PL218692B1

PL218692B1 - Podstawiony 2-(pirydyn-2-yloamino)pirydo[2,3-d]pirymidyn-7-on oraz jego zastosowanie do leczenia zaburzenia lub stanu spowodowanego nieprawidłową proliferacją komórek

Info

Publication number: PL218692B1
Application number: PL372046A
Authority: PL
Inventors: Mark Robert Barvian; Richard John Booth; John Quin Iii; Joseph Thomas Repine; Derek James Sheehan; Peter Laurence Toogood; Scott Norman Vanderwel; Hairong Zhou
Original assignee: Warner Lambert Co
Priority date: 2002-01-22
Filing date: 2003-01-10
Publication date: 2015-01-30
Also published as: OA12755A; NO2017014I2; PL391191A1; CR20120129A; HK1162026A1; EP1470124B1; RS59804A; FR17C1012I1; CY1105686T1; LTC1470124I2; NO2017014I1; IL162721A; IL198243A; WO2003062236A8; CN101906104B; SI1470124T1; GT200300005A; LTPA2017013I1; CA2473026A1; TNSN04126A1

Description

Wynalazek dotyczy podstawionego 2-(pirydyn-2-yloamino)pirydo[2,3-d]pirymidyn-7-onu oraz jego zastosowania do leczenia zaburzenia lub stanu spowodowanego nieprawidłową proliferacją komórek. Podstawione 2-(pirydyn-2-yloamino)pirydo[2,3-d]pirymidyn-7-ony są silnymi inhibitorami kinazy 4 zależnej od cykliny. Związek według wynalazku jest użyteczny w leczeniu stanów zapalnych i chorób związanych z proliferacją komórek, takich jak rak.

Kinazy zależne od cykliny i pokrewne kinazy białkowe serynowo/treoninowe są ważnymi enzymami komórkowymi, które spełniają kluczową rolę w regulowaniu podziału i proliferacji komórek. Katalityczne jednostki kinazy zależnej od cykliny są aktywowane przez regulujące podjednostki znane jako cykliny. Co najmniej 16 cyklin zidentyfikowano u ssaków (Johnson D.G. i Walker C.L., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1999; 39: 295 - 312). Cyklina B/cdk1, cyklina A/cdk2, cyklina E/cdk2, cyklina D/cdk4, cyklina D/Cdk6, i prawdopodobnie inne heterodimery, w tym Cdk3 i Cdk7 są ważnymi regulatorami rozwoju cyklu komórkowego. Dodatkowe funkcje heterodimerów cykliny/Cdk obejmują regulację transkrypcji, naprawę DNA, różnicowanie i apoptozę (Morgan D.O., Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 1997; 13261 - 13291).

Wykazano, że zwiększona aktywność lub przejściowe nieprawidłowe uaktywnienie kinaz zależnych od cykliny powoduje rozwój ludzkich nowotworów (Sherr C.J., Science 1996; 274: 1672 - 1677). Rzeczywiście, rozwój ludzkiego nowotworu jest ściśle związany ze zmianami samych białek Cdk lub ich regulatorów (Cordon-Cardo C., Am. J. Pathol. 1995; 147: 545 - 560; Karp J.E. i Broder S., Nat. Med. 1995; 1: 309 - 320; Hall M. i in., Adv. Cancer Res. 1996; 68: 67 - 108).

Naturalnie występujące białkowe inhibitory Cdks, takie jak p16 i p27, powodują hamowanie wzrostu in vitro w liniach komórkowych raka płuc (Kamb A., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1998; 227: 139 - 148).

Małocząsteczkowe inhibitory Cdk można także stosować w leczeniu zaburzeń sercowo-naczyniowych, takich jak restenoza i miażdżyca tętnic, oraz inne zaburzenia naczyniowe związane z nieprawidłową proliferacją komórek. Proliferacja naczyniowych mięśni gładkich i przerost błony wewnętrznej naczynia po angioplastyce balonowej są hamowane przez nadekspresję białka p21 jako inhibitora kinazy zależnej od cykliny (Chang M.W. i in., J. Clin. Invest., 1995; 96: 2260; Yang Z-Y. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 1996; 93: 9905. Ponadto, purynowy inhibitor cdk2, CVT-313 (Ki = 95 nM) powoduje większe niż 80% hamowanie tworzenia neointymy u szczurów (Brooks E.E. i in., J. Biol. Chem. 1997: 29207 - 29211).

Inhibitory Cdk można stosować w leczeniu chorób spowodowanych licznymi czynnikami zakaźnymi, w tym grzybami, pasożytami pierwotniakowymi, takimi jak Plasmodium falciparum oraz wirusami DNA i RNA. Kinazy zależne od cykliny są np. niezbędne do replikacji wirusowej po zakażeniu wirusem opryszczki pospolitej (HSV) (Schang L.M. i in., J. Virol. 1998; 72: 5626), a homologi Cdk są znane jako odgrywające kluczowe role w drożdżach.

Selektywne inhibitory Cdk można stosować dla łagodzenia skutków różnych zaburzeń autoimmunologicznych. Przewlekła choroba zapalna, reumatoidalne zapalenie stawów, charakteryzuje się rozrostem tkanki maziowej; zahamowanie proliferacji tkanki maziowej powinno zmniejszać zapalenia i zapobiegać uszkodzeniu stawu. Ekspresja białka p16 jako inhibitora Cdk w maziowych fibroblastach prowadzi do wzrostu zahamowania (Taniguchi K. i in., Nat. Med. 1999; 5: 760 - 767). Podobnie, w szczurzym modelu zapalenia stawów obrzęk stawu był znacznie hamowany przez działanie adenowirusem eksprymującym p16. Inhibitory Cdk mogą być skuteczne przeciw innym zaburzeniom proliferacji komórek, w tym łuszczycy (charakteryzującej się nadmierną proliferacją keratynocytów), zapaleniu kłębuszków nerkowych i toczniowi.

