CN102264699A - 新的亚苄基-吲哚啉酮及它们的医疗和诊断用途 - Google Patents

Abstract

本发明广泛涉及有机化学、生物化学、药理学和医学。更具体地，其涉及3-亚苄基-吲哚啉-2-酮衍生物及它们的生理学可接受的盐和前药，它们调节蛋白激酶(″PKs″)特别是蛋白酪氨酸激酶的活性，且因此被期待显示抗异常PK活性相关病症的有益效力。本发明还涉及单独或与其他治疗剂组合地使用这些化合物用于缓解、预防和/或治疗蛋白激酶介导的疾病和病症例如癌症的方法。

Description

新的亚苄基-吲哚啉酮及它们的医疗和诊断用途

相关申请的交叉参考

本申请要求2008年10月14日提交的美国临时专利申请No.61/105,206和2009年1月19日提交的美国临时专利申请No.61/145,595的优先权，这两个申请的内容以其全部引入本文作为参考，用于所有目的。

发明领域

本发明主要涉及有机化学、生物化学、药理学和医学。更具体地，其涉及3-亚苄基-吲哚啉-2-酮衍生物及它们的生理学可接受的盐和前药，它们调节蛋白激酶(″PKs″)，特别是蛋白酪氨酸激酶的活性，且因此被预期显示抗异常PK活性相关病症的有益作用。本发明还涉及单独或与其他治疗剂组合地使用这些化合物用于缓解、预防和/或治疗蛋白激酶-介导的疾病和病症例如癌症的方法。

发明背景

在过去二十年中，酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)用于治疗与未调节的蛋白激酶信号转导有关的疾病的用途已被广泛研究。例如，吲哚啉酮化合物用于治疗疾病包括细胞增殖性疾病例如癌症、动脉粥样硬化、关节炎和再狭窄以及代谢性疾病例如糖尿病的用途已描述于US 6,147,106中。

TKIs在不断成长的抗酪氨酸激酶相关疾病包括癌症的靶向治疗的领域中通常是重要的药理学物质。传统地，它们应用的理论基础在于单基因损伤如在慢性骨髓性白血病中的Bcr-Abl易位或在乳腺癌中的HER2扩增，其提供用于驱动肿瘤发生的排他信号-即：癌基因成瘾(Weinstein IB.癌症对癌基因成瘾-癌症的阿基利斯治疗(Cancer.Addiction tooncogenes--the Achilles heal of cancer).Science 2002年7月5日；297(5578)：63-64)。然而，增加的证据显示许多恶性肿瘤的激酶突变倾向于是散发性的而非聚集在基因组中特异的“热点”上(Bleeker FE，BardelliA.癌症的基因组前景：靶向治疗的前途(Genomic landscapes of cancers：prospects for targeted therapies).Pharmacogenomics 2007年12月；8(12)：1629-1633；Greenman C，Stephens P，Smith R，Dalgliesh GL，Hunter C，Bignell G等人人癌症基因组中体细胞突变的模式(Patterns ofsomatic mutation in human cancer genomes).Nature 2007年3月8日；446(7132)：153-158；Ruhe JE，Streit S，Hart S，Wong CH，Specht K，Knyazev P等人人癌症细胞系的酪氨酸激酶转录组中的遗传改变(Geneticalterations in the tyrosine kinase transcriptome of human cancer cell lines).Cancer Res 2007年12月1日；67(23)：11368-11376；Thomas RK，Baker AC，Debiasi RM，Winckler W，Laframboise T，Lin WM等人人癌症中高通量癌基因突变概貌(High-throughput oncogene mutation profiling in humancancer).Nat Genet 2007年3月；39(3)：347-351)。这暗示疾病引发和恶化的潜在驱动可能与削弱了单一疗法的效力的多重致癌缺陷有关。此外，最近的研究还证明受体交叉感知是普遍的并提供了针对肿瘤的转换致癌依赖的方法。例如，MET扩增被描述于耐EGFR抑制的非小细胞肺癌中(EngelmanJA，Zejnullahu K，Mitsudomi T，Song Y，Hyland C，Park JO等人MET扩增通过激活ERBB3信号导致肺癌的吉非替尼耐药(MET amplificationleads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling).Science 2007年5月18日；316(5827)：1039-1043)；IGF-1R信号转导也被上调以避免由厄洛替尼引起的生长停止(Buck E，Eyzaguirre A，Rosenfeld-Franklin M，Thomson S，Mulvihill M，Barr S等人反馈机制促进表皮和胰岛素样生长因子受体的小分子抑制剂的协同效应(Feedbackmechanisms promote cooperativity for small molecule inhibitors ofepidermal and insulin-like growth factor receptors).Cancer Res 2008年10月15日；68(20)：8322-8332)。因此，靶向多重激酶可能降低导致长期治疗中化学抗性的另一种激酶用途的发生率(Petrelli A，Giordano S.癌症治疗中的单靶向药物至多靶向药物：当非特异性有益时(From single-tomulti-target drugs in cancer therapy：when aspecificity becomes anadvantage).Curr Med Chem 2008；15(5)：422-432；Weinstein IB，Joe A.癌基因成瘾(Oncogene addiction).Cancer Res 2008年5月1日；68(9)：3077-3080)。

肝细胞癌(HCC)例证了一种癌症，其中在细胞信号转导中不可置否的引起疾病的激活的突变仍然是难以琢磨的。已报道一些酪氨酸激酶与HCC形成和生长有关。例如，已分别报道FAK、PYK2、IGF-1R和FGFR3的过表达及可能促使疾病严重(Itoh S，Maeda T，Shimada M，Aishima S，Shirabe K，Tanaka S等人粘着斑激酶在肝细胞癌恶化中的作用(Role ofexpression of focal adhesion kinase in progression of hepatocellularcarcinoma).Clin Cancer Res 2004年4月15日；10(8)：2812-2817；Qiu WH，Zhou BS，Chu PG，Chen WG，Chung C，Shih J等人人肝细胞癌中的成纤维细胞生长因子受体3的过表达(Over-expression of fibroblast growthfactor receptor 3 in human hepatocellular carcinoma).World JGastroenterol 2005年9月14日；11(34)：5266-5272；Scharf JG，Braulke T.IGF轴在肝癌形成中的作用(The role of the IGF axis inhepatocarcinogenesis).Horm Metab Res 2003年11月；35(11-12)：685-693；Sun CK，Ng KT，Sun BS，Ho JW，Lee TK，Ng I等人富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(Pyk2)对肝细胞癌恶化和复发的重要性(The significance ofproline-rich tyrosine kinase2(Pyk2)on hepatocellular carcinomaprogression and recurrence).Br J Cancer 2007年7月2日；97(1)：50-57)。最近，报道了在约三分之一的由正常向肿瘤转化的HCC患者中FGFR4提高并确定了其与AFP调节的潜在关联(Ho HK，Pok S，Streit S，Ruhe JE，Hart S，Lim KS等人成纤维细胞生长因子受体4在肝细胞癌恶化中调节增殖、抗凋亡作用和甲胎蛋白分泌并代表治疗措施的潜在靶点(Fibroblastgrowth factor receptor 4 regulates proliferation，anti-apoptosis andalpha-fetoprotein secretion during hepatocellular carcinoma progressionand represents a potential target for therapeutic intervention).J Hepatol2009年1月；50(1)：118-127)。目前，HCC中TKIs的临床试验应用最初为其他疾病设计的批准的或研究中的药物的经验用法。并不令人惊讶的是，这些试验得到边际效应，因为它们未必靶向疾病中所涉及的特定酪氨酸激酶。例如，当招募的大部分患者显示疾病恶化且没有人经历完全甚至部分响应时，在不可切除的HCC中伊马替尼和厄洛替尼的II期临床研究显示令人失望的响应(Lin AY，Fisher GA，So S，Tang C，Levitt L.伊马替尼在不可切除的肝细胞癌中的II期临床研究(Phase II study of imatinib inunresectable hepatocellular carcinoma).Am J Clin Oncol 2008年2月；31(1)：84-88；Thomas MB，Chadha R，Glover K，Wang X，Morris J，Brown T等人厄洛替尼在患有不可切除的肝细胞癌的患者中的II期临床研究(Phase 2 study of erlotinib in patients with unresectable hepatocellularcarcinoma).Cancer 2007年9月1日；110(5)：1059-1067)。

尽管FDA在2007年批准索拉非尼

-一种对于VEGFRs、PDGFRs、RET、c-kit以及Raf激酶具有亚微摩尔级抑制效应的多靶向TKI-用于HCC治疗(Simpson D，Keating GM.索拉非尼：在肝细胞癌中(Sorafenib：in hepatocellular carcinoma).Drugs 2008；68(2)：251-258)，并且使用另一种多靶向的TKI(舒尼替尼)的试验正在进行中(Zhu AX.索拉非尼和肝细胞癌的其它分子靶向物质的研发(Development of sorafenib andother molecularly targeted agents in hepatocellular carcinoma).Cancer2008年1月15日；112(2)：250-259)，但是本领域仍需要对于癌症具有定向效力的有效的广谱TKIs。

本发明的化合物及它们的制药用途解决了这种需要。

发明概述

本发明涉及3-亚苄基-吲哚啉-2-酮衍生物及它们的生理学可接受的盐和前药，它们调节蛋白激酶(″PKs″)的活性，且因此被期待显示对抗与异常PK活性相关的病症例如癌症的有益作用。

在第一方面，本发明涉及式I的化合物或其药学可接受的盐或前药，

其中：

每个R¹和R²独立地选自未取代或取代的C₁-C₁₀烷基、未取代或取代的C₂-C₁₀链烯基、未取代或取代的C₂-C₁₀炔基、未取代或取代的C₁-C₁₀烷氧基、羟基、卤素和三卤代甲基；

m为整数1，且n为整数1或2；

当m和n各自为1时，则R¹在环A的6位且R²在环B的2’、3’或4’位；且

当m为1且n为2时，则R¹在环A的6位且R²在环B的3’和4’位。

在另一方面，本发明涉及式II的化合物或其药学可接受的盐或前药：

其中：

X为F、Cl、Br或C₁-C₄烷氧基；

每个R³独立地选自未取代或取代的C₁-C₁₀烷基、未取代或取代的C₂-C₁₀链烯基、未取代或取代的C₂-C₁₀炔基、未取代或取代的C₁-C₁₀烷氧基、羟基、卤素和三卤代甲基；

o为整数1或2；

当o为1时，则R³在环B的3’或4’位；

当o为2时，则R³在环B的3’和4’位。

在又一方面，本发明涉及制备式I或II的化合物的方法，所述方法包括在碱存在下，使式(III)的羟吲哚

与式(IV)的醛反应

在又一方面，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的化合物或其盐或前药及药学可接受的载体或赋形剂。

在另一方面，本发明涉及调节蛋白激酶的催化活性的方法，其包括使所述蛋白激酶与至少一种本发明的化合物、盐或前药接触。

在又一方面，本发明涉及治疗或预防蛋白酪氨酸激酶-相关疾病或病症的方法，其包括向有此需要的个体给药药学活性量的本发明的化合物。

在又一方面，本发明涉及鉴别具有抗肝细胞癌的特异性效力的蛋白激酶抑制剂的方法，其包括：

(i)用肝细胞癌细胞系温育候选化合物；

(ii)测定细胞存活；和

(iii)将所测定的细胞存活与候选化合物对正常肝细胞系的作用相比较以鉴别具有抗肝细胞癌细胞的特异性活性的化合物。

在还下文详述中并参考下述附图简述进一步描述本发明。

附图简述

图1A和1B显示荧光激活细胞分选(FACS)图，其表明本发明的两个示例性化合物(化合物46和48)对从(图1A)G1-阻断和(图1B)G2-阻断释放的HCT116细胞的效力。R6、R3、R4、R5分别指的是sub-G1、G1、S和G2/M期。化合物46和48分别在15μM和5μM进行测试(≈1.5xIC₅₀)。

图2表明本发明的示例性化合物(化合物47)以及舒尼替尼(HepG2、HuH7和THLE2)的存活。(A)HuH7、(B)HepG2和(C)THLE2细胞被铺在96孔板上并用0-10μM化合物47(■)和舒尼替尼(●)处理72h。通过Cell-Titer Glo测量存活且结果表达为未处理的对照中的存活细胞的百分数+/-变异系数(n＝8)。

图3表明本发明的示例性化合物(化合物47)对不同组的HCC细胞系的效力。化合物47抗HCC增殖的效力在较宽组的HCC细胞系上进行测试：Hep3B(●)、Hs817T(■)、PLC/PRF/5(▲)和SK-Hep1

通过CellTiter-Glo测定法测定。

图4表明本发明的示例性化合物(化合物47)在HepG2和HuH7中的蛋白质印迹分析。将HuH7或HepG2细胞用渐增浓度的化合物47(0、1、5或10μM)处理24h。收集细胞溶解产物并针对裂解的PARP、磷酸-Erk、磷酸-Akt、PCNA、细胞周期蛋白D1、Bax和Bcl-xL进行免疫印迹，用HSP60作为内参照(loading control)。

图5表明本发明的示例性化合物(化合物47)在HuH7和HepG2中对胱天蛋白酶-3活性的效力。收集如图4中所述处理的HuH7(较深色的柱图)和HepG2(较浅色的柱图)细胞，用于通过荧光Ac-DEVD-AMC的催化水解进行的胱天蛋白酶-3测定。结果被表示为采用AMC底物温育的标准化的RFU/μg溶解产物/h(n＝3)。

图6表明本发明的示例性化合物(化合物47)在HuH7中有效地抑制AFP转录。将HuH7细胞用化合物47(1、5、10μM)或舒尼替尼(10μM)处理24h。对AFP进行实时PCR。将得到的平均CT值针对作为持家对照(housekeeping control)的18S mRNA标准化，且数据表示为相对于未处理的对照的转录表达的倍数变化。误差线代表转化为倍数变化的标准偏差(n＝3)。

图7表明RTK阵列(array)及本发明的示例性化合物化合物47对RTK磷酸化的效力。将血清饥饿的HuH7细胞用化合物47(1、5、10μM)或舒尼替尼(10μM)处理24h。用人类磷酸-RTK阵列确定激酶磷酸化改变。

图8通过免疫印迹分析表明本发明的示例性化合物(化合物47)对IGF-1R、EGFR、EphA2和Tyro3磷酸化的效力。(A)将HuH7细胞用溶媒、化合物47(1、5或10μM)或舒尼替尼(10μM)处理24h。将样品针对磷酸-IGF-1R(Y980和Y1135/1136)进行免疫印迹。用HSP60作为内参照。(B)在用抗磷酸酪氨酸(4G10)免疫印迹前将类似处理的细胞用抗-EGFR、抗-EphA2和抗-Tyro3免疫沉淀。接着用各自的抗体作为内参照再次探测膜。

