CN1235638A

CN1235638A - 枯草酶变种及组合物

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Publication number: CN1235638A
Application number: CN97199434A
Authority: CN
Inventors: 彼得·K·汉森; 克劳斯·冯德奥斯藤; 彼得·鲍蒂茨
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1996-11-04
Filing date: 1997-10-31
Publication date: 1999-11-17
Anticipated expiration: 2017-10-31
Also published as: KR100561826B1; CA2270593A1; BR9712473A; EP0948610B1; BR9712473B1; CA2270593C; WO1998020115A1; EP2278001A1; CN1554750A; CN1165615C; AU4772697A; JP2002510191A; ATE510910T1; KR20000053060A; CN1554750B; EP0948610A1; EP2278001B1; JP4044143B2

Abstract

提供了在第167和170位上对一些枯草酶基因进行突变及在合适宿主中表达该突变基因所产生的酶。与其野生型亲本酶相比,这些酶在任何去污剂中均表现出改良的洗涤效果。

Description

枯草酶变种及组合物

技术领域

本发明涉及新的突变蛋白酶类或酶突变体，其用于配制去污剂组合物，并使去污剂的洗涤效果得以改良；涉及含有所说酶的洗涤和去污组合物；涉及当插入到适当的宿主细胞或生物体时用于编码所说酶的表达的突变基因；以及涉及以此转化了的并能表达所说的酶变种的这类宿主细胞。发明背景

在去污剂工业中，酶作为洗涤剂成分已被用了30多年了。在这些洗涤剂中所用的酶包括蛋白酶、脂酶、淀粉酶、纤维素酶以及其它酶，或者它们的混合物，市场上最重要的酶是蛋白酶。

商业上用得越来越多的蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白质工程的变体，例如DURAZYM^_(Novo Nordisk A/S),RELASE^_(Novo Nordisk A/S),MAXAPEM^_(Gist-Brocades N.V.),PURAFECTt^_(Genecor Intemational,Inc.)。

另外文献中还描述了一系列的蛋白酶，例如EP 130756(GENENTECH)(相应于US再颁布专利号34,606(GENENCOR))；EP 214435(HENKEL)；WO87/04461(AMGEN)；WO 87/05050(GENEX)；EP 260105(GENENCOR)；Thomas,Russell，和Fersht(1985)自然318 375-376；Thomas,Russell，和Fersht(1987)分子生物学杂志193 803-813；Russel and Fersht自然328 496-500(1987)；WO 88/08028(Genex)；WO 88/08033(Amgen)；WO 95/27049(SOLVAY S.A.)；WO 95/30011(PROCTER&GAMBLE公司)；WO 95/30010(PROCTER & GAMBLE公司)；WO 95/29979(PROCTER & GAMBLE公司)；US 5.543.302(SOLVAY S.A.)；EP 251 446(GENENCOR)；WO 89/06279(NOVO NORDISK A/S)；WO 91/00345(NOVO NORDISK A/S)；EP 525 610A1(SOLVAY)；和WO 94/02618(GIST-BROCADES N.V.).

然而，虽然已描述了一些有用的蛋白酶变体，还需要新的改良的蛋白酶变体用于一些工业用途。

因此，本发明的目的之一是提供改良了的蛋白质工程的蛋白酶变体，尤其是将其用于洗涤剂工业。发明简述

最近发现有一种方法可以得到洗涤效果得以增强的枯草酶(Subtilase)变体，该方法是在亲本枯草酶的憎水结构域处或在该结构域附近的一个或多个氨基酸残基用一个或多个比原来氨基酸更加憎水的氨基酸取代，所说的憎水结构域包含对应于BLS 309的1165、Y167、Y171的残基，而且在其附近的所说残基包括对应于BLS 309的残基E136、G159、S164、R¹70、A194和G195(WO 96/34946)。

根据这些信息，本发明人深入地研究了SAVINASE^_的Y167和R¹70的各种可能的组合，并且发现了其洗涤效果有出人意料的提高的一些变体。

进一步的细节请参阅下文的工作实施例。

因此，本发明首先涉及在洗涤剂中增强洗涤效果的枯草酶蛋白酶变体，包括167和170位置的修饰。

其次，本发明涉及在洗涤剂中能增强洗涤效果的枯草酶蛋白酶变体，包括至少一个选自下列的修饰：

167{G,A,S，或T}+170{G,A,S，或T}

167{G,A,S，或T}+170{L,I，或V}

167{G,A,S，或T}+170{Q，或N}

167P

167P+170{L,I，或V}

167{L,I，或V}+170{G,A,S，或T}

167{L,I，或V}+170{Q，或N}

167P+170{G,A,S，或T}

167{L,I或V}+170{L,I，或V}

167{F,W或Y}+170{G,A,S，或T}

167{F,W或Y}+170{E，或D}

167{F,W或Y}+170{R,K，或H}

167{F,W或Y}+170{L,I，或V}

167{L,I，或V}

170H

167{G,A,S，或T}。

上述的命名例如“167{G,A,S，或T}+170{G,A,S，或T}”变体是基本命名，其中术语“167{G,A,S，或T}+170{G,A,S，或T}”包括下列变体：

167G+170G,167G+170A,167G+170S,167G+170T,

167A+170G,167A+170A,167A+170S,167A+170T,

167S+170G,167S+170A,167S+170S,167S+170T,

167T+170G,167T+170A,167T+170S，或167T+170T。

关于此处的枯草酶变体命名的进一步的细节请参考下文的“定义”一节。

本发明的第三方面涉及编码本发明的枯草酶变体的分离的DNA序列。

本发明的第四方面涉及含有编码本发明的枯草酶变体的分离的DNA序列的表达载体。

本发明的第五方面涉及用根据第四方面的表达载体转化的微生物宿主细胞。

本发明的另一方面还涉及本发明的枯草蛋白酶的生产，其方法是将根据第四方面的表达载体插入到适当的微生物宿主中，培养宿主以表达所需的枯草酶，并回收酶产物。

本发明还在一个方面涉及含有本发明的枯草酶变体的组合物。

最后本发明涉及该突变酶用于一些工业相关的应用，尤其是用于洗涤组合物和含有该突变酶的洗涤组合物中，特别是含有突变枯草蛋白酶的洗涤剂组合物中。定义

在进一步对本发明进行详细讨论之前，将对下述各词首先进行定义。

氨基酸命名

A=Ala=丙氨酸

V=Val=缬氨酸

L=Leu=亮氨酸

I=Ile=异亮氨酸

P=Pro=脯氨酸

F=Phe=苯丙氨酸

W=Trp=色氨酸

M=Met=甲硫氨酸

G=Gly=甘氨酸

S=Ser=丝氨酸

T=Thr=苏氨酸

C=Cys=半胱氨酸

Y=Tyr=酪氨酸

N=Asn=天冬酰胺

Q=Gln=谷氨酰胺

D=Asp=天冬氨酸

E=Glu=谷氨酸

K=Lys=赖氨酸

R=Arg=精氨酸

H=His=组氨酸

X=Xaa=任何氨基酸

核酸命名

A=腺嘌呤

G=鸟嘌呤

C=胞嘧啶

T=胸腺嘧啶(仅存在于DNA中)

U=尿嘧啶(仅存在于RNA中)变体命名

在对本发明中产生出或设计出的各种酶变体进行描述时，为便于参考采用了下述命名：

原来的氨基酸位置取代的氨基酸

据此，在195位的谷氨酸对甘氨酸的取代被命名为：

Gly195Glu或G 195E

在相同位置的甘氨酸的缺失为：

Gly195^*或G 195^*

而插入一个另外的氨基酸残基如赖氨酸为：

Gly195GlyLys或G195GK

当指出与原来用于编号的序列相比的缺失时，在这样一个位置上的插入被命名为

^*36Asp或^*36D用于说明在36位上插入了一个天冬氨酸。

被加号分开的多个突变，例如：

Arg 170 Tyr+Gly 195 Glu或R107Y+G195E

分别代表在170和195位上用酪氨酸和谷氨酸取代了精氨酸和甘氨酸。

当原来的氨基酸可能包含任何氨基酸时，那么仅提其位置和取代氨基酸，例如：170 Ser。

该命名尤其适合涉及根据本发明的同源枯草酶(参见下文)的修饰。因此170 Ser例如包括BASBPN中的一个Lys 170 Ser修饰和BLSSAVI中的一个Arg 170 Ser修饰。参见与所说实施例相关的图1。

当取代的氨基酸可包含任何氨基酸时，仅提其原来的氨基酸和位置，例如：Arg 170。

当原来的氨基酸和取代的氨基酸都可以是任何氨基酸时，那么仅指出其位置，例如：170。

当原来的氨基酸和/或取代的氨基酸可包括超过一种但并非全部氨基酸时，那么所选择的氨基酸用“{}”包围，例如：

Arg 170{Gly,Ala,Ser，或Thr}包括变体

Arg 170 Gly,Arg 170 Ala,Arg 170 Ser或Arg 170 Thr；或例如

Tyr 167{Gly,Ala,Ser，或Thr}+Arg 170{Gly,Ala,Ser，或Thr}包括变体

Tyr167Gly+Arg170Gly, Tyr167Gly+Arg170Ala,

Tyr167Gly+Arg170Ser, Tyr167Gly+Arg170Thr,

Tyr167Ala+Arg170Gly, Tyr167Ala+Arg170Ala,

Tyr167Ala+Arg170Ser, Tyr167Ala+Arg170Thr,

Tyr167Ser+Arg170Gly, Tyr167Ser+Arg170Ala,

Tyr167Ser+Arg170Ser, Tyr167Ser+Arg170Thr,

Tyr167Thr+Arg170Gly, Tyr167Thr+Arg170Ala,

Tyr167Thr+Arg170Ser,或Tyr167Thr+Arg170Thr.

该命名尤其适合涉及本发明一个优选枯草酶变体的保守氨基酸修饰。

例如一个优选变体Tyr 167 Ala+Arg 170 Ser的保守氨基酸修改例如是Tyr 167{Gly,Ala,Ser，或Thr}+Arg 170{Gly,Ala,Ser，或Thr}，其中此处用一个小的氨基酸取代了另一个小氨基酸。进一步的细节请参见“发明详述”一节。蛋白酶

在蛋白质底物中切开酰胺键的酶被分类为蛋白酶，或(可互换地)肽酶(见Walsh,1979，酶反应机理W.H.Freeman和Company,San Francisco，第3章)。氨基酸位置/残基的编号

如果不另外指出，则此处所用的氨基酸编号对应于枯草酶BPN′(BASBPN)的序列。对BPN′序列的进一步描述参见Siezen等，Protein Engng.4(1991)719-737及图1。丝氨酸蛋白酶

丝氨酸蛋白酶是催化肽键水解的酶，而且活性位置上有一个必需的丝氨酸残基(White,Handler和Smith,1973“Principles of Biochemistry，”第5版，McGraw-Hill Book Company,NY，第271-272页)。

细菌性丝氨酸蛋白酶的分子量在20000到45000道尔顿的范围内。它们被二异丙基氟磷酸所抑制。其水解简单的末端酯，其活性与真核胰凝乳蛋白酶类似，后者亦为一种丝氨酸蛋白酶。一个更狭义的名词，碱性蛋白酶，包括了一个亚群，其反映了某些丝氨酸蛋白酶的高的最适pH，范围从pH9.0至11.0(综述，参见Priest(1997))Bacteriological Rev.41 711-753)。枯草酶

Siezen等提出了临时被命名为枯草酶(subtilase)的一个亚群的丝氨酸蛋白酶(Protein Engng.4(1991)719-737)。它们是通过丝氨酸蛋白酶的超过40个氨基酸序列的同源性分析确定的，而后者以前已被认为是类枯草蛋白酶的蛋白酶。枯草蛋白酶先前被认为是格兰氏阳性菌和真菌产生的一种丝氨酸蛋白酶，根据Siezen等人现在它被认为是枯草酶的一个亚群。我们已发现了许多的枯草酶，而且也确定了许多枯草酶的氨基酸序列。关于这种枯草酶及其氨基酸序列的更详细的描述请参考Siezen等及本文中的图1。

枯草酶的一个亚群，即I-S1，其包括“传统的”枯草蛋白酶，例如枯草蛋白酶168，枯草蛋白酶BPN′，枯草蛋白酶Carlsberg(ALCALASE^_,NOVONORDISK A/S)，和枯草蛋白酶DY。

另一个亚群枯草酶I-S2是由Siezen等发现的(同上)。I-S2亚群蛋白酶被描述成是高度碱性的枯草蛋白酶，其所包括的酶例如有枯草蛋白酶PB92(MAXACAL^_,Gist-Brocades NY)，枯草蛋白酶309(SAVINASE^_,NOVO NORDISK A/S)，枯草蛋白酶147(ESPERASE^_,NOVO NORDISKA/S)，以及碱性弹性蛋白酶YaB。“SAVINASE^_”

SAVINASE^_由NOVO NORDISK A/S出售。

其是来自于缓慢芽孢杆菌(B.lentus)的枯草蛋白酶309，其与BABP92(参见本文图1)不同仅在于带有N87S。亲本枯草酶

名词“亲本枯草酶”是根据Siezen等(Protein Engineering 4:719-737(1991))所定义的一种枯草酶。进一步细节请参见前面的“枯草酶”的描述。亲本枯草酶还可能是从天然来源分离到的枯草酶，其中随后对其进行修饰但保持枯草酶的特征。可选择地，术语“亲本枯草酶”可被称为“野生型枯草酶”。枯草酶变体的修饰

