CN107108726A - 抗‑肌肉生长抑制因子抗体、包含变体fc区的多肽及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供抗‑肌肉生长抑制因子抗体及其制备和使用方法。还提供编码所述抗‑肌肉生长抑制因子抗体的核酸以及包含所述核酸的宿主细胞。本公开还提供含有变体Fc区的多肽及其制备和使用方法。还提供编码所述多肽的核酸以及包含所述核酸的宿主细胞。

Description

抗-肌肉生长抑制因子抗体、包含变体FC区的多肽及使用方法
技术领域
本发明涉及抗-肌肉生长抑制因子抗体及其使用方法。本发明还涉及包含变体Fc区的多肽及其使用方法。
背景技术
肌肉生长抑制因子(myostatin)，也被称为生长分化因子-8(GDF8)，是一种分泌蛋白并且是转化生长因子-β(TGF-β)蛋白超家族的成员。该超家族的成员具有生长-调节和形态发生性质(参见，例如，NPL1，NPL2，和PTL1)。肌肉生长抑制因子主要表达在发育的和成人骨骼肌中并且作为肌肉生长的负向调节物发挥功能。肌肉生长抑制因子在成年小鼠中的系统性过表达导致肌肉消耗(参见，例如，NPL3)，同时，相反地，肌肉生长抑制因子敲除小鼠表征为骨骼肌的肥大和增生，这导致与其野生型同胞仔相比二至三倍高的肌肉量(参见，例如，NPL4)。
类似于TGF-β家族的其他成员，肌肉生长抑制因子被合成为含有N-端前肽结构域和被认为是活性分子的C-端结构域的大的前体蛋白(参见，例如，NPL5；PTL2)。两个肌肉生长抑制因子前体分子经由C-端生长因子结构域中的单个二硫键共价相连。通过多步蛋白水解加工，具有活性的成熟肌肉生长抑制因子(由C-端生长因子结构域组成的二硫键键合的同源二聚体)从肌肉生长抑制因子前体释放。在肌肉生长抑制因子活化途径的第一步中，在同源二聚前体的两条链中，N-端前肽结构域和C-端生长因子结构域之间的肽键，Arg266-Asp267，被弗林型(furin-type)前蛋白转化酶切割。但是所得的三个肽(两个前肽和一个成熟肌肉生长抑制因子(即，由生长因子结构域组成的二硫键键合的同源二聚体))仍然相连，形成被称为"潜伏性肌肉生长抑制因子"的非共价无活性复合物。然后，经由前肽的降解，成熟肌肉生长抑制因子可以由潜伏性肌肉生长抑制因子释放。金属蛋白酶的骨形态发生蛋白1(BMP1)家族的成员切割前肽内的单个肽键，Arg98-Asp99，其伴随着作为同源二聚体的成熟有活性的肌肉生长抑制因子的释放(参见，例如，NPL6)。此外，通过利用酸或热处理使复合物解离，可以在体外活化潜伏性肌肉生长抑制因子(参见，例如，NPL7)。
肌肉生长抑制因子发挥其作用是通过跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶杂四聚体受体家族，所述受体家族的活化增强受体磷酸转移，从而导致刺激丝氨酸/苏氨酸激酶活性。已经证明，肌肉生长抑制因子途径包括活性肌肉生长抑制因子二聚体以高的亲和力结合激活蛋白受体IIB型(ActRIIB)，后者然后募集并活化低亲和力受体激活蛋白样激酶4(ALK4)或激活蛋白样激酶5(ALK5)的磷酸转移。也已经证明，蛋白Smad 2和Smad 3随后被活化并且与Smad 4形成复合物，所述复合物之后被转移至细胞核用于活化靶基因转录。已经证明，ActRIIB能够介导体内肌肉生长抑制因子的影响，因为小鼠中占优势的阴性形式ActRIIB的表达类似于肌肉生长抑制因子基因敲除(参见，例如，NPL8)。
数种疾病或病症与肌肉消耗(即，肌肉组织损失或功能受损)相关，如肌肉营养不良(muscular dystrophy，MD；包括杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy))，肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)，肌肉萎缩，器官萎缩，虚弱，充血性阻塞性肺病(congestive obstructive pulmonary disease，COPD)，少肌症(sarcopenia)，和由癌症或其他疾病导致的恶病质，以及肾病，心脏衰竭或心脏病，以及肝病。患者将受益于肌肉量和/或肌肉力量的增加；然而，目前可用于这些病症的治疗是有限的。因此，由于其作为骨骼肌生长的负向调节物的角色，肌肉生长抑制因子成为适用于此种疾病或病症的治疗性或预防性干预或适用于监测此种疾病或病症的进展的靶标。特别地，抑制肌肉生长抑制因子活性的药剂可以是治疗有益的。
抑制肌肉生长抑制因子表达导致肌肉肥大和增生(NPL9)。在损伤后，肌肉生长抑制因子负向调节肌肉再生并且无肌肉生长抑制因子小鼠中肌肉生长抑制因子的缺乏导致加速的肌肉再生(参见，例如，NPL10)。在例如PTL3，PTL4，PTL5，PTL6，PTL7，PTL8，PTL9和PTL10中所述的抗-肌肉生长抑制因子(GDF8)抗体已被证明在体外和在体内结合肌肉生长抑制因子并且抑制肌肉生长抑制因子活性，包括与骨骼肌量的负向调节相关的肌肉生长抑制因子活性。肌肉生长抑制因子中和抗体增加野生型小鼠(参见，例如，NPL11)以及作为肌营养不良模型的mdx小鼠(参见，例如，NPL12；NPL13)的体重，骨骼肌量，和骨骼肌中的肌肉尺寸和力量。然而，这些现有技术抗体都是对成熟肌肉生长抑制因子具有特异性，而对潜伏性肌肉生长抑制因子没有特异性，并且记述的用于抑制肌肉生长抑制因子活性的策略已经利用了可以结合并中和成熟肌肉生长抑制因子的抗体。
抗体因其在血液中的高稳定性以及较少的副作用而作为药物得到关注(参见，例如，NPL14和NPL15)。目前市售的几乎所有治疗性抗体都是人IgG1亚类的抗体。IgG类抗体的已知功能之一是抗体依赖性细胞介导性细胞毒性(下文中称为ADCC活性)(参见，例如，NPL16)。对于显示ADCC活性的抗体，抗体Fc区必须结合Fcγ受体(下文中称为Fcγ R)，所述受体是存在于效应器细胞如杀伤细胞，自然杀伤细胞，和激活的巨噬细胞的表面上的抗体结合受体。
在人中，Fcγ RIa(CD64A)，Fcγ RIIa(CD32A)，Fcγ RIIb(CD32B)，FcγRIIIa(CD16A)和Fcγ RIIIb(CD16B)同种型已作为Fcγ R蛋白家族被报道，并且也已经报道了相应的同种异型(参见，例如，NPL17)。Fcγ RIa，Fcγ RIIa和Fcγ RIIIa被称为激活性FcγR，因为其具有免疫学活性功能，而Fcγ RIIb被称为抑制性Fcγ R，因为其具有免疫抑制功能(参见，例如，NPL18)。
在Fc区和Fcγ R之间的结合中，抗体铰链区和CH2结构域中的若干氨基酸残基，以及与CH2结构域结合的连接至位置297(EU编号)处的Asn的糖链已被证明是重要的(参见，例如，NPL19，NPL20和NPL21])。目前已经研究了多种具有Fcγ R结合性质的变体，主要是在这些位点引入有突变的抗体；并且已经获得了对激活性Fcγ R具有更高结合活性的Fc区变体(参见，例如，PTL11，PTL12，PTL13和PTL14)。
当激活性Fcγ R与免疫复合物交联时，其磷酸化胞内结构域或FcR共有γ-链(相互作用配偶体)中包含的免疫受体酪氨酸系激活基序(ITAM)，激活信号转导物SYK，并且通过启动活化信号级联而触发炎性免疫应答(参见，例如，NPL22)。
Fcγ RIIb是唯一在B细胞上表达的Fcγ R(参见，例如，NPL23)。据报道，抗体Fc区与Fcγ RIIb的相互作用抑制B细胞的初级免疫应答(参见，例如，NPL24)。此外，据报道，当B细胞上的Fcγ RIIb和B细胞受体(BCR)经由血液中的免疫复合物交联时，B细胞活化和B细胞的抗体生产被抑制(参见，例如，NPL25)。在该由BCR和Fcγ RIIb介导的免疫抑制信号转导中，包含在Fcγ RIIb的胞内结构域中的免疫受体酪氨酸系抑制基序(ITIM)是必要的(参见，例如，NPL26和NPL27)。当在信号转导后ITIM被磷酸化时，含SH2的肌醇聚磷酸酯5-磷酸酶(SHIP)被招募，其他激活性Fcγ R信号级联的转导被抑制，并且免疫应答被抑制(参见，例如，NPL28)。此外，据报道，由于BCR交联和B细胞增殖，单独的Fcγ RIIb的聚集以独立于BCR的方式短暂抑制钙流入而不引起生产IgM的B细胞的凋亡(参见，例如，NPL29)。
Fcγ RIIb也被表达在树突细胞，巨噬细胞，激活的嗜中性粒细胞，柱状细胞和嗜碱性粒细胞上。Fcγ RIIb抑制这些细胞中激活性Fcγ R的功能如吞噬作用和炎性细胞因子的释放，并且抑制炎性免疫应答(参见，例如，NPL30)。
目前通过使用Fcγ RIIb敲除小鼠的研究已经阐明了Fcγ RIIb免疫抑制功能的重要性。有报道，在Fcγ RIIb敲除小鼠中，体液免疫得不到适当调节(参见，例如，NPL31)，对胶原引起的关节炎(CIA)的敏感性增加(参见，例如，NPL32)，呈现狼疮样症状，并且呈现肺出血肾炎综合征样(Goodpasture's syndrome-like)症状(参见，例如，NPL33)。
此外，据报道，Fcγ RIIb的调节不足与人自体免疫病相关。例如，已经报道了FcγRIIb的跨膜区和启动子区的遗传多态性和系统性红斑狼疮(SLE)的发生频率之间的关系(参见，例如，NPL34，NPL35，NPL36，NPL37，和NPL38)，以及SLE患者中B细胞表面上Fcγ RIIb表达的减少(参见，例如，NPL39和NPL40)。
由小鼠模型和因此的临床发现，Fcγ RIIb被认为通过特别地涉及B细胞而起到控制自体免疫病和炎性疾病的作用，并且其是有希望用于控制自体免疫病和炎性疾病的靶分子。
已知主要被用作市售的治疗性抗体的IgG1不仅结合Fcγ RIIb，而且还强烈地结合激活性Fcγ R(参见，例如，NPL41)。可能的是通过利用与激活性Fcγ R相比具有增强的Fcγ RIIb结合或提高的Fcγ RIIb结合选择性的Fc区，开发具有与IgG1的免疫抑制性质相比更大的免疫抑制性质的治疗性抗体。例如，已有建议，使用具有结合BCR和具有增强的Fcγ RIIb结合的Fc的可变区的抗体可以抑制B细胞活化(参见，例如，NPL42)。据报道，将B细胞上的Fcγ RIIb与结合B细胞受体的IgE交联，抑制B细胞分化成浆细胞，这因此导致IgE生产的抑制；并且在移植有人PBMC的小鼠中，人IgG和IgM浓度得到保持而人IgE浓度减小(参见，例如，NPL43)。除了IgE之外，据报道，当抗体将Fcγ RIIB和作为B-细胞受体复合物的组成分子的CD79b交联时，体外B细胞增殖被抑制，并且在胶原蛋白关节炎模型中关节炎症状减轻(参见，例如，NPL44)。
除了B细胞之外，据报道，利用(其中IgG的具有增强的Fcγ RIIb结合的Fc部分被融合至IgE的结合IgE受体FcεRI的Fc部分的)分子的在肥大细胞上的FcεRI和Fcγ RIIb的交联导致Fcγ RIIb的磷酸化，由此抑制FcεRI依赖性的钙流入。这表明通过增强Fcγ RIIb结合，抑制经由Fcγ RIIb刺激的脱粒是可能的(参见，例如，NPL45)。
因此表明，具有提高的Fcγ RIIb-结合活性的Fc的抗体作为用于炎性疾病如自体免疫病的治疗剂是有希望的。
此外，据报道，在抗体-抗原免疫复合物存在下，由于LPS刺激所致的经由Toll样受体4的巨噬细胞和树突细胞的活化被抑制，并且该作用也被认为是经由Fcγ RIIb的免疫复合物的作用(参见，例如，NPL46和NPL47)。因此预期，使用具有增强的Fcγ RIIb结合的抗体能够增强TLR介导的活化信号-抑制作用；因此表明，此种抗体作为用于炎性疾病如自体免疫病的治疗剂是有希望的。
此外，已提出，具有增强的Fcγ RIIb结合的突变体是有希望的癌症治疗剂，以及用于炎性疾病如自体免疫病的治疗剂。目前，已发现，Fcγ RIIb在针对抗-TNF受体超家族的激动剂抗体的激动剂活性中起重要作用。具体地，已提出，针对包括在TNF受体家族中的CD40，DR4，DR5，CD30，和CD137的抗体的激动剂活性需要与Fcγ RIIb的相互作用(参见，例如，NPL48，NPL49，NPL50，NPL51，NPL52，NPL53和NPL54)。NPL55显示，使用具有增强的FcγRIIb结合的抗体增强抗-CD40抗体的抗肿瘤作用。因此预期，具有增强的Fcγ RIIb的抗体具有增强包括针对抗-TNF受体超家族的抗体在内的激动剂抗体的激动剂活性的作用。
此外，已证明，当使用识别Kit(一种受体酪氨酸激酶(RTK))的抗体来交联FcγRIIb和表达Kit的细胞上的Kit时，细胞增殖被抑制。甚至在该Kit被组成型激活并且具有导致肿瘤形成的突变的情况中，类似的作用也已被报道(参见，例如，NPL56)。因此，预期，使用具有增强的Fcγ RIIb结合的抗体可以增强表达具有组成型激活突变的RTK的细胞上的抑制作用。
已经报道了具有Fcγ RIIb-结合活性提高的Fc的抗体(参见，例如，NPL57)。在该文献中，Fcγ RIIb-结合活性通过向抗体Fc区添加改变如S267E/L328F，G236D/S267E，和S239D/S267E而提高。其中，引入有S267E/L328F突变的抗体最强烈地结合Fcγ RIIb，并且保持相同水平的与Fcγ RIa和Fcγ RIIa H型(其中Fcγ RIIa的位置131处的残基是与天然存在的IgG1一样的His)的结合。然而，另一报道显示，该改变使与Fcγ RIIa R型(其中Fcγ RIIa位置131处的残基是Arg)的结合增强数百倍至Fcγ RIIb结合的相同水平，这意味着与R型Fcγ RIIa相比，Fcγ RIIb-结合选择性没有提高(参见，例如，PTL15)。
增强Fcγ RIIa结合而不增强Fcγ RIIb结合的作用仅被认为是对表达Fcγ RIIa而不表达Fcγ RIIb的细胞如血小板有影响(参见，例如，NPL58)。例如，已知被施用贝伐单抗(bevacizumab，一种针对VEGF的抗体)的患者组的血栓栓塞的风险增加(参见，例如，NPL59)。此外，在针对CD40配体的抗体的临床开发试验中以类似的方式观察到血栓栓塞，并且所述临床研究被中断(参见，例如，NPL60)。在这两种抗体的情况中，使用动物模型等的之后的研究表明施用的抗体经由结合在血小板上的Fcγ RIIa使血小板聚集，并且形成血凝块(参见，例如，NPL61和NPL62)。在作为自体免疫病的系统性红斑狼疮中，血小板经由FcγRIIa依赖性的机制被活化，并且据报道，血小板活化与症状的严重性相关(参见，例如，NPL63)。向此种已经具有高的发展血栓栓塞的风险的患者施用具有增强的Fcγ RIIa结合的抗体将增加发展血栓栓塞的风险，因此是极端危险的。
此外，据报道，具有增强的Fcγ RIIa结合的抗体增强巨噬细胞介导的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)(参见，例如，NPL64)。当抗体要结合的抗原被巨噬细胞吞噬时，抗体自身被认为也被同时吞噬。当抗体被作为药物施用时，推测来源于施用的抗体的肽片段可能也作为抗原被呈现，由此增加产生针对治疗性抗体的抗体(抗-治疗性抗体)的风险。更具体地，增强Fcγ RIIa结合将增加产生针对治疗性抗体的抗体的风险，并且这将显著减小其作为药物的价值。此外，已提出，树突细胞上的Fcγ RIIb通过抑制由抗原和抗体之间形成的免疫复合物引起的树突细胞活化，或通过经由活化Fcγ受体来抑制向T细胞的抗原递呈而助力于外周耐受性(参见，例如，NPL65)。因为Fcγ RIIa也被表达在树突细胞上，所以当具有对Fcγ RIIb的选择性结合增强了的Fc的抗体被用作药物时，由于增强的对Fcγ RIIb的选择性结合，抗原不容易被树突细胞等递呈，并且可以相对降低抗-药物抗体生产的风险。此种抗体在这方面也是有用的。
更具体地，当Fcγ RIIa结合被增强时，导致经由血小板聚集而形成血栓的风险增加并且导致由于增加的免疫原性所致的抗-治疗性抗体产生的风险增加，作为药物的价值将显著下降。
从此角度，前述具有增强的Fcγ RIIb结合的Fc变体显示与天然存在的IgG1相比显著增强的R型Fcγ RIIa结合。因此，其作为用于具有R型Fcγ RIIa的患者的药物的价值显著减小。在高加索人种和非洲裔美国人中以大致相同的频率观察到H型和R型的FcγRIIa(参见，例如，NPL66和NPL67)。因此，当该Fc变体被用于治疗自体免疫病时，可以安全地使用它同时享受其药物作用的患者的数目将是有限的。
此外，在缺乏Fcγ RIIb的树突细胞中或在Fcγ RIIb和抗体Fc部分之间的相互作用被抗-Fcγ RIIb抗体抑制的树突细胞中，树突细胞已被报道为成熟(参见，例如，NPL68和NPL69)。该报道提出，Fcγ RIIb主动抑制处于稳态(不发生炎症等并且不发生活化)的树突细胞的成熟。除了Fcγ RIIb以外，Fcγ RIIa也表达在树突细胞表面上；因此，即使与抑制性Fcγ RIIb的结合被增强并且如果与激活性Fcγ R如Fcγ RIIa的结合也被增强，树突细胞的成熟仍然可以因此被促进。更具体地，不仅提高Fcγ RIIb-结合活性而且还提高FcγRIIb-结合活性相对于Fcγ RIIa-结合活性的比率被认为在提供具有免疫抑制作用的抗体方面是重要的。
因此，当考虑生产利用Fcγ RIIb结合介导的免疫抑制作用的药物时，需要这样的Fc变体，其不仅具有增强的Fcγ RIIb-结合活性，而且还要能结合Fcγ RIIa H型和R型的两种同种异型(被保持在与天然存在的IgG1类似的水平或与天然存在的IgG1相比被减小至较低水平)。
同时，目前已报道了这样的例子，其中氨基酸改变被引入到Fc区中以增加FcγRIIb-结合选择性(参见，例如，NPL70)。然而，如在该文献中报道的所有据说具有提高的Fcγ RIIb选择性的变体与天然存在的IgG1相比都显示减小的Fcγ RIIb结合。因此认为，这些变体实际上难以引起比IgG1更强的Fcγ RIIb介导的免疫抑制反应。
此外，因为Fcγ RIIb在以上提及的激动剂抗体中发挥重要作用，因此预期增强其结合活性将增强激动剂活性。然而，当Fcγ RIIa结合被类似地增强时，将显示非所需的活性如ADCC活性和ADCP活性，并且这可能引起副作用。同样，从此角度，优选的是能够选择性地增强Fcγ RIIb-结合活性。
由这些结果，在制备用于治疗自体免疫病和癌症的利用Fcγ RIIb的治疗性抗体方面，重要的是，与天然存在的IgG相比，与两种Fcγ RIIa同种异型结合的活性都被保持或减小，并且Fcγ RIIb结合被增强。然而，Fcγ RIIb的胞外区与作为激活性Fcγ R之一的Fcγ RIIa的胞外区具有93％序列同一性，并且其在结构上是非常相似的。存在Fcγ RIIa的同种异型，H型和R型，其中位置131处的氨基酸是His(H型)或Arg(R型)，并且其各自与抗体的反应不同(参见，例如，NPL71)。因此，困难的问题可能是制备具有与Fcγ RIIa的各同种异型相比增强的选择性Fcγ RIIb结合的Fc区变体，这涉及区分Fcγ RIIa和Fcγ RIIb之间高度同源性的序列。尽管存在所述困难，目前仍然已经通过在Fc区中进行全面性氨基酸修饰分析，鉴定了若干Fc区变体，其与Fcγ RIIa相比具有对Fcγ RIIb的选择性结合活性(参见，例如，PTL16，PTL17，PTL18，PTL19和PTL20)。
目前已经有关于与人Fcγ R相关的对Fcγ RIIb具有结合选择性的Fc区变体的报道，而还没有关于与猴Fcγ R相关的具有对Fcγ RIIb的结合选择性的Fc区变体的报道。由于不存在此种Fc变体，在猴子中还没有彻底测试Fc变体选择性结合Fcγ RIIb的作用。
除上述之外，据报道，通过改变可能暴露于抗体表面上的氨基酸残基的电荷从而提高或降低抗体的等电点(pI)，可能的是调节抗体在血液中的半衰期(参见，例如，PTL21和PTL22)。其显示，可能的是通过降低抗体的pI来延长抗体的血浆半衰期，并且反之亦然。
此外，据报道，通过特别地改变其CH3结构域中指定的氨基酸残基的电荷从而提高抗体的pI，可以促进抗原结合到细胞中(参见，例如，PTL23)。此外，据报道，改变抗体恒定区(主要是CH1结构域)中的氨基酸残基的电荷从而降低pI，可以延长抗体在血浆中的半衰期(参见，例如，PTL24)。
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发面概述
本发明提供抗-肌肉生长抑制因子抗体及其使用方法。本发明还提供含变体Fc区的蛋白及其使用方法。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗-肌肉生长抑制因子抗体结合潜伏性肌肉生长抑制因子。在另外的实施方案中，所述抗体结合由肌肉生长抑制因子前肽(SEQ ID NO:78)的氨基酸21-100组成的片段内的表位。在一些实施方案中，本发明的分离的抗-肌肉生长抑制因子抗体抑制肌肉生长抑制因子的活化。在另外的实施方案中，所述抗体阻断成熟肌肉生长抑制因子从潜伏性肌肉生长抑制因子的释放。在另外的实施方案中，所述抗体阻断成熟肌肉生长抑制因子的蛋白水解释放。在另外的实施方案中，所述抗体阻断成熟肌肉生长抑制因子的自发释放。在另外的实施方案中，所述抗体不结合成熟肌肉生长抑制因子。在另外的实施方案中，所述抗体与表13中所述的抗体结合相同的表位。在另外的实施方案中，所述抗体与包含表13中所述的VH和VL对的抗体结合相同的表位。在另外的实施方案中，所述抗体与表2a中所述的抗体结合相同的表位。在另外的实施方案中，所述抗体与包含表2a中所述的VH和VL对的抗体结合相同的表位。在另外的实施方案中，所述抗体与表11a中所述的抗体结合相同的表位。在另外的实施方案中，所述抗体与包含表11a中所述的VH和VL对的抗体结合相同的表位。在另外的实施方案中，所述抗体与表2a，11a，或13中所述的抗体结合相同的表位。在另外的实施方案中，所述抗体与包含表2a，11a，或13中所述的VH和VL对的抗体结合相同的表位。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗-肌肉生长抑制因子抗体在中性pH结合潜伏性肌肉生长抑制因子的亲和力比在酸性pH更高。在一些实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体在pH7.4结合潜伏性肌肉生长抑制因子的亲和力比在pH5.8更高。在一些实施方案中，本发明的分离的抗-肌肉生长抑制因子抗体在pH7.4结合由肌肉生长抑制因子前肽(SEQ ID NO:78)的氨基酸21-100组成的多肽片段的亲和力比在pH5.8更高。在一些实施方案中，所述抗体在中性pH与表13中所述的抗体结合相同的肌肉生长抑制因子表位的亲和力比在酸性pH更高。在另外的实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体在pH7.4与表13中所述的抗体结合相同的表位的亲和力比在pH5.8更高。在另外的实施方案中，所述抗体在pH7.4与包含表13中所述的VH和VL对的抗体结合相同的表位的亲和力比在pH5.8更高。在一些实施方案中，所述抗体在中性pH与表2a中所述的抗体结合相同的肌肉生长抑制因子表位的亲和力比在酸性pH更高。在一些实施方案中，所述抗体在pH7.4与表2a中所述的抗体结合相同的肌肉生长抑制因子表位的亲和力比在pH5.8更高。在另外的实施方案中，所述抗体在pH7.4与包含表2a中所述的VH和VL对的抗体结合相同的表位的亲和力比在pH5.8更高。在另外的实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体在中性pH结合与表11a中所述的抗体相同的表位的亲和力比在酸性pH更高。在另外的实施方案中，所述抗体在pH7.4结合与表11a中所述的抗体相同的肌肉生长抑制因子表位的亲和力比在pH5.8更高。在另外的实施方案中，所述抗体在pH7.4结合与包含表11a中所述的VH和VL对的抗体相同的表位的亲和力比在pH5.8更高。在另外的实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体在中性pH结合与表2a，11a，或13中所述的抗体相同的表位的亲和力比在酸性pH更高。在另外的实施方案中，所述抗体在pH7.4结合与表2a，11a，或13中所述的抗体相同的肌肉生长抑制因子表位的亲和力比在pH5.8更高。在另外的实施方案中，所述抗体在pH7.4结合与包含表2a，11a，或13中所述的VH和VL对的抗体相同的表位的亲和力比在pH5.8更高。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗-肌肉生长抑制因子抗体与本文中提供的抗体竞争结合潜伏性肌肉生长抑制因子。在一些实施方案中，本发明的分离的抗-肌肉生长抑制因子抗体与表13中所述的抗体竞争结合潜伏性肌肉生长抑制因子。在一些实施方案中，本发明的分离的抗-肌肉生长抑制因子抗体与包含表13中所述的VH和VL对的抗体竞争结合潜伏性肌肉生长抑制因子。在一些实施方案中，所述抗体与表2a中所述的抗体竞争结合潜伏性肌肉生长抑制因子。在一些实施方案中，本发明的分离的抗-肌肉生长抑制因子抗体与包含表2a所述的VH和VL对的抗体竞争结合潜伏性肌肉生长抑制因子。在一些实施方案中，所述抗体与表11a中所述的抗体竞争结合潜伏性肌肉生长抑制因子。在一些实施方案中，本发明的分离的抗-肌肉生长抑制因子抗体与包含表11a中所述的VH和VL对的抗体竞争结合潜伏性肌肉生长抑制因子。在另外的实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体与表2a，11a，或13中所述的抗体竞争结合潜伏性肌肉生长抑制因子。在另外的实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体与包含表2a，11a，或13中所述的VH和VL对的抗体竞争结合潜伏性肌肉生长抑制因子。在另外的实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体在中性pH结合潜伏性肌肉生长抑制因子的亲和力比在酸性pH更高。在另外的实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体在pH7.4结合潜伏性肌肉生长抑制因子的亲和力比在pH5.8更高。在另外的实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体在pH7.4结合由肌肉生长抑制因子前肽(SEQID NO:78)的氨基酸21-100组成的多肽片段的亲和力比在pH5.8更高。用于评估抗体与参比抗体竞争结合潜伏性肌肉生长抑制因子的能力的方法在本文中被描述并且是本领域中已知的。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗-肌肉生长抑制因子抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，本发明的分离的抗-肌肉生长抑制因子抗体是人、人源化或嵌合抗体。在一些实施方案中，本发明的分离的抗-肌肉生长抑制因子抗体是结合肌肉生长抑制因子的抗体片段。在一些实施方案中，本发明的分离的抗-肌肉生长抑制因子抗体是结合潜伏性肌肉生长抑制因子的抗体片段。在一些实施方案中，本发明的分离的抗-肌肉生长抑制因子抗体是结合由肌肉生长抑制因子前肽(SEQ ID NO:78)的氨基酸21-100组成的多肽片段的抗体片段。在一些实施方案中，本发明的分离的抗-肌肉生长抑制因子抗体是全长IgG抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗-肌肉生长抑制因子抗体包含：
(a)(i)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列GVPAX1SX2GGDX3，其中X1是Y或H，X2是T或H，X3是L或K(SEQ ID NO:128)，(ii)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列AGGYGGGX1YA，其中X1是L或R(SEQ ID NO:131)，和(iii)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列IISX1AGX2X3YX4X5X6WAKX7，其中X1是Y或H，X2是S或K，X3是T、M或K，X4是Y或K，X5是A、M或E，X6是S或E，X7是G或K(SEQ ID NO:127)；
(b)(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列X1X2DIS，其中X1是S或H，X2是Y、T、D或E(SEQ ID NO:126)，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列IISX1AGX2X3YX4X5X6WAKX7，其中X1是Y或H，X2是S或K，X3是T、M或K，X4是Y或K，X5是A、M或E，X6是S或E，X7是G或K(SEQ ID NO:127)，和(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列GVPAX1SX2GGDX3，其中X1是Y或H，X2是T或H，X3是L或K(SEQ ID NO:128)；
(c)(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列X1X2DIS，其中X1是S或H，X2是Y、T、D或E(SEQ ID NO:126)，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列IISX1AGX2X3YX4X5X6WAKX7，其中X1是Y或H，X2是S或K，X3是T、M或K，X4是Y或K，X5是A、M或E，X6是S或E，X7是G或K(SEQ ID NO:127)，(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列GVPAX1SX2GGDX3，其中X1是Y或H，X2是T或H，X3是L或K(SEQ ID NO:128)，(iv)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列X1X2SQX3VX4X5X6NWLS，其中X1是Q或T，X2是S或T，X3是S或E，X4是Y或F，X5是D或H，X6是N、D、A或E(SEQ ID NO:129)；(v)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列WAX1TLAX2，其中X1是S或E，X2是S、Y、F或W(SEQ IDNO:130)；和(vi)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列AGGYGGGX1YA，其中X1是L或R(SEQ IDNO:131)；
(d)(i)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列X1X2SQX3VX4X5X6NWLS，其中X1是Q或T，X2是S或T，X3是S或E，X4是Y或F，X5是D或H，X6是N、D、A或E(SEQ ID NO:129)；(ii)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列WAX1TLAX2，其中X1是S或E，X2是S、Y、F或W(SEQ ID NO:130)；和(iii)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列AGGYGGGX1YA，其中X1是L或R(SEQ ID NO:131)。在一些实施方案中，(b)的抗体还包含：重链可变结构域框架FR1，所述FR1包含SEQ ID NO:132-134中任一的氨基酸序列；FR2，所述FR2包含SEQ ID NO:135-136中任一的氨基酸序列；FR3，所述FR3包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列；和FR4，所述FR4包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列。在一些实施方案中，(d)的抗体还包含：轻链可变结构域框架FR1，所述FR1包含SEQ IDNO:139的氨基酸序列；FR2，所述FR2包含SEQ ID NO:140-141中任一的氨基酸序列；FR3，所述FR3包含SEQ ID NO:142-143中任一的氨基酸序列；和FR4，所述FR4包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗-肌肉生长抑制因子抗体包含(a)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列GVPAX1SX2GGDX3，其中X1是Y或H，X2是T或H，X3是L或K(SEQ IDNO:128)，(b)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列AGGYGGGX1YA，其中X1是L或R(SEQ ID NO:131)，和(c)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列IISX1AGX2X3YX4X5X6WAKX7，其中X1是Y或H，X2是S或K，X3是T、M或K，X4是Y或K，X5是A、M或E，X6是S或E，X7是G或K(SEQ ID NO:127)。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗-肌肉生长抑制因子抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列X1X2DIS，其中X1是S或H，X2是Y、T、D或E(SEQ ID NO:126)，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列IISX1AGX2X3YX4X5X6WAKX7，其中X1是Y或H，X2是S或K，X3是T、M或K，X4是Y或K，X5是A、M或E，X6是S或E，X7是G或K(SEQ ID NO:127)，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列GVPAX1SX2GGDX3，其中X1是Y或H，X2是T或H，X3是L或K(SEQ ID NO:128)。在另外的实施方案中，所述抗体包含重链可变结构域框架FR1，所述FR1包含SEQ IDNO:132-134中任一的氨基酸序列；FR2，所述FR2包含SEQ ID NO:135-136中任一的氨基酸序列；FR3，所述FR3包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列；和FR4，所述FR4包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列。在另外的实施方案中，所述抗体还包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列X1X2SQX3VX4X5X6NWLS，其中X1是Q或T，X2是S或T，X3是S或E，X4是Y或F，X5是D或H，X6是N、D、A或E(SEQ ID NO:129)；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列WAX1TLAX2，其中X1是S或E，X2是S、Y、F或W(SEQ ID NO:130)；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列AGGYGGGX1YA，其中X1是L或R(SEQ ID NO:131)。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗-肌肉生长抑制因子抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列X1X2SQX3VX4X5X6NWLS，其中X1是Q或T，X2是S或T，X3是S或E，X4是Y或F，X5是D或H，X6是N、D、A或E(SEQ ID NO:129)；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列WAX1TLAX2，其中X1是S或E，X2是S、Y、F或W(SEQ ID NO:130)；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列AGGYGGGX1YA，其中X1是L或R(SEQ ID NO:131)。在另一个实施方案中，所述抗体还包含：轻链可变结构域框架FR1，所述FR1包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列；FR2，所述FR2包含SEQ ID NO:140-141中任一的氨基酸序列；FR3，所述FR3包含SEQ ID NO:142-143中任一的氨基酸序列；和FR4，所述FR4包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗-肌肉生长抑制因子抗体包含重链可变结构域框架FR1，所述FR1包含SEQ ID NO:132-134中任一的氨基酸序列；FR2，所述FR2包含SEQID NO:135-136中任一的氨基酸序列；FR3，所述FR3包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列；和FR4，所述FR4包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的分离的抗-肌肉生长抑制因子抗体包含轻链可变结构域框架FR1，所述FR1包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列；FR2，所述FR2包含SEQ ID NO:140-141中任一的氨基酸序列；FR3，所述FR3包含SEQ IDNO:142-143中任一的氨基酸序列；和FR4，所述FR4包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗-肌肉生长抑制因子抗体包含(a)与SEQ IDNO:13、16-30、32-34和86-95中任一的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)与SEQ ID NO:15、31、35-38和96-99中任一的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。在另外的实施方案中，所述抗体包含SEQ IDNO:13、16-30、32-34和86-95中任一的VH序列。在另外的实施方案中，所述抗体包含SEQ IDNO:15、31、35-38和96-99中任一的VL序列。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:13、16-30、32-34和86-95中任一的VH序列。在另外的实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:13、16-30、32-34和86-95中任一的VH序列；以及SEQ ID NO:15、31、35-38和96-99中任一的VL序列。
本发明还提供编码本发明的抗-肌肉生长抑制因子抗体的分离的核酸。本发明还提供包含本发明的核酸的宿主细胞。本发明还提供制备所述抗体的方法，所述方法包括培养本发明的宿主细胞从而制备所述抗体。
在一些方面，本发明提供制备抗-肌肉生长抑制因子抗体的方法，所述方法包括：(a)培养本发明的宿主细胞从而制备所述抗体；或(b)针对多肽免疫动物，其中所述多肽包含对应于肌肉生长抑制因子前肽(SEQ ID NO:78)的位置21至100处的氨基酸的区域。
本发明还提供制备抗-肌肉生长抑制因子抗体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括针对多肽免疫动物，其中所述多肽包含对应于肌肉生长抑制因子前肽(SEQ ID NO:78)的位置21-100处的氨基酸的区域。
本发明还提供药物制剂，所述药物制剂包含本发明的抗-肌肉生长抑制因子抗体和药用载体。
本发明提供包含变体Fc区的多肽及其制备方法和使用方法。
在一个实施方案中，本发明提供包含变体Fc区的Fcγ RIIB-结合多肽及其使用方法。在一些实施方案中，本发明的具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区包含至少一个在亲本Fc区中的氨基酸改变。在另外的实施方案中，[亲本Fc区对猴Fcγ RIIb的KD值]/[变体Fc区对猴Fcγ RIIb的KD值]之比是2.0或更大。在另外的实施方案中，[亲本Fc区对猴Fcγ RIIIa的KD值]/[变体Fc区对猴Fcγ RIIIa的KD值]之比是0.5或更小。在另外的实施方案中，[亲本Fc区对人Fcγ RIIb的KD值]/[变体Fc区对人Fcγ RIIb的KD值]之比是2.0或更大。在另外的实施方案中，[亲本Fc区对人FcγRIIIa的KD值]/[变体Fc区对人Fcγ RIIIa的KD值]之比是0.5或更小。在另外的实施方案中，[亲本Fc区对人Fcγ RIIa(H型)的KD值]/[变体Fc区对人Fcγ RIIa(H型)的KD值]之比是5.0或更小。在另外的实施方案中，[亲本Fc区对人Fcγ RIIa(R型)的KD值]/[变体Fc区对人Fcγ RIIa(R型)的KD值]之比是5.0或更小。在另一个实施方案中，变体Fc区对猴Fcγ RIIb的KD值是1.0x10-6M或更小。在另一个实施方案中，变体Fc区对猴FcγRIIIa的KD值是5.0x10-7M或更大。在另一个实施方案中，变体Fc区对人Fcγ RIIb的KD值是2.0x10-6M或更小。在另一个实施方案中，变体Fc区对人FcγRIIIa的KD值是1.0x10-6M或更大。在另一个实施方案中，变体Fc区对人Fcγ RIIa(H型)的KD值是1.0x10-7M或更大。在另一个实施方案中，变体Fc区对人Fcγ RIIa(R型)的KD值是2.0x10-7M或更大。
在一些实施方案中，本发明的具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区包含选自由以下组成的组的至少一个位置的至少一个氨基酸改变：231、232、233、234、235、236、237、238、239、264、266、267、268、271、295、298、325、326、327、328、330、331、332、334和396(根据EU编号)。
在另外的实施方案中，具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区包含至少两个氨基酸改变，所述至少两个氨基酸改变包含：(a)位置236处的一个氨基酸改变，和(b)选自由以下组成的组的至少一个位置的至少一个氨基酸改变：(i)位置231、232、233、234、235、237、238、239、264、266、267、268、271、295、298、325、326、327、328、330、331、332、334和396；(ii)位置231、232、235、239、268、295、298、326、330和396；或(iii)位置268、295、326和330(根据EU编号)。
在另外的实施方案中，具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区包含至少两个氨基酸改变，所述至少两个氨基酸改变包含：(a)位置236处的一个氨基酸改变，和(b)选自由以下组成的组的至少一个位置的至少一个氨基酸改变：231、232、233、234、235、237、238、239、264、266、267、268、271、295、298、325、326、327、328、330、331、332、334和396(根据EU编号)。
在另外的实施方案中，具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区包含至少两个氨基酸改变，所述至少两个氨基酸改变包含：(a)位置236处的一个氨基酸改变，和(b)选自由以下组成的组的至少一个位置的至少一个氨基酸改变：231、232、235、239、268、295、298、326、330和396(根据EU编号)。
在另外的实施方案中，具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区包含至少两个氨基酸改变，所述至少两个氨基酸改变包含：(a)位置236处的一个氨基酸改变，和(b)选自由以下组成的组的至少一个位置的至少一个氨基酸改变：268、295、326和330(根据EU编号)。
在一些实施方案中，本发明的具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸：(a)位置231处的Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr；(b)位置232处的Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr；(c)位置233处的Asp；(d)位置234处的Trp、Tyr；(e)位置235处的Trp；(f)位置236处的Ala、Asp、Glu、His、Ile、Leu、Met、Asn、Gln、Ser、Thr、Val；(g)位置237处的Asp、Tyr；(h)位置238处的Glu、Ile、Met、Gln、Tyr；(i)位置239处的Ile、Leu、Asn、Pro、Val；(j)位置264处的Ile；(k)位置266处的Phe；(l)位置267处的Ala、His、Leu；(m)位置268处的Asp、Glu；(n)位置271处的Asp、Glu、Gly；(o)位置295处的Leu；(p)位置298处的Leu；(q)位置325处的Glu、Phe、Ile、Leu；(r)位置326处的Thr；(s)位置327处的Ile、Asn；(t)位置328处的Thr；(u)位置330处的Lys、Arg；(v)位置331处的Glu；(w)位置332处的Asp；(x)位置334处的Asp、Ile、Met、Val、Tyr；和(y)位置396处的Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr(根据EU编号)。
在另外的实施方案中，具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸：(a)位置231处的Gly、Thr；(b)位置232处的Asp；(c)位置235处的Trp；(d)位置236处的Asn、Thr；(e)位置239处的Val；(f)位置268处的Asp、Glu；(g)位置295处的Leu；(h)位置298处的Leu；(i)位置326处的Thr；(j)位置330处的Lys、Arg，和(k)位置396处的Lys、Met(根据EU编号)。
在另一个实施方案中，本发明提供包含具有提高的等电点(pI)的变体Fc区的多肽及其使用方法。在一些实施方案中，包含具有提高的pI的变体Fc区的多肽包含在亲本Fc区中的至少两个氨基酸改变。在另外的实施方案中，与亲本Fc区相比，每个所述氨基酸改变提高变体Fc区的等电点(pI)。在另外的实施方案中，所述氨基酸可以暴露在变体Fc区的表面上。在另外的实施方案中，所述多肽包含变体Fc区和抗原结合结构域。在另外的实施方案中，所述抗原结合结构域的抗原结合活性根据离子浓度条件而改变。在另外的实施方案中，本发明的具有提高的pI的变体Fc区包含选自由以下组成的组的至少两个位置的至少两个氨基酸改变：285、311、312、315、318、333、335、337、341、342、343、384、385、388、390、399、400、401、402、413、420、422和431(根据EU编号)。在另外的实施方案中，具有提高的pI的变体Fc区在所选的每个位置处包含Arg或Lys。
在一些实施方案中，本发明的变体Fc区包含表14-30中所述的氨基酸改变。
在一些实施方案中，多肽包含本发明的变体Fc区。在另外的实施方案中，所述亲本Fc区源于人IgG1。在另外的实施方案中，所述多肽是抗体。在另外的实施方案中，所述多肽是Fc融合蛋白。
本发明提供包含SEQ ID NO:229-381中任一的氨基酸序列的多肽。
本发明还提供编码包含本发明的变体Fc区的多肽的分离的核酸。本发明还提供包含本发明的核酸的宿主细胞。本发明还提供制备包含变体Fc区的多肽的方法，所述方法包括培养本发明的宿主从而生产所述多肽。
本发明还提供药物制剂，所述药物制剂包含含有本发明的变体Fc区的多肽和药用载体。
具体地，本发明涉及：
[1]分离的抗体，所述分离的抗体结合潜伏性肌肉生长抑制因子，其中所述抗体抑制肌肉生长抑制因子的活化。
[2][1]的抗体，其中所述抗体：
(a)阻断成熟肌肉生长抑制因子从潜伏性肌肉生长抑制因子的释放；
(b)阻断成熟肌肉生长抑制因子的蛋白水解释放；
(c)阻断成熟肌肉生长抑制因子的自发释放；或
(d)不结合成熟肌肉生长抑制因子；或结合由肌肉生长抑制因子前肽(SEQ ID NO:78)的氨基酸21-100组成的片段内的表位。
[3][1]或[2]的抗体，其中所述抗体与包含表2a、11a或13中所述的VH和VL对的抗体竞争结合潜伏性肌肉生长抑制因子，或与包含表2a、11a或13中所述的VH和VL对的抗体结合相同的表位。
[4][1]至[3]中任一项的抗体，其在中性pH结合潜伏性肌肉生长抑制因子的亲和力比在酸性pH更高，或在pH7.4结合潜伏性肌肉生长抑制因子的亲和力比在pH5.8更高。
[5][1]至[4]中任一项的抗体，其是(a)单克隆抗体，(b)人、人源化或嵌合抗体；(c)全长IgG抗体或(d)结合肌肉生长抑制因子的抗体片段。
[6][1]至[5]中任一项的抗体，其中所述抗体包含：
(a)(i)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列GVPAX1SX2GGDX3，其中X1是Y或H，X2是T或H，X3是L或K(SEQ ID NO:128)，(ii)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列AGGYGGGX1YA，其中X1是L或R(SEQ ID NO:131)，和(iii)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列IISX1AGX2X3YX4X5X6WAKX7，其中X1是Y或H，X2是S或K，X3是T、M或K，X4是Y或K，X5是A、M或E，X6是S或E，X7是G或K(SEQ ID NO:127)；
(b)(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列X1X2DIS，其中X1是S或H，X2是Y、T、D或E(SEQ ID NO:126)，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列IISX1AGX2X3YX4X5X6WAKX7，其中X1是Y或H，X2是S或K，X3是T、M或K，X4是Y或K，X5是A、M或E，X6是S或E，X7是G或K(SEQ ID NO:127)，和(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列GVPAX1SX2GGDX3，其中X1是Y或H，X2是T或H，X3是L或K(SEQ ID NO:128)；
(c)(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列X1X2DIS，其中X1是S或H，X2是Y、T、D或E(SEQ ID NO:126)，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列IISX1AGX2X3YX4X5X6WAKX7，其中X1是Y或H，X2是S或K，X3是T、M或K，X4是Y或K，X5是A、M或E，X6是S或E，X7是G或K(SEQ ID NO:127)，(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列GVPAX1SX2GGDX3，其中X1是Y或H，X2是T或H，X3是L或K(SEQ ID NO:128)，(iv)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列X1X2SQX3VX4X5X6NWLS，其中X1是Q或T，X2是S或T，X3是S或E，X4是Y或F，X5是D或H，X6是N、D、A或E(SEQ ID NO:129)；(v)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列WAX1TLAX2，其中X1是S或E，X2是S、Y、F或W(SEQ IDNO:130)；和(vi)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列AGGYGGGX1YA，其中X1是L或R(SEQ IDNO:131)；或
(d)(i)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列X1X2SQX3VX4X5X6NWLS，其中X1是Q或T，X2是S或T，X3是S或E，X4是Y或F，X5是D或H，X6是N、D、A或E(SEQ ID NO:129)；(ii)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列WAX1TLAX2，其中X1是S或E，X2是S、Y、F或W(SEQ ID NO:130)；和(iii)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列AGGYGGGX1YA，其中X1是L或R(SEQ ID NO:131)。
[7][6](b)的抗体，其还包含重链可变结构域框架FR1，所述FR1包含SEQ ID NO:132-134中任一的氨基酸序列；FR2，所述FR2包含SEQ ID NO:135-136中任一的氨基酸序列；FR3，所述FR3包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列；和FR4，所述FR4包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列。
[8][6](d)的抗体，还包含轻链可变结构域框架FR1，所述FR1包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列；FR2，所述FR2包含SEQ ID NO:140-141中任一的氨基酸序列；FR3，所述FR3包含SEQ ID NO:142-143中任一的氨基酸序列；和FR4，所述FR4包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列。
[9][1]至[5]中任一项的抗体，其包含(a)与SEQ ID NO:13、16-30、32-34和86-95中任一的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)与SEQ ID NO:15、31、35-38和96-99中任一的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)SEQ ID NO:13、16-30、32-34和86-95中任一的VH序列，和SEQ ID NO:15、31、35-38和96-99中任一的VL序列。
[10]分离的核酸，其编码[1]至[9]中任一项的抗体。
[11]宿主细胞，其包含[10]的核酸。
[12]制备抗-肌肉生长抑制因子抗体的方法，所述方法包括：
(a)培养[11]的宿主细胞从而制备所述抗体；或
(b)针对多肽免疫动物，其中所述多肽包含对应于肌肉生长抑制因子前肽(SEQ IDNO:78)的位置21至100处的氨基酸的区域。
[13]药物制剂，所述药物制剂包含[1]至[9]中任一项的抗体和药用载体。
[14]多肽，所述多肽包含变体Fc区，所述变体Fc区包含至少一个亲本Fc区中的氨基酸改变，其中[亲本Fc区对猴Fcγ RIIb的KD值]/[变体Fc区对猴Fcγ RIIb的KD值]之比是2.0或更大，并且[亲本Fc区对猴FcγRIIIa的KD值]/[变体Fc区对猴Fcγ RIIIa的KD值]之比是0.5或更小。
[15][14]的多肽，其中进一步地，[亲本Fc区对人Fcγ RIIb的KD值]/[变体Fc区对人Fcγ RIIb的KD值]之比是2.0或更大，并且[亲本Fc区对人Fcγ RIIIa的KD值]/[变体Fc区对人Fcγ RIIIa的KD值]之比是0.5或更小。
[16][15]的多肽，其中进一步地，[亲本Fc区对人Fcγ RIIa(H型)的KD值]/[变体Fc区对人Fcγ RIIa(H型)的KD值]之比是5.0或更小。
[17][16]的多肽，其中进一步地，[亲本Fc区对人Fcγ RIIa(R型)的KD值]/[变体Fc区对人Fcγ RIIa(R型)的KD值]之比是5.0或更小。
[18][14]的多肽，其中变体Fc区对猴Fcγ RIIb的KD值是1.0x10-6M或更小，并且变体Fc区对猴Fcγ RIIIa的KD值是5.0x10-7M或更大。
[19][15]的多肽，其中变体Fc区对人Fcγ RIIb的KD值是2.0x10-6M或更小，并且变体Fc区对人Fcγ RIIIa的KD值是1.0x10-6M或更大。
[20][16]的多肽，其中变体Fc区对人Fcγ RIIa(H型)的KD值是1.0x10-7M或更大。
[21][17]的多肽，其中变体Fc区对人Fcγ RIIa(R型)的KD值是2.0x10-7M或更大。
[22][14]至[21]中任一项的多肽，其中所述变体Fc区包含选自由以下组成的组的至少一个位置的至少一个氨基酸改变：231、232、233、234、235、236、237、238、239、264、266、267、268、271、295、298、325、326、327、328、330、331、332、334和396(根据EU编号)。
[23][22]的多肽，其中所述变体Fc区包含至少两个氨基酸改变，所述至少两个氨基酸改变包含：
(a)位置236处的一个氨基酸改变，和
(b)选自由以下组成的组的至少一个位置的至少一个氨基酸改变：
(i)位置231、232、233、234、235、237、238、239、264、266、267、268、271、295、298、325、326、327、328、330、331、332、334和396；
(ii)位置231、232、235、239、268、295、298、326、330和396；或
(iii)位置268、295、326和330；(根据EU编号)。
[24][22]或[23]的多肽，其中所述变体Fc区包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸：
(a)位置231处的Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr，
(b)位置232处的Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr,
(c)位置233处的Asp，
(d)位置234处的Trp、Tyr，
(e)位置235处的Trp，
(f)位置236处的Ala、Asp、Glu、His、Ile、Leu、Met、Asn、Gln、Ser、Thr、Val，
(g)位置237处的Asp、Tyr，
(h)位置238处的Glu、Ile、Met、Gln、Tyr，
(i)位置239处的Ile、Leu、Asn、Pro、Val，
(j)位置264处的Ile，
(k)位置266处的Phe，
(l)位置267处的Ala、His、Leu，
(m)位置268处的Asp、Glu，
(n)位置271处的Asp、Glu、Gly，
(o)位置295处的Leu，
(p)位置298处的Leu，
(q)位置325处的Glu、Phe、Ile、Leu，
(r)位置326处的Thr，
(s)位置327处的Ile、Asn，
(t)位置328处的Thr，
(u)位置330处的Lys、Arg，
(v)位置331处的Glu，
(w)位置332处的Asp，
(x)位置334处的Asp、Ile、Met、Val、Tyr，和
(y)位置396处的Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr；(根据EU编号)。
[25][24]的多肽，其中所述变体Fc区包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸：
(a)位置231处的Gly、Thr,
(b)位置232处的Asp，
(c)位置235处的Trp，
(d)位置236处的Asn、Thr，
(e)位置239处的Val，
(f)位置268处的Asp、Glu，
(g)位置295处的Leu，
(h)位置298处的Leu，
(i)位置326处的Thr，
(j)位置330处的Lys、Arg，和
(k)位置396处的Lys、Met；(根据EU编号)。
[26]多肽，所述多肽包含变体Fc区，所述变体Fc区包含在亲本Fc区中的至少两个氨基酸改变，其中每个所述氨基酸改变使变体Fc区的等电点(pI)与亲本Fc区相比提高。
[27][26]的多肽，其中所述氨基酸改变被暴露在变体Fc区的表面上。
[28][26]或[27]的多肽，其还包含抗原结合结构域。
[29][28]的多肽，其中所述抗原结合结构域的抗原结合活性根据离子浓度条件而改变。
[30][26]至[29]中任一项的多肽，其中所述变体Fc区包含选自由以下组成的组的至少两个位置的至少两个氨基酸改变：285、311、312、315、318、333、335、337、341、342、343、384、385、388、390、399、400、401、402、413、420、422和431(根据EU编号)。
[31][30]的多肽，其中所述变体Fc区包含在所选的每个位置处的Arg或Lys。
[32]多肽，所述多肽包含变体Fc区，所述变体Fc区包含表14-30中所述的氨基酸改变。
[33][14]至[32]中任一项的多肽，其中所述亲本Fc区源于人IgG1。
[34][14]至[33]中任一项的多肽，其中所述多肽是抗体或Fc融合蛋白。
[35]多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:229-381中任一的氨基酸序列。
[36]分离的核酸，其编码[14]至[35]中任一项的多肽。
[37]宿主细胞，其包含[36]的核酸。
[38]制备包含变体Fc区的多肽的方法，所述方法包括培养[37]的宿主细胞从而制备所述多肽。
[39]药物制剂，所述药物制剂包含[14]至[35]中任一项的多肽和药用载体。
附图简述
[图1]
图1图示抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体抑制潜伏性肌肉生长抑制因子的蛋白水解活化，如实施例3中所述。在存在抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的情况下，使用HEKBlue测定测量通过BMP1蛋白酶由潜伏性肌肉生长抑制因子释放的活性肌肉生长抑制因子的活性。
[图2]
图2图示抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体抑制潜伏性肌肉生长抑制因子的自发活化，如实施例4中所述。在存在抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的情况下，使用HEK Blue测定测量通过37℃孵育由潜伏性肌肉生长抑制因子释放的活性肌肉生长抑制因子的活性。
[图3]
图3图示抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体与前肽结构域的结合，如实施例5中所述。
[图4]
图4图示针对肌肉生长抑制因子前肽的蛋白质印迹分析，如实施例6中所述。在存在和不存在抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的情况下，测量BMP1对肌肉生长抑制因子前肽的蛋白水解切割。
[图5]
图5A-5C图示抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体MST1032-G1m对于人潜伏性肌肉生长抑制因子(A)，食蟹猴潜伏性肌肉生长抑制因子(B)，和小鼠潜伏性肌肉生长抑制因子(C)的BIACORE(注册商标)感应图，如实施例7中所述。
[图6]
图6图示人源化抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体抑制潜伏性肌肉生长抑制因子的蛋白水解和自发活化，如实施例8中所述。在存在抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的情况下，通过BMP1蛋白酶(蛋白水解)或通过在不存在BMP1的情况下的37℃孵育(自发)，使用HEK Blue测定测量由潜伏性肌肉生长抑制因子释放的活性肌肉生长抑制因子的活性。
[图7]
图7图示抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的组氨酸取代的变体的BIACORE(注册商标)感应图，如实施例9中所述。允许抗体/抗原复合物在pH7.4解离，之后在pH5.8进一步解离(箭头所指)以评估pH依赖性的相互作用。该实验中测试的抗体是：Ab001(黑色实曲线)，Ab002(黑色短虚曲线)，Ab003(黑色点曲线)，Ab004(灰色短虚曲线)，Ab005(灰色实曲线)，Ab006(灰色长虚曲线)，和Ab007(黑色长虚曲线)。
[图8]
图8图示pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体抑制潜伏性肌肉生长抑制因子的蛋白水解和自发活化，如实施例11中所述。在存在抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的情况下，通过BMP1蛋白酶(蛋白水解)或通过在不存在BMP1的情况下的37℃孵育(自发)，使用HEK Blue测定测量由潜伏性肌肉生长抑制因子释放的活性肌肉生长抑制因子的活性。抗体MS1032LO01-SG1，MS1032LO02-SG1，MS1032LO03-SG1，和MS1032LO04-SG1在图中分别被描述为MSLO-01，MSLO-02，MSLO-03，和MSLO-04。MS1032LO01-SG1，MS1032LO02-SG1，MS1032LO03-SG1，和MS1032LO04-SG1实现与MS1032LO00-SG1相当的对潜伏性肌肉生长抑制因子的蛋白水解和自发活化的抑制。
[图9]
图9A-9F图示pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的BIACORE(注册商标)感应图，如实施例12中所述。在中性pH和酸性pH下测量MST1032-SG1(A)，MS1032LO00-SG1(B)，MS1032LO01-SG1(C)，MS1032LO02-SG1(D)，MS1032LO03-SG1(E)，和MS1032LO04-SG1(F)的动力学参数。
[图10]
图10图示在小鼠中静脉内施用抗-肌肉生长抑制因子抗体后的血浆肌肉生长抑制因子浓度的时程，如实施例13中所述。通过比较具有Fcγ R结合的抗-肌肉生长抑制因子抗体(MS1032LO00-SG1)和具有破坏的Fcγ R结合的抗-肌肉生长抑制因子抗体(MS1032LO00-F760)，评估抗体/抗原复合物的Fcγ R介导的细胞摄取对体内肌肉生长抑制因子清除的作用。
[图11]
图11图示在小鼠中静脉内施用抗-肌肉生长抑制因子抗体后的血浆肌肉生长抑制因子浓度的时程，如实施例14中所述。通过比较pH依赖性抗-肌肉生长抑制因子抗体(MS1032LO01-SG1或MS1032LO01-F760)和非pH依赖性抗-肌肉生长抑制因子抗体(MS1032LO00-SG1或MS1032LO00-F760)，评估抗-肌肉生长抑制因子抗体的pH依赖性的结合对体内肌肉生长抑制因子清除的作用。
[图12]
图12图示抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体MST1032与潜伏性肌肉生长抑制因子和GDF11的结合活性，如实施例16中所述。
[图13]
图13图示抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体MST1032针对GDF11的蛋白水解和自发活化的抑制活性，如实施例17中所述。在存在抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的情况下，通过BMP1蛋白酶(蛋白水解)或通过在不存在BMP1的情况下的37℃孵育(自发)，使用HEKBlue测定测量释放的活性GDF11的活性。
[图14]
图14图示抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体抑制潜伏性肌肉生长抑制因子的蛋白水解活化，如实施例19中所述。在存在抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的情况下，使用HEKBlue测定测量通过BMP1蛋白酶由潜伏性肌肉生长抑制因子释放的活性肌肉生长抑制因子的活性。
[图15]
图15图示在小鼠中静脉内施用抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体后血浆肌肉生长抑制因子浓度的时程，如实施例20中所述。通过比较非pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体(MS1032LO00-SG1)和不同的pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体(MS1032LO01-SG1，
MS1032LO06-SG1，MS1032LO11-SG1，MS1032LO18-SG1，
MS1032LO19-SG1，MS1032LO21-SG1和MS1032LO25-SG1)，评估pH依赖性对体内肌肉生长抑制因子清除的作用。
[图16]
图16A和16B图示在食蟹猴中静脉内施用抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体后血浆肌肉生长抑制因子浓度的时程，如实施例21中所述。(A)通过比较非pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体(MS1032LO00-SG1)和具有Fc工程改造的pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体(MS1032LO06-SG1012，MS1032LO06-SG1016，MS1032LO06-SG1029，MS1032LO06-SG1031，MS1032LO06-SG1033，MS1032LO06-SG1034)评估pH依赖性和Fc工程改造对体内肌肉生长抑制因子清除的作用。(B)通过比较抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体(MS1032LO19-SG1079，MS1032LO19-SG1071，MS1032LO19-SG1080，MS1032LO19-SG1074，MS1032LO19-SG1081，和MS1032LO19-SG1077)评估Fc工程改造对体内肌肉生长抑制因子清除的作用。
[图17]
图17图示抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体对潜伏性肌肉生长抑制因子活化的抑制活性，如实施例22中所述。在存在抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体(MST1032，MST1504，MST1538，MST1551，MST1558，MST1572，和MST1573)的情况下，测量通过BMP1蛋白酶由潜伏性肌肉生长抑制因子释放的成熟肌肉生长抑制因子的量。
[图18A]
图18A图示为了抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的表位作图设计的各自100个氨基酸的潜伏性肌肉生长抑制因子片段的示意图，如实施例22中所述。
[图18B]
图18B图示通过抗-GST抗体的针对带GST标签的人潜伏性肌肉生长抑制因子片段(GST-hMSTN)的蛋白质印迹分析，如实施例22中所述。各泳道指示：1，GST-hMSTN 1-100aa；2，GST-hMSTN 21-120aa；3，GST-hMSTN 41-140aa；4，GST-hMSTN 61-160aa；5，GST-hMSTN81-180aa；6，GST-hMSTN 101-200aa；7，GST-hMSTN 121-220aa；8，GST-hMSTN 141-241aa；9，GST对照。
[图18C]
图18C图示通过抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体(MST1032，MST1538，MST1572，和MST1573)的针对带GST标签的人潜伏性肌肉生长抑制因子片段(GST-hMSTN)的蛋白质印迹分析，如实施例22中所述。各泳道指示：1，GST-hMSTN 1-100aa；2，GST-hMSTN 21-120aa；3，GST-hMSTN 41-140aa；4，GST-hMSTN 61-160aa；5，GST-hMSTN 81-180aa；6，GST-hMSTN 101-200aa；7，GST-hMSTN 121-220aa；8，GST-hMSTN 141-241aa；9，GST对照；10，人潜伏性肌肉生长抑制因子(100ng)。
[图18D]
图18D图示抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体(MST1032，MST1538，MST1572，和MST1573)的蛋白质印迹分析和推测的表位位置的概要结果，如实施例22中所述。
[图19]
图19图示食蟹猴(cyno)Fcγ RIIa1，Fcγ RIIa2，Fcγ RIIa3，Fcγ RIIb，人FcγRIIaH，Fcγ RIIaR，和Fcγ RIIb的氨基酸序列的比对。方框区域指示推测的与Fc结构域相互作用的残基。
[图20]
图20图示在全人Fcγ R转基因小鼠中静脉内施用具有Fcγ RIIb增强的Fc变体的抗-肌肉生长抑制因子抗体后血浆中总肌肉生长抑制因子浓度的时程，如实施例24中所述。评估Fcγ RIIb增强的Fc变体通过人Fcγ RIIb的对抗原消除的作用。
[图21]
图21图示在全人Fcγ R转基因小鼠中静脉内施用具有Fcγ RIIb增强的Fc变体的抗-肌肉生长抑制因子抗体后血浆中抗体浓度的时程，如实施例24中所述。评估Fcγ RIIb增强的Fc变体对抗体药物动力学的作用。
[图22]
图22A和22B图示在食蟹猴中静脉内施用抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体后血浆肌肉生长抑制因子浓度的时程，如实施例25中所述。(A)通过比较非pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体(MS1032LO00-SG1)和具有Fc工程改造的pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体(MS1032LO06-SG1012，MS1032LO06-SG1016，MS1032LO06-SG1029，MS1032LO06-SG1031，MS1032LO06-SG1033，MS1032LO06-SG1034)评估pH依赖性和Fc工程改造对体内肌肉生长抑制因子清除的作用。(B)通过比较抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体(MS1032LO19-SG1079，MS1032LO19-SG1071，MS1032LO19-SG1080，MS1032LO19-SG1074，MS1032LO19-SG1081，和MS1032LO19-SG1077)评估Fc工程改造对体内肌肉生长抑制因子清除的作用。
[图23A]
图23A图示在人FcRn转基因小鼠中静脉内施用具有pI提高的Fc变体的抗-肌肉生长抑制因子抗体后血浆中总肌肉生长抑制因子浓度的时程，如实施例26中所述。评估pI提高的Fc变体对抗原消除的作用。
[图23B]
图23B图示在人FcRn转基因小鼠中静脉内施用具有pI提高的Fc变体的抗-肌肉生长抑制因子抗体后血浆中抗体浓度的时程，如实施例26中所述。评估pI提高的Fc变体对抗体药物动力学的作用。
[图24A]
图24A图示在人FcRn转基因小鼠中在静脉内施用具有pI提高的Fc变体的抗-肌肉生长抑制因子抗体后血浆中总肌肉生长抑制因子浓度的时程，如实施例26中所述。评估pI提高的Fc变体对抗原消除的作用。在该测定中，将过量的人正常免疫球蛋白与抗-肌肉生长抑制因子抗体共施用以模拟人血浆的情形。
[图24B]
图24B图示在人FcRn转基因小鼠中静脉内施用具有pI提高的Fc变体的抗-肌肉生长抑制因子抗体后血浆中抗体浓度的时程，如实施例26中所述。评估pI提高的Fc变体对抗体药物动力学的作用。在该测定中，将过量的人正常免疫球蛋白与抗-肌肉生长抑制因子抗体共施用以模拟人血浆的情形。
[图25]
图25图示在人Fcγ RIIb转基因小鼠中静脉内施用具有Fcγ RIIb增强的Fc变体的抗-肌肉生长抑制因子抗体后血浆中总肌肉生长抑制因子浓度的时程，如实施例27中所述。评估Fcγ RIIb增强的Fc变体对通过人FcγRIIb的抗原消除的作用。
[图26]
图26图示在人Fcγ RIIb转基因小鼠中静脉内施用具有Fcγ RIIb增强的Fc变体的抗-肌肉生长抑制因子抗体后血浆中抗体浓度的时程，如实施例27中所述。评估FcγRIIb增强的Fc变体对抗体药物动力学的作用。
[图27]
图27图示具有Fcγ RIIb增强的Fc变体的抗-肌肉生长抑制因子抗体的细胞成像分析的结果，如实施例29中所述。将各抗体与荧光标记的肌肉生长抑制因子复合并测量抗原-抗体复合物到表达人Fcγ RIIb的细胞中的胞内摄取。
具体实施方案
本文中描述或引用的技术和方法是本领域技术人员使用常规方法学通常很好理解并且常规使用的，如，例如，以下中所述的广泛使用的方法Sambrook等,MolecularCloning:A Laboratory Manual第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等,eds.,(2003))；the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR 2:APractical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor eds.(1995)),Harlow和Lane,eds.(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,and Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；Methodsin Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney),ed.,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,和D.G.Newell,eds.,1993-8)J.Wiley and Sons；Handbook ofExperimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell,eds.)；Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos,eds.,1987)；PCR:The Polymerase ChainReaction,(Mullis等,eds.,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等,eds.,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley&Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989)；MonoclonalAntibodies:A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean,eds.,Oxford UniversityPress,2000)；Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane,Cold SpringHarbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra,eds.,Harwood Academic Publishers,1995)；以及Cancer:Principles and Practice ofOncology(V.T.DeVita等,eds.,J.B.Lippincott Company,1993)。
I.定义
除非另外限定，本文中使用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域普通技术人员的通常理解相同的含义。Singleton等,Dictionary of Microbiology andMolecular Biology 2nd ed.,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994)以及March,AdvancedOrganic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure 4th ed.,John Wiley&Sons(New York,N.Y.1992)给本领域技术人员提供了对本申请中所用众多术语的一般指导。本文中引用的所有文献(包括专利申请和出版物)通过引用完整地结合。
为了解释本申请，以下定义将适用并且当合适时，单数使用的术语也将包括复数并且反之亦然。要理解的是，本文中使用的技术仅是为了描述特别的实施方案，并且不意在是限制性的。如果以下给出的任何定义与通过引用结合在本文中的任何文献有冲突，以以下给出的定义为准。
用于本文中的目的的"受体人框架"是包含来源于人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架，如以下所限定。"来源于"人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或其可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10以下，9以下，8以下，7以下，6以下，5以下，4以下，3以下，或2以下。在一些实施方案中，VL受体人框架的序列与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
"亲和力"是指分子(例如，抗体)的单个结合位点及其结合配偶体(例如，抗原)之间非共价相互作用的力量总和。除非另外指出，如本文中使用的，"结合亲和力"是指固有结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(Kd)代表。亲和力可以通过本领域中已知的常规方法测量，所述方法包括本文中所述的那些。以下描述测量结合亲和力的具体的说明性和示例性实施方案。
"亲和力成熟"抗体是指在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变(相比于不具有此种改变的亲本抗体)的抗体，此种改变导致抗体对抗原的亲和力提高。
术语"抗-肌肉生长抑制因子抗体"和"结合肌肉生长抑制因子的抗体"是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合肌肉生长抑制因子以致所述抗体可用作用于靶向肌肉生长抑制因子的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗-肌肉生长抑制因子抗体与不相关的、非肌肉生长抑制因子蛋白的结合程度小于所述抗体与肌肉生长抑制因子结合的约10％，如例如通过放射性免疫测定(RIA)测量的。在某些实施方案中，结合肌肉生长抑制因子的抗体的解离常数(Kd)为1μM以下，100nM以下，10nM以下，1nM以下，0.1nM以下，0.01nM以下，或0.001nM以下(例如，10-8M以下，例如，10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)。在某些实施方案中，抗肌肉生长抑制因子抗体结合肌肉生长抑制因子的表位，所述表位在来源于不同物种的肌肉生长抑制因子之间是保守的。
术语"抗体"在本文中以最广义使用并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，和抗体片段，只要其显示所需的抗原结合活性即可。
"抗体片段"是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体结合完整抗体所结合的抗原的部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv，Fab，Fab'，Fab'-SH，F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
与参比抗体"结合相同表位的抗体"是指这样的抗体，所述抗体在竞争测定中阻断参比抗体与其抗原的结合，和/或相反地，参比抗体在竞争测定中阻断所述抗体与其抗原的结合。示例性竞争测定提供在本文中。
术语"嵌合"抗体是指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分来源于不同的来源或物种。
抗体的"分类"是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。主要有五类抗体：IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，并且这些中的一些可以被进一步划分成亚类(同种异型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，和IgA2。对应于不同的类型的免疫球蛋白的重链恒定结构域被分别称为α，δ，ε，γ，和μ。
如本文中使用的，术语"细胞毒性剂"是指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞死亡或毁坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamycin)，长春花生物碱(vinca alkaloid)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊甙(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素C(mitomycin C)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其他嵌合剂)；生长抑制剂；酶及其片段如核酸水解酶；抗生素；毒素如小分子毒素或细菌，真菌，植物或动物来源的酶学活性毒素，包括其片段和/或变体；以及以下公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
"效应子功能"是指可归因于抗体Fc区的那些生物学活性，其随抗体同种异型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导性细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；以及B细胞活化。
试剂(例如，药物制剂)的"有效量"是指实现所需的治疗或预防结果所必要的剂量和时间的有效量。
术语"表位"包括任何能够被抗体结合的决定簇。表位是抗原的被靶向所述抗原的抗体结合的区域，并且包括与抗体直接接触的特定氨基酸。表位决定簇可以包括分子如氨基酸，糖侧链，磷酰基或磺酰基的化学活性表面簇集，并且可以具有特定的三维结构特征，和/或特定的电荷特征。通常，对于特别的靶抗原具有特异性的抗体将优先识别蛋白和/或大分子的复合物混合物中的靶抗原上的表位。
"Fc受体"或"FcR"描述了结合抗体Fc区的受体。在一些实施方案中，FcR是天然人FcR。在一些实施方案中，FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)并且包括Fcγ RI，Fcγ RII，和Fcγ RIII亚类的受体，包括所述受体的等位变体以及备选地剪接形式。Fcγ RII受体包括Fcγ RIIA("活化受体")和FcγRIIB("抑制受体")，其具有主要区别在于其胞质结构域的类似氨基酸序列。活化受体Fcγ RIIA在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体Fcγ RIIB在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见，例如，Daeron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997)。)FcR被综述于例如Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)；Capel等,Immunomethods 4:25-34(1994)；以及de Haas等,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中。本文中的术语“FcR”涵盖其他FcR，包括未来确定的那些。
术语"Fc受体"或"FcR"还包括新生儿受体，FcRn，其负责将母亲的IgG转移至胎儿(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)以及Kim等,J.Immunol.24:249(1994))和调节免疫球蛋白的稳态。测量与FcRn的结合的方法是已知的(参见，例如，Ghetie和Ward.,Immunol.Today 18(12):592-598(1997)；Ghetie等,Nature Biotechnology 15(7):637-640(1997)；Hinton等,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216(2004)；WO 2004/92219(Hinton等)。可以例如在表达人FcRn的转基因小鼠或转染的人细胞系中或在施用了具有变体Fc区的多肽的灵长类动物中测定与人FcRn的体内结合和人FcRn高亲和力结合多肽的血清半衰期。WO 2000/42072(Presta)描述了与FcR的结合提高或减小的抗体变体。还参见例如，Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
在本文中，术语"Fc区"被用于限定含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的C-端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C-端赖氨酸(Lys447)可能存在也可能不存在。除非本文中另外指出，Fc区或恒定区中的氨基酸残基编号是根据EU编号系统，其也被称为EU指数，如Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所限定的。
术语"包含Fc区的抗体"是指包含Fc区的抗体。Fc区的C-端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可以被去除，例如，在抗体纯化期间或通过编码抗体的核酸的重组工程改造。因此，包含具有根据本发明的Fc区的抗体的组合物可以包含具有K447的抗体，所有K447都被去除的抗体，或具有K447残基的抗体和不具有K447残基的抗体的混合物。
"框架"或"FR"是指不同于高变区(HVR)残基的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1，FR2，FR3和FR4。因此，在VH(或VL)中HVR和FR序列通常以以下顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语"全长抗体"、"完整抗体"和"全抗体"在本文中被可交换地用于指示这样的抗体，所述抗体具有与天然抗体结构基本类似的结构或具有含有如本文中所限定的Fc区的重链。
"功能Fc区"具有天然序列Fc区的"效应子功能"。示例性"效应子功能"包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调等。此种效应子功能通常需要Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合并且可以使用例如在本文中的定义部分中公开的多种测定来评估。
术语"宿主细胞"、"宿主细胞系"和"宿主细胞培养物"被可交换地用于指示被引入外源核酸的细胞，包括此种细胞的后代。宿主细胞包括"转化体"和"转化的细胞"，其包括转化的原代细胞及来源于其的后代(不考虑传代次数)。后代的核酸内容可以与亲本细胞不完全相同，并且可以含有突变。本文中包括具有与对于原始转化的细胞中筛选或选择的相同的功能或生物学活性的突变体后代。
"人抗体"是这样的抗体，其具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体或来源于利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
"人共有框架"是这样的框架，其代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常见的氨基酸残基。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。通常，序列的亚组是如Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIH出版91-3242,Bethesda MD(1991),卷1-3中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，所述亚组是如以上Kabat等中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，所述亚组是如以上Kabat等中那样的亚组III。
