JPH06293660A - 腫瘍壊死因子阻害活性を有する新規ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 腫瘍壊死因子に対して阻害活性を有し、しか
も、安価かつ大量生産が可能な合成ペプチドを提供す
る。 【構成】 配列番号１〜４で表されるペプチドおよびそ
の生理学的に許容される塩（各配列番号で表されるペプ
チドのＮ末端のアミノ基は、アセチル基、t-ブトキシカ
ルボニル基又はベンジルオキシカルボニル基で修飾され
てもよく、Ｃ末端のカルボキシル基はアミド基であって
もよい。配列番号４のペプチド中２個のCysは結合して
分子内ジスルフィド結合を形成する。）、ならびにそれ
らからなる腫瘍壊死因子阻害剤。配列番号１のペプチド
の配列は、Gln Phe Leu Asn GluSer Trp Tyr His Arg T
yr Gln Asn Lys Arg Ala Gly Ala Val Thr Asp Arg Asp
Val Thr Gly である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）
関連ペプチドであり、更には、ＴＮＦに対して阻害活性
を有するペプチド、又は、その生理学的に許容される塩
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ＴＮＦは細胞に対して多くの作用を有す
るサイトカインの一種であり、特異的細胞表面レセプタ
ーに結合し作用を開始する。ＴＮＦは腫瘍細胞やウイル
ス感染細胞を死滅させ、癌治療において効果が期待され
ている。

【０００３】しかし、ある疾患では、ＴＮＦはその過剰
生産により、敗血症ショック、食欲不振、体重減少など
の有害な作用を及ぼす。このことから、ＴＮＦは別名カ
ケクチン(cachectin)とも呼ばれ、悪液質の原因物質と
報告されている[B. Beutlerら、Nature, 316, 552 (198
5) および K. J. Tracey ら、Nature, 330, 662 (198
7)]。また、最近になってＴＮＦは後天性免疫不全症候
群（AIDS）の原因ウイルスであるhuman immunodeficien
cy virus （HIV）の複製を増幅する作用とともに、HIV
標的細胞であるヘルパー／インデユーサーT-細胞（CD4
発現細胞）がHIVに感染した場合に、ＴＮＦは選択的にC
D4細胞を死滅させ、免疫不全を進行させる作用が認めら
れた[薬学雑誌, 113, 1-18 (1993)]。このことから内因
性に形成されたＴＮＦ、または、外因性に投与されたＴ
ＮＦを適切に制御し、それらの副作用に拮抗、ないし阻
害する物質を見付けることが重要な課題である。

【０００４】ＴＮＦ阻害作用を示す物質として、ヒト尿
からTBP-I [I. Olsson ら、Eur. J.Haematol., 42, 27
0 (1989) および H. Engelmann, J. Biol. Chem., 26
4, 11974 (1989)]および TBP- II [H. Engelmannら、J.
Biol. Chem., 265, 1531 (1991)]と呼ばれる約 30kD
の分子量を有するＴＮＦ結合タンパクが単離され、ＴＮ
Ｆレセプタータンパクの細胞外ドメインに相当すると同
定されるとともに、ＴＮＦ作用に対し阻害作用を示すと
報告されている。これらのＴＮＦレセプターの部分タン
パク、その他、抗ＴＮＦモノクローナル抗体等のタンパ
ク質製剤が、敗血症に伴うエンドトキシンショック治療
薬、またはAIDS治療薬として期待されている。

