BRPI9816332B1 - tira de teste de biossensor eletroquímico aperfeiçoada - Google Patents
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Abstract
tira de teste de biossensor eletroquímico aperfeiçoada. o biossensor inclui um primeiro substrato isolante (1), com uma primeira superfície (22) e uma segunda superfície (23). o substrato (1) também inclui uma endentação (2), um entalhe (3) e um orifício de escape (4).
Description
"TIRA DE TESTE DE BIOSSENSOR ELETROQUlMICO APERFEIÇOADA” Pedido Dividido do PI 9815122-3, depositado em 02 de Dezembro de 1998.
Campo da Invenção Esta invenção se refere a um biossensor e a seu uso na detecção ou medição de analitos em fluidos.
Fundamentos da Invenção A técnica anterior inclui tiras de teste, incluindo tiras de teste de biossensor eletro-químico, para a medição da quantidade de um analito em um fluido.
Faz-se uso dessas tiras de teste particularmente para a medição de glicose no sangue humano. Essas tiras de teste têm sido usadas por diabéticos e profissionais de cuidados com a saúde para a monitorização de seus níveis de glicose sanguínea. As tiras de teste são normalmente usadas em conjunto com um medidor, que mede a refletância da luz, se a tira for destinada à detecção fotométrica de um corante, ou que mede alguma propriedade elétrica, como corrente elétrica, se a tira for destinada à detecção de um composto eletroati-vo.
Entretanto, as tiras de teste anteriormente fabricadas apresentam certos problemas para os indivíduos que as usam. Por exemplo, as tiras de teste são relativamente pequenas, e um diabético com a visão prejudicada pode ter grande dificuldade de adicionar apropriadamente uma gota de sangue à área de aplicação de amostra da tira de teste. Seria útil que a tira de teste fosse fabricada de modo que pessoas com a visão prejudicada pudessem dosar facilmente a tira de teste.
Quando a tira de teste é um dispositivo de enchimento capilar, isto é, quando a câmara de reação química da tira de teste é um espaço capilar, podem ocorrer problemas particulares com um enchimento suave e suficiente da câmara com a amostra líquida a ser testada. Devido às pequenas dimensões do espaço capilar e da composição dos materiais u-sados na fabricação da tira de teste, a amostra de teste pode hesitar em entrar na câmara de reação capilar. Além disso, amostra insuficiente também pode entrar na câmara de reação capilar, resultando, dessa forma, em um resultado de teste impreciso. Seria muito útil que esses problemas pudessem ser minimizados.
Finalmente, tiras de teste, particularmente aquelas usadas por diabéticos para a medição da glicose sanguínea, são produzidas em massa. Processos, como punção mecânica, usados para a fabricação dessas tiras de teste podem fazer com que um reagente de teste que tenha sido secado sobre a superfície da área de teste rache ou se rompa, causando, dessa forma, perda de reagente ou uma localização imprópria do reagente na tira. Também seria útil projetar um reagente de teste que pudesse suportar etapas de processamento, como punção mecânica. A tira de teste de biossensor eletroquímico da presente invenção apresenta solu- ções para os problemas acima citados, encontrados em tiras de teste da técnica anterior.
Sumário da Invenção A invenção é uma tira de teste de biossensor eletroquímico aperfeiçoada com quatro novas características altamente vantajosas. A primeira nova característica é uma endentação ao longo de uma borda da tira de teste para uma fácil identificação do orifício de aplicação de amostra para pessoas com a visão prejudicada ou para uso em condições de iluminação zero ou baixa. A tira de teste tem uma câmara de teste capilar, e o teto da câmara de teste inclui a segunda nova característica da tira de teste de biossensor. A segunda nova característica é uma janela transparente ou translúcida, que opera como uma linha de “nível de enchimento”, identificando, dessa forma, quando amostra de teste suficiente (uma amostra líquida, como sangue) foi adicionada à câmara de teste para efetuar um teste com precisão. A janela define a quantidade de amostra mínima, ou dose, requerida para efetuar um teste e, portanto, representa uma prova visual que reduz as chances de resultados de teste errôneos devido a uma subdosagem da tira de teste. O comprimento e a largura da janela são mais curtos que o comprimento e a largura da câmara de teste capilar. A janela é dimensionada e está posicionada de modo a se superpor a toda a largura do eletrodo de trabalho e pelo menos cerca de 10% da largura do contra-eletrodo ou de referência da tira de teste de biossensor. De preferência, a área do teto em volta da janela é colorida para proporcionar um bom contraste de cor entre a amostra, conforme observada através da janela, e a área de teto em volta da janela, para facilitar a identificação de uma dosagem suficiente da tira. A terceira nova característica da tira de teste é a inclusão de um entalhe, ou de múltiplos entalhes, localizado no orifício de aplicação de amostra. Cria-se um entalhe tanto no primeiro substrato isolante, quanto no teto da tira. Esses entalhes são dimensionados e posicionados de modo a se superporem entre si na tira de teste. Esses entalhes reduzem o fenômeno chamado de “hesitação da dose”. Quando uma amostra é adicionada ao orifício de aplicação de amostra de uma tira sem entalhes, a amostra pode hesitar em sua introdução na câmara de teste capilar. Essa “hesitação da dose” aumenta o tempo de teste. Quando a tira de teste inclui um entalhe, a hesitação da dose é reduzida. Além disso, com a inclusão do entalhe tanto no primeiro substrato isolante, quanto no teto, é possível para a a-mostra de teste se aproximar do orifício de aplicação de amostra por uma ampla variedade de ângulos. O ângulo de abordagem da amostra de teste seria mais limitado se o entalhe estivesse apenas no teto.