发明详述

本发明提供式I的化合物：

在式I的化合物或其药学可接受的盐或前药中，每个取代基R¹和R²独立地选自未取代或取代的C₁-C₁₀烷基、未取代或取代的C₂-C₁₀链烯基、未取代或取代的C₂-C₁₀炔基、未取代或取代的C₁-C₁₀烷氧基、羟基、卤素和三卤代甲基。整数m为值1，且整数n为值1或2。因此，当m和n各自为1，则R¹在环A的6位且R²在环B的2’、3’或4’位。当m为1且n为2时，则R¹在环A的6位且R²在环B的3’和4’位。

在式I的化合物的一个实施方案中，R¹各自独立地选自卤素和C₁-C₄烷氧基。因此，在一些实施方案中，R¹独立地选自溴、氯、氟和甲氧基。

在式I的化合物的另一实施方案中，R²各自独立地选自C₁-C₄烷氧基、羟基和三卤代甲基。在一些实施方案中，R²各自独立地选自甲氧基、乙氧基、羟基和三氟甲基。

在一些实施方案中，本发明涉及式II的化合物：

在式(II)的化合物或其药学可接受的盐或前药中，取代基X为F、Cl、Br或C₁-C₄烷氧基。R³取代基各自独立地选自未取代或取代的C₁-C₁₀烷基、未取代或取代的C₂-C₁₀链烯基、未取代或取代的C₂-C₁₀炔基、未取代或取代的C₁-C₁₀烷氧基、羟基、卤素和三卤代甲基。整数o为值1或2。因此，当o为1时，则R³在环B的3’或4’位。当o为2时，则R³在环B的3’和4’位。

在式II的化合物的一个实施方案中，R³各自独立地选自C₁-C₄烷氧基、羟基和三卤代甲基。在一些实施方案中，R³各自独立地选自甲氧基、羟基和三氟甲基。

在式II的化合物的另一实施方案中，X可为甲氧基或乙氧基。

如本文所描述的化合物具有有效的抗增殖活性且特别可用于治疗与不适当或不正常的蛋白酪氨酸激酶功能、特别是增强的蛋白酪氨酸激酶活性有关的或涉及蛋白酪氨酸激酶功能的疾病和病症。因此，可被本发明的化合物治疗和/或预防的疾病和病症为例如但不限于这些疾病和病症、过度增殖性病症和癌症例如肝细胞癌、肺癌、结肠癌和乳腺癌。同时，本发明人已发现本发明的化合物还提供化学预防的可能(见实施例5)。因此，如本文所描述的化合物不仅被预期显示对抗与不正常的PK活性有关的病症例如癌症的有益效力，还具有对于正常细胞的潜在的细胞保护作用。

如本文所使用，“烷基”指的是饱和脂族烃，包括直链或支链基团。优选地，所述烷基具有1至10个碳原子(不论何时，一个数值范围，例如此处所述的“1-10”，其表示所述基团，在这里为烷基基团，可含有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子、6个碳原子等，直至并包括10个碳原子)。更具体地，其可为具有1至6个碳原子的中等大小的烷基或具有1至4个碳原子的低级烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基等。所述烷基基团可被取代或不被取代。当被取代时，取代基为一个或多个、例如一个或两个基团，所述基团独立地选自：C₃-C₈环烷基、C₆-C₁₄芳基、5-10元杂芳基(其中1至4个环原子独立地选自氮、氧或硫)、5-10元杂脂环族(其中1至3个环原子独立地为氮、氧或硫)、羟基、C₁-C₁₀烷氧基、C₃-C₈环烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、氰基、卤素、羰基、硫代羰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、硝基、甲硅烷基、亚磺酰基、磺酰基、氨基和-NR¹⁰R¹¹，其中R¹⁰和R¹¹独立地选自氢、C₁-C₄烷基、C₃-C₈环烷基、C₆-C₁₄芳基、羰基、乙酰基、磺酰基、氨基和三氟甲磺酰基，或者R¹⁰和R¹¹，与它们所连接的氮原子一起，结合形成五元或六元杂脂环族环。

“环烷基”基团指的是3至8个环原子的全碳单环(即：共享相邻的碳原子对的环)，其中一个或多个环的不具有完全共轭的π-电子系统，如：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基等。环烷基基团的非限制性实例为环丙烷、环丁烷、环戊烷、环戊烯、环己烷、金刚烷、环己二烯、环庚烷和环庚三烯。环烷基可被取代或不被取代。当被取代时，取代基为一个或多个例如一个或两个独立选自下述的基团：C₁-C₁₀烷基、C₃-C₈环烷基、C₆-C₁₄芳基、5-10元杂芳基(其中1至4个环原子独立地选自氮、氧或硫)、5-10元杂脂环族(其中1至3个环原子独立地为氮、氧或硫)、羟基、C₁-C₁₀烷氧基、C₃-C₈环烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、氰基、卤素、羰基、硫代羰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、硝基、甲硅烷基、亚磺酰基、磺酰基、氨基和-NR¹⁰R¹¹，其中R¹⁰和R¹¹如上文所定义。

“链烯基”基团指的是包含至少两个碳原子和至少一个碳-碳双键的如本文所定义的烷基基团，例如乙烯基、丙烯基、丁烯基或戊烯基及它们的结构同分异构形式如1-或2-丙烯基，1-、2-或3-丁烯基等。链烯基可包含2至10个碳原子，例如2至8个碳原子、2至6个碳原子或2至5个碳原子，其中数值范围，例如“2至10”或“C₂-C₁₀”涉及在所给定范围内的每个整数，如“C₂-C₁₀链烯基”表示包含2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子、6个碳原子等，直至并且包括10个碳原子的链烯基。本发明的链烯基和烯烃基团可为取代的或未被取代的。当被取代时，取代基可选自与上文就烷基基团取代所公开的相同的基团。这样的基团的实例包括，但不限于：乙烯基、丙烯基、丁烯基、1，4-丁二烯基、戊烯基、己烯基、4-甲基己-1-烯基、4-乙基-2-甲基己-1-烯基等。

“炔基”基团指的是包含至少两个碳原子和至少一个碳-碳叁键的如本文所定义的烷基基团，如：乙炔、乙炔基、丙炔基、丁炔基或戊炔基及它们如上文所描述的结构同分异构形式。所述炔基可包含2至10个碳原子，例如2至8个碳原子、2至6个碳原子或2至5个碳原子，其中数值范围，例如“2至10”或“C₂-C₁₀”涉及在所给定范围内的每个整数，如“C₂-C₁₀炔基”表示包含2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子、6个碳原子等，直至并且包括10个碳原子的炔基。本发明的炔基基团可为取代的或未被取代的。当被取代时，取代基可选自与上文就烷基基团取代所公开的相同的基团。炔烃基团的实例包括但不限于：乙炔基、丙炔基、丁炔基等。

“芳基”基团指的是6至14个环原子并具有完全共轭的π-电子系统的全碳单环或稠环多环(即：共享相邻的碳原子对的环)基团。芳基的非限制性实例为苯基、萘基和蒽基。所述芳基可被取代或不被取代。当被取代时，取代基为一个或多个例如一个、两个或三个独立地选自下述基团的取代基：C₁-C₁₀烷基、C₃-C₈环烷基、C₆-C₁₄芳基、5-10元杂芳基(其中1至4个环原子独立地选自氮、氧或硫)、5-10元杂脂环族(其中1至3个环原子独立地为氮、氧或硫)、羟基、C₁-C₁₀烷氧基、C₃-C₈环烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、氰基、卤素、三卤代甲基、羰基、硫代羰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、硝基、甲硅烷基、亚磺酰基、磺酰基、氨基和-NR¹⁰R¹¹其中R¹⁰和R¹¹如上文所定义。优选地，所述取代基独立地选自氯、氟、溴、甲基、乙基、羟基、甲氧基、硝基、羧基、甲氧羰基、磺酰基或氨基。

“杂芳基”基团指的是其中一个、两个、三个或四个环原子选自氮、氧和硫且其余为碳的5至10个环原子的单环或稠合芳环(即：共享相邻原子对的环)。杂芳基的非限制性实例为吡啶基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、

唑基、异

唑基、噻唑基、异噻唑基、吡唑基、1，2，3-三唑基、1，2，4-三唑基、1，2，3-

二唑基、1，2，4-

二唑基、1，2，5-

二唑基、1，3，4-

二唑基、1，3，4-三嗪基、1，2，3-三嗪基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并三唑基、异苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚基、3H-吲哚基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并

唑基、喹嗪基、喹唑啉基、酞嗪基(pthalazinyl)、喹喔啉基、噌啉基(cinnnolinyl)、萘啶基(napthyridinyl)、喹啉基、异喹啉基、四唑基、5，6，7，8-四氢喹啉基、5，6，7，8-四氢异喹啉基、嘌呤基、蝶啶基、吡啶基、嘧啶基、咔唑基、呫吨基或苯并喹啉基。所述杂芳基基团可被取代或不被取代。当被取代时，取代基为一个或多个例如一个或两个独立地选自下述基团的取代基：C₁-C₁₀烷基、C₃-C₈环烷基、C₆-C₁₄芳基、5-10元杂芳基(其中1至4个环原子独立地选自氮、氧或硫)、5-10元杂脂环族(其中1至3个环原子独立地为氮、氧或硫)、羟基、C₁-C₁₀烷氧基、C₃-C₈环烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、氰基、卤素、三卤代甲基、羰基、硫代羰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、硝基、甲硅烷基、亚磺酰基、磺酰基、氨基和-NR¹⁰R¹¹其中R¹⁰和R¹¹如上文所定义。优选地，所述取代基独立地选自氯、氟、溴、甲基、乙基、羟基、甲氧基、硝基、羧基、甲氧羰基、磺酰基或氨基。

“杂脂环族”基团指的是5至10个环原子的单环或稠环，在所述环中含有一个、两个或三个选自氮、氧和-S(O)_n其中n为0-2的杂原子，其余环原子为碳。所述环也可具有一个或多个双键。然而，所述环不具有完全共轭的π-电子系统。杂脂环族基团的非限制性实例包括：吡咯烷、哌啶、哌嗪、吗啉、咪唑烷、四氢哒嗪、四氢呋喃、硫吗啉、四氢吡啶等。所述杂脂环族环可被取代或不被取代。当被取代时，取代基为一个或多个例如一个、两个或三个独立地选自下述基团的取代基：C₁-C₁₀烷基、C₃-C₈环烷基、C₆-C₁₄芳基、5-10元杂芳基(其中1至4个环原子独立地选自氮、氧或硫)、5-10元杂脂环族(其中1至3个环原子独立地为氮、氧或硫)、羟基、C₁-C₁₀烷氧基、C₃-C₈环烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、氰基、卤素、三卤代甲基、羰基、硫代羰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、硝基、甲硅烷基、亚磺酰基、磺酰基、氨基和-NR¹⁰R¹¹其中R¹⁰和R¹¹如上文所定义。所述取代基例如独立地选自氯、氟、溴、甲基、乙基、羟基、甲氧基、硝基、羧基、甲氧羰基、磺酰基或氨基。

“羟基”基团指的是-OH基团。

“烷氧基”基团指的是-O-未取代的烷基和-O-取代的烷基，所述烷基如本文所定义。实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等。

“环烷氧基”基团指的是-O-环烷基基团，其如本文所定义。一个实例为环丙氧基。

“芳氧基”基团指的是-O-芳基和-O-杂芳基基团，其如本文所定义。实例包括且不限于苯氧基、萘氧基、吡啶氧基、呋喃氧基等。

“巯基”基团指的是-SH基团。

“烷硫基”基团指的是S-烷基和-S-环烷基基团，其如本文所定义。实例包括但不限于甲硫基、乙硫基等。

“芳硫基”基团指的是-S-芳基和-S-杂芳基基团，其如本文所定义。实例包括但不限于苯硫基、萘硫基、吡啶硫基、呋喃硫基等。

“亚硫酰基”基团指的是-S(O)-R”基团，其中R”选自氢、羟基、烷基、环烷基、芳基、杂芳基(通过环碳键合的)和杂脂环族(通过环碳键合的)，它们如本文所定义。

“磺酰基”基团指的是-S(O)₂R”基团，其中R”选自氢、羟基、烷基、环烷基、芳基、杂芳基(通过环碳键合的)和杂脂环族(通过环碳键合的)，它们如本文所定义。

“三卤代甲基”基团指的是-CX₃基团，其中X为如本文所定义的卤素基团，例如三氟甲基、三氯甲基、三溴甲基、二氯氟甲基等。

“羰基”指的是-C(＝O)-R”基团，其中R”选自氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基(通过环碳键合的)和杂脂环族(通过环碳键合的)，它们如本文所定义。代表性的实例包括但不限于乙酰基、丙酰基、苯甲酰基、甲酰基、环丙基羰基、吡啶基羰基、吡咯烷-1-基羰基等。

“硫代羰基”基团指的是-C(＝S)-R”基团，其中R”如本文所定义。

“C-羧基”和“羧基”在本文中可互换使用，其指的是-C(＝O)O-R”基团，其中R”如本文所定义，例如-COOH、甲氧羰基、乙氧羰基、苄氧羰基等。

“O-羧基”基团指的是-OC(＝O)R”基团，其中R”如本文所定义，例如甲基羰基氧基、苯基羰基氧基、苄基羰基氧基等。

“乙酰基”基团指的是-C(＝O)CH₃基团。

“羧酸”基团指的是其中R”为氢的C-羧基基团。

“卤代”或“卤素”基团指的是氟、氯、溴或碘。

“氰基”基团指的是-CN基团。

“硝基”基团指的是-NO₂基团。

“O-氨基甲酰基”基团指的是-OC(＝O)NR¹⁰R¹¹基团，其中R¹⁰和R¹¹如本文所定义。

“N-氨基甲酰基”基团指的是R¹¹OC(＝O)NR¹⁰-基团，其中R¹⁰和R¹¹如本文所定义。

“O-硫代氨基甲酰基”基团指的是-OC(＝S)NR¹⁰R¹¹基团，其中R¹⁰和R¹¹如本文所定义。

“N-硫代氨基甲酰基”基团指的是R¹¹OC(＝S)NR¹⁰-基团，其中R¹⁰和R¹¹如本文所定义。

“氨基”基团指的是-NR¹⁰R¹¹基团，其中R¹⁰和R¹¹独立地为氢或未取代的低级烷基，例如-NH₂、二甲基氨基、二乙基氨基、乙基氨基、甲基氨基等。

“C-酰氨基”基团指的是-C(＝O)NR¹⁰R¹¹基团，其中R¹⁰和R¹¹如本文所定义。例如，R¹⁰为氢或未取代的C₁-C₄烷基且R¹¹为氢，任选被杂脂环族、羟基或氨基取代的C₁-C₄烷基。例如，C(＝O)NR¹⁰R¹¹可为氨基羰基、二甲基氨基羰基、二乙基氨基羰基、二乙基氨基乙基氨基羰基、乙基氨基乙基氨基羰基等。

