JP2003520021A - リパーゼ変異体 - Google Patents
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Abstract
Description
は、特に、初回洗浄効果を有する、ヒュミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanugino
sa)の菌株DSM 4109に由来する野生型リパーゼの変異体に関する。
剤用酵素としてリパーゼ、特に、商品名リポラーゼ(Lipolase)(登録商標)(Novo
Nordisk社の製品)として販売されているヒュミコラ・ラヌギノサ由来のリパーゼ
が用いられてきた。 WO 92/05249, WO 94/25577, WO 95/22615, WO 97/04079及びWO 97/07202には
、洗浄のための特性が向上したヒュミコラ・ラヌギノサのリパーゼの変異体が開
示されている。WO 97/04079には、N末端及び/又はC末端に付加(伸長)ペプ
チドを有する変異体が開示されている。WO 97/07202には、ラードによって汚し
た布片から、一回の洗浄において実質的な量のラードを取り除くことができる「
初回洗浄性能」を有するリパーゼ変異体が開示されている。 それでもなお、多様な市販洗剤において、洗浄特性が向上した新規なリパーゼ
が求められている。本発明は、この様な新規なリパーゼに関する。
の変異体が、洗剤溶液中で特に良い初回洗浄性能を示すことを見出した。このリ
パーゼは、更なる利点、例えば白色性の保持及び黒ずみの浄化も提供しうる。 本発明者は、前記変異体が、三次元構造上N末端の近傍で、陽性アミノ酸によ
る1又は複数の置換を含有するべきであることを見出した。更にこの変異体は、
C末端に付加ペプチドを有し、そして/又は位置90〜101及び210の荷電アミノ酸
に関する一定の条件を満たすべきである。
パーゼを提供する: a)ヒュミコラ・ラヌギノサ株DSM 4109に由来する野生型リパーゼに対して少な
くとも90%の相同性を有すること; b)前記野生型リパーゼに比べて、E1又はQ249から15Å以内の三次元構造表面上
に存在する電気的中性又は陰性荷電アミノ酸の、陽性荷電アミノ酸による置換を
含んでいること;及び c)C末端にペプチドの付加を有すること;及び/又は d)下記の条件を満たすこと: i)前記野生型リパーゼの位置E210に陰性アミノ酸を含んでいること; ii)前記野生型リパーゼの位置90〜101に対応する領域に陰性荷電アミノ酸
を含んでいること;及び iii)前記野生型リパーゼのN94に対応する位置に中性又は陰性アミノ酸を含
み、そして/又は前記野生型リパーゼの位置90〜101に対応する領域に陰性又は
中性の正味電荷を有すること。
する野生型リパーゼである。これは、EP 258 068及びEP 305 216に記載されてお
り、US 5,869,438に記載の配列番号2の位置1〜269に示されるアミノ酸配列を
有している。本明細書では、この参照用リパーゼをリポラーゼとも呼ぶ。
のアミノ酸の、陽性荷電アミノ酸、好ましくはRによる置換を1又は複数個(例
えば2〜4、特に2個)含んで成る。 この置換は、E1又はQ249の15Å以内の三次元構造表面上に、例えば位置1-11,
90, 95, 169, 171-175, 192-211, 213-226, 228-258, 260-262のいずれかに存在
する。 この置換は、E1又はQ249の10Å以内に、例えば位置1-7, 10, 175, 195, 197-2
02, 204-206, 209, 215, 219-224, 230-239, 242-254のいずれかに存在してよい
。
, 228-240, 243-247, 249, 261-262のいずれかに存在してよい。 この置換は、最も好ましくはE1の10Å以内に、例えば位置1-7, 10, 219-224及
