CN110981938A - 靶向grb2 sh2结合域的抗肿瘤多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了靶向GRB2 SH2结构域的抗肿瘤多肽及其应用,所述多肽的氨基酸序列为:IYIHR‑pY‑ENVSI、AELEF‑pY‑MDYEA、VNTTL‑pY‑EKFTY、AEKPF‑pY‑VNVEF、PPDHQ‑pY‑YNDFP、SADHL‑pY‑VNVSE、GPQDI‑pY‑DVPPV的至少一条。本发明的抗肿瘤多肽具有亲和力高、特异性强的特点,具有良好的抗肿瘤效果。本发明为研发抗肿瘤治疗药物提供借鉴,将有助于肝癌等疾病的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及磷酸化酪氨酸多肽及其应用,特别涉及靶向GRB2 SH2结合域的高亲和力多肽及其对GRB2蛋白过表达的肿瘤细胞具有杀伤作用,进而应用于抗肿瘤药物的开发。
背景技术
近年来,药物通过干扰或调控蛋白质-蛋白质相互作用的信号通路而抑制癌症的发生与发展,这种策略已经成为了当今创新药物研究的热点之一。在肿瘤的发展过程中,蛋白质与蛋白质间的相互作用,作为生物信号传输通路的节点或枢纽,通过传递病理、生理信号到达相关的分子网络,从而调控着肿瘤的发生、侵袭和转移。磷酸化酪氨酸(pY)介导的蛋白质-蛋白质相互作用是信号网络的核心组成部分,而Src同源区2(Src homology 2domain,简称SH2结构域),是在生物信号转导中能够特异性识别和结合含有磷酸化酪氨酸(pY)蛋白。人类基因组中包含100多个SH2结构域,分布于100多种不同的蛋白质中,在信号通路的动态调控中起着重要作用。近些年的研究已经表明,SH2结构域家族蛋白与多种疾病的发生与发展密切相关,已发展成为一类重要的药物靶标。
生长因子受体结合蛋白2(Growth factor receptor bound protein 2,GRB2)是由一个SH2结构域和两个SH3结构域组成的衔接蛋白。已有研究表明,GRB2在肝癌等肿瘤组织中异常高表达,并且GRB2的表达水平与肿瘤的淋巴结转移及预后密切相关。同样,癌症中GRB2的过量表达增强了细胞骨架的柔性和细胞的迁移能力,促进肿瘤血管生成。已有研究表明,可通过靶向GRB2 SH2结构域实现调控GRB2蛋白活性的目的。
已有的靶向GRB2 SH2结构域的小分子药物表现出了一定的抗肿瘤生物活性,但是,由于小分子药选择性和特异性较差,易产生“脱靶”效应,对人体有较强的毒副作用,进而限制了这类小分子药物在临床治疗中的大规模应用。近年来,多肽在调控蛋白质-蛋白质相互作用上显示了良好的选择性优势而受到了广泛的关注,这是因为:相比于小分子药物,多肽具有较大的分子量,在和蛋白质表面相互作用时,具有类似抗体的高亲和力与特异性,从而在很大程度能避免产生“脱靶”效应,而降低药物副作用。因此,要研发出由GRB2蛋白诱导的相关癌症的治疗药物,关键是发现亲和力高、特异性强的靶向GRB2 SH2结构域多肽。
本申请致力于研制亲和力高、特异性强的靶向GRB2 SH2结构域多肽。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有选择性靶向GRB2 SH2结构域的多肽及其在作为抗肿瘤药物方面的应用。
本发明的又一目的在于提供上述靶向GRB2 SH2结构域的高亲和力多肽筛选方法。
为达到上述目的,本发明所采取的技术方案是:
本发明的第一方面,提出了靶向GRB2 SH2结构域多肽的筛选方法,包括以下步骤:
1)选取含有磷酸化酪氨酸多肽;
