JP2011188869A - 最適化Ｆｃ変異体 - Google Patents

最適化Ｆｃ変異体 Download PDF

Info

Publication number
JP2011188869A
JP2011188869A JP2011136557A JP2011136557A JP2011188869A JP 2011188869 A JP2011188869 A JP 2011188869A JP 2011136557 A JP2011136557 A JP 2011136557A JP 2011136557 A JP2011136557 A JP 2011136557A JP 2011188869 A JP2011188869 A JP 2011188869A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
variants
antibodies
binding
variant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2011136557A
Other languages
English (en)
Other versions
JP5301611B2 (ja
Inventor
Gregory Alan Lazar
グレゴリー・アラン・ラザー
Wei Dang
ウェイ・ダン
John R Desjarlais
ジョン・アール・デスジャーレイス
Sher Bahadur Karki
シャー・バハドゥル・カーキ
Omid Vafa
オミッド・バファ
Robert Hayes
ロバート・ヘイズ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xencor Inc
Original Assignee
Xencor Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=35501263&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2011188869(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Xencor Inc filed Critical Xencor Inc
Publication of JP2011188869A publication Critical patent/JP2011188869A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5301611B2 publication Critical patent/JP5301611B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2893—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD52
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell

Abstract

【課題】本発明は、数々の治療関連特性について最適化されたＦｃ変異体を提供する。
【解決手段】本発明は、最適化Ｆｃ変異体、それらの生成方法、最適化Ｆｃ変異体を含むＦｃポリペプチド、および最適化Ｆｃ変異体の使用方法に関する。
【選択図】なし