"人源化"抗体是指一种嵌合抗体，其包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个(并且典型地，两个)可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体的"人源化形式"，例如，非人抗体，是指已经进行人源化的抗体。
如本文中使用的术语"高变区"或"HVR"是指抗体可变结构域中序列高变("互补决定区"或"CDR")和/或形成结构确定的环("高变环")和/或含有与抗原接触的残基("抗原触点")的各区域。通常，抗体包含六个HVR：VH中的三个(H1，H2，H3)和VL中的三个(L1，L2，L3)。本文中示例性HVR包括：(a)出现在氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)，和96-101(H3)处的高变环(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；(b)出现在氨基酸残基24-34(L1)，50-56(L2)，89-97(L3)，31-35b(H1)，50-65(H2)，和95-102(H3)处的CDR(Kabat等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,NIH,Bethesda,MD(1991))；(c)出现在氨基酸残基27c-36(L1)，46-55(L2)，89-96(L3)，30-35b(H1)，47-58(H2)，和93-101(H3)处的抗原触点(MacCallum等,J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；以及(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)，47-56(L2)，48-56(L2)，49-56(L2)，26-35(H1)，26-35b(H1)，49-65(H2)，93-102(H3)，和94-102(H3)。
除非另外指出，在本文中，HVR残基和可变结构域中的其他残基(例如，FR残基)根据以上Kabat等编号。
"免疫缀合物"是与一个或多个包括但不限于细胞毒性剂的异源分子缀合的抗体。
"个体"或"受试者"是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如，牛，绵羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴子)，兔，和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
"分离的"抗体是已经与其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，抗体被纯化至大于95％或99％的纯度，如由例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
"分离的"核酸是指已经与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括这样的核酸分子，所述核酸分子被包含在通常含有所述核酸分子的细胞中，但是所述核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置处。
"编码抗-肌肉生长抑制因子抗体的分离的核酸"是指一个或多个编码抗体重链和轻链(或其片段)的核酸分子，包括在单个载体或在分开的载体中的此种核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的此种核酸分子。
如本文中使用的术语"单克隆抗体"是指获自基本上同源的抗体的群体的抗体，即，包括所述群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位，除可能的变体抗体以外，例如，含天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的制备过程中产生，此种变体通常少量存在。对比于多克隆抗体制剂(通常包括针对不同的决定簇(表位)的不同抗体)，单克隆抗体制剂中的各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。因此，定语"单克隆"指示抗体的性质为获得自基本上同源的抗体群体，并且不视为要求通过任何特定的方法制备所述抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法，重组DNA法，噬菌体展示法，以及利用含有所有或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了这样的方法以及其他用于制备单克隆抗体的示例性方法。
"裸抗体"是指不与异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
"天然抗体"是指天然存在的具有多种结构的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异源四聚糖蛋白，由通过二硫键键合的两个相同的轻链和两个相同的重链组成。从N端到C端，各重链具有可变区(VH)，其也被称为可变重链结构域或重链可变结构域，之后是三个恒定结构域(CH1，CH2和CH3)。类似地，从N端到C端，各轻链具有可变区(VL)，其也被称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，之后是轻链恒定(CL)结构域。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列可以被分配至两种类型之一，被称为κ(κ)和λ(λ)。
"天然序列Fc区"包含与自然中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；和天然序列人IgG4 Fc区及其天然存在的变体。
术语"包装插页"用于指通常包含在治疗产品的商业包装中的使用说明，其含有关于此种治疗产品的适应证，用途，剂量，给药，组合疗法，禁忌证和/或使用警告。
相对于参比多肽序列的"百分比(％)氨基酸序列同一性"被定义为在对序列进行比对并且在必要时引入空隙(gap)以实现最大百分比序列同一性，而不将任何保守置换认为是序列同一性的一部分后，候选序列中与参比多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为了确定百分比氨基酸序列同一性的比对可以以在本领域中的技术内的多种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，对于本文来说，％氨基酸序列同一性值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生。ALIGN-2序列比较计算机程序的作者是Genentech,Inc.，并且源代码已经与用户文件一起被提交于美国版权局,Washington D.C.,20559，其以美国版权登记号TXU510087被登记。公众可自Genentech,Inc.,South San Francisco,California获得ALIGN-2程序，或者所述程序可自源代码编译。ALIGN-2程序应当被编译为用于UNIX操作系统，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定并且不需要改变。
在将ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A与或相对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可以备选地表述为给定氨基酸序列A与或相对给定氨基酸序列B具有或包含特定％氨基酸序列同一性)计算如下：100乘以分数X/Y；其中X是在A和B的程序比对中由序列比对程序ALIGN-2评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且Y是B中氨基酸残基的总数。要理解的是，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A对B的％氨基酸序列同一性将不等于B对A的％氨基酸序列同一性。除非另外明确指出，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是如上一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语"药物制剂"是指这样的制剂，其具有的形式允许包含在其中的活性成分的生物学活性是有效的，并且其不含对将被施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的其他组分。
"药用载体"是指药物制剂中除活性成分以外的成分，其对受试者是无毒性的。药用载体包括但不限于缓冲剂，赋形剂，稳定剂或防腐剂。
如本文中使用的术语"肌肉生长抑制因子"可以指来自包括哺乳动物如灵长类动物(例如，人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)在内的任何脊椎动物来源的任何天然肌肉生长抑制因子。除非另外指出，术语"肌肉生长抑制因子"是指具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列并且含有SEQ ID NO:75或78中所示的人肌肉生长抑制因子的末端前肽结构域的人肌肉生长抑制因子蛋白。该术语涵盖"全长"未加工的肌肉生长抑制因子以及由细胞中的加工产生的任何形式的肌肉生长抑制因子。该术语还涵盖肌肉生长抑制因子的天然存在的变体，例如，剪接变体或等位变体。示例性人肌肉生长抑制因子(前肌肉生长抑制因子)的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:1中。人肌肉生长抑制因子的示例性C端生长因子结构域的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:2中。人肌肉生长抑制因子的示例性N端前肽结构域的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:75或78中。活性成熟肌肉生长抑制因子是由两个C-端生长因子结构域组成的二硫键键合的同源二聚体。无活性的潜伏性肌肉生长抑制因子是两个前肽和成熟肌肉生长抑制因子的非共价结合的复合物。如本文中公开的，本发明的抗体结合无活性潜伏性肌肉生长抑制因子，但不结合成熟的活性肌肉生长抑制因子同源二聚体。在一些实施方案中，本发明的抗体结合由肌肉生长抑制因子前肽(SEQ ID NO:78)的氨基酸21-100组成的片段内的表位，但是不结合成熟活性肌肉生长抑制因子同源二聚体。示例性食蟹猴和鼠肌肉生长抑制因子(前肌肉生长抑制因子)的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO:3和5中。食蟹猴和鼠肌肉生长抑制因子的示例性C-端生长因子结构域的氨基酸序列分别显示在SEQ IDNO:4和6中。食蟹猴和鼠肌肉生长抑制因子的示例性N-端前肽结构域的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO:76或79，和77或80中。GDF-11(BMP-11)是与肌肉生长抑制因子紧密相关的分子，两者都是TGF-β超家族的成员。类似于肌肉生长抑制因子，GDF11首先被合成为前体多肽，并且然后被切割成N-端前结构域和C-端成熟GDF11。人GDF11(前体)的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:81中。C-端成熟人GDF11的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:82中。人GDF11的N-端前结构域的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:83或84中。SEQ ID NO:1，3，5，78，79，80，81和84的氨基酸序列包括信号序列。其氨基酸1-24对应于信号序列并且在细胞内的加工期间其被除去。
如本文中使用的，"治疗(treatment)"(及其语法上的变体如"治疗(treat)"或"治疗(treating)")是指尝试改变受治疗的个体的自然过程的临床干预，并且可以为了预防或在临床病程期间进行。治疗的理想效果包括但不限于防止疾病发生或复发，减轻症状，消除疾病的任何直接或间接的病理结果，防止转移，降低疾病进展的速率，改善或减轻疾病状态，以及消除或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体被用于延迟疾病的发展或用于减缓疾病的进展。
术语"可变区"或"可变结构域"是指参与抗体抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中各结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等,KubyImmunology,6th ed.,W.H.Freeman&Co.,第91页(2007))。单个VH或VL结构域可足以给予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可以分别使用来自与所述抗原结合的抗体的VH或VL结构域筛选互补VL或VH结构域的文库来分离。参见，例如，Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等,Nature 352:624-628(1991)。
"变体Fc区"由于至少一个氨基酸修饰(改变)，优选地一个或多个氨基酸置换而包含不同于天然序列Fc区的氨基酸序列的氨基酸序列。优选地，变体Fc区与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比具有至少一个氨基酸置换，例如，在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中的约一个至约十个氨基酸置换，并且优选地约一个至约五个氨基酸置换。本文中的变体Fc区与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区优选地具有至少约80％同源性，并且最优选地至少约90％同源性，更优选地至少约95％同源性。
如本文中使用的，术语"载体"是指能够使与其相连的另一个核酸增殖的核酸分子。该术语包括作为自我复制的核酸结构的载体以及结合到引入有其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。此种载体在本文中被称为"表达载体"。
II.组合物和方法
在一个方面，本发明部分基于抗-肌肉生长抑制因子抗体及其用途。在某些实施方案中，提供结合肌肉生长抑制因子的抗体。本发明的抗体可用于例如疾病的诊断或治疗。
在另一个方面，本发明部分基于包含变体Fc区的多肽及其用途。在一个实施方案中，提供包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽。在另一个实施方案中，提供包含具有提高的pI的变体Fc区的多肽。在特别的实施方案中，本发明的多肽是抗体。本发明的包含变体Fc区的多肽可用于例如疾病的诊断或治疗。
A.示例性抗-肌肉生长抑制因子抗体及包含变体Fc区的多肽
在一个方面，本发明提供结合肌肉生长抑制因子的分离的抗体。在某些实施方案中，本发明的抗-肌肉生长抑制因子抗体结合潜伏性肌肉生长抑制因子。在另外的实施方案中，本发明的抗-肌肉生长抑制因子抗体结合肌肉生长抑制因子前肽(人：SEQ ID NO:75或78；食蟹猴：SEQ ID NO:76或79；小鼠：SEQ ID NO:77或80)。在另外的实施方案中，所述抗体结合由肌肉生长抑制因子前肽(SEQ ID NO:78)的氨基酸21-100组成的片段内的表位。如上所述，前肽被包含在潜伏性肌肉生长抑制因子中作为组分之一。在某些实施方案中，本发明的抗-肌肉生长抑制因子抗体抑制肌肉生长抑制因子的活化。在某些实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体阻断成熟肌肉生长抑制因子从潜伏性肌肉生长抑制因子的释放。据报道，成熟肌肉生长抑制因子经由自潜伏性肌肉生长抑制因子的蛋白水解和非蛋白水解过程被释放。本发明的抗-肌肉生长抑制因子抗体可以阻断成熟肌肉生长抑制因子自潜伏性肌肉生长抑制因子的蛋白水解和/或非蛋白水解释放。在某些实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体阻断潜伏性肌肉生长抑制因子的蛋白水解切割。在某些实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体阻断蛋白酶接近潜伏性肌肉生长抑制因子(特别地，接近潜伏性肌肉生长抑制因子的蛋白水解切割位点(Arg98-Asp99))。在另外的实施方案中，所述蛋白酶可以是BMP1/TLD家族金属蛋白酶如BMP1，TED，tolloid样蛋白-1(TLL-1)或tolloid样蛋白-2(TLL-2)。在另一个实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体阻断成熟肌肉生长抑制因子自潜伏性肌肉生长抑制因子的非蛋白水解释放。如本文中使用的非蛋白水解释放表示成熟肌肉生长抑制因子自潜伏性肌肉生长抑制因子的自发释放，其不伴随潜伏性肌肉生长抑制因子的蛋白水解切割。非蛋白水解释放包括，例如，通过例如在37℃在不存在切割潜伏性肌肉生长抑制因子的蛋白酶的情况下通过孵育潜伏性肌肉生长抑制因子来释放成熟肌肉生长抑制因子。在某些实施方案中，本发明的抗-肌肉生长抑制因子抗体不结合成熟肌肉生长抑制因子。在一些实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体结合与表2a中所述的抗体相同的表位。在一些实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体与表2a中所述的抗体竞争结合潜伏性肌肉生长抑制因子。在另外的实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体与包含表2a中所述的VH和VL对的抗体竞争结合潜伏性肌肉生长抑制因子。在一些实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体与表2a中所述的抗体竞争结合由肌肉生长抑制因子前肽(SEQ ID NO:78)的氨基酸21-100组成的片段。在另外的实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体结合与表11a或13中所述的抗体相同的表位。在一些实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体与表11a或13中所述的抗体竞争结合潜伏性肌肉生长抑制因子。在一些实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体与表11a或13中所述的抗体竞争结合由肌肉生长抑制因子前肽(SEQ ID NO:78)的氨基酸21-100组成的片段。
在一些实施方案中，本发明的抗-肌肉生长抑制因子抗体结合潜伏性肌肉生长抑制因子并且抑制肌肉生长抑制因子的活化。在另外的实施方案中，所述抗体：(a)阻断成熟肌肉生长抑制因子从潜伏性肌肉生长抑制因子的释放；(b)阻断成熟肌肉生长抑制因子的蛋白水解释放；(c)阻断成熟肌肉生长抑制因子的自发释放；或(d)不结合成熟肌肉生长抑制因子；或结合由肌肉生长抑制因子前肽(SEQ ID NO:78)的氨基酸21-100组成的片段内的表位。在另外的实施方案中，所述抗体与包含表2a、11a或13中所述的VH和VL对的抗体竞争结合潜伏性肌肉生长抑制因子，或与包含表2a、11a或13中所述的VH和VL对的抗体结合相同的表位。在另外的实施方案中，所述抗体在中性pH(例如，pH7.4)结合潜伏性肌肉生长抑制因子的亲和力比在酸性pH(例如，pH5.8)更高。在另外的实施方案中，所述抗体是(a)单克隆抗体，(b)人、人源化或嵌合抗体；(c)全长IgG抗体或(d)结合潜伏性肌肉生长抑制因子或肌肉生长抑制因子前肽的抗体片段。
在另一个实施方案中，本发明的抗-肌肉生长抑制因子抗体不结合GDF11。在某些实施方案中，本发明的抗-肌肉生长抑制因子抗体不抑制GDF11的活化。在某些实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体不阻断成熟GDF11自潜伏性GDF11的释放。本发明的抗-肌肉生长抑制因子抗体不阻断成熟GDF11自潜伏性GDF11的水解或非蛋白水解释放。在某些实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体不阻断潜伏性GDF11的蛋白水解切割。在某些实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体不阻断蛋白酶接近潜伏性GDF11(特别是，接近潜伏性GDF11的蛋白水解切割位点)。在另外的实施方案中，所述蛋白酶可以是BMP1/TLD家族金属蛋白酶如BMP1，TED，tolloid样蛋白-1(TLL-1)或tolloid样蛋白-2(TLL-2)。如本文中使用的非蛋白水解释放表示成熟GDF11自潜伏性GDF11的自发释放，其不伴随潜伏性GDF11的蛋白水解切割。非蛋白水解释放包括，例如，通过例如在37℃在不存在切割潜伏性GDF11的蛋白酶的情况下孵育潜伏性GDF11来释放成熟GDF11。目前大部分已知的抗-肌肉生长抑制因子抗体对肌肉生长抑制因子不具有特异性。这些抗体对TGF-β超家族其他成员(如GDF11)也具有高的亲和力，并且中和其生物学活性。GDF11在胚胎发生过程中起重要作用，并且负责中轴骨骼的同源异型转化(homeotic transformation)。纯合体GDF11敲除小鼠是围产期致死的，具有一个野生型GDF11基因拷贝的小鼠可存活但是具有骨骼缺陷。因为GDF11在胚胎发生过程中起重要作用，所以抑制GDF11的拮抗剂引起理论上的安全性风险，其可能呈现为受治患者中的毒性或例如具有怀孕可能的妇女中的生殖毒性。因此，在肌肉生长抑制因子相关疾病的治疗中，特别是在具有怀孕可能的妇女中，需要特异性抑制肌肉生长抑制因子活性。
在另一个方面，本发明提供抗-肌肉生长抑制因子抗体，所述抗体显示pH依赖性的结合性质。如本文中使用的，表述"pH依赖性的结合"表示抗体"在酸性pH显示的与肌肉生长抑制因子的结合与其在中性pH的结合相比减小"(对于本公开，两种表达可以可交换地使用)。例如，"具有pH依赖性的结合性质"的抗体包括在中性pH结合肌肉生长抑制因子的亲和力比在酸性pH更高的抗体。在某些实施方案中，本发明的抗体在中性pH结合肌肉生长抑制因子的亲和力是在酸性pH的至少2，3，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，200，400，1000，10000倍以上高。在一些实施方案中，所述抗体在pH7.4结合肌肉生长抑制因子(例如，潜伏性肌肉生长抑制因子或前肽肌肉生长抑制因子)的亲和力比在pH5.8更高。在另外的实施方案中，所述抗体在pH7.4结合肌肉生长抑制因子的亲和力是在pH5.8的至少2，3，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，200，400，1000，10000倍以上高。
当抗原是可溶蛋白时，抗体与抗原的结合可能导致抗原在血浆中延长的半衰期(即，减小的抗原从血浆的清除)，因为抗体在血浆中的半衰期可以比抗原本身更长并且可以充当抗原的载体。这是由于抗原-抗体复合物通过FcRn经由细胞中的内体途径再循环(Roopenian,Nat.Rev.Immunol.7(9):715-725(2007))。然而，预期具有pH依赖性的结合性质的抗体(其在中性的胞外环境中结合其抗原而在其进入细胞后将抗原释放到酸性的内体区室中)在抗原中和和清除方面相对于其以pH不依赖性方式结合的对应物相比具有较好的性质(Igawa等,Nature Biotechnol.28(11):1203-1207(2010)；Devanaboyina等,mAbs 5(6):851-859(2013)；WO 2009/125825)。
对于本公开，抗体对肌肉生长抑制因子的"亲和力"以抗体的KD表示。抗体的KD是指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。抗体结合其抗原的KD值越大，其对所述具体抗原的结合亲和力越弱。因此，如本文中使用的，表述"在中性pH的亲和力比在酸性pH更高"(或等价表述"pH依赖性的结合")是指在酸性pH抗体结合肌肉生长抑制因子的KD高于在中性pH抗体结合肌肉生长抑制因子的KD。例如，在本发明的语境中，如果在酸性pH抗体结合肌肉生长抑制因子的KD是在中性pH抗体结合肌肉生长抑制因子的KD的至少2倍高，则认为抗体在中性pH结合肌肉生长抑制因子的亲和力比在酸性pH更高。因此，本发明包括这样的抗体，所述抗体在酸性pH结合肌肉生长抑制因子的KD是所述抗体在中性pH结合肌肉生长抑制因子的KD至少2，3，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，200，400，1000，10000倍以上高。在另一个实施方案中，所述抗体在中性pH的KD值可以为10-7M，10-8M，10-9M，10-10M，10-11M，10-12M以下。在另一个实施方案中，所述抗体在酸性pH的KD值可以为10-9M，10-8M，10-7M，10-6M以上。
在另外的实施方案中，如果在pH5.8抗体结合肌肉生长抑制因子的KD是在pH7.4抗体结合肌肉生长抑制因子的KD的至少2倍高，则认为抗体在中性pH结合肌肉生长抑制因子(例如，潜伏性肌肉生长抑制因子或前肽肌肉生长抑制因子)的亲和力比在酸性pH更高。在一些实施方案中，提供的抗体在pH5.8结合肌肉生长抑制因子的KD是所述抗体在pH7.4结合肌肉生长抑制因子的KD的至少3，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，200，400，1000，10000倍以上高。在另一个实施方案中，所述抗体在pH7.4的KD值可以为10-7M，10-8M，10-9M，10-10M，10-11M，10-12M以下。在另一个实施方案中，所述抗体在pH5.8的KD值可以为10-9M，10-8M，10-7M，10-6M或更大。
抗体对特定抗原的结合性质也可以表示为抗体的kd。抗体的kd是指抗体关于特定抗原的解离速率常数并且以单位秒的倒数(即，sec-1)表示。kd值的增加指示抗体与其抗原的结合较弱。本发明因此包括这样的抗体，所述抗体在酸性pH结合肌肉生长抑制因子的kd值比在中性pH更高。本发明包括这样的抗体，所述抗体在酸性pH结合肌肉生长抑制因子的kd是所述抗体在中性pH结合肌肉生长抑制因子的kd的至少2，3，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，200，400，1000，10000倍以上高。在另一个实施方案中，所述抗体在中性pH的kd值可以为10-21/s，10-31/s，10-41/s，10-51/s，10-61/s以下。在另一个实施方案中，所述抗体在酸性pH的kd值可以为10-31/s，10-21/s，10-11/s以上。本发明还包括这样的抗体，所述抗体在pH5.8结合肌肉生长抑制因子(例如，潜伏性肌肉生长抑制因子或前肽肌肉生长抑制因子)的kd值比在pH7.4更高。本发明包括这样的抗体，所述抗体在pH5.8结合肌肉生长抑制因子的kd是所述抗体在pH7.4结合肌肉生长抑制因子的kd的至少3，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，200，400，1000，10000倍以上高。在另一个实施方案中，所述抗体在pH7.4的kd值可以为10-21/s，10- 31/s，10-41/s，10-51/s，10-61/s以下。在另一个实施方案中，所述抗体在pH5.8的kd值可以为10-31/s，10-21/s，10-11/s以上。
在某些情况中，"在酸性pH与肌肉生长抑制因子的结合与其在中性pH的结合相比减小"被表示为抗体在酸性pH结合肌肉生长抑制因子的KD值与抗体在中性pH结合肌肉生长抑制因子的KD值之比(或反之亦然)。例如，对于本发明，如果抗体显示2以上的酸性/中性KD比，则可以认为所述抗体显示"在酸性pH与肌肉生长抑制因子的结合与其在中性pH的结合相比减小"。在某些实施方案中，本发明的抗-肌肉生长抑制因子抗体的pH5.8/pH7.4 KD比为2以上。在某些示例性实施方案中，本发明的抗体的酸性/中性KD比可以为2，3，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，200，400，1000，10000以上。在另一个实施方案中，所述抗体在中性pH的KD值可以为10-7M，10-8M，10-9M，10-10M，10-11M，10- 12M以下。在另一个实施方案中，所述抗体在酸性pH的KD值可以为10-9M，10-8M，10-7M，10-6M以上。在另外的情况中，如果抗体显示2以上的pH5.8/pH7.4 KD比，则可以认为所述抗体显示"在酸性pH与肌肉生长抑制因子(例如，潜伏性肌肉生长抑制因子)的结合与其在中性pH的结合相比减小"。在某些示例性实施方案中，所述抗体的pH5.8/pH7.4 KD比可以为3，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，200，400，1000，10000以上。在另一个实施方案中，所述抗体在pH7.4的KD值可以为10-7M，10-8M，10-9M，10-10M，10-11M，10-12M以下。在另一个实施方案中，所述抗体在pH5.8的KD值可以为10-9M，10-8M，10-7M，10-6M以上。
在某些情况中，"在酸性pH与肌肉生长抑制因子的结合与其在中性pH的结合相比减小"被表示为抗体在酸性pH结合肌肉生长抑制因子的kd值与抗体在中性pH结合肌肉生长抑制因子的kd值之比(或反之亦然)。例如，对于本发明，如果抗体显示2以上的酸性/中性kd比，则可以认为所述抗体显示"在酸性pH与肌肉生长抑制因子的结合与其在中性pH的结合相比减小"。在某些示例性实施方案中，本发明的抗体的pH5.8/pH7.4 kd比为2以上。在某些示例性实施方案中，本发明的抗体的酸性/中性kd比可以为2，3，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，200，400，1000，10000以上。在另一个实施方案中，所述抗体在中性pH的kd值可以为10-21/s，10-31/s，10-41/s，10-51/s，10-61/s以下。在另一个实施方案中，所述抗体在酸性pH的kd值可以为10-31/s，10-21/s，10-11/s以上。在某些示例性实施方案中，本发明的抗体的pH5.8/pH7.4 kd比可以为2，3，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，200，400，1000，10000以上。在另一个实施方案中，所述抗体在pH7.4的kd值可以为10-21/s，10-31/s，10-41/s，10-51/s，10-61/s以下。在另一个实施方案中，所述抗体在pH5.8的kd值可以为10-31/s，10-21/s，10-11/s以上。
如本文中使用的，表述"酸性pH"是指4.0至6.5的pH。表述"酸性pH"包括4.0，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4和6.5中任一的pH值。在特别的方面，"酸性pH"是5.8。
如本文中使用的，表述"中性pH"是指6.7至约10.0的pH。表述"中性pH"包括6.7，6.8，6.9，7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6，7.7，7.8，7.9，8.0，8.1，8.2，8.3，8.4，8.5，8.6，8.7，8.8，8.9，9.0，9.1，9.2，9.3，9.4，9.5，9.6，9.7，9.8，9.9和10.0中任一的pH值。在特别的方面，"中性pH"是7.4。
如本文中表示的，KD值以及kd值可以使用基于表面等离子共振的生物传感器来确定以表征抗体-抗原相互作用。(参见，例如，本文中的实施例7)。KD值和kd值可以在25℃或37℃确定。
在某些实施方案中，本发明的抗-肌肉生长抑制因子抗体结合来自超过一种物种的肌肉生长抑制因子。在另外的实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体结合来自人和非人动物的肌肉生长抑制因子。在另外的实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体结合来自人，小鼠和猴(例如，食蟹猴，猕猴，狨猴，黑猩猩或狒狒)的肌肉生长抑制因子。
在某些实施方案中，本发明的抗-肌肉生长抑制因子抗体结合来自超过一种物种的潜伏性肌肉生长抑制因子。在另外的实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体结合来自人和非人动物的潜伏性肌肉生长抑制因子。在另外的实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体结合来自人，小鼠和猴子的潜伏性肌肉生长抑制因子。
在某些实施方案中，本发明的抗-肌肉生长抑制因子抗体结合来自超过一种物种的前肽肌肉生长抑制因子。在另外的实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体结合来自人和非人动物的前肽肌肉生长抑制因子。在另外的实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体结合来自人，小鼠和猴子的前肽肌肉生长抑制因子。
在另一个方面，本发明提供抗-肌肉生长抑制因子抗体，其与肌肉生长抑制因子形成免疫复合物(即抗原-抗体复合物)。在某些实施方案中，两个以上抗-肌肉生长抑制因子抗体结合两个以上肌肉生长抑制因子分子从而形成免疫复合物。这是可能的，因为肌肉生长抑制因子作为含有两个肌肉生长抑制因子分子的同源二聚体存在，而抗体具有两个抗原结合位点。所述抗-肌肉生长抑制因子抗体可以结合肌肉生长抑制因子分子上相同的表位或可以结合肌肉生长抑制因子分子上不同的表位，与双特异性抗体很像。通常来说，当两个以上抗体与两个以上抗原形成免疫复合物时，所得的免疫复合物由于通过复合物中的抗体的Fc区的亲合力作用而可以强烈地结合细胞表面上存在的Fc受体，并且然后可以以高的效率被摄入到细胞中。因此，上述能够形成含两个以上抗-肌肉生长抑制因子抗体和两个以上肌肉生长抑制因子分子的免疫复合物的抗-肌肉生长抑制因子抗体，经由由于亲合力作用所致的与Fc受体的强结合而可以导致活体中肌肉生长抑制因子自血浆的快速清除。
此外，据信具有pH依赖性的结合性质的抗体在抗原中和和清除方面相对于其以pH不依赖性方式结合的对应物具有更优的性质(Igawa等,Nature Biotech.28(11):1203-1207(2010)；Devanaboyina等mAbs 5(6):851-859(2013)；WO 2009/125825)。因此预期，具有上述两种性质的抗体，即，具有pH依赖性的结合性质并且与两个以上抗原形成含两个以上抗体的免疫复合物的抗体，对于抗原自血浆的高度加速的消除具有甚至更佳的性质(WO2013/081143)。
在另一个方面，本发明提供抗-肌肉生长抑制因子抗体，其包含至少一个，两个，三个，四个，五个或六个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:55-57，114-115，126中任一的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:58-60，116-120，127中任一的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:61-64，121，128中任一的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65-69，122-124，129中任一的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:70-72，125，130中任一的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:73-74，131中任一的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供抗-肌肉生长抑制因子抗体，其包含至少一个，两个，三个，四个，五个或六个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:55-57中任一的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:58-60中任一的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:61-64中任一的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65-69中任一的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:70-72中任一的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:73-74中任一的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供抗-肌肉生长抑制因子抗体，其包含至少一个，两个，三个，四个，五个或六个选自以下的高变区(HVR)：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:114-115中任一的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:116-120中任一的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:122-124中任一的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:73-74中任一的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供抗-肌肉生长抑制因子抗体，其包含至少一个，两个，三个，四个，五个或六个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。在另一个方面，本发明提供抗-肌肉生长抑制因子抗体，其包含至少一个，两个，三个，四个，五个或六个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQID NO:114的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ IDNO:123的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供抗-肌肉生长抑制因子抗体，其包含至少一个，两个，三个，四个，五个或六个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供抗体，其包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:55-57，114-115，126中任一的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:58-60，116-120，127中任一的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:61-64，121，128中任一的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:61-64，121，128中任一的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:61-64，121，128中任一的氨基酸序列；和HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:73-74，131中任一的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:61-64，121，128中任一的氨基酸序列；HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:73-74，131中任一的氨基酸序列；和HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:58-60，116-120，127中任一的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:55-57，114-115，126中任一的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:58-60，116-120，127中任一的氨基酸序列；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:61-64，121，128中任一的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供抗体，其包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:55-57中任一的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:58-60中任一的氨基酸序列；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:61-64中任一的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:61-64中任一的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:61-64中任一的氨基酸序列；和HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:73-74中任一的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:61-64中任一的氨基酸序列；HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:73-74中任一的氨基酸序列；和HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:58-60中任一的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:55-57中任一的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:58-60中任一的氨基酸序列；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:61-64中任一的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供抗体，其包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:114-115中任一的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:116-120中任一的氨基酸序列；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列；和HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:73-74中任一的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ IDNO:121的氨基酸序列；HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:73-74中任一的氨基酸序列；和HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:116-120中任一的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:114-115中任一的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:116-120中任一的氨基酸序列；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供抗体，其包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；和HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列；和HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供抗体，其包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列；和HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列；HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列；和HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供抗体，其包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65-69，122-124，129中任一的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:70-72，125，130中任一的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:73-74，131中任一的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65-69，122-124，129中任一的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:70-72，125，130中任一的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:73-74，131中任一的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供抗体，其包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65-69中任一的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:70-72中任一的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:73-74中任一的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65-69中任一的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQID NO:70-72中任一的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:73-74中任一的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供抗体，其包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:122-124中任一的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQID NO:73-74中任一的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:122-124中任一的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:73-74中任一的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供抗体，其包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。在另一个方面，本发明提供抗体，其包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供抗体，其包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO 131的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH结构域，所述VH结构域包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:55-57，114，115，126中任一的氨基酸序列，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:58-60，116-120，127中任一的氨基酸序列，和(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:61-64，121，128中任一的氨基酸序列；和(b)VL结构域，所述VL结构域包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65-69，122-124，129中任一的氨基酸序列，(ii)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:70-72，125，130中任一的氨基酸序列，和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:73-74，131中任一的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH结构域，所述VH结构域包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:55-57中任一的氨基酸序列，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:58-60中任一的氨基酸序列，和(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:61-64中任一的氨基酸序列；和(b)VL结构域，所述VL结构域包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65-69中任一的氨基酸序列，(ii)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQID NO:70-72中任一的氨基酸序列，和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:73-74中任一的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH结构域，所述VH结构域包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:114-115中任一的氨基酸序列，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:116-120中任一的氨基酸序列，和(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列；和(b)VL结构域，所述VL结构域包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:122-124中任一的氨基酸序列，(ii)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ IDNO:125的氨基酸序列，和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:73-74中任一的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH结构域，所述VH结构域包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，和(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；和(b)VL结构域，所述VL结构域包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列，(ii)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列，和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH结构域，所述VH结构域包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，和(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；和(b)VL结构域，所述VL结构域包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列，(ii)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列，和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH结构域，所述VH结构域包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列，和(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列；和(b)VL结构域，所述VL结构域包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列，(ii)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列，和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供抗体，其包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:55-57，114-115，126中任一的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:58-60，116-120，127中任一的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:61-64，121，128中任一的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65-69，122-124，129中任一的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:70-72，125，130中任一的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:73-74，131中任一的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供抗体，其包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:55-57，114-115中任一的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:58-60，116-120中任一的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:61-64，121中任一的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65-69，122-124中任一的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:70-72，125中任一的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:73-74中任一的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供抗体，其包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:114-115中任一的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:116-120中任一的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:122-124中任一的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:73-74中任一的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供抗体，其包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。在另一个方面，本发明提供抗体，其包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供抗体，其包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列。
在某些实施方案中，如以上提供的抗-肌肉生长抑制因子抗体的任意一个或多个氨基酸在以下HVR位置被取代：(a)在HVR-H1(SEQ ID NO:55)中，在位置1和2处；(b)在HVR-H2(SEQ ID NO:58)中，在位置4，7，8，10，11，12和16处；(c)在HVR-H3(SEQ ID NO:61)中，在位置5，7和11处；(d)在HVR-L1(SEQ ID NO:65)中，在位置1，2，5，7，8和9处；(e)在HVR-L2(SEQ ID NO:70)中，在位置3和7处；和(f)在HVR-L3(SEQ ID NO:73)中，在位置8处。
在某些实施方案中，抗-肌肉生长抑制因子抗体的一个或多个氨基酸置换是保守置换，如本文中提供的。在某些实施方案中，以下置换中的任意一个或多个可以以任意组合进行：(a)在HVR-H1(SEQ ID NO:55)中，S1H；Y2T、D或E；(b)在HVR-H2(SEQ ID NO:58)中，Y4H；S7K；T8M或K；Y10K；A11M或E；S12E；G16K；(c)在HVR-H3(SEQ ID NO:61)中，Y5H；T7H；L11K；(d)在HVR-L1(SEQ ID NO:65)中，Q1T；S2T；S5E；Y7F；D8H；N9D或A或E；(e)在HVR-L2(SEQ ID NO:70)中，S3E；S7Y、F或W；和(f)在HVR-L3(SEQ ID NO:73)中，L8R。
以上置换的所有可能的组合分别被HVR-H1，HVR-H2，HVR-H3，HVR-L1，HVR-L2和HVR-L3的共有序列SEQ ID NO:126，127，128，129，130和131涵盖。
在任意以上实施方案中，抗-肌肉生长抑制因子抗体可以被人源化。在一个实施方案中，抗-肌肉生长抑制因子抗体包含如以上任意实施方案中的HVR，和还包含受体人框架，例如，人免疫球蛋白框架或人共有框架。在另一个实施方案中，抗-肌肉生长抑制因子抗体包含如以上任意实施方案中的HVR，并且还含有包含FR序列的VH或VL。在另一个实施方案中，抗-肌肉生长抑制因子抗体包含以下重链和/或轻链可变结构域FR序列：对于重链可变结构域，FR1包含SEQ ID NO:132-134中任一的氨基酸序列，FR2包含SEQ ID NO:135-136中任一的氨基酸序列，FR3包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列，FR4包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列。对于轻链可变结构域，FR1包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列，FR2包含SEQ ID NO:140-141中任一的氨基酸序列，FR3包含SEQ ID NO:142-143中任一的氨基酸序列，FR4包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供抗-肌肉生长抑制因子抗体，其包含至少一个，两个，三个，四个，五个或六个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:157-162中任一的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:163-168中任一的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:169-174中任一的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:175-180中任一的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ IDNO:181-186中任一的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:187-192中任一的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供抗体，其包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:157-162中任一的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:163-168中任一的氨基酸序列；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:169-174中任一的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:169-174中任一的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:169-174中任一的氨基酸序列，和HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:187-192中任一的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:169-174中任一的氨基酸序列，HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:187-192中任一的氨基酸序列；和HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:163-168中任一的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:157-162中任一的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:163-168中任一的氨基酸序列；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:169-174中任一的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供抗体，其包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:175-180中任一的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:181-186中任一的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:187-192中任一的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:175-180中任一的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:181-186中任一的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:187-192中任一的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH结构域，所述VH结构域包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:157-162中任一的氨基酸序列，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:163-168中任一的氨基酸序列，和(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:169-174中任一的氨基酸序列；和(b)VL结构域，所述VL结构域包含至少一个，至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:175-180中任一的氨基酸序列，(ii)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:181-186中任一的氨基酸序列，和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ IDNO:187-192中任一的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供抗体，其包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:157-162中任一的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:163-168中任一的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:169-174中任一的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:175-180中任一的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:181-186中任一的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:187-192中任一的氨基酸序列。
在另一个方面，抗-肌肉生长抑制因子抗体包含重链可变结构域(VH)序列，所述重链可变结构域(VH)序列与SEQ ID NO:13、16-30、32-34和86-95中任一的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VH序列包含相对于参比序列的置换(例如，保守置换)，插入，或缺失，但是包含所述序列的抗-肌肉生长抑制因子抗体保持结合肌肉生长抑制因子的能力。在某些实施方案中，在SEQ IDNO:13，16-30和32-34的任一中，总共1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换，插入，或缺失出现在HVR外的区域(即，在FR中)。任选地，抗-肌肉生长抑制因子抗体包含SEQ ID NO:13，16-30和32-34中任一的VH序列，其包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VH包含一个，两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:55-57中任一的氨基酸序列，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:58-60中任一的氨基酸序列，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:61-64中任一的氨基酸序列。
在另一个方面，抗-肌肉生长抑制因子抗体包含重链可变结构域(VH)序列，所述重链可变结构域(VH)序列与SEQ ID NO:13、16-30、32-34和86-95中任一的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VH序列包含相对于参比序列的置换(例如，保守置换)，插入，或缺失，但是包含所述序列的抗-肌肉生长抑制因子抗体保持结合肌肉生长抑制因子的能力。在某些实施方案中，在SEQ IDNO:13、16-30、32-34和86-95任一中，总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换，插入，或缺失出现在HVR外的区域(即，在FR中)。任选地，抗-肌肉生长抑制因子抗体包含SEQ ID NO:13、16-30、32-34和86-95中任一中的VH序列，其包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VH包含一个，两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:55-57中任一的氨基酸序列，114-115，126，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:58-60中任一的氨基酸序列，116-120，127，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:61-64，121，128中任一的氨基酸序列。
在另一个方面，抗-肌肉生长抑制因子抗体包含与SEQ ID NO:13，16-30，32，33，和34中任一的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的VH序列。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VH序列包含相对于参比序列的置换(例如，保守置换)，插入，或缺失，但是包含所述序列的抗-肌肉生长抑制因子抗体保持结合肌肉生长抑制因子的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:13，16-30，32，33和34任一中，总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换，插入，或缺失出现在HVR外的区域(即，在FR中)。任选地，抗-肌肉生长抑制因子抗体包含SEQ ID NO:13，16-30，32，33和34中任一中的VH序列，其包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VH包含一个，两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:55-57中任一的氨基酸序列，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:58-60中任一的氨基酸序列，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:61-64中任一的氨基酸序列。
在另一个方面，抗-肌肉生长抑制因子抗体包含VH序列，所述VH序列与SEQ ID NO:86-95中任一的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VH序列包含相对于参比序列的置换(例如，保守置换)，插入，或缺失，但是包含所述序列的抗-肌肉生长抑制因子抗体保持结合肌肉生长抑制因子的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:86-95任一中，总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换，插入，或缺失出现在HVR外的区域(即，在FR中)。任选地，抗-肌肉生长抑制因子抗体包含SEQ ID NO:86-95任一中的VH序列，其包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VH包含一个，两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:114-115，126中任一的氨基酸序列，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQID NO:116-120，127中任一的氨基酸序列，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:121，128中任一的氨基酸序列。
在另一个方面，抗-肌肉生长抑制因子抗体包含VH序列，所述VH序列与SEQ ID NO:86的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VH序列包含相对于参比序列的置换(例如，保守置换)，插入，或缺失，但是包含所述序列的抗-肌肉生长抑制因子抗体保持结合肌肉生长抑制因子的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:86中，总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换，插入，或缺失出现在HVR外的区域(即，在FR中)。任选地，抗-肌肉生长抑制因子抗体包含SEQ ID NO:86中的VH序列，其包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VH包含一个，两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ IDNO:114的氨基酸序列，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在另一个方面，抗-肌肉生长抑制因子抗体包含VH序列，所述VH序列与SEQ ID NO:92的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VH序列包含相对于参比序列的置换(例如，保守置换)，插入，或缺失，但是包含所述序列的抗-肌肉生长抑制因子抗体保持结合肌肉生长抑制因子的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:92中，总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换，插入，或缺失出现在HVR外的区域(即，在FR中)。任选地，抗-肌肉生长抑制因子抗体包含SEQ ID NO:92中的VH序列，其包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VH包含一个，两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ IDNO:58的氨基酸序列，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。
在另一个方面，提供抗-肌肉生长抑制因子抗体，其中所述抗体包含VL，所述VL与SEQ ID NO:15、31、35-38和96-99中任一的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VL序列包含相对于参比序列的置换(例如，保守置换)，插入，或缺失，但是包含所述序列的抗-肌肉生长抑制因子抗体保持结合肌肉生长抑制因子的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:15、31、35-38和96-99任一中，总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换，插入，或缺失出现在HVR外的区域(即，在FR中)。任选地，抗-肌肉生长抑制因子抗体包含SEQ ID NO:15、31、35-38和96-99任一中的VL序列，其包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VL包含一个，两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65-69，122-124，129中任一的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:70-72，125，130中任一的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:73-74，131中任一的氨基酸序列。
在另一个方面，提供抗-肌肉生长抑制因子抗体，其中所述抗体包含VL，所述VL与SEQ ID NO:15，31，35，36，37和38中任一的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VL序列包含相对于参比序列的置换(例如，保守置换)，插入，或缺失，但是包含所述序列的抗-肌肉生长抑制因子抗体保持结合肌肉生长抑制因子的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:15，31，35，36，37和38任一中，总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换，插入，或缺失出现在HVR外的区域(即，在FR中)。任选地，抗-肌肉生长抑制因子抗体包含SEQ ID NO:15，31，35，36，37和38任一中的VL序列，其包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VL包含一个，两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65-69中任一的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:70-72中任一的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:73-74中任一的氨基酸序列。
在另一个方面，提供抗-肌肉生长抑制因子抗体，其中所述抗体包含VL，所述VL与SEQ ID NO:96-99中任一的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VL序列包含相对于参比序列的置换(例如，保守置换)，插入，或缺失，但是包含所述序列的抗-肌肉生长抑制因子抗体保持结合肌肉生长抑制因子的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:96-99任一中，总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换，插入，或缺失出现在HVR外的区域。任选地，抗-肌肉生长抑制因子抗体包含SEQ ID NO:96-99任一中的VL序列，其包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VL包含一个，两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:122-124，129中任一的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQID NO:125，130中任一的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列。
在另一个方面，提供抗-肌肉生长抑制因子抗体，其中所述抗体包含VL，所述VL与SEQ ID NO:96的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VL序列包含相对于参比序列的置换(例如，保守置换)，插入，或缺失，但是包含所述序列的抗-肌肉生长抑制因子抗体保持结合肌肉生长抑制因子的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:96中，总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换，插入，或缺失出现在HVR外的区域。任选地，抗-肌肉生长抑制因子抗体包含SEQ ID NO:96中的VL序列，其包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VL包含一个，两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。在另一个方面，提供抗-肌肉生长抑制因子抗体，其中所述抗体包含VL，所述VL与SEQ ID NO:97的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VL序列包含相对于参比序列的置换(例如，保守置换)，插入，或缺失，但是包含所述序列的抗-肌肉生长抑制因子抗体保持结合肌肉生长抑制因子的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:97中，总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换，插入，或缺失出现在HVR外的区域。任选地，抗-肌肉生长抑制因子抗体包含SEQ ID NO:97中的VL序列，其包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VL包含一个，两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
在另一个方面，提供抗-肌肉生长抑制因子抗体，其中所述抗体包含如上述任意实施方案中的VH和如上述任意实施方案中的VL。在一个实施方案中，所述抗体分别包含SEQID NO:13、16-30、32-34和86-95中任一和SEQ ID NO:15、31、35-38和96-99中任一中的VH和VL序列，其包括所述序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体分别包含SEQ ID NO:13、16-30、32-34和86-95中任一和SEQ ID NO:15、31、35-38和96-99中任一中的VH和VL序列，其包括所述序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体分别包含SEQ ID NO:86-95中任一和SEQ ID NO:96-99中任一中的VH和VL序列，其包括所述序列的翻译后修饰。
在另一个方面，提供抗-肌肉生长抑制因子抗体，其中所述抗体包含如上述任意实施方案中的VH和如上述任意实施方案中的VL。在一个实施方案中，所述抗体分别包含SEQID NO:13，16-30和32-34中任一和SEQ ID NO:15，31和35-38中任一中的VH和VL序列，其包括所述序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体分别包含SEQ ID NO:13，16-30和32-34中任一和SEQ ID NO:15，31和35-38中任一中的VH和VL序列，其包括所述序列的翻译后修饰。
在另一个方面，提供抗-肌肉生长抑制因子抗体，其中所述抗体包含如上述任意实施方案中的VH和如上述任意实施方案中的VL。在一个实施方案中，所述抗体分别包含SEQID NO:86-95中任一和SEQ ID NO:96-99中任一中的VH和VL序列，其包括所述序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体分别包含SEQ ID NO:86-95中任一和SEQ ID NO:96-99中任一中的VH和VL序列，其包括所述序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体分别包含SEQ ID NO:86-95中任一和SEQ ID NO:96-99中任一中的VH和VL序列，其包括所述序列的翻译后修饰。在另一个方面，提供抗-肌肉生长抑制因子抗体，其中所述抗体包含如上述任意实施方案中的VH和如上述任意实施方案中的VL。在一个实施方案中，所述抗体分别包含SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:96中的VH和VL序列，其包括所述序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体分别包含SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:97中的VH和VL序列，其包括所述序列的翻译后修饰。
在另一个方面，抗-肌肉生长抑制因子抗体包含VH序列，所述VH序列与SEQ ID NO:12，145-150中任一的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VH序列包含相对于参比序列的置换(例如，保守置换)，插入，或缺失，但是包含所述序列的抗-肌肉生长抑制因子抗体保持结合肌肉生长抑制因子的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:12，145-150任一中，总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换，插入，或缺失出现在HVR外的区域(即，在FR中)。任选地，抗-肌肉生长抑制因子抗体包含SEQ ID NO:12，145-150任一中的VH序列，其包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VH包含一个，两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO:55，157-162中任一的氨基酸序列，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:58，163-168中任一的氨基酸序列，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:61，169-174中任一的氨基酸序列。
在另一个方面，提供抗-肌肉生长抑制因子抗体，其中所述抗体包含轻链可变结构域(VL)，所述轻链可变结构域(VL)与SEQ ID NO:14，151-156中任一的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VL序列包含相对于参比序列的置换(例如，保守置换)，插入，或缺失，但是包含所述序列的抗-肌肉生长抑制因子抗体保持结合肌肉生长抑制因子的能力。在某些实施方案中，在SEQ IDNO:14，151-156任一中，总计1至10个氨基酸被置换，插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换，插入，或缺失出现在HVR外的区域(即，在FR中)。任选地，抗-肌肉生长抑制因子抗体包含SEQ ID NO:14，151-156任一中的VL序列，其包括所述序列的翻译后修饰。在特别的实施方案中，VL包含一个，两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO:65，175-180中任一的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO:70，181-186中任一的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:73，187-192中任一的氨基酸序列。
在另一个方面，提供抗-肌肉生长抑制因子抗体，其中所述抗体包含如上述任意实施方案中的VH和如上述任意实施方案中的VL。在一个实施方案中，所述抗体分别包含SEQID NO:12，145-150中任一和SEQ ID NO:14，151-156中任一中的VH和VL序列，其包括所述序列的翻译后修饰。
在某些实施方案中，本发明的抗-肌肉生长抑制因子抗体包含如上述任意实施方案中的VH和包含SEQ ID NO:7，9，11，193，195-198，227，228，229-381中任一的氨基酸序列的重链恒定区。在某些实施方案中，本发明的抗-肌肉生长抑制因子抗体包含如上述任意实施方案中的VL和包含SEQ ID NO:8和10中任一的氨基酸序列的轻链恒定区。
在另一个方面，本发明提供抗体，所述抗体与本文中提供的抗-肌肉生长抑制因子抗体结合相同的表位。在另一个方面，本发明提供抗体，所述抗体与表2a中所述的抗体结合相同的表位。在另一个方面，本发明提供抗体，所述抗体与表11a或13中所述的抗体结合相同的表位。在某些实施方案中，提供抗体，所述抗体结合由SEQ ID NO:78的氨基酸21-100组成的肌肉生长抑制因子前肽的片段内的表位。备选地，所述抗体结合由SEQ ID NO:78的氨基酸21-80，41-100，21-60，41-80，61-100，21-40，41-60，61-80或81-100组成的肌肉生长抑制因子前肽片段。
在本发明的另一个方面，根据任意以上实施方案的抗-肌肉生长抑制因子抗体是单克隆抗体，包括嵌合、人源化或人抗体。在一个实施方案中，抗-肌肉生长抑制因子抗体是抗体片段，例如，Fv，Fab，Fab'，scFv，双抗体或F(ab')2片段。在另一个实施方案中，所述抗体是全长IgG抗体，例如，完整的IgG1或IgG4抗体或本文中限定的其他抗体类别或同种型。
在另一个方面，根据任意以上实施方案的抗-肌肉生长抑制因子抗体可以结合以下1-7节中所述任意特征(单独地或组合地)。
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文中提供的抗体的解离常数(Kd)为1μM以下，100nM以下，10nM以下，1nM以下，0.1nM以下，0.01nM以下，或0.001nM以下(例如，10-8M以下，例如，10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)。
在一个实施方案中，Kd通过放射性标记的抗原结合测定(RIA)测量。在一个实施方案中，利用目的抗体的Fab形式及其抗原进行RIA。例如，Fab对抗原的溶液结合亲和力通过以下方式测量：在存在未标记抗原的滴定系列的情况下用最小浓度的(125I)标记的抗原平衡Fab，然后用抗-Fab抗体包被的平板捕获结合的抗原(参见，例如，Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了确定测定条件，将MICROTITER(注册商标)多孔板(Thermo Scientific)用在50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml的捕获抗-Fab抗体(CappelLabs)过夜包被，并且随后用在PBS中的2％(w/v)胎牛血清清蛋白在室温(约23℃)封闭二至五小时。在非吸附性平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与目的Fab的连续稀释液混合(例如，与Presta等,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中的抗-VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。然后将目的Fab孵育过夜；然而，孵育可以持续更长的时间(例如，约65小时)以保证实现平衡。其后，将混合物转移至捕获平板用于室温孵育(例如，持续一小时)。然后除去溶液并将平板用在PBS中的0.1％聚山梨醇酯20(TWEEN-20(注册商标))洗涤八次。当平板已经干燥时，添加150μl/孔的闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，并将平板在TOPCOUNTTMγ计数仪(Packard)上计数十分钟。选择导致小于或等于20％的最大结合的各Fab的浓度用于竞争性结合测定。
