DE60223063T2

DE60223063T2 - C-kit inhibitoren

Info

Publication number: DE60223063T2
Application number: DE60223063T
Authority: DE
Inventors: Alain Moussy; Patrice Dubreuil; Olivier Hermine
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite Paris 5 Rene Descartes; AB Science SA
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite Paris 5 Rene Descartes; AB Science SA
Priority date: 2001-06-29
Filing date: 2002-06-28
Publication date: 2008-07-17
Anticipated expiration: 2022-06-29
Also published as: JP2005500041A; EP1434991B1; US7727731B2; WO2003003006A3; CA2452368A1; DE60223063D1; US20060166281A1; ATE376182T1; EP1434991A2; WO2003003006A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Screening-Verfahren, das die Identifizierung und Auswahl von Verbindungen ermöglicht, die auf die Transphosphorylase-Domäne (auch Phosphotransferase-Domäne genannt) von c-kit abzielen, insbesondere Verbindungen, die als potente Inhibitoren von konstitutiv aktiviertem c-kit selektiert werden, während sie unfähig sind, andere Aktivierungswege zu inhibieren, wie beispielsweise die Wege, die zum Tod von IL-3-abhängigen Zellen, die in Gegenwart von IL-3 kultiviert werden, führen.
Das Protoonkogen c-kit, das den Rezeptor für Stammzellfaktor (stem cell factor, SCF) kodiert, gehört zu der Typ-III-Rezeptor-Tyrosinkinase-Unterfamilie, die durch die Gegenwart von fünf Ig-ähnlichen Domänen in der extrazellulären Domäne und durch eine Interkinasesequenz charakterisiert ist, die die intrazytoplasmatische Domäne in die Adenosintriphosphat-Bindungsdomäne (ATP-Bindungsdomäne) und die Phosphotransferase-Domäne aufteilt [1] (1). Sein Gen ist in Menschen am Chromosom 4q12 angeordnet und wird vom W-Locus am murinen Chromosom 5 kodiert [2]. Das Produkt des c-kit-Gens ist ein Transmembranrezeptor, der sich aus 976 Aminosäuren zusammensetzt, mit 519 extrazellulären Aminosäuren, einer Transmembrandomäne von 23 Aminosäuren und einem intrazellulären Schwanz von 433 Aminosäuren [3].
Der c-kit-Rezeptor wird normalerweise an verschiedenen Zelltypen exprimiert, einschließlich Melanozyten, Mastzellen, primitiver hämatopoetischer Zellen, primordialer Keimzellen und Cajal-Interstitialzellen (interstitial cells of Cajal, ICC) [4]. Der Ligand für c-kit-Rezeptor ist ein Cytokin, das als Stammzellfaktor (stem cell factor, SCF) oder Kit-Ligand (KL) oder Steel-Faktor (SL) oder Mastzellenwachstumsfaktor (mast cell growth factor, MCGF) bezeichnet wird [5, 6]. Dieses Cytokin wird von einem Gen kodiert, das im Menschen an Chromosom 12 und beim S1-Locus am murinen Chromosom 10 angeordnet ist [7]. Das Produkt dieses Gens wird alternativ gespleißt, was zu einer löslichen Form und/oder zu einer membranverankerten Form führt [8]. SCF wirkt entweder für sich oder in Kombination mit anderen Wachstumsfaktoren zum Fördern des Überlebens und der Selbsterneuerung von Stammzellen und der Proliferation, Differenzierung und Migration verschiedener Zelltypen:
Melanozyten, Mastzellen, primitive hämatopoetische Zelle, Keimzellen und ICC. Die SCF-Bindung an seinen Rezeptor fördert die Dimerisation von c-kit und induziert die intrinsische Tyrosinkinaseaktivität, was in der Transphosphorylierung bestimmter Tyrosinreste resultiert [9, 10]. Bei Phosphorylierung werden diese Tyrosinreste zu Docking-Stellen für mehrere intrazelluläre Signalmoleküle, was zu unterschiedlichen Zellantworten in unterschiedlichen Zelltypen führt.
Indes, wie es der Fall für eine Reihe anderer Kinasen ist, kann c-kit aktiviert werden, ohne seinen Liganden-SCF zu binden. Eine Reihe natürlich vorkommender Mutationen führt zu einer konstitutiven Aktivierung der c-kit-Kinase, die in abnormer Zellproliferation und der Entwicklung von Erkrankungen, wie Mastozytose und verschiedenen anderen Krebsarten, resultiert.
Die erste aktivierende Mutation von c-kit wurde in einem Katzenmodell beschrieben, die von dem Hardy-Zuckerman-4-Katzensarkomvirus induziert wird, das das transformierende Onkogen v-kit kodiert, ein mutiertes und gekürztes Virushomologon von c-kit [11]. Vor kurzem wurden Rezeptormutationen, die zu einer konstitutiven Aktivierung von c-kit führen, in Mastzellen-Leukämiezelllinien und in Zellen, die von Patienten mit Mastozytose, die mit anderen hämatologischen Malignitäten assoziiert sind oder nicht, stammten, beschrieben. Die verschiedenen aktivierenden Mutationen von c-kit, die bisher identifiziert wurden, werden im Folgenden ausführlich beschrieben.
Ein zweiter Mechanismus, der zu einer gesteigerten Aktivierung von c-kit führt, ist autokrine Sekretion von SCF in verschiedenen Tumorgeweben, wie in kleinzelligem Lungenkarzinom (small cell lung cancer, SCLC) [12], kolorektalem Karzinom [13], Brustkrebs [14], gynäkologische Tumore [15] und Neuroblastome [16].
Tyrosinkinase-Inhibitoren, die in der Technik zum Inhibieren von c-kit vorgeschlagen wurden, wurden nicht entwickelt oder von ihnen wurde nicht gezeigt, dass sie aktiviertes mutiertes c-kit inhibieren. Es gibt zwei Ausnahmen, die im Folgenden ausführlich beschrieben sind, von denen eine (STI 571) mit unserem Assay nicht aktiv ist, und wir werden hier eine Erklärung für die falsche Deutung der Verfasser liefern, und die andere, SU6577, ist nur in einer hohen Konzentration aktiv, bei der eine Toxizität erkannt wird.
Heinrich et al. (2000, Blood, Aug. 1; 96(3): 925–932) behaupten, dass STI 571 ( WO 99/03854 ) eine potentere inhibierende Auswirkung auf die Kinaseaktivität einer Mutante in einer menschlichen Mastzellen-Leukämiezelllinie (HMC-1, die eine Juxtamembran-Mutation exprimiert) als auf die ligandenabhängige Aktivierung des Wildtyp-Rezeptors hat. Infolgedessen könnte die Verbindung zum Behandeln proliferativer Erkrankungen, die das aktivierte mutierte c-kit einschließt, jedoch nicht von Erkrankungen, die von durch Liganden aktiviertem c-kit verursacht werden, von Nutzen erscheinen.
Die vorliegende Erfindung bewegt sich in die entgegengesetzte Richtung, da das im Folgenden ausführlich beschriebene Verfahren auf die Identifizierung von Verbindungen, die aktiviertes c-kit inhibieren können, ausgerichtet ist, ob sie nun SCF-aktiviertes c-kit oder mutiertes aktiviertes c-kit sind.
Des Weiteren, wie oben erwähnt, stehen die in Heinrich et al., 2000, dargelegten Ergebnisse zu denen im Gegensatz, die in Verbindung mit der Erfindung erhalten wurden. Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren, das auf die Identifizierung von Verbindungen, die konstitutiv aktiviertes c-kit inhibieren können, ausgerichtet ist. Mit diesem Verfahren waren wir dazu im Stande zu zeigen, dass STI 571 ein Inhibitor von c-kit-Wildtyp ist, jedoch nicht auf mutiertes aktiviertes c-kit, wie der D816-Mutante, wirkt.
Das allgemeine Problem, das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, besteht folglich darin, ein Screening-Verfahren zu definieren, das die Identifizierung und Selektion nicht-toxischer Verbindungen ermöglicht, die c-kit inhibieren können, ob sie nun SCF-aktivierte c-kit-Inhibitoren, konstitutiv aktivierte c-kit-Inhibitoren oder beides sind.
Indolinon-Derivate, wie SU4984, SU6663, SU6577 und SU5614, wurden auf c-kit-Inhibierung getestet von Yongsheng Ma und B. Longley, Febr. 2000; Indolinone derivatives inhibit constitutively activated KIT mutants and kill neoplastic mast cells, The Society For Investigative Dermatology, Bd. 114, Nr. 2, Seiten 392–394. Es wird in dieser Veröffentlichung gezeigt, dass unter den getesteten Verbindungen nur SU6577 bei 40 μM die Rezeptorphosphorylierung des mutierten aktivierten c-kit D816 erheblich verringern konnte. Diese Verbindung ist auch an c-kit-Wildtyp aktiv, bei einer Konzentration von 40 μM ist jedoch das Problem, dass die Aktivität von SU6577 an der D816-Mutante aus Toxizität resultieren könnte. Ein Fehlen einer Spezifität an c-kit im Vergleich zu anderen Tyrosinkinasen würde eine solche Verbindung für therapeutische Zwecke inadäquat machen.
In dieser Hinsicht stellt das Verfahren, das von der Erfindung vorgesehen wird, einen zweiten Test an IL-3-abhängigen Zellen, die in Gegenwart von IL-3 kultiviert werden. Bei den Kandidaten-Verbindungen, die gegen aktiviertes c-kit wirksam sind, wird leicht eine Gegenprobe auf ihre Spezifität und Toxizität gemacht.
Viele verschiedene Verbindungen wurden als Tyrosinkinase-Inhibitoren beschrieben, beispielsweise monocyclische, bicyclische oder heterocyclische Bisarylverbindungen ( WO 92/20642 ), Vinylen/Azaindol-Derivate ( WO 94/14808 ) und 1-Cyclopropyl-4- pyridylchinolone ( US 5,330,992 ), Styrylverbindungen ( US 5,217,999 ), styrylsubstituierte Pyridyl-Verbindungen ( US 5,302,606 ), Selenoindole und Selenide ( WO 94/03427 ), tricyclische Polyhydroxy-Verbindungen ( WO 92/21660 ) und Benzylphosphonsäure-Verbindungen ( WO 91/15495 ), Pyrimidin-Derivate ( US 5,521,184 und WO 99/03854 ), Indolinon-Derivate und pyrrolsubstituierte Indolinone ( US 5,792,783 , EP 934 931 , US 5,834,504 , US 5,883,116 , US 5,883,113 , US 5, 886,020 , WO 96/40116 und WO 00/38519 ) sowie monocyclische, bicyclische Bisaryl- und Heteroarylverbindungen ( EP 584 222 , US 5,656,643 und WO 92/20642 ), Chinazolin-Derivate ( EP 602 851 , EP 520 722 , US 3,772,295 und US 4,343,940 ) und Aryl- und Heteroarylchinazolin ( US 5,721,237 , US 5,714,493 , US 5,710,158 und WO 95/15758 ).
Von keiner dieser Verbindungen wurde jedoch gezeigt, dass sie aktiviertes c-kit selektiv inhibieren, während sie potente Inhibitoren von c-kit-Wildtyp sind, die in der Transphosphorylierungs-Domäne wirken und unfähig sind, den Tod von IL-3-abhängigen Zellen, die in Gegenwart von IL-3 kultiviert werden, zu fördern.
Wir zeigen weiterhin hier, dass ein spezifisches Abzielen auf die Transphosphorylase- oder die Juxtamembran-Domäne von c-kit von Interesse ist. In der Tat resultieren Mutationen oder Deletionen in diesen Domänen in konstitutiv aktiviertem c-kit. Zum Beispiel wurde unter Verbindungen, die selektiert werden, um an der D816-Mutante sowie an SCF-aktiviertem c-kit-Wildtyp aktiv zu sein, von einigen in Verbindung mit der Erfindung gefunden, dass sie stark potente c-kit-Wildtyp-Inhibitoren sind.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung auf ein Screening-Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die selektive und potente Inhibitoren von c-kit sind, umfassend:

a) das In-Kontakt-Bringen von (i) aktiviertem c-kit und (ii) wenigstens einer zu testenden Verbindung unter Bedingungen, welche die Ausbildung eines Komplexes der Komponenten (i) und (ii) ermöglichen,
b) Selektieren von Verbindungen, die aktiviertes c-kit inhibieren,
c) Testen und Selektieren einer Untergruppe von in Schritt b) identifizierten Verbindungen, welche unfähig sind, den Tod von IL-3-abhängigen Zellen, die in Gegenwart von IL-3 kultiviert werden, zu fördern.

Im Rahmen der Erfindung bedeutet der Ausdruck „aktiviertes c-kit" ein konstitutiv aktiviertes mutiertes c-kit, einschließlich wenigstens einer Mutation, die aus Punktmutationen, Deletionen, Insertionen, jedoch auch Modifikationen und Veränderungen der natürlichen c-kit-Sequenz (SEQ ID NO: 1). Solche Mutationen, Deletionen, Insertionen, Modifikationen und Veränderungen können in der Transphosphorylase-Domäne, in der Juxtamembran-Domäne sowie in einer beliebigen Domäne, die direkt oder indirekt für c-kit-Aktivität verantwortlich zeichnet, auftreten. Der Ausdruck „aktiviertes c-kit" bedeutet hierin auch SCF-aktiviertes c-kit. In einer bevorzugten Ausführungsform weist das aktivierte mutierte c-kit in Schritt a) wenigstens eine Mutation proximal zu Y823 auf, insbesondere zwischen den Aminosäuren 800 bis 850 von SEQ ID NO: 1, welche bei der c-kit-Autophosphorylierung eine Rolle spielt, und es sich insbesondere um die Mutanten D816V, D816Y, D816F und D820G handelt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist das aktivierte mutierte c-kit in Schritt a) eine Deletion in der Juxtamembran-Domäne von c-kit auf. Solch eine Deletion ist beispielsweise zwischen den Codon-Aminosäuren 573 und 579, die als c-kit d(573–579) bezeichnet wird. Die Punktmutation V559G proximal zum Juxtamembran-Domänen-c-kit ist ebenfalls von Interesse.
Das Screening-Verfahren kann weiterhin den Schritt umfassen, der aus dem Testen und Selektieren einer Untergruppe von in Schritt b) identifizierten Verbindungen, die Inhibitoren von mutiertem aktiviertem c-kit (beispielsweise in der Transphosphorylase-Domäne) sind, die SCF-aktivierten c-kit-Wildtyp inhibieren können, besteht.
Alternativ ist in Schritt a) aktiviertes c-kit SCF-aktivierter c-kit-Wildtyp.
Eine beste Methode zum Ausüben dieses Verfahrens besteht aus einem Test in einer Konzentration über 10 μM in Schritt a). Relevante Konzentrationen sind beispielsweise 10, 15, 20, 25, 30, 35 oder 40 μM.
In Schritt c) liegt IL-3 vorzugsweise in dem Kulturmedium der IL-3-abhängigen Zellen in einer Konzentration von 0,5 bis 10 ng/ml, vorzugsweise von 1 bis 5 ng/ml vor. Beispiele IL-3-abhängiger Zellen beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Zelllinien, die c-kit natürlich exprimieren und von diesem in Bezug auf Wachstum und Überleben abhängen. Unter solchen Zellen können menschliche Mastzelllinien unter Anwendung der folgenden Methoden hergestellt werden: Zum Beispiel können normale menschliche Mastzellen mit retroviralen Vektoren infiziert werden, die Sequenzen, die für ein mutiertes c-kit kodieren, das das c-kit-Signalpeptid umfasst, und eine TAG-Sequenz enthält, die das Differenzieren mutierter c-kits von c-kit-Wildtyp, der mittels Antikörpern in hämatopoetischen Zellen exprimiert wird, ermöglichen.
Diese Technik ist vorteilhaft, da sie keine Zellmortalität induziert und der genetische Transfer stabil ist und zufrieden stellende Ausbeuten ergibt (etwa 20%). Reine normale menschliche Mastzellen können routinemäßig erhalten werden, indem Vorläuferzellen kultiviert werden, die aus Blut stammen, das aus menschlicher Nabelvene bezogen wurde. In dieser Hinsicht wird heparinisiertes Blut aus Nabelvene auf einem Ficoll-Gradienten zentrifugiert, um einkernige Zellen von anderen Blutbestandteilen zu isolieren. CD34+-Vorläuferzellen werden dann aus den oben erwähnten isolierten Zellen unter Verwendung des immunomagnetischen Auswahlsystems MACS (Miltenyi biotech) gereinigt. Die CD34+-Zellen werden dann bei 37°C in einer Atmosphäre mit 5% CO₂ in einer Konzentration von 10⁵ Zellen pro ml in dem Medium MCMM (⌷-MEM, supplementiert mit L-Glutamin, Penicillin, Streptomycin, 5 × 10^–5 M (⌷-Mercaptoethanol, 20% fötales Kälberserum, 1% Rinderserumalbumin und 100 ng/ml rekombinanter menschlicher SCF)) kultiviert. Das Medium wird alle 5 bis 7 Tage gewechselt. Der Prozentanteil von Mastzellen, die in der Kultur vorliegen, wird jede Woche unter Verwendung von May-Grünwal-Giemsa- oder Toluidinblau-Färbung eingeschätzt. Anti-Tryptase-Antikörper können ebenfalls zum Nachweisen von Mastzellen in der Kultur verwendet werden. Nach 10 Wochen Kultur wird eine reine Zellpopulation von Mastzellen (< 98%) erhalten.
Es ist möglich, unter Verwendung von Standardmethoden Vektoren herzustellen, die c-kit zum Transfizieren der wie oben erwähnt hergestellten Zelllinien exprimieren. Die cDNA von menschlichem c-kit wurde in Yarden et al., (1987) EMBO J. 6 (11), 3341–3351, beschrieben. Der kodierende Teil von c-kit (3000 bp) kann mittels PCR amplifiziert und kloniert werden, wobei die folgenden Oligonukleotide verwendet werden:
Die PCR-Produkte, die mit Not1 und Xho1 verdaut wurde, wurde unter Verwendung von T4-Ligase in den pFlag-CMV-Vektor (SIGMA) inseriert, wobei dieser Vektor mit Not1 und Xho1 verdaut und unter Verwendung von CIP (Biolabs) dephosphoryliert wird. Das pFlag-CMV-c-kit wird zum Transformieren des Bakterienklons XL1-blue verwendet. Die Transformation der Klone wird unter Verwendung der folgenden Primer verifiziert.
Ortsgerichtete Mutagenese wird unter Verwendung relevanter Kassetten mit Routine- und herkömmlichen Methoden, die in der Technik bekannt sind, durchgeführt.
Der Vektor Migr-1 (ABC) kann als eine Grundlage zum Konstruieren retroviraler Vektoren verwendet werden, die zum Transfizieren reifer Mastzellen eingesetzt werden. Dieser Vektor ist vorteilhaft, da er die Sequenz enthält, die für GFP am 3'-Ende und einer IHRES kodiert. Diese Merkmale ermöglichen, Zellen, die mit dem Retrovirus infiziert wurden, unter Verwendung von Direktanalyse mit einem Fluorozytometer zu selektieren. Wie oben erwähnt, kann die N-terminale Sequenz von c-kit-cDNA modifiziert werden, um eine Flag-Sequenz einzuführen, die zum Unterscheiden von exogenem von endogenem c-kit von Nutzen sein wird.
Andere IL-3-abhängige Zelllinien, die verwendet werden können, beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt:

