JP2002526775A - ＧＤＮＦについての新規Ｒｅｔ非依存性シグナリング経路 - Google Patents
ＧＤＮＦについての新規Ｒｅｔ非依存性シグナリング経路Info
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Abstract
(57)【要約】
〔Ｃａ2+〕i 上昇、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２およびＣＲＥＢリン酸化をもたらすＧＰＩ固定非依存性細胞内シグナリングのアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニング、およびＳｒｃファミリーキナーゼ活性化のための方法、ならびにかかるシグナリングのアゴニスト／アンタゴニストの投与を含む治療のための方法を記載する。
Description
【０００１】 関連出願との関係 本出願は、引用することによりすべてが本明細書に編入される１９９８年１０
月１日付けの米国仮出願第６０／１０２，６４７号について、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．
§１１９（ｅ）に従って優先権を主張する。 発明の分野 本発明は、Ｒｅｔ−非依存性細胞内シグナリング(signaling) のアゴニストお
よびアンタゴニストに対するスクリーニング方法に関する。 発明の背景 グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）（リンら(Lin et al., 1993)）、
ニュルツリン(neurturin) （ＮＴＮ）（コッツバウアーら(Kotzbauer et al., 1
996)）, ペルセフィン(persephin) （ＰＮＰ）（ミルブラントら(Milbrandt et
al., 1998)）および最近発見されたアルテミン(artemin) （ＡＲＴ）（バローら
(Baloh et al., 1998)）は、ＴＧＦ−βファミリー関連神経栄養因子タンパク質
の群を形成する。一次ニューロンカルチャー内ならびに病変動物モデル内の研究
は、ＧＤＮＦが胚の中脳ドーパミン作動性ニューロン（ベックら(Beck et al.,
1995) 、リンら(Lin et al., 1993)、トマクら(Tomac et al., 1995)）、脊髄運
動ニューロン（ヘンダーソンら(Henderson et al., 1994)、オッペンハイムら(O
ppenheim et al., 1995)、ヤンら(Yan et al., 1995)）、青斑ノルアドレナリン
作動性ニューロン（アレナスら(Arenas et al., 1995) ）、および末梢感覚、交
感神経、副交感神経ニューロンの副次集団（ブジ−ベロら(Buj-Bello et al., 1
995)、トルップら(Trupp et al., 1995)；アイラクシネンら(Airaksinen et al.
, 1999) およびサルマおよびサリオラ(Saarma & Sariola)による概説）の生存因
子である証拠を提供した。従って、ＧＤＮＦの神経栄養活性のパターンは、パー
キンソン病、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患および数種のその他の神経
変性疾患の治療への可能な使用に対して有望である。ＧＤＮＦファミリーの生物
学的な重要性は、一次感覚、交感神経および運動ニューロン中での欠損を示すＧ
ＤＮＦヌルマウスの表現型により証明される。これらのマウスは、腎臓および腸
神経系の大部分の発育も不良で、死産となる（ムアら(Moore et al., 1996)、ピ
シェルら(Pichel et al., 1996) 、サンチェスら(Sanchez et al., 1996)）。
月１日付けの米国仮出願第６０／１０２，６４７号について、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．
§１１９（ｅ）に従って優先権を主張する。 発明の分野 本発明は、Ｒｅｔ−非依存性細胞内シグナリング(signaling) のアゴニストお
よびアンタゴニストに対するスクリーニング方法に関する。 発明の背景 グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）（リンら(Lin et al., 1993)）、
ニュルツリン(neurturin) （ＮＴＮ）（コッツバウアーら(Kotzbauer et al., 1
996)）, ペルセフィン(persephin) （ＰＮＰ）（ミルブラントら(Milbrandt et
al., 1998)）および最近発見されたアルテミン(artemin) （ＡＲＴ）（バローら
(Baloh et al., 1998)）は、ＴＧＦ−βファミリー関連神経栄養因子タンパク質
の群を形成する。一次ニューロンカルチャー内ならびに病変動物モデル内の研究
は、ＧＤＮＦが胚の中脳ドーパミン作動性ニューロン（ベックら(Beck et al.,
1995) 、リンら(Lin et al., 1993)、トマクら(Tomac et al., 1995)）、脊髄運
動ニューロン（ヘンダーソンら(Henderson et al., 1994)、オッペンハイムら(O
ppenheim et al., 1995)、ヤンら(Yan et al., 1995)）、青斑ノルアドレナリン
作動性ニューロン（アレナスら(Arenas et al., 1995) ）、および末梢感覚、交
感神経、副交感神経ニューロンの副次集団（ブジ−ベロら(Buj-Bello et al., 1
995)、トルップら(Trupp et al., 1995)；アイラクシネンら(Airaksinen et al.
, 1999) およびサルマおよびサリオラ(Saarma & Sariola)による概説）の生存因
子である証拠を提供した。従って、ＧＤＮＦの神経栄養活性のパターンは、パー
キンソン病、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患および数種のその他の神経
変性疾患の治療への可能な使用に対して有望である。ＧＤＮＦファミリーの生物
学的な重要性は、一次感覚、交感神経および運動ニューロン中での欠損を示すＧ
ＤＮＦヌルマウスの表現型により証明される。これらのマウスは、腎臓および腸
神経系の大部分の発育も不良で、死産となる（ムアら(Moore et al., 1996)、ピ
シェルら(Pichel et al., 1996) 、サンチェスら(Sanchez et al., 1996)）。
【０００２】 ＤＧＮＦ受容体ファミリーの可能な臨床的重要性にもかかわらず、ＧＤＮＦの
作用の細胞内機序はまだ理解されていない。一般にＧＤＮＦは、グリコシル−ホ
スファチジル−イノシトール（ＧＰＩ）−固定ＧＤＮＦファミリー受容体α１（
ＧＦＲα１）（チンら(Jing et al., 1996) 、トリーナーら(Treanor et al., 1
996)）および膜貫通受容体チロシンキナーゼ、Ｒｅｔ（ダーベックら(Durbec et
al., 1996) 、トルップら(Trupp et al., 1996)）を含む多成分受容体系を通じ
て作用すると考えられている。細胞内ドメインを欠くＧＲＦα１は、最初はＧＤ
ＮＦの結合部位として評価され、ＲｅｔへのＧＲＦα１／ＧＤＮＦ複合体のプレ
ゼンテーション(presentation)においてのみ役立つと考えられていた（チンら(J
ing et al., 1996) 、トリーナーら(Treanoret al., 1996) 、トルップら(Trupp
et al., 1997)）。Ｒｅｔ、ＧＤＮＦまたはＧＲＦα１を欠くラットは、すべて
同じ表現型を共有し、そして生まれて間もなく死亡するので、ＲｅｔおよびＧＰ
Ｉ固定ＧＲＦα１は、ＧＤＮＦのために必要な受容体であることは疑いない（カ
カラノら (Cacalano et al., 1998) 、エノモトら(Enomoto et al., 1998)）。
しかし、これらのＧＦＲαタンパク質が、Ｒｅｔが存在しない場合にＧＤＮＦフ
ァミリータンパク質の作用に対して細胞内シグナルを誘発できるかどうかは分か
っていない。
作用の細胞内機序はまだ理解されていない。一般にＧＤＮＦは、グリコシル−ホ
スファチジル−イノシトール（ＧＰＩ）−固定ＧＤＮＦファミリー受容体α１（
ＧＦＲα１）（チンら(Jing et al., 1996) 、トリーナーら(Treanor et al., 1
996)）および膜貫通受容体チロシンキナーゼ、Ｒｅｔ（ダーベックら(Durbec et
al., 1996) 、トルップら(Trupp et al., 1996)）を含む多成分受容体系を通じ
て作用すると考えられている。細胞内ドメインを欠くＧＲＦα１は、最初はＧＤ
ＮＦの結合部位として評価され、ＲｅｔへのＧＲＦα１／ＧＤＮＦ複合体のプレ
ゼンテーション(presentation)においてのみ役立つと考えられていた（チンら(J
ing et al., 1996) 、トリーナーら(Treanoret al., 1996) 、トルップら(Trupp
et al., 1997)）。Ｒｅｔ、ＧＤＮＦまたはＧＲＦα１を欠くラットは、すべて
同じ表現型を共有し、そして生まれて間もなく死亡するので、ＲｅｔおよびＧＰ
Ｉ固定ＧＲＦα１は、ＧＤＮＦのために必要な受容体であることは疑いない（カ
カラノら (Cacalano et al., 1998) 、エノモトら(Enomoto et al., 1998)）。
しかし、これらのＧＦＲαタンパク質が、Ｒｅｔが存在しない場合にＧＤＮＦフ
ァミリータンパク質の作用に対して細胞内シグナルを誘発できるかどうかは分か
っていない。
【０００３】 ＲｅｔおよびＧＲＦα１の発現パターンは、類似はしているが、多くの組織で
相違が現れ（トルップら(Trupp et al., 1997)、エノモトら(Enomoto et al., 1
998)、ゴールデンら(Golden et al., 1999) 、コカイアら(Kokaia et al., 1999
) ）、これはＧＲＦα受容体単独からまたはトランス作用型(in trans)のＲｅｔ
チロシンキナーゼと関連する個別のシグナリングの徴候であろう（ユら(Yu et a
l., 1998) ）。我々は最近、生体外および生体内で（イリコスキら(Ylikoski et
al., 1998) ）、例えばＧＲＦα１ ｍＲＮＡを発現するがＲｅｔ ｍＲＮＡは
欠損する出生直後の蝸牛聴覚ニューロンの生存をＧＤＮＦが促進することを示し
た。この発現パターンの相違は、ＧＲＦα受容体の活性化により開始される個別
のＲｅｔ非依存性シグナリングの徴候であろう。
相違が現れ（トルップら(Trupp et al., 1997)、エノモトら(Enomoto et al., 1
998)、ゴールデンら(Golden et al., 1999) 、コカイアら(Kokaia et al., 1999
) ）、これはＧＲＦα受容体単独からまたはトランス作用型(in trans)のＲｅｔ
チロシンキナーゼと関連する個別のシグナリングの徴候であろう（ユら(Yu et a
l., 1998) ）。我々は最近、生体外および生体内で（イリコスキら(Ylikoski et
al., 1998) ）、例えばＧＲＦα１ ｍＲＮＡを発現するがＲｅｔ ｍＲＮＡは
欠損する出生直後の蝸牛聴覚ニューロンの生存をＧＤＮＦが促進することを示し
た。この発現パターンの相違は、ＧＲＦα受容体の活性化により開始される個別
のＲｅｔ非依存性シグナリングの徴候であろう。
【０００４】 ＲＮ３３Ｂ細胞内のＧＤＮＦ依存性細胞内シグナリングの開始も記載されてい
る（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１８１９７、引用することにより本明細書に編入される
）。この中でＲＮ３３Ｂ細胞は、ＧＤＮＦの推定受容体４種を発現し、そのいず
れもｃ−Ｒｅｔではないと記載されている。２種の受容体は、その後ＧＲＦα１
およびＧＲＦα２であると決定された（それぞれＧＤＮＦＲαおよびＧＤＮＦＲ
βとして報告された、米国特許出願第０８／８６１，９９０号（引用することに
より本明細書に編入される））。しかし、Ｒｅｔ非依存性シグナリングの機序は
、既知でもなく記載もされていなかった。
る（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１８１９７、引用することにより本明細書に編入される
）。この中でＲＮ３３Ｂ細胞は、ＧＤＮＦの推定受容体４種を発現し、そのいず
れもｃ−Ｒｅｔではないと記載されている。２種の受容体は、その後ＧＲＦα１
およびＧＲＦα２であると決定された（それぞれＧＤＮＦＲαおよびＧＤＮＦＲ
βとして報告された、米国特許出願第０８／８６１，９９０号（引用することに
より本明細書に編入される））。しかし、Ｒｅｔ非依存性シグナリングの機序は
、既知でもなく記載もされていなかった。
【０００５】 ＧＰＩ固定膜タンパク質は、結論的に非依存性細胞内シグナリング機能を示す
と証明はされていないが、この可能性を示唆する証拠は増加している（シモンズ
およびイコネン(Simons and Ikonen, 1997) 、フリードリッヒソンおよびクルズ
カリア(Friedrichson and Kurzchalia, 1998) 、ハーダーら(Harder et al., 19
98) 、ヴァルマおよびメイヤー(Varma and Mayor, 1998) 、ヴァイオラら(Viola et al., 1999)）。例えば、免疫系内のＧＰＩ固定タンパク質は、細胞内シグナ
リングエベント、例えば小型Ｇ−タンパク質、Ｓｒｃタイプチロシンキナーゼの
活性化および細胞内遊離カルシウム濃度（〔Ｃａ2+〕i ）の上昇を媒介できるこ
とが示されている（グリーンら(Green et al., 1997)、ブラウンおよびロンドン
(Brown and London, 1998)、ヴァイオラら(Viola et al., 1999)）。しかし、Ｇ
ＰＩ固定非依存性シグナリングは、これまで神経系の細胞内では証明されていな
い。
と証明はされていないが、この可能性を示唆する証拠は増加している（シモンズ
およびイコネン(Simons and Ikonen, 1997) 、フリードリッヒソンおよびクルズ
カリア(Friedrichson and Kurzchalia, 1998) 、ハーダーら(Harder et al., 19
98) 、ヴァルマおよびメイヤー(Varma and Mayor, 1998) 、ヴァイオラら(Viola et al., 1999)）。例えば、免疫系内のＧＰＩ固定タンパク質は、細胞内シグナ
リングエベント、例えば小型Ｇ−タンパク質、Ｓｒｃタイプチロシンキナーゼの
活性化および細胞内遊離カルシウム濃度（〔Ｃａ2+〕i ）の上昇を媒介できるこ
とが示されている（グリーンら(Green et al., 1997)、ブラウンおよびロンドン
(Brown and London, 1998)、ヴァイオラら(Viola et al., 1999)）。しかし、Ｇ
ＰＩ固定非依存性シグナリングは、これまで神経系の細胞内では証明されていな
い。
【０００６】 従って、本発明の目標は、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングをさらに解明す
ることである。我々は、Ｒｅｔ非依存性シグナリングのアゴニストまたはアンタ
ゴニストである化合物を特定するための方法を開発する目的で、Ｒｅｔ−ヌル（
Ｒｅｔ-/- ）形質転換マウス（シュチャードら(Schuchardt et al., 1994) ）か
ら単離された後根ガングリオン（ＤＲＧ）ニューロン中およびその他のＲｅｔ陰
性細胞株中におけるＧＤＮＦ活性化シグナリングの役割に特定して取り組む。 発明の要約 本発明は、ＧＰＩ固定受容体媒介細胞内シグナリング、さらに詳しくはＧＦＲ
α１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアゴニストまたはアンタゴニ
ストである化合物に関してスクリーニングするための方法、およびこのような化
合物の使用を含んでなる神経細胞疾患を防止または治療するための方法を提供す
る。
ることである。我々は、Ｒｅｔ非依存性シグナリングのアゴニストまたはアンタ
ゴニストである化合物を特定するための方法を開発する目的で、Ｒｅｔ−ヌル（
Ｒｅｔ-/- ）形質転換マウス（シュチャードら(Schuchardt et al., 1994) ）か
ら単離された後根ガングリオン（ＤＲＧ）ニューロン中およびその他のＲｅｔ陰
性細胞株中におけるＧＤＮＦ活性化シグナリングの役割に特定して取り組む。 発明の要約 本発明は、ＧＰＩ固定受容体媒介細胞内シグナリング、さらに詳しくはＧＦＲ
α１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアゴニストまたはアンタゴニ
ストである化合物に関してスクリーニングするための方法、およびこのような化
合物の使用を含んでなる神経細胞疾患を防止または治療するための方法を提供す
る。
【０００７】 一つの態様では、本発明は、神経系細胞におけるＧＰＩ固定受容体によりもた
らされる細胞内シグナリングのアゴニストである化合物を特定するための方法で
あって、かかる受容体を有する神経系細胞を供試化合物と一緒にインキュベート
し、そして細胞内シグナリングが該細胞においてもたらされたかどうかを決定す
ることを含んでなる方法に関する。
らされる細胞内シグナリングのアゴニストである化合物を特定するための方法で
あって、かかる受容体を有する神経系細胞を供試化合物と一緒にインキュベート
し、そして細胞内シグナリングが該細胞においてもたらされたかどうかを決定す
ることを含んでなる方法に関する。
【０００８】 別の態様では、本発明は、神経系細胞内のＧＰＩ固定受容体によりもたらされ
る細胞内シグナリングのアンタゴニストである化合物を特定するための方法であ
って、かかる受容体を有する神経系細胞を供試化合物と一緒に、かかるシグナリ
ングのアゴニストの十分な量の存在下でインキュベートし、そして化合物が存在
しないで行った対照と比較して、かかるシグナリングが該細胞において減少して
いるかどうかを決定することを含んでなる方法に関する。
る細胞内シグナリングのアンタゴニストである化合物を特定するための方法であ
って、かかる受容体を有する神経系細胞を供試化合物と一緒に、かかるシグナリ
ングのアゴニストの十分な量の存在下でインキュベートし、そして化合物が存在
しないで行った対照と比較して、かかるシグナリングが該細胞において減少して
いるかどうかを決定することを含んでなる方法に関する。
【０００９】 その他の態様では、本発明は、ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグ
ナリングのアンタゴニストである化合物を特定するための方法であって、ＧＦＲ
α１受容体を発現し、Ｒｅｔは発現しない細胞を供試化合物と一緒に、かかるシ
グナルのアゴニストの十分な量の存在下でインキュベートし、そして化合物が存
在しないで行った対照と比較して、かかるシグナリングが該細胞において減少し
ているかどうかを決定することによる方法に関する。
ナリングのアンタゴニストである化合物を特定するための方法であって、ＧＦＲ
α１受容体を発現し、Ｒｅｔは発現しない細胞を供試化合物と一緒に、かかるシ
グナルのアゴニストの十分な量の存在下でインキュベートし、そして化合物が存
在しないで行った対照と比較して、かかるシグナリングが該細胞において減少し
ているかどうかを決定することによる方法に関する。
【００１０】 さらに別の態様では、本発明は、ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シ
グナリングのアゴニストである化合物を特定するための方法であって、ＧＦＲα
１受容体を発現し、Ｒｅｔは発現しない細胞を、ＧＦＲα１を結合するとあらか
じめ決定された化合物と一緒にインキュベートし、そして化合物が〔Ｃａ2+〕i
の増加を起こすかどうかを決定することによる方法に関する。
グナリングのアゴニストである化合物を特定するための方法であって、ＧＦＲα
１受容体を発現し、Ｒｅｔは発現しない細胞を、ＧＦＲα１を結合するとあらか
じめ決定された化合物と一緒にインキュベートし、そして化合物が〔Ｃａ2+〕i
の増加を起こすかどうかを決定することによる方法に関する。
【００１１】 その他の態様では、本発明は、ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグ
ナリングのアンタゴニストである化合物を特定するための方法であって、ＧＦＲ
α１受容体を発現し、Ｒｅｔは発現しない細胞を、供試化合物と一緒に、〔Ｃａ 2+ 〕i の増加に有効なＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングの
アゴニストの十分な量の存在下でインキュベートし、そして化合物と一緒にイン
キュベートしない対照と比較して、化合物と一緒にインキュベートした細胞が低
下した〔Ｃａ2+〕i レベルを有するかどうかを決定することによる方法に関する
。
ナリングのアンタゴニストである化合物を特定するための方法であって、ＧＦＲ
α１受容体を発現し、Ｒｅｔは発現しない細胞を、供試化合物と一緒に、〔Ｃａ 2+ 〕i の増加に有効なＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングの
アゴニストの十分な量の存在下でインキュベートし、そして化合物と一緒にイン
キュベートしない対照と比較して、化合物と一緒にインキュベートした細胞が低
下した〔Ｃａ2+〕i レベルを有するかどうかを決定することによる方法に関する
。
【００１２】 さらに別の態様では、本発明は、ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シ
グナリングのアゴニストである化合物を特定するための方法であって、ＧＦＲα
１受容体を発現し、Ｒｅｔは発現しない細胞を供試化合物と一緒にインキュベー
トし、細胞溶解物を調製し、溶解物を抗ＧＦＲα１抗体と一緒に免疫沈降して免
疫沈降物を形成し、そして、その免疫沈降物に基づいてキナーゼリン酸化を測定
するアッセイを行うことによる方法に関する。
グナリングのアゴニストである化合物を特定するための方法であって、ＧＦＲα
１受容体を発現し、Ｒｅｔは発現しない細胞を供試化合物と一緒にインキュベー
トし、細胞溶解物を調製し、溶解物を抗ＧＦＲα１抗体と一緒に免疫沈降して免
疫沈降物を形成し、そして、その免疫沈降物に基づいてキナーゼリン酸化を測定
するアッセイを行うことによる方法に関する。
【００１３】 その他の態様では、本発明は、ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグ
ナリングのアンタゴニストである化合物を特定するための方法であって、ＧＦＲ
α１受容体を発現し、Ｒｅｔは発現しない細胞を供試化合物と一緒に、上記のキ
ナーゼリン酸化をもたらすためにＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグ
ナリングのアゴニストの十分な量の存在下でインキュベートし、細胞溶解物を調
製し、溶解物を抗ＧＦＲα１抗体と一緒に免疫沈降させて免疫沈降物を形成し、
そして、その免疫沈降物に基づいてキナーゼリン酸化を測定するアッセイを行い
、次いで供試化合物が存在しないで行った対照の結果と比較することによる方法
に関する。
ナリングのアンタゴニストである化合物を特定するための方法であって、ＧＦＲ
α１受容体を発現し、Ｒｅｔは発現しない細胞を供試化合物と一緒に、上記のキ
ナーゼリン酸化をもたらすためにＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグ
ナリングのアゴニストの十分な量の存在下でインキュベートし、細胞溶解物を調
製し、溶解物を抗ＧＦＲα１抗体と一緒に免疫沈降させて免疫沈降物を形成し、
そして、その免疫沈降物に基づいてキナーゼリン酸化を測定するアッセイを行い
、次いで供試化合物が存在しないで行った対照の結果と比較することによる方法
に関する。
【００１４】 さらに他の態様では、本発明は、ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シ
グナリングのアゴニストである化合物を特定するための方法であって、ＧＰＩ固
定ＧＦＲα１受容体を発現し、Ｒｅｔは発現しない細胞を供試化合物と一緒にイ
ンキュベートし、そしてＳｒｃ−キナーゼが活性化されているかどうかを決定す
ることによる方法に関する。
グナリングのアゴニストである化合物を特定するための方法であって、ＧＰＩ固
定ＧＦＲα１受容体を発現し、Ｒｅｔは発現しない細胞を供試化合物と一緒にイ
ンキュベートし、そしてＳｒｃ−キナーゼが活性化されているかどうかを決定す
ることによる方法に関する。
【００１５】 さらに他の態様では、本発明は、ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シ
グナリングのアンタゴニストである化合物を特定するための方法であって、ＧＰ
Ｉ固定ＧＦＲα１受容体を発現し、Ｒｅｔは発現しない細胞を供試化合物および
Ｓｒｃキナーゼを活性化物するためにＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内
シグナリングのアゴニストの十分な量と一緒にインキュベートし、そして化合物
と一緒にインキュベートしなかった対照と比較して、化合物と一緒のインキュベ
ートがＳｒｃキナーゼの低い活性化をもたらしたかどうかを決定することによる
方法に関する。
グナリングのアンタゴニストである化合物を特定するための方法であって、ＧＰ
Ｉ固定ＧＦＲα１受容体を発現し、Ｒｅｔは発現しない細胞を供試化合物および
Ｓｒｃキナーゼを活性化物するためにＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内
シグナリングのアゴニストの十分な量と一緒にインキュベートし、そして化合物
と一緒にインキュベートしなかった対照と比較して、化合物と一緒のインキュベ
ートがＳｒｃキナーゼの低い活性化をもたらしたかどうかを決定することによる
方法に関する。
【００１６】 別の態様では、本発明は、ＧＰＩ固定細胞内シグナリングのアゴニストまたは
アンタゴニストのいずれかの有効量を投与することを含んでなる神経系細胞にお
いて細胞反応をもたらすための方法に関する。
アンタゴニストのいずれかの有効量を投与することを含んでなる神経系細胞にお
いて細胞反応をもたらすための方法に関する。
【００１７】 さらに別の態様では、本発明は、ＧＦＲα受容体によりもたらされる細胞内シ
グナリングのアゴニストを特定するための方法であって、かかる受容体を有する
細胞から調製した脂質ラフト(raft)を供試化合物と一緒にインキュベートし、そ
して、Ｓｒｃタイプキナーゼが活性化されているかどうかを決定することを含ん
でなる方法に関する。
グナリングのアゴニストを特定するための方法であって、かかる受容体を有する
細胞から調製した脂質ラフト(raft)を供試化合物と一緒にインキュベートし、そ
して、Ｓｒｃタイプキナーゼが活性化されているかどうかを決定することを含ん