Niektóre inhibitory Cdk mogą być użyteczne jako środki chemioprotekcyjne przez ich zdolność hamowania postępu cyklu komórkowego w normalnych nietransformowanych komórkach (Chen i inni. J. Natl. Cancer Institute, 2000; 92: 1999 - 2008). Wstępne leczenie pacjenta chorego na raka inhibitorem Cdk przed zastosowaniem środków cytotoksycznych może zmniejszyć uboczne skutki równocześnie zastosowanej chemioterapii. Tkanki, w których zachodzi normalna proliferacja, są chronione przed działaniem cytotoksycznym przez działanie selektywnego inhibitora Cdk.

Artykuły przeglądowe dotyczące małocząsteczkowych inhibitorów kinaz zależnych od cykliny wskazują nalrudności identyfikowania związków, które hamują specyficzne białka Cdk bez hamowania innych enzymów. Tak więc, pomimo ich możliwości leczenia różnych chorób, inhibitory Cdk nie zostały dopuszczone do zastosowania handlowego (Fischer P.M., Curr. Opin. Drug Discovery 2001, 4,

PL 218 692 B1

623 - 634; Fry D.W. & Garrett M.D. Curr. Opin. Oncologic, Endocrine & Metabolic Invest. 2000, 2,

- 59; Webster K.R. & Kimball D. Emerging Drugs 2000, 5, 45 - 59; Sielecki T.M. i in., J. Med. Chem.

2000, 43, 1-18. ).

Przedmiotem wynalazku jest 2-(pirydyn-2-yloamino)pirydo[2,3-d]pirymidyn-7-on, którym jest 6-acetylo-8-cyklopentylo-5-metylo-2-(5-piperazyn-1-ylopirydyn-2-yloamino)-8H-pirydo[2,3-d]pirymidyn-7-on Iub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

W korzystnej postaci wynalazku związek ten występuje w postaci chlorowodorku.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie związku określonego powyżej do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia lub stanu spowodowanego nieprawidłową proliferacją komórek u ssaka, w tym człowieka, przy czym nieprawidłową proliferację komórek stanowi rak.

W korzystnej postaci wynalazku nieprawidłową proliferację komórek stanowi rak, wybrany z grupy obejmującej raki sutka, jajników, szyjki macicy, prostaty, jąder, przełyku, żołądka, płuc, kości, okrężnicy, trzustki, tarczycy, jelita cienkiego, jelita grubego, odbytnicy, mózgu i ośrodkowego układu nerwowego, nerwiaka, czerniaka, mięsaka, raka pęcherza, raka wątroby, raka nerki i białaczkę.

Wynalazek dotyczy zatem 2-(pirydyn-2-yloamino)pirydo[2,3-d]pirymidyn-7-onu jako związku użytecznego w leczeniu chorób z niekontrolowaną proliferacją komórek. Dodatkowo związek ten jest użyteczny w leczeniu zapalenia i chorób zapalnych. Dodatkowo związek ten można stosować jako środek przeciwzakaźny. Ponadto, związek ten ma zastosowanie jako środek chemoprotekcyjny dzięki zdolności do hamowania postępu cyklu komórkowego normalnych nietransformowanych komórek. Związek według wynalazku wykazuje nieoczekiwanie zwiększoną selektywność względem kinaz serynowo/treoninowych, kinazy 4 zależnej od cykliny i kinazy 6 zależnej od cykliny. Związek można łatwo syntetyzować i można podawać pacjentom różnymi sposobami.

Związek według wynalazku może występować w postaciach niesolwatowanych jak również w postaciach solwatowanych, włączając postacie uwodnione.

Można także wytwarzać izotopowe znaczone związki, które są identyczne ze związkiem według wynalazku, ale z tym, że jeden lub większa liczba atomów są zastąpione przez atom mający różną masę atomową lub liczbę masową od masy atomowej lub liczby masowej atomów zazwyczaj występujących w naturze. Przykładami izotopów, które można włączyć do związku według wynalazku są od2 3 13 11 powiednio izotopy wodoru, węgla, azotu, tlenu, fosforu, siarki, fluoru i chloru, takie jak ²H, ³H, ¹³C,¹¹C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁸O, ¹⁷O, ³¹P, ³²P, ³⁵S, ¹⁸F i ³⁶Cl. Niektóre izotopowo znaczone związki według wynalazku, np. 3 14 te zawierające radioaktywne izotopy, takie jak ³H i ¹⁴C, są użyteczne w testach rozkładu leku i/lub 3 14 substratu w tkance. Trytowane, to jest ³H, i węgiel-14, to jest ¹⁴C, izotopy są szczególnie korzystne z uwagi na łatwość wytwarzania i wykrywalność. Ponadto, podstawianie cięższymi izotopami, takimi jak ₂ deuter, to jest ²H, może dostarczyć pewnych korzyści terapeutycznych wynikających z większej trwałości metabolicznej, np. zwiększonego okresu półtrwania in vivo lub zmniejszenia wymaganej dawki, a tym samym mogą być korzystne w pewnych okolicznościach. Izotopowo znaczony związek według wynalazku i jego proleki można na ogół wytwarzać postępując zgodnie z procedurami ujawnionymi poniżej na schematach i/lub w przykładach oraz przepisach, przez podstawienie łatwo dostępnego izotopowo znaczonego reagenta w miejsce nieznaczonego izotopowo reagenta.

Związek według wynalazku jest ponadto zdolny do tworzenia farmaceutycznie dopuszczalnych preparatów zawierających sole addycyjne z kwasem.

Można także wytwarzać preparaty farmaceutyczne zawierające terapeutycznie skuteczną ilość związku lub jego terapeutycznie dopuszczalnej soli i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozcieńczalnik lub zaróbkę.

Określenie „anion” oznacza ujemnie naładowany przeciwjon, taki jak jon chlorkowy, bromkowy, trifluorooctanowy i trietyloamoniowy.

Określenie „rak” obejmuje, ale nie wyłącznie, następujące raki: raki sutka, jajników, szyjki macicy, prostaty, jąder, przełyku, żołądka, płuc, kości, okrężnicy, trzustki, tarczycy, jelita cienkiego, jelita grubego, odbytnicy, mózgu, ośrodkowego układu nerwowego, nerwiaka, czerniaka, mięsaka, raka pęcherza, raka wątroby, raka nerek, białaczkę.