Description

本願は、２００４年５月５日に出願されたＵＳＳＮ６０／５６８,４４０；２００４年７月２０日に出願された６０／５８９,９０６；２００４年１１月９日に出願された６０／６２７,０２６；２００４年１１月１０日に出願された６０／６２６,９９１；２００４年１１月１２日に出願された６０／６２７,７７４、２００３年１２月２２日に出願された６０／５３１,７５２；および２００３年１２月２２日に出願された６０／５３１,８９１に３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１１９（ｅ）の下での利益を請求し；そして、２００４年３月２４日に出願されたＵＳＳＮ１０／８２２,２３１の一部継続出願であり；それは、２００３年９月２６日に出願された１０／６７２,２８０の一部継続出願であり；それは、２００３年３月３日に出願された１０／３７９,３９２の一部継続出願であり、これらは全て、全体を出典明示により本明細書の一部とする。
発明の分野
本発明は、新規最適化Ｆｃ変異体、それらの生成のための操作（engineering）方法、および特に治療目的へのそれらの適用に関する。
発明の背景
抗体は、特定の抗原に結合する免疫タンパク質である。ヒトやマウスを含む殆どの哺乳動物において、抗体は、対になった重鎖と軽鎖のポリペプチド鎖から構築される。各々の鎖は、個々の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインからできており、従って一般用語の免疫グロブリンは、このようなタンパク質に対して使用される。各鎖は、２個の別個の領域からなり、これらは可変および定常領域と呼ばれる。軽鎖と重鎖の可変領域は、抗体間でかなりの配列多様性を示し、標的抗原の結合を担う。定常領域は、乏しい配列多様性を示し、重要な生化学的事象を誘起する数々の天然タンパク質の結合を担う。ヒトでは、５種の異なるクラスの抗体があり、ＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）、およびＩｇＭが含まれる。これらの抗体クラス間を区別する顕著な特徴は、それらの定常領域であり、一方可変領域には微妙な違いが存在することがある。図１は、本明細書で免疫グロブリンの一般的構造特徴を説明する例として用いられるＩｇＧ１抗体を示す。ＩｇＧ抗体は、２本の重鎖および２本の軽鎖から構成される四量体タンパク質である。ＩｇＧ重鎖は、Ｎ末端からＣ末端へＶH−ＣH１−ＣH２−ＣH３（各々、可変重鎖ドメイン、定常重鎖ドメイン１、定常重鎖ドメイン２および定常重鎖ドメイン３を表す）の順に連結された４個の免疫グロブリンドメインから構成される。ＩｇＧ ＣH１、ＣH２およびＣH３ドメインは、各々、定常ガンマ１ドメイン（Ｃγ１）、定常ガンマ２ドメイン（Ｃγ２）および定常ガンマ３ドメイン（Ｃγ３）とも呼ばれる。ＩｇＧ軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端へＶL−ＣL（各々、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを表す）の順に連結された２個の免疫グロブリンドメインから構成される。
抗体の可変領域は、この分子の抗原結合決定基を含有し、従って、その標的抗原に対する抗体の特異性を決定する。可変領域は、同じクラス内の他の抗体から配列が最も異なっているために、このように名付けられている。配列可変性の大部分は、相補性決定領域（ＣＤＲ）において生じる。重鎖と軽鎖に３個ずつ、全部で６個のＣＤＲがあり、ＶHＣＤＲ１、ＶHＣＤＲ２、ＶHＣＤＲ３、ＶLＣＤＲ１、ＶLＣＤＲ２およびＶLＣＤＲ３と呼ばれる。ＣＤＲの外側の可変領域は、フレームワーク（ＦＲ）領域と呼ばれる。ＣＤＲほど多様ではないが、配列可変性は、異なる抗体間で、ＦＲ領域において生じる。全体的に、抗体のこの特徴的構造様式が、安定な骨格（ＦＲ領域）をもたらし、その上で実質的な抗原結合多様性（ＣＤＲ）が免疫系により探査され、幅広い抗原群に対する特異性が獲得され得る。様々な生物由来の多様な可変領域フラグメントについて、数々の高解像度構造が入手可能である。未結合のものもあり、抗原と複合体化したものもある。抗体の可変領域の配列および構造的特徴は、十分に特徴解析されており（Morea et al., 1997, Biophys Chem 68:9-16; Morea et al., 2000, Methods 20:267-279、出典明示により本明細書の一部とする）、抗体の保存された特徴は、豊かな抗体操作技法の発展を可能にしてきた（Maynard et al., 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-376、出典明示により本明細書の一部とする）。例えば、ある抗体、例えばマウスの抗体からのＣＤＲを、別の抗体、例えばヒトの抗体のフレームワーク領域に移植することが可能である。当分野で「ヒト化」と呼ばれるこのプロセスは、非ヒト抗体からの免疫原性の低い抗体治療剤の生成を可能にする。可変領域を含むフラグメントは、抗体の他の領域の非存在下で存在でき、例えば、ＶH−Ｃγ１およびＶH−ＣLを含む抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）、ＶHおよびＶLを含む可変フラグメント（Ｆｖ）、同じ鎖中で一緒に連結されたＶHおよびＶLを含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、並びに多様な他の可変領域フラグメントが包含される（Little et al., 2000, Immunol Today 21:364-370、出典明示により本明細書の一部とする）。
抗体のＦｃ領域は、数々のＦｃ受容体およびリガンドと相互作用し、エフェクター機能と呼ばれる一群の重要な機能的能力を伝える。ＩｇＧについて、Ｆｃ領域は、図１に示す通り、ＩｇドメインＣγ２およびＣγ３並びにＣγ２に導くＮ末端ヒンジを含む。ＩｇＧクラスに対する重要なＦｃ受容体ファミリーは、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）である。これらの受容体は、抗体と免疫系の細胞の武器との間のコミュニケーションを媒介する（Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290）。ヒトでは、このタンパク質ファミリーには、アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂおよびＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）およびＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；そして、アイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８およびＦ１５８を含む）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）が含まれる（Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65、出典明示により本明細書の一部とする）。これらの受容体は、典型的には、Ｆｃへの結合を媒介する細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞内でのシグナル伝達事象を媒介し得る細胞内ドメインを有する。これらの受容体は、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびγδＴ細胞を含む様々な免疫細胞において発現される。Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成は、これらのエフェクター細胞を結合した抗原の部位にリクルートし、典型的に細胞内のシグナル伝達事象およびそれに続く重要な免疫反応、例えば、炎症介在物質の放出、Ｂ細胞活性化、エンドサイトーシス、ファゴサイトーシスおよび細胞傷害性攻撃など、をもたらす。細胞傷害およびファゴサイトーシスのエフェクター機能を媒介する能力は、それにより抗体が標的細胞を破壊する潜在能力のあるメカニズムである。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害細胞が標的細胞上の結合した抗体を認識し、それに続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞介在反応は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）と呼ばれる（Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290、出典明示により本明細書の一部とする）。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害細胞が標的細胞上の結合した抗体を認識し、それに続いて標的細胞のファゴサイトーシスを引き起こす細胞介在反応は、抗体依存性細胞介在性ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）と呼ばれる。数々のヒトＦｃγＲの細胞外ドメインの構造が解明されてきた。これには、ＦｃγＲＩＩａ（ｐｄｂ受託コード１Ｈ９Ｖ）（Sondermann et al., 2001, J Mol Biol 309:737-749）（ｐｄｂ受託コード１ＦＣＧ）(Maxwell et al., 1999, Nat Struct Biol 6:437-442）、ＦｃγＲＩＩｂ（ｐｄｂ受託コード２ＦＣＢ）（Sondermann et al., 1999, Embo J 18:1095-1103）；およびＦｃγＲＩＩＩｂ（ｐｄｂ受託コード１Ｅ４Ｊ）（Sondermann et al., 2000, Nature 406:267-273、出典明示により本明細書の一部とする）が含まれる。全ＦｃγＲ類は、Ｆｃ上の同じ領域に、Ｃγ２ドメインのＮ末端および先行するヒンジで結合する（図２に示す）。この相互作用は、十分に構造解析されており（Sondermann et al., 2001, J Mol Biol 309:737-749、出典明示により本明細書の一部とする）、ヒトＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインに結合したヒトＦｃのいくつかの構造（ｐｄｂ受託コード１Ｅ４Ｋ）（Sondermann et al., 2000, Nature 406:267-273）（ｐｄｂ受託コード１ＩＩＳおよび１ＩＩＸ）（Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469-16477、出典明示により本明細書の一部とする）、並びにヒトＩｇＥ Ｆｃ／ＦｃεＲＩα複合体の構造（ｐｄｂ受託コード１Ｆ６Ａ）（Garman et al., 2000, Nature 406:259-266、出典明示により本明細書の一部とする）が解明されてきた。
異なるＩｇＧサブクラスは、ＦｃγＲ類に対して異なる親和性を有し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３が、典型的にＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも実質的に良好に受容体に結合する。全ＦｃγＲ類は、ＩｇＧ Ｆｃの同じ領域に、但し異なる親和性で結合する：高い親和性で結合するＦｃγＲＩは、ＩｇＧ１へのＫｄ１０-8Ｍ-1を有し、一方、低親和性受容体のＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは、一般的に各々１０-6および１０-5で結合する。ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインは、９６％同一であるが、ＦｃγＲＩＩＩｂは細胞内シグナル伝達ドメインを持たない。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ／ｃおよびＦｃγＲＩＩＩａは免疫複合体が引き起こす活性化の正の調節因子であり、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞内ドメインを有することを特徴とし、一方、ＦｃγＲＩＩｂは、免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を有し、従って阻害性である。故に、前者は活性化受容体と呼ばれ、ＦｃγＲＩＩｂは、阻害性受容体と呼ばれる。これらの受容体は、様々な免疫細胞における発現パターンおよびレベルにおいても異なる。さらに、別のレベルの複雑さは、ヒトのプロテオームにおける数々のＦｃγＲ多型の存在である。特に臨床的に意味のある関連多型は、Ｖ１５８／Ｆ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａである。ヒトＩｇＧ１は、Ｆ１５８アロタイプよりもＶ１５８アロタイプに高い親和性で結合する。この親和性の差異、および恐らくそのＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰに対する効果は、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（Rituxan(登録商標)、IDEC Pharmaceuticals Corporation の登録商標）の効力の重大な決定要因であることが示された。Ｖ１５８アロタイプの患者は、リツキシマブ処置に好都合に応答する；しかしながら、低親和性のＦ１５８アロタイプの患者は、不十分に応答する（Cartron et al., 2002, Blood 99:754-758、出典明示により本明細書の一部とする）。ヒトの約１０−２０％はＶ１５８／Ｖ１５８ホモ接合型であり、４５％はＶ１５８／Ｆ１５８ヘテロ接合型であり、ヒトの３５−４５％はＦ１５８／Ｆ１５８ホモ接合型である（Lehrnbecher et al., 1999, Blood 94:4220-4232; Cartron et al., 2002, Blood 99:754-758、出典明示により本明細書の一部とする）。従って、ヒトの８０−９０％は不十分な応答者である、即ち、彼らは少なくとも１つのＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ対立遺伝子を有する。
図１に示す、Ｆｃ上の重なり合うが別個の部位は、補体タンパク質Ｃ１ｑへの接点（interface）として働く。Ｆｃ／ＦｃγＲ結合がＡＤＣＣを媒介するのと同じやり方で、Ｆｃ／Ｃ１ｑ結合は、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を媒介する。Ｃ１ｑは、セリンプロテアーゼＣ１ｒおよびＣ１ｓと複合体を形成し、Ｃ１複合体を形成する。Ｃ１ｑは、６個の抗体を結合する能力があるが、補体カスケードを活性化するには２個のＩｇＧへの結合で十分である。ＦｃのＦｃγＲ類との相互作用と同様に、異なるＩｇＧサブクラスは、Ｃ１ｑに対して異なる親和性を有し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、典型的に、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも実質的に良好にＦｃγＲ類に結合する。Ｆｃ／Ｃ１ｑ複合体の現在入手可能な構造はない；しかしながら、変異誘発研究により、ヒトＩｇＧ上のＣ１ｑの結合部位が、残基Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｋ３２６、Ｐ３２９およびＰ３３１およびＥ３３３を含む領域にマッピングされた（Idusogie et al., 2000, J Immunol 164:4178-4184; Idusogie et al., 2001, J Immunol 166:2571-2575、出典明示により本明細書の一部とする）。
図１に示す、Ｆｃ上のＣγ２およびＣγ３ドメインの間の部位は、新生児の受容体ＦｃＲｎとの相互作用を媒介し、その結合により、エンドサイトーシスされた抗体がエンドソームから血流へ再利用される（Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766、出典明示により本明細書の一部とする）。この過程は、完全長分子のサイズが大きいことによる腎臓濾過の除外と対になって、１ないし３週間の範囲に渡る好都合な抗体血清半減期をもたらす。ＦｃのＦｃＲｎへの結合は、また、抗体輸送において鍵となる役割を果たす。Ｆｃ上のＦｃＲｎ結合部位はまた、細菌のプロテインＡおよびＧが結合する部位でもある。これらのタンパク質による密接な結合は、典型的にはタンパク質精製中にプロテインＡまたはプロテインＧ親和性クロマトグラフィーを用いることにより、抗体精製の手段として活用される。従って、Ｆｃ上のこの領域の忠実度は、抗体の臨床的特性およびそれらの精製の両方にとって重要である。ラットＦｃ／ＦｃＲｎ複合体（Martin et al., 2001, Mol Cell 7:867-877、出典明示により本明細書の一部とする）およびＦｃのプロテインＡおよびＧとの複合体（Deisenhofer, 1981, Biochemistry 20:2361-2370; Sauer-Eriksson et al., 1995, Structure 3:265-278; Tashiro et al., 1995, Curr Opin Struct Biol 5:471-481、出典明示により本明細書の一部とする）の入手可能な構造は、Ｆｃのこれらのタンパク質との相互作用への洞察を与える。
Ｆｃ領域の鍵となる特徴は、図１に示す、Ｎ２９７で生じる保存されたＮ連結グリコシレーションである。この炭水化物またはオリゴサッカライド類（このように呼ばれるときもある）は、抗体にとって決定的な構造的および機能的役割を果たし、哺乳動物発現系を使用して抗体を産生しなければならない根源的理由の１つである。一理論に限定されることを望まないが、この炭水化物の構造的目的は、Ｆｃの安定化または可溶化、Ｃγ３およびＣγ２ドメイン間の特定の角度または可撓性のレベルの決定、２個のＣγ２ドメインを、中心軸を超えて相互に凝集させずにおくこと、またはこれらの組合せであり得ると考えられる。効率的なＦｃγＲおよびＣ１ｑへのＦｃの結合は、この修飾を必要とし、Ｎ２９７の炭水化物の組成の変更またはその除去は、これらのタンパク質への結合に影響を与える（Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Mimura et al., 2001, J Biol Chem 276:45539-45547.; Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16478-16483; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Simmons et al., 2002, J Immunol Methods 263:133-147、出典明示により本明細書の一部とする）。この炭水化物は、ＦｃγＲ類との特異的接触をあるとしてもごくわずかにしか成さないが（Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469-16477、出典明示により本明細書の一部とする）、このことは、Ｆｃ／ＦｃγＲ結合の媒介におけるＮ２９７炭水化物の機能的役割は、それがＦｃの高次構造の決定において果たす構造的役割を介するものであり得ることを示している。このことは、オリゴサッカライド組成がＣγ２の高次構造に、そして結果的にＦｃ／ＦｃγＲの接点に影響を与えることを示す、４種の異なるＦｃ糖形態の結晶構造を集めることにより支持される（Krapp et al., 2003, J Mol Biol 325:979-989、出典明示により本明細書の一部とする）。
上記で論じた抗体の特徴−標的への特異性、免疫エフェクターメカニズムを媒介する能力、および血清中での長い半減期−は、抗体を強力な治療剤にする。モノクローナル抗体は、癌、炎症および心血管疾患を含む様々な症状の処置のために治療的に使用されている。現在市場に１０種を超える抗体製品があり、数百が開発中である。抗体に加え、研究および治療において拡大中の役割を見出している抗体様タンパク質は、Ｆｃ融合体である（Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200、出典明示により本明細書の一部とする）。Ｆｃ融合体は、１個またはそれ以上のポリペプチドが、Ｆｃに機能し得るように連結されたタンパク質である。Ｆｃ融合体は、抗体のＦｃ領域を、従ってその好都合なエフェクター機能および薬物動態を、受容体、リガンドまたはその他のタンパク質またはタンパク質ドメインの標的結合領域と組み合わせる。後者の役割は、標的認識を媒介することであり、従って、それは抗体可変領域と機能的に類似する。Ｆｃ融合体は抗体と構造および機能的に重複するので、本発明における抗体に関する議論は、直接Ｆｃ融合体に及ぶ。
抗体が腫瘍細胞を破壊する数々の可能なメカニズムがあり、必要な増殖経路の遮断を介する抗増殖、アポトーシスへ導く細胞内シグナリング、受容体の下方調節および／または代謝回転の増強、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよび適応免疫反応の促進が含まれる（Cragg et al., 1999, Curr Opin Immunol 11:541-547; Glennie et al., 2000, Immunol Today 21:403-410、出典明示により本明細書の一部とする）。抗腫瘍効力は、これらのメカニズムの組合せによるものであり得、それらの臨床治療における相対的重要性は、癌依存性であると思われる。このように抗腫瘍兵器の兵器庫であるにも関わらず、抗癌剤としての抗体の強度は、特にそれらの高いコストを考えると不満足なものである。患者の腫瘍応答データは、モノクローナル抗体が、通常の単剤の細胞傷害性化学療法剤に対して、治療の成功に小さな改善をもたらすにすぎないことを示している。例えば、低悪性度非ホジキンリンパ腫の全再発患者のちょうど半分が、抗ＣＤ２０抗体のリツキシマブに応答する（McLaughlin et al., 1998, J Clin Oncol 16:2825-2833、出典明示により本明細書の一部とする）。臨床患者１６６人の６％が完全な応答を示し、４２％が部分的応答を示し、応答期間の中央値は約１２月であった。転移乳癌処置用の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体であるトラスツズマブ（Herceptin(登録商標)、Genentechの登録商標）は、もっと低い効力である。総括的応答率は、トラスツズマブを被験患者２２２人に使用して、わずか１５％であり、８人が完全に、２６人が部分的に応答し、応答期間および生存の中央値は９ないし１３月であった（Cobleigh et al., 1999, J Clin Oncol 17:2639-2648、出典明示により本明細書の一部とする）。現在、抗癌療法については、死亡率のいかなる小さな改善であっても、成功と定義される。従って、標的癌細胞を破壊する抗体の能力の増強に対して、重大な要望がある。
抗体の抗癌活性におけるＦｃγＲ媒介性エフェクター機能の役割は、マウスで立証されており（Clynes et al., 1998, Proc Natl Acad Sci U S A 95:652-656; Clynes et al., 2000, Nat Med 6:443-446、出典明示により本明細書の一部とする）、Ｆｃとある種のＦｃγＲ類との間の相互作用の親和性は、細胞をベースとするアッセイにおいて標的細胞傷害と相関する（Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740、出典明示により本明細書の一部とする）。さらに、ヒトにおける臨床的効力と、彼らのＦｃγＲＩＩＩａの高（Ｖ１５８）または低（Ｆ１５８）親和性多型アロタイプとの間に相関が観察された（Cartron et al., 2002, Blood 99:754-758、出典明示により本明細書の一部とする）。
様々な目標に向けて、Ｆｃの変異誘発研究が実行されてきた。置換は典型的にアラニンになされた（アラニンスキャンと呼ばれる）か、または、配列相同性置換により導かれた（Duncan et al., 1988, Nature 332:563-564; Lund et al., 1991, J Immunol 147:2657-2662; Lund et al., 1992, Mol Immunol 29:53-59; Jefferis et al., 1995, Immunol Lett 44:111-117; Lund et al., 1995, Faseb J 9:115-119; Jefferis et al., 1996, Immunol Lett 54:101-104; Lund et al., 1996, J Immunol 157:4963-4969; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604）（ＵＳ５,６２４,８２１；ＵＳ５,８８５,５７３；ＰＣＴ ＷＯ００／４２０７２；ＰＣＴ ＷＯ９９／５８５７２）。これらの全てを出典明示により本明細書の一部とする。置換の大多数は、ＦｃγＲ類との結合を低減させるか、または失わせる。しかしながら、より高いＦｃγＲ親和性を有するＦｃ変異体の獲得において、いくつかの成功が達成された（例えば、ＵＳ５,６２４,８２１およびＰＣＴ ＷＯ００／４２０７２参照）。例えば、Winter と共同研究者たちは、ヒトの位置２３５のアミノ酸をマウスＩｇＧ２ｂ抗体のものと置換し（グルタミン酸からロイシンへの変異）、それはマウス抗体のヒトＦｃγＲＩへの結合を１００倍まで増加させた（Duncan et al., 1988, Nature 332:563-564）（ＵＳ５,６２４,８２１）。Shields らは、アラニンスキャン変異誘発を使用し、ＦｃγＲ結合に重要なＦｃ残基をマッピングし、続いて選択残基を非アラニン変異で置換した（Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490）（ＰＣＴ ＷＯ００／４２０７２）。これらは出典明示により本明細書の一部とする。
ＦｃのＦｃγＲへの親和性の増強は、操作された細胞株または変異体細胞株において抗体を発現させることにより生成させた、操作された糖形態を使用しても達成された（Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473、出典明示により本明細書の一部とする）。このアプローチは、抗体のＦｃγＲＩＩＩａへの結合能力およびＡＤＣＣの媒介能力の増強を生じさせた。
抗体のもう１つの主要な短所は、それらの厳しい製造要件である（Garber, 2001, Nat Biotechnol 19:184-185; Dove, 2002, Nat Biotechnol 20:777-779、出典明示により本明細書の一部とする）。抗体は哺乳動物細胞で発現させなければならず、現在市販されている抗体は、他の要件が厳しいバイオ治療剤（biotherapeutic）と共に、実質的に全ての利用可能な製造能力を使い尽くしている。数百の生物剤（biologic）が開発中であり、その大部分が抗体であるので、より効率的かつ安価な製造方法に対する緊急の要望がある。不十分な抗体製造能力の下流での影響は３倍である。第１に、それは商品のコストを製造者に対して劇的に高め、コストは患者に渡される。第２に、それは承認された抗体製品の産業的製造を妨げ、需要の高い治療剤の患者への入手可能性を制限する。最後に、臨床試験はまだ収益のない大量のタンパク質を必要とするので、不十分な供給は、成長している抗体パイプラインの市場への前進を妨げる。
代替的製造方法が、この問題の解消を試みて探究されてきた。遺伝子組換え植物および動物は、潜在的に安価かつ製造能力の高い製造システムとして追求されている（Chadd et al., 2001, Curr Opin Biotechnol 12:188-194、出典明示により本明細書の一部とする）。しかしながら、そのような発現系は、ヒトの糖タンパク質と有意に異なるグリコシレーションパターンを生じさせ得る。これは、エフェクター機能の低減、あるいは喪失さえもたらし得る。なぜなら、上記で論じたように、炭水化物構造は、ＦｃγＲおよび補体の結合に有意に影響を与え得るからである。非ヒト糖形態に伴い起こり得るより大きい問題は、免疫原性であり得る；炭水化物は、免疫系にとって抗原性の鍵となる供給源であり、非ヒト糖形態の存在は、その治療剤を中和する抗体を誘起する重大な機会を有し、悪くすると有害な免疫反応を引き起こす。従って、遺伝子組換え植物および動物により産生される抗体の効力と安全性は、不確かなままである。細菌発現は、抗体製造問題に対するもう一つの魅力的な解決法である。細菌、例えば大腸菌（E. coli）での発現は、コスト上有効かつ製造能力の高いタンパク質製造方法を提供する。抗体などの複雑なタンパク質には、細菌発現に対する数々の障害があり、これには、折り畳み、これらの複雑な分子の会合、適正なジスルフィド形成、並びに、細菌で発現されたタンパク質はグリコシレーションされないので、グリコシレーションの非存在下での溶解性、安定性および機能性が含まれる。抗原に結合する完全長非グリコシル化抗体は、大腸菌で成功裏に発現され（Simmons et al., 2002, J Immunol Methods 263:133-147、出典明示により本明細書の一部とする）、従って、真核生物のシャペロン機構がなくても、細菌で発現された抗体の折り畳み、会合および適切なジスルフィド形成は可能である。しかしながら、細菌発現抗体の治療剤としての最終的な利用は、エフェクター機能の欠如をもたらし、乏しい安定性と溶解性をもたらし得るグリコシレーションの欠如により、妨げられたままである。このことは、臨床使用に求められる長期間用の高濃度の製剤に関して、さらに問題になると思われる。
要するに、治療特性を増強された抗体への要望がある。
発明の要旨
本発明は、数々の治療関連特性について最適化されたＦｃ変異体を提供する。これらのＦｃ変異体は、一般的に、好ましくは抗体またはＦｃ融合タンパク質を含む変異体タンパク質に含有される。
本発明の目的は、最適化Ｆｃ変異体の生成のためにそこでアミノ酸修飾をなし得る、新規Ｆｃ位置を提供することである。当該Ｆｃ位置には、２３０、２４０、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６６、２７３、２７５、２９９、３０２、３１３、３２３、３２５、３２８および３３２が含まれる。ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスのものである。本発明は、最適化Ｆｃ変異体を生成させるための、当該新規Ｆｃ位置のいずれかにおける任意のアミノ酸修飾に関する。
本発明のさらなる目的は、本発明で特徴解析されたＦｃ変異体を提供することである。ある実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、以下からなる群から選択される位置で、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む：２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２７、２２８、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４９、２５５、２５８、２６０、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７８、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８８、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３１３、３１７、３１８、３２０、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６および３３７。ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスのものである。好ましい実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、以下からなる群から選択される少なくとも１つの置換を含む；Ｄ２２１Ｋ、Ｄ２２１Ｙ、Ｋ２２２Ｅ、Ｋ２２２Ｙ、Ｔ２２３Ｅ、Ｔ２２３Ｋ、Ｈ２２４Ｅ、Ｈ２２４Ｙ、Ｔ２２５Ｅ、Ｔ２２５Ｋ、Ｔ２２５Ｗ、Ｐ２２７Ｅ、Ｐ２２７Ｇ、Ｐ２２７Ｋ、Ｐ２２７Ｙ、Ｐ２２８Ｅ、Ｐ２２８Ｇ、Ｐ２２８Ｋ、Ｐ２２８Ｙ、Ｐ２３０Ａ、Ｐ２３０Ｅ、Ｐ２３０Ｇ、Ｐ２３０Ｙ、Ａ２３１Ｅ、Ａ２３１Ｇ、Ａ２３１Ｋ、Ａ２３１Ｐ、Ａ２３１Ｙ、Ｐ２３２Ｅ、Ｐ２３２Ｇ、Ｐ２３２Ｋ、Ｐ２３２Ｙ、Ｅ２３３Ａ、Ｅ２３３Ｄ、Ｅ２３３Ｆ、Ｅ２３３Ｇ、Ｅ２３３Ｈ、Ｅ２３３Ｉ、Ｅ２３３Ｋ、Ｅ２３３Ｌ、Ｅ２３３Ｍ、Ｅ２３３Ｎ、Ｅ２３３Ｑ、Ｅ２３３Ｒ、Ｅ２３３Ｓ、Ｅ２３３Ｔ、Ｅ２３３Ｖ、Ｅ２３３Ｗ、Ｅ２３３Ｙ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３４Ｇ、Ｌ２３４Ｈ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｋ、Ｌ２３４Ｍ、Ｌ２３４Ｎ、Ｌ２３４Ｐ、Ｌ２３４Ｑ、Ｌ２３４Ｒ、Ｌ２３４Ｓ、Ｌ２３４Ｔ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｗ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ｆ、Ｌ２３５Ｇ、Ｌ２３５Ｈ、Ｌ２３５Ｉ、Ｌ２３５Ｋ、Ｌ２３５Ｍ、Ｌ２３５Ｎ、Ｌ２３５Ｐ、Ｌ２３５Ｑ、Ｌ２３５Ｒ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｔ、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２３５Ｗ、Ｌ２３５Ｙ、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３６Ｄ、Ｇ２３６Ｅ、Ｇ２３６Ｆ、Ｇ２３６Ｈ、Ｇ２３６Ｉ、Ｇ２３６Ｋ、Ｇ２３６Ｌ、Ｇ２３６Ｍ、Ｇ２３６Ｎ、Ｇ２３６Ｐ、Ｇ２３６Ｑ、Ｇ２３６Ｒ、Ｇ２３６Ｓ、Ｇ２３６Ｔ、Ｇ２３６Ｖ、Ｇ２３６Ｗ、Ｇ２３６Ｙ、Ｇ２３７Ｄ、Ｇ２３７Ｅ、Ｇ２３７Ｆ、Ｇ２３７Ｈ、Ｇ２３７Ｉ、Ｇ２３７Ｋ、Ｇ２３７Ｌ、Ｇ２３７Ｍ、Ｇ２３７Ｎ、Ｇ２３７Ｐ、Ｇ２３７Ｑ、Ｇ２３７Ｒ、Ｇ２３７Ｓ、Ｇ２３７Ｔ、Ｇ２３７Ｖ、Ｇ２３７Ｗ、Ｇ２３７Ｙ、Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２３８Ｅ、Ｐ２３８Ｆ、Ｐ２３８Ｇ、Ｐ２３８Ｈ、Ｐ２３８Ｉ、Ｐ２３８Ｋ、Ｐ２３８Ｌ、Ｐ２３８Ｍ、Ｐ２３８Ｎ、Ｐ２３８Ｑ、Ｐ２３８Ｒ、Ｐ２３８Ｓ、Ｐ２３８Ｔ、Ｐ２３８Ｖ、Ｐ２３８Ｗ、Ｐ２３８Ｙ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｆ、Ｓ２３９Ｇ、Ｓ２３９Ｈ、Ｓ２３９Ｉ、Ｓ２３９Ｋ、Ｓ２３９Ｌ、Ｓ２３９Ｍ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｐ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｒ、Ｓ２３９Ｔ、Ｓ２３９Ｖ、Ｓ２３９Ｗ、Ｓ２３９Ｙ、Ｖ２４０Ａ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２４０Ｔ、Ｆ２４１Ｄ、Ｆ２４１Ｅ、Ｆ２４１Ｌ、Ｆ２４１Ｒ、Ｆ２４１Ｓ、Ｆ２４１Ｗ、Ｆ２４１Ｙ、Ｆ２４３Ｅ、Ｆ２４３Ｈ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｑ、Ｆ２４３Ｒ、Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４３Ｙ、Ｐ２４４Ｈ、Ｐ２４５Ａ、Ｋ２４６Ｄ、Ｋ２４６Ｅ、Ｋ２４６Ｈ、Ｋ２４６Ｙ、Ｐ２４７Ｇ、Ｐ２４７Ｖ、Ｄ２４９Ｈ、Ｄ２４９Ｑ、Ｄ２４９Ｙ、Ｒ２５５Ｅ、Ｒ２５５Ｙ、Ｅ２５８Ｈ、Ｅ２５８Ｓ、Ｅ２５８Ｙ、Ｔ２６０Ｄ、Ｔ２６０Ｅ、Ｔ２６０Ｈ、Ｔ２６０Ｙ、Ｖ２６２Ａ、Ｖ２６２Ｅ、Ｖ２６２Ｆ、Ｖ２６２Ｉ、Ｖ２６２Ｔ、Ｖ２６３Ａ、Ｖ２６３Ｉ、Ｖ２６３Ｍ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６４Ａ、Ｖ２６４Ｄ、Ｖ２６４Ｅ、Ｖ２６４Ｆ、Ｖ２６４Ｇ、Ｖ２６４Ｈ、Ｖ２６４Ｉ、Ｖ２６４Ｋ、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ｍ、Ｖ２６４Ｎ、Ｖ２６４Ｐ、Ｖ２６４Ｑ、Ｖ２６４Ｒ、Ｖ２６４Ｓ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｗ、Ｖ２６４Ｙ、Ｄ２６５Ｆ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５Ｈ、Ｄ２６５Ｉ、Ｄ２６５Ｋ、Ｄ２６５Ｌ、Ｄ２６５Ｍ、Ｄ２６５Ｎ、Ｄ２６５Ｐ、Ｄ２６５Ｑ、Ｄ２６５Ｒ、Ｄ２６５Ｓ、Ｄ２６５Ｔ、Ｄ２６５Ｖ、Ｄ２６５Ｗ、Ｄ２６５Ｙ、Ｖ２６６Ａ、Ｖ２６６Ｉ、Ｖ２６６Ｍ、Ｖ２６６Ｔ、Ｓ２６７Ｄ、Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２６７Ｆ、Ｓ２６７Ｈ、Ｓ２６７Ｉ、Ｓ２６７Ｋ、Ｓ２６７Ｌ、Ｓ２６７Ｍ、Ｓ２６７Ｎ、Ｓ２６７Ｐ、Ｓ２６７Ｑ、Ｓ２６７Ｒ、Ｓ２６７Ｔ、Ｓ２６７Ｖ、Ｓ２６７Ｗ、Ｓ２６７Ｙ、Ｈ２６８Ｄ、Ｈ２６８Ｅ、Ｈ２６８Ｆ、Ｈ２６８Ｇ、Ｈ２６８Ｉ、Ｈ２６８Ｋ、Ｈ２６８Ｌ、Ｈ２６８Ｍ、Ｈ２６８Ｐ、Ｈ２６８Ｑ、Ｈ２６８Ｒ、Ｈ２６８Ｔ、Ｈ２６８Ｖ、Ｈ２６８Ｗ、Ｅ２６９Ｆ、Ｅ２６９Ｇ、Ｅ２６９Ｈ、Ｅ２６９Ｉ、Ｅ２６９Ｋ、Ｅ２６９Ｌ、Ｅ２６９Ｍ、Ｅ２６９Ｎ、Ｅ２６９Ｐ、Ｅ２６９Ｒ、Ｅ２６９Ｓ、Ｅ２６９Ｔ、Ｅ２６９Ｖ、Ｅ２６９Ｗ、Ｅ２６９Ｙ、Ｄ２７０Ｆ、Ｄ２７０Ｇ、Ｄ２７０Ｈ、Ｄ２７０Ｉ、Ｄ２７０Ｌ、Ｄ２７０Ｍ、Ｄ２７０Ｐ、Ｄ２７０Ｑ、Ｄ２７０Ｒ、Ｄ２７０Ｓ、Ｄ２７０Ｔ、Ｄ２７０Ｗ、Ｄ２７０Ｙ、Ｐ２７１Ａ、Ｐ２７１Ｄ、Ｐ２７１Ｅ、Ｐ２７１Ｆ、Ｐ２７１Ｇ、Ｐ２７１Ｈ、Ｐ２７１Ｉ、Ｐ２７１Ｋ、Ｐ２７１Ｌ、Ｐ２７１Ｍ、Ｐ２７１Ｎ、Ｐ２７１Ｑ、Ｐ２７１Ｒ、Ｐ２７１Ｓ、Ｐ２７１Ｔ、Ｐ２７１Ｖ、Ｐ２７１Ｗ、Ｐ２７１Ｙ、Ｅ２７２Ｄ、Ｅ２７２Ｆ、Ｅ２７２Ｇ、Ｅ２７２Ｈ、Ｅ２７２Ｉ、Ｅ２７２Ｋ、Ｅ２７２Ｌ、Ｅ２７２Ｍ、Ｅ２７２Ｐ、Ｅ２７２Ｒ、Ｅ２７２Ｓ、Ｅ２７２Ｔ、Ｅ２７２Ｖ、Ｅ２７２Ｗ、Ｅ２７２Ｙ、Ｖ２７３Ｉ、Ｋ２７４Ｄ、Ｋ２７４Ｅ、Ｋ２７４Ｆ、Ｋ２７４Ｇ、Ｋ２７４Ｈ、Ｋ２７４Ｉ、Ｋ２７４Ｌ、Ｋ２７４Ｍ、Ｋ２７４Ｎ、Ｋ２７４Ｐ、Ｋ２７４Ｒ、Ｋ２７４Ｔ、Ｋ２７４Ｖ、Ｋ２７４Ｗ、Ｋ２７４Ｙ、Ｆ２７５Ｌ、Ｆ２７５Ｗ、Ｎ２７６Ｄ、Ｎ２７６Ｅ、Ｎ２７６Ｆ、Ｎ２７６Ｇ、Ｎ２７６Ｈ、Ｎ２７６Ｉ、Ｎ２７６Ｌ、Ｎ２７６Ｍ、Ｎ２７６Ｐ、Ｎ２７６Ｒ、Ｎ２７６Ｓ、Ｎ２７６Ｔ、Ｎ２７６Ｖ、Ｎ２７６Ｗ、Ｎ２７６Ｙ、Ｙ２７８Ｄ、Ｙ２７８Ｅ、Ｙ２７８Ｇ、Ｙ２７８Ｈ、Ｙ２７８Ｉ、Ｙ２７８Ｋ、Ｙ２７８Ｌ、Ｙ２７８Ｍ、Ｙ２７８Ｎ、Ｙ２７８Ｐ、Ｙ２７８Ｑ、Ｙ２７８Ｒ、Ｙ２７８Ｓ、Ｙ２７８Ｔ、Ｙ２７８Ｖ、Ｙ２７８Ｗ、Ｄ２８０Ｇ、Ｄ２８０Ｋ、Ｄ２８０Ｌ、Ｄ２８０Ｐ、Ｄ２８０Ｗ、Ｇ２８１Ｄ、Ｇ２８１Ｅ、Ｇ２８１Ｋ、Ｇ２８１Ｎ、Ｇ２８１Ｐ、Ｇ２８１Ｑ、Ｇ２８１Ｙ、Ｖ２８２Ｅ、Ｖ２８２Ｇ、Ｖ２８２Ｋ、Ｖ２８２Ｐ、Ｖ２８２Ｙ、Ｅ２８３Ｇ、Ｅ２８３Ｈ、Ｅ２８３Ｋ、Ｅ２８３Ｌ、Ｅ２８３Ｐ、Ｅ２８３Ｒ、Ｅ２８３Ｙ、Ｖ２８４Ｄ、Ｖ２８４Ｅ、Ｖ２８４Ｌ、Ｖ２８４Ｎ、Ｖ２８４Ｑ、Ｖ２８４Ｔ、Ｖ２８４Ｙ、Ｈ２８５Ｄ、Ｈ２８５Ｅ、Ｈ２８５Ｋ、Ｈ２８５Ｑ、Ｈ２８５Ｗ、Ｈ２８５Ｙ、Ｎ２８６Ｅ、Ｎ２８６Ｇ、Ｎ２８６Ｐ、Ｎ２８６Ｙ、Ｋ２８８Ｄ、Ｋ２８８Ｅ、Ｋ２８８Ｙ、Ｋ２９０Ｄ、Ｋ２９０Ｈ、Ｋ２９０Ｌ、Ｋ２９０Ｎ、Ｋ２９０Ｗ、Ｐ２９１Ｄ、Ｐ２９１Ｅ、Ｐ２９１Ｇ、Ｐ２９１Ｈ、Ｐ２９１Ｉ、Ｐ２９１Ｑ、Ｐ２９１Ｔ、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｔ、Ｒ２９２Ｙ、Ｅ２９３Ｆ、Ｅ２９３Ｇ、Ｅ２９３Ｈ、Ｅ２９３Ｉ、Ｅ２９３Ｌ、Ｅ２９３Ｍ、Ｅ２９３Ｎ、Ｅ２９３Ｐ、Ｅ２９３Ｒ、Ｅ２９３Ｓ、Ｅ２９３Ｔ、Ｅ２９３Ｖ、Ｅ２９３Ｗ、Ｅ２９３Ｙ、Ｅ２９４Ｆ、Ｅ２９４Ｇ、Ｅ２９４Ｈ、Ｅ２９４Ｉ、Ｅ２９４Ｋ、Ｅ２９４Ｌ、Ｅ２９４Ｍ、Ｅ２９４Ｐ、Ｅ２９４Ｒ、Ｅ２９４Ｓ、Ｅ２９４Ｔ、Ｅ２９４Ｖ、Ｅ２９４Ｗ、Ｅ２９４Ｙ、Ｑ２９５Ｄ、Ｑ２９５Ｅ、Ｑ２９５Ｆ、Ｑ２９５Ｇ、Ｑ２９５Ｈ、Ｑ２９５Ｉ、Ｑ２９５Ｍ、Ｑ２９５Ｎ、Ｑ２９５Ｐ、Ｑ２９５Ｒ、Ｑ２９５Ｓ、Ｑ２９５Ｔ、Ｑ２９５Ｖ、Ｑ２９５Ｗ、Ｑ２９５Ｙ、Ｙ２９６Ａ、Ｙ２９６Ｄ、Ｙ２９６Ｅ、Ｙ２９６Ｇ、Ｙ２９６Ｈ、Ｙ２９６Ｉ、Ｙ２９６Ｋ、Ｙ２９６Ｌ、Ｙ２９６Ｍ、Ｙ２９６Ｎ、Ｙ２９６Ｑ、Ｙ２９６Ｒ、Ｙ２９６Ｓ、Ｙ２９６Ｔ、Ｙ２９６Ｖ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｅ、Ｎ２９７Ｆ、Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｈ、Ｎ２９７Ｉ、Ｎ２９７Ｋ、Ｎ２９７Ｌ、Ｎ２９７Ｍ、Ｎ２９７Ｐ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｒ、Ｎ２９７Ｓ、Ｎ２９７Ｔ、Ｎ２９７Ｖ、Ｎ２９７Ｗ、Ｎ２９７Ｙ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｅ、Ｓ２９８Ｆ、Ｓ２９８Ｈ、Ｓ２９８Ｉ、Ｓ２９８Ｋ、Ｓ２９８Ｍ、Ｓ２９８Ｎ、Ｓ２９８Ｑ、Ｓ２９８Ｒ、Ｓ２９８Ｔ、Ｓ２９８Ｗ、Ｓ２９８Ｙ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｄ、Ｔ２９９Ｅ、Ｔ２９９Ｆ、Ｔ２９９Ｇ、Ｔ２９９Ｈ、Ｔ２９９Ｉ、Ｔ２９９Ｋ、Ｔ２９９Ｌ、Ｔ２９９Ｍ、Ｔ２９９Ｎ、Ｔ２９９Ｐ、Ｔ２９９Ｑ、Ｔ２９９Ｒ、Ｔ２９９Ｓ、Ｔ２９９Ｖ、Ｔ２９９Ｗ、Ｔ２９９Ｙ、Ｙ３００Ａ、Ｙ３００Ｄ、Ｙ３００Ｅ、Ｙ３００Ｇ、Ｙ３００Ｈ、Ｙ３００Ｋ、Ｙ３００Ｍ、Ｙ３００Ｎ、Ｙ３００Ｐ、Ｙ３００Ｑ、Ｙ３００Ｒ、Ｙ３００Ｓ、Ｙ３００Ｔ、Ｙ３００Ｖ、Ｙ３００Ｗ、Ｒ３０１Ｄ、Ｒ３０１Ｅ、Ｒ３０１Ｈ、Ｒ３０１Ｙ、Ｖ３０２Ｉ、Ｖ３０３Ｄ、Ｖ３０３Ｅ、Ｖ３０３Ｙ、Ｓ３０４Ｄ、Ｓ３０４Ｈ、Ｓ３０４Ｌ、Ｓ３０４Ｎ、Ｓ３０４Ｔ、Ｖ３０５Ｅ、Ｖ３０５Ｔ、Ｖ３０５Ｙ、Ｗ３１３Ｆ、Ｋ３１７Ｅ、Ｋ３１７Ｑ、Ｅ３１８Ｈ、Ｅ３１８Ｌ、Ｅ３１８Ｑ、Ｅ３１８Ｒ、Ｅ３１８Ｙ、Ｋ３２０Ｄ、Ｋ３２０Ｆ、Ｋ３２０Ｇ、Ｋ３２０Ｈ、Ｋ３２０Ｉ、Ｋ３２０Ｌ、Ｋ３２０Ｎ、Ｋ３２０Ｐ、Ｋ３２０Ｓ、Ｋ３２０Ｔ、Ｋ３２０Ｖ、Ｋ３２０Ｗ、Ｋ３２０Ｙ、Ｋ３２２Ｄ、Ｋ３２２Ｆ、Ｋ３２２Ｇ、Ｋ３２２Ｈ、Ｋ３２２Ｉ、Ｋ３２２Ｐ、Ｋ３２２Ｓ、Ｋ３２２Ｔ、Ｋ３２２Ｖ、Ｋ３２２Ｗ、Ｋ３２２Ｙ、Ｖ３２３Ｉ、Ｓ３２４Ｄ、Ｓ３２４Ｆ、Ｓ３２４Ｇ、Ｓ３２４Ｈ、Ｓ３２４Ｉ、Ｓ３２４Ｌ、Ｓ３２４Ｍ、Ｓ３２４Ｐ、Ｓ３２４Ｒ、Ｓ３２４Ｔ、Ｓ３２４Ｖ、Ｓ３２４Ｗ、Ｓ３２４Ｙ、Ｎ３２５Ａ、Ｎ３２５Ｄ、Ｎ３２５Ｅ、Ｎ３２５Ｆ、Ｎ３２５Ｇ、Ｎ３２５Ｈ、Ｎ３２５Ｉ、Ｎ３２５Ｋ、Ｎ３２５Ｌ、Ｎ３２５Ｍ、Ｎ３２５Ｐ、Ｎ３２５Ｑ、Ｎ３２５Ｒ、Ｎ３２５Ｓ、Ｎ３２５Ｔ、Ｎ３２５Ｖ、Ｎ３２５Ｗ、Ｎ３２５Ｙ、Ｋ３２６Ｉ、Ｋ３２６Ｌ、Ｋ３２６Ｐ、Ｋ３２６Ｔ、Ａ３２７Ｄ、Ａ３２７Ｅ、Ａ３２７Ｆ、Ａ３２７Ｈ、Ａ３２７Ｉ、Ａ３２７Ｋ、Ａ３２７Ｌ、Ａ３２７Ｍ、Ａ３２７Ｎ、Ａ３２７Ｐ、Ａ３２７Ｒ、Ａ３２７Ｓ、Ａ３２７Ｔ、Ａ３２７Ｖ、Ａ３２７Ｗ、Ａ３２７Ｙ、Ｌ３２８Ａ、Ｌ３２８Ｄ、Ｌ３２８Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｌ３２８Ｇ、Ｌ３２８Ｈ、Ｌ３２８Ｉ、Ｌ３２８Ｋ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｎ、Ｌ３２８Ｐ、Ｌ３２８Ｑ、Ｌ３２８Ｒ、Ｌ３２８Ｓ、Ｌ３２８Ｔ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｗ、Ｌ３２８Ｙ、Ｐ３２９Ｄ、Ｐ３２９Ｅ、Ｐ３２９Ｆ、Ｐ３２９Ｇ、Ｐ３２９Ｈ、Ｐ３２９Ｉ、Ｐ３２９Ｋ、Ｐ３２９Ｌ、Ｐ３２９Ｍ、Ｐ３２９Ｎ、Ｐ３２９Ｑ、Ｐ３２９Ｒ、Ｐ３２９Ｓ、Ｐ３２９Ｔ、Ｐ３２９Ｖ、Ｐ３２９Ｗ、Ｐ３２９Ｙ、Ａ３３０Ｅ、Ａ３３０Ｆ、Ａ３３０Ｇ、Ａ３３０Ｈ、Ａ３３０Ｉ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｍ、Ａ３３０Ｎ、Ａ３３０Ｐ、Ａ３３０Ｒ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３０Ｔ、Ａ３３０Ｖ、Ａ３３０Ｗ、Ａ３３０Ｙ、Ｐ３３１Ｄ、Ｐ３３１Ｆ、Ｐ３３１Ｈ、Ｐ３３１Ｉ、Ｐ３３１Ｌ、Ｐ３３１Ｍ、Ｐ３３１Ｑ、Ｐ３３１Ｒ、Ｐ３３１Ｔ、Ｐ３３１Ｖ、Ｐ３３１Ｗ、Ｐ３３１Ｙ、Ｉ３３２Ａ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｆ、Ｉ３３２Ｈ、Ｉ３３２Ｋ、Ｉ３３２Ｌ、Ｉ３３２Ｍ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｐ、Ｉ３３２Ｑ、Ｉ３３２Ｒ、Ｉ３３２Ｓ、Ｉ３３２Ｔ、Ｉ３３２Ｖ、Ｉ３３２Ｗ、Ｉ３３２Ｙ、Ｅ３３３Ｆ、Ｅ３３３Ｈ、Ｅ３３３Ｉ、Ｅ３３３Ｌ、Ｅ３３３Ｍ、Ｅ３３３Ｐ、Ｅ３３３Ｔ、Ｅ３３３Ｙ、Ｋ３３４Ｆ、Ｋ３３４Ｉ、Ｋ３３４Ｌ、Ｋ３３４Ｐ、Ｋ３３４Ｔ、Ｔ３３５Ｄ、Ｔ３３５Ｆ、Ｔ３３５Ｇ、Ｔ３３５Ｈ、Ｔ３３５Ｉ、Ｔ３３５Ｌ、Ｔ３３５Ｍ、Ｔ３３５Ｎ、Ｔ３３５Ｐ、Ｔ３３５Ｒ、Ｔ３３５Ｓ、Ｔ３
３５Ｖ、Ｔ３３５Ｗ、Ｔ３３５Ｙ、Ｉ３３６Ｅ、Ｉ３３６Ｋ、Ｉ３３６Ｙ、Ｓ３３７Ｅ、Ｓ３３７ＨおよびＳ３３７Ｎ。ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスのものである。この変異体のセットは、本発明の「シングル変異体のセット」と呼ばれるときもある。
本発明の追加的態様は、親Ｆｃポリペプチド、例えば配列番号：ＸのＦｃ領域と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０個またはそれ以上のアミノ酸置換を有するＦｃ変異体（およびこれらの変異体を含有するタンパク質）を提供することである。いくつかの実施態様では、１、２、３および４個の置換が特別な用途を見出す。
本発明のさらなる態様は、親Ｆｃポリペプチド、例えば配列番号：ＸのＦｃ領域と比較して、変更されたＦｃリガンド結合を示し、ヒトＦｃポリペプチドをコードする遺伝子にストリンジェンシーの高い条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるＦｃ変異体（およびこれらの変異体を含有するタンパク質）を提供することである。ストリンジェンシーの高い条件は、当分野で知られている；例えば、特にストリンジェンシーの高い条件について出典明示により本明細書の一部とする、米国特許第６,８７５,８４６号参照。ヒトＦｃポリペプチドをコードする遺伝子は、通常、もっと大きい遺伝子のフラグメントであり、同様に、遺伝子コードの縮重のために、それら自体が天然産生でなくても、天然産生のＦｃポリペプチドをコードする遺伝子であると当分野で知られてもいるものである。
本発明の追加的態様は、変更されたＡＤＣＣ活性、特に上昇したＡＤＣＣ活性を示す変異体Ｆｃポリペプチドを提供することである。いくつかの態様では、これらの変異体は、位置２３９にアミノ酸置換を、場合により位置２３９および３３２にアミノ酸置換を含み、場合により上記のシングル変異体に概説した任意の他の置換を含むことができ、複数の置換を含む変異体を創成する。
本発明のさらなる目的は、本発明で特徴解析されたＦｃ変異体を提供することである。ここで、該Ｆｃ変異体は、Ｄ２２１Ｋ、Ｄ２２１Ｙ、Ｋ２２２Ｅ、Ｋ２２２Ｙ、Ｔ２２３Ｅ、Ｔ２２３Ｋ、Ｈ２２４Ｅ、Ｈ２２４Ｙ、Ｔ２２５Ｅ、Ｔ２２５Ｋ、Ｔ２２５Ｗ、Ｐ２２７Ｅ、Ｐ２２７Ｇ、Ｐ２２７Ｋ、Ｐ２２７Ｙ、Ｐ２２８Ｅ、Ｐ２２８Ｇ、Ｐ２２８Ｋ、Ｐ２２８Ｙ、Ｐ２３０Ａ、Ｐ２３０Ａ／Ｅ２３３Ｄ、Ｐ２３０Ａ／Ｅ２３３Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｐ２３０Ｅ、Ｐ２３０Ｇ、Ｐ２３０Ｙ、Ａ２３１Ｅ、Ａ２３１Ｇ、Ａ２３１Ｋ、Ａ２３１Ｐ、Ａ２３１Ｙ、Ｐ２３２Ｅ、Ｐ２３２Ｇ、Ｐ２３２Ｋ、Ｐ２３２Ｙ、Ｅ２３３Ａ、Ｅ２３３Ｄ、Ｅ２３３Ｆ、Ｅ２３３Ｇ、Ｅ２３３Ｈ、Ｅ２３３Ｉ、Ｅ２３３Ｋ、Ｅ２３３Ｌ、Ｅ２３３Ｍ、Ｅ２３３Ｎ、Ｅ２３３Ｑ、Ｅ２３３Ｒ、Ｅ２３３Ｓ、Ｅ２３３Ｔ、Ｅ２３３Ｖ、Ｅ２３３Ｗ、Ｅ２３３Ｙ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３４Ｇ、Ｌ２３４Ｈ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｉ／Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３４Ｋ、Ｌ２３４Ｍ、Ｌ２３４Ｎ、Ｌ２３４Ｐ、Ｌ２３４Ｑ、Ｌ２３４Ｒ、Ｌ２３４Ｓ、Ｌ２３４Ｔ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｗ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｄ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ２３５Ｄ／Ｓ２３９Ｄ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ｆ、Ｌ２３５Ｇ、Ｌ２３５Ｈ、Ｌ２３５Ｉ、Ｌ２３５Ｋ、Ｌ２３５Ｍ、Ｌ２３５Ｎ、Ｌ２３５Ｐ、Ｌ２３５Ｑ、Ｌ２３５Ｒ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｔ、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２３５Ｗ、Ｌ２３５Ｙ、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３６Ｄ、Ｇ２３６Ｅ、Ｇ２３６Ｆ、Ｇ２３６Ｈ、Ｇ２３６Ｉ、Ｇ２３６Ｋ、Ｇ２３６Ｌ、Ｇ２３６Ｍ、Ｇ２３６Ｎ、Ｇ２３６Ｐ、Ｇ２３６Ｑ、Ｇ２３６Ｒ、Ｇ２３６Ｓ、Ｇ２３６Ｔ、Ｇ２３６Ｖ、Ｇ２３６Ｗ、Ｇ２３６Ｙ、Ｇ２３７Ｄ、Ｇ２３７Ｅ、Ｇ２３７Ｆ、Ｇ２３７Ｈ、Ｇ２３７Ｉ、Ｇ２３７Ｋ、Ｇ２３７Ｌ、Ｇ２３７Ｍ、Ｇ２３７Ｎ、Ｇ２３７Ｐ、Ｇ２３７Ｑ、Ｇ２３７Ｒ、Ｇ２３７Ｓ、Ｇ２３７Ｔ、Ｇ２３７Ｖ、Ｇ２３７Ｗ、Ｇ２３７Ｙ、Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２３８Ｅ、Ｐ２３８Ｆ、Ｐ２３８Ｇ、Ｐ２３８Ｈ、Ｐ２３８Ｉ、Ｐ２３８Ｋ、Ｐ２３８Ｌ、Ｐ２３８Ｍ、Ｐ２３８Ｎ、Ｐ２３８Ｑ、Ｐ２３８Ｒ、Ｐ２３８Ｓ、Ｐ２３８Ｔ、Ｐ２３８Ｖ、Ｐ２３８Ｗ、Ｐ２３８Ｙ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ／Ｌ２３４Ｉ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ／Ｖ２６６Ｉ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｆ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｈ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｉ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｌ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｔ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｙ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｅ２７２Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｅ２７２Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｅ２７２Ｋ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｅ２７２Ｋ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｅ２７２Ｓ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｅ２７２Ｓ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｅ２７２Ｙ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｅ２７２Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｆ２４１Ｓ／Ｆ２４３Ｈ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｔ／Ｎ２９７Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３２７Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｉ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｙ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｅ２７２Ｈ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｅ２７２Ｒ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｅ２８３Ｈ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｅ２８３Ｌ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｇ２３６Ｓ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｈ２６８Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｈ２６８Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｋ２４６Ｈ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｒ２５５Ｙ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｖ２６４Ｉ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｖ２８４Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｖ２８４Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｖ２８４Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ２７４Ｅ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ２７４Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｔ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｎ２９７Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｎ２９７Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２６７Ｅ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２６７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｋ３２６Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｋ３２６Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２４０Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｔ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｙ２７８Ｔ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｙ２７８Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｇ、Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｑ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｅ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｆ、Ｓ２３９Ｇ、Ｓ２３９Ｈ、Ｓ２３９Ｉ、Ｓ２３９Ｋ、Ｓ２３９Ｌ、Ｓ２３９Ｍ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｙ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｐ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｑ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｒ、Ｓ２３９Ｔ、Ｓ２３９Ｖ、Ｓ２３９Ｗ、Ｓ２３９Ｙ、Ｖ２４０Ａ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ｉ／Ｖ２６６Ｉ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２４０Ｔ、Ｆ２４１Ｄ、Ｆ２４１Ｅ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｅ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｒ／Ｖ２６２Ｅ／Ｖ２６４Ｒ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｒ／
Ｖ２６２Ｅ／Ｖ２６４Ｒ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ、Ｆ２４１Ｌ、Ｆ２４１Ｌ／Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６２Ｉ／Ｖ２６４Ｉ、Ｆ２４１Ｌ／Ｖ２６２Ｉ、Ｆ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ、Ｆ２４１Ｗ、Ｆ２４１Ｗ／Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４１Ｗ／Ｆ２４３Ｗ／Ｖ２６２Ａ／Ｖ２６４Ａ、Ｆ２４１Ｙ、Ｆ２４１Ｙ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｔ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｙ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｔ、Ｆ２４３Ｅ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６２Ｉ／Ｖ２６４Ｗ、Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６４Ｉ、Ｆ２４３Ｗ、Ｐ２４４Ｈ、Ｐ２４４Ｈ／Ｐ２４５Ａ／Ｐ２４７Ｖ、Ｐ２４５Ａ、Ｋ２４６Ｄ、Ｋ２４６Ｅ、Ｋ２４６Ｈ、Ｋ２４６Ｙ、Ｐ２４７Ｇ、Ｐ２４７Ｖ、Ｄ２４９Ｈ、Ｄ２４９Ｑ、Ｄ２４９Ｙ、Ｒ２５５Ｅ、Ｒ２５５Ｙ、Ｅ２５８Ｈ、Ｅ２５８Ｓ、Ｅ２５８Ｙ、Ｔ２６０Ｄ、Ｔ２６０Ｅ、Ｔ２６０Ｈ、Ｔ２６０Ｙ、Ｖ２６２Ｅ、Ｖ２６２Ｆ、Ｖ２６３Ａ、Ｖ２６３Ｉ、Ｖ２６３Ｍ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６４Ａ、Ｖ２６４Ｄ、Ｖ２６４Ｅ、Ｖ２６４Ｅ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｆ、Ｖ２６４Ｇ、Ｖ２６４Ｈ、Ｖ２６４Ｉ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｋ、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ｍ、Ｖ２６４Ｎ、Ｖ２６４Ｐ、Ｖ２６４Ｑ、Ｖ２６４Ｒ、Ｖ２６４Ｓ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｗ、Ｖ２６４Ｙ、Ｄ２６５Ｆ、Ｄ２６５Ｆ／Ｎ２９７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５Ｈ、Ｄ２６５Ｉ、Ｄ２６５Ｋ、Ｄ２６５Ｌ、Ｄ２６５Ｍ、Ｄ２６５Ｎ、Ｄ２６５Ｐ、Ｄ２６５Ｑ、Ｄ２６５Ｒ、Ｄ２６５Ｓ、Ｄ２６５Ｔ、Ｄ２６５Ｖ、Ｄ２６５Ｗ、Ｄ２６５Ｙ、Ｄ２６５Ｙ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｄ２６５Ｙ／Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６６Ａ、Ｖ２６６Ｉ、Ｖ２６６Ｍ、Ｖ２６６Ｔ、Ｓ２６７Ｄ、Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２６７Ｅ／Ａ３２７Ｄ、Ｓ２６７Ｅ／Ｐ３３１Ｄ、Ｓ２６７Ｅ／Ｓ３２４Ｉ、Ｓ２６７Ｅ／Ｖ２８２Ｇ、Ｓ２６７Ｆ、Ｓ２６７Ｈ、Ｓ２６７Ｉ、Ｓ２６７Ｋ、Ｓ２６７Ｌ、Ｓ２６７Ｌ／Ａ３２７Ｓ、Ｓ２６７Ｍ、Ｓ２６７Ｎ、Ｓ２６７Ｐ、Ｓ２６７Ｑ、Ｓ２６７Ｑ／Ａ３２７Ｓ、Ｓ２６７Ｒ、Ｓ２６７Ｔ、Ｓ２６７Ｖ、Ｓ２６７Ｗ、Ｓ２６７Ｙ、Ｈ２６８Ｄ、Ｈ２６８Ｅ、Ｈ２６８Ｆ、Ｈ２６８Ｇ、Ｈ２６８Ｉ、Ｈ２６８Ｋ、Ｈ２６８Ｌ、Ｈ２６８Ｍ、Ｈ２６８Ｐ、Ｈ２６８Ｑ、Ｈ２６８Ｒ、Ｈ２６８Ｔ、Ｈ２６８Ｖ、Ｈ２６８Ｗ、Ｅ２６９Ｆ、Ｅ２６９Ｇ、Ｅ２６９Ｈ、Ｅ２６９Ｉ、Ｅ２６９Ｋ、Ｅ２６９Ｌ、Ｅ２６９Ｍ、Ｅ２６９Ｎ、Ｅ２６９Ｐ、Ｅ２６９Ｒ、Ｅ２６９Ｓ、Ｅ２６９Ｔ、Ｅ２６９Ｖ、Ｅ２６９Ｗ、Ｅ２６９Ｙ、Ｄ２７０Ｆ、Ｄ２７０Ｇ、Ｄ２７０Ｈ、Ｄ２７０Ｉ、Ｄ２７０Ｌ、Ｄ２７０Ｍ、Ｄ２７０Ｐ、Ｄ２７０Ｑ、Ｄ２７０Ｒ、Ｄ２７０Ｓ、Ｄ２７０Ｔ、Ｄ２７０Ｗ、Ｄ２７０Ｙ、Ｐ２７１Ａ、Ｐ２７１Ｄ、Ｐ２７１Ｅ、Ｐ２７１Ｆ、Ｐ２７１Ｇ、Ｐ２７１Ｈ、Ｐ２７１Ｉ、Ｐ２７１Ｋ、Ｐ２７１Ｌ、Ｐ２７１Ｍ、Ｐ２７１Ｎ、Ｐ２７１Ｑ、Ｐ２７１Ｒ、Ｐ２７１Ｓ、Ｐ２７１Ｔ、Ｐ２７１Ｖ、Ｐ２７１Ｗ、Ｐ２７１Ｙ、Ｅ２７２Ｄ、Ｅ２７２Ｆ、Ｅ２７２Ｇ、Ｅ２７２Ｈ、Ｅ２７２Ｉ、Ｅ２７２Ｋ、Ｅ２７２Ｌ、Ｅ２７２Ｍ、Ｅ２７２Ｐ、Ｅ２７２Ｒ、Ｅ２７２Ｓ、Ｅ２７２Ｔ、Ｅ２７２Ｖ、Ｅ２７２Ｗ、Ｅ２７２Ｙ、Ｖ２７３Ｉ、Ｋ２７４Ｄ、Ｋ２７４Ｅ、Ｋ２７４Ｆ、Ｋ２７４Ｇ、Ｋ２７４Ｈ、Ｋ２７４Ｉ、Ｋ２７４Ｌ、Ｋ２７４Ｍ、Ｋ２７４Ｎ、Ｋ２７４Ｐ、Ｋ２７４Ｒ、Ｋ２７４Ｔ、Ｋ２７４Ｖ、Ｋ２７４Ｗ、Ｋ２７４Ｙ、Ｆ２７５Ｌ、Ｆ２７５Ｗ、Ｎ２７６Ｄ、Ｎ２７６Ｅ、Ｎ２７６Ｆ、Ｎ２７６Ｇ、Ｎ２７６Ｈ、Ｎ２７６Ｉ、Ｎ２７６Ｌ、Ｎ２７６Ｍ、Ｎ２７６Ｐ、Ｎ２７６Ｒ、Ｎ２７６Ｓ、Ｎ２７６Ｔ、Ｎ２７６Ｖ、Ｎ２７６Ｗ、Ｎ２７６Ｙ、Ｙ２７８Ｄ、Ｙ２７８Ｅ、Ｙ２７８Ｇ、Ｙ２７８Ｈ、Ｙ２７８Ｉ、Ｙ２７８Ｋ、Ｙ２７８Ｌ、Ｙ２７８Ｍ、Ｙ２７８Ｎ、Ｙ２７８Ｐ、Ｙ２７８Ｑ、Ｙ２７８Ｒ、Ｙ２７８Ｓ、Ｙ２７８Ｔ、Ｙ２７８Ｖ、Ｙ２７８Ｗ、Ｙ２７８Ｗ、Ｙ２７８Ｗ／Ｅ２８３Ｒ／Ｖ３０２Ｉ、Ｙ２７８Ｗ／Ｖ３０２Ｉ、Ｄ２８０Ｇ、Ｄ２８０Ｋ、Ｄ２８０Ｌ、Ｄ２８０Ｐ、Ｄ２８０Ｗ、Ｇ２８１Ｄ、Ｇ２８１Ｄ／Ｖ２８２Ｇ、Ｇ２８１Ｅ、Ｇ２８１Ｋ、Ｇ２８１Ｎ、Ｇ２８１Ｐ、Ｇ２８１Ｑ、Ｇ２８１Ｙ、Ｖ２８２Ｅ、Ｖ２８２Ｇ、Ｖ２８２Ｇ／Ｐ３３１Ｄ、Ｖ２８２Ｋ、Ｖ２８２Ｐ、Ｖ２８２Ｙ、Ｅ２８３Ｇ、Ｅ２８３Ｈ、Ｅ２８３Ｋ、Ｅ２８３Ｌ、Ｅ２８３Ｐ、Ｅ２８３Ｒ、Ｅ２８３Ｒ／Ｖ３０２Ｉ／Ｙ２７８Ｗ／Ｅ２８３Ｒ、Ｅ２８３Ｙ、Ｖ２８４Ｄ、Ｖ２８４Ｅ、Ｖ２８４Ｌ、Ｖ２８４Ｎ、Ｖ２８４Ｑ、Ｖ２８４Ｔ、Ｖ２８４Ｙ、Ｈ２８５Ｄ、Ｈ２８５Ｅ、Ｈ２８５Ｋ、Ｈ２８５Ｑ、Ｈ２８５Ｗ、Ｈ２８５Ｙ、Ｎ２８６Ｅ、Ｎ２８６Ｇ、Ｎ２８６Ｐ、Ｎ２８６Ｙ、Ｋ２８８Ｄ、Ｋ２８８Ｅ、Ｋ２８８Ｙ、Ｋ２９０Ｄ、Ｋ２９０Ｈ、Ｋ２９０Ｌ、Ｋ２９０Ｎ、Ｋ２９０Ｗ、Ｐ２９１Ｄ、Ｐ２９１Ｅ、Ｐ２９１Ｇ、Ｐ２９１Ｈ、Ｐ２９１Ｉ、Ｐ２９１Ｑ、Ｐ２９１Ｔ、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｔ、Ｒ２９２Ｙ、Ｅ２９３Ｆ、Ｅ２９３Ｇ、Ｅ２９３Ｈ、Ｅ２９３Ｉ、Ｅ２９３Ｌ、Ｅ２９３Ｍ、Ｅ２９３Ｎ、Ｅ２９３Ｐ、Ｅ２９３Ｒ、Ｅ２９３Ｓ、Ｅ２９３Ｔ、Ｅ２９３Ｖ、Ｅ２９３Ｗ、Ｅ２９３Ｙ、Ｅ２９４Ｆ、Ｅ２９４Ｇ、Ｅ２９４Ｈ、Ｅ２９４Ｉ、Ｅ２９４Ｋ、Ｅ２９４Ｌ、Ｅ２９４Ｍ、Ｅ２９４Ｐ、Ｅ２９４Ｒ、Ｅ２９４Ｓ、Ｅ２９４Ｔ、Ｅ２９４Ｖ、Ｅ２９４Ｗ、Ｅ２９４Ｙ、Ｑ２９５Ｄ、Ｑ２９５Ｅ、Ｑ２９５Ｆ、Ｑ２９５Ｇ、Ｑ２９５Ｈ、Ｑ２９５Ｉ、Ｑ２９５Ｍ、Ｑ２９５Ｎ、Ｑ２９５Ｐ、Ｑ２９５Ｒ、Ｑ２９５Ｓ、Ｑ２９５Ｔ、Ｑ２９５Ｖ、Ｑ２９５Ｗ、Ｑ２９５Ｙ、Ｙ２９６Ａ、Ｙ２９６Ｄ、Ｙ２９６Ｅ、Ｙ２９６Ｇ、Ｙ２９６Ｉ、Ｙ２９６Ｋ、Ｙ２９６Ｌ、Ｙ２９６Ｍ、Ｙ２９６Ｎ、Ｙ２９６Ｑ、Ｙ２９６Ｒ、Ｙ２９６Ｓ、Ｙ２９６Ｔ、Ｙ２９６Ｖ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｙ、Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ、Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｖ、Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａ／Ａ３３０Ｙ、Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｔ２９９Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｔ２９９Ｆ、Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｔ２９９Ｈ、Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｔ２９９Ｉ、Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｔ２９９Ｌ、Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｔ２９９Ｖ、Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｙ２９６Ｄ、Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｙ２９６Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｙ２９６Ｈ、Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｙ２９６Ｎ、Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｙ２９６Ｑ、Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｙ２９６Ｔ、Ｎ２９７Ｅ／
Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｆ、Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｈ、Ｎ２９７Ｉ、Ｎ２９７Ｋ、Ｎ２９７Ｌ、Ｎ２９７Ｍ、Ｎ２９７Ｐ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｒ、Ｎ２９７Ｓ、Ｎ２９７Ｓ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｔ、Ｎ２９７Ｖ、Ｎ２９７Ｗ、Ｎ２９７Ｙ、Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ３２６Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ３２６Ｅ／Ｋ３３４Ｌ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ３３４Ｌ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｅ、Ｓ２９８Ｆ、Ｓ２９８Ｈ、Ｓ２９８Ｉ、Ｓ２９８Ｋ、Ｓ２９８Ｍ、Ｓ２９８Ｎ、Ｓ２９８Ｑ、Ｓ２９８Ｒ、Ｓ２９８Ｔ、Ｓ２９８Ｗ、Ｓ２９８Ｙ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｄ、Ｔ２９９Ｅ、Ｔ２９９Ｆ、Ｔ２９９Ｇ、Ｔ２９９Ｈ、Ｔ２９９Ｉ、Ｔ２９９Ｋ、Ｔ２９９Ｌ、Ｔ２９９Ｍ、Ｔ２９９Ｎ、Ｔ２９９Ｐ、Ｔ２９９Ｑ、Ｔ２９９Ｒ、Ｔ２９９Ｓ、Ｔ２９９Ｖ、Ｔ２９９Ｗ、Ｔ２９９Ｙ、Ｙ３００Ａ、Ｙ３００Ｄ、Ｙ３００Ｅ、Ｙ３００Ｇ、Ｙ３００Ｈ、Ｙ３００Ｋ、Ｙ３００Ｍ、Ｙ３００Ｎ、Ｙ３００Ｐ、Ｙ３００Ｑ、Ｙ３００Ｒ、Ｙ３００Ｓ、Ｙ３００Ｔ、Ｙ３００Ｖ、Ｙ３００Ｗ、Ｒ３０１Ｄ、Ｒ３０１Ｅ、Ｒ３０１Ｈ、Ｒ３０１Ｙ、Ｖ３０２Ｉ、Ｖ３０３Ｄ、Ｖ３０３Ｅ、Ｖ３０３Ｙ、Ｓ３０４Ｄ、Ｓ３０４Ｈ、Ｓ３０４Ｌ、Ｓ３０４Ｎ、Ｓ３０４Ｔ、Ｖ３０５Ｅ、Ｖ３０５Ｔ、Ｖ３０５Ｙ、Ｗ３１３Ｆ、Ｋ３１７Ｅ、Ｋ３１７Ｑ、Ｅ３１８Ｈ、Ｅ３１８Ｌ、Ｅ３１８Ｑ、Ｅ３１８Ｒ、Ｅ３１８Ｙ、Ｋ３２０Ｄ、Ｋ３２０Ｆ、Ｋ３２０Ｇ、Ｋ３２０Ｈ、Ｋ３２０Ｉ、Ｋ３２０Ｌ、Ｋ３２０Ｎ、Ｋ３２０Ｐ、Ｋ３２０Ｓ、Ｋ３２０Ｔ、Ｋ３２０Ｖ、Ｋ３２０Ｗ、Ｋ３２０Ｙ、Ｋ３２２Ｄ、Ｋ３２２Ｆ、Ｋ３２２Ｇ、Ｋ３２２Ｈ、Ｋ３２２Ｉ、Ｋ３２２Ｐ、Ｋ３２２Ｓ、Ｋ３２２Ｔ、Ｋ３２２Ｖ、Ｋ３２２Ｗ、Ｋ３２２Ｙ、Ｖ３２３Ｉ、Ｓ３２４Ｄ、Ｓ３２４Ｆ、Ｓ３２４Ｇ、Ｓ３２４Ｈ、Ｓ３２４Ｉ、Ｓ３２４Ｉ／Ａ３２７Ｄ、Ｓ３２４Ｌ、Ｓ３２４Ｍ、Ｓ３２４Ｐ、Ｓ３２４Ｒ、Ｓ３２４Ｔ、Ｓ３２４Ｖ、Ｓ３２４Ｗ、Ｓ３２４Ｙ、Ｎ３２５Ａ、Ｎ３２５Ｄ、Ｎ３２５Ｅ、Ｎ３２５Ｆ、Ｎ３２５Ｇ、Ｎ３２５Ｈ、Ｎ３２５Ｉ、Ｎ３２５Ｋ、Ｎ３２５Ｌ、Ｎ３２５Ｍ、Ｎ３２５Ｐ、Ｎ３２５Ｑ、Ｎ３２５Ｒ、Ｎ３２５Ｓ、Ｎ３２５Ｔ、Ｎ３２５Ｖ、Ｎ３２５Ｗ、Ｎ３２５Ｙ、Ｋ３２６Ｉ、Ｋ３２６Ｌ、Ｋ３２６Ｐ、Ｋ３２６Ｔ、Ａ３２７Ｄ、Ａ３２７Ｅ、Ａ３２７Ｆ、Ａ３２７Ｈ、Ａ３２７Ｉ、Ａ３２７Ｋ、Ａ３２７Ｌ、Ａ３２７Ｍ、Ａ３２７Ｎ、Ａ３２７Ｐ、Ａ３２７Ｒ、Ａ３２７Ｓ、Ａ３２７Ｔ、Ａ３２７Ｖ、Ａ３２７Ｗ、Ａ３２７Ｙ、Ｌ３２８Ａ、Ｌ３２８Ｄ、Ｌ３２８Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｅ、Ｌ３２８Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｌ３２８Ｇ、Ｌ３２８Ｈ、Ｌ３２８Ｈ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｉ、Ｌ３２８Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｋ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｍ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｎ、Ｌ３２８Ｎ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｐ、Ｌ３２８Ｑ、Ｌ３２８Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｒ、Ｌ３２８Ｓ、Ｌ３２８Ｔ、Ｌ３２８Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｖ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｗ、Ｌ３２８Ｙ、Ｐ３２９Ｄ、Ｐ３２９Ｅ、Ｐ３２９Ｆ、Ｐ３２９Ｇ、Ｐ３２９Ｈ、Ｐ３２９Ｉ、Ｐ３２９Ｋ、Ｐ３２９Ｌ、Ｐ３２９Ｍ、Ｐ３２９Ｎ、Ｐ３２９Ｑ、Ｐ３２９Ｒ、Ｐ３２９Ｓ、Ｐ３２９Ｔ、Ｐ３２９Ｖ、Ｐ３２９Ｗ、Ｐ３２９Ｙ、Ａ３３０Ｅ、Ａ３３０Ｆ、Ａ３３０Ｇ、Ａ３３０Ｈ、Ａ３３０Ｉ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｍ、Ａ３３０Ｎ、Ａ３３０Ｐ、Ａ３３０Ｒ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３０Ｔ、Ａ３３０Ｖ、Ａ３３０Ｗ、Ａ３３０Ｙ、Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｐ３３１Ｄ、Ｐ３３１Ｆ、Ｐ３３１Ｈ、Ｐ３３１Ｉ、Ｐ３３１Ｌ、Ｐ３３１Ｍ、Ｐ３３１Ｑ、Ｐ３３１Ｒ、Ｐ３３１Ｔ、Ｐ３３１Ｖ、Ｐ３３１Ｗ、Ｐ３３１Ｙ、Ｉ３３２Ａ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｅ／Ｇ２８１Ｄ、Ｉ３３２Ｅ／Ｈ２６８Ｄ、Ｉ３３２Ｅ／Ｈ２６８Ｅ、Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ、Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２３９Ｎ／Ｓ２９８Ａ、Ｉ３３２Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ、Ｉ３３２Ｅ／Ｖ２８４Ｅ、Ｉ３３２Ｆ、Ｉ３３２Ｈ、Ｉ３３２Ｋ、Ｉ３３２Ｌ、Ｉ３３２Ｍ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｐ、Ｉ３３２Ｑ、Ｉ３３２Ｒ、Ｉ３３２Ｓ、Ｉ３３２Ｔ、Ｉ３３２Ｖ、Ｉ３３２Ｗ、Ｉ３３２Ｙ、Ｅ３３３Ｆ、Ｅ３３３Ｈ、Ｅ３３３Ｉ、Ｅ３３３Ｌ、Ｅ３３３Ｍ、Ｅ３３３Ｐ、Ｅ３３３Ｔ、Ｅ３３３Ｙ、Ｋ３３４Ｆ、Ｋ３３４Ｉ、Ｋ３３４Ｐ、Ｋ３３４Ｔ、Ｔ３３５Ｄ、Ｔ３３５Ｆ、Ｔ３３５Ｇ、Ｔ３３５Ｈ、Ｔ３３５Ｉ、Ｔ３３５Ｌ、Ｔ３３５Ｍ、Ｔ３３５Ｎ、Ｔ３３５Ｐ、Ｔ３３５Ｒ、Ｔ３３５Ｓ、Ｔ３３５Ｖ、Ｔ３３５Ｗ、Ｔ３３５Ｙ、Ｉ３３６Ｅ、Ｉ３３６Ｋ、Ｉ３３６Ｙ、Ｓ３３７Ｅ、Ｓ３３７ＨおよびＳ３３７Ｎからなる群から選択され、ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスのものである。
本発明のさらなる目的は、１またはそれ以上のＦｃγＲ類により高い親和性で結合するＦｃ変異体を提供することである。ある実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドの１倍より高いＦｃγＲへの親和性を有する。別の実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドの５倍より高いＦｃγＲへの親和性を有する。好ましい実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドの約５倍ないし３００倍高いＦｃγＲへの親和性を有する。
本発明のさらなる目的は、１：１より大きいＦｃγＲＩＩＩａ倍率：ＦｃγＲＩＩｂ倍率の比を有するＦｃ変異体を提供することである。ある実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、１１：１より大きいＦｃγＲＩＩＩａ倍率：ＦｃγＲＩＩｂ倍率の比を有する。好ましい実施態様では、１１：１ないし８６：１のＦｃγＲＩＩＩａ倍率：ＦｃγＲＩＩｂ倍率の比を有する。
本発明のさらなる目的は、エフェクター細胞の存在下で、より効果的にエフェクター機能を媒介するＦｃ変異体を提供することである。ある実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドにより媒介されるものよりも大きいＡＤＣＣを媒介する。好ましい実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドにより媒介されるものの５倍よりも大きいＡＤＣＣを媒介する。最も好ましい実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドにより媒介されるものよりも５倍ないし１０００倍大きいＡＤＣＣを媒介する。
本発明のさらなる目的は、１またはそれ以上のＦｃγＲ類と、より弱い親和性で結合するＦｃ変異体を提供することである。本発明のさらなる目的は、エフェクター細胞の存在下で、より低い効果でＡＤＣＣを媒介するＦｃ変異体を提供することである。
本発明のさらなる目的は、親Ｆｃポリペプチドの非グリコシル化形態と比較して改善された機能および／または溶解特性を有するＦｃ変異体を提供することである。ここで、改善された機能性にはＦｃリガンドへの結合親和性が含まれるが、これに限定されるものではない。ここで、改善された溶解特性には、安定性および溶解性が含まれるが、これらに限定されるものではない。ある実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドのグリコシル化形態の約０.５倍以内の親和性でＦｃγＲに結合する。別の実施態様では、当該非グリコシル化Ｆｃ変異体は、グリコシル化親Ｆｃポリペプチドに匹敵する親和性で、ＦｃγＲに結合する。別の実施態様では、Ｆｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドのグリコシル化形態より高い親和性で、ＦｃγＲに結合する。
本発明はまた、最適化Ｆｃ変異体の操作方法も提供する。本発明のさらなる目的は、最適化Ｆｃ変異体を得るための実験的製造およびスクリーニング方法を提供することである。
本発明は、本明細書に記載のＦｃ変異体をコードする単離された核酸を提供する。本発明は、場合により制御配列に機能し得るように連結された当該核酸を含むベクターを提供する。本発明は、このベクターを含有する宿主細胞、およびＦｃ変異体を製造し、場合により回収する方法を提供する。
本発明は、本明細書で開示するＦｃ変異体を含む、抗体、Ｆｃ融合体、単離ＦｃおよびＦｃフラグメントを包含する、新規Ｆｃポリペプチドを提供する。当該新規Ｆｃポリペプチドは、治療用製品に用途を見出し得る。
本発明は、本明細書に記載のＦｃ変異体を含むＦｃポリペプチド、並びに生理的または医薬的に許容し得る担体または希釈剤を含む組成物を提供する。
本発明は、本明細書で開示のＦｃ変異体を含むＦｃポリペプチドの治療的および診断的使用を意図している。
図１は、抗体の構造および機能を示す。 図２は、Ｆｃ／ＦｃγＲＩＩＩｂ複合体構造１ＩＩＳを示す。 図３は、ヒトＩｇＧ免疫グロブリンＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のアミノ酸配列のアラインメントを示し、図３ａは、ＣＨ１（Ｃγ１）およびヒンジドメインの配列を提供する。 図３は、ヒトＩｇＧ免疫グロブリンＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のアミノ酸配列のアラインメントを示し、図３ｂは、ＣＨ２（Ｃγ２）およびＣＨ３（Ｃγ３）ドメインの配列を提供する。 図４は、Ｆｃ／ＦｃγＲＩＩＩｂ複合体構造１ＩＩＳ上にマッピングした、本発明のＦｃ変異体にアミノ酸修飾を作成した残基を示す。 図５は、２９３Ｔ細胞におけるアレムツズマブのＦｃ変異体および野生型（ＷＴ）タンパク質の発現を示す。 図６は、プロテインＡクロマトグラフィーを使用するアレムツズマブの精製を示す。 図７は、脱グリコシル化抗体の精製を示す。 図８は、２９３Ｔ細胞から発現されたアレムツズマブが、その抗原に結合することを示す。 図９は、ヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域の発現と精製を示す。 図１０は、実施例２に記載の AlphaScreen(商標)アッセイにより測定した、実験用ライブラリーから選択されたアレムツズマブＦｃ変異体によるヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を示す。 図１１ａは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のヒトＶａｌ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を示す AlphaScreenアッセイを示す。 図１１ｂは、選択されたトラスツズマブＦｃ変異体のヒトＶａｌ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を示す AlphaScreenアッセイを示す。 図１２は、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のヒトＦｃγＲＩＩｂへの結合を示す AlphaScreenアッセイを示す。 図１３は、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のヒトＲ１３１ ＦｃγＲＩＩａへの結合を示す AlphaScreenアッセイを示す。 図１４は、実施例２に記載の通りの、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のヒトＦｃＲｎへの結合を示すAlphaScreenアッセイを示す。 図１５は、実施例２に記載の通りの、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体の細菌のプロテインＡへの結合を示すAlphaScreenアッセイを示す。 図１６ａは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を比較する AlphaScreenアッセイを示す。 図１６ｂは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のヒトＦｃγＲＩＩｂ（図１６ｂ）への結合を比較する AlphaScreenアッセイを示す。 図１７ａは、トラスツズマブの文脈で、選択されたＦｃ変異体によるヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を測定する AlphaScreen アッセイを示す。 図１７ｂは、トラスツズマブの文脈で、選択されたＦｃ変異体によるヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を測定する AlphaScreen アッセイを示す。 図１７ｃは、トラスツズマブの文脈で、選択されたＦｃ変異体によるヒトＦｃγＲＩＩｂへの結合を測定する AlphaScreen アッセイを示す。 図１８は、リツキシマブの文脈で、選択されたＦｃ変異体によるヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を測定する AlphaScreen アッセイを示す。 図１９は、セツキシマブの文脈で、選択されたＦｃ変異体によるヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を測定する AlphaScreen アッセイを示す。 図２０ａは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体の、ヒトＦｃγＲＩＩＩａのＶ１５８アロタイプへの結合を示す AlphaScreen アッセイを示す。 図２０ｂは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体の、ヒトＦｃγＲＩＩＩａのＦ１５８アロタイプへの結合を示す AlphaScreen アッセイを示す。 図２１ａは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合から、ＳＰＲのＫｄと AlphaScreen のＩＣ５０との間の相関を示す。 図２１ｂは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合から、ＳＰＲのＫｄと AlphaScreen のＩＣ５０との間の相関を示す。 図２１ｃは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合について、ＷＴに対するＳＰＲおよび AlphaScreen の改善倍率間の相関を示す。 図２１ｄは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合について、ＷＴに対するＳＰＲおよび AlphaScreen の改善倍率間の相関を示す。 図２２ａは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体の、ヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を示す AlphaScreen アッセイを示す。 図２２ｂは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体の、ヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を示す AlphaScreen アッセイを示す。 図２３は、アレムツズマブの文脈で、選択されたＦｃ変異体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイを示す。図２３ａは、１０ｎｇ／ｍｌの明記したアレムツズマブ抗体について未加工の蛍光データを示す棒グラフである。 図２３は、アレムツズマブの文脈で、選択されたＦｃ変異体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイを示す。図２３ｂは、明記したアレムツズマブ抗体について、抗体濃度に対するＡＤＣＣの用量依存を示す。 図２４は、トラスツズマブの文脈で、選択されたＦｃ変異体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイを示す。図２４ａは、１ｎｇ／ｍｌの明記したトラスツズマブ抗体について未加工の蛍光データを示す棒グラフである。 図２４は、トラスツズマブの文脈で、選択されたＦｃ変異体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイを示す。図２４ｂは、明記したトラスツズマブ抗体について、抗体濃度に対するＡＤＣＣの用量依存を示す。 図２４は、トラスツズマブの文脈で、選択されたＦｃ変異体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイを示す。図２４ｃは、明記したトラスツズマブ抗体について、抗体濃度に対するＡＤＣＣの用量依存を示す。 図２５は、リツキシマブの文脈で、選択されたＦｃ変異体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイを示す。図２５ａは、１ｎｇ／ｍｌの明記したリツキシマブ抗体について未加工の蛍光データを示す棒グラフである。 図２５は、リツキシマブの文脈で、選択されたＦｃ変異体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイを示す。図２５ｂは、明記したリツキシマブ抗体について、抗体濃度に対するＡＤＣＣの用量依存を示す。 図２５は、リツキシマブの文脈で、選択されたＦｃ変異体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイを示す。図２５ｃは、明記したリツキシマブ抗体について、抗体濃度に対するＡＤＣＣの用量依存を示す。 図２６ａは、強度および効力の増強を示す選択されたトラスツズマブＦｃ変異体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイを示す。 図２６ｂは、強度および効力の増強を示す選択されたリツキシマブＦｃ変異体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイを示す。 図２７は、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体の、ヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を示す AlphaScreen アッセイを示す。 図２８は、ＷＴトラスツズマブと比較した、選択されたＦｃ変異体トラスツズマブ抗体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイを示す。 図２９は、様々なレベルのＨｅｒ２／ｎｅｕ標的抗原を発現する異なる細胞株に対する選択されたトラスツズマブＦｃ変異体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイを示す。図２９ａは、各細胞株について、Ｈｅｒ２発現レベルを示すウエスタンブロットを提供する。 図２９は、様々なレベルのＨｅｒ２／ｎｅｕ標的抗原を発現する異なる細胞株に対する選択されたトラスツズマブＦｃ変異体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイを示す。図２９ｂの棒グラフは、明示した細胞株に対するＷＴおよびＦｃ変異体のＡＤＣＣデータを提供する。 図３０は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をエフェクター細胞として使用し、細胞溶解をモニターするのにＬＤＨ放出を測定する、トラスツズマブの文脈における選択されたＦｃ変異体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイを示す。 図３１は、選択された変異体の細胞をベースとするＡＤＣＰアッセイを示す。 図３２は、選択されたＦｃ変異体が補体の結合および活性化を媒介する能力を示す。図３２ａは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のＣ１ｑへの結合を測定する AlphaScreen アッセイを示す。 図３２は、選択されたＦｃ変異体が補体の結合および活性化を媒介する能力を示す。図３２ｂは、選択されたリツキシマブＦｃ変異体がＣＤＣを媒介する能力を測定する細胞をベースとするアッセイを示す。 図３２は、選択されたＦｃ変異体が補体の結合および活性化を媒介する能力を示す。図３２ｃは、選択されたリツキシマブＦｃ変異体がＣＤＣを媒介する能力を測定する細胞をベースとするアッセイを示す。 図３３は、実施例９に記載の通りの、マカークザルにおける、Ｆｃ変異体によるＢ細胞枯渇の増強を示す。図３３ａは、マーカーＣＤ２０＋およびＣＤ４０＋を使用して測定した、抗−ＣＤ２０ＷＴおよびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅリツキシマブ抗体での処置中にカニクイザル（Macaca Fascicularis）のサル群に残っているＢ細胞の割合を示す。 図３３は、実施例９に記載の通りの、マカークザルにおける、Ｆｃ変異体によるＢ細胞枯渇の増強を示す。図３３ｂは、マーカーＣＤ３−／ＣＤ１６＋およびＣＤ３−／ＣＤ８＋を使用して測定した、処置中にサル群に残っているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の割合を示す。 図３３は、実施例９に記載の通りの、マカークザルにおける、Ｆｃ変異体によるＢ細胞枯渇の増強を示す。図３３ｃは、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅリツキシマブを用いる処置に対するＣＤ２０＋Ｂ細胞レベルの用量応答を示す。 図３４ａは、実施例１０に記載の通りの、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のマウスＦｃγＲＩＩＩへの結合を測定する AlphaScreen アッセイを示す。 図３４ｂは、実施例１０に記載の通りの、選択されたトラスツズマブＦｃ変異体のマウスＦｃγＲＩＩＩへの結合を測定する AlphaScreen アッセイを示す。 図３４ｃは、実施例１０に記載の通りの、選択されたトラスツズマブＦｃ変異体のマウスＦｃγＲＩＩＩへの結合を測定する AlphaScreen アッセイを示す。 図３５は、マウスＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用する、トラスツズマブの文脈における選択されたＦｃ変異体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイを示す。 図３６は、実施例１１に記載の通りの、２９３ＴおよびＣＨＯ細胞で発現された選択されたトラスツズマブＦｃ変異体によるヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を測定する AlphaScreen アッセイを示す。 図３７は、Ｆｃ変異体および操作された糖形態の相乗作用を示す。図３７ａは、２９３Ｔ、ＣＨＯおよびＬｅｃ−１３ＣＨＯ細胞で発現されたＷＴおよびＦｃ変異体（Ｖ２０９、Ｓ２３９／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ）トラスツズマブによるＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａの結合を示す AlphaScreenアッセイを提示する。 図３７は、Ｆｃ変異体および操作された糖形態の相乗作用を示す。図３７ｂは、２３９Ｔ、ＣＨＯおよびＬｅｃ−１３ＣＨＯで発現されたＷＴおよびＶ２０９トラスツズマブがＡＤＣＣを媒介する能力を示す、細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイを提示する。 図３８は、非グリコシル化アレムツズマブＦｃ変異体のヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を示す AlphaScreen アッセイを示す。 図３９は、グリコシル化（黒色の記号、実線）および脱グリコシル化（白色の記号、破線）状態の選択されたアレムツズマブＦｃ変異体によるヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａの結合を比較する AlphaScreen アッセイを示す。 図４０は、改善された抗ＣＤ２０抗体を示す配列を示す。リツキシマブの軽鎖の配列を、図４０ａに提示する。 図４０は、改善された抗ＣＤ２０抗体を示す配列を示す。リツキシマブの重鎖の配列を、図４０ｂに提示する。 図４０は、改善された抗ＣＤ２０抗体を示す配列を示す。図４０ｃは、改善された抗ＣＤ２０抗体重鎖の配列を示す。 構築され、実験的に試験されたＦｃ変異体のセットを示す。 構築され、実験的に試験されたＦｃ変異体のセットを示す。 構築され、実験的に試験されたＦｃ変異体のセットを示す。 構築され、実験的に試験されたＦｃ変異体のセットを示す。 構築され、実験的に試験されたＦｃ変異体のセットを示す。 構築され、実験的に試験されたＦｃ変異体のセットを示す。 構築され、実験的に試験されたＦｃ変異体のセットを示す。 構築され、実験的に試験されたＦｃ変異体のセットを示す。 構築され、実験的に試験されたＦｃ変異体のセットを示す。 構築され、実験的に試験されたＦｃ変異体のセットを示す。 構築され、実験的に試験されたＦｃ変異体のセットを示す。 構築され、実験的に試験されたＦｃ変異体のセットを示す。 構築され、実験的に試験されたＦｃ変異体のセットを示す。 構築され、実験的に試験されたＦｃ変異体のセットを示す。 構築され、実験的に試験されたＦｃ変異体のセットを示す。 構築され、実験的に試験されたＦｃ変異体のセットを示す。 構築され、実験的に試験されたＦｃ変異体のセットを示す。 構築され、実験的に試験されたＦｃ変異体のセットを示す。 構築され、実験的に試験されたＦｃ変異体のセットを示す。 図４２は、配列番号５を示す。
図１。抗体の構造および機能。示されているのは、ｐｄｂ受託コード１ＣＥ１(James et al., 1999, J Mol Biol 289:293-301）由来のヒト化Ｆａｂ構造、およびｐｄｂ受託コード１ＤＮ２（DeLano et al., 2000, Science 287:1279-1283）由来のヒトＩｇＧ１Ｆｃ構造を使用してモデル化された、完全長ヒトＩｇＧ１抗体のモデルである。ＦａｂとＦｃ領域を連結する可撓性ヒンジは示していない。ＩｇＧ１は、ヘテロ二量体のホモ二量体であり、２本の軽鎖および２本の重鎖からなる。抗体を構成するＩｇドメインを表示しており、それには軽鎖のＶLおよびＣL、重鎖のＶH、Ｃガンマ１（Ｃγ１）、Ｃガンマ２（Ｃγ２）およびＣガンマ３（Ｃγ３）が含まれる。Ｆｃ領域を表示している。関連タンパク質の結合部位を表示しており、それには可変領域の抗原結合部位、並びにＦｃ領域のＦｃγＲ類、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑおよびプロテインＡおよびＧの結合部位が含まれる。
図２。Ｆｃ／ＦｃγＲＩＩＩｂ複合体構造１ＩＩＳ。Ｆｃを灰色のリボン図として示し、ＦｃγＲＩＩＩｂを黒色のリボンとして示す。Ｎ２９７炭水化物を黒色の棒として示す。
図３ａ−３ｂ。ヒトＩｇＧ免疫グロブリンＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のアミノ酸配列のアラインメント。図３ａは、ＣＨ１（Ｃγ１）およびヒンジドメインの配列を提供し、図３ｂは、ＣＨ２（Ｃγ２）およびＣＨ３（Ｃγ３）ドメインの配列を提供する。位置をＩｇＧ１配列のＥＵインデックスに従い番号付け、ＩｇＧ１と他の免疫グロブリンＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４との差異を灰色で示す。数々の位置で多型が存在する（Kim et al., 2001, J. Mol. Evol. 54:1-9）ので、提示した配列と先行技術の配列との間にわずかな差異が存在し得る。可能性のあるＦｃ領域の始点を標識し、これは、本明細書でＥＵ位置２２６または２３０のいずれかと定義される。
図４。Ｆｃ／ＦｃγＲＩＩＩｂ複合体構造１ＩＩＳ上にマッピングした、本発明のＦｃ変異体にアミノ酸修飾を作成した残基。Ｆｃを灰色のリボン図として示し、ＦｃγＲＩＩＩｂを黒色のリボンとして示す。実験用ライブラリーの残基を黒色で示し、Ｎ２９７炭水化物を灰色で示す。
図５。２９３Ｔ細胞におけるアレムツズマブのＦｃ変異体および野生型（ＷＴ）タンパク質の発現。アレムツズマブ重鎖遺伝子（ＷＴまたは変異体）を含有するプラスミドを、アレムツズマブ軽鎖遺伝子を含有するプラスミドと共に形質移入した。形質移入５日後に培地を回収した。各形質移入サンプルについて、培地１０ｕｌをウエスタン分析用のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにのせた。ウエスタン用のプローブは、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Jackson Immuno-Research, catalog # 109-035-088）であった。ＷＴ：野生型アレムツズマブ；１−１０：アレムツズマブ変異体。ＨおよびＬは、各々抗体の重鎖および軽鎖を示す。
図６。プロテインＡクロマトグラフィーを使用するアレムツズマブの精製。ＷＴアレムツズマブタンパク質を、２９３Ｔ細胞で発現させ、形質移入５日後に培地を回収した。培地をＰＢＳで１：１に希釈し、プロテインＡ（Pierce, Catalog # 20334）で精製した。
Ｏ：精製前の最初のサンプル；ＦＴ：流出物（flow through）；Ｅ：抽出物；Ｃ：濃縮された最終サンプル。左の写真は、単純青色染色（Simple Blue-stained）したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、右は、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧを使用して標識したウエスタンブロットを示す。
