NO311355B1

NO311355B1 - Indolinonforbindelser, farmasöytisk preparat samt anvendelse

Info

Publication number: NO311355B1
Application number: NO19965377A
Authority: NO
Inventors: Peng Cho Tang; Li Sun; Gerald Mcmahon
Original assignee: Sugen Inc
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-12-13
Publication date: 2001-11-19
Also published as: DE69612649D1; US20030176487A1; DE29623744U1; ATE200863T1; HUP9701694A3; US6225335B1; US5883116A; US20010027207A1; NO965377L; EP0769947B1; DK0769947T3; US5883113A; AR003088A1; JP3231044B2; EP0934931A2; US5792783A; CA2192797A1; ES2159741T3; JPH10504323A; HU226755B1

Description

Foreliggende oppfinnelse angår nye indolinonforbindelser som er i stand til modulering, regulering og/eller inhibering av tyrosinkinasesignaltransduksjon. Foreliggende oppfinnelse er også rettet mot anvendelse av forbindelsene for regulering, modulering eller inhibering av tyrosinkinaser, enten av reseptor- eller ikke-reseptorklassen, for prevensjon og/eller behandling av forstyrrelser relatert til ikke-regulert tyrosinkinasesignaltransduksjon inkludert celleproliferative og metabolske forstyrrelser. Oppfinnelsen vedrører også farmasøytiske preparater inneholdende de nevnte forbindelser.

Proteintyrosinkinaser, PTK'er, omfatter en stor og uensartet klasse av proteiner med enzymatisk aktivitet. PTK'ene spiller en viktig rolle ved kontroll av cellevekst og differensiering (for et overblikk, se Schlessinger & Ullrich, 1992, "Neuron", 9 : 383-391) .

For eksempel blir reseptortyrosinkinase-mediert signaltransduksjon initiert ved ekstracellulær interaksjon med en spesifikk vekstfaktor (ligand), fulgt av reseptordimerisering, transientstimulering av den iboende proteintyrosinkinaseaktivitet og fosforylering. Derved skapes det bindingsseter for intracellulære signaltransduksjonsmolekyler og det fører til dannelse av komplekser med et spektrum av cytoplasmiske signaleringsmolekyler som letter den egnede cellulære respons (for eksempel celledeling, metabolske virkninger på den ekstracellulære mikroomgivelse), se Schlessinger og Ullrich, 1992, "Neuron", 9: 383-391.

Når det gjelder reseptortyrosinkinaser, er det også vist at tyrosinfosforyleringsseter virker som høy-affinitetsbindings-seter for SH2(src-homologi)-domener av signalerende molekyler, se Fantl et al., 1992, "Cell", 69: 413-423; Songyang et al., 1994, "Mol. Cell. Biol.", 14: 2777-2785; Songyang et al., 1993, "Cell", 72: 767-778; og Koch et al., 1991, "Science", 252: 668-678. Forskjellige intracellulære substratproteiner som assosierer med reseptortyrosinkinaser, RTK<1>er, er identifisert. De kan inndeles i to hovedgrupper, (1) substrater med et katalytisk domene; og (2) substrater som mangler et slikt domene, men som tjener som adaptere og assosierer med katalytisk aktive molekyler, se Songyang et al., 1993, "Cell", 72: 767-778. Spesifisiteten for interaksjonene mellom reseptorer eller proteiner og SH2-domener av deres substrater, bestemmes ved aminosyrerestene som umiddelbart omgir den fosforylerte tyrosinrest. Forskjeller i bind-ingsaffinitetene mellom SH2-domener og aminosyresekvensene som omgir fosfotyrosinrestene på spesielle reseptorer, er konsistent med de observerte differanser når det gjelder deres substrat-fosforyleringsprofiler, se Songyang et al., 1993, "Cell", 72: 767-778. Disse observasjoner antyder at funksjonen for hver reseptortyrosinkinase bestemmes ikke bare ved dens ekspresjonsmønster og 1igandtilgjengelignet, men også ved mønsteret av nedstrøms signaltransduksjonsveier som aktiveres av en spesiell reseptor. Således gir fosforylering et viktig regulatorisk trinn som bestemmer selektiviteten for signaleringsveier som rekrutteres av spesifikke vekstfaktorreseptorer, så vel som differenseringsfaktorreseptorer.

Feilaktig ekspresjon eller mutasjoner i PTK'ene er påvist og fører til enten ikke-kontrollert celleproliferering (for eksempel malign tumorvekst) eller til defekter i nøkkel-utviklingsprosesser. Som et resultat har det biomedisinske fellesskap satt inn betydelige ressurser for å finne den spesifikke, biologiske rolle for medlemmer av PTK-familien, deres funksjon i differenseringsprosesser, deres involvering i tumorigeneser og i andre sykdommer, de biokjemiske mekan-ismer som ligger under signaltransduksjonsveiene som aktiveres ved ligandstimulering og utvikling av nye medikamenter.

Tyrosinkinaser kan være av reseptortypen (med ekstracellulære, transmembrane og intracellulære domener) eller ikke-reseptortypen (helt og holdent intracellulær).

Reseptortyrosinkinaser. RTK'ene omfatter en stor familie av transmembranreseptorer med diverse biologiske aktiviteter. Den iboende funksjon av RTK'ene aktiveres ved ligandbinding som resulterer i fosforylering av reseptoren og multiple cellulære substrater, og deretter i en varietet av cellulær-responser, se Ullrich & Schlessinger, 1990, "Cell", 61: 203-212 .

I dag er minst 19 distinkte RTK-subfamilier identifisert. En RTK-subfamilie, kalt HER-subfamilien, antas å bestå av EGFR, HER2, HER3 og HER4. Ligander til HER-subfamilien av reseptorer inkluderer epitelial vekstfaktor (EGF), TGF-a, amfi-regulin, HB—EGF, fi-cellulin og heregulin.

En andre familie av RTK'er, kalt insulin-subfamilien, består av INS-R, IGF-1R og IR-R. En tredje familie, "PDGF"-subfamilien, inkluderer PDGF-a- og -fi-reseptorene, CSFIR, c-kit og FLK-II. Nok en subfamilie, RTK'er, identifisert som FLK-familien, antas å bestå av den kinase-innskutt-domene-reseptor føtal leverkinase-1 (KDR/FLK-1), den fatale leverkinase-4 (FLK-4) og fms-lignende tyrosinkinase-1 (flt-1). Hver av disse reseptorer ble til å begynne med antatt å være reseptorer for hematopoetiske vekstfaktorer. To andre subfamilier av RTK'er er angitt som FGF-reseptorfamilien (FGFR1, FGFR2, FGFR3 og FGFR4) og Met-subfamilien (c-met og Ron).

På grunn av likhetene mellom PDGF- og FLK-subfamiliene betraktes de to subfamilier ofte sammen. De kjente RTK-subf amilier er identifisert i Plowman et al., 1994, "DN&P", 7 (6) : 334-339, hvor til det henvises for detaljer.

Ikke-reseptortyrosinkinaser. Ikke-reseptortyrosinkinasene representerer en samling av cellulære enzymer som mangler ekstracellulære og transmembrane sekvenser. I dag er over 24 individuelle ikke-reseptortyrosinkinaser, omfattende 11 subfamilier (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack og LIMK) identifisert. I dag består Src-subfamilien av ikke-reseptortyrosinkinaser av det største antall PTK'er og omfatter Src, Yes, Fyn, Lyn, Lek, Blk, Hek, Fgr og Yrk. Src-subfamilien av disse enzymer er forbundet med onkogenese. En mer detaljert diskusjon av ikke-reseptortyrosinkinasene gis i Bolen, 1993, "Oncogene", 8: 2025-2031, hvor til det henvises for detaljer.

Mange av tyrosinkinasene, enten en RTK- eller ikke-reseptortyrosinkinase, er funnet å være involvert i cellulære signaleringsveier som fører til cellulære signalmønstere som signalerer veier som fører til patogene tilstander inkludert cancer, psoriasis og hyperimmunrespons.

Utvikling av forbindelser for å modulere PTK'ene. I lys av den påviste betydning av PTK'er for kontroll, regulering og modulering av celleproliferering og sykdommer og forstyrrelser forbundet med abnorm celleproliferering, er det gjort mange forsøk på å identifisere reseptor- og ikke-reseptortyrosinkinase-"inhibitorer" ved bruk av et antall tilnærm-elser inkludert bruken av mutantligander (US 4 966 849), oppløselige reseptorer og antistoffer (WO 94/10202; Kendall & Thomas, 1994, "Proe. Nat'l Acad. Sei", 90: 10704-09; Kim et al., 1993 "Nature", 362: 841-844), RNA-ligander (Jellinek et al., "Biochemistry", 33: 10450-56); Takano et al., 1993, "Mol. Bio. Cell", 4: 358A; Kinsella et al., 1992, "Exp. Cell Res.", 199: 56-62; Wright et al., 1992, "J. Cellular Phys.", 152: 448-57) og tyrosinkinaseinhibitorer (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; US 5 330 992; Mariani et al., 1994, "Proe. Am. Assoc. Cancer Res.", 35: 2268).

I den senere tid har det vært gjort forsøk på å identifisere små molekyler som virker som tyrosinkinaseinhibitorer. For eksempel er bis-monocykliske, bicykliske eller heterocykliske arylforbindelser (PCT WO 92/20642), vinyliden-azaindolderi-vater (PCT WO 94/14808) og l-cyklopropyl-4-pyridyl-kinoloner (US 5 330 992) påvist generelt som tyrosinkinaseinhibitorer. Styrylforbindelser (US 5 217 999) , styryl-substituerte pyridylforbindelser (US 5 302 606), visse kinazolinderivater (EP 0 566 266 Al), seleoindoler og selenider (PCT WO 94/03427), tricykliske polyhydroksylforbindelser (PCT WO 92/21660) og benzylfosfonsyreforbindelser (PCT WO 91/15495) er beskrevet som forbindelser for bruk som tyrosinkinaseinhibitorer for bruk ved behandling av cancer.

Identifiseringen av effektive små forbindelser som spesifikt inhiberer signaltransduksjonen ved modulering av aktiviteten av reseptor- og ikke-reseptor-tyrosinkinaser for å regulere og modulere abnorm og gal celleproliferering er derfor ønskelig og også et formål for foreliggende oppfinnelse.

Foreliggende oppfinnelse angår organiske molekyler som er i stand til å modulere, regulere og/eller å inhibere tyrosinkinasesignaltransduksjon. Slike forbindelser er anvendbare for behandling av sykdommer relatert til ikke-regulert TKS-transduksjon inkludert celleproliferative sykdommer som cancer, aterosklerose, artritt og restenose og metabolske sykdommer som diabetes.

Foreliggende oppfinnelse vedrører således en forbindelse som er kjennetegnet ved at den har formelen:

og farmasøytisk aksepterbare salter derav, hvor R-l og R3 er H,

R2 er 0,

R4, R5, R6 og R7 er uavhengig valgt blant hydrogen, Cx- C^-alkyl, C1-C4-alkoksy, fenyl som eventuelt er substituert med C-L-Cg-alkyl eller C-L-Cg-alkoksy, halogen, trihalometyl, S02NRR', N02, NRR1 , OH, C(0)R', NHC(0)R, (CH2)nC02R og CONRR' , A er en 5-leddet heteroarylring valgt blant tiofen, pyrrol, pyrazol, imidazol, 1,2,3-triazol, 1,2,4-triazol, oksazol, isoksazol, tiazol, isotiazol, 2-sulfonylfuran, 4-alkylfuran, 1,2,3-oksadiazol, 1,2,4-oksadiazol, 1,2,5-oksadiazol, 1,3,4-oksadiazol, 1,2,3,4-oksatriazol, 1,2,3,5-oksatriazol, 1,2,3-tiadiazol, 1,2,4-tiadiazol, 1,2,5-tiadiazol, 1,3,4-tiadiazol, 1,2,3,4-tiatriazol, 1,2,3,5-tiatriazol og tetrazol, eventuelt substituert i en eller flere stillinger med C^-C^-alkyl, Cx-C4-alkoksy, eventuelt med halogen eller trihalometyl substituert fenyl, fenyl-C1-C4-alkyl, benzoyl, halogen, S03R, SR, N02, C(0)R, (CH2)nC02R eller CONRR' ,

n er 0-3,

R er H eller C1-C4-alkyl, og

R<1> er H, C1-C4-alkyl eventuelt substituert med di-C-L-C^-alkylamino eller pyrrolidino eller fenyl eventuelt substituert med halogen og/eller C^-C^-alkoksy hvor nevnte forbindelse regulerer, inhiberer eller modulerer tyrosinkinasesignaltransduksjon,

med den betingelse at de følgende forbindelser er utelukket: 3-[(pyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon,

3-[(5-klor-3,4-dimetylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(3,5-dimetyl-4-etylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(3,5-dimetyl-4-etoksykarbonylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon,

2- [[[l-etyl-2,3-dihydro-2-okso-3-(lH-pyrrol-2-ylmetylen-lH-indol-5-yl]oksy]metyl]benzosyre,

3- [(i-metyl-5-nitro-imidazol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(tien-2-yl)metylen]-2-indolinon,

3-[(2-butyl-lH-imidazol-4-yl)metylen]-2,3-dihydro-2-okso-lH-indol-7-eddiksyre-etylester,

3-[(2-butyl-l-[(l,1-dimetyletoksy)karbonyl]-lH-imidiazol-4-yl)metylen]-2,3-dihydro-2 -okso-1H-indol-7-eddiksyre-etyl-ester,

3-[(tiofen-2-yl)metylen]-2-indolinon,

6-nitro-3-[(pyrrol-2-yl)metylen] 2-indolinon, 5- klor-3-[(tiazol-5-yl)metylen]-2-indolinon, 6- dietylamino-3-[(isotiazol-5-yl)metylen]-2-indolinon og 5-benzoyl-3-[(imidazol-4-yl)metylen]-2-indolinon.

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av en forbindelse med formel:

og farmasøytisk aksepterbare salter derav, hvor:

Rx og R3 er H,

R2 er 0,

R4, R5, R6 og R7 er uavhengig valgt blant hydrogen, C^-C^-alkyl, C-L-C^-alkoksy, fenyl som eventuelt er substituert med C-L-Cg-alkyl eller C-L-Cg-alkoksy, halogen, trihalometyl, S02NRR', N02, NRR' , OH, C(0)R', NHC(0)R, (CH2)nC02Rog CONRR1 , A er en 5-leddet heteroarylring valgt blant tiofen, pyrrol, pyrazol, imidazol, l,2,3-triazol, 1,2,4-triazol, oksazol, isoksazol, tiazol, isotiazol, 2-sulfonylfuran, 4-alkylfuran, 1,2,3-oksadiazol, 1,2,4-oksadiazol, 1,2,5-oksadiazol, 1,3,4-oksadiazol, l,2,3,4-oksatriazol, 1,2,3,5-oksatriazol, 1,2,3-tiadiazol, 1,2,4-tiadiazol, 1,2,5-tiadiazol, 1,3,4-tiadiazol, 1,2,3,4-tiatriazol, 1,2,3,5-tiatriazol og tetrazol, eventuelt substituert i en eller flere stillinger med C-L-C^-alkyl, C1-C4-alkoksy, eventuelt med halogen eller trihalometyl substituert fenyl, fenyl-C1-C4-alkyl, benzoyl, halogen, S03R, SR, N02, C(0)R, (CH2)nC02R eller CONRR',

n er 0-3,

R er H eller C1-C4-alkyl, og

R' er H, C1-C4-alkyl eventuelt substituert med di-C1-C4-alkyl-amino eller pyrrolidino eller fenyl eventuelt substituert med halogen og/eller C1-C4-alkoksy

hvor nevnte forbindelse regulerer, inhiberer eller modulerer tyrosinkinasesignaltransduksjon,

3- [(l-metyl-5-nitro-imidazol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(tien-2-yl)metylen]-2-indolinon,

3-[(2-butyl-l-[(1,1-dimetyletoksy)karbonyl]-lH-imidiazol-4-yl)metylen]-2,3-dihydro-2-okso-lH-indol-7-eddiksyre-etyl-ester,

3-[(tiofen-2-yl)metylen]-2-indolinon,

6-nitro-3-[(pyrrol-2-yl)metylen]2-indolinon, 5- klor-3-[(tiazol-5-yl)metylen] -2-indolinon, 6- dietylamino-3-[(isotiazol-5-yl)metylen]-2-indolinon, og 5- benzoyl-3-[(imidazol-4-yl)metylen]-2-indolinon,

for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av sykdommer relatert til tyrosinkinasesignaltransduksjon; som regulering, modulering eller inhibering av tyrosinkinasesignaltransduksjon.

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse valgt blant 3-[(3-metylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(3,4-dimetylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(2-metyltien-5-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(3-metyltien-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-{[4-(2-metoksykarbonyletyl)-3-metylpyrrol-5-yl]metylen}-2 - indolinon, 3-[(4,5-dimetyl-3-etylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(5-metylimidazol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 5-klor-3-[(5-metyltien-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(3,5-dimetylpyrrol-2-yl)metylen]-5-nitro-2-indolinon, 3- [ (3- (2-karboksyetyl)-4-metylpyrrol-5-yl)metylen]-2-indolinon, 5-klor-3-[(3,5-dimetylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon og 3-[(2,4-dimetylpyrrol-5-yl)metylen]-2-indolinon, eller et farmasøytisk aksepterbart salt derav, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av sykdommer relatert til tyrosinkinasesignaltransduksjon; som regulering, modulering eller inhibering av tyrosinkinasesignaltransduksjon.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også et farmasøytisk preparat omfattende en farmasøytisk effektiv mengde av en av de ovenfor angitte forbindelser med formel (I) og en farma-søytisk aksepterbar bærer eller eksipiens. Et slikt preparat antas å modulere signaltransduksjonen forårsaket av en tyrosinkinase, enten ved inhibering av katalytisk effektivitet, affinitet til ATP eller evnen til interaksjon med et substrat.

Mere spesielt kan preparatene ifølge oppfinnelsen anvendes for behandling av sykdommer omfattende proliferering, fibrotiske eller metabolske forstyrrelser, for eksempel cancer, fibrose, psoriasis, aterosklerose, artritt eller andre forstyrrelser relatert til abnorm vaskulogenese og/eller angiogenese som diabetisk retinopati.

Definisjoner

"Farmasøytisk akseptable salter" angår de salter som bibe-holder den biologiske effektivitet og egenskaper hos de frie baser og som oppnås ved reaksjon med uorganiske syrer som saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, salpetersyre, fosfor-syre, metansulfonsyre, etansulfonsyre, p-toluensulfonsyre eller salicylsyre og lignende.

"Alkyl" betyr et rettkjedet, forgrenet eller cyklisk, mettet, alifatisk hydrokarbon. Det er fortrinnsvis en lavere alkyl-gruppe med fra 1 til 6 karbonatomer og særlig fra 1 til 4 karbonatomer. Som karakteristiske alkylgrupper kan man nevne metyl, etyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tertiært butyl, pentyl, heksyl og lignende. Alkylgruppen kan eventuelt være substituert som angitt i det foregående.

"Alkoksy" henviser til en "-Oalkyl"-gruppe.

Foreliggende oppfinnelse angår som nevnt i det foregående forbindelser som er i stand til å regulere og/eller modulere tyrosinkinasesignaltransduksjon og mere spesielt reseptor- og ikke-reseptortyrosinkinasesignaltransduksjon.

Reseptortyrosinkinase-mediert signaltransduksjon initieres ved ekstracellulær interaksjon med en spesifikk vekstfaktor (ligand), fulgt av reseptordimerisering, transient stimul-ering av den iboende proteintyrosinkinaseaktivitet og fosforylering. Det dannes derved bindingsseter for intracellulære signaltransduksjonsmolekyler og fører til dannelsen av komplekser med et spektrum av cytoplasmiske signaleringsmolekyler som letter den egnede cellulære respons (for eksempel celledeling, metabolske effekter på den ekstracellulære mikroomgivelse), se Schlessinger og Ullrich, 1992, "Neuron", 9: 3 83-391.

Det er påvist at tyrosinfosforyleringsseter i vekstfaktorreseptorer virker som høy-affinitetsbindingsseter for SH2-(src-homologi)-domener av signalerende molekyler, se Fantl et al., 1992, "Cell", 69: 413-423; Songyang et al., 1994, "Mol. Cell. Biol.", 14: 2777-2785; Songyang et al., 1993, "Cell", 72: 767-778; og Koch et al., 1991, "Science", 252: 668-678. Diverse intracellulære substratproteiner som assosierer med reseptortyrosinkinaser er identifisert. De kan deles i to hovedgrupper, (1) substrater som har et katalytisk domene; og (2) substrater som mangler et slikt domene, men som tjener som adaptere og assosierer med katalytisk aktive molekyler, se Songyang et al., 1993, "Cell", 72: 767-778. Spesifisiteten for interaksjonene mellom reseptorer og SH2-domener av deres substrater bestemmes av aminosyrerestene som umiddelbart omgir den fosforylerte tyrosinrest. Differanser i bindings-affinitetene mellom SH2-domenene og aminosyresekvensene som omgir fosfotyrosinrestene på spesielle reseptorer er konsistent med de observerte differanser i substratfosforylerings-profilene, se Songyang et al., 1993, "Cell", 72: 767-778. Disse observasjoner antyder at funksjonen for hver reseptortyrosinkinase bestemmes ikke bare av dens ekspresjons- og ligandtilgjengelighetsmønster, men også av mønsteret av ned-strøms signaltransduksjonsveier som aktiveres av en spesiell reseptor. Således gir fosforylering et viktig regulatorisk trinn som bestemmer selektiviteten for signaleringsveiene som rekrutteres av spesifikke vekstfaktorreseptorer, så vel som differenseringsfaktorreseptorer.

Tyrosinkinasesignaltransduksjoner resulterer, blant andre responser, i celleproliferering, differensiering og metabo-lisme. Abnorm celleproliferering kan resultere i et vidt spektrum av forstyrrelser og sykdommer, inkludert utvikling av neoplasi som karsinom, sarkom, leukemi, glioblastom, hemangiom, psoriasis, arteriosklerose, artritt og diabetisk retinopati (eller andre forstyrrelser som relaterer til ukontrollert angiogenese og/eller vaskulogenese). Oppfinnelsen er derfor rettet mot forbindelser som regulerer, modulerer og/eller inhiberer tyrosinkinasesignaltransduksjon ved påvirkning av den enzymatiske aktivitet av RTK<1>er og/eller ikke-reseptortyrosinkinaser og interfererer med signalet som transduserer slike proteiner. Mere spesielt er oppfinnelsen rettet mot forbindelser som regulerer, modulerer og/eller inhiberer RTK og/eller ikke-reseptortyrosinkinase-mediert signaltransduksjonsveier som en terapeutisk vei for å helbrede leukemi og mange typer faste tumorer, inkludert men ikke begrenset til karsinom, sarkom, erytroblastom, glioblastom, meningiom, astrocytom, melanom og myoblastom. Indikasjonene kan omfatte, men er ikke begrenset til hjerne-cancer, blærecancer, ovariecancer, gastrisk cancer, pankreas-cancer, koloncancer, blodcancer, lungecancer og bencancer.