Stosowane tu określenie „leczenie”, oznacza odwrócenie, złagodzenie, zahamowanie postępu lub zapobieganie zaburzeniu lub stanowi, do którego takie określenie się odnosi, albo zapobieganie jednemu lub większej liczbie objawów takiego stanu lub zaburzenia. Stosowane tu określenie „leczenie” dotyczy czynności leczenia, jako „leczenia” określonego powyżej.

Określenie „sole” oznacza relatywnie nietoksyczne sole addycyjne z kwasem nieorganicznym i organicznym związku według wynalazku. Takie sole można wytwarzać in situ podczas wydzielania

PL 218 692 B1 i oczyszczania związku lub w odrębnej reakcji oczyszczonego związku w postaci jego wolnej zasady z odpowiednim kwasem organicznym lub nieorganicznym i wydzielenie w ten sposób wytworzonej soli. Związek jest zdolny do wytwarzania różnych soli, z różnymi kwasami nieorganicznymi i organicznymi. Chociaż takie sole muszą być farmaceutycznie dopuszczalne do podawania zwierzętom, często jest pożądane w praktyce początkowe wydzielenie związku zasadowego z mieszaniny reakcyjnej jako soli, która nie jest farmaceutycznie dopuszczalna, a następnie przeprowadzenie w związek w postaci wolnej zasady przez poddanie działaniu reagentem alkalicznym, oraz przeprowadzenie wolnej zasady w farmaceutycznie dopuszczalną sól addycyjną z kwasem. Sole addycyjne z kwasem związków zasadowych są wytwarzane przez kontaktowanie postaci wolnej zasady z wystarczającą ilością żądanego kwasu do wytworzenia soli zwykłym sposobem. Postać wolnej zasady można przywrócić przez kontaktowanie postaci soli z zasadą i wydzielenie wolnej zasady zwykłym sposobem. Postacie wolnej zasady różnią się nieco od odpowiednich postaci soli niektórymi właściwościami fizycznymi, takimi jak rozpuszczalność w polarnych rozpuszczalnikach, ale z drugiej strony sole są równoważne do ich odpowiedniej wolnej zasady dla celów wynalazku.

Sole, takie jak siarczan, pirosiarczan, wodorosiarczan, siarczyn, wodorosiarczyn, azotan, fosforan, monowodorofosforan, diwodorofosforan, metafosforan, pirofosforan, chlorek, bromek, jodek można wytwarzać z kwasów takich jak kwas chlorowodorowy, azotowy, fosforowy, siarkowy, bromowodorowy, jodowodorowy, fosforowy i podobne. Reprezentatywne sole obejmują bromowodorek, chlorowodorek, siarczan, wodorosiarczan, azotan, octan, szczawian, walerianian, oleinian, palmitynian, stearynian, laurynian, boran, benzoesan, mleczan, fosforan, tosylan, cytrynian, maleinian, fumaran, bursztynian, winian, naftylan, mesylan, glukoheptonian, laktobionian, laurylosulfonian i izetionan. Sole można także wytwarzać z kwasów organicznych, takich jak alifatyczne kwasy mono- i dikarboksylowe, podstawione fenylem kwasy alkanowe, kwasy hydroksyalkanowe, kwasy alkanodiowe, kwasy aromatyczne, sulfonowe kwasy alifatyczne i aromatyczne, itd. i podobne. Reprezentatywne sole obejmują octan, propionian, oktanian, izomaślan, szczawian, malonian, bursztynian, suberynian, sebacynian, fumaran, maleinian, migdalan, benzoesan, chlorobenzoesan, metylobenzoesan, dinitrobenzoesan, ftalan, benzenosulfonian, toluenosulfonian, fenylooctan, cytrynian, mleczan, maleinian, winian, metanosulfonian i podobne. (Patrz np. Berge S. M. i in., „Pharmaceutical Salts” J. Pharm. Sci., 1977; 66: 1 - 19, które tu przytoczono jako pozycję literaturową).

Z uwagi na aktywność hamującą przeciw cdks i innym kinazom, związek według wynalazku jest także użytecznym narzędziem do badania mechanizmu działania tych kinaz, zarówno in vitro jak i in vivo.

Leczenie pacjenta jest prowadzone przez podawanie terapeutycznie skutecznej ilości związku osobnikowi wymagającemu leczenia. Związek według wynalazku jest podstawioną 2-amino-pirydyną, które to związki są silnymi inhibitorami kinaz 4 (cdk4), zależnych od cykliny. Związki te są łatwo syntetyzowane i można je podawać różnymi drogami, w tym doustnie i pozajelitowe, oraz są mało toksyczne lub nietoksyczne. Związek według wynalazku stanowi selektywny inhibitor kinazy cdk4 zależnej od cykliny, co znaczy, że hamuje on cdk4 silniej, niż hamują kinazy tyrozynowe i inne kinazy serynowo-treoninowe, włącznie z innymi kinazami zależnymi od cykliny, takimi jak cdk2. Pomimo selektywności w hamowaniu cdk4, związek według wynalazku może hamować inne kinazy, aczkolwiek w wyższym stężeniu niż to, w którym hamują cdk4. Jednakże, związek według wynalazku może także hamować Cdk6 w podobnych stężeniach do tych potrzebnych do hamowania dk4, ponieważ Cdk6 jest strukturalnie do nich podobna i spełnia podobne funkcje do cdk4.

Związek korzystnie hamuje cdk4 co najmniej 100-krotnie silniej od hamowania przez niego cdk2.

Związek według wynalazku ma użyteczne farmaceutyczne i lecznicze właściwości. Wykazuje znaczącą selektywną aktywność hamującą cdk4 i dlatego jest wartościowy w leczeniu szerokiego zakresu stanów klinicznych, w których kinaza cdk4 jest nieprawidłowo podwyższona lub aktywowana, względnie jest obecna w normalnej ilości i aktywności, ale w których hamowanie cdk jest konieczne dla leczenia zaburzenia proliferacji komórek.

Wytwarzanie związku według wynalazku zilustrowano ogólnie na schematach. Dla związku według wynalazku, R¹ = Me, R² = acetyl, R³ = cyklopentyl, X¹ = X² = X³ = Η, R⁴ = piperazyn-1-yl.