– BaF3-Mauszellen, die die Wildtyp- oder mutierte Form von c-kit exprimieren (in der Juxtamembran und in den katalytischen Stellen), sind in Kitayama et al., (1996), Blood 88, 995–1004, und Tsujimura et al., (1999), Blood 93, 1319–1329, beschrieben.
– IC-2-Mauszellen, die entweder c-kit^WT oder c-kit^D814Y exprimieren, sind in Piao et al., (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14665–14669, dargestellt.

IL-3-unabhängige Zelllinien sind:

– HMC-1, eine faktorunabhängige Zelllinie, die von einem Patienten mit Basophilenleukämie stammt, exprimiert ein mutiertes Juxtamembran-c-kit-Polypeptid, das konstitutive Kinaseaktivität aufweist (T. Furitsu et al., J. Clin. Invest. 1993; 92: 1736–1744; Butterfield et al., Establishment of an immature mast cell line from a Patient with mast cell leukemia. Leuk. Res. 1988; 12: 345–355, und Nagata et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995; 92: 10560–10564).
– Die P815-Zelllinie (Mastozytom, das eine c-kit-Mutation an der Position 814 natürlich exprimiert) wurde in Tsujimura et al., (1994), Blood 83, 2619–2626, beschrieben.

Das Ausmaß, in dem die Komponente (ii) aktiviertes c-kit inhibiert, kann in vitro oder ex vivo gemessen werden. In dem Fall, in dem es ex vivo gemessen wird, sind wie oben hergestellte oder aufgeführte Zelllinien, die ein aktiviertes mutiertes c-kit exprimieren, das wenigstens eine Mutation proximal zu Y823 aufweist, insbesondere zwischen den Aminosäuren 800 bis 850 von SEQ ID NO: 1, welche bei der c-kit-Autophosphorylierung eine Rolle spielt, und wobei es sich insbesondere um die Mutanten D816V, D816Y, D816F und D820G handelt, bevorzugt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin den Schritt, der aus dem Testen und Selektieren von Verbindungen, die c-kit-Wildtyp in einer Konzentration unter 1 μM inhibieren können, besteht. Diese kann in vitro oder ex vivo gemessen werden. Beispiele von Zelllinien, die c-kit exprimieren, beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt: Mastzellen, transfizierte Mastzellen, HMC-1, BaF3, P815 und IC-2.
Folglich sind Verbindungen, die gemäß dem oben beschriebenen Verfahren identifiziert und selektiert werden, potente, selektive und nicht-toxische c-kit-Wildtyp-Inhibitoren. Es ist auch erwähnenswert, dass die Inhibitoren auf die Transphosporylierungs-Domäne von c-kit-Wildtyp wirken.
Alternativ kann das erfindungsgemäße Screening-Verfahren in vitro ausgeübt werden. In dieser Hinsicht kann die Inhibierung von mutiertem aktiviertem c-kit und/oder c-kit-Wildtyp unter Anwendung biochemischer Standardtechniken, wie Immunpräzipitation und Western-Blot, gemessen werden. Vorzugsweise wird die Menge der c-kit-Phosphorylierung gemessen.
In noch einer weiteren Ausführungsform sieht die Erfindung ein wie oben beschriebenes Screening-Verfahren zur Identifizierung potenter und selektiver Verbindungen vor, die Inhibitoren von c-kit sind, umfassend:

a) das Durchführen eines Proliferations-Assays mit Zellen, die ein mutiertes c-kit (beispielsweise in der Transphosphorylase-Domäne) exprimieren, wobei die Mutante ein permanent aktiviertes c-kit ist, mit einer Anzahl verschiedener Testverbindungen zur Identifizierung einer Untergruppe von Kandidat-Verbindungen, die auf aktiviertes c-kit abzielen und jeweils einen IC50-Wert < 10 μM aufweisen, durch Messen des Zelltod-Ausmaßes,
b) Durchführen eines Proliferations-Assays mit Zellen, die c-kit exprimieren, mit der Untergruppe der in Schritt a) identifizierten Kandidaten-Verbindungen, wobei die Zellen IL-3-abhängige Zellen sind, die in Gegenwart von IL-3 kultiviert werden, zur Identifizierung einer Untergruppe von Kandidaten-Verbindungen, die spezifisch auf c-kit abzielen,
c) Durchführen eines Proliferations-Assays mit Zellen, die c-kit exprimieren, mit der Untergruppe der in Schritt b) identifizierten Kandidaten-Verbindungen und Selektieren einer Untergruppe von Kandidaten-Verbindungen, die auf c-kit-Wildtyp abzielen und jeweils einen IC50-Wert < 10 μM, bevorzugt einen IC50 < 1 μM, aufweisen, durch Messen des Zelltod-Ausmaßes.