“N-酰氨基”基团指的是R¹¹C(＝O)NR¹⁰-基团，其中R¹⁰和R¹¹如本文所定义，例如乙酰氨基等。

在一些实施方案中，提供了式Ia的化合物：

其中当m和n都为1时，

R¹为选自6-F、6-Cl和6-OCH₃的基团；且

R²为选自3’OCH₃、3’-OH、4’-OCH₃和3’CF₃的基团；

且，其中当m为1且n为2时，

R¹为选自6-F、6-Cl和6-OCH₃的基团；且

R²为选自3’OCH₃、3’-OH、4’-OCH₃和3’CF₃的基团。

在其他实施方案中，提供了式IIa的化合物：

其中，当n为1时，

R³为选自3’-F、3’-Cl、3’-Br、3’-OCH₃、3’-OH、4’-OCH₃、3’CF₃、4’-F、4’-Cl、4’-Br、4’-OCH₃、4’-OH、3’-OCH₃和4’-CF₃的基团；

其中，当n为2时，

R³为选自3’-F、3’-Cl、3’-Br、3’-OCH₃、3’-OH、4’-OCH₃、3’CF₃、4’-F、4’-Cl、4’-Br、4’-OCH₃、4’-OH、3’-OCH₃和4’-CF₃的基团。

在一些实施方案中，本文描述的化合物选自：

6-氟-3-(3’-甲氧基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮(在下文中也称为化合物39)；

6-氟-3-(3’-羟基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮；

6-氟-3-(4’-甲氧基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮；

6-氯-3-(3’-甲氧基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮(在下文中也称为化合物41)；

6-氯-3-(3’-羟基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮；

6-氯-3-(4’-甲氧基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮；

6-甲氧基-3-(3’-甲氧基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮(在下文中也称为化合物42)；

6-甲氧基-3-(3’-羟基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮；

6-甲氧基-3-(4’-甲氧基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮；

6-氟-3-(3’-羟基-4’-甲氧基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮(在下文中也称为化合物43)；

6-氯-3-(3’-羟基-4’-甲氧基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮(在下文中也称为化合物44)；

6-甲氧基-3-(3’-羟基-4’-甲氧基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮(在下文中也称为化合物45)；

6-氟-3-(3’-三氟甲基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮(在下文中也称为化合物46)；

6-氯-3-(3’-三氟甲基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮(在下文中也称为化合物47)；

6-甲氧基-3-(3’-三氟甲基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮(在下文中也称为化合物48)；

5-氯-3-(3’-甲氧基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮(在下文中也称为化合物40)；

5-氯-3-(3’-羟基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮；

5-氯-3-(4’-甲氧基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮；和

5-氯-3-(3’三氟甲基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮。

在其他实施方案中，本发明的化合物为6-氯-3-(3’-三氟甲基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮。

可使用本领域通常已知的技术和容易得到的起始原料合成本发明的化合物或其药学可接受的盐或前药。本发明的化合物也可根据已知技术例如描述于授权于Tang等人的美国专利6,469,032中的合成方法进行合成，将其内容全部引入本文作为参考。因此，本发明的化合物可根据美国专利6,469,032的实施例5.1和5.4中描述的方法A或B，通过使合适的2-吲哚啉酮化合物与合适的醛反应进行制备。

本发明的化合物或其药学可接受的盐或前药还可依照实施例1流程1中所描述的合成流程得到。更详细地，式I或II的化合物可通过使式(III)的羟吲哚

与式(IV)的醛

在碱存在下反应来制备。

在本文中，分别在式III和IV中的R¹和R²取代基如本文描述的式I或II的化合物中所定义。在一些实施方案中，所述碱可包括胺碱。所述胺碱包括但不限于环状胺例如氮丙啶、哌啶和N-甲基哌啶。在一些实施方案中，所述碱可为哌啶。

在本文中，如本文所描述的式I或II的化合物可作为E-异构体、Z-异构体或E和Z异构体的混合物存在。

本发明的化合物可在药物制剂或组合物中单独或与其他药理学活性化合物组合给药。

可包含在药物组合物中的其他活性成分的实例包括但不限于：核酸烷化剂、核苷类似物、蒽环类、抗生素、芳香酶抑制剂、叶酸拮抗剂、雌激素受体调节剂、无机砷酸盐(aresenate)、微管抑制剂、亚硝基脲、破骨细胞抑制剂、含铂化合物、维甲酸类、拓扑异构酶1抑制剂、拓扑异构酶2抑制剂、胸苷酸合酶抑制剂、芳香酶抑制剂、环氧合酶抑制剂、异黄酮、酪氨酸激酶抑制剂、生长因子、双膦酸盐和单克隆抗体。

可包含在本发明的药物组合物中的烷化剂包括但不限于：白消安

苯丁酸氮芥

异环磷酰胺(

有或没有MESNA)、环磷酰胺

葡磷酰胺、美法仑/L-PAM

达卡巴嗪(DTIC-

)和替莫唑胺

作为示例性的实例，化合物2-双[(2-氯乙基)氨基]四氢-2H-1，3，2-氧杂氮杂磷杂苯，2-氧化物，通常又称为环磷酰胺是用于治疗III和IV期恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病、蕈样肉芽肿病、成神经细胞瘤、卵巢腺癌、视网膜母细胞瘤和乳腺癌的烷化剂。

可包含在本发明的药物组合物中的核苷类似物包括但不限于：阿糖胞苷

和吉西他滨

两种氟化的脱氧胞苷类似物、氟达拉滨嘌呤类似物、6-巯基嘌呤(Puri-

)及其前药硫唑嘌呤

可包含在本发明的药物组合物中的蒽环类包括但不限于：多柔比星

米托蒽醌

伊达比星

戊柔比星

和表柔比星

作为一个实例，化合物(8S，10S)-10-(4-氨基-5-羟基-6-甲基-四氢-2H-吡喃-2-基氧基)-6，8，11-三羟基-8-(2-羟基乙酰基)-1-甲氧基-7，8，9，10-四氢并四苯-5，12-二酮，更常被称为多柔比星，是从波塞链霉菌表灰变种(Streptomyces peucetius var.caesius)培养物分离的细胞毒性蒽环类抗生素。多柔比星已成功地用于在弥散性瘤形成疾病如急性成淋巴细胞性白血病、急性成髓细胞性白血病、维尔姆斯瘤、神经母细胞瘤、软组织和骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、膀胱移行细胞癌、甲状腺癌、霍奇金和非霍奇金类型的淋巴瘤、支气管原癌和胃癌中引起消退。

可包含在本发明的药物组合物中的抗生素包括但不限于：更生霉素、放射菌素D

柔红霉素/道诺霉素

博来霉素表柔比星

和米托蒽醌在本发明的实施中有用的芳香酶抑制剂包括但不限于：阿那曲唑

和来曲唑

可包含在本发明的药物组合物中的双膦酸盐抑制剂包括但不限于：唑来膦酸

可包含在本发明的药物组合物中的环氧合酶抑制剂包括但不限于：乙酰水杨酸

塞来昔布

和罗非昔布

可包含在本发明的组合物中的雌激素受体调节剂包括但不限于：他莫昔芬

和氟维司群

可包含在本发明的组合物中的叶酸拮抗剂包括但不限于：甲氨蝶呤

和三甲曲沙

作为示例性的实例，化合物(S)-2-(4-(((2，4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲基氨基)苯甲酰氨基)戊二酸，通常称为甲氨蝶呤，是已被用于治疗妊娠性绒毛膜癌和治疗患有绒膜腺瘤和葡萄胎的抗叶酸药物。它也可用于治疗晚期恶性淋巴瘤和治疗重症蕈样肉芽肿病。

可包含在本发明的药物组合物中的无机砷酸盐包括但不限于：三氧化二砷

可包含在本发明的组合物中的微管抑制剂(如本文所使用，“微管抑制剂”为任何干扰微管装配或分解的物质)包括但不限于：长春新碱

长春碱紫杉醇长春瑞滨

多西他赛

埃坡霉素(epothilone)B或D或两者任一的衍生物、以及discodermolide或其衍生物。

可包含在本发明的药物组合物中的亚硝基脲包括但不限于：丙卡巴肼

洛莫司汀

卡莫司汀

和雌莫司汀

可包含在本发明的药物组合物中的核苷类似物包括但不限于：6-巯基嘌呤

5-氟尿嘧啶

6-硫鸟嘌呤

羟基脲

阿糖胞苷

氟尿苷氟达拉滨

喷司他丁

克拉屈滨吉西他滨

和卡培他滨

作为示例性的实例，化合物5-氟-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮，通常也称为5-氟尿嘧啶，是一种在被认为通过手术或其他方式无法治愈的患有结肠癌、直肠癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌的患者的姑息治疗中有效的抗代谢核苷类似物。核苷类似物的另一实例是吉西他滨。吉西他滨是2′-去氧-2′，2′-二氟-胞苷。其作为单盐酸盐及作为β-异构体商购可得。其在化学上又称为1-(4-氨基-2-氧代-1-H-嘧啶-1-基)-2-脱氧-2，2-二氟核糖。

可包含在本发明的药物组合物中的破骨细胞抑制剂的示例性实例为帕米膦酸二钠

可包含在本发明的药物组合物中的铂化合物包括但不限于：顺铂和卡铂

可包含在本发明的药物组合物中的维甲酸类包括但不限于：维甲酸、ATRA

阿利维A酸

和贝沙罗汀

可包含在本发明的药物组合物中的拓扑异构酶1抑制剂包括，但不限于：托泊替康

和伊立替康

可包含在本发明的药物组合物中的拓扑异构酶2抑制剂包括但不限于：依托泊苷

和替尼泊苷

可包含在本发明的药物组合物中的其他合适的酪氨酸激酶抑制剂的实例包括但不限于：达沙替尼(dasatinib)

厄洛替尼吉非替尼

伊马替尼

拉帕替尼(lapatinib)

索拉非尼和凡德他尼(vandetanib)

可包含在本发明的药物组合物中的(重组体)生长因子的实例包括但不限于：白介素-11、干扰素-α-2b和白介素-2。可包含在本发明的药物组合物中的胸苷酸合酶抑制剂的示例性实例为可包含在本发明的药物组合物中的单克隆抗体的实例包括但不限于：利妥昔单抗或西妥昔单抗

在一些实施方案中，提供了药物组合物。所述药物组合物可包含本发明的化合物或其盐或前药以及药学可接受的载体或赋形剂。

“药物组合物”指的是一种或多种本文所述的化合物或其生理学/药学可接受的盐或前药与其他化学成分例如生理学/药学可接受的载体和赋形剂的混合物。药物组合物的目的是有利于向有机体给药化合物。

式I或II的化合物也可充当前药。“前药”指的是在体内转化为母体药物的物质。前药通常是有用的，因为在一些情况下，它们会比母体药物易于给药。例如，它们可能通过口服给药被生物利用而母体药物则不能。前药还可能在药物组合物中具有超过母体药物的改善的溶解度。前药的非限制性实例可为本发明的化合物，其作为酯(“前药”)给药以促进传送通过细胞膜(此时水溶性对于迁移是有害的)，一旦进入细胞接着代谢水解为羧酸，活性实体，此时水溶性是有利的。前药可通过多种机理包括酶促方法和代谢水解被转化为母体药物。

前药的另一实例可为短的多肽，例如而非限制，2-10个氨基酸多肽，通过末端氨基键合至本发明的化合物的羧基，其中所述多肽在体内水解或代谢以释放活性分子。式I或II的化合物的前药在本发明的范围内。

此外，考虑到式I或II的化合物将被有机体例如人体内的酶代谢产生能调节蛋白酪氨酸激酶活性的代谢物。这样的代谢物在本发明的范围内。

如本文所使用，“生理学/药学可接受的载体”指的是对有机体不引起显著刺激且不消除所给药的化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。

“药学可接受的赋形剂”指的是添加至药物组合物中以进一步有利于化合物给药的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和多种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。

如本文所使用，术语“药学可接受的盐”指的是那些保持母体化合物的生物学有效性和性质的盐。这样的盐包括但不限于：(1)酸加成盐，其通过母体化合物的游离碱与无机酸例如盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、硫酸和高氯酸等或与有机酸例如乙酸、草酸、(D)或(L)苹果酸、马来酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸等，优选盐酸或(L)-苹果酸反应获得；或者(2)当在所述母体化合物中存在的酸性质子被金属离子例如碱金属离子例如钠或钾、碱土金属离子例如镁或钙或铝离子置换时形成的盐；或者与有机碱例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺配位形成的盐。

本文使用的术语“蛋白酪氨酸激酶相关疾病或病症”指的是涉及蛋白酪氨酸激酶活性包括异常的蛋白酪氨酸激酶活性的病况。这样的疾病和病症的实例为异常的细胞增殖性疾病，例如癌症、纤维化和肾小球系膜病症、异常的血管生成和血管发生、伤口愈合、银屑病、糖尿病和炎症；异常分化的病况其包括但不限于：神经变性病症、慢的伤口愈合率和组织移植技术；以及异常的细胞存活病况。异常的细胞存活病况涉及程序性细胞死亡(细胞凋亡)途径被活化或取消的疾病。许多蛋白激酶与细胞凋亡途径有关。在任一种所述蛋白激酶的功能中的失常可能导致细胞永生或早熟细胞死亡。在一些实施方案中，所述蛋白酪氨酸激酶相关病症可包括RTK-相关病症，例如：IGF-1R相关病症、EphA2相关病症或Tyro3相关病症。这些病症可为肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌和肺癌。

本发明的化合物高度特异性和选择性地结合至蛋白酪氨酸激酶，特别是受体酪氨酸激酶(RTKs)。可被本发明的化合物结合的示例性的RTKs非限制性地为：EGFR、HER2、HER3、HER4、IR、IGF-1R、IRR、PDGFRCSFIR、C-Kit、C-fms、Flk-IR、Flk4、KDR/Flk1、Flt-l、FGFR-1R、FGFR-2R、FGFR-3R、FGFR-4R、EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10和Tyro3。在结合后，本发明的化合物减少或消除蛋白酪氨酸激酶-介导的细胞信号转导。不受任何理论约束，认为本发明的化合物会通过特异性地抑制酪氨酸激酶的活性来最小化和除去实体瘤，或者会至少调节或抑制肿瘤生长和/或转移。对于实施本发明，并不需要确理解本发明的化合物抑制蛋白酪氨酸激酶信号转导的机理。然而，尽管因此不受任何特别的机理或理论约束，但认为所述化合物通过非共价相互作用例如氢键、范德华相互作用和离子键与ATP结合区域或靠近那里的接近区域中的蛋白酪氨酸激酶的氨基酸相互作用。因此，这阻断了ATP的结合并从而阻断了其他蛋白质的磷酸化。在本文中，可能通过本发明的化合物的羟吲哚核周围的构件与对于各蛋白酪氨酸激酶特异的氨基酸结构域的相互作用来赋予本发明的化合物对于特定的蛋白酪氨酸激酶的特异性。因此，不同的吲哚啉酮取代基可能有助于对于特定蛋白酪氨酸激酶的优先结合。

