JPH06501153A - リパーゼ変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リパーゼ変異体 らこの変異体を発現することのできる宿主細胞、及び前記宿主細胞によりこの変 異体を生産する方法に間する。

ンバク質、例えば酵素をデザインすることを可能とするものと考えられ、従って 所望の特性を有する化合物の生産を可能とする。

かかる技術の多様性に基づき、所望のアミノ酸配列を有する酵素を作製すること が可能となり、そして多数の研究がこの目的にささげられている。

数多くのリパーゼの一次構造が決定され、且つ論文に詳細されている（Ｂｏｅｌ ら著、以廷■２３．７０１　７０６　（１９８８）、ｄｅ　Ｃａｒｏら著、−ゼ の三次構造も明らかとなっている（Ｗｉｎｋｌｅら署、Ｎａｔｕｒｅ　３４３＋ ７７１−７７４　（１９９０）、Ｂｒａｄｙら著、Ｎａｔｕｒｅ　３４３．７６ ７−７７０　（１９９０）。

Ｊ、Ｄ、Ｓｃｈｒａｇら著、Ｎａｔｕｒｅ　３５１．１９９１頁７６１−７６４ ）、これらの研究から、リパーゼは共通して一定の構造の特徴を有することが認 められるが、その一方で、これらのリパーゼの間では大きな構造的多様性もある 。

発明の概要 改良されたリパーゼ特性は、かかる改良された特性を示すリパーゼ変異体をもた らす特定のリパーゼを発現するＤＮＡ配列における１又は複数の特定の突然変異 によって得られうろことを、これらの研究は示している。

従って第一の観点において、本発明は親（ｐａｒｅｎｔ）　リパーゼのリパーゼ 変異体に関連し、この変異体はリパーゼ分子の主として疎水性である長い結合性 ポケットに位置している、活性セリンを含むトリプシン様触媒三つ組残基を含ん で成り、ここで親リパーゼの脂質含有帯の静電荷及び／又は疎水性は、１もしく は複数の負に荷電しているアミノ酸基を欠失させるか又は中性もしくは正に荷電 しているアミノ酸残基により置換させるか、及び／又はｌもしくは複数の中性ア ミノ酸残基を正に荷電しているアミノ酸残基により置換させるか、及び／又は１ もしくは複数の親水性アミノ酸残基を欠失させるかもしくは疎水性アミノ酸残基 により置換させるかによって変えられている。便宜上、このリパーゼ変異体は以 降リパーゼ変異体■と呼ぶ。

本明細書において、「トリプシン様」とは、トリプシンの活性部位に相当する箇 所に、触媒三つ組残基、即ち、アミノ酸のＳｅｒ、　Ｈ４ｓと、Ａｓρ＊　ＧＩ ｕ＋　Ａｓｎ又はＧｉｎのいづれかを含んで成る親分子を意味することを意図す る。いくつかのリパーゼは、このリパーゼが不活性な形態にあるときに、活性セ リンを覆う表面ループ構造も含んで成る　（このようなリパーゼの例はＢｒａｄ ｙら著、Ｎａｔｕｒｅ　３４３．１９９０゜頁７６７−７７０に記載されている ）、該リパーゼが活性化されると、このループ構造は移動してこの活性残基を露 出させ、加水分解の際に脂質基質と相互作用する高い表層疎水性を有する表層を 生み出す。

本目的のため、この表層を「脂質接触帯」と呼び、これはこの表層（又はこのよ うなループ構造を含んでないリパーゼの相当の表層）に位置する、又はその部分 を形成するアミノ酸残基を含むことを意図する。これらの残基は、該リパーゼが 脂質表層との接触によって活性化されて脂質相からトリグリセリドを加水分解せ しめるとき、この加水分解の際の基質とのリパーゼ相互作用に参入する。トリグ リセリドの加水分解の際、脂肪酸並びにモノ−及びジ−グリセリドが種々の量で 生成される。リパーゼをこの脂質接触帯において突然変異させることによってこ の帯の静電荷及び／又は疎水性を変える一つの理由は、加水分解の際に生成され る脂肪酸が脂質相に残って、負に荷電した表層を形成せしめうるからである。洗 浄の目的のためにリパーゼを用いるとき、負荷電した洗浄剤はこの脂質表層上に 負電荷を形成せしめうる。従って負荷電が低い及び／又はより疎水性であるリパ ーゼ変異体を作ることにより、異なる特異性及び／又は改善された特性を有する リパーゼを獲得することが可能となりうる。

他の観点において本発明は、リパーゼ分子の主として疎水性である長い結合性ポ ケットに位置する、活性セリンを含むトリプシン様触媒三つ組残基を含んで成る リパーゼ変異体に関する。前記リパーゼ変異体は、加水分解の際に基質との相互 作用に参入する、活性セリン残基を含むリパーゼ構造の部分に位置する残基を含 んで成る脂質接触帯の配列を構成する１又は複数のアミノ酸残基の位！での、１ 又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入によって、前記脂質接触帯の表層 コンホメーションが変化されていることを更に特徴とする。リパーゼ分子のかか る表層改質の目的は、リパーゼ基質に対する該リパーゼの活性部位の接近のし易 さの向上を提供することにある６便宜上、このリパーゼ変異体を以降リパーゼ変 異体■と呼更なる観点において本発明は、リパーゼ変異体であって（ｉ）リパー ゼ分子の主として疎水性である長い結合性ポケットに位置する、活性セリンを含 むトリプシン様触媒三つ組残基、及び（１１）該リパーゼが不活性状態にあると きはこの活性セリンを覆っており、そしてこのリパーゼが活性化されているとき は脂質基質にこの活性セリンが接近し易くなるようにそのコンホメーションが変 化するような表層ループ構造を含んで成る型のリパーゼ変異体に関連し；このル ープ構造はこの結合性ポケットに面する主として疎水性である内面及び主として 親水性である外面を有しており；前記リパーゼ変異体は、表層ループ構造の移動 又は加水分解の際の基質との相互作用のいづれかに参入する、ループ構造の配列 を構成する及び／又は活性セリン残基を含むリパーゼ構造の部分に位置している 残基を含んで成る脂質接触帯の配列を構成する／もしくは複数個のアミノ酸残基 の位置での、１又は複数個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入によって特徴付 けられる。これは、ループ構造がより開放されるようになることをもたらし、こ れにより活性セリンは基質により接近し易くなる。便宜上、このリパーゼ変異体 を以降リパーゼ変異体ｍと呼ぶ。

本発明は前記したリパーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ構 造体、前記ＤＮＡ構造体を保有する組換え発現ベクター、このＤＮＡ構造体又は 発現ベクターにより形質転換された細胞、及び本発明のリパーゼ変異体を生産す る方法であって、該リパーゼ変異体の生産を助成する条件のもとで前細胞を培養 又は増殖させ、その後このリパーゼ変異体を培養物から回収することによる方法 にも関連する。

本発明は更に、本発明のリパーゼ変異体を含んで成る、任意的に無粉塵性顆粒、 安定化液体又は保護化酵素の形態における洗浄添加剤、及び本発明のリパーゼ変 異体を含んで成る洗浄組成物に関連する。

発明の詳細な説明 本明細書及び請求の範囲において以下の略語を用いている：ヱ亙左並二 Ａ＝ＡＩａ＝　アラニン Ｖ　＝　Ｖａｌ　−バリン Ｌ＝Ｌｅｕ＝　ロイシン １＝ＩＩｅ＝　イソロイシン Ｐ＝Ｐｒｏ＝　プロリン Ｆ＝Ｐｈｅ＝　フェニルアラニン Ｗ　＝　７ｒｐ＝　）リブトファン Ｍ　＝　Ｍｅｔ　＝　メチオニン Ｇ　＝　ｃｔｙ−グリシン ５＝Ｓｅｔ＝　セリン Ｔ＝Ｔｈｒ＝　スレオニン Ｃ＝Ｃｙｓ＝　システィン Ｙ＝Ｔｙｒ＝　チロシン Ｎ　＝　Ａｓｎ−アスパラギン Ｑ＝ＧＩｎ＝　グルタミン Ｄ　＝　Ａｓρ＝　アスパラギン酸 Ｅ＝Ｇｌｕ＝　グルタミン酸 に＝Ｌｙｓ＝　リジン Ｒ＝Ａｒｇ＝　アルギニン Ｈ＝ｌ’１ｉｓ＝　ヒスチジン 本発明に関するリパーゼ変異体の説明において、以下の用法を参照のし易さのた めに用いている； （複数の）オリジナルのアミノ酸：　（？ｊ［数の）位置：　＜’ｉｓ数の）置 換したアミノ酸 この用法に従うと、位置１９５におけるグリシンに代わるグルタミン酸の置換は Ｇｌｙ　１９５　Ｇｌｕ又はＧ１９５Ｅとして示し；同じ位置におけるグリシン の欠失は Ｇｌｙ　１９５’又はＧ１９５”として示し；そして付加されたアミノ酸残基例 えばリジンの挿入はＧｌｙ　１９５　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ又はＧ１９５ＧＫとして示 す。

特定のリパーゼが他のリパーゼと比べて「欠失」を含み、且つこのような位置に 挿入がなされているときは、例えば位置３６におけるアスパラギン酸の挿入に関 して”３６Ａｓｐ又は＄３６Ｄとして示す。

複数の突然変異はプラスにより分けている、即ち、Ａｒｇ　１７０　Ｔｙｒ＋Ｇ Ｉｙ　１９５　Ｇｌｕ又はＰ１７０Ｙ　＋　Ｇ１９５Ｅは、位置１７０及び１９ ５における、アルギニン及びグリシンそれぞれに代わるチロシン及びグルタミン 酸による置換の突然変異を示している。

本発明に関して、リパーゼ変異体Ｉは好ましくは、リパーゼの脂質接触帯の１又 は複数のグルタミン酸又はアスパラギン酸残基が、グルタミン、アスパラギン、 アラニン、ロイシン、バリン、セリン、スレオニン、リジン又はアルギニンによ って置換されたものである。

親リパーゼは哺乳動物リパーゼのような種々の起源に由来するもの、例えば膵臓 、胃、肝臓又はリポタンパク質リパーゼありうるが、微生物リパーゼであること が一般に好適である。従って、洩りバーゼは酵母、例えば土工ｌヱエ１属（Ｃａ ｎｄｉｄａ）のリパーゼ、細菌、例えば２王二工至±ス（Ｐｓｅｕｄｏ＋＊ｏｎ ａｓ）のリパーゼ、又は菌類、例えばヒュミコラ属（Ｈｕ＋ｗｉｃｏｌａ）もし くはリソ″ムコール＠　（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）のリパーゼより選ばれうる。

構造的に同族なリパーゼの群から親リパーゼを選ぶことが特に好ましい。

本発明のリパーゼ変異体Ｉの好ましい態様において、親リパーゼは−Ｌ！−ｆ≧ ロ：−ヨ４ユ、−二＝！−：：：２工ｌ！１１　ミーヘイ　（Ｒｈｉｚｏｍｕｃ ｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉン　リパーゼ、待Ｅ２３０５２１６号に詳細のリパーゼであ る。このＨ様において、Ｌ又は複数の負に荷電しているアミノ酸残基は以下の通 り、ｌ又は複数の正に荷電しているか又は中性のアミノ酸残基により置換されて いてより９１Ｎ、に、Ｒ，Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｓ、Ｔ；０２５６Ｎ、に、Ｒ，Ａ、Ｖ、 Ｌ、Ｓ、Ｔ。

Ｄ２２６Ｎ、　Ｋ、　Ｒ，Ａ　、シ、Ｌ、Ｓ、Ｔ。

Ｄ６１Ｎ、に、Ｒ，Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｓ、Ｔ。

０１１３Ｎ、に、Ｒ，Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｓ、Ｔ。

Ｅ２０１Ｑ、に、Ｒ，Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｓ、Ｔ；０２４３Ｎ、に、Ｒ，Ａ、Ｖ、Ｌ、 Ｓ、Ｔ。

本発明のリパーゼ変異体Ｉの他の好ましいＬｉ様において、この親すハーゼは左 土ｌユ立立スヱムニヱ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　凰…■匹旦）リパーゼ、特にａ、− 文ノ」）畳二里株ＤＳＭ４１０６により生産されたリパーゼ（ＨＰ　２５８０６ ８号を参照）である、このＢ様において、１又は複数の負の荷電しているアミノ 酸残基は以下の通りｌ又は複数の中性又は正に荷電しているアミノ酸残基により 置換されていてよい。

２８７Ｑ、に、Ｒ，Ａ、Ｎ、Ｔ、Ｓ、Ｌ、Ｖ。

０２５４Ｎ、に、Ｒ，Ａ、Ｑ、Ｔ、Ｓ、１．、Ｖ。

０２４２Ｎ、に、！？、Ａ、Ｑ、Ｔ、Ｓ、Ｌ、ｖ；Ｅ２１０Ｑ、に、ｌｌ、Ａ、 Ｎ、Ｔ、Ｓ、Ｌ、Ｖ。

Ｅ５６Ｑ、に、Ｒ，Ａ、Ｎ、Ｔ、Ｓ、Ｌ、Ｖ。

Ｄ９６Ｎ、に、ｉｌ、Ａ、Ｑ、Ｔ、Ｓ、Ｌ、ν；ＤＩＩＩＮ、に＋Ｒ＋Ａ＋Ｑ＋ Ｔ＋Ｓ＋Ｌ＋Ｖ；Ｄ６２Ａ＋Ｑ、Ｎ、Ｔ、Ｓ、に＋Ｒ１Ｌ、Ｖ；Ｅ２１９Ａ、Ｑ 、Ｎ、Ｔ、Ｓ、に、Ｒ，Ｌ、Ｖ。

Ｅ２３４Ａ、Ｑ、Ｎ、Ｔ、Ｓ、に、Ｒ，Ｌ、Ｖ。

Ｂ５７Ａ、Ｑ、Ｎ、Ｔ、ＳＪ、Ｒ，Ｌ、Ｖ。

Ｂ９９Ａ　、　Ｑ　、闘、　Ｔ、　Ｓ、　Ｌ　Ｒ，Ｌ、シ；Ｄ２７Ａ、Ｑ、に、 　Ｔ、　Ｓ、　Ｋ、　Ｒ，Ｌ、ν；又はＥ２３９Ａ、Ｑ、Ｎ、Ｔ、Ｓ、に、Ｒ， Ｌ、Ｖ。

本発明に関する特に好ましい置換は Ｅ８７Ｑ　＋　Ｄ２５４Ｎ　十Ｄ２４２Ｎ　＋　Ｅ２１０Ｑ　；Ｅ８７Ｑ　＋　 ０２５４Ｎ　＋　２２１０Ｑ　。

０９６Ｎ　＋　Ｅ８７Ｑ　十Ｄ２５４．Ｎ　；Ｔ２６７に、Ｉｌｌ。

５８５に、Ｒ； ７２２６に、Ｒ。

８８８に、Ｉｌｌ。

８９２に、Ｒ； １２５５に、Ｒ。

１２０２に、Ｒ； Ｌ２０６に、Ｒ； Ｌ２５９に、ｌｌ。

Ｖ２Ｏ３に、Ｒ：　又ハ Ｌ２２７に、Ｒ。

る。この２つのリパーゼの三次元構造全体が非常に似かよっていることと考えら れ、そしてＸ線結晶写真により非常に一敗することが示されている（旦、ラヌギ ノーザと肋、ミーヘイ　リパーゼのコンビエータ−モデルをそれぞれ図１のＡと Ｂ及び図２のＡと已に示し、これよりこの２種類のリパーゼの脂質接触帯の類億 が明らかに認められる）、従っていづれかのリパーゼを示すタイプの改質は、そ の他のリパーゼに関しても機能するであろうことも有望である。

