KR20070029190A

KR20070029190A - 최적화된 Ｆｃ 변이체

Info

Publication number: KR20070029190A
Application number: KR1020067025636A
Authority: KR
Inventors: 그레고리 알란 라자르; 웨이 당; 존 알. 데스자르라이스; 셰어 바하두르 카르키; 오미드 바파; 로버트 하이스
Original assignee: 젠코어 인코포레이티드
Priority date: 2004-07-15
Filing date: 2005-05-05
Publication date: 2007-03-13
Also published as: EP2940043A1; EP3342782B1; CN101014619B; IL179048A0; CA2565961A1; EP2471813B1; SI2471813T1; ES2530340T3; DK2471813T3; CN103351434A; WO2006019447A1; CN103351434B; JP5301611B2; AU2005272993B2; EP1919950A1; JP2008505174A; JP2011188869A; CN101987870B; KR100863776B1; BRPI0510674A

Abstract

본 발명은 최적화된 Fc 변이체, 그의 제조 방법, 최적화된 Fc 변이체를 포함하는 Fc 폴리펩티드 및 최적화되 Fc 변이체를 이용하는 방법에 관한 것이다.

Fc 변이체

Description

최적화된 Ｆｃ 변이체{OPTIMIZED Fc VARIANTS}

이 출원은 미합중국 특허법(35 U.S.C) 119조(e)에 의거하여 2004년 5월 5일자 미국 출원번호 60/568,440호, 2004년 7월 20일자 미국 출원번호 60/589,906호, 2004년 11월 9일자 미국 출원번호 60/627,026호, 2004년 11월 10일자 미국 출원번호 60/626,991호, 2004년 11월 12일자 미국 출원번호 60/627,774호, 2003년 12월 22일자 미국 출원번호 60/531,752호, 및 2003년 12월 22일자 미국 출원번호 60/531,891호를 우선권으로 주장하는, 2004년 3월 26일자 미국 출원번호 10/822,231호의 일부 계속 출원이고, 2004년 9월 26일자 미국 출원번호 10/672,280호의 일부 계속 출원이며, 2003년 3월 3일자 미국 출원번호 10/379,392호의 일부 계속 출원이고, 상기 모든 출원은 원용에 의해 본 명세서에서 포함된다.

본 발명은 신규의 최적화된 Fc 변이체(variant), 그것의 제조를 위한 조작 방법 및 그것의 적용, 특히 치료 용도에 관한 것이다.

항체는 특정 항원에 결합하는 면역 단백질이다. 인간과 마우스를 포함하는 대부분의 포유동물에서 항체는 경쇄와 중쇄가 짝을 이루어 만들어진다. 각 쇄는 개별 면역 글로불린 도메인이 모여 이루어지기 때문에, 그러한 단백질을 통틀어 면역 글로불린이라고 일컫는다. 각 쇄는 가변부위와 불변부위라고 하는 뚜렷이 구분 되는 두 부위로 이루어진다. 경쇄와 중쇄의 가변 부위는 항체마다 그 서열이 상당히 다르며, 가변 부위로 인해 표적 항원과 결합할 수 있다. 불변부위는 그 서열 변화가 덜하지만, 불변부위 때문에 항체가 중요한 생화학적 현상을 일으키는 몇 가지 천연 단백질과 결합할 수 있다. 인간에 있어서 항체에는 중요한 5가지 클래스가 있는데 IgA(서브클래스(亞種)인 IgA1과 IgA2 포함), IgD, IgE, IgG(서브클래스인 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 포함), IgM이다. 이 5가지 종류의 항체를 서로 구별하는 것은 그 불변부위에 있는데, 가변부위들 사이에서는 미세한 차이가 있을 수 있다. 도 1은 본 명세서에서 면역 글로불린의 일반적인 구조적 특징을 기술하기 위한 예로 들고 있는 IgG 항체를 도시한다. IgG 항체는 두 개의 경쇄와 두 개의 중쇄로 이루어진 사량체 단백질(tetrameric protein)이다. IgG 중쇄는 N-말단에서 C-말단까지 V_H-C_H1-C_H2-C_H3 순서로 연결된 네 개의 면역 글로불린 도메인으로 이루어지는데, 이들은 각각 중쇄 가변부위, 중쇄 불변 1도메인, 중쇄 불변 2도메인, 중쇄 불변 3도메인을 나타낸다. IgG C_H1, C_H2, 및 C_H3 도메인은 각각 불변 감마 1 도메인(Cγ1), 불변 감마 2 도메인(Cγ2), 및 불변 감마 3 도메인(Cγ3)을 나타낸다. IgG 경쇄는 N-말단에서 C-말단까지 V_L-C_L로 연결된 두 개의 면역 글로불린 도메인으로 이루어지는데, 이들은 각각 경쇄 가변 도메인과 경쇄 불변 도메인을 나타낸다.

항체의 가변부위는 그 분자의 항원 결합 결정부(antigen binding determinant)를 포함하므로 항체가 그 표적 항원에 대하여 가지는 특이성을 결정한다. 가변부위는 같은 종류에 속하는 항체들 사이에서 그 서열이 가장 뚜렷이 구분 되는 부위이므로 가변부위라고 일컫는다. 서열의 변화는 대부분이 상보성 결정 부위(complementarity determining region, CDR)에 몰려 있다. 경쇄와 중쇄에 각 3개씩 총 6개의 상보성 결정 부위가 있는데, V_H CDR1, V_H CDR2, V_H CDR3, V_L CDR1, V_L CDR1, V_L CDR2, V_L CDR3로 지칭한다. CDR 부위 밖의 가변부위는 골격부위(framework region, FR)라고 일컫는다. CDR만큼 다양하지 않으나 서로 다른 항체의 FR 사이에도 다양성이 존재한다. 전체적으로 항체의 이러한 구조적 특성 덕택에 면역계가 광범위한 종류의 항원에 대한 특이성을 획득하기 위한 항원 결합의 다양성(CDR)을 구축하는데 필요한 안정적인 뼈대(FR)가 생긴다. 다양한 생물학적 종에서 비롯한 항체가 항원과 결합하여 이룬 복합체(complex) 또는 항원과 결합하지 않은 항체에 대한 수많은 고해상도 구조가 존재한다. 항체 가변부위의 서열과 구조적 면모는 그 특성이 잘 연구되어 있고(Morea 외, 1997, Biophys Chem 68:9~16; Morea 외, 2000, Methods 20:267~279), 항체에서 보존된 특징들 덕택에 항체 공학적 기법이 풍부하게 발전할 수 있었다(Maynard 외, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339~376, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 예를 들어 한 항체, 가령 마우스 항체에서 CDR을 따와서 다른 항체, 가령 인간 항체의 골격부에 이식하는 것이 가능하다. 당업계에서 “인간화(humanization)"라고 하는 이러한 과정은 인간 유래가 아닌 항체로부터 항원성이 적은 치료제 항체를 생성할 수 있게 한다. 항체의 다른 부위가 없이 가변부위로 구성된 단편이 존재할 수 있는데, 이에는 V_H-Cγ1과 V_H-C_L로 구성된 항원 결합 단편(Fab), V_H와 V_L로 이루어진 가 변 단편(Fv), V_H와 V_L이 한 쇄로 연결된 구성의 단일 쇄 가변 단편(scFv)과 그 밖의 다양한 가변 부위 단편들이 속한다(Little 외, 2000, Immunol Today 21:364~370, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).

항체의 Fc 부위는 다양한 Fc 리셉터와 리간드에 결합하므로 작용자 기능(effector function)으로 일컫는 중요한 기능을 행하는 능력을 가진다. IgG에서 도 1에서 나타낸 Fc 부위는 Ig 도메인 Cγ2와 Cγ3 및 Cγ2로 이어지는 N-말단 경첩부로 구성된다. IgG 종류에서 중요한 Fc 리셉터의 단백질 계열(family)은 Fc 감마 리셉터(FcγR, Fc gamma receptor)이다. 이 리셉터들은 항체와 면역계의 세포와의 교류를 매개한다(Raghavan 외, 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181~220; Ravetch 외, 2001, Annu Rev Immunol 19:275~290). 인간의 경우, 상기 단백질 계열에 속하는 것으로는 FcγRI(CD64), FcγII(CD32) 그리고 FcγRII(CD16)가 있는데, FcγRI에는 FcγRIa, FcγRIb. FcγRIc 아이소형(isoform)이, FcγRII에는 FcγRIIa(H131과 R131 동종이형(allotype)이 포함됨), FcγRIIb(FcγRIIb-1과 FcγRIIb-2의 동종이형 포함), FcγRIIc 아이소형이, 그리고 FcγRIII에는 FcγRIIIa(V158과 F158 동종이형 포함)과 FcγRIIIb 아이소형(FcγRIIIb-NA1과 FcγRIIIb-NA2 동종이형 포함)이 속하게 된다(Jefferis 외, 2002, Immunol Lett 82: 57-65, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 이 리셉터들은 전형적으로 Fc와 결합하는 것을 매개하는 세포외 도메인, 막 통과 부위, 그리고 세포내에서 신호전달 과정을 매개할 가능성도 있는 세포내 도메인을 가지고 있다. 이 리셉터들 은 단핵세포, 대식세포, 중성구, 가지 세포, 호산구(eosinophil), 비만 세포(mast cell), 혈소판, B 세포, 대형 과립상 림프구(large granular lymphocyte), 랑게르한스 세포, 자연 살상 세포 그리고 γδT 세포를 포함하는 다양한 면역 세포에서 발현된다. Fc/FcγR 복합체가 형성되면, 작용자 세포(effector cell)들을 항원이 결합한 곳으로 끌어들여 세포 내에서 일어나는 신호 전달 과정과 그에 따른 중요한 면역 반응을 일으키는 것이 전형적인데, 이러한 면역 반응에는 염증 매개 물질의 방출, B 세포 활성화, 세포내이입(endocytosis), 식세포 작용, 세포 독성 공격(cytotoxic attack) 등이 있다. 세포 독성 작용과 식세포 작용을 매개하는 능력은 항체가 표적 세포를 파괴하는데 쓰일 수 있는 메커니즘이다. FcγR를 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포에 결합한 항원을 인식하고 이어서 그 표적 세포를 용해(lysis)하는 세포 매개 반응을 항체의존 세포매개 세포독성(ADCC, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)라고 한다(Raghavan 외, 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181~220; Ghetie 외, 2000, Annu Rev Immunol 18:739~766; Ravetch 외, 2001, Annu Rev Immunol 19: 275~290, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). FcγR를 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포에 결합한 항체를 인식하고 이어서 그 표적 세포에 대한 식세포 작용을 일으키는 세포 매개 반응을 항체의존 세포매개 식세포 작용(ADCP, antibody-dependent cell-mediated phagocytosis)이라고 한다. 인간 FcγR의 세포외 도메인에 대해서는 구조가 결정된 단백질 구조가 여러 개 있는데, 이에는 FcγRIIa(pdb 기탁 코드(accession code) 1H9V)(Sondermann 외, 2001, J Mol Biol 309: 737~749)(pdb 기 탁 코드 1FCG)(Maxwell 외, 1999, Nat Struct Biol 6: 437~442)와 FcγRIIb(pdb 기탁 코드 2FCB)(Sondermann 외, 1999, Embo J 18:1095~1103) 그리고 FcγRIIIb(pdb 기탁 코드 1E4J)(Sondermann 외, 2000, Nature 406:267~273, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)이 포함된다. 모든 FcγR은 Fc의 동일 부위에 결합하는데, 도 2에 나타낸 Cγ2 도메인 N-말단과 그에 선행하는 경첩부가 그 부위이다. 이 상호작용의 특성은 구조적으로 잘 연구되어 있고(Sondermann 외, 2001, J Mol Biol 309:737~749, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨), 인간 FcγRIIIb의 세포외 도메인에 인간 Fc가 결합한 복합체 몇 가지는 그 구조가 결정되어 있고(pdb 기탁 코드 1E4K)(Sondermann 외, 2000, Nature 406:267~273)(pdb 기탁 코드 1IIS와 1IIX)(Radaev 외, 2001, J Biol Chem 276:16469~16477, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨), 인간 IgE Fc/FcεRIα 복합체(pdb 기탁 코드 1F6A)(Garman 외, 2000, Nature 406:259~266) 역시 구조가 결정되어 있다.

IgG의 다른 서브클래스들은 FcγR에 대하여 서로 다른 친화성을 가지고 있는데, IgG1과 IgG3는 IgG2와 IgG4보다 그 리셉터에 훨씬 더 강하게 결합하는 것이 전형적이다. 모든 FcγR는 IgG Fc의 동일한 부위에 결합하지만 서로 다른 친화성으로 결합한다. 높은 친화성으로 결합하는 FcγRI은 IgG1에 대하여 Kd가 10^-8 M^- ¹ 인데 반하여 친화성이 낮은 FcγRII와 FcγRIII은 일반적으로 그 Kd값이 각각 10^-6과 10^-7에서 결합한다. FcγRIIIa와 FcγRIIIb의 세포외 도메인은 96% 동일하지만, FcγRIIIb는 세포 내 신호전달 도메인을 가지고 있지 않다. 더욱이 FcγRI, Fcγ RIIa/c와 FcγRIIIa는 면역 복합체 유발 활성화에 대한 양성 조절인자이고 티로신에 근거한 면역 리셉터 활성화 모티프(ITAM, immunorecetor tyrosine-based activation motif)를 가지는 세포내 도메인이 있다는 특징을 나타내는데 반하여, FcγRIIb는 티로신에 근거한 면역 리셉터 억제 모티프(ITIM, immunoreceptor tyrosine-based inhibtion motif)를 가지고 있기 때문에 억제 조절인자이다. 따라서 전자는 활성 리셉터로, FcγRIIb는 억제 리셉터로 부른다. 이 리셉터들은 또한 서로 다른 면역 세포에서 그 발현 형태와 발현량을 달리 한다. 여기에 복잡성을 더하는 또 하나는 인간 단백질체에서 나타나는 FcγR의 다형성(polymorphism)이다. 특히 임상적으로 중요하게 관련된 다형성은 V158/F158 FcγRIIIa이다. 인간 IgG1은 V158 동종이형에 F158 이형보다 더 큰 친화성으로 결합한다. 이 친화성 차이 그리고 아마도 ADCC 및/또는 ADCP에 미치는 그 영향은 항CD20 항체 rituximab(Rituxan^®, IDEC Pharmaceutical Corporation의 등록 상표)의 효력을 결정하는 중요한 요소이다. V158 동종이형 보유 환자는 rituximab 요법에 대한 반응이 양호하지만, 친화성이 낮은 F158 동종이형 보유자는 반응이 저조하다(Cartron 외, 2002, Blood 99:754~758, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 약 10~20%의 인간이 V158/V158의 동형접합체(homozygote)이고, 45%의 인간이 V158/F158 이형접합체이며, 35~45%의 인간이 F158/F158 이형접합체이다(Lehmbecher 외, 1999, Blood 94:4220~4232; Cartron 외, 2002, Blood 99:754~758, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 따라서 80~90%의 인간은 치료에 저조하게 반응 하는데, 이는 곧 F158 FcγRIIIa 대립유전자를 적어도 하나 가지고 있다는 뜻이다.

도 1에 나타낸 것처럼 Fc상에서 서로 겹치지만 별개인 하나의 결합 부위가, 보체 단백질 C1q와의 계면 역할을 한다. Fc/FcγR 결합이 ADCC를 매개하는 것과 똑같이 Fc/C1q 결합은 보체 의존성 세포독성(CDC, complement-dependent cytotoxicity)를 매개한다. C1q는 세린 단백질 가수분해 효소 C1r과 C1s와 복합체를 이뤄 C1 복합체를 형성한다. C1q는 항체 6개와 결합할 수 있지만, 두 개의 IgG하고만 결합하여도 보체 연쇄증폭반응(complement cascade)을 일으키는 데는 충분하다. Fc와 FcγR 사이의 상호작용과 유사하게 서로 다른 서브클래스의 IgG들은 C1q에 대하여 그 친화성이 다른데, IgG1과 IgG3가 IgG2와 IgG4보다 FcγR에 대하여 더 세게 결합하는 것이 전형적이다. Fc/C1q 복합체에 대해서 현재로는 어떠한 구조도 얻은 것이 없지만 인간 IgG상의 C1q 결합부위에 대한 돌연변이 연구 결과 D270, K322, K326, P329, P331과 E333 잔기를 포함하는 구역(Idusogie 외, 2000, J Immunol 164:4178~4184; Idusogie 외, 2001, J Immunol 166:2571~2575, 전술한 문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)으로 지도를 작성(mapping)하였다.

도 1에 나타낸 것처럼, Cγ2와 Cγ3 도메인 사이에 위치하는 Fc상의 한 자리는 신생아 리셉터 FcRn과의 상호작용을 매개하는데, 이 결합에 의하여 세포내 이입된 항체가 엔도솜에서 혈액으로 다시 재활용된다(Raghavan 외, 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12: 181~220; Ghetie 외, 2000, Annu Rev Immunol 18:739~766, 전술한 문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 이러한 과정은 전장(全長) 분자의 거대한 크기에 의하여 콩팥에서 여과되는 것이 차단되는 점과 결부되었을 때 항체 의 혈청 내 반감기가 1주에서 3주에 이르도록 하는 유리한 효과를 낳는다. Fc가 FcRn에 결합하는 것도 항체 수송에서 중요한 역할을 맡는다. Fc에서 FcRn과 결합하는 자리는 세균 단백질 A와 단백질 G가 결합하는 자리이기도 하다. 이들 단백질의 강력한 결합을 이용하여 단백질 정제 과정에서 단백질 A나 단백질 G 친화성 크로마토그래피를 사용하는 항체의 정제 수단으로 삼는 것이 전형적인 예이다. 따라서 Fc상에 있는 이 부위의 결합 정확도는 항체의 임상적 특성과 항체의 정제 모두에 있어서 중요하다. 랫(rat) Fc/FcRn 복합체(Martin 외, 2001, Mol Cell 7:867~877, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)와 Fc의 단백질 A와 G에 대한 복합체들(Deisenhofer, 1981, Biochemistry 20, 2361~2370; Sauer-Eriksson 외, 1995, Structure 3:265~278; Tashiro 외, 1995, Curr Opin Struct Biol 5:471~481)의 구조로부터 Fc가 이들 단백질과 일으키는 상호작용에 대한 고찰할 수 있다.

Fc 부위의 주된 특징은 도 1에 나타낸 것처럼 N297에 일어나는 보존된 N-연결 당화 반응이다. 종종 올리고당이라고도 하는 이 탄수화물은 항체에서 그 구조와 기능면에서 핵심적인 역할을 맡으며, 항체를 반드시 포유류 발현 시스템에서 제조하여야 하는 주된 이유 중의 하나이다. 비록 어느 특정 이론에 구애받고자 하는 것은 아니나, 이 탄수화물의 구조적 용도는 아마도 Fc를 안정화하거나 가용화(solubilize)하고, Cγ3와 Cγ2 도메인 사이 특정 각(specific angle)이나 유연도 수준을 정하며, 두 Cγ2 도메인끼리 중심축을 따라 응집하는 것을 막거나 이 모든 요인을 조합한 것이라고 학계에서 생각하고 있다. FcγR과 C1q에 대하여 Fc가 효율적으로 결합하려면 이 수식(modification)이 필요하고 N297 연결 탄수화물의 조성이 바뀌거나 없어지게 되면 이들 단백질에 대한 결합도 영향을 수용체 된다(Umana 외, 1999, Nat Biotechnol 17:176~180; Davies 외, 2001, Biotechnol Bioeng 74:288~294; Mimura 외, 2001, J Biol Chem 276:45539~45547; Radaev 외, 2001, J Biol Chem 276:16478~16483; Shield 외, 2001, J Biol Chem 276:6591~6604; Shields 외, 2002, J Biol Chem 277:26733~26740; Simmons 외, 2002, J Immunol Methods 263:133~147, 전술한 문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 그러나 이 탄수화물은 FcγR과 전혀 특이적으로 접촉하지 않거나 거의 접촉하지 않는데(Radaev 외, 2001, J Biol Chem 276: 16469~16477, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨), 이는 Fc/FcγR 결합을 매개하는 데 있어서 N297 탄수화물의 기능적 역할이 Fc의 형태(conformation)를 결정하는 데 맡는 구조적 역할을 통하여 이루어짐을 가리킬 수 있다. 이러한 점은 Fc 당결합형(glycoform) 4개에 대하여 수집한 결정 구조로 뒷받침되는데, 여기서 이 올리고당의 조성이 Cγ2의 형태에 영향을 주고 그에 따라 Fc/FcγR 계면에도 영향이 미침(Krapp 외, 2003, J Mol Biol 325:979~989, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)이 나타난다.

앞서 설명한 항체들의 특징-표적에 대한 특이성, 면역계의 작용자 메카니즘(effector mechanism)을 매개하는 능력, 혈청 내 긴 반감기-은 항체를 강력한 치료제로 만든다. 단일 클론 항체는 암, 염증, 심장혈관계 질환을 포함하는 다양한 증상을 처치하기 위하여 치료제로 쓰인다. 시판되는 항체 제품은 현재 열 가지가 있고, 개발 중인 것은 수백 가지에 이른다. 항체 외에도, 항체 유사 단백질로서 연구와 치료법에서 점점 그 역할이 커지는 단백질이 Fc 융합 단백질이다(Chamow 외, 1996, Trends Biotechnol 14:52~60; Ashkenazi 외, 1997, Curr Opin Immunol 9:195~200, 전술한 문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). Fc 융합 단백질이란 하나 이상의 폴리펩티드가 Fc에 연결되어 작동하는 단백질이다. Fc 융합 단백질은 항체의 Fc 부위를 가지고 있기 때문에 이 부위의 유리한 작용자 기능과 약동학적 특성을, 리셉터, 리간드 또는 기타 단백질 또는 단백질 도메인의 표적 결합 부위와 함께 지니고 있다. 여기서 후자의 역할은 표적 인식을 매개하기 위함이고 따라서 기능적으로 항체 가변부위와 유사하다. Fc 융합 단백질과 항체는 구조적, 기능적으로 중복되기 때문에 본 발명에서 항체에 대하여 논한 부분은 곧바로 Fc 융합 단백질에도 적용된다.

항체가 종양 세포를 파괴할 수 있는 메카니즘은 여러 가지가 있는데, 이에는 성장에 필수 성장 경로 차단을 통한 항증식 효과, 세포자살(apoptosis)에 이르는 세포 내 신호 과정, 리셉터의 하향 조절(down regulation) 및/또는 리셉터 전환(turnover)의 향상, CDC, ADCC, ADCP와 적응성 면역 반응의 촉진이 포함된다(Cragg 외, 1999, Curr Opin Immunol 11:541~547; Glennie 외, 2000, Immunol Today 21:403~410, 전술한 문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 항종양 작용의 효력은 이러한 메카니즘의 조합에 의한 것일 수 있고, 임상 요법에서 각 요소의 상대적 중요성은 암의 종류에 달려 있다. 이러한 항종양 치료제를 다양하게 구비하고 있음에도 불구하고, 항암제로서의 항체의 효능은, 특히 그 높은 단가를 감 안할 때 만족스럽지 못하다. 환자의 종양 반응 데이터를 보면 단일 클론 항체는 한 가지 치료제의 정상적인 세포 독성 화학요법과 비교했을 때 약간의 향상 효과가 있을 뿐임을 알 수 있다. 예를 들어 저수준(low grade) 비호지킨성 림프종이 재발한 환자 중 절반만이 항CD20 항체 리툭시맵에 반응하였다(McLaughlin 외, 1998, J Clin Oncol 16:2825~2833, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 임상 환자 166명 중, 6%가 완전하게 반응하였고, 42%는 부분적으로 반응하였으며, 반응 지속 기간의 중앙값(median)은 12개월이었다. 전이성 유방암을 치료하는 항HER2/neu 항체 트라스투주맵(Herceptin®, Genentech의 등록 상표)은 효력이 약하다. 트라스투주맵을 사용하는 환자 222명에 대하여 조사한 전체적인 반응율은 15%에 불과했고, 완전한 반응은 8명, 부분적 반응은 26명이었으며 반응 지속기간과 생존 기간의 중앙값은 9에서 13개월이었다(Cobleigh 외, 1999, J Clin Oncol 17:2639~2648, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 현재 항암요법에서는 사망률을 조금 떨어뜨리면 성공이라고 규정한다. 따라서 항체가 표적 암세포를 살상하는 능력을 키워야할 중대한 필요성이 있다.

항체의 항암 활성을 위한 FcγR 매개 작용자 기능의 중요성은 랫에서 입증된 바 있고(Clynes 외, 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:652~656; Clynes 외, 2000, Nat Med 6:443~446, 전술한 문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨), Fc와 특정 FcγR 사이의 상호작용 친화성은 세포기반 검정 실험에서 상관 관계가 있는 것으로 나타난다(Shields 외, 2001, J Biol Chem 276:6591~6604; Presta 외, 2002, Biochem Soc Trans 30:487~490; Shields 외, 2002, J Biol Chem 277:26733~26740, 전술한 문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 더욱이 인간 FcγRIIIa의 고친화성(V158) 혹은 저친화성(F158) 동종이형의 다형성 종류와 임상적 효능 사이에 상관 관계가 관측되었다(Cartron 외, 2002, Blood 99:754~758, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).

Fc에 대한 돌연변이 연구는 다양한 목표하에 이루어 졌으나, 일반적으로는 알라닌으로 치환하거나(alanine scanning으로 지칭) 서열 상동성에 기반한 치환법으로 연구하였다(Duncan 외, 1988, Nature 332: 563~564; Lund 외, 1991, J Immunol 147 : 2657~2662; Lund 외, 1992, Mol Immunol 29:53~59; Jefferiset 외, 1995, Immunol Lett 44:111~117; Lund 외, 1995, Faseb J 9:115-119; Jefferis 외, 1996, Immunol Lett 54: 101~104; Lund 외, 1996, J Immunol 157:4963~4969; Armour 외, 1999, Eur J Immunol 29:2613~2624; Shields 외, 2001, J Biol Chem 276:6591~6604) (미국 특허 5,624,821호, 5,885,573호, PCT출원 WO 00/42072호, WO 99/58572호). 아미노산 치환 중 대부분은 FcγR과의 결합을 약화시키거나 없애버린다. 그러나 더 높은 FcγR 친화성을 가지는 Fc 변이체를 만드는 시도에서 몇 가지 성공 사례가 있었다(예를 들어 미국 특허 5,624,821호와 PCT 출원 WO 00/42072호를 참조). 예를 들어 Winter와 그 동료들은 마우스 IgG2 항체의 235번 위치에 인간 아미노산을 치환해 넣어(글루탐산에서 류신으로 치환) 그 마우스 항체가 인간 FcγRI과 결합하는 능력을 100배 향상시켰다(Duncan 외, 1988, Nature 332:563~564)(미국 특허 5,624,821호). Shields 외의 문헌에는 알라닌 스캐닝(alanine scanning) 돌연변이법을 사용하여 Fc 잔기중 FcγR 결합에 중요한 것들 에 대하여 지도를 작성하고, 이어서 몇몇 선택한 잔기에 대하여 비(非)알라닌 치환을 수행하였다(Shields 외, 2001, J Biol Chem 276:6591~6604; Presta 외, 2002, Biochem Soc Trans 30:487~490) (PCT WO 00/42072).

FcγR에 대한 Fc의 친화성은 공학 기술로 변형한 세포주에서 생산한 항체의 가공된 당결합형을 이용하여서도 향상시킨 바 있다(Umama 외, 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies 외, 2001, Biotechnol Bioeng 74: 288-294; Shields 외, 2002, J Biol Chem 277: 26733~26740; Shinkawa 외, 2003, J Biol Chem 278:3466~3473, 전술한 문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 이러한 방식으로 FcγRIIIa에 결합하는 능력과 ADCC를 매개하는 능력이 크게 향상된 항체를 생성할 수 있었다.

본 발명은 항체의 중대 결점 중 또 다른 하나, 즉 생산 과정의 과도한 요구 조건(Garber, 2001, Nat Biotechnol 19:184~185; Dove, 2002, Nat Biotechnol 20:777~779, 전술한 문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)에 대해서도 다루고 있다. 항체는 포유세포에서 발현되어야만 하고, 현재 시판중인 항체와 대규모의 수요를 가지는 다른 생물학적 치료제를 제조하는 데 실질적으로 가용 설비 능력을 모두 쓰고 있다. 생명공학 제제 수백종이 개발 중이고 그 대부분이 항체인 상황에서, 더욱 효율적이고 저렴한 제조 방법에 대한 필요성은 절실하다. 항체 제조설비가 부족하여 생길 수 있는 파급 효과는 세 가지가 있다. 첫째 생산자들로 하여금 제품의 단가를 높이도록 하여 그 비용을 소비자에게 전가하도록 할 것이다. 둘째, 승인을 얻은 항체 제품의 공업적 생산에 지장을 줌으로써, 환자들을 대상으로 하며 수요가 높은 치료 제제의 공급이 제한될 것이다. 마지막으로 임상 실험은 현재로는 수익성이 없는 단백질을 대량으로 사용하여야 하므로, 부족한 공급량이 개발 도상인 항체를 시장에 진입시키는 데 방해가 될 것이다.

이러한 문제점을 줄이기 위한 시도로서 다른 제조 방법들도 사용되었다. 유전자 이전(transgenic) 식물과 동물을 잠재적인 저렴하고 대용량의 생산 시스템으로 만들기 위한 노력이 경주되고 있다(Chadd 외, 2001, Curr Opin Biotechnol 12:188~194, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 하지만 그러한 발현 시스템은 인간의 당단백질과 상당히 다른 방식으로 당화를 일으킬 수 있다. 이렇게 되면 작용자 기능이 줄어들거나 심지어 없어질 수도 있는데, 이는 앞서 설명하였듯이 그 탄수화물 구조가 FcγR와 보체 결합에 중대한 영향력을 미칠 수 있기 때문이다. 잠재적으로 인간 유래가 아닌 당결합형 단백질에서 더 큰 문제로 작용할 수 있는 것은 항원성이다. 탄수화물은 면역계에서 항원성의 주요한 근원이 되며, 비인간형 당결합형 단백질의 존재는 치료 효과를 없애버리는 항체 반응을 일으킬 수 가능성이 클 뿐만 아니라, 더 심각한 경우 악성 면역 반응을 불러올 수 있다. 따라서 유전자 이식 식물과 동물에서 제조된 항체의 효력과 안전성은 아직 불확실한 채로 있다. 세균내 발현은 항체 제조 문제점에 대한 다른 매력적인 해결책이다. 세균내, 예를 들어 대장균내 발현은 비용에 비하여 효과가 크고 용량이 큰 단백질 제조방법이 된다. 항체와 같이 복잡한 단백질에 대해서는 세균내 발현이 넘어야 할 장애물이 여러 가지가 있는데, 이에는 이 복잡한 분자의 접힘(folding)과 조립(assembly), 적절한 이황화 결합 형성, 용해도, 안정성, 세균에서 발현된 단백 질은 당화되지 않으므로 당화가 부재시의 기능성 등의 문제점이 포함된다. 항원과 결합하는 전장(全長) 비당화 항체를 대장균에서 성공적으로 발현하였고(Simmons 외, 2002, J Immunol Methods 263:133~147, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨), 따라서 세균에서 발현된 항체의 접힘, 조립과 적절한 이황화결합의 형성은 진핵세포의 샤프론(chaperone) 장치가 없는 상황에서도 가능하다. 그러나 세균에서 발현된 항체의 치료제로서의 궁극적인 효용은 당화의 부재 때문에 여전히 지장을 받는데, 당화의 부재는 작용자 기능의 부족을 가져 오고, 안정성과 가용성을 낮출 수도 있다. 이 점은 장기간 동안 고농도로 제제로 조성하여야 하는 임상 응용 분야에서는 더욱 문제가 된다.

요컨대, 향상된 치료 특성을 가지는 항체가 필요한 실정이다.

발명의 개요

본 발명은 치료 요법에 관련된 몇 가지 특성을 최적화한 Fc 변이체를 제공한다. Fc 변이체는 대개 변이체 단백질의 일부분인데, 상기 변이체 단백질은 바람직하게는 항체 또는 Fc 융합 단백질를 포함한다.

본 발명의 목적은 아미노산 변형을 통하여 최적화된 Fc 변이체를 생성하는 데 쓰일 수 있는 Fc의 새로운 위치를 제공하는 것이다. 상기 Fc 위치에는 230, 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 273, 275, 299, 302, 313, 323, 325, 328과 332가 포함되는데, 여기서 Fc 부위에 대한 잔기의 위치 숫자는 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따른다. 본 발명은 최적화된 Fc 변이체를 생성하기 위한 상기 새로운 Fc 위치 모든 곳에 대한 모든 아미노산 변형 방식에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 명세서에 기재된 Fc 변이체를 제공하는 것이다. 일 예에서 상기 Fc 변이체는 이하의 군에서 선택되는 위치에 적어도 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는데, 여기서 잔기 위치를 나타내는 숫자는 Kabat과 같이 EU 인덱스에 따르며 다음과 같다: 221, 222, 223, 224, 225, 227, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 255, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 및 337. 일 예에서 상기 Fc 변이체는 이하의 군에서 선택되는 위치에 적어도 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는데, 여기서 잔기 위치를 나타내는 숫자는 Kabat과 같이 EU 인덱스에 따르며 다음과 같다: D221K, D221Y, K222E, K222Y, T223E, T223K, H224E, H224Y, T225E, T225K, T225W, P227E, P227G, P227K, P227Y, P228E, P228G, P228K, P228Y, P230A, P230E, P230G, P230Y, A231E, A231G, A231K, A231P, A231Y, P232E, P232G, P232K, P232Y, E233A, E233D, E233F, E233G, E233H, E233I, E233K, E233L, E233M, E233N, E233Q, E233R, E233S, E233T, E233V, E233W, E233Y, L234A, L234D, L234E, L234F, L234G, L234H, L234I, L234K, L234M, L234N, L234P, L234Q, L234R, L234S, L234T, L234V, L234W, L234Y, L235A, L235D, L235E, L235F, L235G, L235H, L235I, L235K, L235M, L235N, L235P, L235Q, L235R, L235S, L235T, L235V, L235W, L235Y, G236A, G236D, G236E, G236F, G236H, G236I, G236K, G236L, G236M, G236N, G236P, G236Q, G236R, G236S, G236T, G236V, G236W, G236Y, G237D, G237E, G237F, G237H, G237I, G237K, G237L, G237M, G237N, G237P, G237Q, G237R, G237S, G237T, G237V, G237W, G237Y, P238D, P238E, P238F, P238G, P238H, P238I, P238K, P238L, P238M, P238N, P238Q, P238R, P238S, P238T, P238V, P238W, P238Y, S239D, S239E, S239F, S239G, S239H, S239I, S239K, S239L, S239M, S239N, S239P, S239Q, S239R, S239T, S239V, S239W, S239Y, V240A, V240I, V240M, V240T, F241D, F241E, F241L, F241R, F241S, F241W, F241Y, F243E, F243H, F243L, F243Q, F243R, F243W, F243Y, P244H, P245A, K246D, K246E, K246H, K246Y, P247G, P247V, D249H, D249Q, D249Y, R255E, R255Y, E258H, E258S, E258Y, T260D, T260E, T260H, T260Y, V262A, V262E, V262F, V262I, V262T, V263A, V263I, V263M, V263T, V264A, V264D, V264E, V264F, V264G, V264H, V264I, V264K, V264L, V264M, V264N, V264P, V264Q, V264R, V264S, V264T, V264W, V264Y, D265F, D265G, D265H, D265I, D265K, D265L, D265M, D265N, D265P, D265Q, D265R, D265S, D265T, D265V, D265W, D265Y, V266A, V266I, V266M, V266T, S267D, S267E, S267F, S267H, S267I, S267K, S267L, S267M, S267N, S267P, S267Q, S267R, S267T, S267V, S267W, S267Y, H268D, H268E, H268F, H268G, H268I, H268K, H268L, H268M, H268P, H268Q, H268R, H268T, H268V, H268W, E269F, E269G, E269H, E269I, E269K, E269L, E269M, E269N, E269P, E269R, E269S, E269T, E269V, E269W, E269Y, D270F, D270G, D270H, D270I, D270L, D270M, D270P, D270Q, D270R, D270S, D270T, D270W, D270Y, P271A, P271D, P271E, P271F, P271G, P271H, P271I, P271K, P271L, P271M, P271N, P271Q, P271R, P271S, P271T, P271V, P271W, P271Y, E272D, E272F, E272G, E272H, E272I, E272K, E272L, E272M, E272P, E272R, E272S, E272T, E272V, E272W, E272Y, V273I, K274D, K274E, K274F, K274G, K274H, K274I, K274L, K274M, K274N, K274P, K274R, K274T, K274V, K274W, K274Y, F275L, F275W, N276D, N276E, N276F, N276G, N276H, N276I, N276L, N276M, N276P, N276R, N276S, N276T, N276V, N276W, N276Y, Y278D, Y278E, Y278G, Y278H, Y278I, Y278K, Y278L, Y278M, Y278N, Y278P, Y278Q, Y278R, Y278S, Y278T, Y278V, Y278W, D280G, D280K, D280L, D280P, D280W, G281D, G281E, G281K, G281N, G281P, G281Q, G281Y, V282E, V282G, V282K, V282P, V282Y, E283G, E283H, E283K, E283L, E283P, E283R, E283Y, V284D, V284E, V284L, V284N, V284Q, V284T, V284Y, H285D, H285E, H285K, H285Q, H285W, H285Y, N286E, N286G, N286P, N286Y, K288D, K288E, K288Y, K290D, K290H, K290L, K290N, K290W, P291D, P291E, P291G, P291H, P291I, P291Q, P291T, R292D, R292E, R292T, R292Y, E293F, E293G, E293H, E293I, E293L, E293M, E293N, E293P, E293R, E293S, E293T, E293V, E293W, E293Y, E294F, E294G, E294H, E294I, E294K, E294L, E294M, E294P, E294R, E294S, E294T, E294V, E294W, E294Y, Q295D, Q295E, Q295F, Q295G, Q295H, Q295I, Q295M, Q295N, Q295P, Q295R, Q295S, Q295T, Q295V, Q295W, Q295Y, Y296A, Y296D, Y296E, Y296G, Y296H, Y296I, Y296K, Y296L, Y296M, Y296N, Y296Q, Y296R, Y296S, Y296T, Y296V, N297D, N297E, N297F, N297G, N297H, N297I, N297K, N297L, N297M, N297P, N297Q, N297R, N297S, N297T, N297V, N297W, N297Y, S298D, S298E, S298F, S298H, S298I, S298K, S298M, S298N, S298Q, S298R, S298T, S298W, S298Y, T299A, T299D, T299E, T299F, T299G, T299H, T299I, T299K, T299L, T299M, T299N, T299P, T299Q, T299R, T299S, T299V, T299W, T299Y, Y300A, Y300D, Y300E, Y300G, Y300H, Y300K, Y300M, Y300N, Y300P, Y300Q, Y300R, Y300S, Y300T, Y300V, Y300W, R301D, R301E, R301H, R301Y, V302I, V303D, V303E, V303Y, S304D, S304H, S304L, S304N, S304T, V305E, V305T, V305Y, W313F, K317E, K317Q, E318H, E318L, E318Q, E318R, E318Y, K320D, K320F, K320G, K320H, K320I, K320L, K320N, K320P, K320S, K320T, K320V, K320W, K320Y, K322D, K322F, K322G, K322H, K322I, K322P, K322S, K322T, K322V, K322W, K322Y, V323I, S324D, S324F, S324G, S324H, S324I, S324L, S324M, S324P, S324R, S324T, S324V, S324W, S324Y, N325A, N325D, N325E, N325F, N325G, N325H, N325I, N325K, N325L, N325M, N325P, N325Q, N325R, N325S, N325T, N325V, N325W, N325Y, K326I, K326L, K326P, K326T, A327D, A327E, A327F, A327H, A327I, A327K, A327L, A327M, A327N, A327P, A327R, A327S, A327T, A327V, A327W, A327Y, L328A, L328D, L328E, L328F, L328G, L328H, L328I, L328K, L328M, L328N, L328P, L328Q, L328R, L328S, L328T, L328V, L328W, L328Y, P329D, P329E, P329F, P329G, P329H, P329I, P329K, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329R, P329S, P329T, P329V, P329W, P329Y, A330E, A330F, A330G, A330H, A330I, A330L, A330M, A330N, A330P, A330R, A330S, A330T, A330V, A330W, A330Y, P331D, P331F, P331H, P331I, P331L, P331M, P331Q, P331R, P331T, P331V, P331W, P331Y, I332A, I332D, I332E, I332F, I332H, I332K, I332L, I332M, I332N, I332P, I332Q, I332R, I332S, I332T, I332V, I332W, I332Y, E333F, E333H, E333I, E333L, E333M, E333P, E333T, E333Y, K334F, K334I, K334L, K334P, K334T, T335D, T335F, T335G, T335H, T335I, T335L, T335M, T335N, T335P, T335R, T335S, T335V, T335W, T335Y, I336E, I336K, I336Y, S337E, S337H, 및 S337N. 상기 변이체 세트는 경우에 따라서, "단일 변이체 세트"로서 참조된다.

본 발명의 다른 예에 따르면, 모체 폴리펩티드, 예컨대, Fc 부위 서열번호 X와 비교할 때, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 및 10개 또는 그 이상의 아미노산 치환을 가지는 Fc 변이체(및 상기 변이체를 포함하는 단백질)를 제공한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 1개, 2개, 3개, 및 4개의 치환이 특히 유용하다.

본 발명의 다른 예에 따르면, 모체 Fc 폴리펩티드, 예컨대, 서열번호 X의 Fc 부위와 비교할 때 변형된 Fc 리간드 결합을 나타내며, 인간 Fc 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 대해 엄격한 조건 하에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩되는 Fc 변이체(및 상기 변이체를 포함하는 단백질)를 제공한다. 엄격한 조건은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 미국특허 제6,875,846호에 기재된 내용을 참조할 수 있고, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 인간의 Fc 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자는 기술분야에 공지되어 있는, 일반적으로 이보다 큰 유전자의 단편이며, 또한 그 자체로는 자연에서 발견되지 않더라도 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여 자연에서 발견될 수 있는 유전자이다.

본 발명의 다른 면에 따르면, 변화된 ADCC 활성, 특히 증가된 ADCC 활성을 나타내는 변이체 Fc 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 다른 면에 따르면, 이들 변이체는 239번 위치에 아미노산 치환을 포함하고, 선택적으로 239번 및 332번 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 전술한 단일 치환 세트에 기재된 그 외 치환을 선택적으로 포함하여, 복수의 치환을 포함하는 변이체를 형성할 수 있다.

또한, 본 발명의 일면에 따르면, 이하의 군에서 선택되는 Fc 변이체를 제공하며, 여기서 Fc 부위의 잔기의 위치를 나타내는 숫자는 Kabat과 같이 EU 인덱스에 따른다: D221K, D221Y, K222E, K222Y, T223E, T223K, H224E, H224Y, T225E, T225K, T225W, P227E, P227G, P227K, P227Y, P228E, P228G, P228K, P228Y, P230A, P230A/E233D, P230A/E233D/I332E, P230E, P230G, P230Y, A231E, A231G, A231K, A231P, A231Y, P232E, P232G, P232K, P232Y, E233A, E233D, E233F, E233G, E233H, E233I, E233K, E233L, E233M, E233N, E233Q, E233R, E233S, E233T, E233V, E233W, E233Y, L234A, L234D, L234E, L234F, L234G, L234H, L234I, L234I/L235D, L234K, L234M, L234N, L234P, L234Q, L234R, L234S, L234T, L234V, L234W, L234Y, L235A, L235D, L235D/S239D/A330Y/I332E, L235D/S239D/N297D/I332E, L235E, L235F, L235G, L235H, L235I, L235K, L235M, L235N, L235P, L235Q, L235R, L235S, L235T, L235V, L235W, L235Y, G236A, G236D, G236E, G236F, G236H, G236I, G236K, G236L, G236M, G236N, G236P, G236Q, G236R, G236S, G236T, G236V, G236W, G236Y, G237D, G237E, G237F, G237H, G237I, G237K, G237L, G237M, G237N, G237P, G237Q, G237R, G237S, G237T, G237V, G237W, G237Y, P238D, P238E, P238F, P238G, P238H, P238I, P238K, P238L, P238M, P238N, P238Q, P238R, P238S, P238T, P238V, P238W, P238Y, S239D, S239D/A330L/I332E, S239D/A330Y/I332E/L234I, S239D/A330Y/I332E/V266I, S239D/D265F/N297D/I332E, S239D/D265H/N297D/I332E, S239D/D265I/N297D/I332E, S239D/D265L/N297D/I332E, S239D/D265T/N297D/I332E, S239D/D265Y/N297D/I332E, S239D/E272I/A330L/I332E, S239D/E272I/I332E, S239D/E272K/A330L/I332E, S239D/E272K/I332E, S239D/E272S/A330L/I332E, S239D/E272S/I332E, S239D/E272Y/A330L/I332E, S239D/E272Y/I332E, S239D/F241S/F243H/V262T/V264T/N297D/A330Y/I332E, S239D/H268D, S239D/H268E, S239D/I332D, S239D/I332E, S239D/I332E/A327D, S239D/I332E/A330I, S239D/I332E/A330Y, S239D/I332E/E272H, S239D/I332E/E272R, S239D/I332E/E283H, S239D/I332E/E283L, S239D/I332E/G236A, S239D/I332E/G236S, S239D/I332E/H268D, S239D/I332E/H268E, S239D/I332E/K246H, S239D/I332E/R255Y, S239D/I332E/S267E, S239D/I332E/V264I, S239D/I332E/V264I/A330L, S239D/I332E/V264I/S298A, S239D/I332E/V284D, S239D/I332E/V284E, S239D/I332E/V284E, S239D/I332N, S239D/I332Q, S239D/K274E/A330L/I332E, S239D/K274E/I332E, S239D/K326E/A330L/I332E, S239D/K326E/A330Y/I332E, S239D/K326E/I332E, S239D/K326T/A330Y/I332E, S239D/K326T/I332E, S239D/N297D/A330Y/I332E, S239D/N297D/I332E, S239D/N297D/K326E/I332E, S239D/S267E/A330L/I332E, S239D/S267E/I332E, S239D/S298A/K326E/I332E, S239D/S298A/K326T/I332E, S239D/V240I/A330Y/I332E, S239D/V264T/A330Y/I332E, S239D/Y278T/A330L/I332E, S239D/Y278T/I332E, S239E, S239E/D265G, S239E/D265N, S239E/D265Q, S239E/I332D, S239E/I332E, S239E/I332N, S239E/I332Q, S239E/N297D/I332E, S239E/V264I/A330Y/I332E, S239E/V264I/I332E, S239E/V264I/S298A/A330Y/I332E, S239F, S239G, S239H, S239I, S239K, S239L, S239M, S239N, S239N/I332D, S239N/I332E, S239N/I332E/A330L, S239N/I332E/A330Y, S239N/I332N, S239N/I332Q, S239P, S239Q, S239Q/I332D, S239Q/I332E, S239Q/I332N, S239Q/I332Q, S239Q/V264I/I332E, S239R, S239T, S239V, S239W, S239Y, V240A, V240I, V240I/V266I, V240M, V240T, F241D, F241E, F241E/F243Q/V262T/V264E/I332E, F241E/F243Q/V262T/V264E,F241E/F243R/V262E/V264R/I332E,F241E/F243R/V262E/V264R, F241E/F243Y/V262T/V264R/I332E, F241E/F243Y/V262T/V264R, F241L, F241L/F243L/V262I/V264I, F241L/V262I, F241R/F243Q/V262T/V264R/I332E, F241R/F243Q/V262T/V264R, F241W, F241W/F243W, F241W/F243W/V262A/V264A, F241Y, F241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D/I332E, F241Y/F243Y/V262T/V264T, F243E, F243L, F243L/V262I/V264W, F243L/V264I, F243W, P244H, P244H/P245A/P247V, P245A, K246D, K246E, K246H, K246Y, P247G, P247V, D249H, D249Q, D249Y, R255E, R255Y, E258H, E258S, E258Y, T260D, T260E, T260H, T260Y, V262E, V262F, V263A, V263I, V263M, V263T, V264A, V264D, V264E, V264E/N297D/I332E, V264F, V264G, V264H, V264I, V264I/A330L/I332E, V264I/A330Y/I332E, V264I/I332E, V264K, V264L, V264M, V264N, V264P, V264Q, V264R, V264S, V264T, V264W, V264Y, D265F, D265F/N297E/I332E, D265G, D265H, D265I, D265K, D265L, D265M, D265N, D265P, D265Q, D265R, D265S, D265T, D265V, D265W, D265Y, D265Y/N297D/I332E, D265Y/N297D/T299L/I332E, V266A, V266I, V266M, V266T, S267D, S267E, S267E, S267E/A327D, S267E/P331D, S267E/S324I, S267E/V282G, S267F, S267H, S267I, S267K, S267L, S267L/A327S, S267M, S267N, S267P, S267Q, S267Q/A327S, S267R, S267T, S267V, S267W, S267Y, H268D, H268E, H268F, H268G, H268I, H268K, H268L, H268M, H268P, H268Q, H268R, H268T, H268V, H268W, E269F, E269G, E269H, E269I, E269K, E269L, E269M, E269N, E269P, E269R, E269S, E269T, E269V, E269W, E269Y, D270F, D270G, D270H, D270I, D270L, D270M, D270P, D270Q, D270R, D270S, D270T, D270W, D270Y, P271A, P271D, P271E, P271F, P271G, P271H, P271I, P271K, P271L, P271M, P271N, P271Q, P271R, P271S, P271T, P271V, P271W, P271Y, E272D, E272F, E272G, E272H, E272I, E272K, E272L, E272M, E272P, E272R, E272S, E272T, E272V, E272W, E272Y, V273I, K274D, K274E, K274F, K274G, K274H, K274I, K274L, K274M, K274N, K274P, K274R, K274T, K274V, K274W, K274Y, F275L, F275W, N276D, N276E, N276F, N276G, N276H, N276I, N276L, N276M, N276P, N276R, N276S, N276T, N276V, N276W, 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K317E, K317Q, E318H, E318L, E318Q, E318R, E318Y, K320D, K320F, K320G, K320H, K320I, K320L, K320N, K320P, K320S, K320T, K320V, K320W, K320Y, K322D, K322F, K322G, K322H, K322I, K322P, K322S, K322T, K322V, K322W, K322Y, V323I, S324D, S324F, S324G, S324H, S324I, S324I/A327D, S324L, S324M, S324P, S324R, S324T, S324V, S324W, S324Y, N325A, N325D, N325E, N325F, N325G, N325H, N325I, N325K, N325L, N325M, N325P, N325Q, N325R, N325S, N325T, N325V, N325W, N325Y, K326I, K326L, K326P, K326T, A327D, A327E, A327F, A327H, A327I, A327K, A327L, A327M, A327N, A327P, A327R, A327S, A327T, A327V, A327W, A327Y, L328A, L328D, L328D/I332E, L328E, L328E/I332E, L328F, L328G, L328H, L328H/I332E, L328I, L328I/I332E, L328I/I332E, L328K, L328M, L328M/I332E, L328N, L328N/I332E, L328P, L328Q, L328Q/I332E, L328Q/I332E, L328R, L328S, L328T, L328T/I332E, L328V, L328V/I332E, L328W, L328Y, P329D, P329E, P329F, P329G, P329H, P329I, P329K, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329R, P329S, P329T, P329V, P329W, P329Y, A330E, A330F, 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본 발명의 또다른 목적은 적어도 한 개 이상의 FcγR에 더 큰 친화성을 가지고 결합하는 Fc 변이체를 제공하는 것이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 Fc 변이체는 FcγR에 대하여 모체 Fc 폴리펩티드보다 1배보다 큰 친화성을 가진다. 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 Fc 변이체는 Fc 폴리펩티드 모체보다 FcγR에 대하여 5배보다 큰 친화성을 가진다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 Fc 변이체는 FcγR에 대하여 Fc 폴리펩티드 모체보다 그 친화성이 5배와 300배 사이 정도로 더 크다.

본 발명의 다른 목적은 FcγRIIIa:FcγRIIb 비율이 1:1 이상인 Fc 변이체를 제공하는 것이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 Fc 변이체는 FcγRIIIa:FcγRIIb 비율이 11:1 이상이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 Fc 변이체는 FcγRIIIa:FcγRIIb 비율이 11:1과 86:1 사이에 있다.

본 발명의 또다른 목적은 작용자의 존재하에 작용자 기능을 더 잘 매개하는 Fc 변이체를 제공하는 것이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 Fc 변이체는 Fc 폴리펩티드 모체가 매개하는 것보다 더욱 큰 ADCC 반응을 매개한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 Fc 변이체는 Fc 폴리펩티드가 매개하는 것보다 5배 이상 강한 ADCC 반응을 매개한다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 상기 Fc 변이체가 매개하는 ADCC 반응은 Fc 폴리펩티드 모체가 매개하는 것보다 5배에서 1000배 사이 정도로 더 크다.

본 발명의 또다른 목적은 하나 이상의 FcγR에 보다 약한 친화성으로 결합하는 Fc 변이체를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 작용자의 존재하에 ADCC를 덜 효율적으로 매개하는 Fc 변이체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 당화되지 않은 Fc 폴리펩티드 모체와 비교하였을 때, 그 기능 및/또는 용액 특성이 향상된 Fc 변이체를 제공하는 것이다. 본 명세서에서, 향상된 기능이란, Fc 리간드에 대한 결합력이 강화되는 것을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 또한, 향상된 용액 특성이란, 안정성과 가용성을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 Fc 변이체는 FcγR에 대해서 당화된 Fc 폴리펩티드 모체가 가지는 친화성의 약 0.5배 한도 내에서 결합한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 당화되지 않은 Fc 변이체는 당화된 Fc 폴리펩티드 모체와 비교하였을 때, FcγR에 대해서 비슷하거나 향상된 결합력을 가진다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 Fc 변이체는 당화된 Fc 폴리펩티드 모체보다 큰 친화성을 가지는 FcγR에 결합한다.

