JP3231044B2

JP3231044B2 - 疾患治療用インドリノン化合物

Info

Publication number: JP3231044B2
Application number: JP50136397A
Authority: JP
Inventors: タン，ペン，チョウ; スン，リ; マックマーン，ジェラルド
Original assignee: スーゲン，インコーポレーテッド
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 2001-11-19
Anticipated expiration: 2016-06-05
Also published as: DE69612649D1; US20030176487A1; DE29623744U1; ATE200863T1; HUP9701694A3; US6225335B1; US5883116A; US20010027207A1; NO965377L; EP0769947B1; DK0769947T3; US5883113A; AR003088A1; EP0934931A2; US5792783A; CA2192797A1; NO311355B1; ES2159741T3; JPH10504323A; HU226755B1

Description

【発明の詳細な説明】本出願はここにその全部が参考文献として取り込まれ
る1995年６月７日出願の米国特許出願第08/485,323号の
一部継続出願である。

1. 序論本発明はチロシンキナーゼシグナル伝達をモジュレー
ト、調節および／または阻害しうる新規化合物に関す
る。本発明はまた、細胞増殖性および代謝性の障害を含
めた非調節チロシンキナーゼシグナル伝達に関する障害
の予防および／または治療のための、受容体クラスのも
のであろうと非受容体クラスのものであろうとチロシン
キナーゼを調節、モジュレートまたは阻害する方法にも
関する。

2. 発明の背景タンパク質チロシンキナーゼ（PTK）は酵素活性を有
する大きなそして多様なクラスのタンパク質を包含す
る。このPTKは細胞増殖および分化の制御に重要な役割
を果たす（総説として、Schlessinger ＆ Ullrich,199
2,Neuron 9:383−391参照）。

例えば、受容体チロシンキナーゼ仲介シグナル伝達は
特異的な増殖因子（リガンド）との細胞外相互作用によ
って開始され、受容体の二量化、内因性タンパク質チロ
シンキナーゼ活性の一過性刺激およびりん酸化が続く。
それにより細胞内シグナル伝達分子のための結合部位が
つくられ、そして適当な細胞性応答（例えば細胞分裂、
細胞外ミクロ環境への代謝効果）を促進するあるスペク
トラムの細胞質シグナル伝達（signalling）分子との複
合体が形成される。Schlessinger and Ullrich,1992,Ne
uron 9:383−391参照。

受容体チロシンキナーゼに関しては、チロシンりん酸
化部位がシグナル伝達分子のSH2（src相同）ドメインに
対する高親和性結合部位として機能することも示されて
いるFantlら、1992,Cell 69:413−423;Songyangら、199
4,Mol.Cell.Biol.14:2777−2785;Songyangら、1993,Cel
l 72:767−778;およびKochら、1991,Science 252:668−
678。受容体チロシンキナーゼ（RTK）に関連した幾つか
の細胞内基質タンパクが同定されている。それらは２つ
の主要な群、すなわち（１）触媒ドメインを有する基
質、および（２）かかるドメインを欠いているが、アダ
プターとして作用し、そして触媒的に活性な分子と関連
する基質とに分けることができる。Songyangら、1993,C
ell 72:767−778。受容体またはタンパク質とそれらの
基質のSH2ドメインとの間の相互作用の特異性は、りん
酸化されるチロシン残基を隣接するように取り囲むアミ
ノ酸残基により決定される。特定の受容体上のホスホチ
ロシン残基を包囲するアミノ酸配列をSH2ドメインとの
間の結合アフィニティの相違は、それらの基質りん酸化
プロフィールにおいて観察される相違と一致する。Song
yangら、1993;Cell 72:767−778。これらの観察は、各
受容体チロシンキナーゼの機能がその発現パターンおよ
びリガンドの有用性によるばかりでなく、特定の受容体
によって活性化される下流のシグナル伝達経路の並びに
よっても決定されることを示唆している。従って、りん
酸化は特異的な増殖因子受容体並びに分化因子受容体に
より回復されるシグナル伝達経路の選択性を決定する重
要な調節段階を提供するものである。

PTKにおける異常型発現または突然変異が、非制御性
細胞増殖（例えば、悪性腫瘍の増殖）または重要な発達
過程での欠陥を生じさせることが示されている。結果と
して、生物医学的共同体は、PTKファミリーのメンバー
の特異的な生物学的役割、分化過程におけるそれらの機
能、腫瘍形成および他の疾患におけるそれらの関与、リ
ガンド刺激の際活性化されるそれらのシグナル伝達経路
の土台となる生化学的メカニズムおよび新規薬物の開発
を見出すのにかなりの資源を費やしてきた。

チロシンキナーゼは、受容体型（細胞外ドメイン、膜
貫通ドメインおよび細胞内ドメインを有する）または非
受容体型（完全に細胞内にある）のいずれであってもよ
い。

受容体チロシンキナーゼ PTKは多様な生物学的活性を
有する膜貫通性受容体の大きなファミリーを包含する。
PTKの内因性機能はリガンドの結合によって活性化さ
れ、それが受容体および多数の細胞性基質のりん酸化を
生じ、そして次に種々の細胞性応答を生じさせる。Ullr
ich ＆ Schlessinger,1990,Cell 61:203−212。

現在では、少なくとも19個の異なるPTKサブファミリ
ーが確認されている。HERサブファミリーとして示され
る一つのPTKサブファミリーは、EGFR、HER2、HER3およ
びHER4からなると考えられる。Herサブファミリーの受
容体に対するリガンドは、上皮増殖因子（EGF）、TGF−
α、アンフィレギュリン（amphiregulin）、HB−EGF、
ベータセルリン（betacellulin）およびヘレギュリン
（heregulin）を包含する。

インスリンサブファミリーとして示される第２のPTK
ファミリーはINS−Ｒ、IGF−1RおよびIR−Ｒからなる。
第３のファミリーである“PDGF"サブファミリーにはPDG
Fαおよびβ受容体、CSFIR、ｃ−kitおよびFLK−IIが包
含される。FLKファミリーとして同定されるPTKのもう一
つのファミリーは、キナーゼインサートドメイン受容体
胎児肝キナーゼ−１（Kinase insert−Domein receptor
fetal liver kinase−1;KDR/FLK−１）、胎児肝キナー
ゼ４（FLK−４）およびfms様チロシンキナーゼ１（fit
−１）からなると考えられる。これら受容体のそれぞれ
は当初は造血増殖因子に対する受容体であると考えられ
た。PTKの他の２種のサブファミリーは、FGF受容体ファ
ミリー（FGFR1、FGFR2、FGFR3およびFGFR4）およびMet
サブファミリー（ｃ−metおよびRon）として示されてい
る。

PDGFとFLKサブファミリーとが類似するために、この
２種のサブファミリーはしばしば一緒に考えられる。公
知のRTKサブファミリーは、ここに参考文献としてとり
込まれるPlowmanら、1994,DN＆P ７（６）:334−339に
おいて同定される。

非受容体チロシンキナーゼ非受容体チロシンキナーゼ
は細胞外配列および膜貫通配列を欠く細胞性酵素を集め
たものである。現在では、11種のサブファミリー（Src,
Frk,Btk,Csk,Abl,Zap70,Fes/Fps,Fak,Jak,AckおよびLIM
K）を包含する、24を超える個別の非受容体チロシンキ
ナーゼが同定されている。現在では、非受容体チロシン
キナーゼのSrcサブファミリーは最も多数のPTKを含んで
おり、そしてSrc,Yes,Fyn,Lyn,Lck,Blk,Hck,FgrおよびY
rkを包含する。酵素のSrcサブファミリーは腫瘍形態に
関連している。非受容体チロシンキナーゼのより詳しい
議論は、ここに参考文献としてとり込まれるBolen,199
3,Oncogene 8:2025−2031に示されている。

RTKチロシンキナーゼであろうと非受容体チロシンキ
ナーゼであろうと、多くのチロシンキナーゼは、癌、乾
癬および過免疫応答を含む病原状態を招くシグナル伝達
経路に関わることが見出されている。

PTKをモジュレートする化合物の開発細胞増殖の制
御、調節およびモジュレート、異常な細胞増殖と関連し
た疾患および障害に対するPTKの推測される重要性にか
んがみ、突然変異リガンド（米国特許出願第4,966,849
号）、可溶性受容体および抗体（出願番号WO 94/10202
号:Kendall ＆ Thomas,1994,Proc.Nat'l Acad.Sci 90:1
0705−09;Kimら、1993,Nature 362:841−844）,RNAリガ
ンド（Jellinekら、Biochemistry 33:10450−56）;Taka
noら、1993,Mol.Bio.Cell 4:358A;Kinsellaら、1992,Ex
p.Cell Res.199:56−62;Wrightら、1992,J.Cellular Ph
ys.152:448−57）およびチロシンキナーゼ阻害剤（WO 9
4/03427号;WO 92/21660号;WO 91/15495号;WO 94/14808
号；米国特許番号第5,330,992号;Marianiら、1994,Pro
c.Am.Assoc.Cancer Res.35:2268）の使用を含む種々の
方法を用いる受容体および非受容体チロシンキナーゼ
“阻害剤”を同定する多くの試みがなされている。

さらに近年、チロシンキナーゼ阻害剤として作用する
小さな分子を同定する試みがなされている。例えば、ビ
ス単環式、二環式または複素環式アリール化合物（PCT
WO 92/20642号）、ビニレン−アザインドール誘導体（P
CT WO 94/14808号）および１−シクロプロピル−４−ピ
リジル−キノロン（米国特許第5,330,992号）が一般に
チロシンキナーゼ阻害剤として記載されている。スチリ
ル化合物（米国特許第5,217,999号）、スチリル置換ピ
リジル化合物（米国特許第5,302,606号）、ある種のキ
ナゾリン誘導体（EP出願第0 566 266号A1）、セレオイ
ンドールおよびセレナイド（PCT WO 94/03247号）、三
環式ポリヒドロキシ化合物（PCT WO 92/21660号）およ
びベンジルホスホン酸化合物（PCT WO 91/15495号）
が、癌の治療に使用するためのチロシンキナーゼ阻害剤
として使用するための化合物として記載されている。

それゆえ異常または不適切な細胞増殖を調節およびモ
ジュレートするために受容体および非受容体チロシンキ
ナーゼの活性をモジュレートすることによってシグナル
伝達を特異的に阻害する有効な小さな化合物を同定する
ことが望ましく、そしてこのことが本発明の目的であ
る。

3. 発明の概要本発明は、チロシンキナーゼシグナル伝達をモジュレ
ート、調節および／または阻害しうる有機分子に関す
る。かかる化合物は癌、アテローム性動脈硬化症、関節
炎および再狭窄のような細胞増殖性疾患および糖尿病の
ような代謝疾患を含む非調節性のTKF伝達に関連した疾
患の治療に有用である。

例示的態様の一つにおいては、本発明化合物は式
（Ｉ）：およびその製剤学上許容される塩を有する。ここで上記
式中、 R₁はＨまたはアルキル基であり、 R₂はＯまたはＳであり、 R₃は水素であり、 R₄、R₅、R₆およびR₇は、各々独立に、水素、アルキ
ル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリ
ール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチ
ル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NRR′、O
H、CN、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OCO（Ｒ）、NHC（Ｏ）Ｒ、（CH₂）
_nCO₂R、およびCONRR′からなる群より選択され、 R₃′、R₅′およびR₆′は、各々独立に、水素、アルキ
ル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリ
ール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチ
ル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NRR′、O
H、CN、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、（C
H₂）_nCO₂R、およびCONRR′からなる群より選択され、ｎは０〜３であり、ＸはBr、Cl、ＦまたはＩであり、ＲはＨ、アルキルまたはアリールであり、かつＲ′はＨ、アルキルまたはアリールである。

もう一つの例示的態様においては、本発明化合物は式
（II）：およびその製剤学的に許容される塩を有する。ここで式
中、 R₁はＨまたはアルキルであり、 R₂はＯまたはＳであり、 R₃は水素であり、 R₄、R₅、R₆およびR₇は、各々独立に、水素、アルキ
ル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリ
ール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチ
ル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NRR′、O
H、CN、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、（C
H₂）_nCO₂R、およびCONRR′からなる群より選択され、 R₂′、R₃′、R₅′およびR₆′は、各々独立に、水素、
アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、ア
ルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロ
メチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NR
R′、OH、CN、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、
（CH₂）_nCO₂R、およびCONRR′からなる群より選択さ
れ、 RaおよびRbは、各々独立に、Ｈ、アルキルおよびＣ
（Ｏ）Ｒからなる群より選択されるか、または一緒にな
ったNRaRbは、一以上の位置で水素、アルキル、アルコ
キシ、アリール、アリールオキシ、アルカリール、アル
カリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、Ｓ（Ｏ）
Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NRR′、OH、CN、Ｃ
（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、（CH₂）_nCO₂R、
およびCONRR′で任意に置換されていてもよい３〜８原
子の複素環である。但し、以下のことを条件とする：ｎは０〜３であり、ＸはBr、Cl、ＦまたはＩであり、ＲはＨ、アルキルまたはアリールであり、そしてＲ′はＨ、アルキルまたはアリールである。

さらにもう一つの例示的態様においては、本発明化合
物は式（III）：およびその製剤学的に許容される塩を有する。ここで上
記式中、 R₁はＨまたはアルキルであり、 R₂はＯまたはＳであり、 R₃は水素であり、 R₄、R₅、R₆およびR₇は、各々独立に、水素、アルキ
ル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリ
ール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチ
ル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NRR′、O
H、CN、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、（C
H₂）_nCO₂R、およびCONRR′からなる群より選択され、Ａは、一以上の位置でアルキル、アルコキシ、アリー
ル、アリールオキシ、アルカリール、アルカリールオキ
シ、ハロゲン、トリハロメチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NR
R′、SO₃R、SR、NO₂、NRR′、OH、CN、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC
（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、（CH₂）_nCO₂R、またはCONRR′
で任意に置換された、チオフェン、ピロール、ピラゾー
ル、イミダゾール、1,2,3−トリアゾール、1,2,4−トリ
アゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾー
ル、イソチアゾール、２−スルホニルフラン、４−アル
キルフラン、1,2,3−オキサジアゾール、1,2,4−オキサ
ジアゾール、1,2,5−オキサジアゾール、1,3,4−オキサ
ジアゾール、1,2,3,4−オキサトリアゾール、1,2,3,5−
オキサトリアゾール、1,2,3−チアジアゾール、1,2,4−
チアジアゾール、1,2,5−チアジアゾール、1,3,4−チア
ジアゾール、1,2,3,4−チアトリアゾール、1,2,3,5−チ
アトリアゾールおよびテトラゾールからなる群より選択
されるヘテロアリール五員環であり、ｎは０〜３であり、ＸはBr、Cl、ＦまたはＩであり、ＲはＨ、アルキルまたはアリールであり、そしてＲ′はＨ、アルキルまたはアリールである。

さらにもう一つの例示的態様においては、本発明化合
物は式（IV）：およびその製剤学的に許容される塩を有する。ここで上
記式中、 R₁はＨまたはアルキルであり、 R₂はＯまたはＳであり、 R₃は水素であり、 R₄、R₅、R₆およびR₇は、各々独立に、水素、アルキ
ル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリ
ール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチ
ル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NRR′、O
H、CN、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、（C
H₂）_nCO₂R、およびCONRR′からなる群より選択され、 R₃′、R₄′、R₅′およびR₆′は、各々独立に、水素、
アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、ア
ルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロ
メチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NR
R′、OH、CN、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、
（CH₂）_nCO₂R、およびCONRR′からなる群より選択さ
れ、ｎは０〜３であり、ＸはBr、Cl、ＦまたはＩであり、ＲはＨ、アルキルまたはアリールであり、そしてＲ′はＨ、アルキルまたはアリールである。

最後の例示的態様においては、本発明化合物は式
（Ｖ）：およびその製剤学的に許容される塩を有する。ここで上
記式中、 R₁はＨまたはアルキルであり、 R₂はＯまたはＳであり、 R₃は水素であり、 R₄、R₅、R₆およびR₇は、各々独立に、水素、アルキ
ル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリ
ール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチ
ル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NRR′、O
H、CN、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、（C
H₂）_nCO₂R、およびCONRR′からなる群より選択され、 R₂′、R₃′、R₅′およびR₆′は、各々独立に、水素、
アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、ア
ルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロ
メチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NR
R′、OH、CN、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、
（CH₂）_nCO₂R、およびCONRR′からなる群より選択さ
れ、ｎは０〜３であり、ＺはBr、Cl、Ｆ、Ｉ、メチル、エチル、ｎ−プロピ
ル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチルまたはｔ−
ブチルであり、ＲはＨ、アルキルまたはアリールであり、そしてＲ′はＨ、アルキルまたはアリールである。

本発明はさらに、医薬上有効な量の前述した式Ｉ〜Ｖ
の化合物および製剤学的に許容される担体または賦形剤
を包含する医薬組成物にも関する。かかる組成物は触媒
活性の阻害、ATPへの親和性、または基質との相互作用
能のいずれかにより、チロシンキナーゼによるシグナル
伝達をモジュレートするものと考えられる。

より詳しくは、本発明の組成物は、増殖性、繊維形成
性または代謝性障害を包含する疾患、例えば癌、繊維
症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、関節炎、および糖
尿病性網膜症のような異常な脈管形成および／または血
管形成に関連する他の障害を治療する方法において包含
されうる。

4. 発明の詳細な説明 4.1 定義「製剤学的に許容される塩」とは、遊離塩基の生物学
的有効性および特性を保有しており、そして塩酸、臭化
水素酸、硫酸、硝酸、りん酸、メタンスルホン酸、エタ
ンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸等
のような無機酸との反応により得られる塩を指す。

「アルキル」とは、直鎖状、分枝状または環状の飽和
脂肪族炭化水素をいう。好ましくは、１〜12個の炭素を
有するアルキル基である。より好ましくは、１〜７個の
炭素、より好ましくは１〜４個の炭素を有する低級アル
キルである。代表的なアルキル基には、メチル、エチ
ル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ
−ブチル、ペンチル、ヘキシル等が包含される。これら
アルキル基は、任意に、ヒドロキシル、シアノ、アルコ
キシ、＝Ｏ、＝Ｓ、NO₂、ハロゲン、Ｎ（CH₃）_２アミノ
およびSHからなる群から選択された１個またはそれ以上
の置換基で置換されていてもよい。

「アルケニル」とは、少くとも１個の炭素−炭素二重
結合を含有する直鎖状、分枝状または環状の不飽和炭化
水素基をいう。好ましくは、１〜12個の炭素を有するア
ルケニル基である。より好ましくは、１〜７個の炭素、
より好ましくは１〜４個の炭素を有する低級アルケニル
である。これらアルケニル基は、任意に、ヒドロキシ
ル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、NO₂、ハロゲ
ン、Ｎ（CH₃）_２アミノおよびSHからなる群から選択さ
れた１個またはそれ以上の置換基で置換されていてもよ
い。

「アルキニル」とは、少なくとも１個の炭素−炭素三
重結合を含有する直鎖状、分枝状または環状の不飽和炭
化水素をいう。好ましくは、１〜12個の炭素を有するア
ルキニル基である。より好ましくは、１〜７個の炭素、
より好ましくは１〜４個の炭素を有する低級アルキニル
である。これらアルキニル基は、任意に、ヒドロキシ
ル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、NO₂、ハロゲ
ン、Ｎ（CH₃）_２アミノおよびSHからなる群から選択さ
れた１個またはそれ以上の置換基で置換されていてもよ
い。

「アルコキシ」とは、「−Ｏ−アルキル」基をいう。

「アリール」とは、共役π電子系を有する少くとも１
個の環を有する芳香族基をいい、そして炭素環式アリー
ル、複素環式アリールおよびビアリール基を含む。これ
らのアリール基は、任意に、ハロゲン、トリハロメチ
ル、ヒドロキシル、SH、OH、NO₂、アミン、チオエーテ
ル、シアノ、アルコキシ、アルキル、およびアミノから
なる群から選択された１個またはそれ以上の置換基で置
換されていてもよい。

「アルカリール」とは、アリール基に共有結合したア
ルキルをいう。好ましくはこのアルキルは低級アルキル
である。

「炭素環式アリール」とは、環原子が炭素であるアリ
ール基をいう。

「複素環式アリール」とは、環原子として１〜３個の
ヘテロ原子を有し、残りの環原子が炭素であるアリール
基をいう。ヘテロ原子は、酸素、硫黄、および窒素を含
む。したがって、複素環式アリール基は、フラニル、チ
エニル、ピリジル、ピロリル、Ｎ−低級アルキルピロ
ロ、ピリミジル、ピラジニル、イミダゾリル等を包含す
る。

「アミド」とは、−Ｃ（Ｏ）−NH−Ｒ（ここで、Ｒは
アルキル、アリール、アルキルアリールまたは水素であ
る）をいう。

「チオアミド」とは、−Ｃ（Ｓ）−NH−Ｒ（ここで、
Ｒはアルキル、アリール、アルキルアリールまたは水素
である）をいう。

「アミン」とは、−Ｎ（Ｒ′）Ｒ″基（ここで、Ｒ′
およびＲ″は、各々独立に、アルキル、アリールおよび
アルキルアリールからなる群から独立して選択される）
をいう。

「チオエーテル」とは、−Ｓ−Ｒ（ここで、Ｒはアル
キル、アリール、またはアルキルアリールである）をい
う。

「スルホニル」とは、−Ｓ（Ｏ）_２−Ｒ（ここで、Ｒ
はアリール、Ｃ（CN）＝Ｃ−アリール、CH₂CN、アルカ
リール、スルホンアミド、NH−アルキル、NH−アルキル
アリールまたはNH−アリールである）をいう。

4.2 本発明本発明はチロシンキナーゼのシグナル伝達に関し、よ
り詳しくは、受容体および非受容体チロシンキナーゼシ
グナル伝達を調節および／またはモジュレートしうる化
合物に関する。

受容体チロシンキナーゼにより仲介されるシグナル伝
達は、特異的な増殖因子（リガンド）との細胞外相互作
用で開始され、受容体の二量化、内因性タンパク質チロ
シンキナーゼ活性の一過性刺激およびりん酸化が続く。
それによって細胞内シグナル伝達分子のための結合部位
が作られ、そして適当な細胞性応答（例えば、細胞分
裂、細胞外ミクロ環境への代謝効果）を促進するスペク
トルの細胞質シグナル形成分子との複合体の形成に至
る。Schlessinger and Ullrich,1992,Neuron 9:383−39
1参照。

増殖因子受容体のチロシンのりん酸化部位が、シグナ
ル形成分子のSH2（src相同）ドメインのための高親和性
結合部位として機能することが記載されている。Fantl
ら、1992,Cell 69:413−423;Songyangら、1994,Mol.Cel
l.Biol.14:2777−2785）;Songyangら、1993,Cell 72:76
7−778;and Kochら、1991,Science 252:668−678.受容
体チロシンキナーゼと関連する幾つかの細胞内基質タン
パク質が同定されている。それらは２つの主要なグルー
プ、すなわち（１）触媒ドメインを有する基質、および
（２）かかるドメインを欠いているがアダプターとして
作用し、そして触媒活性分子と関連する基質とに分けら
れる。Songyangら、1993,Cell 72:767−778.受容体とそ
れらの基質のSH2ドメインとの間の相互作用の特異性
は、りん酸化されたチロシン残基を隣接するように取り
囲むアミノ酸残基により決定される。SH2ドメインと、
特定の受容体上のホスホチロシン残基を隣接するように
取り囲むアミノ酸配列との間の結合親和性における相違
は、それらの基質のりん酸化プロフィルにおいて観察さ
れる相違と一致する。Songyangら、1993,Cell 72:767−
778.これらの観察は、各受容体チロシンキナーゼの機能
がその発現パターンおよびリガンドの有用性のみなら
ず、特定の受容体によって活性化される下流シグナル伝
達経路の列によっても決定されることを示唆している。
したがってりん酸化は、特異的な増殖因子受容体によっ
て、ならびに分子因子受容体によって補充されるシグナ
ル伝達経路の選択性を決定する重要な調節段階を提供す
る。

チロシンキナーゼのシグナル伝達により、他の応答の
中でも、細胞増殖、分化および代謝が行なわれる。異常
な細胞増殖では、癌、肉腫、白血病、神経膠芽腫、血管
腫、乾癬、アテローム性動脈硬化症、関節炎および糖尿
病性網膜症（または非制御血管形成および／または脈管
形成に関連する他の障害）のような新形成の発生を含む
広い範囲の障害および疾患を生じうる。

それゆえ本発明は、PTKおよび／または非受容体チロ
シンキナーゼの酵素活性に影響し、そしてシグナル伝達
されたこのようなタンパク質を妨害することによって、
チロシンキナーゼのシグナル伝達を調節、モジュレート
および／または阻害する化合物に関する。より詳細に
は、本発明、癌、肉腫、白血病、赤芽球細胞腫、神経膠
芽腫、髄膜腫、星状細胞腫、メラノーマおよび筋芽細胞
腫を含むがそれらに限定されるものではない多種類の固
形腫瘍を治癒させるための治療手段として、PTKおよび
／または非受容体チロシンキナーゼ仲介シグナル伝達経
路を、調節、モジュレートおよび／または阻害する化合
物に関する。適応症としては、それらに限定されるわけ
ではないが、脳腫瘍、膀胱癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、
結腸癌、血液癌、肺癌および骨癌が含まれる。

4.3 化合物一つの態様においては、本発明は式（Ｉ）：を有する化合物およびその製剤学的に許容され得る塩を
提供する。ここで上記式中、 R₁はＨまたはアルキルであり、 R₂はＯまたはＳであり、 R₃は水素であり、 R₄、R₅、R₆およびR₇は、各々独立に、水素、アルキ
ル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリ
ール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチ
ル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NRR′、O
H、CN、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、（C
H₂）_nCO₂R、およびCONRR′からなる群より選択され、 R₃′、R₅′およびR₆′は、各々独立に、水素、アルキ
ル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリ
ール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチ
ル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NRR′、O
H、CN、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、（C
H₂）_nCO₂R、およびCONRR′よりなる群から選択され、ｎは０−３であり、ＸはBr、Cl、ＦまたはＩであり、そしてＲはＨ、アルキルまたはアリールであり、そしてＲ′はＨ、アルキルまたはアリールである。