Finalmente, a quarta nova característica da tira de teste é um reagente que inclui óxido de polietileno com um peso molecular médio de cerca de 100 quilodaltons a cerca de 900 quilodaltons, a concentrações de cerca de 0,2% (peso:peso) a cerca de 2% (pe- so:peso), que toma o reagente seco mais hidrofílico e mais resistente. Com a inclusão de óxido de polietileno, o reagente de teste pode suportar mais prontamente a punção mecânica durante a montagem da tira e a manipulação mecânica pelo usuário da tira de teste. A-lém disso, o reagente seco, que incluirá de cerca de 1,75% (peso:peso) a cerca de 17,5% (peso:peso) de óxido de polietileno, pode ser facilmente redissolvido, ou ressuspendido, quando uma amostra de teste aquosa é adicionada à câmara de teste da tira.
Breve Descrição dos Desenhos A Fig. 1 é uma vista desmontada de uma modalidade preferida da presente invenção. A Fig. 2 mostra uma tira de teste preferida completamente montada.
As Figs. 3a - 3i representam um processo preferido para a fabricação da tira de teste da invenção. A Fig. 4 é uma vista em seção transversal da tira de teste da Fig. 2 através da linha 28-28. A Fig. 5 é uma vista em seção transversal da tira de teste da Fig. 2 através da linha 29-29. A Fig. 6 ilustra curvas de calibração hipotéticas para diferentes lotes de tiras de teste.
Descrição da Invenção Os componentes de uma modalidade preferida do biossensor da presente invenção são mostrados nas Figuras 1, 2, 4 e 5. O biossensor inclui um primeiro substrato isolante 1, que tem uma primeira superfície 22 e uma segunda superfície 23. O substrato isolante 1 pode ser feito de qualquer material isolante utilizável. Tipicamente, plásticos, como polímeros vinílicos, poliimidas, poliésteres e estirênicos proporcionam as propriedades elétricas e estruturais desejadas. O primeiro substrato isolante 1 também inclui uma endentação 2, um entalhe 3 e um orifício de escape 4. Como o biossensor mostrado na Fig. 1 se destina à produção em massa a partir de rolos de material, necessitando da seleção de um material que seja suficientemente flexível para o processamento em rolos e, ao mesmo tempo, suficientemente rígido para conferir uma rigidez utilizável ao biossensor acabado, um primeiro substrato isolante 1 particularmente preferido é um plástico MELINEX 329 de 178 mícrons (7 mils) de espessura, um poliéster disponível na ICI Films (3411 Silverisde Road, PO Box 15391, Wilmington, Delaware 19850).
Conforme mostradona Fig. 1, percursos condutores de eletricidade 5 e 6 são depositados sobre a primeira superfície 22 do primeiro substrato isolante 1. O percurso 5 pode ser um eletrodo funcional, feito de materiais condutores de eletricidade, como paládio, platina, ouro, carbono e titânio. O percurso 6 pode ser um contra-eletrodo, feito de materiais condutores de eletricidade, como paládio, platina, ouro, prata, ligas contendo prata, ligas de níquel-cromo, carbono, titânio e cobre. Metais nobres são preferidos porque proporcionam uma superfície de eletrodo mais constante e reprodutível. O paládio é particularmente preferido, porque é um dos metais nobres mais difíceis de oxidar e porque é um metal nobre relativamente barato.
De preferência, os percursos condutores de eletricidade 5 e 6 são depositados sobre um suporte isolante, como poliimida ou poliéster, para reduzir a possibilidade de rasgar o material de eletrodo durante a manipulação e fabricação da tira de teste. Um exemplo desses percursos condutores é um revestimento de paládio com uma resistência superficial de menos de 5 ohms por quadrado sobre um suporte de poliimida UPILEX, disponível na Courtalds-Andus Performance Films em Canoga Park, Califórnia.
Os percursos condutores de eletricidade 5 e 6 representam os eletrodos da tira de teste do biossensor. Esses eletrodos têm de estar suficientemente separados para que os eventos eletroquímicos em um eletrodo não interfiram com os eventos eietroquímicos no outro eletrodo. A distância preferida entre os eletrodos 5 e 6 é de cerca de 1,2 milímetros (mm).
Na tira de teste mostrada na Fig. 1, o percurso condutor de eletricidade 5 seria o e-letrodo funcional, e o percurso condutor de eletricidade 6 seria um contra-eletrodo ou um eletrodo de referência. O percurso 6 seria um eletrodo de referência se fosse feito de materiais típicos de eletrodos de referência, como prata/cloreto de prata. Em uma modalidade preferida, o percurso 5 é um eletrodo funcional feito de paládio, e o percurso 6 é um contra-eletrodo que também é feito de paládio e tem substancialmenteό mesmo tamanho que o eletrodo de trabalho.
Arranjos de três eletrodos também são possíveis, em que a tira inclui um percurso condutor de eletricidade adicional localizado entre o percurso condutor 6 e o orifício de escape 4. Em um arranjo de três eletrodos, o percurso condutor 5 seria um eletrodo funcional, o percurso 6 seria um contra-eletrodo, e o terceiro eletrodo entre o percurso 6 e o orifício de escape 4 seria um eletrodo de referência.