図７。脱グリコシル化抗体の精製。アレムツズマブの野生型および変異体を２９３Ｔ細胞で発現させ、プロテインＡクロマトグラフィーで精製した。抗体をペプチド−Ｎ−グリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅＦ）と共に３７℃で２４時間インキュベートした。各抗体について、偽処理サンプル（−ＰＮＧａｓｅＦ）を平衡して行った。ＷＴ：野生型アレムツズマブ；＃１５、＃１６、＃１７、＃１８、＃２２：各々、アレムツズマブ変異体Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｒ／Ｖ２６２Ｅ／Ｖ２６４Ｒ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｅ、Ｆ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４ＲおよびＩ３３２Ｅ。偽処理サンプルよりも早く泳動するＰＮＧａｓｅＦ処理サンプルは、脱グリコシル化重鎖を表す。
図８。２９３Ｔ細胞から発現されたアレムツズマブは、その抗原に結合する。ＧＳＴに融合させた抗原のＣＤ５２ペプチドを、ＩＰＴＧ誘導下で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に発現させた。非誘導および誘導サンプルの両方をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで流し、ＰＶＤＦ膜に移した。ウエスタン分析のために、Sotec (α-CD52, Sotec）のアレムツズマブ（最終濃度２.５ｎｇ／ｕｌ）または形質移入２９３Ｔ細胞の培地（Campath, Xencor）（最終アレムツズマブ濃度約０.１−０.２ｎｇ／ｕｌ）のいずれかを一次抗体として使用し、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧを二次抗体として使用した。Ｍ：予め染色されたマーカー；Ｕ：ＧＳＴ−ＣＤ５２の非誘導サンプル；Ｉ：ＧＳＴ−ＣＤ５２の誘導サンプル。
図９。ヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域の発現と精製。タグを付けたＦｃγＲＩＩＩａを、２９３Ｔ細胞に形質移入し、分泌されたＦｃγＲＩＩＩａを含有する培地を３日後に回収し、親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。１：培地；２：流出物；３：洗浄液；４−８：連続抽出物。単純青色染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびウエスタンの結果を示す。ウエスタンブロットのために、膜を抗ＧＳＴ抗体でプローブした。
図１０。実施例２に記載の AlphaScreen(商標)アッセイにより測定した、実験用ライブラリーから選択されたアレムツズマブＦｃ変異体によるヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合。競合抗体（Ｆｃ変異体またはＷＴアレムツズマブ）の存在下で、発光シグナルの減少として、特徴的な阻害曲線が観察された。リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）単独を負の対照として使用した。結合データは、各々の特定の曲線について、低および高抗体濃度でのベースラインにより各々もたらされる最大および最小発光シグナルに対して標準化した。曲線は、非線形回帰を使用して、一部位競合モデルへのデータのフィット（fit）を表す。これらのフィットは、各抗体のＩＣ５０を提供する。これをＷＴおよびＳ２３９Ｄについて破線で例示説明する。
図１１ａおよび１１ｂ。選択されたアレムツズマブ（図１１ａ）およびトラスツズマブ（図１１ｂ）Ｆｃ変異体のヒトＶａｌ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を示す AlphaScreenアッセイ。各特定の抗体について、結合データを上下のベースラインに対して標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。ＰＢＳを負の対照として使用した。
図１２。選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のヒトＦｃγＲＩＩｂへの結合を示す AlphaScreenアッセイ。各特定の抗体について、結合データを上下のベースラインに対して標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。ＰＢＳを負の対照として使用した。
図１３。選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のヒトＲ１３１ ＦｃγＲＩＩａへの結合を示す AlphaScreenアッセイ。各特定の抗体について、結合データを上下のベースラインに対して標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。
図１４。実施例２に記載の通りの、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のヒトＦｃＲｎへの結合を示すAlphaScreenアッセイ。各特定の抗体について、結合データを上下のベースラインに対して標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。ＰＢＳを負の対照として使用した。
図１５。実施例２に記載の通りの、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体の細菌のプロテインＡへの結合を示す、AlphaScreenアッセイ。各特定の抗体について、結合データを上下のベースラインに対して標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。ＰＢＳを負の対照として使用した。
図１６ａ−１６ｂ。選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ（図１６ａ）およびヒトＦｃγＲＩＩｂ（図１６ｂ）への結合を比較する AlphaScreenアッセイ。各特定の抗体について、結合データを上下のベースラインに対して標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。ＰＢＳを負の対照として使用した。
図１７ａ−１７ｂ。トラスツズマブの文脈で、選択されたＦｃ変異体によるヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａ（図１７ａおよび１７ｂ）およびヒトＦｃγＲＩＩｂ（図１７ｃ）への結合を測定する AlphaScreen アッセイ。各特定の抗体について、結合データを上下のベースラインに対して標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。ＰＢＳを負の対照として使用した。
図１８。リツキシマブの文脈で、選択されたＦｃ変異体によるヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を測定する AlphaScreen アッセイ。各特定の抗体について、結合データを上下のベースラインに対して標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。ＰＢＳを負の対照として使用した。
図１９。セツキシマブの文脈で、選択されたＦｃ変異体によるヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を測定する AlphaScreen アッセイ。各特定の抗体について、結合データを上下のベースラインに対して標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。ＰＢＳを負の対照として使用した。
図２０ａ−２０ｂ。選択されたアレムツズマブＦｃ変異体の、ヒトＦｃγＲＩＩＩａのＶ１５８（図２０ａ）およびＦ１５８（図２０ｂ）アロタイプへの結合を示す AlphaScreen アッセイ。各特定の抗体について、結合データを上下のベースラインに対して標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。ＰＢＳを負の対照として使用した。
図２１ａ−２１ｄ。図２１ａおよび２１ｂは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ（図２１ａ）およびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ（図２１ｂ）への結合から、ＳＰＲのＫｄと AlphaScreen のＩＣ５０との間の相関を示す。図２１ｃおよび２１ｄは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ（図２１ｃ）およびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ（図２１ｄ）への結合について、ＷＴに対するＳＰＲおよび AlphaScreen の改善倍率間の相関を示す。結合のデータを表３に提示する。データの間の線は、データの線形フィットを表し、ｒ2値は、これらのフィットの有意さを示す。
図２２ａ−２２ｂ。選択されたアレムツズマブＦｃ変異体の、ヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を示す AlphaScreen アッセイ。各特定の抗体について、結合データを上下のベースラインに対して標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。ＰＢＳを負の対照として使用した。
図２３ａ−２３ｂ。アレムツズマブの文脈で、選択されたＦｃ変異体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイ。DELFIA(登録商標) EuTDA ベースの細胞傷害作用アッセイ（Perkin Elmer, MA）を使用して、実施例３に記載の通り、ＤｏＨＨ−２リンパ腫標的細胞および５０倍過剰のヒトＰＢＭＣを使用して、ＡＤＣＣを測定した。図２３ａは、１０ｎｇ／ｍｌの明記したアレムツズマブ抗体について未加工の蛍光データを示す棒グラフである。ＰＢＭＣの棒は、抗体の非存在下における細胞傷害作用の基底レベルを示す。図２３ｂは、明記したアレムツズマブ抗体について、抗体濃度に対するＡＤＣＣの用量依存を示し、各特定の曲線について、各々低および高抗体濃度でのベースラインによりもたらされる最小および最大蛍光シグナルに対して標準化したものである。曲線は、非線形回帰を使用して、Ｓ字用量反応モデルへのデータのフィットを表す。
図２４ａ−２４ｃ。トラスツズマブの文脈で、選択されたＦｃ変異体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイ。DELFIA(登録商標) EuTDA ベースの細胞傷害作用アッセイを使用して、実施例３に記載の通り、ＢＴ４７４およびＳｋ−Ｂｒ−３乳癌標的細胞および５０倍過剰のヒトＰＢＭＣを使用して、ＡＤＣＣを測定した。図２４ａは、１ｎｇ／ｍｌの明記したトラスツズマブ抗体について未加工の蛍光データを示す棒グラフである。ＰＢＭＣの棒は、抗体の非存在下における細胞傷害作用の基底レベルを示す。図２４ｂおよび２４ｃは、明記したトラスツズマブ抗体について、抗体濃度に対するＡＤＣＣの用量依存を示し、各特定の曲線について、各々低および高抗体濃度でのベースラインによりもたらされる最小および最大蛍光シグナルに対して標準化したものである。曲線は、非線形回帰を使用して、Ｓ字用量応答モデルへのデータのフィットを表す。
図２５ａ−２５ｃ。リツキシマブの文脈で、選択されたＦｃ変異体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイ。DELFIA(登録商標) EuTDA ベースの細胞傷害作用アッセイを使用して、実施例３に記載の通り、ＷＩＬ２−Ｓリンパ腫標的細胞および５０倍過剰のヒトＰＢＭＣを使用して、ＡＤＣＣを測定した。図２５ａは、１ｎｇ／ｍｌの明記したリツキシマブ抗体について未加工の蛍光データを示す棒グラフである。ＰＢＭＣの棒は、抗体の非存在下における細胞傷害作用の基底レベルを示す。図２５ｂおよび２５ｃは、明記したリツキシマブ抗体について、抗体濃度に対するＡＤＣＣの用量依存を示し、各特定の曲線について、各々低および高抗体濃度でのベースラインによりもたらされる最小および最大蛍光シグナルに対して標準化したものである。曲線は、非線形回帰を使用して、Ｓ字用量応答モデルへのデータのフィットを表す。
図２６ａ−２６ｂ。強度および効力の増強を示す選択されたトラスツズマブ（図２６ａ）およびリツキシマブ（図２６ｂ）Ｆｃ変異体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイ。両アッセイとも、ホモ接合性Ｆ１５８／Ｆ１５８ＦｃγＲＩＩＩａのＰＢＭＣをエフェクター細胞として、トラスツズマブアッセイにはＳｋ−Ｂｒ−３でありリツキシマブアッセイにはＷＩＬ２−Ｓである標的細胞の２５倍過剰で使用した。実施例３に記載の通り、ＰＢＭＣ単独（抗体なし）の存在下の標的細胞の蛍光シグナルにより提供されるそのアッセイの絶対的最小溶解、および、ＴｒｉｔｏｎＸ１０００の存在下の標的細胞の蛍光シグナルにより提供されるそのアッセイの絶対的最大溶解に従い、データを標準化した。
図２７。選択されたアレムツズマブＦｃ変異体の、ヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を示す AlphaScreen アッセイ。各特定の抗体について、結合データを上下のベースラインに対して標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。ＰＢＳを負の対照として使用した。
図２８。ＡＤＣＣ。ＷＴトラスツズマブと比較した、選択されたＦｃ変異体トラスツズマブ抗体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイ。精製ヒト末梢血単球（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として使用し、Ｓｋ−Ｂｒ−３乳癌細胞を標的細胞として使用した。Cytotoxicity Detection Kit (LDH, Roche Diagnostic Corporation, Indianapolis, IN）を使用してＬＤＨ活性を測定することにより、溶解をモニターした。サンプルをトリプリケート（triplicate）で実施し、誤差評価を提供した（ｎ＝３、＋／−Ｓ.Ｄ.）。図は、様々な抗体濃度でのＡＤＣＣの用量依存を示し、本アッセイの溶解の最低および最高レベルに対して標準化したものである。曲線は、非線形回帰を使用して、Ｓ字用量応答モデルへのデータのフィットを表す。
図２９ａ−２９ｂ。様々なレベルのＨｅｒ２／ｎｅｕ標的抗原を発現する異なる細胞株に対する選択されたトラスツズマブＦｃ変異体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイ。実施例５に記載の通り、Ｓｋ−Ｂｒ−３（１ｘ１０6コピー）、ＳｋＯＶ３（〜１ｘ１０5）、ＯＶＣＡＲ３（〜１ｘ１０4）およびＭＣＦ−７（〜３ｘ１０3コピー）を含む、低レベルに増幅されたＨｅｒ２／ｎｅｕ受容体を発現する様々な細胞株でＡＤＣＣアッセイを行った。図２９ａは、各細胞株について、Ｈｅｒ２発現レベルを示すウエスタンブロットを提供する；同等の量の細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに載せ、トラスツズマブを使用してＨｅｒ２を検出した。ホモ接合性Ｆ１５８／Ｆ１５８ＦｃγＲＩＩＩにアロタイプ分類されるヒトＰＢＭＣを、標的細胞に対して２５倍過剰で使用した。図２９ｂの棒グラフは、明示した細胞株に対するＷＴおよびＦｃ変異体のＡＤＣＣデータを提供し、これは、最小溶解（ＰＢＭＣ単独）および最大溶解（ＴｒｉｔｏｎＸ１０００）によりもたらされる最小および最大蛍光シグナルに対して標準化したものである。
図３０。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をエフェクター細胞として使用し、細胞溶解をモニターするのにＬＤＨ放出を測定する、トラスツズマブの文脈における選択されたＦｃ変異体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイ。ヘテロ接合性Ｆ１５８／Ｆ１５８ＦｃγＲＩＩＩａにアロタイプ分類されるＮＫ細胞は、Ｓｋ−Ｂｒ−３乳癌標的細胞に対して４倍過剰であり、細胞傷害性のレベルを、LDH Cytotoxicity Detection Kit を製造業者のプロトコールに従って使用して測定した（Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany）。グラフは、明示したトラスツズマブ抗体についての抗体濃度に対するＡＤＣＣの用量依存を示し、これは、各特定の曲線について、低および高抗体濃度でのベースラインにより各々もたらされる最小および最大蛍光シグナルに対して標準化したものである。曲線は、非線形回帰を使用して、Ｓ字用量応答モデルへのデータのフィットを表す。
図３１。選択された変異体の細胞をベースとするＡＤＣＰアッセイ。実施例７に記載の通りに、流動細胞計測法と組み合わせた共標識戦略を使用して、ＡＤＣＰアッセイを実行した。分化したマクロファージをエフェクター細胞として使用し、Ｓｋ−Ｂｒ−３細胞を標的細胞として使用した。ファゴサイトーシスのパーセントは、集団中のＳｋ−Ｂｒ−３の総数（ファゴサイトーシスされたもの＋ファゴサイトーシスされなかったもの）に対する、共標識された細胞の数（マクロファージ＋Ｓｋ−Ｂｒ−３）を表す。
図３２ａ−３２ｃ。選択されたＦｃ変異体が補体の結合および活性化を媒介する能力。図３２ａは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のＣ１ｑへの結合を測定する AlphaScreen アッセイを示す。結合データは、各特定の抗体について上下のベースラインに対して標準化し、曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。図３２ｂおよび３１ｃは、選択されたリツキシマブＦｃ変異体がＣＤＣを媒介する能力を測定する細胞をベースとするアッセイを示す。ＣＤＣアッセイは、Ｆｃ変異体およびＷＴリツキシマブによりオプソニン化されたＷＩＬ２−Ｓリンパ腫細胞のヒト血清補体による溶解をモニターするのに、Amar Blue を使用して実施した（Quidel, San Diego, CA）。明記したリツキシマブ抗体について、抗体濃度に対する補体媒介溶解の用量依存が示され、これは、各特定の曲線について、低および高抗体濃度でのベースラインにより各々もたらされる最小および最大蛍光シグナルに対して標準化したものである。曲線は、非線形回帰を使用して、Ｓ字用量反応モデルへのデータのフィットを表す。
図３３ａ−３３ｃ。実施例９に記載の通りの、マカークザルにおける、Ｆｃ変異体によるＢ細胞枯渇の増強。図３３ａは、マーカーＣＤ２０＋およびＣＤ４０＋を使用して測定した、抗−ＣＤ２０ＷＴおよびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅリツキシマブ抗体での処置中にカニクイザル（Macaca Fascicularis）のサル群に残っているＢ細胞の割合を示す。図３３ｂは、マーカーＣＤ３−／ＣＤ１６＋およびＣＤ３−／ＣＤ８＋を使用して測定した、処置中にサル群に残っているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の割合を示す。図３３ｃは、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅリツキシマブを用いる処置に対するＣＤ２０＋Ｂ細胞レベルの用量応答を示す。データは、サル３匹／サンプルの平均として提示する。
図３４ａおよび３４ｂ。実施例１０に記載の通りの、選択されたアレムツズマブ（図３４ａ）およびトラスツズマブ（図３４ｂ）Ｆｃ変異体のマウスＦｃγＲＩＩＩへの結合を測定する AlphaScreen アッセイ。各特定の抗体について、結合データを上下のベースラインに対して標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。ＰＢＳを負の対照として使用した。
図３５。マウスＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用する、トラスツズマブの文脈における選択されたＦｃ変異体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイ。ＤＥＬＦＩＡ(登録商標)ＥｕＴＤＡをベースとする細胞傷害性アッセイを使用し、Ｓｋ−Ｂｒ−３乳癌標的細胞および８倍過剰のマウスＰＢＭＣを使用して、ＡＤＣＣを測定した。棒グラフは、明示されたトラスツズマブ抗体について、１０ｎｇ／ｍｌでの未加工の蛍光データを示す。ＰＢＭＣの棒は、抗体の非存在下の細胞傷害性の基底レベルを示し、ＴＸは、ＴｒｉｔｏｎＸ１０００存在下での完全な細胞の溶解を示す。
図３６。実施例１１に記載の通りの、２９３ＴおよびＣＨＯ細胞で発現された選択されたトラスツズマブＦｃ変異体によるヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を測定する AlphaScreen アッセイ。各特定の抗体について、結合データを上下のベースラインに対して標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。ＰＢＳを負の対照として使用した。
図３７ａ−３７ｂ。Ｆｃ変異体および操作された糖形態の相乗作用。図３７ａは、２９３Ｔ、ＣＨＯおよびＬｅｃ−１３ＣＨＯ細胞で発現されたＷＴおよびＦｃ変異体（Ｖ２０９、Ｓ２３９／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ）トラスツズマブによるＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａの結合を示す AlphaScreenアッセイを提示する。各抗体について、データを上下のベースラインに対して標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。ＰＢＳを負の対照として使用した。図３７ｂは、２３９Ｔ、ＣＨＯおよびＬｅｃ−１３ＣＨＯで発現されたＷＴおよびＶ２０９トラスツズマブがＡＤＣＣを媒介する能力を示す、細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイを提示する。以前に記載した通りのＤＥＬＦＩＡ(登録商標)ＥｕＴＤＡをベースとする細胞傷害性アッセイを使用し、Ｓｋ−Ｂｒ−３乳癌標的細胞を用いて、ＡＤＣＣを測定した。データは、明示されたトラスツズマブ抗体について、抗体濃度に対するＡＤＣＣの用量依存を示し、これは、各特定の曲線について、低および高抗体濃度でのベースラインにより各々もたらされる最小および最大蛍光シグナルに対して標準化したものである。曲線は、非線形回帰を使用して、Ｓ字用量反応モデルへのデータのフィットを表す。
図３８。非グリコシル化アレムツズマブＦｃ変異体のヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を示す AlphaScreen アッセイ。各特定の抗体について、結合データを上下のベースラインに対して標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。ＰＢＳを負の対照として使用した。
図３９。グリコシル化（黒色の記号、実線）および脱グリコシル化（白色の記号、破線）状態の選択されたアレムツズマブＦｃ変異体によるヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａの結合を比較する AlphaScreen アッセイ。各特定の抗体について、結合データを上下のベースラインに対して標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。
図４０ａ−４０ｃ。改善された抗ＣＤ２０抗体を示す配列。リツキシマブの軽鎖および重鎖の配列を、図４０ａおよび図４０ｂに各々提示する。これらは、ＵＳ５,７３６,１３７の翻訳された配列３から採用した。図４０ｂ中のＳ２３９、Ｖ２４０、Ｖ２６４Ｉ、Ｈ２６８、Ｅ２７２、Ｋ２７４、Ｎ２９７、Ｓ２９８、Ｋ３２６、Ａ３３０およびＩ３３２を含む関連位置を太字にしてある。図４０ｃは、改善された抗ＣＤ２０抗体重鎖の配列を示し、可変位置を、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｚ1およびＺ2として太字で示してある。配列の下の表は、これらの位置について可能な置換を提供する。改善された抗ＣＤ２０抗体の配列は、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8およびＸ9について可能な置換の群から選択される少なくとも１つの非ＷＴアミノ酸を含む。これらの改善された抗ＣＤ２０抗体の配列はまた、置換Ｚ1および／またはＺ2を含んでもよい。これらの位置は、Kabat にある通りのＥＵインデックスに従って番号付けしてあり、従って配列の連続的順序に対応しない。
図４１は、構築され、実験的に試験されたＦｃ変異体のセットを示す。
図４２は、配列番号：５を示す；特定のＸａａ残基は、表１０に示す通りである。
発明の詳細な説明
本発明がより詳細に理解されるように、数個の定義を以下に記載する。かかる定義は、文法的に均等なものを包含することを意図している。
「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用」は、本明細書で使用されるとき、ＦｃγＲ類を発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上に結合した抗体を認識し、続いてその標的細胞の溶解を引き起こす、細胞介在性反応を意味する。
「ＡＤＣＰ」または抗体依存性細胞介在性ファゴサイトーシスは、本明細書で使用されるとき、ＦｃγＲ類を発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上に結合した抗体を認識し、続いてその標的細胞のファゴサイトーシスを引き起こす、細胞介在性反応を意味する。
「アミノ酸修飾」は、本明細書で、ポリペプチド配列中のアミノ酸の置換、挿入および／または欠失を意味する。本発明で好ましいアミノ酸修飾は、置換である。「アミノ酸置換」または「置換」は、本明細書で、親ポリペプチド配列中の特定の位置での、他のアミノ酸によるアミノ酸の置き換えを意味する。例えば、置換Ｉ３３２Ｅは、位置３３２のイソロイシンが、グルタミン酸で置き換えられている変異体ポリペプチド、この場合Ｆｃ変異体、を表す。いくつかの実施態様では、ＷＴ同一性を決定する必要はない。例えば、置換３３２Ｅは、位置３３２がグルタミン酸に突然変異されている変異体ポリペプチドを表す。
「抗体」は、本明細書で、認められている免疫グロブリン遺伝子の全部または一部により実質的にコードされる１個またはそれ以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。認められている免疫グロブリン遺伝子には、例えば、ヒトでは、カッパ（κ）、ラムダ（λ）および重鎖の遺伝子座が含まれ、それは、無数の可変領域の遺伝子、並びに各々ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＡのアイソタイプをコードする定常領域の遺伝子ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、シグマ（σ）およびアルファ（α）を一緒に含む。本明細書における抗体は、完全長抗体および抗体フラグメントを含むことを意図しており、任意の生物に由来する天然抗体、操作された抗体、または、実験、治療もしくは下記でさらに定義されるような他の目的のために組換え的に生成された抗体に言及し得る。用語「抗体」には、当分野で知られている通り、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖまたは抗体の他の抗原結合配列などの抗体フラグメントが含まれ、それらは、完全な抗体の修飾により産生されるか、または、組換えＤＮＡ技法を使用して新しく合成されるものである。特に好ましいのは、本明細書に記載の通りのＦｃ変異体を含む全長抗体である。用語「抗体」には、モノクローナルおよびポリクローナル抗体が含まれる。抗体は、アンタゴニスト、アゴニスト、中和性、阻害性または刺激性であり得る。下記で詳述する通り、本発明の抗体は、非ヒト、キメラ、ヒト化または完全にヒトであり得る。
「抗体」の定義内に特に含まれるものは、非グリコシル化（aglycosylated）抗体である。「非グリコシル化抗体」は、本明細書で使用されるとき、Ｆｃ領域の位置２９７で結合する炭水化物を欠く抗体を意味する（番号付けは、Kabat にある通りのＥＵシステムによる）。非グリコシル化抗体は、Ｆｃの炭水化物が例えばキメラ的または酵素的に除去された抗体である脱グリコシル化（deglycosylated）抗体であり得る。あるいは、非グリコシル化抗体は、例えば、グリコシレーションパターンをコードする１個または複数の残基の変異により、または、例えば細菌などのタンパク質に炭水化物を結合させない生物での発現により、Ｆｃの炭水化物なしで発現された抗体である、無グリコシル化（nonglycosylated）または未グリコシル化（unglycosylated）抗体であり得る。
「抗体」の定義内に特に含まれるものは、Ｆｃ変異体部分を含有する完全長抗体である。「完全長抗体」は、本明細書では、可変および定常領域を含む抗体の天然の生物学的な形態を構築する構造を意味する。例えば、ヒトやマウスを含む殆どの哺乳動物では、ＩｇＧクラスの完全長抗体は四量体であり、２本の免疫グロブリン鎖の２個の同一の対からなり、各対は、１本の軽鎖および１本の重鎖を有し、各軽鎖は、免疫グロブリンドメインＶLおよびＣLを含み、各重鎖は、免疫グロブリンドメインＶH、Ｃγ１（ＣH１）、Ｃγ２（ＣH２）およびＣγ３（ＣH３）を含む。いくつかの哺乳動物では、例えばラクダやラマなどでは、ＩｇＧ抗体は、２本の重鎖のみからなることもあり、各重鎖は、Ｆｃ領域に結合した可変ドメインを含む。「ＩｇＧ」は、本明細書で使用されるとき、認められている免疫グロブリンガンマ遺伝子により実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。ヒトでは、このクラスには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４が含まれる。マウスでは、このクラスにはＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３が含まれる。
「アミノ酸」および「アミノ酸同一物」（amno acid identity）は、本明細書で使用されるとき、２０個の天然産生アミノ酸または特定の定義された位置に存在し得る任意の非天然類似体の１つを意味する。「タンパク質」は、本明細書では、少なくとも２個の共有結合したアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドが含まれる。タンパク質は、天然産生アミノ酸およびペプチド結合、または合成偽ペプチド（peptidomimetic）構造、即ちペプトイドなどの「類似体」（Simon et al., Proc Natl Acad Sci USA 89(20）:9367 参照、出典明示により本明細書の一部とする）からなり得る（特にＬＣペプチドを患者に投与しようとする場合）。従って、「アミノ酸」または「ペプチド残基」は、本明細書で使用されるとき、天然産生および合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは、本発明のためにアミノ酸とみなされる。「アミノ酸」にはまた、プロリンやヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基も含まれる。側鎖は、（Ｒ）または（Ｓ）配置のどちらでもよい。好ましい実施態様では、アミノ酸は、（Ｓ）またはＬ−配置である。非天然産生側鎖を使用する場合、例えばインビボでの分解を防止するかまたは遅延させるために、アミノ酸ではない置換基を使用してもよい。
「エフェクター機能」は、本明細書で使用されるとき、抗体のＦｃ領域とＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用に起因する生化学的事象を意味する。エフェクター機能には、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣが含まれるがこれらに限定されない。「エフェクター細胞」は、本明細書で使用されるとき、１またはそれ以上のＦｃ受容体を発現し、１またはそれ以上のエフェクター機能を媒介する免疫系の細胞を意味する。エフェクター細胞には、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびγγＴ細胞が含まれるがこれらに限定されず、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルが含まれるがこれらに限定されない、いかなる生物に由来してもよい。「ライブラリー」は、本明細書では、核酸またはアミノ酸配列のリスト、可変位置での核酸またはアミノ酸置換のリスト、ライブラリー配列をコードする核酸を含む物理的ライブラリー、または精製もしくは非精製形態のＦｃ変異体タンパク質を含む物理的ライブラリーを含むが、これらに限定されない、任意の形態のＦｃ変異体のセットを意味する。
「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」は、本明細書で使用されるとき、最初の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味する。従って、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧの最後の２個の定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３個の定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにこれらのドメインのＮ末端の可撓性ヒンジを表す。ＩｇＡおよびＩｇＭについて、Ｆｃは、Ｊ鎖を含み得る。ＩｇＧについて、図１に例示説明する通り、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣガンマ２およびＣガンマ３（Ｃγ２およびＣγ３）、並びにＣガンマ１（Ｃγ１）とＣガンマ２（Ｃγ２）との間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、残基Ｃ２２６またはＰ２３０からカルボキシル末端までを含むと定義される（番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスに従う）。Ｆｃは、単離されたこの領域、または、抗体、抗体フラグメントもしくはＦｃ融合体の文脈におけるこの領域を表し得る。Ｆｃは、後述する通り、単独のこの領域、または、Ｆｃポリペプチドの文脈におけるこの領域を表し得る。本明細書で使用するとき、「Ｆｃポリペプチド」は、Ｆｃ領域の全部または一部を含むポリペプチドを意味する。Ｆｃポリペプチドには、抗体、Ｆｃ融合体、単離ＦｃおよびＦｃフラグメントが含まれる。
「Ｆｃ融合体」は、本明細書で使用されるとき、１またはそれ以上のポリペプチドまたは低分子がＦｃに機能し得るように連結されているタンパク質を意味する。Ｆｃ融合体は、本明細書では、先行技術において使用される通り（Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200、出典明示により本明細書の一部とする）、用語「イムノアドヘシン（immunoadhesin）」、「Ｉｇ融合体」、「Ｉｇキメラ」および「受容体グロブリン」（ダッシュを伴う場合もある）と同義を意味する。Ｆｃ融合体は、免疫グロブリンのＦｃ領域を、融合パートナーと組み合わせる。融合パートナーは、一般に、いかなるタンパク質または低分子でもあり得る。Ｆｃ融合体の非Ｆｃ部分、即ち、融合パートナーの役割は、標的結合を調整することであり得、従って、それは抗体の可変領域に機能的に類似している。
「Ｆｃガンマ受容体」または「ＦｃγＲ」は、本明細書で使用されるとき、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合し、実質的にＦｃγＲ遺伝子にコードされるタンパク質のファミリーのいかなるメンバーをも意味する。ヒトでは、このファミリーには、アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂおよびＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）およびＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；およびアイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８およびＦ１５８を含む）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、並びにいかなる未発見のヒトＦｃγＲ類またはＦｃγＲアイソフォームまたはアロタイプも含まれるが、これらに限定されるものではない。ＦｃγＲは、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルを含むが、これらに限定されるものではない、いかなる生物由来でもよい。マウスＦｃγＲ類には、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）およびＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）、並びにいかなる未発見のマウスＦｃγＲ類またはＦｃγＲアイソフォームまたはアロタイプも含まれるが、これらに限定されない。
「Ｆｃリガンド」または「エフェクターリガンド」は、本明細書で使用されるとき、抗体のＦｃ領域に結合してＦｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する、任意の生物に由来する分子、好ましくはポリペプチドを意味する。ＦｃリガンドのＦｃへの結合は、好ましくは、１つまたはそれ以上のエフェクター機能を誘起する。Ｆｃリガンドには、Ｆｃ受容体、ＦｃγＲ、ＦｃαＲ、ＦｃεＲ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、スタフィロコッカスのプロテインＡ、スタフィロコッカスのタンパク質ＧおよびウイルスのＦｃγＲが含まれるが、これらに限定されない。Ｆｃリガンドには、ＦｃγＲに相同なＦｃ受容体のファミリーであるＦｃ受容体相同体（ＦｃＲＨ）（Davis et al., 2002, Immunological Reviews 190:123-136、出典明示により本明細書の一部とする）も含まれる。Ｆｃリガンドには、Ｆｃに結合する未発見の分子も含まれ得る。
「ＩｇＧ」は、本明細書で使用されるとき、認められている免疫グロブリンガンマ遺伝子により実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。ヒトでは、このクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む。マウスでは、このクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３を含む。「免疫グロブリン（Ｉｇ）」は、本明細書では、免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされる１またはそれ以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。免疫グロブリンには、抗体が含まれるがこれに限定されない。免疫グロブリンは、完全長抗体、抗体フラグメントおよび個々の免疫グロブリンドメインを含むがこれらに限定されるものではない、数々の構造的形態を有し得る。「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」は、本明細書では、タンパク質構造の当業者に確認されるように、別個の構造体として存在する免疫グロブリンの領域を意味する。Ｉｇドメインは、典型的に、特徴的なβ−サンドイッチ折り畳みトポロジーを有する。抗体のＩｇＧクラスにおける既知のＩｇドメインは、ＶH、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、ＶLおよびＣLである。
「親ポリペプチド」または「前駆体ポリペプチド」（Ｆｃの親または前駆体を含む）は、本明細書で使用されるとき、後に修飾されて変異体を生成するポリペプチドを意味する。当該親ポリペプチドは、天然産生ポリペプチド、または天然産生ポリペプチドの変異体もしくは操作された変形物であり得る。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を表し得る。従って、「親Ｆｃポリペプチド」は、本明細書で使用されるとき、修飾されて変異体を生成するＦｃポリペプチドを意味し、「親抗体」は、本明細書で使用されるとき、修飾されて変異体抗体を生成する抗体を意味する。
上記概説の通り、Ｆｃ分子のある種の位置を変更できる。「位置」は、本明細書で使用されるとき、タンパク質配列中の場所を意味する。位置は、連続的に、または、例えばKabat にある通りのＥＵインデックスなどの確立された様式に従って、番号付けし得る。例えば、位置２９７は、ヒト抗体ＩｇＧ１中のある位置である。対応する位置は、上記概説の通りに、一般に他の親配列とのアラインメントを通して決定される。
「残基」は、本明細書で使用されるとき、タンパク質中の位置およびそこに伴うアミノ酸同一物を意味する。例えば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７とも呼ばれ、Ｎ２９７とも呼ばれる）は、ヒト抗体ＩｇＧ１中の残基である。
「標的抗原」は、本明細書で使用されるとき、所定の抗体の可変領域により特異的に結合される分子を意味する。標的抗原は、タンパク質、炭水化物、脂質または他の化学的化合物であり得る。
「標的細胞」は、本明細書で使用されるとき、標的抗原を発現する細胞を意味する。
「可変領域」は、本明細書で使用されるとき、各々カッパ、ラムダおよび重鎖免疫グロブリン遺伝子座をなすＶκ、Ｖλおよび／またはＶH遺伝子により実質的にコードされる１またはそれ以上のＩｇドメインを含む免疫グロブリンの領域を意味する。
「変異体ポリペプチド」は、本明細書で使用されるとき、少なくとも１つのアミノ酸修飾のために親ポリペプチド配列と異なるポリペプチド配列を意味する。親ポリペプチドは、天然産生もしくは野生型（ＷＴ）ポリペプチドであってもよく、または、ＷＴポリペプチドの修飾版であってもよい。変異体ポリペプチドは、ポリペプチド自体、ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を表し得る。好ましくは、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を、例えば、親ポリペプチドと比較して約１ないし約１０個のアミノ酸修飾を、好ましくは約１個ないし約５個のアミノ酸修飾を有する。変異体ポリペプチド配列は、本明細書では、親ポリペプチド配列と、好ましくは少なくとも約８０％の相同性を、最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性を、より好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有する。従って、「Ｆｃ変異体」は、本明細書で使用されるとき、少なくとも１つのアミノ酸修飾のために親Ｆｃ配列と異なるＦｃ配列を意味する。Ｆｃ変異体は、１個のＦｃ領域を包含するだけでもよく、または抗体、Ｆｃ融合体、単離Ｆｃ、Ｆｃフラグメントまたは実質的にＦｃにコードされる他のポリペプチドに関して存在してもよい。Ｆｃ変異体は、Ｆｃポリペプチド自体、Ｆｃ変異体ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を表し得る。
本発明のＦｃ変異体は、それらを構成するアミノ酸修飾に従って定義される。従って、例えば、Ｉ３３２Ｅは、親Ｆｃポリペプチドと比べて置換Ｉ３３２Ｅを有するＦｃ変異体である。同様に、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ（２３９Ｄ／３３０Ｌ／３３２Ｅとも呼ばれる）は、親Ｆｃポリペプチドと比べて置換Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０ＬおよびＩ３３２Ｅ（２３９Ｄ、３３０Ｌおよび３３２Ｅ）を有するＦｃ変異体を定義する。置換が提供される順番は任意である、即ち、例えばＳ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅは、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌと同じＦｃ変異体である、などということが留意される。本発明で議論される全位置について、番号付けは、ＥＵインデックスまたはＥＵ番号付けスキーム（Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, 出典明示により本明細書の一部とする）に従う。ＥＵインデックスまたは Kabat にある通りのＥＵインデックスは、このＥＵ抗体の番号付けを表す（Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85、出典明示により本明細書の一部とする）。
本発明は、様々な文脈で有用な最適化Ｆｃ変異体を対象とする。上記で概説した通り、現行の抗体治療は、様々な問題を抱えている。本発明は、抗体の抗腫瘍強度を増強する有望な手段を提供し、それは、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣなどの細胞傷害性エフェクター機能を媒介するそれらの能力の増強を介するものである。本発明は、ある種のＦｃγＲへの結合を最適化されたＦｃ領域を有する抗体は、より良好にエフェクター機能を媒介し得、それにより患者に置いて癌細胞をより効果的に破壊し得ることを示す。活性化受容体と阻害性受容体との間の均衡は、重要な検討事項であり、最適なエフェクター機能は、活性化受容体、例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ／ｃおよびＦｃγＲＩＩＩａへの親和性が増強され、一方阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂへの親和性が低減されたＦｃに起因し得る。さらに、ＦｃγＲ類は、抗原提示細胞による抗原の取込みおよびプロセッシングを媒介できるので、増強されたＦｃ／ＦｃγＲ親和性は、獲得免疫応答を誘起する抗体治療剤の能力も改善し得る。例えば、本願で開示されるＳ２９８Ａ、Ｅ３３３ＡおよびＫ３３４Ａを含むいくつかの突然変異は、活性化受容体ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増強および阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂへの結合の低減を示す。これらの突然変異を組み合わせて、相加的な結合の改善を示す二重および三重突然変異の変異体を得てもよい。特別な変異体は、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ三重突然変異であり、Ｆ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合において約１.７倍の増加、ＦｃγＲＩＩｂへの結合において５倍の減少、そしてＡＤＣＣにおいて２.１倍の増強を伴った。
より大きいエフェクター機能への要望があるが、いくつかの抗体治療剤のためには、低減または除去されたエフェクター機能が求められることがある。これは、その作用メカニズムが遮断または拮抗作用を含むが標的抗原を有する細胞の殺傷を含まない治療用抗体の場合に、よくあることである。これらの場合、標的細胞の枯渇は望ましくなく、副作用と見なすことができる。例えば、Ｔ細胞上のＣＤ４受容体を遮断する抗ＣＤ４抗体の能力は、これらを効果的な抗炎症剤にしているが、それらのＦｃγＲ受容体をリクルートする能力は、標的細胞に対する免疫攻撃も導き、Ｔ細胞の枯渇をもたらす（Reddy et al., 2000, J Immunol 164:1925-1933、出典明示により本明細書の一部とする）。エフェクター機能は、放射性コンジュゲート（radioconjugate）と呼ばれる放射性標識抗体、および免疫毒と呼ばれる毒素に結合させた抗体についても問題であり得る。これらの薬物は、癌細胞の破壊に使用できるが、ＦｃのＦｃγＲ類との相互作用を介して免疫細胞をリクルートすることは、致死的荷重（放射能または毒素）の近傍に健康な免疫細胞を運び込み、標的癌細胞と共に正常リンパ組織の枯渇をもたらす（Hutchins et al., 1995, Proc Natl Acad Sci U S A 92:11980-11984; White et al., 2001, Annu Rev Med 52:125-145、出典明示により本明細書の一部とする）。この問題は、補体またはエフェクター細胞を弱くリクルートするＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ２およびＩｇＧ４の使用により、回避できる可能性がある。代替的解決法は、結合を低減させるか、または失わせるＦｃ変異体の開発である（Alegre et al., 1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al., 1995, Proc Natl Acad Sci U S A 92:11980-11984; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Reddy et al., 2000, J Immunol 164:1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604）（ＵＳ６,１９４,５５１；ＵＳ５,８８５,５７３；ＰＣＴ ＷＯ９９／５８５７２）、全て出典明示により本明細書の一部とする。エフェクター機能の低減または除去のために重要な検討事項は、他の重要な抗体の特性が乱されないことである。Ｆｃ変異体は、ＦｃγＲ類および／またはＣ１ｑへの結合を失うだけでなく、抗体の安定性、溶解性および構造的完全性（integrity）、並びにＦｃＲｎおよびプロテインＡおよびＧなどの他の重要なＦｃリガンドとの相互作用能を維持するように、操作されるべきである。
加えて、本発明は、Ｆｃ／ＦｃγＲ親和性およびエフェクター機能を増強できる、操作された糖形態を利用する。好都合な溶解特性およびエフェクター機能媒介能力を有する非グリコシル化Ｆｃは、上記の代替的製造方法を大いに可能にするであろう。非グリコシル化Ｆｃの構造的および機能的短所を克服することにより、細菌並びに遺伝子組換え植物および動物において、免疫原性のリスクを低減させて、そして癌などの細胞傷害作用が望まれる臨床適用のためのエフェクター機能をもたせて、抗体を製造することができる。本発明では、エフェクター機能を有する安定な可溶性Ｆｃ変異体を開発するためのタンパク質操作方法の利用を説明する。現在、そのようなＦｃ変異体は、当分野に存在しない。
本発明のＦｃ変異体
本発明のＦｃ変異体は、様々なＦｃポリペプチドで用途を見出し得る。本発明のＦｃ変異体を含むＦｃポリペプチドは、本明細書で「本発明のＦｃポリペプチド」と呼ばれる。本発明のＦｃポリペプチドには、抗体またはＦｃ融合体などのもっと大きいポリペプチドの文脈で本発明のＦｃ変異体を含むポリペプチドが含まれる。即ち、本発明のＦｃポリペプチドには、本発明のＦｃ変異体を含む抗体およびＦｃ融合体が含まれる。「本発明の抗体」は、本明細書で使用するとき、本発明のＦｃ変異体を含む抗体を意味する。「本発明のＦｃ融合体」は、本明細書で使用するとき、本発明のＦｃ変異体を含むＦｃ融合体を表す。本発明のＦｃポリペプチドには、Ｆｃ領域以外に殆どまたは全く追加的ポリペプチド配列を含まないポリペプチドも含まれ、単離Ｆｃと呼ばれる。本明細書で使用する「本発明の単離Ｆｃ」は、本発明のＦｃ変異体を含み、Ｆｃ領域以外に殆どまたは全く追加的ポリペプチド配列を含まないＦｃポリペプチドを意味する。本発明のＦｃポリペプチドには、Ｆｃ領域のフラグメントも含まれる。「本発明のＦｃフラグメント」は、本明細書で使用するとき、本発明のＦｃ変異体を含むＦｃフラグメントを意味する。後述する通り、上述の本発明のＦｃポリペプチドのいずれも、１つまたはそれ以上の融合パートナーまたはコンジュゲート（conjugate）パートナーと融合させ、所望の機能を提供してもよい。
Ｆｃ変異体は、その文脈と関係なく、親Ｆｃポリペプチドにおいて構築し得る。つまり、親Ｆｃポリペプチドの唯一の基準は、それがＦｃ領域を含むことである。本明細書に記載の親Ｆｃポリペプチドは、広範囲の供給源に由来し得、任意の生物由来の１またはそれ以上のＦｃ遺伝子により実質的にコードされ得、これには、ヒト、マウスおよびラットを含むがこれらに限定されない齧歯類、ウサギおよびノウサギなどのウサギ目、ラクダ、ラマおよびヒトコブラクダなどのラクダ科、および原猿類、広鼻下目（新世界ザル）、オナガザル上科（旧世界ザル）、並びにテナガザル、人型類人猿および類人猿を含むヒト上科が含まれるがこれらに限定されない非ヒト霊長類、が含まれるがこれらに限定されず、ヒトが最も好ましい。本発明の親Ｆｃポリペプチドは、抗体のＩｇＧ（ヒトサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ヒトサブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭクラスに属する配列を含むがこれらに限定されない、いずれの抗体クラスに属する免疫グロブリン遺伝子に実質的にコードされていてもよい。最も好ましくは、本発明の親Ｆｃポリペプチドは、抗体のヒトＩｇＧクラスに属する配列を含む。例えば、親Ｆｃポリペプチドは、親抗体、例えばヒトＩｇＧ１抗体、ヒトＩｇＡ抗体またはマウスＩｇＧ２ａもしくはＩｇＧ２ｂ抗体であり得る。当該親抗体は、下記で詳述する通り、非ヒト、キメラ、ヒト化または完全にヒトであり得る。親Ｆｃポリペプチドは、いくつかのやり方で修飾または操作されていてもよい。例えば、親抗体は、全て詳細に後述する通り、親和性成熟化されていてよく、または、操作された糖形態を有してもよい。あるいは、親Ｆｃポリペプチドは、Ｆｃ融合体、例えば融合パートナーが細胞表面受容体を標的化するＦｃ融合体であり得る。あるいは、親Ｆｃポリペプチドは、Ｆｃ領域の外側に殆どまたは全くポリペプチド配列を含まない、単離Ｆｃ領域であり得る。親Ｆｃポリペプチドは、天然に存在するＦｃ領域でもよく、Ｆｃポリペプチドの存在する操作された変異体であってもよい。重要なことは、親Ｆｃポリペプチドが、突然変異させてＦｃ変異体を生成させることができるＦｃ領域を含むことである。
本発明のＦｃ変異体は抗体であり得、本明細書で「本発明の抗体」と呼ばれる。本発明の抗体は、抗体のＩｇＧ（ヒトサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ヒトサブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭクラスに属する配列を含むがこれらに限定されない、いずれの抗体クラスに属する免疫グロブリン遺伝子に実質的にコードされていてもよい免疫グロブリン配列を含み得る。最も好ましくは、本発明の抗体は、抗体のヒトＩｇＧクラスに属する配列を含む。本発明の抗体は、非ヒト、キメラ、ヒト化または完全にヒトであり得る。当業者に理解される通り、これらの異なるタイプの抗体は、「ヒトらしさ」、即ちヒトにおける免疫原性の潜在的レベルの程度を反映している。これらの概念の説明には、Clark et al., 2000 およびそこで引用されている参考文献を参照されたい (Clark, 2000, Immunol Today 21:397-402、出典明示により本明細書の一部とする）。キメラ抗体は、ヒト抗体の定常領域に機能し得るように連結した、非ヒト抗体の可変領域、例えばマウスまたはラット期限のＶHおよびＶLドメインを含む（例えば、米国特許第４,８１６,５６７号参照、出典明示により本明細書の一部とする）。当該非ヒト可変領域は、上記の任意の生物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくは齧歯類または霊長類に由来し得る。ある実施態様では、本発明の抗体は、例えば出典明示により本明細書の一部とする Newman et al., 1992, Biotechnology 10:1455-1460, US 5,658,570およびUS 5,750,105に記載の通り、サルの可変ドメインを含む。好ましい実施態様では、可変領域は、非ヒト供給源に由来するが、その免疫原性はタンパク質の操作を使用して低減されている。好ましい実施態様では、本発明の抗体は、ヒト化されている (Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA)、出典明示により本明細書の一部とする)。「ヒト化」抗体は、本明細書で使用するとき、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）および非ヒト（通常マウスまたはラット）抗体由来の１つまたはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体を意味する。ＣＤＲを提供する非ヒト抗体は、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ばれる。ヒト化は、主としてドナーＣＤＲのアクセプター（ヒト）ＶLおよびＶHフレームワークへの移植による（Winter ＵＳ５２２５５３９、出典明示により本明細書の一部とする)。この戦略は、「ＣＤＲ移植」と呼ばれる。選択されたアクセプターフレームワークの残基を、対応するドナー残基へ「逆突然変異導入（backmutation）」することは、最初に移植されたコンストラクトにおいて失われた親和性を回復させるために、しばしば必要とされる（ＵＳ５,５３０,１０１；ＵＳ５,５８５,０８９；ＵＳ５,６９３,７６１；ＵＳ５,６９３,７６２；ＵＳ６,１８０,３７０；ＵＳ５,８５９,２０５；ＵＳ５,８２１,３３７；ＵＳ６,０５４,２９７；ＵＳ６,４０７,２１３、出典明示により本明細書の一部とする)。多数の他のヒト化方法が当分野で知られており(Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA)、出典明示により本明細書の一部とする)、かかる方法のいずれも、本発明において、免疫原性の低減のためのＦｃ変異体の修飾に用途を見出す。場合により、ヒト化抗体は、免疫グロブリンの定常領域、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含み、故に、典型的にはヒトＦｃ領域を含む。最も好ましい実施態様では、本発明のＦｃ変異体の免疫原性は、出典明示により本明細書の一部とする、２００４年１２月３日に出願された"Methods of Generating Variant Proteins with Increased Host String Content and Compositions Thereof,"と題するＵＳＳＮ１１／００４,５９０に記載の方法を使用して低減される。代替的実施態様では、本発明の抗体は、完全にヒトであり得る、つまり、抗体の配列は、完全または実質的にヒトである。トランスジェニックマウス（Bruggemann et al., 1997, Curr Opin Biotechnol 8:455-458, 出典明示により本明細書の一部とする）または選択方法と組み合わせたヒト抗体ライブラリー（Griffiths et al., 1998, Curr Opin Biotechnol 9:102-108, 出典明示により本明細書の一部とする）の使用を含む、完全にヒトの抗体を生成するための数々の方法が当分野で知られている。
本発明のＦｃ変異体は、Ｆｃ融合体であり得、本明細書で「本発明のＦｃ融合体」と呼ばれる。本発明のＦｃ融合体は、１つまたはそれ以上の融合パートナーと機能し得るように連結した、Ｆｃポリペプチドを含む。融合パートナーの役割は、典型的には、しかし常にではないが、Ｆｃ融合体の標的抗原への結合を媒介することである (Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200, 出典明示により本明細書の一部とする）。例えば、承認された薬物アレファセプト（alefacept）(AMEVIVE(登録商標)として販売) は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に連結したヒト白血球機能抗原−３（ＬＦＡ−３）の細胞外ＣＤ２結合部分からなる免疫抑制性Ｆｃ融合体である。承認された薬物エタネルセプト（etanercept）(ENBREL(登録商標)として販売）は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃに連結したヒト腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の細胞外リガンド結合部分を含むＦｃ融合体である。事実上任意のタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは低分子を、Ｆｃに連結させてＦｃ融合体を生成させ得る。融合パートナーには、受容体および細胞外受容体ドメイン、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカインまたは他のタンパク質またはタンパク質ドメインが含まれるが、これらに限定されない。融合パートナーは、化学誘引物質としても重要な役割を果たし得る。未発見のリガンドまたは受容体を、本発明のＦｃ変異体の融合パートナーとして供し得る。低分子を、融合パートナーとして供し得、それには、Ｆｃ融合体を治療標的に導くいかなる治療物質も含まれ得る。かかる標的は、いかなる分子でもよく、好ましくは疾患に関係する細胞外受容体である。承認された数々の低分子薬物の標的である表面受容体の２つのファミリーは、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）および、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｃａ＋チャネルを含むイオンチャネルである。世界中で現在販売されている全薬物の７０％近くがＧＰＣＲを標的としている。故に、本発明のＦｃ変異体は、例えば、１またはそれ以上のＧＡＢＡ受容体、プリン受容体、アドレナリン受容体、ヒスタミン受容体、オピオイド受容体、ケモカイン受容体、グルタミン受容体、ニコチン受容体、５ＨＴ（セロトニン）受容体およびエストロゲン受容体を標的とする低分子に融合させてもよい。融合パートナーは、治療的に有用な標的を標的化するタンパク質の低分子模倣物（mimetic）であってもよい。Ｆｃ融合パートナーとして役立ち得る特定の薬物の具体例は、L. S. Goodman et al., Eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (McGraw-Hill, New York, ed. 9, 1996, 出典明示により本明細書の一部とする) に見出される。融合パートナーは、存在する薬物の既知の標的のみならず、薬物標的としてまだ存在しないオーファン受容体に結合する低分子およびタンパク質も含む。ゲノムおよびプロテオームプロジェクトの完了は、薬物発見の推進力を提供しており、これらのプロジェクトは、オーファン受容体の発掘をもたらした。これらの新しい分子を薬物標的として有効にし、それらを標的化するタンパク質および低分子の治療剤を開発する大きな可能性がある。そのようなタンパク質および低分子治療剤は、本発明のＦｃ変異体を用いるＦｃ融合パートナーとして意図されている。本発明のＦｃ融合体は、抗体のＩｇＧ（ヒトサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ヒトサブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭクラスを含むがこれらに限定されない、任意の抗体クラスに属する免疫グロブリン遺伝子に実質的にコードされる免疫グロブリン配列を含み得る。最も好ましくは、本発明のＦｃ融合体は、抗体のヒトＩｇＧクラスに属する配列を含む。下記に定義し説明する様々なリンカーを、Ｆｃを融合パートナーに共有結合させるために使用して、Ｆｃ融合体を生成し得る。
本発明のＦｃ変異体は、Ｆｃ領域以外に殆どまたは全く追加的ポリペプチド配列を含まず、本発明のＦｃ変異体を含むＦｃポリペプチドである、単離Ｆｃにおいて用途を見出し得る。本発明の単離Ｆｃは、分子の所望の機能、例えば所望の治療機能が、Ｆｃ領域にのみある分子を意味する。従って、本発明の単離Ｆｃの治療標的は、１つまたはそれ以上のＦｃリガンドを含むと考えられる。Ｆｃ変異体を含む単離Ｆｃは、その所望の成果を達成するために、さらに共有結合したポリペプチド配列を必要としないことがある。好ましい実施態様では、当該単離Ｆｃは、９０ないし１００％のＦｃ領域を含み、「余分の」配列を殆どまたは全く含まない。従って、例えば、本発明の単離Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１のカルボキシル末端に残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含み得る（番号付けは、Kabatにある通りのＥＵインデックスに従う）。ある実施態様では、本発明の単離Ｆｃは、Ｆｃ領域の外側に余分の配列を全く含有し得ない。しかしながら、単離Ｆｃがさらなるポリペプチド配列を含み得ないことも企図されている。例えば、単離Ｆｃは、Ｆｃ変異体Ｆｃ領域を含むのに加えて、発現、精製などを可能にするさらなるポリペプチド配列タグを含んでもよい。
本発明のＦｃ変異体は、Ｆｃ領域のフラグメントに用途を見出し得る。それは、本発明のＦｃ変異体を含むＦｃフラグメントを含むＦｃポリペプチドである。明らかに、本発明のＦｃフラグメントの要件は、それが、Ｆｃ変異体のアミノ酸修飾を行う位置を含有することである。本発明のＦｃフラグメントは、１ないし９０％のＦｃ領域を含み得、１０−９０％が好ましく、３０−９０％が最も好ましい。従って、例えば、本発明のＦｃフラグメントは、Ｆｃ変異体ＩｇＧ１Ｃγ２ドメイン、Ｆｃ変異体ＩｇＧ１Ｃγ２ドメインおよびヒンジ領域、Ｆｃ変異体ＩｇＧ１Ｃγ３ドメインなどを含み得る。ある実施態様では、本発明のＦｃフラグメントは、融合パートナーを付加的に含み、それを効果的にＦｃフラグメント融合体にする。単離Ｆｃと同様に、Ｆｃフラグメントは、余分のポリペプチド配列を含有してもしなくてもよい。
本発明のＦｃ変異体は、任意の生物、好ましくは哺乳動物由来の遺伝子により実質的にコードされ得、これには、ヒト、マウスおよびラットを含むがこれらに限定されない齧歯類、ウサギおよびノウサギを含むがこれらに限定されないウサギ目、ラクダ、ラマおよびヒトコブラクダを含むがこれらに限定されないラクダ科、および原猿類、広鼻下目（新世界ザル）、オナガザル上科（旧世界ザル）、並びにテナガザル、人型類人猿および類人猿を含むヒト上科が含まれるがこれらに限定されない、非ヒト霊長類が含まれるがこれらに限定されるものではない。最も好ましい実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、実質的にヒトである。本発明のＦｃ変異体は、いずれの抗体クラスに属する免疫グロブリン遺伝子に実質的にコードされていてもよい。最も好ましい実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、抗体のＩｇＧクラスに属する配列を含み、これには、ヒトサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４が含まれる。代替的実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、抗体のＩｇＡ（ヒトサブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭクラスに属する配列を含む。本発明のＦｃ変異体は、１つ以上のタンパク質鎖を含み得る。つまり、本発明は、モノマーまたは、ホモもしくはヘテロオリゴマーを含むオリゴマーである、Ｆｃ変異体に用途を見出し得る。
最も好ましい実施態様では、本発明のＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ配列をベースとし、従って、ヒトＩｇＧ配列を「基礎」配列として使用し、それに対して他の配列を比較する。それには、他の生物由来の配列、例えば齧歯類および霊長類の配列、並びにＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧＤ、ＩｇＧＭなどの他の免疫グロブリンクラス由来の配列が含まれる。本発明のＦｃ変異体は、親Ｆｃ変異体の文脈で操作されているが、それらの変異体は、他の第２の親Ｆｃ変異体の文脈において操作されているか、またはそこに「移入」されていてもよいと企図されている。これは、典型的には２つのＦｃ変異体の配列間の配列または構造相同性に基づいて、「等価の」または「対応する」残基を決定し、第１と第２のＦｃ変異体との間で置換することにより行う。相同性を確立するために、本明細書で概説する第１のＦｃポリペプチドのアミノ酸配列を、第２のＦｃ配列と直接比較する。当分野で知られている１またはそれ以上の相同性アラインメントプログラムを使用して（例えば、種間の保存残基を使用して）配列を整列させた後、アラインメントを維持するために必要な挿入および欠失を可能にし（即ち、任意の欠失および挿入による保存残基の除去を回避する）、第１のＦｃの一次配列中の特定のアミノ酸と等価な残基を定義する。保存残基のアラインメントは、好ましくは、そのような残基の１００％を保存するべきである。しかしながら、７５％より高いか、またはわずか５０％の保存残基のアラインメントも、等価残基を定義するのに適している。等価な残基は、三次構造が決定されているＦｃ変異体について、三次構造のレベルで第１と第２のＦｃ変異体の構造相同性を決定することによっても定義し得る。この場合、等価な残基は、親または前駆体の特定のアミノ酸残基の２個またはそれ以上の主鎖原子の原子座標（Ｎ対Ｎ、ＣＡ対ＣＡ、Ｃ対ＣおよびＯ対Ｏ）が、アラインメント後に０.１３ｎｍ以内、好ましくは０.１ｎｍ以内であるものとして定義される。アラインメントは、最良のモデルが方向付けられ、位置付けられて、そのタンパク質の水素ではないタンパク質の原子の原子座標の最大の重複が得られた後に達成される。等価または対応する残基がどのように決定されるかに関わらず、そして、Ｆｃ変異体を作成する親Ｆｃ変異体の同一性に関わらず、伝達しようと意図しているのは、本発明により見出されるＦｃ変異体は、当該Ｆｃ変異体と有意な配列または構造相同性を有する任意の第２の親Ｆｃ変異体へ操作されてもよいということである。従って、例えば、親抗体がヒトＩｇＧ１である変異体抗体を生成するならば、等価残基の決定に上記の方法または他の方法を使用することにより、当該変異体抗体は、ヒトＩｇＧ２親抗体、ヒトＩｇＡ親抗体、マウスＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ親抗体などにおいて操作され得る。再度、上記の通り、親Ｆｃ変異体の文脈は、本発明のＦｃ変異体を他の親Ｆｃ変異体に移入する能力に影響を与えない。例えば、あるエピトープを標的とするヒトＩｇＧ１抗体において操作された変異体抗体は、異なるエピトープを標的とするヒトＩｇＧ２抗体に、また異なるエピトープを標的とするヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域を含むＦｃ融合体に、というように移入し得る。
本発明のＦｃ変異体は、幅広い製品に用途を見出し得る。ある実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、治療剤、診断剤または研究用試薬、好ましくは治療剤である。あるいは、本発明のＦｃ変異体は、農業または工業用途に使用し得る。本発明の抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルである抗体組成物に用途を見出し得る。本発明のＦｃ変異体は、アゴニスト、アンタゴニスト、中和性、阻害性または刺激性であり得る。好ましい実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、標的抗原を有する標的細胞、例えば癌細胞を殺すために使用される。代替的実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、標的抗原を、遮断、アンタゴナイズ（antagonize）またはアゴナイズ（agonize）するのに使用される。代替的に好ましい実施態様では、本発明のＦｃ変異体を使用して、標的抗原を遮断、アンタゴナイズまたはアゴナイズし、かつその標的抗原を有する細胞を殺す。
標的
以下の標的リストに属するタンパク質、サブユニット、ドメイン、モチーフおよび／またはエピトープを含むがこれらに限定されない事実上いかなる抗原も、本発明のＦｃ変異体により標的化し得る：１７−ＩＡ、４−１ＢＢ、４Ｄｃ、６−ケト−ＰＧＦ１ａ、８−イソ−ＰＧＦ２ａ、８−オキソ−ｄＧ、Ａ１アデノシン受容体、Ａ３３、ＡＣＥ、ＡＣＥ−２、アクチビン、アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＲＩＡ、アクチビンＲＩＡＡＬＫ−２、アクチビンＲＩＢＡＬＫ−４、アクチビンＲＩＩＡ、アクチビンＲＩＩＢ、ＡＤＡＭ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭＴＳ、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、アドレシン類、ａＦＧＦ、ＡＬＣＡＭ、ＡＬＫ、ＡＬＫ−１、ＡＬＫ−７、アルファ−１−アンチトリプシン、アルファ−Ｖ／ベータ−１アンタゴニスト、ＡＮＧ、Ａｎｇ、ＡＰＡＦ−１、ＡＰＥ、ＡＰＪ、ＡＰＰ、ＡＰＲＩＬ、ＡＲ、ＡＲＣ、ＡＲＴ、アルテミン（Artemin）、抗−Ｉｄ、ＡＳＰＡＲＴＩＣ、心房性ナトリウム利尿因子、ａｖ／ｂ３インテグリン、Ａｘｌ、ｂ２Ｍ、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ、Ｂ−リンパ球刺激因子（ＢｌｙＳ）、ＢＡＣＥ、ＢＡＣＥ−１、Ｂａｄ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ−Ｒ、Ｂａｇ−１、ＢＡＫ、Ｂａｘ、ＢＣＡ−１、ＢＣＡＭ、Ｂｃｌ、ＢＣＭＡ、ＢＤＮＦ、ｂ−ＥＣＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＩＤ、Ｂｉｋ、ＢＩＭ、ＢＬＣ、ＢＬ−ＣＡＭ、ＢＬＫ、ＢＭＰ、ＢＭＰ−２ＢＭＰ−２ａ、ＢＭＰ−３オステオゲニン（Osteogenin）、ＢＭＰ−４ＢＭＰ−２ｂ、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６Ｖｇｒ−１、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、ＢＭＰ−８（ＢＭＰ−８ａ、ＯＰ−２）、ＢＭＰＲ、ＢＭＰＲ−ＩＡ（ＡＬＫ−３）、ＢＭＰＲ−ＩＢ（ＡＬＫ−６）、ＢＲＫ−２、ＲＰＫ−１、ＢＭＰＲ−ＩＩ（ＢＲＫ−３）、ＢＭＰｓ、ｂ−ＮＧＦ、ＢＯＫ、ボンベシン、骨由来神経栄養因子、ＢＰＤＥ、ＢＰＤＥ−ＤＮＡ、ＢＴＣ、補体因子３（Ｃ３）、Ｃ３ａ、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ１０、ＣＡ１２５、ＣＡＤ−８、カルシトニン、ｃＡＭＰ、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、癌腫関連抗原、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ／ＤＰＰＩ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＨ、カテプシンＬ、カテプシンＯ、カテプシンＳ、カテプシンＶ、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ、ＣＢＬ、ＣＣＩ、ＣＣＫ２、ＣＣＬ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９／１０、ＣＣＲ、ＣＣＲ１、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ３２、ＣＤ３３（ｐ６７タンパク質）、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４９ａ、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７４、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８９、ＣＤ９５、ＣＤ１２３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５２、ＣＤ１６４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＦＴＲ、ｃＧＭＰ、ＣＩＮＣ、ボツリヌス菌毒素、ウェルシュ菌毒素、ＣＫｂ８−１、ＣＬＣ、ＣＭＶ、ＣＭＶＵＬ、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＮ−１、ＣＯＸ、Ｃ−Ｒｅｔ、ＣＲＧ−２、ＣＴ−１、ＣＴＡＣＫ、ＣＴＧＦ、ＣＴＬＡ−４、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＬ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、サイトケラチン腫瘍関連抗原、ＤＡＮ、ＤＣＣ、ＤｃＲ３、ＤＣ−ＳＩＧＮ、崩壊促進因子、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−１）、Ｄｈｈ、ジゴキシン、ＤＮＡＭ−１、Ｄｎａｓｅ、Ｄｐｐ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、Ｄｔｋ、ＥＣＡＤ、ＥＤＡ、ＥＤＡ−Ａ１、ＥＤＡ−Ａ２、ＥＤＡＲ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、ＥＭＡ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥＮＡ、エンドセリン受容体、エンケファリナーゼ、ｅＮＯＳ、Ｅｏｔ、エオタキシン１、ＥｐＣＡＭ、エフリンＢ２／ＥｐｈＢ４、ＥＰＯ、ＥＲＣＣ、Ｅ−セレクチン、ＥＴ−１、ファクターＩＩａ、ファクターＶＩＩ、ファクターＶＩＩＩｃ、ファクターＩＸ、繊維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、Ｆａｓ、ＦｃＲ１、ＦＥＮ−１、フェリチン、ＦＧＦ、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ−８、ＦＧＦＲ、ＦＧＦＲ−３、フィブリン、ＦＬ、ＦＬＩＰ、Ｆｌｔ−３、Ｆｌｔ−４、卵胞刺激ホルモン、フラクタルカイン、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、Ｇ２５０、Ｇａｓ６、ＧＣＰ−２、ＧＣＳＦ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＤＦ、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３（Ｖｇｒ−２）、ＧＤＦ−５（ＢＭＰ−１４、ＣＤＭＰ−１）、ＧＤＦ−６（ＢＭＰ−１３、ＣＤＭＰ−２）、ＧＤＦ−７（ＢＭＰ−１２、ＣＤＭＰ−３）、ＧＤＦ−８（ミオスタチン）、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１５（ＭＩＣ−１）、
ＧＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＧＦＡＰ、ＧＦＲａ−１、ＧＦＲ−アルファ１、ＧＦＲ−アルファ２、ＧＦＲ−アルファ３、ＧＩＴＲ、グルカゴン、Ｇｌｕｔ４、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ｇｐ１３０、ｇｐ７２、ＧＲＯ、成長ホルモン放出因子、ハプテン（ＮＰ−ｃａｐまたはＮＩＰ−ｃａｐ）、ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＣＣ、ＨＣＭＶｇＢエンベロープ糖タンパク質、ＨＣＭＶ）ｇＨエンベロープ糖タンパク質、ＨＣＭＶＵＬ、造血細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＨｅｐＢｇｐ１２０、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、Ｈｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ｇＢ糖タンパク質、ＨＳＶｇＤ糖タンパク質、ＨＧＦＡ、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ＨＩＶｇｐ１２０、ＨＩＶＩＩＩＢｇｐ１２０Ｖ３ループ、ＨＬＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１.２４、ＨＭＦＧＰＥＭ、ＨＲＧ、Ｈｒｋ、ヒト心臓ミオシン、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ＨＶＥＭ、Ｉ−３０９、ＩＡＰ、ＩＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３、ＩＣＥ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮｇ、Ｉｇ、ＩｇＡ受容体、ＩｇＥ、ＩＧＦ、ＩＧＦ結合タンパク質、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦＢＰ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２３、インターフェロン（ＩＮＦ）−アルファ、ＩＮＦ−ベータ、ＩＮＦ−ガンマ、インヒビン、ｉＮＯＳ、インシュリンＡ−鎖、インシュリンＢ−鎖、インシュリン様増殖因子１、インテグリンアルファ２、インテグリンアルファ３、インテグリンアルファ４、インテグリンアルファ４／ベータ１、インテグリンアルファ４／ベータ７、インテグリンアルファ５（アルファＶ）、インテグリンアルファ５／ベータ１、インテグリンアルファ５／ベータ３、インテグリンアルファ６、インテグリンベータ１、インテグリンベータ２、インターフェロンガンマ、ＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、ＪＥ、カリクレイン２、カリクレイン５、カリクレイン６、カリクレイン１１、カリクレイン１２、カリクレイン１４、カリクレイン１５、カリクレインＬ１、カリクレインＬ２、カリクレインＬ３、カリクレインＬ４、ＫＣ、ＫＤＲ、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラミニン５、ＬＡＭＰ、ＬＡＰ、ＬＡＰ（ＴＧＦ−１）、潜在型ＴＧＦ−１、潜在型ＴＧＦ−１ｂｐ１、ＬＢＰ、ＬＤＧＦ、ＬＥＣＴ２、Ｌｅｆｔｙ、ルイス−Ｙ抗原、ルイス−Ｙ関連抗原、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、Ｌｆｏ、ＬＩＦ、ＬＩＧＨＴ、リポタンパク質、ＬＩＸ、ＬＫＮ、Ｌｐｔｎ、Ｌ−セレクチン、ＬＴ−ａ、ＬＴ−ｂ、ＬＴＢ４、ＬＴＢＰ−１、肺胞界面活性物質、黄体形成ホルモン、リンホトキシンベータ受容体、Ｍａｃ−１、ＭＡｄＣＡＭ、ＭＡＧ、ＭＡＰ２、ＭＡＲＣ、ＭＣＡＭ、ＭＣＡＭ、ＭＣＫ−２、ＭＣＰ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ、Ｍｅｒ、ＭＥＴＡＬＬＯＰＲＯＴＥＡＳＥＳ、ＭＧＤＦ受容体、ＭＧＭＴ、ＭＨＣ（ＨＬＡ−ＤＲ）、ＭＩＦ、ＭＩＧ、ＭＩＰ、ＭＩＰ−１−アルファ、ＭＫ、ＭＭＡＣ１、ＭＭＰ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−２４、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＰＩＦ、Ｍｐｏ、ＭＳＫ、ＭＳＰ、ムチン（Ｍｕｃ１）、ＭＵＣ１８、ミュラー管阻害物質、Ｍｕｇ、ＭｕＳＫ、ＮＡＩＰ、ＮＡＰ、ＮＣＡＤ、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＮＣＡ９０、ＮＣＡＭ、ＮＣＡＭ、ネプリライシン、ニューロトロフィン−３、−４、または−６、ニューロツリン（Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、ニューロン成長因子（ＮＧＦ）、ＮＧＦＲ、ＮＧＦ−ベータ、ｎＮＯＳ、ＮＯ、ＮＯＳ、Ｎｐｎ、ＮＲＧ−３、ＮＴ、ＮＴＮ、ＯＢ、ＯＧＧ１、ＯＰＧ、ＯＰＮ、ＯＳＭ、ＯＸ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｒ、ｐ１５０、ｐ９５、ＰＡＤＰｒ、副甲状腺ホルモン、ＰＡＲＣ、ＰＡＲＰ、ＰＢＲ、ＰＢＳＦ、ＰＣＡＤ、Ｐ−カドへリン、ＰＣＮＡ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＤＫ−１、ＰＥＣＡＭ、ＰＥＭ、ＰＦ４、ＰＧＥ、ＰＧＦ、ＰＧＩ２、ＰＧＪ２、ＰＩＮ、ＰＬＡ２、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、ＰｌＧＦ、ＰＬＰ、ＰＰ１４、プロインシュリン、プロリラキシン、タンパク質Ｃ、ＰＳ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＰＴＥＮ、ＰＴＨｒｐ、Ｐｔｋ、ＰＴＮ、Ｒ５１、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＮＴＥＳ、リラキシンＡ−鎖、リラキシンＢ−鎖、レニン、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆ、ＲＳＶＦｇｐ、Ｒｅｔ、リウマチ因子、ＲＬＩＰ７６、ＲＰＡ２、ＲＳＫ、Ｓ１００、ＳＣＦ／ＫＬ、ＳＤＦ−１、ＳＥＲＩＮＥ、血清アルブミン、ｓＦＲＰ−３、Ｓｈｈ、ＳＩＧＩＲＲ、ＳＫ−１、ＳＬＡＭ、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＣ、ＳＭＤＦ、ＳＭＯＨ、ＳＯＤ、ＳＰＡＲＣ、Ｓｔａｔ、ＳＴＥＡＰ、ＳＴＥＡＰ−ＩＩ、ＴＡＣＥ、ＴＡＣＩ、ＴＡＧ−７２（腫瘍関連糖タンパク質−７２）、ＴＡＲＣ、ＴＣＡ−３、Ｔ−細胞受容体（例えば、Ｔ−細胞受容体アルファ／ベータ）、ＴｄＴ、ＴＥＣＫ、ＴＥＭ１、ＴＥＭ５、ＴＥＭ７、ＴＥＭ８、ＴＥＲＴ、精巣ＰＬＡＰ様アルカリホスファターゼ、ＴｆＲ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、汎特異性（Pan Specific）ＴＧＦ−ベータ、ＴＧＦ−ベータＲＩ（ＡＬＫ−５）、ＴＧＦ−ベータＲＩＩ、ＴＧＦ−ベータＲＩＩｂ、ＴＧＦ−ベータＲＩＩＩ、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、ＴＧＦ−ベータ４、ＴＧＦ−ベータ５、トロンビン、胸腺Ｃｋ−１、甲状腺刺激ホルモン、Ｔｉｅ、ＴＩＭＰ、ＴＩＱ、組織因子、ＴＭＥＦＦ２、Ｔｍｐｏ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＦ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−アルファベータ、ＴＮＦ−ベータ２、ＴＮＦｃ、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＴＲＡＩＬＲ１Ａｐｏ−２、ＤＲ４）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＴＲＡＩＬＲ２ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＩＣＫ−２Ａ、ＴＲＩＣＫ−Ｂ）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（ＴＲＡＩＬＲ３ＤｃＲ１、ＬＩＴ、ＴＲＩＤ）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（ＴＲＡＩＬＲ４ＤｃＲ２、ＴＲＵＮＤＤ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫＯＤＦＲ、ＴＲＡＮＣＥＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（ＯＰＧＯＣＩＦ、ＴＲ１）、ＴＮＦＲＳＦ１２（ＴＷＥＡＫＲＦＮ１４）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（ＴＡＣＩ）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（ＢＡＦＦＲ）、
ＴＮＦＲＳＦ１４（ＨＶＥＭＡＴＡＲ、ＨｖｅＡ、ＬＩＧＨＴＲ、ＴＲ２）、ＴＮＦＲＳＦ１６（ＮＧＦＲｐ７５ＮＴＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＢＣＭＡ）、ＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲＡＩＴＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１９（ＴＲＯＹＴＡＪ、ＴＲＡＤＥ）、ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ（ＲＥＬＴ）、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦＲＩＣＤ１２０ａ、ｐ５５−６０）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ＴＮＦＲＩＩＣＤ１２０ｂ、ｐ７５−８０）、ＴＮＦＲＳＦ２６（ＴＮＦＲＨ３）、ＴＮＦＲＳＦ３（ＬＴｂＲＴＮＦＲＩＩＩ、ＴＮＦＣＲ）、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０ＡＣＴ３５、ＴＸＧＰ１Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０ｐ５０）、ＴＮＦＲＳＦ６（ＦａｓＡｐｏ−１、ＡＰＴ１、ＣＤ９５）、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ（ＤｃＲ３Ｍ６８、ＴＲ６）、ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７）、ＴＮＦＲＳＦ８（ＣＤ３０）、ＴＮＦＲＳＦ９（４−１ＢＢＣＤ１３７、ＩＬＡ）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＤＲ６）、ＴＮＦＲＳＦ２２（ＤｃＴＲＡＩＬＲ２ＴＮＦＲＨ２）、ＴＮＦＲＳＴ２３（ＤｃＴＲＡＩＬＲ１ＴＮＦＲＨ１）、ＴＮＦＲＳＦ２５（ＤＲ３アポ−３、ＬＡＲＤ、ＴＲ−３、ＴＲＡＭＰ、ＷＳＬ−１）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬアポ−２リガンド、ＴＬ２）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫリガンドＯＤＦ、ＯＰＧリガンド）、ＴＮＦＳＦ１２（ＴＷＥＡＫアポ−３リガンド、ＤＲ３リガンド）、ＴＮＦＳＦ１３（ＡＰＲＩＬＴＡＬＬ２）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ（ＢＡＦＦＢＬＹＳ、ＴＡＬＬ１、ＴＨＡＮＫ、ＴＮＦＳＦ２０）、ＴＮＦＳＦ１４（ＬＩＧＨＴＨＶＥＭリガンド、ＬＴｇ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＴＬ１Ａ／ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８（ＧＩＴＲリガンドＡＩＴＲリガンド、ＴＬ６）、ＴＮＦＳＦ１Ａ（ＴＮＦ−ａコネクチン、ＤＩＦ、ＴＮＦＳＦ２）、ＴＮＦＳＦ１Ｂ（ＴＮＦ−ｂＬＴａ、ＴＮＦＳＦ１）、ＴＮＦＳＦ３（ＬＴｂＴＮＦＣ、ｐ３３）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンドｇｐ３４、ＴＸＧＰ１）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンドＣＤ１５４、ｇｐ３９、ＨＩＧＭ１、ＩＭＤ３、ＴＲＡＰ）、ＴＮＦＳＦ６（Ｆａｓリガンドアポ−１リガンド、ＡＰＴ１リガンド）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンドＣＤ７０）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンドＣＤ１５３）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンドＣＤ１３７リガンド）、ＴＰ−１、ｔ−ＰＡ、Ｔｐｏ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＮＣＥ、トランスフェリン受容体、ＴＲＦ、Ｔｒｋ、ＴＲＯＰ−２、ＴＳＧ、ＴＳＬＰ、腫瘍関連抗原ＣＡ１２５、腫瘍関連抗原を発現しているルイスＹ関連炭水化物、ＴＷＥＡＫ、ＴＸＢ２、Ｕｎｇ、ｕＰＡＲ、ｕＰＡＲ−１、ウロキナーゼ、ＶＣＡＭ、ＶＣＡＭ−１、ＶＥＣＡＤ、ＶＥ−カドへリン、ＶＥ−カドへリン−２、ＶＥＦＧＲ−１（ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−３（ｆｌｔ−４）、ＶＥＧＩ、ＶＩＭ、ウイルス抗原、ＶＬＡ、ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−４、ＶＮＲインテグリン、フォンウィルブランド因子、ＷＩＦ−１、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ／１３、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ１６、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＸＣＲ１、ＸＣＲ１、ＸＥＤＡＲ、ＸＩＡＰ、ＸＰＤ並びにホルモンおよび増殖因子の受容体。
当業者は、上述の標的リストが特定のタンパク質や生体分子だけでなく、それらを含む生化学経路または経路群を表すことを理解するであろう。例えば、標的抗原としてＣＴＬＡ−４に言及することは、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８およびこれらのタンパク質に結合する任意の他の未発見のリガンドまたは受容体を含む、Ｔ細胞共刺激経路を形成するリガンドおよび受容体もまた標的であることを含意する。従って、標的は、本明細書で使用されるとき、特定の生体分子だけでなく、当該標的と相互作用するタンパク質のセットおよび当該標的が属する生化学的経路のメンバーを表す。当業者はさらに、上述の標的抗原、それらに結合するリガンドまたは受容体、またはそれらの対応する生化学経路の他のメンバーはいずれも、Ｆｃ融合体を生成させるために、本発明のＦｃ変異体に機能し得るように連結され得ることがわかる。従って、例えば、ＥＧＦＲを標的とするＦｃ融合体は、Ｆｃ変異体を、ＥＧＦ、ＴＧＦαまたはＥＧＦＲに結合する既発見もしくは未発見の任意の他のリガンドに機能し得るように連結させることにより構築できる。従って、ＥＧＦ、ＴＧＦα、またはＥＧＦＲに結合する既発見もしくは未発見の任意の他のリガンドに結合するＦｃ融合体を生成させるために、本発明のＦｃ変異体をＥＧＦＲに機能し得るように連結させ得る。従って、事実上いかなるポリペプチドも、上述の標的およびそれらの対応する生化学経路を構成するタンパク質を含むがこれらに限定されるものではない、リガンド、受容体または他のタンパク質またはタンパク質ドメインのいずれであっても、Ｆｃ融合体を開発するために本発明のＦｃ変異体に機能し得るように連結させ得る。
抗体治療用の適正な標的抗原の選択は、複雑なプロセスであり、多くの変数を含む。抗癌処置には、その発現が癌性細胞に限定される標的があるのが望ましい。特に抗体治療が効きやすいと明らかになったいくつかの標的は、シグナル伝達機能を有するものである。他の治療用抗体は、受容体とその同族のリガンドとの結合の阻害により受容体のシグナル伝達を遮断することにより、効果を発揮する。治療抗体の別の作用メカニズムは、受容体の下方調節（down regulation）を引き起こすことである。治療的に有効な抗体の多くは、部分的にそれらの標的抗原を介するシグナル伝達により働くが、常にそうであるとは限らない。例えば、細胞表面の糖形態などのいくつかの標的クラスは、生物学的シグナルを発生させない。しかしながら、変更された糖形態は、しばしば癌などの疾患状態と関連する。別の重要な標的タイプは、正常な機能として、または抗体結合に応じて、内在化するものである。細胞表面に結合しているより、むしろ可溶性である標的の場合、エフェクター機能のリクルートは、細胞死をもたらさないであろう。
特に抗体治療が効きやすいと明らかになったいくつかの標的は、シグナル伝達機能を有するものである。例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原の抗体架橋結合は、癌細胞の死をもたらすアポトーシスシグナルを発生させ得る。ＣＤ３０抗原などの場合、この遊離抗体とのクラスター化は、インビトロでアポトーシスを引き起こすのに不十分であり得る。インビトロアッセイでは、十分なクラスター化は、抗体を架橋結合するか、またはマイクロタイタープレートのウェルなどの表面に高密度で固定することにより、媒介できる。しかしながら、インビボでは、この効果は、近くの細胞で発現されるＦｃリガンド、例えばＦｃγＲに抗体を結合させることにより媒介し得る。従って、Ｆｃリガンドにより緊密に結合する抗体Ｆｃ変異体は、シグナル伝達標的をより効果的にクラスター化し、アポトーシス誘導の増強を導き得る。かかるメカニズムは、Ｆｃリガンド結合が増強された抗体とされていない抗体を、シグナル伝達する所望の標的を発現する細胞に添加することにより、かつ／または、Ｆｃ受容体およびそのＦｃ受容体をクラスター化する対応抗体を添加することにより、実験的に試験できる。Ｆｃ受容体をクラスター化するための代替的手段には、ビーズへの固定および非エフェクター細胞株における過剰発現が含まれる。アポトーシスを起こらせた後、標的発現細胞の相対的アポトーシスを測定することは、効果の定量的決定を可能にする。
それらの標的との相互作用を介して細胞死を引き起こす抗体は、さらなる利点を有し得る。そのような死んでいく細胞により発せられるシグナルは、マクロファージおよび免疫系の他の細胞を引き付ける。次いで、これらの細胞は、死んでいるか、または死んでいく細胞を、抗体に媒介されるやり方で取り込むことができる。これは、抗原の交差提示および標的細胞に対する宿主免疫反応の可能性をもたらすと示された。かかる抗体治療に応じる自己抗体は、抗原標的Ｈｅｒ２およびＣＤ２０について報告された。この理由で、変更された受容体特異性のあるＦｃ変異体をもって、望まざる耐性誘導の効果よりもむしろ交差提示および免疫応答を特異的に刺激するのが有利であり得る。