I en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen, er forbindelsen med formel (I) 3-[(2,4-dimetylpyrrol-5-yl)metylen]-2- indolinon.

Den kjemiske formel som her vises kan oppvise fenomenene tautomeri eller strukturell isomeri. For eksempel kan forbindelsene som her beskrives adoptere en cis- eller trans-konformasjon rundt dobbeltbindingen som forbinder indolinon-3- substituenten til indolinonringen, eller kan være en blanding av cis- og trans-isomerer. Da formeltegningen i beskrivelsen kun kan representere en mulig tautomer eller strukturell isomer form, skal det være klart at oppfinnelsen omfatter enhver tautomer eller strukturelt isomer form eller blandinger derav som har evnen til å regulere, inhibere og/eller modulere tyrosinkinasesignaltransduksjon eller celleproliferering og er ikke begrenset til noen tautomer eller strukturell isomer form som benyttes innenfor formeltegningen.

I tillegg til de ovenfor angitte forbindelser og deres farma-søytisk akseptable salter, er oppfinnelsen videre, der det er mulig, rettet mot solvatiserte så som ikke-solvatiserte former av forbindelsene (for eksempel hydratiserte former) med evnen til å regulere og/eller å modulere celleproliferering .

Forbindelsene som her beskrives kan fremstilles ved en hvilken som helst kjent metode som kan anvendes for fremstilling av kjemisk relaterte forbindelser. Egnede prosesser er illustrert i eksemplene. Nødvendige utgangsstoffer kan oppnås ved standardprosedyrer innen den organiske kjemi.

En individuell forbindelses relevante aktivitet og effektivitet som et middel for å påvirke reseptortyrosinkinase-mediert signaltransduksjon kan bestemmes ved å benytte tilgjengelige teknikker. Fortrinnsvis blir en forbindelse underkastet en serie bedømmelser for å bestemme forbindelsens evne til å modulere, regulere og/eller å inhibere celleproliferering. Disse bedømmelser i den rekke de gjennomføres, inkluderer de biokjemiske analyser, cellevekstanalyser og in vivo-forsøk.

Forbindelsene som her beskrives er brukbare for behandling av forstyrrelser relatert til ikke-regulert tyrosinkinasesignaltransduksjon inkludert celleproliferative forstyrrelser, fibrotiske forstyrrelser og metabolske forstyrrelser.

Celleproliferative forstyrrelser som kan behandles eller studeres ytterligere ved hjelp av forbindelsene ifølge oppfinnelsen er cancere, blodkarproliferative forstyrrelser og mesangialcelle proliferative forstyrrelser.

Blodcelleproliferative forstyrrelser refererer til angio-geniske og vaskulogeniske forstyrrelser som generelt resulterer i abnorm proliferering av blodkar. Dannelsen og spredningen av blodkar eller henholdsvis vaskulogenese og angiogenese, spiller en viktig rolle i en varietet av fysio-logiske prosesser som embryonisk utvikling, corpus luteum dannelse, sårhelbredelse og organ-regenerering. De spiller også en sentral rolle ved cancerutvikling. Andre eksempler på blodprolifereringsforstyrrelser inkluderer artritt, der nye kapillærblodkar invaderer ledd og ødelegger bindevev, og okulære sykdommer som diabetisk retinopati, der nye kapil-lærer i retina invaderer glasslegemet, blør og forårsaker blindhet. Omvendt er forstyrrelser relatert til krymping, kontraksjon og lukking av blodkar som restenose, også implikert.

Fibrotiske forstyrrelser henviser til abnorm dannelse av ekstracellulær matriks. Eksempler på fibrotiske forstyrrelser inkluderer hepatisk cirrhose og mesangialcelle proliferative forstyrrelser. Hepatisk cirrhose karakteriseres ved en økning i ekstracellulære matriksbestanddeler som resulterer i dannelsen av et hepatisk arr. Hepatisk cirrhose kan forårsake sykdommer som levereirrhose. En øket ekstracellulær matriks som resulterer i et hepatisk arr kan også forårsakes av virale infeksjoner som hepatitt. Lipocytter synes å spille en vesentlig rolle ved hepatisk cirrhose. Andre fibrotiske forstyrrelser som er implisert inkluderer aterosklerose (se nedenfor).

Mesangialcelle proliferative forstyrrelser refererer til forstyrrelser som skyldes abnorm proliferering av mesangiale celler. Mesangiale proliferative forstyrrelser inkluderer forskjellige human renale sykdommer, som glomerulonefritt, diabetisk nefropati, malign nefrosklerose, trombotiske mikroangiopatisyndromer, transplantatawisning og glomerulopatier. PDGF-R er implisert i opprettholdelsen av mesangialcelle proliferering, se Floege et al., 1993, "Kidney Inter-national", 43: 47S-54S.

PTK'er er forbundet med slike celleproliferative forstyrrelser. For eksempel er visse medlemmer av RTK-familien assosiert med utvikling av cancer. Enkelte av disse reseptorer som EGFR (Tuzi et al., 1991, "Br. J. Cancer", 63: 227-233; Torp et al., 1992, "AMPIS", 100: 713-719), HER2/neu (Slamon et al., 1989, "Science", 244: 707-712) og PDGF-R (Kumabe et al., 1992, "Oncogene", 7: 627-633) er overuttrykt i mange tumorer og/eller persistent aktivert ved autokrine løkker. Således er, i de fleste vanlige og alvorlige cancere, disse reseptor-overekspresjoner (Akbasak og Suner-Akbasak et al., 1992, "J. Neurol. Sei.", 111: 119-133; Dickson et al., 1992, "Cancer Treatment Res.", 61: 249-273; Kore et al., 1992, "J. Clin. Invest.", 90: 1352-1360) og autokrine løkker (Lee og Donoghue, 1992, "J. Cell. Biol.", 118: 1057-1070; Kore et al., supra; Akbasak og Suner-Akbasak et al., supra) påvist. For eksempel er EGFR-reseptoren assosiert med skvamøs cellekarsinom, astrocytom, glioblastom, hode- og ryggcancer, lungecancer og blærecancer. HER2 er assosiert med bryst-, ovarie-, gastrisk-, lunge-, pankreas- og blærecancer. PDGF-R er forbundet med glioblastom, lunge-, ovarie-, melanom- og prostatacancer. RTK c-met er generelt forbundet med hepato-karsinogenese og således hepatocellulær karsinom. I tillegg er c-met forbundet med malign tumordannelse. Mere spesielt er RTK c-met forbundet med, blant andre cancere, kolorektalt, tyreoid, pankreatisk og gastrisk karsinom, leukemi og lymfom. I tillegg er overekspresjon av c-met-genet påvist hos pasi-enter med Hodgkins sykdom, Burkitts sykdom og lymfomcelle-linjen.

IGF-IR er, i tillegg til å være implisert i næringsstøtte og i type II-diabetes, også assosiert med flere typer cancere. For eksempel er IGF-I implisert som en autokrin vekststimu-lator for flere tumortyper, for eksempel humane brystcancer-karsinomceller (Arteaga et al., 1989, "J. Clin. Invest.", 84: 1418-1423) og små lungetumorceller (Macauley et al., 1990, "Cancer Res.", 50: 2511-2517). I tillegg synes IGF-I, integralt involvert i den normale vekst og differensiering av nervesystemet, å være en autokrin stimulator for humane gliomer, se Sandberg-Nordqvist et al., 1993, "Cancer Res.", 53: 2475-2478. Betydningen av IGF-IR og dens ligander i celleproliferering understøttes ytterligere av det faktum at mange celletyper i kultur (fibroblaster, epitelceller, glatte muskelceller, T-lymfocytter, myeoloidceller, kondrocytter, osteoblaster, stamceller fra benmargen) stimuleres til vekst av IGF-I, se Goldring og Goldring, 1991, "Eukaryotic Gene Expression", 1: 301-326. I en serie nylige publikasjoner foreslår Baserga sogar at IGF-I-R spiller en sentral rolle i mekanismene for transformering og kunne, som sådan, være et foretrukket mål for terapeutiske intervensjoner for et bredt spektrum av humane maligniteter, se Baserga, 1995, "Cancer Res.", 55: 249-252; Baserga, 1994, "Cell", 79:927-930; Coppola et al., 1994, "Mol. Cell. Biol.", 14: 4588-4595.

Assosiasjonen mellom abnormiteter i RTK'er og sykdom er imidlertid ikke begrenset til cancer. For eksempel er RTK'er assosiert med metabolske sykdommer som psoriasis, diabetes mellitus, sårhelbredelse, inflammasjon og neurodegenerative sykdommer. For eksempel er EGF-R indikert i korneal og dermal sårheling. Defekter i insulin-R og IGF-IR indikeres i type type-II-diabetes mellitus. En mer fullstendig korrelasjon mellom spesifikke RTK<1>er og deres terapeutiske indikasjoner er angitt i Plowman et al., 1994, "DN&P", 7: 334-339.

Ikke bare reseptortype tyrosinkinaser, men også mange cellulære tyrosinkinaser, CTK'er, som inkluderer src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lek, blk, hek, fgr, yrk (oppsummert av Bolen et al., 1992, "FASEB J.", 6:3403-3409), er involvert i den proliferative og metabolske signaltransduksjonsvei og således i indikasjoner ifølge oppfinnelsen. For eksempel er mutert src (v-src) påvist som et onkoprotein (pp60<v>-<src>) i kyllinger. Videre transmitterer dens cellulære homolog, proto-onkogenet pp60<c>"<src>, onkogeniske signaler av mange reseptorer. For eksempel fører overekspresjon av EGF-R eller HER2/neu i tumorer til den konstitutive aktivering av pp60<c>"<src>, som er karakteristisk for den maligne celle, men fraværende fra den normale celle. På den annen side viser mus som er defekte for ekspresjon av c-src en osteopetrotisk fenotype, noe som antyder en nøkkeldeltagelse av c-src i osteoklastfunksjon og en mulig involvering i relaterte forstyrrelser. På samme måte er Zap 70 implikert i T-cellesignalering.

Videre er identifiseringen av CTK-moduleringsforbindelser for å øke eller sogar synergisére med RTK-rettede blokker et aspekt ved oppfinnelsen.

Til slutt er både RTK'er og ikke-reseptortype kinaser forbundet med hyperimmune forstyrrelser.

De her beskrevne forbindelser kan administreres til en human pasient per se, eller i farmasøytiske preparater der forbindelsen blandes med egnede bærere eller en eller flere eksipienser. Teknikker for formulering og administrering av forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan finnes i "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, siste utgave.

Egnede veier for administrering kan være oral, rektal, transmukosal eller intestinal administrering; parenteral avlevering inkludert intramuskulær, subkutan eller intra-medullær injeksjon, så vel som intratekal, direkte intra-ventrikulær, intravenøs, intraperitoneal, intranasal eller intraokulær injeksjon.

Alternativt kan man administrere forbindelsen på lokal i stedet for systemisk måte, for eksempel via injeksjon av forbindelsen direkte inn i en fast tumor, ofte i en depotformulering eller en formulering for forsinket avgivelse.

Videre kan man administrere medikamentet i et innsiktet medikamentavleveringssystem, for eksempel i et liposom som er belagt med tumor-spesifikt antistoff. Liposomene vil rettes inn mot og tas selektivt opp av tumoren.

De farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen kan fremstilles på i og for seg kjent måte, for eksempel ved hjelp av konvensjonell blanding, oppløsning, granulering, dragéfrem-stilling, pulverisering, emulgering, innkapsling, innfanging eller frysetørking.

Farmasøytiske preparater for bruk ifølge oppfinnelsen kan således formuleres på konvensjonell måte ved bruk av en eller flere fysiologisk akseptable bærere omfattende eksipienser og hjelpestoffer som letter bearbeiding av de aktive forbindelser til preparater som kan benyttes farmasøytisk. Riktig formulering avhenger av den valgte administreringsvei.

For injeksjon kan midlene ifølge oppfinnelsen formuleres til vandige oppløsninger, fortrinnsvis i fysiologisk forenelige buffere som Hanks oppløsning, Ringers oppløsning eller fysiologisk saltbuffer. For transmukosal administrering benyttes det pentreringsmidler egnet for barrieren som skal gjennom-trenges, i formuleringen. Slike penetreringsmidler er i og for seg kjent.

For oral administrering kan forbindelsene lett formuleres ved å kombinere de aktive forbindelser med farmasøytisk akseptable bærere av velkjent type. Slike bærere muliggjør at forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan formuleres som tabletter, piller, dragéer, kapsler, væsker, geler, siruper, oppslemm-inger, suspensjoner og lignende, for oralt inntak av en pasient som skal behandles. Farmasøytiske preparater for oral anvendelse kan oppnås ved å kombinere de aktive forbindelser med en fast eksipiens, eventuelt oppmaling av en resulterende blanding og bearbeiding av blandingen til granuler etter tilsetning av egnede hjelpestoffer hvis ønskelig, for å oppnå tabletter eller dragékjerner. Egnede eksipienser er særlig fyllstoffer som sukkere inkludert laktose, sukrose, mannitol eller sorbitol; celluloseforbindelser som for eksempel mais-, hvete-, ris- eller potetstivelse, gelatin, tragakantgummi, metylcellulose, hydroksypropylmetylcellulose, natriumkarboksymetylcellulose og/eller polyvinylpyrrolidon (PVP). Hvis ønskelig, kan det anvendes desintegreringsmidler som fornettet polyvinylpyrrolidon, agar eller algininsyre eller et salt derav som natriumalginat.

Dragékjerner tilveiebringes med egnede belegg. For dette formål kan man benytte konsentrerte sukkeroppløsninger som eventuelt kan inneholde gummi arabikum, talkum, polyvinylpyrrolidon, karbopolgel, polyetylenglykol og/eller titan-dioksyd, lakkoppløsninger bg egnede organiske oppløsnings-midler eller blandinger derav. Farvestoffer eller pigmenter kan settes til tablettene eller dragébeleggene for identifi-sering eller for å karakterisere forskjellige kombinasjoner av doser av aktiv forbindelse.

Farmasøytiske preparater som kan benyttes oralt omfatter pressferdige kapsler bestående av gelatin, så vel som myke, forseglede kapsler fremstilt av gelatin og en mykner som glycerol eller sorbitol. De pressferdige kapslene kan inneholde de aktive bestanddeler i blanding med fyllstoffer som laktose, bindemidler som stivelser og/eller smøremidler som talkum eller magnesiumstearat og, eventuelt, stabiliserings-midler. I myke kapsler kan de aktive forbindelser være oppløst eller suspendert i egnede væsker som fettoljer, flytende parafin eller flytende polyetylenglykoler. I tillegg kan stabilisatorer tilsettes. Alle formuleringer for oral administrering bør foreligge i doseringer egnet for slik administrering.

For bukkal administrering kan preparatene ha form av

tabletter eller pastiller som formuleres på konvensjonell måte.

For administrering ved inhalering kan forbindelsene for bruk ifølge oppfinnelsen hensiktsmessig avgis i form av aerosol-spray fra trykksatte pakker eller en forstøver, ved bruk av et egnet drivmiddel som diklordifluormetan, triklorfluor-metan, diklortetrafluoretan, karbondioksyd eller en annen egnet gass. Når det gjelder trykksatt aerosol, kan doserings-enheten bestemmes ved å tilveiebringe en ventil for å avgi en dosert mengde. Kapsler og patroner av for eksempel gelatin for bruk i en inhalator eller en insufflator kan formuleres til å inneholde en pulverblanding av forbindelsen og en egnet pulverbase som laktose eller stivelse.

Forbindelsene kan formuleres for parenteral administrering ved injeksjon, for eksempel ved bolusinjeksjon eller kontinuerlig infusjon. Formuleringer for injeksjon kan foreligge i enhetsdoseform, for eksempel i ampuller eller i multidosebeholdere, med tilsatt preserveringsmiddel. Preparatene kan foreligge i form av suspensjoner, oppløsninger eller emulsjoner i oljeaktige eller vandige bærere, og kan inneholde formuleringsmidler som suspensjons-, stabili-serings- og/eller dispergeringsmidler.

Farmasøytiske formuleringer for parenteral administrering omfatter vandige oppløsninger av aktive forbindelser i vann-oppløselig form. I tillegg kan suspensjoner av aktive forbindelser fremstilles som oljeaktige injeksjonssuspensjoner. Egnede lipofile oppløsningsmidler eller bærere er fettoljer som sesamolje, eller syntetiske fettsyreestere som etyloleat eller triglycerider, eller liposomer. Vandige injeksjons-suspens joner kan inneholde stoffer som øker viskositeten i suspensjonen, for eksempel natriumkarboksymetylcellulose, sorbitol eller dekstran. Eventuelt kan suspensjonen også inneholde egnede stabilisatorer eller midler som øker oppløseligheten av forbindelsene for å tillate fremstilling av meget konsentrerte oppløsninger.

Alternativt kan den aktive bestanddel foreligge i pulverform for konstituering med en egnet bærer, for eksempel sterilt, pyrogenfritt vann, før bruk.

Forbindelsene kan også formuleres i rektale preparater som suppositorier eller retensjonsenemaer, for eksempel inneholdende konvensjonelle suppositoriebaser som kakaosmør eller andre glycerider.

I tillegg til formuleringene som beskrevet tidligere, kan forbindelsene også formuleres som et depotpreparat. Slike lengevirkende formuleringer kan administreres ved implantering (for eksempel subkutan eller intramuskulær) eller ved intramuskulær injeksjon. Således kan for eksempel forbindelsene formuleres med egnede polymerer eller hydrofobe materialer (for eksempel som en emulsjon i en aksepterbar olje) eller ionebytteharpikser, eller som lite oppløselige derivater, for eksempel som et lite oppløselig salt.

En farmasøytisk bærer for de hydrofobe forbindelser er et ko-oppløsningsmiddelsystem omfattende benzylalkohol, en ikke-polar surfaktant, en vannblandbar, organisk polymer og en vandig fase. Ko-oppløsningsmidlet kan være VPD-ko-oppløsn-ingsmidlet. VPD er en oppløsning av 3% vekt/volum benzylalkohol, 8% vekt/volum av den ikke-polare surfaktant polysorbat 80, og 65% vekt/volum polyetylenglykol 300, opp til volum i absolutt etanol. VPD-ko-oppløsningsmiddelsystemet (VPD:D5W) består av VPD, fortynnet 1:1 med en 5% dekstrose i vannoppløsning. Dette ko-oppløsningssystem oppløser hydrofobe forbindelser godt, og gir selv lav toksisitet ved systemisk administrering. Selvfølgelig kan forholdene i et ko-oppløsn-ingsmiddelsystem varieres betydelig uten å ødelegge oppløse-lighets- og toksisitetsegenskapene. Videre kan identiteten for ko-oppløsningskomponentene varieres, for eksempel kan andre ikke-polare surfaktanter med lav toksisitet benyttes i stedet for polysorbat 80; fraksjonsstørrelsen av polyetylen-glykolen kan varieres; andre biokompatible polymerer kan erstatte polyetylenglykol, for eksempel polyvinylpyrrolidon; og andre sukkere eller polysakkarider kan benyttes i stedet for dekstrose.

Alternativt kan andre avleveringssystemer for hydrofobe, farmasøytiske forbindelser, benyttes. Liposomer og emulsjoner er velkjente eksempler på avleveringsbærere eller bærere for hydrofobe medikamenter. Visse organiske oppløsningsmidler som dimetylsulfoksyd kan også benyttes, selv om man da må regne med større toksisitet. I tillegg kan forbindelsene avgis ved bruk av et system med forsinket avgivelse, for eksempel semi-permeable matrikser av faste, hydrofobe polymerer inneholdende det terapeutiske middel. Forskjellige slike materialer som muliggjør forsinket avlevering er påvist og er velkjent for fagfolk. Kapsler av denne type kan, avhengig av den kjemiske art, avgi forbindelser i uker og opptil over 100 dager. Avhengig av den kjemiske art og den biologiske stabilitet for den terapeutiske reagens, kan man benytte ytterligere strategier for proteinstabilisering.

De farmasøytiske preparater kan også omfatte egnede faste eller gelfasebærere eller eksipienser. Eksempler på slike bærere eller eksipienser er, men er ikke begrenset til kalsiumkarbonat, kalsiumfosfat, forskjellige sukkere, stivelser, cellulosederivater, gelatin samt polymerer som polyetylenglykoler.

Mange av de PTK-modulerende forbindelser ifølge oppfinnelsen kan tilveiebringes som salter med farmasøytisk kompatible motioner. Farmasøytisk kompatible salter kan tildannes med mange syrer, inkludert men ikke begrenset til saltsyre, svovelsyre, eddiksyre, melkesyre, vinsyre, malinsyre, ravsyre og så videre. Salter har en tendens til å være mere oppløse-lige i vandige eller andre protoniske oppløsningsmidler enn de tilsvarende frie baseformer.

Farmasøytiske preparater som er egnet for bruk ifølge oppfinnelsen inkluderer preparater der den aktive bestanddel inneholdes i en effektiv mengde for å oppnå et tilsiktet formål. Mere spesielt betyr en terapeutisk effektiv mengde en mengde som er effektiv for å forhindre, lindre eller forbedre sykdomssymptomer eller for å forlenge overlevelsen til det individ som behandles. Bestemmelse av en terapeutisk effektiv mengde er velkjent for fagfolk, spesielt i lys av den detaljerte beskrivelse som her gis.

For en hvilken som helst forbindelse som benyttes kan den terapeutisk effektive dose estimeres initialt fra cellekulturanalyser. For eksempel kan en dose formuleres i.dyremodeller for å oppnå et sirkulerende konsentrasjonsområde som inkluderer IC50-verdien som bestemt i cellekulturen (det vil si konsentrasjonen av testforbindelsen som oppnår en halv-maksimal inhibering av PTK-aktiviteten). Slik informasjon kan benyttes for mer nøyaktig å bestemme brukbare doser hos mennesker.

Toksisitet og terapeutisk effektivitet for slike forbindelser kan bestemmes ved standard farmasøytiske prosedyrer i celle-kulturer eller forsøksdyr, for eksempel for å bestemme LD50-verdien (den letale dose for 50% av populasjonen) og ED50-verdien (den terapeutisk effektive dose hos 50% av populasjonen) . Doseforholdet mellom toksisk og terapeutisk effekt er den terapeutiske indeks og kan uttrykkes som forholdet LD50:ED50. Forbindelser som viser høye terapeutiske indekser er foretrukket. Data som oppnås fra disse cellekulturanalyser og dyrestudier kan benyttes for formulering av et område av doser for bruk i mennesker. Doseringen av slike forbindelser ligger fortrinnsvis innen et område av sirkulerende konsentrasjoner som inkluderer ED50 med liten eller ingen toksisitet . Doseringen kan variere innen dette området avhengig av doseformen som benyttes og den benyttede administreringsvei. Den eksakte formulering, administreringsvei og dosering, kan velges av den individuelle lege i lys av pasientens tilstand (se for eksempel Fingl et al., 1975 i "The Pharmacological Basis of Therapeutics", kap. 1, side 1).