【０００５】従来、報告されている上記の如きタンパク
質を得るためには、まず、遺伝子および細胞工学的に目
的タンパク質を産生し、培養液からの慎重な分離、精製
が必要である。精製品を得るためには、特殊な設備と熟
練した技術を必要とし、長い期間と多大な労力が費やさ
なければならない。従って、今までのタンパク質では、
コスト的に高く、製造されるＴＮＦ拮抗剤または阻害剤
は高価となり、大量生産が難しくなる。現在のところ、
ＴＮＦ拮抗剤または阻害剤は、市販されていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、ＴＮＦ
に対して阻害活性を有し、しかも、安価かつ大量生産が
可能な合成ペプチドを探索した結果、本発明の 短鎖型
の合成ペプチドを見いだした。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、ＴＮＦに対し
て阻害活性を有するペプチド、又は、その生理学的に許
容される塩に関するもので、即ち、より具体的には次の
アミノ酸配列 : （１） 配列番号 １ （２） 配列番号 ２ （３） 配列番号 ３ または （４） 配列番号 ４ で表されるペプチドならびにその生理学的に許容される
塩（各配列番号で表されるペプチドのＮ末端のアミノ基
は、アセチル基、t-ブトキシカルボニル基又はベンジル
オキシカルボニル基で修飾されてもよく、Ｃ末端のカル
ボキシル基はアミド基であってもよい。配列番号４のペ
プチド中２個のCysは結合して分子内ジスルフィド結合
を形成する。）に関するものである。

【０００８】本発明はさらに、上記のペプチド又は生理
学的に許容される塩からなる腫瘍壊死因子阻害剤に関す
る。

【０００９】生理学的に許容される塩としては、アルカ
リ金属塩またはアルカリ土類金属塩、生理学的に許容さ
れるアミンとの塩および無機酸または有機酸、例えば塩
酸、硫酸、燐酸、蟻酸、酢酸、メタンスルホン酸、クエ
ン酸、酒石酸、乳酸、オレイン酸、フマール酸、リンゴ
酸、ケイ皮酸、マロン酸、グルタミン酸、アスパラギン
酸、粘液酸、安息香酸、グルコン酸、シュウ酸、アスコ
ルビン酸、アセチルグリシンとの塩などを挙げることが
出来る。

【００１０】本発明のペプチドは、一般的なペプチド合
成法を適用して、容易に得ることができる。ペプチド合
成法としては活性化エステル法、混合酸無水物法、アジ
ド法などのC 端活性化法、カルボジイミド等のカップリ
ング法、N-カルボキシ無水物( NCA )法、酸化還元法、
酵素法あるいは Merrifield が開発した固相法 ［R.B.
Merrifield, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 24, 799
(1985)］ などがある。なお、ジスルフィド橋による 2
個のシステイン残基の連結は空気、ヨウ素または、ジメ
チルスルオキシドなどを用いる酸化反応によって行われ
る。

【００１１】本発明におけるこれらのペプチドは治療の
ために経口的あるいは非経口的に投与することができ
る。経口投与剤としては散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠
剤などの固形製剤あるいはシロップ剤、エリキシル剤な
どの液状製剤とすることができる。また、非経口投与剤
として注射剤、直腸投与剤、皮膚外用剤、吸入剤とする
ことができる。これらの製剤は活性成分に薬学的に認容
である製造助剤を加えることにより常法に従って製造さ
れる。更に公知の技術により持続性製剤とすることも可
能である。

【００１２】経口投与用の固形製剤を製造するには活性
成分と賦形剤例えば乳糖、デンプン、結晶セルロース、
乳糖カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、
無水ケイ酸などとを混合して散剤とするか、更に必要に
応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニ
ルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロー
ス、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊
剤などを加えて湿式又は乾式造粒して顆粒剤とする。錠
剤を製造するにはこれらの散剤及び顆粒剤をそのままあ
るいはステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤
を加えて打錠すればよい。これらの顆粒または錠剤はヒ
ドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタア
クリル酸、メタアクリル酸メチルコポリマーなどの腸溶
性基剤で被覆して腸溶性製剤、あるいはエチルセルロー
ス、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤
とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには
散剤又は顆粒剤をなどの硬カプセルに充填するか、活性
成分をグリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、
オリーブ油などに溶解したのちゼラチン膜で被覆し軟カ
プセルとすることができる。