根据另一个实施方案，Kd使用BIACORE(注册商标)表面等离子共振测定测量。例如，在25℃利用固定化抗原CM5芯片以～10响应单位(RU)进行使用BIACORE(注册商标)-2000或BIACORE(注册商标)-3000(BIACORE(注册商标),Inc.,Piscataway,NJ)的测定。在一个实施方案中，根据提供者的使用说明，将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE(注册商标),Inc.)用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。将抗原用10mM乙酸钠pH4.8稀释至5μg/ml(～0.2μM)，之后以5μl/分钟的流速注射以实现偶联蛋白的约10个响应单位(RU)。在注射抗原后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。为了动力学测量，在25℃以约25μl/min的流速将Fab的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)注射到具有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中。使用简单一对一(one-to-one)朗缪尔(Langmuir)结合模型(BIACORE(注册商标)Evaluation Software版本3.2)通过同时拟合结合和解离感应图来计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)作为koff/kon之比被计算。参见，例如，Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过以上表面等离子共振测定测量的结合速率超过106M-1s-1，则可以通过以下方式确定结合速率：使用测量如在分光计如配备有截流装置(stop-flow)的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌室的8000-系列SLM-AMINCO TM分光光度计(ThermoSpectronic)中测量的在存在增加浓度的抗原的情况下，在25℃，在PBS，pH7.2中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度的增加或减小的荧光猝灭技术(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab，Fab'，Fab'-SH，F(ab')2，Fv和scFv片段，以及以下描述的其他片段。对于特定抗体片段的综述，参见Hudson等Nat.Med.9:129-134(2003)。对于scFv片段的综述，参见，例如，Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore编辑,(Springer-Verlag,New York),pp.269-315(1994)；还参见，WO 1993/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)中也描述了三元抗体和四元抗体。
单结构域抗体是这样的抗体片段，其包含抗体的全部或部分的重链可变结构域或全部或部分的轻链可变结构域。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见，例如，美国专利号6,248,516。
抗体片段可以通过多种技术制备，所述技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)的制备，如本文中所述。
3.嵌合和人源化抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体被描述于例如美国专利号4,816,567；和Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，来源于小鼠，大鼠，仓鼠，兔或非人灵长类动物如猴的可变区)和人恒定区。在另外的实例中，嵌合抗体是"类型转换"抗体，其中类型或亚类已经由亲本抗体的类型或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。典型地，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如，CDR(或其部分)来源于非人抗体，和FR(或其部分)来源于人抗体序列。人源化抗体任选地还包含至少一部分的人恒定区。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被置换成来自非人抗体(例如，HVR残基所来源于的抗体)的相应残基，例如，以恢复或提高抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法被综述于例如Almagro,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，并且被进一步描述于例如Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods 36:25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了"表面再建(resurfacing)")；Dall'Acqua等,Methods 36:43-60(2005)(描述了"FR改组(shuffling)")；和Osbourn等,Methods 36:61-68(2005)以及Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了用于FR改组的"定向选择"方法)中。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用"最佳匹配(best-fit)"方法选择的框架区(参见，例如，Sims等J.Immunol.151:2296(1993))；来源于具有特定亚组的轻链或重链可变区的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285(1992)；和Presta等J.Immunol.151:2623(1993))；人成熟(体突变)框架区或人生殖系框架区(参见，例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和来源于FR文库筛选的框架区(参见，例如，Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)以及Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。人抗体可以使用本领域中已知的多种技术制备。人抗体被一般性地描述于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-374(2001)以及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。
人抗体可以通过向已被改良成生产完整人抗体或具有人可变区的完整抗体以响应抗原攻击的转基因动物施用免疫原来制备。此种动物典型地含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座，其替代内源性免疫球蛋白基因座，或其存在于染色体外部或被随机整合到动物的染色体中。在此种转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被失活。对于由转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见，例如，美国专利号6,075,181和6,150,584，其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利号5,770,429，其描述了HuMab(注册商标)技术；美国专利号7,041,870，其描述了K-M MOUSE(注册商标)技术，和美国专利申请公布号US 2007/0061900，其描述了VelociMOUSE(注册商标)技术)。来自由此种动物产生的完整抗体的人可变区可以被进一步修饰，例如，通过与不同的人恒定区组合。
人抗体还可以通过基于杂交瘤的方法制备。用于制备人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系已被描述。(参见，例如，Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等,J.Immunol.147:86(1991)。)。经由人B-细胞杂交瘤技术制备的人抗体也被描述于Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:3557-3562(2006)中。另外的方法包括在例如美国专利号7,189,826(描述了由杂交瘤细胞系制备单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue 26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些。人杂交瘤技术(Trioma技术)也被描述于Vollmers和Brandlein,Histologyand Histopathology 20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods andFindings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3):185-191(2005)中。
人抗体也可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生。此种可变结构域序列然后可以与所需的人恒定结构域组合。以下描述用于由抗体文库选择人抗体的技术。
5.来源于文库的抗体
本发明的抗体可以通过筛选具有所需一种或多种活性的抗体的组合文库来分离。例如，本领域中已知多种方法用于生成噬菌体展示文库并且针对具有所需结合性质的抗体筛选所述文库。此种方法被综述于例如Hoogenboom等，Methods in Molecular Biology178:1-37(2000)；O'Brien等,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)中并被进一步描述于例如McCafferty等,Nature 348:552-554；Clackson等,Nature 352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)中。
在某些噬菌体展示方法中，VH和VL基因库通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆并且在噬菌体文库中随机重组，然后可以针对结合抗原的噬菌体筛选所述文库，如Winter等,Ann.Rev.Immunol.12:433-455(1994)中所述。噬菌体典型地将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自被免疫的来源的文库向免疫原提供高亲和力抗体而不需要构建杂交瘤。备选地，可以克隆天然(naive)库(例如，由人)从而向多种非自身抗原以及自身抗原提供单一来源的抗体而不需要进行任何免疫，如Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，也可以通过以下方式合成制备天然文库：自干细胞克隆未重排的V-基因区段，并且使用含随机序列的PCR引物以编码高变CDR3区并且在体外实现重排，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括，例如：美国专利号5,750,373和美国公布号2005/0079574，2005/0119455，2005/0266000，2007/0117126，2007/0160598，2007/0237764，2007/0292936和2009/0002360。
在本文中，分离自人抗体文库的抗体或抗体片段被认为是人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如，双特异性抗体。多特异性抗体是这样的单克隆抗体，其对至少两个不同的位点具有结合特异性。在某些实施方案中，一个结合特异性是针对肌肉生长抑制因子而另一个是针对另一种抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合肌肉生长抑制因子的两个不同的表位。双特异性抗体还可以用于将细胞毒性剂定位于表达肌肉生长抑制因子的细胞。双特异性抗体可以作为全长抗体或抗体片段被制备。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见，Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983)),WO 1993/08829,和Traunecker等,EMBO J.10:3655(1991))，和"突出-孔(knob-in-hole)"工程改造(参见，例如，美国专利号5,731,168)。多特异性抗体也可以通过工程改造用于制备抗体Fc-异源二聚分子的静电导向作用来制备(WO 2009/089004A1)；交联两个以上抗体或片段(参见，例如，美国专利号4,676,980和Brennan等,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链以制备双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992))；使用"双抗体"技术以用于制备双特异性抗体片段(参见，例如，Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如，Gruber等,J.Immunol.152:5368(1994))；以及制备三特异性抗体，如例如Tutt等,J.Immunol.147:60(1991)中所述。
本文中还包括具有三个以上功能抗原结合位点的经改造的抗体，包括"章鱼抗体"(参见，例如，US 2006/0025576A1)。
本文中的抗体或片段还包括"双重作用FAb"或"DAF"，其包含结合肌肉生长抑制因子以及另一种不同的抗原的抗原结合位点(例如参见，US 2008/0069820)。
7.抗体变体
在某些实施方案中，考虑本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，理想的是提高抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质。抗体的氨基酸序列变体可以通过向编码所述抗体的核苷酸序列引入合适的修饰或通过肽合成来制备。此种修饰包括，例如，自抗体氨基酸序列的缺失，和/或向抗体氨基酸序列中的插入和/或置换抗体氨基酸序列内的残基。可以进行缺失，插入和置换的任意组合以获得最终的构建体，前提是最终的构建体具有所需的特征，例如，抗原-结合。
a.置换，插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。置换诱变的目的位点包括HVR和FR。保守置换显示在表1中的″优选置换″的标题下。更多的改变被提供在表1中的″示例性置换″的标题下并且如以下关于氨基酸侧链分类进一步所述。氨基酸置换可以被引入目的抗体和进行所需活性(例如，保持的/提高的抗原结合，降低的免疫原性或提高的ADCC或CDC)筛选的产品中。
[表1]
最初残基 示例性置换 优选置换
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp，Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；Norleucine Leu
Leu(L) Norleucine；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；Norleucine Leu
根据共有侧链性质可以将氨基酸分组为：(1)疏水性：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；(2)中性亲水性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；(3)酸性：Asp，Glu；(4)碱性：His，Lys，Arg；(5)影响链定向的残基：Gly，Pro；和(6)芳香性：Trp，Tyr，Phe。非保守置换需要将这些组之一的成员换成另一组的成员。
一种置换变体包括置换亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，被选择用于进一步研究的所得的变体相对于亲本抗体将具有某些生物学性质(例如，增加的亲和力，减小的免疫原性)的改变(例如，提高)和/或将基本上保持亲本抗体的某些生物学性质。示例性置换变体是亲和力成熟抗体，其可以例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(如本文中描述的那些)常规制备。简言之，将一个或多个HVR残基突变并将变体抗体展示在噬菌体上并且筛选特定的生物学活性(例如，结合亲和力)。
改变(例如，置换)可以在HVR中进行，例如，以提高抗体亲和力。此种改变可以在HVR"热点"中进行，所述HVR"热点"即在体细胞成熟过程期间以高频率进行突变的密码子编码的残基(参见，例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))，和/或接触抗原的残基，测试所得的变体VH或VL的结合亲和力。通过构建二级文库并自其进行再选择的亲和力成熟已被描述于例如Hoogenboom等,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等,ed.,Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法中的任一种(例如，易错PCR，链改组，或寡核苷酸定向诱变)将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后产生二级文库。然后筛选所述文库以鉴定任何具有所需亲和力的抗体变体。引入多样性的另一种方法包括HVR定向方法，其中若干HVR残基(例如，同时4-6个残基)被随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模，具体鉴定参与抗原结合的HVR残基。特别地，CDR-H3和CDR-L3通常被靶向。
在某些实施方案中，置换，插入或缺失可以发生在一个或多个HVR内，只要这样的改变不显著减小抗体结合抗原的能力。例如，不显著减小结合亲和力的保守改变(例如，本文中所述的保守置换)可以在HVR中进行。此种改变可以例如在HVR中接触抗原的残基的外部。在上述提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，各HVR是未改变的，或含不超过一个，两个或三个氨基酸置换。
可用于鉴定可被靶向用于诱变的抗体残基或区域的方法被称为"丙氨酸扫描诱变"，如Cunningham和Wells，Science 244:1081-1085(1989)所述。在该方法中，一个残基或一组靶残基(例如，带电荷的残基如arg，asp，his，lys和glu)被鉴定并被中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替代以确定是否影响抗体与抗原的相互作用。可以在对初始置换显示功能敏感性的氨基酸位置处引入进一步的置换。备选地，或另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构以确定抗体和抗原之间的接触点。此种接触残基及相邻残基可以被靶向或被排除作为用于置换的候选物。可以筛选变体以确定其是否具有所需的性质。
氨基酸序列插入包括长度为一个残基至含一百个以上残基的多肽的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括将抗体的N端或C端与增加抗体血清半衰期的酶(例如，对于ADEPT)或多肽融合。
b.糖基化变体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体被改变成增加或减小抗体被糖基化的程度。向抗体添加糖基化位点或使其缺失糖基化位点可以通过改变氨基酸序列以致产生或除去一个或多个糖基化位点来容易实现。
当抗体包含Fc区时，可以改变与其连接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体典型地包含支链的，分两支的(biantennary)寡糖，所述寡糖通常通过N-连接连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等，TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括多种碳水化合物，例如，甘露糖，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，半乳糖和唾液酸，以及与分两支的寡糖结构的“茎”中的GlcNAc相连的岩藻糖。在一些实施方案中，可以进行本发明抗体中的寡糖的修饰以产生具有特定改善的性质的抗体变体。
在一个实施方案中，提供抗体变体，其具有缺少与Fc区(直接或间接)相连的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此种抗体中岩藻糖的量可以为1％至80％，1％至65％，5％至65％或20％至40％。岩藻糖的量通过计算相对于与Asn 297相连的所有糖结构(例如复合物，杂合物和高甘露糖结构)的总和的Asn297处的糖链内的岩藻糖的平均量来确定，如通过MALDI-TOF质谱法测量的，如WO 2008/077546中所述，例如。Asn297是指位于Fc区的位置297(Fc区残基的Eu编号)附近的天冬氨酸残基；然而，由于抗体中小的序列变异，Asn297也可以位于位置297的上游或下游的约+/-3个氨基酸处，即，在位置294和300之间。此种岩藻糖基化变体可以具有提高的ADCC功能。参见，例如，美国公布号US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。涉及"去岩藻糖基化"或"岩藻糖缺陷型"抗体的公开的实例变体包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki等,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够制备去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括蛋白岩藻糖基化缺陷型Lec13CHO细胞(Ripka等,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108 A1，Presta,L；和WO 2004/056312，Adams等，特别是实施例11)，以及敲除的细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8，敲除的CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等,Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda等,Biotechnol.Bioeng.94(4):680-688(2006)；和WO 2003/085107)。
还提供具有被二等分的寡糖的抗体变体，例如，其中与抗体Fc区相连的分两支的寡糖被GlcNAc二等分。此种抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或提高的ADCC功能。此种抗体变体的实例被描述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利号6,602,684(Umana等)；和US 2005/0123546(Umana等)中。还提供在与Fc区相连的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此种抗体变体可以具有提高的CDC功能。此种抗体变体被描述于例如WO 1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S.)中。
c.Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入到本文中提供的抗体的Fc区中，由此产生Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，置换)的人Fc区序列(例如，人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4 Fc区)。
在某些实施方案中，本发明考虑这样的抗体变体，其具有一些但非全部效应子功能，这使其对于抗体体内半衰期是重要的而某些效应子功能(如补体和ADCC)非必要或有害的应用是理想的候选物。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的减小/消除。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以保证抗体缺少Fcγ R结合(因此可能缺少ADCC活性)，但是保持FcRn结合能力。介导ADCC的初级细胞，NK细胞，仅表达Fcγ RIII，而单核细胞表达Fcγ RI，Fcγ RII和Fcγ RIII。造血细胞上的FcR表达被概述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)第464页上的表3中。用于评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例被描述于美国专利号5,500,362(参见，例如，Hellstrom等Proc.Nat'l Acad.Sci.USA83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中。备选地，可以使用非放射性测定法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；和CytoTox 96(注册商标)非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。可用于此种测定的效应器细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地，或另外地，可以在体内，例如在如Clynes等Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中所述的动物模型中评估目的分子的ADCC活性。也可以进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q并且因此缺少CDC活性。参见，例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(参见，例如，Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods202:163(1996)；Cragg等,Blood 101:1045-1052(2003)；和Cragg,Blood 103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域中已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见，例如，Petkova等,Int'l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有减小的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238，265，269，270，297，327和329中的一个或多个的置换的抗体(美国专利号6,737,056)。此种Fc突变体包括在氨基酸位置265，269，270，297和327中的两个以上处具有置换的Fc突变体，包括所谓的残基265和297置换至丙氨酸的"DANA"Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了具有提高的或减少的与FcR的结合的某些抗体变体。(参见，例如，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，和Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)
在某些实施方案中，抗体变体包含Fc区，所述Fc区具有一个或多个提高ADCC的氨基酸置换，例如，Fc区的位置298，333和/或334(残基的EU编号)处的置换。
在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，所述改变导致改变的(即，提高的或减小的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利号6,194,551，WO 1999/51642，和Idusogie等,J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
US2005/0014934A1(Hinton等)中描述了这样的抗体，其具有增加的半衰期和提高的与负责将母体IgG转送至胎儿的新生儿Fc受体(FcRn)(J.Immunol.117:587(1976)和Kim等,J.Immunol.24:249(1994))的结合。所述抗体包含具有其中的一个或多个置换的Fc区，所述置换提高Fc区与FcRn的结合。此种Fc变体包括在以下一个或多个Fc区残基处具有置换的那些：238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434，例如，Fc区残基434的置换(美国专利号7,371,826)。也参见，Duncan，Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260和5,624,821；以及涉及Fc区变体的其他实例的WO 1994/29351。
d.半胱氨酸工程改造抗体变体
在某些实施方案中，可能理想的是制备半胱氨酸工程改造抗体，例如，"thioMAb"，其中抗体的一个或多个残基被置换成半胱氨酸残基。在特别的实施方案中，置换的残基出现在抗体的接入位点处。通过将所述残基置换成半胱氨酸，反应性硫醇基团由此被置于抗体的接入位点处并且可以用于将抗体缀合至其他部分，如药物部分或接头-药物部分，从而产生免疫缀合物，如本文中进一步所述。在某些实施方案中，以下残基中的任意一个或多个可以被置换成半胱氨酸：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸工程改造抗体可以如例如美国专利号7,521,541中所述产生。
e.抗体衍生物
在某些实施方案中，本文中提供的抗体可以被进一步修饰从而含有本领域中已知的并且可容易获得的另外的非蛋白部分。适用于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1,3-二氧杂环戊烷，聚-1,3,6-三烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)，和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇，聚丙二醇均聚物，聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物，聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)，聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而在制备中可以是有利的。聚合物可以具有任意分子量，并且可以是分支的或非分支的。与抗体相连的聚合物的数目可以变化，并且如果连接超过一个聚合物，其可以是相同或不同的分子。通常，由于衍生化的聚合物的数量和/或种类可以基于以下考虑确定，包括但不限于，要改善的抗体的具体性质或功能，抗体衍生物是否可用于限定条件下的治疗，等等。
在另一个实施方案中，提供可以通过暴露于辐射而被选择性加热的抗体与非蛋白部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白部分是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。所述辐射可以具有任意波长，并且包括但不限于这样的波长，所述波长不损害正常细胞，但是将非蛋白部分加热至邻近抗体-非蛋白部分的细胞被杀死的温度。
8.变体Fc区
在一个方面，本发明提供分离的多肽，其包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区。在一些方面，所述多肽是抗体。在一些方面，所述多肽是Fc融合蛋白。在某些实施方案中，与天然或参比变体序列的Fc区(本文中有时统称为"亲本"Fc区)中的相应序列相比，所述变体Fc区包含至少一个氨基酸残基改变(例如，置换)。在某些实施方案中，本发明的变体Fc区与亲本Fc区相比具有增强的对猴Fcγ RIIb的结合活性。在特别的实施方案中，猴Fcγ RIIb是食蟹猴Fcγ RIIb(SEQ ID NO:223)。
在某些实施方案中，[亲本Fc区对猴Fcγ RIIb的KD值]/[变体Fc区对猴Fcγ RIIb的KD值]之比可以为2.0以上，3.0以上，4.0以上，5.0以上，6.0以上，7.0以上，8.0以上，9.0以上，10以上，15以上，20以上，25以上，30以上，40以上或50以上。在另外的实施方案中，变体Fc区具有减小的对猴Fcγ RIIIa的结合活性。在某些实施方案中，[亲本Fc区对猴FcγRIIIa的KD值]/[变体Fc区对猴Fcγ RIIIa的KD值]之比可以为0.50以下，0.40以下，0.30以下，0.20以下，0.10以下，0.09以下，0.08以下，0.07以下，0.06以下，0.05以下，0.04以下，0.03以下，0.02以下，或0.01以下。在某些实施方案中，猴Fcγ RIIb的序列为SEQ ID NO:223(食蟹猴)。在某些实施方案中，猴Fcγ RIIIa的序列为SEQ ID NO:224(食蟹猴)。
在另外的实施方案中，变体Fc区具有增加的对人Fcγ RIIb的结合活性。在某些实施方案中，[亲本Fc区对人Fcγ RIIb的KD值]/[变体Fc区对人Fcγ RIIb的KD值]之比可以为2.0以上，3.0以上，4.0以上，5.0以上，6.0以上，7.0以上，8.0以上，9.0以上，10以上，15以上，20以上，25以上，30以上，40以上或50以上。在另外的实施方案中，变体Fc区具有减小的对人Fcγ RIIIa的结合活性。在某些实施方案中，[亲本Fc区对人Fcγ RIIIa的KD值]/[变体Fc区对人Fcγ RIIIa的KD值]可以为0.50以下，0.40以下，0.30以下，0.20以下，0.10以下，0.09以下，0.08以下，0.07以下，0.06以下，0.05以下，0.04以下，0.03以下，0.02以下，或0.01以下。在某些实施方案中，人Fcγ RIIb的序列为SEQ ID NO:212，213或214。在某些实施方案中，人Fcγ RIIIa的序列为SEQ ID NO:215，216，217或218。
在另外的实施方案中，变体Fc区具有减小的对人Fcγ RIIa(H型)的结合活性。在某些实施方案中，[亲本Fc区对人Fcγ RIIa(H型)的KD值]/[变体Fc区对人Fcγ RIIa(H型)的KD值]可以为5.0以下，4.0以下，3.0以下，2.0以下，1.0以下，0.9以下，0.8以下，0.7以下，0.6以下，0.5以下，0.4以下，0.3以下，0.2以下或0.1以下。在另外的实施方案中，变体Fc区具有减小的对人Fcγ RIIa(R型)的结合活性。在某些实施方案中，[亲本Fc区对人FcγRIIa(R型)的KD值]/[变体Fc区对人Fcγ RIIa(R型)的KD值]可以为5.0以下，4.0以下，3.0以下，2.0以下，1.0以下，0.9以下，0.8以下，0.7以下，0.6以下，0.5以下，0.4以下，0.3以下，0.2以下或0.1以下。在某些实施方案中，人Fcγ RIIa(H型)的序列为SEQ ID NO:211。在某些实施方案中，人Fcγ RIIa(R型)的序列为SEQ ID NO:210。
在某些实施方案中，[亲本Fc区对猴Fcγ RIIa的KD值]/[变体Fc区对猴Fcγ RIIa的KD值]可以为2.0以上，3.0以上，4.0以上，5.0以上，6.0以上，7.0以上，8.0以上，9.0以上，10以上，15以上，20以上，25以上，30以上，40以上，或50以上。在某些实施方案中，猴FcγRIIa选自猴Fcγ RIIa1(例如，食蟹猴Fcγ RIIa1(SEQ ID NO:220))，猴Fcγ RIIa2(例如，食蟹猴Fcγ RIIa2(SEQ ID NO:221))，和猴Fcγ RIIa3(例如，食蟹猴Fcγ RIIa3(SEQ IDNO:222)。
在另一个实施方案中，变体Fc区对猴Fcγ RIIb的KD值可以为1.0x10-6M以下，9.0x10-7M以下，8.0x10-7M以下，7.0x10-7M以下，6.0x10-7M以下，5.0x10-7M以下，4.0x10-7M以下，3.0x10-7M以下，2.0x10-7M以下，或1.0x10-7M以下。在另一个实施方案中，变体Fc区对猴Fcγ RIIIa的KD值可以为5.0x10-7M以上，6.0x10-7M以上，7.0x10-7M以上，8.0x10-7M以上，9.0x10-7M以上，1.0x10-6M以上，2.0x10-6M以上，3.0x10-6M以上，4.0x10-6M以上，5.0x10-6M以上，6.0x10-6M以上，7.0x10-6M以上，8.0x10-6M以上，9.0x10-6M以上，或1.0x10-5M以上。在另一个实施方案中，变体Fc区对人Fcγ RIIb的KD值可以为2.0x10-6M以下，1.0x10-6M以下，9.0x10-7M以下，8.0x10-7M以下，7.0x10-7M以下，6.0x10-7M以下，5.0x10-7M以下，4.0x10-7M以下，3.0x10-7M以下，2.0x10-7M以下，或1.0x10-7M以下。在另一个实施方案中，变体Fc区对人Fcγ RIIIa的KD值可以为1.0x10-6M以上，2.0x10-6M以上，3.0x10-6M以上，4.0x10-6M以上，5.0x10-6M以上，6.0x10-6M以上，7.0x10-6M以上，8.0x10-6M以上，9.0x10-6M以上，1.0x10-5M以上，2.0x10-5M以上，3.0x10-5M以上，4.0x10-5M以上，或5.0x10-5M以上。在另一个实施方案中，变体Fc区对人Fcγ RIIa(H型)的KD值可以为1.0x10-7M以上，2.0x10-7M以上，3.0x10-7M以上，4.0x10-7M以上，5.0x10-7M以上，6.0x10-7M以上，7.0x10-7M以上，8.0x10-7M以上，9.0x10- 7M以上，1.0x10-6M以上，2.0x10-6M以上，3.0x10-6M以上，4.0x10-6M以上，或5.0x10-6M以上。在另一个实施方案中，变体Fc区对人Fcγ RIIa(R型)的KD值可以为2.0x10-7M以上，3.0x10-7M以上，4.0x10-7M以上，5.0x10-7M以上，6.0x10-7M以上，7.0x10-7M以上，8.0x10-7M以上，9.0x10-7M以上，1.0x10-6M以上，2.0x10-6M以上，3.0x10-6M以上，4.0x10-6M以上，或5.0x10-6M以上。
在另一个实施方案中，变体Fc区对猴Fcγ RIIa的KD值可以为1.0x10-6M以下，9.0x10-7M以下，8.0x10-7M以下，7.0x10-7M以下，6.0x10-7M以下，5.0x10-7M以下，4.0x10-7M以下，3.0x10-7M以下，2.0x10-7M以下，或1.0x10-7M以下。在某些实施方案中，猴Fcγ RIIa可以选自猴FcγRIIa1，猴Fcγ RIIa2和猴Fcγ RIIa3中任一。
当我们开发用于治疗人疾病的药物产品时，评估其在猴中的效力和安全性是重要的，因为猴的生物学与人相近。从此观点，要开发的药物产品在靶结合活性方面优选具有对人和猴两者的交叉反应性。
"Fcγ受体"(本文中，被称为Fcγ受体，Fcγ R或FcgR)是指可以结合IgG1，IgG2，IgG3和IgG4单克隆抗体的Fc区的受体，并且实际上是指由Fcγ受体基因编码的蛋白家族中的任意成员。在人中，该家族包括Fcγ RI(CD64)，包括同种型Fcγ RIa，Fcγ RIb，和FcγRIc；Fcγ RII(CD32)，包括同种型Fcγ RIIa(包括同种异型H131(H型)和R131(R型))，FcγRIIb(包括Fcγ RIIb-1和Fcγ RIIb-2)，和Fcγ RIIc；以及Fcγ RIII(CD16)，包括同种型Fcγ RIIIa(包括同种异型V158和F158)，和Fcγ RIIIb(包括同种异型Fcγ RIIIb-NA1和Fcγ RIIIb-NA2)，和任意人Fcγ R，还未发现的Fcγ R同种型或同种异型，但是不限于此。据报道，Fcγ RIIb1和Fcγ RIIb2是人FcγRIIb的剪接变体。此外，已报道了被称为FcγRIIb3的剪接变体(J Exp Med,1989,170:1369-1385)。除了这些剪接变体以外，人FcγRIIb包括NCBI中登记的所有剪接变体，其是NP_001002273.1，NP_001002274.1，NP_001002275.1，NP_001177757.1，和NP_003992.3。此外，人Fcγ RIIb包括之前报道的每种遗传多态性，以及Fcγ RIIb(Arthritis Rheum.48:3242-3252(2003)；Kono等,Hum.Mol.Genet.14:2881-2892(2005)；和Kyogoju等,Arthritis Rheum.46:1242-1254(2002))，和将来将被报道的每种遗传多态性。
在Fcγ RIIa中，存在两种同种异型，在一个同种异型中Fcγ RIIa位置131处的氨基酸是组氨酸(H型)，在另一个同种异型中位置131处的氨基酸被置换成精氨酸(R型)(Warrmerdam,J.Exp.Med.172:19-25(1990))。
Fcγ R包括来源于人，小鼠，大鼠，兔子和猴子的Fcγ R但是不限于此，并且可以来源于任何生物体。小鼠Fcγ R包括Fcγ RI(CD64)，Fcγ RII(CD32)，Fcγ RIII(CD16)，和Fcγ RIII-2(CD16-2)，和任意小鼠Fcγ R，或Fcγ R同种型，但不限于此。除非另外说明，术语"猴Fcγ R"或其变体是指食蟹猴Fcγ RIIa1(SEQ ID NO:220)，Fcγ RIIa2(SEQID NO:221)，Fcγ RIIa3(SEQ ID NO:222)，Fcγ RIIb(SEQ ID NO:223)，或Fcγ RIIIaS(SEQ ID NO:224)。
人Fcγ RI的多核苷酸序列显示于SEQ ID NO:199(NM_000566.3)；人Fcγ RIIa的多核苷酸序列显示于SEQ ID NO:200(BC020823.1)或SEQ ID NO:201(NM_001136219.1)；人Fcγ RIIb的多核苷酸序列显示于SEQ ID NO:202(BC146678.1)或SEQ ID NO:203(NM_004001.3)；人Fcγ RIIIa的多核苷酸序列显示于SEQ ID NO:204(BC033678.1)或SEQ IDNO:205(NM_001127593.1)；人Fcγ RIIIb的多核苷酸序列显示于SEQ ID NO:206(BC128562.1)。
人Fcγ RI的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:207(NP_000557.1)；人FcγRIIa的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:208(AAH20823.1)，SEQ ID NO:209，SEQ ID NO:210或SEQ IDNO:211；人Fcγ RIIb的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:212(AAI46679.1)，SEQ ID NO:213或SEQ ID NO:214；人Fcγ RIIIa的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:215(AAH33678.1)，SEQ IDNO:216，SEQ ID NO:217或SEQ ID NO:218；人Fcγ RIIIb的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:219(AAI28563.1)。
食蟹猴Fcγ RIIa的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:220(Fcγ RIIa1)，SEQ ID NO:221(Fcγ RIIa2)或SEQ ID NO:222(Fcγ RIIa3)；食蟹猴FcγRIIb的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:223；食蟹猴Fcγ RIIIa的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:224。
在一个方面，相比于相应的参比Fcγ RIIb-结合多肽，本发明提供包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽。在另外的方面，本发明的多肽包含选自由以下组成的组的至少一个位置的至少一个氨基酸改变：231、232、233、234、235、236、237、238、239、264、266、267、268、271、295、298、325、326、327、328、330、331、332、334和396(根据EU编号)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有食蟹猴Fcγ RIIb的序列(SEQ ID NO:223)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有人Fcγ RIIb的序列(例如，SEQ ID NOS:212，213，或214)。
在一个方面，本发明提供包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽，所述变体Fc区包含至少两个氨基酸改变，所述至少两个氨基酸改变包含：(a)位置236处的一个氨基酸改变，和(b)选自由以下组成的组的至少一个位置的至少一个氨基酸改变：231、232、233、234、235、237、238、239、264、266、267、268、271、295、298、325、326、327、328、330、331、332、334和396(根据EU编号)。在某些实施方案中，FcγRIIb具有食蟹猴Fcγ RIIb的序列(SEQ ID NO:223)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有人Fcγ RIIb的序列(例如，SEQ ID NO:212，213，或214)。
在一个方面，本发明提供包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽，所述变体Fc区包含位置236(根据EU编号)处的氨基酸改变。
在一个方面，本发明提供包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽，所述变体Fc区包含至少两个氨基酸改变，所述至少两个氨基酸改变包含：(a)位置236处的一个氨基酸改变，和(b)选自由以下组成的组的至少一个位置的至少一个氨基酸改变：231、232、235、239、268、295、298、326、330和396(根据EU编号)。在另一个实施方案中，变体Fc区包含选自由以下组成的组的至少一个位置的氨基酸改变：231、232、235、239、268、295、298、326、330和396(根据EU编号)。在另一个实施方案中，变体Fc区包含选自由以下组成的组的至少一个位置的氨基酸改变：268、295、326和330(根据EU编号)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有食蟹猴Fcγ RIIb的序列(SEQ ID NO:223)。在某些实施方案中，FcγRIIb具有人Fcγ RIIb的序列(例如，SEQ ID NO:212，213，或214)。
在另一个方面，本发明提供包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽，所述变体Fc区包含以下(1)-(37)中任一的氨基酸改变：(1)位置231，236，239，268和330；(2)位置231，236，239，268，295和330；(3)位置231，236，268和330；(4)位置231，236，268，295和330；(5)位置232，236，239，268，295和330；(6)位置232，236，268，295和330；(7)位置232，236，268和330；(8)位置235，236，268，295，326和330；(9)位置235，236，268，295和330；(10)位置235，236，268和330；(11)位置235，236，268，330和396；(12)位置235，236，268和396；(13)位置236，239，268，295，298和330；(14)位置236，239，268，295，326和330；(15)位置236，239，268，295和330；(16)位置236，239，268，298和330；(17)位置236，239，268，326和330；(18)位置236，239，268和330；(19)位置236，239，268，330和396；(20)位置236，239，268和396；(21)位置236和268；(22)位置236，268和295；(23)位置236，268，295，298和330；(24)位置236，268，295，326和330；(25)位置236，268，295，326，330和396；(26)位置236，268，295和330；(27)位置236，268，295，330和396；(28)位置236，268，298和330；(29)位置236，268，298和396；(30)位置236，268，326和330；(31)位置236，268，326，330和396；(32)位置236，268和330；(33)位置236，268，330和396；(34)位置236，268和396；(35)位置236和295；(36)位置236，330和396；和(37)位置236和396(根据EU编号)。在某些实施方案中，FcγRIIb具有食蟹猴Fcγ RIIb的序列(SEQ ID NO:223)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有人Fcγ RIIb的序列(例如，SEQ ID NO:212，213，或214)。
在另一个实施方案中，具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸：(a)位置231处的Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr；(b)位置232处的Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr；(c)位置233处的Asp；(d)位置234处的Trp、Tyr；(e)位置235处的Trp；(f)位置236处的Ala、Asp、Glu、His、Ile、Leu、Met、Asn、Gln、Ser、Thr、Val；(g)位置237处的Asp、Tyr；(h)位置238处的Glu、Ile、Met、Gln、Tyr；(i)位置239处的Ile、Leu、Asn、Pro、Val；(j)位置264处的Ile；(k)位置266处的Phe；(l)位置267处的Ala、His、Leu；(m)位置268处的Asp、Glu；(n)位置271处的Asp、Glu、Gly；(o)位置295处的Leu；(p)位置298处的Leu；(q)位置325处的Glu、Phe、Ile、Leu；(r)位置326处的Thr；(s)位置327处的Ile、Asn；(t)位置328处的Thr；(u)位置330处的Lys、Arg；(v)位置331处的Glu；(w)位置332处的Asp；(x)位置334处的Asp、Ile、Met、Val、Tyr；和(y)位置396处的Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr(根据EU编号)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有食蟹猴Fcγ RIIb的序列(SEQ ID NO:223)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有人Fcγ RIIb的序列(例如，SEQ ID NO:212，213，或214)。
在另一个实施方案中，具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸改变(例如，置换)：(a)位置231处的Gly、Thr；(b)位置232处的Asp；(c)位置235处的Trp；(d)位置236处的Asn、Thr；(e)位置239处的Val；(f)位置268处的Asp、Glu；(g)位置295处的Leu；(h)位置298处的Leu；(i)位置326处的Thr；(j)位置330处的Lys、Arg；和(k)位置396处的Lys、Met(根据EU编号)。在另一个实施方案中，具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区包含以下的氨基酸改变(例如，置换)：位置236处的Asn，位置268处的Glu，位置330处的Lys，和位置396处的Met(根据EU编号)。在另一个实施方案中，具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区包含以下的氨基酸改变(例如，置换)：位置236处的Asn，位置268处的Asp，和位置330处的Lys(根据EU编号)。在另一个实施方案中，具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区包含以下的氨基酸改变(例如，置换)：位置236处的Asn，位置268处的Asp，位置295处的Leu，和位置330处的Lys(根据EU编号)。在另一个实施方案中，具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区包含以下的氨基酸改变(例如，置换)：位置236处的Thr，位置268处的Asp，和位置330处的Lys(根据EU编号)。在另一个实施方案中，具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区包含以下的氨基酸改变(例如，置换)：位置236处的Asn，位置268处的Asp，位置295处的Leu，位置326处的Thr，和位置330处的Lys(根据EU编号)。在另一个实施方案中，具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区包含以下的氨基酸改变(例如，置换)：位置235处的Trp，位置236处的Asn，位置268处的Asp，位置295处的Leu，位置326处的Thr，和位置330处的Lys(根据EU编号)。
在一个方面，本发明提供包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽，所述变体Fc区包含位置238(根据EU编号)处的氨基酸改变。
在一个方面，本发明提供包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽，所述变体Fc区包含选自由以下组成的组的至少一个位置的至少一个氨基酸改变：234，238，250，264，267，307，和330(根据EU编号)。在另外的实施方案中，所述多肽包含选自由以下组成的组的至少一个位置的至少一个氨基酸改变：234，250，264，267，307，和330(根据EU编号)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有食蟹猴Fcγ RIIb的序列(SEQ ID NO:223)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有人Fcγ RIIb的序列(例如，SEQ ID NO:212，213，或214)。
在另一个方面，本发明提供包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽，所述变体Fc区包含以下(1)-(9)中任一的氨基酸改变：(1)位置234，238，250，307和330；(2)位置234，238，250，264，307和330；(3)位置234，238，250，264，267，307和330；(4)位置234，238，250，267，307和330；(5)位置238，250，264，307和330；(6)位置238，250，264，267，307和330；(7)位置238，250，267，307和330；(8)位置238，250和307；和(9)位置238，250，307和330(根据EU编号)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有食蟹猴Fcγ RIIb的序列(SEQ IDNO:223)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有人Fcγ RIIb的序列(例如，SEQ ID NO:212，213，或214)。
在另一个实施方案中，具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸改变(例如，置换)：(a)位置234处的Tyr；(b)位置238处的Asp；(c)位置250处的Val，(d)位置264处的Ile；(e)位置267处的Ala；(f)位置307处的Pro；和(g)位置330处的Lys(根据EU编号)。在另一个实施方案中，具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区包含以下的氨基酸改变(例如，置换)：位置238处的Asp(根据EU编号)。在另一个实施方案中，具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区包含以下的氨基酸改变(例如，置换)：位置238处的Asp，位置250处的Val，和位置307处的Pro(根据EU编号)。在另一个实施方案中，具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区包含以下的氨基酸改变(例如，置换)：位置238处的Asp，位置250处的Val，位置307处的Pro，和位置330处的Lys(根据EU编号)。在另一个实施方案中，具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区包含以下的氨基酸改变(例如，置换)：位置238处的Asp，位置250处的Val，位置264处的Ile，位置307处的Pro，和位置330处的Lys(根据EU编号)。在另一个实施方案中，具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区包含以下的氨基酸改变(例如，置换)：位置238处的Asp，位置250处的Val，位置267处的Ala，位置307处的Pro，和位置330处的Lys(根据EU编号)。在另一个实施方案中，具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区包含以下的氨基酸改变(例如，置换)：位置234处的Tyr，位置238处的Asp，位置250处的Val，位置307处的Pro，和位置330处的Lys(根据EU编号)。在另一个实施方案中，具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区包含以下的氨基酸改变(例如，置换)：位置234处的Tyr，位置238处的Asp，位置250处的Val，位置267处的Ala，位置307处的Pro，和位置330处的Lys(根据EU编号)。在另一个实施方案中，具有增强的FcγRIIb-结合活性的变体Fc区包含以下的氨基酸改变(例如，置换)：位置238处的Asp，位置250处的Val，位置264处的Ile，位置267处的Ala，位置307处的Pro，和位置330处的Lys(根据EU编号)。在另一个实施方案中，具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区包含以下的氨基酸改变(例如，置换)：位置234处的Tyr，位置238处的Asp，位置250处的Val，位置264处的Ile，位置307处的Pro，和位置330处的Lys(根据EU编号)。在另一个实施方案中，具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区包含以下的氨基酸改变(例如，置换)：位置234处的Tyr，位置238处的Asp，位置250处的Val，位置264处的Ile，位置267处的Ala，位置307处的Pro，和位置330处的Lys(根据EU编号)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有食蟹猴Fcγ RIIb的序列(SEQ ID NO:223)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有人Fcγ RIIb的序列(例如，SEQ IDNO:212，213，或214)。
在另一个方面，本发明提供分离的多肽，其包含具有提高的等电点(pI)的变体Fc区。在某些实施方案中，本文中所述的变体Fc区包含在亲本Fc区中的至少两个氨基酸改变。在某些实施方案中，每个氨基酸改变使得变体Fc区的等电点(pI)相比于亲本Fc区的等电点(pI)提高。其是基于这样的发现，即，例如当在体内施用抗体时，利用通过修饰至少两个氨基酸残基而具有提高的pI的抗体可以促进抗原从血浆的消除。
在本发明中，pI可以是理论上的或实验确定的pI。pI值可以例如通过本领域技术人员已知的等电聚焦确定。理论pI值可以例如使用基因和氨基酸序列分析软件(Genetyx等)计算。
在一个实施方案中，与修饰前相比，pI值可以增加例如至少0.01，0.03，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5或更多，至少0.6，0.7，0.8，0.9或更多，至少1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5或更多，或至少1.6，1.7，1.8，1.9，2.0，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，3.0或更多。
在某些实施方案中，使得pI提高的氨基酸可以暴露于变体Fc区的表面。在本发明中，可以暴露于表面的氨基酸通常是指位于构成变体Fc区的多肽的表面的氨基酸残基。位于多肽表面的氨基酸残基是指具有可与溶剂分子(其通常大多是水分子)接触的侧链的氨基酸残基。然而，侧链不一定需要与溶剂分子完全接触，并且即使当仅部分的侧链接触溶剂分子时，氨基酸也被定义为"位于表面的氨基酸残基"。位于多肽表面的氨基酸残基还包括位置接近表面的氨基酸残基并且因此可能受来自另一个侧链甚至仅部分地与溶剂分子接触的氨基酸残基的电荷影响。例如使用市售的软件，本领域技术人员可以制备多肽的同源性模型。备选地，可能的是使用本领域技术人员已知的方法，如X射线晶体学。例如，使用来自使用计算机程序如InsightII程序(Accelrys)的三维模型的坐标确定可能暴露于表面的氨基酸残基。表面可暴露位点可以使用本技术领域中已知的算法(例如，Lee和Richards(J.Mol.Biol.55:379-400(1971))；Connolly(J.Appl.Cryst.16:548-558(1983))确定。表面可暴露位点可以使用适用于蛋白建模和三维结构信息的软件确定。可用于此种用途的软件包括，例如，SYBYL Biopolymer Module软件(Tripos Associates)。当算法要求用户输入尺寸参数时，用于计算的探针的"尺寸"可以被设定为半径约1.4埃以下。此外，使用用于个人计算机的软件确定表面可暴露区域的方法已被Pacios描述(Comput.Chem.18(4):377-386(1994)；J.Mol.Model.1:46-53(1995))。基于上述信息，可以选择位于构成变体Fc区的多肽表面上的合适氨基酸残基。
在某些实施方案中，多肽包含变体Fc区和抗原结合结构域两者。在另外的实施方案中，抗原是可溶性抗原。在一个实施方案中，抗原存在于受试者的生物学流体(例如，血浆，间隙液，淋巴液，腹水液和胸膜液)中。抗原也可以是膜抗原。
在另外的实施方案中，抗原结合结构域的抗原结合活性根据离子浓度条件而变化。在一个实施方案中，离子浓度不受特别限制并且是指氢离子浓度(pH)或金属离子浓度。本文中，金属离子是指除氢以外的第I族元素如碱金属和铜族元素，第II族元素如碱土金属和锌族元素，除硼以外的第III族元素，除碳和硅以外的第IV族元素，第VIII组元素如铁族和铂族元素，属于第V，VI和VII族的A亚族的元素，和金属元素如锑，铋和钋的离子。在本发明中，金属离子包括，例如，钙离子，如WO 2012/073992和WO 2013/125667中所述。在一个实施方案中，"离子浓度条件"可以是聚焦于低离子浓度和高离子浓度之间抗原结合结构域的生物学表现的差异的条件。此外，"抗原结合结构域的抗原结合活性根据离子浓度条件而改变"是指抗原结合结构域的抗原结合活性在低离子浓度和高离子浓度之间变化(此种抗原结合结构域在本文中被称为"离子浓度依赖性抗原结合结构域")。抗原结合结构域在高离子浓度条件下的抗原结合活性可以比在低离子浓度条件下高(强)或低(弱)。在一个实施方案中，离子浓度依赖性抗原结合结构域(如pH依赖性抗原结合结构域或钙离子浓度依赖性抗原结合结构域)可以通过例如WO 2009/125825，WO 2012/073992和WO 2013/046722中描述的已知方法获得。
在本发明中，抗原结合结构域在高钙离子浓度条件下的抗原结合活性可以比在低钙离子浓度条件下高。高钙离子浓度不受特别限制但是可以是在100μM至10mM之间，在200μM至5mM之间，在400μM至3mM之间，在200μM至2mM之间，在400μM至1mM之间，或在500μM至2.5mM之间选择的浓度，所述浓度优选接近体内钙离子的血浆(血液)浓度。同时，低钙离子浓度不受特别限制但是可以是在0.1μM至30μM，在0.2μM至20μM，在0.5μM至10μM，在1μM至5μM，或在2μM至4μM之间选择的浓度，所述浓度优选接近体内早期内体中的钙离子浓度。
在一个实施方案中，低钙离子浓度条件和高钙离子浓度条件下的抗原结合活性之比不受限制，但是低钙离子浓度条件下的解离常数(KD)与高钙离子浓度条件下的KD之比，即KD(低钙离子浓度条件)/KD(高钙离子浓度条件)，为2或更大，10或更大，或40或更大。所述比的上限可以为400，1000或10000，只要此种抗原结合结构域可以通过本领域技术人员已知的技术制备即可。备选地，例如，可以使用解离速率常数(kd)代替KD。在此情况中，低钙离子浓度条件下的kd与高钙离子浓度条件下的kd之比，即kd(低钙离子浓度条件)/kd(高钙离子浓度条件)，为2或更大，5或更大，10或更大，或30或更大。该比值的上限可以为50，100，或200，只要可以基于本领域技术人员的常规技术知识制备所述抗原结合结构域即可。
在本发明中，抗原结合结构域在低氢离子浓度(中性pH)下的抗原结合活性可以比在高氢离子浓度(酸性pH)下高。酸性pH可以为，例如，选自pH4.0至pH6.5，选自pH4.5至pH6.5，选自pH5.0至pH6.5，或选自pH5.5至pH6.5的pH，所述pH优选接近体内早期内体中的pH。酸性pH也可以为，例如，pH5.8或pH6.0。在特别的实施方案中，酸性pH是pH5.8。同时，中性pH可以为，例如，选自pH6.7至pH10.0，选自pH6.7至pH9.5，选自pH7.0至pH9.0，或选自pH7.0至pH8.0的pH，所述pH优选接近体内血浆(血液)中的pH。中性pH也可以是，例如，pH7.4或pH7.0。在特别的实施方案中，中性pH是pH7.4。
在一个实施方案中，酸性pH条件和中性pH条件下的抗原结合活性之比不受限制但是酸性pH条件下的解离常数(KD)与中性pH条件下的KD之比，即KD(酸性pH条件)/KD(中性pH条件)，为2或更大，10或更大，或40或更大。该比值的上限可以为400，1000或10000，只要此种抗原结合结构域可以通过本领域技术人员已知的技术制备即可。备选地，例如，可以使用解离速率常数(kd)代替KD。在此情况中，酸性pH条件下的kd与中性pH条件下的kd之比，即kd(酸性pH条件)/kd(中性pH条件)是2或更大，5或更大，10或更大，或30或更大。该比值的上限可以为50，100或200，只要可以基于本领域技术人员的常规技术知识制备所述抗原结合结构域即可。
在一个实施方案中，例如，至少一个氨基酸残基被侧链pKa为4.0-8.0的氨基酸残基取代，和/或侧链pKa为4.0-8.0的至少一个氨基酸被插入到抗原结合结构域中，如WO2009/125825中所述。氨基酸可以在任何位点被取代和/或插入，只要与置换或插入前相比抗原结合结构域的抗原结合活性在酸性pH条件下比在中性pH条件下变弱即可。当抗原结合结构域具有可变区或CDR时，所述位点可以在可变区或CDR内。被取代或插入的氨基酸的数目可以由本领域技术人员适当确定；并且所述数目可以是一以上。根据氢离子浓度条件，侧链pKa为4.0-8.0的氨基酸可以用于改变抗原结合结构域的抗原结合活性。此种氨基酸包括，例如，天然氨基酸如His(H)和Glu(E)，和非天然氨基酸如组氨酸类似物(US2009/0035836)，m-NO2-Tyr(pKa 7.45)，3,5-Br2-Tyr(pKa 7.21)，和3,5-I2-Tyr(pKa 7.38)(Heyl等,Bioorg.Med.Chem.11(17):3761-3768(2003))。也可以使用侧链pKa为6.0-7.0的氨基酸，其包括，例如，His(H)。
在另一个实施方案中，用于具有提高的pI的变体Fc区的优选的抗原结合结构域被描述于日本专利申请JP2015-021371和JP2015-185254中并且可以通过其中描述的方法获得。
在某些实施方案中，具有提高的pI的变体Fc区包含选自由以下组成的组的至少两个位置的至少两个氨基酸改变：285、311、312、315、318、333、335、337、341、342、343、384、385、388、390、399、400、401、402、413、420、422和431(根据EU编号)。
在另外的实施方案中，具有提高的pI的变体Fc区包含选自由以下组成的组的至少两个位置的至少两个氨基酸改变：311，341，343，384，399，400，401，402，和413(根据EU编号)。
在另一个方面，本发明提供包含具有提高的pI的变体Fc区的多肽，所述变体Fc区包含以下(1)-(10)中任一的氨基酸改变：(1)位置311和341；(2)位置311和343；(3)位置311，343和413；(4)位置311，384和413；(5)位置311和399；(6)位置311和401；(7)位置311和413；(8)位置400和413；(9)位置401和413；和(10)位置402和413(根据EU编号)。
用于提高蛋白pI的方法是例如减少在中性pH条件具有带负电的侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸和谷氨酸)的数目和/或至增加在中性pH条件具有带正电的侧链的氨基酸(例如，精氨酸，赖氨酸和组氨酸)的数目。具有带负电的侧链的氨基酸在比其侧链pKa足够高的pH条件下具有表示为-1的负电荷，这是本领域技术人员已知的理论。例如，天冬氨酸的侧链的理论pKa为3.9，并且所述侧链在中性pH条件下(例如，在pH7.0的溶液中)具有表示为-1的负电荷。相反地，具有带正电的侧链的氨基酸在比其侧链pKa足够低的pH条件下具有表示为+1的正电荷。例如，精氨酸的侧链的理论pKa为12.5，并且所述侧链在中性pH条件下(例如，在pH7.0的溶液中)具有表示为+1的正电荷。同时，已知在中性pH条件下(例如，在pH7.0的溶液中)侧链没有电荷的氨基酸包括15类天然氨基酸，即，丙氨酸，半胱氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，天冬氨酸，脯氨酸，谷酰胺，丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸，色氨酸，和酪氨酸。当然，要理解的是，用于提高pI的氨基酸可以是非天然氨基酸。
由以上，用于提高蛋白在中性pH条件下(例如，在pH7.0的溶液中)的pI的方法可以给目的蛋白给予+1的电荷改变，例如，通过在蛋白氨基酸序列中用具有不带电荷的侧链的氨基酸置换天冬氨酸或谷氨酸(其侧链具有-1的负电荷)。此外，例如，通过用精氨酸或赖氨酸(其侧链具有+1的正电荷)置换侧链不具有电荷的氨基酸，+1的电荷改变可以被给予蛋白。此外，通过用精氨酸或赖氨酸(其侧链具有+1的正电荷)置换天冬氨酸或谷氨酸(其侧链具有-1的负电荷)可以一次性给予蛋白+2的电荷改变。备选地，为了提高蛋白的pI，可以将侧链没有电荷的氨基酸和/或优选地具有带正电的侧链的氨基酸添加或插入到蛋白的氨基酸序列中，或可以在蛋白的氨基酸序列中缺失侧链没有电荷的氨基酸和/或优选地具有带负电的侧链的氨基酸。被理解的是，例如，蛋白的N-端和C-端氨基酸残基除了具有来源于其侧链的电荷以外还具有来源于主链的电荷(在N-端的氨基的NH3 +和在C-端的羰基的COO-)。因此，蛋白的pI也可以通过向来源于主链的官能团进行一些添加，缺失，置换，或插入来提高。
提高pI的氨基酸置换包括，例如，在亲本Fc区的氨基酸序列中，侧链没有电荷的氨基酸置换具有带负电的侧链的氨基酸，具有带正电的侧链的氨基酸置换侧链没有电荷的氨基酸，以及具有带正电的侧链的氨基酸置换具有带负电的侧链的氨基酸，其单独进行或以适当的组合进行。
提高pI的氨基酸插入或添加包括，例如，在亲本Fc区的氨基酸序列中，插入或添加侧链没有电荷的氨基酸，和/或插入或添加具有带正电的侧链的氨基酸，其单独进行或以适当的组合进行。
提高pI的氨基酸缺失包括，例如，在亲本Fc区的氨基酸序列中，缺失侧链没有电荷的氨基酸，和/或缺失具有带负电的侧链的氨基酸，其单独进行或以适当的组合进行。
在一个实施方案中，用于提高pI的天然氨基酸可以被归类如下：(a)具有带负电的侧链的氨基酸可以是Glu(E)或Asp(D)；(b)侧链没有电荷的氨基酸可以是Ala(A)，Asn(N)，Cys(C)，Gln(Q)，Gly(G)，His(H)，Ile(I)，Leu(L)，Met(M)，Phe(F)，Pro(P)，Ser(S)，Thr(T)，Trp(W)，Tyr(Y)，或Val(V)；并且(c)具有带正电的侧链的氨基酸可以是His(H)，Lys(K)，或Arg(R)。在一个实施方案中，修饰后的氨基酸插入或置换是Lys(K)或Arg(R)。
在另一个方面，本发明提供分离的多肽，所述多肽包含具有增强的FcγRIIb-结合活性和提高的pI的变体Fc区。在某些实施方案中，本文中所述的变体Fc区包含在亲本Fc区中的至少两个氨基酸改变。
在一个方面，本发明提供多肽，所述多肽包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性和提高的pI的变体Fc区，所述变体Fc区包含至少三个包含以下的氨基酸改变：(a)选自由以下组成的组的至少一个位置的至少一个氨基酸改变：231、232、233、234、235、236、237、238、239、264、266、267、268、271、295、298、325、326、327、328、330、331、332、334和396(根据EU编号)，和(b)选自由以下组成的组的至少两个位置的至少两个氨基酸改变：285、311、312、315、318、333、335、337、341、342、343、384、385、388、390、399、400、401、402、413、420、422和431(根据EU编号)。
在一个方面，本发明提供多肽，所述多肽包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性和提高的pI的变体Fc区，并且所述变体Fc区包含至少三个包含以下的氨基酸改变：(a)选自由以下组成的组的至少一个位置的至少一个氨基酸改变：231，232，235，236，239，268，295，298，326，330，和396(根据EU编号)，和(b)选自由以下组成的组的至少两个位置的至少两个氨基酸改变：311，341，343，384，399，400，401，402，和413(根据EU编号)。
在另一个方面，本发明提供多肽，所述多肽包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性和提高的pI的变体Fc区，所述变体Fc区包含以下(1)-(9)中任一的氨基酸改变：(1)位置235，236，268，295，311，326，330和343；(2)位置236，268，295，311，326，330和343；(3)位置236，268，295，311，330和413；(4)位置236，268，311，330，396和399；(5)位置236，268，311，330和343；(6)位置236，268，311，330，343和413；(7)位置236，268，311，330，384和413；(8)位置236，268，311，330和413；和(9)位置236，268，330，396，400和413(根据EU编号)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有食蟹猴Fcγ RIIb的序列(SEQ ID NO:223)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有人Fcγ RIIb的序列(例如，SEQ ID NO:212，213，或214)。
在一个方面，本发明提供多肽，所述多肽包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性和提高的pI的变体Fc区，所述变体Fc区包含至少三个包含以下的氨基酸改变：(a)选自由以下组成的组的至少一个位置的至少一个氨基酸改变：234，238，250，264，267，307，和330，和(b)选自由以下组成的组的至少两个位置的至少两个氨基酸改变：285、311、312、315、318、333、335、337、341、342、343、384、385、388、390、399、400、401、402、413、420、422和431(根据EU编号)。在另外的实施方案中，多肽包含选自由以下组成的组的至少两个位置的至少两个氨基酸改变：311，341，343，384，399，400，401，402，和413(根据EU编号)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有食蟹猴Fcγ RIIb的序列(SEQ ID NO:223)。在某些实施方案中，FcγRIIb具有人Fcγ RIIb的序列(例如，SEQ ID NO:212，213，或214)。
在另一个方面，本发明提供多肽，所述多肽包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性和提高的pI的变体Fc区，所述变体Fc区包含以下(1)-(16)中任一的氨基酸改变：(1)位置234，238，250，264，307，311，330和343；(2)位置234，238，250，264，307，311，330和413；(3)位置234，238，250，264，267，307，311，330和343；(4)位置234，238，250，264，267，307，311，330和413；(5)位置234，238，250，267，307，311，330和343；(6)位置234，238，250，267，307，311，330和413；(7)位置234，238，250，307，311，330和343；(8)位置234，238，250，307，311，330和413；(9)位置238，250，264，267，307，311，330和343；(10)位置238，250，264，267，307，311，330和413；(11)位置238，250，264，307，311，330和343；(12)位置238，250，264，307，311，330和413；(13)位置238，250，267，307，311，330和343；(14)位置238，250，267，307，311，330和413；(15)位置238，250，307，311，330和343；和(16)位置238，250，307，311，330和413(根据EU编号)。
在另一个实施方案中，变体Fc区包含选自表14-30中所述的任何单个改变，单个改变的组合，或组合改变的氨基酸改变。
在一些实施方案中，多肽包含本发明的变体Fc区。在另一个实施方案中，多肽是抗体重链恒定区。在另一个实施方案中，多肽是抗体重链。在另一个实施方案中，多肽是抗体。在另一个实施方案中，多肽是Fc融合蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:229-381中任一的氨基酸序列。
如本文中使用的"亲本Fc区"是指引入本文中所述的氨基酸改变之前的Fc区。亲本Fc区的优选实例包括来源于天然抗体的Fc区。抗体包括，例如，IgA(IgA1，IgA2)，IgD，IgE，IgG(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，和IgM等等。抗体可以来源于人或猴(例如，食蟹猴，猕猴，狨猴，黑猩猩，或狒狒)。天然抗体还可以包括天然存在的突变。由于遗传多态性所致的IgG的多种同种异型序列被描述于"Sequences of proteins of immunological interest",NIH出版No.91-3242中，并且其中任一皆可用于本发明。特别地，对于人IgG1，位置356至358(EU编号)处的氨基酸序列可以是DEL或EEM。亲本Fc区的优选实例包括来源于人IgG1(SEQ IDNO:195)，人IgG2(SEQ ID NO:196)，人IgG3(SEQ ID NO:197)，和人IgG4(SEQ ID NO:198)的重链恒定区的Fc区。亲本Fc区的另一个优选实例是来源于重链恒定区SG1的Fc区(SEQ IDNO:9)。此外，亲本Fc区可以是通过向来源于天然抗体的Fc区添加与本文中所述的氨基酸改变不同的氨基酸改变产生的Fc区。
此外，为其他目的进行的氨基酸改变可以被结合到本文中所述的变体Fc区中。例如，可以添加提高FcRn-结合活性的氨基酸置换(Hinton等,J.Immunol.176(1):346-356(2006)；Dall'Acqua等,J.Biol.Chem.281(33):23514-23524(2006)；Petkova等,Intl.Immunol.18(12):1759-1769(2006)；Zalevsky等,Nat.Biotechnol.28(2):157-159(2010)；WO 2006/019447；WO 2006/053301；和WO 2009/086320)，以及用于提高抗体异质性或稳定性的氨基酸置换(WO 2009/041613)。备选地，WO 2011/122011，WO 2012/132067，WO2013/046704或WO 2013/180201中描述的具有促进抗原清除的性质的多肽，WO 2013/180200中描述的具有与靶组织特异结合的性质的多肽，WO 2009/125825，WO 2012/073992或WO 2013/047752中描述的具有与多个抗原分子重复结合的性质的多肽，可以与本文中所述的变体Fc区结合。备选地，为了给予其他抗原以结合能力，可以将EP1752471和EP1772465中公开的氨基酸改变结合到本文中所述的变体Fc区的CH3中。备选地，为了增加血浆保留，可以将降低恒定区的pI的氨基酸改变(WO 2012/016227)结合到本文中所述的变体Fc区中。备选地，为了促进到细胞中的摄取，可以将提高恒定区的pI的氨基酸改变(WO 2014/145159)结合到本文中所述的变体Fc区中。备选地，为了促进靶分子从血浆的消除，可以将提高恒定区的pI的氨基酸改变(日本专利申请号JP2015-021371和JP2015-185254)结合到本文中所述的变体Fc区中。在一个实施方案中，此种改变可以包括，例如，选自以下的至少一个位置处的置换：311，343，384，399，400，和413(根据EU编号)。在另一个实施方案中，此种置换可以是在每个位置处用Lys或Arg替换氨基酸。
增强在酸性pH下的人FcRn-结合活性的氨基酸改变也可以被结合到本文中所述的变体Fc区中。具体地，此种改变可以包括，例如，根据EU编号，位置428处Leu置换Met和位置434处Ser置换Asn(Zalevsky等,Nat.Biotechnol.28:157-159(2010))；位置434处Ala置换Asn(Deng等,Metab.Dispos.38(4):600-605(2010))；位置252处Tyr置换Met，位置254处Thr置换Ser和位置256处Glu置换Thr(Dall'Acqua等,J.Biol.Chem.281:23514-23524(2006))；位置250处Gln置换Thr和位置428处Leu置换Met(Hinton等,J.Immunol.176(1):346-356(2006))；位置434处His置换Asn(Zheng等,Clin.Pharmacol.Ther.89(2):283-290(2011)，以及WO 2010/106180，WO 2010/045193，WO 2009/058492，WO 2008/022152，WO 2006/050166，WO 2006/053301，WO 2006/031370，WO 2005/123780，WO 2005/047327，WO 2005/037867，WO 2004/035752，或WO 2002/060919中描述的改变。此种改变可以包括，例如，选自以下的至少一个改变：位置428处Leu置换Met，位置434处Ala置换Asn和位置436处Thr置换Tyr。所述改变还可以包括位置438处Arg置换Gln和/或位置440处Glu置换Ser(日本专利申请号JP2015-021371和JP2015-185254)。
两个以上的包含本文中所述的变体Fc区的多肽可以被包括在一个分子中，其中两个包含变体Fc区的多肽相结合，与在抗体中很像。抗体的类型不受限制，并且可以使用IgA(IgA1，IgA2)，IgD，IgE，IgG(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)和IgM等。
两个相结合的包含变体Fc区的多肽可以是包含其中已经引入有相同的氨基酸改变的变体Fc区(下文中称为同源变体Fc区)的多肽，或包含其中引入有不同的氨基酸改变的变体Fc区的多肽，或备选地其中氨基酸改变仅被引入一个Fc区中的包含变体Fc区的多肽(下文中称为异源的包含变体Fc区的多肽)。优选的氨基酸改变之一是涉及与Fcγ RIIb和Fcγ RIIa的结合的Fc区的CH2结构域中位置233至239(EU编号)的环结构中的改变。优选地，一个增强Fcγ RIIb-结合活性和/或选择性的改变被引入到一个Fc区的CH2结构域的环结构中，而另一个使其不稳定的改变被引入到另一个Fc区的CH2结构域的环结构中。可以使CH2结构域的环结构不稳定的氨基酸改变的实例可以是选自位置235，236，237，238和239处的氨基酸的至少一个氨基酸置换成另一个氨基酸。具体地，其可以通过以下方式被去稳定化，例如，将位置235处的氨基酸变成Asp，Gln，Glu或Thr，将位置236处的氨基酸变成Asn，将位置237处的氨基酸变成Phe或Trp，将位置238处的氨基酸变成Glu，Gly或Asn，以及将位置239处的氨基酸变成Asp或Glu(根据EU编号)。
为了结合异源的包含变体Fc区的多肽，可以应用通过在Fc区的CH2或CH3结构域的界面中引入静电排斥而抑制非所需的同源的包含变体Fc区的多肽的结合的技术，如WO2006/106905中所述。
在Fc区的CH2或CH3结构域的界面处接触的氨基酸残基的实例包括，CH3结构域中，位置356(EU编号)处的残基，位置439(EU编号)处的残基，位置357(EU编号)处的残基，位置370(EU编号)处的残基，位置399(EU编号)处的残基，和位置409(EU编号)处的残基。
更具体地，例如，可以制备这样的Fc区，其中选自以下显示的(1)至(3)的一至三对氨基酸残基具有相同的电荷：(1)CH3结构域中位置356和439(EU编号)处的氨基酸残基；(2)CH3结构域中位置357和370(EU编号)处的氨基酸残基；和(3)CH3结构域中位置399和409(EU编号)处的氨基酸残基。
此外，可以制备这样的异源的包含变体Fc区的多肽，其中在第一个Fc区的CH3结构域中选自以上所示的(1)至(3)的一至三对氨基酸残基具有相同的电荷，并且在第二个Fc区的CH3结构域中前述第一个Fc区中选择的氨基酸残基对也具有相同的电荷，前提是第一和第二Fc区中的电荷相反。
在以上提及的Fc区中，例如，带负电的氨基酸残基优选地选自谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)，并且带正电的氨基酸残基优选地选自赖氨酸(K)，精氨酸(R)和组氨酸(H)。
此外，其他已知的技术可以用于异源的包含变体Fc区的多肽的结合。具体地，此种技术通过以下方式进行：用更大的侧链(突出(knob)；其是指"凸出部分")置换存在于一个Fc区中的氨基酸侧链，和用更小的侧链(孔(hole)；其是指"空的")置换存在于Fc区中的氨基酸侧链，以将突出置于孔内。这可以促进具有的不同的氨基酸序列的含Fc区的多肽彼此有效结合(WO 1996/027011；Ridgway等,Prot.Eng.9:617-621(1996)；Merchant等,Nat.Biotech.16,677-681(1998))。
此外，其他已知技术也可以用于包含变体Fc区的多肽的异源结合。包含Fc区的多肽的结合可以使用链交换改造的结构域CH3异源二聚体有效引入(Davis等,Prot.Eng.Des.&Sel.,23:195-202(2010))。该技术也可以用于有效引入具有不同的氨基酸序列的含Fc区的多肽之间的结合。
此外，也可以使用WO 2011/028952中描述的利用抗体CH1和CL的结合以及VH和VL的结合的异源二聚抗体制备技术。
关于WO 2008/119353和WO 2011/131746中所述的方法，同样可能的是使用通过提前制备两种类型的同源二聚的抗体，在还原条件下孵育抗体以使其解离，并且允许其再次结合的制备异源二聚抗体的技术。
关于Strop(J.Mol.Biol.420:204-219(2012))中所述的方法，同样可能的是使用通过引入带电荷的残基如Lys，Arg，Glu和Asp从而将静电排斥引入CH3结构域中的制备异源二聚抗体的技术。
此外，关于WO 2012/058768中所述的方法，同样可能的是使用通过向CH2和CH3结构域加入改变的制备异源二聚抗体的技术。
当同时表达两种包含具有不同氨基酸序列的变体Fc区的多肽以制备包含异源的变体Fc区的多肽时，包含同源变体Fc区的多肽也通常作为杂质产生。在此种情况中，包含异源变体Fc区的多肽可以通过使用已知技术将其与包含同源变体Fc区的多肽分离而有效获得。已经报道了使用离子交换色谱，通过将氨基酸改变引入到两类抗体重链的可变区中以在同源二聚抗体和异源二聚抗体之间产生等电点差异，有效地将异源二聚抗体与同源二聚抗体分离并纯化的方法(WO 2007/114325)。已经报道了另一种使用蛋白A色谱，通过构建包含来源于结合蛋白A的小鼠IgG2a和不结合蛋白A的大鼠IgG2b的两类重链的异源二聚抗体来纯化异源二聚抗体的方法(WO 1998/050431和WO 1995/033844)。
此外，异源二聚抗体可以使用蛋白A色谱，通过用氨基酸如Tyr或His置换位于抗体重链的蛋白A结合位点中的位置435和436(EU编号)处的氨基酸残基以产生不同蛋白A结合亲和性来有效纯化。
在本发明中，氨基酸改变表示置换，缺失，添加，插入和修饰中任一，或其组合。在本发明中，氨基酸改变可以被表述为氨基酸突变。
当置换氨基酸残基时，可以为了改变下述方面如(a)-(c)而进行向不同氨基酸残基的置换：(a)折叠片结构或螺旋结构区中的多肽主链结构；(b)靶位点处的电荷或疏水性；或(c)侧链的大小。
氨基酸残基基于其总体侧链性质而被分类为以下组：(a)疏水性的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，和Ile；(b)中性亲水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，和Gln；(c)酸性的：Asp和Glu；(d)碱性的：His，Lys，和Arg；(e)影响链定位的残基：Gly和Pro；和(f)芳香性的：Trp，Tyr，和Phe。
氨基酸改变通过本领域技术人员已知的多种方法产生。所述方法包括定点诱变法(Hashimoto-Gotoh等,Gene 152:271-275(1995)；Zoller,Meth.Enzymol.100:468-500(1983)；Kramer等,Nucleic Acids Res.12:9441-9456(1984))；Kramer和Fritz,MethodsEnzymol.154:350-367(1987)；以及Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492(1985))，PCR突变法和盒(cassette)突变法，但不限于此。