此处所讨论的与枯草酶变体相关的术语“修饰”被定义为既包括化学修饰，也包括遗传操作。该修饰可以是对目的氨基酸的取代，缺失和/或插入。枯草酶变体

在本发明的范围内，术语枯草酶变体或突变的枯草酶指的是由表达从具有原始的或亲本基因并产生相应亲本酶的亲本微生物衍生的突变基因的有机体产生的枯草酶，为产生突变基因已将亲本基因突变，当突变基因在适当的宿主中表达时可产生所说的突变的枯草酶蛋白酶。同源枯草酶序列

为了获得本发明的枯草酶变体对SAVINASE^_枯草酶的特定氨基酸残基进行了鉴定以进行本文所述的修饰。

然而，本发明并不限于这个特定的枯草酶的修饰，而可以扩展到其它亲本(野生型)枯草酶上，其与SAVINASE^_有着同源的一级结构。

为了识别其它同源枯草酶，在本发明的范围内，将所说的枯草酶与先前已进行过序列对比的枯草酶进行序列对比，同时保持原来的排列不变。对枯草酶中18个高度保守的残基进行了对比。这18个高度保守的残基见表Ⅰ(参见Siezen等以了解关于所说保守残基的进一步细节)。

表Ⅰ

枯草酶中18个高度保守的残基位置：保守残基：23 G32 D34 G39 H64 H65 G66 T70 G83 G125 S127 G146 G154 G155 N219 G220 T221 S225 P

在进行了允许有必要的插入和缺失以维持排列的序列对比后，发现了适当的同源残基。然后，所说的同源残基即可根据本发明进行修饰。

用CLUSTALW(版本1.5,1995年4月)计算机序列对比程序(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.和G.Bson,T.J.(1994)Nucleic Acids Research,22:4673-4680.)，采用10.0的GAP开放补偿和0.1的GAP延伸补偿，用BLOSUM 30蛋白质重量矩阵，就可以使用程序中的特征序列对比选项得到某一给定枯草酶与一组先前已进行过序列对比的枯草酶之间的序列对比。对一个在本发明范围之内的给定的枯草酶，优选该18个高度保守残基100％地保守。但是，只要18个残基中有大于或等于17个能够匹配，或者所说的保守残基匹配少至16个时，仍足以识别同源残基。在枯草酶中催化三联体Asp32/His 64/Ser 221的保守性应得以维持。

先前所确定的序列匹配如图1所示，其中也表明了在此序列匹配中各枯草酶与该18个高度保守残基一致性的百分率。

所说方法还进一步涉及本发明范围内的同源亲本(野生型)枯草酶的鉴定，上述的该18个保守残基与所说同源亲本枯草酶的亲本(野生型)一级结构相关。也就是说，如果亲本枯草酶在上述18个保守残基中的任何一个上发生了修饰，那么就是在所说18个保守残基中的原始亲本野生型序列来确定原来的亲本枯草酶及所说的亲本枯草酶的可能变体(其在上述所说的18个保守残基中的任何一个上有修饰)是否为在本发明的范围内同源的枯草酶。

根据本描述，一个本领域的技术人员来鉴别适当的同源枯草酶和相应的同源残基(根据本发明，其可被修饰)是相当简单的。为了说明，下面的这个表Ⅱ列出了同源枯草酶和根据本发明要被修饰的相应的适当残基的一个有限的一览表。

表Ⅱ

同源枯草酶和根据本发明适于被修饰的相应的同源残基

位置/酶	BASBPN	BLSCAR	BLS309	BLS417	TVTHER
位置/酶	BASBPN	BLSCAR	BLS309	BLS417	TVTHER	167+170	Y167A+K170N	Y167A+K170N	Y167A+R170N	Y167A+R170N	Y167A+Y170N
167+170	Y167A+K170S	Y167A+K170S	Y167A+R170S	Y167A+R170S	Y167A+Y170S	167+170	Y167A+K170N	Y167A+K170N	Y167A+R170N	Y167A+R170N	Y167A+Y170N
167+170	Y167A+K170S	Y167A+K170S	Y167A+R170S	Y167A+R170S	Y167A+Y170S	167	Y167P	Y167P	Y167P	Y167P	Y167P

很明显一个本领域的技术人员可以很容易地制出一个类似或更大的表来涵盖其它的同源枯草酶。洗涤效果

酶在催化在例如洗涤的过程中要被清洗去的某一物体上的各种天然存在的底物的降解的能力常被称为是其洗涤能力、洗涤力、净化力或洗涤效果。在整个本应用中，术语洗涤效果用于包括该特征。分离的DNA序列

当用于一个DNA序列分子时，术语“分离的”指的是被从其天然遗传环境中取出来因而不含其它额外或不需要的编码序列的DNA序列，从而其存在的形式适于用在遗传工程蛋白质生产系统中。这类分离的分子是那些从其天然环境中取出并包括cDNA和基因组克隆的分子。本发明的分离的DNA分子已与那些其一般相联系的其它基因分离开来，但可能包括天然存在的5′和3′非翻译区例如启动子和终止子。对相关联区域的识别对一个本领域的普通技术人员而言也是很明显的(见例如，Dynan和Tijan,Nature316:774-78,1985)。术语“分离的DNA序列”可互换地被称之为“克隆的DNA序列”。分离的蛋白质

当用于蛋白质时，术语“分离的”指的是在非其天然环境中发现的蛋白质。在一个优选的形式下，分离的蛋白质基本不含其它蛋白质，尤其是那些同源蛋白质(即“同源杂质”(见下面))。优选提供高纯度形式的蛋白质，即大于40％纯度，大于60％纯度，高于80％纯，更优选大于95％纯度，进一步优选大于99％纯度，其纯度以SDS-PAGE确定。

术语“分离的蛋白质”可互换地被称之为“纯化蛋白质”。同源杂质

术语“同源杂质”指的是从同源细胞而来的任何杂质(例如本发明的多肽之外的其它多肽)，而本发明的多肽最初就是来源于该同源细胞。来自于

此处所用的与特定的微生物源相联系的术语“来自于”指的是由特定的来源或由其中插入有由此来源获得的基因的细胞产生的多核苷酸和/或多肽。底物

此处所用的与蛋白酶底物相关的术语“底物”应以其最广义的含义被解释为包括含有至少一个易被枯草蛋白酶水解的肽键的化合物。产物

所用的与来源于蛋白酶酶催反应的产物相关的术语“产物”在本发明的上下文中应被理解为包括涉及枯草酶蛋白酶的水解反应的产物。一个产物可能为随后的水解反应的底物。附图简述

图1列出了一些同源枯草酶的匹配，其匹配于枯草酶的18个高度保守残基。该18个高度保守的残基以黑体着重指出。所有列出的枯草酶，除了JP 170，都100％地具有所说的保守残基。JP 170在保守的残基G 146处具有一个“N”而非“G”。发明详述具有改良的洗涤效果的枯草酶变体

本发明的许多枯草酶变体在此处都被测试并在洗涤剂中表现出了改良的洗涤效果(见下文的操作实施例)。

因此，本发明的一个实施方案涉及一个根据本发明第二方面的枯草酶变体，其中修饰选自(按BASBPN编号)：

167A+170S,

167A+170L,

167A+170N

167P

167P+170L

167V+170T

167I+170T

167V+170Q

167S+170Q

167T+170N

167A+170A

167T+170L

167T+170A

167P+170S

167I+170L

167F+170T

167F+170E

167F+170H

167F+170T

167F+170L

167L

170H

167S.

本发明人发现了BLS 309变体(SAVINASE^_)具有改良的洗涤效果，在其亲本野生型一级序列中含有如原来野生型氨基酸的Y167和R¹70(见图1)。

因此，本发明的另一个实施方案涉及根据本发明第二方面的枯草酶变体，其中的修饰选自(按BASBPN编号)：

Y167{G,A,S，或T}+R170{G,A,S，或丁}

Y167{G,A,S，或T}+R170{L,I，或V}

Y167{G,A,S，或T}+R170{Q，或N}

Y167P

Y167P+R170{L,I，或V}

Y167{L,I，或V}+R170{G,A,S，或T}

Y167{L,I，或V}+R170{Q，或N}

Y167P+R170{G,A,S，或T}

Y167{L,I，或V}+R170{L,I，或V}

Y167{F,W，或Y}+R170{G,A,S，或T}

Y167{F,W，或Y}+R170{E，或D}

Y167{F,W，或Y}+R170{R,K，或H}

Y167{F,W，或Y}+R170{L,I，或V}

Y167{L,I，或V}

R170H

Y167{G,A,S，或T}；或更优选的

根据上面实施方案的枯草酶酶变体，其中的修饰选自(按BASBPN编号)：

Y167A+R170S

Y167A+R170L

Y167A+R170N

Y167P

Y167P+R170L

Y167V+R170T

Y167I+R170T

Y167V+R170Q

Y167S+R170Q

Y167T+R170N

Y167A+R170A

Y167T

Y167T+R170A

Y167P+R170S

Y167I+R170L

Y167F+R170T

Y167F+R170E

Y167F+R170H

Y167F+R170T

Y167F+R170L

Y167L

R170H

Y167S.

在本领域中，众所周知将一个氨基酸取代为另一个类似保守的氨基酸只会对酶的特征产生一个微小的变化。

下面的表Ⅲ列出了保守氨基酸组。

表Ⅲ

保守氨基酸取代

碱性的：R=精氨酸

K=赖氨酸

H=组氨酸

酸性的：E=谷氨酸

D=天冬氨酸

极性的：Q=谷氨酰胺

N=天冬酰胺

憎水的：L=亮氨酸

I=异亮氨酸

V=缬氨酸

M=甲硫氨酸

芳香族的：F=苯丙氨酸

W=色氨酸

Y=酪氨酸

小的：G=甘氨酸

A=丙氨酸

S=丝氨酸

T=苏氨酸

因此，枯草酶变体例如167A+170S,167G+170S,167S+170S，以及167T+170S将具有相似的洗涤效果改良。

而且，枯草酶变体例如Y167G+R170S,Y167S+R170S，以及Y167T+R170S将具有与变体Y167A+R170S相似的洗涤效果改良。见例如本文操作实施例中对所说Y167A+R170S变体所作的特定的洗涤效果测试。

根据本文所公开尤其是所列举的各种枯草酶变体，按照本发明的所有方面和枯草酶变体的具体实施方案，为了得到其改良的洗涤效果的枯草酶变体，本领域的普通技术人员通过常规方法就可发现尤其是所说的列举的变体的进一步适宜的保守性修饰。

在本发明的具体实施方案中，目的枯草酶是属于I-S1和I-S2亚群的那些。

关于I-S1亚群，优选的亲本枯草酶选自ABSS 168、BASBPN、BSSDY以及BLSCAR或其保留了I-S1亚群的特征的功能性变体。

关于I-S2亚群，优选的亲本枯草酶选自BLS 147、BLS 309、BAPB92、TVTHER和BYSYAB或保留了I-S2亚群的特征的它们的功能性变体。

尤其，所说的亲本枯草酶是BLS 309(SAVINASE^_NOVO NORDISKA/S)。

本发明也包括在亲本酶的氨基酸序列上的上述位置上的一个或多个修饰并同时有任何的其它修饰。尤其是与那些本领域已知的并能给所设计的酶提供改良的特性的修饰相结合。现有技术描述了一些具有不同改良特征的枯草酶变体及本文的“发明背景”一节中所提到的那些(上文)。这些参考文献均作为鉴别枯草酶变体的参考，该变体可以与本发明的枯草酶变体进行有益的组合。

这种组合包括位置：222(改善氧化稳定性)，218(改善热稳定性)，在Ca结合位点上稳定酶的取代，例如第76位，以及在现有技术中很明显的其它位置。

在另一实施方案中，本发明的一个枯草酶变体可与下列位置的一个或多个修饰有益地组合起来：27,36,57,76,87,97,101,104,120,123,206,218,222,224,235和274。

特别地，下列的BLS 309和BAPB变体被认为是适于组合的：K27R,*36D, S57P,N76D, S87N,G97N,S101G,V104A,V104N,V104Y,H120D,N123S,Q206E,N218S,M222S,M222A,T224S,K235L andT274A.