Synteza

Związek według wynalazku można wytwarzać zgodnie ze schematem 1. Składniki A i B wymagają na ogół wspólnego ich połączenia w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak DMSO, toluen lub pirydyna, a następnie ogrzewania takiej mieszaniny w temperaturze 80 - 140°C.

PL 218 692 B1

Schemat 1

Syntezę sulfotlenków przedstawioną strukturą A opisano uprzednio w zgłoszeniach PCT WO 98/33798 i WO 01/70741. Takie związki pośrednie składa się z zastosowaniem ustalonych i opublikowanych procedur (Barvian i in., J. Med. Chem. 2000, 43, 4606 - 4616) z użyciem jako związku wyjściowego dostępnej w handlu pirymidyny, 4-chloro-2-metylosulfanylopirymidyno-5-karboksylanu etylu.

2 3

Pochodne pirydyny B, w których X¹ = X² = X³ oznacza atom wodoru, można wytworzyć z dostępnej w handlu 5-bromo-2-nitropirydyny ze wspomaganym zasadą lub palladem podstawieniem bromu przez nukleofil, taki jak alkohol albo pierwszorzędowa lub drugorzędowa amina, a następnie redukcję grupy nitrowej. Reprezentatywny przykład takiego sposobu przedstawiono na schemacie 2. Przykłady zasad, które można stosować w tej reakcji, obejmują K2CO3 lub Na2CO3. Te zasady można stosować w obecności katalizatora przeniesienia międzyfazowego, takiego jak BU4NI. Reakcje wspomagane palladem prowadzi się zazwyczaj wobec takich katalizatorów, jak Pd(OAc)2, Pd2(dba)3 lub Pd(PPh3)4 itp., w niepolarnych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak benzen, toluen, tetrahydrofuran lub acetonitryl, w temperaturach 25 - 110°C. Te katalizatory są zazwyczaj stosowane z odpowiednim ligandem, takim jak BINAP, Xantophos lub pokrewny ligand Pd oparty na fosfinie. Redukcję grupy nitrowej prowadzi się zazwyczaj z użyciem niklu Raneya, chociaż inne środki redukujące można także stosować, np. pallad na węglu drzewnym lub Fe/HCl.

Alternatywną drogę dojścia do związku według wynalazku stanowi przeprowadzenie fragmentu rdzenia pirydopirymidyny do C-2 aminopirydopirymidyny jak pokazano na schemacie 4 i zastosowanie takiej aminy jako środka nukleofilowego do podstawienia grupy odszczepiającej się, takiej jak bromek lub jodek, we fragmencie pirydynowym. Tę reakcję prowadzi się z katalizatorem palladowym, z wytworzeniem docelowego związku z równoważnymi wydajnościami do drogi pokazanej na schemacie 1. Przykłady katalizatorów palladowych, które można stosować w tej reakcji obejmują Pd(OAc)2, Pd2(dba)3 lub Pd(PPh3)4 i PdCl2(PPh3)2. Te katalizatory są zazwyczaj stosowane z odpowiednim ligandem, takim jak BINAP, Xantophos lub pokrewny ligand Pd oparty na fosfinie. Typowe rozpuszczalniki obejmują dimetoksyetan, tetrahydrofuran, acetonitryl i toluen. Reakcje prowadzi się zazwyczaj w temperaturze 25 - 160°C. W pewnych przypadkach reakcja ulega przyspieszeniu w obecności podstawników odciągających elektrony w pozycji orto względem grupy odszczepiającej się w pierścieniu pirydyny (Jonckers, T. H. M. i inni. Tetrahedron 2001, 57, 7027 - 7034).

PL 218 692 B1

W innej alternatywnej drodze otrzymywania związku według wynalazku, fragment pirydynowy przeprowadza się do guanidyny i kondensuje się z odpowiednim składnikiem, z wytworzeniem pierścienia pirymidyny, drogą reakcji kondensacji (schemat 5). Ta reakcja kondensacji wymaga zazwyczaj ogrzewania składników reakcji w stężeniach 0,5 - 2M, w odpowiednim niepolarnym rozpuszczalniku organicznym, takim jak chlorobenzen, nitrobenzen lub Dowtherm, w temperaturze 100 - 200°C.

(PG) oznacza grupę zabezpieczającą, taką jak Cbz lub Boc

Dodatkowo, syntezę związku według wynalazku można prowadzić z użyciem podstawionych pirymidyn jako związków pośrednich, takich jak pokazano w schematach 6 - 13. Tak więc, na schemacie 6, sulfid 4-amino-5-chlorowcopirymidyny przeprowadza się bezpośrednio w pirydopirymidynon metodami z chemii wprowadzonymi przez Piersa (np. Piers, E. McEachern, E.J. i Romero, M.A., J. Org. Chem. 1997, 62, 6034 - 6040). Alternatywnie, łańcuch boczny pirydyloaminy wprowadza się w wyniku podstawienia sulfotlenku w pozycji C2 z zastosowaniem standardowych procedur (patrz powyżej), a następnie tworzy się pirydopirymidynon drogą sprzęgania Stille'a i w reakcji zamknięcia pierścienia. Podobne metody z chemii zastosowano na schemacie 7 z użyciem jako związku wyjściowego 2-chloropirymidyny. Reakcje Stille'a na schematach 6 i 7 prowadzi się zazwyczaj w warunkach katalizy z użyciem palladu, z zastosowaniem takich reagentów jak Pd(OAc)2, Pd2(dba)3 lub Pd(PPh3)4 i PdCl2(PPh3)2. Typowe rozpuszczalniki obejmują dimetoksyetan, tetrahydrofuran, acetonitryl i toluen, które można ogrzewać w czasie reakcji do temperatury 100 - 200°C. Zamknięcie pierścienia następuje spontanicznie lub z łagodnym ogrzewaniem w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym w temperaturze mniejszej niż 100°C. Przyłączenie bocznego łańcucha C2 na schemacie 7 prowadzi się zazwyczaj drogą katalizy z udziałem POPd, Pd(OAc)2 lub Pd2dba3 i odpowiedniego ligandu, takiego jak BINAP, Xantophos lub pokrewny ligand Pd oparty na fosfinie.