Doseringsmengde og intervall kan justeres individuelt for å tilveiebringe plasmanivåer for den aktive del som er tilstrekkelig til å opprettholde de kinase-modulerende effekter, eller minimal effektiv konsentrasjon (MEC). MEC-verdien vil variere for hver forbindelse, men kan estimeres fra in vitro-data, for eksempel den konsentrasjon som er nødvendig for å oppnå en 50-90 %-ig inhibering av kinasen ved bruk av de her beskrevne analyser. Doseringene som er nødvendige for å oppnå MEC vil avhenge av individuelle karakteristika og administreringsvei. Imidlertid kan HPLC-analyser eller bioanalyser benyttes for å bestemme plasmakonsentrasjonene.

Doseringsintervallene kan også bestemmes ved bruk av MEC-verdien. Forbindelsene bør administreres ved bruk av et regime som opprettholder plasmanivåene over MEC i 10-90% av tiden, fortrinnsvis mellom 30-90% og aller helst mellom 50-90%.

Når det gjelder lokal administrering eller selektivt opptak, behøver den effektive, lokale konsentrasjon for medikamentet ikke være relatert til plasmakonsentrasjonen.

Mengden av forbindelse som administreres vil selvfølgelig avhenge av individet som béhandles, individets vekt, til-standens alvor, administreringsmåte og den foreskrivende leges bedømmelse.

Preparatene kan, hvis ønskelig, presenteres i en pakke- eller dispenserinnretning som kan inneholde en eller flere enhetsdoseformer inneholdende den aktive bestanddel. Pakken kan for eksempel omfatte en metall- eller plastfolie, for

eksempel en vakuumpakke. Pakken eller dispenserinnretning kan være ledsaget av instruksjoner for administrering. Preparater omfattende en forbindelse ifølge oppfinnelsen, formulert i en kompatibel, farmasøytisk bærer, kan også prepareres,

anbringes i en egnet beholder og merkes for behandling av en indikert tilstand. Egnede betingelser som er indikert på etiketten kan omfatte behandling av en tumor, inhibering av angiogenese, behandling av fibrose, diabetes og lignende.

EKSEMPEL: FORBINDELSESSYNTESE

Forbindelser kan syntetiseres i henhold til kjente teknikker. De følgende representerer foretrukne metoder for synteti-sering av forbindelser. 1. Generell syntese av 3- substituerte- 2- indolinonanaloger De følgende generelle metoder ble benyttet for å syntetisere 3-substituerte-2-indolinonforbindelser.

1.1. Metode A

En reaksjonsblanding av det egnede oksindol (2-indolinon) (1 ekv.), det egnede aldehyd (1,2 ekv.) og piperidin (0,1 ekv.) 1 etanol (1-2 ml/l mmol oksindol) ble omrørt ved 90°C i 3-5 timer. Etter avkjøling ble presipitatet filtrert av, vasket med kald etanol og tørket og man oppnådde den tilsiktede forbindelse.

1.2. Metode B

Fremstilling av de egnede aldehyder via Vilsmeier-reaksjonen. Til en oppløsning av 1,2 ekv. N,N-dimetylformamid i 1,2—di-klormetan (2,0 ml/1,0 mmol utgangsmateriale) ble det dråpevis tilsatt fosforoksyklorid (1,2 ekv.) ved 0°C. Isbadet ble fjernet og reaksjonsblandihgen ble omrørt ytterligere i 3 0 minutter. 1,0 ekv. av det egnede utgangsmateriale ble tilsatt til den ovenfor angitte oppløsning i porsjoner og reaksjonsblandingen ble omrørt ved 50-70°C i 5 timer til 2 dager. Reaksjonsblandingen ble helt inn i iskald IN natriumhydroksydoppløsning (pH = 9 etter blanding) og den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 1 time. Det organiske sjikt ble separert og det vandige sjikt ble ekstrahert med etylacetat. Det kombinerte, organiske sjikt ble vasket med saltoppløsning til pH = 7, tørket over vannfri natriumsulfat og fordampet. Resten ble kromatografert på en silikagelkolonne og eluert med etylacetat:heksan under oppnåelse av tittelforbindelsen.

Syntese av 3-substituerte-2-indolinonanaloger. En reaksjonsblanding av det riktig oksindol (2-indolinon) (1 ekv.), det egnede aldehyd (1,2 ekv.) og piperidin (0,1 ekv.) i etanol (1-2 ml/l mmol oksindol) ble omrørt ved 90°C i 3-5 timer. Etter avkjøling ble presipitatet filtrert av, vasket med kald etanol og tørket og man oppnådde den tilsiktede forbindelse. 2 . Syntese av 3-[( 4- metyltien- 2- yl) metylen]- 2- indolinon En reaksjonsblanding av 133,0 mg oksindol, 151,2 mg 4—metyl-tiofen-2-karboksaldehyd og 3 dråper piperidin i 3 ml etanol ble omrørt ved 90°C i 3 timer. Etter avkjøling ble presipitatet filtrert av, vasket med kald etanol og tørket og man oppnådde 14 7,3 mg (61%) av tittelforbindelsen som et gult faststoff. 3 . Syntese av 3-[( 3- metylpyrrol- 2- yl) metylen]- 2- indolinon En reaksjonsblanding av 133,0 mg oksindol, 130,9 mg 3—metyl-pyrrol -2 -karboksaldehyd og 3 dråper piperidin i 2 ml etanol ble omrørt ved 90°C i 3 timer. Etter avkjøling ble presipitatet filtrert av, vasket med kald etanol og tørket og man oppnådde 150,9 mg (67%) av tittelforbindelsen som et gult faststoff. 4 . Syntese av 3-[( 3, 4- dimetylpyrrol- 2- yl) metylen]- 2-indolinon

3-[(3,4-dimetylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon ble synteti-sert som beskrevet i "J. Heterocyclic Chem.", 13_: 1145-1147

(1976) .

Etyl-4-metylpyrrol-3-karboksylat. En oppløsning av 11,86 (0,1 mol) etylkrotonat og 19,50 g (0,1 mol) p-toluensulfonyl-metylisocyanid i 500 ml 2:1 eter:dimetylsulfoksyd ble dråpevis satt til en suspensjon av 6,8 g natriumhydrid (60 %—ig mineraloljedispersjon, 0,17 mol) i eter ved romtemperatur. Etter ferdig tilsetning ble reaksjonsblandingen omrørt i 3 0 minutter og fortynnet med 4 00 ml vann. Det vandige sjikt ble ekstrahert med 3 x 100 ml eter. De kombinerte eterekstrakter ble ført gjennom en kolonne av aluminiumoksyd og eluert med diklormetan. Det organiske oppløsningsmidlet ble fordampet og den resulterende rest ble bragt til fast form ved henstand. Faststoffet ble vasket med heksan og tørket ved 4 0°C i en vakuumovn over natten og man oppnådde 12,38 g (80%) av tittelforbindelsen.

Fremstilling av 3,4-dimetylpyrrol. Til en oppløsning av 23 g (80 mmol) natriumdihydrobis(2-metoksyetoksyaluminat) ble det dråpevis tilsatt en oppløsning av 5 g (34 mmol) etyl-4-metylpyrrol -3 -karboksylat i 50 ml benzen ved romtemperatur under nitrogen. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 18 timer. 100 ml vann ble satt til reaksjonsblandingen. Det organiske sjikt ble separert, vasket med saltoppløsning og tørket over vannfri natriumsulfat. Oppløsningsmidlet ble fjernet og resten destillert og man oppnådde 1,2 g (44%) av tittelforbindelsen.

Fremstilling av 3,4-dimetylpyrrol-2-karboksaldehyd. Til en oppløsning av 0,92 ml (12 mmol) N,N-dimetylformamid i 10 ml 1,2-dikloretan ble det dråpevis tilsatt 1,0 ml (12 mmol) fosforoksyklorid ved 0°C. Isbadet ble fjernet og reaksjonsblandingen ble omrørt ytterligere i 30 minutter. 3,4-dimetylpyrrol (960,0 mg, 10 mmol) ble tilsatt til den ovenfor angitte oppløsning i porsjoner og reaksjonsblandingen ble omrørt ved 50°C i 5 timer. Reaksjonsblandingen ble helt inn i iskald IN natriumhydroksydoppløsning (pH = 9 etter blanding) og den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 1 time. Det organiske sjikt ble separert og det vandige sjikt ble ekstrahert med etylacetat. Det kombinerte, organiske sjikt ble vasket med saltoppløsning inntil pH = 7, tørket over vannfri natriumsulfat og fordampet. Resten ble kromatografert på en silikagelkolonne ved bruk av en oppløsnings-middelblanding av etylacetat:heksan og man oppnådde 610 mg (50%) av tittelforbindelsen.

3-[(3,4-dimetylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon. En reaksjonsblanding av 67,0 mg (0,5 mmol) oksindol, 73,0 mg (0,6 mmol) 3,4-dimetylpyrrol-2-karboksaldehyd og 2 dråper piperidin i 2 ml etanol ble omrørt ved 90°C i 3 timer. Etter avkjøling ble presipitatet filtrert, vasket med kald etanol og tørket og man oppnådde 87,7 mg (37%) av tittelforbindelsen som et gult faststoff.

5. Syntese av 3-[( 2, 4- dimetyl- 3- etoksykarbonylpyrrol- 5-yl) metylen]- 2- indolinon

En reaksjonsblanding av 134,0 mg oksindol, 234,3 mg 4-etoksykarbonyl-3,5-dimetylpyrrol-2-karboksaldehyd og 3 dråper piperidin i 3 ml etanol ble omrørt ved 90°C i 3 timer. Etter avkjøling ble presipitatet filtrert, vasket med kald etanol og tørket og man oppnådde 244,6 mg (79%) av tittelforbindelsen som et gult faststoff.

6. Syntese av 3-[( 2, 4- dimetylpyrrol- 5- yl) metylen]- 2-indolinon

En reaksjonsblanding av 134,0 mg oksindol, 147,8 mg 3, 5-dimetylpyrrol-2-karboksaldehyd og 3 dråper piperidin i 2 ml etanol ble omrørt ved 90°C i 3 timer. Etter avkjøling ble presipitatet filtrert, vasket med kald etanol og tørket og man oppnådde 136,7 mg (57%) av tittelforbindelsen som et gult faststoff.

7 . Syntese av 3-[( 2- metylmerkaptotien- 5- yl) metylen]- 2-indolinon

En reaksjonsblanding av 134,0 mg oksindol, 189,9 mg 5-metyl-merkaptotiofen-2-karboksaldehyd og 3 dråper piperidin i 2 ml etanol ble omrørt ved 90°C i 3 timer. Etter avkjøling ble presipitatet filtrert, vasket med kald etanol og tørket og man oppnådde 246,6 mg (90%) av tittelforbindelsen som et orange faststoff.

8. Syntese av 3-[( 2- metyltien- 5- yl) metylen]- 2- indolinon En reaksjonsblanding av 134,0 mg oksindol, 151,42 mg 5—metyltiofen-2-karboksaldehyd og 3 dråper piperidin i 2 ml etanol ble omrørt ved 90°C i 3 timer. Etter avkjøling ble presipitatet filtrert, vasket med kald etanol og tørket og man oppnådde 237,8 mg (99%) av tittelforbindelsen som et gult faststoff. 9. Syntese av 3-[( 3- metyltien- 2- yl) metylen]- 2- indolinon En reaksjonsblanding av 134,0 mg oksindol, 151,4 mg 3—metyl-tiof en- 2 -karboksaldehyd og 3 dråper piperidin i 2 ml etanol ble omrørt ved 90°C i 3 timer. Etter avkjøling ble presipitatet filtrert, vasket med kald etanol og tørket og man oppnådde 157,8 mg (65%) av tittelforbindelsen som et gult faststoff. 10. Syntese av 3-[( furan- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(furan-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 11. Syntese av 3-[( tien- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(tien-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 12 . Syntese av 3-[ 2-[ 3, 5- di( trifluormetyl) fenyl] furan- 5- yl] metylen]- 2- indolinon 3-[2-[3,5-di-(trifluormetyl)fenyl]furan-5-yl]metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 13. Syntese av 3-[( 3-( 2- karboksyetyl)- 4- metylpyrrol- 5- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(3-(2-karboksyetyl)-4-metylpyrrol-5-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 14. Syntese av 3-[( 3, 4- dibrom- 5- metylpyrrol- 2- yl) metylen]-2- indolinon 3-[(3,4-dibrom-5-metylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode B. 15 . Syntese av 3-[( 3, 4- dimetyl- 2- formylpyrrol- 5- yl) metylen]-2- indolinon 3-[(3,4-dimetyl-2-formylpyrrol-5-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 16 . Syntese av 3-{[ 4-( 2- metoksykarbonyletyl)- 3- metylpyrrol-5- yl] metylen}- 2- indolinon 3-{[4-(2-metoksykarbonyletyl)-3-metylpyrrol-5-yl]metylen}-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 17. Syntese av 3-[( 2- jodfuran- 5- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[2-jodfuran-5-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 18 . Syntese av 3-[( 3- etoksykarbonyl- 2- metylfuran- 5- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(3-etoksykarbonyl-2-metylfuran-5-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 19. Syntese av 3-[( 3- bromtien- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(3-bromtien-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 20. Syntese av 3-[( 2- klortien- 5- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(2-klortien-5-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 21. Syntese av 3-[( 2, 3- dimetylfuran- 5- yl) metylen]-2- indolinon 3-[(2,3-dimetylfuran-5-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 22. Syntese av 3-[( 5- nitrotien- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(5-nitrotien-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 23. Syntese av 3-[( 2- karboksytien- 5- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(2-karboksytien-5-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 24 . Syntese av 3-[( 2- bromtien- 5- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(2-bromtien-5-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 25. Syntese av 3-[( 4- bromtien- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(4-bromtien-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 26 . Syntese av 3-[( 2- sulfonylfuran- 5- yl) metylen]- 2- indolinon- natriumsalt 3-[(2-sulfonylfuran-5-yl)metylen]-2-indolinon-natriumsalt syntetiseres i henhold til metode A. 27 . Syntese av 3-[( furan- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(furan-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 28. Syntese av 3-[( 2- metylfuran- 5- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(2-metylfuran-5-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 29 . Syntese av 3-[( 2- etylfuran- 5- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(2-etylfuran-5-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 30. Syntese av 3-[( 2- nitrofuran- 5- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(2-nitrofuran-5-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 31. Syntese av 3-[( 5- bromfuran- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(5-bromfuran-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 32. Syntese av 3-[( 2- etyltien- 5- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(2-etyltien-5-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 33. Syntese av 3-[( 4, 5- dimetyl- 3- etylpyrrol- 2- yl) metylen]-2- indolinon 3-[(4,5-dimetyl-3-etylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 34. Syntese av 3-[( 5- etoksykarbonyl- 4- etoksykarbonyletyl- 3- etoksykarbonylmetylpyrrol- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(5-etoksykarbonyl-4-etoksykarbonyletyl-3-etoksykarbonyl-metylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 35. Syntese av 3-[( 5- karboksy- 3- etyl- 4- metylpyrrol- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(5-karboksy-3-etyl-4-metylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 36. Syntese av 3-[( 3, 5- dijod- 4- metylpyrrol- 2- yl) metylen]-2- indolinon 3-[(3,5-dijod-4-metylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 37. Syntese av 3-[( 5- klor- 3- metoksykarbonyl- 4- metoksy- karbonylmetylpyrrol- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(5-klor-3-metoksykarbonyl-4-metoksykarbonylmetylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 38. Syntese av 3-[( 3- acetyl- 5- etoksykarbonyl- 4- metylpyrrol-2- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(3-acetyl-5-etoksykarbonyl-4-metylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 39. Syntese av 3-{[ 1-( 3, 5- diklorfenyl) pyrrol- 2- yl] metylen}-2- indolinon 3-{[l-(3,5-diklorfenyl)pyrrol-2-yl]metylen}-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 40. Syntese av 3-[( 1-( 4- klorfenyl) pyrrol- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(1-(4-klorfenyl)pyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 41. Syntese av 3-[( 4- etoksykarbonyl- 3- metyl) pyrrol- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(4-etoksykarbonyl-3-metyl)pyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 42. Syntese av 3-[( l- metylpyrrol- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(l-metylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 43. Syntese av 3-[( 5- etoksykarbonyl- 3- etoksykarbonyletyl- 4- etoksykarbonylmetylpyrrol- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(5-etoksykarbonyl-3-etoksykarbonyletyl-4-etoksykarbonyl-metylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 44. Syntese av 3-[( 5- metylimidazol- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(5-metylimidazol-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 45 . Syntese av 3- [ ( 5- rmetyltiazol- 2- yl) metylen] - 2- indolinon 3-[(5-metyltiazol-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 46. Syntese av 3-[( 3- metylpyrazol- 5- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(3-metylpyrazol-5-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 47. Syntese av 3-[( imidazol- 4- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(imidazol-4-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 48. Syntese av 3-[( 4- klorpyrazol- 3- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(4-klorpyrazol-3-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 49. Syntese av 3-[( 4- brom- l-( 4- klorbenzyl) pyrazol- 5- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(4-brom-l-(4-klorbenzyl)pyrazol-5-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 50. Syntese av 3-[( 4- klor- l- metylpyrazol- 3- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(4-klor-l-metylpyrazol-3-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 51. Syntese av 3-[( 4- etyl- 3, 5- dimetylpyrrol- 2- yl) metylen]-2- indolinon 3-[(4-etyl-3,5-dimetylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode B. 52. Syntese av 3-[( 5- etylpyrrol- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(5-etylpyrrol-2-yl)metylen] -2-indolinon syntetiseres i henhold til metode B. 53. Syntese av 3-[ 3, 5- dimetyl- 4-( propan- 2- yl) pyrrol- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[3,5-dimetyl-4-(propan-2-yl)pyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode B. 54. Syntese av 5- klor- 3-[( pyrrol- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 5-klor-3-[(pyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 55. Syntese av 5- klor- 3-[( 3- metylpyrrol- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 5-klor-3-[(3-metylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 56. Syntese av 5-klor-3-[( 3, 5- dimetylpyrrol- 2- yl) metylen]-2- indolinon 5-klor-3-[(3,5-dimetylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 57. Syntese av 3-[( pyrrol- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(pyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon er tilgjengelig fra Maybridge Chemical Co. Ltd. 58. Syntese av 5- klor- 3-[( indol- 3- yl) metylen]- 2- indolinon 5-klor-3-[(indol-3-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 59. Syntese av 5- klor- 3-[( tien- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 5-klor-3-[(tien-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 60. Syntese av 5- klor- 3-[( 3- metyltien- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 5-klor-3-[(3-metyltien-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 61. Syntese av 5- klor- 3-[( 5- metyltien- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 5-klor-3-[(5-metyltien-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 62. Syntese av 5- klor- 3-[( 5- etyltien- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 5-klor-3-[(5-etyltien-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 63. Syntese av 5- klor- 3-[( 5- metylmerkaptotien- 2- yl) metylen]-2- indolinon 5-klor-3-[(5-metylmerkaptotien-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 64. Syntese av 5- klor- 3-[( imidazol- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 5-klor-3-[(imidazol-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 65 . Syntese av 5- nitro- 3-[( pyrrol- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 5-nitro-3-[(pyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 66. Syntese av 3-[( 3- metylpyrrol- 2- yl) metylen]- 5- nitro- 2- indolinon 3-[(3-metylpyrrol-2-yl)metylen]-5-nitro-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 67 . Syntese av 3-[( 3, 5- dimetylpyrrol- 2- yl) metylen]- 5- nitro-2- indolinon 3-[(3,5-dimetylpyrrol-2-yl)metylen]-5-nitro-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 68. Syntese av 3-[( indol- 3- yl) metylen]- 5- nitro- 2- indolinon 3-[(indol-3-yl)metylen]-5-nitro-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 69. Syntese av 5- nitro- 3-[( tien- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 5-nitro-3-[(tien-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 70 . Syntese av 3-[( 3- metyltien- 2- yl) metylen]- 5- nitro- 2- indolinon 3-[(3-metyltien-2-yl)metylen]-5-nitro-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 71. Syntese av 3-[( 5- metyltien- 2- yl) metylen]- 5- nitro- 2- indolinon 3-[(5-metyltien-2-yl)metylen]-5-nitro-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 72 . Syntese av 3-[( 5- etyltien- 2- yl) metylen]- 5- nitro- 2- indolinon 3-[(5-etyltien-2-yl)metylen]-5-nitro-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 73 . Syntese av 3-[( 5- metylmerkaptotien- 2- yl) metylen]- 5- nitro- 2- indolinon 3-[(5-metylmerkaptotien-2-yl)metylen]-5-nitro-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 74. Syntese av 3-[( imidazol- 2- yl) metylen]- 5- nitro- 2- indolinon 3-[(imidazol-2-yl)metylen]-5-nitro-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 75. Syntese av 3-[( oksazol- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(oksazol-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 76. Syntese av 3-[( oksazol- 4- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(oksazol-4-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 77. Syntese av 3-[( oksazol- 5- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(oksazol-5-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 78. Syntese av 3-[( tiazol- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(tiazol-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 79. Syntese av 3-[( tiazol- 4- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(tiazol-4-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 80. Syntese av 3-[( tiazol- 5- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(tiazol-5-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 81. Syntese av 3-[( imidazol- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(imidazol-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 82. Syntese av 3-[( pyrazol- 3- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(pyrazol-3-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 83. Syntese av 3-[( pyrazol- 4- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(pyrazol-4-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 84 . Syntese av 3-[( isoksazol- 3- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(isoksazol-3-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 85. Syntese av 3-[ ( isoksazol- 4- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(isoksazol-4-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 86 . Syntese av 3-[( isoksazol- 5- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(isoksazol-5-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 87. Syntese av 3-[( isotiazol- 3- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(isotiazol-3-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 88. Syntese av 3-[( isotiazol- 4- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(isotiazol-4-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 89. Syntese av 3-[( isotiazol- 5- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(isotiazol-5-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 90. Syntese av 3-[( 1, 2, 3- triazol- 4- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(1,2,3-triazol-4-yl)metylen] -2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 91. Syntese av 3-[( 1, 3, 4- tiadiazol- 2- yl) metylen]- 2- indolinon 3-[(1,3,4-tiadiazol-2-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A. 92. Syntese av 3-[( 5- fenyl- l, 2, 4- oksadiazol- 3- yl) metylen]- 2-indolinon

3-[(5-fenyl-l,2,4-oksadiazol-3-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A.