在一些实施方案中，本发明涉及调节蛋白激酶例如上文描述的蛋白酪氨酸激酶的催化活性的方法。所述方法包括使所述蛋白激酶与本发明的化合物、其盐或前药接触。

如本文所使用，术语“调节”指的是改变本文描述的蛋白激酶的活性。例如，调节可引起酪氨酸激酶的蛋白活性、结合特性或任何其他生物学的、功能的或免疫性质的增加或减少。

本发明的化合物适用作蛋白酪氨酸激酶-介导的细胞信号转导的抑制剂。因为蛋白酪氨酸激酶尤其是在细胞增殖、凋亡、分化和迁移中起关键作用，所以本发明的化合物具有抗增殖活性，因此可用于治疗与不适当或不正常的蛋白酪氨酸激酶功能特别是增强的蛋白酪氨酸激酶活性有关的或涉及蛋白酪氨酸激酶功能的疾病和病症。可因此用本发明的化合物治疗和/或预防的疾病和病症例如是但非限制于这些疾病和病症、过度增殖性病症和癌症如RTK-相关病症，例如IGF-1R相关病症、EphA2相关病症或Tyro3相关病症。这些病症可为肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌和肺癌。

因此，在一些实施方案中，本发明涉及在有机体中治疗或预防蛋白酪氨酸激酶-相关疾病或病症的方法。所述方法包括向有此需要的个体给药药学活性量的本发明的化合物。所述个体可为哺乳动物。哺乳动物可包括但不限于有机体例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴和猿以及人类。

“治疗”指的是缓解或消除蛋白酪氨酸激酶相关疾病或病症和/或其伴随的症状的方法。

“预防”指的是阻止蛋白酪氨酸激酶相关疾病或病症发生的方法，即：预防性的方法。

“有机体”指的是包含至少一个细胞的活的实体。活的有机体可能简单如单个的真核细胞或者复杂如哺乳动物包括人类。

在本文中，应注意到对于本发明的化合物作为药物的效力而言，除了亲合力外还有许多变量起关键作用。因此，本发明的化合物可被特别选择用作药物不仅是基于测定的结合特异性和亲合力，而且还基于其他因素，例如：生物利用度、引起的副作用的严重性、所述化合物的代谢转化、所述化合物在有机体中的半衰期等。

本发明的化合物或其药学可接受的盐或前药可就这样给药至人类患者或者可在前述物质与合适的载体或赋形剂混合其中的药物组合物中给药。药物的制剂和给药技术可在“Remington′s Pharmacological Sciences”，Mack Publishing Co.，Easton，PA.，最新版中找到。

如本文所使用，“给药”指的是为了预防或治疗蛋白酪氨酸激酶相关疾病或病症，向有机体递送式(I)或(II)的化合物或其药学可接受的盐或前药或者含有本发明的式(I)或(II)的化合物或其药学可接受的盐或前药的药物组合物。

合适的给药途径可包括而不限于：口服、直肠、经粘膜或肠内给药或者肌肉、皮下、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、玻璃体内、腹膜内、鼻内或眼内注射。在一些实施方案中，所述给药途径为口服和肠胃外给药。

可选地，所述化合物可以以局部而非全身方式给药，例如所述化合物经直接注射入血管，任选以储库或缓释制剂形式。

本发明的药物组合物可通过本领域熟知的方法进行制备，例如通过常规的混合、溶解、制料、制作糖衣剂(drageemaking)、磨细、乳化、包封、捕获或冻干方法。

根据本发明使用的药物组合物可按传统方式使用一种或多种有助于活性化合物加工入制剂的可被药用的生理学可接受的载体包括赋形剂和助剂来配制。合适的制剂取决于所选择的给药途径。

对于注射，本发明的化合物可被配制成水溶液，优选配制在生理学相容的缓冲液例如汉克斯液、林格溶液或生理盐水缓冲液中。对于经粘膜给药，在制剂中使用适于待被穿透的屏障的穿透剂。这样的穿透剂通常是本领域已知的。

对于口服给药，可通过将活性化合物与本领域熟知的药学可接受的载体相混合来配制所述化合物。这样的载体能够使本发明的化合物被配制为用于患者口服摄入的片剂、丸剂、糖锭剂、糖衣剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、混悬剂等。口服使用的药物制剂可如下制备：使用固体赋形剂，在加入其他合适的助剂后(如果需要)，任选地研磨所得混合物，并加工粒料混合物以得到片剂或糖衣剂芯。特别地，有用的赋形剂为：填充剂如糖类包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇，纤维素制品如例如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉和马铃薯淀粉，以及其他材料例如明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可加入崩解剂例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸。也可使用盐例如海藻酸钠。

为糖衣剂芯提供合适的包衣。对于此目的，可使用浓缩的糖溶液，其可任选地含有阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液，以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或色素可被加至所述片剂或糖衣剂包衣中，用于识别或特征化活性化合物剂量的不同组合。

可用于口服的药物组合物包括由明胶制得的推入配合式(push-fit)胶囊，以及由明胶和增塑剂例如丙三醇或山梨糖醇制得的软的密封胶囊。所述推入配合式胶囊可含有与填充剂例如乳糖、粘合剂例如淀粉和/或润滑剂例如滑石粉或硬脂酸镁以及任选的稳定剂相混合的活性成分。在软胶囊中，所述活性化合物可溶解或悬浮于合适的液体例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。稳定剂也可加至这些制剂中。

所述化合物也可被配制用于肠胃外给药，例如：通过快速浓注或连续输注。用于注射的制剂可存在于单位剂型中，如在安瓿或多剂量容器中，含有加入的防腐剂。所述组合物可以为在油性或水性溶媒中的混悬剂、溶液剂或乳剂的形式，且可含有配制材料例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。

用于肠胃外给药的药物组合物包括活性化合物的水溶形式(例如但不限于盐)的水溶液。

此外，活性化合物的混悬剂可在亲脂性溶媒中制备。合适的亲脂性溶媒包括脂肪油例如芝麻油、合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯和甘油三酯、或者例如脂质体的材料。含水注射混悬剂可含有增加所述混悬剂的粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，混悬剂还可含有合适的稳定剂和/或增加所述化合物的溶解度的物质以允许制备高浓度的溶液剂。

可选地，所述活性成分可以为使用前用合适的溶媒如无菌、无热源水配制的散剂形式。

所述化合物还可使用例如常规的栓剂基质如可可脂或其他甘油酯配制为直肠组合物例如栓剂或保留灌肠剂。

除了上文描述的制剂外，所述化合物还可被配制成储库制剂。这样的长效制剂可通过植入(例如：皮下或肌内地)或通过肌内注射给药。本发明的化合物可与合适的聚合或疏水材料(例如，在乳剂中与药理学可接受的油)、与离子交换树脂配制用于这种给药途径，或者作为微溶性衍生物例如但非限于微溶的盐被配制用于这种给药途径。

用于疏水的本发明的化合物的药用载体的非限制性实例为包含苯甲醇、非极性表面活性剂、与水混溶的有机聚合物和水相的共溶剂系统，例如：VPD共溶剂系统。VPD是3％w/v苄醇、8％w/v非极性表面活性剂聚山梨酯80和65％w/v聚乙二醇300的溶液，其由无水乙醇补足剩余体积。所述VPD共溶剂系统(VPD∶D5W)由用5％葡萄糖水溶液1∶1稀释的VPD组成。这种共溶剂系统很好地溶解疏水性化合物，且其自身对全身用药产生的毒性低。

当然，这样的共溶剂系统的比例可显著变化而不破坏其溶解性和毒性特性。此外，可改变共溶剂组分的成分(identity)，例如：可使用其他低毒性的非极性表面活性剂代替聚山梨醇酯80，可改变聚乙二醇的片段(fraction)尺寸，其他生物相容的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮可替代聚乙二醇，且其他糖或多糖可代替葡萄糖。

可选地，对于疏水性药学化合物可应用其他递药系统。脂质体和乳剂是疏水药物的递送溶媒或载体的公知实例。此外，也可应用一些有机溶剂例如二甲亚砜，尽管通常以较大毒性为代价。

此外，所述化合物可使用持续释放的系统进行递送，例如含有治疗剂的固体疏水性聚合物的半渗透性基质。

许多持续释放的材料已被确定且为本领域技术人员所熟知。持续释放的胶囊剂根据它们的化学性质，可释放所述化合物数周直至超过100天。根据治疗试剂的化学性质和生物稳定性，可应用用于稳定作用的其他策略。

本文的药物组合物还可包含合适的固态或凝胶态载体或赋形剂。这样的载体或赋形剂的实例包括但不限于：碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物例如聚乙二醇。

许多本发明的化合物可作为生理学可接受的盐提供，其中所要求保护的化合物可形成带负电荷或正电荷的种类。所述化合物形成正电荷部分(moiety)的盐的实例包括且不限于：通过所述化合物中的羧酸或磺酸基团与合适的碱(如氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)、氢氧化钙(Ca(OH)₂)等)反应形成的钠盐、钾盐、钙盐和镁盐。

适用于本发明的药物组合物包括这样的组合物，其中活性成分以足以实现预期目的(例如抑制蛋白酪氨酸激酶功能或者治疗或预防蛋白酪氨酸激酶相关疾病或病症)的量包含在组合物中。

更具体地，治疗有效量表示有效预防、减轻或改善疾病症状或者延长正被治疗的个体的存活的化合物的量。确定治疗有效量完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是借助于本文提供的详细公开内容。

对于任何在本发明的方法中使用的化合物，可从细胞培养测定来初步估计治疗有效量或剂量。接着，剂量可被配制用于动物模型以获得包括在细胞培养中确定的IC₅₀(即：获得蛋白酪氨酸激酶活性的半最大抑制的测试化合物的浓度)的循环浓度范围。这样的信息可接着用于更精确地确定在人类中的有用剂量。

本文描述的化合物的毒性和治疗效果可通过标准药学操作在细胞培养或实验动物中来确定，例如通过确定受试化合物的IC₅₀和LD₅₀来进行。从这些细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于确定用于人类的剂量范围。所述剂量可根据应用的剂型和使用的给药途径而变化。确切的制剂、给药途径和剂量可通过医生个人根据患者的情况来选择。

剂量和间隔可个别调节以提供足以保持蛋白酪氨酸激酶抑制作用的活性种类的血浆水平。这些血浆水平被称为最小有效浓度(MECs)。所述MEC会根据每种化合物变化，但可从体外数据例如获得某种蛋白酪氨酸激酶的50-90％抑制所必需的浓度进行估计。

达到所述MEC所必需的浓度将取决于个体特征和给药途径。HPLC测定或生物测定可用于确定血浆浓度。

用药间隔也可使用MEC值确定。在本文中，应使用使血浆水平在10-90％、优选30-90％且最优选50-90％的时间保持在MEC以上的给药方案给药化合物。

在局部给药或选择性吸收的情况中，药物的有效局部浓度可不与血浆浓度相关且可应用本领域已知的其他操作以确定正确的用药量和间隔。

当然，给药的组合物的量将取决于正被治疗的个体、病痛的严重度、给药方式、开处方的医生的判断等。

如果需要，所述组合物可提供在包装或配药装置中，例如被管理机构如EMEA或FDA批准的药盒(kit)，其可含有包含活性成分的一个或多个单位剂型。所述包装可例如包括金属或塑料箔，如：泡罩(blister)包装。所述包装或配药装置可配有给药说明书。

所述包装或配药装置还可配有随附在容器上的以被管理药物的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通告，其反映了所述组合物或者人类或兽用给药的形式经机构批准。包含配制在相容的药学载体中的本发明的化合物的组合物还可被制备、置于合适的容器中，并标注治疗指定的病症。

也为本发明的一方面的是本文描述的化合物或其盐或其前药可与用于治疗上文讨论的疾病和病症的其他物质组合。

本发明还包括鉴别具有抗肝细胞癌的特异性效力的蛋白激酶抑制剂的方法。该方法特别用于鉴别抗肝细胞癌(HCC)的蛋白激酶抑制剂且包括：i)用肝细胞癌细胞系温育候选化合物；ii)测定细胞存活；和iii)将所述测定的细胞存活与所述候选化合物对正常肝细胞系的作用相比较以鉴别具有抗肝细胞癌细胞的特异性活性的化合物。

在本文中，应注意术语“抗肝细胞癌的特异性活性”表示“抗正常肝细胞的减少的毒性”，而不表示通过筛选方法鉴别的化合物具有抗其他癌症类型/蛋白酪氨酸激酶相关疾病或病症的减少的活性或无活性。相反，通过本发明的筛选方法鉴别的化合物可能也具有抗被蛋白酪氨酸激酶相关疾病或病症影响的其他细胞(体外和体内)的活性。

在一个实施方案中，用于筛选的肝细胞癌(HCC)细胞系可为本领域技术人员已知的任何HCC细胞系。这些细胞系可包括但不限于：HepG2、HuH7、SNU398、SNU368、Hep3B、Hepa1c1c7、LH86、SK-Hep-1、PLC/PRF/5、Hs817.T和MHCC97细胞系。

在另一实施方案中，用于筛选的正常肝细胞系为THLE2。

在一个实施方案中，所述方法为基于表型的筛选测定。

为了使本发明易于理解并产生实际作用，现通过下述非限制性实施例描述特定实施方案。

实施例

提供下述实验例以进一步说明本发明，但不意在限制本发明的范围。

化学物质

使用描述于美国临时专利申请序列号US 61/105,206“官能化的吲哚啉酮”(“Functionalized Indolinones)”中的方法合成本文描述的本发明的化合物(化合物39-48；见下文表1)，将其内容以其全部引入本文作为参考，用于所有目的。从LC Laboratories(波士顿，MA)获得舒尼替尼。除非另外说明，从Sigma-Aldrich(圣路易斯，MO)获得全部其他试剂。

细胞培养

从P.Hofschneider博士(Max Planck Institute，Martinsried，德国)获得HuH7。从ATCC(Manassas，VA)获得HepG2、SK-Hep1、Hep3B、PLC/PRF/5、THLE2和Hs817.T细胞。将HepG2、Hep3B和PLC/PRF/5维持在MEM中，THLE2维持在BEGM(Lonza，巴塞尔，瑞士)中，所有其他细胞维持在DMEM中。所有细胞培养物补充有ATCC推荐的从Invitrogen(Carlsbad，CA)获得的试剂。

定量实时PCR

如前(14)所述用Trizol(Invitrogen)收集全部RNA，并用RNeasy柱(Qiagen，Valencia，CA)纯化。根据制造商的指导，使用SuperScript III(Invitrogen)，将2μg RNA用于cDNA合成。使用Applied Biosystems 7300(ABI，Foster City，CA)对AFP(NM_001134)进行定量实时PCR，用18SmRNA作为对照。各自用4μL预稀释的cDNA一式三份地制备样品。引物序列为：AGCTTGGTGGTGGATGAAAC(AFP正向；SEQ ID NO：1)；TCTTGCTTCATCGTTTGCAG(AFP反向；SEQ ID NO：2)；CGGCTTAATTTGACTCAACACG(18S正向；SEQ ID NO：3)；TTAGCATGCCAGAGTCTCGTTC(18S反向；SEQ ID NO：4)。以平均C_T值获得数据，并用对照标准化为ΔC_T。正常组织和肿瘤组织之间的AFP转录物表达变化用2^ΔΔCT(配对的ΔC_T之间的差异)作为倍数变化来表示。

