la secuencia IKVAV de laminina, una
proteína insoluble prevalente de la matriz extracelular, estimula
la colonización del hígado por parte de células humanas de cáncer de
colon en ratones atímicos [ver Bresalier et al., Cancer
Research 55: 2476 (1995)]. Dado que la IKVAV, como PHRSN, contiene
un aminoácido básico (K) que en virtud de su carga positiva puede
también funcionar para desplazar un catión divalente de su receptor
de integrina y estimular la invasión, la presente invención
contempla la aplicación de la estrategia de desarrollo de
antagonistas antiinvasión a la secuencia IKVAV de laminina.
\vskip1.000000\baselineskip
Se contemplan una variedad de péptidos
antiinvasivos para antagonizar la actividad promotora de la invasión
de la secuencia de PHSRN, como se define en las
reivindicaciones.
En la realización preferida, el agente
antiinvasivo es un péptido con la secuencia de aminoácidos
PHSCN.
En otra realización, el agente antiinvasivo es
un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende
PHSXN, en donde X es un aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en homocisteína y el isómero D de cisteína.
La presente invención también contempla un
agente antiinvasivo que comprende la secuencia de aminoácidos
X_{1}HSX_{2}N, en donde X_{1} es prolina y X_{2} es un
aminoácido seleccionado del grupo que consiste en el isómero L de
cisteína, el isómero D de cisteína y homocisteína.
También se contempla que, en algunas
realizaciones, los agentes antiinvasivos mencionados anteriormente
comprenden la secuencia de aminoácidos mencionada y aminoácidos
adicionales que se agregan al extremo amino terminal, al extremo
carboxilo terminal o a los extremos amino y carboxilo terminales (en
la forma establecida anteriormente para los péptidos que contienen
PHSRN, por ejemplo PHSRNSIT). En una realización, el agente
antiinvasivo tiene hasta quinientos aminoácidos de largo. También
se contempla que, en algunas realizaciones, los agentes
antiinvasivos mencionados anteriormente comprendan un péptido con
el extremo amino terminal bloqueado por métodos estándar para
prevenir la digestión por exopeptidasas, por ejemplo por
acetilación; y el extremo carboxilo terminal bloqueado por métodos
estándar para prevenir la digestión por exopeptidasas, por ejemplo
por amidación.
A este respecto, la presente invención
proporciona péptidos inhibidores de la invasión para su utilización
en el tratamiento del cáncer, que comprenden: una composición de
materia que comprende un péptido, como se define en la
reivindicación 1, que inhibe la actividad promotora de la invasión
tumoral de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos
PHSRN.
La presente invención contempla también el uso
de antagonistas, como se define en la reivindicación 1, antes y/o
después de la extracción quirúrgica del tumor primario. En una
realización, el método comprende el uso de un antagonista PHSRN,
como se define en la reivindicación 1, como terapia adjunta con
agentes quimioterapéuticos adicionales.
Si bien no se limitan a ningún mecanismo, se
cree que estos agentes quimioterapéuticos antiinvasivos antagonizan
la actividad promotora de la invasión de la secuencia de PHSRN (por
ejemplo, fibronectina) mediante el bloqueo del enlace de esta
secuencia con su receptor en células tumorales. También sin
limitarse a ningún mecanismo, se cree que la secuencia de PHSRN
puede promover la invasión actuando para desplazar un catión
divalente (Mg+2, Ca+2 o Mn+) en el receptor \alpha5\beta1 en
células tumorales metastásicas, y los agentes antiinvasivos
quimioterapéuticos mencionados anteriormente pueden actuar para
inhibir esta invención quelando a uno o más de estos cationes
divalentes.
Los compuestos que imitan la conformación
necesaria para el reconocimiento y anclaje al receptor enlazado a
los péptidos de la presente invención se contemplan dentro del
alcance de este documento. Por ejemplo, se contemplan miméticos de
PHSRN y antagonistas de PHSRN. Son posibles una variedad diseños
para dichos miméticos. Por ejemplo, se contemplan péptidos que
contienen PHSRN y PHSCN cíclicos, en los cuales la conformación
necesaria para la unión es estabilizada por no péptidos. La Patente
de los Estados Unidos Nº 5.192.746, de Lobl et al., Patente
de los Estados Unidos Nº 5.169.862, de Burke, Jr. et al.,
Patente de los Estados Unidos Nº 5.539.085, de Bischoff et
al., Patente de los Estados Unidos Nº 5.576.423, de Aversa
et al., Patente de los Estados Unidos Nº 5.051.448, de
Shashoua y la Patente de los Estados Unidos Nº 5.559.103, de Gaeta
et al., describen múltiples métodos para crear dichos
compuestos.
La síntesis de compuestos no peptídicos, que
imitan secuencias peptídicas, se conoce también en la técnica.
Eldred et al., (J. Med. Chem. 37:3882 (1994)) describen
antagonistas no peptídicos que imitan la secuencia
Arg-Gly-Asp. Del mismo modo, Ku
et al., (J. Med. Chem. 38:9 (1995)) explican más en
profundidad la síntesis de una serie de dichos compuestos.
Se contempla que los antagonistas de la presente
invención se administren sistémica o localmente para inhibir la
invasión de células tumorales en pacientes con cánceres avanzados
localmente o metastásicos. Se pueden administrar por vía
intravenosa, intratecal, intraperitoneal y oral. Los antagonistas de
PHSRN (por ejemplo el péptido PHSCN) pueden administrarse solos o
en combinación con fármacos antiproliferativos en un marco
neoadyuvante para reducir la carga metastásica en el paciente antes
de la cirugía o pueden administrarse después de la cirugía. Dado
que los antagonistas de PHSRN pueden reducir la cicatrización de
heridas (porque la secuencia de PHSRN también provoca la invasión
de fibroblastos, como se describe más adelante), puede ser necesario
utilizar antagonistas de PHSRN algún tiempo después de la cirugía
para extraer el tumor.
Dado que pocas células en el cuerpo deben
invadir para poder funcionar, los antagonistas de PHSRN
administrados sistémicamente probablemente no causan los efectos
secundarios debilitantes de los agentes quimioterapéuticos
citotóxicos. Sin embargo, dado que suprime la invasión, es probable
que causen cierto grado de inmunodepresión. Aun así, los
antagonistas de PSHRN pueden ser administrados profilácticamente con
la dosificación apropiada. En cualquier caso, se contempla que
pueden administrarse en combinación con agentes citotóxicos. Se
contempla la selección simultánea en contra de los dos atributos
fatales de las células metastásicas, proliferación e invasión no
restringidas, como una estrategia terapéutica muy poderosa.
En los casos en los que se contemplan
combinaciones, no se pretende que la presente divulgación esté
limitada por la naturaleza particular de la combinación. La
presente divulgación contempla combinaciones como simples mezclas y
también híbridos químicos. Un ejemplo de estos últimos es en el caso
de que un antagonista se enlace covalentemente con un portador
dirigido o con un producto farmacéutico activo. El enlace covalente
puede lograrse por medio de uno o varios compuestos entrecruzados
disponibles comercialmente.