【００１３】経口投与用の液状製剤を製造するには活性
成分と 白糖、ソルビトール、グリセリンなどの甘味剤
とを水に溶解して透明なシロップ剤、更に精油、エタノ
ールなどを加えてエリキシル剤とするか、アラビアゴ
ム、トラガント、ポリソルベート８０、カルボキシメチ
ルセルロースナトリウムなどを加えて乳剤又は懸濁剤と
してもよい。これらの液状製剤には所望により矯味剤、
着色剤、保存剤などを加えてもよい。

【００１４】注射剤を製造するには活性成分を必要に応
じ塩酸、水酸化ナトリウム、乳剤、乳酸ナトリウム、リ
ン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどの
ｐＨ調製剤、塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化剤
とともに注射用蒸留水に溶解し、無菌ろ過してアンプル
に充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シク
ロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空下凍結乾燥
し、用事溶解型の注射剤としてもよいし、活性成分にレ
シチン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化
ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射用乳剤とす
ることもできる。

【００１５】直腸投与剤を製造するには活性成分及びカ
カオ脂、脂肪酸のトリ、ジ及びモノグリセリド、ポリエ
チレングリコールなどの坐剤用基剤とを加湿して溶融し
型に流しこんで冷却するか、活性成分をポリエチレング
リコール、大豆油などに溶解したのちゼラチン膜で被覆
すればよい。

【００１６】皮膚外用剤を製造するには活性成分を白色
ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレング
リコールなどにくわえて必要ならば加湿して練合し軟膏
剤とするか、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合
体などの粘着剤と練合ししたのちポリエチレンなどの不
織布に展延してテープ剤とする。

【００１７】吸入剤を製造するには活性成分をフロンガ
スなどの噴射剤に溶解又は分散して耐圧容器に充填しエ
アゾール剤とする。

【００１８】本発明のペプチドの投与量は患者の年齢、
体重および病態によって異なるが、通常１日約１mg〜５
００mgであり、１乃至数回に分けて投与することが望ま
しい。

【００１９】本発明の合成ペプチドの生物学的評価は、
L-M 細胞に対するＴＮＦ細胞障害作用の阻害活性を測定
することにより行った。

【００２０】以下、本発明を実施例により、更に、具体
的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものでは
ない。

【００２１】

【実施例】

【００２２】実施例１ 配列番号１で表されるペプチドの合成 本発明のペプチド合成は、固相法を採用し、ペプチド自
動合成機 ( Applied Biosystems社製の430 A または 43
1Ａ型 ) を使用し、同社のプログラムにより実施した。
合成機に使用した試薬は430 A の場合、1. ジイプロピ
ルエチルアミン2. トリフルオロ酢酸 3. ニュートラ
イザー (エタノールアミン) 4. メタノール 5. ヒ
ドロキシベンゾトリアゾール 6. ジシクロヘキシルカ
ルボジイミド 7. ジクロロメタン 8. ジメチルホル
ムアミドである。431 A の場合はジメチルホルムアミド
の代りに、N-メチルピロリドンを用いた。合成にあたっ
て用いたアミノ酸は、Boc-Ala、 Boc- Arg(Mts)、 Boc-
Asn、 Boc-Asp(OBzl)、Boc-Cys(4-CH3OBzl)、Boc- Glu
(OBzl)、Boc-Gln、Boc-Gly、Boc-His(Dnp)、Boc-Leu、B
oc-Lys(Cl-Z)、Boc-Phe、Boc-Ser(Bzl)、Boc-Thr(Bz
l)、Boc-Trp(CHO)、 Boc-Tyr(Br-Z)、 Boc-Val であ
る。Ｃ末端カルボキシル基型のペプチド合成にはPAMレ
ジンを用い、Ｃ末端アミド基型のペプチド合成にはP-メ
チルBHAレジンを用いた。保護基の脱離、樹脂からの切
り出しはApplied Biosystems 社のマニュアルに従っ
た。