リパーゼ変異体■の一態様において、１又は複数のアミノ酸残基は１又は複数の かさ高さの低いアミノ酸残基によって置換されうる。

このような改質の目的はリパーゼの活性部位を露出させ、これによってそれを基 質により接触し易くすることにある。特に、かさ高さの低いアミノ酸残基はバリ ン、スレオニン、セリン、グリシン又はアラニンより選ばれうる。

リパーゼ変異体■の親リパーゼは哺乳動物リパーゼのような種々の起源に由来す るもの、例えば膵臓、胃、肝臓又はリポタンパク質リパーゼでありうるが、これ は微生物リパーゼであることが一般に好ましい。従って、この親リパーゼは酵母 、例えば土ヱｙ７’工久属のリパーゼ、細菌、例えばシュードモナス属のリパー ゼ、又は菌類、例えばヒュミコラ属もしくはりシムコール属のリパーゼから選ば れうる。

例えば、親リパーゼが上記したニス人ユニ上　ミーへイ　リパーゼであるとき、 以下の置換が好適に行われうる；Ｉ２０４Ｖ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｇ； Ｆ２０８Ｖ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｇ。

Ｆ２１３Ｖ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｇ、又は １２５４Ｖ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｇ。

親リパーゼが上記した夏王ｌユニ　立ス玉しニエ　リパーゼであるとき、以下の 置換が好適に行われうる；１２０２Ｖ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｇ。

Ｆ２０６Ｖ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｇ。

Ｆ２１１ν、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｇ、　ｘ；　又はＩ２５５ν、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｇ。

リパーゼ変異体■に１又は複数の表層ループ配列があるとき、このループ配列の 一部を形成する１又は複数のアミノ酸残基が好都合には欠失されうる。かかる改 質の目的は基質に対する活性セリンの接近のし易さの向上にある。

従って、このループ配列から、２−８、特に２−６のアミノ酸残基を欠失させる ことが好都合であることが見い出せた。例えば、親リパーゼが上記した一男ノ５ にユニーと　ミーヘイのリパーゼであるとき、１又は複数の以下の位置、即ち、 ８２−１１３．２１１−２１５．２３５−２４３゜２４５−２６９又は２６４− ２６９の１又は複数のアミノ酸残基を欠失させることができる。適切な欠失（及 び記載の第１の例の場合、置換）の特定の例は以下の通りである； Ｎ２６４”　＋　Ｔ２６５”＋Ｇ２６６”　＋　Ｃ２６７”　＋　Ｃ２６８”　 ＋　Ｔ２６９”＋Ｇ２２Ｔ　：Ｆ２１３°＋Ｐ２１５”： ０２３８”　＋　Ｃ２３９”　＋　Ｆ２４０”　＋　０２４３”、又は５２４７ ’″＋Ｆ２５１”　＋７２５２°。

親リパーゼが上記した竺王ｌユニ　−孟ノ二しｌ：ゴ尤　リパーゼであるとき、 １又は複数の以下の位置、即ち、８４−１１２．２０９−２１３．２３８−２４ ５．２４７−２５４又は２６４−２６９の１又は複数のアミノ酸残基を欠失させ ることができる。適切な欠失（及び、記載の第１の例の場合、買換）の特定の例 は以下の通りである；Ｌ２６４°＋　Ｉ２６５”　＋　Ｇ２６６°＋　７２６７ ”　＋　Ｃ２６８°＋　Ｃ２６９“十Ｃ２２Ｔ　；Ｒ２０９”＋Ｆ２１０”； Ｆ２１１“＋Ｙ２１３°； Ｄ２４２°＋　Ｆ２３９”　＋　１２４１　；ψＮ２４７”　＋　０２５４°。

リパーゼ変異体■の特定のＬｉ様において、親リパーゼは、リパーゼが不活性状 態にあるときに活性セリンを覆い、且つリパーゼが活性化されたときに脂質基質 に対して活性セリンを接近し易くするように、このコンホメーションが変化する 表層ループ構造を含んで成る。このループ構造は、結合性ポケットに面する主と して疎水性な内面及び主として親水性な外面を有している。このリパーゼ変異体 はこのループ構造を構成する配列の１又は複数のアミノ酸残基の欠失により特徴 付けられる。このループ構造はヒト膵臓リパーゼ（Ｗ　ｉ　ｎ　−ｋｌｅら署、 Ｎａｔｕｒｅ　３４３．１９９０．頁７７１−７７４を参照）及びリゾムコ−／ Ｉｚ　ミーヘイ　リパーゼ（Ｂｒａｄｙら著、Ｎａｔｕｒｅ　３４３．１９９０ ．頁７６７−７７０を参照）について説明されたものに相当する。ところで、こ のリパーゼ変異体は好ましくは５個以上のアミノ酸残基を含んで成る短いループ 構造を有する。このループ構造は更に１又は複数のアミノ酸残基の置換を含んで 成りうる。しかしながら、このループ内（且、−之メｊ１）二ニー　リパーゼの Ｎ８９及びハ、ミーヘイ　リパーゼのＮ８８）に存在するトリプトファンは保存 されるべきであるとのいくつかの指標もある。

リパーゼ変異体■において、ループ構造の少なくとも１個のアミノ酸残基は好ま しくはシスティンにより置換され、そして別の少な（とも１個のアミノ酸残基も 好ましくはシスティンにより置換されており、このシスティン残基はそれらがジ スルフィド結合を形成するように互いに相対して位１している。これはループ構 造が移動して、それらがより大きく開き、活性セリンが基質に対してより接近し 易くなるようにするであろう。

例えば、この親リパーゼが上記したりシムコール　ミーへイ　リパーゼであると き、以下の置換がされうる；５１１４Ｃ＋Ａ９０Ｃ； Ｒ８６Ｃ＋　０６１Ｃ。

５８４Ｃ＋　Ｄ６１Ｃ； Ｎ８７Ｃ＋　Ｄ６１Ｃ。

Ｙ６０Ｃ＋　［１７８Ｃ；又は Ｙ６０Ｃ＋　Ｎ８７Ｃ。

一方、親リパーゼが上記した竺五まユニ　立区土左二エ　リパーゼであるとき、 以下の置換がされうる：０６１Ｃ＋Ｎ８８Ｃ； Ｇ６１Ｃ＋　Ｒ８７Ｃ。

０６２Ｃ＋　２８７Ｃ。

Ｄ６２Ｃ＋　５８５Ｃ； ０６２Ｃ＋　Ｎ８８Ｃ、又は ５１１６Ｃ＋　Ｇ９１Ｃ。

他方、水性媒体におけるより大きく開いたループ構造のコンホメーションは、活 性セリンを含む触媒三つ組残基が位置している結合性ポケットの１又は複数の親 水性アミノ酸残基を、１又は複数のあまり親水性でない残基により置換すること によって得られうる。

例えば、親リパーゼが上記したりシムコール　ミーへイ　リパーゼであるとき、 以下の置換がされうる；＋２０４Ｖ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｇ。

Ｆ２０８Ｖ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｇ。

Ｆ２１３ν、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｇ； １２５４Ｖ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｇ。

Ｆ２５５Ｖ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｇ。

Ｆ２５８Ｖ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｇ。

Ｃ２６７Ｖ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｇ、又は Ｆ９４Ｌ、Ｔ、Ｋ。

特に、アミノ酸置換は以下のように組合せることができる；Ｉ２０４Ｔ　＋　Ｃ ２５５Ｔ　＋　Ｃ２６７Ｔ　；　又はＬ２０８Ｔ＋ｒ２５４Ｔ＋Ｌ２５８Ｔ。

親リパーゼが上記した竺五亙ユニ　立刃玉ムニエ　リパーゼであるとき、以下の 置換がされうる； Ｌ９３ν、Ｔ、Ｓ、Ａ、Ｇ。

［９０Ｖ、Ｔ、Ｓ、Ａ、Ｇ。

１８６Ｖ、Ｔ、Ｓ、Ａ、Ｇ； Ｆ２０２Ｖ、Ｔ、Ｓ、Ａ、Ｇ。

Ｆ２０６Ｖ、Ｔ、　Ｓ、　Ａ、Ｇ。

１２５５Ｖ、Ｔ、Ｓ、Ａ、Ｇ。

Ｆ２５９Ｖ、Ｔ、Ｓ、Ａ、Ｇ。

Ｆ９５Ｌ、Ｔ、に；又は Ｆ２１ＬＬ、Ｔ、にゆ リパーゼ■の好ましい態様において、１又はＦ３［数のアミノ酸残基が以下のよ うに置換されうる； Ｆ９５に； １８６Ｔ； １９０Ｔ； １２５５Ｔ。

Ｌ２５９Ｔ； Ｌ２０６Ｔ；　又は Ｌ２０６ｔ＋１２５５Ｔ＋Ｌ２５９Ｔ。

本発明に関して、リパーゼ変異体■−■について前記したアミノ酸配列のいづれ か１つの改質は、前記した別の改質のいづれか一つと組合せることができること が理解されるべきである。

な所見の後に、このリパーゼをコードする配列における特異的な部位に突然変異 を作るための方法について述べる。

々の方法により、問題のリパーゼを生産する任意の細胞又は微生物から単離でき る。まず、調べるべきリパーゼを生産する生物由来の染色体Ｄ）ＪＡ又はメツセ ンジャーＲＮＡを用いてゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリーを作製す べきである。次にこのリパーゼのアミノ酸配列がわかっているならば、相同なラ ベルをオリゴヌクレオチドプローブを合成し、且つ用いて、細菌ＤＮＡのゲノム ライブラリー又は菌類ｃＤＮＡライブラリーからリパーゼコード化クローンを同 定することができる。他方、その他の細菌又は菌類の株由来のリパーゼに対して 相同な配列を含むラベル化オリゴヌクレオチドプローブが、低緊張のもとてのハ イブリダイゼーション及び洗浄条件を利用してリパーゼコード化クローンを同定 するプローブとして利用できる。

リパーゼ生産性クローンを同定するための更なる他の方法は、プラスミドのよう な発現ベクターの中にゲノムＤＮＡのフラグメントを挿入し、この生じるゲノム ＤＮＡライブラリーをリパーゼ陰性細菌に他方、この酵素をコードするＤＮＡ配 列は確立されている標準的なし、精製し、アニールし、リゲートし、そして適当 なベクターの中ライマーを用いるポリメラーゼを連鎖反応によっても作ることが で鎖ギャップをこのリパーゼ遺伝子を保有するベクターに作り上げる。

次に所望の突然変異を保有している合成ヌクレオチドをこの一本鎖ＤＮＡの相同 部分にアニールさせる。次いで残っているギャップをＤＮＡポリメラーゼＩ　（ フレノウフラグメント）により補完し、そしてこの構造体をＴ４リガーゼを用い てリゲートする。この方法の特定の例はＭｏｒｉｎａｇａら（１９８４，Ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２　：　６４６−６３９）に詳細されている。１９８８ 年７月２６日に承認されたＥｓｔｅｌｌらの米国特許第４．７６０，０２５号は 、カセットのわずかに変化させることによる複数の突然変異をコードするオリゴ ヌクレオチドの挿入を開示しているが、しかしながらＭｏｒｉｎａｇａの方法に より同時により多種の突然変異を導入することができ、その理由は種々の長さの 複数のオリゴヌクレオチドを導入できるからである。

リパーゼコード化配列への突然変異の導入のその他の方法はしての化学合成りＮ Ａ鎖を利用することによって導入された所望の突然変異を含むＰｃｔ？フラグメ ントの３段階作製を含む、このＰＣＩ？作製化フラグメントから突然変異を保有 するＤＮＡフラグメントが制限エンドヌクレアーゼによる切断によって単離でき 、そして発現プラスミドの中に再挿入できうるくこの方法を更に概略した図３及 び４を参照のこと）。

リパーゼ・　の 本発明に従うと、上記の方法又はそれに代わる当業界に知られる任意の方法によ り作った突然変異化リパーゼコード化配列は、プロモーター、オペレーター、リ ポソーム結合部位、翻訳開始シグナル及び任意的にリプレッサー遺伝子又は種々 の活性化遺伝子をコードするコントロール配列を典型的に含む発現ベクターを用 い、酵素形態において発現されうる０発現されたタンパク質の分泌を可能とす一 ド化配列の前に挿入していてよい、コントロール配列の方向のもとての発現のた め、本発明に従って処理すべき標的遺伝子を適当な転子の転写を補助することが できるプロモーター配列には原核生物のβ−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌ ｌａ−にａｍａｒｏｆｆら、１９７８．　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、υ、Ｓ、Ａ、　７５　：　３７２７−３７３１） 及びｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、υ、Ｓ、Ａ、　８０　：　２ｌ−２５）が含まれるが、それ らに限定されない。更なる参考はＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎ、　１ ９８０．２４２　：　７４　９４のｒＬＩｓｅｆｕｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒ ｏｍ　ｒｅｃｏｍｂｉ−ｎａｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ　Ｊにも見い出せうる。