No se pretende que la presente divulgación esté
limitada por la naturaleza particular de la preparación terapéutica.
Por ejemplo, dichas composiciones pueden proporcionarse junto con
portadores, diluyentes, adyuvantes y excipientes líquidos, en gel o
sólidos fisiológicamente tolerables.
Estas preparaciones terapéuticas pueden
administrarse a mamíferos para uso veterinario, como por ejemplo a
animales domésticos, y para uso clínico en humanos, de forma similar
a otros agentes terapéuticos. En general, la dosificación requerida
para una eficacia terapéutica variará de acuerdo con el tipo de uso
y modo de administración así como también con los requerimientos
particulares de los huéspedes individuales.
Dichas composiciones son generalmente preparadas
como soluciones o suspensiones líquidas o en formas sólidas. Las
formulaciones orales para el cáncer por lo general incluirán
aditivos empleados normalmente, como por ejemplo aglutinantes,
cargas, portadores, conservantes, agentes estabilizadores,
emulsionantes, soluciones amortiguadoras y excipientes, como por
ejemplo grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato
de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio y
similares. Estas composiciones toman la forma de soluciones,
suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, fórmulas de
liberación sostenida o polvos y generalmente contienen 1%-95% de
ingrediente activo, preferentemente 2%-70%.
Las composiciones se preparan también como
inyectables en forma de soluciones o suspensiones líquidas; también
pueden prepararse formas sólidas apropiadas para solución o
suspensión en líquido antes de inyectarse.
Los antagonistas de la presente invención son
generalmente mezclados con diluyentes o excipientes que son
tolerables y compatibles fisiológicamente. Diluyentes y excipientes
apropiados son por ejemplo agua, solución salina, dextrosa,
glicerol o similares, y las combinaciones de los mismos. Además, si
se desea, las composiciones pueden contener menores cantidades de
sustancias auxiliares como agentes emulsionantes o humectantes,
agentes tamponadores de PH o estabilizadores.
Fórmulas adicionales que son apropiadas para
otros modos de administración, como por ejemplo administración
tópica, incluyen bálsamos, tinturas, cremas, lociones y, en algunos
casos, supositorios. Para bálsamos y cremas, los aglutinantes,
portadores y excipientes tradicionales pueden incluir glicoles de
polialquileno o triglicéridos.
Puede ser deseable evaluar el potencial de la
invasión de las células, prediciendo de este modo la capacidad de
un paciente de responder al tratamiento de heridas. De forma
similar, puede ser deseable detectar el nivel de actividad de
inducción de nuevos agentes terapéuticos potenciales. Para dicho
análisis se contemplan dos sistemas de ensayos.
En un sistema de ensayos, la presente
divulgación contempla el uso de sustratos de fibronectina reducida.
Estos son sustratos que originalmente contienen fibronectina y que
son tratados de acuerdo con los métodos de la presente invención
(ver más adelante) para eliminar fibronectina. No se pretende que la
presente divulgación esté limitada por la naturaleza del sustrato
original; dichos sustratos que contienen fibronectina apropiados
para tratamiento y depleción incluyen: i) sustratos complejos que
contienen una variedad de proteínas extracelulares y ii) sustratos
menos complejos que contienen fibronectina y una o dos proteínas más
(por ejemplo, colágeno, laminina, etc.).
No se pretende tampoco que la presente
divulgación esté limitada por la cantidad exacta de fibronectina que
permanece luego de que el sustrato ha sido tratado. En otras
palabras, si bien los métodos de la presente divulgación eliminan
fibronectina, y en algunas realizaciones reducen considerablemente
toda la fibronectina, es dentro del significado del término
sustrato de "fibronectina reducida" que permanece una pequeña
cantidad en el sustrato.
En una realización, la presente divulgación
contempla el uso de una matriz extracelular disponible
comercialmente. Por ejemplo, la presente divulgación contempla el
tratamiento de matrices de membranas basales como ECM GEL, una
matriz de sarcoma de ratón (disponible comercialmente en Sigma, St.
Louis, Mo). Sin embargo, no se pretende que la presente divulgación
esté limitada por el sustrato particular que contiene fibronectina.
Por ejemplo, se contemplan otros sustratos disponibles
comercialmente, como el sustrato Matrigel comúnmente utilizado
(disponible en Becton Dickinson Labware, Nº de Catálogo 40234); el
Matrigel puede ser tratado apropiadamente de acuerdo con los
métodos de la presente invención para transformarlo en un sustrato
de "fibronectina reducida" (ver más adelante).
Por lo tanto, la presente divulgación contempla
un sustrato libre de fibronectina. En esta realización el Matrigel
es tratado de forma tal que esté considerablemente libre de
fibronectina. La preparación de Matrigel libre de fibronectina
implica "seleccionar" el sustrato Matrigel en gelatina y
"seleccionar" el sustrato en un anticuerpo antifibronectina
(anti-IgG de fibronectina humana comercialmente
disponible, como por ejemplo anticuerpos de Promega Corporation,
Madison, Wisconsin).
En otra realización, la presente divulgación
contempla los sustratos que están naturalmente libres de
fibronectina; dicha fuente proporciona membranas basales
permeables, por ejemplo, para seleccionar clases de células
normalmente invasivas, estando dichas membranas naturalmente libres
de suero. En una realización, la presente divulgación contempla los
erizos de mar como una fuente de dichas membranas. A este respecto,
el ectodermo de embriones de erizos de mar tiene el espesor de una
célula y secreta una membrana basal subyacente (ver Figura 1) muy
similar a la de los mamíferos. Estos embriones no contienen sistema
circulatorio ni linfático y, por lo tanto, sus membranas basales
están libres de suero. En los embriones, la membrana basal
sub-ectodérmica funciona simultáneamente como un
sustrato de migración para varias clases de células
mesenquimalesespecíficas, mientras que funciona como un sustrato de
la invasión para otras.
Las membranas basales de embriones de erizos
marinos (SU-ECM) pueden prepararse por medio de un
tratamiento con detergente suave, como se describe en D. Livant
et al., Cancer Research 55:5085 (1995). En resumen, los
erizos marinos Stronglyocentrotus purpuratus adultos pueden
obtenerse comercialmente (por ejemplo en Pacific BioMarine), y sus
embriones pueden cultivarse para la etapa temprana de pluteus en
agua de mar artificial a 15ºC. Luego las SU-ECM son
preparadas y esterilizadas a partir de ellos mediante el tratamiento
con detergente no iónico y esterilizadas mediante dilución en los
medios apropiados.
