HU226755B1 - Indolinone derivatives for the treatment of disease, use thereof, pharmaceutical compositions containing these compounds - Google Patents

Indolinone derivatives for the treatment of disease, use thereof, pharmaceutical compositions containing these compounds Download PDF

Info

Publication number
HU226755B1
HU226755B1 HU9701694A HUP9701694A HU226755B1 HU 226755 B1 HU226755 B1 HU 226755B1 HU 9701694 A HU9701694 A HU 9701694A HU P9701694 A HUP9701694 A HU P9701694A HU 226755 B1 HU226755 B1 HU 226755B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
indolinone
methylene
alkyl
aryl
group
Prior art date
Application number
HU9701694A
Other languages
English (en)
Inventor
Gerald Mcmahon
Li Sun
Peng Cho Tang
Original Assignee
Sugen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sugen filed Critical Sugen
Publication of HUP9701694A2 publication Critical patent/HUP9701694A2/hu
Publication of HUP9701694A3 publication Critical patent/HUP9701694A3/hu
Publication of HU226755B1 publication Critical patent/HU226755B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/02—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • A61P5/08—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH for decreasing, blocking or antagonising the activity of the anterior pituitary hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/10—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/30—Indoles; Hydrogenated indoles with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D209/32—Oxygen atoms
    • C07D209/34—Oxygen atoms in position 2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D409/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
    • C07D417/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Indole Compounds (AREA)