而且包括下列变体中的任一个的变体：S101G+V104N,S87N+S101G+V104N,K27R+V104Y+N123S+T274A，或者N76D+V104A或者是这些突变(V104N、S101G、K27R、V104Y、N123S、T274A、N76D、V104A)的其它组合与上面提到的一个或多个修饰的组合表现改善了特征。

本发明的主要方面的更进一步的枯草酶变体优选与下列位置上的修饰中的任一个进行组合，这些位置为129、131、133和194，优选为129K、131H、133P和194P修饰，最优选为P129K、P131H、A133P、A133D和194P修饰。这些修饰中的任一个都可以产生本发明的枯草酶变体的更高水平的表达。进一步的细节请参考本文(下文)的操作实施例。

因此，本发明的更进一步的实施方案涉及一个根据本发明的变体，其中所说的修饰选自：

Y167A+R170S+A194P

Y167A+R170L+A194P

Y167A+R170N+A194P

Y167A+R170S+P129K

Y167A+R170L+P129K

Y167A+R170N+P129K

Y167A+R170S+P131H

Y167A+R170L+P131H

Y167A+R170N+P131H

Y167A+R170S+A133P

Y167A+R170L+A133P

Y167A+R170N+A133P

Y167A+R170S+A133D

Y167A+R170L+A133D

Y167A+R170N+A133D枯草酶基因突变的产生

克隆本发明的枯草酶和在基因(例如枯草酶基因)中导入突变的许多方法是本领域熟知的。

为了得到本发明的枯草酶变体，一般可以使用用来克隆基因并在该基因中导入突变(随机的和/或定点的)的标准方法。对适宜的技术的进一步描述请参考本文(下文)的操作实施例和(Sambrook等(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，NY；Ausubel,F.M.等(编辑)“当代分子生物学方法”。John Wiley & Sons,1995；Harwood,C.R.，和Cutting,S.M.(编者)“芽胞杆菌属的分子生物学方法”。John Wiley & Sons,1990)；和WO 96/34946。表达载体

包括编码本发明的酶的DNA构建体的重组表达载体可以是方便地进行DNA重组步骤的任何载体，载体的选择常取决于其所要导入的宿主细胞。因此，该载体可以是自主复制载体，即可作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒。或者，该载体可以是这样一个：当其被导入宿主细胞中时，其可部分或全部地整合到宿主细胞基因组中并与其所整合的染色体一起复制。

该载体优选为表达载体，其中编码本发明的酶的DNA序列可操作地与该DNA的转录必需的其它节段进行连接。一般地，该表达载体衍生自压质粒或病毒DNA，或同时含有二者的成分。术语“可作地连接”是指设计该节段从而其功能与其期望的目的一致，如起始于启动子并在编码该酶的DNA序列中进行的转录。

该启动子可以是任何DNA序列，其在所选择的宿主细胞中表现出了转录活性，并且可衍生于编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。

在细菌宿主细胞中所用的适当的启动子的实例包括嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因，解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因、或者短小芽孢杆菌木糖苷酶基因的启动子或者是λ噬菌体的Pr或Pl启动子或者大肠杆菌lac、trp或tac启动子。

如果有必要，编码本发明的酶的DNA序列也可以可操纵地与一个适宜的终止子相连接。

本发明的重组载体可进一步含有可使得载体在所讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。

该载体还可含有可选择的标记，例如在宿主细胞中其产物为弥补缺陷的基因，或编码对抗生素例如卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、大观霉素等的抗性，或编码对重金属或杀虫剂抗性的基因。

为指导本发明的酶进入宿主细胞的分泌途径，可在重组载体中提供分泌信号序列(也称之为前导序列、前序列原或前序列)。该分泌信号序列在正确的读码框内被结合到编码该酶的DNA序列上。分泌信号序列一般位于编码该酶的DNA序列的5′。该分泌信号序列可以是那些一般与酶相关的或可以是来源于编码其它分泌蛋白的基因。

用于分别连接编码本发明的酶的DNA序列、启动子以及任选的终止子和/或分泌信号序列的方法，或通过适当的PCR扩增方法来装配这些序列的方法，以及将其插入适当的含有复制或整合所必需的信息的载体的方法，对本领域的技术人员而言都是熟知的(参考，例如Sambrook等，在所引用的书中)宿主细胞

引入宿主细胞的编码本发明的酶的DNA序列与所讨论的宿主既可以是同源的，也可以是异源的。如果与宿主细胞同源，即在天然状态下由宿主细胞产生，其将典型地被可操纵地连接到与其天然环境中的不同的另一个启动子序列上或者，如果可适用地，连到另外一个分泌信号序列和/或终止子序列上。术语“同源的”意指包括编码所讨论的问题中的宿主有机体的天然酶的DNA序列。术语“异源的”是指包括不是由宿主细胞在天然状态下表达的DNA序列。因此，该DNA序列可来源于其它有机体，或者它也可能是合成序列。

本发明的DNA构建体或重组载体所导入的细胞可以是任何能产生本发明的酶的细胞，并包括细菌、酵母、真菌和高等真核细胞。

在培养中能产生本发明的酶的细菌宿主细胞的实例是格兰氏阳性细菌例如芽孢杆菌菌株，例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(B.megatherium)或苏云金芽孢杆菌菌株、或链霉菌属，例如浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌菌株，或格兰氏阴性菌例如大肠杆菌。细菌的转化可通过原生质体转化、电穿孔、共沉淀或通过目前已知的利用感受态细胞的方式来实现(参考，Sambrook等，同上)。

当在细菌如大肠杆菌中表达该酶时，该酶可留在胞质中，一般以不溶粒状物的形式(称之为“包涵体”)，或者也可通过细菌分泌序列定位到外周质间隙去。在头一种情况下，细胞被裂解并回收颗粒物并变性，然后通过稀释变性剂而将酶进行再折叠。在后一种情况下，例如通过超声波或渗透休克来释放外周质间隙的内容物并回收该酶。

当在格兰氏阳性菌例如芽孢杆菌或链霉菌菌株中表达该酶时，该酶可留在胞质中，或可通过细菌性分泌序列定位到细胞外培养基中去。在后一种情况下，该酶可如下所述从培养基中回收。产生枯草酶的方法

本发明提供一种产生根据本发明的分离的酶的方法，其中合适的宿主细胞(其已用编码该酶的DNA序列转化)在允许该酶产生的条件下培养，所得的酶从培养物中回收。

当将包含有编码该酶的DNA序列的表达载体转化进入异源宿主细胞中时，就有可能产生本发明的酶的异源重组体。

因此就有可能制备高度纯化的枯草酶组合物，其特征在于其不含同源杂质。

在本文范围内，同源杂质意指来源于本发明的酶的原始来源的同源细胞的任何不纯物(例如除了本发明的酶之外的其它多肽)。

用于培养该转化的宿主细胞的培养基可以是适于所讨论的宿主细胞生长的任何传统培养基。所表达的枯草酶可方便地分泌到培养基中并可用熟知的方法由此回收，这些方法包括从培养基中离心或过滤而分离细胞，用盐例如硫酸铵沉淀蛋白质成分，接着为层析法例如离子交换层析，亲和层析等。本发明的枯草酶变体的用途

本发明的枯草酶变体可用于一些工业应用中，尤其是在洗涤剂工业中。

而且，本发明涉及酶组合物，其包括本发明的枯草酶变体。

优选的工业应用及相应的优选的酶组合物的总结如下所述。

此总结在任何情况下都不是本发明的合适的枯草酶变体的合适应用的全部列举。本发明的枯草酶变体可用于本领域熟知的包括应用蛋白酶，尤其是枯草酶的其它工业应用中。包括该突变酶的洗涤剂组合物

本发明包括将本发明的突变酶用于清洁和洗剂组合物中以及包括突变枯草蛋白酶的组合物中的应用。本领域中这类清洁和洗涤组合物已进行了详细描述，并参考WO 96/34946；WO 97/07202；WO 95/30011以便进一步对合适的清洁和洗涤组合物进行描述。

进一步的参考可见本文的操作实施例，其中表明本发明的许多枯草酶变体的改善的洗涤效果。洗涤剂公开和实施例表面活性剂系统

根据本发明的洗涤剂组合物包括一个表面活性剂系统，其中的表面活性剂可选自非离子和/或阴离子和/或阳离子和/或两性和/或兼性离子和/或半极性型表面活性剂。

该表面活性剂典型的含量为从0.1％到60％重量。

该表面活性剂优选配成与组合物中的酶组分相容的。液态或凝胶组合物中，该表面活性剂最优选地以可以提高，或至少不降低这些组合物中任何酶的稳定性的方式配制。

根据本发明所使用的优选系统包括一至多个此处所述的非离子和/或阴离子表面活性剂。

烷基酚的聚环氧乙烷，聚环氧丙烷和聚环氧丁烷缩合物适于用作本发明的表面活性剂系统的非离子表面活性剂，优选聚环氧乙烷缩合物。这些化合物包括具有烷基的烷基酚缩合产物，该烷基含约6到14个碳原子，优选从约8至约14个碳原子，其与环氧烷形成直链或支链构型。在一个优选的实施方案中，对每一摩尔烷基酚而言，环氧乙烷的量约等于2到25摩尔，更优选约3到约15摩尔。市场上可买到的这种类型的非离子表面活性剂包括Igepal^TMCO-630，由GAF公司出售；以及由Rohm & Haas公司出售的Triton^TMX-45、X-114、X-100和X-102。这些表面活性剂一般被称为烷基酚烷氧基化物(例如，烷基酚乙氧基化物)。

伯和仲脂族醇与约1到约25摩尔的环氧乙烷的缩合产物适于用作本发明的非离子表面活性剂系统的非离子表面活性剂。脂族醇的烷基链可以是直链，也可以是支链，可以是伯的，也可以是仲的，并且一般含有约8到约22个碳原子。优选那些具有含约8到约20个碳原子、更优选从10到18个碳原子的烷基的醇与对每摩尔醇来说含约2到约10摩尔的环氧乙烷的缩合产物。在所说的缩合产物中对每摩尔醇有约2到约7摩尔的环氧乙烷并且最优选从2到5摩尔的环氧乙烷。市场上可买到这种类型的非离子表面活性剂的实例包括Tergitol^TM 15-5-9(C₁₁-C₁₅线性醇与9摩尔环氧乙烷的缩合物)，Tergitol^TM 24-L-6 NMW(C₁₂-C₁₄伯醇与有窄的分子量分布范围的6摩尔的环氧乙烷缩合物)，二者都由Union Carbide公司出售；Neodd^TM 45-9(C₁₄-C₁₅线性醇与4摩尔的环氧乙烷缩合产物)，Neodol^TM 23-3(C₁₂-C₁₃线性醇与3.0摩尔的环氧乙烷的缩合物)，Neodol^TM 45-7(C₁₄-C₁₅线性醇与7摩尔环氧乙烷的缩合物)，Neodol^TM 45-5(C₁₄-C₁₅线性醇与5摩尔环氧乙烷的缩合物)，它们由Shell化学公司出售；由Procter & Gamble公司出售的Kyro^TMEOB(C₁₃-C₁₅醇与9摩尔的环氧乙烷的缩合物)，由Hoechst出售的GenapolLA 050(C₁₂-C₁₄醇与5摩尔的环氧乙烷的缩合物)。这些产品中优选的HLB范围从8-11而且最优选从8-10。

也在本发明的表面活性剂系统中用作非离子表面活性剂是US 4,564,647所公开的烷基多糖，其带有的疏水基因含有约6到约30个碳原子，优选约10到约16个碳原子以及多糖，例如聚苷，亲水基含约1.3到约10，优选约1.3到约3，最优选约1.3到约2.7个多糖单位。可使用任何含5到6个碳原子的还原多糖，例如葡萄糖、半乳糖而半乳糖基部分可用来代替葡糖基部分(可选地疏水基结合到2-,3-,4-等位上从而得到与葡糖苷或半乳糖苷相对的葡萄糖或半乳糖)。该多糖间键可为，例如，在一个额外的多糖单位的位置与上述多糖单位的2-,3-,4-和/或6-位之间。

优选的烷基多糖具有下面的通式

R²O(C_nH_2nO)_t(糖基)_x其中R²选自烷基、烷基苯基、羟烷基、羟烷基苯基，或者它们的混合物，其中的烷基含有约10到约18，优选从约12到约14个碳原子；n为2或3；t从0到约10；优选0；X从1.3到约10，优选从1.3到约3，最优选从1.3到约2.7。糖基优选衍生自葡萄糖。为制备这些化合物，首先制备醇或烷基聚乙氧基醇，然后与葡萄糖或葡萄糖源反应以形成葡糖苷(结合到1-位上)。然后，该额外的糖基单位可以在其1-位与原先的糖基单位的2-、3-、4-和/或6-位结合，优选绝大部分在2-位间结合。

环氧丙烷与丙二醇缩合所形成的疏水基与环氧乙烷的缩合物也适于用作本发明的另一的非离子表面活性剂系统。这些化合物的疏水部分优选具有从约1500到约1800的分子量并且具水不溶性。聚氧乙烯部分在这种疏水部分的加入能够增加整个分子的水溶性，并且该产品的液态特征保留到聚氧乙烯含量到浓缩物总重的50％，其相当于与达约40摩尔的环氧乙烷发生缩合。这种类型的化合物的实例包括由BASF出售的一些在市场上可买到的Pluronic^TM表面活性剂。

还可用作本发明的非离子表面活性剂系统的非离子表面活性剂是环氧乙烷与由环氧丙烷和1,2-乙二胺反应所得的产物所形成的缩合物。这些产物的疏水部分由1,2-乙二胺和过量的环氧丙烷的反应产物组成，并且一般其分子量从约2500到约3000。该疏水部分与环氧乙烷缩合至缩合产物中含有40％到约80％重量的聚氧乙烯并且分子量从约5000到约11000的程度。这种类型的非离子表面活性剂包括某些市场上可买到的由BASF出售的Tetronic^TM产品。

优选用作在本发明的表面活性剂系统中的非离子表面活性剂的为烷基酚的聚环氧乙烷缩合物，伯和仲脂族醇与从约1到约25摩尔的环氧乙烷的浓缩物，烷基多糖，及它们的混合物。最优选的是具有从3到15个乙氧基的C₈-C₁₄烷基酚乙氧基化物和C₈-C₁₈醇乙氧基化物(优选C₁₀平均数)，而后者具有从2到10个乙氧基，以及它们的混合物。