他の治療抗体は、受容体とその同族リガンドとの相互作用の阻害によりそれらの効果を発揮し、最終的に受容体のシグナル伝達を遮断する。かかる抗体は、多くの疾患状態の処置に使用される。この場合、宿主の免疫機能をリクルートしない抗体を利用するのが有利であり得る。かかる抗体の二次的効果は、受容体のクラスター化を介して、それ自体で実際にシグナル伝達を誘導することであり得る。この場合、シグナル伝達を遮断する所望の治療効果は、抗体媒介シグナル伝達により取り消され得る。上記で議論した通り、このクラスター化は、抗体とＦｃ受容体を含有する細胞との相互作用により増強され得る。この場合、Ｆｃ受容体にあまり緊密に、または全く、結合しないＦｃ変異体の使用が好ましいであろう。そのような抗体は、シグナル伝達を媒介せず、それによりその作用メカニズムは、受容体／リガンド相互作用の遮断に限定されるであろう。このことが最も適切であるシグナル伝達受容体は、恐らく、最初の抗体により二量体化できるだけで、実質的にクラスター化できない単量体の受容体であろう。多量体の受容体は、最初の抗体により有意にクラスター化し得、Ｆｃ受容体結合による付加的クラスター化はなくてもよい。
治療抗体の別の潜在的作用メカニズムは、受容体の下方調節である。そのようなものは、例えばインシュリン様増殖因子受容体の場合に該当し得る。細胞の増殖は、受容体を介する継続的シグナル伝達に依存するが、その非存在下では、細胞は増殖を停止する。この受容体に対する抗体の１つの効果は、その発現を下方調節し、それによりシグナル伝達を排除することである。細胞傷害治療からの細胞の回復は、この受容体の刺激を必要とする。この受容体の下方調節は、これらの細胞の回復を防止し、細胞傷害治療をより効果的にする。これが主要な作用メカニズムである抗体について、Ｆｃ受容体結合の減少は、Ｆｃ受容体への非標的結合により、抗体の隔離を防止し得る。
多くの治療的に有効な抗体が、部分的にそれらの標的抗原を介するシグナル伝達により働くが、常にそうであるとは限らない。例えば、細胞表面の糖形態などのいくつかの標的クラスは、生物学的シグナルを発生させない。しかしながら、変更された糖形態は、しばしば癌などの疾患状態と関連する。他の場合では、同じ標的抗原の異なるエピトープと抗体の相互作用は、異なるシグナル伝達効果を与え得る。抗体またはＦｃ融合体の標的抗原への結合により殆どまたは全くシグナル伝達が誘起されないような場合に、本発明のＦｃポリペプチドは、そうでなければ効き目のない分子に新規な効力のメカニズムを提供することにおいて、有用性を見出し得る。
かかる非シグナル伝達性標的に対する治療用抗体の生成において用いられる１つのアプローチは、放射性同位元素、毒素、または、基質を加工して腫瘍の近傍で細胞傷害性物質を産生させる酵素などの細胞傷害性物質に抗体を結合させることである。細胞傷害性部分の代替物として、本発明のＦｃ変異体は、免疫機能のリクルートの増加を提供し得、それは、生来的に宿主に対する毒性が低く、同時に標的癌細胞の破壊になお有効である。かかるＦｃ変異体は、例えば、ＮＫ細胞のリクルートまたはファゴサイトーシスの活性化またはＣＤＣの開始により有効であり得る。あるいは、細胞傷害性物質を利用するならば、低減または変更されたＦｃリガンド結合をもたらすＦｃ変異体を使用するのが有利であり得る。これは、Ｆｃ受容体を発現する免疫細胞に対するその物質の細胞傷害効果を低減または排除し、それにより患者への毒性を低減し得る。さらに、Ｆｃリガンド結合の低減は、毒性物質または酵素に対する免疫反応の発生を最小化する助けとなり得る。上述の通り、細胞死は、宿主の免疫細胞のリクルートをもたらし得る；治療用抗体が細胞傷害性部分に加えてＦｃ受容体結合親和性の増加または変更された受容体特異性を有するならば、抗体媒介性交差提示は、そのような場合、免疫耐性よりむしろ免疫反応に伴い増加し得る。
別の重要な標的タイプは、それらの生物学的機能の正常な役割として、または抗体結合に応答して、内在化する標的である。かかる標的には、内在化後にのみ効果を発揮できるＲＮａｓｅ、リシンおよびカリケアマイシン（calicheamicin）などの細胞傷害性物質を結合させるために多大な努力がなされた。かかる試薬について、Ｆｃリガンドの結合は、Ｆｃリガンドによる治療剤の非生産的隔離のために、効力を低減させ得る。この場合、減少したＦｃリガンド親和性をもたらすＦｃ変異体を利用するのが有利であり得る。逆に、細胞に提示された標的抗原への結合に先立つ、抗体のＦｃリガンドとの事前の会合（pre-association）は、標的の内在化の阻害に役立ち得る。この場合、Ｆｃリガンド親和性の増加は、事前の会合の、そしてそれによりエフェクター細胞のリクルートおよび宿主免疫応答の、改善に役立ち得る。
細胞表面に結合しているよりも、むしろ可溶性の標的の場合、エフェクター機能のリクルートは、直接的に細胞死をもたらさないであろう。しかしながら、その標的に対する宿主抗体の生成を刺激することに有用性があり得る。いくつかの疾患状態について、成功する処置は、極度に長期にわたる治療用抗体の投与を必要とし得る。かかる治療は、極端に重いコストがかかるか、または煩わしいものであり得る。これらの場合、宿主免疫応答の刺激および抗体の生成は、治療剤の効力の改善をもたらし得る。これは、ワクチン治療のアジュバントとして適用可能であり得る。このような効果を媒介する抗体Ｆｃ変異体は、Ｆｃリガンドへの親和性の増加または変更されたＦｃリガンド特異性を有し得る。
治験で使用を承認されたか、または開発中の数々の抗体およびＦｃ融合体は、本発明のＦｃ変異体から利益を受け得る。これらの抗体およびＦｃ融合体は、本明細書で「臨床用製品および候補」と呼ばれる。従って、好ましい実施態様では、本発明のＦｃポリペプチドは、幅広い臨床用製品および候補に用途を見出し得る。例えば、数々のＣＤ２０を標的とする抗体は、本発明のＦｃ変異体から利益を受け得る。例えば、本発明のＦｃポリペプチドは、以下のものを含むがこれらに限定されるものではない、他の臨床用製品および候補に実質的に類似する様々な抗体またはＦｃ融合体において用途を見出し得る；非ホジキンリンパ腫の処置に承認されたキメラ抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブ（Rituxan(登録商標), IDEC/Genentech/Roche）（例えば、ＵＳ５,７３６,１３７参照）；Genmab により現在開発されている抗ＣＤ２０であるHuMax-CD20、ＵＳ５,５００,３６２に記載の抗ＣＤ２０抗体、AME-133（Applied Molecular Evolution）、hA20（Immunomedics, Inc.）、HumaLYM（Intracel）および PRO70769 (PCT/US2003/040426、"Immunoglobulin Variants and Uses Thereof"と題する）に実質的に類似する抗体において、用途を見出し得る。ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、Ｈｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）を含む上皮成長因子受容体ファミリーのメンバーを標的とする数々の抗体は、本発明のＦｃポリペプチドから利益を受け得る。例えば、本発明のＦｃポリペプチドは、トラスツズマブ（Herceptin(登録商標), Genentech）（例えば、ＵＳ５,６７７,１７１参照）、乳癌の処置に承認されたヒト化抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体；Genentech により現在開発されているペルツズマブ（pertuzumab）（rhuMab-2C4, Omnitarg(商標)）；ＵＳ４,７５３,８９４に記載の抗Ｈｅｒ２抗体；セツキシマブ（cetuximab）（Erbitux(登録商標), Imclone）（ＵＳ４,９４３,５３３；ＰＣＴ ＷＯ９６／４０２１０）、様々な癌のために治験中のキメラ抗ＥＧＦＲ抗体；Abgenix-Immunex-Amgen により現在開発されているABX-EGF（ＵＳ６,２３５,８８３）；Genmab により現在開発されているHuMax-EGFr（ＵＳＳＮ１０／１７２,３１７）；425、EMD55900、EMD62000 および EMD72000（Merck KGaA）（ＵＳ５５５８８６４；Murthy et al. 1987, Arch Biochem Biophys. 252（2）:549-60; Rodeck et al., 1987, J Cell Biochem. 35（4）:315-20; Kettleborough et al., 1991, Protein Eng. 4（7）:773-83）；ICR62（Institute of Cancer Research）（ＰＣＴ ＷＯ９５／２００４５；Modjtahedi et al., 1993, J. Cell Biophys. 1993, 22（1-3）:129-46; Modjtahedi et al., 1993, Br J Cancer. 1993, 67（2）:247-53; Modjtahedi et al, 1996, Br J Cancer, 73（2）:228-35; Modjtahedi et al, 2003, Int J Cancer, 105（2）:273-80）; TheraCIMhR3（YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular, Cuba （ＵＳ５,８９１,９９６；ＵＳ６,５０６,８８３；Mateo et al, 1997, Immunotechnology, 3（1）:71-81）；mAb-806（Ludwig Institue for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering）（Jungbluth et al. 2003, Proc Natl Acad Sci U S A. 100（2）:639-44）；KSB-102（KS Biomedix）；MR1-1（IVAX, National Cancer Institute）（ＰＣＴ ＷＯ０１６２９３１Ａ２）；およびSC100（Scancell）（ＰＣＴ ＷＯ０１／８８１３８）に実質的に類似する抗体において、用途を見出し得る。他の好ましい実施態様では、本発明のＦｃポリペプチドは、Ｂ−細胞慢性リンパ性白血病の処置に現在承認されているヒト化モノクローナル抗体であるアレムツズマブ（Campath(登録商標), Millenium）において用途を見出し得る。本発明のＦｃポリペプチドは、Ortho Biotech/Johnson & Johnson により開発された抗ＣＤ３抗体であるムロモナブ（muromonab）−ＣＤ３（Orthoclone OKT3(登録商標)）、IDEC/Schering AG により開発された抗ＣＤ２０抗体であるイブリツモマブチウキセタン（ibritumomab tiuxetan）（Zevalin(登録商標)）、Celltech/Wyeth により開発された抗ＣＤ３３（ｐ６７タンパク質）抗体であるゲンツズマブオゾガミシン（gemtuzumab ozogamicin）（Mylotarg(登録商標)）、Biogen により開発された抗ＬＦＡ−３Ｆｃ融合体であるアレファセプト（alefacept）（Amevive(登録商標)）、Centocor/Lilly により開発されたアブシキシマブ（ReoPro(登録商標)）、Novartis により開発されたバシリキシマブ（Simulect(登録商標)）、MedImmune により開発されたパリビズマブ（palivizumab）（Synagis(登録商標)）、Centocor により開発された抗ＴＮＦアルファ抗体であるインフリキシマブ（Remicade(登録商標)）、Abbott により開発された抗ＴＮＦアルファ抗体であるアダリムマブ（adalimumab）（Humira(登録商標)）、Celltech により開発された抗ＴＮＦアルファ抗体である Humicade(商標)、Immunex/Amgen により開発された抗ＴＮＦアルファＦｃ融合体であるエタネルセプト（Enbrel(登録商標)）、Abgenix により開発されている抗ＣＤ１４７抗体であるABX-CBL、Abgenixにより開発されている抗ＩＬ８抗体であるABX-IL8、Abgenix により開発されている抗ＭＵＣ１８抗体であるABX-MA1、Antisoma により開発されている抗ＭＵＣ１であるペンツモマブ（Pemtumomab）（R1549、90Y-muHMFG1）、Antisoma により開発されている抗ＭＵＣ１抗体であるTherex （R1550）、Antisoma により開発されている AngioMab（AS1405）、Antisoma により開発されている HuBC-1、Antisoma により開発されているチオプラチン（Thioplatin）（AS1407）、Biogen により開発されている抗アルファ−４−ベータ−１（ＶＬＡ−４）およびアルファ−４−ベータ−７抗体であるAntegren(登録商標)（ナタリズマブ（natalizumab））、Biogen により開発されている抗ＶＬＡ−１インテグリン抗体であるVLA-1 mAb、Biogen により開発されている抗リンホトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ）抗体である LTBR mAb、Cambridge Antibody technologyにより開発されている抗ＴＧＦβ２抗体であるCAT-152、Cambridge Antibody technology および Abbott により開発されている抗ＩＬ−１２抗体であるJ695、Cambridge Antibody technology および Genzyme により開発されている抗ＴＧＦβ１抗体である CAT-192、Cambridge Antibody technology により開発されている抗エオタキシン（Eotaxin）１抗体である CAT-213、Cambridge Antibody technology and Human Genome Sciences Inc. により開発されている抗Ｂｌｙｓ抗体であるLymphoStat-B(商標)、Cambridge Antibody technology and Human Genome Sciences, Inc. により開発されている抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１抗体であるTRAIL-R1mAb、Genentechにより開発されている抗ＶＥＧＦ抗体であるAvastin(商標)（ベバシズマブ（bevacizumab）、rhuMAb-VEGF）、Genentechにより開発されている抗ＨＥＲ受容体ファミリー抗体、Genentech により開発されている抗組織因子抗体である抗組織因子（ATF）、Genentech により開発されている抗ＩｇＥ抗体である Xolair(商標)（オマリズマブ（Omalizumab））、Genentech および Xoma により開発されている抗ＣＤ１１ａ抗体であるRaptiva(商標) （エファリズマブ（Efalizumab））、Genentech および Millenium Pharmaceuticals により開発されているＭＬＮ−０２抗体（以前はＬＤＰ−０２）、Genmab により開発されている抗ＣＤ４抗体である HuMax CD4、Genmab および Amgen により開発されている抗ＩＬ１５抗体である HuMax-IL15、Genmab および Medarex により開発されている HuMax-Inflam、Genmab および Medarex および Oxford GcoSciences により開発されている抗ヘパラナーゼＩ抗体である HuMax-Cancer、Genmab および Amgenにより開発されている HuMax-Lymphoma、Genmab により開発されている HuMax-TAC、IDEC Pharmaceuticals により開発されている抗ＣＤ４０Ｌ抗体であるIDEC-131、IDEC Pharmaceuticals により開発されている抗ＣＤ４抗体であるIDEC-151（クレノリキシマブ（Clenoliximab））、IDEC Pharmaceuticals により開発されている抗ＣＤ８０抗体であるIDEC-114、IDEC Pharmaceuticals により開発されている抗ＣＤ２３であるIDEC-152、IDEC Pharmaceuticals により開発されている抗マクロファージ遊走因子（ＭＩＦ）抗体、Imclone により開発されている抗イディオタイプ抗体であるBEC2、Imclone により開発されている抗ＫＤＲ抗体である IMC-1C11、Imclone により開発されている抗flk-1抗体であるDC101、Imclone により開発されている抗ＶＥカドへリン抗体、Immunomedicsにより開発されている抗癌胎児抗原（ＣＥＡ）抗体であるCEA-Cide(商標)（ラベツズマブ（labetuzumab））、Immunomedics により開発されている抗ＣＤ２２抗体である LymphoCide(商標)（エプラツズマブ（Epratuzumab））、Immunomedics により開発されているAFP-Cide、Immunomedics により開発されている MyelomaCide、Immunomedics により開発されている LkoCide、Immunomedics により開発されている ProstaCide、Medarex により開発されている抗ＣＴＬＡ４抗体であるMDX-010、Medarex により開発されている抗ＣＤ３０抗体であるMDX-060、Medarex により開発されているMDX-070、Medarex により開発されているMDX-018、Medarex および Immuno-Designed Molecules により開発されている抗Ｈｅｒ２抗体である Osidem(商標)（IDM-1）、Medarex および Genmab により開発されている抗ＣＤ４抗体である HuMax(商標)-CD4、Medarex および Genmab により開発されている抗ＩＬ１５抗体であるHuMax-IL15、Medarex および Centocor/J&J により開発されている抗ＴＮＦα抗体であるCNTO 148、Centocor/J&J により開発されている抗サイトカイン抗体であるCNTO 1275、MorphoSys により開発されている抗細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）（ＣＤ５４）抗体である MOR101 および MOR102、MorphoSys により開発されている抗線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ−３）抗体である MOR201、Protein Design Labs により開発されている抗ＣＤ３抗体である Nuvion(登録商標)（ビシリズマブ（visilizumab））、Protein Design Labs により開発されている抗ガンマインターフェロン抗体である HuZAF(商標)、Protein Design Labs により開発されている抗α５β１インテグリン、Protein Design Labsにより開発されている抗ＩＬ−１２、Xoma により開発されている抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体である ING-1、並びに Xoma により開発されている抗ベータ２インテグリン抗体である MLN01。全ての引用文献を出典明示により本明細書の一部とする。
上述の抗体およびＦｃ融合体の臨床用製品および候補へのＦｃポリペプチドの適用は、それらの組成そのものに制限されることを意味しない。本発明のＦｃポリペプチドは、上述の臨床用候補および製品に、またはそれらに実質的に類似する抗体およびＦｃ融合体に組み込まれ得る。本発明のＦｃポリペプチドは、ヒト化、親和性成熟化、操作または他のやり方で修飾された、上述の臨床用候補および製品の変形に組み込まれ得る。さらに、本発明のＦｃポリペプチドを組み込む新しい抗体またはＦｃ融合体を構築するのに、上述の臨床用製品および候補のポリペプチド全体を使用する必要はない；例えば、臨床用製品または候補抗体の可変領域、実質的に類似する可変領域、またはヒト化、親和性成熟化、操作または修飾された変形の可変領域のみを使用し得る。他の実施態様では、本発明のＦｃポリペプチドは、上述の臨床用製品および候補の１つとして、同じエピトープ、抗原、リガンドまたは受容体に結合する抗体またはＦｃ融合体において用途を見出し得る。
ある実施態様では、本発明のＦｃポリペプチドを、自己免疫、炎症または移植の適応症の処置に使用する。そのような疾患に意味のある標的抗原並びに臨床用製品および候補には、ＬＤＰ−０２などの抗α４β７インテグリン抗体、ＬＤＰ−０１などの抗ベータ２インテグリン抗体、５Ｇ１.１などの抗補体（Ｃ５）抗体、ＢＴＩ−３２２、ＭＥＤＩ−５０７などの抗ＣＤ２抗体、ＯＫＴ３、ＳＭＡＲＴ抗ＣＤ３などの抗ＣＤ３抗体、ＩＤＥＣ−１５１、ＭＤＸ−ＣＤ４、ＯＫＴ４Ａなどの抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、ＩＣ１４などの抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１８抗体、ＩＤＥＣ１５２などの抗ＣＤ２３抗体、Zenapax などの抗ＣＤ２５抗体、５ｃ８、Antova、ＩＤＥＣ−１３１などの抗ＣＤ４０Ｌ抗体、ＭＤＸ−３３などの抗ＣＤ６４抗体、ＩＤＥＣ−１１４などの抗ＣＤ８０抗体、ＡＢＸ−ＣＢＬなどの抗ＣＤ１４７抗体、ＣＤＰ８５０などの抗Ｅ−セレクチン抗体、ReoPro/Abcixima などの抗ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、ＩＣＭ３などの抗ＩＣＡＭ−３抗体、ＶＸ−７４０などの抗ＩＣＥ抗体、ＭＤＸ−３３などの抗ＦｃＲ１抗体、ｒｈｕＭａｂ−Ｅ２５などの抗ＩｇＥ抗体、ＳＢ−２４０６８３などの抗ＩＬ−４抗体、ＳＢ−２４０５６３、ＳＣＨ５５７００などの抗ＩＬ−５抗体、ＡＢＸ−ＩＬ８などの抗ＩＬ−８抗体、抗インターフェロンガンマ抗体、ＣＤＰ５７１、ＣＤＰ８７０、Ｄ２Ｅ７、Infliximab、ＭＡＫ−１９５Ｆなどの抗ＴＮＦ（ＴＮＦ、ＴＮＦα、ＴＮＦａ、ＴＮＦ−アルファ）抗体、および Antegren などの抗ＶＬＡ−４抗体が含まれるがこれらに限定されるものではない。
本発明のＦｃ変異体をＴＮＦ阻害分子で利用して、特性の増強をもたらし得る。ＦｃγＲＩＩＩａに伴うエフェクター機能は、親和性の高い多型（１５８Ｆ：Ｖ本明細書の他の箇所で論ずる）を有するリウマチ性関節炎または乾癬性関節炎の患者の処置に使用されるある種のＴＮＦ阻害分子の有効性に負に影響を与え得、逆もまた真であることが示された（Z. Tutuncu et al., 2004, "FcR Polymorphisms and Treatment Outcomes in Patients with Inflammatory Arthritis Treated with TNF Blocking Agents", oral presentation on October 18, 2004 at the 2004 ACR Meeting, San Antonio, TX; abstract published in Arthritis & Rheumatism, September 2004, 出典明示により本明細書の一部とする）。一般に、リウマチ性関節炎または乾癬性関節炎などの自己免疫症状には、ＴＮＦ阻害剤を、親と比較して１つまたはそれ以上のＦｃγＲに対する結合の低減をもたらすＦｃ変異体と組み合わせることは、治療の有効性を増強する。理想的には、ＴＮＦ阻害分子での１つまたはそれ以上のＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＩａへの結合の低減、または、ましてや除去は、最良の結果を生み出すであろう。
有用なＴＮＦ阻害分子には、哺乳動物のＴＮＦ−アルファの作用を阻害する任意の分子が含まれる。適例には、Ｆｃ融合体 Enbrel(登録商標) (エタネルセプト) および抗体 Humira(登録商標) (アダリムマブ（adalimumab）) および Remicade(登録商標)（インフリキシマブ）が含まれる。Ｆｃ結合を低減するために本発明のＦｃ変異体を使用して操作されたモノクローナル抗体（Remicade および Humira など）は、より良好な効力に移行し得る。Humira、Remicade および Enbrel のエフェクター機能、ましてやエフェクター機能の調節は、これらの薬物の開発において考慮されなかった。１つまたはそれ以上のＦｃγＲへの結合を低減する本発明のＦｃ変異体を自己免疫症状に作用する抗体またはＦｃ融合体の文脈で使用することにより、現在販売されている製品と比較して、効力を増強し得る。有用なＴＮＦ阻害分子には、好ましくは、ドミナント・ネガティブ（Dominant Negative）ＴＮＦ分子（２０００年３月２日に出願されたＵＳＳＮ０９／７９８,７８９；２００１年１０月１５日に出願された０９／９８１,２８９；２００２年９月３０日に出願された１０／２６２,６３０；および２００４年１０月１２日に出願された１０／９６３,９９４に定義の通り。全て出典明示により本明細書の一部とする）。ドミナント・ネガティブＴＮＦ分子（ＤＮ−ＴＮＦ）は、固有のエフェクター活性を有さず、膜貫通ＴＮＦ（ｔｍＴＮＦ）を「救助する」ように作用する（即ち、ｔｍＴＮＦを含有する細胞の殺傷が、リウマチ性または乾癬性関節炎について疾患の結果に負の効果を有する場合）。受容体へのＦｃγＲ結合を低減または除去するＦｃ変異体と会合したＤＮ−ＴＮＦ分子が好ましい。
ある実施態様では、本発明のＦｃポリペプチドは、全体的また部分的に、ＡＤＣＣ活性を介して治療的に機能する。かかる適用に意味のある標的抗原並びに臨床用製品および候補には、Bexocar、Rituxan(登録商標)、Zevalin(登録商標)およびＰＲＯ７０７６９などの抗ＣＤ２０抗体、ＳｍａｒｔＭ１９５などの抗ＣＤ３３抗体、Lymphocide(商標)などの抗ＣＤ２２抗体、ＡＣ−１０およびＳＧＮ−３０などの抗ＣＤ３０抗体、ＡＢＸ−ＥＧＦ、セツキシマブ、ＩＭＣ−Ｃ２２５、Merck Mab 425 などの抗ＥＧＦＲ抗体、Crucell の抗ＥｐＣＡＭなどの抗ＥｐＣＡＭ抗体、Herceptin およびＭＤＸ−２１０などの抗ＨＥＲ２抗体、および cantumab および Pentacea などの抗ＣＥＡ抗体が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
ある実施態様では、本発明のＦｃポリペプチドは、全体的また部分的に、ＣＤＣ活性を介して治療的に機能する。かかる適用に意味のある標的抗原並びに臨床用製品および候補には、cantumab および Pentacea などの抗ＣＥＡ抗体、Bexocar、Rituxan(登録商標)、Zevalin(登録商標)およびＰＲＯ７０７６９などの抗ＣＤ２０抗体、Crucellの 抗ＥｐＣＡＭおよびEdrecolomab などの抗ＥｐＣＡＭ抗体、および Campath(登録商標)（アレムツズマブ）などの抗ＣＤ５２抗体が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
ある実施態様では、本発明のＦｃポリペプチドは、血液の系譜で発現される抗原に対するものである。かかる適用に意味のある標的抗原並びに臨床用製品および候補には、ＳｍａｒｔＭ１９５などの抗ＣＤ３３抗体、Antova(商標)、ＩＤＥＣ−１３１などのなどの抗ＣＤ４０Ｌ抗体、Blvatuzumab などの抗ＣＤ４４抗体、Campath(登録商標)（アレムツズマブ）などの抗ＣＤ５２抗体、ＩＤＥＣ−１１４などの抗ＣＤ８０抗体、ＭＤＸ−１０１などの抗ＣＴＬＡ−４抗体、Bexocar、Rituxan(登録商標)、Zevalin(登録商標)およびＰＲＯ７０７６９などの抗ＣＤ２０抗体、Lymphocide(商標)などの抗ＣＤ２２抗体、ＩＤＥＣ−１５２などの抗ＣＤ２３抗体、Zenapax(登録商標)（ダクリズマブ）などの抗ＣＤ２５抗体、およびアポリズマブ（apolizumab）などの抗ＭＨＣ（ＨＬＡ−ＤＲ）抗体が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
ある実施態様では、本発明のＦｃポリペプチドは、固形腫瘍で発現される抗原に対するものである。かかる適用に関連する標的抗原並びに臨床用製品および候補には、Crucellの抗ＥｐＣＡＭおよび Edrecolomab などの抗ＥｐＣＡＭ抗体、カンツマブ（cantumab）および Pentacea などの抗ＣＥＡ抗体、ＡＢＸ−ＥＧＦ、セツキシマブ、ＩＭＣ−Ｃ２２５、Merck Mab 425 などの抗ＥＧＦＲ抗体、BravaRex、TriAb などの抗Ｍｕｃ１抗体、Herceptin(登録商標)、ＭＤＸ−２１０などの抗Ｈｅｒ２抗体、３Ｆ８および TriGemなどの抗ＧＤ−２ガングリオシド抗体、ミツモマブ（mitumomab）などの抗ＧＤ−３ガングリオシド抗体、ＭＤＸ−０７０などの抗ＰＳＭＡ抗体、オレゴボマブ（oregovomab）などの抗ＣＡ１２５抗体、ＭＤＸ−２２０などの抗ＴＡＧ−７２抗体およびカンツズマブ（cantuzumab）などの抗ＭＵＣ−１抗体が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
好ましい実施態様では、本発明のＦｃ変異体の標的自体が、１つまたはそれ以上のＦｃリガンドである。本発明のＦｃポリペプチドは、免疫系の活動の調節に利用でき、いくつかの場合では、ＩＶＩｇ治療の効果を、より制御された特異的かつ有効なやり方で模倣する。ＩＶＩｇは、効果的には、静脈に送達される高用量の免疫グロブリンである。一般に、ＩＶＩｇは、自己免疫症状を抑制するために使用される。ＩＶＩｇの作用の治療メカニズムには高頻度でのＦｃ受容体のライゲーションが含まれるという仮説が提唱された (J. Bayry et al., 2003, Transfusion Clinique et Biologique 10: 165-169; Binstadt et al., 2003, J Allergy Clin. Immunol, 697-704)。実際に、Ｉ血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）の動物モデルは、単離ＦｃがＩＶＩｇの活性部分であることを示す（Samuelsson et al, 2001, Pediatric Research 50(5), 551)。治療で使用するために、免疫グロブリンを数千人のドナーから回収する。これにはヒトから集めた非組換え生物由来治療剤（biotherapeutic）に伴う問題の全てが伴う。本発明のＦｃ変異体は、ＩＶＩｇの役割の全てを果たすべきであり、ドナーから回収するよりも、組換えタンパク質として製造するべきである。
ＩＶＩｇの免疫調節効果は、ＦｃγＲ、補体タンパク質およびＦｃＲｎを含むがこれらに限定されるものではない１つまたはそれ以上のＦｃリガンドとの、生産的な相互作用に依存するものであり得る。いくつかの実施態様では、増強されたＦｃγＲＩＩｂへの親和性を有する本発明のＦｃ変異体を使用して、抗炎症活性を促進できる（Samuelsson et al., 2001, Science 291: 484-486）か、または自己免疫を低減できる（Hogarth, 2002, Current Opinion in Immunology, 14:798-802）。他の実施態様では、増強された１種またはそれ以上のＦｃγＲへの親和性を有する本発明のＦｃポリペプチドを、それだけで、またはさらなる修飾と組み合わせて、自己免疫の低減に利用できる（Hogarth, 2002, Current Opinion in Immunology, 14:798-802）。代替的実施態様では、増強されたＦｃγＲＩＩＩａへの親和性を有するが、細胞内シグナル伝達の能力が低減された本発明のＦｃ変異体を使用して、ＦｃγＲＩＩＩａとの結合に競合的に干渉することにより、免疫系の活動を低減できる。Ｆｃ変異体の文脈は、所望の特異性に劇的に影響する。例えば、１種またはそれ以上の活性化ＦｃγＲへの結合の増強をもたらすＦｃ変異体は、ＦｃγＲアンタゴニストとして作用することにより、抗体、Ｆｃ融合体、単離ＦｃまたはＦｃフラグメントの文脈で最適な免疫調節効果をもたらし得る（van Mirre et al., 2004, J. Immunol. 173:332-339）。しかしながら、２種またはそれ以上のＦｃ変異体の融合またはコンジュゲートは、異なる効果をもたらすことがあり、かかるＦｃポリペプチドについて、阻害性受容体への親和性の増強をもたらすＦｃ変異体を利用するのが最適であり得る。
本発明のＦｃ変異体は、免疫調節性治療剤として使用し得る。免疫系の細胞上のＦｃ受容体への結合またはその遮断を使用して、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）およびリウマチ性関節炎（ＲＡ）などが含まれるがこれらに限定されない免疫学的症状における免疫応答に影響を与え得る。親和性が増強された本発明のＦｃ変異体の使用により、典型的なＩＶＩｇ適用で必要とされる投与量を、実質的に類似の治療効果を得ながら、低減させ得る。Ｆｃ変異体は、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂおよび／またはＦｃγＲＩを含むがこれらに限定されないＦｃγＲへの結合の増強をもたらし得る。特に、ＦｃγＲＩＩｂへの結合の増強は、必要に応じて、その受容体の発現または阻害活性を増加させ、効力を改善するであろう。あるいは、ＦｃγＲＩＩＩｂまたはＦｃγＲＩなどの活性化受容体への結合の遮断は、効力を改善し得る。加えて、Ｆｃ変異体のＦｃＲｎおよび／または補体への親和性の調節も、利益をもたらし得る。
ある実施態様では、阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂへの結合の増強をもたらすＦｃ変異体は、ＩＶＩｇ治療アプローチへの増強をもたらし得る。特に、親Ｆｃポリペプチドよりも高い親和性でＦｃγＲＩＩｂ受容体に結合する本発明のＦｃ変異体を使用し得る。従って、かかるＦｃ変異体は、ＦｃγＲＩＩｂアゴニストとして機能するであろうし、自己免疫疾患治療剤としての、そしてまたＢ細胞増殖の調節因子としての、ＩＶＩｇの有益な効果を増強すると期待されるであろう。加えて、かかるＦｃγＲＩＩｂが増強されたＦｃ変異体を、他の受容体への同じかまたは限定された結合を有するようにさらに改変してもよい。さらなる実施態様では、増強されたＦｃγＲＩＩｂ親和性を有するＦｃ変異体を、他の受容体に対する親和性を低減または除去する突然変異と組合せてもよく、それにより治療的に使用する際の副作用をさらに最小化できる可能性がある。
本発明のＦｃ変異体のかかる免疫調節的適用は、腫瘍学的適応症の処置にも、特に、抗体治療が抗体依存性細胞傷害メカニズムに関するものに、利用し得る。例えば、ＦｃγＲＩＩｂへの親和性を増強するＦｃ変異体を使用して、例えば、Ｆｃ／ＦｃγＲＩＩｂ結合部位に結合するが、細胞のシグナル伝達を引き起こさないか、または低減させることにより、この阻害性受容体に拮抗し得、抗体をベースとする抗癌治療の効果を増強できる可能性がある。ＦｃγＲＩＩｂアンタゴニストとして機能するかかるＦｃ変異体は、ＦｃγＲＩＩｂの阻害特性を遮断するか、またはＩＶＩｇの場合と同様にその阻害機能を誘導し得る。ＦｃγＲＩＩｂアンタゴニストを、ＡＤＣＣ関連細胞傷害を基礎として作用する抗体を含むがこれに限定されない任意の他の治療剤と組み合わせて、共治療として使用し得る。このタイプのＦｃγＲＩＩｂアンタゴニスト性のＦｃ変異体は、好ましくは単離ＦｃまたはＦｃフラグメントであるが、代替的実施態様では、抗体およびＦｃ融合体を使用し得る。
最適化された特性
本発明は、数々の治療的に意味のある特性が最適化されたＦｃ変異体を提供する。Ｆｃ変異体は、親ポリペプチドと比べて１つまたはそれ以上のアミノ酸修飾を含み、当該アミノ酸修飾は、１つまたはそれ以上の最適化された特性をもたらす。本発明のＦｃ変異体は、アミノ酸配列において、その親Ｆｃポリペプチドと少なくとも１個のアミノ酸修飾のために異なる。従って、本発明のＦｃ変異体は、親と比較して少なくとも１個のアミノ酸修飾を含む。あるいは、本発明のＦｃ変異体は、親と比較して１個またはそれ以上のアミノ酸修飾を、例えば、親ポリペプチドと比較して約１ないし約５０個のアミノ酸修飾を、好ましくは約１個ないし約１０個のアミノ酸修飾を、最も好ましくは約１個ないし約５個のアミノ酸修飾を有し得る。従って、Ｆｃ変異体の配列と親Ｆｃポリペプチドのものは、実質的に相同である。例えば、ここでは、変異体Ｆｃの変異体配列は、親Ｆｃ変異体配列と、約８０％の相同性、好ましくは少なくとも約９０％の相同性、最も好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有する。
本発明のＦｃ変異体は、様々な特性について最適化され得る。１つまたはそれ以上の最適化特性を発揮するように操作された、または予想されたＦｃ変異体は、本明細書で「最適化Ｆｃ変異体」と呼ばれる。最適化され得る特性には、増強または低減されたＦｃγＲへの親和性が含まれるがこれに限定されない。好ましい実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、ヒト活性化ＦｃγＲ、好ましくはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂ、最も好ましくはＦｃγＲＩＩＩａへの増強された親和性を有するように最適化される。別の好ましい実施態様では、Ｆｃ変異体は、ヒト阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂへの低減された親和性を有するように最適化される。これらの好ましい実施態様は、ヒトにおいて、増強された治療特性、例えば、増強されたエフェクター機能およびより高い抗癌強度を有するＦｃポリペプチドをもたらすと期待される。別の実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂを含むがこれらに限定されるものではないヒトＦｃγＲへの、低減または除去された親和性を有するように最適化される。これらの実施態様は、増強されたヒトにおける治療特性、例えば、低減されたエフェクター機能および低減された毒性を有するＦｃポリペプチドをもたらすと予想される。他の実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、１つまたはそれ以上のＦｃγＲへの親和性の増強と、さらに１つまたはそれ以上の他のＦｃγＲへの親和性の低減をもたらす。例えば、本発明のＦｃ変異体は、ＦｃγＲＩＩＩａへの増強された結合と、さらにＦｃγＲＩＩｂへの低減された結合を有し得る。あるいは、本発明のＦｃ変異体は、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩへの増強された結合と、さらにＦｃγＲＩＩｂへの低減された結合を有し得る。なお別の実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、ＦｃγＲＩＩｂへの増強された親和性と、さらに１つまたはそれ以上の活性化ＦｃγＲへの低減された親和性を有し得る。
好ましい実施態様は、ヒトＦｃγＲに対するＦｃ結合の最適化を含むが、しかしながら、別の実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、齧歯類および非ヒト霊長類を含むがこれらに限定されるものではない非ヒト生物由来のＦｃγＲ類に対して、増強または低減された親和性を有する。非ヒトＦｃγＲへの結合について最適化されたＦｃ変異体は、実験に用途を見出し得る。例えば、マウスモデルは様々な疾患について入手可能であり、所定の薬物候補の効力、毒性および薬物動態などの特性の試験を可能にする。当分野で知られている通り、癌細胞をマウスに移植または注射して、ヒトの癌を模倣することができる（異種移植と呼ばれる方法）。１種またはそれ以上のマウスＦｃγＲ類について最適化されたＦｃ変異体を含むＦｃ変異体の試験は、タンパク質の効力、その作用メカニズムなどに関して、価値ある情報を提供し得る。本発明のＦｃ変異体は、非グリコシル化形態での増強された機能性および／または溶解特性のためにも最適化し得る。好ましい実施態様では、本発明の非グリコシル化Ｆｃ変異体は、親Ｆｃ変異体の非グリコシル化形態よりも高い親和性でＦｃリガンドに結合する。当該Ｆｃリガンドには、ＦｃγＲ類、Ｃ１ｑ、ＦｃＲｎおよびプロテインＡおよびＧが含まれるがこれらに限定されず、ヒト、マウス、ラット、ウサギまたはサル、好ましくはヒトを含むがこれらに限定されない、いかなる供給源由来であってもよい。代替的な好ましい実施態様では、Ｆｃ変異体は、親Ｆｃ変異体の非グリコシル化形態よりも安定かつ／または可溶性であるように最適化される。
本発明のＦｃ変異体は、補体タンパク質、ＦｃＲｎおよびＦｃ受容体ホモログ（ＦｃＲＨ）を含むがこれらに限定されないＦｃγＲ以外のＦｃリガンドとの相互作用を調節する修飾を含み得る。ＦｃＲＨには、ＦｃＲＨ１、ＦｃＲＨ２、ＦｃＲＨ３、ＦｃＲＨ４、ＦｃＲＨ５およびＦｃＲＨ６が含まれるがこれらに限定されない（Davis et al., 2002, Immunol. Reviews 190:123-136）。
好ましくは、本発明のＦｃ変異体のＦｃリガンド特異性は、その治療的有用性を決定する。所定のＦｃ変異体の治療目的への有用性は、エピトープまたは標的抗原の形態および処置される疾患または適応症に依存する。いくつかの標的および適応症には、ＦｃγＲに媒介されるエフェクター機能の増強が好ましいことがある。これは、抗癌Ｆｃ変異体に特に好都合であり得る。従って、活性化ＦｃγＲへの親和性の増強および／または阻害性ＦｃγＲへの親和性の低減をもたらすＦｃ変異体を含むＦｃ変異体を使用し得る。いくつかの標的および適応症には、異なる活性化ＦｃγＲに異なる選択性をもたらすＦｃ変異体を利用するのが、さらに有益であり得る；例えば、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増強が望ましいが、ＦｃγＲＩにはそうではない場合があり得、一方、ＦｃγＲＩＩａのみへの結合の増強が好ましい場合もあり得る。ある種の標的および適応症には、ＦｃγＲ媒介および補体媒介エフェクター機能の両方を増強するＦｃ変異体を利用するのが好ましいことがあり、一方、ＦｃγＲ媒介または補体媒介エフェクター機能のいずれかを増強するＦｃ変異体を利用するのが有利な場合もあり得る。いくつかの標的または癌の適応症には、例えば、Ｃ１ｑ、１種またはそれ以上のＦｃγＲ、ＦｃＲｎ、または１種またはそれ以上の他のＦｃリガンドへの結合をノックアウトすることにより、１つまたはそれ以上のエフェクター機能を低減また除去するのが有利であり得る。他の標的および適応症には、阻害性ＦｃγＲＩＩｂへの増強された結合と、さらに活性化ＦｃγＲへのＷＴレベルの、低減された、または除去された結合を有するＦｃ変異体を利用するのが好ましいことがある。これは、例えば、Ｆｃ変異体の目標が、炎症または自己免疫疾患の阻害または何らかの免疫系の調節であるときに特に有用であり得る。
明らかに、所定のＦｃ変異体の最も有益な選択性を決定する重要なパラメーターは、Ｆｃ変異体の文脈、即ち、どのタイプのＦｃ変異体を使用するかである。従って、所定のＦｃ変異体のＦｃリガンド選択性または特異性は、それが抗体、Ｆｃ融合体または融合もしくはコンジュゲートパートナーと結合したＦｃ変異体のどれを構成するかに依存して、異なる特性をもたらす。例えば、毒素、放射性同位元素または他のコンジュゲートは、それらを構成するＦｃ変異体が１種またはそれ以上のＦｃリガンドへの低減または除去された結合を有するならば、正常な細胞への毒性が低いことがある。他の例として、炎症または自己免疫疾患を阻害するために、これらのＦｃγＲに結合し、かつこれらの活性化を防止するような、活性化ＦｃγＲへの親和性が増強されたＦｃ変異体を利用するのが好ましいことがある。逆に、ＦｃγＲＩＩｂ親和性が増強された２つまたはそれ以上のＦｃ領域を含むＦｃ変異体は、この免疫細胞表面の受容体を共に束縛し、それによりこれらの細胞の増殖を阻害し得る。Ｆｃ変異体がその標的抗原をある細胞タイプ上に束縛し、さらにＦｃγＲを標的抗原から離れた細胞に束縛する場合があり得る一方で、ＦｃγＲを標的抗原と同じ細胞の表面に束縛するのが有利な場合もあり得る。例えば、抗体が、１種またはそれ以上のＦｃγＲも発現する細胞上の抗原を標的とするならば、その細胞の表面上のＦｃγＲへの結合を増強または低減するＦｃ変異体を利用するのが有益であり得る。これは、例えば、Ｆｃ変異体を抗癌剤として使用し、標的抗原とＦｃγＲを同じ細胞の表面上に共に束縛することが、増殖阻害、アポトーシスまたは他の抗増殖効果をもたらすシグナル伝達事象をその細胞内で促進するときに該当し得る。あるいは、抗原およびＦｃγＲを同じ細胞上に共に束縛することは、Ｆｃ変異体を使用して何らかの方法で免疫系を調節し、ここで、標的抗原およびＦｃγＲを共に束縛することが、いくらかの増殖または抗増殖効果をもたらすときに、有利であり得る。同様に、２つまたはそれ以上のＦｃ領域を含むＦｃ変異体は、同じ細胞の表面上でＦｃγＲを共に束縛するようにＦｃγＲ選択性または特異性を調節するＦｃ変異体から利益を受け得る。
本発明のＦｃ変異体のＦｃリガンド特異性を調節して、特定の標的抗原、適応症または患者群にふさわしい様々なエフェクター機能のプロフィールを創成できる。表１は、様々な受容体への結合に対する改善、低減または無効果を含み、かかる変化がある種の文脈で有益であり得る、受容体結合プロフィールのいくつかの好ましい実施態様を記載する。表中の受容体結合プロフィールは、特定の受容体に対する増加または減少の程度により変動し得る。さらに、特定される結合の変化は、例えばＣ１ｑへの結合の除去と組み合わせて補体活性化を遮断することにより、またはＣ１ｑへの結合の増強と組み合わせて補体活性化を増加させることにより、Ｃ１ｑまたはＦｃＲｎなどの他の受容体へのさらなる結合の変化の文脈にあることもできる。他の受容体結合プロフィールを用いる他の実施態様が可能であり、列挙した受容体結合プロフィールは例示である。
表１
ＦｃγＲの様々な多型の形態の存在は、本発明のＦｃ変異体の治療的有効性に影響を与えるなお別のパラメーターを提供する。所定のＦｃ変異体の、異なるクラスのＦｃγＲに対する特異性および選択性は、Ｆｃ変異体が所定の疾患の処置のために所定の抗原を標的化する能力に有意に影響するのに対し、これらの受容体の異なる多型の形態に対するＦｃ変異体の特異性または選択性は、どの調査または臨床前実験が試験に適切であるかを、そして、最終的にどの患者群が処置に応答し得るか、または応答し得ないかを、部分的に決定し得る。従って、ＦｃγＲ、Ｃ１ｑ、ＦｃＲｎおよびＦｃＲＨ多型を含むがこれらに限定されないＦｃリガンド多型に対する、本発明のＦｃ変異体の特異性または選択性を使用して、確実な調査および臨床前実験、治験計画、患者の選択、用量依存性（dosing dependence）および／または治験に関する他の局面の選択を導き得る。
さらなる修飾
本発明のＦｃ変異体を含むことに加えて、本発明のＦｃポリペプチドは、１つまたはそれ以上のさらなる修飾を含み得る。当該修飾は、アミノ酸修飾であっても、酵素的または化学的に為される修飾のように、アミノ酸修飾でなくてもよい。さらなるアミノ酸とアミノ酸修飾ではない修飾の組合せを企図している。かかる付加的修飾は、恐らく、そのＦｃポリペプチドに、例えばその安定性、溶解性、機能または臨床使用の増強などのいくらかの改善をもたらす。本発明は、本発明のＦｃ変異体をさらなる修飾と組み合わせることにより成し得る様々な改善を企図している。
本発明のＦｃ変異体を、ＦｃγＲ、Ｃ１ｑまたは他の補体タンパク質、ＦｃＲｎ、ＦｃＲホモログ（ＦｃＲＨ）および／またはまだ発見されていないＦｃリガンドを含むがこれらに限定されない１つまたそれ以上のＦｃリガンドとの変更または最適化された相互作用をもたらすＦｃ領域中の他のアミノ酸修飾と組み合わせ得る。本発明のＦｃポリペプチド自体が、１つまたはそれ以上のＦｃリガンド、例えばＦｃＲＨと、まだ知られていない有用な相互作用特性を有し得ることが注目される。さらなる修飾は、Ｆｃリガンドに対する変更または最適化された親和性および／または特異性をもたらし得る。さらなる修飾は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣおよび／または血清半減期を含むがこれらに限定されない、変更または最適化されたエフェクター機能をもたらし得る。かかる組合せは、相加的、相乗的または新規の特性をもたらし得る。ある実施態様では、本発明のＦｃ変異体を、既知のＦｃ変異体と組み合わせ得る (Duncan et al., 1988, Nature 332:563-564; Lund et al., 1991, J Immunol 147:2657-2662; Lund et al., 1992, Mol Immunol 29:53-59; Alegre et al., 1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al., 1995, Proc Natl Acad Sci U S A 92:11980-11984; Jefferis et al., 1995, Immunol Lett 44:111-117; Lund et al., 1995, Faseb J 9:115-119; Jefferis et al., 1996, Immunol Lett 54:101-104; Lund et al., 1996, J Immunol 157:4963-4969; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogie et al., 2000, J Immunol 164:4178-4184; Reddy et al., 2000, J Immunol 164:1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26; Idusogie et al., 2001, J Immunol 166:2571-2575; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490; Hinton et al., 2004, J Biol Chem 279:6213-6216)（ＵＳ５,６２４,８２１；ＵＳ５,８８５,５７３；ＵＳ６,１９４,５５１；ＰＣＴＷＯ００／４２０７２；ＰＣＴＷＯ９９／５８５７２；ＵＳ２００４／０００２５８７Ａ１）,ＵＳ６,７３７,０５６,ＰＣＴＵＳ２００４／０００６４３,ＵＳＳＮ１０／３７０,７４９およびＰＣＴ／ＵＳ２００４／００５１１２）、全て出典明示により本明細書の一部とする。例えば、ＵＳ６,７３７,０５６、ＰＣＴＵＳ２００４／０００６４３、ＵＳＳＮ１０／３７０,７４９およびＰＣＴ／ＵＳ２００４／００５１１２に記載の通り、置換Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｄ、Ｋ３２６Ｅ、Ｋ３２６Ｄ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４ＡおよびＰ３９６Ｌは、最適化されたＦｃγＲ結合および／または増強されたＡＤＣＣをもたらす。さらに、出典明示により本明細書の一部とする Idusogie et al., 2001, J. Immunology 166:2571-2572 に記載の通り、置換Ｋ３２６Ｗ、Ｋ３２６ＹおよびＥ３３３Ｓは、補体タンパク質Ｃ１ｑへの結合の増強およびＣＤＣの増強をもたらす。最後に、出典明示により本明細書の一部とする Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216 に記載の通り、置換Ｔ２５０Ｑ、Ｔ２５０Ｅ、Ｍ４２８ＬおよびＭ４２８Ｆは、ＦｃＲｎへの結合の増強および薬物動態の改善をもたらす。
ＦｃγＲ、Ｃ１ｑおよびＦｃＲｎへの結合部位はＦｃ領域にあるので、Ｆｃ領域におけるＩｇＧ間の差異は、恐らくＦｃγＲ−およびＣ１ｑ−に媒介されるエフェクター機能の差異に寄与する。例えば、抗体のＦａｂおよびヒンジ領域、またはＦｃ融合体のＦｃ融合パートナーを含むＦｃ変異体の他の非Ｆｃ領域で修飾を行うこともできる。例えば、出典明示により本明細書の一部とするＵＳＳＮ１１／０９０,９８１に記載の通り、抗体のＦａｂおよびヒンジ領域は、抗体依存性細胞介在性細胞殺傷作用（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）および補体依存性細胞殺傷作用（ＣＤＣ）などのエフェクター機能に影響を与え得る。従って、本発明のＦｃ変異体のＦｃ領域の外側での修飾が企図されている。例えば、本発明の抗体は、抗体のＶL、ＣL、ＶH、ＣH１および／またはヒンジ領域に、１つまたはそれ以上のアミノ酸修飾を含み得る。
例えば "Fc variants with novel Fc receptor binding sites" と題する２００３年１２月２２日に出願されたＵＳＳＮ６０／５３１,７５２に記載の通り、他の修飾は、Ｆｃ変異体に、例えば付加的または新規のＦｃ受容体結合部位などの付加的または新規の結合決定基をもたらし得る。ある実施態様では、ある抗体アイソタイプのＦｃ変異体を、異なるアイソタイプのＦｃ受容体に結合するように操作し得る。これは、各Ｆｃ受容体へのＦｃ結合部位が有意に重複しないときに、特に適用し得る。例えば、ＦｃγＲＩへのＩｇＡの結合の構造決定基を、ＩｇＧＦｃ変異体の中に操作し得る。
本発明のＦｃ変異体は、Ｆｃ変異体のインビボの薬物動態学的特性を調節する修飾を含み得る。これらには、新生児Ｆｃ受容体ＦｃＲｎへの親和性を増強する修飾が含まれるが、これらに限定されない（ＵＳＳＮ１０／０２０３５４；ＷＯ２００１ＵＳ００４８４３２；ＥＰ２００１０００９９７０６３；ＵＳ６２７７３７５；ＵＳＳＮ０９／９３３４９７；ＷＯ１９９７ＵＳ０００３３２１；ＵＳ６７３７０５６；ＷＯ２０００ＵＳ００００９７３；Shields et al., 2001, J Biol Chem 276(9): 6591-6604; Zhou et al., 2003, J Mol Biol., 332: 901-913)。これらは、さらに、ｐＨ特異的なやり方でＦｃＲｎ親和性を改変する修飾を含む。インビボ半減期の増強が望ましいいくつかの実施態様では、高いｐＨ（７−８）と比べて低いｐＨ（５.５−６）で特異的にＦｃＲｎ親和性を増強する修飾が望ましい (Hinton et al., 2004, J Biol Chem 279(8): 6213-6216; Dall' Acqua et al., 2002 J Immuno 169: 5171-5180; Ghetie et al., 1997, Nat Biotechnol 15(7): 637-640；ＷＯ２００３ＵＳ００３３０３７；ＷＯ２００４ＵＳ００１１２１３）。例えば、Hinton et al., 2004, "Engineered Human IgG Antibodies with Longer Serum Half-lives in Primates" J Biol Chem 279(8): 6213-6216 に記載の通り、置換Ｔ２５０Ｑ、Ｔ２５０Ｅ、Ｍ４２８ＬおよびＭ４２８Ｆは、ＦｃＲｎへの結合の増強および薬物動態の改善をもたらす。さらなる好ましい修飾は、高いｐＨと比べて低いｐＨで野生型Ｆｃの結合の改善を維持するものである。迅速なインビボクリアランスが望ましい代替的実施態様では、ＦｃＲｎへの親和性を低減する修飾が好ましい（ＵＳ６１６５７４５；ＷＯ１９９３ＵＳ０００３８９５；ＥＰ１９９３０００９１０８００；ＷＯ１９９７ＵＳ００２１４３７；Medesan et al., 1997, J Immunol 158(5): 2211-2217; Ghetie & Ward, 2000, Annu Rev Immunol 18: 739-766; Martin et al. 2001, Molecular Cell 7: 867-877; Kim et al. 1999, Eur J Immunol 29: 2819-2825）。ＦｃＲｎを増強する好ましい変異体は、２００４年１１月１２日に出願されたＵＳＳＮ６０／６２７,７６３；２００５年１月１１日に出願された６０／６４２,８８６；２００５年２月２日に出願された６０／６４９,５０８；２００５年３月１５日に出願された６０／６６２,４６８および "Fc Variants with Altered Binding to FcRn" と題する２００５年４月６日に出願された６０／６６９,３１１（全て出典明示により本明細書の一部とする）に記載されている。
さらなる修飾は、Ｆｃポリペプチド中の残基を相同Ｆｃポリペプチド中の対応する残基に改変するアミノ酸修飾を含み得る。ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣなどのエフェクター機能および血清半減期は、例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭなどの異なる抗体のクラスの間で有意に異なる（参考文献- Michaelsen et al., 1992, Molecular Immunology 29(3): 319-326)。ヒトＩｇＧ１は、治療目的で最も一般的に使用され、エフェクター機能の増強を示す変異体が構築される操作の研究は、この文脈で主に実施されてきた。上記の通り、有意な配列または構造相同性を相互に有する、Ｆｃポリペプチド中の対応または等価残基を決定することができる。同様に、例えば１０／２１／２００４に出願されたＵＳＳＮ６０／６２１,３８７に記載の通り、かかる方法を使用してさらなるアミノ酸修飾をＦｃポリペプチド中に操作し、さらなる最適化特性をもたらすことができる。ある実施態様では、本発明のＦｃポリペプチド中の１つまたはそれ以上の残基を、他の相同Ｆｃポリペプチド中の１つまたはそれ以上の残基と置き換えるアミノ酸修飾を行うことができる。代替的実施態様では、１つまたはそれ以上の本発明のＦｃポリペプチドの領域を、相同Ｆｃポリペプチドの対応する領域で置き換えるように、ハイブリッドＦｃポリペプチドを構築する。例えば、いくつかの研究は、それらの間のエフェクター機能の差異の決定基を調べるために、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４変異体を探査した。例えば、Canfield & Morrison, 1991, J Exp Med 173: 1483-1491; Chappel et al., 1991, Proc Natl Acad Sci USA 88(20): 9036-9040; Chappel et al., 1993, J Biol Chem 268: 25124-25131; Tao, Canfield, and Morrison, 1991, J Exp Med 173: 1025-1028; Tao et al., 1993, J Exp Med 178: 661-667; Redpath et al., 1998, Human Immunology, 59, 720-727 参照。
ある実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、１つまたはそれ以上の操作された糖形態を含む。「操作された糖形態」は、本明細書で使用されるとき、Ｆｃ変異体に共有結合している炭水化物組成であって、当該炭水化物組成が親Ｆｃ変異体のものと化学的に異なるものを意味する。操作された糖形態は、エフェクター機能の増強または低減を含むがこれらに限定されるものではない、様々な目的に有用であり得る。操作された糖形態は、当分野で知られている様々な方法により生成させ得る (Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473); (ＵＳ６,６０２,６８４；ＵＳＳＮ１０／２７７,３７０；ＵＳＳＮ１０／１１３,９２９；ＰＣＴＷＯ００／６１７３９Ａ１；ＰＣＴＷＯ０１／２９２４６Ａ１；ＰＣＴＷＯ０２／３１１４０Ａ１；ＰＣＴＷＯ０２／３０９５４Ａ１)；（Potelligent(商標)技法 [Biowa, Inc., Princeton, NJ]; GlycoMAb(商標)グリコシレーション操作技法 [GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland]）。これらの技法の多くは、例えば、操作または他のやり方で、Ｆｃ変異体を様々な生物または細胞株で発現させることにより（例えば、Ｌｅｃ−１３ＣＨＯ細胞またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞）、グリコシル化経路に関与する酵素を調節することにより（例えば、ＦＵＴ８［α１,６−フコシルトランスフェラーゼ］および／またはβ１−４−Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＩＩＩ［ＧｎＴＩＩＩ］）、または、Ｆｃ変異体が発現された後に炭水化物（複数も可）を修飾することにより、フコシル化および／または、バイセクティングオリゴサッカライドのレベルを制御することをベースとする。操作された糖形態は、典型的に、この異なる炭水化物またはオリゴサッカライドを表す；従って、Ｆｃ変異体、例えば抗体またはＦｃ融合体は、操作された糖形態を含み得る。あるいは、操作された糖形態は、この異なる炭水化物またはオリゴサッカライドを含むＦｃ変異体を表し得る。
本発明のＦｃ変異体は、エフェクター機能自体に特異的に関連しない特性の最適化をもたらす１つまたはそれ以上の修飾を含み得る。当該修飾は、アミノ酸修飾であっても、酵素的または化学的に為される修飾であってもよい。かかる修飾は、恐らく、Ｆｃ変異体に例えばその機能または臨床使用の増強などのいくらかの改善をもたらす。本発明は、本発明のＦｃ変異体をさらなる修飾と組み合わせることにより成し得る様々な改善を企図している。
好ましい実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、ヒトでの免疫原性を低減する修飾を含み得る。最も好ましい実施態様では、本発明のＦｃ変異体の免疫原性を、"Methods of Generating Variant Proteins with Increased Host String Content and Compositions Thereof"と題する２００４年１２月３日に出願されたＵＳＳＮ１１／００４,５９０に記載の方法を使用して低減させる。代替的実施態様では、本発明の抗体をヒト化する (Clark, 2000, Immunol Today 21:397-402)。「ヒト化」抗体は、本明細書で使用するとき、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）および非ヒト（通常マウスまたはラット）抗体由来の１またはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体を意味する。ＣＤＲを提供する非ヒト抗体は、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ばれる。ヒト化は、主としてドナーＣＤＲのアクセプター（ヒト）ＶＬおよびＶＨフレームワークへの移植による（Winter ＵＳ５２２５５３９）。この戦略は、「ＣＤＲ移植」と呼ばれる。選択されたアクセプターフレームワークの残基を、対応するドナー残基へ「逆突然変異導入（backmutation）」することは、最初に移植されたコンストラクトにおいて失われた親和性を回復させるために、しばしば必要とされる（ＵＳ５５３０１０１；ＵＳ５５８５０８９；ＵＳ５６９３７６１；ＵＳ５６９３７６２；ＵＳ６１８０３７０；ＵＳ５８５９２０５；ＵＳ５８２１３３７；ＵＳ６０５４２９７；ＵＳ６４０７２１３）。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域、典型的にはヒト免疫グロブリンのもの、の少なくとも一部も含み、従って典型的にはヒトＦｃ領域を含む。非ヒト抗体をヒト化および再形成するための様々な技法および方法が当分野で周知である (Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA) およびそこで引用されている参考文献を参照)。ヒト化法には、Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al.,1988; Nature 332:323-329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33; He et al., 1998, J Immunol 160: 1029-1035; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9, Presta et al., 1997, Cancer Res 57(20):4593-9; Gorman et al., 1991, Proc Natl Acad Sci USA 88:4181-4185; O'Connor et al., 1998, Protein Eng 11:321-8 に記載の方法が含まれるが、これらに限定されない。例えば Roguska et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:969-973 に記載の通り、ヒト化または非ヒト抗体可変領域の免疫原性を低減する他の方法は、再表面形成（resurfacing）方法を含み得る。ある実施態様では、Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678-10684; Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 22611-22618; Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915; Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16(10):753-759 に記載の方法を含むがこれらに限定されない、選択をベースとする方法を用いて、抗体可変領域をヒト化および／または親和性成熟化してもよい。他のヒト化方法には、USSN 09/810,502; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125; De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076-3084 に記載の方法を含むがこれらに限定されない、ＣＤＲの一部のみを移植することが含まれ得る。例えばＵＳＳＮ１０／１５３,１５９および関連出願に記載の通り、ヒト化および親和性成熟化のために、構造をベースとする方法を用いてもよい。
免疫原性を低減させる修飾は、親配列に由来する加工ペプチドのＭＨＣタンパク質への結合を低減する修飾を含み得る。例えば、高親和性でいずれかの一般的なＭＨＣ対立遺伝子に結合すると予測される免疫エピトープが全くないか、または最小数であるように、アミノ酸修飾を操作する。タンパク質配列中のＭＨＣ結合エピトープを同定するいくつかの方法が当分野で知られており、本発明のＦｃ変異体のエピトープをスコア付けするのに使用し得る。例えばＷＯ９８／５２９７６；ＷＯ０２／０７９２３２；ＷＯ００／３３１７；ＵＳＳＮ０９／９０３,３７８；ＵＳＳＮ１０／０３９,１７０；ＵＳＳＮ６０／２２２,６９７；ＵＳＳＮ１０／３３９７８８；ＰＣＴＷＯ０１／２１８２３；およびＰＣＴＷＯ０２／００１６５；Mallios, 1999, Bioinformatics 15: 432-439; Mallios, 2001, Bioinformatics 17: 942-948; Sturniolo et al., 1999, Nature Biotech. 17: 555-561；ＷＯ９８／５９２４４；ＷＯ０２／０６９２３２；ＷＯ０２／７７１８７；Marshall et al., 1995, J. Immunol. 154: 5927-5933; および Hammer et al., 1994, J. Exp. Med. 180: 2353-2358 参照。配列をベースとする情報を使用して、所定のペプチド−ＭＨＣ相互作用について結合スコアを決定できる（例えば Mallios, 1999, Bioinformatics 15: 432-439; Mallios, 2001, Bioinformatics 17: p942-948; Sturniolo et. al., 1999, Nature Biotech. 17: 555-561 参照）。構造をベースとする方法を使用することができ、その方法では、所定のペプチドをコンピューター処理により所定のＭＨＣ分子のペプチド結合溝に置き、相互作用エネルギーを決定する（例えば、ＷＯ９８／５９２４４およびＷＯ０２／０６９２３２参照）。かかる方法は、「スレッディング（threading）」法と呼ばれることもある。あるいは、純粋に実験的な方法を使用できる；例えば、関心のあるタンパク質に由来する重なり合うペプチドのセットを、Ｔ細胞活性化および／または他の免疫応答の局面を誘導する能力について、実験的に試験できる（例えばＷＯ０２／７７１８７参照）。好ましい実施態様では、行列法を使用して、各９残基の枠について、タンパク質配列に沿ってＭＨＣ結合性向スコアを算出する（Sturniolo et. al., 前出; Marshall et. al., 1995, J. Immunol. 154: 5927-5933, and Hammer et. al., 1994, J. Exp. Med. 180: 2353-2358 参照）。これらの残基のサブセットについてのみスコアを考慮することもでき、または、関心のある９残基の枠の前後のペプチド残基の同一性を考慮することもできる。その行列は、様々なヒトクラスＩＩＭＨＣ分子のペプチド結合ポケットと相互作用する特定のアミノ酸についての結合スコアを含む。最も好ましい実施態様では、その行列におけるスコアは、ペプチド結合研究から実験的に得られるものである。代替的な好ましい実施態様では、所定のポケットに結合している所定のアミノ酸についてのスコアを、実験的に特徴解析された対立遺伝子から、そのポケットに沿って並ぶ同一または類似残基を有するさらなる対立遺伝子に外挿する。外挿により作られる行列を、「仮想行列」と呼ぶ。代替的実施態様では、さらなるアミノ酸修飾を操作し、未加工の分子がＢ細胞受容体および循環している抗体と相互作用する性向を低減させ得る。
本発明の抗体およびＦｃ融合体は、例えば、抗体のＦａｂ領域またはＦｃ融合パートナーなどの、Ｆｃ領域の外側の１つまたはそれ以上の領域に、最適な特性をもたらすアミノ酸修飾を含み得る。ある実施態様では、本発明の抗体の可変領域は、親和性成熟化し得る。即ち、抗体のＶHおよび／またはＶLドメインでアミノ酸修飾を行い、その標的抗原への抗体の結合を増強する。同様に、Ｆｃ融合パートナー中で修飾を行い、Ｆｃ融合体のその標的抗原に対する親和性を増強し得る。かかるタイプの修飾は、標的抗原への結合について、会合および／または解離速度を改善し得る。他の修飾には、標的抗原への選択性を別の標的に比して改善するものが含まれる。これらには、標的で発現される抗原への選択性を非標的細胞に比して改善する修飾が含まれる。標的認識特性に対する他の改善を、さらなる修飾によりもたらし得る。かかる特性には、特異的な動力学的特性（即ち、会合および解離の動力学）、別の標的と対比した特定の標的への選択性、および別の形態と対比した標的の特定の形態への選択性が含まれるがこれらに限定されない。例には、全長対スプライス変異体、腫瘍細胞などのある種の細胞タイプでのみ発現される異常形態の抗原、細胞表面対可溶形態、様々な多型の変異体への選択性、または標的の特定の立体配座形態への選択性が含まれる。
本発明のＦｃ変異体は、Ｆｃ変異体の内在化の低減または増強をもたらす１つまたはそれ以上の修飾を含み得る。ある実施態様では、１つまたはそれ以上のＦｃリガンドとの相互作用を介して起こるＦｃ変異体の細胞内在化を低減させるために、本発明のＦｃ変異体を利用するか、またはさらなる修飾と組み合わせることができる。この特性は、エフェクター機能を増強し、潜在的に本発明のＦｃ変異体の免疫原性を低減すると期待し得る。あるいは、本発明の本Ｆｃ変異体のＦｃ変異体は、直接またはさらなる修飾と組み合わせて、１つまたはそれ以上のＦｃリガンドとの相互作用を介して起こるＦｃ変異体の細胞内在化を増強するために利用できる。例えば、好ましい実施態様では、樹状細胞で発現され、免疫応答の初期に活性であるＦｃγＲＩへの結合の増強をもたらすＦｃ変異体を使用する。この戦略は、Ｆｃ変異体内または結合した融合またはコンジュゲートパートナー中で、ＭＨＣ分子によるＦｃペプチドフラグメントの認識および提示を促進するさらなる修飾と組み合わせることにより、さらに増強できる。これらの戦略は、標的抗原のプロセッシングを増強し、それにより標的抗原の抗原性を改善し（Bonnerot and Amigorena, 1999, Immunol Rev. 172:279-84）、ヒト免疫系による獲得免疫応答およびより大きい標的細胞殺傷を促進すると期待される。これらの戦略は、標的化される抗原が細胞表面から脱落するときに、特に有利であり得る。これらの概念のさらなる適用は、イディオタイプワクチン免疫治療で起こり、そこでは、患者のリンパ腫細胞により産生されるクローン特異的抗体を使用して患者にワクチン接種する。
好ましい実施態様では、安定性、溶解性および多量体化状態を含むがこれらに限定されない本発明のＦｃ変異体の生物物理学的特性を改善するために、修飾を行う。修飾は、例えば、より高い安定性をもたらすなど、Ｆｃ変異体により好都合な細胞内相互作用をもたらす置換、または、より高い安定性のための露出している非極性アミノ酸の極性アミノ酸による置換を含むことができる。数々の最適化の目標および方法は、ＵＳＳＮ１０／３７９,３９２に記載されており、それは、本発明のＦｃ変異体をさらに最適化するために、さらなる修飾を操作するのに用途を見出し得る。腫瘍提示が増強されるように、または、所望によりインビボクリアランス速度が高まるように、本発明のＦｃ変異体を、多量体化状態またはサイズを低減するさらなる修飾と組み合わせることもできる。
本発明のＦｃ変異体に対する他の修飾には、ホモ二量体またはホモ多量体分子の特異的形成を可能にするものが含まれる。かかる修飾には、操作されたジスルフィド並びに化学修飾または凝集法が含まれるがこれらに限定されず、これらは、共有結合性のホモ二量体またはホモ多量体を生成させるメカニズムを提供し得る。例えば、かかる分子の操作方法および組成物は、Kan et al., 2001, J. Immunol., 2001, 166: 1320-1326; Stevenson et al., 2002, Recent Results Cancer Res. 159: 104-12; US 5,681,566; Caron et al., 1992, J Exp Med 176:1191-1195 および Shopes, 1992, J Immunol 148(9):2918-22 に記載されている。本発明の変異体に対するさらなる修飾には、ヘテロ二量体、ヘテロ多量体、二機能性および／または多機能性の分子の特異的形成を可能にするものが含まれる。かかる修飾には、ＣH３ドメインにおける１つまたはそれ以上のアミノ酸置換が含まれるがこれらに限定されず、ここでは、置換がホモ二量体形成を低減させ、ヘテロ二量体形成を増加させる。例えば、かかる分子の操作方法および組成物は、Atwell et al., 1997, J Mol Biol 270(1):26-35 および Carter et al., 2001, J Immunol Methods 248:7-15に記載されている。さらなる修飾には、ヒンジおよびＣＨ３ドメインにおける修飾が含まれ、ここでは、修飾が二量体を形成する性向を低減させる。
さらなる実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、タンパク質分解部位を除去する修飾を含む。これらには、例えば、生産収量を低減させるプロテアーゼ部位、並びにインビボで投与されたタンパク質を分解するプロテアーゼ部位が含まれ得る。好ましい実施態様では、さらなる修飾を行って、アミド分解（即ち、グルタミニルおよびアスパラギニル残基の対応するグルタミルおよびアスパラチル残基へのアミド分解）、酸化、およびタンパク質分解部位などの共有結合性分解部位を除去する。除去するのに特に有用なアミド分解部位は、グリシンが続くアスパラギニルおよびグルタミル残基（各々、ＮＧおよびＱＧモチーフ）を含むがこれらに限定されない、増強されたアミド分解の性向を有するものである。そのような場合、いずれかの残基の置換は、アミド分解の傾向を有意に低減できる。一般的酸化部位には、メチオニンおよびシステイン残基が含まれる。導入または除去できる他の共有結合性修飾には、プロリンおよびリジンの水酸化、セリルまたはスレオニル残基の水酸基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖の"−アミノ基のメチル化［T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)］、Ｎ末端アミンのアセチル化および任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。さらなる修飾には、Ｎ連結またはＯ連結グリコシル化およびリン酸化などの翻訳後修飾が含まれ得るが、これらに限定されない。
修飾には、生物学的物質（biologic）の生産に一般的に使用される宿主または宿主細胞からの発現および／または精製の収量を改善するものが含まれ得る。これらには、様々な哺乳動物細胞株（例えばＣＨＯ）、酵母細胞株、細菌細胞株および植物が含まれるがこれらに限定されない。さらなる修飾には、重鎖が鎖間ジスルフィド結合を形成する能力を除去または低減する修飾が含まれる。さらなる修飾には、重鎖が鎖内ジスルフィド結合を形成する能力を除去または低減する修飾が含まれる。
本発明のＦｃ変異体は、例えば、Cropp & Shultz, 2004, Trends Genet. 20(12):625-30, Anderson et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101(2):7566-71, Zhang et al., 2003, 303(5656):371-3, および Chin et al., 2003, Science 301(5635):964-7に記載の方法を含むがこれらに限定されない、Schultz と共同研究者により開発された技術を使用して導入される非天然アミノ酸の使用を含む修飾を含み得る。いくつかの実施態様では、これらの修飾は、上記で論じた様々な機能的、生物物理学的、免疫学的、または製造上の特性の操作を可能にする。さらなる実施態様では、これらの修飾は、他の目的でのさらなる化学修飾を可能にする。他の修飾が本発明で企図されている。例えば、Ｆｃ変異体は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン類またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーなどの様々な非タンパク質性ポリマーの１つに連結していてもよい。さらなるアミノ酸修飾を行い、Ｆｃ変異体の特異的または非特異的な化学または翻訳後修飾を可能にし得る。かかる修飾には、ＰＥＧ化（PEGylation）およびグリコシル化が含まれるが、これらに限定されない。ＰＥＧ化を可能にするために利用できる特異的置換には、ＰＥＧまたは他の重合性部分を結合させるために効率的かつ特異的なカップリング化学を使用できるように、新規システイン残基または非天然アミノ酸を導入することが含まれるがこれらに限定されない。特異的グリコシル化部位の導入は、新規Ｎ−Ｘ−Ｔ／Ｓ配列を本発明のＦｃ変異体に導入することにより達成できる。
本発明のＦｃ変異体は、１つまたはそれ以上の他の分子またはポリペプチドに融合またはコンジュゲートさせてよい。コンジュゲートおよび融合パートナーは、低分子化学化合物およびポリペプチドを含むいかなる分子でもよい。例えば、様々な抗体コンジュゲートおよび方法が、Trail et al., 1999, Curr. Opin. Immunol. 11:584-588 に記載されている。可能なコンジュゲートパートナーには、サイトカイン類、細胞傷害性物質、毒素、放射性同位元素、化学療法剤、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤および他の治療的に活性な物質が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、コンジュゲートパートナーは、さらにペイロード（payload）と考えられ得る。つまり、コンジュゲートの目標は、Ｆｃ変異体による、コンジュゲートパートナーの、標的細胞、例えば癌細胞または免疫細胞への送達の標的化である。従って、例えば、毒素を抗体またはＦｃ融合体へコンジュゲートすることは、標的抗原を発現している細胞への当該毒素の送達を標的化する。
ある実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、サイトカインに融合またはコンジュゲートされる。「サイトカイン」は、本明細書で使用されるとき、一細胞群から放出され、細胞間媒介物質として他の細胞に作用するタンパク質を表す一般用語を意味する。例えば、Penichet et al., 2001, J Immunol Methods 248:91-101 に記載の通り、サイトカインを抗体に融合させ、所望の特性のアレイを提供する。かかるサイトカインの例は、リンホカイン、モノカインおよび伝統的なポリペプチドホルモンである。ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；リラキシン；プロリラキシン；濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝細胞成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子−アルファおよび−ベータ；ミュラー管阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−ベータなどの神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータなどのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インシュリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導（osteoinductive）因子；インターフェロン−アルファ、ベータおよびガンマなどのインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５などのインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−アルファまたはＴＮＦ−ベータなどの腫瘍壊死因子；Ｃ５ａ；およびＬＩＦおよびキット（kit）リガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子は、サイトカインに含まれる。本明細書で使用されるとき、用語サイトカインには、天然の供給源由来または組換え細胞培養由来のタンパク質、および天然配列のサイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。
別の実施態様では、本発明のＦｃポリペプチドは、細菌、真菌、植物または動物起源の低分子毒素および酵素的に活性な毒素（それらのフラグメントおよび／または変異体を含む）を含むがこれらに限定されるものではない毒素に、融合、コンジュゲートまたは機能し得るように連結している。低分子毒素には、カリケアマイシン（calicheamicin）、メイタンシン（maytansine）（ＵＳ５,２０８,０２０）、トリコセン（trichothene）およびＣＣ１０６５が含まれるが、これらに限定されない。本発明のある実施態様では、Ｆｃポリペプチドを、１つまたはそれ以上のメイタンシン分子にコンジュゲートさせる（例えば、抗体分子１個につき約１個ないし約１０個のメイタンシン分子）。メイタンシンを、例えば、Ｍａｙ−ＳＳ−Ｍｅに変換し得、それをＭａｙ−ＳＨ３に還元し、改変されたＦｃポリペプチドと反応させ（Chari et al., 1992, Cancer Research 52: 127-131）、メイタンシノイド−抗体またはメイタンシノイド−Ｆｃ融合体コンジュゲートを生成させ得る。興味深い他のコンジュゲートは、１またはそれ以上のカリケアマイシン分子に結合したＦｃポリペプチド、例えば抗体またはＦｃ融合体を含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、ピコモル濃度以下の濃度で二本鎖ＤＮＡの破壊をもたらす能力を有する。使用し得るカリケアマイシン構造類似体には、γ1 1、α2 1、α3、Ｎ−アセチル−γ1 1、ＰＳＡＧ、およびθ1 1（Hinman et al., 1993, Cancer Research 53:3336-3342；Lode et al., 1998, Cancer Research 58:2925-2928） (US 5,714,586；US 5,712,374；US 5,264,586；US 5,773,001）が含まれるが、これらに限定されない。アウリスタチン（auristatin）Ｅ（ＡＥ）およびモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）などのドラスタチン（Dolastatin）１０類似体は、本発明のＦｃ変異体のためのコンジュゲートとして用途を見出し得る（Doronina et al., 2003, Nat Biotechnol 21(7）:778-84；Francisco et al., 2003 Blood 102(4）:1458-65）。有用な酵素的に活性な毒素には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、菌体外毒素Ａ鎖（緑濃菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（modeccin）Ａ鎖、アルファ−サルシン（sarcin）、オオアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（momordica charantia）阻害剤、クルシン（curcin）、クロチン（crotin）、サポナリア（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン（gelonin）、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）およびトリコテセン（tricothecene）が含まれるが、これらに限定されない。例えば、出典明示により本明細書の一部とするＰＣＴ ＷＯ９３／２１２３２参照。本発明はさらに、本発明の抗体またはＦｃ融合体と核酸分解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼ、またはデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）などのＤＮＡエンドヌクレアーゼ）との間のコンジュゲートを企図している。
代替的実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、放射性同位元素に、融合、コンジュゲートまたは機能し得るように連結し、放射性コンジュゲートを形成し得る。放射性コンジュゲートの抗体およびＦｃ融合体を産生するために、様々な放射活性同位元素が利用可能である。例には、Ａｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32およびＬｕの放射性同位元素が含まれるが、これらに限定されない。例えば、参考文献を参照されたい。
さらに他の実施態様では、本発明のＦｃ変異体を、腫瘍の予標的化に利用するために、「受容体」（例えばストレプトアビジン）に結合させ得る。その場合、Ｆｃ変異体−受容体コンジュゲートを患者に投与し、続いて除去剤（clearing agent）を使用して未結合のコンジュゲートを循環から除去し、その後、細胞傷害性物質（例えば、放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートした「リガンド」（例えば、アビジン）を投与する。別の実施態様では、抗体依存性酵素媒介プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）を用いるために、Ｆｃ変異体を酵素にコンジュゲートまたは機能し得るように連結させる。ＡＤＥＰＴは、Ｆｃ変異体を、プロドラッグ（例えば、ペプチド化学療法剤、ＰＣＴ ＷＯ８１／０１１４５参照）を活性な抗癌薬に変換するプロドラッグ活性化酵素に、コンジュゲートまたは機能し得るように連結させることにより使用し得る。例えば、ＰＣＴ ＷＯ８８／０７３７８およびＵＳ４,９７５,２７８参照。ＡＤＥＰＴに有用な免疫結合体の酵素成分には、プロドラッグに対して、それをより活性の高い細胞傷害性形態に変換するようなやり方で作用する能力のある、いかなる酵素も含まれる。本発明の方法に有用な酵素には、ホスフェート含有プロドラッグを遊離の薬物に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ；サルフェート含有プロドラッグを遊離の薬物に変換するのに有用なアリールサルファターゼ；非毒性の５−フルオロシトシンを抗癌薬の５−フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬物に変換するのに有用な、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシンなどのプロテアーゼ類、カルボキシペプチダーゼ類およびカテプシン類（カテプシンＢおよびＬなど）；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ類；グリコシル化プロドラッグを遊離の薬物に変換するのに有用な、ベータ−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼ（neuramimidase）などの炭水化物切断酵素；アルファ−ラクタム類で誘導された薬物を遊離の薬物に変換するのに有用なベータ−ラクタマーゼ；および、アミン窒素でフェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基により各々誘導体化された薬物を遊離の薬物に変換するのに有用な、ペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼなどのペニシリンアミダーゼ類が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、酵素活性を有する抗体（当分野で「抗体酵素」としても知られる）を、本発明のプロドラッグを遊離の活性な薬物に変換するのに使用できる（例えば、Massey, 1987, Nature 328: 457-458参照）。Ｆｃ変異体−抗体酵素結合体は、腫瘍細胞群に抗体酵素を送達するために調製できる。様々なさらなるコンジュゲートが、本発明のＦｃ変異体に企図されている。様々な化学療法剤、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤および他の治療剤は、下記に記載されており、それらはＦｃ変異体コンジュゲートとして用途を見出す。
融合およびコンジュゲートパートナーとしてまた企図されているのは、Ｆｃポリペプチドである。従って、Ｆｃ変異体は、２つまたはそれ以上のＦｃ領域を含む多量体Ｆｃポリペプチドであり得る。かかる分子の利点は、それが単一のタンパク質分子に、Ｆｃ受容体への複数の結合部位を提供することである。ある実施態様では、Ｆｃ領域は、化学的操作アプローチを使用して連結させ得る。例えば、ＦａｂおよびＦｃは、ヒンジ中のシステイン残基に設けたチオエーテル結合により連結させ得、ＦａｂＦｃ2などの分子を生成させる（Kan et al., 2001, J. Immunol., 2001, 166: 1320-1326; Stevenson et al., 2002, Recent Results Cancer Res. 159: 104-12; US 5,681,566）。Ｆｃ領域は、例えば Caron et al., 1992, J. Exp. Med. 176:1191-1195, および Shopes, 1992, J. Immunol. 148(9):2918-22 に記載の通り、ジスルフィド操作および／または化学的架橋を使用して連結させ得る。好ましい実施態様では、Ｆｃ領域を遺伝子的に連結させ得る。例えば、抗体のＦａｂとＦｃ領域の間で複数のＣγ２ドメインを融合させる (White et al., 2001, Protein Expression and Purification 21: 446-455）。好ましい実施態様では、１２／２２／２００３に出願された"Fc polypeptides with novel Fc receptor binding sites"と題するＵＳＳＮ６０／５３１,７５２に記載の通り、Ｆｃ変異体中のＦｃ領域は、縦に連結したＦｃ領域に、遺伝子的に連結している。縦に連結したＦｃポリペプチドは、２個またはそれ以上のＦｃ領域、好ましくは１個ないし３個、最も好ましくは２個のＦｃ領域を含み得る。最も好都合な構造および機能の特性を有するホモまたはヘテロの縦に連結したＦｃ変異体を得るために、数々の操作コンストラクトを探査するのが有利であり得る。縦に連結したＦｃ変異体は、ホモの縦に連結したＦｃ変異体であってよく、それは、１つのアイソタイプのＦｃ変異体を、同じアイソタイプの他のＦｃ変異体に遺伝子的に融合させたものである。縦に連結したＦｃポリペプチドには複数のＦｃγＲ、Ｃ１ｑおよび／またはＦｃＲｎ結合部位があるので、エフェクター機能および／または薬物動態が増強され得ることが予想される。代替的実施態様では、異なるアイソタイプのＦｃ変異体を縦に連結し得る。それは、ヘテロの縦に連結したＦｃ変異体と呼ばれる。例えば、ＦｃγＲおよびＦｃαＲＩ受容体を標的化する能力のために、ＦｃγＲとＦｃαＲＩの両方に結合するＦｃ変異体は、有意な臨床的改善をもたらし得る。
当業者に理解される通り、実際に、融合体とコンジュゲートの概念および定義は重なり合っている。融合体またはコンジュゲートとしてのＦｃ変異体の設計は、何らかの特定の本発明の実施態様に制限されることを意図しない。むしろ、これらの用語は、任意の本発明のＦｃ変異体が、遺伝子的、化学的またはその他のやり方で、１つまたはそれ以上のポリペプチドまたは分子に連結されていくつかの所望の特性をもたらし得る広範な概念を伝えるために、大まかに使用される。
融合およびコンジュゲートパートナーは、Ｎ−もしくはＣ−末端、または両末端間にある残基を含む、本発明のＦｃ変異体のいかなる領域にも連結させ得る。好ましい実施態様では、融合またはコンジュゲートパートナーは、Ｆｃ変異体のＮ−またはＣ末端、最も好ましくはＮ末端で連結している。様々なリンカーが、Ｆｃ変異体を融合またはコンジュゲートパートナーに共有結合的に連結するために、またはＦｃ融合体を生成させるために、本発明で用途を見出し得る。「リンカー」「リンカー配列」「スペーサー」「つなぎ（tethering）配列」またはこれらの文法的等価物は、本明細書において、２個の分子を連結し、しばしば２個の分子を好ましい配置に置くのに役立つ分子または分子の群（モノマーまたはポリマーなど）を意味する。分子を一緒に共有結合させるのに、数々の戦略を使用し得る。これらには、タンパク質またはタンパク質ドメインのＮ−およびＣ−末端間のポリペプチド連結、ジスルフィド結合を介する連結、化学的架橋剤を介する連結が含まれるが、これらに限定されない。この実施態様のある態様では、リンカーは、組換え技法またはペプチド合成により生成されるペプチド結合である。２個のポリペプチド鎖を連結しようとする特定の場合に適するリンカーの選択は、様々なパラメーターに依存し、これには、２個のポリペプチド鎖の性質（例えば、それらが自然にオリゴマー形成するか否か）、もし知られていれば、連結させようとするＮ−およびＣ−末端間の距離、および／またはタンパク質分解および酸化に対するリンカーの安定性が含まれるが、これらに限定されない。さらに、リンカーは、可撓性を与えるアミノ酸残基を含有してもよい。従って、リンカーペプチドは、以下のアミノ酸残基を優勢に含んでもよい：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＴｈｒ。リンカーペプチドは、それらが所望の活性を保持するように相互に対して正しい配置をとるようなやり方で２個の分子を連結するのに適切な長さを有するべきである。この目的に適する長さには、少なくとも１個、そしてせいぜい５０個のアミノ酸残基が含まれる。好ましくは、リンカーは、約１個ないし３０個のアミノ酸の長さであり、１ないし２０個のアミノ酸の長さが最も好ましい。加えて、リンカーペプチドに含まれるように選択されるアミノ酸残基は、ポリペプチドの活性に有意に干渉しない特性を示すべきである。従って、リンカーペプチド全体は、ポリペプチドの活性と相反する電荷を示したり、内部の折り畳みを妨害したり、あるいはモノマー中の１またはそれ以上のアミノ酸残基と、受容体モノマードメインの結合をひどく妨げる結合または他の相互作用を形成したりすべきではない。有用なリンカーには、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（ＧＧＧＧＳ）ｎおよび（ＧＧＧＳ）ｎを含み、ここで、ｎは、少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマーおよびシェーカー型カリウムチャネルのテザー（tether）などの他の柔軟なリンカー、および当業者に明らかである通りの多種多様な他の可撓性リンカーが含まれる。グリシン−セリンポリマーが好ましい。なぜなら、これらのアミノ酸が両方とも比較的構造化されず、従って成分間の中立的テザーとして役立ち得るからである。第２に、セリンは親水性であり、従って、球状グリシン鎖になり得るものを可溶化できる。第３に、類似の鎖は、一本鎖抗体などの組換えタンパク質のサブユニットを連結するのに有効であると示された。適するリンカーは、２本のポリペプチド鎖間のギャップを架橋できる天然産生モチーフについて既知三次元構造のデータベースをスクリーニングすることによっても同定し得る。好ましい実施態様では、リンカーは、ヒトの患者に投与されるときに免疫原性ではない。従って、リンカーは、低免疫原性であるか、低免疫原性であると考えられるように選択し得る。例えば、ヒトに天然に存在するリンカーを選択し得る。最も好ましい実施態様では、リンカーは、抗体のＦａｂおよびＦｃ領域を連結する配列である、抗体のヒンジ領域の配列を有する；あるいは、リンカーは、ヒンジ領域の一部を含む配列、または抗体のヒンジ領域に実質的に類似する配列を有する。適するリンカーを得る他のやり方は、単純なリンカー、例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを、ランダムな突然変異導入を通して最適化することによる。あるいは、一度適するポリペプチドリンカーを定めたら、さらなるリンカーポリペプチドを創成して、連結されているドメインとより最適に相互作用するアミノ酸を選択し得る。本発明で使用し得る他のタイプのリンカーには、人工ポリペプチドリンカーおよびインテインが含まれる。他の実施態様では、２つの分子を連結するためにジスルフィド結合を設計する。他の実施態様では、リンカーは、化学架橋剤である。例えば、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（ジメチルアジプイミデートＨＣＬなど）、活性エステル類（ジスクシニミジルスベレートなど）、アルデヒド類（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート類（トリエン（tolyene）２,６−ジイソシアネートなど）、およびビス−活性フッ素化合物（１,５−ジフルオロ−２,４−ジニトロベンゼンなど）を含むがこれらに限定されない、様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用し得る。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al., 1971, Science 238:1098 に記載の通りに製造できる。化学リンカーは、同位元素のキレート化を可能にし得る。例えば、炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に放射線ヌクレオチドをコンジュゲートさせるための例示的キレート化剤である（ＰＣＴＷＯ９４／１１０２６参照）。リンカーは、切断可能であり得、細胞中で細胞傷害性の薬物の放出を助長し得る。例えば、酸で変化しやすい（acid-labile）リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー (Chari et al., 1992, Cancer Research 52: 127-131）を使用し得る。あるいは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレンまたはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーを含むがこれらに限定されない様々な非タンパク質性ポリマーは、本発明のＦｃ変異体を融合またはコンジュゲートパートナーに連結してＦｃ融合体を生成させるか、または、本発明のＦｃ変異体をコンジュゲートに連結するリンカーとして、用途を見出し得る。