또한, 본 발명은 Fc 변이체를 최적화하는 단백질 공학적 가공 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 목적은, 최적화된 Fc 변이체를 얻기 위한 생산과 선별의 실험적인 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 본 명세서에서 기술하는 Fc 변이체를 코딩하는 분리된 핵산을 제공한다. 본 발명은 상기 핵산을 갖춘 벡터를 제공하며, 이 경우 선택적으로는 제어 서열에 연결되어 작동하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 이 벡터를 포함하는 숙주세포와 이 Fc 변이체를 제조하는 방법을 제공하고, 선택적으로는 이 변이체를 회수하는 방법을 제공한다.

본 발명은 본 발명에 따른 Fc 변이체를 가지는 Fc 폴리펩티드, 및 생리적 또는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 본 발명에 따른 Fc 변이체를 가지는 Fc 폴리펩티드의 치료용 및 진단용 용도를 갖춘 신규한 항체와 Fc 융합 단백질을 제공한다. 상기 신규한 항체와 Fc 융합 단백질은 치료제로서 사용될 수도 있다.

본 발명은 본 발명의 Fc 변이체를 포함하는 Fc 폴리펩티드를 치료용 및 진단용으로서 이용할 수 있다.

발명의 상세한 설명

발명을 좀 더 상세하게 기술하게 위하여 몇 가지 용어의 정의에 대해 설명하면 다음과 같다. 이같은 정의에는 그와 문법적으로 동등한 내용도 포함되는 것으로 한다.

“ADCC” 또는 “항체 의존적 세포매개 세포독성”은 본 명세서에서 FcγR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포는 표적세포에 결합된 항체를 인식하고, 이후 표적 세포에 세포 용해를 초래하는 세포 매개 반응을 뜻한다.

“ADCP” 또는 “항체 의존적 세포 매개 식세포작용”은 본 명세서에서 FcγR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적세포에 결합한 항체를 인식하고 그에 따라 그 표적 세포에 대한 식세포작용을 야기하는 세포 매개 반응을 뜻한다.

"아미노산 변형”은 본 명세서에서 폴리펩티드 서열상의 아미노산 치환, 삽입, 삭제를 뜻한다. 본 명세서에서 바람직한 아미노산 변형은 치환이다. “아미노산 치환” 또는 “치환”이라고 함은 본 명세서에서 모체 폴리펩티드 서열의 어떤 위치에 있는 아미노산을 다른 아미노산으로 바꾸는 것이다. 예를 들어 I332E 치환은 변형 폴리펩티드를 가리키는데, 이 경우는 Fc의 한 변이체이며, 332 위치의 아이소류신이 글루탐산으로 바뀐 것이다. 다른 예에 따르면, 천연형에 대한 정의는 필요치 않다. 예컨대, 332E 치환이란, 332번 위치의 변형 폴리펩티드가 글루탐산으로 변이된 것을 나타낸다.

“항체”는 본 명세서에서 실질적으로 알려진 면역 글로불린 유전자 전체 또는 일부에 의하여 코딩되는 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어진 단백질을 의미한다. 알려진 면역 글로불린 유전자에는, 예를 들어 인간의 경우, κ, λ와 중쇄 유전자좌(locus)가 포함되는데, 이들이 모여 수많은 가변부위 유전자를 구성하며, 또한 불변부위 유전자 μ, δ, γ, σ, α가 포함되는데, 이들은 각각 IgM, IgD, IgG, IgE와 IgA 아이소형을 코딩한다. 본 명세서에서 항체란 전장 길이의 항체와 항체 단편을 모두 포함하는 것을 의미하며, 어떤 생명체에서 비롯한 자연 항체, 가공된 항체 또는 실험이나 치료 용도 혹은 아래에서 정의할 다른 용도로 재조합 생성한 항체를 가리킬 수 있다. “항체”라는 용어는 선행기술에 알려진 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv 등의 항체 단편이나 다른 항원에 결합하는 항체의 부분 서열을 포함하는데, 이 부분 서열은 완전한 항체를 변형하거나 재조합 DNA 기술을 이용하여 새로 합성하여 만들어진다. 특히 바람직한 것은 여기서 기술하는 Fc 변이체를 갖춘 전장 항체이다. “항체”라는 용어에는 단일 클론과 다클론 항체가 포함된다. 항체는 길항제(antagonist)로도 작동제(agonist)로도 작용할 수 있으며, 억제성, 중화성이거나 촉진성일 수도 있다. 본 발명의 항체는 인간 항체가 아니거나, 키메라이거나 인간화된 것이거나 또는 완전한 인간 항체일 수도 있으며, 이에 대해서는 이하에 보다 상세하게 설명되어 있다.

“항체”의 정의에 분명하게 포함되는 것이 비당화 항체이다. “ 비당화 항체”란 본 명세서에서 그 Fc 부위의 297 위치에 부착된 탄수화물이 없는 항체를 뜻하는데, 위치의 번호는 Kabat와 같이 EU 인덱스에 따른다. 이 비당화 항체는 탈당화 항체, 즉 Fc 탄수화물이 제거, 예를 들어 화학저리나 효소학절으로 제거된 항체일 수 있다. 한편 이 비당화 항체는 Fc 탄수화물 없이 발현된 당화가 일어나지 않은 항체, 예를 들어 당화 방식을 코딩하는 잔기 하나 혹은 여러 개가 돌연변이되거나, 단백질에 탄수화물을 접합시키지 않는 생물, 예를 들어 세균에서 발현된 항체일 수 있다.

“항체”의 정의에 분명하게 포함되는 것이 Fc 변이체 부분을 가지고 있는 전장 항체이다. “전장 항체”란 본 명세서에서 가변부위와 불변부위를 포함하는 항체의 그 자연스런 생물학적 형태를 이루는 구조를 의미한다. 예를 들어 인간과 쥐를 포함하는 대부분의 포유동물에서 IgG 종류의 전장 항체는 4량체로서 두 개의 면역 글로불린 쇄이 이루는 쌍이 동일하게 두 개 있는 분자인데, 여기서 각 쌍에는 하나의 경쇄와 하나의 중쇄이 존재하고, 각 경쇄은 면역 글로불린 V_L과 C_L 도메인을, 각 중쇄은 면역 글로불린 V_H, Cγ1(C_H1), Cγ2(C_H2), 및 Cγ3(C_H3) 도메인을 갖추고 있다. 몇몇 포유동물, 예를 들어 낙타와 라마(llama)에서는 IgG 항체가 오로지 두 중쇄만으로 이루어지는데, 각 중쇄는 Fc 부위에 연결된 가변부위를 갖추고 있다. 본 명세서에서 “IgG”라고 함은 IgG 항체 종류에 속하는 폴리펩티드로서 알려진 면역 글로불린 감마 유전자에 의하여 실질적으로 코딩되는 것을 말한다. 이 항체 종류는 인간에서 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함한다. 마우스에서는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3를 포함한다.

“아미노산” 및 "아미노산 성동성"은 본 명세서에서 자연적으로 존재하는 20개의 아미노산과 어느 특정, 정의된 위치에 존재할 수 있는 모든 비자연적 유사 물질을 의미한다. “단백질”이란 본 명세서에서 적어도 두 개의 아미노산이 공유결합으로 연결된 것을 말하며, 여기에는 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드와 펩티드가 포함된다. 이 단백질들은 자연적으로 존재하는 아미노산과 펩티드 결합으로 이루어질 수도 있고, 합성한 펩티드유사 구조(peptidomimetic structure), 즉 펩토이드(peptoid; Simon 외, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89(20):9367)등의 유사체로 이루어질 수도 있는데, 특히 LC 펩티드를 환자에게 투여하는 경우 그러하다. 따라서 본 명세서에서 사용하는 “아미노산” 또는 “펩티드 잔기”란 자연적으로 존재하는 아미노산과 합성된 것 모두를 말한다. 예를 들어 호모페닐알라닌, 시트룰린, 노르류신은 본 발명에 관해서는 아미노산으로 간주한다. “아미노산”은 또한 프롤린과 수산화프롤린과 같은 이미노산 잔기도 포함한다. 아미노산 측쇄는 (R) 또는 (S) 배열 중의 어느 하나일 수 있다. 바람직한 예에서 아미노산은 (S) 또는 L-배열을 이룬다. 만약 비자연적으로 존재하는 측쇄를 사용한 경우, 비아미노산 치환을 사용할 수도 있는데, 이는 예를 들어 생체 내 파괴를 막거나 지연시키기 위함이다.

“작용자 기능( effector function )”은 본 명세서에서 항체 Fc 부위가 Fc 리셉터나 리간드와 상호작용하여 일어나는 생화학적 사건(event)을 의미한다. 작용자 기능은 ADCC, ADCP와 CDC를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. “작용자 세포( effector cell )”란 본 명세서에서 면역계의 세포로서 Fc 리셉터를 한 개 또는 여러 개 가지며, 하나 혹은 여러 가지의 작용자 기능을 매개하는 것을 말한다. 작용 세포는 단핵세포, 대식세포, 중성구, 가지 세포, 호산구(eosinophil), 비만 세포(mast cell), 혈소판, B 세포, 대형 과립상 림프구(large granular lymphocyte), 랑게르한스 세포, 자연 세포독성 세포와 γγ T 세포를 포함하지만 이에 국한되지는 않으며, 인간, 마우스, 랫, 토끼와 원숭이 등의 생물에서 유래할 수 있지만 이에 국한되지는 않는다. “라이브러리”란 본 명세서에서 모든 형태의 Fc 변이체의 집합을 의미하며, 이에는 핵산 또는 아미노산 서열의 목록, 다양한 위치에 일어난 핵산 또는 아미노산 치환의 목록, 라이브러리 서열을 코딩하는 핵산을 구비한 물리적 라이브러리, 정제 또는 비정제 Fc 변이체 단백질을 갖춘 물리적 라이브러리가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.

“Fc”, 또는 “Fc 부위” 등은 본 명세서에서 정의한 항체로서 항체의 불변부위 중 첫째 면역 글로불린 도메인을 제외한 불변부위를 갖춘 폴리펩티드를 포함하는 것을 의미한다. 따라서 Fc는 IgA, IgD, IgG의 불변부위 마지막 두 면역 글로불린 도메인과 IgE, IgM의 마지막 세 면역 글로불린 도메인, 그리고 이들 도메인에 대하여 N-말단 방향인 유연한 경첩부를 지칭한다. IgA와 IgM에서는 Fc가 J 쇄를 포함할 수도 있다. IgG에서는 도 1에서 나타낸 대로, Fc가 면역 글로불린 도메인 Cγ2와 Cγ3, 그리고 Cγ1과 Cγ2를 이어주는 경첩부를 갖추고 있다. 비록 Fc 부위의 경계가 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 부위는 대체로 C226 또는 P230 잔기부터 그 C-말단 잔기까지로 구성된다고 정의하며, 여기서 잔기 번호는 Kabat와 같이 EU 인덱스에 따른다. Fc라고 하면 이 부위가 분리된 상태이거나, 하기 Fc 폴리펩티드에서의 부위를 가리킨다. 여기서, “Fc 폴리펩티드”란, Fc 부위의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. Fc 폴리펩티드로서는 항체, Fc 융합체, 분리된 Fc, 및 Fc 단편이 포함된다.

“Fc 융합체”란 본 명세서에서 하나 이상의 폴리펩티드 또는 소형 분자가 한 Fc 부위 또는 그 유도체에 작동할 수 있게 연결된 것을 의미한다. Fc 융합체는 본 명세서에서 선행기술상의 용어“면역 부착소(immunoadhesin)”, “Ig 융합체”, “Ig 키메라”, “리셉터 글로불린”(Chamow 외, 1996, Trends Biotechnol 14:52~60; Ashkenazi 외, 1997, Curr Opin Immunol 9:195~200, 전술한 문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)과 같은 의미이다. Fc 융합체는 면역 글로불린 Fc 부위와 융합 파트너를 결합한 것인데, 융합 파트너는 일반적으로 모든 단백질과 소형 분자가 될 수 있다. Fc 융합체의 비Fc 부분, 즉 융합 파트너의 역할은 표적에 대한 결합을 매개하는 것이며, 따라서 항체 가변부위의 역할과 유사하다.

“Fc 감마 리셉터” 또는 “Fc γR"는 본 명세서에서 IgG 항체 Fc 부위에 결합하고 실질적으로 FcγR 유전자에 의하여 코딩되는 단백질군의 모든 구성원을 의미한다. 인간에 있어서 이 단백질군에는 아이소형 FcγRIa, FcγRIb, FcγRIc를 가지는 FcγRI(CD64), 아이소형 FcγRIIa(동종이형 H131과 R131 포함), FcγRIIb(FcγRIIb-1과 FcγRIIb-2 포함), FcγRIIc를 가지는 FcγRII(CD32), 그리고 아이소형 FcγRIIIa(동종이형 V158과 F158 포함), FcγRIIIb(동종이형 FcγRIIIb-NA1과 FcγRIIIb-NA2 포함)를 가지는 FcγRIII(CD16) 뿐만 아니라 모든 미발견 인간 Fcγ또는 FcγR 아이소형이나 동종이형도 포함되지만, 전술한 것으로 제한되지는 않는다. Fcγ어떤 생물로부터도 유래할 수 있으며, 이에는 인간, 마우스, 랫, 토끼, 원숭이가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 마우스 FcγR는 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16), FcγRIII-2(CD16-2)뿐만 아니라 모든 미발견 마우스 FcγR과 FcγR 아이소형 또는 동종이형을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.

“Fc 리간드” 또는 “작동 리간드 ( effector ligand )” 란 본 명세서에서 항체 Fc 부위에 결합하여 Fc/Fc 리간드 복합체를 이룰 수 있으며 어떠한 생물로부터도 유래할 수 있는 분자를 가리키는데, 바람직하게는 폴리펩티드이다. Fc에 Fc 리간드가 결합됨으로써 보다 큰 작동 효과를 얻을 수 있다. Fc 리간드는 Fc 리셉터, FcγR, FcγαR, FcεγR, FcRn, C1q, C3, 만난(mannan) 결합 렉틴, 만노스 리셉터, 포도상구균(staphylococcal) 단백질 A, 포도상구균 단백질 G, 바이러스성 FcγR을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. Fc 리간드는 또한 Fc 리셉터 동족물(homolog, FcRH)를 포함하는데, 이들은 FcγR에 상동성이 있는 Fc 리셉터 군이다(Davis 외, 2002, Immunological Reviews 190:123~136, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). Fc 리간드는 Fc에 결합하는 미발견 분자를 포함할 수 있다.

“IgG”는 본 명세서에서 알려진 면역 글로불린 감마 유전자에 의하여 실질적으로 코딩되는 항체 종류(class)에 속하는 폴리펩티드를 뜻한다. 인간에 있어서 이 항체 종류에는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4가 속한다. 마우스에서 이 항체 종류에는 IgG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3가 속한다. “면역 글로불린( Ig )"은 본 명세서에서 면역 글로불린 유전자에 의하여 실질적으로 코딩되는 폴리펩티드 하나 또는 여러 개로 구성된 단백질을 뜻한다. 면역 글로불린은 항체를 포함하는데 항체에 국한되지는 않는다. 면역 글로불린은 여러 구조적 형태를 가질 수 있는데, 전장 항체, 항체 단편, 개별 면역 글로불린 도메인이 이에 속하지만, 이것들에 국한되지는 않는다. “면역 글로불린( Ig ) 도메인”이란, 본 명세서에서 면역 글로불린 부위로서 단백질 구조 분야의 당업자가 독립한 구조적 단위로서 존재한다고 확인한 것을 말한다. Ig 도메인은 전형적으로 β-샌드위치 접힘 모양(folding topology)을 띠고 있다. 알려진 항체 IgG 종류에 속하는 Ig 도메인들은 V_H, Cγ1, Cγ2, Cγ3, V_L과 C_L이다.

"모체 폴리펩티드” 또는 “전구체 폴리펩티드”(Fc 모체 또는 전구체를 포함함)란, 본 명세서에서 변이체를 생성하도록 변형될 폴리펩티드를 말한다. 상기 모체 폴리펩티드는 자연적으로 존재하는 폴리펩티드거나 자연적으로 존재하는 폴리펩티드의 변이체거나 가공한 형태일 수 있다. 모체 폴리펩티드는 폴리펩티드 그 자체, 그를 갖춘 조성물 또는 그를 코딩하는 아미노산 서열을 가리킬 수 있다. 그에 따라 본 명세서에서 “모체 Fc 폴리펩티드”는 변형되지 않은 Fc 폴리펩티드로서 변이체를 생성하도록 변형될 것을 뜻하며, “모체 항체”란 변형되지 않은 항체로서 변이 항체를 생성하도록 변형될 것을 뜻한다.

앞에서 설명한 것과 같이 Fc 분자의 어떤 위치는 변형될 수 있다. “위치”란 본 명세서에서 단백질 서열에서 한 장소를 뜻한다. 위치는 순서대로 번호를 매길 수도 있고, 또는 확립된 틀에 따라서, 예를 들어 Kabat과 같이 EU 인덱스에 따라서 번호를 매길 수도 있다. 예를 들어 위치 297은 인간 항체 IgG1의 한 위치이다. 앞에서 설명한 대로 서로 대응하는 위치는 일반적으로 다른 모체 서열과 정렬하여 결정한다.

“잔기”란 본 명세서에서 단백질의 한 위치로서 아미노산과 결부된 것을 말한다. 예를 들어 아스파라긴 297(또는 Asn297, N297이라고도 지칭한다)은 인간 항체 IgG1의 한 잔기이다.

“표적 항원”이란, 본 명세서에서 어느 지정한 항체 가변부위에 특이적으로 결합하는 분자를 뜻한다. 표적 항원은 단백질, 탄수화물, 지질 또는 다른 화합물일 수 있다.

“표적 세포”란, 본 명세서에서 표적 항원을 발현하는 세포를 뜻한다.

“가변부위”란, 본 명세서에서 면역 글로불린의 한 부위로서 각각 κ, λ, 중쇄 면역 글로불린 유전자좌(genetic locus)를 이루는 유전자 V_κ, V_λ, 및/또는 V_H에 의하여 실질적으로 코딩되는 Ig 도메인을 하나나 여럿을 갖추고 있는 것을 뜻한다.

“폴리펩티드 변이체”란, 본 명세서에서 적어도 하나의 아미노산 변형 때문에 모체 폴리펩티드와 달라진 폴리펩티드 서열을 뜻한다. 모체 폴리펩티드는 자연적으로 발생한 것, 또는 천연형 폴리펩티드일 수 있고, 또는 천연형 폴리펩티드의 변이형일 수 있다. 폴리펩티드 변이체는 그 폴리펩티드 자체, 그 폴리펩티드를 갖춘 조성물 또는 그를 코딩하는 아미노산 서열을 가리킬 수 있다. 바람직하게는 폴리펩티드 변이체에는 모체 폴리펩티드와 비교하였을 때 적어도 한 아미노산 변형, 예를 들어, 1개에서 10개 정도의 아미노산 변형을 가지고 있으며, 바람직하게는 모체와 비교하여 1개에서 5개 정도의 아미노산 변형을 가진다. 본 명세서의 폴리펩티드 변이체 서열은 그 모체 폴리펩티드 서열과 적어도 약 80% 상동성을 지니는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 적어도 약 90% 상동성을, 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 상동성을 지닌다. 그에 따라 본 명세서에서 “ Fc 변이체 ”라고 하면, 모체 Fc 서열에서 적어도 한 아미노산 변형 때문에 달라진 Fc 서열을 뜻한다. Fc 변이체는 Fc 부위만으로 이루어지거나 항체, Fc 융합체, Fc 단편, Fc에 의해 실질적으로 코팅된 그 밖의 폴리펩티드로 존재할 수도 있다. Fc 변이체는 Fc 폴리펩티드 그 자체, Fc 변이체를 갖춘 조성물, 그를 코딩하는 아미노산 서열을 가리킬 수도 있다.

본 발명의 Fc 변이체는 상기 Fc 변이체를 포함하는 아미노산 변형체에 따라 정의된다. 따라서, 예를 들면, I332E는 모체 Fc 폴리펩티드에 대해 I332E 치환을 가지는 Fc 변이체이다. 마찬가지로, S239D/A330L/I332E(역시, 239D/330L/332E라고 칭함)는 모체 Fc 폴리펩티드에 대해 S239D, A330L, 및 I332E(239D, 330L, 및 332E) 치환을 가지는 Fc 변이체이다. 치환이 제공되는 순서는 임의에 따르며, 다시 말하면, S239D/A330L/I332E는 S239D/I332E/A330L 등의 Fc 변이체와 동일하다. 본 발명에서 논의하는 모든 위치의 번호는 EU 인덱스 또는 EU 넘버링 스킴에 따라서 부여된다(Kabat 외, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). EU 인덱스 또는 Kabat 등의 문헌에 기재된 바와 같은 EU 인덱스는 EU 항체의 위치 번호를 일컫는다(Edelman 외, 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).

본 발명은 여러 측면에서 유용한 최적화된 Fc 변이체에 관한 것이다. 전술한 바와 같이, 종래의 항체 치료제에서는 여러 가지 문제점이 나타난다. 본 발명에 따르면, ADCC, ADCP, 및 CDC와 같은 세포독성 작용 기능을 매개하는 능력을 향상시킴으로써 항체의 항종양 효능을 향상시키는 우수한 수단을 제공한다. 본 발명은 소정의 FcγR에 대한 결합이 최적화된 Fc 부위를 가지는 항체는 작용자 기능을 보다 바람직하게 매개할 수 있기 때문에, 환자의 암 세포를 보다 효과적으로 파괴할 수 있다. 활성 리셉터와 억제 리셉터 간의 균형을 이루는 것이 관건이며, 최적의 작용자 기능은 활성 리셉터, 예컨대, FcγRI, FcγRIIa/c, 및 FcγRIIIa에 대해서는 향상된 친화성을 가지되, 억제 리셉터 F는 FcγRIIb에 대해서는 감소된 활성을 가지는 Fc로부터 제공될 수 있다. 아울러, FcγR은 항원 흡수, 및 항원 존재 세포에 의한 처리를 매개할 수 있기 때문에, Fc/FcγR 친화성이 향상됨으로써, 항체 치료제가 후천성 면역 반응을 도출하는 능력을 개선시킬 수 있다. 예를 들면, S298A, E333A, 및 K334A를 포함하는, 본 명세서에 기재된 몇 가지 돌연변이체는 활성 리셉터 FcγRIIIa에 대한 향상된 결합력, 및 억제 리셉터 FcγRIIb에 대한 감소된 결합력을 나타낸다. 이러한 돌연변이체가 결합하여, 결합력이 한층 더 향상된 이중 및 삼중 돌연변이체를 얻을 수도 있다. 이러한 돌연변이체로서는 S298A/E333A/K334A 삼중 돌연변이체가 있으며, 상기 삼중 돌연변이체는 F158 FcγRIIIa에 대하여 약 1.7배 늘어난 결합력을, FcγRIIb에 대하여 5배 줄어든 결합력을, 그리고 2.1배 늘어난 ADCC 효능을 나타낸다.

비록 더 나은 작용자 기능에 대한 필요성이 있지만, 몇몇 항체 치료법에서는 작용자 기능의 감축이나 제거가 바람직할 수 있다. 이는 치료용 항체의 메카니즘이 표적 항체를 지니는 세포를 차단하거나 길항(antagonism)하지만 살상하지는 않는 경우일 때 종종 그러하다. 이러한 경우에 표적 세포를 사멸시키는 것은 바람직하지 않으며 부작용으로 볼 수 있다. 예를 들어, 항-CD4 항체는 T세포에 대해 CD4 리셉터를 차단하는 능력 덕택에 효과적인 소염제가 되지만, 항-CD4 항체가 FcγR 리셉터를 끌어들이므로 표적 세포에 대한 면역 공격을 지시하게 되어 T 세포가 고갈되는 결과를 낳는다(Reddy 외, 2000, J Immunol 164:1925~1933, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 작용자 기능은 방사표지된 항체와 독소 단백질에 접합한 항체에 있어서도 문제가 될 수 있는데, 이하, 전자는 방사성 접합물, 후자는 면역독소로 지칭하기로 한다. 이들 약물로 암세포를 살상할 수 있지만, Fc와 FcγR의 상호작용을 통하여 면역세포를 끌어들이게 되면 건강한 면역 세포를 위험한 약제(방사능이나 독소) 옆에 놓게 되므로 정상 림프 조직도 표적 암세포와 함께 살상되는 결과를 낳을 수 있다(Hutchinset 외, 1995, Proc Natl Acad Sci USA 92:11980~11984; White 외, 2001, Annu Rev Med 52:125~142, 전술한 문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 이 문제는 보체 또는 작용자를 끌어들이는 능력이 부족한 IgG 아이소면역형, 예를 들어 IgG2와 IgG4를 사용하면 잠재적으로 해결할 수 있다. 다른 해결책은 결합력이 감소되었거나 없어진 Fc 변이체를 개발하는 것이다(Alegre 외, 1994, Transplantation 57:1537~1543; Hutchins 외, 1995, Proc Natl Acad Sci USA · 92: 11980~11984; Armouret 외, 1999, Eur J Immunol 29: 2613~2624; Reddyet 외, 2000, J Immunol 164 :1925~1933; Xu 외, 2000, Cell Immunol 200:16~26; Shields 외, 2001, J Biol Chem 276:6591~6604) (미국특허 6,194,551호, 5,885,573호 PCT출원 WO 99/58572호). 작용자 기능을 없애거나 줄이는 데에 있어서 핵심적으로 고려할 사항은 항체의 다른 중요한 특성이 변질되지 않도록 하는 것이다. Fc 변이체에 단백질 공학적 가공을 함에 있어서는 FcγR 및/또는 C1q에 대한 결합력을 상실할 뿐 아니라 항체의 안정성, 용해도, 구조적 일체성과 FcRn, 단백질 A, 단백질 G 등의 다른 중요 Fc 리간드와 상호작용하는 능력을 유지하도록 하여야 한다.

아울러, 본 발명에 따르면, Fc/FcγR 친화성 및 작용자 기능을 향상시킬 수 있는, 단백질 공학적으로 가공된 당결합형을 이용한다. 바람직한 용액 특성, 및 작용자 기능을 매개하는 능력을 가지는 비당화 Fc를 이용하여, 전술한 제조 방법을 변형시킬 수 있다. 비당화 Fc의 구조적 및 기능적 결점을 극복함으로써, 면역원성이 감소할 우려가 있으며, 암과 같은 세포독성이 바람직하게 적용되는 임상용 작용자 기능을 가지는 박테리아, 및 유전자 변형 식물 및 동물로부터 항체를 생산할 수 있다. 본 발명에 따르면, 안정하고 가용성을 가지는 Fc 변이체을 개발하기 위해 단백질 공학적 방법을 이용할 수 있다. 현재, 전술한 바와 같은 Fc 변이체는 종래 기술에 존재하지 않는다.

본 발명의 Fc 변이체

본 발명의 Fc 변이체는 각종 Fc 폴리펩티드에 이용할 수 있다. 이하, 본 발명의 Fc 변이체를 포함하는 Fc 폴리펩티드를 "본 발명의 Fc 폴리펩티드"라 칭한다. 본 발명의 Fc 폴리펩티드는 대형 폴리펩티드, 예컨대, 항체 또는 Fc 융합체로 볼 때, 본 발명의 Fc 변이체를 포함한다. 즉, 본 발명의 Fc 폴리펩티드는 본 발명의 Fc 변이체를 포함하는 항체 또는 Fc 융합체를 포함한다. 본 명세서에서 "본 발명의 항체"란, 본 발명의 Fc 변이체를 포함하는 항체를 의미한다. "본 발명의 Fc 융합체"란, 본 발명의 Fc 변이체를 포함하는 Fc 융합체를 의미한다. 아울러, 본 발명의 Fc 폴리펩티드는 Fc 부위 이외에, 즉, 분리된 Fc라고 칭하는 부위에 추가적인 폴리펩티드를 거의 또는 전혀 포함하지 않는 폴리펩티드를 포함한다. "본 발명의 분리된 Fc"란, 본 발명의 Fc 변이체를 포함하며, Fc 부위 외에는 추가적인 폴리펩티드 서열을 거의 또는 전혀 포함하지 않는 Fc 폴리펩티드를 일컫는다. 본 발명의 Fc 폴리펩티드는 Fc 부위의 단편을 더 포함한다. "본 발명의 Fc 단편"이란, 본 발명의 Fc 변이체를 포함하는 Fc 단편을 의미한다. 이하에 기재하는 바와 같이, 본 발명의 Fc 폴리펩티드는 바람직한 기능적 특성을 제공하기 위해, 하나 이상의 융합 파트너 또는 콘쥬게이트 파트너에 융합되어 있을 수 있다.

Fc 변이체는 그 의미와 무관하게 모체 Fc 폴리펩티드 내에 형성될 수 있다. 즉, 모체 Fc 폴리펩티드를 결정하는 유일한 기준은 Fc 부위를 포함 여부이다. 본 명세서에서 모체 Fc 폴리펩티드는 광범위한 소스에서 유래될 수 있으며, 인간, 설치류(마우스 및 랫을 포함하나, 전술한 것으로 제한되지는 않음), 래빗 및 헤어(hare)와 같은 토끼목(lagomorpha), 낙타, 라마, 및 단봉 낙타(dromedary)와 같은 낙타과, 및 예컨대, 원원류(Prosimians), 광비원류(Platyrrhini)(신세계 원숭이), 유미원과(Cercopithecoidea)(구세계 원숭이), 및 인상과(Hominoidea)를 들 수 있으나, 전술한 것으로 제한되지 않는, 인간을 제외한 영장류, 예컨대, 긴팔원숭이(Gibbons), 레서(Lesser), 및 그레이트 에이프(Great Apes)를 포함하나, 전술한 것으로 제한되지 않는 임의의 유기체, 가장 바람직하게는 인간 유래의 하나 이상의 Fc 유전자에 의하여 실질적으로 코딩될 수 있다. 본 발명의 모체 Fc 폴리펩티드는, 인간 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4를 포함하는 IgG 클래스, IgA (서브클래스 IgA1 및 IgA2 포함), IgD, IgE, IgG, 또는 IgM 클래스의 항체에 속하는 서열을 포함하나 전술한 것으로 제한되지 않는, 임의의 항체 클래스의 면역글로불린 유전자에 의하여 실질적으로 코딩될 수 있다. 가장 바람직하기로는, 본 발명의 모체 Fc 폴리펩티드는 인간 IgG 클래스 항체에 속하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 상기 모체 Fc 폴리펩티드는 모체 항체, 예컨대, 인간 IgG1 항체, 인간 IgA 항체, 또는 마우스 IgG2a 또는 IgG2b 항체일 수 있다. 상기 모체 항체는 이하에 보다 상세하게 설명한 바와 같이, 인간 항체가 아니거나, 키메라이거나 인간화된 것이거나 또는 완전한 인간 항체일 수도 있다. 상기 모체 Fc 폴리펩티드는 몇 가지 방법에 따라 변형 또는 조작될 수 있으며, 예를 들면, 모체 항체는 보다 향상된 친화성을 가질 수 있고, 또는 조작된 당형태를 가질 수 있다. 다른 예를 들면, 상기 모체 Fc 폴리펩티드는 Fc 융합체, 예컨대, 융합 파트너가 세포 표면 리셉터를 표적으로 하는 Fc 융합체일 수 있다. 또 다른 예를 들면, 상기 모체 Fc 폴리펩티드는 Fc 부위 외부에 그 밖의 폴리펩티드 서열을 거의 또는 전혀 가지지 않는, 분리된 Fc 부위일 수 있다. 상기 모체 Fc 폴리펩티드는 자연적으로 존재하는 Fc 부위일 수도 있고, 또는 Fc 폴리펩티드의 조작 변이체로서 존재할 수도 있다. 요건은 상기 모체 Fc 폴리펩티드는 Fc 부위를 포함하며, 상기 Fc 부위는 Fc 변이체가 생성되도록 추후에 변이될 수 있다.

본 발명의 Fc 변이체는 항체(이하, "본 발명의 항체"라 칭함)일 수 있다. 본 발명의 항체는, IgG (인간 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4를 포함), IgA(인간 서브클래스 IgA1 및 IgA2를 포함), IgD, IgE, IgG, 및 IgM를 포함하나, 전술한 것으로 제한되지는 않는 임의의 항체 클래스에 속하는 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 코딩된다. 가장 바람직하기로는, 본 발명의 항체는 인간 IgG 클래스의 항체에 속하는 염기 서열을 포함한다. 본 발명의 항체는 인간 항체가 아니거나, 키메라이거나 인간화된 것이거나 또는 완전한 인간 항체일 수도 있다. 당업자라면 알 수 있는 바와 같이, 서로 다른 타입의 항체는 "인간화(humanness)" 정도, 또는 인간에서의 잠재적인 면역원성 수준을 반영한다. 이러한 개념에 대한 설명을 예시하면, Clark 등, 2000의 문헌, 및 상기 문헌에 인용된 문헌을 들 수 있다( Clark, 2000, Immunol Today 21:397-402, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 키메라 항체는 비인간 항체의 가변부위를 갖추고 있는데, 일례로 마우스나 랫에서 유래한 V_H나 V_L 도메인이 인간 항체의 불변부위에 연결되어 작동하는 항체를 들 수 있다(예컨대, 미국 특허 4,816,567호에 기재된 내용을 들 수 있으며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 상기 비인간 가변 부위는 전술한 유기체, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 설치류 또는 영장류에서 유래된 것일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 원숭이 가변 도메인을 포함하며, 예컨대, Newman 외, 1992, Biotechnology 10:1455-1460, 미국특허 제5,658,570호, 및 미국특허 제5,750,105호에 기재된 내용을 참조할 수 있으며, 전술한 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 가변 부위는 인간이 아닌 소스에서 유래된 것이지만, 그 면역 원성을 단백질 공학적 방법을 이용하여 감소시킨 바 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 인간화된다(Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA), 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). “인간화” 항체란 본 명세서에서 인간의 골격(FR) 부위와 인간 유래가 아닌(대개 마우스나 랫) 하나 혹은 여러 개의 상보성 결정 부위(CDR)를 갖추고 있는 것을 뜻한다. CDR이 유래한 비인간 항체는 “공여체(donor)"로, 골격 부위가 유래한 인간 항체는 “수용체(acceptor)”로 지칭한다. 인간화는 주로 공여체 CDR을 수용체(인간) V_L과 V_H 골격 부위(Winter 미국특허 제5,225,539호, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)에 이식하는 것에 달려 있다. 이러한 전략은 “CDR 이식”이라고 한다. 선택된 수용체 골격부위에 대하여 “역돌연변이”를 일으켜 그 해당 공여체 아미노산 잔기로 바꿔주지 않으면 처음 이식시 잃어버린 친화성을 회복할 수 없는 경우가 잦다(미국특허 제5,530,101호, 제5,585,089호, 제5,693,761호, 제5,693,762호, 제6,180,370호, 제5,859,205호, 제5,821,337호, 제6,054,297호, 제6,407,213호, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 그 밖의 다양한 인간화 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있으며(Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA), 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨), Fc 변이체의 면역원성이 저하되도록 변형하기 위해 이러한 방법들을 본 발명에 이용할 수 있다. 최적화된 인간화 항체는 면역 글로불린 불변부위를 적어도 한 부분 이상 가질 수 있는데, 전형적으로 인간 면역 글로불린 불변부위를 갖추며, 따라서 전형적으로 인간 Fc 부위를 갖추게 된다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 발명의 명칭을 "Methods of Generating Variant Proteins with Increased Host String Content and Compositions Thereof"로 하여 2004년 12월 3일에 출원한 미국특허 11/004,590에 기재된 방법을 이용하여, 본 발명의 Fc 변이체의 면역원성을 저하시키며, 전술한 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 완전한 인간 항체일 수 있으며, 이는 항체의 서열이 완전하게 또는 실질적으로 인간 서열인 것을 말한다. 완전한 인간 항체를 생성하는 많은 방법이 선행 기술로 알려져 있는데, 이에는 유전자이전 마우스(Bruggemann 외, 1997, Curr Opin Biotechnol 8:455~458) 또는 인간 항체 라이브러리와 그에 결부된 선택 방법(Griffiths 외, 1988, Curr Opin Biotechnol 9:102~108, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)이 포함된다.

본 발명의 Fc 변이체는 "본 발명의 FC 융합체"라 칭하는 Fc 융합체일 수 있다. 본 발명의 Fc 융합체는 하나 이상의 융합 파트너에 사용 가능하게 연결된 Fc 폴리펩티드를 포함한다. 상기 융합 파트너의 역할은 표적 항원에 상기 Fc 융합체의 결합을 매개하는 것이지만, 항상 이러한 역할을 하는 것만은 아니다(Chamow 외, 1996, Trends Biotechnol 14:52~60; Ashkenazi 외, 1997, Curr Opin Immunol 9:195~200, 전술한 문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 예를 들면, 승인받은 약물인 알레파셉(alefacept)(상표명 AMEVIVE®로서 시판됨)은, 인간 IgG1의 Fc 부위에 결합된 인간 백혈구 기능 항원-3(LFA-3)의 세포외 CD2-결합부를 구성하는 면역억제성 Fc 융합체이다. 또한, 승인받은 약물인 에타네르셉트(etanercept)(상표명 ENBREL®로서 시판됨)는 인간 IgG1의 Fc 부위에 결합된 인간 종양 괴사 인자 리셉터(TNFR: tumor necrosis factor receptor)의 세포외 리간드 결합부를 포함하는 Fc 융합체이다. 실질적으로 임의의 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 또는 소형 분자가 Fc에 결합됨으로써, Fc 융합체를 이룰 수 있다. 이러한 융합 파트너로서는 리셉터, 세포외 리셉터 도메인, 부착 분자, 리간드, 효소, 사이토킨, 케모킨, 또는 그 밖의 단백질 또는 단백질 도메인이 포함되지만, 이것으로 국한되는 것은 아니다. 아울러, 상기 융합 파트너는 화학유인물질(chemoattractant)로서의 역할을 할 수도 있다. 발견되지 않은 리간드 또는 리셉터는 본 발명의 Fc 변이체에 대한 융합 파트너로서 제공될 수 있다. 소형 분자는 융합 파트너로서 제공딜 수 있으며, Fc 융합체를 치료 표적으로 인도하는 모든 치료제가 포함된다. 그러한 표적에는 모든 분자가 될 수 있으며, 바람직하게는 질병에 연루된 세포외 리셉터가 된다. 승인받은 여러 소형 분자 약물의 표적이 되는 표면 리셉터 중 두 단백질군(protein family)은 G-단백질 연결 리셉터(G-protein coupled receptor, GPCR)와 K⁺, Na⁺, Ca² ⁺ 통로단백질을 포함하는 이온 통로 단백질이다. 세계적으로 시판되는 약물의 70%에 가까운 양이 GPCR을 표적으로 한다. 따라서 본 발명의 Fc 변이체는 예를 들어 다음을 표적으로 하는 소형 분자에 융합될 수 있다: 한 개나 여러 개의 GABA 리셉터, 퓨린성(purinergic) 리셉터, 아드레날린성 리셉터(adrenergic receptor), 히스타민성 리셉터, 아편계 약물리셉터(opioid receptor), 케모킨 리셉터, 글루탐산 리셉터, 니코틴 리셉터, 5HT(세로토닌) 리셉터, 에스트로겐 리셉터. 융합 파트너는 치료상 유용한 표적에 접근하는 단백질에 대한 소형 분자유사체일 수도 있다. Fc 융합 파트너로 작용할 수 있는 구체적인 약물에 대한 예는 L. S. Goodman 외 편집, Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics(9판, 1996 뉴욕 McGraw-Hill 출판사)에서 찾을 수 있다. 융합 파트너에는 존재하는 약물의 표적에 결합하는 소형 분자와 단백질만 포함되는 것이 아니라, 현재 약물 표적으로 되어 있지 않은 고아 리셉터(orphan receptor)도 포함된다. 유전체와 단백질체 프로젝트가 완료되면서 이것이 약물 발견에 있어서 추동력이 된다는 것이 확인되고 있는데, 이 프로젝트들에 의해 수많은 고아 리셉터가 얻어졌다. 이들 새 분자를 약물 표적으로 확증하고, 이들을 표적으로 하는 단백질과 소형 분자 치료제를 개발하는 데에는 엄청난 가능성이 잠재되어 있다. 그러한 단백질과 소형 분자 치료제는 본 발명의 Fc 변이체를 이용한 Fc 융합 파트너로서 고려할 수 있다. 실질적으로 본 발명의 Fc 융합체는 인간 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4를 포함하는 IgG 클래스, IgA (서브클래스 IgA1 및 IgA2 포함), IgD, IgE, IgG, 또는 IgM 클래스의 항체에 속하는 서열을 포함하나 전술한 것으로 제한되지 않는, 임의의 항체 클래스의 면역글로불린 유전자에 의하여 실질적으로 코딩될 수 있다. 가장 바람직하기로는, 본 발명의 Fc 융합체는 인간 IgG 클래스 항체에 속하는 서열을 포함한다. 아래에서 정의하고 기술할 다양한 링커(linker)를 사용하여, Fc를 융합 파트너에 공유결합으로 연결함으로써 Fc 융합체를 생성할 수 있다.

본 발명의 Fc 변이체는 분리된 Fc, 즉, 본 발명의 Fc 변이체를 포함하며, Fc 부위 외에는 추가적인 폴리펩티드 서열을 거의 또는 전혀 포함하지 않는 Fc 폴리펩티드에 이용될 수 있다. 본 발명의 분리된 Fc란, 상기 Fc 부위에서만 분자의 바람직한 기능, 예컨대, 바람직한 치료 기능을 가지는 분자를 의미한다. 따라서, 본 발명의 분리된 Fc의 치료 표적은 하나 이상의 Fc 리간드를 포함할 수 있다. 상기 Fc 변이체를 포함하는 분리된 Fc를 이용하는 경우에는 바람직한 결과를 얻기 위해, 공유결합된 추가적인 폴리펩티드 서열이 필요치 않다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 분리된 Fc는 90-100%의 Fc 부위를 포함하며, "여분의" 서열을 거의 또는 전혀 갖지 않는다. 따라서, 예를 들면, 본 발명의 분리된 Fc는 인간 IgG1의 카르복시 말단에 C226 또는 P230 잔기를 포함할 수 있으며, 상기 잔기의 위치는 Kabat의 문헌에 기재된 바와 같이, EU 인덱스에 따라 번호를 부여할 수 있다. 그러나, 상기 분리된 Fc는 추가적인 폴리펩티드 서열을 더 포함할 수 있지는 않다고 생각된다. 예컨대, 분리된 Fc는 Fc 변이체 Fc 부위를 포함하는 것 외에도, 발현, 정제 등을 가능하게 하는 추가적인 폴리펩티드 서열을 더 포함한다.

본 발명의 Fc 변이체는 상기 Fc 부위의 단편, 즉, 본 발명의 Fc 변이체를 포함하는 Fc 단편을 포함하는 Fc 폴리펩티드에 이용될 수 있다. 본 발명의 Fc 단편의 요건은 Fc 변이체의 아미노산 변형이 일어나는 위치에 상기 단편이 포함되어야 한다는 것이다. 본 발명의 Fc 단편은 1-90%의 Fc 부위를 포함하고, 바람직하게는 10-90%, 가장 바람직하게는 30-90%의 Fc 부위를 포함한다. 그러므로, 예를 들면, 본 발명의 Fc 단편은 Fc 변이체 IgG1 Cγ2 도메인, Fc 변이체 IgG1 Cγ2 도메인 및 경첩부, Fc 변이체 IgG1 Cγ3 도메인 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 Fc 단편은 융합 파트너를 더 포함함으로써, 보다 효과적으로 Fc 단편 융합이 가능하게 할 수 있다. 분리된 Fc를 이용하는 경우에서와 같이, Fc 단편은 추가적인 폴리펩티드 서열을 더 포함할 수도 있고, 포함하지 않을 수도 있다.

실질적으로 본 발명의 Fc 변이체는 유기체, 바람직하기로는 포유류, 즉, 인간, 설치류(마우스 및 랫을 포함하나, 전술한 것으로 제한되지는 않음), 래빗 및 헤어(hare)와 같은 토끼목(lagomorpha), 낙타, 라마, 및 단봉 낙타(dromedary)와 같은 낙타과, 및 예컨대, 원원류(Prosimians), 광비원류(Platyrrhini)(신세계 원숭이), 유미원과(Cercopithecoidea)(구세계 원숭이), 및 인상과(Hominoidea)를 들 수 있으나, 전술한 것으로 제한되지 않는, 인간을 제외한 영장류, 예컨대, 긴팔원숭이(Gibbons), 레서(Lesser), 및 그레이트 에이프(Great Apes)를 포함하나, 전술한 것으로 제한되지 않는 임의의 유기체 유래의 하나 이상의 Fc 유전자에 의하여 실질적으로 코딩될 수 있다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 Fc 변이체는 실질적으로 인간이다. 실질적으로 본 발명의 Fc 변이체는 상기 임의의 항체 클래스에 속하는 면역글로불린 유전자에 의해 코딩될 수 있다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 Fc 유전체는 인간 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4를 포함하는 IgG 클래스의 항체에 속하는 서열을 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 Fc 변이체는 IgA (서브클래스 IgA1 및 IgA2 포함), IgD, IgE, IgG, 또는 IgM 클래스의 항체에 속하는 서열을 포함한다. 본 발명의 Fc 변이체는 하나 이상의 단백질 사슬을 포함할 수 있다. 즉, 본 발명은 모노머, 또는 동종 올리고머 또는 이종 올리고머를 포함하는 올리고머인 Fc 변이체에 이용될 수 있다.

본 발명이 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 인간 서열을 근간으로 한 것이므로, 따라서 인간의 서열은 그외 서열, 예컨대, 설치류 및 영장류의 서열은 물론, 그 밖의 면역글로불린 클래스, 예컨대, IgA, IgE, IgGD, IgGM 등에서 유래된 서열과 비교되는 "베이스" 서열로 사용된다. 본 발명의 Fc 변이체는 하나의 모체 Fc 변이체에서 조작되지만, 이들 변이체는 제2의 모체 Fc 변이체에서 조작 또는 "전위"될 수 있다. 이는 통상적으로는 2개의 Fc 변이체의 서열 사이에 서열 또는 구조적 상동성(homology)에 근거하여, "동등한" 또는 "상응하는" 잔기를 결정하여 제1 Fc 변이체와 제2 Fc 변이체 사이에 치환함으로써 수행될 수 있다. 상동성을 확정하기 위해서는 본 명세서에서 설명한 제1 Fc 변이체의 아미노산 서열을 제2 Fc 변이체의 서열과 직접 비교한다. 서열 정렬하여, 하나 이상의 공지의 상동성 정렬 프로그램을 사용하고(예컨대 종 사이에 보존된 잔기를 이용함), 정렬을 유지하기 위한 필수 삽입 및 삭제를 허용(즉, 임의적인 삭제 및 삽입을 통한 보존성 잔기 제거를 피하기 위함)한 후, 인간 Fc의 일차 서열에서 특정 서열에 동등한 잔기를 확인한다. 보존적 잔기의 정렬시 이러한 잔기들이 100% 보존되어야 한다. 그러나, 보존적 잔기의 75% 이상 또는 적게는 50%는, 또한 동등한 잔기를 확인하는데 적합하다. 또한 동등한 잔기는 3차 구조가 결정된 Fc 폴리펩티드에 대한 제1 Fc 변이체와 제2 Fc 변이체 간의 구조적 상동성을 결정함으로써 규정될 수 있다. 전술한 경우, 동등한 잔기는 모체 또는 전구체(N상의 N, CA상의 CA, C 상의 C 및 O 상의 O)의 특정 아미노산 잔기의 주쇄 원자 둘 이상의 원자 대등물은 정렬후 0.13nm 이내인 것으로 정의되며, 바람직하기로는 0.1nm 이내인 것으로 정의된다. 정렬은 최상 모델이 파악되어 Fc 폴리펩티드의 비-수소성 단백질 원자의 원자적 대등물의 최대 중첩을 제공하도록 배치된다. 동등한 또는 상응하는 잔기가 어떻게 결정되는지에 상관없이, 그리고 Fc 변이체가 생성되는 모 Fc 변이체의 정체에 상관없이, 말하고자하는 것은 본 발명에서 발견된 Fc 변이체는 이 변이체와 상당한 서열 또는 구조적 상동성을 갖는 임의의 제2의 Fc 변이체로 엔지니어링 될 수 있다는 것이다. 따라서, 예를 들면, 만약 모항체가 인간 IgG1인, 변이체 항체가 상술한 방법 또는 동등한 잔기를 결정하는 기타 방법을 사용하여 생성되는 경우에, 상기 변이체 항체는 인간 IgG2 모항체, 인간 IgA 모항체, 마우스 IgG2a 또는 IgG2b 모항체 등으로 엔지니어링될 수 있다. 다시, 전술한 바와 같이, 모 Fc 변이체의 맥락을 유지하는 경우, 본 발명의 Fc 변이체를 다른 모 Fc 변이체로 전달하는 능력에 영향을 미치지 않는다. 예를 들면, 하나의 에피토프를 표적으로 하는 인간 IgG1 항체로 엔지니어링된 변이체 항체는 상이한 에피토프를 표적으로 하는 인간 IgG2 항체로 될 수 있거나, 여전히 다른 상이한 에피토프를 표적으로 하는 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는 Fc 융합체 등과 같이 계속적으로 다른 항체로 전달될 수 있다.

본 발명의 Fc 변이체는 다양한 제품에 이용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 Fc 변이체는 치료제, 진단제, 또는 리서치 시약(research agent), 바람직하기로는 치료제이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 Fc 변이체는 농업용 또는 산업용 용도로서 이용될 수 있다. 본 발명의 항체는 단일클론 또는 다중클론 항체 조성물에 이용될 수 있다. 본 발명의 Fc 변이체는 작용제, 길항제, 중성, 억제성, 또는 자극성일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 Fc 변이체는 표적 항원을 가지는 표적 세포, 예컨대, 암세포를 죽이는 데 이용된다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 Fc 변이체는 표적 항원의 차단(blocking), 길항(antagonizing), 또는 작용화(agonizing)하는 데 이용된다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 Fc 변이체는 표적 항원을 가지는 표적 세포를 차단, 길항, 또는 작용화하거나, 죽이는 데 이용된다.