Las células para el ensayo de la invasión son
cosechadas enjuagándolas en una solución salina balanceada de Hanks
y luego se tratan brevemente con 0,25% de tripsina, 0,02% de EDTA, y
de granulación y resuspensión en el medio apropiado con o sin 5% de
FCS a una densidad de aproximadamente 50.000 células por ml. Cuando
se estimó apropiado, se agregaron fibronectina purificada de plasma
bovina (Sigma), fragmento quimotríptico de 120 kDa purificado
(Gibco BRL) o péptidos PHSRN (sintetizados en el Biomedical Research
Core Facilities de la Universidad de Michigan) a las células
resuspendidas antes de la colocación de las células en
SU-ECM. En cada pocillo de la placa utilizada para
un ensayo de la invasión, se colocaron SU-ECM en 0,5
ml del medio apropiado, y 0,5 ml de las células resuspendidas
caídas en sus superficies exteriores. Se incubaron ensayos de la
invasión 1 a 16 horas antes del ensayo. En algunas circunstancias,
los ensayos de la invasión se fijaron en solución salina tamponada
con fosfato (PBS) con 2% de formaldheído durante 5 minutos a
temperatura ambiente y luego se enjuagaron en PBS.
Los ensayos de la invasión son codificados y
marcados a ciegas por examen microscópico bajo contraste de fase a
200 y 400 veces de aumento. Cada célula que entra en contacto con
una SU-ECM se puntúa por su posición relativa a las
superficies exterior o interior. Se juzga que una célula ha invadido
si se localiza en la superficie interior debajo del plano focal
pasando a través de la superficie superior de la
SU-ECM, pero por encima de plano focal pasando a
través de su superficie inferior. La viabilidad mínima de las
células en cada ensayo siempre es determinada en el momento del
ensayo mediante la determinación de la fracción de células
adherentes de propagación en el fondo de cada pocillo puntuado.
Una frecuencia de la invasión se define como la
fracción de células en contacto con membranas basales que se
localizan en sus interiores en el momento del ensayo. De este modo,
una frecuencia de la invasión de 1 denota una invasión del 100% de
las células en contacto con membranas basales. Las frecuencias de la
invasión se determinan múltiples veces para cada clase de células
ensayadas. Se calculó la desviación media y estándar de las
frecuencias de la invasión para cada clase de células ensayadas.
Independientemente de cuál de las dos clases de
sustratos se emplea, los sustratos de la invasión de la presente
invención son fáciles de preparar y dan resultados rápidos y muy
consistentes con una variedad de células que incluyen, a modo no
taxativo, fibroblastos y queratinocitos.
Si bien no se limitan a ningún mecanismo, se
cree que las células expuestas a agentes inductores de la invasión
de este modo se vuelven potencialmente capaces de invadir el
sustrato. También sin limitarse a ningún mecanismo, se cree que el
agente inductor de la invasión que comprende la secuencia de PHSRN
se enlaza al receptor \alpha5\beta1 en la célula y de ese modo
induce la invasión del sustrato.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar
determinadas realizaciones y aspectos preferidos de la presente
invención y no deben interpretarse como restrictivos del alcance de
la misma.
En la divulgación experimental que sigue se
aplican las siguientes abreviaturas: eq (equivalentes); \mu
(micrómetro); M (Molar); \muM (micromolar); mM (milimolar); N
(Normal); mol (moles); mmol (milimoles); \mumol (micromoles);
nmol (nanomoles); g (gramos); mg (miligramos); \mug (microgramos);
ng (nanogramos); L (litros); ml (mililitros); \mul (microlitros);
cm (centímetros); mm (milímetros); \mum (micrómetros); nM
(nanomolar); ºC (grados Centígrados); mAb (anticuerpo monoclonal);
MW (peso molecular), PBS (solución salina tamponada con fosfato); U
(unidades); d (días).
En algunos de los ejemplos a continuación, se
crean heridas en animales. En resumen, en un abordaje se crearon
heridas experimentales en animales que fueron previamente
anestesiados por inhalación de metofano e inyección de lidocaína
por vía intradérmica. Se cortó el pelo del lomo de los animales y se
desinfectó la piel con etanol al 70%. Luego se extrajo un trozo de
piel del lugar desinfectado con una biopsia de punción de 4 mm.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe un abordaje de
purificación para la extracción de fibronectina de plasma (y/o
fibronectina celular) de un sustrato (Matrigel). En este ejemplo,
se intentó la extracción por cromatografía de afinidad en
Gelatina-Sefarosa (una técnica que puede utilizarse
para extraer fibronectina de plasma de suero fetal bovino).
Las perlas de Gelatina-Sefarosa
se obtuvieron de Pharmacia (Nº de Catálogo
17-0956-01). Se prepararon dos
columnas Kontes con aproximadamente 2 mls de perlas de
Gelatina-Sefarosa a 4ºC para evitar la gelificación
del Matrigel. Las columnas se enjuagaron luego con aproximadamente
10 volúmenes de columna de PBS para extraer el conservante de las
perlas. Se drenaron las columnas hasta la parte superior de las
perlas y luego se agregó cuidadosamente Matrigel a la columna. Una
vez que el Matrigel ingresó a la columna, se agregó PBS a la parte
superior de la columna. El Matrigel que se pasó por la primera
columna se recogió y se pasó por la segunda columna. El Matrigel de
fibronectina reducida recogido de la segunda columna se colocó en
placas de 48 pocillos (150 \mul/pocillo), se esterilizó bajo una
luz UV durante 10 minutos y se incubó a 37ºC durante la noche. El
Matrigel tratado de este modo no formó un gel a 37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe un abordaje de
purificación para la extracción de fibronectina de plasma (y/o
fibronectina celular) de un sustrato (Matrigel). En este ejemplo,
la extracción se intentó por selección sucesiva en gelatina. Ocho
pocillos de placas de 24 pocillos fueron recubiertos con solución de
gelatina al 2% (la gelatina se obtuvo de Becton Dickinson Labware,
Nº de Catálogo 11868). Los pocillos se llenaron con la solución de
gelatina que había sido calentada a 50ºC e incubada durante 3
minutos. Luego, la solución se extrajo y se pusieron a secar los
pocillos. Luego de secarse, los pocillos se enjuagaron totalmente
con ddH2O seguido de dos enjuagues con PBS. Nuevamente, las placas
se pusieron a secar; a continuación, fueron almacenados a -20ºC
hasta ser utilizados. El Matrigel se descongeló y luego se agregó a
uno de los pocillos de la placa recubierta con gelatina (entre 800
\mul y 1 ml de Matrigel se agregó a un pocillo de una placa de 24
pocillos). La placa se colocó en un recipiente de hielo en una
habitación a 4ºC en un agitador orbital en donde se incubó el
Matrigel en el pocillo durante dos horas (aunque también puede
utilizarse incubación durante toda la noche). Luego de la
incubación, el Matrigel se trasladó del primer pocillo al segundo
pocillo y luego se incubó durante dos horas en las mismas
condiciones. Este proceso se repitió hasta que el Matrigel había
sido incubado en los ocho pocillos de la placa revestida de
gelatina.