引入Fc区中的氨基酸改变的数目不受限制。在某些实施方案中，其可以为1，2以下，3以下，4以下，5以下，6以下，8以下，10以下，12以下，14以下，16以下，18以下，或20以下。
氨基酸修饰包括翻译后修饰。具体的翻译后修饰可以是糖链的添加或缺失。例如，IgG1恒定区中位置297(EU编号)处的氨基酸残基可以是糖链修饰的。用于修饰的糖链结构不受限制。例如，唾液酸可以被添加到Fc区的糖链(MAbs 2010Sep-Oct，2(5)：519-527)。通常，真核细胞中表达的抗体在恒定区中包含糖基化。例如，已知，一些类型的糖链通常被添加到细胞中表达的抗体，所述细胞如天然存在的哺乳动物的抗体生产细胞或转化有包含编码抗体的DNA的表达载体的真核细胞。
此处显示的真核细胞包括酵母和动物细胞。例如，CHO细胞和HEK293细胞是用于利用包含编码抗体的DNA的表达载体的转化的代表性动物细胞。另一方面，不具有糖基化的恒定区也包括在本发明中。恒定区未被糖基化的抗体可以通过在原核细胞如大肠杆菌中表达抗体编码基因来获得。
此外，包含本发明的变体Fc区的多肽可以用多种分子如聚乙二醇(PEG)和细胞毒性物质化学修饰。用于多肽的此种化学修饰的方法在本领域中是确定的。
在一个方面，本发明提供分离的多肽，所述多肽包含具有增强的FcγRIIb-结合活性的变体Fc区。在一些方面，所述多肽是抗体。在一些方面，所述多肽是Fc融合蛋白。在一个方面，本发明提供分离的多肽，所述多肽包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区。在一些方面，所述多肽是抗体。在某些实施方案中，抗体是嵌合抗体或人源化抗体。抗体的来源不受特别限制，但是实例包括人抗体，小鼠抗体，大鼠抗体和兔抗体。在一些方面，所述多肽是Fc融合蛋白。
包含本文中提供的变体Fc区的抗体的可变区和包含变体Fc区的Fc融合蛋白的蛋白结合基序可以识别任何抗原。可以被此种抗体和融合蛋白结合的抗原的实例包括但不限于配体(细胞因子，趋化因子等)，受体，癌症抗原，MHC抗原，分化抗原，免疫球蛋白，和部分含有免疫球蛋白的免疫复合物。
可以被含有本发明的变体Fc区和/或与包含公开的变体Fc区的多肽重组融合的抗体或融合蛋白结合的细胞因子的实例包括但不限于，白介素1至18，集落刺激因子(G-CSF，M-CSF，GM-CSF等)，干扰素(IFN-α，IFN-β，IFN-γ等)，生长因子(EGF，FGF，IGF，NGF，PDGF，TGF，HGF等)，肿瘤坏死因子(TNF-α和TNF-β)，淋巴毒素，红细胞生成素，瘦素，SCF，TPO，MCAF和BMP。
可以被含有本发明的变体Fc区和/或与包含公开的变体Fc区的多肽重组融合的抗体或融合蛋白结合的趋化因子的实例包括但不限于，CC趋化因子如CCL1至CCL28，CXC趋化因子如CXCL1至CXCL17，C趋化因子如XCL1至XCL2，和CX3C趋化因子如CX3CL1。
可以被含有本发明的变体Fc区和/或与包含公开的变体Fc区的多肽重组融合的抗体或融合蛋白结合的受体的实例包括但不限于，属于受体家族如造血生长因子受体家族，细胞因子受体家族，酪氨酸激酶型受体家族，丝氨酸/苏氨酸激酶型受体家族，TNF受体家族，G蛋白偶联受体家族，GPI锚定型受体家族，酪氨酸磷酸酶型受体家族，黏附因子家族和激素受体家族的受体。属于这些受体家族的受体及其特征已在许多文献中被描述，如Cooke,ed.New Comprehesive Biochemistry Vol.18B"Hormones and their ActionsPart II"pp.1-46(1988)Elsevier Science Publishers BV；Patthy(Cell 61(1):13-14(1990))；Ullrich(Cell 61(2):203-212(1990))；Massague(Cell 69(6):1067-1070(1992))；Miyajima等(Annu.Rev.Immunol.10:295-331(1992))；Taga等(FASEB J.6:3387-3396(1992))；Fantl等(Annu.Rev.Biochem.62:453-481(1993))；Smith等(Cell 76(6):959-962(1994))；和Flower(Biochim.Biophys.Acta 1422(3):207-234(1999))。
属于以上提及的受体家族的具体受体的实例包括人或小鼠红细胞生成素(EPO)受体(Jones等，Blood 76(1):31-35(1990)；D'Andrea等，Cell 57(2):277-285(1989))，人或小鼠粒细胞集落刺激因子(G-CSF)受体(Fukunaga等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(22):8702-8706(1990),mG-CSFR；Fukunaga等,Cell 61(2):341-350(1990))，人或小鼠血小板生成素(TPO)受体(Vigon等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89(12):5640-5644(1992)；Skoda等,EMBO J.12(7):2645-2653(1993))，人或小鼠胰岛素受体(Ullrich等，Nature 313(6005):756-761(1985))，人或小鼠Flt-3配体受体(Small等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91(2):459-463(1994))，人或小鼠血小板衍生生长因子(PDGF)受体(Gronwald等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85(10):3435-3439(1988))，人或小鼠干扰素(IFN)-α和β受体(Uze等，Cell 60(2)：225-234(1990)；Novick等，Cell 77(3):391-400(1994))，人或小鼠瘦素受体，人或小鼠生长激素(GH)受体，人或小鼠白介素(IL)-10受体，人或小鼠胰岛素样生长因子(IGF)-I受体，人或小鼠白血病抑制因子(LIF)受体，和人或小鼠多毛神经营养因子(CNTF)受体。
癌症抗原是当细胞变成恶性时表达的抗原，并且其也被称为肿瘤特异性抗原。细胞变成癌细胞时出现在细胞表面或蛋白分子上的异常糖链也是癌症抗原，并且其也被称为糖链癌症抗原。可以被包含本发明的变体Fc区的抗体或融合蛋白结合的癌症抗原的实例包括但不限于，GPC3，其是属于以上提及的GPI锚定型受体家族的受体，并且也被表达在包括肝癌在内的多种癌症中(Midorikawa等,Int.J.Cancer 103(4):455-465(2003))，以及EpCAM，其被表达在包括肺癌在内的多种癌症中(Linnenbach等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1):27-31(1989))，CA19-9，CA15-3和唾液酰SSEA-1(SLX)。
MHC抗原大致被分类为MHC I型抗原和MHC II型抗原。MHC I型抗原包括HLA-A，-B，-C，-E，-F，-G，和-H，并且MHC II型抗原包括HLA-DR，-DQ，和-DP。
可以被含有本发明的变体Fc区和/或与包含公开的变体Fc区的多肽重组融合的抗体或融合蛋白结合的分化抗原的实例包括但不限于，CD1，CD2，CD4，CD5，CD6，CD7，CD8，CD10，CD11a，CD11b，CD11c，CD13，CD14，CD15s，CD16，CD18，CD19，CD20，CD21，CD23，CD25，CD28，CD29，CD30，CD32，CD33，CD34，CD35，CD38，CD40，CD41a，CD41b，CD42a，CD42b，CD43，CD44，CD45，CD45RO，CD48，CD49a，CD49b，CD49c，CD49d，CD49e，CD49f，CD51，CD54，CD55，CD56，CD57，CD58，CD61，CD62E，CD62L，CD62P，CD64，CD69，CD71，CD73，CD95，CD102，CD106，CD122，CD126，和CDw130。
免疫球蛋白包括IgA，IgM，IgD，IgG和IgE。免疫复合物包括至少任意免疫球蛋白的组分。
可以被含有本发明的变体Fc区和/或与包含公开的变体Fc区的多肽重组融合的抗体或融合蛋白结合的抗原的其他实例包括但不限于，17-IA，4-1BB，4Dc，6-酮-PGF1a，8-异-PGF2a，8-氧代-dG，A1腺苷受体，A33，ACE，ACE-2，激活蛋白，激活蛋白A，激活蛋白AB，激活蛋白B，激活蛋白C，激活蛋白RIA，激活蛋白RIA ALK-2，激活蛋白RIB ALK-4，激活蛋白RIIA，激活蛋白RIIB，ADAM，ADAM10，ADAM12，ADAM15，ADAM17/TACE，ADAM8，ADAM9，ADAMTS，ADAMTS4，ADAMTS5，地址素，aFGF，ALCAM，ALK，ALK-1，ALK-7，α-1-抗胰蛋白酶，α-V/β-1拮抗剂，ANG，Ang，APAF-1，APE，APJ，APP，APRIL，AR，ARC，ART，artemin，抗-Id，ASPARTIC，房前促尿钠排泄肽，av/b3整联蛋白，Axl，b2M，B7-1，B7-2，B7-H，B-淋巴细胞刺激因子(BlyS)，BACE，BACE-1，Bad，BAFF，BAFF-R，Bag-1，BAK，Bax，BCA-1，BCAM，Bcl，BCMA，BDNF，b-ECGF，bFGF，BID，Bik，BIM，BLC，BL-CAM，BLK，BMP，BMP-2BMP-2a，BMP-3成骨素，BMP-4，BMP-2b，BMP-5，BMP-6Vgr-1，BMP-7(OP-1)，BMP-8(BMP-8a，OP-2)，BMPR，BMPR-IA(ALK-3)，BMPR-IB(ALK-6)，BRK-2，RPK-1，BMPR-II(BRK-3)，BMP，b-NGF，BOK，铃蟾肽，骨源神经营养因子，BPDE，BPDE-DNA，BTC，互补因子3(C3)，C3a，C4，C5，C5a，C10，CA125，CAD-8，降钙素，cAMP，癌胚抗原(CEA)，癌症相关抗原，组织蛋白酶A，组织蛋白酶B，组织蛋白酶C/DPPI，组织蛋白酶D，组织蛋白酶E，组织蛋白酶H，组织蛋白酶L，组织蛋白酶O，组织蛋白酶S，组织蛋白酶V，组织蛋白酶X/Z/P，CBL，CCI，CCK2，CCL，CCL1，CCL11，CCL12，CCL13，CCL14，CCL15，CCL16，CCL17，CCL18，CCL19，CCL2，CCL20，CCL21，CCL22，CCL23，CCL24，CCL25，CCL26，CCL27，CCL28，CCL3，CCL4，CCL5，CCL6，CCL7，CCL8，CCL9/10，CCR，CCR1，CCR10，CCR11，CCR2，CCR3，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR8，CCR9，CD1，CD2，CD3，CD3E，CD4，CD5，CD6，CD7，CD8，CD10，CD11a，CD11b，CD11c，CD13，CD14，CD15，CD16，CD18，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD25，CD27L，CD28，CD29，CD30，CD30L，CD32，CD33(p67蛋白)，CD34，CD38，CD40，CD40L，CD44，CD45，CD46，CD49a，CD52，CD54，CD55，CD56，CD61，CD64，CD66e，CD74，CD80(B7-1)，CD89，CD95，CD123，CD137，CD138，CD140a，CD146，CD147，CD148，CD152，CD164，CEACAM5，CFTR，cGMP，CINC，肉毒毒素，产气荚膜梭菌毒素，CKb8-1，CLC，CMV，CMV UL，CNTF，CNTN-1，COX，C-Ret，CRG-2，CT-1，CTACK，CTGF，CTLA-4，CX3CL1，CX3CR1，CXCL，CXCL1，CXCL2，CXCL3，CXCL4，CXCL5，CXCL6，CXCL7，CXCL8，CXCL9，CXCL10，CXCL11，CXCL12，CXCL13，CXCL14，CXCL15，CXCL16，CXCR，CXCR1，CXCR2，CXCR3，CXCR4，CXCR5，CXCR6，细胞角蛋白肿瘤相关抗原，DAN，DCC，DcR3，DC-SIGN，补体调节因子(腐烂加速因子)，des(1-3)-IGF-I(脑IGF-1)，Dhh，地高辛，DNAM-1，DNA酶，Dpp，DPPIV/CD26，Dtk，ECAD，EDA，EDA-A1，EDA-A2，EDAR，EGF，EGFR(ErbB-1)，EMA，EMMPRIN，ENA，内皮缩血管肽受体，脑啡肽酶，eNOS，Eot，嗜酸细胞活化趋化因子1，EpCAM，肝配蛋白B2/EphB4，EPO，ERCC，E-选择素，ET-1，因子IIa，因子VII，因子VIIIc，因子IX，成纤维细胞活化蛋白(FAP)，Fas，FcR1，FEN-1，铁蛋白，FGF，FGF-19，FGF-2，FGF3，FGF-8，FGFR，FGFR-3，纤维蛋白，FL，FLIP，Flt-3，Flt-4，滤泡刺激激素，趋化因子CX3(fractalkine)，FZD1，FZD2，FZD3，FZD4，FZD5，FZD6，FZD7，FZD8，FZD9，FZD10，G250，Gas6，GCP-2，GCSF，GD2，GD3，GDF，GDF-1，GDF-3(Vgr-2)，GDF-5(BMP-14，CDMP-1)，GDF-6(BMP-13，CDMP-2)，GDF-7(BMP-12，CDMP-3)，GDF8(肌肉生长抑制因子)，GDF-9，GDF-15(MIC-1)，GDNF，GFAP，GFRa-1，GFR-α1，GFR-α2，GFR-α3，GITR，胰高血糖素，Glut4，糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)，GM-CSF，gp130，gp72，GRO，生长激素释放激素，半抗原(NP-cap或NIP-cap)，HB-EGF，HCC，HCMV gB包膜糖蛋白，HCMV gH包膜糖蛋白，HCMV UL，造血生长因子(HGF)，Hep B gp120，类肝素酶，Her2，Her2/neu(ErbB-2)，Her3(ErbB-3)，Her4(ErbB-4)，单纯疱疹病毒(HSV)gB糖蛋白，HSV gD糖蛋白，HGFA，高分子量黑素瘤相关抗原(HMW-MAA)，HIV gp120，HIV IIIB gp 120V3环，HLA，HLA-DR，HM1.24，HMFGPEM，HRG，Hrk，人心脏肌球蛋白，人巨细胞病毒(HCMV)，人生长激素(HGH)，HVEM，I-309，IAP，ICAM，ICAM-1，ICAM-3，ICE，ICOS，IFNg，Ig，IgA受体，IgE，IGF，IGF结合蛋白，IGF-1R，IGFBP，IGF-I，IGF-II，IL，IL-1，IL-1R，IL-2，IL-2R，IL-4，IL-4R，IL-5，IL-5R，IL-6，IL-6R，IL-8，IL-9，IL-10，IL-12，IL-13，IL-15，IL-18，IL-18R，IL-23，干扰素(IFN)-α，IFN-β，IFN-γ，抑制素，iNOS，胰岛素A链，胰岛素B链，胰岛素样生长因子1，整联蛋白α2，整联蛋白α3，整联蛋白α4，整联蛋白α4/β1，整联蛋白α4/β7，整联蛋白α5(αV)，整联蛋白α5/β1，整联蛋白α5/β3，整联蛋白α6，整联蛋白β1，整联蛋白β2，干扰素γ，IP-10，I-TAC，JE，激肽释放酶2，激肽释放酶5，激肽释放酶6，激肽释放酶11，激肽释放酶12，激肽释放酶14，激肽释放酶15，激肽释放酶L1，激肽释放酶L2，激肽释放酶L3，激肽释放酶L4，KC，KDR，角质形成细胞生长因子(KGF)，层粘连蛋白5，LAMP，LAP，LAP(TGF-1)，潜伏性TGF-1，潜伏性TGF-1bp1，LBP，LDGF，LECT2，lefty，Lewis-Y抗原，Lewis-Y相关抗原，LFA-1，LFA-3，Lfo，LIF，LIGHT，脂蛋白，LIX，LKN，Lptn，L-选择素，LT-a，LT-b，LTB4，LTBP-1，肺表面，促黄体激素，淋巴毒素β受体，Mac-1，MAdCAM，MAG，MAP2，MARC，MCAM，MCK-2，MCP，M-CSF，MDC，Mer，金属蛋白酶S，MGDF受体，MGMT，MHC(HLA-DR)，MIF，MIG，MIP，MIP-1-α，MK，MMAC1，MMP，MMP-1，MMP-10，MMP-11，MMP-12，MMP-13，MMP-14，MMP-15，MMP-2，MMP-24，MMP-3，MMP-7，MMP-8，MMP-9，MPIF，Mpo，MSK，MSP，粘蛋白(Muc1)，MUC18，Mullerian抑制物质，Mug，MuSK，NAIP，NAP，NCAD，N-钙黏着蛋白，NCA90，NCAM，肾胰岛素残基溶酶(neprilysin)，神经营养因子-3，-4或-6，neurturin，神经生长因子(NGF)，NGFR，NGF-β，nNOS，NO，NOS，Npn，NRG-3，NT，NTN，OB，OGG1，OPG，OPN，OSM，OX40L，OX40R，p150，p95，PADPr，甲状旁腺素，PARC，PARP，PBR，PBSF，PCAD，P-钙黏着蛋白，PCNA，PDGF，PDK-1，PECAM，PEM，PF4，PGE，PGF，PGI2，PGJ2，PIN，PLA2，胎盘碱性磷酸酶(PLAP)，PIGF，PLP，PP14，胰岛素原，松弛素原(prorelaxin)，蛋白C，PS，PSA，PSCA，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，PTEN，PTHrp，Ptk，PTN，R51，RANK，RANKL，RANTES，松弛素A链，松弛素B链，肾素，呼吸道合胞病毒(RSV)F，RSV Fgp，Ret，类风湿因子，RLIP76，RPA2，RSK，S100，SCF/KL，SDF-1，丝氨酸，血清清蛋白，sFRP-3，Shh，SIGIRR，SK-1，SLAM，SLPI，SMAC，SMDF，SMOH，SOD，SPARC，Stat，STEAP，STEAP-II，TACE，TACI，TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)，TARC，TCA-3，T-细胞受体(例如，T-细胞受体α/β)，TdT，TECK，TEM1，TEM5，TEM7，TEM8，TERT，睾丸PLAP样碱性磷酸酶，TfR，TGF，TGF-α，TGF-β，TGF-βPan Specific，TGF-βRI(ALK-5)，TGF-βRII，TGF-βRIIb，TGF-βRIII，TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4，TGF-β5，凝血酶，胸腺Ck-1，甲状腺刺激激素，Tie，TIMP，TIQ，组织因子，TMEFF2，Tmpo，TMPRSS2，TNF，TNF-α，TNF-αβ，TNF-β2，TNFc，TNF-RI，TNF-RII，TNFRSF10A(TRAIL R1Apo-2，DR4)，TNFRSF10B(TRAIL R2DR5，KILLER，TRICK-2A，TRICK-B)，TNFRSF10C(TRAIL R3DcR1，LIT，TRID)，TNFRSF10D(TRAIL R4DcR2，TRUNDD)，TNFRSF11A(RANK ODF R，TRANCE R)，TNFRSF11B(OPG OCIF，TR1)，TNFRSF12(TWEAK RFN14)，TNFRSF13B(TACI)，TNFRSF13C(BAFF R)，TNFRSF14(HVEM ATAR，HveA，LIGHT R，TR2)，TNFRSF16(NGFR p75NTR)，TNFRSF17(BCMA)，TNFRSF18(GITR AITR)，TNFRSF19(TROY TAJ，TRADE)，TNFRSF19L(RELT)，TNFRSF1A(TNF RI CD120a，p55-60)，TNFRSF1B(TNF RIICD120b，p75-80)，TNFRSF26(TNFRH3)，TNFRSF3(LTbR TNF RIII，TNFC R)，TNFRSF4(OX40ACT35，TXGP1R)，TNFRSF5(CD40p50)，TNFRSF6(Fas Apo-1，APT1，CD95)，TNFRSF6B(DcR3M68，TR6)，TNFRSF7(CD27)，TNFRSF8(CD30)，TNFRSF9(4-1BB CD137，ILA)，TNFRSF21(DR6)，TNFRSF22(DcTRAIL R2TNFRH2)，TNFRST23(DcTRAIL R1TNFRH1)，TNFRSF25(DR3Apo-3，LARD，TR-3，TRAMP，WSL-1)，TNFSF10(TRAIL Apo-2配体，TL2)，TNFSF11(TRANCE/RANK配体ODF，OPG配体)，TNFSF12(TWEAK Apo-3配体，DR3配体)，TNFSF13(APRIL TALL2)，TNFSF13B(BAFF BLYS，TALL1，THANK，TNFSF20)，TNFSF14(LIGHT HVEM配体，LTg)，TNFSF15(TL1A/VEGI)，TNFSF18(GITR配体AITR配体，TL6)，TNFSF1A(TNF-a Conectin，DIF，TNFSF2)，TNFSF1B(TNF-b LTa，TNFSF1)，TNFSF3(LTb TNFC，p33)，TNFSF4(OX40配体gp34，TXGP1)，TNFSF5(CD40配体CD154，gp39，HIGM1，IMD3，TRAP)，TNFSF6(Fas配体Apo-1配体，APT1配体)，TNFSF7(CD27配体CD70)，TNFSF8(CD30配体CD153)，TNFSF9(4-1BB配体CD137配体)，TP-1，t-PA，Tpo，TRAIL，TRAIL R，TRAIL-R1，TRAIL-R2，TRANCE，转铁蛋白受体，TRF，Trk，TROP-2，TSG，TSLP，肿瘤相关抗原CA125，表达Lewis-Y相关碳水化合物的肿瘤相关抗原，TWEAK，TXB2，Ung，uPAR，uPAR-1，尿激酶，VCAM，VCAM-1，VECAD，VE-钙黏着蛋白，VE-钙黏着蛋白-2，VEFGR-1(flt-1)，VEGF，VEGFR，VEGFR-3(flt-4)，VEGI，VIM，病毒抗原，VLA，VLA-1，VLA-4，VNR整联蛋白，von Willebrand因子，WIF-1，WNT1，WNT2，WNT2B/13，WNT3，WNT3A，WNT4，WNT5A，WNT5B，WNT6，WNT7A，WNT7B，WNT8A，WNT8B，WNT9A，WNT9B，WNT10A，WNT10B，WNT11，WNT16，XCL1，XCL2，XCR1，XCR1，XEDAR，XIAP，XPD，HMGB1，IgA，A-β，CD81，CD97，CD98，DDR1，DKK1，EREG，Hsp90，IL-17/IL-17R，IL-20/IL-20R，氧化的LDL，PCSK9，前激肽释放酶，RON，TMEM16F，SOD1，色颗粒蛋白A，色颗粒蛋白B，tau，VAP1，高分子量激肽原，IL-31，IL-31R，Nav1.1，Nav1.2，Nav1.3，Nav1.4，Nav1.5，Nav1.6，Nav1.7，Nav1.8，Nav1.9，EPCR，C1，C1q，C1r，C1s，C2，C2a，C2b，C3，C3a，C3b，C4，C4a，C4b，C5，C5a，C5b，C6，C7，C8，C9，因子B，因子D，因子H，备解素，sclerostin，纤维蛋白原，纤维蛋白，凝血酶原，凝血酶，组织因子，因子V，因子Va，因子VII，因子VIIa，因子VIII，因子VIIIa，因子IX，因子IXa，因子X，因子Xa，因子XI，因子XIa，因子XII，因子XIIa，因子XIII，因子XIIIa，TFPI，抗凝血酶III，EPCR，血栓调节蛋白，TAPI，tPA，纤维蛋白溶酶原，纤溶酶，PAI-1，PAI-2，GPC3，多配体聚糖-1，多配体聚糖-2，多配体聚糖-3，多配体聚糖-4，LPA，和S1P；以及激素和生长因子的受体。
如本文中所述，在构成可变区的氨基酸序列中允许一个或多个氨基酸残基改变，只要其抗原结合活性得以保持即可。当改变可变区氨基酸序列时，对改变的位点和改变的氨基酸的数目没有特别限制。例如，CDR和/或FR中存在的氨基酸可以被适当地改变。当改变可变区中的氨基酸时，结合活性优选地被保持，而没有特别限制；并且例如，与改变前相比，结合活性可以为50％以上，80％以上，和100％以上。此外，氨基酸改变可以使结合活性提高。例如，结合活性可以是改变前的2倍，5倍，10倍等。氨基酸序列的改变可以是氨基酸残基置换，添加，缺失和修饰中的至少一种。
例如，通过焦谷氨酰化将可变区的N-端谷酰胺修饰为焦谷氨酸是本领域技术人员熟知的修饰。因此，当重链N端是谷酰胺时，本文中所述的抗体可以包含这样的可变区，其中谷酰胺被修饰为焦谷氨酸。
本文中所述的抗体可变区可以具有任何序列，并且其可以是任意来源的抗体可变区，如小鼠抗体，大鼠抗体，兔抗体，山羊抗体，骆驼抗体，通过人源化这些非人抗体产生的人源化抗体，以及人抗体。此外，这些抗体可以在其可变区中引入有多种氨基酸置换以改善其抗原结合，药物动力学，稳定性和免疫原性。可变区由于其在抗原结合方面的pH依赖性而可以能够重复地结合抗原(WO 2009/125825)。
κ链和λ链存在于抗体轻链恒定区中，并且任一个都是可接受的。此外，其可以具有一些氨基酸改变如置换，缺失，添加，和/或插入。
此外，包含本文中所述的变体Fc区的多肽可以通过连接至其他蛋白如具有生理活性的肽而被制成Fc融合蛋白。此种融合蛋白可以是至少两个包含变体Fc区的多肽的多聚体。其他蛋白的实例包括受体，黏附分子，配体和酶，但不限于此。
Fc融合蛋白的实例包括利用Fc区与结合靶分子的受体融合的蛋白，包括TNFR-Fc融合蛋白，IL1R-Fc融合蛋白，VEGFR-Fc融合蛋白和CTLA4-Fc融合蛋白(Economides等,.Nat.Med.9(1):47-52(2003)；Dumont等,BioDrugs.20(3):151-60(2006))。此外，要被融合的蛋白可以是具有靶结合活性的其他分子，例如，scFv(WO 2005/037989)，单结构域抗体(WO 2004/058821；WO 2003/002609)，抗体样分子(Davinder,Curr.Op.Biotech.17:653-658(2006)；Current Opinion in Biotechnology 18:1-10(2007)；Nygren等,Curr.Op.Struct.Biol.7:463-469(1997)；和Hoss.Protein Science 15:14-27(2006))如DARPins(WO 2002/020565)，Affibody(WO 1995/001937)，Avimer(WO 2004/044011；WO2005/040229)，和Adnectin(WO 2002/032925)。此外，抗体和Fc融合蛋白可以是多特异性的并且可以结合多种类型的靶分子或表位。
B.重组方法和组合物
抗体可以使用重组方法和组合物制备，例如，如美国专利号4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供分离的核酸，其编码本文中所述的抗-肌肉生长抑制因子抗体。在另一个实施方案中，提供分离的核酸，其编码本文中所述的包含变体Fc区或亲本Fc区的的多肽。此种核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在另一个实施方案中，提供一种或多种包含此种核酸的载体(例如，表达载体)。在另一个实施方案中，提供包含此种核酸的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞包含(例如，转化有)：(1)载体，所述载体包含核酸，所述核酸编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列，或(2)包含编码包含抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一载体，和包含编码包含抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如，Y0，NS0和Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供制备抗-肌肉生长抑制因子抗体的方法，其中所述方法包括在适合于表达如上所述的抗体的条件下培养包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，和任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。在另一个实施方案中，提供制备包含变体Fc区或亲本Fc区的多肽的方法，其中所述方法包括在适合于表达如上所述的多肽如抗体，Fc区或变体Fc区的条件下培养包含编码所述多肽的核酸的宿主细胞，和任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收多肽。
为了重组制备抗-肌肉生长抑制因子抗体，将例如如上所述的编码抗体的核酸分离并插入到一种或多种载体中用于在宿主细胞中的进一步克隆和/或表达。为了重组制备Fc区，将编码Fc区的核酸分离并插入到一种或多种载体中用于在宿主细胞中的进一步克隆和/或表达。此种核酸可以使用常规方法容易地分离并测序(例如，使用能够特异结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。
适用于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文中所述的原核或真核细胞。例如，抗体可以在细菌中制备，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见，例如，美国专利号5,648,237，5,789,199和5,840,523。(还参见，Charlton,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ,2003),pp.245-254，其描述了在大肠杆菌中表达抗体片段)。在表达后，抗体可以从细菌细胞糊料分离到可溶级分中并且可以被进一步纯化。
除了原核生物以外，真核微生物如丝状真菌或酵母对于编码抗体的载体来说也是合适的克隆或表达宿主，包括糖基化途径已被"人源化"从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体的真菌和酵母株系。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004),和Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适用于表达糖基化抗体的宿主细胞还来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了多种杆状病毒株，其可以与昆虫细胞一起使用，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
植物细胞培养物也可以被用作宿主。参见，例如，美国专利号5,959,177，6,040,498，6,420,548，7,125,978和6,417,429(其描述了用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可以被用作宿主。例如，适合于悬浮培养的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是SV40(COS-7)转化的猴肾CV1细胞系；人胚胎肾细胞系(293或如例如Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977)中所述的293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠sertoli细胞(TM4细胞，如例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；水牛鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562)；如例如Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述的TRI细胞；MRC5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如Y0，NS0和Sp2/0。对于适用于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。
具有pH依赖性特征的抗体可以使用筛选方法和/或诱变方法获得，例如，如WO2009/125825中所述。筛选方法可以包括在对特定抗原具有特异性的抗体群体中鉴定具有pH依赖性结合性质的抗体的任何方法。在某些实施方案中，筛选方法可以包括在酸性pH和中性pH测量在初始抗体群体内的个体抗体的一种以上的结合参数(例如，KD或kd)。抗体的结合参数可以使用例如以下方法测量：表面等离子共振，或允许定量或定性评估抗体对特定抗原的结合性质的任何其他分析方法。在某些实施方案中，筛选方法可以包括鉴定以2以上的酸性/中性KD比结合抗原的抗体。在另外的实施方案中，筛选方法可以包括鉴定以2以上的pH5.8/pH7.4 KD比结合抗原的抗体。备选地，筛选方法可以包括鉴定以2以上的酸性/中性kd比结合抗原的抗体。在另外的实施方案中，筛选方法可以包括鉴定以2以上的pH5.8/pH7.4 kd比结合抗原的抗体。
在另一个实施方案中，诱变方法可以包括在抗体的重链和/或轻链内引入氨基酸缺失，置换或添加以增强抗体对抗原的pH依赖性结合。在某些实施方案中，诱变可以在抗体的一个或多个可变结构域内进行，例如，在一个或多个HVR(例如，CDR)内进行。例如，诱变可以包括将抗体的一个或多个HVR(例如，CDR)内的氨基酸置换成另一种氨基酸。在某些实施方案中，诱变可以包括将抗体的至少一个HVR(例如，CDR)中的一个或多个氨基酸置换成组氨酸。在某些实施方案中，"增强的pH依赖性结合"是指突变形式的抗体显示比诱变前的原始"亲本"(即，较少的pH依赖性)形式的抗体更大的酸性/中性KD比或更大的酸性/中性kd比。在某些实施方案中，突变形式的抗体的酸性/中性KD比为2以上。在某些实施方案中，突变形式的抗体的pH5.8/pH7.4 KD比为2以上。备选地，突变形式的抗体的酸性/中性kd比为2以上。在另外的实施方案中，突变形式的抗体的pH5.8/pH7.4 kd比为2以上。
优选地通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来在动物中制备多克隆抗体。可能有用的是使用双功能或衍生化试剂，例如，马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)，N-羟基琥珀酰亚胺基(通过赖氨酸残基)，戊二醛，琥珀酸酐，SOCl2，或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基，将相关抗原与在要被免疫的物种中具有免疫原性的蛋白(例如，钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)，血清清蛋白，牛甲状腺球蛋白，或大豆胰蛋白酶抑制剂)缀合。
通过将例如100μg或5μg蛋白或缀合物(分别对于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂合并并将溶液在多个位点进行皮内注射，使动物(通常是非人哺乳动物)针对抗原，免疫原性缀合物或衍生物进行免疫。一个月后，通过在多个位点处的皮下注射，用在弗氏完全佐剂中的1/5至1/10原有量的肽或缀合物对动物进行加强免疫。7至14天后，给动物放血并且测定血清的抗体效价。对动物进行加强免疫直至效价平台。优选地，用与不同蛋白缀合和/或通过不同的交联剂缀合的相同抗原的缀合物对动物进行加强免疫。缀合物也可以作为蛋白融合物在重组细胞培养物中制备。此外，聚集剂如明矾适用于增强免疫应答。
单克隆抗体获得自基本上均质的抗体群体，即，构成所述群体的个体抗体除了可能少量存在的可能的天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化，酰胺化)以外是相同的。因此，定语"单克隆"指示不作为分立的抗体的混合物的抗体特征。
例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤方法制备，所述方法首先由Kohler等，Nature256(5517):495-497(1975)描述。在杂交瘤方法中，小鼠或其他合适的宿主动物(如仓鼠)被如上文所述那样免疫以引起产生或能够产生与用于免疫的蛋白特异性结合的抗体的淋巴细胞。备选地，淋巴细胞可以在体外被免疫。
免疫试剂将典型地包括抗原蛋白或其融合变体。通常，如果需要人来源的细胞，则使用外周血淋巴细胞(PBL)，或如果需要非人哺乳动物来源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合试剂(如聚乙二醇)将淋巴细胞与永生的细胞系融合，从而形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press(1986),pp.59-103)。
永生细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类，牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。将因此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种并培养，所述培养基优选地含有一种或多种抑制非融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型地将包含次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，其是阻止HGPRT缺陷细胞生长的物质。
优选的永生化骨髓瘤细胞是那些细胞，所述细胞有效融合，支持所选择的抗体生产细胞稳定高水平的生产抗体，并且对培养基如HAT培养基敏感。其中，优选的是鼠骨髓瘤细胞系，如来源于可获得自Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California USA的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些，和可获得自美国模式培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，Virginia USA)的SP-2细胞(及其衍生物，例如，X63-Ag8-653)。人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系也被描述为用于生产人单克隆抗体(Kozbor等J.Immunol.133(6):3001-3005(1984)；Brodeur等,MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York,pp.51-63(1987))。
对于针对抗原的单克隆抗体的生产，测定培养杂交瘤细胞的培养基。优选地，由杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定，如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定。此种技术和测定是本领域中已知的。例如，结合亲和力可以通过Munson,Anal.Biochem.107(1):220-239(1980)的Scatchard分析确定。
在鉴定了产生具有所需特异性，亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，克隆可以通过有限稀释法被亚克隆并通过标准方法培养(Goding，同上)。适用于此目的的培养基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以作为肿瘤在哺乳动物中体内培养。
通过常规免疫球蛋白纯化方法如，例如，蛋白A-Sepharose，羟基磷灰石色谱，凝胶电泳，透析，或亲和色谱合适地将由亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基，腹水或血清分离。
抗体可以通过针对抗原免疫合适的宿主动物制备。在一个实施方案中，抗原是多肽，所述多肽包含全长肌肉生长抑制因子。在一个实施方案中，抗原是多肽，所述多肽包含潜伏性肌肉生长抑制因子。在一个实施方案中，抗原是多肽，所述多肽包含肌肉生长抑制因子前肽。在一个实施方案中，抗原是多肽，所述多肽包含对应于肌肉生长抑制因子前肽(SEQID NO:78)的位置21至100处的氨基酸的区域。在一个实施方案中，抗原是多肽，所述多肽包含肌肉生长抑制因子前肽(SEQ ID NO:78)的位置21-80，41-100，21-60，41-80，61-100，21-40，41-60，61-80，或81-100处的氨基酸。还包括在本发明中的是通过针对抗原免疫动物制备的抗体。所述抗体可以结合任何特征，单独地或组合地，如以上"示例性抗-肌肉生长抑制因子抗体"中所述。
Fc区可以通过以下方式获得：在使用蛋白酶如胃蛋白酶部分消化IgG1，IgG2，IgG3，IgG4单克隆抗体等后将吸附在蛋白A柱上的级分再洗脱。所述蛋白酶不受特别限制，只要其通过适当地设定酶反应条件如pH可以消化全长抗体从而以限制性的方式产生Fab和F(ab')2即可，并且实例包括胃蛋白酶和木瓜蛋白酶。
此外，本发明提供用于制备与包含亲本Fc区的多肽相比具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的包含变体Fc区的多肽的方法，所述方法包括将至少一个氨基酸改变引入至亲本Fc区。在一些方面，制备的多肽是抗体。在某些实施方案中，抗体是嵌合抗体或人源化抗体。在一些方面，制备的多肽是Fc融合蛋白。
在某些实施方案中，制备方法包括以下步骤：(a)准备包含亲本Fc区的多肽；(b)将至少一个氨基酸改变引入至多肽内的亲本Fc区；(c)测量包含亲本Fc区的多肽和步骤(b)中的包含Fc区的多肽的猴Fcγ RIIb-结合活性；和(d)选择与包含亲本Fc区的多肽相比具有增强的猴Fcγ RIIb-结合活性的包含变体Fc区的多肽。
在某些实施方案中，制备方法包括以下步骤：(a)准备包含亲本Fc区的多肽；(b)将至少一个氨基酸改变引入至多肽内的亲本Fc区；(c)测量包含亲本Fc区的多肽和步骤(b)中的包含Fc区的多肽的猴Fcγ RIIIa-结合活性；和(d)选择与包含亲本Fc区的多肽相比具有减小的猴Fcγ RIIIa-结合活性的包含变体Fc区的多肽。
在某些实施方案中，制备方法包括以下步骤：(a)准备包含亲本Fc区的多肽；(b)将至少一个氨基酸改变引入至多肽内的亲本Fc区；(c)测量包含亲本Fc区的多肽和步骤(b)中的包含Fc区的多肽的人Fcγ RIIb-结合活性；和(d)选择与包含亲本Fc区的多肽相比具有增强的人Fcγ RIIb-结合活性的包含变体Fc区的多肽。
在某些实施方案中，制备方法包括以下步骤：(a)准备包含亲本Fc区的多肽；(b)将至少一个氨基酸改变引入至多肽内的亲本Fc区；(c)测量包含亲本Fc区的多肽和步骤(b)中的包含Fc区的多肽的人Fcγ RIIIa-结合活性；和(d)选择与包含亲本Fc区的多肽相比具有减小的人Fcγ RIIIa-结合活性的包含变体Fc区的多肽。
在某些实施方案中，制备方法包括以下步骤：(a)准备包含亲本Fc区的多肽；(b)将至少一个氨基酸改变引入至多肽内的亲本Fc区；(c)测量包含亲本Fc区的多肽和步骤(b)中的包含Fc区的多肽的人Fcγ RIIa(H型)-结合活性；和(d)选择与包含亲本Fc区的多肽相比具有减小的人Fcγ RIIa(H型)-结合活性的包含变体Fc区的多肽。
在某些实施方案中，制备方法包括以下步骤：(a)准备包含亲本Fc区的多肽；(b)将至少一个氨基酸改变引入至多肽内的亲本Fc区；(c)测量包含亲本Fc区的多肽和步骤(b)中的包含Fc区的多肽的人Fcγ RIIa(R型)-结合活性；和(d)选择与包含亲本Fc区的多肽相比具有减小的人Fcγ RIIa(R型)-结合活性的包含变体Fc区的多肽。
在一个方面，在以上提及的用于制备包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中，选自以下的至少一个位置的至少一个氨基酸被改变：231、232、233、234、235、236、237、238、239、264、266、267、268、271、295、298、325、326、327、328、330、331、332、334和396(根据EU编号)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有食蟹猴Fcγ RIIb的序列(SEQ ID NO:223)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有人Fcγ RIIb的序列(例如，SEQ IDNO:212，213，或214)。
在另一个方面，在以上提及的用于制备包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中，一个在位置236处的氨基酸被改变。
在另一个方面，在以上提及的用于制备包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中，至少两个氨基酸被改变，所述改变包括：(a)位置236处的一个氨基酸改变，和(b)选自由以下组成的组的至少一个位置的至少一个氨基酸改变：231、232、233、234、235、237、238、239、264、266、267、268、271、295、298、325、326、327、328、330、331、332、334和396(根据EU编号)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有食蟹猴Fcγ RIIb的序列(SEQID NO:223)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有人Fcγ RIIb的序列(例如，SEQ ID NO:212，213，或214)。
在另一个方面，在以上提及的用于制备包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中，至少两个氨基酸被改变，所述改变包括：(a)位置236处的一个氨基酸改变，和(b)选自由以下组成的组的至少一个位置的至少一个氨基酸改变：231、232、235、239、268、295、298、326、330和396(根据EU编号)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有食蟹猴Fcγ RIIb的序列(SEQ ID NO:223)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有人Fcγ RIIb的序列(例如，SEQ ID NO:212，213，或214)。
在另一个方面，在以上提及的用于制备包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中，至少两个氨基酸被改变，所述改变包括：(a)位置236处的一个氨基酸改变，和(b)选自由以下组成的组的至少一个位置的至少一个氨基酸改变：268、295、326和330(根据EU编号)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有食蟹猴Fcγ RIIb的序列(SEQ IDNO:223)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有人Fcγ RIIb的序列(例如，SEQ ID NO:212，213，或214)。
在另一个方面，在以上提及的用于制备包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中，以下(1)-(37)中任一的位置处的氨基酸被改变：(1)在位置231，236，239，268和330处；(2)在位置231，236，239，268，295和330处；(3)在位置231，236，268和330处；(4)在位置231，236，268，295和330处；(5)在位置232，236，239，268，295和330处；(6)在位置232，236，268，295和330处；(7)在位置232，236，268和330处；(8)在位置235，236，268，295，326和330处；(9)在位置235，236，268，295和330处；(10)在位置235，236，268和330处；(11)在位置235，236，268，330和396处；(12)在位置235，236，268和396处；(13)在位置236，239，268，295，298和330处；(14)在位置236，239，268，295，326和330处；(15)在位置236，239，268，295和330处；(16)在位置236，239，268，298和330处；(17)在位置236，239，268，326和330处；(18)在位置236，239，268和330处；(19)在位置236，239，268，330和396处；(20)在位置236，239，268和396处；(21)在位置236和268处；(22)在位置236，268和295处；(23)在位置236，268，295，298和330处；(24)在位置236，268，295，326和330处；(25)在位置236，268，295，326，330和396处；(26)在位置236，268，295和330处；(27)在位置236，268，295，330和396处；(28)在位置236，268，298和330处；(29)在位置236，268，298和396处；(30)在位置236，268，326和330处；(31)在位置236，268，326，330和396处；(32)在位置236，268和330处；(33)在位置236，268，330和396处；(34)在位置236，268和396处；(35)在位置236和295处；(36)在位置236，330和396处；和(37)在位置236和396处(根据EU编号)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有食蟹猴Fcγ RIIb的序列(SEQ ID NO:223)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有人Fcγ RIIb的序列(例如，SEQ ID NO:212，213，或214)。
在另一个方面，在以上提及的用于制备包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中，在来自由以下组成的组的每个位置处选择氨基酸改变：(a)位置231处的Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr；(b)位置232处的Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr；(c)位置233处的Asp；(d)位置234处的Trp、Tyr；(e)位置235处的Trp；(f)位置236处的Ala、Asp、Glu、His、Ile、Leu、Met、Asn、Gln、Ser、Thr、Val；(g)位置237处的Asp、Tyr；(h)位置238处的Glu、Ile、Met、Gln、Tyr；(i)位置239处的Ile、Leu、Asn、Pro、Val；(j)位置264处的Ile；(k)位置266处的Phe；(l)位置267处的Ala、His、Leu；(m)位置268处的Asp、Glu；(n)位置271处的Asp、Glu、Gly；(o)位置295处的Leu；(p)位置298处的Leu；(q)位置325处的Glu、Phe、Ile、Leu；(r)位置326处的Thr；(s)位置327处的Ile、Asn；(t)位置328处的Thr；(u)位置330处的Lys、Arg；(v)位置331处的Glu；(w)位置332处的Asp；(x)位置334处的Asp、Ile、Met、Val、Tyr；和(y)位置396处的Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr(根据EU编号)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有食蟹猴Fcγ RIIb的序列(SEQ ID NO:223)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有人Fcγ RIIb的序列(例如，SEQ ID NO:212，213，或214)。
在另一个方面，在以上提及的用于制备包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中，在来自由以下组成的组的每个位置处选择氨基酸改变：(a)位置231处的Gly、Thr；(b)位置232处的Asp；(c)位置235处的Trp；(d)位置236处的Asn、Thr；(e)位置239处的Val；(f)位置268处的Asp、Glu；(g)位置295处的Leu；(h)位置298处的Leu；(i)位置326处的Thr；(j)位置330处的Lys、Arg，和(k)位置396处的Lys、Met(根据EU编号)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有食蟹猴Fcγ RIIb的序列(SEQ ID NO:223)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有人Fcγ RIIb的序列(例如，SEQ ID NO:212，213，或214)。
在另一个方面，以上提及的用于制备包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中的氨基酸改变是：位置236处的Asn，位置268处的Glu，位置330处的Lys，和位置396处的Met(根据EU编号)。在另一个方面，以上提及的用于制备包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中的氨基酸改变是：位置236处的Asn，位置268处的Asp，和位置330处的Lys(根据EU编号)。在另一个方面，以上提及的用于制备包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中的氨基酸改变是：位置236处的Asn，位置268处的Asp，位置295处的Leu，和位置330处的Lys(根据EU编号)。在另一个方面，以上提及的用于制备包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中的氨基酸改变是：位置236处的Thr，位置268处的Asp，和位置330处的Lys(根据EU编号)。在另一个方面，以上提及的用于制备包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中的氨基酸改变是：位置236处的Asn，位置268处的Asp，位置295处的Leu，位置326处的Thr，和位置330处的Lys(根据EU编号)。在另一个方面，以上提及的用于制备包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中的氨基酸改变是：位置235处的Trp，位置236处的Asn，位置268处的Asp，位置295处的Leu，位置326处的Thr，和位置330处的Lys(根据EU编号)。
在一个方面，在以上提及的用于制备包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中，选自由以下组成的组的至少一个位置的至少一个氨基酸被改变：234，238，250，264，267，307，和330(根据EU编号)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有食蟹猴Fcγ RIIb的序列(SEQ ID NO:223)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有人Fcγ RIIb的序列(例如，SEQ ID NO:212，213，或214)。
在另一个方面，在以上提及的用于制备包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中，位置238处的一个氨基酸被改变。
在另一个方面，在以上提及的用于制备包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中，至少两个氨基酸被改变，所述改变包括：(i)位置238处的一个氨基酸改变，和(ii)选自由以下组成的组的至少一个位置的至少一个氨基酸改变：234，250，264，267，307，和330(根据EU编号)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有食蟹猴Fcγ RIIb的序列(SEQ ID NO:223)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有人Fcγ RIIb的序列(例如，SEQID NO:212，213，或214)。
在另一个方面，在以上提及的用于制备包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中，以下(1)-(9)中任一的位置处的氨基酸被改变：(1)在位置234，238，250，307和330处；(2)在位置234，238，250，264，307和330处；(3)在位置234，238，250，264，267，307和330处；(4)在位置234，238，250，267，307和330处；(5)在位置238，250，264，307和330处；(6)在位置238，250，264，267，307和330处；(7)在位置238，250，267，307和330处；(8)在位置238，250和307处；和(9)在位置238，250，307和330处(根据EU编号)。
在另一个方面，在以上提及的用于制备包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中，在来自由以下组成的组的每个位置处选择氨基酸改变：(a)位置234处的Tyr；(b)位置238处的Asp；(c)位置250处的Val；(d)位置264处的Ile；(e)位置267处的Ala；(f)位置307处的Pro；和(g)位置330处的Lys(根据EU编号)。在另一个方面，以上提及的用于制备包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中的氨基酸改变是：位置238处的Asp(根据EU编号)。在另一个方面，以上提及的用于制备包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中的氨基酸改变是：位置238处的Asp，位置250处的Val，和位置307处的Pro(根据EU编号)。在另一个方面，以上提及的用于制备包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中的氨基酸改变是：位置238处的Asp，位置250处的Val，位置307处的Pro，和位置330处的Lys(根据EU编号)。在另一个方面，以上提及的用于制备包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中的氨基酸改变是：位置238处的Asp，位置250处的Val，位置264处的Ile，位置307处的Pro，和位置330处的Lys(根据EU编号)。在另一个方面，以上提及的用于制备包含具有增强的FcγRIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中的氨基酸改变是：位置238处的Asp，位置250处的Val，位置267处的Ala，位置307处的Pro，和位置330处的Lys(根据EU编号)。在另一个方面，以上提及的用于制备包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中的氨基酸改变是：位置234处的Tyr，位置238处的Asp，位置250处的Val，位置307处的Pro，和位置330处的Lys(根据EU编号)。在另一个方面，以上提及的用于制备包含具有增强的FcγRIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中的氨基酸改变是：位置234处的Tyr，位置238处的Asp，位置250处的Val，位置267处的Ala，位置307处的Pro，和位置330处的Lys(根据EU编号)。在另一个方面，以上提及的用于制备包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中的氨基酸改变是：位置238处的Asp，位置250处的Val，位置264处的Ile，位置267处的Ala，位置307处的Pro，和位置330处的Lys(根据EU编号)。在另一个方面，以上提及的用于制备包含具有增强的FcγRIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中的氨基酸改变是：位置234处的Tyr，位置238处的Asp，位置250处的Val，位置264处的Ile，位置307处的Pro，和位置330处的Lys(根据EU编号)。在另一个方面，以上提及的用于制备包含具有增强的Fcγ RIIb-结合活性的变体Fc区的多肽的方法中的氨基酸改变是：位置234处的Tyr，位置238处的Asp，位置250处的Val，位置264处的Ile，位置267处的Ala，位置307处的Pro，和位置330处的Lys(根据EU编号)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有食蟹猴Fcγ RIIb的序列(SEQ ID NO:223)。在某些实施方案中，Fcγ RIIb具有人Fcγ RIIb的序列(例如，SEQ IDNO:212，213，或214)。
此外，本发明提供用于制备与包含亲本Fc区的多肽相比具有提高的pI的包含变体Fc区的多肽的方法，所述方法包括将至少两个氨基酸改变引入至亲本Fc区。
在某些实施方案中，用于制备本文中所述的包含变体Fc区的多肽的制备方法包括以下步骤：(a)准备包含亲本Fc区的多肽；(b)将至少两个氨基酸改变引入至多肽内的亲本Fc区；(c)测量包含亲本Fc区的多肽和步骤(b)中的包含Fc区的多肽的pI；和(d)选择与相应的包含亲本Fc区的多肽相比具有提高的pI的包含变体Fc区的多肽。
在一个方面，在以上提及的用于制备具有提高的pI的包含变体Fc区的多肽的方法中，选自以下的至少两个位置的至少两个氨基酸被改变：285、311、312、315、318、333、335、337、341、342、343、384、385、388、390、399、400、401、402、413、420、422和431(根据EU编号)。在另一个方面，制备的多肽包含具有提高的pI的变体Fc区，选自以下的至少两个位置：311，341，343，384，399，400，401，402，和413(根据EU编号)。
在另一个方面，在以上提及的用于制备具有提高的pI的包含变体Fc区的多肽的方法中，以下(1)-(10)中任一的位置处的氨基酸被改变：(1)在位置311和341处；(2)在位置311和343处；(3)在位置311，343和413处；(4)在位置311，384和413处；(5)在位置311和399处；(6)在位置311和401处；(7)在位置311和413处；(8)在位置400和413处；(9)在位置401和413处；和(10)在位置402和413处(根据EU编号)。
在另一个方面，以上提及的用于制备具有提高的pI的包含变体Fc区的多肽的方法中的氨基酸改变是：位置400处的Arg和位置413处的Lys(根据EU编号)。在另一个方面，以上提及的用于制备具有提高的pI的包含变体Fc区的多肽的方法中的氨基酸改变是：位置311处的Arg和位置413处的Lys(根据EU编号)。在另一个方面，以上提及的用于制备具有提高的pI的包含变体Fc区的多肽的方法中的氨基酸改变是：位置311处的Arg和位置399处的Arg(根据EU编号)。在另一个方面，以上提及的用于制备具有提高的pI的包含变体Fc区的多肽的方法中的氨基酸改变是：位置311处的Arg和位置343处的Arg(根据EU编号)。在另一个方面，以上提及的用于制备具有提高的pI的包含变体Fc区的多肽的方法中的氨基酸改变是：位置311处的Arg和位置413处的Arg(根据EU编号)。在另一个方面，以上提及的用于制备具有提高的pI的包含变体Fc区的多肽的方法中的氨基酸改变是：位置311处的Arg，位置343处的Arg，和位置413处的Arg(根据EU编号)。在另一个方面，以上提及的用于制备具有提高的pI的包含变体Fc区的多肽的方法中的氨基酸改变是：位置311处的Arg，位置384处的Arg，和位置413处的Arg(根据EU编号)。
在另一个方面，以上提及的用于制备具有提高的pI的包含变体Fc区的多肽的方法中的氨基酸改变选自每个位置处的Lys或Arg。
在另一个方面，以上提及的制备方法中的氨基酸改变选自表14-30中所述的任意单个改变，单个改变的组合，或组合改变。
任选地，当多肽还包含抗原结合结构域时，以上提及的用于制备包含变体Fc区的多肽的方法中可以包括以下额外的步骤：(e)在动物如小鼠，大鼠，兔，狗，猴和人中施用包含亲本Fc区的多肽和包含变体Fc区的多肽后，评估血浆中抗原的药物动力学；和(f)选择与包含亲本Fc区的多肽相比具有增强的从血浆消除抗原的能力的包含变体Fc区的多肽。
通过任一以上提及的方法或本领域中已知的其他方法制备的包含变体Fc区的多肽包括在本发明中。
C.测定
通过本领域已知的多种测定可以鉴定、筛选本文中提供的抗-肌肉生长抑制因子抗体或表征其物理/化学性质和/或生物学活性。
通过本文中描述的或本领域中已知的多种测定可以鉴定、筛选本文中提供的变体Fc区或表征其物理/化学性质和/或生物学活性。
1.结合测定和其他测定
在一个方面，通过已知方法如ELISA，蛋白质印迹，BIACORE(注册商标)等来测试本发明的抗体的抗原结合活性。在一个方面，通过已知方法如BIACORE(注册商标)等来测试包含本发明的变体Fc区的多肽的Fc受体结合活性。
在另一个方面，竞争测定可以用于鉴定与本文中所述的任何抗-肌肉生长抑制因子抗体竞争结合肌肉生长抑制因子的抗体。在某些实施方案中，当此种竞争抗体过量存在时，其阻断(例如，减少)参比抗体与肌肉生长抑制因子的结合达至少10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％或更高。在一些情况中，结合被抑制达至少80％，85％，90％，95％或更高。在某些实施方案中，此种竞争抗体结合的表位(例如，线性或构象表位)与本文中所述的抗-肌肉生长抑制因子抗体(例如，表2a、11a或13中所述的抗-肌肉生长抑制因子抗体)结合的表位相同。在另外的方面，参比抗体具有表2a，11a，或13中描述的VH和VL对。用于将抗体结合的表位作图的详细的示例性方法提供在Morris(1996)"Epitope Mapping Protocols,"于Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中。
在示例性竞争测定中，将固定的潜伏性肌肉生长抑制因子或肌肉生长抑制因子前肽在溶液中孵育，所述溶液包含第一标记的抗体和第二未标记的抗体，所述第一标记的抗体结合肌肉生长抑制因子，测试所述第二未标记的抗体与第一抗体竞争结合肌肉生长抑制因子的能力。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定的肌肉生长抑制因子在包含第一标记的抗体但不包含第二未标记的抗体的溶液中孵育。在允许第一抗体与肌肉生长抑制因子结合的条件下孵育后，除去过量的未结合的抗体，并测量与固定的肌肉生长抑制因子结合的标记的量。如果相对于对照样品，在测试样品中，与固定的肌肉生长抑制因子结合的标记的量显著减少，则这指示第二抗体与第一抗体竞争结合肌肉生长抑制因子。参见，Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
用于确定包含变体Fc区的多肽对一个或多个Fcγ R家族成员的结合活性的测定在本文中被描述或是本领域中已知的。此种结合测定包括但不限于利用表面等离子共振(SPR)现象的BIACORE(注册商标)分析，放大发光接近均质测定(Amplified LuminescentProximity Homogeneous Assay)(ALPHA)筛选，ELISA，和荧光活化细胞分选(FACS)(Lazar等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11):4005-4010)。
在一个实施方案中，BIACORE(注册商标)分析可以用于评估关于特定的Fcγ R家族成员包含变体Fc区的多肽的结合活性是否被增强，或保持或减弱。例如，通过观察获自感应图分析的解离常数(KD)值是否减小或增加，其中多种Fcγ R作为分析物与使用已知方法和试剂如蛋白A，蛋白L，蛋白A/G，蛋白G，抗-λ链抗体，抗-κ链抗体，抗原肽，抗原蛋白)固定或捕获在传感器芯片上的包含变体Fc区的多肽进行相互作用。结合活性的改变也可以通过比较一种或多种Fcγ R作为分析物与捕获的包含变体Fc区的多肽进行相互作用之前和之后感应图上共振单位(RU)值的变化来确定。备选地，Fcγ R可以被固定或捕获在传感器芯片上，并且包含变体Fc区的多肽被用作分析物。
在BIACORE(注册商标)分析中，在相互作用的观察中，将所述物质之一(配体)固定在传感器芯片上的金薄膜上，并且通过自传感器芯片的反侧发光从而使得全反射都发生在金薄膜和玻璃之间的界面处，减小的反射强度的一部分部分由反射的光形成(SPR信号)。当使得相互作用观察中的另一物质(分析物)在传感器芯片表面流动并且配体结合分析物时，固定的配体分子的质量增加并且传感器芯片表面上的溶剂的折射率改变。SPR信号的位置随着折射率的此种改变而移位(另一方面，当该结合解离时，信号位置返回)。BIACORE(注册商标)系统指示以上提及的移位的量，或更具体地通过将传感器芯片表面上的质量变化在坐标上作图指示质量的时间变量作为测量数据(感应图)。与传感器芯片表面上捕获的配体结合的分析物的量由感应图确定。动力学参数如结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)由感应图曲线确定，并且解离常数(KD)由这些常数之比确定。在BIACORE(注册商标)方法中，优选使用用于测量抑制的方法。用于测量抑制的方法的实例描述于Lazar等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(11):4005-4010(2006)中。
筛选通过ALPHA技术进行，所述技术基于以下原则利用两种小珠，供体和受体。仅当与供体小珠结合的分子和与受体小珠结合的分子物理相互作用，并且两种小珠彼此紧邻时，检测到发光信号。供体小珠中激光激发的光敏剂将周围的氧转化为激发态的单态(singlet)氧。单态氧分散在整个供体小珠上，并且当其碰到邻近的受体小珠时，在小珠中引起化学发光反应，并且最终发出光来。当与供体小珠结合的分子不和与受体小珠结合的分子相互作用时，不发生化学发光反应，因为由供体小珠产生的单态氧碰不到受体小珠。
例如，将生物素化的多肽复合物与供体小珠结合，并将带有谷胱甘肽S转移酶(GST)标签的Fcγ受体与受体小珠连接。在不存在包含变体Fc区的竞争多肽复合物的情况下，包含亲本Fc区的多肽复合物与Fcγ受体相互作用并且产生520-620nm信号。包含不带标签的变体Fc区的多肽复合物与包含亲本Fc区的多肽复合物竞争与Fcγ受体的相互作用。相对结合活性可以通过量化观察到的竞争所致的荧光的减少来确定。使用Sulfo-NHS-生物素等的多肽复合物如抗体的生物素化是已知的。在带有通过将编码Fcγ受体的多核苷酸与编码GST的多核苷酸同框融合在可表达载体中制备的融合基因的细胞中表达Fcγ受体和GST，并且使用谷胱甘肽柱进行纯化的方法被合适地用作用于使Fcγ受体具有GST标签的方法。获得的信号优选地通过例如以下方式被分析：将其拟合为单点竞争模型，其使用非线性回归分析，使用软件如GRAPHPAD PRISM(GraphPad，San Diego)。
具有减小的Fcγ R-结合活性的变体Fc区是指这样的Fc区，其结合FcγR的结合活性比亲本Fc区显著更弱(当使用基本上相同量的相应的亲本Fc区和变体Fc区进行测定时)。此外，具有增强的Fcγ R-结合活性的变体Fc区是指这样的Fc区，其结合Fcγ R的结合活性比相应的亲本Fc区显著更强(当使用基本上相同量的相应的亲本Fc区和变体Fc区进行测定时)。具有保持的Fcγ R-结合活性的变体Fc区是指这样的Fc区，其结合Fcγ R的结合活性与亲本Fc区的结合活性相同或没有显著不同(当使用基本上相同量的相应的亲本Fc区和变体Fc区进行测定时)。
Fc区对不同Fcγ R的结合活性是否增强或减弱可以由不同Fcγ R与Fc区的结合的量的增加或减少来确定，所述量的增加或减少根据以上提及的测量方法来确定。此处，不同Fcγ R与Fc区的结合的量可以被评估为通过将作为分析物的不同Fcγ R与Fc区相互作用之前和之后改变的感应图的RU值之差除以将Fc区捕获至传感器芯片之前和之后改变的感应图的RU值之差获得的值。
在本发明中，增强的Fcγ RIIb-结合活性优选地表示，例如，在通过以上提及的测量方法测量的KD值中[亲本Fc区对Fcγ RIIb的KD值]/[变体Fc区对Fcγ RIIb的KD值]之比优选地变成2.0以上，3.0以上，4.0以上，5.0以上，6.0以上，7.0以上，8.0以上，9.0以上，10以上，15以上，20以上，25以上，30以上，35以上，40以上，45以上，或甚至50以上，55以上，60以上，65以上，70以上，75以上，80以上，85以上，90以上，95以上，或100以上。
本文中所述的变体Fc区对Fcγ RIIb的KD值(mol/L)优选地小于亲本Fc区对FcγRIIb的KD值，并且可以为，例如，2.0x10-6M以下，1.0x10-6M以下，9.0x10-7M以下，8.0x10-7M以下，7.0x10-7M以下，6.0x10-7M以下，5.0x10-7M以下，4.0x10-7M以下，3.0x10-7M以下，2.0x10- 7M以下，1.0x10-7M以下，9.0x10-8M以下，8.0x10-8M以下，7.0x10-8M以下，6.0x10-8M以下，5.0x10-8M以下。
此外，对Fcγ RIIb的结合选择性比对Fcγ RIIa增加的变体Fc区是指这样的Fc区，其中：(a)Fcγ RIIb-结合活性增强，并且Fcγ RIIa-结合活性保持或减弱；(b)FcγRIIb-结合活性增强并且Fcγ RIIa-结合活性也增强，但是Fcγ RIIa-结合活性增强的程度小于Fcγ RIIb-结合活性增强的程度；或(c)Fcγ RIIb-结合活性减弱并且Fcγ RIIa-结合活性也减弱，但是Fcγ RIIb-结合活性减弱的程度小于Fcγ RIIa-结合活性减弱的程度。变体Fc区是否对FcγRIIb而不是Fcγ RIIa具有提高的结合选择性可以例如通过将根据以上提及的实例确定的变体Fc区的对Fcγ RIIa的KD值与对Fcγ RIIb的KD值之比([变体Fc区对Fcγ RIIa的KD值]/[变体Fc区对Fcγ RIIb的KD值]之比)与亲本Fc区的对FcγRIIa的KD值与对Fcγ RIIb的KD值之比([亲本Fc区对Fcγ RIIa的KD值]/[亲本Fc区对FcγRIIb的KD值]之比)比较来确定。具体地，当变体Fc区的KD比大于亲本Fc区的KD比时，可以确定，与亲本Fc区相比，变体Fc区对Fcγ RIIb而不是Fcγ RIIa具有提高的结合选择性。尤其是在人中，Fcγ RIIb-结合活性可能与对Fcγ RIIa(R型)的结合活性相关而不是与对FcγRIIa(H型)的结合活性相关，因为Fcγ RIIb的氨基酸序列与Fcγ RIIa(R型)的同一性比与Fcγ RIIa(H型)的同一性高。因此，发现可以使对人Fcγ RIIb的结合选择性相比于对人Fcγ RIIa(R型)的结合选择性增强的氨基酸改变对于使人中的对Fcγ RIIb的结合选择性相比于对Fcγ RIIa的结合选择性增强是重要的。
当本发明的变体Fc区与亲本Fc区相比具有更高的针对Fcγ RIIb的结合活性和更低的针对Fcγ RIII(如Fcγ RIIIa或Fcγ RIIIb)的结合活性时，可以说所述变体Fc区是Fcγ RIIb特异性的。
2.活性测定
在一个方面，提供测定用于鉴定具有生物学活性的抗-肌肉生长抑制因子抗体。生物学活性可以包括，例如，抑制肌肉生长抑制因子的活化，阻断成熟肌肉生长抑制因子从潜伏性肌肉生长抑制因子的释放，抑制潜伏性肌肉生长抑制因子的蛋白水解切割，阻断蛋白酶接近潜伏性肌肉生长抑制因子等。还提供在体内和/或体外具有所述生物学活性的抗体。在某些实施方案中，测试本发明的抗体的所述生物学活性。
在某些实施方案中，测试抗体是否抑制潜伏性肌肉生长抑制因子的切割通过在存在或不存在测试抗体的情况下将可以切割潜伏性肌肉生长抑制因子的蛋白酶与潜伏性肌肉生长抑制因子接触后使用本领域中已知的方法如电泳，色谱法，免疫印迹分析，酶联免疫吸附测定(ELISA)或质谱法检测潜伏性肌肉生长抑制因子的切割产物(肌肉生长抑制因子)来确定(参见，例如，Thies等,Growth Factors 18(4):251-259(2001))。当在存在测试抗体的情况下(或在与其接触后)检测到潜伏性肌肉生长抑制因子(例如，人肌肉生长抑制因子前肽)的切割产物的量减少时，测试抗体被鉴定为是可以抑制潜伏性肌肉生长抑制因子的切割的抗体。在某些实施方案中，测试抗体是否阻断蛋白酶接近潜伏性肌肉生长抑制因子通过用于检测蛋白酶和潜伏性肌肉生长抑制因子之间的蛋白相互作用的方法来确定，所述方法例如ELISA或BIACORE(注册商标)。当在存在测试抗体的情况下(或在与其接触后)检测到蛋白酶和潜伏性肌肉生长抑制因子之间的相互作用减小时，测试抗体被鉴定为是可以阻断蛋白酶接近潜伏性肌肉生长抑制因子的抗体。
在某些实施方案中，测试抗体是否阻断成熟肌肉生长抑制因子从潜伏性肌肉生长抑制因子的释放通过检测成熟肌肉生长抑制因子活性，例如，与肌肉生长抑制因子受体结合的活性，或介导表达肌肉生长抑制因子受体(例如，ActRIIb)的细胞中的信号转导的活性来确定。可用于所述测定的细胞可以是表达内源性肌肉生长抑制因子受体的那些，例如，L6肌细胞，或可以是被瞬时或稳定地遗传修饰从而表达编码肌肉生长抑制因子受体(例如，激活蛋白受体如激活蛋白II型受体)的转基因的那些(Thies等，同上)。肌肉生长抑制因子与肌肉生长抑制因子受体的结合可以使用受体结合测定检测。肌肉生长抑制因子介导的信号转导可以在信号转导途径中的任何水平检测，例如，通过检测Smad多肽的磷酸化，检测肌肉生长抑制因子调节基因(包括报告基因)的表达，或测量肌肉生长抑制因子依赖性细胞的增殖。当在存在测试抗体的情况下(或在与其接触后)检测到成熟肌肉生长抑制因子活性减小时，测试抗体被鉴定为是可以阻断成熟肌肉生长抑制因子从潜伏性肌肉生长抑制因子的释放的抗体。
肌肉生长抑制因子活化的抑制也可以使用实施例中描述和例示的方法来检测和/或测量。使用这些或其他合适的类型的测定，可以筛选能够抑制肌肉生长抑制因子的活化的测试抗体。在某些实施方案中，肌肉生长抑制因子活化的抑制包括与在类似条件下的阴性对照相比测定中肌肉生长抑制因子活化减少至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％或40％以上。在一些实施方案中，其是指至少45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％以上的肌肉生长抑制因子活化的抑制。
在另一个方面，提供用于鉴定与肌肉生长抑制因子形成免疫复合物(即，抗原-抗体复合物)的抗-肌肉生长抑制因子抗体的测定。还提供在体内和/或体外具有所述生物学活性的抗体。
在某些实施方案中，测试本发明的抗体的所述生物学活性。
在某些实施方案中，免疫复合物的形成通过方法如尺寸排阻(凝胶过滤)色谱法，超速离心，光散射，电子显微镜或质谱来评估(Mol.Immunol.39:77-84(2002),Mol.Immunol.47:357-364(2009))。这些方法利用的性质是免疫复合物是比单独的抗体或单独的抗原更大的分子。当在存在测试抗体和抗原的情况下检测到含两个以上抗体和两个以上抗原(例如，肌肉生长抑制因子分子)的大复合物时，测试抗体被鉴定为是可以形成含两个以上抗体和两个以上肌肉生长抑制因子分子的免疫复合物的抗体。在另一个实施方案中，免疫复合物的形成通过方法如ELISA，FACS或SPR(表面等离子共振测定；例如，使用BIACORE(注册商标))评估(Shields等,J.Biol.Chem.276(9):6591-6604(2001)；Singh等,J.Immunol.Methods 50:109-114(1982)；Suzuki等,J.Immunol.184(4):1968-1976(2010)；Luo等,mAbs 1(5):491-504(2009))。这些方法利用的性质是含两个以上抗体和两个以上抗原的免疫复合物可以比单独的抗体或抗原更强烈地结合Fc受体或补体组分。当在存在测试抗体和抗原两者的情况下检测到的与Fc受体或补体组分的结合比在存在单独的抗体的情况下增加时，测试抗体被鉴定为是可以形成含两个以上抗体和两个以上肌肉生长抑制因子分子的免疫复合物的抗体。在另一个实施方案中，免疫复合物的形成通过向动物(例如，小鼠)施用测试抗体并测量抗原从血浆的清除来评估。如上所述，预期形成含两个以上抗体和两个以上抗原的免疫复合物的抗体加速抗原从血浆的消除。因此，当在施用测试抗体的小鼠中观察到的肌肉生长抑制因子从血浆的消除相比于施用参比抗体的小鼠加速时，测试抗体被鉴定为是可以比参比抗体更有效地形成含两个以上抗体和两个以上肌肉生长抑制因子分子的免疫复合物的抗体。
D.免疫缀合物
在一些实施方案中，本发明提供免疫缀合物，所述免疫缀合物包含本文中的抗-肌肉生长抑制因子抗体，所述抗体缀合于一种或多种细胞毒性剂如化疗剂或药物，生长抑制剂，毒素(例如，蛋白毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素。
在一些实施方案中，本发明提供免疫缀合物，所述免疫缀合物包含本文中的包含变体Fc区的多肽，所述多肽缀合于一种或多种细胞毒性剂如化疗剂或药物，生长抑制剂，毒素(例如，蛋白毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体缀合于一种或多种药物，包括但不限于美坦生类化合物(参见美国专利号5,208,020，5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235B1)；auristatin如单甲基auristatin药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利号5,635,483和5,780,588，和7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见美国专利号5,712,374，5,714,586，5,739,116，5,767,285，5,770,701，5,770,710，5,773,001和5,877,296；Hinman等,Cancer Res.53:3336-3342(1993)；和Lode等,Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环类抗生素(anthracycline)如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(参见Kratz等,Current Med.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等,Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362(2006)；Torgov等,Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000)；Dubowchik等,Bioorg.&Med.Chem.Letters12:1529-1532(2002)；King等,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；和美国专利号6,630,579)；甲氨蝶呤(methotrexate)；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)如多西他赛(docetaxel)，紫杉醇(paclitaxel)，拉罗他赛(larotaxel)，替司他赛(tesetaxel)和奥他赛(ortataxel)；新月毒素(trichothecene)；和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含本文中所述的抗体，所述抗体缀合于酶活性毒素或其片段，包括但不限于白喉A链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))，蓖麻毒素A链，相思子毒素A链，蒴莲根毒素A链，α-八叠球菌，油桐(Aleurites fordii)蛋白，石竹素(dianthin)蛋白，美洲商陆(PhytolacaAmericana)蛋白(PAPI，PAPII和PAP-S)，苦瓜(momordica charantia)抑制剂，麻风树毒蛋白，巴豆毒蛋白，肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂，白树毒素，丝林霉素(mitogellin)，局限曲菌素，酚霉素，依诺霉素，和单胞霉烯族毒素(tricothecene)。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含如本文中所述的抗体，所述抗体缀合于放射性原子从而形成放射性缀合物。多种放射性同位素可用于制备放射性缀合物。实例包括At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，其可以包含放射性原子用于闪烁法研究，例如tc99m或I123，或自旋标记用于核磁共振(NMR)成像(也被称为磁共振成像，mri)，如碘-123(再一次)，碘-131，铟-111，氟-19，碳-13，氮-15，氧-17，钆，锰和铁。
抗体和细胞毒性剂的缀合物可以使用多种双功能蛋白偶联剂制备，所述偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷盐酸盐(IT)，亚胺基酯的双功能衍生物(如二甲基己二酸HCl)，活性酯(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)，醛(如戊二醛)，二叠氮基化合物(如二(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)，二-重氮基衍生物(如二-(对重氮基苯甲酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)，和二-活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素可以如Vitetta等,Science 238:1098(1987)中所述制备。碳-14-标记的1-异硫氰酰苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核素缀合至抗体的示例性螯合剂。参见WO1994/11026。接头可以是"可切割的接头"，其助力于细胞中细胞毒性药物的释放。例如，可以使用酸不稳定接头，肽酶敏感性接头，光不稳定接头，二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等,Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
本文中的免疫缀合物或ADC明确考虑，但不限于此种利用交联剂试剂制备的缀合物，所述交联剂包括，但不限于，BMPS，EMCS，GMBS，HBVS，LC-SMCC，MBS，MPBH，SBAP，SIA，SIAB，SMCC，SMPB，SMPH，硫代-EMCS，硫代-GMBS，硫代-KMUS，硫代-MBS，硫代-SIAB，硫代-SMCC和硫代-SMPB，和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，其是市售的(例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。
E.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文中提供的任一抗-肌肉生长抑制因子抗体都可用于检测生物学样品中肌肉生长抑制因子的存在。如本文中使用的，术语"检测"包括定量检测或定性检测。在某些实施方案中，生物学样品包括细胞或组织，如血清，全血，血浆，活检样品，组织样品，细胞悬液，唾液，痰，口腔液，脑脊液，羊水，腹水，乳汁，初乳，乳腺分泌，淋巴液，尿液，汗液，泪液，胃液，滑液，腹膜液，眼晶状体液或黏液。
在一个实施方案中，提供用于诊断或检测方法的抗-肌肉生长抑制因子抗体。在另一个方面，提供检测潜伏性肌肉生长抑制因子或肌肉生长抑制因子前肽在生物学样品中存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括使生物学样品与如本文中所述的抗-肌肉生长抑制因子抗体在允许抗-肌肉生长抑制因子抗体结合肌肉生长抑制因子的条件下接触，并且检测在抗-肌肉生长抑制因子抗体和肌肉生长抑制因子之间是否形成复合物。此种方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，将抗-肌肉生长抑制因子抗体用于选择适合于利用抗-肌肉生长抑制因子抗体治疗的受试者，例如，其中肌肉生长抑制因子是用于选择患者的生物标志物。
在某些实施方案中，提供标记的抗-肌肉生长抑制因子抗体。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(如荧光，发色团，电子密度，化学发光，和放射性标记)，以及间接检测的部分如酶或配体，例如，通过酶反应或分子相互作用。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P，14C，125I，3H，和131I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰，伞形酮，荧光素酶，例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)，萤光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，例如，葡糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，与利用过氧化氢的酶偶联以氧化染料前体如HRP，乳糖过氧化物酶，或微过氧化物酶，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基等。
F.药物制剂
如本文中所述的抗-肌肉生长抑制因子抗体的药物制剂通过将具有所需程度的纯度的所述抗体与一种或多种任选的药用载体(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.Ed.(1980))混合而被制备成冻干制剂或水溶液的形式。
如本文中所述的包含变体Fc区的多肽的药物制剂通过将具有所需程度的纯度的所述多肽与一种或多种任选的药用载体混合而被制备成冻干制剂或水溶液的形式。
药用载体在使用的剂量和浓度下对于接受者通常是无毒性的，并且包括，但不限于：缓冲剂如磷酸盐，柠檬酸盐，和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚，丁基或苄基醇；烷基对羟苯甲酸酯如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基的)多肽；蛋白，如血清清蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷酰胺，天冬氨酸，组氨酸，精氨酸，或赖氨酸；单糖，二糖，和其他碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性药用载体还包括间质药物分散剂如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(HYLENEX(注册商标)，Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20，被描述于美国公布号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
示例性冻干的抗体制剂被描述于美国专利号6,267,958中。含水抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些，后者的制剂包含组氨酸-乙酸缓冲液。
当需要时，本文中的制剂还可以含有超过一种用于治疗的特定适应证的活性成分，优选地具有相互之间没有不利影响的互补活性的那些。此种活性成分合适地以对目的用途有效的量存在于组合中。
活性成分可以被包封在例如通过凝聚技术或通过分别界面聚合例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊制备的微胶囊中，在胶体药物递送系统(例如，脂质体，清蛋白微球，微乳液，纳米粒和纳米胶囊)中或在粗乳液中。此种技术被公开在Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.Ed.(1980)中。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的实例包括含抗体的固体疏水聚合物的半渗透性基质，所述基质的形式为有形物品，例如，薄膜或微胶囊。