표적

실질적으로, 본 발명의 Fc 변이체는 하기 표적 리스트에 속하는 단백질, 서브유닛, 도메인, 모티프, 및/또는 에피토프를 포함하나, 이것으로 국한되지는 않는 항원을 표적으로 한다: 17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-케토-PGF1a, 8-이소-PGF2a, 8-옥소-dG, A1 아데노신 리셉터, A33, ACE, ACE-2, 액티빈(Activin), 액티빈 A, 액티빈 AB, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 RIA, 액티빈 RIA ALK-2, 액티빈 RIB ALK-4, 액티빈 RIIA, 액티빈 RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, 아드레신(Addressin), aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, 알파-1-항트립신(antitrypsin), 알파-V/베타-1 길항제, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, 아르테민(Artemin), 항-Id, 아스파르트산(ASPARTIC), 심방성 나트륨 이뇨인자(Atrial natriuretic factor), av/b3 인테그린, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, B-림프구 자극제 (BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3 오스테오게닌(Osteogenin), BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMPs, b-NGF, BOK, 봄베신(Bombesin), 뼈 유도성 향신경 인자(bone-derived neurotrophic factor), BPDE, BPDE-DNA, BTC, 보체 인자 3 (C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, 칼시토닌(Calcitonin), cAMP, 암배아 항원(carcinoembryonic antigen) (CEA), 종양 관련 항원(carcinoma-associated antigen), 카텝신 A, 카텝신 B, 카텝신 C/DPPI, 카텝신 D, 카텝신 E, 카텝신 H, 카텝신 L, 카텝신 O, 카텝신 S, 카텝신 V, 카텝신 X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (p67 단백질), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, 클로스트리디움 보툴리눔 독소(Clostridium botulinum toxin), 클로스트리디움 페르프린젠즈 독소(Clostridium perfringens toxin), CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, 사이토케라틴 종양 관련 항원(cytokeratin tumor-associated antigen), DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, 붕괴촉진인자(decay accelerating factor), des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-1), Dhh, 디곡신(digoxin), DNAM-1, DNA 분해효소(Dnase), Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, 엔도텔린 리셉터(endothelin receptor), 엔케팔리네이스(Enkephalinase), eNOS, Eot, 이오탁신(eotaxin) 1, EpCAM, Ephrin B2/ EphB4, EPO, ERCC, E-셀렉틴(E-selectin), ET-1, 인자 IIa, 인자 VII, 인자 VIIIc, 인자 IX, 섬유모세포 활성화 단백질(fibroblast activation protein: FAP), Fas, FcR1, FEN-1, 페리틴(Ferritin), FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, 피브린(Fibrin), FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, 난포 자극 호르몬(follicle stimulating hormone), 프랙탈킨(Fractalkine), FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas 6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (마이오스타틴(Myostatin)), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-알파1, GFR-알파2, GFR-알파3, GITR, 글루카곤(Glucagon), Glut 4, 당단백질 IIb/IIIa (GP IIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, 성장 호르몬 방출 인자, 합텐 (Hapten) (NP-cap 또는 NIP-cap), HB-EGF, HCC, HCMV gB 막 당단백질, HCMV) gH 막 당단백질, HCMV UL, 조혈 성장 인자(Hemopoietic growth factor: HGF), Hep B gp120, 헤파라네이스(heparanase), Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), 단순 헤르페스 바이러스(HSV: herpes simplex virus) gB 당단백질, HSV gD 당단백질, HGFA, 고분자량 멜라닌종 관련 항원(HMW-MAA), HIV gp120, HIV IIIB gp 120 V3 루프, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, 인간 심장 마이오신(human cardiac myosin), 인간 거대세포 바이러스(human cytomegalovirus: HCMV), 인간 성장 호르몬 (HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, IgA 리셉터, IgE, IGF, IGF 결합 단백질, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, 인터페론 (INF)-알파, INF-베타, INF-감마, 인히빈(Inhibin), iNOS, 인슐린 A-사슬, 인슐린 B-사슬, 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor) 1, 인테그린 알파2, 인테그린 알파3, 인테그린 알파4, 인테그린 알파4/베타1, 인테그린 알파4/베타7, 인테그린 알파5 (알파V), 인테그린 알파5/베타1, 인테그린 알파5/베타3, 인테그린 알파6, 인테그린 베타1, 인테그린 베타2, 인터페론 감마, IP-10, I-TAC, JE, 칼리크레인 2(Kallikrein 2), 칼리크레인 5, 칼리크레인 6, , 칼리크레인 11, 칼리크레인 12, 칼리크레인 14, 칼리크레인 15, 칼리크레인 L1, 칼리크레인 L2, 칼리크레인 L3, 칼리크레인 L4, KC, KDR, 각질형성세포 성장 인자(Keratinocyte Growth Factor: KGF), 라미닌 5(laminin 5), LAMP, LAP, LAP (TGF- 1), 잠재성 TGF-1, 잠재성 TGF-1 bp1, LBP, LDGF, LECT2, Lefty, 루이스-Y 항원, 루이스-Y 관련 항원, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, 지질 단백질(lipoprotein), LIX, LKN, Lptn, L-셀렉틴, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, 폐 계면활성제(lung surfactant), 황체 형성 호르몬(luteinizing hormone), 림프독소 베타 리셉터(Lymphotoxin Beta Receptor), Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, 메탈로프로테아제(METALLOPROTEASE), MGDF 리셉터, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-알파, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, 점액소(mucin) (Muc1), MUC18, 뮬러관 억제 물질(Muellerian-inhibiting substance), Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-카드헤린(N-Cadherin), NCA 90, NCAM, NCAM, 네프릴라이신(Neprilysin), 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 또는 뉴로트로핀-6, Neurturin, 신경세포 성장 인자(neuronal growth factor: NGF), NGFR, NGF-베타, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, 부갑상선 호르몬, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-카드헤린, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, PLAP(placental alkaline phosphatase), PlGF, PLP, PP14, 프로인슐린(proinsulin), 프로릴랙신(prorelaxin), 단백질 C, PS, PSA, PSCA, PSMA(prostate specific membrane antigen), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, 릴랙신 A-사슬, 릴랙신 B-사슬, 레닌(renin), 호흡기 세포융합 바이러스(RSV: respiratory syncytial virus) F, RSV Fgp, Ret, 류마티스 인자(Rheumatoid factor), RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, 세린(SERINE), 혈청 알부민, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (종양 관련 당단백질-72), TARC, TCA-3, T-세포 리셉터 (예컨대, T-세포 리셉터 알파/베타), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, 고환 PLAP 유사 알칼리성 포스파타제, TfR, TGF, TGF-알파, TGF-베타, TGF-베타 Pan Specific, TGF-베타 RI (ALK-5), TGF-베타 RII, TGF-베타 RIIb, TGF-베타 RIII, TGF-베타1, TGF-베타2, TGF-베타3, TGF-베타4, TGF-베타5, 트롬빈(thrombin), 가슴샘 Ck-1, 갑상선 자극 호르몬, Tie, TIMP, TIQ, 조직 인자, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-알파, TNF-알파 베타, TNF-베타2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (TRAIL Apo-2 Ligand, TL2), TNFSF11 (TRANCE/RANK 리간드 ODF, OPG 리간드), TNFSF12 (TWEAK Apo-3 리간드, DR3 리간드), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (LIGHT HVEM 리간드, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (GITR 리간드 AITR 리간드, TL6), TNFSF1A (TNF-a Conectin, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (OX40 리간드 gp34, TXGP1), TNFSF5 (CD40 리간드 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (Fas 리간드 Apo-1 리간드, APT1 리간드), TNFSF7 (CD27 리간드 CD70), TNFSF8 (CD30 리간드 CD153), TNFSF9 (4-1BB 리간드 CD137 리간드), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, 전달 리셉터(transferring receptor), TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, 종양 관련 항원 CA 125, 종양 관련 항원 발현 루이스 Y 관련 탄수화물, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, 유로키네이스(Urokinase), VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-카드헤린, VE-카드헤린-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, 바이러스 항원, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR 인테그린, von Willebrands 인자, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, 및 호르몬 및 성장 인자에 대한 리셉터.

기술분야의 당업자라면 상기 언급한 바와 같은 표적 리스트가 단지 특정의 단백질 및 생체분자만을 언급하는 것이 아니라, 이들을 포함하는 경로 또는 생화학적 경로를 언급하는 것임을 인식할 수 있을 것이다. 예를 들어, 표적 항원으로서, CTLA-4 의 언급은 CTLA-4, B7-1, B7-2, CD28을 포함하는, T 세포 공동자극 경로를 구성하는 리간드 및 수용체를 의미하는 것이며, 이들 단백질에 결합하는 임의의 다른 발견되지 않은 리간드 또는 수용체도 또한 표적이 된다. 따라서, 본 명세서 사용된 표적은 특정의 생체분자만을 의미하는 것이 아니라, 상기 표적과 상호작용하는 한 세트의 단백질 및 상기 표적이 속하는 생화학적 경로의 일원을 언급하는 것이다. 기술분야의 당업자라면 Fc 융합체를 생성하기 위해, 상기 언급한 임의의 표적 항원, 이들에 결합하는 리간드 또는 수용체, 또는 이들의 상응하는 생화학적 경로의 기타 일원이 본 발명의 Fc 변이체에 작동가능하게 연결될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 예를 들면, EGFR을 표적으로 하는 Fc 융합체는 Fc 변이체를 EGF, TGF-베타 또는 EGFR에 결합하는 발견 또는 발견전의 임의의 다른 리간드에 작동가능하게 연결함으로서 구축될 수 있다. 따라서, 본 발명의 Fc 변이체는, EGF, TGF-베타 또는 EGFR에 결합하는 발견 또는 발견전의 임의의 다른 리간드에 결합하는 Fc 변이체의 생성을 위해 EGFR작동가능하게 연결될 수 있다. 따라서, 실질적으로, 리간드, 수용체, 또는 일부 기타 단백질 또는 단백질 영역에 상관없이, 이로 제한하는 것은 아니나 상기 언급한 표적 및 그의 상응하는 생화학적 경로를 구성하는 단백질을 포함하는, 모든 폴리펩타이드는 본 발명의 Fc 변이체에 작동가능하게 연결되어 Fc 융합체로 만들어 질 수 있다.

항체 치료용에 적합한 표적 항원의 선택은 복잡한 과정으로서, 많은 변수를 포함한다. 항암 치료의 경우, 발현이 암세포로 제한되는 표적을 선택하는 것이 바람직하다. 항체 치료법에 특히 적합한 것으로 증명된 일부 표적은 신호전달 기능을 갖는 것들이다. 기타 치료적 항체는 수용체 및 이의 상응하는 리간드사이의 결합을 방해함으로써, 수용체의 신호전달을 방해하여 그 효과를 차단하여 기능을 발휘한다. 치료항체의 다른 작용기전은 수용체의 하향 발현을 유발하는 것이다. 비록 치료적으로 유효한 많은 항체가 부분적으로는 이들의 표적 항원을 통하여 신호전달에 관여하지만, 반드시 이런 경우에 해당하는 것은 아니다. 예를 들면, 예컨대 세포 표면 글리코형태와 같은 일부 표적 부류는 어떤 생물학적 신호도 생성하지 않는다. 그러나, 변형된 글리코형태는 종종 암과 같은 질환과 연관되어 있다. 다른 중요한 표적 유형은, 정상적 기능으로서, 또는 항체의 결합에 반응하여 내부화 되는 것들이다. 세포표면에 결합하여 효과기 기능을 일어나도록 하는 것이 아니라, 세포질에 용해되는 표적의 경우는 임의의 세포죽음도 초래하지 않는다.

항체 치료에 특히 적합한 것으로 증명된 일부 표적은 신호전달 기능을 갖는 것이다. 예를 들면, Her2/neu 항원의 항체 가교연결은 암세포의 죽음을 초래하는 세포사멸 신호를 생성할 수 있다. CD30 항원과 같은 일부 경우에, 자유 항체와의 집합체형성(clustering)은 시험관내에서는 세포사멸의 유발에 불충분하다. 시험관내 분석의 경우, 충분한 집합체형성은 항체를 가교연결 또는 항체를 고밀도로 마이크로타이터 플레이터와 같은 표면에 부착하여 매개될 수 있다. 그러나, 생체내에서, 이러한 효과는 항체의 Fc 리간드에의 결합, 예를 들면 주변의 세포상에 발현되는 FcgRs에 의해 매개될 수 있다. Fc 리간드에 보다 강하게 결합하는 항체 Fc 변이체는 따라서 신호전달 표적을 더욱 효과적으로 클러스터링하여 세포사멸의 유도가 향상된다. 이러한 기전은 항체의 신호를 전달하는 목적하는 표적을 발현하는 세포에 결합하는 향상된 Fc 리간드와 함께 또는 이러한 리간드 없이 항체를 첨가하거나/하고 상기 Fc 수용체를 클러스터할 상응하는 항체 및 Fc 수용체를 첨가하여 실험적으로 테스트될 수 있다. Fc 수용체를 클러스터링하는 대안적 방법은 비드상에의 고정화 및 비-효과기 세포주에서의 과발현을 포함한다. 세포사멸이 일어나도록 한 후, 표적을 발현하는 세포의 상대적 세포사멸을 통하여 효과의 정량적 측정이 가능하다.

표적과의 상호작용을 통해 세포 사멸을 초래하는 항체는 추가적인 이익을 가질 수 있다. 이러한 사멸중인 세포에서 방출되는 신호는 대식세포와 그외 면역계 세포를 유인한다. 이들 세포는 사멸 세포나 사멸중인 세포를 항체 매개 방법으로 흡수한다. 이는 항원의 교차-존재(cross-presentation) 및 표적 세포에 대한 숙주 면역 반응에 대한 가능성을 형성하는 것으로 알려져 있다. 항원 표적 Her2 및 CD20에 있어서 항체 요법에 대한 반응에서 이러한 자동-항체(antibody)들이 보고되고 있다. 이러한 이유로, 특히 교차-존재 및 부적절한 허용(tolerance) 유발 효과가 아닌 면역 반응을 자극하기 위해 변형된 수용체 특이성을 가진 Fc 변이체가 이로울 수 있다.

다른 치료 항체들은 수용체와 그것의 동족 리간드간의 상호작용을 작용함으로써 그것의 효과를 발휘하며, 궁극적으로 상기 수용체의 시그널링을 차단한다. 이러한 항체들을 이용하여 다수 질환 상태를 치료한다. 이러한 경우, 임의의 숙주 면역 기능을 강화하지 않는 항체를 이용하는 것이 이로울 수 있다. 이러한 항체의 이차적인 효과는 수용체 클러스터링을 통해 스스로 시그널링을 실제 유도할 수 있다. 이 경우, 시그널링을 차단하는 바람직한 치료 효과는 항원 매개성 시그널링에 의해 저지될 것이다. 전술한 바와 같이, 이러한 클러스터링은 Fc 수용체를 함유하는 세포들과의 항체 상호작용에 의해 강화될 수 있다. 이 경우, Fc 수용체에 거의 또는 전혀 단단하게 결합하지 않는 Fc 변이체를 사용하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 항체는 시그널링을 매개하지 않으며, 따라서 그것의 작용 기작은 수용체 리간드 상호작용의 차단으로 제한될 것이다. 가장 적합한 시그널링 수용체는 단지 이량화될 수 있을 뿐 실질적으로 일차 항체에 의해 클로스터할 수 없는 단량성 수용체(monomeric receptor)일 것이다. 다량성 수용체(Mulitimeric receptor)는 일차 항체에 의해 현저하게 클러스터를 이룰 수 있으며, Fc 수용체 결합에 의한 추가적인 클러스터링이 필요하진 않을 수 있다.

다른 가능성 있는 치료 항체의 작용 기작은 수용체 하향 조절(downregulation)이다. 이는 예컨대, 인슐린계 성장 인자 수용체의 경우일 수 있다. 세포 생육은 수용체를 통한 연속적인 시그널링에 의존되며, 이러한 시그널링이 없는 세포는 생육이 중지된다. 이러한 수용체에 가해지는 항체 효과는 그것의 발현을 하향 조절하는 것이고 따라서 시그널링이 삭제된다. 세포독성 요법에서의 세포 회복에는 이러한 수용체의 자극이 필요로 한다. 이들 수용체의 하향 조절은 이들 세포의 회복을 막으며 세포독성 요법이 실질적으로 보다 효과적이도록 한다. 이것이 일차 작용 기작인 항체에서, Fc 수용체 결합 감소는 Fc 수용체에 대한 비표적 결합에 의해 항체의 봉쇄(sequestration)를 방지할 수 있다.

치료학적으로 유효한 다수 항체들은 그것의 표적 항원을 통한 시그널링에 의해 부분적으로 작용하지만, 항상 그런 것은 아니다. 일예로, 세포 표면 단백당형(glycoform)와 같은 일부 표적 클래스들은 임의의 생물학적인 시그널을 형성하지 않는다. 그러나, 변이된 단백당형는 종종 암과 같은 질병 상태와 관련되어 있다. 다른 경우들에서, 동일한 표적 항원의 여러 에피토프와의 항체간의 상호작용은 여러가지 시그널링 효과를 부여할 수 있다. 표적 항원에 대한 항체 또는 Fc 융합의 결합에 의한 시그널링이 거의 또는 전혀 없는 경우, 본 발명의 Fc 폴리펩티드는 무효능의 분자들에 대해 새로운 효능 기작을 제공하는데 있어서의 이용성을 찾을 수 있다.

이러한 비-시그널링 표적물에 대한 치료 항체를 제조하는 방법은 방사능-동위원소, 독소 또는 기질을 처리하여 종양 부근에서 세포독성 물질을 형성할 수 있는 효소와 같은 세포독송 물질을 항체와 커플링하는 것이다. 세포독성 모이어티의 대안으서, 본 발명의 Fc 변이체는 본질적으로 숙주에 거의 독성이 없으면서도 여전히 표적 암 세포를 파괴하는데는 효과적인 면역 기능의 보충 증가를 제공할 수 있다. 이러한 Fc 변이체는, 예컨대 NK 세포를 보충하거나 식균을 활성화하거나 CDC를 개시하는데 보다 효과적일 수 있다. 대안적으로, 세포독성 물질이 이용된다면, Fc 리간드 결합을 감소 또는 변이시키는 Fc 변이체를 이용하는 것이 이로울 수 있다. 이는 Fc 수용체를 발현하는 면역 세포상의 상기 물질의 세포독성 효과를 감소 또는 없앨 수 있으며, 따라서, 환자에 대한 독성을 완화시킨다. 또한, Fc 리간드 결합 감소는 독성 물질 또는 효소에 대한 면역 반응 형성을 최소화하는 것을 보조할 것이다. 전술한 바와 같이, 세포 사멸은 숙주 면역 세포의 보충을 초래하며, 세포독성 모이어티 뿐만 아니라 치료 항체가 증가된 Fc 수용체 결합 친화성 또는 변이된 수용체 특이성을 가진다면 상기 경우에서 항체 매개 교차-존재는 면역 허용 보다는 면역 반응이 증가될 것이다.

또다른 유의한 표적 타입은 그것의 정상적인 생물학적 기능으로서 또는 항체 결합 반응시 내재화하는(internalize) 표적들이다. 그러한 항체에서, RNase, 리신 및 칼리치아미신(calicheamicin)과 같이 내재화된 후에만 그것의 작용이 발휘될 수 있는 세포독성 물질과의 커플링을 만들기 위한 많은 노력들이 행해졌다. 이러한 물질들에서, Fc 리간드 결합은 Fc 리간드에 의한 비생산적인 치료제 격리로 인해 효능을 감소시킬 수 있다. 이 경우, 감소된 Fc 리간드 친화성을 제공하는 Fc 변이체를 사용하는 것이 이로울 수 있다. 반대로, 세포상에 존재하는 표적 항원에 그것이 결합하기 이전에 Fc 리간드와 항체의 전-조합(pre-association)은 표적의 내재화를 저해하는 것으로 제공될 수 있다. 이 경구, 증가된 Fc 리간드 친화성은 전-조합을 향상시키도록 작용하여, 따라서 작용자(effector) 세포 및 숙주 면역 반응을 보충시킬 수 있다.

세포 표면에 결합하지 않고 오히려 가용적인 표적의 경우, 작용자 기능의 조충은 세포 사멸을 직접적으로 초래하진 않을 것이다. 그러나, 표적에 대한 숙주 항체들의 제조를 자극하는데 사용할 수 있다. 일부 질병 상태에서, 성공적인 치료에는 매우 장기간의 치료 항체의 투여가 필요할 수 있다. 이러한 치료는 비용이 엄청나게 많이 들거나 번거러울 수 있다. 이러한 경우들에서, 숙주 면역 반응 및 항체 생산의 촉진은 치료제의 효능을 개선시킬 수 있다. 이는 백신 요법에 대한 보강제로서 적용가능하 수 있다. 이러한 효과를 매개하는 항체 Fc 변이체는 Fc 리간드에 대해 증가된 친화성 또는 변이된 Fc 리간드 특이성을 가질 수 있다.

임상 또는 개발에 사용 허가된 다수의 항체 및 Fc 융합체들은 본 발명의 Fc 변이체로부터 이익을 볼 수 있다. 이들 항체 및 Fc 융합체들은 본원에서 "임상 제품 및 후보물질"로 언급한다. 따라서, 바람직한 예에서, 본 발명의 Fc 폴리펩티드는 임상 제품 및 후보물질의 범위에서 용도를 찾을 수 있다. 예컨대, CD20을 표적으로 하는 다수 항체들은 본 발명의 Fc 폴리펩티드로부터 이익을 볼 수 있다. 예를 들면, 본 발명이 Fc 폴리펩티드는 실질적으로 리투시맵(Rituxan^® IDEC/Genentech/Roche)(예를 들어, US 5,736,137 참조), 비-호드그킨의 림프종(non-Hodgkin's lymphoma)을 치료하는 것으로 허가된 키메라 항-CD20 항체; HuMax-CD20, 현재 Genmab에 의하여 개발되고 있는 중인 항-CD20, US 5,500,362에 개시된 항-CD20 항체, AME-133 (Applied Molecular Evolution), hA20 (Immunomedics, Inc.), 및 HumaLYM (Intracel) 및 PRO70769(PCT/US2003/040426, "Immunoglobulin Variants and Uses Thereof")과 실질적으로 유사한 항체에 사용될 수 있다. EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4)를 포함하는 표피 성장 인자 리셉터(epidermal growth factor receptor) 부류의 일원들을 표적화하는 다수의 항체가 본 발명의 Fc 변이체로부터 이익을 취할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 Fc 변이체는 다음과 실질적으로 유사한 항체에 사용될 수 있다: 트라스투주맵(Herceptin^®; Genentech) (예를 들어, US 5,677,171 참조), 유방암의 치료에 대하여 허가된 인간화된 항-Her2/neu 항체; 현재 Genentech이 개발 중인 페르투주맵(pertuzumab) (rhuMab-2C4, Omnitarg™); US 4,753,894에 개시되어 있는 항-Her2 항체; 세투시맵(Erbitux^®, Imclone) (US 4,943,533; PCT WO 96/40210); 다양한 암에 대한 임상 실험에 사용되는 키메라 항-EGFR 항체; 현재 Abgenix/Immunex/Amgen이 개발 중인 ABX-EGF (US 6,235,883); 현재 Genmab가 개발 중인 HuMax-EGFr (USSN 10/172,317); 425, EMD55900, EMD62000, 및 EMD72000 (Merck KGaA) (US 5,558,864; Murthy et al. 1987, Arch Biochem Biophys . 252(2):549-60; Rodeck et al., 1987, J Cell Biochem . 35(4):315-20; Kettleborough et al., 1991, Protein Eng. 4(7):773-83); ICR62 (Institute of Cancer Research) (PCT WO 95/20045; Modjtahedi et al., 1993, J. Cell Biophys. 1993, 22(1-3):129-46; Modjtahedi et al., 1993, Br J Cancer . 1993, 67(2):247-53; Modjtahedi et al, 1996, Br J Cancer, 73(2):228-35; Modjtahedi et al, 2003, Int J Cancer , 105(2):273-80); TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular, Cuba (US 5,891,996; US 6, 506,883; Mateo et al, 1997, Immunotechnology, 3(1):71-81); mAb-806 (Ludwig Institue for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth et al. 2003, Proc Natl Acad Sci U S A. 100(2):639-44); KSB-102 (KS Biomedix); MR1-1 (IVAX, National Cancer Institute) (PCT WO 0162931A2); 및 SC100 (Scancell) (PCT WO 01/88138). 또 다른 하나의 바람직한 일면에 있어서, 본 발명의 Fc 폴리펩티드는, 현재 B-세포 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia)의 치료용으로 허가되어 있는 인간화된 단일 클론성 항체인 알렘투주맵(Campath^®, Millenium)에 사용될 수 있다. 본 발명의 Fc 변이체는 이들로 제한되지는 않으나, 비제한적으로 다음을 포함하는 기타 임상 제품 및 후보 물질과 실질적으로 유사한 항체 또는 Fc 융합체에 사용할 수 있다: 뮤로몬냅(muromonab)-CD3 (Orthoclone OKT32^®), Ortho Biotech/Johnson & Johnson에 의하여 개발된 항-CD3 항체, 이브리투모맵 타이욱세탄(ibritumomab tiuxetan)(Zevalin^®), IDEC/Schering AG에 의하여 개발된 항-CD20 항체, 젬투주맵 오조자마이신(gemtuzumab ozogamicin)(Mylotarg^®), Celltech/Wyeth에 의하여 개발된 항-CD33(p67 단백질) 항체, 알레파셉트(alefacept)(Amevive^®), Biogen에 의하여 개발된 항-LFA-3 Fc 융합체, Centocor/Lilly에 의하여 개발된, 아브식사이맵(abciximab)(ReoPro^®), Novartis에 의하여 개발된 바실릭사이맵(basiliximab)(Simulect^®), Medlmmune에 의하여 개발된 팔리바이주맵(Synagis^®), 인플릭사이맵(Remicade^®), Centocor에 의하여 개발된 항-TNF α 항체, 아달리뮤맵(Humira^®), Abbott에 의하여 개발된 항-TNF α 항체, Humicade^TM, Celltech에 의하여 개발된 항-TNF α 항체, 에타네르셉트(Enbrel^®), Immunex/Amgen에 의하여 개발된 항-TNF α Fc 융합체, ABX-CBL, Abgenix에 의하여 개발된, 항-CD147 항체, ABX-IL8, Abgenix가 개발 중인 항-IL8 항체, ABX-MA1, Abgenix가 개발 중인 항-MUC18 항체, 펩투모맵(Pemtumomab)(R1549, ⁹⁰Y-mu-HMFG1), Antisoma가 개발 중인 항-MUC1, Therex(R1550), Antisoma가 개발 중인 항-MUC1 항체, Antisoma가 개발 중인 안지오맵(AngioMAb), Antisoma가 개발 중인 HuBC-1, Antisoma가 개발 중인 티오플라틴(Thioplatin)(AS1407), Antegren^®(나탈리주맵), Biogen이 개발 중인 항-α-4-β-1 (VLA-4) 및 α-4-β-7 항체, VLA-1 mAb, Biogen이 개발 중인 항-VLA-1 인테그린 항체, LTBR mAb, Biogen이 개발 중인 항-림포톡신 β 리셉터 (anti-lymphotoxin beta receptor; LTBR) 항체, CAT-152, Cambridge Antibody Technology이 개발 중인 항-TGFβ2 항체, J695, Cambridge Antibody Technology 및 Abbott이 개발 중인 항-IL-12 항체, CAT-192, Cambridge Antibody Technology 및 Genzyme이 개발 중인 항-TGFβ1 항체, CAT-213, Cambridge Antibody Technology이 개발 중인 항-에오탁신 1 항체, Lymphostat-B^TM, Cambridge Antibody Technology 및 Human Genome Sciences Inc.이 개발 중인 항-Blys 항체, TRAIL-R1mAb, Cambridge Antibody Technology 및 Human Genome Sciences Inc.이 개발 중인 항-TRAIL-R1 항체, Avastin™ (bevacizumab, rhuMAb-VEGF), Genentech이 개발 중인 항-VEGF 항체, Genentech이 개발 중인 항-HER 리셉터 부류의 항체, 항-조직 인자 (Anti-Tissue Factor; ATF), Genentech이 개발 중인 항-조직 인자 항체, Xolair™ (Omalizumab), Genentech이 개발 중인 항-lgE 항체, Raptiva™ (Efalizumab), Genentech 및 Xoma가 개발 중인 항-CD11a 항체, Genentech 및 Millenium Pharmaceuticals가 개발 중인 MLN-02 항체 (이전에는 LDP-02이란 불림), HuMax CD4, Genmab가 개발 중인 항-CD4 항체, HuMax-IL15, Genmab 및 Amgen이 개발 중인 항-IL15 항체, Genmab 및 Medarex가 개발 중인 HuMax-Inflam, HuMax-Cancer, Genmab 및 Medarex 및 Oxford GcoSciences가 개발 중인 항-헤파라나제 I 항체, Genmab 및 Amgen이 개발 중인 HuMax-Lymphoma, Genmab가 개발 중인 HuMax-TAC, IDEC Pharmaceuticals가 개발 중인 IDEC-131 및 항-CD40L 항체, IDEC-151(Clenoliximab), IDEC Pharmaceuticals가 개발 중인 항-CD4 항체, IDEC-114, IDEC Pharmaceuticals가 개발 중인 항-CD80 항체, IDEC-152, IDEC Pharmaceuticals가 개발 중인 항-CD23, IDEC Pharmaceuticals가 개발 중인 항-대식세포 이동 인자(macrophage migration factor; MIF) 항체, BEC2, Imclone이 개발 중인 항-이디오타입(idiotypic) 항체, IMC-1C11, Imclone이 개발 중인 항-KDR 항체, DC101, Imclone이 개발 중인 항-flk-1 항체, Imclone이 개발 중인 항-VE 카드헤린(cadherin) 항체, CEA-Cide™ (Iabeteuzumab), Immunomedics가 개발 중인 항-암배아 항체(anti-carcinoembryonic antibody; CEA), LymphoCide™ (Epratuzumab), Immunomedics가 개발 중인 항-CD22 항체, Immunomedics가 개발 중인 AFP-Cide, Immunomedics가 개발 중인 MyelomaCide, Immunomedics가 개발 중인 LkoCide, Immunomedics가 개발 중인 ProstaCide, MDX-010, Medarex가 개발 중인 항-CTLA4 항체, MDX-060, Medarex가 개발 중인 항-CD30 항체, Medarex가 개발 중인 MDX-070, Medarex가 개발 중인 MDX-018, Medarex 및 Immuno-Designed Molecules가 개발 중인 항-Her2 항체, Osidem™ (IDM-1), HuMax™-CD4, Medarex 및 Genmab가 개발 중인 항-CD4 항체, HuMax-IL15, Medarex 및 Genmab가 개발 중인 항-IL15 항체, CNTO 148, Medarex 및 Centocor/J&J가 개발 중인 항-TNFα 항체, CNTO1275, Centocor/J&J가 개발 중인 항-사이토카인 항체, MOR101 및 MOR102, MorphoSys가 개발 중인 항-세포내 부착 분자(intercellular adhesion molecule)-1(ICAM-1)(CD54) 항체, MOR201, MorphoSys가 개발 중인 항-섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor)-3(FGFR-3), Nuvion^® (visilizumab), Protein Design Labs가 개발 중인 항-CD3 항체, HuZAF™, Protein Design Labs가 개발 중인 항-감마 인터페론 항체, Protein Design Labs가 개발 중인 항-α5β1-인테그린, Protein Design Labs가 개발 중인 항-IL-12, ING-1, Xoma가 개발 중인 항-Ep-CAM 항체, 및 MLN01, Xoma가 개발 중인 항-Beta 2 인테그린 항체. 이들은 원용에 의해 본 발명에 포함됨.

전술한 항체 및 Fc 융합체 임상 제품 및 후보 물질에 대한 Fc 폴리펩티드의 적용이, 그들의 정밀한 조성에 제한되는 것을 의미하지는 않는다. 본 발명의 Fc 변이체는 전술한 임상 제품 및 후보 물질, 또는 그들과 실질적으로 유사한 항체 및 Fc 융합체 내로 도입될 수 있다. 본 발명의 Fc 폴리펩티드는 기타 다양한 방식으로 인간화된, 친화성 발달된, 조작된, 또는 변형된, 전술한 임상 후보 물질 및 제품의 개조된 형태로도 도입될 수 있다. 나아가, 전술한 임상 제품 및 후보 물질의 전체 폴리펩티드는, 본 발명의 Fc 폴리펩티드를 혼입한 새로운 항체 또는 Fc 융합체를 제작하는 데 사용될 필요는 없다. 예를 들어, 임상 제품 또는 후보 항체의 단지 가변 부위, 실질적으로 유사한 가변 부위, 또는 상기 가변 부위의 인간화된, 친화성 발달된, 조작된, 또는 변형된 개조형이 사용될 수 있다. 또 다른 일면에 있어서, 본 발명의 Fc 변이체는, 전술한 임상 제품 및 후보 물질과 동일한 에피토프, 항원, 리간드, 또는 리셉터에 결합하는 항체 또는 Fc 융합체에 있어서의 용도를 가질 수 있다.

일 구현예로, 본 발명의 Fc 폴리펩티드는 자가면역, 염증 또는 이식 증상들의 치료제로서 사용된다. 표적 항원과 이러한 질병과 관련있는 임상 제품 및 후보 물질들은, 비제한적으로, LDP-02와 같은 항-α4β7 인테그린, LDP-01과 같은 항-β2 인테그린, 5G1.1과 같은 항-보체(C5) 항체, BTI-322와 같은 항-CD2 항체, MEDI-507, OKT3과 같은 항-CD3 항체, SMART 항-CD3, 항-CD4 항체, 예컨대 IDEC-151, MDX-CD4, OKT4A, 항-CD11a 항체, 항-CD14 항체, 예컨대 IC14, 항-CD18 항체, 항-CD23 항체, 예컨대 IDEC 152, 항-CD25 항체, 예컨대 Zenapax, 항-CD40L 항체, 예컨대 5c8, Antova, IDEC-131, 항-CD64 항체, 예컨대 MDX-33, 항-CD80 항체, 예컨대 IDEC-114, 항-CD147 항체, 예컨대 ABX-CBL, 항-E-셀렉틴 항체, 예컨대 CDP850, 항-gpIIb/IIIa 항체, 예컨대 ReoPro/Abcixima, 항-ICAM-3 항체, 예컨대 ICM3, 항-ICE 항체, 예컨대 VX-740, 항-FcR1 항체, 예컨대 MDX-33, 항-IgE 항체, 예컨대 rhuMab-E25, 항-IL-4 항체, 예컨대 SB-240683, 항-IL-5 항체, 예컨대 SB-240563, SCH55700, 항-IL-8 항체, 예컨대 ABX-IL8, 항-인터페론 감마 항체, 항-TNF (TNF, TNFa, TNFa, TNF-alpha) 항체, 예컨대 CDP571, CDP870, D2E7, Infliximab, MAK-195F, 및 항-VLA-4 항체, 예컨대 Antegren을 포함한다.

본 발명의 Fc 변이체는 TNF 저해제 분자에 사용되어 강화된 특성을 제공할 수 있다. FcγRIIIa와 관련된 작용자 기능은 고친화성 다형성을 가지는 류마티스 관절염 또는 건성 관절염 환자의 치료에 사용된 특정 TNF 저해제 분자의 효능과 역으로 작용할 수 있으며, 반대로도 그런 것으로 확인되고 있다(Z. Tutuncu et al., 2004, "FcR Polymorphisms and Treatment Outcomes in Patients with Inflammatory Arthritis Treated with TNF Blocking Agents" oral presentation on October 18, 2004 at the 2004 ACR Meeting, San Antonio, TX; abstract published in Arthritis & Rheumatism, September 2004, incorporated by reference). 류마티스 관절염 또는 건성 관절염과 같은 자가면역 증상들에서, 한가지 이상의 FcγR에 대한 감소된 결합성을 제공하는 Fc 변이체와 TNF를 조합하면 모체에 비해 치료 효능이 증강된다. 이상적으로는, TNF 저해제 분자를 이용한 한가지 이상의 FcγR, 예컨대 FcγRIIIa에 대한 결합성 감소 또는 제거는 최상의 결과를 도출할 것이다.

유용한 TNF 저해제 분자는 포유류에서 TNF-α의 기능을 저해하는 임의의 분자를 포함한다. 적정 예로는, Fc 융합 Enbrel^®(etanercept) 및 항체들, Humira^®(adalimumab) 및 Remicade^®(infliximab)가 있다. 본 발명의 Fc 변이체를 이용하여 Fc 결합성이 감소되도록 조작한 단일클론 항체(예컨대, Remicade 및 Humira)은 보다 우수한 효능을 나타낼 수 있다. Humira, Remicade, 및 Enbrel의 작용자 기능과 작용자 기능 조절은 이들 약물의 개발에서 고려되지 않았다. 자가면역 증상들에서 작용하는 항체 또는 Fc 융합체의 측면에서 한가지 이상의 FcγR에 대한 결합성을 감소시키는 본 발명의 Fc 변이체를 이용함으로써, 현재 시판 제품에 비해 효과가 증강될 수 있다. 유용한 TNF 저해제 분자는 바람직하기로는 우성 음성(Dominant Negative) TNF 분자(USSN 09/798,789, March 2, 2000; 09/981,289, October 15, 2001; 10/262,630, filed September 30, 2002; 및 10/963,994, October 12, 2004, 모두 원용에 의해 포함됨)을 포함한다. 우성 음성 TNF 분자(DN-TNF)는 고유 작용자 활성을 가지지 않으며, (예컨대, tmTNF를 함유하는 세포의 사멸은 류마티스 또는 건성 관절염을 발생시키는 질병에 나쁜 영향을 가지는 경우) 트랜스멤브레인 TNF(tmTNF)를 "모우는(save)" 것으로 작용한다. 수용체에 대한 FcγR 결합성을 감소 또는 젝하는 Fc 변이체 관련 DN-TNF 분자가 바람직하다.

일 구현예에서, 본 발명의 Fc 폴리펩티드는 ADCC 활성을 통해 전체적으로 또는 일부분 치료적으로 작용한다. 표적 항원과 이러한 적용과 관련있는 임상 제품 및 후보 물질들로는, 항-CD20 항체, 예컨대 Bexocar, Rituxan^®, Zevalin^® 및 PRO70769, 항-CD33 항체, 예컨대 Smart M195, anti-CD22 항체, 예컨대 Lymphocide^®, 항-CD30 항체, 예컨대 AC-10 및 SGN-30, 항-EGFR 항체, 예컨대 ABX-EGF, 세투시맵, IMC-C225, Merck Mab 425, 항-EpCAM 항체, 예컨대 Crucell의 항-EpCAM, 항-HER2 항체, 예컨대 Herceptin 및 MDX-210, 및 항-CEA 항체, 예컨대 cantumab 및 Pentacea가 있으며, 이로 한정되는 것은 아니다.

일 구현예에서, 본 발명의 Fc 폴리펩티드는 CDC 활성을 통해 전체적으로 또는 일부분 치료적으로 작용한다. 표적 항원과 이러한 적용과 관련있는 임상 제품 및 후보 물질들로는, 항-CEA 항체, 예컨대 cantumab 및 Pentacea, 항-CD20 항체, 예컨대 Bexocar, Rituxan^®, Zevalin^® 및 PRO70769, 항-EpCAM 항체, 예컨대 Crucell의 항-EpCAM 및 Edrecolomab, 및 항-CD52 항체, 예컨대 Campath^®(alemtuzumab)가 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 Fc 폴리펩티드는 조혈계에서 발현된 항원에 대한 것이다. 표적 항원 및 이러한 사용과 관련있는 임상 제품 및 후보 물질은 항-CD33 항체, 예컨대 Smart M195, 항-CD40L 항체, 예컨대 Antova^®, IDEC-131, 항-CD44 항체, 예컨대 Blvatuzumab, 항-CD52 항체, 예컨대 Campath^®(alemtuzumab), 항-CD80 항체, 예컨대 IDEC-114, 항-CTLA-4 항체, 예컨대 MDX-101, 항-CD20 항체, 예컨대 Bexocar, Rituxan^®, Zevalin^® 및 PRO70769, 항-CD22 항체, 예컨대 Lymphocide^®, 항-CD23 항체, 예컨대 IDEC-152, 항-CD25 항체, 예컨대 Zenapax^®(daclizumab), 및 항-MHC (HLA-DR) 항체, 예컨대 아폴리주맵(apolizumab)을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다.

일 구현예로, 본 발명의 Fc 폴리펩티드는 고형 종양에서 발현되는 항원에 관한 것이다. 표적 항원 및 이러한 용도와 관련된 임상 제품 및 후보 물질들은, 항-EpCAM 항체, 예컨대 Crucell의 항-EpCAM 및 Edrecolomab, 항-CEA 항체, 예컨대 cantumab 및 Pentacea, 항-EGFR 항체, 예컨대 ABX-EGF, 세투시맵, IMC-C225, Merck Mab 425, 항-Muc1 항체, 예컨대 BravaRex, TriAb, 항-Her2 항체, 예컨대 Herceptin, MDX-210, 항-GD-2 갱글리오사이드 항체, 예컨대 3F8 및 TriGem, 항-GD-3 갱글리오사이드 항체, 예컨대 mitumomab, 항-PSMA 항체, 예컨대 MDX-070, 항-CA125 항체, 예컨대 oregovomab, 항-TAG-72 항체, 예컨대 MDX-220, 및 항-MUC-1 항체, 예컨대 cantuzumab가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

바람직한 예에서, 본 발명의 Fc 변이체의 표적은 하나 이상의 그것의 Fc 리간드이다. 본 발명의 Fc 폴리펩티드를 사용하여 면역계의 활성을 조절할 수 있으며, 일부 경우에서는 보다 조절된, 특이적 및 효율적인 방식으로 IVIg 요법의 효과를 모방할 수 있다. IVIg는 정맥내로 전달된 고투여량의 효과적인 면역글로불린이다. 일반적으로, IVIg를 사용하여 자가면역 증상을 하향 조절한다. IVIg의 치료 작용 기작은 고빈도의 Fc 수용체의 삽입(ligation)을 포함한다(J. Bayry et al., 2003, Transfusion Clinique et Biologique 10: 165-169; Binstadt et al., 2003, J Allergy Clin. Immunol, 697-704). 실제 ITP(Ithrombocytopenia purpura) 동물 모델에서는 분리된 Fc가 IVIg의 활성부인 것으로 확인되었다(Samuelsson et al, 2001, Pediatric Research 50(5), 551). 요법에 사용하기 위해, 수천의 공여체로부터 면역글로불린을 수득하는데, 이는 인간에서 수집한 비-재조합 생치료제와 관련된 오염 문제가 있다. 본 발명의 Fc 변이체는 공여체로부터 수득하지 않고 재조합 단백질로서 제조하면서 IVIg의 역할을 모두 제공해야한다.

IVIg의 면역조절 효과는 FcγRs, 보체 단백질 및 FcRn을 비제한적으로 포함하는, 한가지 이상의 Fc 리간드와 생산적인 상호작용에 의존적일 수 있다. 일부 예들에서, 본 발명의 FcγRIIb에 대해 증강된 친화성을 가지는 Fc 변이체를 사용하여 항-염증 활성을 조장하거(Samuelsson et al., 2001, Science 291: 484-486)나 또는 자가면역성을 감소시킬 수 있다(Hogarth, 2002, Current Opinion in Immunology, 14:798-802). 다른 예에서, 하나 이상의 FcγR에 대해 증강된 치화성을 가지는 본 발명의 Fc 폴리펩티드는 그 자체로 또는 추가적인 변형체와 병용 사용하여, 자가면역성을 감소시킬 수 있다(Hogarth, 2002, Current Opinion in Immunology, 14:798-802). 다른 예에서, FcγRIIIa에 대해 증강된 친화성을 가지지만 세포간 시그널링 작용이 감소된 본 발명의 Fc 변이체를 사용하여, FcγRIIIa 결합성을 경쟁적으로 방해함으로써 면역계의 활성화를 감소시킬 수 있다. 관련 Fc 변이체는 원하는 특이성에 극적으로 영향을 미친다. 예컨대, 하나 이상의 활성 FcγR에 대해 증강된 결합성을 제공하는 Fc 변이체는 항체, Fc 융합체, 분리된 Fc 또는 Fc 단편 측면에서 FcγR 길항제로서 작용함으로써 최적의 면역조절 효과를 제공할 수 있다(van Mirre et al., 2004, J. Immunol. 173:332-339). 그러나, 2이상의 Fc 변이체 융합체 또는 접합체는 다른 효과를 제공할 수 있으며, 이러한 Fc 폴리펩티드에 대해, 저해 수용체에 대해 증강된 친화성을 제공하는 Fc 변이체를 사용하기 위해 최적화될 수 있다.

본 발명의 Fc 변이체는 면역조절 치료제로서 사용될 수 있다. 면역계 세포상의 Fc 수용체 결합 또는 차단을 이용하여, 특발성 혈소판 감소증(idiopathic thrombocytopenia purpura)(ITP) 및 류마티스 관절염(RA)를 비제한적으로 포함하는 면역학적 증상에서 면역 반응에 영향을 미칠 수 있다. 본 발명의 치환성이 증강된 Fc 변이체를 사용함으로써, 전형적인 IVIg 이용에 필요한 투여량은 실질적으로 유사한 치료 효과를 얻으면서도 감소될 수 있다. Fc 변이체는 FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIIb, 및/또는 FcγRI를 비제한적으로 포함하는 FcγR에 증강된 결합성을 제공할 수 있다. 특히, FcγRIIb에 결합 증강은 그 수용체의 필요에 따라 발현 또는 저해 활성을 증가시키고 효능을 향상시킬 것이다. 대안적으로, FcγRIIIb 또는 FcγRI과 같은 활성 수용체에 결합 차단은 효능을 향상시킬 수 있다. 또한, FcRn 및/또는 보체에 대한 Fc 변이체의 조절된 친화성 역시 이로울 수 있다.

일 구현예에서, 저해 수용체 FcγRIIb에 증강된 결합성을 제공하는 Fc 변이체는 IVIg 치료 방법에 강화를 제공한다. 특히, 모체 Fc 폴리펩티드보다 FcγRIIb 수용체에 보다 큰 친화성으로 결합하는 본 발명의 Fc 변이체를 사용할 수 있다. 이러한 Fc 변이체는 따라서, FcγRIIb 작용제로서 기능하며, 자가면역 질환 치료제로서 그리고 또한 B-세포 증식의 조절자로서 IVIg의 유리한 효과를 증강시킬 것으로 예상된다. 또한, 이러한 FcγRIIb-증강된 Fc 변이체는 추가적으로 변형되어, 드란 수용체에 동일한 또는 제한된 결합성을 가질 수 있다. 추가적인 예로, 증강된 FcγRIIb 친화성을 가진 Fc 변이체는 다른 수용체에 대한 결합성을 감소 또는 제거하는 돌연변이와 조합되어, 치료적인 용도로 사용시 부작용을 추가적으로 최소화할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 Fc 변이체들의 면역조절성 적용은 암 증상 치료, 특히 항체 요법이 항체-의존적 세포독성 기작을 수반하는 치료에 활용할 수 있다. 예컨대, FcγRIIb에 대한 친화성을 증강시킨 Fc 변이체를 사용하여, 예컨대 Fc/FcγRIIb 결합부에 결합함으로써 이들 저해 수용체를 길항화할 수 있지만, 세포 시그널링을 표적하거나 감소시키지 못하며 항체를 기본으로하는 항암 요법의 효과를 잠재적으로 강화시킬 수 있다. FcγRIIb 길항제로서 작용하는 이러한 Fc 변이체들은 FcγRIIb의 저해 특성을 차단하거나 또는 IVIg 경우에서 처럼 그것의 저해 기능을 유발할 수 있다. FcγRIIb 길항제는 ADCC계 세포독성을 토대로 작용하는 항체를 비제한적으로 포함하는, 모든 다른 치료제들과 조합하여 병용-요법으로서 사용할 수 있다. 이러한 타입의 FcγRIIb 길항적인 Fc 변이체는, 다른 예에서 항체 및 Fc 융합체를 사용할 수 있지만, 바람직하기로는 분리된 Fc 또는 Fc 절편이다.

특성 최적화

본 발명은 치료 관련 특성 대부분이 최적화된 Fc 변이체를 제공한다. Fc 변이체는 모체 Fc 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하며, 이러한 아미노산 변현은 한가지 이상의 최적화된 특성을 제공한다. 본 발명의 Fc 변이체는 적어도 하나 이상의 아미노산 변형에 의해 그것의 모체 Fc 폴리펩티드와는 아미노산 서열이 다르다. 따라서, 본 발명의 Fc 변이체는 모체에 비해 적어도 하나 이상의 아미노산 변형을 가진다. 대안적으로, 본 발명의 Fc 변이체는 모체에 비해 2이상의 아미노산 변형, 예컨대 1 내지 15개의 아미노산 변형, 바람직하기로는 약 1 내지 10개의 아미노산 변형, 가장 바람직하기로는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 변형을 포함할 것 있다. 따라서, Fc 변이체와 모체 Fc 폴리펩티드의 서열은 실질적으로 상동하다. 예컨대, 변형체 Fc 변이체 서열은 모체 Fc 변이체 서열과 약 80% 상동하며, 바람직하기로는 약 90% 이상, 가장 바람직하기로는 약 95% 이상 상동하다.

본 발명의 Fc 변이체는 다양한 특성들이 최적화될 수 있다. 한가지 이상의 최적화된 특성을 나타내도록 조잘 또는 예측된 Fc 변이체는 이후 "최적화된 Fc 변이체"라 한다. 최적화될 수 있는 특성은 FcγR에 대한 친화성 증강 또는 감소를 포함하느, 이로 한정되는 것은 아니다. 바람직한 예에서, 본 발명의 Fc 변이체는 인간 활성화 FcγR, 바람직하기로는 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIIa, 및 FcγRIIIb, 가장 바람직하기로는 FcγRIIIa에 대해 증강된 친화성을 가지도록 최적화된다. 다른 바람직한 예에서, Fc 변이체는 인간 저해 수용체 FcγRIIb에 대해 감소된 친화성을 가지도록 최적화된다. 이들 바람직한 예들은 인간에게서 증강된 치료 특성, 예컨대 증강된 작용자 기능 및 보다 우수한 항암 약효를 가진 Fc 폴리펩티드를 제공한다. 다른 예에서, 본 발명의 Fc 변이체는 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa, 및 FcγRIIIb를 비제한적으로 포함하는 인간 FcγR에 대한 친화성 감소 또는 삭제를 위해 최적화된다. 이들 예들은 인간에게서 증강된 치료 특성, 예컨대 작용자 기능 감소 및 독성 감소를 가진 Fc 폴리펩티드를 제공한다. 다른 예에서, 본 발명의 Fc 변이체는 하나 이상의 FcγR에 대해 증강된 친화성을 제공하며, 그외 다른 하나 이상의 FcγR에 대해선 감소된 친화성을 제공한다. 예컨대, 본 발명의 Fc 변이체는 FcγRIIIa에 대해 증강된 결합성을 제공하며, FcγRIIb에 대해 감소된 결합성을 제공한다. 대안적으로, 본 발명의 Fc 변이체는 FcγRIIa 및 FcγRI에 대한 증강된 결합성을 가질 수 있으며, FcγRIIb에 대핸 감소된 결합성을 가질 수 있다. 또다른 예에서, 본 발명의 Fc 변이체는 FcγRIIb에 대해선 증강된 친화성을, 하나 이상의 활성화 FcγR에 대해선 감소된 친화성을 가질 수 있다.

바람직한 예는 인간 FcγR에 대한 Fc 결합성을 최적화하는 것을 포함하나, 다른 예에서는, 본 발명의 Fc 변이체는 설치류 및 인간을 제외한 영장류를 비제한적으로 포함하는 인간을 제외한 유기체 유래의 FcγRc에 대해 증강된 또는 감소된 친화성을 가진다. 비인간성 FcγR에 대한 결합성이 최적화된 Fc 변이체는 실험에서 사용할 수 있다. 예컨대 마우스 모델은 주어진 후보 약물의 효능, 독성 및 약리와 같은 특성을 테스트할 수 있는 여러가지 질병들에 이용가능하다. 당업계에 알려진 바와 같이, 암 세포를 마우스에 이식 또는 주입하여 인간 암을 모방할 수 있으며, 이러한 과정을 이종이식이라고 한다. 한가지 이상의 마우스 FcγR에 대해 최적화된 Fc 변이체를 포함하는 Fc 변이체 테스트를 통해, 단백질의 효능, 작용 기작 등에 대한 값진 정보를 제공할 수 있다. 본 발명의 Fc 변이체 역시 증강된 기능성 및/또는 어글리코실화된 형태의 용액 특성을 최적화할 수 있다. 바람직한 예에서, 본 발명의 어글리코실화된 Fc 변이체는 모체 Fc 변이체의 어글리코실화된 형태에 비해 보다 높은 친화성으로 Fc 리간드에 결합한다. 상기 Fc 리간드는 비제한적으로 FcγRs, C1q, FcRn, 단백질 A 및 단백질 G를 포함하며, 인간, 마우스, 랫, 토끼 또는 원숭이를 비제한적으로 포함하는 모든 소스, 바람직하기로는 인간 유래일 수 있다. 다른 바람직한 예에서, Fc 변이체는 모체 Fc 변이체의 어글리코실화된 형태에 비해 보다 안정적이며/이거나 보다 가용적이도록 최적화된다.

본 발명의 Fc 변이체는 보체 단백질, FcRn, 및 Fc 수용체 상동체(FcRHs)를 비제한적으로 포함하는, FcγR 이외의 Fc 리간드와 상호작용을 조절하는 변형을 포함할 수 있다. FcRH는 FcRH1, FcRH2, FcRH3, FcRH4, FcRH5, 및 FcRH6을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다(Davis et al., 2002, Immunol. Reviews 190:123-136).

바람직하기로는, 본 발명에 따른 Fc 변이체의 Fc 리간드 특이성은 그것의 치료적 용도를 결정할 것이다. 치료 목적에 있어서 주어진 Fc 변이체의 용도는 표적 항원의 형태 또는 에피토프 및 치료중인 질병 또는 증상에 따라 결정될 것이다. 일부 표적 및 증상들에서, 증강된 FcγR-매개 작용자 기능이 바람직할 수 있다. 이는 특히 항-암 Fc 변이체에 우호적일 수 있다. 따라서, 활성화 FcγR에 대해 증강된 친화성을 및또는 저해 FcγR에 대해 감소된 친화성을 제공하는 Fc 변이체를 포함하는 Fc 변이체를 사용할 수 있다. 일부 표적 및 증상들에서, 여러가지 활성화 FcγR에 대한 상이한 선택성을 제공하는 Fc 변이체를 이용하는 것이 보다 이로울 수 있으며, 예컨대 일부 예들에서, FcγRI이 아닌 FcγRIIa 및 FcγRIIIa에 대한 결합성 증강이 적합할 수 있으며, 반면 다른 예에서, FcγRIIa에 국한된 결합성 증강이 바람직할 수 있다. 특정 표적 및 증상의 경우, FcγR 매개 및 보체 매개 작용자 작용 둘다가 증강된 Fc 변이체를 사용하는 것이 바람직할 수 있으며, 다른 경우에서는 FcγR 매개 또는 보체 매개 작용 기능중 어느 한가지만 증강된 Fc 변이체를 사용하는 것이 이로울 수 있다. 일부 표적 또는 암 증상의 경우, 예컨대 C1q, 하나 이상의 FcγR, FcRn, 또는 하나 이상의 그외 Fc 리간드에 대한 결합성을 낫 아웃시킴으로써, 한가지 이상의 작용자 기능을 감소 또는 제거하는 것이 이로울 수 있다. 다른 표적 및 증상의 경우에서는, 저해 FcγRIIb에 대한 증강된 결합성을 제공하나, 활성화 FcγR에 대해선 천연형 수준, 감소 또는 제거된 결합성을 보이는 Fc 변이체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 특히, 예컨대 목표 Fc 변이체가 여러가지 방식으로 면역계를 조절하거나 염증 또는 자가 면역 질환을 저해할 때, 유용할 수 있다.