Luego de la reducción del Matrigel, se recogió
en tubos Eppendorf. Luego se colocó en una placa de 48 pocillos (150
\mul/pocillo), se esterilizó bajo una luz UV durante 10 minutos y
se incubó a 37ºC durante la noche. El Matrigel formó un gel y al día
siguiente se agregaron las células a cada pocillo.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe un abordaje de
purificación para la extracción de fibronectina de plasma (y/o
fibronectina celular) de un sustrato (Matrigel). En este ejemplo se
intenta extraer la fibronectina mediante la selección en gelatina
seguida por la selección de un anticuerpo.
Pocillos recubiertos de anticuerpos
antifibronectina: Se recubrieron pocillos de una placa de 24
pocillos con un anticuerpo antifibronectina. Un anticuerpo
monoclonal de ratón para fibronectina humana se obtuvo de Oncogene
Science (Nº de Catálogo CP13). Cada pocillo se incubó con 1 ml de
anticuerpo a una concentración de 30 \mul/ml durante 2 horas a
temperatura ambiente. Luego cada pocillo se incubó con una solución
de BSA al 3% en PBS durante 2 horas a temperatura ambiente. Luego
de los dos períodos de incubación, se lavaron totalmente los
pocillos con PBS y se almacenaron a -20ºC hasta ser utilizados.
Reducción del Matrigel de Fibronectina:
El Matrigel se preparó en ocho pocillos recubiertos de gelatina
(como se describe anteriormente en el Ejemplo 2) para extraer la
mayor parte de la fibronectina y sus fragmentos. A continuación, se
colocó el Matrigel en los pocillos recubiertos de anticuerpos para
extraer todo resto de fragmento de fibronectina que contiene el
dominio de enlace a las células pero no el dominio de enlace a la
gelatina. Se incubó el Matrigel en un recipiente de hielo en un
agitador orbital a 4ºC durante 2 horas. Una vez que el Matrigel se
redujo, se recogió en tubos Eppendorf. El Matrigel de fibronectina
reducida se colocó en una placa de 48 pocillos (150
\mul/pocillo), se esterilizó bajo una luz UV durante 10 minutos y
se incubó a 37ºC durante toda la noche. El Matrigel formó un gel y
al día siguiente se agregaron las células en los pocillos.
En este ejemplo, se demuestra el papel de la
fibronectina de plasma en la inducción de los comportamientos
invasivos de células metastásicas de cáncer de mama y de próstata.
Las líneas celulares humanas de carcinoma de mama humano SUM 52 PE
y SUM 44 PE fueron cultivadas originalmente a partir de las
efusiones pleurales de pacientes con cáncer de mama metastásico; y
SUM 102 fue cultivado a partir de un carcinoma de mama microinvasivo
primario (Ethier, S.P., Mahack, M.L., Gullick, W.J Frank, T.S. y
Weber, B.L. Differential isolation of normal luminal mammary
epithelial cells and breast cancer cells from primary and metastatic
sites using selective media. Cancer Res. 53:
627-635). La línea celular de cáncer de próstata
humano metastásico fue cultivada originalmente a partir de una
metástasis en el cerebro (Stone, K.R., Mickey, D.D., Wunderli, H.,
Mickey, G.H., Paulsen D.F. (1978) Isolation of a human prostate
carcinoma cell line (DU 145), Int., J. Cancer 21:
274-281. Estas líneas celulares pueden mantenerse
por al menos 24 horas en condiciones libres de suero; de este modo,
son ideales para utilizar en ensayos de la invasión libre de suero
en SU-ECM.
Los erizos de mar Stronglyocentrotus
purpuratus adultos se obtuvieron de Pacific BioMarine y sus
embriones se cultivaron para la etapa temprana de pluteus en agua de
mar artificial a 15ºC. Las SU-ECM se prepararon a
partir de ellos mediante un tratamiento con detergente no iónico y
se esterilizaron mediante dilución en los medios apropiados.
Las células se cosecharon mediante el enjuague
en solución salina balanceada de Hanks y luego se tratan brevemente
con 0,25% de tripsina, 0,02% de EDTA, y granulación y resuspensión
en los medios apropiados con o sin un 5% de FCS a una densidad de
aproximadamente 50.000 células por ml. Cuando se estimó apropiado,
se agregaron fibronectina purificada de plasma bovina (Sigma),
fragmento quimotríptico de 120 kDa purificado (Gibco BRL) o péptidos
PHSRN o PHSCN (sintetizados en el Biomedical Research Core
Facilities de la Universidad de Michigan), o péptidos GRGDPS o
GRGESP (Gibco BRL) a las células resuspendidas antes de la
colocación de las células en SU-ECM. En cada
pocillo de la placa utilizada para un ensayo de la invasión, se
colocaron SU-ECM en 0,5 ml del medio apropiado, y
0,5 ml de las células resuspendidas caídas en sus superficies
exteriores. Se incubaron ensayos de la invasión 1 a 16 horas antes
del ensayo. En algunas circunstancias, los ensayos de la invasión se
fijaron en solución salina tamponada con
fosfato (PBS) con 2% de formaldheído durante 5 minutos a temperatura ambiente y luego se enjuagaron en PBS.
fosfato (PBS) con 2% de formaldheído durante 5 minutos a temperatura ambiente y luego se enjuagaron en PBS.
Los ensayos de la invasión fueron codificados y
puntuados a ciegas por examen microscópico bajo contraste de fase a
200 y 400 veces de aumento. Cada célula que entró en contacto con
una SU-ECM fue puntuada por su posición relativa a
las superficies exterior o interior. Se juzgó que una célula había
invadido si se localizó en la superficie interior debajo del plano
focal pasando a través de la superficie superior de la
SU-ECM, pero por encima de plano focal pasando a
través de su superficie inferior. La viabilidad mínima de las
células en cada ensayo siempre fue determinada en el momento del
ensayo mediante la determinación de la fracción de células
adherentes de propagación en el fondo de cada pocillo puntuado.
Una frecuencia de la invasión se define como la
fracción de células en contacto con membranas basales que se
localizan en sus interiores en el momento del ensayo. De este modo,
una frecuencia de la invasión de 1 denota una invasión del 100% de
las células en contacto con membranas basales. Las frecuencias de la
invasión se determinaron múltiples veces para cada clase de células
ensayadas. Se calculó la desviación media y estándar de las
frecuencias de la invasión para cada clase de células ensayadas.
Las secuencias inductoras de la invasión de
fibronectina de plasma se pusieron en correspondencia con una
secuencia peptídica con un largo de 5 aminoácidos, el péptido PHSRN,
para células metastásicas de cáncer de mama y de próstata. Dado que
la secuencia de PHSRN está presente en la fibronectina de plasma, un
componente importante del suero, provocar el papel regulatorio de
esta secuencia sólo fue posible debido a la disponibilidad de
sustrato de la invasión in vitro libre se suero. Cabe
destacar que los fibroblastos humanos neonatales también se inducen
con el péptido PHSRN para invadir la SU-ECM libre
de suero. Si bien los fibroblastos no invaden la
SU-ECM en presencia de suero, el fragmento de
fibronectina de plasma de 120 kDa que contiene la secuencia de
PHSRN puede inducir la invasión de fibroblastos igual de bien tanto
en presencia de suero como en ausencia del mismo.