高度优选的非离子表面活性剂是具有下列通式的多羟基脂肪酸酰胺表面活性剂：其中R¹为H，或R¹为C_1-4烃基、2-羟乙基、2-羟丙基或它们的混合物，R²是C_5-31烃基，而Z为聚羟基烃基，其具有一个线性烃基链，其上有与其直接相连的至少三个烃基，或它们的乙氧化的衍生物。优选R₁为甲基，R₂为直链的C_11-15烷基或C₁₆-C₁₈烷基或链烯基链例如椰子烷基或其混合物，而Z衍生自还原胺化反应中的还原糖例如葡萄糖、果糖、麦芽糖或乳糖。

高度优选的阴离子表面活性剂包括烷基烷氧基化的硫酸盐表面活性剂。此处的实例包括通式为RO(A)_mSO₃M的水溶性的盐或酸，其中R为未取代的C₁₀-C₂₄烷基或具有C₁₀-C₂₄烷基成分的羟烷基，优选C₁₂-C₂₀烷基或羟烷基，更优选C₁₂-C₁₈烷基或羟烷基，A为乙氧基或丙氧基单位，m大于零，典型地在0.5到约6之间，更优选在0.5到约3之间，而M为H或阳离子，例如可为一个金属阳离子(例如，钠、钾、锂、钙、镁，等)，铵或取代的铵阳离子。烷基乙氧基化的硫酸盐及烷基丙氧基化的硫酸盐在本发明中都被考虑。取代的铵阳离子的特定实例包括甲基、二甲基、三甲基铵阳离子以及季铵阳离子例如四甲基铵以及二甲基哌啶鎓离子及那些衍生自烷基胺例如乙胺、二乙胺、三乙胺的，它们的混合物，及诸如此类。表面活性剂的实例为C₁₂-C₁₈烷基聚乙氧基化物(1.0)硫酸盐(C₁₂-C₁₈E(1.0)M),C₁₂-C₁₈烷基聚乙氧基化物(2.25)硫酸盐(C₁₂-C₁₈(2.25)M，以及C₁₂-C₁₈烷基聚乙氧基化物(3.0)硫酸盐(C₁₂-C₁₈E(3.0)M)，以及C₁₂-C₁₈烷基聚乙氧基化物(4.0)硫酸盐(C₁₂-C₁₈E(4.0)M)，其中M可便利地从钠和钾中选择。

所要使用的合适的阴离子表面活性剂为烷基酯磺酸盐表面活性剂，包括根据“美国石油化学学会期刊”，52(1975)第323-329页用气态SO₃磺化的C₈-C₂₀羧酸(即，脂肪酸)的线性酯。合适的起始物质可包括衍生自动物脂、棕榈油等的天然的脂肪族物质。

优选的烷基酯磺酸盐表面活性剂，尤其是用于洗衣的，包括具有下列结构通式的烷基酯磺酸盐表面活性剂：

其中R³是C₈-C₂₀烃基，优选烷基，或其组合，R⁴是C₁-C₆烃基，优选烷基，或其组合，M是与烷基酯磺酸盐形成水溶性盐的阳离子。合适的形成盐的阳离子包括金属，如钠钾，和锂，以及取代或非取代的铵阳离子，例如单乙醇胺、二乙醇胺，和三乙醇胺。优选R³为C₁₀-C₁₆烷基，R⁴为甲基，乙基或异丙基。尤其优选的是甲基酯磺酸盐，其中R³为C₁₀-C₁₆烷基。

其它合适的阴离子表面活性剂包括烷基硫酸盐表面活性剂，其为通式为ROSO₃M的水溶性盐或酸，其中R优选为C₁₀-C₂₄烃基，优选为具有C₁₀-C₂₀烷基成分的烷基或羟烷基，更优选为C₁₂-C₁₈烷基或羟烷基，而M为H或阳离子，例如碱金属阳离子(例如钠、钾、锂)，或铵或取代的铵(例如甲基-、二甲基-、和三甲基铵阳离子及季铵阳离子例如四甲基铵和二甲基哌啶鎓阳离子及衍生自例如乙铵、二乙胺、三乙胺，和它们的混合物的季胺阳离子，等等)。一般而言，C₁₂-C₁₆的烷基链优选于较低的洗涤温度(例如低于约50℃)以及C₁₆-C₁₈烷基链优选于较高的洗涤温度(例如高于约50℃)。

用于洗涤目的其它阴离子表面活性剂也可包括到本发明的洗衣剂组合物中来。这些可包括皂的盐(包括，例如，钠、钾、铵和取代的铵盐例如单、二和三乙醇铵盐)，C₈-C₂₂伯或仲烷基磺酸盐，C₈-C₂₄烯属磺酸盐，通过碱土金属柠檬酸盐的热解产物的磺化制备的磺化的聚羧酸，例如英国专利说明书1,082,179所描述，C₈-C₂₄烷基聚乙二醇醚硫酸盐(含有多至10摩尔的环氧乙烷)；烷基甘油磺酸盐，脂肪酰甘油磺酸盐、脂肪油酰甘油硫酸盐、烷基、酚环氧乙烷醚硫酸盐、链烷烃磺酸盐、烷基磷酸盐、羟乙磺酸盐例如酰基羟乙磺酸盐，N-酰基牛磺酸盐，烷基琥珀酰胺酸盐和磺基琥珀酸盐，磺基琥珀酸酯的单酯(尤其是饱和和未饱和的C₁₂-C₁₈单酯)以及磺基琥珀酸酯的二酯(尤其是饱和和未饱和的C₆-C₁₂二酯)，酰基肌氨酸盐，烷基多糖的硫酸盐例如烷基聚葡糖苷的硫酸盐(如下所述的非离子非硫酸化的化合物)，支链的伯烷基硫酸盐，以及烷基聚乙氧基羧酸盐例如那些具通式RO(CH₂CH₂O)_k-CH₂OO-M⁺的，其中R是C₈-C₂₂烷基，k是1-10的整数，而M为形成可溶盐的阳离子。树脂酸和氢化的树脂酸也是适合的，例如松脂、氢化的松脂，以及存在于或衍生自浮油的树脂酸和氢化的树脂酸。

高度优选的是烷基苯磺酸盐。尤其优选的是线性(直链)的烷基苯磺酸盐(LAS)，其中的烷基优选含有从10到18个碳原子。

进一步的实例见“表面活性剂和去污剂”(第Ⅰ卷和第Ⅱ卷，Schwartz,Perry和Berch)。许多这种表面活性剂在US 3,929,678中也有一般性的公开(第23段，第58行到第29段，第23行，在此处用作参考)。

若被包括其中，本发明的洗衣剂组合物一般从约1％到约40％，优选从约3％到约20％重量的这种阴离子表面活性剂。

本发明的洗衣剂组合物也可含有阳离子、两性、两性离子和半极性的表面活性剂，以及除了本文已描述过的以外的其它非离子和/或阴离子表面活性剂。

适于本发明的洗衣去污剂组合物所用的阳离子去污表面活性剂是具一个长链烃基的那些。这种阳离子表面活性剂的实例包括铵表面活性剂例如烷基三甲基铵卤化物，以及具有通式：

[R²(OR³)_y][R⁴(OR³)_y]₂R⁵N+X-的表面活性剂，其中R²为烷基或在烷基链中具有约8到约18个碳原子的烷基苄基基团，每个R³选自-CH₂CH₂-,-CH₂CH(CH₃)-,CH₂CH(CH₂OH)-,-CH₂CH₂CH₂-，以及它们的混合物；每个R⁴选自C₁-C₄烷基，C₁-C₄羟烷基，通过将两个R⁴基团结合在一起形成的苄环，-CH₂CHOHCHOHCOR⁶CHOHCH₂OH其中R⁶为己糖或任何分子量小于1000的己糖多聚物，而且当y不是0时，它是氢；R⁵与R⁴相同或者它是一个烷基链，其中碳原子总数或R²加上R⁵不多于约18；每个y从0到约10，而y值的总数从0到约15；X是任何相容的阴离子。

高度优选的阳离子表面活性剂是本发明的组合物中所用的水溶性季铵化合物，其具有下列通式：

R₁R₂R₃R₄N⁺X^-(i)其中R¹为C₈-C₁₆烷基，R₂,R₃和R₄中的每一个分别是C₁-C₄烷基，C₁-C₄羟烷基，苄基，以及-(C₂H₄₀)_xH其中x的值从2到5，而X为阴离子。R₂,R₃或R₄中不少于一个应为苄基。

对R₁，优选的烷基链长为C₁₂-C₁₅，尤其若其中烷基为衍生自椰子或棕榈核脂肪的链长的混合物或者是由烯烃构建或羰基合成醇合成而人工合成衍生时。

优选的R₂R₃和R₄基团是甲基和羟乙基，而且阴离子X可选自卤离子、甲基硫酸根、乙酸根及磷酸根离子。

此处所用的合适的通式(ⅰ)的季铵化合物的实例为：

氯化或溴化椰子三甲基铵；

氯化或溴化椰子甲基二羟乙基铵；

氯化癸基三乙基铵；

氯化或溴化癸基二甲基羟乙基铵；

氯化或溴化C₁₂-C₁₅二甲基羟乙基铵；

氯化或溴化椰子二甲基羟乙基铵；

甲基硫酸肉豆蔻基三甲基铵；

氯化或溴化月桂基二甲基苄铵；

氯化或溴化月桂基二甲基(乙氧基)₄铵；

胆碱酯(通式(ⅰ)的化合物，其中R₁为

烷基而且R₂R₃R₄为甲基)。

二-烷基咪唑啉[通式(ⅰ)的化合物]。

此处所用的其它阳离子表面活性剂也在US 4,228,044和EP 000 224中有描述。

若在其中包括，本发明的洗衣剂组合物一般包括从0.2％到约25％，优选从约1％到8％重量的这种阳离子表面活性剂。

两性表面活性剂也适用于本发明的洗衣剂组合物。这些表面活性剂可被广泛地描述为仲胺或叔胺的脂族衍生物；或者是杂环仲胺和叔胺的脂族衍生物，其中脂族基团可以是直链也可是支链的。其中的一个脂族取代基含有至少约8个碳原子，一般从约8到约18个碳原子，并且至少一个是含有阴离子的水溶性基团的，例如羧基、磺酸根，硫酸根。两性表面活性剂的实例见US 3,929,678(第19段，第18-35行)。

若包括其中，本发明的洗衣剂组合物一般含有从0.2％到约15％，优选从约1％到10％的重量的这种两性表面性剂。

两性离子表面活性剂也适用于洗衣剂组合物。这些表面表面活性剂可被广泛地描述为仲胺和叔胺的衍生物，杂环仲胺和叔胺的衍生物，或者季胺的衍生物，季磷鎓或叔锍化合物的衍生物。两性离子表面活性剂的实例参见US 3,929,678(第19段，第39行至第22段，第48行)。

若包括其中，本发明的洗衣剂组合物一般包括从0.2％到约15％，优选从约1％到约10％重量的这种两性离子表面活性剂。

半极性的非离子表面活性剂是一类特殊的非离子表面活性剂，其包括水溶性的氧化胺，其含有一个烷基部分，有从约10到约18个碳原子，以及选自含有约1到约3个碳原子的烷基和羟烷基的2个部分；含有一个从约10到约18个碳原子的烷基部分以及选自含约1-3个碳原子的烷基和羟烷基的2部分的水溶性氧化膦；以及含约10到约18个碳原子的烷基部分及一个选自含从约1到约3个碳原子的烷基和羟烷基部分的水溶性的亚砜。

半极性的非离子去污剂表面活性剂包括具有下式的氧化胺表面活性剂：其中R³为含从约8到约22个碳原子的烷基、羟烷基、或烷基苯基或其混合物；R⁴为含有从约2到约3个碳原子的亚烷基或羟亚烷基或其混合物；x从0到约3：而每个R⁵为烷基或羟烷基，其含有从约1到约3个碳原子，或含有从约1到约3个环氧乙烷基团的聚环氧乙烷基。该R⁵基团可互相结合，例如，通过一个氧原子或氮原子来形成环的结构。

这些氧化胺表面活性剂尤其包括C₁₀-C₁₈烷基二甲基氧化胺和C₈-C₁₂烷氧基乙基二羟基乙基氧化胺。

若包括于其中，本发明的洗衣洗剂组合物一般包含从0.2％到约15％；优选从约1％到约10％重量的这种半极性非离子表面活性剂。助洗剂系统

根据本发明的组合物可进一步含有助洗剂系统。任何传统的助洗剂系统都在此处适用，包括硅铝酸盐材料、硅酸盐、聚羧酸盐和脂肪酸，例如乙二胺四乙酸盐的材料，金属离子螯合剂，如氨基聚膦酸盐，尤其是乙二胺四亚甲基膦酸及二乙三胺五亚甲基膦酸。虽由于明显的环境原因而较不优选，但此处还是可以使用磷酸盐助洗剂的。