PL 218 692 B1

Schemat 6

Hal = Cl, Br, lub I

Schemat 7

W innym sposobie prowadzącym do utworzenia pierścienia pirydonu wychodzi się ze związku z grupą aldehydową lub ketonową w pozycji C5, i stosuje się proste podstawienie 4-aminopirymidyny, oraz przeprowadzenie reakcji Wittiga, Hornera-Wadswortha Emmonsa, Knoevenagela lub podobnej reakcji, takiej jak reakcja z anionem enolanowym, w celu wprowadzenia wiązania podwójnego C4-C5 w układzie pirydopirymidynonu. Te reakcje prowadzi się w warunkach znanych fachowcowi, z zastosowaniem odpowiedniej zasady, takiej jak NaH, NaOEt, LDA, BuLi, HMDS i podobne. Zamknięcie pierścienia następuje zazwyczaj spontanicznie w takich warunkach reakcji, gdy geometria podwójnego wiązania jest taka, że pirymidyna i ester znajdują się w położeniu cis przy nowoutworzonym podwójnym wiązaniu. Z drugiej strony łagodne ogrzewanie w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym do temperatury niższej niż 100°C może być konieczne do ułatwienia zamknięcia pierścienia. Gdy geometria podwójnego wiązania jest taka, że pirymidyna i ester znajdują się w położeniu trans przy nowoutworzonym podwójnym wiązaniu, zamknięcie pierścienia można osiągnąć przez izomeryzację podwójnego wiązania, np. przez ogrzewanie w DBU do temperatury 100 - 200°C, albo przez poddanie działaniu ze źródłem rodnikowym, takim jak jod i promieniowanie UV, w warunkach dobrze znanych

PL 218 692 B1 fachowcowi. Kolejność tworzenia pierścienia i wprowadzenie bocznego łańcucha może być zmieniona, jak pokazano na schematach 11 - 13.

G1 i G2 oznaczają grupy funkcyjne odciągające elektrony, takie jak CN, CO2Et, CO2Me.

Schemat 11

PL 218 692 B1

Związek według wynalazku można formułować i podawać w szerokiej odmianie doustnych i pozajelitowych postaci dawkowanych, włączając podawanie przezskórne i doodbytnicze. Fachowiec wie, że następujące postacie dawkowane mogą zawierać jako substancję czynną związek według wynalazku lub odpowiednią farmaceutycznie dopuszczalną sól lub solwat.

Preparat farmaceutyczny powinien zawierać terapeutycznie skuteczną ilość związku według wynalazku razem z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, rozcieńczalnikiem lub zaróbką. Dla wytwarzania preparatów farmaceutycznych ze związkiem według wynalazku, farmaceutycznie dopuszczalne nośniki mogą być stałe lub ciekłe. Stała postać preparatów obejmuje proszki, tabletki, pigułki, kapsułki, opłatki, czopki i granulaty do dyspergowania. Stałym nośnikiem może być jedna lub większa liczba substancji, które mogą także działać jako rozcieńczalniki, środki smakowe, środki wiążące, środki konserwujące, środki rozsadzające tabletki lub substancję kapsułkującą.

W proszkach nośnikiem jest drobno zmielona substancja stała, taka jak talk lub skrobia w mieszaninie z drobno zmieloną substancją czynną. W tabletkach substancja czynna jest zmieszana z nośnikiem mającym właściwości wiążące w odpowiednich proporcjach i sprasowania w żądanym kształcie i rozmiarze.

Preparaty zawierają korzystnie około 5 - 70% lub więcej substancji czynnej. Odpowiednie nośniki obejmują węglan magnezu, stearynian magnezu, talk, cukier, laktozę, pektynę, dekstrynę, skrobię, żelatynę, tragakant, metylocelulozę, sól sodową karboksymetylocelulozy, niskotopliwy wosk, masło kakaowe i podobne. Korzystną postacią do stosowania doustnego są kapsułki obejmujące preparat substancji czynnej z substancją kapsułkującą jako nośnikiem, z tym, że kapsułka, w której substancja czynna z ewentualnie innymi nośnikami, jest otoczona przez nośnik, który jest z nią połączony. Dotyczy to także opłatków i pastylek do ssania. Tabletki, proszki, kapsułki, pigułki, opłatki i pastylki do ssania można stosować jako stałe postacie dawkowania do podawania doustnego.

Dla wytwarzania czopków, niskotopliwy wosk, taki jak mieszanina glicerydów kwasu tłuszczowego i masła kakaowego najpierw topi się i substancję czynną homogenicznie się w niej dysperguje, np. przez mieszanie. Stopioną homogeniczną mieszaninę wlewa się następnie do form odpowiedniej wielkości, następnie ochładza i tym samym zestala.

Preparaty w postaci ciekłej obejmują roztwory, zawiesiny i emulsje, takie jak roztwory w wodzie lub w wodzie/glikolu propylenowym. Do iniekcji pozajelitowej, preparaty ciekłe można formułować w roztworze w postaci wodnego roztworu glikolu polietylenowego, izotonicznym roztworze soli, 5%

PL 218 692 B1 wodnym roztworze glukozy i podobnych. Odpowiednie wodne roztwory do stosowania doustnego można wytwarzać przez rozpuszczenie substancji czynnej w wodzie i dodanie w razie potrzeby odpowiednich środków barwiących, środków smakowo-zapachowych, środków stabilizujących i zagęszczających. Odpowiednie wodne zawiesiny do stosowania doustnego można wytworzyć przez dyspergowanie drobno zmielonej substancji czynnej w wodzie i mieszanie z lepką substancją, taką jak naturalne lub syntetyczne gumy, żywice, metyloceluloza, sól sodowa karboksymetylocelulozy lub inne dobrze znane środki ułatwiające tworzenie zawiesiny.

Do podawania doustnego włączone są także preparaty w postaci stałej, które na krótko przed zastosowaniem przeprowadza się w preparaty w postaci ciekłej. Takie postacie ciekłe obejmują roztwory, zawiesiny i emulsje. Te preparaty mogą zawierać oprócz substancji czynnej, środki barwiące, środki smakowo-zapachowe, środki stabilizujące, bufory, sztuczne i naturalne środki słodzące, środki dyspergujące, środki zagęszczające, środki solubilizujące i podobne. Woski, polimery, mikrocząstki i podobne, można stosować do wytwarzania postaci dawkowanych o przedłużonym uwalnianiu. Osmotyczne pompy można również wykorzystywać do jednostajnego dostarczenia substancji czynnej przez przedłużony okres.