Superpondo-se aos percursos condutores 5 e 6, há um segundo substrato isolante 7. O segundo substrato isolante 7 é feito de um material similar, ou, de preferência, igual, ao do primeiro substrato isolante 1. O substrato 7 tem uma primeira superfície 8 e uma segunda superfície 9. A segunda superfície 9 está fixada à superfície do substrato 1 e aos percursos condutores 5 e 6 por um adesivo, como uma cola derretida com calor. Um exemplo dessa cola é a cola DYNAPOL S-1358, disponível na Hüls America, Inc., 220 Davidson Street, PO Box 6821, Somerset, NJ 08873. O substrato 7 também inclui uma primeira abertura 10 e uma segunda abertura 11. A primeira abertura 10 expõe partes dos percursos condutores 5 e 6 para conexão elétrica a um medidor, que mede alguma propriedade elétrica de uma a-mostra de teste após a amostra de teste ser misturada com o reagente da tira de teste. A segunda abertura 11 expõe uma parte diferente dos percursos condutores 5 e 6 para aplicação do reagente de teste 12 às superfícies expostas dos percursos 5 e 6. {Na Fig. 1, a largura inteira dos percursos condutores 5 e 6 está exposta pela abertura 11. Entretanto, também é possível expor apenas uma parte da largura do percurso condutor 6, que é um contra-eletrodo ou um eletrodo de referência, contanto que pelo menos cerca de 10% da largura sejam expostos pela abertura 11.) Além disso, o segundo substrato isolante 7 inclui uma endentação 19, que coincide com a endentação 2, conforme mostrado na Fig. 1. O reagente de teste 12 é um reagente específico para o teste a ser efetuado pela tira de teste. O reagente 12 pode ser aplicado a toda a área de superfície exposta dos percursos condutores 5 e 6 na área definida pela segunda abertura 11. Outras aplicações de reagente 12 nessa região também são possíveis. Por exemplo, se o percurso condutor 6 nessa região da tira tiver uma construção de eletrodo de referência, como prata/cloreto de prata, então, o reagente de teste 12 pode precisar cobrir apenas a área exposta do eletrodo funcional 5 nessa região. Além disso, a área exposta inteira de um eletrodo não precisa ser coberta pelo reagente de teste, contanto que uma área bem definida e reprodutível do eletrodo seja coberta pelo reagente.
Superpondo-se à primeira superfície 8 e à segunda abertura 11 está o teto 13. O teto 13 inclui a endentação 14 e o entalhe 15. A endentação 14 e o entalhe 15 são modelados e posicionados de modo que se superponham diretamente às endentações 2 e 19 e ao entalhe 3. O teto 13 pode ser feito de um material plástico, como uma folha de poliéster transparente ou translúcida de cerca de 51 mícrons (2 mils) a cerca de 152 mícrons (6 mils) de espessura. O teto 13 tem uma primeira superfície 16 e uma segunda superfície 17. A segunda superfície 17 do teto 13 é fixada à primeira superfície 8 do segundo substrato isolante 7 por um adesivo adequado, como o acrílico 3M 9458, disponível na 3M, Identification and Converter Systems Division, 3M Center, Building 220-7W-03, St. Paul, MN 55144.
De preferência, o teto 13 também inclui uma janela 18 transparente ou translúcida. A janela 18 é dimensionada e está posicionada de modo que, quando o teto 13 é fixado ao segundo substrato isolante 7, a janela se superponha à largura inteira do percurso condutor 5 e a pelo menos cerca de dez por cento da largura do percurso condutor 6. A segunda superfície 17 do teto 13, as bordas da abertura 11 e a primeira superfície 22 do substrato isolante 1 {e os percursos condutores 5 e 6 fixados à primeira superfície 22 do substrato 1) definem uma câmara de teste capilar. O comprimento e a largura dessa câmara capilar são definidos pelo comprimento e pela largura da abertura 11, e a altura da câmara é definida pela espessura do segundo substrato isolante 7.
Uma tira de teste preferida pode ser fabricada conforme mostrado pelo processo i-lustrado nas Figs. 3a-3i. Uma folha de material de substrato isolante 21 (MELINEX 329, 178 mícrons (7 mil) de espessura, disponível na ICI) é revestida de um lado com adesivo derretí- do com calor (DYNAPOL S-1358, disponível na Hüls). (Fig. 3a) A folha 21 é cortada ao longo da linha 24, formando, dessa forma, um primeiro substrato isolante 1, revestido com adesivo na primeira superfície 22, e um segundo substrato isolante 7, revestido com adesivo na segunda superfície 9. (Figs. 3b e 3c) A primeira abertura 10 e a segunda abertura 11 são criadas no substrato 7 por punção com matriz. (Fig. 3d) A seguir, os percursos condutores de eletricidade 5 e 6, feitos de paládio sobre um suporte de Upilex (disponível na Courtlads-Andus Performance Films), são desenrolados de bobinas pré-cortadas a cerca de 1,5 milímetros de largura e depositados sobre a superfície 22 do substrato 1, de modo que o suporte de Upilex fique adjacente à superfície 22. A superfície 9 do substrato 7 é depositada adjacente à superfície 22 do substrato 1 e aos percursos condutores 5 e 6, formando, dessa forma, a estrutura de sanduíche mostrada na Fig. 3e. Essa estrutura de sanduíchõe colóüã-da com calor.
Um reagente de teste 12 é, então, distribuído na abertura 11 e secado. (Fig. 3f) A-pós secar o reagente 12, cria-se um orifício de escape 4 com uma matriz de punção (Fig. 3g) A seguir, o teto 13, que inclui um revestimento hidrofílico 25 e uma janela 18, é depositado sobre a abertura 11, de modo que a janela 18 se superponha à largura inteira do percurso condutor 5 e a cerca de metade da largura do percurso condutor 6. O teto 13 é separado de um revestimento removível e fixado adesivamente à superfície 8, conforme mostrado na Fig. 3h.