可用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌可以例如通过经由无菌过滤膜过滤而容易地实现。
G.治疗方法和组合物
本文中提供的任一抗-肌肉生长抑制因子抗体都可以用于治疗方法中。类似地，本文中提供的任一包含变体Fc区的多肽都可以用于治疗方法中。
在一个方面，提供用作药物的抗-肌肉生长抑制因子抗体。在另外的方面，提供用于治疗疾病的抗-肌肉生长抑制因子抗体。在某些实施方案中，提供用于治疗方法的抗-肌肉生长抑制因子抗体。在某些实施方案中，本发明提供抗-肌肉生长抑制因子抗体，其用于治疗患有疾病的个体的方法，所述方法包括向个体施用有效量的抗-肌肉生长抑制因子抗体。在一个实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。根据任一以上实施方案的"个体"优选是人。
本发明的抗-肌肉生长抑制因子抗体可以显示pH依赖性的结合性质。在另外的实施方案中，本发明提供抗-肌肉生长抑制因子抗体，其用于增强肌肉生长抑制因子从血浆的清除。在某些实施方案中，本发明提供抗-肌肉生长抑制因子抗体，其用于在个体中增强肌肉生长抑制因子从血浆的清除的方法，所述方法包括向个体施用有效量的抗-肌肉生长抑制因子抗体以增强肌肉生长抑制因子从血浆的清除。在一个实施方案中，相比于不具有pH依赖性的结合性质的常规抗-肌肉生长抑制因子抗体，具有pH依赖性的结合性质的抗-肌肉生长抑制因子抗体增强肌肉生长抑制因子从血浆的清除。在另一个实施方案中，相比于不具有pH依赖性的结合性质的常规抗-肌肉生长抑制因子抗体，具有在pH5.8和pH7.4的结合之间的pH依赖性的结合性质的抗-肌肉生长抑制因子抗体增强肌肉生长抑制因子从血浆的清除。根据任一以上实施方案的"个体"优选是人。
在另一个方面，本发明提供抗-肌肉生长抑制因子抗体在制备或配制药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗疾病。在另一个实施方案中，所述药物用于治疗疾病的方法，所述方法包括向患病个体施用有效量的药物。在一个实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。根据任一以上实施方案的”个体”可以是人。
本发明的抗-肌肉生长抑制因子抗体可以显示pH依赖性的结合性质。在另一个实施方案中，所述药物用于增强肌肉生长抑制因子从血浆的清除。在另一个实施方案中，所述药物用于在个体中增强肌肉生长抑制因子从血浆的清除的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物以增强肌肉生长抑制因子从血浆的清除。在一个实施方案中，相比于不具有pH依赖性的结合性质的常规抗-肌肉生长抑制因子抗体，具有pH依赖性的结合性质的抗-肌肉生长抑制因子抗体增强肌肉生长抑制因子从血浆的清除。在另一个实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体在pH5.8至pH7.4之间显示不同的pH依赖性的结合性质。根据任一以上实施方案的"个体"优选是人。
在另一个方面，本发明提供用于治疗疾病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有此种疾病的个体施用有效量的本文中提供的抗-肌肉生长抑制因子抗体。在一个实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种另一种治疗剂。根据任一以上实施方案的”个体”可以是人。
本发明的抗-肌肉生长抑制因子抗体可以显示pH依赖性的结合性质。在另一个实施方案中，本发明提供用于在个体中增强肌肉生长抑制因子从血浆的清除的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向个体施用有效量的本文中提供的抗-肌肉生长抑制因子抗体以增强肌肉生长抑制因子从血浆的清除。在一个实施方案中，相比于不具有pH依赖性的结合性质的常规抗-肌肉生长抑制因子抗体，具有pH依赖性的结合性质的抗-肌肉生长抑制因子抗体增强肌肉生长抑制因子从血浆的清除。在另一个实施方案中，所述抗-肌肉生长抑制因子抗体在pH5.8至pH7.4之间显示不同的pH依赖性的结合性质。在一个实施方案中，"个体"是人。
在另一个方面，本发明提供例如用于任一上述治疗方法的包含本文中提供的任一抗-肌肉生长抑制因子抗体的药物制剂。在一个实施方案中，所述药物制剂包含本文中提供的任一抗-肌肉生长抑制因子抗体和药用载体。在另一个实施方案中，所述药物制剂包含本文中提供的任一抗-肌肉生长抑制因子抗体和至少一种另外的治疗剂。
在另一个方面，所述药物制剂用于治疗疾病。本发明的抗-肌肉生长抑制因子抗体可以显示pH依赖性的结合性质。在另一个实施方案中，所述药物制剂用于增强肌肉生长抑制因子从血浆的清除。在一个实施方案中，向患病个体施用所述药物制剂。根据任一以上实施方案的”个体”优选是人。
在另一个方面，本发明提供用于制备药物或药物制剂的方法，所述方法包括将本文中提供的任一抗-肌肉生长抑制因子抗体与药用载体混合，例如，以用于任一上述治疗方法。在一个实施方案中，用于制备药物或药物制剂的方法还包括添加至少一种另外的治疗剂至药物或药物制剂。
本文中提供的任一包含变体Fc区的多肽可以用于治疗方法中。在另一个方面，本发明提供例如用于治疗方法中的药物制剂，所述药物制剂包含多肽，所述多肽包括本文中提供的任一包含变体Fc区的多肽。在一个实施方案中，所述药物制剂包含多肽和药用载体，所述多肽包括本文中提供的任一包含变体Fc区的多肽。在另一个实施方案中，所述药物制剂包含多肽和至少一种另外的治疗剂，所述多肽包含本文中提供的任一变体Fc区。
在一个方面，提供用作药物的包含变体Fc区的多肽。在另外的方面，提供用于治疗疾病的包含变体Fc区的多肽。在某些实施方案中，提供用于治疗方法中的包含变体Fc区的多肽。在某些实施方案中，本发明提供包含变体Fc区的多肽，其用于治疗患病个体的方法，所述方法包括向个体施用有效量的本文中提供的包含变体Fc区的多肽。在一个实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。在一个实施方案中，"个体"是人。
在另一个方面，本发明提供包含变体Fc区的多肽在制备或配制药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗疾病。在一些方面，所述多肽是抗体。在一些方面，所述多肽是Fc融合蛋白。在另一个实施方案中，所述药物用于治疗疾病的方法，所述方法包括向患有待治疾病的个体施用有效量的药物。在一个实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。在一个实施方案中，"个体"是人。
在另一个方面，本发明提供用于治疗疾病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有此种疾病的个体施用有效量的包含变体Fc区的多肽。在一个实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。在一个实施方案中，"个体"是人。
在另一个方面，本发明提供包含本文中提供的包含变体Fc区的多肽的药物制剂，其用于治疗方法如本文中描述的任一治疗方法。在一个实施方案中，所述药物制剂包含本文中提供的包含变体Fc区的多肽和药用载体。在另一个实施方案中，所述药物制剂包含本文中提供的包含变体Fc区的多肽和至少一种另外的治疗剂。
在另一个方面，所述药物制剂用于治疗疾病。在一个实施方案中，将所述药物制剂施用给患病个体。在一个实施方案中，"个体"是人。
已通过修饰至少一个氨基酸残基而被修饰成具有增强的对Fcγ R(包括FcγRIIb)的结合活性的抗体可以促进抗原从血浆的消除，如例如WO 2013/047752，WO 2013/125667，WO 2014/030728，或WO 2014/163101中描述或表明的。
不希望受限于特定理论，在中性pH条件下具有增强的Fcγ R-结合活性的抗体和与其形成复合物的抗原一起被快速地摄入到细胞中，并且因此，当在体内施用所述抗体时，可以促进抗原从血浆的消除。
已通过修饰至少一个可能暴露于抗体表面上的氨基酸残基而被修饰成具有提高的pI的抗体可以被更快速地结合到细胞中或可以促进抗原从血浆的消除，如例如WO 2007/114319，WO 2009/041643，WO 2014/145159，或WO 2012/016227中描述或表明的。
不希望受限于特定理论，据信，生物学液体(例如，血浆)的pH在中性pH范围内。在生物学液体中，pI提高的抗体的净正电荷由于pI提高而增加，并且因此，相比于不具有提高的pI的抗体，所述抗体更强烈地被物化库仑相互作用吸引至具有净负电荷的内皮细胞表面。这意味着，经由此种非特异性结合，与其抗原复合的抗体到细胞中的摄取被增强，这导致抗原从血浆的消除增强。预期这些现象在体内普遍发生，而不管细胞类型，组织类型，器官类型等如何。
本文中，抗原从血浆的消除增强意味着，例如，与当施用包含没有被如此修饰的相应Fc区的多肽时相比，抗原从血浆消除的速率提高。抗原从血浆的消除增加可以例如通过测量抗原在血浆中的浓度来评估。多种用于测量血浆中抗原浓度的方法是本领域中已知的。
在另外的实施方案中，本发明提供包含变体Fc区的多肽，其用于促进抗原从血浆的消除。在某些实施方案中，本发明提供包含变体Fc区的多肽，其用于在个体中促进抗原从血浆的消除的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包含变体Fc区的多肽以促进抗原从血浆的消除。自这些实施方案中，优选的是，所述多肽还包含抗原结合结构域。根据任一以上实施方案的”个体”优选是人。
在另一个方面，本发明提供包含变体Fc区的多肽在制备或配制药物中的用途。在一些方面，所述多肽是抗体。在一些方面，所述多肽是Fc融合蛋白。在另一个实施方案中，所述药物用于促进抗原从血浆的消除。在另一个实施方案中，所述药物用于在个体中促进抗原从血浆的消除的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物以促进抗原从血浆的消除。在这些实施方案中，优选的是，所述多肽还包含抗原结合结构域。根据任一以上实施方案的”个体”可以是人。
在另一个实施方案中，本发明提供用于在个体中促进抗原从血浆的消除的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向个体施用有效量的包含变体Fc区的多肽以促进抗原从血浆的消除。在这些实施方案中，优选的是，所述多肽还包含抗原结合结构域。在一个实施方案中，"个体"是人。
在另一个方面，本发明提供药物制剂，其包含本文中提供的任一包含变体Fc区的多肽。在另一个实施方案中，所述药物制剂用于促进抗原从血浆的消除。在所述实施方案中，优选的是，所述多肽还包含抗原结合结构域。
在一个实施方案中，相比于氨基酸修饰前，当在体内施用抗体时，具有本发明的变体Fc区的抗体使抗原从血浆的消除增强例如至少1.1倍，1.25倍，1.5倍，1.75倍，2.0倍，2.25倍，2.5倍，2.75倍，3.0倍，3.25倍，3.5倍，3.75倍，4.0倍，4.25倍，4.5倍，4.75倍，5.0倍，5.5倍，6.0倍，6.5倍，7.0倍，7.5倍，8.0倍，8.5倍，9.0倍，9.5倍，或10.0倍以上。
在另一个方面，本发明提供用于制备药物或药物制剂的方法，所述方法包括将本文中提供的任一包含变体Fc区的多肽与药用载体混合，例如，用于任一上述治疗方法。在一个实施方案中，用于制备药物或药物制剂的方法还包括向药物或药物制剂添加至少一种另外的治疗剂。
本发明的抗体可以单独地用于治疗或与其他试剂组合地用于治疗。例如，本发明的抗体可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。
类似地，包含本发明的变体Fc区的多肽可以单独地用于治疗或与其他试剂组合地用于治疗。例如，包含本发明的变体Fc区的多肽可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。
上述的此种组合治疗包括组合施用(其中两种以上治疗剂被包含在同一或分开的制剂中)和分开施用，在此种情况中，本发明的包含变体Fc区的抗体或多肽的施用可以发生在另外的治疗剂或试剂的施用之前，同时，和/或之后。在一个实施方案中，抗-肌肉生长抑制因子抗体的施用和另外的治疗剂的施用彼此发生在约一个月以内，或在约一周，两周或三周以内，或在约一天，两天，三天，四天，五天或六天以内。
在另一个实施方案中，包含变体Fc区的多肽的施用和另外的治疗剂的施用彼此发生在约一个月以内，或在约一周，两周或三周以内，或在约一天，两天，三天，四天，五天或六天以内。
本发明的包含变体Fc区的抗体或多肽(以及任选地任意另外的治疗剂)可以通过任何合适的手段施用，包括肠胃外施用，肺内施用，和鼻内施用，以及，如果局部治疗需要，病变内施用。肠胃外注入包括肌肉内施用，静脉内施用，动脉内施用，腹膜内施用，或皮下施用。用药可以是通过任何合适的途径，例如，通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文中考虑多种用药方案，包括但不限于单次施用或在多个时间点的多次施用，推注施用，和脉冲注入。
本发明的包含变体Fc区的抗体或多肽可以与良好医学实践一致的方式配制，用药和施用。该语境中考虑的因素包括治疗的具体疾病，治疗的具体哺乳动物，个体患者的临床状况，病因，药剂递送位点，给药方法，给药时间安排，以及医疗从业者已知的其他因素。所述抗体不需要，但任选地，与目前用于预防或治疗目标疾病的一种或多种药剂配制在一起。此种其他药剂的有效量取决于制剂中存在的抗体的量，疾病或治疗的类型，以及以上讨论的其他因素。这些通常以与本文中所述相同的剂量和给药途径使用，或为本文中所述剂量的约1至99％，或以经验/临床确定为合适的任何剂量和任何途径。
为了预防或治疗疾病，本发明的抗体的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病的类型，抗体的类型，包含变体Fc区的多肽的类型，疾病的严重度和病程，包含变体Fc区的抗体或多肽的施用是为了预防目的还是为了治疗目的，之前的治疗，患者的临床史和对包含变体Fc区的抗体或多肽的反应，以及主治医生的判断。本发明的包含变体Fc区的抗体或多肽被合适地一次性或随系列治疗施用于患者。根据疾病的类型和严重度，约1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是用于施用至患者的初始候选剂量，不论是，例如，通过一次或多次分开的施用，还是通过连续注入。一个典型的日剂量可以为约1μg/kg至100mg/kg以上，这取决于以上提及的因素。对于在若干天或更长的时间内的重复施用，根据条件，通常可以持续治疗直至出现所需的疾病症状的阻抑。包含变体Fc区的抗体或多肽的一个示例性剂量为约0.05mg/kg至约10mg/kg。因此，可以将一个或多个剂量，约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)施用于患者。此种剂量可以间歇施用，例如，每周一次或每三周一次(例如，使得患者接受约两个至约二十个，或例如，约六个剂量的包含变体Fc区的抗体或多肽)。可以施用初始较高的加载剂量，继之以一个或多个较低的剂量。该治疗过程可以容易地通过常规技术和测定监测。
要理解的是，任何上述制剂或治疗方法都可以使用本发明的免疫缀合物(以代替抗-肌肉生长抑制因子抗体或除了抗-肌肉生长抑制因子抗体以外)进行。
同样要理解的是，任何上述制剂或治疗方法都可以使用本发明的免疫缀合物(代替本文中提供的包含变体Fc区的多肽或除了本文中提供的包含变体Fc区的多肽以外)进行。
H.制品
在本发明的另一个方面，提供制品，其包含可用于治疗，预防和/或诊断上述疾病的材料。所述制品包含容器和在容器上或与容器结合的标记或包装插页。合适的容器包括，例如，瓶子，小瓶，注射器，IV溶液袋等。所述容器可以由多种材料(如玻璃或塑料)制成。所述容器盛装组合物，所述组合物是单独的或与对于治疗，预防和/或诊断病症有效的另一种组合物组合，并且所述容器可以具有无菌接入端口(例如所述容器可以是具有可被皮下注射针刺破的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标记或包装插页指示组合物用于治疗所选的病症。此外，所述制品可以包含(a)其中盛装有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中盛装有组合物的第二容器，其中所述组合物还包含细胞毒性或其他治疗剂。本发明的该实施方案中的制品还可以包含包装插页，所述包装插页指示组合物可以用于治疗特定病症。备选地，或另外地，所述制品还可以包含第二(或第三)容器，所述容器包含药用缓冲液，如注射用抑菌水(BWFI)，磷酸缓冲盐水，林格溶液和右旋糖溶液。其还可以包含商业或用户需要的其他材料，包括其他缓冲液，稀释液，填料，针和注射器。
要理解的是，任何上述制品都可以包括本发明的免疫缀合物以替代抗-肌肉生长抑制因子抗体，或者除了抗-肌肉生长抑制因子抗体以外，任何上述制品还可以包括本发明的免疫缀合物。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。要理解的是，已知以上提供的一般性描述，可以实施多种其他实施方案。
实施例1
潜伏性和成熟形式的人、食蟹猴和小鼠肌肉生长抑制因子的表达和纯化
使用FreeStyle293-F细胞(FS293-F细胞)(Thermo Fisher，Carlsbad，CA，USA)瞬时表达人潜伏性肌肉生长抑制因子(本文中也被称为潜伏形式的人肌肉生长抑制因子)(SEQ ID NO:1)。将含表达的潜伏形式的人肌肉生长抑制因子的条件培养基酸化至pH6.8并用1/2体积的milliQ水稀释，之后施用至Q-琼脂糖FF阴离子交换柱(GE健康护理，Uppsala，Sweden)。将流通的级分调节至pH5.0并施用至SP-琼脂糖HP阳离子交换柱(GE健康护理，Uppsala，Sweden)，然后用NaCl梯度洗脱。将含潜伏形式的人肌肉生长抑制因子的级分收集并且随后施用至用1x PBS平衡的Superdex 200凝胶过滤柱(GE健康护理，Uppsala，Sweden)。然后将含潜伏形式的人肌肉生长抑制因子的级分汇集并存储在-80℃。
成熟的人肌肉生长抑制因子(本文中也被称为成熟形式的人肌肉生长抑制因子)(SEQ ID NO:2)纯化自纯化的潜伏形式的人肌肉生长抑制因子。将潜伏形式的人肌肉生长抑制因子通过添加0.1％三氟乙酸(TFA)酸化并施用至Vydac 214TP C4反相柱(Grace，Deerfield，IL，USA)并用TFA/CH3CN梯度洗脱。将含人成熟肌肉生长抑制因子的级分汇集，干燥并存储在-80℃。将人成熟肌肉生长抑制因子溶解在4mM HCl中从而重构。
来自食蟹猴(cynomolgus或cyno)(分别为SEQ ID NO:3和4)和小鼠(分别为SEQ IDNO:5和6)的潜伏形式和成熟形式的肌肉生长抑制因子的表达和纯化都以与人对应物完全相同的方式进行。人，食蟹猴和小鼠之间成熟形式的序列同源性为100％相同，因此，任何成熟肌肉生长抑制因子(不管是什么物种)在所有必要的实验中都可以用作成熟肌肉生长抑制因子。
实施例2
鉴定抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体
如下地制备、选择和测定抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体。
将12至16周龄NZW兔用小鼠潜伏性肌肉生长抑制因子和/或人潜伏性肌肉生长抑制因子皮内免疫(50-100μg/剂量/兔)。在一个月的时间将该剂量重复3-4次。最终免疫后一周，收集来自经免疫的兔的脾和血液。将抗原特异性B-细胞用标记的抗原染色，用FCM细胞分选仪(FACS aria III，BD)分选，并以一个细胞/孔的密度与25,000个细胞/孔的EL4细胞(欧洲细胞培养物保藏中心)和稀释20倍的兔T-细胞条件培养基一起铺板在96孔板中，并且培养7-12天。将EL4细胞用丝裂霉素C(Sigma)处理2小时并提前洗涤3次。兔T-细胞条件培养基通过在含植物凝集素-M(Roche)，佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(Sigma)和2％FBS的RPMI-1640中培养兔胸腺细胞来制备。在培养后，将B-细胞培养物上清收集以用于进一步分析并将细胞沉淀(pellet)冷冻保存。
将ELISA测定用于测试B-细胞培养物上清中抗体的特异性。在室温将在PBS中50nM的链霉亲和素(GeneScript)包被在384孔MAXISorp(Nunc)上达1小时。然后用稀释5倍的Blocking One(Nacalai Tesque)将平板封闭。将人或小鼠潜伏性肌肉生长抑制因子标记以NHS-PEG4-生物素(PIERCE)并添加至封闭的ELISA平板，孵育1小时，并用含0.05％Tween-20的Tris缓冲的盐水(TBS-T)洗涤。将B-细胞培养物上清添加至ELISA平板，孵育1小时，并用TBS-T洗涤。通过山羊抗-兔IgG-辣根过氧化物酶(BETHYL)继之以添加ABTS(KPL)检测结合。
筛选总计17,818个B-细胞系的与小鼠和/或人潜伏性肌肉生长抑制因子的结合特异性，并选择299个细胞系并将其指定为MST0255-287，630-632，677-759，910，932-1048，1050-1055，1057-1066，1068，1070-1073，1075-1110，1113-1119。使用ZR-96Quick-RNA试剂盒(ZYMO RESEARCH)从相应的细胞沉淀纯化RNA。
将各个选择的细胞系的编码重链和轻链的可变区的DNA通过反转录PCR扩增并克隆到分别具有重链恒定区G1m序列(SEQ ID NO:50(氨基酸序列显示在SEQ ID NO:7中))和具有轻链恒定区k0MTC或k0MC序列(SEQ ID NO:53或194(氨基酸序列(两者是相同的)显示在SEQ ID NO:8中))的表达载体中。根据生产者的使用说明，使用FreeStyle FS293-F细胞和293fectin(Life technologies)瞬时表达重组抗体。将培养物上清或重组抗体用于筛选。重组抗体用蛋白A(GE健康护理)纯化并洗脱在D-PBS或His缓冲液(20mM组氨酸，150mMNaCl，pH6.0)中。如果需要，进一步进行尺寸排阻色谱法以除去高分子量和/或低分子量的组分。
实施例3
抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的表征
(HEK Blue测定(BMP1活化))
使用报告基因测定来评估体外活性肌肉生长抑制因子的生物学活性。表达Smad3/4-结合元件(SBE)诱导型SEAP报告基因的HEK-BlueTM TGF-β细胞(Invivogen)允许通过监测激活蛋白1型和2型受体的活化来检测具有生物活性的肌肉生长抑制因子。活性肌肉生长抑制因子刺激被分泌到细胞上清中的SEAP的生产。然后使用QUANTIBlueTM(Invivogen)评估分泌的SEAP的量。
将HEK-BlueTM TGF-β细胞保持在补充以10％胎牛血清，50μg/mL链霉素，50U/mL青霉素，100μg/mL NormocinTM，30μg/mL杀稻瘟素(Blasticidin)，200μg/mL HygroGoldTM和100μg/mL ZeocinTM的DMEM培养基(Gibco)中。在功能测定期间，细胞被改变至测定培养基(具有0.1％牛血清清蛋白，链霉素，青霉素和NormocinTM的DMEM)并被接种至96孔板。将人、食蟹猴或小鼠潜伏性肌肉生长抑制因子与重组人BMP1(R&D Systems)和抗-潜伏性抗体在37℃孵育过夜。将样品混合物转移至细胞。在24小鼠孵育后，将细胞上清与QUANTIBlueTM混合并在比色板读数仪中测量620nm处的光密度。如图1所示，mAb MST1032-G1m(氨基酸和核苷酸序列参见表2a)阻止蛋白酶介导的人、食蟹猴和小鼠潜伏性肌肉生长抑制因子的活化，如降低的分泌的SEAP浓度所反映的。MST1032-G1m显示几乎相当的针对人、食蟹猴和小鼠潜伏性肌肉生长抑制因子的抑制活性。
[表2a]
[表2b]
实施例4
抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的表征
(HEK Blue测定(自发活化))
将人、食蟹猴或小鼠潜伏性肌肉生长抑制因子与抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体在37℃孵育过夜并将样品混合物转移至HEK-BlueTM TGF-β细胞。在24小时孵育后，将细胞上清与QUANTIBlueTM混合并在比色平板读数仪中测量620nm处的光密度。如图2所示，在37℃孵育后检测到活性肌肉生长抑制因子自其潜伏形式的释放。mAb MST1032-G1m的存在，肌肉生长抑制因子活化被抑制并且因此在细胞上清中检测到较低的SEAP水平。MST1032-G1m抑制潜伏性肌肉生长抑制因子的自发活化，并且显示几乎相当的针对人、食蟹猴和小鼠潜伏性肌肉生长抑制因子的抑制活性。
实施例5
抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的表征(ELISA)
将未包被的ELISA平板(NUNC-IMMUNO平板MAXISORP表面，Nalge NuncInternational)用20μl的50nM链霉亲和素(GenScript)在室温包被1小时。然后将平板用PBST洗涤三次并用50μl 20％Blocking One(Nacalai Tesque)封闭过夜。在第二天，将各平板的各孔与生物素化的成熟肌肉生长抑制因子，人或小鼠生物素化的潜伏性肌肉生长抑制因子，或生物素化的重组小鼠肌肉生长抑制因子前肽-Fc嵌合蛋白(R&D Systems)以4nM/孔/20μl孵育2小时。在洗涤后，将20μl抗体样品加入孔中并将平板静置1小时。将平板洗涤并加入稀释在HEPES缓冲的盐水中的20μl抗-人IgG-辣根过氧化物酶(HRP)(Abcam)，并将平板再静置一小时。然后再次洗涤平板，然后将50μl ABTS(KPL)加入各孔中，并将平板孵育1小时。在比色平板读数仪中在405nm检测信号。结合实验的结果显示在图3中。MST1032-G1m结合潜伏性肌肉生长抑制因子(即，成熟肌肉生长抑制因子和前肽的非共价复合物)和前肽，但是不结合成熟肌肉生长抑制因子。这些结果显示MST1032-G1m特异性结合肌肉生长抑制因子前肽(例如，前(prp)肽部分)，但是不结合活性肌肉生长抑制因子(例如，成熟区)。
实施例6
抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的表征(蛋白质印迹)
将小鼠潜伏性肌肉生长抑制因子与重组人BMP1(R&D Systems)在存在或不存在MST1032-G1m的情况下在37℃孵育过夜。然后将样品与4x还原SDS-PAGE样品缓冲液(Wako)混合并在95℃加热5分钟，然后上样以用于SDS凝胶电泳。然后通过Trans-Blot(注册商标)TurboTM Transfer System(Bio-rad)将蛋白转移至膜。使用绵羊抗-小鼠GDF8前肽抗体(R&DSystems)检测肌肉生长抑制因子前肽，所述前肽抗体之后通过抗-绵羊IgG-HRP(SantaCruz)检测。将膜与ECL底物孵育，并且使用ImageQuant LAS 4000(GE健康护理)成像。如图4中所示，通过BMP1的前肽切割被MST1032-G1m抑制。
实施例7
抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的表征(BIACORE(注册商标))
抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体针对人、食蟹猴(cyno)和小鼠潜伏性肌肉生长抑制因子的动力学参数在37℃在pH7.4使用BIACORE(注册商标)T200仪器(GE健康护理)评估。使用胺偶联试剂盒(GE健康护理)将ProA/G(Pierce)固定在CM4芯片的所有流动室上。在ACES pH7.4(20mM ACES，150mM NaCl，1.2mM CaCl2，0.05％Tween 20，0.005％NaN3)中准备抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体和分析物。通过ProA/G将抗体捕获到传感器表面上。抗体捕获水平典型地为150至220个共振单位(RU)。然后注射通过两倍连续稀释制备的3.125至50nM的人、食蟹猴或小鼠潜伏性肌肉生长抑制因子，之后分离。传感器表面用25mM NaOH再生。动力学参数通过使用BIACORE(注册商标)T200 Evaluation软件，2.0版本(GE健康护理)处理并拟合数据至1:1结合模型来确定。感应图显示在图5中。结合速率(ka)，解离速率(kd)，和结合亲和力(KD)列在表3中。MST1032-G1m对人、食蟹猴和小鼠潜伏性肌肉生长抑制因子的动力学参数是相当的。
[表3]
抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体MSTl032-Glm的ka、kd和KD
实施例8
抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的人源化
抗体可变区的氨基酸残基根据Kabat编号(Kabat等,Sequence of proteins ofimmunological interest,5th Ed.,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991))。
设计人源化MST1032抗体重链和轻链的可变区。一些人源化MST1032抗体在框架区中含有回复突变。设计的重链和轻链可变区的多核苷酸由GenScript Inc.合成，并被克隆到分别含有重链恒定区SG1序列(SEQ ID NO:52(氨基酸序列显示在SEQ ID NO:9)中)和轻链恒定区SK1序列(SEQ ID NO:54(氨基酸序列显示在SEQ ID NO:10中))的表达载体中。在FS293-F细胞中瞬时表达人源化抗体，并如上所述进行HEK Blue测定和BIACORE(注册商标)分析。如图6和表4中所示，并且相比于图1和2，人源化抗体(MS1032LO00-SG1)与嵌合抗体(MST1032-G1m)显示相当的抑制活性和亲和力。
[表4]
人源化抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的动力学参数
实施例9
pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的产生
为了制备pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体，对mAb MS1032LO00-SG1的所有CDR进行组氨酸扫描诱变。使用In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech Inc.或TakaraBio company)，根据生产者的使用说明，将CDR中的各氨基酸单个地突变为组氨酸。在通过测序确认各变体被正确突变后，通过上述方法瞬时表达并纯化变体。所有组氨酸置换的变体通过与上述相比改进的BIACORE(注册商标)测定来评估。简言之，将在pH5.8的另外的解离阶段整合到BIACORE(注册商标)测定中，其紧接着pH7.4的解离阶段之后。这是为了评估与在pH5.8的相应的解离阶段对的抗体(Ab)和抗原(Ag)之间从在pH7.4形成的复合物的pH依赖性的解离。在pH5.8缓冲液中的解离速率通过使用Scrubber 2.0(BioLogic Software)曲线拟合软件处理并拟合数据来确定。
如图7中所示，亲本抗体(Ab001)显示的在pH5.8的结合响应相比于pH7.4解离阶段没有减小。若干单组氨酸置换导致在pH5.8的结合响应相比于pH7.4解离阶段有中等至强的减小。各个单组氨酸置换变体在pH5.8的解离速率显示在表5中。如表5中所示，在pH5.8，Ab002显示最快的Ab/Ag复合物解离速率，是亲本抗体(Ab001)200倍快。然后制备在CDR中具有这些突变的组合的抗体。含这些不同突变的抗体的CDR序列显示在表6中。
[表5]
单组氨酸置换的抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的pH5.8解离速率
[表6]
实施例10
pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的亲和力提高
为了鉴定提高在pH7.4的亲和力和/或体外抑制活性的突变，分别制备重链和轻链的超过500个变体，使用实施例9中制备的至少一种变体作为模板。这些变体的CDR中的各氨基酸被置换成18种其他氨基酸，不包括原始的氨基酸和半胱氨酸。变体与人潜伏性肌肉生长抑制因子的结合能力使用BIACORE(注册商标)4000仪器(GE健康护理)在37℃在pH7.4下评估。含FS293-F细胞中的变体的培养物上清利用含10mg/ml BSA和0.1mg/ml羧甲基葡聚糖(CMD)的ACES pH7.4缓冲液制备。将各抗体捕获到流动室上直至捕获水平达到约200RU。然后将25nM人潜伏性肌肉生长抑制因子注射在流动室上。将另外的在pH5.8的解离阶段整合到BIACORE(注册商标)测定中，紧接着在pH7.4的解离阶段之后。该另外的解离阶段评估抗体(Ab)和抗原(Ag)之间自在pH7.4形成的复合物的pH依赖性的解离。流动室表面用25mMNaOH再生。动力学参数使用BIACORE(注册商标)4000Evaluation软件，2.0版本(GE健康护理)确定。另外的在pH5.8的解离的分析使用Scrubber2(BioLogic Software)进行。
选择具有提高的在pH7.4的亲和力和/或体外抑制活性的变体，并将其与实施例9中鉴定的提高pH依赖性的突变组合。在这些突变的组合后，选择四种变体(MS1032LO01，02，03和04)，并将其在SG1或F760(SEQ ID NO:11和51)中瞬时表达以用于BIACORE(注册商标)结合动力学分析，体外和/或体内测定。SG1和F760都是人重链恒定区。SG1对人Fcγ R的结合亲和力与对天然IgG1恒定区的结合亲和力相当，而Fc修饰使得F760的结合亲和力被消除(本文中也被称为沉默Fc)。四种抗-肌肉生长抑制因子变体的氨基酸和核苷酸序列显示在表2a中。
实施例11
pH依赖性的MS1032变体的表征
(HEK Blue测定(BMP1和自发活化))
所有实验设定与实施例3和4中相同。如图8中所示，所有变体都显示与MS1032LO00-SG1相当的针对人潜伏性肌肉生长抑制因子的抑制活性。
实施例12
pH依赖性的MS1032变体的表征(BIACORE(注册商标))
所有实验设定与实施例7中相同，不同之处在于，除了ACES pH7.4条件以外，测量也在ACES pH5.8缓冲液中进行。一些抗体仅针对人潜伏性肌肉生长抑制因子被测量。对于亲合力和亲和力测定，抗体捕获水平分别瞄准185RU和18.5RU。动力学参数使用BIACORE(注册商标)T200 Evaluation软件，2.0版本(GE健康护理)使用1:1结合拟合来确定。所有抗体针对人潜伏性肌肉生长抑制因子的感应图以及亲合力条件显示在图9中，并且计算自不同条件的ka、kd和KD列在表7-10中。在亲合力条件下，所有抗体(除了MS1032LO00-SG1以外)在酸性pH下显示的解离速率都比中性pH快。在亲和力条件下，所有抗体(除了MS1032LO00-SG1以外)在酸性pH下都显示弱的与潜伏性肌肉生长抑制因子的相互作用，并且因此，没有测得动力学参数。
[表7]
在中性pH下的亲合力条件测定的ka、kd和KD
N/T：未测试
[表8]
在酸性pH下的亲合力条件测定的ka、kd和KD
N/T：未测试
[表9]
在中性pH下的亲和力条件测定的ka、kd和KD
N/T：未测试
[表10]
在酸性pH下的亲和力条件测定的ka、kd和KD
n.d.：未确定，N/T：未测试
实施例13
小鼠中抗体之间血浆总肌肉生长抑制因子浓度与Fcγ R结合和消除的Fcγ R结合的比较
使用C.B-17SCID小鼠的体内测试
在将抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体在C.B-17SCID小鼠(In Vivos,Singapore)中施用后，体内评估内源性肌肉生长抑制因子的积聚。将抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体(3mg/ml)以10ml/kg的单剂量施用到尾静脉中。在施用后5分钟，7小时，1天，2天，3天，7天，14天，21天，和28天收集血液。将收集的血液立即以14,000rpm在4℃离心10分钟以分离血浆。将分离的血浆存储在-80℃以下直至测量。使用的抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体是MS1032LO00-SG1和MS1032LO00-F760。
通过电化学发光(ECL)测量血浆中总肌肉生长抑制因子浓度
通过ECL测量小鼠血浆中总肌肉生长抑制因子的浓度。通过将抗-成熟肌肉生长抑制因子抗体RK35(如WO 2009/058346中所述)分配到MULTI-ARRAY 96孔平板(Meso ScaleDiscovery)上并在4℃孵育过夜，制备固定有抗-成熟肌肉生长抑制因子的平板。制备成熟肌肉生长抑制因子校正曲线样品和稀释40倍以上的小鼠血浆样品。将样品混合在酸性溶液(0.2M甘氨酸-HCl，pH2.5)中以使成熟肌肉生长抑制因子自其结合蛋白(如前肽)解离。随后，将样品添加到固定有抗-成熟肌肉生长抑制因子的平板上，并允许在室温结合1小时，之后洗涤。接着，添加SULFO TAG标记的抗-成熟肌肉生长抑制因子抗体RK22(如WO 2009/058346中所述)并将平板在室温孵育1小时，之后洗涤。将Read缓冲液T(x4)(Meso ScaleDiscovery)立即添加至平板并通过SECTOR Imager 2400(Meso Scale Discovery)检测信号。基于校正曲线的响应，使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)计算成熟肌肉生长抑制因子浓度。通过该方法测量的静脉内施用抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体后血浆中总肌肉生长抑制因子浓度的时程显示在图10中。
体内Fcγ R结合对肌肉生长抑制因子积累的作用
在施用抗体MS1032LO00-F760后，相比于5分钟时的血浆总肌肉生长抑制因子浓度，28天时的血浆总肌肉生长抑制因子浓度积聚248倍。相比之下，在施用MS1032LO00-SG1后，第28天的血浆总肌肉生长抑制因子浓度相比于5分钟时的血浆总肌肉生长抑制因子浓度积聚37倍。由于Fcγ R结合，在第28天，在MS1032LO00-F760(沉默Fc)和MS1032LO00-SG1之间观察到约7倍的血浆总肌肉生长抑制因子浓度差异。在人可溶性IL-6R(hsIL-6R)中，在抗-hsIL-6R抗体-F760(沉默Fc)和-SG1(如WO 2013/125667中所述)之间没有观察到血浆hsIL-6R浓度的显著差异。因为hsIL-6R是单体抗原，所以抗体-hsIL-6R复合物仅含1个Fc。因此，WO 2013/125667中的结果表明，具有1个Fc的抗体-抗原复合物在体内不显著结合Fcγ R而加速细胞对免疫复合物的摄取。另一方面，多聚体抗原(如肌肉生长抑制因子)，抗体可以形成大的免疫复合物并且所述抗体-抗原复合物含有超过2个Fc。因此，由于强的针对Fcγ R的亲合力结合，在F760和SG1之间可以观察到血浆抗原浓度的显著差异。结果表明，MST1032可以与肌肉生长抑制因子形成含超过2个抗体的大免疫复合物。
实施例14
小鼠中非pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体和pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体之间血浆总肌肉生长抑制因子浓度的比较
使用C.B-17SCID小鼠的体内测试
在将抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体施用在C.B-17SCID小鼠(In Vivos,Singapore)中后评估内源性小鼠肌肉生长抑制因子的体内积聚，如实施例13中所述。使用的抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体是MS1032LO01-SG1和MS1032LO01-F760。
通过ECL测量血浆中的总肌肉生长抑制因子浓度
通过ECL测量小鼠血浆中总肌肉生长抑制因子浓度，如实施例13中所述。通过该方法测量的静脉内施用抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体后的血浆总肌肉生长抑制因子浓度的时程显示在图11中。
pH依赖性的肌肉生长抑制因子结合对体内肌肉生长抑制因子积累的作用
体内测试pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体(MS1032LO01-SG1和MS1032LO01-F760)并进行血浆总肌肉生长抑制因子浓度的比较。施用实施例13中描述的MS1032LO00-SG1和MS1032LO00-F760后的总肌肉生长抑制因子浓度测量结果也显示在图11中。MS1032LO00是非pH依赖性抗体而MS1032LO01是pH依赖性抗体。如图11中所示，由于pH依赖性的结合，施用MS1032LO01-F760后的总肌肉生长抑制因子浓度相比于MS1032LO00-F760减小。此外，由于pH依赖性的结合和通过Fcγ R结合的增加的细胞摄取，施用MS1032LO01-SG1后的总肌肉生长抑制因子浓度相比于MS1032LO00-SG1显著减小。预期，MS1032LO01-SG1作为"清扫抗体"具有优异的增强肌肉生长抑制因子自血浆清除的性质。
实施例15
人和小鼠潜伏性GDF11的表达和纯化
N-端具有Flag标签的人GDF11(本文中也被称为Flag-hGDF11，人潜伏性GDF11，hGDF11，或人GDF11，SEQ ID NO:85)使用FreeStyle293-F细胞(Thermo Fisher)瞬时表达。将表达Flag-hGDF11的条件培养基施用至装填有抗-Flag M2亲和树脂(Sigma)的柱上并用Flag肽(Sigma)洗脱。收集含Flag-hGDF11的级分并且随后上至用1x PBS平衡的Superdex200凝胶过滤柱(GE healthcare)上。然后将含Flag-hGDF11的级分汇集并且存储在-80℃。
实施例16
抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的表征(ELISA)
将未包被的ELISA平板(NUNC-IMMUNO平板MAXISORP表面，Nalge NuncInternational)用20μl的50nM链霉亲和素(GenScript)在室温包被2小时。然后将平板用PBST洗涤三次并用50μl 20％Blocking One(Nacalai Tesque)封闭过夜。在第二天，将平板的各孔与2nM/孔/20μl的生物素化的人潜伏性肌肉生长抑制因子或20nM/孔/20μl的生物素化的人潜伏性GDF11孵育2小时。在洗涤后，将20μl抗体样品添加至孔中并将平板静置1小时。将平板洗涤并加入稀释在HEPES缓冲的盐水中的20μl抗-人IgG-辣根过氧化物酶(HRP)(Abcam)，并将平板再静置一小时。将孔再次洗涤，然后将50μl ABTS(KPL)加至各孔，并将平板孵育1小时。在比色平板读数仪中在405nm检测信号。结合实验的结果显示在图12中。MST1032-G1m结合潜伏性肌肉生长抑制因子(即，成熟肌肉生长抑制因子和前肽的非共价复合物)，但是不结合hGDF11。这些结果显示MST1032-G1m特异性结合肌肉生长抑制因子，而非hGDF11。
实施例17
抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的表征
(HEK Blue测定(BMP1和自发活化))
将报告基因测定用于评估体外活性GDF11的生物学活性。表达Smad3/4-结合元件(SBE)诱导型SEAP报告基因的HEK-BlueTM TGF-β细胞(Invivogen)允许通过监测激活蛋白1型和2型受体的活化来检测生物活性的GDF11。活性GDF11刺激SEAP产生并分泌到细胞上清中。然后使用QUANTIBlueTM(Invivogen)评估分泌的SEAP的量。
将HEK-BlueTM TGF-β细胞保持在补充有10％胎牛血清，50μg/mL链霉素，50U/mL青霉素，100μg/mL NormocinTM，30μg/mL杀稻瘟素，200μg/mL HygroGoldTM和100μg/mLZeocinTM的DMEM培养基(Gibco)中。在功能测定期间，改变细胞至测定培养基(含0.1％牛血清清蛋白，链霉素，青霉素和NormocinTM的DMEM)并接种至96孔板。将人GDF11在存在或不存在重组人BMP1(Calbiochem)和抗-潜伏性的抗体(MST1032-G1m)的情况下在37℃孵育过夜。将样品混合物转移至细胞。在24小时孵育后，将细胞上清与QUANTIBlueTM混合并在比色平板读数仪中测量620nm的光密度。如图13所示，MST1032-G1m不阻止人GDF11的蛋白酶介导的或自发的活化并因此不能抑制SEAP分泌。
实施例18
进一步优化MS1032变体以增强清扫效果
作为pH依赖性抗体，MS1032LO01-SG1，在小鼠中显示优异的效力，通过将突变引入至抗体CDR中或通过改变框架区进行进一步优化以增加pH依赖性，增强到细胞中的摄取，增加稳定性等。在如上所述的BIACORE(注册商标)和/或HEK Blue测定中评估了超过一千种变体，并且制备了MS1032LO06-SG1，MS1032LO07-SG1，MS1032LO10-SG1，MS1032LO11-SG1，MS1032LO12-SG1，MS1032LO18-SG1，MS1032LO19-SG1，MS1032LO21-SG1，MS1032LO23-SG1，MS1032LO24-SG1，MS1032LO25-SG1，和MS1032LO26-SG1。这些制备的抗体的氨基酸和核苷酸序列显示在表11中。
[表11a]
[表11b]
在37℃使用BIACORE(注册商标)T200仪器(GE Healthcare)确定MS1032变体与人、食蟹猴(cyno)或小鼠潜伏性肌肉生长抑制因子在pH7.4和pH5.8的结合亲和力以评估pH对抗原结合的作用。使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)将ProA/G(Pierce)固定到CM4芯片的所有流动室上。在含20mM ACES，150mM NaCl，1.2mM CaCl2，0.05％Tween 20，0.005％NaN3的ACES pH7.4或pH5.8缓冲液中制备所有抗体和分析物。通过proA/G将各抗体捕获在传感器表面上。抗体捕获水平典型地为130至240共振单位(RU)。以3.125至50nM注射通过两倍连续稀释制备的人、食蟹猴和小鼠潜伏性肌肉生长抑制因子，之后解离。每个循环将传感器表面用10mM甘氨酸HCl pH1.5再生。通过使用BIACORE(注册商标)T200 Evaluation软件，2.0版本(GE Healthcare)处理和拟合数据至1:1结合模型来确定结合亲和力。
MS1032变体与人、食蟹猴(cyno)和小鼠潜伏性肌肉生长抑制因子在pH7.4和pH5.8的结合亲和力(KD)显示在表12中。所有变体显示5以上的KD比((pH5.8的KD)/(pH7.4的KD))，指示与潜伏性肌肉生长抑制因子的pH依赖性结合。
[表12]
实施例19
在HEK Blue测定中评估进一步优化的变体的中和活性
我们评估了MS1032LO06-SG1，MS1032LO07-SG1，MS1032LO10-SG1，MS1032LO11-SG1，MS1032LO12-SG1，MS1032LO18-SG1，MS1032LO19-SG1，MS1032LO21-SG1，MS1032LO23-SG1和MS1032LO25-SG1对人潜伏性肌肉生长抑制因子的中和活性，如实施例3中所述。如图14中所示，所有变体都显示与MS1032LO01-SG1相当的活性。
实施例20
在小鼠中非pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体和不同的pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体之间血浆总肌肉生长抑制因子浓度的比较
使用C.B-17SCID小鼠的体内测试
在将抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体在C.B-17SCID小鼠(In Vivos,Singapore)中施用后评估内源性肌肉生长抑制因子的体内积聚。将抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体(3mg/ml)以10ml/kg的单剂量施用到尾静脉中。在施用后5分钟，7小时，1天，2天，3天，7天，14天，21天，和28天收集血液。立即将收集的血液以14,000rpm在4℃离心10分钟以分离血浆。将分离的血浆存储在-80℃以下直至测量。测试的抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体为MS1032LO00-SG1，MS1032LO01-SG1，MS1032LO06-SG1，MS1032LO11-SG1，MS1032LO18-SG1，MS1032LO19-SG1，MS1032LO21-SG1和MS1032LO25-SG1。
通过电化学发光(ECL)测量血浆中的总肌肉生长抑制因子浓度
通过ECL测量总肌肉生长抑制因子在小鼠血浆中的浓度。通过将生物素化的抗-成熟肌肉生长抑制因子抗体RK35(如WO 2009/058346中所述)分配到MULTI-ARRAY 96孔链霉亲和素平板(Meso Scale Discovery)上并在室温在封闭缓冲液中孵育2小时来制备固定有抗-成熟肌肉生长抑制因子的平板。制备成熟肌肉生长抑制因子校正曲线样品和稀释40倍以上的小鼠血浆样品。将样品混合在酸性溶液(0.2M甘氨酸-HCl，pH2.5)中以使成熟肌肉生长抑制因子自其结合蛋白(如前肽)解离。随后，将样品添加至固定有抗-成熟肌肉生长抑制因子的平板，并且允许在室温结合1小时，之后洗涤。接着，加入SULFO TAG标记的抗-成熟肌肉生长抑制因子抗体RK22(如WO 2009/058346中所述)并将平板在室温孵育1小时，之后洗涤。立即将Read Buffer T(x4)(Meso Scale Discovery)加至平板并通过SECTOR Imager2400(Meso Scale Discovery)检测信号。基于校正曲线的响应，使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)计算成熟肌肉生长抑制因子浓度。通过该方法测量的静脉内施用抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体后血浆中总肌肉生长抑制因子浓度的时程显示在图15中。
在小鼠体内研究中pH依赖性的肌肉生长抑制因子结合对肌肉生长抑制因子积累的作用
使用非pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体(MS1032LO00-SG1)和不同的pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体(MS1032LO01-SG1，MS1032LO06-SG1，MS1032LO11-SG1，MS1032LO18-SG1，MS1032LO19-SG1，MS1032LO21-SG1和MS1032LO25-SG1)比较小鼠中pH依赖性对肌肉生长抑制因子积累的作用。引入pH依赖性显著加速肌肉生长抑制因子自SCID小鼠血浆的清除。如图15中所示，在第28天，相比于非pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体(MS1032LO00-SG1)，pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体(MS1032LO01-SG1，MS1032LO06-SG1，MS1032LO11-SG1，MS1032LO18-SG1，MS1032LO19-SG1，MS1032LO21-SG1和MS1032LO25-SG1)可以减少肌肉生长抑制因子积累。
实施例21
在食蟹猴中非pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体和具有pH-和Fc工程改造两者的抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体之间血浆总肌肉生长抑制因子浓度的比较
使用食蟹猴的体内测试
在将抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体在来自柬埔寨的2-4岁龄的成束猴(Macacafascicularis，食蟹猴)(Shin Nippon Biomedical Laboratories Ltd.,日本)中施用后评估内源性肌肉生长抑制因子的体内积聚。使用一次性注射器，延长管，置留针，和输液泵将30mg/kg的剂量水平注射到前臂的头静脉。用药速度为30分钟/身体。在开始用药前和在用药结束后5分钟，7小时和1，2，3，7，14，21，28，35，42，49和56天或在用药结束后5分钟和2，4和7小时和1，2，3，7，14，21，28，35，42，49和56天收集血液。利用含肝素钠的注射器自股静脉抽取血液。立即将血液在冰上冷却，并通过在4℃，1700xg离心10分钟获得血浆。将血浆样品存储在深冻冰箱中(可接受的范围：-70℃以下)直至测量。使用的抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体为MS1032LO00-SG1，MS1032LO06-SG1012，MS1032LO06-SG1016，MS1032LO06-SG1029，MS1032LO06-SG1031，MS1032LO06-SG1033，和MS1032LO06-SG1034(本文中，SG1012，SG1016，SG1029，SG1031，SG1033和SG1034是基于SG1构建的重链恒定区，如下所述)。
使用一次性注射器和置留针将2mg/kg剂量水平的抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体MS1032LO19-SG1079，MS1032LO19-SG1071，MS1032LO19-SG1080，MS1032LO19-SG1074，MS1032LO19-SG1081，和MS1032LO19-SG1077(本文中，SG1079，SG1071，SG1080，SG1074，SG1081，和SG1077是基于SG1构建的重链恒定区，如下所述)施用到前臂的头静脉或隐静脉中。在开始用药前和在用药结束后5分钟和2，4，和7小时和1，2，3，7，14天收集血液。如上所述地处理血液。将血浆样品存储在深冻冰箱中(可接受的范围：-70℃以下)直至测量。
通过电化学发光(ECL)测量血浆中的总肌肉生长抑制因子浓度
通过ECL测量猴血浆中总肌肉生长抑制因子的浓度，如实施例20中所述。通过该方法测量的静脉内施用抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体后血浆总肌肉生长抑制因子浓度的时程显示在图16中。
使用电化学发光(ECL)测量猴血浆中的ADA
将生物素化的药物包被在MULTI-ARRAY 96孔链霉亲和素平板(Meso ScaleDiscovery)上并在室温在低交叉缓冲液(low cross buffer)(Candor)中孵育2小时。将猴血浆样品在低交叉缓冲液中稀释20倍，之后添加至平板。将样品在4℃孵育过夜。第二天，将平板用洗涤缓冲液洗涤三次，之后添加SULFO TAG标记的抗猴IgG二抗(Thermo FisherScientific)。室温孵育一小时后，将平板用洗涤缓冲液洗涤三次。立即将Read Buffer T(x4)(Meso Scale Discovery)添加至平板并使用SECTOR Imager 2400(Meso ScaleDiscovery)检测信号。
pH依赖性和Fc工程改造对在猴体内肌肉生长抑制因子积累的作用
在食蟹猴中，施用非pH依赖性抗体(MS1032LO00-SG1)导致在第28天肌肉生长抑制因子浓度自基线的至少60倍增加。在第28天，pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体MS1032LO06-SG1012和MS1032LO06-SG1033分别导致自基线的3倍和8倍增加。强的清除主要归因于对食蟹猴Fcγ RIIb的亲和力的增加。在第28天，pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体MS1032LO06-SG1029，MS1032LO06-SG1031和MS1032LO06-SG1034可以清除抗原至低于基线。MS1032LO06-SG1029，MS1032LO06-SG1031和MS1032LO06-SG1034的强的清除的原因在于抗体正电荷簇增加所致的细胞中非特异性摄取的增加以及与Fcγ R的结合增强所致的Fcγ R介导的细胞摄取的增加。
在食蟹猴中，自第1天起，施用pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体MS1032LO19-SG1079，MS1032LO19-SG1071，MS1032LO19-SG1080，MS1032LO19-SG1074，MS1032LO19-SG1081和MS1032LO19-SG1077使肌肉生长抑制因子浓度降低至低于检出限(<0.25ng/mL)。在第14天，对于MS1032LO19-SG1079和MS1032LO19-SG1071，肌肉生长抑制因子的浓度增加至检出限以上，而对于MS1032LO19-SG1080，MS1032LO19-SG1074，MS1032LO19-SG1081和MS1032LO19-SG1077，肌肉生长抑制因子的浓度保持在检出限以下。MS1032LO19-SG1079和MS1032LO19-SG1071的较弱的抑制可能是由于pI突变的差异。
数据表明，肌肉生长抑制因子自血浆的强的清除可以通过提高与FcγRIIb的结合的突变或将增加抗体的正电荷和提高与Fcγ RIIb的结合的突变结合来实现。预期的是，在人中肌肉生长抑制因子的强的清除可以通过将增加抗体的正电荷和提高与Fcγ R的结合的突变结合来实现。
实施例22
抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的表位作图
制备另外的抗-人潜伏性肌肉生长抑制因子抗体用于其相应的结合表位的作图。将两只NZW兔免疫并收获，如实施例2中所述。针对其阻断BMP1介导的人潜伏性肌肉生长抑制因子的活化的能力，进一步筛选鉴定的1760个生产抗体的B-细胞系。简言之，将含分泌的抗体的B-细胞上清与人潜伏性肌肉生长抑制因子在存在重组人BMP1(R&D Systems)的情况下在37℃孵育过夜。然后将50μl反应混合物转移至被抗-成熟肌肉生长抑制因子抗体RK35(如WO 2009/058346中所述)包被的Meso Scale Discovery MULTI-ARRAY 96孔板。在室温振荡孵育1小时后，将平板与生物素化的抗-成熟肌肉生长抑制因子抗体RK22(如WO 2009/058346中所述)孵育，之后与带SULFO标签的链霉亲和素孵育。然后将Read Buffer T(x4)(Meso Scale Discovery)添加至平板并通过SECTOR Imager 2400(Meso ScaleDiscovery)检测ECL信号。选择显示不同水平的中和活性的94个细胞系用于下游分析(MST1495-MST1588)。克隆这些被选择的细胞系的可变区，如实施例2中所述，不同之处在于使用具有重链恒定区F1332m序列(SEQ ID NO:193)的表达载体。
进一步评估一组7个抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体(MST1032，MST1504，MST1538，MST1551，MST1558，MST1572和MST1573；这些抗体的氨基酸序列的序列标识符显示在表13中)对人潜伏性肌肉生长抑制因子活化的抑制活性。如图17中所示，所有抗体都能够以剂量依赖性方式抑制BMP1介导的人潜伏性肌肉生长抑制因子的活化。
[表13]
抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的氨基酸序列
选择在蛋白印迹法中表现良好的4个抗体用于表位作图。将人潜伏性肌肉生长抑制因子的N-端前肽编码区的片段克隆到pGEX4.1载体中，从而制备各自具有80个氨基酸重叠的100个氨基酸的带GST标签的前肽片段(图18A)。利用Overnight ExpressAutoinduction System(Merck Millipore)在转化的BL21感受态细胞中诱导蛋白表达并使用BugBuster蛋白提取试剂(Novagen)提取蛋白。通过如实施例6中所述的蛋白质印迹分析验证了约37kDa的所需蛋白片段的表达(抗-GST抗体(Abcam))(图18B)。当用抗-人潜伏性肌肉生长抑制因子抗体测试时，如图18C中所示，虽然全部4种抗体都能够抑制潜伏性肌肉生长抑制因子活化，但是其识别人潜伏性肌肉生长抑制因子上的不同表位。MST1032抗体可以检测前五个片段，在去除氨基酸81-100(SEQ ID NO:78)后没有检测到条带。MST1538和MST1572抗体都只结合前三个片段，在不存在SEQ ID NO:78的氨基酸41-60的情况下没有检测到条带。抗体MST1573仅与前两个片段有强烈结合，这表明其表位位于SEQ ID NO:78的氨基酸21-40内(图18D)。
实施例23
开发新的Fcγ RIIb增强的Fc变体
在该实施例中，说明用于增强肌肉生长抑制因子清除的Fc工程改造。
在WO 2013/125667中已经证明，可溶性抗原的清除可以通过其施用包含对FcγRIIb显示提高的亲和力的Fc结构域的抗原结合分子来增强。此外，在WO 2012/115241和WO2014/030728中已经举例说明了可以显示增强的对人Fcγ RIIb的结合的Fc变体。同样举例说明的是，这些Fc变体可以选择性地显示增强的对人Fcγ RIIb的结合和降低的对其他活性FcγR的结合。该选择性的Fcγ RIIb结合增强不仅可以对可溶性抗原的清除有利而且还可以对降低非所需的效应子功能和免疫应答的风险有利。
为了开发抗体药物，应当在药物对其具有药理学活性的非人动物中评估效力，药物动力学和安全性。如果其仅在人中有活性，必须考虑备选方法如使用替代抗体(Int.J.Tox.28:230-253(2009))。然而，使用替代抗体准确地预测人中Fc区和Fcγ R之间相互作用的效果并非易事，因为Fcγ R在非人动物中的表达模式和/或功能并不总是与人中相同。优选的是，抗体药物的Fc区对非人动物(特别是具有与人近似的Fcγ R表达模式和功能的食蟹猴)具有交叉反应性，以使在非人动物中获得的结果可以外推至人。
因此，在本研究中开发了对人和食蟹猴Fcγ R显示交叉反应性的Fc变体。
现有的Fcγ RIIb增强的Fc变体对人和猴Fcγ R的亲和力测量
通过在被称为M103205H795-SG1(VH，SEQ ID NO:86；CH，SEQ ID NO:9)的MS1032LO06-SG1的重链中用Asp置换EU编号位置238处的Pro来制备WO 2012/115241公开的人Fcγ RIIb增强变体(本文中，"Fcγ RIIb增强"是指"具有增强的Fcγ RIIb-结合活性")的重链基因。所得的重链被称为M103205H795-MY009(VH，SEQ ID NO:86；CH，SEQ ID NO:252)。作为抗体轻链，使用M103202L889-SK1(VL，SEQ ID NO:96；CL，SEQ ID NO:10)。根据实施例30中所示的方法表达重组抗体。
用以下方式制备Fcγ R的胞外结构域。通过本领域技术人员已知的方法基于NCBI中登记的信息进行人Fcγ R胞外结构域基因的合成。具体地，分别地，Fcγ RIIa是基于NCBI编号NM_001136219.1的序列，Fcγ RIIb是基于NM_004001.3，Fcγ RIIIa是基于NM_001127593.1。分别根据关于FcγRIIa(J.Exp.Med.172:19-25(1990))和Fcγ RIIIa(J.Clin.Invest.100(5):1059-1070(1997))的多态性的报道制备Fcγ RIIa和Fcγ RIIIa的同种异型。通过使用本领域技术人员已知的方法克隆来自食蟹猴的各Fcγ R的cDNA，进行食蟹猴Fcγ R胞外结构域基因的合成。构建的Fcγ R胞外结构域的氨基酸序列显示在序列表中：(SEQ ID NO 210为人Fcγ RIIaR，SEQ ID NO 211为人Fcγ RIIaH，SEQ ID NO 214为人Fcγ RIIb，SEQ ID NO 217为人Fcγ RIIIaF，SEQ ID NO 218为人Fcγ RIIIaV，SEQID NO 220为食蟹猴Fcγ RIIa1，SEQ ID NO 221为食蟹猴Fcγ RIIa2，SEQ ID NO 222为食蟹猴Fcγ RIIa3，SEQ ID NO 223为食蟹猴Fcγ RIIb，SEQ ID NO 224为食蟹猴FcγRIIIaS)。然后将His标签添加到其C-端并将获得的各基因插入到被设计成用于哺乳动物细胞表达的表达载体中。所述表达载体被引入到来源于人胚肾细胞的FreeStyle293细胞(Invitrogen)中以表达靶蛋白。在培养后，将所得的培养物上清过滤并且原则上通过以下四步纯化。进行使用SP Sepharose FF的阳离子交换色谱法作为第一步，针对His标签的亲和色谱法(HisTrap HP)作为第二步，凝胶过滤柱色谱法(Superdex200)作为第三步，并且无菌过滤作为第四步。使用分光光度计测量纯化的蛋白在280nm的吸光度并且使用通过PACE法计算的消光系数，确定纯化的蛋白的浓度(Protein Science 4:2411-2423(1995))。
这些抗体和Fcγ R之间相互作用的动力学分析使用BIACORE(注册商标)T200或BIACORE(注册商标)4000(GE Healthcare)进行。将HBS-EP+(GE Healthcare)用作运行缓冲液，并将测量温度设定为25℃。使用通过胺偶联法通过将蛋白A，蛋白A/G或小鼠抗-人IgGκ轻链(BD Biosciences)固定在Series S Sensor Chip CM4或CM5(GE Healthcare)上制备的芯片。将目的抗体捕获在该芯片上以与已用运行缓冲液稀释的各Fcγ R相互作用，并且测量与抗体的结合。在测量后，通过允许与10mM甘氨酸-HCl，pH1.5和25mM NaOH反应将芯片上捕获的抗体洗去以使芯片再生并重复使用。通过1:1Langmuir结合模型使用BIACORE(注册商标)Evaluation Software分析作为测量结果获得的感应图以计算结合速率常数ka(L/mol/s)和解离速率常数kd(1/s)，并由这些值计算解离常数KD(mol/L)。因为MS1032LO06-MY009与人Fcγ RIIaH，人Fcγ RIIIaV和食蟹猴Fcγ RIIIaS的结合弱，所以动力学参数如KD无法由以上提及的分析方法计算。关于所述相互作用，使用BIACORE(注册商标)T100Software Handbook BR1006-48Edition AE中描述的以下1:1结合模型计算KD值。
根据BIACORE(注册商标)上的1:1结合模型的相互作用分子的表现可以由等式1描述：Req＝C x R max/(KD+C)+RI，其中，Req是稳态结合水平对分析物浓度的图，C是浓度，RI是样品中的本体折射率(bulk refractive index)分布，并且Rmax是表面的分析物结合能力。当将该等式重排时，KD可以表示为等式2：KD＝C x Rmax/(Req-RI)-C。KD可以通过将Rmax，RI和C的值替换到等式1或等式2中来计算。由目前的测量条件，可以使用RI＝0，C＝2μMol/L。此外，将当使用1:1Langmuir结合模型全面拟合作为分析各Fcγ R与IgG1的相互作用的结果获得的感应图时获得的Rmax值除以捕获的SG1的量，将其乘以捕获的MY009的量，并将所得的值用作Rmax。该计算是基于这样的假设，即对于通过将突变引入到SG1中制备的所有变体，可以被SG1结合的各Fcγ R的极限量保持不变，并且测量时的Rmax与测量时芯片上结合的抗体的量成比例。Req被定义为测量时观察到的各Fcγ R与传感器芯片上的各变体结合的量。
表14显示SG1和MY009对人和食蟹猴Fcγ R的动力学分析的结果。填充以灰色的格中的KD值使用[等式2]计算，因为其亲和力过弱而不能通过动力学分析正确地确定。KD倍数值通过将对各Fcγ R的SG1的KD值除以变体KD的值来计算。
如表14中所示，人Fcγ RIIb增强变体MY009不显示增强的与食蟹猴Fcγ RIIb的结合而是显示增强的与人Fcγ RIIb的结合。其对食蟹猴Fcγ RIIb的亲和力相比于SG1减小0.4倍，指示人Fcγ RIIb增强变体MY009对食蟹猴Fcγ R不具有交叉反应性。
开发对人和食蟹猴Fcγ RIIb两者都显示增强的结合的新的Fc变体
理想地，新的Fc变体应当选择性地具有增强的与人和食蟹猴Fcγ RIIb两者的结合和减弱的与其他活性Fcγ R的结合。然而，因为推测的食蟹猴Fcγ RIIb中的Fc结合残基与食蟹猴Fcγ RIIa的任一同种异型完全相同(图19)，理论上不可能实现食蟹猴Fcγ RIIb结合相对于食蟹猴Fcγ RIIa的选择性增强。因此，新的Fc变体应当选择性地具有增强的与人Fcγ RIIb，食蟹猴Fcγ RIIb和食蟹猴Fcγ RIIa的结合。
为了获得显示选择性增强的与人和食蟹猴Fcγ RIIb两者的结合的新的Fc变体，使用WO 2012/115241中进行的广泛性诱变研究的结果。在广泛性诱变研究中，将广泛性的突变引入到IgG1抗体的Fcγ R结合区中的所有位置，并且全面分析与各Fcγ R的结合，如以下过程中所示。
[表14]
包含作为WO 2009/041062中公开的具有改善的血浆动力学的抗-磷脂酰肌醇聚糖3抗体的GpH7的CDR的磷脂酰肌醇聚糖3抗体的可变区被用作抗体重链可变区(GpH7：SEQ IDNO:225)。类似地，对于抗体轻链，使用WO 2009/041062中公开的具有改善的血浆动力学的磷脂酰肌醇聚糖3抗体的GpL16-k0(SEQ ID NO:226)。此外，B3(SEQ ID NO:228)被用作抗体H链恒定区，在B3中K439E突变被引入到通过去除IgG1的C端Gly和Lys制备的G1d(SEQ IDNO:227)中。通过将GpH7和B3融合制备的该重链被称为GpH7-B3(VH，SEQ ID NO:225；CH，SEQID NO:228)。
关于GpH7-B3，被认为参与Fcγ R结合的氨基酸残基及周围的氨基酸残基(位置234至239，265至271，295，296，298，300，和324至337，根据EU编号)各自被18种氨基酸残基(不包括原来的氨基酸残基和Cys)置换。这些Fc变体被称为B3变体。表达B3变体并且如下地全面评估蛋白-A纯化的抗体与各Fcγ R(Fcγ RIIa类型H，Fcγ RIIa类型R，Fcγ RIIb，和Fcγ RIIIaF)的结合。使用BIACORE(注册商标)T100(GE Healthcare)，BIACORE(注册商标)T200(GE Healthcare)，BIACORE(注册商标)A100，或BIACORE(注册商标)4000进行如以上提及地制备的各改变的抗体和Fcγ受体之间相互作用的分析。将HBS-EP+(GE Healthcare)用作运行缓冲液，并将测量温度设定为25℃。使用通过胺偶联方法通过将蛋白A(ThermoScientific)，蛋白A/G(Thermo Scientific)，或蛋白L(ACTIGEN或BioVision)固定到Series S传感器芯片CM5或CM4(GE Healthcare)上制备的芯片。在将目的抗体捕获到这些传感器芯片上后，允许用运行缓冲液稀释的Fcγ受体相互作用，测量与抗体结合的量。然而，因为结合的Fcγ受体的量取决于捕获的抗体的量，所以将结合的Fcγ受体的量除以捕获的各抗体的量以获得修正的值，并且比较这些值。此外，将捕获在芯片上的抗体用10mM甘氨酸-HCl，pH1.5洗涤，并将芯片再生和重复利用。将各B3变体的FcγR结合量的值除以亲本B3抗体(在根据EU编号的位置234至239，265至271，295，296，298，300，和324至337具有天然存在的人IgG1的序列的抗体)的Fcγ R结合量的值。将通过将该值乘以100获得的值用作各变体的相对Fcγ R-结合活性的指示。
表15显示基于以下标准(与亲本B3抗体相比，对人Fcγ RIIb超过40％，对人FcγRIIaR和Fcγ RIIaH低于100％，对人Fcγ RIIIaF低于10％)选择的有希望的置换的结合特征。
[表15]
选择的置换对人Fcγ R的结合特征
在接下来的步骤中，评估这些置换对食蟹猴Fcγ R的交叉反应性。将这16个突变引入到M103205H795-SG1中。使用M103202L889-SK1作为轻链表达所述变体并分析其对食蟹猴Fcγ RIIa1，IIa2，IIa3，IIb，IIIaS的亲和力。
表16显示这16个变体对食蟹猴Fcγ R的结合特征。Fcγ R结合量的值通过将结合的Fcγ R的量除以捕获的各抗体的量获得。将该值用作为100的SG1的值进一步标准化。
[表16]
选择的置换对食蟹猴Fcγ R的结合特征
在选择的16个Fc变体中，仅MY001与食蟹猴Fcγ RIIb的结合保持为与SG1相比的85％。此外，MY001显示减弱的与食蟹猴Fcγ RIIIaS的结合而其与食蟹猴Fcγ RIIa1，IIa2和IIa3的结合得以保持。因此，G236N突变是唯一的对人和食蟹猴Fcγ R两者显示类似结合特征的置换。
虽然G236N置换显示对人和食蟹猴Fcγ R两者的交叉反应性，但是其对Fcγ RIIb的亲和力低于SG1(分别地，对人Fcγ RIIb为75％，对食蟹猴Fcγ RIIb为85％)。为了增加其对Fcγ RIIb的亲和力，评估另外的置换。具体地，基于广泛性诱变研究的结果选择显示增强的对人Fcγ RIIb的结合，减弱的对人Fcγ RIIIa的结合和相对于人Fcγ RIIa增强的对人Fcγ RIIb的选择性的置换(表17)。
[表17]
另外选择的置换对人Fcγ R的结合特征
在这些置换中，因为相对于人Fcγ RIIa提高的对人Fcγ RIIb的选择性而选择L234W和L234Y。并且因为减弱的对人Fcγ RIIIa的结合而选择G236A，G236S，A330R，A330K和P331E。因为增强的与人Fcγ RIIb的结合而选择所有其他置换。评估所选的置换对食蟹猴Fcγ R的交叉反应性。此外，还评估三种置换，P396M，V264I和E233D。将所述置换引入到M103205H795-SG1中并使用M103202L889-SK1作为轻链表达所述变体。
表18显示包括G236N在内的所选的置换对人和食蟹猴Fcγ R两者的动力学分析。具体地，将置换引入到M103205H795-SG1中。使用M103202L889-SK1作为轻链表达所述变体，并分析其对食蟹猴Fcγ RIIa1，IIa2，IIa3，IIb，IIIaS的亲和力。
填充以灰色的格子中的KD值使用[等式2]计算，因为其亲和力过弱而不能通过动力学分析正确确定。KD倍数的值通过将对各Fcγ R的SG1的KD值除以变体的KD值获得。
G236N显示与SG1相当的对食蟹猴Fcγ RIIa1，食蟹猴Fcγ RIIa2，食蟹猴FcγRIIa3和食蟹猴Fcγ RIIb的结合亲和力。虽然对人Fcγ RIIb的亲和力减小至0.6倍，但对人Fcγ RIIaH和人Fcγ RIIaR的亲和力分别减小至0.2倍和0.1倍，指示该置换对人FcγRIIb的选择性比对人Fcγ RIIa更高。此外，其对食蟹猴Fcγ RIIIaS和人Fcγ RIIIaV的亲和力分别为0.03倍和0.04倍，这对消除ADCC活性是有利的。基于该结果，G236N显示几乎理想的对人和食蟹猴Fcγ R的交叉反应性(虽然其对人和食蟹猴Fcγ RIIb两者的亲和力都应当被增强)。
在评估的另外的置换中，S298L，G236A，P331E，E233D，K334Y，K334M，L235W，S239V，K334I，L234W，K328T，Q295L，K334V，K326T，P396M，I332D，H268E，P271G，S267A和H268D显示增强的与人和食蟹猴Fcγ RIIb两者的结合。具体地，H268D显示最明显的效果(对人FcγRIIb为7倍，对食蟹猴Fcγ RIIb为5.3倍)。关于Fcγ RIIIa结合的减弱作用，G236S，A330K和G236D显示的亲和力低于SG1的0.5倍。
为了增强MY001对人和食蟹猴Fcγ RIIb两者的亲和力，评估表18中列出的置换的组合。具体地，将置换引入到M103205H795-SG1中。使用M103202L889-SK1作为轻链表达所述变体并分析其亲和力。表19显示针对人和食蟹猴Fcγ R的动力学分析的结果。填充以灰色的格子中的KD值使用[等式2]计算，因为其亲和力过弱而不能通过动力学分析正确地确定。KD倍数的值通过将SG1对各Fcγ R的KD值除以变体对各Fcγ R的KD值获得。
[表18]
[表19]
所有变体都抑制与人Fcγ RIIIaV的亲和力(与SG1相比小于0.26倍)并且抑制与食蟹猴Fcγ RIIIaS的亲和力(与SG1相比小于0.42倍)。此外，所有变体(除了MY047，MY051和MY141以外)都成功地显示与MY001相比增强的与人和食蟹猴Fcγ RIIb两者的结合并且其人Fcγ RIIa结合保持为与SG1相比小于2倍。其中，MY201，MY210，MY206，MY144，MY103，MY212，MY105，MY205，MY109，MY107，MY209，MY101，MY518，MY198和MY197显示与SG1相比增强超过4倍的与人和食蟹猴Fcγ RIIb两者的结合。最重要地，MY205，MY209，MY198和MY197显示增强超过7倍的与人和食蟹猴Fcγ RIIb两者的结合。
WO2014030728中显示，CH3结构域中位置396的置换增强了对人Fcγ RIIb的亲和力。将广泛性诱变引入含G236N/H268E/P396M置换的M103205H795-MY052的位置396中。使用M103202L889-SK1作为轻链表达所得的变体并评估其对人和食蟹猴Fcγ R的亲和力(表20)。KD倍数的值通过将SG1对各Fcγ R的KD值除以变体对各Fcγ R的KD值获得。
在测试的置换中，P396I，P396K和P396L保持与SG1相比超过5倍的人Fcγ RIIb结合，并且与MY052相比仅P396L置换增强了对人Fcγ RIIb的亲和力。关于与食蟹猴FcγRIIb的结合，亲本MY052显示最高的亲和力，其比SG1增加3.9倍。
因为G236N显示理想的对人和食蟹猴Fcγ R的交叉反应性，所以测试在之前的实施例中未评估的位置236上的其他置换。具体地，将M103205H795-MY201中的Asn置换成Met，His，Val，Gln，Leu，Thr和Ile。使用M103202L889-SK1作为轻链表达所得的变体并评估其对人和食蟹猴Fcγ R的亲和力(表21)。填充以灰色的格子中的KD值使用[等式2]计算，因为其亲和力过弱而不能通过动力学分析正确地确定。KD倍数的值通过将SG1对各Fcγ R的KD值除以变体对各Fcγ R的KD值获得。
[表20]
[表21]
[表22]
虽然所有变体与亲本MY201相比都显示减弱的对人和食蟹猴Fcγ RIIb两者的亲和力，但是通过在MY201的位置236处用Thr置换Asn制备的MY265与SG1相比保持增强的结合，分别地，对人Fcγ RIIb为2.1倍，对食蟹猴Fcγ RIIb为3.1倍。MY265还保持减弱的与人和食蟹猴FcγRIIIa两者的结合。虽然与SG1相比对人Fcγ RIIaH和Fcγ RIIaR的亲和力增强了超过2.5倍，但是在位置236处G236T是第二优选的。
为了提高MY265对人Fcγ RIIb的选择性和亲和力，在位置231和232中进行广泛性诱变研究。具体地，将M103205H795-MY265的位置231和232置换成不包括原来的氨基酸和Cys在内的18种氨基酸残基。使用M103202L889-SK1作为轻链表达所得的变体并评估其对人和食蟹猴Fcγ R的亲和力(表22)。KD倍数的值通过将SG1对各Fcγ R的KD值除以变体对各Fcγ R的KD值获得。
关于对Fcγ RIIb的亲和力，与亲本MY265相比，A231T，A231M，A231V，A231G，A231F，A231I，A231L，A231，A231W，P232V，P232Y，P232F，P232M，P232I，P232W，P232L的加入提高了与人和食蟹猴Fcγ RIIb两者的结合。最重要地，与MY265相比，A231T和A231G的加入减弱人Fcγ RIIaR结合。
评估在之前的实施例中未评估的置换的组合。将经测试并表现为有希望的置换组合地引入到M103205H795-SG1中。使用M103202L889-SK1作为轻链表达所得的变体并评估其对人和食蟹猴Fcγ R的亲和力。表23显示了结果，并且填充以灰色的格子中的KD值使用[等式2]计算，因为其亲和力过弱而不能通过动力学分析正确地确定。KD倍数的值通过将SG1对各Fcγ R的KD值除以变体对各Fcγ R的KD值获得。表19中作为有希望的变体被选择的MY209的值被再次显示以用于比较。
在测试的变体中，与MY209相比，仅MY213显示较高的对人和食蟹猴Fcγ RIIb两者的结合亲和力。然而，MY213对人Fcγ RIIaH和人Fcγ RIIaR的亲和力比MY209的高。
[表23A]
[表23B]
[表24]
实施例24
在全人Fcγ R转基因小鼠中使用Fcγ RIIb增强的Fc变体评估肌肉生长抑制因子的清除
在其中所有鼠Fcγ R已被缺失并且作为转基因编码的人Fcγ R已被插入到小鼠基因组中的小鼠中，评估实施例23中构建的Fcγ RIIb增强的Fc变体对肌肉生长抑制因子清除的作用(Proc.Natl.Acad.Sci.,2012,109,6181)。在该小鼠中，所有小鼠Fcγ R都被置换成人Fcγ R从而可以在小鼠中评估对人Fcγ RIIb的亲和力增强对可溶性抗原清除的作用。此外，结合实施例23中构建的Fcγ RIIb增强的Fc变体来评估提高pI的置换。
测试变体的制备和特征
测试的8个抗体及其结合特征概述在表24中。重链，MS103205H795-PK2，通过将提高pI的置换(S400R/D413K)引入到MS103205H795-MY101中来制备。MS103205H795-MY351，MS103205H795-MY344，MS103205H795-MY335通过分别将另一种提高pI的置换(Q311R/D413K)引入到MS103205H795-MY201，MS103205H795-MY205，MS103205H795-MY265中来制备。根据实施例23所示的方法以M103202L889-SK1作为轻链表达所有MS1032LO06变体并使用实施例23中的方法评估其对人和食蟹猴Fcγ R的亲和力。
基于表24中概述的SPR分析，确认的是，提高pI的置换不影响Fcγ RIIb增强的Fc变体的Fcγ R结合。MY101和通过将S400R/D413K引入到MY101中制备的PK2分别显示增强9倍和8倍的人Fcγ RIIb结合。MY101和PK2对人Fcγ RIIa的亲和力保持与SG1相当。关于其他人和食蟹猴Fcγ R，其显示几乎相同的结合特征。类似地，分别地，MY351显示与亲本MY201类似的结合特征，MY344显示与亲本MY205类似的结合特征，MY335显示与亲本MY265类似的结合特征(表21)。这些结果表明任一对提高pI的置换，S400R/D413K或Q311R/D413K，都不影响对人和食蟹猴Fcγ R的亲和力。
全人Fcγ R转基因小鼠中的PK研究
使用全人Fcγ R转基因小鼠的体内测试
在将抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体和人潜伏性肌肉生长抑制因子共同施用在全人Fcγ R转基因小鼠中后，在体内评估肌肉生长抑制因子和抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的消除(图20和21)。将抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体(0.3mg/ml)和潜伏性肌肉生长抑制因子(0.05mg/ml)以10ml/kg的单剂量施用到尾静脉中。以10ml/kg的剂量三次(每10天一次)将抗-CD4抗体(1mg/ml)施用到尾静脉中以抑制抗-药物抗体。在施用后5分钟，15分钟，1小时，4小时，7小时，1天，2天，7天，14天，21天和28天收集血液。立即将收集的血液以15,000rpm在4℃离心5分钟以分离血浆。将分离的血浆存储在-20℃以下直至测量。使用的抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体为MS1032LO06-SG1，MS1032LO06-MY101，MS1032LO06-PK2，MS1032LO06-MY201，MS1032LO06-MY351，MS1032LO06-MY205，MS1032LO06-MY344和MS1032LO06-MY335。
通过电化学发光(ECL)测量血浆中的总肌肉生长抑制因子浓度
通过ECL测量小鼠血浆总肌肉生长抑制因子的浓度。通过将抗-成熟肌肉生长抑制因子抗体RK35(WO 2009058346)分配在MULTI-ARRAY 96孔板(Meso Scale Discovery)上并在4℃孵育过夜来制备固定有抗-成熟肌肉生长抑制因子抗体的平板。制备成熟肌肉生长抑制因子校正曲线样品和稀释4倍以上的小鼠血浆样品。将样品混合在酸性溶液(0.2M甘氨酸-HCl，pH2.5)中以使成熟肌肉生长抑制因子自其结合蛋白(如前肽)解离。随后，将样品添加到固定有抗-成熟肌肉生长抑制因子抗体的平板上，并允许在室温结合1小时，之后洗涤。接着，添加BIOTIN TAG标记的抗-成熟肌肉生长抑制因子抗体RK22(WO 2009/058346)并将平板在室温孵育1小时，之后洗涤。接着，加入SULFO TAG标记的链霉亲和素(Meso ScaleDiscovery)并将平板在室温孵育1小时，之后洗涤。立即将Read Buffer T(x4)(Meso ScaleDiscovery)添加至平板并通过SECTOR Imager 2400(Meso Scale Discovery)检测信号。基于校正曲线的响应，使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)计算成熟肌肉生长抑制因子浓度。通过该方法测量的在静脉内施用抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体和潜伏性肌肉生长抑制因子后血浆中总肌肉生长抑制因子浓度的时程显示在图20中。
通过高效液相色谱-电喷雾串联质谱(LC/ESI-MS/MS)测量血浆中的抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体浓度
通过LC/ESI-MS/MS测量小鼠血浆中的抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体浓度。在小鼠血浆中，校正标准物的浓度为1.56 25，3.125，6.25，12.5，25，50，100和200μg/mL。将3μl校正标准物和血浆样品添加至50μl Ab-Capture Mag(ProteNova)，并允许在室温孵育2小时。之后，将磁珠自样品回收并且用0.2mL 10mmol/L PBS(含0.05％Tween 20)洗涤两次。随后，将磁珠用10mmol/L PBS洗涤以保证除去Tween 20。在洗涤后，将磁珠悬浮在25μl的7.5mol/L尿素，8mmol/L二硫苏糖醇和在50mmol/L碳酸氢铵中的1μg/mL溶菌酶(鸡蛋清)中并将悬浮的样品在56℃孵育45分钟。然后，加入2μl的500mmol/L碘乙酰胺并将样品在37℃在暗处孵育30分钟。接着，通过加入150μl的在50mmol/L碳酸氢铵中的0.67μg/mL用于生化的赖氨酰内肽酶(Lysyl Endopeptidase for Biochemistry，Wako)并将样品在37℃孵育3小时进行赖氨酰内肽酶消化。随后，通过加入10μl的在50mmol/L碳酸氢铵中的10μg/mL测序级修饰胰蛋白酶(Promega)进行胰酶消化。允许样品在混合下在37℃过夜消化，并且通过加入5μl 10％三氟乙酸猝灭。对50μl的消化样品进行通过LC/ESI-MS/MS的分析。使用配备有2D I-class UPLC(Waters)的Xevo TQ-S三重四极(triple quadrupole)仪器(Waters)进行LC/ESI-MS/MS。抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体特异性肽YAFGQGTK和作为内标的溶菌酶特异性肽GTDVQAWIR通过选择的反应监测(SRM)来监测。SRM跃迁对抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体为[M+2H]2+(m/z 436.2)至y8离子(m/z 637.3)，并且对溶菌酶为[M+2H]2+(m/z523.3)至y8离子(m/z 545.3)。通过加权(1/x或1/x2)线性回归，使用针对浓度作图的峰面积来构建内部校正曲线。由校正曲线使用分析软件Masslynx Ver.4.1(Waters)计算小鼠血浆中的浓度。通过该方法测量的静脉内施用抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体和潜伏性肌肉生长抑制因子血浆中抗体后浓度的时程显示在图21中。
pI和Fcγ R结合对体内肌肉生长抑制因子浓度的作用
在施用MS1032LO06-SG1后，与5分钟时的血浆总肌肉生长抑制因子浓度相比，7小时时的血浆总肌肉生长抑制因子浓度降低5倍。相反，在施用MS1032LO06-MY101，MS1032LO06-MY201和MS1032LO06-MY205后，与5分钟时的血浆总肌肉生长抑制因子浓度相比，7小时时的血浆总肌肉生长抑制因子浓度减小28-200倍。此外，在施用MS1032LO06-PK2，MS1032LO06-MY351，MS1032LO06-MY344和MS1032LO06-MY335后，与5分钟时的血浆总肌肉生长抑制因子浓度相比，7小时时的血浆总肌肉生长抑制因子浓度减小361-419倍。另一方面，与MS1032LO06-SG1相比，各抗体在各取样点的浓度差异大约在2倍内，并且pI变体不提高抗体从血浆中的消除。人Fcγ RIIb结合增强抗体和提高pI的置换都使肌肉生长抑制因子的消除增加，但不使抗体的消除增加。
高pI变体在血浆中具有更多的正电荷。因为该正电荷与细胞表面的负电荷相互作用，所以高pI变体的抗原-抗体免疫复合物与细胞表面变得更接近，从而导致高pI变体的抗原-抗体免疫复合物的细胞摄取增加。
实施例25
在猴中使用Fcγ RIIb增强的Fc变体评估肌肉生长抑制因子的清除
在食蟹猴中评估实施例23中开发的Fc变体与食蟹猴Fcγ RIIb的增强的结合对肌肉生长抑制因子清除的作用。并且还评估与提高pI的置换的组合作用。
测试变体的制备和特征
测试的14种抗体及其结合特征概述在表25中。据报道，在酸性pH具有增强的与FcRn的结合的Fc变体增长抗体的体内半衰期(J.Biol.Chem.2006 281:23514-23524(2006)；Nat.Biotechnol.28:157-159(2010),Clin Pharm.&Thera.89(2):283-290(2011))。为了增长抗体半衰期而不结合类风湿因子，我们将这些置换与Fcγ RIIb增强和pI提高的Fc变体组合。
重链，MS103205H795-SG1012，MS103205H795-SG1029，MS103205H795-SG1031，MS103205H795-SG1033，MS103205H795-SG1034分别通过将N434A置换引入到MS103205H795-MY101，MS103205H795-MY344，MS103205H795-MY351，MS103205H795-MY201，MS103205H795-MY335中来制备。MS103205H795-SG1016通过将提高pI的置换(Q311R/D399K)引入到MS103205H795-SG1012中来制备。MS103240H795-SG1071和MS103240H795-SG1079分别通过将M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E置换和N434A/Q438R/S440E置换引入到MS103240H795-MY344中来制备(MS103240H795：VH，SEQ ID NO；92)。