Description

Ez a beadvány a 08/485323 sorszámú, 1995. június 7-én iktatott amerikai szabadalmi alkalmazás folytatása, így az a hivatkozás révén teljes egészében a találmány részét képezi.
1. Bevezetés
A találmány olyan új vegyületekkel kapcsolatos, melyek képesek a tirozin-kináz jelátalakítás modulálására, szabályozására és/vagy gátlására. A találmány ezenkívül kapcsolatos olyan eljárásokkal is, melyek akár a receptorcsoportba, akár a nem receptor csoportba tartozó tirozin-kinázok szabályozására, modulálására vagy gátlására vonatkoznak, a szabályozatlan tirozin-kináz jelátalakítással kapcsolatos rendellenességek, így például a sejtburjánzásos és anyagcsere-rendellenességek megelőzése és/vagy kezelése céljából.
2. A találmány háttere
A protein-tirozin-kinázok (PTK-k) az olyan fehérjék egy nagy és szerteágazó osztályát foglalják magukban, melyek enzimatikus aktivitással rendelkeznek. A protein-tirozin-kinázok fontos szerepet játszanak a sejtek növekedésének és differenciálódásának irányításában (áttekintés céljából lásd: Schlesinger & Ullrich, 1992, Neuron 9: 383-391).
A receptor tirozin-kináz által közvetített jelátalakítást például egy specifikus növekedési faktorral (ligandummal) való extracelluláris kölcsönhatás indítja el, amit receptordimerizáció, az inherens protein-tirozin-kináz-aktivitás átmeneti stimulálása és foszforiláció követ. Ily módon kötőhelyek keletkeznek az intracelluláris jelátalakító molekulák számára, ami citoplazmikus jelzőmolekulák egy sorával való komplexképződéshez vezet, ami elősegíti a megfelelő sejtválaszt (például sejt osztódását, az extracelluláris mikrokörnyezetre tett metabolikus hatásokat). Lásd: Schlesinger & Ullrich,
1992, Neuron 9: 303-391.
A receptor tirozin-kinázokat illetőleg azt is kimutatták, hogy a tirozinfoszforilációs helyek nagy affinitású kötőhelyül szolgálnak a jelzőmolekulák SH2 (src homológia) doménjei számára. Fantl és munkatársai, 1992, Cell 69: 413-423; Songyang és munkatársai, 1994, Mól. Cell. Bioi. 14:2777-2785; Songyang és munkatársai, 1993, Cell 72: 767-778 és Koch és munkatársai, 1991, Science 252: 668-678. Több olyan intracelluláris szubsztrát proteint azonosítottak, melyek a receptor tirozin-kinázokhoz (RTK-k) kapcsolódnak. Ezek két fő csoportra oszthatók: (1) azon szubsztrátok, melyek katalitikus doménnal rendelkeznek; és (2) azon szubsztrátok, melyekből hiányzik az ilyen dómén, de amelyek adapterekként szolgálnak és katalitikusán aktív molekulákhoz kapcsolódnak. Songyang és munkatársai,
1993, Cell 72: 767-778. A receptorok vagy proteinek és a szubsztrátjaik SH2 doménjei közötti kölcsönhatások tulajdonságait a foszforilált tirozinreziduumokat azonnal körülvevő aminosavreziduumok határozzák meg. Az SH2 domének és az egyes receptorokon lévő foszfotirozinreziduumokat körülvevő aminosavszekvenciák közötti kötések közti különbségek összhangban vannak a szubsztrátjaik foszforilációs profiljai között megfigyelt különbségekkel. Songyang és munkatársai, 1993, Cell 72: 767-778. Ezek a megfigyelések azt sugallják, hogy az egyes receptor tirozin-kinázok funkcióját nemcsak expressziós formájuk és ligandumelérhetőségük határozza meg, hanem a bizonyos receptorok által aktivált jelátalakítási csatornák sora is. így a foszforiláció olyan fontos szabályozólépést jelent, ami meghatározza a specifikus növekedési faktor receptorok, valamint differenciálódási faktor receptorok által felfrissített jelátalakítási csatornák szelektivitását.
A protein-tirozin-kinázokban létrejövő rendellenes expresszióról vagy mutációkról kimutatták, hogy azok szabályozatlan sejtburjánzáshoz (például rosszindulatú tumornövekedéshez) vagy kulcsfontosságú fejlődési folyamatok defektusaihoz vezetnek. Ennek következtében az orvosi társadalom jelentős összegeket fordít a protein-tirozin-kináz család tagjainak specifikus biológiai szerepének megismerésének, a differenciálódási folyamatokban betöltött szerepük, a daganatképződésben és más betegségek kialakulásában betöltött szerepük és a ligandumstimulálás hatására aktivált jelátalakítási csatornáik alapjául szolgáló biokémiai mechanizmusaik megismerésére, valamint új gyógyszerek kifejlesztésére.
A tirozin-kináz lehet receptor típusú (extracelluláris, transzmembrán és intracelluláris doménekkel), vagy nem receptor típusú (mely teljesen intracelluláris).
A receptor tirozin-kinázok. A receptor tirozin-kinázok a transzmembrán receptorok egy változatos biológiai tulajdonságokkal rendelkező nagy családját tartalmazzák. A receptor tirozin-kinázok inherens funkciói a ligandum kötésekor aktiválódnak, ami a receptor és az összetett celluláris szubsztrátok foszforilációját, ezt követően pedig celluláris válaszreakciók sorát eredményezi. Ullrich és Schlessinger, 1990, Cell 61: 203-212.
Eddig legalább tizenkilenc (19) különböző receptor tirozin-kináz alcsaládot azonosítottak. Az egyik receptor tirozin-kináz alcsaládról, melyet HER alcsaládként jelölnek, úgy gondolják, hogy az tartalmazza az EGFR, a HER2, a HER3 és a HER4 alcsaládokat. A receptorok HER alcsaládjához tartozó ligandumok közé tartozik például az epiteliális növekedési faktor [EGF (epithelial growth factor)], a TGF-α, az amfiregulin, a ΗΒ-EGF, a betacellulin és a heregulin.
A receptor tirozin-kinázok egy másik családja, melyet inzulinalcsaládnak neveznek, az INS-R, az IGF-1R és az IR-R alcsaládokat tartalmazza. Egy harmadik család, a „PDGF” alcsalád a PDGF a- és β-receptorokat, a CSFIR-t, a c-kit-et és az FLK-ll-t tartalmazza. A receptor tirozin-kinázok egy másik alcsaládja, melyet FLK családként azonosítottak, ismereteink szerint a Kinase inser Domain-Receptor magzati máj kináz-1 -et (fetal liver kinase) (KDR/FLK—1), a magzati máj kináz 4-et (fetal liver 4) és az fms típusú tirozin-kináz 1-et (fit—1) tartalmazza. Eredetileg e receptorok mindegyikét a vérképző növekedési faktorok receptorainak gondolták. A receptor tirozin-kinázok két további alcsaládját FGF receptor családnak (FGFR1, FGFR2, FGFR3 és FGFR4), valamint Met alcsaládnak (c-met és Ron) nevezik.
HU 226 755 Β1
A PDGF és az FLK alcsaládok közötti hasonlóságok miatt e két alcsaláddal gyakran együtt foglalkoznak. Az ismert receptor tirozin-kináz alcsaládok leírása megtalálható Plowman és munkatársai cikkében [1994, DN&P 7 (6): 334-339], mely a hivatkozás révén a találmány részét képezi.
A nem receptor tirozin-kinázok. A nem receptor tirozin-kinázok olyan celluláris enzimekből állnak, melyekből hiányoznak az extracelluláris és a transzmembrán szekvenciák. Eddig tizenegy (11) alcsaládba (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fák, Jak, Ack és LIMK) tartozó, több mint huszonnégy nem receptor tirozin-kinázt azonosítottak. Jelenleg a nem receptor tirozin-kinázok Ser alcsaládja tartalmazza a legtöbb protein-tirozin-kinázt; idetartozik például az Ser, a Yes, a Fyn, a Lyn, az Lek, a Blk, a Hck, az Fgr és az Yrk. Az enzimek Ser alcsaládja az onkogenezishez kapcsolódik. A nem receptor tirozin-kinázok részletesebb leírását Bólén cikke adja meg (1993, Oncogene 8: 2025-2031), mely a hivatkozás révén a találmány részét képezi.
A tirozin-kinázok közül, mind a receptor tirozin-kinázok, mind pedig a nem receptor tirozin-kinázok közül sokról kiderült, hogy kapcsolatos a celluláris jelcsatornákkal, ami celluláris jelvizsgálatokhoz vezetett, melyek során megjelölték azokat a csatornákat, melyek patogén állapotokhoz, így például rákhoz, pikkelysömörhöz és túlfokozott immunválasz-reakciókhoz vezetnek.
A protein-tirozin-kinázok modulálására szolgáló vegyületek kifejlesztése. A protein-tirozin-kinázoknak a sejtburjánzás kontrollálásában, szabályozásában és modulálásában, valamint a rendellenes sejtburjánzással kapcsolatos betegségekben és rendellenességekben gyanított fontosságának fényében nagy erőfeszítéseket tettek a receptor tirozin-kinázok és nem receptor tirozin-kinázok „inhibitorainak” azonosítására, többféle megközelítésből kiindulva, például mutáns ligandumok felhasználásával (4966849 számú amerikai szabadalmi leírás), oldható receptorok és antitestek felhasználásával (WO 94/10202 számú beadvány; Kendall & Thomas, 1994, Proc. Nat’l Acad. Sci. 90: 10705-09; Kim és munkatársai, 1993, Natúré 362: 841-844), RNS-ligandumok felhasználásával (Jelűnek és munkatársai, Biochemistry 33: 10450-56; Takano és munkatársai, 1993, Mól. Bio. Cell 4: 358A; Kinsella és munkatársai, 1992, Exp. Cell Rés. 199: 56-62; Wright és munkatársai, 1992, J. Cellular Phys. 152: 448-57) és tirozin-kináz-inhibitorok felhasználásával (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808 és US 5330992 számú szabadalmi leírások, Mariani és munkatársai 1994, Proc. Am. Assoc. Cancer Rés. 35: 2268).
A közelmúltban több kísérletet tettek olyan kis molekulák beazonosítására, melyek tirozin-kináz-inhibitorokként viselkednek. Például a biszmonociklikus, a biciklikus és a heterociklusos arilvegyületeket (PCT WO 92/20642), a vinilén-aza-indol-származékokat (PCT WO 94/14808) és az 1-ciklopropil-4-piridilkinolonokat (5330992 számú amerikai szabadalmi leírás) írták le általánosan tirozin-kináz-inhibitorokként. A rák kezelésében alkalmazható, tirozin-kináz-inhibitorokként felhasználható vegyületekként írták le a sztirilvegyületeket (5217999 számú amerikai szabadalmi leírás), a sztiril-szubsztituált-piridil-vegyületeket (5302606 számú amerikai szabadalmi leírás), bizonyos kinazolinszármazékokat (0 566 266 A1 számú EP szabadalmi leírás), a szeleoindolokat és a szelenideket (PCT WO 94/03427), a triciklusos polihidroxilvegyületeket (PCT WO 92/21660) és a benzil-foszfonsav-vegyületeket (PCT WO 91/15495).
Ily módon kívánatos és a találmány tárgyát képezi az olyan, elegendően kis méretű vegyületek beazonosítása, melyek specifikusan gátolják a jelátalakítást a receptor tirozin-kinázok és a nem receptor tirozin-kinázok aktivitásának modulálásával, hogy szabályozzák és modulálják az abnormális és nem megfelelő sejtburjánzást.
3. A találmány összefoglalása
A találmány olyan szerves molekulákkal kapcsolatos, melyek képesek a tirozin-kináz jelátalakítás modulálására, szabályozására és/vagy gátlására. Az ilyen vegyületek hasznosak az olyan betegségek kezelésében, melyek a szabályozatlan tirozin-kináz jelátalakítással kapcsolatosak, így a sejtburjánzásos betegségek kezelésében, amilyen például a rák, az atheroszklerózis, az ízületi gyulladás vagy a resztenózis, valamint az olyan anyagcsere-betegségek kezelésében, mintamilyen például a cukorbaj.
A találmány tárgyát az (I) általános képletű vegyületek vagy azok gyógyászatilag elfogadható sói képezik, ahol
R-ι jelentése hidrogénatom;
R2 jelentése oxigénatom vagy kénatom;
R3 jelentése hidrogénatom;
R4, R5, R6 és R7 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, alkilcsoport, alkoxicsoport, arilcsoport, aril-oxi-csoport, alkarilcsoport, alkaril-oxi-csoport, halogénatom, trihalogén-metil-csoport, -S(O)R csoport, -SO2NRR’ csoport, -SO3R csoport, -SR csoport, -NO2 csoport, -NRR’ csoport, -OH csoport, -CN csoport, -C(O)R csoport, -OC(O)R csoport, -NHC-(O)R csoport, -(CH2)nCO2R csoport és -CONRR’ csoport;
A jelentése egy öttagú heteroarilgyűrű, amelyet a tiofenil-, pirrolil-, pirazolil-, 1,2,3-triazolil-, 1,2,4-triazolil-, oxazolil-, izoxazolil-, tiazolil-, izotiazolil-, 2-szulfonilfuril-, 4-alkil-furil-, 1,2,3-oxadiazolil-, 1,2,4-oxadiazolil-, 1,2,5-oxadiazolil-, 1,3,4-oxadiazolil-, 1,2,3,4-oxatriazoΙΪΙ-, 1,2,3,5-oxatriazolil-, 1,2,3-tiadiazolil-, 1,2,4-tiadiazoΙΪΙ-, 1,2,5-tiadiazolil-, 1,3,4-tiadiazolil-, 1,2,3,4-tiatriazolil-, 1,2,3,5-tiatriazolil- és tetrazolilcsoportot magában foglaló csoportból választjuk, melyek adott esetben egy vagy több pozícióban alkilcsoporttal, alkoxicsoporttal, arilcsoporttal, aril-oxi-csoporttal, alkarilcsoporttal, alkaril-oxi-csoporttal, halogénatommal, trihalogén-metilcsoporttal, -S(O)R csoporttal, -SO2NRR’ csoporttal, -SO3R csoporttal, -SR csoporttal, -NO2 csoporttal, -NRR’ csoporttal, -OH csoporttal, -CN csoporttal, -C(O)R csoporttal, -OC(O)R csoporttal, -NHC(O)R csoporttal, -(CH2)nCO2R csoporttal vagy -CONRR’ csoporttal vannak szubsztituálva;
HU 226 755 Β1 n értéke 0-3;
R jelentése hidrogénatom, alkilcsoport vagy arilcsoport és
R’ jelentése hidrogénatom, alkilcsoport vagy arilcsoport, ahol a fenti kifejezéseknél az alkilcsoport 1-12 szénatomot tartalmazó, egyenes vagy elágazó láncú vagy ciklusos lánccal rendelkező alifás szénhidrogéncsoport, amely adott esetben egy vagy több, az alábbi csoportból választott szubsztituenssel helyettesített: hidroxilcsoport, cianocsoport, =0, =S, NO2, halogénatom, -N(CH3)2, aminocsoport és -SH-csoport;
az arilcsoport jelentése egy olyan aromás csoport, amely legalább egy konjugált pi-elektronrendszerrel rendelkező gyűrűt tartalmaz, beleértve a karbociklusos aril-, a heterociklusos aril- és a biarilcsoportokat, és amely arilcsoport adott esetben egy vagy több, az alábbi csoportból választott szubsztituenssel helyettesített: halogénatom, trihalogén-metil-csoport, hidroxilcsoport, -SH, -OH, -NO2, -SR általános képletű csoport, ahol R jelentése alkilcsoport, arilcsoport vagy alkil-arilcsoport, cianocsoport, alkoxicsoport, alkilcsoport és aminocsoport;
az alkarilcsoport jelentése egy olyan alkilcsoport, amely kovalensen kötődik egy arilcsoporthoz; és az alkoxicsoport, az aril-oxi-csoport és az alkariloxi-csoport —Ο-alkil-, —O-aril- és -O-alkaril-csoportot jelent;
azzal a kikötéssel, hogy a vegyületek az alábbi vegyietektől eltérőek:
3-(pirrol-2-il-metilén)-2-indolinon;
3-(5-klór-3,4-dimetil-pirrol-2-il-metilén)-2-indolinon;
3-(3,5-dimetil-4-etil-pirrol-2-il)-2-indolinon;
3-(3,5-dimetil-4-etoxi-karbonil-pirrol-2-il)-2-indolinon;
2- [[[1 -etil-2,3-di hidro-2-oxo-3-(1 H-pirrol-2-il-metilén)-1H-indol-5-il]-oxi]-metil]-benzoesav;
3- (tién-2-il-metilén)-2-indolinon;
6-dietil-amino-3-[(izotiazol-2-il)-metilén]-2-indolinon;
5- klór-3-[(tiazol-2-il)-metilén]-2-indolinon; és
6- nitro-3-[(pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinon.
A találmány további tárgya olyan gyógyszerkészítmények megadása, melyek a fentebb leírt, I általános képlettel jellemezhető vegyületek gyógyszerészeti szempontból hatékony mennyiségét tartalmazzák egy gyógyszerészeti szempontból elfogadható hordozó vagy oldószer mellett. Az ilyen gyógyszerkészítmények legjobb tudomásunk szerint modulálják a tirozin-kináz általi jelátalakítást, akár a katalitikus aktivitás gátlásával, az ATP felé mutatott affinitás gátlásával, vagy egy szubsztráttal való kölcsönhatásra vonatkozó képesség gátlásával.
Részletesebben, a találmány készítményei felhasználhatók olyan eljárásokban, melyek olyan betegségek kezelésére vonatkoznak, mint amilyen például a sejtburjánzás, a fibrotikus vagy anyagcsere-rendellenességek, így például a rák, a rostos elfajulás (fibrózis), a pikkelysömör, az atheroszklerózis, az ízületi gyulladás, valamint más, a rendellenes érfejlődéssel és/vagy érképződéssel kapcsolatos betegségek, mint amilyen például a diabetikus recehártya-betegség.
Szintén a találmány tárgyát képezi az (I) általános képletű vegyületek alkalmazása a tirozin-kináz jelátalakítással kapcsolatos rendellenességek kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására.
4. A találmány részletes leírása
4.1. Definíciók
A „gyógyszerészeti szempontból elfogadható sók” kifejezés olyan sókra utal, melyek megtartják a megfelelő szabad bázis biológiai hatékonyságát és tulajdonságait, és amelyeket olyan szervetlen savakkal való reakció útján kapunk meg, mint amilyen például a sósav, hidrobrómsav, a kénsav, a salétromsav, a foszforsav, a metánszulfonsav, az etánszulfonsav, a p-toluénszulfonsav, a szalicilsav, valamint más hasonló savak.
Az „alkilcsoport” kifejezés egyenes láncú, elágazásos vagy ciklikus, telített alifás szénhidrogéncsoportokra vonatkozik. Előnyösen az alkilcsoport 1-12 szénatomot tartalmaz. Még előnyösebben a kifejezés olyan kis szénatomszámú alkilcsoportokra utal, melyek
1-7 szénatomot, még előnyösebben pedig 1-4 szénatomot tartalmaznak. A jellegzetes alkilcsoportok közé tartozik például a metilcsoport, az etilcsoport, a propilcsoport, az izopropilcsoport, a butilcsoport, az izobutilcsoport, a tercier butilcsoport, a pentilcsoport, a hexilcsoport, valamint más hasonló csoportok. Az alkilcsoport adott esetben szubsztituálva lehet egy vagy több olyan szubsztituenssel, mely szubsztituensek lehetnek hidroxilcsoportok, cianocsoportok, alkoxicsoportok, =O-csoportok, =S-csoportok, NO2-csoportok, halogénatomok, N(CH3)2-csoportok, aminocsoportok vagy SH-csoportok.
Az „alkenilcsoport” kifejezés olyan egyenes láncú, elágazásos vagy ciklikus, telítetlen alifás szénhidrogéncsoportokra vonatkozik, melyek legalább egy szénszén kettős kötést tartalmaznak. Előnyösen az alkenilcsoport 1-12 szénatomot tartalmaz. Még előnyösebben a kifejezés olyan kis szénatomszámú alkenilcsoportokra utal, melyek 1-7 szénatomot, még előnyösebben pedig 1-4 szénatomot tartalmaznak. Az alkenilcsoport adott esetben szubsztituálva lehet egy vagy több olyan szubsztituenssel, mely szubsztituensek lehetnek hidroxilcsoportok, cianocsoportok, alkoxicsoportok, =O-csoportok, =S-csoportok, NO2-csoportok, halogénatomok, N(CH3)2-csoportok, aminocsoportok vagy SH-csoportok.
Az „alkinilcsoport” kifejezés olyan egyenes láncú, elágazásos vagy ciklikus, telítetlen alifás szénhidrogéncsoportokra vonatkozik, melyek legalább egy szénszén hármas kötést tartalmaznak. Előnyösen az alkinilcsoport 1-12 szénatomot tartalmaz. Még előnyösebben a kifejezés olyan kis szénatomszámú alkinilcsoportokra utal, melyek 1-7 szénatomot, még előnyösebben pedig 1-4 szénatomot tartalmaznak. Az alkinilcsoport adott esetben szubsztituálva lehet egy vagy több olyan szubsztituenssel, mely szubsztituensek lehetnek hidroxilcsoportok, cianocsoportok, alkoxicsoportok,
HU 226 755 Β1 =O-csoportok, =S-csoportok, NO2-csoportok, halogénatomok, N(CH3)2-csoportok, aminocsoportok vagy SH-csoportok.
Az „alkoxicsoport” kifejezés ,,-O-alkil-csoportokat” jelöl.
Az „arilcsoport kifejezés olyan aromás csoportokat jelöl, melyek legalább egy olyan gyűrűt tartalmaznak, melyben konjugált π-elektronrendszer van. Az ilyen csoportok közé tartoznak a karbociklusos árucsoportok, a heterociklusos arilcsoportok és a biarilcsoportok. Az arilcsoport adott esetben szubsztituálva lehet egy vagy több olyan szubsztituenssel, mely szubsztituensek lehetnek halogénatomok, trihalometilcsoportok, hidroxilcsoportok, SH-csoportok, OH-csoportok, NO2csoportok, amincsoportok, tioétercsoportok, cianocsoportok, alkoxicsoportok, alkilcsoportok vagy aminocsoportok.
Az „alkarilcsoport” kifejezés olyan alkilcsoportokat jelöl, melyek kovalens kötéssel kapcsolódnak egy árucsoporthoz. Az alkilcsoport ebben az esetben előnyösen egy kis szénatomszámú alkilcsoport.
A „karboxiciklusos arilcsoport” kifejezés olyan árucsoportokat jelöl, melyekben a gyűrű atomjai szénatomok.
A „heterociklusos arilcsoport” kifejezés olyan árucsoportokat jelöl, melyekben a gyűrű atomjai között 1-3 heteroatom található, míg a gyűrű többi atomja szénatom. A lehetséges heteroatomok közé tartozik az oxigénatom, a kénatom és a nitrogénatom. így a heterociklusos arilcsoportok közé tartozik például a furanilcsoport, a tienilcsoport, a piridilcsoport, a pirrolilcsoport, az N-kis szénatomszámú alkil-pirrolo-csoport, a pirimidilcsoport, a pirazi ni lesöpört, az imidazolilcsoport, valamint más hasonló csoportok.
Az „amidcsoport” kifejezés -C(O)-NH-R jellegű csoportokat jelöl, ahol R jelentése alkilcsoport, arilcsoport, alkil-aril-csoport vagy hidrogénatom.
A „tioamidcsoport” kifejezés -C(S)-NH-R jellegű csoportokat jelöl, ahol R jelentése alkilcsoport, arilcsoport, alkil-aril-csoport vagy hidrogénatom.
Az „amincsoport” kifejezés -N(R’)R” jellegű csoportokat jelöl, ahol R’ és R” jelentése egymástól függetlenül alkilcsoport, arilcsoport vagy alkil-aril-csoport.
A „tioéter” kifejezés -S-R jellegű csoportokat jelöl, ahol R jelentése alkilcsoport, arilcsoport vagy alkil-arilcsoport.
A „szulfonilcsoport” kifejezés S(O)2-R jellegű csoportokat jelöl, ahol R jelentése arilcsoport, C(CN)=Caril-csoport, CH2CN-csoport, alkil-aril-csoport, szulfonamidcsoport, NH-alkil-csoport, NH-alkil-aril-csoport vagy NH-aril-csoport.
4.2. A találmány
A találmány olyan vegyületekkel kapcsolatos, melyek képesek a tirozin-kináz jelátalakítás, részletesebben a receptor tirozin-kináz és a nem receptor tirozinkináz jelátalakítás szabályozására és/vagy modulálására.
A receptor tirozin-kináz által közvetített jelátalakítást például egy specifikus növekedési faktorral (ligandummal) való extracelluláris kölcsönhatás indítja el, amit receptordimerizáció, az inherens protein-tirozin-kináz-aktivitás átmeneti stimulálása és foszforiláció követ. Ily módon kötőhelyek keletkeznek az intracelluláris jelátalakító molekulák számára, ami citoplazmikus jelzőmolekulák egy sorával való komplexképzödéshez vezet, ami elősegíti a megfelelő sejtválaszt (például sejt osztódását, az extracelluláris mikrokörnyezetre tett metabolikus hatásokat). Lásd: Schlesinger & Ullrich, 1992, Neuron 9: 303-391.
Kimutatták, hogy a tirozin foszforilációs helyek nagy affinitású kötőhelyül szolgálnak a jelzőmolekulák SH2 (src homológia) doménjei számára. Fantl és munkatársai, 1992, Cell 69: 413—423; Songyang és munkatársai, 1994, Mól. Cell. Bioi. 14: 2777-2785; Songyang és munkatársai, 1993, Cell 72: 767-778 és Koch és munkatársai, 1991, Science 252: 668-678. Több olyan intracelluláris szubsztrát proteint azonosítottak, melyek a receptor tirozin-kinázokhoz (RTK-k) kapcsolódnak. Ezek két fő csoportra oszthatók: (1) azon szubsztrátok, melyek katalitikus doménnal rendelkeznek; és (2) azon szubsztrátok, melyekből hiányzik az ilyen dómén, de amelyek adapterekként szolgálnak és katalitikusán aktív molekulákhoz kapcsolódnak. Songyang és munkatársai, 1993, Cell 72: 767-778. A receptorok vagy proteinek és a szubsztrátjaik SH2 doménjei közötti kölcsönhatások tulajdonságait a foszforilált tirozinreziduumokat azonnal körülvevő aminosavreziduumok határozzák meg. Az SH2 domének és az egyes receptorokon lévő foszfotirozinreziduumokat körülvevő aminosavszekvenciák közötti kötések közti különbségek összhangban vannak a szubsztrátjaik foszforilációs profiljai között megfigyelt különbségekkel. Songyang és munkatársai, 1993, Cell 72: 767-778. Ezek a megfigyelések azt sugallják, hogy az egyes receptor tirozinkinázok funkcióját nemcsak expressziós formájuk és ligandumelérhetőségük határozza meg, hanem a bizonyos receptorok által aktivált jelátalakítási csatornák sora is. így a foszforiláció olyan fontos szabályozólépést jelent, ami meghatározza a specifikus növekedési faktor receptorok, valamint differenciálódási faktor receptorok által felfrissített jelátalakítási csatornák szelektivitását.
A tirozin-kináz jelátalakítás eredménye többek között a sejtburjánzás, a sejtdifferenciálódás és a sejtanyagcsere. Az abnormális sejtburjánzás rendellenességek és betegségek hosszú sorát idézheti elő, így például elősegítheti a kóros szövetképződést, mint amilyen például a karcinóma, a szarkóma, a leukémia, a glioblastoma, a vérérdaganat, a pikkelysömör, az arteriosderosis, az ízületi gyulladás és a diabetikus recehártya-betegség (vagy más, a szabályozatlan érképződéssel és/vagy érfejlődéssel kapcsolatos rendellenességek).
Ezért a találmány olyan vegyületekkel foglalkozik, melyek a receptor tirozin-kinázok és/vagy a nem receptor tirozin-kinázok enzimatikus aktivitására gyakorolt hatásuk révén, valamint az ilyen fehérjék által átalakított jelek megváltoztatásával szabályozzák, modulálják és/vagy gátolják a tirozin-kináz jelátalakítást. Részletesebben a találmány olyan vegyületekkel kapcsolatos,
HU 226 755 Β1 melyek szabályozzák, modulálják és/vagy gátolják a receptor tirozin-kinázok és/vagy a nem receptor tirozinkinázok által közvetített jelátalakítási csatornákat; a tömör tumor sok fajtájának a gyógyítására vonatkozó gyógyászati megközelítésként. Az itt megemlíthető betegségek közé tartozik, a rájuk való korlátozás nélkül a karcinóma, a szarkóma, a leukémia, a magvas vörösvérsejt-daganat, a glioblastoma, az agyhártyadaganat, az astrocytoma, a melanoma és az izomsejtdaganat. A tünetek közé tartoznak, a rájuk való korlátozás nélkül az agydaganatok, a hólyagdaganatok, gyomorrákok, a hasnyálmirigyrák, a petefészekrák, a vastagbélrák, a vérrákok, a tüdőrákok és a csontrákok.
4.3. A vegyületek
A találmány szerinti vegyületek az (I) általános képletű vegyületek vagy azok gyógyászatilag elfogadható sói, ahol
R1 jelentése hidrogénatom;
R2 jelentése oxigénatom vagy kénatom;
R3 jelentése hidrogénatom;
R4, R5, R6 és R7 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, alkilcsoport, alkoxicsoport, arilcsoport, aril-oxi-csoport, alkarilcsoport, alkaril-oxi-csoport, halogénatom, trihalogén-metil-csoport, -S(O)R csoport, -SO2NRR’ csoport, -SO3R csoport, -SR csoport, -NO2 csoport, -NRR’ csoport, -OH csoport, -CN csoport, -C(O)R csoport, -OC(O)R csoport, -NHC-(O)R csoport, -(CH2)nCO2R csoport és -CONRR’ csoport;
A jelentése egy öttagú heteroarilgyűrű, amelyet a tiofenil-, pirrolil-, pirazolil-, 1,2,3-triazolil-, 1,2,4-triazoΙΪΙ-, oxazolil-, izoxazolil-, tiazolil-, izotiazolil-, 2-szulfonilfuril-, 4-alkil-furil-, 1,2,3-oxadiazolil-, 1,2,4-oxadiazolil-, 1,2,5-oxadiazolil-, 1,3,4-oxadiazolil-, 1,2,3,4-oxatriazoΙΪΙ-, 1,2,3,5-oxatriazolil-, 1,2,3-tiadiazolil-, 1,2,4-tiadiazolil-, 1,2,5-tiadiazolil-, 1,3,4-tiadiazolil-, 1,2,3,4-tiatriazolil-, 1,2,3,5-tiatriazol i I- és tetrazolilcsoportot magában foglaló csoportból választjuk, melyek adott esetben egy vagy több pozícióban alkilcsoporttal, alkoxicsoporttal, árucsoporttal, aril-oxi-csoporttal, alkarilcsoporttal, alkaril-oxi-csoporttal, halogénatommal, trihalogén-metilcsoporttal, -S(O)R csoporttal, -SO2NRR’ csoporttal, -SO3R csoporttal, -SR csoporttal, -NO2 csoporttal, -NRR’ csoporttal, -OH csoporttal, -CN csoporttal, -C(O)R csoporttal, -OC(O)R csoporttal, -NHC(O)R csoporttal, -(CH2)nCO2R csoporttal vagy -CONRR’ csoporttal vannak szubsztituálva;
n értéke 0-3;
R jelentése hidrogénatom, alkilcsoport vagy arilcsoport és
R’ jelentése hidrogénatom, alkilcsoport vagy arilcsoport, ahol a fenti kifejezéseknél az alkilcsoport 1-12 szénatomot tartalmazó, egyenes vagy elágazó láncú vagy ciklusos lánccal rendelkező alifás szénhidrogéncsoport, amely adott esetben egy vagy több, az alábbi csoportból választott szubsztituenssel helyettesített: hidroxicsoport, cianocsoport, -0, -S, NO2, halogénatom, -N(CH3)2, aminocsoport és -SH-csoport;
az arilcsoport jelentése egy olyan aromás csoport, amely legalább egy konjugált pi-elektronrendszerrel rendelkező gyűrűt tartalmaz, beleértve a karbociklusos aril-, a heterociklusos aril- és a biarilcsoportokat, és amely arilcsoport adott esetben egy vagy több, az alábbi csoportból választott szubsztituenssel helyettesített: halogénatom, trihalogén-metil-csoport, hidroxilcsoport, -SH, -OH, -NO2, -SR általános képletű csoport, ahol R jelentése alkilcsoport, arilcsoport vagy alkil-arilcsoport, cianocsoport, alkoxicsoport, alkilcsoport és aminocsoport;
az alkarilcsoport jelentése egy olyan alkilcsoport, amely kovalensen kötődik egy árucsoporthoz; és az alkoxicsoport, az aril-oxi-csoport és az alkariloxi-csoport —Ο-alkil-, —O-aril- és -O-alkaril-csoportot jelent;
azzal a kikötéssel, hogy a vegyületek az alábbi vegyietektől eltérőek:
3-(pirrol-2-il-metilén)-2-indolinon;
3-(5-klór-3,4-dimetil-pirrol-2-il-metilén)-2-indolinon;
3-(3,5-dimetil-4-etil-pirrol-2-il)-2-indolinon;
3-(3,5-dimetil-4-etoxi-karbonil-pirrol-2-il)-2-indolinon;
2- [[[1 -etil-2,3-dihidro-2-oxo-3-( 1 H-pirrol-2-il-metilén)-1H-indol-5-il]-oxi]-metil]-benzoesav;
3- (tién-2-il-metilén)-2-indolinon;
6-dietil-amino-3-[(izotiazol-2-il)-metilén]-2-indolinon;
5- klór-3-[(tiazol-2-il)-metilén]-2-indolinon; és
6- nitro-3-[(pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinon.
Előnyös találmány szerinti vegyület a 3-[(2,4-dimetil-pirrol-5-il)-metilén]-2-indolinon.
Az említett vegyületek mutathatják a tautoméria vagy a strukturális izoméria jelenségét. így például az itt leírt vegyületek fölvehetik a cisz- vagy a transz-konformációt az indolinon 3-szubsztituense és az indolinongyűrű közötti kettős kötésnél, vagy lehetnek a ciszés a transz-izomerek keverékei is. Mivel a leírásban szereplő formulák rajza csak egy lehetséges tautomer vagy strukturális izomer formációt reprezentálhat, azért világosan kell látni, hogy a találmány magában foglal minden olyan tautomer vagy strukturális izomer formát, valamint ilyenek keverékét, melyben megvan a képesség a tirozin-kináz jelátalakítás vagy a sejtburjánzás szabályozására, gátlására és/vagy modulálására; és így a találmány nem korlátozódik azon tautomer vagy strukturális izomer formációkra, melyeket a formulák megrajzolásánál alapul vettünk.
A fentebb leírt vegyületeken és azok gyógyszerészeti szempontból elfogadható sóin túlmenően, ahol arra mód van, a találmány vonatkozik a vegyületek olyan szolvatált és nem szolvatált formáira is (például a hidratált formákra), melyekben megvan a képesség a sejtburjánzás szabályozására és/vagy modulálására.
Az itt leírt vegyületek minden olyan ismert módszerrel előállíthatok, mely módszerek alkalmazhatók más, kémiailag rokon vegyületek előállítására. Alkalmas eljárások bemutatása a példák között található meg. A szükséges kiindulási anyagok szokásos szerves kémiai eljárások felhasználásával állíthatók elő. Egy adott
HU 226 755 Β1 vegyület releváns aktivitása és a receptor tirozin-kinázok által közvetített jelátalakításra hatást gyakorló szerként való hatékonysága rendelkezésre álló eljárások felhasználásával határozható meg. Előnyösen a vegyületet egy sor vizsgálatnak vetjük alá, hogy meghatározzuk arra vonatkozó képességét, hogy modulálja, szabályozza és/vagy gátolja a sejtburjánzást. Ezek a vizsgálatok, a végrehajtásuk sorrendjében, biokémiai vizsgálatokból, sejtnövekedési vizsgálatokból és in vivő kísérletekből állnak.
4.4. Tünetek
Az itt leírt vegyületek hasznosak az olyan rendellenességek kezelésében, melyek a szabályozatlan tirozin-kináz jelátalakítással kapcsolatosak. Az ilyen rendellenességek közé tartoznak a sejtburjánzásos betegségek, a fibrotikus rendellenességek és az anyagcsere-rendellenességek.
Azok közé a sejtburjánzásos betegségek közé, melyek a találmány alapján kezelhetők vagy tovább vizsgálhatók, tartoznak a rákos megbetegedések, az erek burjánzásos rendellenességei, valamint a mezangiális sejtburjánzásos rendellenességek.
Az erek burjánzásos rendellenességei olyan angiogén és vaszkulogén rendellenességeket jelentenek, melyek általában az erek abnormális burjánzását eredményezik. Az erek képződése és terjeszkedése, vagy más néven a vaszkulogenezis és az angiogenezis, sok fiziológiai folyamatban játszanak fontos szerepet, így például az embrionális fejlődésben, a corpus luteum képződésben, a sebek gyógyulásában és a szervregenerálódásban. Ezenkívül kulcsfontosságú szerepet játszanak a rák kifejlődésében is. Az erek burjánzásos rendellenességeire ad további példát az ízületi gyulladás, ahol is új hajszálerek lepik el az ízületet és tönkreteszik a porcot; az olyan szembetegségek, mint amilyen például a diabetikus recehártya-betegség, ahol a retinában új hajszálerek lepik el az üvegtestet, és vérzésükkel vakságot okoznak. Ezzel szemben az erek összezsugorodásával, kontrakciójával vagy elzáródásával kapcsolatos rendellenességek, mint amilyen például a restenosis, szintén szóba jöhetnek.
A fibrotikus rendellenességek a sejtközi állomány abnormális képződését jelentik. A fibrotikus rendellenességekre ad példát a hepaticus cirrhosis és a mezangiális sejtburjánzásos rendellenességek. A hepaticus cirrhosist a sejtközi állomány alkotórészeinek elszaporodása jellemzi, ami a máj hegesedéséhez vezet. A hepaticus cirrhosis olyan betegségeket idézhet elő, mintamilyen például a máj cirrhosisos megbetegedése. A máj hegesedéséhez vezető megnövekedett sejtközi állomány eredménye lehet olyan vírusfertőzésnek is, mint amilyen például a hepatitis. Úgy tűnik, hogy a zsírsejtek fontos szerepet játszanak a hepaticus cirrhosisban. Az egyéb idetartozó fibrotikus rendellenességek közé tartozik az atheroszklerózis (lásd alább).
A mezangiális sejtburjánzásos rendellenességek olyan rendellenességeket jelentenek, melyek a mezangiális sejtek abnormális burjánzásából fakadnak. A mezagniális burjánzásos rendellenességek közé tartozik többféle humán vesebetegség, mint amilyen például a glomerulonephritis, a diabetikus vesebaj, a rosszindulatú vesezsugorodás, a trombózisos hajszálérbetegség tünetcsoport, a szervátültetéseknél megfigyelhető kilökődés és a glomerulopathiák. A mezangiális sejtburjánzás fenntartásáért a PDGF-R a felelős. Floege és munkatársai, 1993, Kidney International 43: 47S-54S.
A protein-tirozin-kinázok kapcsolatban vannak az ilyen sejtburjánzásos rendellenességekkel. így például a receptor tirozin-kináz család néhány tagja kapcsolatba hozható a rák kifejlődésével. E receptorok némelyike, így például az EGFR (Tűzi és munkatársai, 1991, Br. J. Cancer 63: 227-233; Trop és munkatársai, 1992, APMIS 100: 713-719), a HER2/neu (Slamon és munkatársai, 1989, Science 244: 707-712) és a PDGF-R (Kumabe és munkatársai, 1992, Oncogene 7: 627-633) sok tumorban túlzott mértékű és/vagy tartósan aktivált az autokrin hurkok által. Valójában a legelterjedtebb és legsúlyosabb rákok esetében ezeket a receptortúltengéseket (Akbasak és Suner-Akbasak és munkatársai, 1992, J. Neurol. Sci. 111: 119-133; Dickson és munkatársai, 1992, Cancer Treatment Rés. 61: 249-273; Köre és munkatársai, 1992, J. Clin. Invest. 90: 1352-1360) és autokrin hurkokat (Lee és Dongohue, 1992, J. Cell. Bioi. 118: 1057-1070; Köre és munkatársai, mint fentebb, Akbasak és Suner-Akbasak és munkatársai, mint fentebb) ki is mutatták. így például az EGFR receptort kapcsolatba hozták a pikkelyes sejtkarcinómával, az astrocytomával, a glioblastomával, a fej- és nyakrákkal, a tüdőrákkal és a hólyagrákkal. A HER2-t kapcsolatba hozták az emlőrákkal, a petefészekrákkal, a gyomorrákkal, a tüdőrákkal, a hasnyálmirigyrákkal és a hólyagrákkal. A PDGF-R-t kapcsolatba hozták a glioblastomával, a tüdőrákkal, a petefészekrákkal, a pigmentsejtes rákkal és a prosztatarákkal. Az RTK c-met általában a májrákképződéssel, és így a májsejtrákkal kapcsolatos. Ezen túlmenően a c-met kapcsolatos a rosszindulatú daganatképződéssel. Részletesebben, az RTK c-met más rákos megbetegedések között kapcsolatos a vastagbélrákkal, a pajzsmirigyrákkal, a hasnyálmirigyrákkal, a gyomorrákkal, a leukémiával és a nyirokszövet-daganattal. Ezen túlmenően a c-met gén túltengését megfigyelték Hodgkins-kóros és Burkitts-kóros betegeknél, valamint nyirokszövetráksejtek esetében is.
Az IGF-IR, azonkívül, hogy kapcsolatban van a tápanyagellátással és a II típusú cukorbajjal, több rákfajtával is kapcsolatba hozható. így például az IGF-I autokrin növekedés stimulátorként működik több tumortípus esetében is, így például a humán mellrákkarcinóma sejtjei (Arteaga és munkatársai, 1989, J. Clin. Invest. 84: 1418-1423) és a kis tüdőtumorsejtek (Macauley és munkatársai, 1990, Cancer Rés. 50: 2511-2517) esetében. Ezen túlmenően úgy tűnik, hogy az IGF—I, mely fontos szerepet játszik az idegrendszer normális növekedésében és differenciálódásában, egyben a humán gliomák egy autokrin stimulátora is. Sandberg-Nordqvist és munkatársai, 1993, Cancer Rés. 53: 2475-2478. Az IGF-IR és annak ligandumainak fontosságát a sejtburjánzásban alátámasztja az a tény is, hogy sejttenyészetben sokfajta sejtet [a kötőszöveti sej7
HU 226 755 Β1 teket, a hámsejteket, a simaizomsejteket, a T-limfocitákat, a csontvelősejteket, a porcsejteket, a csontképző sejteket, a csontvelő törzssejtjeit (stem cells)] is növekedésre serkent az IGF—I. Goldring és Goldring, 1991, Eukaryotic Gene Expression 1: 301-326. Mostanában megjelent publikációk sorozatában Baserga még azt is leírja, hogy az IGF-I-R központi szerepet játszik a degeneráció mechanizmusában, és mint ilyen, előnyben részesített célpont lehet a humán rosszindulatú daganatok széles spektrumú terápiás kezelésében. Baserga, 1995, Cancer Rés. 55: 249-252; Baserga, 1994, Cell 79: 927-930; Coppola és munkatársai, 1994, Mól. Cell Bioi. 14:4588-4595.
Azonban a receptor tirozin-kinázok rendellenességei és a betegségek közötti kapcsolat nem korlátozódik kizárólag a rákra. így például a receptor tirozin-kinázok kapcsolatba hozhatók olyan anyagcsere-betegségekkel is, mint amilyen például a pikkelysömör, a mellitcukorbaj, a sebgyógyulás, a gyulladás, valamint a neurodegeneratív betegségek. Az EGF-R például kapcsolatos a corneális és dermális sebgyógyulással. Az Insulin-R és az IGF—1R defektusai jelennek meg a II típusú mellitcukorbajban. Az egyes receptor tirozin-kinázok és terápiás megjelenéseik közötti teljesebb megfeleltetés megtalálható Plowman és munkatársai cikkében, 1994, DN&P 7: 334-339.
Nemcsak a receptor típusú tirozin-kinázok, hanem sok celluláris tirozin-kináz (CTK), így például az src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lek, blk, hek, fgr, yrk (összefoglalta Bólén és munkatársai, 1992, FASEB J. 6: 3403-3409) is kapcsolatos a sejtburjánzásos és metabolikus jelátalakítási csatornával; és így ezek is kapcsolatba hozhatók a találmány keretei közé tartozó tünetekkel. így például a mutáción átesett src-ről (v-sre) kimutatták, hogy az a csirkében egy onkoprotein (pp60v_src). Ezen túlmenően a celluláris homológja, a protoonkogén pp60c_src sok receptor onkogén jelét közvetíti. Az EGF-R vagy a HER2/neu tumorokban való túltengése például a pp60c_src lényeges aktiválásához vezet, ami jellemző a rosszindulatú sejtekre, de nem figyelhető meg a normális sejtek esetében. A másik oldalon, a c-scr expressziójára nézve fogyatékos egerek márványcsont-betegséges fenotípust mutatnak, azt jelezvén, hogy a c-scr kulcsfontosságú szerepet játszik az osteoclast funkciókban, és mint ilyen, kapcsolatban állhat ezzel kapcsolatos betegségekkel. Hasonlóan, a Zap 70 kapcsolatban van a T-sejt-jelzéssel.
Ezen túlmenően a találmány célját képezi azon celluláris tirozin-kinázok modulálására alkalmas vegyületek azonosítása, melyek a receptor tirozin-kináz blokkolók hatását növelik, vagy amelyek akár együttműködnek azokkal.
Végül mind a receptor tirozin-kinázok, mind a nem receptor tirozin-kinázok kapcsolatba hozhatók hiperimmun rendellenességekkel.
4.5. Gyógyszerkészítményekés azok beadási módjai
A fent leírt vegyületek embereknek beadhatók önmagukban vagy gyógyszerkészítmények formájában, megfelelő hordozókkal vagy oldószerekkel keverve. A vegyületek közvetlen felhasználásra való formulázásának technikái megtalálhatók a „Remington’s Pharmaceutical Sciences” című könyvben (Mack Publishing Co., Easton, PA, legutóbbi kiadás).
4.5.1. Az adminisztráció útjai
Az adminisztráció alkalmas útjai közé tartozik például az orális, a rektális, a nyálkahártyán keresztül történő vagy az intesztinális adminisztráció, a parenterális beadás, ideértve az intramuszkuláris, a szubkutáns és az intramedulláris injekciókat, valamint az intratekális, a közvetlen intraventrikuláris, az intravénás, az intraperitoneális, az intranazális és az intraokuláris injekciókat.
Másik lehetőségként a vegyületek alkalmazhatók lokálisan is, így például közvetlenül a tömör tumorba injekciózva azokat, gyakran egy raktározó vagy késleltetett felszívódású készítmény formájában.
Ezen túlmenően a gyógyszerek beadhatók célzott gyógyszer-felszabadító rendszerek formájában is, így például egy tumorspecifikus antitesttel borított liposzóma formájában. A liposzómák a tumort fogják megcélozni, és ott szelektíven fognak felszívódni.
4.5.2. Összetétel/előállítás
A találmány gyógyszerkészítményei önmagukban ismert eljárások felhasználásával állíthatók elő, így például hagyományos keverési, oldási, granulálási, drazsírozási, őrlési, emulgeálási, kapszulázási, felfogási vagy liofilezési eljárások felhasználásával.
így a találmánnyal összhangban felhasználható gyógyszerkészítmények hagyományos eljárások felhasználásával állíthatók elő, egy vagy több olyan fiziológiailag elfogadható hordozó felhasználásával, melyek olyan kötőanyagokat és segédanyagokat tartalmaznak, melyek elősegítik az aktív vegyületek feldolgozását gyógyszerészetileg alkalmazható készítményekké. A megfelelő formulázás az alkalmazás választott útjától függ.
Injekciók előállításához a találmány vegyületeit vizes oldatok formájában, előnyösen fiziológiailag összeférhető kiegyenlítő oldatok formájában használjuk fel, mint amilyen például a Hank-féle oldat, a Ringer-féle oldat vagy a fiziológiás sóoldat.
A nyálkahártyán keresztül való alkalmazáshoz az átjárandó gáthoz megfelelő penetránsokat használunk a készítményekben. Az ilyen penetránsok a szakemberek számára általában ismertek.
Orális alkalmazásra a vegyületeket úgy formulázhatjuk meg könnyen, hogy az aktív vegyületeket összekeverjük a szakemberek számára jól ismert gyógyszerészeti szempontból elfogadható hordozókkal. Az ilyen hordozók lehetővé teszik, hogy a találmány vegyületeiből tablettákat, drazsékat, kapszulákat, folyadékokat, zseléket, szirupokat, szuszpenziókat, valamint más hasonló készítményeket állítsunk elő, melyet a kezelésre szoruló beteg szájon át vehet be. Orális alkalmazásra való gyógyszerkészítményeket szilárd kötőanyagok felhasználásával állíthatunk elő tabletták vagy drazséma8
HU 226 755 Β1 gok formájában, adott esetben a keletkező elegy megőrlésével, a szemcsék elegyének feldolgozásával, és amennyiben szükséges, megfelelő segédanyagok hozzáadásával. A megfelelő kötőanyagok közé tartoznak különösen az olyan töltőanyagok, mint amilyenek például a cukrok, így például a laktóz, a szacharóz, a mannitol vagy a szorbitol; olyan cellulózkészítmények, mint amilyen például a kukoricakeményítő, a búzakeményítő, a rizskeményítő, a burgonyakeményítő, a zselatin, a tragakantmézga, a metil-cellulóz, a hidroxipropil-metil-cellulóz, a nátrium-karboxi-metil-cellulóz és/vagy a poli(vinil-pirrolidon) (PVP). Amennyiben az kívánatos, a készítményekhez dezintegrálószerek is adhatók, mint amilyen például a keresztkötéses poli(vinil-pirrolidon), az agar, az alginsav vagy annak egy sója, mint amilyen például a nátrium-alginát.
A drazsémagokat megfelelő bevonattal látjuk el. Erre a célra használhatók olyan telített cukoroldatok, melyek adott esetben tartalmazhatnak gumiarábikumot, talkot, poli(vinil-pirrolidon)-t, karbopolgélt, polietilénglikolt és/vagy titánium-dioxidot, lakkoldatokat és megfelelő szerves oldószereket vagy oldószerelegyeket. A tablettákhoz vagy a drazsék bevonatához festékanyagokat vagy pigmentanyagokat is hozzáadhatunk az azonosíthatóság kedvéért, vagy a különböző mennyiségű aktív vegyületet tartalmazó készítmények megjelölésére.
Az orálisan alkalmazható gyógyszerkészítmények közé tartoznak a zselatinból készült „push-fit” kapszulák, valamint a zselatinból és egy lágyítószerből, mint amilyen például a glicerol vagy a szorbitol, készült lágy, lezárt kapszulák. A push-fit kapszulák az aktív hatóanyagukat tartalmazhatják olyan töltőanyagokkal elkeverve, mint amilyen például a laktóz, olyan kötőanyagokkal elkeverve, mint amilyenek például a keményítők, és/vagy olyan lubrikánsokkal elkeverve, mint amilyen például a talk vagy a magnézium-sztearát; adott esetben további stabilizárószerekkel együtt. A lágy kapszulákban az aktív hatóanyag megfelelő folyadékokban, így például zsíros olajokban, folyékony paraffinban vagy folyékony polietilénglikolokban van feloldva vagy szuszpendálva. Ezenkívül ezek is tartalmazhatnak más stabilizálószereket. Az orális alkalmazásra szánt készítményeket az ilyen alkalmazáshoz megfelelő dózisokban kell előállítani.
Az orális (buccal) alkalmazáshoz a készítményeket hagyományos eljárások felhasználásával készült tabletták vagy pasztillák formájában állíthatjuk elő.
A találmánnyal összhangban álló inhalálásos adminisztrációra a vegyületeket kényelmesen aeroszolspray formájában hozhatjuk forgalomba, túlnyomásos palackokban vagy egy porlasztóban, megfelelő hajtógáz, például diklór-difluor-metán, triklór-fluor-metán, diklór-tetrafluor-etán, szén-dioxid, vagy más megfelelő gáz felhasználásával. Nyomás alatt lévő aeroszol esetében a dózisegységet egy olyan szelep segítségével állíthatjuk be, ami egy adott mennyiség kibocsátását biztosítja. Inhalálókészülékben vagy befúvókészülékben való alkalmazásra a például zselatinból készült kapszulákat és patronokat úgy állíthatjuk elő, hogy azok a vegyületnek és egy alkalmas poralapnak, például laktóznak vagy keményítőnek a porkeverékét tartalmazzák.
A vegyületekből készíthetők injekciózással, például egyszeri injekciózással vagy folyamatos infúzióval parenterálisan beadható készítmények is. Az injekciózásra szolgáló készítmények forgalomba hozhatók egységadagok formájában, például ampullák alakjában, vagy több adagot tartalmazó tartályokban, tartósítószer hozzáadása mellett. A készítmények előállíthatók szuszpenziók, oldatok vagy emulziók formájában, olajos vagy vizes hordozókban, és tartalmazhatnak olyan anyagokat, mint amilyenek például a szuszpendálószerek, a stabilizálószerek és/vagy a diszpergálószerek.
A parenterális alkalmazásra szolgáló gyógyszerkészítmények közé tartoznak az aktív vegyületek vízoldható formáinak vizes oldatai. Ezen túlmenően az aktív vegyületek szuszpenziói előállíthatók megfelelő olajos, beinjekciózásra alkalmas szuszpenziókként. A megfelelő lipofil oldószerek vagy hordozók közé tartoznak az olyan zsíros olajok, mint amilyen például a szezámolaj, az olyan zsírsav-észterek, mint amilyen például az etiloleát vagy a trigliceridek, vagy a liposzómák. A beinjekciózásra alkalmas vizes szuszpenziók olyan anyagokat tartalmazhatnak, melyek fokozzák a szuszpenzió viszkozitását, így például nátrium-karboxi-metil-cellulózt, szorbitolt vagy dextránt. Adott esetben a szuszpenzió tartalmazhat megfelelő stabilizálószereket vagy olyan szereket is, melyek megnövelik a vegyületek oldhatóságát, így lehetővé téve nagy koncentrációjú oldatok előállítását.
Másik lehetőségként az aktív hatóanyag lehet olyan por formájában, melyet felhasználás előtt elkeverünk egy megfelelő hordozóval, például steril, pirogénmentes vízzel.
A vegyületeket rektális készítmények formájában is előállíthatjuk, például kúpok vagy beöntések alakjában, melyek például olyan hagyományos kúpalapokat tartalmazhatnak, mint amilyen a kakaóvaj vagy más gliceridek.
Az eddig leírt készítményeken túlmenően a vegyületek előállíthatók raktározó- („depót”) készítményekként is. Az ilyen hosszú távon ható készítmények adminisztrálhatok beültetéssel (például szubkutáns vagy intramuszkuláris beültetéssel), vagy intramuszkuláris injekciózással. Ilyenkor a vegyületeket megfelelő polimer vagy hidrofób anyagokkal formulázzuk meg (például egy alkalmas olajban lévő emulzióként), ioncserélő gyantákkal szereljük ki, vagy olyan gyengén oldódó származékokként hozzuk forgalomba, mint amilyen például egy gyengén oldódó só.
A találmány hidrofób vegyületeihez alkalmas gyógyszerészeti hordozók olyan oldószerrendszerek, melyek benzil-alkoholt, egy nem poláros felületaktív anyagot, egy vízzel elegyedő szerves polimert és egy vizes fázist tartalmaznak. Az oldószerrendszer lehet például a VPD oldószerrendszer. A VPD egy olyan oldat, mely 3% (w/v%) benzil-alkoholt, 8% (w/v%) poliszorbát 80 nem poláros felületaktív anyagot és 65% (w/v%) polietilénglikol 300-at tartalmaz, és amelynek a
HU 226 755 Β1 végső térfogatát abszolút etanollal állítjuk be. A VPD oldószerrendszer (VPD:5W) 5%-os dextrózzal 1:1 arányban felhígított VPD-t tartalmaz egy vizes oldatban. Az oldószerrendszer hidrofób vegyületeket is felold úgy, hogy közben csak alacsony toxicitási szintet idéz elő a szervezeti adminisztráció esetén. Természetesen egy oldószerrendszer összetételének arányai jelentősen megváltoztathatók anélkül, hogy oldhatósági és toxicitási jellemzőit elrontanánk. Sőt, az oldószerrendszernek még az összetevőin is változtathatunk, így például a poliszorbát 80 helyett használhatunk más kis toxicitású nem poláros felületaktív anyagot; megváltoztathatjuk a polietilénglikol-frakció méretét; a polietilénglikol helyett használhatunk más biokompatibilis polimert, például poli(vinil-pirrolidon)-t; a dextróz helyett pedig használhatunk más cukrokat vagy poliszacharidokat.
A hidrofób gyógyszerészeti vegyületekből más készítményeket is készíthetünk. A hidrofób gyógyszerekhez való hordozókra ismert például szolgálnak a liposzómák és emulziók. Bizonyos szerves oldószerek, mint amilyen például a dimetil-szulfoxid, szintén alkalmazhatók, bár általában csak a nagyobb toxicitás árán. Ezen túlmenően a vegyületek egy késleltetett felszívódású rendszer felhasználásával is bejuttathatok a szervezetbe. Az ilyen rendszerekre ad példát az aktív hatóanyagot tartalmazó tömör hidrofób polimerek féligáteresztő állománya. Sok késleltetett felszívódású anyagot azonosítottak már, melyek a szakemberek számára jól ismertek. A késleltetett felszívódású kapszulák, kémiai természetüktől függően néhány héttől több mint 100 napig terjedő időtartam alatt szabadítják fel az aktív vegyületeket. A gyógyszer kémiai természetétől és biológiai stabilitásától függően a proteinstabilizáció további módszerei is alkalmazhatók.
A gyógyszerkészítmények ezenkívül tartalmazhatnak megfelelő szilárd vagy gélfázisú hordozókat vagy kötőanyagokat is. Az ilyen hordozókra és kötőanyagokra ad példát, a rájuk való korlátozás nélkül, a kalciumkarbonát, a kalcium-foszfát, sok cukorféle, a keményítők, a cellulózszármazékok, a zselatin és az olyan polimerek, mint amilyenek például a polietilénglikolok.
A találmány protein-tirozin-kinázokat moduláló vegyületei közül sok megadható gyógyszerészeti szempontból elfogadható ionpárral rendelkező sók formájában. Gyógyszerészeti szempontból elfogadható sók képezhetők sok savval, így például, a rájuk való korlátozás nélkül, sósavval, kénsavval, ecetsavval, tejsavval, borkősavval, almasavval, szukcinsavval stb. A savak általában jobban oldódnak vízben és más protikus oldószerekben, mint a megfelelő szabad bázisok.
4.5.3. A hatékony dózis
A találmány szerinti felhasználásra alkalmas gyógyszerkészítmények közé azok a készítmények tartoznak, melyek az aktív vegyületet a kívánt célnak megfelelő mennyiségben tartalmazzák. Pontosabban megfogalmazva a gyógyszerészeti szempontból hatékony mennyiség az aktív vegyület olyan mennyiségét jelenti, mely hatékony a kezelt betegség tüneteinek megelőzésére, enyhítésére vagy javítására, vagy a kezelt beteg túlélési idejének meghosszabbítására. A gyógyszerészeti szempontból hatékony mennyiség meghatározása nem haladja meg a szakemberek képességeit, különösen az itt megadott részletes leírás fényében.
A találmány módszereiben felhasznált bármely vegyületre vonatkozó gyógyszerészeti szempontból hatékony dózis sejttenyészet-vizsgálatok alapján becsülhető meg előzetesen. Például a dózisok állatkísérletekben való alkalmazásával megállapíthatunk egy olyan körülbelüli koncentrációsávot, ami magában foglalja a sejttenyészetek alapján meghatározott IC50-értéket (vagyis azt a koncentrációját a tesztvegyületnek, mely a protein-tirozin-kináz-aktivitás maximális gátlásának a felét éri el). Az ilyen információ felhasználható az ember esetében megfelelő dózis pontosabb meghatározására.
Az itt leírt vegyületek toxicitása és terápiás hatékonysága sejttenyészeteken vagy kísérleti állatokon elvégzett standard gyógyszerészeti eljárások felhasználásával állapítható meg. így határozható meg például az LD50-érték (a populáció 50%-ára halálos dózis) és az ED50-érték (a populáció 50%-ánál gyógyszerészeti szempontból hatékony dózis). A toxikus és a terápiás hatékonyság közötti dózisarány a terápiás index, ami az LD50-érték és az ED50-érték hányadosával fejezhető ki. Azok a vegyületek az előnyösek, melyek magas terápiás indexszel rendelkeznek. Ezekből a sejttenyészet-vizsgálatokból és állatkísérletekből származó adatok felhasználhatók az emberi felhasználásra vonatkozó dózishatárok megállapítására. Az ilyen vegyületek adagolása előnyösen abba az ED50-érték körüli sávba esik, ahol a toxicitás még kicsi, vagy egyáltalán nem jelentkezik. Az adagolás ezeken a határokon belül változhat, az alkalmazott készítmény fajtájától és az alkalmazás módjától függően. A legmegfelelőbb készítményt, az alkalmazás módját és adagolását az orvos választhatja meg a beteg állapotának ismeretében (lásd például Fingl és munkatársai, 1975, „The Pharmacological Basis of Therapeutics”, 1. fejezet 1. oldal).
A dózisszintek és dózissávok minden adott esetben külön-külön állíthatók be úgy, hogy az aktív részlet plazmaszintje olyan legyen, ami elegendő a kinázmoduláló hatások vagy a minimális hatékony koncentráció (MEC, minimál effective concentration) fenntartására. A minimális hatékony koncentráció minden vegyület esetében más és más lesz, de minden esetben megbecsülhető in vitro adatok alapján; például a kináz 50-90%-os gátlásának eléréséhez szükséges koncentráció alapján, melyet az itt leírt vizsgálatok felhasználásával kaphatunk meg. A minimális hatékony koncentráció eléréséhez szükséges dózis függeni fog az egyedi jellemzőktől és az alkalmazás módjától. HPLC vizsgálatok vagy biológiai tesztek mégis használhatók a plazmakoncentráció meghatározására.
A dózisintervallumok meghatározására a minimális hatékony koncentráció értéke is felhasználható. A vegyületek olyan diéta mellett alkalmazandók, ami a plazmaszintet a minimális hatékony koncentráció felett tart10
HU 226 755 Β1 ja az idő 10-90%-ában, előnyösebben az idő 30-90%ában, legelőnyösebben pedig 50-90%-ában.
Helyi alkalmazás vagy szelektív felszívódás esetén a gyógyszer hatékony helyi koncentrációja nem biztos, hogy összefüggésben van a plazmakoncentrációval.
Az alkalmazott készítmény mennyisége természetesen függeni fog a kezelés alanyától, annak testsúlyától, a betegség súlyosságától, az alkalmazás módjától, valamint a kezelést végző orvos ítéletétől.
4.5.4. Csomagolás
A készítmény, amennyiben az kívánatos, forgalomba hozható olyan csomagolásban vagy adagolókészülékben, mely egy vagy több, aktív hatóanyagot tartalmazó egységadagot tartalmazhat. A csomagolás állhat például fém- vagy műanyag fóliából, mint amilyen például a hólyagcsomagolás (blister pack). A csomaghoz vagy az adagolókészülékhez csatolhatók az alkalmazásra vonatkozó utasítások is. A találmány vegyületeit megfelelő gyógyszerészeti hordozóban tartalmazó készítmények szintén előállíthatok, megfelelő csomagolásba helyezhetők, és elláthatók olyan címkékkel, melyeken fel van tüntetve egy megjelölt betegség kezelése. A címkén szereplő betegségek közé tartozhat valamely tumor kezelése, az érképződés gátlása, a fibrózis, a cukorbaj, valamint más hasonló betegségek kezelése.
5. Példák: A vegyületek előállítása
A találmány vegyületei ismert eljárások felhasználásával állíthatók elő. A következő példák a találmány vegyületeinek előnyben részesített előállítási módszereit adják meg.
5.1. A 3-szubsztituált-2-indolinon-analogonok általános előállítása
A találmány 3-szubsztituált-2-indolinon-vegyületeinek az előállítására az alábbi módszereket alkalmazzuk.
5.1.1. A) eljárás
A megfelelő oxindol (2-indolinon) 1 ekv. mennyiségének, a megfelelő aldehid 1,2 ekv. mennyiségének és 0,1 ekv. mennyiségű piperidin etanolban (1-2 ml/1 mmol oxindol) lévő reakcióelegyét 90 °C hőmérsékleten 3-5 órán keresztül keverjük. Hűtés után a csapadékot szűrjük, hideg etanollal mossuk és szárítjuk, hogy megkapjuk a célvegyületet.
5.1.2. B) eljárás
A megfelelő aldehidek Vilsmeier-reakcióval történő előállítása
1,2 ekv. W,/V-dimetil-formamid 1,2-diklór-etánban (2,0 ml/1,0 mmol kiindulási anyag) lévő oldatához cseppenként hozzáadunk 1,2 ekv. foszfor(V)-oxi-kloridot 0 °C hőmérsékleten. Ezután az alkalmazott jégfürdőt eltávolítjuk, és a reakcióelegyet további 30 percen keresztül keverjük. Ezután az így keletkező oldathoz részletenként hozzáadjuk a kiindulási anyag 1,0 ekv. mennyiségét, és a reakcióelegyet 50-70 °C hőmérsékleten 5-48 órán keresztül keverjük. Ezután a reakcióelegyet 1 N jéghideg nátrium-hidroxid-oldatra öntjük (pH=9 keverés után), és az így keletkező elegyet szobahőmérsékleten 1 órán keresztül keverjük. A szerves fázist elválasztjuk, a vizes réteget pedig etil-acetáttal extraháljuk. Az összeöntött szerves fázisokat a 7-es pH eléréséig mossuk sóoldattal, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és párologtatjuk. A visszamaradó anyagot szilikagél oszlopon kromatografáljuk, eluálószerként etil-acetát és hexán elegyéből álló oldatot használva, hogy megkapjuk a címvegyületet.
A 3-szubsztituált-2-indolinon-analogonok előállítása
A megfelelő oxindol (2-indolinon) 1 ekv. mennyiségének, a megfelelő aldehid 1,2 ekv. mennyiségének és 0,1 ekv. mennyiségű piperidin etanolban (1-2 ml/1 mmol oxindol) lévő reakcióelegyét 90 °C hőmérsékleten 3-5 órán keresztül keverjük. Hűtés után a csapadékot szűrjük, hideg etanollal mossuk és szárítjuk, hogy megkapjuk a célvegyületet.
5.2. A 3-benzilidén-2-indolinon előállítása
A 3-benzilidén-2-indolinon előállítására vonatkozó előnyben részesített eljárás a következő: 2,0 ml metanolban lévő 137,0 mg oxindol oldatához hozzáadunk
123,2 μΙ benzaldehidet és 40 μΙ piperidint. A reakcióelegyet 3 órán keresztül visszafolyatjuk, majd az elegyet jeges vizes fürdőben lehűtjük. Az így keletkező csapadékot szűrjük, hideg metanollal mossuk, és egy sütőben 40 °C hőmérsékleten egy éjszakán keresztül szárítjuk. Ezt az eljárást alkalmazva hozzávetőlegesen 129,0 mg mennyiségben kapjuk meg a címvegyületet.
5.3. A 3-[(pirid-4-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(pirid-4-il)-metilén]-2-indolinon előállítására vonatkozó előnyben részesített eljárás a következő: 2,0 ml metanolban lévő 138,0 mg oxindol oldatához hozzáadunk 117,0 μΙ 4-piridil-karboxaldehidet és 40 μΙ piperidint. A reakcióelegyet 3 órán keresztül visszafolyatjuk, majd az elegyet jeges vizes fürdőben lehűtjük. Az így keletkező csapadékot szűrjük, hideg metanollal mossuk, és egy sütőben 40 °C hőmérsékleten egy éjszakán keresztül szárítjuk, hogy 134,5 mg mennyiségben megkapjuk a címvegyületet.
5.4. A 3-[4-(morfolin-4-il)-benzilidenil]-2-indolinon előállítása (B eljárás)
4-(Morfolin-4-il)-benzaldehid. 15 ml Ν,Ν-dimetilformamid 50 ml 1,2-diklór-etánban lévő oldatához cseppenként hozzáadunk 10 ml foszfor(V)-oxi-kloridot 0 °C hőmérsékleten. Ezután az alkalmazott jégfürdőt eltávolítjuk, és a reakcióelegyet további 30 percen keresztül keverjük. Az így keletkező oldathoz részletenként hozzáadunk 16,3 g 4-fenil-morfolint, és a reakcióelegyet 2 napon keresztül visszafolyatjuk. Az így keletkező reakcióelegyhez hozzáadunk 2,5 ml trietil-amint, és az elegyet 2 napon keresztül visszafolyatjuk. Ezután a reakcióelegyet 1 N jéghideg nátrium-hidroxid-oldatra öntjük (pH=9 keverés után), és az így keletkező ele11
HU 226 755 Β1 gyet szobahőmérsékleten 1 órán keresztül keverjük. A szerves fázist elválasztjuk, a vizes réteget pedig 2x20 ml diklór-metánnal extraháljuk. Az összeöntött szerves fázisokat a 7-es pH eléréséig mossuk sóoldattal, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és párologtatjuk. A visszamaradó anyagot szilikagél oszlopon szeparáljuk, eluálószerként etil-acetát és hexán elegyéből álló oldatot használva, hogy 12,95 g (68%) mennyiségben megkapjuk a címvegyületet egy fehér szilárd anyag formájában.
A 3-[4-(morfolin-4-il)-benzilidenil]-2-indolinon. 6,66 g oxindol, 11,50 g 4-(morfolin-4-il)-benzaldehid és 5 ml piperidin 50 ml etanolban lévő reakcióelegyét 90 °C hőmérsékleten 5 órán keresztül keverjük. Hűtés után a csapadékot szűrjük, hideg etanollal mossuk és szárítjuk, hogy 15,0 g mennyiségben (98%) megkapjuk a címvegyületet egy sárga szilárd anyag formájában.
5.5. A 3-[4-(4-formil-piperazin-1-il)-benzilidenil]-2indolinon előállítása (B eljárás) 4-(4-Formil-piperazin-1-il)-benzaldehid. 2,3 ml (30 mmol) Ν,Ν-dimetil-formamid 10 ml 1,2-diklóretánban lévő oldatához cseppenként hozzáadunk 2,8 ml (30 mmol) foszfor(V)-oxi-kloridot 0 °C hőmérsékleten. Ezután az alkalmazott jégfürdőt eltávolítjuk, és a reakcióelegyet további 15 percen keresztül keverjük. Az így keletkező oldathoz részletenként hozzáadunk
3,2 ml (20 mmol) 1 -fenil-piperidint, és a reakcióelegyet egy éjszakán keresztül visszafolyatjuk. Ezután a reakcióelegyet 2 N jéghideg nátrium-hidroxid-oldatra öntjük, és az így keletkező elegyet szobahőmérsékleten 1 órán keresztül keverjük. A szerves fázist elválasztjuk, a vizes réteget pedig 2x20 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az összeöntött szerves fázisokat a 7-es pH eléréséig mossuk sóoldattal, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és párologtatjuk. A visszamaradó anyagot szilikagél oszlopon szeparáljuk, eluálószerként etil-acetátot és hexánt használva, hogy 1,5 g (40%) mennyiségben megkapjuk a címvegyületet egy fehér szilárd anyag formájában.
A 3-[4-(4-formil-piperazin-1-il)-benzilidenil]-2-indolinon. 133,15 mg oxindol, 228,3 mg 4-(piperazin-1-il)benzaldehid és 3 csepp piperidin 2 ml etanolban lévő reakcióelegyét 90 °C hőmérsékleten 5 órán keresztül keverjük. Hűtés után a csapadékot szűrjük, hideg etanollal mossuk és szárítjuk, hogy 199,5 mg mennyiségben (65%) megkapjuk a címvegyületet egy sárga szilárd anyag formájában.