Preparaty farmaceutyczne według wynalazku występują korzystnie w postaci dawki jednostkowej. W takiej postaci, preparat podzielony jest na dawki jednostkowe zawierające odpowiednie ilości substancji czynnej. Postać dawki jednostkowej może być preparatem opakowanym, opakowaniem zawierającym oddzielone ilości preparatu, takiego jak opakowane tabletki, kapsułki i proszki we fiolkach lub ampułkach. Postacią dawki jednostkowej może być także kapsułka, tabletka, opłatek lub sama pastylka, lub może być odpowiednia liczba któregokolwiek z nich w postaci opakowanej.

Terapeutycznie skuteczna dawka związku według wynalazku zmienia się od około 0,01 do około 100 mg/kg masy ciała na dzień. Typowa dawka dla dorosłego pacjenta wynosi około 0,1 - 3000 mg na dzień. Ilość substancji czynnej w preparacie dawki jednostkowej można zmieniać lub dostosowywać od około 0,1 - 500 mg, korzystnie około 0,6 - 100 mg zgodnie z konkretnym zastosowaniem i skutecznością substancji czynnej. W razie potrzeby preparat może także zawierać inne terapeutycznie zgodne środki. Pacjentowi potrzebującemu leczenia związkiem według wynalazku podaje się dawkę około 0,6 - 500 mg dziennie, albo pojedynczo lub w kilku dawkach w ciągu 24 godzin. Takie leczenie może być powtarzane sukcesywnie w zależności od potrzeby.

Środek farmaceutyczny służy do leczenia zaburzenia lub stanu wybranego z grupy obejmującej zaburzenia proliferacji komórek, takie jak rak.

Zadaniem podanych poniżej przykładów jest zilustrowanie konkretnych postaci wynalazku lecz w żaden sposób nie ograniczają one zakresu opisu lub zastrzeżeń.

Fachowiec będzie wiedział, że można wprowadzić zmiany i modyfikacje bez naruszenia istoty i zakresu wynalazku.

P r z y k ł a d 1 (porównawczy)

4-[6-(6-Bromo-8-cyklopentylo-5-metylo-7-okso-7,8-dihydropirydo[2,3-d]pirymidyn-2-yloamino)pirydyn-3-ylo]piperazyno-1-karboksylan tert-butylu.

Zawiesinę 6-bromo-8-cyklopentylo-2-metanosulfinylo-5-metylo-8H-pirydo[2,3-d] pirymidyn-7-onu (10,00 g, 0,027 mola, wytworzonego jak w przykładzie 6 w WO 01/707041, który wprowadzono tu jako odniesienie) i 10,37 g (0,0373 mola) 4-(6-aminopirydyn-3-ylo)piperazyno-1-karboksylanu tert-butylu w toluenie (100 ml) ogrzewano w atmosferze azotu w łaźni olejowej przez 7 godzin. Chromatografia cienkowarstwowa (SiO2, 10% MeOH/DCM) wykazała, że oba związki wyjściowe pozostały. Zawiesinę ogrzewano do temperatury wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez dalsze 18 godzin. Otrzymaną zawiesinę ochłodzono do temperatury pokojowej, przesączono i otrzymano 4-[6-(6-bromo-8-cyklopentylo-5-metylo-7-okso-7,8-dihydropirydo-[2,3-d]pirymidyn-2-yloamino)pirydyn-3-ylo]piperazyno-1-karboksylan tert-butylu (5,93 g, 38%). Temperatura topnienia >250°C. MS (APCI); M⁺+1: obliczono: 584,2; stwierdzono: 584,2.

P r z y k ł a d 2 (porównawczy)

4-{6-[8-(Cyklopentylo-6-(1-etoksywinylo)-5-metylo-7-okso-7,8-dihydropirydo[2,3-d]pirymidyn-2-yloamino]pirydyn-3-ylo}piperazyno-1-karboksylan tert-butylu

Zawiesinę 4-[6-(6-bromo-8-cyklopentylo-5-metylo-7-okso-7,8-dihydropirydo[2,3-d]pirymidyn-2-yloamino)pirydyn-3-yIo]piperazyno-1-karboksylanu tert-butylu (5,93 g, 0,010 mola, wytworzonego jak w przykładzie 1), tetrakis(trifenylofosfina)palladu(0) (1,40 g, 0,00121 mola) i tributylo(1-etoksywinylo)cyny (5,32 ml, 0,0157 mola) w toluenie (30 ml) ogrzewano do temperatury wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez 3,5 godziny. Mieszaninę ochłodzono, przesączono i otrzymano substancję stałą.

PL 218 692 B1

Po oczyszczeniu tej substancji stałej drogą chromatografii na żelu krzemionkowym z elucją gradientową 5 - 66% mieszaniną octanu etylu/heksanu przez 15 minut otrzymano 4-{6-[8-cyklopentylo-6-(1-etoksywinylo)-5-metylo-7-okso-7,8-dihydropirydo[2,3-d]pirymidyn-2-yloamino]pirydyn-3-ylo}piperazyno-1-karboksylan tert-butylu w postaci żółtej piany (4,50 g, 78%). MS (APCI) M⁺+1: obliczono: 576,2; stwierdzono: 576,3.