주어진 질병을 치료하기 위한 해당 Fc 변이체의 가장 이로운 선택성을 결정하는 주된 파라미터는 Fc 변이체와 관련 있으며, 즉 사용중인 Fc 변이체 타입과 관련있다. 따라서, 해당 Fc 변이체의 Fc 리간드 선택성 또는 특이성은 항체, Fc 융합체 또는 Fc 변이체가 커플링된 융합체 또는 접합 파트너와 함께 구성됨에 따라 여러가지 특성을 제공할 수 있다. 예컨대, 독소, 방사능뉴클레오티드 또는 그외 접합체는 이를 포함하는 Fc 변이체가 하나 이상이 Fc 변이체에 대해 감소되거나 또는 삭제된 결합성을 가진다면 정상 세포에 대해 거의 독성이 없을 것이다. 다른 예로서, 염증 또는 자가면역 질환을 저해하기 위해, 이들 FcγR에 결합하여 그 활성화를 방해하기 위해, 활성화 FcγR에 대해 증강된 친화성을 가진 Fc 변이체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 반대로, FcγRIIb에 대한 증강된 친화성을 가지는 2개 이상의 Fc 부위를 포함하는 Fc 변이체는 면역 세포 표면의 수용체에 공동 참여하여, 상기 세포의 증식을 저해할 수 있다. 반면, 일부 경우에서, Fc 변이체는 한가지 세포 타입상의 그것의 표적 항원에 참여할 수 있으며 표적 항원에서 떨어진 세포상의 FcγR에도 여전히 참여할 수 있지만, 다른 경우들에서 표적 항원으로서 동일 세포 표면상의 FcγR에 참여하는 것이 이로울 수 있다. 예컨대, 항체가 하나 이상의 FcγR를 또한 발현하는 세포상의 항원을 표적으로 한다면, 상기 세포 표면상의 FcγR에 대해 결합성이 증가 또는 감소된 Fc 변이체를 사용하는 것이 좋을 것이다. 이는 예컨대 항암제로서 Fc 변이체를 사용중이 경우 일 수 있으며, 동일 세포 표면에서의 표적 항원과 FcγR의 공동-참여는 생육 저해, 세포자살 또는 그외 항-증식 효과를 초래하는 세포내 시그널링 현상을 조장한다. 대안적으로, 동일 세포상의 항원 및 FcγR의 공동-참여는 Fc 변이체를 여러 방법으로 면역계를 조절하기 위해 사용하는 동안에 이로울 수 있으며, 표적 항원과 FcγR의 공동 참요는 일부 증식성 또는 항-증식성 효과를 제공한다. 이와 같이, 2이상의 Fc 부위를 포함하는 Fc 변이체는 동일 세포 표면에서 FcγR을 공동-참여하기 위한 FcγR 선택성 또는 특이성을 조절하는 Fc 변이체로부터 이익을 얻을 수 있다.

본 발명의 Fc 변이체의 Fc 리간드 특이성을 조절하여 특정 표적 항원, 증상 또는 환자 집단에 맞을 수 있는 여러가지 작용자 기능을 형성할 수 있다. 표 1은 특정 측면에서 변화가 이로울 수 있는 경우에, 여러가지 수용체에 대한 결합성의 개선, 감소 또는 무효능을 포함하는 바람직한 수개의 수용체 결합 프로파일 구현예를 나타낸다. 표의 수용체 결합 프로파일은 특정화된 수용체에 증가 또는 감소 정도를 다양화할 수 있다. 또한, 구체화한 결합 변화는 예컨대 보체 활성화를 차단하기 위해 C1q에 대한 결합성 삭제와의 조합에 의해, 또는 보체 활성화를 증가시키기 위해 C1q 결합성 증강과의 조합에 의해, C1q 또는 FcRn와 같은 다른 수용체에 추가적인 결합 변화와 관련있을 수 있다. 그외 수용체 결합 프로파일과 관련된 다른 예들도 가능하며, 하기 기재된 수용체 결합 프로파일은 예에 불과하다.

표 1

친화성 증강	친화성 감소	세포 활성	치료 활성
FcγRI 단독	-	수지상 세포의 활성, 수득(uptake) 및 이후 항원 존재 증강 항체에 대한 단핵구 및 대식세포 반응 증강	표적에 대한 세포 매개성 면역 반응 증강
FcγRIIIa	-	ADCC 및 다양한 세포 타입의 식균 작용 증강	표적 세포 용혈 증가
FcγRIIIa	FcγRIIb	ADCC 및 다양한 세포 타입의 식균 작용 증강	표적 세포 용혈 증가
FcγRIIb FcγRIIc	-	NK 세포를 제외한 세포 타입이 가지는 모든 FcγR의 활성 감소 FcγRIIc 수용체 시그널링을 통한 NK 세포의 활성화 가능성	NK 세포 접근가능한 표적 세포에 선택적인 표적 세포 용혈 증강
FcγRIIb FcγRIIIa	-	NK 세포의 특이 활성화 및 NK 세포 매개 ADCC의 증강 가능성	NK 세포 접근가능한 표적 세포에 선택적인 표적 세포 용혈 증강
FcγRIIIb	-	호중구 매개 식균작용 증강	호중구 접근가능한 세포에 대한 표적 세포 파괴 증강
FcαR	-	호중구 매개 식균작용 증강	호중구 접근가능한 세포에 대한 표적 세포 파괴 증강
FcγRI FcγRIIa FcγRIIIa	FcγRIIb	수지상 세포의 활성, 수득 및 이후 T 세포에 항원 존재 증강 항체에 대한 단핵구 및 대식세포 반응 증강	표적에 대한 세포 매개성 면역 반응 증강
FcγRIIb	FcγRI FcγRIIa FcγRIIIa	단핵구, 대식세포, 호중구, NK, 수지상 세포 및 그외 감마 수용체를 가지는 세포의 활성 감소	표적을 가지는 세포에 대한 세포 매개 세포독성 소거 또는 감소

여러가지 다형성 형태의 FcγR 존재는 본 발명의 Fc 변이체의 치료학적 활용에 영향을 주는 또다른 파라미터를 제공한다. 여러가지 FcγR 클래스에 대한 해당 Fc 변이체의 특이성 및 선택성은 주어진 질병의 치료를 위해 주어진 항원을 표적으로하는 Fc 변이체의 능력에 현저하게 작용하지만, 이들 수용체의 여러가지 다형성 형태에 대한 Fc 변이체의 특이성 또는 선택성은 연구 또는 전임상 실험으로 테스트에 적합할 수 있는지를 부분적으로 결정할 수 있으며, 궁극적으로 환자 집단의 치료에 반응 여부를 결정할 수 있다. 따라서, FcγR, C1q, FcRn, 및 FcRH를 비제한적으로 포함하는, Fc 리간드 다형성에 대한 본 발명의 Fc 변이체의 특이성 또는 선택성을 사용하여 유효한 연구 및 전임상 실험 선택, 임상 실험 설계, 환자 선택, 투여량 의존성 및또는 그외 임상 실험 관련 측면을 유도할 수 있다.

추가적인 변형

본 발명의 Fc 변이체를 포함할 뿐만 아니라, 본 발명의 Fc 폴리펩티드는 하나 이상의 추가적인 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 아미노산 변형일 수 있으며, 또는 효소학적으로 또는 화학적으로 만들어진 변형과 같은 아미노산 변형이 아니 변형일 수 있다. 추가적인 아미노산 변형 및 아미노산 변형이 아닌 변형의 조합도 포함된다. 이러한 추가적인 변형은 Fc 폴리펩티드에 일부 개선, 예컨대 안정성, 가용성, 기능 또는 임상적인 용도 측면에서의 증진을 제공할 것이다. 본 발명은 본 발명의 Fc 변이체를 추가적인 변형과 커플링함으로써 형성된 여러가지 개선을 포함한다.

본 발명의 Fc 변이체는, FcγRs, C1q 또는 그외 보체 단백질, FcRn, FcR 상동체(FcRHs), 및/또는 아직 확인되지 않은 Fc 리간드를 포함한, 하나 이상의 Fc 리간드와의 변이체 또는 최적화된 상호작용을 제공하는 Fc 부위에서의 그외 아미노산 변형과 조합될 수 있다. 본 발명의 Fc 폴리펩티드는 하나 이상의 Fc 리간드, 예컨대 FcRH와 아직 미확인된 유용한 상호작용을 그자체가 가질 수 있음을 주지하여야 한다. 추가적인 변형은 Fc 리간드의 변이된 또는 최적화된 최적성 및/또는 특이성을 제공할 수 있다. 추가적인 변형은 변이된 또는 최적화된 작용자 기능을 제공할 수 있으며, ADCC, ADCP, CDC 및또는 혈청 반감기를 비제한적으로 포함한다. 이러한 조합은 부가적인, 상승적인 또는 새로운 특성을 제공할 수 있다. 일 구현예로, 본 발명의 Fc 변이체는 공지의 Fc 변이체와 조합될 수 있다 (Duncan et al., 1988, Nature 332:563-564; Lund et al., 1991, J Immunol 147:2657-2662; Lund et al., 1992, Mol Immunol 29:53-59; Alegre et al., 1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al., 1995, Proc Natl Acad Sci U S A 92:11980-11984; Jefferis et al., 1995, Immunol Lett 44:111-117; Lund et al., 1995, Faseb J 9:115-119; Jefferis et al., 1996, Immunol Lett 54:101-104; Lund et al., 1996, J Immunol 157:4963-4969; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogie et al., 2000, J Immunol 164:4178-4184; Reddy et al., 2000, J Immunol 164:1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26; Idusogie et al., 2001, J Immunol 166:2571-2575; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490; Hinton et al., 2004, J Biol Chem 279:6213-6216) (US 5,624,821; US 5,885,573; US 6,194,551; PCT WO 00/42072; PCT WO 99/58572; US 2004/0002587 A1), US 6,737,056, PCT US2004/000643, USSN 10/370,749, 및 PCT/US2004/005112), 이들 모두 원용에 의해 포함됨. 예로, US 6,737,056, PCT US2004/000643, USSN 10/370,749, 및 PCT/US2004/005112에 개시된 바와 같이, 치환 S298A, S298D, K326E, K326D, E333A, K334A, 및 P396L은 최적화된 FcγR 결합성 및/또는 증강된 ADCC를 제공한다. 또한, Idusogie et al., 2001, J. Immunology 166:2571-2572에 개시된 바와 같이, 치환 K326W, K326Y 및 E333S는 보체 단백질 C1q에 대한 증강된 결합성 및 증강된 CDC를 제공한다. 마지막으로, Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216에 개시된 바와 같이, 치환 T250Q, T250E, M428L 및 M428F는 FcRn에 대한 증강된 결합성 개선된 약물 동태학을 제공한다.

FcγRs, C1q 및 FcRn에 대한 결합부는 Fc 부위에 자리잡고 있기 때문에, Fc 부위에서의 IgG들 간의 차이는 FcγR- 및 C1q-매개 작용자 기능상의 차이의 원인이 될 수 있다. 또한, 변형은 예컨대 fab 및 항체의 힌지 부위, 또는 Fc 융합체의 Fc 융합 파트너를 포함한, Fc 변이체의 다른 비-Fc 부위에서 수행될 수 있다. 예컨대, USSN 11/090,981에 개시된 바와 같이, Fab 및 항체의 힌지 부위는 항체 의존적 세포 매개성 세포독성(ADCC), 항체 의존적 세포 매개성 식균작용(ADCP) 및 보체 의존적 세포독성(CDC)와 같은 작용자 기능에 작용할 수 있다. 따라서, Fc 변이체의 Fc 부위 이외의 변형은 본 발명에 포함된다. 예로, 본 발명의 항체는 항체의 V_L, C_L, V_H, C_H1, 및/또는 힌지 부위에서의 하나 이상의 아미노산 변형을 포함할 수 있다.

다른 변형은 Fc 변이체에 부가적인 또는 신규한 결합 결정자(binding determinant), 예컨대 USSN 60/531,752, 12/22,2003, 표제" Fc variants with novel Fc receptor binding sites"에 개시된 바와 같이 부가적인 또는 신규한 Fc 수용체 결합부를 제공할 수 있다. 일 에로, 하나의 항체 이소타입의 Fc 변이체는 상이한 이소타입의 Fc 수용체에 결합하도록 조작될 수 있다. 이는 특히, 각 Fc 수용체에 대한 Fc 결합부가 유의적으로 중복되지 않을 경우에 적용가능할 수 있다. 예를 들면, FcγRI에 대한 IgA 결합의 구조적 결정부를 IgG Fc 변이체에 조작할 수 있다.

본 ㅂ발명의 Fc 변이체는 Fc 변이체의 생체내 약물 동태학적 특성을 조절하는 변형을 포함할 수 있다. 이러한 것으로는, Fc 수용체 FcRn에 대한 친화성을 증강시키는 변형을 비제한적으로 포함한다(USSN10/020354; WO2001US0048432; EP2001000997063; US6277375; USSN 09/933497; WO1997US0003321; US6737056; WO2000US0000973; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276(9): 6591-6604; Zhou et al., 2003, J Mol Biol., 332: 901-913). 이는 pH 특이적인 방식으로 FcRn 친화성을 변형시키는 변형을 더 포함한다. 생체내 반감기 증가가 적합한 일부 예들에서, 보다 높은 pH(7-8) 보다 보다 낮은 pH(5.5-6)에서 FcRn 친화성을 특이적으로 증강시키는 변형이 바람직하다(Hinton et al., 2004, J Biol Chem 279(8): 6213-6216; Dall'Acqua et al., 2002 J Immuno 169: 5171-5180; Ghetie et al., 1997, Nat Biotechnol 15(7): 637-640; WO2003US0033037; WO2004US0011213). 예컨대, Hinton et al., 2004, "Engineered Human IgG Antibodies with Longer Serum Half-lives in Primates" J Biol Chem 279(8): 6213-6216에 개시된 바와 같이, 치환 T250Q, T250E, M428L, 및 M428F는 FcRn에 결합성 증강 및 약물 동태학 향상을 제공한다. 추가적으로 바람직한 변형은 보다 높은 pH에서 보다 낮은 pH에서 천연형 Fc에 대해 개선된 결합성을 유지시키는 변형이다. 생체내 신속한 소거가 바람직한 다른 예의 경우, FcRn에 대한 친화성을 감소시키는 변형이 바람직하다(US6165745; WO1993US0003895; EP1993000910800; WO1997US0021437; Medesan et al., 1997, J Immunol 158(5): 2211-2217; Ghetie & Ward, 2000, Annu Rev Immunol 18: 739-766; Martin et al. 2001, Molecular Cell 7: 867-877; Kim et al. 1999, Eur J Immunol 29: 2819-2825). FcRn을 증강시키는 바람직한 변이체는 2004년 11월 12일자 USSN 60/627,763, 2005년 1월 11일자 60/642,886, 2005년 2월 5일자 60/649,508, 2005년 3월 15일자 및 2005년 4월 6일자 60/669,311, 표제 "Fc Variants with Altered Binding to FcRn"에 개시되어 있으며, 이들 문헌은 원용에 의해 본 발명에 포함된다.

부가적인 변형은 Fc 폴리펩티드내 잔기가 상동성 Fc 폴래펩티드내 해당 잔기로의 변형되는 아미노산 변형을 포함할 수 있다. ADCC, ADCP, CDC와 같은 작용자 기능과 혈청 반감기는 예컨대 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG, 및 IgM(참조문헌 - Michaelsen et al., 1992, Molecular Immunology 29(3): 319-326)을 포함하는 여러가지 항체 클래스들간에 현저하게 상이하다. 인간 IgG1은 치료 목적으로 가장 일반적으로 사용되는 항체이며, 강화된 작용자 기능을 보이는 변이체를 구축하는 조작 실험은 이러한 측면에서 가장 우세적으로 수행된다. 전술한 바와 같이, 서로 현저한 서열 또는 구조적 상동성을 가지는 Fc 폴리펩티드내 해당 또는 동급의 잔기를 결정할 수 있다. 마찬가지로, 2004년 10월 21일자 USSN 60/621,387에 개시된 바와 같이 부가적인 최적화된 특성을 제공하기 위해 Fc 폴리펩티드에 부가적인 아미노산 변형을 조작하기 위한 이러한 방법을 사용할 수 있다. 일 구현예로, 아미노산 변형은 본 발명의 Fc 폴리펩펩티드에 하나 이상의 잔기를 다른 상동성 Fc 폴리펩티드의 하나 이상의 잔기로 치환하는 것을 수행할 수 있다. 다른 예에서, 본 발명의 Fc 폴리펩티드의 한 곳 이상의 부위를 상동성 Fc 폴리펩티드의 해당 부위로 치환하여, 하이브리드 Fc 폴리펩티드를 구축한다. 예컨대, 일부 연구들에서는 서로간의 작용자 기능의 상이성을 결정하는 것을 조사하기 위해, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 변형체를 조사하였다. 예컨대, Canfield & Morrison, 1991, J Exp Med 173: 1483-1491; Chappel et al., 1991, Proc Natl Acad Sci USA 88(20): 9036-9040; Chappel et al., 1993, J Biol Chem 268: 25124-25131; Tao, Canfield, and Morrison, 1991, J Exp Med 173: 1025-1028; Tao et al., 1993, J Exp Med 178: 661-667; Redpath et al., 1998, Human Immunology, 59, 720-727을 참조한다.

일 구현예에서, 본 발명의 Fc 변이체는 하나 이상의 조작된 단백당형를 포함한다. "조작된 단백당형"는 본 명세서에서 Fc 변이체에 공유결합에 의해 부착된 탄수화물 구성을 의미하며, 상기 탄수화물 구성은 모체 Fc 변이체와는 화학적으로 상이하다. 조작된 단백당형는 작용자 기능 증강 또는 감소를 비제한적으로 포함하는, 여러가지 목적에 있어 유용할 수 있다. 조작된 단백당형는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제조될 수 있다(Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473); (US 6,602,684; USSN 10/277,370; USSN 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/29246A1; PCT WO 02/31140A1; PCT WO 02/30954A1); (Potelligent™ technology [Biowa, Inc., Princeton, NJ]; GlycoMAb™ glycosylation engineering technology [GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland]). 이러한 수많은 기법은, 예컨대 조작 또는 그렇지 않은 다양한 유기체 또는 세포주((예, Lec-13 CHO 세포 또는 랫 하이브리도마 YB2/0 세포)에서 Fc 변이체를 발현시킴으로써, 당화 경로에 관여하는 효소(예, FUT8[α1,6-푸코실트랜스퍼라제] 및/또는 β1-4-N-아세틸글루코사미닐트래스퍼라제III [GnTIII]) 를 규제함으로써, 또는 Fc 변이체가 발현된 후 탄수화물을 변형함으로써 Fc 부위에 공유결합으로 부착된 푸코실레이트화된(fucosylated) 및/또는 바이섹팅(bisecting) 올리고당의 레벨을 조절하는 것을 토대로 하며, 따라서 Fc 변이체, 예컨대 항체 또는 Fc 융합체는 조작된 단백당형를 포함할 수 있다. 대안적으로, 조작된 단백당형는 상이한 탄수화물 또는 올리고당을 포함하는 Fc 변이체를 만든다.

본 발명의 Fc 변이체는 본질적으로 작용자 기능과 특이적으로 관련되어 있지 않은 특성의 최적화를 제공하는 한가지 이상의 변형을 포함할 수 있다. 상기 변형은 아미노산 변형일 수 있으며, 또는 효소학적으로 또는 화학적으로 제조된 변형일 수 있다. 이러한 변형은 Fc 변이체에 일부 개선, 예컨대 안정성, 가용성, 기능 또는 임상적인 용도에 있어서의 증진을 제공할 수 있다. 본 발명은 본 발명의 Fc 변이체를 추가적인 변형과 커플링시킴으로써 제조된 다양한 개선을 포함한다.

바람직한 예에서, 본 발명의 Fc 변이체는 인간에서 면역원성(immunogenicity)을 감소시키기 위한 변형을 포함할 수 있다. 가장 바람직한 예에서, 본 발명의 Fc 변이체의 면역원성은 2004년 12월 3일자 USSN 11/004,590, 표제 "Methods of Generating Variant Proteins with Increased Host String Content and Compositions Thereof"에 개시된 방법을 이용하여 감소시킨다. 다른 예에서, 본 발명의 항체는 인간회된다(Clark, 2000, Immunol Today 21:397-402). 본 명세서에서 "인간화된" 항체는 인간 프래임워크 부위(FR) 또는 인간을 제외한 유기체(일반적으로 마우스 또는 랫) 항체로부터 유래된 하나 이상의 상보성 결정 부위(complementarity determining region, CDR)을 포함하는 항체이다. CDR을 제공하는 비-인간 항체는 "공여체"라하고, 프래임워크를 제공하는 인간 면역글로불린은 "수여체"라 한다. 인간화는 공여체 CDR을 수여체(인간) V_L 및 V_H 프래임워크(Winter US 5225539)상에 이식하는 것을 필요로한다. 이러한 방법은 "CDR 이식"이라 한다. 해당 공여체 잔기에 선택된 수영체 프래임워크 잔기의 "역돌연변이(Backmutation)"는 처음 이식된 구조체에서 없어진 친화성을 다시 수득하기 위해 흔히 필요하다(US 5530101; US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 6180370; US 5859205; US 5821337; US 6054297; US 6407213). 인간화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변부의 적어도 일부분 이상을 최적으로 포함할 것이며, 따라서 인간 Fc 부위를 전형적으로 포함할 것이다. 비-인간 항체를 인간화하고 재형성하기 위한 다양한 기법 및 방법들이 당업계에 잘 알려져 있다(Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA), 원용에 의해 본 발명에 포함됨). 인간화 방법은 Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988; Nature 332:323-329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33; He et al., 1998, J Immunol 160: 1029-1035; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9, Presta et al., 1997, Cancer Res 57(20):4593-9; Gorman et al., 1991, Proc Natl Acad Sci USA 88:4181-4185; O'Connor et al., 1998, Protein Eng 11:321-8에 개시된 방법을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 인간화 방법 및 그외 비인간 항체 가변 부위의 면역원성을 감소시키는 방법은, 예컨대 Roguska et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:969-973에 개시된 바와 같이, 재표면화(resurfacing) 방법을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 선별을 토대로한 방법을 사용하여 인간화 및/또는 성숙형 항체 가변 부위를 친화시킬 수 있으며, 상기 방법은 Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678-10684; Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 22611-22618; Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915; Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16(10):753-759를 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 그외 인간화 방법은 USSN 09/810,502; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125; De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076-3084을 비제한적으로 포함하며, CDR의 일부분만을 이식하는 것을 포함할 수 있다. 구조를 토대로한 방법은 예컨대 USSN 10/153,159 및 관련 적용에 개시된 바와 같이 인간화 및 친화성 성숙에 사용할 수 있다.

면역원성을 감소시키기 위한 변형은 MHC 단백질에 대한 모체 서열 유래 가공된 펩티드의 결합성을 감소시키는 변형을 포함할 수 있다. 예로, 임의의 유력한 MHC 대립유전자에 고친화성으로 결합하는 것으로 예측되는 면역 에피토프가 없거나 또는 그 수를 최소화하도록 아미노산 변형을 조작한다. 단백질 서열로 MHC 결합 에피토프를 식별하는 여러가지 방법들이 당업계에 공지되어 있으며, 이를 사용하여 본 발명의 Fc 변이체에 에피토프의 수를 알 수 있다. 예로, WO 98/52976; WO 02/079232; WO 00/3317; USSN 09/903,378; USSN 10/039,170; USSN 60/222,697; USSN 10/339788; PCT WO 01/21823; and PCT WO 02/00165; Mallios, 1999, Bioinformatics 15: 432-439; Mallios, 2001, Bioinformatics 17: 942-948; Sturniolo et al., 1999, Nature Biotech . 17: 555-561; WO 98/59244; WO 02/069232; WO 02/77187; Marshall et al., 1995, J. Immunol . 154: 5927-5933; and Hammer et al., 1994, J. Exp . Med . 180: 2353-2358를 참조한다. 서열을 기초로한 정보를 사용하여 해당 펩티드-MHC 상호작용의 결합 수를 결정할 수 있다(예, Mallios, 1999, Bioinformatics 15: 432-439; Mallios, 2001, Bioinformatics 17: p942-948; Sturniolo et al., 1999, Nature Biotech. 17: 555-561). 주어진 펩티드가 주어진 MHC 분자의 펩티드 결합 그로브에 계산적 위치되고 상호작용 에너지가 결정되는, 구조를 토대로한 방법을 사용할 수 있다(예, WO 98/59244 및 WO 02/069232). 이러한 방법은 "트레딩(threading)" 방법이라 한다. 대안적으로, 한가지 실험 방법을 사용할 수 있으며, 예컨대 목적 단백질 유래 펩티드를 중첩하는 세트는 T 세포 활성화을 유도하는 능력 및/또는 그외 면역 반응 측면에서 실험적으로 테스트할 수 있다(WO 02/77187). 바람직한 예에서, MHC-결합 특성 수친는 매트릭스 방법을 이용하여 단백질 서열에 따라 각 9-잔기 프래임에 대해 계산한다(Sturniolo et. al., supra; Marshall et. al., 1995, J. Immunol. 154: 5927-5933, and Hammer et. al., 1994, J. Exp . Med . 180: 2353-2358). 또한, 이들 잔기의 서브세트에 한정된 수치를 고려하거나, 또는 목적한 9-잔기 프래임 전 및 후의 펩티드 잔기의 정체(identity)를 고려할 수 있다. 상기 매트릭스는 여러가지 인간 클래스 II MHC 분자에서 펩티드 결합 포켓과 상호작용하는 특이적인 아미노산에 대한 결합 수치를 구성한다. 가장 바람직한 예에서, 매트릭스의 수치는 펩티드 결합 실험으로부터 구한다. 다른 바람직한 예에서, 주어진 포켓에 결합하는 주어진 아미노산의 수치는 실험으로 특정화한 대립유전자로부터 상기 포켓 내부의 동일한 또는 유사한 잔기를 가지는 부가적인 대립유전자를 추정한다. 추정에 의해 만들어진 매트릭스를 "가상 매트릭스(virtual matrices)"라 한다. 다른 예에서, 추가적인 아미노산 변형을 조작하여 B 세포 수용체 및 순환성 항체와 상호작용하는 천연 분자의 성향을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 항체 및 Fc 융합체는 최적의 특성을 제공하는, 하나 이상의 Fc 부위 이외, 예컨대 항체 Fab 부위 또는 Fc 융합 파트너에 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항체의 가변부는 친화성이 성숙되어있을 수 있으며, 즉, 아미노산 변형이 항체의 V_H 및/또는 V_L 도메인에 행해져, 그것의 표적에 대한 항체 결합성이 증가될 수 있다. 이와 같이, 변형은 Fc 융합 파트너에 행해져, Fc 융합체와 표적 항원과의 친화성이 증강될 수 있다. 이러한 변형은 표적 항원과의 결합에 있어서 조합 및/또는 해리 동역학을 개선시킬 수 있다. 그외 변형은 표적 항원 대 대안 표적에 대한 선택성을 향상시키는 변형을 포함한다. 이는 표적 대 비-표적 세포에 발현되는 항원에 대한 선택성을 개선시키는 변형을 포함한다. 그외 표적 인지 특성 향상은 부가적인 변형에 의해 제공될 수 있다. 이러한 특성은, 특이적인 동역학 특성(예, 조합 및 해리 동역학), 특정 표적 대 대안 표적에 대한 선택성 및 표적 대 대안 형태의 특이적인 형태를 포함할 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 예로, 전장 대 스플라이스 변이체, 종양 세포와 같은 특성 세포 타입에서만 발현되는 항원의 비정상적인 형태, 세포-표면형 대 가용성 형태, 여러가지 다형성 변이체에 대한 선택성, 또는 표적의 특이적 배위 형태에 대한 선택성을 포함한다.

본 발명의 Fc 변이체는 Fc 변이체의 내재화 감소 또는 증강을 제공하는, 한가지 이상의 변형을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 본 발명의 Fc 변이체를 이용하거나 또는 하나 이상의 Fc 리간드와 상호작용을 통해 이루어지는 Fc 변이체의 세포 내재화를 감소시키기 위해 부가적인 변형을 조합할 수 있다. 이러한 특성은 작용자 기능을 강화하고, 본 발명의 Fc 변이체의 면역원성을 잠재적으로 감소시킬 것으로 예상할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 Fc 변이체를 직접 사용하거나 또는 하나 이상의 Fc 리간드와의 상호작용을 통해 발생되는 Fc 변이체의 세포 내재화를 강화시키기 위해 부가적인 변형과 조합할 수 있다. 예컨대, 바람직한 예에서, 수지상 세포에서 발현되고 초기 면역 반응에 활성형인 FcγRI에 대하여 증강된 결합성을 제공하는 Fc 변이체를 사용한다. 이러한 방법은 Fc 변이체 또는 부착된 융합 또는 접합 파트너 중 어느 하나에 MHC 분자에 의한 Fc 펩티드 단편의 인지 및 존재화를 촉진시키는 부가적인 변형을 조합시킴으로써 더욱 강화될 수 있다. 이러한 방법은 표적 항원 처리를 강화시킬 것으로 예상되며, 따라서 표적 항원의 항원성을 향상시키고(Bonnerot and Amigorena, 1999, Immunol Rev . 172:279-84), 후천적 면역 반응을 촉진시키고 인간 면역계에 의한 표적 세포 사멸을 향상시킨다. 이러한 방법들은 표적 항원이 세포 표면에서 떨어질때, 특히 이롭다. 이러한 개념은 환자의 림프종 세포에 의해 형성된 클론 특이 항체를 사용하여 환자를 면역화하는, 이디오타입 백신(idiotype vaccine) 면역치료법에 적용된다.

바람직한 구현예에서, 이로 제한하는 것은 아니나, 안정성, 가용성 및 올리고머 상태를 포함하는, 본 발명의 Fc 변이체의 생물리학적 특성의 향상을 위해 변형이 가해진다. 변형은 예를 들면, 보다 나은 안정성을 제공하기 위한 것과 같은 보다 양호한 Fc 변이체의 분자간 상호작용을 가져오는 치환, 또는 노출된 비극성 아미노산의 보다 큰 가용성를 갖는 극성 아미노산으로의 치환을 포함한다. 다수의 적정화 목표 및 방법은 USSN 10/379,392 에 기술되어 있으며, 상기 문헌은 본 발명의 Fc 변이체의 추가의 적정화를 위한 부가의 변형에 사용될 수도 있다. 본 발명의 Fc 변이체는, 종양 침투가 향상되거나 또는 목적하는 대로 생체내 제거속도가 증가하는 방식으로 변형되도록 하는, 다량체 상태 또는 크기를 감소시키는 추가의 변형과 조합될 수 있다.

본 발명의 Fc 변이체에 대한 다른 변형은, 특이적인, 동종이량체 또는 동종다량체 분자 형성을 가능하게 하는 것을 포함한다. 이러한 변형은 이로 제한하는 것은 아니나, 조작된 이황화결합, 및 공유결합성 동종이량체 또는 동종다량체의 생성 기전을 제공하는 화학적 변형 또는 응집 방법을 포함한다. 예를 들면 이러한 분자의 생성 방법 및 분자의 조성은 Kan et al ., 2001, J. Immunol ., 2001, 166: 1320-1326; Stevenson et al ., 2002, Recent Results Cancer Res . 159: 104-12; US 5,681,566; Caron et al., 1992, J Exp Med 176:1191-1195, and Shopes, 1992, J Immunol 148(9):2918-22에 기술되어 있다. 본 발명의 변이체에 대한 부가적 변형은 이종이량체, 이종다량체, 이관능성 및/또는 다관능성 분자의, 특이적 형성을 가능하게 하는 것을 포함한다. 이러한 변형은 이로 제한하는 것은 아니나, C_H3 영역에서의 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함하며, 상기 치환은 동종이량체의 형성을 감소시키며 이종이량체의 형성은 증가시킨다. 예를 들면, 이러한 분자의 생성 방법 및 분자의 조성은 Atwell et al., 1997, J Mol Biol 270(1):26-35, 및 Carter et al., 2001, J Immunol Methods 248:7-15에 기술되어 있다. 부가의 변형은 힌지 (hinge) 및 CH3 영역의 변형을 포함하며, 상기 변형은 이량체를 형성하려는 경향을 감소시킨다.

추가의 구현예에서, 본 발명의 Fc 변이체는 단백질분해성 부위를 제거하는 변형을 포함한다. 이러한 변형은 예를 들면 단백질 생산율을 감소시키는 단백질 분해효소 부위 및 생체내에서 투여된 단백질을 분해하는 단백질 분해효소 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 추가의 변형을 수행하여, 탈아미드화 (즉, 글루타민 및 아스파라진 잔기를 탈아미드화하여 각각 글루탐 및 아스파르트 잔기로 전환), 산화, 및 단백질 분해성 부위와 같은 공유결합성 분해 부위를 제거한다. 제거에 특히 유용한 탈아미드화 부위는 탈아미드화 경향을 증가시키는 부위이며, 이는 이로 제한하는 것은 아니나, 아스파라진 및 글루타민와 그 뒤에따라 오는 글라이신 잔기를 포함한다 (각각 NG 및 QG 모티브). 이러한 경우, 아스파라진 및 글루타민 잔기 어느 쪽에서의 치환은 탈아미드화의 경향을 상당히 감소시킨다. 통상적 산화 부위는 메티오닌 및 시스테인 잔기를 포함한다. 제거 또는 도입될 수 있는, 다른 공유결합성 변형은 프롤린 및 라이신의 하이드록실화, 세린 또는 트레오닌 잔기의 하이드록실 기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 "-아미노기"의 메틸화 [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다. 추가의 변형은 N-링크 또는 O-링크된 글리코실화 및 인산화와 같은 후번역 변형을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.

변형은 생물제제의 생산에 통상적으로 사용되는 숙주세포 또는 숙주에서의 발현 및/또는 정제 수율을 증가할 수 있는 것을 포함할 수 있다. 이들은 다양한 동물 세포주 (예, CHO), 이스트 세포주, 박테리아 세포주, 및 식물을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 부가의 변형은 중쇄의 가닥간 이황화 결합의 형성을 감소 또는 제거하는 변형을 포함한다. 부가의 변형은 중쇄의 가닥내 이황화 결합의 형성을 감소 또는 제거하는 변형을 포함한다.

본 발명의 Fc 변이체는 이로 제한 하는 것은 아니나, Cropp & Shultz, 2004, Trends Genet. 20(12):625-30, Anderson et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101(2):7566-71, Zhang et al., 2003, 303(5656):371-3, and Chin et al., 2003, Science 301(5635):964-7에 의해 기술된 방법을 포함하는, 예를 들면 Schultz 등에 의해 개발된 기술을 사용하여 도입된 비천연 아미노산의 사용을 포함하는 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이들 변형은 상술한 다양한 기능, 생물리학적, 면역학적, 또는 제조적 특성의 조작을 가능하게 한다. 부가의 구현예에서, 이들 변형은 기타 목적을 위한 부가의 화학적 변형을 가능하게 한다. 다른 변형도 본 발명에의 사용이 고려된다. 예를 들면, 상기 Fc 변이체는 다양한 비단백질성 폴리머, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중 어느 하나에 연결될 수 있다. 아미노산에 상기 Fc 변이체의 특이적 또는 비특이적인 화학적 또는 후번역 변형과 같은 추가의 변형을 가할 수 있다. 이러한 변형은 페길화 및 글리코실화를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 페길화를 가능하게 하기 위하여 사용될 수 있는 특이적 치환은 신규한 시스테인 잔기 또는 비천연 아미노산의 도입을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니며, 이러한 변형으로 효율적이고 특이적인 커플링법을 사용하여 PEG 또는 다른 중합성 모이어티에의 부착이 가능하다. 특이적 글리코실화 부위의 도입은 본 발명의 Fc 변이체에 신규한 N-X-T/S 서열의 도입에 의해 달성될 수 있다.

본 발명의 Fc 변이체는 하나 이상의 기타 분자 또는 폴리펩티드에 접합체 또는 융합될 수 있다. 접합체 또는 융합 파트너는 임의 분자일 수 있으며, 소분자 화합물 및 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, 다양한 항체 접합체 및 방법은 rail et al., 1999, Curr. Opin. Immunol. 11:584-588에 기술되어 있다. 가능한 접합체 파트너은 사이토카인, 세포독성제, 독소, 방사능물질, 화학치료요법제, 항혈관신생제, 타이로신 카이나제 억제제, 및 기타 치료적 활성 물질을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 접합체 파트너은 페이로드(payload)의 역할을 하는 것으로서, 즉, 접합체의 목적은 Fc 변이체에 의해 다른 파트너을 표적세포 예를 들면 암세포 또는 면역세포로 전달하는 표적화된 전달을 하는 것이다. 따라서, 독소의 항체 또는 Fc 융합체 접합체은 상기 독소를 표적 항원을 발현하는 세포로 표적화한다.

한 구현예에서, 본 발명의 Fc 변이체는 사이토카인에 접합체 또는 융합된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "사이토카인"은 한 세포집단에서 방출되어 세포간 매개자로서 다른 세포에 작용하는 단백질에 대한 총칭이다. 예를 들면, Penichet et al., 2001, J Immunol Methods 248:91-101에서 기술된 바대로, 사이토카인은 항체에 융합되어 목적하는 다양한 특성을 가져올 수 있다. 이러한 사이토카인의 예는, 림포카인, 모노카인, 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이 있다. 사이토카인에 포함되는 것 중에는 성장호르몬 예컨대 인간성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 싸이록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴렉신; 프로릴렉신; 당단백질 호르몬 예컨대 난포자극호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 및 황체형성호르몬(LH); 간성장인자; 섬유모세포 성장호르몬; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양괴사 인자 -알파 및 베타; 뮬러리안 억제 물질; 마우스 생식샘-연관 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관내피성장인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); 신경 성장인자 예컨대 NGF-베타; 혈소판 성장 인자; 형질전환 성장인자(TGF) 예컨대 TGF-알파 및 베타; 인슐린 유사 성장 인자 -I 및 II; 에리쓰로포이에틴 (EPO); 골유도성인자; 인터페론 예컨대 인터페론-알파, 베타, 및 감마; 콜로니 자극 인자 (CSF) 예컨대 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF); 인터류킨(IL) 예컨대 IL-1, IL-1 알파, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, 종양괴사인자 예컨대 TNF-알파 또는 TNF-베타; C5a; 및 기타 LIF 및 kit 리간드 (KL)을 포함하는 폴리펩티드 인자를 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 사이토카인은 천연 또는 재조합의 세포배양으로 제조된 단백질, 및 천연 서열의 사이토카인과 생물학적 활성 동등체를 포함한다.

대안적 구현예에서, 본 발명의 Fc 폴리펩티드는, 이로 제한하는 것은 아니나, 소분자 독소, 효소적으로 활성인 박테리아, 곰팡이, 식물 또는 동물 유래의 독소, 및/또는 그 변이체를 포함하는 독소에 융합, 접합체 또는 작동가능하게 연결된다. 예를 들면, 다양한 면역독소 및 면역독소 방법이 Thrush et al., 1996, Ann. Rev. Immunol. 14:49-71에 기술되어 있다. 소분자 독소는 칼리키아미신, 메이탄신 (US 5,208,020), 트리코텐, 및 CC1065를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 한 구현예에서, Fc 폴리펩티드는 하나 이상의 메이탄신 분자에 접합체된다 (예를 들면 항체 한 분자당 약 1 내지 약 10 메이탄신 분자). 메이탄신은 예를 들면 May-SS-Me로 전환될 수 있으며, 이는 다시 May-SH3로 환원되어 변형된 Fc 폴리펩티드와 반응하여 (Chari et al., 1992, Cancer Research 52: 127-131) 메이탄시노이드-항체 또는 메이탄시노이드-Fc 융합 접합체를 생성한다. 관심있는 다른 접합체는 Fc 폴리펩티드, 예를 들면 하나 이상의 칼리키아미신 분자에 접합체된, 항체 또는 Fc 융합체를 포함한다. 칼리키아미신 패밀리의 항생제는 피코몰 아래의 농도에서 이중 가닥 DNA를 절단할 수 있다. 사용될 수 있는 칼리키아미신의 구조적 유사체는 γ₁ ¹, α₂ ¹, α₃ ¹, N-아세틸-γ₁ ¹, PSAG 및 θ¹ ₁을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다 (Hinman et al., 1993, Cancer Research 53:3336-3342; Lode et al., 1998, Cancer Research 58:2925-2928) (US 5,714,586; US 5,712,374; US 5,264,586; US 5,773,001). 돌라스틴 10 유사체 예컨대 어리스타틴 E (AE) 및 모노에틸어리스타틴 E(MMAE)는 본 발명의 Fc 변이체의 접합체로서 사용될 수 있다 (Doronina et al., 2003, Nat Biotechnol 21(7):778-84; Francisco et al., 2003 Blood 102(4):1458-65). 유용한 효소적으로 활성인 독소는 디프테리아독소 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합성 활성 단편, 엑소톡신 A 사슬 (Pseudomonas aeruginosa 유래), 리신(ricin) A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨락카 아메리카나 (Phytolaca americana ) 단백질(PAP I, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 리스릭토신, 펜노마이신, 엔노마이신 및 트리코테센을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 예를 들면, 원용에 의해 본 명세서에 그 전문이 포함되는 PCT WO 93/21232을 참조하라. 본 발명은 추가로 본 발명의 Fc 변이체 및 핵산분해 활성을 갖는 화합물, 예를 들면 리보뉴클리아제 및 DNA 엔도뉴클리아제 예컨대 데옥시리보뉴클리아제 (DNase)와의 접합체를 추가로 포함한다.

대안적 구현예에서, 본 발명의 Fc 변이체는 방사능물질에 융합, 접합체 또는 작동가능하게 연결되어 방사능 접합체를 형성할 수 있다. 다양한 방사능 동위원소가 방사능접합된 항체 및 Fc 융합의 생산에 사용가능하다. 예로는, 이로제한 하는 것은 아니나, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사능 동위원소를 포함한다. 예를 들면 참조문헌을 참고하라.

추가의 구현예에서, 본 발명의 Fc 변이체는 "수용체" (예를 들면 스트렙타비딘)에 접합체되어 종양 예비 표적화에 사용될 수 있으며, 여기에서 상기 Fc 변이체-수용체 접합체는 환자에게 투여된 후, 제거제를 사용하여 환자의 혈액으로부터 비결합 접합체를 제거하고, 이어서 세포독성제 (예를 들면 방사능뉴클레오타이드)에 접합체되어 있는 "리간드: (예를 들면 아비딘)을 투여한다. 대안적 구현예에서, Fc 변이체는 Antibody Dependent Enzyme Mediated Prodrug Therapy (ADEPT) 의 사용을 위해 효소에 접합체 또는 작동가능하게 연결된다. ADEPT는 상기 Fc 변이체를 전구약물( e.g. 펩티딜 화학치료요법제, PCT WO 81/01145 참조)을 활성화 항암 약물로 전환하는 전구약물-활성화 효소에 접합체 또는 작동가능하게 연결하는 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들면, PCT WO 88/07378 및 US 4,975,278를 참조하라. ADEPT에 유용한 면역접합체의 효소 성분은 전구약물을 보다 활성인, 세포독성 형태로 전환할 수 있도록 전구 약물에 작용할 수 있는 임의의 효소를 포함한다. 본 발명의 방법에 유용한 효소는 이로 제한하는 것은 아니나, 포스파타제 함유 전구약물을 이의 자유 약물로 전환하는 알칼린 포스파타제; 설페이트 함유 전구약물을 이의 자유 약물로 전환하는 아릴설파타제; 비독성 5-플루오로사이토신를 항암제인 5-플루오로우라실로 전환하는 사이토신 데아미나제; 펩티드 함유 전구약물을 자유 약물로 전환하는데 유용한, 프로테아제, 예컨대 세라티아 프로테아제, 써몰리신, 서브틸리신, 카르복시펩티다제 및 카세프신 (예컨대 카세프신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 포함하는 전구약물의 전환에 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화 전구약물을 이의 자유 약물로의 전환에 유용한, 카르보하이드레이트-절단 효소, 예컨대 베타-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; 알파-락탐으로 유도체와 된 약물의 자유 약물로의 전환에 유용한 베타-락타마제; 및 아민 질소에서 각각 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸기로 유도체화된 약물의 자유 약물로의 전환에 유용한, 페니실린 아미다제, 예컨대 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제를 포함한다. 대안적으로, 효소활성을 갖는 항체가 또한 당업계에 "애비자임(abzyme)"으로 공지되어 있으며, 이 또한 본 발명의 전구약물을 자유 활성 약물로 전환에 사용될 수 있다 (예를 들면 Massey, 1987, Nature 328: 457-458 참조). Fc 변이체-애비자임 접합체는 상기 애비자임의 종양 세포 집단으로의 전달용으로 제조될 수 있다. 다양한 추가의 접합체가 본 발명의 Fc 변이체의 사용에 고려될 수 있다. 본 발명의 Fc 변이체의 접합체로서 사용될 수 있는 다양한 화학치료요법제, 항혈관신생제, 타이로신 카이나제 억제제, 및 기타 치료제를 하기에 기술한다.

융합 또는 접합체 파트너로서 고려될 수 있는 것이 Fc 폴리펩티드이다. 따라서, Fc 변이체는 두개 이상의 Fc 영역을 포함하는, 다량체의 Fc 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 분자의 장점은 상기 분자가 단일 단백질 분자로 Fc 수용체에 대한 다수의 결합부위를 제거한다는데 있다. 한 구현예에서, Fc 영역은 화학 공학적 접근법을 사용하여 연결될 수 있다. 예를 들면, Fab' 및 Fc'는 힌지의 시스테인에 있는 씨오에테르 결합에 의해 연결될 수 있으며, 이에 의해 FabFc₂ 와 같은 분자가 생성된다 (Kan et al ., 2001, J. Immunol ., 2001, 166: 1320-1326; Stevenson et al ., 2002, Recent Results Cancer Res . 159: 104-12; US 5,681,566). Fc 영역은, 예를 들면 Caron et al., 1992, J. Exp. Med. 176:1191-1195, and Shopes, 1992, J. Immunol. 148(9):2918-22에 기술된 방법과 같은, 이황화 조작 및/또는 화학적 가교연결을 사용하여 연결될 수 있다. 바람직한 구현예에서, Fc 영역은 유전적으로 연결될 수 있다. 예를 들면 항체의 Fab 및 Fc 영역사이에서 다수의 Cγ2 영역이 융합될 수 있다 (White et al ., 2001, Protein Expression and Purification 21: 446-455). 바람직한 구현예에서, Fc 변이체 중의 Fc 영역은 유전적으로 연결되어 제목이 "Fc polypeptides with novel Fc receptor binding sites" 인, 12/22/2003에 출원된 USSN 60/531,752에 기술된 바대로, 일렬로 반복 연결된 Fc 영역을 생성할 수 있다. 일렬 반복 연결된 Fc 폴리펩티드는 두 개 이상의 Fc 영역, 바람직하게는 1개 내지 3개, 가장 바람직하게는 두 개의 Fc 영역을 포함할 수 있다. 목적하는 가장 바람직한 구조 및 기능적 특성을 갖는, 동종 또는 이종의 일련 반복된 Fc 변이체의 수득을 위하여 다수의 구조체를 만드는 것이 유리할 수 있다. 일련 반복된 Fc 변이체는 동종의 일렬 반복된 Fc 변이체일 수 있으며, 이는 한 이소타입의 Fc 변이체가 유전적으로 동일한 이소타입의 Fc 변이체에 융합된 것이다. 일렬 반복 연결된 Fc 폴리펩티드 상에 다수의 FcγR, C1q, 및/또는 FcRn 결합부위가 존재하기 때문에, 작용자(effector) 기능 및/또는 약동학적 특성이 향상될 수 있다. 대안적 구현예에서, 상이한 이소타입 유래의 Fc 변이체가 일렬 반복적으로 연결될 수 있으며, 이는 이종-일렬 반복 연결된 Fc 변이체로 언급된다. 예를 들면, FcγR 및 FcaRI 수용체를 표적화하는 능력으로 인해, FcγRs 및 FcaRI에 결합하는 Fc 변이체는 상당한 임상적 효과의 향상을 가져올 수 있다.

기술분야의 당업자가 인식하는 바와 같이, 실제에 있어서는 융합 및 접합체의 개념 및 정의는 중복된다. Fc 변이체의 융합 또는 접합체로서의 명명은 이를 본 발명의 임의의 특정한 구현예로 한정하는 것을 의미하는 것이 아니다. 이보다는, 이러한 용어는 다소 광범위한 의미로 넓게 사용되어 본 발명의 임의의 Fc 변이체는 유전적으로, 화학적으로, 또는 그 외의 방법으로, 하나 이상의 폴리펩티드 또는 분자에 연결되어 목적하는 특성을 가져올 수 있다.

융합 및 접합체 파트너은, N- 또는 C-말단, 또는 상기 말단 사이의 일부 잔기를 포함하는, 본 발명의 Fc 변이체의 임의의 영역에 연결될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 융합 및 접합체 파트너은 Fc 변이체의 N- 또는 C-말단, 가장 바람직하게는 N-말단에 연결된다. Fc 변이체를 공유결합적으로 융합 또는 접합체 파트너에 연결하기 위해, 또는 Fc 융합체의 생성을 위해 다양한 연결체가 본 발명에 사용될 수 있다. "연결체", "연결체 서열", "스페이서" "결박(tethering)서열" 또는 이와 문법적으로 동등한 의미의 용어는 본 명세서에서 두 분자를 연결하는 분자 또는 분자 그룹 (예컨대 단량체 또는 중합체)을 연결하는 분자를 의미하는 것으로서, 두 개의 분자를 바람직한 구조적 형태(configuration)에 놓이게 하는 기능을 한다. 다수의 방법을 사용하여 분자를 공유결합적으로 연결할 수 있다. 이는, 이로 제한하는 것은 아니지만, 단백질 또는 단백질 영역의 N- 및 C-말단간의 폴리펩티드 연결, 이황화 결합을 통한 연결, 및 화학적 가교제를 통한 연결을 포함한다. 본 구현에의 한 측면에서 상기 연결체는 재조합 기술 또는 펩티드 합성으로 생성된 펩티드 결합이다. 두 개의 폴리펩티드 사슬이 연결되는 경우와 같은 특정 경우에 적합한 연결체의 선택은 다양한 변수에 의존하며, 이로 제한하는 것은 아니지만, 변수는 상기 두개의 폴리펩티드의 성질 (예를 들면 이들이 자연적으로 올리고머를 형성하는 지 여부), 알려진 경우라면, 연결된 N- 및 C-말단 간의 거리, 및/또는 단백질 분해 및 산화에 대한 연결체의 안정성을 포함한다. 나아가, 상기 연결체는 유연성을 제공하는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 따라서, 연결체 펩티드는 주로 다음의 아미노산을 포함할 수 있다: Gly, Ser, Ala, 또는 Thr. 상기 연결체 펩티드는, 두 개의 분자가 서로에 대하여 올바른 구조적 형태 (conformation)를 취할 수 있게 하여 목적하는 활성을 유지하도록 하는 방식으로 두 분자가 적절하게 연결될 수 있는 길이를 가져야만 한다. 본 목적을 위해 적절한 길이는 하나 이상 내지 50 이하 길이의 아미노산 잔기이다. 바람직하게는, 상기 연결체는 약 1 내지 30개 길이의 아미노산, 가장 바람직하게는 1 내지 20개 길이의 아미노산이 이다. 부가하여 연결체 펩티드에 포함되는 아미노산 잔기는 폴리펩티드의 활성을 실질적으로 방해하지 않는 특성을 나타내야 한다. 따라서, 전체적으로 연결체 펩티드는 상기 폴리펩티드의 활성과 상충되는 전하를 갖지 않거나, 또는 내부적 접힘을 방해하지 않아야 하며, 또는 수용체 단량체 영역의 결합을 심각하게 방해할 수 있는, 하나 이상의 단량체 중의 아미노산 잔기와 결합 또는 기타 상호작용을 하지 않아야 한다. 유용한 연결체는, 당업자라면 모두 인식할 수 있는 바와 같이, 글라이신-세린 중합체 (예를 들면 (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n, 및 (GGGS)n를 포함하며, n은 1 이상의 정수이다), 글라이신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 및 기타 유연한 연결체 예컨대 쉐이커 포타슘 채널의 결박체, 및 다수의 다양한 기타 유연한 연결체를 포함한다. 글라이신-세린 중합체가 이들 아미노산의 상대적인 비구조적 특성으로 인하여 바람직하며, 그러므로 성분사이의 중성의 결박체로서 기능할 수 있다. 두 번째로, 세린은 친수성이며 이로 인해 둥근모양의 글라이신 사슬과 같은 것을 용해되게 할 수 있다. 세 번째, 유사한 사슬은 단일 사슬 항체와 같은 재조합 단백질의 서브유니트의 연결에 효과적인 것으로 나타났다. 적절한 연결체는 또한 두 개의 폴리펩티드 사이의 간격을 연결할 수 있는 자연적으로 발견되는 모티브에 대한 공지된 3차원 구조모델 데이터베이스를 스크리닝하여 규명될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 연결체는 인간 환자에게 투여시 면역원성이 없다. 따라서 연결체는 면역원성이 낮거나 또는 낮은 면역원성을 갖는 것으로 생각되는 것을 선택해야 한다. 예를 들면, 연결체는 인간에서 자연적으로 발견되는 것을 선택할 수 있다. 가장 바람직한 구현예에서, 상기 연결체는 항체의 Fab 및 Fc를 연결하는 서열인, 항체의 힌지 영역의 서열을 가지고 있다; 대안적으로 상기 연결체는 힌지 영역의 일부, 또는 항체의 힌지 영역에 상당히 유사한 서열을 포함하는 서열일 수 있다. 적절한 연결체를 수득하는 다른 방법은 단순한 연결체, 예를 들면, (Gly4Ser)n를 무작위 돌연변이를 통하여 최적화하는 것이다. 대안적으로, 일단, 적절한 폴리펩티드 연결체가 결정되며, 연결된 영역과 보다 적합하게 상호작용하는 아미노산을 선택하기 위해, 부가의 연결체 폴리펩티드를 생성한다. 본 발명에 사용될 수 있는 다른 유형의 연결체는 인공적 폴리펩티드 연결체 및 인테인(intein)을 포함한다. 다른 구현예에서, 이황화 결합은 두 개의 분자를 연결하기 위해 고안된다. 다른 구현예에서, 연결체는 화학적 가교제이다. 예를 들면 다양한 이관능성 단백질 커플링제를 사용할 수 있으며, 이는 N-숙시니미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 숙시니미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체(예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대 디숙시니미딜 수베레이트), 알데하이드 (예컨대 글루타르알데하이드), bis-아지도 화합물 (예컨대 bis (p-아지도벤조일) 헥산디아민), bis-디아조늄 유도체(예컨대 bis-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 bis-활성 플루오린 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 리신(ricin) 면역독소는 Vitetta et al., 1971, Science 238:1098에 기술된 방법대로 제조될 수 있다. 화학적 연결체는 동위원소의 킬레이션을 가능하게 할 수 있다. 예를 들면, 탄소-14로 표지된 1-이소티오씨아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 항체에 방사능뉴클레오타이드의 접합체용으로 사용되는 예시적인 킬레이트화제이다 (PCT WO 94/11026 참조). 연결체는 절단할 수 있어, 세포에서의 세포독성 약물의 방출을 용이하게 한다. 예를 들면, 산에 약한 연결체, 펩티다제에 민감한 연결체, 디메틸 연결체 또는 이황화-함유 연결체가 사용될 수 있다 (Chari et al., 1992, Cancer Research 52: 127-131). 대안적으로, 다양한 비단백질성 중합체가 연결체로 사용될 수 있으며, 이는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌 또는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜의 중합체를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니며, 이러한 연결체는 본 발명의 Fc 변이체를 융합 또는 접합체 파트너에 연결하여 Fc 융합체를 생성할 수 있거나, 또는 본 발명의 Fc 변이체를 접합체에 연결할 수 있다.