合适的助洗剂可以是无机的离子交换物质，一般是无机的水合的硅铝酸盐材料，更具体是水合的合成的沸石例如水合沸石A、X、B、HS或MAP。

另外的合适的无机助洗剂材料是层叠式的硅酸盐，例如SKS-6(Hoechst)。SKS-6是由硅酸钠(Na₂Si₂O₅)组成的结晶态的层叠式硅酸盐。

含有一个羧基的合适的聚羧酸盐包括比利时专利号831,368,821,369和821,370所公开的乳酸、乙醇酸及其醚衍生物。含有两个羧基的聚羧酸盐包括琥珀酸、丙二酸、(亚乙二氧基)二乙酸、马来酸、二乙醇酸、酒石酸，丙醇二酸和富马酸的水溶性盐类，以及德国公开说明书2,446,686，以及2,446,487，美国3,935,257中所描述的醚羧酸盐以及比利时专利号840,623中所描述的亚磺酰羧酸盐。含有三个羧基的聚羧酸盐包括，尤其是，水溶性的柠檬酸盐、顺乌头酸盐(aconitrate)和柠康酸盐以及琥珀酸盐衍生物例如英国专利号1,379,241所描述的羧甲基氧琥珀酸盐，荷兰申请7205873所描述的乳氧琥珀酸盐，以及英国专利号1,387,447中所描述的氧化聚羧酸盐材料例如2-噁-1,1,3-丙烷三羧酸盐。

含有四个羧基的聚羧酸盐包括英国专利号1,261,829所公开的氧二琥珀酸盐、1,1,2,2-乙烷四羧酸盐，含磺基取代基的1,1,3,3-丙烷四羧酸盐，包括英国专利号1,398,421和1,398,422和美国专利号3936,488所公开的磺基琥珀酸盐衍生物，以及英国专利号1,082,179所描述的磺化的热解的柠檬酸盐，而英国专利号1,439,000中所公开的是含膦取代基的聚羧酸盐。

脂族和杂环的聚羧酸盐包括环戊烷-顺，顺-顺-四羧酸盐，环戊二烯五羧酸盐(cyclopentadienide pentacarboxylates),2,3,4,5-四氢呋喃-顺，顺，顺-四羧酸盐，2,5-四氢-呋喃-顺，顺羧酸盐(2,5-tetrahydro-furan-cis,discarboxylates),2,2,5,5-四氢呋喃-四羧酸盐，1,2,3,4,5,6-己烷-六羧酸盐和多元醇例如山梨醇、甘梨糖醇和木糖醇的羧甲基衍生物。英国专利号1,425,343中所公开的芳香族聚羧酸盐包括苯六甲酸、1,2,4,5苯四酸以及苯二甲酸衍生物。

上述中，优选的聚羧酸盐是每分子含有多至三个羧基的羟基羧酸盐，更具体的是柠檬酸盐。

本发明优选使用的优选的助洗剂系统包括一种水溶性硅铝酸盐助洗剂例如沸石A或层叠硅酸盐(SKS-6)与一种水溶性的羧酸螯合剂例如柠檬酸的混合物。

包括在本发明的去污剂组合物中的合适的螯合剂是乙二胺-N,N′-二琥珀酸(EDDS)或者是其碱金属、碱土金属，铵，或取代的铵盐，或其混合物。优选的EDDS化合物为游离酸形式，和其钠或镁盐。这种优选的EDDS的钠盐实例包括Na₂EDDS和Na₄EDDS。这种优选的EDDS的镁盐实例包括MgEDDS和Mg₂EDDS。根据本发明的组合物中最优选是其镁盐。

优选的助洗剂系统包括水不溶性铝硅酸助洗剂例如沸石A与水溶性羧酸螯合剂例如柠檬酸的混合物。

能够用于颗粒组合物中形成助洗剂系统部分的其它助洗剂物质包括无机物质例如碱金属碳酸盐，碳酸氢盐、硅酸盐，和有机物质例如有机膦酸盐、氨基聚亚烷磷酸盐和氨基聚羧酸盐。

其它合适的水溶性有机盐是其均聚或共聚酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个羧基，它们由不超过两个的碳原子分隔开。

这种类型的多聚物公开于GB-A-1,596,756中。这种盐的实例为MW2000-5000的聚丙烯酸盐及其与马来酐的共聚体，这种共聚物的分子量从20,000到70,000，特别是约40,000。

洗涤剂助洗剂盐一般包括的量是组合物重量的5％到80％。液体洗涤剂的助洗剂的优选量从5％到30％。酶

优选的洗涤剂组合物除了本发明的酶制剂之外，还包括其它提供清洁效果和/或织物护理优点的酶。

这类酶包括其它蛋白酶、脂酶、角质酶(Cutinases)、淀粉酶、纤维素酶、过氧化物酶、氧化酶(例如漆酶)。蛋白酶：任何适于在碱性溶液中使用的其它蛋白酶都可使用。合适的蛋白酶包括那些来源于动物、植物或微生物的。优选来源于微生物的。包括化学或遗传修饰后的突变体。该蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或类胰蛋白酶的蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草蛋白酶、尤其是那些衍生自芽孢杆菌的，例如枯草蛋白酶Novo，枯草蛋白酶Carlsberg，枯草蛋白酶309，枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶148(WO 89/06279有描述)。类糜蛋白酶的蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如来源于猪或牛)及WO89/06270中所述的镰孢菌属蛋白酶。

优选的市场上可买到的蛋白酶包括那些以商品名Alcalase、Savinase、Primase、Durazym，和Esperase，由Novo Nordisk A/S(丹麦)出售，由Genencor Intemational以商品名Maxatase、Maxacal、Maxapem、Properase、Purafect和Purafect OXP，以及由Solvay Enzymes以商品名Opticlean和Optimase出售的。可包括在本发明的组合物范围内的蛋白酶占从0.00001％到2％的组合物重量的酶蛋白，优选0.001％-1％组合物重量的酶蛋白，更优选占该组合物重量0.001％到0.5％的酶蛋白，进一步优选占该组合物重量0.01％到0.2％的酶蛋白。脂肪酶：任何适于在碱性溶液中使用的脂肪酶都可被使用。适合的脂肪酶包括那些来源于细菌或真菌的。包括化学或遗传修饰的突变体。

有用的脂肪酶的实例包括Humicola lanuginosa脂酶，例如EP 258 068和EP 305 216中所描述，Rhizomucor miehei脂酶，例如EP 238,023中所描述，念珠菌属脂酶，例如C.antarctica脂酶，例如EP 214 761中所述的C.antarctica脂酶A和B，假单胞菌属脂酶如产碱假单胞菌和类产碱假单胞菌，例如EP 218 272中所述，洋葱伯克霍尔德氏菌脂酶，例如EP 331 376中所述，施氏假单胞菌脂酶，例如GB 1,372,034所公开，荧光假单胞菌脂酶，芽孢杆菌脂酶，例如枯草芽孢杆菌脂酶(Dartois等，(1993),Biochemicaet Biophysia acta 1131,253-260)，嗜热脂肪芽孢杆菌脂酶(JP 64/744992)及短小芽孢杆菌脂酶(WO 91/16422)。

而且，可以使用许多克隆的脂酶，包括Yamaguchi等(1991),Gene 103,61-67所描述的沙门氏柏干酪青霉脂酶，白地霉脂酶(Schimada,Y.等，(1989),J.Biochem.,106,383-388)，以及各种根霉脂酶例如德列马青霉脂酶(Hass,M.J.等，(1991),Gene 109,117-113)，雪白根霉(Kugimiya等，(1992),Biosci,Biotech.Biochem.56,T16-719)和米根霉脂酶。

也可使用其它类型的脂解酶例如角质酶，例如WO 88/09367所述的来源于门多茜娜假单胞菌的角质酶，或者是来源于Fusarium solani pisi(例如WO 90/09446中所述)的角质酶。

特别适合的脂酶是例如M1 Lipase^TM、Luma fast^TM和Lipomax^TM(Genecor),Lipolase^TM和Lipolase Ultra^TM(Novo Nordisk A/S)，以及Lipase P“Amano”(Amano Pharmaceutical Co.Ltd.)的脂酶。

这些脂酶在去污剂组合物中一般以该组合物重量的0.00001％到2％的酶蛋白的量存在，优选为占该组合物重量的0.0001％到1％的酶蛋白，更优选为占该组合物重量0.001％到0.5％的酶蛋白，进一步优选为占该组合物重量0.01％到0.2％的酶蛋白。

淀粉酶：任何适于在碱性溶液中使用的淀粉酶(α和/或β)都可使用。合适的酶包括那些来源于细菌和真菌的。包括化学或遗传修饰的突变体。淀粉酶包括，例如，来自于地衣芽孢杆菌的特定株的α-淀粉酶，其在GB1,296,839中有更详细的描述。市场上可买到的淀粉酶为Duramyl^TM,Termamyl^TM，Fungammyl^TM和BAN^TM(来自于Novo Nordisk A/S)和Rapidase^TM和Maxamyl P^TM(来自于Genencor)。

在去污剂组合物中所包括的淀粉酶的量一般是占组合物重量为0.00001％到2％的酶蛋白，优选为占该组合物重量0.0001％到1％的酶蛋白，更优选为占该组合物重量0.001％到0.5％的酶蛋白，进一步优选为占该组合物重量为0.01％到0.2％的酶蛋白。纤维素酶：可使用任何用于碱性溶液中的纤维素酶。合适的纤维素酶包括那些来源于细菌或真菌的。包括化学或遗传修饰的突变体。合适的纤维素公开于美国4,435,307中，其公开了来自于Humicola insolens的真菌纤维素酶。尤其适合的纤维素酶是具有护色功能的纤维素酶。这种纤维素酶的实例是欧洲专利申请号0 495 257中所述的纤维素酶。

市场上可买到的纤维素酶包括Celluzyme^TM，其产自Humicola insolens的一个菌株(Novo Nordisk A/S)，以及KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)。

洗涤剂组合物中的纤维素酶常以占该组合物重量的0.00001％到2％酶蛋白的量加入，优选为占该组合物重量的0.0001％到1％酶蛋白，更优选为占该组合物重量0.001％到0.5％的酶蛋白，进一步优选为占该组合物重量的0.01％到0.2％的酶蛋白。过氧化物酶/氧化酶：过氧化物酶与过氧化氢或其来源一起使用(例如过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)。氧化酶与氧一起使用。两种类型的酶都用于“溶液漂白”，即当所说的织物在洗涤液中一起洗涤时防止织物染料从一种已染色的织物转移到另一种织物上，优选与例如WO 94/12621和WO 95/01426的增效剂一起使用。合适的过氧化氢酶/氧化酶包括来自于植物、细菌和真菌的。包括化学或遗传修饰的突变体。

过氧化氢酶和/或氧化酶一般以占该组合物重量0.00001％到2％的酶蛋白的量加入到洗涤剂组合物中，优选以占该组合物重量0.0001％到1％的酶蛋白的量，更优选以占该组合物重量的0.001％到0.5％酶蛋白的量，进一步优选占该组合物重量的0.01％到0.2％的量。

本文包括上述的酶的混合物，优其是蛋白酶、淀粉酶，脂酶和/或纤维素酶。

本发明的酶，或者加入到洗涤剂组合物中的任何其它酶一般都以占该洗涤剂组合物重量的0.00001％到2％的蛋白酶量加入，优选以占该组合物重量的0.0001％到1％的酶蛋白的量，更优选以占该组合物重量的0.001％到0.5％的酶蛋白的量，进一步优选以占该组合物重量的0.01％到0.2％的量。漂白剂：额外的可选洗涤剂成分可以包括在本发明的洗涤剂组合物中的包括漂白剂例如PB1、PB4和具有颗粒大小为400-800微米的过碳酸盐。这些漂白剂组分可包括一种或多种氧漂白剂以及，取决于所选漂白剂的一种或多种漂白活化剂。本氧漂白化合物将一般以约1％到约25％的量存在。一般而言，在非液体配方如粒状去污剂中，漂白化合物是任选加入的成分。

此处所用的漂白剂可以是任何用于去污剂组合物中的漂白剂，包括氧漂白剂及其它本领域熟知的。

适用于本发明的漂白剂可以是活化或非活化的漂白剂。

可以使用的一类氧漂白剂包括过羧酸漂白剂及其盐。该类型漂白剂的合适实例包括六水合单过氧邻苯二甲酸镁，间氯过苯甲酸、4-壬胺-4-氧代过氧丁酸和二过氧十二双酸的镁盐。这类漂白剂公开于US 4,483,781,US740,446,EP 0 133 354和US 4,412,934中。高度优选的漂白剂还包括6-壬胺-6-氧代过氧己酸，如US 4,634,551中有描述。

另一类可以使用的漂白剂包括卤素漂白剂。hypohalite漂白剂的实例例如包括三氯异氰尿酸以及二氯异氰尿酸的钠和钾盐，以及N-氯和N-溴烷基磺酰胺。这些材料一般以占终产品重量的0.5-10％加入，优选以1-5％的重量。

可与漂白活化剂一起使用的过氧化氢释放剂例如四乙酰乙二胺(TAED)，壬酰氧苯磺酸盐(NOBS，描述于US 4,412,934),3,5-三甲基-己酰氧苯磺酸盐(ISONOBS,EP 120591所述)或五乙酰葡萄糖(PAG)，其被全水解形成过酸作为活性漂白物，产生改进的漂白效果。此外，非常适用的有漂白活化剂C₈(6-辛酰氨-己酰)氧苯磺酸盐，C₉(6-壬酰氨-己酰)氧苯磺酸盐和C₁₀(6-癸酰氨己酰)氧苯磺酸盐或其混合物。也适合的活化剂是酰化的柠檬酸酯，例如欧洲专利申请号91870207.7中所公开的。