操作方法
設計戦略、コンピューター処理スクリーニングの方法およびライブラリーの生成方法は、"Optimized Fc Variants and Methods for their Generation"と題するＵＳＳＮ１０／６７２,２８０およびＵＳＳＮ１０／８２２,２３１に記載されており、これらを出典明示により本明細書の一部とする。これらの戦略、アプローチ、技法および方法を個別にまたは様々な組合せで適用して、最適化Ｆｃ変異体を生成する。
Ｆｃ変異体の実験的産生
本発明は、Ｆｃ変異体を産生し、実験的に試験する方法を提供する。記載した方法は、本発明をいかなる特定の適用または操作理論にも制限することを意味しない。むしろ、提供される方法は、１またはそれ以上のＦｃ変異体を実験的に産生および試験し、変異Ｆｃ変異体を得てもよいことを一般的に例示説明する意味である。Ｆｃ変異体は、本明細書で厳密に定義した通りのＦｃ領域、そのドメインまたはフラグメント、または抗体またはＦｃ融合体などのＦｃを含む大きいポリペプチドとしてなど、いかなる文脈で産生およびスクリーニングしてもよい。抗体の分子生物学、発現、精製およびスクリーニングのための一般方法は、Antibody Engineering, edited by Duebel & Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001；および Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689；Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76; Antibodies: A Laboratory Manual by Harlow & Lane, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 に記載されている。
本発明のある実施態様では、Ｆｃ変異体をコードする核酸を創生する。それは、次いで、所望により宿主細胞にクローニングされ、発現され、アッセイされ得る。このように、各タンパク質配列をコードする核酸、そして特にＤＮＡを作成し得る。これらの実践は周知手法を使用して実行される。例えば、本発明で用途を見出し得る様々な方法が、Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001） および Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons）に記載されている。当業者にはわかるように、多数の配列を含むライブラリーの配列そのものの生成は、潜在的に高価であり時間がかかる。従って、本発明のライブラリーを効率的に生成させるのに使用し得る様々な技法がある。本発明で用途を見出し得るそのような方法は、ＵＳ６,４０３,３１２；ＵＳＳＮ０９／７８２,００４；ＵＳＳＮ０９／９２７,７９０；ＵＳＳＮ１０／２１８,１０２；ＰＣＴ ＷＯ０１／４００９１；およびＰＣＴ ＷＯ０２／２５５８８に記載または参照されている。そのような方法には、遺伝子集合方法、ＰＣＲをベースとする方法およびＰＣＲの変形を使用する方法、リガーゼ連鎖反応をベースとする方法、合成的混合、誤りがちな増幅方法およびランダムな変異を有するオリゴを使用する方法で用いられるもののような集積オリゴ（pooled oligo）方法、古典的部位特異的変異誘発方法、カセット変異誘発、および他の増幅および遺伝子合成方法が含まれるが、これらに限定されない。当分野で知られているように、遺伝子集合、変異誘発、ベクターのサブクローニングなどのための様々な市販のキットおよび方法がある。そのような市販品は、Ｆｃ変異体をコードする核酸を生成させるために、本発明に用途を見出す。
本発明のＦｃ変異体は、Ｆｃ変異体をコードする核酸を含有する核酸、好ましくは発現ベクターを形質移入された宿主細胞を、タンパク質の発現を誘導するかまたは引き起こすのに適切な条件下で培養することにより産生させ得る。発現に適する条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって変動し、日常的な実験を通して容易に当業者に確認されるであろう。幅広い様々な適する宿主細胞を使用し得、それには哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞および酵母が含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、本発明において用途を見出し得る様々な細胞株が、the American Type Culture Collection から入手可能な ATCC(登録商標)細胞株カタログに記載されている。
好ましい実施態様では、Ｆｃ変異体は、哺乳動物発現系で発現される。これには、レトロウイルスまたはアデノウイルスなどのウイルスを使用して発現コンストラクトが哺乳動物細胞に導入されるシステムが含まれる。いかなる哺乳動物細胞を使用してもよく、ヒト、マウス、ラット、ハムスターおよび霊長類の細胞が特に好ましい。適する細胞には、Jurkat T 細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲＣ.６、ＨｅＬａ、Ｓｐ２／０、ＮＳ０細胞およびこれらの変異体を含むがこれらに限定されるものではない、既知の研究用細胞も含まれる。代替的な好ましい実施態様では、ライブラリーのタンパク質は、細菌細胞で発現される。細菌発現系は当分野で周知であり、大腸菌 (E. coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ストレプトコッカス・クレモリス（Streptococcus cremoris）およびストレプトコッカス・リビダンス（Streptococcus lividans）が含まれる。別の実施態様では、Ｆｃ変異体は、昆虫細胞（例えばＳｆ２１／Ｓｆ９、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）Ｂｔｉ−Ｔｎ５ｂ１−４）または酵母細胞（例えばＳ.セレビシアエ（cerevisiae）、ピチア（Pichia）など)で産生される。別の実施態様では、Ｆｃ変異体は、無細胞翻訳系を使用してインビトロで発現される。原核生物 (例えば、E. coli） および真核生物 (例えば、麦芽、ウサギの網状赤血球）細胞の両方に由来するインビトロ翻訳系が入手可能であり、関心のあるタンパク質の発現レベルおよび機能的特性に基づいて選択し得る。例えば、当業者にはわかるように、インビトロ翻訳は、例えばリボソームディスプレイなどのいくつかのディスプレイ技法に必要とされる。加えて、Ｆｃ変異体は、化学合成方法により産生してもよい。また、動物（例えば、ウシ、ヒツジまたはヤギ乳、有胚ニワトリ卵、昆虫の幼虫全体など）および植物（例えばトウモロコシ、タバコ、ウキクサなど）の両方のトランスジェニック発現系。
本発明のＦｃ変異体をコードする核酸は、タンパク質を発現するために発現ベクターに導入され得る。様々な発現ベクターをタンパク質発現のために利用し得る。発現ベクターは、宿主ゲノムに組み込む自己複製用染色体外ベクターを含んでもよい。発現ベクターは、宿主の細胞タイプに適合するように構築される。従って、本発明において用途を見出す発現ベクターには、哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞、酵母およびインビトロ系でタンパク質発現を可能にするものが含まれるがこれらに限定されない。当分野で知られているように、Ｆｃ変異体の発現のために本発明において用途を見出し得る様々な発現ベクターが、商業的にまたは他の手段で入手可能である。
発現ベクターは、典型的に、制御または調節配列、選択可能マーカー、任意の融合パートナーおよび／または付加的エレメントに機能し得るように連結されたタンパク質を含む。「機能し得るように連結された」は、本明細書において、核酸が他の核酸配列と機能的関係に置かれていることを意味する。一般に、これらの発現ベクターは、Ｆｃ変異体をコードする核酸に機能し得るように連結された転写および翻訳調節核酸を含み、典型的にタンパク質の発現に使用される宿主細胞に適するものである。一般に、転写および翻訳調節配列には、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、およびエンハンサーまたは活性化配列が含まれ得る。当分野でまた知られている通り、発現ベクターは、発現ベクターを含有する形質移入された宿主細胞の選択を可能にする選択遺伝子またはマーカーを典型的に含有する。選択遺伝子は、当分野で周知であり、使用される宿主細胞とともに変動する。
Ｆｃ変異体は、発現されたタンパク質の標的化、精製、スクリーニング、ディスプレイなどを可能にする融合パートナーに機能し得るように連結されていてもよい。融合パートナーは、リンカー配列を介してＦｃ変異体配列に連結していてもよい。リンカー配列は、一般的に、典型的に１０個より少ない、少数のアミノ酸を含むが、もっと長いリンカーも使用し得る。典型的に、リンカー配列は、可撓性かつ分解耐性であるように選択される。当業者にはわかるように、幅広く様々な配列のいずれも、リンカーとして使用し得る。例えば、一般的なリンカー配列は、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳを含む。融合パートナーは、Ｆｃ変異体および任意の付随する融合パートナーを、所望の細胞内場所または細胞外培地に導く標的化またはシグナル配列であり得る。当分野で知られているように、ある一定のシグナル配列は、増殖培地に分泌されるか、細胞膜周辺腔に分泌されるか、細胞の内膜と外膜の間に局在するかのいずれかに、タンパク質を標的化し得る。融合パートナーは、精製および／またはスクリーニングを可能にするペプチドまたはタンパク質をコードする配列であってもよい。そのような融合パートナーには、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−タグ）（例えばＨ6およびＨ10または固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）系（例えば、Ｎｉ+2親和性カラム）と共に使用するための他のタグ）、ＧＳＴ融合体、ＭＢＰ融合体、ストレプ−タグ、細菌酵素ＢｉｒＡのＢＳＰビオチン化標的配列、および抗体により標的化されるエピトープタグ（例えばｃ−ｍｙｃタグ、ｆｌａｇ−タグなど）が含まれるがこれらに限定されない。当業者にはわかるように、このようなタグは、精製、スクリーニングまたはその両方に有用であり得る。例えば、Ｆｃ変異体は、Ｈｉｓ−タグを使用して、それをＮｉ+2親和性カラムに固定化することにより精製し得、精製後、同じＨｉｓ−タグを、抗体をＮｉ+2被覆プレートに固定化してＥＬＩＳＡまたは他の結合アッセイを実施するのに使用し得る（下記の通り）。融合パートナーは、Ｆｃ変異体をスクリーニングするための選択方法の使用を可能にし得る（下記参照）。融合パートナーは、当分野で周知であり全て本発明において用途を見出す様々な選択方法を可能にする。例えば、Ｆｃ変異体ライブラリーのメンバーを遺伝子ＩＩＩタンパク質に融合させることにより、ファージディスプレイを用いることができる（Kay et al., Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual, Academic Press, San Diego, CA, 1996；Lowman et al., 1991, Biochemistry 30:10832-10838；Smith, 1985, Science 228:1315-1317）。融合パートナーは、Ｆｃ変異体の標識化を可能にし得る。あるいは、融合パートナーは、発現ベクター上の特異的配列に結合し、融合パートナーおよび付随するＦｃ変異体が、それらをコードする核酸と共有結合的または非共有結合的に連結することを可能にする。例えば、ＵＳＳＮ０９／６４２,５７４；ＵＳＳＮ１０／０８０,３７６；ＵＳＳＮ０９／７９２,６３０；ＵＳＳＮ１０／０２３,２０８；ＵＳＳＮ０９／７９２,６２６；ＵＳＳＮ１０／０８２,６７１；ＵＳＳＮ０９／９５３,３５１；ＵＳＳＮ１０／０９７,１００；ＵＳＳＮ６０／３６６,６５８；ＰＣＴ ＷＯ００／２２９０６；ＰＣＴ ＷＯ０１／４９０５８；ＰＣＴ ＷＯ０２／０４８５２；ＰＣＴ ＷＯ０２／０４８５３；ＰＣＴ ＷＯ０２／０８０２３；ＰＣＴ ＷＯ０１／２８７０２；およびＰＣＴ ＷＯ０２／０７４６６は、本発明において用途を見出し得るそのような融合パートナーおよび技法を記載している。
外来核酸を宿主細胞に導入する方法は、当分野で周知であり、使用する宿主細胞によって変化する。技法には、デキストラン介在形質移入、カルシウムホスフェート沈殿、塩化カルシウム処理、ポリブレン介在形質移入、プロトプラスト融合体、エレクトロポレーション、ウイルスまたはファージ感染、ポリヌクレオチドのリポソーム内カプセル化、およびＤＮＡの核への直接的マイクロインジェクションが含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物細胞の場合、形質移入は、一過的であっても安定であってもよい。
好ましい実施態様では、Ｆｃ変異体は、発現後に精製または単離される。タンパク質は、当業者に周知の様々なやり方で単離または精製し得る。標準的な精製方法には、イオン交換、疎水性相互作用、親和性、サイズまたはゲル濾過、および逆相を含むクロマトグラフィー技法が含まれ、大気圧または高圧でＦＰＬＣやＨＰＬＣなどの系を使用して実行される。精製方法には、また、電気泳動、免疫学、沈殿、透析および等電点電気泳動の技法も含まれる。タンパク質濃縮と共に限外濾過およびダイアフィルトレーション技法も有用である。当分野で周知の通り、様々な天然タンパク質がＦｃおよび抗体に結合し、これらのタンパク質は、本発明においてＦｃ変異体精製のために用途を見出し得る。例えば、細菌のプロテインＡおよびＧは、Ｆｃ領域に結合する。同様に、細菌のプロテインＬは、いくつかの抗体のＦａｂ領域に結合し、抗体の標的抗原は当然結合する。精製は、しばしば特定の融合パートナーにより可能にすることができる。例えば、Ｆｃ変異体は、ＧＳＴ融合体が用いられているならばグルタチオン樹脂を、Ｈｉｓ−タグが用いられているならばＮｉ+2親和性クロマトグラフィーを、ｆｌａｇ−タグが使用されているならば固定化抗ｆｌａｇ抗体を使用して、精製し得る。適する精製技法の一般的手引きには、Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994 を参照。必要な精製度は、Ｆｃ変異体のスクリーニングまたは用途に依存して変動する。いくつかの例では、精製は必要ない。例えば、ある実施態様では、Ｆｃ変異体が分泌される場合、スクリーニングは培地から直接行い得る。当分野で周知の通り、タンパク質の精製を含まない精製方法もある。このように、例えば、Ｆｃ変異体ライブラリーをファージディスプレイライブラリーにする場合、タンパク質精製を実施しなくてもよい。
実験のアッセイ
Ｆｃ変異体は、インビトロアッセイ、インビボおよび細胞をベースとするアッセイ、並びに選択技法を使用するものを含むが、これらに限定されるものではない様々な方法を使用して、スクリーニングし得る。スクリーニングの手順において、自動化および高処理量スクリーニング技法を利用し得る。スクリーニングは、融合パートナーまたは標識を使用してもよい。融合パートナーは、上記で論じた。「標識化」は、本明細書において、本発明のＦｃ変異体が、スクリーニングにおける検出を可能にするために取り付けられた１またはそれ以上のエレメント、同位元素または化学的化合物を有することを意味する。一般に、標識は、３つのクラスに分類される：ａ）免疫標識、これは、融合パートナーとして組み込まれたエピトープであり得、抗体により認識される、ｂ）同位元素標識、これは、放射性または重同位元素であり得る、およびｃ）低分子標識、これは、蛍光もしくは比色染料、または他の標識方法を可能にするビオチンなどの分子を含み得る。標識は、任意の位置で化合物に組み込み得、タンパク質発現の間にインビトロまたはインビボで組み込んでもよい。
好ましい実施態様では、Ｆｃ変異体の機能的および／または生物物理的特性を、インビトロアッセイにおいてスクリーニングする。インビトロアッセイは、幅広い動的な範囲の関心のある特性のスクリーニングを可能にし得る。スクリーニングされ得るＦｃ変異体の特性には、安定性、溶解性およびＦｃリガンド、例えばＦｃγＲ、に対する親和性が含まれるが、これらに限定されない。多数の特性を同時または個別にスクリーニングし得る。タンパク質は、アッセイの要件に応じて、精製されてもされなくてもよい。ある実施態様では、スクリーニングは、Ｆｃ変異体に結合すると知られているか、または考えられているタンパク質または非タンパク質分子に対する、Ｆｃ変異体の定性的または定量的結合アッセイである。好ましい実施態様では、スクリーニングは、標的抗原に対する結合を測定するための結合アッセイである。別の好ましい実施態様では、スクリーニングは、ＦｃγＲ類のファミリー、新生児受容体ＦｃＲｎ、補体タンパク質Ｃ１ｑおよび細菌タンパク質ＡおよびＧを含むがこれらに限定されるものではないＦｃリガンドに対するＦｃ変異体の結合についてのアッセイである。当該Ｆｃリガンドはいかなる生物に由来してもよく、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルが好ましい。結合アッセイは、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）およびＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー転移）をベースとするアッセイ、AlphaScreen(商標)（発光増幅近接均質化アッセイ（Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay））、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)としても知られる）、等温滴定熱量測定、示差走査熱量測定、ゲル電気泳動およびゲル濾過を含むクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されるものではない、当分野で知られている様々な方法を使用して実行できる。これらおよびその他の方法は、いくつかのＦｃ変異体の融合パートナーまたは標識を利用し得る。アッセイは、色素生産性、蛍光、発光または同位元素標識を含むがこれらに限定されるものではない、様々な検出方法を用いてもよい。
Ｆｃ変異体の生物物理的特性、例えば安定性や溶解性を、当分野で知られている様々な方法を使用してスクリーニングし得る。タンパク質の安定性は、折り畳まれた状態と折り畳まれていない状態との間の熱力学的平衡を測定することにより決定し得る。例えば、本発明のＦｃ変異体は、化学変性剤、熱またはｐＨを使用して折り畳まれていなくすることができ、この転移を、円二色性分光法、蛍光分光法、吸光分光法、ＮＭＲ分光法、熱量測定法およびタンパク質分解を含むがこれらに限定されるものではない方法を使用して、モニタリングし得る。当業者にはわかるように、折り畳まれたものおよび折り畳まれていないものへの転移の動力学的パラメーターも、これらおよび他の技法を使用してモニタリングし得る。Ｆｃ変異体の溶解性および全体構造的完全性は、当分野で知られている広範囲の方法を使用して定量的または定性的に測定し得る。Ｆｃ変異体の生物物理学的特性の特徴分析のために本発明において用途を見出し得る方法には、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、キャピラリー電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび逆相高速液体クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、ペプチドマッピング、オリゴサッカライドマッピング、質量分析、紫外吸光分光法、蛍光分光法、円二色分光法、等温滴定熱量測定、示差走査熱量測定、分析的超遠心分離、動的光散乱法、タンパク質分解およびクロスリンク、濁度測定、フィルター遅延アッセイ、免疫学的アッセイ、蛍光染料結合アッセイ、タンパク質染色アッセイ、顕微鏡およびＥＬＩＳＡまたは他のアッセイによる凝集体の検出が含まれる。Ｘ線結晶構造解析技法およびＮＭＲ分光法を用いる構造分析も、用途を見出し得る。ある実施態様では、何らかの決められた期間後にタンパク質溶液の量を測定することにより、安定性および／または溶解性を測定し得る。このアッセイでは、タンパク質は、例えば高温、低ｐＨまたは変性剤の存在などの極端な条件に曝されていてもいなくてもよい。典型的に、機能は、安定な、可溶の、および／または良好に折り畳まれた／構造化されたタンパク質を要するので、後述の機能および結合アッセイも、そのような測定の実施方法を提供する。例えば、Ｆｃ変異体を含む溶液を、その標的抗原に結合する能力についてアッセイし、次いで１またはそれ以上の決められた期間にわたって高温に曝し、次いで抗原結合について再度アッセイできる。折り畳まれていない凝集したタンパク質は、抗原を結合できないと予期されるので、残っている活性の量は、Ｆｃ変異体の安定性および溶解性の測定を提供する。
好ましい実施態様では、１つまたはそれ以上の細胞をベースとする、即ちインビトロのアッセイを使用して、ライブラリーをスクリーニングする。そのようなアッセイのために、典型的に、細胞がライブラリーに属する個々の変異体または変異体のグループに曝されるように、精製または未精製のＦｃ変異体を外来的に添加する。これらのアッセイは、典型的に、しかし常にではないが、抗体またはＦｃ融合体が標的抗原に結合し、何らかの生物化学的事象、例えば細胞の溶解などのエフェクター機能、ファゴサイトーシス、リガンド／受容体結合阻害、成長および／または増殖の阻害、アポトーシスなどを媒介する能力の生物学をベースとする。そのようなアッセイは、しばしば、例えば、細胞の生存、細胞の死、細胞のファゴサイトーシス、細胞の溶解、細胞形態の変化、細胞の天然遺伝子またはレポーター遺伝子の発現などの転写活性化などの、Ｆｃ変異体に対する細胞の反応をモニターすることを含む。例えば、そのようなアッセイは、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰまたはＣＤＣを誘起するＦｃ変異体の能力を測定し得る。いくつかのアッセイには、標的細胞に加えて、付加的細胞または成分、例えば、血清の補体または末梢血単球（ＰＢＭＣ）、ＮＫ細胞、マクロファージなどのエフェクター細胞を添加する必要があり得る。かかる付加的細胞は、いかなる生物由来でもよく、好ましくは、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサル由来である。架橋または単量体の抗体およびＦｃ融合体は、抗体の標的抗原を発現しているある一定の細胞株のアポトーシスを引き起こし得、または、それらは、アッセイに添加された免疫細胞による標的細胞への攻撃を媒介し得る。細胞の死亡または生存度をモニターする方法は当分野で知られており、染料、フルオロフォア、免疫化学、細胞化学および放射活性試薬の使用を含む。例えば、カスパーゼアッセイまたはアネキシン−フルオロコンジュゲート（flourconjugate）は、アポトーシスの測定を可能にし得、放射活性基質（例えば、クロム−５１放出アッセイ）の取込または放出またはアラマーブルー（alamar blue）などの蛍光染料の代謝的還元は、細胞の成長、増殖または活性化のモニタリングを可能にし得る。好ましい実施態様では、DELFIA(登録商標) EuTDAをベースとする細胞傷害アッセイ (Perkin Elmer, MA）を使用する。あるいは、死亡した、または損傷した標的細胞は、例えば乳酸デヒドロゲナーゼなどの１またはそれ以上の天然細胞内タンパク質の放出を測定することによりモニタリングし得る。転写活性化も、細胞をベースとするアッセイにおいて機能をアッセイする方法として役立ち得る。この場合、上方調節または下方調節され得る天然遺伝子またはタンパク質をアッセイすることにより反応をモニタリングし得、例えば、ある種のインターロイキンの放出を測定し得、あるいは、読出しはルシフェラーゼまたはＧＦＰレポーターコンストラクトによってもよい。細胞をベースとするアッセイは、Ｆｃ変異体の存在に対する反応として、細胞の形態変化の測定も含み得る。このようなアッセイのための細胞タイプは、原核でも真核でもよく、当分野で知られている様々な細胞株を用い得る。あるいは、Ｆｃ変異体をコードする核酸で形質転換または形質移入された細胞を使用して、細胞をベースとするスクリーニングを実施する。
インビトロアッセイには、結合アッセイ、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、細胞傷害作用、増殖、過酸化物／オゾンの放出、エフェクター細胞の走化性、エフェクター機能が低減された抗体によるかかるアッセイの阻害；＞１００ｘの改善または＞１００ｘの低減などの活性の範囲、受容体活性化の混合、および、かかる受容体のプロフィールから期待されるアッセイの結果が含まれるがこれらに限定されない。
臨床前実験および動物モデル
本発明のＦｃ変異体の生物学的特性は、細胞、組織および生物全体での実験で特徴分析し得る。当分野で知られているように、薬物は、しばしば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタおよびサルを含むがこれらに限定されない動物で、疾患または疾患モデルの処置に関する薬物の効力を測定するために、または薬物の薬物動力学、毒性および他の特性を測定するために試験される。当該動物は、疾患モデルと呼ばれることがある。本発明のＦｃ変異体に関して、ヒトにおける候補ポリペプチドの効力についての潜在能力を評価するために動物モデルを使用するときに、特定の挑戦が発生する。このことは、少なくとも部分的に、ヒトＦｃ受容体への親和性に対して特異的効果を有するＦｃ変異体が、オルソロガス（orthologous）な動物の受容体に同様の親和性の効果を有さないことがあるという事実に起因する。これらの問題は、真のオルソログの正しい割当てに伴う避けがたい曖昧さ（Mechetina et al., Immunogenetics, 2002 54:463-468）、および、いくつかのオルソログが単純にその動物に存在しないという事実（例えば、ヒトはＦｃγＲＩＩａを有するが、マウスは有さない）により、さらに悪化し得る。治療薬は、しばしば、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植マウスおよび遺伝子組換えマウス（ノックインおよびノックアウトを含む）を含むがこれらに限定されるものではないマウスで試験される。例えば、抗癌治療薬として企図される本発明の抗体またはＦｃ融合体は、例えば異種移植マウスなどのマウス癌モデルで試験し得る。この方法では、腫瘍または腫瘍細胞株をマウスに移植または注射し、その後マウスを治療薬で処置して、抗体またはＦｃ融合体の癌の増殖および転移を低減または阻害する能力を測定する。代替的アプローチは、ＳＣＩＤマウスモデルの使用である。そこでは、免疫不全マウスにヒトＰＢＬを注射し、準機能的（semi-functional）なヒトの免疫系を−適切なヒトＦｃγＲのアレイと共に−そのマウスに与え、その後、そのマウスに注射したヒト腫瘍細胞を標的化する抗体またはＦｃポリペプチドを注射する。そのようなモデルでは、所望の抗原（ＳｋＯＶ３卵巣癌細胞上のｈｅｒ２／ｎｅｕなど）を標的化するＦｃポリペプチドは、そのマウス内でヒトＰＢＬと相互作用し、殺腫瘍的エフェクター機能を保証する。かかる実験法は、治療剤として使用しようとする当該Ｆｃ変異体の潜在能力の決定のために、意味のあるデータを提供する。任意の生物、好ましくは哺乳動物を、試験に使用し得る。例えばそのヒトとの遺伝的類似性のために、サルは、適する治療モデルであり得、従って本発明の抗体およびＦｃ融合体の効力、毒性、薬物動態または他の特性の試験に使用し得る。薬物としての承認にはヒトにおける本発明の抗体およびＦｃ融合体の試験が最終的に必要とされ、従って、当然これらの実験が企図される。従って、本発明の抗体およびＦｃ融合体を、ヒトで試験して、それらの治療効力、毒性、薬物動態および／または他の臨床的特性について判定し得る。
本発明のＦｃ変異体は、動物モデルにおいて、またはヒトにおいて、Ｆｃポリペプチド治療剤に優れた性能を与え得る。かかるＦｃ変異体の受容体結合プロフィールは、本明細書に記載の通り、例えば、細胞傷害性薬物の強度を増加させるか、または特定のエフェクター機能またはエフェクター細胞を標的化してその薬物の作用の選択性を改善するように選択し得る。さらに、いくつかまたは全てのエフェクター機能を低減し得る受容体結合プロフィールを選択でき、それによりかかるＦｃポリペプチド薬物の副作用または毒性を低減させる。例えば、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩａへの結合が低減されたＦｃ変異体は、殆どの細胞介在性エフェクター機能を除去するために選択でき、または、Ｃ１ｑへの結合が低減されたＦｃ変異体は、補体介在性エフェクター機能を制限するために選択し得る。いくつかの文脈では、かかるエフェクター機能は、潜在的毒性効果を有すると知られており、故に、それらの除去は、Ｆｃポリペプチド薬物の安全性を高め得、そして、かかる安全性の改善は、動物モデルで特徴付け得る。いくつかの文脈では、かかるエフェクター機能は、望ましい治療効果を媒介すると知られており、故に、それらの増強は、Ｆｃポリペプチド薬物の活性または強度を増加させ得、そして、かかる活性または強度の改善は、動物モデルで特徴付け得る。
最適化Ｆｃ変異体は、様々な同所性の腫瘍モデルで試験できる。これらの臨床的に意味のある動物モデルは、膵臓、前立腺および乳癌などの高悪性度の癌の病態生理および治療の研究に重要である。胸腺欠損ヌードまたはＳＣＩＤマウスを含むがこれらに限定されない免疫剥脱マウスは、ヒト腫瘍細胞またはドナー患者の断片の器官内（例えば膵臓、前立腺または乳腺）注射部位から広がった局所および全身的な腫瘍のスコア付けに、頻繁に使用される。
好ましい実施態様では、本発明のＦｃ変異体を、様々なヒト疾患の臨床的に意味のある動物モデルにおいて、効力について評価し得る。多くの場合、意味のあるモデルには、特定の腫瘍抗原についての様々なトランスジェニック動物が含まれる。ヒトＦｃ受容体（例えば、ガンマ鎖を含むＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂなど）を発現するものなどの意味のあるトランスジェニックモデルを使用して、本発明のＦｃポリペプチドの効力を評価および試験し得る。マウスまたは他の齧歯類において直接的または間接的にエフェクター機能を媒介するヒト遺伝子の導入によるＦｃ変異体の評価は、腫瘍毒性または自己免疫障害およびＲＡなどの他の疾患における、効力の生理学的研究を可能にし得る。ＦｃγＲＩＩＩａなどのヒトＦｃ受容体は、位置１５８（記載の通り、ＶまたはＦ）などで多型を有し得る。それは、さらに、特異的かつ組合せのヒト多型を齧歯類に導入することを可能にする。多型特異的ＦｃγＲに関わる様々な研究は、このセクションに限定されないが、しかしながら、本願を通して一般的に特定されるＦｃγＲの全ての議論および適用を包含する。本発明のＦｃ変異体は、かかるトランスジェニックモデルにおいて、Ｆｃポリペプチドに優れた活性を与え得る。特に、ヒトＦｃγＲＩＩＩａに媒介される活性について最適化された結合プロフィールを有する変異体は、トランスジェニックＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）マウスにおいて優れた活性を示し得る。他のヒトＦｃ受容体、例えばＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩなどについてトランスジェニックであるマウスにおける効力の同様の改善は、各々の受容体について最適化された結合プロフィールを有するＦｃ変異体について観察され得る。複数のヒト受容体についてトランスジェニックであるマウスは、例えば表１に概説する通り、対応する複数の受容体について最適化された結合プロフィールを有するＦｃ変異体の活性の改善を示すであろう。
トランスジェニック動物モデルの形態での、ヒトＣＤ２０などの標的腫瘍抗原の齧歯類Ｂ細胞への導入を使用して、より意味のある効力の評価を提供できる。このように、標的抗原は、完全にヒトのコンストラクトに限定される必要はないが、標的抗原の関連するヒトエピトープを含有する融合体タンパク質であり得る。好ましい実施態様では、Ｆｃポリペプチドの試験は、トランスジェニックモデル系を含み得る。それは、効力および殺腫瘍的活性を評価するために、ヒト標的抗原とヒトＦｃ受容体（例えばＣＤ１６とエフェクター機能を媒介する他の関連受容体）の両方の組合せを含むが、これらに限定されない。
好ましい実施態様では、Ｈｅｒ２抗原（例えばｍｕ４Ｄ５のＦｃ変異体またはそのヒト化類似体）を標的化する本発明のＦｃポリペプチドを、臨床的に意味のある乳癌のマウスモデルにおいて、効力について評価し得る。意味のあるモデルの例には、以下が含まれるがこれらに限定されない：１）ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｎｅｕ−Ｎ）−トランスジェニックマウス、それは、親のＦＶＢ／Ｎマウス系統に由来し、プロトオンコジーンＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｎｅｕ）のラット形態について遺伝子導入されている；および２）マウス乳癌ウイルスプロモーター下でヒトＨＥＲ２を過剰発現するトランスジェニックマウス (Finkle et al., 2004, Clin Cancer Res.10 (7):2499-511）。これらのモデルで優れた効力を示す本発明のＦｃポリペプチドは、恐らく、さらなる開発の候補に相当する。
ヒト患者における候補治療用抗体の潜在的効力を特徴付けるために動物モデルを使用することに伴う困難とあいまいさのために、いくつかの本発明の変異体ポリペプチドは、潜在的なヒトにおける効力を評価するための代用物として用途を見出し得る。かかる代用分子は、好ましくは、動物の系において、対応する候補ヒトＦｃ変異体のＦｃγＲおよび／または補体の生物学を模倣するであろう。この模倣は、特異的Ｆｃ変異体と動物対ヒト受容体との間の相対的会合親和性により最も本当らしく表されるであろう。例えば、マウスモデルを使用して、ヒトＦｃγＲＩＩＩａへの親和性が増強されたＦｃ変異体の潜在的なヒトにおける効力を評価するならば、適切な代用変異体は、マウスＦｃγＲＩＩＩ−２（マウスＣＤ１６−２）への親和性が増強されたものであろう。あるいは、マウスモデルを使用して、ヒト阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂへの親和性が低減されたＦｃ変異体の潜在的なヒトにおける効力を評価するならば、適切な代用変異体は、マウスＦｃγＲＩＩへの親和性が低減されたものであろう。代用Ｆｃ変異体は、ヒトＦｃ変異体、動物Ｆｃ変異体または両方の文脈で創成され得ることにも留意すべきである。
好ましい実施態様では、Ｆｃ変異体の試験には、標的抗原を有する特異的標的細胞の減少の評価を容易にするために、霊長類（例えばカニクイザルモデル）における効力の研究が含まれ得る。さらなる霊長類モデルには、自己免疫、移植および癌の治療研究におけるアカゲザルおよびＦｃポリペプチドのものが含まれるがこれらに限定されない。
毒性研究を実施して、標準的な薬理学的プロフィールでは評価できないか、または、物質の反復投与後にのみ生じる、Ｆｃポリペプチドに関連する効果を決定する。殆どの毒性試験は、齧歯類および非齧歯類の２つの種で実施し、新しい治療成分がヒトに導入される前に、いかなる予想外の有害作用も見過ごされないようにする。一般に、これらのモデルは、遺伝毒性、慢性毒性、免疫原性、生殖／発生毒性を含む様々な毒性を測定し得る。上述のパラメーターに含まれるものは、食物消費、体重、抗体形成、臨床化学の標準的測定、および標準的器官／組織の肉眼および顕微鏡での調査（例えば心毒性）である。さらなる測定のパラメーターは、もしあれば、注射部位外傷および中和抗体の測定である。伝統的には、裸またはコンジュゲートのモノクローナル抗体治療剤は、正常組織との交差反応性、免疫原性／抗体産生、コンジュゲートまたはリンカーの毒性および放射性標識種の「傍観者」毒性について評価される。それにも関わらず、かかる研究は、特定の関心に取り組むために、そしてＩＣＨ Ｓ６により定められたガイダンスに従うために、個別に扱わねばならないことがある（バイオテクノロジー的製品の安全性研究も、上記に記載されている）。このように、一般原則は、製品を十分よく特徴解析すること、その不純物／混入物を除去すること、試験物質が開発を通して比較可能であること、そしてＧＬＰ法令遵守である。
本発明のＦｃ変異体の薬物動態（ＰＫ）は、様々な動物の系で試験でき、最も意味があるのは、カニクイザル、アカゲザルなどの、非ヒト霊長類である。６０００倍にわたる用量範囲（０.０５−３００ｍｇ／ｋｇ）での単回または反復ｉ.ｖ.／ｓ.ｃ.投与を、血漿濃度およびクリアランスを使用して半減期（数日ないし数週間）について評価でき、定常状態での分布量および全身的吸収のレベルを測定できる。かかる測定パラメーターの例には、一般的に、観察される最大の血漿濃度（Ｃｍａｘ）、Ｃｍａｘに到達する時間（Ｔｍａｘ）、時間０から無限までの血漿濃度−時間曲線の下の面積［ＡＵＣ（０−ｉｎｆ］および明白な排出半減期（Ｔ１／２）が含まれる。さらなる測定パラメーターには、ｉ.ｖ.投与後に得られる濃度−時間データのコンパートメント解析およびバイオアベイラビリティーが含まれ得る。カニクイザルを使用する薬理学／毒理学研究の例は、ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体が交差反応性である Rituxan および Zevalin について確立された。生体分布、線量測定（放射性標識化抗体またはＦｃ融合体について）、およびＰＫ研究は、齧歯類モデルで行うこともできる。かかる研究は、全投与用量での耐性、局所組織への毒性、齧歯類異種移植動物モデルへの優先的な局在、標的細胞（例えばＣＤ２０陽性細胞）の枯渇を評価するであろう。
本発明のＦｃ変異体は、動物の系において、またはヒトにおいて、Ｆｃポリペプチド治療剤に優れた薬物動態を与え得る。例えば、ＦｃＲｎへの結合の増加は、Ｆｃポリペプチドの半減期および露出を増加させ得る。あるいは、ＦｃＲｎへの結合の減少は、かかる薬物が副作用を有するなど、露出の低減が好ましい場合に、Ｆｃポリペプチドの半減期および露出を減少させ得る。
Ｆｃ受容体のアレイが様々な免疫細胞タイプで、そして異なる組織で、異なって発現されることが当分野で知られている。Ｆｃ受容体の異なる組織分布は、最終的には、本発明のＦｃ変異体の薬力学（ＰＤ）および薬物動態（ＰＫ）特性に影響を有し得る。提示のＦｃ変異体は、Ｆｃ受容体のアレイに様々な親和性を有するので、ＰＤおよび／またはＰＫ特性についてのポリペプチドのさらなるスクリーニングは、各候補ポリペプチドにより与えられるＰＤ、ＰＫおよび治療効力の最適なバランスを決定するのに極度に有用であり得る。
薬力学研究には、特定の腫瘍細胞の標的化またはシグナル伝達メカニズムの遮断、標的抗原発現細胞またはシグナルの枯渇の測定などが含まれ得るが、これらに限定されない。本発明のＦｃ変異体は、特定のエフェクター細胞群を標的化し、それによりＦｃポリペプチドに一定の活性をリクルートさせ、強度を改善するか、または特定の好都合な生理的コンパートメントへの浸透を増加させ得る。例えば、好中球の活性および局在は、好ましくはＦｃγＲＩＩＩｂを標的化するＦｃ変異体により標的化できる。かかる薬力学的効果は、動物モデルにおいて、またはヒトにおいて、立証し得る。
Ｆｃ変異体の治療的使用
本発明のＦｃ変異体は、様々な治療目的に使用し得る。当業者に理解されるように、本発明のＦｃ変異体は、そのために抗体、Ｆｃ融合体などを使用し得るいかなる治療目的にも使用し得る。好ましい実施態様では、Ｆｃ変異体は、自己免疫および炎症性疾患、感染症および癌を含むがこれらに限定されない疾患を処置するために患者に投与される。
本発明のための「患者」には、ヒトおよび他の動物の両方が含まれ、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトである。従って、本発明のＦｃ変異体には、ヒトの治療および獣医学の両方の適用がある。本発明における用語「処置」は、治療的処置、並びに疾患または障害の予防的または抑制的措置を含む意味である。従って、例えば、疾患の発病に先立ちＦｃ変異体を成功裏に投与することは、疾患の処置をもたらす。他の例として、疾患の臨床的顕在化の後に最適化Ｆｃ変異体を成功裏に投与して疾患の症状と闘うことは、疾患の処置を含む。「処置」は、疾患を根絶するために、最適化Ｆｃ変異体を疾患の出現後に投与することも包含する。発病後および臨床的症状の進行後に、可能性のある臨床的症状の減退と恐らくは疾患の改善を伴って物質を成功裏に投与することは、疾患の処置を含む。「処置を必要とする」ものには、疾患または障害を既に有する哺乳動物、並びに疾患または障害を有する傾向のあるものが含まれ、疾患または障害を予防すべきものが含まれる。
ある実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、不適切なタンパク質または他の分子の発現に関わる疾患を有する患者に投与される。本発明の範囲内で、これは、例えば、タンパク質存在量の変化、タンパク質局在、翻訳後修飾、立体配座状態、突然変異または病原性タンパク質の存在などによる、異常なタンパク質により特徴付けられる疾患および障害を含むことを意図する。同様に、疾患または障害は、ポリサッカライドおよびガングリオシドを含むがこれらに限定されない分子の変化により特徴付けられ得る。過多は、分子レベルでの過剰発現、作用部位での延長または蓄積された出現、または正常と比して増加したタンパク質活性を含むがこれらに限定されない、いかなる原因によるものでもよい。この定義に含まれるのは、タンパク質の低減により特徴付けられる疾患および障害である。この低減は、分子レベルでの発現の低減、作用部位での短縮または低減された出現、タンパク質の突然変異形態、または正常と比して減少したタンパク質活性を含むがこれらに限定されない、いかなる原因によるものでもよい。かかるタンパク質の過多または低減は、タンパク質の正常な発現、出現または活性と比べて測定でき、当該測定は、本発明のＦｃ変異体の開発および／または臨床試験に重要な役割を果たし得る。
本明細書において「癌」および「癌性」は、典型的には、調節されていない細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理的症状を言及するか、または記載する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫（脂肪肉腫を含む）、神経内分泌系腫瘍、中皮腫、シュワン腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫および白血病またはリンパ性悪性疾患が含まれるがこれらに限定されない。
かかる癌のより特定の例には、血液悪性腫瘍、ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ球性白血病、菌状息肉腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、毛様細胞白血病およびリンパ形質細胞性白血病）、リンパ球前駆細胞の腫瘍（Ｂ細胞急性リンパ芽球白血病／リンパ腫およびＴ細胞急性リンパ芽球白血病／リンパ腫を含む）、胸腺腫、成熟ＴおよびＮＫ細胞の腫瘍（末梢Ｔ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫および大顆粒リンパ球性白血病を含む）、ランゲルハンス細胞組織球症、骨髄新形成（急性骨髄性白血病（成熟を認めるＡＭＬ、分化していないＡＭＬ、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病および急性単球性白血病を含む）、骨髄異形成症候群、および慢性骨髄増殖性障害（慢性骨髄性白血病を含む）など）、中枢神経系の腫瘍、例えば、神経膠腫、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、星細胞腫、骨髄腫、上衣細胞腫および網膜芽細胞腫；頭部および頚部（例えば、上咽頭癌、唾液腺癌および食道癌）、肺（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌）、消化器系（例えば、胃癌または消化管癌を含む胃の癌、胆管または胆道の癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌および肛門の癌腫）、生殖器系（例えば、精巣、陰茎または前立腺の癌、子宮、膣、陰門、子宮頸、卵巣および子宮内膜の癌）、皮膚（例えば、黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、光線性角化症）、肝臓（例えば、肝臓癌、肝癌、肝細胞癌および肝細胞腫）、骨（例えば、骨巨細胞腫および骨溶性骨癌）、さらなる組織および器官（例えば、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌または腎癌、甲状腺癌、乳癌、腹膜の癌およびカポジ肉腫）の固形腫瘍、および血管系の腫瘍（例えば、血管肉腫および血管外皮細胞腫）が含まれる。
「自己免疫疾患」は、本明細書において、同種島移植片拒絶（allogenic islet graft rejection）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、抗好中球細胞質自己抗体（ＡＮＣＡ）、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性心筋炎、自己免疫性好中球減少、自己免疫性卵巣炎および睾丸炎、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性じんま疹、ベーチェット病、類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン症候群、セリアックスプルー（celiac spruce）皮膚炎、慢性疲労性免疫不全症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素疾患、クローン病、皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合性クリオグロブリン血症、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、線維筋痛症−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー、グッドパスチャー症候群、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、橋本甲状腺炎、血友病Ａ、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡニューロパチー、ＩｇＭ多発性ニューロパチー、免疫介在性血小板減少症、若年性関節炎、川崎病、扁平苔癬、紅斑性狼瘡、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、１型真性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多発性内分泌腺症候群（polyglandular syndromes）、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ性関節炎、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、固形器官移植片拒絶、全身硬直症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血栓性血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、血管炎、例えば疱疹状皮膚炎血管炎、白斑症、およびウェジナー肉芽腫症を含む。
「炎症性障害」は、本明細書では、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性敗血症性関節炎、アレルギー性脳脊髄炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性血管炎、アレルギー、喘息、アテローム性動脈硬化症、慢性細菌またはウイルス感染による慢性炎症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、冠動脈疾患、脳炎、炎症性腸疾患、炎症性骨溶解、に伴う炎症、急性および遅延性過敏反応、腫瘍に伴う腫瘍、末梢神経損傷または脱髄性疾患、火傷および虚血などの組織外傷に伴う炎症、髄膜炎による炎症、多臓器損傷症候群（multiple organ injury syndrome）、肺線維症、敗血症および敗血症ショック、スティーブンス・ジョンソン症候群、未分化関節症および未分化脊椎関節症を含む。
「感染性疾患」は、本明細書では、ウイルス、細菌、真菌、原生動物および寄生生物などの病原体に起因する疾患を含む。感染性疾患は、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、テング熱、エプスタイン・バー、ハンタ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、単純ヘルペス１型、単純ヘルペス２型、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、インフルエンザ、はしか、おたふく風邪、パポバウイルス、ポリオ、呼吸器合胞体ウイルス、牛疫、ライノウイルス、ロタウイルス、風疹、ＳＡＲＳウイルス、天然痘、ウイルス性髄膜炎などを含むウイルスに起因し得る。感染性疾患は、炭疽菌（Bacillus antracis）、ライム病菌（Borrelia burgdorferi）、カンピロバクタージェジュニ（Campylobacter jejuni）、トラコーマ病原体（Chlamydia trachomatis）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ジフテリア菌（Diptheria）、大腸菌（E. coli）、レジオネラ、ヘリコバクターピロリ（Helicobacter pylori）、マイコバクテリウムリケッチア（Mycobacterium rickettsia）、マイコプラズマナイセリア（Mycoplasma nesisseria）、百日咳、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）肺炎連鎖球菌（S. pneumonia）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、コレラ菌（Vibria cholerae）、ペスト菌（Yersinia pestis）などを含む細菌にも起因し得る。感染性疾患は、アスペルギルスフミガーツフ（Aspergillus fumigatus）、ブラストミセスデルマティティディス（Blastomyces dermatitidis）、カンジダアルビカンス（Candida albicans）、コクシジオイデスイミティス（Coccidioides immitis）、クリプトコッカスネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラズマカプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、ペニシリウムマルネフェイ（Penicillium marneffei）などの真菌にも起因し得る。感染性疾患は、クラミジア、コクジディア（kokzidioa）、リーシュマニア、マラリア、リケッチア、トリパノソーマなどの原生動物および寄生生物にも起因し得る。
さらに、本発明のＦｃ変異体は、心臓の症状、例えば、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、心筋炎および心筋の他の症状；皮膚の症状、例えば、酒さ、アクネおよび湿疹；骨および歯の症状、例えば、骨減少、骨粗鬆症、パジェット病、ランゲルハンス細胞組織球症、歯周部の疾患、廃用性骨減少症、骨軟化症、単発性線維性骨異形成症、多骨性線維性骨異形成症、骨転移、骨痛の管理、体液性悪性高カルシウム血症、歯周部の再構築、脊髄損傷、および骨折；代謝の症状、例えばゴーシェ病；内分泌の症状、例えばクッシング症候群；および神経の症状を含むがこれらに限定されない、さらなる症状の予防または処置に使用し得る。
製剤、投与および投与態様
本発明のＦｃ変異体および１またはそれ以上の治療的活性物質を製剤化した医薬組成物が企図されている。本発明のＦｃ変異体の製剤は、所望の純度を有する当該Ｆｃ変異体を、任意の医薬的に許容し得る担体、賦形剤または安定化剤（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.,1980）と混合することにより、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で、保存用に調製する。許容し得る担体、賦形剤または安定化剤は、用いる用量および濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、アセテートおよび他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム（methonium）；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン類；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖類、二糖類および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；甘味料および他の香味料；微結晶セルロース、ラクトース、トウモロコシおよび他のデンプンなどの増量剤；結合剤；添加物；着色料；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはTWEEN(商標)、PLURONICS(商標)またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。好ましい実施態様では、本発明のＦｃ変異体を含む医薬組成物は、医薬的に許容し得る塩（これは、酸および塩基付加塩の両方を含む意味である）として存在するなど、水溶性形態であり得る。「医薬的に許容し得る酸付加塩」は、遊離塩基の生物学的有効性を保持する、生物学的または他の点で不都合ではない塩を表し、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、および酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、蓚酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などの有機酸により形成されたものである。「医薬的に許容し得る塩基付加塩」には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩などの、無機塩基から誘導されたものが含まれる。特に好ましいのは、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩である。医薬的に許容し得る有機非毒性塩基から誘導される塩には、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミンおよびエタノールアミンなどの、第一級、第二級および第三級アミン類、天然産生置換アミン類を含む置換アミン類、環状アミン類および塩基性イオン交換樹脂が含まれる。インビボ投与に使用される製剤は、好ましくは無菌である。これは、滅菌濾過膜を通す濾過または他の方法により、容易に達成される。
本明細書で開示されるＦｃ変異体は、免疫リポソームとしても製剤し得る。リポソームは、哺乳動物に治療物質を送達するのに有用な、様々なタイプの脂質、リン脂質および／または界面活性剤を含む小胞である。Ｆｃ変異体を含有するリポソームは、Epstein et al., 1985, Proc Natl Acad Sci USA, 82:3688；Hwang et al., 1980, Proc Natl Acad Sci USA, 77:4030；US 4,485,045；US 4,544,545；および PCT WO 97/38731に記載されているような、当分野で知られている方法により製造する。循環時間が延長されたリポソームは、ＵＳ５,０１３,５５６に開示されている。リポソームの成分は、生体膜の脂質配置と同様に、一般に二層形態で配置される。特に有用なリポソームは、逆相蒸発法により、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成を用いて生成させることができる。所望の直径を有するリポソームを得るために、リポソームを所定の孔サイズのフィルターを通して押し出す。化学療法剤または他の治療的に活性な物質を、場合によりリポソームに含有させる（Gabizon et al., 1989, J National Cancer Inst 81:1484）。
Ｆｃ変異体および他の治療的に活性な物質は、コアセルべーション技法、界面重合（例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセル、またはポリ−（メチルメトアシレート（methylmethacylate））マイクロカプセルを使用する）、コロイド性薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ−粒子およびナノカプセル）およびマクロエマルジョンを含むがこれらに限定されない方法により調製されるマイクロカプセルに封入してもよい。かかる技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980 に開示されている。持続放出製剤を調製してもよい。適する持続放出製剤の例には、固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、そのマトリックスは、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルなどの成形品の形態である。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル類、ヒドロゲル類（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（ＵＳ３,７７３,９１９）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー、分解不能なエチレン−ビニルアセテート、LUPRON DEPOT(登録商標)（これは、乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリドアセテートで構成される注射可能ミクロスフェアである）などの分解可能な乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸および ProLease(登録商標) (Alkermesから販売されている）（これは、ポリ−ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧ）のマトリックスに組み込まれた所望の生体活性分子で構成されるミクロスフェアベースの送達系である）が含まれる。
好ましくは滅菌水性溶液の形態で本発明のＦｃ変異体を含む医薬組成物の投与は、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、耳内（intraotically）、経皮、局所（例えば、ゲル、膏薬、ローション、クリームなど）、腹腔内、筋肉内、肺内、膣内、非経腸、直腸または眼内を含むがこれらに限定されない、様々な方法で行い得る。いくつかの例では、例えば、創傷、炎症などの処置のために、Ｆｃ変異体を、液剤またはスプレーとして直接適用し得る。当分野で知られているように、医薬組成物は、導入様式に応じてしかるべく製剤し得る。
患者が医薬組成物を自分で投与し得るので、いくつかの状況では、皮下投与が好ましいことがある。多くのタンパク質治療剤は、皮下投与に許容される最大量の内で治療的に有効な用量の製剤化を可能にするほど十分に強力ではない。この問題には、アルギニン−ＨＣｌ、ヒスチジンおよびポリソルベートを含むタンパク質製剤の使用により部分的に取り組み得る（ＷＯ０４０９１６５８参照）。本発明のＦｃポリペプチドは、例えば強度の増加、血清半減期の改善または溶解性の増強のために、より皮下投与し易い。
当分野で知られている通り、タンパク質治療剤は、しばしばＩＶ点滴またはボーラスにより送達し得る。本発明のＦｃ変異体も、かかる方法を使用して送達し得る。例えば、投与は、塩化ナトリウムを点滴媒体として用いる静脈内点滴により、静脈内であり得る。
吸入器または噴霧器およびエアゾル化剤を含む製剤を使用して、肺送達を達成し得る。例えば、例えば、Aradigm から購入できる AERx(登録商標)吸入技法、またはNektar Therapeutics から購入できる Inhance(商標)肺送達系を使用し得る。本発明のＦｃ変異体は、より肺内送達し易いであろう。ＦｃＲｎは肺に存在し、肺から血流への移動を促進し得る (例えば Syntonix WO 04004798, Bitonti et.al. (2004) Proc. Nat. Acad. Sci. 101:9763-8）。従って、肺でより効率的にＦｃＲｎに結合するか、または、血流により効率的に放出される抗体またはＦｃ融合体は、改善された肺内投与後のバイオアベイラビリティーを有し得る。本発明のＦｃ変異体は、例えば、溶解性の改善または等電点の変更のために、より肺内投与し易いであろう。
さらに、本発明のＦｃポリペプチドは、例えば、胃のｐＨでの安定性の改善およびタンパク質分解への耐性の増加のために、より経口送達し易いであろう。さらに、ＦｃＲｎは、大人の腸管上皮で発現されると思われるので（Dickinson et al., 1999, J Clin Invest 104:903-11）、ＦｃＲｎ相互作用プロフィールが改善された本発明のＦｃポリペプチド、例えば抗体またはＦｃ融合体は、経口投与後のバイオアベイラビリティーの増強を示し得る。ＦｃＲｎに媒介されるＦｃ変異体の輸送は、消化管、気道および生殖器官のものなど、他の粘膜でも起こり得る（Yoshida et al., 2004, Immunity 20:769-83）。
加えて、当分野で知られている数々の送達系のいずれを使用して本発明のＦｃ変異体を投与してもよい。例には、リポソーム、微小粒子、ミクロスフェア（例えば、ＰＬＡ／ＰＧＡミクロスフェア）などへの封入が含まれるがこれらに限定されない。あるいは、膜または繊維を含む、多孔質、非多孔質またはゼラチン状物質のインプラントを使用し得る。持続放出系は、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ乳酸、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、エチレン−ビニルアセテート、乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば LUPRON DEPOT(登録商標)、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸などの重合性物質またはマトリックスを含み得る。例えばレトロウイルス感染、直接注入、または脂質による被覆、細胞表面受容体、または他の形質移入物質により、本発明のＦｃ変異体をコードする核酸を投与することも可能である。全ての場合で、制御放出系を使用して、Ｆｃ変異体を所望の作用部位で、またはその近くで放出し得る。
投薬量および投与頻度は、好ましい実施態様では、治療的または予防的に有効であるように選択される。当分野で知られているように、タンパク質分解、全身対局所の送達、および新規プロテアーゼ合成の速度、並びに年齢、体重、全般的健康、性別、食事、投与時間、薬物の相互作用および症状の重篤さのために補正が必要なことがあり、当業者により日常的な実験で確認可能である。
製剤中の治療的に活性な本発明のＦｃ変異体の濃度は、約０.１ないし１００重量％で変動し得る。好ましい実施態様では、Ｆｃ変異体の濃度は、０.００３ないし１.０モル濃度の範囲にある。患者を処置するために、治療的有効量の本発明のＦｃ変異体を投与し得る。「治療的有効量」は、本明細書では、それが投与される目的である効果を奏する用量を意味する。正確な用量は処置目的に依存し、既知の技法を使用して当業者により確認可能である。投薬量は、０.０００１ないし１００ｍｇ／ｋｇ体重またはそれ以上の範囲で変動し得、例えば、０.１、１、１０または５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、１ないし１０ｍｇ／ｋｇが好ましい。
いくつかの実施態様では、Ｆｃ変異体の単回用量のみを使用する。他の実施態様では、Ｆｃ変異体の複数の用量を投与する。投与間の経過時間は、１時間より短い、約１時間、約１−２時間、約２−３時間、約３−４時間、約６時間、約１２時間、約２４時間、約４８時間、約２−４日間、約４−６日間、約１週間、約２週間または２週間より長いものであり得る。
他の実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、継続的点滴または長い休息期間のない頻繁な投与により、規則正しい投薬法で投与される。かかる規則正しい投与は、休息期間のない一定間隔の投薬を含み得る。典型的には、かかる投薬法は、例えば１−２日間、１−２週間、１−２月間または６月間まで、またはそれ以上の、長期間にわたる慢性の低用量または継続的点滴を包含する。低用量の使用により、副作用および休息期間の必要性を最小化し得る。
ある種の実施態様では、本発明のＦｃ変異体および１種またはそれ以上の他の予防または治療剤は、循環的に患者に投与される。循環治療は、ある時点で第１の物質を投与し、第２の時点で第２の物質を投与し、場合によりさらなる時点でさらなる物質を投与し、場合により休息期間をとり、次いで、この投与順序を１回またはそれ以上繰り返すことを含む。循環数は、典型的には２−１０回である。循環治療は、１種またはそれ以上の物質への耐性の発生を低減させ得るか、副作用を最小化し得るか、または、処置効力を改善し得る。
組合せ治療および共治療
本発明のＦｃ変異体は、１種またはそれ以上の他の治療法または物質と同時に投与し得る。さらなる治療法または物質を使用して、Ｆｃ変異体の効力または安全性を改善し得る。また、さらなる治療法または物質を使用して、Ｆｃ変異体の作用を変更するよりも、むしろ、同じ疾患または併存疾患を処置し得る。例えば、本発明のＦｃ変異体は、化学療法、放射線療法、または化学療法と放射線療法の両方と並行して、患者に投与し得る。本発明のＦｃ変異体は、細胞傷害性物質、化学療法剤、サイトカイン類、増殖阻害性物質、抗ホルモン剤、キナーゼ阻害剤、抗血管新生剤、心保護剤（cardioprotectant）、免疫刺激剤、免疫抑制剤、血液細胞の増殖を促進する物質、血管新生阻害剤、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）阻害剤、さらなるＦｃ変異体、ＦｃγＲＩＩｂまたは他のＦｃ受容体阻害剤、または他の治療剤を含むがこれらに限定されない、１種またはそれ以上の他の予防または治療剤と組み合わせて投与し得る。
用語「と組み合わせて」および「共に投与」は、当該予防または治療剤を正確に同時に投与することに限定されない。むしろ、それは、本発明のＦｃ変異体と他の物質を、それらが一緒に作用して、本発明のＦｃ変異体または他の物質の一方のみでの処置に対して増加した利益をもたらし得るような時間の間隔で、順番に投与することを意図する。Ｆｃ変異体と他の物質が相加的に作用するのが好ましく、それらが相乗的に作用するのが特に好ましい。かかる分子は、意図する目的に効果的な量の組合せで、ふさわしく存在する。熟練した医療従事者は、経験的に、または、その物質の薬物動態および作用様式を考慮して、各物質の適切な用量、並びに投与の適切な時機および方法を決定できる。
ある実施態様では、本発明のＦｃ変異体を、抗体またはＦｃを含む１種またはそれ以上のさらなる付加的分子と共に投与する。本発明のＦｃ変異体は、同じ疾患またはさらなる併存疾患を処置する効力を有する１種またはそれ以上の他の抗体と共に投与し得る；例えば、所定のタイプの癌で過剰発現される２種の抗原、または、自己免疫または感染性疾患の病因に介在する２種の抗原を認識する２種の抗体を投与し得る。
共に投与し得る抗癌抗体の例には、Panorex(商標) (エドレコロマブ（edrecolomab）)などの抗１７−ＩＡ細胞表面抗原抗体；抗４−１ＢＢ抗体；抗４Ｄｃ抗体；Ａ３３およびＣＤＰ−８３３などの抗Ａ３３抗体；ナタリズマブなどの抗α４β１インテグリン抗体；ＬＤＰ−０２などの抗α４β７インテグリン抗体；Ｆ−２００、Ｍ−２００およびＳＪ−７４９などの抗αＶβ１インテグリン抗体；アブシキシマブ、ＣＮＴＯ−９５、Ｍａｂ−１７Ｅ６および Vitaxin(商標)などの抗αＶβ３インテグリン抗体；５Ｇ１.１などの抗補体因子５（Ｃ５）抗体；OvaRex(登録商標)(オレゴボマブ（oregovomab））などの抗ＣＡ１２５抗体；Nuvion(登録商標)(ビシリズマブ（visilizumab））および Rexomab などの抗ＣＤ３抗体；ＩＤＥＣ−１５１、ＭＤＸ−ＣＤ４、ＯＫＴ４Ａなどの抗ＣＤ４抗体；Oncolysin B および Oncolysin CD6 などの抗ＣＤ６抗体；ＨＢ２などの抗ＣＤ７抗体；Ｂ４３、ＭＴ−１０３および Oncolysin B などの抗ＣＤ１９抗体；２Ｈ７、２Ｈ７.ｖ１６、２Ｈ７.ｖ１１４、２Ｈ７.ｖ１１５、Bexxar(登録商標)(トシツモマブ)、Rituxan(登録商標)(リツキシマブ)、Zevalin(登録商標)(イブリツモマブチウキセタン) およびＰＲＯ７０７６９などの抗ＣＤ２０抗体；Lymphocide(商標)(エピラツズマブ）などの抗ＣＤ２２抗体；ＩＤＥＣ−１５２などの抗ＣＤ２３抗体；バシリキシマブおよび Zenapax(登録商標)(ダクリズマブ）などの抗ＣＤ２５抗体；ＡＣ１０、ＭＤＸ−０６０およびＳＧＮ−３０などの抗ＣＤ３０抗体；Mylotarg(登録商標)(ゲムツズマブオゾガミシン)、Oncolysin M および Smart M195 などの抗ＣＤ３３抗体；抗ＣＤ３８抗体；ＳＧＮ−４０およびトラリズマブ（toralizumab）などの抗ＣＤ４０抗体；５ｃ８、Antova(商標)およびＩＤＥＣ−１３１などの抗ＣＤ４０Ｌ抗体；ビバツズマブ（bivatuzumab）などの抗ＣＤ４４抗体；抗ＣＤ４６抗体；Campath(登録商標)（アレムツズマブ）などの抗ＣＤ５２抗体；ＳＣ−１などの抗ＣＤ５５抗体；ｈｕＮ９０１−ＤＭ１などの抗ＣＤ５６抗体；ＭＤＸ−３３などの抗ＣＤ６４抗体；ＸＲ−３０３などの抗ＣＤ６６ｅ抗体；ＩＭＭＵ−１１０などの抗ＣＤ７４抗体；ガリキシマブ（galiximab）およびＩＤＥＣ−１１４などの抗ＣＤ８０抗体；ＭＤＸ−２１４などの抗ＣＤ８９抗体；抗ＣＤ１２３抗体；Ｂ−Ｂ４−ＤＭ１などの抗ＣＤ１３８抗体；ＡＡ−９８などの抗ＣＤ１４６抗体；抗ＣＤ１４８抗体；ｃＴ８４.６６、ラベツズマブ（labetuzumab）および Pentacea(商標)などの抗ＣＥＡ抗体；ＭＤＸ−１０１などの抗ＣＴＬＡ−４抗体；抗ＣＸＣＲ４抗体；ＡＢＸ−ＥＧＦ、Erbitux(登録商標)（セツキシマブ）、ＩＭＣ−Ｃ２２５および Merck Mab 425 などの抗体; Crucell の抗ＥｐＣＡＭ、ＩＮＧ−１およびＩＳ−ＩＬ−２などの抗ＥｐＣＡＭ抗体；抗エフリンＢ２／ＥｐｈＢ４抗体；Herceptin(登録商標)、ＭＤＸ−２１０などの抗Ｈｅｒ２抗体；シブロツズマブ（sibrotuzumab）などの抗ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）抗体；ＮＸＴ−２１１などの抗フェリチン抗体；抗ＦＧＦ−１抗体；抗ＦＧＦ−３抗体；抗ＦＧＦ−８抗体；抗ＦＧＦＲ抗体、抗フィブリン抗体；ＷＸ−Ｇ２５０および Rencarex(登録商標)などの抗Ｇ２５０抗体；ＥＭＤ−２７３０６３および TriGem などの抗ＧＤ２ガングリオシド抗体；ＢＥＣ２、ＫＷ−２８７１およびミツモマブ（mitumomab）などの抗ＧＤ３ガングリオシド抗体；ReoPro などの抗ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体；抗へパリナーゼ抗体; Herceptin(登録商標)（トラスツズマブ）、ＭＤＸ−２１０およびペルツズマブ（pertuzumab）などの抗Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ２抗体；Oncolym(登録商標)、Smart 1D10 などの抗ＨＬＡ抗体；抗ＨＭ１.２４抗体；ＩＣＭ３などの抗ＩＣＡＭ抗体；抗ＩｇＡ受容体抗体；ＣＰ−７５１８７１およびＥＭ−１６４などの抗ＩＧＦ−１抗体；ＩＭＣ−Ａ１２などの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体；ＣＮＴＯ−３２８およびエリシリモマブ（elsilimomab）などの抗ＩＬ−６抗体；HuMax(商標)-IL15 などの抗ＩＬ−１５抗体；抗ＫＤＲ抗体；抗ラミニン５抗体；Ｈｕ３Ｓ１９３およびＩＧＮ−３１１などの抗ルイスＹ抗原抗体；抗ＭＣＡＭ抗体；BravaRex および TriAb などの抗Ｍｕｃ１抗体；ＥＲＩＣ−１およびＩＣＲＴなどの抗ＮＣＡＭ抗体；Theragyn および Therex などの抗ＰＥＭ抗原抗体；抗ＰＳＡ抗体；ＩＧ８などの抗ＰＳＣＡ抗体；抗Ｐｔｋ抗体；抗ＰＴＮ抗体；ＡＭＧ−１６２などの抗ＲＡＮＫＬ抗体；抗ＲＬＩＰ７６抗体；Monopharm C などの抗ＳＫ−１抗原抗体；抗ＳＴＥＡＰ抗体；ＣＣ４９−ＳＣＡおよびＭＤＸ−２２０などの抗ＴＡＧ７２抗体；ＣＡＴ−１５２などの抗ＴＧＦ−β抗体；ＣＤＰ５７１、ＣＤＰ８７０、Ｄ２Ｅ７、Humira(登録商標)（アダリムマブ）および Remicade(登録商標)(インフリキシマブ）などの抗ＴＮＦ−α抗体；抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体；抗ＶＥ−カドへリン−２抗体；およびAntegren(商標)などの抗ＶＬＡ−４抗体が含まれる。さらに、ＧＤ３エピトープ抗体ＢＥＣ２およびｇｐ７２エピトープ抗体１０５ＡＤ７を含むがこれらに限定されない抗イディオタイプ抗体を使用し得る。加えて、抗ＣＤ３／ＣＤ２０抗体Ｂｉ２０を含むがこれらに限定されない二重特異性抗体を使用し得る。
自己免疫または炎症性疾患、移植片拒絶、ＧＶＨＤなどを処置するために共に投与し得る抗体の例には、ＬＤＰ−０２などの抗α４β７インテグリン抗体、ＬＤＰ−０１などの抗ベータ２インテグリン抗体、５Ｇ１.１などの抗補体（Ｃ５）抗体、ＢＴＩ−３２２、ＭＥＤＩ−５０７などの抗ＣＤ２抗体、ＯＫＴ３、ＳＭＡＲＴ抗ＣＤ３などの抗ＣＤ３抗体、ＩＤＥＣ−１５１、ＭＤＸ−ＣＤ４、ＯＫＴ４Ａなどの抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、ＩＣ１４などの抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１８抗体、ＩＤＥＣ１５２などの抗ＣＤ２３抗体、Zenapax などの抗ＣＤ２５抗体、５ｃ８、Antova、ＩＤＥＣ−１３１などの抗ＣＤ４０Ｌ抗体、ＭＤＸ−３３などの抗ＣＤ６４抗体、ＩＤＥＣ−１１４などの抗ＣＤ８０抗体、ＡＢＸ−ＣＢＬなどの抗ＣＤ１４７抗体、ＣＤＰ８５０などの抗Ｅ−セレクチン抗体、ReoPro/Abcixima などの抗ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、ＩＣＭ３などの抗ＩＣＡＭ−３抗体、ＶＸ−７４０などの抗ＩＣＥ抗体、ＭＤＸ−３３などの抗ＦｃＲ１抗体、rhuMab-E25 などの抗ＩｇＥ抗体、ＳＢ−２４０６８３などの抗ＩＬ−４抗体、ＳＢ−２４０５６３、ＳＣＨ５５７００などの抗ＩＬ−５抗体、ＡＢＸ−ＩＬ８などの抗ＩＬ−８抗体、抗インターフェロンガンマ抗体およびＣＤＰ５７１、ＣＤＰ８７０、Ｄ２Ｅ７、インフリキシマブ、ＭＡＫ−１９５Ｆなどの抗ＴＮＦａ抗体、Antegren などの抗ＶＬＡ−４抗体が含まれるがこれらに限定されない。自己免疫または炎症性疾患、移植片拒絶、ＧＶＨＤなどを処置するために共に投与し得る他のＦｃ−含有分子の例には、ｐ７５ＴＮＦ受容体／Ｆｃ融合体 Enbrel(登録商標)(エタネルセプト) および Regeneron の IL-1 trap が含まれるがこれらに限定されない。
感染性疾患を処置するために共に投与し得る抗体の例には、ABthrax などの抗炭疽菌抗体、CytoGam およびセビルマブ（sevirumab）などの抗ＣＭＶ抗体、CryptoGAM、Sporidin-G などの抗クリプトスポリジウム抗体、Pyloran などの抗ヘリコバクター抗体、HepeX-B、Nabi-HB などの抗Ｂ型肝炎抗体、ＨＲＧ−２１４などの抗ＨＩＶ抗体、felvizumab、HNK-20、palivizumab、RespiGam などの抗ＲＳＶ抗体、および Aurexis、Aurograb、BSYX-A110 および SE-Mab などの抗スタフィロコッカス抗体が含まれるがこれらに限定されない。
あるいは、本発明のＦｃ変異体は、１種またはそれ以上のＦｃ受容体への結合を競合する１種またはそれ以上の他の分子と共に投与し得る。例えば、阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂの阻害剤を共に投与することは、エフェクター機能の増加をもたらし得る。同様に、活性化受容体、例えばＦｃγＲＩＩＩａの阻害剤を共に投与することは、望まれないエフェクター機能を最小化し得る。Ｆｃ受容体阻害剤には、競合的ＦｃγＲ阻害剤として作用するように操作されたＦｃ変異体、並びに他の免疫グロブリン、そして特に静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）が含まれるがこれらに限定されない。ある実施態様では、Ｆｃ変異体を投与する前に阻害剤を投与し、作用させる。連続投薬の効果を達成する代替的なやり方は、Ｆｃ受容体阻害剤の即時放出投薬形を、次いで本発明のＦｃ変異体の持続放出製剤を提供することであろう。即時放出および制御放出製剤は、別々に、または１つの単位投薬形に合わせて、投与できる。ＦｃγＲＩＩｂ阻害剤の投与を使用して、望まれない免疫応答、例えば血友病患者への第ＶＩＩＩ因子投与後の抗第ＶＩＩＩ因子抗体応答を、制限し得る。
ある実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、化学療法剤と共に投与される。「化学療法剤」は、本明細書で使用されるとき、癌の処置に有用な化学的化合物を意味する。化学療法剤の例には、チオテパおよびシクロスホスファミド（cyclosphosphamido）（CYTOXAN(商標)）などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン（piposulfan）などのアルキルスルホネート類；カルステロン（calusterone）、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤（anti-adrenal）；およびフルタミド、ニルタミド（nilutamide）、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリンなどの抗アンドロゲン類；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（cactinomycin）、カリケアマイシン（calicheamicin）、カラビシン（carabicin）、カミノマイシン（caminomycin）、カルジノフィリン（carzinophilin）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（detorubicin）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（esorubicin）、イダルビシン、マルセロマイシン（marcellomycin）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン（nogalamycin）、オリボマイシン（olivomycins）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロボルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（tubercidin）、ウベニメクス、ジノスタチン（zinostatin）、ゾルビシン（zorubicin）などの抗生物質；タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール類、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（trioxifene）、ケオキシフェン（keoxifene）、LY 117018、オナプリストン（onapristone）およびトレミフェン（Fareston）などの抗エストロゲン類；メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝剤；デノプテリン（denopterin）、メトトレキセート、プテロプテリン（pteropterin）、トリメトレキセートなどの葉酸類似体；ベンゾドーパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドーパ（meturedopa）およびウレドーパ（uredopa）などのアジリジン類；アルトレトアミン（altretamine）、トリエチレンメルアミン（triethylenemelamine）、トリエチレンホスホルアミド（trietylenephosphoramide）、トリエチレンチオホスホルアミド（triethylenethiophosphaoramide）およびトリメチロールオメラミン（trimethylolomelamine）を含むエチレンイミン類およびメチルアメルアミン（methylamelamine）類；フロリン酸（frolinic acid）などの葉酸補充剤（replenisher）；クロランブシル、クロルナファジン（chlornaphazine）、クロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニマスチン（prednimustine）、トロフォスファミド（trofosfamide）、ウラシルマスタードなどの窒素マスタード；カルムスチン（carmustine）、クロロゾトシン（chlorozotocin）、フォテムスチン（fotemustine）、ロムスチン（lomustine）、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソ尿素類；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；アルギニンデイミナーゼおよびアスパラギナーゼなどのタンパク質；フルダラビン（fludarabine）、６−メルカプトプリン、チアミプリン（thiamiprine）、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フルオキシウリジン（floxuridine）、５−ＦＵなどのピリミジン類似体；タキサン類、例えばパクリタキセル（TAXOL(登録商標), Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.）およびドセタキセル（TAXOTERE(登録商標), Rhne-Poulenc Rorer, Antony, France）；トポイソメラーゼ阻害剤 RFS 2000；チミジル酸合成阻害剤（Tomudexなど）；アセグラトンを含むさらなる化学療法剤；アルドホルホラミド（aldophosphamide）グリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（bestrabucil）；ビサントレン（bisantrene）；エダトラキセート（edatraxate）；デホファミン（defofamine）；デメコルシン（demecolcine）；ジアジクオン（diaziquone）；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；エルホルミチン（elformithine）；エリプチニウムアセテート（elliptinium acetate）；エトグルシド（etoglucid）；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン（lonidamine）；ミトグアゾン（mitoguazone）；ミトキサントロン；モピダモール（mopidamol）；ニトラシン（nitracrine）；ペントスタチン；フェナメット（phenamet）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（podophyllinic acid）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK(登録商標)；ラゾキサン（razoxane）；シゾフラン（sizofuran）；スピロゲルマニウム（spirogermanium）；テヌアゾン酸（tenuazonic acid）；トリアジコン（triaziquone）；２,２',２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノマスチン（mannomustine）；ミトブロニトール；ミトラクトール（mitolactol）；ピポブロマン（pipobroman）；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン（vinorelbine）；ナベルビン（navelbine）；ノバントロン（novantrone）；テニポシド（teniposide）；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ（xeloda）；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；レチノイン酸；エスペラミシン（esperamicins）；カペシタビン（capecitabine）が含まれるがこれらに限定されない。上記のいずれかの医薬的に許容し得る塩、酸または誘導体も使用し得る。
化学療法剤または他の細胞傷害性物質は、プロドラッグとして投与し得る。「プロドラッグ」は、本明細書で使用されるとき、腫瘍細胞に対する細胞傷害性が親の薬物と比較して低く、酵素的に活性化されるか、より活性の高い親の形態に変換される能力のある、医薬的に活性な物質の前駆体または誘導体形を意味する。例えば、Wilman, 1986, Biochemical Society Transactions, 615th Meeting Belfast, 14:375-382；and Stella et al., Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.）: 247-267, Humana Press, 1985 参照。本発明で用途を見出し得るプロドラッグには、より活性の高い細胞傷害性の遊離薬物に変換され得る、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、サルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、ベータ−ラクタム含有プロドラッグ、置換されていることもあるフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは置換されていることもあるフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよび他の５−フルオロウリジンプロドラッグ類が含まれるが、これらに限定されない。本発明のＦｃ変異体と共に使用するためにプロドラッグ形態に誘導体化できる細胞傷害性の薬物の例には、上述の化学療法剤のいずれもが含まれるが、これらに限定されない。
様々な他の治療物質が、本発明のＦｃ変異体との投与に用途を見出し得る。ある実施態様では、Ｆｃ変異体は、抗血管形成剤と共に投与される。「抗血管形成剤」は、本明細書で使用されるとき、血管の発達を阻害するか、ある程度妨害する化合物を意味する。抗血管形成因子は、例えば、血管形成の促進に関与する成長因子または成長因子受容体に結合する抗体、Ｆｃ融合体またはサイトカインなどの低分子またはタンパク質であり得る。本発明において好ましい抗血管形成因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体である。ＶＥＧＦを介するシグナル伝達を阻害する他の物質、例えばＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ−Ｒの発現レベルを低下させるＲＮＡをベースとする治療剤、ＶＥＧＦ−毒素融合体、Regeneron の VEGF-trap、およびＶＥＧＦ−Ｒに結合する抗体も使用し得る。別の実施態様では、抗体またはＦｃ融合体は、適応免疫反応を誘導または増強する治療剤、例えば、ＣＴＬＡ−４を標的とする抗体、と共に投与される。さらなる抗血管新生剤には、アンジオスタチン（プラスミノーゲンフラグメント）、抗トロンビンＩＩＩ、アンジオザイム（angiozyme）、ＡＢＴ−６２７、Ｂａｙ１２−９５６６、ベネフィン（benefin）、ベバシズマブ、ビスホスホネート、ＢＭＳ−２７５２９１、軟骨由来阻害剤（ＣＤＩ）、ＣＡＩ、ＣＤ５９補体フラグメント、ＣＥＰ−７０５５、Ｃｏｌ３、コンブレトスタチン（combretastatin）Ａ−４、エンドスタチン（コラーゲンＸＶＩＩＩフラグメント）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、フィブロネクチンフラグメント、グロ（gro）−ベータ、ハロフジオネン（halofuginone）、へパリナーゼ、ヘパリンヘキササッカライドフラグメント、ＨＭＶ８３３、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ＩＭ−８６２、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターフェロン誘導可能タンパク質１０（ＩＰ−１０）、インターロイキン−１２、クリングル５（プラスミノーゲンフラグメント）、マリマスタット（marimastat）、メタロプロテイナーゼ阻害剤（例えば、ＴＩＭＰ）、２−メトジエストラジオール（methodyestradiol）、ＭＭＩ２７０（ＣＧＳ２７０２３Ａ）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ）、血小板因子−４（ＰＦ４）、プリモスタット（prinomastat）、プロラクチン１６ｋＤａフラグメント、プロリフェリン（proliferin）関連タンパク質（ＰＲＰ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５９４、レチノイド類、ソリマスタット（solimastat）、スクアラミン（squalamine）、ＳＳ３３０４、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＳＵ１１２４８、テトラヒドロコルチゾール−Ｓ、テトラチオモリブデート（tetrathiomolybdate）、サリドマイド、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）、ＴＮＰ−４７０、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、バソクロスタチン（vasculostatin）、バソスタチン（vasostatin）（カルレティキュリンフラグメント）、ＺＳ６１２６およびＺＤ６４７４が含まれるが、これらに限定されない。
好ましい実施態様では、Ｆｃ変異体は、チロシンキナーゼ阻害剤と共に投与される。「チロシンキナーゼ阻害剤」は、本明細書で使用されるとき、チロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性をある程度阻害する分子を意味する。そのような阻害剤の例には、ＰＤ１５３０３５、４−（３−クロロアニリノ）キナゾリンなどのキナゾリン類；ピリドピリミジン類；ピリミドピリミジン類；ＣＧＰ５９３２６、ＣＧＰ６０２６１およびＣＧＰ６２７０６などのピロロピリミジン類；ピラゾロピリミジン類、４−（フェニルアミノ）−７Ｈ−ピロロ（２,３−ｄ）ピリミジン類；クルクミン（ジフェルロイルメタン、４,５−ビス（４−フルオロアニリノ）フタルイミド）；ニトロチオフェン部分を含有するチルホスチン（tyrphostine）類；ＰＤ−０１８３８０５（Warner-Lambert）；アンチセンス分子 (例えば、ＥｒｂＢをコードする核酸に結合するもの）；キノキサリン類 (US 5,804,396）；トリホスチン（tryphostin）類 (US 5,804,396）；ZD6474 (Astra Zeneca）；PTK-787 (Novartis/Schering A G）；C1-1033 (Pfizer）などのpan-ErbB 阻害剤；Affinitac (ISIS 3521；Isis/Lilly）；イマチニブメシレート (STI571, Gleevec(登録商標)；Novartis）；PKI 166 (Novartis）；GW2016 (Glaxo SmithKline）；C1-1033 (Pfizer）；EKB-569 (Wyeth）；Semaxinib (Sugen）；ZD6474 (AstraZeneca）；PTK-787 (Novartis/Schering AG）；INC-1C11 (Imclone）；または以下の特許公開のいずれかに記載されている通り: US 5,804,396；PCT WO 99/09016 (American Cyanimid）；PCT WO 98/43960 (American Cyanamid）；PCT WO 97/38983 (Warner-Lambert）；PCT WO 99/06378 (Warner-Lambert）；PCT WO 99/06396 (Warner-Lambert）；PCT WO 96/30347 (Pfizer, Inc）；PCT WO 96/33978 (AstraZeneca）；PCT WO96/3397 (AstraZeneca）；PCT WO 96/33980 (AstraZeneca）、ゲフィチニブ（IRESSA(商標), ZD1839, AstraZeneca）および OSI-774 (Tarceva(商標), OSI Pharmaceuticals/Genentech）が含まれるが、これらに限定されない。
代替的実施態様では、Ｆｃ変異体は、１種またはそれ以上の免疫調節剤と共に投与される。かかる物質は、１種またはそれ以上のサイトカインの産生を増加または減少させ得るか、自己抗原提示を上方または下方調節し得るか、ＭＨＣ抗原をマスクし得るか、または、１種またはそれ以上のタイプの免疫細胞の増殖、分化、遊走または活性化状態を促進し得る。免疫調節剤には、アスプリン（asprin）、イブプロフェド（ibuprofed）、セレコキシブ、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、インドメタシン、ケトロラック、オキサプロジン、ナブメトン、スリンダク、トルメチン、ロフェコキシブ、ナプロキセン、ケトプロフェンおよびナブメトンなどの非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）；ステロイド類（例えば、グルココルチコイド、デキサメサゾン、コルチゾン、ヒドロキシコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、プロスタグランジンなどのアズリフィジネイコサノイド（azulfidineicosanoid）、トロンボキサンおよびロイコトリエン；並びにアントラリン（anthralin）、カルシポトリエン、クロベタゾールおよびタザロテンなどの局所用ステロイド類); Enbrel(登録商標) (エタネルセプト)、Humira(登録商標)(アダリムマブ）およびRemicade(登録商標)（インフリキシマブ）を含む、ＴＧＦｂ、ＩＦＮａ、ＩＦＮｂ、ＩＦＮｇ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０などのサイトカイン；ＢＡＦＦ、Ｂ７、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１４７、ＣＤ１５２、補体因子（Ｃ５、Ｄ）ＣＴＬＡ４、エオタキシン、Ｆａｓ、ＩＣＡＭ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮＡＲ、ＩｇＥ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１３Ｒ１、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２３、インテグリン、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＭＨＣ、セレクチン、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＴＮＦ−Ｒ１、Ｔ−細胞受容体に対する抗体、可溶性受容体および受容体−Ｆｃ融合体を含む、サイトカイン、ケモカインまたは受容体アンタゴニスト；異種抗リンパ球グロブリン；２−アミノ−６−アリール−５置換ピリミジン化合物などの他の免疫調節分子、ＭＨＣ結合ペプチドおよびＭＨＣフラグメントの抗イディオタイプ抗体、アザチオプリン、ブレキナル（brequinar）、ブロモクリプチン（bromocryptine）、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ、Ｄ−ペニシラミン、デオキシスペルグアリン（deoxyspergualin）、ＦＫ５０６、グルタルアルデヒド、金、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、マロノニトリロアミド類（例えば、レフルノミド）、メトトレキセート、ミノサイクリン、ミゾリビン、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシンおよびスルファサラジンが含まれるがこれらに限定されない。