5.6. A 3-[4-(4-piperidin-1-il)-benzilidenil]-2-indolinon előállítása (B eljárás)
4-(Piperidin-1 -il)-benzaldehid. 3,9 ml (30 mmol) Ν,Ν-dimetil-formamid 20 ml 1,2-diklór-etánban lévő oldatához cseppenként hozzáadunk 3 ml (3,9 mmol) foszfor(V)-oxi-kloridot 0 °C hőmérsékleten. Ezután az alkalmazott jégfürdőt eltávolítjuk, és a reakcióelegyet további 15 percen keresztül keverjük. Az így keletkező oldathoz részletenként hozzáadunk 16,0 g (10 mmol) 1 -fenil-piperazint, és a reakcióelegyet 50 °C hőmérsékleten 1 órán keresztül keverjük. Ezután a reakcióelegyet 1 N jéghideg nátrium-hidroxid-oldatra öntjük, és az így keletkező elegyet szobahőmérsékleten 1 órán keresztül keverjük. A szerves fázist elválasztjuk, a vizes réteget pedig 2x20 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az összeöntött szerves fázisokat a 7-es pH eléréséig mossuk sóoldattal, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és párologtatjuk. A visszamaradó anyagot szilikagél oszlopon szeparáljuk, eluálószerként etil-acetát és hexán elegyéből álló oldatot használva, hogy 9,0 g (41%) mennyiségben megkapjuk a címvegyületet egy világossárga szilárd anyag formájában.
A 3-[4-(piperidin-1-il)-benzilidenil]-2-indolinon. 134,0 mg oxindol, 226,8 mg 4-(piperidin-1-il)-benzaldehid és 3 csepp piperidin 2 ml etanolban lévő reakcióelegyét 90 °C hőmérsékleten 5 órán keresztül keverjük. Hűtés után a csapadékot szűrjük, hideg etanollal mossuk és szárítjuk, hogy 268,5 mg mennyiségben (88%) megkapjuk a címvegyületet egy sárga szilárd anyag formájában.
5.7. A 3-[2-klór-4-metoxi-benzilidenil]-2-indolinon előállítása
2- Klór-4-metoxi-benzaldehid. 10 ml Ν,Ν-dimetilformamidban lévő 1,0 g (6,4 mmol) 2-klór-4-hidroxibenzaldehid, 4,4 g (32 mmol) kálium-karbonát és 1,4 g (9,6 mmol) metil-jodid reakcióelegyét 70 °C hőmérsékleten 2 órán keresztül keverjük, majd jeges vízbe öntjük. Az így keletkező csapadékot szűrjük, vízzel mossuk és egy vákuumsütőben 40 °C hőmérsékleten szárítjuk egy éjszakán keresztül, hogy 750 mg (68%) mennyiségben megkapjuk a címvegyületet egy világos rózsaszín szilárd anyag formájában.
3- [2-Klór-4-metoxi-benzilidenil]-2-indolinon. 487,9 mg (3,7 mmol) oxindol, 750 mg (4,3 mmol) 2-klór-4-metoxi-benzaldehid és 4 csepp piperidin 5 ml etanolban lévő reakcióelegyét 90 °C hőmérsékleten 5 órán keresztül hevítjük, majd szobahőmérsékletre hűtjük. Az így keletkező sárga csapadékot szűrjük, hideg etanollal mossuk, és egy vákuumsütőben 40 °C hőmérsékleten szárítjuk egy éjszakán keresztül, hogy
680,2 mg mennyiségben (62%) megkapjuk a címvegyületet.
5.8. A 3-[(4-metil-tien-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
133,0 mg oxindol, 151,2 mg 4-metil-tiofén-2karboxaldehid és 3 csepp piperidin 3 ml etanolban lévő reakcióelegyét 90 °C hőmérsékleten 3 órán keresztül keverjük. Hűtés után a csapadékot szűrjük, hideg etanollal mossuk és szárítjuk, hogy 147,3 mg mennyiségben (61%) megkapjuk a címvegyületet egy sárga szilárd anyag formájában.
5.9. A 3-[(3-metil-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
133,0 mg oxindol, 130,9 mg 3-metil-pirrol-2karboxaldehid és 3 csepp piperidin 2 ml etanolban lévő reakcióelegyét 90 °C hőmérsékleten 3 órán keresztül keverjük. Hűtés után a csapadékot szűrjük, hideg eta12
HU 226 755 Β1 nollal mossuk és szárítjuk, hogy 150,9 mg mennyiségben (67%) megkapjuk a címvegyületet egy sárga szilárd anyag formájában.
5.10. A 3-[(3,4-dimetil-pirrol-2-il)-metilén]-2indolinon előállítása
A 3-[(3,4-dimetil-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinont a J. Heterociclic Chem. 13: 1145-1147 (1976)-ban leírtak szerint állítjuk elő.
Etil-4-metil-pirrol-3-karboxilát. 11,86 g (0,1 mól) etilkrotonát és 19,50 g (0,1 mól) p-toluénszulfonil-metilizocianid-éter és dimetil-szulfoxid 2:1 arányú, 500 ml térfogatú elegyében lévő oldatát szobahőmérsékleten cseppenként hozzáadjuk 6,8 g nátrium-hidrid (60%-os ásványi olajos diszperzió, 0,17 mól) éterben lévő szuszpenziójához. A hozzáadás befejeztével a reakcióelegyet 30 percen keresztül keverjük, és felhígítjuk 400 ml vízzel. A vizes réteget 3*100 ml éterrel extraháljuk. Az összeöntött éterextraktumokat egy timföldoszlopon vezetjük át, eluálószerként diklór-metánt használva. A szerves oldószert elpárologtatjuk, és az így visszamaradó anyagot állás közben engedjük megszilárdulni. Ezt a szilárd anyagot hexánnal mossuk, és egy vákuumsütőben 40 °C hőmérsékleten szárítjuk egy éjszakán keresztül, hogy 12,38 g (80%) mennyiségben megkapjuk a címvegyületet.
3.4- Dimetil-pirrol előállítása. 23 g (80 mmoi) nátrium-dihidrobisz(2-metoxi-etoxi-aluminát) oldatához szobahőmérsékleten, nitrogénatmoszféra alatt cseppenként hozzáadjuk 5 g (34 mmoi) etil-4-metil-pirrol-3karboxilát 50 ml benzénben lévő oldatát. A reakcióelegyet 18 órán keresztül keverjük. A reakcióelegyhez hozzáadunk 100 ml vizet. A szerves fázist elválasztjuk, sóoldattal mossuk és vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk. Az oldószert eltávolítjuk, a visszamaradó anyagot pedig desztilláljuk, hogy 1,2 g (44%) mennyiségben megkapjuk a címvegyület.
3.4- Dimetil-pirrol-2-karboxaldehid előállítása. 0,92 ml (12 mmoi) Ν,Ν-dimetil-formamid 10 ml 1,2-diklór-etánban lévő oldatához cseppenként hozzáadunk 1,0 ml (12 mmoi) foszfor(V)-oxi-kloridot 0 °C hőmérsékleten. Ezután az alkalmazott jégfürdőt eltávolítjuk, és a reakcióelegyet további 30 percen keresztül keverjük. Az így keletkező oldathoz részletenként hozzáadunk 960,0 mg (10 mmoi) 3,4-dimetil-pirrolt, és a reakcióelegyet 50 °C hőmérsékleten 5 órán keresztül keverjük. Ezután a reakcióelegyet 1 N jéghideg nátrium-hidroxidoldatba öntjük (pH=9 keverés után), és az így keletkező elegyet szobahőmérsékleten 1 órán keresztül keverjük. A szerves fázist elválasztjuk, a vizes réteget pedig etil-acetáttal extraháljuk. Az összeöntött szerves fázisokat a 7-es pH eléréséig mossuk sóoldattal, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és párologtatjuk. A visszamaradó anyagot szilikagél oszlopon kromatografáljuk, eluálószerként etil-acetát és hexán elegyéből álló oldatot használva, hogy 610 mg (50%) mennyiségben megkapjuk a címvegyületet.
3-[(3,4-Dimetil-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinon. 67,0 mg (0,5 mmoi) oxindol, 73,0 mg (0,6 mmoi) 3,4dimetil-pirrol-2-karboxaldehid és 2 csepp piperidin 2 ml etanolban lévő reakcióelegyét 90 °C hőmérsékleten 3 órán keresztül keverjük. Hűtés után a csapadékot szűrjük, hideg etanollal mossuk és szárítjuk, hogy 87,7 mg mennyiségben (37%) megkapjuk a címvegyületet egy sárga szilárd anyag formájában.
5.11. A 3-[(2,4-dimetil-3-etoxi-karbonil-pirrol-5-il)metilén]-2-indolinon előállítása
134,0 mg oxindol, 234,3 mg 4-etoxi-karbonil-3,5dimetil-pirrol-2-karboxaldehid és 3 csepp piperidin 3 ml etanolban lévő reakcióelegyét 90 °C hőmérsékleten 3 órán keresztül keverjük. Hűtés után a csapadékot szűrjük, hideg etanollal mossuk és szárítjuk, hogy
244.6 mg mennyiségben (79%) megkapjuk a címvegyületet egy sárga szilárd anyag formájában.
5.12. A 3-[(2,3-dimetil-pirrol-5-il)-metilén]-2indolinon előállítása
134,0 mg oxindol, 147,8 mg 3,5-dimetil-pirrol-2karboxaldehid és 3 csepp piperidin 2 ml etanolban lévő reakcióelegyét 90 °C hőmérsékleten 3 órán keresztül keverjük. Hűtés után a csapadékot szűrjük, hideg etanollal mossuk és szárítjuk, hogy 136,7 mg mennyiségben (57%) megkapjuk a címvegyületet egy sárga szilárd anyag formájában.
5.13. A 3-[(2-metil-merkapto-tien-5-il)-metilén]-2indolinon előállítása
134,0 mg oxindol, 189,9 mg 5-metil-merkaptotiofén-2-karboxaldehid és 3 csepp piperidin 2 ml etanolban lévő reakcióelegyét 90 °C hőmérsékleten 3 órán keresztül keverjük. Hűtés után a csapadékot szűrjük, hideg etanollal mossuk és szárítjuk, hogy
246.6 mg mennyiségben (90%) megkapjuk a címvegyületet egy narancssárga szilárd anyag formájában.
5.14. A 3-[(2-metil-tien-5-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
134,0 mg oxindol, 151,42 mg 5-metil-tiofén-pirrol-2karboxaldehid és 3 csepp piperidin 2 ml etanolban lévő reakcióelegyét 90 °C hőmérsékleten 3 órán keresztül keverjük. Hűtés után a csapadékot szűrjük, hideg etanollal mossuk és szárítjuk, hogy 237,8 mg mennyiségben (99%) megkapjuk a címvegyületet egy sárga szilárd anyag formájában.
5.15. A 3-[(3-metil-tien-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
134,0 mg oxindol, 151,4 mg 3-metil-tiofén-2karboxaldehid és 3 csepp piperidin 2 ml etanolban lévő reakcióelegyét 90 °C hőmérsékleten 3 órán keresztül keverjük. Hűtés után a csapadékot szűrjük, hideg etanollal mossuk és szárítjuk, hogy 157,8 mg mennyiségben (65%) megkapjuk a címvegyületet egy sárga szilárd anyag formájában.
5.16. A 3-(2,5-dimetoxi-benzilidenil)-2-indolinon előállítása
A 3-(2,5-dimetoxi-benzilidenil)-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
HU 226 755 Β1
5.17. A 3-(2,3-dimetoxi-benzilidenil)-2-indolinon előállítása
A 3-(2,3-dimetoxi-benzilidenil)-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.18. A 3-(3-bróm-6-metoxi-benzilidenil)-2indolinon előállítása
A 3-(3-bróm-6-metoxi-benzilidenil)-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.19. A 3-[4-(4-t-butil-karbonilpiperazin-1-il)-benzilidenil]-2-indolinon előállítása
A 3-[4-(4-t-butil-karbonil-piperazin-1 -il)-benzilidenil]-2-indolinont a B eljárás szerint állítjuk elő.
5.20. A 3-[(furan-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(furan-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.21. A 3-(4-acetamido-benzilidenil)-2-indolinon előállítása
A 3-(4-acetamido-benzilidenil)-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.22. A 3-(2-klór-4-hidroxi-benzilidenil)-2-indolinon előállítása
A 3-(2-klór-4-hidroxi-benzilidenil)-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.23. A 3-(4-bróm-benzilidenil)-2-indolinon előállítása
A 3-(4-bróm-benzilidenil)-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.24. A 3-(4-acetil-amino-benzilidenil)-2-indolinon előállítása
A 3-(4-acetil-amino-benzilidenil)-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.25. A 3-(2-metoxi-benzilidenil)-2-indolinon előállítása
A 3-(2-metoxi-benzilidenil)-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.26. A 3-(4-dimetil-amino-benzilidenil)-1-metil-2indolinon előállítása
A 3-(4-dimetil-amino-benzilidenil)-1 -metil-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.27. A 3-(4-dimetil-amino-benzilidenil)-2-indolinon előállítása
A 3-(4-dimetil-amino-benzilidenil)-2-indolinon a Maybridge Chemical Co. Ltd.-től szerezhető be.
5.28. A 3-(4-bróm-benzilidenil)-1-metil-2-indolinon előállítása
A 3-(4-bróm-benzilidenil)-1 -metil-2-indolinont az
A eljárás szerint állítjuk elő.
5.29. Az 5-klór-3-(4-dimetil-amino-benzilidenil)-2indolinon előállítása
Az 5-klór-3-(4-dimetil-amino-benzilidenil)-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.30. A 3-(4-bróm-benzilidenil)-5-klór-2-indolinon előállítása
A 3-(4-bróm-benzilidenil)-5-klór-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.31. A 3-(4-dietil-amino-benzilidenil)-2-indolinon előállítása
A 3-(4-dietil-amino-benzilidenil)-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.32. A 3-(4-di-n-butil-amino-benzilidenil)-2indolinon előállítása
A 3-(4-di-n-butil-amino-benzilidenil)-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.33. Az 1-metil-3-[4-(morfolin-4-il)-benzilidenil]-2indolinon előállítása
Az 1 -meti l-3-[4-( morfol i η-4-i I )-benzi I idén i l]-2-i ndol inont a B eljárás szerint állítjuk elő.
5.34. Az 5-klór-3-(4-(morfolin-4-il)-benzilidenil)-2indolinon előállítása
Az 5-klór-3-(4-(morfolin-4-il)-benzilidenil)-2-indolinont a B eljárás szerint állítjuk elő.
5.35. A 3-(3,4-diklór-benzilidenil)-2-indolinon előállítása
A 3-(3,4-diklór-benzilidenil)-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.36. A 3-(2-etoxi-benzilidenil)-2-indolinon előállítása
A 3-(2-etoxi-benzilidenil)-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.37. A 3-(4-fluor-benzilidenil)-2-indolinon előállítása
A 3-(4-fluor-benzilidenil)-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.38. A 3-[(tien-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(tien-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.39. A 3-(2-metoxi-benzilidenil)-2-indolinon előállítása
A 3-(2-metoxi-benzilidenil)-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.40. A 3-[2-[3,5-di(trifluor-metil)fenil]-furan-5-il]-etilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[-2[3,5-di(trifluor-metil)-fenil]-furan-5-il]-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
HU 226 755 Β1
5.41. A 2,6-di(dimetil-amino)-3,5di[(indolin-2-on-3-ilidenil)-metil]-fenil-cianid előállítása
A 2,6-di(dimetil-amino)-3,5-di[(indolin-2-on-3-ilidenil)-metil]-fenil-cianidot az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.42. A 3-[(3-(2-karboxi-etil)-4-metil-pirrol-5-il)metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(3-(2-karboxi-etil)-4-metil-pirrol-5-il)-metilén]-2indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.43. A 3-[(3,4-dibróm-5-metil-pirrol-2-il)-metilén]-2indolinon előállítása
A 3-[(3,4-dibróm-5-metil-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinont a B eljárás szerint állítjuk elő.
5.44. A 3-[(3,4-dimetil-2-formil-pirrol-5-il)-metilénj2-indolinon előállítása
A 3-[(3,4-dimetil-2-formil-pirrol-5-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.45. A 3-{[4-(2-metoxi-karbonil-etil)-3-metil-pirrol5-il]-metilén}-2-indolinon előállítása
A 3-{[4-(2-metil-karbonil-etil)-2-metil-pirrol-5-il]-metilén}-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.46. A 3-[(2-jód-furan-5-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(2-jód-furan-5-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.47. A 3-[(3-etoxi-karbonil-2-metil-furan-5-il)metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(3-etoxi-karbonil-2-metil-furan-5-il)-metilén]-2indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.48. A 3-[(3-bróm-tien-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(3-bróm-tien-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.49. A 3-[(2-klór-tien-5-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(2-klór-tien-5-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.50. A 3-[(2,3-dimetil-furan-5-il)-metilén]-2indolinon előállítása
A 3-[(2,3-dimetil-furan-5-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.51. A 3-[(5-nitro-tien-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(5-nitro-tien-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.52. A 3-[(2-karboxi-tien-5-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(2-karboxi-tien-5-il)-metilén]-2-indolinont az
A eljárás szerint állítjuk elő.
5.53. A 3-[(2-bróm-tien-5-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(2-bróm-tien-5-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.54. A 3-[(4-bróm-tien-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(4-bróm-tien-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.55. A 3-[(2-szulfonil-furan-5-il)metilén]-2-indolinon nátriumsójának az előállítása
A 3-[(szulfonil-furan-5-il)-metilén]-2-indolinon nátriumsóját az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.56. A 3-[(furan-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(furan-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.57. A 3-[(2-metil-furan-5-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(2-metil-furan-5-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.58. A 3-[(2-etil-furan-5-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(2-etil-furan-5-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.59. A 3-[(2-nitro-furan5-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(2-nitro-furan-5-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.60. A 3-[(5-bróm-furan-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(5-bróm-furan-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.61. A 3-[(2-etil-tien-5-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(2-etil-tien-5-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.62. A 3-[(4,5-dimetil-3-etilpirrol-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(4,5-dimetil-3-etil-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.63. A 3-[(5-etoxi-karbonil-4etoxi-karbonil-etil-3-etoxi-karbonilmetil-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(5-etoxi-karbonil-4-etoxi-karbonil-etil-3-etoxikarbonil-metil-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
HU 226 755 Β1
5.64. A 3-[(5-karboxi-3-etil-4metil-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(5-karboxi-3-etil-4-metil-pirrol-2-il)-metilén]-2indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.65. A 3-[(3,5-dijód-4-metil-pirrol-2-il)-metilén]-2indolinon előállítása
A 3-[(3,5-dijód-4-metil-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.66. A 3-[(5-klór-3-metoxi-karbonil-4-metoxikarbonil-metil-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(5-klór-3-metoxi-karbonil-4-metoxi-karbonilmetil-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.67. A 3-[(3-acetil-5-etoxi-karbonil4-metil-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(3-acetil-5-etoxi-karbonil-4-metil-pirrol-2-il)metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.68. A 3-[[1-(3,5-diklór-fenil)-pirrol-2-il]-metilén]-2indolinon előállítása
A 3-[[ 1 -(3,5-diklór-feniI)-pirrol-2-il]-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.69. A 3-[1-((4-klór-fenil)-pirrol-2-il)-metilén]-2indolinon előállítása
A 3-[ 1 -((4-klór-feniI)-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.70. A 3-[((4-etoxi-karbonil-3-metil)-pirrol-2-il)metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[((4-etoxi-karbonil-3-metil)-pirrol-2-il)-metilén]2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.71. A 3-[(1-metil-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(1-metil-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.72. A 3-[(5-etoxi-karbonil-3-etoxi-karbonil-etil-4etoxi-karbonil-metil-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(5-etoxi-karbonil-3-etoxi-karbonil-etil-4-etoxikarbonil-metil-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.73. A 3-[4-(pirrolidin-1-il)-benzilidenil]-2-indolinon előállítása
A 3-[4-(pirrolidin-1 -il)-benzilidenil]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.74. A 3-[(5-metil-imidazol-2-il)-metilén]-2indolinon előállítása
A 3-[(5-metil-imidazol-2-il)-metilén]-2-indolinont az
A eljárás szerint állítjuk elő.
5.75. A 3-[(5-metil-tiazol-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(5-metil-tiazol-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.76. A 3-[(3-metil-pirazol-5-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(3-metil-pirazol-5-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.77. A 3-[(imidazol-4-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(imidazol-4-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.78. A 3-[(4-klór-pirazol-3-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(4-klór-pirazol-3-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.79. A 3-[(4-bróm-1-(4-klór-benzil)-pirazol-5-il)metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(4-bróm-1 -(4-klór-benziI)-pirazol-5-iI)-metilénj2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.80. A 3-[(4-klór-1-metil-pirazol-3-il)-metilén]-2indolinon előállítása
A 3-[(4-klőr-1 -méti l-pi razol-3-i I )-méti lén]-2-i ndol inont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.81. A 3-[(4-etil-3,5-dimetil-pirrol-2-il)-metilén]-2indolinon előállítása
A 3-[(4-etil-3,5-dimetil-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinont a B eljárás szerint állítjuk elő.
5.82. A 3-[(5-etil-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(5-etil-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinont a B eljárás szerint állítjuk elő.
5.83. A 3-[(3,5-dimetil-4-(propen2-il)-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(3,5-dimetil-4-(propen-2-il)-pirrol-2-il)-metilén]2-indolinont a B eljárás szerint állítjuk elő.
5.84. Az 5,6-dimetoxil-3-[2,3-dimetoxil-benzilidenil]2-indolinon előállítása
Az 5,6-dimetoxil-3-[2,3-dimetoxil-benzilidenil]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.85. A 3-[2,4,6-trimetoxi-benzilidenil]-2-indolinon előállítása
A 3-[2,4,6-trimetoxi-benzilidenil]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.86. Az 5-klór-3-[(pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
Az 5-klór-3-[(pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
HU 226 755 Β1
5.87. Az 5-klór-3-[(3-metil-pirrol-2-il)-metilén]-2indolinon előállítása
Az 5-klór-3-[(3-metil-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.88. A 3-(4-izopropil-benzilidenil)-2-indolinon előállítása
A 3-(4-izopropil-benzilidenil)-2-indolinon beszerezhető a Maybridge Chemical Co. Ltd.-től.
5.89. Az 5-klór-3-[(3,5-dimetil-pirrol-2-il)-metilén]-2indolinon előállítása
Az 5-klór-3-[(3,5-dimetil-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.90. A 3-[(pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinon beszerezhető a Maybridge Chemical Co. Ltd.-től.
5.91. Az 5-klór-3-[(indol-3-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
Az 5-klór-3-[(indol-3-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.92. Az 5-klór-3-[(tien-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
Az 5-klór-3-[(tien-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.93. Az 5-klór-3-[(3-metil-tien-2-il)-metilén]-2indolinon előállítása
Az 5-klór-3-[(3-metil-tien-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.94. Az 5-klór-3-[(5-metil-tien-2-il)-metilén]-2indolinon előállítása
Az 5-klór-3-[(5-metil-tien-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.95. Az 5-klór-3-[(5-etil-tien-2-il)-metilén]-2indolinon előállítása
Az 5-klór-3-[(5-etil-tien-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.96. Az 5-klór-3-[(5-metilmerkapto-tien-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
Az 5-klór-3-[(5-metil-merkapto-tien-2-il)-metilén]-2indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.97. Az 5-klór-3-[(imidazol-2-il)-metilén]-2indolinon előállítása
Az 5-klór-3-[(imidazol-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.98. A 3-[2,4-dimetoxi-6-metil-benzilidenil]-2indolinon előállítása
A 3-[2,4-dimetoxi-6-metil-benzilidenil]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.99. Az 3-nitro-3-[(3-pirrol-2-il)-metilén]-2indolinon előállítása
Az 5-nitro-3-[(3-pirro-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.100. A 3-[(3-metil-pirrol-2-il)-metilén]-5-nitro-2indolinon előállítása
A 3-[(3-metil-pirrol-2-il)-metilén]-5-nitro-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.101. A 3-[(3,5-dimetil-pirrol-2-il)-metilén]-5-nitro2-indolinon előállítása
A 3-[(3,5-dimetil-pirrol-2-il)-metilén]-5-nitro-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.102. A 3-[(indol-3-il)-metilén]-5-nitro-2-indolinon előállítása
A 3-[(indol-3-il)-metilén]-5-nitro-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.103. Az 5-nitro-3-[(tien-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
Az 5-nitro-3-[(tien-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.104. A 3-[(3-metil-tien-2-il)-metilén]-5-nitro-2indolinon előállítása
A 3-[(3-metil-tien-2-il)-metilén]-5-nitro-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.105. A 3-[(5-metil-tien-2-il)-metilén]-5-nitro-2indolinon előállítása
A 3-[(5-metil-tien-2-il)-metilén]-5-nitro-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.106. A 3-[(5-etil-tien-2-il)-metilén]-5-nitro-2indolinon előállítása
A 3-[(5-etil-tien-2-il)-metilén]-5-nitro-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.107. A 3-[(5-metil-merkaptotien-2-il)-metilén]-5-nitro-2-indolinon előállítása
A 3-[(5-metil-merkapto-tien-2-il)-metilén]-5-nitro-2indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.108. A 3-[(imidazol-2-il)-metilén]-5-nitro-2indolinon előállítása
A 3-[(imidazol-2-il)-metilén]-5-nitro-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.109. A 3-[(oxazol-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(oxazol-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.110. A 3-[(oxazol-4-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(oxazol-4-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
HU 226 755 Β1
5.111. A 3-[(oxazol-5-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(oxazol-5-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.112. A 3-[(tiazol-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(tiazol-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.113. A 3-[(tiazol-4-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(tiazol-4-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.114. A 3-[(tiazol-5-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(tiazol-5-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.115. A 3-[(imidazol-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(imidazol-2-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.116. A 3-[(pirazol-3-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(pirazol-3-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.117. A 3-[(pirazol-4-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(pirazol-4-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.118. A 3-[(izoxazol-3-2-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(izoxazol-3-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.119. A 3-[(izoxazol-4-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(izoxazol-4-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.120. A 3-[(izoxazol-5-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(izoxazol-5-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.121. A 3-[(izotiazol-3-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(izotiazol-3-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.122. A 3-[(izotiazol4-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(izotiazol-4-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.123. A 3-[(izotiazol-5-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[(izotiazol-5-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.124. A 3-[(1,2,3-triazol-4-il)-metilén]-2-indolinon előállítása
A 3-[( 1,2,3-triazol-4-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.125. A 3-[(1,3,4-tiadiazol-2-il)-metilén]-2indolinon előállítása
A 3-[( 1,3,4-tiadiazol-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.126. A 3-[(5-fenil-1,2,4-oxadiazol-3-il)-metilén]-2indolinon előállítása
A 3-[(5-feni 1-1,2,4-oxadiazol-3-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.127. A 3-[(3-fenil-1,2,4-oxadiazol-5-il)-metilén]-2indolinon előállítása
A 3-[(3-feni 1-1,2,4-oxadiazol-5-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
5.128. A 3-[(3-fenil-1,2,5-oxadiazol-4-il)-metilén]-2indolinon előállítása
A 3-[(3-feni 1-1,2,5-oxadiazol-4-il)-metilén]-2-indolinont az A eljárás szerint állítjuk elő.
6. Példák: In vitro RTK vizsgálatok
A találmány különböző vegyületeinek az aktivitási szintjét és egy vagy több receptor tirozin-kinázra gyakorolt hatását a következő in vitro vizsgálatok felhasználásával állapíthatjuk meg. Ugyanezen irányelvek alapján bármely másik tirozin-kinázra is tervezhető hasonló vizsgálat, szakemberek számára jól ismert módszerek felhasználásával.
6.1. Enzimkötésű immunoszorbens vizsgálat (ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Az enzimkötésű immunoszorbens vizsgálatok (ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent Assay) felhasználásával kimutatható és megmérhető a tirozin-kináz-aktivitás jelenléte. Az ELISA ismert eljárások szerint végezhető el, melyek leírása megtalálható például: Voller és munkatársai, 1980, „Enzyme-Linked Immunosorbent Assay”, a Manual of Clinical Immunology című könyvben, 2. kiadás, kiadta Rose és Friedman, 359-371. oldal, Am. Soc. of Microbiology, Washington, D.C.
A leírt eljárás adaptálható egy specifikus receptor tirozin-kináz aktivitásának a meghatározására is. Specifikus receptor tirozin-kinázokra vonatkozó ELISA kísérletek elvégzésének előnyben részesített módjait alább adjuk meg. Ezeknek az eljárásoknak az adaptálása egy vegyületnek a receptor tirozin-kináz család más tagjaival vagy nem receptor tirozin-kinázokkal szemben mutatott aktivitásának a meghatározására szakemberek számára nem okozhat nehézséget.
HU 226 755 Β1
6.1.1. FLK-1 ELISA
Az FLK-1 receptor kináz aktivitásának, pontosabban az FLK-1 receptoron megfigyelhető protein-tirozin-kináz-aktivitás gátlásának vagy aktiválásának a mérésére egy ELISA vizsgálatot végzünk el. Még pontosabban a következő vizsgálatot végezzük el FLK—1/NIH3T3 sejtekben lévő FLK-1 receptor kináz aktivitásának a kimérésére.
Anyagok és módszerek
Anyagok. A következő reagenseket és anyagokat használjuk fel:
a) 96 üregű Corning típusú ELISA lemezek (Corning katalógusszám: 25805-96);
b) Cappel gyártmányú kecske antinyúl IgG (katalógusszám: 55614);
c) PBS (Gibco katalógusszám: 450-1300EB);
d) TBSW-puffer [50 mM Tris (pH=7,2), 150 mM nátrium-klorid és 0,1% Tween 20];
e) etanol-amin-készlet [10%-os etanol-amin (pH=7,0), °C hőmérsékleten tárolva];
f) HNTG-puffer [20 mM HEPES-puffer (pH=7,5),
150 mM nátrium-klorid, 0,2% Triton X-100 és 10% glicerol];
g) EDTA [0,5 M (pH=7,0), egy 100X készletként];
h) nátrium-orto-vanadát (0,5 M, egy 100X készletként);
i) nátrium-pirofoszfát (0,2 M, egy 100X készletként);
j) NUNC 96 üregű V fenekű polipropilénlemezek (Applied Scientific katalógusszám: AS-72092);
k) NIH3T3 C7#3 sejtek (FLK-1-gyel rendelkező sejtek);
l) DMEM 1X magas glukóztartalmú L Glutamin (katalógusszám: 11965-050);
m) FBS, Gibco (katalógusszám: 16000-028);
n) L-glutamin, Gibco (katalógusszám: 25030-016);
o) VEGF, PeproTech, Inc. (katalógusszám: 100-20) (1 pg/100 μΙ készlet formájában tárolva Milli-Q dH2O-ban, -20 °C hőmérsékleten raktározva);
p) tisztított affinitású anti-FLK—1 antiszérum, Enzymology Láb, Sugen, Inc.;
q) foszfotirozinspecifikus UB40 monoklonális antitest,
Enzymology Láb, Sugen, Inc. (Lásd Fendley és munkatársai, 1990, Cancer Research 50:1550-1558);
r) EIA minőségű kecske antiegér IgG-POD (BioRad katalógusszám: 172-1011);
s) 2,2-azino-bisz(3-etil-benztiazolin)-6-szulfonsav (ABTS) oldat [100 mM (vízmentes) citromsav,
250 mM Na2HPO4 (pH=4,0), 0,5 mg/ml ABTS (Sigma katalógusszám: A-1888)], az oldatot sötétben, 4 °C hőmérsékleten kell tartani a felhasználásig;
t) hidrogén-peroxid (30%-os oldat) (Fisher katalógusszám: H325);
u) ABTS/H2O2 (15 ml ABTS-oldat, 2 μΙ hidrogén-peroxid), elkészítendő 5 perccel a felhasználás előtt, majd a felhasználásig szobahőmérsékleten tárolandó;
v) 0,2 M sósavkészlet H2O-ban;
w) dimetil-szulfoxid (100%-os) (Sigma katalógusszám: D—8418); valamint
y) Trypsin-EDTA (Gibco BRL katalógusszám: 25200049).
Az eljárás. A vizsgálat elvégzésére a következő eljárást alkalmazzuk:
1. A Corning gyártmányú 96 üregű ELISA lemezekre felhordunk üregenként 1,0 pg 0,1 M nátrium-karbonátban (pH=9,6) lévő antinyúl IgG antitestet. A végső térfogatot üregenként 150 μΙ-re állítjuk be. A bevont lemezeket egy éjszakán keresztül 4 °C hőmérsékleten tartjuk. A lemezek 4 °C hőmérsékleten tárolva maximum két hétig tarthatók el.
2. Növesztő táptalajban (Growth média) (DMEM, 2,0 mM L-glutaminnal és 10% FBS-sel kiegészítve) sejteket tenyésztünk megfelelő sejttenyészeti csészékben az összefolyásig, 37 °C hőmérsékleten, 5%-os szén-dioxid-arány mellett.
3. Tripszinizálással begyűjtjük a sejteket, és azokat Corning 25850 polisztirén 96 üregű kerek fenekű sejtlemezekbe telepítjük, 25 000 sejt/üreg mennyiségben, 200 μΙ táptalajban.
4. A sejteket legalább egy napon keresztül tenyésztjük 37 °C hőmérsékleten, 5%-os szén-dioxid-tartalom mellett.
5. A sejteket 1X D-PBS felhasználásával mossuk.
6. A rendszerhez üregenként hozzáadunk 200 μΙ éheztető táptalajt (starvation média) (DMEM, 2,0 mM L-glutamin, 0,1% FBS). A rendszert egy éjszakán keresztül inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten, 5%-os széndioxid-tartalom mellett.
7. A vegyületeket/extraktumokat az éheztető táptalajjal 1:20 arányban felhígítjuk polipropilén 96 üregű lemezekben. A kontrollként szolgáló üregekben dimetilszulfoxidot hígítunk 1:20 arányban.
8. A 96 üregű sejttenyészeti lemezekből eltávolítjuk az éheztető táptalajt, és minden üregbe 162 μΙ friss éheztető táptalajt teszünk.
9. Minden üreghez hozzáadunk 18 μΙ mennyiséget a (7. lépésből származó) 1:20 arányban hígított vegyületből/extraktumból, a kontroliul szolgáló üregekhez (+/- VEGF) pedig az 1:20 arányban hígított dimetilszulfoxidból, és a sejtstimulálás utáni végső hígítást 1:200-ra állítjuk be. A végső dimetil-szulfoxid-tartalom 5%. A lemezt 37 °C hőmérsékleten 2 órán keresztül inkubáljuk 5%-os szén-dioxid-tartalom mellett.
10. A meg nem kötött antitestet a lemezek lefordításával távolítjuk el az ELISA lemezekből, hogy a folyadék eltávozhasson. A rendszert 3-szor mossuk TBSW+0,5% etanol-aminnal (pH=7,0). A lemezt papírtörülközővel megtörölgetjük, hogy a fölösleges folyadékot és a buborékokat eltávolítsuk.
11. A lemezeket üregenként 150 μΙ TBSW+0,5% etanol-aminnal (pH=7,0) blokkoljuk. A lemezeket 30 percen keresztül inkubáljuk, egy mikrotiterlemez-rázón való rázás közben.
12. A lemezt a 10. lépésben leírtak szerint 3-szor mossuk.
13. A rendszerhez üregenként hozzáadunk 0,5 pg tisztított affinitású anti-FLU—1 poliklonális nyúl antiszérumot. A végső térfogatot TBSW+0,5% etanol-aminnal
HU 226 755 Β1 (pH=7,0) minden egyes üregben 150 μΙ-re állítjuk be. Rázás közben a lemezt 30 percen keresztül inkubáljuk.
14. A sejtekhez hozzáadunk 180 μΙ éheztető táptalajt, és a sejteket üregenként 20 μ110,0 mM nátrium-orto-vanadáttal és 500 ng/ml VEGF-fel (mely 1,0 mM nátrium-orto-vanadát és 50 ng/ml VEGF végső koncentrációt eredményez üregenként) stimuláljuk 8 percen keresztül, 37 °C hőmérsékleten, 5%-os szén-dioxid-tartalom mellett. A negatív kontroliüregekhez csak éheztető táptalajt adunk.
15. A 8 perc elteltével a táptalajt eltávolítjuk a sejtekről, és a rendszert üregenként 200 μΙ PBS felhasználásával egyszer átmossuk.
16. A sejteket üregenként 150 μΙ HNTG felhasználásával 5 percen keresztül tartó, szobahőmérsékleten való rázás közben szétroncsoljuk. A HNTG nátrium-orto-vanadátot, nátrium-pirofoszfátot és EDTA-t tartalmaz.
17. Az ELISA lemezt a 10. lépésben leírtak szerint háromszor mossuk.
18. A sejtbomlástermékeket a sejtlemezből az ELISA lemezbe tesszük, és rázás közben 2 órán keresztül inkubáljuk. A sejtbomlástermék átvitelét fel-le pipettázással hajtjuk végre, az üregek kapargatása közben.
19. A lemezt a 10. lépésben leírtak szerint háromszor mossuk.
20. Az ELISA lemezt üregenként 0,02 pg TBSW+0,5% etanol-aminban lévő UB40-nel inkubáljuk. Az üregenként! végső térfogatot 150 μΙ-re állítjuk be. Az inkubálást rázás közben, 30 percen keresztül végezzük.
21. A lemezt a 10. lépésben leírtak szerint háromszor mossuk.
22. Az ELISA lemezt TBSW+0,5% etanol-aminban (pH=7,0) lévő 1:10 000 arányban hígított EIA minőségű kecske antiegér IgG konjugált tormaperoxidázzal inkubáljuk. Az üregenként! végső térfogatot 150 μΙ-re állítjuk be. Az inkubálást rázás közben, 30 percen keresztül végezzük.
23. A lemezt a 10. lépésben leírtak szerint mossuk.
24. Az üregekhez hozzáadunk 100 μΙ ABTS/H2O2 oldatot. A lemezt rázás közben tíz percen keresztül inkubáljuk.
25. Az elszíneződéssel járó reakció megállítására 100 μΙ 0,2 M sósavat adunk az üregekhez, hogy a sósav végső koncentrációja 0,1 M legyen. A rendszert 1 percen keresztül rázzuk szobahőmérsékleten. A buborékokat lassú légáramlattal eltávolítjuk, és az ELISA lemezt egy ELISA lemezleolvasón leolvassuk 410 nm hullámhosszon.
6.1.2. HER-2 ELISA
1. vizsgálat: EGF receptor-HER2 chimer receptor vizsgálat egész sejtekben. Egész EGFR-NIH3T3 sejtekben a HER-2 kináz aktivitást az alább leírtak szerint mérjük meg.
Anyagok és reagensek. A vizsgálat végrehajtásához a következő anyagokat és reagenseket használjuk fel:
a) EGF: szabványkoncentráció=16,5 ILM; EGF 201,
TOYOBO, Co., Ltd. Japán.
b) 05-101 (UBI) (egy EGFR extracelluláris domént felismerő monoklonális antitest).
c) Antifoszfotirozin antitest (anti-Ptyr) (poliklonális) (lásd Flendley és munkatársai, mint fentebb).
d) Detektáló antitest: kecske antinyúl IgG tormaperoxidáz konjugát, TAGO, Inc., Burlingame, CA.
e) TBST-puffer:
Tris-HCI, pH=7,2 50 mM
NaCI 150 mM
Triton X-100 0,1
f) HNTG 5X készlet:
HEPES 0,1 M
NaCI 0,75 M
Glicerol 50%
Triton X-100 1,0%
g) ABTS készlet:
Citromsav 100 mM
Na2HPO4 250 mM
Tömény HCI 0,5 pM
ABTS* 0,5 mg/ml * (2,2’-azino-bisz(3-etil-benztiazolin-szulfonsav). Az oldat felhasználásig sötétben, 4 °C hőmérsékleten tárolandó.
h) A következő szabványreagensek:
EDTA 100 mM pH=7,0
Na3VO4 0,5 M
Na4(P2O7) 0,2 M
Eljárás. A következő eljárást alkalmazzuk:
A) Az ELISA lemez előbevonása
1. Az ELISA lemezre (Corning, 96 üregű, katalógusszám: 25805-96) felhordunk 0,5 g 05-101 antitestet üregenként, PBS-ben, 100 μΙ üregenkénti végső térfogat mellett, és a rendszert egy éjszakán keresztül 4 °C hőmérsékleten tároljuk. A bevont lemezek maximum 10 napig használhatók fel, ha 4 °C hőmérsékleten tároljuk azokat.
2. A felhasználás napján eltávolítjuk a bevonópuffert, és azt 100 μΙ blokkolópufferre [PBS-ben lévő 5%-os szegfű instant zsírmentes száraz tej (Carnation Instant Non-Fat Dry Milk)] cseréljük. A lemezt rázás közben szobahőmérsékleten (körülbelül 23-25 °C hőmérsékleten) inkubáljuk 30 percen keresztül. Közvetlenül a felhasználás előtt a blokkolópuffert eltávolítjuk, és a lemezt négyszer mossuk TBST-pufferrel.
B) A sejtek telepítése
1. A vizsgálathoz olyan NIH3T3 sejtfonalat használhatunk, melyben túlzott mennyiségben van jelen egy olyan chirem receptor, mely tartalmaz EGFR extracelluláris domént és extracelluláris HER2 kináz domént.
2. A kísérlethez olyan csészéket választunk, melyek 80-90%-os összefolyással rendelkeznek. A sejteket tripszinizáljuk, majd a reakciónak 10%-os magzati szarvasmarhaszérummal vetünk véget. A sejteket DMEMtáptalajban (10% CS DMEM-táptalaj) szuszpendáljuk, és szobahőmérsékleten, 1500 percenkénti fordulatszámon egyszer 5 percen keresztül centrifugáljuk.
HU 226 755 Β1
3. A sejteket újraszuszpendáljuk telepítő táptalajban (DMEM, 0,5% szarvasmarhaszérum), majd tripánkék felhasználásával megszámoljuk. A 90% fölötti életképesség elfogadható. A sejteket DMEM-táptalajba (0,5% szarvasmarhaszérum) telepítjük, 10 000 sejt/üreg sűrűségben, 100 pl üregenkénti térfogat mellett, egy 96 üregű mikrotiterlemezben. A telepített sejteket 37 °C hőmérsékleten, 5%-os szén-dioxid-tartalom mellett körülbelül 40 órán keresztül inkubáljuk.
C) Vizsgálati eljárások
1. A telepített sejtek szennyezettségét egy invertált mikroszkóp felhasználásával ellenőrizzük. A gyógyszerkészletet (10 mg/ml, DMSO-ban) 1:10 arányban hígítjuk DMEM-táptalajban, majd 5 I mennyiséget ebből átrakunk egy TBST üregbe, hogy végül 1:200 arányban hígított gyógyszeroldatot és 1%-os DMSO-koncentrációt kapjunk. A kontroliüregekbe csak DMSO-t teszünk. A rendszert 37 °C hőmérsékleten, 5%-os szén-dioxidtartalom mellett két órán keresztül inkubáljuk.
2. Elkészítjük az EGF ligandumot: a szabvány EGF-et DMEM-ben hígítjuk oly módon, hogy 10 μΙ hígított EGF átvitelekor (1:12 hígítás) 100 nM végső koncentrációt kapjunk.
3. Elkészítünk annyi friss HNTG*-t, amennyi elég az üregenkénti 100 μΙ térfogathoz; majd jégre tesszük.
HNTG* (10 ml):
HNTG készlet 2,0 ml
Milli-Q H2O 7,3 ml
EDTA, 100 mM, pH=7,0 0,5 ml
Na3VO4, 0,5 M 0,1 ml
Na4(P2O7), 0,2 M 0,1 ml
4. 120 percen keresztül tartó, a gyógyszerrel együtt
történő inkubálás után a sejtekhez hozzáadunk előkészített SGF ligandumot, üregenként 10 μΙ mennyiségben, hogy a végső koncentráció 100 nM legyen. A kontroliüregekbe csak DMEM-et teszünk. A rendszert szobahőmérsékleten, rázás közben 5 percen keresztül inkubáljuk.
5. A rendszerből eltávolítjuk a gyógyszert, az EGF-et és a DMEM-et. A sejteket kétszer mossuk PBS-sel. A HNTG*-t a sejtekhez adjuk, 100 μΙ üregenkénti mennyiségben. A rendszert 5 percre jégre tesszük. Ez alatt az idő alatt egy másik ELISA lemezből eltávolítjuk a blokkolópuffert, és a fentebb leírtak szerint a lemezt TBST-vel mossuk.
6. Egy pipettaheggyel, melyet biztonságosan egy mikropipettorhoz erősítünk, a sejteket lekaparjuk a lemezről, és a sejtes anyagot a HNTG* sejtoldó puffer többszöri beszívásával és kiengedésével homogenizáljuk. A sejtbomlásterméket átvisszük egy burkolt, blokkolt és mosott ELISA lemezre. A rendszert rázás közben egy órán keresztül inkubáljuk szobahőmérsékleten.
7. A sejtbomlásterméket eltávolítjuk, és négyszer mossuk TBST-vel. Az ELISA lemezre ráviszünk üregenként 100 μΙ frissen hígított anti-Ptyr antitestet. A rendszert rázás közben 30 percen keresztül inkubáljuk szobahőmérsékleten, az anti-Ptyr antiszérum jelenlétében (1:3000 hígítás TBST-ben).
8. Az anti-Ptyr antitestet eltávolítjuk, és négyszer mossuk TBST-vel. Az ELISA lemezre ráviszünk üregenként 100 μΙ frissen hígított TAGO antinyúl IgG antitestet. A rendszert rázás közben 30 percen keresztül inkubáljuk szobahőmérsékleten (antinyúl IgG antitest: 1:3000 hígítás TBST-ben).
9. A TAGO detektáló antitestet eltávolítjuk, és négyszer mossuk TBST-vel. Az ELISA lemezre ráviszünk üregenként 100 μΙ frissen hígított ABTS/H2O2 oldatot. A rendszert rázás közben 20 percen keresztül inkubáljuk szobahőmérsékleten (ABTS/H2O2 oldat: 1,0 μΙ 30%-os H2O2 10 ml ABTS készletben).
10. A reakciót 50 μΙ 5 N kénsav hozzáadásával megszakítjuk (nem kötelező), és meghatározzuk az OD-t410 nm-nél.
11. A maximális foszfotirozinjelet akkor kapjuk, ha a pozitív kontrollokra kapott értékből levonjuk a negatív kontrollokra kapott értéket. Az extraktumot tartalmazó üregekre vonatkozó százalékos foszfotirozingátlást ezután számoljuk ki, a negatív kontrollra kapott érték levonása után.
2. vizsgálat: HER-2-BT474 ELISA. Az egész sejt HER2-aktivitás mérésére egy második vizsgálatot végezhetünk. Egy ilyen vizsgálat a következőképpen végezhető el.
Anyagok és reagensek. A következő anyagokat és reagenseket használjuk fel:
a) BT-474 (ATCC HBT20), egy olyan humán mellráksejtfonal, mely magas HER2 kinázszintet mutat.
b) Növesztő táptalaj, melynek tartalma: RPMI+10%
FBS+GMS-G (Gibco készlet)+glutamin; BT-474 sej35
c)
d)
e)
g)
h) tek 37 °C hőmérsékleten való, 5%-os szén-dioxidtartalom mellett egy inkubátorban történő tenyésztésére.
Eqy monoklonális anti-HER2 antitest.
D-PBS:
KH2PO4 K2HPO4 KCI NaCI
Blokkolópuffer:
0,20 g/l 10 (GIBCO, 310-4190AJ) 2,16 g/l 0,20 g/l
8,00 g/l (pH=7,2)
TBST+5% tej (koncentrált instant zsírmentes száraz tej).
TBST-puffer:
Tris-HCI 50 mM
NaCI 150 mM (pH=7,2, HCI 10 N)
Triton X-100 0,1% ahol is a szabvány TES-oldatot (10X) készítjük el, és a Triton Χ-100-at hígítás közben adjuk hozzá a pufferhez.
HNTG-puffer (5x):
HEPES 0,1 M
NaCI 750 mM [pH=7,2 (HCI, 1 N)]
Glicerol 50%
Triton X-100 1,0%
Szabványoldatot (5x) állítunk elő, és 4 °C hőmérsékleten tároljuk.
EDTA-HCI: 0,5 M pH=7,0 (10 N HCI), 500X készlet60 ként.
HU 226 755 Β1
i) Na3VO4: 0,5 Μ, 100X készletként, részletekben
-80 °C hőmérsékleten tároljuk.
j) Na4(P2O7): 0,2 Μ, 100X készletként.
k) Poliklonális antiszérum antifoszfotirozin.
l) Kecske antinyúl IgG, tormaperoxidáz (POD) konjugát [detektáló antitest, Tago (katalógusszám: 4520; Lót No. 1802]: Tago, Inc., Burlingame, CA.
m) ABTS-oldat:
Citromsav 100 mM
Na2HPO4 250 mM
ABTS 0,5 mg/ml ahol az ABTS jelentése (2,2’-azino-bisz(3-etil-benztiazolin-szulfonsav). Ehhez a vizsgálathoz az ABTS-oldatot sötétben, 4 °C hőmérsékleten kell tárolni. Amikor az oldat megzöldül, ki kell dobni.
n) Hidrogén-peroxid: a 30%-os oldatot sötétben tároljuk, 4 °C hőmérsékleten.
Eljárás. A következő lépések mindegyikét szobahőmérsékleten, steril körülmények között hajtjuk végre, hacsak mást nem mondunk. Az ELISA lemezek mosását minden alkalommal háromszori desztillált vízzel való, és egyszeri TBST-vel való öblítéssel végezzük.
A) A sejtek telepítése
1. Szövettenyészeti csészékben (Corning 25020100) BT474 sejteket tenyésztünk, 80-90%-os összefolyásig, majd Trypsin-EDTA (0,25%, GIBCO) felhasználásával összegyűjtjük azokat.
2. A sejteket friss táptalajban újraszuszpendáljuk, majd 96 üregű szövettenyészeti lemezekbe (Corning, 25806-96) rakjuk, körülbelül 25 000-50 000 sejt/üreg (100 μΙ/üreg) sűrűségben. A sejteket 37 °C hőmérsékleten 5%-os szén-dioxid-tartalom mellett egy éjszakán keresztül inkubáljuk.
B) Az ELISA lemezek beborltása és blokkolása
1. Az ELISA lemezre (Corning 25805-96) egy éjszaka alatt, 4 °C hőmérsékleten felhordunk 150 μΙ PBS-ben lévő 0,5 μg HER2 antitestet üregenként, és a lemezt parafilmmel lezárjuk. Az antitesttel borított lemezek maximum két hétig használhatók fel, amennyiben 4 °C hőmérsékleten tároljuk azokat.
2. A felhasználás napján a bevonóoldatot eltávolítjuk, azt 200 μΙ blokkolópufferre cseréljük, a lemezt rázzuk, majd eltávolítjuk a blokkolópuffert is, és a lemezt közvetlenül a sejtbomlástermék hozzáadása előtt mossuk.
C) Vizsgálati eljárások
1. A gyógyszereket szérummentes állapotban TBST-zzük. A gyógyszerek hozzáadása előtt a régi táptalajt szérummentes RPMI-re cseréljük (90 μΙ/üreg).
2. A gyógyszerkészletet (100% DMSO-ban) 1:10 arányban hígítjuk RPMI-vel, majd 10 μΙ/üreg mennyiségben az így kapott oldatot a sejtekhez adjuk, aminek eredményeképpen a végső gyógyszer DMSOkoncentráció 1 % lesz. A sejteket 37 °C hőmérsékleten 5%-os szén-dioxid-tartalom mellett inkubáljuk.
3. Friss sejtoldó puffért (HNTG*) készítünk:
5*HNTG 2 ml
EDTA 0,2 ml
Na3VO4 0,1 ml
0,1 ml
h2o 7,3 ml.
4. A gyógyszer két órán keresztül tartó preinkubá-
ciója után az oldatot teljesen eltávolítjuk a lemezről, a sejtekhez HNTG*-t adunk (100 μΙ/üreg), és a lemezt 10 percen keresztül rázzuk.
5. Egy 12 csatornás pipetta felhasználásával a sejteket eltávolítjuk a lemezről, és a sejtbomlásterméket többszöri beszívással és kieresztéssel homogenizáljuk. Ezután a sejtbomlásterméket teljes egészében átvisszük az ELISA lemezre, és azt 1 órán keresztül rázzuk.
6. A sejtbomlásterméket eltávolítjuk, a lemezt mossuk, hozzáadunk üregenként 100 μΙ anti-pTyr-t (1:3000 arányú hígítás TBST-vel), és a rendszert 30 percen keresztül rázzuk.
7. Az anti-pTyr-t eltávolítjuk, a lemezt mossuk, hozzáadunk üregenként 100 μΙ kecske antinyúl IgG konjugált antitestet (1:5000 arányú hígítás TBST-vel), és a rendszert 30 percen keresztül rázzuk.
8. Eltávolítjuk az antinyúl IgG antitestet, a lemezt mossuk, és hozzáadunk üregenként 100 I friss ABTS/H2O2 oldatot (1,2 μΙ H2O2 10 ml ABTS-hez), hogy az elszíneződés beinduljon, ami általában 20 percet vesz igénybe.
9. OD-mérés 410 nm-en, Dynatec MR5000.
6.1.3. PDGF-R ELISA
Minden sejttenyészeti táptalajt, a glutamint és a magzati szarvasmarhaszérumot a Gibco Life Technologiestől (Gran Island, NY) szerezzük be, hacsak mást nem mondunk. Minden sejttenyészetet 90-95% levegő és 5-10% szén-dioxid összetételű nedves atmoszférában növesztünk, 37 °C hőmérsékleten. Hetente kétszer minden sejtfonalból rutinszerűen kitenyésztünk egy álkultúrát, és a tenyészeteket Mycotest módszerrel (Gibco) vizsgálva negatív mycoplazma eredményt kapunk.
Az ELISA vizsgálathoz a sejteket (U1242, beszerzési hely: Joseph Schlessinger, NY) 80-90%-os összefolyásig növesztjük növesztő táptalajban (MÉM 10% FBS-sel, NEAA, 1 mM NaPyr és 2 mM GLN), és 96 üregű szövettenyésztő lemezekbe telepítjük, 0,5% szérumban, üregenként! 25 000-30 000 sejtsűrűség mellett. Egy éjszakán keresztül tartó, 0,5% szérumtartalmú táptalajban való inkubálás után a sejteket átrakjuk szérummentes táptalajba, és 2 órán keresztül kezeljük a tesztvegyülettel, 5%-os szén-dioxid-tartalom mellett, 37 °C hőmérsékleten. Ezután a sejteket 5-10 percen keresztül stimuláljuk a ligandummal, majd HNTG-vel (20 mM Hepes, 150 mM nátrium-klorid, 10% glicerol, 5 mM EDTA, 5 mM Na3VO4, 0,2% Triton X-100 és 2 mM NaPyr) szétroncsoljuk. A sejtbomlásterméket (0,5 mg/üreg, PBS-ben) olyan ELISA lemezekre visszük át, melyeket előzőleg receptorspecifikus antitesttel borítottunk, és amelyeket TBST-ben (50 mM Tris-HCI pH=7,2, 150 mM NaCI és 0,1% Triton X-100)
HU 226 755 Β1 lévő 5%-os tejjel szobahőmérsékleten, 30 percen keresztül blokkolunk. A sejtbomlásterméket rázás közben egy órán keresztül inkubáljuk szobahőmérsékleten.
A lemezeket négyszer mossuk TBST-vel, majd poliklonális antifoszfotirozin antitesttel inkubáljuk szobahő- 5 mérsékleten, 30 percen keresztül. Az antifoszfotirozin antitest fölöslegét TBST-vel való négyszeri öblítéssel eltávolítjuk. Az ELISA lemezhez 30 percre kecske antinyúl IgG antitestet adunk szobahőmérsékleten, majd a lemezt négyszer öblítjük TBST-vel. Az elszíneződés 10 megindításához ABTS (100 mM citromsav, 250 mM Na2HPO4 és 0,5 mg/ml 2,2’-azino-bisz(3-etil-benztiazolin-6-szulfonsav)+H2O2 (1,2 ml 30%-os H2O2 10 ml ABTS-hez) elegyet adunk. A 410 nm hullámhosszon és a 630 nm referencia-hullámhosszon való abszorban- 15 ciát körülbelül 15-30 perccel az ABTS hozzáadása után vesszük fel.
j) Na4(P2O7): 0,2 M, 100X készletként.
k) Inzulinszerű növekedési faktor (Insuline-like growth factor-1), a Promegától (katalógusszám: G5111).
l) Poliklonális antiszérum antifoszfotirozin: az Enzymology Láb., SUGEN Inc.-től származó nyúlszérum.
m) Kecske antinyúl IgG, POD konjugát (detektáló antitest), Tago (katalógusszám: 4520; Lót No. 1802): Tago, Inc., Burlingame, CA.
n) ABTS (2,2’-azino-bisz(3-etil-benztiazolin-szulfonsav)-oldat:
Citromsav 100 mM
Na2HPO4 250 mM (pH=4,0/l N HCI)
ABTS 0,5 mg/ml
Az ABTS-oldatot sötétben, 4 °C hőmérsékleten kell tárolni. Amikor az oldat megzöldül, ki kell dobni.
o) Hidrogén-peroxid: a 30%-os oldatot sötétben tároljuk, 4 °C hőmérsékleten.
6.1.4. IGF-I ELISA
A foszfotirozin szintjét az IGF-I receptoron a követ- 20 kező eljárás felhasználásával mérhetjük meg, mely az IGF-I receptor tirozin-kináz-aktivitást adja meg.
Anyagok és reagensek. A következő anyagokat és reagenseket használjuk fel:
a) Ebben a vizsgálatban 3T3/IGF-1R sejtfonalat használunk, mely sejtfonalban túlteng az IGF-1 receptor.
b) A NIH3T3/IGF—1R sejteket egy inkubátorban növesztjük 37 °C hőmérsékleten, 5%-os szén-dioxidtartalom mellett. A növesztő táptalaj összetétele: DMEM+10% FBS (hővel inaktivált)+2 mM L-glutamin.
c) A 17-69 nevezetű anti-IGF—1R antitestet használjuk. Az antitesteket az Enzimology Láb., SUGEN, Inc. tisztítja.
d) D-PBS:
KH2PO4 0,20 g/l
K2HPO4 2,16 g/l
KCI 0,20 g/l
NaCI 8,00 g/l (pH=7,2)
e) Blokkolópuffer: TBST+5% tej (koncentrált instant zsírmentes száraz tej).
f) TBST-puffer:
Tris-HCI 50 mM
NaCI 150 mM (pH=7,2, HCI 10 N)
Triton X-100 0,1% ahol is a szabvány TES-oldatot (10X) készítjük el, és a Triton Χ-100-at hígítás közben adjuk hozzá a pufferhez.
g) HNTG-puffer:
h)
HEPES NaCI Glicerol Triton X-100 mM
150 mM (pH=7,2/HC11 N)
10%
0,2%
Szabványoldatot (5x) állítunk elő, és 4 °C hőmérsékleten tároljuk.
EDTA-HCI: 0,5 M pH=7,0 (NaOH), 100X készlet55 ként.
Eljárás. A következő lépések mindegyikét szobahőmérsékleten visszük végbe, hacsak mást nem mondunk. Az ELISA lemezek mosását háromszori csapvízzel való, és egyszeri TBST-vel való öblítéssel végezzük. A lemezeket papírtörülközőkkel szárazra töröljük.
A) A sejtek telepítése
1. A szövettenyészeti csészékben (Corning 25020100) 80-90%-os összefolyásig növesztett sejteket, Trypsin-EDTA (0,25%, 0,5 ml/D-100, GIBCO) felhasználásával összegyűjtjük.
2. A sejteket friss DMEM+10% FBS+2 mM L-glutamin elegyében újraszuszpendáljuk, majd 96 üregű szövettenyészeti lemezekbe (Corning, 25806-96) rakjuk, körülbelül 20 000 sejt/üreg (100 μΙ/üreg) sűrűségben. A sejteket 1 napon keresztül inkubáljuk, majd a táptalajt szérummentes táptalajra cseréljük ki (90/μΙ), és a sejteket 37 °C hőmérsékleten 5%-os szén-dioxid-tartalom mellett egy éjszakán keresztül inkubáljuk.
B) Az ELISA lemezek beborítása és blokkolása
1. Az ELISA lemezre (Corning 25805-96) legalább 2 óra alatt, felhordunk 100 μΙ PBS-ben lévő 0,5 μg antiIGF—1R antitestet.
2. A bevonóoldatot eltávolítjuk, azt 100 μΙ blokkolópufferre cseréljük, és a lemezt 30 percen keresztül rázzuk. Ezután eltávolítjuk a blokkolópuffert is, és a lemezt közvetlenül a sejtbomlástermék hozzáadása előtt mossuk.
C) Vizsgálati eljárások
1. A gyógyszereket szérummentes állapotban TBST-zzük.
2. A gyógyszerkészletet (100% DMDO-ban) 1:10 arányban hígítjuk DMEM-vel egy 96 üregű polipropilénlemezen, majd 10 μΙ/üreg mennyiségben az így kapott oldatot a sejtekhez adjuk, aminek eredményeképpen a végső gyógyszerhígítási arány 1:100 lesz, a végső DMSO-koncentráció pedig 1% lesz. A sejteket 37 °C hőmérsékleten 5%-os szén-dioxid-tartalom mellett 2 órán keresztül inkubáljuk.
i) Na3VO4: 0,5 Μ, 100X készletként, részletekben
-80 °C hőmérsékleten tároljuk.
HU 226 755 Β1
3. Friss sejtoldó puffért (HNTG*) készítünk:
HNTG 2 ml
EDTA 0,1 ml
Na3VO4 0,1 ml
0,1 ml
h2o 7,3 ml
4. A gyógyszer két órán keresztül tartó inkubációja
után a sejtekhez hozzáadunk üregenként 10 μΙ PBSben lévő 200 nM IGF-1 ligandumot (a végső koncentráció=20 nM), és a rendszert 37 °C hőmérsékleten 5%-os szén-dioxid-tartalom mellett 10 percen keresztül inkubáljuk.
5. A táptalajt eltávolítjuk, a rendszerhez hozzáadunk üregenként 100 μΙ HNTG*-t, és a lemezt 10 percen keresztül rázzuk. A sejteket megvizsgáljuk mikroszkóppal, hogy ellenőrizzük, megfelelő mértékben elbomlottak-e.
6. Egy 12 csatornás pipetta felhasználásával a sejteket eltávolítjuk a lemezről, és a sejtbomlásterméket többszöri beszívással és kieresztéssel homogenizáljuk. Ezután a sejtbomlásterméket teljes egészében átvisszük az antitesttel borított ELISA lemezre, és azt 1 órán keresztül rázzuk.
7. A sejtbomlásterméket eltávolítjuk, a lemezt mossuk, hozzáadunk üregenként 100 μΙ anti-pTyr-t (1:3000 arányú hígítás TBST-vel), és a rendszert 30 percen keresztül rázzuk.
8. Az anti-pTyr-t eltávolítjuk, a lemezt mossuk, hozzáadunk üregenként 100 μΙ Tagét (1:3000 arányú hígítás TBST-vel), és a rendszert 30 percen keresztül rázzuk.
9. Eltávolítjuk a detektáló antitestet, a lemezt mossuk, és hozzáadunk üregenként 100 μΙ friss ABTS/H2O2 oldatot (1,2 μΙ H2O2 10 ml ABTS-hez), hogy az elszíneződés beinduljon.
10. Az OD-t egy Ingres-hez kapcsolt Dynatec MR5000 felhasználásával mérjük.
6.1.5. EGF receptor ELISA
Egész sejtekben az EGF receptor kináz aktivitást (EGFR-NIH3T3 vizsgálat) az alább leírtak szerint mérjük meg.
Anyagok és reagensek. A vizsgálat végrehajtásához a következő anyagokat és reagenseket használjuk fel:
a) EGF ligandum: szabványkoncentráció=16,5 ILM;
EGF 201, TOYOBO, Co., Ltd., Japán.
b) 05-101 (UBI) (egy EGFR extracelluláris domént felismerő monoklonális antitest).
c) Antifoszfotirozin antitest (anti-Ptyr) (poliklonális).
d) Detektáló antitest: Kecske antinyúl IgG tormaperoxidáz konjugát, TAGO, Inc., Burlingame, CA.
e) TBST-puffer:
Tris-HCI, pH=7,2 50 mM
NaCI 150 mM
Triton X-100 0,1
f) HNTG 5X készlet:
HEPES 0,1 M
NaCI 0,75 M
Glicerol 50%
Triton X-100 1,0%
g) ABTS készlet:
Citromsav 100 mM
Na2HPO4 250 mM
Tömény HCI 4,0 pH
ABTS* 0,5 mg/ml
Az oldat felhasználásáig sötétben, 4 °C hőmérsékleten tárolandó.
h) A következő szabványreagensek:
EDTA 100 mM pH=7,0
Na3VO4 0,5 M
Na4(P2O7) 0,2 M
Eljárás. A következő eljárást alkalmazzuk:
A) Az ELISA lemez előbevonása
1. Az ELISA lemezekre (Corning, 96 üregű, katalógusszám: 25805-96) felhordunk 0,5 pg 05-101 antitestet üregenként, PBS-ben, 150 μΙ üregenként! végső térfogat mellett, és a rendszert egy éjszakán keresztül 4 °C hőmérsékleten tároljuk. A bevont lemezek maximum 10 napig használhatók fel, ha 4 °C hőmérsékleten tároljuk azokat.
2. A felhasználás napján eltávolítjuk a bevonópuffert, és azt blokkolópufferre [PBS-ben lévő 5%-os szegfű instant zsírmentes száraz tej (Carnation Instant Non-Fat Dry Milk)] cseréljük. A lemezt rázás közben, szobahőmérsékleten (körülbelül 23-25 °C hőmérsékleten) inkubáljuk 30 percen keresztül. Közvetlenül a felhasználás előtt a blokkolópuffert eltávolítjuk, és a lemezt négyszer mossuk TBST-pufferrel.
B) A sejtek telepítése
1. A vizsgálathoz használhatunk NIH 3T3/C7 sejtfonalat (Honegger és munkatársai, Cell 51: 199-209, 1987).
2. A kísérlethez olyan csészéket választunk, melyek 80-90%-os összefolyással rendelkeznek. A sejteket tripszinizáljuk, majd a reakciónak 10% CS DMEMtáptalaj hozzáadásával vetünk véget. A sejteket DMEM-táptalajban (10% CS DMEM-táptalaj) szuszpendáljuk, és egyszer 1000 percenkénti fordulatszámon, egyszer szobahőmérsékleten 5 percen keresztül centrifugáljuk.
3. A sejteket újraszuszpendáljuk telepítő táptalajban (DMEM, 0,5% szarvasmarhaszérum), és tripánkék felhasználásával megszámoljuk. A 90% fölötti életképesség elfogadható. A sejteket telepítsük DMEM-táptalajba (0,5% szarvasmarhaszérum), 10 000 sejt/üreg sűrűségben, 100 μΙ üregenként! térfogat mellett, egy 96 üregű mikrotiterlemezben. A telepített sejteket 37 °C hőmérsékleten, 5%-os szén-dioxid-tartalom mellett körülbelül 40 órán keresztül inkubáljuk.
C) Vizsgálati eljárások
1. A telepített sejtek szennyezettségét egy invertált mikroszkóp felhasználásával ellenőrizzük. A gyógyszerkészletet (10 mg/ml, DMSO-ban) 1:10 arányban hígítjuk DMEM-táptalajjal, majd 5 μΙ mennyiséget ebből átrakunk egy vizsgálati üregbe, hogy végül 1:200 arányban
HU 226 755 Β1 hígított gyógyszeroldatot és 1%-os DMSO-koncentrációt kapjunk. A kontroliüregekbe csak DMSO-t teszünk.
A rendszert 37 °C hőmérsékleten, 5%-os szén-dioxidtartalom mellett két órán keresztül inkubáljuk.
2. Elkészítjük az EGF ligandumot: a szabvány 5 EGF-et DMEM-ben hígítjuk oly módon, hogy 10 μΙ hígított EGF átvitelekor (1:12 hígítás) 25 nM végső koncentrációt kapjunk.
3. Elkészítünk 10 ml friss HNTG*-t, amennyi elég az üregenként! 100 μΙ térfogathoz. 10
A HNTG* a következő összetevőket tartalmazza:
HNTG készlet 2,0 ml
Milli-Q H2O 7,3 ml
EDTA, 100 mM, pH=7,0 0,5 ml
Na3VO4, 0,5 M 0,1 ml
Na4(P2O7), 0,2 M 0,1 ml
4. Jégre tesszük.
5. 120 percen keresztül tartó, a gyógyszerrel együtt
történő inkubálás után a sejtekhez hozzáadunk előkészített EGF ligandumot, üregenként 10 μΙ mennyiség- 20 ben, hogy a végső koncentráció 25 nM legyen. A kontroliüregekbe csak DMEM-et teszünk. A rendszert szobahőmérsékleten, rázás közben 5 percen keresztül inkubáljuk.
6. A rendszerből eltávolítjuk a gyógyszert, az 25 EGF-et és a DMEM-et. A sejteket kétszer mossuk PBS-sel. A HNTG*-t a sejtekhez adjuk, 100 μΙ üregenként! mennyiségben. A rendszert 5 percre jégre tesszük. Ez alatt az idő alatt egy másik ELISA lemezből eltávolítjuk a blokkolópuffert, és a fentebb leírtak sze- 30 rint a lemezt TBST-vel mossuk.
7. Egy pipettaheggyel, melyet biztonságosan egy mikropipettorhoz erősítünk, a sejteket lekaparjuk a lemezről, és a sejtes anyagot a HNTG* sejtoldó puffer többszöri beszívásával és kiengedésével homogenizál- 35 juk. A sejtbomlásterméket átvisszük egy burkolt, blokkolt és mosott ELISA lemezre. A rendszert rázás közben egy órán keresztül inkubáljuk szobahőmérsékleten.
8. A sejtbomlásterméket eltávolítjuk, és négyszer 40 mossuk TBST-vel. Az ELISA lemezre ráviszünk üregenként 100 μΙ frissen hígított anti-Ptyr antitestet.
A rendszert rázás közben 30 percen keresztül inkubáljuk szobahőmérsékleten, az anti-Ptyr antiszérum jelenlétében (1:3000 hígítás TBST-ben). 45
9. Az anti-Ptyr antitestet eltávolítjuk, és négyszer mossuk TBST-vel. Az ELISA lemezre ráviszünk üregenként 100 μΙ frissen hígított TAGO 30 antinyúl IgG antitestet. A rendszert rázás közben 30 percen keresztül inkubáljuk szobahőmérsékleten (antinyúl IgG anti- 50 test: 1:3000 hígítás TBST-ben).
10. A detektáló antitestet eltávolítjuk, és négyszer mossuk TBST-vel. Az ELISA lemezre ráviszünk üregenként 100 μΙ frissen hígított ABTS/H2O2 oldatot.
A rendszert 20 percen keresztül inkubáljuk szobahő- 55 mérsékleten (ABTS/H2O2 oldat: 1,2 μΙ 30%-os H2O2 10 ml ABTS készletben).
11. A reakciót 50 μΙ 5 N kénsav hozzáadásával megszakítjuk (nem kötelező), és meghatározzuk az
OD-t 410 nm-nél. 60
12. A maximális foszfotirozinjelet akkor kapjuk, ha a pozitív kontrollokra kapott értékből levonjuk a negatív kontrollokra kapott értéket. Az extraktumot tartalmazó üregekre vonatkozó százalékos foszfotirozingátlást ezután számoljuk ki, a negatív kontrollra kapott érték levonása után.
6.1.6. Celluláris inzulin receptor ELISA
Annak eldöntésére, hogy a találmány vegyülete rendelkezik-e inzulinreceptor tirozin-kináz-aktivitással, a következő eljárást alkalmazzuk.
Anyagok és reagensek. A következő anyagokat és reagenseket használjuk fel az inzulinreceptoron megfigyelhető foszfotirozinszintek mérésére (ami az inzulinreceptor tirozin-kináz-aktivitását adja meg):
1. Az előnyben részesített sejtfonal egy NIH3T3 sejtfonal (ATCC No. 1658), melyben túlteng az inzulinreceptor (H25 sejtek).
2. A H25 sejteket egy inkubátorban növesztjük 37 °C hőmérsékleten, 5%-os szén-dioxid-tartalom mellett. A növesztő táptalaj összetétele: DMEM+10% FBS (hővel inaktivált)+2 mm L-glutamin.
3. Az ELISA lemez befedésére a BBE nevezetű monoklonális anti-IR antitestet használjuk. Az antitesteket az Enzimology Láb., SUGEN, Inc. tisztítja.
4. D-PBS:
KH2PO4 0,20 g/l (GIBCO, 310-4190AJ)
K2HPO4 2,16 g/l
KCI 0,20 g/l
NaCI 8,00 g/l (pH=7,2)
5. Blokkolópuffer: TBST+5% tej (koncentrált instant zsírmentes száraz tej)
6. TBST-puffer:
Tris-HCI 50 mM
NaCI 150 mM (pH=7,2, HCI 1 N)