MS103240H795-SG1074和MS103240H795-SG1077分别通过将提高pI的置换Q311R/P343R和M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E置换引入到MS103240H795-MY209和MS103240H795-MY518中来制备。MS103240H795-SG1080和MS103240H795-SG1081分别通过将提高pI的置换Q311R/P343R和N434A/Q438R/S440E置换引入到MS103240H795-MY209和MS103240H795-MY518中来制备。MS103240H795-SG1071通过将提高pI的置换Q311R/D413K和M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E置换引入到MS103240H795-MY205中来制备。MS103240H795-SG1079通过将提高pI的置换Q311R/D413K和N434A/Q438R/S440E置换引入到MS103240H795-MY205中来制备。根据实施例30中所示的方法，分别利用M103202L889-SK1和M103202L1045-SK1(M103202L1045：VL，SEQ ID NO:97)作为轻链表达这些MS1032LO06变体和MS1032LO19变体，并使用实施例23中的方法评估其对人和食蟹猴Fcγ R的亲和力。在该实施例中，各Fc变体的KD倍数值通过将亲本SG1对各Fcγ R的KD值除以变体对各Fcγ R的KD值来计算。例如，MS1032LO06-SG1012和MS1032LO19-SG1071的KD倍数值分别通过将MS1032LO06-SG1和MS1032LO19-SG1的KD值除以MS1032LO06-SG1012和MS1032LO19-SG1071的KD值来计算。
[表25]
SPR分析结果概述在表25中。在这些变体中，SG1012，SG1016，SG1074和SG1080显示最强的对人Fcγ RIIb的亲和力，其与SG1相比具有的对人Fcγ RIIb的亲和力增强10倍。
29.2.猴中的PK研究
使用食蟹猴的体内测试
在将抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体在来自柬埔寨的2-4岁龄的成束猴(食蟹猴)(Shin Nippon Biomedical Laboratories Ltd.,日本)中施用后在体内评估内源性肌肉生长抑制因子的积聚。使用一次性注射器，延长管，置留针和输液泵将30mg/kg的剂量水平注射到前臂的头静脉中。用药速度为30分钟/身体。在开始用药前和在用药结束后5分钟，7小时和1，2，3，7，14，21，28，35，42，49和56天或在用药结束后5分钟和2，4和7小时和1，2，3，7，14，21，28，35，42，49和56天收集血液。用含肝素钠的注射器自股静脉抽取血液。立即将血液在冰上冷却，并通过在4℃，1700xg离心10分钟获得血浆。将血浆样品存储在深冻冰箱(可接受的范围：-70℃以下)中直至测量。使用的抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体为MS1032LO00-SG1，MS1032LO06-SG1012，MS1032LO06-SG1016，MS1032LO06-SG1029，MS1032LO06-SG1031，MS1032LO06-SG1033和MS1032LO06-SG1034(本文中，SG1012，SG1016，SG1029，SG1031，SG1033和SG1034是如下所述基于SG1构建的重链恒定区)。
对于抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体MS1032LO19-SG1079，MS1032LO19-SG1071，MS1032LO19-SG1080，MS1032LO19-SG1074，MS1032LO19-SG1081，和MS1032LO19-SG1077(本文中，SG1079，SG1071，SG1080，SG1074，SG1081和SG1077是如下所述基于SG1构建的重链恒定区)，使用一次性注射器和置留针将2mg/kg的剂量水平施用到前臂的头静脉或隐静脉中。在开始用药前和在用药结束后5分钟和2，4，和7小时和1，2，3，7，14天收集血液。如上所述地处理血液。将血浆样品存储在深冻冰箱(可接受的范围：-70℃以下)中直至测量。
通过电化学发光(ECL)测量血浆中的总肌肉生长抑制因子浓度
通过ECL测量猴血浆中的总肌肉生长抑制因子浓度，如实施例20中所述。通过该方法测量的静脉内施用抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体后血浆总肌肉生长抑制因子浓度的时程显示在图22中。
使用电化学发光(ECL)测量猴血浆中的ADA
将生物素化的药物包被在MULTI-ARRAY 96孔链霉亲和素平板(Meso ScaleDiscovery)上并在低交叉缓冲液(Candor)中在室温孵育2小时。将猴血浆样品在低交叉缓冲液中稀释20倍，之后添加到平板中。将样品在4℃孵育过夜。第二天，将平板用洗涤缓冲液洗涤三次，之后添加SULFO TAG标记的抗猴IgG二抗(Thermo Fisher Scientific)。在室温孵育一小时后，将平板用洗涤缓冲液洗涤三次。立即将Read Buffer T(x4)(Meso ScaleDiscovery)加至平板并且使用SECTOR Imager 2400(Meso Scale Discovery)检测信号。
猴体内pH依赖性和Fc工程改造对肌肉生长抑制因子积累的作用
在食蟹猴中，施用非pH依赖性抗体(MS1032LO00-SG1)在第28天导致肌肉生长抑制因子浓度自基线增加至少60倍。在第28天，pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体MS1032LO06-SG1012和MS1032LO06-SG1033分别导致自基线增加3倍和8倍。强的清除主要归因于对食蟹猴Fcγ RIIb的亲和力增加。在第28天，pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体MS1032LO06-SG1029，MS1032LO06-SG1031和MS1032LO06-SG1034可以清除抗原至低于基线。MS1032LO06-SG1029，MS1032LO06-SG1031和MS1032LO06-SG1034的强清除的原因在于由于抗体正电荷簇增加所致的细胞中非特异性摄取增加以及由于与Fcγ R的结合增强所致的Fcγ R介导的细胞摄取增加。
在食蟹猴中，自第1天起，施用pH依赖性抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体MS1032LO19-SG1079，MS1032LO19-SG1071，MS1032LO19-SG1080，MS1032LO19-SG1074，MS1032LO19-SG1081和MS1032LO19-SG1077使肌肉生长抑制因子浓度降低至低于检出限(<0.25ng/mL)。在第14天，对于MS1032LO19-SG1079和MS1032LO19-SG1071，肌肉生长抑制因子的浓度增加至检出限以上，而对于MS1032LO19-SG1080，MS1032LO19-SG1074，MS1032LO19-SG1081和MS1032LO19-SG1077，肌肉生长抑制因子的浓度保持低于检出限。MS1032LO19-SG1079和MS1032LO19-SG1071的较弱的抑制可能是由于pI突变的不同。
该数据表明，肌肉生长抑制因子自血浆的强的清除可以通过增强与Fcγ RIIb的结合的突变或将增加抗体正电荷和增强与Fcγ RIIb的结合的突变组合来实现。预期的是，在人中肌肉生长抑制因子的强清除可以通过将增加抗体正电荷和增强与Fcγ R的结合的突变组合来实现。
实施例26
筛选pI提高的置换以增强肌肉生长抑制因子的清除。
为了增强肌肉生长抑制因子的清除，在该实施例中评估抗体的Fc部分中提高pI的置换。将氨基酸置换添加至抗体恒定区以提高pI的方法不受特别限制，但是例如，其可以通过WO 2014/145159中所述的方法进行。与可变区的情况中相同，引入到恒定区中的氨基酸置换优选是减少带负电的氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)的数目同时增加带正电的氨基酸(如精氨酸和赖氨酸)的那些。此外，氨基酸置换可以被引入到抗体恒定区中的任何位置，并且可以是单个氨基酸置换或多个氨基酸置换的组合。在没有特别限制的情况下，用于引入氨基酸置换的位点优选是氨基酸侧链可以被暴露在抗体分子表面上的位置。特别优选的实例包括引入可以被暴露在抗体分子表面上的位置处的多个氨基酸置换的组合的方法。备选地，此处引入的多个氨基酸置换的优选位置使得其在结构上彼此接近。此外，在没有特别限制的情况下，本文中引入的多个氨基酸置换优选是向带正电的氨基酸置换，以致优选地其导致这样的状态，其中多个正电荷存在于在结构上相邻的位置处。
测试变体的制备和特征
测试的抗体概述在表26中。重链，MS103205H795-SG141，通过将提高pI的置换Q311R/D399R引入到MS103205H795-SG1中来制备。其他重链变体也通过将表26中显示的相应置换引入到MS103205H795-SG1中来制备。根据实施例30中显示的方法利用M103202L889-SK1作为轻链表达所有MS1032LO06变体。
使用BIACORE(注册商标)的pI提高的Fc变体的小鼠Fcγ RII-结合测定
关于制备的含Fc区变体的抗体，使用BIACORE(注册商标)T200(GE Healthcare)进行可溶性小鼠Fcγ RII和抗原-抗体复合物之间的结合测定。通过本领域技术人员已知的方法将可溶性小鼠Fcγ RII制备成带His标签的分子的形式。通过胺偶联法使用His捕获试剂盒(GE Healthcare)将适当量的抗-His抗体固定到传感器芯片CM5(GE Healthcare)上以捕获小鼠FcγRII。接着，注射抗体-抗原复合物和运行缓冲液(作为参比液)，并且允许与捕获在传感器芯片上的小鼠Fcγ RII发生相互作用。将20mM N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸，150mM NaCl，1.2mM CaCl2和0.05％(w/v)Tween 20pH7.4用作运行缓冲液，并且还使用相应的缓冲液来稀释可溶性小鼠Fcγ RII。为了使传感器芯片再生，使用10mM甘氨酸-HClpH1.5。所有测量都在25℃进行。基于由通过测量获得的感应图计算的结合(RU)进行分析，并且显示相对值(将SG1的结合量定义为1.00)。为了计算参数，使用BIACORE(注册商标)T100Evaluation Software(GE Healthcare)。
SPR分析结果概述在表26中。一些Fc变体被证明具有增强的对被固定在BIACORE(注册商标)传感器芯片上的小鼠Fcγ RII的亲和力。
不受限于特定的理论，可以如下地解释该结果。已知BIACORE(注册商标)传感器芯片带负电，并且该带电状态可以被认为是与细胞膜表面相似。更具体地，猜测抗原-抗体复合物对被固定到带负电的BIACORE(注册商标)传感器芯片上的小鼠Fcγ RII的亲和力类似抗原-抗体复合物结合存在于类似地带负电的细胞膜表面上的小鼠Fcγ RII的方式。
[表26]
pI提高的Fc变体的总结
重链名称 置换 细胞摄取 biacore IC结合
M103205H795-SG1 1.00 1.00
M103205H795-SG141 Q311R/D399R 4.42 1.64
M103205H795-P1375m Q311R/D413K 3.43 1.21
M103205H795-P1378m Q400R/D413K 3.86 1.23
M103205H795-P1483m Q311E/S400R/D413K 5.66 1.41
M103205H795-P1484m Q311R/D312R 0.00 1.33
M103205H795-P1485m Q311E/N315R 1.68 1.29
M103205H795-P1486m Q311R/N315K 1.52 1.20
M103205H795-P1487m Q311R/N384R 1.23 1.46
M103205H795-P1488m Q311R/N384K 1.45 1.43
M103205H795-P1489m Q311R/E318R 1.68 1.24
M103205H795-P1490m Q311R/E318K 1.33 1.28
M103205H795-P1491m Q311R/E333R 1.37 1.05
M103205H795-P1492m Q311R/E333K 1.13 0.88
M103205H795-P1493m Q311R/T335R 0.99 1.10
M103205H795-P1494m Q311R/T335K 1.12 1.14
M103205H795-P1495m Q311R/S337R 1.76 1.30
M103205H795-P1496m Q311R/S337K 1.69 1.28
M103205H795-P1497m Q311R/Q342R 1.38 1.49
M103205H795-P1498m Q311R/Q342K 1.56 1.36
M103205H795-P1499m Q311R/P343R 3.61 1.98
M103205H795-P1500m Q311R/P343K 1.82 1.32
M103205H795-P1501m Q311R/D413R 2.40 1.82
M103205H795-P1522m Q311R/H285R 2.13 1.24
M103205H795-P1523m Q311R/H285K 1.91 1.19
M103205H795-P1524m Q311R/G341R 3.66 1.40
M103205H795-P1525m Q311R/G341K 3.55 1.31
M103205H795-P1526m Q311R/G385R 1.20 1.04
M103205H795-P1527m Q311R/G385K 0.92 0.98
M103205H795-P1528m Q311R/W388R 3.02 1.12
M103205H795-P1529m Q311R/E388K 2.86 1.08
M103205H795-P1530m Q311R/N390R 3.12 1.09
M103205H795-P1531m Q311R/N390K 2.35 1.01
M103205H795-P1532mi Q311R/D401R 4.16 1.23
M103205H795-P1533m Q311R/D401K 3.52 1.18
M103205H795-P1534m Q311R/G102R 3.12 1.12
M103205H795-P1535m Q311R/G402K 2.49 1.11
M103205H795-P1536m Q311R/G420R 2.05 1.16
M103205H795-P1537m Q311R/V422R 2.77 1.32
M103205H795-P1538m Q311R/V422K 1.84 1.11
M103205H795-P1539m Q311R/A431R 3.20 0.90
M103205H795-P1540m D401R/D413K 7.64 1.73
M103205H795-P1541m D401K/D413K 7.17 1.57
M103205H795-P1542m G402R/D413K 3.32 1.21
M103205H795-P1543m G402K/D413K 3.70 1.19
M103205H795-P1544m Q311R/D401R/D413K 7.66 2.04
M103205H795-P1545m Q311R/D401K/D413K 7.73 1.80
M103205H795-P1546m Q311R/G402R/D413K 5.10 1.41
M103205H795-P1547m Q311R/G402K/D413K 4.85 1.33
M103205H795-P1548m Q311R/G385R/D401R 2.30 1.37
M103205H795-P1549m W311R/G385R/G402R 2.03 1.22
M103205H795-P1550m Q311R/E388R/D401R 6.43 1.63
M103205H795-P1551m Q311R/E388R/G402R 2.91 1.32
M103205H795-P1552m G385R/D401R/D413K 4.44 2.19
M103205H795-P1553m G385R/G402R/D413K 2.86 1.47
M103205H795-P1555m E388R/G402R/D413K 3.71 2.01
此处，通过将pI-提高修饰引入到Fc区中制备的抗体是这样的抗体，其中与引入修饰前相比Fc区的电荷更向正侧。因此，可以认为Fc区(正电荷)和传感器芯片表面(负电荷)之间的库仑相互作用被pI提高氨基酸修饰加强。此外，预期在相同地带负电的细胞膜表面上会类似地发生此种作用；因此，还预期其显示使体内到细胞中的摄取的速度加快的作用。
在与SG1相比具有两个氨基酸置换的pI提高的Fc变体中，由SG141，P1499m，P1501m和P1540m形成的抗原-抗体复合物显示最强的与人Fcγ RIIb的结合。猜测Q311R/D399R，Q311R/P343R，Q311R/D413R和D401R/D413K的氨基酸置换对与传感器芯片上的人Fcγ RIIb的结合具有强的电荷作用。
pI提高的Fc变体的细胞摄取
为了评估到表达人Fcγ RIIb的细胞系中的胞内摄取速率，进行以下测定。通过已知方法制备组成型表达人Fcγ RIIb的MDCK(Madin-Darby犬肾)细胞系。使用这些细胞评估抗原-抗体复合物的胞内摄取。
具体地，根据确定的方案将pHrodoRed(Life Technlogies)用于标记人潜伏性肌肉生长抑制因子(抗原)，并且在抗体浓度为10mg/mL并且抗原浓度为2.5mg/mL的培养溶液中形成抗原-抗体复合物。将含抗原-抗体复合物的培养溶液添加到以上提及的组成型表达人Fcγ RIIb的MDCK细胞的培养平板并孵育一小时，然后使用InCell Analyzer 6000(GEhealthcare)量化摄入到细胞中的抗原的荧光强度。摄取的抗原的量被表示为相对于被取为1.00的SG1值的相对值。
细胞摄取的定量结果概述在表26中。在若干Fc变体中观察到源于细胞中的抗原的强荧光。
不受限于特定理论，该结果可以解释如下。
添加到细胞培养溶液中的抗原和抗体在培养溶液中形成抗原-抗体复合物。抗原-抗体复合物经由抗体Fc区结合表达在细胞膜上的人Fcγ RIIb，并以受体依赖性的方式被摄入到细胞中。该实验中使用的抗体以pH依赖性的方式结合抗原；因此，在细胞内在内体(酸性pH条件)中抗体可以与抗原解离。因为解离的抗原如之前所述被pHrodoRed标记，所以其在内体中发荧光。因此，据信细胞内强的荧光强度指示发生更快或更大量的抗原-抗体复合物被摄取到细胞中。
在与SG1相比具有两个氨基酸置换的pI提高的Fc变体中，由SG141，P1375m，P1378m，P1499m，P1524m，P1525m，P1532m，P1533m，P1540m，P1541m和P1543m形成的抗原-抗体复合物显示更强的抗原的细胞摄取。猜测Q311R/D399R，Q311R/D413K，S400R/D413K，Q311R/P343R，Q311R/G341R，Q311R/G341K，Q311R/D401R，Q311R/D401K，D401R/D413K，D401K/D413K和G402K/D413K的氨基酸置换对抗原抗体复合物的细胞摄取具有强的电荷作用。
人FcRn转基因小鼠中的PK研究
使用人FcRn转基因小鼠的体内测试
在将抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体和潜伏性肌肉生长抑制因子共同施用于人FcRn转基因小鼠(其中小鼠FcRn被置换成人FcRn)中后，在体内评估肌肉生长抑制因子和抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的消除。在实验PK-2(图23中描述的)中，将抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体(0.1mg/ml)和小鼠潜伏性肌肉生长抑制因子(0.05mg/ml)以10ml/kg的单剂量施用到尾静脉中。在实验PK-4(图24中描述的)中，将抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体(0.3mg/ml)，人潜伏性肌肉生长抑制因子(0.05mg/ml)和人正常免疫球蛋白(CSLBehring AG)(100mg/ml)以10ml/kg的单剂量施用到尾静脉中。在实验PK-2中，在施用后5分钟，15分钟，1小时，4小时，7小时，1天，2天，7天，14天，21天和28天收集血液。在实验PK-4中，在施用后5分钟，1小时，4小时，7小时，1天，7天，14天，21天和30天收集血液。将收集的血液立即以15,000rpm在4℃离心5分钟以分离血浆。将分离的血浆存储在-20℃以下直至测量。使用的抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体在实验PK-2中为MS1032LO06-SG1，MS1032LO06-P1375m，MS1032LO06-P1378m，MS1032LO06-P1383m，并且在实验PK-4中为MS1032LO06-P1375m，MS1032LO06-P1499m。
通过电化学发光(ECL)测量血浆中的总肌肉生长抑制因子浓度
通过ECL测量小鼠血浆总肌肉生长抑制因子的浓度，如实施例24中所述(RavetchPK)。通过该方法测量的静脉内施用抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体和潜伏性肌肉生长抑制因子后血浆中总肌肉生长抑制因子浓度的时程显示在图23A和24A中。
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量血浆中的抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体浓度
在实验PK-2中通过ELISA测量小鼠血浆中抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的浓度。将抗-人IgG(γ-链特异性)F(ab')2抗体片段(Sigma)分配到Nunc-ImmunoPlateMaxiSorp(Nalge Nunc International)上并允许在4℃静置过夜以制备固定有抗-人IgG的平板。制备血浆浓度为2.5，1.25，0.625，0.313，0.156，0.078和0.039μg/ml的校正曲线样品以及稀释100倍以上的小鼠血浆样品。然后，将样品分配到固定有抗-人IgG的平板上，并允许在室温静置1小时。随后，添加山羊抗-人IgG(γ-链特异性)生物素缀合物(SouthernBiotech)以在室温反应1小时。然后，加入链霉亲和素-PolyHRP80(StereospecificDetection Technologies)以在室温反应一小时，并且使用TMB One Component HRPMicrowell Substrate(BioFX Laboratories)作为底物进行生色反应。在用1N硫酸(ShowaChemical)终止反应后，通过微板读数仪测量450nm的吸光度。使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)由吸光度校正曲线计算小鼠血浆中的浓度。通过该方法测量的静脉内施用抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体和潜伏性肌肉生长抑制因子后血浆中抗体浓度的时程显示在图23B中。
在实验PK-4中，通过Gyrolab BioaffyTM CD(Gyros)测量小鼠血浆中抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的浓度。使生物素化的抗-人IgG Fc抗体在CD的微结构内的链霉亲和素小珠柱上流动。制备具有0.5，1，2，4，8，16和32μg/ml的峰值(spiking)血浆浓度的5mg/mL血浆浓度的人正常免疫球蛋白(CSL Behring AG)和200μg/ml的小鼠潜伏性肌肉生长抑制因子的校正曲线样品，和稀释25倍以上200μg/ml峰值血浆浓度的小鼠潜伏性肌肉生长抑制因子的小鼠血浆样品。然后将样品添加到CD中并在小珠柱上流动。随后，将Alexa标记的山羊抗-人IgG多克隆抗体(BETHYL)加入到CD中并在小珠柱上流动。使用Gyrolab EvaluatorProgram由校正曲线的响应计算小鼠血浆中的浓度。通过该方法测量的静脉内施用抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体和潜伏性肌肉生长抑制因子后血浆中抗体浓度的时程显示在图24B中。
pI对体内肌肉生长抑制因子浓度的作用
在实验PK-2中，在施用MS1032LO06-SG1后，与5分钟时的血浆总肌肉生长抑制因子浓度相比，7小时时的血浆总肌肉生长抑制因子浓度减小12倍。相反，在实验PK-2中，在施用MS1032LO06-P1375m，MS1032LO06-P1378m和MS1032LO06-P1383m后，与5分钟时的血浆总肌肉生长抑制因子浓度相比，7小时时的血浆总肌肉生长抑制因子浓度减小26-67倍。虽然在实验PK-2中与MS1032LO06-SG1相比各取样点的MS1032LO06-P1375m浓度差异在2倍以内，但是MS1032LO06-P1378m和MS1032LO06-P1383m的抗体浓度的减小与MS1032LO06-SG1相比超过3倍。包括氨基酸置换Q311R/D413K的pI变体显示增强肌肉生长抑制因子从血浆中的消除而不增强抗体从血浆中的消除。
此外，在共同施用人正常免疫球蛋白以模拟人血浆的情况下，评估施用MS1032LO06-P1499m后的总肌肉生长抑制因子浓度和抗体浓度。在实验PK-4中，在施用MS1032LO06-P1375m和MS1032LO06-P1499m后，与5分钟时的血浆总肌肉生长抑制因子浓度相比，7小时时的血浆总肌肉生长抑制因子浓度减小3.4和5.3倍，并且在MS1032LO06-P1499m中各取样点的总肌肉生长抑制因子浓度和抗体浓度与MS1032LO06-P1375m相比在1.5倍以内。包括氨基酸置换Q311R/P343R的pI变体也显示增强肌肉生长抑制因子从血浆中的消除而不增强抗体从血浆中的消除。
高pI变体在血浆中具有更多的正电荷。因为该正电荷与细胞表面的负电荷相互作用，所以高pI变体的抗原-抗体免疫复合物更接近细胞表面，这导致高pI变体的抗原-抗体免疫复合物的细胞摄取增加。
实施例27
pI提高的置换与Fcγ RIIb增强的Fc变体组合
在人Fcγ RIIb转基因小鼠中评估Fcγ RIIb增强的Fc变体与其他提高pI的置换的组合对肌肉生长抑制因子清除的作用。通过标准技术(参见，例如，J.Immunol.,2015Oct1；195(7):3198-205)通过将含人FCGR2B基因全部外显子的BAC(细菌人工染色体)载体显微注射到C57BL/6N的受精卵的原核中产生人Fcγ RIIb转基因小鼠。使用被设计成靶向外显子1的锌指核酸酶(ZFN)产生小鼠Fcγ RIIb缺陷型小鼠。通过将人Fcγ RIIb转基因小鼠与小鼠Fcγ RIIb KO小鼠杂交，建立人源化Fcγ RIIb小鼠。使用该小鼠可以评估对人FcγRIIb的亲和力增强和pI提高对可溶性抗原清除的组合作用。
测试的变体的制备和特征
测试的7种抗体及其结合特征概述在表27中。重链，MS103205H795-MY352，MS103205H795-PK55，MS103205H795-PK56，MS103205H795-PK57，分别通过将提高pI的置换Q311R/D413R，Q311R/P343R，Q311R/P343R/D413R，Q311R/N384R/D413R引入到MS103205H795-MY201中来制备。根据实施例30中所示的方法以M103202L889-SK1作为轻链表达所有MS1032LO06变体，并使用实施例23中的方法评估其对人和食蟹猴Fcγ R的亲和力。
[表27]
基于表27中概述的SPR分析，确认：提高pI的置换不影响Fcγ RIIb增强的Fc变体的Fcγ R结合。MY201和通过将Q311R/D413K引入到MY201中制备的MY351分别显示增强6倍和5倍的人Fcγ RIIb结合。关于其他人和食蟹猴Fcγ R，其显示几乎相同的结合特征。类似地，MY352，PK55，PK56和PK57显示与亲本MY201相似的结合特征(表27)。这些结果表明，任一对提高pI的置换都不影响对人和食蟹猴Fcγ R的亲和力。
在人Fcγ RIIb转基因小鼠中的PK研究
使用人Fcγ RIIb转基因小鼠的体内测试
在将抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体和人潜伏性肌肉生长抑制因子共同施用于人Fcγ RIIb转基因小鼠(其中小鼠Fcγ RII被置换成人Fcγ RIIb)中后在体内评估肌肉生长抑制因子和抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的消除。将抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体(0.3mg/ml)和潜伏性肌肉生长抑制因子(0.05mg/ml)以10ml/kg的单剂量施用到尾静脉中。在施用后5分钟，1小时，4小时，7小时，1天，7天，14天，21天和28天收集血液。立即将收集的血液以15,000rpm在4℃离心5分钟以分离血浆。将分离的血浆存储在-20℃以下直至测量。使用的抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体为MS1032LO06-SG1，MS1032LO06-MY201，MS1032LO06-MY351，MS1032LO06-MY352，MS1032LO06-PK55，MS1032LO06-PK56和MS1032LO06-PK57。
通过电化学发光测量血浆中的总肌肉生长抑制因子浓度
通过电化学发光(ECL)测量小鼠血浆中总肌肉生长抑制因子的浓度，如实施例24中所述。通过该方法测量的静脉内施用抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体和潜伏性肌肉生长抑制因子后血浆中总肌肉生长抑制因子浓度的时程显示在图25中。
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量血浆中的抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体浓度
通过ELISA测量小鼠血浆中抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体的浓度。将抗-人IgG(γ-链特异性)F(ab')2抗体片段(Sigma)分配到Nunc-ImmunoPlate MaxiSorp(Nalge NuncInternational)上并允许在4℃静置过夜以制备固定有抗-人IgG的平板。制备血浆浓度为2.5，1.25，0.625，0.313，0.156，0.078和0.039μg/ml的校正曲线样品以及被稀释100倍以上的小鼠血浆样品。然后，将样品分配到固定有抗-人IgG的平板上，并允许在室温静置1小时。随后，加入山羊抗-人IgG(γ-链特异性)生物素缀合物(Southern Biotech)以在室温反应1小时。然后，加入链霉亲和素-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)以在室温反应一小时，并且使用TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFXLaboratories)作为底物进行发色反应。在用1N硫酸(Showa Chemical)终止反应后，通过微板读数仪测量450nm的吸光度。使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)由吸光度校正曲线计算小鼠血浆中的浓度。通过该方法测量的在静脉内施用抗-潜伏性肌肉生长抑制因子抗体和潜伏性肌肉生长抑制因子后血浆中抗体浓度的时程显示在图26中。
pI和Fcγ R结合对体内肌肉生长抑制因子浓度的作用
在施用MS1032LO06-MY201后，与5分钟时的血浆总肌肉生长抑制因子浓度相比，7小时时的血浆总肌肉生长抑制因子浓度减小8倍。相反，在施用MS1032LO06-PK57后，与5分钟时的血浆总肌肉生长抑制因子浓度相比，7小时时的血浆总肌肉生长抑制因子浓度减小376倍。其他高pI变体显示类似的肌肉生长抑制因子从血浆中消除的增强。在第28天，与MS1032LO06-SG1的抗体浓度相比，高pI变体的抗体浓度减小2-3倍，并且pI变体显示轻微增强的抗体从血浆中的消除。
高pI变体在血浆中具有更多的正电荷。因为该正电荷与细胞表面的负电荷相互作用，所以高pI变体的抗原-抗体免疫复合物更接近细胞表面，这导致高pI变体的抗原-抗体免疫复合物被细胞的摄取增加。
实施例28
开发人Fcγ RIIb增强的Fc变体
构建具有抗-肌肉生长抑制因子可变区的人Fcγ RIIb增强的Fc变体并评估其对人Fcγ R的亲和力。具体地，通过将置换与T250V/T307P置换组合地引入到MS103240H795-SG1中来构建人Fcγ RIIb增强的Fc变体(VH，SEQ ID NO:92；CH，SEQ ID NO:9)。此外，还引入置换(Q311R/D413K或Q311R/P343R)。使用M103202L1045-SK1作为轻链表达所述变体并根据实施例30中显示的方法分析其对人Fcγ R的亲和力。表28显示针对人和食蟹猴Fcγ R的动力学分析的结果。填充以灰色的格子中的KD值使用[等式2]计算，因为其亲和力过弱而不能通过动力学分析正确地确定。
与SG1相比，所有评估的变体都显示增强的对人Fcγ RIIb的亲和力和减弱的与人Fcγ RIIaR，Fcγ RIIaH，Fcγ RIIIaV的结合。与SG1相比，对人Fcγ RIIb的亲和力增加4.1倍至30.5倍。对人Fcγ RIIaR的亲和力为0.02倍至0.22倍。对人Fcγ RIIaH和人FcγRIIIaV的亲和力分别小于0.04倍和0.012倍。通过比较MY009(P238D)和MY214(P238D/T250V/T307P)的亲和力，揭示了置换(T250V/T307P)不影响对人Fcγ R的结合特征。另一方面，与不含有提高pI的置换的变体相比，两对提高pI的置换(Q311R/D413K和Q311R/P343R)减小结合亲和力约0.5倍。例如，虽然TT14对人Fcγ RIIb显示高30.5倍的亲和力，但是在与Q311R/D413K(TT33)和Q311R/P343R(TT32)组合的情况下，其仅分别显示16.1倍和14.5倍的增加。
此外，将实施例25中用于改善抗体半衰期并减少与类风湿因子的结合的置换引入到人Fcγ RIIb增强的Fc变体中，并分析其对人Fcγ R的亲和力(表29)。在该SPR分析中，使用用于捕获目的抗体的小鼠抗-人IgGκ轻链获得所有数据。表30显示结果，并且填充以灰色的格子中的KD值使用[等式2]计算，因为其亲和力过弱而不能通过动力学分析正确地确定。[表28]
[表29]
包含人Fcγ RIIb增强的Fc变体的重链恒定区的氨基酸序列(显示为SEQ ID NO)
[表30]
在该测量中再次评估SG1和TT33，其中捕获方法与表28中的不同。结果，TT33的"KD倍数"值与利用表28获得的那些一致(对人Fcγ RIIb，表28中为16.1倍，表30中为15.7倍)。通过将N434A/Q438R/S440E和M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E引入到TT33中构建的TT92和TT93显示与TT33相当的结合特征。类似地，来源于TT32的TT90和TT91，来源于TT31的TT72和TT73，来源于TT30的TT70和TT71，来源于TT21的TT68和TT69，和来源于TT20的TT66和TT67显示与表28中显示的亲本抗体的结合特征相当的结合特征。这些结果表明，用于改善抗体半衰期和减弱与类风湿因子的结合的置换不影响人Fcγ RIIb增强的变体对人Fcγ R的结合特征。
实施例29
Fcγ RIIb增强的Fc变体的细胞成像分析
为了评估由实施例28中所述的抗体形成的抗原-抗体复合物的胞内摄取，进行实施例26中所述的细胞成像测定。在该实施例中，为了避免信号饱和，在抗体浓度为1.25mg/mL并且抗原浓度为0.34mg/mL的培养溶液中形成抗原-抗体复合物。
测定结果显示在图27中。通过提高对人Fcγ RIIb的结合亲和力，抗原-抗体复合物的细胞摄取增加。在与SG1相比对人Fcγ RIIb的结合亲和力增强30倍的TT14的例子中，细胞内的抗原荧光强度增加为SG1的7.5倍。
虽然提高pI的置换(Q311R/D413K和Q311R/P343R)与不含有提高pI的置换的变体相比使对人Fcγ RIIb的结合亲和力减小约0.5倍，但是与不具有提高pI的置换的Fc变体相比，具有提高pI的置换的Fc变体的抗原抗体复合物的细胞摄取增加。与SG1相比，TT33显示的细胞内的抗原抗体摄取增加36倍，而其亲本TT14显示的细胞摄取增加7.5倍。此外，TT33显示与在食蟹猴中显示强的清除的SG1071，SG1074，SG1077，SG1079，SG1080和SG1081相当的细胞内抗原-抗体复合物的细胞摄取。这些结果表明，将提高pI的置换与Fcγ RIIb增强的Fc变体结合对于抗原清除是一种有力的工具。
实施例30
抗体表达载体的构建；
和抗体的表达和纯化
通过本领域技术人员已知的制备方法，使用Assemble PCR等进行编码抗体可变区的H链和L链的核苷酸序列的全长基因的合成。通过本领域技术人员已知的方法使用PCR等进行氨基酸置换的引入。将获得的质粒片段插入到动物细胞表达载体中，并制备H-链表达载体和L-链表达载体。获得的表达载体的核苷酸序列通过本领域技术人员已知的方法确定。将制备的质粒瞬时引入到来源于人胚肾癌细胞的HEK293H细胞系(Invitrogen)或FreeStyle293细胞(Invitrogen)中用于抗体表达。将获得的培养物上清收集，然后通过0.22微米MILLEX(R)-GV滤器(Millipore)，或通过0.45微米MILLEX(R)-GV滤器(Millipore)，以获得培养物上清。通过本领域技术人员已知的方法使用rProtein ASepharose Fast Flow(GE Healthcare)或Protein G Sepharose 4 Fast Flow(GEHealthcare)，从获得的培养物上清纯化抗体。对于纯化的抗体的浓度，使用分光光度计测量其在280nm的吸光度。由获得的值，通过方法如PACE计算的消光系数用于计算抗体浓度(Protein Sci.4:2411-2423(1995))。
虽然为了清楚理解通过例示和实施例描述了上述发明的一些细节，但是说明书和实施例不应被视为限制本发明的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用完整地明确地结合。
序列表
<110> 中外制药株式会社
<120> 抗-肌肉生长抑制因子抗体、包含变体FC区的多肽及使用方法
<130> C1-A1413P
<150> JP 2014-257636
<151> 2014-12-19
<160> 381
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 375
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Gln Lys Leu Gln Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile
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20 25 30
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Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val
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Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr
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Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala
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Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr
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Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val
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Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
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<210> 2
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys
1 5 10 15
Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile
20 25 30
Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu
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<212> PRT
<213> 成束猴(Macaca fascicularis)
<400> 3
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1 5 10 15
Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn
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Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val
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Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys
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Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val
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Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
370 375
<210> 4
<211> 109
<212> PRT
<213> 成束猴
<400> 4
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Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile
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<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 5
Met Met Gln Lys Leu Gln Met Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu
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Ile Ala Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Gly Ser Glu Arg Glu Glu
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Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg Gln Asn
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355 360 365
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<210> 6
<211> 109
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 6
Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys
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<210> 7
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 7
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 8
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 8
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<210> 9
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 9
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 10
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 11
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 11
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Arg Gly Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 12
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 12
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Thr Val Thr Cys Arg Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr Asp
20 25 30
Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr
65 70 75 80
Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Val
85 90 95
Pro Ala Tyr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 13
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala Tyr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 14
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asp Asn
20 25 30
Asn Trp Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu
65 70 75 80
Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Gly Gly
85 90 95
Gly Leu Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 15
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 15
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asp Asn
20 25 30
Asn Trp Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Gly Gly
85 90 95
Gly Leu Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 16
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 16
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser His Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala Tyr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 17
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 17
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ile Ile Ser His Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala Tyr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 18
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala His Ser Thr Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 19
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala Tyr Ser His Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 20
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser His Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ile Ile Ser His Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala Tyr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 21
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 21
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ile Ile Ser His Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala His Ser Thr Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 22
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser His Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala His Ser Thr Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 23
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser His Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ile Ile Ser His Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala His Ser Thr Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 24
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser His Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala Tyr Ser His Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 25
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ile Ile Ser His Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala Tyr Ser His Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 26
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 27
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser His Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ile Ile Ser His Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala Tyr Ser His Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 28
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Ile Ile Ser His Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala His Ser His Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 29
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 29
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Gly Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala His Ser His Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 30
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser His Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ile Ile Ser His Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala His Ser His Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 31
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr His Asn
20 25 30
Asn Trp Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Gly Gly
85 90 95
Gly Leu Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 32
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 32
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser His Thr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala Tyr Ser His Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 33
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser His Thr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Met Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala Tyr Ser His Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 34
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser His Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala Tyr Ser His Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 35
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Thr Ser Ser Gln Ser Val Tyr His Asn
20 25 30
Asn Trp Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Leu Ala Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Gly Gly
85 90 95
Gly Arg Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 36
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 36
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr His Asn
20 25 30
Asn Trp Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Leu Ala Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Gly Gly
85 90 95
Gly Leu Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 37
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 37
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Gln Thr Ser Gln Ser Val Tyr His Asp
20 25 30
Asn Trp Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Gly Gly
85 90 95
Gly Arg Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 38
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 38
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Thr Ser Ser Gln Ser Val Tyr His Asp
20 25 30
Asn Trp Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Leu Ala Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Gly Gly
85 90 95
Gly Leu Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 39
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 39
cagtcgctgg aggagtccgg gggtcgcctg gtaacgcctg gaggatccct gacagtcacc 60
tgcagagtct ctggaatcga cctcagtagt tacgacatca gctgggtccg ccaggctcca 120
gggaaggggc tggagtggat cggaatcatt agttatgctg gtagcacata ctacgcgagc 180
tgggcaaaag gccgattcac catctccaaa acctcgacca cggtggatct gaaaatgacc 240
agtctgacaa ccgaggacac ggccacctat ttctgtgcca gaggtgtgcc tgcttatagt 300
actggtggtg acttgtgggg cccaggcacc ctggtcaccg tctcctcc 348
<210> 40
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 40
caggtgacac tgaaagaaag cggccccgtg ctggtgaagc caaccgagac actgactctg 60
acctgcacag tgagtgggat cgacctgagc agctacgaca tctcctgggt gcggcaggca 120
cccggaaagg gcctggaatg ggtcggcatc attagctacg ccgggagcac atactatgcc 180
agctgggcta aaggaagact gactatctcc aaggacacct ctaaaaacca ggtggtcctg 240
actatgacca atatggaccc cgtggataca gcaacttact attgtgccag gggcgtccct 300
gcttactcta ccggagggga tctgtgggga cagggaaccc tggtgacagt ctctagt 357
<210> 41
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 41
gcgcaagtgc tgacccagac tgcatcatcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaattgcc agtccagtca gagtgtttat gataacaact ggttatcctg gtttcagcag 120
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tattgggcat ccactctggc atctggggtc 180
ccatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcgacctg 240
gagtgtgacg atgctgccac ttactactgt gcaggcggtt atggtggtgg tctgtatgct 300
ttcggcggag ggaccaaggt ggagatcaaa 330
<210> 42
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 42
gacattgtga tgactcagtc tcctgccact ctgtcactga gccctggcga gcgagcaacc 60
ctgtcttgcc agagcagcca gtccgtgtac gacaacaatt ggctgagctg gttccagcag 120
aagccagggc agccccctaa actgctgatc tattgggcat caacactggc cagcggcgtc 180
ccctccagat tctccggatc tggcagtggg actgacttta ccctgaccat cagcagcctc 240
cagcccgagg atgccgctac ctactattgt gctggcgggt acggaggcgg gctgtatgca 300
tttggacagg gcacaaaggt ggaaatcaaa 330
<210> 43
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 43
caggtgacac tgaaagaaag cggccccgtg ctggtgaagc caaccgagac actgactctg 60
acctgcacag tgagtgggat cgacctgagc cacaccgaca tctcctgggt gcggcaggca 120
cccggaaagg gcctggaatg ggtcggcatc attagctacg ccgggagcac atactatgcc 180
agctgggcta aaggaagact gactatctcc aaggacacct ctaaaaacca ggtggtcctg 240
actatgacca atatggaccc cgtggataca gcaacttact attgtgccag gggcgtccct 300
gcttactctc acggagggga tctgtgggga cagggaaccc tggtgacagt ctctagt 357
<210> 44
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 44
caggtgacac tgaaagaaag cggccccgtg ctggtgaagc caaccgagac actgactctg 60
acctgcacag tgagtgggat cgacctgagc cacaccgaca tctcctgggt gcggcaggca 120
cccggaaagg gcctggaatg ggtcggcatc attagctacg ccgggagcac atactatatg 180
agctgggcta aaggaagact gactatctcc aaggacacct ctaaaaacca ggtggtcctg 240
actatgacca atatggaccc cgtggataca gcaacttact attgtgccag gggcgtccct 300
gcttactctc acggagggga tctgtgggga cagggaaccc tggtgacagt ctctagt 357
<210> 45
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 45
caggtgacac tgaaagaaag cggccccgtg ctggtgaagc caaccgagac actgactctg 60
acctgcacag tgagtgggat cgacctgagc cactacgaca tctcctgggt gcggcaggca 120
cccggaaagg gcctggaatg ggtcggcatc attagctacg ccgggagcac atactatgcc 180
agctgggcta aaggaagact gactatctcc aaggacacct ctaaaaacca ggtggtcctg 240
actatgacca atatggaccc cgtggataca gcaacttact attgtgccag gggcgtccct 300
gcttactctc acggagggga tctgtgggga cagggaaccc tggtgacagt ctctagt 357
<210> 46
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 46
gacattgtga tgactcagtc tcctgccact ctgtcactga gccctggcga gcgagcaacc 60
ctgtcttgca ccagcagcca gtccgtgtac cacaacaatt ggctgagctg gttccagcag 120
aagccagggc agccccctaa actgctgatc tattgggcat caacactggc ctacggcgtc 180
ccctccagat tctccggatc tggcagtggg actgacttta ccctgaccat cagcagcctc 240
cagcccgagg atgccgctac ctactattgt gctggcgggt acggaggcgg gcggtatgca 300
tttggacagg gcacaaaggt ggaaatcaaa 330
<210> 47
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 47
gacattgtga tgactcagtc tcctgccact ctgtcactga gccctggcga gcgagcaacc 60
ctgtcttgcc agagcagcca gtccgtgtac cacaacaatt ggctgagctg gttccagcag 120
aagccagggc agccccctaa actgctgatc tattgggcat caacactggc cttcggcgtc 180
ccctccagat tctccggatc tggcagtggg actgacttta ccctgaccat cagcagcctc 240
cagcccgagg atgccgctac ctactattgt gctggcgggt acggaggcgg gctgtatgca 300
tttggacagg gcacaaaggt ggaaatcaaa 330
<210> 48
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 48
gacattgtga tgactcagtc tcctgccact ctgtcactga gccctggcga gcgagcaacc 60
ctgtcttgcc agaccagcca gtccgtgtac cacgacaatt ggctgagctg gttccagcag 120
aagccagggc agccccctaa actgctgatc tattgggcat caacactggc cagcggcgtc 180
ccctccagat tctccggatc tggcagtggg actgacttta ccctgaccat cagcagcctc 240
cagcccgagg atgccgctac ctactattgt gctggcgggt acggaggcgg gcggtatgca 300
tttggacagg gcacaaaggt ggaaatcaaa 330
<210> 49
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 49
gacattgtga tgactcagtc tcctgccact ctgtcactga gccctggcga gcgagcaacc 60
ctgtcttgca ccagcagcca gtccgtgtac cacgacaatt ggctgagctg gttccagcag 120
aagccagggc agccccctaa actgctgatc tattgggcat caacactggc ctacggcgtc 180
ccctccagat tctccggatc tggcagtggg actgacttta ccctgaccat cagcagcctc 240
cagcccgagg atgccgctac ctactattgt gctggcgggt acggaggcgg gctgtatgca 300
tttggacagg gcacaaaggt ggaaatcaaa 330
<210> 50
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 50
gcttccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagtc cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctctcctc cgtggtgacc gtgccctcct cgtccttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagccctcc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
tccacgtacc gtgtggtctc cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggaa 720
atgaccaaga accaggtctc cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc ctccgacatc 780
gccgtggagt gggagtccaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac tccaagctca ccgtggacaa gtccaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagtcgc tctccctgtc tccgtag 987
<210> 51
<211> 984
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 51
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact ccggggggga 360
ccgaaagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tccg 984
<210> 52
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 52
gcttccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagtc gacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagtggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagtag tgtggtgacc gtgccctcca gtagtttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagt aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgagct cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagt cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agtacgtacc gtgtggtcag tgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720
atgaccaaga accaggtcag tctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagtgacatc 780
gccgtggagt gggagagtaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agtaagctca ccgtggacaa gagtaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagtc tctccctgtc tccgtga 987
<210> 53
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 53
cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
tccaaggact gcacctactc cctctcctcc accctgacgc tgtccaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgtcctcgcc cgtcacaaag 300
tccttcaaca ggggagagtg ttga 324
<210> 54
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 54
cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggtaccgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agtaaggaca gtacctacag tctcagtagt accctgacgc tgtccaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgtcctcgcc cgtcacaaag 300
tccttcaaca ggggagagtg ttga 324
<210> 55
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 55
Ser Tyr Asp Ile Ser
1 5
<210> 56
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 56
His Tyr Asp Ile Ser
1 5
<210> 57
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 57
His Thr Asp Ile Ser
1 5
<210> 58
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 58
Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 59
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 59
Ile Ile Ser His Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 60
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 60
Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Met Ser Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 61
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 61
Gly Val Pro Ala Tyr Ser Thr Gly Gly Asp Leu
1 5 10
<210> 62
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 62
Gly Val Pro Ala His Ser Thr Gly Gly Asp Leu
1 5 10
<210> 63
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 63
Gly Val Pro Ala Tyr Ser His Gly Gly Asp Leu
1 5 10
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 64
Gly Val Pro Ala His Ser His Gly Gly Asp Leu
1 5 10
<210> 65
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 65
Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asp Asn Asn Trp Leu Ser
1 5 10
<210> 66
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 66
Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr His Asn Asn Trp Leu Ser
1 5 10
<210> 67
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 67
Thr Ser Ser Gln Ser Val Tyr His Asn Asn Trp Leu Ser
1 5 10
<210> 68
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 68
Gln Thr Ser Gln Ser Val Tyr His Asp Asn Trp Leu Ser
1 5 10
<210> 69
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 69
Thr Ser Ser Gln Ser Val Tyr His Asp Asn Trp Leu Ser
1 5 10
<210> 70
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 70
Trp Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 71
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 71
Trp Ala Ser Thr Leu Ala Tyr
1 5
<210> 72
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 72
Trp Ala Ser Thr Leu Ala Phe
1 5
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 73
Ala Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Leu Tyr Ala
1 5 10
<210> 74
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 74
Ala Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Arg Tyr Ala
1 5 10
<210> 75
<211> 242
<212> PRT
<213> 智人
<400> 75
Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn
1 5 10 15
Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile
20 25 30
Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile
35 40 45
Ser Lys Asp Val Ile Arg Gln Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg
50 55 60
Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly
65 70 75 80
Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr
85 90 95
Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu Met Gln Val Asp Gly Lys Pro Lys
100 105 110
Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val
115 120 125
Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Thr
130 135 140
Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr
145 150 155 160
Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr
165 170 175
Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu
180 185 190
Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu
195 200 205
Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly
210 215 220
Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser
225 230 235 240
Arg Arg
<210> 76
<211> 242
<212> PRT
<213> 成束猴
<400> 76
Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn
1 5 10 15
Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile
20 25 30
Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile
35 40 45
Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg
50 55 60
Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly
65 70 75 80
Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr
85 90 95
Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu Met Gln Val Asp Gly Lys Pro Lys
100 105 110
Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val
115 120 125
Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Thr
130 135 140
Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr
145 150 155 160
Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr
165 170 175
Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu
180 185 190
Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu
195 200 205
Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly
210 215 220
Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser
225 230 235 240
Arg Arg
<210> 77
<211> 242
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 77
Glu Gly Ser Glu Arg Glu Glu Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn
1 5 10 15
Ala Cys Ala Trp Arg Gln Asn Thr Arg Tyr Ser Arg Ile Glu Ala Ile
20 25 30
Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile
35 40 45
Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln Leu Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Arg
50 55 60
Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly
65 70 75 80
Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr
85 90 95
Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu Met Gln Ala Asp Gly Lys Pro Lys
100 105 110
Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val
115 120 125
Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu Arg Pro Val Lys Thr Pro Thr Thr
130 135 140
Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr
145 150 155 160
Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu Lys Leu Asp Met Ser Pro Gly Thr
165 170 175
Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu
180 185 190
Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu
195 200 205
Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly
210 215 220
Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser
225 230 235 240
Arg Arg
<210> 78
<211> 266
<212> PRT
<213> 智人
<400> 78
Met Gln Lys Leu Gln Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile
1 5 10 15
Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn
20 25 30
Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr
35 40 45
Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu
50 55 60
Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gln Leu
65 70 75 80
Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val
85 90 95
Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His
100 105 110
Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu
115 120 125
Met Gln Val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser
130 135 140
Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu
145 150 155 160
Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu
165 170 175
Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu
180 185 190
Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val
195 200 205
Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly
210 215 220
Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr
225 230 235 240
Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys
245 250 255
Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg
260 265
<210> 79
<211> 266
<212> PRT
<213> 成束猴
<400> 79
Met Gln Lys Leu Gln Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile
1 5 10 15
Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn
20 25 30
Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr
35 40 45
Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu
50 55 60
Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln Leu
65 70 75 80
Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val
85 90 95
Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His
100 105 110
Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu
115 120 125
Met Gln Val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser
130 135 140
Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu
145 150 155 160
Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu
165 170 175
Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu
180 185 190
Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val
195 200 205
Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly
210 215 220
Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr
225 230 235 240
Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys
245 250 255
Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg
260 265
<210> 80
<211> 267
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 80
Met Met Gln Lys Leu Gln Met Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu
1 5 10 15
Ile Ala Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Gly Ser Glu Arg Glu Glu
20 25 30
Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg Gln Asn
35 40 45
Thr Arg Tyr Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys
50 55 60
Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln
65 70 75 80
Leu Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp
85 90 95
Val Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr
100 105 110
His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe
115 120 125
Leu Met Gln Ala Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser
130 135 140
Ser Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr
145 150 155 160
Leu Arg Pro Val Lys Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg
165 170 175
Leu Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser
180 185 190
Leu Lys Leu Asp Met Ser Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp
195 200 205
Val Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu
210 215 220
Gly Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val
225 230 235 240
Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val
245 250 255
Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg
260 265
<210> 81
<211> 407
<212> PRT
<213> 智人
<400> 81
Met Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Glu Leu Arg Pro Arg Gly Glu Ala Ala Glu Gly Pro Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Val Gly Gly Glu Arg Ser
35 40 45
Ser Arg Pro Ala Pro Ser Val Ala Pro Glu Pro Asp Gly Cys Pro Val
50 55 60
Cys Val Trp Arg Gln His Ser Arg Glu Leu Arg Leu Glu Ser Ile Lys
65 70 75 80
Ser Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Lys Glu Ala Pro Asn Ile Ser
85 90 95
Arg Glu Val Val Lys Gln Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Gln
100 105 110
Ile Leu Asp Leu His Asp Phe Gln Gly Asp Ala Leu Gln Pro Glu Asp
115 120 125
Phe Leu Glu Glu Asp Glu Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr Val Ile Ser
130 135 140
Met Ala Gln Glu Thr Asp Pro Ala Val Gln Thr Asp Gly Ser Pro Leu
145 150 155 160
Cys Cys His Phe His Phe Ser Pro Lys Val Met Phe Thr Lys Val Leu
165 170 175
Lys Ala Gln Leu Trp Val Tyr Leu Arg Pro Val Pro Arg Pro Ala Thr
180 185 190
Val Tyr Leu Gln Ile Leu Arg Leu Lys Pro Leu Thr Gly Glu Gly Thr
195 200 205
Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Arg His Ile Arg Ile Arg Ser Leu
210 215 220
Lys Ile Glu Leu His Ser Arg Ser Gly His Trp Gln Ser Ile Asp Phe
225 230 235 240
Lys Gln Val Leu His Ser Trp Phe Arg Gln Pro Gln Ser Asn Trp Gly
245 250 255
Ile Glu Ile Asn Ala Phe Asp Pro Ser Gly Thr Asp Leu Ala Val Thr
260 265 270
Ser Leu Gly Pro Gly Ala Glu Gly Leu His Pro Phe Met Glu Leu Arg
275 280 285
Val Leu Glu Asn Thr Lys Arg Ser Arg Arg Asn Leu Gly Leu Asp Cys
290 295 300
Asp Glu His Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val
305 310 315 320
Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr
325 330 335
Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Gln Cys Glu Tyr Met Phe Met Gln Lys
340 345 350
Tyr Pro His Thr His Leu Val Gln Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala
355 360 365
Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr
370 375 380
Phe Asn Asp Lys Gln Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Gly Met Val
385 390 395 400
Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
405
<210> 82
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人
<400> 82
Asn Leu Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys
1 5 10 15
Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile
20 25 30
Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Gln Cys Glu
35 40 45
Tyr Met Phe Met Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Gln Gln Ala
50 55 60
Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser
65 70 75 80
Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Asp Lys Gln Gln Ile Ile Tyr Gly
85 90 95
Lys Ile Pro Gly Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
100 105
<210> 83
<211> 274
<212> PRT
<213> 智人
<400> 83
Ala Glu Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ala Gly Val Gly Gly Glu Arg Ser Ser Arg Pro Ala Pro Ser Val Ala
20 25 30
Pro Glu Pro Asp Gly Cys Pro Val Cys Val Trp Arg Gln His Ser Arg
35 40 45
Glu Leu Arg Leu Glu Ser Ile Lys Ser Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg
50 55 60
Leu Lys Glu Ala Pro Asn Ile Ser Arg Glu Val Val Lys Gln Leu Leu
65 70 75 80
Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Gln Ile Leu Asp Leu His Asp Phe Gln
85 90 95
Gly Asp Ala Leu Gln Pro Glu Asp Phe Leu Glu Glu Asp Glu Tyr His
100 105 110
Ala Thr Thr Glu Thr Val Ile Ser Met Ala Gln Glu Thr Asp Pro Ala
115 120 125
Val Gln Thr Asp Gly Ser Pro Leu Cys Cys His Phe His Phe Ser Pro
130 135 140
Lys Val Met Phe Thr Lys Val Leu Lys Ala Gln Leu Trp Val Tyr Leu
145 150 155 160
Arg Pro Val Pro Arg Pro Ala Thr Val Tyr Leu Gln Ile Leu Arg Leu
165 170 175
Lys Pro Leu Thr Gly Glu Gly Thr Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg
180 185 190
Arg His Ile Arg Ile Arg Ser Leu Lys Ile Glu Leu His Ser Arg Ser
195 200 205
Gly His Trp Gln Ser Ile Asp Phe Lys Gln Val Leu His Ser Trp Phe
210 215 220
Arg Gln Pro Gln Ser Asn Trp Gly Ile Glu Ile Asn Ala Phe Asp Pro
225 230 235 240
Ser Gly Thr Asp Leu Ala Val Thr Ser Leu Gly Pro Gly Ala Glu Gly
245 250 255
Leu His Pro Phe Met Glu Leu Arg Val Leu Glu Asn Thr Lys Arg Ser
260 265 270
Arg Arg
<210> 84
<211> 298
<212> PRT
<213> 智人
<400> 84
Met Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Glu Leu Arg Pro Arg Gly Glu Ala Ala Glu Gly Pro Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Val Gly Gly Glu Arg Ser
35 40 45
Ser Arg Pro Ala Pro Ser Val Ala Pro Glu Pro Asp Gly Cys Pro Val
50 55 60
Cys Val Trp Arg Gln His Ser Arg Glu Leu Arg Leu Glu Ser Ile Lys
65 70 75 80
Ser Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Lys Glu Ala Pro Asn Ile Ser
85 90 95
Arg Glu Val Val Lys Gln Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Gln
100 105 110
Ile Leu Asp Leu His Asp Phe Gln Gly Asp Ala Leu Gln Pro Glu Asp
115 120 125
Phe Leu Glu Glu Asp Glu Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr Val Ile Ser
130 135 140
Met Ala Gln Glu Thr Asp Pro Ala Val Gln Thr Asp Gly Ser Pro Leu
145 150 155 160
Cys Cys His Phe His Phe Ser Pro Lys Val Met Phe Thr Lys Val Leu
165 170 175
Lys Ala Gln Leu Trp Val Tyr Leu Arg Pro Val Pro Arg Pro Ala Thr
180 185 190
Val Tyr Leu Gln Ile Leu Arg Leu Lys Pro Leu Thr Gly Glu Gly Thr
195 200 205
Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Arg His Ile Arg Ile Arg Ser Leu
210 215 220
Lys Ile Glu Leu His Ser Arg Ser Gly His Trp Gln Ser Ile Asp Phe
225 230 235 240
Lys Gln Val Leu His Ser Trp Phe Arg Gln Pro Gln Ser Asn Trp Gly
245 250 255
Ile Glu Ile Asn Ala Phe Asp Pro Ser Gly Thr Asp Leu Ala Val Thr
260 265 270
Ser Leu Gly Pro Gly Ala Glu Gly Leu His Pro Phe Met Glu Leu Arg
275 280 285
Val Leu Glu Asn Thr Lys Arg Ser Arg Arg
290 295
<210> 85
<211> 409
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 85
Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Ile Ser Gly Ser Ala
1 5 10 15
Phe Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ala Glu Gly Pro Ala Ala
20 25 30
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Val Gly Gly Glu
35 40 45
Arg Ser Ser Arg Pro Ala Pro Ser Val Ala Pro Glu Pro Asp Gly Cys
50 55 60
Pro Val Cys Val Trp Arg Gln His Ser Arg Glu Leu Arg Leu Glu Ser
65 70 75 80
Ile Lys Ser Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Lys Glu Ala Pro Asn
85 90 95
Ile Ser Arg Glu Val Val Lys Gln Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu
100 105 110
Gln Gln Ile Leu Asp Leu His Asp Phe Gln Gly Asp Ala Leu Gln Pro
115 120 125
Glu Asp Phe Leu Glu Glu Asp Glu Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr Val
130 135 140
Ile Ser Met Ala Gln Glu Thr Asp Pro Ala Val Gln Thr Asp Gly Ser
145 150 155 160
Pro Leu Cys Cys His Phe His Phe Ser Pro Lys Val Met Phe Thr Lys
165 170 175
Val Leu Lys Ala Gln Leu Trp Val Tyr Leu Arg Pro Val Pro Arg Pro
180 185 190
Ala Thr Val Tyr Leu Gln Ile Leu Arg Leu Lys Pro Leu Thr Gly Glu
195 200 205
Gly Thr Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Arg His Ile Arg Ile Arg
210 215 220
Ser Leu Lys Ile Glu Leu His Ser Arg Ser Gly His Trp Gln Ser Ile
225 230 235 240
Asp Phe Lys Gln Val Leu His Ser Trp Phe Arg Gln Pro Gln Ser Asn
245 250 255
Trp Gly Ile Glu Ile Asn Ala Phe Asp Pro Ser Gly Thr Asp Leu Ala
260 265 270
Val Thr Ser Leu Gly Pro Gly Ala Glu Gly Leu His Pro Phe Met Glu
275 280 285
Leu Arg Val Leu Glu Asn Thr Lys Arg Ser Arg Arg Asn Leu Gly Leu
290 295 300
Asp Cys Asp Glu His Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu
305 310 315 320
Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys
325 330 335
Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Gln Cys Glu Tyr Met Phe Met
340 345 350
Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Gln Gln Ala Asn Pro Arg Gly
355 360 365
Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met
370 375 380
Leu Tyr Phe Asn Asp Lys Gln Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Gly
385 390 395 400
Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
405
<210> 86
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 86
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser His Asp
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala Tyr Ser His Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 87
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 87
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser His Asp
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Ser Met Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala Tyr Ser His Gly Gly Asp Lys Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 88
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 88
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser His Thr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Lys Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala Tyr Ser His Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 89
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 89
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser His Thr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Lys Lys Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala Tyr Ser His Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 90
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 90
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser His Thr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Ser Lys Tyr Lys Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala Tyr Ser His Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 91
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 91
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser His Asp
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Lys Lys Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala Tyr Ser His Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 92
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 92
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser His Asp
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala Tyr Ser His Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 93
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 93
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser His Asp
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala Tyr Ser His Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 94
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 94
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser His Glu
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala Tyr Ser His Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 95
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 95
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser His Glu
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Ser Lys Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Val Pro Ala Tyr Ser His Gly Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 96
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 96
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Thr Ser Ser Gln Ser Val Tyr His Ala
20 25 30
Asn Trp Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Leu Ala Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Gly Gly
85 90 95
Gly Arg Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 97
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 97
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gln Ser Val Tyr His Glu
20 25 30
Asn Trp Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Leu Ala Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Gly Gly
85 90 95
Gly Arg Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 98
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 98
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Thr Ser Ser Gln Ser Val Phe His Glu
20 25 30
Asn Trp Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Leu Ala Trp Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Gly Gly
85 90 95
Gly Arg Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 99
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 99
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gln Ser Val Tyr His Glu
20 25 30
Asn Trp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Leu Ala Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Gly Gly
85 90 95
Gly Arg Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 100
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 100
caggtgacac tgaaagaaag cggccccgtg ctggtgaagc caaccgagac actgactctg 60
acctgcacag tgagtgggat cgacctgagc cacgacgaca tctcctgggt gcggcaggca 120
cccggaaagg gcctggaatg ggtcggcatc attagctacg ccgggagcac atactatgcc 180
agctgggcta aaggaagact gactatctcc aaggacacct ctaaaaacca ggtggtcctg 240
actatgacca atatggaccc cgtggataca gcaacttact attgtgccag gggcgtccct 300
gcttactctc acggagggga tctgtgggga cagggaaccc tggtgacagt ctctagt 357
<210> 101
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 101
caggtgacac tgaaagaaag cggccccgtg ctggtgaagc caaccgagac actgactctg 60
acctgcacag tgagtgggat cgacctgagc cacgacgaca tctcctgggt gcggcaggca 120
cccggaaagg gcctggaatg ggtcggcatc attagctacg ccgggagcat gtactatgcc 180
agctgggcta aaggaagact gactatctcc aaggacacct ctaaaaacca ggtggtcctg 240
actatgacca atatggaccc cgtggataca gcaacttact attgtgccag gggcgtccct 300
gcttactctc acggagggga taagtgggga cagggaaccc tggtgacagt ctctagt 357
<210> 102
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 102
caggtgacac tgaaagaaag cggccccgtg ctggtgaagc caaccgagac actgactctg 60
acctgcacag tgagtgggat cgacctgagc cacaccgaca tctcctgggt gcggcaggca 120
cccggaaagg gcctggaatg ggtcggcatc attagctacg ccgggaagac atactatgcc 180
agctgggcta aaaaaagact gactatctcc aaggacacct ctaaaaacca ggtggtcctg 240
actatgacca atatggaccc cgtggataca gcaacttact attgtgccag gggcgtccct 300
gcttactctc acggagggga tctgtgggga cagggaaccc tggtgacagt ctctagt 357
<210> 103
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 103
caggtgacac tgaaagaaag cggccccgtg ctggtgaagc caaccgagac actgactctg 60
acctgcacag tgagtgggat cgacctgagc cacaccgaca tctcctgggt gcggcaggca 120
cccggaaagg gcctggaatg ggtcggcatc attagctacg ccgggaagaa atactatgcc 180
agctgggcta aaggaagact gactatctcc aaggacacct ctaaaaacca ggtggtcctg 240
actatgacca atatggaccc cgtggataca gcaacttact attgtgccag gggcgtccct 300
gcttactctc acggagggga tctgtgggga cagggaaccc tggtgacagt ctctagt 357
<210> 104
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 104
caggtgacac tgaaagaaag cggccccgtg ctggtgaagc caaccgagac actgactctg 60
acctgcacag tgagtgggat cgacctgagc cacaccgaca tctcctgggt gcggcaggca 120
cccggaaagg gcctggaatg ggtcggcatc attagctacg ccgggagcaa atacaaggcc 180
agctgggcta aaggaagact gactatctcc aaggacacct ctaaaaacca ggtggtcctg 240
actatgacca atatggaccc cgtggataca gcaacttact attgtgccag gggcgtccct 300
gcttactctc acggagggga tctgtgggga cagggaaccc tggtgacagt ctctagt 357
<210> 105
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 105
caggtgacac tgaaagaaag cggccccgtg ctggtgaagc caaccgagac actgactctg 60
acctgcacag tgagtgggat cgacctgagc cacgacgaca tctcctgggt gcggcaggca 120
cccggaaagg gcctggaatg ggtcggcatc attagctacg ccgggaagaa atactatgcc 180
agctgggcta aaggaagact gactatctcc aaggacacct ctaaaaacca ggtggtcctg 240
actatgacca atatggaccc cgtggataca gcaacttact attgtgccag gggcgtccct 300
gcttactctc acggagggga tctgtgggga cagggaaccc tggtgacagt ctctagt 357
<210> 106
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 106
caggtgcagc tggtcgaatc tggaggagga ctggtgcagc caggagggtc actgcgactg 60
agctgtgccg tgtccgggat cgacctgtca cacgacgata ttagctgggt gagacaggca 120
cccgggaagg gactggaatg ggtctctatc attagttacg ccggcagcac ctactatgcc 180
tcttgggcta aaggcaggct gaccatttct aaggacacaa gtaaaaacca ggtggtcctg 240
accatgacaa atatggaccc cgtggatact gcaacctact attgcgcccg gggcgtccct 300
gcttatagcc acggcggcga tctgtgggga caggggacac tggtgactgt cagctcc 357
<210> 107
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 107
caggtgacac tgaaagaaag cggccccgtg ctggtgaagc caaccgagac actgactctg 60
acctgcaaag tgagtgggat cgacctgagc cacgacgaca tctcctgggt gcggcaggca 120
cccggaaagg gcctggaatg ggtctccatc attagctacg ccgggagcac atactatgcc 180
agctgggcta aaggaagact gactatctcc aaggacacct ctaaaaacca ggtggtcctg 240
actatgacca atatggaccc cgtggataca gcaacttact attgtgccag gggcgtccct 300
gcttactctc acggagggga tctgtgggga cagggaaccc tggtgacagt ctctagt 357
<210> 108
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 108
caggtgacac tgaaagaaag cggccccgtg ctggtgaagc caaccgagac actgactctg 60
acctgcaaag tgagtgggat cgacctgagc cacgaggaca tctcctgggt gcggcaggca 120
cccggaaagg gcctggaatg ggtctccatc attagctacg ccgggagcac atactatgcc 180
agctgggcta aaggaagact gactatctcc aaggacacct ctaaaaacca ggtggtcctg 240
actatgacca atatggaccc cgtggataca gcaacttact attgtgccag gggcgtccct 300
gcttactctc acggagggga tctgtgggga cagggaaccc tggtgacagt ctctagt 357
<210> 109
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 109
caggtgcagc tggtcgaatc tggaggagga ctggtgcagc caggagggtc actgcgactg 60
agctgtgccg tgtccgggat cgacctgtca cacgaggata ttagctgggt gagacaggca 120
cccgggaagg gactggaatg ggtctctatc attagttacg ccggcagcaa gtactatgcc 180
tcttgggcta aaggcaggct gaccatttct aaggacacaa gtaaaaacca ggtggtcctg 240
accatgacaa atatggaccc cgtggatact gcaacctact attgcgcccg gggcgtccct 300
gcttatagcc acggcggcga tctgtgggga caggggacac tggtgactgt cagctcc 357
<210> 110
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 110
gacattgtga tgactcagtc tcctgccact ctgtcactga gccctggcga gcgagcaacc 60
ctgtcttgca ccagcagcca gtccgtgtac cacgccaatt ggctgagctg gttccagcag 120
aagccagggc agccccctaa actgctgatc tattgggcat caacactggc ctacggcgtc 180
ccctccagat tctccggatc tggcagtggg actgacttta ccctgaccat cagcagcctc 240
cagcccgagg atgccgctac ctactattgt gctggcgggt acggaggcgg gcggtatgca 300
tttggacagg gcacaaaggt ggaaatcaaa 330
<210> 111
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 111
gacattgtga tgactcagtc tcctgccact ctgtcactga gccctggcga gcgagcaacc 60
ctgtcttgca ccaccagcca gtccgtgtac cacgagaatt ggctgagctg gttccagcag 120
aagccagggc agccccctaa actgctgatc tattgggcat caacactggc ctacggcgtc 180
ccctccagat tctccggatc tggcagtggg actgacttta ccctgaccat cagcagcctc 240
cagcccgagg atgccgctac ctactattgt gctggcgggt acggaggcgg gcggtatgca 300
tttggacagg gcacaaaggt ggaaatcaaa 330
<210> 112
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 112
gacattgtga tgactcagtc tcctgccact ctgtcactga gccctggcga gcgagcaacc 60
ctgtcttgca ccagcagcca gtccgtgttc cacgagaatt ggctgagctg gttccagcag 120
aagccagggc agccccctaa actgctgatc tattgggcat caacactggc ctggggcgtc 180
ccctccagat tctccggatc tggcagtggg actgacttta ccctgaccat cagcagcctc 240
cagcccgagg atgccgctac ctactattgt gctggcgggt acggaggcgg gcggtatgca 300
tttggacagg gcacaaaggt ggaaatcaaa 330
<210> 113
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 113
gacattgtga tgactcagtc tcctgccact ctgtcactga gccctggcga gcgagcaacc 60
ctgtcttgca ccaccagcca gtccgtgtac cacgagaatt ggctgagctg gtaccagcag 120
aagccagggc agccccctaa actgctgatc tattgggcat caacactggc ctacggcgtc 180
ccctccagat tctccggatc tggcagtggg actgacttta ccctgaccat cagcagcctc 240
cagcccgagg atgtcgctac ctactattgt gctggcgggt acggaggcgg gcggtatgca 300
tttggacagg gcacaaaggt ggaaatcaaa 330
<210> 114
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 114
His Asp Asp Ile Ser
1 5
<210> 115
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 115
His Glu Asp Ile Ser
1 5
<210> 116
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 116
Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Ser Met Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 117
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 117
Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Lys
1 5 10 15
<210> 118
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 118
Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Lys Lys Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 119
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 119
Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Ser Lys Tyr Lys Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 120
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 120
Ile Ile Ser Tyr Ala Gly Ser Lys Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 121
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 121
Gly Val Pro Ala Tyr Ser His Gly Gly Asp Lys
1 5 10
<210> 122
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 122
Thr Ser Ser Gln Ser Val Tyr His Ala Asn Trp Leu Ser
1 5 10
<210> 123
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 123
Thr Thr Ser Gln Ser Val Tyr His Glu Asn Trp Leu Ser
1 5 10
<210> 124
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 124
Thr Ser Ser Gln Ser Val Phe His Glu Asn Trp Leu Ser
1 5 10
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 125
Trp Ala Ser Thr Leu Ala Trp
1 5
<210> 126
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Ser或His
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Tyr, Thr, Asp或Glu
<400> 126
Xaa Xaa Asp Ile Ser
1 5
<210> 127
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Tyr或His
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Ser或Lys
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是Thr, Met或Lys
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是Tyr或Lys
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa是Ala, Met或Glu
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa是Ser或Glu
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> Xaa是Gly或Lys
<400> 127
Ile Ile Ser Xaa Ala Gly Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Trp Ala Lys Xaa
1 5 10 15
<210> 128
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Tyr或His
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Thr或His
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa是Leu或Lys
<400> 128
Gly Val Pro Ala Xaa Ser Xaa Gly Gly Asp Xaa
1 5 10
<210> 129
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Gln或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Ser或Glu
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Tyr或Phe
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是Asp或His
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是Asn, Asp, Ala或Glu
<400> 129
Xaa Xaa Ser Gln Xaa Val Xaa Xaa Xaa Asn Trp Leu Ser
1 5 10
<210> 130
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Ser或Glu
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Ser, Tyr, Phe或Trp
<400> 130
Trp Ala Xaa Thr Leu Ala Xaa
1 5
<210> 131
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是Leu或Arg
<400> 131
Ala Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Xaa Tyr Ala
1 5 10
<210> 132
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 132
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser
20 25 30
<210> 133
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 133
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser
20 25 30
<210> 134
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 134
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser
20 25 30
<210> 135
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 135
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
1 5 10
<210> 136
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 136
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10
<210> 137
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 137
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1 5 10 15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 138
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 138
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 139
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 139
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
20
<210> 140
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 140
Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 141
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 141
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 142
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 142
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 143
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 143
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 144
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 144
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 145
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 145
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Tyr Thr Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ala Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr
65 70 75 80
Gly Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Gly Phe Leu
85 90 95
Asp Tyr Ser His Tyr Thr Thr Gly Gly Tyr Tyr Leu Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 146
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 146
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Thr
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Ser Tyr Tyr
20 25 30
Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Cys Ile Tyr Ala Gly Ile Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Tyr His Phe Asp Tyr Gly Ser Leu Trp Gly Pro Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 147
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 147
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Trp
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Ser Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ser
85 90 95
Arg Tyr Gly Ala Ala Arg Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
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<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 148
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ile
20 25 30
Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Phe Ile Tyr Val Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Arg Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Thr Trp
85 90 95
Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105
<210> 149
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 149
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Tyr Gly Val Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Ala
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Asp
85 90 95
Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 150
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 150
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Ser Ser
20 25 30
Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Lys Tyr Ile Gly
35 40 45
Phe Ile Ser Lys Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly
85 90 95
Tyr Ser Gly Asp Trp Asp Tyr Phe Thr Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 151
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 151
Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn Lys
20 25 30
Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Pro Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln
65 70 75 80
Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Glu Phe Ser Cys Gly
85 90 95
Ser Ala Asp Cys Thr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 152
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 152
Ala Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Gly Gly
20 25 30
Asn Glu Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Glu Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Arg Thr Tyr
85 90 95
Ser Asp Asp Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 153
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 153
Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Ala Gly Asn Asp
20 25 30
Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Arg Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln
65 70 75 80
Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Asn Tyr Asp Cys Ser
85 90 95
Ser Ala Asp Cys Asp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 154
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 154
Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Ala Ala Val Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asp Asn Asn
20 25 30
Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu
65 70 75 80
Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Tyr Ser Gly Asn
85 90 95
Ile Tyr Pro Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 155
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 155
Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln
65 70 75 80
Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Ser Tyr Tyr Ser Ser
85 90 95
Gly Trp Tyr Arg Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 156
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 156
Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val
1 5 10 15
Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Gly Asn
20 25 30
Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu
65 70 75 80
Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Phe Trp Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Ile Tyr Ala Phe Trp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
100 105 110
Ile Lys
<210> 157
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 157
Arg Tyr Tyr Val Ser
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 158
Ser Tyr Tyr Tyr Met Cys
1 5
<210> 159
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 159
Arg Tyr Trp Met Ser
1 5
<210> 160
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 160
Ser Tyr Ile Met Gly
1 5
<210> 161
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 161
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 162
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 162
Ser Ser Ser Met Ile
1 5
<210> 163
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 163
Ile Ile Tyr Thr Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 164
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 164
Cys Ile Tyr Ala Gly Ile Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 165
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 165
Ile Ile Ser Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 166
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 166
Phe Ile Tyr Val Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 167
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 167
Ile Ile Tyr Gly Val Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 168
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 168
Phe Ile Ser Lys Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 169
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 169
Phe Leu Asp Tyr Ser His Tyr Thr Thr Gly Gly Tyr Tyr Leu Asp Leu
1 5 10 15
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 170
Asp Pro Tyr His Phe Asp Tyr Gly Ser Leu
1 5 10
<210> 171
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 171
Asp Ser Arg Tyr Gly Ala Ala Arg Leu Asp Leu
1 5 10
<210> 172
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 172
Thr Trp Asp Leu
1
<210> 173
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 173
Asp Asp Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Asn Leu
1 5 10
<210> 174
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 174
Gly Gly Tyr Ser Gly Asp Trp Asp Tyr Phe Thr Leu
1 5 10
<210> 175
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 175
Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn Lys Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 176
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 176
Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Gly Gly Asn Glu Leu Ser
1 5 10
<210> 177
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 177
Gln Ser Ser Gln Ser Val Ala Gly Asn Asp Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 178
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 178
Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asp Asn Asn Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 179
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 179
Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 180
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 180
Gln Ala Ser Glu Ser Ile Gly Asn Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 181
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 181
Tyr Ala Ser Thr Leu Pro Ser
1 5
<210> 182
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 182
Ser Ala Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 183
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 183
Tyr Ala Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 184
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 184
Gly Ala Ser Thr Leu Asp Ser
1 5
<210> 185
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 185
Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 186
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 186
Gly Ala Phe Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 187
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 187
Gln Gly Glu Phe Ser Cys Gly Ser Ala Asp Cys Thr Ala
1 5 10
<210> 188
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 188
Ala Gly Tyr Arg Thr Tyr Ser Asp Asp Asp Asn Ala
1 5 10
<210> 189
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 189
Leu Gly Asn Tyr Asp Cys Ser Ser Ala Asp Cys Asp Ala
1 5 10
<210> 190
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 190
Gln Gly Gly Tyr Ser Gly Asn Ile Tyr Pro
1 5 10
<210> 191
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 191
Gln Gly Ser Tyr Tyr Ser Ser Gly Trp Tyr Arg Ala
1 5 10
<210> 192
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 192
Gln Gly Tyr Phe Trp Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Ala Phe Trp Ala
1 5 10 15
<210> 193
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 193
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 194
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 194
cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agtaaggact gcacctacag tctcagtagt accctgacgc tgtccaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgtcctcgcc cgtcacaaag 300
tccttcaaca ggggagagtg ttga 324
<210> 195
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 195
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 196
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人
<400> 196
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 197
<211> 377
<212> PRT
<213> 智人
<400> 197
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115 120 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130 135 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 198
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人
<400> 198
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 199
<211> 1125
<212> DNA
<213> 智人
<400> 199
atgtggttct tgacaactct gctcctttgg gttccagttg atgggcaagt ggacaccaca 60
aaggcagtga tcactttgca gcctccatgg gtcagcgtgt tccaagagga aaccgtaacc 120
ttgcactgtg aggtgctcca tctgcctggg agcagctcta cacagtggtt tctcaatggc 180
acagccactc agacctcgac ccccagctac agaatcacct ctgccagtgt caatgacagt 240
ggtgaataca ggtgccagag aggtctctca gggcgaagtg accccataca gctggaaatc 300
cacagaggct ggctactact gcaggtctcc agcagagtct tcacggaagg agaacctctg 360
gccttgaggt gtcatgcgtg gaaggataag ctggtgtaca atgtgcttta ctatcgaaat 420
ggcaaagcct ttaagttttt ccactggaat tctaacctca ccattctgaa aaccaacata 480
agtcacaatg gcacctacca ttgctcaggc atgggaaagc atcgctacac atcagcagga 540
atatctgtca ctgtgaaaga gctatttcca gctccagtgc tgaatgcatc tgtgacatcc 600
ccactcctgg aggggaatct ggtcaccctg agctgtgaaa caaagttgct cttgcagagg 660
cctggtttgc agctttactt ctccttctac atgggcagca agaccctgcg aggcaggaac 720
acatcctctg aataccaaat actaactgct agaagagaag actctgggtt atactggtgc 780
gaggctgcca cagaggatgg aaatgtcctt aagcgcagcc ctgagttgga gcttcaagtg 840
cttggcctcc agttaccaac tcctgtctgg tttcatgtcc ttttctatct ggcagtggga 900
ataatgtttt tagtgaacac tgttctctgg gtgacaatac gtaaagaact gaaaagaaag 960
aaaaagtggg atttagaaat ctctttggat tctggtcatg agaagaaggt aatttccagc 1020
cttcaagaag acagacattt agaagaagag ctgaaatgtc aggaacaaaa agaagaacag 1080
ctgcaggaag gggtgcaccg gaaggagccc cagggggcca cgtag 1125
<210> 200
<211> 951
<212> DNA
<213> 智人
<400> 200
atgactatgg agacccaaat gtctcagaat gtatgtccca gaaacctgtg gctgcttcaa 60
ccattgacag ttttgctgct gctggcttct gcagacagtc aagctgctcc cccaaaggct 120
gtgctgaaac ttgagccccc gtggatcaac gtgctccagg aggactctgt gactctgaca 180
tgccaggggg ctcgcagccc tgagagcgac tccattcagt ggttccacaa tgggaatctc 240
attcccaccc acacgcagcc cagctacagg ttcaaggcca acaacaatga cagcggggag 300
tacacgtgcc agactggcca gaccagcctc agcgaccctg tgcatctgac tgtgctttcc 360
gaatggctgg tgctccagac ccctcacctg gagttccagg agggagaaac catcatgctg 420
aggtgccaca gctggaagga caagcctctg gtcaaggtca cattcttcca gaatggaaaa 480
tcccagaaat tctcccattt ggatcccacc ttctccatcc cacaagcaaa ccacagtcac 540
agtggtgatt accactgcac aggaaacata ggctacacgc tgttctcatc caagcctgtg 600
accatcactg tccaagtgcc cagcatgggc agctcttcac caatgggggt cattgtggct 660
gtggtcattg cgactgctgt agcagccatt gttgctgctg tagtggcctt gatctactgc 720
aggaaaaagc ggatttcagc caattccact gatcctgtga aggctgccca atttgagcca 780
cctggacgtc aaatgattgc catcagaaag agacaacttg aagaaaccaa caatgactat 840
gaaacagctg acggcggcta catgactctg aaccccaggg cacctactga cgatgataaa 900
aacatctacc tgactcttcc tcccaacgac catgtcaaca gtaataacta a 951
<210> 201
<211> 954
<212> DNA
<213> 智人
<400> 201
atgactatgg agacccaaat gtctcagaat gtatgtccca gaaacctgtg gctgcttcaa 60
ccattgacag ttttgctgct gctggcttct gcagacagtc aagctgcagc tcccccaaag 120
gctgtgctga aacttgagcc cccgtggatc aacgtgctcc aggaggactc tgtgactctg 180
acatgccagg gggctcgcag ccctgagagc gactccattc agtggttcca caatgggaat 240
ctcattccca cccacacgca gcccagctac aggttcaagg ccaacaacaa tgacagcggg 300
gagtacacgt gccagactgg ccagaccagc ctcagcgacc ctgtgcatct gactgtgctt 360
tccgaatggc tggtgctcca gacccctcac ctggagttcc aggagggaga aaccatcatg 420
ctgaggtgcc acagctggaa ggacaagcct ctggtcaagg tcacattctt ccagaatgga 480
aaatcccaga aattctccca tttggatccc accttctcca tcccacaagc aaaccacagt 540
cacagtggtg attaccactg cacaggaaac ataggctaca cgctgttctc atccaagcct 600
gtgaccatca ctgtccaagt gcccagcatg ggcagctctt caccaatggg gatcattgtg 660
gctgtggtca ttgcgactgc tgtagcagcc attgttgctg ctgtagtggc cttgatctac 720
tgcaggaaaa agcggatttc agccaattcc actgatcctg tgaaggctgc ccaatttgag 780
ccacctggac gtcaaatgat tgccatcaga aagagacaac ttgaagaaac caacaatgac 840
tatgaaacag ctgacggcgg ctacatgact ctgaacccca gggcacctac tgacgatgat 900
aaaaacatct acctgactct tcctcccaac gaccatgtca acagtaataa ctaa 954
<210> 202
<211> 876
<212> DNA
<213> 智人
<400> 202
atgggaatcc tgtcattctt acctgtcctt gccactgaga gtgactgggc tgactgcaag 60
tccccccagc cttggggtca tatgcttctg tggacagctg tgctattcct ggctcctgtt 120
gctgggacac ctgcagctcc cccaaaggct gtgctgaaac tcgagcccca gtggatcaac 180
gtgctccagg aggactctgt gactctgaca tgccggggga ctcacagccc tgagagcgac 240
tccattcagt ggttccacaa tgggaatctc attcccaccc acacgcagcc cagctacagg 300
ttcaaggcca acaacaatga cagcggggag tacacgtgcc agactggcca gaccagcctc 360
agcgaccctg tgcatctgac tgtgctttct gagtggctgg tgctccagac ccctcacctg 420
gagttccagg agggagaaac catcgtgctg aggtgccaca gctggaagga caagcctctg 480
gtcaaggtca cattcttcca gaatggaaaa tccaagaaat tttcccgttc ggatcccaac 540
ttctccatcc cacaagcaaa ccacagtcac agtggtgatt accactgcac aggaaacata 600
ggctacacgc tgtactcatc caagcctgtg accatcactg tccaagctcc cagctcttca 660