別の実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、サイトカインと共に投与される。「サイトカイン」は、本明細書で使用されるとき、一細胞群から放出され、細胞間媒介物質として他の細胞に作用するタンパク質を表す一般用語を意味する。かかるサイトカインの例は、リンホカイン、モノカインおよび伝統的なポリペプチドホルモンである。ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；リラキシン；プロリラキシン；濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝細胞成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子−アルファおよび−ベータ；ミュラー管阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−ベータなどの神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータなどのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インシュリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導（osteoinductive）因子；インターフェロン−アルファ、ベータおよびガンマなどのインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５などのインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−アルファまたはＴＮＦ−ベータなどの腫瘍壊死因子；およびＬＩＦおよびキット（kit）リガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子は、サイトカインに含まれる。本明細書で使用されるとき、用語サイトカインには、天然の供給源由来または組換え細胞培養由来のタンパク質、および天然配列のサイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。
好ましい実施態様では、免疫系の細胞を刺激するサイトカインまたは他の物質を、本発明のＦｃ変異体と共に投与する。かかる処置様式は、所望のエフェクター機能を増強し得る。例えば、ＩＬ−２を含むがこれに限定されない、ＮＫ細胞を刺激する物質を、共に投与し得る。他の実施態様では、Ｃ５ａ、Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（Beigier-Bompadre et. al. (2003) Scand. J. Immunol. 57: 221-8）などのホルミルペプチドを含むがこれらに限定されない、マクロファージを刺激する物質を、共に投与し得る。また、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦなどを含むがこれらに限定されない、好中球を刺激する物質を投与し得る。さらに、かかる免疫刺激性サイトカインの遊走を促進する物質を使用し得る。また、インターフェロンガンマ、ＩＬ−３およびＩＬ−７を含むがこれらに限定されないさらなる物質は、１種またはそれ以上のエフェクター機能を促進し得る。代替的実施態様では、エフェクター細胞機能を阻害するサイトカインまたは他の物質を、本発明のＦｃ変異体と共に投与する。かかる処置様式は、望まれないエフェクター機能を制限し得る。
さらなる実施態様では、アミノグリコシド抗生物質（例えばアプラマイシン、アルベカシン、バンベルマイシン（bambermycin）、ブチロシン（butirosin）、ジベカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクトリノマイシン）、アミノシクリトール（aminocyclitol）類（例えばスペクチノマイシン）、アムフェニコール（amphenicol）抗生物質（例えばアジダムフェニコール（azidamfenicol）、クロラムフェニコール、フロルフェニコール（florfrnicol）およびチアムフェニコール（thiamphemicol）)、アンサマイシン抗生物質（例えばリファミド（rifamide）およびリファンピン）、カルバペネム類（例えばイミペネム、メロペネム、パニペネム（panipenem））；セファロスポリン類（例えばセファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン（cefazedone）、セフォゾプラン（cefozopran）、セフピミゾール、セフピラミド、セフピロム（cefpirome）、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セファレキシン、セフラジン）、セファマイシン類（セフブペラゾン、セフォキシチン、セフミノクス、セフメタゾールおよびセフォテタン）；リンコサミド（lincosamide）類（例えばクリンダマイシン、リンコマイシン）；マクロライド（例えばアジスロマイシン、ブレフェルジンＡ、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トブラマイシン）、モノバクタム類（例えばアズトレオナム、カルモナムおよびチゲルノナム（tigernonam））；ムピロシン；オキサセフェム（oxacephem）類（例えばフロモキセフ、ラタモキセフおよびモキサラクタム）；ペニシリン類（例えばアムジノシリン、アムジノシリンピボキシル（amdinocillin pivoxil）、アモキシシリン、バカンピシリン、ベキシジルペニシリン酸（bexyzyl penicillinic acid）、ベンジルペニシリンナトリウム、エピシリン（epicillin）、フェンベニシリン（fenbenicillin）、フロキサシリン（floxacillin）、ペナメシリン（penamecillin）、ペネタメートヒドリオジド（penethamate hydriodide）、ペニシリンｏ−ベネタミン（benethamine）、ペニシリンＯ、ペニシリンＶ、ペニシリンＶベンゾエート、ペニシリンＶヒドラバミン（hydrabamine）、ペニメピサイクリン（penimepicycline）およびフェンシヒシリン（phencihicillin）カリウム)；ポリペプチド(例えばバシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ、テイコプラニン（teicoplanin）、バンコマイシン）；キノロン類（アミフロキサシン（amifloxacin）、シノキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、エンロフロキサシン（enrofloxacin）、フェロキサシン（feroxacin）、フルメキン（flumequine）、ガチフロキサシン、ジェミフロキサシン（gemifloxacin）、グレパフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン（moxifloxacin）、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オキソリン酸（oxolinic acid）、ペフロキサシン（pefloxacin）、ピペミド酸、ロソキサシン（rosoxacin）、ルフロキサシン（rufloxacin）、スパルフロキサシン、テマフロキサシン（temafloxacin）、トスフロキサシン、トロバフロキサシン）；リファンピン；ストレプトグラミン類（例えばキヌプリスチン、ダルフォプリスチン）；スルホンアミド類（スルファニルアミド、スルファメトキサゾール）；テトラサイクリン類（クロルテトラサイクリン、デメクロサイクリン塩酸塩、デメチルクロルテトラサイクリン、ドキシサイクリン、ヅラマイシン（duramycin）、ミノサイクリン、ネオマイシン、オキシテトラサイクリン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、バンコマイシン）を含むがこれらに限定されない１種またはそれ以上の抗生物質と共に、Ｆｃ変異体を投与する。
アンホテリシンＢ、シクロピロクス、クロトリマゾール、エコナゾール、フルコナゾール、フルシトシン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ニコナゾール（niconazole）、ニスタチン、テルビナフィン、テルコナゾールおよびチオコナゾールなどの抗真菌剤も使用し得る。
プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤を含む抗ウイルス剤、並びに、タイプＩインターフェロン類、ウイルス融合阻害剤およびニューラミダーゼ（neuramidase）阻害剤を含む他の物質も使用し得る。抗ウイルス剤の例には、アシクロビル、アデフォビル、アマンタジン、アンプレナビル、クレバジン（clevadine）、エンフビルチド（enfuvirtide）、エンテカビル、フォスカーネット、ガンシクロビル（gangcyclovir）、イドクスウリジン、インジナビル、ロピナビル、プレコナリル、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、サキナビル、トリフルリジン、ビダラビンおよびジドブジンが含まれるがこれらに限定されず、これらを使用し得る。
本発明のＦｃ変異は、他の治療法と組み合わせてもよい。例えば、ある実施態様では、本発明の抗体またはＦｃ融合体で処置されるべき患者は、放射線療法も受け得る。放射線療法は、当分野で一般的に用いられ、当業者に知られているプロトコールに従って施すことができる。かかる治療には、セシウム、イリジウム、ヨウ素またはコバルト放射が含まれるが、これらに限定されるものではない。放射線療法は、全身放射であってもよく、肺、膀胱または前立腺などの体内または体表の特定の部位または組織に局所的に向けてもよい。典型的に、放射線療法は、約１ないし２週間の期間にわたり、パルスで施す。しかしながら、放射線療法は、もっと長い期間施してもよい。例えば、放射線療法は、頭部および頚部の癌を有する患者に、約６ないし約７週間施してもよい。場合により、放射線療法は、単回用量または複数回、連続的用量として施し得る。熟練した医療従事者は、ここで有用な放射線療法の適切な用量または複数の用量を、経験的に決定できる。本発明の他の実施態様によると、本発明のＦｃ変異体および１またはそれ以上の他の抗癌療法を、癌細胞をエクスビボで処置するのに用いる。かかるエクスビボ処置は、骨髄移植および特に自家骨髄移植において有用であり得ると企図されている。例えば、Ｆｃ変異体および上記のような１またはそれ以上の他の抗癌治療による細胞または癌細胞を含有する組織（複数も可）の処置は、レシピエントの患者への移植に先立ち、癌細胞を枯渇させるか、または実質的に枯渇させるのに用いることができる。
放射線療法は、同位体的に標識された抗体などの分子による処置を含み得る。放射性免疫治療剤の例には、Zevalin(商標)（Ｙ−９０標識化抗ＣＤ２０）、LymphoCide(商標)（Ｙ−９０標識化抗ＣＤ２２）および Bexxar(商標)（Ｉ−１３１標識化抗ＣＤ２０）が含まれる。
当然、本発明のＦｃ変異体は、手術または光線療法などのもっと他の治療技法と組み合わせて用い得ると企図されている。
治験計画および承認後の処置戦略
ａｂｄ治療の治験への薬理ゲノミクス的アプローチは、本発明の実施態様である。本発明のＦｃ変異体と相互作用し得る数々の受容体は、ヒト個体群において多型である。所定の患者または患者群について、本発明のＦｃ変異体の効力は、タンパク質中の特定の多型の有無により影響を受け得る。例えば、ＦｃγＲＩＩＩは、位置１５８で多型であり、一般的にＶ（高親和性）またはＦ（低親和性）のいずれかである。Ｖ／Ｖホモ接合型遺伝子型の患者は、抗ＣＤ２０抗体 Rituxan(登録商標)（リツキシマブ）を用いる処置に、より良好な臨床応答を有すると観察された（Carton et al., 2002, Blood 99:754-758; Weng et al., 2003, J Clin Oncol 21:3940-3947; Dall'Ozzo et al., 2004, Cancer Res 64:4664-9)。さらなる多型には、ＦｃγＲＩＩａＲ１３１またはＨ１３１が含まれるがこれらに限定されず、かかる多型は、多型に依存して、Ｆｃ結合および続く生物学的活性を増加または減少させると知られている。本発明のＦｃ変異体は、受容体の特定の多型の形態、例えば、Ｆ１５８ＦｃγＲＩＩＩａに優先的に結合し得るか、または、受容体中の特定の位置で、例えばＦｃγＲＩＩＩａのＶ１５８およびＦ１５８多型の両方で、同等の親和性で全多型に結合し得る。好ましい実施態様では、各多型に同等の結合をもたらす本発明のＦｃ変異体を抗体において使用し、異なる多型を有する患者に観られる効力の差異を排除し得る。かかる特性は、治療応答により高い一貫性を与え、非応答患者群を低減し得る。このような受容体多型への同一の結合を有する変異体Ｆｃは、関連するＦｃ受容体への結合の調節を介して、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたは循環半減期などの生物学的活性の増加、あるいは、活性の減少を有し得る。好ましい実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、結合に存在する差異を強調するか、または差異を逆転させて、受容体の多型の１つにより高いかまたは低い親和性で結合し得る。かかる特性は、特にかかる多型を有する患者群で、効力について特にあつらえた治療剤の創成を可能にし得る。例えば、高い親和性でＦｃに結合するＦｃγＲＩＩｂ多型を有する患者群は、かかる受容体の多型の形態への結合が低減されたＦｃ変異体を含有する薬物を受容でき、より効能のある薬物を創成できる。
好ましい実施態様では、本発明のＦｃ変異体の効力を予測するために、１つまたはそれ以上の多型について、患者をスクリーニングする。この情報を使用して、例えば、治験に含めるか、または除外する患者を選択し得るか、または、承認後に、適切な用量および処置の選択肢に関する指針を医師および患者に与え得る。例えば、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブは、Ｆ１５８ＦｃγＲＩＩＩａについてホモ接合性またはヘテロ接合性である患者において、最小限に効果的である（Carton et al., 2002, Blood 99:754-758; Weng et al., 2003, J Clin Oncol 21:3940-3947; Dall'Ozzo et al., 2004, Cancer Res 64:4664-9)。かかる患者は、本発明のＦｃ変異体を含む抗体に対する治療応答の改善を示し得る。ある実施態様では、患者の遺伝子型により、彼らが１種またはそれ以上の現在使用されている抗体治療剤と比較して、本発明の抗体に有意に良好に応答すると思われると示されるならば、彼らを治験に含めるように選択する。他の実施態様では、かかる遺伝子型の情報を使用して、適切な用量および処置法を決定する。他の実施態様では、患者の多型遺伝子型に基づいて、治験に含めるように、または承認後の治療を受けるように、患者を選択する。ここで、かかる治療は、かかる群に特に効くように操作されたＦｃ変異体を含有するか、あるいは、かかる処置は、多型の異なる形態に異なる活性を示さないＦｃ変異体を含有する。
本発明に含まれるのは、本発明のＦｃ変異体に好都合な臨床的応答を示すと思われるか、または、本発明のＦｃ変異体で処置したときに１種またはそれ以上の現在使用されている抗体治療剤と対比して有意に良好な応答を示すと思われる、患者を同定する診断的試験である。当分野で知られているヒトにおけるＦｃγＲ多型を決定する方法をいくつ使用してもよい。
好ましい実施態様では、本発明のＦｃポリペプチドの効力を予測するために、患者をスクリーニングする。この情報を使用して、例えば、治験に含めるか、または除外する患者を選択し得るか、または、承認後に、適切な用量および処置の選択肢に関する指針を医師および患者に与え得る。スクリーニングには、標的抗原の発現レベルまたは分布の測定が含まれ得る。例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ発現のレベルは、どの患者がトラスツズマブ治療に最も好都合に応答するかを選択するのに現在使用されている。スクリーニングは、また、遺伝子型の多型、例えばＦｃγＲまたはＦｃαＲに関する多型の決定も含み得る。例えば、ＦｃγＲＩＩＩａのＦ１５８多型の形態についてホモ接合性またはヘテロ接合性である患者は、臨床的により好都合に本発明のＦｃポリペプチドに応答し得る。治験に含める患者を選択するために、適切な投与量および処置法を決定するために、または他の治療適用のために、患者のスクリーニングから得られる情報を使用し得る。本発明に含まれるのは、本発明のＦｃ変異体に好都合な臨床的応答を示すと思われるか、または、本発明のＦｃポリペプチドで処置したときに１種またはそれ以上の現在使用されている生体治療剤と対比して有意に良好な応答を示すと思われる、患者を同定する診断的試験である。当分野で知られている抗原発現レベル、抗原分布および／またはヒトにおける遺伝子多型を決定する方法をいくつ使用してもよい。
さらに、本発明は、血液および組織サンプルなどの臨床サンプルに実施する予後の試験を含む。かかる試験は、エフェクター機能活性をアッセイし得、これには、オプソニン作用、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、ＡＤＣＰ、またはメカニズムに関係なく、癌またはその他の病原性細胞を殺傷することが含まれるがこれらに限定されない。好ましい実施態様では、本明細書で記載するものなどのＡＤＣＣアッセイを使用して、本発明の所定のＦｃポリペプチドの効力を、特定の患者について予測する。かかる情報を使用して、治験に含めるか、または除外する患者を同定し得、または、適切な投与量および処置法に関する決定をもたらし得る。かかる情報を使用して、かかるアッセイで優れた活性を示す特定のＦｃ変異体を含有する薬物も選択し得る。
実施例
本発明を例示説明するために、下記の実施例を提供する。これらの実施例は、本発明をいかなる特定の適用または操作理論に制限することも意味しない。
本発明で論じる全位置について、番号付けはＥＵインデックスまたはＥＵ番号付けスキームに従う（Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda）。これは、ＥＵ抗体の番号付けに言及するものである (Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85)。抗体の分野の当業者は、これらの慣習が免疫グロブリン配列の特定領域における非連続的番号付けからなり、免疫グロブリンファミリー中で保存された位置への標準化された参照を可能にすることがわかる。従って、ＥＵインデックスにより定義される任意の所定の免疫グロブリンの位置は、必ずしもその連続的配列に対応しない。図３は、この原理をより明確に例示説明するために、抗体アレムツズマブの連続およびＥＵインデックスの番号付けスキームを示す。Kabat ２７０、２７２、３１２、３１５、３５６および３５８を含むがこれらに限定されるものではない数々のＦｃ位置で多型が観察されており、提示した配列と科学文献中の配列との間に僅かな差異が存在し得ることにも留意すべきである。
Ｆｃ変異体およびＦｃ変異体ライブラリーは、ＵＳＳＮ１０／６７２,２８０およびＵＳＳＮ１０／８２２,２３１に記載の通り、コンピューター処理による配列をベースとする方法を使用して設計した。実験的ライブラリーは、コンピューター処理および実験的スクリーニングの連続的繰り返しで設計した。後続のＦｃライブラリーの設計は、先行するライブラリーから利益を受け、かくして、典型的には、以前のスクリーニングにおいて好都合な特性を示したＦｃ変異体の組合せからなる。図４は、ヒトＦｃ／ＦｃγＲＩＩＩｂ構造にマッピングした、本発明のＦｃ変異体でアミノ酸修飾を作成した残基を示す。構築し、実験的に試験したＦｃ変異体の全体のセットを図４１に示す。
実施例１：分子生物学およびタンパク質発現／精製
Ｆｃ変異体の実験法の大部分は、抗癌抗体アレムツズマブ（Campath(登録商標)、Ilex Pharmaceuticals LPの登録商標）に関して実行した。アレムツズマブは、その標的抗原であるＣＤ５２中の短い線状のエピトープに結合する（Hale et al., 1990, Tissue Antigens 35:118-127; Hale, 1995, Immunotechnology 1:175-187）。アレムツズマブは、その効力が一部にはそのエフェクター細胞をリクルートする能力によるので（Dyer et al., 1989, Blood 73:1431-1439; Friend et al., 1991, Transplant Proc 23:2253-2254; Hale et al., 1998, Blood 92:4581-4590; Glennie et al., 2000, Immunol Today 21:403-410）、そして結合アッセイにおけるその抗原の産生と使用が比較的簡単であるので、主たる操作の鋳型として選択された。他の抗体に関して本発明の最適化Ｆｃ変異体を評価するために、選択されたＦｃ変異体を抗Ｈｅｒ２抗体トラスツズマブ（Herceptin(登録商標)、Genentech の登録商標）、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（Rituxan(登録商標)、IDEC Pharmaceuticals Corporation の登録商標）、抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブ (Erbitux(登録商標)Imclone の登録商標）、および抗ＣＤ２０抗体ＰＲＯ７０７６９（"Immunoglobulin Variants and Uses Thereof"と題するＰＣＴ／ＵＳ２００３／０４０４２６）で評価した。スクリーニング目的でのアレムツズマブ、トラスツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブおよびＰＲＯ７０７６９の使用は、本発明をいかなる特定の抗体にも制限することも意味しない。
アレムツズマブ（campath-1H, James et al., 1999, J Mol Biol 289: 293-301）、トラスツズマブ（hu4D5-8; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-4289; Gerstner et al., 2002, J. Mol. Biol., 321: 851-862）、リツキシマブ（C2B8, US 6,399,061）およびセツキシマブ（C225, PCT US96/09847）について、ＩｇＧ１の完全長の軽鎖（ＶL−ＣL）および重鎖（ＶH−Ｃγ１−Ｃγ２−Ｃγ３）の抗体の遺伝子を、帰納的ＰＣＲを使用して、サブクローニングを補助するための便利な末端制限部位と共に構築した。これらの遺伝子を哺乳動物発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３.１Ｚｅｏ（Invitrogen）にライゲーションし、これらは、完全長軽鎖カッパ（Ｃκ）および重鎖ＩｇＧ１定常領域を含む。ｐｃＤＮＡ３.１ｚｅｏ中のこのＶH−Ｃγ１−Ｃγ２−Ｃγ３クローンを、Ｆｃ領域の変異誘発の鋳型として使用した。このクローンに、ＰＣＲをベースとする変異誘発技法または quick-change mutagenesis (Stratagene) 技法を使用して変異を導入した。Ｆｃ変異体を配列解読し、配列の忠実度を確認した。重鎖遺伝子（ＶH−Ｃγ１−Ｃγ２−Ｃγ３）（野生型または変異体）を含有するプラスミドを、軽鎖遺伝子（ＶL−ＣL）を含有するプラスミドと共に２９３Ｔ細胞に形質移入した。形質移入の５日後に培地を回収した。ペルオキシダーゼ結合ヤギ−抗ヒトＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch, catalog # 109-035-088）を使用するウエスタンで形質移入体の培養上清をスクリーニングすることにより、免疫グロブリンの発現をモニタリングした。図５は、野生型アレムツズマブおよび変異体１ないし１０の２９３Ｔ細胞における発現を示す。プロテインＡ親和性クロマトグラフィー（Pierce, Catalog # 20334）を使用して上清から抗体を精製した。図６は、ＷＴアレムツズマブについて、タンパク質精製の結果を示す。抗体のＦｃ変異体は、ＷＴと類似の発現および精製結果を示した。炭水化物の非存在下でのそれらの溶解性と機能的特性を測定するために、いくつかのＦｃ変異体を脱グリコシル化した。脱グリコシル化抗体を得るために、精製したアレムツズマブ抗体をペプチド−Ｎ−グリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅＦ）と３７℃で２４時間インキュベートした。図７は、いくつかのＦｃ変異体およびＷＴアレムツズマブの脱グリコシル化を確認するＳＤＳ ＰＡＧＥのゲルを提示する。
これらの条件下で産生されたアレムツズマブの機能的忠実度を確認するために、ＧＳＴに融合させた抗原性ＣＤ５２ペプチドを、ＩＰＴＧ誘導下、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させた。非誘導および誘導サンプルの両方を、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで流し、ＰＶＤＦ膜に転写した。ウエスタン分析のために、Sotec由来のアレムツズマブ（最終濃度２.５ｎｇ／ｕｌ）または形質移入２９３Ｔ細胞の培地（最終アレムツズマブ濃度約０.１−０.２ｎｇ／ｕｌ）を一次抗体として使用し、ペルオキシダーゼ結合ヤギ−抗ヒトＩｇＧを二次抗体として使用した。図８は、これらの結果を提示する。標的抗原に結合する能力は、発現されたアレムツズマブの構造および機能的忠実度を確認するものである。ＷＴアレムツズマブと同じ可変領域を有するＦｃ変異体は、匹敵する抗原への結合親和性を維持すると予想される。
ヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域をコードする遺伝子を、Mammalian Gene Collection (MGC:22630）から得られるクローンから、ＰＣＲにより入手した。Ｖ１５８ＦｃγＲＩＩＩａ遺伝子の突然変異導入により、Ｆ１５８ＦｃγＲＩＩＩａを構築した。ヒトＦｃγＲＩ、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ヒトＦｃγＲＩＩｂ、ヒトＦｃγＲＩＩｃ、マウスＦｃγＲＩＩＩおよびヒトＦｃＲｎα鎖およびβ−ミクログロブリン鎖の細胞外領域をコードする遺伝子を、帰納的ＰＣＲを使用して構築した。ＦｃγＲおよびＦｃＲｎα鎖を、Ｃ末端で６ｘＨｉｓタグおよびＧＳＴタグと融合させた。全遺伝子をｐｃＤＮＡ３.１ｚｅｏベクターにサブクローニングした。発現のために、ヒトＦｃγＲを含有するベクターを２９３Ｔ細胞に形質移入し、ＦｃＲｎα鎖およびβ−ミクログロブリン鎖を２９３Ｔ細胞に共に形質移入し、マウスＦｃγＲＩＩＩをＮＩＨ３Ｔ３細胞に形質移入した。分泌された受容体を含有する培地を、３日後に回収し、ニッケル親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。ウエスタン分析のために、メンブレンを抗ＧＳＴ抗体で調べた。図９は、ヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａの発現および精製の結果を示すＳＤＳ ＰＡＧＥゲルを提示する。精製ヒトＣ１ｑタンパク質複合体は、商業的に購入した (Quidel Corp., San Diego)。
実施例２．Ｆｃリガンド結合アッセイ
ヒトＦｃリガンドＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、Ｃ１ｑおよびＦｃＲｎへの結合を、設計したＦｃ変異体について測定した。結合親和性は、ビーズをベースとする発光近接アッセイである AlphaScreen(商標) アッセイ (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay (ALPHA), PerkinElmer, Wellesley, MA）を使用して測定した。ドナービーズのレーザー励起が酸素を励起し、それがアクセプタービーズに十分近ければ、化学発光事象のカスケードを生成させ、最終的に５２０−６２０ｎｍでの蛍光放射を導く。ストレプトアビジンのドナービーズに取り付けるためにＷＴアレムツズマブ抗体を標準的方法でビオチン化し、ＧＳＴタグ付きＦｃγＲおよびＦｃＲｎをグルタチオンキレートアクセプタービーズに結合させた。Ｃ１ｑ結合アッセイには、Ｎ−ヒドロスクシンイミド（ＮＨＳ）化学を使用して、タグ無しＣ１ｑタンパク質を Digoxygenin (DIG, Roche) とコンジュゲートさせ、ＤＩＧアクセプタービーズに結合させた。プロテインＡ結合アッセイには、プロテインＡアクセプタービーズを PerkinElmer から直接購入した。AlphaScreen アッセイを、Ｆｃ変異体をスクリーニングするための競合アッセイとして適用した。競合するＦｃ変異体の非存在下では、ＷＴ抗体とＦｃγＲは相互作用し、５２０−６２０ｎｍのシグナルを奏する。タグのないＦｃ変異体の添加はＷＴＦｃ／ＦｃγＲ相互作用と競合し、蛍光を定量的に減少させ、相対的結合親和性の測定を可能にする。Ｆｃ変異体をアレムツズマブまたはトラスツズマブに関してスクリーニングし、選択されたＦｃ変異体を、リツキシマブおよびセツキシマブに関してもスクリーニングした。
図１０は、選択されたＦｃ変異体によるヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａの結合について、AlphaScreen のデータを示す。低および高抗体濃度でのベースラインにより各々与えられる、各々の特定の曲線についての最大および最小発光シグナルに対して結合データを標準化した。非線形回帰を使用してデータを一部位競合モデルにフィットさせた。これらのフィットは図中で曲線により表す。これらのフィットは、各抗体について阻害濃度５０％（ＩＣ５０）（即ち、５０％阻害に必要とされる濃度）をもたらし（図１０中、破線で図解）、故にＦｃ変異体の相対的結合親和性を定量的に決定することを可能にする。各変異体のＩＣ５０をＷＴアレムツズマブのもので割ることにより、WT Herceptin に対する増強または低減の倍率（Fold WT）を得る。ここで、ＷＴアレムツズマブは（４.６３ｘ１０-9）ｘ（２）＝９.２ｎＭのＩＣ５０を有し、一方Ｓ２３９Ｄは（３.９８ｘ１０-10）ｘ（２）＝０.８ｎＭのＩＣ５０を有する。従って、Ｓ２３９Ｄアレムツズマブは、ＷＴアレムツズマブよりも９.２ｎＭ／０.８ｎＭ＝１１.６４倍緊密にヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａに結合する。図１１ａおよび１１ｂは、ＦｃγＲＩＩＩにより緊密に結合し、従ってＦｃポリペプチドエフェクター機能を改善する候補である、位置２３９、２６４、２７２、２７４および３３２に置換を有するさらなるＦｃ変異体を示す AlphaScreen データを提供する。
Ｆｃ変異体を、他のＦｃリガンドについても並行してスクリーニングした。論ずる通り、阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂは、エフェクター機能に重要な役割を果たす。AlphaScreen により測定される通りの、選択された本発明のＦｃ変異体のヒトＦｃγＲＩＩｂへの結合についての例示的データを、図１２に提供する。ＦｃγＲＩＩａは、ＦｃγＲＩＩｂと相同性の高い活性化受容体である。選択されたＦｃ変異体のヒトＦｃγＲＩＩａのＲ１３１多型の形態への結合の例示的データを、図１３に提供する。他の重要なＦｃリガンドは、新生児のＦｃ受容体ＦｃＲｎである。論ずる通り、この受容体は、Ｃγ２とＣγ３ドメインの間のＦｃ領域に結合する；結合はエンドソームの再循環を媒介するので、ＦｃのＦｃＲｎへの親和性は、抗体およびＦｃ融合体の薬物動態の鍵となる決定要因である。AlphaScreen により測定される通りの、選択されたＦｃ変異体のＦｃＲｎへの結合を示す例示的データを図１４に提供する。Ｃγ２とＣγ３ドメインの間のＦｃ上のＦｃＲｎの結合部位は、細菌のプロテインＡおよびＧの結合部位と重なり合う。プロテインＡは、抗体の精製に頻繁に用いられるので、選択された変異体を、このＦｃリガンドへの結合について試験した。図１５は、これらの AlphaScreen データを提供する。全ての変異体についてプロテインＡを並行スクリーニングに含めたわけではないが、プロテインＡクロマトグラフィーを使用してＦｃ変異体が精製される能力（実施例１参照）は、Ｆｃ変異体の大部分について、プロテインＡを結合する能力、および、さらにＣγ２−Ｃγ３ヒンジ領域の完全性が、これらのＦｃ置換により影響を受けないことを暗示する。
Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、Ｃ１ｑおよびＦｃＲｎへの結合についてのデータを、図１１について上記した通りに分析した。AlphaScreen により測定される通り、各変異体の各Ｆｃリガンドへの結合について、ＷＴと比べた増強または低減倍率を、図４１に提供する。その表は、各変異体について、変異体番号 (Variant）、変異体の置換（Substitution(s)）、抗体の文脈（Context）、ＷＴと比べた親和性の倍率（Fold）および各Ｆｃリガンドへの結合についての親和性の倍率における信頼性（Conf）、および、ＩＩＩａ：ＩＩｂ特異性の比（ＩＩＩａ：ＩＩｂ）（下記参照）を提示する。複数のデータのセットが多数の変異体について得られ、所定の変異体についての全データを一緒にグループ化した。抗体の文脈は、特定のＦｃ変異体を用いてどの抗体が構築されたかを示す；ａ＝アレムツズマブ、ｔ＝トラスツズマブ、ｒ＝リツキシマブ、ｃ＝セツキシマブおよびｐ＝ＰＲＯ７０７６９。提供されるデータは、列挙した最初の抗体、典型的にはアレムツズマブの文脈で得られたが、いくつかの場合ではトラスツズマブであった。アスタリスク（＊）は、所定のＦｃリガンドについてのデータが、トラスツズマブの文脈で得られたことを示す。１より高い倍率（Fold）は、所定のＦｃリガンドについて、親抗体と比較した結合親和性の増強を示し、１より低い倍率は、ＷＴＦｃと比較した結合親和性の低減を示す。信頼度（Conf）は対数信頼水準に対応し、これは、Ｓ字用量応答曲線へのデータのフィットから得られる。当分野で知られている通り、より低いConf値は、Fold値のより低い誤差とより高い信頼性を示す。所定の変異体およびＦｃリガンドのデータがないことは、データへのフィットが意味のある値をもたらさなかったか、または、その変異体をそのＦｃリガンドについて試験しなかったことを示す。
図４１は、様々なＦｃリガンドへの増強された親和性および変更された特異性を有する数々のＦｃ変異体が得られたことを示す。いくつかの本発明のＦｃ変異体は、様々なＦｃリガンドへの結合親和性の選択的増強をもたらし、一方、他のものは様々なＦｃリガンドへの結合親和性の選択的低減をもたらす。「選択的増強」は、本明細書で使用するとき、Ｆｃ変異体の１種またはそれ以上のＦｃリガンドへの結合親和性における、１種またはそれ以上の他のＦｃリガンドと比較した改善またはより大きい改善を意味する。例えば、所定の変異体について、例えばＦｃγＲＩＩａへの結合についてのFold WTは、例えばＦｃγＲＩＩｂへの結合についてのFold WTより大きくてよい。「選択的低減」は、本明細書で使用するとき、Ｆｃ変異体の１種またはそれ以上のＦｃリガンドへの結合親和性における、１種またはそれ以上の他のＦｃリガンドと比較した低減またはより大きい低減を意味する。例えば、所定の変異体について、例えばＦｃγＲＩへの結合についてのFold WTは、例えばＦｃγＲＩＩｂへの結合についてのFold WTより低くてよい。かかる選択性の例として、Ｇ２３６Ｓは、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩａと比較して、ＦｃγＲＩＩ類（ＩＩａ、ＩＩｂおよびＩＩｃ）に選択的増強をもたらし、ＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩｃと比較して、ＦｃγＲＩＩａへの増強がいくらか高い。しかしながら、Ｇ２３６Ａは、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩａに関してだけでなく、ＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩｃと比べても、ＦｃγＲＩＩａについて高度に選択的に増強される。選択的増強および低減は、残基Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｓ２６７、Ｈ２６８、Ｒ２９２、Ｅ２９３、Ｑ２９５、Ｙ３００、Ｓ３２４、Ａ３２７、Ｌ３２８、Ａ３３０およびＴ３３５での置換を含む変異体を含むがこれらに限定されない、数々のＦｃ変異体について観察される。包括的に、図４１で提供されるデータは、相同性の高い数々の受容体が同じＦｃγＲ結合部位に結合するという事実にも関わらず、非常に僅かな突然変異の差異を使用して、Ｆｃ領域をＦｃリガンド特異性について調整することが実際に可能であることを示す。本発明は、ある種のＦｃリガンドへのＦｃポリペプチドの親和性を他と比較して選択的に増強、同様に選択的に低減するために使用し得る、数々のＦｃ変異体を提供する。これらのようなＦｃ変異体のコレクションは、所望の結果のためにあつらえたエフェクター機能を有する抗体およびＦｃ融合体の生成を可能にするだけでなく、それを用いてエフェクター機能の生物学を実験的に調査および特徴解析する試薬の独特のセットも提供する。
論じたように、最適なエフェクター機能は、活性化ＦｃγＲ類への親和性が阻害性ＦｃγＲＩＩｂへの親和性より大きいＦｃ変異体から生じ得る。実際に、ＦｃγＲＩＩＩａに対して、ＦｃγＲＩＩｂよりも異なって増強された結合を示す数々のＦｃ変異体が得られた。この特異的プロフィールを有する２つのＦｃ変異体、Ａ３３０ＬおよびＡ３３０Ｙについて、ＦｃγＲＩＩＩａとＦｃγＲＩＩｂへの結合を直接比較するAlphaScreen(商標)データを、図１６ａおよび１６ｂに示す。この概念は、活性化ＦｃγＲＩＩＩａの増強または低減倍率（図４１、列１２）を、阻害性ＦｃγＲＩＩｂの増強または低減倍率（表４１、列８）で割ることにより定量的に定義でき、本明細書では「ＦｃγＲＩＩＩａ倍率：ＦｃγＲＩＩｂ倍率の比」または「ＩＩＩａ：ＩＩｂの比」と呼ぶ。この値を図４１の列１８に提供する（ＩＩＩａ：ＩＩｂとして）。Ａ３３０ＬおよびＡ３３０Ｙと他の変異体の組合せ、例えばＡ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２およびＳ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅは、非常に好ましいＩＩＩａ：ＩＩｂの比をもたらす。図４１は、数々のＦｃ変異体が、最高で８６：１のＩＩＩａ：ＩＩｂの比で、正の、好都合なＦｃγＲＩＩＩａ対ＦｃγＲＩＩｂの特異性プロフィールをもたらすことを示す。
エフェクター機能の増強について最も有望ないくつかの本発明のＦｃ変異体は、ＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性の実質的な増加および好都合なＦｃγＲＩＩＩａ倍率：ＦｃγＲＩＩｂ倍率の比の両方を有する。これらには、例えば、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（ＦｃγＲＩＩＩａ倍率＝５６−１９２、ＦｃγＲＩＩＩａ倍率：ＦｃγＲＩＩｂ倍率＝３）、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ（ＦｃγＲＩＩＩａ倍率＝１３０）、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ（ＦｃγＲＩＩＩａ倍率＝１３９、ＦｃγＲＩＩＩａ倍率：ＦｃγＲＩＩｂ倍率＝１８）およびＳ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ（ＦｃγＲＩＩＩａ倍率＝２９５、ＦｃγＲＩＩＩａ倍率：ＦｃγＲＩＩｂ倍率＝４８）が含まれる。図１７ａ−１７ｃは、ヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａおよびヒトＦｃγＲＩＩｂに対するこれらおよび他のＦｃ変異体の結合をトラスツズマブの文脈でモニターする、AlphaScreen データを示す。
アレムツズマブおよびトラスツズマブに加えて、選択されたＦｃ変異体を、これらの適用性の広さを調べるために、他の抗体の文脈でスクリーニングした。リツキシマブおよびセツキシマブの文脈で、選択されたＦｃ変異体のヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を測定する AlphaScreen データを、各々図１８および図１９に示す。アレムツズマブおよびトラスツズマブについて以前に示したデータと共に、これらの結果は、抗体の文脈に関わらず一貫した結合の増強を示し、従って、本発明のＦｃ変異体は、抗体およびＦｃ融合体に広く適用できる。
上記で論じた通り、Ｆｃ媒介エフェクター機能の重要なパラメーターは、ＦｃγＲＩＩＩａのＶ１５８とＦ１５８の両多型に対するＦｃの親和性である。選択された変異体の２つの受容体アロタイプへの結合を比較するAlphaScreen データを、図２０ａ（Ｖ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ）および図２０ｂ（Ｆ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ）に示す。見られるように、全変異体は、両ＦｃγＲＩＩＩａアロタイプへの結合を改善する。これらのデータは、エフェクター機能が増強された本発明のこれらのＦｃ変異体が全患者群に広く適用可能であり、臨床的効力への増強は、それを最も必要とする低応答患者群に対して潜在的に最大であることを示す。
これらのＦｃ変異体のＦｃγＲ結合親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Biacore, Uppsala, Sweden）を使用してさらに調べた。ＳＰＲは、タンパク質−タンパク質相互作用の結合親和性の測定を可能にする鋭敏かつ極度に定量的な方法であり、Ｆｃ／ＦｃγＲ結合を有効に測定するために使用されてきた（Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16478-16483)。従って、ＳＰＲは、AlphaScreenアッセイに優れた補足的結合アッセイを提供する。Ｈｉｓ−タグ付きＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａをＳＰＲチップに固定し、ＷＴおよびＦｃ変異体のアレムツズマブ抗体を広範囲の濃度でチップ上に流した。標準的な曲線フィット法を使用してデータをフィットさせることにより結合定数を得た。表３は、ＳＰＲを使用して得られた選択されたＦｃ変異体のＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合についての解離定数（Ｋｄ）を提示し、これらをAlphaScreenアッセイから得られたＩＣ５０と比較する。各変異体のＫｄおよびＩＣ５０をＷＴアレムツズマブのそれで割ることにより、ＷＴに対する改善倍率（FoldWT）を得る。
表３
ＳＰＲデータは、AlphaScreenアッセイで観察されたＦｃγＲＩＩＩａ親和性の改善を補強する。表３はさらに、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２ＥおよびＩ３３２ＥがＳ２９８ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａよりも優位であることを示す；Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４ＡはＶ１５８およびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへのＦｃ結合を各々１.７倍および４.７倍改善するが、一方Ｉ３３２Ｅは、各々２.２倍および１０.１倍の結合の増強を示し、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅは、各々４.０倍および１４倍の結合の増強を示す。Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２ＥのＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性（５２ｎＭ）が、ＷＴのＶ１５８アロタイプに対するそれ（６８ｎＭ）より良好であることも留意に値する。これは、このＦｃ変異体並びにさらに大きい結合の改善を伴うものは、低応答患者群のための抗体の臨床的効力が高応答者のために現在可能なものを達成することを可能にする。ＳＰＲとAlphaScreenの結合測定の相関を図２１ａ−２１ｄに示す。図２１ａおよび２１ｂは、各々Ｖ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合についてＫｄ−ＩＣ５０の相関を示し、図２１ｃおよび２１ｄは、各々Ｖ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合についての倍率−改善の相関を示す。これらのデータの直線への良好なフィット（ｒ2＝０.９、ｒ2＝０.８４、ｒ2＝０.９８およびｒ2＝０.９０）は、AlphaScreen 測定の正確さを支持し、Ｆｃ変異体の相対的ＦｃγＲ結合親和性の測定のためのその使用の妥当性を立証する。
ＳＰＲデータは、選択されたトラスツズマブＦｃ変異体のヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ、Ｆ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂへの結合についても獲得された。これらのデータを表４に示す。試験したＦｃ変異体は、活性化受容体ＦｃγＲＩＩＩａに対して実質的な結合の増強を示し、１００倍以上緊密な結合がＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８ＡのＦ１５８ＦｃγＲＩＩＩａとの相互作用について観察される。さらに、この最良のＦｃγＲＩＩＩａ結合物について、３−４のＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａ／ＦｃγＲＩＩｂ比が観察される。
表４
論じた通り、より高いエフェクター機能への必要性があるが、いくつかの抗体治療剤には、低減または除去されたエフェクター機能が望ましいことがある。図４１に示すいくつかのＦｃ変異体は、ＦｃγＲ結合を実質的に低減または除去し、従って、エフェクター機能が望ましくない抗体およびＦｃ融合体に用途を見出し得る。いくつかの例示的Ｆｃ変異体のヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合を測定する AlphaScreen データを、図２２ａおよび２２ｂに示す。これらのＦｃ変異体並びにそれらの組み合わせた使用は、望ましい場合に、例えばその作用メカニズムが阻害または拮抗作用を含むが標的抗原を有する細胞の殺傷を含まない抗体およびＦｃ融合体において、エフェクター機能を除去するのに用途を見出し得る。図４１に提供されるデータに基づき、Ｆｃリガンド結合および／またはエフェクター機能を低減するのに好ましい位置は、つまり、１種またはそれ以上のＦｃリガンドへの結合を低減し、かつ／または、エフェクター機能を低減するために改変し得る位置は、位置２３２、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６４、２６５、２６７、２６９、２７０、２９９、３２５、３２８、３２９および３３０を含むが、これらに限定されない。
実施例３．Ｆｃ変異体のＡＤＣＣ
エフェクター機能に対する効果を測定するために、選択されたＦｃ変異体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイを実施した。精製ヒト末梢血単球（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として用いるＤＥＬＦＩＡ(登録商標)ＥｕＴＤＡベースの細胞傷害作用アッセイ（Perkin Elmer, MA）を使用して、ＡＤＣＣを測定した。標的細胞にＢＡＴＤＡを１ｘ１０6細胞／ｍｌで載せ、４回洗浄し、９６ウェルプレートに１０,０００細胞／ウェルで播いた。次いで、明記した最終濃度でＦｃ変異体またはＷＴの抗体を使用して、標的細胞をオプソニン化した。バフィーコートから単離したヒトＰＢＭＣを指示された過剰倍率の標的細胞で添加し、プレートを３７℃で４時間インキュベートした。一緒に培養した細胞を５００ｘｇで遠心分離し、上清を別のプレートに移し、Ｅｕ溶液とインキュベートし、Packard Fusion(商標)α-FP HTリーダー（Packard Biosciences, IL）を使用して相対的蛍光ユニットを測定した。サンプルを３重（triplicate）とし、誤差評価を得た（ｎ＝３、＋／−Ｓ.Ｄ.）。ＰＣＲを使用して、ＰＢＭＣをＶ１５８またはＦ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａアロタイプについてアロタイプ分析した。
ＤｏＨＨ−２リンパ腫標的細胞を使用して、Ｆｃ変異体およびＷＴアレムツズマブのＡＤＣＣアッセイを行った。図２３ａは、これらのタンパク質の１０ｎｇ／ｍｌ抗体でのＡＤＣＣを示す棒グラフである。結果は、アレムツズマブＦｃ変異体Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４ＩおよびＩ３３２Ｅ／Ｖ２６４ＩがＷＴアレムツズマブと比較して実質的に増強されたＡＤＣＣを有することを示し、相対的ＡＤＣＣ増強は、AlphaScreen アッセイおよびＳＰＲで示されたそれらのＦｃγＲＩＩＩａへの結合の改善に比例する。ＡＤＣＣの抗体濃度に対する用量依存性を図２３ｂに示す。結合データは、低および高抗体濃度でベースラインにより各々もたらされる、各々の特定の曲線についての最小および最大発光シグナルに対して標準化した。非線形回帰を使用して、データをＳ字型用量反応モデルにフィットさせた。これは、図中の曲線で表される。このフィットは、各Ｆｃ変異体について相対的なＡＤＣＣの増強を提供する５０％有効濃度（ＥＣ５０）（即ち、５０％の有効性に必要とされる濃度）の決定を可能にする。これらの結合データのＥＣ５０は、AlphaScreen 競合データから得られたＩＣ５０に類似し、従って、これらの値の派生物は、実施例２および図１１に記載したものと類似する。図２３ｂ中、ＷＴ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅアレムツズマブのデータへのフィットから得られるｌｏｇ（ＥＣ５０）は、各々０.９９、０.６０および０.４９であり、従って、それらの各々のＥＣ５０は、９.９、４.０および３.０である。故に、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｅは、ヘテロ接合性Ｖ１５８／Ｆ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａを発現しているＰＢＭＣを使用して、ＷＴアレムツズマブの各々２.５倍および３.３倍のＡＤＣＣ増強をもたらす。これらのデータを下記表５にまとめる。
表５
これらのＡＤＣＣ増強が抗体に対して広く適用可能であるか否かを判定するために、選択されたＦｃ変異体をトラスツズマブおよびリツキシマブに関して評価した。２種の乳癌標的細胞株ＢＴ４７４およびＳｋ−Ｂｒ−３を使用して、ＡＤＣＣアッセイをＦｃ変異体およびＷＴトラスツズマブで行った。図２４ａは、１ｎｇ／ｍｌ抗体でのＡＤＣＣを図解する棒グラフを示す。結果は、Ｖ２６４ＩおよびＶ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅトラスツズマブが、ＷＴトラスツズマブと比較して実質的に増強されたＡＤＣＣをもたらすことを示し、相対的ＡＤＣＣ増強は、AlphaScreen アッセイおよびＳＰＲで示された通りの、それらのＦｃγＲＩＩＩａへの結合の改善に比例する。図２４ｂおよび２４ｃは、選択されたＦｃ変異体について、ＡＤＣＣの抗体濃度に対する用量依存を示す。これらのデータのフィットから得られるＥＣ５０およびＡＤＣＣの相対的改善倍率を、下記の表６に提供する。Ｉ３３２Ｅトラスツズマブについて、Ａ３３０ＬおよびＡ３３０Ｙと組み合わせると、有意なＡＤＣＣの改善が観察される。さらに、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅは、ホモ接合性Ｆ１５８／Ｆ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａを発現するＰＢＭＣについて、ＷＴトラスツズマブおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａと比較して３００倍より高い実質的なＡＤＣＣの増強をもたらし、これは、AlphaScreenアッセイおよびＳＰＲで観察されたＦｃγＲの結合データと合致する。
表６
ＷＩＬ２−Ｓリンパ腫標的細胞を使用して、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、ＷＴおよびＳ２９８Ａ／Ｄ３３３Ａ／Ｋ３３４ＡリツキシマブでＡＤＣＣアッセイを行った。図２５ａは、１ｎｇ／ｍｌ抗体でのこれらのタンパク質のＡＤＣＣを示す棒グラフを提示する。結果は、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅリツキシマブが、ＷＴリツキシマブと比較して実質的に増強された、そしてＳ２９８Ａ／Ｄ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａよりも優れたＡＤＣＣをもたらすことを示し、これは、AlphaScreen アッセイおよびＳＰＲにより観察されたＦｃγＲＩＩＩａの結合の改善と合致する。図２５ｂおよび２５ｃは、選択されたＦｃ変異体について、ＡＤＣＣの抗体濃度に対する用量依存を示す。これらのデータのフィットから得られるＥＣ５０およびＡＤＣＣの相対的改善倍率を、下記の表７に提供する。見られるように、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌリツキシマブは、ホモ接合性Ｆ１５８／Ｆ１５８ＦｃγＲＩＩＩａを発現するＰＢＭＣについて、ＷＴに対して９００倍より高いＥＣ５０の増強を提供する。アレムツズマブ、トラスツズマブおよびリツキシマブについて観察されたＡＤＣＣ増強の差異は、恐らく、異なるＰＢＭＣ、異なる抗体および異なる標的細胞株の使用によるものである。
表７
ここまでは、各Ｆｃポリペプチドの下方および上方のベースラインが、典型的には各々最低および最高抗体濃度での蛍光シグナルであるその特定のＦｃポリペプチドの最小および最大蛍光シグナルに設定されるように、ＡＤＣＣデータを標準化した。このやり方でデータを提示することは、異なる抗体の相対的ＥＣ５０の直接的な視覚的比較を可能にするが（故に、このように提示する理由であるが）、各Ｆｃポリペプチドによるエフェクター機能の絶対的レベルに関する重要な情報は失われる。図２６ａおよび２７ｂは、各々トラスツズマブおよびリツキシマブについて、ＰＢＭＣ単独（抗体なし）の存在下の標的細胞の蛍光シグナルにより提供されるそのアッセイの絶対的最小溶解、および、ＴｒｉｔｏｎＸ１０００の存在下の標的細胞の蛍光シグナルにより提供されるそのアッセイの絶対的最大溶解に従って標準化した、細胞をベースとするＡＤＣＣのデータを提示する。グラフは、抗体はそれらの相対的強度（potency）を反映してそれらのＥＣ５０において異なるのみならず、それらの相対的効力（efficacy）を反映して飽和濃度の抗体により得ることができる最大ＡＤＣＣレベルにおいても異なることを示す。ここまでは、これら２つの用語、強度と効力を所望の臨床特性を表すのに漠然と使用してきた。しかしながら、この今の実験の文脈では、それらは特定の量として示されるので、ここで明確に定義する。この今の実験の文脈で使用される「強度」は、ＦｃポリペプチドのＥＣ５０を表す。この今の実験の文脈で使用される「効力」は、飽和レベルでのＦｃポリペプチドの最大の起こり得るエフェクター機能を表す。ここまでに記載した強度の実質的増強に加えて、図２６ａおよび２６ｂは、本発明のＦｃ変異体がＷＴトラスツズマブおよびリツキシマブに対して１００％より高い効力の増強をもたらすことを示す。
実施例４．Ｆｃ変異体の交差確認
選択されたＦｃ変異体を、２種の抗体−アレムツズマブおよびトラスツズマブの文脈で、それらのＦｃγＲ結合およびＡＤＣＣの改善について確認した。上記の通り、AlphaScreen およびＳＰＲの両方を使用して、ヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を測定した。ＦｃγＲＩＩＩａ結合を測定する例示的 AlphaScreen データを、図２７に提供する。上記の通り、トラスツズマブの文脈で、Ｓｋ−Ｂｒ−３標的細胞およびＬＤＨ検出を使用して、ＡＤＣＣを実施した。例示的ＡＤＣＣデータを、図２８に提供する。表８は、一連のＦｃ変異体について、アレムツズマブ（alem）およびトラスツズマブ（trast）の文脈で、AlphaScreen およびＳＰＲにより決定されたＷＴに対するＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性倍率およびＷＴに対するＡＤＣＣ倍率のまとめを提供する。
表８
実施例５．様々な標的抗原発現レベルでのＡＤＣＣ
抗癌抗体の臨床的効力を統御する決定的パラメーターは、腫瘍細胞表面の標的抗原の発現レベルである。従って、ＡＤＣＣを増強するＦｃ変異体の主要な臨床的利点は、それが低レベルの抗原を発現する腫瘍の標的化を可能にすることであり得る。この仮説を試験するために、ＷＴおよびＦｃ変異体トラスツズマブ抗体を、様々なレベルのＨｅｒ２／ｎｅｕ標的抗原を発現する異なる細胞株に対してＡＤＣＣを媒介する能力について、DELFIA EuTDA 法を使用して試験した。Ｓｋ−Ｂｒ−３（１ｘ１０6コピー）、ＳｋＯＶ３（〜１ｘ１０5）、ＯＶＣＡＲ３（〜１ｘ１０4）およびＭＣＦ−７（〜３ｘ１０3コピー）を含む、低レベルに増幅されたＨｅｒ２／ｎｅｕ受容体を発現する４種の細胞株を使用した（図２９ａ）。標的細胞にＢＡＴＤＡをバッチで２５分間載せ、培地で数回洗浄し、１０,０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播いた。標的細胞を様々な抗体および濃度で１５分間オプソニン化した（最終濃度は、１／２ログ間隔で１００ｎｇ／ｍｌないし.０３１６ｎｇ／ｍｌの範囲にあり、非処理の対照を含む）。次いで、バフィーコートから単離され、ホモ接合性Ｆ１５８／Ｆ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａにアロタイプ分類されるヒトＰＢＭＣを、オプソニン化した細胞に２５倍過剰で添加し、３７℃で４時間共培養する。その後、プレートを遠心分離し、上清を除去し、Ｅｕ３＋溶液で処理し、Packard Fusion(商標)α-FP HTリーダー（PerkinElmer, Boston, MA）を使用して相対的蛍光ユニット（細胞溶解のレベルに対応する）を測定した。実験は３重に（in triplicates）実行した。図２９ｂは、４つの異なるＨｅｒ２／ｎｅｕ+細胞株に対して、ＷＴとＦｃ変異体のトラスツズマブを比較するＡＤＣＣデータを示す。Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ変異体は、高い、中度の、そして低い標的抗原の発現レベルで、ＷＴトラスツズマブに対して実質的なＡＤＣＣの増強をもたらす。この結果は、本発明のＦｃ変異体が抗癌抗体の治療手段を広げ得ることを示唆する。
実施例６．ＮＫ細胞をエフェクター細胞として用いるＡＤＣＣ
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ＡＤＣＣで重大な役割を果たすと考えられる、ＰＢＭＣに存在する細胞の亜集団である。ＰＢＭＣではなくナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をエフェクター細胞として使用する細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイで、選択されたＦｃ変異体を試験した。このアッセイでは、ＥｕＴＤＡではなく、内在性ラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を、細胞溶解をモニターするのに使用した。図３０は、ＮＫ細胞をエフェクター細胞として使用するとき、Ｆｃ変異体が実質的なＡＤＣＣの増強を示すことを示す。さらに、以前のアッセイと併せて、結果は、本発明のＦｃ変異体が、エフェクター細胞のタイプまたは使用する検出方法に関わりなく、実質的なＡＤＣＣの増強を示すことを示す。
実施例７．Ｆｃ変異体のＡＤＣＰ
もう１つの重要なＦｃγＲ媒介性エフェクター機能は、ＡＤＣＰである。標的癌細胞のファゴサイトーシスは、迅速な標的細胞の破壊を導き得るのみならず、ファゴサイトーシスは抗原提示細胞による抗原取込およびプロセシングの潜在的メカニズムであるので、増強されたＡＤＣＰは、Ｆｃポリペプチドが獲得免疫応答を誘起する能力も改善し得る。故に、本発明のＦｃ変異体がＡＤＣＰを媒介する能力を調べた。パーコール勾配を使用して単球をヘテロ接合性Ｖ１５８／Ｆ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａのＰＢＭＣから単離した。０.１ｎｇ／ｍｌの存在下で１週間培養した後、分化したマクロファージをＥＤＴＡ／ＰＢＳ−で剥がし、親油性フルオロフォアのＰＫＨ２６で製造業者のプロトコールに従って標識化した（Sigma, St Louis, Mo）。Ｓｋ−Ｂｒ−３標的細胞をＰＫＨ６７（Sigma, St Louis, Mo）で標識化し、２０,０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播き、指定した最終濃度のＷＴまたはＦｃ変異体トラスツズマブで処理する。次いで、ＰＫＨ２６で標識化したマクロファージを、オプソニン化され、標識化されたＳｋ−Ｂｒ−３細胞に、２０,０００細胞／ウェルで添加し、細胞を１８時間共培養し、その後二重標識流動細胞計測法による分析のために細胞を加工した。１０,０００カウント後、ファゴサイトーシスの割合を、集団中のＳｋ−Ｂｒ−３の総数（ファゴサイトーシスされたもの＋ファゴサイトーシスされなかったもの）に対する、ＰＫＨ７６およびＰＫＨ２６で共標識された細胞（マクロファージ＋Ｓｋ−Ｂｒ−３）の数として判定した。図３１は、様々な抗体濃度でＷＴおよびＦｃ変異体のトラスツズマブを比較するデータを示す。結果は、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ変異体が、ＷＴトラスツズマブに対してＡＤＣＰの有意な増強をもたらすことを示す。
実施例８．Ｆｃ変異体による補体の結合および活性化
補体タンパク質Ｃ１ｑは、Ｆｃ上のＦｃγＲ結合部位に近接する部位に結合し、従って、Ｆｃ変異体が補体をリクルートし活性化するそれらの能力を維持しているか否かを判定することが賢明であった。AlphaScreen アッセイを使用して、選択されたＦｃ変異体の補体タンパク質Ｃ１ｑへの結合を測定した。実施例２に記載のようにストレプトアビジンドナービーズに付着したビオチン化ＷＴアレムツズマブ抗体を用いて、そしてアクセプタービーズに直接結合したＣ１ｑを使用して、アッセイを実行した。図３２ａに示す、Ｖ２６４Ｉ、Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９ＥおよびＶ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅリツキシマブの結合データは、Ｃ１ｑ結合が損なわれていないことを示す。選択されたＦｃ変異体の細胞をベースとするＣＤＣアッセイも実施し、Ｆｃ変異体が補体を活性化する能力を維持しているか否かを調べた。Almar Blue を使用して、Ｆｃ変異体およびＷＴのリツキシマブでオプソニン化されたＷＩＬ２−Ｓリンパ腫細胞のヒト血清補体（Quidel, San Diego, CA）による溶解をモニターした。図３２ｂのデータは、Ｆｃ変異体Ｓ２３９Ｅ、Ｖ２６４ＩおよびＶ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅリツキシマブについて、ＣＤＣが妥協されないことを示す。対照的に、図３２ｃは、Ｆｃ変異体Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０ＬのＣＤＣが完全に排除され、一方Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ変異体はＷＴリツキシマブに匹敵するＣＤＣを媒介することを示す。これらの結果は、タンパク質の操作を使用して、異なるエフェクター機能の間を区別できることを示す。そのような制御は、所望の臨床成果にあつらえた特性を有する、抗体およびＦｃ融合体を含むＦｃポリペプチドの生成を可能にするのみならず、それを用いてエフェクター機能の生物学を実験的に調べるための独特な試薬のセットも提供する。
実施例９．マカークザルにおけるＢ細胞枯渇の増強
Ｆｃ変異体がエフェクター機能をインビボで増強する能力を評価するために、Ｂ細胞枯渇を使用して、カニクイザル（マカカファシクラリス（Macaca fascicularis））における抗体の細胞傷害作用を測定する臨床前研究を実施した。サンプル毎に３匹のサルにＷＴまたはＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅリツキシマブ抗体を静脈注射した。注射は、一日１回、１日目から４日目まで、４０μｇ／ｋｇ（ＷＴ対照）または１、４、１０または４０μｇ／ｋｇ（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅおよび／またはＷＴ）の適切な用量範囲で与えた。実際の濃度は、実験的に測定した。５日目から２８日目までＢ細胞およびナチュラルキラー細胞のレベルをモニターし、Ｂ細胞マーカーＣＤ２０＋およびＣＤ４０＋、並びにナチュラルキラー細胞マーカーＣＤ３−／ＣＤ１６＋およびＣＤ３−／ＣＤ８＋を使用する流動細胞計測法を使用して細胞集団を計数した。
図３３ａは、ＷＴまたはＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅリツキシマブを含む抗体を投与したサルに残っているＣＤ２０＋Ｂ細胞の割合を示す。低用量（１.８および２.１ｕｇ／ｋｇ）のＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ変異体およびＷＴ対照は、５日目に最大のＢ細胞数の差異を示す。ＮＫ細胞集団をモニターして、この細胞タイプへのエフェクター機能増強の影響を評価した；図３３ｂは、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ変異体のＣＤ２０＋Ｂ細胞殺傷の増加は、ナチュラルキラー細胞集団に影響を与えないことを示す。Ｂ細胞レベルの低下はまた、５日目について図３３ｃに示す通り、用量依存性である。
実施例１０．マウスでＦｃ変異体を試験する能力
非ヒトＦｃγＲ類のＦｃの最適化は、動物モデルでＦｃ変異体を実験的に試験するのに有用であり得る。例えば、マウス（例えば、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植マウスおよび／または遺伝子組換えマウス）で試験する場合、１種またはそれ以上のマウスＦｃγＲについて最適化されたＦｃ変異体を含む抗体およびＦｃ融合体は、臨床的効力、作用メカニズムなどに関して価値ある情報を提供し得る。本発明のＦｃ変異体がそのような実験に有用であり得るか否かを評価するために、選択されたＦｃ変異体のマウスＦｃγＲＩＩＩに対する親和性を、AlphaScreen アッセイを使用して測定した。実施例２に記載の通りストレプトアビジンドナービーズに付着したビオチン化ＷＴアレムツズマブ、および実施例２に記載の通り発現および精製した、グルタチオンキレートアクセプタービーズに結合したＧＳＴタグ付きマウスＦｃγＲＩＩＩを使用して、AlphaScreenアッセイを実行した。これらの結合データを、アレムツズマブの文脈のＦｃ変異体について図３４ａに、そして、トラスツズマブの文脈で図３４ｂおよび３４ｃに示す。結果は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａへの結合を増強するいくつかのＦｃ変異体は、マウスＦｃγＲＩＩＩへの結合も増強することを示す。ヒトではなくマウスのＰＢＭＣを使用する、上述の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイを実施することにより、Ｆｃ変異体によるマウスのエフェクター機能の増強を調べた。図３５は、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌトラスツズマブ変異体が、マウス免疫細胞の存在下でＷＴに対して実質的なＡＤＣＣ増強をもたらすことを示す。この結果は、本発明のＦｃ変異体または非ヒトＦｃγＲ類について最適化された他のＦｃ変異体が、動物モデルを使用する実験において用途を見出し得ることを示す。
実施例１１．ＣＨＯ細胞で発現されたＦｃ変異体の妥当性
本発明のＦｃ変異体をスクリーニングの目的で２９３Ｔ細胞に発現させたが、大スケールでの抗体の産生は、典型的にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株での発現により実行される。ＣＨＯで発現されたＦｃ変異体の特性を評価するために、選択されたＦｃ変異体およびＷＴのアレムツズマブを、実施例１に記載の通りにＣＨＯ細胞で発現させ、精製した。図３６は、ＣＨＯおよび２９３Ｔで発現させたＦｃ変異体およびＷＴのアレムツズマブのヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を比較するAlphaScreenデータを示す。結果は、２９３ＴまたはＣＨＯのどちらで発現されても、本発明のＦｃ変異体が同等のＦｃγＲ結合の増強を示すことを示す。
実施例１２．フコースマイナス系統（Fucose Minus Strain）におけるＦｃ変異体の増強 本発明のＦｃ変異体と他のＦｃ修飾との組合せは、最適化された特性を有する新規のＦｃポリペプチドを生成する目標と共に企図されている。本発明のＦｃ変異体を、エフェクター機能または１もしくはそれ以上のＦｃリガンドとの相互作用を変更する修飾を含む他のＦｃ修飾と組み合わせるのが有利であり得る。そのような組合せは、Ｆｃポリペプチドに、相加的、相乗的または新規の特性をもたらし得る。例えば、エフェクター機能を変更するＦｃの様々な糖形態を操作するための、数々の方法が存在する。操作された糖形態は、当分野で知られている様々な方法で生成させてよく、これらの技法の多くは、Ｆｃ領域に共有結合しているフコシル化および／またはバイセクティングオリゴサッカライドのレベルを制御することをベースとする。Ｆｃ糖形態を操作する１つの方法は、変更された糖形態を生成する細胞株、例えばＬｅｃ−１３ＣＨＯ細胞で、Ｆｃポリペプチドを発現させることである。操作された糖形態と組み合わされたＦｃ変異体の特性を調べるために、ＷＴおよびＶ２０９（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ）トラスツズマブをＬｅｃ−１３ＣＨＯ細胞で発現させ、上記の通りに生成した。図３７ａは、２９３Ｔ、ＣＨＯおよびＬｅｃ−１３細胞で発現されたＷＴおよびＶ２０９トラスツズマブによるヒトＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を比較する、AlphaScreen 結合データを示す。結果は、細胞株により産生された操作された糖形態と本発明のＦｃ変異体との間に実質的な相乗作用があることを示す。図３７ｂに示す細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイは、この結果を支持する。これらのデータは、一緒になって、他のＦｃ修飾、特に操作された糖形態が、本発明のＦｃ変異体と組み合わされて、最適化されたエフェクター機能を有するＦｃポリペプチド、例えば抗体およびＦｃ融合を生成し得ることを示す。
実施例１３．非グリコシル化Ｆｃ変異体
論じたように、本実験の１つの目標は、最適化非グリコシル化Ｆｃ変異体を得ることであった。いくつかのＦｃ変異体は、この目標に対して有意な進歩を提供する。グリコシレーション部位であるので、Ｎ２９７での置換は、非グリコシル化Ｆｃをもたらす。Ｎ２９７での置換を有する他の全てのＦｃ変異体は完全にＦｃγＲ結合を除去するが、一方Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅは、図４１に示し、図３８に図解するように、有意なＦｃγＲＩＩＩａへの結合親和性を有する。この結果の正確な理由はこの変異体の高解像度の構造がないので不確かであるが、コンピューター処理スクリーニング予想は、これは新しい好都合なＦｃ／ＦｃγＲ相互作用と好都合な静電気的特性の組合せによる可能性があることを示唆する。実際に、他の静電気的置換が、さらなる非グリコシル化Ｆｃの最適化のために構想されている。図４１は、Ｎ２９７Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅなどの他の非グリコシル化Ｆｃ変異体が、ＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性をグリコシル化ＷＴアレムツズマブの各々０.４−および０.８倍にする結合の増強をもたらすことを示す。これらの変異体の他のＦｃγＲ結合を増強するＦｃ変異体との組合せが企図されており、グリコシル化親Ｆｃとほぼ同等かまたはより良好な親和性を有する１種またはそれ以上のＦｃγＲ類に結合する非グリコシル化Ｆｃ変異体を得ることを目標としている。非グリコシル化ＦｃポリペプチドのＦｃリガンド結合および／またはエフェクター機能を増強するのに好ましいＦｃ変異体には、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｎ２９７Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｎ２９７Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅが含まれるが、これらに限定されない。本発明は、勿論、これらの非グリコシル化変異体と、Ｆｃリガンド結合および／またはエフェクター機能を増強する他の本明細書に記載のＦｃ変異体との組合せを企図している。
さらなる有望なＦｃ変異体のセットは、炭水化物の非存在下で安定性と溶解性の増強をもたらす。ＦγＲ結合を媒介しないが炭水化物とＦｃとの間の接点を決定する位置である位置２４１、２４３、２６２および２６４で置換を含むＦｃ変異体は、恐らくそれらが炭水化物の立体構造を乱すので、ＦγＲ結合を除去する。しかしながら、脱グリコシル化形態では、Ｆｃ変異体Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｒ／Ｖ２６２Ｅ／Ｖ２６４Ｒ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｅ、Ｆ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４ＲおよびＦ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒは、図３９のAlphaScreenデータで示すように、グリコシル化形態よりも強いＦｃγＲＩＩＩａへの結合を示す。この結果は、これらが非グリコシル化Ｆｃの構造、安定性、溶解性および機能の最適化の鍵となる位置であることを示す。これらの結果は共に、タンパク質の操作を使用して、炭水化物の非存在下で、抗体およびＦｃ融合体の好都合な機能および溶解特性を回復でき、これらおよび他のＦｃ位置で置換を含む好都合な溶解特性および十分な機能性を有する非グリコシル化抗体およびＦｃ融合体への道を開くことができることを示唆する。
実施例１４．好ましい変異体
総合して、本発明で提供されるデータは、最適化されたＦｃγＲ結合特性をもたらすＦｃ変異体が、増強されたエフェクター機能も提供することを示す。２３６、２３９、２４６、２４６、２４９、２５５、２５８、２６０、２６４、２６７、２６８、２７２、２７４、２８１、２８３、３０４、３２４、３２６、３２７、３３０、３３２、３３３、３３４および３３４を含むがこれらに限定されない数々の位置での置換は、エフェクター機能の改善、故に抗体およびＦｃ融合体を含むＦｃポリペプチドの臨床特性の改善に、有望な候補を提供する。本発明のＦｃ変異体の組合せは、典型的には、相加的または相乗的な結合の改善、および、従って相加的または相乗的なエフェクター機能の増強をもたらしたので、まだ探査されていない図４１に提供されるＦｃ変異体の組合せも、好都合な結果を提供すると予想される。Ｆｃリガンド結合および／またはエフェクター機能の増強に好ましい本発明のＦｃ変異体を表９に提供する。
表９
この好ましいＦｃ変異体のリストは、本発明を制限することを意図しない。実際に、図４１に提供される任意のＦｃ変異体の全ての組合せが、本発明の実施態様である。さらに、本発明のＦｃ変異体のいずれかと、他の既発見または未発見のＦｃ変異体との組合せも、好都合な特性をもたらし得、これらの組合せも本発明の実施態様として企図されている。最後に、本発明で突然変異導入された位置での他の置換も、好ましい結合の増強および特異性をもたらし得ることがこれらの結果から予想され、従って、図４１の全位置での置換が企図される。
実施例１５．Ｆｃ変異体の治療適用
本発明について記載された数々のＦｃ変異体は、抗癌抗体の治療効力の改善に有意な潜在能力を有する。例示説明のために、数々の本発明のＦｃ変異体を抗体リツキシマブの配列に組み込んだ。ＵＳ５,７３６,１３７に記載されたＷＴリツキシマブの軽鎖および重鎖を図４０ａおよび４０ｂに提供する。改善された抗ＣＤ２０抗体の配列を図４０ｃに提供する。改善された抗ＣＤ２０抗体の配列は、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8およびＸ9からなる群から選択される非ＷＴアミノ酸を少なくとも含む。これらの改善された抗ＣＤ２０抗体の配列は、置換Ｚ1および／またはＺ2も含み得る。ここでのリツキシマブの使用は、単なる例示であり、Ｆｃ変異体の適用をこの抗体または何らかの他の特定のＦｃポリペプチドに制限することを意味しない。
表１０は、ヒトＦｃの位置、野生型残基および特に本発明の実施態様に含まれる変異体を示す。表１０は、ＩｇＧ１をベースとしているが、当業者に理解されるように、同じことを任意のＩｇ、特にＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に対して行い得る。
表１０
全参考文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
例示説明のために本発明の特定の実施態様を上記で記載したが、添付の特許請求の範囲に記載した本発明から逸脱せずに、膨大な詳細の変形をなし得ることが当業者に理解される。
次に、本発明の好ましい態様を示す。
１. ヒトＦｃポリペプチド（配列番号：１）のＦｃ変異体を含むタンパク質であって、当該変異体が、ヒトＦｃポリペプチドと比較して変更されたＦｃリガンドへの結合を示し、当該変異体が：
Ｖｂ（２２１）−Ｖｂ（２２２）−Ｖｂ（２２３）−Ｖｂ（２２４）−Ｖｂ（２２５）−Ｆｘ（２２６）−Ｖｂ（２２７）−Ｖｂ（２２８）−Ｆｘ（２２９）−Ｖｂ（２３０）−Ｖｂ（２３１）−Ｖｂ（２３２）−Ｖｂ（２３３）−Ｖｂ（２３４）−Ｖｂ（２３５）−Ｖｂ（２３６）−Ｖｂ（２３７）−Ｖｂ（２３８）−Ｖｂ（２３９）−Ｖｂ（２４０）−Ｖｂ（２４１）−Ｆｘ（２４２）−Ｖｂ（２４３）−Ｖｂ（２４４）−Ｖｂ（２４５）−Ｖｂ（２４６）−Ｖｂ（２４７）−Ｆｘ（２４８）−Ｖｂ（２４９）−Ｆｘ（２５０−２５４）−Ｖｂ（２５５）−Ｆｘ（２５６−２５７）−Ｖｂ（２５８）−Ｆｘ（２５９）−Ｖｂ（２６０）−Ｆｘ（２６１）−Ｖｂ（２６２）−Ｖｂ（２６３）−Ｖｂ（２６４）−Ｖｂ（２６５）−Ｖｂ（２６６）−Ｖｂ（２６７）−Ｖｂ（２６８）−Ｖｂ（２６９）−Ｖｂ（２７０）−Ｖｂ（２７１）−Ｖｂ（２７２）−Ｖｂ（２７３）−Ｖｂ（２７４）−Ｖｂ（２７５）−Ｖｂ（２７６）−Ｆｘ（２７７）−Ｖｂ（２７８）−Ｆｘ（２７９）−Ｖｂ（２８０）−Ｖｂ（２８１）−Ｖｂ（２８２）−Ｖｂ（２８３）−Ｖｂ（２８４）−Ｖｂ（２８５）−Ｖｂ（２８６）−Ｆｘ（２８７）−Ｖｂ（２８８）−Ｆｘ（２８９）−Ｖｂ（２９０）−Ｖｂ（２９１）−Ｖｂ（２９２）−Ｖｂ（２９３）−Ｖｂ（２９４）−Ｖｂ（２９５）−Ｖｂ（２９６）−Ｖｂ（２９７）−Ｖｂ（２９８）−Ｖｂ（２９９）−Ｖｂ（３００）−Ｖｂ（３０１）−Ｖｂ（３０２）−Ｖｂ（３０３）−Ｖｂ（３０４）−Ｖｂ（３０５）−Ｆｘ（３０６−３１２）−Ｖｂ（３１３）−Ｆｘ（３１４−３１６）−Ｖｂ（３１７）−Ｖｂ（３１８）−Ｆｘ（３１９）−Ｖｂ（３２０）−Ｆｘ（３２１）−Ｖｂ（３２２）−Ｖｂ（３２３）−Ｖｂ（３２４）−Ｖｂ（３２５）−Ｖｂ（３２６）−Ｖｂ（３２７）−Ｖｂ（３２８）−Ｖｂ（３２９）−Ｖｂ（３３０）−Ｖｂ（３３１）−Ｖｂ（３３２）−Ｖｂ（３３３）−Ｖｂ（３３４）−Ｖｂ（３３５）−Ｖｂ（３３６）−Ｖｂ（３３７）；
式中、Ｖｂ（２２１）は、Ｄ、ＫおよびＹ；
Ｖｂ（２２２）は、Ｋ、ＥおよびＹからなる群から選択され；
Ｖｂ（２２３）は、Ｔ、ＥおよびＫからなる群から選択され；
Ｖｂ（２２４）は、Ｈ、ＥおよびＹからなる群から選択され；
Ｖｂ（２２５）は、Ｔ、Ｅ、ＫおよびＷからなる群から選択され；
Ｆｘ（２２６）は、Ｃであり；
Ｖｂ（２２７）は、Ｐ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｙからなる群から選択され
Ｖｂ（２２８）は、Ｐ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｙからなる群から選択され
Ｆｘ（２２９）は、Ｃであり；
Ｖｂ（２３０）は、Ｐ、Ａ、Ｅ、ＧおよびＹからなる群から選択され；
Ｖｂ（２３１）は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、ＰおよびＹからなる群から選択され；
Ｖｂ（２３２）は、Ｐ、Ｅ、Ｇ、ＫおよびＹからなる群から選択され；
Ｖｂ（２３３）は、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（２３４）は、Ｌ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され
Ｖｂ（２３５）は、Ｌ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（２３６）は、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（２３７）は、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（２３８）は、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（２３９）は、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され
Ｖｂ（２４０）は、Ｖ、Ａ、Ｉ、Ｍ、Ｔからなる群から選択され；
Ｖｂ（２４１）は、Ｆ、Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され
Ｆｘ（２４２）は、Ｌであり；
Ｖｂ（２４３）は、Ｆ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（２４４）は、Ｐ、Ｈからなる群から選択され；
Ｖｂ（２４５）は、Ｐ、Ａからなる群から選択され；
Ｖｂ（２４６）は、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（２４７）は、Ｐ、Ｇ、Ｖからなる群から選択され
Ｆｘ（２４８）は、Ｋであり；
Ｖｂ（２４９）は、Ｄ、Ｈ、Ｑ、Ｙからなる群から選択され；
Ｆｘ（２５０−２５４）は、配列−（Ｔ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｓ）−であり、
Ｖｂ（２５５）は、Ｒ、Ｅ、Ｙからなる群から選択され；
Ｆｘ（２５６−２５７）は、配列−（Ｔ−Ｐ）−であり；
Ｖｂ（２５８）は、Ｅ、Ｈ、Ｓ、Ｙからなる群から選択され；
Ｆｘ（２５９）は、Ｖであり；
Ｖｂ（２６０）は、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｙからなる群から選択され；
Ｆｘ（２６１）は、Ｃであり；
Ｖｂ（２６２）は、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｔからなる群から選択され；
Ｖｂ（２６３）は、Ｖ、Ａ、Ｉ、Ｍ、Ｔからなる群から選択され；
Ｖｂ（２６４）は、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷおよびＹからなる群から選択され；
Ｖｂ（２６５）は、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（２６６）は、Ｖ、Ａ、Ｉ、Ｍ、Ｔからなる群から選択され；
Ｖｂ（２６７）は、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（２６８）は、Ｈ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（２６９）は、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（２７０）は、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（２７１）は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（２７２）は、Ｅ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（２７３）は、Ｖ、Ｉからなる群から選択され；
Ｖｂ（２７４）は、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（２７５）は、Ｆ、Ｌ、Ｗからなる群から選択され；
Ｖｂ（２７６）は、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｆｘ（２７７）は、Ｗであり；
Ｖｂ（２７８）は、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗからなる群から選択され；
Ｆｘ（２７９）は、Ｖであり；
Ｖｂ（２８０）は、Ｄ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｗからなる群から選択され；
Ｖｂ（２８１）は、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（２８２）は、Ｖ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（２８３）は、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（２８４）は、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（２８５）は、Ｈ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｑ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（２８６）は、Ｎ、Ｅ、Ｇ、Ｐ、Ｙからなる群から選択され；
Ｆｘ（２８７）は、Ａからなる群から選択され；
Ｖｂ（２８８）は、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｙからなる群から選択され；
Ｆｘ（２８９）は、Ｔであり；
Ｖｂ（２９０）は、Ｋ、Ｄ、Ｈ、Ｌ、Ｎ、Ｗからなる群から選択され；
Ｖｂ（２９１）は、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｑ、Ｔからなる群から選択され；
Ｖｂ（２９２）は、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｔ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（２９３）は、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（２９４）は、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（２９５）は、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（２９６）は、Ｙ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖからなる群から選択され；
Ｖｂ（２９７）は、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（２９８）は、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（２９９）は、Ｔ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（３００）は、Ｙ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗからなる群から選択され；
Ｖｂ（３０１）は、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（３０２）は、Ｖ、Ｉからなる群から選択され；
Ｖｂ（３０３）は、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（３０４）は、Ｓ、Ｄ、Ｈ、Ｌ、Ｎ、Ｔからなる群から選択され；
Ｖｂ（３０５）は、Ｖ、Ｅ、Ｔ、Ｙからなる群から選択され；
Ｆｘ（３０６−３１２）は、−（Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｌ−Ｈ−Ｑ−Ｄ）−であり；
Ｖｂ（３１３）は、Ｗ、Ｆからなる群から選択され；
Ｆｘ（３１４−３１６）は、−（Ｌ−Ｎ−Ｇ）−であり；
Ｖｂ（３１７）は、Ｋ、Ｅ、Ｑからなる群から選択され；
Ｖｂ（３１８）は、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｙからなる群から選択され；
Ｆｘ（３１９）は、Ｙであり；
Ｖｂ（３２０）は、Ｋ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｆｘ（３２１）は、Ｃであり；
Ｖｂ（３２２）は、Ｋ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（３２３）は、Ｖ、Ｉからなる群から選択され；
Ｖｂ（３２４）は、Ｓ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（３２５）は、Ｎ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（３２６）は、Ｋ、Ｉ、Ｌ、Ｐ、Ｔからなる群から選択され；
Ｖｂ（３２７）は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（３２８）は、Ｌ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（３２９）は、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（３３０）は、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（３３１）は、Ｐ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（３３２）は、Ｉ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（３３３）は、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｔ、Ｙからなる群から選択され；Ｖｂ（３３４）は、Ｋ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｐ、Ｔからなる群から選択され；
Ｖｂ（３３５）は、Ｔ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（３３６）は、Ｉ、Ｅ、Ｋ、Ｙからなる群から選択され；
Ｖｂ（３３７）は、Ｓ、Ｅ、Ｈ、Ｎからなる群から選択される；
を含む式を有し、かつ、当該変異体が、配列番号：１と比較して１個ないし４個のアミノ酸置換を含む、タンパク質。
２. 当該置換が、Ｇ２３６Ｓ、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｔ、Ｋ２４６Ｈ、Ｔ２６０Ｈ、Ｋ２４６Ｙ、Ｄ２４９Ｙ、Ｒ２５５Ｙ、Ｅ２５８Ｙ、Ｖ２６４Ｉ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｄ、Ｈ２６８Ｅ、Ｅ２７２Ｙ、Ｅ２７２Ｉ、Ｅ２７２Ｈ、Ｋ２７４Ｅ、Ｇ２８１Ｄ、Ｅ２８３Ｌ、Ｅ２８３Ｈ、Ｓ３０４Ｔ、Ｓ３２４Ｇ、Ｓ３２４Ｉ、Ｋ３２６Ｔ、Ａ３２７Ｄ、Ａ３３０Ｙ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｉ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｑ、Ｅ３３３Ｙ、Ｋ３３４ＴおよびＫ３３４Ｆからなる群から選択され、番号付けはＥＵインデックスに従うものである、上記１に記載のタンパク質。
３. 当該Ｆｃ変異体が、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｇ２３６Ｓ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｉ、Ｉ３３２Ｅ／Ｖ２６４Ｉ、Ｉ３３２Ｅ／Ｈ２６８Ｄ、Ｉ３３２Ｅ／Ｈ２６８Ｅ、Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａ、Ｉ３３２Ｅ／Ｋ３２６Ｅ、Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｙ、Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｉ、Ｉ３３２Ｅ／Ｇ２３６Ａ、Ｉ３３２Ｅ／Ｇ２３６Ｓ、Ｉ３３２Ｄ／Ｖ２６４Ｉ、Ｉ３３２Ｄ／Ｈ２６８Ｄ、Ｉ３３２Ｄ／Ｈ２６８Ｅ、Ｉ３３２Ｄ／Ｓ２９８Ａ、Ｉ３３２Ｄ／Ｋ３２６Ｅ、Ｉ３３２Ｄ／Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｄ／Ａ３３０Ｙ、Ｉ３３２Ｄ／Ａ３３０Ｉ、Ｉ３３２Ｄ／Ｇ２３６Ａ、Ｉ３３２Ｄ／Ｇ２３６Ｓ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ２４６Ｈ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２６７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ３２４Ｇ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ３２４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３２７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３３４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ２４６Ｈ／Ｔ２６０Ｈ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ２４６Ｈ／Ｈ２６８Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ２４６Ｈ／Ｈ２６８Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｓ３２４Ｇ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｅ／Ｓ３２４Ｇ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｋ３２６Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｅ／Ｋ３２６Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｅ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｅ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ２６７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｈ２６８Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｈ２６８Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｇ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｋ３２６Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｋ３２６Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ａ３２７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｔ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｔ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選択され、番号付けはＥＵインデックスに従うものである、上記２に記載のタンパク質。
４. Ｓ２９８Ａ、Ｋ３２６Ｅ、Ｋ３２６Ｄ、Ｋ３２６Ａ、Ｅ３３３ＡおよびＫ３３４Ａからなる群から選択される置換をさらに含み、番号付けはＥＵインデックスに従うものである、上記２に記載のタンパク質。
５. ヒトＦｃポリペプチド（配列番号：１）のＦｃ変異体を含むタンパク質であって、当該Ｆｃ変異体が、当該親ＦｃポリペプチドのＦｃ領域に少なくとも１個のアミノ酸修飾を含み、当該変異体タンパク質が、１種またはそれ以上のＦｃリガンドへの結合を、１種またはそれ以上の他のＦｃリガンドと比べて選択的に増強し、かつ、当該Ｆｃ変異体が、２３４、２３５、２３６、２６７、２６８、２９２、２９３、２９５、３００、３２４、３２７、３２８、３３０および３３５からなる群から選択される位置で置換を含み、番号付けはＥＵインデックスに従うものである、タンパク質。
６. 当該Ｆｃ変異体が、ＦｃγＲＩＩＩと比べて、１種またはそれ以上のＦｃγＲＩＩへの結合を増強する、上記５に記載のタンパク質。
７. 当該Ｆｃ変異体が、置換Ｇ２３６ＳまたはＧ２３６Ａを含む、上記６に記載のタンパク質。
８. 当該Ｆｃ変異体が、ＦｃγＲＩＩｂと比べて、ＦｃγＲＩＩａまたはＦｃγＲＩＩｃへの結合を増強する、上記５に記載のタンパク質。
９. 当該Ｆｃ変異体が、置換Ｇ２３６ＳまたはＧ２３６Ａを含む、上記８に記載のタンパク質。
１０. 親ＦｃポリペプチドのＦｃ変異体を含むタンパク質であって、当該Ｆｃ変異体が、当該親ＦｃポリペプチドのＦｃ領域に少なくとも１個のアミノ酸修飾を含み、当該変異体タンパク質が、１種またはそれ以上のＦｃリガンドへの結合を低減させ、かつ、当該Ｆｃ変異体が、２３２、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６４、２６５、２６７、２６９、２７０、２９９、３２５、３２８、３２９および３３０からなる群から選択される位置で置換を含み、番号付けはＥＵインデックスに従うものである、タンパク質。
１１. 当該Ｆｃ変異体が、位置２９９または３２８で置換を含み、番号付けはＥＵインデックスに従うものである、上記１０に記載のタンパク質。
１２. 当該変異体が、ヒトＦｃポリペプチドと比較して変更されたＦｃリガンドへの結合を示す、配列番号：５を含むタンパク質。