【００２３】本実施例のペプチドの合成に当っては、Bo
c法を採用し、0.5mmol Boc-Gly-PAMResinを使用した。
合成を終了し、2.6 gのペプチド樹脂を得た。ジメチル
ホルムアミド(50 ml)に上記のペプチド樹脂を懸濁、チ
オフェノール(2.6 ml)を添加した後、1 時間、室温で攪
拌し, まず、ヒスチジンの保護基Dnpを除去した。ペプ
チド樹脂をろ別し、 ジクロロメタン で洗浄した。ペプ
チド樹脂から、以下、Applied Biosystems 社のマニュ
アルに従い、特別法で切り出しを行った。即ち、m-クレ
ゾール (2.1 ml)、ジメチルスルフィド (7.8 ml)を加
え、攪拌した混合物に、氷浴中で冷却しながらトリフル
オロ酢酸 (13.0 ml)、次いでトリフルオロメタンスルホ
ン酸 (2.6 ml)を加えた。その温度で3時間攪拌した。エ
ーテル (150ml)を加え、反応混合物をろ過し、エーテル
で3 回洗浄した。得られた混合物にチオアニソール :
1,2-エタンジチオール (2:1) ( 3.9 ml)を加 え、10分
間攪拌した。次に、氷浴中で冷却しながらトリフルオロ
酢酸 (26 ml)を加えた。トリフルオロメタンスルホン酸
(2.6 ml)をゆっくり加えて、室温で30分間攪拌した。
冷却したエーテルを加えて、反応混合物をろ過し、エー
テルで3 回洗浄した。

【００２４】得られた粗ペプチドをトリフルオロ酢酸
(15 ml ) で溶解し、冷却、攪拌してあるエーテル中に
滴下した。析出物をろ過し、エーテルで3 回洗浄した。
10％酢酸水溶液で溶解し、ろ過した。この粗ペプチドを
酢酸水溶液に溶解しオープンカラム[Bio-Gel P-2]を用
い、10％ 酢酸水溶液で展開した。目的物を含む溶出液
を凍結乾燥 し、白色粉末 1.68 g を得た。HPLC ［ODS-
80TMカラム（東ソー、21.5mmID ｘ30cm)、アセトニトリ
ル直線勾配／0.1% トリフルオロ酢酸］で分取し、凍結
乾燥し白色粉末(500 mg)を得た。分析用カラム［ODS-80
TMカラム（東ソー、4.6mmID ｘ15cm)アセトニトリル直
線勾配／0.1% トリフルオロ酢酸］を使用し、HPLCを行
い、精製物が単一なことを確認した。一部を、Applied
Biosystems社製の477Ａプロテインシーケンサー、120A
PTH アナライザーを使用し、アミノ酸配列分析を行っ
た。また、6N 塩酸で110℃、20 時間加水分解した後、
医理化工業のA-8700型アミノ酸分析装置を使用して分析
した。分析結果よりペプチドが配列Gln Phe Leu Asn
Glu Ser Trp Tyr His Arg Tyr Gln Asn Lys
Arg Ala Gly Ala Val Thr Asp Arg Asp Val
Thr Glyを有していることを確認した。

【００２５】実施例２〜３ 実施例１と同様の反応操作を行い、表１に示す実施例２
及び３のペプチドを得た。

【００２６】

【表１】

【００２７】実施例４ 配列番号４で表されるペプチドの合成 Boc-Cys(4-CH₃OBzl)-PAM-resinを用いて、実施例 1と
同様の方法で、ペプチド樹脂1.38gを得た。ジメチルホ
ルムアミド(33ml)に懸濁し、チオフェノール(2.8ml)を
添加し、3.5 時間攪拌した。ろ過後、ペプチド樹脂をジ
クロロメタンで洗浄した。以下、一般法で脱保護と樹脂
からの切り出しを行った。ペプチド樹脂にチオアニソー
ル(1.4ml)、 1,2-エタンジチオール(0.7ml)を加え、氷
冷下、攪拌しながら、トリフルオロ酢酸(14ml)、トリフ
ルオロメタンスルホン酸(1.4ml)を加えた。30分後、ジ
エチルエーテル(100ml)を加えた。沈澱物をろ過して、
ジエチルエーテルで洗浄した。沈澱物にトリフルオロ酢
酸(5ml)を加えて、ペプチドを溶解し、このトリフルオ
ロ酢酸層を攪拌してあるジエチルエーテル中に滴下し
た。生じた沈澱物をろ過し、ジエチルエーテルで洗浄し
た。沈澱物を水ー酢酸の系に溶解し、オープンカラムで
精製した。凍結乾燥して粉末(250mg)を得た。この粉末
をジメチルスルオキシド(2.5ml)とトリフルオロ酢酸(25
0ml)の混合液に溶解し、12時間攪拌した。水流減圧下、
溶媒を留去後、残さをHPLCで精製し 実施例４のペプチ
ド（配列番号４）を57mg得た。