び230-239のいずれかに存在する。 従って、いくつかの好ましい置換は、S3R, S224R, P229R, T231R, N233R, D23
4R及びT244Rである。
チド付加により、多様な洗剤において初回洗浄性能が向上する。 この付加ペプチドは、好ましくは1〜5個のアミノ酸、例えば2,3又は4個
のアミノ酸から成る。この付加ペプチドのアミノ酸を270, 271などと番号づける
。
く、例えばPGL又はPGである。別の態様では、当該リパーゼの付加ペプチドは中
性(例えば疎水性)アミノ酸及びアミノ酸Cから成り、かつこのリパーゼは、付
加ペプチド内のCとジスルフィド架橋を形成する様に、適当な位置のアミノ酸の
Cによる置換を含んでなる。この例は、 270CとG23C又はT32Cとの架橋; 271CとK24C, T37C, N26C又はR81Cとの架橋; 272CとD27C, T35C, E56C, T64C又はR81Cとの架橋 である。
の条件を満たすことが好ましい。この荷電に関する条件を満足するリパーゼは、
陰イオン含量の高い洗剤において特に有効である。 従って、アミノ酸210は陰性であってよい。E210は未変更でもよく、又は置換E
210D/C/Y、特に置換E210Dを有してもよい。 当該リパーゼは、位置90〜101(特に94〜101)のいずれかに、例えば位置D96及
び/又はE99に、陰性荷電アミノ酸を含んでよい。 また、当該リパーゼは、位置N94に中性又は陰性アミノ酸を含んでよく、すな
わちN94(中性又は陰性)であり、例えばN94N/D/Eであってよい。
を有してよく、すなわち陰性アミノ酸の数が、陽性アミノ酸の数に等しいか、又
はそれよりも多い。従って、前記領域は、リポラーゼから未変更であってよく、
すなわち2個の陰性アミノ酸(D96及びE99)、1個の陽性アミノ酸(K98)、及び位
置94に中性アミノ酸(N94)を有してよく、あるいは当該領域は、1又は複数の置
換により修飾されてよい。
有するか、又は電荷未変更であってもよい。従って、3つのアミノ酸全てが未変
更であってもよいし、又は保存的置換若しくは陰性置換により変更されてもよく
、すなわちN94(中性又は陰性)、D(陰性)及びE99(陰性)であってよい。この例に
は、N94D/E及びD96Eがある。また前記3つのアミノ酸の内1つのアミノ酸は、電
荷が増加する様に置換されてもよく、すなわちN94(陽性)、D96(中性又は陽性)又
はE99(中性又は陽性)であってよい。この例には、N94K/R, D96I/L/N/S/W又はE99
N/Q/K/R/Hがある。
性能を改善しうる。陽性アミノ酸による中性アミノ酸の置換(N94K/R)は、陰イオ
ン性洗剤と陰イオン性/非イオン性洗剤(界面活性剤全体中、例えば40〜70%が
陰イオン性である洗剤)の双方において性能の良いリパーゼ変異体を提供しうる
。
剤の双方において当該性能を改善しうること、そして中性又は陰性アミノ酸によ
るR209の置換(例えばR209P/S)が、陰イオン性洗剤における当該性能を改善しう
ることを見出した。当該リパーゼは、場合により置換G91Aを含んでもよい。 当該リパーゼは、場合により1又は複数の別のアミノ酸の置換を含んでもよい
。この様な置換を、例えば、当業界に既知の原則に従って実行してよく、例えば
WO 92/05249, WO 94/25577, WO 95/22615, WO 97/04079及びWO 97/07202に記載
されている置換でよい。