式Ｉの化合物の好ましい態様においては、R₃′はメチ
ル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチ
ル、イソブチル、ｔ−ブチル、ハロゲン、アリールおよ
びOR（ここでＲはＨ、アルキルまたはアリールである）
からなる群から選択され、そしてR₅′は水素、メチル、
エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イ
ソブチル、ｔ−ブチル、ハロゲン、アリールおよびOR
（ここでＲはＨ、アルキルまたはアリールである）から
なる群から選択される。

特に好ましい式Ｉの化合物は３−（２−クロロ−４−
ヒドロキシベンジリデニル）−２−インドリノンであ
る。

もう一つの態様においては、本発明は式（II）：を有する化合物およびその製剤学的に許容され得る塩を
提供する。ここで、上記式中、 R₁はＨまたはアルキルであり、 R₂はＯまたはＳであり、 R₃は水素であり、 R₄、R₅、R₆およびR₇は、各々独立に、水素、アルキ
ル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリ
ール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチ
ル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NRR′、O
H、CN、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、（C
H₂）_nCO₂R、およびCONRR′よりなる群から選択され、 R₂′、R₃′、R₅′およびR₆′は、各々独立に、水素、
アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、ア
ルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロ
メチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NR
R′、OH、CN、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、
（CH₂）_nCO₂R、およびCONRR′よりなる群から選択さ
れ、 RaおよびRbは、各々独立に、Ｈ、アルキルおよびＣ
（Ｏ）Ｒからなる群より選択されるか、または一緒にな
ったNRaRbは一以上の一で、水素、アルキル、アルコキ
シ、アリール、アリールオキシ、アルカリール、アルカ
リールオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、Ｓ（Ｏ）
Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NRR′、OH、CN、Ｃ
（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、（CH₂）_nCO₂R、
またはCONRR′で任意に置換されていてもよい３〜８原
子からなる複素環であってもよく、ｎは０〜３であり、ＸはBr、Cl、ＦまたはＩであり、そしてＲはＨ、アルキルまたはアリールであり、そしてＲ′はＨ、アルキルまたはアリールである。

式IIの化合物の好ましい態様においては、R₃′は、メ
チル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチ
ル、イソブチル、ｔ−ブチル、ハロゲン、アリールおお
びOR（ここでＲはＨ、アルキルまたはアリールである）
からなる群から選択され、そしてR₅′は、水素、メチ
ル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチ
ル、イソブチル、ｔ−ブチル、ハロゲン、アリールおよ
びOR（ここでＲはＨ、アルキルまたはアリールである）
からなる群から選択される。

特に好ましい式IIの化合物は３−（４−ジメチルアミ
ノベンジリデニル）−２−インドリノン（SU4312）であ
る。

さらにもう一つの態様においては、本発明は式（II
I）：を有する化合物およびその製剤学的に許容され得る塩を
提供する。ここで、上記式中、 R₁はＨまたはアルキルであり、 R₂はＯまたはＳであり、 R₃は水素であり、 R₄、R₅、R₆およびR₇は、各々独立に、水素、アルキ
シ、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリ
ール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチ
ル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NRR′、O
H、CN、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OCO（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、（C
H₂）_nCO₂R、およびCONRR′よりなる群から選択され、Ａは、一以上の位置で、アルキル、アルコキシ、アリ
ール、アリールオキシ、アルカリール、アルカリールオ
キシ、ハロゲン、トリハロメチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NR
R′、SO₃R、SR、NO₂、NRR′、OH、CN、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC
（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、（CH₂）_nCO₂R、またはCONRR′
で任意に置換された、チオフェン、ピロール、ピラゾー
ル、イミダゾール、1,2,3−トリアゾール、1,2,4−トリ
アゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾー
ル、イソチアゾール、２−スルホニルフラン、４−アル
キルフラン、1,2,3−オキサジアゾール、1,2,4−オキサ
ジアゾール、1,2,5−オキサジアゾール、1,3,4−オキサ
ジアゾール、1,2,3,4−オキサトリアゾール、1,2,3,5−
オキサトリアゾール、1,2,3−チアジアゾール、1,2,4−
チアジアゾール、1,2,5−チアジアゾール、1,3,4−チア
ジアゾール、1,2,3,4−チアトリアゾール、1,2,3,5−チ
アトリアゾールおよびテトラゾールよりなる群から選択
された５員ヘテロアリール環であり、ｎは０〜３であり、ＸはBr、Cl、ＦまたはＩであり、ＲはＨ、アルキルまたはアリールであり、そしてＲ′はＨ、アルキルまたはアリールである。

本発明の好ましい態様においては、式IIIの化合物は
３−［（2,4−ジメチルピロール−５−イル）メチレ
ン］−２−インドリノン（SU5416）である。

さらにもう一つの態様においては、本発明は式（I
V）：を有する化合物およびその製剤学的に許容される塩を提
供する。ここで上記式中、 R₁はＨまたはアルキルであり、 R₂はＯまたはＳであり、 R₃は水素であり、 R₄、R₅、R₆およびR₇は、各々独立に、水素、アルキ
ル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリ
ール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチ
ル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NRR′、O
H、CN、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、（C
H₂）_nCO₂R、およびCONRR′よりなる群から選択され、 R₃′、R₄′、R₅′およびR₆′は、水素、アルキル、ア
ルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリール、
アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、Ｓ
（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NRR′、OH、CN、
Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、（CH₂）_nCO
₂R、およびCONRR′よりなる群から選択され、ｎは０〜３であり、ＸはBr、Cl、ＦまたはＩであり、ＲはＨ、アルキルまたはアリールであり、そしてＲ′はＨ、アルキルまたはアリールである。

式IVの化合物の好ましい態様において、R₃′はメチ
ル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチ
ル、イソブチル、ｔ−ブチル、ハロゲン、アリール、お
よびOR（ここでＲはＨ、アルキル、またはアリールであ
る）からなる群から選択され、そしてR₅′は、水素、メ
チル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチ
ル、イソブチル、ｔ−ブチル、ハロゲン、アリールおよ
びOR（ここでＲはＨ、アルキルまたはアリールである）
よりなる群から選択される。

特に好ましい式IVの化合物は３−（２−エトキシベン
ジリデニル）−２−イルドリノン（SU5204）である。

最後の態様においては、本発明は式（Ｖ）：を有する化合物およびその製剤学的に許容される塩を提
供する。ここで上記式中、 R₁はＨまたはアルキルであり、 R₂はＯまたはＳであり、 R₃は水素であり、 R₄、R₅、R₆およびR₇は、各々独立に、水素、アルキ
ル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリ
ール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチ
ル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NRR′、O
H、CN、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、（C
H₂）_nCO₂R、およびCONRR′よりなる群から選択され、 R₂′、R₃′、R₅′およびR₆′は、各々独立に、水素、
アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、ア
ルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロ
メチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NR
R′、OH、CN、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、
（CH₂）_nCO₂RおよびCONRR′よりなる群から選択され、ｎは０〜３であり、ＺはBr、Cl、Ｆ、Ｉ、メチル、エチル、ｎ−プロピ
ル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチルまたはｔ−
ブチルであり、ＲはＨ、アルキルまたはアリールであり、そしてＲ′はＨ、アルキルまたはアリールである。

式Ｖの化合物の好ましい態様においては、R₃′は、メ
チル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチ
ル、イソブチル、ｔ−ブチル、ハロゲン、アリールおよ
びOR（ここでＲはＨ、アルキルまたはアリールである）
からなる群から選択され、そしてR₅′は水素、メチル、
エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イ
ソブチル、ｔ−ブチル、ハロゲン、アリールおよびOR
（ここでＲはＨ、アルキルまたはアリールである）から
なる群から選択される。

特に好ましい式Ｖの化合物は３−（４−ブロモベンジ
リデニル）−２−インドリノン（SU4942）である。

本明細書で言及する化学式は互変異性または構造異性
現象を示しうる。例えば、ここに記載される化合物はイ
ンドリノン３−置換基をインドリノン環に連結する二重
結合についてシスまたはトランス配位をとることがで
き、またはシスおよびトランス異性体の混合物であって
もよい。本明細書の式を示す図は、あり得る互変異性体
または構造異性体の１つのみしか表わせないが、本発明
は、チロシンキナーゼシグナル伝達または細胞増殖を、
調節、阻害および／またはモジュレートする能力を有す
る、任意の互変異性または構造異性体、またはこれらの
混合物を包含し、式を示す図に表された任意の１つの互
変異性体または構造異性体のみに限定されないというこ
とを理解すべきである。

前記化合物およびそれらの製剤学的に許容され得る塩
に加え、適用できる場合には、本発明はさらに細胞増殖
の調節、および／またはモジュレート能を有する化合物
の溶媒和物のならびに非溶媒和物（例えば水和物）にも
関する。

ここに記載された化合物は、化学的に関連した化合物
の製造に適用できることが知られている任意の方法によ
って製造できる。好適な方法は実施例に例示してある。
必要な出発物質は、有機化学の標準的な操作により得る
ことができる。

受容体チロシンキナーゼ仲介シグナル伝達に影響する
ための薬物として個々の化合物の適切な活性および効力
は、利用可能な技法を用いて決定することができる。優
先的には、化合物の一連のスクリーニングにかけて細胞
増殖をモジュレート、調節および／または阻害するその
化合物の能力を決定する。これらのスクリーニングに
は、実施される順に、生化学的アッセイ、細胞増殖アッ
セイおよびin vivo実験が含まれる。

4.4 適応症ここに記載された化合物は、細胞増殖性障害、繊維症
性障害および代謝性障害を含む非調節チロシンキナーゼ
シグナル伝達に関連する障害の治療に有用である。

本発明により治療できるかまたはさらに研究できる細
胞増殖性障害には、癌、血管増殖性障害およびメサンギ
ウム細胞増殖性障害が包含される。

血管増殖性障害とは、一般に血管の異常増殖をもたら
す血管形成性および脈管形成性障害を指す。血管の形成
および拡張、またはそれぞれ脈管形成および血管形成は
胚発生、黄体形成、創傷治癒および臓器再生のような種
々の生理学的過程において重要な役割を果す。それらは
また癌の発生にも中枢的な役割を果す。血管増殖性障害
の他の例としては、新たな毛細血管が関節を侵襲して軟
骨を破壊する関節炎、および網膜中の新たな毛細管が硝
子体を侵襲し、出血しそして失明を惹起するものである
糖尿病性網膜症のような眼の疾患が包含される。逆に、
再狭窄などの、血管の収縮、萎縮または閉塞に関連する
障害も含まれる。

繊維症性障害は、細胞外マトリックスの異常増殖を指
す。繊維症性障害の例としては、肝硬変およびメサンギ
ウム細胞増殖性障害が含まれる。肝硬変は、肝瘢痕の形
成を来たす細胞外マトリックス構成成分の増加によって
特徴づけられる。肝硬変は、肝臓の硬変のような疾患を
ひき起す。肝瘢痕を生成する細胞外マトリックスの増加
はまた、肝炎のようなウイルス感染によっても惹起され
る。脂肪細胞は肝硬変において、主たる役割を演じてい
ると思われる。関連する他の繊維症性障害としては、ア
テローム性動脈硬化症（下記参照）がある。

メサンギウム細胞増殖性障害は、メサンギウム細胞の
異常な増殖によりもたらされる障害をいう。メサンギウ
ム増殖性障害には、糸球体腎炎、糖尿病性腎臓症、悪性
腎硬化症、血栓性微小血管障害症候群、移植片拒絶、お
よび糸球体症のような種々のヒトの腎疾患が包含され
る。PDGF−Ｒはメサンギウム細胞増殖の維持に関わる。
Floegeら,1993,Kidney International 43:47S−54S. PTKはこのような細胞増殖性障害と関連している。例
えば、PTKファミリーの幾つかのメンバーは癌の発生と
関連している。EGFR（Tuziら、1991,Br.J.Cancer 63:22
7−233;Torpら、1992,APMIS 100:713−719）、HER2/neu
（Slamonら、1989,Science 244:707−712）およびPDGF
−Ｒ（Kumabeら、1992,Oncogene 7:627−633）のような
これら受容体の幾つかは、多くの腫瘍で過剰発現される
か、および／またはオートクラインループにより持続的
に活性化される。事実、最も一般的で重篤な癌では、こ
れらの受容体の過剰発現（Akbasak and Suner−Akbasak
ら、1992,J.Neurol.Sci.111:119−133;Dicksonら、199
2,Cancer Treatment Res.61:249−273;Korcら、1992,J.
Clin.Invest.90:1352−1360）とオートクラインループ
（Lee and Donoghue,1992,J.Clee.Biol.118:1057−107
0;Korcら、前出;Akbasak and Suner−Akbasakら、前
出）とが示されている。例えば、EGFR受容体、扁平上皮
癌、星状細胞腫、神経膠芽腫、頭部および頸部の癌、肺
癌および膀胱癌に関連している。HER2は乳癌、卵巣癌、
胃癌、肺癌、膵癌および膀胱癌と管れしている。PDGF−
Ｒは神経膠芽腫、肺癌、卵巣癌、メラノーマおよび前立
腺癌と関連している。RTK c−metは、一般的に肝癌の発
生に関連し、肝細胞の癌腫と関連している。加えて、ｃ
−metは悪性腫瘍形成とつながっている。より詳細に
は、RTK c−metは他の癌のうちでも、結腸直腸、甲状
腺、膵臓および胃の癌腫、白血病およびリンパ腫と関連
している。さらに、ｃ−met遺伝子の過剰発現がホジキ
ン病、バーキット病およびリンパ腫細胞系の患者で検出
されている。

IGF−IRは、栄養上の支持およびII型糖尿病に関与し
ているのに加え、幾種類かの癌にも関連している。例え
ば、IGF−Ｉは幾つかの型の腫瘍、例えばヒト乳癌癌腫
細胞（Arteagaら、1989,J.Clin.Invest.84:1418−142
3）および小型の肺癌細胞（Macauleyら、1990,Cancer R
es.50:2511−2517）にとってのオートクライン増殖刺激
剤として関与している。加えて、神経系の正常な増殖と
分化とに全体的に関与しているIGF−Ｉは、ヒトの神経
膠腫のオートクライン刺激剤であると思われる。Sandbe
rg−Nordqvistら、1993,Cancer Res.53:2475−2478.細
胞増殖におけるIGF−IRとそのリガンドの重要性は、多
くの種類の細胞（繊維芽細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、
Ｔ−リンパ球、骨髄細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨髄の
幹細胞）が、培養中にIGF−Ｉにより刺激されて増殖す
るという事実によってさらに支持される。Goldring and
Goldring,1991,Eukaryotic Gene Expression 1:301−3
26.一連の最近の刊行物においてBasergaはIGF−IRはト
ランスフォーメーションのメカニズムにおいて中心的な
役割を果たし、そのようにして広いスペクトルでヒト悪
性腫瘍にとって治療的介入の好ましい標的であり得るは
ずであるということまでも示唆している。Baserga,199
5,Cancer.Res.55:249−252;Baserga,1994,Cell 79:927
−930;Coppolaら、1994,Mol.Cell.Biol.14:4588−4595. RTKの異常と疾患との間の関連は、しかしながら癌に
限定されない。例えば、PTKは、乾癬、糖尿病、創傷治
癒、炎症および神経退行性疾患のような代謝性疾患と関
連している。例えば、EGF−Ｒは、角膜および皮膚の創
傷治癒において関連が示唆されている。インスリン−Ｒ
の欠損とIGF−1Rとは、II型糖尿病において示唆されて
いる。特異的なPTKとそれらの治療上の適応症との間の
より完全な相関関係は、Plowmanら、1994,DN＆P 7:334
−339で述べられている。

受容体型チロシンキナーゼのみならず、src,abl,fps,
yes,fyn,lyn,lck,blk,hck,fgr,yrk（Bolenら、1992,FAS
EB J.6:3403−3409による総説がある）を含む多くの細
胞性チロシンキナーゼ（CTK）は増殖性および代謝性シ
グナル伝達経路に関与しており、従って本発明の適応症
に関与する。例えば、突然変異したsrc（ｖ−src）は、
ニワトリのがんタンパク（pp60^v-src）として示されて
いる。その上、その細胞性相同体であるプロト−がん遺
伝子pp60^c-srcは、多くの受容体の発癌シグナルを伝達
する。例えば、癌におけるEGF−ＲまたはHER2/neuの過
剰発現は、pp60^c-srcの構造的な活性化を来たす。これ
は悪性細胞の特徴であり、正常な細胞には存在しないも
のである。他方、ｃ−srcの発現に欠けるマウスは大理
石骨病の表現型を示し、このことは破骨細胞機能におけ
るｃ−srcの決定的な関与と関連する障害に関与する可
能性とを示すものである。同様に、Zap70はＴ−細胞の
シグナル伝達に関与している。

さらに、RTKをねらいとするブロッカーを増強する
か、またはそれと相乗作用までも行なうためのCTKをモ
ジュレートする化合物の同定は、本発明の１つの態様で
ある。

終りに、RTKキナーゼおよび非受容体型キナーゼ双方
の過免疫障害と結びついている。

4.5 医薬組成物および投与経路本明細書に記載された化合物は、それ自体で、または
適当な担体もしくは賦形剤と混合した医薬組成物にてヒ
ト患者に投与することができる。本出願の化合物の製剤
化および投与技術は、“Remington's Pharmaceutical S
ciences,"Mack Publishing Co.,Easton,PA,最近版、に
掲載されている。

4.5.1 投与経路好適な投与経路としては、例えば、経口、直腸、経粘
膜、または腸管投与、筋肉内、皮下、脊椎内注射を含む
非経口デリバリー；ならびに髄腔内、直接脳内（intrav
entricular）、静脈内、腹腔内、鼻腔内または眼内注射
が挙げられる。

あるいは、例えば化合物をしばしばデポ製剤または除
放性製剤にて、直接固形腫瘍に注入することにより、全
身的よりむしろ局所的に化合物を投与することもでき
る。

さらに、薬物を標的化薬物放出系、例えば、腫瘍特異
的抗体で被覆されたリポソームにて投与することもでき
る。リポソームは腫瘍細胞を標的とし、そしてリポソー
ム中に選択的にとり込まれる。

4.5.2 組成物／製剤本発明の医薬組成物はそれ自体知られた方法、例え
ば、従来の混合工程、溶解工程、顆粒形成工程、糖衣剤
形成工程、すりつぶし工程、乳化工程、カプセル化工
程、捕捉化工程または凍結乾燥工程を用いて製造するこ
とができる。

したがって、本発明により使用するための医薬組成物
は、活性化合物を医薬上使用できる製剤に加工処理する
ことを促進する助剤および賦形剤を含む、１種以上の生
理学的に許容しうる担体を用いて、従来の方法で製剤化
することができる。投与経路に応じて、適正な製剤を選
択する。

注射剤は、本発明の薬物を、水溶液、好ましくは、ハ
ンクス緩衝液、リンゲル緩衝液または生理食塩緩衝液な
どの生理学的に適合する緩衝液中にて製剤化することが
できる。経粘膜投与では、透過すべき障壁に適した浸透
剤が製剤化において使用される。このような浸透剤は、
当業者に公知である。

経口投与では、当業者に周知の製剤学的に許容し得る
担体と活性化合物とを組み合せることにより、本化合物
を容易に製剤化することができる。このような担体を用
いると、本発明化合物を、治療すべき患者が経口的に摂
取するための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、
ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等として製剤
化することができる。経口使用のための医薬製剤は、固
形賦形剤と混合し、生成する混合物を任意に粉砕し、そ
して所望により、適当な助剤を添加した後に顆粒混合物
を加工して錠剤または糖衣錠コアとすることによって得
ることができる。

好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マ
ンニトールまたはソルビトールを含む糖のような充填
剤；例えばとうもろこし澱粉、小麦澱粉、米澱粉、馬鈴
薯澱粉、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロー
ス、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキ
シメチルセルロースナトリウムのようなセルロース調製
物、および／またはポリビニルピロリドン（PVP）であ
る。所望の場合は崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリ
ドン、寒天、またはアルギン酸、またはアルギン酸ナト
リウムのようなそれらの塩を添加しうる。

糖衣錠コアは適当なコーティングを備える。この目的
には、濃厚糖溶液を使用でき、このものは場合によりア
ラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポ
ルゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸
化チタン、ラッカー溶液、および適当な有機溶媒または
溶媒混合物を含有しうる。活性化合物量の確認のためま
たは異なる組み合わせを特徴づけるために染料または顔
料を錠剤または糖衣錠コーティングに添加しうる。

経口使用できる医薬調製物にはゼラチン製プッシュフ
ィットカプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤例えば
グリセリンまたはソルビトールから作られた軟質の、密
封カプセルが包含される。プッシュフィットカプセルは
活性成分をラクトースのような充填剤、澱粉のような結
合剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネ
シウムのような潤滑剤および、場合により安定剤と混合
して含有しうる。軟カプセルにおいては、活性化合物は
脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリ
コールのような適当な液体中に溶解または懸濁させるこ
とができる。さらに、安定剤を添加することもできる。
経口投与のためのすべての製剤はかかる投与にとって好
適な薬量であるべきである。

バッカル投与には、組成物は慣用の方法で製剤化され
た錠剤またはトローチの形態をとることができる。

吸入による投与のためには、本発明により使用するた
めの化合物は好適な推進剤、例えばジクロロジフルオロ
メタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフ
ルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガスを使用
して、加圧されたパックまたはネブライザーからのエー
ロゾルスプレー提供物の形態で好都合に放出される。加
圧エーロゾルの場合、薬量単位は計量された量を放出す
るためのバルブを備えることにより決定することができ
る。吸入器または吹き入れ器で使用するための例えばゼ
ラチン製のカプセルおよびカートリッジは化合物および
適当な粉末ベース、例えばラクトースまたは澱粉の粉末
混合物を含有させて製剤化することができる。

本化合物は注射、例えば巨丸注射または連続注入によ
る非経口投与用に製剤化できる。注射用製剤は単位剤
形、例えば防腐剤を添加したアンプルまたはバイアル瓶
中にて提供できる。これら組成物は油性または水性ビヒ
クル中における懸濁液、溶液または乳剤のような形態を
とることができ、そして懸濁剤、安定剤および／または
分散剤のような製剤化剤を含有できる。

非経口投与用の医薬製剤には水溶性形態における活性
化合物の水溶液が包含される。加えて、活性化合物の懸
濁液が適切な油状の注射懸濁液として調製されうる。好
適な親指性溶媒またはビヒクルにはゴマ油のような脂肪
油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのよ
うな合成脂肪酸エステル、またはリポソームが包含され
る。水性注射懸濁液はカルボキシメチルセルロースナト
リウム、ソルビトール、またはデキストランのような懸
濁液の粘度を増大させる物質を含有しうる。所望の場合
は、懸濁液はまた好適な安定剤または化合物の溶解度を
高めて高濃度溶液の製造を可能にする物質をも含有しう
る。

あるいはまた、活性成分は好適なビヒクル、例えば滅
菌パイロジェンフリー水を用いて使用前に構成するため
の粉末形態であることもできる。

本化合物はまた例えばカカオバターまたは他のグリセ
リドのような慣用の座薬基剤を含有する座薬または保持
浣腸のような直腸組成物にて製剤化することもできる。

先に記載した製剤に加え、本化合物はまたデポ製剤と
しても製剤化できる。かかる長期作用性製剤は植込み
（例えば皮下または筋肉内）によるかまたは筋肉内注射
により投与できる。従って例えば、本化合物は好適なポ
リマー性または疎水性物質（例えば受容しうる油状物中
における乳濁液として）またはイオン交換樹脂を用い
て、または難溶性誘導体、例えば難溶性塩として製剤化
できる。

本発明の疎水性化合物のための医薬担体はベンジルア
ルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機ポリマーお
よび水相を包含する共溶媒系である。共溶媒系はVPD共
溶媒系であることができる。VPDは無水エタノール中で
容量に作られた３％w/vベンジルアルコール、８％w/v非
極性界面活性剤ポリソルベート80、および65％w/vポリ
エチレングリコール300の溶液である。VPD共溶媒系（VP
D:D5W）は５％デキストロース水溶液中で1:1に希釈した
VPDからなる。この共溶媒系は疎水性化合物を良く溶解
させ、そしてそれ自身全身投与に際しては低い毒性しか
生じない。当然、共溶媒系の割合はその溶解度および毒
性特性を破壊することなく相当に変動しうる。その上、
共溶媒成分の同一性も変動できる、すなわち例えば他の
低毒性非極性界面活性剤がポリソルベート80の代わりに
使用でき；ポリエチレングリコールのフラクションサイ
ズが変動でき；他の生物相溶性ポリマー、例えばポリビ
ニルピロリドンがポリエチレングリコールにとって代わ
ることができ；そして他の糖またはポリサッカライドが
デキストロースにとって代わることができる。

あるいはまた、疎水性医薬化合物のための他の放出系
を用いることもできる。リポソームおよび乳剤は疎水性
薬物のための良く知られた放出ビヒクルまたは担体の例
である。通常毒性が大きくなるという犠牲はあるが、ジ
メチルスルホキシドのようなある種の有機溶媒も使用で
きる。加えて、これら化合物は治療剤を含有する固形疎
水性ポリマーの半透過性マトリックスのような徐放系を
用いて放出することもできる。種々の徐放性物質が確立
されておりそして当業者には良く知られている。徐放性
カプセルは、それらの化学的性質の如何に応じて、化合
物を数週間から100日間以上放出する。治療剤の化学的
性質および生物学的安定性に応じて、タンパク安定化の
ためのさらなる手段を用いることもできる。

医薬組成物はまた好適な固相またはゲル相担体または
賦形剤をも含有しうる。かかる担体または賦形剤の例に
は、それらに限定されないが、炭酸カルシウム、燐酸カ
ルシウム、種々の糖、澱粉、セルロース誘導体、ゼラチ
ン、およびポリエチレングリコールのようなポリマーが
包含される。

本発明のPTK変調化合物の多くが医薬的に相溶性のカ
ウンターイオンとの塩として提供されうる。医薬的に相
溶性の塩は、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ
酸、コハク酸、等を包含するがそれらに限定されない多
くの酸を用いて形成できる。塩は水性溶媒中または相当
する遊離塩基形態である他のプロトン性溶媒中でより溶
解性が高い傾向がある。