包括过酸及含有本发明的清洗组合物所用的漂白活化剂和过氧漂白化合物的漂白系统的有用的漂白剂描述于申请USSN 08/136,626中。

通过加入酶系统(即酶及其底物)也可以产生过氧化氢，该酶系统在洗涤和/或漂洗过程开始或进行中能够产生过氧化氢。这种酶系统公开于欧洲专利申请EP 0 537 381中。

除了氧漂白剂外的漂白剂也是本领域已知的而且可用于此处。特别感兴趣的一种非氧漂白剂包括光活化的漂白剂例如磺化酞菁锌和/或铝。在洗涤过程中这些物质可沉积到底物上。当以光照射时，在有氧存在下，例如将衣物挂于日光下，磺化的酞菁锌被活化，并因此使得底物被漂白。优选的酞菁锌和光活化的漂白过程描述于US 4,033,718中。一般地，去污剂组合物中将含占其重量约0.025％到约1.25％的磺化酞菁锌。

漂白剂还可含有锰催化剂。该锰催化剂可例如是描述于“低温漂白的有效的锰催化剂”Nature 369,1994，第637-639中的一种化合物。泡沫抑制剂：另外一个可选的成分是泡沫抑制剂，其例子有硅氧烷和硅石-硅氧烷混合物。硅氧烷一般以烷基化的聚硅氧烷材料表示，而硅石常使用是精细分散的形式的，其例子是硅石气凝胶和干凝胶以及各种类型的疏水二氧化硅。这些材料可作为粒子加入，其中的泡沫抑制剂有益可释放地掺入到水溶性或水可扩散性的，基本上是非表面活性去污剂可渗透的载体中。可互换地，泡沫抑制剂可溶于或分散于液态载体中，并通过喷洒而应用于一种或多种其它组分上。

优选的硅氧烷泡沫抑制剂公开于US 3,933,672中。其它特别有用的泡沫抑制剂为自身乳化硅氧烷泡沫抑制剂，描述于德国专利申请DTOS2,646,126中。这种化合物的一个实例是DC-544，市场上可买到的形式是Dow Corming，其为一种硅氧烷-甘醇共聚物。尤其优选的泡沫控制剂是含有硅氧烷油和2-烷基-链烷醇的混合物的抑泡系统。合适的2-烷基-链烷醇是2-丁基-辛醇，其市场上可买到的是商品名ISofol 12R。

这种泡沫抑制剂系统描述于欧洲专利申请EP 0 593 841。

尤其优选的硅氧烷泡沫抑制剂描述于欧洲专利申请号92201649.8。所说的组合物可包含硅氧烷/二氧化硅混合物，其结合烟熏的非多孔性二氧化硅例如Aerosil^_。

上面所描述的泡沫抑制剂使用时一般占本组合物重量的0.001％到20％，优选从0.01％到1％。其它成分：在去污剂组合物中使用的其它成分可有例如污垢悬浮剂、污垢释放剂，荧光增白剂、研磨剂、杀菌剂、晦暗抑制剂、着色剂、和/或包胶或未包胶的香料。

尤其适用的包胶材料是水溶性的胶囊，其由多糖和多羟基的化合物组成，例如GB 1,464,616中所描述。

其它合适的水溶性包胶材料包括如US 3,455,838中所述的衍生自取代的二羧酸的未凝胶化的淀粉酸酯的糊精。这些酸性酯糊精优选制备自这种淀粉例如含蜡玉米、含蜡高梁、西米、木薯和马铃薯。所说封装材料的合适的例子包括由National Starch制造的N-Lok。N-Lok封装材料由改良的玉米淀粉和葡萄糖组成。淀粉的改良通过加入单官能的取代基例如辛烯基琥珀酸酐。

此处适用的抗再沉洗剂和污垢悬浮剂包括纤维素衍生物例如甲基纤维素、羧甲基纤维素和羟乙基纤维素，以及均聚或共聚的聚羧酸或其盐。这种类型的多聚物包括聚丙烯酸酯及前面提到过作为助洗剂的马来酸酐-丙烯酸共聚物，以及马来酸酐和乙烯，甲基乙烯基醚或异丁烯酸的共聚物，马来酸酐至少构成共聚物摩尔数的20％。这些材料一般用量是组合物重量的0.5％到10％，更优选0.75％到8％，最优选从1％到6％。

优选的荧光增白剂是阴离子的，其例子有4,4′-二-(2-二乙醇氨-4-苯胺基-S-三嗪-6-基-氨基)芪-2:2′-二磺酸二钠，4,-4′-=-(2-吗啉代-4-苯胺基-S-三嗪-6-基氨基-芪-2:2′-二-磺酸二钠，4,4′-二-(2,4-二-苯胺基-S-三嗪-6-基氨基)芪-2:2′-二磺酸二钠，4′,4″-二-(2,4-二-苯胺基-S-三嗪-6-基氨基)芪-2-磺酸单钠，4,4′-二-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟乙基氨基)-S-三嗪-6-基氨基)芪-2,2′-二磺酸二钠，4,4′-二-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)-芪-2,2′-二磺酸二钠，4,4′二(2-苯胺基-4-(1-甲基-2-羟乙基氨基)-S-三嗪-6-基氨基)芪-2,2′-二磺酸二钠，2(芪基-4″-(萘并-1′,2′:4,5-)-1,2,3-三唑-2″-磺酸钠和4,4′-二(2-硫代苯乙烯基)二苯基。

其它有用的多聚体物质为聚乙二醇，尤其是分子量为1000-10000，更尤其是2000到8000，最优选为约4000。其用量为0.20％到5％重量，更优选为0.25％到2.5％重量。这些多聚体和前面提到的均聚或共聚聚羧酸盐在改进的洁白保持、织物灰尘沉淀、以及在过渡金属杂质存在下对陶土，含蛋白质及可氧化污垢的清洁效果方面是很有价值的。

在本发明的组合物中使用的污垢释放剂一般是对苯二酸与乙二醇和/或丙二醇单位的以各种排列的共聚体或三元共聚物。这种多聚体的实例公开于US 4,116,885和4,771,730和EP 0 272 033中。根据EP 0 272 033的一个尤其优选的多聚体具有通式：

(CH₃(PEG)₄₃)_0.75(POH)_0.25[T-PO]_2.8(T-EG)_0.4]T(POH)_0.25((PEG)₄₃CH₃)_0.75

其中PEG为-(OC₂H₄)O-,PO为(OC₃H6O),T是(POOC₆H₄CO)。

也很有用的是经修饰的聚酯，其为二甲基对苯二酸、二甲基磺基异邻苯二甲酸盐、乙二醇和1,2-丙二醇的随机共聚物，其末端基团主要由硫代苯甲酸酯和次要的乙二醇和/1,2-丙二醇的单酯组成。目的是得到两端都被加上了硫代苯甲酸基团的帽子的多聚体，“主要”在本公开中此处所说的大多数共聚体将被硫代苯甲酸基加上末端帽子。然而，有些共聚体将有部分还未被全部加帽，因此其末端基团可能由乙二醇和/或1,2-丙二醇的单酯所组成，因此由这些“次要”的物种。

此处所选的聚酯含有占重量46％的二甲基对苯二酸，占重量约为16％的1,2-丙二醇，占重量约为10％的乙二醇，约13％的二甲基硫代苯甲酸，以及约15％的磺基异邻苯二甲酸，而分子量约为3,000。该聚酯及其制备方法的细节描述见EP 311 342。

柔顺剂：织物柔顺剂也可包括在本发明的洗衣剂组合物中。这些剂可以是无机的也可以是有机的。无机柔顺剂例如公开于GB-A-1 400898和US5,019,292中的绿土粘土。有机织物柔顺剂包括GB-A1 514 276和EP 0 011340中公开的水不溶性的叔胺，以及EP-B-0 026 528中公开的其与单C₁₂-C₁₄季铵盐的并用和EP 0 242 919中公开的二长链酰胺。其它有用的织物柔顺剂系统的有机成分包括高分子量的聚环氧乙烷物质，其公开于EP 0 299 575和0313146中。

绿土粘土的用量一般在5％到15％重量的范围内，更优选占重量的8％到12％，该物质作为干混合成分加到配方的剩余部分中。有机织物柔顺剂例如水不溶性的叔胺或双长链酰胺物质以重量比为0.5％到5％的量掺入，一般从1％到3％，但高分子量的聚环氧乙烷物质和水溶性的阳离子物质物质加入的量为重量比从0.1到2％，一般为0.15％到1.5％。这些物质一般加到该组合物的喷雾干燥部分，虽然在有些情况下将其作为干燥混合颗粒加入可能是更方便的，或将其作为熔融液体喷到该组合物的其它固体成分上。多聚染料-转移抑制剂：根据本发明的去污剂组合物也可含有从占重量比为0.001％到10％，优选从0.01％到2％，更优选从0.05％到1％的多聚染料-转移抑制剂。所说的多聚染料-转移抑制剂一般掺入到去污剂组合物中用以抑制染料从其所染的织物上转染到一起洗涤的织物上。这些多聚物具有的能力可在染料有机会结合到洗涤中的其它衣物上之前将从染过的织物上洗涤下来的短效染料复合或吸收掉。

尤其适合的多聚染料-转移抑制剂是聚胺N-氧化物聚合物，N-乙烯基-吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物，聚乙烯基吡咯烷酮多聚物，聚乙烯基噁唑烷酮聚乙烯咪唑或其混合物。

这些多聚物的加入也增强了本发明的酶的效果。

根据本发明的去污剂组合物可以是液体、糊状，胶状，条状，或粒状形式。

可生产非粉尘的颗粒，例如，US 4,106 991和4,661,452(二者均对NovoIndustri A/S)所公开并且可选地以本领域已知技术包被。蜡状包被材料的实例有聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)，平均分子量为1000到20000；具有16到50个环氧乙烷单位的乙氧化的壬基酚；其中有15到80个环氧乙烷单位的含12到20个碳原子的醇的乙氧化的脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；脂肪酸的单和二和三甘油酯。通过液床技术适于应用的成膜包被材料的实例见于GB 1483591。

根据本发明的粒状组合物也可以是“压缩形式”，即其密度可相对高于传统的粒状去污剂，即550到950克/升；在这种情况下，根据本发明的粒状去污剂相对于传统的粒状去污剂将含有较低量的“无机填充盐”；典型的填充盐为硫酸和氯化的碱土金属盐，典型的是硫酸钠；“压缩的”去污剂典型地含有不超过10％的填充盐。本发明的液体组合物也可为浓缩形式的，在此情况下，根据本发明的液体组合物与传统的液体去污剂而言将含有更低数量的水。典型地，浓缩的液体去污剂的含水量会低于去污剂重量的30％，更优选低于20％，最优选低于10％。

本发明的组合物可例如配成手洗或机洗的洗衣去污剂组合物，包括洗衣添加组合物和适用于染色的织物预处理的组合物。漂洗添加织物柔顺组合物，以及适于一般家庭坚硬表面清洗操作和洗碟操作的组合物。

下面的实施例意在说明本发明的组合物，但是并非意在限制或另外限定本发明的范围。

在该去污剂组合物中，简写的组分具有下列意思。

LAS：线性C₁₂烷基苯磺酸钠

TAS：牛脂烷基硫酸钠

XYAS：C_1X-C_1Y烷基硫酸钠

SS：通式2-丁基辛酸的二级皂表面活性剂

25EY：与平均有Y摩尔环氧乙烷缩合的C₁₂-C₁₅的主要是线性的伯醇

45EY：与平均有Y摩尔环氧乙烷缩合的C₁₄-C₁₅的主要是线性的伯醇

XYEZS：与平均每摩尔有Z摩尔环氧乙烷缩合的C_1x-C_1y烷基硫酸钠

非离子的：C₁₃-C₁₅混合的乙氧化/丙氧化的脂肪醇，其平均乙氧化程度

为3.8而平均丙氧化程度为4.5，商品名为plurafax LF404，

由BASF Gmbh出售

CFAA：C₁₂-C₁₄烷基N-甲基葡糖酰胺(glucamide)

TFAA：C₁₆-C₁₈烷基N-甲基葡糖胺

硅酸盐：无定形的硅酸钠(SiO₂∶Na₂O比率=2.0)

NaSK-6：通式δ-Na₂Si₂O₅结晶层化的硅酸盐

碳酸盐：无水碳酸钠

磷酸盐：三聚磷酸钠

MA/AA：1∶4马来酸/丙烯酸的共聚物，平均分子量约为80,000

聚丙烯酸酯：聚丙烯酸酯均聚物，平均分子量为8,000，由BASF Gmbn

以商品名PA30出售

沸石A：通式Na₁₂(AlO₂SiO₂)₁₂·27H₂O的水合硅铝酸钠，基本颗粒大

小在1到10微米范围内

柠檬酸盐：二水柠檬酸三钠

柠檬酸：柠檬酸

过硼酸盐：无水的单水合过硼酸钠漂白，经验式为NaBO₂·H₂O₂

PB4：无水的四水合过硼酸钠

过碳酸钠：无水的过碳酸钠漂白剂，经验式为2Na₂CO₃·3H₂O₂

TAED：四乙酰乙二胺

CMC：羧甲基纤维素钠

DETPMP：二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)，由Monsanto以商品名

Dequest 2060出售

PVP：聚乙烯基吡咯烷酮多聚物

EDDS：乙二胺-N,N′-二琥珀酸，钠盐形式的[S,S]异构体

泡沫抑制剂：25％石蜡(熔点50℃),17％疏水二氧化硅，58％石蜡油

粒状泡沫抑制剂：12％硅氧烷/二氧化硅，18％十八烷醇，70％粒状

淀粉

硫酸盐：无水硫酸钠

HMWPEO：高分子量聚环氧乙烷

TAE 25：牛脂醇乙氧化物(25)去污剂实施例Ⅰ

根据本发明的粒状的织物清洁组合物可按下法配制：线性C₁₂烷基苯磺酸钠 6.5硫酸钠 15.0沸石A 26.0次氮基三乙酸钠 5.0本发明的酶 0.1PVP 0.5TAED 3.0硼酸 4.0过硼酸盐 18.0苯酚磺酸盐 0.1次要成分至100去污剂实施例Ⅱ