Al tomarlos juntos, los resultados de los
experimentos que muestran que la secuencia de PHSRN de fibronectina
de plasma induce los comportamientos invasivos de células
metastásicas de cáncer de próstata y de mama, así como también los
de fibroblastos normales, sugieren la intrigante posibilidad de que
los comportamientos invasivos asociados con metástasis de células
tumorales pueden resultar de defectos en la regulación de los
comportamientos invasivos normales asociados con la cicatrización de
heridas.
En este ejemplo, se evaluaron fibroblastos
neonatales normales en el material Matrigel reducido preparado de
acuerdo con el Ejemplo 3 anterior (es decir, la reducción de
anticuerpos). Como se muestra en la Figura 4, la selección con un
anticuerpo luego de la reducción de gelatina mejoró el método de
extracción, según se midió por la invasividad reducida de los
fibroblastos. Por otro lado, la invasividad de los fibroblastos
podía inducirse agregando el péptido PHSRN.
El éxito de la selección de anticuerpos sugiere
la viabilidad de extraer otros componentes por los métodos de
selección de anticuerpos. Otros componentes de suero, como por
ejemplo la trombospondina, factores de crecimiento y citoquinas son
contemplados por la presente invención para la extracción mediante
el anticuerpo apropiado (disponible comercialmente).
En este ejemplo se muestra el papel del péptido
PHSCN en la inhibición del comportamiento invasivo de las células
metastásicas de cáncer de mama. Se emplea el método del Ejemplo 4,
agregando varias concentraciones del péptido PHSCN.
El Ejemplo 4 indica que las células
SUM-52 (en un medio con un 5% de suero fetal bovino)
se inducen para invadir el sustrato de la SU-ECM en
presencia de fibronectina de suero o solamente la secuencia de PHSRN
de fibronectina. De este modo, el procedimiento del Ejemplo 4
proporciona un método para determinar el potencial inhibitorio del
péptido PHSCN mediante la comparación de la cantidad de invasiones
de células en presencia del péptido PHSCN, con la cantidad de
invasiones de células en ausencia del péptido PHSCN.
Los resultados de agregar diversas
concentraciones del péptido PHSCN a células metastásicas
SUM-52 PE de cáncer de mama inducidas por suero se
presentan en la Figura 5A. Los logaritmos de las concentraciones de
péptidos PHSCN en ng por ml se representan gráficamente en el eje
de las X. Los porcentajes de células SUM 52 PE invadidas relativos
al porcentaje invadido en ausencia del péptido PHSCN se representan
gráficamente en el eje de las Y. Los porcentajes de la invasión
medios se muestran con sus primeras desviaciones estándar.
Claramente, el péptido PHSCN exhibe un efecto inhibitorio
importante en estas células, incluso en concentraciones
relativamente bajas. El efecto inhibitorio del péptido PHSCN se
demuestra también por el hecho de que concentraciones relativamente
altas causan una inhibición completa.
Los resultados de agregar diversas
concentraciones del péptido PHSCN a la invasión inducida por PHSRN
de células metastásicas SUM-52 PE de cáncer de mama
(en un medio libre de suero) y células epiteliales mamarias humanas
normales (en un 10% de FCS) se presentan en la Figura 5B. Todos los
ensayos de la invasión se llevaron a cabo en 100 ng por ml del
péptido PHSRN para inducir la invasión. El péptido PHSCN también
exhibe un efecto inhibitorio importante en ambas líneas celulares
en bajas concentraciones y una inhibición casi completa en
concentraciones más altas.
Este ejemplo demuestra que el péptido PHSCN es
un inhibidor efectivo de la invasión de células de cáncer de mama
humano. De esta forma, el péptido PHSCN, o secuencias relacionadas,
pueden proporcionar una terapia efectiva para el cáncer de mama
humano evitando los efectos letales de metástasis de células
tumorales.
En este ejemplo se muestra el papel del péptido
PHSCN en la inhibición del comportamiento invasivo de las células
metastásicas de cáncer de próstata. Se emplea el método del Ejemplo
4, agregando varias concentraciones del péptido PHSCN.
El Ejemplo 4 indica que las células
DU-145 se inducen para invadir el sustrato de la
SU-ECM en presencia de fibronectina de suero o
solamente la secuencia de PHSRN de fibronectina. De este modo, el
procedimiento del Ejemplo 4 proporciona un método para determinar
el potencial inhibitorio del péptido PHSCN mediante la comparación
de la cantidad de invasiones de células en presencia del péptido
PHSCN, con la cantidad de invasiones de células en ausencia del
péptido PHSCN.
Los resultados de agregar diversas
concentraciones del péptido PHSCN a la invasión células metastásicas
DU-145 de cáncer de próstata inducida por suero (en
un 10% de suero) se presentan en la Figura 6A. Los logaritmos de
las concentraciones de PHSCN se representan gráficamente en el eje
de las X. Los porcentajes de células DU-145
invadidas relativos al porcentaje invadido en ausencia del péptido
PHSCN se representan gráficamente en el eje de las Y. Los
porcentajes de la invasión medios se muestran con sus primeras
desviaciones estándar. Claramente, el péptido PHSCN exhibe un
efecto inhibitorio importante en estas células, incluso en
concentraciones relativamente bajas. El efecto inhibitorio del
péptido PHSCN se demuestra también por el hecho de que
concentraciones relativamente altas causan una inhibición
completa.
Los resultados de agregar diversas
concentraciones del péptido PHSCN a la invasión inducida por PHSRN
de células metastásicas DU-145 de cáncer de
próstata (en un medio libre de suero) y células epiteliales de
próstata humanas normales (en un 10% de FCS) se presentan en la
Figura 6B. Todos los ensayos de la invasión se llevaron a cabo en
100 ng por ml del péptido PHSRN para inducir la invasión. El péptido
PHSCN también exhibe un efecto inhibitorio impor-
tante en ambas líneas celulares en bajas concentraciones y una inhibición casi completa en concentraciones más altas.
tante en ambas líneas celulares en bajas concentraciones y una inhibición casi completa en concentraciones más altas.
Este ejemplo demuestra que el péptido PHSCN es
un inhibidor efectivo de la invasión de células de cáncer de
próstata humano. De esta forma, el péptido PHSCN o secuencias
relacionadas pueden proporcionar una terapia efectiva para el cáncer
de próstata humano evitando los efectos letales de la metástasis de
células tumorales.
En este ejemplo, se demuestra el papel del
péptido PHSCN en la inhibición del comportamiento invasivo de las
células metastásicas MatLyLu (MLL) de carcinoma de próstata de rata
(ver el Ejemplo 4 para el procedimiento general empleado). El
resultado de agregar un microgramo por ml del péptido PHSCN a
células MLL inducidas por suero causa una inhibición completa de la
invasión (ver Figura 7A).