Triton X-100 0,1% ahol is a szabvány TBS-oldatot (10X) készítjük el, és a Triton Χ-100-at hígítás közben adjuk hozzá a pufferhez.
7. HNTG-puffer:
HEPES 20 mM
NaCI 150 mM pH=7,2 (HCI 1 N)
Glicerol 10%
Triton X-100 0,2%
Szabványoldatot (5x) állítunk elő, és azt 4 °C hőmérsékleten tároljuk.
8. EDTA-HCI: 0,5 M pH=7,0 (NaOH), 100X készletként.
9. Na3VO4: 0,5 Μ, 100X készletként, részletekben -80 °C hőmérsékleten tároljuk.
10. Na4(P2O7): 0,2 Μ, 100X készletként.
11. Inzulin a GIBCO BRL-től (katalógusszám:
18125039).
12. Poliklonális antiszérum antifoszfotirozin: az Enzymology Láb., SUGEN Inc.-től származó nyúlszérum.
13. Detektáló antitest, előnyösen kecske antinyúl IgG, POD konjugát, Tago (katalógusszám: 4520; Lót No. 1802): Tago, Inc., Burlingame, CA.
HU 226 755 Β1
14. ABTS (2,2’-azino-bisz(3-etil-benztiazolin-szulfonsav)-oldat:
Citromsav 100 mM
Na2HPO4 250 mM (pH=4,0/1 N HCI)
ABTS 0,5 mg/ml
Az ABTS-oldatot sötétben, 4 °C hőmérsékleten kell tárolni. Amikor az oldat megzöldül, ki kell dobni.
15. Hidrogén-peroxid: a 30%-os oldatot sötétben tároljuk, 4 °C hőmérsékleten.
Eljárás. A következő lépések mindegyikét szobahőmérsékleten visszük végbe, hacsak mást nem mondunk. Az ELISA lemezek mosását háromszori csapvízzel való, és egyszeri TBST-vel való öblítéssel végezzük. A lemezeket papírtörülközőkkel szárazra töröljük.
A) A sejtek telepítése
1. A szövettenyészeti csészékben (10 cm, Corning 25020-100) 80-90%-os összefolyásig növesztett sejteket Trypsin-EDTA (0,25%, 0,5 ml/D-100, GIBCO) felhasználásával összegyűjtjük.
2. A sejteket friss DMEM+10% FBS+2 mM L-glutamin elegyében újraszuszpendáljuk, majd 96 üregű szövettenyészeti lemezekbe (Corning, 25806-96) rakjuk, körülbelül 20 000 sejt/üreg (100 μΙ/üreg) sűrűségben. A sejteket ezután 1 napon keresztül inkubáljuk. Az inkubálást követően a táptalajt 0,01% szérumtartalmú táptalajra cseréljük ki (90/μΙ), és a sejteket 37 °C hőmérsékleten 5%-os szén-dioxid-tartalom mellett egy éjszakán keresztül inkubáljuk.
B) Az ELISA lemezek beborítása és blokkolása
1. Az ELISA lemezre (Corning 25805-96) legalább 2 óra alatt felhordunk 100 μΙ PBS-ben lévő 0,5 μg anti-IR antitestet.
2. A bevonóoldatot eltávolítjuk, azt 100 μΙ blokkolópufferre cseréljük, és a lemezt 30 percen keresztül rázzuk. Ezután eltávolítjuk a blokkolópuffert is, és a lemezt közvetlenül a sejtbomlástermék hozzáadása előtt mossuk.
C) Vizsgálati eljárások
1. A gyógyszereket szérummentes állapotban TBST-zzük.
2. A gyógyszerkészletet (100% DMDO-ban) 1:10 arányban hígítjuk DMEM-vel egy 96 üregű polipropilénlemezen, majd 10 μΙ/üreg mennyiségben az így kapott oldatot a sejtekhez adjuk, aminek eredményeképpen a végső gyógyszerhígítási arány 1:100 lesz, a végső DMSO-koncentráció pedig 1% lesz. A sejteket 37 °C hőmérsékleten 5%-os szén-dioxid-tartalom mellett 2 órán keresztül inkubáljuk.
3. Friss sejtoldó puffért (HNTG* ) készítünk:
HNTG (5x) 2 ml
EDTA 0,1 ml
Na3VO4 0,1 ml
Na4P2O7 0,1 ml
H2O 7,3 ml
HNTG* 10 ml
4. A gyógyszer két órán keresztül tartó inkubációja
után a sejtekhez hozzáadunk üregenként 10 μΙ PBSben lévő 1 μΜ inzulint (a végső koncentráció=100 nM), és a rendszert 37 °C hőmérsékleten 5%-os szén-dioxid-tartalom mellett 10 percen keresztül inkubáljuk.
5. A táptalajt eltávolítjuk, a rendszerhez hozzáadunk üregenként 100 μΙ HNTG*-t, és a lemezt 10 percen keresztül rázzuk. A sejteket megvizsgáljuk mikroszkóppal, hogy ellenőrizzük, megfelelő mértékben elbomlottak-e.
6. Egy 12 csatornás pipetta felhasználásával a sejteket lekaparjuk a lemezről, és a sejtbomlásterméket többszöri beszívással és kieresztéssel homogenizáljuk. Ezután a sejtbomlásterméket teljes egészében átvisszük az antitesttel borított ELISA lemezre, és azt 1 órán keresztül rázzuk.
7. A sejtbomlásterméket eltávolítjuk, a lemezt mossuk, hozzáadunk üregenként 100 μΙ anti-pTyr-t (1:3000 arányú hígítás TBST-vel), és a rendszert 30 percen keresztül rázzuk.
8. Az anti-pTyr-t eltávolítjuk, a lemezt mossuk, hozzáadunk üregenként 100 μΙ Tagót (1:3000 arányú hígítás TBST-vel), és a rendszert 30 percen keresztül rázzuk.
9. Eltávolítjuk a detektáló antitestet, a lemezt mossuk, és hozzáadunk üregenként 100 μΙ friss ABTS/H2O2 oldatot (1,2 μΙ H2O2 10 ml ABTS-hez), hogy az elszíneződés beinduljon.
10. Az OD-t egy Ingres-hez kapcsolt Dynatec MR5000 felhasználásával mérjük. Minden további lépést az Ingres instrukciói alapján kell elvégezni.
6.1.7. Az ELISA vizsgálatokból származó kísérleti eredmények
A találmány különböző vegyületeire vonatkozó, a fent leírt eljárások alkalmazásával nyert kísérleti eredményeket az 1. táblázat tartalmazza.
1. táblázat
Az ELISA vizsgálatok eredményei
Vegyület (példa száma) PDGFR FLK-1 EGFR HER2 kináz IGF-1R
ICso(pM) IC50 (μΜ) IC5o (μΜ) IC50 (μΜ) IC50 (μΜ)
27. 19,4 0,8
4313. 14,5 18,8 11 16,9 8,0
1B. 12 0,39
16. 87,4 4,2
HU 226 755 Β1
1. táblázat (folytatás)
Vegyület (példa száma) PDGFR FLK-1 EGFR HER2 kináz IGF-1R
IC50(pM) IC50 (μΜ) IC50 (μΜ) IC50 (μΜ) IC50 (μΜ)
17. 11,8
20. 28,8
21. 9
22. 2,2
24. 8,5
26. 22,6
28. 22,5
29. 7,9 11,2
32. 20,9
4. 33,1 2,1
33. 21,6 39,4
34. 4,1
5. 5,8 1,6 90,2
36. 4 51,5
37. 9,6
38. 4,7
39. 14,8 36,7
41. 6,4
8. 2,9 89,8
42. 0,4
43. 1,8
9. 17 0,24
44. 23,8
10. 0,17
45. 53,7 1,1
11. 0,07
12. 10,8 0,11
48. 15,4
13. 2,3
50. 4,6
14. 2,4
53. 51,4
15. 4,5 70,6
55. 8,6
57. 73,4
58. 41,2
59. 22,8
6. 4,5 92,6
61. 3,4 44
62. 65,5 0,14
64. 36,2
70. 0,18
71. 20,3
HU 226 755 Β1
1. táblázat (folytatás)
Vegyület (példa száma) PDGFR FLK-1 EGFR HER2 kináz IGF-1R
IC50(pM) IC50 (μΜ) IC50 (μΜ) IC50 (μΜ) IC50 (μΜ)
73. 86 1,6
74. 55,9 2,7
76. 8,7
77. 14,2 1,5
78. 7,4
81. 0,15
7. 5,3 39,6 30,4
6.2. Sejtnövekedési vizsgálatok A találmány vegyületeinek a sejtek növekedésére gyakorolt hatása, ami az adott vegyület és egy vagy több receptor tirozin-kináz kölcsönhatásának az eredménye, a következő vizsgálatok elvégzésével mérhető. Hacsak mást nem mondunk, a következő vizsgálatok általánosan alkalmazhatók egy adott vegyület tetszőleges receptor tirozin-kinázzal szemben mutatott aktivitásának a mérésére. Az alább leírt vizsgálatok mindig egy adott receptor tirozin-kinázra vonatkoznak, de szakemberek számára nem okozhat problémát, hogy a leírt eljárásokat egy másik receptor tirozin-kinázzal szembeni aktivitás mérésére adaptálja.
6.2.1. Lágy agar vizsgálat A lágy agar vizsgálatot alkalmazhatjuk az egyes anyagok sejtnövekedésre gyakorolt hatásának mérésére. Hacsak mást nem mondunk, a lágy agar vizsgálatot a következők szerint hajtjuk végre.
Anyagok és reagensek. Az alábbi anyagokat és reagenseket használjuk fel:
a) Egy 39 °C hőmérsékletű és egy 37 °C hőmérsékletű vízfürdő.
b) A 2X vizsgálati táptalaj olyan 2X Dulbecco-féle 5-módosított Eagle-féle táptalajt (DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Médium) (Gibco katalógusszám: CA400-4AN03) tartalmaz, melyet a következőkkel egészítünk ki:
- 20% magzati szarvasmarhaszérum (FBS, Fetal Bovine Serum), 2 mM nátrium-piruvát 4 mM glutamin-amin és
- 20 mM HEPES nem esszenciális aminosavak (1:50 100x készletből).
c) Az 1X vizsgálati táptalaj olyan 1X DMEM-ből készül, melyet 10% FBS-sel, 1 mM nátrium-piruváttal, 2 mM glutamin, 10 mM HEPES-sel, nem esszenciális aminosawal (1:100 arányban a 100x készletből).
d) 1,6% SeaPlaque Agarose autokláv üvegben.
e) Steril 35 mm-es Corning lemezek (FMC Bioproducts katalógusszám: 50102).
f) Steril 5 ml-es üvegpipetták (egyesével csomagolva).
g) Steril 15 ml-es és 50 ml-es kúpszerű centrifugakémcsövek.
h) Pipetták és steril hegyek.
i) Steril mikrocentrifuga-kémcsövek.
j) T75 lombikokban lévő sejtek: SKOV-3 (ATCC
HTB77).
k) 0,25%-os tripszinoldat (Gibco katalógusszám:
25200-015).
Eljárás. A lágy agar vizsgálat elvégzéséhez a következő eljárást alkalmazzuk:
A) Az alapréteg elkészítésére vonatkozó eljárás
1. Az összes táptalajt felmelegítjük a 37 °C hőmérsékletű vízfürdőben.
2. Az 1X vizsgálati táptalaj+0,8% agar elkészítése: a megolvasztott (és 39 °C hőmérsékletre hűtött) agárból a 2X vizsgálati táptalajjal 1:2 (térfogat:térfogat) arányú hígítást készítünk.
3. Amikor nem használjuk, az összes agarral együtt lévő táptalajt melegen tartjuk a 39 °C hőmérsékletű vízfürdőben.
4. Az 1X vizsgálati táptalaj+0,8% agar 1 ml mennyiségét több csészébe szétosztjuk, és a lemezt óvatosan megkeverjük, hogy egy egységes alapréteget kapjunk. A buborékképződést elkerüljük.
5. Az alapréteget hűtőszekrényben hűtjük, amíg az meg nem szilárdul (körülbelül 20 perc). Az alaprétegeket a hűtőszekrényben tarthatjuk éjszakára.
B) A sejtek összegyűjtésére vonatkozó eljárás
1. Sejtfonalanként egy lombikot kiveszünk az inkubátorból; a táptalajt leszívjuk; egyszer mossuk PBS-sel és leszívjuk; és hozzáadunk 3 ml tripszinoldatot.
2. Miután minden sejtet kimostunk a lombikból, hozzáadunk 3 ml 1X vizsgálati táptalajt, hogy legátoljuk a tripszinaktivitást. A sejteket föl-le pipettázzuk, majd a szuszpenziót egy 15 ml-es kémcsőbe rakjuk.
3. A sejtek koncentrációját egy Coulter számláló felhasználásával, életképességüket pedig tripánkék-kirekesztéssel határozzuk meg.
4. Kiveszünk a rendszerből akkora mennyiséget, ami elegendő lemezenként 3300 életképes sejt telepítésére, és azt az 1X vizsgálati táptalajjal 1,5 ml-re hígítjuk.
HU 226 755 Β1
C) A felső 0,4% „agarose”réteg elkészítésére vonatkozó eljárás
1. Hozzáadjuk a TBST-vegyületeket kétszer akkora koncentrációban, mint amilyen a kívánt végső vizsgálati koncentrációjuk; +1,5 ml 1X vizsgálati táptalaj és 10% FBS elegyben lévő sejtszuszpenziót; +1,5 ml 1X vizsgálati táptalajt+0,8% „agarose”-t*: összesen=3 ml 1X táptalaj, 10% FBS+0,4% „agarose”, 3300 életképes sejt/ml koncentráció mellett, TBST-vegyületekkel és azok nélkül.
*(A 2X táptalajnak a fent leírt alapréteg-eljáráshoz felhasznált 1,6% agar 30-cal való 1:2 arányú hígításával állítjuk elő.)
2. A vizsgálati elegy (Assay Mix) 1 ml mennyiségét felhordjuk az alapréteg 1 ml mennyiségére. A másodpéldányokat a 3 ml térfogatból borítjuk be.
3. A csészéket 2-3 héten keresztül inkubáljuk egy 100%-os nedvességtartalmú, 10% szén-dioxid-tartalmú inkubátorban.
4. A 60 mikronos és annál nagyobb kolóniákat pozitívnak értékeljük.
6.2.2. Szulforodamin B (SRB) növekedési vizsgálatok
Az SRB vizsgálatokat az egyes anyagok sejtnövekedésre kifejtett hatásának mérésére használhatjuk. A vizsgálatokat a következők szerint végezzük el:
1. vizsgálat: 3T3/E/H+TGF-a(T) sejtnövekedési
SRB vizsgálat Anyagok:
üregű, lapos fenekű steril lemezek, üregű kerek fenekű steril lemezek, steril 25 ml-es és 100 ml-es tartály, pipetták, többcsatornás pipettázó, steril pipettacsúcsok, steril 15 ml-es és 50 ml-es kémcsövek.
Reagensek:
1%-os ecetsavban lévő 0,4%-os SRB, mM Tris-bázis,
10%-os TCA, %-os ecetsav, steril DMSO (Sigma),
DMSO-ban lévő vegyület (100 mM vagy még kisebb koncentrációjú szabványoldat), sejtdisszociációs oldatban lévő 25%-os Trypsin-EDTA (Sigma).
Sejtfonal és növesztő táptalaj:
3T3/E/H+TGF-a(T) (NIH 3T3 clone 7 sejtek, melyek EGF-R/HER2 chimerát és TGF-a-t tartalmaznak, tumorból származó autokrin huroksejtek),
2%-os borjúszérum/DMEM+2 mM glutamin.
Eljárás:
0. nap: A sejtek felhordása
A vizsgálat ezen részét egy lamináris áramlási térben (laminar flow hood) visszük végbe.
1. A sejteket a szokásos módon tripszinezzük. A sejtszuszpenzióból 100 μΙ mennyiséget átteszünk 10 ml izotónba. A sejteket a Coulter számlálóval számoljuk.
2. A sejteket növesztő táptalajban 60 000 sejt/ml sűrűségűre hígítjuk. Egy 96 üregű lapos fenekű lemez minden üregébe átteszünk belőlük 100 μΙ mennyiséget, hogy 6000 sejt/üreg sűrűséget kapjunk.
3. Minden egyes vegyülethez egy fél lemezt használunk fel (4 sor), a vegyület minden egyes koncentrációjához 4 üreget használunk, 4 üreget a táptalajkontrollhoz és 4 üreget a DMSO-kontrollhoz.
4. A lemezeket óvatosan összerázzuk, hogy a sejtek egyenletesen oszoljanak el rajtuk.
5. A lemezeket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy 10%-os szén-dioxid-tartalmú inkubátorban.
1. nap: A vegyületek hozzáadása
A vizsgálat ezen részét egy lamináris áramlási térben visszük végbe.
1. Egy 96 üregű kerek fenekű lemez 3-11. oszlopaiba beleteszünk 125 μΙ növesztés! táptalajt. Ezt a lemezt használjuk a vegyületek kititrálására; vegyületenként 4 sort.
2. Egy steril 15 ml-es kémcsőben, 8 μΙ mennyiségű vegyület összesen 2 ml növesztő táptalajba való vitelével elkészítjük a vegyület legmagasabb koncentrációjának 2X oldatát 1:250 arányú hígításra. Ennél a hígításnál a DMSO koncentrációja 0,4% a 2X oldat esetében vagy 0,2% az 1X oldat esetében a sejteken. A vegyület kiindulási koncentrációja általában 100 μΜ, de ez a koncentráció változhat a vegyület oldhatóságától függően.
3. A kiindulási vegyület 2X oldatát vigyük a 96 üregű kerek fenekű lemez 12. oszlopában lévő üregnégyesbe. A lemezen jobbról balra 1:2 arányú sorozathígítást végzünk oly módon, hogy a 12. oszlopból 125 μΙ mennyiséget átviszünk a 11. oszlopba, a 11. oszlopból a 10. oszlopba, és így tovább. A 96 üregű lapos fenekű lemez megfelelő üregeibe a sejteken lévő táptalaj 100 μΙ mennyiségére 100 μΙ mennyiségeket viszünk a vegyület hígításaiból. Az üregenként! teljes térfogat 200 μΙ kell legyen.
4. A vivőanyag (vehicle) kontrolihoz DMSO-ból 2X oldatot készítünk, a táptalajban lévő 0,4% DMSO-koncentráció mellett. A DMSO-oldat 100 μΙ mennyiségét a megfelelő sejtes üregekbe visszük. A DMSO végső koncentrációja 0,2%.
5. A táptalajkontroll üregei esetében a megfelelő sejtes üregekhez üregenként 100 μΙ növesztő táptalajt adunk.
6. A lemezt visszatesszük az inkubátorba, és 4 napon keresztül inkubáljuk.
5. nap: A vizsgálat végrehajtása
A vizsgálat ezen részét az asztalon visszük végbe.
1. Leszívjuk vagy leöntjük a táptalajt. A sejtek fixálására minden egyes üreghez hozzáadunk 200 μΙ hideg, 1%-os TCA-t. A lemezt legalább 60 percen keresztül inkubáljuk 4 °C hőmérsékleten.
2. A TCA-t eltávolítjuk, és az üregeket vízzel ötször mossuk. A lemezeket fejjel lefelé papírtörölközőkre téve szárítjuk.
3. A sejteket 0,4%-os SRB-vel megfestjük, 10 percen keresztül.
4. Az SRB-t leöntjük, és az üregeket ötször öblítjük 1%-os ecetsavval. A lemezeket teljesen fejjel lefelé fordítva szárítjuk papírtörölközőkön.
HU 226 755 Β1
5. Afestéket üregenként 100 μ110 mM Tris-bázissal oldhatóvá tesszük egy rázógépen, 5-10 perc alatt.
6. A lemezeket egy Dynatech ELISA lemezleolvasóval leolvassuk 570 nm hullámhosszon, 630 nm-en felvett referencia mellett.
2. vizsgálat: 3T3/EGF-R+TGF-a(T) sejtnövekedési
SRB vizsgálat
Anyagok és reagensek: ugyanaz, mint az 1. vizsgálat esetében.
Sejtfonal és növesztő táptalaj:
3T3/EGF-R+TGF-a(T) (NIH 3T3 clone 7 sejtek, melyek EGF-R és TGF-a-t tartalmaznak, tumorból származó autokrin huroksejtek),
2%-os borjúszérum/DMEM+2 mM glutamin.
Eljárás:
0. nap: A sejtek felhordása
A vizsgálat ezen részét egy lamináris áramlási térben visszük végbe.
1. A sejteket a szokásos módon tripszinezzük. A sejtszuszpenzióból 100 μΙ mennyiséget átteszünk 10 ml izotónba. A sejteket a Coulter számlálóval számoljuk.
2. A sejteket növesztő táptalajban 60 000 sejt/ml sűrűségűre hígítjuk. Egy 96 üregű lapos fenekű lemez minden üregébe ebből átteszünk 100 μΙ mennyiséget, hogy 6000 sejt/üreg sűrűséget kapjunk.
3. Minden egyes vegyülethez egy fél lemezt használunk fel (4 sor), a vegyület minden egyes koncentrációjához 4 üreget használunk, 4 üreget a táptalajkontrollhoz és 4 üreget a DMSO-kontrollhoz.
4. A lemezeket óvatosan összerázzuk, hogy a sejtek egyenletesen oszoljanak el rajtuk.
5. A lemezeket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy 10%-os szén-dioxid-tartalmú inkubátorban.
1. nap: A vegyület hozzáadása: ugyanaz, mint az 1. vizsgálat esetében.
5. nap: A vizsgálat végrehajtása: ugyanaz, mint az 1. vizsgálat esetében.
3. vizsgálat: 3T3/PDGP-fiR/PDGF-BB(T) sejtnövekedési SRB vizsgálat
Sejtfonal és növesztő táptalaj:
3T3/PDGF-pR/PDGF-BB(T) (NIH 3T3 clone 7 sejtek, melyek PDGF β-receptort és PDGF-BB-t tartalmaznak, thymushiányos egerekből kimetszett tumorokból), 2%-os borjúszérum/DMEM+2 mM glutamin.
Eljárás:
0. nap: A sejtek felhordása
A vizsgálat ezen részét egy lamináris áramlási térben visszük végbe.
1. A sejteket a szokásos módon tripszinezzük. A sejtszuszpenzióból 100 μΙ mennyiséget átteszünk 10 ml izotónba. A sejteket a Coulter számlálóval számoljuk.
2. A sejteket növesztő táptalajban 60 000 sejt/ml sűrűségűre hígítjuk. Egy 96 üregű lapos fenekű lemez minden üregébe ebből átteszünk 100 μΙ mennyiséget, hogy 6000 sejt/üreg sűrűséget kapjunk.
3. Minden egyes vegyülethez egy fél lemezt használunk fel (4 sor), a vegyület minden egyes koncentrációjához 4 üreget használunk, 4 üreget a táptalajkontrollhoz és 4 üreget a DMSO-kontrollhoz.
4. A lemezeket óvatosan összerázzuk, hogy a sejtek egyenletesen oszoljanak el rajtuk.
5. A lemezeket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy 10%-os szén-dioxid-tartalmú inkubátorban.
1. nap: A vegyület hozzáadása: ugyanaz, mint az 1. vizsgálat esetében.
5. nap: A vizsgálat végrehajtása: ugyanaz, mint az 1. vizsgálat esetében.
4. vizsgálat: Humán simaizomsejtek (SMC, Smooth
Muscle Cells) sejtnövekedési SRB vizsgálata Anyagok és reagensek: ugyanaz, mint az 1. vizsgálat esetében.
Sejtfonal és növesztő táptalaj:
Humán aortasimaizom-sejtek (Clonetics),
Clonetics-féle „Buliét készlet: Simaizom-alaptáptalaj (SmBM, Smooth Muscle Basal Médium), ami olyan módosított MCDB 131, mely a következő összetevőket tartalmazza: magzati szarvasmarhaszérum (5%), hFGF (2 ng/ml), hEGF (0,1 ng/ml), inzulin (5,0 pg/ml), gentamicin (50 pg/ml) és amhotericin B (50 ng/ml). Eljárás:
0. nap: A sejtek felhordása
A vizsgálat ezen részét egy lamináris áramlási térben visszük végbe.
1. A sejteket a szokásos módon tripszinezzük. A sejtszuszpenzióból 100 μΙ mennyiséget átteszünk 10 ml izotónba. A sejteket a Coulter számlálóval számoljuk.
2. A sejteket növesztő táptalajban 60 000 sejt/ml sűrűségűre hígítjuk. Egy 96 üregű lapos fenekű lemez minden üregébe ebből átteszünk 100 μΙ mennyiséget, hogy 6000 sejt/üreg sűrűséget kapjunk.
3. Minden egyes vegyülethez egy fél lemezt használunk fel (4 sor), a vegyület minden egyes koncentrációjához 4 üreget használunk, 4 üreget a táptalajkontrollhoz és 4 üreget a DMSO-kontrollhoz.
4. A lemezeket óvatosan összerázzuk, hogy a sejtek egyenletesen oszoljanak el rajtuk.
5. A lemezeket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy 10%-os szén-dioxid-tartalmú inkubátorban.
1. nap: A vegyület hozzáadása: ugyanaz, mint az 1. vizsgálat esetében.
5. nap: A vizsgálat végrehajtása: ugyanaz, mint az 1. vizsgálat esetében.
6.2.3. 3T3 sejtnövekedési vizsgálat
1. vizsgálat: PDGF-indukált BrdU egyesítési vizsgálat (PDGF-Induced BrdU Incorporation Assay)
Anyagok és reagensek
1. PDGF: humán PDGF B/B; 1276-956, Boehringer
Mannheim, Németország.
2. BrdU jelzőreagens: 10 mM, PBS-ben (pH=7,4), katalógusszám: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Németország.
HU 226 755 Β1
3. FixDenat: fixálóoldat (felhasználásra kész állapotban), katalógusszám: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Németország.
4. Anti-BrdU-POD: peroxidázzal konjugált monoklonális egérantitest, katalógusszám: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Németország.
5. TMB-szubsztrátoldat: tetrametil-benzidin (TMB), felhasználásra kész állapotban, katalógusszám: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Németország.
6. PBS mosóoldat: 1X PBS, pH=7,4, helyben készített.
7. Albumin, szarvasmarha (BSA): V frakciójú por; A-8551, Sigma Chemical Co., USA.
Eljárás
1.3T3 sejtfonal: 3T3/EGFRc7.
2. A sejteket 8000 sejt/üreg sűrűségben DMEM,
10% CS és 2 mM Gin elegyébe telepítjük egy 96 üregű lemezben. A sejteket egy éjszakán keresztül inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten, 5%-os szén-dioxid-tartalom mellett.
3. 24 óra elteltével a sejteket PBS-sel mossuk, majd 24 órán keresztül szérummentes táptalajban (0% CS DMEM és 0,1% BSA) a szérumra nézve kiéheztetjük.
4. A 3. napon a sejtekhez egy időben hozzáadjuk a tesztvegyületet és a ligandumot (PDGF=3,8 nM, DMEM-ben 0,1% BSA mellett állítjuk elő). A negatív kontroliüregekhez csak szérummentes DMEM+0,1% BSA-t adunk; a pozitív kontrollsejtekhez hozzáadjuk a ligandumot (PDGF), de a tesztvegyületet nem. A tesztvegyületeket szérummentes, ligandumtartalmú DMEMben állítjuk elő egy 96 üregű lemezben, és sorozathígítással 7 tesztkoncentrációt készítünk.
5. 20 óra ligandumaktiválás után a rendszerhez hígított BrdU jelzőreagenst adunk (1:100 arányú hígítás DMEM-ben, 0,1% BSA), és a sejteket a BrdU-val (végső koncentráció=10 μΜ) 1,5 órán keresztül inkubáljuk.
6. A jelzőreagenssel való inkubálás után a táptalajt dekantálással és a fejjel lefelé fordított lemez papírtörölközőhöz való érintésével eltávolítjuk. A rendszerhez hozzáadunk üregenként 50 μΙ FixDenat-oldatot, és a lemezeket szobahőmérsékleten 45 percen keresztül inkubáljuk egy lemezrázón.
7. A FixDenat-oldatot dekantálással és a fejjel lefelé fordított lemez papírtörölközőhöz való érintésével alaposan eltávolítjuk. Blokkolóoldatként tejet (PBS-ben lévő 5%-os dehidratált tej, 200 μΙ/üreg) adunk a rendszerhez, és a lemezt szobahőmérsékleten 30 percen keresztül inkubáljuk egy lemezrázón.
8. A blokkolóoldatot dekantálással eltávolítjuk, és az üregeket egyszer mossuk PBS-sel. A rendszerhez hozzáadunk üregenként 100 μΙ anti-BrdU-POD oldatot (1:100 arányú hígítás PBS-ben, 1% BSA), és a lemezt szobahőmérsékleten 90 percen keresztül inkubáljuk egy lemezrázón.
9. Az antitestkonjugátot dekantálással és az üregek ötszöri PBS-sel való kiöblítésével alaposan eltávolítjuk, és a lemezt fejjel lefelé fordítva egy papírtörölközőre téve szárítjuk.
10. A rendszerhez hozzáadunk üregenként 100 μΙ TMB-szubsztrátoldatot, és a lemezt szobahőmérsékleten 20 percen keresztül inkubáljuk egy lemezrázón, amíg a színfejlődés elégséges nem lesz a fotometriás detektáláshoz.
11. A minták abszorbanciáját 410 nm hullámhosszon mérjük („duális hullámhossz” módban, ahol egy szűrő referencia-hullámhosszként 490 nm-en mér), egy Dynatech ELISA lemezleolvasó felhasználásával.
2. vizsgálat: EGF-indukált BrdU egyesítési vizsgálat
Anyagok és reagensek
1. EGF: egér EGF, 201; Toyobo, Co., Ltd. Japán.
2. BrdU jelzőreagens: 10 mM, PBS-ben (pH=7,4), katalógusszám: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Németország.
3. FixDenat: fixálóoldat (felhasználásra kész állapotban), katalógusszám: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Németország.
4. Anti-BrdU-POD: peroxidázzal konjugált monoklonális egérantitest, katalógusszám: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Németország.
5. TMB-szubsztrátoldat: tetrametil-benzidin (TMB), felhasználásra kész állapotban, katalógusszám: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Németország.
6. PBS mosóoldat: 1X PBS, pH=7,4, helyben készített.
7. Albumin, szarvasmarha (BSA): V frakciójú por; A-8551, Sigma Chemical Co., USA.
Eljárás
1.3T3 sejtfonal: 3T3/EGFRC7.
2. A sejteket 8000 sejt/üreg sűrűségben DMEM,
10% CS és 2 mM Gin elegyébe telepítjük egy 96 üregű lemezben. A sejteket egy éjszakán keresztül inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten, 5%-os szén-dioxid-tartalom mellett.
3. 24 óra elteltével a sejteket PBS-sel mossuk, majd 24 órán keresztül szérummentes táptalajban (0% CS DMEM és 0,1% BSA) a szérumra nézve kiéheztetjük.
4. A 3. napon a sejtekhez egy időben hozzáadjuk a tesztvegyületet és a ligandumot (EGF=2 nM, DMEMben 0,1% BSA mellett állítjuk elő). A negatív kontroliüregekhez csak szérummentes DMEM+0,1% BSA-t adunk; a pozitív kontrollsejtekhez hozzáadjuk a ligandumot (EGF), de a tesztvegyületet nem. A tesztvegyületeket szérummentes, ligandumtartalmú DMEM-ben állítjuk elő egy 96 üregű lemezben, és sorozathígítással 7 tesztkoncentrációt készítünk.
5. 20 óra ligandumaktiválás után a rendszerhez hígított BrdU jelzőreagenst adunk (1:100 arányú hígítás DMEM-ben, 0,1% BSA), és a sejteket a BrdU-val (végső koncentráció=10 μΜ) 1,5 órán keresztül inkubáljuk.
6. A jelzőreagenssel való inkubálás után a táptalajt dekantálással és a fejjel lefelé fordított lemez papírtörölközőhöz való érintésével eltávolítjuk. A rendszerhez hozzáadunk üregenként 50 μΙ FixDenat-oldatot, és a
HU 226 755 Β1 lemezeket szobahőmérsékleten 45 percen keresztül inkubáljuk egy lemezrázón.
7. A FixDenat-oldatot dekantálással és a fejjel lefelé fordított lemez papírtörölközőhöz való érintésével alaposan eltávolítjuk. Blokkolóoldatként tejet (PBS-ben lévő 5%-os dehidratált tej, 200 μΙ/üreg) adunk a rendszerhez, és a lemezt szobahőmérsékleten 30 percen keresztül inkubáljuk egy lemezrázón.
8. A blokkolóoldatot dekantálással eltávolítjuk, és az üregeket egyszer mossuk PBS-sel. A rendszerhez hozzáadunk üregenként 100 μΙ anti-BrdU-POD oldatot (1:100 arányú hígítás PBS-ben, 1% BSA), és a lemezt szobahőmérsékleten 90 percen keresztül inkubáljuk egy lemezrázón.
9. Az antitestkonjugátot dekantálással és az üregek ötszöri PBS-sel való kiöblítésével alaposan eltávolítjuk, és a lemezt fejjel lefelé fordítva egy papírtörölközőre téve szárítjuk.
10. A rendszerhez hozzáadunk üregenként 100 μΙ TMB-szubsztrátoldatot, és a lemezt szobahőmérsékleten 20 percen keresztül inkubáljuk egy lemezrázón, amíg a színfejlődés elégséges nem lesz a fotometriás detektáláshoz.
11. A minták abszorbanciáját 410 nm hullámhosszon mérjük („duális hullámhossz” módban, ahol egy szűrő referencia-hullámhosszként 490 nm-en mér), egy Dynatech ELISA lemezleolvasó felhasználásával.
3. vizsgálat: EGF-indukált HER2-hajtott BrdU egyesítési vizsgálat Anyagok és reagensek
1. EGF: egér, 201; Toyobo, Co., Ltd., Japán.
2. BrdU jelzőreagens: 10 mM, PBS-ben (pH=7,4), katalógusszám: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Németország.
3. FixDenat: fixálóoldat (felhasználásra kész állapotban), katalógusszám: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Németország.
4. Anti-BrdU-POD: peroxidázzal konjugált monoklonális egérantitest, katalógusszám: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Németország.
5. TMB-szubsztrátoldat: tetrametil-benzidin (TMB), felhasználásra kész állapotban, katalógusszám: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Németország.
6. PBS mosóoldat: 1X PBS, pH=7,4, helyben készített.
7. Albumin, szarvasmarha (BSA): V frakciójú por; A-8551, Sigma Chemical Co., USA.
Eljárás
1. 3T3 sejtfonal: 3T3/EGFr/Her2/EGFr (EGFr egy
Her2 kináz doménnel).
2. A sejteket 8000 sejt/üreg sűrűségben DMEM,
10% CS és 2 mM Gin elegyébe telepítjük egy 96 üregű lemezben. A sejteket egy éjszakán keresztül inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten, 5%-os szén-dioxid-tartalom mellett.
3. 24 óra elteltével a sejteket PBS-sel mossuk, majd 24 órán keresztül szérummentes táptalajban (0%
CS DMEM és 0,1% BSA) a szérumra nézve kiéheztetjük.
4. A 3. napon a sejtekhez egy időben hozzáadjuk a tesztvegyületet és a ligandumot (EGF=2 nM, DMEMben 0,1% BSA mellett állítjuk elő). A negatív kontroliüregekhez csak szérummentes DMEM+0,1% BSA-t adunk; a pozitív kontrollsejtekhez hozzáadjuk a ligandumot (EGF), de a tesztvegyületet nem. A tesztvegyületeket szérummentes, ligandumtartalmú DMEM-ben állítjuk elő egy 96 üregű lemezben, és sorozathígítással 7 tesztkoncentrációt készítünk.
5. 20 óra ligandumaktiválás után a rendszerhez hígított BrdU jelzőreagenst adunk (1:100 arányú hígítás DMEM-ben, 0,1% BSA), és a sejteket a BrdU-val (végső koncentráció=10 μΜ) 1,5 órán keresztül inkubáljuk.
6. A jelzőreagenssel való inkubálás után a táptalajt dekantálással és a fejjel lefelé fordított lemez papírtörölközőhöz való érintésével eltávolítjuk. A rendszerhez hozzáadunk üregenként 50 μΙ FixDenat-oldatot, és a lemezeket szobahőmérsékleten 45 percen keresztül inkubáljuk egy lemezrázón.
7. A FixDenat-oldatot dekantálással és a fejjel lefelé fordított lemez papírtörölközőhöz való érintésével alaposan eltávolítjuk. Blokkolóoldatként tejet (PBS-ben lévő 5%-os dehidratált tej, 200 μΙ/üreg) adunk a rendszerhez, és a lemezt szobahőmérsékleten 30 percen keresztül inkubáljuk egy lemezrázón.
8. A blokkolóoldatot dekantálással eltávolítjuk, és az üregeket egyszer mossuk PBS-sel. A rendszerhez hozzáadunk üregenként 100 μΙ anti-BrdU-POD oldatot (1:100 arányú hígítás PBS-ben, 1% BSA), és a lemezt szobahőmérsékleten 90 percen keresztül inkubáljuk egy lemezrázón.
9. Az antitestkonjugátot dekantálással és az üregek ötszöri PBS-sel való kiöblítésével alaposan eltávolítjuk, és a lemezt fejjel lefelé fordítva egy papírtörölközőre téve szárítjuk.
10. A rendszerhez hozzáadunk üregenként 100 μΙ TMB-szubsztrátoldatot, és a lemezt szobahőmérsékleten 20 percen keresztül inkubáljuk egy lemezrázón, amíg a színfejlődés elégséges nem lesz a fotometriás detektáláshoz.
11. A minták abszorbanciáját 410 nm hullámhosszon mérjük („duális hullámhossz” módban, ahol egy szűrő referencia-hullámhosszként 490 nm-en mér), egy Dynatech ELISA lemezleolvasó felhasználásával.
4. vizsgálat: IGF1-indukált BrdU egyesítési vizsgálat
Anyagok és reagensek
1. IGF1 ligandum: humán, rekombináns; G511, Promega Corp., USA.
2. BrdU jelzőreagens: 10 mM, PBS-ben (pH=7,4), katalógusszám: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Németország.
3. FixDenat: fixálóoldat (felhasználásra kész állapotban), katalógusszám: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Németország.
HU 226 755 Β1
4. Anti-BrdU-POD: peroxidázzal konjugált monoklonális egérantitest, katalógusszám: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Németország.
5. TMB-szubsztrátoldat: tetrametil-benzidin (TMB), felhasználásra kész állapotban, katalógusszám: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Németország.
6. PBS mosóoldat: 1X PBS, pH=7,4, helyben készített.
7. Albumin, szarvasmarha (BSA): V frakciójú por; A-8551, Sigma Chemical Co., USA.
Eljárás
1.3T3 sejtfonal: 3T3/IGF1r.
2. A sejteket 8000 sejt/üreg sűrűségben DMEM,
10% CS és 2 mM Gin elegyébe telepítjük egy 96 üregű lemezben. A sejteket egy éjszakán keresztül inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten, 5%-os szén-dioxid-tartalom mellett.
3. 24 óra elteltével a sejteket PBS-sel mossuk, majd 24 órán keresztül szérummentes táptalajban (0% CS DMEM és 0,1% BSA) a szérumra nézve kiéheztetjük.
4. A 3. napon a sejtekhez egy időben hozzáadjuk a tesztvegyületet és a ligandumot (IGF1 =3,3 nM, DMEMben 0,1% BSA mellett állítjuk elő). A negatív kontroliüregekhez csak szérummentes DMEM+0,1% BSA-t adunk; a pozitív kontrollsejtekhez hozzáadjuk a ligandumot (IGF1), de a tesztvegyületet nem. A tesztvegyületeket szérummentes, ligandumtartalmú DMEM-ben állítjuk elő egy 96 üregű lemezben, és sorozathígítással 7 tesztkoncentrációt készítünk.
5. 16 óra ligandumaktiválás után a rendszerhez hígított BrdU jelzőreagenst adunk (1:100 arányú hígítás DMEM-ben, 0,1% BSA), és a sejteket a BrdU-val (végső koncentráció=10 μΜ) 1,5 órán keresztül inkubáljuk.
6. A jelzőreagenssel való inkubálás után a táptalajt dekantálással és a fejjel lefelé fordított lemez papírtörölközőhöz való érintésével eltávolítjuk. A rendszerhez hozzáadunk üregenként 50 μΙ FixDenat-oldatot, és a lemezeket szobahőmérsékleten 45 percen keresztül inkubáljuk egy lemezrázón.
7. A FixDenat-oldatot dekantálással és a fejjel lefelé fordított lemez papírtörölközőhöz való érintésével alaposan eltávolítjuk. Blokkolóoldatként tejet (PBS-ben lévő 5%-os dehidratált tej, 200 μΙ/üreg) adunk a rendszerhez, és a lemezt szobahőmérsékleten 30 percen keresztül inkubáljuk egy lemezrázón.
8. A blokkolóoldatot dekantálással eltávolítjuk, és az üregeket egyszer mossuk PBS-sel. A rendszerhez hozzáadunk üregenként 100 μΙ anti-BrdU-POD oldatot (1:100 arányú hígítás PBS-ben, 1% BSA), és a lemezt szobahőmérsékleten 90 percen keresztül inkubáljuk egy lemezrázón.
9. Az antitestkonjugátot dekantálással és az üregek ötszöri PBS-sel való kiöblítésével alaposan eltávolítjuk, és a lemezt fejjel lefelé fordítva egy papírtörölközőre téve szárítjuk.
10. A rendszerhez hozzáadunk üregenként 100 μΙ TMB-szubsztrátoldatot, és a lemezt szobahőmérsékleten 20 percen keresztül inkubáljuk egy lemezrázón, amíg a színfejlődés elégséges nem lesz a fotometriás detektáláshoz.
11. A minták abszorbanciáját 410 nm hullámhosszon mérjük („duális hullámhossz” módban, ahol egy szűrő referencia-hullámhosszként 490 nm-en mér), egy Dynatech ELISA lemezleolvasó felhasználásával.
5. vizsgálat: Inzulinindukált BrdU egyesítési vizsgálat
Anyagok és reagensek
1. Inzulin: kristályos, szarvasmarha, cink; 13 007, Gibco BRL, USA.
2. BrdU jelzőreagens: 10 mM, PBS-ben (pH=7,4), katalógusszám: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Németország.
3. FixDenat: fixálóoldat (felhasználásra kész állapotban), katalógusszám: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Németország.
4. Anti-BrdU-POD: peroxidázzal konjugált monoklonális egérantitest, katalógusszám: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Németország.
5. TMB-szubsztrátoldat: tetrametil-benzidin (TMB), felhasználásra kész állapotban, katalógusszám: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Németország.
6. PBS mosóoldat: 1X PBS, pH=7,4, helyben készített.
7. Albumin, szarvasmarha (BSA): V frakciójú por; A-8551, Sigma Chemical Co., USA.
Eljárás
1.3T3 sejtfonal: H25.
2. A sejteket 8000 sejt/üreg sűrűségben DMEM,
10% CS és 2 mM Gin elegyébe telepítjük egy 96 üregű lemezben. A sejteket egy éjszakán keresztül inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten, 5%-os szén-dioxid-tartalom mellett.
3. 24 óra elteltével a sejteket PBS-sel mossuk, majd 24 órán keresztül szérummentes táptalajban (0% CS DMEM és 0,1% BSA) a szérumra nézve kiéheztetjük.
4. A 3. napon a sejtekhez egy időben hozzáadjuk a tesztvegyületet és a ligandumot (lnzulin=10 nM, DMEM-ben 0,1% BSA mellett állítjuk elő). A negatív kontroliüregekhez csak szérummentes DMEM+0,1% BSA-t adunk; a pozitív kontrollsejtekhez hozzáadjuk a ligandumot (Inzulin), de a tesztvegyületet nem. A tesztvegyületeket szérummentes, ligandumtartalmú DMEMben állítjuk egy 96 üregű lemezben, és sorozathígítással 7 tesztkoncentrációt készítünk.
5. 16 óra ligandumaktiválás után a rendszerhez hígított BrdU jelzőreagenst adunk (1:100 arányú hígítás DMEM-ben, 0,1% BSA), és a sejteket a BrdU-val (végső koncentrációul0 μΜ) 1,5 órán keresztül inkubáljuk.
6. A jelzőreagenssel való inkubálás után a táptalajt dekantálással és a fejjel lefelé fordított lemez papírtörölközőhöz való érintésével eltávolítjuk. A rendszerhez hozzáadunk üregenként 50 μΙ FixDenat-oldatot, és a lemezeket szobahőmérsékleten 45 percen keresztül inkubáljuk egy lemezrázón.
HU 226 755 Β1
7. A FixDenat-oldatot dekantálással és a fejjel lefelé fordított lemez papírtörölközőhöz való érintésével alaposan eltávolítjuk. Blokkolóoldatként tejet (PBS-ben lévő 5%-os dehidratált tej, 200 μΙ/üreg) adunk a rendszerhez, és a lemezt szobahőmérsékleten 30 percen keresztül inkubáljuk egy lemezrázón.
8. A blokkolóoldatot dekantálással eltávolítjuk, és az üregeket egyszer mossuk PBS-sel. A rendszerhez hozzáadunk üregenként 100 μΙ anti-BrdU-POD oldatot (1:100 arányú hígítás PBS-ben, 1% BSA), és a lemezt szobahőmérsékleten 90 percen keresztül inkubáljuk egy lemezrázón.
9. Az antitestkonjugátot dekantálással és az üregek ötszöri PBS-sel való kiöblítésével alaposan eltávolítjuk, és a lemezt fejjel lefelé fordítva egy papírtörölközőre téve szárítjuk.
10. A rendszerhez hozzáadunk üregenként 100 μΙ TMB-szubsztrátoldatot, és a lemezt szobahőmérsékleten 20 percen keresztül inkubáljuk egy lemezrázón, amíg a színfejlődés elégséges nem lesz a fotometriás detektáláshoz.
11. A minták abszorbanciáját 410 nm hullámhosszon mérjük („duális hullámhossz” módban, ahol egy szűrő referencia-hullámhosszként 490 nm-en mér), egy Dynatech ELISA lemezleolvasó felhasználásával.
6.2.4. HUV-EC-C vizsgálat
A vegyületek aktivitásának a mérésére a következő eljárást is alkalmazhatjuk:
0. nap
1. A HUV-EC-C sejteket (humán köldökvéna endotheliális sejtek) (Amerikai szövetgyűjtemény; katalógusszám: 1730 CRL) mossuk és tripszinezzük. A rendszert kétszer mossuk Dulbecco-féle foszfátpufferezett sóoldattal (D-PBS; a Gibco BRL-töl; katalógusszám: 14190-029), körülbelül 1 ml mennyiség felhasználásával a szövettenyésztő csésze 10 cm2-einként. A tripszinezést 0,05% Tripszin-EDTA felhasználásával végezzük, nem enzimatikus sejtdisszociációs oldatban (Sigma Chemical Company; katalógusszám: C—1544). A 0,05%-os tripszint 0,25%-os tripszin/1 mM EDTA (Gibco; katalógusszám: 25200-049) sejtdisszociációs oldatban való hígításával készítjük el. A tripszinezést a szövettenyésztő csésze 25-30 cm2-einként körülbelül 1 ml oldattal végezzük 37 °C hőmérsékleten, körülbelül 5 percen keresztül. Miután a sejtek leváltak a csészéről, hozzáadunk ugyanakkora mennyiségű vizsgálati táptalajt, és áttesszük egy 50 ml-es steril centrifugáló kémcsőbe (Fisher Scientific; katalógusszám: 05-539-6).
2. A sejteket 35 ml vizsgálati táptalajjal mossuk az 50 ml-es steril centrifugáló kémcsőben a vizsgálati táptalaj hozzáadásával, körülbelül 200*g-vel 10 percen keresztül centrifugálunk, a felülúszó folyadékot leszívjuk és 35 ml D-PBS-sel újraszuszpendáljuk. A D-PBSsel való mosást még kétszer megismételjük, és a sejteket a szövettenyésztő csésze 10 cm2-einként körülbelül 1 ml vizsgálati táptalajban újraszuszpendáljuk.
A vizsgálati táptalaj összetétele a következő: F12K táptalaj (Gibco BRL; katalógusszám: 21127-014)+0,5% hővel inaktivált magzati szarvasmarhaszérum. A sejteket egy Coulter Counter®v (Coulter Electronics, Inc.) felhasználásával számláljuk, majd hozzáadunk annyi vizsgálati táptalajt, hogy a sejtek koncentrációja 0,8-1,0*105 legyen ml-enként.
3. A sejteket 96 üregű lapos fenekű lemezekre visszük 100 μΙ/üreg vagy 0,8-1,0*104 sejt/üreg mennyiségben, és a lemezeket körülbelül 24 órán keresztül inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten 5%-os szén-dioxid-tartalom mellett.
1. nap
1. Különálló 96 üregű lemezekben kétszeres gyógyszerhígítási sort készítünk, általában 50 μΜ-tói lefelé 0 μΜ-ig. Ugyanazt a vizsgálati táptalajt használjuk most is, mint amit a 0. nap 2. lépésében leírtunk. A híg ítási sorokat a lemez megfelelő oszlopának felső üregéhez 90 μΙ/üreg mennyiségű, 200 μΜ koncentrációjú (4X a végső üregbeni koncentráció) gyógyszer hozzáadásával készítjük el. Mivel a szabvány-gyógyszerkoncentráció általában 20 mM DMSO-ban, így a 200 μΜ gyógyszer-koncentráció 2% DMSO-t tartalmaz.
így a gyógyszer hígítási soraihoz olyan oldószert használunk, melyet a vizsgálati táptalajban (F12K+0,5 magzati szarvasmarhaszérum) 2% DMSOtartalommal készítünk el, azért, hogy a gyógyszer felhíguljon, de a DMSO-koncentráció ne változzon. Ezt az oldószert hozzáadjuk az oszlop fennmaradó üregeihez, 60 μΙ/üreg mennyiségben. Az oszlop felső üregében lévő 120 μΙ 200 μΜ-os hígítású gyógyszerből 60 μΙ mennyiséget kiveszünk, és azt összekeverjük a következő üregben lévő 60 μΙ-rel. Ezután ebből az üregből veszünk ki 60 μΙ mennyiséget, és azt a harmadik üregben lévő 60 μΙ-rel keverjük el, és így tovább egészen addig, míg a kétszeres hígítási sor el nem készül. Amikor az utolsó előtti üreget bekevertük, az üregben lévő 120 μΙ-bői 60 μΙ-t kiveszünk, és azt eldobjuk. Az utolsó üregben meghagyjuk az eredetileg benne lévő 60 μΙ DMSO/táptalaj oldószert, mint gyógyszer nélküli kontrollt. A gyógyszer hígításaiból 9 oszlopot készítünk, ami elég ahhoz, hogy 3-3 üregünk legyen mind 1. a VEGF-hez (származási hely: Pepro Tech Inc., katalógusszám: 100-200), 2. az endoteliális sejt növekedési faktorhoz (ECGF) (mely más néven savas fibroblaszt faktorként vagy aFGF-ként is ismert) (származási hely: Boehringer Mannheim Biochemica, katalógusszám: 143 9 600) és 3. a vizsgálati táptalajkontrollhoz. Az ECGF nátrium-heparinnal való preparátumként szerezhető be.
2. A gyógyszerhígításokból üregenként 50 μΙ mennyiséget átviszünk a HUV-EC-C sejteket 0,8-1,0*104 sejt/100 μΙ/üreg mennyiségben tartalmazó, 0. napról való, 96 üregű vizsgálati lemezekbe, és azokat körülbelül 2 órán keresztül inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten, 5%-os szén-dioxid-tartalom mellett.
3. Minden egyes gyógyszer-koncentrációhoz három példányban hozzáadunk üregenként 50 μΙ
HU 226 755 Β1 pg/ml koncentrációjú VEGF-et, 20 ng/ml koncentrációjú ECGF-et vagy vizsgálat táptalajt. Akárcsak a gyógyszer esetében, a növekedési faktor koncentrációja is négyszerese a kívánt végső koncentrációnak. A növekedési faktorok koncentrációinak beállítására a 0. nap 2. lépéséből származó vizsgálati táptalajt használjuk. A rendszert körülbelül 24 órán keresztül inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten, 5%-os szén-dioxid-tartalom mellett. Ekkor minden egyes üregben lesz 50 pl gyógyszerhígítás, 50 μΙ növekedési faktor vagy táptalaj és 100 μΙ sejt, azaz összesen 200 μΙ mennyiség üregenként. így a gyógyszerek és a növekedési faktorok 4X koncentrációi 1X koncentrációk lesznek, amint minden összetevőt az üregekhez adunk.
2. nap
1. A rendszerhez hozzáadunk üregenként 1 pCi (10 μΙ/üreg a 100 pCi/ml oldatból, melyet RMPI táptalajban készítünk el 10% hővel inaktivált magzati szarvasmarhaszérum hozzáadásával) 3H-timidint (Amersham; katalógusszám: TRK-686), és a rendszert körülbelül 24 órán keresztül inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten, 5%-os szén-dioxid-tartalom mellett. Megjegyzés: a 3H-timidin-oldatot azért RPMI táptalajban készítjük el, mert minden más esetben, amikor a 3H-timidint használjuk, olyan kísérletekről van szó, melyeket RPMI-ben kell elvégezni. A táptalaj különbözősége ennél a lépésnél valószínűleg nem lényeges. Az RPMI származási helye a Gibco BRL, katalógusszám: 11875-051.
3. nap
1. A lemezeket egy éjszakán keresztül fagyasztjuk -20 °C hőmérsékleten.
4. nap
1. A lemezeket felolvasztjuk, és tartalmukat egy 96 üregű lemezbetakarító (Tomtec Harvester 96®) felhasználásával szűrőlapokra (Wallac; katalógusszám: 1205-401) gyűjtjük; és a beütéseket egy Wallac Betaplate™ folyadékszcintillációs számlálóval számláljuk.
6.2.5. PDGF-R celluláris vizsgálat
A PDGF celluláris kináz vizsgálatot a következők szerint végezzük el: a sejteket 0,2 M Hepes, 0,15 M NaCI, 10% VA/ glicerol, 0,04% Triton X-100, 5 mM EDTA, 5 mM nátrium-vanadát és 2 mM Na+pirofoszfát elegyében elbomlasztjuk; a sejtbomlásterméket ezután egy olyan ELISA lemezre visszük, mely anti-PDGF receptor antitesttel van borítva (Genzime); az ELISA lemezeket a sejtbomlástermék hozzáadása előtt borítjuk be üregenként 150 μΙ PBS-ben lévő 0,5 pg antitesttel 18 órán keresztül, 4 °C hőmérsékleten; a sejtbomlásterméket a beburkolt lemezekben 1 órán keresztül inkubáljuk, majd négyszer mossuk TBST-ben (35 nM Tris-HCI pH=7,0, 0,15 M NaCI, 0,1% Triton X-100); a rendszerhez 100 pl PBS-ben lévő antifoszfotirozin antitestet adunk, és az elegyet szobahőmérsékleten 30 percen keresztül inkubáljuk; ezután az üregeket négyszer mossuk TBST-ben, egy POD-hoz konjugált másodlagos antitestet adunk minden egyes üreghez, és a kezelt üregeket szobahőmérsékleten 30 percen keresztül inkubáljuk; az üregeket ezután négyszer mossuk TBST-ben, minden egyes üreghez ABTS/H2O2 oldatot adunk, és az üregeket két percen keresztül inkubáljuk; az abszorbanciát ezután 410 nm hullámhosszon mérjük.
6.2.6. A sejtnövekedési vizsgálat kísérleti eredményei
A különböző vegyületekre a fent leírt vizsgálatok felhasználásával kapott eredmények a következő táblázatokban találhatók.
2. táblázat
Endoteliális sejtekben való mitogenezis pHjtimidin egyesítés (inkorporáció)
Vegyület (példa száma) HUV-EC VEGF (μΜ) Vizsgálat a-FGF (μΜ)
27. 1,1 153,8
1B. 0,2 6,0
16. 6,6 3,4
17. 4,8 35,7
4796. 30,7 35,8
20. 43,2
21. 19,9
22. 2,5 45,2
23. 1,6 4,6
24. 14,8
25. 3,4 3,7
26. 25,6 19,3
28. 8,0 13,0
29. 34,3 16,3
30. 1,0 1,4
32. 4,4 4,9
4. 0,6
33. 46,1 27,3
5. 0,8 25,8
5201. 2,5 2,3
36. 2,3 0,7
37. 5,1 11,8
38. 2,9 130
5217. 9,6 10,5
41. 2,4 2,7
8. 2,2
42. <0,8 2,0
9. <0,8 31,1
44. 0,9 0,6
10. <0,8
45. 39,8 35,5
11. <0,8 22,7
HU 226 755 Β1
2. táblázat (folytatás)
Vegyület (példa száma) HUV-EC VEGF (μΜ) Vizsgálat a-FGF (μΜ)
5409. 26,0
12. <0,8
48. 13,6 40
13. 0,7
50. 11,4
14. 2,5
15. 5,7
5429. 27,6
59. 0,16 0,14
60. 39,8 33,0
61. 1,2 30,0
63. 3,8 3,4
64. 20 20
68. <0,07 <0,07
69. 0,5 0,8
70. 0,14 7,9
71. 3,8 12,9
73. 1,3 3,2
74. 0,54 8,7
76. 2,0 5,0
77. 1,2 14,1
81. 0,05 37,8
7. 1,2 3,8
3. táblázat
Mitogenezis 3T3/EGFR sejtekben BrdU egyesítés (inkorporáció)
Vegyület (példa száma) PDGFR PDGF ligandum FGFR FGF ligandum EGFR EGF ligandum
IC50 (μΜ) IC50 (μΜ) IC50 (μΜ)
27. 75
4313. 6 5,5 5,5
1B. 2,5
29. 9 4,9 60
4. 3 10 20
5402. 50 40
36. 3 25
10. 5,2
45. 7,5 70 100
12. 2,8 70
61. 30 16
5463. 23
71. 70 60 95
5465. 40 25 50
73. 18 15 17
74. 8
5469. 4 15 28
77. 4 50 54
81. 6,5 9 48
4. táblázat
Különféle sejtfonalakon elvégzett sejtnövekedési vizsgálatok SRB readout
Vegyület (példa száma) 3T3/E/H+TGF-a(T) 3T3/EGFR+TGF-a(T) 3T3/PDGFR+PDGF(T) SMC
IC50(pM) IC50 (μΜ) IC50 (μΜ) IC50 (μΜ)
27. 36
4313. 32 10,7 8,8
1B. 78 10
5. 22,2
3T3/E/H+TGF-a(T): NIH 3T3 sejtek, melyek EGFR/HER2 chimerát és TGF-a-t tartalmaznak, tumorból származnak. 3T3/EGFR+TGF-a(T): NIH 3T3 sejtek, melyek EGFR-t és TGF-a-t tartalmaznak, tumorból származnak. 3T3/PDGFR+PDGF(T): NIH 3T3 sejtek, melyek PDGF-3R-t és PDGF-ββ-Ι tartalmaznak, tumorból származnak. SMC: humán simaizomsejtek a Cloneticstől.
6.3. A sejttoxicitás mérése A gyógyhatású vegyületeknek erősebb kell legyen a receptor tirozin-kináz-aktivitást gátló képessége, mint 55 az általa gyakorolt citotoxikus hatás. Egy vegyület hatékonyságának és sejttoxicitásának mértéke megkapható a terápiás indexének meghatározásával: IC50/LD50. Az IC50, az 50%-os gátlás eléréséhez szükséges dózis, standard eljárások felhasználásával hatá- 60 rozható meg, így például az itt leírt módon. Az LD50, az 50%-os toxicitást eredményező dózis szintén mérhető standard eljárások felhasználásával (Mossman, 1993, J. Immunoi. Methods, 65: 55-63), a felszabadított LDH mennyiségének a mérésével (Korzeniewski és Callewaert, 1983, J. Immunoi. Methods 64: 313; Decker és Lohmann-Matthes, 1988, J. Immunoi. Methods 115: 61), vagy a halálos dózis állatkísérletekben való méré36
HU 226 755 Β1 sével. Azok a vegyületek az előnyben részesítettek, melyek nagy terápiás indexszel rendelkeznek. A terápiás index értéke nagyobb kell legyen, mint 2, előnyösen azonban értéke legalább 10, még előnyösebben pedig legalább 50.
6.3. In vivő állatmodellek
6.3.1. Xenograft állatmodellek
A humán tumorok arra vonatkozó képessége, hogy xenograftokként thymushiányos egerekben (például Balb/c, nu/nu) nőjön, hasznos in vivő modellt szolgáltat a humán tumorokkal szembeni terápiákra adott biológiai válaszreakciók tanulmányozására. A humán tumorok thymushiányos egerekbe történő első sikeres xenotranszplantációja óta (Rygaard és Polvsen, 1969, Acta Pathol. Microbial. Scand. 77: 758-760) sok különböző humán tumorsejtfonalat (például emlőráksejtek, tüdőráksejtek, húgy- és ivarszervi ráksejtek, gyomor- és bélráksejtek, fej- és nyaki ráksejtek, a glioblastomasejtek, csontráksejtek és a rosszindulatú pigmentsejtes ráksejtek) ültettek át és növesztettek sikeresen „nude” egerekben. A humán emlőtumor-sejtfonalakról, ideértve az MCF-7, a ZR75-1 és az MDAMB-231 sejtfonalakat is, megállapították, hogy azok szubkutáns xenograftok a „nude” egerekben (Warri és munkatársai, 1991, Int. J. Cancer 49: 616-623; Ozzello és Sordat, 1980, Eur. J. Cancer 16: 553-559; Osborne és munkatársai, 1985, Cancer Rés. 45: 584-590; Seibert és munkatársai, 1983, Cancer Rés. 43: 2223-2239).
1. vizsgálat: HER2/xenograft állatmodell
A lehetséges tumorellenes gyógyszerek HER2-tartalmú tumorokra kifejtett hatásának vizsgálatához a tumorsejteknek képeseknek kell lenniük a növekedésre pótlólagos ösztrogén hiányában is. Sok emlősejtfonal áll függőségben az ösztrogéntől a „nude” egerekben való in vivő növekedéshez (Osborne és munkatársai, mint fentebb), azonban az exogén ösztrogén elnyomja HER2-t a „nude” egerekben (Warri és munkatársai, mint fentebb, Dati és munkatársai, 1990, Oncogene 5: 1001-1006). így például az MCF-7, a ZR-75-1 és a T47D sejtek jól nőnek in vivő körülmények között ösztrogén jelenlétében, de nagyon alacsony HER2-szinteket mutatnak (Warri és munkatársai, mint fentebb, Dati és munkatársai, mint fentebb).
A következő típusú xenograft eljárás alkalmazható:
1. Öt-hat hetes nőstény Balb/c nu/nu thymushiányos egerek hátulsó csípőjébe (szubkutánsan) beültetjük a tumorsejteket;
2. beadjuk a tumor elleni vegyületet;
3. a tumor növekedését a tumor méretének mérésével mérjük.
A tumorokat vizsgálhatjuk egyes receptorok, mint amilyen például a HER2, az EGF vagy a PDGF, jelenlétére is, Western- és immunhisztokémiai vizsgálatok felhasználásával. A fenti eljárásokat a tudomány e területén jártas szakemberek jól ismert módszerek alkalmazásával, például különféle kezelési rendszerek alkalmazásával tovább módosíthatják.
2. vizsgálat: FLK-1/xenograft állatmodell
Megvizsgáljuk a találmány vegyületeinek arra vonatkozó képességét, hogy miként gátolják az SC xenograftokként meghonosított petefészek-, melanóma-, prosztata-, tüdő- és emlőtumorsejteket. Ezeket a vizsgálatokat 1 mg/kg/nap és 75 mg/kg/nap közötti dózisok felhasználásával végezzük.
Anyagok és módszerek. A tumorsejteket szubkutánsan a megjelölt egértörzsekbe ültetjük. A kezelést az átültetést követő első napon kezdjük, hacsak mást nem mondunk (az SCID egerekben az A375 melanoma-sejtfonal kezelését például a 9. napon kezdjük el). Minden egyes vizsgálati csoport nyolc (8)—tizenhat (16) egérből áll.
Részletes leírás
Az állatok. A nőstény thymushiányos egerek (BALB/c, nu/nu), a BALB/c egerek, a Wistar-patkányok és a Fisher 344 patkányok a Simonsen Laboratoriesből (Gilroy, CA) származnak. A nőstény A/l egerek beszerzési helye a Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). A DA patkányok a B&K Universal, Inc.-ból (Fremont, CA) származnak. A thymushiányos R/Nu patkányok, a DBA/2N egerek és a BALB/c egerek származási helye a Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN). A nőstény C57BL/6 egerek származási helye a Taconic (Germantown, NY). Minden állatot „clean-room” körülmények között tartunk Micro-isolator ketrecekben, Alpha-dri alommal. Steril rágcsáló-ennivalót és ad libitum vizet adunk nekik.
Minden eljárást a „NIH Guide fór the Care and Use of Laboratory Animals” útmutatásaival összhangban végzünk el.
Szubkutáns xenograft modell. A sejtfonalakat a fentebb leírtak szerint növesztjük a megfelelő táptalajban (lásd a 6. fejezetet). A sejteket összefolyásukkor vagy azt kicsivel megelőzően gyűjtjük be 0,05%-os tripszinEDTA felhasználásával, és 10 percen keresztül 450*g-n pelletezzük. Az így kapott pelleteket steril PBS-ben vagy táptalajban (FBS nélkül) újraszuszpendáljuk az ábrák magyarázó szövegében jelzett megfelelő koncentrációban, és a sejteket beültetjük az egerek hátulsó csípőjébe. A tumornövekedést 3-6 héten keresztül mérjük nóniuszos tolómérők felhasználásával; a tumor térfogatát a hossz*szélességxmagasság formula alapján számítjuk ki, hacsak mást nem mondunk. A P értékeket a Student-féle t-próbával állapítjuk meg. Az 50-100 μΙ kötőanyagban (dimetil-szulfoxid, PBTE, PBTE6C:D5w vagy PBTE:D5W) lévő vegyületet IP injekció formájában juttatjuk a helyükre, az ábrák magyarázó szövegében jelzett koncentrációban.
Intracerebrális xenograft modell. Az egér IC modellhez patkányból származó C6 gliomasejteket gyűjtünk be, és azokat steril PBS-ben szuszpendáljuk 2,5* 107 sejt/ml koncentrációban, majd jégre tesszük. A sejteket BALB/c, nu/nu egerekbe ültetjük a következők szerint: a 70%-os etanollal való mosás előtt, amennyiben szükséges, az egerek homlokfalcsonti fejbőrét egy állatszőrnyíró géppel leborotváljuk. Az állatokat izofluoránnal elaltatjuk, és a tűt a koponyacsonton keresztül behelyezzük a bal agyféltekébe. A sejteket a Hamilton-féle gáz37
HU 226 755 Β1 biztos fecskendőkből olyan 30 ga 12,7 mm-es tűk felhasználásával adagoljuk ki, melyekhez csak 3 mm-es behatolást lehetővé tévő hüvelyeket erősítünk. A 4 μΙ mennyiségű sejtszuszpenzió pontos beadása érdekében egy ismétlő kiadagolót használunk. Az állatok hogylétét naponta ellenőrizzük, és akkor öljük meg azokat, amikor súlyuknak körülbelül 40%-át már elveszítették, és/vagy idegi tüneteket kezdenek mutatni.
A patkány IC modellhez a patkányokat [Wistar, Sprague-DawIey, Fisher 344 vagy thymushiányos R/Nu patkányok; körülbelül 200-400 g testtömeggel (némelyek 300-400 g testtömeggel)] 100 mg/kg Ketaset (ketaminhidroklorid; Aveco, Fort Dodge, lowa) IP injekcióval való beadásával elaltatjuk. A narkózis beállta után a fejbőrt leborotváljuk, és az állatot behelyezzük egy sztereotaxikus készülékbe (Stoelting, Wood Dalé, IL). A bőrt a bemetszés helyén háromszor megtisztítjuk, felváltva használva 70%-os etanolos és 10%-os Povidone-lodine-os tampont. A fejbőr középső részén egy 1,0-1,5 cm hosszúságú bemetszést készítünk egy steril szike felhasználásával. A bőrt enyhén elválasztjuk és oldalirányba széthúzzuk, hogy szabaddá tegyük a koponyacsont felszínén a csontvarratot. Egy fogászati fúrógép (Stoelting, Wood Dalé, IL) felhasználásával egy kis (1-2 mm átmérőjű) lyukat készítünk a koponyacsontban, körülbelül 1 mm-re előre és 2 mm-re oldalirányban a koponyatetőtől. A sejtszuszpenziót egy 50 μΙ-es Hamilton-féle fecskendőbe szívjuk, melyre egy 23 vagy 25 ga standard vágott hegyű tűt teszünk. A fecskendőt a koponyacsonton fúrt lyukba vezetjük a pókhálóburok szintjén, és addig nyomjuk előre, amíg a tű hegye 3 mm mélyen nem hatol az agyba, ahová a sejtszuszpenziót lassan beinjekciózzuk. Miután a sejteket beinjekcióztuk, a tűt a lyukban hagyjuk még 1-2 percre, hogy időt hagyjunk a sejtek teljes bejutására. A koponyacsontot megtisztítjuk, és a bőrt 2-3 öltéssel összevarrjuk. Megvizsgáljuk, hogy az állatok rendbejönnek-e az altatás és a műtét után. A kísérlet teljes tartama alatt az állatokat legalább naponta kétszer megvizsgáljuk, hogy megjelentek-e az intracerebrális tumor fejlődésével kapcsolatos tünetek. Azokat az állatokat, melyeknél előrehaladott tüneti jelenségek figyelhetők meg (támaszkodás, egyensúlyvesztés, kiszáradás, étvágytalanság, koordinációs zavarok, az ápolási tevékenységek megszűnése és/vagy jelentős súlyveszteség), humánusan megöljük, és a kísérlet szempontjából érdekes szerveket és szöveteket kimetsszük.
Intraperitoneális modell. A sejtfonalakat a megfelelő táptalajban növesztjük. A sejteket összegyűjtjük, és steril PBS-sel vagy FBS-mentes táptalajjal mossuk, megfelelő koncentrációban újraszuszpendáljuk, és a megfelelő egértörzs egyedeinek IP üregébe injekciózzuk. Az egereket naponta megvizsgáljuk a hasvízkór kialakulásának szempontjából. Az egyes egyedeket akkor öljük meg, amikor súlygyarapodásuk elérte a 40%-ot, vagy amikor az IP tumor terhe kezd túl nagy stresszt és fájdalmat okozni az állatnak.
6.3.2. In vivő VEGFpellet modell
A következő példában a pelletmodellt alkalmazzuk egy vegyület FLK-1 receptorral szembeni aktivitásának, valamint az érképződéssel kapcsolatos rendellenességekkel szembeni aktivitásának vizsgálatára. Ebben a modellben a VEGF egy időkésleltetett pelletbe van ágyazva, és azt szubkutánsan ültetjük be a „nude” egerek hasára, hogy egy „vörösödési” reakciót, azt követően pedig egy, a pellet körüli feldagadást váltsunk ki. Ezután a potenciális FLK-1 inhibitorokat metilcellulózban beültethetjük a VEGF pellet közelébe, hogy eldönthessük, vajon az adott inhibitor használható-e a „vörösödés” és az azt követő feldagadás gátlására.
Anyagok és eljárások. A következő anyagokat használjuk fel:
1. VEGF - humán rekombináns liofilezett termék: kereskedelmi úton beszerezhető a Peprotechtől, Inc., Princeton Businness Park, G2; P.O. box 275, Rocky Hill, NJ 08553.
2. A 21 napos késleltetett pelletekbe ágyazott VEGF beszerzési helye: Innovative Research of America (Innovative Research of America, 3361 Executive Parkway, P.O. Box 2746, Toledo, Ohio 34606), „patent mátrix driven” kézbesítési rendszer felhasználásával. A pelletek VEGF-tartalma 0,20, 0,21 vagy 2,1 pg VEGF/pellet. Ezek a dózisok közelítőleg napi 10 és 100 ng VEGF-felszabadulást eredményeznek.
3. Metil-cellulóz.
4. Víz (steril).
5. Metanol.
6. A megfelelő gyógyszerek/inhibitorok.
7.10 cm-es szövettenyészeti lemezek.
8. Parafilm.
A VEGF pellet modell vizsgálat elvégzéséhez a következő eljárást követjük:
1. A Peprotechtől beszerzett VEGF-et elküldjük az Innovative Researchbe a megrendelt pellet előállítására.
2. Steril vízben 1,5%-os (w/v) metil-celIulóz-oldatot készítünk.
3. A gyógyszereket metanolban oldjuk (a szokásos koncentrációtartomány: 10-20 mg/ml).
4. A steril 10 cm-es lemezekbe steril parafilmet helyezünk.
5. Az 1,5%-os metil-cellulóz 1,35 ml mennyiségéhez 150 pg metanolban lévő gyógyszert adunk, és az elegyet erősen megkeverjük/megforgatjuk.
6. A homogenátum 25 μΙ-es részleteit a parafilmre helyezzük, és lemezekké szárítjuk.
7. Az egereket (6-10 hetes Balb/C thymushiányos nu/nu nőstény egerek) izoflurán belélegeztetésével elaltatjuk.
8. A VEGF pelleteket és a metil-cellulóz-lemezeket szubkutánsan beültetjük az egerek hasára; és
9. az egereket 24 óra és 48 óra elteltével megvizsgáljuk a vörösödés és a feldagadás szempontjából.
A kísérlet pontos kivitelezési körülményei a következők voltak:
N=4 állat/csoport
Kontrollok: VEGF pellet+gyógyszer placebo,
VEGF placebo+gyógyszerpellet.
Kísérleti eredmények. A találmány vegyületeitől e kísérlet alapján azt várjuk, hogy azok aktivitást mutatnak.
HU 226 755 Β1
6.3.3. Emlőzsírcsomó-modell
Sok receptor tirozin-kináz, így például a HER2 receptor, mellrákban igazoltan betöltött szerepe miatt az emlőzsírcsomó-modell különösen hasznos az ilyen receptor tirozin-kinázokat gátló vegyületek hatékonyságának mérésére. A tumorsejteket közvetlenül a kívánt helyre ültetve, az így kapott in situ modellek pontosabb képet adnak a tumorfejlődés biológiájáról, mint a szubkutáns modellek. Humán emlősejtfonalakat, ideértve az MCF-7-et is, már növesztettek thymushiányos egerek emlőzsírcsomójában. Shafie és Grantham, 1981, Natl. Cancer Instit. 67: 51-56; Gottardis és munkatársai, 1988, J. Steroid Biochem. 30: 311-314. Pontosabban a következő eljárás alkalmazható egy vegyület HER2 receptorra gyakorolt gátlóhatásának a mérésére:
1. Nőstény thymushiányos egerek hónalji emlőzsírcsomójába különböző koncentrációkban beültetünk olyan MDA-MB-231 és MCF-7 sejteket, melyek HER2-vel vannak transzfektálva;
2. beadjuk a vegyületet;
3. a tumor növekedését különböző időpontokban mérjük.
A tumorokat vizsgálhatjuk egyes receptorok, mint amilyen például a HER2, jelenlétére is, Western- és immunhisztokémiai vizsgálatok felhasználásával. A fenti eljárásokat a tudomány e területén jártas szakemberek jól ismert módszerek alkalmazásával, például különféle kezelési rendszerek alkalmazása révén tovább módosíthatják.
6.3.4. Tumorbehatolásos modell (Tumor Invasion
Model)
Az alábbiakban leírt, újonnan kifejlesztett tumorbehatolásos modell alkalmazható a KDR/FLK-1 receptorokkal szemben szelektív inhibitorokként azonosított vegyületek gyógyászati értékének és hatékonyságának a megbecslésére.
6.3.4.1. Eljárás
Kísérleti állatokként nyolchetes (nőstény) „nude” egereket (Simonsen Inc.) használunk. A tumorsejtek beültetését egy lamináris áramlási térben végezzük. Az altatást Xylazin/Ketamin koktél (100 mg/kg ketamin és 5 mg/kg) intraperitoneális úton való beadásával végezzük. A hasüreg feltárásához egy középvonalas vágást csinálunk (körülbelül 1,5 cm hosszúságban), 107 tumorsejt 10 μΙ térfogatú táptalajban való befecskendezéséhez. A sejteket vagy a hasnyálmirigy doudenális lebenyébe, vagy a vastagbél savóhártyája alá fecskendezzük. A hashártyát és az izmokat 6-0 selyem tovafutó varrattal zárjuk össze, a bőrt pedig kapcsok (would clips) felhasználásával zárjuk össze. Az állatokat naponta megvizsgáljuk.
6.3.4.2. A vizsgálat
2-6 hét elteltével, az állatok duzzadásos vizsgálatától függően az egereket megöljük, a különféle szerveket (tüdő, máj, agy, gyomor, lép, szív, izom) kimetsszük és megvizsgáljuk (a tumor méretének mérése, a behatolás nagysága, immunkémiai vizsgálatok és in situ hibridizáció).
6.3.5. Eredmények
A fent leírt in vivő vizsgálat alapján kapott, különböző vegyületekre vonatkozó eredmények az alábbi, 5. táblázatban találhatók meg.
5. táblázat In vivő adatok
Vegyület (példa száma) EpH4-VEGF %-os gátlás @ mg/kg
27. 56% @ 75
22. 50% @ 75 63% @ 50 42% @ 75
4942. 12. 42% @ 50/50 46% @ 50 47% @ 25 50% @ 50
14. 57% @ 37,5/37,5 45% @ 50
15. 65% @ 50 47% @ 50
65% @ 50
A találmányt a példaként bemutatott megtestesülései semmi esetre sem korlátozzák érvényességi területében; a példák csupán a találmány egyes megtestesüléseinek illusztrálására szolgálnak; és így minden olyan klón, DNS vagy aminosavszekvencia, mely a példákban megadottakkal funkcionális szempontból ekvivalens, a találmány keretei közé tartozik. Az itt leírt módosítási lehetőségeken túlmenően a találmány számos más módosítási lehetősége is nyilvánvaló lesz a tudomány e területén jártas szakemberek számára a fenti leírásból és a hozzá kapcsolódó rajzokból. Az ilyen módosítások is beleértendők a csatolt igénypontok érvényességi körébe.
A megidézett összes forrásmű a hivatkozás révén teljes egészében a találmány részét képezi.