Finalmente, tiras de teste individuais são puncionadas com uma matriz de punção, conforme mostrado na Fig. 3i. A matriz de punção pode puncionar tiras de teste com ou sem um entalhe 15. Se o entalhe 15 for incluído, o ângulo preferido do vértice é de 105°. Outros ângulos, como de cerca de 45° a cerca de 105°, também são possíveis para o entalhe 15. Além disso, o entalhe 15 pode ser um único entalhe ou múltiplos entalhes.
Conforme acima citado, o reagente de teste 12 é distribuído na área da tira de teste definida pelo corte 11. No processo de fabricação acima descrito, é preferível um tratamento de coroa da abertura 11 antes de o reagente de teste 12 ser aplicado. A aplicação do tratamento de coroa serve para aumentar a energia superficial da parte da superfície 22 e dos percursos condutores 5 e 6 expostos pela abertura 11, encorajando um espalhamento uniforme do reagente 12, e para pré-limpar a parte dos percursos condutores 5 e 6 expostos pela abertura 11. Verificou-se que a pré-limpeza dos percursos condutores 5 e 6 melhora significativamente o desempenho da tira de teste. O tratamento de coroa pode ser aplicado a densidades de watts que variam de cerca de 20 a cerca de 90 watts por centímetro por segundo (W/cm/s), com um vão de arco de cerca de 1 milímetro (0,040 polegadas).
No processo preferido, o tratamento de coroa é aplicado em forma de cobertura por sobre as superfícies mostradas na Fig. 3e, às densidades de watts acima descritas. O tratamento é mais eficaz se aplicado até 5 minutos após a aplicação do reagente 12 e é tipi- camente praticado até 45 segundos após a aplicação do reagente 12. É vantajoso reduzir os efeitos do tratamento de coroa sobre a superfície 8, para assegurar que o reagente 12 coalesça completamente na abertura 11 e não tenha uma uma afinidade maior pela superfície 8 do que pela parte de superfície 22 e pelos percursos condutores 5 e 6 expostos pela abertura 11. Um processo de dissipação de coroa, que permite a redução seletiva dos efeitos de um processo de tratamento de coroa por cobertura, é incorporado para reduzir os efeitos do tratamento em áreas da tela (a folha de tiras de teste que está sendo processada) fora da abertura 11. Esse processo de dissipação de coroa consiste na aplicação de uma fina película de água desionizada, de modo que a água entre em contato com a superfície 8, mas não com as aberturas 10 e 11. A aplicação da fina película de água, que tem, de preferência, de cerca de 1,5 mícrons a cerca de 3,0TTiícrons de espessura (cerca de 9,1 gramas de água por metro quadrado), pode ser realizada com um chumaço, impressão flexográfica ou outroprocesso de aplicação de revestimentos comercialmente disponível. A fina película de água é, então, secada na superfície, usando-se convecção forçada ou processos infravermelhos, pouco antes da aplicação do reagente 12. O efeito líquido desse tratamento é que a energia superficial da superfície 8 é eficazmente reduzida a menos de 62 dinas antes da aplicação do reagente 12, ao passo que a superfície da área dentro da abertura 11 é mantida em sua energia superficial pós-tratamento de coro-a.
Na modalidade preferida, o reagente de teste 12 é formulado para a medição de glicose em uma amostra de sangue humano. Um protocolo para a preparação de um litro de um reagente de glicose preferido utilizando a enzima quinoproteína (contendo pirrolo-quinolina quinona (PQQ)) glicose desidrogenase e o mediador redox ferricianeto é mostrado imediatamente abaixo. (A quinoproteína glicose desidrogenase é a Comissão de Enzimas n° 1.1.99.17.) Etapa 1: Preparar uma solução de NATROSOL em água desionizada. Isso é realizado pela adição de 0,45 gramas (g) de NATROSOL-250M (uma hidroxietilcelulose micro-cristalina disponível na Aqualon) a 414 g de água desionizada, enquanto-se agita a uma velocidade de no mínimo 250 revoluções por minuto (rpm), durante um período de no mínimo 30 minutos. A misturação é melhor realizada com um propulsor rotativo superior, usando-se uma propulsor do tipo turbina de três ou quatro pás. A seleção do tamanho e da configuração do propulsor se baseia principalmente no raio do recipiente de misturação que está sendo usado. O propulsor selecionado terá tipicamente um raio maior que 75% do raio do recipiente de misturação.
Etapa 2: À solução da Etapa 1, 5,6 g de AVICEL RC-591F (uma celulose microcris-talina disponível na FMC Corp.) são dispersados por adição gradual desse AVICEL à soiu-ção, enquanto se mistura a uma velocidade de no mínimo 570 rpm durante no mínimo 60 minutos.
Etapa 3: À mistura da Etapa 2, 8,4 g de óxido de polietileno (peso molecular médio de 300 quilodaltons) são gradualmente adicionados enquanto se mistura a uma velocidade de no mínimo 690 rpm, durante um período de no mínimo 45 minutos.
Etapa 4: Uma solução tampão é preparada pela adição de 12,1 g de fosfato de p7otássio monobásico (anidro) e 21,3 g de fosfato de potássio dibásico (anidro) a 450 g de água desionizada.
Etapa 5: Uma alíquota de 50 g da solução tampão é removida da preparação da Etapa 4. A essa alíquota de 50 g, 12,5 mg de coenzima PQQ (disponível na Fluka) são adicionados. Essa solução é agitada até que a coenzima esteja completamente dissolvida. (U-ma barra de agitação magnética e uma placa de agitação magnética São preferidas para a preparação da enzima.) Etapa 6: À solução da Etapa 5, 1,21 milhões de unidades da apoenzima de quino-proteína glicose desidrogenase são gradualmente adicionadas enquanto se agita a baixa velocidade (menos de 400 rpm em uma placa de agitação magnética) para evitar a formação de espuma. A solução resultante é misturada durante no mínimo 2 horas, para permitir que a associação de enzima e coenzima estabilize, resultando, dessa forma, em uma solução de quinoproteína glicose desidrogenase.