4.5.3. 有効量本発明で使用するのに好適な医薬組成物には活性成分
がその意図する目的を達成するのに有効な量で含有され
る組成物が包含される。より詳細には、治療的に有効な
量とは疾患の症状を阻止、軽減または改善するかまたは
治療される患者の生存を延長するのに有効な化合物量を
意味する。治療的に有効な量の決定は、特に本明細書に
提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力
の範囲内である。

本発明方法で使用されるいずれの化合物にとっても、
治療的に有効な量は細胞培養アッセイから当初に見積も
ることができる。例えば、細胞培養物で決定されたIC₅₀
（すなわち、PTK活性の最大阻害の半分を達成する試験
化合物の濃度）を包含する循環濃度範囲を達成するため
に動物モデルにおいて薬量を公式化できる。かかる情報
はヒトにおける有用な薬量をより正確に決定するのに用
いることができる。

本明細書に記載される化合物の毒性および治療効果は
例えば、LD₅₀（その集団の50％が死ぬ量）およびED
₅₀（その集団の50％において治療的に有効な量）を測定
するための細胞培養物または実験動物における標準的な
医薬上の操作により決定できる。毒性効果と治療効果と
の間の用量の比が治療指数であり、そしてLD₅₀とED₅₀の
比として表される。高い治療指数を示す化合物が好まし
い。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得ら
れたデータはヒトで使用するための用量範囲を公式化す
るのに使用できる。かかる化合物の用量は毒性が少ない
かまたは毒性を伴わないED₅₀を包含する循環濃度の範囲
内にあるのが好ましい。薬用量は用いられる剤形および
利用される投与経路に応じてこの範囲内で変動しうる。
正確な製剤、投与経路および薬用量は患者の状態にかん
がみそれぞれの医師により選択されうる。（例えば、Fi
ngl et al.,1975,in“The Pharmacological Basis of T
herapeutics",Ch.1 p.1参照）。

薬用量および間隔は、キナーゼ変調効果または最小有
効濃度（MEC）を維持するに十分な活性部分の血漿レベ
ルを生ずるようそれぞれに調整されうる。MECはそれぞ
れの化合物について変動しようが、しかしインビトロデ
ータ、例えば本明細書に記載されたアッセイを用いてキ
ナーゼの50−90％阻害を達成するのに必要な濃度、から
見積もることができる。MECを達成するのに必要な薬用
量はそれぞれの特性および投与経路の如何によるであろ
う。しかしながら、HPLCアッセイまたはバイオアッセイ
が血漿濃度の測定に使用できる。

薬量間隔もMEC値を用いて決定できる。化合物はその
時間の10−90％、好ましくは30−90％そして最も好まし
くは50−90％の間血漿レベルをMECより高く維持する処
法を用いて投与されるべきである。

局所投与または選択的取り込みの場合には、薬物の有
効局所濃度は血漿濃度とは関連しないかも知れない。

投与される組成物の量は、勿論、治療される患者、患
者の体重、苦痛の重さ、投与様式および指示する医師の
判断の如何によろう。

4.5.4. 包装組成物は所望の場合は活性成分を含有する１つまたは
それ以上の単位剤形を含有しうるパックまたはディスペ
ンサー装置中にて提供されうる。このパックは例えばブ
リスターパックのような、金属またはプラスチックホイ
ルを包含しうる。パックまたはディスペンサー装置は投
与説明書を伴うことができる。相溶性の医薬担体中に製
剤化された本発明の化合物を含有する組成物も製造で
き、適当な容器中に入れ、そして指示された状態の治療
用にラベルがつけられうる。ラベルに指示される適合す
る症状には、腫瘍の治療、血管形成の阻止、繊維症の治
療、糖尿病、等が包含される。

5. 実施例：化合物合成本発明化合物は知られた方法に従って合成できる。以
下は請求された本発明の化合物を合成するための好まし
い方法を示す。

5.1. ３−置換−２−インドリノン類似体（SU4312およ
びSU4314類似体）の一般的合成以下の一般的方法を用いて本発明の３−置換−２−イ
ンドリノン化合物を合成した。

5.1.1. 方法Ａエタノール（１−2mL/1ミリモルオキシインドール）
中の、適正なオキシインドール（２−インドリノン）
（１当量）、適当なアルデヒド（1.2当量）、およびピ
ペリジン（0.1当量）からなる反応混合物を90℃で３−
５時間攪拌した。冷却後、沈殿を濾過し、冷エタノール
で洗い、乾燥して目的とする化合物を得た。

5.1.2. 方法Ｂ Vilsmeier反応による適正なアルデヒドの調製反応 1,2−ジクロロエタン（2.0mL/1.0ミリモル出発物質）
中のN,N−ジメチルホルムアミド（1.2当量）の溶液中
に、オキシ塩化燐（1.2当量）を０℃で滴下した。氷浴
をはずしそして反応混合物をさらに30分間攪拌した。適
正な出発物質（1.0当量）を上記溶液に少しずつ加え、
そして反応混合物を50−70℃で５時間−２日間攪拌し
た。この反応混合物を氷冷1N水酸化ナトリウム溶液中に
注ぎ入れ（混合後でpH＝９）そして生成する混合物を室
温で１時間攪拌した。有機層を分離しそして水層を酢酸
エチルで抽出した。合一した有機層をpH＝７となるまで
食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥しそして蒸発
させた。残留物をシリカゲルカラム上のクロマトグラフ
ィーにかけ、酢酸エチルとヘキサンの溶媒混合物を用い
て溶離して標記化合物を得た。

３−置換−２−インドリノン類似体の合成エタノール（１−2mL/1ミリモルオキシインドール）
中の、適正なオキシインドール（２−インドリノン）
（１当量）、適当なアルデヒド（1.2当量）、およびピ
ペリジン（0.1当量）からなる反応混合物を90℃で３−
５時間攪拌した。冷却後、沈殿を濾過し、冷エタノール
で洗いそして乾燥して目的とする化合物を得た。

5.2. ３−ベンジリデン−２−インドリノン（SU4928）
の合成３−ベンジリデン−２−インドリノンの好ましい合成
法は次のとおりである:2.0mLメタノール中の137.0mgの
オキシインドールの溶液に123.2μＬのベンズアルデヒ
ドおよび40μｌのピペリジンを加えた。この反応混合物
を３時間還流させそしてこの混合物を氷水浴中で冷却し
た。生成する沈殿を濾過し、冷メタノールで洗いそして
オーブン中40℃で一夜乾燥させた。かかるプロトコルを
用いて約129.0mgの化合物を得た。

5.3. ３−〔（ピリド−４−イル）メチレン〕−２−イ
ンドリノン（SU5212）の合成３−〔（ピリド−４−イル）メチレン〕−２−インド
リノンの好ましい合成法は次のとおりである：すなわ
ち、2.0mLメタノール中の138.0mgのオキシインドールの
溶液に117.0μＬの４−ピリジンカルボキシアルデヒド
および40μＬのピペリジンを加えた。この反応混合物を
３時間還流させそして氷水浴中で冷却した。生成する沈
殿を濾過し、冷メタノールで洗い、オーブン中40℃で一
夜乾燥させて134.5mgの化合物を得た。

5.4. ３−〔４−（モルホリン−４−イル）ベンジリデ
ニル〕−２−インドリノン（SU4981）の合成（方法Ｂ）４−（モルホリン−４−イル）ベンズアルデヒド 50mLの1,2−ジクロロエタン中の15mLのN,N−ジメチル
ホルムアミドの溶液に、オキシ塩化燐10mLを０℃で滴下
した。氷浴をはずしそして反応混合物をさらに30分間攪
拌した。４−フェニルモルホリン（16.3g）を上記溶液
に少しずつ加えそして反応混合物を２日間還流させた。
上記反応混合物にトリエチルアミン（2.5mL）を加え、
反応物を２日間還流させた。この反応混合物を氷浴1N水
酸化ナトリウム溶液中に注ぎ入れ（混合後でpH＝９）そ
して生成する混合物を室温で１時間攪拌した。有機層を
分離しそして水層を２×20mLのジクロロメタンで抽出し
た。合一した有機層をpH＝７となるまで食塩水で洗い、
無水硫酸ナトリウムで乾燥しそして蒸発させた。残留物
をシリカゲルカラム上、酢酸エチルとヘキサンの溶媒混
合物を用いて溶離して標記化合物12.95g（68％）を白色
固形物として得た。

３−〔４−（モルホリン−４−イル）ベンジリデニル）
−２−インドリノン（SU4981）エタノール50mL中の、オキシインドール6.66g、４−
（モルホリン−４−イル）ベンズアルデヒド11.50g、お
よびピペリジン5mLからなる反応混合物を90℃で５時間
攪拌した。冷却後、沈殿を濾過し、冷エタノールで洗
い、乾燥して標記化合物15.0g（98％）を黄色固形物と
して得た。

5.5. ３−〔４−（４−ホルミルピペラジン−１−イ
ル）ベンジリデニル〕−２−インドリノン（SU4984）の
合成（方法Ｂ）４−（４−ホルミルピペラジン−１−イル）ベンズアル
デヒド 20mLの1,2−ジクロロエタン中の3.9mL（30ミリモル）
のN,N−ジメチルホルムアミドの溶液に、オキシ塩化燐
3.0mL（3.9ミリモル）を０℃で滴下した。氷浴をはずし
そして反応混合物をさらに15分間攪拌した。１−フェニ
ルピペラジン（16.0g、10ミリモル）を上記溶液に少し
ずつ加えそして反応混合物を50℃で１時間攪拌した。こ
の反応混合物を氷冷1N水酸化ナトリウム溶液中に注ぎ入
れ、室温で１時間攪拌した。有機層を分離しそして水層
を２×20mLの酢酸エチルで抽出した。合一した有機層を
pH＝７となるまで食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウムで
乾燥し、蒸発させた。残留物をシリカゲルカラム上、酢
酸エチルとヘキサンの混合物を用いて溶離して標記化合
物9.0g（41％）を淡黄色固形物として得た。

３−〔４−（４−ホルミルピペラジン−１−イル）ベン
ジリデニル〕−２−インドリノン（SU4984）エタノール2mL中の、オキシインドール133.15mg、４
−（ピペラジン−１−イル）ベンズアルデヒド228.3m
g、およびピペリジン３滴からなる反応混合物を90℃で
５時間攪拌した。冷却後、沈殿を濾過し、冷エタノール
で洗い、乾燥して標記化合物199.5mg（65％）を黄色固
形物として得た。

5.6. ３−〔４−ピペリジン−１−イル）ベンジリデニ
ル〕−２−インドリノン（SU5450）の合成（方法Ｂ）４−（ピペリジン−１−イル）ベンズアルデヒド 10mLの1,2−ジクロロエタン中の2.3mL（30ミリモル）
のN,N−ジメチルホルムアミドの溶液に、オキシ塩化燐
2.8mL（30ミリモル）を０℃で滴下した。氷浴をはずし
そして反応混合物を15分間攪拌した。１−フェニルピペ
リジン（3.2mL、20ミリモル）を上記溶液に少しずつ加
えそして反応混合物を一夜還流させた。この反応混合物
を氷冷2N水酸化ナトリウム溶液中に注ぎ入れ、室温で１
時間攪拌した。有機層を分離しそして水層を２×20mLの
酢酸エチルで抽出した。合一した有機層をpH＝７となる
まで食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発
させた。残留物をシリカゲルカラム上、酢酸エチルとヘ
キサンの混合物を用いて溶離して標記化合物1.5g（40
％）を白色固形物として得た。

３−〔４−（ピペリジン−１−イル）ベンジリデニル〕
−２−インドリノン（SU5450）エタノール2mL中の、オキシインドール134.0mg、４−
（ピペリジン−１−イル）ベンズアルデヒド226.8g、お
よびピペリジン３滴からなる反応混合物を90℃で５時間
攪拌した。冷却後、沈殿を濾過し、冷エタノールで洗
い、乾燥して標記化合物268.5mg（88％）を黄色固形物
として得た。

5.7. ３−〔２−クロロ−４−メトキシベンジリデニ
ル〕−２−インドリノン（SU5480）の合成２−クロロ−４−メトキシベンズアルデヒド 10mLのN,N−ジメチルホルムアミド中の1.0g（6.4ミリ
モル）の２−クロロ−４−ヒドロキシベンズアルデヒ
ド、炭酸カリウム4.4g（32ミリモル）および沃化メチル
1.4g（9.6ミリモル）からなる反応混合物を70℃で２時
間攪拌し次に氷水中に注ぎ入れた。沈殿を濾過し、水洗
し、真空オーブン中40℃で一夜乾燥して標記化合物750m
g（68％）を淡桃色固形物として得た。

３−〔２−クロロ−４−メトキシベンジリデニル〕−２
−インドリノン（SU5480）エタノール5mL中の、オキシインドール487.9mg（3.7
ミリモル）、２−クロロ−４−メトキシベンズアルデヒ
ド750mg（4.3ミリモル）、およびピペリジン４滴からな
る反応混合物を90℃で２時間加熱しそして室温に冷却し
た。黄色沈殿を濾過し、冷エタノールで洗い、真空オー
ブン中40℃で一夜乾燥して標記化合物680.2mg（62％）
を得た。

5.8. ３−〔（４−メチルチエン−２−イル）メチレ
ン〕−２−インドリノン（SU5401）の合成エタノール3mL中の、オキシインドール133.0mg、４−
メチルチオフェン−２−カルボキシアルデヒド151.2m
g、およびピペリジン３滴からなる反応混合物を90℃で
３時間攪拌した。冷却後、沈殿を濾過し、冷エタノール
で洗い、乾燥して標記化合物147.3mg（61％）を黄色固
形物として得た。

5.9. ３−〔（３−メチルピロール−２−イル）メチレ
ン〕−２−インドリノン（SU5404）の合成エタノール2mL中の、オキシインドール133.0mg、３−
メチルピロール−２−カルボキシアルデヒド130.9mg、
およびピペリジン３滴からなる反応混合物を90℃で３時
間攪拌した。冷却後、沈殿を濾過し、冷エタノールで洗
い、乾燥して標記化合物150.9mg（67％）を黄色固形物
として得た。

5.10 ３−〔（3,4−ジメチルピロール−２−イル）メ
チレン〕−２−インドリノン（SU5406）の合成３−〔（3,4−ジメチルピロール−２−イル）メチレ
ン〕−２−インドリノンはJ.Heterocyclic Chem.13:114
5−1147（1976）に記載されるようにして合成した。

エチル４−メチルピロール−３−カルボキシレートエーテル／ジメチルスルホキシド（2:1）500mL中のク
ロトン酸エチル11.86g（0.1モル）およびｐ−トルエン
スルホニルメチルイソシアナイド19.50g（0.1モル）の
溶液を、エーテル中の水素化ナトリウム6.8g（60％鉱油
分散物、0.17モル）の懸濁液中に室温で滴下した。添加
完了後、反応混合物を30分間攪拌し、水400mLで希釈し
た。水層を３×100mLのエーテルで抽出した。合一した
エーテル抽出液をアルミナカラムに通し、ジクロロメタ
ンで溶離した。有機溶媒を蒸発させ、得られる残留物を
放置して凝固させた。この固形物をヘキサンで洗い、真
空オーブン中40℃で一夜乾燥させて標記化合物12.38g
（80％）を得た。

3,4−ジメチルピロールの調製ナトリウムジヒドロビス（２−メトキシエトキシアル
ミネート）23g（80ミリモル）の溶液中に、ベンゼン50m
L中のエチル４−メチルピロール−３−カルボキシレー
ト5g（34ミリモル）の溶液を室温で窒素雰囲気の下滴下
した。この反応混合物を18時間攪拌した。反応混合物に
水（100mL）を加えた。有機層を分離し、食塩水で洗
い、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を除去し、残
留物を蒸発させると標記化合物1.2g（44％）が得られ
た。

3,4−ジメチルピロール−２−カルボキシアルデヒドの
製造 10mLの1,2−ジクロロエタン中の0.92mL（12ミリモ
ル）のN,N−ジメチルホルムアミドの溶液に、０℃でオ
キシ塩化燐1.0mL（12ミリモル）を滴下した。氷浴をは
ずしそして反応混合物をさらに30分間攪拌した。3,4−
ジメチルピロール（960.0mg、10ミリモル）を上記溶液
に少しずつ加えそして反応混合物を50℃で５時間攪拌し
た。この反応混合物を氷冷1N水酸化ナトリウム溶液中に
注ぎ入れ（混合後でpH＝９）、得られる混合物を室温で
１時間攪拌した。有機層を分離しそして水層を酢酸エチ
ルで抽出した。合一した有機層をpH＝７となるまで食塩
水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させた。
残留物をシリカゲルカラム上クロマトグラフにかけ、酢
酸エチルとヘキサンの溶媒混合物を用いて溶離して標記
化合物610mg（50％）を得た。

３−〔（3,4−ジメチルピロール−２−イル）メチレ
ン〕−２−インドリノン（SU5406）エタノール2mL中の、オキシインドール67.0mg（0.5ミ
リモル）、3,4−ジメチルピロール−２−カルボキシア
ルデヒド73.0mg（0.6ミリモル）、およびピペリジン２
滴からなる混合物を90℃で３時間攪拌した。冷却後、沈
殿を濾過し、冷エタノールで洗い、つぎに乾燥して標記
化合物87.7mg（37％）を黄色固形物として得た。

5.11. ３−〔（2,4−ジメチル−３−エトキシカルボニ
ルピロール−５−イル）メチレン〕−２−インドリノン
（SU5408）の合成エタノール3mL中の、オキシインドール134.0mg、４−
エトキシカルボニル−3,5−ジメチルピロール−２−カ
ルボキシアルデヒド234.3mg、およびピペリジン３滴か
らなる反応混合物を90℃で３時間攪拌した。冷却後、沈
殿を濾過し、冷エタノールで洗い、つぎに乾燥して標記
化合物244.6mg（79％）を黄色固形物として得た。

5.12. ３−［（2,4−ジメチルピロール−５−イル）メ
チレン］−２−インドリノン（SU5416）の合成エタノール2mL中の、オキシインドール134.0mg、3,5
−ジメチルピロール−２−カルボキシアルデヒド147.8m
g、およびピペリジン３滴からなる反応混合物を90℃で
３時間攪拌した。冷却後、沈殿を濾過し、冷エタノール
で洗い、つぎに乾燥して標記化合物136.7mg（57％）を
黄色固形物として得た。

5.13. ３−〔（２−メチルメルカプトチエン−５−イ
ル）メチレン〕−２−インドリノン（SU5419）の合成エタノール2mL中の、オキシインドール134.0mg、５−
メチルメルカプトチオフェン−２−カルボキシアルデヒ
ド189.9mg、およびピペリジン３滴からなる反応混合物
を90℃で３時間攪拌した。冷却後、沈殿を濾過し、冷エ
タノールで洗い、つぎに乾燥して標記化合物246.6mg（9
0％）を橙色固形物として得た。

5.14. ３−〔（２−メチルチエン−５−イル）メチレ
ン〕−２−インドリノン（SU5424）の合成エタノール2mL中の、オキシインドール134.0mg、５−
メチルチオフェン−２−カルボキシアルデヒド151.42m
g、およびピペリジン３滴からなる反応混合物90℃で３
時間攪拌した。冷却後、沈殿を濾過し、冷エタノールで
洗い、つぎに乾燥して標記化合物237.8mg（99％）を黄
色固形物として得た。

5.15. ３−〔（３−メチルチエン−２−イル）メチレ
ン〕−２−インドリノン（SU5427）の合成エタノール2mL中の、オキシインドール134.0mg、３−
メチルチオフェン−２−カルボキシアルデヒド151.4m
g、およびピペリジン３滴からなる反応混合物を90℃で
３時間攪拌した。冷却後、沈殿を濾過し、冷エタノール
で洗い、つぎに乾燥して標記化合物157.8mg（65％）を
黄色固形物として得た。

5.16. ３−（2,5−ジメトキシベンジリデニル）−２−
インドリノンの合成（SU4793）３−（2,5−ジメトキシベンジリデニル）−２−イン
ドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.17. ３−（2,3−ジメトキシベンジリデニル）−２−
インドリノンの合成（SU4794）３−（2,3−ジメトキシベンジリデニル）−２−イン
ドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.18. ３−（３−ブロモ−６−メトキシベンジリデニ
ル）−２−インドリノンの合成（SU4796）３−（３−ブロモ−６−メトキシベンジリデニル）−
２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.19. ３−［４−（４−ｔ−ブチルカルボニル−ピペ
ラジン−１−イル）ベンジリデニル］−２−インドリノ
ンの合成（SU5393）３−［４−（４−ｔ−ブチルカルボニル−ピペラジン
−１−イル）ベンジリデニル］−２−インドリノンを方
法Ｂに従って合成する。

5.20. ３−［（フラン−２−イル）メチレン］−２−
インドリノンの合成（SU4798）３−［（フラン−２−イル）メチレン］−２−インド
リノンを方法Ａに従って合成する。

5.21. ３−（４−アセトアミドベンジリデニル）−２
−インドリノンの合成（SU4799）３−（４−アセトアミドベンジリデニル）−２−イン
ドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.22. ３−（２−クロロ−４−ドロキシベンジリデニ
ル）−２−インドリノンの合成（SU4932）３−（２−クロロ−４−ヒドロキシベンジリデニル）
−２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.23. ３−（４−ブロモベンジリデニル）−２−イン
ドリノンの合成（SU4942）３−（４−ブロモベンジリデニル）−２−インドリノ
ンを方法Ａに従って合成する。

5.24. ３−（４−アセチルアミノベンジリデニル）−
２−インドリノンの合成（SU4944）３−（４−アセチルアミノベンジリデニル）−２−イ
ンドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.25. ３−（２−メトキシベンジリデニル）−２−イ
ンドリノンの合成（SU4949）３−（２−メトキシベンジリデニル）−２−インドリ
ノンを方法Ａに従って合成する。

5.26. ３−（４−ジメチルアミノベンジリデニル）−
１−メチル−２−インドリノンの合成（SU4952）３−（４−ジメチルアミノベンジリデニル）−１−メ
チル−２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.27. ３−（４−ジメチルアミノベンジリデニル）−
２−インドリノンの合成（SU4312）３−（４−ジメチルアミノベンジリデニル）−２−イ
ンドリノンは、Maybridge Chemical Co.Ltd.から入手で
きる。

5.28. ３−（４−ブロモベンジリデニル）−１−メチ
ル−２−インドリノンの合成（SU4956）３−（４−ブロモベンジリデニル）−１−メチル−２
−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.29. ５−クロロ−３−（４−ジメチルアミノベンジ
リデニル）−２−インドリノンの合成（SU4967）５−クロロ−３−（４−ジメチルアミノベンジリデニ
ル）−２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.30. ３−（４−ブロモベンジリデニル）−５−クロ
ロ−２−インドリノンの合成（SU4972）３−（４−ブロモベンジリデニル）−５−クロロ−２
−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.31. ３−（４−ジエチルアミノベンジリデニル）−
２−インドリノンの合成（SU4978）３−（４−ジエチルアミノベンジリデニル）−２−イ
ンドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.32. ３−（４−ジ−ｎ−ブチルアミノベンジリデニ
ル）−２−インドリノンの合成（SU4979）３−（４−ジ−ｎ−ブチルアミノベンジリデニル）−
２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.33. １−メチル−３−［４−（モルホリン−４−イ
ル）ベンジリデニル］−２−インドリノンの合成（SU49
82）１−メチル−３−［４−（モルホリン−４−イル）ベ
ンジリデニル］−２−インドリノンを方法Ｂに従って合
成する。

5.34. ５−クロロ−３−（４−（モルホリン−４−イ
ル）ベンジリデニル）−２−インドリノンの合成（SU49
83）５−クロロ−３−（４−（モルホリン−４−イル）ベ
ンジリデニル）−２−インドリノンを方法Ｂに従って合
成する。

5.35. ３−（3,4−ジクロロベンジリデニル）−２−イ
ンドリノンの合成（SU5201）３−（3,4−ジクロロベンジリデニル）−２−インド
リノンを方法Ａに従って合成する。

5.36. ３−（２−エトキシベンジリデニル）−２−イ
ンドリノンの合成（SU5204）３−（２−エトキシベンジリデニル）−２−インドリ
ノンを方法Ａに従って合成する。

5.37. ３−（４−フルオロベンジリデニル）−２−イ
ンドリノンの合成（SU5205）３−（４−フルオロベンジリデニル）−２−インドリ
ノンを方法Ａに従って合成する。

5.38. ３−［（チエン−２−イル）メチレン］−２−
インドリノンの合成（SU5208）３−［（チエン−２−イル）メチレン］−２−インド
リノンを方法Ａに従って合成する。

5.39. ３−（２−メトキシベンジリデニル）−２−イ
ンドリノンの合成（SU5214）３−（２−メトキシベンジリデニル）−２−インドリ
ノンを方法Ａに従って合成する。

5.40. ３−［２−［3,5−ジ−（トリフルオロメチル）
フェニル］フラン−５−イル］メチレン］−２−インド
リノンの合成（SU5217）３−［２−［3,5−ジ−（トリフルオロメチル）フェ
ニル］フラン−５−イル］メチレン］−２−インドリノ
ンを方法Ａに従って合成する。

5.41. 2,6−ジ−（ジメチルアミノ）−3,5−ジ−
［（インドリン−２−オン−３−イリデニル）メチル］
−フェニルシアニドの合成（SU5218） 2,6−ジ−（ジメチルアミノ）−3,5−ジ−［（インド
リン−２−オン−３−イリデニル）メチル］−フェニル
シアニドを方法Ａに従って合成する。

5.42. ３−［（３−（２−カルボキシエチル）−４−
メチルピロール−５−イル）メチレン］−２−インドリ
ノンの合成（SU5402）３−［（３−（２−カルボキシエチル）−４−メチル
ピロール−５−イル）メチレン］−２−インドリノンを
方法Ａに従って合成する。

5.43. ３−［（3,4−ジブロモ−５−メチルピロール−
２−イル）メチレン］−２−インドリノンの合成（SU54
03）３−［（3,4−ジブロモ−５−メチルピロール−２−
イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ｂに従って
合成する。