飾することにより得ることができる。括弧内の置換は任意である。 T231R +N233R; N94K +D96L +T231R +N233R +Q249R +270P +271G +272L; D96L +T231R +N233R; G91A +E99K +T231R +N233R +Q249R; (N33Q) +D96L +T231R +N233R +Q249R +270PGL; R209 +T231R +N233R; (N33Q) +E99N +N101S +T231R +N233R +Q249R +270PGL; K24C +(N33Q) +D96S +T231R +N233R +Q249R +270PCL; (N33Q) +G91A +E99K +T231R +N233R +Q249R +270PGL; E1A +(N33Q) +G91A +E99K +T231R +N233R +Q249R +270PGL; (N33Q) +G91A +E99K +G255R +T231R +N233R +Q249R +270PGL; (N33Q) +G91A +E99K +T231R +N233R +T244R +Q249R +270PGL;
た通りである。従ってT231Rは、位置231のTの、Rによる置換を表す。PGL又は2
70P+271G+272Lは、C末端(L269)に付加されたペプチドPGLを表す。
性荷電、陽性荷電、又は電気的中性に分類する。従って、陰性アミノ酸はE,D
,C(システイン)及びYであり、特にE及びDである。陽性アミノ酸はR,K
及びHであり、特にR及びKである。中性アミノ酸はG,A,V,L,I,P,
F,W,S,T,M,N,Q、及びジスルフィド架橋を形成しているCである。
同じグループ(陰性、陽性又は中性)内の別のアミノ酸による置換を保存的置換
という。 前記の中性アミノ酸を、疎水性(G,A,V,L,I,P,F,W,ジスルフ
ィド架橋部分のC)と親水性(S,T,M,N,Q)とに分けることができる。
95%超、又は98%超)のアミノ酸相同性を有する。 相同性は、当業界に既知のコンピュータプログラム、例えばGCGプログラムパ
ッケージ内のGAP (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, Au
gust 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsi
n, USA 53711)(Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970) Journal of Molecu
lar Biology 48, 443-45)により適宜決定されうる。GAPを用いる場合、ポリペプ
チド配列比較のために、そのクリエーションペナルティを3.0に、そしてエクス
テンションペナルティを0.1に設定する。
現ベクター、そして前記DNA配列又は発現ベクターを含有する形質転換された宿
主細胞を提供する。これらは、当業界に既知の方法により調製される。 また本発明は、当該リパーゼを生産する方法であって、前記の形質転換宿主細
胞を、リパーゼの生産を誘導する条件下で培養すること、及び生成したブロスか
らリパーゼを回収することを含んで成る前記方法を提供する。この方法を、当業
界に既知の原則に従って実行しうる。
る。この添加剤を、非飛散性の顆粒、安定化された液体、スラリー、又は保護化
された酵素として調合することが都合がよい。この添加剤を、当業界に既知の方
法により調製しうる。
、例えば、洗濯用添加組成物、汚れた繊維物の前処理に適する組成物、リンス時
に添加する繊維物の柔軟剤組成物、並びに一般的な家庭内の硬質表面の洗浄及び
皿洗いのための組成物として調合しうる。 本発明の洗剤組成物は、本発明のリパーゼ及び界面活性剤を含んで成る。更に
これは、場合により、ビルダー、別の酵素、消泡剤、柔軟剤、色移り防止剤、及
び洗剤に通常用いられるその他の成分、例えば汚れ縣濁化剤、汚れ放出剤、蛍光
増白剤、研磨剤、殺菌剤、変色防止剤、着色剤、及び/又は、封入化若しくは未
封入香料を含んでもよい。
そのpH(使用濃度で水溶液中で測定する)は通常、中性又はアルカリ性、例えば
7〜11、特に9〜11である。本発明の顆粒状組成物は「圧縮形」であってもよく
、すなわち通常の顆粒状洗剤よりもかなり高い密度、すなわち550〜950 g/lを有
するものでよい。 本発明のリパーゼ、又は、場合により洗剤組成物中に組み込む別の酵素は、標