でなる方法に関する。
【００１８】 さらに別の態様では、本発明は、ＧＦＲα受容体によりもたらされる細胞内シ
グナリングのアンタゴニストを特定するための方法であって、かかる受容体を有
する細胞から調製した脂質ラフトを、供試化合物と一緒に、Ｓｒｃタイプキナー
ゼを活性化するためにＧＦＲα１依存性シグナリングのアゴニストの十分な量の
存在下でインキュベートし、そして、供試化合物を用いないでインキュベートし
た対照と比較して、供試化合物の存在下でＳｒｃタイプキナーゼ活性化が低下し
たかどうかを決定することを含んでなる方法に関する。
グナリングのアンタゴニストを特定するための方法であって、かかる受容体を有
する細胞から調製した脂質ラフトを、供試化合物と一緒に、Ｓｒｃタイプキナー
ゼを活性化するためにＧＦＲα１依存性シグナリングのアゴニストの十分な量の
存在下でインキュベートし、そして、供試化合物を用いないでインキュベートし
た対照と比較して、供試化合物の存在下でＳｒｃタイプキナーゼ活性化が低下し
たかどうかを決定することを含んでなる方法に関する。
【００１９】 さらに別の態様では、本発明は、ＧＰＩ固定細胞内シグナリングのアゴニスト
またはアンタゴニストである薬剤の投与を含んでなる神経細胞疾患を治療するた
めの方法に関する。
またはアンタゴニストである薬剤の投与を含んでなる神経細胞疾患を治療するた
めの方法に関する。
【００２０】 別の態様では、本発明は、ＧＰＩ固定細胞内シグナリングのアゴニストおよび
／またはアンタゴニストである薬剤の投与を含んでなる神経細胞疾患を治療する
ための方法に関する。
／またはアンタゴニストである薬剤の投与を含んでなる神経細胞疾患を治療する
ための方法に関する。
【００２１】 本発明のこれらおよびその他の態様は、下記の詳細な説明からさらに明らかと
なるであろう。
なるであろう。
【００２２】
ますます増加する証拠が、脂質ラフトと連合(associate) したＧＰＩ連結タン
パク質（サルジャコモ(Sargiacomo, 1993)、フラら(Fra et al., 1994)、カセイ
(Casey, 1995) 、シモンズおよびイコネン(Simons & Ikonen, 1997) 、ザビエル
ら(Xavier et al., 1998) ）が、細胞内シグナリングイベントを生体外でも生体
内でも媒介できることを示唆する（グリーンら(Green et al., 1997)、シモンズ
およびイコネン(Simons & Ikonen, 1997) 、メイヤーら(Mayor et al., 1998)）
。ＧＰＩ固定タンパク質のミクロドメインの存在は、最近、生きている細胞内で
証明された（ヴァルマおよびメイヤー(Varma & Mayor, 1998) 、フリードリッヒ
ソンおよびクルズカリア(Friedrichson and Kurzchalia, 1998) ）。上記のよう
に、ＧＦＲαタンパク質はＧＰＩ固定されている。
パク質（サルジャコモ(Sargiacomo, 1993)、フラら(Fra et al., 1994)、カセイ
(Casey, 1995) 、シモンズおよびイコネン(Simons & Ikonen, 1997) 、ザビエル
ら(Xavier et al., 1998) ）が、細胞内シグナリングイベントを生体外でも生体
内でも媒介できることを示唆する（グリーンら(Green et al., 1997)、シモンズ
およびイコネン(Simons & Ikonen, 1997) 、メイヤーら(Mayor et al., 1998)）
。ＧＰＩ固定タンパク質のミクロドメインの存在は、最近、生きている細胞内で
証明された（ヴァルマおよびメイヤー(Varma & Mayor, 1998) 、フリードリッヒ
ソンおよびクルズカリア(Friedrichson and Kurzchalia, 1998) ）。上記のよう
に、ＧＦＲαタンパク質はＧＰＩ固定されている。
【００２３】 われわれは、本明細書中で、ＧＤＮＦが、Ｒｅｔ非依存性、ＧＰＩ固定ＧＦＲ
α１媒介経路を通じて強力な細胞内シグナリングを誘発できることを開示する。
我々は、ＧＤＮＦ結合をすると、ＧＰＩ固定ＧＦＲα１は、Ｓｒｃファミリーキ
ナーゼの活性化に依存しそして長期持続〔Ｃａ2+〕i をもたらすＰＬＣγシグナ
リング経路の誘導を単独で誘発できることも開示する。我々はさらに、ＰＬＣγ
およびカルシウムシグナリングの活性化に加えて、ＧＤＮＦは、Ｒｅｔ-/- ＤＲ
Ｇニューロン中および種々のＲｅｔ陰性細胞株中でＲｅｔ非依存性Ｓｒｃキナー
ゼ媒介ＥＲＫ１／ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ）およびＣＲＥＢを活性化することも開示
する。
α１媒介経路を通じて強力な細胞内シグナリングを誘発できることを開示する。
我々は、ＧＤＮＦ結合をすると、ＧＰＩ固定ＧＦＲα１は、Ｓｒｃファミリーキ
ナーゼの活性化に依存しそして長期持続〔Ｃａ2+〕i をもたらすＰＬＣγシグナ
リング経路の誘導を単独で誘発できることも開示する。我々はさらに、ＰＬＣγ
およびカルシウムシグナリングの活性化に加えて、ＧＤＮＦは、Ｒｅｔ-/- ＤＲ
Ｇニューロン中および種々のＲｅｔ陰性細胞株中でＲｅｔ非依存性Ｓｒｃキナー
ゼ媒介ＥＲＫ１／ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ）およびＣＲＥＢを活性化することも開示
する。
【００２４】 我々は、さらに〔Ｃａ2+〕i 上昇およびＳｒｃファミリーキナーゼの活性化に
基づくＧＰＩ固定、細胞内シグナリングのアゴニストまたはアンタゴニストであ
る化合物に対するアッセイも記述する。我々は、ＭＡＰＫおよびＣＲＥＢのリン
酸化合物に基づくＧＰＩ固定細胞内シグナリングのアゴニストまたはアンタゴニ
ストである化合物を特定するための方法も開示する。
基づくＧＰＩ固定、細胞内シグナリングのアゴニストまたはアンタゴニストであ
る化合物に対するアッセイも記述する。我々は、ＭＡＰＫおよびＣＲＥＢのリン
酸化合物に基づくＧＰＩ固定細胞内シグナリングのアゴニストまたはアンタゴニ
ストである化合物を特定するための方法も開示する。
【００２５】 化合物がＧＦＲα１に結合するかどうかは、当該技術分野の熟練者により、例
えば米国特許出願第０８／８６１，９９０号（引用することにより本明細書に編
入する）中に記載のように、ＧＤＮＦの受容体を結合する化合物を特定する方法
を用いて、容易に決定できる。あるいは、バイアコア(Biacore) 装置（ファルマ
シア(Pharumacia)）が使用できる。Ｓｒｃキナーゼ活性は、チロシンリン酸化状
態またはこれには限定されないがｐ１３０Ｃａｓ（サカイら(Sakai et al., 199
7)）およびＦＡＫ（ポルテら(Polte et al., 1997)）を含む基質のキナーゼ活性
の観察により間接的に決定できる。ＭＡＰＫおよびＣＲＥＢ活性化を決定する方
法は、本明細書中に記載される。
えば米国特許出願第０８／８６１，９９０号（引用することにより本明細書に編
入する）中に記載のように、ＧＤＮＦの受容体を結合する化合物を特定する方法
を用いて、容易に決定できる。あるいは、バイアコア(Biacore) 装置（ファルマ
シア(Pharumacia)）が使用できる。Ｓｒｃキナーゼ活性は、チロシンリン酸化状
態またはこれには限定されないがｐ１３０Ｃａｓ（サカイら(Sakai et al., 199
7)）およびＦＡＫ（ポルテら(Polte et al., 1997)）を含む基質のキナーゼ活性
の観察により間接的に決定できる。ＭＡＰＫおよびＣＲＥＢ活性化を決定する方
法は、本明細書中に記載される。
【００２６】 ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性シグナリング経路の活性化は、Ｒｅｔ依存
性経路とは異なる細胞反応を刺激する。例えば、ニューロン生存、神経突起伸展
、神経伝達物質合成の増強、またはその他のＧＤＮＦに対する細胞反応が、他の
経路をしのぐ一つの経路により優先的に増強されるであろう。これらのシグナリ
ング機序の一つのアゴニストまたはアンタゴニストは、ＧＤＮＦ自体のものより
もさらに特異的な細胞反応をもたらし、そしてこれによりＧＤＮＦをしのぐ治療
的な利点を得るであろう。Ｒｅｔ依存性細胞内シグナリングのアゴニストおよび
アンタゴニストを特定する方法は、米国特許出願第０８／８６１，９９０号（引
用することにより本明細書に編入する）中に記載されている。両方のシグナリン
グ経路のアゴニスト、両方の経路のアンタゴニスト、一方の経路だけのアゴニス
トまたはアンタゴニスト、または一方の経路にはアゴニスト作用をするが他の経
路にはアンタゴニスト作用をする化合物の開発の方法も本明細書中に含まれる。
性経路とは異なる細胞反応を刺激する。例えば、ニューロン生存、神経突起伸展
、神経伝達物質合成の増強、またはその他のＧＤＮＦに対する細胞反応が、他の
経路をしのぐ一つの経路により優先的に増強されるであろう。これらのシグナリ
ング機序の一つのアゴニストまたはアンタゴニストは、ＧＤＮＦ自体のものより
もさらに特異的な細胞反応をもたらし、そしてこれによりＧＤＮＦをしのぐ治療
的な利点を得るであろう。Ｒｅｔ依存性細胞内シグナリングのアゴニストおよび
アンタゴニストを特定する方法は、米国特許出願第０８／８６１，９９０号（引
用することにより本明細書に編入する）中に記載されている。両方のシグナリン
グ経路のアゴニスト、両方の経路のアンタゴニスト、一方の経路だけのアゴニス
トまたはアンタゴニスト、または一方の経路にはアゴニスト作用をするが他の経
路にはアンタゴニスト作用をする化合物の開発の方法も本明細書中に含まれる。
【００２７】 ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性シグナリングは、特定のニューロン集団の
生存および機能を促進する。感覚聴毛細胞からのインパルスを受け取り、これら
を脳に伝達する聴覚ニューロンは、生体外および生体内の両方でＧＤＮＦに反応
する。ＧＤＮＦは、内耳のニューロンを保護することが示されている（テイら(T
ay et al., 1998)、ショジら(Shoji et al., 1998)、およびケイスリーら(Keith
ley et al., 1998) ）。ＧＦＲα１は、Ｒｅｔが存在しない場合に聴覚ニューロ
ン上に発現される。従って、Ｒｅｔ非依存性シグナリングがどのように作動し、
そしてのニューロンの集団が、受容体またはその後の細胞内シグナリングイベン
トにおけるＧＦＲα１のＧＤＮＦ二量体化を特異的に擬態する化合物によりどの
ように支持されるかを示唆する機序も本明細書中に記載する。
生存および機能を促進する。感覚聴毛細胞からのインパルスを受け取り、これら
を脳に伝達する聴覚ニューロンは、生体外および生体内の両方でＧＤＮＦに反応
する。ＧＤＮＦは、内耳のニューロンを保護することが示されている（テイら(T
ay et al., 1998)、ショジら(Shoji et al., 1998)、およびケイスリーら(Keith
ley et al., 1998) ）。ＧＦＲα１は、Ｒｅｔが存在しない場合に聴覚ニューロ
ン上に発現される。従って、Ｒｅｔ非依存性シグナリングがどのように作動し、
そしてのニューロンの集団が、受容体またはその後の細胞内シグナリングイベン
トにおけるＧＦＲα１のＧＤＮＦ二量体化を特異的に擬態する化合物によりどの
ように支持されるかを示唆する機序も本明細書中に記載する。
【００２８】 本明細書中に使用される「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、単数または
複数を示す。 本明細書中に使用される用語「効果」（もたらす(effect)）は、変更または変
化を意味する。効果は、積極的、例えばある種の物質を増加させるか、または消
極的、例えばアンタゴニスト的または阻害であることができる。
複数を示す。 本明細書中に使用される用語「効果」（もたらす(effect)）は、変更または変
化を意味する。効果は、積極的、例えばある種の物質を増加させるか、または消
極的、例えばアンタゴニスト的または阻害であることができる。
【００２９】 本明細書中に使用される用語「アゴニスト」は、本明細書中に記載する細胞内
シグナリング経路を刺激または正に影響するか、その上であらゆる他の化合物ま
たは組成物の活性を上昇または相乗作用を及ぼすことができる化合物または組成
物を呼ぶ。
シグナリング経路を刺激または正に影響するか、その上であらゆる他の化合物ま
たは組成物の活性を上昇または相乗作用を及ぼすことができる化合物または組成
物を呼ぶ。
【００３０】 本明細書中に使用される用語「アンタゴニスト」は、本明細書中に記載する細
胞内シグナリング経路を阻害、抑制、ブロックまたは負に影響することができる
化合物または組成物を呼ぶ。
胞内シグナリング経路を阻害、抑制、ブロックまたは負に影響することができる
化合物または組成物を呼ぶ。
【００３１】 本明細書中に使用される用語「十分な量」は、効果と呼ばれるものをもたらす
薬剤の量を呼ぶ。
薬剤の量を呼ぶ。
【００３２】 本明細書中に使用される用語「結合」は、リガンドとその受容体との間の相互
作用を呼び、結合は、本明細書で開示するアッセイの条件下で該結合の検出を可
能とするために十分な力および十分な時間のものである。
作用を呼び、結合は、本明細書で開示するアッセイの条件下で該結合の検出を可
能とするために十分な力および十分な時間のものである。
【００３３】 数値に関連する用語「約」は、数値の±１０％、さらに好ましくは±５％、最
も好ましくは±２％を意味する。
も好ましくは±２％を意味する。
【００３４】 用語「投与」は、経口、舌下、経皮、非経口、皮下および局所を含むが、これ
に限定はされない。これらの投与経路に対する共通の要件は、効率的および容易
な送達である。
に限定はされない。これらの投与経路に対する共通の要件は、効率的および容易
な送達である。
【００３５】 本明細書中に使用される用語「有効量」は、予防および治療のための意図する
目的に望ましくない副作用、例えば毒性、炎症またはアレルギー反応を起こさな
いで達成するために必要な量を呼ぶ。個体ごとの所要量は変化するが、処方の有
効量の最適な範囲の決定は、当該技術分野の技術の範囲内である。ヒトの用量は
、動物研究から容易に外挿できる（カトクスら「レミントンの医薬科学」第１８
版、第２７章(Katocs et al., Chapter 27 In: Remington's Pharmaceutical Sc
iences, 18th Ed. Gennaro ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1990) ）。
一般に、当該技術分野の熟練者により調整できる処方の有効量を供給するために
必要な用量は、年齢、健康、身体状態、体重、被治療者の疾患および障害の種類
および重症度、治療の頻度、必要な場合には同時に行っている治療の性質、およ
びさらに希望する効果の性質および範囲を含む数種の因子によって変化する。（
ニースら「グッドマンとギルマンの治療の薬学的基礎」第９版、第３章(Nies et
al., Chapter 3 In: Goodman & Gilman's The Phamacological Basis of Thera
peutics, 9th Ed., Hardman et al., eds., McGraw-Hill, New York, NY, 1996)
）。
目的に望ましくない副作用、例えば毒性、炎症またはアレルギー反応を起こさな
いで達成するために必要な量を呼ぶ。個体ごとの所要量は変化するが、処方の有
効量の最適な範囲の決定は、当該技術分野の技術の範囲内である。ヒトの用量は
、動物研究から容易に外挿できる（カトクスら「レミントンの医薬科学」第１８
版、第２７章(Katocs et al., Chapter 27 In: Remington's Pharmaceutical Sc
iences, 18th Ed. Gennaro ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1990) ）。
一般に、当該技術分野の熟練者により調整できる処方の有効量を供給するために
必要な用量は、年齢、健康、身体状態、体重、被治療者の疾患および障害の種類
および重症度、治療の頻度、必要な場合には同時に行っている治療の性質、およ
びさらに希望する効果の性質および範囲を含む数種の因子によって変化する。（
ニースら「グッドマンとギルマンの治療の薬学的基礎」第９版、第３章(Nies et
al., Chapter 3 In: Goodman & Gilman's The Phamacological Basis of Thera
peutics, 9th Ed., Hardman et al., eds., McGraw-Hill, New York, NY, 1996)
）。
【００３６】 本明細書中に使用される用語「神経系細胞」は、ニューロン細胞、例えばニュ
ーロン、および非ニューロン細胞、例えばグリア細胞を含むが、これには限定さ
れない神経系内に存在またはこれから誘導されるすべての細胞を呼ぶ。
ーロン、および非ニューロン細胞、例えばグリア細胞を含むが、これには限定さ
れない神経系内に存在またはこれから誘導されるすべての細胞を呼ぶ。
【００３７】 本明細書中に使用される用語「形質転換された細胞」は、ＧＦＲα１を発現お
よび／またはＲｅｔを発現しない、当該技術分野では公知の方法を用いて変性さ
れた細胞を呼ぶ。
よび／またはＲｅｔを発現しない、当該技術分野では公知の方法を用いて変性さ
れた細胞を呼ぶ。
【００３８】 本明細書中に使用される用語「神経細胞疾患」は、遺伝子的または環境的な起
源を有し、先天的に存在または後天的に受けたすべての異常を起こしまたはこれ
らを含むあらゆるものから、そして感染、外傷、毒性、変性、炎症または新生物
などのあらゆる原因からのあらゆる神経系細胞の構造または機能内の障害を意味
する。これは中枢神経系の神経、軸索、または管の死も含み、神経系の１個また
はそれ以上の細胞内の神経変性的または退行過程をも含むものとする。
源を有し、先天的に存在または後天的に受けたすべての異常を起こしまたはこれ
らを含むあらゆるものから、そして感染、外傷、毒性、変性、炎症または新生物
などのあらゆる原因からのあらゆる神経系細胞の構造または機能内の障害を意味
する。これは中枢神経系の神経、軸索、または管の死も含み、神経系の１個また
はそれ以上の細胞内の神経変性的または退行過程をも含むものとする。
【００３９】 本明細書中に使用される用語「細胞反応」は、ニューロン生存、ニューロン可
塑性、神経突起伸展、細胞移動、または神経伝達物質合成および／または放出の
あらゆる促進または阻害におけるあらゆる変化を制限することなく呼ぶ。
塑性、神経突起伸展、細胞移動、または神経伝達物質合成および／または放出の
あらゆる促進または阻害におけるあらゆる変化を制限することなく呼ぶ。
【００４０】 本明細書中に使用される用語「脂質ラフト」は、細胞膜の液体二重層内の可動
性プラットフォーム内へ包み込まれたスフィンゴ脂質またはコレステロールの構
造体を呼び、そしてトリトン(Triton)Ｘ−１００または類似の界面活性剤を用い
る抽出後に残る界面活性剤に不溶性の糖脂質濃縮画分を含む。
性プラットフォーム内へ包み込まれたスフィンゴ脂質またはコレステロールの構
造体を呼び、そしてトリトン(Triton)Ｘ−１００または類似の界面活性剤を用い
る抽出後に残る界面活性剤に不溶性の糖脂質濃縮画分を含む。
【００４１】 受容体に関連して本明細書中に使用される用語「ＧＰＩ固定」または「ＧＰＩ
連結」は、ＧＰＩと会合される受容体を呼ぶ。
連結」は、ＧＰＩと会合される受容体を呼ぶ。
【００４２】 受容体に関連して本明細書中に使用される用語「非依存性細胞内シグナリング
」は、補助受容体(co-receptor) を必要としないかまたはその存在なしで、細胞
内シグナリングを誘発する受容体を呼ぶ。
」は、補助受容体(co-receptor) を必要としないかまたはその存在なしで、細胞
内シグナリングを誘発する受容体を呼ぶ。
【００４３】 我々は、意外にも、Ｒｅｔ-/- マウスから単離されたＤＲＧニューロン内でＧ
ＤＮＦ（１０〜１００ｎｍ／ｍｌ）に応答して、長期継続〔Ｃａ2+〕i 上昇が得
られることを発見した。この現象の研究は、ＧＤＮＦ誘発〔Ｃａ2+〕i 上昇が、
名目的に遊離の細胞外Ｃａ2+溶液中で持続し、そしてＧＰＩ連結タンパク質の除
去、ＰＬＣγ阻害またはＩＰ3 感受性Ｃａ2+放出チャンネルのアンタゴニストで
ある低分子量ヘパリンの内部貯蔵(internal store)への細胞内投与のいずれかに
より有効にブロックできることを示した。従って、Ｒｅｔ-/- ＤＲＧニューロン
内で、ＧＤＮＦは、内部Ｃａ2+貯蔵からのＣａ2+の放出を多分ＰＬＣγ依存性の
Ｃａ2+放出経路を介して開始させる。しかし、我々は現在他のカルシウム放出機
序の存在を除外できない。不幸なことには、Ｕ−７３１２２は、ＰＬＣγのみの
阻害剤ではなく、そしてヘパリンはカルシウム放出チャンネルにおけるＩＰ3 結
合部位の競合的ブロック作用より他の効果も有するであろう。それにもかかわら
ず、本研究に使用する低分子量ヘパリン（ソーンら(Thorn et al., 1993)、メイ
ヤー・ツー・ヘリングドルフ(Meyer zu Heringdorf, 1998) 、タケイら(takei e
t al., 1998)および下記の参照文献）およびＵ−７３１２２（ブレットら(Boure
tte et al., 1997) 、ダフレトフら(Davletoc et al., 1998) 、スタムら(Stam
et al., 1998) ）の両方は、ＰＬＣγ依存性シグナリングの複雑な研究のために
最も広く使用されている薬学的ツールである。
ＤＮＦ（１０〜１００ｎｍ／ｍｌ）に応答して、長期継続〔Ｃａ2+〕i 上昇が得
られることを発見した。この現象の研究は、ＧＤＮＦ誘発〔Ｃａ2+〕i 上昇が、
名目的に遊離の細胞外Ｃａ2+溶液中で持続し、そしてＧＰＩ連結タンパク質の除
去、ＰＬＣγ阻害またはＩＰ3 感受性Ｃａ2+放出チャンネルのアンタゴニストで
ある低分子量ヘパリンの内部貯蔵(internal store)への細胞内投与のいずれかに
より有効にブロックできることを示した。従って、Ｒｅｔ-/- ＤＲＧニューロン
内で、ＧＤＮＦは、内部Ｃａ2+貯蔵からのＣａ2+の放出を多分ＰＬＣγ依存性の
Ｃａ2+放出経路を介して開始させる。しかし、我々は現在他のカルシウム放出機
序の存在を除外できない。不幸なことには、Ｕ−７３１２２は、ＰＬＣγのみの
阻害剤ではなく、そしてヘパリンはカルシウム放出チャンネルにおけるＩＰ3 結
合部位の競合的ブロック作用より他の効果も有するであろう。それにもかかわら
ず、本研究に使用する低分子量ヘパリン（ソーンら(Thorn et al., 1993)、メイ
ヤー・ツー・ヘリングドルフ(Meyer zu Heringdorf, 1998) 、タケイら(takei e
t al., 1998)および下記の参照文献）およびＵ−７３１２２（ブレットら(Boure
tte et al., 1997) 、ダフレトフら(Davletoc et al., 1998) 、スタムら(Stam
et al., 1998) ）の両方は、ＰＬＣγ依存性シグナリングの複雑な研究のために
最も広く使用されている薬学的ツールである。
【００４４】 Ｒｅｔ非依存性長期持続Ｃａ2+上昇の後期では、カルシウム放出活性化チャン
ネル（ＣＲＡＣ）を介するカルシウム移入は、細胞内Ｃａ2+貯蔵の再補充をバラ
ンスすることにより上昇した〔Ｃａ2+〕i の維持に関与しているであろう（シャ
レンバーグおよびキネット(Sharenberg and Kinet, 1998)）。〔Ｃａ2+〕i の持
続上昇は、遺伝子発現、神経細胞可塑性、神経突起伸展、およびニューロン生存
性の大きい改変を含みこれに限定はされない種々の細胞反応の長期の増強に導く
であろうし、そして数種だけを挙げれば学習能力、記憶、テンカン、および聴覚
失調などの領域に重要な役割を演ずるであろう。枯渇したカルシウム貯蔵の再充
填をめざす強力な容量的カルシウム移入は、ＤＲＧニューロン内に存在する（ウ
サチェフら(Usachev et al., 1999)）。
ネル（ＣＲＡＣ）を介するカルシウム移入は、細胞内Ｃａ2+貯蔵の再補充をバラ
ンスすることにより上昇した〔Ｃａ2+〕i の維持に関与しているであろう（シャ
レンバーグおよびキネット(Sharenberg and Kinet, 1998)）。〔Ｃａ2+〕i の持
続上昇は、遺伝子発現、神経細胞可塑性、神経突起伸展、およびニューロン生存
性の大きい改変を含みこれに限定はされない種々の細胞反応の長期の増強に導く
であろうし、そして数種だけを挙げれば学習能力、記憶、テンカン、および聴覚
失調などの領域に重要な役割を演ずるであろう。枯渇したカルシウム貯蔵の再充
填をめざす強力な容量的カルシウム移入は、ＤＲＧニューロン内に存在する（ウ
サチェフら(Usachev et al., 1999)）。
【００４５】 我々は、ヘパリンおよびＰＬＣγ感受性内部貯蔵からのカルシウム放出の開始
を介して、Ｒｅｔ含有野性型およびＧＦＲα２-/- ＤＲＧニューロン内の〔Ｃａ 2+ 〕i 上昇の異なるパターンをＧＤＮＦが刺激できることを開示する。Ｒｅｔチ
ロシンキナーゼは、ＰＬＣγ結合部位を介して強力なＰＬＣγ活性化を誘発する
ことが示されている（ボレロら(Borrello et al., 1996) ）。生体内ＧＤＮＦは
、ＧＦＲα１に優先的に結合し、ＮＴＮはＧＦＲα２に結合するという共通の見
解があるが、生体外で高濃度のＧＤＮＦはＧＦＲα２を活性化でき、そしてＮＴ
ＮはＧＦＲα１に結合できる（ブジ−ベロ(Buj-Bello, 1997) 、チンら(Jing et
al., 1997) 、クラインら(Klein et al., 1997)、スヴァントら(Suvanto et al
., 1997)、アイラクシネンら(Airaksinen et al., 1999) が総説）。ＧＤＮＦの
作用におけるＧＦＲα２の寄与を研究するために、我々は、ＧＦＲα２欠損マウ
スから単離されたＧＦＲα２陰性（ＧＦＲα２-/- ）ニューロン内で〔Ｃａ2+〕 i に対するＧＤＮＦの効果を研究した（ロッシら(Rossi et al., 1999)）。我々
は、ＧＤＮＦが野性型ＤＲＧニューロン内と同様にＧＦＲα２-/- 内の〔Ｃａ2+ 〕i 上昇の同じパターンを誘発するので、ＤＲＧニューロン中のＧＤＮＦ依存性
〔Ｃａ2+〕i 上昇は、ＧＦＲα１活性化に特異的に依存することを発見した。
を介して、Ｒｅｔ含有野性型およびＧＦＲα２-/- ＤＲＧニューロン内の〔Ｃａ 2+ 〕i 上昇の異なるパターンをＧＤＮＦが刺激できることを開示する。Ｒｅｔチ
ロシンキナーゼは、ＰＬＣγ結合部位を介して強力なＰＬＣγ活性化を誘発する
ことが示されている（ボレロら(Borrello et al., 1996) ）。生体内ＧＤＮＦは
、ＧＦＲα１に優先的に結合し、ＮＴＮはＧＦＲα２に結合するという共通の見
解があるが、生体外で高濃度のＧＤＮＦはＧＦＲα２を活性化でき、そしてＮＴ
ＮはＧＦＲα１に結合できる（ブジ−ベロ(Buj-Bello, 1997) 、チンら(Jing et
al., 1997) 、クラインら(Klein et al., 1997)、スヴァントら(Suvanto et al