2)构建包含步骤1)磷酸化酪氨酸多肽和构建相应的微阵列,所述预测的磷酸化酪氨酸多肽通过其生物素标签与链霉亲和素高亲和力作用而固定在微阵列芯片上;
3)将“单点”微阵列、“双颜色”策略微阵列、基于浓度梯度的微阵列动力学分析依次应用于GRB2 SH2结构域高亲和力多肽的筛选;
所述单点微阵列筛选得到F01、E19、D21、A01、D04、F11、F16、E21、B15、D12的多肽;所述F01、E19、D21、A01、D04、F11、F16、E21的氨基酸序列如SEQ ID NO.1~7所示;
4)在微阵列上鉴定预测的磷酸化酪氨酸多肽及其衍生物与GRB2蛋白SH2结构域的相互作用,从而筛选得到高亲和力结合GRB2 SH2结构域的磷酸化酪氨酸先导多肽的氨基酸序列,即靶向GRB2 SH2结构域多肽;
所述方法不适用于疾病诊断与治疗。
本发明的第二方面,提出了靶向GRB2 SH2结构域多肽,所述多肽的氨基酸序列选自以下至少一条:IYIHR-pY-ENVSI、AELEF-pY-MDYEA、VNTTL-pY-EKFTY、AEKPF-pY-VNVEF、PPDHQ-pY-YNDFP、SADHL-pY-VNVSE、GPQDI-pY-DVPPV。
根据本发明的实施例,所述多肽序列来源于在信号转导/疾病调控中起重要作用的具有磷酸化位点的蛋白上的多肽片段。
本发明的第三方面,提出了前面任一项所述多肽在制备诊断GRB2蛋白介导的疾病试剂中的应用。
根据本发明的实施例,所述疾病为肿瘤。
根据本发明的实施例,所述肿瘤为肝癌。
本发明的第四方面,提出了任一项所述多肽在制备治疗GRB2蛋白介导的疾病试剂中的应用。
根据本发明的实施例,所述疾病为肿瘤。
根据本发明的实施例,所述肿瘤为肝癌。
本发明的第五方面,提出了一种诊断或治疗肿瘤试剂,所述试剂包括前面任一项所述多肽。
根据本发明的实施例,所述肿瘤为肝癌。
根据本发明的实施例,还包括药学上可接受的载体和/或辅料。
本发明的有益效果是:
本发明基于微阵列平台和高通量筛选鉴定得到靶向GRB2 SH2结构域的高亲和力、高选择性多肽,及其在检测或治疗癌症中的作用。本发明的微阵列筛选方法,克服了传统筛选方法步骤繁琐、筛选速度慢和效率低的缺点。具有原料用量小、通量高、误差小、信息含量大、单次实验可同时进行多个样品以获取大量样品分析数据的优点。
通过“单点”微阵列策略,能够快速识别GRB2 SH2结构域的有效结合多肽。同时使用“双颜色”策略微阵列筛选,可高效识别GRB2 SH2结构域的选择性结合多肽。此外,还通过浓度梯度动力学实验测多肽与GRB2蛋白之间的Kd值,表征多肽与蛋白的结合强度,从而筛选出高亲和力、高特异性的GRB2 SH2靶向多肽,从而为后续开发靶向GRB2 SH2结构域的抗肿瘤药物提供先导多肽氨基酸序列。
附图说明
图1为144条多肽组成的pY肽库的Pro-QTM分析图像。
图2为实验中Cy3染料标记的GRB2 SH2结构域蛋白、Cy5染料标记Lck SH2结构域、Src1 SH2结构域蛋白示意图。
图3为“单点”筛选结果的指纹图谱。
图4为“双颜色”筛选结果的指纹图谱,根据指纹图谱上多肽样点上荧光信号的颜色不同,判断多肽对GRB2 SH2结构域的选择性,其中A为GRB2-Cy3,Lck-Cy5指纹图谱;B为GRB2-Cy3,Src1-Cy5指纹图谱。
图5是7条多肽基于浓度梯度的微阵列实验而得到的动力学研究结果和相应的Kd值,其中A为E21、B为F16、C为F11、D为E19、E为A01、F为D21、G为F01。
图6是多肽在细胞裂解液中反应的蛋白沉降实验的实验结果。
图7是多肽对肝癌细胞生长活性的影响,其中A为F01对细胞的抑制率、B为D21对细胞的抑制率。