El resultado de agregar una concentración
variada del péptido PHSCN a células MLL inducidas por PHRSN en
medios libres de suero se muestra en la Figura 7B, en donde se
utilizaron 100 ng por ml de PHSRN para inducir la invasión. La
Figura 7B indica que el péptido PHSCN exhibe un efecto inhibitorio
importante incluso en concentraciones bajas y una inhibición casi
completa en concentraciones más altas. Este ejemplo demuestra que la
invasión de células de cáncer de próstata de rata se inhibe del
mismo modo que las células de cáncer de mama humano (ver el Ejemplo
8) y las células de cáncer de próstata humano (ver el Ejemplo
9).
En este ejemplo se demuestra el papel del
péptido que contiene homocisteína (es decir, PHS(hC)N)
en la inhibición del comportamiento invasivo de las células
metastásicas MarLyLu (MLL) de carcinoma de próstata de rata. El
procedimiento que se describe en el Ejemplo 10 se empleó utilizando
sustratos de SU-ECM en un 10% de FCS y
PHS(hC)N en lugar de PHSCN. El resultado de agregar
variadas concentraciones del péptido PHS(hC)N a
células MLL inducidas por suero indica que este péptido también
tiene un efecto inhibitorio en la invasión de células (ver Figura
8). Como con el péptido PHSCN, el péptido PHS(hC)N
inhibe considerablemente la invasión en concentraciones bajas, e
inhibe completamente la invasión en concentraciones más altas. Este
ejemplo demuestra que el péptido PHS(hC)N tiene un
efecto inhibitorio similar al péptido PHSCN. El Ejemplo 12 describe
el uso de péptidos para la fabricación de un medicamento para tratar
el cáncer.
En este ejemplo se demuestra el papel del
péptido PHSCN en la inhibición del crecimiento y la metástasis de
tumores de cáncer de próstata. En la primera parte de este ejemplo,
se inyectaron cuatro ratas Copenhagen con 500.000 células MatLyLu
por vía subcutánea en el muslo. Dos de estas ratas recibieron
también 1 mg del péptido PHSCN junto con las células MLL
inyectadas, y a continuación recibieron 1 mg del péptido PHSCN que
se inyectó en la vena de la cola tres veces por semana durante dos
semanas. Las otras dos ratas inyectadas no se trataron. Se midió el
tamaño de los tumores con calibradores el día 14 y se extrajeron los
tumores en las ratas no tratadas. Los resultados representados en
la Figura 9A demuestran claramente que el péptido PHSCN retrasa
considerablemente el crecimiento de los tumores de MLL inyectados en
ratas. Es posible que la capacidad del péptido PHSCN de retrasar el
crecimiento de los tumores se deba a la inhibición de la invasión
tumoral por células endoteliales normales, un efecto
antiangiogénico.
Dos semanas después de medir el tamaño de los
tumores, las ratas fueron sacrificadas y la cantidad media de
metástasis de pulmón se determinó con 10 veces de aumento. La
cantidad media de metástasis de pulmón en los ratones no tratados
(sólo con MLL) fue de casi 35 a pesar del hecho de que los tumores
de próstata iniciales habían sido extraídos cuando se midió su
tamaño. La cantidad media de metástasis de pulmón en los ratones
tratados (con MLL + PHSCN) fue de menos de 5, aunque los tumores de
próstata iniciales nunca fueron extraídos porque eran muy pequeños.
Esta diferencia notoria en la cantidad media de metástasis,
representada en la Figura 9B, indica que el péptido PHSCN inhibe
considerablemente la metástasis de células tumorales en ratas. De
este modo, el péptido PHSCN proporciona una terapia in vivo
efectiva para el cáncer evitando lo efectos letales del crecimiento
de las células tumorales y la metástasis. Los métodos de tratamiento
del cuerpo humano o animal no son parte de las reivindicaciones. El
Ejemplo 13 describe el uso de péptidos para la fabricación de un
medicamento para tratar el cáncer.
En este ejemplo, como en el Ejemplo 12, se
demuestra el papel del péptido PHSCN en la inhibición del
crecimiento y la metástasis de tumores de cáncer de próstata in
vivo. En la primera parte de este ejemplo, se inyectaron 20
ratas Copenhagen con 500.000 células MatLyLu (MLL) por vía
subcutánea en el muslo. Para aproximarlo más a una situación
clínica, el tratamiento del péptido PSCN de 10 de estas ratas se
inició después de 24 horas y no inmediatamente. Las 10 ratas
tratadas (con MLL/PHSCN) recibieron un total de 5 inyecciones i.v.
de 1 mg del péptido PHSCN por la vena de la cola durante dos
semanas. Se midió el tamaño de los tumores con calibradores el día
14 y se extrajeron los tumores en las ratas no tratadas. Dado que
los tumores inyectados en las ratas MLL/PHSCN aún eran pequeños, se
retuvieron en las ratas por otros 7 a 9 días después de la última
inyección de PHSCN. En este momento, sus tamaños eran de más de 2
cm y también se extrajeron. El resultado de la primera parte de
este ejemplo, representado en la Figura 10A, indica claramente que
el péptido PHSCN, incluso cuando se administra después de que las
células tumorales "se sembraron", retrasa considerablemente el
crecimiento de los tumores de cáncer de próstata de rata.
El gran efecto inhibidor de crecimiento del
péptido PHSCN en tumores de MLL puede deberse a la inhibición de la
invasión de células endoteliales huésped en el tumor. La invasión de
células endoteliales huésped puede inducirse por la secreción de
grandes cantidades de proteinasas de los tumores y la resultante
fragmentación de fibronectina de plasma huésped. Se ha demostrado
que los fragmentos de fibronectina estimulan los comportamientos
migratorios/invasivos de células mesenquimales y endoteliales
normales. Se cree que este proceso angiogénico ocurre durante la
cicatrización normal de heridas. De este modo, la capacidad de las
células metastásicas de ser inducidas constitutivamente por
fibronectina de plasma intacta para expresar proteinasas e invadir
puede jugar un papel fundamental en la invasión de células tumorales
y el crecimiento del tumor. De esta forma, el péptido PHSCN es un
efectivo agente quimioterapéutico para evitar el crecimiento de
tumores in vivo.
En la segunda parte de este ejemplo, las ratas
MLL/PHSCN recibieron dos dosis i.v. más del péptido PHSCN antes de
ser sacrificadas. Diez días después de determinar el tamaño de los
tumores primarios inyectados, todas las ratas en los dos grupos
(tratadas sólo con MLL y MLL/PHSCN) fueron sacrificadas y la
cantidad de metástasis de pulmón se determinó con 7,5 veces de
aumento. Como se puede ver en la Figura 10B, hay una reducción
importante en la cantidad media de metástasis de pulmón en las
ratas que recibieron tratamiento de PHSCN en comparación con las
ratas no tratadas.