., 1997)、アイラクシネンら(Airaksinen et al., 1999) が総説）。ＧＤＮＦの
作用におけるＧＦＲα２の寄与を研究するために、我々は、ＧＦＲα２欠損マウ
スから単離されたＧＦＲα２陰性（ＧＦＲα２-/- ）ニューロン内で〔Ｃａ2+〕 i に対するＧＤＮＦの効果を研究した（ロッシら(Rossi et al., 1999)）。我々
は、ＧＤＮＦが野性型ＤＲＧニューロン内と同様にＧＦＲα２-/- 内の〔Ｃａ2+ 〕i 上昇の同じパターンを誘発するので、ＤＲＧニューロン中のＧＤＮＦ依存性
〔Ｃａ2+〕i 上昇は、ＧＦＲα１活性化に特異的に依存することを発見した。
【００４６】 我々は、ニューロン内のＲｅｔ非依存性ＧＤＮＦ誘発細胞内シグナリングが、
Ｃａ2+上昇の種々のパターンの活性化よりもさらに広いことも開示する。ＧＤＮ
Ｆ誘発Ｃａ2+上昇に加えて、我々は、Ｒｅｔ-/- ＤＲＧニューロン内のＭＡＰＫ
およびＣＲＥＢの強力なＧＤＮＦ依存性一過性活性化を検出した。ＧＰＩ固定タ
ンパク質結合キナーゼ、殊にはＳｒｃタイプキナーゼは、ＰＬＣγ刺激、〔Ｃａ 2+ 〕i 上昇およびＭＡＰＫ活性化を誘発することが示されている（ブラウンおよ
びロンドン(Brown and Lonndon, 1998) 、ディキッチら(Dikic et al., 1996)、
フィンクベイナーおよびグリーンバーグ(Finkbeiner and Greenbergm 1998)、カ
ーレら(Khare et al., 1997)、ルトレルら(Lutrell et al., 1996, 1997)、トー
マスおよびブルッジェ(Thomas and Brugge, 1997) ）。実際、我々の実験で、低
用量の（４−アミノ−５−（４−メチルフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾ
ロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン（ＰＰ１）または（４−アミノ−５−（４−クロロ
フェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン（ＰＰ２）
（両方ともカルビオケム(Calbiochem)から）（強力で特異性のＳｒｃタイプキナ
ーゼの阻害剤）は、Ｒｅｔ陰性ＤＲＧニューロン中のＧＤＮＦ誘発〔Ｃａ2+〕i
上昇を可逆的にブロックし、ならびにＲｅｔ陰性細胞株中のＭＡＰＫのＧＤＮＦ
依存活性化を阻害する。従って、我々は、細胞内ドメインを欠損するＧＰＩ固定
ＧＦＲα１タンパク質が、それにもかかわらず、どのようにして膜の細胞質側で
ＳｒｃおよびＭＡＰキナーゼに結合および活性化できるかを研究しようとした。
この問題を解決するために、我々は、安定にＧＦＲα１ ｃＤＮＡを用いて移入
したＲｅｔ陰性細胞株、ＳＨＥＰ神経芽細胞腫細胞およびＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細
胞を使用した。
Ｃａ2+上昇の種々のパターンの活性化よりもさらに広いことも開示する。ＧＤＮ
Ｆ誘発Ｃａ2+上昇に加えて、我々は、Ｒｅｔ-/- ＤＲＧニューロン内のＭＡＰＫ
およびＣＲＥＢの強力なＧＤＮＦ依存性一過性活性化を検出した。ＧＰＩ固定タ
ンパク質結合キナーゼ、殊にはＳｒｃタイプキナーゼは、ＰＬＣγ刺激、〔Ｃａ 2+ 〕i 上昇およびＭＡＰＫ活性化を誘発することが示されている（ブラウンおよ
びロンドン(Brown and Lonndon, 1998) 、ディキッチら(Dikic et al., 1996)、
フィンクベイナーおよびグリーンバーグ(Finkbeiner and Greenbergm 1998)、カ
ーレら(Khare et al., 1997)、ルトレルら(Lutrell et al., 1996, 1997)、トー
マスおよびブルッジェ(Thomas and Brugge, 1997) ）。実際、我々の実験で、低
用量の（４−アミノ−５−（４−メチルフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾ
ロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン（ＰＰ１）または（４−アミノ−５−（４−クロロ
フェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン（ＰＰ２）
（両方ともカルビオケム(Calbiochem)から）（強力で特異性のＳｒｃタイプキナ
ーゼの阻害剤）は、Ｒｅｔ陰性ＤＲＧニューロン中のＧＤＮＦ誘発〔Ｃａ2+〕i
上昇を可逆的にブロックし、ならびにＲｅｔ陰性細胞株中のＭＡＰＫのＧＤＮＦ
依存活性化を阻害する。従って、我々は、細胞内ドメインを欠損するＧＰＩ固定
ＧＦＲα１タンパク質が、それにもかかわらず、どのようにして膜の細胞質側で
ＳｒｃおよびＭＡＰキナーゼに結合および活性化できるかを研究しようとした。
この問題を解決するために、我々は、安定にＧＦＲα１ ｃＤＮＡを用いて移入
したＲｅｔ陰性細胞株、ＳＨＥＰ神経芽細胞腫細胞およびＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細
胞を使用した。
【００４７】 最新の理解によると（シモンズおよびイコネン(Simons and Ikonen, 1997) 、
ブラウンおよびロンドン(Brown and London, 1998)）、ＳｒｃファミリーのＧＰ
Ｉ固定タンパク質、経膜チロシンキナーゼタンパク質、Ｇ−タンパク質およびア
シル化チロシンキナーゼは、すべて、液体二重層内の可動プラットフォーム内に
包み込まれたスフィンゴ脂質およびコレステロールの構造体であるいわゆる脂質
ラフトに会合できる（サルジャコモら(Sargiacomo et al., 1993) 、シモンズお
よびイコネン(Simons & Ikonen, 1997) 、ブラウンおよびロンドン(Brown and L
ondon, 1998)、ルットレルら(Luttrell et al., 1999) 、ヴァイオラら(Viola e
t al., 1999)）。かかる脂質ラフトがＤＲＧニューロン中に存在するかどうかは
知られていない。ＧＤＮＦファミリー受容体がラフト内に含まれているどうかも
知られていない。しかし、ミリスチル化またはパルミチル化連結によるラフトの
内部リーフレット内へのＳｒｃタイプキナーゼの会合は、すでに多数の細胞に関
して証明されている（ブラウンおよびロンドン(Brown and London, 1998)）。
ブラウンおよびロンドン(Brown and London, 1998)）、ＳｒｃファミリーのＧＰ
Ｉ固定タンパク質、経膜チロシンキナーゼタンパク質、Ｇ−タンパク質およびア
シル化チロシンキナーゼは、すべて、液体二重層内の可動プラットフォーム内に
包み込まれたスフィンゴ脂質およびコレステロールの構造体であるいわゆる脂質
ラフトに会合できる（サルジャコモら(Sargiacomo et al., 1993) 、シモンズお
よびイコネン(Simons & Ikonen, 1997) 、ブラウンおよびロンドン(Brown and L
ondon, 1998)、ルットレルら(Luttrell et al., 1999) 、ヴァイオラら(Viola e
t al., 1999)）。かかる脂質ラフトがＤＲＧニューロン中に存在するかどうかは
知られていない。ＧＤＮＦファミリー受容体がラフト内に含まれているどうかも
知られていない。しかし、ミリスチル化またはパルミチル化連結によるラフトの
内部リーフレット内へのＳｒｃタイプキナーゼの会合は、すでに多数の細胞に関
して証明されている（ブラウンおよびロンドン(Brown and London, 1998)）。
【００４８】 ＧＦＲα１がラフト内でＳｒｃタイプキナーゼと結合できることをテストする
ために、我々は、トリトンＸ−１００界面活性剤耐性膜画分内のＧＦＲα１抗体
を用いて、ＧＦＲα１タンパク質に多分結合したキナーゼの同時沈降を含む実験
を行った。トリトンＸ−１００抽出の後、不溶性の脂質およびタンパク質は、界
面活性剤不溶性糖脂質濃縮複合体（ＤＩＧ）または脂質ラフトの形で残る（シモ
ンズおよびイコネン(Simons & Ikonen, 1997) による総説）。我々は、本明細書
中で、Ｓｒｃタイプキナーゼが、Ｒｅｔ-/- ＤＲＧニューロンからのＤＩＧ中な
らびに種々のＲｅｔ陰性であるがしかしＧＦＲα１発現性の細胞株中でもＧＦＲ
α１と同時沈降できることを開示する。ＳＨＥＰ神経芽細胞腫細胞からのＤＩＧ
中で、ＧＤＮＦは、Ｓｒｃキナーゼの強力な一過性活性化を誘発した。これらの
所見は、Ｒｅｔ陰性ＤＲＧニューロンおよび神経芽細胞腫細胞中のＧＤＮＦによ
るＳｒｃタイプキナーゼの活性化が脂質ラフト内で起きるのではないかというこ
とを示す。
ために、我々は、トリトンＸ−１００界面活性剤耐性膜画分内のＧＦＲα１抗体
を用いて、ＧＦＲα１タンパク質に多分結合したキナーゼの同時沈降を含む実験
を行った。トリトンＸ−１００抽出の後、不溶性の脂質およびタンパク質は、界
面活性剤不溶性糖脂質濃縮複合体（ＤＩＧ）または脂質ラフトの形で残る（シモ
ンズおよびイコネン(Simons & Ikonen, 1997) による総説）。我々は、本明細書
中で、Ｓｒｃタイプキナーゼが、Ｒｅｔ-/- ＤＲＧニューロンからのＤＩＧ中な
らびに種々のＲｅｔ陰性であるがしかしＧＦＲα１発現性の細胞株中でもＧＦＲ
α１と同時沈降できることを開示する。ＳＨＥＰ神経芽細胞腫細胞からのＤＩＧ
中で、ＧＤＮＦは、Ｓｒｃキナーゼの強力な一過性活性化を誘発した。これらの
所見は、Ｒｅｔ陰性ＤＲＧニューロンおよび神経芽細胞腫細胞中のＧＤＮＦによ
るＳｒｃタイプキナーゼの活性化が脂質ラフト内で起きるのではないかというこ
とを示す。
【００４９】 野性型ＤＲＧニューロン内と同様に、ＧＤＮＦは、種々のＲｅｔ欠損細胞株中
のｐ４２／ｐ４４ＭＡＰＫおよびＣＲＥＢの強力な活性化を誘発した。この場合
にも、ＭＡＰＫのＧＤＮＦ誘発リン酸化は、選択的なＳｒｃキナーゼ阻害剤のＰ
Ｐ２の低用量で完全に消失した。抗リン酸化されたＭＡＰＫ抗体を用いる免疫染
色により、我々は、リン酸化されたＭＡＰＫがＳＨＥＰ細胞の核に有効にトラン
スロケートされ、そしてこのトランスロケーションはＰＰ２により調節されるこ
とを見いだした（ポテリアエフおよびティティエフスキー(Poteriaev and Titie
vsky) 未発表の観察）。従って、ＭＡＰＫのＧＤＮＦ誘発Ｒｅｔ非依存性リン酸
化は、ＳｒｃタイプキナーゼのＧＤＮＦ誘発活性化に完全に依存する。ニューロ
ン生存に関する研究が、ＭＡＰＫがＣＲＥＢを効果的にリン酸化することを示し
たので、Ｒｅｔ陰性ニューロンおよび細胞株中の活性化されたＭＡＰＫの下流標
的を明らかにすることは非常に重要であった。実際、我々は、ＣＲＥＢの著しい
ＧＤＮＦ依存性活性化を、Ｒｅｔ-/- ＤＲＧニューロン内およびＳＨＥＰ細胞内
の両方で検出した。従って、我々の結果は、ＧＤＮＦが、ＣＲＥＢリン酸化をＲ
ｅｔとは非依存性に活性化するがＲＮ３３Ｂ細胞内のＲａｓ／ＥＲＫ経路はしな
いことを見いだしたトルップら(Trupp et al., 1999)の結果とある程度は矛盾す
る。強力なＧＤＮＦ依存性ＥＲＫ１／ＥＲＫ２活性化の検出に加えて、我々は、
ＲＮ３３Ｂ細胞で行ったトルップらの研究（１９９９）と比較して、ＳＨＥＰ細
胞内のＣＲＥＢ活性化の著しく延長された動態を観察した。興味があることには
、我々は、ＣＲＥＢ関連タンパク質ＡＴＦ−１のＧＤＮＦ依存性の強い活性化を
Ｒｅｔ陰性ＳＨＥＰ細胞中では観察したが、しかしＲｅｔ-/- ＤＲＧニューロン
内では観察しなかった。従って、我々の結果とトルップら(Trupp et al., 1999)
の結果との間に認められた不一致は、細胞の異なるタイプの間の変動を反映して
いる可能性がある。
のｐ４２／ｐ４４ＭＡＰＫおよびＣＲＥＢの強力な活性化を誘発した。この場合
にも、ＭＡＰＫのＧＤＮＦ誘発リン酸化は、選択的なＳｒｃキナーゼ阻害剤のＰ
Ｐ２の低用量で完全に消失した。抗リン酸化されたＭＡＰＫ抗体を用いる免疫染
色により、我々は、リン酸化されたＭＡＰＫがＳＨＥＰ細胞の核に有効にトラン
スロケートされ、そしてこのトランスロケーションはＰＰ２により調節されるこ
とを見いだした（ポテリアエフおよびティティエフスキー(Poteriaev and Titie
vsky) 未発表の観察）。従って、ＭＡＰＫのＧＤＮＦ誘発Ｒｅｔ非依存性リン酸
化は、ＳｒｃタイプキナーゼのＧＤＮＦ誘発活性化に完全に依存する。ニューロ
ン生存に関する研究が、ＭＡＰＫがＣＲＥＢを効果的にリン酸化することを示し
たので、Ｒｅｔ陰性ニューロンおよび細胞株中の活性化されたＭＡＰＫの下流標
的を明らかにすることは非常に重要であった。実際、我々は、ＣＲＥＢの著しい
ＧＤＮＦ依存性活性化を、Ｒｅｔ-/- ＤＲＧニューロン内およびＳＨＥＰ細胞内
の両方で検出した。従って、我々の結果は、ＧＤＮＦが、ＣＲＥＢリン酸化をＲ
ｅｔとは非依存性に活性化するがＲＮ３３Ｂ細胞内のＲａｓ／ＥＲＫ経路はしな
いことを見いだしたトルップら(Trupp et al., 1999)の結果とある程度は矛盾す
る。強力なＧＤＮＦ依存性ＥＲＫ１／ＥＲＫ２活性化の検出に加えて、我々は、
ＲＮ３３Ｂ細胞で行ったトルップらの研究（１９９９）と比較して、ＳＨＥＰ細
胞内のＣＲＥＢ活性化の著しく延長された動態を観察した。興味があることには
、我々は、ＣＲＥＢ関連タンパク質ＡＴＦ−１のＧＤＮＦ依存性の強い活性化を
Ｒｅｔ陰性ＳＨＥＰ細胞中では観察したが、しかしＲｅｔ-/- ＤＲＧニューロン
内では観察しなかった。従って、我々の結果とトルップら(Trupp et al., 1999)
の結果との間に認められた不一致は、細胞の異なるタイプの間の変動を反映して
いる可能性がある。
【００５０】 ＳｒｃキナーゼおよびＭＡＰＫは、これらのキナーゼが細胞分裂誘発、神経突
起伸展を伴う神経成長因子誘導細胞分化、細胞移動ならびにフォーカルアドヒー
ジョンキナーゼ（ＦＡＫ）依存性細胞運動（カーレら(Khare et al., 1997)、ト
ーマスおよびブルッジェ(Thomas and Brugge, 1997) ）に決定的に関係すること
が確認されているので、細胞機能に大きく影響するであろう。強力なＭＡＰＫ活
性化、例えば我々の実験で観察されたものは、ニューロン生存およびニューロン
可塑性を促進するであろう（Ｋ．フクナガおよびＥ．ミヤモト(Fukunaga, K. &
Miyamoto, E., 1998) およびインペイら(Impey et al., 1999)により概説）。し
かし、現在では、Ｒｅｔ-/- ＤＲＧニューロン内および細胞株内でのＧＤＮＦに
訴える長期継続Ｃａ2+上昇およびＭＡＰＫおよびＣＲＥＢ活性化の正確な生理学
的意味は知られていない。ＣＲＥＢファミリーの転写因子のＲｅｔ非依存性ＧＤ
ＮＦ誘発活性化は、遺伝子発現の強力な上向き調節に導くことができる。ＭＡＰ
Ｋシグナリングが、最初からのＣＲＥＢ調節遺伝子発現の促進による記憶の固定
および長期増強を容易にすることが示されているので（インペイら(Impey et al
, 1999) により概説）、これはニューロン可塑性内に大きい変化をもたらすこと
ができる（フィンクベイナーら(Finkbeiner et al., 1997) ）。不幸なことに、
Ｒｅｔ-/- またはＧＦＲα１欠損ニューロン内でＧＤＮＦに訴えるニューロン可
塑性における可能な変化の研究は、ノックアウト動物の初期出生後死亡により除
外される。ＤＲＧニューロンはこのＧＦＲα１媒介シグナリングを生存因子とし
て使用しないと考えられ、これはＧＤＮＦがカルチャー内のＲｅｔ-/- ＤＲＧニ
ューロンの生存を刺激しないことが示されていないからである（未発表観察およ
びタラヴィラスら(Taraviras et al., 1999)）。しかし我々は、最近、ＧＤＮＦ
が出生後の蝸牛感覚ニューロンの生存を促進し、これはＧＦＲα１ ｍＲＮＡを
発現するが、Ｒｅｔ ｍＲＮＡは欠くことを示した（イリコフスキーら(Ylikovs
ki et al., 1998)）。ＧＤＮＦ誘発Ｒｅｔ非依存性シグナリングにより開始され
るであろう形態学的および生物学的な因果関係は、まだ解明されていないけれど
も、しかし、種々のニューロン集団は、種々の目的でこのシグナリング経路を使
用して種々の結果を得ていることは明らかである。
起伸展を伴う神経成長因子誘導細胞分化、細胞移動ならびにフォーカルアドヒー
ジョンキナーゼ（ＦＡＫ）依存性細胞運動（カーレら(Khare et al., 1997)、ト
ーマスおよびブルッジェ(Thomas and Brugge, 1997) ）に決定的に関係すること
が確認されているので、細胞機能に大きく影響するであろう。強力なＭＡＰＫ活
性化、例えば我々の実験で観察されたものは、ニューロン生存およびニューロン
可塑性を促進するであろう（Ｋ．フクナガおよびＥ．ミヤモト(Fukunaga, K. &
Miyamoto, E., 1998) およびインペイら(Impey et al., 1999)により概説）。し
かし、現在では、Ｒｅｔ-/- ＤＲＧニューロン内および細胞株内でのＧＤＮＦに
訴える長期継続Ｃａ2+上昇およびＭＡＰＫおよびＣＲＥＢ活性化の正確な生理学
的意味は知られていない。ＣＲＥＢファミリーの転写因子のＲｅｔ非依存性ＧＤ
ＮＦ誘発活性化は、遺伝子発現の強力な上向き調節に導くことができる。ＭＡＰ
Ｋシグナリングが、最初からのＣＲＥＢ調節遺伝子発現の促進による記憶の固定
および長期増強を容易にすることが示されているので（インペイら(Impey et al
, 1999) により概説）、これはニューロン可塑性内に大きい変化をもたらすこと
ができる（フィンクベイナーら(Finkbeiner et al., 1997) ）。不幸なことに、
Ｒｅｔ-/- またはＧＦＲα１欠損ニューロン内でＧＤＮＦに訴えるニューロン可
塑性における可能な変化の研究は、ノックアウト動物の初期出生後死亡により除
外される。ＤＲＧニューロンはこのＧＦＲα１媒介シグナリングを生存因子とし
て使用しないと考えられ、これはＧＤＮＦがカルチャー内のＲｅｔ-/- ＤＲＧニ
ューロンの生存を刺激しないことが示されていないからである（未発表観察およ
びタラヴィラスら(Taraviras et al., 1999)）。しかし我々は、最近、ＧＤＮＦ
が出生後の蝸牛感覚ニューロンの生存を促進し、これはＧＦＲα１ ｍＲＮＡを
発現するが、Ｒｅｔ ｍＲＮＡは欠くことを示した（イリコフスキーら(Ylikovs
ki et al., 1998)）。ＧＤＮＦ誘発Ｒｅｔ非依存性シグナリングにより開始され
るであろう形態学的および生物学的な因果関係は、まだ解明されていないけれど
も、しかし、種々のニューロン集団は、種々の目的でこのシグナリング経路を使
用して種々の結果を得ていることは明らかである。
【００５１】 解決されていない一つの問題は、ラフトの外部リーフレットから内部のものに
シグナルがどのようにして通過するか、または膜の外側から内側にどのようにし
て通過するかである。いかなる理論または機序によっても限定されない意図の下
で、我々は、未知の経膜タンパク質を連結するＧＦＲα１およびシグナルのトラ
ンスデューサーとして機能するＳｒｃタイプタンパク質キナーゼがあることを提
案する。このようなアダプター形質膜関連タンパク質が、最近ＤＲＧニューロン
中に発見された（ラングら(Lang et al., 1998) ）。我々の実験で、約７２ｋＤ
未確認タンパク質が、ＧＦＲα１抗体を用いて免疫沈降した。しかし、潜在的な
アダプタータンパク質とＧＦＲα１との相互作用は、Ｒｅｔ−ＧＦＲα１カプリ
ングとは異ならなければならない。Ｒｅｔを発現した細胞中においてＧＤＮＦの
存在下でＭＡＰＫリン酸化の誘導が可能な可溶性ＧＦＲα１は、Ｒｅｔ陰性親Ｎ
ＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞内の細胞内シグナリングを発現できない。これらの実験に
基づいて、アダプタータンパク質が存在する場合には、Ｒｅｔとは異なり、ＧＦ
Ｒα１のＧＰＩアンカーとの会合を厳格に要求すると我々は結論する。他の可能
性は、アンカー開放に関与するラフト中で活性化される酵素が可溶性ホスホ−オ
リゴ糖類を生成することにあるであろう。次いで、これらは、二重層を飛び越し
、細胞質ゾル中で活性な二次メッセンジャーとして機能するであろう。ＧＤＮＦ
は脂質−脂質相互反応および細胞内リン酸化タンパク質のラフト集合依存性蓄積
を開始させることもできる。かかるシグナリング経路が、ＧＤＮＦの作用に関与
するかどうかは現在分かっていない。
シグナルがどのようにして通過するか、または膜の外側から内側にどのようにし
て通過するかである。いかなる理論または機序によっても限定されない意図の下
で、我々は、未知の経膜タンパク質を連結するＧＦＲα１およびシグナルのトラ
ンスデューサーとして機能するＳｒｃタイプタンパク質キナーゼがあることを提
案する。このようなアダプター形質膜関連タンパク質が、最近ＤＲＧニューロン
中に発見された（ラングら(Lang et al., 1998) ）。我々の実験で、約７２ｋＤ
未確認タンパク質が、ＧＦＲα１抗体を用いて免疫沈降した。しかし、潜在的な
アダプタータンパク質とＧＦＲα１との相互作用は、Ｒｅｔ−ＧＦＲα１カプリ
ングとは異ならなければならない。Ｒｅｔを発現した細胞中においてＧＤＮＦの
存在下でＭＡＰＫリン酸化の誘導が可能な可溶性ＧＦＲα１は、Ｒｅｔ陰性親Ｎ
ＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞内の細胞内シグナリングを発現できない。これらの実験に
基づいて、アダプタータンパク質が存在する場合には、Ｒｅｔとは異なり、ＧＦ
Ｒα１のＧＰＩアンカーとの会合を厳格に要求すると我々は結論する。他の可能
性は、アンカー開放に関与するラフト中で活性化される酵素が可溶性ホスホ−オ
リゴ糖類を生成することにあるであろう。次いで、これらは、二重層を飛び越し
、細胞質ゾル中で活性な二次メッセンジャーとして機能するであろう。ＧＤＮＦ
は脂質−脂質相互反応および細胞内リン酸化タンパク質のラフト集合依存性蓄積
を開始させることもできる。かかるシグナリング経路が、ＧＤＮＦの作用に関与
するかどうかは現在分かっていない。
【００５２】 要約すると、我々は、Ｒｅｔ-/- ＤＲＧニューロンおよびＲｅｔ陰性細胞株内
で、ＧＤＮＦが〔Ｃａ2+〕i 上昇およびＳｒｃ−チロシンキナーゼ、ＰＬＣγ、
ＭＡＰＫおよびＣＲＥＢ−結合細胞内シグナリング経路のＲｅｔ非依存性活性化
を誘発することを発見した。ＧＤＮＦはＧＰＩ固定ＧＦＲα１に結合し、引き続
いてＧＦＲα１と会合したＳｒｃキナーゼの活性化、引き続いてＭＡＰＫ、ＣＲ
ＥＢ、ＰＬＣγの活性化および〔Ｃａ2+〕i の持続性上昇が起きる。提案するシ
グナリング経路を図９に要約する。
で、ＧＤＮＦが〔Ｃａ2+〕i 上昇およびＳｒｃ−チロシンキナーゼ、ＰＬＣγ、
ＭＡＰＫおよびＣＲＥＢ−結合細胞内シグナリング経路のＲｅｔ非依存性活性化
を誘発することを発見した。ＧＤＮＦはＧＰＩ固定ＧＦＲα１に結合し、引き続
いてＧＦＲα１と会合したＳｒｃキナーゼの活性化、引き続いてＭＡＰＫ、ＣＲ
ＥＢ、ＰＬＣγの活性化および〔Ｃａ2+〕i の持続性上昇が起きる。提案するシ
グナリング経路を図９に要約する。
【００５３】
材料および方法 ニューロン培養 胚発生１８日目（Ｅ１８）のマウスからのＤＲＧを、トリプシン（ウォーシン
トン(Worthington) ）で処理し、プレプレーティング(Preplating)により非神経
細胞を取り除き、そして純度約９５％のニューロンを、ＮＧＦ、ＢＤＮＦおよび
ＮＴ−３（すべてペトロテク(PetroTech) から、いずれも２ｎｇ／ｍｌ）を含む
代用血清を含むハム(Ham) Ｆ１４培地（インペリアル・ラボラトリーズ(Imperia
l Laboratories) ）中のポリオルニチン−ラミニン被覆カバーガラス上で、少な
くとも測定の前に１日間培養した。神経栄養因子をＧＤＮＦ添加の前に完全に洗
浄除去した。ＧＤＮＦはペトロテクからのもので、セファロン社(Cephalon, Inc
) から提供された。Ｒｅｔ欠損マウス（シューチャートら(Schuchardt et al.,
1994) ）を異型接合体交配により、腎臓の欠損およびＰＣＲベースの遺伝子型決
定により特定した。ＧＦＲα２欠損マウスは、相同接合体交配により得た（ロッ
シら(Rossi et al., 1999)）。 〔Ｃａ2+〕i 測定 〔Ｃａ2+〕i は、アルゴン−クリプトンレーザーを備えたバイオ−ラッド(Bio
-Rad) ＭＲＣ−１０２４共焦点顕微鏡を用いて測定した。細胞には、膜透過性Ｃ
ａ2+染料であるカルシウムグリーン−１ＡＭ（モレキュラープローブ(Molecular
Probe) ）の１０μＭを用い、３０分間、血清を含まない細胞培地内、３７℃お
よび５％ＣＯ2 でインキュベートして加えた。添加の後、ニューロンを２０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．４）を含むダルベッコ(Dulbecco)のＰＢＳ溶液中で、
少なくとも実験の２０分間、室温に維持した。すべての化合物をぜん動ポンプに
より浴に加えた。６ｋＤヘパリン（シグマ(Sigma) ）およびアレキサ(Alexa) ５
６８ｎｍ蛍光染料（モレキュラープローブ）をモレキュラープローブの飲作用流
入ローディング試薬を基本的に製造者の指示に従って使用して細胞内に加えた。
この添加は、実験を通じてニューロンの生存活力に影響しなかった。細胞注入は
、エッペンドルフ(Eppendorf) ミクロ注入システムを用いて行った。事前に規定
したＲＯＩ（関係領域）内の蛍光の平均強度は、バイオラッドからのタイムコー
ス(TimeCourse)ソフトウエアを用いてオンラインで測定した。蛍光トレースの校
正は、生体外で、カルシウム校正緩衝液キット（モレキュラープローブ）を用い
て得たＦmax およびＦmin 値を用いて行った。校正溶液は細胞内の環境を反映し
ないので、実験データは、カルシウムグリーン−１に対するＫd ＝１９０ｎＭを
用いて算出したデルタ〔Ｃａ2+〕i として表した。 形質転換ＧＦＲα２マウス 形質転換ＧＦＲα２ノックアウトマウスは、我々の実験室で生産した。ＧＦＲ
α２ゲノムクローンを単離するために、我々はマウス１２９／Ｓｖライブラリー
（ストラタジーン(Stratagene)）を、プローブとしてラットＧＲＦα２ ｃＤＡ
ＮＡ断片を用いてスクリーニングした。６．７ｋｂ ＨｉｎＤＩＩＩ−ＸＢＡＩ
断片を標的ベクターを構築するために使用した。翻訳開始部位を有する一次コー
ディングエキソンの部分を含むＧＦＲα２遺伝子の０．５ｋｂ ＮｏｔＩ−Ｘｂ
ａＩ断片を、ＰＧＫプロモーターおよびポリアデニル化シグナルにより駆動され
るネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）を含む２．０ｋｂカセットと置換した。Ｒ
１胚幹細胞を、線状化したプラスミドを用いてエレクトロポレーションし、Ｇ４
１８（２５０ｕｇ／ｍｌ）中で選択した。耐性クローンは、ＢａｍＨＩ消化の後
に７．８ｋｂ野性型および５．５ｋｂ変異型バンドを認識する５’外部プローブ
を用いるサザンブロット分析によりスクリーニングした。陽性クローンをｎｅｏ
および３’外部プローブを用いてさらにハイブリダイズしてベクターのランダム
な合体を排除した。キメラをＣ５７ＢＬ／６ＪＯ１ａＨｓｄと交配すると、注入