Claims (15)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Az (I) általános képletű
    HU 226 755 Β1 vegyületek vagy azok gyógyászatilag elfogadható sói, ahol
    R1 jelentése hidrogénatom;
    R2 jelentése oxigénatom vagy kénatom;
    R3 jelentése hidrogénatom;
    R4, R5, R6 és R7 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, alkilcsoport, alkoxicsoport, arilcsoport, aril-oxi-csoport, alkarilcsoport, alkaril-oxi-csoport, halogénatom, trihalogén-metil-csoport, -S(O)R csoport, -SO2NRR’ csoport, -SO3R csoport, -SR csoport, -NO2 csoport, -NRR’ csoport, -OH csoport, -CN csoport, -C(O)R csoport, -OC(O)R csoport, -NHC(O)R csoport, -(CH2)nCO2R csoport és -CONRR’ csoport;
    A jelentése egy öttagú heteroarilcsoport, amelyet a tiofenil-, pirrolil-, pirazolil-, 1,2,3-triazolil-, 1,2,4-triazolil-, oxazolil-, izoxazolil-, tiazolil-, izotiazolil-, 2-szulfonilfuril-, 4-alkil-furil-, 1,2,3-oxadiazolil-, 1,2,4-oxadiazolil-, 1,2,5-oxadiazolil-, 1,3,4-oxadiazolil-, 1,2,3,4-oxatriazolil-, 1,2,3,5-oxatriazolil-, 1,2,3-tiadiazolil-, 1,2,4-tiadiazolil-, 1,2,5-tiadiazolil-, 1,3,4-tiadiazolilgyűrűt, 1,2,3,4tiatriazol i I-, 1,2,3,5-tiatriazol i I- és tetrazolilcsoportot magában foglaló csoportból választjuk, melyek adott esetben egy vagy több pozícióban alkilcsoporttal, alkoxicsoporttal, arilcsoporttal, aril-oxi-csoporttal, alkarilcsoporttal, alkaril-oxi-csoporttal, halogénatommal, trihalogén-metil-csoporttal, -S(O)R csoporttal, -SO2NRR’ csoporttal, -SO3R csoporttal, -SR csoporttal, -NO2 csoporttal, -NRR’ csoporttal, -OH csoporttal, -CN csoporttal, -C(O)R csoporttal, -OC(O)R csoporttal, -NHC(O)R csoporttal, -(CH2)nCO2R csoporttal vagy -CONRR’ csoporttal vannak szubsztituálva;
    n értéke 0-3;
    R jelentése hidrogénatom, alkilcsoport vagy arilcsoport és
    R’ jelentése hidrogénatom, alkilcsoport vagy arilcsoport, ahol a fenti kifejezéseknél az alkilcsoport 1-12 szénatomot tartalmazó, egyenes vagy elágazó láncú vagy ciklusos alifás szénhidrogéncsoport, amely adott esetben egy vagy több, az alábbi csoportból választott szubsztituenssel helyettesített: hidroxilcsoport, cianocsoport, =0, =S, -NO2, halogénatom, -N(CH3)2, aminocsoport és -SH csoport;
    az arilcsoport jelentése egy olyan aromás csoport, amely legalább egy konjugált pi-elektronrendszerrel rendelkező gyűrűt tartalmaz, beleértve a karbociklusos aril-, a heterociklusos aril- és a biarilcsoportokat, és amely arilcsoport adott esetben egy vagy több, az alábbi csoportból választott szubsztituenssel helyettesített: halogénatom, trihalogén-metil-csoport, hidroxilcsoport, -SH, -OH, -NO2, -SR általános képletű csoport, ahol R jelentése alkilcsoport, arilcsoport vagy alkil-aril-csoport, cianocsoport, alkoxicsoport, alkilcsoport és aminocsoport; az alkarilcsoport jelentése egy olyan alkilcsoport, amely kovalensen kötődik egy arilcsoporthoz; és az alkoxicsoport, az aril-oxi-csoport és az alkariloxi-csoport —Ο-alkil-, -O-aril- és -O-alkaril-csoportot jelent;
    azzal a kikötéssel, hogy a vegyületek az alábbi vegyietektől eltérőek:
    3-(pirrol-2-il-metilén)-2-indolinon;
    3-(5-klór-3,4-dimetil-pirrol-2-il-metilén)-2-indolinon;
    3-(3,5-dimetil-4-etil-pirrol-2-il)-2-indolinon;
    3-(3,5-dimetil-4-etoxi-karbonil-pirrol-2-il)-2-indolinon;
  2. 2- [[[1 -etil-2,3-dihidro-2-oxo-3-( 1 /-/-pirrol-2-il-metilén)-1H-indol-5-il]-oxi]-metil]-benzoesav;
  3. 3- (tién-2-il-metilén)-2-indolinon; 6-dietil-amino-3-[(izotiazol-2-il)-metilén]-2-indolinon;
    5- klór-3-[(tiazol-2-il)-metilén]-2-indolinon; és
    6- nitro-3-[(pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinon.
    2. Az (I) általános képletű vegyületek vagy azok gyógyászatilag elfogadható sói, ahol
    R-i jelentése hidrogénatom;
    R2 jelentése oxigénatom vagy kénatom;
    R3 jelentése hidrogénatom;
    R4, R5, R6 és R7 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, alkilcsoport, alkoxicsoport, arilcsoport, aril-oxi-csoport, alkarilcsoport, alkaril-oxi-csoport, halogénatom, trihalogén-metil-csoport, -S(O)R csoport, -SO2NRR’ csoport, -SO3R csoport, -SR csoport, -NO2 csoport, -NRR’ csoport, -OH csoport, -CN csoport, -C(0)R csoport, -0C(0)R csoport, -NHC(O)R csoport, -(CH2)nCO2R csoport és -CONRR’ csoport;
    A jelentése egy öttagú heteroarilcsoport, amelyet a pirazolil-, 1,2,3-triazolil-, 1,2,4-triazolil-, oxazolil-, izoxazolil-, tiazolil-, izotiazolil-, 2-szulfonil-furil-, 4-alkil-furil-,
    1.2.3- oxadiazolil-, 1,2,4-oxadiazolil-, 1,2,5-oxadiazolil-,
    1.3.4- oxadiazolil-, 1,2,3,4-oxatriazolil-, 1,2,3,5-oxatriazolil-, 1,2,3-tiadiazolil-, 1,2,4-tiadiazolil-, 1,2,5-tiadiazolil-, 1,3,4-tiadiazolil-, 1,2,3,4-tiatriazolil-, 1,2,3,5-tiatriazolil- és tetrazolilcsoportot magában foglaló csoportból választjuk, amelyek adott esetben egy vagy több pozícióban alkilcsoporttal, alkoxicsoporttal, arilcsoporttal, aril-oxi-csoporttal, alkarilcsoporttal, alkaril-oxi-csoporttal, halogénatommal, trihalogén-metil-csoporttal, -S(O)R csoporttal, -SO2NRR’ csoporttal, -SO3R csoporttal, -SR csoporttal, -NO2 csoporttal, -NRR’ csoporttal, -OH csoporttal, -CN csoporttal, -C(0)R csoporttal, -0C(0)R csoporttal, -NHC(O)R csoporttal, -(CH2)nCO2R csoporttal vagy -CONRR’ csoporttal vannak szubsztituálva;
    n értéke 0-3;
    R jelentése hidrogénatom, alkilcsoport vagy arilcsoport és
    R’ hidrogénatomot, alkilcsoportot vagy arilcsoportot jelent, ahol a fenti kifejezéseknél az alkilcsoport, az arilcsoport, az alkarilcsoport, az alkoxicsoport, az aril-oxi40
    HU 226 755 Β1 csoport és az alkaril-oxi-csoport jelentése az 1. igénypontban megadott; azzal a kikötéssel, hogy a vegyületek az alábbi vegyületektől eltérőek:
    6-dietil-amino-3-[(izotiazol-2-il)-metilén]-2-indolinon; és
    5-klór-3-[(tiazol-2-il)-metilén]-2-indolinon.
    3. Az 1. igénypont szerinti vegyület, amelyet az alábbi csoportból választunk: 3-[(3-metil-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinon; 3-[(3,4-dimetil-pirrol-2-il)-metilén]-2indolinon; 3-[(2-metil-tién-5-il)-metilén]-2-indolinon; 3-[(3-metil-tién-2-il)-metilén]-2-indolinon; 3-{[4-(2-metoxi-karbonil-etil)-3-metil-pirrol-5-il]-metilén}-2-indolinon; 3-[(4,5-dimetil-3-etil-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinon; 5-klór-3-[(5-metil-tién-2-il)-metilén]-2-indolinon; 3-[(3,5dimetil-pirrol-2-il)-metilén]-5-nitro-2-indolinon; 3-[(3-(2-karboxi-etil)-4-metil-pirrol-5-il)-metilén]-2-indolinon; 5-klór-3-[(3,5-dimetil-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinon; és 3-[(2,4-dimetil-pirrol-5-il)-metilén]-2-indolinon vagy ezek gyógyszerészetileg elfogadható sói.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti vegyület, azzal jellemezve, hogy az említett vegyület a 3-[(2,4-dimetil-pirrol5-iI)-metilén]-2-indolinon vagy ennek gyógyászatilag elfogadható sója.
  5. 5. Gyógyászati készítmény, amely egy gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy kötőanyagot és egy, az
    1-4. igénypontok bármelyike szerinti vegyületet tartalmaz.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely gyógyászati készítmény parenterális vagy szubkután beadásra alkalmas, vagy retardkészítmény formájú.
  7. 7. Az (I) általános képletű vegyületeknek vagy azok gyógyászatilag elfogadható sóinak, ahol
    R1 jelentése hidrogénatom;
    R2 jelentése oxigénatom vagy kénatom;
    R3 jelentése hidrogénatom;
    R4, R5, R6 és Ry jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, alkilcsoport, alkoxicsoport, arilcsoport, aril-oxi-csoport, alkarilcsoport, alkaril-oxi-csoport, halogénatom, trihalogén-metil-csoport, -S(O)R csoport, -SO2NRR’ csoport, -SO3R csoport, -SR csoport, -NO2 csoport, -NRR’ csoport, -OH csoport, -CN csoport, -C(O)R csoport, -OC(O)R csoport, -NHC-(O)R csoport, -(CH2)nCO2R csoport és -CONRR’ csoport;
    A jelentése egy öttagú heteroarilcsoport, amelyet a tiofenil-, pirrolil-, pirazolil-, 1,2,3-triazolil-, 1,2,4-triazolil-, oxazolil-, izoxazolil-, tiazolil-, izotiazolil-, 2-szulfonil-furil-, 4-alkil-furil-, 1,2,3-oxadiazolil-, 1,2,4-oxadiazolil-, 1,2,5-oxadiazolil-, 1,3,4-oxadiazolil-, 1,2,3,4oxatriazolil-, 1,2,3,5-oxatriazolil-, 1,2,3-tiadiazolil-,
    1,2,4-tiadiazolil-, 1,2,5-tiadiazolil-, 1,3,4-tiadiazolilgyűrűt, 1,2,3,4-tiatriazolil-, 1,2,3,5-tiatriazolil- és tetrazolilcsoportot magában foglaló csoportból választjuk, melyek adott esetben egy vagy több pozícióban alkilcsoporttal, alkoxicsoporttal, arilcsoporttal, aril-oxicsoporttal, alkarilcsoporttal, alkaril-oxi-csoporttal, halogénatommal, trihalogén-metil-csoporttal, -S(O)R csoporttal, -SO2NRR’ csoporttal, -SO3R csoporttal, -SR csoporttal, -NO2 csoporttal, -NRR’ csoporttal, -OH csoporttal, -CN csoporttal, -C(O)R csoporttal, -OC(O)R csoporttal, -NHC(O)R csoporttal, -(CH2)nCO2R csoporttal vagy -CONRR’ csoporttal vannak szubsztituálva;
    n értéke 0-3;
    R jelentése hidrogénatom, alkilcsoport vagy arilcsoport és
    R’ jelentése hidrogénatom, alkilcsoport vagy arilcsoport, ahol a fenti kifejezéseknél az alkilcsoport, az arilcsoport, az alkarilcsoport, az alkoxicsoport, az aril-oxicsoport és az alkaril-oxi-csoport jelentése az 1. igénypontban megadott;
    alkalmazása a szabályozatlan tirozin-kináz jelátalakítással kapcsolatos rendellenességek kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.
  8. 8. Az (I) általános képletű vegyületeknek vagy azok gyógyászatilag elfogadható sóinak, ahol
    R-i jelentése hidrogénatom;
    R2 jelentése oxigénatom vagy kénatom;
    R3 jelentése hidrogénatom;
    R4, R5, R6 és Ry jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, alkilcsoport, alkoxicsoport, arilcsoport, aril-oxi-csoport, alkarilcsoport, alkaril-oxi-csoport, halogénatom, trihalogén-metil-csoport, -S(O)R csoport, -SO2NRR’ csoport, -SO3R csoport, -SR csoport, —NO2 csoport, -NRR’ csoport, -OH csoport, -CN csoport, -C(O)R csoport, -OC(O)R csoport, -NHC(O)R csoport, -(CH2)nCO2R csoport és -CONRR’ csoport;
    A jelentése egy öttagú heteroarilcsoport, amelyet a pirazolil-, 1,2,3-triazolil-, 1,2,4-triazoliI-, oxazolil-, izoxazolil-, tiazolil-, izotiazolil-, 2-szulfonil-furil-, 4-alkil-furil-,
    1.2.3- oxadiazolil-, 1,2,4-oxadiazolil-, 1,2,5-oxadiazolil-,
    1.3.4- oxadiazolil-, 1,2,3,4-oxatriazolil-, 1,2,3,5-oxatriazolil-, 1,2,3-tiadiazolil-, 1,2,4-tiadiazolil-, 1,2,5-tiadiazolil-, 1,3,4-tiadiazolil-, 1,2,3,4-tiatriazolil-, 1,2,3,5-tiatriazolil- és tetrazolilcsoportot magában foglaló csoportból választjuk, amelyek adott esetben egy vagy több pozícióban alkilcsoporttal, alkoxicsoporttal, arilcsoporttal, aril-oxi-csoporttal, alkarilcsoporttal, alkaril-oxi-csoport41
    HU 226 755 Β1 tál, halogénatommal, trihalogén-metil-csoporttal, -S(O)R csoporttal, -SO2NRR’ csoporttal, -SO3R csoporttal, -SR csoporttal, -NO2 csoporttal, -NRR’ csoporttal, -OH csoporttal, -CN csoporttal, -C(O)R csoporttal, -OC(O)R csoporttal, -NHC(O)R csoporttal, -(CH2)nCO2R csoporttal vagy -CONRR’ csoporttal vannak szubsztituálva;
    n értéke 0-3;
    R jelentése hidrogénatom, alkilcsoport vagy arilcsoport és
    R’ hidrogénatomot, alkilcsoportot vagy arilcsoportot jelent, ahol a fenti kifejezéseknél az alkilcsoport, az arilcsoport, az alkarilcsoport, az alkoxicsoport, az aril-oxicsoport és az alkaril-oxi-csoport jelentése az 1. igénypontban megadott;
    alkalmazása a szabályozatlan tirozin-kináz jelátalakítására, szabályozására, módosítására és gátlására szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.
  9. 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a betegséget az alábbi csoportból választjuk: rák, véredény-proliferatív rendellenesség, fibrózisos rendellenesség, mezangiális sejtproliferatív rendellenesség és metabolikus rendellenesség.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a véredény-proliferatív rendellenesség arthritis vagy restenosis.
  11. 11. A 9. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a fibrózisos rendellenesség hepatikus cirrhosis vagy atheroszklerózis.
  12. 12. A 9. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a mezangiális sejtproliferatív rendellenesség glomerulonephritis, diabetikus nefropátia, rosszindulatú nefroszklerózis, trombózisos mikroangiopátia szindrómák, transzplantátumkilökődés és glomerulopathiák.
  13. 13. A 9. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a metabolikus rendellenesség psoriasis, diabetes mellitus, sebgyógyulás, gyulladás vagy neurodegeneratív betegség.
  14. 14. A 7. vagy 8. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a vegyületet az alábbi csoportból választjuk: 3-[(3-metilpirrol-2-il)-metilén]-2-indolinon; 3-[(3,4-dimetil-pirrol2-il)-metilén]-2-indolinon; 3-[(2-metil-tién-5-il)-metilén]2- indolinon; 3-[(3-metil-tién-2-il)-metilén]-2-indolinon;
    3- {[4-(2-metoxi-karbonil-etil)-3-metil-pirrol-5-il]-metilén}2-indolinon; 3-[(4,5-dimetil-3-etil-pirrol-2-il)-metilén]-2indolinon; 5-klór-3-[(5-metil-tién-2-il)-metilén]-2-indolinon; 3-[(3,5-dimetil-pirrol-2-il)-metilén]-5-nitro-2-indolinon; 3-[(3-(2-karboxi-etil)-4-metil-pirrol-5-il)-metilén]-2indolinon; 5-klór-3-[(3,5-dimetil-pirrol-2-il)-metilén]-2-indolinon; és 3-[(2,4-dimetil-pirrol-5-il)-metilén]-2-indolinon vagy ezek gyógyszerészetileg elfogadható sói.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett vegyület a 3-[(2,4-dimetil-pirrol-5-il)-metilén]-2indolinon vagy ennek gyógyászatilag elfogadható sója.
HU9701694A 1995-06-07 1996-06-05 Indolinone derivatives for the treatment of disease, use thereof, pharmaceutical compositions containing these compounds HU226755B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/485,323 US5880141A (en) 1995-06-07 1995-06-07 Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
PCT/US1996/008903 WO1996040116A1 (en) 1995-06-07 1996-06-05 Indolinone compounds for the treatment of disease