Hier kann das Zelltod-Ausmaß mittels 3H-Thymidin-Einbau, das Trypan-Blau-Ausschlussverfahren oder Fließzytometrie mit Propidiumiodid gemessen werden. Dabei handelt es sich um übliche Techniken, die in der Technik routinemäßig ausgeübt werden.
Verbindungen, die gescreent werden sollen, können Tyrosinkinase-Inhibitoren sein. Viele verschiedene Verbindungen wurden als Tyrosinkinase-Inhibitoren beschrieben, beispielsweise monocyclische, bicyclische oder heterocyclische Bisarylverbindungen ( WO 92/20642 ), Vinylen/Azaindol-Derivate ( WO 94/14808 ) und 1-Cyclopropyl-4-pyridylchinolone ( US 5,330,992 ), Styrylverbindungen ( US 5,217,999 ), styrylsubstituierte Pyridyl-Verbindungen ( US 5,302,606 ), Selenoindole und Selenide ( WO 94/03427 ), tricyclische Polyhydroxyl-Verbindungen ( WO 92/21660 ) und Benzylphosphonsäure-Verbindungen ( WO 91/15495 ).
Folglich betrifft die Erfindung ein wie oben definiertes Screening-Verfahren, wobei die Verbindungen ausgewählt sind aus Indolinon, Pyrimidin-Derivaten, Pyrrolopyrimidin-Derivaten, Chinazolin-Derivaten, Chinoxalin-Derivaten, Pyrazol-Derivaten, monocyclischen, bicyclischen oder heterocyclischen Bisarylverbindungen, Vinylen-Azaindol-Derivaten und Pyridyl-Chinolon-Derivaten, Styrylverbindungen, styrylsubstituierten Pyridyl-Verbindungen, Selenoindolen, Seleniden, tricyclischen Polyhydroxyl-Verbindungen und Benzylphosphonsäure-Verbindungen.
Unter bevorzugten Verbindungen, die gemäß dem Verfahren der Erfindung getestet werden wollen, ist es von Interesse, sich auf Pyrimidin-Derivate zu konzentrieren, wie N-Phenyl-2-pyrimidinamin-Derivate der Formel I:
in der R1-, R2-, R3-, R13- bis R17-Gruppen die Bedeutungen aufweisen, die in EP 564 409 B1 dargestellt sind, die hiermit in die Beschreibung aufgenommen sind.
Vorzugsweise wird das N-Phenyl-2-pyrimidinamin-Derivat aus den Verbindungen ausgewählt, die der Formel II entsprechen:
in der R1, R2 und R3 unabhängig ausgewählt sind aus H, F, Cl, Br, I, einer C1-C5-Alkyl- oder einer cyclischen oder heterocyclischen Gruppe, insbesondere einer Pyridylgruppe;
R4, R5 und R6 unabhängig ausgewählt sind aus H, F, Cl, Br, I, einer C1-C5-Alkyl-, insbesondere einer Methylgruppe;
und R7 eine Phenylgruppe ist, die wenigstens einen Substituenten trägt, der wiederum wenigstens eine basische Stelle besitzt, wie eine Aminofunktion. Zum Beispiel kann R7 Folgendes sein:
Unter diesen Verbindungen sind die bevorzugten wie folgt definiert:
R1 ist eine heterocyclische Gruppe, insbesondere eine Pyridylgruppe,
R2 und R3 sind H,
R4 ist eine C1-C3-Alkyl-, insbesondere eine Methylgruppe, R5 und R6 sind H und R7 ist eine Phenylgruppe, die wenigstens einen Substituenten trägt, der wiederum wenigstens eine basische Stelle besitzt, wie eine Aminofunktion, beispielsweise die Gruppe:
Die Herstellung solcher Verbindungen ist in Beispiel 21 von EP 564 409 beschrieben.
Alternativ kann das Screening mit Indolinonderivaten und pyrrolsubstituierten Indolinoen ( US 5,792,783 , EP 934 931 , US 5,834,504 , US 5,883,116 , US 5,883,113 , US 5, 886,020 , WO 96/40116 und WO 00/38519 ) sowie monocyclischen, bicyclischen Bisaryl- und Heteroarylverbindungen ( EP 584 222 , US 5,656,643 und WO 92/20642 ); Chinazolin-Derivaten ( EP 602 851 , EP 520 722 , US 3,772,295 und US 4,343,940 ), 4-aminosubstituierten Chinazolinen ( US 3,470,182 ), 4-Thienyl-2-(1H)-chinazolonen, 6,7-Dialkoxychinazolinen ( US 3,800,039 ), Aryl- und Heteroarylchinazolin ( US 5,721,237 , US 5,714,493 , US 5,710,158 und WO 95/15758 ), 4-Anilionchinazolin-Verbindungen ( US 4,464,375 ) und 4-Thienyl-2-(1H)-chinazolonen ( US 3,551,427 ) durchgeführt werden.
Somit betrifft die Erfindung vorzugsweise ein wie oben definiertes Screening-Verfahren, wobei die Verbindungen Folgendes sind:

– Pyrimidin-Derivate, insbesondere N-Phenyl-2-pyrimidinamin-Derivate,
– Indolinon-Derivate, insbesondere pyrrolsubstituierte Indolinone,
– monocyclische, bicyclische Aryl- und Heteroarylverbindungen
– oder Chinazolin-Derivate.

Der Nutzen der Erfindung wird sich weiterhin aus der ausführlichen Beschreibung molekularer Mechanismen der Signaltransduktion über c-kit und mutiertes c-kit, die mit zahlreichen Erkrankungen in Verbindung gebracht werden, ergeben.
DURCH AKTIVIERUNG VON NORMALEM C-KIT INDUZIERTE SIGNALTRANSDUKTION.
SCF ist ein essentieller Wachstumsfaktor in der Hämatopoese, da er mit nahezu allen hämatopoetischen Wachstumsfaktoren, außer M-CSF, synergisiert, um Hämatopoese in vitro zu induzieren [17]. Dieser Faktor wird von Knochenmarkstromazellen produziert und wirkt über Interaktion mit seinem Rezeptor, c-kit [18]. Wie zuvor bemerkt, ist der c-kit-Rezeptor ein Glykoprotein von 145 kDa und gehört zu der Typ-III-Tyrosinkinase-Unterfamilie, die durch die Gegenwart von fünf Ig-ähnlichen Domänen im extrazellulären Teil des Moleküls und durch eine Interkinasesequenz charakterisiert ist, die die intrazytoplasmatische Domäne in die Adenosintriphosphat-Bindungsdomäne (ATP-Bindungsdomäne) und die Phosphotransferase-Domäne aufteilt [1]. C-kit wird von CFU-GEMM, BFU-E und von Vorläuferzellen und reifen Zellen des Mastzellstammbaums stark exprimiert [19].
Die Ligandenbindung an c-kit resultiert in der Aktivierung der katalytischen Funktion, was zu Autophosphorylierung oder Tyrosinresten der zytoplasmatischen Domäne führt. Diese Phosphotyrosinreste werden zu Docking-Stellen für verschiedene zytoplasmatische Signalmoleküle, die die SH2-Domäne enthalten. C-kit aktiviert kanonische Signaltransduktionswege, die vielen Wachstumfaktorrezeptoren gemein sind, einschließlich denen, die von PI3-Kinase, ras und JAK2 abhängen. Moleküle, von denen bekannt ist, dass sie sich in vivo oder in vitro mit c-kit verbinden, beinhalten eine p85-Untereinheit von PI3-Kinase, mehrere Src-Familienmitglieder, Lyn und Fyn, Vav, Grb2, SHP-1, SHP-2, PKC, MATK (CHK) und Socs1, während es abweichende Daten in Bezug auf PLC-⌷, GTPase-aktivierendes Protein von ras (CAP) und JAK2 gibt. Weitere Moleküle werden als Reaktion auf die c-kit-Aktivierung aktiviert oder phosphoryliert: Shc, Tec, Vav-GDP/GTP-Austauschfaktor, raf-1, MAPK, Akt, CRKL, p120 Cbl und Doc. Neue Studien, die an verschiedenen Zellsystemen vorgenommen wurden, haben abweichende Ergebnisse in Bezug auf die Substrate, die sich mit c-kit verbinden und von c-kit phosphoryliert werden, ergeben. Diese Abweichungen könnten entweder Unterschiede der Versuchsverfahren oder funktionell relevante Variationen der Substratexpressionsprofile einzelner Zelltypen widerspiegeln, die die Basis unterschiedlicher Signale und zelltypspezifischer Antworten, die von demselben Liganden-/Rezeptorsystem vermittelt werden, sein könnten. Aus diesen Gründen ziehen wir vor, die Daten zu beschreiben, die in Bezug auf c-kit-Signalisierung in verschiedenen zellulären Zusammenhängen erhalten werden.
Der erste Signalisierungsinitiator ist die ligandeninduzierte Dimerisation von c-kit, die die intrinsische Tyrosinkinaseaktivität von c-kit induziert, was in der Transphosphorylierung bei kritischen Tyrosinresten resultiert [10]. Darüber hinaus scheint c-kit als Reaktion auf die Ligandenstimulierung an Serinresten von PKC phosphoryliert zu werden, was die c-kit-Autophosphorylierung inhibiert [20].
Eine der effektivsten Assoziation mit c-kit, die in verschiedenen Zelltypen beobachtet wurde, wird von der SH2-Domäne der p85-Untereinheit von PI3-Kinase [21, 22] mittels des phosphorylierten Tyrosinrests 719 von murinem c-kit oder Tyrosin 721 von menschlichem c-kit [23] zusammengezogen.

Die c-kit-Signalisierung wurde in menschlichen hämatopoetischen Zellen studiert, vor allem in MO7e und CMK, zwei Knochenmarkriesenzelllinien (Tabelle 1 unten). Tabelle 1: Mit dem intrazellulären Abschnitt des menschlichen c-kit interagierende und/oder als Reaktion auf SCF aktivierte Moleküle.