免疫印迹测定

通过BCA方法(Pierce，罗克福德，IL)测定蛋白质浓度。使用6-10％SDS-PAGE溶解样品并通过槽转移器(tank transfer)将样品转移至硝基纤维素或PVDF膜。使用稀释在含有0.05％(v/v)吐温20和5％(w/v)奶粉或BSA的PBS中的特异性抗体，通过化学发光(SuperSignal，Pierce)进行免疫检测。抗-磷酸-IGF-1R、抗-磷酸-EphA2、抗-磷酸-Erk、抗-磷酸-Akt、抗-Bax、抗-BCL-xL来自Cell Signaling Technology(Beverly，MA)；抗-PCNA和抗-HSP60来自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)；抗-细胞周期蛋白-D1来自BD Pharmingen(San Jose，CA)。二级抗体为抗-小鼠和抗-兔HRP-共轭抗体(Pierce)。

免疫沉淀

如前面对免疫印迹测定所述那样处理HuH7细胞并用溶胞缓冲液(1％NP-40，20mM Tris-HCl，137mM NaCl，10％丙三醇，2mM EDTA，1mM原钒酸钠，10μg/mL抑肽酶，10mg/μL亮肽素)收集。将溶胞产物(300μg)稀释在500μL HNTG缓冲液(250mM HEPES，150mM NaCl，10％丙三醇，0.1％Triton-X)中并用30μL Protein A/G混合物(GE Healthcare，Waukesha，WI)和2μg抗-EGFR(Upstate，Lake Placid，NY)、抗-EphA2(Santa Cruz)或抗-Tyro3(Bethyl Laboratories，Montgomery，TX))在4℃温育过夜。用HNTG缓冲液洗涤得到的珠，接着在20μL SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸用于电泳。用抗-磷酸酪氨酸(4G10，Upstate)进行随后的免疫检测并通过用各自的一级抗体进行剥离(stripping)和再探测来确定负荷。

细胞存活测定

将细胞按5000-7000细胞/每孔铺板并在处理前温育24h。将不同浓度(0-10μM)的测试化合物(化合物39-48和舒尼替尼)加至细胞中，保持72h，一式八份。根据制造商的说明书采用SpectraMax M5(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)检测的发光进行Cell Titer-Glo(Promega，麦迪逊，WI)测定。数据被表达为相对于溶媒处理的对照的生存百分数。

胱天蛋白酶-3活性测定

在收集前将细胞用化合物47处理24h。通过之前所述(Ho HK，Pok S，Streit S，Ruhe JE，Hart S，Lim KS等人成纤维细胞生长因子受体4在肝细胞癌恶化中调节增殖、抗凋亡作用和甲胎蛋白分泌并代表治疗措施的潜在靶点.J Hepatol 2009年1月；50(1)：118-127)那样测定胱天蛋白酶-3活性。数据被表达为RFU/μg溶胞产物/h温育以及关于SD的误差线，n＝3。

磷酸-RTK概貌(profiling)

用人类磷酸-RTK阵列(RnD Systems，Minneapolis，MN)实现多个RTK磷酸化的同时测定。在无血清条件下，将HuH7细胞用溶媒、化合物47或舒尼替尼处理24h。根据制造商的指导，收集细胞、用RTK阵列杂交并用抗磷酸酪氨酸进行温育。用Fujifilm LAS-3000(东京，日本)成像并定量斑强度。对于每一RTK确定两份(duplicate)斑的平均信号。

实施1：表1，化合物39-48的合成

流程1：本发明的化合物39-48的合成路径

通过式IV的醛和式III的羟吲哚之间的诺文格尔(Knoevenagel)反应合成本发明的化合物39-48。用哌啶作为碱催化剂在乙醇中通过回流或在微波反应器中进行该缩合(流程1)。

表1：使用的吲哚啉酮类

合成化合物39-48的一般方法

将等摩尔量(0.5mmol)的羟吲哚和醛溶解在乙醇(10ml)中，加入一滴哌啶(2μl)并将混合物在充满氩气的密闭容器(10ml)中加热。将该容器在微波合成器(Biotage

)中加热至140℃，持续15min。接着冷却反应混合物至室温并通过过滤移除所得沉淀，用冷的乙醇小心洗涤沉淀，并且至少一种从乙醇中重结晶，得到期望的产物。

所合成的化合物的构型指定

所合成的化合物由于存在环外双键，所以可以以E或Z异构体存在。因此，有必要确定合成是已产生单一(占优势的)异构体还是异构体的混合物。化合物的¹H和¹³C NMR波谱分析表明它们作为单一(或占优势的)异构体而得到。

为确定本文描述的所合成的化合物是E还是Z异构体，对亚苄基环B上的芳族质子(H-2’和H-6’)的化学位移进行分析。在Z而非E异构体中，H-2’或H-6’质子将由于羰基的去屏蔽而向低场位移。在文献中，7.85-8.53ppm的化学位移被指认为Z异构体，且7.45-7.84ppm的化学位移被指认为E异构体(Sun，L.等人，J Med Chem 1998，41，2588；Andreani，A等人，J Med Chem 2006，49，6922)。对于已报道为E异构体且其化学位移可从文献得到的化合物，我们的实验值与报道值的比较提供了需要的确认(Corsico Coda，A.等人，J.Chem.Soc.，Perkin Trans.2(1972-1999)，1984，4，615；Andreani，A.等人，Eur.J.Med.Chem.1990，25，187；Andreani，A.等人，Eur.J.Med.Chem.1992，27，167)。

对于其立体化学先前未被指定的化合物，H-2’和H-6’质子的化学位移在7.45-7.84ppm被用于推定所合成的化合物为E异构体。本发明的化合物例如化合物46和47被作为E和Z异构体的混合物得到，但具有一种占优势的异构体。当检测异构体的¹H波谱时(在通过柱色谱法分离后)，发现占优势的异构体的H-2’和H-6’的化学位移在7.90-8.01ppm，而次要异构体的在8.40-8.50ppm。因此，占优势的异构体被指认为E构型。

化合物39-48的实验方法和分析数据

(E)-6-氟-3-(3-甲氧基亚苄基)吲哚啉-2-酮(39)，收率29％，mp 169-170℃；MS-APCI：[M+H]⁺270.3(269.1)；¹H NMR(300MHz DMSO-d₆)δppm 3.79(s，3H)，6.68(m，2H)，7.03(dd，J＝8.1，2.1Hz，1H)，7.24(m，2H)，7.43(t，J＝7.9Hz，1H)，7.54(m，2H)，10.77(s，1H)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d6)δppm 168.92，164.80，161.55，159.36，144.94，144.78，135.60，135.35，135.31，130.01，126.75，124.24，124.10，121.40，117.35，117.32，115.69，114.25，107.74，107.44，98.39，98.02，55.24。

(E)-5-氯-3-(3-甲氧基亚苄基)吲哚啉-2-酮(40)，收率70％，mp 212-214℃；MS-APCI：[M+H]⁺286.2(285.1)；¹H NMR(300MHz DMSO-d₆)δppm 3.80(s，3H)，6.88(d，J＝8.7Hz，1H)，7.07(m，1H)，7.27(m，3H)，7.46(m，2H)，7.68(s，1H)，10.75(s，1H)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d6)δppm 168.31，159.39，141.77，137.55，135.37，130.05，129.64，127.02，124.94，122.51，122.02，121.50，116.15，114.18，111.54，55.26。

(E)-6-氯-3-(3-甲氧基亚苄基)吲哚啉-2-酮(41)，收率71％，mp 198-200℃；MS-APCI：[M+H]⁺286.2(285.1)；¹H NMR(300MHz DMSO-d₆)δppm 3.79(s，3H)，6.91(m，2H)，7.04(dd，J＝8.3，2.3Hz，1H)，7.24(m，2H)，7.43(t，J＝7.9Hz，1H)，7.52(d，J＝8.3Hz，1H)，7.63(s，1H)，10.76(s，1H)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d6)δppm 168.60，159.36，144.33，136.55，135.50，134.20，130.02，126.71，123.77，121.52，120.95，119.80，115.91，114.28，110.14，55.24。

(E)-6-甲氧基-3-(3-甲氧基亚苄基)吲哚啉-2-酮(42)⁴⁷：收率31％，mp161-163℃，lit.162-163℃；MS-APCI：[M+H]⁺282.2(281.1)；¹H NMR(300MHz DMSO-d₆)δppm 3.77(m，6H)，6.44(m，2H)，7.01(dd，J＝8.1，2.1Hz，1H)，7.22(m，2H)，7.41(m，2H)，7.49(d，J＝8.3Hz，1H)，10.54(s，1H)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d6)δppm 169.29，161.15，159.29，144.77，136.06，132.32，129.83，127.36，123.80，121.37，115.20，114.18，113.63，106.52，96.50，55.30，55.17。

(E)-6-氟-3-(3-羟基-4-甲氧基亚苄基)吲哚啉-2-酮(43)，收率33％，mp225-227℃；MS-APCI：[M+H]⁺286.2(285.1)；¹H NMR(300MHzDMSO-d₆)δppm 3.83(s，3H)，6.69(t，J＝10.2Hz，2H)，7.05(m，1H)，7.16(s，2H)，7.47(s，1H)，7.71(dd，J＝8.1，5.8Hz，1H)，9.41(s，1H)，10.70(s，1H)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d6)δppm 169.32，164.48，161.22，149.50，146.51，144.52，144.35，136.20，136.16，126.69，124.27，123.93，123.81，122.16，117.69，117.65，116.14，112.13，107.50，107.20，98.18，97.82，55.66。

(E)-6-氯-3-(3-羟基-4-甲氧基亚苄基)吲哚啉-2-酮(44)，收率53％，mp220-223℃；MS-APCI：[M+H]⁺302.2(301.1)；¹H NMR(300MHzDMSO-d₆)δppm 3.84(s，3H)，6.87(d，J＝1.9Hz，1H)，6.94(dd，J＝8.3，1.9Hz，1H)，7.06(d，J＝9.0Hz，1H)，7.18(m，2H)，7.52(s，1H)，7.70(d，J＝8.3Hz，1H)，9.41(s，1H)，10.69(s，1H)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d6)δppm 169.02，149.72，146.55，143.94，137.45，133.55，126.64，124.14，123.53，122.43，120.77，120.17，116.30，112.12，109.96，55.68。

(E)-3-(3-羟基-4-甲氧基亚苄基)-6-甲氧基吲哚啉-2-酮(45)，收率38％，mp 184-186℃；MS-APCI：[M+H]⁺298.2(297.1)；¹H NMR(300MHzDMSO-d₆)δppm 3.75(s，3H)，3.83(s，3H)，6.44(m，2H)，7.03(d，J＝8.3Hz，1H)，7.13(d，J＝10.6Hz，2H)，7.31(s，1H)，7.64(d，J＝8.3Hz，1H)，9.35(s，1H)，10.49(s，1H)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d6)δppm 169.72，160.78，149.11，146.45，144.38，133.30，127.23，125.04，123.63，121.90，116.09，114.07，112.14，106.42，96.43，55.67，55.34。

(E)-6-氟-3-(3-(三氟甲基)亚苄基)吲哚啉-2-酮(46)，收率50％，mp132-135℃；MS-APCI：[M+H]⁺308.1(307.1)；¹H NMR(300MHzDMSO-d₆)δppm 6.66(m，2H)，7.32(dd，J＝8.3，5.7Hz，1H)，7.64(s，1H)，7.77(m，2H)，7.97(d，J＝6.4Hz，2H)，10.82(s，1H)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d6)δppm 168.62，165.06，161.79，145.30，145.13，135.49，133.38，133.34，132.87，130.27，129.96，129.84，129.42，129.00，128.10，128.08，125.99，125.95，125.80，125.76，123.91，123.78，122.16，118.55，117.00，116.96，107.77，107.48，98.57，98.21.46(Z)，¹H NMR(300MHz DMSO-d₆)δppm6.66(dd，J＝9.2，2.1Hz，1H)，6.83(m，1H)，7.73(m，3H)，7.89(s，1H)，8.46(d，J＝7.5Hz，1H)，8.83(s，1H)，10.82(s，1H)。

(E)-6-氯-3-(3-(三氟甲基)亚苄基)吲哚啉-2-酮(47)⁴⁸：收率51％，mp204-207℃；¹H NMR(300MHz DMSO-d₆)δppm 6.87(d，J＝7.9Hz，2H)，7.29(d，J＝7.9Hz，1H)，7.76(m，3H)，7.97(d，J＝7.2Hz，2H)，10.81(s，1H)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d6)δppm 168.26，144.60，135.39，134.66，132.94，130.02，129.84，129.42，128.06，126.18，126.15，125.94，125.90，125.75，123.46，122.14，121.01，119.44，110.33.47(Z)，¹H NMR(300MHzDMSO-d₆)δppm 6.88(s，1H)，7.05(dd，J＝8.1，1.7Hz，1H)，7.72(m，3H)，7.91(s，1H)，8.43(d，J＝7.9Hz，1H)，8.84(s，1H)，10.81(s，1H)。

(E)-6-甲氧基-3-(3-(三氟甲基)亚苄基)吲哚啉-2-酮(48)，收率43％，mp157-160℃；MS-APCI：[M+H]⁺320.1(319.1)；¹H NMR(300MHzDMSO-d₆)ppm 3.74(s，3H)，6.40(dd，J＝10.9，2.6Hz，2H)，7.28(d，J＝8.3Hz，1H)，7.47(s，1H)，7.74(ddd，J＝15.0，7.9，7.6Hz，2H)，7.96(d，J＝7.2Hz，2H)，10.61(s，1H)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d6)δppm 169.04，161.54，145.14，135.99，132.91，130.40，130.16，129.90，129.74，129.44，129.31，128.89，128.72，125.83，125.69，125.65，125.59，123.50，122.22，118.61，113.28，106.61，96.75，55.39。

实施例2：通过HPLC确定化合物39-48的化合物纯度

通过反相高压柱色谱法评价化合物的纯度。使用Agilent ZorbaxEclipse XDB-C₁₈柱(4.6mm×150mm，5μM)，在Waters Delta 600液相色谱系统上进行测定。使用两种溶剂系统(A：甲醇-水和B：乙腈-水，比率：4∶1)应用等度模式。流速被固定在1ml/min且在双波长(278nm和305nm)下应用UV检测。测定主峰下面积并表示为在20min运行期间总峰面积的百分数(％)。纯化所有化合物直至它们的色谱图在两种溶剂系统中都显示面积＞96％的主峰(P_HPLC)。以分钟(min)确定主峰在两种溶剂系统中的保留时间(t_R)。

表2：通过HPLC测定化合物纯度

用于生物学测定的材料

从Sigma-Aldrich(圣路易斯，MO)购买甲萘醌、毛地黄皂苷、3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑盐溴化物(MTT)、β-萘黄酮(BNF)、双香豆素(dicuomarol)、水杨酰胺、碘化丙啶、核糖核酸酶A、7-乙氧基试卤灵和莱菔硫烷。从AccuStandard(纽黑文，USA)购买2，3，7，8-四氯二苯-p-二氧芑(TCDD)。其他试剂为分析级的。