Etapa 7: À solução tamão da Etapa 4, 59,1 g de ferricianeto de potássio são adicionados. A seguir, 6,2 g de succinato de sódio são adicionados. A solução resultante é misturada até que todos os solutos estejam completamente dissolvidos. Após a dissolução, o pH da solução é avaliado e deve ser de aproximadamente 6,76 mais ou menos 0,05.
Etapa 8: A solução da Etapa 7 é gradualmente incorporada na mistura da Etapa 3, enquanto se mistura a uma taxa de no mínimo 190 rpm.
Etapa 9: À mistura da Etapa 8, 20 g de trealose são adicionados, enquanto se mistura a uma taxa de no mínimo 190 rpm, durante um período de no mínimo 10 minutos.
Etapa 10: 0,35 g de surfatante TRITON X-100, disponível na Boehringer Mannheim Biochemicals, são adicionados à mistura da Etapa 9, enquanto se mistura a uma taxa de no mínimo 190 rpm. Essa mistura tem de continuar a misturação durante no mínimo 5 minutos.
Etapa 11: A solução de enzima da Etapa 6 é adicionada à mistura da Etapa 10, e o reagente agora completo é misturado a uma taxa de no mínimo 190 rpm, durante um período de no mínimo 30 minutos.
Etapa 12: O reagente pode ser agora filtrado, quando necessário pelo equipamento de fabricação, por passagem através de um saco de filtração de 100 mícrons ou através de um filtro de 100 mícrons integrado a um sistema de bombeamento. A apoenzima da quinoproteína glicose desidrogenase, acima especificada, é obtida na Boehringer Mannheim GmbH na Alemanha (número de identificação na Boehringer Man- nheim GmbH 1464221). Alternativamente, essa apoenzima pode ser obtida de Acinetobac-ter calcoaceticus, pelo protocolo a seguir, apresentado em Duine et ai,, FEBS Letters, vol. 108, n° 2, pp. 443-46.
Acinetobacter calcoaceticus foi cultivado em um meio de sal mineral suplementado com 0,02 molares (M) de succinato de sódio ou 0,10 M de etanol a 22°C, com boa aeração. As células são colhidas ao término da fase logarítmica, e se pode obter um rendimento de células molhadas de ~4 g/l. Células congeladas (10 g) são descongeladas e misturadas com 15 mililitros (ml) de tampão Tris a 36 milimolares (mM)/glicina a 39 mM. Após a adição de 6 miligramas (mg) de lisozima, a suspensão é agitada à temperatura ambiente durante 45 min e centrifugada durante 10 minutos a 48.000 xg. O sobrenadante é dêscartadü, e a pelota é extraída duas vezes com tampão Tris a 36 mM/glicina a 39 mM, contendo 1% de surfatante TRITON X-100. Os sobrenadantes das etapas de centrifugação são combinados e usados imediatamente. O extrato livre de células é adicionado a uma coluna de DEAE-Sephacel (13 x 2,2 centímetros (cm)), equilibrado com tampão Tris a 36 mM/glicina a 39 mM, contendo 1% de surfatante TRITON X-100, e a coluna é lavada com o mesmo tampão. A enzima não adere ao material da coluna, e as frações ativas combinadas são tituladas com 2 M de ácido acéti-co a pH 6,0. Essa solução é adicionada imediatamente a uma coluna de CM-Sepharose CL-6 B (5 x 1 cm), equilibrada com 5 mM de fosfato de potássio (pH 6,0). Após a lavagem da coluna com o mesmo tampão até que nenhum surfatante TRITON X-100 esteja presente no eluído, a enzima é eluída com 0,1 M de fosfato de potássio (pH 7,0). A enzima é, então, dialisada contra 0,1 M de acetato de potássio (pH 4,5), contendo 3 M de brometo de potássio, a 4°C durante 72 horas. A enzima é, então, dialisada contra 0,02 M de fosfato de potássio (pH 7,0) durante 12 horas, resultando na apoenzima.
Na tira de teste preferida, a abertura 11 tem cerca de 3,2 milímetros por cerca de 6,7 milímetros. Na modalidade preferida da tira de teste de glicose, 4,5 microlitros de rea-gente de teste, preparado pelo protocolo acima, são adicionados à abertura 11. (Veja Fig. 3f) Essa quantidade de reagente cobrirá substancialmente as superfícies expostas dos percursos condutores 5 e 6 na abertura 12. O reagente de teste 12 é, então, secado a cerca de 70°C durante cerca de 1 a 2 minutos. A película de reagente de glicose seca preferida resultante conterá de cerca de 2.000 a cerca de 9.000 unidades de atividade de enzima por grama de reagente. O reagente preferido conterá os seguintes componentes adicionais por grama de reagente: 62,2 miligramas (mg) de óxido de polietileno; 3,3 mg de NATROSOL 250 M; 41,5 mg de AVICEL RC-591 F; 89,4 mg de fosfato de potássio monobásico; 157,9 mg de fosfato de potássio dibásico; 437,3 mg de ferricianeto de potássio; 46.0 mg de succinato de sódio; 148.0 mg de trealose; e 2,6 mg de surfatante TRITON X-100.