图8是多肽对肝癌细胞细胞迁移的影响,其中A为F01和D21的细胞迁移,B为F01和D21的划痕愈合率。
图9为多肽在细胞中的荧光共定位实验结果图,FITC修饰的多肽在细胞内与GRB2蛋白有明显的重合。
具体实施方式
本发明在于提供一种靶向GRB2 SH2结构域的多肽,所述多肽序列为IYIHR-pY-ENVSI()、AELEF-pY-MDYEA、VNTTL-pY-EKFTY、AEKPF-pY-VNVEF、PPDHQ-pY-YNDFP、SADHL-pY-VNVSE、GPQDI-pY-DVPPV,所述多肽含有磷酸化酪氨酸(pY)。以及上述任一多肽在制备GRB2蛋白介导的肿瘤治疗试剂中的应用。
发明中选取了144不同序列的多肽组成多肽化合物库,多肽均来源于具有磷酸化位点的信号通路蛋白、磷酸化相关蛋白等对各种疾病调控起重要作用的蛋白。通过查阅文献与蛋白数据库(www.hprd.org)等资料,得到蛋白的磷酸化位点(pY)及与pY相接的氨基酸序列,作为药物靶标GRB2 SH2结构域的潜在结合肽用于微阵列筛选。
本发明首先将144条不同序列的多肽通过其生物素标签与芯片上修饰的链霉亲和素高亲和力作用而固定在芯片上,从而制备出微阵列芯片可用于后续多肽筛选试验。
本发明中涉及的结合GRB2 SH2结构域高亲和力、高选择性多肽筛选中,首先使用微阵列“单点”筛选策略,快速的筛选鉴定出与靶标蛋白GRB2 SH2结构域结合的高亲和力多肽。具体过程是:首先,Cy3荧光标记靶标蛋白;然后,再与构建好的多肽微阵列孵育;最后,通过扫描读取多肽微阵列芯片上结合荧光靶标蛋白的荧光信号,而判断出多肽与蛋白之间的亲和力强弱,一般荧光越强,亲和力越强。
本发明通过微阵列“双颜色”筛选策略,进一步鉴定出与药物靶标蛋白高选择性结合的多肽。筛选出具有选择性识别GRB2蛋白SH2结构域的结合多肽的是可以避免药物产生“脱靶”效应,从而降低药物的副作用。在“双颜色”筛选试验中,靶标蛋白GRB2与其他的同源蛋白Lck、Src1用不同荧光的染料进行荧光标记,通过芯片上荧光信号的颜色来确定选择性结合GRB2蛋白SH2结构域的多肽。
本发明通过基于浓度梯度的微阵列动力学实验,获得了可衡量多肽与靶标蛋白作用力强弱的Kd值,可准确量化多肽与蛋白之间亲和力的大小,为抗癌药物制备提供了更为精准的数据。
本发明还通过细胞实验,进一步表征筛选得到多肽的抗肿瘤效果,确保多肽可作为由GRB2蛋白过量表达导致的肿瘤的候选治疗药物。
实施例1靶向GRB2 SH2结构域多肽
靶向GRB2 SH2结构域多肽,其核心氨基酸序列分别为:IYIHR-pY-ENVSI、AELEF-pY-MDYEA、VNTTL-pY-EKFTY、AEKPF-pY-VNVEF、PPDHQ-pY-YNDFP、SADHL-pY-VNVSE、GPQDI-pY-DVPPV。
所述多肽均含有磷酸化酪氨酸pY,所述多肽来源于具有磷酸化位点与疾病调控相关的蛋白的磷酸化位点(pY)及与pY相接的氨基酸序列。
磷酸化酪氨酸多肽的筛选
(1)磷酸化酪氨酸多肽库的合成
选取了144条不同序列的多肽组成多肽化合物库,多肽来源于具有磷酸化位点的信号通路蛋白、磷酸化相关蛋白等对各种疾病调控起重要作用的蛋白。我们通过查阅文献与蛋白数据库(www.hprd.org)等方法,筛选出蛋白的磷酸化位点(pY)及与pY相接的氨基酸序列,作为药物靶标GRB2 SH2结构域的潜在结合肽而用于下一步的微阵列筛选实验。
并且采用Fmoc固相合成法合成多肽化合物库的多肽。
反应物质的摩尔比如下,树脂:Fmoc氨基酸:TBTU:DIEA=1:4:4:8
1.膨胀树脂:称取0.1g的Fmoc-Rink Amide树脂至反应器中(根据合成需要改变重量),加入约2-5mL的DMF,放置0.5~1h使树脂膨化。