实施例3：NQO1活性的测定

从美国标准培养收集所(American Type Culture Collection)(Rockville，MD)购买Hepa1c1c7，并在5％CO₂的潮湿气氛中在37℃在α-最低必需培养基(α-MEM)中培养，该培养基无核苷且含有10％(v/v)热-和炭-处理的胎牛血清(每100ml血清1g炭；55℃下90min)、0.15％碳酸氢钠、0.01％青霉素G、0.01％硫酸链霉素。当细胞达到80-90％汇合时，将它们传代培养，并将6-17次传代内的细胞用于测定。为此测定，使约10000个细胞在α-MEM中在96-孔板的每个孔中生长24h。基于Bradford测定，发现每孔的总蛋白质含量为0.036mg/孔。在DMSO中制备测试化合物的储备溶液并将等分试样加至每孔中以得到期望的浓度。在每孔中的最终DMSO浓度保持在0.5％v/v或更低。在温育48h后，倒出培养基并用含0.8％w/v毛地黄皂苷和2mM EDTA的溶液溶解细胞，在37℃温育(10min)。在定轨振荡器上于23℃将板轻轻搅动10min。接着向各孔中加入溶液(“完全反应的混合物”)的等分试样(200μl)。该溶液在使用前新鲜制备并由7.5ml 0.5M Tris-Cl(pH＝7.4)、100mg牛血清、1ml 1.5％吐温-20、0.1ml7.5mM FAD、1ml 150mM 6-磷酸葡萄糖、90μl 50mM NADP、300单位酵母葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、45mg MTT和去离子水组成，其中用去离子水补至150ml最终体积。加入甲萘醌(对于每毫升反应混合物，1μl50mM溶解在乙腈中的甲萘醌)，紧接着将混合物分散至孔中。加毕，轻轻搅拌该板5min，并通过加入在0.5％DMSO中的0.3mM双香豆素和5mM磷酸钾的pH＝7.4的溶液(50μl)将反应淬灭。由于形成了甲

，所以在每孔中观察到蓝色，在板读数器上于590nm测量其吸光度。用含有0.5％DMSO但无测试化合物的培养基处理不含有细胞的空白孔和含有Hepa 1c1c 7细胞的对照孔。测试化合物在给定浓度的NQO1诱导活性由下述方程确定：

诱导程度＝A_{测试化合物}-A_空白/A_对照-A_空白

其中A为在590nm测量的甲

的吸光度。

在类似条件下测定莱菔硫烷和BNF作为阳性对照。用OriginPro 7.5SR1(版本V7.5776 B776)，OriginLab Corporation，MA标绘结果(诱导程度相对于浓度)，并测定双倍基底NQO1活性(CD)需要的测试化合物的浓度。进行3组单独测定并以平均值±SD报道CD，n＝3。

在Hepa1c1c7细胞中NQO1的诱导

在鼠类肝细胞瘤(Hepa1c1c7)细胞中筛选化合物对NQO1的诱导(Prochaska，H.J.；Santamaria，A.B.Anal.Biochem.1988，169，328)。简言之，该测定基于在辅因子NADP存在下，当葡糖-6-磷酸(G6P)被G6P脱氢酶还原时，产生NADPH。NADPH充当介导由甲萘醌(一种醌)还原至甲萘氢醌(一种二酚)的NQO1的电子供体。甲萘氢醌还原MTT至甲

(一种有色产物)且在测定中监测其形成。诱导NQO1的化合物增加甲萘氢醌形成速率，并因此增加甲

的形成。

首先在Hepa1c1c7细胞上筛选化合物的生长抑制IC₅₀值以确保在诱导测定中使用的浓度对细胞无细胞毒性。在25μM(最高测试浓度)不影响细胞存活的化合物被作为具有超过25μM的IC₅₀列出。测试化合物在10-100倍浓度范围的诱导活性，将其以CD方式表示，定义为与未处理的Hepa1c1c7细胞相比，使被处理的细胞的NQO1活性增加2-倍所需要的浓度。结果给出在表3中。该测定的阳性对照是已知的NQO1诱导剂莱菔硫烷和β-萘黄酮(BNF)。它们的CD值为0.26(±0.04)μM和0.028(±0.003)μM，其很好地符合报道值(Dinkova-Kostova，A.T.；Liby，K.T.；Stephenson，K.K.；Holtzclaw，W.D.；Gao，X.；Suh，N.；Williams，C.；Risingsong，R.；Honda，T.；Gribble，G.W.；Sporn，M.B.；Talalay)。

表3：化合物39-48对Hepa1c1c7细胞的CD和IC50值

^a与未处理的Hepa1c1c7细胞相比，使被处理的细胞的NQO1活性增加2倍所需要的浓度。平均值和SD(n＝3)。

如表3中可见，本发明的化合物具有0.36μM至4nM的CD值，为普遍有效的NQO1诱导剂。为确定是否环A上的取代在改善诱导性质中有帮助，进行了下述比较(用单向ANOVA进行分析)。在化合物39-42(环B上有3’-OCH₃，在环A上有不同取代基)中，41(6-Cl)和42(6-OCH₃)被观察到较大的诱导。当将环B上有3’-CF₃，环A上没有取代基的化合物与化合物46-47(在环B上有3’-CF₃，在环A上有不同取代基)比较时，仅47(6-Cl)改善了活性。因此，仅当与某些环B基团即3’-OCH₃和3’-CF₃联合时，在环A上具有6-Cl的化合物远好于它们的环A上未取代的类似物。这可能对于其他取代基也是正确的，但目前还没有确定到底环A还是环B起支配作用。

实施例4：在Hepa1c1c7细胞中测定7-乙氧基试卤灵O-去乙基酶 (EROD)活性

将Hepa1c1c7细胞以每孔10000个细胞的密度铺在的96孔板中并培养24h。在DMSO中制备测试化合物的储备溶液并用培养基连续稀释以得到每孔中的期望浓度。DMSO的最终浓度为0.5％v/v。用测试化合物将细胞温育48h，之后移除培养基，将孔用200μl 1×磷酸盐-缓冲水溶液(PBS)洗涤并接着在37℃用在200μl培养基中的5μM 7-乙氧基试卤灵和2mM水杨酰胺温育40min。在荧光计上，在λ_激发530nm和λ_发射590nm进行读数。在相同波长测定测试化合物的荧光(如果有)以考虑它对观察到的读数的贡献。还测定了空孔(无细胞，“空白”)和具有在含有0.5％DMSO但无测试化合物的培养基中的Hepa1c1c7细胞的孔(“对照”)的读数。TCDD，CYP1A1活性的强诱导剂，以及BNF和莱菔硫烷被用作对照。

通过以下表达式给出CYP1A1诱导活性：

诱导程度＝F_{细胞+测试化合物}-F_空白/F_对照-F_空白

化合物对Hepa1c1c7细胞中7-乙氧基试卤灵O-去乙基酶(EROD)活性的影响

因为已观察到上述化合物对NQO1活性的诱导(见实施例3)，所以确定是否1相酶活性也被诱导是重要的。EROD测定用于此目的(Burke，M.D.；Mayer，R.T.，Drug Metab Dispos 1974，2，583)。EROD活性描述了CYP1A1引起7-乙氧基试卤灵的O-去乙基化至试卤灵的速度。如果化合物诱导CYP1A1活性，那么与对照未处理的Hepa1c1c7细胞相比会形成更多的试卤灵，且处理的细胞中的试卤灵的荧光与对照Hepa1c1c7细胞的比值会增加。在约4倍于它们的CD值的浓度测定化合物的该比值。这里不使用固定浓度，因为考虑到NQO1诱导活性的巨大变化，将难以选择该浓度。还获得每个化合物的NQO1和CYP1A1诱导比值(在相同浓度确定的比值)的商。值＞1将意指相对于CYP1A1而言NQO1的更大的诱导。化合物39-48的结果被列于表4中。

TCDD、BNF和莱菔硫烷在该实验中用作对照。TCDD为已知的CYP1A1诱导剂(Nishiumi，S.；Yamamoto，N.；Kodoi，R.；Fukuda，I.；Yoshida，K.；Ashida，H.，Arch Biochem Biophys 2008，470，187)，且当用于本测定时，在EROD测定中在1nM得到2.99的比值。BNF和莱菔硫烷分别为双功能和单功能的NQO1诱导剂(Dinkova-Kostova，A.T.；Liby，K.T.；Stephenson，K.K.；Holtzclaw，W.D.；Gao，X.；Suh，N.；Williams，C.；Risingsong，R.；Honda，T.；Gribble，G.W.；Sporn，M.B.；Talalay)。因此，BNF在Hepa1c1c7细胞中应当诱导CYP1A1和NQO1活性，而莱菔硫烷应当以更大程度诱导NQO1活性(相比CYP1A1活性)。发现BNF在0.01μM以1.83倍诱导NQO1活性(NQO1诱导比值)且以1.13倍诱导CYP1A1活性(CYP1A1诱导比值)，因此得到NQO1/CYP1A1商为1.62。用莱菔硫烷获得的结果与其单功能特征一致。在1μM，它几乎不能诱导CYP1A1活性(比值＝0.924)，但增加NQO1活性接近四倍(比值＝3.89)。

通常，本发明的化合物是CYP1A1的弱诱导剂。作为示例性实例，化合物47显示提高CYP1A1活性超过两倍。比CYP1A1诱导比值更重要的是NQO1与CYP1A1诱导比值的商，因为该值指示该化合物是否优先诱导NQO1而不是CYP1A1。CYP1A1的强诱导可能不是不利的，如果它通过甚至更强的NQO1诱导来平衡。最有效的NQO1诱导剂是47(NQO1诱导比值5.20，表4)，且其具有为2.17的适当的NQO1/CYP1A1商。在化合物45中注意到类似的联系。

表4：化合物39-48的CYP1A1和NQO1诱导比值

^a化合物编号和在括号中给出的在CYP1A1诱导测定中使用的浓度(≈4xCD对于NQO1活性)。

^b在栏1给定的浓度在Hepa1c1c7细胞上测定。平均值±SD，n＝3。CYP1A1诱导比值＝(荧光_{细胞+测试化合物}-F_空白)/(荧光_对照细胞-F_空白)

^c在对CYP1A1诱导比值的相同浓度在Hepa1c1c7细胞上测定，从诱导程度比浓度的曲线读出对每个化合物的值。

^d商＝NQO1诱导活性/CYP1A1诱导活性

^j从浓度0.005、0.05、0.5和5μM BNF构成的曲线读出该值。因此，没有SD被指定给该值。在0.05μM BNF，CYP1A1比值为1.27±0.12。

实施例5：通过微量培养的四唑盐(MTT)测定法测定抗增殖活性

本发明的化合物的抗增殖活性通过MTT测定法在下述细胞系中进行测定：MCF7(人类乳腺癌细胞系)、HCT116(人类结肠癌细胞系)和CCL186(正常的人类二倍体胚胎的肺成纤维细胞)。细胞系购自American TypeCulture Collection(Rockville，MD)。MCF7和CCL186细胞在补加有10％FBS和0.01％抗生素的含有1mM丙酮酸钠、1.5g/L碳酸氢钠、2mM L-谷氨酰胺的伊格尔氏(Eagle′s)最低必需培养基(EMEM)中培养。HCT116细胞在添加有10％FBS和0.01％抗生素的含有2.2g/L碳酸氢钠的McCoy’s5A培养基中培养。细胞按下述密度铺板：10000细胞/孔(MCF7)、4000细胞/孔(HCT116)、5000细胞/孔(CCL186)。它们在96孔板中生长24h，在各孔中配有100μl的相应培养基。在DMSO中制备测试化合物并用培养基稀释至系列浓度。在各孔中存在不超过1％DMSO(最终浓度)。用细胞温育测试化合物72h，然后加入100μl MTT溶液(0.5mg/ml在1×PBS中)，持续3h，细胞溶解以释放甲

产物。将后者溶解在DMSO(150μl)中，并在30min内在微量滴定板读出器上在590nm测定吸光度。下述表达式给出细胞存活：

细胞存活(％)＝[(A_{细胞+测试化合物}-A_空白)/(A_{未处理的细胞}-A_空白)]x100

其中A为在测试(A_{细胞+测试化合物})、对照(A_{未处理的细胞})或空白(A_空白)孔中在590nm测量的甲

的吸光度。在3个单独的场合评价测试化合物的每一浓度。使用OriginPro 7.5 SR1(版本V7.5776 B776)，OriginLab Corporation，MA通过用％存活细胞对浓度绘图获得的S曲线来确定抑制50％细胞生长的浓度(IC₅₀)。

为了确定测试化合物的细胞毒性，该MTT测定还在Hepa1c1c7细胞中进行。采用相同的操作除了化合物经细胞的温育期为48h，而不是72h。

化合物对HCT116、MCF7和CCL186细胞的抗增殖活性

在人类癌细胞系HCT116和MCF7细胞上以固定浓度10μM最初筛选化合物。化合物例如42、45-48在该浓度引起超过50％的细胞死亡，且这些化合物被进一步评价它们对于两种癌症细胞系的IC₅₀(表5)。所发现的影响细胞存活的小数目(11，18％)的化合物可能暗示对于抗增殖活性存在更迫切的需要，与化学预防相比，其中大部分化合物诱导NQO1活性，其CD值＜10μM(表3)。

表5：下述化合物对人类乳腺癌(MCF-7)、人类结肠癌(HCT116)和正常的人类二倍体胚胎的肺成纤维细胞(CCL-186)细胞系的IC₅₀和选择性比值

^a用测试化合物温育72h后细胞存活减少50％所需要的浓度。平均值±SD，n＝3。粗体和斜体的值代表选择性比值：IC_50 CCL186/IC_50 MCF7或IC_50 CCL186/IC_{50 HCT116}

表5中的化合物对于两种癌症细胞系具有可比较的抗增殖活性，具有从1.2至19.6μM的IC₅₀值。当这些活性与从正常细胞系(人类肺成纤维细胞)获得的那些相比时，观察到适度的选择性(平均约2倍)。化合物46和47在癌细胞和正常细胞间区别不大，并具有接近1的选择性比值。

本发明的化合物强烈显示抗增殖活性。作为示例性实施例，在环B上具有3’-CF3的化合物(46，47，48)列于表5中，提示该取代基所起的重要作用，非常不依赖于环A的取代基。类似地，第2组的环A在6位仅具有3种不同的取代基，即：6-OCH₃、6-Cl和6-F。在这些中，6-OCH₃似乎是优选的，因为不考虑环B的基团，具有6-OCH₃的全部3个化合物(42，45，48)被列于表5中。因此，可推断6-OCH₃(环A)和3’-CF₃(环B)对于抗增殖活性是优选基团，尽管最有效的化合物42(6-OCH₃，3’-OCH₃)在同一分子中不同时具有这两个特征。对于抗增殖活性的取代基优先选择相对好定义，不同于实施例3中描述的NQO1诱导活性。