De forma importante, a inclusão de cerca de 0,2% em peso a cerca de 2% em peso de óxido de polietileno com um peso molecular médio de cerca de 100 quilodaltons a cerca de 900 quilodaltons, de preferência cerca de 0,71% em peso de óxido de polietileno com um peso molecular médio de 300 quilodaltons, no reagente úmido acima citado fornece um rea-gente de teste que, quando seco, é mais resistente^ etapas de processamento da tira, como punção mecânica, mais resistente à manipulação mecânica pelo usuário da tira de teste, e que é redissolvido ou ressuspendido quando uma amostra aquosa, como sangue humano, é adicionada a ele. Após a secagem, a porcentagem de óxido de polietileno varia de cerca de 1,75% (peso:peso) a cerca de 17,5% (peso:peso). No reagente seco preferido, a porcentagem de óxido de polietileno é de cerca de 6,2% (peso:peso). A espessura da película de reagente de glicose seco preferido é suficiente para que, em combinação com as propriedades inerentes da química de teste, a sensibilidade do teste à interferência pela variação do hematócrito seja mitigada. Nessa modalidade preferida da invenção, a espessura da película (conforme medida pela razão de volume de distribuição de reagente úmido para a área de superfície exposta pela abertura 11) é suficiente para que 4,5 microlitros de reagente sejam distribuídos em uma área de aproximadamente 22,5 milímetros quadrados (a área preferida da abertura 11). A inclusão de óxido de polietileno com um peso molecular médio de cerca de 100 quilodaltons a cerca de 900 quilodaltons em uma película com a espessura acima descrita resulta em um sensor que possui uma sensibilidade reduzida à variação do hematócrito quando a glicose é medida em uma amostra de sangue humano.
Após o reagente de teste 12 ter secado na abertura 11, o teto 13 é depositado sobre a abertura 11 e fixado por adesivo à superfície 8, conforme acima descrito. O próprio teto 13 é fabricado em um processo separado, de acordo com os procedimentos descritos abaixo.
De preferência, o teto 13 é feito com uma folha de poliéster MELINEX 561, com uma espessura de 127 mícrons (5 mils). Uma tinta substancialmente opaca é impressa sobre a primeira superfície 16, em um padráo 27, de modo que a janela 18 permaneça transparente ou translúcida. A janela é posicionada e dimensionada de modo que, quando o teto é fixado à superfície 8, se alinhe com a abertura 11, conforme mostrado na Fig. 3h.
Na segunda superfície 17, lamina-se um sistema adesivo para que o teto possa ser finalmente fixado à superfície 8. Esse sistema adesivo pode ser convenientemente um adesivo acrílico, como os disponíveis em muitas fontes comerciais, mas, de preferência, a peça número 9458 da 3M Inc.
Além disso, antes da colocação do teto sobre a superfície 8, um pedaço de plástico transparente ou translúcido, de preferência um tereftalato de polietileno (PET), como o plástico Melinex X, com cerca de 25 a cerca de 102 mícrons (0,001 a 0,004 polegadas) de espessura, é colocado contra o sistema adesivo na segunda superfície 17, e alinhado com e estendendo-se além das dimensões da janela 18. Esse plástico revestido é o revestimento hidrofílico 25. O revestimento 25 é especificamente escolhido para conferir uma natureza hidrofílica à superfície interna da câmara de teste capilar, para encorajar o fluxo de uma a-mostra aquosa, como sangue, para ã câmáTâ de teste. O revestimento 25 pode ser escolhido dentre muitos revestimentos disponíveis, destinados a apresentar uma superfície hidrofílica, mas o produto número ARCARE 8586, disponível na Adhesives Research, Inc., é preferido. O revestimento 25 também age na prevenção do contato direto do adesivo do teto com o reagente 12.
Finalmente, o teto 13 é colocado sobre a superfície 8. (Veja Fig. 3h) É nesse estágio que a janela transparente ou translúcida 18, definida pela ausência de tinta impressa no teto 13, tem de se alinhar com a abertura 11, conforme mostrado na Fig. 3h. As dimensões da janela transparente ou translúcida 18 devem ser escolhidas para que uma fração substancial da largura (mais de cerca de 75%) do canal capilar subjacente seja visível através da janela 18. A dimensão ortogonal da janela 18 deve expor toda a largura do eletrodo funcional 5. Conseqüentemente, quando uma amostra, como sangue, é introduzida na câmara de teste capilar, através do orifício de aplicação de amostra 20, é possível para um usuário com uma acuidade visual razoável determinar se a janela está completamente cheia da amostra. Com a escolha das dimensões da janela conforme apresentado, é possível para o usuário da tira de teste ter um feedback de que a tira foi suficientemente dosada com uma amostra de teste. A confirmação visual da janela cheia assegura que uma área suficiente do eletrodo funcional está coberta pela amostra-e que uma parte suficiente do contra-eletrodo ou de referência 6 também está coberta. Esse recobrimento dos eletrodos pela amostra de teste é importante para se conseguir um teste preciso em um biossensor eletroquímico de enchimento capilar. Essa confirmação visual de dosagem suficiente da tira de teste proporciona uma garantia contra resultados de teste errôneos devidos a uma subdosagem não detectada da tira de teste.
As tiras de teste 26 completadas são usadas em conjunto com um medidor capaz de medir alguma propriedade elétrica da amostra de teste, após a adição da amostra de teste ao orifício de aplicação de amostra 20. (Veja Fig. 2) A propriedade elétrica que é medida pode ser, por exemplo, a corrente elétrica, o potencial elétrico, a carga elétrica ou a im- pedância. Um exemplo de medição de alterações no potencial elétrico para efetuar um teste analítico é ilustrado na Patente U.S. n° 5,413.690, cuja exposição é aqui incorporada por referência.