【００２８】実施例５ ＴＮＦ細胞障害抑制活性測定試験 ＴＮＦを培養液中（5% 牛血清 及び 0.2% グルコース
を含むDulbecco's Modified Eagle Medium ) でペプチ
ドと37℃、18時間感作させ、その溶液を96 ウエルマイ
クロプレートに1 x104 個/ウエルで1日間培養したL-M細
胞に加えた。24時間後に各ウエルをクリスタル紫により
染色し、550nmで吸光度を測定した。ＴＮＦ単独添加の
ウエルの吸光度をＴＮＦ細胞障害抑制 0％、ＴＮＦ無添
加、つまり培養液のみでＴＮＦの細胞障害が全く認めら
れないウエルの吸光度をＴＮＦ細胞障害抑制100％の基
準とした。ペプチド、ＴＮＦ混合添加時のウエルの吸光
度からペプチドのＴＮＦ細胞障害抑制（％）を計算し
た。

【００２９】

【表２】 表２. L-M細胞に対するＴＮＦの細胞障害活性に及ぼす合成ペプチドの影響 ─────────────────────────────────── ＴＮＦ細胞障害抑制（％） ─────────────────────────────────── ＴＮＦ(3.5ng/ml) 0 ＴＮＦ(3.5ng/ml) + 実施例１(1mM) 56 ＴＮＦ(3.5ng/ml) + 実施例２(1mM) 46 ＴＮＦ(3.5ng/ml) + 実施例３(1mM) 53 ───────────────────────────────────

【００３０】表２の結果は、実施例１、２、及び３の合
成ペプチドの共存下でＴＮＦの細胞障害活性が抑制され
ていることを示している。

【００３１】

【配列表】

【００３２】配列番号：１ 配列の長さ：２６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gln Phe Leu Asn Glu Ser Trp Tyr His Arg Tyr Gln Asn Lys Arg 1 5 10 15 Ala Gly Ala Val Thr Asp Arg Asp Val Thr Gly 20 25

【００３３】配列番号：２ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Asn Glu Arg Leu Phe Phe Gly Ala His Ala Thr Ala Val Thr 1 5 10 15 Asn Gln Lys Glu Gln Gly 20

【００３４】配列番号：３ 配列の長さ：２３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 His Ala Thr Ala Val Thr Asn Gln Lys Glu Gln Ala Ser Leu His 1 5 10 15 Val Thr Gly Asn Leu Ala Leu Ser 20

【００３５】配列番号：４ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：環状 配列の種類：ペプチド

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 99:00

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（１） 配列番号 １ （２） 配列番号 ２ （３） 配列番号 ３ または （４） 配列番号 ４ で表されるペプチドならびにその生理学的に許容される
   塩（各配列番号で表されるペプチドのＮ末端のアミノ基
   は、アセチル基、t-ブトキシカルボニル基又はベンジル
   オキシカルボニル基で修飾されてもよく、Ｃ末端のカル
   ボキシル基はアミド基であってもよい。配列番号４のペ
   プチド中２個のCysは結合して分子内ジスルフィド結合
   を形成する。）。
2. 【請求項２】請求項 1に記載のペプチド又はその生理学
   的に許容される塩からなる腫瘍壊死因子阻害剤。