5.44. ３−［（3,4−ジメチル−２−ホルミルピロール
−５−イル）メチレン］−２−インドリノンの合成（SU
5405）３−［（3,4−ジメチル−２−ホルミルピロール−５
−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａに従っ
て合成する。

5.45. ３−｛［４−（２−メトキシカルボニルエチ
ル）−３−メチルピロール−５−イル］メチレン｝−２
−インドリノンの合成（SU5407）３−｛［４−（２−メトキシカルボニルエチル）−３
−メチルピロール−５−イル］メチレン｝−２−インド
リノンを方法Ａに従って合成する。

5.46. ３−［（２−ヨードフラン−５−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンの合成（SU5409）３−［（２−ヨードフラン−５−イル）メチレン］−
２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.47. ３−［（３−エトキシカルボニル−２−メチル
フラン−５−イル）メチレン］−２−インドリノンの合
成（SU5410）３−［（３−エトキシカルボニル−２−メチルフラン
−５−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａに
従って合成する。

5.48. ３−［（３−ブロモチエン−２−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンの合成（SU5418）３−［（３−ブロモチエン−２−イル）メチレン］−
２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.49. ３−［（２−クロロチエン−５−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンの合成（SU5420）３−［（２−クロロチエン−５−イル）メチレン］−
２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.50. ３−［（2,3−ジメチルフラン−５−イル）メチ
レン］−２−インドリノンの合成（SU5421）３−［（2,3−ジメチルフラン−５−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.51. ３−［（５−ニトロチエン−２−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンの合成（SU5422）３−［（５−ニトロチエン−２−イル）メチレン］−
２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.52. ３−［（２−カルボキシチエン−５−イル）メ
チレン］−２−インドリノンの合成（SU5423）３−［（２−カルボキシチエン−５−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.53. ３−［（２−ブロモチエン−５−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンの合成（SU5425）３−［（２−ブロモチエン−５−イル）メチレン］−
２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.54. ３−［（４−ブロモチエン−２−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンの合成（SU5426）３−［（４−ブロモチエン−２−イル）メチレン］−
２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.55. ３−［［２−スルホニルフラン−５−イル）メ
チレン］−２−インドリノンナトリウム塩の合成（SU54
28）３−［（２−スルホニルフラン−５−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンナトリウム塩を方法Ａに従って
合成する。

5.56. ３−［（フラン−２−イル）メチレン］−２−
インドリノンの合成（SU5429）３−［（フラン−２−イル）メチレン］−２−インド
リノンを方法Ａに従って合成する。

5.57. ３−［（２−メチルフラン−５−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンの合成（SU5430）３−［（２−メチルフラン−５−イル）メチレン］−
２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.58. ３−［（２−エチルフラン−５−イル）メチレ
ン−２−インドリノンの合成（SU5431）３−［（２−エチルフラン−５−イル）メチレン−２
−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.59. ３−［（２−ニトロフラン−５−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンの合成（SU5432）３−［（２−ニトロフラン−５−イル）メチレン］−
２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.60. ３−［（５−ブロモフラン−２−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンの合成（SU5438）３−［（５−ブロモフラン−２−イル）メチレン］−
２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.61. ３−［（２−エチルチエン−５−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンの合成（SU5451）３−［（２−エチルチエン−５−イル）メチレン］−
２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.62. ３−［（4,5−ジメチル−３−エチルピロール−
２−イル）メチレン］−２−インドリノンの合成（SU54
53）３−［（4,5−ジメチル−３−エチルピロール−２−
イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａに従って
合成する。

5.63. ３−［（５−エトキシカルボニル−４−エトキ
シカルボニルエチル−３−エトキシカルボニルメチルピ
ロール−２−イル）メチレン］−２−インドリノンの合
成（SU5454）３−［（５−エトキシカルボニル−４−エトキシカル
ボニルエチル−３−エトキシカルボニルメチルピロール
−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａに
従って合成する。

5.64. ３−［（５−カルボキシ−３−エチル−４−メ
チルピロール−２−イル）メチレン］−２−インドリノ
ンの合成（SU5455）３−［（５−カルボキシ−３−エチル−４−メチルピ
ロール−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方
法Ａに従って合成する。

5.65. ３−［（3,5−ジヨード−４−メチルピロール−
２−イル）メチレン］−２−インドリノンの合成（SU54
56）３−［（3,5−ジヨード−４−メチルピロール−２−
イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａに従って
合成する。

5.66. ３−［（５−クロロ−３−メトキシカルボニル
−４−メトキシカルボニルメチルピロール−２−イル）
メチレン］−２−インドリノンの合成（SU5459）３−［（５−クロロ−３−メトキシカルボニル−４−
メトキシカルボニルメチルピロール−２−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.67. ３−［（３−アセチル−５−エトキシカルボニ
ル−４−メチルピロール−２−イル）メチレン］−２−
インドリノンの合成（SU5460）３−［（３−アセチル−５−エトキシカルボニル−４
−メチルピロール−２−イル）メチレン］−２−インド
リノンを方法Ａに従って合成する。

5.68. ３−｛［１−（3,5−ジクロロフェニル）ピロー
ル−２−イル］メチレン｝−２−インドリノンの合成
（SU5461）３−｛［１−（3,5−ジクロロフェニル）ピロール−
２−イル］メチレン｝−２−インドリノンを方法Ａに従
って合成する。

5.69. ３−［１−（４−クロロフェニル）ピロール−
２−イル）メチレン］−２−インドリノンの合成（SU54
62）３−［１−（４−クロロフェニル）ピロール−２−イ
ル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａに従って合
成する。

5.70. ３−［（４−エトキシカルボニル−３−メチ
ル）ピロール−２−イル）メチレン］−２−インドリノ
ンの合成（SU5463）３−［（４−エトキシカルボニル−３−メチル）ピロ
ール−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法
Ａに従って合成する。

5.71. ３−［（１−メチルピロール−２−イル）メチ
レン］−２−インドリノンの合成（SU5464）３−［（１−メチルピロール−２−イル）メチレン］
−２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.72. ３−［（５−エトキシカルボニル−３−エトキ
シカルボニルエチル−４−エトキシカルボニルメチルピ
ロール−２−イル）メチレン］−２−インドリノンの合
成（SU5465）３−［（５−エトキシカルボニル−３−エトキシカル
ボニルエチル−４−エトキシカルボニルメチルピロール
−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａに
従って合成する。

5.73. ３−［４−（ピロリジン−１−イル）ベンジリ
デニル］−２−インドリノンの合成（SU5466）３−［４−（ピロリジン−１−イル）ベンジリデニ
ル］−２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.74. ３−［（５−メチルイミダゾール−２−イル）
メチレン］−２−インドリノンの合成（SU5468）３−［（５−メチルイミダゾール−２−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.75. ３−［（５−メチルチアゾール−２−イル）メ
チレン］−２−インドリノンの合成（SU5469）３−［（５−メチルチアゾール−２−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.76. ３−［（３−メチルピラゾール−５−イル）メ
チレン］−２−インドリノンの合成（SU5472）３−［（３−メチルピラゾール−５−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.77. ３−［（イミダゾール−４−イル）メチレン］
−２−インドリノンの合成（SU5473）３−［（イミダゾール−４−イル）メチレン］−２−
インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.78. ３−［（４−クロロピラゾール−３−イル）メ
チレン］−２−インドリノンの合成（SU5474）３−［（４−クロロピラゾール−３−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.79. ３−［（４−ブロモ−１−（４−クロロベンジ
ル）ピラゾール−５−イル）メチレン］−２−インドリ
ノンの合成（SU5475）３−［（４−ブロモ−１−（４−クロロベンジル）ピ
ラゾール−５−イル）メチレン］−２−インドリノンを
方法Ａに従って合成する。

5.80. ３−［（４−クロロ−１−メチルピラゾール−
３−イル）メチレン］−２−インドリノンの合成（SU54
76）３−［（４−クロロ−１−メチルピラゾール−３−イ
ル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａに従って合
成する。

5.81. ３−［（４−エチル−3,5−ジメチルピロール−
２−イル）メチレン］−２−インドリノンの合成（SU54
77）３−［（４−エチル−3,5−ジメチルピロール−２−
イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ｂに従って
合成する。

5.82. ３−［（５−エチルピロール−２−イル）メチ
レン］−２−インドリノンの合成（SU5478）３−［（５−エチルピロール−２−イル）メチレン］
−２−インドリノンを方法Ｂに従って合成する。

5.83. ３−［（3,5−ジメチル−４−（プロペン−２−
イル）ピロール−２−イル）メチレン］−２−インドリ
ノンの合成（SU5479）３−［（3,5−ジメチル−４−（プロペン−２−イ
ル）ピロール−２−イル）メチレン］−２−インドリノ
ンを方法Ｂに従って合成する。

5.84. 5,6−ジメトキシル−３−［2,3−ジメトキシベ
ンジリデニル］−２−インドリノンの合成（SU5495） 5,6−ジメトキシル−３−［2,3−ジメトキシベンジリ
デニル］−２−インドリノンを方法Ａに従って合成す
る。

5.85. ３−［2,4,6−トリメトキシベンジリデニル］−
２−インドリノンの合成（SU5607）３−［2,4,6−トリメトキシベンジリデニル］−２−
インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.86. ５−クロロ−３−［（ピロール−２−イル）メ
チレン］−２−インドリノンの合成（SU5612）５−クロロ−３−［（ピロール−２−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.87. ５−クロロ−３−［（３−メチルピロール−２
−イル）メチレン］−２−インドリノンの合成（SU561
3）５−クロロ−３−［（３−メチルピロール−２−イ
ル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａに従って合
成する。

5.88. ３−（４−イソプロピルベンジリデニル）−２
−インドリノンの合成（SU4313）３−（４−イソプロピルベンジリデニル）−２−イン
ドリノンは、Maybridge Chemical Co.Ltd.から入手でき
る。

5.89. ５−クロロ−３−［（3,5−ジメチルピロール−
２−イル）メチレン］−２−インドリノンの合成（SU56
14）５−クロロ−３−［（3,5−ジメチルピロール−２−
イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａに従って
合成する。

5.90. ３−［（ピロール−２−イル）メチレン］−２
−インドリノンの合成（SU4314）３−［（ピロール−２−イル）メチレン］−２−イン
ドリノンは、Maybridge Chemical Co.Ltd.から入手でき
る。

5.91. ５−クロロ−３−［（インドール−３−イル）
メチレン］−２−インドリノンの合成（SU5615）５−クロロ−３−［（インドール−３−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.92. ５−クロロ−３−［（チエン−２−イル）メチ
レン］−２−インドリノンの合成（SU5616）５−クロロ−３−［（チエン−２−イル）メチレン］
−２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.93. ５−クロロ−３−［（３−メチルチエン−２−
イル）メチレン］−２−インドリノンの合成（SU5617）５−クロロ−３−［（３−メチルチエン−２−イル）
メチレン］−２−インドリノンを方法Ａに従って合成す
る。

5.94. ５−クロロ−３−［（５−メチルチエン−２−
イル）メチレン］−２−インドリノンの合成（SU5618）５−クロロ−３−［（５−メチルチエン−２−イル）
メチレン］−２−インドリノンを方法Ａに従って合成す
る。

5.95 ５−クロロ−３−［（５−エチルチエン−２−イ
ル）メチレン］−２−インドリノンの合成（SU5619）５−クロロ−３−［（５−エチルチエン−２−イル）
メチレン］−２−インドリノンを方法Ａに従って合成す
る。

5.96. ５−クロロ−３−［（５−メチルメルカプトチ
エン−２−イル）メチレン］−２−インドリノンの合成
（SU5620）５−クロロ−３−［（５−メチルメルカプトチエン−
２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａに従
って合成する。

5.97. ５−クロロ−３−［（イミダゾール−２−イ
ル）メチレン］−２−インドリノンの合成（SU5621）５−クロロ−３−［（イミダゾール−２−イル）メチ
レン］−２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.98. ３−［（2,4−ジメトキシ−６−メチルベンジリ
デニル］−２−インドリノンの合成（SU5623）３−［2,4−ジメトキシ−６−メチルベンジリデニ
ル］−２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.99. ５−ニトロ−３−［（ピロール−２−イル）メ
チレン］−２−インドリノンの合成（SU5624）５−ニトロ−３−［（ピロール−２−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.100. ３−［（３−メチルピロール−２−イル）メチ
レン］−５−ニトロ−２−インドリノンの合成（SU562
5）３−［（３−メチルピロール−２−イル）メチレン］
−５−ニトロ−２−インドリノンを方法Ａに従って合成
する。

5.101. ３−［（3,5−ジメチルピロール−２−イル）
メチレン］−５−ニトロ−２−インドリノンの合成（SU
5626）３−［（3,5−ジメチルピロール−２−イル）メチレ
ン］−５−ニトロ−２−インドリノンを方法Ａに従って
合成する。

5.102. ３−［（インドール−３−イル）メチレン］−
５−ニトロ−２−インドリノンの合成（SU5627）３−［（インドール−３−イル）メチレン］−５−ニ
トロ−２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.103. ５−ニトロ−３−［（チエン−２−イル）メチ
レン］−２−インドリノンの合成（SU5628）５−ニトロ−３−［（チエン−２−イル）メチレン］
−２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.104. ３−［（３−メチルチエン−２−イル）メチレ
ン］−５−ニトロ−２−インドリノンの合成（SU5629）３−［（３−メチルチエン−２−イル）メチレン］−
５−ニトロ−２−インドリノンを方法Ａに従って合成す
る。

5.105. ３−［（５−メチルチエン−２−イル）メチレ
ン］−５−ニトロ−２−インドリノンの合成（SU5630）３−［（５−メチルチエン−２−イル）メチレン］−
５−ニトロ−２−インドリノンを方法Ａに従って合成す
る。

5.106. ３−［（５−エチルチエン−２−イル）メチレ
ン］−５−ニトロ−２−インドリノンの合成（SU5631）３−［（５−エチルチエン−２−イル）メチレン］−
５−ニトロ−２−インドリノンを方法Ａに従って合成す
る。

5.107. ３−［（５−メチルメルカプトチエン−２−イ
ル）メチレン］−５−ニトロ−２−インドリノンの合成
（SU5632）３−［（５−メチルメルカプトチエン−２−イル）メ
チレン］−５−ニトロ−２−インドリノンを方法Ａに従
って合成する。

5.108. ３−［（イミダゾール−２−イル）メチレン］
−５−ニトロ−２−インドリノンの合成（SU5633）３−［（イミダゾール−２−イル）メチレン］−５−
ニトロ−２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.109. ３−［（オキサゾール−２−イル）メチレン］
−２−インドリノンの合成（CS7127）３−［（オキサゾール−２−イル）メチレン］−２−
インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.110. ３−［（オキサゾール−４−イル）メチレン］
−２−インドリノンの合成（CS7128）３−［（オキサゾール−４−イル）メチレン］−２−
インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.111. ３−［（オキサゾール−５−イル）メチレン］
−２−インドリノンの合成（CS7129）３−［（オキサゾール−５−イル）メチレン］−２−
インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.112. ３−［（チアゾール−２−イル）メチレン］−
２−インドリノンの合成（CS7130）３−［（チアゾール−２−イル）メチレン］−２−イ
ンドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.113. ３−［（チアゾール−４−イル）メチレン］−
２−インドリノンの合成（CS7131）３−［（チアゾール−４−イル）メチレン］−２−イ
ンドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.114. ３−［（チアゾール−５−イル）メチレン］−
２−インドリノンの合成（CS7132）３−［（チアゾール−５−イル）メチレン］−２−イ
ンドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.115. ３−［（イミダゾール−２−イル）メチレン］
−２−インドリノンの合成（CS7133）３−［（イミダゾール−２−イル）メチレン］−２−
インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.116. ３−［（ピラゾール−３−イル）メチレン］−
２−インドリノンの合成（CS7135）３−［（ピラゾール−３−イル）メチレン］−２−イ
ンドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.117. ３−［（ピラゾール−４−イル）メチレン］−
２−インドリノンの合成（CS7136）３−［（ピラゾール−４−イル）メチレン］−２−イ
ンドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.118. ３−［（イソキサゾール−３−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンの合成（CS7137）３−［（イソキサゾール−３−イル）メチレン］−２
−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.119. ３−［（イソキサゾール−４−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンの合成（CS7138）３−［（イソキサゾール−４−イル）メチレン］−２
−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.120. ３−［（イソキサゾール−５−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンの合成（CS7139）３−［（イソキサゾール−５−イル）メチレン］−２
−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.121. ３−［（イソチアゾール−３−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンの合成（CS7140）３−［（イソチアゾール−３−イル）メチレン］−２
−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.122. ３−［（イソチアゾール−４−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンの合成（CS7141）３−［（イソチアゾール−４−イル）メチレン］−２
−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.123. ３−［（イソチアゾール−５−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンの合成（CS7142）３−［（イソチアゾール−５−イル）メチレン］−２
−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.124. ３−［（1,2,3−トリアゾール−４−イル）メ
チレン］−２−インドリノンの合成（CS7143）３−［（1,2,3−トリアゾール−４−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.125. ３−［（1,3,4−チアジアゾール−２−イル）
メチレン］−２−インドリノンの合成（CS7144）３−［（1,3,4−チアジアゾール−２−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンを方法Ａに従って合成する。

5.126. ３−［（５−フェニル−1,2,4−オキサジアゾ
ール−３−イル）メチレン］−２−インドリノンの合成
（CS7145）３−［（５−フェニル−1,2,4−オキサジアゾール−
３−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａに従
って合成する。

5.127. ３−［（３−フェニル−1,2,4−オキサジアゾ
ール−５−イル）メチレン］−２−インドリノンの合成
（CS7146）３−［（３−フェニル−1,2,4−オキサジアゾール−
５−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａに従
って合成する。

5.128. ３−［（３−フェニル−1,2,5−オキサジアゾ
ール−４−イル）メチレン］−２−インドリノンの合成
（CS7147）３−［（３−フェニル−1,2,5−オキサジアゾール−
４−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａに従
って合成する。

6. 実施例:In Vitro RTKアッセイ以下のin vitroアッセイは、１又はそれ以上のRTKに
対し、本発明の異なる化合物の活性及び効果のレベルを
測定するために使用し得る。同様のアッセイを、当業界
でよく知られた技術を用いて任意のチロシンキナーゼに
ついて同じ方針に沿って計画することができる。

6.1. 固相酵素免疫測定法（ELISA）固相酵素免疫測定法（ELISA）は、チロシンキナーゼ
活性の存在を検出し測定するために使用することができ
る。ELISAは、例えばVoller,et al.,1980,“Enzyme−Li
nked Immunosorbent Assay,"In:Manual of Clinical Im
munology,2d ed.,Rose及びFriedman編,pp359−371,Am.S
oc.of Microbiology,Washigton,D.C.に記載された公知
のプロトコールに従って行ってもよい。

開示されたプロトコールを、特異的RTKについて活性
を測定するために適合させることができる。例えば、特
異的RTKについてのELISA実験を行うための好ましいプロ
トコールは、以下に用意されている。RTKファミリーの
他のメンバー、及び受容体のないチロシンキナーゼに対
する化合物の活性を測定するためにこれらのプロトコー
ルを適合させることは、当業者の範囲内である。

6.1.1. FLK−1 ELISA FLK−１受容体のキナーゼ活性、より詳しくは、FLK−
１受容体に対するプロテインチロシンキナーゼ活性の阻
害又は活性化を測定するためにELISAアッセイを行っ
た。特に、以下のアッセイを行ってFLK−1/NIH3T3細胞
におけるFLK−１受容体のキナーゼ活性を測定した。

材料及び方法材料以下の試薬及び補給物を使用した。

a. Corning 96ウェルELISAプレート（Corningカタログ
番号25805−96）； b. Cappelヤギ抗ウヤギIgG（カタログ番号55641）； c. PBS（Gibcoカタログ番号450−1300EB）； d. TBSW緩衝液（50mM Tris（pH7.2）,150mM NaCl及び
0.1％Tween−20）； e. エタノールアミン原液（10％エタノールアミン（pH
7.0）,4℃で保存）； f. HNTG緩衝液（20mM HEPES緩衝液（pH7.5）,150mM Na
Cl,0.2％Triton X−100,及び10％グリセロール）； g. EDTA（100×原液として0.5M（pH7.0）； h. オルトバナジウム酸ナトリウム（100×原液として
0.5M）； i. ピロリン酸ナトリウム（100×原液として0.2M）； j. NUNC 96ウェルＶ底ポリプロピレンプレート（Appli
ed Scientific カタログ番号AS−72092）； k. NIH3T3 C7＃３細胞（FLK−１発現細胞）； l. 1X高グルコースＬグルタミンを有するDMEM（カタロ
グ番号11965−050）； m. FBS,Gibco（カタログ番号16000−028）； n. Ｌ−グルタミン,Gibco（カタログ番号25030−01
6）； o. VEGF,PeproTech,Inc.（カタログ番号100−20）（Mi
lli−Q dH₂O中に１μg/100μｌの原液として保持し、−
20℃で保存した）； p. アフィニティー精製抗FLK−１抗血清,Enzymology L
ab,Sugen,Inc.; q. ホスホチロシンに特異的なUB40モノクローナル抗
体,Enzymology Lab,Sugen,Inc.（Fendley,et al.,1990,
Cancer Research 50:1550−1558を参照） r. EIA級ヤギ抗マウスIgG−POD（BioRad カタログ番
号172−1011）； s. 2,2−アジノ−ビス−（３−エチルベンズ−チアゾ
リン−６−スルホン酸（ABTS）溶液（100mM クエン酸
（無水）,250mM Na₂HPO₄（pH4.0）,0.5mg/ml ABTS（Sig
ma カタログ番号Ａ−1888）），溶液は、使用まで４℃
で暗所に保存すべきである； t. H₂O₂（30％溶液）（Fisherカタログ番号H325）； u. ABTS/H₂O₂（15ml ABTS溶液,2μl H₂O₂）使用５分前
に調製し、室温で放置した； v. H₂O中0.2M HCl原液； w. ジメチルスルホキシド（100％）（Sigma カタログ
番号Ｄ−8418）；および y. トリプシン−EDTA（Gibco BRL カタログ番号25200
−049）プロトコールアッセイを行うため以下のプロトコールを使用した。

1. 96ウェルのELISAプレートを、0.1M Na₂CO₃（pH9.
6）中、ウェルあたり1.0μｇのCappel抗−ウサギIgG抗
体でコートする。最終容量をウェルあたり150μｌにす
る。４℃で一晩プレートをコートする。プレートは、４
℃で貯蔵した場合は２週間維持することができる。

2. 適当な培養皿により、細胞を、増殖培地（DMEM,2.0
mM L−グルタミンを補給,10％FBS）中で集密状まで37
℃,5％CO₂で増殖させる。

3. トリプシン処理して細胞を回収し、Corning 25850
ポリスチレン性96ウェル丸底細胞プレートに、200μ
ｌの増殖培地中に25,000細胞／ウェルでまく。

4. 細胞を、37℃,5％CO₂で少なくとも１日増殖させ
る。

5. 細胞をＤ−PBS 1Xで洗浄する。

6. 200μl/ウェルの飢餓培地（DMEM,2.0mM L−グルタ
ミン,0.1％FBS）を加え、37℃,5％CO₂で一晩インキュベ
ートする。

7. 飢餓培地を用いて、ポリプロピレン性96ウェルプレ
ート中で化合物／抽出物を1:20に希釈する。対照ウェル
に使用するためジメチルスルホキシドを1:20に希釈す
る。

8. 飢餓培地を96ウェル細胞培養プレートから除去し、
162μｌの新鮮飢餓培地を各ウェルに加える。

9. 1:20に希釈した化合物／抽出物の希釈物（ステップ
７から）18μｌを各ウェルに加え、1:20のジメチルスル
ホキシド希釈物を対照ウェル（＋／− VEGF）に加え、
細胞刺激後の最終希釈を1:200とする。最終ジメチルス
ルホキシドは0.5％である。37℃、５％CO₂でプレートを
２時間インキュベートする。

10. 液体を除去するための反転プレートにより、ELISA
プレートから未結合の抗体を除去する。TBSW＋0.5％エ
タノールアミン,pH7.0で３回洗浄する。過剰の液及び泡
を除去するため、ペーパータオル上でプレートを軽くた
たく。

11. TBSW＋0.5％エタノールアミン,pH7.0、150μl/ウ
ェルでプレートを固定化する。マイクロタイタープレー
トシェーカー上で振盪しながら、プレートを30分インキ
ュベートする。

12. ステップ10に記載したようにして、プレートを３
回洗浄する。

13. アフィニティー精製した抗−FLU−１ポリクローナ
ルウサギ抗血清の0.5μg/ウェルを加える。TBSW＋0.5％
エタノールアミン pH7.0で最終容量を150μl/ウェルに
する。プレートを振盪しながら30分インキュベートす
る。

14. 180μｌの飢餓培地を細胞に加え、10.0mMのオルト
バナジウム酸ナトリウム及び500ng/mlのVEGF（ウェルあ
たり、1.0mMのオルトバナジウム酸ナトリウム及び50ng/
mlのVEGFの最終濃度となる）を用いて、細胞を37℃で、
５％CO₂で８分刺激する。陰性対照ウェルは、飢餓培地
のみを加える。

15. ８分後、培地を細胞から除去し、200μl/ウェルの
PBSで１回洗浄する。

16. 150μl/ウェルのHNTG中、細胞を振盪しながら室温
で５分溶解する。HNTGの処方は、オルトバナジウム酸ナ
トリウム、ピロリン酸ナトリウム及びEDTAを含む。

17. ステップ10に記載したようにしてELISAプレートを
３回洗浄する。

18. 細胞プレートから細胞溶解物をELISAプレートに移
し、振盪しながら２時間インキュベートする。細胞溶解
物を移すため、ウェルを掻きながらピペッティングす
る。

19. ステップ10に記載したようにしてプレートを３回
洗浄する。

20. TBSW＋0.5％エタノールアミン中、0.02μg/ウェル
のUB40を用いてELISAプレートをインキュベートする。
最終容量を150μl/ウェルにし、振盪しながら30分イン
キュベートする。

21. ステップ10に記載したようにしてプレートを３回
洗浄する。

22. TBSW＋0.5％エタノールアミン,pH7.0中、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼを結合させた、1:10,000に希釈のEI
A級ヤギ抗−マウスIgGでELISAプレートをインキュベー
トする。最終容量を150μl/ウェルにし、振盪しながら3
0分インキュベートする。