实施例6：通过细胞计数法确定测试化合物对HCT116细胞的细胞周 期的影响

HCT116细胞生长至汇合并在该状态保持至少5天，而不变化培养基。接着，血清饥饿的细胞受胰蛋白酶作用并在六孔板中以5x10⁵细胞/孔的密度传代培养。生长培养基含有10％胎牛血清。将测试化合物立即加至同步在G1期的细胞，或者在24h后当细胞同步在G2期时加入。将细胞从加入时用测试化合物温育24h。在此时间后，采集细胞、受胰蛋白酶作用并固定在70％冰-冷乙醇中最少24h。在离心分离后，弃去上清液并用核糖核酸酶A(200μg/ml)在室温将沉淀处理30min，接着使用碘化丙啶以20μg/ml的最终浓度染色细胞。接着，使用Summit(版本4.3)软件在装配有氩固态激光器(488nm)的Dako Cytomation Cyan LX(Dako Colorado，FortCollins，CO，USA)上分析染色的细胞在sub-G1、G1、S和G2/M期中的细胞周期分布。以≈1.5xIC₅₀的浓度测试化合物，通过在HCT116细胞上的MTT测定来确定IC₅₀。

统计分析

通过单向ANOVA分析数据的统计学显著性，接着在用于Windows的SPSS 15.0，芝加哥，IL上通过Tukey HSD作为事后比较(post-hoc)检验。在相同软件上进行Spearman相关分析。0.05的概率水平用作显著性标准。

所选择的化合物对HCT116细胞的细胞周期的作用

为更好地理解列于表5中的化合物的抗增殖活性的根本机理，使用流式细胞计数法通过荧光激活细胞分选(FACS)分析来研究它们对细胞周期的作用。设计该实验以检查测试化合物对在G1或G2/M期的同步细胞群的作用。通过使细胞生长至汇合高达5天得到G1同步的细胞，并通过在较低密度传代培养刺激它们再进入细胞周期。在生长24小时后，这些细胞将调准在G2/M期。

将从G1-阻断释放的细胞暴露于固定浓度(≈1.5xIC₅₀对于HCT116细胞)的测试化合物24h，之后确定细胞在不同期的分布，并与对照的未处理的细胞相比。类似地处理调准在G2/M期的细胞。图1给出了从G1阻断和G2阻断释放的对照细胞的代表性FACS图。表6给出了从G1-或G2-阻滞释放后各期中的细胞比例。

表6：测试化合物对细胞周期不同期的作用

^a括号中指出使用的浓度≈1.5xIC_50 HCT116

^b各期细胞的比例是3次单独测定的平均值。

结果分析显示化合物引起G1阻滞(46，47)或G2阻滞(42，45，48)。其抗增殖活性可能来自于其他机理如自噬或坏死。以46作为与G1阻滞相关的化合物的实例，FACS图表明当用46处理从G1阻断释放的细胞时，从G1到G2/M的进程被中断(图1A)。观察到在sub-G1期的显著增长(表6)。如所预测的，46对细胞从G2/M至G1的转变没有影响(图1B)。至于48，其引起G2-阻滞，它不干扰从G1释放的细胞的前进(图1A)，但阻止细胞从G2/M转变至G1(图1B)。因此，在接触(24h)48后，G1中的细胞比例不增加(30.55％在G1中，与未处理的细胞中的55.88％相比)(表6)。在sub-G1期中的凋亡细胞也没有显著增加(图1B，表6)。

在引起G1或G2阻滞的化合物中观察到结构上的倾向。引起G2阻滞的化合物(42，45，48)在环A或B上共同存在一或两个甲氧基基团。化合物42、45和48在环A上具有6-OCH₃。42和45的环B也被甲氧基化。作为对照，引起G1阻滞的化合物(46，47)被卤化(46，47)。

实施例7：化合物39-48在HCC细胞系中的抗增殖潜力

使用两种代表性的肝癌细胞系HepG2和HuH7，使用表型测定法来测试这些化合物抗HCC的抗癌潜力，其中化合物进行100-倍浓度范围(0.1to10μM)的筛选。此外，THLE2作为正常肝细胞系被用于区分抗癌潜力与非特异性细胞毒性。通过细胞内ATP含量的减少来测定72h时基于细胞存活50％抑制的IC₅₀值。从这些结果，化合物47显示抗HuH7和HepG2(分别为0.5μM和0.6μM)的亚微摩尔的IC₅₀。化合物46和48显示类似的效力，但对HepG2比对HuH7更显著(表2)。这些响应可比或优于临床上相关的吲哚啉酮(舒尼替尼)，其在HuH7和HepG2中分别具有4.7μM和4.5μM的IC₅₀。

通过Prism5分析图2中显示的细胞存活测定以确定各自的IC₅₀值。

表7：基于HuH7、HepG2和THLE2中存活测定的测试化合物的IC₅₀

接着，通过用正常肝对照细胞系将在10μM的存活百分数标准化来定量测试化合物的安全指数(即：THLE2/(HuH7或HepG2)。大部分化合物得到＞1的值，表示相对于正常细胞，化合物对肿瘤的抗增殖效力具有选择性(表8)。

如先前在表7中所描述那样测定细胞存活。测定在10μM处理的存活百分数并通过将HCC细胞系中的存活对THLE2进行标准化来计算安全比。

表8：10μM的测试化合物在HCC和正常细胞系中的安全比

化合物编号	HuH7	SR(HuH7/THLE2)	HepG2	SR(HepG2/THLE2)
					39	65.8±1.1	1.19	40.0±4.2	1.95
40	57.5±6.6	1.55	46.1±2.2	1.93
					41	101.7±6.9	0.87	46.4±2.5	1.90
42	49.2±4.0	0.79	20.7±2.0	1.89
					43	84.1±7.5	1.22	28.3±6.7	3.63
44	63.0±4.0	1.36	15.0±1.3	5.72
					45	46.6±1.8	1.54	19.9±1.4	3.61
46	11.3±1.0	6.39	4.2±0.3	17.19
					47	3.3±0.2	21.76	1.1±0.09	65.27
48	27.3±0.5	1.27	14.5±1.3	2.40
					舒尼替尼	3.4±0.2	10.79	1.8±0.3	20.39

值得注意，化合物47显示显著的安全性，如由HuH7(SR＝21.76)和HepG2(SR＝65.27)所评估的。与已确认的舒尼替尼相比，化合物47显示更好的效力和降低的细胞毒性(图2)。

实施例8：化合物47对不同组HCC细胞系的作用

因此，针对更大组的4个另外的HCC细胞系的筛选化合物47。这些后续试验证实了其在测试的4个细胞系中的3个中具有低的微摩尔或亚微摩尔浓度的IC₅₀的效力。SK-Hep1是仅有的边缘应答者，其中IC₅₀未达到10μM。在另一方面，Hs817T对化合物47最敏感，在5μM具有不能探察的存活(图3)。

实施例9：化合物47对细胞周期和凋亡的生化标记的作用

接着，研究化合物47的抗增殖作用的机理。化合物47在24h引发Erk和Akt磷酸化的剂量依赖的抑制(图3)。细胞周期标记(细胞周期蛋白-D1和PCNA表达)也有相应减少。类似地，细胞凋亡标记如裂解的PARP(图4)和胱天蛋白酶-3活化(图5)证实了前细胞凋亡机理的参与。然而，对于线粒体细胞凋亡参与者Bax和BCL-xL几乎没有作用。

实施例10：化合物47抑制HuH7中的AFP转录

为评价化合物47对HCC治疗的特异性，转录地测量肿瘤标记AFP。AFP mRNA定量相对于更加确定的ELISA测定法的优势是确定化合物47对AFP的干扰是由于直接的基因调节作用还是改变细胞增殖的间接后果。使用HuH7(高AFP产生的)，我们发现在给药化合物47(10μM)后的24h内，AFP转录物被显著抑制至三分之一，而舒尼替尼没有显示可测量的作用(图6)。

实施例11：通过抗体阵列剖析研究RTK靶

接着针对化合物47在HCC细胞系中的效力考虑化合物47的RTK靶。用人类磷酸-RTK阵列(RnD Systems)通过温育被处理的细胞的溶胞产物来确定被化合物47或舒尼替尼抑制的受体酪氨酸激酶的剖析研究。使用血清饥饿的HuH7细胞，因为它具有比应用在该研究中的其他HCC细胞系更组成性磷酸化的RTK(数据没有显示)。因此，该平台将允许我们在靶激酶磷酸化抑制后检测更多信号转导变化。这里，观察到化合物47对RTK包括胰岛素受体、IGF-1R、Tyro3、EphA2、HER3、Met和RON的显著的抑制(图7)。密度计量地测定这些作用的大小并发现在主要排除胰岛素受体外，其普遍强于舒尼替尼。

定量在用化合物47或舒尼替尼处理后在RTK磷酸化的变化(图7)并根据在未处理的对照中表达的大小进行排列(最高至最低)。

表9：定量RTK阵列数据

观察到对于FGFR4和CSF-1R的其他较小作用，但这些斑对于精确定量而言太微弱了(图7)。

实施例12：通过蛋白质印迹证实IGF-1R、EphA2和Tyro3磷酸化的 抑制

通过免疫印迹独立地确定主要的RTK磷酸化变化。具体来讲，我们检查作为有吸引力的靶点的组成性磷酸化的IGF-1R、EphA2和Tyro3，其可能为在HuH7中致肿瘤性的新的引领者(driver)。从这些结果中，随化合物47浓度的增加观察到IGF-1R和EphA2磷酸化的成比例的减少(图8A和8B)。这些观察是化合物特异性的，因为10μM舒尼替尼不能可感觉到地抑制两种酪氨酸激酶中的任一种的磷酸化。在另一方面，甚至使用最低浓度(1μM)时，Tyro3磷酸化也被抑制，且没有在较高浓度观察到进一步耗竭。舒尼替尼显示抗Tyro3的类似作用。单独地，在用化合物47而非舒尼替尼处理后，也再次产生EGFR磷酸化的意想不到的增加(图8B)。

总之，本发明的发明人发现本文描述的化合物不仅适用于抗增殖活性，而且适用于化学预防。不限制于任何特定理论，环B上的3’-CF₃取代基和环A上的6-OCH₃取代基对于抗增殖活性似乎是重要的取代基，尽管对于NQO1诱导的优选情况并不明确。鉴别出结合良好抗增殖活性和化学预防潜力(如从它们的NQO1/CYP1A1商所评价的)的少数化合物。这些是主要的化合物(42，45-48)。这些化合物具有超过2的NQO1/CYP1A1商。化合物42、45-48是特别有希望的，因为它们具有纳摩尔范围的CD值但对于NQO1诱导仍显示至少2倍的选择性。这些化合物可能具有对于正常细胞的细胞保护作用和对于癌症细胞的细胞毒性的双重作用。

一个意外的发现是具有抗增殖活性的化合物中的结构特征与它们对于细胞周期进程的作用是如何相关的。发现在环A和B具有至少两个甲氧基的化合物(42，45)可能是通过干扰有丝分裂纺锤体的形成来引起G2阻滞。作为对照，在两个环上都具有卤代基团的化合物(46-48)引起G1阻滞，其可能涉及细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶活性的抑制。对于这些化合物，观察到细胞凋亡的迹象。

综上所述，发明人已证明本文所述化合物的化学预防潜力，正如从它们诱导NQO1活性的能力所见。所评价的大部分化合物具有小于10μM的CD值，这突显了这种骨架对于化学预防的潜力。在另一方面，氮的存在可能使所述化合物倾向于诱导CYP1A1和NQO1两者的活性，尽管在该系列中有候选化合物选择性地诱导NQO1达4倍或更高。至于抗增殖活性，本文所述的化合物(42，45-48)能成功地将选择性诱导NQO1与良好的抗增殖活性(对两种癌症细胞系IC₅₀＜10μM)相结合。因此，它们对于结合针对于癌症细胞的抗增殖活性与通过正常细胞中的NQO1诱导介导的一定程度的细胞保护作用的化合物可能是有用的先导。

本发明的发明人还使用HuH7和HepG2中细胞存活的抑制作为效力的初步证据进行筛选新的亚苄基-吲哚啉酮化合物。吲哚啉酮环是一个对于衍生以产生化合物库而言具有多个位点的多用途骨架。重要地，该骨架满足类药性质的关键标准，例如：适合有效递送的小分子量(＜500)以及对于细胞通透性和分布的令人满意的亲油性(cLogP＜5)。此外，因为吲哚啉酮类的之前优化也已给出其他有效的多靶向抑制剂如舒尼替尼，因此，推测吲哚啉酮类最佳地适合进入多种酶的ATP-结合袋的化学空间，且该骨架的精细功能化可能有助于发现具有临床价值的其他类似物。

使用该方法，本发明的发明人发现取代的亚苄基-吲哚啉酮的子集(化合物46-48)在HCC中特别有效。这些分子都是来自化合物库的3-三氟甲基取代的类似物，因此提示其作为药物设计中进一步优化的有用的药效团。特别是，化合物47显示了亚微摩尔的IC₅₀且在HepG2细胞中优于先前报道的舒尼替尼(图3)和索拉非尼(Liu L，Cao Y，Chen C，Zhang X，McNabola A，Wilkie D等人索拉非尼在肝细胞癌模型PLC/PRF/5中阻断RAF/MEK/ERK通路，抑制肿瘤血管发生并诱导肿瘤细胞凋亡(Sorafenibblocks the RAF/MEK/ERK pathway，inhibits tumor angiogenesis，andinduces tumor cell apoptosis in hepatocellular carcinoma modelPLC/PRF/5).Cancer Res 2006年12月15日；66(24)：11851-11858)。该效能可被外推至多种病因学的HCC细胞系范围。唯一的弱响应者是单独的间质样细胞系(lone mesenchymal-like cell line)，SK-Hep1，其具有非常不同的病理学(来自结肠癌的远端转移的继发性肿瘤)。此外，基于在THLE2中减少的细胞毒性，化合物47显示非常有利的安全性特性。这对于多靶向的激酶抑制剂是特别关键的属性，因为在其靶选择性的内在低严紧度可能不经意地导致更多与靶无关的作用。