P r z y k ł a d 3

Chlorowodorek 6-acetylo-8-cyklopentylo-5-metylo-2-(5-piperazyn-1-yIopirydyn-2-yloamino)-8H-pirydo[2,3-d]pirymidyn-7-onu

Przez ochłodzony w łaźni lodowej roztwór 4-{6-[8-cyklopentylo-6-(1-etoksywinylo)-5-metylo-7-okso-7,8-dihydropirydo[2,3-d]pirymidyn-2-yloamino]pirydyn-3-ylo}piperazyno-1-karboksylanu tert-butylu (4,50 g, 0,00783 mola, wytworzonego jak w przykładzie 2) w DCM (100 ml) przepuszczono pęcherzykami gazowy chlorowodór. Otrzymaną zawiesinę zamknięto korkiem i mieszano w temperaturze pokojowej przez noc, a następnie rozcieńczono eterem dietylowym (200 ml). Substancję stałą odsączono, przemyto eterem dietylowym, wysuszono i otrzymano chlorowodorek 6-acetylo-8-cyklopentylo-5-metylo-2-(5-piperazyn-1-yIopirydyn-2-yloamino)-8H-pirydo[2,3-d]pirymidyn-7-onu w postaci żółtej substancji stałej (4,01 g, 92%). Temperatura topnienia 200°C. HPLC, odwrócony układ faz C18, 10 - 95% gradient 0,1% TFA/CH3CN w 0,1% TFA/H2O przez 22 minuty: 99,0% w 11,04 minut. MS (APCI); M⁺+1: obliczono: 448,2, stwierdzono: 448,3.

Analiza dla C24H29NtO2-2,4H2O-1,85HCI:

obliczono: C, 51,64; Η, 6,44; N, 17,56, Cl (całkowity), 11,75;

stwierdzono: C, 51,31; H, 6,41; N, 17,20; Cl (całkowity), 12,11.

P r z y k ł a d 4

Testy biologiczne

W celu ustalenia działania hamującego i selektywności związku według wynalazku przeciw Cdk4 i pokrewnych kinaz, związek oceniono w standardowych próbach stosowanych rutynowo do pomiaru hamowania enzymów kinazowych zależnych od cyklin i innych kinaz białkowych (patrz np.

D. W. Fry i inni, J. Biol. Chem. 2001, 276, 16617 - 16623). Testy wykonano jak opisano poniżej.

Test hamowania Cdk2/cykliny A

Testy z enzymem Cdk2 w celu określenia IC50 i kinetycznej oceny prowadzono jak następuje.

Zastosowano 96-studzienkowe płytki filtracyjne (Millipore MADVN6550). W teście stosowano bufor A (20 mM TRIS (tris[hydroksymetylo]aminometan) (pH 7,4), 50 mM NaCl, 1 mM ditiotreitol, 10 mM MgCl₂), w ostatecznej objętości 0,1 ml, 12 mM ATP zawierający 0,25 μ0 [³²Ρ]ΑΤΡ, 20 ng Cdk2/cykliny A, 1 μg białka glejaka siatkówki i badany związek w odpowiednich rozcieńczeniach w buforze A (sam bufor A bez dodatku badanego związku użyto jako kontrolę braku hamowania. Bu32 for A zawierający nadmiar EDTA zastosowano dla określenia poziomu tła ³²P w nieobecności aktywności enzymu). Wszystkie składniki za wyjątkiem ATP dodano do studzienek i płytkę umieszczono na mieszalniku do płytek na 2 minuty. Reakcję zainicjowano przez dodanie [ P]ΑΤΡ i płytkę inkubowano w temperaturze 25°C przez 15 minut. Reakcję zakończono przez dodanie 0,1 ml 20% TCA. Płytkę trzymano w temperaturze 4°C przez co najmniej 1 godzinę, aby umożliwić wytrącenia substratu. Stu32 dzienki następnie przemyto pięciokrotnie 0,2 ml 10% TCA i określono wbudowanie ³²P z użyciem licznika β płytek (Wallac Inc., Gaithersburg, MD). Wartość IC50 badanego związku określono metodą efektu medianowego (Chou T-C i Talalay P.) Applications of the median effect principle for the assessment of low-dose risk of carcinogens and for the quantitation of synergism and antagonism of chemotherapeutic agents. W: New Avenues in Developmental Cancer Chemotherapy (Red. Harrap

K.T. i Connors T.A. ), str. 37 - 64. Academic Press, Nowy Jork, 1987).

Próby hamowania Cdk4/cykliny D

Test z enzymem Cdk4 do określenia IC50 i kinetycznej oceny prowadzono jak następuje. Zastosowano 96-studzienkowe płytki filtracyjne (Millipore MADVN6550). W teście stosowano bufor A (20 mM TRIS (tris[hydroksymetylo]aminometan) (pH 7,4), 50 mM NaCl, 1 mM ditiotreitol, 10 mM MgCl₂), w ostatecznej objętości 0,1 ml, 25 μΜ ATP zawierający 0,25 μ0 [³²P]ATP, 20 μg Cdk4, 1 μg białka glejaka siatkówki i badany związek w odpowiednim rozcieńczeniu w buforze A. Sam bufor A bez dodatku badanego związku zastosowano jako kontrolę braku hamowania. Bufor A zawierający nadmiar EDTA zastosowano dla określenia poziomu tła ³²P przy braku aktywności enzymu. Wszystkie składniki z wyjątkiem ATP dodano do studzienek i płytkę umieszczono na mieszalniku płytkowym na 2 minuty. Reakcję zainicjowano przez dodanie [ P]ATΡ i płytkę inkubowano w temperaturze 25°C przez 15 minut. Reakcję zakończono przez dodanie 0,1 ml 20% kwasu trichlorooctowego (TCA).

PL 218 692 B1

Płytkę trzymano w temperaturze 4°C przez co najmniej 1 godzinę w celu doprowadzenia do wytrącenia substratu. Studzienki następnie przemyto pięciokrotnie 0,2 ml 10% TCA i określono wbudowa32 nie ³²P licznikiem β do płytek (Wallac Inc., Gaithersburg, MD). Wartość IC50 badanego związku określono metodą efektu medianowego (Chou T-C i Talalay P., Applications of the median effect principle for the assessment of low-dose risk of carcinogens and for the guantitation of synergism and antagonism of chemotherapeutic agents. W: New Avenues in Developmental Cancer Chemotherapy (red. Harrap K.T. i Connors T.A.), str. 37 - 64. Academic Press, Nowy Jork, 1987).