−態様に従うと、旦、スブチリス（号ユ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）を該突然変異は翻 訳開始シグナルに続き、且つ対象のＤＮＡ配列に先行していることができる。こ のシグナル配列は発現生成物を細胞壁へと輸送するのに働き、ここでこの生成物 は分泌に基づいて切断される。前記したコントロール配列は、存在しているなら ば、シグナル配列を含むことを意図している。

本発明のリパーゼ変異体を生産する現状好ましい方法において、宿主生物として 糸状菌類を利用する。この糸状Ｗ＊宿主生物は好都合には組換えタンパク質を生 産するために宿主として既に利用されているもの、例えばアスペルギルス（動態 」ｉ　１１　ｕ　ｓ　）属の種の株、例おける人、オリザの利用は例えばＥＰ　 ２３８．０２３号に詳しく説明されている。

アスペルギルス属におけるリパーゼ変異体の発現のため、リパーゼ変異体をコー ドするＤＮＡ配列にプロモーターが先行する。このプロモーターはアスペルギル ス属において強い転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であってよく、そしてこれは 細胞外又は細胞内タンパク質、例えばアミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテア ーゼ、リパーゼ、セルラーゼ又は解糖系酵素をコードする遺伝子に由来しろる。

適切なプロモーターの例は人、オリザ　ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール　ミ ーヘイ　アスパラギン酸ブロテナーゼ、人、ニガー　中性α−アミラーゼ、人、 ニガー　酸安定のα−アミラーゼ、人、三光二　グルコアミラーゼ、リゾムコー ル　ミーへイ　リパーゼ、人。

オリザ　アルカリ性プロテアーゼ又は人、オリザ　トリオースリン酸イソメラー ゼをコードする遺伝子に由来するものである。

特に宿主生物が人、オリザのとき、本発明のプロセスにおいて利用するのに好ま しいプロモーターは人、オリザ　ＴＡＫＡアミラーゼプロモーターであり、なぜ ならこれはＡ９±１丈において強い転写活性を示すからである。ＴＡＫＡアミラ ーゼプロモーターの配列はＥＰ２３８．０２３号に明らかにされている。

終止及びポリアデニル化配列はプロモーターと同じ起源に由来することが適切で ある。

菌類宿主細胞を形質転換させるのに用いる技術はＥＰ　２３８．０２３号に詳細 されている。

宿主細胞からのリパーゼ変異体の分泌を保証するため、該リパーゼ変異体をコー ドするＤＮＡ配列の前にシグナル配列があってよく、これは細胞からのタンパク 質の分泌を提供せしめる天然のシグナル配列もしくはその機能部分、又は合成配 列でありうる。特に、このシグナル配列はアスペルギルス属の種のアミラーゼも しくはグルコアミラーゼをコードする遺伝子、−史ノＬに２：二火　主二仝エ　 リパーゼもしくはプロテアーゼをコードする遺伝子又はヒュミコラ属のセルラー ゼ、キシラナーゼもしくはリパーゼをコードする遺伝子に由来しろる。このシグ ナル配列は好ましくは人、　Ｑ　ＴＡＫＡアミラーゼ、人、ニガー　中性α−ア ミラーゼ、人、ニガー　酸安定α−アミラーゼ又は人、ニガー　グルコアミラー ゼをコードする遺伝子に由来する。

形質転換化宿主細胞を培養するのに用いる培地はアスペルギルス属の細胞を増殖 するのに適する任意の常用の培地でありうる。この形質転換体は通常安定であり 、そして淘汰圧の非存在下において培養されうる。ところで、形質転換体が不安 定であると見い出されたなら、細胞に導入した選択マーカーを選別のために用い られうる。

宿主細胞から分泌される成熟リパーゼタンパク質は、遠心又は濾過により培地か ら細胞を分離させること、次いで硫酸アンモニウムのような塩類の手段によりこ の培地のタンパク質性成分を沈殿させること、その後のイオン交換クロマトグラ フィー、アフィニティークロマトグラフィー等のようなりロマトグラフイ一工程 を含むよく知られた工程により培養培地から好適に回収することができる。

本発明は、好ましくは無粉塵性、安定化液体又は保護化酵素の形態にある本発明 の関するリパーゼ変異体を含んで成る洗浄添加剤にも関連する。無粉塵性顆粒は 例えば米国４，１０６，９９１号及び４，６６１．４５２号（両方ともＮｏｖａ 　Ｉｎｄｕｓｔｒｔ＾／Ｓに属する）に従って製造でき、そして当業界に知られ る方法によって任意的に被覆化されうる。液状酵素調製物は例えば確立された方 法に従ってポリオール、例えばプロピレングリコール、糖又は塘アルコール、乳 酸又は硼酸を加えることにより安定化されうる。その他の酵素安定剤が当業界に おいてよく知られている。保護化酵素はＥＰ　２３８，２１６号に開示されてい る方法に従って調製できる。

洗浄添加剤は適切には、添加剤のダラム当り０．０２　２００ｍｇの酵素タンパ ク質を含みうる。この添加剤は洗浄添加剤の中に通常音まれる−又は複数種のそ の他の酵素、例えばプロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ又はアミラー ゼを更に含みうろことが理解されるであろう。

更なる観点において本発明は、本発明のリパーゼ変異体を含んで成る洗浄組成物 に関連する。本発明の洗浄組成物は陰イオン、非イオン、陽イオン、両性イオン 又は双掻子イオン型でありうる界面活性剤、及びこれらの界面活性剤分類の混合 物を更に含んで成る。適切な界面活性剤の典型例は線状アルキルベンゼンスルホ ネート（ＬＡＳ）、アルファーオレフィンスルホネート（ＡＯ３）、アルコール エトキシスルフニー）　（ＡＥＯ５）、アルコールエトキシレー）　（ＡＥＯ） 　、７＜岑ルスル　１字１フエート（ＡＳ）　、アルキルポリグリコシド（ＡＰ Ｇ）及び中性脂肪酸の　−アルカリ金属塩である。

本発明の洗浄組成物は当業界において知られているその他の洗浄成分、例えばビ ルダー、漂白剤、漂白活性剤、耐腐蝕剤、金属イオン封鎖剤、香料、酵素安定剤 等を含みうる。

本発明の洗浄組成物は任意の常用の形態、例えば粉末又は液状において製剤化さ れうる。該酵素は前記の酵素安定剤の添加により液状洗浄剤において安定化され うる。通常、本発明の洗浄組成物の溶液のｐｌは７〜１２であり、そしである場 合においては７．０〜１０．５である。その他の洗浄酵素、例えばプロテアーゼ 、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ又はアミラーゼを本発明の洗浄組成物の中に、 別々に、又は前記した通り組合せ添加剤として含ませることができうる。

図面の簡単な説明 本発明は以降において、添付図面を参照しながら説明し、ここで、図ＩＡ及びＢ は、旦、ラヌギノーザ　リパーゼの脂質接触帯の三次元構造を示し、ここでこの リパーゼは不活性（Ａ）及び活性（Ｂ）のそれぞれの型にある。「白色」残基は 疎水性アミノａｌ！　（Ａｌａ、　Ｖａｔ。

Ｌｅｕ、　Ｉｌｅ、　Ｐｒｏ＋　Ｐｈｅ、　Ｔｒｐ、　Ｇｌｙ及びＭｅ　ｔ）を 表わし、「黄色」残基は親水性アミノ酸（Ｔｈｒ、　Ｓｅｒ、　Ｇｌｎ、　Ａｓ ｎ、　Ｔｙｒ及びＣｙｓ）を表わし、「青色」残基は正荷電アミノ酸（Ｌｙｓ、 　Ａｒｇ及び旧Ｓ）を表わし、そして「赤色」残基は負荷電アミノ＃（Ｇｌｕ及 びＡｓｐ）を表わしており；図２Ａ及びＢは、肚、ミーヘイ　リパーゼの脂質接 触帯の三次元構造を示し、ここでこのリパーゼは不活性（Ａ）及び活性（Ｂ）の それぞれの型にある。「白色」残基は疎水性アミノ酸（Ａｌａ、　Ｖａｌ。

Ｌｅｕ＋　ＩＩｓ、　Ｐｒｏ＋　Ｐｈｅ、　Ｔｒｐ＋　Ｇｌｙ及びＭｅｔ）を表 わし、「黄色」残基は親水性アミノ酸（Ｔｈｒ、　Ｓｅｒ、　Ｇｌｎ、　Ａｓｎ ＋　Ｔｙｒ及びＣｙｓ）を表わし、「青色Ｊ残基は正荷電アミノ酸（Ｌｙｓ、　 Ａｒｇ及び旧Ｓ）を表わし、そして「赤色」残基は負荷電アミノ酸（ＧＩｕ及び Ａｓｐ）を表わしており；図３はポリメラーゼ連鎖反応によるリパーゼ変異体を コードするプラスミドの調製の図解であり； 図４はＰＣＩＩによる３段階突然変異誘発の図解であり；図５はプラスミドｐＡ Ｏ１の制限地図を示し：図６はプラスミドｐＡＨＬの制限地図を示し；図７はプ ラスミドｐＡＲ？ＩＬの制限地図を示す。

本発明を以下の実施例において更に説明し、ここでこれらは本発明の範囲を限定 する意図はない。

・−船方法 スペルギルス　オｒザにお番るヒ上］λ−５５Ｚ−＃）　ｆ　’ｉｔ＜号に詳細 されている。これらの特許出願はアスペルギルス　オリザにおける２種類のリパ ーゼの発現及び特徴付けも詳細している。利用されている２つの発現プラスミド はｐ９６０　（旦、旦区エムニヱ　リパーゼ遺伝子を保有）及び９７８７　（Ｒ ，ミーヘイ　リパーゼ遺伝子を保有）と呼ばれている。

本用途において用いる発現プラスミドは、リパーゼコード化領域のすぐ３“側の 若干の改質を除き、ｐ７８７及びｐ９６０にＩ！（以している。

これらの改質は以下の方法においてなされる：　ｐ９６０をＮｒｕ　Ｉ及びＢａ ｍＨｒ制限酵素により消化する。これらの２つの部位の間にプラスミドｐＢＲ３ ２２由来のＢａＩＩＨＩ　／　Ｎｈｅ　ＩフラグメントであってＮｈｅ　Ｉフラ グメントがフレノウフラグメントにより補完されているものをクローンし、これ によりＢａｔａＨＩ及びＮｈｅ　１部位を含むプラスミドｐＡＯ１（図５）を作 り上げる。これらの固有部位の間に、ｐ９６０及びｐ７８７に由来のＢａｍＨＩ 　／　Ｘｂａ　ｒフラグメントをクローンしてそれぞれｐＡＨＬ（図６）及びｐ ＡＲＭＬ（図７）を得る。

リパーゼ遺伝子の部位特異的インビトロ突然変異誘発リパーゼ遺伝子の中に突然 変異を導入するのに三通りの手法を用いた。

第一の方法はｚｏｌｌｅｒとＳｍｉ　ｔｈの［ｌＮＡ第３巻、第６号、４７９− ４８８（１９８４＞に詳細されてているオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異 誘発を採用する。この方法を以下に簡単な説明し、そして例１において詳しく説 明する。

発現プラスミドから単離した対象のリパーゼ遺伝子を環状Ｍ１３バクテリオファ ージヘクターの中に挿入する。−末鎖ゲノムに、化学構成した相補性ＤＮＡ鎖を アニールさせる。このＤＮＡ鎖は、環状ＤＮＡ上のリパーゼ配列に相補性の配列 がフランクした導入すべき突然変異を含んでいる。次にインビトロで、プライマ ーをタレノウポリメラーゼを用いて生化学的に環状ゲノムの全長において広げる 。旦。

：］　’Ｊ　（Ｌｃｏｌｉ）に形質転換させた場合、ヘテロ二本鎖は、フラグメ ントを単し、そして発現プラスミドの中に再挿入することのできる所望の配列を 有する二本鏡開Ａをもたらすであろう。

採用する他の方法はＮｅ１ｓｏｎとＬｏｎｇのＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃ ｈｅｓ＋１ｓｔｒｙ。

１８０、１４７−１５１　（１９８９）に詳細されている。これはＰＣＲ反応に おける一つのプライマーとして化学合成りＮＡ鎖を用いることにより導入した所 望の突然変異を含むＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）フラグメントの３段階作製 を包含する。ＰＣＩ？作製化フラグメントから、制限酵素による切断によって突 然変異を保有するＤＮＡフラグメントが単離でき、そして発現プラスミドの中に 再挿入することができる。この方法は例３において詳しく説明する６図３及び４ においてこの方法を概略する。

更なる方法、通称「カセット突然変異誘発」においては、リパーゼコード化領域 の２つの制限部位の間のセグメントを所望の突然変異を保有する合成りＮＡフラ グメントにより置き換えている。

ユパニ差変異生上 １：ヒュミコー　−ヌギノーザ　リパーゼのＤ９６Ｌ　を　る１立スｊ工■詐裂 リパーゼ遺伝子の単離： 発現プラスミドｐ９６０はＢａｍＨＩ　／　Ｘｂａ　Ｉ　ｔｉｌｌ限フラグメン ト上にヒエミコラ　ラヌギノーザ　リパーゼに関するコード領域を含む（このリ パーゼのＤＮＡ及びアミノ酸配列を添付した配列表Ｎｏ、　１に示す）。

ＢａｍＨＩ　／　Ｘｂａ　Ｉフラグメントは以下の通りに単離した：発現プラス ミドを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＸｂａ　Ｉとインキュベートした 。その条件は１５８ｇのプラスミド、１０単位のＢａＩＩ）ｌ　Ｉ　、１０単位 のＸｂａ　Ｉ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５０鱈のトリス−１（ＣＩ　、ｐｉ（７ ，５、ｌ０１ｗＭの？１ｇＣｌ□及びＩｇＭのＤＴＴ、５０μｍ容量とした。温 度は３７℃、そして反応時間は２時間とした。２つのフラグメントを１％のアガ ロースゲルで分け、そして所望のフラグメントをこのゲルから単離した。