93. Syntese av 3-[( 3- fenyl- 1, 2, 4- oksadiazol- 5- yl) metylen]- 2-indolinon

3-[(3-fenyl-l,2,4-oksadiazol-5-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A.

94. Syntese av 3-[( 3- fenyl- l, 2, 5- oksadiazol- 4- yl) metylen]- 2-indolinon

3-[(3-fenyl-1,2,5-oksadiazol-4-yl)metylen]-2-indolinon syntetiseres i henhold til metode A.

EKSEMPLER: IN VITRO- RTK- ANALYSER

De følgende in vitro-analyser kan benyttes for å bestemme nivået av aktivitet og effekt for de forskjellige forbindelser ifølge oppfinnelsen på en eller flere av RTK<1>ene. Tilsvarende analyser kan settes opp langs de samme retnings-linjer for en hvilken som helst tyrosinkinase ved bruk av teknikker som er velkjente for fagmannen.

Enzym- bundet immunosorbentanalyse ( ELISA)

Enzym-bundet immunosorbentanalyser (ELISA) kan benyttes for å detektere og å måle nærværet av tyrosinkinaseaktivitet. ELISA kan gjennomføres i henhold til kjente protokoller som for eksempel er beskrevet i Voller et al., 1980, "Enzym-Linked Immunosorbent Assay", i "Manual of Clinical Immunology", 2. utg., utgitt av Rose og Friedman, sidene 359-371. Am. Soc. Of Microbiology, Washington, D.C.

Den beskrevne protokoll kan tilpasses for bestemmelse av aktiviteten når det gjelder en spesifikk RTK. For eksempel er de foretrukne protokoller for å gjennomføre ELISA-forsøk for spesifikke RTK'er, gitt nedenfor. Tilpasning av disse protokoller for bestemmelse av en forbindelses aktivitet for andre medlemmer av RTK-familien, så vel som ikke-reseptor-tyrosinkinaser, ligger innenfor oppfinnelsens ramme.

FLK-1-ELISA

En ELISA-analyse ble gjennomført for å måle kinaseaktiviteten for FLK—1-reseptoren og mer spesielt inhiberingen eller akti-veringen av proteintyrosinkinaseaktiviteten for FLK—1-reseptoren. Spesifikt ble den følgende analyse gjennomført for å måle kinaseaktiviteten for FLK-1-reseptoren i FLK-1/NIH3T3-celler.

Materialer og metoder.

Materialer. De følgende reagenser og stamløsninger ble benyttet: a. Corning 96-brønners ELISA-plater (Corning katalog nr. 25805-96); b. Cappel-geit-anti-kanin IgG (katalog nr. 55641); c. PBS (Gibco katalog nr. 450-1300EB); d. TBSW-buffer (50 mM Tris (pH 7,2), 150 mM NaCl og 0,1% Tween-2 0); e. Etanolamin-stamløsning (10% etanolamin (pH 7,0), lagret ved 4°C); f. HNTG-buffer (20 mM HEPES-buffer (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,2% Triton X-100 og 10% glycerol); g. EDTA (0,5M (pH 7,0) som en 100X stamløsning); h. Natrium-orto-vanadat (0,5M som en 100X stamløsning); i. Natrium-pyrofosfat (0,2M som en 100X stamløsning); j . NUNC 96-brønners V-bunn polypropylenplater (Applied Scientific katalog nr. AS-72092); k. NIH3T3 C7#3-celler (FLK-l-ekspresjonsceller); 1. DMEM med IX høyglukose-L-glutamin (katalog nr. 11965-050); m. FBS, Gibco (katalog nr. 16000-028); n. L-glutamin, Gibco (katalog nr. 25030-016); o. VEGF, PeproTech, Inc. (katalog nr. 100-20) (holdt som 1 /ug pr. 100 /il stamløsning i Milli-Q dH20 og lagret ved -20°C); p. Affinitetsrenset anti-FLK-l-antiserum, Enzymology Lab, Sugen, Inc.; q. UB40-monoklonalt antistoff som er spesifikk for fosfotyrosin, Enzymology Lab, Sugen, Inc. (se Fendly et al., 1990, "Cancer Research", 50: 1550-1558); r. EIA-kvalitets geit-anti-mus-IgG-POD (BioRad katalog nr. 172-1011); s. 2,2-azino-bis(3-etylbenztiazolin-6-sulfonsyre) (ABTS)-oppløsning (100 mM vannfri sitronsyre, 250 mM Na2HP04 (pH 4,0), 0,5 mg/ml ABTS (Sigma katalog nr. A-1888), opp-løsningen bør lagres mørkt ved 4°C til bruk; t. H202 (30 %-ig oppløsning) (Fisher katalog nr. H325); u. ABTS/H202 (15 ml ABTS-oppløsning, 2 /il H202) fremstilt 5 minutter før bruk og satt hen ved romtemperatur; v. o,2M HCl-stamløsning i H20;

w. Dimetylsulfoksyd (100%) (Sigma katalog nr. D-8418); og y. Trypsin-EDTA (Gibco BRL-katalog nr. 25200-049).

Protokoll. Den følgende protokoll ble benyttet for å gjennomføre analysen. 1. Corning 96-brønners ELISA-plater belegges med 1,0 ug pr. brønn Cappel-anti-kanin-IgG-antistoff i 0,1M Na2C03, pH 9,6. Sluttvolumet bringes til 150 /xl pr. brønn. Platene belegges over natten ved 4°C. Platene kan holdes opptil 2 uker hvis de lagres ved 4°C. 2. Celler dyrkes i vekstmedia (DMEM, supplert med 2,0 mM L-glutamin, 10% FBS) i egnede kulturskåler til konfluens ved 37°C, 5% C02. 3 . Cellene høstes ved trypsinering og utsåes i Corning 25850 polystyren 96-brønners rundbunn-celleplater,

25 000 celler pr. brønn i 200 fil vekstmedia.

4. Cellene dyrkes minst en dag ved 37°C, 5% C02.

5. Cellene vaskes med D-PBS IX.

6. 200 fil pr. brønn utsultingsmedia tilsettes (DMEM, 2,0 mM l-glutamin, 0,1% FBS). Det hele inkuberes over natten ved 37°C, 5% C02. 7. Forbindelser:Ekstrakter fortynnes 1:20 i polypropylen 96-brønners plater ved bruk av utsultingsmedia. Dimetylsulfoksyd fortynnes 1:20 for bruk i kontroll-brønner. 8. Utsultingsmedia fjernes fra 96-brønners cellekultur-plater og det tilsettes 162 /il nylaget utsultingsmedia til hver brønn. 9. Det tilsettes 18 /il 1:20 fortynnet forbindelse:ekstrakt-fortynning (fra trinn 7) til hver brønn pluss 1:20 dimetylsulfoksydfortynningen til kontroilbrønnene (+ VEGF), for en sluttfortynning på 1:200 etter celle-stimulering. Endelig dimetylsulfoksyd er 0,5%. Platen

inkuberes ved 3 7°C, 5% C02 i 2 timer.

10. Ikke-bundet antistoff fjernes fra ELISA-platene ved å snu platene for å fjerne væske. Den vaskes 3 ganger med TBSW + 0,5% etanolamin, pH 7,0. Platen tørkes på et

papirhåndkle for å fjerne overskytende væske og bobler.

11. Platene blokkeres med TBSW + 0,5% etanolamin, pH 7,0, 150/il pr. brønn. Platen inkuberes 3 0 minutter under

rysting på en mikrotiterplateryster.

12. Platen vaskes 3 ganger som beskrevet i trinn 10.

13. 0,5 /ig pr. brønn affinitetsrenset anti-FLU-l-polyklonalt kanin-antiserum tilsettes. Sluttvolumet bringes til 150 /il pr. brønn med TBW + 0,5% etanolamin, pH 7,0. Platene

inkuberes i 3 0 minutter under rysting.

14. 180/il utsultingsmedium settes til cellene og cellene stimuleres med 20 /il pr. brønn 10,0 mM natrium-orto-vanadat og 500 ng/ml VEGF (som gir en sluttkonsentrasjon på 1,0 mM natrium-orto-vanadat og 50 ng/ml VEGF pr. brønn) i 8 minutter ved 37°C, 5% C02. Negative kontroll-brønner mottok kun utsultingsmedium. 15. Etter 8 minutter bør media fjernes fra cellene og de vaskes en gang med 2 00 /il pr. brønn PBS. 16. Cellene lyseres i 150 /il pr. brønn HNTG under rysting ved romtemperatur i 5 minutter. HNTG-formuleringen inkluderer natrium-orto-vanadat, natrium-pyrofosfat og

EDTA.

17. ELISA-platene vaskes tre ganger som beskrevet i trinn 10. 18. Cellelysatene overføres fra celleplaten til ELISA-platen og inkuberes under rysting i 2 timer. For å overføre cellelysatet beveges pipetten opp og ned under skraping

av brønnene.

19. Platen vaskes tre ganger som beskrevet i trinn 10.

20. ELISA-platen inkuberes med 0,02 /ig pr. brønn UB40 i TBSW + 0,5% etanolamin. Sluttvolumet bringes til 150/il pr. brønn. Det hele inkuberes under rysting i 30

minutter.

21. Platen vaskes tre ganger som beskrevet i trinn 10.

22. ELISA-platen inkuberes med 1:10.000 fortynnet EIA-kvalitet geit-anti-mus-IgG-konjugert pepperrotperoksy-dase i TBSW + 0,5% etanolamin, pH 7,0. Sluttvolumet bringes til 150 /il pr. brønn. Det hele inkuberes under

rysting i 30 minutter.

23. Platen vaskes som beskrevet i trinn 10.

24. 100 /xl ABTS/H202-oppløsning settes til brønnen. Det hele inkuberes i 10 minutter under rysting. 25. 100 /il 0,2M HC1 for 0, IM HCl slutt tilsettes for å stanse farvefremkallingsreaksjonen. Det hele rystes 1 minutt ved romtemperatur. Bobler fjernes ved hjelp av en langsom luftstrøm og ELISA-platen avleses i en ELISA-plateleser ved 410 nm.

HER-2 ELISA

Analyse 1: EGF-reseptor-HER2 kimerisk reseptoranalyse i hele celler. HER2-kinaseaktiviteten i hele EGFR-NIH3T3-celler ble målt som beskrevet nedenfor: Materialer og reagenser. De følgende materialer og reagenser ble benyttet for å gjennomføre analysen:

a. EGF: stamkonsentrasjon : 16,5 ILM; EGF 2 01,

TOYBO, Co., Ltd., Japan

b. 05-101 (UBI) (et monoklonalt antistoff som erkjenner et

EGFR-ekstracellulært domene).

c. Anti-fosfortyrosinantistoff (anti-Ptyr) (polyklonalt) (se,

Fendly et al., supra).

d. Deteksjonsantistoff: geit-anti-kanin-IgG-pepperrot-peroksydasekonjugat, TAGO, Inc., Burlingame, CA.

e. TBST-buffer:

f. HNTG 5X-stamløsning:

* (2,2'-azinobis(3-etylbenztiazolinsulfonsyre)).

Hold oppløsningen i mørke ved 4°C til bruk. h. Stamreagens av:

Prosedyre. Man benyttet den følgende protokoll:

A. Forbelegging av ELISA- plate

1. ELISA-platene belegges (Corning, 96 brønner, kat. #25805-96) med 05-101-antistoff ved 0,5 g pr. brønn i PBS, 100 /xl

sluttvolum pr. brønn og lagres over natten ved 4°C. Belagte plater er gode i opptil 10 dager ved lagring ved 4°C. 2. På bruksdagen blir bufferbelegget fjernet og erstattet med 100 til blokkeringsbuf f er (5% Carnation Instant ikke-fet tørrmelk i PBS). Platen inkuberes, rystes ved romtemperatur (23 til 25°C) i 30 minutter. Like før bruk blir blokkeringsbufferen fjernet og platen vasket 4 ganger med TBST-buffer.

B. Utsåing av celler

1. En IH3T3-cellelinje som overuttrykker en kimær reseptor inneholdende det EGFR-ekstracellulære domene og ekstracellulære HER2-kinasedomene kan benyttes for denne analyse. 2. Man velger skåler med 80-90% konfluens for forsøket. Cellene trypsineres og reaksjonen stanses ved tilsetning av 10% føtalt bovint serum. Cellene suspenderes i DMEM-medium (10% CS DMEM-medium) og sentrifugeres en gang ved 1500 omdr./min. ved romtemperatur i 5 minutter. 3. Cellene resuspenderes i utsåingsmedium (DMEM, 0,5% bovint serum), og cellene telles ved bruk av trypan-blått. Overlevelse over 90% er aksepterbart. Cellene såes i DMEM-medium (0,5% bovint serum) i en densitet av 10 000 celler pr. brønn, 100 /xl pr. brønn, i en 96-brønners mikrotiterplate. Utsådde celler inkuberes i 5% C02 ved 37°C i ca.

4 0 timer.

C. Analyseprosedyre

1. De utsådde celler undersøkes for kontaminering ved bruk av et invertert mikroskop. Stammedikamentet (10 mg/ml i DMSO) fortynnes 1:10 i DMEM-medium og 5 /xl overføres til en TBST-brønn for en endelig medikamentfortynning på

1:200 og en slutt-DMSO-konsentrasjon på 1%. Kontroll-brønnene får kun DMSO. Det hele inkuberes i 5% C02 ved 3 7°C i 2 timer.

2. EGF-liganden prepareres: EGF-stamløsning fortynnes i DMEM slik at det ved overføring av 10 /xl fortynnet EGF (1:12 fortynning) oppnås 100 nM sluttkonsentrasjon. 3. Det fremstilles nylaget HNTG<*> som er tilstrekkelig for 100/xl pr. brønn, og det hele anbringes på is. 4. Etter 120 minutter inkubering med medikament, tilsettes preparert SGF-ligand til cellene, 10 /xl pr. brønn, til en sluttkonsentrasjon på 100 nM. Kontrollbrønner får kun DMEM. Det hele inkuberes og rystes ved romtemperatur i 5 minutter. 5. Medikament, EGF og DMEM fjernes. Cellene vaskes to ganger med PBS. HNTG<*> overføres til cellene, 100 /xl pr. brønn. Det hele anbringes på is i 5 minutter. I mellom-tiden fjernes blokkeringsbuffer fra andre ELISA-plater som vaskes med TBST som beskrevet ovenfor. 6. Med en pipettespiss fastfestet til en mikropipettør skrapes cellene fra platen og cellematerialet homogeniseres ved gjentatt aspirering og dispensering av HNTG*-lyseringsbufferen. Lysatet overføres til en belagt, blokkert og vasket ELISA-plate. Inkuberingsrysting ved romtemperatur gjennomføres i 1 time. 7. Lysatet fjernes og det hele vaskes 4 ganger med TBST. Nyfortynnet anti-Ptyr-antistoff overføres til ELISA-platen i en mengde av 100 /xl pr. brønn. Inkuberingsrysting gjennomføres ved romtemperatur i 3 0 minutter i nærvær av anti-Ptyr-antiserum (1:3000 fortynning i

TBST).

8. Anti-Ptyr-antistoffet fjernes og det hele vaskes 4 ganger med TBST. Det nyfortynnede TAGO-anti-kanin-IgG-antistoff overføres til ELISA-platen i en mengde av 100/xl pr. brønn. Det hele inkuberes under rysting ved romtemperatur i 30 minutter (anti-kanin-IgG-antistoff:

1:3000 fortynning i TBST).

9. TAGO-detekteringsantistoffet fjernes og det hele vaskes 4 ganger med TBST. Nypreparert ABTS/H202-oppløsning overføres til ELISA-platen i en mengde av 100 /xl pr. brønn. Det hele inkuberes ved rysting ved romtemperatur i 20 minutter. (ABTS/H202-oppløsning: 1,0 /xl 3 0 %-ig H202 i 10 ml ABTS-stamløsning). 10. Reaksjonen stanses ved tilsetning av 50 /xl 5N H2S04 (eventuelt) og optisk densitet bestemmes ved 410 nm. 11. Det maksimale fosfotyrosinsignalet bestemmes ved å trekke verdien av de negative kontroller fra den til de positive kontroller. Prosentuell inhibering av

fosfotyrosininnholdet for ekstraktholdige brønner kan så beregnes, etter subtraksjon av de negative kontroller.

Analyse 2: HER-2-BT474 ELISA. En andre analyse kan gjennom-føres for å måle helcelle HER2-aktivitet. En slik analyse kan gjennomføres som følger: Materialer og reagenser. De følgende materialer og reagenser ble benyttet: a. BT-474 (ATCC HBT20), en human brysttumorcellelinje som

uttrykker høye nivåer av HER2-kinase.

b. Vekstmedium omfattende RPMI + 10% FBS + GMS-G (Gibco supplement) + glutamin for bruk ved dyrking av BT-474 i en

inkubator med 5% C02 ved 3 7°C.

c. Et monoklonalt anti-HER2-antistoff.

d. D-PBS:

e. Blokkeringsbuffer: TBST pluss 5% melk (Carnation Instant

ikke-fet tørrmelk).

f. TBST-buffer:

der stamoppløsningen av TES (10X) fremstilles og Triton

X-100 settes til bufferen under fortynning,

g. HNTG-buffer (5X):

Stamoppløsningen (5X) fremstilles og holdes ved 4°C. h. EDTA-HC1: 0,5M, pH 7,0 (ION HC1) som 500X stamløsning.

i. Na3V04: 0,5M som 100X stamløsning holdes ved -80°C som

alikvoter.

j. Na4 (P207) : 0,2M som 100X stamløsning.

k. Polyklonalt antiserum anti-fosfotyrosin.

1. Geit-anti-kanin-IgG, pepperrotperoksydase(POD)konjugat (deteksjonsantistoff), Tago (kat. nr. 4520; lott nr.

1802): Tago, Inc., Burlingame, CA.

m. ABTS-oppløsning:

der ABTS er 2,2 *-azinobis(3-etylbenztiazolinsulfonsyre). For denne analyse bør ABTS-oppløsningen holdes i mørke ved

4°C. Oppløsningen bør kasseres når den blir grønn,

n. Hydrogenperoksyd: 3 0% oppløsning holdes i mørke og ved

4°C.

Prosedyre. Alle de følgende trinn utføres ved romtemperatur og aseptisk, hvis ikke annet er sagt. All ELISA-platevasking skjer ved skylling med destillert vann tre ganger og en gang med TBST.

A. Celleutsåing

1. En BT474-celler dyrkes i vevkulturskåler (Corning 25020-100) til 80-90% konfluens og samles ved bruk av trypsin-EDTA (0,25%, Gibco). 2. Cellene resuspenderes i nylaget medium og overføres til 96-brønners vevkulturplater (Corning, 25806-96) ved ca. 25 000 til 50 000 celler pr. brønn (100 fil pr. brønn) . Cellene inkuberes ved 5% C02 og 37°C over natten.

B. ELISA- platebelegging og blokkering

1. ELISA-platen (Corning 25805-96) belegges med anti-HER2-antistoff ved 0,5 fig pr. brønn i 150 fil PBS over natten ved 4°C og forsegles med parafilm. Antistoffbelagte plater kan benyttes opptil 2 uker, når de lagres ved 4°C. 2. På bruksdagen blir belegget fjernet, erstattet med 200 fil blokkerende buffer, platen rystet, hvoretter blokkeringsbuf feren fjernes og platen vaskes akkurat før tilsetning av lysat.

C. Analyseprosedyrer

1. Medikamentet behandles med BST under serumfrie betingelser. Før medikamentene tilsettes blir gammelt medium erstattet med serumfritt RPMI (90 fil pr. brønn) . 2. Stammedikamentet (i 100% DMSO) fortynnes 1:10 med RPMI og 10 fil pr. brønn av denne oppløsning overføres til cellene

for å oppnå en slutt-medikament-DMSO-konsentrasjon på 1%. Cellene inkuberes ved 5% C02 og 3 7°C.

3. Nylaget cellelyseringsbuffer fremstilles (HNTG<*>)

4. Etter medikamentpreinkubering i 2 timer fjernes all oppløsning fra platen, HNTG<*> (100 fil pr. brønn) over-føres til cellene og det hele rystes i 10 minutter. 5. Det benyttes en 12-kanals pipette for å skrape cellene fra platen og lysatet homogeniseres ved gjentatt aspirering og dispensering. Alt lysat overføres til ELISA-platen og det hele rystes i 1 time. 6. Lysatet fjernes, platen vaskes, anti-pTyr (1:3000 med TBST) i en mengde av 100 fil pr. brønn tilsettes og det hele rystes i 30 minutter. 7. Anti-pTyr fjernes, platen vaskes, geit-anti-kanin-IgG-konjugert antistoff (1:5000 med TBST) 100 fil pr. brønn tilsettes og det hele rystes i 30 minutter. 8. Anti-kanin-IgG-antistoff fjernes, platen vaskes og nylaget ABTS:H202 (1,2 fil H2O2:10 ml ABTS) tilsettes i en mengde av 10 0 fil pr. brønn til platen for å starte farveutvikling, noe som vanligvis tar 2 0 minutter. 9. Den optiske densitet måles ved 410 nm, Dynatech MR5000.

PDGF-R ELISA

Alt cellekulturmedium, glutamin og føtalt bovint serum erverves fra Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) hvis ikke annet er sagt. Alle celler ble dyrket i en fuktig atmos-fære på 90-95% luft og 5-10% C02 ved 37°C. Alle cellelinjer ble rutinemessig subdyrket to ganger i uken og var negative for mykoplasma som bestemt ved Mycotest-metoden (Gibco).

For ELISA-analyser ble celler (U1242, oppnådd fra Joseph Schlessinger, NYU) dyrket til 80-90% konfluens i vekstmedium (MEM med 10% FBS, NEAA, 1 mM NaPyr og 2 mM GLN) og sådd ut i 96-brønners vevkulturplater i 0,5% serum med 25 000 til 30 000 celler pr. brønn. Etter inkubering over natten i 0,5% serumholdig medium ble cellene flyttet til serumfritt medium og behandlet med prøveforbindelse i 2 timer i en 5% C02, 37°C inkubator. Cellene ble så stimulert med ligand i 5-10 minutter fulgt av lysering med HNTG (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 5 mM EDTA, 5 mM Na3V04, 0,2% Triton X-100 og 2 mM NaPyr). Cellelysater (0,5 mg pr. brønn i PBS) ble overført til ELISA-plater som på forhånd var belagt med reseptorspesifikt antistoff og som var blokkert med 5% melk i TBST (50 mM Tris-HCl, pH 7,2, 150 mM NaCl og 0,1% Triton X—10 0) ved romtemperatur i 30 minutter. Lysatene ble inkubert under rysting i 1 time ved romtemperatur. Platene ble vasket med TBST fire ganger og så inkubert med polyklonalt anti-fosfotyrosin-antistoff ved romtemperatur i 3 0 minutter. Overskytende anti-fosfotyrosin-antistoff ble fjernet ved skylling av platen med TBST fire ganger. Geit-anti-kanin-IgG-antistoff ble satt til ELISA-platen i 30 minutter ved romtemperatur, fulgt av skylling med TBST ytterligere fire ganger. ABTS (100 mM sitronsyre, 250 mM Na2HP04 og 0,5 mg/ml 2,21-azino-bis(3-etylbenztiazolin-6-sulfonsyre)) pluss H202 (1,2 ml 30% H2O2:10 ml ABTS) ble satt til ELISA-platene for å starte farvefremkallingen. Absorbansen ved 410 nm med en referansebølgelengde på 63 0 nm ble registrert ca. 15 til 3 0 minutter etter ABTS-tilsetning.