準的には、当該洗剤組成物中に、その組成物重量の0.00001〜2重量%、好まし
くは0.0001〜1重量%、より好ましくは0.001〜0.5重量%、更により好ましくは
0.01〜0.2重量%の酵素タンパク質のレベルで組み込まれる。
g、例えば100〜1000 LU/gに相当する量で当該リパーゼを含んでよい。この洗剤
を水に溶解することにより、洗浄液1Lあたり25〜15000 LU、特に100〜5000 LU/L
、例えば300〜2000 LU/Lに相当する量で脂質分解酵素を含有する洗浄液を生産し
うる。そのリパーゼタンパク質の量は、洗剤1gあたり0.001〜10 mg、又は洗浄液
1Lあたり0.001〜100 mgであってよい。 より詳しくは、WO 97/04079, WO 97/07202, WO 97/41212, PCT/DK WO 98/0893
9及びWO 97/43375に記載の通りに、本発明のリパーゼを洗剤組成物中に組み込み
うる。
/又は両性イオン性の界面活性剤を含んでよい。前記通り、本発明のリパーゼ変
異体は、陰イオン性界面活性剤70〜100重量%と非イオン性界面活性剤0〜30重
量%との組合せ、特には陰イオン性界面活性剤80〜100重量%と非イオン性界面
活性剤0〜20重量%との組合せを含んで成る洗剤に特に適している。更に、本発
明のいくつかの好ましいリパーゼは、陰イオン性界面活性剤40〜70重量%と非イ
オン性界面活性剤30〜60重量%とを含んで成る洗剤にも適している。 この界面活性剤は、典型的には、0.1〜60重量%、例えば1〜40重量%、特に
は10〜40重量%、好ましくは約3〜約20重量%のレベルで存在する。界面活性剤
のいくつかの例を以下に示す。
シスルフェート、線状アルキルベンゼンスルホネート、及びそれらの混合物が含
まれる。 アルキルスルフェート系界面活性剤は、式ROSO3Mで表せる水溶性の塩又は酸で
ある。ただし前記式中Rは、好ましくはC10〜C24のヒドロカルボイル、好ましく
はC10〜C20のアルキル又はヒドロキシアルキル、より好ましくはC12〜C18のアル
キル又はヒドロキシアルキルであり、そしてMは、水素又はカチオン、例えばア
ルキル金属カチオン(例えばナトリウム、カリウム、リチウム)、あるいはアン
モニウム又は置換アンモニウムである。 アルキルベンゼンスルホネートは、適当な、特には線状(直鎖状)の、好まし
くはアルキル基の炭素数が10〜18であるアルキルベンゼンスルホネート(LAS)で
ある。
あるアルキルアルコキシ化スルフェートがある。ただし前記式中Rは、C10〜C24 の未置換アルキル又はヒドロキシアルキル、より好ましくはC10〜C20のアルキル
又はヒドロキシアルキル、より好ましくはC12〜C18のアルキル又はヒドロキシア
ルキルであり、Aはエトキシ又はプロポキシであり、mは0より大きく、典型的
には約0.5〜約6であり、より好ましくは約0.5〜約3であり、そしてMは、水素
又はカチオン、例えば金属カチオン(例えばナトリウム、カリウム、リチウム、
カルシウム、マグネシウムなど)、あるいはアンモニウム又は置換アンモニウム
カチオンである。ここではアルキルエトキシル化スルフェート及びアルキルプロ
ポキシル化スルフェートが考えられる。置換アンモニウムカチオンの特定の例に
は、メチル−、ジメチル−、トリメチル−アンモニウムカチオン、及び第四アン
モニウムカチオン、例えばテトラメチルアンモニウム及びジメチルピペリジニウ
ムカチオン、そしてアルキルアミン、例えばエチルアミン、ジエチルアミン、ト
リエチルアミンに由来するもの、それらの混合物、及び類似物がある。
、アンモニウム、及び置換アンモニウムの塩、例えばモノ−、ジ−及びトリエタ
ノールアミンの塩)、C8〜C22の第一又は第二アルカンスルホネート、C8〜C24の
オレフィンスルホネート、アルカリ土類金属クエン酸塩の熱分解産物のスルホン
化によって調製されるスルホン化ポリカルボン酸がある。