Moleküle	Menschliche Zellen	Referenzen
Akt	293, U2OS, BHX2I, HeLa	[82]
c-Cbl	MO7e, TF-1	[79, 80]
CRKL	MO7e	[81]
Doc	MO7e	[86]
p125 Fak	TF-1	[94]
Fyn	MO7e	[127]
Grap	MO7e, TF-1, K562	[78]
Jak2	MO7e, TF-1	[87, 88]

Lyn	MO7e, normale Vorläuferzellen	[128]
MAPK	melano 501 mel	[93]
MATK (CHK)	CMK	[84, 127]
PI3-K	293, U2OS, BHX21, HeLa	[82, 91]
PLC-⌷	MO7e	[99]
Raf1	MO7e	[77]
Ras	MO7e	[77]
SHP-1	MO7e	[97]
SHP2 (Syp)	MO7e	[77]
Tec	MO7e	[83]
Vav	MO7e, TF-1	[85]

In diesen Zellen induziert SCF die Aktivierung und/oder Rekrutierung von wichtigen Kinasen wie PI3-Kinase, Src-Kinasen (Fyn und Lyn) und JAK2 und verschiedenen Adaptermolekülen, Grb2, Grap, Vav, CRKL, über ihre SH2-Domäne. Diese Ereignisse resultieren in der Bildung verschiedener molekularer Assoziationen über SH2-, SH3- oder PH-Domänen, die wiederum die Aktivierung verschiedener Wege starten. Von dem Ras-Weg wurde gezeigt, dass er als Reaktion auf SCF-Stimulierung aktiviert wird, was zu einer Interaktion zwischen Ras und Raf-1 führt, wodurch eine MAPKinase-Kaskade initiiert wird [24]. In der Tat interagiert Grap, ein Adaptermolekül, mit durch Liganden aktiviertem c-kit über seine SH2-Domäne und ist durch seine SH3-Domäne mit einem ras-Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor, mSos1, assoziiert, wodurch Signale vom Rezeptor und der zytoplasmatischen Tyrosinkinase mit dem ras-Signalweg gekoppelt werden [25]. Ein anderes Adaptermolekül, das mit Grap verwandt ist, Grb2, und das mit seiner SH2-Domäne mit einem phosphorylierten Tyrosinrest von c-kit interagiert, kann c-Cbl und Shc rekrutieren [26, 27]. Nach Aktivierung kann Kinase entweder die Rolle eines Adaptermoleküls wie PI3-Kinase, die mit c-Cbl und CRKL interagiert [28], oder die Rolle von Kinase wie PI3-Kinase, die Akt phosphoryliert [29], spielen. In wenigen Fällen wird die Interaktion und/oder Aktivierung ohne Verbindung mit einem beliebigen bekannten Signalweg beschrieben. Dies ist der Fall für Tec [30], MATK [31], Vav [32] und Doc [33]. In unerwarteter Weise wird der JAKSTAT-Weg während c-kit-Aktivierung schlecht beschrieben. JAK2, eine zytosolische Tyrosinkinase, die für die Signalisierung der Nicht-Tyrosinkinase-Cytokinrezeptor-Superfamilie wichtig ist, wurde als mit c-kit vor der Aktivierung durch Liganden assoziiert und an Tyrosinresten als Reaktion auf SCF phosphoryliert [34–36] oder nicht mit c-kit assoziiert [30] beschrieben. Darüber hinaus aktiviert SCF zytosolische Transkriptionsfaktoren wie STAT1 in der MO7e-Zelllinie [37].
Die c-kit-Signalisierung wurde ebenfalls in verschiedenen nicht-hämatopoetischen menschlichen Zelllinien untersucht. Blume-Jensen et al. demonstrierten, dass SCF die Aktivierung von Akt induzierte und die Phosphorylierung des Serinrests 136 von Bad auf eine PI3-Kinase-abhängige Art und Weise vermittelte [29]. An embryonalen Fibroblasten durchgeführte In-vitro-Versuche deuten darauf hin, dass PI3-Kinase und PLC-B um die Assoziation mit dem Tyrosinrest 721 von menschlichem c-kit konkurrieren, wobei p85/PI3-Kinase eine höhere Affinität zeigt [38]. In der Zelllinie H526 (kleinzelliges Lungenkarzinom, small cell lung carcinoma, SCLC) induzierte SCF die Aktivierung von Src-Kinase, Lck, und deren Interaktion mit der Juxtamembran-Domäne von c-kit [39]. In 501 mel, einer menschlichen Melanomzelllinie, beschrieben Hemesath et al., dass die SCF-Stimulierung in der Aktivierung von MAPK resultierte, die wiederum den Transkriptionsfaktor Microphtalmia (Mi) phosphorylierte, wodurch die Mi-Transaktion mittels Interaktion mit p300/CBP hochreguliert wurde [40].
Interessanterweise wurde eine Querverbindung zwischen c-kit- und Integrin-Signalwegen in der Zelllinie TF-1 beobachtet [94]. SCF induziert die Ausbreitung von an Fibronektin haftenden TF-1-Zellen und fördert die Tyrosinphosphorylierung von pp125 FAK in einer von der Dosis abhängigen Art und Weise im Vergleich zum Niveau der Tyrosinphosphorylierung von pp125 FAK in Abwesenheit von SCF. Diese Auswirkungen hängen von Wegen ab, die auf Worthmannin-, Integrinaktivierung empfindlich reagieren.
In Bezug auf die c-kit-Deaktivierung wurden zwei Hauptwege in unterschiedlichen zellulären Zusammenhängen beschrieben. In hämatopoetischen Zellen schließt ein Weg SHP-1, eine Tyrosinphosphatase, ein, die mit c-kit wahrscheinlich am phosphorylierten Tyrosinrest 569 interagiert, was den Tyrosinrest-Phosphorylierungszustand von c-kit herunterreguliert. [42–45]. Die Rolle der Phosphatase SHP-2 (Syp) ist weniger klar. Es wurde gezeigt, dass SHP-2 sich mit aktiviertem c-kit in der MO7e-Zelllinie über seine SH-2-Domäne verbindet, phosphoryliert wurde und mit Grb2 einen Komplex bildete [24]. Diese Verbindung mit Grb2 könnte zu einer ras/MAPKinase-Weg-Aktivierung und zu einer Zellproliferation führen. Im Gegensatz dazu wurde gezeigt, dass die SHP-2-Assoziation mit c-kit Y567F in BA/F3-Zellen, die c-kit exprimieren, erheblich reduziert ist. In diesem Fall wurde eine hyperproliferative Antwort auf SCF beobachtet, was nahe legt, dass SHP-2 die SCF-induzierte Proliferation herunterreguliert [45].
Die Aktivierung und die Deaktivierung von menschlichem c-kit wurden ebenfalls in Endothelzelle des Schweins (porcine endothelial cell, PAE) studiert (Tabelle 5). Die Aktivierung der PI3-Kinase-, PLC-⌷- und Raf/MAPKinase-Kaskade wurde als Reaktion auf SCF in PAE-Zellen, die mit menschlichem c-kit transfiziert wurden, beschrieben [46]. In diesen Zellen ist eine erste negative Rückkopplungsschleife der PI3-K-, PLD- und PKC-Weg, der zur Phosphorylierung an den Serinresten 741 und 746 von c-kit führt [47]. Ein zweiter Deaktivierungsweg ist die PI3-Kinase-induzierte PLD-Aktivierung und PtdCho-spezifische (PtdCho = Phosphatidylcholin) Phospholipase-D-Aktivierung, (PtdCho)-PLD, die Phosphatidsäure (PtdH) erzeugte, die zu Diacylglycerin (DAG) metabolisierte, einen Aktivator von PKC und einen Vorläufer von Arachidonsäure (D4Ach) [48]. Diese Verfasser zeigten außerdem, dass SCF die PLA2-Aktivierung induzierte, einen zweiten Weg, der D4Ach erzeugt.
In murinen, von Knochenmark stammenden Mastzellen (bone marrow-derived mast cells, BMMC) wurde demonstriert, dass SCF i) die PI3-Kinase-Aktivierung induziert, die wiederum den Rac-1- und Jnk-Weg stimuliert [49], und ii) die Bindung und Phosphorylierung der Src-Kinasen Fyn an Tyrosin 567 [49] und Lyn [50] induziert. In Rattenmastzellen, die aus der Peritonealhöhle isoliert wurde, haben Koike et al. gezeigt, dass SCF die PLD-Aktivierung und anschließende Freisetzung von D4Ach über den Tyrosinkinase-Weg und ohne Aktivierung des phosphoinositidspezifischen PLC-⌷ induzierte [51, 52]. In diesen Zellen haben Nagai et al. die Beteiligung von PI3-Kinase, Proteintyrosinkinase (PTK) und der leichten Kette der Myosinkinase an der SCF-induzierten Histaminfreisetzung gezeigt [53]. In Bezug auf die c-kit-Deaktivierung in Mauszellen besteht eine weitere Methode zum Verringern des SCF-Signals in der Heruntermodulation der c-kit-Expression. Yee et al. und Miyazawa et al. haben gezeigt, dass c-kit-Internalisierung und -Ubiquitinierung von einer intakten Kinaseaktivität von c-kit abhängt [54, 55]. In BMMC aktiviert c-kit PLC-⌷, was in der Hydrolyse von PI4,5-diP zu DAG und Inositol-1,4,5-triP resultiert, die die Mobilisierung von intrazellulärem Ca⁺⁺ induziert [56]. Dieser Calciumeinstrom scheint für die c-kit-Internalisierung wichtig zu sein. Darüber hinaus internalisiert der c-kit-Rezeptor in Abwesenheit von PI3-Kinase-Aktivierung, bleibt jedoch in der Nähe der Innenseite der Plasmamembran angeordnet. Von Interesse ist, dass die c-kit-Internalisierung komplett verhindert wird, wenn sowohl PI3-Kinase als auch Ca⁺⁺-Einstrom inhibiert werden [56]. Ein neuartiger Mediator der Herunterregulation von c-kit-abhängiger Mitogenese könnte Socs-1 (Suppressor der Cytokin-Signalisierung) sein [57]. SCF induziert die Synthese von Socs-1, das über seine SH2-Domäne an c-kit bindet. Der Mechanismus der Socs-1-Aktivität scheint dessen Interaktion mit Grb2 und dem negativ regulatorischen N-Terminus von Vav einzuschließen [58].
MIT C-KIT-MUTATIONEN ZUSAMMENHÄNGENDE MOLEKULARE DYSFUNKTIONEN
In Menschen vorgefundene c-kit-Mutationen wirken sich auf die Phosphotransferase-Domäne in der Nähe der Y823-Autophosphorylierungsstelle aus. Studien, die sich mit molekularen Dysfunktionen von c-kit-Mutanten befassen, offenbarten jedoch, dass Mutationen verschiedene Aspekte des c-kit-Stoffwechsels verändern: Dimerisation, Signalisierung, Enzymexpression und Internalisierung.
C-kit-Rezeptor-Dimerisation
Die c-kit-Rezeptor-Dimerisation ist ein Schlüsselereignis in der Signaltransduktion und findet vor der Tyrosinphosphorylierung statt. Ein Folgemodell der c-kit-Aktivierung wird von Blechman et al. vorgeschlagen [58]. Monovalente SCF-Bindung legt eine putative Rezeptorstelle frei, die die schnelle Dimerisation des Rezeptors erleichtert, die von der Bindung des zweiten Arms des dimeren SCF-Moleküls weiter stabilisiert wird. Die Ligandenbindungsstelle scheint auf die drei N-terminalen Ig-ähnlichen Domänen beschränkt zu sein und die Dimerbildung scheint von der vierten Ig-ähnlichen Domäne vermittelt zu werden [10, 58].