23. ステップ10に記載したようにしてプレートを洗浄
する。

24. 100μｌのABTS/H₂O₂溶液をウェルに加え、振盪し
ながら10分インキュベートする。

25. 最終0.1M HClとなるように100μｌの0.2M HClを加
え、発色反応を停止させる。室温で１分振盪する。ゆっ
くりとした空気流で泡を除き、ELISAプレートリーダー
により410nmでELISAプレートを読み取る。

6.1.2 HER−2 ELISA アッセイ 1:全細胞中のEGF受容体−HER2キメラ受容体
アッセイ EGFR−NIH3T3細胞の細胞全体のHER2キナーゼ活性を下
記の方法で測定した。

材料と試薬下記の材料と試薬をアッセイに用いた。

a. EGF:ストック濃度＝16.5 ILM;EGF 201,東洋紡，日
本 b. 05−101（UBI）（EGFRの細胞外ドメインを認識する
モノクローナル抗体） c. 抗ホスホチロシン抗体（抗Ptyr）（ポリクローナ
ル）（前述のFendleyら参照） d. 検出用抗体：ヤギ抗ウサギ抗体IgGと西洋わさびペ
ルオキシダーゼとのコンジュゲート、TAGO,Inc.,Burlin
game,CA. e. TBST緩衝液： Tris−HCl,pH7.2 50mM NaCl 150mM Triton X−100 0.1 f. HNTG 5Xストック： HEPES 0.1M NaCl 0.75M グリセロール 50％ Triton X−100 1.0％ g. ABTSストック：クエン酸 100mM Na₂HPO₄ 250mM 濃塩酸 0.5pM ABTS^＊ 0.5mg/ml ＊（2,2′−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリ
ンスルホン酸））。本溶液は使用時まで４℃で暗所に保
管。

h. ストック試薬類： EDTA 100mM pH7.0 Na₃VO₄ 0.5M Na₄（P₂O₇） 0.2M 試験方法下記のプロトコールを用いた： A. ELISAプレートのプレコート 1. ELISAプレート（Corning,96ウエル、カタログ＃258
05−96）に１ウエルあたり0.5gの05−101抗体（PBS中）
を、最終容量が100μl/ウエルとなるようにコートし、
４℃で一晩保存する。このコートされたプレートは４℃
で保存すれば10日間まで良好である。

2. 使用日にコーティング用緩衝液を取り除き、100μ
ｌのブロッキング用緩衝液（PBS中に５％Carnation Ins
tant Non−Fat Dry Milkを含有）と置き換える。プレー
トを振盪させながら室温（約23℃から25℃）で30分間イ
ンキュベートする。使用直前にブロッキング用緩衝液を
取り除き、プレートをTBST緩衝液で４回洗う。

B. 細胞の接種 1. EGFRの細胞外ドメイン及びHER2キナーゼの細胞外ド
メインを含むキメラ受容体を過剰に発現しているNIH3T3
株をこのアッセイに用いうる。

2. 80−90％集密のディッシュを本実験用に選択する。
細胞をトリプシン処理し、10％ウシ胎児血清を添加する
ことにより反応を停止する。細胞をDMEM培地（10％CS D
MEM培地）中に懸濁し、室温で５分間、1500rpmで一度遠
心する。

3. 接種用培地（DMEM,0.5％ウシ血清）中に細胞を再懸
濁し、トリパンブルーを用いて細胞数を計測する。生細
胞が90％以上のものが本実験に使用可能である。DMEM培
地（0.5％ウシ血清）中の細胞を、１ウエルあたり10,00
0個、１ウエルあたり100μｌで96ウエルのマイクロタイ
タープレートに接種する。接種した細胞を５％CO₂、37
℃で約40時間インキュベートする。

C. アッセイ方法 1. 接種した細胞に汚染がないか倒立顕微鏡でチェック
する。薬剤のストック（DMSO中に10mg/ml含有）をDMEM
培地で1:10に希釈し、51をTBSTウエルに移し、その結
果、薬剤の最終希釈が1:200、DMSOの最終濃度が１％と
なる。対照のウエルにはDMSOのみを入れる。５％CO₂,37
℃で２時間インキュベートする。

2. EGFリガンドの調製：ストックEGFをDMEMで希釈し、
10μｌの希釈EGF（1:12希釈）を移す際に最終濃度が100
nMとなるようにする。

3. １ウエルあたり100μｌを用いるのに十分な量の新
鮮なHNTG^＊を調製し、氷上に置く。

HNTG^＊（10ml）： HNTGストック 2.0ml milli−Q H₂O 7.3ml EDTA,100mM,pH7.0 0.5ml Na₃VO₄,0.5M 0.1ml Na₄（P₂O₇）,0.2M 0.1ml 4. 薬剤と120分間インキュベートした後、調製後のSGF
リガンドを１ウエルあたり10μｌ、終濃度100nMとなる
ように細胞に加える。対照のウエルにはDMEMのみを加え
る。室温で５分間振盪しつつインキュベートする。

5. 薬剤、EGF及びDMEMの除去。PBSで二度細胞を洗浄す
る。HNTG^＊を１ウエルあたり100μｌ、細胞に加える。
氷上に５分間置く。一方、上述の方法で他のELISAプレ
ートからブロッキング用緩衝液を取り除き、TBSTで洗
う。

6. マイクロピペッターにしっかり取り付けたピペット
チップでプレートから細胞を掻き取り、吸引排出を繰り
返すことにより細胞をホモゲナイズし、HNTG溶菌用緩衝
液に入れる。溶解物をELISAプレート（コート、ブロッ
ク及び洗浄済のもの）に入れる。室温で振盪しつつ１時
間インキュベートする。

7. 溶解物を除去し、TBSTで４回洗う。抗Ptyr抗体（新
たに希釈したもの）をELISAプレートに１ウエルあたり1
00μｌ移す。抗Ptyr抗血清（TBSTで1:3000に希釈）の存
在下で振盪しつつ室温で30分間インキュベートする。

8. 抗Ptyr抗体を除去し、TBSTで４回洗う。TAGOの抗ウ
サギIgG抗体（新たに希釈したもの）をELISAプレートに
１ウエルあたり100μｌ移す。室温で振盪しつつ30分間
インキュベートする（抗ウサギIgG抗体:TBSTで1:3000に
希釈）。

9. TAGOの検出用抗体を除去し、TBSTで４回洗う。新た
に調製したABTS/H₂O₂溶液をELISAプレートに１ウエルあ
たり100μｌ移す。室温で振盪しつつ20分間インキュベ
ートする（ABTS/H₂O₂溶液:10mlのABTSストック中に30％
H₂O₂を1.0μｌ含有する）。

10. 5N H₂SO₄（任意に選択）を50μｌ添加して反応を
停止させ、410nmのO.D.を測定する。

11. ホスホチロシンシグナルの最大値は陽性対照の値
から陰性対照の値を差し引くことによって求める。抽出
物を含有するウエルのホスホチロシン含量の阻害率は陰
性対照の値を差し引いてから求める。

アッセイ 2:HER−２−BT474 ELISA 細胞全体でのHER2活性を測定するために第二のアッセ
イを行いうる。そのアッセイは下記のように行われる。

材料と試薬類次の材料と試薬類を用いた。

a. BT−474（ATCC HBT20）,HER2キナーゼを高レベルで
発現しているヒト乳ガン細胞系統 b. RPMI＋10％FBS＋GMS−Ｇ（GIBCO supplement）＋グ
ルタミンを含む増殖用培地を、５％CO₂,37℃のインキュ
ベーターでBT−474を増殖させるために用いる。

c. 抗HER2モノクローナル抗体 d. Ｄ−PBS: KH₂HPO₄ 0.20g/l 10（GIBCO,310−4190AJ） K₂HPO₄ 2.16g/l KCl 0.20g/l NaCl 8.00g/l（pH7.2） e. ブロッキング用緩衝液:TBSTにミルク（Carnation I
nstant Non−Fat Dry Milk）を５％添加。

f. TBST緩衝液： Tris−HCl 50mM NaCl 150mM（pH7.2,HCl 10N） Triton X−100 0.1％ TBS（10X）のストック溶液を調製し、Triton X−100
は希釈時に緩衝液に添加する。

g. HNTG緩衝液（5X）： HEPES 0.1M NaCl 750mM（pH7.2,HCl 1N）グリセロール 50％ Triton X−100 1.0％ストック溶液（5X）を調製し、４℃に保存する。

h. EDTA−HCl:0.5M,pH7.0（10N HCl）を500Xのストッ
クとして調製 i. Na₃VO₄:0.5Mを100Xのストックとし、アリコートを
−80℃で保存する。

j. Na₄（P₂O₇）:0.2Mを100Xのストックとして調製 k. 抗ホスホチロシンポリクローナル抗血清 l. ヤギ抗ウサギ抗体と西洋わさびペルオキシダーゼ
（POD）とのコンジュゲート（検出用抗体）、TAGO（カ
タログNo.4520;Lot No.1802）:TAGO Inc.,Burlingame,C
A. m. ABTS溶液：クエン酸 100mM Na₂HPO₄ 250mM（pH4.0,1N HCl） ABTS 0.5mg/ml ABTSは2,2′−アジノビス（３−エチルベンズチアゾ
リンスルホン酸）。本アッセイ用としてはABTS溶液は４
℃で暗所に保管しなければならない。ABTS溶液が緑色に
変色した場合は廃棄しなければならない。

n. 過酸化水素:30％溶液を４℃で暗所に保管する。

試験方法下記の全ステップは特に断らない限り室温で無菌的に
行う。ELISAプレートの洗浄は、全て、蒸留水で三度、T
BSTで一度すすぐことにより行う。

A. 細胞の接種 1. 組織培養用ディッシュ（Corning 25020−100）でBT
474細胞を80−90％集密となるまで増殖させ、トリプシ
ン−EDTA（0.25％,GIBCO）を用いて細胞を集める。

2. 新鮮培地に細胞を再懸濁し、96ウエルの組織培養用
プレート（Corning 25806−96）に１ウエルあたり25,00
0−50,000の細胞数（100μl/ウエル）となるように移
す。その細胞を５％CO₂,37℃で一晩インキュベートす
る。

B. ELISAプレートのコーティングとブロッキング 1. ELISAプレート（Corning 25805−96）を１ウエルあ
たり0.5μｇ（150μｌのPBS中）の抗HER2抗体と４℃で
一晩置くことによりコートし、パラフィルムで密封す
る。抗体をコートしたプレートは４℃に保存すれば２週
間まで使用可能である。

2. 使用日にコーティング溶液を除去し、200μｌのブ
ロッキング用緩衝液と置き換え、プレートを振盪し、ブ
ロッキング用緩衝液を除去し、溶解物添加の直前にプレ
ートを洗う。

C. アッセイ方法 1. 薬剤を無血清条件下で試験する。薬剤添加前に古い
培地を無血清RPMI（90μl/ウエル）に置き換える。

2. 薬剤ストック（100％DMSO中）をRPMIで1:10に希釈
し、この溶液を１ウエルあたり10μｌで細胞の入ったウ
エルに添加し、薬剤をDMSOの終濃度として１％となるよ
うにする。５％CO₂,37℃でインキュベートする。

3. 新鮮細胞溶解用緩衝液の調製（HNTG^＊） 5XHNTG ２ ml EDTA 0.2ml Na₃VO₄ 0.1ml Na₄P₂O₇ 0.1ml H₂O 7.3ml 4. 薬剤を２時間プレインキュベーションした後、プレ
ートから溶液を全て取り除き、HNTG^＊（100μl/ウエ
ル）を細胞に移し、10分間振盪する。

5. 12チャンネルのピペットを用いてプレートから細胞
を掻き取り、吸引と排出を繰り返して、溶解物をホモゲ
ナイズする。溶解物を全てELISAプレートに移し１時間
振盪する。

6. 溶解物を除去し、プレートを洗い、抗Ptyr（TBSTで
1:3,000希釈）を100μl/ウエル添加し、30分間振盪す
る。

7. 抗Ptyrを除去し、プレートを洗浄し、ヤギ抗ウサギ
IgGコンジュゲート抗体（TBSTで1:5,000希釈）を100μl
/ウエル添加し30分間振盪する。

8. 抗ウサギIgG抗体を除去し、プレートを洗い、新鮮A
BTS/H₂O₂（H₂O₂ 1.2μｌを10mlのABTSに加えたもの）を
100l/ウエル、プレートに添加し、発色を開始させる。
この発色は通常20分間を要する。

9. OD 410nmをDynatec MR5000で測定する。

6.1.3. FDGF−R ELISA 全ての細胞培養用培地、グルタミン、及びウシ胎児血
清は特に断らない限りGIBCO Life Technologies（Grand
Island,NY）から購入した。細胞の増殖は全て湿潤な雰
囲気下（90−95％空気と５−10％CO₂の混合、37℃）で
行った。全ての細胞系統は週２回定期的にサブカルチャ
ーし、マイコプラズマはMycotect法（GIBCO）で陰性で
あった。

ELISAアッセイには細胞（U1242,Joseph Schlessinge
r,NYUより入手）を増殖用培地（MEMに10％FBS,NEAA,1mM
NaPyr及び2mM GLNを添加）中で80−90％集密となるま
で増殖させ、96ウエルの組織培養用プレートに１ウエル
あたり25,000−30,000の細胞数（0.5％血清中）となる
よう接種した。0.5％血清含有培地中で一晩インキュベ
ートした後、無血清培地に変え、供試化合物で２時間、
５％CO₂,37℃のインキュベーターで処理した。次いで、
細胞をリガンドで５−10分間刺激し、HNTG（20mM Hepe
s,150mM NaCl,10％グリセロール,5mM EDTA,5mM Na₃VO₄,
0.2％Triton X−100,及び2mM NaPyr）で溶解させた。細
胞溶解物（0.5mg/ウエル,PBS中）を、あらかじめ受容体
特異的抗体がコートされ、TBST（50mM Tris−HCl pH7.
2,150mM NaCl,及び0.1％Triton X−100）に５％ミルク
を含有する液で室温で30分間ブロックされたELISAプレ
ートに移した。溶解物は室温で振盪しつつ１時間インキ
ュベートした。プレートをTBSTで４回洗った後、ポリク
ローナル抗体ホスホチロシン抗体と室温で30分間インキ
ュベートした。過剰の抗ホスホチロシン抗体はTBSTで４
回すすぐことにより除去した。ヤギ抗ウサギIgG抗体をE
LISAプレートに添加して室温で30分間置き、次いでTBST
で４回洗った。ABTS（100mM クエン酸,250mM Na₂HPO₄,
及び0.5mg/ml 2,2′−アジノ−ビス（３−エチルベンズ
チアゾリン−６−スルホン酸））にH₂O₂（30％H₂O₂ 1.2
mlを10mlのABTSに添加）を加えたものをELISAプレート
に添加し、発色を開始させた。410nmの吸光度を、630nm
の吸光度を対照としてABTS添加15−30分後に記録した。

6.1.4. IGF−I ELISA 下記のプロトコールをIGF−Ｉ受容体上のホスホチロ
シンレベルの測定に用いうる。このレベルはIGF−Ｉ受
容体チロシンキナーゼ活性を示している。

材料と試薬類下記の材料と試薬類を用いた。

a. 本アッセイに用いた細胞系統はIGF−Ｉ受容体を過
剰に発現している3T3/IGF−1Rである。

b. NIH3T3/IGF−1Rを５％CO₂,37℃のインキュベーター
で増殖させる。増殖用培地はDMEM＋10％FBS（加熱によ
り不活化）＋2mM L−グルタミンである。

c. 17−69という名称の抗IGF−1R抗体を用いる。抗体
はEnzymology Lab.,SUGEN,Inc.で精製されたものであ
る。

d. Ｄ−PBS: KH₂PO₄ 0.20g/l K₂HPO₄ 2.16g/l KCl 0.20g/l NaCl 8.00g/l（pH7.2） e. ブロッキング用緩衝液： TBSTに５％ミルク（Carnation Instant Non−Fat Dry
Milk）を加えたもの。

f. TBST緩衝液： Tris−HCl 50mM NaCl 150mM（pH7.2/HCl 10N） Triton X−100 0.1％ TBS（10X）のストック溶液を調製し、Triton X−100
は希釈時に緩衝液に添加する。

g. HNTG緩衝液： HEPES 20mM NaCl 150mM（pH7.2/HCl 1N）グリセロール 10％ Triton X−100 0.2％ストック溶液（5X）は調製後、４℃で保存する。

h. EDTA/HCl: 0.5M,pH7.0（NaOH）を100Xのストックとして用いる。

i. Na₃VO₄: 0.5Mを100Xのストックとしアリコートを−80℃で保存
する。

j. Na₄P₂O₇: 0.2Mを100Xのストックとして用いる。

k. インシュリン様成長因子（Insulin−like growth f
actor）はPromega（カタログ＃G5111）から入手。

l. ポリクローナル抗ホスホチロシン抗血清： Enzymology Lab.,SUGEN Inc.によって作製されたウサ
ギ血清。

m. ヤギ抗ウサギIgG抗体とPODのコンジュゲート（検出
用抗体）,TAGO（カタログNo.4520,Lot No.1802）:TAGO,
Inc.,Burlingame,CA n. ABTS（2,2′−アジノビス（３−エチルベンズチア
ゾリンスルホン酸））溶液：クエン酸 100mM Na₂HPO₄ 250mM（pH4.0/1N HCl） ABTS 0.5mg/ml ABTS溶液は４℃の暗所に保存する。溶液の色が緑色に
変わった場合は廃棄しなければならない。

o. 過酸化水素： 30％溶液を４℃で暗所に保存する。

試験方法特に断らない限り、下記の各ステップは全て室温で行
われる。全てのELISAプレートの洗浄は水道水で３度、
次いでTBSTで１度洗うことにより行われる。プレートを
軽くたたき、ペーパータオルで乾燥する。

A. 細胞の接種 1. 組織培養用ディッシュ（Corning 25020−100）で80
−90％集密となるまで増殖させた細胞をトリプシン−ED
TA（0.25％,0.5ml/D−100,GIBCO）を用いて採取する。

2. 新鮮DMEM＋10％FBS＋2mM L−グルタミンに細胞を再
懸濁し、96ウエルの組織培養用プレート（Corning,2580
6−96）に20,000個／ウエル（100μl/ウエル）となるよ
うに移す。１日間インキュベートし、次いで培地を無血
清培地（90/μｌ）に置き換え、５％CO₂,37℃で一晩イ
ンキュベートする。

B. ELISAプレートのコーティング及びブロッキング 1. ELISAプレート（Corning 25805−96）を抗IGF−1R
抗体（0.5μl/ウエル,100μl PBS中）で少なくとも２時
間コートする。

2. コーティング溶液を除去し、100μｌのブロッキン
グ用緩衝液に置き換え、30分間振盪する。ブロッキング
用緩衝液を除去し、溶解物を添加する直前にプレートを
洗う。

C. アッセイ方法 1. 薬剤は無血清条件下で試験する。

2. 薬剤ストック（100％DMSO中）を96ウエルのポリプ
ロピレンプレート中DMEMで1:10に希釈し、この溶液を細
胞に１ウエルあたり10μｌ移し、最終的に薬剤の希釈倍
率が1:100、DMSO濃度が1.0％となるようにする。細胞を
５％CO₂,37℃で２時間インキュベートする。

3. 新鮮細胞溶解用緩衝液を調製する（HNTG^＊）。

HNTG ２ ml EDTA 0.1ml Na₃VO₄ 0.1ml Na₄（P₂O₇） 0.1ml H₂O 7.3ml 4. 薬剤を２時間インキュベートした後、200nMのIGF−
１リガンド（PBS中）を10μl/ウエルで細胞に加え（終
濃度＝20nM）、５％CO₂,37℃で10分間インキュベートす
る。

5. 培地を除去し、HNTG^＊を100μl/ウエル加え、10分
間振盪する。細胞が十分に溶解しているか顕微鏡下で確
認すること。

6. 12チャンネルピペットを用いて細胞をプレートから
掻き取り、吸引排出を繰り返すことにより、溶解物をホ
モゲナイズする。溶解物の全量を、抗体をコート済のEL
ISAプレートに移し、１時間振盪する。

7. 溶解物を除去し、プレートを洗い、抗Ptyr（TBSTで
1:3,000としたもの）を100μl/ウエル移し、30分間振盪
する。

8. 抗Ptyrを除去し、プレートを洗い、Tago（TBSTで1:
3,000としたもの）を100μl/ウエル移し、30分間振盪す
る。

9. 検出用抗体を除去し、プレートを洗い、新鮮ABTS/H
₂O₂（1.2μｌのH₂O₂を10mlのABTSに加えたもの）をプレ
ートに100μl/ウエル移し、発色を開始させる。

10. Dynatec MR5000（Ingresに接続されている）でOD
を測定する。

6.1.5. EGF受容体ELISA 細胞全体でのEGF受容体キナーゼ活性（EGFR−NIH3T3
アッセイ）は下記の方法で測定した。

材料と試薬類下記の材料と試薬類を用いた。

a. EGFリガンド：ストック濃度＝16.5μM EGF201,東洋紡，日本 b. 05−101（UBI）（EGFRの細胞外ドメインを認識する
モノクローナル抗体） c. 抗ホスホチロシン抗体（抗Ptyr）（ポリクローナ
ル） d. 検出用抗体：ヤギ抗ウサギIgGと西洋わさびペルオ
キシダーゼのコンジュゲート、TAGO,Inc.,Burlingame,C
A e. TBST緩衝液： Tris−Hcl,pH7 50mM NaCl 150mM Triton X−100 0.1 f. HNTG 5Xストック： HEPES 0.1M NaCl 0.75M グリセロール 50 Triton X−100 1.0％ g. ABTSストック：クエン酸 100mM Na₂HPO₄ 250mM 濃塩酸 pH4.0 ABTS^＊ 0.5mg/ml 使用前まで４℃で暗所に保存。

h. ストック試薬類： EDTA 100mM pH7.0 Na₃VO₄ 0.5M Na₄（P₂O₇） 0.2M 試験方法下記のプロトコールを用いた。

A. ELISAプレートのプレコート 1. ELISAプレート（Corning,96ウエル，カタログ＃258
05−96）に１ウエルあたり0.5μｇの05−101抗体（PBS
中）を、最終容量が150μl/ウエルとなるようにコート
し、４℃で一晩保存する。このコートされたプレートは
４℃で保存すれば10日間まで使用しうる。

2.使用日にコーティング用緩衝液を取り除き、ブロッキ
ング用緩衝液（PBS中に５％Carnation Instant Non−Fa
t Dry Milkを含有）と置き換える。プレートを振盪させ
ながら室温（約23℃から25℃）で30分間インキュベート
する。使用直前にブロッキング用緩衝液を取り除き、プ
レートをTBST緩衝液で４回洗う。

B. 細胞の接種 1. NIH3T3/C7株（Honeggerら、Cell 51:199−209,198
7）をこのアッセイに用いうる。

2. 80−90％集密のディッシュを本実験用に選択する。
細胞をトリプシン処理し、10％CS DMEM培地を添加する
ことにより反応を停止する。細胞をDMEM培地（10％CS D
MEM培地）中に懸濁し、室温で５分間、1000rpmで一度遠
心する。

3. 接種用培地（DMEM,0.5％ウシ血清）中に細胞を再懸
濁し、トリパンブルーを用いて細胞数を計測する。生細
胞が90％以上のものが本実験に使用可能である。DMEM培
地に懸濁した細胞を１ウエルあたり10,000個、１ウエル
あたり100μｌを96ウエルのマイクロタイタープレート
に接種する。接種した細胞を５％CO₂、37℃で約40時間
インキュベートする。

C. アッセイ方法 1. 接種した細胞に汚染がないか倒立顕微鏡でチェック
する。薬剤ストック（DMSO中に10mg/ml含有）をDMEM培
地で1:10に希釈し、５μｌを試験用のウエルに薬剤の最
終希釈倍率が1:200、DMSOの最終濃度が１％となるよう
に移す。対照のウエルにはDMSOのみを入れる。５％CO₂,
37℃で１時間インキュベートする。

2. EGFリガンドの調製：ストックEGFをDMEM中、10μｌ
の希釈EGF（1:12希釈）を移す際に終濃度が25nMとなる
ように希釈する。

3. １ウエルあたり100μｌとするために十分な、10ml
の新鮮HNTG^＊を調製する。ここでHNTG^＊とは次の組成の
ものである。HNTGストック（2.0ml）,milli−Q H₂O（7.
3ml）,EDTA 100mM pH7.0（0.5ml）,Na₃VO₄ 0.5M（0.1m
l）,Na₄P₂O₇ 0.2M（0.1ml）。

4. 氷上に置く。

5. 薬剤と２時間インキュベートした後、調製済のEGF
リガンドを１ウエルあたり10μｌ、終濃度25nMとなるよ
うに細胞に加える。対照のウエルにはDMEMのみを加え
る。室温で５分間振盪しつつインキュベートする。

6. 薬剤、EGF及びDMEMの除去。PBSで二度細胞を洗う。
HNTG^＊を１ウエルあたり100μｌ、細胞に移す。氷上に
５分間置く。一方、上述の方法で他のELISAプレートか
らブロッキング用緩衝液を取り除き、TBSTで洗う。

7. マイクロピペッターにしっかり取り付けたピペット
チップでプレートから細胞を掻き取り、吸引排出を繰り
返すことにより細胞をホモゲナイズし、HNTG^＊溶解用緩
衝液に入れる。溶解物をELISAプレート（コート、ブロ
ック及び洗浄済のもの）に移す。室温で振盪しつつ１時
間インキュベートする。

8. 溶解物を除去し、TBSTで４回洗う。抗Ptyr抗体（新
たに希釈したもの）をELISAプレートに１ウエルあたり1
00μｌ移す。抗Ptyr抗血清（TBSTで1:3000に希釈）の存
在下で振盪しつつ室温で30分間インキュベートする。