ポリエチレンオキサイド)縮合体を含んでよい。そのアルキル基は約6〜約14の
炭素原子を含み、直鎖又は分鎖状であってよい。そのエチルオキサイドは、アル
キルフェノール1モルあたり約2〜約25モルに相当する量で存在しうる。 当該界面活性剤は、第一及び第二脂肪族アルコールと約1〜約25モルのエチレ
ンオキサイドとの縮合産物を含んでもよい。その脂肪族アルコールのアルキル鎖
は直鎖でも分鎖でもよく、一般的には約8〜約22の炭素原子を含む。
ド縮合体、第一及び第二脂肪族アルコールと約1〜約25モルのエチレンオキサイ
ドとの縮合産物、アルキル多糖、及びそれらの混合物を含んでよい。最も好まし
いものは、3〜15のエトキシル基を有するC8〜C14のアルキルフェノールエトキ
シレート、及び2〜10のエトキシル基を有するC8〜C18(好ましくは平均としてC 10 )のアルキルエトキシレート、及びそれらの混合物である。 好ましい非イオン性界面活性剤は、アルコールエトキシレート、アルコールフ
ェノールエトキシレート、ポリヒドロキシ脂肪酸アミド、アルキルポリグルコシ
ド、及びそれらの混合物である。
検査した。比較のために親リパーゼを検査した。 T231R +N233R; G91A +D96W +E99K +G263Q +L264A +I265T +G266D +T267A +L269N +270AGGFSWRRY
RSAESVDKRATMTDAELEKKLNSYVQMDKEYVKNNQARS; R209P +T231R +N233R; N33Q +D96S +T231R +N233R +Q249R; E99N +N101S +T231R +N233R +Q249R。
れる酵素を不活性化し、それを、Tergot-o-meterTM研究用洗浄機中で1.4 g/Lの
濃度で用いた。水の硬度は6°dHであった(Ca:Mg 2:1)。洗浄条件は30℃で12分
間1サイクルであり、その後、濾紙上で一晩乾燥を行った。リパーゼ変異体を64
00及び12800 LU/Lの用量で加えた。2回別々の洗浄を行い、2回の測定を行った
(同一TOM)。
n Red)を付けたコットンスタイル400;20-LSリップスティックを付けたポリエス
テル/コットン;及び10-LSリップスティックを付けたコットン。初回の洗浄サ
イクルを行った後に460nmでの減少を測定することにより、汚れの除去を評価し
た。その結果を、酵素を含まないブランクでの減少分を差し引いたΔRとして表
した。
性能を示した(ΔR=5〜13)。一方、親酵素は、同一条件下で本質的な効果を
示さなかった(ΔR=0±2)。
Claims (21)
- 【請求項1】 下記を満たすアミノ酸配列を有するポリペプチドであるリパ
ーゼ: a)ヒュミコラ・ラヌギノサ株DSM 4109に由来する野生型リパーゼに対して少な
くとも90%の相同性を有すること; b)前記野生型リパーゼに比べて、E1又はQ249から15Å以内の三次元構造表面上
に存在する電気的中性又は陰性荷電アミノ酸が、陽性荷電アミノ酸により置換さ
れていること;及び c)C末端にペプチドの付加を有すること;及び/又は d)下記の条件を満たすこと: i)前記野生型リパーゼの位置E210に陰性アミノ酸を含んでいること; ii)前記野生型リパーゼの位置90〜101に対応する領域に陰性荷電アミノ酸
を含んでいること;及び iii)前記野生型リパーゼのN94に対応する位置に中性又は陰性アミノ酸を含
み、そして/又は前記野生型リパーゼの位置90〜101に対応する領域に陰性又は
中性の正味電荷を有すること。 - 【請求項2】 前記置換が、E1又はQ249から10Å以内に存在する、請求項1
のリパーゼ。 - 【請求項3】 前記置換が、E1から15Å(好ましくは10Å)以内に存在する
、請求項1又は2のリパーゼ。 - 【請求項4】 2〜4個(好ましくは2個)の前記置換を含んでいる、請求
項1〜3のいずれかのリパーゼ。 - 【請求項5】 E1から10Å以内に存在する電気的に中性又は陰性荷電のアミ