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP9701694A2 HUP9701694A2 (hu) 1999-06-28
HUP9701694A3 HUP9701694A3 (en) 2004-03-01
HU226755B1 true HU226755B1 (en) 2009-09-28

Family

ID=23927713

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9701694A HU226755B1 (en) 1995-06-07 1996-06-05 Indolinone derivatives for the treatment of disease, use thereof, pharmaceutical compositions containing these compounds

Country Status (20)

Country Link
US (9) US5880141A (hu)
EP (2) EP0769947B1 (hu)
JP (2) JP3231044B2 (hu)
CN (1) CN1268333C (hu)
AR (2) AR003088A1 (hu)
AT (1) ATE200863T1 (hu)
AU (1) AU706597C (hu)
BR (1) BR9606410A (hu)
CA (1) CA2192797C (hu)
DE (2) DE69612649T2 (hu)
DK (1) DK0769947T3 (hu)
ES (1) ES2159741T3 (hu)
GR (1) GR3036315T3 (hu)
HK (2) HK1001121A1 (hu)
HU (1) HU226755B1 (hu)
MX (1) MX9606401A (hu)
NO (1) NO311355B1 (hu)
NZ (1) NZ310109A (hu)
PT (1) PT769947E (hu)
WO (1) WO1996040116A1 (hu)