IGF-I ELISA

Den følgende protokoll kan benyttes for å måle fosfotyrosin-nivået på IGF-I-reseptor som indikerer IGF-I-reseptortyrosinkinaseaktivitet.

Materialer og reagenser. De følgende materialer og reagenser ble benyttet: a. Cellelinjen som benyttes i denne analyse er 3T3/IGF-1R, en

cellelinje som overuttrykker IGF-l-reseptoren.

b. NIH3T3/IGF-1R dyrkes i en inkubator med 5% C02 ved 37°C.

Vekstmediet er DMEM + 10% FBS (varmeinaktivert) + 2 mM

L—glutamin.

c. Det benyttes anti-IGF-lR-antistoff kalt 17-69. Antistoffene renses av Enzymology Lab, Sugen, Inc.

d. D-PBS:

e. Blokkeringsbuffer: TBST pluss 5% melk (Carnation Instant

ikke-fet tørrmelk).

f. TBST-buffer:

Stamoppløsning av TBS (10X) fremstilles og Triton X—100

settes til bufferen under fortynningen,

g. HNTG-buffer:

Stamoppløsningen (5X) prepareres og holdes ved 4°C.

h. EDTA-HC1: 0,5M, pH 7,0 (NaOH) som 100X stamløsning.

i. Na3V04: 0,5M som 100X stamløsning og alikvoter holdes ved -80°C.

j. Na4P207: 0,2M som 100X stamløsning.

k. Insulinlignende vekstfaktor-1 fra Promega (kat. # G5111).

1. Polyklonalt antiserum anti-fosfotyrosin:

Kaninsera produsert av Enzymology Lab., SUGEN Inc.

m. Geit-anti-kanin-IgG, POD-konjugat (deteksjonsantistoff),

Tago (kat. nr. 4520; lott nr. 1802): Tago, Inc.,

Buriingame, CA.

n. ABTS (2,2'-azino-bis(3-etylbenztiazolinsulfonsyre))-oppløsning:

ABTS-oppløsningen bør holdes i mørke ved 4°C. Oppløsningen

bør kasseres når den blir grønn.

0. Hydrogenperoksyd: 30 %-ig oppløsning holdes i mørke og ved

4°C.

Prosedyre. Alle de følgende trinn gjennomføres ved romtemperatur, hvis ikke annet spesielt er sagt. Alle ELISA-platevaskinger gjennomføres ved skylling av platen med springvann tre ganger, fulgt av en TBST-skylling. Platen tørkes ved pressing med papirhåndklær.

A. Celleutsåing

1. Cellene, dyrket i vevkulturskåler (Corning 25020-100) til 80-90% konfluens, høstes med trypsin-EDTA (0,25%, 0,5 ml/D-100, Gibco). 2. Cellene resuspenderes i nylaget DMEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamin og overføres til 96-brønners vevkulturplater (Corning, 25806-96) med 20 000 celler pr. brønn (100 /il pr. brønn). Det hele inkuberes en dag, hvoretter mediet erstattes med serumfritt medium (90//il) og det hele inkuberes i 5% C02 og 37°C over natten.

B. ELISA- platebelegging og blokkering

1. ELISA-platen (Corning 25805-96) belegges med anti-IGF-lR-antistoff ved 0,5 fig pr. brønn i 100 fil PBS i minst 2 timer. 2. Beleggingsoppløsningen fjernes og erstattes med 100 fil blokkerende buffer og det hele rystes i 30 minutter. Den blokkerende buffer fjernes og platen vaskes akkurat før lysatet tilsettes.

C. Analyseprosedyrer

1. Medikamentene prøves i serumfri tilstand.

2. Medikament-stamløsning (i 100% DMSO) fortynnes 1:10 med DMEM i 96-brønners polypropylenplater og 10 fil pr. brønn av denne oppløsning overføres til cellene for å oppnå slutt-medikamentfortynninger på 1:100 og slutt-DMSO-konsentrasjon på 1,0%. Cellene inkuberes i 5% C02 ved 37°C i 2 timer.

3. Nylaget cellelyseringsbuffer (HNTG<*>) prepareres

4. Etter medikamentinkubering i 2 timer overføres 10 fil pr. brønn av 200 nM IGF-1-ligand i PBS til cellene (sluttkonsentrasjon = 20 nM) og det hele inkuberes ved 5% C02 ved 37°C i 10 minutter. 5. Medium fjernes og 100 fil pr. brønn HNTG<*> tilsettes og det hele rystes i 10 minutter. Cellene observeres under mikroskop for å se hvorvidt de er adekvat lysert. 6. Det benyttes en 12-kanals pipette for å skrape cellene fra platen, hvoretter lysatet homogeniseres ved gjentatt aspirering og dispergering. Alt lysat overføres til antistoffbelagt ELISA-plate og det hele rystes i 1 time. 7. Lysatet fjernes, platen vaskes, anti-pTyr (1:3000 med TBST) i en mengde av 100 iil pr. brønn overføres og det hele rystes i 30 minutter. 8. Anti-pTyr fjernes, platen vaskes, Tago (1:3000 med TBST) 100 /xl pr. brønn overføres og det hele rystes i 3 0 minutter. 9. Detekteringsantistoff fjernes, platen vaskes og nylaget ABTS/H202 (1,2 ( il H202 pr. 10 ml ABTS) overføres i en mengde av 100 iil pr. brønn til platen for å starte farvefremka11ing. 10. OD måles i Dynatech MR5000 som er forbundet med Ingres.

EGF-reseptor ELISA

EGF-reseptorkinaseaktivitet (EGFR-NIH3T3-analyse) i hele celler ble målt som beskrevet nedenfor: Materialer og reagenser. De følgende materialer og reagenser ble benyttet: a. EGF-ligand: Stamkonsentrasjon = 16,5 ixM; EGF 201, Toyobo,

Co., Ltd., Japan

b. 05-101 (UBI) (et monoklonalt antistoff som erkjenner et

EGFR-ekstracellulært domene).

c. Anti-fosfotyrosin-antistoff (anti-Ptyr) (polyklonalt).

d. Detekteringsantistoff: Geit-anti-kanin-IgG-pepperrot-peroksydasekonjugat, TAGO, Inc., Burlingame, CA.

e. TBST-buffer:

f. HNTG 5X-stamløsning: g. ABTS-stamløsning:

Hold oppløsningen i mørke ved 4°C til bruk. h. Stamreagens av:

Prosedyre. Den følgende protokoll ble benyttet:

A. ELISA- platen forbelegges

1. ELISA-platene belegges (Corning, 96 brønner, kat. # 25805-96) med 05-101-antistoff ved 0,5 /zg pr. brønn i PBS, 150

/xl sluttvolum pr. brønn, og settes hen over natten ved 4°C. Belagte plater kan stå opptil 10 dager når de lagres ved 4°C. 2. På bruksdagen blir beleggsbuffer fjernet og erstattet med blokkerende buffer (5% Carnation Instant ikke-fet tørrmelk i PBS). Platen inkuberes, rystes ved romtemperatur (ca. 23-25°C) i 30 minutter. Akkurat før bruk blir den blokkerende buffer fjernet og platen vasket 4 ganger med TBST-buffer.

B. Utsåing av celler

NIH3T3/C7-cellelinje (Honegger et al., "Cell", 51: 199-209, 1987) kan benyttes for denne analyse. 2. Det velges plater med 80-90% konfluens for forsøket. Cellene trypsineres og reaksjonen stanses ved tilsetning av 10% CS-DMEM-medium. Cellene suspenderes i DMEM-medium (10% CS-DMEM-medium) og sentrifugeres en gang ved 1000 omdr./min. og en gang ved romtemperatur i 5 minutter. 3. Cellene resuspenderes i utsåingsmedium (DMEM, 0,5% bovint serum) og cellene telles ved bruk av trypan-blått. Overlevelse over 90% er aksepterbart. Cellene såes ut i DMEM-medium (0,5% bovint serum) ved en densitet av 10 000 celler pr. brønn, 100 /il pr. brønn, i en 96-brønners mikrotiterplate. Utsådde celler inkuberes i 5% C02 ved 37°C i ca. 40 timer.

C. Analyseprosedyrer

1. Utsådde celler undersøkes på kontaminering ved bruk av et invertert mikroskop. Medikament-stamløsning (10 mg/ml i DMSO) fortynnes 1:10 i DMEM-medium, hvoretter 5 /ti overføres til en prøvebrønn for en sluttmedikament-fortynning på 1:200 og en slutt-DMSO-konsentrasjon på 1%. Kontroilbrønnene får DMSO alene. Det hele inkuberes i 5% C02 ved 37°C i 1 time. 2. EGF-ligand prepareres: EGF-stamløsning fortynnes i DMEM slik at det ved overføring av 10 /il fortynnet EGF i 1:12-fortynning, oppnås en 25 nM-sluttkonsentrasjon. 3. Det fremstilles 10 ml HNTG<*>, tilstrekkelig for 100 /il pr. brønn, der HNTG<*> omfatter: HNTG-stamløsning (2,0 ml), milli-Q H20 (7,3 ml), EDTA, 100 mM, pH 7,0 (0,5 ml), Na3V04 0,5 M (0,1 ml) og Na4(P207), 0,2 M (0,1 ml).

4. Det hele anbringes på is.

5. Etter 2 timers inkubering med medikament tilsettes preparert EGF-ligand til cellene, 10 /il pr. brønn, for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 25 nM. Kontrollbrønner mottar DMEM alene. Det hele inkuberes under rysting ved romtemperatur i 5 minutter. 6. Medikament, EGF og DMEM fjernes. Cellene vaskes to ganger med PBS. HNTG<*> overføres til cellene, 100 /il pr. brønn. Det hele anbringes på is i 5 minutter. I mellom-tiden fjernes blokkeringsbuffer fra andre ELISA-plater og vaskes med TBST som beskrevet ovenfor. 7. Med en pipettespiss fast festet til en mikropipettør skrapes cellene fra platen, og cellematerialet homogeniseres ved gjentatte ganger å aspirere og dispensere HMTG*-lyseringsbuffer. Lysat overføres til en belagt, blokkert og vasket ELISA-plate. Inkubering under rysting gjennomføres ved romtemperatur i 1 time. 8. Lysat fjernes og det vaskes 4 ganger med TBST. Nyfortynnet anti-pTyr-antistoff overføres til ELISA-plate med 100/il pr. brønn. Inkubering under rysting ved romtemperatur i 30 minutter i nærvær av anti-Ptyr-antiserum (13000-fortynning i TBST). 9. Anti-pTyr-antistoff fjernes og det hele vaskes 4 ganger med TBST. Nyfortynnet TAGO 3 0 anti-kanin-IgG-antistoff overføres til ELISA-platen i en mengde av 100 /il pr. brønn. Inkubering under rysting ved romtemperatur i 30 minutter (anti-kanin-IgG-antistoff: 1:3000-fortynning i

TBST).

10. Detekteringsantistoff fjernes og det vaskes 4 ganger med TBST. Nyfremstilt ABTS :H202-oppløsning overføres ELISA-platen, 100 /il pr. brønn. Det hele inkuberes ved romtemperatur i 20 minutter. ABTS:H202-oppløsning: 1,2 /il 30 %-ig H202 i 10 ml ABTS - stamløsning. 11. Reaksjonen stanses ved tilsetning av 50 /il 5N H2S04 (eventuelt), og man bestemmer OD-verdien ved 410 nm. 12. Det maksimale fosfotyrosinsignal bestemmes ved å trekke verdien av de negative kontroller fra de positive kontroller. Den prosentuelle inhibering av fosfotyrosininnholdet for ekstraktholdige brønner beregnes så etter subtraksjon av de negative kontroller.

Cellulær insulinreseptor ELISA

Den følgende protokoll ble benyttet for å bestemme hvorvidt forbindelsene ifølge oppfinnelsen hadde insulinreseptor-tyrosinkinaseaktivitet.

Materialer og reagenser. De følgende materialer og reagenser ble benytte for å måle fosfotyrosin-nivåene på insulinreseptor (som indikerer insulinreseptor-tyrosinkinaseaktivitet): 1. Den foretrukne cellelinje var en NIH3T3-cellelinje (ATCC nr. 1658) som overuttrykte insulinreseptor (H25-celler); 2. H25-celler dyrkes i en inkubator med 5% C02 ved 37°C. Vekstmediet er DMEM +10% FBS (varmeinaktivert) + 2 mM L-glutamin; 3. For ELISA-platebelegning benyttes monoklonalt anti-IR-antistoff kalt BBE. Antistoffene ble renset av Enzymology Lab., SUGEN, Inc.;

4. D-PBS, omfattende:

5. Blokkeringsbuffer: TBST pluss 5% melk (Carnation Instant ikke-fet tørrmelk);

6. TBST-buffer, omfattende:

Merk: Det prepareres en stamoppløsning av TBS (10X) og Triton X-100 settes til bufferen under fortynning;

7. HNTG-buffer, omfattende:

Merk: Stamoppløsningen (5X) fremstilles og holdes ved 4°C; 8. EDTA.HC1: 0,5M, pH 7,0 (NaOH) som 100X stamløsning; 9. Na3V04: 0,5M som 100X stamløsning og alikvoter holdes ved -80°C; 10. Na4P207: 0,2M som 100X stamløsning; 11. Insulin fra Gibco BRL (kat. # 18125039);

12. Polyklonalt antiserum anti-fosfotyrosin:

Kaninsera oppnådd fra Enzymology Lab., SUGEN Inc.; 13. Detekteringsantistoff, fortrinnsvis geit-anti-kanin-IgG, POD-konjugat, Tago (kat. nr. 4520; lott nr. 1802): Tago, Inc., Burlingame, CA.

14. ABTS-oppløsning omfattende:

der ABTS er 2,21-azino-bis(3-etylbenztiazolinsulfonsyre) og det hele lagres mørkt ved 4°C og kasseres når den blir grønn; 15. Hydrogenperoksyd: 30 %-ig oppløsning holdes i mørke og ved 40°C.

Protokoll. Alle de følgende trinn gjennomføres ved romtemperatur, hvis ikke annet spesielt er sagt. Alle ELISA-platevaskinger gjennomføres ved skylling av platen med springvann tre ganger, fulgt av en TBST-skylling. Alle platene ble tørket ved pressing med papirhåndklær før bruk.

A. Celleutsåing

1. Cellene ble dyrket i vevkulturskåler (10 cm, Corning 25020-100) til 80-90% konfluens og høstet med trypsin-EDTA (0,25%, 0,5 ml/D-100, Gibco); 2. Cellene resuspenderes i nylaget DMEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamin og overføres til en 96-brønners vevkulturplate (Corning, 25806-96) med 20 000 celler pr. brønn (100 fil pr. brønn). Cellene inkuberes deretter en dag. Etter denne inkubering erstattes gammelt medium med 0,01% serummedium (90//xl) og cellene inkuberes i 5% C02 og ved 37°C over natten.

B. ELISA- platebelegging og blokkering

1. ELISA-platen (Corning 25805-96) belegges med anti-IR-antistoff i en mengde av 0,5 /ig pr. brønn i 100 /il PBS i minst 2 timer. 2. Beleggingsoppløsningen fjernes og erstattes med 100/il blokkeringsbuffer og det hele rystes i 3 0 minutter. Blokkeringsbufferen fjernes og platen vaskes akkurat før tilsetning av lysatet.

C. Analyseprosedyrer

1. Medikamentene testes under serumfrie betingelser.

2. Medikament-stamløsningen fortynnes (i 100% DMSO) 1:10 med DMEM i en 96-brønners polypropylenplate og 10 /il pr. brønn av denne oppløsning overføres til cellene for å oppnå en slutt-medikamentfortynning på 1:100 og en slutt-DMSO-konsentrasjon på 1,0%. Cellene inkuberes i 5% C02 ved 37°C i 2 timer. 3. Det fremstilles nylaget cellelyseringsbuffer (HNTG<*>)4. Etter medikament inkubering i 2 timer overføres 10 /il pr. brønn av 1 /iM insulin i PBS til cellene (sluttkonsentrasjon = 100 nM) og det hele inkuberes ved 5% C02 og 37°C i 10 minutter. 5. Mediet fjernes og det tilsettes 100 /il pr. brønn HNTG* og det hele rystes i 10 minutter. Cellene observeres under mikroskop for å undersøke hvorvidt de er adekvat lysert. 6. Ved bruk av en 12-kanals pipette skrapes cellene fra platen, og lysatet homogeniseres ved gjentatt aspirering og dispensering. Hele lysatet overføres til den antistoff belagt ELISA-plate og rystes i 1 time. 7. Lysatet fjernes, platen vaskes, anti-pTyr overføres (1:3000 med TBST) i en mengde av 100 /il pr. brønn og det hele rystes i 3 0 minutter. 8. Anti-pTyr fjernes, platen vaskes, Tago (1:3000 med TBST) overføres 100 /il pr. brønn og det hele rystes i 30 minutter. 9. Detekteringsantistoff fjernes, platen vaskes og nylaget ABTS:H202 (1,2 /il H202 pr. 10 ml ABTS) overføres i en mengde av 100 /il pr. brønn til platen for å starte farvefremkalling. 10. OD måles i en Dynatech MR5000 som er forbundet med en Ingres. Alle de følgende trinn bør følge Ingres-instruk-sjonen.

Forsøksresultater fra ELISA-analyser

Forsøksresultatene for forskjellige forbindelser ved bruk av de ovenfor angitte protokoller er angitt i tabell 1:

Cel le veks tanaly se

De følgende analyser kan gjennomføres for å måle virkning av forbindelser på celleveksten som et resultat av forbind-elsenes interaksjon med en eller flere RTK'er. Hvis ikke annet er sagt, kan de følgende analyser generelt anvendes for å måle aktiviteten av en forbindelse mot en hvilken som helst spesiell RTK. I den grad en analyse som angitt nedenfor henviser til en spesifikk RTK, vil fagmannen være i stand til å tilpasse den beskrevne protokoll til bruk for måling av aktiviteten for en annen RTK.

Mykagaranalyse

Mykagaranalysen kan benyttes for å måle virkningene av stoffer på cellevekst. Hvis ikke annet er sagt, ble mykagaranalysene gjennomført som følger: Materialer og reagenser. Det ble benyttet følgende materialer og reagenser: a. Et vannbad innstilt til 39°C og et andre vannbad innstilt til 37°C.

b. 2X analysemedium bestående av 2X Dulbecco's 5-modifi-serte Eagle's medium (DMEM) (Gibco kat. # CA400-4ANO3), supplert med følgende;

20% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM natriumpyruvat,

4 mM glutaminamin; og

2 0 mM Hepes ikke-essensielle aminosyrer (1:50 fra 100X stamløsning).

c. IX analysemedium bestående av IX DMEM supplert med 10%

FBS, l mM natriumpyruvat, 2 mM glutamin, 10 mM HEPES, ikke-essensiell aminosyre (1:100 fra 100X stam-løsning) .

d. 1,6% SeaPlaque Agarose i autoklavflaske.

e. Sterile 35 mm Corning-plater (FMC Bioproducts kat.

• 50102).

f. Sterile 5 ml glasspipetter (individuelt pakket).

g. Sterile 15 ml og 50 ml koniske sentrifugerør.

h. Pipetter og sterile spisser.

i. Sterile mikrosentrifugerør.

j. Celler i T75-kolber: SKOV-3 (ATCC HTB77).

k. 0,25% Trypsin-oppløsning (Gibco # 25200-015).

Prosedyre. Man benytter den følgende prosedyre for å gjennomføre mykagaranalysen:

A. Prosedyre for fremstilling av basissjiktet

1. Hele mediet ble oppvarmet i vannbadet av 37°C.

2. For å fremstille IX analysemedium + 0,8% agar: Det ble tildannet en 1:2 (vol:vol) fortynning av smeltet agar (avkjølt til 3 9°C), med 2X analysemedium. 3. Hele mediet med agar ble holdt varmt i badet av 39°C når det ikke var i bruk. 4. 1 ml IX analysemedium + 0,8% agar dispenseres inn i skåler og virvles forsiktig for å danne et enhetlig basissjikt. Bobler bør unngås. 5. Basissjiktene avkjøles til størkning (ca. 20 minutter) . Basissjiktene kan lagres over natten i et kjøleskap.

B. Prosedyre for samling av celler

1. Man tar ut en kolbe pr. cellelinje fra inkubatoren; mediet aspireres av; det hele vaskes en gang med PBS og aspireres av; til slutt tilsettes 3 ml trypsin-oppløsning. 2. Etter at alle celler er dissosiert fra flasken, tilsettes 3 ml IX analysemedium for å inhibere trypsin-aktiviteten. Cellene pipetteres opp og ned, og suspensjonen overføres så til et 15 ml rør. 3. Konsentrasjonen av celler bestemmes ved bruk av en Coulter-teller og levedyktigheten bestemmes ved trypan-blått eksklusjon. 4. Man tar ut det egnede volum som er nødvendig for utsåing av 3300 levedyktige celler pr. plate og fortynner dette til 1,5 ml med IX analysemedium.

C. Prosedyre for fremstillin<g> av det øvre 0. 4%

aoarosesiikt

1. TBST-forbindelser tilsettes ved to ganger den ønskede analysekonsentrasjon; + 1,5 ml cellesuspensjon i IX analysemedium 10% FBS; + 1,5 ml IX analysemedium + 0,8% agarose<*>: Totalt = 3,0 ml IX medium 10% FBA + 0,4% agarose med 3300 levedyktige celler pr. ml, med og uten TBST-forbindelser. *(Oppnås ved 1:2 -fortynning av 2X medium med 1,6% agar 3 0 for basissjiktprosedyren ovenfor.) 2. 1 ml av analyseblandingen fordeles på 1 ml basissjikt.

Duplikatene utplates fra 3 ml volumet.

3. Skålene inkuberes i 2-3 uker i en inkubator med 100% fuktighet og 10% C02. 4. Kolonier på 60 /im og større bedømmes som positive.