ノ酸がRによって置換されている、請求項1〜4のいずれかのリパーゼ。 - 【請求項6】 アミノ酸S3, S224, P229, T231, N233, D234及びT244が、陽
性荷電アミノ酸、好ましくはRによって置換されている、請求項1〜5のいずれ
かのリパーゼ。 - 【請求項7】 前記の付加ペプチドが、1〜5個のアミノ酸から成る、請求
項1〜6のいずれかのリパーゼ。 - 【請求項8】 前記の付加ペプチドが、電気的に中性(好ましくは疎水性)
のアミノ酸から成る、最も好ましくはPGL又はPGである、請求項1〜7のいずれ
かのリパーゼ。 - 【請求項9】 前記の付加ペプチドが、電気的に中性(好ましくは疎水性)
アミノ酸及びCから成り、かつ前記付加ペプチドのCとジスルフィド架橋を形成
する様に、当該リパーゼ内のアミノ酸がCにより置換されている、請求項1〜7
のいずれかのリパーゼ。 - 【請求項10】 前記の野生型リパーゼの位置N94, D96及びE99の内少なく
とも2つの位置に、陰性電荷又は電荷未変更のアミノ酸を含んでいる、請求項1
〜9のいずれかのリパーゼ。 - 【請求項11】 置換G91A, N94D/E/K/R, D96E/I/L/N/S/W, E99N/Q/K/R/H,
N101S, R209P/S又はQ249R/K/Hを含んでいる、請求項1〜10のいずれかのリパ
ーゼ。 - 【請求項12】 下記の置換セットのいずれかを、場合によりQ249R/K/H及
び/又はK98Xと共に含んでいる、請求項1〜11のいずれかのリパーゼ: a) G91G/A/S/T +N94(中性又は陰性) +D96D/E/C/Y +E99E/D/C/Y; b) G91G/A/S/T +N94(中性又は陰性) +D96D/E/C/Y +E99N +N101S; c) G91G/A/S/T +N94R/K/H +D96D/E/C/Y +E99E/D/C/Y; d) G91G/A/S/T +N94(中性又は陰性) +D96(中性又は陽性) +E99E/D/C/Y;又は e) G91G/A/S/T +N94(中性又は陰性) +D96D/E/C/Y +E99(中性又は陽性)。 - 【請求項13】 下記の置換セットのいずれかを、場合によりR209(中性又
は陰性)と共に含んでいる、請求項1〜11のいずれかのリパーゼ: a) E99R/K/H +Q249R/K/H; b) N94R/K/H +Q249R/K/H;又は c) D96(中性又は陽性) +Q249R/K/H。 - 【請求項14】 界面活性剤及び請求項1〜13のいずれかのリパーゼを含
んでいる、洗剤組成物。 - 【請求項15】 前記界面活性剤が、界面活性剤の総重量に対して70重量%
超の量の陰イオン性界面活性剤を含んでいる、請求項14の洗剤組成物。 - 【請求項16】 前記界面活性剤が、界面活性剤の総重量に対して40〜70重
量%の陰イオン性界面活性剤と30〜60重量%の非イオン性界面活性剤とを含んで
なり、かつ前記リパーゼが請求項8又は9のリパーゼである、請求項14の洗剤
組成物。 - 【請求項17】 10〜40重量%の界面活性剤を含み、好ましくは40〜70%の
ビルダーを含み、かつ水に0.5〜5 g/Lで溶解した時に、好ましくは9〜11のpHを
有する、請求項14〜16のいずれかの洗剤組成物。 - 【請求項18】 請求項1〜13のいずれかのリパーゼをコードするDNA配
列。 - 【請求項19】 請求項18のDNA配列を有する発現ベクター。
- 【請求項20】 請求項18のDNA配列又は請求項19の発現ベクターを含
んでいる形質転換された宿主細胞。 - 【請求項21】 請求項1〜13のいずれかのリパーゼを生産する方法であ
って、請求項20の形質転換宿主細胞を、前記リパーゼの生産を誘導する条件下
で培養すること、及び生成したブロスから前記リパーゼを回収することを含んで
成る、前記方法。
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