したベクター２種が、生殖細胞伝達を示した。 単細胞ＲＴ−ＰＣＲ マイクロピペットに負の圧力を加え、そして全細胞を目視確認下で収穫した。
ピペットの内容物を、トリゾール(Trizol)TM試薬溶解緩衝液（ジブコ(Gibco) Ｂ
ＲＬ）およびキャリヤｔＲＮＡの１μｇを含む試験管内に排出した。全ＲＮＡを
単離し、そしてタイタン(Titan) TMワンチューブＲＴ−ＰＣＲキット（ベーリン
ジャー・マンハイム(Behringer Mannheim)）を用い、製造者の指示に従ってＲＴ
−ＰＣＲを行った。各ニューロンからの物質の半分をＧＦＲα１ ｍＲＮＡの増
幅に使用した。試料中の全ＲＮＡの存在は、物質の第二の半分を用いたシクロフ
ィリンｍＲＮＡの２１６ｂｐ断片の増幅により確認された。シクロフィリン増幅
のために、クオンタム(Quantum) ＲＮＡTMキット（アンビオン(Ambion, TX)）か
らのプライマーを用いた。ＧＦＲα１発現の分析に使用したプライマーは、下記
であった。５’−ＧＣＧＧＣＡＣＣＡＴＧＴＴＣＣＴＡＧＣＣ−３’（配列番号
１）および５’−ＣＡＧＡＣＴＣＡＧＧＣＡＧＴＴＧＧＧＣＣ−３’（配列番号
２）。プライマーは、少なくとも１個のイントロンをクロスし、そしてゲノムＤ
ＮＡからの増幅を除外するように設計した。増幅は、９５℃で４５秒、６２℃で
４５秒、および７２℃で６０秒の４５サイクルで行った。得られた断片を、マウ
スＧＦＲα１クローンの32Ｐ標識ｃＤＮＡインサートおよびシクロフィリンのｃ
ＤＮＡ断片を用いるサザンブロット法により特定した。放射性シグナルは、フジ
・バオイメージ(Fuji Bioimage) アナライザーＢＡＳ２０００を用いて検出した
。培養したニューロンの培地から断片は得られなかった。 培養したＤＲＧニューロンおよびＳＨＥＰ神経芽細胞腫細胞株中のＧＤＮＦ受容
体のＲＴ−ＰＣＲ分析 培養したＤＲＧニューロン（細胞約２００個）からの全ＲＮＡを３部分に等分
し、上記のようにしてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＧＦＲα２に対するプライマーは
下記であった。５’−ＴＡＴＴＧＧＡＧＣＡＴＣＣＡＴＣＴＧＧＧ−３’（配列
番号３）、および５’−ＡＧＣＡＧＴＴＧＧＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＧ−３’（配
列番号４）、そしてＲｅｔに対しては下記であった。５’−ＡＴＧＡＡＡＧＧＧ
ＴＡＣＴＧＡＣＣＡＴＧＧ−３’（配列番号５）および５’−ＡＧＧＡＣＣＡＣ
ＡＣＡＴＣＡＣＴＴＴＧＡＧ−３’（配列番号６）。ＰＣＲは、上記の条件下の
４０サイクルで行った。ＳＨＥＰ細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析において、我々はヒト
ＧＦＲα１、ＧＦＲα２およびＲｅｔに対するプライマーを使用した。プライマ
ー配列およびＰＣＲ条件は、ヒシキら(Hishiki et al., 1998)により報告された
。 免疫複合キナーゼアッセイおよび免疫ブロッティング ＤＲＧニューロン（５ｘ１０5 ）、ＳＨＥＰ神経芽細胞腫細胞（１０7 ）、Ｇ
ＦＲα１を用いて安定に移行したＮｅｕｒｏ２Ａ神経芽細胞腫細胞（１０7 ）ま
たはＧＦＲα１を用いて安定に移行したＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３／ｐＢ
ｐＧＦＲα１）（１０7 ）を、ＧＤＮＦ処理なし（対照）または０．５〜１５分
間、３７℃でＧＤＮＦ処理（ＧＤＮＦ処理）した無血清培地内でインキュベート
した。細胞を、低温ＰＢＳ／バナジン酸塩を用いて２回洗浄し、そして氷上のＴ
Ｘ−１００溶解緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭオルトバナジン酸
ナトリウム、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）およびプ
ロターゼ阻害剤（ベーリンジャー）内で１時間溶解した。核溶解物をヤギポリク
ローナル抗体のための５０％タンパク質Ｇ−セファロースまたはラビットポリク
ローナル抗体のためのタンパク質Ａ−セファロースＣＬ４Ｂ（ファルマシア）の
５０μｌを用いて１時間、＋４℃でインキュベートしてプレクリア(pre-clear)
した。ビードを除去した後、上清を、抗ＧＦＲα１または抗Ｙｅｓポリクローナ
ル抗体（サンタクルス・バイオテクノロジー(Santa Cruz Biotechnology)）の０
．４〜０．５μｇと一緒に、一晩、＋４℃でインキュベートし、次いでタンパク
質ＧまたはＡ−セファロースと一緒に２時間インキュベートした。免疫複合体を
、ＥＤＴＡを含まないＴＸ−１００溶解緩衝液中で２回、そしてキナーゼ緩衝液
（２５ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５ｍＭ ＭｎＣｌ2
、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム）中で２回洗浄した。免疫複合体を、〔γ
−32Ｐ〕ＡＴＰの５〜１０μＣｉを補足したキナーゼ緩衝液中で、２０分間、３
７℃でインキュベートした。試料を組み込んだ標識から洗浄除去し、１０％ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥを行った。タンパク質を半乾燥ブロット装置（シュナイダー＆シュ
ル(Schneider & Schuell, Dassel, FRG)）を用いてハイボンド(Hybond)ＥＣＬ膜
（アマーシャム）に転移した。標識されたタンパク質を、フジ・バオイメージ・
アナライザーＢＡＳ２０００またはオートラジオグラフィーを用いて可視化した
。ブロットの光学密度の定量は、ＴＩＮＡプログラムを用いて行った。
トン(Worthington) ）で処理し、プレプレーティング(Preplating)により非神経
細胞を取り除き、そして純度約９５％のニューロンを、ＮＧＦ、ＢＤＮＦおよび
ＮＴ−３（すべてペトロテク(PetroTech) から、いずれも２ｎｇ／ｍｌ）を含む
代用血清を含むハム(Ham) Ｆ１４培地（インペリアル・ラボラトリーズ(Imperia
l Laboratories) ）中のポリオルニチン−ラミニン被覆カバーガラス上で、少な
くとも測定の前に１日間培養した。神経栄養因子をＧＤＮＦ添加の前に完全に洗
浄除去した。ＧＤＮＦはペトロテクからのもので、セファロン社(Cephalon, Inc
) から提供された。Ｒｅｔ欠損マウス（シューチャートら(Schuchardt et al.,
1994) ）を異型接合体交配により、腎臓の欠損およびＰＣＲベースの遺伝子型決
定により特定した。ＧＦＲα２欠損マウスは、相同接合体交配により得た（ロッ
シら(Rossi et al., 1999)）。 〔Ｃａ2+〕i 測定 〔Ｃａ2+〕i は、アルゴン−クリプトンレーザーを備えたバイオ−ラッド(Bio
-Rad) ＭＲＣ−１０２４共焦点顕微鏡を用いて測定した。細胞には、膜透過性Ｃ
ａ2+染料であるカルシウムグリーン−１ＡＭ（モレキュラープローブ(Molecular
Probe) ）の１０μＭを用い、３０分間、血清を含まない細胞培地内、３７℃お
よび５％ＣＯ2 でインキュベートして加えた。添加の後、ニューロンを２０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．４）を含むダルベッコ(Dulbecco)のＰＢＳ溶液中で、
少なくとも実験の２０分間、室温に維持した。すべての化合物をぜん動ポンプに
より浴に加えた。６ｋＤヘパリン（シグマ(Sigma) ）およびアレキサ(Alexa) ５
６８ｎｍ蛍光染料（モレキュラープローブ）をモレキュラープローブの飲作用流
入ローディング試薬を基本的に製造者の指示に従って使用して細胞内に加えた。
この添加は、実験を通じてニューロンの生存活力に影響しなかった。細胞注入は
、エッペンドルフ(Eppendorf) ミクロ注入システムを用いて行った。事前に規定
したＲＯＩ（関係領域）内の蛍光の平均強度は、バイオラッドからのタイムコー
ス(TimeCourse)ソフトウエアを用いてオンラインで測定した。蛍光トレースの校
正は、生体外で、カルシウム校正緩衝液キット（モレキュラープローブ）を用い
て得たＦmax およびＦmin 値を用いて行った。校正溶液は細胞内の環境を反映し
ないので、実験データは、カルシウムグリーン−１に対するＫd ＝１９０ｎＭを
用いて算出したデルタ〔Ｃａ2+〕i として表した。 形質転換ＧＦＲα２マウス 形質転換ＧＦＲα２ノックアウトマウスは、我々の実験室で生産した。ＧＦＲ
α２ゲノムクローンを単離するために、我々はマウス１２９／Ｓｖライブラリー
（ストラタジーン(Stratagene)）を、プローブとしてラットＧＲＦα２ ｃＤＡ
ＮＡ断片を用いてスクリーニングした。６．７ｋｂ ＨｉｎＤＩＩＩ−ＸＢＡＩ
断片を標的ベクターを構築するために使用した。翻訳開始部位を有する一次コー
ディングエキソンの部分を含むＧＦＲα２遺伝子の０．５ｋｂ ＮｏｔＩ−Ｘｂ
ａＩ断片を、ＰＧＫプロモーターおよびポリアデニル化シグナルにより駆動され
るネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）を含む２．０ｋｂカセットと置換した。Ｒ
１胚幹細胞を、線状化したプラスミドを用いてエレクトロポレーションし、Ｇ４
１８（２５０ｕｇ／ｍｌ）中で選択した。耐性クローンは、ＢａｍＨＩ消化の後
に７．８ｋｂ野性型および５．５ｋｂ変異型バンドを認識する５’外部プローブ
を用いるサザンブロット分析によりスクリーニングした。陽性クローンをｎｅｏ
および３’外部プローブを用いてさらにハイブリダイズしてベクターのランダム
な合体を排除した。キメラをＣ５７ＢＬ／６ＪＯ１ａＨｓｄと交配すると、注入
したベクター２種が、生殖細胞伝達を示した。 単細胞ＲＴ−ＰＣＲ マイクロピペットに負の圧力を加え、そして全細胞を目視確認下で収穫した。
ピペットの内容物を、トリゾール(Trizol)TM試薬溶解緩衝液（ジブコ(Gibco) Ｂ
ＲＬ）およびキャリヤｔＲＮＡの１μｇを含む試験管内に排出した。全ＲＮＡを
単離し、そしてタイタン(Titan) TMワンチューブＲＴ−ＰＣＲキット（ベーリン
ジャー・マンハイム(Behringer Mannheim)）を用い、製造者の指示に従ってＲＴ
−ＰＣＲを行った。各ニューロンからの物質の半分をＧＦＲα１ ｍＲＮＡの増
幅に使用した。試料中の全ＲＮＡの存在は、物質の第二の半分を用いたシクロフ
ィリンｍＲＮＡの２１６ｂｐ断片の増幅により確認された。シクロフィリン増幅
のために、クオンタム(Quantum) ＲＮＡTMキット（アンビオン(Ambion, TX)）か
らのプライマーを用いた。ＧＦＲα１発現の分析に使用したプライマーは、下記
であった。５’−ＧＣＧＧＣＡＣＣＡＴＧＴＴＣＣＴＡＧＣＣ−３’（配列番号
１）および５’−ＣＡＧＡＣＴＣＡＧＧＣＡＧＴＴＧＧＧＣＣ−３’（配列番号
２）。プライマーは、少なくとも１個のイントロンをクロスし、そしてゲノムＤ
ＮＡからの増幅を除外するように設計した。増幅は、９５℃で４５秒、６２℃で
４５秒、および７２℃で６０秒の４５サイクルで行った。得られた断片を、マウ
スＧＦＲα１クローンの32Ｐ標識ｃＤＮＡインサートおよびシクロフィリンのｃ
ＤＮＡ断片を用いるサザンブロット法により特定した。放射性シグナルは、フジ
・バオイメージ(Fuji Bioimage) アナライザーＢＡＳ２０００を用いて検出した
。培養したニューロンの培地から断片は得られなかった。 培養したＤＲＧニューロンおよびＳＨＥＰ神経芽細胞腫細胞株中のＧＤＮＦ受容
体のＲＴ−ＰＣＲ分析 培養したＤＲＧニューロン（細胞約２００個）からの全ＲＮＡを３部分に等分
し、上記のようにしてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＧＦＲα２に対するプライマーは
下記であった。５’−ＴＡＴＴＧＧＡＧＣＡＴＣＣＡＴＣＴＧＧＧ−３’（配列
番号３）、および５’−ＡＧＣＡＧＴＴＧＧＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＧ−３’（配
列番号４）、そしてＲｅｔに対しては下記であった。５’−ＡＴＧＡＡＡＧＧＧ
ＴＡＣＴＧＡＣＣＡＴＧＧ−３’（配列番号５）および５’−ＡＧＧＡＣＣＡＣ
ＡＣＡＴＣＡＣＴＴＴＧＡＧ−３’（配列番号６）。ＰＣＲは、上記の条件下の
４０サイクルで行った。ＳＨＥＰ細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析において、我々はヒト
ＧＦＲα１、ＧＦＲα２およびＲｅｔに対するプライマーを使用した。プライマ
ー配列およびＰＣＲ条件は、ヒシキら(Hishiki et al., 1998)により報告された
。 免疫複合キナーゼアッセイおよび免疫ブロッティング ＤＲＧニューロン（５ｘ１０5 ）、ＳＨＥＰ神経芽細胞腫細胞（１０7 ）、Ｇ
ＦＲα１を用いて安定に移行したＮｅｕｒｏ２Ａ神経芽細胞腫細胞（１０7 ）ま
たはＧＦＲα１を用いて安定に移行したＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３／ｐＢ
ｐＧＦＲα１）（１０7 ）を、ＧＤＮＦ処理なし（対照）または０．５〜１５分
間、３７℃でＧＤＮＦ処理（ＧＤＮＦ処理）した無血清培地内でインキュベート
した。細胞を、低温ＰＢＳ／バナジン酸塩を用いて２回洗浄し、そして氷上のＴ
Ｘ−１００溶解緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭオルトバナジン酸
ナトリウム、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）およびプ
ロターゼ阻害剤（ベーリンジャー）内で１時間溶解した。核溶解物をヤギポリク
ローナル抗体のための５０％タンパク質Ｇ−セファロースまたはラビットポリク
ローナル抗体のためのタンパク質Ａ−セファロースＣＬ４Ｂ（ファルマシア）の
５０μｌを用いて１時間、＋４℃でインキュベートしてプレクリア(pre-clear)
した。ビードを除去した後、上清を、抗ＧＦＲα１または抗Ｙｅｓポリクローナ
ル抗体（サンタクルス・バイオテクノロジー(Santa Cruz Biotechnology)）の０
．４〜０．５μｇと一緒に、一晩、＋４℃でインキュベートし、次いでタンパク
質ＧまたはＡ−セファロースと一緒に２時間インキュベートした。免疫複合体を
、ＥＤＴＡを含まないＴＸ−１００溶解緩衝液中で２回、そしてキナーゼ緩衝液
（２５ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５ｍＭ ＭｎＣｌ2
、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム）中で２回洗浄した。免疫複合体を、〔γ
−32Ｐ〕ＡＴＰの５〜１０μＣｉを補足したキナーゼ緩衝液中で、２０分間、３
７℃でインキュベートした。試料を組み込んだ標識から洗浄除去し、１０％ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥを行った。タンパク質を半乾燥ブロット装置（シュナイダー＆シュ
ル(Schneider & Schuell, Dassel, FRG)）を用いてハイボンド(Hybond)ＥＣＬ膜
（アマーシャム）に転移した。標識されたタンパク質を、フジ・バオイメージ・
アナライザーＢＡＳ２０００またはオートラジオグラフィーを用いて可視化した
。ブロットの光学密度の定量は、ＴＩＮＡプログラムを用いて行った。
【００５４】 免疫ブロット法のために、ｃ−Ｓｒｃ、ＦｙｎおよびＹｅｓを認識するＳｒｃ
−２抗体（サンタクルス・バイオテクノロジー）を用い、次いで二次ＨＲＰ−複
合抗ラビット抗体（シグマ）を用いて膜をプローブした。膜をＥＣＬ試薬（アマ
ーシャム・ライフ・サイエンス）を用いて展開した。 ＰＬＣγの免疫沈降およびウエスタンブロット試験 ＧＤＮＦ発現ＰＬＣγチロシンリン酸化における変化を決定するために、カー
レら(Khare et al., 1997)の記載に従ってウエスタンブロット法を行った。要約
すると、ＳＨＥＰ神経芽細胞腫細胞を無血清培地中で１ｍＭバナジン酸ナトリウ
ムを用いて、３０分間、３７℃で前インキュベートし、次いで３７℃で１〜１０
０ｎｇ／ｍｌＧＤＮＦを用いて１分間、別途断らないかぎり処理した。インキュ
ベーションは、１ｍＭバナジン酸ナトリウムを含む氷冷ＰＢＳ緩衝液添加により
停止した。全細胞溶解物（最終タンパク質濃度０．１〜０．３ｍｇ／ｍｌ）を、
５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭバナジン酸ナトリウム
、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０％グリセロール、１％ＮＰ−４０およびプロテアーゼ
阻害剤カクテル（ベーリンジャー）を含む抽出緩衝液（ｐＨ７．５）中、４℃で
調製した。ホスホチロシンを含むタンパク質を４Ｇ−１０抗体（ベーリンジャー
）を用いて免疫沈降し、タンパク質Ａセファロースビードを用いて捕集し、そし
て７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。タンパク質をハイボンド−ＥＣＬニト
ロセルロース膜に転移させ、そしてＰＬＣγを抗ＰＬＣγ抗体（アップステート
・バイオテクノロジー(Upstate Biotechnology) ）を用いるウエスタンブロッテ
ィング法により評価した。一部の実験では、我々は最初に抗ＰＬＣγ抗体を用い
て細胞溶解物からＰＬＣγをを免疫沈降し、そして上記のようにして抗ホスホチ
ロシン４Ｇ−１０抗体を用いてフィルターをプローブした。これらの実験中で、
免疫沈降物のホスホチロシン検出の後、膜をストリッピングし、抗ＰＬＣγ抗体
（アップステート・バイオテクノロジー）を用いて再プローブした。膜は、ＥＣ
Ｌ試薬を用いて展開した。 ＭＡＰＫ、ＪＮＫおよびＣＲＥＢリン酸化アッセイ すべての研究した細胞株中でＧＤＮＦ依存性ＭＡＰＫおよびＣＲＥＢリン酸化
を評価するために、半集密細胞単層を３時間、無血清培地内で飢餓状態とし、次
いでＧＤＮＦを指定の時間に与えた。Ｒｅｔ-/- 動物中のＭＡＰＫおよびＣＲＥ
Ｂ活性化の分析のために、ＤＲＧニューロンをＥ１８マウスから切り取り、そし
てＮＧＦ含有培地内で２時間保持した。この時間の後に、抗ＮＧＦ抗体の存在下
でＮＧＦを含まない培地内にこれらを配置して、ニューロンからＮＧＦを取り去
った。ＮＧＦなし状態での２時間後に、ニューロンをＧＤＮＦを用いて刺激した
。Ｓｒｃ−キナーゼ阻害を含む実験では、Ｓｒｃファミリーキナーゼ阻害剤ＰＰ
２を、ＧＤＮＦ添加の５分前に細胞単層に指定濃度で加えた。一部の実験では、
ＧＰＩアンカーを欠いた可溶性ＧＦＲα１（ＧＦＲα１／Ｆｃキメラタンパク質
、Ｒ＆Ｄシステムズ）の１μｇ／ｍｌをＧＤＮＦ添加の５分前に加え、そしてＧ
ＤＮＦ処理の間、溶液内に保持した。刺激の後、ＰＢＳ／バナジン酸ナトリウム
を用いて短時間で細胞を洗浄し、そしてＴＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−
４０、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ Ｎａ3 ＶＯ4 およ
びＣｏｍｐｌｅｔｅTMプロテアーゼ阻害剤カクテル（ベーリンジャー・マンハイ
ム）を含む緩衝液中で溶解した。各溶解物に対して全細胞タンパク質をＭｉｃｒ
ｏＢＳＡ（ピアス(Pierce)）により測定し、そしてタンパク質の相当量を１０％
ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により分離した。タンパク質をハイボンド
ＥＣＬ（アマーシャム）膜に転移し、ブロットをＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）また
はＪＮＫ抗ＡｃｔｉｖｅTM ｐＡｂｓ（プロメガ(Promega) ）のいずれかを製造
者の指示に従って用いてプローブした。次いで、ブロットをＧＦＲα１ ｍＡｂ
ｓ（トランスダクション・ラボラトリーズ(Transduction Laboratories) ）を用
いて再プローブした。ＣＲＥＢリン酸化試験において、ウエスターンブロットを
、ＣＲＥＢのＳｅｒ−１３３リン酸化形を特異的に認識する抗体を用いてプロー
ブし、次いで抗ＣＲＥＢ抗体（ニューイングランド・バイオラブズ）を用いて再
プローブした。
−２抗体（サンタクルス・バイオテクノロジー）を用い、次いで二次ＨＲＰ−複
合抗ラビット抗体（シグマ）を用いて膜をプローブした。膜をＥＣＬ試薬（アマ
ーシャム・ライフ・サイエンス）を用いて展開した。 ＰＬＣγの免疫沈降およびウエスタンブロット試験 ＧＤＮＦ発現ＰＬＣγチロシンリン酸化における変化を決定するために、カー
レら(Khare et al., 1997)の記載に従ってウエスタンブロット法を行った。要約
すると、ＳＨＥＰ神経芽細胞腫細胞を無血清培地中で１ｍＭバナジン酸ナトリウ
ムを用いて、３０分間、３７℃で前インキュベートし、次いで３７℃で１〜１０
０ｎｇ／ｍｌＧＤＮＦを用いて１分間、別途断らないかぎり処理した。インキュ
ベーションは、１ｍＭバナジン酸ナトリウムを含む氷冷ＰＢＳ緩衝液添加により
停止した。全細胞溶解物（最終タンパク質濃度０．１〜０．３ｍｇ／ｍｌ）を、
５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭバナジン酸ナトリウム
、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０％グリセロール、１％ＮＰ−４０およびプロテアーゼ
阻害剤カクテル（ベーリンジャー）を含む抽出緩衝液（ｐＨ７．５）中、４℃で
調製した。ホスホチロシンを含むタンパク質を４Ｇ−１０抗体（ベーリンジャー
）を用いて免疫沈降し、タンパク質Ａセファロースビードを用いて捕集し、そし
て７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。タンパク質をハイボンド−ＥＣＬニト
ロセルロース膜に転移させ、そしてＰＬＣγを抗ＰＬＣγ抗体（アップステート
・バイオテクノロジー(Upstate Biotechnology) ）を用いるウエスタンブロッテ
ィング法により評価した。一部の実験では、我々は最初に抗ＰＬＣγ抗体を用い
て細胞溶解物からＰＬＣγをを免疫沈降し、そして上記のようにして抗ホスホチ
ロシン４Ｇ−１０抗体を用いてフィルターをプローブした。これらの実験中で、
免疫沈降物のホスホチロシン検出の後、膜をストリッピングし、抗ＰＬＣγ抗体
（アップステート・バイオテクノロジー）を用いて再プローブした。膜は、ＥＣ
Ｌ試薬を用いて展開した。 ＭＡＰＫ、ＪＮＫおよびＣＲＥＢリン酸化アッセイ すべての研究した細胞株中でＧＤＮＦ依存性ＭＡＰＫおよびＣＲＥＢリン酸化
を評価するために、半集密細胞単層を３時間、無血清培地内で飢餓状態とし、次
いでＧＤＮＦを指定の時間に与えた。Ｒｅｔ-/- 動物中のＭＡＰＫおよびＣＲＥ
Ｂ活性化の分析のために、ＤＲＧニューロンをＥ１８マウスから切り取り、そし
てＮＧＦ含有培地内で２時間保持した。この時間の後に、抗ＮＧＦ抗体の存在下
でＮＧＦを含まない培地内にこれらを配置して、ニューロンからＮＧＦを取り去
った。ＮＧＦなし状態での２時間後に、ニューロンをＧＤＮＦを用いて刺激した
。Ｓｒｃ−キナーゼ阻害を含む実験では、Ｓｒｃファミリーキナーゼ阻害剤ＰＰ
２を、ＧＤＮＦ添加の５分前に細胞単層に指定濃度で加えた。一部の実験では、
ＧＰＩアンカーを欠いた可溶性ＧＦＲα１（ＧＦＲα１／Ｆｃキメラタンパク質
、Ｒ＆Ｄシステムズ）の１μｇ／ｍｌをＧＤＮＦ添加の５分前に加え、そしてＧ
ＤＮＦ処理の間、溶液内に保持した。刺激の後、ＰＢＳ／バナジン酸ナトリウム
を用いて短時間で細胞を洗浄し、そしてＴＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−
４０、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ Ｎａ3 ＶＯ4 およ
びＣｏｍｐｌｅｔｅTMプロテアーゼ阻害剤カクテル（ベーリンジャー・マンハイ
ム）を含む緩衝液中で溶解した。各溶解物に対して全細胞タンパク質をＭｉｃｒ
ｏＢＳＡ（ピアス(Pierce)）により測定し、そしてタンパク質の相当量を１０％
ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により分離した。タンパク質をハイボンド
ＥＣＬ（アマーシャム）膜に転移し、ブロットをＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）また
はＪＮＫ抗ＡｃｔｉｖｅTM ｐＡｂｓ（プロメガ(Promega) ）のいずれかを製造
者の指示に従って用いてプローブした。次いで、ブロットをＧＦＲα１ ｍＡｂ
ｓ（トランスダクション・ラボラトリーズ(Transduction Laboratories) ）を用
いて再プローブした。ＣＲＥＢリン酸化試験において、ウエスターンブロットを
、ＣＲＥＢのＳｅｒ−１３３リン酸化形を特異的に認識する抗体を用いてプロー
ブし、次いで抗ＣＲＥＢ抗体（ニューイングランド・バイオラブズ）を用いて再
プローブした。
【００５５】 実施例１ Ｒｅｔ／ＧＦＲα１陽性野性型およびＧＦＲα２-/- ＤＲＧニューロン中の〔Ｃ
ａ2+〕i へのＧＤＮＦの影響 ニューロン内の可能なＲｅｔ非依存性ＧＤＮＦシグナリングを研究するために
、我々は、Ｒｅｔ発現性およびＲｅｔ-/- ＤＲＧニューロン中の共焦点顕微鏡観
察により細胞内Ｃａ2+濃度（〔Ｃａ2+〕i ）のＧＤＮＦ誘導変化を追跡した。〔
Ｃａ2+〕i におけるＧＤＮＦ誘発変化の２種類の異なるタイプが、Ｒｅｔ、ＧＦ
Ｒα１およびＧＦＲα２の両方を発現する野性型ＤＲＧニューロンの６０〜７０
％中で観察された（図１Ｃ）。ＧＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）は、〔Ｃａ2+〕i に
急速な一過性増加を誘導し、一方１０ｎｇ／ｍｌ以上の濃度（１０〜１００ｎｇ
／ｍｌ）は、〔Ｃａ2+〕i に一過性および緩徐で長期持続性の両方の上昇を誘発
した（図１Ａ）（実験ｎ＝１５、各実験で少なくともニューロン３〜４個は記録
した）。観察されたＧＤＮＦ誘発長期持続〔Ｃａ2+〕i 上昇の特異性の対照とす
るために、我々は熱不活性化ＧＤＮＦを使用した。熱不活性化ＧＤＮＦは、基礎
〔Ｃａ2+〕i にいかなる変化も発現しなかった（記録した細胞８個）（図１Ｂ）
。実験終了時の内部カルシウムプールの機能を検査するために、我々は通常、細
胞内カルシウム貯蔵のＳＥＲＣＡポンプの阻害剤であるタプシガーギン(thapsig
argin)５μＭを加えた。すべての細胞がタプシガーギンの添加に対して〔Ｃａ2+ 〕i の大きい上昇を起こして反応した（図１Ｂに示した代表的な記録２例）。別
の対照実験を、ホスファチジルイノシトール−特異性ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−
ＰＬＣ）を用いて膜からＧＰＩ固定タンパク質の切断を利用して行った（記録７
例）。前処理ニューロンのいずれもＧＤＮＦの添加（１００ｎｇ／ｍｌ）に反応