2.脱Fmoc保护基团:抽滤去除管内溶剂,加入约2-3mL的20%哌啶/DMF溶液,旋转混匀器上反应1h。
3.冲洗:抽去反应器内的溶液,分别用DMF、DCM、DMF冲洗,共冲洗9遍。
4.偶联氨基酸:在提前称好的Fmoc-氨基酸、TBTU固体中先加入2-4mL的DMF溶剂,并加入DIEA充分混匀震荡溶解氨基酸和TBTU,并放置2~3min,再将混合溶液加至反应器中,旋转混匀器上反应2h。(针对Arg,Trp和非天然氨基酸,适当延长反应时间至3-4h)
5.冲洗:抽去反应器内的液体,分别用DMF、DCM、DMF冲洗,共冲洗9遍。
6.重复步骤2~5偶联剩余的氨基酸,直至完成最后一个氨基酸的偶联和脱保护。
7.完成最后一个氨基酸偶联和脱保护之后,在多肽的N端连接(Biotin)-GG,用于后续微阵列的固定。
8.剪切树脂:多肽用DMF、DCM分别冲洗三次后,用甲醇冲洗2~3次,室温放置让甲醇挥发干燥树脂。配制95%三氟乙酸(TFA)溶液(95%的TFA+2.5%三异丙基硅烷(TIS)+2.5%水)。根据产物的量加适量的95%TFA溶液(约1~2mL,不需要加太多)旋转混匀器上反应2-3h(若多肽中含有精氨酸时间延长至3-4h)。
9.冰乙醚沉淀多肽:将含有多肽的TFA溶液进行过滤,除去树脂固体,溶液转移至干净EP管内。用氮气吹去所有的TFA。加入8-10mL冰乙醚,放入-80℃中冷藏过夜,进一步沉淀析出所有的多肽。
10.3500rpm离心10min,弃去上清乙醚,多肽沉淀在底部。再加入8-10mL冰乙醚重悬固体,同样的,在3500rpm下离心10min,重复两遍。弃去上清后,室温下挥干乙醚。
11.多肽合成结束后用LC-MS进行分子量鉴定,最后HPLC分离纯化。
图1为144条多肽组成的pY肽库的Pro-QTM分析图像。
(2)蛋白表达纯化
将转染重组质粒的大肠杆菌在5mL LB培养基在37℃,230rpm摇床中过夜培养,次日按照1:100的体积比例将大肠杆菌在200mL培养基中扩大培养,大肠杆菌的生长达到OD600=0.6~0.8,加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达,IPTG的工作浓度为0.1mM。加入IPTG后在16℃,230rpm摇床中继续培养18~20h。
诱导表达结束后,培养基3500rpm下离心10~15min,弃去菌液上清,收集大肠杆菌沉淀。PBS重悬沉淀后,利用超声破碎细菌外壳,在4℃条件下,4000rpm转速离心30min,将含有蛋白的上清液加到含有Ni-NTA树脂的层析柱中,4℃下旋转反应1h。
先用20mM的咪唑PBS溶液大量冲洗柱中树脂,8~10遍后,加入2mL 250mM咪唑PBS溶液洗脱GRB2蛋白,重复6~8遍。最后用超滤管进行蛋白换液与浓缩,并测定蛋白浓度。后续用于蛋白标记。
(3)多肽微阵列构建
每个肽微阵列芯片,包含了6个相同的子阵列作为平行实验,同时每个子阵列上都固定144种磷酸化酪氨酸多肽,由此得到了本发明中的磷酸化酪氨酸多肽微阵列芯片。
在食人鱼刻蚀液(硫酸:过氧化氢=7:3)中清洗25mm×75mm的载玻片(Sigma-Aldrich),使用3%三乙氧基硅烷在2%水和95%乙醇溶液中通过硅烷化将氨基官能团结合到载玻片上,孵育1-2h后,用乙醇清洗载玻片,并在150℃固化2h以上。将所得载玻片在180mM琥珀酸酐DMF溶液中孵育30min,然后转移至沸水浴中2min。用乙醇冲洗载玻片并挥干,得到羧酸衍生的载玻片。用含100mM HBTU,200mM DIEA和100mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的DMF溶液活化羧酸衍生载玻片表面,从而生成NHS衍生化的载玻片表面。最后载玻片与1mg/mL的亲和素在10mM NaHCO3(pH=9)的溶液中反应40min,用水洗涤并干燥。用2mM天冬氨酸在0.5M NaHCO3(pH=9)缓冲液中封闭载玻片表面未反应的NHS基团。用水洗掉并干燥后,4℃保存。