ベクター）１１３＋ｐ１８へのリゲーション：二本鎖の復製型分子のバクテリオ ファージベクターＭ１３ｍｐ１８ヲＭ記した条件のもとでＢａｍＨＩ及びＸｂａ 　Ｔにより消化した。単離した制限フラグメントを以下の反応混合物中で、消化 したバクテリオファージベクターにリゲートさせたニブラスミド０．２μｇ、ベ クター０．０２μｇ、５０℃Ｍのトリス−ＨＣｌ　、ｐＨ７，４，１０ｗＭのｌ ’１ｇｃＩｍ、１０ｎ＋ＭのＤＴＴ及び１ｍＭのＡＴＰ、容量２０μｍ中で１６ ℃で３時間、この混合物５μｍをＥ、コリ株ＪＭＩＯＩに形質転換させた。ベク ター中のフラグメントの存在は、この形質転換体から単離した二本鎖Ｍ１３−［ ］ＮＡに基づく制限酵素分析によって同定した・ 一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ　（鋳型）の単離：前記の形質転換体から、Ｍｅｓｓｉｎ ｇのＧｅｎｅ、　１９．２６９−２７６　（１９８２）に詳細の方法に従ってｓ ｓ　−ＤＮＡを単離した。

突然変異誘発プライマーの５”　リン酸化：５″−ＴＴＴＣＴＴＴＣＡＡＣＡＡ ＧＡＡｆ、ＴＴＡＡＧＡ−３’の配列を有する突然変異誘発プライマーを、７０ ■Ｈのトリス−ＨＣｌ　、ｐＨ７，０，１０易Ｈの！ＩＩｇＣＩ□、５ｍＭのＤ ＴＴ、１　ｍＭのＡＴＰ、１．００ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチド及び３．６単 位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含む３０μｍの反応混合物の中で５゛末端 にてリン酸化させた。反応は３７℃で３０分行った。次に６５℃で１０分この混 合物をインキュベートすることによって酵素を不活性化させた。

鋳型とリン酸化突然変異誘発プライマーのアニール：鋳型とプライマーのアニー ルは、Ｑ　、　５μｍｏ　＋の鋳型、５μｇｏ＋のプライマー、２Ｑｍｆｆのト リス−ＨＣｌ　、ｐＨ１，５，１０＋＋Ｍの７１ｇＣ１，，５０ｏ＋ＭのＮａＣ １及びＩＷＡＦＩのＤＴＴを含む１０μｍの容量の中で６５℃で１０分間熱し、 次いでその後Ｏ℃に冷却することで行った。

伸長／ソゲ−９５２反応： 上記の反応混合物に以下の混合物１０μｌを加えた：０．３■ｉのｄＡＴＰ。

０．３＋ｓＭのｄＣＴＰ、０．３ｍＭのｄＧＴＰ、０．３ｍＭのＴＴＰ、１ｍＭ のＡＴＰ、　２０ｍＭのトリス−）ＩＣＩ　、ｐＨ７，５，１％Ｍの阿ｇｃ１． 、ｌ０ＩＩｆｆの［ｌＴＴ、３単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ及び２．５単位のタレ ノウポリメラーゼ。次に、反応を１６℃で１６時間行った。

Ｊｌｌｌｏｌの形質転換： 上記の反応混合物を標準の技術を利用してＣａＣ１ｇ＝処理化Ｅ、コリＪ？１１ ０１細胞の中に種々の希釈率において形質転換させ、そして２×のＹＴアガープ レート上の２ＸのＹＴトフブアガーにおいて平板培養した（２×のＹＴ＝）リブ シン１６ｇ／Ｌ、酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ＮａＣ１５ｇ／　Ｌ、　２　ＸのＹＴ ）７ブアガー＝２ＸのＹＴに０．４％のアガロースを加え、そしてオートクレー ブにかけたもの、２×のＹＴアガープレート＝２ＸＹＴに２％のアガーを加え、 そしてオートクレーブにかけたもの）。このプレートを３７℃で一夜インキユベ ートした。

陽性クローンの同定： 利用する方法は以下に詳細するブラークーリフトハイブリダイゼーションである ：ニトロセルロースフィルターを適切なプラーク密度を存するプレート上に置き 、このフィルターを湿らした。次にこのフィルターを以下の溶液：　１．５Ｍの ＮａＣ１，０，５ＭのＮａＯＨニ３０秒、１．５ＭのＮａＣ１，０，５Ｍのトリ ス−ＨＣｌ　、ｐＨ８，０に１分、そして２×のＳＳＣ（０，３ＭのＮａＣｌ、 ０−０３Ｍのクエン酸ナトリウム）にその後使用するまで浸した。このフィルタ ーを３ＭＭの濾紙上で乾カル、そして真空オーブンの中で８０℃で２時間ベータ した。

５’−ＴＴＴＣＴＴＴＣＡＡＣＡＡＧＡＡＧＴＴＡＡＧＡ−３’の配列を有する 突然変異誘発プライマーを、７ｋｌｌのトリス−１（Ｃ１、ｐＨ７，５，１０＋ ＭのＭｇＣｈ、５μｌＭのＤＴＴ、　１０ｐｍｏ１のオリゴヌクレオチド、２Ｏ ｐ鋼Ｏ１のｙ−３２Ｐ−ＡＴＰ及び３．５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ を含む３０μｌの容量の中で、５°末端にて放射線的にラベルした。この混合物 を３７℃で３０分間、次いで１００℃で５分間インキュベートした。

乾かしたフィルターを６×のＳＳＣ，０，２％の牛血清アルブミン、０．２％の フィコール、０．２％のポリビニルピロリドン、０．２％のドデシル硫酸ナトリ ウム（ＳＤＳ）及び５（ｌｃｒｇ／ｇ＋１の音波処理化サケ精子ＤＮＡの中で６ ５℃で２時間予備ハイブリダイズさせた。次に、ラベル化プローブを含む反応混 合物を１５＋＊ｌの新鮮な予備／％イブリダイゼーシヲン混合物に加え、そして このフィルターをこの中でゆっくり振盪させながら２７℃で一夜浸した。ハイブ リダイゼーションの後、このフィルターを２×のｓｓｃ、０．１％のＳＤＳの中 で３回、１５分ずつ洗い、そしてオートラジオグラフにかけた。同じ溶液の中で しかしながら５℃での洗浄、及び更なるオートラジオグラフィーの後、突然変異 誘発プライマーに相補性のＤＮＡ配列を含むプラークが同定された。

同定されたクローンはへテロ二重鎖の結果であるため、このプラークを再度プレ ートした。ハイブリダイゼーションと同定の工程を繰り返した。

二本鎖Ｍ１３ファージＤＩＩＩＡの精製：再度スクリーンしたクローンをＥ、コ リ株ＪＭＩＯＩの感染のために用いた。約１０１のファージ及びＪＭＩＯＩの５ コロニーを含む培養物を５ｍｌの２×のＹＴ培地の中で３７℃で５時間増殖させ た０次に二本鎖の環状ＤＮＡをＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙのＮｕｃｌｅｉｃ　 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、＋　２＋　１５１３　（１９７９）に記載の方法に従って ベレットから精製した。

改質型リパーゼをコードする制限フラグメントの単離：上記の通りに単離したＤ ＮＡ調製物（約５μｇ）を６０μｍの１００ｍＭのＮａＣ１，５ＯＮＭのトリス −１（Ｃ１、ｐＨ７，５，１０５ＭのＭｇＣ１ｚ及び１０ｍＭの［ｌＴＴ中の１ ０単位の各制限エンドヌクレアーゼＢａｗｌ　Ｉ及びＸｂａ　１により、３７℃ で２時間消化させた。この［ｌＮ＾生成物を７ガロースゲＪし上で分け、そして プラスミドをこのゲルから精製した。

アスペルギルス発現ベクター９ＡＯ１へのリゲーション（図５）二重層した制限 フラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＮｈｅ　Ｉにより消化したアスペルギル スベクターρ＾Ｏ１に、以下の反応混合物：フラグメント０．２μｇ１ベクター ０．０２μｇ　−５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，４，１０曽門のＭｇＣ１ ｚ、１０−ＭのＩＩＴＴ、１ｓＭのＡＴＰ、全容量２０ｍ１中でリゲートさせた 。この反応混合物５μｌをＥ、コリ株ＭＣ１０６１の形質転換のために用い、こ の中で改質した発現プラスミドを同定及び増殖させた。

このプラスミドをｐＡＨＬＤ９６Ｌと呼び、そしてこれは改質コドン以外ρＡＨ Ｌと同じである。

ｐＡＨＬＤ９６Ｌの配列確認： 突然変異させたプラスミドをもとはＳａｎｇｅｒにより詳細されたジデオキシ連 鎖停止方法を利用して二本鎖プラスミドに基づいて直接シ作袈 その他の突然変異リパーゼ遺伝子を例１に記載と同じ方法を利用して作製した。

改質のために利用したプラスミドの名称及びプライマーを以下に列挙する。

プラスミドの名称　プライマーの配列 ρＡ）ｌＬＤ９６Ｎ　５′−ＴＣＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＡＧＴＴＡＡＧＡ−３ ’ｐＡＨＬＩ）ＬＬＬＮ　Ｓ’　−ＧＴＧＡＡＧＣＣＧＴＴＡＴＧＴＣＣＣＣＴ Ｇ−３’ｐＡＨＬＥ８７Ｑ　５’　−ＣＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＴＧＴＡＴＧＧＡ ＡＣＧＡ−３”ｐＡＨＬＲ２０９Ａ／Ｅ２１０＾　５’　−ＧＣＴＧＴＡＡＣＣ ＧＡＡＡＧＣＡＧＣＣＧＧＣＧＧＧＡＧＴＣＴ−３″ｐＡＨＬＥ８７Ａ　５’　 −ＣＧＡＴＣＣＡＧＴＴＡＧＣＴＡＴＧＧＡＡＣＧ−３’ρＡＨＬＥ５６八　５ ’−ＣＴＣＣＡＧＡＧＴＣＡＧＣＡＡＡＣＧＡＧＴＡ−３’ρＡＨＬＥ５６Ｑ　 ５’　−ＣＣＡＧＡＧＴＣＴＴＧＡＡＡＣＧＡＧＴＡＧ−３″ｐＡＨＬＤ１１１ Ｌ　５’　−ＡＡＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＡＡ丁ＧＴＣＣＣＣＴＧ−３’ｐＡｌ（ ＬＥ２１０Ａ　５’　−ＴＧＴＡＡＣＣＧＡＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧ−３” １）ＡＨＬＥ２１０Ｑ　５’−ＴＡＡＣＣＧＡＡＴＴＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧ− ３”ρＡＨＬＲ２０９Ａ　５’　−ＡＡＣＣＧＡＡＴＴＣＡＧＣＣＧＧＣＧＧＧ ＡＧＴ−３’３：ヒュミコラ　−ヌギノーザ　リパーゼの０２５４Ｎするプラス ミドの プラスミド１）ＡＨＬの線状化： 環状プラスミドｐＡＨＬを以下の反応混合物：　５０ｍＭのＮａ　ＣＩ、１０１ Ｍのトリス−１１ｃＩ　、ｐｌ（７，９，１０＋Ｍの門ｇｃ１□、１＋ｍｌｌの ジチオスレイトール、１μｇのプラスミド及び２単位のＳｐｈ　ｔの中で、制限 酵素ｓｐｈ　Ｉにより線状化した。この消化は３７℃で２時間行った。この反応 混合物をフェノール（トリス−ＨＣｌ　、ｐＨ７，５で平衡化）により抽出し、 そして２容量の水冷９６％エタノールを加えて沈殿させた。遠心しそしてベレッ トを乾かした後、線状化ＤＮＡを５０μｌのＨｚＯに熔かし、そしてその濃度を アガロースゲル上で評価した。

３段階Ｉ’ＣＩ？突然変異誘発： 図４に示す通り、３段階突然変異誘発は４種のプライマーの利用を含む： 突然変異誘発プライマー（・Ａ）： ５’　−ＧＴＧＣＧＣＡＧＧＧＡＴＧＴＴＣＧＧＡＡＴＧＴＴＡＧ［；−３’Ｐ ＣＲヘルパー１　（・Ｂ）： ５’　−ＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＴＣＡＣＴＧＡＧＡＣＣＣＴＣＴＡＣＣＴＡＴＴ ＡＡＡＴＣＧＧＣ−３’ＰＣＲヘルパー２　（＝Ｃ）；　５°−ＣＣＡＴＧＧＣ ＴＴＴＣＡＣＧＧＴＧＴＣＴ−３’ＰＣＲハンドル（＝Ｄ）：　５’−ＧＧＴＣ ＡＴＣＣＡ［；ＴＣＡＣＴＧＡＧＡＣ−３゜３段階全て、１ｈＨのトリス−ＨＣ ｌ　５９Ｈ８，３，５０１のＫＣＩ、１，５１の１１ｇｃ１．、ｏ、ｏｏｉ％の ゼラチン、０．２ｆｆｉＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、　０．２１１℃ ＭのｄＧＴＰ、Ｏ−２μｌＭの↑ＴＰ、２．５単位のＴａｑポリメラーゼを含む 緩衝液中で行った。

段階１において、１００ｐ＋＊ｏｌのプライマーＡ、１００１００ｐのプライマ ーＢ及び１　ｆ＋ｓｏｌの線状化プラスミドを全部で１００μｍの反応混合物に 加え、次いで９５℃で２分、３７℃で２分及び７２℃で３分より成るサイクル１ ５周を実施した。

Ｐｃｔ？生成物の濃度はアガロースゲル上で評価した。次に段階２を行った。０ ．６μｍｏｌの段階１の生成物及びｌｆｍｏｌの線状化プラスミドを全部で１０ ０１ｊｌの前記した緩衝液の中に含ませ、次いで９５℃で５分、３７℃で２分及 び７２℃で１０分より成るサイクル１周を実施した。

段階２の反応混合物に１００１００ｐのプライマーＣ及び１００１００ｐのプラ イマーＤを加え（それぞれ１μｌ）、そして９５℃で２分、３７℃で２分及び７ ２℃で３分より成るサイクル２０周を実施した。この操作は突然変異誘発工程に おける段階３を構成する。

突然変異化制限フラグメントの単離： 段階３からの生成物をアガロースゲルより単離し、そして２０μｌのｎｚｏに再 溶解させた。次に、制限酵素ＢｓｐＭ■により、以下の組成：１１００ｆｆ１の ＮａＣ１，５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　、ｐＨ７，９，１０ｍＭの１１ｇｃ１． ．１ｍＰｌのＤＴＴ及び１０単位のａｓｐ−■により全容量５０μｌにおいて消 化した。

インキュベーションは３７℃で２時間とした。　２６４ｂρのＢｓｐＭ　ＩＩフ ラグメントをアガロースゲルから単離した。

発現ベクターｐＡＨＬへのリゲーション：発現プラスミドｐＡ）ＩＬを前記した 条件のもとでＢｓｐＭ　ＩＩにより切断しそして大きなフラグメントをアガロー スゲルから単離した。このベクターに、上記で単離した突然変異化フラグメント をリゲートさせそしてこのリゲーション混合物をＥ、コリへの形質転換のために 用いた。このフラグメントの存在及び方向を、制限酵素による形質転換体由来の プラスミド調製物の切断により確認した６配列分析はＳａｎｇｅｒにより開発さ れたジ−デオキシ連鎖停止手順を利用して二本鎖プラスミドに基づいて実施した 。このプラスミドをｐＡｔ（ＬＤ２５４Ｎと命名し、そしてこれは改変したコド ンを除き、ｐＡＨＬと同一である。

４；ヒュミコラ　リパーゼのその　の−　を　するブラスミ上葛務裂 以下の突然変異体を例３に記載と同じ方法を用いて作製したが、ただしＰＣＲ生 成物及び突然変異フラグメントの再クローニングのために用いるベクターの消化 のためにその他の制限酵素を利用した。

改質のために用いたプラスミドの名称及びプライマーを以下に列挙する。

プライマーの名称　プライマーへの配列ｐＡｌｌＬＤ２５４Ｋ　５’　−ＧＴＧ ＣＧＣＡＧＧＧＡＴＣＴＴＣＧＧＡＡＴＧＴＴ−３’ｐＡ）ＩＬＤ２５４＋１　 ５’　−ＧＴＧＣＧＣＡＧＧＧＡＴＴＣＴＣＧＧＡＡＴＧＴＴ−３’ｐＡＨＬＤ ２４２Ｎ　Ｓ’　−ＧＣＣＧＣＣＧＧＴＧＧＣＧＴＴＧＡＴＧＣＣＴＴＣＴＡＴ −３’ｐＡＩＩＬＥ８７Ｋ　５’　−ＣＧＡＴＣＣＡＧＴＴＣＴＴＴＡＴＣＧＡ ＴＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＧＧ−３゜０２５４にはｐＡＨＬＥ８７ＫからＢａｔｓ Ｈｒ　／ＢｓｔＸＩ制限フラグメントを単離し、次いでＢａ５ＨＩ及びａｓ　ｔ Ｘ　Ｉにより消化したｐＡＨＬＤ２５４にの中にこのフラグメントを挿入するこ とによって作製される：［プラスミド ｐＡＨＬＥ８７に／［１２５４に ρＡ１１ＬＥ８７Ｑ／［１２５４Ｎ／Ｄ２４２Ｎ／［４２１０ＱｐＡ１（ＬＥ８ ７Ｑ／Ｄ２４２！Ｊ／Ｅ２１０ＱｐＡＨＬＲ２０９Ａ／Ｅ２１０Ａ／Ｄ９６Ｌｐ ＡＨＬＲ２０９Ａ／Ｅ２ＬＯＱ／Ｅ５６ＱｐＡＨＬＥ２１０Ｑ１０２４２Ｎ１０ ２５４ＮｐＡ）ＩＬＥ８７Ｑ／Ｅ２１０［１１０２４２Ｎを　するプラスミドの 　１１ プラスミドｐＡＨＬの線状化： をフェノール（トリス−ＨＣｌ　、ｐＨ７，５により平衡化）により抽出し、次 いで２容量の水冷９６％エタノールを加えることによって沈殿させた。遠心及び ベレットの乾燥の後、線状化ＤＮＡを５０μｌの［２０に溶かし、そしてその用 度をアガロースゲルに基づいて評価した。

突然変異誘発プライマー（・Ａ）： ５’　−ＣＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧＣＣＡＣＣＣＧＡＡＧＴＡＣＣＡＴＡＧ−３ ’Ｐｃｔ？ヘルパー１　（５Ｂ）： ５“−ＧＧＴＣＡＴＣＣＡ　ＧＴＣＡ　ＣＴＧ　ＡＧ　Ａ　ＣＣＣＴＣＴ　ＡＣ ＣＴＡ　ＴＴＡ　Ａ　Ａ　ＴＣＧＩＩ；Ｃ−３”に加え、次いで９５℃で２分、 ３７℃で２分及び７２℃で３分より成るす２分及び７２℃で３分より成るサイク ル２０周を実施した。この操作は突然変異誘発工程における段階３を構成する。

ら単離した。

ｐＡＩ（ＬΔＬ２６４−Ｌ２６９と命名し、そしてこれは改変したコドンを除き 、改質のために用いたプラスミドの名称及びプライマーを以下に列挙する。

プラスミド　プライマーＡの配列 ｐＡＨＬΔＮ２４７−０２５４　５　’　−ＴＡＧＧＴＧＣＧＣＡＧＧＧＡＴＣ ＧＧＡＡＴＧＴＴＡＧＧＣＴＧＧＴＴＧＣＣＧＣＣＧＧＴＧＧＣＡＴＣ−３゜ｐ ＡｌｌＬＥ２３９”　＋　Ｔ２４１”　＋　０２４２°　５°−ＡＴＴＧＣＣＧ ＣＣＧＧＴＧＧＣＧＣＣＴＡＴＣＴＴＣＡＣＧＡＴＡＴＣ−３’ ８：カセフト″′然゛によるリパーゼ゛　の　Ｉ：例６に記載した方法を利用し 、プラスミドρＡ）ＩＬ上のコード化配列を固有のＡｖｒ　１１及びＭｌｕ　１ 部位を含むように改質させた。Ａｖｒ　Ｉ［部位はコード化配列のＧ６８１をア デノシンに変えることによって作った。

河１ｕｒ部位はＣ７５９をＧに、そしてＡ７６２をＴに変えることにより作った 。新たなプラスミドをｐＡ）ＩＬ７と命名し、そしてこれはｐＡＨＬと同じリパ ーゼをコード化する。Ａｖｒ■−とＭｌｕ　Ｉ一部位との間に、以下の合成的に 作ったリンカ−を挿入した（形質転換体の容易なるスクリーニングのため、Ｌｅ ｕコドンをνａｌコドンに変え、そしてＳｃａ　ｒ一部位を欠失させである）： 生ずるプラスミドをｐＡ）ＩＬＬ２０６Ｖと命名し、そしてこれは塩基が変って いることを除いてｐＡＨＬと同じである。

９：カセ・　ト”然゛悸　を１　るその　のりバーゼパ　の例８に記載の通りカ セット突然変異誘発により作製したその他の突然変異体を以下に挙げる。適当な 突然変異誘発を導入するためにその他のリンカ−を用いた。

プラスミドの名称 ｐＡＨＬＬ２０６＾ ｐＡＨＬＦ２１１Ｖ ｐＡＩ（ＬＰ２１１＾ ｐＡＨＬＤＲ２０９／Ｅ２１０ ユΔ上ヨθＵ」木！ １０：ヒエミコー　−ヌギノーザ　リパーゼのＤ６２Ｃ＋　Ｅ８７Ｃ・するプラ スミドの　ｌ＋ プラスミドｐＡＨＬの線状化： 環状プラスミドｐＡ）ＩＬを以下の５０μｌの反応混合物：　５０ｍＭのＮａＣ １，１０ｍＭ（７）　）　’Ｊ　ス−ＨＣＩ　、ｐＨ７，９，１０ｍＭ（７）　 ＭｇＣ１１，１ｍＭのジチオスレイトール、１μｇのプラスミド及び２単位のｓ ｐｈ　Ｉの中で制限酵素Ｓｐｈ　ｒにより線状化した。消化は３７℃で２時間行 った。反応混合物をフェノール（トリス−１１ｃＩ　、ｐＨ７，５で平衡化）に より抽出し、そして２容量の氷冷９６％エタノールを加えることにより沈殿させ た。

遠心及びペレ７）の乾燥の後、この線状化ＤＮＡを５０μｌのＨ，Ｏに溶かし、 そして濃度をアガロースゲルで評価した。

３段階ＰＣＲ突然変異誘発： 図４に示す通り、３段階突然変異誘発は４種のプライマーの利用を含む： 突然変異誘発プライマー （＝Ａ）：　５’−ＡＴＴＣＣＣＧＡＴＣＣＡＧＴＴＡＣＡＴＡＴＧＧＡＡＣＧ ＡＧＡＧＣＣＡＣＧＧＡＡＧＣＴＴＡＧＧＡＣＧＡＴＣＡ　ＡＴＴＴＧＴＴＣＧ ＴＧＴＴＧＴＣＧＡＧＡＧＣＡ　ＡＧＧ　Ａ　Ａ　ＧＣＣＧＧＴＧＡ　ＣＡＣＡ 　ＧＣＣＣＡＣＴＣＣＡＧＡＧＴＣ〜３゛ ＰＣＲへ／Ｉｚバー１（−８）：　５’−ＧＧＴｃＡＴＣＣＡＧＴＣＡＣＴＧＡ ＧＡＣＣＣＴＣＴＡＣ，ＣＴＡＴＴＡＡＡ−ＴＣＧＧＣ−３’ ＰＣＲヘルパー２（・Ｃ）：５°−ＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＡＣＧＧＴＧＴＣＴ −３’ＰＣＲハンドル（工［］）：　５’−ＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＴＣＡＣＴＧ ＡＧＡＣ−３“リパーゼコード化領域中の２つのコドンを変えることとは別に、 プライマーＡにサイレント突然変異を導入してこの変化したコドンの間に旧ｎｄ −ｍ部位を作り上げた。

３段階全て、Ｌｏｗ）’Ｉのトリス−ＨＣｌ　、ｐＨ８，３，５０ｍＭのにＣ】 、１　、５ｍＭの−ｇｃ１．．０．００１％のゼラチン、０．２ｍＭのｄＡＴＰ 、０．２ｄのｄＣＴＰ、　０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０　、２ｍＭのＴＴＰ、２． ５単位のＴａｑポリメラーゼを含む緩衝液中で行った。

段階ｌにおいて、１０Ｑｐ＊ｏ＋のプライマーＡ　、ｌ００ｐ＊ｏｌのプライマ ーＢ及び１　ｆ＋ｗｏｌの線状化プラスミドを全部で１００μｍの反応混合物に 加え、次いで９５℃で２分、３７℃で２分及び７２℃で３分より成るサイクル１ ５周を実施した。

ＰＣＩｉ生成物の濃度はアガロースゲル上で評価した。次に段階２を行った。０ ．６ｐｍｏｌの段階１の生成物及び１　ｆｍｏｌの線状化プラスミドを全部で１ ００μｍの前記した緩衝液の中に含ませ、次いで９５℃で５　分、３７℃で２分 及び７２℃で１０分より成るサイクル１周を実施した。

段階２の反応混合物に１００１００ｐのプライマーＣ及び１００１００ｐのプラ イマーＤを加え（それぞれ１μｍ）、そして９５℃で２分、３７℃で２分及び７ ２℃で３分より成るサイクル２０］１を実施した。この操作は突然変異誘発工程 における段階３を構成する。

突然変異化制限フラグメントの単離： 段階３からの生成物をアガロースゲルより単離し、そして２０μｌのＨｚＯに再 溶解させた０次に、制限酵素Ｂａｗｌ　Ｉ及びＢｓｔＨにより、以下の組成：　 １００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｆｆｉＭのトリス−ＭＣＩ　、ｐＨ１，９，１０ｄ の門ｇＣｈ、１ｍＭの［ｌＴＴ、　１０単位のＢａｗｌ　Ｉ及び１０単位のＢｓ ｔＸＩにより全容量５０μｌにおいて消化した。インキュベーションは３７℃で ２時間とした。　７３３ｂｐのＢａｍＨＩ　／　ＢｓｔＸＩフラグメントをアガ ロースゲルから単離した。

発現ベクターｐＡＨＬへのリゲーンヨン：発現プラスミドｐＡ肛を前記した条件 のもとでＢａｍＨＩ及びＢｓｔＸＩにより切断し、そして大きなフラグメントを アガロースゲルから単離した。このベクターに、上記で単離した突然変異化フラ グメントをリゲートさせ、そしてこのリゲーション混合物をＥ、コリへの形質転 換のために用いた。このフラグメントの存在及び方向を、制限酵素による形質転 換体由来のプラスミド調製物の切断により確認した。

配列分析はＳａｎｇｅｒにより開発されたジ−デオキシ連鎖停止手順を利用して 二本鎖プラスミドに基づいて実施した。このプラスミドをｐＡＩ（ＬＤ６２Ｃ／ Ｅ８７Ｃと命名し、そしてこれは改変したコドンを除き、ｐＡＨＬと同一である 。

１１：ヒュミコラ　リパーゼのその　の゛　岑　するブラスミ上亘作ｌ 以下の突然変異体を例１０に記載と同じ方法を用いて作製したが、ただしＰｃｔ ？生成物及び突然変異フラグメントの再クローニングのために用いるベクターの 消化のために別の制限酵素を利用した。改質のために用いたプラスミドの名称及 びプライマーを以下に列挙する。

プラスミド　プライマーＡの配列 ＡＴＧＴＴＡＧ−３” １２：カセ、ト″＝然、−ニよるリパーゼ゛　Ｌ２０６Ｖ〕’Ｉ　：例３に記載 した方法を利用し、プラスミドｐＡＨＬ上のコード化配列を固有のＡｖｒ　［［ 及びＭｌｕ　Ｔ部位を含むように改質させた。、Ａｖｒ１１部位はコード化配列 のＧ６８１をアデノシンに変えることによって作った。

旧ｕＴ部位はＣ７５９をＧに、そしてＡ７６２をＴに変えることにより作った。

新たなプラスミドをｐＡＨＬ７と命名し、そしてこれはｐＡ）ＩＬと同じリパー ゼをコード化する。　ＡｖｒＩＩ−と）１１ｕ　Ｉ一部位との間に、以下の合成 的に作ったリンカ−を挿入した（形質転換体の容易なるスクリーニングのため、 ＬｅｕコドンをＶａｌコドンに変え、そしてＳｅａ　１一部位を欠失させである ）： 生ずるプラスミドをρＡＨＬＬ２０６Ｖと命名し、そしてこれは塩基が変ってい ることを除いてｐＡＨＬと同じである。

１３：カセット７然′・　様　を１　るその　のｉバーゼ′　の例３に記載の通 りカセント突然変異誘発により作製したその他の突然変異体を以下に挙げる。適 当な突然変異誘発を導入するためにその他のリンカ−を用いた。