Próba hamowania FGFr

W przypadku testu z receptorem FGF (FGFr) kinazy tyrozynowej w 96-studzienkowych płytkach 32 32 (100 μΐ/inkubację/studzienkę) zoptymalizowano warunki dla pomiaru wbudowania P z [γ Ρ]ΑΤΡ do substratu w postaci kopolimeru glutaminian-tyrozyna. W skrócie, do każdej studzienki dodano 82,5 μΐ buforu inkubacyjnego B (25 mM Hepes (pH 7,0), 150 mM NaCl, 0,1% Tritonu Χ-100, 0,2 mM PMSF, 0,2 mM Na₃VO₄, 10 mM MnCl₂) i 750 μ^ poliglutaminianu-tyrozyny (4:1), a następnie 2,5 μl badanego związku w buforze B i 5 μl roztworu 7,5 μg/μl FGFr, w celu rozpoczęcia reakcji. Po 10-minutowej

OO inkubacji w temperaturze 25°C, do każdej studzienki dodano 10 μl [γ P]ΑΤΡ (0,4 μφ plus 50 μΜ ATP) i próbki inkubowano dodatkowo przez 10 minut w temperaturze 25°C. Reakcję zakończono przez dodanie 100 μl 30% kwasu trichlorooctowego (TCA) zawierającego 20 mM pirofosforanu sodu i wytrącenie materiału na matach z włókien szklanych (Wallac). Filtry przemyto trzykrotnie 15% TCA zawierającego 100 mM pirofosforan sodu i pozostałą na filtrach radioaktywność zliczono użyciem czytnika β do płytek Wallac 1250. Aktywność niespecyficzną określono jako radioaktywność pozostałą na filtrach po inkubacji próbek z samym buforem (bez enzymu). Specyficzną aktywność enzymatyczną (enzym plus bufor) określono jako aktywność całkowitą minus aktywność niespecyficzna. Stężenie testowego związku hamującego aktywność specyficzną 50% (IC50) określono na podstawie krzywej hamowania.

Wyniki poniższych oznaczeń w porównaniu ze związkami ujawnionymi w WO 98/33798 przedstawiono w tabeli 1. Dla porównania zamieszczono również dane dotyczą analogu C2 fenyloaminowego związku, gdy był on dostępny. Taki analog różni się od związku z przykładu zamianą atomu azotu w pierścieniu pirydylowym na CH i wyróżniono je przez indeks górny „' ” Takie C2-fenylaminopirydopirymidynony były poprzednio opisane w zgłoszeniach patentowych WO 98/33798 i WO 01/70741.

T a b e l a 1

Przykład	IC50 Cdk4 (μΜ)	IC₅0 Cdk2 (μΜ)	IC₅0 FGFr (μΜ)
3'	0,006	0,233	1,83
3	0,011	>5	>5

Przykłady preparatów

Jak podano powyżej, związek według wynalazku formułuje się zazwyczaj ze zwykłymi zaróbkami, rozcieńczalnikami i nośnikami, z wytworzeniem kompozycji odpowiednich do podawania ssakom. Poniższe przykłady ilustrują typowe kompozycje.

P r z y k ł a d 5 Preparaty Preparat w postaci tabletki Składnik	Ilość
Związek 3b z przykładu 3	50 mg
Laktoza	80 mg
Skrobia kukurydziana (do mieszania)	10 mg
Skrobia kukurydziana (do pasty)	8 mg
Stearynian magnezu (1%)	2 mg

150 mg

Związek według niniejszego wynalazku miesza się z laktozą i skrobią kukurydzianą (do mieszanki) i doprowadza do ujednorodnienia proszku. Skrobię kukurydzianą (do pasty) przeprowadza się w zawiesinę w 6 ml wody i ogrzewa w trakcie mieszania do otrzymania pasty. Pastę dodaje się do wymieszanego proszku i mieszaninę granuluje się. Wilgotne granulki przepuszcza się przez twarde sito nr 8 i suszy w temperaturze 50°C. Mieszaninę z dodatkiem 1% stearynianu magnezu jako środka poślizgowego sprasowuje się w tabletkę. Tabletki podaje się pacjentowi w ilości 1 - 4 na dobę w celu profilaktyki i leczenia raka.

PL 218 692 B1

P r z y k ł a d 6

Roztwór do podawania pozajelitowego

Do roztworu 700 ml glikolu propylenowego i 200 ml wody do iniekcji dodaje się 20,0 g związku 3b według wynalazku. Mieszaninę w trakcie mieszania doprowadza się do pH 5,5 kwasem chlorowodorowym. Objętość doprowadza się do 1000 ml wodą do iniekcji. Roztwór sterylizuje się, napełnia nim 5,0 ml ampułki w dawkach po 2,0 ml (40 mg związku), po czym ampułki zamyka się w atmosferze azotu. Roztwór podaje się drogą iniekcji pacjentowi cierpiącemu na raka i potrzebującego leczenia.

Wynalazek oraz tryb i sposób wytwarzania i jego zastosowanie, zostały opisane w pełni, jasno, zwięźle i w dokładnych określeniach dla umożliwienia fachowcowi do którego się odnoszą, jego wykonanie i zastosowanie. Zrozumiałe jest, że powyżej opisano korzystne postacie wynalazku i dokonać można ich modyfikacji bez wychodzenia poza istotę i zakres wynalazku, określonego w zastrzeżeniach. Aby szczególnie wskazać i wyraźnie zastrzec przedmiot wynalazku, poniższe zastrzeżenia stanowią konkluzję opisu.

Claims

1. 2-(Pirydyn-2-yloamino)-pirydo[2,3-d]pirymidyn-7-on, którym jest 6-acetylo-8-cyklopentylo-5-metylo-2-(5-piperazyn-1-ylopirydyn-2-yloamino)-8H-pirydo[2,3-d]pirymidyn-7-on lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

2. Związek według zastrz. 1, w postaci chlorowodorku.

3. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia lub stanu spowodowanego nieprawidłową proliferacją komórek u ssaka, w tym człowieka, przy czym nieprawidłową proliferację komórek stanowi rak.

4. Zastosowanie według zastrz. 3, w którym nieprawidłową proliferację komórek stanowi rak, wybrany z grupy obejmującej raki sutka, jajników, szyjki macicy, prostaty, jąder, przełyku, żołądka, płuc, kości, okrężnicy, trzustki, tarczycy, jelita cienkiego, jelita grubego, odbytnicy, mózgu i ośrodkowego układu nerwowego, nerwiaka, czerniaka, mięsaka, raka pęcherza, raka wątroby, raka nerki i białaczki.