Las 20 ratas que se describen en las partes uno
y dos de este ejemplo también se examinaron en busca de tejidos
metastásicos en sus sistemas linfáticos. Todas estas metástasis
fueron disecadas y pesadas. La Figura 10C representa gráficamente
las masas medias de metástasis intraperitoneales (gramos) para los
dos grupos de 10 ratas. Como se demuestra claramente, hay una
reducción importante en las masas medias de metástasis linfáticas
en las ratas que recibieron tratamiento de péptido PHSCN, en
comparación con las ratas no tratadas. Esto puede deberse al efecto
antiangiogénico del péptido PHSCN, como se describe en la parte uno
de este ejemplo. De esta forma, el péptido PHSCN puede ser un
agente quimioterapéutico inhibidor del crecimiento y antimetastásico
efectivo para utilizar en el tratamiento del cáncer. Los métodos de
tratamiento del cuerpo humano o animal no son parte de las
reivindicaciones.
En este ejemplo la invasión in vitro de
células cancerosas en sustratos se inhibe con péptidos que han sido
químicamente modificados con grupos protectores y péptidos que
tienen grupos protectores así como la modificación, en donde un
aminoácido L fue reemplazado por el isómero D. Se analizó el péptido
PHSCN, el péptido PHSCN bloqueado, y el péptido PHSCN bloqueado con
una cisteína D en lugar del isómero L (Figura 11). El péptido PHSCN
sin grupos protectores (es decir, círculos abiertos de PHSCN "sin
bloquear") inhibe completamente la invasión de células DU145
metastásicas en un medio con un 10% de suero en una concentración de
3 ng/ml. Cuando el PHSCN está protegido de la degradación de
exoproteasa por acetilación de N-terminal y
amidación de C-terminal, el péptido
Ac-PHSCN-NH_{2} (círculos
cerrados) puede inhibir completamente la invasión de células
metastásicas DU145 en un medio con un 10% de suero en una
concentración de aproximadamente 1,3 ng/ml. La sustitución del
isómero D de cisteína (formando
Ac-PHS(dC)N-NH_{2}
para protección contra la actividad endoproteolítica, círculos a
rayas) aumenta aun más la actividad inhibitoria de la invasión del
péptido.
Si bien no se pretende limitar la invención a
ningún mecanismo particular, se cree que los aumentos en actividad
pueden deberse a la resistencia de proteinasa. Dichas proteasas
pueden encontrarse en el suero o pueden producirse por las células
DU145 (es decir, proteasas enlazadas y secretadas por membranas). Si
la resistencia a la proteinasa es la razón de la actividad
adicional, esto sugiere que dichos péptidos modificados tendrán
vidas medias de circulación más largas al administrarse a animales,
incluyendo a los humanos. Esto permitirá dosis más bajas para
terapia.
Alternativamente, estos cambios pueden hacer que
los inhibidores interactúen más efectivamente con el bolsillo de
unión a PHRSN del receptor \alpha_{5}\beta_{1}. Es decir,
agregar grupos en los extremos del péptido puede tener un efecto
posicionador o estérico que es beneficioso para la unión.
En este ejemplo, la invasión in vitro de
células cancerosas en sustratos se inhibe con miméticos no
peptídicos en comparación con péptidos químicamente modificados (en
una base molar). Los péptidos del Ejemplo 14 (es decir, péptidos
químicamente modificados con grupos protectores y péptidos que
tienen grupos protectores así como la modificación, en donde el
aminoácido L ha sido reemplazado por el isómero D) se compararon con
los miméticos no peptídicos
DL-N-Acetilhomocisteinatiolactona,
Tiobutirolactona, y Ácido Mercaptopropiónico, con el fin de
investigar la relación de la actividad de la estructura para inhibir
la invasión mediante la interacción con el bolsillo de unión a PHRSN
del receptor de fibronectina \alpha_{5}\beta_{1} (Figura
12).
El péptido PHSCN sin grupos protectores (es
decir, PHSCN "sin bloquear", cuadrados abiertos) inhibe
completamente la invasión de células DU145 metastásicas en un medio
con un 10% de suero en una concentración de aproximadamente 2
\muM. Cuando el PHSCN está protegido de la degradación de
exoproteinasa por acetilación de N-terminal y
amidación de C-terminal, el péptido
Ac-PHSCNH_{2} (cuadrados a rayas) puede inhibir
completamente la invasión de células DU145 metastásicas en un medio
con un 10% de suero en una concentración de aproximadamente 0,06
\muM. La sustitución del isómero D de cisteína (formando
Ac-PHS(dC)N-NH_{2}
para protección contra la actividad endopro-
teolíctica, círculos cerrados) aumenta más considerablemente la actividad inhibitoria de la invasión del péptido.
teolíctica, círculos cerrados) aumenta más considerablemente la actividad inhibitoria de la invasión del péptido.
El mimético no peptídico
DL-N-Acetilhomocisteinatiolactona
(círculos cerrados) inhibe completamente la invasión de DU145 en
una concentración de 0,6 \muM. De este modo, es 3 veces más activo
que el péptido PHSCN sin bloquear y aproximadamente 10 veces menos
activo que el PHSCN bloqueado. La tiobutirolactona (círculos a
rayas) inhibe completamente la invasión de DU145 en una
concentración de 30 \muM. De este modo, es 15 veces menos activo
que el péptido PHSCN sin bloquear y aproximadamente 500 veces menos
activo que el PHSCN bloqueado. También es 50 veces menos activo que
la N-acetilhomocisteinatiolactona. El ácido
mercaptopropiónico (círculos abiertos) no redujo la invasión de
DU145 más de un 20% en ninguna de las concentraciones analizadas. De
este modo, es al menos 100 veces menos activo en la inhibición de
la invasión que la tiobutirolactona y 1500 veces menos activo que el
péptido PHSCN sin bloquear.
Los resultados (Figura 12) pueden ser examinados
en el contexto de motivos estructurales compartidos mediante la
comparación de los componentes (Figura 13). El péptido PHSCN
contiene cisteína y el grupo sulfidrilo de la cisteína tiene el
potencial de formar un anillo de 6 miembros interactuando con el
oxígeno de carbonilo de su residuo de serina para quelar un catión
divalente que se conoce reside en el bolsillo de unión de PHSRN del
receptor \alpha5\beta1 de fibronectina de integrina. La
quelación de este catión divalente puede evitar su desplazamiento
por la arginina de la secuencia de PHSRN para activar la invasión.
Esta actividad puede explicar cómo funciona el PHSCN como un
inhibidor competitivo de la invasión inducida por PHSRN. Los
resultados con el mimético no peptídico
DL-N-Acetilhomocisteinatiolactona
sugieren que los aminoácidos que rodean a la cisteína en el PHSCN
pueden contribuir a aumentar 10 veces la actividad inhibitoria de la
invasión, supuestamente aumentando su asociación con el bolsillo de
unión de PHSRN del receptor \alpha5\beta1 de fibronectina. La
N-Acetilhomocisteinatiolactona tiene la posibilidad
de formar un anillo de 6 miembros muy similar al propuesto para el
péptido PHSCN inhibidor de la invasión, mediante la quelación de un
catión divalente entre su grupo sulfidrilo rico en electrones y su
grupo oxígeno de carbonilo o hidroxilo (luego de hidrólisis).