プラスミドの名称 １）ＡＨＬＬ２０６Ｔ ｐＡＨＬＬ２０６ｓ ｐＡＨＬＬ２０６Ａ ρＡＨＬＬ２０６Ｇ ｐＡ）ＩＬＦ２１１．Ｌ ｐＡＨＬＦ２１１Ｔ ｐＡＨＬＰ２１１に １４：　な０然−の　ム本よるリパーゼ・　のに以下の突然変異体を、前記で作 製した突然変異体のプラスミドのフラグメントを組合せることによって作製した 。例えば、ｐＡＨＬＧ６１ｃ＋　Ｅ８７Ｇを、ｐＡＨＬＤ６２Ｃ＋　Ｅ８７Ｃ由 来の旧ｎｄｌｆｆ制限フラグメント　（作製のために用いたプライマーは２箇所 の突然変異の間に旧ｎｄｌｎ部位が導入されている）を単離し、次いでこのフラ グメントを旧ｎｄＩＩＩ（これも突然変異と共に導入されている）により消化し ておいたｐＡ）ｌＬＧ６１ｃ＋　Ｎ８８Ｃの中に挿入することにより作製した。

プラスミド ｐＡＨＬＤ６１Ｇ　＋　８７Ｃ ｐＡＨＬＬ２０６ｓ　＋　１２５５Ｔ　＋　Ｌ２５９Ｔ罰 アスペルギルス　オリザの形質転換（一般的手順）１００ｍｌのＹＰＤ　（Ｓｈ ｅｒｍａｎら著、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃ ｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８１）にＡ 、オリザの胞子を接種し、そして約２４時間振盪させながらインキュベートした 。菌糸をミラクロス（ｍｉｒａｃｌｏｔｈ）を介する濾過によって集め、そして ０．６ＭのＭｇ５０４２００ｍ　ｌで洗った。この菌糸を１．２ＭのＭｇ５Ｏｔ 、１０−ＭのＮａ）ＩｚＰＯｔ、ｐＫ”’５．８１５ｍ１に懸濁した。この懸濁 物を氷上で冷やし、そして１２０ｍｇのノポザイム（商標）２３４、バッチ番号 １６８７を含む緩衝液工■ｌを加えた。５分後、１２ａ＋ｇ／ｍｌのＢＳＡ　（ ＳｉｇｍａタイプＨ２５）　１ｍｌを加え、そして顕！鏡のもとでサンプル中に 大量のプロトプラストが識別されるようになるまで、ゆっくり撹拌しながら３７ ℃で１．５〜２．５時閉インキュベーションした。

この懸濁物をミラクロスで濾過し、この濾液を滅菌チューブに移し入れ、そして ０．６Ｍのソルビトール、１０ｋＭのトリス−１１ｃＩ　、ｐＨ＝　７．０５　 ｍｌをその上に載せた。１０００　ｇで１５分間の遠心を行い、そしてＭｇ５Ｏ ，クッションの上からプロトプラストを集める。２容量の５ＴＣ（１，，２Ｍの ソルヒ゛ト−／し、！０１のトリス−）１ｃＩ　、ＰＨ＝１．５．１０ｕ門のＣ ａＣ１ｚ）をこのプロトプラスト懸濁物吻に加え、そしてこの混合物を１０００ 　ｇで５分間遠心した。このプロトプラストのペレットを３１のＳＴＣに再懸濁 し、そして再ベレフト化した。これを繰り返した。最後に、このプロトプラスト を０．２−１ｍ１のＳＴＣに再！Ａ濁させた。

１００ンのプロトプラスト懸濁物を１０．ｃＩｌＯ５ＴＣ中の５−２５μｇのｐ ３ｓＲ２（Ｈｙｎｅｓら著、Ｍａｌａｎｄ　Ｃｅ１．Ｂｉｏｌ、、第３巻、第８ 号、１４３０−１４３９、１９８３年８月に詳細されているＡ、ニドウランスａ ｓ＋ｄｓ遺伝子保有プラスミドと混ぜた。この混合物を室温で２５分放置した。

６０％のＰＥＩＩ；　４０００　（８Ｄ）ｌ　２９５７６）、１０＋ｓ］のＣａ Ｃ］　ｚ及び１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　、ｐＨ＝７．５　０．２ｍｌを加え、 そして慎重に混合しく２回）、次いで最後に０．８５ｍ１の同し溶液を加え、そ して慎重に混合した。この混合物を室温で２５分放１し、２，５００ｇで１５分 遠心し、そしてこのベレットを１．２Ｍのソルビトール２纏ｌの中に再９．濁さ せた。更にもう一回の沈降化の後、このプロトプラストを、１．０Ｍのスクロー ス、ｐｉ（＝　７．０、窒素源としての１０１のアセトアミド及び２０１のＣｓ Ｃ１を含む最少プレート（Ｃｏｖｅ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ、Ｂｉｏｐｈｓ、Ａｃｔ ａ　１１３　（１９６６）　５ｌ−５６）上においてバックグランド増殖を阻止 した。３７℃で４〜７日間のインキユベーションの後、胞子を採取し、滅菌水に 懸濁し、そして単一のコロニーについてまいた。この手順を操り返し、そして２ 回目の単離化の後の単一コロニーの胞子を定義の形質転換体として保存した。

進 Ａ、オリザにおけるリパーゼ−Ｄ９６ＬのｐＡ）ＩＬＤ９６Ｌを人、オリザＩＦ Ｏ４１７７の中に、例１５に記載の人、三上つランス由来のａｓｄｓ遺伝子を含 むｐ３ＳＲ２とその同時形質転換によって形質転換させた。上記の通りに調製し たプロトプラストを等容量のｐＡ）ｌＬＤ９６Ｌ及びｐ３ＳＲ２の混合物とイン キュベートし、ここでそれぞれ約５μｇを用いた。アセトアミドを唯一の窒素源 として利用することのできる９つの形質転換体を２回再単離した。ＹＰＤ上で３ 日間増殖させた後、例１６に記載のリパーゼ活性についてアッセイ　（本発明の リパーゼ変異体の精製）を利用して培養上清液をアッセイした。

更なる試験のために最も優れた形質転換体を選び、そして１１の振盪フラスコの 中で、２０抛１のＦＧ４培地（３％のダイズ肉、３％のマルトデキストリン、１ ％のペプトン、４ＭのＮａＯＨでｐＨを７．０に調整）において３０℃で４日間 増殖させた。このような条件のもとで、この形質転換体は培養！！！７ｔ１ｍｌ 当り約５００リパーゼ単位を示した。

その他のリパーゼ変異体は例１５に記載の一般的な手順を利用して、本質的に前 記の通りに作った。

罰 腎のリパーゼ′・　の　１ リパーゼ活性についてのアッセイ： リパーゼにとっての基質は乳化剤としてアラビアゴムを用いてグリセリントリブ チラット（ＭＥＲＣＫ）を乳化することにより調製した。

リパーゼ活性はｐｌスタット法を用いてｐ１１７でアッセイした。１分間に１マ イクロモルの脂肪酸を遊離させるのに必要な量として１単位のリパーゼ活性（Ｌ Ｕ／ｍｇ）を定義した。段階１ニ一発酵上清液を遠心し、沈渣を廃棄する。この 上清液のｐＨを７に合わせ、そして等容量の冷９６％エタノールをゆっくり加え る。水浴の中でこの混合物を３０分間放置する。遠心し、次いで沈渣を廃棄する 。

段階２ニーイオン交換クロマトグラフイー。この上滑液を濾過し、そして５０ｍ Ｍのトリス−酢酸塩緩衝液ｐＨ７により平衡にしたＤＥＡＥ−ファストフロ−（ Ｐｈａｒｓａｃｉａ　ＴＭ）カラム上に適用する。　２８０ｎｍでの吸光度が０ ．０５のＯＤを下廻るまで同じ緩衝液でこのカラムを洗う。結合した酵素活性を 同し緩衝液中の線状塩勾配（Ｏ〜０．５ＭのＮａＣｌ）により、５倍のカラム容 量を利用して溶離させる。酵素活性を含む画分をプールする。

段階３ニー疎水性クロマトグラフイー、固形酢酸アンモニウムを加えることによ り、酵素活性を含むプールのモル濃度を０．８Ｍに合わせる。この酵素を０．８ Ｍの酢酸アンモニウムで予備平衡化させたＴＳＫゲル　ブチル−トヨバール６５ ００カラム（東ソー（株）、日本より入手可）に適用する。結合している物質を ０．８Ｍの酢酸アンモニウムで洗い、そして蒸留水によって結合物質を溶離させ る。

段階４：リパーゼ活性を含むプールを水で希釈して導電率を２ｍＳ、そしてｐＨ を７に合わせる。このプールを５０＋ｉＭのトリス−酢酸緩衝液ｐＨ７により予 備平衡化した高性能Ｑセファロース（ファルマシア）カラムに適用する。ｖＡ状 基塩勾配より結合酵素を溶離させる。

勇」 本発明のリパーゼ変異体の洗浄性能 本発明のヒニミコラ　ラヌギノーザ　リパーゼ変異体の洗浄性能を、野生型ｆ１ ．ｉ困玉ムニ丈　リパーゼと比較して、０Ｄｚｓ。に従って、リフドル当りのタ ンパク質のｍｇにおける酵素投入量に基づいて評価した。

洗浄試験は恒温湯浴の中に置いた１５０ｍ１のビーカーの中で実施した。このビ ーカーを三角形マグネット棒により撹拌した。

実験条件は以下の通りである； 方　法：３サイクル；各サイクルの間に一夜乾燥が伴う洗浄液：ビーカーにつき １００１ スワフチ（見本）：ビーカーにつき６枚のスワンチ（３，５Ｘ　３．５ｃｍ）布 　帛：綿１００％、試験用布帛スタイル＃４００よごれニス−ダンレッドで着色 したラード（０，７５ｍｇの染料／ラードのｇ）、７０℃に熱したラード６μｍ を各スワフチの中心に適用した。よごれを適用した後、このスワソチをオーブン の中で７５℃で３０分間熱した。次のこのスワフチを一回目の洗浄の前に室温で 一夜保存した。

洗浄剤：　ＬＡＳ（Ｎａｎｓａ　１１６９／　Ｐ、　３０％　ａ、ｍ、）　１． １７ｇ　／　ＩＡＥＯ（Ｄｏｂａｎｏｌ　２５　７　）　、０．１５ｇ　／　１ 三リン酸ナトリウム　１．２５　ｇ　／　Ｒ硫酸ナトリウム　１゜００ｇ／ｌ 炭酸ナトリウム　０．４５　ｇ　／　１珪酸ナトリウム　０．１５ｇ／ｊ！ ｐＨ：　１０．２ リパーゼの濃度：リソトル当り０．０７５．０．１８Ｂ、　０．３７５．０．７ ５及び２．５−ｇのリパーゼタンパク質 時　間＝２０分 温度：３０℃ すすぎ：流水道水中で１５分 乾　燥二室温で一夜（冬２０℃、　３０−５０％のＲＨ）評　価＝３回の洗浄の 後、４６０ｎａでの反射率を測定。

結果 リパーゼ変異体と天然且、−孟ｌ二Ｆ／二二匹　リパーゼについての投入量一応 答曲線を比較した。投入量一応答曲線は測定データーを以下の弐に入れることに よって計算した：（式中、ΔＲは反射率の単位で表わす効果Ｃは酵素濃度（ｍｇ ／Ｉり ΔＲｓａ、は最大の効果を表わす定数 には定数、Ｋｍは最大効果の半分が得られるときの酵素濃度を表わす）。

各リパーゼ変異体よ野生型リパーゼに関して見い出される特有の定数ΔＲｓａ、 及びＫに基づき、改良系数が計算される。この改良系数は ｆ　＋−，ｒ−ｖ−＝　ＣＩ−Ｔ／　Ｃ（Ｉ［）として定義し、これは対照の野 生型タンパク質０．２５＋＊ｇ／　ｌにより得られる効果と同等のそれを得るた めに必要なリパーゼ変異体のタンパク質量を表わしている（Ｃｗｔ）。

従って、改良系数を計算する手順は以下の通りである：１〕弐（Ｉ）によって０ ．２５ｍｇ／ｆでの野生型タンパク質の効果（ΔＲｗｉＬｄ−ＬｒｐＨ）を計算 し；２　）　０．２５＋ｗｇ／　ｌでの野生型と同等の効果をもたらすリパーゼ 変異体の濃度を以下の式より計算し； ３）式■により改良系数を計算する。

この結果を以下の表１に示す。

表　１ １１２０９Ａ＋Ｅ２１０Ａ　１．　９ Ｒ２０９Ａ＋Ｅ２１ＯＡ＋Ｄ９６Ｌ　２．８Ｅ２１０Ｑ　＋Ｄ２４２Ｎ　＋Ｄ２ ５４Ｎ　１　、８Ｒ２０９Ａ＋Ｅ２１０Ａ＋Ｄ９６Ｌ＋Ｅ５６Ｑ　１．５表１か ら、リパーゼ変異体Ｒ２０９Ａ＋Ｅ２１０Ａ、Ｅ５６ｔｌｌ及びＤ９６Ｌは野生 型リパーゼよりかなり優れた洗浄性能を有することが認められる。

これはおそらく、洗浄中の高められた吸収性及びその結果として乾燥期間中のよ り高い活性をもたらす、これらの変異体の低められた負の電荷及び高められた疎 水性に起因するであろう。リパーゼ変異体Ｅ８７Ａ、　ＤＩＩＩＮ及びＲ２０９ Ａの性能は野生型酵素のそれと同程度であった。

撚■ リパーゼ・　の１め゛れた鵠 一比一＝Ｌ乙ヱノニ二士　リパーゼの特定の変異体の熱安定性を示差走査熱量計 （ＤＳＣ）により調べた。この技術を利用して、熱変性温度Ｔｄを、この酵素溶 液を定常にプログラムされた速度（レート）によって決定した。

スー並二 Ｍｉｃｒｏｃａ１社の示差走査熱量計ＭＣ−２０を試験のために用いた。その中 の５０ｄの緩衝溶液は、以下のｐＨ値で調製した＝４　（酢酸塩）、７（トリス −酢酸塩）、１０（グリシン）、酵素濃度は０．６〜０．９　Ｍｇ／−１の範囲 とし、そして各実験に関して約１．２１の全容量を利用した。