9. 抗Ptyr抗体を除去し、TBSTで４回洗う。TAGOの抗ウ
サギIgG抗体（新たに希釈したもの）をELISAプレートに
１ウエルあたり100μｌ移す。室温で振盪しつつ30分間
インキュベートする（抗ウサギIgG抗体:TBSTで1:3000に
希釈）。

10. 検出用抗体を除去し、TBSTで４回洗う。新たに調
製したABTS/H₂O₂溶液をELISAプレートに１ウエルあたり
100μｌ移す。室温で20分間インキュベートする（ABTS/
H₂O₂溶液:10mlのABTSストック中に1.2μｌの30％H₂O₂を
含有する）。

11. 50μｌの5N H₂SO₄（任意に選択）を添加して反応
を停止させ、410nmのO.D.を測定する。

12. ホスホチロシンシグナルの最大値は陽性対照の値
から陰性対照の値を差し引くことによって求める。抽出
物を添加したウエルのホスホチロシン含量の阻害率は陰
性対照の値を差し引いてから求める。

6.1.6. 細胞性インシュリン受容体ELISA 本発明の化合物がインシュリン受容体チロシンキナー
ゼ活性を有するか否かを下記のプロトコールを用いて調
べた。

材料と試薬類下記の材料と試薬量をインシュリン受容体上のホスホ
チロシンレベル（インシュリン受容体チロシンキナーゼ
活性を示す）の測定に用いた。

1. 細胞系統として好ましいものは、NIH3T3（ATCC No.
1658）で、インシュリン受容体を過剰に発現しているも
の（H25細胞）あった。

2. H25細胞は５％CO₂,37℃のインキュベーターで増殖
させる。増殖用培地はDMEM＋10％FBS（加熱による不活
化済）＋2mM L−グルタミンを用いる。

3. ELISAプレートのコーティングにはBBEという名称の
モノクローナル抗IR抗体を用いる。その抗体はEnzymolo
gy Lab,SUGEN,Inc.により精製されたものである。

4. Ｄ−PBSの組成は次のとおり： KH₂PO₄ 0.20g/l（GIBCO,310−4190AJ） K₂HPO₄ 2.16g/l KCl 0.20g/l NaCl 8.00g/l（pH7.2） 5. ブロッキング用緩衝液 TBSTに５％ミルク（Carnation Instant Non−Fat Dry
Milk）を加える。

6. TBST緩衝液の組成は次のとおり Tris−HCl 50mM NaCl 150mM pH7.2（HCl,1N） Triton X−100 0.1％注記:TBS（10X）のストック溶液を調製し、Triton−
Ｘ−100は希釈時に緩衝液に添加する。

7. HNTG緩衝液は次の組成を含む。

HEPES 20mM NaCl 150mM pH7.2（HCl,1N）グリセロール 10％ Triton X−100 0.2％注記：ストック溶液（5X）を調製し４℃で保存する。

8. EDTA.HCl: 0.5M pH7.0（NaOH）を100Xのストックとして調製。

9. Na₃VO₄:0.5Mを100Xのストックとし、アリコートを
−80℃で保存する。

10. Na₄（P₂O₇）:0.2Mを100Xのストックとして用い
る。

11. インシュリン（GIBCO BRLより入手、カタログ＃18
125039）； 12. 抗ホスホチロシンポリクローナル抗血清： Enzymology Lab,,SUGEN Inc.により作製されたウサギ
血清； 13. 検出用抗体、好ましくはヤギ抗ウサギIgGとPODと
のコンジュゲート、TAGO（カタログNo.4520;Lot No.180
2）TAGO Inc.,Burlingame,CA. 14. ABTS溶液は次の組成を含む。

クエン酸 100mM Na₂HPO₄ 250mM pH4.0（1N HCl） ABTS 0.5mg/ml ABTSは2,2′−アジノビス（３−エチルベンズチアゾ
リンスルホン酸）で、４℃で暗所に保管し、緑色に変色
した場合は廃棄する。

15. 過酸化水素:30％溶液を４℃の暗所に保管する。

プロトコール下記の全ステップは特に断らない限り室温で行う。全
てのELISAプレートの洗浄は、水道水で三度、TBSで一度
すすぐことにより行う。全プレートを使用前にペーパー
タオルで軽くたたき水分を除去する。

A. 細胞の接種 1. 組織培養用ディッシュ（10cm,Corning 25020−10
0）で細胞を80−90％集密となるまで増殖させ、トリプ
シン−EDTA（0.25％,0.5ml/D−100,GIBCO）を用いて細
胞を採取する。

2. 新鮮DMEM＋10％FBS＋2mM L−グルタミン培地に細胞
を再懸濁し、96ウエルの組織培養用プレート（Corning
25806−96）に、細胞数が20,000個／ウエル（100μl/ウ
エル）となるように移す。その細胞を一日間インキュベ
ートする。インキュベーション後、培地を0.01％血清培
地（90μｌ）に置き換え、５％CO₂,37℃で一晩インキュ
ベートする。

B. ELISAプレートのコーティングとブロッキング 1. ELISAプレート（Corning 25805−96）を抗IR抗体
（0.5μg/ウエル,100μl PBS中）で少なくとも２時間コ
ートする。

C. アッセイ方法 1. 薬剤は無血清条件下で試験する。

2. 薬剤ストック（100％DMSO中）を96ウエルのポリプ
ロピレンプレート中DMEMで1:10に希釈し、この溶液を１
ウエルあたり10μｌ細胞に移し、最終的に薬剤の希釈倍
率が1:100、DMSO濃度が1.0％となるようにする。細胞を
５％CO₂,37℃で２時間インキュベートする。

3. 新鮮細胞溶解用緩衝液を調製する（HNTG^＊）。

HNTG（5X） 2ml EDTA 0.1ml Na₃VO₄ 0.1ml Na₄P₂O₇ 0.1ml H₂O 7.3ml HNTG^＊ 10ml 4. 薬剤を２時間インキュベートした後、１μＭインシ
ュリン（PBS中）を10μl/ウエル、細胞に移し（終濃度
＝100nM）、５％CO₂,37℃で10分間インキュベートす
る。

5. 培地を除去し、100μl/ウエルのHNTG^＊を加え、10
分間振盪する。細胞が十分に溶解しているか顕微鏡下で
確認すること。

6. 12チャンネルピペットを用いて細胞をプレートから
掻き取り、吸引排出を繰り返すことにより、溶解物をホ
モゲナイズする。溶解物の全量を、抗体をコートしたEL
ISAプレートに移し、１時間振盪する。

7. 溶解物を除去し、プレートを洗い、抗Ptyr（TBSTで
1:3,000としたもの）を100μl/ウエルに移し、30分間振
盪する。

9. 検出用抗体を除去し、プレートを洗い、新たに調製
したABTS/H₂O₂（1.2μｌのH₂O₂を10mlのABTSに加えたも
の）を100μl/ウエル、プレートに移し、発色を開始さ
せる。

10. Dynatec MR5000（Ingresに接続されている）でOD
を測定する。これ以降のステップは全てIngresの指示に
従う。

6.1.7. ELISAアッセイの実験結果本発明の各種化合物についての上記のプロトコールを
用いて試験した結果を表１に示す。

6.2 細胞増殖アッセイ本発明の化合物と１種又はそれ以上のRTKとの相互作
用の結果として、その化合物の細胞増殖に対する作用を
調べるため、下記のアッセイを用いることができる。特
に断らない限り、下記のアッセイ法はある化合物のどの
RTKに対しての活性についても一般に適用しうる。下記
に述べるアッセイはある特定のRTKに関するものである
が、当業者にはここに公表したプロトコールを別のRTK
活性の測定用に適用することが可能である。

6.2.1. 軟寒天アッセイ軟寒天アッセイは物質の細胞増殖に対する作用を調べ
るために用いうる。特に断らない限りは、軟寒天アッセ
イは下記のように行われる。

材料と試薬類次の材料と試薬類を用いた。

a. 39℃の水浴槽と、37℃の別の水浴槽 b. 2Xのアッセイ用培地は2Xのダルベッコ（Dulbecco）
の5 Modified Eagles' Medium（DMEM）（GIBCO カタロ
グ＃CA400−4ANO3）に下記のものを添加したものであ
る。

・20％ウシ胎児血清（FBS）、2mMビルビン酸ナトリウ
ム,4mMグルタミン、及び・20mM HEPES、非必須アミノ酸（100Xのストックから
1:50） c. 1Xアッセイ用培地は1X DMEMに10％FBS,1mMピルビン
酸ナトリウム,2mMグルタミン,10mM HEPES,非必須アミノ
酸（100Xのストックから1:100）を添加したものからな
る。

d. オートクレーブ瓶に1.6％のSeaPlaqueアガロースを
入れたもの e. 滅菌済の35mm Corningプレート（FMC Bioproducts
カタログ＃50102） f. 滅菌済の5mlガラスピペット（個別に包装されたも
の） g. 滅菌済の15mlと50mlの円錐遠心管 h. ピペットと滅菌済チップ i. 滅菌済ミクロ遠心管 j. T75フラスコに入れた細胞:SKOV−３（ATCC HTB77） k. 0.25％トリプシン溶液（GIBCO＃25200−015）試験方法軟寒天アッセイは次の方法で行った。

A. 底層の作製法 1. 培地を全て37℃の水浴槽で暖める。

2. 1Xのアッセイ用培地＋0.8寒天を調製する：溶解し
た寒天（39℃まで冷却）を2Xのアッセイ用培地で1:2（v
ol:vol）に希釈する。

3. 培地は使用しないときは39℃の水浴槽中で寒天と共
に保存する。

4. 1Xのアッセイ用培地＋0.8％寒天の1mlをディッシュ
に入れ、緩やかに揺り動かし均一な底層を作る。発泡を
避ける。

5. 底層を冷蔵庫で固化する（約20分間）。底層は冷蔵
庫で一晩保存することができる。

B. 細胞の採集方法 1. １細胞系統あたり１個のフラスコをインキュベータ
ーから取り出す。培地を吸引しPBSで１度洗い、吸引す
る。トリプシン溶液3mlを添加する。

2. 全細胞をフラスコから分離させた後、トリプシン活
性を阻害するための、1Xのアッセイ用培地3mlを添加す
る。ピペットで細胞を上下させた後、その懸濁液を15ml
の試験管に移す。

3. コールターカウンターを用いて細胞の濃度を測定
し、トリパンブルーで死細胞を除外し、生存率を調べ
る。

4. １プレートあたり3300の生存細胞を接種するのに要
する量を取り出し、1Xのアッセイ用培地を1.5mlで希釈
する。

C. 上層の0.4％アガロースの調製 1. 最終的に要求されるアッセイ時の濃度の２倍の濃度
でTBST化合物を添加し、1Xのアッセイ用倍地（10％FBS
を含む）に細胞を懸濁したものを1.5mlを加え、さらに1
Xのアッセイ用倍地に0.8％の寒天^＊を加えたものを1.5m
l添加する。この結果、1Xの倍地（10％FBS含有）に、0.
4％寒天、生細胞3300個/mlを含む液3.0ml、TBST化合物
を含む液と含まない液ができる。

＊（上記の底層調製法記載の2X倍地に1.6％寒天30含
有の液を1:2希釈で調製） 2. 底層1mlにアッセイ混液1mlを重層する。3mlの量か
ら２回重層する。

3. 湿度100％,10％CO₂のインキュベーター中でディッ
シュを２−３週間インキュベートする。

4. 60ミクロン以上の大きさのコロニーを陽性とする。

6.2.2. スルホローダミンＢ（SRB）増殖アッセイ SRBアッセイは物質の効果又は細胞増殖を測定するた
めに用いうる。アッセイは下記のように行われる。

アッセイ1:3T3/E/H＋TGF−ａ（Ｔ）細胞増殖SRBアッセ
イ材料： 96ウエル平底滅菌済プレート 96ウエル丸底滅菌済プレート滅菌済25ml又は50ml貯蔵器ピペット、多チャンネルピペットマン滅菌済ピペットチップ滅菌済の15ml及び50ml試験管試薬類：１％酢酸中に0.4％SRBを含有するもの 10mM Tris塩基 10％TCA １％酢酸滅菌済のDMSO（Sigma） DMSOに溶解させた化合物（100mM以下のストック溶液） 25％トリプシン−EDTAを含有する細胞解離溶液（Sigm
a）細胞系統及び増殖用培地： 3T3/E/H＋TGF−ａ（Ｔ）（EGF−R/HER2キメラを発現し
ているNIH3T3クローン７細胞及びTGF−α、腫瘍由来オ
ートクラインループ細胞）２％子牛血清/DMEM＋2mMグルタミンプロトコール：０日目：細胞のプレーティングアッセイのこの部分は層流のフードの中で行う。

1. 細胞を通常どおりトリプシン処理する。100μｌの
細胞懸濁液を10mlのイソトンに移す。コールターカウン
ターで細胞数を計測する。

2. 増殖用培地中の細胞を60,000個/mlに希釈する。96
ウエル平底プレートの各ウエルに細胞100μｌを移し、6
000個／ウエルとする。

3. 各化合物にプレートの半分（４行）を用い、各化合
物濃度について４つのウエルを用い、４ウエルを対照の
培地に、別の４ウエルを対照のDMEMに用いる。

4. 細胞を均一に付着させるためにプレートを緩やかに
振盪する。

5. プレートを37℃で10％CO₂のインキュベーターでイ
ンキュベートする。

第１日目：化合物の添加アッセイのこの部分は層流のフード中で行う。

1. 96ウエルの丸底プレートに125μｌの増殖用培地を
第３列から第11列に添加する。このプレートは化合物の
段階希釈に用いられ、化合物あたり４列用いる。

2. 滅菌済の15ml試験管に、化合物８μｌを増殖用培地
に加えて全量を2mlとし、1:250の希釈となるようにした
ものを最高濃度の2X溶液とする。この希釈倍数で、細胞
について、DMSOの濃度は2X溶液で0.4％、1X溶液で0.2％
とする。化合物の開始濃度は通常100μＭであるが、こ
れはその化合物の溶解度によって変わりうる。

3. 2Xの開始化合物溶液の96ウエルの丸底プレートの第
12列の４つのウエルに移す。プレートの右から左へ、12
5μｌを第12列から第11列へ、第11列から第10列へとい
うように順次1:2に希釈する。化合物希釈液の100μｌ
を、96ウエルの平底プレートの細胞培地100μｌの対応
するウエルに移す。１ウエルあたりの容量合計は200μ
ｌとなるはずである。

4. 対照のヴィークルについては増殖用培地中に0.4％
のDMSOを含む2X DMSO液を調製する。このDMSO溶液100μ
ｌを細胞の入った適当なウエルに移す。DMSOの終濃度は
0.2％である。

5. 対照の培地に用いるウエルについては、増殖用培地
の100μl/ウエルを、細胞を入れた対照（培地）用のウ
エルに添加する。

6. プレートをインキュベーターに戻し、４日間インキ
ュベートする。

第５日目：アッセイ結果の発色アッセイのこの部分はベンチで行われる。

1. 培地を吸い出すか又は流し出す。各ウエルに200μ
ｌの10％冷TCAを添加し細胞を固定する。プレートを４
℃で少なくとも60分間インキュベートする。

2. TCAを捨て、ウエルを水で５回すすぐ。プレートを
ペーパータオル上で逆さまにすることにより乾燥させ
る。

3. 100μl/ウエルの0.4％SRBで10分間細胞を染色す
る。

4. SRBを流し出し、ウエルを１％酢酸で５回すすぐ。
プレートをペーパータオルの上に逆さまにすることによ
り完全に乾燥させる。

5. 10mM Tris塩基100μl/ウエルで振盪機で５−10分間
振盪することにより染料を溶解する。

6. Dynatech ELISA Plate Readerで、630nmの吸光度を
対照としてプレートの570nmの吸光度を測定する。

アッセイ2:3T3/EGF−Ｒ＋TGF−ａ（Ｔ）細胞増殖SRBア
ッセイ材料と試薬類はアッセイ１と同様。

細胞系統と増殖用培地： 3T3/EGF−Ｒ＋TGF−ａ（Ｔ）（EGF−ＲとRGF−ａを発現
しているNIH3T3クローン７細胞、腫瘍由来オートクライ
ンループ細胞）２％子牛血清/DMEM＋2mMグルタミンプロトコール：第０日目：細胞のプレーティングアッセイのこの部分は層流のフード中で行う。

1. 細胞を通常どおりトリプシン処理する。細胞懸濁液
100μｌを10mlのイソトンに移す。コールターカウンタ
ーで細胞数を計測する。

2. 細胞増殖用培地中で細胞を60,000個/mlに希釈す
る。この液を96ウエルの平底プレートの各ウエルに細胞
が6000個／ウエルとなるよう、100μｌずつ移す。

3. 各化合物に対してプレートの半分（４行）を用い、
各化合物の１濃度について４個のウエル、培地（対照）
について４ウエルのセット、及びDMSO（対照）について
４ウエルのセットを用いる。

4. 細胞が均一に付着するよう、プレートを緩やかに振
盪する。

5. 10％CO₂のインキュベーターで37℃でプレートをイ
ンキュベートする。

第１日目：化合物の添加：アッセイ１と同様第５日目：アッセイ結果の発色：アッセイ１と同様アッセイ3:3T3/PDGF−βR/PDGF−BB（Ｔ）細胞増殖SRB
アッセイ細胞系統及び増殖用培地： 3T3/PDGF−βR/PDGF−BB（Ｔ）（PDGF β−受容体及びP
DGF−BBを発現しているNIH3T3クローン７細胞、胸腺除
去マウスから切除した腫瘍由来のもの）２％子牛血清/DMEM＋2mMグルタミンプロトコール：第０日目：細胞のプレーティングアッセイのこの部分は層流のフード中で行う。

1. 細胞を通常どおりトリプシン処理する。細胞懸濁液
200μｌを10mlのイソトンに移す。コールターカウンタ
ーで細胞数を計測する。

2. 細胞増殖用培地中で細胞を60,000個/mlに希釈す
る。この液を96ウエルの平底プレートの各ウエルに細胞
が6000個／ウエルとなるように、100μｌずつ移す。

4. 細胞が均一にプレートに付着するよう、プレートを
緩やかに振盪する。

第１日目：化合物の添加：アッセイ１と同様第５日目：アッセイ結果の発色：アッセイ１と同様アッセイ4:ヒト平滑筋細胞（（SMC）増殖SRBアッセイ材料と方法はアッセイ１と同様：細胞系統と増殖用培地：ヒト大動脈平滑筋細胞（Clonetics） Clonetics's Bullet Kit:平滑筋基礎培地（SmBM,Smooth
Muscle Basal Medium）この培地はMCDB 131に変更を加えたもので、ウシ胎児
血清（５％）,hFGF（2ng/ml）,hEGF（0.1ng/ml），イン
シュリン（5.0μg/ml），ゲンタマイシン（50μg/m
l），及びアムホテリシンＢ（50ng/ml）を含有する。

プロトコール：第０日目：細胞のプレーティングアッセイのこの部分は層流のフード中で行う。

2. 細胞増殖用培地中で細胞を20,000個/mlに希釈す
る。この液を96ウエルの平底プレートの各ウエルに細胞
が2000個／ウエルとなるよう、100μｌずつ移す。

第１日目：化合物の添加：アッセイ１と同様第５日目：アッセイ結果の発色：アッセイ１と同様 6.2.3. 3T3細胞増殖アッセイアッセイ1:PDGF誘発BrdU取り込みアッセイ材料と試薬類（１） PGDF:ヒトPDGF B/B;1276−956,Boehringer Man
nheim,ドイツ（２） BrdUラベル試薬:10mM,PBS（pH7.4）中に溶解、
カタログNo.1 647 229,Boehringer Mannheim,ドイツ（３） FixDenat:固定液（直ちにそのまま使用可）、
カタログNo.1 647 229,Boehringer Mannheim,ドイツ（４）抗BrdU−POD:ペルオキシダーゼをコンジュゲー
トさせたマウスモノクローナル抗体、カタログNo.1 647
229,Boehringer Mannheim,ドイツ（５） TMB基質液：テトラメチルベンジジン（TMB）、
直ちにそのまま使用可、カタログNo.1 647 229,Boehrin
ger Mannheim,ドイツ（６） PBS洗浄液:1X PBS,pH7.4,自家調製（７）アルブミン、ウシ（BSA）：フラクションＶ粉
末;A−8551,Sigma Chemical Co.,米国プロトコール（１） 3T3改変細胞系統:3T3/EGFRc7 （２） DMEM（10％CS,2mMグルタミン含有）に懸濁した
細胞を96ウエルのプレートに8000個／ウエル接種する。
細胞を５％CO₂,37℃で一晩インキュベートする。

（３） 24時間後、細胞をPBSで洗い、無血清培地（０
％CS DMEM,BSA 0.1％含有）で24時間、血清枯渇状態と
する。

（４）第３日目にリガンド（PDGF＝3.8nM,0.1％BSA含
有のDMEMで調製）及び供試化合物を同時に細胞に添加す
る。陰性対照のウエルには無血清DMEM（0.1％BSA含有）
のみを入れ、陽性対照の細胞にはリガンド（PDGF）のみ
（供試化合物は添加しない）入れる。供試化合物は96ウ
エルのプレート中に無血清DMEMにリガンドを加えた液で
調製し、順次希釈して７段階の濃度とする。

（５）リガンド活性化を20時間行った後、希釈したBr
dUラベル試薬（1:100,DMEM中,0.1％BSA）を添加し、細
胞をBrdU（終濃度＝10μＭ）と1.5時間インキュベート
する。

（６）ラベル試薬とインキュベーションした後、培地
を傾斜して流し出し、ペーパータオル上でプレートを逆
さまにし軽くたたく。FixDenant液を添加し（50μl/ウ
エル）、プレート振盪機でプレートを室温で45分間イン
キュベートする。

（７） FixDenant液を傾斜及びペーパータオル上に逆
さまにすることにより、完全に除去する。ミルク（PBS
中に５％脱水ミルクを含むもの、200μl/ウエル）をブ
ロッキング液として加え、プレート振盪機でプレートを
室温で30分間インキュベートする。

（８）ブロッキング液を傾斜して除去し、ウエルをPB
Sで１度洗う。抗BrdU−POD液（PBSで1:100に希釈、１％
BSAを含有）を添加し（100μl/ウエル）、プレート振盪
機でプレートを室温で90分間インキュベートする。

（９）抗体コンジュゲートを傾斜して十分に除去し、
ウエルをPBSで５度洗い、プレートをペーパータオル上
で逆さまにし、軽くたたくことにより乾燥させる。

（10） TMB基質液を添加し（100μl/ウエル）、プレー
ト振盪機で室温で20分間、発色が吸光度測定に十分な程
度となるまでインキュベートする。

（11）サンプルの吸光度をDynatechのELISAプレート
リーダーで410nmで（「二波長モード」でフィルターを
かけた490nmを対照の波長とし）測定する。

アッセイ2:EGF誘発BrdU取り込みアッセイ材料と試薬類（１） EGF:マウスEGF,201;東洋紡，日本（２） BrdUラベル試薬:10mM,PBS（pH7.4）中に溶解、
カタログNo.1 647 229,Boehringer Mannheim,ドイツ（３） FixDenat:固定液（直ちにそのまま使用可）、
カタログNo.1 647 229,Boehringer Mannheim,ドイツ（４）抗BrdU−POD:ペルオキシダーゼをコンジュゲー
トさせたマウスモノクローナル抗体、カタログNo.1 647
229,Boehringer Mannheim,ドイツ（５） TMB基質液：テトラメチルベンジジン（TMB）、
直ちにそのまま使用可、カタログNo.1 647 229,Boehrin
ger Mannheim,ドイツ（６） PBS洗浄液:1X PBS,pH7.4,自家調製（７）アルブミン、ウシ（BSA）：フラクションＶ粉
末;A−8551,Sigma Chemical Co.,米国プロトコール（１） 3T3改変細胞系統:3T3/EGFRc7 （２） DMEM（10％CS,2mMグルタミン含有）に懸濁した
細胞を96ウエルのプレートに8000個／ウエル接種する。
細胞を５％CO₂,37℃で一晩インキュベートする。

（４）第３日目にリガンド（EGF＝2nM,0.1％BSA含有
のDMEMで調製）及び供試化合物を同時に細胞に添加す
る。陰性対照のウエルには無血清DMEM（0.1％BSA含有）
のみを入れ、陽性対照の細胞にはリガンド（EGF）のみ
（供試化合物は添加しない）入れる。供試化合物は96ウ
エルのプレート中に無血清DMEMにリガンドを加えた液で
調製し、順次希釈して７段階の濃度とする。

アッセイ3:EGF誘発HER2促進BrdU取り込み材料と試薬類（１） EDF:マウスEGF 201;東洋紡，日本（２） BrdUラベル試薬:10mM,PBS（pH7.4）中に溶解、
カタログNo.1 647 229,Boehringer Mannheim,ドイツ（３） FixDenat:固定液（直ちにそのまま使用可）、
カタログNo.1 647 229,Boehringer Mannheim,ドイツ（４）抗BrdU−POD:ペルオキシダーゼをコンジュゲー
トさせたマウスモノクローナル抗体、カタログNo.1 647
229,Boehringer Mannheim,ドイツ（５） TMB基質液：テトラメチルベンジジン（TMB）、
直ちにそのまま使用可、カタログNo.1 647 229,Boehrin
ger Mannheim,ドイツ（６） PBS洗浄液:1X PBS,pH7.4,自家調製（７）アルブミン、ウシ（BSA）：フラクションＶ粉
末;A−8551,Sigma Chemical Co.,米国プロトコール（１） 3T3改変細胞系統:3T3/EGFr/Her2/EGFr（Her2キ
ナーゼドメインを有するEGFr）（２） DMEM（10％CS,2mMグルタミン含有）に懸濁した
細胞を96ウエルのプレートに8000個／ウエル接種する。
細胞を５％CO₂,37℃で一晩インキュベートする。