Folglich können Modifikationen von c-kit entweder die Dimerisations-Domäne oder die Transduktions-Domäne dieses Rezeptors verändern. Tsujimura et al. [59] und Kitayama et al. [60] haben eine Vernetzungsanalyse verschiedener c-kit-Rezeptoren, Wildtyp- und mutierte Varianten, durchgeführt, um zu ermitteln, ob das konstitutiv aktivierte c-kit in Abwesenheit von SCF zur Rezeptordimerisation führt oder nicht. Sie haben jeweils vier Formen von c-kit studiert: ckit^WT, c-kit^d ⁽ ^573-579 ⁾ (c-kit mit einer Deletion aus Codon 573 bis 579), c-kit^V559G oder c-kit^D814V, die in Ba/F3-Zellen eingeführt wurden. SCF induziert die Tyrosinphosphorylierung von c-kit^WT, das bei einem ungefähren Molekulargewicht von 330 kDa nachgewiesen wird, was einen Komplex darstellt, der vernetztes Homodimer von c-kit^WT und SCF enthält. Nach Behandlung mit SCF werden die phosphorylierten Formen von c-kit^d ⁽ ^573-579 ⁾ und c-kit^V559G mit einem Molekulargewicht von 330 kDa, wie bei c-kit^WT, nachgewiesen. In Abwesenheit von SCF wird eine Tyrosinphosphorylierung von c-kit^d ⁽ ^573-579 ⁾ und c-kit^V559G im Überfluss beobachtet und sie entspricht einem vernetzten Homodimer der c-kit-Mutante von 290 kDa. Im Gegensatz dazu ist konstitutiv phosphoryliertes c-kit^D814V in Abwesenheit von SCF als eine dimere Form von 290 kDa kaum nachweisbar, wohingegen ein 330 kDa, was einen vernetzten Komplex darstellt, enthaltendes Homodimer von c-kit^D814V und SCF nach Stimulierung mit SCF beobachtet wird. Diese Daten legen nahe, dass eine aktivierende Deletion, wie c-kit^d(573-579), oder eine aktivierende Mutation, wie das c-kit^V559G, die in der Juxtamembran-Domäne stattfinden, eine konstitutive Dimerisation von c-kit in Abwesenheit von SCF-Stimulierung induzieren können, wohingegen eine aktivierende Mutation an der katalytischen Kinase-Domäne (c-kit^D814V) eine konstitutive Aktivierung von c-kit ohne Dimerisation verursacht.
Dennoch haben Tsujimura et al. kontrastierende Daten hinsichtlich des Mechanismus der konstitutiven Aktivierung von c-kit^D814V oder c-kit^D814Y gemeldet [61]. In der Tat stellten sie fest, dass eine gekürzte Form dieses Variantenrezeptors ohne extrazelluläre Domäne konstitutiv aktiviert wurde und murinen IL-3-abhängigen Ba/F3-Zellen faktorunabhängiges Wachstum verleihen konnte, wohingegen eine äquivalente Kürzung von Wildtyp-c-kit nicht dazu fähig war, was nahe legt, dass die extrazelluläre Domäne nicht an der konstitutiven Aktivierung von c-kit^D814Y oder c-kit^D814V beteiligt ist. Darüber hinaus legten diese Verfasser Daten vor, die darauf hinweisen, dass c-kit^D814V möglicherweise als eine monomere Form nicht funktioniert. Sie beobachteten, dass das um die extrazelluläre Domäne gekürzte c-kit^D814V zusammen mit vollständigem Wildtyp-Rezeptor oder c-kit^W42, einem dominant-negativen Rezeptor, immunpräzipitierte. Diese Verfasser schlugen vor, dass die Selbstassoziierung von c-kit^D814Y oder c-kic-kit^D814V aus der Mutation selbst resultieren könnte, indem eine neuartige Rezeptorselbstassoziierungsdomäne erzeugt wurde.
Signalisierungsveränderungen
In Bezug auf c-kit^D814V haben Piao et al. [62] den Mechanismus der onkogenen Aktivierung durch diese Mutation in der murinen Mastzelllinie IC2 untersucht, die entweder c-kit^WT oder c-kit^D814Y exprimiert.
In dieser Zelllinie veränderte die Expression von c-kit^D814V die c-kit-Signalisierung im Vergleich zu c-kit^WT [62]. Die Mutation c-kit^D814V führte Veränderungen der Substraterkennung von c-kit ein, wie im Muster der Rezeptor-Autophosphorylierungsstellen, im Muster der tyrosinphosphorylierten Proteine und der Selektivität des mutierten Rezeptors für synthetische Peptidsubstrate beobachtet.
Dies ist im Hinblick auf die Tatsache relevant, dass diese Mutation einen Rest, der in der Rezeptortyrosinkinase-Familie (RTK) konserviert ist, zu einem Rest, der in der Nicht-Rezeptortyrosinkinase-Familie (NRTK), einschließlich c-Abl, konserviert ist, verändert. Diese Mutation könnte dann die Rezeptorkonformation verändern, um eine Interaktion mit einer Gruppe-I-SH2-Doqmäne, relevanten Substraten für NRTK, zu begünstigen [63, 64]. Ein neuartiges Substrat könnte das Protein von 130 kDa sein, das von diesen Verfassern entdeckt wurde. Darüber hinaus, angesichts der Tatsache, dass SHP-1 c-kit deaktiviert, könnte die Mutation c-kit^D814Y einen Weg der c-kit-Deaktivierung verändern, indem sie die Rate der SHP-1-Ub-vermittelten Proteolyse erhöht, da SHP-1 in c-kit^D814Y exprimierenden Zellen fehlt. Tatsächlich stabilisiert ein Peptidinhibitor des Proteolysewegs, LLnL, SHP-1 und verhindert dessen Abbau. Somit könnten zwei Hauptargumente die Ausdehnung von IC2/c-kit^D814Y-Zellen in Abwesenheit etwaiger Wachstumsfaktoren erklären: die konstitutive Kinaseaktivität der Mutante c-kit^D814Y und der gesteigerte Abbau von SHP-1. Was auch immer, die Verfasser haben keine Daten dargelegt, die nahe legen, dass die c-kit^D814V-Aktivierung im Vergleich zu der von c-kit^WT verlängert ist. Um die Tatsache darzulegen, dass die Mutation c-kit^D814Y die Fidelität der c-kit-Signalisierung verändern könnte, könnte man die Parallele zwischen dieser Mutation und der Mutation M918T von Ret, die in 95% der multiplen endokrinen Neoplasie vom Typ 2B (NEM 2B) vorgefunden wird, anmerken [65]. Ret ist ein weiterer Tyrosinkinaserezeptor, der zur PDGF-Rezeptor-Familie gehört, in der M918 stark konserviert ist [66, 67]. Interessanterweise gibt es in einer anderen Tyrosinkinaserezeptor-Familie ein Threonin an einem äquivalenten Codon, was nahe legt, dass die Mutation M918T die Veränderung der Substrataffinität oder Affinität für neues Substrat induziert.
Enzymatische Funktionen und c-kit-Mutationen
Die SHP-1-Expression ist in IC2/c-kit^WT- und IC2/c-kit^D814Y-Zellen unterschiedlich und dies ist auch der Fall für andere Proteine, wie MMCP-4 und MMCP-6, bei denen es sich um Proteasen handelt, die in den Körnchen von murinen Mastzellen vorliegen und in verschiedenen Stadien der Mastzellenreifung unterschiedlich exprimiert werden. In der Tat werden MMCP-6-Transkripte in IC2/c-kit^WT-Zellen in Gegenwart von exogenem SCF in geringem Niveau exprimiert; und dieses Niveau nimmt infolge der c-kit^D814Y-Expression zu. MMCP-4-Transkripte können in IC2/c-kit^WT-Zellen mittels RT-PCR nicht nachgewiesen werden, werden jedoch in IC2/c-kit^D814Y-Zellen reichlich exprimiert. Die zwischen der Wildtyp-Form und der Mutante beobachteten Unterschiede legen nahe, dass die Signale, die von c-kit^WT transduziert werden, das mit SCF und mit c-kit^D814Y stimuliert wurde, nicht äquivalent sind: Die Mutation c-kit^D814Y verändert nicht nur die Proliferation von Mastzellen, sondern auch deren Reifungsstadium.
Rezeptorinternalisierung und c-kit-Mutationen
Die Herunterregulation des Internalisierungssignals kann in der verlängerten Aktivierung von c-kit eine Rolle spielen, da von der Internalisierung bekannt ist, dass sie als ein Attenuationsmechanismus für Rezeptorsignalisierung dient. Tatsächlich zeigten Studien der Kinetik des Abbaus von c-kit-Rezeptor, dass das Oberflächen-c-kit^d ⁽ ^573-579 ⁾ ohne SCF kaum abnimmt, wohingegen das Oberflächen-c-kit^d(573-579), wenn FMA3-Zellen mit SCF inkubiert werden, beträchtlich abnimmt. Im Gegensatz dazu wird der aktivierte c-kit^D814V-Rezeptor kontinuierlich abgebaut, selbst in Abwesenheit von SCF [68]. Da Calciumstoffwechsel und PI3-Kinaseaktivität als Mediatoren der c-kit-Internalisierung beschrieben wurden [54–56], wird es interessant sein, diese Wege in Zellen zu studieren, die c-kit^d ⁽ ^573-579 ⁾, c-kit^V559G oder c-kit^D814V exprimieren.
Beispiel 1: Methodik/Versuchsansätze
Erster Schritt: Zellproliferation, um Moleküle zu selektieren, die das von der c-kit-Aktivierung induzierte Zellwachstum verlangsamen oder stoppen können. Hier wird SCF-aktiviertes c-kit verwendet.
Dann wird die Auswirkung dieser Moleküle mittels Biochemietechniken (Immunpräzipitationen und Western-Blots) analysiert, um so zu ermitteln, ob der Inhibitor direkt auf den Rezeptor c-kit oder auf andere Proteine, die Mediatoren von Kit-Signalen sind, wirkt. In einem zweiten Schritt wird ein Teilsatz identifizierter Moleküle in einem Zelltest an IL-3-abhängigen Zellen, die in Gegenwart von IL-3 kultiviert werden, selektiert. Moleküle, die nicht-toxisch sind, werden als potente spezifische c-kit-Inhibitoren zur Verwendung in der Therapie identifiziert.
Beispiel 2: Zellmodelle
Zwei Arten von Zelllinien, die Wildtyp- oder mutierte Formen von c-kit tragen, stehen zur Verfügung: Linien, die von Mastozytomen abgeleitet sind, und das Ba/F3-Zellmodell (Zellen, die von IL-3 abhängen). In den Ba/F3-Zellen beseitigt die Expression von c-kit die Abhängigkeit gegenüber IL-3. Dementsprechend wurde cDNA von Wildtyp- oder mutiertem murinem c-kit eingeführt und diese Zellen proliferieren entweder in Gegenwart von SCF im Fall von c-kit-Wildtyp oder in Abwesenheit eines beliebigen Wachstumsfaktors im Fall von aktiviertem mutiertem c-kit.
Herstellung von Zelllinien:

– Ba/F3-Kit: Ba/F3-Zellen, in die Kit-Gen, mutiert oder Wildtyp, eingeführt wurde. Sie proliferieren entweder in Gegenwart von Kit-Ligand (SCF) oder in Gegenwart von IL-3.

Juxtamembran-Mutationen

– Ba/F3-KitD27 (transfizierte Juxtamembran-Mutation – im Labor identifiziert)
– Ba/F3-KitG559 (transfizierte Juxtamembran-Mutation)
– FMA3 (Deletion 7aa. Juxtamembran in einem Mausmastozytom identifiziert)

Mutation in der Kinase-Domäne (Rest 814)

– IC2 (murine Mastzelllinie, die endogenes c-kit nicht exprimiert), die mit dem mutierten c-kit 814 transfiziert wurde
– P815 (murine Mastozytomzelllinie, die ein endogenes c-kit exprimiert, das die Mutation 814V trägt).

Beispiel 3: Studie von STI 571 an c-kit-Wildtyp und mutiertem aktiviertem c-kit.
Der Inhibitor des Onkogens BCR-ABL, STI 571, ist auch ein Inhibitor des PDGF-Rezeptors, der mit c-kit verwandt ist. Dementsprechend wurde der STI 571 an Kit getestet.
2.1 Auswirkung von STI 571 auf die von c-kit induzierte Zellproliferation (1).
Für diese Versuche wird IL-3 als eine Kontrolle verwendet, um toxische Dosen des Inhibitors zu ermitteln. Bei Dosen, die unter dem Toxizitätsniveau liegen (< 10 μM), stellten wir fest, dass STI 571 die Proliferation in Abhängigkeit von c-kit im Fall von c-kit-Wildtyp und Juxtamembran-Mutationen (⌷27, FMA3) vollständig inhibiert, jedoch nicht die Proliferation von Zellen, die die Mutation 814 (IC2 und P815) tragen.
2.2 Auswirkung von STI 571 auf aktiviertes c-kit (2)
Der erste Schritt der c-kit-Aktivierung besteht in der Rezeptorphosphorylierung an Tyrosinresten. Folglich ist der Phosphorylierungszustand ein Maßstab der Rezeptoraktivierung. Indem spezifische Antikörper verwendet wurden, wurde c-kit mittels Immunpräzipitation und c-kit-Phosphorylierung unter Anwendung herkömmlicher Vorgehensweisen isoliert. Der STI 571 reduziert die Phosphorylierung von c-kit-Wildtyp und c-kit, das Juxtamembran-Mutationen trägt, erheblich. Im Gegensatz dazu wird die Phosphorylierung der c-kit-Mutante 814 vom STI 571 nicht reduziert.
Fazit: STI 571 ist ein neuer Inhibitor, der bei c-kit-Wildtyp und Juxtamembran-aktivierenden Mutationen von Kit sehr wirksam ist, die c-kit-Mutante 814 jedoch nicht inhibiert.
Beispiel 4: Studie von 37 neuen potentiellen c-kit-Inhibitoren.
Wir haben 37 Verbindungen, bei denen es sich um Indolinon-Derivate handelt, in verschiedenen Zelllinien getestet und nacheinander gescreent, um interessante Inhibitoren zu selektieren.
Verfahren: Selektieren der Verbindungen, die wirksame c-kit-Inhibitoren sind (Tabelle 1)
Jede Verbindung wurde in einer hohen Dosis (10 μM) auf Zellen getestet, die Folgendes exprimieren:

– c-kit, das die Mutation 814 trägt
– SCF-aktivierter c-kit-Wildtyp
– in IL-3 kultivierte Kontrollzellen.

Zellen, die c-kit exprimieren, das eine der Juxtamembran-Mutationen (⌷27) trägt, wurden ebenfalls als Kontrolle verwendet.
Ergebnisse: 21 Verbindungen inhibieren die c-kit-Mutante 814: 6, 9, 10, 11, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 und 36.

– Manche Verbindungen haben schlechte Inhibitionsfähigkeiten bei SCF-aktiviertem c-kit: 7, 12, 13, 24, 25 und 27; diese Verbindungen werden dementsprechend ausgeschlossen. Die 21 Verbindungen oben werden als auch bei SCF-aktiviertem c-kit aktiv selektiert.
– 10 Verbindungen sind bei c-kit-Wildtyp aktiv, jedoch nicht bei mutiertem c-kit 814: 1, 2, 3, 4, 5, 8, 15, 22, 23 und 37 (sie wirken mutmaßlich nicht auf die Transphosphorylierungs-Domäne von c-kit).