将所有的多肽储存液用DMSO/PBS(1:1)溶液稀释至1mM,确定所有多肽均溶解于溶液中再转移至384孔板中,将载玻片放置在ESI SMA阵列仪上,按照每个多肽样点直径为350μm,不同样点之间的距离(450μm)进行多肽点样。多肽微阵列芯片制备完成后4℃保存,用于后续实验研究。
Pro-QTM染色能够基于荧光测定多肽序列中pY残基,基于此原理我们通过Pro-QTM染色检测多肽芯片是否制备成功。用水润湿载玻片表面后,Pro-QTM金刚石染料室温下染色1h,用20%乙腈的乙酸钠溶液(pH=4)将载玻片脱色0.5h,并用微阵列扫描仪在Cy3通道下可视化。(λ激发=548nm;λ发射=595nm)
如图1,144条多肽组成的pY肽库的Pro-QTM分析图像。芯片上的不同子阵列之间和子阵列内不同点之间都具有高度的重现性(r>0.9),微阵列芯片制备成功,保证了后续筛选试验的可靠性。
(4)多肽微阵列筛选
1)“单点”微阵列分析
磷酸化酪氨酸多肽微阵列芯片进行“单点”微阵列分析,快速识别GRB2 SH2结构域蛋白的有效结合多肽。
使用Cy3(绿光)商用染料(Amersham,G.E.Healthcare)标记GRB2蛋白,蛋白染色步骤按产品说明书进行操作。蛋白标记结果如图2所示。
室温下用水润湿微阵列芯片10min,再与1%BSA的HEPES缓冲液(1mol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液,pH=7.0)在室温下孵育0.5h。0.5μM Cy3标记的GRB2蛋白缓冲液分别与微阵列芯片上不同的子阵列在室温下进行酶反应1h。然后用含0.05%Tween 20的TBS缓冲液反复冲洗(3×10min),将没有参与反应的蛋白从芯片上洗去。在安装有相关激光器的微阵列扫描仪对芯片进行扫描(Cy3:λ激发=548nm、λ发射=595nm)。
根据芯片上不同多肽样点上连接的蛋白荧光信号强弱评价多肽与蛋白结合能力。
结果如图3,指纹图谱上多肽样点的荧光信号强弱,确定GRB2蛋白与多肽的亲和力的强弱,并根据芯片上的荧光信号,排列出与GRB2蛋白亲和力最强前10条多肽,部分的多肽的序列(表1),分别为F01、E19、D21、A01、D04、F11、F16、E21、B15、D12。
表1多肽氨基酸序列
2)“双颜色”策略微阵列筛选
SH2结构域出现在许多蛋白结构中,筛选出具有选择性识别GRB2蛋白SH2结构域的抑制剂具有重要意义。本发明基于微阵列平台的“双颜色”策略,筛选出对不同SH2域的选择结合肽。
首先用两种不同的染料对蛋白进行标记,Cy5(红光)染料(Amersham,G.E.Healthcare)用于标记Lck、Src1蛋白,而靶标蛋白GRB2用Cy3(绿光)染料标记,蛋白标记结果如图2所示。
0.5μM GRB2分别与0.5μM LCK、SRC1蛋白混合后,将Cy3-GRB2/Cy5-Lck混合液、Cy3-GRB2蛋白/Cy5-Src1蛋白混合液分别与微阵列芯片上不同的子阵列在室温下孵育1h。然后用含0.05%Tween 20的TBS缓冲液反复冲洗(3×10min),将没有参与反应的蛋白从芯片上洗去。在安装有相关激光器的微阵列扫描仪对芯片进行扫描(Cy3:λ激发=548nm、λ发射=595nm;Cy5:λ激发=663nm、λ发射=692nm)。