Um exemplo de medição da corrente elétrica para efetuar um teste analítico é ilustrado nas Patentes U.S. ri* 5.288.636 e 5.508.171, cujas exposições são aqui incorporadas por referência.
Na modalidade preferida, a tira de teste 26 está conectada a um medidor, que inclui uma fonte de energia (uma bateria). Aperfeiçoamentos nesses medidores e um sistema bi-ossensor podem ser encontrados nas Patentes U.S. nos 4.999.632, 5.243.516, 5.366.609, 5.352.351, 5.405.511 e 5.438.271, cujas exposições são aqui incorporadas por referência.
Muitos fluidos contendo ãhalitos podem ser analisados pela tira de teste eletroquí-mico da presente invenção. Por exemplo, analitos em fluidos corporais humanos, como sangue total, soro sangüíneo, urina e fluido cerebroespinhal, podem ser medidos. Da mesma forma, analitos encontrados em produtos de fermentação e em substâncias ambientais, que potencialmente contenham contaminantes ambientais, podem ser medidos.
Para se determinar a concentração de glicose em uma amostra de sangue humano com a tira de teste preferida acima apresentada, em que os percursos 5 e 6 são de paládio e têm substancialmente o mesmo tamanho, e o reagente de glicose é o reagente acima especificado, uma amostra de sangue pode ser adicionada ao orifício de aplicação de amostra 20. A amostra será puxada para a câmara de teste por ação capilar. Uma vez dentro da câmara de teste, a amostra de sangue se misturará com o reagente de teste 12. Após um período de incubação de algum tempo desejado, por exemplo, 30 segundos, aplica-se uma diferença de potencial pela fonte de energia do medidor entre os percursos 5 e 6. Na modalidade preferida, a diferença de potencial é de 300 milivolts. A corrente pode ser medida a qualquer momento de 0,5 segundos a cerca de 30 segundos após a diferença de potencial de 300 milivolts ter sido aplicada. A corrente medida pode ser correlacionada à concentração de glicose na amostra de sangue. A corrente medida -durante o ensaio de um analito de uma amostra de fluido pode ser correlacionada à concentração do analito na amostra, mediante aplicação de um algoritmo pelo medidor de corrente. O algoritmo pode ser simples, conforme ilustrado pelo e-xemplo a seguir: [Analito] = Ci7i5 + d em que [Analito] representa a concentração do analito na amostra (veja Fig. 6), i7i5 é a corrente (em microamperes) medida 7,5 segundos após a aplicação da diferença de potencial entre os eletrodos, C é a inclinação da linha 30 (Fig. 6), e d é a interseção como eixo (Fig. 6).
Fazendo-se medições com concentrações conhecidas de analito, pode-se construir uma curva de calibração 30 (Fig. 6). Essa calibração será armazenada na chave de Memória Apenas de Leitura (ROM) do medidor e será aplicável a um lote particular de tiras de teste. As linhas 31 e 32 na Fig. 6 representam outras curvas de calibração hipotéticas para dois outros lotes diferentes de tiras de teste. A calibração desses lotes de biossensores geraria valores ligeiramente diferentes para C e d no algoritmo acima.
Em um processo preferido para a análise de glicose em uma amostra de sangue total humano, as medições de corrente são feitas a intervalos de 0,5 segundos, de 3 segundos a 9 segundos após a aplicação da diferença de potencial entre os eletrodos. Essas medições de corrente são correlacionadas à concentração de glicose na amostra de sangue.
Neste exemplo de medição de glicose em uma amostra de sangue, as medições de corrente são feitas em rflCmentos diferentes (de 3 segundos a 9 segundos após a aplicação da diferença de potencial), em vez de em um único momento fixo (conforme acima descrito), e o algoritmo resultante é mais complexo e pode ser representado pela seguinte equação: [Glicose] = Ciii + C2i2 + C3Í3 +... Cnin + d, em que u é a corrente medida no primeiro momento de medição (3 segundos após a aplicação da diferença de potencial de 300 milivolts), i2 é a corrente medida no segundo momento de medição (3,5 segundos após a aplicação da diferença de potencial de 300 milivolts), i3 é a corrente medida no terceiro momento de medição (4 segundos após a aplicação da diferença de potencial de 300 milivolts), in é a corrente medida no enésimo momento de medição (neste exemplo, no 13° momento de medição ou 9 segundos após a aplicação da diferença de potencial de 300 milivolts), C1, C2, C3 e Cn são coeficientes derivados de uma técnica de análise de regressão com múltiplas variáveis, como a Análise de Componentes de Princípios ou de Mínimos Quadrados Parcial, e d é a interseção da regressão (em unidades de concentração de glicose).
Alternativamente, a concentração de glicose na amostra que está sendo medida pode ser determinada integrando-se a curva gerada traçando-se a corrente, i, contra 0 momento de medição em um intervalo de tempo (por exemplo, de 3 segundos a 9 segundos após a aplicação da diferença de potencial de 300 milivolts), obtendo-se, dessa forma, a carga total transferida durante 0 período de medição. A carga total transferida é diretamente proporcional à concentração de glicose na amostra que está sendo medida.