조작 방법 ( Engineering Method )

디자인 전략, 컴퓨터 스크리닝 방법, 및 라이브러리 생성 방법은 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 "OptimizedFc Variants and Methods for their Generation" 이라는 명칭의 USSN 10/672,280 및 USSN 10/822,231에 기술되어 있다. 이들 전략, 접근법, 기술 및 방법은 개별적으로 또는 다양한 조합으로 최적화된 Fc 변이체를 생성할 수 있다.

Fc 변이체의 실험적 생산

본 발명은 Fc 변이체를 생산하여 실험적으로 테스트하는 방법을 제공한다. 기술된 방법은 본 발명은 임의의 특정 응용 또는 작동 이론으로 한정하는 것은 아니다. 그 보다는 본 발명에서 제공하는 방법은 하나 이상의 Fc 변이체를 생산하고 이를 실험적으로 테스트하여 다양한 Fc 변이체를 수득하는 것을 일반적으로 설명하기 위한 것이다. 항체 분자생물학, 발현, 정제 및 스크리닝에 대한 일반적 방법은 Antibody Engineering, edited by Duebel & Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689; 및 Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76; Antibodies: A Laboratory Manual by Harlow & Lane, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988에 기술되어 있다.

본 발명의 한 구현예에서, Fc 변이체를 코딩하는 핵산이 생성되며, 이는 이어서 숙주세포로 클로닝되어 필요에 따라 발현되고 분석된다. 따라서, 핵산, 및 특히 DNA는 각 단백질 서열을 코딩하도록 만들어질 수 있다. 이러한 방법은 공지된 방법을 사용하여 수행된다. 예를 들면, 본 발명에 사용될 수 있는 다양한 방법은 Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3^rd Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001), 및 Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons)에 기술되어 있다. 기술분야의 당업자라면 알 수 있듯이, 다수의 서열을 포함하는 라이브러리용의 정확한 서열의 생성은 잠재적으로 고비용이며 많은 시간이 요구되는 것이다. 따라서, 본 발명의 라이브러리의 효과적 생산에 사용될 수 있는 다양한 기술이 있다. 이러한 본 발명에 사용될 수 있는 방법은 US 6,403,312; USSN 09/782,004; USSN 09/927,790; USSN 10/218,102; PCT WO 01/40091; 및 PCT WO 02/25588에 기술되어 있거나, 이들 문헌에서 참조로 기재되어 있다. 이러한 방법은 유전자 어셈블리 방법, PCR을 기초로 하는 방법 및 PCR을 변형한 다양한 방법, 라이게이즈 체인 반응을 기초로 하는 방법, 에러-유발성 증폭 방법, 무작위 돌연변이를 갖는 올리고를 사용하는 방법 및 합성 셔플링에서 사용되는 것과 같은 풀(Pooled) 올리고 방법, 전통적 부위 특이적 돌연변이 유발 방법, 카세트 돌연변이화 및 기타 증폭 및 유전자 합성 방법을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 기술분야에 공지된 바와 같이, 유전자 에셈블리, 돌연변이화, 벡터 서브클로닝 등의 수행을 위한 다양한 키트 및 방법을 시중에서 구할 수 있으며, 이러한 시중의 제품이 Fc 변이체를 코딩하는 핵산의 생성을 위해 본 발명에 사용될 수 있다.

본 발명의 Fc 변이체는 Fc 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는, 핵산, 바람직하게는 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 적절한 조건하에서 배양하여 단백질의 유도 또는 발현을 유발하여 생산될 수 있다. 발현에 적합한 조건은 선택한 발현 벡터 및 숙주세포에 따라 변할 것이며, 당업자라면 이를 통상의 실험을 통하여 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 매우 다양한 종류의 적절한 숙주세포가 사용될수 있으며, 이는 포유류 세포, 박테리아, 곤충세포, 및 이스트를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 예를 들면, 본 발명에 사용될 수 있는 다양한 세포주는 ATCC의 세포주 카탈로그에 기술되어 있으며, 이는 American Type Culture Collection으로 부터 입수할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 상기 Fc 변이체는 포유류 발현 시스템에서 발현되며, 이러한 시스템은 발현 구조체가 레트로바이러스 또는 아데노바이러스를 사용하여 포유류 세포로 도입되는 시스템을 포함한다. 임의의 포유류 세포가 사용될 수 있으며, 인간, 마우스, 래트, 햄스터 및 영장류 세포가 특히 바람직하다. 적절한 세포는 또한 공지된 연구용 세포를 포함하며, 이는 Jurkat T 세포, NIH3T3, CHO, BHK, COS, HEK293, PER C.6, HeLa, Sp2/0, NS0 세포 및 그 변이체를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 대안적으로 바람직한 구현예에서, 라이브러리 단백질은 박테리아 세포에서 발현된다. 박테리아 발현 시스템은 기술분야에서 주지되어 있으며, 에스세리키아 콜라이 (Escherichia coli (E. coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis ), 스트렙토코커스 크레모리스 (Streptococcus cremoris ), 및 스트렙토코커스 리비단스( Streptococcus lividans)를 포함한다. 대안적 구현예에서, Fc 변이체는 곤충세포 (예, Sf21/Sf9, Trichoplusia ni Bti-Tn5b1-4) 또는 이스트 세포 (예, S. cerevisiae, Pichia, etc)에서 생산된다. 대안적 구현예에서, Fc 변이체는 무세포 번역시스템을 사용하여 시험관내에서 발현된다. 원핵 (예, E. coli) 및 진핵 (예, wheat germ, rabbit reticulocytes) 세포 유래의 시험관내 번역 시스템이 사용가능하며, 관심있는 단백질의 발현 수준 및 특성을 기준으로 선택될 수 있다. 예를 들면, 기술분야의 당업자가 인식하듯이, 시험관내 번역은 예를 들면 리보솜 디스플레이와 같은 일부 디스플레이 기술을 필요로 한다. 부가하여, Fc 변이체는 화학적 합성 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 또한 동물 (예, cow, sheep 또는 goat milk, embryonated hen's eggs, whole insect larvae, etc.) 및 식물 (예, corn, tobacco, duckweed, etc.)의 트랜스제닉 발현 시스템을 사용하여 생산될 수 있다.

본 발명의 Fc 변이체를 코딩하는 핵산은 단백질의 발현을 위해 발현 벡터내로 혼입될 수 있다. 다양한 발현 벡터가 단백질 발현에 사용될 수 있다. 발현 벡터는 자가 복제성의 엑스트라-크로모좀 벡터 또는 숙주의 게놈으로 통합되어 들어가는 벡터를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 숙주 세포 유형과 부합되도록 구축된다. 따라서, 본 발명에 사용될 수 있는 발현벡터는 포유류 세포, 박테리아, 곤충세포, 이스트 및 시험관내 시스템에서 단백질 발현을 가능하게 하는 것을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 기술분야에 공지된 바와 같이, 다양한 발현 벡터가 시중 또는 그외의 경로로 입수 가능하며, 이들은 본 발명의 Fc 변이체의 발현에 사용될 수 있다.

발현벡터는 전형적으로 조절 또는 제어 서열과 작동가능하게 연결된 단백질, 선별성 마커, 임의의 융합 파트너, 및/또는 부가의 요소를 포함한다. "작동가능하게

연결된"은 핵산이 다른 핵산과 기능적 관계가 되도록 위치하는 것을 의미한다. 일반적으로, 이러한 발현 벡터는 Fc 변이체를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 전사 및 번역 조절성 핵산 서열을 포함하며, 단백질의 발현에 사용되는 숙주 세포에 전형적으로 적합하다. 일반적으로, 전사 및 번역 조절성 서열은 프로모터 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 개시 및 종결 서열, 번역 개시 및 종결 서열, 및 인핸서 또는 활성화 서열을 포함한다. 기술분야에 공지된 바와 같이, 발현 벡터는 전형적으로 형질전환된 숙주세포의 선별을 가능하게 하는 선별 유전자 또는 마커를 포함한다. 선별 유전자는 기술분야에 주지되어 있으며, 사용되는 숙주세포에 따라 달라질 것이다.

Fc 변이체는 융합 파트너에 작동가능하게 연결되어 발현된 단백질의 표적화, 정제, 스크리닝, 디스플레이 등을 가능하게 할 수 있다. 융합 파트너은 Fc 변이체 서열에 연결체 서열을 통하여 연결될 수 있다. 상기 연결체 서열은 일반적으로 소수의 아미노산 전형적으로 10개 미만을 포함할 것이지만, 이보다 긴 연결체도 또한 사용될 수 있다. 전형적으로, 연결체 서열은 유연성이 있으며, 분해에 저항성이 있도록 선택된다. 기술분야의 당업자가 인식하는 바와 같이, 임의의 매우 다양한 서열이 연결체로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 통상적 연결체 서열은 아미노산 서열 GGGGS을 포함한다. 융합 파트너은 Fc 변이체 및 임의의 회합된 융합 파트너을 목적하는 세포의 위치 또는 세포외 매질로 유도하는 표적화 또는 신호 서열일 수 있다. 기술분야에 공지된 바와 같이, 특정 신호서열은 단백질을 성장 배지로, 또는 세포의 안쪽 및 바깥쪽 막 사이에 위치한, 세포막간공간으로 분비하도록 표적화할 수 있다. 융합 파트너은 정제 및/또는 스크리닝을 가능하게 하는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 서열일 수 있다. 이러한 융합 파트너은 폴리히스티딘 태그 (His-tag) (예를 들면, H₆ 및 H₁₀ 또는 Immobilized Metal Affinity 크로마토그래피 (IMAC) system(예, Ni⁺²affinity columns)과 사용되는 기타 태그), GST 융합, MBP 융합, 스트렙-태그, 박테리아 효소 BirA의 BSP 바이오티닐화 표적 서열, 및 항체에 의해 표적화되는 에피토프 태그 (예를 들면, c-myc 태그, 플래그-태그, 등)을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 기술분야의 당업자가 인식하는 바와 같이, 이러한 태그는 정제, 스크리닝, 또는 이 모두에 유용할 수 있다. 예를 들면, Fc 변이체는 His-태그를 사용하여 이를 Ni⁺² 친화성 컬럼에 부착하여 정제될 수 있으며, 정제 후 동일한 His-태그를 사용하여 항체를 Ni⁺² 코팅된 플레이트에 고정하여 ELISA 또는 기타 결합 분석 (하기에 기술된 바와 같은 것)을 수행한다. 융합 파트너은 Fc 변이체를 스크리닝하기 위한 선별 방법의 사용을 가능하게 한다 (하기 참조). 다양한 선별을 가능하게 하는 융합 파트너은 기술분야에 주지되어 있으며, 이들 모두가 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들면, Fc 변이체 라이브러리의 일원을 유전자 III 단백질에 융합하는, 파아지 디스플레이를 사용할 수 있다 (Kay et al ., Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual, Academic Press, San Diego, CA, 1996; Lowman et al ., 1991, Biochemistry 30:10832-10838; Smith, 1985, Science 228:1315-1317). 융합 파트너은 Fc 변이체의 표지를 가능하게 할 수 있다. 대안적으로, 융합 파트너은 발현 벡터 상의 특정 서열에 결합할 수 있어, 융합 파트너 및 회합된 Fc 변이체가 공유결합적으로 또는 비공유결합적으로 이들을 코딩하는 서열에 결합할 수 있게 한다. 예를 들면, USSN 09/642,574; USSN 10/080,376; USSN 09/792,630; USSN 10/023,208; USSN 09/792,626; USSN 10/082,671; USSN 09/953,351; USSN 10/097,100; USSN 60/366,658; PCT WO 00/22906; PCT WO 01/49058; PCT WO 02/04852; PCT WO 02/04853; PCT WO 02/08023; PCT WO 01/28702; 및 PCT WO 02/07466은 본 발명에 사용될 수 있는 상기와 같은 융합 파트너 및 기술을 개시하고 있다.

외인성 핵산을 숙주세포로 도입하는 방법은 기술분야에 주지되어 있으며, 사용되는 숙주세포에 따라 달라질 것이다. 이러한 기술은 덱스트란-매개된 전달이입, 칼슘포스페이트 침전법, 칼슘클로라이드 처리, 폴리브렌 매개된 전달이입, 프로플라스트 융합, 전기천공, 바이러스 또는 파아지 감염, 폴리펩티드의 리포좀으로의 캡슐화, 및 핵으로의 DNA의 직접 주입을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 포유류 세포의 경우, 전달이입은 일시적 (transient) 또는 안정적 (stable)인 것일 수 있다.

바람직한 구현예에서, Fc 변이체는 발현 후 정제 또는 분리된다. 단백질은 기술분야의 당업자에게 공지된 다양한 방법으로 분리 또는 정제될 수 있다. 표준 정제 방법은 이온 교환, 소수성 상호작용, 친화성, 크기 또는 젤 여과, 및 역상을 포함하는, 대기압 또는 FPLC 및 HPLC와 같은 장비를 사용하여 고압에서 수행되는 크로마토그래프 기술을 포함한다. 정제 방법은 또한 전기영동, 면역적 방법, 침전, 투석, 및 크로마토포거스 기술을 포함한다. 한외여과 및 투석여과 기술을 단백질 농축 기술과 조합하여 사용하는 것도 또한 유용하다. 기술분야에 주지된 바대로, 다양한 천연 단백질이 Fc 및 항체에 결합하고, 이들 단백질을 본 발명의 Fc 변이체의 정제에 사용될 수 있다. 예를 들면, 박테리아 단백질 A 및 G는 Fc 영역에 결합한다. 마찬가지로, 항체가 항원을 표적으로하듯이, 박테리아 단백질 L은 일부 항체의 Fab 영역에 결합한다. 정제는 종종 특정 융합 파트너에 의해 가능할 수 있다. 예를 들면, Fc 변이체는 GST 융합을 사용하는 경우라면 글루타티온 수지를 사용하여 정제될 수 있고, His-태그가 사용되는 경우라면, Ni⁺²친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있거나, 또는 플래그-태그가 사용되는 경우라면, 고정된 항-플래그 항체를 사용하여 정제될 수 있다. 적절한 정제 기술에 대한 일반적인 방법 및 사항에 대하여는, Protein Purification: Principles and Practice, 3^rd Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994를 참조하면 된다. 필요한 정제의 정도는 Fc 변이체의 용도 또는 스크리닝에 따라 달라질 것이다. 일부 경우에는 정제가 필요하지 않을 수도 있다. 예를 들면, 한 구현예에서, 만약 Fc 변이체가 분비되는 경우라면, 스크리닝은 배지에서 직접 수행될 수 있다. 기술분야의 당업자가 인식하듯이, 일부 선별 방법은 단백질을 정제를 필요로 하지 않는다. 따라서, 예를 들면, Fc 변이체의 라이브러리가 파아지 디스플레이 라이브러리로 만들어진다면, 단백질 정제는 수행되지 않을 수 있다.

실험적 분석

Fc 변이체는 다양한 방법을 사용하여 스크리닝 될 수 있으며, 이는 시험관내 분석법, 생체내 및 세포를 기본으로 하는 분석법, 및 선별기술을 사용하는 것을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 자동화 및 고용량 스크리닝 기술이 스크리닝 방법에 사용될 수 있다. 스크리닝은 융합 파트너 또는 표지를 사용할 수 있다. 융합 파트너의 사용은 상술한 바와 같다. 본 명세서에 사용된 용어 "표지된"은 본 발명의 Fc 변이체가 스크리닝에서의 검출을 가능하게 하기 위해 부착되는, 하나 이상의 요소, 동위원소, 또는 화합물을 갖는 것을 의미한다. 일반적으로, 표지는 세가지 부류로 나뉜다: a) 면역 표지로, 이는 항체에 의해 인식되는 융합 파트너로서 통합된 에피토프일 수 있으며, b) 동위원소 표지로, 이는 방사능 또는 중동위원소 일 수 있으며, c) 소분자 표지로, 이는 형광 및 발색염료, 또는 다른 표지 방법의 사용을 가능하게 하는 바이오틴과 같은 분자일 수 있다. 표지는 임의의 위치에서 화합물에 도입될 수 있으며, 또는 단백질 발현 동안에, 시험관내 또는 생체내에서 혼입되어 들어갈 수 있다.

바람직한 구현예에서, Fc 변이체의 기능적 및/또는 생물리적 특성은 시험관내 분석법을 통하여 스크리닝된다. 시험관내 분석은 관심있는 스크리닝의 특성에 대하여 다양한 광범위한 분석을 가능하게 한다. 스크리닝 될 수 있는 Fc 변이체의 특성은 안정성, 용해성, 및 예를 들면, FcγRs와 같은 Fc 리간드에 대한 친화도를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 다수의 특성을 동시에 또는 개별적으로 스크리닝 할 수 있다. 단백질은 분석법에 따라, 정제 또는 비정제 될 수 있다. 한 구현예에서, 스크리닝은 Fc 변이체의, 상기 변이체 결합하는 것으로 공지 또는 생각되는 단백질 또는 비단백질 분자에의 결합에 대한 정량 또는 정성적 결합 분석이다. 바람직한 구현예에서, 스크리닝은 표적 항원에의 결합을 측정하는 결합분석이다. 대안적으로 바람직한 구현예에서, 스크리닝은 Fc 변이체의 Fc 리간드에 대한 결합 분석으로, FcγRs 패밀리, 신생아 수용체 FcRn, 보체 단백질 C1q, 및 박테리아 단백질 A 및 G를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 Fc 리간드는 임의의 유기체 유래일 수 있으며, 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 원숭이가 바람직하다. 결합 분석은 기술분야에 공지된 다양한 방법을 사용하여 수행될 수 있으며, 이는 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 및 BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer)을 기본으로 하는 분석법, 알파스크린a ^TM(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay), Scintillation Proximity Assay, ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), SPR (Surface Plasmon Resonance, also known as BIACORE®), 등온적정열량측정법 (isothermal titration calorimetry), 시차주사열량측정법 (differential scanning calorimetry), 전기 영동법, 및 겔 여과법을 포함하는 크로마토그래피를를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 이들 및 기타 다른 방법은 Fc 변이체의 융합 파트너 또는 표지의 이점을 이용할 수 있다. 분석법은 다양한 검출방법을 포함할 수 있으며, 이에는 색소, 형광, 발광, 또는 동위원소 표지가 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다.

Fc 변이체의 생물리적 특성은, 예를 들면, 안정성 및 가용성는 기술분야에 공지된 다양한 방법을 사용하여 스크리닝 될 수 있다. 단백질 안정성은 접힘 또는 비접힘 상태간의 열역학적 평형을 측정하여 결정될 수 있다. 본 발명의 Fc 변이체는 화학적 변성제, 열, 또는 pH를 사용하여 비접힘상태로 될 수 있으며, 이러한 전이는 원형광이색성분광법, 형광 분광법, 흡광 분광법, NMR 분광법, 열량 측정법, 및 단백질 분해 방법을 통하여 모니터 될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 기술분야의 당업자가 인식하는 바와 같이, 접힘 및 비접힘 전이 동적 변수는 상기 또는 기타 기술을 통하여 모니터될 수 있다. Fc 변이체의 가용성 및 전반적 구조적 완전성(integrity)은 기술분야 공지된 다양한 방법을 사용하여 정량 또는 정성적으로 결정될 수 있다. Fc 변이체의 생물리적 특성의 규명을 위해 본 발명에 사용될 수 있는 방법은 전기영동, 등전압초점맞춤법, 모세관전기영동, 크기배제 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 및 역상 고성능액체 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피, 펩티드 맵핑, 올리고사카라이드 맵핑, 질량분광법, 자외선 흡수 분광법, 형광 분광법, 원형광이색성분광법, 등온적정열량측정법, 시차주사열량측정법, 분석용초원심분리법, 동적광산란분석법. 단백질분해법 및 가교법, 혼탁도 측정법, 여과지연분석법, 면역적 분석법, 형광염료 결합분석법, 단백질 염색법, 현미경 및 ELISA 또는 기타 결합 분석을 통한 응집물 검출법을 포함한다. X-선결정분석 기술 및 NMR 분광법을 사용한 구조적 분석법이 또한 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 안전성 및/또는 가용성는 일정 시간 경과 후에 단백질 용액의 양을 결정하여 측정될 수 있다. 이러한 분석에서, 단백질은 일부 극한 조건, 예를 들면 상승된 온도, 낮은 pH, 또는 변성제 등에 노출되거나 노출되지 않을 수 있다. 기능을 하기 위해서는 안정한, 용해성의 및/또는 잘 접힌/구조화된 단백질을 필요로 하며, 앞서 언급한 기능 및 결합 분석법도 또한 이러한 측정을 할 수 있는 방법이다. 예를 들면, Fc 변이체를 포함하는 용액을 표적 항원에 결합능에 대하여 분석한 후, 하나 이상의 정해진 일정한 시간 동안 상승된 온도에 노출시킨 후, 항원 결합을 다시 분석한다. 접히지 않고 응집된 단백질은 항원에 결합할 수 없기 때문에, 남아있는 활성의 양은 Fc 변이체의 안정성 및 가용성의 척도가 된다.

바람직한 구현예에서, 라이브러리를 하나 이상의 세포를 기본으로 하는 또는 시험관내 분석법을 사용하여 스크리닝한다. 이러한 분석에서, 정제 또는 비정제된 Fc 변이체는 전형적으로 외부에서 가하여, 세포가 라이브러리에 속하는, 개별적 변이체 또는 일군의 변이체에 노출되게 한다. 이러한 분석법은 항상 그런것은 아니지만, 전형적으로 항체 또는 Fc 융합체의 표적 항원에의 결합능 및 예를 들면, 세포터짐(lysis), 식균작용, 리간드/수용체 결합 방해, 성장 및/또는 증식 방해, 세포사멸 등과 같은 효과를 가져오는 작용과 같은 일부 생화학적 반응의 매개능을 기본으로 한다. 이러한 분석법은 종종 세포의 Fc 변이체에 대한 반응, 예를 들면 세포 생존, 세포죽음, 세포성 식균작용, 세포터짐, 세포형태의 변화, 또는 천연 유전자 또는 리포터 유전자의 세포내 발현과 같은 전사 활성을 모니터링 한다. 예를 들면, 이러한 분석법은 Fc 변이체의 ADCC, ADCP, 또는 CDC의 유발능을 측정할 수 있다. 일부 분석에서, 표적세포에 부가하여, 추가의 세포 또는 성분, 예를 들면, 혈청보체성분, 또는 말초혈액단핵구(PBMCs), NK 세포, 대식세포 등과 같은 작용자 세포의 추가가 필요할 수 있다. 이러한 추가의 세포는 임의의 유기체 유래일 수 있으나, 인간, 마우스, 래트, 토끼, 및 원숭이가 바람직하다. 가교되거나 단량체의 항체와 Fc 융합체는 항체의 표적 항원을 발현하는 특정 세포주의 세포사멸을 유발할 수 있거나, 또는 분석에 첨가된 면역세포에 의해 표적 세포에 대한 공격을 매개할 수도 있다. 세포죽음 또는 생존을 모니터링하는 방법은 기술분야에 공지되어 있으며, 염료, 형광물질, 면역화학적 물질, 세포화학적 물질, 및 방사능 물질의 사용을 포한다. 예를 들면, 캐스페이즈 분석법 또는 아넥신-플루오로접합체는 세포사멸의 측정, 및 방사능 기질 (예, Chromium-51 방출분석법)의 흡수 및 방출의 측정을 가능하게 할 수 있으며, 알마르 블루와 같은 형광염료의 대사성 감소는 세포성장, 증식 또는 활성의 모니터를 가능하게 한다. 바람직한 구현예에서, DELFIA®EuTDA-기본 세포독성 분석법(Perkin Elmer, MA)이 사용된다. 대안적으로, 죽거나 또는 손상된 표적 세포는 하나 이상의 천연 세포내 단백질 예를 들면, 락테이트 데하이드로지나제의 방출을 측정하여 모니터될 수 있다. 전사적 활성은 또한 세포를 기본으로 하는 분석법에서 기능을 분석하는 방법으로 사용될 수 있다. 이러한 경우, 상향 또는 하향 조절될 수 있는 천연 유전자 또는 단백질에 대한 분석을 하여 모니터될 수 있으며, 예를 들면 특정 인터루킨의 방출을 측정할 수 있거나, 또는 대안적으로 판독은 루시퍼라제 또는 GFP-리포터 구축물을 사용하여 수행될 수 있다. 세포를 기본으로 하는 분석법은 또한 Fc 변이체 존재에 반응하여 변화한 세포의 형태적 변화의 측정을 포함할 수 있다. 이러한 분석의 세포유형은 원핵 또는 진핵일 수 있으며, 기술분야에 공지된 다양한 세포주가 사용될 수 있다. 대안적으로, 세포를 기본으로 하는 스크리닝은 Fc 변이체를 코딩하는 핵산으로 형질전환 또는 전달이입된 세포를 사용하여 수행된다.

시험관내 분석은 결합분석, ADCC, CDC, 세포독성, 증식, 퍼옥사이드/오존 방출, 작용자 세포의 화학주성, 감소된 작용자(effector) 기능 항체에 의한 상기 분석의 억제; >100x 향상 또는 >100x 감소와 같은 활성의 범위, 수용체 활성의 혼합 및 이렇나 수용체 프로파일로부터 예상되는 분석의 결과를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.

전임상 실험 및 동물모델

본 발명의 Fc 변이체의 생물학적 특성은 세포, 조직, 및 동물 실험에서 규명될 수 있다. 기술분야에 공지된 바와 같이, 약물은, 이의 질환 또는 질환 모델에서의 약물의 치료 효능을 측정하기 위해, 또는 약동학적 특성, 독성 및 기타 다른 특성의 측정을 위해, 종종 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 및 원숭이와 같은 동물에서 시험되나, 이러한 동물로 제한하는 것은 아니다. 상기 동물은 질환 모델로서 언급될 수 있다. 본 발명의 Fc 변이체와 관련하여, 특히 어려운 점은 동물을 사용하여 후보 폴리펩티드의 인간에서의 잠재적 효능에 대하여 평가하는 것이다. 이는 적어도 일부는 인간 Fc 에 대하여 친화도에 특정 영향을 미치는 Fc 변이체가, 종이 다른 동물 수용체에 대하여는 유사한 친화도를 나타내지 않을 수도 있기 때문이다. 이러한 문제는, 진정으로 종간에서 같은 기능을 하는 유전자/단백질 (true orthologues)과의 정확한 회합 가능여부에 대한 어쩔 수 없는 불명확성(Mechetina et al., Immunogenetics, 2002 54:463-468) 및 일부 오쏘로그가 어떤 동물에서는 아에 존재하지 않는다는 사실에 의해 더 커진다 (예를 들면, 인간은 FcγRIIa를 갖지만, 마우스에는 없다). 치료제는 종종 누드마우스, SCID 마우스, 제노그라프트 마우스, 및 트랜스제닉 마우스 (낫인 및 낙아웃 마우스 포함)를 포함하는 마우스에 시험되나, 이들 마우스로만 제한하는 것은 아니다. 예를 들면, 항암 치료제를 목적으로 하는 본 발명의 항체 또는 Fc 융합체는 마우스 암 모델, 예를 들면 제노그라프트 마우스에서 테스트될 수 있다. 이러한 방법에서, 종양 또는 종양 세포주를 마우스에 이식 또는 주입하고, 이어서, 상기 마우스에 치료제를 투여하여 항체 또는 Fc 융합체의 암 성장 또는 전이를 감소 또는 억제하는 능력을 결정한다. 대안적 접근법으로는 면역이 결핍된 마우스에, 적절한 인간 FcγRs를 사용하여 반-기능성의 인간 면역시스템을 부여할 수 있는 인간 PBL을 주입하고, 후속적으로 주입된 인간 종양 세포를 표적으로 하는, 항체 또는 Fc 폴리펩티드를 주입하는 것이다. 이러한 모델에서, 목적하는 항원 (예컨대 SkOV3 난소암세포주 상의 her2/neu)을 표적으로 하는 상기 Fc 폴리펩티드는 마우스내에서 인간 PBL과 상호작용하여 종양을 없애는 작용자 기능에 관여한다. 이러한 실험은 상기 Fc 변이체의 치료제로서의 잠재성을 결정하는데 유용한 데이터를 제공할 수 있다. 임의의 유기체, 바람직하게는 포유류가 테스트에 사용될 수 있다. 예를 들면 인간과의 유전적 유사성으로 인해서, 원숭이가 치료제 테스트 모델로서 적합할 수 있으며, 따라서 본 발명의 Fc 폴리펩티드의 효능, 독성, 약동학적 특성 및 기타 특성의 테스테에 사용될 수 있다. 인간에서의 본 발명의 Fc 변이체의 테스트는 궁극적으로는 약물로서의 승인이 필요로 하기 때문에, 이러한 실험도 본 발명에서 고려된다. 따라서, 본 발명의 Fc 변이체는 인간에서 치료적 효능, 독성, 약동학적 특성 및/또는 기타 임상적 특성에 대하여 시험될 수 있다.

본 발명의 Fc 변이체는 동물 또는 인간에 있어서, Fc 폴리펩티드 치료제에 대하여 탁월한 성능을 부여할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, Fc 변이체와 같은 수용체 결합 프로파일은 예를 들면 세포독성 약물의 효능 증가 또는 약물 작용에 있어 선별성의 향상을 위해 특정 작용자 기능 또는 작용자 세포를 표적화하기 위하여 선택될 수 있다. 추가로, 수용체 결합 프로파일은 일부 또는 모든 작용자 기능을 감소시킴으로써 Fc 폴리펩티드 약물의 부작용 또는 독성을 감소시키도록 선별될 수 있다. 예를 들면, FcγRIIIa, FcγRI 및 FcγRIIa에 대하여 감소된 결합을 나타내는 Fc 변이체를 선택하면 대부분의 세포-매개된 작용자 기능을 제거할 수 있으며, 또는 C1q 에 대하여 감소된 반응을 나타내는 Fc 변이체를 선택하면 보체 매개된 작용자 기능을 제한할 수 있다. 일부 맥락에서 이러한 작용자 기능은 잠재적 독성 효과를 갖는 것으로 알려져 있기 때문에, 이를 제거하는 것은 Fc 폴리펩티드 약물의 안정성을 높일 수 있으며, 이러한 증가된 안정성은 동물 모델을 사용하여 규명될 수 있다. 일부 맥락에서, 이러한 작용자 기능은 목적하는 치료활성을 매개하는 것으로 알려져 있기 때문에, 이들의 향상은 Fc 폴리펩티드 약물의 활성 또는 효능을 증가시킬 수 있으며, 이러한 향상된 활성 또는 효능은 동물모델에서 규명될 수 있다.

최적화된 Fc 변이체는 다양한 동소 종양 모델에서 테스트될 수 있다. 이러한

임상적으로 의미있는 동물모델은 췌장, 전립선 및 유방암과 같은 공격적 암의 치료 및 병생리학적 연구에 있어서 중요하다. 이로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 흉선이 없는 누드 또는 SCID 마우스를 포함하는 면역결핍 마우스가 인간 종양세포 또는 공여환자의 조직이 주입된 내부 장기 (예를 들면, 췌장, 전립선 또는 유선) 부위로부터 퍼진 국소 또는 전신 종양의 스코어링에 자주 사용된다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 Fc 변이체는 임상적으로 의미있는 다양한 인간질병에 대한 동물모델에서 효능이 평가될 수 있다. 많은 경우에, 적절한 모델은 특정 종양 항원에 대한 다양한 트랜스제닉 동물을 포함한다. 적절한 트렌스제닉 모델 예컨대 인간 Fc 수용체(예,, 감마사슬, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb 등을 포함하는 FcγRIIIa)를 발현하는 모델을 사용하여 본 발명의 Fc 폴리펩티드의 효능을 평가하고 시험할 수 있다. 마우스 및 다른 설취류에서 작용자 기능을 직접 또는 간접적으로 매개하는 인간 유전자의 도입에 의한 Fc 변이체의 평가는 종양의 독성 또는 자가질환 및 RA와 같은 기타 질환에서의 효능의 생리학적 연구를 가능하게 한다. FcγRIIIa와 같은 인간 Fc 수용체는 다형(polymorphism)을 가질 수 있으며, 그 결과 158 (기술한 바대로 V 또는 F) 위치에서의 특정 인간 다형 또는 다형의 조합의 설취류로의 도입을 가능하게 한다. 다형-특이적 FcγRs를 포함하는 다양한 연구는 본 부분으로 한정되지 않으며, 본 명세서의 전반에 걸쳐 기술된 바와 같은 FcγRs 일반적 응용 및 논의를 모두 포함한다. 본 발명의 Fc 변이체는 이러한 트렌스제닉 모델에서 Fc 폴리펩티드에 대하여 탁월한 활성을 부여한다. 특히, 인간 FcγRIIIa 매개된 활성에 대하여 최적화된 결합 프로파일을 갖는 변이체는 트렌스제닉 CD16 (FcγRIII) 마우스에서 탁월한 활성을 나타낼 수 있다. 다른 인간 Fc 수용체, e.g. FcγRIIa, FcγRI, 등에 대한 트렌스제닉 마우스에 있어서의 유사한 효능의 향상이 각각 해당하는 수용체에 대하여 최적화된 결합 프로파일을 갖는 Fc 변이체에서 관찰되었다. 다수의 인간 수용체에 대한 트렌스제닉 마우스는 상응하는 다수의 수용체 예를 들면 표 1에 기재된 바와 같은 수용체에 대하여 최적화된 결합 프로파일을 갖는 Fc 변이체에 대하여 향상된 활성을 나타낼 것이다.

트렌스제닉 동물의 형태로 표적 종양 항원 예컨대 인간 CD20의 설취류 B-세포로의 도입법을 사용하여 보다 의미있는 효능을 평가할 수 있다. 그렇기 때문에, 표적항원은 완전한 인간 구조체로 한정되는 것이라기보다는, 표적 항원의 관련성 있는 인간 에피토프를 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 바람직한 구현예에서, Fc 폴리펩티드의 테스트는, 이로 한정하는 것은 아니지만, 인간 표적 항원 및 인간 Fc 수용체 (예, CD16 및 기타 작용자 기능을 수행하는 관련된 수용체)의 조합을 포함하는 트랜스제닉 모델 시스템을 사용하여 효능 및 종양사멸 활성에 대하여 평가할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의, Her2 항원 (예, mu4D5의 Fc 변이체 또는 그의 인간화 유사체)을 표적으로 하는 Fc 폴리펩티드는 임상적으로 의미있는 유방암 마우스 모델에서 효능이 평가될 수 있다. 관련성 있는 모델의 예는 1) FVB/N 마우스 주 유래로서, 원발암 유전자 HER2/neu (neu)의 래트 형에 대하여 트랜스제닉인 HER2/neu (neu-N)-트랜스제닉 마우스, 및 2) 뮤린매머리튜머바이러스 프로모터 하에서 인간 HER2를 과발현하는 트랜스제닉 마우스 (Finkle et al., 2004, Clin Cancer Res.10 (7):2499-511). 이러한 모델에서 탁월한 효능을 보이는 본 발명의 Fc 폴리펩티드는 추가의 개발을 위한 가능성 있는 후보물질임을 나타낸다.

동물모델을 사용하여 인간 환자에서의 후보 치료제의 잠재적 효능성을 시험하는 것과 연관된 곤란성 및 불명확성으로 인하여, 본 발명의 일부 변이체 폴리펩티드는 인간에서의 잠재적 효능의 평가를 위한 프락시(proxy)로서 사용될 수 있다. 이러한 프락시 분자는 바람직하게는 동물 시스템에서의 상응하는 인간 Fc 변이체 후보의 FcγR 및/또는 보체 생물학적 특성을 흉내낸다. 이러한 모방은 특정 Fc 변이체 및 동물 대 인간 수용체 간의 상대적 회합 친화도로 나타날 가능성이 매우 높다. 예를 들면, 마우스모델을 사용하여, 인간 FcγRIIIa에 대하여 향상된 친화성을 나타내는 Fc 변이체의 인간에서의 잠재적 효능을 평가하는 경우라면, 적절한 프락시 변이체는 마우스 FcγRIII-2 (mouse CD16-2)에 대하여 향상된 친화도를 가질 것이다. 대안적으로, 만약 마우스 모델을 사용하여 인간 억제성 수용체 FcγRIIb에 대한 감소된 친화성을 나태내는 Fc 변이체의 인간에서의 잠재적 효능을 평가하는 경우라면, 적절한 프락시 변이체는 마우스 FcγRII에 대하여 감소된 친화성을 나타낼 것이다. 프락시 Fc 변이체는 인간 Fc 변이체의 맥락, 동물 Fc 변이체의 맥락 또는 이 모두의 맥락에서 생성될 수 있음을 또한 주목하라.

바람직한 구현예에서, Fc 변이체의 테스트는 표적 항원을 포함하는 특정 표적 세포의 제거여부에 대한 평가를 용이하게 하기 위하여 영장류(예, 시노몰구스 원숭이 모델)에서의 효능의 연구를 포함할 수 있다. 부가의 영장류 모델은 레서스 원숭이 모델을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니며 자가면역, 이식 및 암 치료 연구에서의 Fc 폴리펩티드를 포함한다.

독성 연구를 수행하여, 표준 약리학적 프로파일에서는 평가될 수 없거나 또는 제제의 반복적 투여 후에만 나타나는 Fc 폴리펩티드 관련 효과를 측정한다. 대부분의 독성 시험은 두 종의 동물, 설취류 및 비설취류에서 수행하여, 새로운 치료제가 인간에 투여되기 전에, 임의의 예상치 못한 부작용이 간과되지 않도록 확인한다. 일반적으로, 이러한 모델은 DNA에 대한 독성, 만성적 독성, 면역원성, 생식/발달에 미치는 독성 및 암유발성을 포함하는 다양한 독성을 측정할 수 있다. 상기 언급한 변수에는 먹이의 섭취, 체중, 항체 형성, 임상화학, 및 표준 기관/조직의 육안 및 현미경적 검사 (예를 들면 심독성)에 대한 표준 측정이 포함된다. 부가의 측정은 만약 있는 경우라면, 주사부위의 외상 및 중화성 항체의 측정이다. 전통적으로, 단일클론 항체 치료제는 그 자체로 또는 접합체화 되어 동물 조직에서 교차 반응성, 면역원성/항체 생산, 접합체 또는 연결체 독성 및 방사능 표지된 종의 "방관자(bystander)" 독성에 대하여 평가된다. 어떠하든 간에, 이러한 연구는 구체적 문제의 해결을 위해 개별적으로 수행되어야 하며, ICH S6에서 정해진 가이드라인을 따라야 한다 (상기 언급한 Safety studies for biotechnological products). 따라서, 일반적 원리는 산물을 충분히 잘 규명하고, 불순물/오염물을 제거하여 시험 물질이 개발 동안에 거의 일정하며 GLP에 적합해야 한다는 것이다.

본 발명의 Fc 변이체의 약동학적(PK) 연구는 다양한 동물 시스템을 사용하여 수행될 수 있으며, 그 중 가장 적합한 것은 비인간 영장류 예컨대 시노몰구스, 레서스 원숭이이다. 6000-배 (0.05-300 mg/kg) 투여량 범위에 걸친 단일 또는 반복된 i.v./s.c. 투여를 한 후, 혈장 농도 및 제거와 안정화상태에서의 분포 부피를 측정하여 반감기 (일 내지 주 단위)를 측정할 수 있으며, 전신 흡수 농도를 측정할 수 있다. 이러한 측정 변수의 예는 일반적으로 관찰된 최대 혈장 농도 (Cmax), Cmax 도달 시간 (Tmax), 0부터 무한대시간 까지[AUC(0-inf]의 혈장농도-시간 곡선 밑 면적 및 겉보기 제거 반감기 (T1/2)를 포함한다. 측정하는 부가의 변수는 i.v. 투여 후에 수득한 농도-시간 데이터 구획 분석 및 생체이용율을 포함할 수 있다. 시노몰구스 원숭이를 사용한 약리/독성학적 연구는 CD20에 대한 단일클론 항체에 대하여 교차 반응성을 갖는 Rituxan 및 Zevalin에 대하여 확립되었다. 생체분포, 방사선량측정 (방사능표지된 항체 또는 Fc 융합체의 경우), 및 PK 연구를 설취류 모델에서 또한 수행할 수 있다. 이러한 연구는 투여된 모든 투여량에서의 내성, 국소 조직에 대한 독성, 설취류 제노그라프트 동물 모델에서의 바람직한 위치화, 표적 세포의 제거 (예, CD20 양성 세포)를 평가할 수 있을 것이다.

본 발명의 Fc 변이체는 동물 및 인간 시스템에서 Fc 폴리펩티드 치료제에 대하여 탁월한 약동학적 특성을 부여할 수 있다. 예를 들면, FcRn에의 증가된 결합은 Fc 폴리펩티드의 반감기 및 노출을 증가시킬 수 있다. 대안적으로, FcRn에 대한 감소된 결합은 감소된 노출이 바람직한 경우에, 예컨대 약물이 부작용이 있는 경우에는 Fc 폴리펩티드의 반감기 및 노출을 감소시킬 수 있다.

다양한 Fc 수용체가 다양한 면역세포 및 상이한 조직에서 발현되는 것으로 기술분야에 공지되어 있다. Fc 수용체의 차별적인 조직 분포는 본 발명의 Fc 변이체의 약역학적 (PD) 및 약동학적 (PK) 특성에 궁극적인 영향을 미칠 수 있다. 본 발명의 Fc 변이체는 다양한 Fc 수용체에 대하여 다양한 친화도를 나타내기 때문에, PD 및/또는 PK 특성에 대한 폴리펩티드의 추가의 스크리닝이, 각각의 후보 폴리펩티드에 의해 부여되는 치료적 효능, PD 및 PK의 최적 균형의 결정을 위해 매우 유용할 수 있다.

약역학적 연구는 종양 특이적 표적화 또는 신호 기전의 차단, 표적 항원 발현 세포 또는 신호의 제거 측정 등을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 본 발명의 Fc 변이체는 특정 작용자 세포 집단을 표적화할 수 있으며 이에 의해, Fc 폴리펩티드로 하여금 효능의 향상 또는 특히 유리한 생리학적 부분으로의 침투 증가를 위해 특정 활성을 동원하도록 하게 할 수 있다. 예를 들면, 호중성 활성 및 국소화는 FcγRIIIb를 선별적으로 표적하는 Fc 변이체에 의해 표적화될 수 있다. 이러한 약역학적 효과는 동물 모델 또는 인간에서 증명될 수 있다.

Fc 변이체의 치료 용도

본 발명의 Fc 변이체는 다양한 치료 목적으로 사용될 수 있다. 당업자라면 이해하는 바와 같이, 본 발명의 Fc 변이체는 항체, Fc 융합체 등이 사용될 수 있는 임의의 치료 목적에 사용될 수 있다. 바람직한 예에 있어서, Fc 변이체는, 제한되지는 않지만 자가면역 및 염증성 질환, 전염성 질환 및 암을 포함하는 질환을 치료하기 위하여 환자에게 투여된다.

본 발명의 목적에 있어서, "환자( patient )"는 인간 및 기타 동물을 포함하며, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 인간을 포함한다. 그러므로, 본 발명의 Fc 변이체는 인간 요법 및 수의학적(veterinary) 용도를 갖는다. 본원에 있어서, "치료( treatment )"란 용어는, 질병 또는 질환의 치료학적 처치(therapeutic treatment)뿐 아니라, 예방학적 처치(prophylactic treatment), 또는 억제 조치(suppressive measure)를 포함하는 것을 의미한다. 그러므로, 예를 들어, 질병이 발생하기 전에 Fc 변이체를 성공적으로 투여하면, 그러한 질환을 치료할 수 있다. 또 다른 하나의 일례로서, 질병의 임상적 징후(clinical manifestation) 이후, 상기 질병의 증후(symptom)를 퇴치하기 위하여, 최적화된 Fc 변이체를 성공적으로 투여하는 것은, 상기 질병을 치료하는 과정에 포함된다. "치료(treatment)"는 또한, 질병이 발현된 후, 상기 질병을 박멸하기 위하여, 최적화된 Fc 변이체를 투여하는 것을 포괄한다. 임상적 증후가 발병한 후 및 임상적 증후가 발달한 이후, 제제를 성공적으로 투여하는 것은, 임상적 증후의 가능한 경감 및 질병의 개선과 함께, 상기 질병을 치료하는 과정을 포함한다. "치료를 필요로 하는( in need of treatment )" 개체란, 이미 질병 또는 질환을 가지는 포유류뿐 아니라, 질병 또는 질환이 예방된 바 있는 포유류를 포함하여, 질병 또는 질환을 갖기 쉬운 포유류를 포함한다.

일 실시예에 있어서, 본 발명의 Fc 변이체는 단백질 또는 다른 분자의 부적절한 발현을 수반하는 질환을 가진 환자에게 투여된다. 본 발명의 범위 내에서, 이는, 존재하는 단백질의 양에 있어서의 변화, 단백질 국재화(localization), 번역후 수정(posttranslational modification), 입체적 구조 상태, 돌연변이체 또는 병원체 단백질의 존재, 등에 기인하는 이상(aberrant) 단백질을 특징으로 하는 질병 및 질환을 포함하는 것을 의미한다. 마찬가지로, 상기 질병 또는 질환은 제한되지는 않지만 다당류 및 갱글리오사이드(ganglioside)를 포함하는 변형 분자를 특징으로 한다. 과다성은, 이들로 제한되지는 않으나, 분자적 수준에 있어서의 과다 발현, 작용 부위에 있어서의 연장된 또는 축적된 출현, 또는 정상 수준에 비하여 증가된 단백질 활성을 포함하는 임의의 원인에 기인할 수 있다. 이러한 정의 내에는, 단백질 감소를 특징으로 하는 질병 및 질환이 포함된다. 그러한 단백질 감소는, 이들로 제한되지는 않으나, 분자적 수준에 있어서의 감소된 발현, 작용 부위에 있어서의 단축된 또는 감소된 출현, 단백질의 돌연변이 형태, 또는 정상 수준에 비하여 감소된 단백질 활성을 포함하는 임의의 원인에 기인할 수 있다. 그러한 단백질 과다 또는 감소는 정상 발현, 출현, 또는 단백질 활성을 기준으로 하여 측정될 수 있으며, 그러한 측정은 본 발명의 Fc 변이체의 개발 및/또는 임상적 테스트에 있어 중요한 역할을 담당할 수 있다.

본원에 있어서, "암( cancer )" 및 "암성 ( cancerous )"이란, 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유류 내에서의 생리학적 증상(physiological condition)을 일컫거나 설명한다. 암의 예로는, 이들로 제한되지는 않으나, 카르시노마, 림프종, 모세포종(blastoma), 사르코마(sarcoma) (림포사르코마 포함), 신경 내분비 종양(neuroendocrine tumor), 메소텔라이오마(mesothelioma), 쉬와노마(schwanoma), 수막종(meningioma), 아데노카르시노마(adenocarcinoma), 흑색종(melanoma), 및 백혈병 또는 림프 악성 종양(malignancy)이 포함된다.

그러한 암의 보다 구체적인 예로는 다음과 같은 것들이 있다: 혈액상 악성 종양, 예를 들어, 호드그킨 림프종; 비-호드그킨 림프종(부르키트 림프종(Burkitt's lymphom), 작은 림프구성 림프종/만성 림프구성 백혈병, 사상균병 균상종(mycosis fungoid), 맨틀 세포 림프종(mantlecell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 발산성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 연변 림프종(marginal zone lymphoma), 모발 세포 백혈병(hairycell leukemia) 및 림프 형질 세포성 백혈병(lymphoplasmacytic leukemia)), 림프구 전구체 세포 종양, 예를 들어 B-세포 급성 림프 모세포성(lymphoblastic) 백혈병/림프종, 및 T-세포 급성 림프 모세포성 백혈병/림프종, 흉선종(thymoma), 성숙된 T 및 NK 세포 종양, 예를 들어 주변 T-세포 백혈병, 성체(adult) T-세포 백혈병/T-세포 림프종 및 거대 과립구 림프구성 백혈병(large granular lymphocytic leukemia), 랑게르한스 세포 혈구증(histocytosis), 골수 신생종(myeloid neoplasia), 예를 들어 급성 골수 백혈병(myelogenous leukemia), 예를 들어, 화농증(maturation)을 동반하는 AML, 분화(differentiation)를 동반하지 않는 AML, 급성 전구 골수구성 백혈병(acute promyelocytic leukemia), 급성 골수 단구성 백혈병(acute myelomonocytic leukemia), 및 급성 단구성 백혈병(acute monocytic leukemia), 골수 이형성 증후군(myelodysplastic syndrome), 및 만성 골수 증식성 질환(clonic myeloproliferative disorder), 예를 들어 만성 골수 백혈병; 중추 신경계(central nervous system)에 있어서의 종양, 예를 들어, 신경교종(glioma), 신경교아종(glioblastoma), 신경아세포종(neuroblastoma), 성형세포종(astrocytoma), 속질 모세포종(medulloblastoma), 뇌실막 세포종(ependymoma), 및 망막 모세포종(retinoblastoma); 두부와 목부의 고형 종양(예컨대, 비강인두암(nasopharyngeal cancer), 타액선 카르시노마, 및 식도암), 폐의 고형 종양(예컨대, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 아데노카르시노마 및 폐의 편평(squamous) 카르시노마), 소화계의 고형 종양(예컨대, 위장암을 포함하는 위암(gastric 또는 stomach cancer), 담즙관의 암, 결장암, 직장암, 대장결장암(colorectal cancer), 및 항문 카르시노마), 생식계의 고형 종양(예컨대, 고환, 음경, 또는 전립선의 암, 자궁, 질, 음문, 자궁경부, 난소 및 자궁내막의 암), 피부의 고형 종양(예컨대, 흑색종, 기저세포암, 편평 상피세포암, 화학선 각화증(actinic keratosis)), 간의 고형 종양(예컨대, 간암, 간장 카르시노마, 간세포 카르시노마 및 간 종양), 뼈의 고형 종양(예컨대, 파골세포 종양(osteoclastoma), 및 용골성 뼈 암(osteolytic bone cancer), 부가적 조직 및 기관의 고형 종양(예컨대, 췌장암, 방광암, 신장암 또는 신암(renal cancer), 갑상선암, 유방암, 복막의 암, 및 카포시 사르코마(Kaposi's sarcoma)), 및 혈관계의 종양(예컨대, 안지오사르코마(angiosarcoma) 및 혈관주위 세포종(hemagiopericytoma)).

본원에 있어서, "자가면역 질환"에는 다음이 포함된다: 동종 격리 이식 거부반응(allogenic islet graft rejection), 원형 탈모증, 교착성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 아디손 질환(Addison's disease), 안티뉴트로필 세포질 자가항체(ANCA), 부신의 자가면역 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 심근염, 자가면역 호중구 감소증, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역 혈소판 감소증, 자가면역 두드러기, 베세트 질환(Behcet's disease), 수포성 유천포창, 심근증, 카스텔만 증후군(Castleman's syndrome), 복강 스프루스 피부염(celiac spruce-dermatitis), 만성 피로 면역 기능장애 증후군, 만성 염증성 탈수 다발성 신경장애, 처그-스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 반흔성 유천포창, CREST 증후군, 저온 응집소 질환, 크론병, 피부근염, 원판상 루푸스, 필수 혼합 크리오글로불린 혈증, 제8 인자 결핍증, 결합조직염-섬유근염, 신구체신염, 그레이브 질환(Grave's disease), 귈랑-바레 증후군, 굿파스튀르 증후군(Goodpasture's syndrome), 그라프트-대-호스트(graft-versus-host) 질환(GVHD), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 혈우병 A, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반병(ITP), IgA 신경장애, IgM 다발성 신경장애, 면역 중개 혈소판 감소증, 소아성 관절염, 가와사키병(Kawasaki's disease), 태선 플란투스(lichen plantus), 루푸스 홍반증, 메니에르병(Meniere's disease), 혼합 연결 조직 질환, 다발성 경화증, 타입 1 당뇨병, 중증 근무력증, 통상적 천포창(pemphigus vulgaris), 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염(polyarteritis nodosa), 다연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발성 근육통, 다발성 근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린 혈증, 원발성 담즙성 간경변, 건선, 건선 관절염, 레이놀드 현상(Reynauld's phenomenon), 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 류마티스성 관절염, 유육종증 경피증, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 고체 기관 이식 거부반응, 스티프맨 증후군(stiff-man syndrome), 전신 낭창성 홍반증, 타카야스 동맥염, 일시적 관절염/거대 세포 관절염, 혈전성 혈소판 감소성 자반병, 궤양성 대장염, 포도막염, 피부염 포진상 맥관염과 같은 맥관염(vasculitides), 백반, 및 웨그너 육아종증(Wegner's granulomatosis).

본원에 있어서 "염증성 질환"에는 다음이 포함된다: 급성 호흡 장애 증후군(ARDS), 급성 패혈성 관절염, 알러지성 뇌척수염, 알러지성 비염, 알러지성 혈관염, 알러지, 천식, 아테롬성 동맥경화증, 만성 박테리아 또는 바이러스 감염으로 인한 만성 염증, 만성 폐색성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 관상 동맥 질환, 뇌염, 염증성 장 질환, 염증성 골융해(osteolysis), 급성 및 지연성 과민 반응과 관련된 염증, 종양과 관련된 염증, 주변 신경 상해 또는 탈수 질환, 화상 및 국소 빈혈과 같은 조직 외상과 관련된 염증, 수막염으로 인한 염증, 다중 기관 상해 증후군, 폐 섬유증, 패혈증 및 패혈성 쇼크, 스티븐스-존슨 증후군, 미분화 관절증(undifferentiated arthropy), 및 미분화 척추관절증(spondyloarthropathy).