因为先前结果支持化合物47作为潜在的药物候选物，所以回顾性地研究了受抑制的激酶，并且通过这样做，推断其在HuH7中的活性的机械论(mechanistic)基础(在血清饥饿的条件下)。可论证地，这样的策略将妨碍所有被靶定的激酶的广泛鉴别。然而，该方法的益处是对在HCC中组成性活化且因此在维持致肿瘤性中起关键作用的RTK的子集产生有价值的洞察。因此，IGF-1R被发现作为主要的靶，与EphA2和Tyro3作为新的且有潜力的重要贡献的分子用于未来HCC发病机制的研究中。有趣的是，还观察到EGFR磷酸化反常的增长。尽管EGFR激活通常与通过Erk信号转导增加细胞增殖有关，但还未检测到这样的下游作用(图5)。不期望束缚于任何理论，一种假设是EGFR激活可能是对IGF-1R抑制的代偿性反应，因为肿瘤试图转换对旁路途径的致癌依赖。与EGFR激活成正比的随后的Erk磷酸化的失败提示了IGF-1R，而不是EGFR具有对肿瘤增殖的越权控制。EGFR和IGF-1R之间的相互依赖性受先前报道的交叉对话(其中肝细胞瘤细胞通过IGF-1R信号转导获得对EGFR抑制剂吉非替尼的耐药性)的支持(sbois-Mouthon C，Cacheux W，Blivet-Van Eggelpoel MJ，Barbu V，Fartoux L，Poupon R等人IGF-1R/EGFR交叉对话对于肝细胞瘤细胞对吉非替尼的敏感性的影响(Impact of IGF-1R/EGFR cross-talkson hepatoma cell sensitivity to gefitinib).Int J Cancer 2006年12月1日；119(11)：2557-2566)。IGF-1R的交互抑制也显示BxPC3细胞中EGFR磷酸化的增加，其反映了这些观察结果(Buck E，Eyzaguirre A，Rosenfeld-Franklin M，Thomson S，Mulvihill M，Barr S等人反馈机制促进表皮和胰岛素样生长因子受体的小分子抑制剂的协同效应(Feedbackmechanisms promote cooperativity for small molecule inhibitors ofepidermal and insulin-like growth factor receptors).Cancer Res 2008年10月15日；68(20)：8322-8332)。同样地，另一研究表明IGF-1R的干扰直接改变HuH7细胞中的ERK磷酸化并促成肿瘤生成(Cheng W，Tseng CJ，Lin TT，Cheng I，Pan HW，Hsu HC等人磷脂酰肌醇聚糖-3介导的癌发生涉及胰岛素样生长因子信号转导通路(Glypican-3-mediated oncogenesisinvolves the Insulin-like growth factor-signaling pathway).Carcinogenesis2008年7月；29(7)：1319-1326)，因此，与更多在其他癌症类型中见到的已确立的EGFR信号转导相比，确认了IGF-1R作为最有可能的HCC中的MAPK信号转导的转导物。

IGF-1R是对于癌症研究越来越重要的癌基因。报道已描述IGF-1R在肝癌形成中的作用和它在HCC模型中对下游细胞周期和抗细胞凋亡途径的控制(Cheng W，Tseng CJ，Lin TT，Cheng I，Pan HW，Hsu HC等人磷脂酰肌醇聚糖-3介导的癌发生涉及胰岛素样生长因子信号转导通路(Glypican-3-mediated oncogenesis involves the Insulin-like growthfactor-signaling pathway).Carcinogenesis 2008年7月；29(7)：1319-1326；Hopfner M，Huether A，Sutter AP，Baradari V，Schuppan D，Scherubl H.IGF-1受体酪氨酸激酶的阻滞在肝细胞癌细胞中具有抗肿瘤作用(Blockadeof IGF-1 receptor tyrosine kinase has antineoplastic effects inhepatocellular carcinoma cells).Biochem Pharmacol 2006年5月14日；71(10)：1435-1448)。IGF-1R为HuH7中最强磷酸化的RTK(除了生理学活化的胰岛素受体外)的观察结果使其有资格作为HCC表型维持中的关键候选物。分别地，EphA2和Tyro3是HCC中新的癌基因。EphA2是新出现的靶，因为积累的证据表明其在一些恶性肿瘤中过表达并起作用。至少在一些黑素瘤中，已证明EphA2活性促成肿瘤新血管形成(Walker-Daniels J，Hess AR，Hendrix MJ，Kinch MS.正常和恶性细胞中EphA2的差别调节(Differential regulation of EphA2 in normal and malignant cells).Am JPathol 2003年4月；162(4)：1037-1042)。Tyro3属于RTK的Axl亚家族。至今，将Tyro3与人类癌症相关联的报道仍有限，尽管它的转化性质已在实验模型中被实验地证明(Hafizi S，Dahlback B.Axl受体酪氨酸激酶亚家族的Gas6和蛋白质S.维生素K依赖性配体(Gas6 and protein S.VitaminK-dependent ligands for the Axl receptor tyrosine kinase subfamily).FEBSJ 2006年12月；273(23)：5231-5244)。虽然这些RTK在HCC中的确切功能需要进一步研究，但细胞周期标记(PCNA和细胞周期蛋白D1)的抑制和早期凋亡的刺激(胱天蛋白酶-3激活和PARP裂解)提供了进一步的证据：激酶抑制的结果通过信号级联放大而被翻译，导致协同的生长停滞和细胞死亡。

尽管还未探究出化合物47的RTK靶的完全范围，但是，到目前为止提供的证据表明它与经典的多重RTK抑制剂舒尼替尼完全可比。化合物47抑制胰岛素受体，但显著地小于舒尼替尼对胰岛素受体的抑制。这可能由于与舒尼替尼相比，观察到化合物47具有减少的细胞毒性作用。相反，对于舒尼替尼，没有见到化合物47那样的对IGF-1R和EphA2的强抑制。一个重要结果是在AFP调节中的显著差别，其中化合物47显著地减少AFP转录而舒尼替尼对此具有可忽略的效力。该发现暗示下述可能性：受抑制的激酶组可能机械地调节AFP并因此赋予对HCC的选择性作用，其中已知60-70％是AFP阳性的(Abelev GI，Eraiser TL.肿瘤中甲胎蛋白再表达的细胞方面(Cellular aspects of alpha-fetoprotein reexpression in tumors).Semin Cancer Biol 1999年4月；9(2)：95-107)。此外，AFP击倒促进了HuH7细胞中的凋亡的最新发现提示AFP可代替无害的肿瘤标记物来积极地调节HCC生长(Yang X，Zhang Y，Zhang L，Zhang L，Mao J.沉默的甲胎蛋白表达在人肝细胞癌细胞中诱导生长停滞和细胞凋亡(Silencingalpha-fetoprotein expression induces growth arrest and apoptosis inhuman hepatocellular cancer cell).Cancer Lett 2008年11月28日；271(2)：281-293)。总体上，涉及IGF-1R和其他RTK例如EphA2和Tyro3的激酶抑制的新的组合使得化合物47成为用于HCC治疗的其他先导物优化和合适的RTK靶的探索的令人关注且可能有用的物质。

总之，已鉴定出新的吲哚啉酮衍生物对癌症且特别是HCC显示超过目前TKI的治疗益处。就机理而言，IGF-1R信号转导对于HCC中的肿瘤维持可能是关键驱动者，且EphA2和Tyro3的可能的作用需要进一步研究。聚焦于IGF-1R和其他途径的多靶激酶抑制剂可能因此代表用于抗HCC以及其他恶性肿瘤(其中可能涉及多重信号转导异常)的一类新的TKIs。

本领域技术人员也将容易地理解本发明很好地适于实现所述目的并获得提及的以及隐含在本文中的结果和益处。本文描述的分子复合物和方法、步骤、处理、分子、具体化合物是目前代表性的优选实施方案，是示例性的，且非意在限制本发明的范围。本领域技术人员会想到其中的变化和其他用途，其包含在由权利要求的范围定义的本发明的主旨内。

本领域技术人员容易明白本文公开的发明可进行各种替换和修饰，而不脱离本发明的范围和主旨。

所有在说明书中提及的专利和出版物指示了本发明的所属领域的技术人员的水平。所有专利和出版物以如下程度在此引作参考，正如每个单独的出版物被明确且独立地指明引作参考。

本文示例性描述的发明可适当地在缺少本文没有明确公开的任何要素、限制的情况下被实施。因此，例如，在本文的各种情况下，术语“包含”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任一个可被其他两个术语中的任一个替换。已被应用的术语和表述用作描述性而非限制性的术语，且无意使用排除所示和描述的特征的任何等同体或其部分的术语和表述，但要认识到多种修饰可能在本发明所要求保护的范围内。因此，应当理解尽管已通过优选实施方案和任选特征具体公开了本发明，但文中公开的概念的修饰和变化可能借助于本领域技术人员，且这样的修饰和变化被认为在所附权利要求所定义的本发明的范围内。

此外，本发明的特征和方面以马库什组来描述，本领域技术人员会认识到本发明也因此以马库什组的任何个体成员或成员亚组进行描述。例如，如果X被描述为选自溴、氯和碘，则X为溴的权利要求和X为溴和氯的权利要求全都被描述。

其他实施方案在下述权利要求内。

Claims (30)

1.式I的化合物或其药学可接受的盐或前药，

其中：

每个R¹和R²独立地选自未取代或取代的C₁-C₁₀烷基、未取代或取代的C₁-C₁₀链烯基、未取代或取代的C₁-C₁₀炔基、未取代或取代的C₁-C₁₀烷氧基、羟基、卤素和三卤代甲基；

m为整数1且n为整数1或2；

当m和n各自为1时，则R¹在环A的6位且R²在环B的2’、3’或4’位；且

当m为1且n为2时，则R¹在环A的6位且R²在环B的3’和4’位。

2.权利要求1的化合物，其中R¹各自独立地选自卤素和C₁-C₄烷氧基。

3.权利要求1或2的化合物，其中R¹各自独立地选自溴、氯、氟和甲氧基。

4.权利要求1至3中任一项的化合物，其中R²各自独立地选自C₁-C₄烷氧基、羟基和三卤代甲基。

5.权利要求1至4中任一项的化合物，其中R²各自独立地选自甲氧基、乙氧基、羟基和三氟甲基。

6.权利要求1至5中任一项的化合物，其中所述化合物具有式Ia：

其中，当m和n都为1时，

R¹为选自6-F、6-Cl和6-OCH₃的基团；且

R²为选自3’OCH₃、3’-OH、4’-OCH₃和3’CF₃的基团；

且，其中当m为1且n为2时，

R¹为选自6-F、6-Cl和6-OCH₃的基团；且

R²为选自3’OCH₃、3’-OH、4’-OCH₃和3’CF₃的基团。

7.权利要求1至6中任一项的化合物，其中所述化合物选自：

6-氟-3-(3’-甲氧基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮；

6-氟-3-(3’-羟基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮；

6-氟-3-(4’-甲氧基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮；

6-氯-3-(3’-甲氧基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮；

6-氯-3-(3’-羟基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮；

6-氯-3-(4’-甲氧基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮；

6-甲氧基-3-(3’-甲氧基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮；

6-甲氧基-3-(3’-羟基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮；

6-甲氧基-3-(4’-甲氧基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮；

6-氟-3-(3’-羟基-4’-甲氧基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮；

6-氯-3-(3’-羟基-4’-甲氧基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮；

6-甲氧基-3-(3’-羟基-4’-甲氧基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮；

6-氟-3-(3’-三氟甲基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮；

6-氯-3-(3’-三氟甲基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮；和

6-甲氧基-3-(3’-三氟甲基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮。

8.权利要求7的化合物，其中所述化合物为6-氯-3-(3’-三氟甲基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮。

9.式II的化合物或其药学可接受的盐或前药，

其中：

X为F、Cl、Br或C₁-C₄烷氧基；

R³各自独立地选自未取代或取代的C₁-C₁₀烷基、未取代或取代的C₁-C₁₀链烯基、未取代或取代的C₁-C₁₀炔基、未取代或取代的C₁-C₁₀烷氧基、羟基、卤素和三卤代甲基；

o为整数1或2；

当o为1时，则R³在环B的3’或4’位；

当o为2时，则R³在环B的3’和4’位。

10.权利要求9的化合物，其中R³各自独立地选自C₁-C₄烷氧基、羟基和三卤代甲基。

11.权利要求9或10的化合物，其中R³各自独立地选自甲氧基、羟基和三氟甲基。

12.权利要求9至11中任一项的化合物，其中X为甲氧基或乙氧基。

13.权利要求9至12中任一项的化合物，其中所述化合物具有式IIa：

其中，当n为1时，R³为选自3’-F、3’-Cl、3’-Br、3’-OCH₃、3’-OH、4’-OCH₃、3’CF₃、4’-F、4’-Cl、4’-Br、4’-OCH₃、4’-OH、3’-OCH₃和4’-CF₃的基团；

其中，当n为2时，R³为选自3’-F、3’-Cl、3’-Br、3’-OCH₃、3’-OH、4’-OCH₃、3’CF₃、4’-F、4’-Cl、4’-Br、4’-OCH₃、4’-OH、3’-OCH₃和4’-CF₃的基团。

14.权利要求9至13中任一项的化合物，其中所述化合物选自：

5-氯-3-(3’-甲氧基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮；

5-氯-3-(3’-羟基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮；

5-氯-3-(4’-甲氧基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮；

5-氯-3-(3’三氟甲基-亚苄基)-吲哚啉-2-酮。

15.制备式I或II的化合物的方法，所述方法包括在碱存在下使式(III)的羟吲哚

与式(IV)的醛反应

16.药物组合物，其包含权利要求1至14中任一项的化合物或盐或前药以及药学可接受的载体或赋形剂。

17.权利要求16的药物组合物，其还包含另外的药品或药物。

18.用于调节蛋白激酶的催化活性的方法，其包括使所述蛋白激酶与权利要求1至14中任一项所述的化合物、盐或前药接触。

19.权利要求18的方法，其中所述蛋白激酶包括蛋白酪氨酸激酶。

20.权利要求18或19的方法，其中所述蛋白酪氨酸激酶包括受体蛋白酪氨酸激酶。

21.权利要求20的方法，其中所述受体蛋白酪氨酸激酶选自EGFR、HER2、HER3、HER4、IR、IGF-1R、IRR、PDGFR CSFIR、C-Kit、C-fms、Flk-1R、Flk4、KDR/Flk1、Flt-l、FGFR-1R、FGFR-2R、FGFR-3R、FGFR-4R、EphA2和Tyro3。

22.用于治疗或预防蛋白酪氨酸激酶相关疾病或病症的方法，其包括向有此需要的个体给药药学活性量的权利要求1至14中任一项的化合物。

23.权利要求22的方法，其中所述个体为哺乳动物，优选人类。

24.权利要求22或23的方法，其中所述蛋白酪氨酸激酶相关疾病或病症包括受体蛋白酪氨酸激酶相关病症。

25.权利要求22或23的方法，其中所述蛋白酪氨酸激酶相关疾病或病症包括IGF-1R相关病症。

26.权利要求25的方法，其中所述IGF-1R相关病症为癌症。

27.权利要求22的方法，其中所述蛋白酪氨酸激酶相关疾病或病症选自肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌和肺癌。

28.权利要求27的方法，其中蛋白酪氨酸激酶相关疾病或病症为肝细胞癌。

29.鉴别具有抗肝细胞癌的特异性效力的蛋白激酶抑制剂的方法，所述方法包括：

(i)用肝细胞癌细胞系温育候选化合物；

(ii)测定细胞存活；和

(iii)将所述测定的细胞存活与所述候选化合物对正常肝细胞系的作用相比较以鉴别具有抗肝细胞癌细胞的特异性活性的化合物。

30.权利要求29的方法，其中所述肝细胞癌细胞系选自HepG2和HuH7。

Images