ccgatgggga tcattgtggc tgtggtcact gggattgctg tagcggccat tgttgctgct 720
gtagtggcct tgatctactg caggaaaaag cggatttcag ccaatcccac taatcctgat 780
gaggctgaca aagttggggc tgagaacaca atcacctatt cacttctcat gcacccggat 840
gctctggaag agcctgatga ccagaaccgt atttag 876
<210> 203
<211> 933
<212> DNA
<213> 智人
<400> 203
atgggaatcc tgtcattctt acctgtcctt gccactgaga gtgactgggc tgactgcaag 60
tccccccagc cttggggtca tatgcttctg tggacagctg tgctattcct ggctcctgtt 120
gctgggacac ctgcagctcc cccaaaggct gtgctgaaac tcgagcccca gtggatcaac 180
gtgctccagg aggactctgt gactctgaca tgccggggga ctcacagccc tgagagcgac 240
tccattcagt ggttccacaa tgggaatctc attcccaccc acacgcagcc cagctacagg 300
ttcaaggcca acaacaatga cagcggggag tacacgtgcc agactggcca gaccagcctc 360
agcgaccctg tgcatctgac tgtgctttct gagtggctgg tgctccagac ccctcacctg 420
gagttccagg agggagaaac catcgtgctg aggtgccaca gctggaagga caagcctctg 480
gtcaaggtca cattcttcca gaatggaaaa tccaagaaat tttcccgttc ggatcccaac 540
ttctccatcc cacaagcaaa ccacagtcac agtggtgatt accactgcac aggaaacata 600
ggctacacgc tgtactcatc caagcctgtg accatcactg tccaagctcc cagctcttca 660
ccgatgggga tcattgtggc tgtggtcact gggattgctg tagcggccat tgttgctgct 720
gtagtggcct tgatctactg caggaaaaag cggatttcag ctctcccagg ataccctgag 780
tgcagggaaa tgggagagac cctccctgag aaaccagcca atcccactaa tcctgatgag 840
gctgacaaag ttggggctga gaacacaatc acctattcac ttctcatgca cccggatgct 900
ctggaagagc ctgatgacca gaaccgtatt tag 933
<210> 204
<211> 765
<212> DNA
<213> 智人
<400> 204
atgtggcagc tgctcctccc aactgctctg ctacttctag tttcagctgg catgcggact 60
gaagatctcc caaaggctgt ggtgttcctg gagcctcaat ggtacagggt gctcgagaag 120
gacagtgtga ctctgaagtg ccagggagcc tactcccctg aggacaattc cacacagtgg 180
tttcacaatg agagcctcat ctcaagccag gcctcgagct acttcattga cgctgccaca 240
gttgacgaca gtggagagta caggtgccag acaaacctct ccaccctcag tgacccggtg 300
cagctagaag tccatatcgg ctggctgttg ctccaggccc ctcggtgggt gttcaaggag 360
gaagacccta ttcacctgag gtgtcacagc tggaagaaca ctgctctgca taaggtcaca 420
tatttacaga atggcaaagg caggaagtat tttcatcata attctgactt ctacattcca 480
aaagccacac tcaaagacag cggctcctac ttctgcaggg ggcttgttgg gagtaaaaat 540
gtgtcttcag agactgtgaa catcaccatc actcaaggtt tgtcagtgtc aaccatctca 600
tcattctttc cacctgggta ccaagtctct ttctgcttgg tgatggtact cctttttgca 660
gtggacacag gactatattt ctctgtgaag acaaacattc gaagctcaac aagagactgg 720
aaggaccata aatttaaatg gagaaaggac cctcaagaca aatga 765
<210> 205
<211> 765
<212> DNA
<213> 智人
<400> 205
atgtggcagc tgctcctccc aactgctctg ctacttctag tttcagctgg catgcggact 60
gaagatctcc caaaggctgt ggtgttcctg gagcctcaat ggtacagggt gctcgagaag 120
gacagtgtga ctctgaagtg ccagggagcc tactcccctg aggacaattc cacacagtgg 180
tttcacaatg agagcctcat ctcaagccag gcctcgagct acttcattga cgctgccaca 240
gtcgacgaca gtggagagta caggtgccag acaaacctct ccaccctcag tgacccggtg 300
cagctagaag tccatatcgg ctggctgttg ctccaggccc ctcggtgggt gttcaaggag 360
gaagacccta ttcacctgag gtgtcacagc tggaagaaca ctgctctgca taaggtcaca 420
tatttacaga atggcaaagg caggaagtat tttcatcata attctgactt ctacattcca 480
aaagccacac tcaaagacag cggctcctac ttctgcaggg ggctttttgg gagtaaaaat 540
gtgtcttcag agactgtgaa catcaccatc actcaaggtt tggcagtgtc aaccatctca 600
tcattctttc cacctgggta ccaagtctct ttctgcttgg tgatggtact cctttttgca 660
gtggacacag gactatattt ctctgtgaag acaaacattc gaagctcaac aagagactgg 720
aaggaccata aatttaaatg gagaaaggac cctcaagaca aatga 765
<210> 206
<211> 702
<212> DNA
<213> 智人
<400> 206
atgtggcagc tgctcctccc aactgctctg ctacttctag tttcagctgg catgcggact 60
gaagatctcc caaaggctgt ggtgttcctg gagcctcaat ggtacagcgt gcttgagaag 120
gacagtgtga ctctgaagtg ccagggagcc tactcccctg aggacaattc cacacagtgg 180
tttcacaatg agagcctcat ctcaagccag gcctcgagct acttcattga cgctgccaca 240
gtcaacgaca gtggagagta caggtgccag acaaacctct ccaccctcag tgacccggtg 300
cagctagaag tccatatcgg ctggctgttg ctccaggccc ctcggtgggt gttcaaggag 360
gaagacccta ttcacctgag gtgtcacagc tggaagaaca ctgctctgca taaggtcaca 420
tatttacaga atggcaaaga caggaagtat tttcatcata attctgactt ccacattcca 480
aaagccacac tcaaagatag cggctcctac ttctgcaggg ggcttgttgg gagtaaaaat 540
gtgtcttcag agactgtgaa catcaccatc actcaaggtt tggcagtgtc aaccatctca 600
tcattctctc cacctgggta ccaagtctct ttctgcttgg tgatggtact cctttttgca 660
gtggacacag gactatattt ctctgtgaag acaaacattt ga 702
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<213> 智人
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Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile
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Glu Pro Gln Gly Ala Thr
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<213> 智人
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Thr Ala Val Ala Ala Ile Val Ala Ala Val Val Ala Leu Ile Tyr Cys
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
<400> 219
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65 70 75 80
Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg
85 90 95
Cys Gln Thr Gly Arg Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His Leu Thr Val
100 105 110
Leu Ser Glu Trp Leu Ala Leu Gln Thr Pro His Leu Glu Phe Arg Glu
115 120 125
Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu
130 135 140
Ile Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Ile Ala Lys Lys Phe Ser His
145 150 155 160
Met Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Arg Ala Asn His Ser His Ser Gly
165 170 175
Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Pro Tyr Ser Ser Lys
180 185 190
Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro Ser Val Gly Ser Ser Ser Pro
195 200 205
Met Gly Ile
210
<210> 221
<211> 211
<212> PRT
<213> 成束猴
<400> 221
Met Ser Gln Asn Val Cys Pro Gly Asn Leu Trp Leu Leu Gln Pro Leu
1 5 10 15
Thr Val Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala Asp Ser Gln Thr Ala Pro Pro
20 25 30
Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp Ile Asn Val Leu Arg Glu
35 40 45
Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gly Gly Ala His Ser Pro Asp Ser Asp
50 55 60
Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr His Thr Gln
65 70 75 80
Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg
85 90 95
Cys Gln Thr Gly Arg Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His Leu Thr Val
100 105 110
Leu Ser Glu Trp Leu Ala Leu Gln Thr Thr His Leu Glu Phe Arg Glu
115 120 125
Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu
130 135 140
Ile Lys Val Ala Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Lys Asn Phe Ser His
145 150 155 160
Met Asn Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser His Ser Gly
165 170 175
Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Pro Tyr Ser Ser Lys
180 185 190
Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro Ser Val Gly Ser Ser Ser Pro
195 200 205
Met Gly Ile
210
<210> 222
<211> 211
<212> PRT
<213> 成束猴
<400> 222
Met Ser Gln Asn Val Cys Pro Gly Asn Leu Trp Leu Leu Gln Pro Leu
1 5 10 15
Thr Val Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala Asp Ser Gln Thr Ala Pro Pro
20 25 30
Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp Ile Asn Val Leu Arg Glu
35 40 45
Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gly Gly Ala His Ser Pro Asp Ser Asp
50 55 60
Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr His Thr Gln
65 70 75 80
Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg
85 90 95
Cys Gln Thr Gly Arg Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His Leu Thr Val
100 105 110
Leu Ser Glu Trp Leu Ala Leu Gln Thr Thr His Leu Glu Phe Arg Glu
115 120 125
Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu
130 135 140
Ile Lys Val Ala Phe Phe Gln Asn Gly Ile Ser Lys Lys Phe Ser Pro
145 150 155 160
Met Asn Pro Asn Phe Ser Ile Pro Arg Ala Asn His Ser His Ser Gly
165 170 175
Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Pro Tyr Ser Ser Lys
180 185 190
Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro Ser Val Gly Ser Ser Ser Pro
195 200 205
Met Gly Ile
210
<210> 223
<211> 217
<212> PRT
<213> 成束猴
<400> 223
Met Gly Ile Leu Ser Phe Leu Pro Val Leu Ala Thr Glu Ser Asp Trp
1 5 10 15
Ala Asp Cys Lys Ser Ser Gln Pro Trp Gly His Met Leu Leu Trp Thr
20 25 30
Ala Val Leu Phe Leu Ala Pro Val Ala Gly Thr Pro Ala Ala Pro Pro
35 40 45
Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp Ile Asn Val Leu Arg Glu
50 55 60
Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gly Gly Ala His Ser Pro Asp Ser Asp
65 70 75 80
Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr His Thr Gln
85 90 95
Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg
100 105 110
Cys Gln Thr Gly Arg Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His Leu Thr Val
115 120 125
Leu Ser Glu Trp Leu Ala Leu Gln Thr Pro His Leu Glu Phe Arg Glu
130 135 140
Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu
145 150 155 160
Ile Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Ile Ser Lys Lys Phe Ser His
165 170 175
Met Asn Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser His Ser Gly
180 185 190
Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Pro Tyr Ser Ser Lys
195 200 205
Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro
210 215
<210> 224
<211> 208
<212> PRT
<213> 成束猴
<400> 224
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Ala Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Arg Trp Phe His Asn Glu
50 55 60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Thr Ser Ser Tyr Phe Ile Ala Ala Ala Arg
65 70 75 80
Val Asn Asn Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Ser Leu Ser Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100 105 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Glu Ser Ile His Leu Arg Cys
115 120 125
His Ser Trp Lys Asn Thr Leu Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130 135 140
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His Gln Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Ile
165 170 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180 185 190
Asp Leu Ala Val Ser Ser Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
195 200 205
<210> 225
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 225
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Glu Ser Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 226
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 226
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Gln Ala Ser Glu Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 227
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 227
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 228
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 228
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 229
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 229
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Asn Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Lys Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Met Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 230
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 230
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Asn Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Lys Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Met Val Leu Asp Arg Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Lys Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 231
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 231
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Asn Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Lys Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 232
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 232
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Asn Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Lys Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Lys Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 233
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 233
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Asn Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Leu Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Lys Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 234
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 234
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Asn Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
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180 185 190
His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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<220>
<223> 人工合成的序列
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35 40 45
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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275 280 285
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305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 236
<211> 328
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<223> 人工合成的序列
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 237
<211> 328
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<213> 人工序列
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<223> 人工合成的序列
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 238
<211> 328
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<220>
<223> 人工合成的序列
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325
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<213> 人工序列
<220>
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 240
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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<223> 人工合成的序列
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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<211> 328
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<213> 人工序列
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<223> 人工合成的序列
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165 170 175
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180 185 190
His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
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210 215 220
Gln Arg Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
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275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Thr Thr
305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 245
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 245
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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Asn Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Leu Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Lys Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Lys Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr
305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 246
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 246
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Asn Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
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130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
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His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Thr Ala Leu Pro Lys Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Arg Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr
305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 247
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 247
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1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 248
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 248
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Lys Ala Leu Pro Lys Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
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325
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<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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Gln Arg Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
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Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 250
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 251
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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Lys Ala Leu Pro Lys Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
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Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
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275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Arg Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 252
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 253
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 253
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 254
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 254
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 255
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 255
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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195 200 205
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275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 256
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 256
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Val Val Val Asp Val Ala His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Lys Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 257
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 257
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1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
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Lys Pro Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
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Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 258
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 258
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305 310 315 320
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325
<210> 259
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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325
<210> 260
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<223> 人工合成的序列
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 261
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 261
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325
<210> 262
<211> 328
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 263
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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<213> 人工序列
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<223> 人工合成的序列
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<210> 266
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305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 267
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 267
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Lys Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 268
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 268
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Tyr Leu Gly Gly Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
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His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
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210 215 220
Gln Arg Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 269
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 269
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245 250 255
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260 265 270
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290 295 300
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305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 270
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 271
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 271
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 272
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 272
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 273
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 273
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 274
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 274
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 275
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 275
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
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165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
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305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 279
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 279
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65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
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210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
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260 265 270
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Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 280
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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50 55 60
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65 70 75 80
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 281
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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325
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<211> 328
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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325
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<220>
<223> 人工合成的序列
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<211> 328
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<213> 人工序列
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<223> 人工合成的序列
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Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 285
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
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<211> 328
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<213> 人工序列
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<223> 人工合成的序列
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325
<210> 289
<211> 328
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<220>
<223> 人工合成的序列
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Lys Ala Leu Pro Lys Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
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275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Lys Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
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305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 290
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 290
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Lys Pro Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
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Val Val Ile Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Val Leu
180 185 190
His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Lys Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Arg Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr
305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 291
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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290 295 300
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305 310 315 320
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325
<210> 292
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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<211> 328
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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325
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<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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<210> 296
<211> 328
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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<213> 人工序列
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<223> 人工合成的序列
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290 295 300
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305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 301
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 301
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Lys Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr
305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 302
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 302
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Tyr Leu Gly Gly Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Ile Asp Val Ala His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
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195 200 205
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210 215 220
Gln Arg Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr
305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 303
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 303
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35 40 45
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290 295 300
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305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 304
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 304
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
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325
<210> 305
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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290 295 300
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305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 306
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 306
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325
<210> 307
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ala His Thr Thr
305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 308
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 309
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 309
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325
<210> 310
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 311
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325
<210> 312
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 312
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ala His Thr Thr
305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 313
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 313
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1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
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325
<210> 314
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 314
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325
<210> 315
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 315
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325
<210> 316
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 316
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325
<210> 317
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 317
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
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325
<210> 318
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 319
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325
<210> 320
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 320
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Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
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<210> 321
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 323
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275 280 285
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325
<210> 324
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 324
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Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Ile Asp Val Ala His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Val Leu
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His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
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Lys Ala Leu Pro Lys Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
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225 230 235 240
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Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 325
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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290 295 300
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305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 326
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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325
<210> 327
<211> 328
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<223> 人工合成的序列
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325
<210> 328
<211> 328
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<220>
<223> 人工合成的序列
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<210> 330
<211> 328
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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<223> 人工合成的序列
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Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
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<211> 328
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<213> 人工序列
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<223> 人工合成的序列
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325
<210> 334
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Val Leu
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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245 250 255
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290 295 300
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305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 335
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 335
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
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Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
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180 185 190
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Lys Ala Leu Pro Lys Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
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290 295 300
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325
<210> 336
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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325
<210> 337
<211> 328
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<213> 人工序列
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325
<210> 338
<211> 328
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325
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<223> 人工合成的序列
<400> 346
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275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Thr Thr
305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 347
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 347
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35 40 45
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305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 348
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 348
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<210> 350
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<213> 人工序列
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<223> 人工合成的序列
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<213> 人工序列
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325
<210> 357
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 357
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180 185 190
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195 200 205
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305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 358
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 358
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
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225 230 235 240
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245 250 255
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<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 359
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325
<210> 360
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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325
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<211> 328
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<223> 人工合成的序列
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<220>
<223> 人工合成的序列
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<213> 人工序列
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Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 364
<211> 328
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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<211> 328
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
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<211> 328
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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<211> 328
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<220>
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<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 368
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Gln Arg Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr
305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 369
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 369
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
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Lys Pro Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
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Val Val Ile Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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325
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<211> 328
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<213> 人工序列
<220>
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Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
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<213> 人工序列
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<223> 人工合成的序列
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180 185 190
His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Lys Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Arg Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr
305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 381
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 381
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Tyr Leu Gly Gly Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Ile Asp Val Ala His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Val Leu
180 185 190
His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Lys Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Lys Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr
305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325

Claims (39)

1.分离的抗体，所述分离的抗体结合潜伏性肌肉生长抑制因子，其中所述抗体抑制肌肉生长抑制因子的活化。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体：
(a)阻断成熟肌肉生长抑制因子从潜伏性肌肉生长抑制因子的释放；
(b)阻断成熟肌肉生长抑制因子的蛋白水解释放；
(c)阻断成熟肌肉生长抑制因子的自发释放；或
(d)不结合成熟肌肉生长抑制因子；或结合由肌肉生长抑制因子前肽(SEQ ID NO:78)的氨基酸21-100组成的片段内的表位。
3.权利要求1或2的抗体，其中所述抗体与包含表2a、11a或13中所述的VH和VL对的抗体竞争结合潜伏性肌肉生长抑制因子，或与包含表2a、11a或13中所述的VH和VL对的抗体结合相同的表位。
4.权利要求1至3中任一项的抗体，其在中性pH结合潜伏性肌肉生长抑制因子的亲和力比在酸性pH更高，或其在pH7.4结合潜伏性肌肉生长抑制因子的亲和力比在pH5.8更高。
5.权利要求1至4中任一项的抗体，其是(a)单克隆抗体，(b)人、人源化或嵌合抗体；(c)全长IgG抗体或(d)结合肌肉生长抑制因子的抗体片段。
6.权利要求1至5中任一项的抗体，其中所述抗体包含：
(a)(i)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列GVPAX1SX2GGDX3，其中X1是Y或H，X2是T或H，X3是L或K(SEQ ID NO:128)，(ii)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列AGGYGGGX1YA，其中X1是L或R(SEQ ID NO:131)，和(iii)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列IISX1AGX2X3YX4X5X6WAKX7，其中X1是Y或H，X2是S或K，X3是T、M或K，X4是Y或K，X5是A、M或E，X6是S或E，X7是G或K(SEQ ID NO:127)；
(b)(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列X1X2DIS，其中X1是S或H，X2是Y、T、D或E(SEQID NO:126)，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列IISX1AGX2X3YX4X5X6WAKX7，其中X1是Y或H，X2是S或K，X3是T、M或K，X4是Y或K，X5是A、M或E，X6是S或E，X7是G或K(SEQ ID NO:127)，和(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列GVPAX1SX2GGDX3，其中X1是Y或H，X2是T或H，X3是L或K(SEQ ID NO:128)；
(c)(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列X1X2DIS，其中X1是S或H，X2是Y、T、D或E(SEQID NO:126)，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列IISX1AGX2X3YX4X5X6WAKX7，其中X1是Y或H，X2是S或K，X3是T、M或K，X4是Y或K，X5是A、M或E，X6是S或E，X7是G或K(SEQ ID NO:127)，(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列GVPAX1SX2GGDX3，其中X1是Y或H，X2是T或H，X3是L或K(SEQ ID NO:128)，(iv)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列X1X2SQX3VX4X5X6NWLS，其中X1是Q或T，X2是S或T，X3是S或E，X4是Y或F，X5是D或H，X6是N、D、A或E(SEQ ID NO:129)；(v)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列WAX1TLAX2，其中X1是S或E，X2是S、Y、F或W(SEQ ID NO:130)；和(vi)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列AGGYGGGX1YA，其中X1是L或R(SEQ ID NO:131)；或
(d)(i)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列X1X2SQX3VX4X5X6NWLS，其中X1是Q或T，X2是S或T，X3是S或E，X4是Y或F，X5是D或H，X6是N、D、A或E(SEQ ID NO:129)；(ii)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列WAX1TLAX2，其中X1是S或E，X2是S、Y、F或W(SEQ ID NO:130)；和(iii)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列AGGYGGGX1YA，其中X1是L或R(SEQ ID NO:131)。
7.权利要求6(b)的抗体，其还包含：重链可变结构域框架FR1，所述FR1包含SEQ ID NO:132-134中任一的氨基酸序列；FR2，所述FR2包含SEQ ID NO:135-136中任一的氨基酸序列；FR3，所述FR3包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列；和FR4，所述FR4包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列。
8.权利要求6(d)的抗体，其还包含：轻链可变结构域框架FR1，所述FR1包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列；FR2，所述FR2包含SEQ ID NO:140-141中任一的氨基酸序列；FR3，所述FR3包含SEQ ID NO:142-143中任一的氨基酸序列；和FR4，所述FR4包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列。
9.权利要求1至5中任一项的抗体，其包含(a)与SEQ ID NO:13、16-30、32-34和86-95中任一的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)与SEQ ID NO:15、31、35-38和96-99中任一的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)SEQ ID NO:13、16-30、32-34和86-95中任一的VH序列，和SEQ ID NO:15、31、35-38和96-99中任一的VL序列。
10.分离的核酸，其编码权利要求1至9中任一项的抗体。
11.宿主细胞，其包含权利要求10的核酸。
12.制备抗-肌肉生长抑制因子抗体的方法，所述方法包括：
(a)培养权利要求11的宿主细胞从而制备所述抗体；或
(b)针对多肽免疫动物，其中所述多肽包含对应于肌肉生长抑制因子前肽(SEQ ID NO:78)的位置21至100处的氨基酸的区域。
13.药物制剂，所述药物制剂包含权利要求1至9中任一项的抗体和药用载体。
14.多肽，所述多肽包含变体Fc区，所述变体Fc区包含在亲本Fc区中的至少一个氨基酸改变，其中[亲本Fc区对猴FcγRIIb的KD值]/[变体Fc区对猴FcγRIIb的KD值]之比是2.0或更大，并且[亲本Fc区对猴FcγRIIIa的KD值]/[变体Fc区对猴FcγRIIIa的KD值]之比是0.5或更小。
15.权利要求14的多肽，其中进一步地，[亲本Fc区对人FcγRIIb的KD值]/[变体Fc区对人FcγRIIb的KD值]之比是2.0或更大，并且[亲本Fc区对人FcγRIIIa的KD值]/[变体Fc区对人FcγRIIIa的KD值]之比是0.5或更小。
16.权利要求15的多肽，其中进一步地，[亲本Fc区对人FcγRIIa(H型)的KD值]/[变体Fc区对人FcγRIIa(H型)的KD值]之比是5.0或更小。
17.权利要求16的多肽，其中进一步地，[亲本Fc区对人FcγRIIa(R型)的KD值]/[变体Fc区对人FcγRIIa(R型)的KD值]之比是5.0或更小。
18.权利要求14的多肽，其中变体Fc区对猴FcγRIIb的KD值是1.0x10-6M或更小，并且变体Fc区对猴FcγRIIIa的KD值是5.0x10-7M或更大。
19.权利要求15的多肽，其中变体Fc区对人FcγRIIb的KD值是2.0x10-6M或更小，并且变体Fc区对人FcγRIIIa的KD值是1.0x10-6M或更大。
20.权利要求16的多肽，其中变体Fc区对人FcγRIIa(H型)的KD值是1.0x10-7M或更大。
21.权利要求17的多肽，其中变体Fc区对人FcγRIIa(R型)的KD值是2.0x10-7M或更大。
22.权利要求14至21中任一项的多肽，其中，根据EU编号，所述变体Fc区包含选自由以下组成的组的至少一个位置的至少一个氨基酸改变：231、232、233、234、235、236、237、238、239、264、266、267、268、271、295、298、325、326、327、328、330、331、332、334和396。
23.权利要求22的多肽，其中，根据EU编号，所述变体Fc区包含至少两个氨基酸改变，所述至少两个氨基酸改变包含：
(a)位置236处的一个氨基酸改变，和
(b)选自由以下组成的组的至少一个位置的至少一个氨基酸改变：
(i)位置231、232、233、234、235、237、238、239、264、266、267、268、271、295、298、325、326、327、328、330、331、332、334和396；
(ii)位置231、232、235、239、268、295、298、326、330和396；或
(iii)位置268、295、326和330。
24.权利要求22或23的多肽，其中，根据EU编号，所述变体Fc区包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸：
(a)位置231处的Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr，
(b)位置232处的Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr，
(c)位置233处的Asp，
(d)位置234处的Trp、Tyr，
(e)位置235处的Trp，
(f)位置236处的Ala、Asp、Glu、His、Ile、Leu、Met、Asn、Gln、Ser、Thr、Val，
(g)位置237处的Asp、Tyr，
(h)位置238处的Glu、Ile、Met、Gln、Tyr，
(i)位置239处的Ile、Leu、Asn、Pro、Val，
(j)位置264处的Ile，
(k)位置266处的Phe，
(l)位置267处的Ala、His、Leu，
(m)位置268处的Asp、Glu，
(n)位置271处的Asp、Glu、Gly，
(o)位置295处的Leu，
(p)位置298处的Leu，
(q)位置325处的Glu、Phe、Ile、Leu，
(r)位置326处的Thr，
(s)位置327处的Ile、Asn，
(t)位置328处的Thr，
(u)位置330处的Lys、Arg，
(v)位置331处的Glu，
(w)位置332处的Asp，
(x)位置334处的Asp、Ile、Met、Val、Tyr，和
(y)位置396处的Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr。
25.权利要求24的多肽，其中，根据EU编号，所述变体Fc区包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸：
(a)位置231处的Gly、Thr,
(b)位置232处的Asp，
(c)位置235处的Trp，
(d)位置236处的Asn、Thr，
(e)位置239处的Val，
(f)位置268处的Asp、Glu，
(g)位置295处的Leu，
(h)位置298处的Leu，
(i)位置326处的Thr，
(j)位置330处的Lys、Arg，和
(k)位置396处的Lys、Met。
26.多肽，所述多肽包含变体Fc区，所述变体Fc区包含在亲本Fc区中的至少两个氨基酸改变，其中每个所述氨基酸改变使得所述变体Fc区的等电点(pI)与亲本Fc区的等电点相比提高。
27.权利要求26的多肽，其中所述氨基酸改变被暴露在所述变体Fc区的表面上。
28.权利要求26或27的多肽，其还包含抗原结合结构域。
29.权利要求28的多肽，其中所述抗原结合结构域的抗原结合活性根据离子浓度条件而改变。
30.权利要求26至29中任一项的多肽，其中，根据EU编号，所述变体Fc区包含选自由以下组成的组的至少两个位置的至少两个氨基酸改变：285、311、312、315、318、333、335、337、341、342、343、384、385、388、390、399、400、401、402、413、420、422和431。
31.权利要求30的多肽，其中所述变体Fc区在所选的每个位置处包含Arg或Lys。
32.多肽，所述多肽包含变体Fc区，所述变体Fc区包含表14-30中所述的氨基酸改变。
33.权利要求14至32中任一项的多肽，其中所述亲本Fc区源于人IgG1。
34.权利要求14至33中任一项的多肽，其中所述多肽是抗体或Fc融合蛋白。
35.多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:229-381中任一的氨基酸序列。
36.分离的核酸，所述分离的核酸编码权利要求14至35中任一项的多肽。
37.宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求36的核酸。
38.制备包含变体Fc区的多肽的方法，所述方法包括培养权利要求37的宿主细胞从而制备所述多肽。
39.药物制剂，所述药物制剂包含权利要求14至35中任一项的多肽和药用载体。
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