Além disso, a medição da concentração de glicose pode ser corrigida quanto a diferenças entre a temperatura ambiente no momento da medição real e a temperatura ambiente no momento em que a calibração foi efetuada. Por exemplo, se a curva de calibração para a medição de glicose foi construída a uma temperatura ambiente de 23°C, a medição de glicose é corrigida usando-se a seguinte equação: [GliCOSejcorrigida — [GllCOSejmedida X (1 “ K(T 23 C)), em que T é a temperatura ambiente (em °C) no momento da medição da amostra, e K é uma constante derivada da seguinte equação de regressão: Y = K(T-23), em que [GliCOSe] medida a 230c — [GliCOSeJmedjda a tOc [Glicose]medida a jOq Para se calsular o valor de K, mede-se cada uma de uma multiplicidade de concen-traçõesTte glicose pelo medidor a várias temperaturas, T, e a 23°C (o caso básico). A seguir, efetua-se uma regressão linear de Y em T-23, O valor de K é a inclinação dessa regressão. Várias características da presente invenção podem ser incorporadas em outras tiras de teste eletroquímico, como as apresentadas nas Patentes U.S. nos 5.120.420, 5.141.868, 5.437.999, 5.192.415, 5.264.103 e 5.575.895, cujas exposições são aqui incorporadas por referência.
REIVINDICAÇÕES
Claims (20)
1. Tira de teste de biossensor eletroquímico compreendendo: um primeiro substrato isolante (1) com primeira (22) e segunda (23) superfícies; pelo menos dois percursos condutores (5,6} dispostos na primeira superfície (22) do primeiro substrato isolante (1); um reagente de teste (12) superposto a pelo menos uma parte dos percursos condutores (5,6) expostos por uma câmara de teste capilar; um teto (13) com primeira (16) e segunda (17) superfícies, a segunda superfície (17) do teto (13) estando posicionada de modo que a segunda superfície (17) do teto (13) e a primeira superfície (22) do primeiro substrato isolante (1) formem paredes opostas da câmara de teste capilar compreendendo um orifício de aplicação de amostra (20); e um orifício de escape (4) em comunicação com a câmara de teste capilar, CARACTERIZADA por o teto (13) adicionalmente compreender uma janela transparente ou translúcida (18), em que a referida janela: está depositada sobre a abertura (11), tem uma borda opaca nos três lados; é dimensionada de forma que mais que 75 por cento da largura da câmara de teste capilar seja visível através da janela (18); sobrepõe pelo menos 10% da largura de um contra-eletrodo (6); e fornece confirmação visual de dosagem suficiente da tira de teste
2. Tira de teste de biossensor, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA por adicionalmente compreender um segundo substrato isolante (7) com primeira (8) e segunda (9) superfícies e definindo pelo menos uma abertura (11), a segunda superfície (9) sendo fixada aos percursos condutores de eletricidade (5,6) e à primeira superfície (22) do primeiro substrato isolante (1), a abertura (11) expondo uma porção dos percursos condutores (5,6), em que a segunda superfície (17) do teto (13) é fixada à primeira superfície (8) do segundo substrato isolante (7).
3. Tira de teste de biossensor, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a área definida pelo comprimento e largura da janela (18) é menor do que a área definida pelo comprimento e largura da câmara de teste capilar.
4. Tira de teste de biossensor, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, CARACTERIZADA pelo fato de que a janela transparente ou translúcida (18) fornece identificação quando amostra de teste suficiente foi adicionada à câmara de teste para efetuar um teste com precisão.
5. Tira de teste de biossensor, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a janela define a quantidade de amostra mínima requerida para efetuar um teste com precisão.
6. Tira de teste de biossensor, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, CARACTERIZADA pelo fato de que através da janela (18) uma fração substancial da largura do canal capilar subjacente está visível.
7. Tira de teste de biossensor, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, CARACTERIZADA pelo fato de que uma amostra é introduzida na dita câmara de teste capilar através do orifício de aplicação de amostra (20).
8. Tira de teste de biossensor, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, CARACTERIZADA pelo fato de que pelo menos dois percursos condutores se estendem transversalmente à dita câmara de teste capilar.
9. Tira de teste de biossensor, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o reagente de teste (12) sobrepõe pelo menos um dos ditos percursos condutores.
10. Tira de teste de biossensor, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um substrato isolante flexível (1).
11. Tira de teste de biossensor, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, CARACTERIZADA pelo fato de que a dimensão ortogonal da janela (18) expõe a largura completa de um eletrodo de trabalho (5).
12. Tira de teste de biossensor, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita janela fornece uma resposta visual que a tira foi suficientemente dosada com a amostra de teste.
13. Tira de teste de biossensor, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, CARACTERIZADA pelo fato de que o comprimento e a largura da janela são menores que o comprimento e a largura da câmara de teste capilar.
14. Tira de teste de biossensor, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, CARACTERIZADA pelo fato de que a confirmação visual da dosagem suficiente da tira de teste é fornecida pela janela operando como uma linha de “nível de enchimento”.
15. Tira de teste de biossensor, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um entalhe para reduzir a “hesitação de dose” localizada no orifício de aplicação de amostra.
16. Tira de teste de biossensor, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito entalhe para reduzir a “hesitação de dose” é criada em ambos de um primeiro substrato isolante e o teto da tira.
17. Tira de teste de biossensor, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADA pelo fato de que os ditos entalhes para reduzir a “hesitação de dose” são dimensionados e posicionados de forma que eles sobreponham um ao outro da tira de teste.
18. Tira de teste de biossensor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 16, CARACTERIZADA pelo fato de o teto inclui um revestimento hidrofílico.
19. Tira de teste de biossensor, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma endentação ao longo de uma extremidade da tira de teste para fácil identificação do orifício de aplicação da amostra (20).
20. Tira de teste de biossensor, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, CARACTERIZADA pelo fato de que a janela (18) fornece confirmação visual que uma área suficiente de pelo menos dois percursos condutores sejam cobertos com a amostra do líquido de teste para efetuar um teste com precisão.
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