Claims (13)

  1. 親ＦｃポリペプチドのＦｃ変異体を含むタンパク質であって、前記変異体は、Ｆｃ領域において、２６７Ｄおよび２６７Ｅから選択されるアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスに従うものである、タンパク質。
  2. Ｆｃ変異体が、親Ｆｃポリペプチドと比較して増加したＦｃγＲＩＩｂへの結合親和性を示す、請求項１に記載のタンパク質。
  3. Ｆｃ変異体が、親Ｆｃポリペプチドと比較して５倍より高いＦｃγＲへの親和性を示す、請求項１に記載のタンパク質。
  4. 抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  5. 抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体およびモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項４に記載のタンパク質。
  6. 抗体が、操作された糖形態を含む、請求項４または５に記載のタンパク質。
  7. 操作された糖形態が、天然ヒトＩｇＧと比較して減少したレベルのフコースを有する、請求項６に記載のタンパク質。
  8. ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、Ｍｕｃ１、ＧＤ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＩｇＥ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＮＦ−アルファ、ＭＵＣ１８、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）およびＶＥＧＦからなる群から選択される標的抗原に対して特異性を有する、請求項４〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
  9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質を含み、さらに医薬的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
  10. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
  11. 請求項１０に記載の核酸を含む発現ベクター。
  12. 請求項１０に記載の核酸を含む宿主細胞。
  13. 抗体応答疾患の治療用の医薬を製造するための、請求項４〜８のいずれか１項に記載のタンパク質の使用。
JP2011136557A 2004-07-15 2011-06-20 最適化Ｆｃ変異体 Active JP5301611B2 (ja)