根据本发明的压缩粒状织物清洗组合物(浓度800克/升)可如下制备：45AS 8.025E3S 2.025E5 3.O25E3 3.0TFAA 2.5沸石A 17.0NaSKS-6 12.0柠檬酸 3.0碳酸盐 7.0MA/AA 5.0CMC 0.4本发明的酶 0.1TAED 6.0过碳酸盐 22.0EDDS 0.3粒状泡沫抑制剂 3.5水/次要成分至100％去污剂实施例Ⅲ

尤其用于染过色的织物清洗的本发明的粒状织物清洗组合物可如下配制：LAS 10.7 -TAS 2.4 -TFAA - 4.045AS 3.1 10.045E7 4.0 -25E3S - 3.068E11 1.8 -25E5 - 8.0柠檬酸盐 15.0 7.0碳酸盐 - 10柠檬酸 2.5 3.0沸石A 32.1 25.0Na-SKS-6 - 9.0MA/AA 5.0 5.0DETPMP 0.2 0.8本发明的酶 0.10 0.05硅酸盐 2.5 -硫酸盐 5.2 3.0PVP 0.5 -聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物/乙烯基咪唑和乙烯- 0.2基吡咯烷酮的共聚物过硼酸盐 1.0 -苯酚磺酸盐 0.2 -水/次要成分至100％去污剂实施例Ⅳ

提供“通过洗涤柔顺”的能力的本发明的粒状织物清洗组合物可如下制备：45AS - 10.0LAS 7.6 -68AS 1.3 -45E7 4.0 -25E3 - 5.0椰子-烷基-二甲基-羟基-1.4 1.0乙基氯化铵柠檬酸盐 5.0 3.0Na-SKS-6 - 11.0沸石A 15.0 15.0MA/AA 4.0 4.0DETPMP 0.4 0.4过硼酸盐 15.0 -过碳酸盐 - 15.0TAED 5.0 5.0绿土粘土 10.0 10.0HMWPEO - 0.1本发明的酶 0.10 0.05硅酸盐 3.0 5.0碳酸盐 10.0 10.0粒状泡沫抑制剂 1.0 4.0CMC 0.2 0.1水/次要成分至100％去污剂实施例Ⅴ

根据本发明的重级液体织物清洗组合物也可如下制备：

Ⅰ Ⅱ酸形式的LAS - 25.0柠檬酸 5.0 2.0酸形式的25AS 8.0 -酸形式的25AE2S 3.0 -25AE7 8.0 -CFAA 5 -DETPMP 1.0 1.0脂肪酸 8 -油酸 - 1.0乙醇 4.0 6.0丙二醇 2.0 6.0本发明的酶 0.10 0.05椰子-烷基二甲基羟基- 3.0乙基氯化铵绿土粘土 - 5.0PVP 2.0 -水/次要成分至100％皮革工业应用

本发明的枯草酶可用于皮革工业，尤其用于皮的脱毛。

在所说的应用中，本发明的枯草酶优选用于进一步包含其它蛋白酶的酶组合物。

对合适的其它蛋白酶的更具体的描述见去污剂组合物中所用的合适的酶的相关章节(上文)。羊毛工业应用

本发明的枯草酶可用于羊毛工业中，尤其是用于包括羊毛的衣物清洗上。

在所说的应用中，本发明的枯草酶的优选用于进一步包括其它蛋白酶的酶组合物。

合适的其它蛋白酶的更具体的描述见去污剂组合物(上文)中的相关章节。

本发明还在下面的实施例中进一步进行了详述，这些实施例不以任何方式来限制如权利要求所述的本发明的范围。材料和方法

菌株：

枯草芽孢杆菌DN 1885(Diderichsen等，1990)

迟缓芽孢杆菌309和147是迟缓芽孢杆菌的特定株，保藏于NCIB，入藏号为NCIB 10309和10147，并于在本文中用作参考的US专利号3,723,250中有描述。

通过传统方法将大肠杆菌MC 1000(M.J.Casadaban和S.N.Cohen(1980)；J.Mol.Biol 138 179-207)制备为r、m⁺，而这些方法也公开了美国专利申请顺序号0 39,298。

质粒：

PJS 3：大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体，含有编码枯草酶309的合成基因。(Jacob Schiφdt等描述，蛋白质和肽通信3:39-44(1996))。

PSX222：枯草芽孢杆菌表达载体(WO 96/34946描述)。常规分子生物学方法：

除非另有提及，DNA操作和转化用常规的分子生物学方法(Sambrook等(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，NY；Ausubll,F.M.等(编者)“现代分子生物学方法”。John wiley & Sons,1995；Harwood,C.R.和Cutting,S.M.(编者)“芽孢杆菌的分子生物学方法”John Wiley &Sons,1990)。DNA操作中的酶的使用根据供应商的说明书。

DNA操作中的酶：

除非另有说明，DNA操作中的所有酶，例如限制性内切酶、连接酶等得自New England Biolabs公司。

蛋白酶解活性

在本发明的上下文中，蛋白水解活性以Kilo Novo蛋白酶单位(KNPV)表达。该活性以相对于酶标准品(SAVINASEO)来测定，并且这种测定是根据二甲基酪蛋白(DMC)溶液在标准条件下通过蛋白酶的消化而来的，标准条件即50℃,pH8.3,9分钟反应时间，3分钟测定时间。一个小册子AF 220/1可按要求得自于Novo Nordisk A/S，丹麦，该小册子在此处用作参考。

GU即甘氨酸单位，其定义为在标准条件下，在40℃下与作为底物的N-乙酰酪蛋白一起温育15分钟，产生了相当于1毫摩尔甘氨酸的NH₂基团的量的蛋白酶活性。

酶活性也可用PNA试验来测定，其根据与可溶性的底物琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯基-丙氨酸-对硝基苯酚的反应，描述于Journalof American Oil Chemists Society,Rothgeb,T.M.,Goodlander,B.D.,Garrison,P.H.以及Smith,L.A.(1988)。

发酵：

枯草酶的发酵在30℃下在一个旋转摇动台(300r.p.m.)上在含100毫升BPX培养基的500毫升带有障板的Erlenmeyer烧瓶中进行5天。因此为了制备例如2升肉汤，将20个Erlenmeyer烧瓶进行同时发酵。

培养基：

BPX：配方(每升)

马铃薯淀粉 100克

磨过的大麦 50克

豆粉 20克

Na₂HPO₄×12H₂O 9克

Pluronic 0.1克

酪蛋白酸钠 10克

培养基中的淀粉用α-淀粉酶液化，培养基在120℃加热到45分钟灭菌。灭菌后，培养基中加入NaHCO₃到0.1M将pH调到9。实施例实施例1酶变体的构建和表达

定点诱变：

通过“单一位点去除(USE)”或“尿嘧啶-USE”技术来制备枯草酶309定点诱变的变体，这两种技术分别描述于Deng等(Anal.Biochem 200:81-88(1992))及Markvardsen等(BioTechniques 18(3):371-372(1995))。

模板质粒为PJS3，或者其含有枯草酶309的变体的类似物，例如在含有带有目的在于导致最终的Y167A+R170L枯草酶309变体构建体R170L变体的寡核苷酸的编码Y167A变体的基因的PJS3类似物上进行USE诱变。

该在PJS3中构建的枯草酶309变体然后被亚克隆到枯草芽孢杆菌PSX222表达载体，所用的酶是限制酶KpnⅠ和MluⅠ。

局部的随机诱变：

用于进行局部随机诱变的总体策略为：

合成相应于除了相应于要被诱变的氨基酸密码外的待诱变的DNA序列部分的诱变引物(寡核苷酸)。

随后，在PCR反应中将所得的突变引物与合适的相反引物一起使用。纯化和消化所得的PCR片段并克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体中。

可替换地，如果有必要，可将所得的PCR片段在第二次PCR反应中用作引物，并同时使用第二个合适的相反引物，以将突变的区域消化并克隆到穿梭载体中。该PCR反应在常规条件下进行。

根据这种策略，在SAVINASE中构建于局部随机文库，其中Y167和R170都是完全随机的。

在要被突变的氨基酸密码子上第一和第二位碱基上用四种碱基(N)每各占25％合成一个寡核苷酸。密码子中第三核苷酸(摆动碱基)以50％G/50％C(S)合成以避免三个终止密码子中的两个(TAA TGA)。

在一个PCR反应中，使用突变引物(5′-GTT TGG ATC AGT AGC TCCGAC TGC CAT TGC GTT CGC ATA SNN CGC CGG SNN GCT GAT TGAGCC-3′(反义))，和合适的相反引物(例如5′GAA CTC GAT CCA GCG ATTTC′(有义))，并使用质粒PJS 3为模板。利用限制酶Asp 718和BclⅠ将所得产物克隆到PJS 3穿梭载体中。

然后将在PJS 3中构建的局部随机文库亚克隆到枯草芽孢杆菌pSX 222表达质核中，所用的限制酶为KpnⅠ和MluⅠ。

所制备的文库含约100,000个单独克隆/文库。

十个随机选出的克隆被进行测序以确证所设计的突变。

为了纯化本发明的枯草酶变体，将含本发明的变体的枯草芽孢杆菌PSX 222表达质粒转化到一个感受态枯草芽孢杆菌株中，并如上述在含10μg/ml氯霉素(CAM)的培养基中进行发酵。实施例2酶变体纯化

本法涉及纯化2升量的枯草蛋白酶147酶、枯草蛋白酶309酶或其变体的发酵。

将约1.6升的发酵肉汤在1升的烧杯中在5000rpm下离心35分。上清用10％乙酸调至pH6.5，并在Seitz Supra S100滤板上进行过滤。

用装备有Amicon S1Y10 UF柱的Amicon CH₂A UF装置将滤液浓缩至约400毫升。将UF浓缩物离心并过滤，然后于室温下在Bacitracin亲和柱上在pH7下吸收。用调至pH7的含0.01二甲基戊二酸，0.1M硼酸和0.002M氯化钙的缓冲溶液中的25％2-丙醇和1M氯化钠于室温下将蛋白酶从Bacitracin柱上洗脱下来。

将源于Bacitracin纯化步骤的具蛋白酶活性的馏分合并并上到用调到pH6.5的含0.01二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.02M氯化钙的缓冲液平衡的750ml Sephadex G25柱(5cm直径)上。

来自于Sephadex G25柱上的具蛋白酶解活性的馏分合并并上到用调到pH6.5的含0.01M二甲基戊二酸、0.2M硼酸，以及0.002M氯化钙的缓冲液平衡的150ml CM Sepharose CL6B阳离子交换柱(5cm直径)上。

蛋白酶的洗脱使用在2升相同缓冲液(0～0.2M氯化钠，对枯草蛋白酶147而言)中线性梯度的0～0.1M氯化钠。

在最后的纯化步骤中，将含有蛋白酶的从CM Sepharose柱上下来的馏分合并并在配有GR 81PP膜(来自Danish Sugar Factories公司)的Amicon超滤室中浓缩。

用实施例1中的技术进行构建及上述的分离方法，生产并分离了下面的枯草蛋白酶309变体。

Y167A+R170S

Y167A+R170L

Y167A+R170N

Y167P

Y167P+R170L

Y167V+R170T

Y167I+R170T

Y167V+R170Q

Y167S+R170Q

Y167T+R170N

Y167A+R170A

Y167T

Y167T+R170A

Y167P+R170S

Y167I+R170L

Y167F+R170T

Y167F+R170E

Y167F+R170H

Y167F+R170T

Y167F+R170L

Y167L

R170H

Y167S实施例3

含酶变体的去污剂组合物的洗涤效果

下面的实施例提供了在所指定的条件下进行的一些洗涤测试所得的结果。实验条件表Ⅳ评价枯草蛋白酶309变体的实验条件

去污剂	蛋白酶型去污剂′96
去污剂	蛋白酶型去污剂′96	去污剂剂量	1.0g/l
pH	10.4(调节后)	去污剂剂量	1.0g/l
pH	10.4(调节后)	洗涤时间	15分钟
温度	15℃	洗涤时间	15分钟
温度	15℃	水硬度	6°dH(Ca²⁺∶Mg²⁺=2∶1)
酶	下面所列的枯草蛋白酶309变体	水硬度	6°dH(Ca²⁺∶Mg²⁺=2∶1)
酶	下面所列的枯草蛋白酶309变体	酶浓度	0-10nM
测试系统	150ml带有搅拌棒的烧杯	酶浓度	0-10nM
测试系统	150ml带有搅拌棒的烧杯	衣物/体积	5件衣服(φ2.5cm)/50ml去污剂溶液
衣物	具草汁污迹的棉布	衣物/体积	5件衣服(φ2.5cm)/50ml去污剂溶液