También tiene unido un grupo nitrógeno y un grupo carbonilo por un
enlace peptídico, que puede parecerse al enlace peptídico entre la
serina y la histidina en el péptido PHSCN. Estos grupos pueden
contribuir considerablemente a su actividad inhibitoria de la
invasión.
La tiobutirolactona, como la homocisteína que se
describió anteriormente, puede potencialmente formar un anillo de 6
miembros mediante la quelación de un catión divalente entre su grupo
sulfidrilo rico en electrones y su grupo oxígeno de carbonilo o
hidroxilo (luego de hidrólisis). Sin embargo, carece de los grupos
nitrógeno y carbonilo enlazados a péptidos unidos de la tiolactona.
De este modo, estos grupos unidos pueden contribuir a que se aumente
50 veces la inhibición de la invasión.
Finalmente, el ácido mercaptopropiónico, a
diferencia de la tiobutirolactona, tiene el potencial de formar
únicamente un anillo de 5 miembros con la interacción con el catión
divalente. Los escasos resultados con este compuesto sugieren que
la presencia de un anillo de 6 miembros en el inhibidor después de
quelar un catión divalente puede aumentar la actividad inhibitoria
de la invasión 100 veces estabilizando la presencia del catión
divalente en el bolsillo de unión de PHSRN. Se sabe que el catión
divalente en este bolsillo está enlazado por 4 ácidos aspárticos en
la cadena \alpha5 de \alpha5\beta1. Es interesante que la
inclusión de este ión metálico entre los grupos -SH y -O u -OH
ricos en electrones derivaría en quelación por seis restos ricos en
electrones en lugar de 4, una configuración mucho más estable. La
capacidad de los inhibidores del péptido PHSCN,
N-Acetilhomocisteinatiolactona y tiobutirolactona de
formar anillos de 6 miembros a medida que incluyen el catión
divalente en estos 6 motivos ricos en electrones puede contribuir
considerablemente
a las actividades inhibitorias de la invasión dado que se favorecen energéticamente anillos orgánicos de 6 miembros.
a las actividades inhibitorias de la invasión dado que se favorecen energéticamente anillos orgánicos de 6 miembros.
La presencia de un NH-COOH
ligado con el anillo de 6 miembros puede aumentar 50 veces más la
actividad inhibitoria de la invasión imitando el enlace peptídico
de serina e histidina. Esto sugiere que este enlace interactúa con
los aminoácidos del bolsillo de unión de PHSRN considerablemente. La
presencia de los otros aminoácidos en el péptido PHSCN puede
contribuir a aumentar 10 veces más la actividad inhibitoria de la
invasión interactuando con los aminoácidos del bolsillo de unión de
PHSRN del receptor \alpha5\beta1 de integrina de
fibronectina.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Livant, Donna L.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Agentes inductores de la invasión e inhibidores de la invasión para su utilización en la cicatrización de heridas y cáncer.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- CANTIDAD DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Medlen & Carroll, LLP
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 220 Montgomery Street, Suite 2200
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: San Francisco
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 94104
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- COMPUTADORA: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL REPRESENTANTE/AGENTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Carrol, Peter G.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 32.827
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: UM-03024
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (415) 705-8410
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (415) 397-8338
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ. ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LARGO: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ. ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LARGO: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ. ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LARGO: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ. ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LARGO: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ. ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LARGO: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LARGO: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (23)
1. Un péptido inhibidor de la invasión que
comprende la secuencia de aminoácidos X_{1}HSX_{2}N, en la que
X_{1} es prolina y X_{2} es un aminoácido seleccionado del
grupo que consiste en el isómero L de cisteína, el isómero D de
cisteína y homocisteína.
2. El péptido inhibidor de la invasión de la
reivindicación 1, en el que dicho péptido inhibidor de la invasión
comprende la secuencia de aminoácidos PHSCN.
3. El péptido inhibidor de la invasión de la
reivindicación 1 ó 2, en el que dicho péptido inhibidor de la
invasión contiene aminoácidos adicionales agregados al extremo
amino terminal, al extremo carboxilo terminal o a los extremos
amino y carboxilo terminales.
4. El péptido inhibidor de la invasión de la
reivindicación 3, en el que dicho péptido inhibidor de la invasión
tiene entre seis aminoácidos y cien aminoácidos de largo.
5. El péptido inhibidor de la invasión de la
reivindicación 1, 2 ó 3, en el que el extremo amino terminal de
dicho péptido inhibidor de la invasión está bloqueado con un grupo
protector.
6. El péptido inhibidor de la invasión de la
reivindicación 5, en el que el extremo carboxilo terminal de dicho
péptido inhibidor de la invasión está bloqueado con un grupo
protector.
7. El péptido inhibidor de la invasión de la
reivindicación 5, en el que el extremo amino terminal de dicho
péptido inhibidor de la invasión está bloqueado con un grupo
acetilo y el extremo carboxilo terminal de dicho péptido está
bloqueado con un grupo amida.
8. El péptido inhibidor de la invasión de la
reivindicación 1 ó 2, en el que dicho péptido inhibidor de la
invasión es resistente a exoproteinasas.
9. El péptido inhibidor de la invasión de la
reivindicación 1 ó 2, en el que dicho péptido inhibidor de la
invasión es resistente a endoproteinasas.
10. El péptido inhibidor de la invasión de una
cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 9, en el que dicho
péptido inhibidor de la invasión está suspendido en medios libres
de suero.
11. Una formulación farmacéutica que comprende
el péptido inhibidor de la invasión de una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 10, junto con un portador, adyuvante y/o
diluyente farmacéuticamente aceptable.
12. El uso de la formulación farmacéutica de la
reivindicación 11 para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento del cáncer.
13. El uso de la reivindicación 12, en el que
dicha formulación se administra antes o después de la extracción
quirúrgica de un tumor.
14. El uso de la reivindicación 12, en el que
dicha formulación se administra por vía intravenosa.
15. La formulación de la reivindicación 11 para
utilizar en el tratamiento del cáncer.
16. La formulación de la reivindicación 15, en
el que dicha formulación se administra antes o después de la
extracción quirúrgica de un tumor.
17. La formulación de la reivindicación 15, en
el que dicha formulación se administra por vía intravenosa.
18. Uso de un péptido inhibidor de la invasión
de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10 para la preparación
de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
19. El uso de acuerdo con la reivindicación 18,
en el que dicho medicamento se administra antes o después de la
extracción quirúrgica de un tumor.
20. El uso de acuerdo con la reivindicación 18 ó
19, en el que dicho medicamento se administra por vía
intra-
venosa.
venosa.
21. El péptido inhibidor de la invasión de una
cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10 para utilizar en el
tratamiento del cáncer.
\newpage
22. El péptido inhibidor de la invasión de la
reivindicación 21 para administración antes o después de la
extracción quirúrgica de un tumor.
23. El péptido inhibidor de la invasión de la
reivindicación 21 ó 22 para administración por vía intravenosa.
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