Sulforhodamin B (SRB)-vekstanalyse

SRB-analyser kan benyttes for å måle virkningene av stoffer på cellevekst. Analysene gjennomføres som følger: Analyse 1: 3T3/E/H+TGF-a(T)-cellevekst-SRB-analyse Materialer:

96-brønners flatbunnede, sterile plater

96-brønners rundbunnede, sterile plater

Sterile 25 ml eller 100 ml reservoarer

Pipetter, multi-kanalpipetter

Sterile pipettespisser

Sterile 15 ml og 50 ml rør

Reagenser:

0,4% SRB i 1% eddiksyre

10 mM Tris-base

10% TCA

1% eddiksyre

Steril DMSO (Sigma)

Forbindelse i DMSO (100 mM eller mindre stamoppløsning) 25% trypsin-EDTA i celledissosiasjonsoppløsning (Sigma)

Cellelinje og vekstmedium:

3T3/E/H+TGF-a(T) (NIH 3T3-klon 7 celler som uttrykker EGF-R/HER2-kimærer og TGF-a, tumor-avledede autokrine løkke-celler)

2% kalveserum/DMEM + 2 mM glutamin

Protokoll:

Dag 0: Celleutplating:

Denne del av analysen gjennomføres i en laminær strømnings-hette. 1. Cellene trypsineres som vanlig. 100 /il cellesuspensjon overføres til 10 ml isoton. Cellene telles med Coulter Counter. 2. Cellene fortynnes i vekstmedium til 60 000 celler pr. ml. 100 /xl celler overføres til hver brønn i en 96-brønners flatbunnet plate for å oppnå 6000 celler pr. brønn. 3. Halvparten av platen (4 rekker) benyttes for hver forbindelse og brønnene kvadruplikeres for hver forbindelseskonsentrasjon, et sett på 4 brønner for mediumkontroll og 4 brønner for DMSO-kontroi1. 4. Platene rystes forsiktig for å tillate enhetlig festing av cellene.

5. Platene inkuberes ved 37°C i en 10% C02-inkubator.

Dag 1: Tilsetning av forbindelse:

Denne del av analysen gjennomføres i en laminær strømnings-hette. 1. I 96-brønners rundbunnet plate tilsettes 12 5 /il vekst medium til kolonnene 3 til 11. Denne plate benyttes for å titrere ut forbindelsen, 4 rekker pr. forbindelse. 2. I et sterilt, 15 ml rør lages det en 2X oppløsning av den høyeste konsentrasjon av forbindelsen ved å tilsette 8 /il av forbindelsen til tilsammen 2 ml vekstmedium for en fortynning på 1:250. Ved denne fortynning er konsentrasjonen av DMSO 0,4% for en 2X oppløsning eller 0,2% for IX oppløsning på cellene. Utgangskonsentrasjonen av forbindelsen er vanligvis 100/iM, men denne konsentrasjon kan variere avhengig av forbindelsens oppløselighet. 3 . 2X utgangsforbindelsesoppløsningén overføres til kvadruplikatbrønnene i kolonne 12 av den 96-brønners rundbunnplate. Det gjennomføres 1:2 seriefortynninger over platen fra høyre mot venstre ved å overføre 12 5 fil fra kolonne 12 til 11, fra kolonne 11 til 10 og så videre. 100 fil av forbindelsesfortynningene over-føres på 100 fil medium på celler i tilsvarende brønner i 96-brønners flatbunnplaten. Totalt volum pr. brønn skal nå være 200 fil. 4. For bærerkontroll prepareres det en 2X oppløsning av DMSO ved 0,4% DMSO i vekstmedium. 100 fil DMSO-oppløsning overføres til de egnede brønner av celler. Sluttkonsentrasjonen av DMSO er 0,2%. 5. For mediumkontrollbrønner tilsettes 100 fil pr. brønn vekstmedium til de egnede brønner av celler. 6. Platen returneres til inkubatoren og inkuberes i 4 dager.

Dag 5: Fremkalling av analysen

Denne del av analysen gjennomføres på benken.

1. Medium aspireres eller helles av. Det tilsettes 200 /il kaldt 10 %-ig TCA til hver brønn for å fiksere cellene. Platen inkuberes i minst 60 minutter ved 4°C. 2. TCA kasseres og brønnene skylles 5 ganger med vann.

Platene tørkes oppned på papirhåndklær.

3. Cellene f arves med 100 /il pr. brønn 0,4% SRB i 10 minutter. 4. SRB helles av og brønnene skylles 5 ganger med 1% eddiksyre. Platene tørkes fullstendig oppned på papirhåndklaer .

5. Farvestoffet oppløseliggjøres med 100 /il pr. brønn

10 mM Tris-base i 5-10 minutter på en ryster.

6. Platene avleses på en Dynatech ELISA Plate Reader ved 570 nm med referanse ved 630 nm.

Analyse 2: 3T3/EGF-R+TGF-a(T)-cellevekst SRB-analyse Materialer og reagenser er som for analyse 1.

Cellelinje og vekstmedium:

3T3/EGF-R+TGF-a(T) (NIH 3T3-klon 7 celler som uttrykker EGF—R og TGF-a, tumor-avledede autokrine løkkeceller)

2% kalveserum/DMEM + 2 mM glutamin

Protokoll:

Dag 0: Celleutplating:

Denne del av analysen gjennomføres i en laminær strømnings-hette. 1. Cellene trypsineres som vanlig. 100 /il av cellesuspensjonen overføres til 10 ml isoton. Cellene telles med en Coulter Counter. 2. Cellene fortynnes i vekstmedium til 60 000 celler pr. ml. 100 fil av cellene overføres til hver brønn i en 96-brønners flatbunnplate til 6000 celler pr. brønn. 3. Halvparten av platen (4 rekker) for hver forbindelse benyttes og brønnene kvadruplikeres for hver forbindelseskonsentrasjon, et sett på 4 brønner for mediumkontroll og 4 brønner for DMSO-kontroll. 4. Platene rystes forsiktig for å tillate enhetlig festing av cellene.

5. Platene inkuberes ved 37°C i en 10% C02-inkubator.

Dag 1: Tilsetning av forbindelse: Samme som for analyse 1.

Dag 5: Fremkalling av analyse: Samme som for analyse 1.

Analyse 3: 3T3/PDGF-BR/PDGF-BB(T)-cellevekst-SRB-analyse Cellelinje og vekstmedium: 3T3/PDGF-SR/PDGF-BB(T) (NIH 3T3-klon 7 celler som uttrykker PDGF-fi-reseptor og PDGF-BB, fra tumorer operativt fjernet fra athymiske mus)

2% kalveserum/DMEM + 2 mM glutamin

Protokoll:

Dag 0: Celleutplating:

Denne del av analysen gjennomføres i en laminær strømnings-hette. 1. Cellene trypsineres som vanlig. 200 fil cellesuspensjon overføres til 10 ml isoton. Cellene telles på en Coulter Counter. 2. Cellene fortynnes i vekstmedium til 60 000 celler pr. ml. 100 fil celler overføres til hver brønn i en 96-brønners flatbunnet plate til 6000 celler pr. brønn. 3. Halvparten av platen (4 rekker) tillates for hver forbindelse og brønnene kvadruplikeres for hver forbindelseskonsentrasjon, et sett på 4 brønner for mediumkontroll og 4 brønner for DMSO-kontroi1. 4. Platene rystes forsiktig for å tillate enhetlig festing av cellene til platen.

5. Platene inkuberes ved 37°C i en 10% C02-inkubator.

Dag 1: Tilsetning av forbindelse: Samme som for analyse 1.

Dag 5: Fremkalling av analyse: Samme som for analyse 1.

Analyse 4: Human glatt-muskelcelle (SMC)-vekst-SRB-analyse

Materialer og reagenser er som for analyse 1:

Cellelinje og vekstmedium:

Human aorta-glatt-muskelceller (Clonetics).

Clonetics's Bullet Kit: Glatt-muskel-basalmedium (SmBM) som er modifisert MCDB 131 inneholdende føtalt bovint serum (5%), hFGF (2 ng/ml), hEGF (0,1 ng/ml), insulin (5,0 /xg/ml) , gentamicin (50 /xg/ml) og amfotericin B (50 ng/ml) .

Protokoll:

Dag 0: Celleutplating:

Denne del av analysen gjennomføres i en laminær strømnings-hette. 1. Cellene trypsineres som vanlig. 200 /il av cellesuspensjonen overføres til 10 ml isoton. Cellene telles på en Coulter Counter. 2. Cellene fortynnes i vekstmedium til 20 000 celler pr. ml. 100 fil celler overføres til hver brønn i en 96-brønners flatbunnplate til 2000 celler pr. brønn. 3. Halvparten av platen (4 rekker) tillates for hver forbindelse og brønner kvadruplikeres for hver forbindelseskonsentrasjon, et sett på 4 brønner for mediumkontroll og 4 brønner for DMSO-kontroll. 4. Platene rystes forsiktig for å tillate enhetlig festing av cellene til platen. 5. Platene inkuberes ved 37°C i en 10% C02-inkubator.

Dag 1: Tilsetning av forbindelse: Samme som for analyse 1.

Dag 5: Fremkalling av analyse: Samme som for analyse 1.

3T3-cellevekstanalyse

Analyse 1: PDGF-indusert BrdU-innarbeidingsanalyse

Materialer og reagenser:

1. PDGF: human PDGF B/B; 1276-956, Boehringer Mannheim,

Tyskland.

2. BrdU-merkingsreagens: 10 mM i PBS (pH 7,4), kat. nr.

1 647 229, Boehringer Mannheim, Tyskland.

3. FixDenat: Fikseringsoppløsning (ferdig til bruk), kat. nr. 1 647 22 9, Boehringer Mannheim, Tyskland. 4. Anti-BrdU-POD: Mus-monoklonalt antistoff, konjugert med peroksydase, kat. nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Tyskland. 5. TMB-substratoppløsning: Tetrametylbenzidin (TMB), ferdig til bruk, kat. nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Tyskland. 6. PBS-vaskeoppløsning: IX PBS, pH 7,4, fremstilt i huset. 7. Albumin, Bovin (BSA): fraksjon V-pulver; A-8551, Sigma EGF: muse-EGF, 201; Toyobo, Co., Ltd., Japan Chemical Co., USA.

Protokoll:

1. 3T3 konstruert cellelinje: 3T3/EGFRc7.

2. Cellene utsåes med 8000 celler pr. brønn i DMEM, 10% CS, 2 mM Gin i en 96-brønners plate. Cellene inkuberes over natten ved 37°C i 5% C02. 3. Etter 24 timer vaskes cellene med PBS, hvoretter de serumsultes i serumfritt medium (0% CS DMEM med 0,1% BSA) i 24 timer. 4. På dag 3 blir ligand (PDGF =3,8 nM, fremstilt i DMEM med 0,1% BSA) og prøveforbindelsene samtidig tilsatt til cellene. De negative kontrollbrønner får serumfritt DMEM med kun 0,1% BSA; de positive kontrollceller får ligand (PDGF), men ingen prøveforbindelse. Prøveforbindelsene fremstilles i serumfritt DMEM med ligand i en 96-brønners plate og seriefortynnes for 7 testkonsentrasj oner. 5. Etter 20.timers ligandaktivering blir fortynnet BrdU-merkereagens (1:100 i DMEM, 0,1% BSA) tilsatt og cellene inkubert med BrdU (sluttkonsentrasjon = 10 /xM) i 1,5 timer. 6. Etter inkubering med merkereagens blir mediet fjernet ved dekantering og banking av den inverterte plate på et papirhåndkle. FixDenat-oppløsning tilsettes (50 fil pr. brønn) og platene inkuberes ved romtemperatur i 45 minutter på en plateryster. 7. FixDenat-oppløsningen fjernes grundig ved dekantering og banking av den inverterte plate på et papirhåndkle. Melk tilsettes (5% dehydratisert melk i PBS, 2 00 fil pr. brønn) som blokkeringsoppløsning og platen inkuberes i 3 0 minutter ved romtemperatur på en plateryster. 8. Blokkeringsoppløsningen fjernes ved dekantering og brønnene vaskes en gang med PBS. Anti-BrdU-POD-oppløsning (1:100 fortynning i PBS, 1% BSA) tilsettes i en mengde av 10 0 /xl pr. brønn og platen inkuberes i 90 minutter ved romtemperatur på en plateryster. 9. Antistoffkonjugatet fjernes grundig ved dekantering og skylling av brønnene 5 ganger med PBS, hvoretter platene tørkes ved å snus og legges mot et papirhåndkle . 10. TMB-substratoppløsning tilsettes (100 /xl pr. brønn) og inkuberes i 20 minutter ved romtemperatur på en plateryster inntil farvefremkallingen er tilstrekkelig for fotometrisk detektering. 11. Absorbansen for prøvene måles ved 410 nm (i "dual-bølgelengde"-metoden med en filteravlesning ved 490 nm, som referansebølgelengde) på en Dynatech ELISA-plateavleser.

Analyse 2: EGF-indusert BrdU-innarbeidingsanalyse Materialer og reagenser:

1. EGF: muse-EGF, 201; Toyobo, Co., Ltd., Japan

2. BrdU-merkingsreagens: 10 mM, i PBS (pH 7,4), kat. nr.

1 647 22 9, Boehringer Mannheim, Tyskland.

3. FixDenat: Fikseringsoppløsning (ferdig til bruk), kat. nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Tyskland. 4. Anti-BrdU-POD: mus-monoklonalt antistoff, konjugert med peroksydase, kat. nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Tyskland. 5. TMB-substratoppløsning: tetrametylbenzidin (TMB), ferdig til bruk, kat. nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Tyskland. 6. PBS-vaskeoppløsning: IX PBS, pH 7,5, fremstilt i huset. 7. Albumin, bovin (BSA): Fraksjon V-pulver; A-8551, Sigma Chemical Co., USA

Protokoll:

1. 3T3 konstruert cellelinje: 3T3/EGFRC7

2. Cellene utsåes med 8000 celler pr. brønn i 10% CS, 2 mM Gin i DMEM, i en 96-brønners plate. Cellene inkuberes over natten ved 37°C i 5% C02. 3. Etter 24 timer vaskes cellene med PBS, og serumsultes deretter i serumfritt medium (0% CS DMEM med 0,1% BSA) i 24 timer. 4. På dag 3 blir ligand (EGF = 2 nM, fremstilt i DMEM med 0,1% BSA) og prøveforbindelsene satt til cellene samtidig. De negative kontrollceller mottar serumfritt DMEM med kun 0,1% BSA; de positive kontrollceller mottar ligand (EGF), men ingen prøveforbindelse. Prøveforbindelsene fremstilles i serumfritt DMEM med ligand i en 96-brønners plate og seriefortynnes for 7 testkonsentrasjoner. 5. Etter 20 timers ligandaktivering tilsettes fortynnet BrdU-merkingsreagens (1:100 i DMEM, 0,1% BSA) og cellene inkuberes med BrdU (sluttkonsentrasjon = 10 iiM) i 1,5 timer. 6. Etter inkubering med merkingsreagens fjernes mediet ved dekantering og banking av den snudde plate på et papirhåndkle. Det tilsettes 50 /xl pr. brønn FixDenat-oppløsning og platene inkuberes ved romtemperatur i 45 minutter på en plateryster. 7. FixDenat-oppløsningen fjernes grundig ved dekantering og banking av den inverterte plate på et papirhåndkle. Melk tilsettes (5% dehydratisert melk i PBS, 200 /xl pr. brønn) som blokkeringsoppløsning og platen inkuberes i 3 0 minutter ved romtemperatur på en plateryster. 8. Blokkeringsoppløsningen fjernes ved dekantering og brønnene vaskes en gang med PBS. Anti-BrdU-POD-oppløsning (1:100 fortynning i PBS, 1% BSA) tilsettes i en mengde av 100 fil pr. brønn og platen inkuberes i 90 minutter ved romtemperatur på en plateryster. 9. Antistoffkonjugatet fjernes grundig ved dekantering og skylling av brønnene 5 ganger med PBS og platen tørkes ved snuing og banking mot et papirhåndkle. 10. Det tilsettes TMB-substratoppløsning i en mengde av 100 til pr. brønn og det hele inkuberes i 20 minutter ved romtemperatur på en plateryster inntil farvefremkallingen er tilstrekkelig for fotometrisk detektering. 11. Absorbansen for prøvene måles ved 410 nm (etter "dual-bølgelengde"-metoden med en filteravlesning ved 490 nm, som referansebølgelengde) på en Dynatech ELISA-plateavleser.

Analyse 3 : EGF-indusert Her2-dreven BrdU-innarbeiding Materialer og rea<g>enser:

1. EGF: muse-EGF, 201; Toyobo, Co., Ltd., Japan

2. BrdU-merkingsreagens: 10 mM, i PBS (pH 7,4), kat. nr.

1 647 229, Boehringer Mannheim, Tyskland.

3. FixDenat: Fikseringsoppløsning (bruksferdig), kat. nr.

1 647 22 9, Boehringer Mannheim, Tyskland.

4. Anti-BrdU-POD: mus-monoklonalt antistoff, konjugert med peroksydase, kat. nr. l 647 22 9, Boehringer Mannheim, Tyskland. 5. TMB-substratoppløsning: tetrametylbenzidin (TMB), bruksferdig, kat. nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Tyskland.

6. PBS-vaskeoppløsning: IX PBS, pH 7,5, eget produkt.

7. Albumin, bovin (BSA): Fraksjon V-pulver; A-8551, Sigma Chemical Co., USA

Protokoll:

1. 3T3 konstruert cellelinje:

3T3/EGFr/Her2/EGFr (EGFr med et Her2-kinasedomene)

2. Cellene utsåes med 8000 celler pr. brønn i 10% CS, 2 mM Gin i en 96-brønners plate. Cellene inkuberes over natten ved 37°C i 5% C02. 3. Etter 24 timer vaskes cellene med PBS, og serumsultes i serumfritt medium (0% CS DMEM med 0,1% BSA) i 24 timer. 4. På dag 3 blir ligand (EGF = 2 nM, fremstilt i DMEM med 0,1% BSA) og testforbindelsene satt til cellene samtidig. De negative kontrollceller mottar serumfritt DMEM med kun 0,1% BSA; de positive kontrollceller får ligand (EGF), men ingen testforbindelse. Testforbindelsene fremstilles i serumfritt DMEM med ligand i en 96-brønners plate og seriefortynnes for 7 testkonsentrasjoner. 5. Etter 2 0 timers ligandaktivering blir fortynnet BrdU-merkingsreagens (1:100 i DMEM, 0,1% BSA) tilsatt og cellene inkubert med BrdU (slut tkonsent ras jon = 10 iiM) i 1,5 timer. 6. Etter inkubering med merkingsreagens blir mediet fjernet ved dekantering og banking av den inverterte plate på et papirhåndkle. FixDenat-oppløsning tilsettes i en mengde av 50 fil pr. brønn og platene inkuberes ved romtemperatur i 45 minutter på en plateryster. 7. FixDenat-oppløsningen fjernes grundig ved dekantering og banking av den snudde plate på et papirhåndkle. Melk tilsettes (5% dehydratisert melk i PBS, 200 [ il pr. brønn) som en blokkeringsoppløsning og platen inkuberes i 3 0 minutter ved romtemperatur på en plateryster. 8. Blokkeringsoppløsningen fjernes ved dekantering og brønnene vaskes en gang med PBS. Anti-BrdU-POD-oppløsning (1:100 fortynning i PBS, 1% BSA) tilsettes i en mengde av 100/xl pr. brønn og platen inkuberes i 90 minutter ved romtemperatur på en plateryster. 9. Antistoffkonjugatet fjernes grundig ved dekantering og skylling av brønnene 5 ganger med PBS, hvoretter platen tørkes ved snues og bankes på et papirhåndkle. 10. TMB-substratoppløsning tilsettes i en mengde av 100 /xl pr. brønn og inkuberes i 20 minutter ved romtemperatur på en plateryster inntil farvefremkallingen er tilstrekkelig for fotometrisk detektering. 11. Absorbansen for prøvene måles ved 410 nm (etter "dual-bølgelengde"-metoden med en filteravlesning ved 4 90 nm, som referansebølgelengde) på en Dynatech ELISA-plateavleser.

Analyse 4: IGFl-indusert BrdU-innarbeidingsanalyse Materialer og reagenser: 1. IGFl-ligand: human, rekombinant; G511, Promega Corp.,

USA

2. BrdU-merkingsreagens: 10 mM, i PBS (pH 7,4), kat. nr.

1 647 229, Boehringer Mannheim, Tyskland.

3. FixDenat: Fikseringsoppløsning (bruksferdig), kat. nr.

1 647 229, Boehringer Mannheim, Tyskland.

4. Anti-BrdU-POD: mus-monoklonalt antistoff, konjugert med peroksydase, kat. nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Tyskland. 5. TMB-substratoppløsning: tetrametylbenzidin (TMB), bruksferdig, kat. nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Tyskland.

6. PBS-vaskeoppløsning: IX PBS, pH 7,5, selvfremstilt.

7. Albumin, bovin (BSA): Fraksjon V-pulver; A-8551, Sigma Chemical Co., USA

Protokoll:

1. 3T3 konstruert cellelinje: 3T3/IGFlr.

2. Cellene utsåes med 8000 celler pr. brønn i DMEM, 10% CS, 2 mM Gin i en 96-brønners plate. Cellene inkuberes over natten ved 37°C i 5% C02. 3. Etter 24 timer vaskes cellene med PBS, og serumsultes så i serumfritt medium (0% CS DMEM med 0,1% BSA) i 24 timer. 4. På dag 3 blir ligand (IGFl =3,3 nM, fremstilt i DMEM med 0,1% BSA) og testforbindelser satt til cellene samtidig. De negative kontrollbrønner mottar serumfritt DMEM med kun 0,1% BSA; de positive kontrollceller mottar ligand (IGFl), men ingen testforbindelse. Testforbindelsene fremstilles i serumfritt DMEM med ligand i en 96-brønners plate og seriefortynnes for 7 testkonsentrasjoner. 5. Etter 16 timers ligandaktivering blir fortynnet BrdU-merkingsreagens (1:100 i DMEM, 0,1% BSA) tilsatt og cellene inkubert med BrdU (sluttkonsentrasjon = 10 /iM) i 1,5 timer. 6. Etter inkubering med merkingsreagens blir mediet fjernet ved dekantering og banking av den snudde plate på et papirhåndkle. FixDenat-oppløsning tilsettes i en mengde av 50 /il pr. brønn og platene inkuberes ved romtemperatur i 45 minutter på en plateryster. 7. FixDenat-oppløsningen fjernes grundig ved dekantering og banking av den snudde plate på et papirhåndkle. Man tilsetter melk (5% dehydratisert melk i PBS, 200/xl pr. brønn) som blokkeringsoppløsning og platen inkuberes i 3 0 minutter ved romtemperatur på en plateryster. 8. Blokkeringsoppløsningen fjernes ved dekantering og brønnene vaskes en gang med PBS. Anti-BrdU-POD-oppløsning (1:100 fortynning i PBS, 1% BSA) tilsettes i en mengde av 100 /il pr. brønn og platen inkuberes i 90 minutter ved romtemperatur på en plateryster. 9. Antistoffkonjugatet fjernes grundig ved dekantering og skylling av brønnene 5 ganger med PBS, hvoretter platen tørkes ved å snu den og banke den på et papirhåndkle . 10. Det tilsettes 100 /il pr. brønn TMB-substratoppløsning og det hele inkuberes i 20 minutter ved romtemperatur på en plateryster inntil farvefremkallingen er tilstrekkelig til fotometrisk detektering.-11. Absorbansen for prøvene måles ved 410 nm (etter "dual-bølgelengde"-metoden med en filteravlesning ved 490 nm, som referansebølgelengde) på en Dynatech ELISA-plateavleser.