본원에 있어서 "전염성 질환"은 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 원충(ptotozoa) 및 기생충과 같은 병원체에 의해 야기되는 질환을 포함한다. 전염성 질환은 다음을 포함하는 바이러스에 의해 야기될 수 있다: 아데노바이러스, 시토메갈로바이러스, 뎅기열, 엡스타인-바르(Epstein-Barr), 한타, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 타입 I 단순 포진, 타입 II 단순 포진, 인체 면역결핍 바이러스(HIV), 인간 유두종 바이러스(human papilloma virus; HPV), 인플루엔자, 홍역, 유행성 이하선염, 파포버 바이러스(papova virus), 폴리오, 호흡기 다핵성 바이러스(syscytial virus), 우역(rinderpest), 리노바이러스, 로타바이러스, 풍진, SARS 바이러스, 천연두, 바이러스성 수막염 등. 전염성 질환은 또한 다음과 같은 박테리아에 의해 야기될 수 있다: 바실러스 안트라시스, 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 캄필로박터 공장균(campylobacter jejuni), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클로스트리듐 보투리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 파상풍균, 디프테리아, 대장균, 레지오넬라, 헬리코박터 파일로리, 마이코박테리움 리켓챠, 마이코플라스마 네시세리아(Mycoplasma nesisseria), 백일해, 녹농균, S. 뉴모니아, 연쇄구균, 포도상구균, 비브리아 콜레라, 페스트균 등. 전염성 질환은 또한, 아스페르길루스 푸미가투스, 블라스토마이세스 더마티티디스, 칸디다 알비칸스, 콕시디오이데스 이미티스, 크립토코쿠스 네오포르만스, 히스토플라스마 캅술라툼, 페니실리움 마르네페이 등과 같은 진균에 의해 야기될 수도 있다. 전염성 질환은 또한 클라미디아, 코크지디오아, 리슈마니아, 말라리아, 리켓챠, 트리파노소마 등과 같은 원충 및 기생충에 의해 야기될 수도 있다.

또한, 본 발명의 Fc 변이체는, 제한되지는 않지만 다음을 포함하는 증상의 예방 또는 처치에 사용될 수 있다: 울혈성 심부전(CHF), 심근염 및 기타 심근 이상과 같은 심장 이상; 만성 피지선 염증, 여드름 및 습진과 같은 피부 이상; 골 상실, 골다공증, 페제트병(Peget's disease), 랑게르한스 세포 히스티오시토시스(histiocytosis), 치주 질환, 골 감소, 골 연화증, 단골 섬유성 형성이상증(monostotic fibrous dysplasia), 다골성 섬유성 형성이상증, 골 전이, 골 통증 제어, 체액성 악성 칼슘과다혈증, 치주 복원, 척수 상해 및 골절과 같은 뼈와 치아 이상; 고셰병(Gaucher's disease); 쿠싱 증후군(Cushing's syndrome)과 같은 내분비선 이상; 및 신경학적 이상.

포뮬레이션 , 투여 및 투여량

본 발명의 Fc 변이체 및 하나 이상의 치료적 활성제가 처방되어 있는 약물 조성물을 도모한다. 본 발명의 Fc 변이체의 포뮬레이션은, 원하는 순도를 가진 상기 Fc 변이체와 선택적인 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 냉동 건조 제형 또는 수용액 형태로 혼합함으로써 저장을 위해 제조된다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980). 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 피투여자에 대해 무독성이며, 다음과 같은 물질을 포함한다: 인산염, 시트르산염, 아세트산염, 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산과 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들면, 옥타데실디메틸벤질 암모늄클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 오르벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이상류 및 기타 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린과 같은 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 슈크로스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨과 같은 슈거; 감미류 및 기타 조미제; 미세 결정질 셀룰로오스, 락토오스, 콘 및 기타 전분과 같은 충전제; 결합제, 첨가제, 착색제; 나트륨과 같은 염 형성 카운터 이온; 금속 착체(예; Zn-단백질 착체); 및/또는 TWEEN^TM, PLURONICS^TM 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)와 같은 미이온성 계면활성제. 바람직한 예에서, 본 발명의 Fc 변이체를 포함하는 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 염으로 존재하는 것과 같은 수용성 형태로 되어 있을 수 있으며, 이는 산과 염기 모두의 부가염(addition salt)을 포함한다는 것을 의미한다. "약제학적으로 허용되는 산 부가염"이라 함은, 유리 염기의 생물학적 유효성을 유지하고 생물학적으로 바람직한 염으로서, 염화수소산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산 및 다음과 같은 유기산에 의해 형성된다: 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말레산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산 등.

"약제학적으로 허용되는 염기 부가염"으로는, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 등의 염과 같은 무기 염기로부터 유도된 것이 포함된다. 특히 바람직한 것으로는, 암모늄, 칼륨, 나트륨, 칼슘 및 망간 염이다. 약제학적으로 허용가능한 유기 무독성 염기로부터 유도된 염으로는, 1차, 2차 및 3차 아민의 염, 천연 발생 치환 아민을 포함하는 치환된 아민, 환형 아민 및 염기성 이온교환 수지, 예를 들면 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 및 에탄올아민이 포함된다. 생체내 투여용으로 사용되는 포뮬레이션은 무균인 것이 바람직하다. 이것은 무균 여과 멤브레인을 통한 여과 또는 기타 방법에 의해 용이하게 달성된다.

본 원에 개시되는 Fc 변이체는 또한 면역 리포솜(immunoliposome)으로서 처방될 수 있다. 리포솜은 포유류에 대한 치료제의 전달에 유용한, 다양한 형태의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제를 포함하는 소낭(vesicle)이다. Fc 변이체를 함유하는 리포솜은, 하기 문헌에 기재되어 있는 바와 같은 공지된 방법에 의해 제조된다: Epstein et al., 1985, Proc natl Acad Sci USA, 82:3688; Hwang et al., 1980, Proc Natl Acad Sci USA, 77:4030; US 4,485,045; US 4,544,545; 및 PCT WO 97/38731. 순환 시간을 강화시킨 리포솜은 US 5,013,556에 개시되어 있다. 리포솜의 성분은 보통 생물학적 막의 지질 배열과 유사한 이중막 형성으로 배열되어 있다. 특히 유용한 리포솜은, 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG 유도 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하여 역상 증발법(reverse phase evaporation method)에 의해 생성될 수 있다. 리포솜은 규정된 크기의 기공을 가진 필터를 통해 압출하여 원하는 직경을 가진 리포솜이 얻어진다. 선택적으로, 리포솜 내에 화학요법제 또는 다른 치료상 활성제가 함유된다(Gabizon et al., 1989, J National Cancer Inst 81:1484).

Fc 변이체 및 다른 치료적 활성제는 또한, 제한되지 않지만, 액적 형성(coacervation) 기법, 계면 중합(예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐, 또는 폴리(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐을 이용하여), 콜로이드 약물 전달 시스템(예컨대, 리포솜, 알부민 마이크로 구체, 마이크로에멀젼, 나노 입자 및 나노캡슐), 및 마크로에멀젼을 포함하는 방법에 의해 제조된 마이크로캡슐에 담겨질 수 있다. 그러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980에 개시되어 있다. 서방형 제제(sustained-release preparation)를 제조할 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예로는, 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이들 매트릭스는 예를 들면 필름이나 마이크로캡슐과 같은 성형물 형태로 되어 있다. 서방형 매트릭스의 예로는, 폴리에스테르, 하이드로젤(예; 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리액타이드(US 3,773,919), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-굴루타메이트의 코폴리머, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 코폴리머, 예를 들면 LUPRON DEPOT^®(락트산-글리콜산 코폴리머 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사형 마이크로 구체), 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산, 및 ProLease^®(Alkermes사로부터 구입 가능)(폴리-DL-락타이드-코-글리콜라이드(PLG)의 매트릭스 내에 혼입된 소망의 생물활성 분자로 이루어진 마이크로구체계 전달 시스템)가 포함된다.

바람직하게는 멸균 수용액 형태로 되어 있는 본 발명의 Fc 변이체를 포함하는 약제학적 조성물의 투여는, 제한되지는 않지만, 다음과 같은 다양한 경로를 통해 이루어질 수 있다: 경구(orally), 피하(subcutaneously), 정맥내(intravenously), 비내(intranasally), 이내(intraotically), 경피(transdermally), 국소(topically)(예를 들어, 젤, 고약(salve), 로션(lotion), 크림(cream) 등), 복막내(intraperitoneally), 근육내(intramuscularly), 폐내(intrapulmonary), 질(vaginally), 비경구(parenterally), 직장(rectally), 또는 안내(intraocularly) 경로. 일부의 경우, 예를 들어 상처 또는 염증 등을 치료하는 경우, Fc 변이체는 용액 또는 스프레이(spray)로서 직접 적용될 수 있다. 따라서, 당 기술 분야에 공지된 바와 같이, 상기 약제학적 조성물은 투여 방식에 따라 제형화될 수 있다.

경우에 따라서는 환자 자신이 약제학적 조성물의 투여자이기 때문에 피하 투여가 바람직할 수 있다. 많은 단백질 치료제는 치료적으로 유효한 투여량의 포뮬레이션에 있어서 피하 투여에 대한 최대 허용가능 체적으로 할 수 있기에는 충분치 못하다. 이 문제는 아르기닌-HCl, 히스티딘 및 폴리소르베이트(WO 04091658 참조)를 포함하는 단백질 포뮬레이션을 이용함으로써 부분적으로 해결할 수 있다. 본 발명의 Fc 폴리펩티드는, 예를 들어 증가된 효능, 향상된 혈청 분감기 또는 증강된 가용성로 인해 피하 투여에 대해 더욱 용이할 것이다.

해당 분야에 알려져 있는 바와 같이, 단백질 치료제는 종종 정맥내 주사 또는 환괴(bolus)로 전달된다. 본 발명의 Fc 변이체도 그러한 방법으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 주입 매개체로서 0.9% 소금과 함께 정맥내 주사하여 투여될 수 있다.

폐를 통한 전달은 흡입기 또는 호흡 보조기(nebulizer) 및 에어로졸화제를 포함하는 포뮬레이션을 이용하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, Aradigm으로부터 상업적으로 입수 가능한 AERx^® 흡입 가능한 기술(inhalable technology) 또는 Nektar Therapeutics로부터 상업적으로 입수 가능한 Inhance^TM 폐 전달 시스템을 이용할 수 있다. 본 발명의 Fc 변이체는 폐내 전달에 대해 보다 용이할 수 있다. FcRn이 폐에 존재하여 폐로부터 혈류로 수송을 촉진할 수 있다 (예; Syntonix 재04004798, Bitoni et al. (2004) Proc. Nat. Acad. Sci. 101:9763-8). 따라서, 폐에서 FcRn을 보다 효과적으로 결합하거나 혈류에서 보다 효율적으로 방출되는 항체 또는 Fc 용융체는 폐내 투여를 통해 향상된 생물학적 이용도를 가질 수 있다. 본 발명의 Fc 변이체는 또한, 예를 들여 향상된 가용성 또는 변화된 등전점으로 인해 폐내 투여에 대해 보다 용이할 수 있다.

더 나아가, 본 발명의 Fc 폴리펩티드는, 예를 들어 위의 pH에서 향상된 안정성 및 단백질 분해에 대한 증가된 내성으로 인해 경구 전달에 대해 보다 용이할 수 있다. 또한, FcRn은 성인의 장내 상피에서 발현되는 것으로 보이며(Dickinson et al., 1999, J Clin Invest 104:903-11), 따라서 본 발명의 Fc 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 Fc 용융체는 향상된 FcRn 작용 프로파일을 가짐으로써, 경구 투여를 통해 증강된 생물학적 이용도를 나타낼 수 있다. Fc 변이체의 RcRn 매개 수송은 또한 다른 점막, 예를 들면 위장, 호흡기, 및 생식기 관에서와 같은 점막에서 일어날 수 있다(Yoshida et al., 2004, Immunity 20:769-83).

이에 더하여, 다수의 전달 시스템 중 어느 것이나 종래 기술에 알려져 있으며, 본 발명의 Fc 변이체를 투여하는 데 이용될 수 있다. 그 예로는, 제한되지는 않지만, 리포솜, 마이크로 입자, 마이크로구체(예; PLA/PGA 마이크로구체) 등에서의 캡슐화가 포함된다.

이와는 달리, 멤브레인이나 섬유를 포함하는 다공성, 비다공성, 또는 젤라틴형 재료를 사용할 수 있다. 서방형 시스템은, 폴리에스테르, 하이드로젤, 폴리(비닐알코올), 폴리락타이드, L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트, 에틸렌-비닐 아세테이트, LUPRON DEPOT^®과 같은 락트산-글리콜산 코폴리머 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산과 같은 폴리머 재료 또는 매트릭스를 포함할 수 있다. 또한, 예를 들면 레트로바이러스 감염, 직접 주사 또는 지질, 세포 표면 수용체, 기타 트랜스펙션제에 의한 코팅에 의해 본 발명의 Fc 변이체를 코딩하는 핵산을 투여할 수 있다. 모든 경우에, 서방형 시스템은 원하는 작용 지점에 또는 그에 근접하게 Fc 변이체를 방출하는 데 이용될 수 있다.

투여량 및 투여 빈도는, 바람직한 예에서, 치료학적으로 또는 예방학적으로 효과적이 되도록 선택된다. 해당 분야에서 알려져 있는 바와 같이, 단백질 분해, 전신 대비 국소 전달 및 새로운 프로테아제 합성의 속도뿐 아니라, 연령, 체중, 일반적 건강 상태, 성별, 다이어트, 투여 시간, 약물 상호작용 및 상태의 심각성에 대한 조절이 필요할 것이며, 당업자에 의한 일상적인 실험에 의해 구명될 수 있을 것이다.

포뮬레이션에서의 치료학적으로 활성인 Fc 변이체의 농도는 약 0.1 내지 100 중량% 범위로 변동될 수 있다. 바람직한 실시에에서, Fc 변이체의 농도는 0.003 내지 1.0 몰의 범위이다. 환자를 치료하기 위해서, 본 발명의 Fc 변이체의 치료학적 유효 투여량을 투여할 수 있다. 여기서 말하는 "치료학적 유효 투여량"이란 그것이 투여되어 기대되는 효과를 생성하는 투여량을 의미한다. 정확한 투여량은 치료 목적에 좌우될 것이며, 당업자라면 공지된 기법을 이용하여 구명할 수 있을 것이다. 투여량은 체중 1 kg당 0.0001 내지 100 mg 이상, 예를 들면 체중 1 kg당 0.1 mg, 1 mg, 10 mg, 또는 50 mg일 수 있고, 1-10 mg/kg이 바람직하다.

몇몇 실시예에서는, Fc 변이체의 단일 투여량이 사용된다. 다른 실시예에서는, Fc 변이체의 다중 투여량이 사용된다. 투여 사이의 경과 시간은 1시간 미만, 약 1시간, 약 1-2시간, 약 2-3시간, 약 3-4시간, 약 6시간, 약 12시간, 약 24시간, 약 48시간, 약 2-4일, 약 4-6일, 약 1주일, 약 2주일, 또는 2주일 이상일 수 있다.

다른 실시예에서, 본 발명의 Fc 변이체는, 연속적인 주입 또는 연장된 휴식 기간 없는 빈번한 투여에 의해, 규칙적인 투여법(metronomic dosing regime)으로 투여된다. 그러한 규칙적 투여는 휴식 기간 없이 일정한 간격으로 투여하는 방법이 포함된다. 전형적으로 그러한 투여법은, 예를 들어 1-2일, 1-2주일, 1-2개월 또는 6개월 이하 또는 그 이상으로 연장된 기간 동안 장기적인 저투여량 또는 연속적 주입법을 포함한다.

특정한 실시예에서, 본 발명의 Fc 변이체 및 하나 이상의 다른 예방학적 약제 또는 치료제를 환자에게 순환방식으로 투여한다. 순환방식 치료(cycling therapy)는, 한 시점에 제1 약제를 투여하고, 제2 시점에 제2 약제를 투여하고, 선택적으로 추가 시점, 선택적으로 휴식 기간에 추가 약제를 투여하고, 이어서 이러한 투여 순서를 1회 이상 반복하는 방법을 포함한다. 순환 회수는 전형적으로 2-10회이다. 순환방식 치료는 하나 이상의 약제에 대한 내성의 발달을 감소시킬 수 있고, 부작용을 최소화하거나 치료 효과를 향상시킬 수 있다.

조합방식 치료법( combination - therapy ) 및 병용 치료법( co - therapy )

본 발명의 Fc 변이체는 하나 이상의 다른 치료법 또는 치료제를 수반하여 투여될 수 있다. 추가적 치료법 또는 치료제는 Fc 변이체의 효능 또는 안정성을 향상시키기 위해 이용될 수 있다. 또한, 추가적 치료법 또는 치료제는 Fc 변이체의 작용을 변화시키기 위해서가 아니라 동일한 질환 또는 공존이환(comorbidity)을 치료하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 Fc 변이체는 화학요법, 방사선 요법, 또는 화학요법과 방사선 요법 모두와 함께 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 Fc 변이체는, 제한되지는 않지만, 세포독성제(cytotoxic agent), 화학요법제, 사이토킨(cytokine), 성장 억제제, 항-호르몬제, 키나아제 억제제, 항-맥관형성제(anti-angiogenic agent), 심장보호제, 면역자극제, 면역억제제, 혈액학적 세포의 증식을 촉진하는 약제, 맥관형성 억제제, 단백질 티로신 키나아제(PTK) 억제제, 부가적 Fc 변이체, FcγRIIb 또는 다른 Fc 수용체 억제제, 또는 그 밖의 치료제를 포함하는 하나 이상의 다른 예방제 또는 치료제와 조합하여 투여될 수 있다.

"조합하여" 및 "공동 투여"라는 용어는 정확히 동일한 시간에 상기 예방제 또는 치료제를 투여하는 것에 한정되지 않는다. 그와는 달리, 상기 용어는 본 발명의 Fc 변이체와 다른 약제(들) 중 어느 하나만을 사용하여 치료하는 것에 비해 그 두 가지가 함께 작용하여 증가된 이점을 제공하도록, 본 발명의 Fc 변이체 및 다른 약제(들)을 소정의 시간 내에 순차적으로 투여되는 것을 의미한다. 본 발명의 Fc 변이체 및 다른 약제(들)이 부가적으로 작용하는 것이 바람직하고, 특히 상승 작용을 하는 것이 바람직하다. 그러한 분자들은 의도하는 목적에 효과적인 양으로 조합 내에 적절히 존재한다. 숙련된 의료인은 실험적으로, 또는 약제의 약물 통태학(pharmacokinetics) 및 작용 방식을 고려하여, 각각의 치료제의 적절한 투여량 및 적절한 투여 시기와 방법을 결정할 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명의 Fc 변이체는 항체 또는 Fc를 포함하는 하나 이상의 추가적 분자와 함께 투여된다. 본 발명의 Fc 변이체는 동일한 질환 또는 부가적 공존이환을 처치하는 데 있어서 약효를 가진 하나 이상의 다른 항체와 함께 공동 투여되고; 예를 들면 주어진 형태의 암에서 과다 발현되는 2개의 항원 또는 자가면역 또는 전염성 질환의 병발을 조정하는 2개의 항원을 인지하는 2개의 항체를 투여할 수 있다.

공동 투여될 수 있는 항암 항체의 예는, 제한되지는 않지만, 다음과 같은 것이 포함된다: Panorex^TM(에드레콜로맵(edrexolomab))과 같은 안티 17-IA 세포 표면 항원 항체; 항-4-1BB 항체; 항-4Dc 항체, A33 및 CDP-833과 같은 항-A33 항체; 나탈리주맵(natalizumab)과 같은 항-αVβ1 인테그린 항체; LDP-02와 같은 항-α4β7 인테그린 항체; F-200, M-200 및 SJ-749와 같은 항-αVβ1 인테그린 항체; 압식시맵(abciximab), CNTO-95, Mab-17E6 및 Vitaxin^TM과 같은 항-αVβ3 인테그린 항체; 5G1.1과 같은 항-보충 인자(anti-complement factor) 5(C5) 항체; OvaRex^®(오레고보맵(oregovomab))과 같은 항-CA125 항체; Nuvion^®(비질리주맵(visilizumab) 및 Rexomab과 같은 항-CD3 항체; IDEC-151, MDX-CD4, OKT4A와 같은 항-CD4 항체;온콜리신(Oncolysin) B 및 온콜리신 CD6와 같은 항-CD6 항체; HB2와 같은 항-CD7 항체; B43, MT-103 및 온콜리신 B와 같은 항-CD19 항체; 2H7, 2H7.v16, 2H7.v114, 2H7.v115, Bexxar^®(토시투모맵(tositumomab)), Rituxan^®(리툭시맵(rituximab)), Zevalin^®(이브리투모맵 티욱세탄(ibritumomab tiuxetan)) 및 PRO70769와 같은 항-CD20 항체; Lymphocide^TM(에프라투주맵)과 같은 항-CD22 항체; IDEC-152와 같은 항-CD23 항체; 바실릭시맵(basiliximab) 및 Zenapax^®(다클리주맵)와 같은 항-CD25 항체; AC10, MDX-060 및 SGN-30과 같은 항-CD30 항체; Mylotarg^®(wpaxnwnaoa 오조가미신), 온콜리신 M, 및 Smart M195와 같은 항-CD33 항체; 항-CD38 항체; SGN-40 및 토탈리주맵과 같은 항-CD40 항체; 5c8, Antova^TM 및 IDEC-131과 같은 항-CD40L 항체; 비바투주맵(bivatuzumab)과 같은 항-CD44 항체; 항-CD46 항체; Campath^®(알렘투주맵)과 같은 항-CD52 항체; SC-1과 같은 항-CD55 항체; huN901-DM1과 같은 항-CD56 항체; MDX-33과 같은 항-CD64 항체; XR-303과 같은 항-CD66e 항체; IMMU-110과 같은 항-CD74 항체; 갈릭시맵 및 IDEC-114와 같은 항-CD80 항체; MDX-214와 같은 항-CD89 항체; 항-CD123 항체; B-B4-DM1과 같은 항-CD138 항체; AA-98과 같은 항-CD146 항체; 항-CD148 항체; cT84.66, 라베투주맵(labetuzumab) 및 Pentacea^TM와 같은 항-CEA 항체; MDX-101과 같은 항-CTLA-4 항체; 항-CXCR4 항체; ABX-EGF, Erbitux(세툭시맵(cetuximab)), IMC-C225 및 Merck Mab 425와 같은 항체; Crucell의 항-epCAM, ING-1 및 IS-IL과 같은 항-EpCAM 항체; 항-에프린 B2/EphHB4CD 항체; Herceptin^®, MDX-210과 같은 항-Her2 항체; 시브로투주맵(sibrotuzumab)과 같은 항-FAP(섬유 모세포 활성화 단백질) 항체; NXT-211과 같은 항-페리틴 항체; 항-FGF-1 항체; 항-FGF-3 항체; 항-FGF-8 항체; 항-FGFR 항체; 항-피브린 항체; WX-G250 및 Rencare^®와 같은 항-G250 항체; EMD-273063 및 TriGem과 같은 항-GD2 갱글리오사이드 항체; BEC2, KW-2871 및 미투모맵과 같은 항-GD3 갱글리오사이드 항체; ReoPro와 같은 항-gpIIb/IIIa 항체; 항-헤파리나아제 항체; Herceptin^®(트라스투주맵), MDX-210 및 페르투주맵(pertuzumab))과 같은 항-Her2/ErbB2 항체; Oncolym^®, Smart 1D10과 같은 항-HLA 항체; 항-HM1.24 항체; ICM3과 같은 항-ICAM 항체; 항-IgA 수용체 항체; CP-751871 및 EM-164와 같은 항-IGF-1 항체; IMC-A12와 같은 항-IGF-1R 항체; CNTO-328 및 엘실리모맵(elsilimomab)과 같은 항-IL-6 항체; HuMax^TM-IL15와 같은 항-IL-15 항체; 항-KDR 항체; 항-라미닌 5 항체; Hu3S193 및 IGN-311과 같은 항-루이스 Y 항원 항체; 항-MCAM 항체; BravaRex 및 TriAb와 같은 항-Muc1 항체; ERIC-1 및 ICRT와 같은 항-NCAM 항체; 테트라진 및 Therex와 같은 항-PEM 항원 항체; 항-PSA 항체; IG8과 같은 항-PSCA 항체; 항-Ptk 항체; 항-PTN 항체; AMG-162와 같은 항-RANKL 항체; 항-RLIP76 항체; Monopharm C와 같은 항-SK-1 항원 항체; 항-STEAP 항체; CC49-SCA 및 MDX-220과 같은 항-TAG72 항체; CAT-152와 같은 항-TGF-β 항체; C에71, DCP870, D2E7, Humira^®(아달리무맵) 및 Remicade^®(인플릭시맵(infliximab))와 같은 항-TNF-α 항체; 항-TRAIL-R1 및 TRAIL-R2 항체; 항-VE-카드헤린-2 항체; 및 Antegren^TM과 같은 항-VLA-4 항체.

자가면역 또는 염증성 질환, 이식 거부반응, GVHD 등의 처치를 위해 공동 투여될 수 있는 항체의 예는, 제한되지는 않지만, 다음을 포함한다: LDP-02와 같은 항-α4β7 인테그린 항체, LDP-01과 같은 항-베타2 인테그린 항체, 5G1.1과 같은 항-컴플리먼트(C5) 항체, BTI-322, MEDI-507과 같은 항-CD2 항체, OKT3, SMART 항-CD3와 같은 항-CD3 항체, IDEC-151, MDX-CD4, OKT4A와 같은 항-CD4 항체, 항-CD11a 항체, IC14와 같은 항-CD14 항체, 항-CD18 항체, IDEC 152와 같은 항-CD23 항체, 제나팍스와 같은 항-CD25 항체, 5c8, 안토바, IDEC-131과 같은 항-CD40L 항체, MDX-33과 같은 항-CD64 항체, IDEC-114와 같은 항-CD80 항체, ABX-CBL과 같은 항-CD147 항체, CDP850과 같은 항-E-셀렉틴 항체, ReoPro/Abcixima와 같은 항-gpIIb/IIIa 항체, ICM3과 같은 항-ICAM-3 항체, VX-740과 같은 항-ICE 항체, MDX-33과 같은 항-FcR1 항체, rhuMab-E25과 같은 항-IgE 항체, SB-240683과 같은 항-IL-4 항체, SB-240563, SCH55700과 같은 항-IL-5 항체, ABX-IL8과 같은 항-IL-8 항체, 항-인터페론 감마 항체, CDP571, CDP870, D2E7, 인플릭시맵, MAK-195F와 같은 항-TNFa 항체, 및 안테그렌과 같은 항-VLA-4 항체. 자가면역 또는 염증성 질환, 이식 거부반응, GVHD 등의 처치를 위해 공동 투여될 수 있는 다른 Fc 함유 분자의 예는, 제한되지는 않지만, p75 TNF 수용체/Fc 융합체 Enbrel^®(에타네르셉트(etanercept)) 및 Regeneron's IL-1 트랩을 포함한다.

전염성 질환의 처치를 위해 공동 투여될 수 있는 항체의 예는, 제한되지는 않지만 다음을 포함한다: ABthrax와 같은 항-anthrax 항체, CytoGam 및 세비루맵(sevirumab)과 같은 항-CMV 항체, CryptoGAM, Sporidin-G와 같은 항-크립토스포리디움 항체, Pyloran과 같은 항-헬리코박터 항체, HepeX-B, Nabi-HB와 같은 항-헤파티티스 B 항체, HRG-214와 같은 항-HIV 항체, 펠비주맵(felvizumab), HNK-20, 팔리비주맵, RespiGam과 같은 항-RSV 항체, Aurexis, Aurograb, BSYX-A 및 SE-Mab와 같은 항-스타필로코쿠스 항체.

이와는 달리, 본 발명의 Fc 변이체는 하나 이상의 Fc 수용체에 결합하기 위해 경쟁하는 하나 이상의 분자와 공동 투여될 수 있다. 예를 들면, 억제성 수용체 FcγRIIb의 억제제를 공동 투여하면 작동체(effector) 기능을 증가시킬 수 있다. 마찬가지로, 활성화 수용체, 예컨대 FcγRIIIa의 억제제를 공동 투여하면, 불필요한 작동체 기능을 최소화할 수 있다. Fc 수용체 억제제는, 제한되지는 않지만, 경쟁적인 FcγR 억제제로서, 그리고 다른 면역 글로불린 및 구체적으로는 정맥내 면역 글로불린(IVIg)으로서 작용하도록 엔지니어링된 Fc 변이체를 포함한다. 일 실시에에서, 상기 억제제는 Fc 변이체가 투여되기 전에 투여되어 작용하도록 한다. 순차적 투여의 효과를 달성하는 또 다른 방법은 Fc 수용체 억제제의 즉시 방출 투여량을 제공한 다음, 본 발명의 Fc 변이체의 서방형 포뮬레이션을 제공하는 것이다. 즉시 방출형 및 서방형 포뮬레이션은 서로 분리해서 투여할 수도 있고, 하나의 단위 투여량 형태로 합칠 수도 있다. 원하지 않는 면역 반응, 예를 들면 혈우병 환자에게 Factor VIII 투여 이후의 항-Factor VIII 항체 반응을 제한하기 위해, FcγRIIb 억제제의 투여를 이용할 수도 있다.

일 실시예에서, 본 발명의 Fc 변이체는 화학요법제와 함께 투여된다. 여기서 말하는 "화학요법제"라 함은 암의 치료에 유용한 화합물을 의미한다. 화학요법제의 예는, 제한되지는 않지만, 다음을 포함한다: 티오테파 및 사이클로스포스파미드(CYTOXAN^TM)과 같은 알킬화제; 부술판, 임프로술판 및 피포술판과 같은 알킬 술포네이트; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토테인, 트릴로스테인과 같은 항-아드레날; 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프로라이드 및 고세렐린과 같은 항-안드로겐; 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오스라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리치아미신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 펩플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 튜베르시딘, 유베니멕스, 지노스타틴, 조루비신과 같은 항생제; 예를 들면 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타아제 억제 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY 117018, 오나프리스톤 및 토레미펜(Fareston)을 포함하는 항 에스트로겐; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 항대사물질; 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트와 같은 폴산(folic acid) 동족체; 벤조도파, 카르보퀴온, 메투레도파 및 우레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스파오르아미드 및 트리메틸롤멜라민을 포함하는 에틸렌이민과 메틸아멜라민; 프롤린산과 같은 폴산 보충물(replenisher); 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴과 같은 니트로스우레아; 시스플라틴 및 카르보플라틴과 같은 백금 동족체; 빈블라스틴; 백금; 아르기닌 디이미나아제 및 아스파라기나아제와 같은 단백질; 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미피린, 티오구아닌과 같은 퓨린 동족체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 옥시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘, 5-FU과 같은 피리미딘 동족체; 탁센, 예컨대 파클리탁셀(TAXOL^®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 오세탁셀(TAXOTERE^®, Rhne-Poulenc Rorer, Antony, France); 토피오소머라아제 억제제 RFS 2000; 티미딜레이트 합성 억제제(예컨대 Tomudex); 아세글라톤을 포함하는 부가적 화학요법제; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레불린산(aminolevulinic acid); 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지퀴온; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산(podophyllinic acid); 2-에틸하이드라자이드; 프로카르바진; PSK^®; 라족산; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산(tenuazonic acid); 트리아지퀴온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 에토포사이드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미토크산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포사이드; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; CPT-11; 레티노산(retinoic acid); 에스페라미신; 카베시타빈. 상기 물질의 약제학적 허용 가능한 염, 산 또는 유도체도 사용될 수 있다.

화학 치료제 또는 그외 세포독성제를 프로드럭으로 투여할 수 있다. "프로드럭"은 본 명세서에서 모체 약물에 비해 종양 세포에 대한 세포 독성이 낮으며, 효소적으로 활성화되거나 또는 보다 활성의 모체 형태로 변환될 수 있는, 약학적으로 활성 성분의 전구체 또는 유도체 형태이다. 예컨대, Wilman, 1986, Biochemical Society Transactions, 615th Meeting Belfast, 14:375-382; 및 Stella et al ., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al ., (ed.): 247-267, Humana Press, 1985를 참조한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 프로드럭으로는, 포스페이트 함유 프로드럭, 티오포스페이트 함유 프로드럭, 펩티드 함유 프로드럭, D-아미노산 변형된 프로드럭, 당화된 프로드럭, β-락탐 함유 프로드럭, 선택적으로 치환된 페녹시아세트아미드 함유 프로드럭 또는 선택적으로 치환된 페닐아세트아미드 함유 프로드럭, 5-플루오로사이토신 및 그외 세포독성이 없는 보다 활성의 약물로 변환될 수 있는 5-플루오로우리딘 프로드럭이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 Fc 변이체와 사용하기 위한 프로드럭 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예로는 전술한 임의의 화학치료제가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

그외 다양한 치료제를 본 발명의 Fc 변이체와 함께 투여할 수 있다. 일 구현예로, Fc 변이체는 항-혈관신생제와 투여된다. "항- 혈관신생제"는 본 명세서에서 혈관의 발생을 일부분 차단 또는 방해하는 화합물을 의미한다. 예컨대, 항-혈관신생 인자는 혈관형성을 촉진하는데 관여하는 성장 인자 또는 성장 인자 수용체에 결합하는, 소형 분자 또는 단백질, 예컨대, 항체, Fc 융합체 또는 사이토카인일 수 있다. 본원에서 바람직항 항-혈관신생 인자는 혈관내피 성장 인자(VEGF)에 결합하는 항체이다. 그외 VEGF를 통한 시그널링을 저해하는 물질 역시, 예컨대 VEGF 또는 VEGF-R 발현 수준을 감소시키는 RNA계 치료제, VEGF-독소 융합체, 리게네론의 VEGF-트랩(Regeneron's VEGF-trap) 및 VEGF-R 에 결합하는 항체를 사용할 수 있다. 다른 예에서, Fc 변이체는 후천성 면역 반응을 유도 또는 증강시키는 치료제, 예컨대 CTLA-4를 포적으로하는 항체와 함께 투여된다. 추가적인 항-혈관신생제로는 안지오스타틴(angiostatin)(plasminogen fragment), 항트롬빈(antithrombin) III, 안지오자임(angiozyme), ABT-627, Bay 12-9566, 베네핀(benefin), 베바시주맵(bevacizumab), 비스포스포네이트(bisphosphonate), BMS-275291, 연골 유래 저해제(cartilage-derived inhibitor)(CDI), CAI, CD59 보체 단편, CEP-7055, Col 3, 컴브레타스타틴(combretastatin) A-4, 엔도스타틴(endostatin)(collagen XVIII fragment), 파르네실 트랜스퍼라제 저해제(farnesyl transferase inhibitor), 파이브로넥틴 단편, gro-beta, 할로푸기논(halofuginone), 헤파린아제(heparinases), 헤파린 6탄당 단편(heparin hexasaccharide fragment), HMV833, 인간 융모성선 자극 호르몬(human chorionic gonadotropin)(hCG), IM-862, 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 감마, 인터페론 유발성 단백질10 (IP-10), 인터루킨-12, 크링글(kringle) 5 (plasminogen fragment), 마리마스타트(marimastat), 메탈로프로테아제 저해제(metalloproteinase inhibitor)(예, TIMPs), 2-메토디에스트라디올(methodyestradiol), MMI 270(CGS 27023A), 플라스미노겐 활성자 저해제(plasminogen activiator inhibitor)(PAI), 혈소판 인자-4 (PF4), 프리노마스타트(prinomastat), 프로락틴(prolactin) 16kDa 단편, 프로리페린 관련 단백질(proliferin-related protein)(PRP), PTK 787/ZK 222594, 레티노이드, 솔리마스타트(solimastat), 스퀄아민(squalamine), SS3304, SU5416, SU6668, SU11248, 테트라하이드로코르티솔-S, 테트라티오콜리브데이트(tetrathiomolybdate), 탈리도미드(thalidomide), 트롬보스폰딘-1(thrombospondin-1)(TSP-1), TNP-470, 형질전환 성장 인자 β(transforming growth factor beta)(TGF-β), 바스큘로스타틴)(vasculostatin), 바소스타틴(vasostatin)(calreticulin fragment), ZS6126 및 ZD6474을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다.

바람직한 예에서, Fc 변이체는 타이로신 키나제 저해제와 함께 투여된다. "타이로신 키나제 저해제"는 본원에서 타이로신 키나제의 일부 티로시키나제 활성을 저해하는 분자를 의미한다. 이러한 저해제의 예로는, 퀴라졸린(quinazoline), 예컨대 PD 153035, 4-(3-클로로아닐리노)퀴나졸린; 피리도피리미딘; 피리미도피리미딘(pyrimidopyrimidine); 피롤로피리미딘(pyrrolopyrimidine), 예컨대 CGP 59326, CGP 60261 및 CGP 62706; 피라졸로피리미딘(pyrazolopyrimidine), 4-(페닐아미노)-7H-피롤로(2,3-d) 피리미딘; 쿠르쿠민(curcumin)(디페룰로일 메탄, 4,5-비스(4-플루오로아닐리노)-프탈리미드); 티르포스틴 함유 니트로티오펜 모이어티(tyrphostines containing nitrothiophene moiety); PD-0183805(Warner-Lambert); 안티센스 분자(예, ErbB 코딩 핵산에 결합하는 것); 퀴녹살린(quinoxaline)(US 5,804,396); 트리포스틴(tryphostin)(US 5,804,396); ZD6474(Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering A G); pan-ErbB 저해제, 예컨대 C1-1033 (Pfizer); 아피니탁(Affinitac)(ISIS 3521; Isis/Lilly); 이마티닙 메실레이트(Imatinib mesylate)(STI571, Gleevec^® Novartis); PKI 166(Novartis); GW2016(Glaxo SmithKline); C1-1033(Pfizer); EKB-569(Wyeth); Semaxinib(Sugen); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787(Novartis/Schering AG); INC-1C11(Imclone); 또는 US 5,804,396; PCT WO 99/09016(American Cyanimid); PCT WO 98/43960(American Cyanamid); PCT WO 97/38983(Warner-Lambert); PCT WO 99/06378 (Warner-Lambert); PCT WO 99/06396(Warner-Lambert); PCT WO 96/30347(Pfizer, Inc); PCT WO 96/33978 (AstraZeneca); PCT WO96/3397(AstraZeneca); PCT WO 96/33980(AstraZeneca)에 기재된 것, 게피티닙(gefitinib)(IRESSA^® ZD1839, AstraZeneca), 및 OSI-774 (Tarceva™ OSI Pharmaceuticals/Genentech)을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다.

다른 예에서, Fc 변이체는 하나 이상의 면역조절제와 함께 투여된다. 이러한 물질은 하나 이상의 사이토카인의 생산을 증가 또는 감소시키고, 자가 항원 존재를 상향 조절 또는 하향 조절하고, MHC 항원을 마스킹하고, 또는 한가지 이상의 면역 세포 타입의 증식, 분화, 이동 또는 활성화 상태를 촉진시킬 수 있다. 면역조절제로는 비스테로이드계 항-염증 약물(NSAIDs), 예컨대 아스피린, 이부프로페드, 셀렉콕십(celecoxib), 디클로페낙(diclofenac), 에토돌락(etodolac), 펜노프로펜(fenoprofen), 인도메타신(indomethacin), 케토랄락(ketoralac), 옥사프로진(oxaprozin), 나부멘톤(nabumentone), 설린닥(sulindac), 톨멘틴(tolmentin), 로페콕십(rofecoxib), 나프로센(naproxen), 케토프로펜(ketoprofen), 및 나부메톤(nabumetone); 스테로이드(예, 글루코코르티코이드, 덱사메타손, 코르티손, 하이드록시코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니손, 프레드니솔론, 트림시놀론, 아줄피디네이코사노이드(azulfidineicosanoid), 예컨대 프로스타슬란딘, 트롬복산 및 루코트리엔; 국소 스테로이드, 예컨대 안트랄린(anthralin), 칼시포트리엔(calcipotriene), 클로β졸(clobetasol) 및 타자로텐(tazarotene)); 사이토카인, 예컨대 TGFb, IFNa, IFNb, IFNg, IL-2, IL-4, IL-10; 사이토카인, 케모카인 또는 수용체 길항제, BAFF, B7, CCR2, CCR5, CD2, CD3, CD4, CD6, CD7, CD8, CD11, CD14, CD15, CD17, CD18, CD20, CD23, CD28, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD52, CD64, CD80, CD86, CD147, CD152, 보체 인자(C5, D) CTLA4, 에오탁신(eotaxin), Fas, ICAM, ICOS, IFNα IFNβ IFNγ IFNAR, IgE, IL-1, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5R, IL-6, IL-8, IL-9 IL-12, IL-13, IL-13R1, IL-15, IL-18R, IL-23, 인테그린, LFA-1, LFA-3, MHC, 셀렉틴, TGFβ, TNFα, TNFβ TNF-R1, T-세포 수용체에 대한 항체, 가용성 수용체 및 수용체-Fc 융합체 포함, Enbrel^®(etanercept), Humira^®(adalimumab), 및 Remicade^®(infliximab) 포함; 이종의 항-림프구 글로불린(heterologous anti-lymphocyte globulin); 그외 면역조절 분자, 예컨대 2-아미노-6-아릴-5 치환된 피리미딘, MHC 결합 펩티드 및 MHC 단편에 대한 항-이디오타입의 항체, 아자티오프린(azathioprine), 브레퀴나르(brequinar), 브로모크립틴(bromocryptine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 사이클로스포린(cyclosporine) A, D-페니실린아민, 데옥시스페르구알린(deoxyspergualin), FK506, 글루타르알데하이드, 금, 하이드록시클로로퀸, 레플루노마이드(leflunomide), 말로노니트릴로아미드(malononitriloamide)(예, 레플루노미드), 메토트렉세이트(methotrexate), 미노사이클린(minocycline), 미조리빈(mizoribine), 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil), 라파마이신(rapamycin) 및 설파사사진(sulfasasazine)을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다.

다른 예에서, 본 발명의 Fc 변이체는 사이토카인과 함께 투여된다. 본원에서, "사이토카인"은 세포간 매개제로서 다른 세포에 작용하는 하나의 세포 개체에서 발출된 단백질의 일반적인 명칭이다. 이러한 사이토카인의 예로는, 림포카인, 모노카인 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이 있다. 사이토카인중, 성장 호르몬, 예컨대, 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone); 티록신(thyroxine); 인슐린; 프로인슐린(proinsulin); 렉락신(relaxin); 프로렐락신(prorelaxin); 당단백질 호르몬, 예컨대, 여포 자극 호르몬(follicle stimulating hormone)(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 황체형성 호르몬(luteinizing hormone)(LH); 간 성장 인자(hepatic growth factor); 파이브로블라스트 성장 인자; 프롤락틴; 태반성 최유 물질(placental lactogen); 종양 괴사 인자-α 및 -β; 뮐러관(mullerian)-저해 물질; 마우스 고나도트로핀 관련 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(thrombopoietin)(TPO); 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β; 혈소판 성장 인자; 형질전환 성장 인자(TGF), 예컨대 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린 유사 성장 인자-1 및 -2; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도 인자(osteoinductive factor); 인터페론, 예컨대 인터페론-α, β 및 -감마; 콜로니 자극 인자(colony stimulating factor)(CSF), 예컨대 대식세포-CSF(M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터루킨(IL), 예컨대 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, 종양 괴사 인자, 예컨대 TNF-α 또는 TNF-β; 및 그외 LIF 및 키트 리간드(KL)를 포함하는 폴리펩티드 인자를 포함한다. 본원에서, 용어 사이토카인은 천연 소스 또는 재조합 세포 배양으로부터 유래된, 본래 서열의 사이토카인과 동등한 생물학적 활성을 지닌, 단백질을 포함한다.

바람직한 예에서, 면역계의 세포를 자극하는 사이토카인 또는 그외 물질은 본 발명의 Fc 변이체와 공동-투여된다. 이러한 치료 방식은 원하는 작용자 기능을 증강시킬 수 있다. 예컨대, IL-2를 비제한적으로 포함하는 NK 세포를 자극하는 물질을 공동-투여할 수 있다. 다른 예로, C5a, 포르밀 펩티드, 예컨대 N-포르밀-메티오닐-루실-페닐알라닌(Beigier-Bompadre et. al. (2003) Scand. J. Immunol. 57: 221-8)을 비제한적으로 포함하는, 대식세포를 자극하는 물질을 공동-투여할 수 있다. 또한, G-CSF, GM-CSF 등을 비제한적으로 포함하는 호중구 자극 물질을 투여할 수 있다. 또한, 이러한 면역자극성 사이토카인의 이동을 촉진하는 물질을 사용할 수 있다. 또한, 인터페론 감마, IL-3 및 IL-7을 비제한적으로 포함하는 추가적인 물질은 한가지 이상의 작용자 기능을 촉진시킬 수 있다. 다른 예에서, 작용자 세포 기능을 저해하는 사이토카인 또는 다른 물질을 본 발명의 Fc 변이체와 공동-투여할 수 있다. 이러한 치료 방식은 원하지 않은 작용자 기능을 제한할 수 있다.

다른 예에서, Fc 변이체는 하기를 비제한적으로 포함하는 하나 이상의 항생제와 함께 투여할 수 있다: 아미노글리코시드 항생제(예, 아프라마이신(apramycin), 아르베카신(arbekacin), 밤베르마이신(bambermycin), 부티로신(butirosin), 디베카신(dibekacin), 겐타마이신(gentamicin), 카나마이신(kanamycin), 네오마이신, 네틸미신(netilmicin), 파로모마이신(paromomycin), 리보스타마이신(ribostamycin), 시소마이신(sisomycin), 스펙트리노마이신(spectrinomycin)), 아미노사이클리톨(aminocyclitol)(예, 스프렉티노마이신(sprctinomycin)), 암페니콜 항생제(amphenicol antibiotic)(예, 아지담페니콜(azidamfenicol), 클로람페니콜(chloramphenicol), 플로르프르니콜(florfrnicol) 및 티암페미콜(thiamphemicol)), 안사마이신 항생제(ansamycin antibiotic)(예, 리팜미드 및 리팜핀), 카르바페넴(carbapenem)(예, 이미페넴(imipenem), 메로페넴(meropenem), 파니페넴(panipenem)); 세팔로스포린(cephalosporin)(예, 세파클러(cefaclor), 세파드록실(cefadroxil), 세파만돌(cefamandole), 세파트리진(cefatrizine), 세파제돈(cefazedone), 세포조프란(cefozopran), 세프피미졸(cefpimizole), 세프피라미드(cefpiramide), 세프피롬(cefpirome), 세프프로질(cefprozil), 세푸록신(cefuroxine), 세픽심(cefixime), 세파렉신(cephalexin), 세프라딘(cephradine) ), 세파마이신류(cephamycins) (세프부페라존(cefbuperazone), 세폭시틴(cefoxitin), 세프미녹(cefminox), 세프메타졸(cefmetazole), and 세포테탄(cefotetan)); 린코사미드류(lincosamides) (예, 클린다마이신(clindamycin), 린코마이신(lincomycin)); 마크로라이드(macrolide) (예, 아지쓰로마이신(azithromycin), 브레펠딘 A(brefeldin A), 클라리쓰로마이신(clarithromycin), 에리쓰로마이신(erythromycin), 록시쓰로마이신(roxithromycin), 토브라마아신( tobramycin)), 모노박탐류(monobactams) (예, 아즈트레오남(aztreonam), 사루모남(carumonam), and 티게르모남(tigernonam)); 무피로신(mupirocin); 옥사세펨류(oxacephems) (예, 플로목세프(flomoxef), 라타목세프(latamoxef), 및 목살락탐(moxalactam)); 페니실린류(penicillins) (예, 암디노실린(amdinocillin), 암디노실린 피복실(amdinocillin pivoxil), 아목시실린(amoxicillin), 바캄피실린(bacampicillin), 벤질페니실린산(bexzylpenicillinic acid), 벤질페니실린염(benzylpenicillin sodium), 에피실린(epicillin), 펜베니실린(fenbenicillin), 플록사실린(floxacillin), 페나메실린(penamecillin), 페네타메이트 하이드리오다이드(penethamate hydriodide), 페니실린 o-베네타민(penicillin o-benethamine), 페니실린 O(penicillin O), 페니실린 V(penicillin V), 페니실린 V 벤조에이트(penicillin V benzoate), 페니실린 V 하이드라바민(penicillin V hydrabamine), 페니메피사이클린(penimepicycline), and 펜시히실린 포타슘(phencihicillin potassium)); 폴리펩티드류(polypeptides) (예, 바시트라신(bacitracin), 콜리스틴(colistin), 폴리믹신 B(polymixin B), 테이코플라닌(teicoplanin), 반코마이신(vancomycin)); 퀴놀론류(quinolones) (아미플록사신(amifloxacin), 시녹사신(cinoxacin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 에녹사신(enoxacin), 엔로플록사신(enrofloxacin), 페록사신(feroxacin), 플루메퀸(flumequine), 가티플록사신(gatifloxacin), 게미플록사신(gemifloxacin), 그레파플록사신(grepafloxacin), 로메플록사신(lomefloxacin), 목시플록사신(moxifloxacin), 날리딕스산(nalidixic acid), 노르플록사신(norfloxacin), 오플록사신(ofloxacin), 옥솔린산(oxolinic acid), 페플록사신(pefloxacin), 피페미드산(pipemidic acid), 로속사신(rosoxacin), 루플록사신(rufloxacin), 스파르플록사신(sparfloxacin), 테마플록사신(temafloxacin), 토수플록사신(tosufloxacin), 트로바플록사신(trovafloxacin)); 리팜핀(rifampin); 스트렙토그라민류(streptogramins )(예, 퀴누프리스틴(quinupristin), 달포프리스틴(dalfopristin)); 설폰아이드류(sulfonamides) (설포닐아미드(sulfanilamide), 설파메톡사졸(sulfamethoxazole)); 테트라시클렌류(tetracyclenes) (클로르테트라시클린(chlortetracycline), 데메클로시클린 하이드로클로라이드(demeclocycline hydrochloride), 데메틸클로르테트라시클린(demethylchlortetracycline), 독시시클린(doxycycline), 두라마이신(duramycin), 미노시클린(minocycline), 네오마이신(neomycin), 옥시테트라시클린(oxytetracycline), 스트렙토마이신(streptomycin), 테트라시클린(tetracycline), 반코마이신(vancomycin)).

암포페리신 B(amphotericin B), 시클로피록스(ciclopirox), 클로트리마졸(clotrimazole), 에코나졸(econazole), 플루코나졸(fluconazole), 플루시토신(flucytosine), 이트라코나졸(itraconazole), 케토코나졸(ketoconazole), 니코나졸(niconazole), 니스타틴(nystatin), 테르비나핀(terbinafine), 테르코나졸(terconazole), 및 티오코나졸(tioconazole)과 같은 항-진균제 또한 사용할 수 있다.

프로테아제 저해제, 역전사효소 저해체 및 타입 1 인터페론, 바이러스 융합 저해제 및 뉴라미다제 저해제를 포함한 다른 것을 포함한, 항바이러스제 역시 사용할 수 있다. 항바이러스제의 예로는 아시클로비어(acyclovir), 아데포비어(adefovir), 아만타딘(amantadine), 암프레나비어(amprenavir), 클레바딘(clevadine), 엔푸비어티드(enfuvirtide), 엔테카비어(entecavir), 포스카네트(foscarnet), 강시클로비어(gangcyclovir), 아이독수리딘(idoxuridine), 인디나비어(indinavir), 로피나비어(lopinavir), 플레코나릴(pleconaril), 리바비린(ribavirin), 리만타딘(rimantadine), 리토나비어(ritonavir), 사퀴나비어(saquinavir), 트리플루리딘(trifluridine), 비바라빈(vidarabine), 및 지도부딘(zidovudine)이 있으나, 이로 한정되지 않으며, 이를 사용할 수 있다.

본 발명의 Fc 변이체 다른 치료 요법과 병용할 수 있다. 예로, 일예에서, 항체 또는 본 발명의 Fc 융합체로 처리된 환자는 또한 방사능 요법을 받을 수 있다. 방사능 요법은 당업계에 공지된 당업계에서 일반적으로 사용되는 프로토콜에 따라 투사될 수 있다. 이러한 요법은 세슘, 이리듐, 요오드 또는 코발트 방사능을 비제한적으로 포함한다. 방사능 요법은 전신 조사일 수 있으며, 또는 신체내 특정 부위 또는 조직, 예컨대 폐, 방광 또는 전립선에 국소적으로 인가될 수 있다. 전형적으로, 방사능 요법은 약 1주일 내지 2주동안 펄스형으로 수행할 수 있다. 그러나, 방사능 요법은 보다 긴 기간동안 수행할 수 있다. 예를 들면, 방사능 요법은 약 6 내지 약 7주간 두경부암 환자에게 투여할 수 있다. 선택적으로, 방사능 요법은 1회 또는 다수회 순차적으로 투여될 수 있다. 의학 전문가라면 본원에 유용한 방사능 요법의 적정 투여량 및 횟수는 경험으로 결정할 수 있다. 본 발명의 다른 예에 있어서, 본 발명의 Fc 변이체와 하나 이상의 다른 항암 치료제를 사용하여, 생체외(ex vivo) 항암세포를 치료한다. 이러한 생체외 치료는 골수 이식 및 특히 자가 골수 이식에 유용할 수 있다. 예컨대, 전술한 바와 같이 Fc 변이체 및 하나 이상의 그외 항암제를 이용하여 항암 세포가 있는 세포 또는 조직(들)을 치료하는 방법을 사용하여, 수여 환자에게 이식전에 암세포를 제거 또는 실질적으로 제거할 수 있다.