しなかった（図１Ｄ）。５μＭタプシガーギンを用いる細胞内Ｃａ2+貯蔵の欠乏
（記録５例）またはＰＬＣγ阻害剤、Ｕ−７３１２２を用いるニューロンの前処
理（記録６例）も、ＧＤＮＦの効果の消失をもたらした（それぞれ図１Ｅおよび
１Ｆ）。ＧＤＮＦの特異性に相応して（ロッシら(Rossi et al., 1999)）、ＧＤ
ＮＦに対して、野性型ニューロンと同様にＣａ2+上昇の急速および緩徐な動態の
同じパターンで反応した（図１Ｇ）（記録９例）。細胞外カルシウムの名目的な
除去（細胞外媒体へＥＤＴＡを添加しないと〔Ｃａ2+〕o は約２０μＭであった
）は、〔Ｃａ2+〕i の減少に導いた。興味あることには、これらの細胞内へのＧ
ＤＮＦの添加は、大きい迅速で振動性（細胞９例の内５例）の〔Ｃａ2+〕i 増加
をもたらした（図１Ｄ）。カルシウム含有媒体に灌流を切り換え戻すと、大きい
カルシウム超過をもたらした。我々の結果は、ＤＲＧニューロン中の細胞内カル
シウム貯蔵の欠乏は、これらの貯蔵の再充填を目的とする実質的なカルシウム移
入を誘発するという最近の報告（ウサチェフら(Usachev etal., 1999) ）と一致
する。
ａ2+〕i へのＧＤＮＦの影響 ニューロン内の可能なＲｅｔ非依存性ＧＤＮＦシグナリングを研究するために
、我々は、Ｒｅｔ発現性およびＲｅｔ-/- ＤＲＧニューロン中の共焦点顕微鏡観
察により細胞内Ｃａ2+濃度（〔Ｃａ2+〕i ）のＧＤＮＦ誘導変化を追跡した。〔
Ｃａ2+〕i におけるＧＤＮＦ誘発変化の２種類の異なるタイプが、Ｒｅｔ、ＧＦ
Ｒα１およびＧＦＲα２の両方を発現する野性型ＤＲＧニューロンの６０〜７０
％中で観察された（図１Ｃ）。ＧＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）は、〔Ｃａ2+〕i に
急速な一過性増加を誘導し、一方１０ｎｇ／ｍｌ以上の濃度（１０〜１００ｎｇ
／ｍｌ）は、〔Ｃａ2+〕i に一過性および緩徐で長期持続性の両方の上昇を誘発
した（図１Ａ）（実験ｎ＝１５、各実験で少なくともニューロン３〜４個は記録
した）。観察されたＧＤＮＦ誘発長期持続〔Ｃａ2+〕i 上昇の特異性の対照とす
るために、我々は熱不活性化ＧＤＮＦを使用した。熱不活性化ＧＤＮＦは、基礎
〔Ｃａ2+〕i にいかなる変化も発現しなかった（記録した細胞８個）（図１Ｂ）
。実験終了時の内部カルシウムプールの機能を検査するために、我々は通常、細
胞内カルシウム貯蔵のＳＥＲＣＡポンプの阻害剤であるタプシガーギン(thapsig
argin)５μＭを加えた。すべての細胞がタプシガーギンの添加に対して〔Ｃａ2+ 〕i の大きい上昇を起こして反応した（図１Ｂに示した代表的な記録２例）。別
の対照実験を、ホスファチジルイノシトール−特異性ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−
ＰＬＣ）を用いて膜からＧＰＩ固定タンパク質の切断を利用して行った（記録７
例）。前処理ニューロンのいずれもＧＤＮＦの添加（１００ｎｇ／ｍｌ）に反応
しなかった（図１Ｄ）。５μＭタプシガーギンを用いる細胞内Ｃａ2+貯蔵の欠乏
（記録５例）またはＰＬＣγ阻害剤、Ｕ−７３１２２を用いるニューロンの前処
理（記録６例）も、ＧＤＮＦの効果の消失をもたらした（それぞれ図１Ｅおよび
１Ｆ）。ＧＤＮＦの特異性に相応して（ロッシら(Rossi et al., 1999)）、ＧＤ
ＮＦに対して、野性型ニューロンと同様にＣａ2+上昇の急速および緩徐な動態の
同じパターンで反応した（図１Ｇ）（記録９例）。細胞外カルシウムの名目的な
除去（細胞外媒体へＥＤＴＡを添加しないと〔Ｃａ2+〕o は約２０μＭであった
）は、〔Ｃａ2+〕i の減少に導いた。興味あることには、これらの細胞内へのＧ
ＤＮＦの添加は、大きい迅速で振動性（細胞９例の内５例）の〔Ｃａ2+〕i 増加
をもたらした（図１Ｄ）。カルシウム含有媒体に灌流を切り換え戻すと、大きい
カルシウム超過をもたらした。我々の結果は、ＤＲＧニューロン中の細胞内カル
シウム貯蔵の欠乏は、これらの貯蔵の再充填を目的とする実質的なカルシウム移
入を誘発するという最近の報告（ウサチェフら(Usachev etal., 1999) ）と一致
する。
【００５６】 実施例２ Ｒｅｔ-/- 、ＧＦＲα１陽性ＤＲＧニューロン内の〔Ｃａ2+〕i に対するＧＤＮ
Ｆの効果 Ｒｅｔチロシンキナーゼは、ＰＬＣγドッキング部位を介して細胞質ＰＬＣγ
を活性化でき（ボレロら(Borrello et al., 1996) ）、そしてこれはＩＰ3 産生
および引き続いてのＣａ2+放出に導くであろう。従って、我々は、Ｒｅｔ-/- マ
ウスから単離されたＤＲＧニューロン（シューテャートら(Schuchardt et al.,
1994) ）を用いるＧＤＮＦ誘発カルシウムシグナリング内でのＲｅｔの役割を評
価した。試験したＲｅｔ-/- ＤＲＧニューロン１８例の内１６例で、我々はＧＦ
Ｒα１ ｍＲＮＡを検出し（代表的なレーン１１例を図２Ａに示す）。これは最
近公開された観察結果（ナタラヤンら(Natarayan et al., 1999)）と一致して、
Ｒｅｔ-/- ニューロンがＧＦＲα１ ｍＲＮＡの発現を良く維持していることを
意味する。意外にも、我々はこれらのニューロン中にＧＤＮＦ依存性の急速な〔
Ｃａ2+〕i 上昇はこれまで認めなかったけれども、長期持続〔Ｃａ2+〕i 上昇は
、ニューロンの６０〜７０％で１０〜１００ｎｇ／ｍｌＧＤＮＦに反応して記録
された（図２Ｂ）（実験ｎ＝２１、ニューロン６１例の内４１例が反応した）。
対照実験では、ＤＲＧニューロンは、表面灌流溶液の変化、ぜん動ポンプのオン
／オフの短時間の切り替わり、または熱不活性化ＧＤＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）
の長期の添加に対して、〔Ｃａ2+〕i 上昇を伴っては反応しなかった（実験３回
、データは記載せず。実験条件は、野性型ＤＲＧニューロンを用いた実験と同じ
。図１Ｂ参照）。さらにＧＤＮＦの長期の添加に加えて、ＰＩ−ＰＬＣを用いて
前処理したＲｅｔ-/- ニューロン内でも〔Ｃａ2+〕i に影響しなかった（図２Ｃ
、記録３例）。野性型ＤＲＧニューロンを用いた実験の場合と同様に、ニューロ
ンの生存は、タプシガーギン（５μＭ）の細胞内貯蔵の欠乏によってもまたは５
０ｍＭ外部Ｋ+ により誘発されたニューロン脱分極によっても証明された（図２
Ｃ）。
Ｆの効果 Ｒｅｔチロシンキナーゼは、ＰＬＣγドッキング部位を介して細胞質ＰＬＣγ
を活性化でき（ボレロら(Borrello et al., 1996) ）、そしてこれはＩＰ3 産生
および引き続いてのＣａ2+放出に導くであろう。従って、我々は、Ｒｅｔ-/- マ
ウスから単離されたＤＲＧニューロン（シューテャートら(Schuchardt et al.,
1994) ）を用いるＧＤＮＦ誘発カルシウムシグナリング内でのＲｅｔの役割を評
価した。試験したＲｅｔ-/- ＤＲＧニューロン１８例の内１６例で、我々はＧＦ
Ｒα１ ｍＲＮＡを検出し（代表的なレーン１１例を図２Ａに示す）。これは最
近公開された観察結果（ナタラヤンら(Natarayan et al., 1999)）と一致して、
Ｒｅｔ-/- ニューロンがＧＦＲα１ ｍＲＮＡの発現を良く維持していることを
意味する。意外にも、我々はこれらのニューロン中にＧＤＮＦ依存性の急速な〔
Ｃａ2+〕i 上昇はこれまで認めなかったけれども、長期持続〔Ｃａ2+〕i 上昇は
、ニューロンの６０〜７０％で１０〜１００ｎｇ／ｍｌＧＤＮＦに反応して記録
された（図２Ｂ）（実験ｎ＝２１、ニューロン６１例の内４１例が反応した）。
対照実験では、ＤＲＧニューロンは、表面灌流溶液の変化、ぜん動ポンプのオン
／オフの短時間の切り替わり、または熱不活性化ＧＤＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）
の長期の添加に対して、〔Ｃａ2+〕i 上昇を伴っては反応しなかった（実験３回
、データは記載せず。実験条件は、野性型ＤＲＧニューロンを用いた実験と同じ
。図１Ｂ参照）。さらにＧＤＮＦの長期の添加に加えて、ＰＩ−ＰＬＣを用いて
前処理したＲｅｔ-/- ニューロン内でも〔Ｃａ2+〕i に影響しなかった（図２Ｃ
、記録３例）。野性型ＤＲＧニューロンを用いた実験の場合と同様に、ニューロ
ンの生存は、タプシガーギン（５μＭ）の細胞内貯蔵の欠乏によってもまたは５
０ｍＭ外部Ｋ+ により誘発されたニューロン脱分極によっても証明された（図２
Ｃ）。
【００５７】 実施例３ ＧＤＮＦはＲｅｔ陰性ＤＲＧニューロン内の内部貯蔵からのＣａ2+放出を開始さ
せる。
せる。
【００５８】 ＰＬＣγの活性化は、ＩＰ3 産生および引き続いてのＩＰ3 感受性貯蔵からの
Ｃａ2+放出に導くように見える。内部Ｃａ2+貯蔵上のＩＰ3 受容体をブロックす
るために、我々は、ＩＰ3 感受性Ｃａ2+放出チャンネルにおけるＩＰ3 結合部位
の競合的アンタゴニストである６ｋＤヘパリンを含む細胞内類似溶液と一緒にＤ
ＲＧニューロンを注入するか（ベリッジ(Berridge, 1998)）またはアレクサ(Ale
xa) ５６８蛍光染料との混合物内の試薬の飲作用添加を用いて細胞内にヘパリン
を添加した（実験ｎ＝２）。ヘパリン注入ニューロン内で、ＧＤＮＦは、生理食
塩水を注入した対照ニューロンと比較して、〔Ｃａ2+〕i の増加を誘発しなかっ
た（図２Ｄ）。ヘパリンおよびアレクサ染料を飲作用により添加されたニューロ
ンは、タプシガーギンおよび高い細胞外Ｋ+ 誘発脱分極の両方に対して反応して
〔Ｃａ2+〕i 上昇で応答した。しかし、これらは、１００ｎＭ ＧＤＮＦまたは
１０ｎＭ ＡＴＰには反応しなかった（データは記載せず）。ＧＤＮＦ誘発長期
持続〔Ｃａ2+〕i 上昇は、ＰＬＣγの阻害剤であるＵ−７３１２２を用いるＲｅ
ｔ-/- ニューロンの前処理により、完全に消失した。（実験ｎ＝３、データは記
載せず）。これらを一緒に考えると、これらの結果は、Ｒｅｔ陰性ＤＲＧニュー
ロンＧＤＮＦは、ＧＦＲα１／ＰＬＣγ結合経路を介してＩＰ3 感受性内部カル
シウム貯蔵からＣａ2+放出を開始できることを示す。
Ｃａ2+放出に導くように見える。内部Ｃａ2+貯蔵上のＩＰ3 受容体をブロックす
るために、我々は、ＩＰ3 感受性Ｃａ2+放出チャンネルにおけるＩＰ3 結合部位
の競合的アンタゴニストである６ｋＤヘパリンを含む細胞内類似溶液と一緒にＤ
ＲＧニューロンを注入するか（ベリッジ(Berridge, 1998)）またはアレクサ(Ale
xa) ５６８蛍光染料との混合物内の試薬の飲作用添加を用いて細胞内にヘパリン
を添加した（実験ｎ＝２）。ヘパリン注入ニューロン内で、ＧＤＮＦは、生理食
塩水を注入した対照ニューロンと比較して、〔Ｃａ2+〕i の増加を誘発しなかっ
た（図２Ｄ）。ヘパリンおよびアレクサ染料を飲作用により添加されたニューロ
ンは、タプシガーギンおよび高い細胞外Ｋ+ 誘発脱分極の両方に対して反応して
〔Ｃａ2+〕i 上昇で応答した。しかし、これらは、１００ｎＭ ＧＤＮＦまたは
１０ｎＭ ＡＴＰには反応しなかった（データは記載せず）。ＧＤＮＦ誘発長期
持続〔Ｃａ2+〕i 上昇は、ＰＬＣγの阻害剤であるＵ−７３１２２を用いるＲｅ
ｔ-/- ニューロンの前処理により、完全に消失した。（実験ｎ＝３、データは記
載せず）。これらを一緒に考えると、これらの結果は、Ｒｅｔ陰性ＤＲＧニュー
ロンＧＤＮＦは、ＧＦＲα１／ＰＬＣγ結合経路を介してＩＰ3 感受性内部カル
シウム貯蔵からＣａ2+放出を開始できることを示す。
【００５９】 実施例４ カルシウム移入に対するＧＤＮＦの効果 我々は、ＧＤＮＦ誘発の封鎖されたＣａ2+の放出に加えて、細胞外Ｃａ2+の移
入がＧＤＮＦを用いる刺激の後に観察された上昇したＣａ2+レベルの維持に関与
すると仮定した。さらに、ＤＲＧニューロン内の細胞内カルシウム貯蔵の欠乏が
実質的な容量的カルシウム移入をもたらすことが最近示された（ウサチェフら(U
sachev et al., 1999)）。Ｒｅｔ-/- ニューロン２４例の内１５例で、名目的に
Ｃａ2+を含まない外部溶液への切り替え（〔Ｃａ2+〕o 約２０μＭＣａ2+、形質
膜内外のカルシウム勾配はこの条件下でもまだ約２００倍であった）は、大きい
Ｃａ2+超過をもたらした（図３Ａ）。この超過は、２ｍＭ ＥＧＴＡを含む外部
溶液内に浸っている細胞内には決して観察されなかったので（〔Ｃａ2+〕o 約１
ｎＭ，記録ｎ＝１４、データは記載せず）、我々は、名目的にＣａ2+を含まない
溶液の一部の細胞の灌流は、非常に変動しやすいカルシウムプールの急速な欠乏
および同時に起きるカルシウムの容量的な移入をもたらすことを示唆した。正常
（２ｍＭカルシウム含有）細胞外溶液の再添加が追加的な大きいカルシウムの超
過をもたらすので、２０μＭ外部カルシウムでの細胞内貯蔵の再充足は、完全で
はなかった。低い細胞外カルシウムの存在下でのＧＤＮＦの再適用（図３Ａ）（
曲線は記録１５例の代表）は、名目的にカルシウムを含まない溶液のみの対照適
用と比較して、大量の〔Ｃａ2+〕i 超過および実質的に遅く低下する動態を誘発
した（図３Ａ）。我々は、ＧＤＮＦが、細胞内貯蔵の追加的欠乏を介するかまた
は形質膜カルシウム放出活性化チャンネル（ＣＲＡＣ）への直接作用を介して、
容量的カルシウム移入を遅延させていると結論した。実験の別の組で、我々は、
カルシウム移入の遅延した低下が、ＣＲＡＣに対するＧＤＮＦの直接作用に依存
するかどうかを試験した。これらの実験で、我々は、カルシウム超過の中間で、
名目的にカルシウムを含まない細胞外媒体からＧＤＮＦを取り除いた。３回の別
の実験でＲｅｔ-/- ＤＲＧニューロン内で行った記録１２例の代表的な曲線を図
３Ｂに示す。正常なカルシウム含有細胞外溶液内へのＧＤＮＦの添加（１００ｎ
ｇ／ｍｌ）は、洗浄期間で中断された通常の長期持続〔Ｃａ2+〕i 上昇をもたら
した。名目的にカルシウムを含まない（約２０μＭの遊離カルシウム含有）細胞
外溶液への切り替えは、大きいカルシウムの超過をもたらし、これは図３Ａに示
したものに類似している。〔Ｃａ2+〕i 低下の間に、ＧＤＮＦを外部媒体から取
り除いた（図３Ｂの矢印１で示す）。これは〔Ｃａ2+〕i の急速な低下をもたら
し、ＧＤＮＦが形質膜ＣＲＡＣに対する直接調節作用を有し、内部貯蔵からのカ
ルシウムの欠乏を通じて媒介される間接効果ではないことを示唆している。名目
的にカルシウムを含まない溶液内へのＧＤＮＦの再添加（１００ｎｇ／ｍｌ、矢
印２および３で示す）は、〔Ｃａ2+〕i の大きい増加をもたらした（図３Ｂ、記
録されたニューロン１２例）。
入がＧＤＮＦを用いる刺激の後に観察された上昇したＣａ2+レベルの維持に関与
すると仮定した。さらに、ＤＲＧニューロン内の細胞内カルシウム貯蔵の欠乏が
実質的な容量的カルシウム移入をもたらすことが最近示された（ウサチェフら(U
sachev et al., 1999)）。Ｒｅｔ-/- ニューロン２４例の内１５例で、名目的に
Ｃａ2+を含まない外部溶液への切り替え（〔Ｃａ2+〕o 約２０μＭＣａ2+、形質
膜内外のカルシウム勾配はこの条件下でもまだ約２００倍であった）は、大きい
Ｃａ2+超過をもたらした（図３Ａ）。この超過は、２ｍＭ ＥＧＴＡを含む外部
溶液内に浸っている細胞内には決して観察されなかったので（〔Ｃａ2+〕o 約１
ｎＭ，記録ｎ＝１４、データは記載せず）、我々は、名目的にＣａ2+を含まない
溶液の一部の細胞の灌流は、非常に変動しやすいカルシウムプールの急速な欠乏
および同時に起きるカルシウムの容量的な移入をもたらすことを示唆した。正常
（２ｍＭカルシウム含有）細胞外溶液の再添加が追加的な大きいカルシウムの超
過をもたらすので、２０μＭ外部カルシウムでの細胞内貯蔵の再充足は、完全で
はなかった。低い細胞外カルシウムの存在下でのＧＤＮＦの再適用（図３Ａ）（
曲線は記録１５例の代表）は、名目的にカルシウムを含まない溶液のみの対照適
用と比較して、大量の〔Ｃａ2+〕i 超過および実質的に遅く低下する動態を誘発
した（図３Ａ）。我々は、ＧＤＮＦが、細胞内貯蔵の追加的欠乏を介するかまた
は形質膜カルシウム放出活性化チャンネル（ＣＲＡＣ）への直接作用を介して、
容量的カルシウム移入を遅延させていると結論した。実験の別の組で、我々は、
カルシウム移入の遅延した低下が、ＣＲＡＣに対するＧＤＮＦの直接作用に依存
するかどうかを試験した。これらの実験で、我々は、カルシウム超過の中間で、
名目的にカルシウムを含まない細胞外媒体からＧＤＮＦを取り除いた。３回の別
の実験でＲｅｔ-/- ＤＲＧニューロン内で行った記録１２例の代表的な曲線を図
３Ｂに示す。正常なカルシウム含有細胞外溶液内へのＧＤＮＦの添加（１００ｎ
ｇ／ｍｌ）は、洗浄期間で中断された通常の長期持続〔Ｃａ2+〕i 上昇をもたら
した。名目的にカルシウムを含まない（約２０μＭの遊離カルシウム含有）細胞
外溶液への切り替えは、大きいカルシウムの超過をもたらし、これは図３Ａに示
したものに類似している。〔Ｃａ2+〕i 低下の間に、ＧＤＮＦを外部媒体から取
り除いた（図３Ｂの矢印１で示す）。これは〔Ｃａ2+〕i の急速な低下をもたら
し、ＧＤＮＦが形質膜ＣＲＡＣに対する直接調節作用を有し、内部貯蔵からのカ
ルシウムの欠乏を通じて媒介される間接効果ではないことを示唆している。名目
的にカルシウムを含まない溶液内へのＧＤＮＦの再添加（１００ｎｇ／ｍｌ、矢
印２および３で示す）は、〔Ｃａ2+〕i の大きい増加をもたらした（図３Ｂ、記
録されたニューロン１２例）。
【００６０】 実施例５ ＧＤＮＦは、Ｒｅｔ-/- ＤＲＧニューロン内のＧＦＲα１結合キナーゼ、ＭＡＰ
キナーゼおよびｃＡＭＰ反応エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）を活性化す
る。
キナーゼおよびｃＡＭＰ反応エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）を活性化す
る。
【００６１】 Ｒｅｔ欠損ＤＲＧニューロン中で〔Ｃａ2+〕i に対するＧＤＮＦの効果は、Ｇ
ＰＩ固定受容体の存在に特異的に依存するので、我々は、ＧＦＲα１のＲｅｔ非
依存性ＧＤＮＦ誘発活性化に連結するシグナリング経路に焦点を当てた。ＧＰＩ
固定タンパク質は、脂質ラフトに局在しており、そしてＳｒｃファミリーキナー
ゼに直接会合していることが示されている（ベリッジ(Berridge, 1998)、ハーダ
ーら(harder et al., 1998) ）。ＳｒｃファミリーチロシンキナーゼがＰＬＣγ
を基質として使用できることを示唆する多くの証拠がある（カーレら(Khare et
al., 1997)、ベリッジ(Berridge, 1998)、ハーダーら(harder et al., 1998) ）
。我々は、Ｒｅｔ-/- ニューロン内で、ＧＤＮＦ誘発、長期持続Ｃａ2+上昇が、
選択的Ｓｒｃキナーゼ阻害剤ＰＰ１の低用量により顕著にかつ可逆的に阻害され
ることを見いだした（図４Ａ、記録されたニューロン９例）。ＧＤＮＦ刺激Ｒｅ
ｔ-/- ＤＲＧニューロンからの抗ＧＦＲα１沈降トリトンＸ−１００不溶性溶解
物に対する生体外キナーゼアッセイは、約６０ｋＤの大幅なリン酸化を明らかに
し（図４Ｂ）、これは数個のＳｒｃタイプチロシンキナーゼのＭｒに相当する（
ｐ５９Ｆｙｎ、ｐｐ６０Ｓｒｃおよびｐ６２Ｙｅｎ）。これらの約６０ｋＤバン
ドは、対照の免疫沈降実験では存在しなかった（図４Ｂ）。
ＰＩ固定受容体の存在に特異的に依存するので、我々は、ＧＦＲα１のＲｅｔ非
依存性ＧＤＮＦ誘発活性化に連結するシグナリング経路に焦点を当てた。ＧＰＩ
固定タンパク質は、脂質ラフトに局在しており、そしてＳｒｃファミリーキナー
ゼに直接会合していることが示されている（ベリッジ(Berridge, 1998)、ハーダ
ーら(harder et al., 1998) ）。ＳｒｃファミリーチロシンキナーゼがＰＬＣγ
を基質として使用できることを示唆する多くの証拠がある（カーレら(Khare et
al., 1997)、ベリッジ(Berridge, 1998)、ハーダーら(harder et al., 1998) ）
。我々は、Ｒｅｔ-/- ニューロン内で、ＧＤＮＦ誘発、長期持続Ｃａ2+上昇が、
選択的Ｓｒｃキナーゼ阻害剤ＰＰ１の低用量により顕著にかつ可逆的に阻害され
ることを見いだした（図４Ａ、記録されたニューロン９例）。ＧＤＮＦ刺激Ｒｅ
ｔ-/- ＤＲＧニューロンからの抗ＧＦＲα１沈降トリトンＸ−１００不溶性溶解
物に対する生体外キナーゼアッセイは、約６０ｋＤの大幅なリン酸化を明らかに
し（図４Ｂ）、これは数個のＳｒｃタイプチロシンキナーゼのＭｒに相当する（
ｐ５９Ｆｙｎ、ｐｐ６０Ｓｒｃおよびｐ６２Ｙｅｎ）。これらの約６０ｋＤバン
ドは、対照の免疫沈降実験では存在しなかった（図４Ｂ）。
【００６２】 我々は、さらに、ＧＦＲα１結合キナーゼの活性化が、Ｒｅｔの不存在でセリ
ン／チロシンキナーゼＥＲＫ１およびＥＲＫ２（ＭＡＰＫ）のリン酸化に導くか
どうかの可能性を、ＳＲＣキナーゼがＭＡＰＫを活性化するのではないかという
こと（ディキッチら(Dikic et al., 1996)）に留意して検査した。リン酸化ＭＡ
ＰＫを認識する抗体を用いて、我々は、Ｅ１８Ｒｅｔ-/- マウスから単離された
ＤＲＧニューロン中で、ＧＤＮＦの適用（１００ｎｇ／ｍｌ）がＭＡＰＫの数倍
速い活性化を誘発したことを見いだした（実験ｎ＝３、図４Ｃ）。神経栄養因子
、例えばＢＤＮＦへのニューロンの暴露は、ＣＲＥＢリン酸化内で最高となるＲ
ａｓ／ＥＲＫ／ｐｐ９０リボソームＳ６キナーゼ経路を活性化する（フィンクベ
イナーら(Finkbeiner et al., 1997) ）。我々は、Ｓｅｒ−１３３におけるＣＲ
ＥＢリン酸化が、Ｒｅｔ-/- ＤＲＧニューロン中のＧＤＮＦ処理の５分後ですで
に実質的に増加したことを見いだした（図４Ｄ）。
ン／チロシンキナーゼＥＲＫ１およびＥＲＫ２（ＭＡＰＫ）のリン酸化に導くか
どうかの可能性を、ＳＲＣキナーゼがＭＡＰＫを活性化するのではないかという
こと（ディキッチら(Dikic et al., 1996)）に留意して検査した。リン酸化ＭＡ
ＰＫを認識する抗体を用いて、我々は、Ｅ１８Ｒｅｔ-/- マウスから単離された
ＤＲＧニューロン中で、ＧＤＮＦの適用（１００ｎｇ／ｍｌ）がＭＡＰＫの数倍
速い活性化を誘発したことを見いだした（実験ｎ＝３、図４Ｃ）。神経栄養因子
、例えばＢＤＮＦへのニューロンの暴露は、ＣＲＥＢリン酸化内で最高となるＲ
ａｓ／ＥＲＫ／ｐｐ９０リボソームＳ６キナーゼ経路を活性化する（フィンクベ
イナーら(Finkbeiner et al., 1997) ）。我々は、Ｓｅｒ−１３３におけるＣＲ
ＥＢリン酸化が、Ｒｅｔ-/- ＤＲＧニューロン中のＧＤＮＦ処理の５分後ですで
に実質的に増加したことを見いだした（図４Ｄ）。
【００６３】 実施例６ ＧＤＮＦはＳＨＥＰ神経芽細胞腫細胞内のＧＦＲα１結合ｐ６２Ｙｅｓタイプキ
ナーゼを刺激する。
ナーゼを刺激する。
【００６４】 我々は、ＳＨＥＰヒト神経芽細胞腫細胞株をＧＤＮＦ依存性非−Ｒｅｔシグナ
リングのこれ以上の探究のために使用した。ＳＨＥＰ細胞は、Ｒｅｔ ｍＲＮＡ
を欠いているが、しかしＧＦＲα１ｍＲＮＡ（図５Ａ）および大量のＧＦＲα１
タンパク質を発現する（データは記載せず）。平均してこれらの細胞内で、ＧＤ
ＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）は、ホスホイメージャー(phosphoimager) およびＴＩ
ＮＡプログラムを用いて、トリトンＸ−１００不溶性画分からの抗ＧＦＲα１抗
体との同時沈降で検出されたものより、Ｓｒｃタイプキナーゼ活性の約１２倍の
時間依存性増加誘発した（図５Ｂ）。ＧＤＮＦで活性化された特定のＳｒＣタイ
プキナーゼを特定するために、我々は抗Ｙｅｓ抗体を用いて細胞溶解物を沈降し
、そしてその後キナーゼアッセイを行った。ＧＦＲα１と同時沈降した主要なＧ
ＤＮＦ刺激キナーゼは、ｐ６２Ｙｅｓキナーゼと一緒に同時移動した（図５Ｃ）
。約７２〜７５ｋＤのＭｒを有するより他のタンパク質も、ＧＦＲα１抗体と同
時沈降した。タンパク質の性質は未知である。
リングのこれ以上の探究のために使用した。ＳＨＥＰ細胞は、Ｒｅｔ ｍＲＮＡ
を欠いているが、しかしＧＦＲα１ｍＲＮＡ（図５Ａ）および大量のＧＦＲα１
タンパク質を発現する（データは記載せず）。平均してこれらの細胞内で、ＧＤ
ＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）は、ホスホイメージャー(phosphoimager) およびＴＩ
ＮＡプログラムを用いて、トリトンＸ−１００不溶性画分からの抗ＧＦＲα１抗
体との同時沈降で検出されたものより、Ｓｒｃタイプキナーゼ活性の約１２倍の
時間依存性増加誘発した（図５Ｂ）。ＧＤＮＦで活性化された特定のＳｒＣタイ
プキナーゼを特定するために、我々は抗Ｙｅｓ抗体を用いて細胞溶解物を沈降し
、そしてその後キナーゼアッセイを行った。ＧＦＲα１と同時沈降した主要なＧ
ＤＮＦ刺激キナーゼは、ｐ６２Ｙｅｓキナーゼと一緒に同時移動した（図５Ｃ）
。約７２〜７５ｋＤのＭｒを有するより他のタンパク質も、ＧＦＲα１抗体と同
時沈降した。タンパク質の性質は未知である。
【００６５】 実施例７ ＧＤＮＦはＳＨＥＰ細胞内のＥＲＫ１／ＥＲＫ２、ＣＲＥＢおよびＣＲＥＢ関連
タンパク質ＡＴＦ−１を活性化する。
タンパク質ＡＴＦ−１を活性化する。
【００６６】 ＳＨＥＰ細胞内で、ＧＤＮＦの適用（１００ｎｇ／ｍｌ）は、Ｒｅｔ-/- ＤＲ
Ｇニューロン内と同様の迅速なＭＡＰＫ活性化を誘発した（実験ｎ＝３、図６Ａ
、図４Ｃと比較のこと）。Ｒｅｔ-/- Ｅ１８ＤＲＧニューロン内およびＳＨＥＰ
神経芽細胞腫細胞内のＭＡＰＫ活性化の急速なパターンは、Ｒｅｔ／ＧＦＲα１
発現細胞内で観察されたＭＡＰＫリン酸化の長期持続上昇とは異なる（トルップ
ら(Trupp et al., 1999)）。ＭＡＰＫのＧＤＮＦ依存性リン酸化は、Ｓｒｃタイ
プキナーゼ阻害剤ＰＰ２により、すでに低濃度（１μＭ）でもほぼ完全にブロッ
クされた（図６Ｂ、別の実験ｎ＝２）。ＰＰ２がＳｒｃタイプキナーゼ以外に影
響した可能性を除外するために、我々はＰＣ１２細胞内のＮＧＦ媒介ＭＡＰＫ活
性化に対するＰＰ２の効果を検査した。ＰＰ２（０．１〜１０μＭ）は、ＰＣ１
２内のＭＡＰＫのＮＧＦ依存性活性化には影響しなかった（データは記載せず）
。
Ｇニューロン内と同様の迅速なＭＡＰＫ活性化を誘発した（実験ｎ＝３、図６Ａ
、図４Ｃと比較のこと）。Ｒｅｔ-/- Ｅ１８ＤＲＧニューロン内およびＳＨＥＰ
神経芽細胞腫細胞内のＭＡＰＫ活性化の急速なパターンは、Ｒｅｔ／ＧＦＲα１
発現細胞内で観察されたＭＡＰＫリン酸化の長期持続上昇とは異なる（トルップ
ら(Trupp et al., 1999)）。ＭＡＰＫのＧＤＮＦ依存性リン酸化は、Ｓｒｃタイ
プキナーゼ阻害剤ＰＰ２により、すでに低濃度（１μＭ）でもほぼ完全にブロッ
クされた（図６Ｂ、別の実験ｎ＝２）。ＰＰ２がＳｒｃタイプキナーゼ以外に影
響した可能性を除外するために、我々はＰＣ１２細胞内のＮＧＦ媒介ＭＡＰＫ活
性化に対するＰＰ２の効果を検査した。ＰＰ２（０．１〜１０μＭ）は、ＰＣ１
２内のＭＡＰＫのＮＧＦ依存性活性化には影響しなかった（データは記載せず）
。
【００６７】 我々はさらに、ＧＤＮＦがＣＲＥＢのリン酸化に影響するかどうかを研究し、
そして我々は、ＧＤＮＦがＳｅｒ−１３３部位においてＣＲＥＢのリン酸化を強
力に誘導することを見いだした（図６Ｃ、実験ｎ＝２）。興味あることに、ＧＤ
ＮＦはＣＲＥＢ関連タンパク質ＡＴＦ−１のリン酸化も誘導した（図６Ｃ）。Ｇ