根据芯片上不同多肽样点上连接的蛋白荧光信号评价多肽与对药物靶标蛋白的选择性。
结果如图4所示,若芯片上的多肽选择性与靶标蛋白GRB2结合,多肽样点上的荧光信号为绿色,则证明多肽具有较强特异性(若与Lck或Src1蛋白与结合,多肽样点上会产生红色荧光信号);当荧光信号为黄色时,即证明多肽与GRB2或Lck、Src1均产生相互作用,特异性较差。
通过使用“双颜色”筛选试验,识别出靶标蛋白GRB2 SH2结构域的选择性结合肽,根据Cy3-GRB2/Cy5-Src1蛋白反应的子阵列指纹图谱分析,肽段D04、F16、A01、E22、A11、A13、C17、B17、F01对GRB2蛋白具有较高的选择性,根据Cy3-GRB2/Cy5-Lck蛋白反应的子阵列指纹图谱分析,肽段F16、A01、D04、F02、F01、C17、D11、F03、F19、E22对GRB2蛋白的选择性较强。
3)基于浓度梯度的微阵列筛选实验
基于前面的“单点”与“双颜色”策略,筛选识别出与GRB2 SH2结构域的选择性结合多肽。为了进一步评价磷酸酪氨酸多肽与SH2结构域之间的结合强度,利用微阵列芯片的6个子阵列进行了浓度相关的微阵列分析。基于浓度的微阵列分析可以获得144个动力学常数Kd值,能够得到不同多肽对相同SH2结构域的亲和力大小。
将微阵列芯片的6个子阵列同时与6个不同浓度(0μM、0.0625μM、0.125μM、0.25μM、0.5μM、1μM)的SH2结构域蛋白缓冲液分别与微阵列芯片上不同的子阵列在室温下进行酶反应1h。然后用含0.05%Tween 20的TBS缓冲液反复冲洗(3×10min),将没有参与反应的蛋白从芯片上洗去。在安装有相关激光器的微阵列扫描仪对芯片进行扫描(Cy3:λ激发=548nm;λ发射=595nm)。
将不同浓度的SH2结构域应用于磷酸肽微阵列,然后得到浓度相关的指纹图谱。定量分析这些数据后,在软件上进行拟合得到动力学曲线,得到相应的Kd值,从而判断结合强度。
利用ArrayWoRx软件提取微阵列数据。将重复点的值减去背景值并取平均值。使用Treeview软件将数据集显示为彩色热图。其他数据分析使用Microsoft Excel进行。对于微阵列Kd实验,假设在孵育期间达到平衡,曲线拟合得到相应的Kd值。
结果如图5所示,多肽与蛋白间具有良好的亲和力,Kd值已经能够达到nM级别。
经过一系列筛选方法得到的多肽作进一步效果实验。
(5)蛋白沉降实验(Pull-down assay)
按照常规培养方法进行细胞培养,细胞培养在100mm培养皿中生长至90%以上,用胰酶将培养皿中的细胞消化,1000rpm离心5min除去上清液。用200~400μL PBS溶液重悬细胞,用1mL注射器通过22G针头反复吹打30~50次将细胞裂解,然后在4℃下13200rpm离心30min,上清液转移至新的离心管中,通过Bradford法测定蛋白浓度。
将抗生物素琼脂糖磁珠(Pierce,USA)与通过筛选证明与GRB2蛋白有结合的生物素多肽(终浓度10μM)在室温下孵育1h,然后用TBS缓冲液洗去未结合的多肽。洗涤后将磁珠加入到含有磷酸酶抑制剂(Na3VO4,最终浓度2mM)与2.5mg细胞裂解物的TBS缓冲液中,并在摇床上室温孵育1h。将含有磁珠的TBS缓冲液室温下4000xg离心5min,并用含有0.05%Tween 20的TBS缓冲液洗涤5~10次。用适量1×上样缓冲液重悬磁珠,并通过蛋白印迹实验(Western Blotting)进行表征分析,DMSO作为阴性对照。