Applications Claiming Priority (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US56844004P 2004-07-15 2004-07-15
US60/568,440 2004-07-15
US58990604P 2004-07-20 2004-07-20
US60/589,906 2004-07-20
US62702604P 2004-11-09 2004-11-09
US60/627,026 2004-11-09
US62699104P 2004-11-10 2004-11-10
US60/626,991 2004-11-10
US62777404P 2004-11-12 2004-11-12
US60/627,774 2004-11-12

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2007520301A Division JP2008505174A (ja) 2004-07-15 2005-05-05 最適化Ｆｃ変異体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2011188869A true JP2011188869A (ja) 2011-09-29
JP5301611B2 JP5301611B2 (ja) 2013-09-25

Family

ID=35501263

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2007520301A Pending JP2008505174A (ja) 2004-07-15 2005-05-05 最適化Ｆｃ変異体
JP2011136557A Active JP5301611B2 (ja) 2004-07-15 2011-06-20 最適化Ｆｃ変異体

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2007520301A Pending JP2008505174A (ja) 2004-07-15 2005-05-05 最適化Ｆｃ変異体

Country Status (13)

Country Link
EP (4) EP2471813B1 (ja)
JP (2) JP2008505174A (ja)
KR (1) KR100863776B1 (ja)
CN (4) CN101987870B (ja)
AU (1) AU2005272993B2 (ja)
BR (1) BRPI0510674A (ja)
CA (1) CA2565961A1 (ja)
DK (1) DK2471813T3 (ja)
ES (1) ES2530340T3 (ja)
IL (1) IL179048A0 (ja)
PL (1) PL2471813T3 (ja)
SI (1) SI2471813T1 (ja)
WO (1) WO2006019447A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11840571B2 (en) 2015-12-14 2023-12-12 Macrogenics, Inc. Methods of using bispecific molecules having immunoreactivity with PD-1 and CTLA-4

Families Citing this family (285)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040132101A1 (en) * 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
CA2536408A1 (en) 2003-08-22 2005-03-03 Biogen Idec Ma Inc. Improved antibodies having altered effector function and methods for making the same
JP2008504002A (ja) 2003-11-12 2008-02-14 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）結合ポリペプチド改変体、ダイマーＦｃ結合タンパク質、およびそれらに関連する方法
US8647625B2 (en) 2004-07-26 2014-02-11 Biogen Idec Ma Inc. Anti-CD154 antibodies
ES2426817T3 (es) 2004-08-04 2013-10-25 Mentrik Biotech, Llc Regiones Fc variantes
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
EP2325207B1 (en) * 2004-11-12 2017-03-15 Xencor, Inc. FC variants with altered binding to FCRN
CA2602663A1 (en) * 2005-03-31 2006-10-05 Xencor, Inc. Fc variants with optimized properties
AU2006232287B2 (en) 2005-03-31 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
JP5144499B2 (ja) 2006-03-31 2013-02-13 中外製薬株式会社 二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法
EP4342995A2 (en) 2006-03-31 2024-03-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
EP2011870A4 (en) * 2006-04-14 2010-09-15 Medical & Biol Lab Co Ltd MUTANT POLYPEPTIDE WITH EFFECTOR FUNCTION
KR101528939B1 (ko) 2006-07-18 2015-06-15 사노피 암 치료를 위한 ｅｐｈａ2에 대한 길항제 항체
WO2008030564A2 (en) * 2006-09-08 2008-03-13 Verenium Corporation Aglycosylated antibodies and methods of making and using those antibodies
JPWO2008032833A1 (ja) * 2006-09-14 2010-01-28 株式会社医学生物学研究所 Ａｄｃｃ活性を増強させた抗体及びその製造方法
US8394374B2 (en) 2006-09-18 2013-03-12 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target HM1.24
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
CL2007003411A1 (es) 2006-11-28 2008-07-04 Centelion Proteina fusion que consiste en una region fc de una inmunoglobulina con un fragmento o dominio soluble de un receptor para fgf; polinucleotido que la codifica y vector y celula que lo comprenden; composicion farmaceutica que comprende la proteina fu
US20080311034A1 (en) * 2007-04-30 2008-12-18 Anderson Glenn M Anti-Tissue Factor Antibodies and Compositions with Enhanced Effector Function
NZ599278A (en) * 2007-05-14 2013-12-20 Medimmune Llc Methods of reducing eosinophil levels
EP2176298B1 (en) 2007-05-30 2017-11-15 Xencor, Inc. Methods and compositions for inhibiting cd32b expressing cells
AU2012244352B2 (en) * 2007-05-30 2017-02-02 Xencor, Inc. Methods and compositions for inhibiting CD32b expressing cells
CA2687377C (en) * 2007-05-30 2013-05-14 Genexine Co., Ltd. Immunoglobulin fusion proteins
AU2013204271B2 (en) * 2007-05-30 2016-10-20 Xencor, Inc. Methods and compositions for inhibiting CD32b expressing cells
PE20120259A1 (es) 2007-08-09 2012-04-04 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-cd37
EP2853267B1 (en) 2007-09-21 2016-12-07 The Regents of the University of California Targeted interferon demonstrates potent apoptotic and anti-tumor activities
MX2010003450A (es) 2007-09-26 2010-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Region constante de anticuerpo modificada.
EP3127921A1 (en) 2007-09-26 2017-02-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substition in cdr
JP5427348B2 (ja) * 2007-10-12 2014-02-26 株式会社医学生物学研究所 エフェクター機能が向上した抗体
EP2230300A4 (en) * 2007-10-24 2012-08-08 Otsuka Chemical Holdings Co Ltd POLYPEPTIDE WITH IMPROVED EFFECTOR FUNCTION
CA2705509A1 (en) 2007-11-14 2009-05-22 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Diagnosis and treatment of cancer using anti-gpr49 antibody
MX337081B (es) 2007-12-05 2016-02-10 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-nr10 y su uso.
HUE024903T2 (en) 2007-12-26 2016-02-29 Xencor Inc FC variants with modified binding to FCRN
AU2009206506B2 (en) * 2008-01-23 2013-01-10 Xencor, Inc. Optimized CD40 antibodies and methods of using the same
EP2650017A3 (en) * 2008-02-05 2014-01-22 Bristol-Myers Squibb Company Alpha 5 - beta 1 antibodies and their uses
KR102269708B1 (ko) 2008-04-11 2021-06-25 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
CN102292353B (zh) * 2008-09-17 2015-04-29 Xencor公司 用于治疗ige介导的疾患的新组合物和方法
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
WO2010078526A1 (en) 2008-12-31 2010-07-08 Biogen Idec Ma Inc. Anti-lymphotoxin antibodies
WO2010107110A1 (ja) 2009-03-19 2010-09-23 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
TWI646193B (zh) 2009-03-19 2019-01-01 中外製藥股份有限公司 抗體恆定區域改變體
NZ595792A (en) 2009-04-20 2014-01-31 Oxford Biotherapeutics Ltd Antibodies specific to cadherin-17
JP5669732B2 (ja) 2009-05-15 2015-02-12 中外製薬株式会社 抗ａｘｌ抗体
AU2010290077C1 (en) 2009-08-24 2015-12-03 Bioverativ Therapeutics Inc. Coagulation factor IX compositions and methods of making and using same
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
US10150808B2 (en) 2009-09-24 2018-12-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
UY32914A (es) 2009-10-02 2011-04-29 Sanofi Aventis Anticuerpos que se usan específicamente al receptor epha2
EP2470569A1 (en) 2009-10-13 2012-07-04 Oxford Biotherapeutics Ltd. Antibodies against epha10
PT3202898T (pt) 2009-11-02 2018-12-28 Univ Washington Composições de nucleases terapêuticas e métodos
SI2506871T1 (sl) 2009-11-30 2016-12-30 Janssen Biotech, Inc. Mutanti Fc protitelesa z odstranjenimi efektorskimi funkcijami
US10053513B2 (en) 2009-11-30 2018-08-21 Janssen Biotech, Inc. Antibody Fc mutants with ablated effector functions
US8362210B2 (en) 2010-01-19 2013-01-29 Xencor, Inc. Antibody variants with enhanced complement activity
JP5841072B2 (ja) 2010-02-10 2016-01-06 イミュノジェン・インコーポレーテッド Ｃｄ２０抗体およびその使用
WO2011108502A1 (ja) * 2010-03-02 2011-09-09 協和発酵キリン株式会社 改変抗体組成物
US10435458B2 (en) 2010-03-04 2019-10-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variants with reduced Fcgammar binding
CA2794708C (en) * 2010-03-29 2021-11-16 Zymeworks Inc. Antibodies with enhanced or suppressed effector function
BR112012030179A8 (pt) 2010-05-27 2023-03-14 Merck Sharp & Dohme Polipeptídeo contendo fc
EP2582722A4 (en) 2010-06-19 2013-12-18 Sloan Kettering Inst Cancer ANTIBODIES AGAINST GD2
EA201291482A1 (ru) 2010-07-09 2013-10-30 Байоджен Айдек Хемофилия Инк. Химерные факторы коагуляции
UA112062C2 (uk) 2010-10-04 2016-07-25 Бьорінгер Інгельхайм Інтернаціональ Гмбх Cd33-зв'язувальний агент
MX355060B (es) 2010-11-17 2018-04-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula multiespecifica de union a antigeno que tiene funcion alternativa a la funcion del factor viii de coagulacion sanguinea.
AU2011337704B2 (en) 2010-11-30 2017-06-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
RU2018108836A (ru) * 2011-02-04 2019-03-14 Дженентек, Инк. ВАРИАНТЫ Fc И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
US10689447B2 (en) 2011-02-04 2020-06-23 Genentech, Inc. Fc variants and methods for their production
WO2012132067A1 (ja) 2011-03-30 2012-10-04 中外製薬株式会社 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法
KR102147548B1 (ko) 2011-02-25 2020-08-24 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 ＦｃγＲＩＩｂ 특이적 Ｆｃ 항체
EA029300B1 (ru) * 2011-03-02 2018-03-30 Роше Гликарт Аг Антитело к связанному с мембраной человеческому карциноэмбриональному антигену, его получение и применение
MX336740B (es) * 2011-03-29 2016-01-29 Roche Glycart Ag Variantes de fragmento cristalizable (fc) de los anticuerpos.
EP3825325A3 (en) 2011-03-30 2021-10-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Retention of antigen-binding molecules in blood plasma and method for modifying immunogenicity
KR102639563B1 (ko) 2011-03-30 2024-02-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항원 결합 분자의 혈장 체류성과 면역원성을 개변하는 방법
CA2834626A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 University Of Washington Therapeutic nuclease compositions and methods
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
JP2014517846A (ja) * 2011-05-25 2014-07-24 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション 改善された特性を有するＦｃ含有ポリペプチドの製造方法
US9486507B2 (en) 2011-06-10 2016-11-08 Biogen Ma Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
CA2840537C (en) 2011-06-28 2021-12-14 Oxford Biotherapeutics Ltd. Antibodies to adp-ribosyl cyclase 2
CN103827300A (zh) * 2011-06-30 2014-05-28 中外制药株式会社 异源二聚化多肽
US9738707B2 (en) 2011-07-15 2017-08-22 Biogen Ma Inc. Heterodimeric Fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto
UY34317A (es) 2011-09-12 2013-02-28 Genzyme Corp Anticuerpo antireceptor de célula T (alfa)/ß
US20130108641A1 (en) 2011-09-14 2013-05-02 Sanofi Anti-gitr antibodies
TW201817744A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
EP3939996A1 (en) 2011-09-30 2022-01-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
TWI681970B (zh) 2011-09-30 2020-01-11 日商中外製藥股份有限公司 包含依離子濃度之條件對抗原之結合活性會改變之抗原結合分域、及於pH中性之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域、且誘導對標的抗原的免疫反應之抗原結合分子
CN108144058A (zh) * 2011-09-30 2018-06-12 中外制药株式会社 促进抗原消除的抗原结合分子
CN113416256A (zh) 2011-11-30 2021-09-21 中外制药株式会社 包含进入细胞内以形成免疫复合体的搬运体(载体)的药物
AU2012347972B2 (en) 2011-12-05 2018-05-10 X-Body, Inc. PDGF receptor beta binding polypeptides
BR112014017165B1 (pt) 2012-01-12 2023-05-02 Bioverativ Therapeutics Inc Proteína quimérica compreendendo uma proteína de fator viii, composição farmacêutica, e seus usos
US20150210763A1 (en) * 2012-02-09 2015-07-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha MODIFIED Fc REGION OF ANTIBODY
CA2864126A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Biogen Idec Ma Inc. Recombinant factor viii proteins
WO2013122617A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Amunix Operating Inc. Factor viii compositions and methods of making and using same
TW202015731A (zh) 2012-02-24 2020-05-01 日商中外製藥股份有限公司 經FcγRIIB促進抗原消失之抗原結合分子
TWI605060B (zh) 2012-03-28 2017-11-11 賽諾菲公司 抗緩激肽ｂ１受體配位體之抗體
RU2014147741A (ru) * 2012-04-27 2016-06-20 Байоатла Ллк. Модифицированные области антител и их применение
CA2872856A1 (en) 2012-05-07 2013-11-14 Sanofi Methods for preventing biofilm formation
WO2013175276A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Argen-X B.V Il-6 binding molecules
JP2015521589A (ja) 2012-06-08 2015-07-30 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． プロコアグラント化合物
CA2875247A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Biogen Idec Ma Inc. Chimeric clotting factors
WO2013187495A1 (ja) 2012-06-14 2013-12-19 中外製薬株式会社 改変されたFc領域を含む抗原結合分子
WO2014008480A2 (en) 2012-07-06 2014-01-09 Biogen Idec Ma Inc. Cell line expressing single chain factor viii polypeptides and uses thereof
EP4269431A1 (en) 2012-07-11 2023-11-01 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor viii complex with xten and von willebrand factor protein, and uses thereof
KR20150038012A (ko) * 2012-08-08 2015-04-08 로슈 글리카트 아게 인터루킨-10 융합 단백질 및 그의 용도
TWI717591B (zh) 2012-08-24 2021-02-01 日商中外製藥股份有限公司 ＦｃγＲＩＩｂ特異性Ｆｃ區域變異體
US11236168B2 (en) 2012-08-24 2022-02-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Mouse FcγammaRII-specific Fc antibody
US9790268B2 (en) 2012-09-12 2017-10-17 Genzyme Corporation Fc containing polypeptides with altered glycosylation and reduced effector function
CA2884762C (en) 2012-09-12 2022-07-19 Genzyme Corporation Fc containing polypeptides with altered glycosylation and reduced effector function
US9803021B2 (en) 2012-12-07 2017-10-31 The Regents Of The University Of California CD138-targeted interferon demonstrates potent apoptotic and anti-tumor activities
JP6433297B2 (ja) 2012-12-27 2018-12-05 中外製薬株式会社 ヘテロ二量化ポリペプチド
PL3889173T3 (pl) 2013-02-15 2023-12-11 Bioverativ Therapeutics Inc. Zoptymalizowany gen czynnika viii
EP2983701A2 (en) 2013-03-11 2016-02-17 Genzyme Corporation Site-specific antibody-drug conjugation through glycoengineering
CA2899089C (en) 2013-03-15 2021-10-26 Biogen Ma Inc. Factor ix polypeptide formulations
CA2903576C (en) 2013-03-15 2021-06-08 Nai-Kong V. Cheung High affinity anti-gd2 antibodies
KR20210130260A (ko) 2013-04-02 2021-10-29 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Ｆｃ영역 개변체
GB201308658D0 (en) * 2013-05-14 2013-06-26 Isis Innovation Antibodies
WO2014194100A1 (en) 2013-05-29 2014-12-04 The Regents Of The University Of California Anti-cspg4 fusions with interferon for the treatment of malignancy
WO2015021423A2 (en) 2013-08-08 2015-02-12 Biogen Idec Ma Inc. Purification of chimeric fviii molecules
CN112142845A (zh) 2013-08-13 2020-12-29 赛诺菲 纤溶酶原激活剂抑制剂-1(pai-1)的抗体及其用途
TWI592426B (zh) 2013-08-13 2017-07-21 賽諾菲公司 胞漿素原活化素抑制劑－１（ｐａｉ－１）之抗體及其用途
US10548953B2 (en) 2013-08-14 2020-02-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII-XTEN fusions and uses thereof
MX2016002870A (es) 2013-09-05 2017-02-23 Amgen Inc Moleculas que contienen fc que presentan perfiles de glicoforma predecibles, consistentes y reproducibles.
US10611794B2 (en) 2013-09-25 2020-04-07 Bioverativ Therapeutics Inc. On-column viral inactivation methods
JP6534615B2 (ja) 2013-09-27 2019-06-26 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
PL3063275T3 (pl) 2013-10-31 2020-03-31 Resolve Therapeutics, Llc Terapeutyczne fuzje nukleaza-albumina i sposoby
EP3065769A4 (en) 2013-11-08 2017-05-31 Biogen MA Inc. Procoagulant fusion compound
CN105940107B (zh) 2013-11-11 2021-06-15 中外制药株式会社 含有改变了抗体可变区的抗原结合分子
BR112016015512B1 (pt) 2014-01-10 2023-12-19 Bioverativ Therapeutics Inc Proteína quimérica, composição farmacêutica e seus usos
BR112016016658A2 (pt) * 2014-02-06 2018-01-23 F. Hoffmann-La Roche Ag proteína de fusão de um anticorpo, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, composição farmacêutica, métodos para produzir uma proteína de fusão e de tratamento de uma doença em um indivíduo e uso da proteína de fusão
MX2016010951A (es) 2014-03-05 2016-11-29 Ucb Biopharma Sprl Proteinas de fc multimericas.
SG10201808158UA (en) 2014-03-19 2018-10-30 Genzyme Corp Site-specific glycoengineering of targeting moieties
ES2800674T3 (es) 2014-03-21 2021-01-04 X Body Inc Polipéptidos biespecíficos de unión a antígeno
AU2015248785A1 (en) * 2014-04-16 2016-11-24 Ucb Biopharma Sprl Multimeric Fc proteins
EP3160478A4 (en) 2014-06-30 2018-05-16 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor ix gene
CA2962486A1 (en) 2014-09-26 2016-03-31 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Stabilized adrenomedullin derivatives and use thereof
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
AU2015330869B2 (en) 2014-10-09 2021-07-08 Genzyme Corporation Glycoengineered antibody drug conjugates
JP6625627B2 (ja) 2014-10-14 2019-12-25 ハロザイム インコーポレイテッド アデノシンデアミナーゼ−２（ａｄａ２）、その変異体の組成物およびそれを使用する方法
JP7125248B2 (ja) 2014-11-11 2022-08-24 中外製薬株式会社 改変された抗体可変領域を含む抗原結合分子のライブラリ
EP3233921B1 (en) 2014-12-19 2021-09-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c5 antibodies and methods of use
MA41294A (fr) 2014-12-19 2017-11-08 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticorps anti-myostatine, polypeptides contenant des variants de régions fc, et procédés d'utilisation
CN114773470A (zh) 2015-02-05 2022-07-22 中外制药株式会社 包含离子浓度依赖性的抗原结合结构域的抗体，fc区变体，il-8-结合抗体及其应用
CA2976236A1 (en) * 2015-02-09 2016-08-18 Research Development Foundation Engineered immunoglobulin fc polypeptides displaying improved complement activation
CA2972393A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Composition for treating il-6-related diseases
US11142587B2 (en) 2015-04-01 2021-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide hetero-oligomer
AR104368A1 (es) 2015-04-03 2017-07-19 Lilly Co Eli Anticuerpos biespecíficos anti-cd20- / anti-baff
JP2018512856A (ja) 2015-04-17 2018-05-24 アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド 調整可能な親和性を有する免疫調節タンパク質
CN108472337B (zh) 2015-08-03 2022-11-25 比奥贝拉蒂治疗公司 因子ix融合蛋白以及其制备和使用方法
US20190022092A1 (en) 2015-09-15 2019-01-24 Acerta Pharma B.V. Therapeutic Combinations of a BTK Inhibitor and a GITR Binding Molecule, a 4-1BB Agonist, or an OX40 Agonist
MX2018003005A (es) 2015-09-18 2018-04-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos que se unen a interleucina 8 (il-8) y sus usos.
US20190048089A1 (en) 2015-09-30 2019-02-14 Janssen Biotech, Inc. Antagonistic Antibodies Specifically Binding Human CD40 and Methods of Use
JP7141336B2 (ja) 2015-12-25 2022-09-22 中外製薬株式会社 抗ミオスタチン抗体および使用方法
SG11201803989WA (en) 2015-12-28 2018-06-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for promoting efficiency of purification of fc region-containing polypeptide
SG10201913278PA (en) 2016-02-01 2020-02-27 Bioverativ Therapeutics Inc Optimized factor viii genes
US11072666B2 (en) 2016-03-14 2021-07-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell injury inducing therapeutic drug for use in cancer therapy
WO2017181152A2 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
KR20230051601A (ko) 2016-04-15 2023-04-18 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Icos 리간드 변이체 면역조절 단백질 및 그의 용도
CN109476699B (zh) 2016-06-02 2021-10-12 艾伯维公司 糖皮质激素受体激动剂及其免疫偶联物
US20190263918A1 (en) * 2016-06-08 2019-08-29 Shanghai Jiao Tong University School Of Medicine Sequence of antibody heavy chain constant region for enhancing agonistic antibody activity
ES2963807T3 (es) 2016-06-08 2024-04-02 Xencor Inc Tratamiento de enfermedades relacionadas con la IgG4 con anticuerpos anti-CD19 de reticulación a CD32B
EP3472197A1 (en) 2016-06-15 2019-04-24 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies with engineered ch2 domains, compositions thereof and methods of using the same
CA3019904A1 (en) 2016-06-17 2017-12-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
JP7308034B2 (ja) 2016-07-01 2023-07-13 リゾルブ セラピューティクス， エルエルシー 最適化二重ヌクレアーゼ融合物および方法
CA3032120A1 (en) 2016-07-28 2018-02-01 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11471488B2 (en) 2016-07-28 2022-10-18 Alpine Immune Sciences, Inc. CD155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11834490B2 (en) 2016-07-28 2023-12-05 Alpine Immune Sciences, Inc. CD112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CN116271014A (zh) 2016-08-05 2023-06-23 中外制药株式会社 用于预防或治疗il-8相关疾病的组合物
AU2017321973A1 (en) 2016-09-02 2019-03-07 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Composition and methods of treating B cell disorders
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
TWI788307B (zh) 2016-10-31 2023-01-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞
KR20190091292A (ko) 2016-12-02 2019-08-05 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 응고 인자에 대한 면역 내성 유도 방법
BR112019011115A2 (pt) 2016-12-02 2019-10-01 Bioverativ Therapeutics Inc métodos para tratar artropatia hemofílica usando fatores de coagulação quiméricos
WO2018129029A1 (en) 2017-01-04 2018-07-12 Immunogen, Inc. Met antibodies and immunoconjugates and uses thereof
JP2020503351A (ja) 2017-01-06 2020-01-30 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド カリウムチャネルアゴニストによる腫瘍浸潤リンパ球の増殖及びその治療的使用
KR20190104048A (ko) 2017-01-06 2019-09-05 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 (tnfrsf) 효능제를 사용한 종양 침윤 림프구 (til)의 확장 및 til과 tnfrsf 효능제의 치료 조합물
EP3569615A4 (en) * 2017-01-13 2020-07-29 Hanx Biopharmaceutics, Inc PROCESS FOR IMPROVING THE BINDING AFFINITY OF AN IGG ANTIBODY TOWARDS FCRN AND PROLONGING THE SERIC HALF-LIFE OF THE latter
DK3596116T3 (da) 2017-03-16 2023-11-27 Alpine Immune Sciences Inc Variante immunmodulatoriske pd-l1-proteiner og anvendelser deraf
BR112019018747A2 (pt) 2017-03-16 2020-05-05 Alpine Immune Sciences Inc proteínas imunomoduladoras variantes de cd80 e usos das mesmas
AU2018235835A1 (en) 2017-03-16 2019-09-05 Alpine Immune Sciences, Inc. PD-L2 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
MX2019013202A (es) 2017-05-10 2020-01-21 Iovance Biotherapeutics Inc Expansion de linfocitos de infiltracion de tumor a partir de tumores liquidos y usos terapeuticos de los mismos.
WO2019103857A1 (en) 2017-11-22 2019-05-31 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of peripheral blood lymphocytes (pbls) from peripheral blood
AU2018266847A1 (en) * 2017-05-10 2019-11-28 Albajuna Therapeutics, S.L. Fc-fusion protein derivatives with high dual HIV antiviral and immunomodulatory activity
RU2771174C2 (ru) * 2017-05-16 2022-04-28 Байондис Б. В. АНТИ-SIRPα АНТИТЕЛА
ES2923143T3 (es) 2017-05-25 2022-09-23 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos monoclonales antagonistas contra CD40 y sus usos
CN116333129A (zh) * 2017-05-25 2023-06-27 百时美施贵宝公司 包含经修饰的重链恒定区的抗体
US20200148779A1 (en) * 2017-05-25 2020-05-14 Bristol-Myers Squibb Company MODIFIED IgG1 Fc DOMAINS AND ANTI-CD40 DOMAIN ANTIBODY FUSIONS THEREWITH
WO2019011918A1 (en) 2017-07-10 2019-01-17 International - Drug - Development - Biotech TREATMENT OF LYMPHOCYTE B MALIGNANCIES USING AFUCOSYLATED PRO-APOPTOTIC ANTI-CD19 ANTIBODIES IN COMBINATION WITH ANTI-CD20 ANTIBODIES OR CHEMOTHERAPEUTIC AGENTS
CN111183360A (zh) * 2017-07-19 2020-05-19 生物辐射欧洲有限公司 同时评估非酒精性脂肪性肝炎和肝纤维化状态的生物标志物组合
EP3665289A1 (en) 2017-08-09 2020-06-17 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof
SG11202001311VA (en) 2017-08-22 2020-03-30 Sanabio Llc Soluble interferon receptors and uses thereof
CA3198255A1 (en) 2017-10-10 2019-04-18 Alpine Immune Sciences, Inc. Ctla-4 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
AU2018351000B2 (en) 2017-10-18 2023-11-30 Alpine Immune Sciences, Inc. Variant ICOS Ligand immunomodulatory proteins and related compositions and methods
KR20200095477A (ko) 2017-12-01 2020-08-10 애브비 인코포레이티드 글루코코르티코이드 수용체 작용제 및 이의 면역접합체
TW201938194A (zh) 2017-12-05 2019-10-01 日商中外製藥股份有限公司 包含結合cd3及cd137的改變的抗體可變區之抗原結合分子
CA3085765A1 (en) 2017-12-15 2019-06-20 Iovance Biotherapeutics, Inc. Systems and methods for determining the beneficial administration of tumor infiltrating lymphocytes, and methods of use thereof and beneficial administration of tumor infiltrating lymphocytes, and methods of use thereof
AU2018388791A1 (en) * 2017-12-19 2020-07-16 The Rockefeller University Human IgG Fc domain variants with improved effector function
BR112020013236A2 (pt) 2018-01-03 2020-12-01 Alpine Immune Sciences, Inc. proteínas imunomoduladoras de múltiplos domínios e métodos de seu uso
CN110028588A (zh) * 2018-01-11 2019-07-19 上海细胞治疗研究院 抗原-Fc融合蛋白及其检测阳性CAR-T细胞的应用
MX2020008152A (es) 2018-02-01 2020-11-24 Bioverativ Therapeutics Inc Uso de vectores lentivirales que expresan el factor viii.
WO2019160829A1 (en) 2018-02-13 2019-08-22 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes (tils) with adenosine a2a receptor antagonists and therapeutic combinations of tils and adenosine a2a receptor antagonists
MX2020009296A (es) 2018-03-15 2020-11-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos anti-virus del dengue que tienen reactividad cruzada con el virus zika y metodos de uso.
PE20210313A1 (es) 2018-03-28 2021-02-12 Bristol Myers Squibb Co Proteinas de fusion interleucina-2/receptor alfa de interleucina-2 y metodos de uso
EP3793588A1 (en) 2018-05-18 2021-03-24 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of treating hemophilia a
CN112566938A (zh) 2018-06-03 2021-03-26 拉姆卡普生物测试有限公司 针对ceacam5和cd47的双特异性抗体
JP7457661B2 (ja) 2018-06-04 2024-03-28 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッド 低減したエフェクター機能を有する抗ｖｌａ－４抗体
WO2019241758A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
SG11202013240RA (en) 2018-07-03 2021-01-28 Bristol Myers Squibb Co Fgf21 formulations
WO2020014306A1 (en) 2018-07-10 2020-01-16 Immunogen, Inc. Met antibodies and immunoconjugates and uses thereof
CA3108799A1 (en) 2018-08-09 2020-02-13 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof for non-viral gene therapy
AR114550A1 (es) 2018-08-10 2020-09-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Moléculas de unión al antígeno anti-cd137 y sus usos
TW202031273A (zh) 2018-08-31 2020-09-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 抗ｐｄ－１抗體難治療性之非小細胞肺癌（ｎｓｃｌｃ）病患的治療
WO2020061376A2 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods and uses of variant cd80 fusion proteins and related constructs
EP3856785A4 (en) 2018-09-28 2022-07-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTIGEN-BINDING MOLECULES ABLE TO BIND TO CD3 AND CD137 BUT NOT SIMULTANEOUSLY
JP2022501325A (ja) 2018-09-28 2022-01-06 中外製薬株式会社 改変された抗体可変領域を含む抗原結合分子
GB201817354D0 (en) * 2018-10-25 2018-12-12 Hummingbird Bioscience Pte Ltd Engineered FC
KR20210091212A (ko) 2018-11-05 2021-07-21 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. 항-pd-1 항체에 불응성인 nsclc 환자의 치료
AR117091A1 (es) 2018-11-19 2021-07-07 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos monoclonales antagonistas contra cd40 y sus usos
CA3120793A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Anti-cd40 antibody, antigen binding fragment and pharmaceutical use thereof
JP2022510276A (ja) 2018-11-30 2022-01-26 アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド Ｃｄ８６バリアント免疫調節タンパク質およびその使用
JP2022516635A (ja) 2019-01-04 2022-03-01 リゾルブ セラピューティクス， エルエルシー ヌクレアーゼ融合タンパク質によるシェーグレン病の処置
WO2020154889A1 (zh) * 2019-01-29 2020-08-06 上海鑫湾生物科技有限公司 具有Fc突变体的抗体与效应细胞的组合、用途和制法
CN110205296B (zh) * 2019-01-29 2021-08-24 上海鑫湾生物科技有限公司 具有Fc突变体的抗体与效应细胞的组合、用途和制法
EP3931310A1 (en) 2019-03-01 2022-01-05 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes from liquid tumors and therapeutic uses thereof
WO2020206063A1 (en) 2019-04-03 2020-10-08 Genzyme Corporation Anti-alpha beta tcr binding polypeptides with reduced fragmentation
KR20210149779A (ko) 2019-04-10 2021-12-09 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Fc 영역 개변 항체의 정제 방법
SG11202111033VA (en) 2019-04-17 2021-11-29 Alpine Immune Sciences Inc Methods and uses of variant icos ligand (icosl) fusion proteins
EP4023230A4 (en) 2019-06-05 2023-11-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTIBODY CLEAVAGE SITE BINDING MOLECULE
EP3986918A1 (en) 2019-06-18 2022-04-27 Bayer Aktiengesellschaft Adrenomedullin-analogues for long-term stabilization and their use
EP3999544A4 (en) * 2019-07-19 2023-08-09 Wuxi Xdc Singapore Private Limited POLYPEPTIDE COMPLEX FOR CONJUGATION AND ITS USE
WO2021023117A1 (zh) * 2019-08-02 2021-02-11 康方药业有限公司 抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体及其用途
EP4038182A1 (en) 2019-09-30 2022-08-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Lentiviral vector formulations
CN112574315B (zh) * 2019-09-30 2023-04-07 广东菲鹏制药股份有限公司 改变效应功能的Fc变体及其融合蛋白
EP3831849A1 (en) 2019-12-02 2021-06-09 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
EP4071167A4 (en) * 2019-12-03 2024-03-06 Shanghai Jiao Tong Univ School Of Medicine FC REGION OF ANTIBODIES WITH ENHANCED AFFINITY TO FC?RIIB
AU2020403913A1 (en) 2019-12-18 2022-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-CCL2 antibodies
AU2019479791A1 (en) 2019-12-27 2022-07-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-CTLA-4 antibody and use thereof
TW202140553A (zh) 2020-01-13 2021-11-01 美商威特拉公司 C5ar1抗體分子及其用途
JP2023514152A (ja) 2020-02-06 2023-04-05 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｉｌ－１０およびその使用
TW202144395A (zh) 2020-02-12 2021-12-01 日商中外製藥股份有限公司 用於癌症之治療的抗cd137抗原結合分子
JP2023516952A (ja) 2020-02-28 2023-04-21 ジェンザイム・コーポレーション 最適化された薬物コンジュゲーションのための改変された結合ポリペプチド
US11365239B2 (en) 2020-03-20 2022-06-21 Tsb Therapeutics (Beijing) Co., Ltd. Anti-SARS-COV-2 antibodies and uses thereof
CN115397866A (zh) 2020-03-31 2022-11-25 中外制药株式会社 靶向dll3的多特异性抗原结合分子及其用途
AU2021267276A1 (en) 2020-05-08 2022-12-15 Alpine Immune Sciences, Inc. April and BAFF inhibitory immunomodulatory proteins and methods of use thereof
GB202008860D0 (en) 2020-06-11 2020-07-29 Univ Oxford Innovation Ltd BTLA antibodies
WO2022006153A1 (en) 2020-06-29 2022-01-06 Resolve Therapeutics, Llc Treatment of sjogren's syndrome with nuclease fusion proteins
TW202220677A (zh) 2020-07-31 2022-06-01 日商中外製藥股份有限公司 含有表現嵌合受體之細胞的醫藥組成物
JP2023540705A (ja) 2020-08-28 2023-09-26 サナ バイオテクノロジー，インコーポレイテッド 修飾された抗ウイルス結合剤
WO2022044248A1 (ja) 2020-08-28 2022-03-03 中外製薬株式会社 ヘテロ二量体Ｆｃポリペプチド
JP2023546359A (ja) 2020-10-06 2023-11-02 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球療法によるｎｓｃｌｃ患者の治療
WO2022076606A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
WO2022125941A1 (en) 2020-12-11 2022-06-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with braf inhibitors and/or mek inhibitors
JP2024500403A (ja) 2020-12-17 2024-01-09 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球によるがんの治療
AU2021401302A1 (en) 2020-12-17 2023-07-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with ctla-4 and pd-1 inhibitors
JP2024501809A (ja) 2020-12-18 2024-01-16 ランカプ バイオ ベータ リミテッド Ｃｅａｃａｍ５およびｃｄ４７に対する二重特異性抗体
TW202242085A (zh) 2020-12-31 2022-11-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 供自動生產腫瘤浸潤淋巴球的裝置和方法
EP4277931A1 (en) 2021-01-13 2023-11-22 Visterra, Inc. Humanized complement 5a receptor 1 antibodies and methods of use thereof
CA3206549A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Frederick G. Vogt Methods of making modified tumor infiltrating lymphocytes and their use in adoptive cell therapy
JP2024509184A (ja) 2021-03-05 2024-02-29 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍保存及び細胞培養組成物
EP4308691A1 (en) 2021-03-19 2024-01-24 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods for tumor infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd69 selection and gene knockout in tils
AR125199A1 (es) 2021-03-23 2023-06-21 Iovance Biotherapeutics Inc Edición génica cish de linfocitos infiltrantes de tumores y usos de los mismos en inmunoterapia
EP4314253A2 (en) 2021-03-25 2024-02-07 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for t-cell coculture potency assays and use with cell therapy products
WO2022225981A2 (en) 2021-04-19 2022-10-27 Iovance Biotherapeutics, Inc. Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
EP4335868A1 (en) * 2021-05-07 2024-03-13 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Fc mutant with altered binding to fc receptor
KR20240019124A (ko) 2021-05-07 2024-02-14 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Taci-fc 융합 면역조절 단백질의 투여 및 치료 방법
WO2022245754A1 (en) 2021-05-17 2022-11-24 Iovance Biotherapeutics, Inc. Pd-1 gene-edited tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
WO2022263501A1 (en) 2021-06-18 2022-12-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-ccl2 antibodies
CN117616123A (zh) 2021-06-25 2024-02-27 中外制药株式会社 抗ctla-4抗体
AR126236A1 (es) 2021-06-25 2023-10-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Uso del anticuerpo anti-ctla-4
WO2023004074A2 (en) 2021-07-22 2023-01-26 Iovance Biotherapeutics, Inc. Method for cryopreservation of solid tumor fragments
CA3226942A1 (en) 2021-07-28 2023-02-02 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with kras inhibitors
US20230181671A1 (en) 2021-09-02 2023-06-15 Djs Antibodies Ltd Polypeptides
WO2023028715A1 (en) * 2021-09-03 2023-03-09 Zymeworks Bc Inc. Fc variant with high thermal stability and attenuated effector function
TW202328439A (zh) 2021-09-09 2023-07-16 美商艾歐凡斯生物治療公司 使用ｐｄ－１ ｔａｌｅｎ基因減弱生成ｔｉｌ產物之方法
WO2023049862A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion processes and agents for tumor infiltrating lymphocytes
TW202331735A (zh) 2021-10-27 2023-08-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 協調用於患者特異性免疫療法之細胞之製造的系統及方法
WO2023086803A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes
WO2023147488A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods
WO2023147486A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Tumor infiltrating lymphocytes engineered to express payloads
WO2023172883A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Alpine Immune Sciences, Inc. Immunomodulatory proteins of variant cd80 polypeptides, cell therapies thereof and related methods and uses
WO2023196877A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
WO2023201369A1 (en) 2022-04-15 2023-10-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Til expansion processes using specific cytokine combinations and/or akti treatment
WO2023220608A1 (en) 2022-05-10 2023-11-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with an il-15r agonist
WO2023242351A1 (en) 2022-06-16 2023-12-21 Lamkap Bio Beta Ag Combination therapy of bispecific antibodies against ceacam5 and cd47 and bispecific antibodies against ceacam5 and cd3
WO2024011114A1 (en) 2022-07-06 2024-01-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Devices and processes for automated production of tumor infiltrating lymphocytes
WO2024030758A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Iovance Biotherapeutics, Inc. Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
WO2024062074A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Sanofi Biotechnology Humanized anti-il-1r3 antibody and methods of use
WO2024077018A2 (en) 2022-10-04 2024-04-11 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods and uses of taci-fc fusion immunomodulatory protein

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004029207A2 (en) * 2002-09-27 2004-04-08 Xencor Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
JP4578467B2 (ja) * 2003-05-02 2010-11-10 ゼンコー・インコーポレイテッド 最適化Ｆｃ変異体およびそれらの生成方法

Family Cites Families (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2035401A (en) 1933-10-21 1936-03-24 Dow Chemical Co Transportation of automobiles
US2320801A (en) 1940-10-03 1943-06-01 Simons Leon Method of coating metal
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3917002A (en) 1971-10-15 1975-11-04 Massey Ferguson Inc Draft control linkage for a tractor
CU22545A1 (es) 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4753894A (en) 1984-02-08 1988-06-28 Cetus Corporation Monoclonal anti-human breast cancer antibodies
US4943533A (en) 1984-03-01 1990-07-24 The Regents Of The University Of California Hybrid cell lines that produce monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
WO1988007089A1 (en) * 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
US5681566A (en) 1988-10-24 1997-10-28 3I Research Exploitation Limited Antibody conjugates with two or more covalently linked FC regions
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
EP1362868A3 (en) 1991-03-06 2004-02-11 MERCK PATENT GmbH Humanized and chimeric monoclonal antibodies that bind epidermal growth factor receptor (EGF-R)
DE122004000008I1 (de) 1991-06-14 2005-06-09 Genentech Inc Humanisierter Heregulin Antikörper.
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5264586A (en) 1991-07-17 1993-11-23 The Scripps Research Institute Analogs of calicheamicin gamma1I, method of making and using the same
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
CA2118508A1 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Elizabeth S. Ward Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
PT752248E (pt) 1992-11-13 2001-01-31 Idec Pharma Corp Aplicacao terapeutica de anticorpos quimericos e marcados radioactivamente contra antigenios de diferenciacao restrita de linfocitos b humanos para o tratamento do linfoma de celulas b
US5885573A (en) 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
GB9401182D0 (en) 1994-01-21 1994-03-16 Inst Of Cancer The Research Antibodies to EGF receptor and their antitumour effect
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
JP3794701B2 (ja) 1994-07-21 2006-07-12 アクゾ ノーベル ナムローゼ フェンノートシャップ 環状ケトン過酸化物処方
US5804396A (en) 1994-10-12 1998-09-08 Sugen, Inc. Assay for agents active in proliferative disorders
US6214388B1 (en) 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
WO1996030347A1 (en) 1995-03-30 1996-10-03 Pfizer Inc. Quinazoline derivatives
GB9508565D0 (en) 1995-04-27 1995-06-14 Zeneca Ltd Quiazoline derivative
GB9508538D0 (en) 1995-04-27 1995-06-14 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
AU6267896A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Imclone Systems Incorporated Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth oftumors
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
BR9708640B1 (pt) 1996-04-12 2013-06-11 inibidores irreversÍveis de tirosina-cinases e composiÇço farmacÊutica compreendendo os mesmo.
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
UA73073C2 (uk) 1997-04-03 2005-06-15 Уайт Холдінгз Корпорейшн Заміщені 3-ціанохіноліни, спосіб їх одержання та фармацевтична композиція
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
EP0983303B1 (en) 1997-05-21 2006-03-08 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
GB9712892D0 (en) 1997-06-20 1997-08-20 Eclagen Ltd Identification of mhc binding peptides
ZA986732B (en) 1997-07-29 1999-02-02 Warner Lambert Co Irreversible inhibitiors of tyrosine kinases
ZA986729B (en) 1997-07-29 1999-02-02 Warner Lambert Co Irreversible inhibitors of tyrosine kinases
TW436485B (en) 1997-08-01 2001-05-28 American Cyanamid Co Substituted quinazoline derivatives
US6242195B1 (en) * 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
CA2323757C (en) * 1998-04-02 2011-08-02 Genentech, Inc. Antibody variants and fragments thereof
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
EP2261229A3 (en) 1998-04-20 2011-03-23 GlycArt Biotechnology AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
GB9815157D0 (en) 1998-07-13 1998-09-09 Metron Designs Ltd High resolution pulse width setting from relatively low frequency clocks
US6403312B1 (en) 1998-10-16 2002-06-11 Xencor Protein design automatic for protein libraries
NZ539776A (en) * 1999-01-15 2006-12-22 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP2270148A3 (en) 1999-04-09 2011-06-08 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
GB9922283D0 (en) 1999-09-22 1999-11-17 Kennedy Rheumatology Inst Adenoviral vectors
AU7950400A (en) 1999-10-19 2001-04-30 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Process for producing polypeptide
AU8008100A (en) 1999-10-19 2001-04-30 Minergy Corp. Processing of contaminated river sediment in a glass melting furnace
DE19958134C2 (de) 1999-12-02 2003-05-15 Koenig & Bauer Ag Saugwalze
AU1663000A (en) 1999-12-10 2000-05-08 Wcl Wireless Commerce Ltd Oy Method and system for performing electronic auctions
EP1458211A1 (en) 1999-12-27 2004-09-15 Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha Radio communication device
WO2001058949A2 (en) 2000-02-11 2001-08-16 Biogen, Inc. Heterologous polypeptide of the tnf family
YU63302A (sh) 2000-02-25 2005-09-19 The Government Of The Un.Stat. Anti-egfrv iii scfvs sa pojačanom citotoksičnošću i povećanim prinosom, imunotoksini na bazi istog i metodi za upotrebu na bazi istog
ES2637801T3 (es) * 2000-04-11 2017-10-17 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
BR0110927A (pt) 2000-05-19 2003-03-11 Scancell Ltd Anticorpo, ácido nucléico, vetor, célula, método de fabricar um anticorpo, composição farmacêutica, uso de um anticorpo ou de um ácido nucleico, e, método para o tratamento ou profilaxia do câncer
AU6625701A (en) 2000-06-28 2002-01-08 Bakulesh, Mafatlal Khamar Agent for reversal of drug resistance in mycobacterium tuberculosis
WO2002004853A1 (fr) 2000-07-07 2002-01-17 Sugimoto, Motoichi Dispositif de production d'energie infinie
FR2811735B1 (fr) 2000-07-11 2002-09-20 Asco Joucomatic Vanne commande pneumatique
AU2001281714A1 (en) 2000-07-19 2002-01-30 Siemens Aktiengesellschaft Method for providing software in radio-based cellular communications networks, and a communications network for implementing said method
US6724920B1 (en) 2000-07-21 2004-04-20 Trw Inc. Application of human facial features recognition to automobile safety
AU2001291175A1 (en) 2000-09-21 2002-04-02 Md Online Inc. Medical image processing systems
MXPA00009407A (es) 2000-09-26 2004-12-08 Mexicano Inst Petrol Procedimiento para la preparacion de un catalizador monometalico de tipo zeolitico para la obtencion de gasolinas de alto octando mediante reformacion de naftas.
CA2424977C (en) 2000-10-06 2008-03-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
ES2639222T5 (es) 2000-10-06 2023-11-24 Kyowa Kirin Co Ltd Células que producen unas composiciones de anticuerpo
EP1366455B1 (en) 2001-02-19 2008-07-02 MERCK PATENT GmbH Method for identification of t-cell epitopes and use for preparing molecules with reduced immunogenicity
ATE527276T1 (de) 2001-03-23 2011-10-15 Genencor Int Proteine, die veränderte immunogene reaktionen bewirken, und verfahren zu deren herstellung und anwendung
WO2002079415A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
HUP0600342A3 (en) * 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
WO2005056606A2 (en) * 2003-12-03 2005-06-23 Xencor, Inc Optimized antibodies that target the epidermal growth factor receptor
WO2004004798A2 (en) 2002-07-03 2004-01-15 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
JP4869064B2 (ja) 2003-04-04 2012-02-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド 高濃度抗体及びタンパク質製剤
JP4762156B2 (ja) * 2004-01-12 2011-08-31 アプライド モレキュラー エボリューション，インコーポレイテッド Ｆｃ領域変異体
CA2602663A1 (en) * 2005-03-31 2006-10-05 Xencor, Inc. Fc variants with optimized properties
EP2176298B1 (en) 2007-05-30 2017-11-15 Xencor, Inc. Methods and compositions for inhibiting cd32b expressing cells
JP5220435B2 (ja) 2008-02-20 2013-06-26 オリンパスメディカルシステムズ株式会社 洗浄チューブ、及び内視鏡洗浄消毒装置
US8037602B2 (en) 2009-03-27 2011-10-18 Eneron, Inc. Methods of making energy efficient cookware
US9303895B1 (en) 2011-06-07 2016-04-05 Merritt A. A. Grant Window air conditioner installation system
US9098105B2 (en) 2012-08-24 2015-08-04 Avago Technologies General Ip (Singapore) Pte. Ltd. Dynamic Y-buffer size adjustment for retained sector reprocessing
JP6289481B2 (ja) 2012-10-17 2018-03-07 デラヴァル ホルディング アーベー 動物給水装置
US9703321B2 (en) 2013-07-09 2017-07-11 I-Blades, Inc. Snap on wearable module
US9721437B2 (en) 2014-11-09 2017-08-01 Interblock D.D. Slot machine with secondary game content
US9710002B2 (en) 2015-05-27 2017-07-18 Texas Instruments Incorporated Dynamic biasing circuits for low drop out (LDO) regulators
US11392902B2 (en) 2017-06-06 2022-07-19 United Parcel Service Of America, Inc. Systems, methods, apparatuses and computer program products for providing notification of items for pickup and delivery

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004029207A2 (en) * 2002-09-27 2004-04-08 Xencor Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
JP4578467B2 (ja) * 2003-05-02 2010-11-10 ゼンコー・インコーポレイテッド 最適化Ｆｃ変異体およびそれらの生成方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6010061805; Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．　２００１，　Ｖｏｌ．２７６，　Ｎｏ．９，　ｐ．６５９１-６６０４ *
JPN6010061806; Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．　２００２，　Ｖｏｌ．３，　Ｎｏ．３，　ｐ．２３７-５６ *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11840571B2 (en) 2015-12-14 2023-12-12 Macrogenics, Inc. Methods of using bispecific molecules having immunoreactivity with PD-1 and CTLA-4

Also Published As

Publication number Publication date
AU2005272993A1 (en) 2006-02-23
EP3342782B1 (en) 2022-08-17
CA2565961A1 (en) 2006-02-23
BRPI0510674A (pt) 2007-12-26
CN101014619B (zh) 2010-11-03
CN101014619A (zh) 2007-08-08
EP2471813A1 (en) 2012-07-04
CN103172731A (zh) 2013-06-26
CN103351434B (zh) 2015-09-30
KR100863776B1 (ko) 2008-10-16
DK2471813T3 (en) 2015-03-02
SI2471813T1 (sl) 2015-03-31
EP1919950A1 (en) 2008-05-14
PL2471813T3 (pl) 2015-09-30
EP3342782A1 (en) 2018-07-04
CN103351434A (zh) 2013-10-16
KR20070029190A (ko) 2007-03-13
ES2530340T3 (es) 2015-03-02
EP2940043A1 (en) 2015-11-04
AU2005272993B2 (en) 2010-02-11
EP2471813B1 (en) 2014-12-31
WO2006019447A1 (en) 2006-02-23
CN101987870B (zh) 2013-07-03
CN101987870A (zh) 2011-03-23
JP5301611B2 (ja) 2013-09-25
JP2008505174A (ja) 2008-02-21
IL179048A0 (en) 2007-03-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10584176B2 (en) Fc variants with increased affinity for FcγRIIc
JP5301611B2 (ja) 最適化Ｆｃ変異体
US8753629B2 (en) Optimized Fc variants
US8188231B2 (en) Optimized FC variants
US9051373B2 (en) Optimized Fc variants
US20240026023A1 (en) OPTIMIZED Fc VARIANTS
US20150315284A1 (en) OPTIMIZED Fc VARIANTS

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20110621

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20121029

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20130124

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20130129

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20130430

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20130520

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20130619

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5301611

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250