アッセイ4:IGF−１誘発BrdU取り込みアッセイ材料と試薬類（１） IGF1リガンド；ヒト，遺伝子組換え,G511,Prom
ega Corp,米国（２） BrdUラベル試薬:10mM,PBS（pH7.4）中に溶解、
カタログNo.1 647 229,Boehringer Mannheim,ドイツ（３） FixDenat:固定液（直ちにそのまま使用可）、
カタログNo.1 647 229,Boehringer Mannheim,ドイツ（４）抗BrdU−POD:ペルオキシダーゼをコンジュゲー
トさせたマウスモノクローナル抗体、カタログNo.1 647
229,Boehringer Mannheim,ドイツ（５） TMB基質液：テトラメチルベンジジン（TMB）、
直ちにそのまま使用可、カタログNo.1 647 229,Boehrin
ger Mannheim,ドイツ（６） PBS洗浄液:1X PBS,pH7.4,自家調製（７）アルブミン、ウシ（BSA）：フラクションＶ粉
末;A−8551,Sigma Chemical Co.,米国プロトコール（１） 3T3改変細胞系統:3T3/IGF1r （２） DMEM（10％CS,2mMグルタミン含有）に懸濁した
細胞を96ウエルのプレートに8000個／ウエル接種する。
細胞を５％CO₂,37℃で一晩インキュベートする。

（４）第３日目にリガンド（IGF1＝3.3nM,0.1％BSA含
有のDMEMで調製）及び供試化合物を同時に細胞に添加す
る。陰性対照のウエルには無血清DMEM（0.1％BSA含有）
のみを入れ、陽性対照の細胞にはリガンド（IGF1）のみ
（供試化合物は添加しない）入れる。供試化合物は96ウ
エルのプレート中に無血清DMEMにリガンドを加えた液で
調製し、順次希釈して７段階の濃度とする。

（５）リガンド活性化を16時間行った後、希釈したBr
dUラベル試薬（1:100,DMEM中,0.1％BSA）を添加し、細
胞をBrdU（終濃度＝10μＭ）と1.5時間インキュベート
する。

アッセイ5:インシュリン誘発BrdU取り込みアッセイ材料と試薬類（１）インシュリン：結晶，ウシ，亜鉛;13007,GIBCO
BRL,米国（２） BrdUラベル試薬:10mM,PBS（pH7.4）中に溶解、
カタログNo.1 647 229,Boehringer Mannheim,ドイツ（３） FixDenat:固定液（直ちにそのまま使用可）、
カタログNo.1 647 229,Boehringer Mannheim,ドイツ（４）抗BrdU−POD:ペルオキシダーゼをコンジュゲー
トさせたマウスモノクローナル抗体、カタログNo.1 647
229,Boehringer Mannheim,ドイツ（５） TMB基質液：テトラメチルベンジジン（TMB）、
直ちにそのまま使用可、カタログNo.1 647 229,Boehrin
ger Mannheim,ドイツ（６） PBS洗浄液:1X PBS,pH7.4,自家調製（７）アルブミン、ウシ（BSA）：フラクションＶ粉
末;A−8551,Sigma Chemical Co.,米国プロトコール（１） 3T3改変細胞系統:H25 （２） DMEM（10％CS,2mMグルタミン含有）に懸濁した
細胞を96ウエルのプレートに8000個／ウエル接種する。
細胞を５％CO₂,37℃で一晩インキュベートする。

（４）第３日目にリガンド（インシュリン＝10nM,0.1
％BSA含有のDMEMで調製）及び供試化合物を同時に細胞
に添加する。陰性対照のウエルには無血清DMEM（0.1％B
SA含有）のみを入れ、陽性対照の細胞にはリガンド（イ
ンシュリン）のみ（供試化合物は添加しない）入れる。
供試化合物は96ウエルのプレート中に無血清DMEMにリガ
ンドを加えた液で調製し、順次希釈して７段階の濃度と
する。

6.2.4. HUV−EC−Ｃアッセイ下記のプロトコールも化合物の活性測定に用いうる。

第０日目 1. HUV−EC−Ｃ細胞（ヒト臍静脈内皮細胞、American
Type Culture Collection;カタログNo.1730 CRL）を洗
い、トリプシン処理する。ダルベッコ（Dulbecco）のリ
ン酸加生理食塩液（Ｄ−PBS,GIBCO BRLより入手、カタ
ログNo.14190−029）で２度、組織培養用フラスコの10c
m²あたり1mlで洗う。非酵素的細胞分離液（Sigma Chemi
cal Company,カタログNo.C−1544）中に0.05％トリプシ
ン−EDTAを含有する液でトリプシン処理する。0.05％ト
リプシンは0.25％トリプシン/1mM EDTA（GIBCO,カタロ
グNo.25200−049）を細胞分離液で希釈して調製した。
組織培養用フラスコの25−30cm²あたり約1mlで37℃で５
分間、トリプシン処理する。細胞がフラスコから離れた
後、等量のアッセイ用培地を添加し、50mlの滅菌済遠心
管（Fisher ScientificカタログNo.05−539−６）に移
す。

2. 50mlの滅菌済遠心管にアッセイ用培地35mlを加えて
洗い、約200xgで10分間遠心し、上清を吸引し、35mlの
Ｄ−PBSで再懸濁する。さらに２度Ｄ−PBSでの洗いを繰
り返し、組織培養フラスコの15cm²あたり約1mlのアッセ
イ用培地で細胞を再懸濁する。アッセイ用培地は、F12K
培地（GIBCO BRL,カタログNo.21127−014）に、加熱し
て不活化したウシ胎児血清を0.5％加えたものである。
コールターカウンターｖ（Coulter Electronics,In
c.）で細胞数を計測し、アッセイ用培地を細胞に加え、
0.8−1.0x10⁵個/mlの濃度とする。

3. 96ウエルの平底プレートに細胞を100μl/ウエル、
すなわち0.8−1.0x10⁴個／ウエル添加し、５％CO₂,37℃
で約24時間インキュベートする。

第１日目 1. 薬剤の二段階希釈を別々の96ウエルプレートに作
る。通常は50μＭから順次濃度を下げ０μＭまでとす
る。

上記第０日目，ステップ２に記載のものと同じアッセ
イ用培地を用いる。段階希釈は200μＭ（4X最終ウエル
濃度）の薬剤を、特定のプレートの列の上端のウエルに
90μl/ウエル入れて行う。薬剤ストックの濃度は通常DM
SO中に20mMとしているので、200μｇの薬剤濃度では２
％のDMSOを含有している。

それ故、薬剤濃度を希釈してもDMSO濃度を一定に保つ
ために、希釈液としてアッセイ用培地に２％のDMSOを添
加したもの（F12K＋0.5％ウシ胎児血清）を用いて薬剤
の段階希釈を行う。この希釈液をその列の残りのウエル
に60μl/ウエル添加する。その列の上端のウエル中の20
0μＭの薬剤希釈液120μｌから60μｌをとり、その列の
２番目のウエルの60μｌと混合する。このウエルから60
μｌ取り、その列の３番目のウエルの60μｌと混合し、
以下同様に２倍段階希釈を完成させる。最後の一つ前の
ウエルを混合した後、そのウエルの120μｌから60μｌ
を取り、棄てる。最後のウエルは60μｌのDMSO/培地希
釈液のままにしておき、薬剤不含の対照とする。９列の
薬剤の段階希釈を作れば１）VEGF（Pepro Tech Inc.,カ
タログNo.100−200から入手した）、２）内皮細胞増殖
因子（ECGF）（酸性繊維芽細胞増殖因子又はaFGFとして
も知られている）（Boehringer Mannheim Biochemica,
カタログNo.1439 600から入手した）、及びアッセイ用
培地（対照）について３回測定するのに十分である。EC
GFはヘパリンナトリウムを含む製品として供給される。

2. 第０日目からの、HUV−EC−Ｃ細胞を0.8−1.0x10⁴
個/100μl/ウエル含有する96ウエルのアッセイ用プレー
トに薬剤希釈液を50μl/ウエル移し、５％CO₂,37℃で約
２時間インキュベートする。

3. 各薬剤濃度について50μl/ウエルのVEGF（80ng/m
l）、ECGF（20ng/ml）、又は培地（対照）を３つ組で添
加する。薬剤の場合と同様に、増殖因子の濃度は要求さ
れる最終濃度の４倍（4X）とする。この濃度の増殖因子
液を調製するために第０日のステップ２で調製したアッ
セイ用培地を用いる。５％CO₂,37℃で約24時間インキュ
ベートする。各ウエルは50μｌの薬剤希釈液、50μｌの
増殖因子又は培地、及び100μｌの細胞で合計200μl/ウ
エルとなる。従って、4X濃度の薬剤と増殖因子は、ウエ
ルに全てのものが添加された後は1Xとなる。

第２日目 1. ³H−チミジン（Amersham;カタログNo.TRK−686）を
１μCi/ウエルとなるように添加し（RPMI培地で100μCi
/mlとした液＋10％加熱不活化ウシ胎児血清を10μl/ウ
エル）、５％CO₂,37℃で約24時間インキュベートする。
注記:³H−チミジンはRPMI培地を用いて調製する。なぜ
ならば、他の用途に³H−チミジンを用いる場合にもRPMI
中で行うからである。このステップでの培地の相違はお
そらく重要ではないであろう。RPMIはGIBCO BRLから入
手しうる（カタログNo.11875−051）。

第３日目 1. −20℃でプレートを一晩冷凍する。

第４日目 1. プレートを融解し、96ウエルプレートハーベスター
（Tomtec Harvester 96）でフィルターマット（Walla
c;カタログNo.1205−401）上に採取する。Wallac Betap
lateTM液体シンチレーションカウンターでカウントす
る。

6.2.5. PDGF−Ｒ細胞アッセイ PDGF細胞性キナーゼアッセイは下記のとおり行った。
細胞を0.2M Hepes,0.15M NaCl,10％ v/vグリセロール,
0.04％ Triton X−100,5mM EDTA,5mMバナジン酸ナトリ
ウム，及び2mMピロリン酸ナトリウムで溶解し、細胞溶
解物を抗PDGF受容体抗体（Genzyme）でコートしたELISA
プレートに添加する。ELISAプレートは溶解物添加前に
４℃、18時間 0.5μg/ウエルの抗体（150μl PBS中）
でコートする。溶解物をコート済プレート中で１時間イ
ンキュベートし、TBST（35mM Tris−HCl pH7.0,0.15M N
aCl,0.1％Triton X100）中で４度洗う。抗ホスホチロシ
ン抗体（PBS中,100μｌ）を添加し、その混合液を室温
で30分間インキュベートする。次いで、ウエルをTBST中
で４度洗い、POD（TAGO）にコンジュゲートさせた第２
抗体を各ウエルに加え、処理したウエルを室温で30分間
インキュベートする。その後ウエルをTBST中で４度洗
い、ABTS/H₂O₂液を各ウエルに加え、２分間インキュベ
ートし、410nmの吸光度を測定する。

6.2.6. 細胞増殖アッセイの実験結果各種化合物について上記のアッセイから得られた結果
を次の表に示す。

3T3/E/H＋TGF−α（Ｔ）:EGFR/HER2キメラ及びTGF−α
を発現しているNIH3T3細胞、腫瘍由来 3T3/EGFR＋TGF−α（Ｔ）:EGFRとTGF−αを発現してい
るNIH3T3細胞、腫瘍由来 3T3/PDGFR＋PDGF（Ｔ）:PDGF−βＲ及びPDGF−ββを発
現しているNIH3T3細胞、腫瘍由来 SMC:ヒト平滑筋細胞（Cloneticsから入手） 6.3. 細胞毒性の測定治療用に用いる化合物は受容体型チロシンキナーゼ阻
害活性が細胞毒性の発現より強くなければならない。あ
る化合物についての有効性と細胞毒性の尺度は治療指数
（therapeutic index）、IC₅₀/LD₅₀、を決めることによ
って得られる。IC₅₀は50％阻害に要する投与量であり、
標準的な技法、例えばここに述べたような方法により測
定することができる。LD₅₀は50％毒性を示す投与量であ
り、これも標準的な技法（Mossman,1983,J.Immunol.Met
hods,65:55−63）で、LDHの放出量を測定することによ
り（Korzeniewski and Callewaers,1983,J.Immunol.Met
hods 64:313;Decker and Lohmann−Matthes,1988,J.Imm
unol.Methods 115:61）、又は動物モデルの致死量を測
定することにより求めることができるができる。治療指
数の値が大きい化合物が好ましい。治療指数は２以上な
ければならず、好ましくは少なくとも10、より好ましく
は少なくとも50あることである。

6.3. in vivo動物モデル 6.3.1. 異種移植動物モデル胸腺除去マウス（例えば、Balb/c,nu/nu）におけるヒ
トの腫瘍の異種移植片としての増殖能は、ヒト腫瘍の治
療法に対する生物学的反応を研究するためのin vivoの
モデルとして有用である。ヒトの腫瘍の胸腺除去マウス
への異種移植の最初の成功（Rygaard and Povlsen,196
9,Acta Pathol.Microbial.Scand.77:758−760）以来、
多種のヒト腫瘍細胞系統（例えば、乳房、肺、尿生殖
器、胃腸、頭頸歩、膠芽腫、骨、及び悪性メタノーマ）
が移植され、ヌードマウスでの増殖に成功している。ヒ
ト乳ガン細胞系統（MCF−7,ZR75−１及びMDA−MB−231
を含むが）、ヌードマウスでの皮下異種移植片として確
立している（Warriら,1991,Int.J.Cancer 49:616−623;
Ozzello and Sordat,1980,Eur.J.Cancer 16:553−559;O
sborneら,1985,Cancer Res.45:584−590;Seibertら,198
3,Cancer Res.43:2223−2239）。

アッセイ1:HER2/異種移植動物モデル抗ガン剤候補薬剤のHER2発現腫瘍に対する効力を調べ
るためには、その腫瘍細胞がエストロゲンを補助的に加
えることなしに増殖しうるものでなければならない。多
くの乳ガン細胞系統はヌードマウスでのin vivo増殖に
おいてエストロゲン要求性であるが（Osborneら、前述
の文献）、細胞外エストロゲンはヌードマウスにおける
HER2の発現を抑制する（Warriら、前述の文献、Datiら,
1990,Oncogene ５:1001−1006）。

例えば、エストロゲンの存在下、MCF−7,ZR−75−1,
およびT47D細胞はインビボでよく成長するが、非常に低
レベルのHER2を発現する（Warriら、前述の文献,Dati
ら、前述の文献）。

下記の異種移植プロトコールを用いうる。

１）腫瘍細胞を５−６週令の雌のBalb/c nu/nu胸腺除
去マウスの後横腹の皮下に埋め込む。

２）抗ガン剤を投与する。

３）腫瘍の容量を測定することにより腫瘍の増殖度を
測定する。

その腫瘍について受容体、例えばHER2,EGF,またはPDG
F、の有無についてもウエスタン法及び免疫組織化学的
分析で調べる。当業界で知られた手法を用い当業者であ
るならば上記の方法を例えば異なる治療処法を用いるこ
とにより変更しうる。

アッセイ2:FLK−1/異種移植モデル皮下異種移植片として確立された卵巣ガン、メラノー
マ、前立腺ガン、肺ガン、乳ガンの細胞系統に対する本
発明の化合物の阻害能を検討した。これらの研究での投
与量は１から75mg/kg/dayで行った。

材料と方法腫瘍細胞を定められたマウスの指示された系統の皮下
に埋め込んだ。治療は特に断らない限りは（例えばA375
メラノーマ細胞系統を埋め込んだSCIDマウスの治療は第
９日目に開始した）、埋め込み後第１日目に開始した。
各実験群は８匹〜16匹のマウスで構成した。

特別な事項：動物雌の胸腺除去マウス（Balb/c,nu/nu）、Balb/cマウ
ス、Wistar系ラット、及びFisher 344系ラットはSimons
en Laboratories（Gilroy,CA,米国）より入手した。雌
のA/IマウスはJackson Laboratory（Bar Harbor,ME,米
国）より入手した。DAラットはＢ＆K Universal Inc.
（Fremont,CA,米国）より入手した。胸腺除去R/Nuラッ
ト、DBA/2Nマウス、及びBalb/cマウスはHarlan Sprague
Dawley（Indianapolis,IN,米国）より入手した。雌のC
57BL/6マウスはTaconic（Germantown,NY,米国）より入
手した。全ての動物はAlpha−dri敷き藁を備えたミクロ
アイソレーターケージ中でクリーンルームの条件下で維
持した。動物には滅菌済の齧歯類用餌及び水を自由に摂
取させた。

全ての作業はNIHの「実験動物のケアと使用法ガイ
ト」（NIH Guide for the Care and Use of Laboratory
Animals）に従って行われた。

皮下異種移植モデル細胞系統は適当な培地中で上述したごとく増殖させた
（第６節参照）。細胞は0.05％トリプシン−EDTAを添加
しコンフルエント又はほぼコンフルエントな状態まで培
養し、450xgで10分間遠心してペレットとする。ペレッ
トを滅菌済PBS又は培地（FBS不含）に再懸濁し図に示さ
れた適当な濃度とし、その細胞をマウスの後横腹に埋め
込んだ。腫瘍の増殖を３〜６週間以上、venierキャリパ
ーを用いてその大きさを計測し、腫瘍の大きさは特に断
らない限りは長さｘ幅ｘ高さで計算した。Ｐ値（危険
率）はStudentのｔ−検定を用いて計算した。50−100μ
ｌの溶剤（ジメチルスルホキシド、PBTE,PBTE6C,又はPB
TE:D5W）に溶解した化合物を図に示された濃度で腹腔内
注射で投与した。

脳内異種移植モデルマウス脳内移植モデルに対してはラットC6グリオーマ
細胞を採取し滅菌済のPBS中に2.5x10⁷個/mlの濃度に懸
濁し氷上に置いた。細胞をBalb/c,nu/nuマウスに次のや
り方で移植した。70％エタノールで拭う前に必要ならば
動物用のバリカンでマウスの前額歩の毛を剃った。動物
をイソフルオランで麻酔し、針を左半球の脳室に頭蓋骨
を貫通して差し込んた。スリーブをつけて3mm以上刺入
できないようにした30ゲージ1/2インチの注射針を、Ham
ilton Gastight Syringeに取り付け、細胞を注入した。
４μｌの細胞懸濁液を正確に注入するための反復分注器
を用いた。動物の一般状態を毎日モニターし、約40％の
体重減少及び／又は神経症状が認められた場合には屠殺
した。

ラット脳内移植モデルとしては、ラット（Wistar,Spr
ague Dawley,Fisher 344又は胸腺除去R/Nu系の約200−4
00g（300−400gのもの数匹を含む）のもの）を、100mg/
kgのKetaset（塩酸ケミタン、Aveco,Fort Dodge,Iowa,
米国）及び5mg/kgのRompun（キシラジン、２％溶液、Ba
yer,ドイツ）を腹腔内投与することによって麻酔した。
麻酔の効果発現の後、前額部を剃り、定位固定装置（St
oelting,Wood Date,IL,米国）に置いた。切開部位の皮
膚を３回、70％エタノールと10％ポピドンヨードで交互
に拭った。滅菌済の外科用の刃で前額歩の正中線を1.0
−1.5cm切開した。皮膚をわずかに引き離し頭蓋骨表面
の縫合腺を露出させるために両脇に引っ張った。歯科用
ドリル（Stoelting,Wood Date,IL,米国）を用いて、プ
レグマから約1mm後方、2mm水平方向の位置の頭蓋骨に小
さい穴（直径１−2mm）をあけた。23−25ゲージの標準
傾斜針を取り付けたハミルトンシリンジ中に細胞懸濁液
を50μｌ取った。シリンジをくも膜の高さで小穴の中に
向け、針先が脳の構造物へ3mmの深さに達するまでシリ
ンジを沈め、そこで細胞懸濁液を緩徐に注入した。細胞
を注入した後、針を小穴の中に１−２分置き、細胞が完
全に注入されるようにした。頭蓋骨を清拭し、２−３針
縫うことにより皮膚を閉じた。その動物の手術と麻酔か
らの回復を観察した。実験期間中、動物は毎日少なくと
も２回、脳内腫瘍の増大に伴う症状の発現を観察した。
症状の進行（もたれかかり，平衡感覚の消失、脱水、食
欲の喪失、協調の喪失、毛づくろい行動の停止、及び／
又は著明な体重の減少）が認められた動物については人
為的に屠殺し、関連があると考えられる器官と組織を切
除した。

腹腔内モデル細胞系統を適当な培地で増殖させた。細胞を採取し滅
菌済PBS又はFBS不含の培地で洗い、適度な濃度に再懸濁
し、適当な系統のマウスの腹腔内に注入した。マウスの
腹水形成の有無について毎日観察した。各動物が40％の
体重増加又は腹腔内の腫瘍が大きくなり、はなはだしい
ストレス及び頭痛をその動物に与える場合には屠殺し
た。

6.3.2. in vivo PEGFペレットモデル次の実施例において、化合物のFLK−１受容体に対す
る活性及び血管形成に伴う障害に対する活性について調
べるためにペレットモデルを用いた。このモデルではVE
GFは放出時間調整ペレットにパッケージし、ペレット周
囲の発赤反応及びそれに引き続く腫脹とを誘導するため
に、ヌードマウスの腹部の皮下にペレットを埋め込ん
だ。FLK−１の阻害剤である可能性のある薬剤をメチル
セルロース中に入れて、その阻害剤が発赤反応及びそれ
に続く腫脹を抑制するために用いうるかを決めるため、
VEGFのペレットの近傍に埋め込んだ。

材料と方法下記の材料を用いた。

１） VEGF−ヒト遺伝子組替え産物（凍結乾燥品）はPe
protecj,Inc.,Princeton Business Park,G2;P.O.box 27
5,Rocky Hill,NJ 08553,米国，から市販品として入手し
うるであろう。

２） 21日間で放出されるVEGFのペレットはInnovative
Research of America（Innovative Research of Ameri
ca,3361 Executive Parkway,P.O.Box 2746,Toledo,Ohio
43606,米国）−同社の特許のマトリックス化デリヴァ
リーシステムを使用−から入手しうる。ペレットは0.2
0,0.21又は2.1μg VEGF/ペレットでパッケージした。こ
れらの投与量は約10及び100ng/日のVEGFの放出にあた
る。

３）メチルセルロース４）水（滅菌済）５）メタノール６）適当な薬剤／阻害剤７） 10cm培養プレート８）パラフィルム VEGFペレットモデルの実験は、下記のプロトコールに
従って行った。

１） VEGF,Peprotechから購入したものをInnovative R
esearchにペレット製剤の注文加工製造のために送っ
た。

２）メチルセルロースは滅菌水中に1.5％となるよう
調製した。

３）メタノール中に溶解させた薬剤（通常、濃度範囲
は10−20mg/ml）４）滅菌済の10cmのプレートに滅菌済のパラフィルム
を置く。

５）薬剤をメタノールに溶解したもの150μｌを1.5％
のメチルセルロース1.35mlに加え、混合/Vortexでの混
合を十分行う。

６）ホモジネートのアリコート25μｌをパラフィルム
の上に置き、ディスク状に乾燥させる。

７）マウス（６−10週令、Balb/C胸腺除去、nu/nu,
雌）をイソフルラン吸入により麻酔する。

８） VEGFペレットとメチルセルロースディスクを腹部
上の皮下に埋め込む。

９）マウスは24時間目と48時間目に発赤と腫脹反応に
ついてスコアをつけた。この実施例での特別な実験デザ
インは次のとおり：Ｎ＝４匹／群対照群:VEGFペレット＋薬剤の偽薬 VEGFの偽薬＋薬剤のペレット実験結果本発明の化合物はこのアッセイによって活性
を示すことが期待される。

6.3.3. 乳房脂肪パットモデル RTKの多くのものの役割が既に確立しているので、例
えば、HER2受容体について、乳ガンにおいて、そのよう
なRTKを阻害する化合物の有効性を測定するためには乳
房脂肪パットモデルは特に有用である。当該箇所へ腫瘍
細胞を直接埋め込むことにより、in situモデルは皮下
モデルに比べ、より正確に腫瘍の発達の生物学的な面を
反映する。ヒト乳房細胞系統（MCF−７を含む）は胸腺
除去マウスの乳房脂肪パッドで増殖する。Shafie and G
rantham,1981,Natl.Cancer Instit.67:51−56,Gottardi
sら:1988,J.Steroid Biochim.30:311−314。とりわけ、
ある化合物のHER2受容体に対する阻害効果を測定するた
めには下記の方法を用いうる。

１） HER−２でトランスフェクトしたMDA−MB−231及
びMCF−７細胞を各種の濃度で雌の胸腺除去マウスの腋
窩の乳房脂肪パッドへ埋め込んだ。

２）化合物を投与。

３）各時点で腫瘍の増殖を測定。

例えばHER2のようなの受容体がその腫瘍に存在してい
るかをウエスタンブロッティング及び免疫組織化学的に
分析しうる。当業界で知られている方法を用いて当業者
なら上記の方法を、例えば異なる治療処法を用いること
により改変することができる。

6.3.4. 腫瘍浸潤モデル下記の腫瘍浸潤モデルを開発した。これはKDR/FLK−
１受容体を選択的に阻害することが分かった化合物につ
いてその治療における価値及び効力を評価するために用
いうる。

6.3.4.1. 方法実験動物として８週令（雌）のヌードマウス（Simons
en Inc.）を用いた。腫瘍細胞の埋め込みは層流のフー
ドの中で行った。麻酔はXylazine/Ketamine Cocktail
（100mg/kgのケタミン及び5mg/kgのジラジン）を腹腔内
に投与する。100μｌの培地中に10⁷個の腫瘍細胞を含む
液を注入するため、正中線の切開を行い、腹腔を露出さ
せる（約1.5cmの長さで）。細胞は膵臓の十二指腸小葉
中又は大腸の漿膜下に注入する。腹腔と筋肉を６−０の
絹の連続縫合糸で閉じ、皮膚は木製のクリップで閉じ
る。動物を毎日観察する。

6.3.4.2. 分析２−６週間後、動物の総合所見の如何によって、マウ
スを屠殺し、腫瘍の各種器官への転移（肺、肝臓、脳、
胃、脾臓、心臓、筋肉）の有無を調べ、分析（腫瘍サイ
ズ、浸潤の程度、免疫化学、及びin situハイブリダイ
ゼーション）を行う。

6.3.5. 効果上述のin vivoアッセイから得られた各種化合物につ
いての試験結果を次の表５に示す。

本発明はここに例示した実施態様、それは本発明のあ
る態様を例示するものであるが、それのみに本発明の範
囲を限定すべきものではなく、機能的に同じものである
いかなるクローン、DNA、又はアミノ酸も本発明の範囲
に含まれるものである。事実、ここに記述して事柄に加
えて、本発明に各種の改変を加えることは、上記の説明
から当業者にとっては自明なこととなろう。そのような
改変は本発明の請求の範囲に包含されるものとする。