结果如图6所示。从结果中可以清楚而明确地看出,本发明磷酸酪氨酸多肽能够从含多种蛋白的细胞裂解液垂钓出靶标蛋白GRB2,这与本发明微阵列筛选的结果一致,进一步证明了本发明的微阵列用于筛选药物靶标GRB2 SH2结构域结合多肽的准确性和能力。
抗肿瘤活性验证
(1)细胞毒性实验:
将肝癌细胞Huh7(来源于中科院细胞库)按照5000个细胞/孔的密度接种在96孔板中,细胞贴壁培养后加入工作浓度为200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、0μM多肽继续培养24h,96孔板中每孔加入10μL CCK-8试剂,1h后用酶标仪测定450nm波长下的吸光度。处理数据计算多肽对抑制Huh7细胞的IC50值。
细胞抑制率(%)=OD(实验组-空白组)/OD(对照组-空白组)×100%
结果如图6所示,多肽D21、F01的IC50值分别为36.40μM、53μM,结果表明多肽能够显著抑制肝癌细胞Huh7的生长。
(2)细胞划痕实验:
将肝癌细胞Huh7按照4×105个细胞/孔的密度接种在6孔板中,贴壁培养后,将DMEM完全培养基更换为DMEM基础培养基(无FBS)饥饿培养12h,排除FBS对细胞生长的干扰。用枪头在各个孔上画一条直线,将细胞刮除,再用PBS吹洗细胞表面,并加入新的培养基,实验组加入工作浓度为50μM的多肽继续培养,DMSO作为阴性对照组。用显微镜下拍照记录不同时间(0h、36h)细胞划痕的愈合情况,用Image J软件处理图片,并计算划痕面积。
伤口愈合率(%)=(划痕面积t=0h—划痕面积t=36h)/划痕面积t=0h×100%
结果图8A和图8B所示,多肽F01和D21分别对Huh7癌细胞的迁移产生了抑制作用,表现出了抑制肿瘤转移的潜力。
(3)荧光共定位实验:
将Huh7细胞按照3000个细胞/皿接种在共聚焦培养皿中,贴壁培养后,除去旧的培养基,加入含有50μM氨基端FITC-ACP修饰的多肽的DMEM培养基,DMSO作为阴性对照组,继续培养24h。除去培养基后,用PBS缓冲液清洗三遍,加入1mL 4%多聚甲醛溶液室温下孵育0.5h固定细胞。除去多聚甲醛溶液并用PBS缓冲液清洗三遍,再加入含有0.1%Triton的PBS缓冲液孵育10min破膜。除去Triton溶液并用PBS缓冲液清洗三遍,加入含Anti-GRB2抗体(1:1000,购于Abcam公司)的PBST溶液(含有1%BSA和0.1%Tween 20的PBS缓冲液),4℃摇床上孵育过夜。之后用PBS缓冲液清洗三遍,加入含荧光二抗(1:5000,购于CST公司)PBST缓冲液,室温摇床上避光孵育2h。之后用PBS缓冲液清洗三遍,加入含20μg/mL DAPI染料(购于Sigma公司)避光孵育3min,之后用PBS缓冲液清洗三遍,最后用抗荧光淬灭封片剂。用激光共聚焦显微镜对样本进行检测。
结果如图9所示,结果显示FITC修饰多肽(绿光)在细胞内与GRB2蛋白(红光)有明显的重合,表明多肽在细胞中也能够靶向GRB2蛋白,进一步验证上述抑制癌细胞的生长,是通过靶向细胞内GRB2蛋白而实现的。
实施例2
一种诊断或治疗肿瘤试剂,包括IYIHR-pY-ENVSI、AELEF-pY-MDYEA、VNTTL-pY-EKFTY、AEKPF-pY-VNVEF、PPDHQ-pY-YNDFP、SADHL-pY-VNVSE、GPQDI-pY-DVPPV的至少一条多肽;所述肿瘤为肝癌,还包括药学上可接受的载体和/或辅料。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学·深圳
<120> 靶向GRB2 SH2结合域的抗肿瘤多肽及其应用