또한, 방사능 요법은 항체와 같이 동위원소로 표지된 분자를 사용한 처리를 포함할 수 있다. 방사능면역치료제의 예로는 Zevalin™(Y-90 labeled anti-CD20), LymphoCide^®(Y-90 labeled anti-CD22) 및 Bexxar^®(I-131 labeled anti-CD20)가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 Fc 변이체는 수술 또는 광 치료법과 같은 다른 치료 기술과 조합하여 사용할 수 있다.

임상 실험 설계 및 승인 후 치료 전략

임상 실험 abd 치료법에 대한 약물게놈 접근법(Pharmacogenomic approach)은 본 발명의 예이다. 본 발명의 Fc 변이체와 상호작용할 수 있는 다수개의 수용체는 인간 집단에서 다형성을 가지고 있다. 해당 환자 또는 환자 집단에서, 본 발명의 Fc 변이체의 효능은 단백질의 특이적 다형성의 존재 유무에 따라 영향을 받을 수 있다. 예컨대, FcγRIII는 일반적으로 V(고친화성) 또는 F(저친화성) 중 어느 하나인 158번 위치에 다형성이 있다. V/V 동종접합 유전자형의 환자에서는 항-CD20 항체 Rituxan®(리투시맵)(Carton et al., 2002, Blood 99:754-758; Weng et al., 2003, J Clin Oncol 21:3940-3947; Dall'Ozzo et al., 2004, Cancer Res 64:4664-9)를 이용한 처리에 보다 우수한 임상 반응을 가지는 것으로 관찰되었다. 다른 다형성으로는 비제한적으로 FcγRIIa R131 또는 H131가 있으며, 이러한 다형성은 다형성에 따라 Fc 결합성의 증가 또는 감소시키고, 이후 생물학적 활성을 증가 또는 감소시키는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 Fc 변이체는 특정 다형성 형태의 수용체, 예컨대 F158 FcγRIIIa에 선호적으로 결합할 수 있으며, 또는 수용체내 특정 위치에 있는 다형성 모두에, 예컨대 FcγRIIIa의 V158과 F158 다형성 둘다에 동일한 친화력으로 결합할 수 있다. 바람직한 예에서, 다형성에 동등한 결합성을 제공하는 본 발명의 Fc 변이체는 다른 다형성을 가진 환자에게서 보이는 상이한 효능을 제거하기 위해 항체에 사용될 수 있다. 이러한 특성은 치료 반응에 보다 우수한 지속성을 줄 수 있으며, 무반응 환자 집단을 감소시킬 수 있다. 수용체 다형성에 동일한 결합성을 가지는 변이체 Fc는 관련 Fc 수용체에 대한 결합 조절을 통해, ADCC, CDC 또는 순환성 반감시와 같은 생물학적 활성 증가 또는 대안적으로 활성 감소를 가질 수도 있다. 바람직한 예에서, 본 발명의 Fc 변이체는 수용체의 다형성중 어느 하나에 보다 높은 또는 낮은 친화력으로 결합할 수 있으며, 기존 결합 차이를 강조하거나 또는 상기 차이를 역위시킨다. 이러한 특성은 이러한 다형성을 지닌 환자 집단에 맞게 효능을 구체적으로 적정한 치료체의 창출을 허용할 수 있다. 예컨대, Fc에 보다 우수한 친화력으로 결합하는 FcγRIIb 다형성을 지닌 환자 집단에, 보다 효과있는 약물을 형성하는 수용체의 상기 다형성 형태에 대해 감소된 결합성을 가진 Fc 변이체 함유 약물을 투여할 수 있다.

바람직한 예에서, 본 발명의 Fc 변이체의 효능을 예측하기 위해 환자에서 하나 이상의 다형성을 스크리닝한다. 이러한 정보는 예컨대 임상 실험, 또는 승인후 포함 또는 배제하지 위한 환자를 선별하는데 사용하여, 적합한 투여량 및 치료 옵션에 있어 의사 및 환자에 지침을 제공할 수 있다. 예컨대, 항-CD20 항체 리투시맴은 F158 FcγRIIIa에 대해 동형접합 또는 이형접합인 환자에서는 효과가 가장 낮다(Carton et al., 2002, Blood 99:754-758; Weng et al., 2003, J Clin Oncol 21:3940-3947; Dall'Ozzo et al., 2004, Cancer Res 64:4664-9). 이러한 환자들에서는 본 발명의 Fc 변이체를 포함하는 항체에 대한 증강된 임상 반응을 보일 수 있다. 일 구현예로, 환자의 유전형이 현재 사용되는 하나 이상의 항체 치료제에 비해 본 발명의 항체에 현저하게 우수하게 반응하는 것으로 나타나는 경우, 환자는 임상 실험에 포함시키는 것으로 선택한다. 다른 예로, 적정 투여량 및 치료 요법은 이러한 유전형에 대한 정보를 이용하여 결정한다. 다른 예로, 환자는 다형성 유전자형을 기초로 임상 실험에 포함시키거나 또는 승인후 치료법을 받도록 선택하며, 이러한 치료법은 상기 집단에서 특히 유효하게 조작된 Fc 변이체를 포함하거나, 또는 다른 다형성 형태에 대해서는 다른 활성을 보이지 않는 Fc 변이체를 포함한다.

본 발명의 Fc 변이체에 우호적인 임상 반응을 보이거나, 또는 현재 사용되는 하나 이상의 항체 치료제에 비해 본 발명의 Fc 변이체를 처리하였을때 현저하게 향상된 반응을 보이는 환자를 식별하기 위한 진단 테스트도 본 발명에 포함된다. 당업계에 공지된 수많은 인간 FcγR 다형성 결정 방법을 사용할 수 있다.

바람직한 예에서, 환자를 스크리닝하여 본 발명의 Fc 폴리펩티드의 효능을 예측한다. 이러한 정보를 사용하여, 예컨대 임상 실험, 또는 승인후 포함 또는 배제하기 위한 환자를 선별하여, 적합한 투여량 및 치료 옵션에 있어 의사 및 환자에 지침을 제공할 수 있다. 스크리닝은 표적 항원의 발현 수준 또는 분포의 결정을 포함할 수 있다. 예컨대, Her2/neu 발현 수준은 현재 사용하여 트라스투주맴 치료법에 가장 우호적으로 반응할 환자를 선별한다. 또한, 스크리닝은 유전자 다형성의 결정, 예컨대 FcγRs 또는 FcaR과 관련된 다형성을 결정하는 것을 포함한다. 예컨대, FcγRIIIa의 F158 다형성 형태가 동형접합 또는 이형접합인 환자는 본 발명의 Fc 폴리펩티드에 임상적으로 보다 우호적으로 반응할 것이다. 환자 스크리닝으로 수득한 정보를 사용하여, 임상 실험에 포함되는 환자를 선택하고, 적정 투여량 및 치료 요법을 결정하거나 또는 그외 임상적인 적용을 결정할 수 있다. 본 발명의 Fc 폴리펩티드에 우호적인 임상 반응을 보일 환자나 또는 현재 사용되는 한가지 이상의 바이오치료제에 비해 본 발명의 Fc 폴리펩티드 처리시 현저하게 우수한 반응을 보일 환자를 동정하는 진단 테스트는 본 발명에 포함된다. 항원의 발현 수준, 항원 분포 및 또는 유전자 다형성을 결정하는 공지된 임의의 다수 방법을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 혈액 및 조직 샘플과 같은 임상 샘플에 수행되는 예후 테스트(prognostic test)를 포함한다. 이러한 테스트는 옵소니제이션(opsonization), ADCC, CDC, ADCP 또는 암성 또는 병원성 세포의 기작에 상관없는 사멸을 비제한적으로 포함하는, 작용자 기능 활성을 분석할 수 있다. 바람직한 예에서, 전술한 바와 같이 ADCC 분석을 사용하여 특정 환자에게서 본 발명의 해당 Fc 폴리펩티드의 효능을 예측한다. 이러한 정보를 사용하여, 임상 실험에 포함 또는 배제할 환자를 식별할 수 있으며, 또는 적정 투여량 및 치료 요법에 대한 결정 사항을 제공할 수 있다. 또한, 이러한 정보를 사용하여 상기 분석에서 월등한 활성을 보이는 특정 Fc 변이체를 함유한 약물을 선별할 수 있다.

도 1. 항체의 구조와 기능. 도시한 내용은 전장 인간 IgG1 항체의 모형으로서, pdb 기탁 코드 1CE1(James 외, 1999, J Mol Biol 289:293~301)로부터 얻은 인간화된 Fab 구조와 pdb 기탁 코드 1DN2(DeLano 외, 2000, Science 287:1279~1283)로부터 얻은 인간 IgG1 Fc 구조를 나타낸다. Fab와 Fc를 연결하는 유연한 경첩부는 도시하지 않는다. IgG1는 이종이량체들의 동종이량체인데, 2개의 경쇄와 2개의 중쇄로 구성된다. 도 1에는 항체를 이루는 Ig 도메인이 표시되어 있으며, 상기 도메인에는 경쇄의 V_L과 C_L, 중쇄의 Cγ1, Cγ2, Cγ3와 V_H가 포함된다. 또한, 도 1 에는 Fc 도메인이 표시되어 있다. 아울러, 관련 단백질의 결합 자리가 표시되어 있으며, 가변부위의 항원 결합 자리, FcγR, FcRn, C1q와 단백질 A와 단백질 G가 Fc 부위에서 결합하는 자리도 포함된다.

도 2. Fc/FcγRIIIb 복합체 구조 1IIS. Fc는 회색의 리본 다이어그램으로, FcγRIIb는 검은색 리본으로 도시한다. N297 탄수화물은 검은 막대로 도시한다.

도 3a-3b. 인간 IgG 면역글로불린인 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4의 아미노산 서열의 배열. 도 3a에는 CH1(Cγ1) 및 경첩부의 서열이 도시되어 있으며, 도 3b에는 CH2(Cγ2) 및 CH3(Cγ3)의 서열이 도시되어 있다. IgG1 서열의 EU 인덱스에 따라서 잔기 위치의 번호를 매겼으며, IgG1과 그 밖의 면역글로불린 IgG2, IgG3, 및 IgG4 사이의 차이는 회색으로 도시한다. 수많은 위치에서 다형성(polymorphism)이 존재(Kim 외, 2001, J. Mol. Evol. 54:1-9)하기 때문에, 본 발명에 따라 존재하는 서열과 종래 기술에 따른 서열 사이에는 약간의 차이가 있을 수 있다. Fc 부위 가능성 있는 시작 부위를 표지하고, 이를 EU 226번 위치 또는 230번 위치로 한다.

도 4. Fc/FcγRIIIb 복합체 구조 1IIS에 대해 잔기들로서, 본 발명의 Fc 변이체 중에서는 상기 잔기에서 아미노산 변형이 수행되었다. Fc는 회색 리본 다이어그램으로, FcγRIIIb는 검은색 리본으로 나타내었다. 실험 라이브러리 잔기는 검은색으로, N297 탄수화물은 회색으로 나타내었다.

도 5. 293T 세포에서 알렘투주맵항체의 천연형(wild-type: WT)과 Fc 변이체 단백질을 발현하였다. 알렘투주맵 중쇄 유전자(천연형이나 변이형)를 가지는 플라스미드와 알렘투주맵 경쇄 유전자를 가지는 플라스미드로 공동-형질감염(co- transfection)을 수행하였다. 형질감염 5일 후 배양액을 수집하였다. 각 형질감염 시료마다 배양액 10μL를 SDS-PAGE 겔에 로딩하여 웨스턴 분석을 수행하였다. 웨스턴 분석용 프로브는 과산화효소 접합 염소 항인간IgG 항체(peroxidase-conjugated goat anti-human IgG, Jackson Immuno-Research社 카탈로그 번호 109-035-088)였다. WT: 천연형 알렘투주맵, 1-10: 알렘투주맵 변이체들, H와 L은 각각 항체 중쇄와 경쇄를 가리킨다.

도 6. 단백질 A 크로마토그래피를 이용한 알렘투주맵의 정제. 천연형 알렘투주맵 단백질을 293T 세포에서 발현하였고 그 배양액을 형질감염일로부터 5일 후에 수집하였다. PBS로 배양액을 1:1 비율로 희석하고 단백질 A(Pierce, 카탈로그 번호 20334) 정제하였다. O: 정제 전의 원래 시료, FT: 유출액(flow-through), E: 용리액(elution), C: 농축한 최종 시료. 왼쪽 사진은 Simple Blue로 염색한 SDS-PAGE 겔을 나타내고, 오른쪽 사진은 과산화효소 접합 염소 항인간IgG 항체로 표지한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.

도 7. 탈당화 항체의 생산. 천연형과 변이형 알렘투주맵을 293T 세포에서 발현시켜 단백질 A 크로마토그래피로 정제하였다. 이 항체를 펩티드 N-글리코시다아제(peptide N-glycosidase, PNGase F)와 함께 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 각 항체별로 PNGase 없이 모의 처리한 시료(-PNGase F)도 병행하였다. WT: 천연형 알렘투주맵, #15, #16, #17, #18과 #22: 각각 alemetuzumab의 F241E/F243R/V262E/V264R, F241E/F243Q/V262T/V264E, F241R/F243Q/V262T/V264R, F241E/F243Y/V262T/V264R와 I332E 변이체들이다. PNGase F로 처리한 시료가 모의 처리한 시료보다 더 빨리 이동한다는 점이 중쇄에서 탈당화 일어난 것을 나타낸다.

도 8. 293T 세포에서 발현된 알렘투주맵 항체는 그 항원과 결합한다. 항원성이 있는 CD52 펩티드를 GST와 융합하여 대장균 BL21(DE3)에서 IPTG 유도로써 발현하였다. 유도된 시료와 유도되지 않은 시료 모두를 SDS-PAGE 겔에 건 뒤, PVDF 막으로 전이시켰다. 웨스턴 분석을 위하여 Sotec사의 알렘투주맵(a-CD52)(최종 농도 2.5 ng/μL) 또는 형질감염된 293T 세포(Xencor사, Campath)의 배양액(최종 알렘투주맵 농도는 약 0.1~0.2 ng/μL)을 1차 항체로 사용하였고, 과산화효소 접합 염소 항인간IgG를 2차 효소로 사용하였다. M: 미리 염색된 마커, U : 비유도 GST-CD52 시료, I: 유도된 GST-CD52 시료.

도 9. 인간 V158 FcγRIIIa의 세포외 부위의 발현과 정제. 표지한 FcγRIIIa으로 293T 세포에 형질감염한 다음, 분비된 FcγRIIIa를 포함하는 배양액을 그 3일 후에 수집하여 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 1: 배양액, 2: 유출액, 3: 세척액, 4~8: 연속된 용리액. 심플 블루(Simple blue) 염색한 SDS-PAGE와 웨스턴 결과를 모두 나타내었다. 웨스턴 블롯의 경우, 그 막은 항GST 항체로 검사하였다.

도 10. 상기 실험 라이브러리에서 선택한 알렘투주맵 Fc 변이체가 인간 V158 FcγRIIIa에 결합하는 것을 알파스크린^TM(상표명) 검사법으로 감지한 결과, 실시예 2에서 기재한다. 경쟁 항체(Fc 변이체나 천연형 알렘투주맵)의 존재하에서 발광 신호가 줄어드는 것으로부터 특징적인 억제 곡선을 관측하였다. 인산 완충 식염 수(PBS, phosphate buffered saline)만으로 음성 대조군을 삼았다. 결합 데이터는 각 특정 곡선마다 최대와 최저 발광 신호에 대하여 표준화(normalization)하였는데, 각각 항체의 낮은 농도와 높은 농도 조건에서 베이스라인(baseline)을 기준으로 하였다. 이 곡선은 비선형 회귀법을 사용하여 단일 결합 자리 경쟁 모형에 맞춰 얻은 근사 곡선이다. 이 근사 곡선은 각 항체별 IC₅₀을 제공하는데, 천연형과 S239D에 대하여 점선으로 도시하였다.

도 11a 및 11b. 선택된 알렘투주맵(도 11a)과 트라스투주맵(도 11b) Fc 변이체들의 인간 Val158 FcγRIIIa에 대한 결합을 알파스크린^TM으로 검사한 결과. 이 결합 데이터는 각 특정 항체에 대한 상한 및 하한 베이스라인으로 표준화하였고, 단일 경쟁 모델에 맞춰 데이타의 근사 곡선을 얻었다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다.

도 12. 선택된 알렘투주맵 Fc 변이체들의 인간 FcγRIIb에 대한 결합을 알파스크린^TM으로 검사한 결과. 이 결합 데이터는 각 특정 항체에 대한 상한 및 하한 베이스라인으로 표준화하였고, 단일 경쟁 모델에 맞춰 데이타의 근사 곡선을 얻었다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다.

도 13. 선택된 알렘투주맵 Fc 변이체들의 인간 R131 FcγRIIa에 대한 결합을 알파스크린^TM으로 검사한 결과. 이 결합 데이터는 각 특정 항체에 대한 상한 및 하한 베이스라인으로 표준화하였고, 단일 경쟁 모델에 맞춰 데이타의 근사 곡선을 얻 었다.

도 14. 실시예 2에 기재된 바와 같은, 선택된 알렘투주맵 Fc 변이체들의 인간 FcRn에 대한 결합도를 알파스크린^TM으로 측정한 결과. 이 결합 데이터는 각 특정 항체에 대한 상한 및 하한 베이스라인으로 표준화하였고, 단일 경쟁 모델에 맞춰 데이타의 근사 곡선을 얻었다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다.

도 15. 실시예 2에 기재된 바와 같은, 선택된 알렘투주맵 Fc 변이체들의 균체 단백질 A에 대한 결합도를 알파스크린^TM으로 측정한 결과. 이 결합 데이터는 각 특정 항체에 대한 상한 및 하한 베이스라인으로 표준화하였고, 단일 경쟁 모델에 맞춰 데이타의 근사 곡선을 얻었다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다.

도 16a-16b. 선택된 알렘투주맵 Fc 변이체들의 인간 Val158 FcγRIIIa(도 16a)와 인간 FcγRIIb(도 16b)에 대한 결합을 알파스크린^TM으로 비교한 결과. 이 결합 데이터는 각 특정 항체에 대한 상한 및 하한 베이스라인으로 표준화하였고, 단일 경쟁 모델에 맞춰 데이타의 근사 곡선을 얻었다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다.

도 17a-17b. 선택된 트라스투주맵 Fc 변이체들의 인간 V158 FcγRIIIa에 대한 결합도(도 17a 및 도 17b)와 상기 트라스투주맵 Fc 변이체들의 인간 FcγRIIb에 대한 결합도(도 17c)를 알파스크린^TM으로 측정한 결과. 이 결합 데이터는 각 특정 항체에 대한 상한 및 하한 베이스라인으로 표준화하였고, 단일 경쟁 모델에 맞춰 데이타의 근사 곡선을 얻었다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다.

도 18. 선택된 리툭시맵 Fc 변이체들의 인간 V158 FcγRIIIa에 대한 결합도를 알파스크린^TM으로 측정한 결과. 이 결합 데이터는 각 특정 항체에 대한 상한 및 하한 베이스라인으로 표준화하였고, 단일 경쟁 모델에 맞춰 데이타의 근사 곡선을 얻었다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다.

도 19. 선택된 세툭시맵 Fc 변이체들의 인간 V158 FcγRIIIa에 대한 결합도를 알파스크린^TM으로 측정한 결과. 이 결합 데이터는 각 특정 항체에 대한 상한 및 하한 베이스라인으로 표준화하였고, 단일 경쟁 모델에 맞춰 데이타의 근사 곡선을 얻었다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다.

도 20a-20b. 선택된 알렘투주맵 Fc 변이체들이 인간 FcγRIIIa의 V158(도 20a)과 F158(도 20b) 동종이형에 결합하는 것을 알파스크린^TM으로 검사한 결과. 이 결합 데이터는 각 특정 항체에 대한 상한 및 하한 베이스라인으로 표준화하였고, 단일 경쟁 모델에 맞춰 데이타의 근사 곡선을 얻었다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다.

도 21a-21d. 도 21a 및 21b는 SPR Kd와 알파스크린^TM으로 선택된 알렘투주맵 Fc 변이체들이 인간 V158 FcγRIIIa(도 21a)와 F158 FcγRIIIa(도 21b)에 결합할 때 측정한 IC₅₀와의 상관관계를 보여준다. 도 21c와 도 21d는 선택된 알렘투주맵 Fc 변이체가 V158 FcγRIIIa(도 21c)와 F158 FcRIIIa(도 21d)에 결합할 때 알파스 크린^TM으로 검사한 결합 정도의 증가 배율과 SPR 사이의 상관 관계를 도시한다. 결합 데이터는 표 3에 나타내었다. 데이터를 잇는 직선은 데이터에 대하여 선형으로 근사한 것이며, r² 값은 이 근사의 유의도를 가리킨다.

도 22a 및 22b. 선택된 알렘투주맵 Fc 변이체들이 인간 V158 FcγRIIIa에 결합하는 것을 알파스크린^TM으로 검사한 결과. 이 결합 데이터는 각 특정 항체에 대한 상한 및 하한 베이스라인으로 표준화하였고, 단일 경쟁 모델에 맞춰 데이타의 근사 곡선을 얻었다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다.

도 23a-도 23b. 선택된 알렘투주맵 Fc 변이체들의 ADCC 현상을 세포기반 검사 방법으로 분석하였다. ADCC는 실시예 3에 기재된 바와 같이, DELFIA® EuTDA 기반 세포독성 검사법(미국 매사추세츠주 Perkin Elmer社)으로 분석하였으며, DoHH-2 림프구 표적 세포와 50배 과량의 인간 PBMC를 사용하였다. 도 23a는 표시한 알렘투주맵 항체가 10 ng/μL일 때 가공 않은 형광 데이터를 보여 주는 막대 그래프이다. PBMC 막대는 항체가 없을 때의 바닥 수준의 세포독성을 나타낸다. 도 23b는 표시한 알렘투주맵 항체의 농도와 ADCC 사이의 용량 의존성을 보여주는데, 여기에서 항체의 농도가 낮거나 높을 때의 기저선으로부터 각각 최소와 최대 형광 신호를 구하여 이를 기준으로 각 곡선마다 크기를 표준화하였다. 이 곡선은 비선형 회귀법을 사용하여 데이터를 S자형 용량 의존성 모형에 맞춰 근사한 것이다.

도 24a-24c. 선택된 트라스투주맵 Fc 변이체들을 세포기반 ADCC 검사법으로 분석한 결과. ADCC는 실시예 3에 기재한대로 DELFIA EuTDA 기반 세포독성 검사법 을 이용하여 BT474와 Sk-Br-3 유방암 세포주를 표적세포로, 인간 PBMC를 50배 과량으로 하여 측정하였다. 도 24a는 트라스투주맵 항체가 1 ng/μL일 때 가공 않은 형광 데이터를 보여 주는 막대 그래프이다. PBMC 막대는 항체가 없을 때의 바닥 수준의 세포독성을 나타낸다. 도 24a 및 24b는 표시한 트라스투주맵 항체의 농도와 ADCC 사이의 용량 의존성을 보여주는데, 여기에서 항체의 농도가 낮거나 높을 때의 기저선으로부터 각각 최소와 최대 형광 신호를 구하여 이를 기준으로 각 곡선마다 크기를 표준화하였다. 이 곡선은 비선형 회귀법을 사용하여 데이터를 S자형 용량 의존성 모형에 맞춰 근사한 것이다.

도 25a-25c. 선택된 리툭시맵 Fc 변이체들을 세포기반 ADCC 검사법으로 분석한 결과. ADCC는 실시예 3에 기재한대로 DELFIA EuTDA 기반 세포독성 검사법을 이용하여 WIL2-S 림프종 세포주를 표적세포로, 인간 PBMC를 50배 과량으로 하여 측정하였다. 도 25a는 리툭시맵 항체가 1 ng/μL일 때 가공 않은 형광 데이터를 보여 주는 막대 그래프이다. PBMC 막대는 항체가 없을 때의 바닥 수준의 세포독성을 나타낸다. 도 25b와 25c는 표시한 리툭시맵 항체의 농도와 ADCC 사이의 용량 의존성을 보여주는데, 여기에서 항체의 농도가 낮거나 높을 때의 기저선으로부터 각각 최소와 최대 형광 신호를 구하여 이를 기준으로 각 곡선마다 크기를 표준화하였다. 이 곡선은 비선형 회귀법을 사용하여 데이터를 S자형 용량 의존성 모형에 맞춰 근사한 것이다.

도 26a-26b. ADCC 현상의 세기와 효능의 향상이 있는 선택된 트라스투주맵 Fc 변이체(도 26a)와 리툭시맵 Fc 변이체(도 26b)들을 세포기반 검사법으로 분석한 결과. 두 측정 실험 모두 F158/F158 FcγRIIIa PBMC 동종접합체를 작용자로 하여 표적 세포보다 25배 과량으로 사용하였는데, 표적세포는 트라스투주맵 분석에 Sk-Br-3, 리툭시맵 분석에 WIL2-S를 사용하였다. 데이터는 실시예 3에서 기재한대로, PBMC만으로 처리(항체 없음)한 표적 세포의 형광 신호에서 구할 수 있는 절대 최소 세포용해 조건과 Triton X-1000 존재하에 표적 세포의 형광 신호에서 구할 수 있는 절대 최대 세포용해 조건을 기준으로 표준화하였다.

도 27. 선택된 알렘투주맵 Fc 변이체들이 인간 V158 FcγRIIIa에 결합하는 것을 알파스크린^TM으로 검사한 결과. 이 결합 데이터는 각 특정 항체에 대한 상한 및 하한 베이스라인으로 표준화하였고, 단일 경쟁 모델에 맞춰 데이타의 근사 곡선을 얻었다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다.

도 28. ADCC. 선택된 Fc 변이체 트라스투주맵 항체를 세포기반 ADCC 검사법으로 분석한 결과를 WT 트라스투주맵의 분석 결과와 비교. 정제된 인간 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 작용자로서 이용하였고, Sk-Br-3 유방암 세포를 표적 세포로서 이용하였다. 세포독성 감지 키트(LDH, Roche Diagnostic Corporation, 미국 인디애나폴리스에 소재)를 이용하여 LDH 활성을 측정함으로써, 용해도를 모니터링하였다. 시료를 오류 추정을 제공하기 위하여 3배수로 전개하였다(n=3, +/- S.D.). 각각의 도면은 다양한 항체 농도에서의 용량 의존도를 도시하며, 분석 시의 용해 최소 수준과 용해 최대 수준을 구하여 이를 기준으로 표준화하였다. 이 곡선은 비선형 회귀법을 사용하여 데이터를 S자형 용량 의존성 모형에 맞춰 근사한 것이다.

도 29a-29b. 서로 다른 수준의 Her2/neu 표적 항원을 발현하는 다양한 세포주에 대하여 선택된 트라스투주맵 Fc 변이체들이 일으키는 ADCC를 세포기반 검사법으로 분석한 결과. ADCC 검사법은 실시예 5에 기재된 대로 실행하였는데, Her/neu 리셉터를 확대된 수준에서 또는 낮은 수준에서 발현하는 다양한 세포주를 대상으로 하였다. 이에는 Sk-Br-3 (약 1x10⁶ 리셉터), SkOV3 (약 1X10⁵), OVCAR3 (약 1x10⁵), 및 MCF-7 (약 3x10³)이 포함된다. 도 29a는 각각의 세포주에 대한 Her2 발현 수준을 나타내는 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한 도면이며, 상기 분석 시, 당량의 세포 용해질을 SDS-PAGE 겔에 로딩하고, 트라스투주맵을 이용하여 Her2를 검출하였다. F158/F158 FcγRIIIa로 그 동종이형이 밝혀진 인간 PBMC를 표적 세포에 대하여 25배 과량으로 사용하였다. 막대 그래프는 천연형과 Fc 변이체가 표시한 세포주에 대하여 일으키는 ADCC 데이터를 나타내는데, 데이터는 최소 세포용해 조건(PBMC만 가함)과 최대 세포용해 조건(Triton X-1000)으로 정하여지는 형광 신호의 최소값과 최대값을 기준으로 표준화하였다.

도 30. 선택된 트라스투주맵 Fc 변이체의 ADCC 검사에 있어서 자연 세포독성 세포를 작용자로 사용하고 LDH 방출을 측정하여 세포 용해를 관측함으로써 세포기반 둔 분석 방법으로 수행하였다. 자연 세포독성 세포의 동종이형은 F158/F158 FcγRIIIa였고, 그 양은 Sk-Br-3 유방암 표적 세포에 대하여 4배 과량이었으며, 세포독성은 LDH 세포독성 감지 키트(독일 Penzberg 소재 Roche Diagnostics社)를 제조사의 설명대로 사용하여 측정하였다. 그래프는 표시한 트라스투주맵 항체에 있어 서 항체 농도와 ADCC 사이의 용량 의존성을 보여주는데, 데이터를 각각 항체 농도가 낮거나 높을 때의 기저선에서 얻은 형광 신호의 최소값과 최대값을 기준으로 표준화하였다. 그림의 곡선은 비선형 회귀법을 사용하여 데이터를 S자형 용량 반응 모형(sigmoidal dose-response model)에 맞춰 근사한 것이다.

도 31. 세포를 토대로 선택한 변이체의 ADCP 분석. ADCP 분석법은 실시예 7에 나타난 대로, 공동 표지 방식을 유동세포 분석과 결합하여 수행하였다. 분화된 대식세포(macrophage)를 작용자로 사용하였고, Sk-Br-3 세포를 표적 세포로 사용하였다. 퍼센트 식세포작용은 Sk-Br-3의 총수(포식된 세포와 되지 않은 것)에서 공동표지된 세포(대식세포 + Sk-Br-3)의 수가 차지하는 분율을 나타낸다.

도 32a-32d. 선택된 Fc 변이체가 보체의 결합과 활성화를 매개하는 능력. 도 32a는 선택된 알렘투주맵 Fc 변이체가 C1q에 결합하는 것을 알파스크린^TM 검사법으로 측정한 결과를 보여준다. 결합 데이터는 각 항체마다 상부와 하부의 기저선을 기준으로 표준화하였고, 그림의 곡선은 단일 결합자리 경쟁 모형에 맞춰 데이터를 근사한 것이다. 도 32b와 32c는 선택된 리툭시맵 Fc 변이체가 CDC를 매개하는 능력을 세포기반 검사법으로 측정한 것이다. CDC 검사법은 Alamar Blue를 사용하여 천연형 또는 Fc 변이체 리툭시맵으로 옵소닌화(opsonization)한 WIL2-S 림프종 세포에 대하여 인간 혈청 보체로 세포 용해하는 것을 관찰하여 수행하였다(캘리포니아 샌디에고 소재 Quidel社). 보체 매개 세포 용해의 항체 농도에 따른 용량반응성을 표시한 리툭시γ맵 항체에 대하여 나타내고 있는데, 데이터는 각각 항체 농 도가 낮거나 높을 때의 기저선에서 얻은 형광 신호의 최소값과 최대값을 기준으로 표준화하였다. 그림의 곡선은 비선형 회귀법을 사용하여 데이터를 S자형 용량 반응 모형에 맞춰 근사한 것이다.

도 33a-33c. 실시예 9의 원숭이(macaque)에서 Fc 변이체에 의한 B 세포 고갈 증강. 도 33a는 마커 CD20+ 및 CD40+를 이용하여 측정한, 항-CD20 WT 및 S239D/I332E 리투시맴 항체 처리하는 동안 원숭이(Macaca Fascicularis)의 잔류 B 세포 퍼센트를 나타낸다. 도 33b는 마커 CD3-/CD16+ 및 CD3-/CD8+로 측정한, 치료동안의 원숭이의 잔류 자연 살상(NK) 세포 퍼센트를 나타낸다. 도 33c는 S239D/I332E 리투시맴으로 처리시 CD20+ B 세포 수준의 투여량 반응을 나타낸 것이다. 데이타는 3 마리 원숭이샘플의 평균으로 나타낸다.

도 34a 및 34b. 실시예 10에 개시된 바에 따른 마우스 FcγRIII에 대한 알렘투주맵(도 34a) 및 트라스투주맵(도 34b) Fc 변이체의 선택적 결합성을 측정한 알파스크린 분석. 결합 데이타는 각 특정 항체에 대한 상한 및 하한 베이스라인으로 표준화하였고, 곡선은 단일 부분 경쟁 모델의 데이타 핏(fit)을 나타낸다. PBS는 음성 대조군으로 이용하였다.

도 35. 작용자 세포로서 마우스 PBMC를 이용한 트라스투주맴에서의 Fc 변이체 선택성을 나타낸 세포성 ADCC 분석. ADCC는 Sk-Br-3 유방 암 표적 세포와 8배의 마우스 PBMC를 이용한 DELFIA^® EuTDA계 세포독성 분석으로 측정하였다. 막대 그래프는 10 ng/ml에서의 지정된 트라스투주맵 항체에 대한 가공하지 않은 형광분 석 데이타이다. PBMC 막대 그래프를 항제 무존재시 세포독성의 베이스 레벨을 나타내며, TX는 트리톤 X1000의 존재시 세포가 완전히 용혈됨을 나타낸다.

도 36. 실시예 11의, 293T 및 CHO 세포에서 발현된 트라스투주맵 Fc 변이체를 선별함에 의한 인간 V158 FcγRIIIa에 대한 결합성을 측정한 알파스크린 분석. 결합 데이타는 각 특정 항체에 대한 상한 및 하한 베이스라인으로 표준화하였고, 단일 경쟁 모델에 맞춰 데이타의 근사 곡선을 얻었다. PBS는 음성 대조군으로서 사용하였다.

도 37a - 37b. Fc 변이체 및 조작한 단백당형의 상승 효과. 도 37a는 293T, CHO, 및 Lec-13 CHO 세포에서 발현된 WT 및 Fc 변이체(V209, S239/I332E/A330L) 트라스투주맵에 의한 V158 FcγRIIIa 결합성을 보이는 알파스크린 분석을 나타낸다. 데이타는 각 항체에 대한 상한 및 하한 베이스라인으로 표준화하였고, 단일 경쟁 모델에 맞춰 데이타의 근사 곡선을 얻었다. PBS는 음성 대조군으로서 사용하였다. 도 37b는 239T, CHO, 및 Lec-13CHO에서 발현된 WT 및 V209 트라스투주맵의 ADCC 매개 능력을 나타낸, 세포성 ADCC 분석을 나타낸 것이다. ADCC는 전술한 바와 같이 Sk-Br-3 유방 암종 표적 세포를 이용한 DELFIA^® EuTDA계 세포독성 분석으로 측정하였다. 데이타는 지정된 트라스투주맵 항체에 대한 항체농도에서의 ADCC의 투여량 의존성을 나타낸 것으로, 이는 각 특정 곡선에 대한 최소 및 최대 형광 시그널로 표준화하여 각 고농도 및 저농도 항체에서의 베이스 라인을 제공한다. 곡선은 비선형 회귀를 이용한 시그모이달 투여량-반응 모델에 데이타 핏을 나타낸다.

도 38. 어글리코실화된 알렘투주맵 Fc 변이체의 인간 V158 FcγRIIIa에 대한 결합성을 확인한 알파스크린 분석. 결합 데이타는 각 특정 항체에 대한 상한 및 하한 베이스라인으로 표준화하였고, 단일 경쟁 모델에 맞춰 데이타의 근사 곡선을 얻었다. PBS는 음성 대조군으로서 사용하였다.

도 39. 당화(속이 비지 않은 기호(solid symbol) 및 연속 선) 및 탈당화(속이 빈 기호 및 점선) 형태의 알렘투주맵 Fc 변이체 선택에 의한 인간 V158 FcγRIIIa 결합성을 비교한 알파스크린 분석. 결합 데이타는 각 특정 항체에 대한 상한 및 하한 베이스라인으로 표준화하였고, 단일 경쟁 모델에 맞춰 데이타의 근사 곡선을 얻었다.

도 40a - 40c. 개선된 항-CD20 항체 서열. 리투시맵의 경쇄 및 중쇄 열은 도 40a 및 40b에 나타내며, US 5,736,137의 번역 서열 3에서 취하였다. 도 40 b에 S239, V240, V264I, H268, E272, K274, N297, S298, K326, A330, 및 I332를 포함한, 해당 위치를 진하게 표시한다. 도 40c는 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, Z1, 및 Z2로 진하게 표시한 가변 위치가 있는, 개선된 항-CD20 항체 중쇄 서열을 나타낸다. 하기 표는 이들 위치에 가능한 치환을 나타낸다. 개선된 항-CD20 항체 서열은 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, 및X9에 대한 가능한 치환 군으로부터 선택된 하나 이상의 비천연성 아미노산을 포함한다. 이들 개선된 항-CD20 항체 서열은 또한 치환 Z1 및/또는 Z2를 포함할 수 있다. 이들 위치는 Kabat의 EU 인덱스에 따라 넘버링하며, 따라서, 서열에서의 순서와 동일하지 않다.

도 41은 구축 및 실험한 Fc 변이체 세트이다.

도 42는 서열번호 5를 나타내며, Xaa 잔기는 표 10에 나타낸다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이다. 이들 실시예는 본 발명을 어떠한 특정 용도 또는 작동 이론으로 제한하지 않는다.

본 발명에 논의된 모든 위치에 대하여, 넘버링은 EU 항체의 넘버링에 관한 (Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85) EU 인덱스 또는 EU 넘버링 (Kabat et al ., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda)에 따른다. 항체 분야의 당업자는 이들 조약이 면역글로불린 서열의 특정 영역에서 비순차적 넘버링으로 이루어지며 면역글로불린 패밀리에서 보존된 위치에 대한 표준화된 참조를 가능케함을 인식할 것이다. 따라서, EU 인덱스에 의해 정의되는 임의의 주어진 면역글로불린의 위치은 반드시 그 순차적 서열에 상응하지 않는다. 도 3은 그 원리를 보다 명확히 예시하기 위하여 항체 알렘투주맵(alemtuzumab)에 대한 순차적 및 EU 인덱스 넘버링 계획을 도시한다. Kabat 270, 272, 312, 315, 356, 및 358을 포함하는 다수의 Fc 위치에서 다형성이 관측되었으며 따라서 제시된 서열과 과학 문헌에서의 서열간의 근소한 차이가 존재할 수 있음을 주목하여야 한다.

Fc 변이체 및 Fc 변이체 라이브러리를 USSN 10/672,280 및 USSN 10/822,231에 기재된 바와 같이 컴퓨터 및 서열 기초 방법을 사용하여 고안하였다. 컴퓨터식 및 실험적 스크리닝의 연속적 라운드로 실험적 라이브러리를 설계하였다. 후속적 라이브러리의 설계는 이전의 라이브러리로부터의 피드백에 의하였으며 따라서 전형적으로 이전의 스크린에서 유리한 특성을 보인 Fc 변이체의 조합으로 전형적으로 이루어졌다. 도 4는 본 발명의 Fc 변이체에서 아미노산 변형이 이루어진 잔기를 도시하며, 인간 Fc/FcγRIIIb 구조 상으로 매핑되었다. 작제되고 실험적으로 테스트된 전체 Fc 변이체 세를 도 41에 도시한다.

실시예 1: 분자 생물학 및 단백질 발현/정제

Fc 변이체 상에서 대다수의 실험을 항암 항체 알렘투주맵(Campath a registered trademark of Ilex Pharmaceuticals LP)에 따라 행하였다. 알렘투주맵은 짧은 선형 에피토프를 그 표적 항원 CD52 내에 결합시킨다 (Hale et al ., 1990, Tissue Antigens 35:118-127; Hale, 1995, Immunotechnology 1:175-187). 알렘투주맵은 그 효율성이 부분적으로 작용자 세포를 모으는 능력으로 인한 것이며 결합 분석에서 그 항원의 생산 및 사용이 비교적 직접적이기 때문에 일차 엔지니어링 주형으로 선택되어 왔다(Dyer et al ., 1989, Blood 73:1431-1439; Friend et al ., 1991, Transplant Proc 23:2253-2254; Hale et al ., 1998, Blood 92:4581-4590; Glennie et al., 2000, Immunol Today 21:403-410). 다른 항체와의 관계에서 본 발명의 최적화된 Fc 변이체를 평가하기 위하여, 선별된 Fc 변이체를 항-Her2 항체 트라스투주맵(trastuzumab)(Herceptin a registered trademark of Genentech), 항-CD20 항체 리투시맵(rituximab)(Rituxan a registered trademark of IDEC Pharmaceuticals Corporation), 항-EGFR 항체 세투시맵(cetuximab)(Erbitux a registered trademark of Imclone), 및 항-CD20 항체 PRO70769(PCT/US2003/040426, entitled "Immunoglobulin Variants and Uses Thereof")에서 평가하였다. 스크리닝 목적의 알렘투주맵, 트라스투주맵, 리투시맵, 세투시맵 및 PRO70769의 사용은 본 발명을 특정 항체로 제한하는 것을 의미하는 것이 아니다.

알렘투주맵(campath-1H, James et al., 1999, J Mol Biol 289: 293-301), 트라스투주맵(trastuzumab)(hu4D5-8; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-4289; Gerstner et al., 2002, J. Mol . Biol ., 321: 851-862), 리투시맵 (C2B8, US 6,399,061), 및 세투시맵(C225, PCT US96/09847)에 대한 IgG1 전장 경쇄 (V_L-C_L) 및 중쇄 (V_H-Cγ1-Cγ2-Cγ3) 항체 유전자를 간편한 말단 제한 부위를 가진 순환 PCR 을 사용하여 작제하여 서브클로닝을 촉진시켰다. 유전자를 전장 경쇄 카파 (Ck) 및 중쇄 IgG1 불변 영역을 포함하는 포유류 발현 벡터 pcDNA3.1Zeo (Invitrogen)에 결찰시켰다. pcDNA3.1zeo 내 V_H-Cγ1-Cγ2-Cγ3 클론을 Fc 영역의 돌연변이 생성을 위한 주형으로 사용하였다. 돌연변이를 상기 클론 내로 PCT-기초 돌연변이 생성 또는 퀵 체인지 돌연변이생성(Stratagene) 기법을 사용하여 도입하였다. Fc 변이체를 서열의 복제성을 확인하기 위하여 시퀀싱하였다. 중쇄 유전자 (V_H-Cg1-Cg2-Cg3) (야생형 또는 변이체)를 함유하는 플라스미드를 경쇄 유전자(V_L-C_L)를 함유하는 플라스미드를 사용하여 293T 세포 내로 동시 형질감염시켰다. 배지를 형질감염 5일후 수확하였다. 면역글로불린의 발현을 퍼옥시다아제-접합 고트-항 인간 IgG (Jackson ImmunoResearch, catalog # 109-035-088)를 사용하여 웨스턴에 의한 transfectomas의 배양 상청액의 스크리닝에 의해 모니터링하였다. 도 5는 293T 세포 내 변이체 1 내지 10 및 야생형 알렘투주맵의 발현을 도시한다. 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 상청액으로부터 정제하였다(Pierce, Catalog # 20334). 도 6은 WT 알렘투주맵에 대한 단백질 정제 결과를 보인다. 항체 Fc 변이체는 WT와 유사한 발현 및 정제를 보였다. Fc 변이체를 탈글리코실화하여 탄수화물 부재시 그 용액 및 기능적 특성을 결정하였다. 탈글리코실화 항체를 얻기 위해, 정제된 알렘투주맵 항체를 펩티드-N-글리코시다아제(PNGase F)로 37℃ 24시간 인큐베이션하였다. 도 7은 몇몇 Fc 변이체 및 WT 알렘투주맵에 대한 탈글리코실화를 확인하는 SDS PAGE 겔을 제시한다.

상기 조건에서 생산된 알렘투주맵의 기능적 복제성을 확인하기 위해, GST에 융합된 항원성 CD52 펩티드를 IPTG 유도하에 E. coli BL21 (DE3) 내에서 발현시켰다. 비유도 및 유도 샘플을 모두 SDS PAGE 겔 상에서 시험하고 PVDF 막으로 이송하였다. 웨스턴 분석을 위하여, Sotec으로부터의 알렘투주맵 (최종 농도 2.5ng/ul) 또는 형질감염된 293T 세포 배지(최종 알렘투주맵 농도 약 0.1-0.2 ng/ul)을 일차 항체로 사용하고, 퍼옥시다아제-접합 코트-항 인간 IgG를 2차 항체로 사용하였다. 도 8은 이 결과를 제시한다. 표적 항원에 결합하는 능력은 발현된 알렘투주맵의 기능적 및 구조적 성실성을 확인한다. WT 알렘투주맵과 동일 가변영역을 가진 Fc 변이체가 필적할 만한 항원에 대한 결합 친화성을 유지할 것으로 기대된다.

인간 V158 FcγRIIIa의 세포외 영역을 인코딩하는 유전자를 Mammalian Gene Collection (MGC:22630)으로부터 얻은 클론으로부터 PCR에 의해 얻었다. F158 Fc γRIIIa 을 V158 FcγRIIIa 유전자의 돌연변이 생성에 의해 작제하였다 인간 FcγRI, 인간 FcγRIIa, 인간 FcγRIIb, 인간 FcγRIIc, 마우스 FcγRIII, 및 인간 FcRn α 체인 및 β-마이크로글로뷸린 체인의 세포외 영역을 인코딩하는 유전자를 순환 PCR을 사용하여 작제하였다. FcγRs 및 FcRn α 체인을 6x His-tag 및 GST-tag를 사용하여 C-말단에서 융합하였다. 모든 유전자를 pcDNA3.1zeo 벡터내로 서브클로닝하였다. 발현을 위해, 인간 FcγRs 을 함유하는 벡터를 293T 세포내로 형질감염시키고, FcRn α 체인 및 β-마이크로글로뷸린 체인을 293T 세포내로 동시형질감염하고, 마우스 FcγRIII 를 NIH3T3 세포내로 형질감염하였다. 분비된 수용체를 함유하는 배지를 3일 후에 수확하고 니켈 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 웨스턴 분석을 위해, 막을 항-GST 항체로 탐침하였다. 도 9는 인간 V158 FcγRIIIa 의 발현 및 정제 결과를 보이는 SDS PAGE 겔을 제시한다. 정제된 인간 C1 단백질 착체를 상업적으로 구입하였다(Quidel Corp., San Diego).

실시예 2. Fc 리간드 결합 분석

인간 Fc 리간드 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa, C1q, 및 FcRn에 대한 결합을 설계된 Fc 변이체에 대하여 측정하였다. 결합 친화성을 비드-기초 발광 분석인 알파스크린 assay (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay (ALPHA), PerkinElmer, Wellesley, MA)를 사용하여 측정하였다. 도너 비드의 레이저 여기는 산소를 흥분시키며, 이는 충분히 억셉터 비드에 근접한다면 일련의 화학발광 사건을 생성하여 궁극적으로 520-620nm에서 형광 발광을 초래한다. WT 알렘투주맵 항체를 스트렙파비딘 도너 비드에의 부착을 위해 표준 방 법으로 비오티닐화하고, GST-tagged FcγRs 및 FcRn을 글루타티온 킬레이트 억셉터 비드에 결합시켰다. C1q 결합 분석을 위해, untagged C1q 단백질을 N-히드로숙신이미드(NHS) 화학을 사용하여 Digoxygenin (DIG, Roche)과 접합시키고 DIG 억셉터 비드에 결합시켰다. 단백질 A 결합 분석을 위해, 단백질 A 억셉터 비드를 PerkinElmer로부터 직접 구입하였다. α스크린 분석을 Fc 변이체 스크리닝에 대한 경쟁 분석으로 적용하였다. 경쟁 Fc 변이체 부재시, WT 항체 및 FcγR는 상호작용하여 520-620nm에서 시그널을 생산한다. untagged Fc 변이체의 첨가는 WT Fc/FcγR 상호작용과 경쟁하여 정량적 형광을 감소시켜 상대적 결합 친화성 측정을 가능케 한다. Fc 변이체를 알렘투주맵 또는 트라스투주맵에 대하여 스크리닝하고 선별된 Fc 변이체를 또한 리투시맵 및 세투시맵에 대하여 스크리닝하였다.

도 10은 선별된 Fc 변이체에 의한 인간 V158 FcγRIIIa에 대한 결합에 대한 α스크린 데이터를 보인다. 결합 데이트를 각각 최저 및 최고 항체 농도에서 기저선에 의해 제공되는 각각 특정 커브에 대하여 최대 및 최소 발광 시그널로 표준화하였다. 데이터를 비선형 회귀를 사용하여 1 부위 경쟁 모델에 적합하도록 하고, 이들 핏을 도면에서 곡선으로 나타낸다. 이들 핏은 각각의 항체에 대한 억제 농도 50%(IC50)(즉 50% 억제에 필요한 농도)를 제공하며, 이는 도 10에서 점선으로 표시된다. 따라서, Fc 변이체의 상대 결합 친화성의 정량적 측정이 가능하다. WT 알렘투주맵의 IC50으로 각각의 변이체에 대한 IC50을 나누어 WT Herceptin에 대한 상대적 증진 또는 감소(Fold WT)를 얻는다. 여기서, WT 알렘투주맵는 IC50 (4.63x10^{- 9})x(2) = 9.2 nM 인 반면, S239D는 IC50 (3.98x10^-10)x(2) = 0.8 nM이다. 따라서 S239D 알렘투주맵이 WT 알렘투주맵 보다 인간 V158 FcγRIIIa에 9.2 nM/0.8 nM = 11.64-배 보다 타이트하게 결합한다. 도 11a 및 11b는 위치 239, 264, 272, 274, 및 332에 치환을 가지고, FcγRIIIa에 보다 타이트하게 결합하는 부가적인 Fc 변이체가 Fc 폴리펩티드의 작용자 기능을 증진시키기 위한 후보자임을 보이는 α스크린 데이터를 보인다.

Fc 변이체를 또한 다른 Fc 리간드에 대하여 평행하게 스크리닝하였다. 논의된 바와 같이, FcγRIIb의 억제 수용체는 작용자 기능에서 중요 역할을 한다. α스크린에 의해 측정된 선별 Fc 변이체의 인간 FcγRIIb에의 결합에 대한 실험 데이터를 도 12에 제공한다. FcγRIIa 는 FcγRIIb에 매우 상동인 활성화 수용체이다. 선별 Fc 변이체의 인간 FcγRIIa의 R131 다형체에의 결합에 대한 실험 데이터를 도 13에 제공한다. 또 다른 중요한 Fc 리간드는 neonatal Fc 수용체 FcRn이다. 논의된 바와 같이, 이 수용체는 Cg2 및 Cg3 도메인 사이 Fc 영역에 결합하며; 결합이 endosomal 리사이클링을 중재하므로, FcRn에 대한 Fc의 친화성은 항체 및 Fc 융합 약리역학의 주요 결정자이다. α스크린에 의해 측정된 선별 Fc의 FcRn에 대한 결합을 보이는 실험 데이터를 도 14에 제공한다. Fc 상에서 Cg2 및 Cg3 사이에 FcRn에 대한 결합 부위가 박테리아 단백질 A 및 G에 대한 결합 부위와 중첩된다. 단백질 A는 종종 항체 정제를 위해 사용되므로, 선별 변이체를 Fc 리간드에의 결합에 대하여 시험하였다. 도 15는 이들 α스크린 데이터를 제공한다. 단백질 A는 모든 변이체에 대한 평행 스크린에 포함되지 않지만, 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 Fc 변이체가 정제되는 능력(실시예 1 참조)은 대다수의 Fc 변이체에 있어서 단백질 A에 결합 능력 및 나아가 Cg2-Cg3 힌지 영역의 성실성이 Fc 치환에 의해 영향받지 않음을 암시한다.

FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa, C1q, 및 FcRn에 대한 Fc 변이체의 결합 데이터를 도 11에 기재된 바와 같이 분석하였다. α스크린에 의해 측정한, 각각의 Fc 리간드에 각각의 변이체의 결합에 대한 WT에 상대적인 증진 또는 감소를 도 41에 제공한다. 표는 각각의 변이체에 대하여 변이체 넘버(변이체), 변이체의 치환, 항체 관련(context), WT에 상대적인 fold 친화성(fold) 및 각각의 Fc 리간드에 대한 결합에 대한 폴드 친화성에서 confidence(Conf), IIIa:IIb 특이성 비율(IIIa:IIb)을 제시한다. 많은 변이체에 대하여 복수 데이터 세트를 얻었으며, 주어진 변이체에 대한 모든 데이터를 함께 그루핑하였다. 항체의 관계(context)는 어떤 항체가 특정 Fc 변이체와 함께 작제되었는지를 나타낸다; a = 알렘투주맵, t = 트라스투주맵, r = 리투시맵, c= 세투시맵, and p = PRO70769. 제공된 데이터는 나열된 1차 항체, 전형적으로 알렘투주맵과의 관계에서 얻었으나, 어떠한 경우 트라스투주맵였다. 별표(*)는 주어진 Fc 리간드에 대한 데이터를 트라스투주맵과의 관계에서 얻었음을 나타낸다. 1 이상의 폴드(Fold)는 결합 친화성에서 증진을 나타내며, 1 이하의 폴드는 주어진 Fc 리간드에 대한 부모 항체에 대하여 결합 친화성 감소를 나타낸다. Confidence values (Conf)는 log confidence 레벨에 상응하며, 데이터의 피트로부터 sigmoidal dose 반응 곡선으로 제공된다. 당업계에 공지된 바와 같이, 보다 낮은 Conf 값은 Fold 값에서 보다 낮은 에러 및 보다 큰 confidence를 나타낸다. 주어진 변이체 및 Fc 리간드에 대한 데이터 부족은 데이터에 피트가 의미있는 값을 제공하지 않거나 변이체가 그 Fc 리간드에 대하여 시험되지 않음을 나타낸다.