全てのサンプルを９０℃／ｈｒのスキャン速度で５℃から９５℃にまで熱した。

桔−」（二 野生型と特定の突然変異体の結果を以下の表に示す。

注：　ｄＴＤは突然変異の結果としての熱安定性における変化を表わす。

源 パに番　Ｈｏ−ヌギノーザ　１パーゼ　の立 いくつかの変異体を以下の組成を有する標品液状洗浄剤において試験した： ％ｗ　／　ｗ 陰イオン　ＬＡＳ　１０ ＡＳ　１ 石けん　１４ 非イオン　ＡＥＯ１３ 溶剤　１，２−プロパンジオール　３ エタノール　５ 緩衝剤　ＴＥＡ　６ ビルグー　クエン酸ナトリウム　１ 中和剤　ＮａＯＨ２ 安定剤、他　ＳＸＳ　Ｉ Ｃａ　”　”　０　、００２５ ホスフオネート　０．４ Ｎａ＊ＳＯｅ　Ｏ，２ 水　１００％まで ｐＨ８又は１０ １ｇの洗浄剤当り１００ＯＬυを加え、そしていくつかのサンプルには０．０２ ５ＡＵ／　ｇ　（Ａｌｃａｌａｓｅ　Ｃ商標〕）を加えた。サンプルを以下の条 件に従って保存した（それぞれ三重測定）：保存温度ニー１８℃　３０℃ 洗浄剤 ｐＨ８、プロテアーゼ無し　２及び７日　２及び７日ｐＨ８，０，０２５ＡＵ／ 　ｇ　’　２日ｐＨｌＯ、フ゛ロチアーゼ無し　７日　７日このインキュベーシ ョンの後、このサンプルをＬＵ−法（ノボ　ノルディスクＡＰ　９５．５）に従 って分析した。

リパーゼ活性の衰退が一次反応に従うと仮定すると、この衰退の速度定数が決定 することができる： Ａ　（ｔ）　＝Ａｏ’″ｅｘｐ（−ｋ　”　ｔ　）Ａ　（ｔ）はｔ時での酵素活 性、Ａｏは初期活性、そしてｋは一次速度定数である。

７’Ｏテアーゼを含む洗浄剤に関して、タンパク質分解についテノ速度定数は、 Ａ　（ｔ）＝Ａ、”ｅｘｐ（−Ｃｋ＋に、）”ｔ）（式中、ｋ、はタンパク質分 解の速度定数であり、そしてｋはプロテアーゼを含まない洗浄剤において決定さ れた安定性データーがら計算される）より計算することができる。

各実験の中には対照として野生型且、−之２二Ｌｌ二＝製　リパーゼを含ませて おり、そして変異体と野生型との比較は実験間での不明確な変動を小さくするた めにこの実験において行ったにすぎない。

以下の結果が得られ、そして野生型に対する変異体の相対的改良を ＩＦ、＝に、ｔ／ｋ。

（式中、ＩＰは改良系数を表わし、ｋｉｌ＆は野生型の衰退の速度定数（一定条 件での）であり、そしてに８は同じ実験における問題の変異体の相当の速度定数 である）として示される。

ＩＦは半減期の相対的改良を表わす（ＩＰ、＝２は変異体Ｘの半減期が同じ実験 において野生型のそれの２倍長いことを示す）。

実験における繰り返しの変動の評価に基づき、ＩＰ＜０．７又はＩＦ＞１．３は 有意であると考える。ｋの単位は（日）−１である。

Ｅ５６Ｑ　３　０．０１　０．２２　２．２　０．１４　１．４Ｒ２０９Ａ／Ｅ ２１０Ａ／Ｄ９６Ｌ　７　０．０２　０．３６　１．４　０．１０　２．３Ｅ２ １０Ｑ１０２４２Ｎ／Ｄ２５４Ｎ　７　０．０２　０．４９　１．Ｏｎ、ｄ。

Ｆ２１１Ｌ　６　０．０２　０．４１　０．８　０．０８　１．ｌＦ２１１Ｔ　 ８　０．０２　１．４　０．４　０．０６１．５Ｆ２１１Ａ　８　０．０１　０ ．５８　０．９　０．０２　３．ｌＦ２１１１　８　０．０２　１．４　０．４ 　０．０８１．２０ｐＨ８での洗浄剤中のｋは全てのケースにおいて低く、従っ て短い保存期間に原因しく７日、約９０％の残留活性）これを非常に正確に決定 することができなかった。従ってＩＰは計算していない。

以上より、試験した数多くの変異体はタンパク質分解に対する改良された耐性を 有し、そしてこれらのほとんどがアルカリ土類金属する改良された耐性を有して いた。

ｌ 比活性 リパーゼ変異体に関して、野生型（ｗｔ）よりも高い比活性（単位量当り、単位 時間にて分解される基質分子の量）が以下に示すように測定された。このことは 、これらのリパーゼが実質の基質を加水分解する優れた性能を有することを意味 する。

このリパーゼは同じ方法で増殖且つ精製しである。精製したリパーゼを標準のＬ Ｕアフセイで試験したく分析法、内部ノボ　ノルディスクＡＦ　９５／　６−Ｇ Ｂ　１９９１．０２．０７）、このサンプルを２回分析し、そしてその平均値を 一覧表にした。タンパク質の量は波長２ＢＯｎ−を用い、島津の分光光度計によ る光学密度によって評価した。このサンプルは、０Ｄ２６０により割った００２ ８０の比の値が１．６より大きいとき、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳 動の単一バンドとともに純粋であると考えられる。

３−回の試験のみ 配列表 （１）一般情報 （ｉ＞出願人　：ノボ　ノルディスク　Ａ／Ｓ（ｉｉ　）発明の名称：リパーゼ 変異体（山）配列の数　＝２ （ｉｖ　）関連住所： （Ａ）宛　先　：ノボ　ノルディスク　Ａ／５（Ｂ）通　リ　：ノボ　アレ （Ｃ）市　：バグスバード （Ｄ）国　：デンマーク （Ｅ）郵便番号：　２８８０ （ｖ）コンピューターの読み取り方式：（Ａ）媒体のタイプ　：フロッピーディ スク（Ｂ）コンピューター：　ＩＢＮ　ＰＣコンパチブル（Ｃ）作動システム　 ：　ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ　−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェアー：パテントイン　リリ ース＃１．０　、バージョン６１．２５ （ｖｌ）現出願のデーター： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日　： （Ｃ）分類： （ｖｉ）先の出願のデーター： （Ａ）出願番号：　ＤＫ　２１９６／９０（Ｂ）出願日　：　１９９０年９月Ｉ ３日（ｖｊ）先の出願のデータｍ： （Ａ）出願番号：　ＤＫ　２１９４／９０（Ｂ）出願日　７１９９０年９月１３ 日（ｖｉ　）先の出願のデータｍ： （Ａ、　）出願番号：　ＤＫ　２１９５／９０（Ｂ）出願日　：　１９９０年９ 月１３日（ｖｉ）代理人／代理店の情報： （Ａ）名　称：サルソエーマドセン、バージント（Ｃ）参照／事件番号７３５２ ０．２０４−　Ｎｏ（ＩＸ）通信情報： （Ａ）電話　：　＋４５４４４４８８８８（Ｂ）テレファックス：　＋４５４４ ４！１１３２５６（Ｃ）テレックス　：　３７３０４ （２）配列Ｎｏ：ｌに関する情報 （１）配列の特徴 （Ａ）長　さ　＝９１８塩基対 （Ｂ）種類　：核酸 ＜Ｃ＞鎖　ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：＆Ｉ　状 （ｉｉ　）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｖｉ　）起源： （Ａ＞生　物：ヒュミコラ　ラヌギノーザ（：ｘ　）特＠： （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）位置　：　１．．８７３ （ｘＨ配列の詳細：配列ＮＯ：ｌ： （２）配列ＮＯ：２に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長　さ　：２９１アミノ酸 （Ｂ）種　頻　二アミノ酸 （Ｄ）　トポロジー二線　状 （ｉｉ　）分子の型コタンパク質 （ｘｉ）配列の詳細：配列ＮＯ：２： Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　ｌｉｅ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　 Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｓｐ日９．１ａ Ｆｉｇ、１ｂ 重　３段階ＰＣＲ併合突然変異 十　制“限酵素による切断、フラグメントの単離す　発現プラスミドへの再クロ ーン化 Ｆｉｇ、　３ ＴＥＰ３ Ｆｉｇ、４ Ｆｉｇ、　５ 情止量（／Ｊ翻訳又促山量 （特許法第１８４条の８） 平成５年３月　１１日

Claims (66)