随后在水龙头水下冲洗涤涤的衣物并进行空气干燥。

上述的类型去污剂是一种简单的去污剂配方。其最典型的特征是将STP用作助洗剂并且阴离子表面活性剂(LAS)含量是相当高的。而且pH被调至10.4，其位于粉末去污剂的正常范围内。

表Ⅴ

该型洗涤剂的成分如下：

25％ STP(Na₅P₃O₁₀)

10％沸石(Wessalith P)

10％ Na₂SO₄

10％ Na₂CO₃

25％ LAS(Nansa 80S)

5％ NI(Dobanol 25-7)

5％ Na₂S₂O₅

0.5％羧甲基纤维素(CMC)

9.5％水

通过在去离子水中加入CaCl₂和MgCl₂来调节水的硬度。通过加入酸来将去污剂溶液的pH调到所需的值。

用Elrepho 2000光度计(无UV)于460nm测定试验物质的反射率(R)。孔径：10mM

在XnM的洗涤效果可计数为：

P_{x} = \frac{R_{X} - R_{O}}{R_{X}, ref - R_{O}}

R_x:XnM酶的洗涤效果(以反射率单位表示)

R_o:0nM酶的洗涤效果(空白值)表Ⅵ:SAVINASE^_的变体和改进因子

名称	变体	P₈
名称	变体	P₈	SAVINASE,_ref	Y167A+R170S	1.02.5
	Y167A+R170L	2.4	SAVINASE,_ref	Y167A+R170S	1.02.5
	Y167A+R170L	2.4		Y167A+R170N	2.0
	Y167I+R170L	1.8		Y167A+R170N	2.0

如同从表Ⅵ中可看出一样，本发明的SAVINASE^_变体表现出改进的洗涤效果。

在一个相似的洗涤测试中，下面的SAVINASE^_变体表现出了在变体Y167I+R170L和Y167A+R170S之间的洗涤效果值：

Y167P

Y167P+R170L

Y167V+R170T

Y167I+R170T

Y167V+R170Q

Y167S+R170Q

Y167T+R170N

Y167A+R170A

Y167T+R170L

Y167T+R170A

Y167P+R170S实施例4

含有酶变体的去污剂组合物的洗涤效果

下面的实施例提供了来自于在指定条件下进行的洗涤测试的结果。

实验条件表Ⅶ：评价枯草蛋白酶309变体的实验条件

去污剂	蛋白酶型去污剂95
去污剂	蛋白酶型去污剂95	去污剂剂量	3.0g/l
pH	10.5	去污剂剂量	3.0g/l
pH	10.5	洗涤时间	15分钟
温度	15℃	洗涤时间	15分钟
温度	15℃	水硬度	6°dH
酶	下面所列的枯草蛋白酶309变体	水硬度	6°dH
酶	下面所列的枯草蛋白酶309变体	酶浓度	10nM
测试系统	150ml配有搅拌棒的玻璃烧杯	酶浓度	10nM
测试系统	150ml配有搅拌棒的玻璃烧杯	织物/体积	5片织物(φ2.5cm)，在50ml去污剂中
测试材料	得自荷兰的测试材料中心的EMPA117	织物/体积	5片织物(φ2.5cm)，在50ml去污剂中

所用的去污剂为一简单型配方。去污剂的pH调到10.5，其位于粉末去污剂的正常范围内。该型去污剂95的组成如下：25％ STP(Na₅P₃O₁₀)25％ Na₂SO₄10％ Na₂CO₃20％ LAS(Nansa 80S)5.0％非离子表面活性剂(Dobanol 25-7)5.0％ Na₂Si₂O₅0.5％羧甲基纤维素(CMC)9.5％水

通过在去离子水中添加CaCl₂和MgCl₂(Ca²⁺∶Mg²⁺=2∶1)来调节水硬度(亦参见消费品中的表面活性剂-理论，技术和应用，Springr Verlag 1986)。通过添加HCl将去污剂溶液的pH调节至10.5。

用Macbeth ColorEye 7000光度计(Macbeth,Kollmorgen仪器公司分部，德国)在460nm下测定待测物质的反射率(R)。根据产商方法进行测定。

通过计算效果因子来评价枯草蛋白酶309变体的洗涤效果：

P：效果因子

R_变体：以变体洗涤的待测物质的反射率

R_savinase：以Savinase^_洗涤的待测物质的反射率

R_空白：没有用酶洗涤的待测物质的反射率

与Savinase^_相比，所要求的全部枯草蛋白酶均提高了洗涤效果，即P＞1。

将变体的改良进行分级，并以大写字母命名：

A级：1＜P≤1.5

B级：1.5＜P≤2

C组：P＞2

表Ⅷ枯草蛋白酶309变体及改良级别

改良级别	变体
改良级别	变体	A	Y167T+R170LY167F+R170TY167F+R170EY167F+R170HY167F+R170TY167F+R170LY167LR170HY167SY167T+R170A
B	Y167V+R170T	A
B	Y167V+R170T	C	Y167A+R170SY167A+R170LY167A+R170N

实施例5

对结合有在第129、131、133和/或194位上的进一步修饰的作为本发明主要方面的变体的对比性发酵实验

将Savinase^_变体Y167I+R170L+A194P在发酵中与无A194P取代的变体Y167I+R170L的对比。

将两个变体都克隆到PSX 222表达载体背景中，并如上述在含10μg/mlCAM的100ml BPX培养基中发酵。

发酵5天后，将1.5ml的BPX发酵培养基进行离心，并如上述将上清液用于测定蛋白酶解活性(KPNU)。

含Y167I+R170L+A194P变体的发酵培养基较之于含Y167I+R170L变体的发酵培养基具有更高的蛋白酶解活性。

两种变体均具有相同的特异性活性。

用变体Y167A+R170S+A194P,Y167A+R170L+A194B以及Y167A+R170N+A194P与其相应的无A194P突变的变体进行比较都得到了类似的结果。

进一步用变体A133P+Y167A+R120S、A133D+Y16AA+R170S,R129K+Y167A+R170S以及P131H+Y167A+R170S与其相应的无A133P、A133D、P129K及P131H突变的变体相比也得到了类似的结果。

Claims

1．在去污剂中具改良的洗涤效果的枯草酶变体，包括同在167和170位上具有修饰(以BASBPN编号)。

2．在去污剂中具改良的洗涤效果的枯草酶变体，包括选自下列的至少一个修饰(以BASBPN编号)。

167{G,A,S，或T}+170{G,A,S，或T}

167{G,A,S，或T}+170{L,I，或V}

167{G,A,S，或T}+170{Q，或N}

167P

167P+170{L,I，或V}

167{L,I，或V}+170{G,A,S，或T}

167{L,I，或V}+170{Q，或N}

167P+170{G,A,S，或T}

167{L,I，或V}+170{L,I，或V}

167{F,W或Y}+170{G,A,S，或T}

167{F,W或Y}+170{E，或D}

167{F,W或Y}+170{R,K，或H}

167{F,W或Y}+170{L,I，或V}

167{L,I，或V}

170H

167{G,A,S，或T}

3．根据权利要求2的枯草酶酶变体，其中的修饰选自下列组中(以BASBPN编号)：

167A+170S,

167A+170L,

167A+170N

167P

167P+170L

167V+170T

167I+170T

167V+170Q

167S+170Q

167T+170N

167A+170A

167T+170L

167T+170A

167P+170S

167I+170L

167F+170T

167F+170E

167F+170H

167F+170T

167F+170L

167L

170H

167S。

4．根据权利要求2的枯草酶酶变体，其中的修饰选自下列组中(以BASBPN编号)：

Y167{G,A,S，或T}+R170{G,A,S，或T}

Y167{G,A,S，或T}+R170{L,I，或V}

Y167{G,A,S，或T}+R170{Q，或N}

Y167P

Y167P+R170{L,I，或V}

Y167{L,I，或V}+R170{G,A,S，或T}

Y167{L,I，或V}+R170{Q，或N}

Y167P+R170{G,A,S，或T}

Y167{L,I，或V}+R170{L,I，或V}

Y167{F,W，或Y}+R170{G,A，S，或T}

Y167{F,W，或Y}+R170{E，或D}

Y167{F,W，或Y}+R170{R,K，或H}

Y167{F,W，或Y}+R170{L,I，或V}

Y167{L,I，或V}

R170H

Y167{G,A,S，或T}

5．根据权利要求4的枯草酶酶变体，其中的修饰选自下列组(以BASBPN编号)：

Y167A+R170S

Y167A+R170L

Y167A+R170N

Y167P

Y167P+R170L

Y167V+R170T

Y167I+R170T

Y167V+R170Q

Y167S+R170Q

Y167T+R170N

Y167A+R170A

Y167T

Y167T+R170A

Y167P+R170S

Y167I+R170L

Y167F+R170T

Y167F+R170E

Y167F+R170H

Y167F+R170T

Y167F+R170L

Y167L

R170H

Y167S。

6．权利要求1至5中任一项的变体，其中的亲本枯草酶选自I-S1亚群。

7．权利要求6的变体，其中亲本枯草酶选自ABSS 168、BASBPN、BSSDY和BLSCAR或其保留了I-S1亚群的特征的功能性变体。

8．权利要求1至5中任一项的变体，其中的亲本枯草酶选自I-S2亚群。

9．权利要求8的变体，其中亲本枯草酶选自BLS 147、BLS 309、BAPB 92、TVTHER和BYSYAB或保留了I-S2亚群的特征的功能性变体。

10．上述权利要求中任一项的变体，其中所说的修饰结合了一个或多个任何其它位置上的修饰。

11．权利要求10的变体，其中所说的修饰结合了27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、206、218、222、224、235和274位中的一个或多个位置上修饰。

12．权利要求11的变体，其中所说的枯草酶属于I-S2亚群并且所说的进一步的改变选自K27R、^*36D、S57P、N76D、S87N、G97N、S101G、V104A、V104N、V104Y、H120D、N123S、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、K235L和T274A。

13．权利要求11的变体，包括S101G+V104N,S87N+S101G+V104N,K27R+V104Y+N123S+T274A，或N76D+V104A的任何变体，或者这些突变(V104N,S101G,K27R,V104Y,N123S,T274A,N76D,V104A)的其它组合的变体，并带有权利要求1到12中任一项所提到的任何一个或多个取代、缺失和/或插入。

14．前述权利要求中任一项的枯草酶变体，其中所说的修饰与第129、131、133和194位上的一个或多个修饰相结合。

15．权利要求14的变体，其中所说的枯草酶属于I-S2亚群而且所说的进一步修饰选自P129K、R131H、A133P、A133D和A194P。

16．根据权利要求15的变体，其中所说的修饰选自：

Y167A+R170S+A194P

Y167A+R170L+A194P

Y167A+R170N+A194P

Y167A+R170S+P129K

Y167A+R170L+P129K

Y167A+R170N+P129K

Y167A+R170S+P131H

Y167A+R170L+P131H

Y167A+R170N+P131H

Y167A+R170S+A133P

Y167A+R170L+A133P

Y167A+R170N+A133P

Y167A+R170S+A133D

Y167A+R170L+A133D

Y167A+R170N+A133D

17．编码权利要求1到16中任一项的枯草酶变体的分离的DNA序列。

18．含有权利要求17的分离的DNA序列的表达载体。

19．以权利要求18的表达载体转化的微生物宿主细胞。

20．权利要求19的微生物宿主，其为细菌，优选芽孢杆菌，尤其是迟缓芽孢杆菌。

21．权利要求19的微生物宿主，其为真菌或酵母，优选为丝状真菌，尤其是曲霉属。

22．产生权利要求1到16中任一项的变体的方法，其中将权利要求19到21中任一项的宿主在有助于所说变体表达和分泌的条件下进行培养，并回收该变体。

23．含有根据权利要求1到16中任一项的枯草酶变体的组合物。

24．根据权利要求23的组合物，其另外含有纤维素、脂酶、角质酶、氧化还原酶、其它蛋白酶，或淀粉酶。

25．根据权利要求23或24的组合物，其中的组合物是去污剂组合物。

26．根据权利要求1到16中任一项的枯草酶变体或者根据权利要求23到25中任一项的酶组合物在洗衣和/或洗碟去污剂中的用途。

27．鉴别在去污剂中表现出改良的洗涤效果的蛋白酶变体的方法，其包括在编号枯草酶或其前蛋白酶或前蛋白酶原的DNA中于相应于下列氨基酸(以BASBPN编号)的一个或多个位置上产生突变：

Y167A+R170S

Y167A+R170L

Y167A+R170N

Y167P

Y167P+R170L

Y167V+R170T

Y167I+R170T

Y167V+R170Q

Y167S+R170Q

Y167T+R170N

Y167A+R170A

Y167T

Y167T+R170A

Y167P+R170S

Y167I+R170L

Y167F+R170T

Y167F+R170E

Y167F+R170H

Y167F+R170T

Y167F+R170L

Y167L

R170H

Y167S；或包括在上述任何变体中的一个或多个保守性修饰的变体；

用所说的突变DNA转化芽孢杆菌菌株；

产生这种蛋白酶变体的菌株选择发酵或培养这种菌株；

回收所说的蛋白酶变体，以及

测试在去污剂中的改良的洗涤效果。