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ile Tyr Ile His Arg Tyr Glu Asn Val Ser Ile
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Ala Glu Leu Glu Phe Tyr Met Asp Tyr Glu Ala
1 5 10
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Val Asn Thr Thr Leu Tyr Glu Lys Phe Thr Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Ala Glu Lys Pro Phe Tyr Val Asn Val Glu Phe
1 5 10
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Pro Pro Asp His Gln Tyr Tyr Asn Asp Phe Pro
1 5 10
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu
1 5 10
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Gly Pro Gln Asp Ile Tyr Asp Val Pro Pro Val
1 5 10
Claims (10)
1.一种靶向GRB2 SH2结构域多肽的筛选方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)选取含有磷酸化酪氨酸多肽;
2)构建包含步骤1)磷酸化酪氨酸多肽的微阵列,所述磷酸化酪氨酸多肽通过生物素标签与链霉亲和素高亲和力作用而固定在微阵列芯片上;
3)将“单点”微阵列、双颜色策略微阵列、基于浓度梯度的微阵列动力学分析依次应用于GRB2 SH2结构域的高亲和力多肽筛选;
4)根据微阵列上磷酸化酪氨酸多肽与GRB2 SH2结构域的相互作用,从而鉴定出与GRB2SH2结构域相互作用的多肽,即靶向GRB2 SH2结构域多肽。
2.权利要求1方法筛选得到的靶向GRB2 SH2结构域多肽,其特征在于,所述多肽的氨基酸序列选自以下至少一条:IYIHR-pY-ENVSI、AELEF-pY-MDYEA、VNTTL-pY-EKFTY、AEKPF-pY-VNVEF、PPDHQ-pY-YNDFP、SADHL-pY-VNVSE、GPQDI-pY-DVPPV。
3.权利要求2所述多肽在制备诊断GRB2蛋白介导的疾病试剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述疾病为肿瘤。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述肿瘤为肝癌。
6.权利要求2所述多肽在制备治疗GRB2蛋白介导的疾病试剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述疾病为肿瘤。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述肿瘤为肝癌。
9.一种诊断或治疗肿瘤试剂,其特征在于,所述试剂包括权利要求2所述多肽。
10.根据权利要求9所述的试剂,其特征在于,所述肿瘤为肝癌。
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