【特許請求の範囲】
1. １．親リパーゼのリパーゼ変異体であって、このリパーゼ分子の主として疎水性 である長い結合性ポケットに位置する活性セリンを含むトリプシン様触媒三つ組 残基を含んで成り、ここで基質との相互作用に、又は加水分解に参入しうる残基 でありうる、活性セリン残基を含むこのリパーゼ構造部分に位置する残基を含ん で成る脂質接触帯の瀞電荷及び／又は疎水性が、１もしくは複数の負に荷電して いるアミノ酸残基を欠失させるか、又は中性もしくは正に荷電しているアミノ酸 残基によって置換させることにより；及び／あるいは１もしくは複数の中性アミ ノ酸残基を正に荷電しているアミノ酸残基によって置換させることにより；及び ／あるいは１もしくは複数の親水性アミノ酸残基を欠失させるか、又は疎水性ア ミノ酸残基によって置換させるかにより変えられている、リパーゼ変異体。
2. ２．前記脂質接触帯の１又は複数のグルタミン酸、アスパラギン酸残基が、グル タミン、アスパラギン、アラニン、ロイシン、バリン、セリン、スレオニン、リ ジン又はアルギニンによって置換されている、請求項１に記載のリパーゼ変異体 。
3. ３．親リパーゼが微生物リパーゼである、請求項１又は２に記載のリパーゼ変異 体。
4. ４．親リパーゼが菌類リパーゼである、請求項３に記載のリパーゼ変異体。
5. ５．親リパーゼがヒュミコラ属又はリゾムコール属の株に由来する、請求項４に 記載のリパーゼ変異体。
6. ６．親利パーゼがリゾムコールミーヘイリパーゼである、請求項５に記載のリパ ーゼ変異体。
7. ７．１又は複数のアミノ酸残基が以下の通り：Ｄ９１Ｎ，Ｋ，Ｒ，Ａ，Ｖ，Ｌ， Ｓ，Ｔ；Ｄ２５６Ｎ，Ｋ，Ｒ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｓ，Ｔ；Ｄ２２６Ｎ，Ｋ，Ｒ，Ａ， Ｖ，Ｌ，Ｓ，Ｔ；Ｄ６１Ｎ，Ｋ，Ｒ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｓ，Ｔ；Ｄ１１３Ｎ，Ｋ，Ｒ ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｓ，Ｔ；Ｅ２０１Ｑ，Ｋ，Ｒ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｓ，Ｔ；Ｄ２４３Ｎ ，Ｋ，Ｒ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｓ，Ｔに置換されている、請求項６に記載のリパーゼ変 異体。
8. ８．親リパーゼがヒュミコララヌギノーザリパーゼである、請求項５に記載のリ パーゼ変異体。
9. ９．１又は複数のアミノ酸残基が以下の通り；Ｅ８７Ｑ，Ｋ，Ｒ，Ａ，Ｎ，Ｔ， Ｓ，Ｌ，Ｖ；Ｄ２５４Ｎ，Ｋ，Ｒ，Ａ，Ｑ，Ｔ，Ｓ，Ｌ，Ｖ；Ｄ２４２Ｎ，Ｋ， Ｒ，Ａ，Ｑ，Ｔ，Ｓ，Ｌ，Ｖ；Ｅ２１０Ｑ，Ｋ，Ｒ，Ａ，Ｎ，Ｔ，Ｓ，Ｌ，Ｖ； Ｅ５６Ｑ，Ｋ，Ｒ，Ａ，Ｎ，Ｔ，Ｓ，Ｌ，Ｖ；Ｄ９６Ｎ，Ｋ，Ｒ，Ａ，Ｑ，Ｔ， Ｓ，Ｌ，Ｖ；Ｄ１１１Ｎ，Ｋ，Ｒ，Ａ，Ｑ，Ｔ，Ｓ，Ｌ，Ｖ；Ｄ６２Ａ，Ｑ，Ｎ ，Ｔ，Ｓ，Ｋ，Ｒ，Ｌ，Ｖ；Ｅ２１９Ａ，Ｑ，Ｎ，Ｔ，Ｓ，Ｋ，Ｒ，Ｌ，Ｖ；Ｅ ２３４Ａ，Ｑ，Ｎ，Ｔ，Ｓ，Ｋ，Ｒ，Ｌ，Ｖ；Ｅ５７Ａ，Ｑ，Ｎ，Ｔ，Ｓ，Ｋ， Ｒ，Ｌ，Ｖ；Ｅ９９Ａ，Ｑ，Ｎ，Ｔ，Ｓ，Ｋ，Ｒ，Ｌ，Ｖ；Ｄ２７Ａ，Ｑ，Ｎ， Ｔ，Ｓ，Ｋ，Ｒ，Ｌ，Ｖ；又はＥ２３９Ａ，Ｑ，Ｎ，Ｔ，Ｓ，Ｋ，Ｒ，Ｌ，Ｖに 置換されている、請求項８に記載のリパーゼ変異体。
10. １０．１又は複数のアミノ酸残基が以下の通り；Ｅ８７Ｑ＋Ｄ２５４Ｎ＋Ｄ２４ ２Ｎ＋Ｅ２１０Ｑ；Ｅ８７Ｑ＋Ｄ２５４Ｎ＋Ｅ２１０Ｑ； Ｄ９６Ｎ＋Ｅ８７Ｑ＋Ｄ２５４Ｎ； Ｒ２０９Ａ＋Ｅ２１０Ａ に置換されている、請求項９に記載のリパーゼ変異体。
11. １１．１又は複数のアミノ酸残基が以下の通り；Ｔ２６７Ｋ，Ｒ； Ｓ８５Ｋ，Ｒ； Ｔ２２６Ｋ，Ｒ； Ｎ８８Ｋ，Ｒ； Ｎ９２Ｋ，Ｒ； Ｉ２５５Ｋ，Ｒ； Ｉ２０２Ｋ，Ｒ； Ｌ２０６Ｋ，Ｒ； Ｌ２５９Ｋ，Ｒ； Ｖ２０３Ｋ，Ｒ；又は Ｌ２２７Ｋ，Ｒ に置換されている、請求項８に記載のリパーゼ変異体。
12. １２．親リパーゼが酵母のリパーゼである、請求項４に記載のリパーゼ変異体。
13. １３．親リパーゼがキャンディダ属の株に由来する、請求項１２に記載のリパー ゼ変異体。
14. １４．親リパーゼが細菌のリパーゼである、請求項３に記載のリパーゼ変異体。
15. １５．親リパーゼがシェードモナス属の株に由来する、請求項１４に記載のリパ ーゼ変異体。
16. １６．リパーゼ変異体であって、リパーゼ分子の主として疎水性である長い結合 性ポケットに位置すの活性セリンを含むトリプシン様三つ組残基を含んで成り、 基質との相互作用に又は加水分解に参入する残基である、活性セリン残基を含む リパーゼ構造部分に位置する残基を含んで成る脂質接触帯の配列を構成する１又 は複数のアミノ酸残基の位置での、前記脂質接触帯の表層コンホメーションが変 化するような１又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入によって特徴付け られるリパーゼ変異体。
17. １７．１又は複数のアミノ酸残基が１又は複数のその他のかさ高さの低いアミノ 酸残基によって置換されている、請求項１６に記載のリパーゼ変異体。
18. １８．１又は複数のアミノ酸残基がバリン、スレオニン、セリン、グリシン又は アラニンによって置換されている、請求項１７に記載のリパーゼ変異体。
19. １９．脂質接触帯におけるループ配列を形成せしめる１又は複数のアミノ酸残基 が欠失されている請求項１６に記載のリパーゼ変異体。
20. ２０．２〜８、特に２〜６のアミノ酸残基が、脂質接触帯における１又は複数の ループ配列から欠失されていの、請求項１９に記載のリパーゼ変異体。
21. ２１．親リパーゼが微生物のリパーゼである、請求項１６〜２０のいづれか１項 に記載のリパーゼ変異体。
22. ２２．親リパーゼが菌類のリパーゼである、請求項２１に記載のリパーゼ変異体 。
23. ２３．親リパーゼがヒユみコラ属又はリゾムコール属の株に由来する、請求項２ ２に記載のリパーゼ変異体。
24. ２４．親リパーゼがリゾムコールミーヘイリパーゼである、請求項２３に記載の リパーゼ変異体。
25. ２５．１又は複数のアミノ酸残基が以下の通り；Ｉ２０４Ｖ，Ａ，Ｔ，Ｓ，Ｇ； Ｌ２０８Ｖ，Ａ，Ｔ，Ｓ，Ｇ； Ｆ２１３Ｖ，Ａ，Ｔ，Ｓ，Ｇ；又は Ｉ２５４Ｖ，Ａ，Ｔ，Ｓ，Ｇ に置換されている、請求項２４に記載のリパーゼ変異体。
26. ２６．１又は複数のアミノ酸残基が１又は複数の以下の位置：８２−１１３，２ １１−２１５，２３５−２４３，２４５−２６９又は２６４−２６９にて欠失し ている、請求項２４に記載のリパーゼ変異体。
27. ２７．以下の通り； Ｎ２６４＊＋Ｔ２６５＊＋Ｇ２６６＊＋Ｌ２６７＊＋Ｃ２６８＊＋Ｔ２６９＊＋ Ｃ２２Ｔに改質されている、請求項２６に記載のリパーゼ変異体。
28. ２８．以下のアミノ酸残基■： Ｆ２１３＊＋Ｆ２１５＊； Ｄ２３８＊＋Ｌ２３９＊＋Ｅ２４０＊＋０２４３＊；又はＦ２５１＊＋Ｔ２５２ ＊＋Ｓ２４７＊ している、請求項２６に記載のリパーゼ変異体。
29. ２９．親リパーゼがヒュミコララヌギノーザリパーゼである、請求項２３に記載 のリパーゼ変異体。
30. ３０．１又は複数のアミノ酸残基が以下の通り；Ｉ２０２Ｖ，Ａ，Ｔ，Ｓ，Ｇ； Ｌ２０６Ｖ，Ａ，Ｔ，Ｓ，Ｇ； Ｆ２１１Ｖ，Ａ，Ｔ，Ｓ，Ｇ，Ｉ；又はＩ２５５Ｖ，Ａ，Ｔ，Ｓ，Ｇ に置換されている、請求項２９に記載のリパーゼ変異体。
31. ３１．１又は複数のアミノ酸残基が１又は複数の以下の位置：８４−１１２，２ ０９−２１３，２３８−２４５，２４７−２５４又は２６４−２６９にて欠失し ている、請求項２９に記載のリパーゼ変異体。
32. ３２．以下の通り； Ｌ２６４＊＋Ｉ２６５＊＋Ｇ２６６＊＋Ｔ２６７＊＋Ｃ２６８＊＋Ｌ２６９＊＋ Ｃ２２７に改質されている、請求項３１に記載のリパーゼ変異体。
33. ３３．以下のアミノ酸残基■： Ｒ２０９＊＋Ｆ２１０＊； Ｆ２１１＊＋Ｙ２１３＊； Ｄ２４２＊＋Ｅ２３９＊＋Ｉ２４１＊；又はＮ２４７＊＋Ｄ２５＊ していの、請求項３１に記載のリパーゼ変異体。
34. ３４．親リパーゼが酵母リパーゼである、請求項２１に記載のリパーゼ変異体。
35. ３５．親リパーゼがキャンディダ属の株に由来する、請求項３４に記載のリパー ゼ変異体。
36. ３６．親リパーゼが細菌リパーゼである、請求項２１に記載のリパーゼ変異体。
37. ３７．親リパーゼがシュードモナス属の株に由来すの、請求項３６に記載のリパ ーゼ変異体。
38. ３８．以下のタイプのリパーゼ変異体、（ｉ）リパーゼ分子の主として疎水性で ある長い結合性ポケットに位置する活性セリンを含むトリプシン様触媒三つ組残 基、及び（ｉｉ）このリパーゼが不活性状態にあるときはこの活性セリンを覆い 、そしてこのリパーゼが活性化されているときは脂質基質に対してこの活性セリ ンが接近し易くなるようにそのコンホメーションが変化するような表層ループ構 造を含んで成り、このループ構造はこの結合性ポケットに面した主として疎水性 である内面及び主として親水性である外面を有しており、前記リパーゼ変異体は 、この表層ループ構造の移動又は基質との相互作用もしくは加水分解のいづれか に参入する残基である、このループ構造の配列を構成する及び／又はこの活性セ リン残基を含むリパーゼ構造部分に位置する残基を含んで成る脂質接触帯の配列 を構成する、１又は複数のアミノ酸の位置での１又は複数のアミノ酸の置換、欠 失又は挿入によって特徴付けられるリパーゼ変異体。
39. ３９．ループ構造の少なくとも１個のアミノ酸残基がシステインによって置換さ れており、そしてここで少なくとも別の１個のアミノ酸残基がシステインによっ て置換されており、この２個のシステイン残基がジスルフィド結合を互いに形成 できるように位置している、請求項３８に記載のリパーゼ変異体。
40. ４０．親リパーゼが微生物のリパーゼである、請求項３８又は３９に記載のリパ ーゼ変異体。
41. ４１．親リパーゼが菌類のリパーゼである、請求項３８〜４０のいづれか１項に 記載のリパーゼ変異体。
42. ４２．親リパーゼがヒュミコラ属又はリゾムコール属の株に由来する、請求項４ １に記載のリパーゼ変異体。
43. ４３．親利パーゼがリゾムコールミーヘイリパーゼである、請求項４２に記載の リパーゼ変異体。
44. ４４．１又は複数のアミノ酸残基が以下の通り；Ｓ１１４Ｃ＋Ａ９０Ｃ； Ｒ８６Ｃ＋Ｄ６１Ｃ； Ｓ８４Ｃ＋Ｄ６１Ｃ； Ｎ８７Ｃ＋Ｄ６１Ｃ； Ｙ６０Ｃ＋Ｒ７８Ｃ；又は Ｙ６０Ｃ＋Ｎ８７Ｃ に置換されている、請求項４３に記載のリパーゼ変異体。
45. ４５．１又は複数のアミノ酸残基が以下の通り；Ｉ２０４Ｖ，Ｔ，Ｓ，Ａ，Ｇ； Ｌ２０８Ｖ，Ｔ０，Ｓ，Ａ，Ｇ； Ｖ２５４Ｖ，Ｔ，Ｓ，Ａ，Ｇ； Ｌ２５５Ｖ，Ｔ，Ｓ，Ａ，Ｇ； Ｌ２５８Ｖ，Ｔ，Ｓ，Ａ，Ｇ； Ｌ２６７Ｖ，Ｔ，Ｓ，Ａ，Ｇ； Ｆ９４Ｌ，Ｔ，Ｋ；又は Ｆ２１３Ｌ，Ｔ，Ｋ に置換されている、請求項４３に記載のリパーゼ変異体。
46. ４６．以下のアミノ酸置換： Ｉ２０４Ｔ＋Ｌ２５５Ｔ＋Ｌ２６７Ｔ；又はＬ２０８Ｔ＋Ｖ２５４Ｔ＋Ｌ２５８ Ｔ を含んで成る、請求項４３に記載のリパーゼ変異体。
47. ４７．親リパーゼがヒュミコララヌギノーザリパーゼである、請求項４２に記載 のリパーゼ変異体。
48. ４８．１又は複数のアミノ酸残基が以下の通り；Ｇ６１Ｃ＋Ｎ８８Ｃ； Ｇ６１Ｃ＋Ｅ８７Ｃ； Ｄ６２Ｃ＋Ｅ８７Ｃ； Ｄ６２Ｃ＋Ｓ８５Ｃ； Ｄ６２Ｃ＋Ｎ８８Ｃ；又は Ｓ１１６Ｃ＋Ｇ９１Ｃ に置換されている、請求項４７に記載のリパーゼ変異体。
49. ４９．１又は複数のアミノ酸残基が以下の通り；Ｌ９３Ｖ，Ｔ，Ｓ，Ａ，Ｇ； Ｉ９０Ｖ，Ｔ，Ｓ，Ａ，Ｇ； Ｉ８６Ｖ，Ｔ，Ｓ，Ａ，Ｇ； Ｉ２０２Ｖ，Ｔ，Ｓ，Ａ，Ｇ； Ｌ２０６Ｖ，Ｔ，Ｓ，Ａ，Ｇ； Ｉ２５５Ｖ，Ｔ，Ｓ，Ａ，Ｇ； Ｌ２５９Ｖ，Ｔ，Ｓ，Ａ，Ｇ； Ｉ２６５Ｖ，Ｔ，Ｓ，Ａ，Ｇ； Ｆ９５Ｌ，Ｔ，Ｋ；又は Ｆ２１１Ｌ，Ｔ，Ｋ に置換されている、請求項４７に記載のリパーゼ変異体。
50. ５０．１又は複数のアミノ酸残基が以下の通り；Ｆ９５Ｋ； Ｉ８６Ｔ； Ｉ９０Ｔ； Ｉ２５５Ｔ； Ｌ２５９Ｔ； Ｌ２０６Ｔ；又は Ｌ２０６Ｔ＋Ｉ２５５Ｔ＋Ｌ２５９Ｔ に置換されている、請求項４９に記載のリパーゼ変異体。
51. ５１．親リパーゼが酵母のリパーゼである、請求項４０に記載のリパーゼ変異体 。
52. ５２．親リパーゼがキャンディダ属の株に宙来する、請求項５１に記載のリパー ゼ変異体。
53. ５３．親リパーゼが細菌のリパーゼである、請求項４０に記載のリパーゼ変異体 。
54. ５４．親リパーゼがシュードモナス属の株に由来する、請求項５３に記載のリパ ーゼ変異体。
55. ５５．請求項１〜５４のいづれか１項に記載のリパーゼ変異体をコードするＤＨ Ａ配列を含んで成るＤＮＡ構造体。
56. ５６．請求項５５に記載のＤＮＡ構造体を保有する組換え発現ベクター。
57. ５７．請求項５５に記載のＤＮＡ構造体又は請求項５６に記載のベクターにより 形質転換された細胞。
58. ５８．菌類細胞、例えばアスペルギルス属に宙来するもの、例えばＡ．ニガー、 Ａ．オリザもしくはＡ．ニドゥランス；酵母細胞、例えばサッカロマイシス属の 株に属するもの、例えばＳ．セレビジア又はハンセヌラ（ＨａｎｓｅｎｕＩａ） 属由来のメチロトローフ酵母、例えばＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐ ｈａ）、もしくはフィチア（Ｐｈｉｃｈｉａ）属の例えばＰ．パストリス（Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ）；あるいは細菌細胞、例えばバチルス属の株に属するもの、 例えばＢ．スブチリスもしくはＢ．リンタスである、請求項５７に記載の細胞。
59. ５９．植物細胞、例えばソラナシア（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）属に属する、例え ばソラナムチュベロスム（ＳｏＩａｎａｍｕｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、又はニコチ アナタバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）であの、請求項５７に記載 の細胞。
60. ６０．請求項５９に記載の細胞を含んで成る植物。
61. ６１．請求項５７−５９のいづれかＩ項に記載の細胞又は請求項６０に記載の植 物を、リパーゼ変異体の生産をもたらす条件のもとで培養又は成長させ、そして このリパーゼ変異体をその後この培養物又は植物から回収する、請求項１〜５４ のいづれか１項に記載のリパーゼ変異体を生産する方法。
62. ６２．任意的に無粉塵性顆粒、安定化液体又は保護化酵素の形態にある、請求項 １〜５４のいづれか１項に記載のリパーゼ変異体を含んで成る洗浄添加剤。
63. ６３．０．０２−２００ｍｇの酵素タンパク質／１ｇの添加剤を含む、請求項６ ２に記載の洗浄添加剤。
64. ６４．他の酵素、例えばプロテアーゼ、アミラーゼ、ペルオキシダーゼ及び／又 はセルラーゼを更に含んで成る、請求項６２又は６３に記載の洗浄添加剤。
65. ６５．請求項１−５４のいづれか１項に記載のリパーゼ変異体を含んで成の洗浄 組成物。
66. ６６．その他の酵素、例えばプをテアーゼ、アミラーゼ、ペルオキシダーゼ及び ／又はセルラーゼを更に含んで成る、請求項６５に記載の洗浄組成物。