本明細書中に引用された全ての参照文献は、参考とし
てその全体を本明細書中に組み込むこととする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 31/4245 Ａ６１Ｋ 31/4245 31/427 31/427 31/433 31/433 Ａ６１Ｐ 1/16 Ａ６１Ｐ 1/16 3/10 3/10 9/10 9/10 13/12 13/12 17/02 17/02 25/00 25/00 27/02 27/02 29/00 29/00 35/00 35/00 37/00 37/00 43/00 43/00 Ｃ０７Ｄ 405/06 Ｃ０７Ｄ 405/06 409/06 409/06 413/06 413/06 417/06 417/06 (72)発明者マックマーン，ジェラルドアメリカ合衆国 95452 カリフォルニア州ケンウッド，シュルツロード 1800番地 (56)参考文献米国特許4002749（ＵＳ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07D 403/06 C07D 405/06 C07D 409/06 C07D 413/06 C07D 417/06 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】次式：［式中、 R₁はＨであり； R₂はＯまたはＳであり； R₃は水素であり； R₄、R₅、R₆、およびR₇は、それぞれ、水素、アルキル、
アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリー
ル、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、
Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NRR′、OH、C
N、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、（CH₂）_nCO
₂R、およびCONRR′からなる群より独立して選択され；Ａは、チオフェン、ピロール、ピラゾール、イミダゾー
ル、1,2,3−トリアゾール、1,2,4−トリアゾール、オキ
サゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾ
ール、２−スルホニルフラン、４−アルキルフラン、1,
2,3−オキサジアゾール、1,2,4−オキサジアゾール、1,
2,5−オキサジアゾール、1,3,4−オキサジアゾール、1,
2,3,4−オキサトリアゾール、1,2,3,5−オキサトリアゾ
ール、1,2,3−チアジアゾール、1,2,4−チアジアゾー
ル、1,2,5−チアジアゾール、1,3,4−チアジアゾール、
1,2,3,4−チアトリアゾール、1,2,3,5−チアトリアゾー
ル、およびテトラゾールからなる群より選択される５員
のヘテロアリール環であり、１またはそれ以上の位置に
おいて、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオ
キシ、アルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、
トリハロメチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO
₂、NRR′、OH、CN、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC
（Ｏ）Ｒ、（CH₂）_nCO₂RまたはCONRR′で任意に置換さ
れていてもよく；ｎは０−３であり；ＲはＨ、アルキルまたはアリールであり；およびＲ′はＨ、アルキルまたはアリールである］を有する化合物またはその薬学的に許容しうる塩であっ
て、前記化合物は、チロシンキナーゼシグナル伝達を制御、
阻害または調節し；但し以下の化合物は除かれる：３−［（ピロール−２−イル）メチレン］−２−インド
リノン；３−［（５−クロロ−3,4−ジメチルピロール−２−イ
ル）メチレン］−２−インドリノン；３−［（3,5−ジメチル−４−エチルピロール−２−イ
ル）メチレン］−２−インドリノン；３−［（3,5−ジメチル−４−エトキシカルボニルピロ
ール−２−イル）メチレン］−２−インドリノン；安息香酸、２−［［［１−エチル−2,3−ジヒドロ−２
−オキソ−３−（1H−ピロール−２−イルメチレン−1H
−インドール−５−イル］オキシ］メチル］−；３−［（１−メチル−５−ニトロ−イミダゾール−２−
イル）メチレン］−２−インドリノン；３−（チエン−２−イルメチレン）−２−インドリノ
ン； 1H−インドール−７−酢酸、３−［（２−ブチル−1H−
イミダゾール−４−イル）メチレン］−2,3−ジヒドロ
−２−オキソ−、エチルエステル； 1H−インドール−７−酢酸、３−［（２−ブチル−１−
［（1,1−ジメチルエトキシ）カルボニル］−1H−イミ
ダゾール−４−イル）メチレン］−2,3−ジヒドロ−２
−オキソ−、エチルエステル；３−［（チオフェン−２−イル）メチレン］−２−イン
ドリノン；３−［（ピロール−２−イル）メチレン］−６−ニトロ
−２−インドリノン；３−［（チアゾール−５−イル）メチレン］−５−クロ
ロ−２−インドリノン；３−［（イソチアゾール−５−イル）メチレン］−６−
ジエチルアミノ−２−インドリノン；および３−［（イミダゾール−５−イル）メチレン］−５−フ
ェニルカルボニル−２−インドリノン；ことを特徴とする化合物。
【請求項２】次式：［式中、 R₁はＨであり； R₂はＯまたはＳであり； R₃は水素であり； R₄、R₅、R₆、およびR₇は、それぞれ、水素、アルキル、
アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリー
ル、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、
Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NRR′、OH、C
N、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、（CH₂）_nCO
₂R、およびCONRR′からなる群より独立して選択され；Ａは、ピラゾール、1,2,3−トリアゾール、1,2,4−トリ
アゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾー
ル、イソチアゾール、２−スルホニルフラン、４−アル
キルフラン、1,2,3−オキサジアゾール、1,2,4−オキサ
ジアゾール、1,2,5−オキサジアゾール、1,3,4−オキサ
ジアゾール、1,2,3,4−オキサトリアゾール、1,2,3,5−
オキサトリアゾール、1,2,3−チアジアゾール、1,2,4−
チアジアゾール、1,2,5−チアジアゾール、1,3,4−チア
ジアゾール、1,2,3,4−チアトリアゾール、1,2,3,5−チ
アトリアゾール、およびテトラゾールからなる群より選
択される５員のヘテロアリール環であり、１またはそれ
以上の位置において、アルキル、アルコキシ、アリー
ル、アリールオキシ、アルカリール、アルカリールオキ
シ、ハロゲン、トリハロメチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NR
R′、SO₃R、SR、NO₂、NRR′、OH、CN、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC
（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、（CH₂）_nCO₂RまたはCONRR′で
任意に置換されていてもよく；ｎは０−３であり；ＲはＨ、アルキルまたはアリールであり；およびＲ′はＨ、アルキルまたはアリールである；但し、３−［（チアゾール−５−イル）メチレン］−５
−クロロ−２−インドリノンおよび３−［（イソチアゾ
ール−５−イル）メチレン］−６−ジエチルアミノ−２
−インドリノンは除かれる］を有する化合物またはその薬学的に許容しうる塩。
【請求項３】３−［（３−メチルピロール−２−イル）
メチレン］−２−インドリノン；３−［（3,4−ジメチルピロール−２−イル）メチレ
ン］−２−インドリノン；３−［（２−メチルチエン−５−イル）メチレン］−２
−インドリノン;3−［（３−メチルチエン−２−イル）
メチレン］−２−インドリノン;3−｛［４−（２−メト
キシカルボニルエチル）−３−メチルピロール−５−イ
ル］メチレン｝−２−インドリノン;3−［（4,5−ジメ
チル−３−エチルピロール−２−イル）メチレン］−２
−インドリノン;3−［（５−メチルイミダゾール−２−
イル）メチレン］−２−インドリノン;5−クロロ−３−
［（５−メチルチエン−２−イル）メチレン］−２−イ
ンドリノン;3−［（3,5−ジメチルピロール−２−イ
ル）メチレン］−５−ニトロ−２−インドリノン;3−
［（３−（２−カルボキシエチル）−４−メチルピロー
ル−５−イル）メチレン］−２−インドリノン;5−クロ
ロ−３−［（3,5−ジメチルピロール−２−イル）メチ
レン］−２−インドリノン；および３−［（2,4−ジメ
チルピロール−５−イル）メチレン］−２−インドリノ
ンからなる群より選択される化合物、またはその薬学的
に許容しうる塩。
【請求項４】３−［（2,4−ジメチルピロール−５−イ
ル）メチレン］−２−インドリノン、またはその薬学的
に許容しうる塩。
【請求項５】次式：［式中、 R₁はＨであり； R₂はＯまたはＳであり； R₃は水素であり； R₄、R₅、R₆、およびR₇は、それぞれ、水素、アルキル、
アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリー
ル、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、
Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NRR′、OH、C
N、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、（CH₂）_nCO
₂R、およびCONRR′からなる群より独立して選択され；Ａは、チオフェン、ピロール、ピラゾール、イミダゾー
ル、1,2,3−トリアゾール、1,2,4−トリアゾール、オキ
サゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾ
ール、２−スルホニルフラン、４−アルキルフラン、1,
2,3−オキサジアゾール、1,2,4−オキサジアゾール、1,
2,5−オキサジアゾール、1,3,4−オキサジアゾール、1,
2,3,4−オキサトリアゾール、1,2,3,5−オキサトリアゾ
ール、1,2,3−チアジアゾール、1,2,4−チアジアゾー
ル、1,2,5−チアジアゾール、1,3,4−チアジアゾール、
1,2,3,4−チアトリアゾール、1,2,3,5−チアトリアゾー
ル、およびテトラゾールからなる群より選択される５員
のヘテロアリール環であり、１またはそれ以上の位置に
おいて、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオ
キシ、アルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、
トリハロメチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO
₂、NRR′、OH、CN、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC
（Ｏ）Ｒ、（CH₂）_nCO₂RまたはCONRR′で任意に置換さ
れていてもよく；ｎは０−３であり；ＲはＨ、アルキルまたはアリールであり；およびＲ′はＨ、アルキルまたはアリールである］を有する化合物またはその薬学的に許容しうる塩、およ
び薬学的に許容しうる担体または賦形剤を含む医薬組成
物。
【請求項６】請求項２−４のいずれかに記載の化合物お
よび薬学的に許容しうる担体または賦形剤を含む医薬組
成物。
【請求項７】細胞増殖性疾患、肝硬変、アテローム性動
脈硬化、メサンギウム細胞増殖性疾患、乾癬、真性糖尿
病、創傷治癒、炎症、神経変性性疾病および過免疫疾患
からなる群より選択される疾患を治療するための医薬組
成物であって、次式：［式中、 R₁はＨまたはアルキルであり； R₂はＯまたはＳであり； R₃は水素であり； R₄、R₅、R₆、およびR₇は、それぞれ、水素、アルキル、
アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリー
ル、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、
Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NRR′、OH、C
N、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、（CH₂）_nCO
₂R、およびCONRR′からなる群より独立して選択され；Ａは、チオフェン、ピロール、ピラゾール、イミダゾー
ル、1,2,3−トリアゾール、1,2,4−トリアゾール、オキ
サゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾ
ール、２−スルホニルフラン、４−アルキルフラン、1,
2,3−オキサジアゾール、1,2,4−オキサジアゾール、1,
2,5−オキサジアゾール、1,3,4−オキサジアゾール、1,
2,3,4−オキサトリアゾール、1,2,3,5−オキサトリアゾ
ール、1,2,3−チアジアゾール、1,2,4−チアジアゾー
ル、1,2,5−チアジアゾール、1,3,4−チアジアゾール、
1,2,3,4−チアトリアゾール、1,2,3,5−チアトリアゾー
ル、およびテトラゾールからなる群より選択される５員
のヘテロアリール環であり、１またはそれ以上の位置に
おいて、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオ
キシ、アルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、
トリハロメチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO
₂、NRR′、OH、CN、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC
（Ｏ）Ｒ、（CH₂）_nCO₂R、およびCONRR′で任意に置換
されていてもよく；ｎは０−３であり；ＲはＨ、アルキルまたはアリールであり；およびＲ′はＨ、アルキルまたはアリールである］を有する化合物またはその薬学的に許容しうる塩を含む
組成物。
【請求項８】細胞増殖性疾患、肝硬変、アテローム性動
脈硬化、メサンギウム細胞増殖性疾患、乾癬、真性糖尿
病、創傷治癒、炎症、神経変性性疾病および過免疫疾患
からなる群より選択される疾患を治療するための医薬組
成物であって、３−［（３−メチルピロール−２−イ
ル）メチレン］−２−インドリノン;3−［（3,4−ジメ
チルピロール−２−イル）メチレン］−２−インドリノ
ン;3−［（２−メチルチエン−５−イル）メチレン］−
２−インドリノン;3−［（３−メチルチエン−２−イ
ル）メチレン］−２−インドリノン;3−｛［４−（２−
メトキシカルボニルエチル）−３−メチルピロール−５
−イル］メチレン｝−２−インドリノン;3−［（4,5−
ジメチル−３−エチルピロール−２−イル）メチレン］
−２−インドリノン;3−［（５−メチルイミダゾール−
２−イル）メチレン］−２−インドリノン;5−クロロ−
３−［（５−メチルチエン−２−イル）メチレン］−２
−インドリノン;3−［（3,5−ジメチルピロール−２−
イル）メチレン］−５−ニトロ−２−インドリノン;3−
［（３−（２−カルボキシエチル）−４−メチルピロー
ル−５−イル）メチレン］−２−インドリノン;5−クロ
ロ−３−［（3,5−ジメチルピロール−２−イル）メチ
レン］−２−インドリノン;3−［（チエン−２−イル）
メチレン］−２−インドリノン;3−［（ピロール−２−
イル）メチレン］−２−インドリノンおよび３−［（2,
4−ジメチルピロール−５−イル）メチレン］−２−イ
ンドリノンからなる群より選択される化合物またはその
薬学的に許容しうる塩を含む組成物。
【請求項９】前記化合物が、３−［（2,4−ジメチルピ
ロール−５−イル）メチレン］−２−インドリノンまた
はその薬学的に許容しうる塩である、請求項８記載の医
薬組成物。
【請求項１０】前記細胞増殖性疾患が、癌および血管増
殖性疾患からなる群より選択される、請求項７−９のい
ずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】血管増殖性疾患が、関節炎、再狭窄およ
び眼の疾患からなる群より選択される、請求項10記載の
医薬組成物。
【請求項１２】メサンギウム細胞増殖性疾患が、糸球体
腎炎、糖尿病性腎症、悪性腎硬化症、血栓性細小血管症
症候群、移植片拒絶および糸球体症からなる群より選択
される、請求項７−９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１３】チロシンキナーゼシグナル伝達を制御、
調節または阻害するための医薬組成物であって、次式：［式中、 R₁はＨまたはアルキルであり； R₂はＯまたはＳであり； R₃は水素であり； R₄、R₅、R₆、およびR₇は、それぞれ、水素、アルキル、
アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリー
ル、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、
Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NRR′、OH、C
N、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、（CH₂）_nCO
₂R、およびCONRR′からなる群より独立して選択され；Ａは、チオフェン、ピロール、ピラゾール、イミダゾー
ル、1,2,3−トリアゾール、1,2,4−トリアゾール、オキ
サゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾ
ール、２−スルホニルフラン、４−アルキルフラン、1,
2,3−オキサジアゾール、1,2,4−オキサジアゾール、1,
2,5−オキサジアゾール、1,3,4−オキサジアゾール、1,
2,3,4−オキサトリアゾール、1,2,3,5−オキサトリアゾ
ール、1,2,3−チアジアゾール、1,2,4−チアジアゾー
ル、1,2,5−チアジアゾール、1,3,4−チアジアゾール、
1,2,3,4−チアトリアゾール、1,2,3,5−チアジアゾー
ル、およびテトラゾールからなる群より選択される５員
のヘテロアリール環であり、１またはそれ以上の位置に
おいて、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオ
キシ、アルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、
トリハロメチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO
₂、NRR′、OH、CN、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC
（Ｏ）Ｒ、（CH₂）_nCO₂R、およびCONRR′で任意に置換
されていてもよく；ｎは０−３であり；ＲはＨ、アルキルまたはアリールであり；およびＲ′はＨ、アルキルまたはアリールである］を有する化合物またはその薬学的に許容しうる塩を含む
組成物。
【請求項１４】チロシンキナーゼシグナル伝達を制御、
調節または阻害するための医薬組成物であって、３−
［（３−メチルピロール−２−イル）メチレン］−２−
インドリノン;3−［（3,4−ジメチルピロール−２−イ
ル）メチレン］−２−インドリノン;3−［（２−メチル
チエン−５−イル）メチレン］−２−インドリノン;3−
［（３−メチルチエン−２−イル）メチレン］−２−イ
ンドリノン;3−｛［４−（２−メトキシカルボニルエチ
ル）−３−メチルピロール−５−イル］メチレン｝−２
−インドリノン;3−［（4,5−ジメチル−３−エチルピ
ロール−２−イル）メチレン］−２−インドリノン;3−
［（５−メチルイミダゾール−２−イル）メチレン］−
２−インドリノン;5−クロロ−３−［（５−メチルチエ
ン−２−イル）メチレン］−２−インドリノン;3−
［（3,5−ジメチルピロール−２−イル）メチレン］−
５−ニトロ−２−インドリノン;3−［（３−（２−カル
ボキシエチル）−４−メチルピロール−５−イル）メチ
レン］−２−インドリノン;5−クロロ−３−［（3,5−
ジメチルピロール−２−イル）メチレン］−２−インド
リノン;3−［（チエン−２−イル）メチレン］−２−イ
ンドリノン;3−［（ピロール−２−イル）メチレン］−
２−インドリノンおよび３−［（2,4−ジメチルピロー
ル−５−イル）メチレン］−２−インドリノンからなる
群より選択される化合物またはその薬学的に許容しうる
塩を含む組成物。
【請求項１５】前記化合物が、３−［（2,4−ジメチル
ピロール−５−イル）メチレン］−２−インドリノンま
たはその薬学的に許容しうる塩である、請求項13記載の
医薬組成物。
【請求項１６】前記組成物が患者への非経口投与に適し
たものである、請求項５−15のいずれかに記載の医薬組
成物。
【請求項１７】前記組成物が患者への皮下投与に適した
ものである、請求項16記載の医薬組成物。
【請求項１８】前記組成物がデポー製剤の形態である、
請求項５−15のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１９】３−［（2,4−ジメチルピロール−５−
イル）メチレン］−２−インドリノンを製造する方法で
あって、オキシインドール、2,4−ジメチルピロール−５−カル
ボキシアルデヒド、ピペリジンおよびエタノールの混合
物を加熱し、前記混合物を冷却し、そして３−［（2,4−ジメチルピロール−５−イル）メチレ
ン］−２−インドリノンを単離する、ことを含む方法。
【請求項２０】前記加熱が90℃で行われる、請求項19記
載の方法。
【請求項２１】前記加熱が３時間から５時間行われる、
請求項20記載の方法。
【請求項２２】前記３−［（2,4−ジメチルピロール−
５−イル）メチレン］−２−インドリノンが濾過により
単離される、請求項19記載の方法。
【請求項２３】単離された３−［（2,4−ジメチルピロ
ール−５−イル）メチレン］−２−インドリノンを冷エ
タノールで洗浄することをさらに含む、請求項22記載の
方法。
【請求項２４】前記疾患が癌である、請求項10記載の医
薬組成物。
【請求項２５】前記癌が、結腸直腸癌および小細胞肺癌
から選択される、請求項24記載の医薬組成物。
【請求項２６】前記眼の疾患が糖尿病性網膜症である、
請求項11記載の医薬組成物。
【請求項２７】３−［（2,4−ジメチルピロール−５−
イル）メチレン］−２−インドリノンまたはその薬学的
に許容しうる塩を含む医薬組成物。
【請求項２８】次式：［式中、 R₁はＨであり； R₂はＯまたはＳであり； R₃は水素であり； R₄、R₅、R₆、およびR₇は、それぞれ、水素、アルキル、
アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリー
ル、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、
Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NRR′、OH、C
N、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、（CH₂）_nCO
₂R、およびCONRR′からなる群より独立して選択され；Ａは、チオフェン、ピロール、ピラゾール、イミダゾー
ル、1,2,3−トリアゾール、1,2,4−トリアゾール、オキ
サゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾ
ール、２−スルホニルフラン、４−アルキルフラン、1,
2,3−オキサジアゾール、1,2,4−オキサジアゾール、1,
2,5−オキサジアゾール、1,3,4−オキサジアゾール、1,
2,3,4−オキサトリアゾール、1,2,3,5−オキサトリアゾ
ール、1,2,3−チアジアゾール、1,2,4−チアジアゾー
ル、1,2,5−チアジアゾール、1,3,4−チアジアゾール、
1,2,3,4−チアトリアゾール、1,2,3,5−チアトリアゾー
ル、およびテトラゾールからなる群より選択される５員
のヘテロアリール環であり、１またはそれ以上の位置に
おいて、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオ
キシ、アルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、
トリハロメチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO
₂、NRR′、OH、CN、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC
（Ｏ）Ｒ、（CH₂）_nCO₂RまたはCONRR′で任意に選択さ
れていてもよく；ｎは０−３であり；ＲはＨ、アルキルまたはアリールであり；およびＲ′はＨ、アルキルまたはアリールである；但し以下の化合物は除かれる：３−［（ピロール−２−イル）メチレン］−２−インド
リノン；３−［（５−クロロ−3,4−ジメチルピロール−２−イ
ル）メチレン］−２−インドリノン；３−［（3,5−ジメチル−４−エチルピロール−２−イ
ル）メチレン］−２−インドリノン；３−［（3,5−ジメチル−４−エトキシカルボニルピロ
ール−２−イル）メチレン］−２−インドリノン；安息香酸、２−［［［１−エチル−2,3−ジヒドロ−２
−オキソ−３−（1H−ピロール−２−イルメチレン−1H
−インドール−５−イル］オキシ］メチル］−；３−［（１−メチル−５−ニトロ−イミダゾール−２−
イル）メチレン］−２−インドリノン；３−（チエン−２−イルメチレン）−２−インドリノ
ン； 1H−インドール−７−酢酸、３−［（２−ブチル−1H−
イミダゾール−４−イル）メチレン］−2,3−ジヒドロ
−２−オキソ−、エチルエステル； 1H−インドール−７−酢酸、３−［（２−ブチル−１−
［（1,1−ジメチルエトキシ）カルボニル］−1H−イミ
ダゾール−４−イル）メチレン］−2,3−ジヒドロ−２
−オキソ−、エチルエステル；３−［（チオフェン−２−イル）メチレン］−２−イン
ドリノン；３−［（ピロール−２−イル）メチレン］−６−ニトロ
−２−インドリノン；３−［（チアゾール−５−イル）メチレン］−５−クロ
ロ−２−インドリノン；３−［（イソチアゾール−５−イル）メチレン］−６−
ジエチルアミノ−２−インドリノン；および３−［（イミダゾール−５−イル）メチレン］−５−フ
ェニルカルボニル−２−インドリノン］を有する化合物またはその薬学的に許容しうる塩、およ
び薬学的に許容しうる担体または賦形剤を含む医薬組成
物。
【請求項２９】チロシンキナーゼシグナル伝達を制御、
調節または阻害するための医薬組成物であって、次式：［式中、 R₁はＨまたはアルキルであり； R₂はＯまたはＳであり； R₃は水素であり； R₄、R₅、R₆、およびR₇は、それぞれ、水素、アルキル、
アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリー
ル、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、
Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO₂、NRR′、OH、C
N、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC（Ｏ）Ｒ、（CH₂）_nCO
₂R、およびCONRR′からなる群より独立して選択され；Ａは、チオフェン、ピロール、ピラゾール、イミダゾー
ル、1,2,3−トリアゾール、1,2,4−トリアゾール、オキ
サゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾ
ール、２−スルホニルフラン、４−アルキルフラン、1,
2,3−オキサジアゾール、1,2,4−オキサジアゾール、1,
2,5−オキサジアゾール、1,3,4−オキサジアゾール、1,
2,3,4−オキサトリアゾール、1,2,3,5−オキサトリアゾ
ール、1,2,3−チアジアゾール、1,2,4−チアジアゾー
ル、1,2,5−チアジアゾール、1,3,4−チアジアゾール、
1,2,3,4−チアトリアゾール、1,2,3,5−チアジアゾー
ル、およびテトラゾールからなる群より選択される５員
のヘテロアリール環であり、１またはそれ以上の位置に
おいて、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオ
キシ、アルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、
トリハロメチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、SO₂NRR′、SO₃R、SR、NO
₂、NRR′、OH、CN、Ｃ（Ｏ）Ｒ、OC（Ｏ）Ｒ、NHC
（Ｏ）Ｒ、（CH₂）_nCO₂R、およびCONRR′で任意に置換
されていてもよく；ｎは０−３であり；ＲはＨ、アルキルまたはアリールであり；およびＲ′はＨ、アルキルまたはアリールである；但し以下の化合物は除かれる：３−［（ピロール−２−イル）メチレン］−２−インド
リノン；３−［（５−クロロ−3,4−ジメチルピロール−２−イ
ル）メチレン］−２−インドリノン；３−［（3,5−ジメチル−４−エチルピロール−２−イ
ル）メチレン］−２−インドリノン；３−［（3,5−ジメチル−４−エトキシカルボニルピロ
ール−２−イル）メチレン］−２−インドリノン；安息香酸、２−［［［１−エチル−2,3−ジヒドロ−２
−オキソ−３−（1H−ピロール−２−イルメチレン−1H
−インドール−５−イル］オキシ］メチル］−；３−［（１−メチル−５−ニトロ−イミダゾール−２−
イル）メチレン］−２−インドリノン；３−（チエン−２−イルメチレン）−２−インドリノ
ン； 1H−インドール−７−酢酸、３−［２−ブチル−1H−イ
ミダゾール−４−イル）メチレン］−2,3−ジヒドロ−
２−オキソ−、エチルエステル； 1H−インドール−７−酢酸、３−［（２−ブチル−１−
［（1,1−ジメチルエトキシ）カルボニル］−1H−イミ
ダゾール−４−イル）メチレン］−2,3−ジヒドロ−２
−オキソ−、エチルエステル；３−［（チオフェン−２−イル）メチレン］−２−イン
ドリノン；３−［（ピロール−２−イル）メチレン］−６−ニトロ
−２−インドリノン；３−［（チアゾール−５−イル）メチレン］−５−クロ
ロ−２−インドリノン；３−［（イソチアゾール−５−イル）メチレン］−６−
ジエチルアミノ−２−インドリノン；および３−［（イミダゾール−５−イル）メチレン］−５−フ
ェニルカルボニル−２−インドリノン］を有する化合物またはその薬学的に許容しうる塩を含む
組成物。