Analyse 5: Insulin-indusert BrdU-innarbeidingsanalyse Materialer og reagenser: 1. Insulin: krystallinsk, bovin, sink; 13007, Gibco BRL,

USA.

2. BrdU-merkingsreagens: 10 mM, i PBS (pH 7,4), kat. nr.

1 647 22 9, Boehringer Mannheim, Tyskland.

3. FixDenat: Fikseringsoppløsning (bruksferdig), kat. nr. 1 64 7 229, Boehringer Mannheim, Tyskland. 4. Anti-BrdU-POD: mus-monoklonalt antistoff, konjugert med peroksydase, kat. nr. 1 647 22 9, Boehringer Mannheim, Tyskland. 5. TMB-substratoppløsning: tetrametylbenzidin (TMB), bruksferdig, kat. nr. 1 647 22 9, Boehringer Mannheim, Tyskland.

6. PBS-vaskeoppløsning: IX PBS, pH 7,5, selvfremstilt.

7. Albumin, bovin (BSA): Fraksjon V-pulver; A-8551, Sigma Chemical Co., USA

Protokoll:

1. 3T3 konstruert cellelinje: H2 5

2. Cellene utsåes med 8000 celler pr. brønn i DMEM, 10% CS, 2 mM Gin i en 96-brønners plate. Cellene inkuberes over natten ved 37°C i 5% C02. 3. Etter 24 timer vaskes cellene med PBS, og deretter serumsultes de i serumfritt medium (0% CS DMEM med 0,1% BSA) i 24 timer. 4. På dag 3 blir ligand (insulin = 10 nM, fremstilt i DMEM med 0,1% BSA) og testforbindelser satt til cellene samtidig. De negative kontrollbrønner mottar serumfritt DMEM med kun 0,1% BSA; de positive kontrollceller mottar ligand (insulin), men ingen testforbindelse. Testforbindelsene prepareres i serumfritt DMEM med ligand i en 96-brønners plate og seriefortynnes for 7 testkonsentrasjoner. 5. Etter 16 timers ligandaktivering blir fortynnet BrdU-merkingsreagens (1:100 i DMEM, 0,1% BSA) tilsatt og cellene inkubert med BrdU (sluttkonsentrasjon = 10 itM) i 1,5 timer. 6. Etter inkubering med merkingsreagens blir mediet fjernet ved dekantering og den snudde plate bankes på papirhåndkle. FixDenat-oppløsning tilsettes i en mengde av 50 fil pr. brønn og platene inkuberes ved romtemperatur i 45 minutter på en plateryster. 7. FixDenat-oppløsningen fjernes grundig ved dekantering og banking av den snudde plate på et papirhåndkle. Det tilsettes melk (5% dehydratisert melk i PBS i en mengde av 2 00 fil pr. brønn) som en blokkerings-oppløsning og platen inkuberes i 3 0 minutter ved romtemperatur på en plateryster. 8. Blokkeringsoppløsningen fjernes ved dekantering og brønnene vaskes en gang med PBS. Anti-BrdU-POD-oppløsningen (1:100 fortynning i PBS, 1% BSA) tilsettes i en mengde av 100 fil pr. brønn og platen inkuberes i 90 minutter ved romtemperatur på en plateryster. 9. Antistoffkonjugatet fjernes grundig ved dekantering og skylling av brønnene 5 ganger med PBS, hvoretter platen tørkes ved å snu den og legge den på et papirhåndkle . 10. TMB-substratoppløsning tilsettes i en mengde av 100 fil pr. brønn og inkuberes i 20 minutter ved romtemperatur på en plateryster inntil farvefremkallingen er tilstrekkelig for fotometrisk detektering. 11. Absorbansen for prøvene måles ved 410 nm (etter "dual-bølgelengde"-metoden med en filteravlesning ved 490 nm, som referansebølgelengde) på en Dynatech ELISA-plateavleser.

HUV-EC-C-analyse

Også den følgende protokoll kan benyttes for å måle en forbindelses aktivitet:

DAG 0

1. HUV-EC-C-celler (human umbilikalvene-endotelceller, American Type Culture Collection; katalog nr. 173 0 CRL) vaskes og trypsineres. Det hele vaskes med Dulbecco's fosfatbufret saltoppløsning (D-PBS, oppnådd fra Gibco BRL, katalog nr. 14190-029) 2 ganger ved ca. 1 ml pr. 10 cm2 vev skult ur ko lbe. Det hele trypsineres med 0,05% trypsin-EDTA i ikke-enzymatisk celledissosi-asjonsoppløsning (Sigma Chemical Company, katalog nr. C-1544) . 0,05% trypsin oppnås ved å fortynne 0,25% trypsin/l mM EDTA (Gibco, katalog nr. 25200-049) i celledissosiasjonsoppløsningen. Det trypsineres med ca. 1 ml pr. 25-30 cm<2> vevskulturkolbe i ca. 5 minutter ved 37°C. Etter at cellene har sluppet flasken, tilsettes et likt volum analysemedium og det hele overføres til et 50 ml sterilt sentrifugeringsrør (Fisher Scientific, katalog nr. 05-539-6). 2. Cellene vaskes med ca. 35 ml analysemedium i det 50 ml store sterile sentrifugerar ved tilsetning av analysemedium, hvoretter det hele sentrifugeres i 10 minutter ved ca. 2 00xg, supernatanten aspirerer og det hele resuspenderes med 35 ml D-PBS. Vaskingen gjentas ytterligere 2 ganger med D-PBS med resuspendering av cellen i ca. 1 ml analysemedium pr. 15 cm<2> vevskulturkolbe. Analysemediet består av F12K-medium (Gibco BRL, katalog nr. 2117-014) + 0,5% varmeinaktivert føtalt bovint serum. Cellene telles med en Coulter Counter v Coulter Electronics, Inc.) og man tilsetter analysemedium til cellene for å oppnå en konsentrasjon på 0,8-1,0 x IO<4> celler pr. ml. 3. Cellene settes til en 96-brønners flatbunnplate ved 100 /xl pr. brønn eller 0,8-1,0 x IO<4> celler pr. brønn, hvoretter det hele inkuberes i ca. 24 timer ved 37°C under 5% C02.

DAG 1

1. Det gjennomføres doble medikamenttitreringer i sepa-rate 96-brønners plater, generelt 50 /xM og ned til 0 /xM. Man benytter det samme analysemedium som nevnt under dag 0, trinn 2 ovenfor. Titreringene skjer ved å tilsette 90 /xl pr. brønn medikament ved 200 /xM (4X sluttbrønnkonsentrasjonen) til toppbrønnen av en gitt platekolonne. Fordi stammedikamentkonsentrasjonen vanligvis er 20 mM i DMSO, inneholder 200 /xM medika-mentkonsentrasjonen 2% DMSO.

Derfor benyttes fortynningsmiddel bestående av 2% DMSO 1 analysemedium (F12K + 0,5% føtalt bovint serum) som

fortynningsmiddel for medikamenttitreringene for å fortynne medikamentet, men for å holde DMSO-konsentrasjonen konstant. Dette fortynningsmiddel settes til de gjenværende brønner i kolonnen med 60 /xl pr. brønn. Man tar 60 /xl fra de 120 /xl av 200 /xM medikament fortynningen i toppbrønnen av kolonnen og blander med de 60 /xl i den andre brønn i kolonnen. Deretter tas 60 /xl

fra denne brønn og blandes med 60 /il i den tredje brønn i kolonnen og deretter fortsetter man på samme måte inntil de to-doble titreringer er ferdig. Når den nest siste brønn er blandet, tar man 60 /il av de 12 0 /il i denne brønn og kasserer. Den siste brønn etter-lates med 60 /il DMSO/mediumfortynningsmiddel som ikke-medikamentholdig kontroll. Man tildanner 9 kolonner av titrert medikament, nok for triplikate brønner hver for 1) VEGF (oppnådd fra Pepro Tech Inc., katalog nr. 100-200), 2) endotelcellevekstfaktor (ECGF) (også kjent som sur fibroblastvekstfaktor eller aFGF)

(oppnådd fra Boehringer Mannheim Biochemica, katalog nr. 1439 600), og analysemediumkontroll. ECGF kommer som et preparat, med natriumheparin. 2. 50 /il pr. brønn av medikament fortynningene overføres til 96-brønners analyseplate inneholdende 0,8-1,0 x IO<4> celler pr. 100 /il pr. brønn av HUV-EC-C-cellene fra dag 0 og inkuberes i ca. 2 timer ved 37°C og 5% C02. 3. I triplikat tilsettes 50 /il pr. brønn av 80 /ig/ml VEGF, 20 ng/ml ECGF eller mediumkontroll til hver medikamenttilstand. På samme måte som med medikamentene er vekstfaktorkonsentrasjonene 4X den ønskede sluttkonsentrasjon. Man bruker analysemedium fra dag 0, trinn 2 for å tilveiebringe konsentrasjonene av vekstfaktor. Man inkuberer det hele i ca. 24 timer ved 37°C og 5% C02. Hver brønn vil ha 50 /il medikamentfortynning, 50 /il vekstfaktor eller medium og 100 /il celler, = 200 /il pr. brønn tilsammen. Således blir 4X-konsentrasjonene av medikamenter og vekstfaktorer IX når alt først er satt til brønnene.

DAG 2

1. <3>H-thymidin (Amersham; katalog nr. TRK-686) tilsettes som 1 /iCi pr. brønn (10 /il pr. brønn av 100 /iCi pr. ml oppløsning tildannet i RPMI-medium + 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum) og det inkuberes i 24 timer ved 37°C under 5% C02. Merk: <3>H-thymidin tildannes i RPMI-medium fordi alle andre anvendelser for hvilke det anvendes 3H-thymidin involverer forsøk gjennomført i RPMI. Mediumforskjellene på dette trinn er sannsyn-ligvis ikke signifikante. RPMI ble oppnådd fra Gibco BRL, katalog nr. 11875-051.

DAG 3

1. Platene frysetørkes over natten ved -20°C.

DAG 4

1. Platene tines og høstes med en 96-brønners platehøster (Tomtec Harvester 96v ') til filtermatter (Wallac, katalog nr. 1205-401) og man avleser tellingene på en Wallac Betaplate(TM) -væskescintillasjonsteller.

PDGF-R-cellulæranalyse

Den PDGF-cellulære kinaseanalyse ble gjennomført som følger: Celler lyseres i 0,2M Hepes, 0,15M NaCl, 10% v/v glycerol, 0,04% Triton X—100, 5 mM EDTA, 5 mM natrium-vanadat og 2 mM Na+pyrofosfat; cellelysatene settes så til en ELISA-plate belagt med et anti-PDGF-reseptor-antistoff (Genzyme) ; ELISA-platene belegges ved 0,5 /ig antistoff pr. brønn i 150 /il PBS i 18 timer ved 4°C før tilsetning av lysatet; lysatet inkuberes i de belagte plater i 1 time og vaskes så 4 ganger i TBST (35 mM Tris-HCl, pH 7,0, 0,15M NaCl, 0,1% Triton X-100); anti-fosfortyrosin-antistoff (100/il i PBS) tilsettes og blandingen inkuberes i 30 minutter ved romtemperatur; brønnene vaskes så fire ganger med TBST, et sekundært antistoff konjugert til POD (TAGO) settes til hver celle og den behandlede brønn inkuberes i 3 0 minutter ved romtemperatur; brønnene vaskes så fire ganger i TBST, ABTS/H202-oppløsning settes til hver brønn og brønnene inkuberes i 2 minutter, hvoretter absorbansen måles ved 410 nm.

Forsøksresultater for cellevekstanalyse

Resultatene for forskjellige forbindelser oppnådd fra de ovenfor angitte analyser er angitt i de etterfølgende tabeller:

Måling av celletoksisiteten

Terapeutiske forbindelser må være mere potente i inhibering av reseptortyrosinkinaseaktivitet enn i å utøve cytotoksisk effekt. En måling på effektiviteten og celletoksisiteten for en forbindelse kan oppnås ved å bestemme den terapeutiske indeks: IC50:LD50. IC50-verdien, den dose som er nødvendig for å oppnå 50% inhibering, kan måles ved bruk av standardteknikker som her beskrevet. LD50-verdien, den dose som resulterer i 50% toksisitet, kan også måles ved standardteknikker (Mossman, 1983, "J. Immunol. Methods",

65:55-63), ved å måle mengden frigitt LDH (Korzeniewski og Callewaert, 1983, "J. Immunol. Methods", 64:313; Decker og Lohmann-Matthes, 1988, "J. Immunol. Methods", 115:61) eller ved å måle den letale dose i dyremodeller. Forbindelser med høy terapeutisk indeks er foretrukket. Den terapeutiske indeks bør være større enn 2, fortrinnsvis minst 10 og aller helst minst 50.

In vivo- dyremodeller

Xenotransplanterte dyremodeller

Evnen for en human tumor til å vokse som xenotransplantasjoner i athymiske mus (for eksempel Balb/c, nu/nu) gir en brukbar in vivo modell for å studere biologiske responser for terapier på humane tumorer. Etter den første, vel-lykkede xenotransplantasjon av humane tumorer i athymiske mus (Rygaard og Povlsen, 1969, "Acta Pathol. Microbial. Scand.", 22: 758-760) har mange forskjellige humane tumor-cellelinjer (for eksempel bryst, lunge, genitalie, gastro-intestinal, hode og nakke, glioblastom, ben og maligne melanomer) vært transplantert og med hell dyrket i hårløse mus. Humane brysttumorcellelinjer inkludert MCF-7, ZR75—1 og MDA-MB-231, er opprettet som subkutane xenotransplantasjoner i hårløse mus (Warri et al., 1991, "Int. J. Cancer", 49: 616-623; Ozzello og Sordat, 1980, "Eur. J. Cancer", 16.: 553-559; Osborne et al., 1985, "Cancer Res.", 15: 584-590; Seibert et al., 1983, "Cancer Res.", 4J.: 2223-2239).

Analyse 1: HER2/Xenotransplantasjons-dyremodell

For å studere virkningen av anti-tumormedikamentkandidater på HER2-uttrykkende tumorer, må tumorcellene være i stand til å vokse i fravær av supplement-østrogen. Mange brystcellelinjer er avhengig av østrogen for in vivo-vekst i hårløse mus (Osborne et al., supra); imidlertid under-trykker eksogent østrogen HER2-ekspresjon i hårløse mus (Warri et al., supra, Dati et al., 1990 "Oncogene", 5: 1001-1006). For eksempel vokser MCF-7-, ZR-75-1- og T47D-celler godt in vivo i nærvær av østrogen, men uttrykker meget lave nivåer av HER2 (Warri et al., supra, Dati et al., supra).

Den følgende type xenotransplantasjonsprotokoll kan benyttes: 1. Tumorceller implanteres (subkutant) inn i bakflanken på 5 til 6 uker gamle hunn-Balb/c nu/nu athymiske mus;

2. anti-tumorforbindelsen administreres; og

3 . man måler tumorveksten ved å måle tumorvolumet.

Tumorene kan også analyseres på nærvær av en reseptor som HER2, EGF eller PDGF, ved Western og immunohistokjemiske analyser. Ved bruk av i og for seg kjente teknikker kan fagmannen variere de ovenfor angitte prosedyrer, for eksempel ved bruk av forskjellige behandlingsregimer.

Analyse 2: FLK-l/xenotransplantasjonsmodell

Evnen hos forbindelsene ifølge oppfinnelsen til å inhibere ovarie-, melanom-, prostata-, lunge- og brysttumorcellelinjer som er etablert som SC-xenotransplantasjoner, ble undersøkt. Disse studier ble gjennomført ved bruk av doser fra 1 til 75 mg/kg/dag.

Materialer og metoder:

Tumorcellene ble implantert subkutant i de indikerte stammer av mus. Behandlingen ble initiert på dag 1 etter implantering hvis ikke annet er sagt (for eksempel behandling av SCID-mus relatert til A3 75 melanomcellelinjen begynte på dag 9). Hver testgruppe omfattet 8 til 16 mus.

Spesifikt:

Dyr. Athymiske hunnmus (Balb/c, nu/nu), Balb/c-mus, Wistar-rotter og Fisher 344-rotter ble oppnådd fra Simonsen Laboratories (Gilroy, CA). A/I-hunnmus ble oppnådd fra Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). DA-rotter ble oppnådd fra B&K Universal, Inc. (Fremont, CA). Athymiske R/Nu-rotter, DBA/2N-mus og Balb/c-mus ble oppnådd fra Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN). C57B1/6-hunnmus ble oppnådd fra Taconic (Germantown, NY). Alle dyr ble holdt under betingelser med rene rom i mikro-isolatorbur med Alpha-dristrø. De mottok sterilt gnagerfor og vann ad libitum.

Alle prosedyrer ble gjennomført i henhold til <n>NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals".

Subkutan xenotransplantasjonsmodell. Cellelinjer ble dyrket i egnet medium som beskrevet i det foregående. Cellene ble høstet ved eller nær konfluens med 0,05% Trypsin-EDTA og pelletisert ved 450xg i 10 minutter. Pelleter ble resuspendert i steril PBS eller medium (uten FBS) til en egnet konsentrasjon som antydet i figurforklaringene og cellene ble implantert i den bakre flanke på mus. Tumorveksten ble målt over 3 til 6 uker ved bruk av vene-kaliper og tumorvolumene ble beregnet som et produkt av lengde x bredde x høyde, hvis ikke annet er antydet. P-verdiene ble beregnet ved bruk av Student's t-test. Forbindelsen i 50 - 100 /xl eksipiens (dimetylsulfoksyd, PBTE, PBTE6C:D5W eller PBTE:D5W) ble avgitt ved IP-injeksjon ved konsentrasjoner som antydet i figurforklaringene.

Intracerebral xenotransplantasjonsmodell. For mus-IC-modellen ble rotte-C6-gliomaceller høstet og suspendert i steril PBS ved en konsentrasjon på 2,5 x IO<7> celler pr. ml og anbragt på is. Cellene ble implantert i Balb/c, nu/nu-mus på følgende måte: Frontoparietal-skalper på mus ble barbert med egnet redskap hvis nødvendig før vasking med 70% etanol. Dyrene ble bedøvet med isofluoran og nålen ble innført gjennom skallen til den venstre hemisfære av hjernen. Cellene ble avgitt fra Hamilton Gastight Syringes ved bruk av 30 ga nåler utstyrt med mansjetter som tillot en penetrering på kun 3 mm. En gjentagelsesdispenser ble benyttet for nøyaktig avlevering av 4 /xl cellesuspensjon. Dyrene ble overvåket daglig med henblikk på velbe-finnende og ble avlivet etter et vekttap på ca. 40% og/eller når de viste neurologiske symptomer.

For rotte-IC-modellen ble rotter (Wistar, Sprague Dawley, Fisher 344, eller athymiske R/Nu; ca. 200-400 g (noen 3-400

g)) bedøvet med en IP-injeksjon av 100 mg/kg Ketaset (ketaminhydroklorid; Aveco, Fort Dodge, Iowa) og 5 mg/kg

Rompun (xylazin, 2 %-ig oppløsning; Bayer, Tyskland). Etter begynnende anestete ble skalpen barbert og dyrene orientert i en stereotaksisk apparatur (Stoelting, Wood Dale, IL). Huden på snittstedet ble renset 3 ganger med alternerende vasking med 70% etanol og 10% Povidone-Iodine. Et 1,0-1,5 cm medianinnsnitt ble utført ved bruk av en steril kirurgisk kniv. Huden ble løsnet forsiktig og trukket til side for å eksponere suturene på skalleoverflaten. Et dentalbor (Stoelting, Wood Dale, IL) ble benyttet for å lage et lite (1-2 mm diameter) borehull i skallen ca. 2 mm bak og 2 mm til side for bregma. Cellesuspensjonen ble trukket inn i en 50 ill Hamilton-sprøyte utstyrt med en 23 eller 25 g standardåpningsnål. Sprøyten ble orientert i borehullet på nivå av araknoidea og senket inntil spissen av nålen var 3 mm inn i hjernestrukturen, der cellesuspensjonen langsomt ble injisert. Etter at cellene var injisert, ble nålen latt tilbake i borehullet i 1-2 minutter for å tillate fullstendig avlevering av cellene. Skallen ble renset og huden lukket med 2-3 suturer. Dyrene ble observert i forbindelse med rekonvalesens fra kirurgi og anestesi. Under hele forsøket ble dyrene observert minst 2 ganger pr. dag for utvikling av symptomer forbundet med progresjon av intracerebral tumor. Dyr som viste frem-skredne symptomer (trengte støtte, mistet balansen, dehydratisering, mistet apetitten, tap av koordinasjon, svekning av kjønnsdrift og/eller signifikante vekttap) ble avlivet humant og organ og vev av interesse ble fjernet kirurgisk.

Intraperitoneal modell. Cellelinjer ble dyrket i egnede medier. Cellene ble høstet og vasket i steril PBS eller medium uten FBS, resuspendert til egnet konsentrasjon og injisert inn i IP-kaviteten i mus av egnet stamme. Musene ble observert daglig for opptreden av ascites-dannelse. Individuelle dyr ble avlivet når de viste en vektøkning på 40% eller når IP-tumorbyrden begynte å forårsake urimelig belastning eller smerte.

In vivo VEGF-pelletmodell

I det følgende eksempel ble pellet-modellen benyttet for å prøve en forbindelses aktivitet mot FLK-l-reseptoren og mot forstyrrelser forbundet med dannelsen av blodkar. I denne modell ble VEGF pakket i en tidsavgivelsespellet og implantert subkutant på abdomen til hårløse mus for å indusere en "rødmings11-respons og etterfølgende svelling rundt pelleten. Potensielle FLK-1-inhibitorer kan så implanteres i metylcellulose nær VEGF-pelleten for å bestemme hvorvidt en slik inhibitor kan benyttes for å inhibere "rødmings"-responsen og etterfølgende svelling.