Zweite Selektion: Selektion aus den 21 Verbindungen derjenigen, die in niedrige Dosen aktiv sind (3)
Die Auswirkung der 21 Inhibitoren wurden in abnehmenden Konzentrationen (10 – 10^–1 – 10^–2 μM) getestet, um Verbindungen zu offenbaren, die bei 1 μM die Proliferation der IC2-D814V-Linie inhibieren können, während sie die Antwort auf einen anderen Stimulus (IL-3, Toxizitätskontrolle) beibehält.
Neun Inhibitoren wurden aus den verbleibenden 21 selektiert, die interessante Proliferationsprofile aufweisen: 10, 11, 14, 16, 17, 18, 19, 31 und 35.
Dritte Selektion: Identifikation der wirksamsten Verbindungen (die spezifischsten der Mutation 814) (4)
Die neun selektierten Verbindungen wurden in geringeren Dosen getestet: zwischen 0,1 und 1 μM. In dieser Phase wurden die drei wirksamsten Verbindungen in niedrigeren Dosen selektiert (≤ 0,6 μM): 11, 14 und 35.

Verbindung Nr. 11 ist ein guter Kandidat für therapeutische Verwendungszwecke, da sie eine schwache Aktivität bei der IL-3-abhängigen Zelllinie zeigt, was darauf hinweist, dass sie weniger toxisch ist. TABELLE 2: Proliferationstest in Gegenwart von Verbindungen in einer Dosis von 10 μM

Verbindung Nr.	Ba/F3 Kit IL3	Ba/F3 Kit SCF	Ba/F3 ⌷27	IC2 DS814V
1	–	+	––	––
2	–	++	++	–
3	––	++	++	--
4	+/–	++	+/–	+/–
5	–	+	–	+/–
6	–	++	++	+/–
7	––	+/–	–	––
8	––	++	+	––
9	++	++	++	++
10	++	++	++	++
11	+	++	++	++
12	––	––	––	––
13	––	+/–	––	––
14	++	++	++	++
15	–	++	++	–
16	++	++	++	++
17	++	++	++	++
18	++	++	++	++
19	++	++	++	++
20	++	++	++	++
21	++	++	++	++
22	––	+	++	–
23	––	++	+	––
24	––	–	––	––
25	––	+/–	––	––
26	++	++	++	+
27	––	––	––	––
28	++	++	++	++
29	++	++	++	++
30	++	++	++	++
31	++	++	++	++
32	++	++	++	++
33	++	++	++	++
34	++	++	++	++
35	++	++	++	++
36	++	++	++	++
37	+/–	++	++	–

Tabelle gemäß CPM-Prozentanteil (CPM = Counts Per Minutes, Zahl pro Minute) aufgestellt, der nach Proliferation in Abwesenheit von Inhibitoren als 100% (% CPM > 80 = ––/50 <% CPM < 80 = –/20 <% CPM < 50 = +/5 <% CPM < 20 = +/% CPM < 5 = ++) erhalten wurde. Alle Versuche wurden dreimal durchgeführt.
1 zeigt einen Test der Spezifität im Vergleich zur Toxizität (kit D814 im Vergleich zu kit + IL3) in niedrigen Konzentrationen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Verbindung Nr. 11 in der Konzentration nicht-toxisch ist und dahingehend wirksam ist, SCF-aktiviertes und mutiertes aktiviertes c-kit zu inhibieren.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Screening-Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die selektive und potente Inhibitoren von c-kit sind, umfassend: a) das In-Kontakt-Bringen von (i) aktiviertem c-kit und (ii) wenigstens einer zu testenden Verbindung unter Bedingungen, welche die Ausbildung eines Komplexes der Komponenten (i) und (ii) ermöglichen, b) Selektieren von Verbindungen, die aktiviertes c-kit inhibieren, c) Testen und Selektieren einer Untergruppe von in Schritt b) identifizierten Verbindungen, welche unfähig sind, den Tod von IL-3-abhängigen Zellen, die in Gegenwart von IL-3 kultiviert werden, zu fördern.
Screening-Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das aktivierte c-kit ein, aktiviertes mutantes c-kit ist.
Screening-Verfahren gemäß Anspruch 2, weiterhin umfassend den Schritt: Testen und Selektieren einer Untergruppe von in Schritt b) identifizierten Verbindungen, die Inhibitoren von mutantem aktiviertem c-kit sind und die SCF-aktiviertes c-kit Wildtyp inhibieren können.
Screening-Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das aktivierte C-kit SCF-aktiviertes c-kit Wildtyp ist.
Screening-Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Verbindungen in Schritt a) in einer Konzentration über 10 μM getestet werden.
Screening-Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei IL-3 in dem Kulturmedium der IL-3-abhängigen Zellen In einer Konzentration von 0,5 bis 10 ng/ml vorliegt.
Screening-Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei IL-3 in dem Kulturmedium der IL-3-abhängigen Zellen in einer Konzentration von 1 bis 5 ng/ml vorliegt.
Screening-Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 und 7, wobei die IL-3-abhängigen Zellen ausgewählt sind aus Mastzellen, transfizierten Mastzellen, BaF3 und IC-2.
Screening-Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das aktivierte mutante c-kit in Schritt a) wenigstens eine Mutation proximal zu Y823 aufweist, insbesondere zwischen den Aminosäuren 800 bis 850 von SEQ ID NO1, welche bei der c-kit Autophosphoqrylierung eine Rolle spielen, und es sich insbesondere um die Mutanten DS16V, D816Y, D816F und D820G handelt.
Screening-Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Ausmaß, in dem die Komponente (ii) aktiviertes c-kit inhibiert, in vitro oder ex vivo gemessen wird.
Screening-Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, weiterhin umfassend den Schritt: Testen und Selektieren von Verbindungen, die c-kit Wildtyp in Konzentrationen unter 1 μM inhibieren können.
Screening-Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das Ausmaß, in dem die Verbindungen c-kit Wildtyp inhibieren, in vitro oder ex vivo gemessen wird.
Screening-Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die Verbindungen potente, selektive und nicht-toxische Inhibitoren von c-kit Wildtyp sind.
Screening-Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Inhibitoren auf die Transphosphorylierungs-Domäne von c-kit Wildtyp wirken.
Screening-Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Inhibierung von mutantem aktiviertem c-kit und/oder c-kit Wildtyp anhand der Menge der c-kit-Phosphorylierung gemessen wird.
Screening-Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Identifizierung potenter und selektiver Verbindungen, die Inhibitoren von c-kit sind, umfassend: a) das Durchführen eines Proliferations-Assays mit Zellen, die ein mutantes c-kit (beispielsweise in der Transphosphorylase-Domäne) exprimieren, wobei die Mutante ein permanent aktiviertes c-kit ist, mit einer Anzahl verschiedener Testverbindungen zur Identifizierung einer Untergruppe von Kandidat-Verbindungen, die auf aktiviertes c-kit abzielen und jeweils einen IC50-Wert < 10 μM aufweisen, durch Messen des Zelltod-Ausmaßes, b) Durchführen eines Proliferations-Assays mit Zellen, die c-kit Wildtyp exprimieren, mit der Untergruppe der in Schritt a) identifizierten Kandidat-Verbindungen, wobei die Zellen IL-3-abhängige Zellen sind, die in Gegenwart von IL-3 kultiviert werden, zur Identifizierung einer Untergruppe von Kandidat-Verbindungen, die spezifisch auf c-kit abzielen, c) Durchführen eines Proliferations-Assays mit Zellen, die c-kit exprimieren, mit der Untergruppe der in Schritt b) identifizierten Kandidat-Verbindungen und Selektieren einer Untergruppe von Kandidat-Verbindungen, die auf c-kit-Wildtyp abzielen und jeweils einen IC50- Wert < 10 μM, bevorzugt einen IC50 < 1 μM, aufweisen, durch Messen des Zelltod-Ausmaßes.
Screening-Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei das Zelltod-Ausmaß durch 3H-Thymidin-Einbau, das Trypan-Blau-Ausschlussverfahren oder Fließzytometrie mit Propidiumiodid gemessen wird.
Screening-Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die Verbindungen Tyrosinkinase-Inhibitoren sind.
Screening-Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Verbindungen ausgewählt sind aus Indolinon, Pyrimidin-Derivaten, Pyrrolopyrimidin-Derivaten, Quinazolin-Derivaten, Quinoxalin-Derivaten, Pyrazol-Derivaten, bis monocyclischen, bicyclischen oder heterocyclischen Arylverbindungen, Vinylen-Azaindol-Derivaten und Pyridyl-Quinolon-Derivaten, Styrylverbindungen, Styryl-substituierten Pyridyl-Verbindungen, Seleoindolen, Seleniden, tricyclischen Polyhydroxyl-Verbindungen und Benzylphosphonsäure-Verbindungen.
Screening-Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Verbindungen Pyrimidin-Derivate, insbesondere N-Phenyl-2-pyrimidin-amin-Derivate, sind.
Screening-Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Verbindungen Indolinon-Derivate, insbesondere Pyrrolsubstituierte Indolinone, sind.
Screening-Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Verbindungen monocyclische, bicyclische Aryl- und Heteroaryl-Verbindungen sind.
Screening-Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Verbindungen Quinazolin-Derivate sind.