도 41은 다수의 Fc 변이체가 증진된 친화성 및 변경된 다양한 Fc 리간드에 대한 특이성으로 얻어졌음을 보인다. 본 발명의 일부 Fc 변이체는 상이한 Fc 리간드에 대한 결합 친화성에서 선택적 증진을 보이는 반면, 다른 것은 상이한 Fc 리간드에 대한 결합 친화성에서 선택적 감소를 보인다. "선택적 증진"은 Fc 변이체의 하나 이상의 Fc 리간드에 대한 결합 친화성에서 하나 이상의 다른 Fc 리간드와 비교하여 증진 또는 보다 큰 증진을 의미한다. 예컨대, 주어진 변이체에 대하여, FcγRIIa에 대한 결합에 대한 Fold WT는 FcγRIIb에 대한 결합에 대한 Fold WT 보다 클 수 있다. "선택적 감소"란 Fc 변이체의 하나 이상의 Fc 리간드에 대한 결합 친화성에서 하나 이상의 다른 Fc 리간드와 비교하여 감소 또는 보다 큰 감소를 의미한다. 예컨대, 주어진 변이체에 대하여, FcγRI에 대한 결합에 대한 Fold WT는 FcγRIIb에 대한 결합에 대한 Fold WT 보다 낮을 수 있다. 그러한 선택성의 예로서, G236S는 FcγRI 및 FcγRIIIa와 비교하여 FcγRII's (IIa, IIb, and IIc)에 대한 선택적 증진을 제공한다; FcγRIIb 및 FcγRIIc와 비교하여 FcγRIIa에 대하여 다소 큰 증진. G236A는 그러나 FcγRI 및 FcγRIIIa 뿐 아니라 FcγRIIb 및 FcγRIIc에 대하여도 FcγRIIa에 대하여 매우 선택적으로 증진된다. 선택적 증진 및 감소는 잔기 L234, L235, G236, S267, H268, R292, E293, Q295, Y300, S324, A327, L328, A330, 및 T335에서 치환을 포함하는 변이체를 포함하는 다수의 Fc 변이체에서 관측된다. 전체적으로, 도 41에 제공된 데이터는, 다수의 매우 상동인 수용체가 동일 FcγR 부위에 결합한다는 사실에도 불구하고, 종종 매우 미묘한 돌연변이적 차이를 사용함으로써 Fc 리간드 특이성을 위하여 Fc 영역을 튜닝하는 것이 가능함을 보인다. 본 발명은 특정 Fc 리간드에 대한 Fc 폴리펩티드의 친화성을 다른것에 대하여 상대적으로 선택적으로 증진 및 감소시키는데에 사용될 수 있는 다수의 Fc 변이체를 제공한다. 그러한 Fc 변이체의 수집은 원하는 결과를 위해 맞추어진 작용자 기능을 가진 항체 및 Fc 융합체의 생산을 가능케 할 뿐 아니라, 작용자 기능 생물학을 실험적으로 조사 및 규명할 독특한 시약 세트를 제공한다.

논의된 바와 같이, FcγRs을 활성화하기 위한 친화성이 억제 FcγRIIb.에 대한 친화성보다 큰 Fc 변이체로부터 최적의 작용자 기능이 초래될 수 있다. 과연, FcγRIIb에 비하여 FcγRIIIa 에 대한 증진된 결합을 차별적으로 보이는 다수의 Fc 변이체가 얻어졌다. 두개의 Fc 변이체에 대한 FcγRIIIa 및 FcγRIIb에의 결합을 특이성 프로파일 A330L 및 A330Y과 함께 직접적으로 비교하는 α스크린 데이터가 도 16a 및 16b에 제시된다. 이러한 개념은 억제 FcγRIIb의 fold-증진 또는 -감소(도 41, 컬럼 8)에 의해 나누어진 활성화 FcγRIIIa의 fold-증진 또는 -감소(도 41, 컬럼 12)로서 정량적으로 정의될 수 있으며, 본원에서 이를 "Fcγ RIIIa - fold :FcγR IIb - fold ratio " 또는 "IIa : IIb ratio " 라 한다. 이 값은 도 41의 컬럼 18에 제공된다 (IIIa:IIb로서). A330L 및 A330Y의 다른 변이체, 예컨대 A330L/I332E, A330Y/I332, 및 S239D/A330L/I332E와의 조합은 매우 유리한 IIIa:IIb 비율을 제공한다. 도 41은 다수의 Fc 변이체가 IIIa:IIb 비율이 86:1로 높은 포지티브의 유리한 FcγRIIIa to FcγRIIb 특이성 프로파일을 제공함을 보인다.

작용자 기능 증진을 위해 가장 유망한 본 발명의 Fc 변이체 중 일부는 FcγRIIIa에 대한 친화성에 있어서 상당한 증가 및 유리한 FcγRIIIa-fold:FcγRIIb-fold 비율을 가진다. 이는 예컨대, S239D/I332E (FcRIIIa-fold = 56 - 192, FcγRIIIa-fold:FcγRIIb-fold = 3), S239D/A330Y/I332E (FcγRIIIa-fold = 130), S239D/A330L/I332E (FcγRIIIa-fold = 139, FcγRIIIa-fold:FcγRIIb-fold = 18), 및 S239D/S298A/I332E (FcγRIIIa-fold = 295, FcγRIIIa-fold:FcγRIIb-fold = 48). 도 17a - 17c는 인간 V158 FcγRIIIa 및 인간 FcγRIIb에 대한 트라스투주맵의 견지에서 이들 및 다른 Fc 변이체의 결합을 모니터링하는 데이터를 도시한다.

알렘투주맵 및 트라스투주맵 외에, 선별 Fc 변이체를 다른 항체에 대하여 스크리닝하여 그 적용성의 범위를 조사하였다. 리투시맵 및 세투시맵의 견지에서 선별 Fc 변이체의 인간 V158 FcγRIIIa에 대한 결합을 측정하는 α스크린 데이터를 도 18 및 19에 도시한다. 알렘투주맵 및 트라스투주맵에 대하여 이전에 도시한 데이터와 함께, 상기 결과는 항체 관련성과 무관하게 지속적인 결합이 증진되며 따라서 본 발명의 Fc 변이체가 항체 및 Fc 융합체에 광범위하게 적용가능함을 보인다.

논의된 바와 같이, Fc 개재 작용자 기능의 중요 파라미터는 FcγRIIIa의 V158 및 F158 다형체 모두에 대한 Fc의 친화성이다. 상기 두 수용체 알로타입에 대한 선별 변이체의 결합을 비교하는 α스크린 데이터를 도 20a(V158 FcγRIIIa) 및 도 20b(F158 FcγRIIIa)에 도시한다. 이로부터 알수 있는 바와 같이, 모든 변 이체가 FcγRIIIa 알로타입에 대한 결합을 증진시켰다. 이러한 데이터는 증진된 작용자 기능을 가진 본 발명의 Fc 변이체가 전체 환자 인구에 광범위하게 적용가능하며 이를 가장 필요로 하는 저반응성 환자 집단에 대하여 임상적 효율성 증진이 잠재적으로 가장 클 것임을 나타낸다.

이들 Fc 변이체의 FcγR 결합 친화성을 Surface Plasmon Resonance (SPR) (Biacore, Uppsala, Sweden)을 사용하여 더욱 조사하였다. SPR은 단백질-단백질 상호작용의 결합 친화성의 측정을 가능케 하며 Fc/FcγR 결함성을 효율적으로 측정하기 위해 사용되어온 민감하고 매우 정량적인 방법이다(Radaev et al ., 2001, J Biol Chem 276:16478-16483). 따라서, SPR은 α스크린 분석에 대한 우수한 보충적인 결합 분석을 제공한다. His-tagged V158 FcRIIIa를 SPR 칩 상에 고정하고, WT 및 Fc 변이체 알렘투주맵 항체를 상기 칩 상에서 일정 범위 농도로 유동시켰다. 표준 곡선 피팅 방법을 사용하여 데이터를 피팅함으로써 결합 계수를 얻었다. 표 3은 SPR을 사용하여 얻은 선별 Fc 변이체의 V158 FcγRIIIa 및 F158 FcγRIIIa에 대한 결합에 대한 해리 상수(Kd)를 제시하며, 이를 α스크린 분석으로 얻은 IC50s와 비교한다. 각각의 변이체의 Kd 및 IC50을 WT 알렘투주맵으로 나눔으로써, WT (Fold WT)에 대한 fold-증진을 얻었다.

표 3

상기 SPR 데이터는 α스크린 분석에 의해 얻은 FcγRIIIa 친화성에 대한 향상을 확증한다. 표 3은 S298A 및 S298A/E333A/K334A에 비하여 V264I/I332E 및 I332E의 우수성을 더욱 나타내는 반면; S298A/E333A/K334A는 V158 및 F158 FcγRIIIa에 대한 Fc 결합을 1.7배 및 4.7배 각각 향상시키고, I332E는 각각 2.2배 및 10.1배 결합 증진을 보이고, V264I/I332E는 각각 4.0배 및 14배 결합 증진을 보인다. 또한, F158 FcγRIIIa에 대한 V264I/I332E 의 친화성(52 nM)이 V158 알로타입에 대한 WT의 친화성(68nM) 보다 좋음을 주목할 만하며, 이는 Fc 변이체 및 보다 큰 결합 향상을 가진 변이체들이 저반응 환자 집단에 대한 항체의 임상적 효율성을 가능케 하여 고반응자들에게 현재 가능한 것을 달성할 수 있도록 함을 시사한다. SPR과 α스크린과 결합 측정과의 상관 관계를 도 21a - 21d에 보인다. 도 21a 및 21b는 각각 V158 FcγRIIIa 및 F158 FcγRIIIa에 대한 결합 상관관계를 도시하며, 도 21c 및 21d는 각각 V158 FcγRIIIa 및 F158 FcγRIIIa에 대한 결합에 대한 폴드 -증진 상관관계를 도시한다. 직선에 상기 데이터의 좋은 피트는 (r²= 0.9, r²= 0.84, r² = 0.98, 및 r² = 0.90) α스크린 측정의 정확성을 지지하며, Fc 변이체의 상대적 FcγR 결합 친화성 측정에 그 사용의 정당성을 입증한다.

SPR 데이터를 또한 선별 트라스투주맵 Fc 변이체의 인간 V158 FcγRIIIa, F158 FcγRIIIa, 및 FcγRIIb에 대한 결합에 대하여 얻었다. 데이터를 도 4에 도시한다. 시험된 Fc 변이체는 S239D/I332E/S298A의 F158 FcγRIIIa와의 상호작용에서 관측된 것보다 100배 더 타이트한 결합으로 활성화 수용체 FcγRIIIa에 상당한 결합 증진을 보인다. 또한, F158 FcγRIIIa/FcγRIIb 비율 3-4의 최상의 FcγRIIIa 바인더가 관측된다.

표 4

논의된 바와 같이, 보다 큰 작용자 기능에 대한 요구가 있으나, 일부 항체 요법을 위해서는 감소되거나 제거된 작용자 기능이 요구된다. 도 41에서 일부 Fc 변이체는 FcγR 결합을 상당히 감소 또는 제거시킴으로써 작용자 기능이 바람직하지 않은 항체 및 Fc 융합체에서 유용하다. 일부 예증적 Fc 변이체의 인간 V158 FcγRIIIa에 대한 결합을 측정한 α스크린 데이터를 도 22a 및 22b에 도시한다. 이들 Fc 변이체 및 조합 용도는 필요할 경우 예컨대 활성 메커니즘이 블로킹 또는 안타고니즘을 수반하나 표적 항원을 포함하는 세포의 사멸을 수반하지 않는 항체 및 Fc 융합체에서 작용자 기능을 제거하는데 유용할 것이다. 도 41에 제공된 데이터에 근거하여, Fc 리간드 결합 및/또는 작용자 기능 감소에 바람직한 위치, 즉 하나 이상의 Fc 리간드 및/또는 작용자 기능을 감소시키도록 변경된 위치은 위치 232, 234, 235, 236, 237, 239, 264, 265, 267, 269, 270, 299, 325, 328, 329, 및 330을 비제한적으로 포함한다.

실시예 3. Fc 변이체의 ADCC

작용자 기능에 대한 영향을 결정하기 위하여, 세포 기초 ADCC 분석을 선별 Fc 변이체 상에서 수행하였다. ADCC를 DELFIA EuTDA-기초 세포독성 분석(Perkin Elmer, MA)을 사용하여 정제된 인간 말초 혈관 세포(PBMCs)를 작용자 세포로서 사용하여 측정하였다. 표적 세포를 1x10⁶ cells/ml로 BATDA로 적재하고, 4회 세척하고 96-웰 플레이트에 10,000 cells/well로 시딩하였다. 다음, 표적 세포를 Fc 변이체 또는 WT 항체를 사용하여 지시된 최종 농도에서 옵소닌화하였다. buffy-coat로부터 분리한 인간 PBMC을 지시된 표적 세포의 폴드-엑세스로 첨가하고 플레이트 를 37℃ 4 시간 인큐베이션하였다. 동시-배양된 세포를 500xg에서 원심분리하고, 상청액을 별도의 플레이트로 옮겨 Eu 용액으로 인큐베이션하고, 상대 형광 유닛을 Packard Fusion α-FP HT reader (Packard Biosciences, IL)를 사용하여 측정하였다. 샘플을 삼중 실험하여 추정 오차(n=3, +/- S.D.)를 제공하였다. PBMCs을 V158 또는 F158 FcγRIIIa에 대하여 PCR을 사용하여 알로타이핑하였다.

ADCC 분석을 DoHH-2 림포마 표적 세포를 사용하여 Fc 변이체 및 WT 알렘투주맵에서 수행하였다. 도 23a은 10 ng/ml 항체에서 이들 단백질의 ADCC를 보이는 막대그래프이다. 결과는 알렘투주맵 Fc 변이체 I332E, V264I, 및 I332E/V264I가 상대적 ADCC 증진이 α스크린 분석 및 SPR에 의해 나타내어지는 FcγRIIIa에 대한 결합 향상에 비례하며 WT 알렘투주맵에 비하여 상당히 증진된 ADCC를 가짐을 보인다. 항체 농도에 대한 ADCC의 투여량 의존성을 도 23b에 보인다. 상기 결합 데이터는 각각 최저 및 최고 항체 농도에서 기저선에 의해 제공된 각각의 특정 곡선에 대한 최소 및 최대 형광 시그널로 표준화되었다. 상기 데이터는 도에서 곡선으로 나타내어지며 비선형 회귀법을 사용하여 S자 모양 투여량-반응 모델에 피팅되었다. 상기 피트는 유효농도 50%(EC50)(즉, 50% 효율성에 필요한 농도)의 측정을 가능케 하며, 이는 각각의 Fc 변이체에 대한 ADCC의 상대적 증진을 제공한다. 이들 결합 데이터에 대한 EC50s는 α스크린 경쟁 데이터로부터 얻은 IC50s와 유사하며, 이들 값의 유도는 따라서 실시예 2 및 도 11에 기재된 것과 유사하다. 도 23b에서, WT, V264I/I332E, 및 S239D/I332E 알렘투주맵에 대한 데이터의 피트로부터 얻은 log(EC50)s는 각각 0.99, 0.60, 및 0.49이고, 따라서 반응성 EC50s는 9.9, 4.0, 및 3.0이다. 따라서,V264I/I332E 및 S239E/I332E은 이형 V158/F158 FcγRIIIa을 발현하는 PBMCs을 사용하여 WT 알렘투주맵에 비하여 ADCC에서 2.5-배 및 3.3-배 증진을 각각 제공한다. 이들 데이터를 하기 표 5에 제시한다.

표 5

ADCC 증진이 항체에 광범위하게 적용가능한지 판단하기 위하여, 선별 Fc 변이체를 트라스투주맵 및 리투시맵에 대하여 평가하였다. ADCC 분석을 두개의 유방암 표적 세포주 BT474 및 Sk-Br-3을 사용하여 Fc 변이체 및 WT 트라스투주맵 상에서 수행하였다. 도 24a는 1 ng/ml 항체에서 ADCC를 보이는 막대그래프이다. 결과는 V264I 및 V264I/I332E 트라스투주맵가 α스크린 분석 및 SPR에 의해 나타내지는 바와 같이 상대적 ADCC 증진이 FcγRIIIa에의 결합 향상에 비례하며 WT 트라스투주맵에 비하여 상당히 증진된 ADCC를 제공함을 보인다. 도 24b 및 24c는 선별 Fc 변이체에 대한 항체 농도에 대한 ADCC 투여량 의존성을 보인다. 상기 데이터의 피트 및 ADCC에서 상대적 폴드 향상으로부터 얻은 EC50s를 하기 표 6에 제공한다. 상당한 ADCC 향상이 A330L 및 A330Y와 조합될 경우 I332E 트라스투주맵에서 관측된다. 또한, S239D/A330L/I332E는 WT 트라스투주맵 및 S298A/E333A/K334A에 비하여, 동형 F158/F158 FcγRIIIa을 발현하는 PBMCs에 대하여 300배 큰 상당한 ADCC 증진을 제공하며, 이는 α스크린 분석 및 SPR에 의해 관측된 FcγR 결합 데이터와 일치한다.

표 6

ADCC 분석을 V264I/I332E, WT, 및 S298A/D333A/K334A 리투시맵 상에서 WIL2-S 림포마 표적 세포를 사용하여 수행하였다. 도 25a는 1 ng/ml 항체에서 이들 단백질의 ADCC를 보이는 막대그래프이다. 결과는 V264I/I332E 리투시맵가 S298A/D333A/K334A에 비하여 우수한 ADCC 뿐 아니라 WT 리투시맵에 대하여 상당히 증진된 ADCC를 제공하며, 이는 α스크린 분석 및 SPR에 의해 관측된 FcγRIIIa 결합 증진과 일치한다. 도 25b 및 25c는 선별 Fc 변이체에 대한 항체 농도에 대한 ADCC 투여량 의존성을 보인다. 이들 데이터의 피트 및 ADCC에서 상대적 폴드 증진으로부터 얻은 EC50s를 하기 표 7에 제공한다. S239D/I332E/A330L 리투시맵 는 동형 F158/F158 FcγRIIIa을 발현하는 PBMCs에 대하여 WT에 비하여 900배 EC50 증진을 제공한다. 알렘투주맵, 트라스투주맵, 및 리투시맵에 대하여 관측된 ADCC 증진 차이는 상이한 PBMCs, 상이한 항체 및 상이한 표적 세포주 사용으로 인한 것일 것 이다.

표 7

따라서, 현재까지 ADCC 데이터는 각각의 Fc 폴리펩티드의 하한 및 상한 기저선이 특이 Fc 폴리펩티드의 최소 및 최대 형광 시그널, 전형적으로 최저 및 최고 항체 농도에서 형광 시그널에 세팅되도록 표준화되어 왔다. 데이터를 이와 같이 제시하는 것이 상이한 항체의 상대적 EC50s의 직접적 가시적 비교를 가능케 하지만 (따라서, 이러한 방식으로 데이터를 제시하는 이유임), 각각의 Fc 폴리펩티드에 의해 얻어지는 작용자 기능의 절대 레벨에 관한 중요한 정보를 손실한다. 도 26a 및 27b는 각각 트라스투주맵 및 리투시맵에 대한 세포-기초 ADCC 데이터를 제시하며, PBMCs만의 존재하에(항체 없음) 표적 세포의 형광 시그널에 의해 제공된 분석을 위한 절대 최소 세포용해 및 Triton X1000의 존재하에 표적 세포의 형광 시그널에 의해 제공된 절대 최대 용해에 따라 표준화되었다. 이 그래프는 항체가 그들의 EC50에 있어 다름을 보이고 이는 상대적 잠재성의 차이를 반영하며, 또한 항체에 의해 도달가능한 ADCC 최대 레벨에 있어서도 다름을 보이며 이는 상대적 효율성 차이를 반영한다. 따라서, 지금까지 이들 두가지 용어 잠재성 및 효율성을 사용하여 원하는 임상적 특성을 대략적으로 언급하여왔다. 그러나, 본 실험에서는, 이들이 특정 양으로 지칭되며 따라서 명확히 정의된다. 본 명세서의 실험에서 "잠재성"은 Fc 폴리펩티드의 EC50을 의미하고, "효율성"은 포화 레벨에서 Fc 폴리펩티드의 최대 가능 작용자 기능을 의미한다. 지금까지 기재된 잠재성에 대한 상당한 증진 외에, 도 26a 및 26b는 본 발명의 Fc 변이체가 WT 트라스투주맵 및 리투시맵에 비하여 효율성에 있어서 100% 보다 큰 증진을 제공함을 보인다.

실시예 4. Fc 변이체의 교차 검정

선별 Fc 변이체를 두가지 항체-알렘투주맵 및 트라스투주맵과 관련하여 그들의 FcγR 결합 및 ADCC 향상에 대하여 검정하였다. 인간 V158 FcγRIIIa에 대한 결합을 α스크린 및 SPR을 사용하여 본원에 기재된 바와 같이 측정하였다. V158 FcγRIIIa 결합을 측정한 예증적인 α스크린 데이터가 도 27에 제공된다. ADCC를 Sk-Br-3 표적 세포 및 LDH 탐지를 사용하여 트라스투주맵과 관련하여 수행하였다. 예증적 ADCC 데이터를 도 28에 제공한다. 표 8은 α스크린 및 SPR에 의해 측정되는 WT에 대한 폴드 FcγRIIIa 결합 친화성, 알렘투주맵 (alem) 및 트라스투주맵 (trast)와 관련하여 일련의 Fc 변이체에 대한 WT에 대한 폴드 ADCC의 요약을 제공한다.

표 8

실시예 5, 다양한 표적 항원 발현 수준에서의 ADCC

항암 항체의 임상적 효율성을 지배하는 결정적인 파라미터는 종양 세포 표면에서 표적 항원의 발현 레벨이다. 따라서, ADCC를 증진시키는 Fc 변이체의 주요 임상적 이점은 그것이 보다 낮은 레벨의 항원을 발현시키는 종양의 표적화를 가능케한다는 것일 것이다. 이러한 가설을 시험하기 위하여, WT 및 Fc 변이체 트라스투주맵 항체를 다양한 레벨의 Her2/neu 표적 항원을 발현하는 상이한 세포주에 대하여 ADCC를 중재하는 능력에 대하여 DELFIA EuTDA 방법을 사용하여 시험하였다. 낮은 레벨의 Her2/neu 수용체로 증폭된 네 가지 세포주를 사용하였다; Sk-Br-3 (1x10⁶ copies), SkOV3 (~1x10⁵), OVCAR3(~1x10⁴), 및 MCF-7 (~3x10³ copies) 포함 (도 29a). 표적 세포를 BATDA로 수조에 25분 동안 적재하고, 수회 배지로 세척하고 웰 당 10,000 세포로 96-well 플레이트내에 시딩하였다. 표적 세포를 다양한 항체 및 농도로 (최종 농도 100ng/ml 내지 .0316 ng/ml in 1/2 log steps, 처리 대조군 포함하지 않음) 15분간 옵소닌화하였다. buffy-coat로부터 분리되고 동형 F158/F158 FcγRIIIa로 알로타이핑된 인간 PBMCs을 첨가하여 세포를 25배 엑세스로 옵소닌화하고 37℃ 4시간 동시-배양하였다. 그 다음, 플레이트를 원심분리하고, 상청액을 제거하고 Eu3+ 용액으로 처리하고, 상대 형광 유닛(세포 용해 레벨과 관련)을 Packard Fusion α-FP HT reader (PerkinElmer, Boston, MA)를 사용하여 측정하였다. 실험을 삼중으로 수행하였다. 도 29b는 네가지 상이한 Her2/neu⁺ 세포주에 대하여 WT 및 Fc 변이체 트라스투주맵을 비교한 ADCC 데이터를 도시한다. S239D/I332E 및 S239D/I332E/A330L 변이체는 높은, 중간의 및 낮은 표적 항원 발현 레벨로 WT 트라스투주맵에 비하여 상당한 ADCC 증진을 제공한다. 이러한 결과는 본 발명의 Fc 변이체가 항암 항체의 치료학적 윈도우를 넓힐 수 있음을 시사한다.

실시예 6. NK 세포를 작용자 세포로 사용한 ADCC

천연 킬러(NK) 세포는 ADCC에서 상당한 역할을 하는 것으로 생각되는 PBMCs 에 존재하는 세포의 서브 집단이다. 선별 Fc 변이체를 세포-기초 ADCC 분석에서 시험하였으며, 여기서 PBMCs 가 아닌 천연 킬러(NK) 세포를 작용자 세포로 사용하였다. 이러한 분석에서, EuTDA 보다 내생 락토오스 디하이드로게나아제(LDH)의 방출을 사용하여 세포 용해를 모니터링하였다. 도 30은 NK 세포를 작용자 세포로 사 용할 경우 Fc 변이체가 상당한 ADCC 증진을 보임을 보인다. 또한, 이전의 분석과 함께, 결과는 본 발명의 Fc 변이체가 작용자 세포의 유형 또는 탐지 방법과 무관하게 상당한 ADCC 증진을 보임을 나타낸다.

실시예 7. Fc 변이체의 ADCP

또 다른 중요한 FcγR-중재 작용자 기능은 ADCP이다. 표적 암세포의 식균작용은 표적 세포를 즉각적으로 파괴시킬 뿐 아니라, 식균작용은 항원 업테이크 및 항원 제시 세포에 의한 과정에 대한 잠재적 메커니즘이므로 증진된 ADCP가 또한 Fc 폴리펩티드의 성능을 향상시켜 적응성의 면역 반응을 유발할 수 있다. 본 발명의 Fc 변이체의 ADCP 중재 능력을 따라서 조사하였다. 단핵세포를 이형 V158/F158 FcγRIIIa PBMCs로부터 Percoll gradient를 사용하여 분리하였다. 배양액 내에서 0.1 ng/ml 존재하에 1주일 후, 분화된 대식세포를 EDTA/PBS-로 떼어내고 친지성 fluorophore, PKH26로 제조업자의 프로토콜에 따라 표지하였다(Sigma, St Louis, Mo). Sk-Br-3 표적 세포를 PKH67 (Sigma, St Louis, Mo)로 표지하고, 웰 당 20,000 세포로 96-웰 플레이트에 시딩하고, 지시된 최종 농도의 WT 또는 Fc 변이체 트라스투주맵로 처리하였다. PKH26-표지된 대식세포를 옵소닌화되고 표지된 Sk-Br-3 세포에 웰당 20,000 세포로 첨가하고, 이중 표지 유동혈구계산 분석을 위한 세포 가공 전에 세포를 18시간 동시 배양하였다. 식균작용 백분율을 10,000 카운트 후에 집단 내에 전체 Sk-Br-3 수(식균된 + 비-식균된)에 대한 PKH76 및 PKH26 (대식세포 + Sk-Br-3)로 동시 표지된 세포 수로서 측정하였다. 도 31은 다양한 항체 농도에서 WT 및 Fc 변이체 트라스투주맵을 비교하는 데이터를 도시한다. 결과 는 S239D/I332E/A330L 변이체가 WT 트라스투주맵에 비하여 ADCP에 있어서 상당한 증진을 제공함을 나타낸다.

실시예 8. Fc 변이체에 의한 보체 결합 및 활성화

보체 단백질 C1q은 FcγR 결합 부위에 근접한 Fc 부위에 결합하며, 따라서 Fc 변이체가 보체 단백질을 모으고 활성화하는 능력을 유지하는지 여부를 측정하는 것이 중요하다. α스크린 분석을 사용하여 선별 Fc 변이체의 보체 단백질 C1q에의 결합을 측정하였다. 상기 분석을 실시예 2에 기재된 바와 같이 streptavidin 도너 비드에 부착된 비오틴화된 WT 알렘투주맵 항체를 사용하고, 억셉터 비드에 직접적으로 커플링된 C1q을 사용하여 수행하였다. V264I, I332E, S239E, 및 V264I/I332E 리투시맵의 결합 데이터는 도 32a에 도시된 바와 같으며, C1q 결합이 비-타협적임을 나타낸다. 세초 기초 ADCP 분석을 선별 Fc 상에서 수행하여 Fc 변이체가 보체를 활성화하는 능력을 유지하는지를 조사하였다. Alamar Blue를 사용하여Fc 변이체 및 WT 리투시맵-옵소닌화된 WIL2-S 림포마 세포의 인간 혈청 보체에 의한 용해를 모니터링하였다(Quidel, San Diego, CA). 도 32b의 데이터는CDC가 Fc 변이체 S239E, V264I, 및 V264I/I332E 리투시맵에 대하여 비타협적임을 보인다. 대조적으로, 도 32c는1 Fc 변이체 S239D/I332E/A330L의 CDC는 완전히 제거된 반면, S239D/I332E 변이체는 WT 리투시맵에 필적하는 CDC를 중재함을 보인다. 이러한 결과는 단백질 공학을 사용하여 상이한 작용자 기능을 구별할 수 있음을 나타낸다. 이와 같은 대조는 원하는 임상적 결과를 위해 특성을 맞추면서 항체 및 Fc 융합체를 포함하는 Fc 폴리펩티드의 생성을 가능케 할 뿐 아니라, 실험적으로 작용자 기 능 생물학을 조사할 시약 세트의 제공 또한 가능케 한다.

실시예 9. 원숭이(macaque)에서의 증진된 B 세포 고갈

Fc 변이체의 in vivo 작용자 기능 증진 능력을 평가하기 위하여, cynomogus monkeys(Macaca fascicularis) 내에서 B 세포 고갈을 사용하여 항체 세포독성을 측정한 예비 임상적 연구를 수행하였다. 샘플당 세 마리 원숭이를 WT 또는 S239D/I332E 리투시맵 항체로 정맥주사하였으며, 주사는 1-4일에 걸쳐 1일 1회 약 40 ㎍/kg (WT control) or 1, 4, 10, or 40 ㎍/kg (S239D/I332E and/or WT)의 투여량으로 행하였다. 실제 농도를 실험적으로 측정하였다. B 세포 및 천연 킬러 세포 레벨을 5 내지 28일 모니터링하고, 세포 집단을 유동 혈구계산으로 B 세포 마커 CD20+ 및 CD40+ 및 천연 킬러 세포 마커 CD3-/CD16+ 및 CD3-/CD8+를 사용하여 계수하였다.

도 33a는 WT 또는 S239D/I332E 리투시맵을 포함하는 항체 투여된 원숭이 내에 남아있는 CD20+ B 세포 백분율을 도시한다. 보다 낮은 투여량에서(1.8 및 2.1 ug/kg) S239D/I332E 변이체 및 WT 대조군은 5일째 B 세포에서 가장 큰 차이를 보인다. NK 세포 집단을 모니터링하여 이러한 세포 유형에 대한 작용자 기능 증진의 영향을 평가하였다; 도 33b은 S239D/I332E 변이체의 증가된 CD20+ B 세포 사멸은 천연 킬러 세포 집단에 영향을 미치니 않음을 보인다. B 세포 레벨 감소 또한 투여량 의존적이며 5일간 도 33c에 나타내는 바와 같다.

실시예 10. 마우스에서 Fc 변이체 시험 능력

비인간 FcγRs에 대한 Fc의 최적화는 동물 모델에서 Fc 변이체 시험에 유용 할 것이다. 예컨대, 마우스 시험할 경우(예를 들면 누드 마이스, SCID 마이스, xenograft 마이스 및/또는 트랜스제닉 마이스), 하나 이상의 마우스 FcγRs에 대하여 최적화된 Fc 변이체를 포함하는 항체 및 Fc 융합체는 임상적 효율성, 활성 기작 등에 대한 가치있는 정보를 제공할 것이다. 본 발명의 Fc 변이체가 그러한 실험에 유용한지 여부를 평가하기 위해, 선별 Fc 변이체의 마우스 FcγRIII 에 대한 친화성을 α스크린 분석을 이용하여 측정하였다. α스크린 분석을 실시예 2에 기재된 스트렙타비딘 도너 비드에 부착된 비오틴화된 WT 알렘투주맵, 및 실시예 2에서와 같이 발현 및 정제된 글루타티온 킬레이트 억셉터 비드에 결합된 GST-테깅된 마우스 FcγRIII를 사용하여 수행하였다. 결합 데이터를 도 34a에 Fc 변이체에 대하여 알렘투주맵에 대하여 도시하고, 도 34b 및 34c에 트라스투주맵에 대하여 도시한다. 결과는 인간 FcγRIIIa에 대한 결합을 증진시키는 일부 Fc 변이체가 마우스 FcγRIII에 대한 결합 또한 증진시킴을 보인다. Fc 변이체에 의한 마우스 작용자 기능의 증진을 상기 세포 기초 ADCC 분석에 의해 인간 PBMC's 보다 마우스를 사용하여 조사하였다. 도 35는 S239D/I332E/A330L 트라스투주맵 변이체가 마우스 면역 세포 존재하에 WT에 비하여 상당한 ADCC 증진을 제공함을 보인다. 이러한 결과는 본 발명의 Fc 변이체 또는 비인간 FcγRs에 대하여 최적화된 다른 Fc 변이체가 동물 모델을 사용하는 실험에 유용할 것임을 나타낸다.

실시예 11. CHO 세포 내에서 발현된 Fc 변이체의 검정

본 발명의 Fc 변이체가 293T 세포 내에서 스크리닝 목적으로 발현된 반면, 항체의 대규모 생산은 전형적으로 Chinese Hamster Ovary (CHO) 세포주 내 발현에 의해 수행된다. CHO-발현된 Fc 변이체의 특성 평가를 위해, 선별 Fc 변이체 및 WT 알렘투주맵을 CHO 세포 내에서 발현시키고 실시예 1과 같이 정제하였다. 도 36은 CHO- 및 293T- 발현 Fc 변이체 및 WT 알렘투주맵의 인간 V158 FcγRIIIa에 대한 결합을 비교하는 α스크린 데이터이다. 이 결과는 본 발명의 Fc 변이체가 293T 또는 CHO내에서 발현되든 상당한 FcγR 결합을 보임을 나타낸다.

실시예 12. 푸코스( fucose) 마이너스 균주 내에서 Fc 변이체의 증진

본 발명의 Fc 변이체와 다른 Fc 변형체와의 조합을 최적화된 특성을 가진 신규한 Fc 폴리펩티드 생성을 목적으로 상정하였다. 본 발명의 Fc 변이체를 하나 이상의 Fc 리간드와 상호작용 또는 작용자 기능을 변경한 변경을 포함하는 다른 Fc 변형체와 조합하는 것이 유리할 것이다. 그러한 조합은 Fc 폴리펩티드내에 부가적인 상승 또는 신규한 특성을 제공할 것이다. 예컨대, 작용자 기능을 변경하는 상이한 Fc의 단백당형을 엔지니어링하기 위한 다수의 방법이 존재한다. 엔지니어링된 단백당형은 다양한 공지된 방법에 의해 생성될 수 있고, 이러한 기법은 Fc 영역에 공유결합된 푸코실화된 및/또는 양분 올리고사카라이드 레벨 조절에 근거한다. Fc 단백당형 엔지니어링의 한 방법은 변경된 단백당형을 생성하는 세포주, 예컨대 Lec-13 CHO 세포 내에서 Fc 폴리펩티드를 발현하는 것이다. 엔지니어링된 단백당형와 결합된 Fc 변이체의 특성 조사를 위해, WT 및 V209 (S239D/I332E/A330L) 트라스투주맵을 Lec-13 CHO 세포 내에서 발현시키고 상기한 바와 같이 정제하였다. 도 37a은 293T, CHO, 및 Lec-13 세포 내에서 발현된 WT 및 V209 트라스투주맵에 의한 인간 V158 FcγRIIIa에의 결합을 비교하는 α스크린 결합 데이터이다. 이 결과는 상기 세포주에 의해 생산된 엔지니어링된 단백당형와 본 발명의 Fc 변이체 사이에 상당한 상승작용이 있음을 보인다. 도 37b에 도시된 바와 같은 세포 기초 ADCC 분석은 이 결과를 뒷받침한다. 이러한 데이터들은 함께 다른 Fc 변형체, 특히 엔지니어링된 단백당형이 본 발명의 Fc 변이체와 결합되어 최적화된 작용자 기능을 가진 Fc 폴리펩티드, 예컨대 항체 및 Fc 융합체를 생성할 수 있음을 나타낸다.

실시예 13. 탈글리코실화된 Fc 변이체

논의된 바와 같이, 본 실험의 한가지 목적은 최적화된 탈글리코실화된 Fc 변이체를 얻는 것이다. 몇몇 Fc 변이체는 이러한 목적에 대한 상당한 진보를 제공한다. 이것은 글리코실화 부위이므로, N297에서 치환은 탈글리코실화된 Fc를 초래한다. N297에서 치환을 포함하는 모든 다른 Fc 변이체는 완전히 FcγR 결합을 제거하는 반면, N297D/I332E는 도 41 및 38에 도시하는 바와 같이 FcγRIIIa에 대한 상당한 결합 친화성을 가진다. 이러한 결과의 정확한 이유는 이 변이체에 대한 고해상도 구조의 부재시에 불확정적이나, 컴퓨터 스크리닝 예측은 새로운 유리한 Fc/FcγR 상호작용 및 유리한 정전기적 특성의 결합으로 인한 것임을 시사한다. 과연, 다른 정전기적 치환은 탈글리코실화된 Fc의 추가 최적화를 위해 상정된다. 도 41은 N297D/A330Y/I332E 및 S239D/N297D/I332E와 같은 다른 탈글리코실환된 Fc 변이체가 글리코실화된 WT 알렘투주맵 0.8- 이내의 FcγRIIIa 에 대한 결합 친화성을 가져오는 결합 증진을 제공함을 보인다. 글리코실화된 부모 Fc와 동등 또는 보다 나은 친화성으로 하나 이상의 FcγRs 에 결합하는 탈글리코실화된 Fc 변이체를 얻을 목적으로, 이들 변이체와 FcγR 결합을 증진시키는 다른 Fc 변이체와의 결합 을 상정한다. 탈글리코실화된 Fc 폴리펩티드 내에 Fc 리간드 결합 및/또는 작용자 기능을 위한 바람직한 Fc 변이체는 비제한적으로 N297D, N297D/I332E, N297D/I332D, S239D/N297D, S239D/N297D/I332E, N297D/A330Y/I332E, 및 S239D/N297D/A330Y/I332E을 포함한다. 본 발명은 물론 이들 탈글리코실화된 변이체와 본원에 기재된 다른 Fc 변이체와의 결합을 고려하며 이 또한 Fc 리간드 결합 및/또는 작용자 기능을 증진시킨다.

유망한 Fc 변이체의 부가적 세트가 탄수화물 부재하에 안정성 및 가용성 증진을 제공한다. 위치 241, 243, 262, 및 264, 즉 FcγR 결합을 중재하지 않으나 탄수화물과 Fc와의 경계를 결정하는 위치 에서 치환을 포함하는 Fc 변이체는 FcγR 결합을 제거하며, 이는 이들이 탄수화물의 구조를 혼란시키기 때문일 것이다. 그러나, 탈글리코실화된 형태에서 Fc 변이체 F241E/F243R/V262E/V264R, F241E/F243Q/V262T/V264E, F241R/F243Q/V262T/V264R, 및 F241E/F243Y/V262T/V264R 는 글리코실화된 형태에서보다 더 강한 FcγRIIIa에의 결합을 보이며, 이는 도 39에 α스크린에 의해 도시된 바와 같다. 이러한 결과는 이들이 탈글리코실화된 Fc의 구조, 안정성, 가용성 및 기능의 최적화를 위한 주요 위치임을 나타낸다. 이러한 결과는 함께 단백질 엔지니어링을 사용하여 탄수화물 부재시에 항체 및 Fc 융합체의 유리한 기능적 및 가용성 특성을 복구할 수 있으며, 유리한 가용성 특성 및 이들 및 다른 Fc 위치에서 치환을 포함하는 완전한 기능성을 가진 탈글리코실화된 항체 및 Fc 융합체에 대한 방법을 제공할 수 있다.

실시예 14. 바람직한 변이체

본 발명에 제공된 데이터는 함께 최적화된 FcγR 결합 특성을 제공하는 Fc 변이체가 또한 증진된 작용자 기능을 제공함을 나타낸다. 비제한적으로 236, 239, 246, 246, 249, 255, 258, 260, 264, 267, 268, 272, 274, 281, 283, 304, 324, 326, 327, 330, 332, 333, 334, 및 334을 포함하는 다수 위치에서의 치환은 작용자 기능 및 따라서 항체 및 Fc 융합체를 포함하는 Fc 폴리펩티드의 임상학적 특성을 향상시키기 위한 유망한 후보를 제공한다. 본 발명의 Fc 변이체의 결합은 전형적으로 부가적 또는 상승적 결합 향상 따라서 작용자 기능에서의 부가적 또는 상승적 향상을 초래하므로, 도 41에 제공된 바와 같은 아직 개발되지 않은 Fc 변이체의 결합이 또한 유리한 결과를 제공할 것으로 기대된다. Fc 리간드 결합 및/또는 작용자 기능 향상을 위한 본 발명의 바람직한 Fc 변이체는 표 9에 제공된다.

표 9

상기 바람직한 Fc 변이체 리스트는 본 발명을 제한하는 것이 아니다. 과연, 도 41에 제공된 Fc 변이체의 모든 조합이 본 발명의 구현예이다. 또한, 본 발명의 Fc 변이체와 다른 발견된 또는 미발견된 Fc 변이체와의 조합 또한 유리한 특성을 제공할 것이며, 이들 조합 또한 본 발명의 구현예로서 고려된다. 마지막으로, 상기 결과들로부터 본 발명에서 돌연변이된 위치에서 다른 치환 또한 유리한 결합 증진 및 특이성을 제공할 것으로 기대되며, 따라서 도 41의 모든 위치에서의 치환이 고려된다.

실시예 15. Fc 변이체의 치료학적 용도

본원에 기재된 다수의 Fc 변이체는 항암 항체의 치료학적 효율성을 향상시키기 위한 상당한 잠재성을 가진다. 예시를 목적으로 본 발명의 다수의 Fc 변이체는 항체 리투시맵의 서열 내로 통합되었다. US 5,736,137에 기재된 WT 리투시맵 경쇄 및 중쇄가 도 40a and 40b에 제공된다. 향상된 항-CD20 항체 서열이 도 40c에 제공된다. 향상된-CD20 항체 서열은 적어도 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇, X₈, and X₉ 로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-WT 아미노산을 포함한다. 이들 향상된 항-CD20 항체 서열은 또한 Z₁ 및/또는 Z₂에서 치환을 포함할 수 있다. 본원에서 리투시맵의 사용은 단지 실시예일 뿐이며, Fc 변이체의 적용을 이러한 항체 또는 기타 특정 Fc 폴리펩티드로 제한하려는 것은 아니다.

표 10은 인간 Fc의 위치, 야생형 잔기, 및 본 발명의 특정 구현예에 포함되는 변이체를 기재한다. 표 10은 IgG1에 근거하나, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 임의의 Ig, 특히 IgG2, IgG3 및 IgG4에도 동일하게 적용될 수 있다.

표 10

본원에 모든 참조 문헌은 참조로 통합된다.

본 발명의 특정 구현예가 예시를 목적으로 기재되었으나, 첨부되는 청구범위에 기재된 바와 같이 당업자에 의하여 세부사항의 무수한 변경이 본 발명으로부터 이탈됨이 없이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.

Claims

인간 Fc 폴리펩티드(서열번호 1)에 대한 Fc 변이체를 포함하는 단백질로서,

상기 변이체는 하기 식으로 표시되며;

인간 Fc 폴리펩티드에 비해 변이된 Fc 리간드 결합성을 보이며;

서열번호 1에 비해1 내지 4개의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는, 단백질:

(식)

Vb(221)-Vb(222)-Vb(223)-Vb(224)-Vb(225)-Fx(226)-Vb(227)-Vb(228)-Fx(229)-Vb(230)-Vb(231)-Vb(232)-Vb(233)-Vb(234)-Vb(235)-Vb(236)-Vb(237)-Vb(238)-Vb(239)-Vb(240)-Vb(241)-Fx(242)-Vb(243)-Vb(244)-Vb(245)-Vb(246)-Vb(247)-Fx(248)-Vb(249)-Fx(250-254)-Vb(255)-Fx(256-257)-Vb(258)-Fx(259)-Vb(260)-Fx(261)-Vb(262)-Vb(263)-Vb(264)-Vb(265)-Vb(266)-Vb(267)-Vb(268)-Vb(269)-Vb(270)-Vb(271)-Vb(272)-Vb(273)-Vb(274)-Vb(275)-Vb(276)-Fx(277)-Vb(278)-Fx(279)-Vb(280)-Vb(281)-Vb(282)-Vb(283)-Vb(284)-Vb(285)-Vb(286)-Fx(287)-Vb(288)-Fx(289)-Vb(290)-Vb(291)-Vb(292)-Vb(293)-Vb(294)-Vb(295)-Vb(296)-Vb(297)-Vb(298)-Vb(299)-Vb(300)-Vb(301)-Vb(302)-Vb(303)-Vb(304)-Vb(305)-

Fx(306-312)-Vb(313)-Fx(314-316)-Vb(317)-Vb(318)-Fx(319)-Vb(320)-Fx(321)-Vb(322)-Vb(323)-Vb(324)-Vb(325)-Vb(326)-Vb(327)-Vb(328)-Vb(329)-Vb(330)-Vb(331)-Vb(332)--Vb(333)-Vb(334)-Vb(335)-Vb(336)-Vb(337)

상기 식에서,

Vb(221)는 D, K 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(222)는 K, E 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(223)는 T, E 및 K로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(224)는 H, E 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(225)는 T, E, K 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Fx(226)는 C이고;

Vb(227)는 P, E, G, K 및Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(228)는 P, E, G, K 및Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Fx(229)는 C이고;

Vb(230)는 P, A, E, G 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(231)는 A, E, G, K, P 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(232)는 P, E, G, K 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(233)는 A, D, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(234)는 L, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(235)는 L, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(236)는 G, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(237)는 G, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(238)는 P, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(239)는 S, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(240)는 V, A, I, M 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(241)는 F, D, E, L, R, S, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Fx(242)는 L이며;

Vb(243)는 F, E, H, L, Q, R, W, Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(244)는 P 또는 H이며;

Vb(245)는 P 또는 A이며;

Vb(246)는 K, D, E, H 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(247)는 P, G 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Fx(248)는 K이며;

Vb(249)는 D, H, Q 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Fx(250-254)는 서열 -(T-L-M-I-S)-이며;

Vb(255)는 R, E 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Fx(256-257)는 서열 -(T-P)-이며;

Vb(258)는 E, H, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Fx(259)는 V이며;

Vb(260)는 T, D, E, H 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Fx(261)는 C이며

Vb(262)는 V, A, E, F, I 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(263)는 V, A, I, M 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(264)는 V, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(265)는 D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(266)는 V, A, I, M 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(267)는 S, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(268)는 H, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(269)는 E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(270)는 D, F, G, H, I, L, M, P, Q, R, S, T, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(271)는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로 이루 어진 군으로부터 선택되며;

Vb(272)는 E, D, F, G, H, I, K, L, M, P, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(273)는 V 또는 I이며;

Vb(274)는 K, D, E, F, G, H, L, M, N, P, R, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(275)는 F, L 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(276)는 N, D, E, F, G, H, I, L, M, P, R, S, T, V, W, Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Fx(277)는 W이며;

Vb(278)는 Y, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Fx(279)는 V이며;

Vb(280)는 D, G, K, L, P 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(281)는 G, D, E, K, N, P, Q 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(282)는 V, E, G, K, P 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(283)는 E, G, H, K, L, P, R 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(284)는 V, D, E, L, N, Q, T 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(285)는 H, D, E, K, Q, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(286)는 N, E, G, P 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Fx(287)는 A이며;

Vb(288)는 K, D, E 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Fx(289)는 T이며;

Vb(290)는 K, D, H, L, N 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(291)는 P, D, E, G, H, I, Q 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(292)는 R, D, E, T 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(293)는 E, F, G, H, I, L, M, N, P, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(294)는 E, F, G, H, I, K, L, M, P, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(295)는 Q, D, E, F, G, H, I, M, N, P, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(296)는 Y, A, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(297)는 N, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(298)는 S, D, E, F, H, I, K, M, N, Q, R, T, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(299)는 T, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(300)는 Y, A, D, E, G, H, K, M, N, P, Q, R, S, T, V 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(301)는 R, D, E, H 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(302)는 V 또는 I이며;

Vb(303)는 V, D, E 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(304)는 S, D, H, L, N 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(305)는 V, E, T 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Fx(306-312)는 -(L-T-V-L-H-Q-D)-이며;

Vb(313)는 W 또는 F이며;

Fx(314-316)는 -(L-N-G)-이며;

Vb(317)는 K, E 및 Q로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(318)는 E, H, L, Q, R 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Fx(319)는 Y이며;

Vb(320)는 K, D, F, G, H, I, L, N, P, S, T, V, W및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Fx(321)는 C이며;

Vb(322)는 K, D, F, G, H, I, P, S, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(323)는 V 또는 I이며;

Vb(324)는 S, D, F, G, H, I, L, M, P, R, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로 부터 선택되며;

Vb(325)는 N, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(326)는 K, I, L, P 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(327)는 A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(328)는 L, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(329)는 P, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(330)는 A, E, F, G, H, I, L, M, N, P, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(331)는 P, D, F, H, I, L, M, Q, R, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(332)는 I, A, D, E, F, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(333)는 E, F, H, I, L, M, N, P, T및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(334)는 K, F, I, L, P 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(335)는 T, D, F, G, H, I, L, M, N, P, R, S, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(336)는 I, E, K 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되며;

Vb(337)는 S, E, H 및 N로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제 1항에 있어서, 상기 치환은 EU 인덱스에 따라 넘버링한 G236S, G236A, S239D, S239E, S239N, S239Q, S239T, K246H, T260H, K246Y, D249Y, R255Y, E258Y, V264I, S267E, H268D, H268E, E272Y, E272I, E272H, K274E, G281D, E283L, E283H, S304T, S324G, S324I, K326T, A327D, A330Y, A330L, A330I, I332D, I332E, I332N, I332Q, E333Y, K334T, 및 K334F로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질.
제 2항에 있어서, 상기 Fc 변이체는 EU 인덱스에 따라 넘버링한 S239D/I332E, S239D/G236A, S239D/G236S, S239D/V264I, S239D/H268D, S239D/H268E, S239D/S298A, S239D/K326E, S239D/A330L, S239D/A330Y, S239D/A330I, I332E/V264I, I332E/H268D, I332E/H268E, I332E/S298A, I332E/K326E, I332E/A330L, I332E/A330Y, I332E/A330I, I332E/G236A, I332E/G236S, I332D/V264I, I332D/H268D, I332D/H268E, I332D/S298A, I332D/K326E, I332D/A330L, I332D/A330Y, I332D/A330I, I332D/G236A, I332D/G236S, S239D/K246H/I332E, S239D/V264I/I332E, S239D/S267E/I332E, S239D/H268D/I332E, S239D/H268E/I332E, S239D/S298A/I332E, S239D/S324G/I332E, S239D/S324I/I332E, S239D/K326T/I332E, S239D/K326E/I332E, S239D/K326D/I332E, S239D/A327D/I332E, S239D/A330L/I332E, S239D/A330Y/I332E, S239D/A330I/I332E, S239D/K334T/I332E, S239D/K246H/T260H/I332E, S239D/K246H/H268D/I332E, S239D/K246H/H268E/I332E, S239D/H268D/S324G/I332E, S239D/H268E/S324G/I332E, S239D/H268D/K326T/I332E, S239D/H268E/K326T/I332E, S239D/H268D/A330L/I332E, S239D/H268E/A330L/I332E, S239D/H268D/A330Y/I332E, S239D/H268E/A330Y/I332E, S239D/S298A/S267E/I332E, S239D/S298A/H268D/I332E, S239D/S298A/H268E/I332E, S239D/S298A/S324G/I332E, S239D/S298A/S324I/I332E, S239D/S298A/K326T/I332E, S239D/S298A/K326E/I332E, S239D/S298A/A327D/I332E, S239D/S298A/A330L/I332E, S239D/S298A/A330Y/I332E, S239D/K326T/A330Y/I332E, S239D/K326E/A330Y/I332E, S239D/K326T/A330L/I332E, 및 S239D/K326E/A330L/I332E로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 단백질.
제 2항에 있어서, EU 인덱스에 따라 넘버링한 S298A, K326E, K326D, K326A, E333A, 및 K334A로 이루어진 군으로부터 선택된 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질.
인간 Fc 폴리펩티드(서열번호 1)에 대한 Fc 변이체를 포함하는 단백질로서,

상기 Fc 변이체는 상기 모체 Fc 폴리펩티드의 Fc 부위에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하며,

상기 변이체 단백질은 하나 이상의 Fc 리간드에 비해 하나 이상의 Fc 리간드에 대한 결합성을 선택적으로 증강시키고,

상기 Fc 변이체는 EU 인덱스에 따라 넘버링한 234, 235, 236, 267, 268, 292, 293, 295, 300, 324, 327, 328, 330, 및 335로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질.
제 5항에 있어서, 상기 Fc 변이체는 FcγRIII에 비해 하나 이상의 FcγRII에 대한 결합성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 단백질
제 6항에 있어서, 상기 Fc 변이체는 G236S 또는 G236A 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질.
제 5항에 있어서, 상기 Fc 변이체는 FcγRIIb에 비해 FcγRIIa 또는 FcγRIIc에 대한 결합성을 증강시키는 것을 특징으로 하는 단백질.
제 8항에 있어서, 상기 Fc 변이체는 G236S 또는 G236A 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질.
모체 Fc 폴리펩티드에 대한 Fc 변이체를 포함하는 단백질로서,

상기 Fc 변이체는 상기 모체 Fc 폴리펩티드의 Fc 부위에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하며,

상기 변이체 단백질은 하나 이상의 Fc 리간드에 대한 결합성을 감소시키고,

상기 Fc 변이체는 EU 인덱스에 따라 넘버링한 232, 234, 235, 236, 237, 239, 264, 265, 267, 269, 270, 299, 325, 328, 329 및 330으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질.
제 10항에 있어서, 상기 Fc 변이체는 EU 인덱스에 따라 넘버링한 299 또는 328 위치에 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질.
인간 Fc 폴리펩티드에 비해 Fc 리간드에 대해 변이된 결합성을 나타내는, 서열번호 5를 포함하는 단백질.