Families Citing this family (463)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6872699B2 (en) 1992-11-13 2005-03-29 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften, E.V. Truncated Flk-1 receptor protein, methods of use and a recombinant vector containing a nucleotide encoding the truncated Flk-1 protein
US6177401B1 (en) 1992-11-13 2001-01-23 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis
US5837815A (en) * 1994-12-15 1998-11-17 Sugen, Inc. PYK2 related polypeptide products
US6147106A (en) * 1997-08-20 2000-11-14 Sugen, Inc. Indolinone combinatorial libraries and related products and methods for the treatment of disease
US6906093B2 (en) 1995-06-07 2005-06-14 Sugen, Inc. Indolinone combinatorial libraries and related products and methods for the treatment of disease
US6846839B1 (en) * 1995-06-07 2005-01-25 Sugen, Inc. Methods for treating diseases and disorders related to unregulated angiogenesis and/or vasculogenesis
US5880141A (en) * 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
US6316635B1 (en) * 1995-06-07 2001-11-13 Sugen, Inc. 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
DE69630639T2 (de) * 1995-08-16 2004-09-16 Huntington Medical Research Institutes, Pasadena Rhodamin 123 Zusammensetzungen für Behandlung von Prostatakrebs
ES2201266T3 (es) * 1996-01-17 2004-03-16 Taiho Pharmaceutical Company Limited Inhibidores del espesamiento de la capa intima.
US6462048B2 (en) * 1996-03-29 2002-10-08 Pfizer Inc. Benzyl(idene)-lactam derivatives, their preparation and their use as selective (ant)agonists of 5-HT1A- and/or 5-HT1D receptors
US6696448B2 (en) 1996-06-05 2004-02-24 Sugen, Inc. 3-(piperazinylbenzylidenyl)-2-indolinone compounds and derivatives as protein tyrosine kinase inhibitors
US6682921B1 (en) 1996-08-21 2004-01-27 New York University Crystals of the tyrosine kinase domain of non-insulin receptor tyrosine kinases
CA2264220A1 (en) * 1996-08-23 1998-02-26 Sugen, Inc. Indolinone combinatorial libraries and related products and methods for the treatment of disease
AU7622698A (en) * 1996-12-05 1998-06-29 Sugen, Inc. Use of indolinone compounds as modulators of protein kinases
DE69729954T2 (de) * 1996-12-11 2005-09-08 Sugen, Inc., San Francisco Identifizierungsverfahren für Substanzen die an das Pyk2 Polypeptid binden
WO1998038984A2 (en) 1997-03-05 1998-09-11 Sugen, Inc. Formulations for hydrophobic pharmaceutical agents
AR012634A1 (es) 1997-05-02 2000-11-08 Sugen Inc Compuesto basado en quinazolina, composicion famaceutica que lo comprende, metodo para sintetizarlo, su uso, metodos de modulacion de la funcion deserina/treonina proteinaquinasa con dicho compuesto y metodo in vitro para identificar compuestos que modulan dicha funcion
US6486185B1 (en) 1997-05-07 2002-11-26 Sugen, Inc. 3-heteroarylidene-2-indolinone protein kinase inhibitors
US6316429B1 (en) * 1997-05-07 2001-11-13 Sugen, Inc. Bicyclic protein kinase inhibitors
CA2289102A1 (en) * 1997-05-07 1998-11-12 Sugen, Inc. 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
US6987113B2 (en) 1997-06-11 2006-01-17 Sugen, Inc. Tyrosine kinase inhibitors
US6313158B1 (en) 1997-06-20 2001-11-06 Sugen, Inc. Bioavailability of 3-heteroarylidenyl-2-indolinones active as protein tyrosine kinase inhibitors
US6114371A (en) * 1997-06-20 2000-09-05 Sugen, Inc. 3-(cyclohexanoheteroarylidenyl)-2-indolinone protein tyrosine kinase inhibitors
TW527355B (en) * 1997-07-02 2003-04-11 Bristol Myers Squibb Co Inhibitors of farnesyl protein transferase
US6235769B1 (en) * 1997-07-03 2001-05-22 Sugen, Inc. Methods of preventing and treating neurological disorders with compounds that modulate the function of the C-RET receptor protein tyrosine kinase
GB9716557D0 (en) 1997-08-06 1997-10-08 Glaxo Group Ltd Benzylidene-1,3-dihydro-indol-2-one derivatives having anti-cancer activity
US20040067531A1 (en) * 1997-08-20 2004-04-08 Sugen, Inc. Methods of modulating protein tyrosine kinase function with substituted indolinone compounds
EP1005470B1 (en) 1997-08-22 2007-08-01 AstraZeneca AB Oxindolylquinazoline derivatives as angiogenesis inhibitors
GB9718913D0 (en) 1997-09-05 1997-11-12 Glaxo Group Ltd Substituted oxindole derivatives
US6133305A (en) 1997-09-26 2000-10-17 Sugen, Inc. 3-(substituted)-2-indolinones compounds and use thereof as inhibitors of protein kinase activity
WO1999016438A1 (en) * 1997-09-26 1999-04-08 Asta Medica Aktiengesellschaft Azabenzimidazole-based compounds for modulating serine/threonine protein kinase function
UA71555C2 (en) 1997-10-06 2004-12-15 Zentaris Gmbh Methods for modulating function of serine/threonine protein kinases by 5-azaquinoline derivatives
US20030219380A1 (en) * 1997-11-07 2003-11-27 Annie Fong Method of determining an efficacious dose of a drug
US8071384B2 (en) * 1997-12-22 2011-12-06 Roche Diagnostics Operations, Inc. Control and calibration solutions and methods for their use
US7494816B2 (en) 1997-12-22 2009-02-24 Roche Diagnostic Operations, Inc. System and method for determining a temperature during analyte measurement
US6531502B1 (en) 1998-01-21 2003-03-11 Sugen, Inc. 3-Methylidenyl-2-indolinone modulators of protein kinase
JP2002507598A (ja) * 1998-03-26 2002-03-12 スージェン・インコーポレーテッド チロシン蛋白質キナーゼを調節するためのヘテロ環式化合物のファミリー
US6514981B1 (en) 1998-04-02 2003-02-04 Sugen, Inc. Methods of modulating tyrosine protein kinase function with indolinone compounds
DE19816624A1 (de) * 1998-04-15 1999-10-21 Boehringer Ingelheim Pharma Neue substituierte Indolinone, ihre Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel
US6569868B2 (en) 1998-04-16 2003-05-27 Sugen, Inc. 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
DK2020408T3 (da) 1998-05-29 2013-09-30 Sugen Inc Pyrrol-substitueret 2-indolinon som proteinkinaseinhibitor
DE19824922A1 (de) * 1998-06-04 1999-12-09 Boehringer Ingelheim Pharma Neue substituierte Indolinone, ihre Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel
US6319918B1 (en) 1998-06-04 2001-11-20 Boehringer Ingelheim Pharma Kg Substituted indolinones with kinase inhibitory activity
EP1117397A1 (en) 1998-08-31 2001-07-25 Sugen, Inc. Geometrically restricted 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
DK1115704T3 (da) * 1998-09-25 2003-09-29 Boehringer Ingelheim Pharma Substituerede indolinoner med inhiberende virkning for forskellige kinaser og cyclin/CDK komplekser
JP2002532493A (ja) * 1998-12-17 2002-10-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー Ｊｎｋプロテインキナーゼ阻害剤としての４−アリールオキシインドール
TR200101860T2 (tr) 1998-12-17 2001-12-21 F.Hoffmann-La Roche Ag Sikline bağlı kinaz inhibitörleri olarak 4-alkenil (ve alkinil) oksidoller
JP2002532503A (ja) 1998-12-17 2002-10-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー プロテインキナーゼ阻害剤としての４，５−ピラジノオキシンドール
ES2209527T3 (es) * 1998-12-17 2004-06-16 F. Hoffmann-La Roche Ag "44- y 5-alquiniloxindolels y 4- y 5-alqueniloxindones.
US6153634A (en) * 1998-12-17 2000-11-28 Hoffmann-La Roche Inc. 4,5-azolo-oxindoles
US20030119895A1 (en) * 1998-12-23 2003-06-26 Pharmacia Corporation Methods using a combination of a 3-heteroaryl-2-indolinone and a cyclooxygenase-2 inhibitor for the treatment of neoplasia
EP1630559A3 (en) * 1998-12-30 2006-06-07 Sugen, Inc. PYK2 (RAFTK) and inflammation
US6861442B1 (en) * 1998-12-30 2005-03-01 Sugen, Inc. PYK2 and inflammation
WO2000038519A1 (en) * 1998-12-31 2000-07-06 Sugen, Inc. 3-heteroarylidenyl-2-indolinone compounds for modulating protein kinase activity and for use in cancer chemotherapy
US6828106B2 (en) * 1999-02-26 2004-12-07 Cyclacel Limited Methods and compositions using coiled binding partners
US6670144B1 (en) * 1999-02-26 2003-12-30 Cyclacel, Ltd. Compositions and methods for monitoring the phosphorylation of natural binding partners
US6656696B2 (en) * 1999-02-26 2003-12-02 Cyclacel Compositions and methods for monitoring the phosphorylation of natural binding partners
US6972182B1 (en) * 1999-02-26 2005-12-06 Cyclacel, Ltd. Methods and compositions using coiled binding partners
GB9904933D0 (en) 1999-03-04 1999-04-28 Glaxo Group Ltd Compounds
US6492398B1 (en) 1999-03-04 2002-12-10 Smithkline Beechman Corporation Thiazoloindolinone compounds
US6624171B1 (en) 1999-03-04 2003-09-23 Smithkline Beecham Corporation Substituted aza-oxindole derivatives
US7064114B2 (en) 1999-03-19 2006-06-20 Parker Hughes Institute Gel-microemulsion formulations
US7226991B1 (en) * 1999-03-23 2007-06-05 United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Phenylalanine derivatives
CA2855415A1 (en) * 1999-03-23 2000-09-28 The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Phenylalanine derivatives
JP2002540096A (ja) * 1999-03-24 2002-11-26 スージェン・インコーポレーテッド キナーゼ阻害剤としてのインドリノン化合物
US6689806B1 (en) 1999-03-24 2004-02-10 Sugen, Inc. Indolinone compounds as kinase inhibitors
US6399743B1 (en) 1999-05-14 2002-06-04 Dept. Of Veterans Affairs Isolation and characterization of a rat epidermal growth factor related protein
US7049410B2 (en) * 1999-05-14 2006-05-23 Majumdar Adhip P N Antibodies to a novel EGF-receptor related protein (ERRP)
US6762180B1 (en) 1999-10-13 2004-07-13 Boehringer Ingelheim Pharma Kg Substituted indolines which inhibit receptor tyrosine kinases
DE19949209A1 (de) * 1999-10-13 2001-04-19 Boehringer Ingelheim Pharma In 5-Stellung substituierte Indolinone, ihre Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel
UA75054C2 (uk) * 1999-10-13 2006-03-15 Бьорінгер Інгельхайм Фарма Гмбх & Ко. Кг Заміщені в положенні 6 індолінони, їх одержання та їх застосування як лікарського засобу
US7132392B1 (en) 1999-10-22 2006-11-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibition of cell motility and angiogenesis by inhibitors of Grb2-SH2-domain
US20030162223A1 (en) * 1999-10-22 2003-08-28 Lowery David E. Drosophila G protein coupled receptors, nucleic acids, and methods related to the same
US7871981B2 (en) * 1999-10-22 2011-01-18 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibition of cell motility, angiogenesis, and metastasis
US7364866B2 (en) * 1999-10-22 2008-04-29 Pharmacia & Upjohn Company Drosophila G protein coupled receptors, nucleic acids, and methods related to the same
JP2003512838A (ja) * 1999-10-22 2003-04-08 ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー ショウジョウバエｇタンパク質結合レセプター、核酸、およびそれに関連する方法。
UA74803C2 (uk) 1999-11-11 2006-02-15 Осі Фармасьютікалз, Інк. Стійкий поліморф гідрохлориду n-(3-етинілфеніл)-6,7-біс(2-метоксіетокси)-4-хіназолінаміну, спосіб його одержання (варіанти) та фармацевтичне застосування
US20030082534A1 (en) * 1999-11-16 2003-05-01 Peter Lind Novel G protein-coupled receptors
AU784543B2 (en) * 1999-11-16 2006-04-27 Pharmacia & Upjohn Company Novel G protein-coupled receptors
US8682005B2 (en) 1999-11-19 2014-03-25 Gentex Corporation Vehicle accessory microphone
WO2001037820A2 (en) * 1999-11-24 2001-05-31 Sugen, Inc. Ionizable indolinone derivatives and their use as ptk ligands
US6878733B1 (en) 1999-11-24 2005-04-12 Sugen, Inc. Formulations for pharmaceutical agents ionizable as free acids or free bases
DE60028907T2 (de) 1999-11-24 2007-02-15 Donnelly Corp., Holland Rückspiegel mit Nutzfunktion
US6313310B1 (en) 1999-12-15 2001-11-06 Hoffmann-La Roche Inc. 4-and 5-alkynyloxindoles and 4-and 5-alkenyloxindoles
DK1255536T3 (da) * 1999-12-22 2006-10-30 Sugen Inc Indolinonderivater til modulation af c-kit-tyrosinproteinkinase
US6339100B1 (en) 1999-12-29 2002-01-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for inhibiting mastocytosis
EP1259234B9 (en) * 1999-12-30 2007-02-14 Sugen, Inc. 3-heteroarylidenyl-2-indolinone compounds for modulating protein kinase activity and for use in cancer chemotherapy
CA2399358C (en) * 2000-02-15 2006-03-21 Sugen, Inc. Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors
US6620818B1 (en) 2000-03-01 2003-09-16 Smithkline Beecham Corporation Method for reducing the severity of side effects of chemotherapy and/or radiation therapy
TWI270545B (en) 2000-05-24 2007-01-11 Sugen Inc Mannich base prodrugs of 3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives
US6706709B2 (en) 2000-06-02 2004-03-16 Sugen, Inc. Indolinone derivatives as protein kinase/phosphatase inhibitors
GB0016454D0 (en) 2000-07-04 2000-08-23 Hoffmann La Roche Thienopyrrolidinones
US7425537B2 (en) * 2000-08-22 2008-09-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services SH2 domain binding inhibitors
EP1383792A2 (en) * 2000-08-22 2004-01-28 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Sh2 domain binding inhibitors
US20030133972A1 (en) * 2000-10-11 2003-07-17 Targesome, Inc. Targeted multivalent macromolecules
US20030129223A1 (en) * 2000-10-11 2003-07-10 Targesome, Inc. Targeted multivalent macromolecules
DE60134679D1 (de) * 2000-10-20 2008-08-14 Eisai R&D Man Co Ltd Stickstoff enthaltende aromatische Heterozyklen
PE20020572A1 (es) 2000-12-06 2002-07-31 Centro Inmunologia Molecular Preparaciones para potenciar la inmunogenicidad de antigenos poco inmunogenicos
PE20020776A1 (es) * 2000-12-20 2002-08-22 Sugen Inc Indolinonas 4-aril sustituidas
WO2002060426A2 (en) * 2001-01-03 2002-08-08 President And Fellows Of Harvard College Compounds regulating cell proliferation and differentiation
EP1399483B1 (en) 2001-01-05 2010-04-14 Pfizer Inc. Antibodies to insulin-like growth factor i receptor
US6504034B2 (en) 2001-01-23 2003-01-07 Hoffmann-La Roche Inc. Naphthostyrils
US20050069976A1 (en) * 2001-02-14 2005-03-31 Peter Lind Protein-coupled receptor
AR042586A1 (es) 2001-02-15 2005-06-29 Sugen Inc 3-(4-amidopirrol-2-ilmetiliden)-2-indolinona como inhibidores de la protein quinasa; sus composiciones farmaceuticas; un metodo para la modulacion de la actividad catalitica de la proteinquinasa; un metodo para tratar o prevenir una afeccion relacionada con la proteinquinasa
SI2762140T1 (sl) * 2001-02-19 2017-07-31 Novartis Ag Zdravljenje trdnih možganskih tumorjev z derivatom rapamicina
FR2821358B1 (fr) * 2001-02-27 2006-04-07 Aventis Pharma Sa Oxindoles inhibiteurs de cdk-1 et leur application en therapeutique
EP1370527A1 (en) * 2001-03-06 2003-12-17 AstraZeneca AB Indolone derivatives having vascular-damaging activity
FR2822155B1 (fr) * 2001-03-13 2003-12-12 Aventis Pharma Sa Composes derives des oxindoles et leur application therapeutique en cancerologie
SE0101230L (sv) * 2001-04-06 2002-10-07 Innoventus Project Ab Ny användning av en tyrosinkinasinhibitor
WO2002081466A1 (en) * 2001-04-09 2002-10-17 Sugen, Inc. Prodrugs of 3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives
DE60219617T2 (de) 2001-05-16 2008-01-03 Novartis Ag Kombination von n- 5- 4-(4-methyl-piperazino-methyl)-benzoylamido -2-methylphenyl -4-(3-pyridil)-2pyrimidine-amin mit einem biphosphonat
US6599902B2 (en) 2001-05-30 2003-07-29 Sugen, Inc. 5-aralkysufonyl-3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives as kinase inhibitors
US6995171B2 (en) 2001-06-21 2006-02-07 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic pyrimidine and pyrimidine derivatives useful as anticancer agents
ATE401079T1 (de) * 2001-06-29 2008-08-15 Ab Science Die verwendung von c-kithemmern zur behandlung von autoimmunerkrankungen
EP1401413B1 (en) 2001-06-29 2006-11-22 AB Science Use of tyrosine kinase inhibitions for treating allergic diseases
ES2274075T3 (es) * 2001-06-29 2007-05-16 Ab Science Utilizacion de inhibidores de c-kit para tratar enfermedades inflamatorias intestinales (eii).
DE60223063T2 (de) * 2001-06-29 2008-07-17 Ab Science C-kit inhibitoren
WO2003004006A2 (en) * 2001-06-29 2003-01-16 Ab Science Use of potent, selective and non toxic c-kit inhibitors for treating tumor angiogenesis
ES2266553T3 (es) * 2001-06-29 2007-03-01 Ab Science Utilizacion de derivados de la n-fenil-2-pirimidina-amina para tratar las enfermedades inflamatorias.
DE10134196B4 (de) * 2001-07-13 2005-08-18 Forschungszentrum Karlsruhe Gmbh Technik Und Umwelt Pharmazeutische Zusammensetzung zur Hemmung der unkontrollierten Vermehrung und/oder Induzierung der Apoptose von Zellen
TWI315982B (en) 2001-07-19 2009-10-21 Novartis Ag Combinations comprising epothilones and pharmaceutical uses thereof
AR038957A1 (es) * 2001-08-15 2005-02-02 Pharmacia Corp Terapia de combinacion para el tratamiento del cancer
GEP20063777B (en) * 2001-08-15 2006-03-27 Upjohn Co Crystals Including Malic Acid Salt of N-[2-(Diethylamino) Ethyl]-5-[(5-Fluoro-2-Oxo-3h-Indole-3-Ylidene) Methyl]-2, 4-Dimethyl-1h-Pyrrole-3-Carboxamide, Processes for Its Preparation and Compositions Thereof
US20040242612A1 (en) * 2001-09-20 2004-12-02 Alain Moussy Use of tyrosine kinase inhibitors for promoting hair growth
WO2003039550A1 (en) * 2001-09-20 2003-05-15 Ab Science Use of tyrosine kinase inhibitors for whitening human skin and treating melanocyte dysfunction associated diseases
ATE404202T1 (de) * 2001-09-20 2008-08-15 Ab Science Die verwendung von potenten, selektiven und nontoxischen c-kithemmern zur behandlung von interstitieller blasenentzündung
US7005444B2 (en) 2001-09-27 2006-02-28 Allergan, Inc. 3-(heteroarylamino)methylene-1, 3-dihydro-2H-indol-2-ones as kinase inhibitors
CA2461812C (en) * 2001-09-27 2011-09-20 Allergan, Inc. 3-(arylamino)methylene-1,3-dihydro-2h-indol-2-ones as kinase inhibitors
MXPA04003385A (es) 2001-10-10 2005-04-11 Sugen Inc Derivados de 3-?4-substituido con heterociclilo)-pirrol-2-ilmetilidene?-2-indolinona como inhibidores de cinasa.
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
WO2003045307A2 (en) * 2001-11-21 2003-06-05 Sugen, Inc. Pharmaceutical formulations comprising indolinone derivatives
US6797825B2 (en) 2001-12-13 2004-09-28 Abbott Laboratories Protein kinase inhibitors
US20030187026A1 (en) 2001-12-13 2003-10-02 Qun Li Kinase inhibitors
PE20030701A1 (es) 2001-12-20 2003-08-21 Schering Corp Compuestos para el tratamiento de trastornos inflamatorios
US6686362B2 (en) 2001-12-27 2004-02-03 Theravance, Inc. Indolinone derivatives
PT1474425E (pt) 2002-01-07 2006-09-29 Eisai Co Ltd Desazapurinas e sua utilizacao
WO2003072090A2 (en) * 2002-02-27 2003-09-04 Ab Science Use of tyrosine kinase inhibitors for treating cns disorders
MXPA04008403A (es) * 2002-03-01 2004-11-26 Pfizer Indolil-urea derivados de tienopiridinas utiles como agentes antiangiogenicos, y procedimientos para su uso.
GB0206215D0 (en) 2002-03-15 2002-05-01 Novartis Ag Organic compounds
US6541504B1 (en) * 2002-04-03 2003-04-01 Allergan Sales, Llc (3Z)-3-(2,3-dihydro-1H-inden-1-ylidene)-1,3-dihydro-2H-indol-2-ones as kinase inhibitors
CA2481036C (en) * 2002-04-03 2012-05-29 Allergan, Inc. (3z)-(3-(3-hydro-isobenzofuran-1-ylidene)-1,3-dihydro-2h-indol-2-ones as kinase inhibitors
MXPA04011384A (es) 2002-05-16 2005-02-14 Novartis Ag Uso de agentes de union del receptor edg en cancer.
UA77303C2 (en) * 2002-06-14 2006-11-15 Pfizer Derivatives of thienopyridines substituted by benzocondensed heteroarylamide useful as therapeutic agents, pharmaceutical compositions and methods for their use
EP1542734A1 (en) * 2002-08-01 2005-06-22 Pharmacia Italia S.p.A. Isotopically labelled indolinone derivatives and process for their preparation
US8450302B2 (en) * 2002-08-02 2013-05-28 Ab Science 2-(3-aminoaryl) amino-4-aryl-thiazoles and their use as c-kit inhibitors
EP1525200B1 (en) * 2002-08-02 2007-10-10 AB Science 2-(3-aminoaryl)amino-4-aryl-thiazoles and their use as c-kit inhibitors
US20050032871A1 (en) * 2002-09-03 2005-02-10 Sugen, Inc. Sulfonylated pyrrole-2-indolinone derivatives as kinase inhibitors
JP2006510727A (ja) * 2002-11-15 2006-03-30 エクセリクシス， インク． キナーゼモジュレーター
AU2003295798B2 (en) * 2002-11-21 2009-09-10 Genentech, Inc. Therapy of non-malignant diseases or disorders with anti-ErbB2 antibodies
US6699863B1 (en) 2002-11-27 2004-03-02 Allergan, Inc. Kinase inhibitors for the treatment of disease
US6747025B1 (en) * 2002-11-27 2004-06-08 Allergan, Inc. Kinase inhibitors for the treatment of disease
US20040186160A1 (en) * 2002-12-13 2004-09-23 Sugen, Inc. Hexahydro-cyclohepta-pyrrole oxindole as potent kinase inhibitors
NZ540340A (en) * 2002-12-19 2007-07-27 Pfizer 2-(1H-indazol-6-ylamino)-benzamide compounds as protein kinases inhibitors useful for the treatment of ophthalmic diseases
US20040138104A1 (en) * 2003-01-14 2004-07-15 The Government Of The United States Of America Represented By The Secretary, Peptides
ITRM20030074A1 (it) * 2003-02-21 2004-08-22 Pharmacia Italia Spa Formulazioni semisolide a rilascio immediato intese
OA13151A (en) 2003-02-26 2006-12-13 Sugen Inc Aminoheteroaryl compounds as protein kinase inhibitors.
US7157577B2 (en) * 2003-03-07 2007-01-02 Sugen Inc. 5-sulfonamido-substituted indolinone compounds as protein kinase inhibitors
US20040266843A1 (en) * 2003-03-07 2004-12-30 Sugen, Inc. Sulfonamide substituted indolinones as inhibitors of DNA dependent protein kinase (DNA-PK)
EP1604665B1 (en) * 2003-03-10 2011-05-11 Eisai R&D Management Co., Ltd. C-kit kinase inhibitor
BRPI0409230A (pt) * 2003-04-03 2006-03-28 Pfizer formas de dosagem compreendendo ag013736
MY150088A (en) 2003-05-19 2013-11-29 Irm Llc Immunosuppressant compounds and compositions
AR044402A1 (es) 2003-05-19 2005-09-14 Irm Llc Compuestos heterociclicos y su uso como inmunodepresores. composiciones farmaceuticas que los contienen.
NZ544797A (en) 2003-07-18 2011-04-29 Amgen Fremont Inc Specific antibodies that bind HGF and neutralise binding of HGF to met
DE10334582A1 (de) * 2003-07-28 2005-02-24 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von Maleinsäureanhydrid
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
US7105562B2 (en) * 2003-08-06 2006-09-12 Sugen, Inc. Geometrically restricted 3-cyclopentylidene-1,3-dihydroindol-2-ones as potent protein tyrosine kinase inhibitors
WO2005016323A2 (en) * 2003-08-15 2005-02-24 Ab Science Use of c-kit inhibitors for treating type ii diabetes
MXPA06002296A (es) * 2003-08-29 2006-05-22 Pfizer Tienopiridina-fenilacetamidas y sus derivados utiles como nuevos agentes antiangiogenicos.
BRPI0414011A (pt) * 2003-08-29 2006-10-24 Pfizer naftalencarboxamidas e seus derivados úteis como novos agentes antiangiogênicos
AR045563A1 (es) * 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
US20050119163A1 (en) 2003-09-18 2005-06-02 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, SH2 domain binding inhibitors
CN1950347B (zh) 2003-10-23 2012-04-04 Ab科学公司 作为酪氨酸激酶抑制剂的2-氨基芳基噁唑化合物
US7105563B2 (en) * 2003-10-24 2006-09-12 Schering Aktiengesellschaft Indolinone derivatives and their use in treating disease-states such as cancer
EP1683785B1 (en) * 2003-11-11 2013-10-16 Eisai R&D Management Co., Ltd. Urea derivative and process for producing the same
DK1689721T3 (da) * 2003-11-26 2010-09-20 Pfizer Prod Inc Aminopyrazolderivater som GSK-3-ihibitorer
EP1696906A1 (en) * 2003-12-16 2006-09-06 Leo Pharma A/S Novel therapeutic use of indolinone derivatives
MXPA06007242A (es) * 2003-12-23 2006-08-18 Pfizer Nuevos derivados de quinolina.
EP1711598A4 (en) * 2004-01-30 2009-04-08 Lifecord Inc METHOD OF ISOLATING AND CULTURING MULTIPOTENTED PRECURSOR / STEM CELLS FROM CORDIAL BLOOD BLOOD AND METHOD OF INDUCING THEIR DIFFERENTIATION
CA2556025A1 (en) * 2004-02-23 2005-09-09 Sugen, Inc. Method of treating abnormal cell growth using c-met and m-tor inhibitors
DE102004012070A1 (de) * 2004-03-12 2005-09-29 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Neue cycloalkyl-haltige 5-Acylindolinone, deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel
JP2007530654A (ja) * 2004-03-30 2007-11-01 ファイザー・プロダクツ・インク シグナル伝達阻害剤の組合せ
US8455656B2 (en) * 2004-04-30 2013-06-04 Allergan, Inc. Kinase inhibitors
BRPI0510485A (pt) 2004-04-30 2007-11-13 Allergan Inc implantes inibidores de tirosina cinase intravìtreos biodegradáveis
US7771742B2 (en) * 2004-04-30 2010-08-10 Allergan, Inc. Sustained release intraocular implants containing tyrosine kinase inhibitors and related methods
GB0512324D0 (en) 2005-06-16 2005-07-27 Novartis Ag Organic compounds
WO2006002422A2 (en) 2004-06-24 2006-01-05 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Compounds for immunopotentiation
WO2006008639A1 (en) * 2004-07-16 2006-01-26 Pfizer Products Inc. Combination treatment for non-hematologic malignancies using an anti-igf-1r antibody
WO2006021884A2 (en) * 2004-08-26 2006-03-02 Pfizer Inc. Enantiomerically pure aminoheteroaryl compounds as protein kinase inhibitors
JP2008510792A (ja) * 2004-08-26 2008-04-10 ファイザー・インク タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤としてのアミノヘテロアリール化合物
PT1784396E (pt) * 2004-08-26 2011-01-27 Pfizer Compostos amino-heteroarílicos substituídos com pirazole como inibidores de proteína quinases
US8772269B2 (en) * 2004-09-13 2014-07-08 Eisai R&D Management Co., Ltd. Use of sulfonamide-including compounds in combination with angiogenesis inhibitors
EP2364699A1 (en) 2004-09-13 2011-09-14 Eisai R&D Management Co., Ltd. Joint use of sulfonamide based compound with angiogenesis inhibitor
ES2322175T3 (es) 2004-09-17 2009-06-17 EISAI R&amp;D MANAGEMENT CO., LTD. Composicion medicinal con estabilidad mejorada y gelificacion reducida.
GB0423043D0 (en) * 2004-10-16 2004-11-17 Astrazeneca Ab Compounds
US20060107555A1 (en) * 2004-11-09 2006-05-25 Curtis Marc D Universal snow plow adapter
EP1828123A1 (en) * 2004-12-17 2007-09-05 Boehringer Ingelheim International GmbH Indolinones and their use as antiproliferative agents
PE20060777A1 (es) * 2004-12-24 2006-10-06 Boehringer Ingelheim Int Derivados de indolinona para el tratamiento o la prevencion de enfermedades fibroticas
NZ561215A (en) 2005-02-22 2010-12-24 Univ Michigan Small molecule inhibitors of MDM2 and uses thereof
EP3300739A3 (en) 2005-03-31 2018-07-18 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to 161p2f10b proteins
KR20080019578A (ko) 2005-04-04 2008-03-04 에이비 사이언스 치환된 옥사졸 유도체 및 이의 티로신 키나제 억제제로서의용도
MX2007013304A (es) 2005-04-26 2007-12-13 Pfizer Anticuerpos de p-caderina.
GB0510390D0 (en) 2005-05-20 2005-06-29 Novartis Ag Organic compounds
US7439371B2 (en) * 2005-07-13 2008-10-21 Allergan, Inc. Indol kinase inhibitors
US7309787B2 (en) * 2005-07-13 2007-12-18 Allergan, Inc. Kinase inhibitors
US7749530B2 (en) 2005-07-13 2010-07-06 Allergan, Inc. Kinase inhibitors
US7692005B2 (en) * 2005-07-13 2010-04-06 Allergan, Inc. Kinase inhibitors
WO2007015569A1 (ja) * 2005-08-01 2007-02-08 Eisai R & D Management Co., Ltd. 血管新生阻害物質の効果を予測する方法
JP4989476B2 (ja) 2005-08-02 2012-08-01 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 血管新生阻害物質の効果を検定する方法
CN102716490A (zh) * 2005-09-01 2012-10-10 卫材R&D管理有限公司 药物组合物的崩解性的改善方法
MY164457A (en) 2005-09-07 2017-12-15 Amgen Fremont Inc Human monoclonal antibodies to activin receptor-like kinase-1
ATE533057T1 (de) 2005-09-20 2011-11-15 Osi Pharm Inc Biologische marker als prädiktoren der antikrebsreaktion auf insulinähnlichen wachstumsfaktor-1-rezeptor-kinaseinhibitoren
JP2009510073A (ja) 2005-09-27 2009-03-12 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト カルボキシアミン化合物およびその使用方法
AU2006309551B2 (en) 2005-11-07 2012-04-19 Eisai R & D Management Co., Ltd. Use of combination of anti-angiogenic substance and c-kit kinase inhibitor
NO20220050A1 (no) 2005-11-21 2008-08-12 Novartis Ag Neuroendokrin tumorbehandling
EP1964837A4 (en) * 2005-11-22 2010-12-22 Eisai R&D Man Co Ltd Antitumor agent against multiple myeloma
JO2660B1 (en) 2006-01-20 2012-06-17 نوفارتيس ايه جي Pi-3 inhibitors and methods of use
WO2007087419A2 (en) 2006-01-24 2007-08-02 Allergan, Inc. Substituted 3-(5-membered unsaturated heterocyclyl) -1, 3-dihydro-indol-2-one derivatives as tyrosine kinase inhibitors for the treatment of cancer
PE20070978A1 (es) * 2006-02-14 2007-11-15 Novartis Ag COMPUESTOS HETEROCICLICOS COMO INHIBIDORES DE FOSFATIDILINOSITOL 3-QUINASAS (PI3Ks)
JP2009529047A (ja) 2006-03-07 2009-08-13 アレイ バイオファーマ、インコーポレイテッド ヘテロ二環系ピラゾール化合物およびその使用
US7977351B2 (en) 2006-03-22 2011-07-12 Allergan, Inc. Heteroaryl dihydroindolones as kinase inhibitors
JP2009532503A (ja) 2006-04-05 2009-09-10 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト 癌を処置するための治療剤の組合せ
AR060358A1 (es) * 2006-04-06 2008-06-11 Novartis Vaccines & Diagnostic Quinazolinas para la inhibicion de pdk 1
MX2008013430A (es) 2006-04-19 2009-01-26 Novartis Vaccines & Diagnostic Compuestos de indazol y metodos para la inhibición de cdc7.
AU2007247112B2 (en) 2006-05-09 2010-08-26 Novartis Ag Combination comprising an iron chelator and an anti-neoplastic agent and use thereof
RS20080525A (en) 2006-05-09 2009-09-08 Pfizer Products Inc., Cycloalkylamino acid derivatives and pharmaceutical compositions thereof
CN104706637A (zh) * 2006-05-18 2015-06-17 卫材R&D管理有限公司 针对甲状腺癌的抗肿瘤剂
US20110053931A1 (en) * 2006-06-08 2011-03-03 John Gaudino Quinoline compounds and methods of use
GB0612721D0 (en) 2006-06-27 2006-08-09 Novartis Ag Organic compounds
JPWO2008001956A1 (ja) * 2006-06-29 2009-12-03 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 肝線維症治療剤
US8217177B2 (en) 2006-07-14 2012-07-10 Amgen Inc. Fused heterocyclic derivatives and methods of use
PE20121506A1 (es) 2006-07-14 2012-11-26 Amgen Inc Compuestos triazolopiridinas como inhibidores de c-met
US8246966B2 (en) * 2006-08-07 2012-08-21 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Trypanosome microsome system and uses thereof
WO2008022013A1 (en) 2006-08-11 2008-02-21 Allergan, Inc. Kinase inhibitors
CN101511793B (zh) * 2006-08-28 2011-08-03 卫材R&D管理有限公司 针对未分化型胃癌的抗肿瘤剂
WO2008037477A1 (en) 2006-09-29 2008-04-03 Novartis Ag Pyrazolopyrimidines as p13k lipid kinase inhibitors
US9532980B2 (en) * 2006-10-25 2017-01-03 The Rockefeller University Methods for the treatment of A-β related disorders and compositions therefor
EP2099757B1 (en) 2006-11-16 2014-06-25 Allergan, Inc. Sulfoximines as kinase inhibitors
US8143410B2 (en) 2006-11-16 2012-03-27 Allergan, Inc. Kinase inhibitors
US8558002B2 (en) 2006-11-16 2013-10-15 Allergan, Inc. Sulfoximines as kinase inhibitors
WO2008066755A2 (en) * 2006-11-22 2008-06-05 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Tyrosine kinase inhibitors as anti-kinetolastid and anti-apicomplexan agents
EP2094850B1 (en) * 2006-12-01 2013-06-12 Agency for Science, Technology And Research Cancer-related protein kinases
WO2008093855A1 (ja) * 2007-01-29 2008-08-07 Eisai R & D Management Co., Ltd. 未分化型胃癌治療用組成物
US9187485B2 (en) * 2007-02-02 2015-11-17 Baylor College Of Medicine Methods and compositions for the treatment of cancer and related hyperproliferative disorders
WO2008100985A2 (en) 2007-02-15 2008-08-21 Novartis Ag Combination of lbh589 with other therapeutic agents for treating cancer
US8314087B2 (en) 2007-02-16 2012-11-20 Amgen Inc. Nitrogen-containing heterocyclyl ketones and methods of use
WO2008127710A2 (en) 2007-04-13 2008-10-23 Dana Farber Cancer Institute Methods for treating cancer resistant to erbb therapeutics
CA2683804A1 (en) * 2007-04-13 2008-10-23 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Receptor tyrosine kinase profiling
US7825143B2 (en) 2007-07-10 2010-11-02 Montana State University - Billings Method for controlling the yeast-to-filamentous growth transition in fungi
WO2009026303A1 (en) 2007-08-21 2009-02-26 Amgen Inc. Human c-fms antigen binding proteins
CA2704000C (en) 2007-11-09 2016-12-13 Eisai R&D Management Co., Ltd. Combination of anti-angiogenic substance and anti-tumor platinum complex
US8940771B2 (en) 2007-12-20 2015-01-27 Novartis Ag Organic compounds
JP2011506494A (ja) 2007-12-21 2011-03-03 ユニバーシティ・ヘルス・ネットワーク 癌の治療に有用なキナーゼ阻害剤としてのインダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル置換インドルモン誘導体
US20110104166A1 (en) * 2008-01-18 2011-05-05 Stankovic Konstantina M Methods and Compositions for Treating Polyps
CN102036962B (zh) * 2008-01-29 2013-08-07 卫材R&D管理有限公司 血管生成抑制剂和紫杉烷的组合使用
US8232402B2 (en) 2008-03-12 2012-07-31 Link Medicine Corporation Quinolinone farnesyl transferase inhibitors for the treatment of synucleinopathies and other indications
PL2260020T3 (pl) 2008-03-26 2015-01-30 Novartis Ag Hydroksamianowe inhibitory deacetylaz B
ES2537529T3 (es) * 2008-06-05 2015-06-09 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Novedosos moduladores de la señalización de proteínas cinasas
AU2009267048A1 (en) * 2008-06-30 2010-01-07 Cylene Pharmaceuticals, Inc. Oxindole compounds
US20100029491A1 (en) * 2008-07-11 2010-02-04 Maike Schmidt Methods and compositions for diagnostic use for tumor treatment
US20100029675A1 (en) * 2008-07-25 2010-02-04 Hwang Soo-In Pyrimidine-2, 4-diamine JAK2 Kinase inhibiting anti-inflammation use
WO2010017541A2 (en) * 2008-08-08 2010-02-11 The Johns Hopkins University Compositions and methods for treatment of neurodegenerative disease
KR20110068987A (ko) * 2008-08-29 2011-06-22 제넨테크, 인크. Ｖｅｇｆ-비의존적 종양의 진단 및 치료
JP2012505880A (ja) * 2008-10-14 2012-03-08 ナショナル ユニバーシティ オブ シンガポール 新規ベンジリデン−インドリノンとその医療及び診断用途
EP2344161B1 (en) 2008-10-16 2018-12-19 Celator Pharmaceuticals, Inc. Combinations of a liposomal water-soluble camptothecin with cetuximab or bevacizumab
US8476410B2 (en) 2008-10-16 2013-07-02 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Fully human antibodies to high molecular weight-melanoma associated antigen and uses thereof
MX2011005096A (es) 2008-11-13 2011-11-18 Link Medicine Corp Derivados de azaquinolinona y usos de los mismos.
US20100222371A1 (en) * 2008-11-20 2010-09-02 Children's Medical Center Corporation Prevention of surgical adhesions
CN103204794A (zh) 2008-12-18 2013-07-17 诺瓦提斯公司 新的盐
KR20110096584A (ko) 2008-12-18 2011-08-30 노파르티스 아게 1-［4-［1-(4-시클로헥실-3-트리플루오로메틸-벤질옥시이미노)-에틸］-2-에틸-벤질］-아제티딘-3-카르복실산의 헤미푸마레이트 염
BRPI0922457A2 (pt) 2008-12-18 2015-12-15 Novartis Ag forma polimórfica de ácido 1-(4-{1-[(e)-4-ciclo-hexil-3-trifluormetil-benziloxi-imino]-etil)-2-etil-benzil)-azetidino-3-carboxílico"
SI2391366T1 (sl) 2009-01-29 2013-01-31 Novartis Ag Substituirani benzimidazoli za zdravljenje astrocitomov
EP2393814A1 (en) 2009-02-09 2011-12-14 SuperGen, Inc. Pyrrolopyrimidinyl axl kinase inhibitors
EP2400985A2 (en) 2009-02-25 2012-01-04 OSI Pharmaceuticals, LLC Combination of an either an anti-igf-1r antibody or an igf binding protein and a small molecule igf-1r kinase inhibitor
WO2010099137A2 (en) 2009-02-26 2010-09-02 Osi Pharmaceuticals, Inc. In situ methods for monitoring the emt status of tumor cells in vivo
WO2010099138A2 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Osi Pharmaceuticals, Inc. Methods for the identification of agents that inhibit mesenchymal-like tumor cells or their formation
EP2401613A2 (en) 2009-02-27 2012-01-04 OSI Pharmaceuticals, LLC Methods for the identification of agents that inhibit mesenchymal-like tumor cells or their formation
EP2401614A1 (en) 2009-02-27 2012-01-04 OSI Pharmaceuticals, LLC Methods for the identification of agents that inhibit mesenchymal-like tumor cells or their formation
TW201035088A (en) 2009-02-27 2010-10-01 Supergen Inc Cyclopentathiophene/cyclohexathiophene DNA methyltransferase inhibitors
JP5629752B2 (ja) 2009-04-06 2014-11-26 ユニバーシティ・ヘルス・ネットワークＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ キナーゼインヒビターおよびこれを用いた癌の治療方法
WO2010131460A1 (ja) 2009-05-12 2010-11-18 大鵬薬品工業株式会社 テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びオキサリプラチンを含有する抗腫瘍剤
UA105794C2 (uk) 2009-06-26 2014-06-25 Новартіс Аг 1,3-ДИЗАМІЩЕНІ ПОХІДНІ ІМІДАЗОЛІДИН-2-ОНУ ЯК ІНГІБІТОРИ Cyp17
US8293753B2 (en) 2009-07-02 2012-10-23 Novartis Ag Substituted 2-carboxamide cycloamino ureas
CN102482715A (zh) 2009-07-13 2012-05-30 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于癌症治疗的诊断方法和组合物
WO2011014726A1 (en) 2009-07-31 2011-02-03 Osi Pharmaceuticals, Inc. Mtor inhibitor and angiogenesis inhibitor combination therapy
US8389526B2 (en) 2009-08-07 2013-03-05 Novartis Ag 3-heteroarylmethyl-imidazo[1,2-b]pyridazin-6-yl derivatives
WO2011018454A1 (en) 2009-08-12 2011-02-17 Novartis Ag Heterocyclic hydrazone compounds and their uses to treat cancer and inflammation
CA2771532C (en) 2009-08-17 2021-03-23 Intellikine, Inc. Heterocyclic compounds and uses thereof
IN2012DN01453A (hu) 2009-08-20 2015-06-05 Novartis Ag
BR112012008075A2 (pt) 2009-08-26 2016-03-01 Novartis Ag compostos de heteroarila tetrassubstituídos e seu uso como moduladores de mdm2 e/ou mdm4
EP2473500A2 (en) 2009-09-01 2012-07-11 Pfizer Inc. Benzimidazole derivatives
US9340555B2 (en) 2009-09-03 2016-05-17 Allergan, Inc. Compounds as tyrosine kinase modulators
RU2012112151A (ru) 2009-09-03 2013-10-10 Аллерган, Инк. Соединения как модуляторы тирозинкиназы
CA2773661A1 (en) 2009-09-10 2011-03-17 Novartis Ag Ether derivatives of bicyclic heteroaryls
AU2010292060A1 (en) 2009-09-11 2012-04-12 Genentech, Inc. Method to identify a patient with an increased likelihood of responding to an anti-cancer agent
AU2010297344A1 (en) 2009-09-17 2012-02-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods and compositions for diagnostics use in cancer patients
MX2012005293A (es) 2009-11-04 2012-06-19 Novartis Ag Derivados de sulfonamida heterociclicos utiles como inhibidores de mek.
CN102712648A (zh) 2009-11-25 2012-10-03 诺瓦提斯公司 双环杂芳基的与苯稠合的6元含氧杂环衍生物
CN102648188A (zh) 2009-12-08 2012-08-22 诺瓦提斯公司 杂环磺酰胺衍生物
WO2011073521A1 (en) 2009-12-15 2011-06-23 Petri Salven Methods for enriching adult-derived endothelial progenitor cells and uses thereof
US8440693B2 (en) 2009-12-22 2013-05-14 Novartis Ag Substituted isoquinolinones and quinazolinones
CU24130B1 (es) 2009-12-22 2015-09-29 Novartis Ag Isoquinolinonas y quinazolinonas sustituidas
DK3150610T3 (da) 2010-02-12 2019-11-04 Pfizer Salte og polymorfer af 8-fluor-2-{4-[(methylamino}methyl]phenyl}-1,3,4,5-tetrahydro-6h-azepino[5,4,3-cd]indol-6-on
CA2783665A1 (en) 2010-03-03 2011-09-09 OSI Pharmaceuticals, LLC Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors
JP2013527748A (ja) 2010-03-03 2013-07-04 オーエスアイ・ファーマシューティカルズ，エルエルシー インスリン様増殖因子１受容体キナーゼ阻害剤に対する抗癌反応の予測に役立つ生物学的マーカー
BR112012025496B1 (pt) 2010-04-06 2021-02-23 University Health Network composto inibidor quinase e composição farmacêutica que o compreende
WO2011153224A2 (en) 2010-06-02 2011-12-08 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for treatment of cancer
EP3135692B8 (en) 2010-06-16 2019-03-20 University of Pittsburgh - Of the Commonwealth System of Higher Education Antibodies to endoplasmin and their use
JP2013532149A (ja) 2010-06-17 2013-08-15 ノバルティス アーゲー ピペリジニル置換１，３−ジヒドロ−ベンゾイミダゾール−２−イリデンアミン誘導体
EP2582680A1 (en) 2010-06-17 2013-04-24 Novartis AG Biphenyl substituted 1,3-dihydro-benzoimidazol-2-ylideneamine derivatives
EP2586443B1 (en) 2010-06-25 2016-03-16 Eisai R&D Management Co., Ltd. Antitumor agent using compounds having kinase inhibitory effect in combination
JP2013538338A (ja) 2010-07-19 2013-10-10 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗癌治療への応答可能性の増大した患者を同定する方法
SG187120A1 (en) 2010-07-19 2013-02-28 Hoffmann La Roche Method to identify a patient with an increased likelihood of responding to an anti-cancer therapy
CN103261225A (zh) 2010-07-23 2013-08-21 波士顿大学董事会 作为用于抑制病理性血管生成和肿瘤细胞侵袭力的治疗剂以及用于分子成像和靶向递送的抗DEspR抑制剂
CN101912363A (zh) * 2010-07-29 2010-12-15 蔡海德 溶解超滤-喷雾干燥-分子分散包衣-水化制粒-冷冻干燥生产脂质体组合药物
AR082418A1 (es) 2010-08-02 2012-12-05 Novartis Ag Formas cristalinas de 1-(4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il)-amida de 2-amida del acido (s)-pirrolidin-1,2-dicarboxilico
WO2012027716A1 (en) 2010-08-27 2012-03-01 Collabrx, Inc. Method to treat melanoma in braf inhibitor-resistant subjects
EP2627648A1 (en) 2010-09-16 2013-08-21 Novartis AG 17aHYDROXYLASE/C17,20-LYASE INHIBITORS
WO2012042421A1 (en) 2010-09-29 2012-04-05 Pfizer Inc. Method of treating abnormal cell growth
CA2813162C (en) 2010-10-20 2015-06-16 Pfizer Inc. Pyridine-2- derivatives as smoothened receptor modulators
US8987257B2 (en) 2011-01-31 2015-03-24 Novartis Ag Heterocyclic derivatives
WO2012107500A1 (en) 2011-02-10 2012-08-16 Novartis Ag [1, 2, 4] triazolo [4, 3 -b] pyridazine compounds as inhibitors of the c-met tyrosine kinase
WO2012116040A1 (en) 2011-02-22 2012-08-30 OSI Pharmaceuticals, LLC Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors in hepatocellular carcinoma
WO2012116237A2 (en) 2011-02-23 2012-08-30 Intellikine, Llc Heterocyclic compounds and uses thereof
EP2683722A1 (en) 2011-03-08 2014-01-15 Novartis AG Fluorophenyl bicyclic heteroaryl compounds
PT2688887E (pt) 2011-03-23 2015-07-06 Amgen Inc Inibidores duais tricíclicos fusionados de cdk 4/6 e flt3
WO2012142164A1 (en) 2011-04-12 2012-10-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Human monoclonal antibodies that bind insulin-like growth factor (igf) i and ii
AU2012246490B2 (en) 2011-04-18 2016-08-04 Eisai R&D Management Co., Ltd. Therapeutic agent for tumor
CA3019531A1 (en) 2011-04-19 2012-10-26 Pfizer Inc. Combinations of anti-4-1bb antibodies and adcc-inducing antibodies for the treatment of cancer
EP2702173A1 (en) 2011-04-25 2014-03-05 OSI Pharmaceuticals, LLC Use of emt gene signatures in cancer drug discovery, diagnostics, and treatment
MX359399B (es) 2011-04-28 2018-09-27 Novartis Ag Inhibidores de 17alfa-hidroxilasa/c17-20-liasa.
US9945862B2 (en) 2011-06-03 2018-04-17 Eisai R&D Management Co., Ltd. Biomarkers for predicting and assessing responsiveness of thyroid and kidney cancer subjects to lenvatinib compounds
KR20140034898A (ko) 2011-06-09 2014-03-20 노파르티스 아게 헤테로시클릭 술폰아미드 유도체
US8859535B2 (en) 2011-06-20 2014-10-14 Novartis Ag Hydroxy substituted isoquinolinone derivatives
EP2721007B1 (en) 2011-06-20 2015-04-29 Novartis AG Cyclohexyl isoquinolinone compounds
WO2013013188A1 (en) 2011-07-21 2013-01-24 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Heterocyclic protein kinase inhibitors
SG187375A1 (en) 2011-08-04 2013-02-28 Univ Singapore Benzylidene-indolinone compounds and their medical uses
US9745288B2 (en) 2011-08-16 2017-08-29 Indiana University Research And Technology Corporation Compounds and methods for treating cancer by inhibiting the urokinase receptor
ES2691650T3 (es) 2011-09-15 2018-11-28 Novartis Ag 3-(quinolin-6-il-tio)-[1,2,4]-triazolo-[4,3-a]-piridinas 6-sustituidas como inhibidores de tirosina quinasa c-Met
MD20140023A2 (ro) 2011-09-22 2014-06-30 Pfizer Inc. Derivaţi de pirolpirimidină şi purină
EP2764025B1 (en) 2011-10-04 2017-11-29 IGEM Therapeutics Limited Ige-antibodies against hmw-maa
PT2771342T (pt) 2011-10-28 2016-08-17 Novartis Ag Derivados de purina e o seu uso no tratamento de doença
RU2014114015A (ru) 2011-11-08 2015-12-20 Пфайзер Инк. Способы лечения воспалительных расстройств с использованием антител против m-csf
WO2013080141A1 (en) 2011-11-29 2013-06-06 Novartis Ag Pyrazolopyrrolidine compounds
CN104136429A (zh) 2011-12-23 2014-11-05 诺华股份有限公司 用于抑制bcl2与结合配偶体相互作用的化合物
CA2859862A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Novartis Ag Compounds for inhibiting the interaction of bcl2 with binding partners
AU2012355624A1 (en) 2011-12-23 2014-07-17 Novartis Ag Compounds for inhibiting the interaction of BCL2 with binding partners
CN104125954A (zh) 2011-12-23 2014-10-29 诺华股份有限公司 用于抑制bcl2与结合配偶体相互作用的化合物
MX2014007725A (es) 2011-12-23 2015-01-12 Novartis Ag Compuestos para inhibir la interaccion de bcl2 con los componentes de enlace.
CN102491932A (zh) * 2011-12-26 2012-06-13 天津科技大学 一种3-吲哚啉酮类衍生物及其制备方法及其应用
UY34591A (es) 2012-01-26 2013-09-02 Novartis Ag Compuestos de imidazopirrolidinona
AR090263A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hoffmann La Roche Terapia combinada de anticuerpos contra el csf-1r humano y las utilizaciones de la misma
EP2834246B1 (en) 2012-04-03 2021-07-28 Novartis AG Combination products with tyrosine kinase inhibitors and their use
WO2013152252A1 (en) 2012-04-06 2013-10-10 OSI Pharmaceuticals, LLC Combination anti-cancer therapy
MX360892B (es) 2012-05-16 2018-11-20 Novartis Ag Régimen de dosificación para un inhibidor de cinasa pi-3.
JP6171003B2 (ja) 2012-05-24 2017-07-26 ノバルティス アーゲー ピロロピロリジノン化合物
US9394257B2 (en) 2012-10-16 2016-07-19 Tolero Pharmaceuticals, Inc. PKM2 modulators and methods for their use
US9260426B2 (en) 2012-12-14 2016-02-16 Arrien Pharmaceuticals Llc Substituted 1H-pyrrolo [2, 3-b] pyridine and 1H-pyrazolo [3, 4-b] pyridine derivatives as salt inducible kinase 2 (SIK2) inhibitors
US9334239B2 (en) 2012-12-21 2016-05-10 Eisai R&D Management Co., Ltd. Amorphous form of quinoline derivative, and method for producing same
US9556180B2 (en) 2013-01-22 2017-01-31 Novartis Ag Pyrazolo[3,4-d]pyrimidinone compounds as inhibitors of the P53/MDM2 interaction
WO2014115077A1 (en) 2013-01-22 2014-07-31 Novartis Ag Substituted purinone compounds
CN105308033B (zh) 2013-03-14 2018-08-24 特雷罗药物股份有限公司 Jak2和alk2抑制剂及其使用方法
WO2014151147A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Intellikine, Llc Combination of kinase inhibitors and uses thereof
WO2014155268A2 (en) 2013-03-25 2014-10-02 Novartis Ag Fgf-r tyrosine kinase activity inhibitors - use in diseases associated with lack of or reduced snf5 activity
US9206188B2 (en) 2013-04-18 2015-12-08 Arrien Pharmaceuticals Llc Substituted pyrrolo[2,3-b]pyridines as ITK and JAK inhibitors
AU2014266223B2 (en) 2013-05-14 2020-06-25 Eisai R&D Management Co., Ltd. Biomarkers for predicting and assessing responsiveness of endometrial cancer subjects to lenvatinib compounds
US9770454B2 (en) 2013-07-14 2017-09-26 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. IGF-1R signaling pathway inhibitors useful in the treatment of neurodegenerative diseases
WO2015022663A1 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Novartis Ag Compounds and compositions as inhibitors of mek
US9227969B2 (en) 2013-08-14 2016-01-05 Novartis Ag Compounds and compositions as inhibitors of MEK
WO2015022664A1 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Novartis Ag Compounds and compositions as inhibitors of mek
JP6946000B2 (ja) 2013-10-04 2021-10-06 アプトース バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド がんの治療用組成物及び方法
WO2015054781A1 (en) 2013-10-18 2015-04-23 University Health Network Treatment for pancreatic cancer
US20150141438A1 (en) * 2013-11-15 2015-05-21 Pharmacyclics, Inc. Methods for delaying or preventing the onset of type 1 diabetes
UA115388C2 (uk) 2013-11-21 2017-10-25 Пфайзер Інк. 2,6-заміщені пуринові похідні та їх застосування в лікуванні проліферативних захворювань
WO2015084804A1 (en) 2013-12-03 2015-06-11 Novartis Ag Combination of mdm2 inhibitor and braf inhibitor and their use
MX2016007376A (es) 2013-12-06 2017-05-11 Novartis Ag Regimen de dosificacion para un inhibidor selectivo alfa-isomorfo de fosfatidilinositol 3-quinasa.
AU2015204566A1 (en) 2014-01-09 2016-08-25 Intra-Cellular Therapies, Inc. Organic compounds
MX2016012285A (es) 2014-03-24 2017-01-23 Genentech Inc Tratamiento de cáncer con antagonista de c-met y correlación de estos con la expresión de hgf.
WO2015149721A1 (en) 2014-04-04 2015-10-08 Crown Bioscience, Inc.(Taicang) Methods for determining responsiveness to mek/erk inhibitors
WO2015155624A1 (en) 2014-04-10 2015-10-15 Pfizer Inc. Dihydropyrrolopyrimidine derivatives
NZ725496A (en) 2014-04-30 2019-11-29 Pfizer Cycloalkyl-linked diheterocycle derivatives
WO2016001789A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Pfizer Inc. Pyrimidine derivatives as pi3k inhibitors for use in the treatment of cancer
CN106999578B (zh) 2014-07-31 2022-03-04 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 针对epha4的人类单克隆抗体和其用途
CA2954862A1 (en) 2014-07-31 2016-02-04 Novartis Ag Combination therapy
PL3524595T3 (pl) 2014-08-28 2022-10-31 Eisai R&D Management Co., Ltd. Pochodna chinoliny o wysokiej czystości i sposób jej wytwarzania
CN104326964A (zh) * 2014-09-16 2015-02-04 中国科学院海洋研究所 一类氟代2-吲哚酮衍生物及其制备和应用
CN105481751A (zh) * 2014-09-16 2016-04-13 中国科学院海洋研究所 一类2-吲哚酮衍生物及其制备和应用
WO2016097918A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 Pfizer Inc. Pyrimidine and triazine derivatives and their use as axl inhibitors
EP3750530A1 (en) 2015-02-05 2020-12-16 TyrNovo Ltd. Combinations of irs/stat3 dual modulators and anti-cancer agents for treating cancer
HUE064614T2 (hu) 2015-02-25 2024-04-28 Eisai R&D Man Co Ltd Eljárás egy kinolin-származék keserû ízének elnyomására
KR20240064733A (ko) 2015-03-04 2024-05-13 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 암을 치료하기 위한 pd-1 길항제 및 vegfr/fgfr/ret 티로신 키나제 억제제의 조합
MX2017013383A (es) 2015-04-20 2017-12-07 Tolero Pharmaceuticals Inc Prediccion de respuesta a alvocidib mediante perfilado mitocondrial.
MX2017013956A (es) 2015-05-01 2018-09-05 Cocrystal Pharma Inc Analogos de nucleosidos para el tratamiento de la familia de virus flaviviridae y cancer.
EP3298021B1 (en) 2015-05-18 2019-05-01 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Alvocidib prodrugs having increased bioavailability
BR112017027227B1 (pt) 2015-06-16 2023-12-12 Eisai R&D Management Co., Ltd Agente anti-câncer
WO2017009751A1 (en) 2015-07-15 2017-01-19 Pfizer Inc. Pyrimidine derivatives
AU2016301315C1 (en) 2015-08-03 2022-07-07 Sumitomo Pharma Oncology, Inc. Combination therapies for treatment of cancer
KR20180073674A (ko) 2015-11-02 2018-07-02 노파르티스 아게 포스파티딜이노시톨 3-키나제 억제제에 대한 투여 요법
AU2016364855B2 (en) 2015-12-03 2019-08-29 Les Laboratoires Servier MAT2A inhibitors for treating MTAP null cancer
WO2018060833A1 (en) 2016-09-27 2018-04-05 Novartis Ag Dosage regimen for alpha-isoform selective phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor alpelisib
WO2018094275A1 (en) 2016-11-18 2018-05-24 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Alvocidib prodrugs and their use as protein kinase inhibitors
KR20190099260A (ko) 2016-12-19 2019-08-26 톨레로 파마수티컬스, 인크. 프로파일링 펩티드 및 감도 프로파일링을 위한 방법
JOP20190154B1 (ar) 2016-12-22 2022-09-15 Amgen Inc بنز أيزو ثيازول، أيزو ثيازولو [3، 4-b] بيريدين، كينازولين، فثالازين، بيريدو [2، 3-d] بيريدازين ومشتقات بيريدو [2، 3-d] بيريميدين على هيئة مثبطات kras g12c لمعالجة سرطان الرئة، أو سرطان البنكرياس أو سرطان القولون والمستقيم
JOP20190272A1 (ar) 2017-05-22 2019-11-21 Amgen Inc مثبطات kras g12c وطرق لاستخدامها
ES2928576T3 (es) 2017-09-08 2022-11-21 Amgen Inc Inhibidores de KRAS G12C y métodos de uso de los mismos
WO2019055579A1 (en) 2017-09-12 2019-03-21 Tolero Pharmaceuticals, Inc. TREATMENT REGIME FOR CANCERS THAT ARE INSENSITIVE TO BCL-2 INHIBITORS USING THE MCL-1 ALVOCIDIB INHIBITOR
US20200237766A1 (en) 2017-10-13 2020-07-30 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Pkm2 activators in combination with reactive oxygen species for treatment of cancer
CA3079076A1 (en) 2017-10-18 2019-04-25 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus Methods and compounds for improved immune cell therapy
EP3730483B1 (en) 2017-12-21 2023-08-30 Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Sciences Class of pyrimidine derivative kinase inhibitors
MA52496A (fr) 2018-05-04 2021-03-10 Amgen Inc Inhibiteurs de kras g12c et leurs procédés d'utilisation
MA52501A (fr) 2018-05-04 2021-03-10 Amgen Inc Inhibiteurs de kras g12c et leurs procédés d'utilisation
MX2020011907A (es) 2018-05-10 2021-01-29 Amgen Inc Inhibidores de kras g12c para el tratamiento de cancer.
CA3098885A1 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Amgen Inc. Kras g12c inhibitors and methods of using the same
EP3802537A1 (en) 2018-06-11 2021-04-14 Amgen Inc. Kras g12c inhibitors for treating cancer
JP7369719B2 (ja) 2018-06-12 2023-10-26 アムジエン・インコーポレーテツド ＫＲａｓ Ｇ１２Ｃ阻害剤及びそれを使用する方法
CN112512597A (zh) 2018-07-26 2021-03-16 大日本住友制药肿瘤公司 用于治疗与acvr1表达异常相关的疾病的方法以及用于此的acvr1抑制剂
JP2020090482A (ja) 2018-11-16 2020-06-11 アムジエン・インコーポレーテツド Ｋｒａｓ ｇ１２ｃ阻害剤化合物の重要な中間体の改良合成法
JP7377679B2 (ja) 2018-11-19 2023-11-10 アムジエン・インコーポレーテツド がん治療のためのｋｒａｓｇ１２ｃ阻害剤及び１種以上の薬学的に活性な追加の薬剤を含む併用療法
CA3117222A1 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Amgen Inc. Kras g12c inhibitors and methods of using the same
CN109912490B (zh) * 2018-11-30 2020-10-16 深圳大学 一种吲哚类化合物Plancyindole E及其制备方法
AU2019391097A1 (en) 2018-12-04 2021-05-20 Sumitomo Pharma Oncology, Inc. CDK9 inhibitors and polymorphs thereof for use as agents for treatment of cancer
CA3123044A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Amgen Inc. Heteroaryl amides useful as kif18a inhibitors
JP2022513967A (ja) 2018-12-20 2022-02-09 アムジエン・インコーポレーテツド Ｋｉｆ１８ａ阻害剤として有用なヘテロアリールアミド
MA54543A (fr) 2018-12-20 2022-03-30 Amgen Inc Inhibiteurs de kif18a
MX2021007104A (es) 2018-12-20 2021-08-11 Amgen Inc Inhibidores de kif18a.
WO2020167990A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Formulations comprising heterocyclic protein kinase inhibitors
CN113767100A (zh) 2019-03-01 2021-12-07 锐新医药公司 双环杂芳基化合物及其用途
WO2020180770A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Revolution Medicines, Inc. Bicyclic heterocyclyl compounds and uses thereof
US11793802B2 (en) 2019-03-20 2023-10-24 Sumitomo Pharma Oncology, Inc. Treatment of acute myeloid leukemia (AML) with venetoclax failure
EP3941463A1 (en) 2019-03-22 2022-01-26 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. Compositions comprising pkm2 modulators and methods of treatment using the same
EP3738593A1 (en) 2019-05-14 2020-11-18 Amgen, Inc Dosing of kras inhibitor for treatment of cancers
CN114144414A (zh) 2019-05-21 2022-03-04 美国安进公司 固态形式
JP2022542392A (ja) 2019-08-02 2022-10-03 アムジエン・インコーポレーテツド Ｋｉｆ１８ａ阻害剤としてのピリジン誘導体
AU2020324963A1 (en) 2019-08-02 2022-02-24 Amgen Inc. KIF18A inhibitors
CN114302880A (zh) 2019-08-02 2022-04-08 美国安进公司 Kif18a抑制剂
RU2734495C1 (ru) * 2019-09-13 2020-10-19 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Способ лечения сахарного диабета
MX2022004656A (es) 2019-10-24 2022-05-25 Amgen Inc Derivados de piridopirimidina utiles como inhibidores de kras g12c y kras g12d en el tratamiento del cancer.
TW202132315A (zh) 2019-11-04 2021-09-01 美商銳新醫藥公司 Ras 抑制劑
JP2022553859A (ja) 2019-11-04 2022-12-26 レボリューション メディシンズ インコーポレイテッド Ｒａｓ阻害剤
CN114901662A (zh) 2019-11-08 2022-08-12 锐新医药公司 双环杂芳基化合物及其用途
MX2022005708A (es) 2019-11-14 2022-06-08 Amgen Inc Sintesis mejorada del compuesto inhibidor de g12c de kras.
US20220395553A1 (en) 2019-11-14 2022-12-15 Cohbar, Inc. Cxcr4 antagonist peptides
MX2022005726A (es) 2019-11-14 2022-06-09 Amgen Inc Sintesis mejorada del compuesto inhibidor de g12c de kras.
CN114980976A (zh) 2019-11-27 2022-08-30 锐新医药公司 共价ras抑制剂及其用途
JP2023509701A (ja) 2020-01-07 2023-03-09 レヴォリューション・メディスンズ，インコーポレイテッド Ｓｈｐ２阻害剤投薬およびがんを処置する方法
WO2021155006A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Les Laboratoires Servier Sas Inhibitors of cyclin-dependent kinases and uses thereof
IL299131A (en) 2020-06-18 2023-02-01 Revolution Medicines Inc Methods for delaying, preventing and treating acquired resistance to RAS inhibitors
US11945809B2 (en) 2020-07-19 2024-04-02 King Saud University Isatin derivatives
EP4208261A1 (en) 2020-09-03 2023-07-12 Revolution Medicines, Inc. Use of sos1 inhibitors to treat malignancies with shp2 mutations
EP4214209A1 (en) 2020-09-15 2023-07-26 Revolution Medicines, Inc. Indole derivatives as ras inhibitors in the treatment of cancer
AR124449A1 (es) 2020-12-22 2023-03-29 Qilu Regor Therapeutics Inc Inhibidores de sos1 y usos de los mismos
CN117616031A (zh) 2021-05-05 2024-02-27 锐新医药公司 用于治疗癌症的ras抑制剂
WO2022235866A1 (en) 2021-05-05 2022-11-10 Revolution Medicines, Inc. Covalent ras inhibitors and uses thereof
EP4334321A1 (en) 2021-05-05 2024-03-13 Revolution Medicines, Inc. Ras inhibitors
IT202100023357A1 (it) 2021-09-09 2023-03-09 Cheirontech S R L Peptidi con attività anti-angiogenica
AR127308A1 (es) 2021-10-08 2024-01-10 Revolution Medicines Inc Inhibidores ras
CA3237696A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Progentos Therapeutics, Inc. Platelet-derived growth factor receptor (pdgfr) alpha inhibitors and uses thereof
WO2023114954A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Genzyme Corporation Pyrazolopyrazine compounds as shp2 inhibitors
EP4227307A1 (en) 2022-02-11 2023-08-16 Genzyme Corporation Pyrazolopyrazine compounds as shp2 inhibitors
US20230263771A1 (en) * 2022-02-21 2023-08-24 University Of Houston System Small molecules that treat or prevent viral infections
WO2023172940A1 (en) 2022-03-08 2023-09-14 Revolution Medicines, Inc. Methods for treating immune refractory lung cancer
WO2023240263A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Revolution Medicines, Inc. Macrocyclic ras inhibitors
WO2024081916A1 (en) 2022-10-14 2024-04-18 Black Diamond Therapeutics, Inc. Methods of treating cancers using isoquinoline or 6-aza-quinoline derivatives