ＤＮＦ誘導Ｒｅｔ非依存性のＣＲＥＢおよびＡＴＦ−１リン酸化の動力学は、Ｇ
ＤＮＦ誘導ＭＡＰＫリン酸化のものと類似していた。
そして我々は、ＧＤＮＦがＳｅｒ−１３３部位においてＣＲＥＢのリン酸化を強
力に誘導することを見いだした（図６Ｃ、実験ｎ＝２）。興味あることに、ＧＤ
ＮＦはＣＲＥＢ関連タンパク質ＡＴＦ−１のリン酸化も誘導した（図６Ｃ）。Ｇ
ＤＮＦ誘導Ｒｅｔ非依存性のＣＲＥＢおよびＡＴＦ−１リン酸化の動力学は、Ｇ
ＤＮＦ誘導ＭＡＰＫリン酸化のものと類似していた。
【００６８】 実施例８ ＧＤＮＦはＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞内のＥＲＫ１／ＥＲＫ２の活性化を、Ｓｒｃ
タイプキナーゼを介して誘導する。
タイプキナーゼを介して誘導する。
【００６９】 ＧＦＲα１を用いて安定して移行されるＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ
３／ｐＢｐＧＦＲα１）は、Ｒｅｔを発現しないので、従ってＧＤＮＦ誘発Ｒｅ
ｔ非依存性シグナリングの研究のための非ニューロン細胞株として使用した。Ｓ
ｒｃタイプキナーゼもこれらの細胞内のＧＦＲα１抗体と同時沈降できる（実験
ｎ＝２、図７Ａ）。Ｒｅｔ-/- ＤＲＧニューロン内およびＳＨＥＰ神経芽細胞腫
細胞内の迅速な活性化と比較してＭＡＰＫ活性化は遅れるけれども、ＧＤＮＦ（
１００ｎｇ／ｍｌ）は、この場合にも３Ｔ３ＮＩＨ／ｐＢｐＧＦＲα１繊維芽細
胞内のＭＡＰＫのリン酸化を再現可能的に増加する（実験ｎ＝３、図７Ｂ）。Ｐ
Ｐ２の適用（５μＭ）は、この場合にも３Ｔ３ＮＩＨ／ｐＢｐＧＦＲα１細胞内
のＧＤＮＦ誘発ＭＡＰＫリン酸化を排除した（図７Ｂ、右の図、実験ｎ＝２）。
ＲｅｔおよびＧＦＲα１の両方を欠いている親のＮＩＨ３Ｔ３神経芽細胞内で、
単独または可溶性ＧＦＲα１（ＧＰＩアンカーを欠くＧＦＲα１／Ｆｃ、１μｇ
／ｍｌ）と一緒のＧＤＮＦの適用（１００ｎｇ／ｍｌ）は、いかなるＭＡＰＫリ
ン酸化も誘発しなかった（データは記載せず）。ＧＤＮＦの存在下で、可溶性Ｇ
ＦＲα１は、内因性ＧＦＲα１を欠き、しかしＲｅｔを発現するＮｅｕｒｏ２Ａ
神経芽細胞腫細胞内のＭＡＰＫをリン酸化できた（図７Ｃ）。
３／ｐＢｐＧＦＲα１）は、Ｒｅｔを発現しないので、従ってＧＤＮＦ誘発Ｒｅ
ｔ非依存性シグナリングの研究のための非ニューロン細胞株として使用した。Ｓ
ｒｃタイプキナーゼもこれらの細胞内のＧＦＲα１抗体と同時沈降できる（実験
ｎ＝２、図７Ａ）。Ｒｅｔ-/- ＤＲＧニューロン内およびＳＨＥＰ神経芽細胞腫
細胞内の迅速な活性化と比較してＭＡＰＫ活性化は遅れるけれども、ＧＤＮＦ（
１００ｎｇ／ｍｌ）は、この場合にも３Ｔ３ＮＩＨ／ｐＢｐＧＦＲα１繊維芽細
胞内のＭＡＰＫのリン酸化を再現可能的に増加する（実験ｎ＝３、図７Ｂ）。Ｐ
Ｐ２の適用（５μＭ）は、この場合にも３Ｔ３ＮＩＨ／ｐＢｐＧＦＲα１細胞内
のＧＤＮＦ誘発ＭＡＰＫリン酸化を排除した（図７Ｂ、右の図、実験ｎ＝２）。
ＲｅｔおよびＧＦＲα１の両方を欠いている親のＮＩＨ３Ｔ３神経芽細胞内で、
単独または可溶性ＧＦＲα１（ＧＰＩアンカーを欠くＧＦＲα１／Ｆｃ、１μｇ
／ｍｌ）と一緒のＧＤＮＦの適用（１００ｎｇ／ｍｌ）は、いかなるＭＡＰＫリ
ン酸化も誘発しなかった（データは記載せず）。ＧＤＮＦの存在下で、可溶性Ｇ
ＦＲα１は、内因性ＧＦＲα１を欠き、しかしＲｅｔを発現するＮｅｕｒｏ２Ａ
神経芽細胞腫細胞内のＭＡＰＫをリン酸化できた（図７Ｃ）。
【００７０】 実施例９ ＧＤＮＦはＳＨＥＰ細胞中のＰＬＣγを一過性に活性化するが、ＪＮＫは活性化
しない。
しない。
【００７１】 我々はさらに、ＧＤＮＦがＳＨＥＰ細胞中のＰＬＣγ活性化を開始できるかど
うかを研究した。ＧＤＮＦ（１〜１００ｎｇ／ｍｌ）を用いるＳＨＥＰ神経芽細
胞腫細胞の処理は、ＰＬＣγチロシンリン酸化を著しく増加した（実験ｎ＝３、
図８Ａ）。この効果は急速で、１分で著しく増加し、そして５分以内に基礎チロ
シンリン酸化レベルに復帰した（図８Ｂ）。ＰＣ１２内の内因性Ｒｅｔの活性化
ならびに一過性または安定に発現されたＣＯＳ−１またはＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細
胞内のＲｅｔの活性化は、ｃ−Ｊｕｎ ＮＨ２−末端タンパク質キナーゼ（ＪＮ
Ｋ）のリン酸化に導くことが示された（キアリエロら(Chiariello et al., 1998
) ）。我々の実験で、ＧＤＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）は、Ｒｅｔを欠くＳＨＥＰ
細胞内でＪＮＫ活性化を誘発しなかった（ｎ＝２実験、図８Ｃ）。
うかを研究した。ＧＤＮＦ（１〜１００ｎｇ／ｍｌ）を用いるＳＨＥＰ神経芽細
胞腫細胞の処理は、ＰＬＣγチロシンリン酸化を著しく増加した（実験ｎ＝３、
図８Ａ）。この効果は急速で、１分で著しく増加し、そして５分以内に基礎チロ
シンリン酸化レベルに復帰した（図８Ｂ）。ＰＣ１２内の内因性Ｒｅｔの活性化
ならびに一過性または安定に発現されたＣＯＳ−１またはＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細
胞内のＲｅｔの活性化は、ｃ−Ｊｕｎ ＮＨ２−末端タンパク質キナーゼ（ＪＮ
Ｋ）のリン酸化に導くことが示された（キアリエロら(Chiariello et al., 1998
) ）。我々の実験で、ＧＤＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）は、Ｒｅｔを欠くＳＨＥＰ
細胞内でＪＮＫ活性化を誘発しなかった（ｎ＝２実験、図８Ｃ）。
【００７２】 上記の実施例は、本発明を説明することを意図しており、いかなる意味でも本
発明を限定するとは解釈されない。当該技術分野の熟練者は、本発明の精神およ
び範囲の内での変更を認めるであろう。
発明を限定するとは解釈されない。当該技術分野の熟練者は、本発明の精神およ
び範囲の内での変更を認めるであろう。
【００７３】
本明細書中に引用されるすべての参考文献は、これらの全体を引用することに
より本明細書に編入する。
より本明細書に編入する。
【００７４】
【表１】
【００７５】
【表２】
【００７６】
【表３】
【００７７】
【表４】
【００７８】
【表５】
【００７９】
【表６】
【００８０】
【表７】
【００８１】
【表８】
【００８２】
【表９】
【００８３】
【表１０】
【００８４】
【表１１】
【図１】 図１Ａ〜Ｇは、野性型マウスＤＲＧニューロン内でのＧＤＮＦ誘発の急速およ
び長期持続〔Ｃａ2+〕i 変化を描いている。縦棒は、１００ｎＭのデルタ〔Ｃａ 2+ 〕i 変化を示す。Ａ．ニューロンに１０μＭＣａ−グリーン１ＡＭを加えた。
記載の浴に加えた１０〜１００ｎｇ／ｍｌＧＤＮＦの濃度増加は、〔Ｃａ2+〕i
に急速および長期持続性の上昇を誘発した（別々の実験ｎ＝１５、少なくとも３
〜４例のニューロンが各実験で記録された）。Ｂ．９８℃で１５分間熱不活性化
した１００ｎｇ／ｍｌＧＤＮＦは、〔Ｃａ2+〕i に変化を誘発しなかった（記録
された細胞８例）。これらの代表的な記録２例の中に、内部カルシウム貯蔵の機
能を証明するために、タプシガーギン（５μＭ）（Ｔｈａ）を実験の終わりに加
えた。Ｃ．ＲＴ−ＰＣＲは、野性型ＤＲＧニューロンがＲｅｔ（２８４ｂｐ断片
）、ＧＦＲα１（７４６ｂｐ断片）、およびＧＦＲα２（４２９ｂｐ断片）ｍＲ
ＮＡを発現することを示した。神経フィラメント軽鎖（ＮＦ−Ｌ、６４４ｂｐ断
片）をニューロンｍＲＮＡに対する陽性対照として使用した。Ｈ2 Ｏレーンは、
ｍＲＮＡを加えない陰性対照を示している。分子量マーカーのサイズを右端に示
す。Ｄ．１Ｕ／ｍｌ ＰＩ−ＰＬＣを用いる前処理は、ＧＤＮＦ誘発〔Ｃａ2+〕 i 上昇を消去する。Ｅ．５μＭタプシガーギンを用いる前処理は、ＧＤＮＦの効
果を消去する。Ｆ．ＰＬＣγ阻害剤Ｕ−７３１２２を用いる前処理も、ＧＤＮＦ
の効果の消失をもたらす。Ｇ．ＧＤＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）は、一過性および
持続性の両方の〔Ｃａ2+〕i 上昇をＧＦＲα２陰性（ＧＦＲα２-/- ）マウスか
ら単離したＥ１８ＤＲＧニューロン中に誘発する（記録したニューロン９例）。
これらのニューロン内で、外部Ｃａ2+の名目的な除去（ＥＧＴＡ添加せず、約２
０μＭ遊離Ｃａ2+）は、〔Ｃａ2+〕i の迅速な低下に導く。この条件下で、ＧＤ
ＮＦの添加は、急速、一過性およびしばしば振動的な反応をこれらすべての細胞
内で誘発する。外部Ｃａ2+の再添加（ウオッシュアウト(wash out)）は、ＧＦＲ
α２-/- 中（記録したニューロン９例）ならびに野性型ＤＲＧニューロン中（記
録したニューロン８例）の両方に〔Ｃａ2+〕i 上昇を誘発した。
び長期持続〔Ｃａ2+〕i 変化を描いている。縦棒は、１００ｎＭのデルタ〔Ｃａ 2+ 〕i 変化を示す。Ａ．ニューロンに１０μＭＣａ−グリーン１ＡＭを加えた。
記載の浴に加えた１０〜１００ｎｇ／ｍｌＧＤＮＦの濃度増加は、〔Ｃａ2+〕i
に急速および長期持続性の上昇を誘発した（別々の実験ｎ＝１５、少なくとも３
〜４例のニューロンが各実験で記録された）。Ｂ．９８℃で１５分間熱不活性化
した１００ｎｇ／ｍｌＧＤＮＦは、〔Ｃａ2+〕i に変化を誘発しなかった（記録
された細胞８例）。これらの代表的な記録２例の中に、内部カルシウム貯蔵の機
能を証明するために、タプシガーギン（５μＭ）（Ｔｈａ）を実験の終わりに加
えた。Ｃ．ＲＴ−ＰＣＲは、野性型ＤＲＧニューロンがＲｅｔ（２８４ｂｐ断片
）、ＧＦＲα１（７４６ｂｐ断片）、およびＧＦＲα２（４２９ｂｐ断片）ｍＲ
ＮＡを発現することを示した。神経フィラメント軽鎖（ＮＦ−Ｌ、６４４ｂｐ断
片）をニューロンｍＲＮＡに対する陽性対照として使用した。Ｈ2 Ｏレーンは、
ｍＲＮＡを加えない陰性対照を示している。分子量マーカーのサイズを右端に示
す。Ｄ．１Ｕ／ｍｌ ＰＩ−ＰＬＣを用いる前処理は、ＧＤＮＦ誘発〔Ｃａ2+〕 i 上昇を消去する。Ｅ．５μＭタプシガーギンを用いる前処理は、ＧＤＮＦの効
果を消去する。Ｆ．ＰＬＣγ阻害剤Ｕ−７３１２２を用いる前処理も、ＧＤＮＦ
の効果の消失をもたらす。Ｇ．ＧＤＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）は、一過性および
持続性の両方の〔Ｃａ2+〕i 上昇をＧＦＲα２陰性（ＧＦＲα２-/- ）マウスか
ら単離したＥ１８ＤＲＧニューロン中に誘発する（記録したニューロン９例）。
これらのニューロン内で、外部Ｃａ2+の名目的な除去（ＥＧＴＡ添加せず、約２
０μＭ遊離Ｃａ2+）は、〔Ｃａ2+〕i の迅速な低下に導く。この条件下で、ＧＤ
ＮＦの添加は、急速、一過性およびしばしば振動的な反応をこれらすべての細胞
内で誘発する。外部Ｃａ2+の再添加（ウオッシュアウト(wash out)）は、ＧＦＲ
α２-/- 中（記録したニューロン９例）ならびに野性型ＤＲＧニューロン中（記
録したニューロン８例）の両方に〔Ｃａ2+〕i 上昇を誘発した。
【図２】 図２Ａ〜Ｄは、Ｒｅｔ-/- （Ｒｅｔ陰性）ＤＲＧニューロン内のヘパリン感受
性内部カルシウム貯蔵からのＧＤＮＦ開始Ｃａ2+放出を描いている。Ａ．単一細
胞ＲＴ−ＰＣＲを１８Ｒｅｔ-/- ＤＲＧニューロン中で行った。上パネルは、１
１細胞内のＧＦＲα１ ｍＲＮＡ発現パターンを示す。シクロフィリン（ＣＰ、
下図）を対照として使用した。試験したニューロン１８例中１６例がＧＦＲα１
ｍＲＮＡを発現した。Ｂ．ＧＤＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）は、Ｒｅｔ-/- ＤＲ
Ｇニューロン中に長期持続Ｃａ2+上昇を誘発した（２曲線は、記録４１例の代表
である）。縦棒は１００ｎＭのｄ〔Ｃａ2+〕i 変化を示す。Ｃ．ＰＩ−ＰＬＣを
用いる前処理（１Ｕ／ｍｌ、１時間、３７℃）は、膜からのＧＰＩ固定タンパク
質の除去によるＧＤＮＦの効果を消失する。実験の終点における細胞の生存を検
査するために、ニューロンをタプシガーギン（５μＭ）を用いて処理し、そして
５０ｍＭ Ｋ+ を用いて脱分極もした。タプシガーギンまたはＫ+ 処理の後に、
〔Ｃａ2+〕i は、一過性に増加し、内部Ｃａ2+貯蔵および電圧作動性Ｃａ2+チャ
ンネルが機能していることを示す。縦棒は１００ｎＭのｄ〔Ｃａ2+〕i 変化を示
す。Ｄ．２回の別々の実験で、Ｃａ−グリーンを前添加したニューロンの部分に
ヘパリンを注入した。対照ニューロンには溶剤を注入した。ヘパリン注入ニュー
ロン（＃２で示す。下の曲線、ニューロンｎ＝３）は、ＧＤＮＦ添加に対して著
しくは反応しなかったが、対照ニューロンは長期持続〔Ｃａ2+〕i 上昇に反応し
、これはウオッシュアウトの間にゆっくりと低下した（＃１で示す。下の曲線、
ニューロンｎ＝３）。縦棒は１００ｎＭのｄ〔Ｃａ2+〕i 変化を示す。
性内部カルシウム貯蔵からのＧＤＮＦ開始Ｃａ2+放出を描いている。Ａ．単一細
胞ＲＴ−ＰＣＲを１８Ｒｅｔ-/- ＤＲＧニューロン中で行った。上パネルは、１
１細胞内のＧＦＲα１ ｍＲＮＡ発現パターンを示す。シクロフィリン（ＣＰ、
下図）を対照として使用した。試験したニューロン１８例中１６例がＧＦＲα１
ｍＲＮＡを発現した。Ｂ．ＧＤＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）は、Ｒｅｔ-/- ＤＲ
Ｇニューロン中に長期持続Ｃａ2+上昇を誘発した（２曲線は、記録４１例の代表
である）。縦棒は１００ｎＭのｄ〔Ｃａ2+〕i 変化を示す。Ｃ．ＰＩ−ＰＬＣを
用いる前処理（１Ｕ／ｍｌ、１時間、３７℃）は、膜からのＧＰＩ固定タンパク
質の除去によるＧＤＮＦの効果を消失する。実験の終点における細胞の生存を検
査するために、ニューロンをタプシガーギン（５μＭ）を用いて処理し、そして
５０ｍＭ Ｋ+ を用いて脱分極もした。タプシガーギンまたはＫ+ 処理の後に、
〔Ｃａ2+〕i は、一過性に増加し、内部Ｃａ2+貯蔵および電圧作動性Ｃａ2+チャ
ンネルが機能していることを示す。縦棒は１００ｎＭのｄ〔Ｃａ2+〕i 変化を示
す。Ｄ．２回の別々の実験で、Ｃａ−グリーンを前添加したニューロンの部分に
ヘパリンを注入した。対照ニューロンには溶剤を注入した。ヘパリン注入ニュー
ロン（＃２で示す。下の曲線、ニューロンｎ＝３）は、ＧＤＮＦ添加に対して著
しくは反応しなかったが、対照ニューロンは長期持続〔Ｃａ2+〕i 上昇に反応し
、これはウオッシュアウトの間にゆっくりと低下した（＃１で示す。下の曲線、
ニューロンｎ＝３）。縦棒は１００ｎＭのｄ〔Ｃａ2+〕i 変化を示す。
【図３】 図３Ａ〜Ｅは、Ｒｅｔ-/- ＤＲＧニューロン中のＧＤＮＦ誘発カルシウム移入
を描いている。Ａ．ＤＲＧニューロンの部分で、名目的にＣａ2+を含まない細胞
外溶液（ＥＧＴＡ添加なし）の適用は、多分容量的カルシウム移入の活性化によ
る遅延した一過性〔Ｃａ2+〕i 上昇をもたらす（記録されたニューロン１５例）
、この〔Ｃａ2+〕i 超過は、名目的にＣａ2+を含まない外部溶液内のカルシウム
濃度が２ｍＭ ＥＧＴＡを用いて約１ｎＭに固定された場合には、観察されなか
った（記録されたニューロン１４例、データ記載せず）。２ｍＭ外部Ｃａ2+（ウ
オッシュアウト）への復帰は、大きい〔Ｃａ2+〕i 超過をもたらし、Ｃａ2+に対
する増加した膜透過性を示す。ＧＤＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下での名目
的にＣａ2+を含まない外部媒体への切り替え復帰は、〔Ｃａ2+〕i 低下の著しく
引き延ばされた動態を伴う〔Ｃａ2+〕i の一過性上昇をもたらした。これは、静
止した膜ポテンシャルにおて、ＧＤＮＦは、内部貯蔵のさらに大きい欠乏を経由
するか、または形質膜内のカルシウムチャンネルへの直接作用によるかのいずれ
かにより容量的カルシウム移入を引き延ばすことができることを示す。曲線は、
独立した実験３回で行った記録１４例の代表である。Ｂ．Ｒｅｔ-/- ＤＲＧニュ
ーロン内に正常な細胞外Ｃａ2+濃度の存在下および名目的にＣａ2+を含まない溶
液の存在下の両方でＧＤＮＦを反復して加えた。正常なカルシウム細胞外溶液中
のＧＤＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の適用は、典型的な長期持続Ｃａ2+上昇を誘発
し、これはウオッシュアウトにより逆転できる。ＧＤＮＦの連続的存在下での名
目的にＣａ2+を含まない外部溶液への切り替えは、大きい（そして記録１２例の
内５例では振動的な）〔Ｃａ2+〕i の増加および引き続いて〔Ｃａ2+〕i の緩徐
な低下をもたらした。ＧＤＮＦの取り除き（矢印１で示す）は、著しい〔Ｃａ2+ 〕i の低下に導く。ＧＤＮＦを再度加えると、〔Ｃａ2+〕i の急速な上昇に導く
（矢印２および３）（記録ニューロン１２例）。正常な外部Ｃａ2+を含む溶液へ
切替えて復帰すると、〔Ｃａ2+〕i の追加的な容量的超過をもたらす。
を描いている。Ａ．ＤＲＧニューロンの部分で、名目的にＣａ2+を含まない細胞
外溶液（ＥＧＴＡ添加なし）の適用は、多分容量的カルシウム移入の活性化によ
る遅延した一過性〔Ｃａ2+〕i 上昇をもたらす（記録されたニューロン１５例）
、この〔Ｃａ2+〕i 超過は、名目的にＣａ2+を含まない外部溶液内のカルシウム
濃度が２ｍＭ ＥＧＴＡを用いて約１ｎＭに固定された場合には、観察されなか
った（記録されたニューロン１４例、データ記載せず）。２ｍＭ外部Ｃａ2+（ウ
オッシュアウト）への復帰は、大きい〔Ｃａ2+〕i 超過をもたらし、Ｃａ2+に対
する増加した膜透過性を示す。ＧＤＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下での名目
的にＣａ2+を含まない外部媒体への切り替え復帰は、〔Ｃａ2+〕i 低下の著しく
引き延ばされた動態を伴う〔Ｃａ2+〕i の一過性上昇をもたらした。これは、静
止した膜ポテンシャルにおて、ＧＤＮＦは、内部貯蔵のさらに大きい欠乏を経由
するか、または形質膜内のカルシウムチャンネルへの直接作用によるかのいずれ
かにより容量的カルシウム移入を引き延ばすことができることを示す。曲線は、
独立した実験３回で行った記録１４例の代表である。Ｂ．Ｒｅｔ-/- ＤＲＧニュ
ーロン内に正常な細胞外Ｃａ2+濃度の存在下および名目的にＣａ2+を含まない溶
液の存在下の両方でＧＤＮＦを反復して加えた。正常なカルシウム細胞外溶液中
のＧＤＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の適用は、典型的な長期持続Ｃａ2+上昇を誘発
し、これはウオッシュアウトにより逆転できる。ＧＤＮＦの連続的存在下での名
目的にＣａ2+を含まない外部溶液への切り替えは、大きい（そして記録１２例の
内５例では振動的な）〔Ｃａ2+〕i の増加および引き続いて〔Ｃａ2+〕i の緩徐
な低下をもたらした。ＧＤＮＦの取り除き（矢印１で示す）は、著しい〔Ｃａ2+ 〕i の低下に導く。ＧＤＮＦを再度加えると、〔Ｃａ2+〕i の急速な上昇に導く
（矢印２および３）（記録ニューロン１２例）。正常な外部Ｃａ2+を含む溶液へ
切替えて復帰すると、〔Ｃａ2+〕i の追加的な容量的超過をもたらす。
【図４】 図４Ａ〜Ｄは、Ｒｅｔ-/- ＤＲＧニューロン内のＧＦＲα１関連Ｓｒｃキナー
ゼ、ＭＡＰキナーゼおよびＣＲＥＢのＧＤＮＦ活性化を描いている。Ａ．Ｓｒｃ
ファミリーチロシンキナーゼの特異性阻害剤であるＰＰ１（１０μＭ）は、Ｒｅ
ｔ-/- ＤＲＧニューロン内のＧＤＮＦ誘発長期持続〔Ｃａ2+〕i 上昇を可逆的に
ブロックした。曲線は記録６例の代表である。Ｂ．パネル１．ＧＤＮＦ（１００
ｎｇ／ｍｌ、５分間）−刺激Ｒｅｔ-/- マウスＤＲＧニューロンの溶解物からの
トリトンＸ−１００不溶性画分をＧＦＲα１抗体と一緒に免疫沈降（ＩＰ）した
。免疫沈降物を生体外キナーゼアッセイで試験し、そして大きくリン酸化された
約６０ｋＤバンドが現れた。パネル２．このバンドは、Ｒｅｔ-/- ＤＲＧニュー
ロンで行った対照キナーゼアッセイでは、タンパク質Ａセファロース単独を用い
て（ａ）もまたはＧＦＲα１抗体の代わりにｂＦＧＦ抗体を用いて（ｂ）も見ら
れなかった。Ｃ．Ｒｅｔ-/- ＤＲＧニューロン中でのｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰＫ
キナーゼの迅速なＧＤＮＦ誘導リン酸化（上パネル）。レーン下の数字は、対照
に対するｐ４２バンドリン酸化の誘導倍数を示す。バンドの光学密度の決定は、
ソフトウエアＴＩＮＡを用いて行った。下パネルは、ウエスタンブロッティング
法（ＷＢ）による抗ＧＦＲα１ ｍＡｂを用いた同じフィルターの再プロービン
グを示す（独立した実験ｎ＝３）。Ｄ．ＧＤＮＦは、ＧＤＮＦＳｅｒ−１３３リ
ン酸化に大きい増加を誘導した。レーン下の数字は、対照に対するＧＤＮＦリン
酸化の誘導倍数を示す。下パネルは、抗ＣＲＥＢ抗体を用いた同じフィルターの
再プロービングを示し、そしてすべてのレーンでの同程度の量のＣＲＥＢタンパ
ク質を示す。
ゼ、ＭＡＰキナーゼおよびＣＲＥＢのＧＤＮＦ活性化を描いている。Ａ．Ｓｒｃ
ファミリーチロシンキナーゼの特異性阻害剤であるＰＰ１（１０μＭ）は、Ｒｅ
ｔ-/- ＤＲＧニューロン内のＧＤＮＦ誘発長期持続〔Ｃａ2+〕i 上昇を可逆的に
ブロックした。曲線は記録６例の代表である。Ｂ．パネル１．ＧＤＮＦ（１００
ｎｇ／ｍｌ、５分間）−刺激Ｒｅｔ-/- マウスＤＲＧニューロンの溶解物からの
トリトンＸ−１００不溶性画分をＧＦＲα１抗体と一緒に免疫沈降（ＩＰ）した
。免疫沈降物を生体外キナーゼアッセイで試験し、そして大きくリン酸化された
約６０ｋＤバンドが現れた。パネル２．このバンドは、Ｒｅｔ-/- ＤＲＧニュー
ロンで行った対照キナーゼアッセイでは、タンパク質Ａセファロース単独を用い
て（ａ）もまたはＧＦＲα１抗体の代わりにｂＦＧＦ抗体を用いて（ｂ）も見ら
れなかった。Ｃ．Ｒｅｔ-/- ＤＲＧニューロン中でのｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰＫ
キナーゼの迅速なＧＤＮＦ誘導リン酸化（上パネル）。レーン下の数字は、対照
に対するｐ４２バンドリン酸化の誘導倍数を示す。バンドの光学密度の決定は、
ソフトウエアＴＩＮＡを用いて行った。下パネルは、ウエスタンブロッティング
法（ＷＢ）による抗ＧＦＲα１ ｍＡｂを用いた同じフィルターの再プロービン
グを示す（独立した実験ｎ＝３）。Ｄ．ＧＤＮＦは、ＧＤＮＦＳｅｒ−１３３リ
ン酸化に大きい増加を誘導した。レーン下の数字は、対照に対するＧＤＮＦリン
酸化の誘導倍数を示す。下パネルは、抗ＣＲＥＢ抗体を用いた同じフィルターの
再プロービングを示し、そしてすべてのレーンでの同程度の量のＣＲＥＢタンパ
ク質を示す。
【図５】 図Ａ〜Ｃは、Ｒｅｔ陰性ヒトＳＨＥＰ神経芽細胞腫細胞株中のＧＦＲα１と会
合するＧＤＮＦ刺激Ｓｒｃタイプキナーゼを描いている。Ａ．ＲＴ−ＰＣＲ分析
は、ＳＨＥＰ細胞がＧＦＲα１（５３８ｂｐ断片）のみを発現し、ＧＦＲα２も
Ｒｅｔ ｍＲＮＡも発現しないことを示す（それぞれ２８０および２８１ｂｐの
期待される断片）。Ｈ2 Ｏ対照は、図１Ｃに示したものと同じである。Ｂ．上パ
ネル：ＳＨＥＰ細胞の溶解物からのトリトンＸ−１００不溶性画分を抗ＧＦＲα
１抗体と一緒に免疫沈降（ＩＰ）し、そして材料および方法のセクションに記載
のようにして生体外キナーゼ活性のアッセイを行った。細胞は、非処理（０分）
または指定の時間、１００ｎｇ／ｍｌＧＤＮＦを用いて処理した。バンドの光学
密度は、ホスホイメージャーおよびＴＩＮＡプログラムを用いて決定し、対照（
ＧＤＮＦ非処理細胞）に対する増加倍数で表した。下パネル：キナーゼアッセイ
の後の沈降物を、Ｆｙｎ、ＹｅｓおよびＳｒｃを認識するｐａｎ−Ｓｒｃ抗体を
用いるウエスタンブロット法（ＷＢ）によりプローブした。Ｃ．左パネル（ＧＦ
Ｒα１）：ＧＤＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、１分間）を用いて非処理（−）または
前処理（＋）したＳＨＥＰ細胞からの核溶解物(postnucear lysate) をＧＦＲα
１抗体と一緒に沈降した。同時沈降物を、材料および方法のセクションに記載の
ようにしてキナーゼ活性のアッセイを行った。ＧＤＮＦは、ＧＦＲα１に会合す
るＳｒｃタイプキナーゼ活性を著しく増加させた。これらの結果は、５回の独立
した試験の代表である。右パネル（Ｙｅｓ）：ＳＨＥＰ細胞を非処理（−）また
はＧＤＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、１分間）を用いて前処理（＋）し、Ｓｒｃ関連
キナーゼｐ６２Ｙｅｓを全細胞溶解物から抗Ｙｅｓポリクローナル抗体と一緒に
免疫沈降し（抗ＧＦＲα１抗体を用いる予備ＩＰは行わない）、そしてキナーゼ
活性をアッセイした。主要なＧＤＮＦ刺激バンドが、約６２ｋＤのＹｅｓタイプ
キナーゼと一緒に同時移動することが明らかになった。試料はタンパク質量によ
り正規化した。
合するＧＤＮＦ刺激Ｓｒｃタイプキナーゼを描いている。Ａ．ＲＴ−ＰＣＲ分析
は、ＳＨＥＰ細胞がＧＦＲα１（５３８ｂｐ断片）のみを発現し、ＧＦＲα２も
Ｒｅｔ ｍＲＮＡも発現しないことを示す（それぞれ２８０および２８１ｂｐの
期待される断片）。Ｈ2 Ｏ対照は、図１Ｃに示したものと同じである。Ｂ．上パ
ネル：ＳＨＥＰ細胞の溶解物からのトリトンＸ−１００不溶性画分を抗ＧＦＲα
１抗体と一緒に免疫沈降（ＩＰ）し、そして材料および方法のセクションに記載
のようにして生体外キナーゼ活性のアッセイを行った。細胞は、非処理（０分）
または指定の時間、１００ｎｇ／ｍｌＧＤＮＦを用いて処理した。バンドの光学
密度は、ホスホイメージャーおよびＴＩＮＡプログラムを用いて決定し、対照（
ＧＤＮＦ非処理細胞）に対する増加倍数で表した。下パネル：キナーゼアッセイ
の後の沈降物を、Ｆｙｎ、ＹｅｓおよびＳｒｃを認識するｐａｎ−Ｓｒｃ抗体を
用いるウエスタンブロット法（ＷＢ）によりプローブした。Ｃ．左パネル（ＧＦ
Ｒα１）：ＧＤＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、１分間）を用いて非処理（−）または
前処理（＋）したＳＨＥＰ細胞からの核溶解物(postnucear lysate) をＧＦＲα
１抗体と一緒に沈降した。同時沈降物を、材料および方法のセクションに記載の
ようにしてキナーゼ活性のアッセイを行った。ＧＤＮＦは、ＧＦＲα１に会合す
るＳｒｃタイプキナーゼ活性を著しく増加させた。これらの結果は、５回の独立
した試験の代表である。右パネル（Ｙｅｓ）：ＳＨＥＰ細胞を非処理（−）また
はＧＤＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、１分間）を用いて前処理（＋）し、Ｓｒｃ関連
キナーゼｐ６２Ｙｅｓを全細胞溶解物から抗Ｙｅｓポリクローナル抗体と一緒に
免疫沈降し（抗ＧＦＲα１抗体を用いる予備ＩＰは行わない）、そしてキナーゼ
活性をアッセイした。主要なＧＤＮＦ刺激バンドが、約６２ｋＤのＹｅｓタイプ
キナーゼと一緒に同時移動することが明らかになった。試料はタンパク質量によ
り正規化した。
【図６】 図６Ａ〜Ｃは、Ｒｅｔ陰性ＳＨＥＰ神経芽細胞腫細胞株中のＭＡＰＫ、ＣＲＥ
ＢおよびＡＦＴ−１のＧＤＮＦ誘発リン酸化を描いている。Ａ．ＧＤＮＦの添加
は、ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰＫリン酸化の一過性で大きい増加を誘発する（左パ
ネル）。レーン下の数字は、対照に対するｐ４２リン酸化の誘導倍数を示す。下
パネルは、抗ＧＦＲα１抗体を用いる同じフィルターの再プロービングを示し、
そして全てのレーン中でＧＦＲα１タンパク質の同程度の量を示す。図示した結
果は、４回の独立した試験の代表である。Ｂ．ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰＫのＧＤ
ＮＦ誘導リン酸化は、１μＭの低濃度でもＰＰ２を用いて５分間の前処理により
完全に消失した（上パネル）。ブロットを抗ＧＦＲα１抗体を用いて再プローブ
した。下パネルは、すべてのレーンでＧＦＲα１タンパク質が均等に分布してい
たことを示す（実験ｎ＝２）。Ｃ．ＳＨＥＰ細胞のＧＤＮＦ処理は、ＣＲＥＢ
Ｓｅｒ−１３３リン酸化の強力な誘導をもたらし、ならびにＣＲＥＢ関連タンパ
ク質ＡＴＦ−１のリン酸化を誘導した。レーン下の数字は、対照に対するＣＲＥ
Ｂリン酸化の誘導倍数を示す。下パネルは、抗ＣＲＥＢ抗体を用いた同じフィル
ターの再プロービングを示す（実験ｎ＝２）。
ＢおよびＡＦＴ−１のＧＤＮＦ誘発リン酸化を描いている。Ａ．ＧＤＮＦの添加
は、ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰＫリン酸化の一過性で大きい増加を誘発する（左パ
ネル）。レーン下の数字は、対照に対するｐ４２リン酸化の誘導倍数を示す。下
パネルは、抗ＧＦＲα１抗体を用いる同じフィルターの再プロービングを示し、
そして全てのレーン中でＧＦＲα１タンパク質の同程度の量を示す。図示した結
果は、４回の独立した試験の代表である。Ｂ．ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰＫのＧＤ
ＮＦ誘導リン酸化は、１μＭの低濃度でもＰＰ２を用いて５分間の前処理により
完全に消失した（上パネル）。ブロットを抗ＧＦＲα１抗体を用いて再プローブ
した。下パネルは、すべてのレーンでＧＦＲα１タンパク質が均等に分布してい
たことを示す（実験ｎ＝２）。Ｃ．ＳＨＥＰ細胞のＧＤＮＦ処理は、ＣＲＥＢ
Ｓｅｒ−１３３リン酸化の強力な誘導をもたらし、ならびにＣＲＥＢ関連タンパ
ク質ＡＴＦ−１のリン酸化を誘導した。レーン下の数字は、対照に対するＣＲＥ
Ｂリン酸化の誘導倍数を示す。下パネルは、抗ＣＲＥＢ抗体を用いた同じフィル
ターの再プロービングを示す（実験ｎ＝２）。
【図７】 図７Ａ〜Ｃは、ＧＦＲαを用いて安定に移行したＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞内の
ＧＤＮＦ活性化ＳｒｃタイプキナーゼおよびＭＡＰキナーゼを描いている。Ａ．
キナーゼアッセイ実験。主要な約６０ｋＤタンパク質は、Ｒｅｔを発現するＮｅ
ｕｒｏ２Ａ−２０神経芽細胞腫細胞内（１）およびＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞内（
２）の両方でＧＤＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）前処理した後にＧＦＲα１と一緒に
同時沈降できる（両方の細胞株はＧＦＲα１を用いて安定に移行された）。Ｂ．
Ｒｅｔを欠くＮＩＨ３Ｔ３細胞中のｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰＫのリン酸化をＧＤ
ＮＦが誘導した（上パネル、独立した実験ｎ＝３）。選択性Ｓｒｃキナーゼ阻害
剤ＰＰ２（５μＭ）を用いる指定時間の間の細胞の前処理は、ＧＤＮＦの効果を
消失させる。レーン下の数字は、対照に対するｐ４２ＭＡＰＫリン酸化の誘導倍
数を示す。下パネルは、抗ＧＦＲα１抗体を用いた同じフィルターの再プロービ
ングを示し、そしてすべてのレーンでＧＦＲα１タンパク質の同程度の量を示す
（独立した実験ｎ＝２）。Ｃ．Ｒｅｔは発現するが内因性ＧＦＲα１は発現しな
いＮｅｕｒｏ２Ａ神経芽細胞腫細胞を、ＧＰＩアンカーを欠いている可溶性ＧＦ
Ｒα１（ＧＦＲα１／Ｆｃキメラタンパク質；１μｇ／ｍｌ）の存在下でＧＤＮ
Ｆを用いて処理した。可溶性ＧＦＲα１は、ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰＫのＧＤＮ
Ｆ依存性リン酸化を誘導した。レーン下の数字は、対照（ＧＤＮＦ処理せず）に
対するｐ４２ＭＡＰＫリン酸化の誘導倍数を示す。
ＧＤＮＦ活性化ＳｒｃタイプキナーゼおよびＭＡＰキナーゼを描いている。Ａ．
キナーゼアッセイ実験。主要な約６０ｋＤタンパク質は、Ｒｅｔを発現するＮｅ
ｕｒｏ２Ａ−２０神経芽細胞腫細胞内（１）およびＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞内（
２）の両方でＧＤＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）前処理した後にＧＦＲα１と一緒に
同時沈降できる（両方の細胞株はＧＦＲα１を用いて安定に移行された）。Ｂ．
Ｒｅｔを欠くＮＩＨ３Ｔ３細胞中のｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰＫのリン酸化をＧＤ
ＮＦが誘導した（上パネル、独立した実験ｎ＝３）。選択性Ｓｒｃキナーゼ阻害
剤ＰＰ２（５μＭ）を用いる指定時間の間の細胞の前処理は、ＧＤＮＦの効果を
消失させる。レーン下の数字は、対照に対するｐ４２ＭＡＰＫリン酸化の誘導倍
数を示す。下パネルは、抗ＧＦＲα１抗体を用いた同じフィルターの再プロービ
ングを示し、そしてすべてのレーンでＧＦＲα１タンパク質の同程度の量を示す
（独立した実験ｎ＝２）。Ｃ．Ｒｅｔは発現するが内因性ＧＦＲα１は発現しな
いＮｅｕｒｏ２Ａ神経芽細胞腫細胞を、ＧＰＩアンカーを欠いている可溶性ＧＦ
Ｒα１（ＧＦＲα１／Ｆｃキメラタンパク質；１μｇ／ｍｌ）の存在下でＧＤＮ
Ｆを用いて処理した。可溶性ＧＦＲα１は、ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰＫのＧＤＮ
Ｆ依存性リン酸化を誘導した。レーン下の数字は、対照（ＧＤＮＦ処理せず）に
対するｐ４２ＭＡＰＫリン酸化の誘導倍数を示す。
【図８】 図８Ａ〜Ｃは、ＳＨＥＰ神経芽細胞腫細胞中のＧＤＮＦ増加ＰＬＣγチロシン
リン酸化を描いている。Ａ．ＳＨＥＰ細胞をＧＤＮＦの指定の濃度を用いて１分
間インキュベートし、次いで溶解した。チロシンリン酸化タンパク質を４Ｇ−１
０抗ホスホチロシン抗体（α−ＰＹ）と一緒に免疫沈降し、次いで抗ＰＬＣγ抗
体と一緒に、材料および方法のセクションに記載のようにしてウエスターンブロ
ット法によりＰＬＣγをプローブした。ＧＤＮＦは、ＰＬＣγチロシンリン酸化
に投与量依存性増加を誘発した（実験ｎ＝３）。試料はタンパク質の量により正
規化した。Ｂ．左パネル：ＳＨＥＰ細胞を指定のＧＤＮＦ濃度で１分間または５
分間インキュベートした。ＰＬＣγタンパク質を抗ＰＬＣγ抗体による溶解物か
ら免疫沈降した。免疫複合体を４Ｇ−１０抗体（α−ＰＹ）を用いてウエスター
ンブロット法によりチロシンリン酸化タンパク質についてプローブした。右パネ
ル：ブロットを抗ＰＬＣγ抗体を用いて再プローブした。すべてのパネルで、レ
ーン下の数字は、対照に対するＰＬＣγリン酸化の誘導倍数を示す。Ｃ．ＧＤＮ
Ｆ適用は、ＪＮＫのリン酸化に影響しなかった（実験ｎ＝２）。
リン酸化を描いている。Ａ．ＳＨＥＰ細胞をＧＤＮＦの指定の濃度を用いて１分
間インキュベートし、次いで溶解した。チロシンリン酸化タンパク質を４Ｇ−１
０抗ホスホチロシン抗体（α−ＰＹ）と一緒に免疫沈降し、次いで抗ＰＬＣγ抗
体と一緒に、材料および方法のセクションに記載のようにしてウエスターンブロ
ット法によりＰＬＣγをプローブした。ＧＤＮＦは、ＰＬＣγチロシンリン酸化
に投与量依存性増加を誘発した（実験ｎ＝３）。試料はタンパク質の量により正
規化した。Ｂ．左パネル：ＳＨＥＰ細胞を指定のＧＤＮＦ濃度で１分間または５
分間インキュベートした。ＰＬＣγタンパク質を抗ＰＬＣγ抗体による溶解物か
ら免疫沈降した。免疫複合体を４Ｇ−１０抗体（α−ＰＹ）を用いてウエスター
ンブロット法によりチロシンリン酸化タンパク質についてプローブした。右パネ
ル：ブロットを抗ＰＬＣγ抗体を用いて再プローブした。すべてのパネルで、レ
ーン下の数字は、対照に対するＰＬＣγリン酸化の誘導倍数を示す。Ｃ．ＧＤＮ
Ｆ適用は、ＪＮＫのリン酸化に影響しなかった（実験ｎ＝２）。
【図９】 図９Ａ〜Ｂは、提案するＲｅｔ非依存性ＧＤＮＦ誘発シグナリング経路の概略
図を描いている。Ａ．ＧＦＲα１タンパク質がトリトンＸ−１００不溶性膜画分
中のＳｒｃタイプキナーゼと一緒に同時沈降できるので、ＧＤＮＦ開始膜シグナ
リングは、脂質ラフト内で起こることが最も可能性がある。Ｂ．ＧＦＲα１のＧ
ＤＮＦ誘発活性化は、Ｓｒｃタイプキナーゼ（特には、ＳＨＥＰ細胞内のｐｐ６
２Yes キナーゼ）活性化および引き続いてのＰＬＣγおよびＭＡＰキナーゼのリ
ン酸化を誘導する。ＰＬＣγ活性化は、内部カルシウム貯蔵からのＣａ2+のＩＰ 3 依存性放出に導く。ＭＡＰＫのＳｒｃ依存性リン酸化は、核へのそのトランス
ロケーションおよびＣＲＥＢ活性化に導く。
図を描いている。Ａ．ＧＦＲα１タンパク質がトリトンＸ−１００不溶性膜画分
中のＳｒｃタイプキナーゼと一緒に同時沈降できるので、ＧＤＮＦ開始膜シグナ
リングは、脂質ラフト内で起こることが最も可能性がある。Ｂ．ＧＦＲα１のＧ
ＤＮＦ誘発活性化は、Ｓｒｃタイプキナーゼ（特には、ＳＨＥＰ細胞内のｐｐ６
２Yes キナーゼ）活性化および引き続いてのＰＬＣγおよびＭＡＰキナーゼのリ
ン酸化を誘導する。ＰＬＣγ活性化は、内部カルシウム貯蔵からのＣａ2+のＩＰ 3 依存性放出に導く。ＭＡＰＫのＳｒｃ依存性リン酸化は、核へのそのトランス
ロケーションおよびＣＲＥＢ活性化に導く。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年１１月１日（２０００．１１．１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項４１】 該供試化合物が該ＧＰＩ固定受容体に結合することを決定
することをさらに含んでなる、請求項３９記載の方法。
することをさらに含んでなる、請求項３９記載の方法。
【請求項４２】 該細胞内シグナリングが、キナーゼ活性化として測定され
る、請求項３９記載の方法。
る、請求項３９記載の方法。
【請求項４３】 該キナーゼ活性化が、（ｉ）細胞溶解物を調製し、（ｉｉ
）細胞溶解物の界面活性剤不溶性画分を抗ＧＦＲα１受容体抗体を用いて免疫沈
降して免疫沈降物を形成し、（ｉｉｉ）該免疫沈降物に基づいてキナーゼリン酸
化を測定するアッセイを行い、そして（ｉｖ）該化合物と一緒にインキュベート
されない対照と結果を比較することにより測定される、請求項４２記載の方法。
）細胞溶解物の界面活性剤不溶性画分を抗ＧＦＲα１受容体抗体を用いて免疫沈
降して免疫沈降物を形成し、（ｉｉｉ）該免疫沈降物に基づいてキナーゼリン酸
化を測定するアッセイを行い、そして（ｉｖ）該化合物と一緒にインキュベート
されない対照と結果を比較することにより測定される、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】 該キナーゼがＳｒｃタイプキナーゼである、請求項４２記
載の方法。
載の方法。
【請求項４５】 Ｓｒｃタイプキナーゼの活性化が、ＭＡＰＫの活性化とし
て測定される、請求項４４記載の方法。
て測定される、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】 Ｓｒｃタイプキナーゼの活性化が、ＣＲＥＢの活性化とし
て測定される、請求項４４記載の方法。
て測定される、請求項４４記載の方法。
【請求項４７】 Ｓｒｃタイプキナーゼの活性化が、ＰＬＣγ活性化として
測定される、請求項４４記載の方法。
測定される、請求項４４記載の方法。
【請求項４８】 該細胞が、ＤＲＧ Ｒｅｔ（−／−）ニューロンである、
請求項３１記載の方法。
請求項３１記載の方法。
【請求項４９】 該細胞が形質転換された細胞である、請求項３１記載の方
法。
法。
【請求項５０】 該細胞が神経芽細胞腫細胞である、請求項３１記載の方法
。
。
【請求項５１】 該細胞内シグナリングが細胞内Ｃａ2+の増加として測定さ
れ、そして、該供試化合物を用いないで行った対照と比較して、さらに低いかか
る増加が該供試化合物を用いて測定される、請求項３１記載の方法。
れ、そして、該供試化合物を用いないで行った対照と比較して、さらに低いかか
る増加が該供試化合物を用いて測定される、請求項３１記載の方法。
【請求項５２】 該アゴニストがＧＤＮＦである、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】 該細胞が、ＤＲＧ Ｒｅｔ（−／−）ニューロンである、
請求項５１記載の方法。
請求項５１記載の方法。
【請求項５４】 該細胞が形質転換された細胞である、請求項５１記載の方
法。
法。
【請求項５５】 該細胞が神経芽細胞腫細胞である、請求項５１記載の方法
。
。
【請求項５６】 ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングの
アゴニストである化合物を特定するための方法であって、（ｉ）ＧＦＲα１を発
現し、Ｒｅｔは発現しない細胞を供試化合物と一緒にインキュベートし、（ｉｉ
）細胞溶解物を調製し、（ｉｉｉ）細胞溶解物の界面活性剤不溶性画分を抗ＧＦ
Ｒα１抗体を用いて免疫沈降して免疫沈降物を形成し、そして（ｉｖ）該免疫沈
降物に基づいてキナーゼリン酸化を測定するアッセイを行うことを含んでなる方
法。
アゴニストである化合物を特定するための方法であって、（ｉ）ＧＦＲα１を発
現し、Ｒｅｔは発現しない細胞を供試化合物と一緒にインキュベートし、（ｉｉ
）細胞溶解物を調製し、（ｉｉｉ）細胞溶解物の界面活性剤不溶性画分を抗ＧＦ
Ｒα１抗体を用いて免疫沈降して免疫沈降物を形成し、そして（ｉｖ）該免疫沈
降物に基づいてキナーゼリン酸化を測定するアッセイを行うことを含んでなる方
法。
【請求項５７】 該細胞が、ＤＲＧ Ｒｅｔ（−／−）ニューロンである、
請求項５６記載の方法。
請求項５６記載の方法。
【請求項５８】 該細胞が形質転換された細胞である、請求項５６記載の方
法。
法。
【請求項５９】 該細胞が神経芽細胞腫細胞である、請求項５６記載の方法
。
。
【請求項６０】 ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングの
アンタゴニストである化合物を特定するための方法であって、（ｉ）ＧＦＲα１
を発現し、Ｒｅｔは発現しない細胞を、供試化合物と一緒に、キナーゼリン酸化
を起こすために該細胞内シグナリングのアゴニストの十分な量の存在下でインキ
ュベートし、（ｉｉ）細胞溶解物を調製し、（ｉｉｉ）細胞溶解物の界面活性剤
不溶性画分を抗ＧＦＲα１抗体を用いて免疫沈降して免疫沈降物を形成し、（ｉ
ｖ）該免疫沈降物に基づいてキナーゼリン酸化を測定するアッセイを行い、そし
て（ｖ）該供試化合物が存在しないで行った対照実験で達したものと該アッセイ
の結果とを比較することを含んでなる方法。
アンタゴニストである化合物を特定するための方法であって、（ｉ）ＧＦＲα１
を発現し、Ｒｅｔは発現しない細胞を、供試化合物と一緒に、キナーゼリン酸化
を起こすために該細胞内シグナリングのアゴニストの十分な量の存在下でインキ
ュベートし、（ｉｉ）細胞溶解物を調製し、（ｉｉｉ）細胞溶解物の界面活性剤
不溶性画分を抗ＧＦＲα１抗体を用いて免疫沈降して免疫沈降物を形成し、（ｉ
ｖ）該免疫沈降物に基づいてキナーゼリン酸化を測定するアッセイを行い、そし
て（ｖ）該供試化合物が存在しないで行った対照実験で達したものと該アッセイ
の結果とを比較することを含んでなる方法。
【請求項６１】 該アゴニストがＧＤＮＦである、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】 該細胞が、ＤＲＧ Ｒｅｔ（−／−）ニューロンである、
請求項６０記載の方法。
請求項６０記載の方法。
【請求項６３】 該細胞が形質転換された細胞である、請求項６０記載の方
法。
法。
【請求項６４】 該細胞が神経芽細胞腫細胞である、請求項６０記載の方法
。
。
【請求項６５】 ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングの
アゴニストである化合物を特定するための方法であって、（ｉ）ＧＦＲα１を発
現し、Ｒｅｔは発現しない細胞を供試化合物と一緒にインキュベートし、そして
（ｉｉ）該化合物を一緒にインキュベートしない対照と比較してＳｒｃタイプキ
ナーゼの活性化をもたらしているかどうかを決定することを含んでなる方法。
アゴニストである化合物を特定するための方法であって、（ｉ）ＧＦＲα１を発
現し、Ｒｅｔは発現しない細胞を供試化合物と一緒にインキュベートし、そして
（ｉｉ）該化合物を一緒にインキュベートしない対照と比較してＳｒｃタイプキ
ナーゼの活性化をもたらしているかどうかを決定することを含んでなる方法。
【請求項６６】 ＳｒｃタイプキナーゼがＦｙｎ、ｃ−Ｓｒｃ、およびＹｅ
ｓからなる群から選ばれる、請求項６５記載の方法。
ｓからなる群から選ばれる、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】 Ｓｒｃタイプキナーゼ活性化がＭＡＰＫのリン酸化を測定
することにより決定される、請求項６５記載の方法。
することにより決定される、請求項６５記載の方法。
【請求項６８】 Ｓｒｃタイプキナーゼ活性化がＣＲＥＢのリン酸化を測定
することにより決定される、請求項６５記載の方法。
することにより決定される、請求項６５記載の方法。
【請求項６９】 該細胞が、ＤＲＧ Ｒｅｔ（−／−）ニューロンである、
請求項６５記載の方法。
請求項６５記載の方法。
【請求項７０】 該細胞が形質転換された細胞である、請求項６５記載の方
法。
法。
【請求項７１】 該細胞が神経芽細胞腫細胞である、請求項６７記載の方法
。
。
【請求項７２】 ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリング経
路のアンタゴニストである化合物を特定するための方法であって、（ｉ）ＧＦＲ
α１を発現し、Ｒｅｔは発現しない細胞を、供試化合物と一緒に、Ｓｒｃタイプ
キナーゼの活性化を起こすために該経路のアゴニストの十分な量の存在下でイン
キュベートし、そして（ｉｉ）該化合物と一緒インキュベートしない対照と比較
して、該化合物がＳｒｃタイプキナーゼ活性化の低下をもたらすかどうかを決定
することを含んでなる方法。
路のアンタゴニストである化合物を特定するための方法であって、（ｉ）ＧＦＲ
α１を発現し、Ｒｅｔは発現しない細胞を、供試化合物と一緒に、Ｓｒｃタイプ
キナーゼの活性化を起こすために該経路のアゴニストの十分な量の存在下でイン
キュベートし、そして（ｉｉ）該化合物と一緒インキュベートしない対照と比較
して、該化合物がＳｒｃタイプキナーゼ活性化の低下をもたらすかどうかを決定
することを含んでなる方法。
【請求項７３】 ＳｒｃタイプキナーゼがＦｙｎ、ｃ−ＳｒｃおよびＹｅｓ
からなる群から選ばれる、請求項７２記載の方法。
からなる群から選ばれる、請求項７２記載の方法。
【請求項７４】 Ｓｒｃタイプキナーゼ活性化がＭＡＰＫのリン酸化を測定
することにより決定される、請求項７２記載の方法。
することにより決定される、請求項７２記載の方法。
【請求項７５】 Ｓｒｃタイプキナーゼ活性化がＣＲＥＢのリン酸化を測定
することにより決定される、請求項７２記載の方法。
することにより決定される、請求項７２記載の方法。
【請求項７６】 該アゴニストがＧＤＮＦである、請求項７２記載の方法。
【請求項７７】 該細胞が、ＤＲＧ Ｒｅｔ（−／−）ニューロンである、
請求項７２記載の方法。
請求項７２記載の方法。
【請求項７８】 該細胞が形質転換された細胞である、請求項７２記載の方
法。
法。
【請求項７９】 該細胞が神経芽細胞腫細胞である、請求項７２記載の方法
。
。
【請求項８０】 ＧＦＲα受容体によりもたらされる細胞内シグナリングの
アゴニストである化合物を特定するための方法であって、（ｉ）ＧＦＲα受容体
を有する細胞から調製した脂質ラフトを該化合物と一緒にインキュベートし、そ
して（ｉｉ）該化合物と一緒にインキュベートしない対照と比較して、Ｓｒｃタ
イプキナーゼが活性化されているかどうかを決定することを含んでなる方法。
アゴニストである化合物を特定するための方法であって、（ｉ）ＧＦＲα受容体
を有する細胞から調製した脂質ラフトを該化合物と一緒にインキュベートし、そ
して（ｉｉ）該化合物と一緒にインキュベートしない対照と比較して、Ｓｒｃタ
イプキナーゼが活性化されているかどうかを決定することを含んでなる方法。
【請求項８１】 ＳｒｃタイプキナーゼがＦｙｎ、ｃ−ＳｒｃおよびＹｅｓ
からなる群から選ばれる、請求項８０記載の方法。
からなる群から選ばれる、請求項８０記載の方法。
【請求項８２】 Ｓｒｃタイプキナーゼ活性化がＭＡＰＫのリン酸化を測定
することにより決定される、請求項８０記載の方法。
することにより決定される、請求項８０記載の方法。
【請求項８３】 Ｓｒｃタイプキナーゼ活性化がＣＲＥＢのリン酸化を測定
することにより決定される、請求項８０記載の方法。
することにより決定される、請求項８０記載の方法。
【請求項８４】 ＧＦＲα受容体によりもたらされる細胞内シグナリングの
アンタゴニストである化合物を特定するための方法であって、（ｉ）ＧＦＲα受
容体を有する細胞から調製した脂質ラフトを、該化合物と一緒に、Ｓｒｃタイプ
キナーゼを活性化するために、ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナ
リング経路のアゴニストの十分な量の存在下でインキュベートし、そして（ｉｉ
）該化合物が存在しないで行った対照実験の結果と比較することを含んでなる方
法。
アンタゴニストである化合物を特定するための方法であって、（ｉ）ＧＦＲα受
容体を有する細胞から調製した脂質ラフトを、該化合物と一緒に、Ｓｒｃタイプ
キナーゼを活性化するために、ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナ
リング経路のアゴニストの十分な量の存在下でインキュベートし、そして（ｉｉ
）該化合物が存在しないで行った対照実験の結果と比較することを含んでなる方
法。
【請求項８５】 ＳｒｃタイプキナーゼがＦｙｎ、ｃ−Ｓｒｃ、およびＹｅ
ｓからなる群から選ばれる、請求項８４記載の方法。
ｓからなる群から選ばれる、請求項８４記載の方法。
【請求項８６】 Ｓｒｃタイプキナーゼ活性化がＭＡＰＫのリン酸化を測定
することにより決定される、請求項８４記載の方法。
することにより決定される、請求項８４記載の方法。
【請求項８７】 Ｓｒｃタイプキナーゼ活性化がＣＲＥＢのリン酸化を測定
することにより決定される、請求項８４記載の方法。
することにより決定される、請求項８４記載の方法。
【請求項８８】 該アゴニストがＧＤＮＦである、請求項８４記載の方法。
【請求項８９】 ＧＰＩ−固定細胞内シグナリングのアゴニストまたはアン
タゴニストの有効量を投与することを含んでなる神経系細胞内に細胞反応をもた
らすための方法。
タゴニストの有効量を投与することを含んでなる神経系細胞内に細胞反応をもた
らすための方法。
【請求項９０】 該神経系細胞が運動ニューロンである、請求項８９記載の
方法。
方法。
【請求項９１】 該神経系細胞が感覚ニューロンである、請求項８９記載の
方法。
方法。
【請求項９２】 該神経系ニューロンが聴覚ニューロンである、請求項９１
記載の方法。
記載の方法。
【請求項９３】 該神経系細胞がグリア細胞である、請求項８９記載の方法
。
。
【請求項９４】 ＧＰＩ固定、細胞内シグナリングの該アゴニストまたはア
ンタゴニストが、ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアゴ
ニストまたはアンタゴニストである、請求項８９から９３記載の方法。
ンタゴニストが、ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアゴ
ニストまたはアンタゴニストである、請求項８９から９３記載の方法。
【請求項９５】 ＧＰＩ固定細胞内シグナリングのアゴニストである薬剤の
有効量を投与することを含んでなる神経細胞疾患の治療のための方法。
有効量を投与することを含んでなる神経細胞疾患の治療のための方法。
【請求項９６】 ＧＰＩ固定細胞内シグナリングの該アゴニストが、ＧＦＲ
α１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアゴニストである、請求項９
５記載の方法。
α１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアゴニストである、請求項９
５記載の方法。
【請求項９７】 ＧＰＩ固定細胞内シグナリングのアンタゴニストである薬
剤の有効量を投与することを含んでなる神経細胞疾患の治療のための方法。
剤の有効量を投与することを含んでなる神経細胞疾患の治療のための方法。
【請求項９８】 ＧＰＩ固定細胞内シグナリングの該アンタゴニストが、Ｇ
ＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアンタゴニストである、
請求項９７記載の方法。
ＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアンタゴニストである、
請求項９７記載の方法。
【請求項９９】 Ｒｅｔ依存性およびＧＰＩ固定、Ｒｅｔ非依存性細胞内シ
グナリングの両方のアゴニストである薬剤の有効量を投与することを含んでなる
神経細胞疾患の治療のための方法。
グナリングの両方のアゴニストである薬剤の有効量を投与することを含んでなる
神経細胞疾患の治療のための方法。
【請求項１００】 ＧＰＩ固定、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングの該ア
ゴニストが、ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアゴニス
トである、請求項９９記載の方法。
ゴニストが、ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアゴニス
トである、請求項９９記載の方法。
【請求項１０１】 Ｒｅｔ依存性およびＧＰＩ固定、Ｒｅｔ非依存性細胞内
シグナリングの両方のアンタゴニストである薬剤の有効量を投与することを含ん
でなる神経細胞疾患の治療のための方法。
シグナリングの両方のアンタゴニストである薬剤の有効量を投与することを含ん
でなる神経細胞疾患の治療のための方法。
【請求項１０２】 ＧＰＩ固定、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングの該ア
ンタゴニストが、ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアン
タゴニストである、請求項１０１記載の方法。
ンタゴニストが、ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアン
タゴニストである、請求項１０１記載の方法。
【請求項１０３】 Ｒｅｔ依存性細胞内シグナリングのアゴニストおよびＧ
ＰＩ固定、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアンタゴニストである薬剤また
は数種の薬剤の有効量を投与することを含んでなる神経細胞疾患の治療のための
方法。
ＰＩ固定、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアンタゴニストである薬剤また
は数種の薬剤の有効量を投与することを含んでなる神経細胞疾患の治療のための
方法。
【請求項１０４】 ＧＰＩ固定、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングの該ア
ンタゴニストが、ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアン
タゴニストである、請求項１０３記載の方法。
ンタゴニストが、ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアン
タゴニストである、請求項１０３記載の方法。
【請求項１０５】 Ｒｅｔ依存性細胞内シグナリングのアンタゴニストおよ
びＧＰＩ固定、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアゴニストである薬剤また
は数種の薬剤の有効量を投与することを含んでなる神経細胞疾患の治療のための
方法。
びＧＰＩ固定、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアゴニストである薬剤また
は数種の薬剤の有効量を投与することを含んでなる神経細胞疾患の治療のための
方法。
【請求項１０６】 ＧＰＩ固定、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングの該ア
ゴニストが、ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアゴニス
トである、請求項１０５記載の方法。
ゴニストが、ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアゴニス
トである、請求項１０５記載の方法。
【請求項１０７】 ＧＰＩ固定細胞内シグナリングのアゴニストである薬剤
の有効量を投与することを含んでなる聴覚ニューロンを保護するための方法。
の有効量を投与することを含んでなる聴覚ニューロンを保護するための方法。
【請求項１０８】 ＧＰＩ固定細胞内シグナリングのアゴニストである薬剤
の有効量を投与することを含んでなる記憶喪失を防止するための方法。
の有効量を投与することを含んでなる記憶喪失を防止するための方法。
【請求項１０９】 ＧＰＩ固定細胞内シグナリングのアゴニストである薬剤
の有効量を投与することを含んでなる学習能力を改善するための方法。
の有効量を投与することを含んでなる学習能力を改善するための方法。
【請求項１１０】 ＧＰＩ固定細胞内シグナリングのアゴニストである薬剤
の有効量を投与することを含んでなるてんかんを治療するための方法。
の有効量を投与することを含んでなるてんかんを治療するための方法。
【請求項１１１】 ＧＰＩ固定細胞内シグナリングのアゴニストである薬剤
の有効量を投与することを含んでなるパーキンソン病を治療するための方法。
の有効量を投与することを含んでなるパーキンソン病を治療するための方法。
【請求項１１２】 ＧＰＩ固定細胞内シグナリングの該アゴニストが、ＧＦ
Ｒα１依存性、ＲＥＴ非依存性細胞内シグナリングのアゴニストである、請求項
１０７から１１１記載の方法。
Ｒα１依存性、ＲＥＴ非依存性細胞内シグナリングのアゴニストである、請求項
１０７から１１１記載の方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 サールマ，マルト フインランド・エフアイエヌ−00570ヘル シンキ・クロサーレンプイストテイエ38エ イ４ (72)発明者 テイテイエブスキ，アレクセイ・ウラデイ ミロビチ フインランド・エフアイエヌ−00710ヘル シンキ・コエテイランクジヤ２ジー55 (72)発明者 ポテリアエブ，ドミトリ フインランド・エフアイエヌ−00014ヘル シンキ・ビーキンカーリ９ (72)発明者 アルマエ，ウルマス フインランド・エフアイエヌ−02200エス ポー・ニーテイカトウ３デイ53 (72)発明者 サールマ，マルト フインランド・エフアイエヌ−00570ヘル シンキ・クロサーレンプイストテイエ38エ イ４ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB20 BB29 CB01 CB02 DA20 DA36 DA77 DB07 FB01 FB02 FB03 JA01 4B024 AA11 CA04 DA02 EA04 GA11 GA25 4B063 QA01 QA18 QR80 4C084 AA02 AA16 CA59 MA02 NA14 ZA02 ZA06 ZA15
Claims (114)
- 【請求項１】 神経系細胞におけるＧＰＩ固定受容体によりもたらされる細
胞内シグナリングのアゴニストである化合物を特定するための方法であって、（
ｉ）ＧＰＩ固定受容体を有する該神経系細胞を供試化合物と一緒にインキュベー
トし、そして（ｉｉ）細胞内シグナリングが該細胞においてもたらされているか
どうかを決定することを含んでなる方法。 - 【請求項２】 該神経系細胞がＧＦＲα受容体を発現するが、しかしＲｅｔ
受容体は発現しない、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 該ＧＦＲα受容体がＧＦＲα１受容体である、請求項２記載
の方法。 - 【請求項４】 該神経系細胞がＤＲＧニューロンである、請求項１記載の方
法。 - 【請求項５】 該ＤＲＧニューロンが、Ｒｅｔ（−／−）である、請求項４
記載の方法。 - 【請求項６】 該神経系細胞が神経芽細胞腫細胞である、請求項１記載の方
法。 - 【請求項７】 該細胞内シグナリングが、該化合物と一緒にインキュベート
されない対照と比較して、細胞内Ｃａ2+濃度の増加として測定される、請求項１
記載の方法。 - 【請求項８】 該供試化合物が該ＧＰＩ固定受容体に結合することを決定す
ることをさらに含んでなる、請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 該細胞内シグナリングが、キナーゼ活性化により測定される
、請求項１記載の方法。 - 【請求項１０】 該キナーゼ活性化が、（ｉ）細胞溶解物を調製し、（ｉｉ
）細胞溶解物を抗ＧＰＩ固定受容体抗体を用いて免疫沈降して免疫沈降物を形成
し、（ｉｉｉ）該免疫沈降物に基づいてキナーゼリン酸化を測定するアッセイを
行い、そして（ｉｖ）該化合物と一緒にインキュベートされない対照と結果を比
較することにより測定される、請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 該抗体が抗ＧＦＲα１である、請求項１０記載の方法。
- 【請求項１２】 該キナーゼがＳｒｃタイプキナーゼである、請求項９記載
の方法。 - 【請求項１３】 Ｓｒｃタイプキナーゼの活性化が、ＭＡＰＫの活性化とし
て測定される、請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 Ｓｒｃタイプキナーゼの活性化が、ＣＲＥＢの活性化とし
て測定される、請求項１２記載の方法。 - 【請求項１５】 Ｓｒｃタイプキナーゼの活性化が、ＰＬＣγ活性化として
測定される、請求項１２記載の方法。 - 【請求項１６】 神経系細胞におけるＧＰＩ固定受容体によりもたらされる
細胞内シグナリングのアンタゴニストである化合物を特定するための方法であっ
て、（ｉ）ＧＰＩ固定受容体を有する該神経系細胞を、供試化合物と一緒に、細
胞内シグナリングをもたらすために該細胞内シグナリングのアゴニストの十分な
量の存在下でインキュベートし、そして（ｉｉｉ）該化合物と一緒にインキュベ
ートされない対照と結果を比較することを含んでなる方法。 - 【請求項１７】 該神経系細胞がＧＦＲα受容体を発現する、請求項１６記
載の方法。 - 【請求項１８】 該ＧＦＲα受容体がＧＦＲα１受容体である、請求項１７
記載の方法。 - 【請求項１９】 該神経系細胞がＤＲＧニューロンである、請求項１６記載
の方法。 - 【請求項２０】 該ＤＲＧニューロンが、Ｒｅｔ（−／−）である、請求項
１９記載の方法。 - 【請求項２１】 該神経系細胞が神経芽細胞腫細胞である、請求項１６記載
の方法。 - 【請求項２２】 測定される該細胞内シグナリングが、細胞内Ｃａ2+濃度の
増加である、請求項１６記載の方法。 - 【請求項２３】 測定される該細胞内シグナリングが、キナーゼ活性化であ
る、請求項１６記載の方法。 - 【請求項２４】 該キナーゼ活性化が、（ｉ）細胞溶解物を調製し、（ｉｉ
）細胞溶解物を抗ＧＰＩ固定受容体抗体を用いて免疫沈降して免疫沈降物を形成
し、（ｉｉｉ）該免疫沈降物に基づいてキナーゼリン酸化を測定するアッセイを
行い、そして（ｉｖ）該化合物と一緒にインキュベートされない対照と結果を比
較することにより測定される、請求項２３記載の方法。 - 【請求項２５】 該抗体が抗ＧＦＲα１である、請求項２４記載の方法。
- 【請求項２６】 該キナーゼがＳｒｃタイプキナーゼである、請求項２３記
載の方法。 - 【請求項２７】 該Ｓｒｃタイプキナーゼの活性化が、ＭＡＰＫの活性化と
して測定される、請求項２６記載の方法。 - 【請求項２８】 該Ｓｒｃタイプキナーゼの活性化が、ＣＲＥＢ活性化とし
て測定される、請求項２６記載の方法。 - 【請求項２９】 該Ｓｒｃタイプキナーゼの活性化が、ＰＬＣγ活性化とし
て測定される、請求項２６記載の方法。 - 【請求項３０】 ＧＰＩα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングの
アゴニストである化合物を特定するための方法であって、（ｉ）ＧＦＲα１受容
体を発現し、Ｒｅｔ受容体は発現しない細胞を供試化合物と一緒にインキュベー
トし、そして（ｉｉ）細胞内シグナリングが該細胞においてもたらされているか
どうかを決定することを含んでなる方法。 - 【請求項３１】 該細胞内シグナリングが、該化合物と一緒にインキュベー
トされない対照と比較して、細胞内Ｃａ2+濃度の増加として測定される、請求項
３０記載の方法。 - 【請求項３２】 該供試化合物が該ＧＰＩ固定受容体に結合することを決定
することをさらに含んでなる、請求項３１記載の方法。 - 【請求項３３】 該細胞内シグナリングが、キナーゼ活性化として測定され
る、請求項３０記載の方法。 - 【請求項３４】 該キナーゼ活性化が、（ｉ）細胞溶解物を調製し、（ｉｉ
）細胞溶解物の界面活性剤不溶性画分を抗ＧＦＲα１受容体抗体を用いて免疫沈
降して免疫沈降物を形成し、（ｉｉｉ）該免疫沈降物に基づいてキナーゼリン酸
化を測定するアッセイを行い、そして（ｉｖ）該化合物と一緒にインキュベート
されない対照と結果を比較することにより測定される、請求項３３記載の方法。 - 【請求項３５】 該キナーゼがＳｒｃタイプキナーゼである、請求項３３記
載の方法。 - 【請求項３６】 Ｓｒｃタイプキナーゼの活性化が、ＭＡＰＫの活性化とし
て測定される、請求項３３記載の方法。 - 【請求項３７】 Ｓｒｃタイプキナーゼの活性化が、ＣＲＥＢの活性化とし
て測定される、請求項３３記載の方法。 - 【請求項３８】 Ｓｒｃタイプキナーゼの活性化が、ＰＬＣγ活性化として
測定される、請求項３３記載の方法。 - 【請求項３９】 ＧＰＩα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングの
アンタゴニストである化合物を特定するための方法であって、（ｉ）ＧＦＲα１
受容体を発現し、Ｒｅｔ受容体は発現しない細胞を、供試化合物と一緒に、細胞
内シグナリングをもたらすために該細胞内シグナリングのアゴニストの十分な量
の存在下でインキュベートし、そして（ｉｉｉ）該化合物と一緒にインキュベー
トされない対照と結果を比較することを含んでなる方法。 - 【請求項４０】 該アゴニストがＧＤＮＦである、請求項３９記載の方法。
- 【請求項４１】 該細胞内シグナリングが、該化合物と一緒にインキュベー
トされない対照と比較して、細胞内Ｃａ2+濃度の増加として測定される、請求項
３９記載の方法。 - 【請求項４２】 該供試化合物が該ＧＰＩ固定受容体に結合することを決定
することをさらに含んでなる、請求項３９記載の方法。 - 【請求項４３】 該細胞内シグナリングが、キナーゼ活性化として測定され
る、請求項３９記載の方法。 - 【請求項４４】 該キナーゼ活性化が、（ｉ）細胞溶解物を調製し、（ｉｉ
）細胞溶解物の界面活性剤不溶性画分を抗ＧＦＲα１受容体抗体を用いて免疫沈
降して免疫沈降物を形成し、（ｉｉｉ）該免疫沈降物に基づいてキナーゼリン酸
化を測定するアッセイを行い、そして（ｉｖ）該化合物と一緒にインキュベート
されない対照と結果を比較することにより測定される、請求項４３記載の方法。 - 【請求項４５】 該キナーゼがＳｒｃタイプキナーゼである、請求項４３記
載の方法。 - 【請求項４６】 Ｓｒｃタイプキナーゼの活性化が、ＭＡＰＫの活性化とし
て測定される、請求項４３記載の方法。 - 【請求項４７】 Ｓｒｃタイプキナーゼの活性化が、ＣＲＥＢの活性化とし
て測定される、請求項４３記載の方法。 - 【請求項４８】 Ｓｒｃタイプキナーゼの活性化が、ＰＬＣγ活性化として
測定される、請求項４３記載の方法。 - 【請求項４９】 ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングの
アゴニストである化合物を特定するための方法であって、（ｉ）ＧＦＲα１受容
体を発現し、Ｒｅｔ受容体は発現しない細胞を供試化合物と一緒にインキュベー
トし、（ｉｉ）該化合物と一緒にインキュベートされない対照と比較して、細胞
内Ｃａ2+濃度の増加が該細胞においてもたらされるかどうかを決定することを含
んでなる方法。 - 【請求項５０】 該供試化合物がＧＰＩα１受容体に結合することを決定す
るこを含んでなる、請求項４９記載の方法。 - 【請求項５１】 該細胞が、ＤＲＧ Ｒｅｔ（−／−）ニューロンである、
請求項４９記載の方法。 - 【請求項５２】 該細胞が形質転換された細胞である、請求項４９記載の方
法。 - 【請求項５３】 該細胞が神経芽細胞腫細胞である、請求項４９記載の方法
。 - 【請求項５４】 ＧＰＩα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングの
アンタゴニストである化合物を特定するための方法であって、（ｉ）ＧＦＲα１
受容体を発現し、Ｒｅｔ受容体は発現しない細胞を、供試化合物と一緒に、細胞
内Ｃａ2+濃度の増加を起こすためにＧＰＩα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シ
グナリングのアゴニストの十分な量の存在下でインキュベートし、そして（ｉｉ
）該供試化合物が存在しないで行われた対照と比較して細胞内Ｃａ2+濃度の低下
がもたらされているかどうかを決定することを含んでなる方法。 - 【請求項５５】 該アゴニストがＧＤＮＦである、請求項５４記載の方法。
- 【請求項５６】 該細胞が、ＤＲＧ Ｒｅｔ（−／−）ニューロンである、
請求項５４記載の方法。 - 【請求項５７】 該細胞が形質転換された細胞である、請求項５４記載の方
法。 - 【請求項５８】 該細胞が神経芽細胞腫細胞である、請求項５４記載の方法
。 - 【請求項５９】 ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングの
アゴニストである化合物を特定するための方法であって、（ｉ）ＧＦＲα１を発
現し、Ｒｅｔは発現しない細胞を供試化合物と一緒にインキュベートし、（ｉｉ
）細胞溶解物を調製し、（ｉｉｉ）細胞溶解物の界面活性剤不溶性画分を抗ＧＦ
Ｒα１抗体を用いて免疫沈降して免疫沈降物を形成し、そして（ｉｖ）該免疫沈
降物に基づいてキナーゼリン酸化を測定するアッセイを行うことを含んでなる方
法。 - 【請求項６０】 該細胞が、ＤＲＧ Ｒｅｔ（−／−）ニューロンである、
請求項５９記載の方法。 - 【請求項６１】 該細胞が形質転換された細胞である、請求項５９記載の方
法。 - 【請求項６２】 該細胞が神経芽細胞腫細胞である、請求項５９記載の方法
。 - 【請求項６３】 ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングの
アンタゴニストである化合物を特定するための方法であって、（ｉ）ＧＦＲα１
を発現し、Ｒｅｔは発現しない細胞を、供試化合物と一緒に、キナーゼリン酸化
を起こすために該細胞内シグナリングのアゴニストの十分な量の存在下でインキ
ュベートし、（ｉｉ）細胞溶解物を調製し、（ｉｉｉ）細胞溶解物の界面活性剤
不溶性画分を抗ＧＦＲα１抗体を用いて免疫沈降して免疫沈降物を形成し、（ｉ
ｖ）該免疫沈降物に基づいてキナーゼリン酸化を測定するアッセイを行い、そし
て（ｖ）該供試化合物が存在しないで行った対照実験で達成したものと該アッセ
イの結果とを比較することを含んでなる方法。 - 【請求項６４】 該アゴニストがＧＤＮＦである、請求項６３記載の方法。
- 【請求項６５】 該細胞が、ＤＲＧ Ｒｅｔ（−／−）ニューロンである、
請求項６３記載の方法。 - 【請求項６６】 該細胞が形質転換された細胞である、請求項６３記載の方
法。 - 【請求項６７】 該細胞が神経芽細胞腫細胞である、請求項６３記載の方法
。 - 【請求項６８】 ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングの
アゴニストである化合物を特定するための方法であって、（ｉ）ＧＦＲα１を発
現し、Ｒｅｔは発現しない細胞を供試化合物と一緒にインキュベートし、そして
（ｉｉ）該化合物を一緒にインキュベートしない対照と比較してＳｒｃタイプキ
ナーゼの活性化をもたらしているかどうかを決定することを含んでなる方法。 - 【請求項６９】 ＳｒｃタイプキナーゼがＦｙｎ、ｃ−Ｓｒｃ、およびＹｅ
ｓからなる群から選ばれる、請求項６８記載の方法。 - 【請求項７０】 Ｓｒｃタイプキナーゼ活性化がＭＡＰＫのリン酸化を測定
することにより決定される、請求項６８記載の方法。 - 【請求項７１】 Ｓｒｃタイプキナーゼ活性化がＣＲＥＢのリン酸化を測定
することにより決定される、請求項６８記載の方法。 - 【請求項７２】 該細胞が、ＤＲＧ Ｒｅｔ（−／−）ニューロンである、
請求項６８記載の方法。 - 【請求項７３】 該細胞が形質転換された細胞である、請求項６８記載の方
法。 - 【請求項７４】 該細胞が神経芽細胞腫細胞である、請求項６８記載の方法
。 - 【請求項７５】 ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリング経
路のアンタゴニストである化合物を特定するための方法であって、（ｉ）ＧＦＲ
α１を発現し、Ｒｅｔは発現しない細胞を、供試化合物と一緒に、Ｓｒｃタイプ
キナーゼの活性化を起こすために該経路のアゴニストの十分な量の存在下でイン
キュベートし、そして（ｉｉ）該化合物と一緒インキュベートしない対照と比較
して、該化合物がＳｒｃタイプキナーゼ活性化の低下をもたらすかどうかを決定
することを含んでなる方法。 - 【請求項７６】 ＳｒｃタイプキナーゼがＦｙｎ、ｃ−ＳｒｃおよびＹｅｓ
からなる群から選ばれる、請求項７５記載の方法。 - 【請求項７７】 Ｓｒｃタイプキナーゼ活性化がＭＡＰＫのリン酸化を測定
することにより決定される、請求項７５記載の方法。 - 【請求項７８】 Ｓｒｃタイプキナーゼ活性化がＣＲＥＢのリン酸化を測定
することにより決定される、請求項７５記載の方法。 - 【請求項７９】 該アゴニストがＧＤＮＦである、請求項７５記載の方法。
- 【請求項８０】 該細胞が、ＤＲＧ Ｒｅｔ（−／−）ニューロンである、
請求項７５記載の方法。 - 【請求項８１】 該細胞が形質転換された細胞である、請求項７５記載の方
法。 - 【請求項８２】 該細胞が神経芽細胞腫細胞である、請求項７５記載の方法
。 - 【請求項８３】 ＧＦＲα受容体によりもたらされる細胞内シグナリングの
アゴニストである化合物を特定するための方法であって、（ｉ）ＧＦＲα受容体
を有する細胞から調製した脂質ラフトを該化合物と一緒にインキュベートし、そ
して（ｉｉ）該化合物と一緒にインキュベートしない対照と比較して、Ｓｒｃタ
イプキナーゼが活性化されているかどうかを決定することを含んでなる方法。 - 【請求項８４】 ＳｒｃタイプキナーゼがＦｙｎ、ｃ−Ｓｒｃ、およびＹｅ
ｓからなる群から選ばれる、請求項８３記載の方法。 - 【請求項８５】 Ｓｒｃタイプキナーゼ活性化がＭＡＰＫのリン酸化を測定
することにより決定される、請求項８３記載の方法。 - 【請求項８６】 Ｓｒｃタイプキナーゼ活性化がＣＲＥＢのリン酸化を測定
することにより決定される、請求項８３記載の方法。 - 【請求項８７】 ＧＦＲα受容体によりもたらされる細胞内シグナリングの
アンタゴニストである化合物を特定するための方法であって、（ｉ）ＧＦＲα受
容体を有する細胞から調製した脂質ラフトを、該化合物と一緒に、Ｓｒｃタイプ
キナーゼを活性化するために、ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナ
リング経路のアゴニストの十分な量の存在下でインキュベートし、そして（ｉｉ
）該化合物が存在しないで行った対照実験の結果と比較することを含んでなる方
法。 - 【請求項８８】 ＳｒｃタイプキナーゼがＦｙｎ、ｃ−ＳｒｃおよびＹｅｓ
からなる群から選ばれる、請求項８７記載の方法。 - 【請求項８９】 Ｓｒｃタイプキナーゼ活性化がＭＡＰＫのリン酸化を測定
することにより決定される、請求項８７記載の方法。 - 【請求項９０】 Ｓｒｃタイプキナーゼ活性化がＣＲＥＢのリン酸化を測定
することにより決定される、請求項８７記載の方法。 - 【請求項９１】 該アゴニストがＧＤＮＦである、請求項８７記載の方法。
- 【請求項９２】 ＧＰＩ−固定細胞内シグナリングのアゴニストまたはアン
タゴニストの有効量を投与することを含んでなる神経系細胞内に細胞反応をもた
らすための方法。 - 【請求項９３】 該神経系細胞が運動ニューロンである、請求項９２記載の
方法。 - 【請求項９４】 該神経系細胞が感覚ニューロンである、請求項９２記載の
方法。 - 【請求項９５】 該神経系ニューロンが聴覚ニューロンである、請求項９２
記載の方法。 - 【請求項９６】 該神経系細胞がグリア細胞である、請求項９２記載の方法
。 - 【請求項９７】 ＧＰＩ固定、細胞内シグナリングの該アゴニストまたはア
ンタゴニストが、ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアゴ
ニストまたはアンタゴニストである、請求項９２から９７記載の方法。 - 【請求項９８】 ＧＰＩ固定細胞内シグナリングのアゴニストである薬剤の
有効量を投与することを含んでなる神経細胞疾患の治療のための方法。 - 【請求項９９】 ＧＰＩ固定細胞内シグナリングの該アゴニストが、ＧＦＲ
α１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアゴニストである、請求項９
８記載の方法。 - 【請求項１００】 ＧＰＩ固定細胞内シグナリングのアンタゴニストである
薬剤の有効量を投与することを含んでなる神経細胞疾患の治療のための方法。 - 【請求項１０１】 ＧＰＩ固定細胞内シグナリングの該アンタゴニストが、
ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアンタゴニストである
、請求項１００記載の方法。 - 【請求項１０２】 Ｒｅｔ依存性およびＧＰＩ固定、Ｒｅｔ非依存性細胞内
シグナリングの両方のアゴニストである薬剤の有効量を投与することを含んでな
る神経細胞疾患の治療のための方法。 - 【請求項１０３】 ＧＰＩ固定、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングの該ア
ゴニストが、ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアゴニス
トである、請求項１０２記載の方法。 - 【請求項１０４】 Ｒｅｔ依存性およびＧＰＩ固定、Ｒｅｔ非依存性細胞内
シグナリングの両方のアンタゴニストである薬剤の有効量を投与することを含ん
でなる神経細胞疾患の治療のための方法。 - 【請求項１０５】 ＧＰＩ固定、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングの該ア
ンタゴニストが、ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアン
タゴニストである、請求項１０４記載の方法。 - 【請求項１０６】 Ｒｅｔ依存性細胞内シグナリングのアゴニストおよびＧ
ＰＩ固定、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアンタゴニストである薬剤また
は数種の薬剤の有効量を投与することを含んでなる神経細胞疾患の治療のための
方法。 - 【請求項１０７】 ＧＰＩ固定、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングの該ア
ンタゴニストが、ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアン
タゴニストである、請求項１０６記載の方法。 - 【請求項１０８】 Ｒｅｔ依存性細胞内シグナリングのアンタゴニストおよ
びＧＰＩ固定、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアゴニストである薬剤また
は数種の薬剤の有効量を投与することを含んでなる神経細胞疾患の治療のための
方法。 - 【請求項１０９】 ＧＰＩ固定、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングの該ア
ゴニストが、ＧＦＲα１依存性、Ｒｅｔ非依存性細胞内シグナリングのアゴニス
トである、請求項１０８記載の方法。 - 【請求項１１０】 ＧＰＩ固定細胞内シグナリングのアゴニストである薬剤
の有効量を投与することを含んでなる聴覚ニューロンを保護するための方法。 - 【請求項１１１】 ＧＰＩ固定細胞内シグナリングのアゴニストである薬剤
の有効量を投与することを含んでなる記憶喪失を防止するための方法。 - 【請求項１１２】 ＧＰＩ固定細胞内シグナリングのアゴニストである薬剤
の有効量を投与することを含んでなる学習能力を改善するための方法。 - 【請求項１１３】 ＧＰＩ固定細胞内シグナリングのアゴニストである薬剤
の有効量を投与することを含んでなるてんかんを治療するための方法。 - 【請求項１１４】 ＧＰＩ固定細胞内シグナリングのアゴニストである薬剤
の有効量を投与することを含んでなるパーキンソン病を治療するための方法。
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