Materialer og metoder:

De følgende materialer ble benyttet:

1. VEGF-human rekombinant frysetørket produkt er kommer-sielt tilgjengelig og kan oppnås fra Peprotech, Inc., Princeton Business Park, G2; P.O. box 275, Rocky Hill, NJ 08553. 2. VEGF pakket i 21 dagers avgivelsespellets ble oppnådd fra Innovative Research of America (Innovative Research of America, 3361 Executive Parkway, P.O. box 2746, Toledo, Ohio 43606), produktet anvendte et patentert matriksdrevet avleveringssystem. Pelleter ble pakket ved 0,20, 0,21 eller 2,1 /tg VEGF pr. pellet. Disse doser tilsvarer 10 og 100 ng pr. dag avgivelse av VEGF.

3. Metylcellulose.

4. Vann (sterilt)

5. Metanol

6. Egnede medikamenter/inhibitorer

7. 10 cm dyrkingsplater

8. Parafilm.

Den følgende protokoll ble så fulgt for å gjennomføre VEGF-pelletmodellen: 1. VEGF, erververt fra Peprotech, ble sendt til Innovative Research for preparering av pellet; 2. metylcellulose tilveiebragt i en mengde av 1,5% (vekt/volum) i sterilt vann; 3. medikamenter oppløseliggjort i metanol (vanlig konsentrasjonsområde = 10 til 20 mg/ml); 4. steril parafilm ble anbragt i sterile 10 cm plater; 5. 150/xl medikament i metanol ble tilsatt til 1,35 ml 1,5% metylcellulose og blandet/omrørt grundig; 6. 25/il alikvoter av homogenat ble anbragt på parafilm og tørket til skiver; 7. mus (6-10 uker gamle Balb/c athymiske nu/nu hunnmus) ble bedøvet ved hjelp av isofluran-inhalering; 8. VEGF-pellets og metylcelluloseskiver ble implantert subkutant på abdomen; og 9. musene ble bedømt ved 24 timer og 48 timer med hensyn til rødt vev og svelling.

Den spesifikke eksperimentell design som ble benyttet i dette eksempel var:

N = 4 dyr pr. gruppe

Kontroller: VEGF-pellet + medikament placebo VEGF-placebo + medikament pellet

Forsøksresultater:

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen forventes å vise aktivitet i henhold til denne analyse.

Brystfettputemodell

På grunn av den etablerte rolle som spilles av mange av RTK'ene, for eksempel HER2-reseptoren, ved brystkreft, er brystfettputemodellen særlig brukbar for måling av effektiviteten av forbindelser som inhiberer slike RTK'er. Ved å implantere tumorceller direkte inn i lokasjonen av interesse, reflekterer in situ-modellene mer nøyaktig biologien for tumorutvikling enn subkutane modeller gjør. Humane brystcellelinjer som inkluderer MCF-7 er dyrket i brystfettputen på athymiske mus (Shafie og Grantham, 1981, "Nati. Cancer Instit.", £7: 51-56; Gottardis et al., 1988, "J. Steroid Biochem.", 62:311-314). Mere spesielt kan følgende prosedyre benyttes for å måle den inhibitoriske virkning av en forbindelse på HER2-reseptoren: 1. MDA-MB-231- og MCF-7-celler, transfektert med HER2, implanteres ved forskjellige konsentrasjoner i de aksillære brystfettputer på athymiske hunnmus;

2. forbindelsen administreres; og

3. tumorveksten måles til forskjellige tider.

Tumorene kan også analyseres på nærvær av en reseptor for HER2, ved Western- og immunohistokjemiske analyser. Ved bruk av i og for seg kjente teknikker kan fagmannen variere prosedyrene, for eksempel ved bruk av andre behandlingsregimer.

Tumorinvasjonsmodellen

Den følgende tumorinvasjonsmodell er utviklet og kan benyttes for bedømmelse av terapeutisk verdi og effektivitet for forbindelsene identifisert for selektiv inhibering av KDR/FLK—1-reseptor.

Prosedyre

8 uker gamle hårløse mus (hunnmus) (Simonsen Inc.) ble benyttet som forsøksdyr. Implantering av tumorceller ble gjennomført i en laminær strømningshette. For anestesi ble xylazin/ketamin-cocktail (100 mg/kg ketamin og 5 mg/kg) administrert intraperitonealt. Det ble foretatt et midt-linjeinnsnitt for å eksponere abdominalkaviteten (lengde ca. 1,5 cm) for å injisere IO<7> tumorceller i et volum på 100/xl medium. Cellene ble injisert inn i enten duodenal-lappen av pankreas eller under serosa av colon. Peritoneum og musklene ble lukket med en 6-0 kontinuerlig silkesutur og huden ble lukket ved bruk av klemmer. Dyrene ble observert daglig.

Analyse

Etter 2 til 6 uker, avhengig av de generelle observasjoner av dyrene, ble musene avlivet og de lokale tumormetastaser, til forskjellige organer (lunge, lever, hjerne, mave, milt, hjerte, muskel) skjæres ut og analyseres (måling av tumor-størrelse, grad av invasjon, immunokjemi og in situ hybridisering).

Resultater

Resultater for forskjellige forbindelser oppnådd fra de ovenfor beskrevne in vivo-analyser er angitt i tabell 5.

Claims

1. Forbindelse, karakterisert ved at den har formelen: og farmasøytisk aksepterbare salter derav, hvor Rx og R3 er H, R2 er 0, R4, R5, R6 og R7 er uavhengig valgt blant hydrogen, C^- C^-alkyl, Cx-C4-alkoksy, fenyl som eventuelt er substituert med C^-Cg-alkyl eller C-L-Cg-alkoksy, halogen, trihalometyl S02NRR', N02, NRR1 , OH, C(0)R', NHC(0)R, (CH2)nC02Rog CONRR<1>, A er en 5-leddet heteroarylring valgt blant tiofen, pyrrol, pyrazol, imidazol, 1,2,3-triazol, 1,2,4-triazol, oksazol, isoksazol, tiazol, isotiazol, 2-sulfonylfuran, 4-alkylfuran, l,2,3-oksadiazol, l,2,4-oksadiazol, 1,2,5-oksadiazol, 1,3,4-oksadiazol, 1,2,3,4-oksatriazol, 1,2,3,5-oksatriazol, 1,2,3-tiadiazol, l,2,4-tiadiazol, 1,2,5-tiadiazol, 1,3,4-tiadiazol, 1,2,3,4-tiatriazol, 1,2,3,5-tiatriazol og tetrazol, eventuelt substituert i en eller flere stillinger med C1-C4-alkyl, .C1-C4-alkoksy, eventuelt med halogen eller trihalometyl substituert fenyl, fenyl-C-L-C4-alkyl, benzoyl, halogen, S03R, SR, N02, C(0)R, (CH2)nC02R eller CONRR<1>, n er 0-3, R er H eller C1-C4-alkyl, og R<1> er H, C1-C4-alkyl eventuelt substituert med di-C1-C4-alkylamino eller pyrrolidino eller fenyl eventuelt substituert med halogen og/eller C1-C4-alkoksy hvor nevnte forbindelse regulerer, inhiberer eller modulerer tyrosinkinasesignaltransduksjon, med den betingelse at de følgende forbindelser er utelukket: 3-[(pyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(5-klor-3,4-dimetylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(3,5-dimetyl-4-etylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(3, 5-dimetyl-4-etoksykarbonylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 2- [[[l-etyl-2,3-dihydro-2-okso-3-(lH-pyrrol-2-ylmetylen-lH-indol-5-yl]oksy]metyl]benzosyre, 3- [(l-metyl-5-nitro-imidazol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(tien-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(2-butyl-lH-imidazol-4-yl)metylen]-2,3-dihydro-2-okso-lH-indol-7-eddiksyre-etylester,3-[(2-butyl-l-[(1,1-dimetyletoksy)karbonyl]-lH-imidiazol-4-y1)me tylen]-2,3-dihydro-2 -okso-1H-indol-7-eddiksyre-etyl-ester, 3-[(tiofen-2-yl)metylen]-2-indolinon, 6-nitro-3-[(pyrrol-2-yl)metylen]2-indolinon, 5-klor-3-[(tiazol-5-yl)metylen]-2-indolinon, 6-dietylamino-3-[(isotiazol-5-yl)metylen]-2-indolinon og 5- benzoyl-3-[(imidazol-4-yl)metylen]-2-indolinon.

2. Forbindelse som angitt i krav 1 og farmasøytisk aksepterbare salter derav, karakterisert ved at R1 og R3 er H, R2 er 0, R4' R5» R6 °9 R7 er nver uavhengig valgt blant hydrogen, Cx-C4-alkyl, C1-C4-alkoksy, fenyl som eventuelt er substituert med C-L-Cg-alkyl eller C^-Cg-alkoksy, halogen, trihalometyl, S02NRR', N02, NRR1 , OH, C(0)R', NHC(0)R, (CH2)nC02Rog CONRR', A er en 5-leddet heteroarylring valgt blant pyrazol, 1,2,3-triazol, 1,2,4-triazol, oksazol, isoksazol, tiazol, isotiazol, 2-sulfonylfuran, 4-alkylfuran, 1,2,3-oksadiazol, 1,2,4-oksadiazol, 1,2,5-oksadiazol, 1,3,4-oksadiazol, 1,2,3,4-oksatriazol, 1,2,3,5-oksatriazol, 1,2,3-tiadiazol, l,2,4-tiadiazol, 1,2,5-tiadiazol, 1,3,4-tiadiazol, 1,2,3,4-tiatriazol, 1,2,3,5-tiatriazol og tetrazol, eventuelt substituert i en eller flere stillinger med C1-C4-alkyl, C-L-C4-alkoksy, eventuelt med halogen eller trihalometyl substituert fenyl, fenyl-C1-C4-alkyl, benzoyl, halogen, S03R, SR, N02, C(0)R, (C<H>2)nC02R eller CONRR1, n er 0-3, R er H eller C1-C4-alkyl, og R' er H, C1-C4-alkyl eventuelt substituert med di-C1-C4-alkylamino eller pyrrolidino eller fenyl eventuelt substituert med halogen og/eller C1-C4-alkoksy.

3. Forbindelse som angitt i ett eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at den er valgt blant 3-[(3-metylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3- [(3,4-dimetylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(2-metyltien-5-yDmetylen] -2-indolinon, 3- [ (3-metyltien-2-yl)metylen] -2-indolinon, 3-{[4-(2-metoksykarbonyletyl)-3-metylpyrrol-5-yl]metylen}-2-indolinon, 3-[(4,5-dimetyl-3-etylpyrrol-2-yUmetylen] -2-indolinon, 3- [ (5-metylimidazol-2-yl)metylen] - 2- indolinon, 5-klor-3-[(5-metyltien-2-yl)metylen] -2-indolinon, 3-[(3,5-dimetylpyrrol-2-yl)metylen]-5-nitro-2-indolinon, 3-[(3-(2-karboksyetyl)-4-metylpyrrol-5-yl)metylen]-2-indolinon, 5-klor-3-[(3,5-dimetylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon og 3-[(2,4-dimetylpyrrol-S-yl) metylen] -2-indolinon, eller et farmasøytisk aksepterbart salt derav.

4. Forbindelse som angitt i krav 3, karakterisert ved at nevnte forbindelse er 3- [(2,4-dimetylpyrrol-5-yl)metylen]-2-indolinon, eller et farmasøytisk aksepterbart salt derav.

5. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en farmasøytisk aksepterbar bærer eller eksipiens og en forbindelse som angitt i krav 1.

6. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en farmasøytisk aksepterbar bærer eller eksipiens og en forbindelse som angitt i krav 2.

7. Farmasøytisk preparat som angitt i krav 6 egnet for parenteral administrering til et individ, karakterisert ved at det omfatter en forbindelse som angitt i krav 2.

8. Farmasøytisk preparat som angitt i krav 6 egnet for subkutan administrering til et individ, karakterisert ved at det omfatter en forbindelse som angitt i krav 2.

9. Farmasøytisk preparat som angitt i krav 6, karakterisert ved at nevnte preparat er i en depotformulering.

10. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en farmasøytisk aksepterbar bærer eller eksipiens og en forbindelse som angitt i krav 3.

11. Farmasøytisk preparat som angitt i krav 10, karakterisert ved at nevnte forbindelse er 3-[(2,4-dimetylpyrrol-5-yl)metylen]-2-indolinon, eller et farmasøytisk aksepterbart salt derav.

12 . Farmasøytisk preparat som angitt i krav 10 egnet for parenteral administrering til et individ, karakterisert ved at det omfatter en forbindelse som angitt i krav 3.

13. Farmasøytisk preparat som angitt i krav 10 egnet for subkutan administrering til et individ, karakterisert ved at det omfatter en forbindelse som angitt i krav 3.

14. Farmasøytisk preparat som angitt i krav 10, karakterisert ved at nevnte preparat er i en depotformulering.

15. Anvendelse av en forbindelse med formel: og farmasøytisk aksepterbare salter derav, hvor: Rx og R3 er H, R2 er O, R4, R5, R6 og R7 er uavhengig valgt blant hydrogen, C-l-C^-alkyl, C-L-C^-alkoksy, fenyl som eventuelt er substituert med C^-Cg-alkyl eller Cj^-Cg-alkoksy, halogen, trihalometyl, S02NRR', N02, NRR' , OH, C(0)R', NHC(0)R, (CH2)nC02Rog CONRR', A er en 5-leddet heteroarylring valgt blant tiofen, pyrrol, pyrazol, imidazol, 1,2,3-triazol, 1,2,4-triazol, oksazol, isoksazol, tiazol, isotiazol, 2-sulfonylfuran, 4-alkylfuran, 1,2,3-oksadiazol, 1,2,4-oksadiazol, 1,2,5-oksadiazol, 1,3,4-oksadiazol, 1,2,3,4-oksatriazol, 1,2,3,5-oksatriazol, 1,2,3-tiadiazol, 1,2,4-tiadiazol, 1,2,5-tiadiazol, 1,3,4-tiadiazol, 1,2,3,4-tiatriazol, 1,2,3,5-tiatriazol og tetrazol, eventuelt substituert i en eller flere stillinger med C1-C4-alkyl, C1-C4-alkoksy, eventuelt med halogen eller trihalometyl substituert fenyl, fenyl-C-L-C4-alkyl, benzoyl, halogen, S03R, SR, N02, C(0)R, (CH2)nC02R eller CONRR', n er 0-3, R er H eller C1-C4-alkyl, og R' er H, C1-C4-alkyl eventuelt substituert med di-C1-C4-alkylamino eller pyrrolidino eller fenyl eventuelt substituert med halogen og/eller C1-C4-alkoksy hvor nevnte forbindelse regulerer, inhiberer eller modulerer tyrosinkinasesignaltransduksjon, med den betingelse at de følgende forbindelser er utelukket: 3-[(pyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon,3-[(5-klor-3,4-dimetylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(3,5-dimetyl-4-etylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(3,5-dimetyl-4-etoksykarbonylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 2- [[[l-etyl-2,3-dihydro-2-okso-3-(lH-pyrrol-2-ylmetylen-lH-indol-5-yl]oksy]metyl]benzosyre, 3- [(l-metyl-5-nitro-imidazol-2-yl)metylen] -2-indolinon, 3-[(tien-2-yl)metylen]-2-indolinon,3-[(2-butyl-lH-imidazol-4-yl)metylen]-2,3-dihydro-2-okso-i 1H-indol-7-eddiksyre-etylester,3-[(2-butyl-l-[(l,1-dimetyletoksy)karbonyl]-lH-imidiazol-4-yl)metylen]-2,3-dihydro-2 -okso-1H-indol-7-eddiksyre-etyl-ester,3-[(tiofen-2-yl)metylen]-2-indolinon, 6-nitro-3-[(pyrrol-2-yl)metylen]2-indolinon,

5- klor-3- [ (tiazol-5-yl)metylen]-2-indolinon,

6- dietylamino-3-[(isotiazol-5-yl)metylen]-2-indolinon, og 5- benzoyl-3-[(imidazol-4-yl)metylen] -2-indolinon, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av sykdommer relatert til tyrosinkinasesignaltransduksjon.

16. Anvendelse som angitt i krav 15, hvor nevnte sykdom er valgt fra cancer, blodkar-proliferative lidelser, fibrotiske lidelser, mesangialcelle-proliferative lidelser og metabolske sykdommer.

17. Anvendelse som angitt i krav 16, hvor den blodkar-prolif erative lidelse er valgt fra artritt og restenose.

18. Anvendelse som angitt i krav 16, hvor den fibrotiske lidelse er valgt fra hepatisk cirrhose og aterosklerose.

19. Anvendelse som angitt i krav 16 hvor den mesangialcelle-prolif erative lidelse er valgt fra glomerulonefritt, diabetisk nefropati, malign nefrosklerose, trombotiske mikroangiopatisyndromer, transplantatawisning og glomerulopatier.

20. Anvendelse som angitt i krav 16 hvor den metabolske lidelse er valgt blant psoriasis, diabetes mellitus, sårheling, inflammasjon og nevrogenerative sykdommer.

21. Anvendelse av en forbindelse med formelen: og farmasøytisk aksepterbare salter derav, hvor: R-l og R3 er H, R2 er 0, R4, R5, R6 og R7 er uavhengig valgt blant hydrogen, C-l-C^-alkyl, C1-C4-alkoksy, fenyl som eventuelt er substituert med C-j^-Cg-alkyl eller C-L-Cg-alkoksy, halogen, trihalometyl, S02NRR', N02, NRR1 , OH, C(0)R<*>, NHC(0)R, (CH2)nC02R og CONRR', A er en 5-leddet heteroarylring valgt blant tiofen, pyrrol, pyrazol, imidazol, 1,2,3-triazol, 1,2,4-triazol, oksazol, isoksazol, tiazol, isotiazol, 2-sulfonylfuran, 4-alkylfuran, 1,2,3-oksadiazol, 1,2,4-oksadiazol, 1,2,5-oksadiazol, 1,3,4-oksadiazol, l,2,3,4-oksatriazol, 1,2,3,5-oksatriazol, 1,2,3-tiadiazol, 1,2,4-tiadiazol, 1,2,5-tiadiazol, 1,3,4-tiadiazol, 1,2,3,4-tiatriazol, 1,2,3,5-tiatriazol og tetrazol, eventuelt substituert i en eller flere stillinger med C1-C4-alkyl, C1-C4-alkoksy, eventuelt med halogen eller trihalometyl substituert fenyl, fenyl-Cj^-C4-alkyl, benzoyl, halogen, S03R, SR, N02, C(0)R, (CH2)nC02R eller CONRR', n er 0-3, R er H eller C1-C4-alkyl, og R' er H, Cx-C4-alkyl eventuelt substituert med di-C1-<C>4-alkylamino eller pyrrolidino eller fenyl eventuelt substituert med halogen og/eller C1-C4-alkoksy hvor nevnte forbindelse regulerer, inhiberer eller modulerer tyrosinkinasesignaltransduksjon, med den betingelse at de følgende forbindelser er utelukket:3-[(pyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon,3-[(5-klor-3,4-dimetylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(3,5-dimetyl-4-etylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(3,5-dimetyl-4-etoksykarbonylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 2- [[[l-etyl-2,3-dihydro-2-okso-3-(lH-pyrrol-2-ylmetylen-lH-indol-5-yl]oksy]metyl]benzosyre, 3- [(l-metyl-5-nitro-imidazol-2-yl)metylen]-2-indolinon,3-[(tien-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(2-butyl-lH-imidazol-4-yl)metylen]-2,3-dihydro-2-okso-1H-indol-7-eddiksyre-etylester, 3-[(2-butyl-l-[(1,1-dimetyletoksy)karbonyl]-lH-imidiazol-4-yl)metylen]-2,3-dihydro-2 -okso-1H-indol-7-eddiksyre-etyl-ester, 3-[(tiofen-2-yl)metylen]-2-indolinon, 6-nitro-3-[(pyrrol-2-yl)metylen]2-indolinon,

5- klor-3-[(tiazol-5-yl)metylen]-2-indolinon,

6- dietylamino-3-[(isotiazol-5-yl)metylen]-2-indolinon, og 5- benzoyl-3-[(imidazol-4-yl)metylen] -2-indolinon, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for regulering, modulering eller inhibering av tyrosinkinasesignaltransduksjon.

22. Anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse valgt blant 3-[(3-metylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(3,4-dimetylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(2-metyltien-5-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(3-metyltien-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-{[4-(2-metoksykarbonyletyl)-3-metylpyrrol-5-yl]metylen}-2-indolinon, 3-[(4,5-dimetyl-3-etylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(5-metylimidazol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 5-klor-3-[(5-metyltien-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(3,5-dimetylpyrrol-2-yl)-metylen]-5-nitro-2-indolinon, 3-[(3-(2-karboksyetyl)-4-metylpyrrol-5-yl)metylen]-2-indolinon, 5-klor-3-[(3,5-dimetylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon og 3-[(2,4-dimetylpyrrol-5-yl)metylen]-2-indolinon, eller et farma-søytisk aksepterbart salt derav, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av sykdommer relatert til tyrosinkinasesignaltransduksjon.

23. Anvendelse som angitt i krav 22 hvor nevnte sykdom er valgt fra cancer, blodkarproliferative lidelser, fibrotiske lidelser, mesangialcelle-proliferative lidelser og metabolske sykdommer.

24. Anvendelse som angitt i krav 23 hvor den blodkar-prolif erative lidelse er valgt blant artritt og restenose.

25. Anvendelse som angitt i krav 23 hvor den fibrotiske lidelse er valgt blant hepatisk cirrhose og aterosklerose.

26. Anvendelse som angitt i krav 23 hvor den mesangialcelle-proliferative lidelse er valgt blant glomerulonefritt, diabetisk nefropati, malign nefrosklerose, trombotiske mikroangiopatisyndromer, transplantatavvisning og glomerulopatier.

27. Anvendelse som angitt i krav 23 hvor den metabolske lidelse er valgt blant psoriasis, diabetes mellitus, sårheling, inflammasjon og nevrodegenerative sykdommer.

28. Anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse valgt blant 3-[(3-metylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(3,4-dimetylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(2-metyltien-5-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(3-metyltien-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-{[4-(2-metoksykarbonyletyl)-3-metylpyrrol-5-yl]metylen}-2-indolinon, 3-[(4,5-dimetyl-3-etylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 3-[(5-metylimidazol-2-yl)metylen]-2-indolinon, 5-klor-3-[(5-metyltien-2-yl)-metylen]-2-indolinon, 3-[(3,5-dimetylpyrrol-2-yl)metylen]-5-nitro-2-indolinon, 3-[(3-(2-karboksyetyl)-4-metylpyrrol-5-yl)metylen]-2-indolinon, 5-klor-3-[(3,5-dimetylpyrrol-2-yl)metylen]-2-indolinon og 3-[(2,4-dimetylpyrrol-5-yl)-metylen]-2-indolinon, eller et farmasøytisk aksepterbart salt derav for fremstilling av et farmasøytisk preparat for å regulere, modulere eller inhibere tyrosinkinasesignaltransduksjon.