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL230368A (hu) * 1957-08-19
DE878539C (de) * 1939-08-17 1953-06-05 Hoechst Ag Verfahren zur Herstellung von Methinfarbstoffen
BE553661A (hu) * 1955-12-23
NL96047C (hu) * 1956-06-08
FR1398224A (fr) * 1964-05-06 1965-05-07 Ici Ltd Procédé de teinture de matières textiles de polyacrylonitrile
DE2159363A1 (de) * 1971-11-30 1973-06-14 Bayer Ag Antimikrobielle mittel
DE2159361A1 (de) * 1971-11-30 1973-06-14 Bayer Ag Nitrofuranderivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel
DE2159360A1 (de) * 1971-11-30 1973-06-14 Bayer Ag Nitrofuranderivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel
DE2159362A1 (de) * 1971-11-30 1973-06-14 Bayer Ag Nitrofuranderivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel
GB1384599A (en) * 1972-05-04 1975-02-19 Colgate Palmolive Co Coloured detergent compositions
US4002749A (en) * 1975-08-12 1977-01-11 E. R. Squibb & Sons, Inc. Substituted indolinones
US4053613A (en) 1975-09-17 1977-10-11 E. R. Squibb & Sons, Inc. 1,3,thiazolinyl and 1,3 thiazinyl substituted indolinones
DE3310891A1 (de) * 1983-03-25 1984-09-27 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Neue indolinon-(2)-derivate, verfahren zu ihrer herstellung, diese verbindungen enthaltende arzneimittel und zwischenprodukte
DE3426419A1 (de) * 1984-07-18 1986-01-23 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Neue oxindol-derivate, verfahren zu ihrer herstellung, diese verbindungen enthaltende arzneimittel und zwischenprodukte
US4827847A (en) * 1985-05-30 1989-05-09 Her Majesty The Queen In Right Of Canada Short range tubular projectile
JPS6229570A (ja) * 1985-07-29 1987-02-07 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd ３，５−ジイソプロピルベンジリデン複素環式化合物
JPH078851B2 (ja) * 1985-07-29 1995-02-01 鐘淵化学工業株式会社 ３−フエニルチオメチルスチレン誘導体
JPS6239564A (ja) * 1985-08-13 1987-02-20 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd α−ベンジリデン−γ−ブチロラクトンまたはγ−ブチロラクタム誘導体
US4966849A (en) * 1985-09-20 1990-10-30 President And Fellows Of Harvard College CDNA and genes for human angiogenin (angiogenesis factor) and methods of expression
WO1993012786A1 (en) * 1986-07-10 1993-07-08 Howard Harry R Jr Indolinone derivatives
JPS63141955A (ja) * 1986-12-03 1988-06-14 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd トリベンジルアミン誘導体
US5089516A (en) * 1987-03-11 1992-02-18 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha 1-phenyl-3,5-pyrazolidinedione hydroxystyrene compounds which have tyrosine kinase inhibiting activity
JP2539504B2 (ja) * 1987-03-11 1996-10-02 鐘淵化学工業株式会社 ヒドロキシスチレン誘導体
US5202341A (en) * 1987-03-11 1993-04-13 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Hydroxystyrene compounds having tyrosine kinase inhibiting activity
US5217999A (en) * 1987-12-24 1993-06-08 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Styryl compounds which inhibit EGF receptor protein tyrosine kinase
US4868304A (en) * 1988-05-27 1989-09-19 Iowa State University Research Foundation, Inc. Synthesis of nitrogen heterocycles
GB8816944D0 (en) * 1988-07-15 1988-08-17 Sobio Lab Compounds
GB8816945D0 (en) 1988-07-15 1988-08-17 Ici Plc Polymeric foams
DK0429685T3 (da) * 1989-07-25 1997-12-15 Taiho Pharmaceutical Co Ltd Oxoindolderivat
GB9004483D0 (en) * 1990-02-28 1990-04-25 Erba Carlo Spa New aryl-and heteroarylethenylene derivatives and process for their preparation
CA2012634A1 (en) * 1990-03-20 1991-09-20 Hassan Salari Tyrphostins for treatment of allergic, inflammatory and cardiovascular diseases
DE69105495T2 (de) * 1990-04-02 1995-04-06 Pfizer Benzylphosphonsäure-tyrosinkinaseinhibitoren.
US5302606A (en) * 1990-04-16 1994-04-12 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Styryl-substituted pyridyl compounds which inhibit EGF receptor tyrosine kinase
US5196446A (en) 1990-04-16 1993-03-23 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Certain indole compounds which inhibit EGF receptor tyrosine kinase
WO1992007830A2 (en) * 1990-10-29 1992-05-14 Pfizer Inc. Oxindole peptide antagonists
WO1992020642A1 (en) * 1991-05-10 1992-11-26 Rhone-Poulenc Rorer International (Holdings) Inc. Bis mono-and bicyclic aryl and heteroaryl compounds which inhibit egf and/or pdgf receptor tyrosine kinase
US5480883A (en) 1991-05-10 1996-01-02 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Bis mono- and bicyclic aryl and heteroaryl compounds which inhibit EGF and/or PDGF receptor tyrosine kinase
JPH06503095A (ja) * 1991-05-29 1994-04-07 ファイザー・インコーポレーテッド 三環式ポリヒドロキシ系のチロシンキナーゼ阻害薬
GB9115160D0 (en) * 1991-07-12 1991-08-28 Erba Carlo Spa Methylen-oxindole derivatives and process for their preparation
US5124347A (en) * 1991-07-31 1992-06-23 Warner-Lambert Co. 3-5-ditertiarybutylphenyl-4-hydroxymethylidene derivatives of 1,3-dihydro-2H-indole-2-ones as antiinflammatory agents
JPH0558894A (ja) * 1991-08-27 1993-03-09 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 抗腫瘍剤
US5322950A (en) * 1991-12-05 1994-06-21 Warner-Lambert Company Imidazole with angiotensin II antagonist properties
EP0549348A1 (en) * 1991-12-24 1993-06-30 PHARMACIA S.p.A. Arylidene-heterocyclic derivatives, process for their preparation and their use as tyrisine kinase inhibitors
AU661533B2 (en) 1992-01-20 1995-07-27 Astrazeneca Ab Quinazoline derivatives
FR2689397A1 (fr) * 1992-04-01 1993-10-08 Adir Utilisation des dérivés de la 3-(3,5-Ditert-Butyl-4-Hydroxybenzylidenyl) Indoline-2-one pour l'obtention de médicaments.
ATE195530T1 (de) 1992-05-20 2000-09-15 Merck & Co Inc 17-ether und thioether von 4-aza-steroiden
FR2694004B1 (fr) * 1992-07-21 1994-08-26 Adir Nouvelles 3-(Hydroxybenzylidényl)-indoline-2-ones et 3-(hydroxybenzylidényl)-indoline-2-thiones, leurs procédés de préparation, et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
CZ283965B6 (cs) * 1992-08-06 1998-07-15 Warner-Lambert Company 2-thioindolové, 2-indolinthionové a polysulfidové sloučeniny, 2-selenoindolové, 2-indolinselenonové a selenidové sloučeniny a farmaceutické prostředky na jejich bázi
US5565324A (en) 1992-10-01 1996-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5330992A (en) * 1992-10-23 1994-07-19 Sterling Winthrop Inc. 1-cyclopropyl-4-pyridyl-quinolinones
DK0666868T4 (da) * 1992-10-28 2006-09-18 Genentech Inc Anvendelse af anti-VEGF-antistoffer til behandling af cancer
FR2698397B1 (fr) 1992-11-20 1995-06-09 Arte Procede d'isolation et de revetement exterieur d'une construction et nouveau type de corniere destinee a sa mise en oeuvre.
DE4239169A1 (de) * 1992-11-21 1994-05-26 Merck Patent Gmbh Cyclobutan - Benzol - Derivate
GB9226855D0 (en) * 1992-12-23 1993-02-17 Erba Carlo Spa Vinylene-azaindole derivatives and process for their preparation
JP3507124B2 (ja) * 1993-05-26 2004-03-15 塩野義製薬株式会社 ベンジリデン誘導体の製造法
EP0632102B1 (de) * 1993-06-28 1997-04-02 Bayer Ag Massefärben von Kunststoffen
GB9313638D0 (en) * 1993-07-01 1993-08-18 Erba Carlo Spa Arylidene and heteroarylidene oxindole derivatives and process for their preparation
US5502072A (en) * 1993-11-26 1996-03-26 Pfizer Inc. Substituted oxindoles
FR2713431B1 (fr) * 1993-12-01 1996-02-16 Dehaeze Jean Marie Perfectionnement à l'interface "Amplificateur de puissance-enceinte acoustique".
GB9326136D0 (en) * 1993-12-22 1994-02-23 Erba Carlo Spa Biologically active 3-substituted oxindole derivatives useful as anti-angiogenic agents
GB9412719D0 (en) * 1994-06-24 1994-08-17 Erba Carlo Spa Substituted azaindolylidene compounds and process for their preparation
GB9423997D0 (en) * 1994-11-28 1995-01-11 Erba Carlo Spa Substituted 3-arylidene-7-azaoxindole compounds and process for their preparation
GB9501567D0 (en) * 1995-01-26 1995-03-15 Pharmacia Spa Hydrosoluble 3-arylidene-2-oxindole derivatives as tyrosine kinase inhibitors
GB9507298D0 (en) * 1995-04-07 1995-05-31 Pharmacia Spa Substituted indolylmethylene-oxindale analogues as tyrosine kinase inhibitors
US5880141A (en) * 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
ES2201266T3 (es) * 1996-01-17 2004-03-16 Taiho Pharmaceutical Company Limited Inhibidores del espesamiento de la capa intima.
EP0788890A1 (en) * 1996-02-06 1997-08-13 Agfa-Gevaert N.V. Dyes and dye-donor elements for thermal dye transfer recording
WO1997034920A1 (en) * 1996-03-21 1997-09-25 Sugen, Inc. Assays for kdr/flk-1 receptor tyrosine kinase inhibitors
US6462048B2 (en) * 1996-03-29 2002-10-08 Pfizer Inc. Benzyl(idene)-lactam derivatives, their preparation and their use as selective (ant)agonists of 5-HT1A- and/or 5-HT1D receptors
JP3696330B2 (ja) * 1996-04-18 2005-09-14 大鵬薬品工業株式会社 ３−（ジアリールメチレン）オキシインドール誘導体の製造方法
JP2001514484A (ja) 1996-08-21 2001-09-11 スージェン・インコーポレーテッド タンパク質チロシンキナーゼの結晶構造
CA2264220A1 (en) 1996-08-23 1998-02-26 Sugen, Inc. Indolinone combinatorial libraries and related products and methods for the treatment of disease
AU7622698A (en) 1996-12-05 1998-06-29 Sugen, Inc. Use of indolinone compounds as modulators of protein kinases
WO1998038984A2 (en) 1997-03-05 1998-09-11 Sugen, Inc. Formulations for hydrophobic pharmaceutical agents
CA2289102A1 (en) 1997-05-07 1998-11-12 Sugen, Inc. 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
GB9716557D0 (en) 1997-08-06 1997-10-08 Glaxo Group Ltd Benzylidene-1,3-dihydro-indol-2-one derivatives having anti-cancer activity
JP2002507598A (ja) 1998-03-26 2002-03-12 スージェン・インコーポレーテッド チロシン蛋白質キナーゼを調節するためのヘテロ環式化合物のファミリー
DK2020408T3 (da) 1998-05-29 2013-09-30 Sugen Inc Pyrrol-substitueret 2-indolinon som proteinkinaseinhibitor

Also Published As

Publication number Publication date
DE69612649D1 (de) 2001-06-07
US20030176487A1 (en) 2003-09-18
DE29623744U1 (de) 1999-09-30
ATE200863T1 (de) 2001-05-15
HUP9701694A3 (en) 2004-03-01
US6225335B1 (en) 2001-05-01
US5883116A (en) 1999-03-16
US20010027207A1 (en) 2001-10-04
NO965377L (no) 1997-02-12
EP0769947B1 (en) 2001-05-02
DK0769947T3 (da) 2001-08-13
US5883113A (en) 1999-03-16
AR003088A1 (es) 1998-07-08
JP3231044B2 (ja) 2001-11-19
EP0934931A2 (en) 1999-08-11
US5792783A (en) 1998-08-11
CA2192797A1 (en) 1996-12-19
NO311355B1 (no) 2001-11-19
ES2159741T3 (es) 2001-10-16
JPH10504323A (ja) 1998-04-28
EP0769947A1 (en) 1997-05-02
EP0934931A3 (en) 1999-10-20
DE69612649T2 (de) 2001-10-31
GR3036315T3 (en) 2001-10-31
US5886020A (en) 1999-03-23
AU706597C (en) 2001-10-18
NO965377D0 (no) 1996-12-13
HK1001121A1 (en) 1998-05-29
HUP9701694A2 (hu) 1999-06-28
AU706597B2 (en) 1999-06-17
CA2192797C (en) 2006-05-16
CN1155838A (zh) 1997-07-30
WO1996040116A1 (en) 1996-12-19
PT769947E (pt) 2001-10-31
US5834504A (en) 1998-11-10
JP2000026412A (ja) 2000-01-25
US5880141A (en) 1999-03-09
BR9606410A (pt) 1997-12-30
US6469032B2 (en) 2002-10-22
MX9606401A (es) 1998-01-31
AR037562A2 (es) 2004-11-17
EP0769947A4 (en) 1998-09-30
HK1011933A1 (en) 1999-07-23
AU6044196A (en) 1996-12-30
CN1268333C (zh) 2006-08-09
NZ310109A (en) 1999-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU226755B1 (en) Indolinone derivatives for the treatment of disease, use thereof, pharmaceutical compositions containing these compounds
US5763470A (en) Benzopyran compounds and methods for their use
KR100743287B1 (ko) 피롤기로 치환된 2-인돌리논 단백질 인산화 효소 억제제
US5886195A (en) Thienyl compounds for inhibition of cell proliferative disorders
US7189721B2 (en) Bicyclic protein kinase inhibitors
US6316635B1 (en) 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
JP2002511852A (ja) 蛋白質キナーゼ活性の調節剤としての２−インドリノン誘導体
US6649635B2 (en) Heteroarylcarboxamide compounds active against protein tyrosine kinase related disorders
US20030069421A1 (en) 3-(Piperazinylbenzylidenyl)-2-indolinone compounds and derivatives as protein tyrosine kinase inhibitors
US6906093B2 (en) Indolinone combinatorial libraries and related products and methods for the treatment of disease
US6130238A (en) 3-(cyclohexanoheteroarylidenyl)-2-indolinone protein tyrosine kinase inhibitors
US6569868B2 (en) 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity